Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong tơ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

TRONG TƠ NẤM LINH CHI ĐEN

AMAURODERMA SUBRESINOSUM

Ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG

Sinh viên thực hiện

: TRẦN LÊ VIỆT HÀ

MSSV: 1151110113 Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

TRONG TƠ NẤM LINH CHI ĐEN

AMAURODERMA SUBRESINOSUM

Ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG

Sinh viên thực hiện

: TRẦN LÊ VIỆT HÀ

MSSV: 1151110113 Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện dựa

trên cơ sở thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới

Tp. Hồ Chí Minh. Các số liệu, kết quả trong đồ án là trung thực và chưa từng được

công bố ở bất kỳ công trình nào khác.

TP. HCM, ngày 20 tháng 8, năm 2015

Trần Lê Việt Hà

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được cuốn đồ án một cách tốt đẹp, em đã nhận được rất nhiều sự

giúp đỡ từ quý thầy cô, gia đình cũng như bạn bè.

Em xin gửi lời cảm ơn và lời chúc sức khỏe đến ban lãnh đạo trường Đại học

Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm

– Môi trường đã truyền đạt cho em những kiến thức về chuyên ngành trong suốt quá

trình học tập tại trường, giúp cho em nắm vững lý thuyết cũng như thực hành.

Em xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Hoàng Dũng đã tận tình hướng dẫn và

giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đồ án cũng như lúc viết bài báo cáo, để hôm nay

em có thể hoàn thành bài báo cáo tốt nhất của mình.

Và em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị và các bạn cùng làm việc tại

phòng Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em

hoàn thành công việc một cách tốt nhất.

Con vô cùng cảm ơn ba mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên con

trong suốt quá trình học tập. Cám ơn bạn bè, tập thể lớp 11DSH04 đã hỗ trợ, chia sẻ

việc học tập trong thời gian 4 năm Đại học.

MỤC LỤC

MỤC LỤC ......................................................................................................................... i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... iv

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ v

DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................................. vi

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................... 1

2. Tình hình nghiên cứu ........................................................................................ 1

3. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................... 2

4. Nhiệm vụ nghiên cứu ......................................................................................... 3

5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 3

6. Các kết quả đạt được của đề tài ....................................................................... 3

7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp ................................................................................... 4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 5

1.1 Nấm linh chi ....................................................................................................... 5

1.1.1 Khái quát chung ............................................................................................ 5

1.1.2 Đặc điểm sinh học......................................................................................... 6

1.1.3 Điều kiện sống của nấm linh chi .................................................................. 8

1.1.4 Sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi .................................. 8

1.1.5 Tác dụng trị liệu của nấm Linh chi ............................................................. 13

1.2 Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) ............................................ 16

1.2.1 Vị trí phân loại................................................................................................ 16

1.2.2 Đặc điểm hình thái ......................................................................................... 17

1.2.3 Các nghiên cứu về nấm Linh chi đen ............................................................ 19

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 20

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 20

2.2 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 20

2.3 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 20

2.3.1 Thiết bị............................................................................................................ 20

2.3.2 Hóa chất .......................................................................................................... 20

2.3.3 Môi trường sử dụng ........................................................................................ 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 21

2.4.1 Theo dõi sự tăng sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng. ...... 21

2.4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi đen A. subresinosum ..... 21

2.4.3 Khảo sát hoạt tính của tơ nấm linh chi khi chiết với các phân đoạn dung môi khác nhau. ................................................................................................................ 25

2.4.4 Xác định thành phần có trong các phân đoạn dịch chiết thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................................ 29

2.5 Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN............................................................... 31

3.1 Thu nhận sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng ................... 31

3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi A. subresinosum ............ 33

3.2.1 Định tính anthraglycosid ................................................................................ 33

3.2.2 Định tính flavonoid ........................................................................................ 33

3.2.3 Định tính acid béo .......................................................................................... 34

3.2.4 Định tính alkaloid ........................................................................................... 35

3.2.5 Định tính tinh dầu ........................................................................................... 36

3.2.6 Định tính carotenoid ....................................................................................... 36

3.2.7 Định tính phytosterol...................................................................................... 36

3.2.8 Định tính steroid ............................................................................................. 37

3.2.9 Định tính tanin ................................................................................................ 38

3.2.10 Định tính đường khử .................................................................................... 38

3.2.11 Định tính antocyanosid ................................................................................ 39

3.2.12 Định tính saponin ......................................................................................... 40

3.2.13 Định tính acid uronic .................................................................................... 41

3.2.14 Định tính acid hữu cơ ................................................................................... 41

3.3 Khảo sát hoạt tính cao chiết Methanol tổng của tơ nấm Linh chi đen ......... 44

3.3.1 Khả năng kháng khuẩn của tơ nấm linh chi trong cao Methanol .................. 44

3.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết Methanol tổng ................................. 45

3.4 Khảo sát hoạt tính các phân đoạn cao của tơ nấm Linh chi A.subresinosum ..................................................................................................................................... 47

3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm linh chi ................................... 47

3.4.2 Khả năng kháng oxy hóa của các loại cao chiết ............................................ 49

3.5 Kết quả phân tích thành phần có trong cao chiết tơ nấm A. subresinosum bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................. 55

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 59

4.1 Kết luận ................................................................................................................ 59

4.2 Kiến nghị .............................................................................................................. 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 60

PHỤ LỤC

iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DMSO : Dimethylsunfoxide

DPPH : 2,2 diphenyl-1-pycryl-hydrazyl

HPLC : High-performance liquid chromatography

: The half maximal Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế 50%) IC50

: Luria Bertani LB

MeOH : Methanol

: Optical Density OD

: Potato Dextrose Agar PDA

PD-broth : Potato Dextrose Broth

UV : Ultra Violet

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi .......................... 8

Bảng 1.2 Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi ................... 10

Bảng 1.3 Lục bảo Linh chi và các tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590)............................... 13

Bảng 3.1 Khả năng tích lũy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng của nấm linh chi đen. ........... 31

Bảng 3.2 Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết .......................... 42

Bảng 3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học có trong các loại tơ nấm Linh chi .................... 43

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao MeOH thu được trên ................... 44

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao MeOH thu được .......................... 46

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn cao thu được trên đĩa

thạch .......................................................................................................................................... 47

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Hexane thu được ......................... 50

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Chloroform thu được .................. 51

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Ethyl acetate thu được ................ 52

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Nước thu được .......................... 53

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu tạo nấm Linh chi .................................................................................................. 7

Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi ........................................................................ 7

Hình 1.3 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum. (Corner, 1993) ................... 17

Hình 1.4 Quả thể của A.subresinosum ..................................................................................... 19

Hình 2.1 Quy trình thu nhận dịch chiết tơ nấm để phân tích thành phần hóa hoc ................... 22

Hình 2.2 Sơ đồ điều chế cao chiết chứa hoạt chất từ tơ nấm Linh chi đen .............................. 26

Hình 2.3 Phản ứng trung hòa gốc DPPH ................................................................................. 28

Hình 2.4 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Hexane và Chloroform. ............................ 30

Hình 2.5 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Ethyl acetate và Nước. ............................. 30

Hình 3.1 Khả năng tích lũy sinh khối của sợi nấm Amauroderma subresinosum trong môi

trường lỏng ................................................................................................................................ 32

Hình 3.2 Định tính anthraglycosid ........................................................................................... 33

Hình 3.3 Định tính flavonoid ................................................................................................... 33

Hình 3.4 Định tính acid béo ..................................................................................................... 34

Hình 3.5 Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer .................................................................... 35

Hình 3.6 Định tính alkaloid với thuốc thử Bouchardat ............................................................ 35

Hình 3.7 Định tính carotenoid .................................................................................................. 36

Hình 3.8 Định tính phytosterol ................................................................................................. 36

Hình 3.9 Định tính steroid ........................................................................................................ 37

Hình 3.10 Định tính tanin ........................................................................................................ 38

Hình 3.11 Định tính đường khử trước khi đun......................................................................... 38

Hình 3.12 Định tính đường khử sau khi đun ............................................................................ 39

Hình 3.13 Định tính antocyanosid ........................................................................................... 39

Hình 3.14 Định tính saponin .................................................................................................... 40

Hình 3.15 Định tính acid uronic ............................................................................................... 41

Hình 3.16 Định tính acid hữu cơ ............................................................................................. 41

Hình 3.17 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao MeOH ....................................................... 45

Hình 3.18 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao MeOH thu được. ...... 46

Hình 3.19 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Hexane ...................................................... 48

Hình 3.20 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Chloroform ............................................... 48

Hình 3.21 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Ethyl acetate .............................................. 49

Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Hexane thu được. ..... 50

Hình 3.23 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Chloroform thu được.

.................................................................................................................................................. 51

Hình 3.24 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Ethyl acetate thu được.

.................................................................................................................................................. 52

Hình 3.25 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao nước thu được. ......... 53

Hình 3.26 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết ................................................................. 54

Hình 3.27 Sắc ký đồ của dung dịch cao Hexane đo ở bước sóng 254 nm ............................... 55

Hình 3.28 Sắc ký đồ của dung dịch cao Chloroform đo ở bước sóng 254 nm ........................ 56

Hình 3.29 Sắc ký đồ của dung dịch cao Ethyl acetate đo ở bước sóng 254 nm ...................... 57

Hình 3.30 Sắc ký đồ của dung dịch cao Nước đo ở bước sóng 254 nm .................................. 58

vii

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc. Các sách

dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhân Linh chi được sử dụng làm

thuốc từ lâu đời. Sách “Thần nông bản thảo” đã nói: “Linh chi là thuốc kết tinh được

cái quý của mây mưa trên núi cao, cái tinh của ngũ hành trong ngày đêm mà khoe năm

sắc nên có thể giữ sức khỏe cho các bậc đế vương”. Đến đời Minh (năm 1590) trong

sách “Bản thảo cương mục”, tác giả Lý Thời Trân đã phân nấm Linh chi thành “Lục

bảo Linh chi” theo sáu màu sắc xanh, trắng, đỏ, vàng, đen, tím và khái quát tác dụng trị

liệu của Linh chi theo từng màu. Nhưng nói chung các loại Linh chi đều có tính bình,

không độc, có tác dụng chữa trị tốt đối với những bệnh về tim mạch, phổi, gan…

Đến nay với sự phát triển Khoa học – kỹ thuật, nấm Linh chi còn được chứng

minh tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim

mạch, HIV, viêm gan siêu vi… Chính vì thế, việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng

nấm Linh chi vẫn đang được chú trọng. Việc nuôi trồng cũng như thu hoạch quả thể

nấm Linh chi tốn khá nhiều thời gian. Amauroderma subresinosum là một loại nấm

Linh chi đen thường thấy ở các rừng quốc gia Việt Nam. Đây là một loại nấm hiếm

trong họ Ganodermataceae, hoạt tính của A. subresinosum hiện nay vẫn chưa được

nghiên cứu thấu đáo. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu “Khảo sát

sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong tơ nấm

Linh chi đen Amauroderma subresinosum” để nâng cao hiệu quả sản xuất hoạt tính

cần thiết của nấm Linh chi mà không cần chờ thời gian ra quả thể, đáp ứng nhanh nhu

cầu sử dụng của con người.

