Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị bằng Isoniazid và đánh giá ảnh hưởng của gen NAT2 của bệnh nhân lao đến tính kháng thuốc Isoniazid

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Nguyễn Thị Thu Hà

KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO

PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN LAO ĐIỀU TRỊ BẰNG ISONIAZID VÀ

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA GEN NAT2 CỦA BỆNH NHÂN LAO

ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Nguyễn Thị Thu Hà

KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO

PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN LAO ĐIỀU TRỊ BẰNG ISONIAZID VÀ

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA GEN NAT2 CỦA BỆNH NHÂN LAO

ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số:

8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Vũ Thị Thơm

TS. Phạm Thế Hải

Hà Nội, 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hà

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự quan

tâm giúp đỡ của các Thầy Cô, nhà trường, cơ quan, gia đình và bạn bè.

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới TS. Vũ Thị Thơm,

TS. Phạm Thế Hải là những người Thầy đã tận tình hướng dẫn khoa học, tạo điều

kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Thị Luyến - chủ nhiệm đề tài, ThS. Lê Anh Tuấn

- nghiên cứu sinh của đề tài Nghị định thư hợp tác nghiên cứu giữa Đại học Quốc gia

Hà Nội và Đại học Liverpool - Vương quốc Anh (Mã số HNQT/SPĐP/01.06), đã tạo

điều kiện để tôi được tham gia nghiên cứu, hoàn thành luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các nhà khoa học trong hội

đồng chấm đề cương và luận văn tốt nghiệp đã đóng góp những ý kiến quý báu cho

luận văn.

Tôi xin gửi lời biết ơn tới Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo sau đại học, các

Thầy Cô Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia

Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học

tập, nghiên cứu tại trường.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Các cán bộ Bộ môn Y Dược học cơ sở, Ban lãnh đạo Khoa Y Dược - Đại

học Quốc gia Hà Nội; các bác sĩ và nhân viên Bệnh viện Phổi Trung ương đã tạo

điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Sự biết ơn đối với gia

đình và bạn bè đã luôn sát cánh động viên và khích lệ tôi.

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới những bệnh nhân đã tham gia vào nhóm

nghiên cứu, sự đóng góp của các bệnh nhân đã giúp tôi có thành công này.

Hà Nội, ngày tháng năm

Nguyễn Thị Thu Hà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về vi khuẩn lao .............................................................................. 3

1.1.1. Hình thể, cấu trúc ...................................................................................... 3

1.1.2. Khả năng gây bệnh .................................................................................... 4

1.1.3. Nuôi cấy vi khuẩn lao................................................................................ 5

1.2. Thuốc điều trị lao và lao kháng thuốc .......................................................... 6

1.2.1. Thuốc điều trị lao và phân loại lao kháng thuốc ....................................... 6

1.2.2. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao ........................................................... 7

1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tính kháng thuốc của

vi khuẩn lao.............................................................................................................. 9

1.3. Isoniazid trong điều trị lao .......................................................................... 10

1.3.1. Dược lý và chuyển hóa của Isoniazid ..................................................... 10

1.3.2. Gen liên quan đến chuyển hóa Isoniazid ở bệnh nhân lao ...................... 12

1.4. Đặc điểm của gen NAT2 và đa hình gen NAT2 ......................................... 13

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16

2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 16

2.1.1. Dụng cụ, trang thiết bị ............................................................................. 16

2.1.2. Hóa chất, môi trường ............................................................................... 16

2.2. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 17

2.2.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu ............................................. 17

2.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ .................................................................................. 17

2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 17

2.3.1. Cỡ mẫu .................................................................................................... 17

2.3.2. Thu thập mẫu bệnh phẩm ........................................................................ 18

2.3.3. Quy trình nuôi cấy đờm trên môi trường lỏng BACTEC MGIT ............ 18

2.3.4. Phương pháp kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một ................ 20

2.3.5. Phân tích kiểu gen NAT2 để xác định kiểu hình acetyl hóa isoniazid.... 26

2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 27

2.3.7. Đạo đức nghiên cứu y học ....................................................................... 28

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 29

3.1. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao đối với thuốc kháng lao hàng một ... 29

3.1.1. Đặc điểm chung của quần thể bệnh nhân nghiên cứu ............................. 29

3.1.2. Tình hình kháng thuốc chống lao hàng 1 ở các bệnh nhân lao phổi ....... 32

3.2. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao và mối ảnh hưởng

đến tính kháng thuốc Isoniazid .............................................................................. 40

3.2.1. Kết quả tối ưu quy trình phân tích NAT2 ............................................... 40

3.2.2. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao .......................... 42

3.2.3. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen NAT2 và tình hình kháng INH .... 47

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 50

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Nhận định kết quả nuôi cấy MGIT ........................................................... 19

Bảng 2.2: Nồng độ thuốc và ngưỡng kháng thuốc kháng lao hàng 1

trên môi trường đặc ................................................................................................... 22

Bảng 2.3: Hướng dẫn pha dung dịch thuốc (1) ......................................................... 23

Bảng 2.4: Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc dựa vào khuẩn lạc .................................. 25

Bảng 2.5: Đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao ............................................ 25

Bảng 2.6: Thành phần tối ưu cho phản ứng nhân dòng gen NAT2 ........................... 27

Bảng 3.1: Thông tin chung của quần thể nghiên cứu ................................................ 29

Bảng 3.2: Thời gian nuôi cấy và đơn vị sinh trưởng của vi khuẩn lao ..................... 32