2. Tình hình nghiên cứu

❖ Ngoài nước

Trên thế giới, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm Linh chi cũng như

những ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau.

Trong một nghiên cứu của Mekkaway, Min và cộng sự (1998) cho biết

Ganoderiol F, ganodermanontriol, acid ganoderic beta, ganodermanondiol, ganoderma

nontriol, acid ganolucidic A, gucidumol B có trong dịch chiết nước của Linh chi có tác

dụng chống HIV và còn nhiều ứng dụng có lợi khác của nấm Linh chi.

Năm 2014, Huey Jen Lin và cộng sự, nghiên cứu một loại protein điều hòa miễn

dịch từ nấm Linh Chi Ganoderma lucidum có khả năng chữa lành nhanh vết thương

sau khi phẫu thuật điện ở mô gan chuột.

❖ Trong nước

Những năm gần đây, tại Việt Nam, trên thị trường thuốc y học cổ truyền dân tộc

cả nước, đặc biệt tại TP.HCM, xuất hiện nhiều loại thuốc mới mang tên Linh chi với

giá bán rất đắt (mắc hơn nhân sâm). Hiện nay, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm

thuốc chữa bệnh trong nước và xuất khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành chế

biến nuôi trồng, nghiên cứu thăm dò những dược chất có trong nấm Linh chi.

Một số công trình nghiên cứu khoa học đã công bố như: “Bước đầu nghiên cứu

tác dụng nấm linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua một số chỉ số lipid máu ở

chuột cống” [15],“Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của nấm Linh chi Việt Nam

(Ganoderma lucidum) trên chuột gây suy gan thực nghiệm” (Nguyễn Thị Mai Anh,

Đào Văn Phan), “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

đối với cấu trúc mô tinh hoàn chuột nhắt trắng dòng SWISS khi bị chiếu xạ liều cao”

(Đoàn Suy Nghĩ) [4], “Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma

subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan – Việt Nam” (Nguyễn Minh

Khang) [13].

3. Mục đích nghiên cứu

Nuôi cấy thu nhận sinh khối hệ sợi nấm linh chi đen Amauroderma

subresinosum và khảo sát một số hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm cũng như các phân

đoạn cao chiết.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Thu nhận sinh khối của tơ nấm Linh chi Amauroderma subresinosum.

- Định tính sơ bộ thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi A.subresinosum.

- Khảo sát khả năng kháng khuẩn và khả năng bắt các gốc tự do có trong tơ nấm

Linh chi A.subresinosum.

5. Phương pháp nghiên cứu

- Tăng sinh tơ nấm Linh chi trong môi trường lỏng để thu nhận sinh khối.

- Thu dịch chiết tơ nấm để khảo sát sơ bộ thành phần hóa học có trong tơ nấm

Linh chi.

- Dùng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch để khảo sát khả năng kháng

khuẩn của tơ nấm với các phân đoạn dung môi khác nhau.

- Dùng phương pháp thử nghiệm DPPH để khảo sát khả năng chống oxy hóa của

tơ nấm Linh chi A.subresinosum.

- Ghi chép và xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2010, Statgraphics

centurion.

6. Các kết quả đạt được của đề tài

- Thời gian nuôi cấy thích hợp để thu nhận sinh khối tơ nấm linh chi là 18 ngày

trong điều kiện nhiệt độ 30oC và đặt nơi tránh ánh sáng.

- Trong thành phần tơ nấm linh chi, được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 30oC thì

có các hoạt chất: antraglycosid, acid béo, tinh dầu, phytosterol, tanin, đường

khử, saponin, acid uronic, acid hữu cơ,…

- Trong các phân đoạn chiết của tơ nấm, cao Methanol được đánh giá có khả năng

kháng khuẩn tốt nhất với các loại vi khuẩn S.aureus, B.subtilis, E.coli,

P.aeruginosa ở nồng độ 20 mg/ml cũng như khả năng bắt gốc tự do IC50 là

1,094 mg/ml.

- Các phân đoạn cao chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, nước của tơ nấm

có khả năng kháng khuẩn yếu hơn cao tổng Methanol, khả năng kháng oxy hóa

của cao Chloroform và cao Ethyl acetate thì tốt hơn cao tổng, cao Hexane thì

tương đương, còn cao nước thì khả năng kháng oxy hóa yếu nhất.

- Phân tích các phân đoạn chiết, thu được trong cao Hexane có 3 hợp chất, cao

Chloroform có 1 chất, cao Ethyl acetate có 2 chất và cao nước thì chưa xác định

được.

7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp

Đồ án gồm có 4 chương:

• Chương 1: Tổng quan tài liệu

• Chương 2: Vật liệu và phương pháp

• Chương 3: Kết quả và thảo luận

• Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nấm linh chi

1.1.1 Khái quát chung

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganodermataceae, người miền Bắc xưa còn

gọi là nấm lim. Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên

thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung…[8].

Nấm Linh chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường

phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ. Hình thái quả thể nấm

Linh chi được mô tả như sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt hoặc thận. Mặt trên mũ có vân

đồng tâm và bóng loáng, màu vàng cam cho đến màu đỏ đậm hoặc nâu đen. Mặt dưới

phẳng, có nhiều lỗ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử. Cuống nấm đặc và cứng, sậm màu

và bóng loáng [12].

Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung

Quốc, cách nay hơn 4000 năm. Trong sách “Thần nông bản thảo“ cách đây khoảng

2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc Lý Thời

Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi” thời nhà Minh với các khái quát công dụng

dược lý khác nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590). Theo Lý Thời Trân thì

nấm Linh chi có 6 màu khác nhau:

▪ Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)

▪ Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)

▪ Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi)

▪ Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)

▪ Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)

▪ Tử chi (Linh chi tím)

Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại,

trong đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crôm... Chúng đã được sử dụng

là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa,

đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế

bào với hàm lượng rất thấp [17].

Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…,

việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô

lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm. Đồng thời

nghiên cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng.

Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác (1720-

1791) cũng thấy đề cập đến Linh chi. Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định, đây là

nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam. Trong quyển “Cây thuốc và vị thuốc

Việt Nam” [2], giáo sư Đổ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu

của loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dược.

1.1.2 Đặc điểm sinh học

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganodermataceae)

Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành

một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi

nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài [6].

Quả thể nấm Linh chi gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối diện

với mũ nấm). Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3 cm.

Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu

đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm. Mũ nấm khi non có hình

trứng, lớn dần có hình quạt. Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh

- vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng như láng vecni. Mũ

nấm có đường kính 2 – 15 cm, dày 0,8 – 1,2 cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc

hơi lõm. Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm.

Hình 1.1 Cấu tạo nấm Linh chi

1.1.2.2 Chu trình sống của nấm Linh chi

Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm. Bào

tử nấm thường có dạng hình trứng cụt đầu màu rỉ sắt. Cấu tạo vỏ ngoài bào tử gồm hai

lớp, có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Lớp ngoài nhẵn, lớp trong có nhiều gai

nhỏ, nối liền hai lớp vỏ. Bào tử nấm Linh chi có kích thước trung bình 4,5 – 6,5 x 8,5 –

11,5 µm. Khi nuôi cấy tơ nấm lúc đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, sợi

nấm ngăn thành nhiều phần và hình thành các bào tử vô tính. Chu kỳ sống của nấm

Linh chi giống như hầu hết các loại nấm khác, nghĩa là cũng bắt đầu từ các bào tử, bào

tử nảy mầm phát triển thành hệ mạng sợi tơ nấm. Gặp điều kiện thuận lợi sợi nấm sẽ

kết thành nụ nấm, nụ phát triển thành chồi, rồi tán và thành tai trưởng thành. Trên tai

nấm sinh ra các bào tử, bào tử phóng thích ra ngoài và chu trình lại tiếp tục. [1]

Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi

1.1.3 Điều kiện sống của nấm linh chi

Linh chi phân bố khắp nơi trên thế giới, ký sinh và hoại sinh rộng khắp ở các

loài cây lá rộng đến lá kim, thậm chí ở các tre trúc, dừa, cau, cọ dừa và nho. Nấm Linh

chi tiết ra các men phân giải màng tế bào endopolygalacturonase (endo – PG) và

endopectin methyl – translinase (endo – PMTE) có tác dụng làm nhũn tế bào thực vật

rất mạnh gây nên tình trạng các loại gỗ và rễ cây bị mùn ra [9].

Bảng 1.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi [1]

Yếu tố Nuôi tơ Ra quả thể

Nhiệt độ 20 – 35oC 25 – 30oC

Ẩm độ 55 – 60% 90 – 95%

pH 4,5 – 6 4,5 – 6

Ánh sáng Không cần Cần ánh sáng tán xạ từ mọi phía

1.1.4 Sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi

Nấm Linh chi có lịch sử lâu đời trong nền y học cổ truyền các nước phương

Đông. Nhiều thành phần có hoạt tính sinh học đã được xác định trong quả thể, tơ nấm,

bào tử và trong cả môi trường nuôi cấy. Polysaccharide và triterpenes là hai hoạt chất

sinh học chính trong số đó. Polysaccharide từ Ganoderma lucidum được tìm thấy trước

tiên trong phòng thí nghiệm có tác dụng chống lại ung thư theo con đường điều biến

miễn dịch. hoạt chất sinh học chống lại sự oxy hóa, cân bằng lượng cholesterol, chống

tăng huyết áp, bảo vệ gan, tổng hợp cholesterol…[25]

Nghiên cứu mới nhất của Viện Nghiên cứu Linh chi hoang dại của Trung Quốc

cho thấy, Linh chi có lượng germanium (một chất giúp khí huyết lưu thông, thúc đẩy

sự hấp thụ ôxy của tế bào) cao hơn nhân sâm 8 lần. Lượng polysaccaride cao trong

Linh chi giúp tăng cường miễn dịch, làm mạnh gan, cô lập và diệt các tế bào ung thư.

Các hoạt chất của Linh chi còn có tác dụng chống dị ứng, chống viêm, chữa trị các

bệnh liên quan đến tim và huyết áp, làm mạnh thận, bổ phổi, mạnh gân xương, tăng trí

nhớ, chống lão hóa…[6]

1.1.4.1 Ganoderma polysaccharide (GLPs)

Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi. Hầu

hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều,

giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon,

lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào

(CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan

trong nước nóng. Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận

từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh

học trong việc chữa trị. Một trong 4 loại polysaccharide có đặc tính chống khối u mạnh

nhất là beta – D glucan, trọng lượng phân tử 3,12 * 105 hoặc 1,56 * 106, có tác dụng

chống ung thu và tăng tính miễn dịch cho cơ thể. [24, 25]

Vai trò dược học của polysaccharide:

▪ Kích thích hệ miễn dịch cơ thể

▪ Gia tăng khả năng dung nạp oxygen

▪ Giảm gốc tự do hydroxyl

▪ Ức chế khối u phát triển

▪ Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ

▪ Tăng chức năng gan

▪ Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường

▪ Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein

1.1.4.2 Ganoderic Acid

Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm

lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử

ganoderma. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng

G.acid cao thì có nhiều vị đắng.

Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen

có bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật.

Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng,

mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc

tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexane, eter ethyl,

chloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành

glycosid [14, 16].

Bảng 1.2 Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi [8]

Hoạt chất Hoạt tính

Ganoderic acid R,S Ức chế giải phóng histamin

Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp

Ganodermaldiol Hạ huyết áp

Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganodermic acid Ức chế tổng hợp cholesterol

Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy rằng Ganoderic acid còn có tác dụng:

▪ Giảm đau

▪ Bảo vệ gan

▪ Chống khối u

1.1.4.3 Ganoderma Adenosine

Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic

acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược

liệu mạnh. Chức năng của adenosine:

▪ Giảm độ nhớt máu

▪ Ức chế kết dính tiểu cầu

▪ Ngăn chặn hình thành cục nghẽn

▪ Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin

▪ Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lưu lượng máu cung cấp cho não

▪ Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể

1.1.4.4 Alkaloid

❖ Định nghĩa

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản

ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Tuy nhiên cũng

có một số alkaloid không có nhân dị vòng với nitơ và một số alkaloid không có phản

ứng kiềm. Một số alcacoid còn có thể có phản ứng acid yếu do có nhóm chức acid

trong phân tử. [16]

❖ Tính chất

Đa số alkaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn. Một vài alkaloid ở dạng

nhựa vô định hình, một vài akcaloid ở dạng lỏng và có màu. Alkaloid là những hợp

chất có tính base yếu, do sự có mặt nguyên tử nitơ. Tính base của các alkaloid khác

nhau tùy theo nhóm thế (R-) gắn trên nguyên tử nitơ. Các alkaloid tính base yếu thì

phải cần môi trường acid mạnh để tạo thành muối, tan trong nước. Các alkaloid ở dạng

tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan trong dung môi hữu cơ:

chloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alkaloid thì tan trong nước, alcol

và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: chloroform, eter, benzen. Chính vì

thế, tính hòa tan của các alkaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích alkaloid ra

khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống [14].

❖ Công dụng

Alkaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y

dược và nhiều chất rất độc. Các alkaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu

trúc của alkaloid.

▪ Tác dụng lên hệ thần kinh

▪ Tác dụng lên huyết áp

▪ Tác dụng trị ung thư

1.1.4.5 Hợp chất Saponin

❖ Khái niệm chung về Saponin

Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là

glycon và phần không đường gọi là aglycon. Saponin có tính chất đặc trưng: khi hòa

tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt;

làm vỡ hồng cầu. Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó

tinh chế, có điểm nóng chảy cao từ 200oC trở lên và có thể trên 300oC. Saponin bị tủa

bởi chì acetate, hidroxid barium, sulfat amonium nên lợi dụng tính chất này để cô lập

saponin.

- Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu

tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:

o Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc

gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan.

Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean.

o Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân

thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan.

- Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan,

spiroalan, solanidan.

❖ Công dụng [6]

▪ Trị long đờm, chữa ho

▪ Là chất phụ gia trong một số vắc xin

▪ Tác dụng thông tiểu

▪ Tác dụng kháng viêm, chống khối u

1.1.4.6 Germanium hữu cơ

Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm

1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của

oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên

đến 1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa. Cơ

thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm

thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ sẽ

duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế

bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều

hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển [21].

Chức năng của Germanium:

▪ Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư

▪ Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ

▪ Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ

1.1.5 Tác dụng trị liệu của nấm Linh chi

Ở các nước Đông Nam Á, (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…) việc

nghiên cứu, phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn

về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm, đồng thời nghiên

cứu hóa dược các hoạt chất, tác dụng dược lý và phương cách điều trị lâm sàng. Giá trị

dược lý của Linh chi càng được khẳng định khi Hội nghị Nấm học thế giới thành lập

Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế tại New York.

Bảng 1.3 Lục bảo Linh chi và các tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590)

Tên gọi Màu sắc Đặc tính dược lý

Thanh chi (long Chi) Xanh Vị chua, tính bình, không độc chữa trị sáng

mắt, bổ gan khí, an thần, tăng trí nhớ.

Hồng chi (xích chi) Đỏ Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ,

dưỡng tim, bổ trung, trị tức ngực.

Hoàng chi (kim chi) Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần, ích tì

khí

Bạch chi (ngọc chi) Trắng Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông

mũi, an thần, chữa ho nghịch.

Hắc chi (huyền chi) Đen Vị ngọt, tính bình, không độc, trị bí tiểu, ích

thận khí.

Tứ chi Tím Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị đau nhức

xương khớp, gân cốt.

Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng cụ thể

của nấm Linh chi được tập hợp vào những mặt tác dụng lớn như sau: [3, 9, 10]

✓ Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn).

✓ Bảo can (bảo vệ gan).

✓ Cường tâm (thêm sức cho tim).

✓ Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hóa).

✓ Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp).

✓ Giải độc (giải toả trạng thái nhiễm độc).

✓ Giải cảm (giải toả trạng thái bị cảm).

✓ Trường sinh (sống lâu, tăng tuổi thọ).

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh chi,

người ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh:

Đối với bệnh về hệ tim mạch: nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định

huyết áp. Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm

bớt, dùng nhiều thì huyết áp ổn định. Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp

thấp thì nấm Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện,

chuyển hoá dinh dưỡng [6, 8].

Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch dùng nấm Linh chi có tác dụng giảm

cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỉ trọng cao trong máu, làm giảm hệ

số sinh bệnh. Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ

trong máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim.

Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với

những ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm

nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn [9].

Khả năng miễn dịch: nấm Linh chi có chứa một lượng lớn Germanium hữu cơ,

Polysaccharides và Triterpenes. Những thành phần này đã được chứng minh là tốt hơn

cho hệ miễn dịch và cải thiện hệ miễn dịch của chúng ta [10].

Chữa bệnh gan: ở Trung Quốc, Linh chi thường được kê vào đơn thuốc cho

những bệnh nhân bị viêm gan mãn tính. Trong điều trị lâu dài từ 2 – 15 tuần thì tỉ lệ

chữa hiệu quả là từ 70,7 – 98 %. Ở Nhật, phần chiết nấm Linh chi đã được báo cáo là

có hiệu quả đối với những bệnh nhân suy gan.

Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị,

giải phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ

dày có thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm. Nhiều

thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị

cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn [7].

Khả năng kháng HIV: để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong

nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm

kháng virus HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sự nhân lên của virus được xác

định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây

nhiễm HIV – 1. Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại

virus này (Gau J.P, 1990; Kim, 1996). Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác

đồ điều trị tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các

bệnh nhân trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt. Các nghiên cứu tại Nhật

Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori,

2001).

o Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1.

Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV– 1.

o Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A

(mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma).

o Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol

(- OH) ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột. [8, 25]

Khả năng antioxidant: nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponin và

triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985).

Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố

khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi. Chính vì vậy con người

có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và

Linh chi Việt Nam nói riêng [8].

- Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do

sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay sau khi bị nhiễm xạ. Chúng làm phục hồi các

tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ nào cho cơ thể [1, 6].

Để sử dụng nấm Linh chi chữa bệnh, người ta thường dùng một số cách như sau:

[29]

▪ Ngâm rượu: nấm Linh chi thái mỏng, ngâm trong rượu mạnh 40o – 45oC, sau

20 ngày có thể sử dụng (ngày uống 2 lần, mỗi lần một chén con).

▪ Sắc nước uống: lấy một khối lượng Linh chi khoảng 3 – 16 gam cho 1 lần

sắc (đổ 3 bát nước đun sôi cô đặc để lấy một bát, làm 3 lần như vậy). Sau đó

đổ trộn lẫn với nhau để uống.

▪ Uống dạng trà: sấy nấm Linh chi, nghiền nát thành bột, mỗi lần uống 3 – 7

gam (cho vào 200 ml nước sôi) hãm lại sau 10 phút rồi uống.

▪ Bào chế ở dạng chè, thuốc viên…

1.2 Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum)

1.2.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại nấm linh chi: [27]

- Giới: Mycota

- Ngành: Basidiomycota

- Lớp: Agaricomycetes

- Bộ: Polyporales

- Họ: Ganodermataceae

- Chi: Amauroderma

- Loài: Amauroderma subresinosum

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Các nhóm nấm dược quý cổ truyền ngày nay xác định là thuộc họ

Ganodermataceace, bao gồm 150 – 200 loài: trong đó nổi bật là Ganoderma (trên 100

loài) và chi Amauroderma (trên 30 loài) [6].

Nấm Linh chi được xem là nấm nhiều lỗ (polypore) sống bám trên thân cây gỗ.

Chúng thường sống đa niên, hoá gỗ cứng, phân tầng, có cuống hoặc không. Khi theo

dõi quá trình phát sinh hình thái ở các loài Amauroderma, tán nấm hình thành, liền tán

và tạo kiểu đính tâm rất tương đồng với các loài Ganoderma mọc tự do dưới đất. Cho

nên có thể xem chi Amauroderma đã phát sinh trực tiếp từ Ganoderma và đây là nhánh

phân hoá lớn nhất trong họ Ganodermataceae [6].

Hình 1.3 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum. (Corner, 1993)

a: Hệ sợi sinh dưỡng; b: Hệ sợi cứng trong hịt nấm

c: Hệ sợi bên trong thịt nấm; d: Bào tử đảm

Bào tử kích thước khá lớn, hình elip, bề mặt bào tử gần như nhẵn dưới kính hiển

vi quang học, kích thước bào tử 9 – 10 µm x 4 – 5 µm [7]. Corner dựa vào kích thước,

hình dạng bào tử nấm và khẳng định chi Amauroderma thuộc họ Ganodermataceae.

[23]. Nấm Linh chi là dạng thể quả. Thể quả có cuống dài hoặc ngắn, thường đính bên,

đôi khi đính tâm. Cuống nấm thường hình trụ hoặc thanh mảnh (cỡ 0,3 – 0,8 cm đường

kính), hoặc mập khỏe (2 – 3,5 cm đường kính), ít khi phân nhánh, dài từ 2,7 – 22 cm,

đôi khi có uốn khúc cong quẹo. Lớp vỏ cuống láng đỏ – nâu đỏ – nâu đen, bóng, không

có lông, phủ suốt lên bề mặt tán nấm.