Bảng 3.3: Tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm lao mới và lao tái trị ...................................... 34

Bảng 3.4: Kết quả kháng sinh đồ với từng thuốc chống lao hàng một ..................... 36

Bảng 3.5: Tần số phân bố allen NAT2 ở nhóm lao mới và lao tái trị ........................ 43

Bảng 3.6: Tần số phân bố kiểu gen NAT2 ở nhóm lao mới và lao tái trị .................. 44

Bảng 3.7: Mối liên quan giữa kiểu hình chuyển hóa với thể lao .............................. 45

Bảng 3.8: Tần số kiểu hình acetyl hóa NAT2 ở các vùng trên thế giới ..................... 46

Bảng 3.9: Mối liên quan kiểu hình chuyển hóa với tính kháng INH ........................ 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: M. tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x ....................... 3

Hình 1.2: Hình ảnh M.tuberculosis nuôi cấy trên môi trường đặc [23], [59] ............. 5

Hình 1.3: Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao ......................................................... 9

Hình 1.4: Chuyển hóa Isoniazid ở gan [39]. ............................................................. 11

Hình 1.5: Vị trí gen NAT2 trên NST số 8 .................................................................. 14

Hình 2.1: Sơ đồ thu mẫu và luân chuyển mẫu tại 3 bệnh viện ................................. 18

Hình 2.2: Hệ thống BACTEC MGIT 960 ................................................................. 19

Hình 2.3: Kháng sinh đồ PZA ................................................................................... 21

Hình 2.4: Chuẩn bị huyền dịch làm kháng sinh đồ đặc ............................................ 24

Hình 3.1: Biểu đồ dinh dưỡng theo BMI của hai nhóm bệnh nhân .......................... 31

Hình 3.2: Một số hình ảnh kết quả kháng sinh đồ trên môi trường đặc ................... 33

Hình 3.3: Biểu đồ tỷ lệ số thuốc kháng mỗi loại ....................................................... 34

Hình 3.4: Kết quả DNA tổng số tách chiết điện di trên gel agarose 1,2% ............... 41

Hình 3.5: Kết quả nhân dòng gen NAT2 của một số mẫu theo điều kiện tối ưu ...... 41

Hình 3.6: Kết quả đọc kiểu gen NAT2 ...................................................................... 42

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Vi khuẩn kháng cồn kháng axit (Acid Fast Bacilli) AFB

Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index) BMI

Ethambutol EMB

Isoniazid INH

Lowenstein-Jensen LJ

Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) MTB

MDR-TB Lao đa kháng thuốc (Multi Drug Resistant Tuberculosis)

MDR/RR-TB Lao đa kháng hoặc Lao kháng Rifampicin

(Multi Drug Resistant - Rifampicin Resistant - Tuberculosis)

Mycobacteria Growth Indicator Tube MGIT

N-Acetyltransferase 2 NAT2

Rifampicin RMP

Pyrazinamid PZA

Streptomycin SM

Đa hình đơn nucleotit (Single Nucleotide polymorphisms) SNP

XDR-TB Lao siêu kháng thuốc

(Extensively Drug Resistant-Tuberculosis)

WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lao là một bệnh truyền nhiễm có tính lây nhiễm cao, diễn biến lâm sàng

phức tạp và thời gian điều trị kéo dài. Theo thống kê của WHO (2018), với sự nỗ

lực không ngừng của toàn thế giới, từ năm 2000 đến 2018 ước tính có khoảng 53

triệu người đã được phát hiện và điều trị lao giúp giảm tỷ lệ tử vong do lao xuống

còn 37%. Mặc dù đã được tập trung kiểm soát, bệnh lao vẫn là một trong 10 nguyên

nhân tử vong hàng đầu và là nguyên nhân tử vong số 1 do bệnh truyền nhiễm (trên

cả HIV). Việt Nam là một trong những điểm nóng của bệnh lao, đứng thứ 14 trong

số 30 nước có gánh nặng cao do lao (WHO, 2018). Năm 2017, tổng số trường hợp

mắc lao được báo cáo ở Việt Nam là 105.733 bệnh nhân trong số đó có khoảng 80%

là bệnh nhân lao phổi mới mắc và tái nhiễm. Mặc dù trên toàn thế giới, tỷ lệ mắc lao

đang giảm đi khoảng 2% mỗi năm nhưng đến nay bệnh lao vẫn còn là vấn đề thách

thức do sự phát triển và lan rộng của lao kháng thuốc. Bệnh nhân mang lao kháng

thuốc thường có thời gian điều trị kéo dài, tốn kém. Ở Việt Nam theo ước tính trung

bình chi phí cho một bệnh nhân lao đa kháng thuốc khoảng gần 400 USD cao hơn

nhiều so với chi phí hơn 150 USD cho bệnh nhân lao thông thường. Theo thống kê

mới nhất của WHO, trên toàn cầu 3,5% trường hợp lao mới và 18% trường hợp lao

tái trị có kháng Rifampicin hoặc đa kháng Rifampicin và Isoniazid (MDR/RR-TB).

Ở Việt Nam con số này ước tính tương ứng là 4,1% và 17%. Tuy nhiên đây chỉ là

con số ước tính vì chỉ có khoảng 32%-67% được thực hiện đánh giá tính kháng

thuốc với Rifampicin (WHO, 2018). Trong các thuốc chống lao hàng một, ngoài

Rifampicin và Isoniazid là hai thuốc quan trọng nhất trong các phác đồ điều trị lao

còn có Streptomycin, Ethambutol, Pyrazinamid. Trong những năm gần đây, tình

hình kháng thuốc với 3 loại thuốc này ít được quan tâm, báo cáo. Việc chỉ tập trung

vào hai thuốc quan trọng nhất là Rifampicin và Isoniazid có thể bỏ qua các biến

động đáng chú ý về tình hình kháng thuốc của ba thuốc này.

Theo hướng dẫn của WHO cũng như của Bộ Y tế, Isoniazid được dùng trong

hầu hết các đối tượng bệnh nhân lao theo tuổi, giới, trong các phác đồ điều trị bệnh

nhân lao mới, lao tái trị và kể cả điều trị dự phòng lao. Isoniazid được chuyển hóa bởi

1

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

enzyme NAT2 tại gan. Đa hình di truyền gen NAT2 được biết đến có liên quan chặt

chẽ tới đáp ứng Isoniazid trên các bệnh nhân mắc lao. Nghiên cứu tại Nam Phi cho

thấy mặc dù > 98% bệnh nhân tuân thủ điều trị nhưng tình hình kháng thuốc vẫn xảy

ra và một nghiên cứu khác cũng khẳng định kháng thuốc không phải chỉ do không

tuân thủ điều trị mà còn do sự khác biệt về dược động học của thuốc giữa các cá thể.

Mặt khác một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng yếu tố di truyền của bệnh nhân cũng có

thể là một trong những yếu tố nguy cơ đối với việc việc lây nhiễm vi khuẩn lao.

Tại Việt Nam, việc chẩn đoán lao kháng thuốc thật sự còn là vấn đề hết sức

khó khăn tại các bệnh viện, kể cả những bệnh viện tuyến Trung ương. Chỉ một số

lượng nhất định bệnh nhân được chỉ định làm kháng sinh đồ và thời gian này mất

khoảng 2-3 tháng mới có kết quả do vi khuẩn lao sinh trưởng tương đối chậm trong

quá trình nuôi cấy. Hiện nay một số các test phân tử được áp dụng để chẩn đoán

nhanh lao kháng thuốc là Hain test hay Xpert MTB/RIF. Tuy nhiên, các xét nghiệm

này giá thành khá cao và không được chỉ định rộng rãi. Hơn nữa các kit thương mại

này mới chỉ đánh giá được lao kháng Rifampicin, Isoniazid chứ chưa đánh giá được

với các thuốc khác trong thuốc kháng lao hàng một. Từ thực tiễn chẩn đoán và điều

trị lao, với mục tiêu xác định được tính kháng thuốc của các thuốc chống lao hàng

một và tiên lượng nguy cơ mắc vi khuẩn lao kháng thuốc Isoniazid liên quan đến

yếu tố di truyền gen NAT2 ở bệnh nhân lao phổi, chúng tôi đề xuất đề tài “Khảo sát

tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị bằng

Isoniazid và đánh giá ảnh hƣởng của gen NAT2 của bệnh nhân lao đến tính

kháng thuốc Isoniazid”.

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được tính kháng thuốc của vi khuẩn lao với các thuốc chống lao

hàng một trên bệnh nhân lao phổi;

Xác định được đa hình di truyền gen NAT2 và mối liên quan tới tính kháng

thuốc Isoniazid của vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao phổi.

2

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về vi khuẩn lao

1.1.1. Hình thể, cấu trúc

Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales,

phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, chi Mycobacterium, gồm hơn

169 loài, đa phần không gây bệnh cho người. Nhóm vi khuẩn gây bệnh lao cho

người được gọi là nhóm Mycobacterium tuberculosis complex (MTBc) gồm có các

loài chính như Mycobacterium tuberculosis (trực khuẩn lao người), Mycobacterium

bovis (trực khuẩn lao bò), Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti. Trong

đó quan trọng nhất là loài Mycobacterium tuberculosis[64].

Mycobacterium được gọi là trực khuẩn kháng cồn kháng acid, được Robert

Koch phân lập năm 1882, gọi tắt là BK (Bacille de Koch). M. tuberculosis là trực

khuẩn thanh mảnh, hơi cong, kích thước 0,5 x 2-6 µm. Chúng không có vỏ, không

có lông và không có nha bào. Trong bệnh phẩm chúng thường đứng thành từng đám

nối đầu vào nhau. Thành tế bào của M. tuberculosis chỉ chứa một lượng nhỏ

peptidoglycan, nhưng chứa nhiều lipid tạo nên tính kháng cồn - kháng acid, và làm

cho vi khuẩn lao không nhuộm được bằng phương pháp thông thường mà phải

nhuộm bằng phương pháp Ziehl - Neelsen (hình 1.1) [15].

Hình 1.1: M. tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x

3

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

1.1.2. Khả năng gây bệnh

1.1.2.1. Độc lực và con đường lây truyền

Trực khuẩn lao không có ngoại độc tố và nội độc tố. Độc lực của vi khuẩn

lao có thể liên quan đến yếu tố sợi và lớp sáp ở vách tế bào. Các chủng lao độc lực

có chứa nhiều yếu tố sợi có bản chất hóa học là 6,6’-dimycoly trehalose. Yếu tố sợi

này làm vi khuẩn lao gắn với nhau thành bó và khi mất đi sẽ làm giảm độc lực. Vi

khuẩn lao có thể sống sót trong đại thực bào sau khi bị thực bào. Vi khuẩn lao phát

triển trong đại thực bào, phá vỡ tế bào và xâm nhập đại thực bào khác [15].