Quả thể nấm A. subresinosum có dạng hình quạt. Ở giai đoạn mầm nấm có dạng

hình tròn, màu trắng. Sau khoảng 20 - 25 ngày, mầm nấm hình tròn chuyển sang hình

quạt và lớp sắc tố nâu - đen bắt đầu hình thành xung quanh cuống nấm. Phía ngoài

cùng rìa của quả thể nấm có màu trắng đục, dày và sau khoảng 30 – 40 ngày tiếp theo

thì lớp rìa trắng chuyển sang màu đen - quế, lúc này quả thể đã già. Trên mặt mũ nấm

có vân gợn đồng tâm và những rãnh nhỏ lồi lõm nhấp nhô không đồng nhất. Mũ nấm

rộng 6 – 12 cm, dày 1 – 2 cm, đôi khi có vài mũ nhỏ phát triển từ 1 gốc chung. Mép

mũ thường dày, uốn lượn cong vào có các nếp gấp và các khía răng cưa. Mặt dưới quả

thể nấm là lớp bào tầng chứa rất nhiều lỗ nhỏ, màu trắng đục và dày cỡ 4 – 6 ống/mm.

Chính những lỗ nhỏ này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành [26].

Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có dạng thận, gần tròn, đôi khi xòe hình

quạt hoặc có hình dạng khác thường. Trên mặt nấm có vân gợn đồng tâm và có chia

rãnh phóng xạ, màu sắc đỏ nâu, nâu tím, nâu đen, nhẵn bóng, láng như veni, thường

sẫm màu dần khi già. Kích thước tán biến động lớn từ 2 – 36 cm, dày 0,8 – 3,3 cm.

Phần đính cuống gồ lên hay lõm. Phần thịt nấm màu vàng kem – nâu nhợt, phân chia

theo kiểu lớp trên và lớp dưới.

Hình 1.4 Quả thể của A.subresinosum

1.2.3 Các nghiên cứu về nấm Linh chi đen

- Năm 2006, Lê Xuân Thám và công sư đã phát hiện và định danh loài Linh chi

đen Amauroderma subresinosum đầu tiên của Việt Nam ở Vườn Quốc gia Cát Tiên

- Năm 2010, Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã nghiên cứu hoạt chất kháng tế

bào ung thư từ ba loài nấm Linh chi đen, Linh chi đỏ và Linh chi vàng từ vườn Quốc

gia Cát Tiên, Lâm Đồng. Kết quả tác giả đã tinh sạch được 12 hợp chất ergosterol

peroxide có khả năng kháng 4 dòng tế bào ung thư biểu mô, gan, phổi và vú.

- Năm 2011, Đăng Ngọc Quang và các cộng sự tiếp tục nghiên cứu thành phần

hóa học của nấm Linh chi đen Việt Nam A.subresinosum. Kết quả xác định được 14

loại acid béo thiết yếu từ nấm Linh chi đen.

- Năm 2013, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự nghiên cứu hoạt động chống

oxy hóa của các Polysaccharides thô chiết xuất từ nấm Linh chi đen Amauroderma

subresinosum.

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 4/5/2015 đến 16/8/2015, tại phòng Vi sinh thuộc Viện

sinh học nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh.

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) được thu hái tại vùng núi

Chứa Chan tỉnh Đồng Nai và giữ giống tại Viện sinh học Nhiệt đới TP.HCM.

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị

- Cân phân tích A&D, EK-300i

- Cân kỹ thuật A&D, HR-200

- Bếp điện từ

- Nồi hấp Autoclave TOMY, ES-315

- Tủ cấy vô trùng Sanyo MCV-710ATS, Japan

- Tủ sấy Sanyo-MIR-162

- Máy cô quay Heidolph.

- Máy đo OD, Elisa 96 giếng

- Máy Votex Disruptor genie, USA

- Bể điều nhiệt Cole-parmer, BT-15

- Máy HPLC Waters 2695 Separations Module

- Cột HPLC Silica Chrom_Silicycle (Canada). Kích thước 4,6 × 250 mm, 5µm

2.3.2 Hóa chất

- Hóa chất vô cơ: H2SO4, HCl, NH4OH, KOH, Mg, CHCl3, (CH3CO)2O, Na,

FeCl3, Na2CO3, HgCl2, KI, I2, Bi(NO3)3, CuSO4, NaOH.

- Hóa chất hữu cơ: methanol, hexane, chloroform, ethyl acetate, diethyl ether,

CH3COOH, DMSO 10%.

2.3.3 Môi trường sử dụng

2.3.3.1 Môi trường nhân giống

▪ Môi trường PDA

Nước cất: 1000 ml

Khoai tây: 200 g

D-glucose: 20 g

Agar: 20 g

2.3.3.2 Môi trường tăng sinh

▪ Môi trường PD-broth

Nước cất: 1000 ml

Khoai tây: 200 g

D-glucose: 20 g

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Theo dõi sự tăng sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng.

Theo dõi khoảng thời gian tơ nấm Linh chi tăng trọng khi nuôi trồng trong môi

trường lỏng. Tiến hành thu nhận sinh khối ở các ngày 3, 6, 9, 12, 15, 18 mỗi lần thu 5

chai, mẫu thu được đem đi sấy ở 55oC đến khối lượng không đổi và cân trọng lượng

khô.

Cách tiến hành: đổ 80 ml môi trường lỏng vào chai thủy tinh. Hấp khử trùng ở

121oC trong 15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào. Giống lấy từ tơ

nấm nuôi cấy trên môi trường agar, mỗi lần cấy cắt một miếng nhỏ (1,5 x 1,5 cm) nhẹ

nhàng cho vào chai (tránh để mẫu chìm xuống nếu không tơ nấm sẽ rất khó phát triển).

Chai đã cấy được ủ ở nhiệt độ 30oC và đặt ở nơi tránh ánh sáng.

2.4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi đen A. subresinosum

❖ Nguyên tắc

Nguyên tắc căn bản của phương pháp này là tách các hợp chất hữu cơ thành các

nhóm khác nhau dựa vào độ hòa tan khác nhau của các hợp chất này trong các dung

môi hữu cơ có tính phân cực khác nhau, sau đó mỗi nhóm được phát hiện bằng các

thuốc thử đặc trưng.

❖ Phương pháp chiết [11]

Mẫu khô

Dietyl eter

Bã Dịch chiết Eter

Ethanol

Dịch chiết cồn Bã

Nước 70oC/cách thủy

Bã Dịch chiết nước

Hình 2.1 Quy trình thu nhận dịch chiết tơ nấm để phân tích thành phần hóa hoc

➢ Chiết với dietyl eter

Trong một erlen 100 ml, cho vào 5g mẫu khô và 30ml dietyl eter, khuấy trộn

đều trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lọc ngang qua giấy lọc. Lặp lại sự chiết với dietyl

eter vài lần cho đến khi dung dịch chiết cuối nhạt màu.

Cho dịch chiết dietyl eter vào bình lóng, chiết 3 × 20 ml dung dịch nước KOH

10%: trong bình lóng có hai lớp là lớp nước kiềm và lớp dietyl eter.

Lấy lớp nước kiềm: cho vào becher, trung hòa bằng dung dịch HCl 25% cho đến

khi trung tính. Lọc bằng phễu để lấy tủa. Hòa tủa này vào 5ml ethanol 90o và chia dung

dịch này vào đều trong 3 ống nghiệm

▪ Ống 1: nhỏ vài giọt KOH 10%, nếu thấy có màu đỏ, có thể có antraglycosid.

▪ Ống 2: Acid hóa với HCl đậm đặc, sau đó cho một vài hột Mg kim loại, nếu

thấy có màu đỏ, có thể có flavonoid.

▪ Ống 3: Nhỏ một vài giọt dung dịch lên tờ giấy lọc, nếu thấy trên tờ giấy lọc

có vết mờ, có thể có acid béo.

Lấy lớp dietyl eter: cho vào bình lóng, rửa dung dịch eter này với nước cất (3 x

20 ml), tiếp theo chiết với dung dịch H2SO4 2% (3 x 5 ml) sẽ có hai lớp: lớp etyl eter

và lớp nước của acid.

▪ Lớp nước acid được gom chung lại, định tính với các thuốc thử alkaloid.

Thuốc thử Mayer cho tủa màu vàng nhạt; thuốc thử Bouchardat cho tủa màu nâu;

▪ Lớp ethyl eter được chia đều vào ba chén sứ và cho bốc hơi đến khô:

* Chén 1: nếu có mùi thơm có thể có tinh dầu.

* Chén 2: nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu có màu xanh có thể có

carotenoid.

* Chén 3: Sử dụng thuốc thử Lieberman (Ac2O/H2SO4): nhỏ 10 giọt

anhidrid acetic vào chén để hòa tan cắn, rồi rót hết dung dịch này vào

một ống nghiệm. Nhỏ chầm chậm vào dọc theo thành ống nghiệm vài

giọt H2SO4 đậm đặc, nếu thấy mặt phân cách giữa hai dung dịch trong

ống nghiệm có màu vàng lục hoặc lục đỏ, có thể có phytosterol (steroid

thực vật).

➢ Chiết với ethanol 90o

Bã cao sau khi chiết với ethyl eter được chiết với ethenol (3 x 30ml). Sau mỗi

lần chiết, lọc qua ngang qua một tờ giấy lọc, gộp ba lần chiết lại để có dung dịch alcol.

Dung dịch được chia làm 6 phần, mỗi phần khoảng 15 ml dung dịch.

Phần 1: Pha loãng dung dịch alcol với 4 lần thể tích nước cất. Kiềm hóa bằng

dung dịch NH4OH đậm đặc, sẽ có tủa. Lọc để có phần tủa và phần dung dịch qua lọc.

• Phần tủa được hòa với 1 ml chloroform, cho vào ống nghiệm. Thêm vào

thuốc thử Lieberman gồm 1 ml anhidrid acetic và nhỏ chầm chậm vào dọc

theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu dung dịch có màu xanh

dương lục, có thể có steroid.

• Phần dịch lọc được acid hóa bằng HCl, sẽ có tủa. Lọc lấy tủa và hòa tủa với

3 – 4 ml etanol 90o và chia đều vào hai ống nghiệm

* Ống 1: cho và giọt KOH 10%, nếu có màu đỏ, có thể có antraglycosid.

* Ống 2: cho vào một ít bột Mg kim loại và vài giọt HCl đậm đặc, nếu có màu

đỏ, có thể có flavonoid.

Phần 2: Pha loãng dung dịch alcol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào

hay ống nghiệm.

* Ống 1: Trung hòa bằng acetate natri , sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu

có màu xanh đen, có thể có tanin.

* Ống 2: Cho vào vài tinh thể Na2CO3, nếu có sủi bọt, có thể có acid hữu cơ.