Bệnh lao lây chủ yếu qua đường hô hấp. Người bị nhiễm lao do hít phải

những giọt đờm (đường kính 1 - 5 μm) có chứa vi khuẩn lao từ bệnh nhân lao ho,

hắt hơi vào không khí. Các vi khuẩn khi qua được hàng rào thứ nhất của cơ thể sẽ ở

lại phế nang và tiến triển thành viêm phế quản phổi với phần lớn các trường hợp có

triệu chứng không rõ ràng. Vi khuẩn cũng có thể lây nhiễm sang thai nhi bằng

đường máu qua tĩnh mạch rốn nếu mẹ bị lao cấp tính hoặc qua nước ối khi chuyển

dạ nếu mẹ bị lao niêm mạc tử cung, âm đạo. Đôi khi, đường lây khác có thể là

đường tiêu hóa khi uống sữa bò bị bệnh do M. bovis. Từ cơ quan bị lao ban đầu,

trực khuẩn lao theo đường máu và bạch huyết đến các cơ quan khác để gây bệnh

(lao hạch, lao mang não lao xương). Tuy nhiên, con đường truyền bệnh quan trọng

nhất với bệnh lao là đường hô hấp [11], [15].

1.1.2.2. Cơ chế gây bệnh

Bệnh lao là một loại bệnh nhiễm trùng bên trong tế bào và tiến triển mạn

tính. Vi khuẩn lao khi xâm nhập vào phế nang sẽ bị các đại thực bào tiêu diệt một

phần. Những tế tào không bị đại thực bào tiêu diệt sẽ tiếp tục nhân lên trong đại

thực bào và dần thành nang lao. Nếu các nang lao vỡ ra vi khuẩn lao lây nhiễm

rộng, sinh sản và bệnh lao xuất hiện.

Khi tiếp xúc lần đầu với vi khuẩn lao thì một phản ứng viêm cấp tính nhẹ ở

phổi xuất hiện. Sau khi vi khuẩn lao bị thực bào, ở người có đáp ứng miễn dịch tế

bào đầy đủ, sau 4 - 6 tuần lymphokin được sản xuất, hoạt hóa đại thực bào giết

4

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

chết vi khuẩn lao. Cơ thể sinh ra đáp ứng quá mẫn muộn với vi khuẩn lao, kết quả

là hình thành u hạt. Tiếp theo là hoại tử ở trung tâm, bã đậu hoá, xơ hoá và hình

thành sẹo. Sau khi liền tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao vẫn không bị diệt hoàn

toàn. Chúng có thể tồn tại mãi trong cơ thể dưới dạng không hoạt động, những

người nhiễm lao thường chỉ biểu hiện ở test tuberculin (+) và không có khả năng

lây nhiễm. Ở những người này có khoảng 10% vi khuẩn lao tái hoạt động trở

thành người mắc lao. Ngoài ra các yếu tố nguy cơ đối với việc mắc lao như: tuổi

trẻ, bệnh đi kèm như đái tháo đường, bụi phổi, HIV, phụ nữ có thai, yếu tố cơ địa -

yếu tố gen [11].

1.1.3. Nuôi cấy vi khuẩn lao

Để chuẩn đoán xác định có nhiều phương pháp cận lâm sàng như nhuộm

Ziehl-Neelsen tìm AFB, Xpert MTB/RIF, nuôi cấy…. trong đó xét nghiệm nuôi cấy

vi khuẩn lao là tiêu chuẩn vàng.

Vi khuẩn lao thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC và dưới

áp suất của oxy là 100 mmHg. Đây là một trong những lý do giải thích tại sao lao

phổi là thể bệnh gặp nhiều nhất. Vi khuẩn lao không nuôi được ở môi trường thông

thường, phải nuôi ở môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng (hình 1.2).

a. Khuẩn lạc đƣợc phóng đại

b. Khuẩn lạc trên LJ

Hình 1.2: Hình ảnh M.tuberculosis nuôi cấy trên môi trƣờng đặc [24], [60]

5

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Vi khuẩn lao mọc rất chậm, thời gian phân chia khoảng 20-24 giờ một lần

trên môi trường thử nghiệm. Trên môi trường Lowenstein- Jensen (LJ, gồm chủ yếu

khoai tây, lòng đỏ trứng gà, asparagin, glycerin 0,75%), sau 4-6 tuần vi khuẩn lao

mới hình thành khuẩn lạc điển hình. Khuẩn lạc dạng R, sần sùi như hình hoa lơ.

Trên môi trường lỏng (canh thang Sauton, Middlebbrook 7H9, 7H12) vi khuẩn lao

mọc thành váng, đám hoặc lắng cặn. Hiện nay trên môi trường thương mại

Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) dạng lỏng nuôi cấy vi khuẩn lao có

thể cho kết quả dương tính sau 3-13 ngày[15].

1.2. Thuốc điều trị lao và lao kháng thuốc

1.2.1. Thuốc điều trị lao và phân loại lao kháng thuốc

Hiện nay, trong thực tế điều trị, người ta phân loại 2 nhóm thuốc trị bệnh lao,

thường gọi là “thuốc kháng lao hàng 1” và “thuốc kháng lao hàng 2” [18]:

Kháng lao hàng 1 gồm: Bao gồm Streptomycin (viết tắt là SM hay S),

Rifampicin (viết tắt RIF hay RMP hay R ), Isoniazid (INH hay H), Pyrazinamid

(PZA hay Z) và Ethambutol (EMB hay E). Đây là các thuốc được lựa chọn đầu tiên

để điều trị cho bệnh nhân bị lao.

Kháng lao hàng 2 gồm nhiều thuốc, chia làm 4 nhóm A, B, C, D: Nhóm A

gồm các thuốc thuộc nhóm kháng sinh Fluoroquinolones như Levofloxacin,

Moxifloxacin, Gatifloxacin. Nhóm B là các thuốc tiêm hàng hai như Amikacin,

Capreomycin, Kanamycin. Nhóm C là các thuốc hàng hai chủ đạo khác như

Ethionamide, Cycloserin, Clofazimine, Linezolid, Prothionamide. Nhóm D là các

thuốc bổ sung, không thuộc nhóm chủ đạo như: Isoniazid liều cao, Pyrazinamide,

Ethambutol, Bedaquiline, Meropenem [18]. Đây là các thuốc được dùng khi bệnh

nhân bị kháng với thuốc lao hàng một, hay dùng trong một số trường hợp đặc biệt.

Các thuốc này thường có nhiều tác dụng phụ hơn và việc sử dụng thuốc cũng phức

tạp hơn thuốc kháng lao hàng một. Ngoài ra, giá thành của các thuốc kháng lao

hàng hai cũng đắt hơn rất nhiều. Nhận diện nhanh các chủng kháng thuốc, đặc biệt

là các chủng kháng RMP và INH, sẽ tạo điều kiện để áp dụng kịp thời các biện

pháp điều trị thích hợp; và điều này là vô cùng quan trọng trong giảm sự lan

truyền của các chủng kháng thuốc.

6

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Có thể phân loại lao kháng thuốc dựa vào tính kháng các loại thuốc chống

lao hàng một như sau[18]: Nếu vi khuẩn kháng một loại trong các loại thuốc kháng

lao hàng một mà không phải là Rifampicin thì được gọi là kháng một loại thuốc.

Nếu vi khuẩn lao kháng với trên một loại thuốc chống lao hàng một nhưng không

kháng Rifampicin thì được gọi là kháng nhiều loại thuốc. Nếu vi khuẩn kháng

Rifampicin, có hoặc không kháng thêm các thuốc khác trừ Isoniazid thì được gọi là

kháng Rifampicin. Vi khuẩn kháng đồng thời với ít nhất hai thuốc chống lao là

Isoniazid và Rifampicin thì được gọi là lao đa kháng thuốc (MDR-TB).

Dựa trên tính kháng thuốc với các thuốc chống lao hàng hai để phân loại lao

siêu kháng thuốc. Lao tiền siêu kháng: Lao đa kháng có kháng thêm với bất cứ

thuốc nào thuộc nhóm Fluoroquinolone hoặc với ít nhất một trong ba thuốc tiêm

hàng hai Capreomycin, Kanamycin, Amikacin. Lao siêu kháng thuốc (XDR-TB):

Lao đa kháng có kháng thêm với bất cứ thuốc nào thuộc nhóm Fluoroquinolone và

bất cứ thuốc nào trong ba thuốc tiêm hàng hai (Capreomycin, Kanamycin,

Amikacin).

Ngoài ra còn có phân loại bệnh nhân lao theo tiền sử điều trị:

- Lao mới là người bệnh lao chưa bao giờ dùng thuốc chống lao hoặc dùng

thuốc dưới một tháng. Lao phổi mới là bệnh nhân lao mới mắc thể lao phổi.

- Lao tái trị là người bệnh lao đã dùng thuốc chống lao từ một tháng trở lên

có thể là người bệnh đã điều trị khỏi lao từ lần trước hoặc điều trị thất bại trước đây

do nhiều nguyên nhân. Lao phổi tái trị là bệnh nhân lao tái trị mắc thể lao phổi

Trong lao tái trị người bệnh có thể tái nhiễm ngoại sinh (chủng vi khuẩn

khác với chủng vi khuẩn ban đầu) hoặc do tái phát (chủng vi khuẩn giống với chủng

vi khuẩn ban đầu) [64], [21].

1.2.2. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao

Kháng thuốc là hiện tượng giảm độ nhạy cảm của vi khuẩn lao với thuốc

điều trị lao in vitro với nồng độ vừa đủ hợp lý của một vài chủng kiểm tra so với

chủng hoang dại chưa từng tiếp xúc với thuốc điều trị lao [53].

7

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Kháng thuốc tiên phát là kháng thuốc xảy ra ở một bệnh nhân trước đó chưa

sử dụng một liệu pháp điều trị chống lao nào; kháng thuốc thứ phát là kháng thuốc

sau khi bệnh nhân lao đã có tiếp xúc với thuốc. Kháng thuốc tự nhiên là tính kháng

thuốc của chủng kiểu dại. Ví dụ như M.tuberculosis kháng tự nhiên với penicilin

[43]. Tỷ lệ vi khuẩn lao kháng thuốc tự nhiên khác nhau tùy từng loại loại thuốc đặc hiệu: Rifampicin là 1/108, Isoniazid là 1/106, Streptomycin và Ethambutol là 1/105.

Trong quá trình nhân lên của vi khuẩn tính kháng thuốc sẽ được phát sinh do các

đột biến ngẫu nhiên. Khi không có mặt của thuốc, các chủng mẫn cảm sẽ phát triển

lấn áp các chủng có đột biến khác. Khi có mặt của thuốc sẽ tạo thành áp lực chọn

lọc và chủng đột biến kháng thuốc sẽ trở nên ưu thế và và lây lan sang người khác

làm cho người bị nhiễm vi khuẩn lao này sẽ kháng thuốc ngay từ đầu [43].

Cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn lao cũng giống như cơ chế kháng kháng sinh

ở các loại vi khuẩn khác do sự hạn chế xâm nhập của kháng sinh vào bên trong

thành tế bào hoặc sản xuất ra các men (enzzyme) để phá hủy kháng sinh hoặc che

chắn hay làm biến đổi đích tác động của kháng sinh và làm kháng sinh mất hiệu lực.

Ở 70-80% vi khuẩn lao kháng INH người ta nhận thấy có sự biến đổi ở gen katG

làm giảm hoặc mất hoạt tính men catalase-peroxidase do đó sẽ làm giảm hoặc mất

tác dụng của INH đối với vi khuẩn lao [5]. INH sẽ mất khả năng ức chế sự tổng hợp

axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao vì vậy mà vi khuẩn lao sẽ kháng

thuốc. Đối với RMP, vi khuẩn lao kháng RMP có chứa đột biến gen rpoB làm cho

RMP mất khả năng ức chế men RNA-polymeraza của vi khuẩn lao. Tùy từng loại

thuốc với cơ chế tác động khác nhau sẽ có cơ chế kháng thuốc khác nhau. Cơ chế

kháng một số thuốc của vi khuẩn lao được trình bày trong hình 1.3.

8

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Hình 1.3: Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao

1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tính kháng thuốc của vi

khuẩn lao

Theo WHO, năm 2014 số lượng ước tính của các ca nhiễm đa kháng thuốc

(MDR/RR-TB) và siêu kháng thuốc (XDR-TB) trong số bệnh nhân nhiễm mới là

480.000, nhưng chỉ khoảng 25% trong số này được chẩn đoán và báo cáo. Trong năm

2014, ước tính có 190.000 người chết vì MDR-TB. Đến năm 2015, đã có báo cáo

xuất hiện XDR-TB ở 105 quốc gia; khoảng 9,7% bệnh nhân nhiễm MDR-TB sẽ bị

XDR-TB. Và tính đến năm 2016 ước tính có khoảng 600.000 ca nhiễm MDR/RR-TB

nhưng chỉ có 153.000 ca được báo cáo và 130.000 ca được điều trị [67].

Việt Nam nằm trong nhóm 30 quốc gia có gánh nặng lao đa kháng thuốc

cao nhất thế giới, xếp thứ 14/27 quốc gia có số lượng bệnh nhân MDR-TB nhiều

nhất, chiếm 1,7% toàn cầu (WHO, 2015). Bên cạnh đó, Việt Nam là 1 trong 20

quốc gia xảy ra 80% trường hợp nhiễm TB mới của thế giới. Hiện tượng kháng

thuốc đã được giám sát từ năm 1978, và tỉ lệ giảm dần đến năm 1998. Năm 1996-

1997 Việt Nam đã tham gia dự án nghiên cứu tình hình kháng thuốc lao trên toàn

cầu của WHO cho thấy tỷ lệ kháng thuốc tiên phát khá cao 32,5% trong đó có cả

9

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

2,3% kháng đa thuốc. Nghiên cứu năm 2005-2006 tỷ lệ kháng thuốc tiên phát có

giảm nhưng không đáng kể 30,9%; kháng thuốc thứ phát ở bệnh nhân lao đã điều

trị là 58,9% và đặc biệt là tỷ lệ đa kháng ở lao mới (kháng tiên phát) cũng không

giảm 2,7% và ở bệnh nhân lao tái trị là 19.3%. Vào năm 2006, tỉ lệ kháng thuốc

lại tăng 12,52% so với năm 1978 (30,7% và 18,18%). Những nghiên cứu đơn lẻ

của một số cá nhân quanh thời điểm này cũng cho thấy những kết quả kháng thuốc

tương tự [3].

Lê Ngọc Hưng và cộng sự (2008) nghiên cứu 193 bệnh nhân lao phổi tái trị

tại Bệnh viện Phổi trung ương cho thấy tỷ lệ kháng đa thuốc là 62,9% [8]. Chu Thị

Mão và cộng sự (2007) cũng tiến hành nghiên cứu trên bệnh nhân lao phổi mới cho

thấy tỷ lệ lao đa kháng là 4% [9]. Lê Thị Kim Hoa (2008) nghiên cứu trên bệnh

nhân lao mới và lao tái trị cho thấy tỷ lệ đa kháng trên lao mới là 8,5% và trên lao

tái trị là 40,3% [7]. Trong các năm gần đây, tỉ lệ về tính kháng ít nhất 1 thuốc được

báo cáo: ví dụ kháng INH là 16% - 25%, và tỉ lệ MDR-TB là 2%-4% đối với bệnh

nhân điều trị lần đầu, 17%-18% với bệnh nhân điều trị tái trị. Năm 2017, theo

WHO, tại Việt Nam tỷ lệ ước tính lao kháng MDR/RR-TB ở thể lao mới là 4,1% và

17% ở thể lao tái trị. Có thể thấy, tình hình kháng thuốc lao tại Việt Nam vẫn đang

được theo dõi, tập trung nhiều vào nhóm vi khuẩn lao đa kháng thuốc.