Phần 3: Dung dịch alcol được cô cách thủy đến cạn. Hòa cặn này với 3 – 4 ml

H2SO4 2%. Dung dịch này được thử với 2 loại thuốc thử alkaloid: Mayer, Bouchardat.

Nếu dương tính với tất cả 2 loại thuốc thử, có thể có alkaloid.

Phần 4: Dung dịch alcol được cô cách thủy đến cạn. Hòa cặn này với 3 – 4 ml

nước cất, đun nóng và lọc. Cho vào dung dịch lọc 4 -5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 -5

giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa màu đỏ gạch, có thể có đường

khử.

Phần 5: Pha loãng dung dịch alcol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào 2

ống nghiệm. Ống 1: acid hóa, nếu có màu đỏ. Ống 2: kiềm hóa nếu có màu lục. Nếu cả

hai ống nghiệm đều có màu như nêu trên, có thể có antocyanosid.

Phần 6: Chia dung dịch alcol đều vào 2 ống nghiệm và cho bốc hơi đến cạn.

* Ống 1: Cho vào 5 ml nước cất, bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều

dài của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin.

* Ống 2: Cho vào 0,5 ml chloroform và 0,5 ml anhidrid acetic. Nhỏ chầm

chậm vào dọc theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu ở mặt phân

cách xuất hiện màu tím, có thể có saponin triterpen; nếu có mặt phân cách xuất

hiện màu xanh dương lục, có thể có saponin steroid.

➢ Chiết với dung dịch nước H2SO4 1%

Phần bả còn lại được chiết với dung dịch nước H2SO4 1% (3 x 20 ml). Lọc và

chia dịch chiết vào 5 ống nghiệm.

Phần 1: Lắc mạnh theo chiều dài của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin.

Phần 2: Kiềm hóa với dung dịch NH4OH 10%, chiết với diethyl eter (3 x 5 ml).

Lóng lấy lớp dietyl eter. Lại chiết lớp dietyl eter này với dung dịch H2SO4 1%. Lóng

lấy lớp nước, để định tính với 2 loại thuốc thử Mayer, Bouchardat. Nếu dương tính với

tất cả 2 loại thuốc thử, có thể có alkaloid.

Phần 3: Cho vào dung dịh lọc 4 -5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 -5 giọt thuốc

thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa màu đỏ gạch, có thể có đường khử.

Phần 4: Trung hòa bằng acetate natri , sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu có

màu xanh đen, có thể có tanin.

Phần 5: Pha loãng với 2 lần thể tích etanol cao độ, nếu có tủa nhiều, có thể có

hợp chất đường loại acid uronic.

2.4.3 Khảo sát hoạt tính của tơ nấm linh chi khi chiết với các phân đoạn dung môi

khác nhau.

❖ Quy trình tách chiết:

Từ 30g sinh khối tơ nấm được sấy khô, ly trích được 5,7 g cao Methanol thô.

Hòa tan cao này vào nước, rồi lần lượt trích lỏng – lỏng với hexane, chloroform, ethyl

acetate thu được tương ứng 1,7 g cao Hexane, 0,3 g cao Chloroform, 0,23g cao Ethyl

acetate, 2,8 g cao nước.

Sinh khối nấm

Sấy khô

- Chiết với MeOH - Cô quay

Cao MeOH

- Hòa tan với nước - Chiết với Hexane - Cô quay

Cao Hexane Dịch nước

- Chiết với chloroform - Cô quay

Dịch nước Cao Chloroform

- Chiết với ethyl acetate - Cô quay

Cao Ethyl acetate Cao nước

Hình 2.2 Sơ đồ điều chế cao chiết chứa hoạt chất từ tơ nấm Linh chi đen

2.4.3.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm Linh chi

❖ Nguyên tắc: Dịch chiết nấm linh chi sẽ khuếch tán trong môi trường thạch và tác

động lên vi khuẩn được kiểm tra. Nếu dịch chiết kháng được vi khuẩn kiểm tra

thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Độ lớn của vòng

kháng khuẩn sẽ tỷ lệ thuận với độ nhạy cảm của vi khuẩn so với dịch chiết.

❖ Mục đích: Đánh giá sơ bộ khả năng kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm Linh chi

thu được.

❖ Tiến hành:

- Các chủng vi khuẩn được khảo sát là: S.aureus, B.subtilis, E.coli và

P.aeruginosa. Tất cả các chủng trên sẽ được nuôi cấy lắc trong môi trường

LB lỏng, ở 37oC trong 24 giờ.

- Mẫu dịch chiết thô được hòa tan trong DMSO 10%, votex kỹ, để đạt được

nồng độ 20 mg/ml.

- Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường thạch LB đã được hấp khử trùng ở 121 oC

trong 15 phút. Tiến hành đục giếng thạch: đục bốn giếng đường kính 5 mm

gồm một giếng chứa đối chứng âm và ba giếng chứa dịch chiết nấm.

- Hút 100 µl dịch nuôi cấy của từng loại vi khuẩn lần lượt cho vào các đĩa

thạch, rồi dùng que cấy trải đều dịch vi khuẩn trên bề mặt thạch.

- Hút 60 µl nước cất vô trùng cho vào giếng đối chứng âm và hút 60 µl dịch

chiết thô lần lượt cho vào các giếng còn lại.

- Ủ đĩa ở 37 oC trong 24 giờ.

- Quan sát và đo vòng kháng khuẩn và so sánh khả năng kháng khuẩn của các

loại cao thu được.

2.4.3.2 Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tơ nấm Linh chi.

❖ Nguyên tắc: DPPH (2,2 diphenyl-1-pycryl-hydrazyl; C18H12N5O6, M = 394.33)

là một gốc tự do, trong dung dịch ethanol tuyệt đối sẽ có màu tím và độ hấp thu cực đại

ở bước sóng 517 nm [18]. Khi phản ứng với các chất có tính kháng oxi hóa, electron

thừa của nguyên tử nitơ trong DPPH sẽ kết hợp với nguyên tử hydro từ chất có tính

kháng oxi hóa để tạo thành dạng hydrazine tương ứng (Diphenylpicrylhydrazine)

không có gốc tự do. Kết quả làm mất màu tím của DPPH ban đầu và dung dịch dần

chuyển sang màu vàng.

Hình 2.3 Phản ứng trung hòa gốc DPPH

❖ Tiến hành:

- Hòa tan DPPH (dạng bột) vào ethanol để đạt nồng độ 1,2 mg/ml.

- Hòa tan vitamin C (dạng bột) – đối chứng dương, vào nước cất sau đó votex để

đạt nồng độ 2 mg/ml. Pha loãng dung dịch xuống các nồng độ 0,2 mg/ml.

- Các mẫu dịch chiết được hòa tan trong ethanol, votex để đạt nồng độ 4 mg/ml.

Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ tương ứng: 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125 mg/ml.

- Hút lần lượt 100 µl các mẫu dịch chiết tơ nấm ở các nồng độ tương ứng 4; 2; 1;

0,5; 0,25; 0,125 mg/ml cho vào các giếng 1, 2, 3 của các hàng I, II, III, IV, V, VI

- Hút 100 µl ethanol tuyệt đối – đối chứng âm cho vào giếng.

- Hút 100 µl Vitamin C – đối chứng dương ở nồng độ 0,2 mg/ml cho vào giếng 1,

2, 3.

- Thêm 100 µl dung dịch DPPH vào tất cả các giếng, trộn đều hỗn hợp.

- Bao đĩa bằng giấy bạc và ủ ở 37oC trong 30 phút.

- Đo độ hấp thu (OD) ở bước sóng 517 nm.

Khả năng kháng oxy hóa hay bắt các gốc tự do DPPH của các mẫu dịch chiết nấm

sẽ được tính theo công thức sau:

% Hoạt tính chống oxy hóa = (1-ODmẫu/ODđối chứng )×100

2.4.4 Xác định thành phần có trong các phân đoạn dịch chiết thu được bằng kỹ

thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

❖ Nguyên tắc:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC)

là một kỹ thuật sắc ký sử dụng để phân tách một hỗn hợp trong lĩnh vực hóa phân tích

và sinh hóa với mục đích xác định, định lượng và tinh khiết từng thành phân riêng lẻ

của hợp chất. HPLC dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một chất dung môi lỏng để tải

một chất hỗn hợp đơn giản (pha động) vào cột hóa học chứa các hạt (pha tĩnh), qua đó

quá trình phân tách xảy ra dựa vào sự tương tác khác nhau của từng chất trong pha

động với các hạt ở pha tĩnh, mà thời gian ra khỏi cột của từng chất là khác nhau. Đồng

thời dầu dò có thể là UV – VIS, quỳnh quang, khối phổ… sẽ phát hiện chất phân tích

khi chúng đi qua cột và ghi lại những đỉnh peak, một đỉnh peak tương ứng với một chất

có trong mẫu cần phân tích [20].

❖ Tiến hành

• Chuẩn bị mẫu: Mẫu được hòa tan trong methanol để đạt được nồng độ mẫu là

5 mg/ml, sau đó được lọc qua màn lọc Nitrocellulose 0,22 µm nhằm loại bỏ tạp

chất ảnh hưởng đến quá trình phân tách trong cột.

• Quy trình phân tích

- Hệ dung môi methanol và nước cất hai lần phải được đuổi khí để sử dụng

làm pha động trong quá trình chạy HPLC.

- Cột HPLC được rửa bằng methanol trong 60 phút.

- Sau đó phân tích mẫu cao chiết Hexane, Chloroform bằng HPLC theo

gradient nồng độ trong thời gian 50 phút theo quy trình hình 2.4

120

100

l

o n a h t e M %

Thời gian (t)

Hình 2.4 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Hexane và Chloroform.

- Mẫu cao chiết Ethyl acetate và nước được phân tích bằng HPLC trong thời

gian 50 phút theo chương trình hình 2.5

l

o n a h t e M %

Thời gian (t)

Hình 2.5 Quy trình phân tách mẫu của phân đoạn Ethyl acetate và Nước.

- Tốc độ pha động: 1 ml/phút

- Đầu dò: UV 254 nm.

2.5 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được ghi chép và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và

Statgraphics centurion.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN

3.1 Thu nhận sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng

Trong thí nghiệm này, tiến hành nuôi cấy thu nhận sinh khối trong trong những

chai 80 ml trong vòng 18 ngày, thời gian lấy mẫu cách nhau 3 ngày. Mẫu được sấy khô

ở 55oC đến khối lượng không đổi sau đó đem đi cân và ghi nhận số liệu. Số liệu được

ghi nhận ở Bảng 3.1 và Hình 3.1.

Bảng 3.1 Khả năng tích lũy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng của nấm linh chi đen.