1.3. Isoniazid trong điều trị lao

1.3.1. Dược lý và chuyển hóa của Isoniazid

Isoniazid (viết tắt là INH), là một hydrazid của axit isonicotinic được tổng

hợp lần đầu tiên ở Praha năm 1912 nhưng đến năm 1952 mới biết được tác dụng

của INH với vi khuẩn lao. Isoniazid có cấu trúc đơn giản chứa vòng pyridine và

nhóm hydrazide có tác dụng kìm hãm sinh trưởng và diệt vi khuẩn lao trong và

ngoài tế bào. Cơ chế tác dụng của thuốc là thông qua sự ức chế hình thành axit

mycolic có ở thành tế bào vi khuẩn lao [15]. Tuy nhiên, INH cũng được phát hiện

là có thể bị kháng bởi M.tuberculosis liên quan tới các đột biến ở nhiều gen, bao

gồm katG, ahpC, inhA, kasA, ndh. INH là một tiền thuốc cần được hoạt hóa bởi

10

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

catalase/ peroxidase mã hóa bởi katG. INH đã hoạt hóa sẽ can thiệp vào quá trình

tổng hợp một thành phần thiết yếu của vi khuẩn lao là mycolic acid bằng cách ức

chế NADH-dependent enoyl-ACP reductase được mã hóa bởi inhA. Hai cơ chế

phân tử này chính là các nguyên nhân chính dẫn đến tính kháng Isoniazid: đột biến

trên katG và inhA.

Sau khi uống, INH hấp thu qua ruột vào máu: 40% ở dạng tự do, một phần

kết hợp với axit amin trong máu thành hydrazol; INH ở dạng tự do và hydrazol có

tác dụng với vi khuẩn lao. Phần còn lại sẽ được chuyển hóa ở gan tạo thành các hợp

chất không có tác dụng với vi khuẩn lao. Tại gan, 50% - 90% INH được acetyl hóa

bởi enzyme NAT2 như Hình 1.4 tạo thành acetyl Isoniazid, sản phẩm tiếp tục bị

thủy phân tạo thành acetyl hydrazine. Một con đường khác là INH có thể bị thủy

phân trực tiếp tạo ra hydrazin. Sau đó NAT2 xúc tác quá trình acetyl hóa của

hydrazin tạo acetyl hydrazin và diacetyl hydrazin. INH, Acetyl hydrazine và

hydrazin có thể bị oxi hóa bởi cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) tạo thành các hợp

chất trung gian gây độc cho cơ thể. Enzyme glutathione S-transferase (GST) có thể

kết hợp với các chất trung gian này với glutathione và loại bỏ các chất chuyển hóa

độc hại này. Các chất chuyển hóa của INH được thải trừ ra khỏi cơ thể chủ yếu qua

hệ tiết niệu (chiếm 80%). Dưới 10% liều INH được đào thải qua phân [40].

CYP2E1: cytochrome P450 2E1; NAT2: N-Acetyltransferase 2

Hình 1.4: Chuyển hóa Isoniazid ở gan [40].

11

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Nồng độ ức chế tối thiểu trong huyết thanh của INH với vi khuẩn lao là

0,04 µg/mL, hệ số vượt là 20 ở người có kiểu hình acetyl hóa nhanh và 62 ở người

có kiểu hình acetyl hóa chậm. Nồng độ của INH trong huyết thanh của mỗi người

khác nhau phụ thuộc vào kiểu hình acetyl hóa của cá thể. Khi uống INH liều 5

mg/kg sau 1-2 giờ sẽ đạt nồng độ tối đa trong huyết tương là 3-5 µg/mL [15], [18].

Liều dùng hàng ngày của INH là 5 mg (4-6 mg)/kg thể trọng cho cả trẻ em

và người lớn, liều hàng ngày tối đa là 300 mg, nên uống một lần lúc đói. Liều cách

quãng 3 lần/tuần là 10 mg/kg thể trọng (8-12 mg), liều cách quãng 2 lần/tuần là 15

mg/kg thể trọng (13-17 mg) [10].

INH có thể gây các tác dụng phụ trên hệ thần kinh và gan. Trên hệ thần kinh,

INH có thể gây ra viêm dây thần kinh, co giật, viêm dây thần kinh thị giác, rối

loạn tâm thần. Tại gan, INH có thể gây viêm gan với các triệu chứng chán ăn,

buồn nôn, nôn, mệt mỏi. 10 – 20% bệnh nhân sử dụng INH có thể có nồng độ

transaminase huyết thanh (AST, ALT), bilirubin máu, bilirubin nước tiểu tăng

bất kì trong đợt điều trị, nhưng thường tăng trong 1 đến 3 tháng đầu và sau đó trở

lại bình thường. Ngoài ra bệnh nhân có thể gặp một số tác dụng phụ khác như:

buồn nôn, nôn, đau thượng vị, viêm tụy; thiếu máu, giảm hoặc mất bạch cầu hạt,

giảm bạch cầu ưa axit giảm tiểu cầu, sốt, viêm da [55].

1.3.2. Gen liên quan đến chuyển hóa Isoniazid ở bệnh nhân lao

Tổn thương gan do thuốc chống lao là một tác dụng phụ phổ biến, đa phần

do INH gây ra. Quá trình chuyển hóa INH đóng vai trò quan trọng trong tổn thương

gan [59]. Sự khác biệt về độc tính của INH gây ra là do sự biến đồi về di truyền ở

một số gen như: N - acetyltransferase 2 (NAT2), Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1),

glutathione S - transferase M1 (GSTM1), glutathione S - transferase T1 (GSTT1)

[45].

CYP2E1 là gen mã hóa cho enzyme CYP2E1 có tác dụng chuyển hóa thuốc

ở gan. CYP2E1 xúc tác quá trình oxy hóa AcHz và Hz tạo ra các chất trung gian

gây độc cho cơ thể [42]. Sự đa hình của gen CYP2E1 quyết định khả năng hoạt

động của gen, hoạt tính cao hơn của enzyme này có thể làm tăng sự tổng hợp của

các độc tố gan [61].