Thời gian (ngày) Sinh khối (gam)

0,276 ± 0,01a 3

0,652 ± 0,019b 6

1,803 ± 0,102c 9

1,904 ± 0,05c 12

2,11 ± 0,065d 15

(Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng kí tự a, b, c,…thì

không có sự khác biệt về mặt thống kê và chỉ sự khác nhau ở mức ý nghĩa 0,05)

2,15 ± 0,055d 18

2.5

2.0

)

1.5

1.0

m a g ( i ố h k h n

i

S

0.5

0.0

10 Thời gian nuôi cấy (ngày )

Hình 3.1 Khả năng tích lũy sinh khối của sợi nấm Amauroderma subresinosum trong môi trường lỏng

Nhận xét

- Trong 6 ngày đầu, tơ nấm thích nghi với môi trường, sinh khối tăng lên rất ít.

- Từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9, sinh khối phát triển rất nhanh.

- Đến ngày thứ 12 sinh khối phát triển nhưng không nhanh, quanh mẫu cấy xuất

hiện sắc tố đỏ nâu, vòng sắc tố lan dần và đậm dần theo thời gian.

- Từ ngày 15 trở đi sinh khối tăng chậm dần đến ngày thứ 18 thì hầu như không

đổi.

Để tiết kiệm thời gian nuôi cấy và cũng một phần phụ thuộc vào thời gian để sinh

hoạt chất của tơ nấm Linh chi, chúng tôi quyết định thu nhận sinh khối ở ngày thứ 18

để tiến hành sấy khô và khảo sát một số hoạt tính hóa học.

3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi A. subresinosum

3.2.1 Định tính anthraglycosid

Hình 3.2 Định tính anthraglycosid

Ống 1: Nước cất + KOH 10%

Ống 2: Dịch chiết diethyl ether + KOH 10%

Ống 3: Dịch chiết ethanol + KOH 10%

Nhỏ vài giọt KOH 10% vào dịch chiết nấm linh chi, mẫu thử ống 2 và 3 cho kết

quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ. Quan sát màu sắc sơ bộ ở Hình 3.2 có thể kết

luận sự có mặt anthraglycosid trong dịch chiết etanol nhiều hơn đối với dịch chiết

diethyl eter.

3.2.2 Định tính flavonoid

Hình 3.3 Định tính flavonoid

Ống 1: Nước cất + HClđđ + Mg

Ống 2: Dịch chiết với diethyl eter + HClđđ + Mg

Ống 3: Dịch chiết với ethanol + HClđđ + Mg

Thêm vài giọt HCl đậm đặc vào mẫu thử sau đó cho một ít bột Mg kim loại vào,

theo quan sát như Hình 3.3 thì không thấy sự chuyển sang màu đỏ của các loại dịch

chiết, có thể kết luận sơ bộ là trong dịch chiết tơ nấm linh chi không có sự xuất hiện

của flavonoid.

3.2.3 Định tính acid béo

Hình 3.4 Định tính acid béo

Nhỏ 1 giọt dịch chiết tơ nấm lên giấy lọc, hơ khô, quan sát vết mờ để lại trên

giấy lọc, mẫu đối chứng là nước cất không để lại vết mờ, còn với dịch chiết nấm thì có

(Hình 3.4). Ta có thể kết luận được sự có mặt của acid béo trong dịch chiết tơ nấm linh

chi với diethyl eter.

3.2.4 Định tính alkaloid

Hình 3.5 Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer

Ống 1: Nước cất + TT Mayer

Ống 2: Dịch chiết với diethyl eter + TT Mayer

Ống 3: Dịch chiết với ethanol + TT Mayer

Ống 4: Dịch chiết nước + TT Mayer

Hình 3.6 Định tính alkaloid với thuốc thử Bouchardat

Ống 1: Nước cất + TT Bouchardat

Ống 2: Dịch chiết với diethyl eter + TT Bouchardat

Ống 3: Dịch chiết với ethanol + TT Bouchardat

Ống 4: Dịch chiết nước + TT Bouchardat

Cho dịch chiết bột tơ nấm Linh chi đen tác dụng với thuốc thử Mayer không

phát hiện có tủa màu vàng nhạt (Hình 3.5), tác dụng với thuốc thử Bouchardat cũng

không xảy ra hiện kết tủa màu nâu (Hình 3.6). Có thể là do trong tơ nấm linh chi không

có mặt alkaloid.

3.2.5 Định tính tinh dầu

Cho dịch chiết tơ nấm linh chi đen với diethyl eter vào chén sứ và bốc hơi đến

khô, ngửi thấy có mùi thơm, có thể kết luận được trong dịch chiết có thể có tinh dầu.

3.2.6 Định tính carotenoid

Hình 3.7 Định tính carotenoid

Cho dịch chiết tơ nấm linh chi đen với diethyl eter vào chén sứ và bốc hơi đến

khô, nhỏ vài giọt H2SO4 đđ vào, không thấy xuất hiện màu xanh nên có thể kết luận

không có mặt carotenoid trong tơ nấm. (Hình 3.7)

3.2.7 Định tính phytosterol

Hình 3.8 Định tính phytosterol

Cho dịch chiết tơ nấm linh chi đen với diethyl eter vào chén sứ và bốc hơi đến

khô, sử dụng thuốc thử Lieberman: nhỏ vài giọt anhidrid acetic vào chén để hòa tan

cắn, nhỏ chầm chậm vào dọc theo thành chén, thấy mặt phân cách giữa hai dung dịch

có màu vàng lục (Hình 3.8). Ta kết sơ bộ luận trong dịch chiết tơ nấm linh chi đen có

thể có phytosterol.

3.2.8 Định tính steroid

Hình 3.9 Định tính steroid

Ống 1: Mẫu nước cất

Ống 2: Mẫu dịch chiết tơ nấm với ethanol.

Hòa mẫu thử với 1 ml chloroform, cho vào ống nghiệm. Thêm vào thuốc thử

Lieberman gồm 1 ml anhidrid acetic và nhỏ chầm chậm vào doc theo thành ống

nghiệm vài giọt H2SO4 đđ, không thấy xuất hiện màu xanh dương lục (Hình 3.9). Kết

luận sơ bộ là không có steroid trong dịch chiết tơ nấm Linh chi đen.

3.2.9 Định tính tanin

Hình 3.10 Định tính tanin

Ống 1: Nước cất + acetate natri + FeCl3 5%

Ống 2: Dịch chiết tơ nấm với ethanol + acetate natri + FeCl3 5%

Ống 3: Dịch chiết tơ nấm với nước + acetate natri + FeCl3 5%

Trung hòa mẫu thử bằng acetate natri, sau đó thêm dịch FeCl3 5%, quan sát

Hình 3.10 nhận thấy rằng ống 3 có phản ứng tạo màu xanh đen. Ta có thể kết luận sơ

bộ được là trong dịch chiết tơ nấm linh chi với nước, có thể có tanin.

3.2.10 Định tính đường khử

Hình 3.11 Định tính đường khử trước khi đun

Hình 3.12 Định tính đường khử sau khi đun

Ống 1: Nước cất + TT Fehling A, B

Ống 2: Dịch chiết tơ nấm với ethanol + TT Fehling A, B

Ống 3: Dịch chiết tơ nấm với nước + TT Fehling A, B

Cho vào dung dịch lọc 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 – 5 giọt thuốc thử

Fehling B, đun cách thủy, ta thấy được ống nghiệm 2 và 3 có xuất hiện kết tủa đỏ gạch,

là có thể có đường khử, theo quan sát màu và lượng kết tủa trong Hình 3.12 thì thấy

được đường khử có trong dich chiết với nước nhiều hơn dịch chiết với ethanol.

3.2.11 Định tính antocyanosid

Pha loãng dịch chiết tơ nấm linh chi trong ethanol với 1 lần thể tích nước cất, rồi

rót đều vào 2 ống nghiệm.

Hình 3.13 Định tính antocyanosid

Ống 1: Dịch chiết tơ nấm trong ethanol + HClđđ

Ống 2: Dịch chiết tơ nấm trong ethanol + NaOH

Ống 1 sau khi acid hóa, quan sát không thấy có sự chuyển sang màu đỏ. Ống 2

cũng âm tính với thử nghiệm kiềm hóa khi không có sự chuyển sang màu lục (Hình

3.13). Có thể kết luận sơ bộ trong tơ nấm linh chi không có sự hiện diện của

antocyanosid.

3.2.12 Định tính saponin

Hình 3.14 Định tính saponin

Ống 1: Dịch chiết tơ nấm linh chi trong ethanol

Ống 2: Dịch chiết tơ nấm linh chi trong nước

Cho vào 5ml nước cất, bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dài của

ống, nhận thấy được cả 2 ống đều tạo bọt, theo độ bền thì hợp chất saponin ở tơ nấm

linh chi được chiết với nước nhiều hơn so với ethanol (Hình 3.14).

3.2.13 Định tính acid uronic

Hình 3.15 Định tính acid uronic

Ống 1: Nước cất + ethanol 96o

Ống 2: Dịch chiết tơ nấm trong nước + ethanol 96o

Pha loãng mẫu thử với 2 lần thể tích ethanol 96o, thấy trong dịch chiết tơ nấm có

xuất hiện nhiều kết tủa (Hình 3.15), kết luận sơ bộ rằng trong tơ nấm linh chi có thể có

hợp chất đường loại acid uronic.

3.2.14 Định tính acid hữu cơ

Cho vài tinh thể Na2CO3 vào mẫu thử, có hiện tượng sủi bọt xảy ra, nên có thể

có sự xuất hiện của acid hữu cơ trong tơ nấm linh chi (Hình 3.16)

Hình 3.16 Định tính acid hữu cơ

Kết quả định tính sơ bộ được tóm tắt trong Bảng 3.2. Kết quả cho thấy trong hệ

sợi nấm Linh chi có sự xuất hiện của antraglycosid, acid béo, tinh dầu, phytosterol,

tanin, đường khử, saponin, acid urunic và acid hữu cơ.

Bảng 3.2 Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết

Loại dung dịch chiết

Thuốc thử Kết quả Hợp chất tự nhiên Ethanol Nước

Diethyl eter + ++ KOH 10% Màu đỏ nhạt Antraglycosid

Mg/HCl đđ Có vòng màu đỏ Flavonoid - -

+ Để lại vết ố Acid béo Nhỏ dịch trên giấy lọc

- - - Có tủa màu Alkaloid Mayer, Bouchardat

+ Có mùi thơm Tinh dầu Bốc hơi còn lại cắn

- Màu xanh Carotenoid H2SO4 đđ

+ Lieberman Phytosterol

- Steroid Ac2O, H2SO4

- + FeCl3 Màu vàng lục Màu xanh dương lục Màu lục đen Tanin

+ + Fehling A, B Tủa màu đỏ gạch Đường khử

- HCl/ KOH Màu đỏ/màu lục Antocyanosid

+ ++ Có bọt bền Saponin Lắc mạnh dung dịch

+ Có tủa nhiều Acid uronic Pha loãng với ethanol 90o

+ Sủi bọt Na2CO3

Ghi chú: Acid hữu cơ (-): âm tính (+): dương tính (++): thể hiện nồng độ cao hơn

Khi so sánh thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi đen (A. subresinosum)

với tơ nấm Ganoderma lucidum và tơ nấm Hoàng chi G.colossum đã được nghiên cứu

trước đây [5], kết quả cho thấy trong tơ nấm Linh chi A. subresinosum có nhiều hoạt

chất hóa học hơn G. lucidum và G.colossum, cụ thể như antraglycosid, acid béo, tinh

dầu, acid hữu cơ (Bảng 3.3).

Bảng 3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học có trong các loại tơ nấm Linh chi

Kết quả định tính thành phần hóa học trong tơ nấm Hợp chất

tự nhiên G.lucidum G.colossum A.subresinosum

+ Antraglycosid - -

- Flavonoid - -

+ Acid béo - -

- Alkaloid - -

+ Tinh dầu - -

- Carotenoid + +

+ Phytosterol + +

- Steroid - -

+ Tanin - +

+ Đường khử + +

- Antocyanosid - -

+ Saponin + +

+ Acid uronic + +

+ Acid hữu cơ - -

3.3 Khảo sát hoạt tính cao chiết Methanol tổng của tơ nấm Linh chi đen

3.3.1 Khả năng kháng khuẩn của tơ nấm linh chi trong cao Methanol

Để khảo sát hoạt tính kháng lại một số chủng vi khuẩn: S.aureus, B.subtilis,

E.coli và P.aeruginosa bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, các loại cao

chiết được chuẩn bị ở nồng độ 20 mg/ml, sau đó được bơm vào các giếng đã đánh dấu

và được ủ ở 37 0C, trong 24 giờ. Quan sát và đo vòng kháng khuẩn (Bảng 3.4)

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao MeOH thu được trên

đĩa thạch

Đường kính vòng STT Chủng vi khuẩn kháng khuẩn (mm)

1 Bacillus subtilis 17,8 ± 0,82a

2 Staphylococcus aureus 17 ± 1,41a

3 Pseudomonas aeruginosa 19,7 ± 0,47b

(Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng kí tự a, b, c,…thì

không có sự khác biệt về mặt thống kê và chỉ sự khác nhau ở mức ý nghĩa 0,05)

4 Escherichia coli 20,3 ± 0,47b

Kết quả thu được cho thấy cao MeOH có khả năng kháng lại cả 4 loại vi khuẩn

với đường kính từ 17 – 20 mm sau 24 giờ ủ ở 37oC. Trong đó khả năng kháng lại

P.aeruginosa và E.coli (đường kính 19 – 20 mm) cao hơn so với 2 chủng còn lại.

Hình 3.17 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao MeOH

3.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết Methanol tổng

Khả năng kháng oxy hóa của các phân đoạn được tiến hành khảo sát bằng phản

ứng DPPH (2,2 diphenyl-1-picryl-hydrazyl) trên đĩa 96 giếng, ủ ở 37 0C, trong 30 phút

và đo OD517nm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.18.

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao MeOH thu được

OD 1

OD 2

OD 3

% sai số

Trung bình

% bắt gốc tự do

Nồng độ mẫu (mg/ml) 4 2 1 0,5 0,25 0,125

0,12 0,17 0,28 0,49 0,54 0,61

0,13 0,206 0,29 0,46 0,57 0,59

0,12 0,26 0,34 0,49 0,605 0,57

0,12 0,23 0,30 0,48 0,56 0,59

81,21 64,71 53,82 26,78 14,92 10,39

1,153 7,943 4,872 2,562 2,02 3,132

Hình 3.18 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao MeOH thu được.

Kết quả cho thấy cao MeOH thu được có khả năng bắt các gốc tự do DPPH theo

nồng độ tăng dần từ 10,39 % ở nồng độ 0,125 mg/ml đến 81,21 % ở nồng độ 4 mg/ml.

Nồng độ cao MeOH ức chế các gốc tự do DPPH ở 50% (IC50) là 1,094 mg/ml.

3.4 Khảo sát hoạt tính các phân đoạn cao của tơ nấm Linh chi A.subresinosum

3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm linh chi

Để khảo sát hoạt tính kháng lại một số chủng vi khuẩn: S.aureus, B.subtilis,

E.coli và P.aeruginosa bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, các loại cao

chiết được chuẩn bị ở nồng độ 20 mg/ml, sau đó được bơm vào các giếng đã đánh dấu

và được ủ ở 37 0C, trong 24 giờ. Quan sát và đo vòng kháng khuẩn.

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn cao thu được trên đĩa thạch

Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

Dịch chiết Ethyl Hexane Chloroform Nước Chủng VK acetate

Bacillus subtilis 10 ± 0,30 16 ± 0,36 10 ± 0,30 0

Staphylococcus aureus 10 ± 0,20 15 ± 0,58 10 ± 0,45 0

Pseudomonas 0 0 0 0 aeruginosa

Escherichia coli 0 0 0 0

Theo kết quả bảng 3.6, bước đầu cho thấy được rằng dịch chiết tơ nấm trong các

phân đoạn có khả năng kháng lại các vi khuẩn gram dương tốt hơn so với gram âm.

Trong 4 phân đoạn thu nhận được, thì khả năng kháng khuẩn của phân đoạn

Chloroform là tốt nhất so với phân đoạn Hexane và Ethyl acetate. Trong cao nước thì

hầu như không có khả năng kháng khuẩn.

So với cao tổng Methanol thì Methanol kháng được 4 chủng vi khuẩn, các phân

đoạn sau chỉ kháng được B.subtilis, S.aureus vì hợp chất kháng khuẩn trong các loại

cao có thể bị mất khi thực hiện các giai đoạn tách chiết, nên khả năng kháng khuẩn của

phân đoạn cũng giảm so với cao ban đầu.

Hình 3.19 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Hexane

Hình 3.20 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Chloroform

Hình 3.21 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Ethyl acetate

3.4.2 Khả năng kháng oxy hóa của các loại cao chiết

Khả năng kháng oxy hóa của các phân đoạn được tiến hành khảo sát bằng phản

ứng DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) trên đĩa 96 giếng, ủ ở 37 0C, trong 30 phút

và đo OD517nm.

Kết quả được thể hiện ở các hình 3.22, 3.23, 3.24, 3.25 tương ứng cho các phân

đoạn chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate và nước.

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Hexane thu được

OD 1

OD 2

OD 3

% sai số

Trung bình

% bắt gốc tự do

Nồng độ mẫu (mg/ml) 4 2 1 0.5 0.25 0.125

0,095 0,174 0,349 0,575 0,542 0,634

0,104 0,153 0,372 0,550 0,642 0,703

0,108 0,244 0,391 0,602 0,605 0,710

0,102 0,190 0,371 0,576 0,596 0,682

85,95 73,86 49,10 20,96 18,12 6,316

0,914 6,542 2,888 3,571 6,942 5,767

Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Hexane thu được.

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Chloroform thu được

OD 1

OD 2

OD 3

% sai số

Trung bình

% bắt gốc tự do

Nồng độ mẫu (mg/ml) 4 2 1 0.5 0.25 0.125

0,136 0,112 0,170 0,331 0,433 0,499

0,148 0,118 0,176 0,320 0,443 0,506

0,152 0,115 0,181 0,319 0,428 0,506

0,145 0,115 0,176 0,323 0,435 0,504

80,04 84,21 75,88 55,6 40,32 30,84

1,143 0,412 0,756 0,914 1,049 0,555

Hình 3.23 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Chloroform thu được.

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Ethyl acetate thu được

OD 1

OD 2

OD 3

% sai số

Trung bình

% bắt gốc tự do

Nồng độ mẫu (mg/ml) 4 2 1 0.5 0.25 0.125

0,125 0,119 0,252 0,409 0,400 0,555

0,107 0,097 0,237 0,397 0,501 0,562

0,109 0,098 0,231 0,396 0,486 0,555

0,114 0,105 0,240 0,401 0,509 0,557

84,39 85,62 67,04 44,98 30,11 23,48

1,35 1,706 1,485 0,993 3,827 0,555

Hình 3.24 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Ethyl acetate thu được.

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Nước thu được

OD 1

OD 2

OD 3

% sai số

Trung bình

% bắt gốc tự do

Nồng độ mẫu (mg/ml) 4 2 1 0.5 0.25 0.125

0,155 0,269 0,433 0,584 0,681 0,612

0,112 0,211 0,430 0,567 0,555 0,609

0,107 0,203 0,404 0,571 0,551 0,614

0,108 0,228 0,422 0,574 0,596 0,612

85,17 68,74 42,01 21,19 18,21 16,02

0,495 4,945 2,190 1,220 10,150 0,346

Hình 3.25 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao nước thu được.

Kết quả cho thấy được rằng những phân đoạn thu được đều có khả năng bắt các

gốc tự do DPPH theo nồng độ tăng dần. Và nồng độ ức chế 50% của các phân đoạn lần

lượt là 1,115; 0,336; 0.521; 1,218 mg/ml cho các cao Hexan, Chloroform, Ethyl acetate

và nước.

Qua các giá trị IC50 của các phân đoạn và IC50 của cao tổng MeOH cho thấy

được phân đoạn chiết với Chloroform, Ethyl acetate có khả năng bắt các gốc tự do tốt

hơn cao tổng với các giá trị IC50 lần lượt là 0,336 và 0,521 mg/ml. Phân đoạn Hexane

có giá trị tương đương với phân đoạn cao tổng Methanol trong khi đó phân đoạn nước

1.4

1.2

có giá trị IC50 cao nhất.

) l

0.8

m / g m

0.6

( 0 5 C I

0.4

0.2

MeOH

Hexan

Cloroform Ethyl acetate

H2O

Các phân đoạn

Hình 3.26 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết

3.5 Kết quả phân tích thành phần có trong cao chiết tơ nấm A. subresinosum bằng

kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Để xác định thành phần hoạt chất chính có trong các phân đoạn cao, kỹ thuật sắc

ký lỏng hiệu năng cao được thực hiện. Sắc ký đồ của cao Hexane, Chloroform, Ethyl

acetate, nước lần lượt được thề hiện ở các hình 3.27, 3.28, 3.29 và 3.30.

Hình 3.27 Sắc ký đồ của dung dịch cao Hexane đo ở bước sóng 254 nm

Theo quan sát sắc ký đồ thu được, có 3 peak đặc trưng, tương ứng với các chất

có trong cao Hexane. Peak đầu tiên thời gian lưu là 24 phút, peak kế tiếp vào khoảng

phút 31. Peak thứ 3 thời gian lưu là 35 phút.

Hình 3.28 Sắc ký đồ của dung dịch cao Chloroform đo ở bước sóng 254 nm

Trong cao Chloroform, phân tích được một chất đặc trưng, thời gian lưu của

chất ở phút thứ 24.

Hình 3.29 Sắc ký đồ của dung dịch cao Ethyl acetate đo ở bước sóng 254 nm

Quan sát sắc ký đồ của cao Ethyl acetate, có 2 peak đồng nghĩa với việc có chất đặc

trưng và một vài tạp chất khác. Thời gian lưu của 2 chất lần lượt là 14 và 21 phút.

Hình 3.30 Sắc ký đồ của dung dịch cao Nước đo ở bước sóng 254 nm

Đối với phân đoạn cao nước, các chất có thời gian gian lưu rất ngắn khi phân

tách bằng cột C18 nên việc phân tách bằng cột C18 không hiệu quả. Các chất này có

thể là đường khử, polysaccharide,… Phân đoạn đang được tiến hành phân tách bằng

các hệ thống sắc ký khác như sử dụng cột carbohydrate, cột amine.

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

Thời gian nuôi cấy thích hợp để thu nhận sinh khối tơ nấm linh chi là 18 ngày

trong điều kiện nhiệt độ 30oC.

Trong thành phần tơ nấm linh chi, được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 30oC thì

có các hoạt chất: antraglycosid, acid béo, tinh dầu, phytosterol, tanin, đường khử,

saponin, acid uronic, acid hữu cơ,…

Cao Methanol được đánh giá có khả năng kháng khuẩn tốt nhất với các loại vi

khuẩn S.aureus, B.subtilis, E.coli, P.aeruginosa ở nồng độ 20 mg/ml. Đồng thời cao

Methanol cũng có khả năng kháng oxy hóa tốt với IC50 là 1,094 mg/ml.

Các phân đoạn cao chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, nước của tơ nấm

có khả năng kháng khuẩn yếu hơn cao tổng Methanol, khả năng kháng oxy hóa của cao

Chloroform và cao Ethyl acetate thì tốt hơn cao tổng, cao Hexane thì tương đương, còn

cao nước thì khả năng kháng oxy hóa yếu nhất.

Phân tích các phân đoạn chiết, thu được trong cao Hexane có 3 hợp chất, cao

Chloroform có 1 chất, cao Ethyl acetate có 2 chất và cao nước thì chưa xác định được.

4.2 Kiến nghị

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao Methanol đối với các chủng vi khuẩn.

Dùng các hệ thống sắc ký khác để xác định thành phần phân đoạn của cao nước.

Thu nhận và xác định các hoạt chất chính có trong các phân đoạn cao được phân

tách được bằng HPLC.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Arichi D.S. and Hagashi D.T. (2003). Linh chi nguyên chất và bệnh thời nay

(Đoàn Sáng dịch). Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, Việt Nam.

2. Đỗ Tất Lợi (2006). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học,

Hà Nội.

3. Đoàn Sáng (2003). Linh chi nguyên chất và bệnh thời nay. Nhà xuất bản Y học,

Hà Nội, Việt Nam.

4. Đoàn Suy Nghĩ (2008), Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của nấm Linh chi

(Ganoderma lucidum) đối với cấu trúc mô tinh hoàn chuột nhắt trắng dòng SWISS

khi bị chiếu xạ liều cao. Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 49.

5. Lê Quỳnh Loan (2014), Thử nghiệm nuôi cấy và khảo sát thành phần hoạt chất

chính của một số chủng nấm họ Linh chi Ganodermataceae thu nhận tự nhiên,

Luận văn Thạc sĩ, ĐH KHTN TP.HCM, Tp. Hồ Chí Minh.

6. Lê Xuân Thám (1996). Nấm Linh chi – tài nguyên dược liệu quí ở Việt Nam. Nhà

xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

7. Lê Xuân Thám (2013). Phát triển sản xuất nấm trên cơ sở điều tra xây dựng bảo

tàng nấm ở Vườn quốc gia Cát Tiên. Báo cáo Khoa Học – Sở Khoa học và Công

nghệ Đồng Nai.

8. Lê Xuân Thám (1996). Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điển hấp thu khoáng

nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst. Luận án phó tiến sỹ khoa

học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Việt Nam.

9. Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh (2000). Nấm ăn nấm dược liệu - công

dụng và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Hà Nội, Hà Nội.

10. Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn và Zani Federico (2002). Cơ sở khoa học và

công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

11. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, ĐH Quốc

gia TP.HCM, Thành phố Hồ Chí Minh.

12. Nguyễn Lân Dũng (2001). Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1 và 2. Nhà xuất bản

Nông nghiệp, Hà Nội.

13. Nguyễn Minh Khang (2005), Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen

(Amauroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan – Việt

Nam, Luận văn kỹ sư, ĐH Nông Lâm TP.HCM, Tp. Hồ Chí Minh.

14. Nguyễn Phước Nhuận (2001). Giáo trình sinh hoá học, phần 1, Nhà xuất bản Đại

học Quốc Gia TPHCM, T.p Hồ Chí Minh.

15. Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan, Phạm Thị Vân Anh (2005), Bước đầu

nghiên cứu tác dụng nấm linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua một số chỉ

số lipid máu ở chuột cống. Tạp chí nghiên cứu Y Học 38 (5).

16. Trần Hùng (2004). Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược

TP.HCM.

17. Trần Văn Mão (2004). Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa bệnh.

Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội.

18. Viện Dược liệu – Bộ Y Tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của

thuốc từ Dược thảo, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội , tr. 28-35, 279-292, 367.

Tài liệu Tiếng Anh

19. Chairul, T.T., Hayashi, Y., Nishizawa, M., Tokuda, H., Chairul, S.M., Hayashi,

Y.(1991). Applanoxidic acids A, B, C and D, biologically active tetracyclic

triterpenes from Ganoderma applanatum. Phytochemistry 30, 4105–4109.

20. Hamide Ceniuva and tuncel Ozden (2002). Simultaneous High Performance

Liquid Chromatographic Determination of paracetamol, phenylephrin HCl and

chlorpheniramine maleate in pharmaceutical dosage forms. Journal of

Chrmatografic Sience, ISSN 0021-9665 Volume 40, Number 2, pp. 97-100.

21. Masao Hattori (2006), Protective effects of an acidic polysaccharide isolated from

fruiting bodies of Ganoderma lucidum against murine hepatic injury induced by

Propionibacterium acnes and lipopolysaccharide, J. Nat. Med.

22. Shwu-Bin Lin, Chyi-Hann Li, Shiuh-Sheng Lee, Lou-Sing Kan (2003).

Triterpene-enriched extracts from ganoderma lucidum inhibit growth of hepatoma

cells via suppressing protein kinase c, activatin mitogen-activated protein kinases

and g2-phase cell cycle arrest. Life Sciences 72 (2003) 2381 – 2390.

23. Steyaert R.L (1972). Species of Ganoderma and related genera mainly of the

boyor and leiden herbaria. National de Beigique, Burxelle.

24. Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou (2001).

Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature. Froc Int

Symposium Ganoderma Sci, Auckland.

25. YihuaiGao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of Ganoderma

polysaccharides. Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,00-00.

26. Zhaoji – Ding (1980). The Ganodermataceae in chine. Berlin Shiffigart.

Tài liệu từ Internet

27. https://sv.wikipedia.org/wiki/Ganoderma_subresinosum

28. http://www.Mushroom InformationGanoHIV.mht

29. http://khoahoc247.com/index.php/2014/01/tim-hieu-ve-linh-chi-p2/

PHỤ LỤC

Phụ lục A: Hình ảnh thí nghiệm

Tơ nấm Linh chi đen nuôi trên môi trường PDA

Sinh khối nấm Linh chi đen trong môi trường lỏng sau 15 ngày nuôi cấy

Thực hiện phản ứng DPPH trên đĩa 96 giếng

(I) 4 mg/ml ; (II) 2 mg/ml;

(III) 1mg/ml; (IV) 0,5 mg/ml;

(V) 0,25 mg/ml; (VI) 0,125 mg/ml

Máy HPLC

Phụ lục B: Các bảng phân tích ANOVA

0.41407

0.473963 -0.0385617

N3 N6 N9 N12 N15 N18 Total

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness 0.267 0.0100664 0.631 0.019218 1.713 0.101589 1.87 0.0504777 2.05 0.0655744 2.1 0.055003 0.267 0.761445

0.02 0.038 -0.535305 0.2 0.620533 0.092 1.17089 0.13 0.11 1.943 -1.29252

3.64286% 2.94906% 5.63549% 2.65114% 3.10779% 2.55195% 51.3334%

0.287 0.669 1.913 1.962 2.18 2.21 2.21

1. Theo dõi sự tăng sinh khối của tơ nấm Linh chi đen trong môi trường lỏng

Summary Statistics Average Count 0.276333 3 0.651667 3 1.80267 3 1.904 3 2.11 3 2.15533 3 1.48333 18 ANOVA Table

Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares Df Mean Square 5 9.81524 12 0.0413287 17 9.85657

1.96305 0.00344406

F-Ratio 569.98

P-Value 0.0000

Multiple Range Tests

Homogeneous Groups X X X X X X

Count Mean 3 3 3 3 3 3

0.276333 0.651667 1.80267 1.904 2.11 2.15533

Method: 95.0 percent LSD N3 N6 N9 N12 N15 N18

2. Khả năng kháng khuẩn của tơ nấm linh chi trong cao Methanol khảo sát bằng

Count

Average

Coeff. of variation Minimum Maximum Range

B subtilis E coli P aeruginosa S aureus Total

3 3 3 3 12

Standard deviation 1.0 0.57735 0.57735 1.73205 1.83402

5.88235% 2.83943% 2.93568% 10.1885% 9.91363%

16.0 20.0 19.0 16.0 16.0

18.0 21.0 20.0 19.0 21.0

2.0 1.0 1.0 3.0 5.0

Stnd. skewness 0.0 1.22474 -1.22474 1.22474 -0.525181

phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Summary Statistics

17.0 20.3333 19.6667 17.0 18.5 ANOVA Table

Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares Df Mean Square 3 27.6667 8 9.33333 11 37.0

9.22222 1.16667

F-Ratio 7.90

P-Value 0.0089

Multiple Range Tests

Homogeneous Groups X X X X

Method: 95.0 percent LSD B subtilis S aureus P aeruginosa E coli

Count Mean 3 3 3 3

17.0 17.0 19.6667 20.3333

Phụ lục C: Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn

▪ Môi trường tăng sinh vi khuẩn: LB

Nước cất : 100 ml

Pepton : 1 g

NaCl : 1 g

Yeast extract : 0,5 g

▪ Môi trường đĩa thạch kháng khuẩn: LB-agar

Nước cất : 100 ml

Pepton : 1 g

NaCl : 1 g

Yeast extract : 0,5 g

Agar : 2 g