12

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Các enzyme thuộc họ Glutathione S - transferase (GST) tham gia vào khả

năng giải độc cho cơ thể, chúng chuyển các chất trung gian gây độc hoặc các sản

phẩm oxy hóa thành chất ít hoặc không gây độc và giúp cơ thể đào thải ra ngoài.

GST tham gia quá trình chuyển hóa của thuốc điều trị lao thông qua các phản ứng

liên hợp các chất chuyển hóa trung gian gây độc ở dạng tiềm ẩn [40]. Sự thiếu hụt

hoạt tính GST do sự đồng hợp tử tại locus GSTM1 và GSTT1 có thể ảnh hưởng

đến tính nhạy cảm với độc tính gan do INH gây ra. Nguy cơ nhiễm độc gan do

INH ở bệnh nhân Ấn Độ có GSTM1 đồng hợp tử đột biến đã tăng so với nhóm

còn lại [34] . Tuy nhiên ở một số nghiên cứu khác lại chỉ ra không chỉ ra được tính

liên quan giữa sự đa hình của gen GST và nguy cơ tổn thương gan. Ngoài ra còn có

một số gen khác cũng ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa INH như HLA-

DQA1/DQB1 [54].

So với các enzyme trên, N-acetyltransferase 2 (NAT2) là enzyme được

chứng minh có vai trò quan trọng nhất liên quan tới chuyển hóa Isoniazid. Đa hình

gen NAT2 ảnh hưởng đến tốc độ acetyl hóa, tạo ra các kiểu hình acetyl hóa chậm

làm tăng nồng độ INH trong huyết thanh, giảm tốc độ thanh thải của INH và tăng

các sản phẩm chuyển hóa trung gian gây độc cho cơ thể [45], [36].

1.4. Đặc điểm của gen NAT2 và đa hình gen NAT2

NAT là một loại enzyme xúc tác quá trình acetyl hóa arylamine từ acetyl-

CoA. Nó được tìm thấy ở nhiều loài khác nhau. NAT1 và NAT2 là các gen chính

của NAT nằm gần nhau trên nhiễm sắc số 8, vị trí 8p22. Biểu hiện của 2 gen này

khác nhau ở các mô riêng biệt và các enzyme có các ưu tiên khác nhau. NAT1 biểu

hiện ở hầu hết các mô như mô thần kinh, gan, đường tiêu hóa, tế bào máu, trong khi

NAT2 chỉ giới hạn tại gan và đường tiêu hóa [32]. Gen NAT2 gồm hai exon, exon 2

là một khung đọc mở dài 870 bp (tức là các vùng mã hóa protein) không có intron.

Đa hình gen NAT2 gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm làm tăng nồng độ INH trong

huyết thanh, giảm tốc độ thanh thải của INH, tăng các sản phẩm chuyển hóa trung

gian gây độc cho cơ thể [48], [44] .

13

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Hình 1.5: Vị trí gen NAT2 trên NST số 8

Sự đa hình của gen NAT2 có vai trò quan trọng trong việc biểu hiện các vai

trò của gen ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng thuốc cũng như gia tăng tỷ lệ mắc một

số bệnh khi tiếp xúc với các yếu tố phơi nhiễm. Dựa vào kiểu gen của NAT2, các

nhà khoa học đã chia kiểu hình của enzyme NAT2 thành 3 dạng: kiểu hình acetyl

hóa nhanh (RA), acetyl hóa chậm (SA), acetyl hóa trung gian (IA). Các nghiên cứu

đều chỉ ra rằng kiểu hình acetyl hóa nhanh khi mang 2 alen kiểu dại (NAT2*4*4),

acetyl hóa trung bình khi có 1 alen kiểu dại (NAT2*4/*5, NAT2*4/*6 và

NAT2*4/*7) và acetyl hóa chậm khi có 2 đa hình alen (NAT2*5/*5, NAT2*5/*6,

NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7 và NAT2*7/*7) [44]. Hiện nay, các nhà di

truyền học đã xác định được alen kiểu dại (được qui ước là NAT2*4) và 88 biến thể

trên gen NAT2 [30]. Trong các đa hình gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm, 3 alen

NAT2*5, *6, *7 được nghiên cứu nhiều nhất. Alen NAT2*5 có axit amin thay thế là

I1e114Thr; alen NAT2*6 có axit amin thay thế là Arg197Gln, alen NAT2*7 có axit

amin thay thế là Gly286Glu. Thường gặp nhất là nhóm cá thể có kiểu hình acetyl

hóa nhanh, kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại (NAT2*4) ở cả 3 vị trí SNP (T341C,

14

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

G590A, G857A). Các cá thể có kiểu hình acetyl hóa trung bình thường có kiểu gen

dị hợp tử về alen biến đổi ở một locus đơn, tức là một trong 3 vị trí NAT2*5, *6

hoặc *7 . Những người acetyl hóa chậm là những người có nhiều hơn một đa hình

alen. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh, những bệnh nhân có kiểu hình

acetyl hóa chậm có nguy cơ tổn thương gan, gặp các tác dụng phụ và tỉ lệ thất bại

điều trị cao hơn 2 kiểu hình còn lại. Đa hình gen cho thấy có sự khác biệt ở các

chủng tộc, gần 50% người da trắng Châu Âu cho kiểu hình acetyl hoá chậm, trong

khi đó ở người Nhật chỉ có 10% có kiểu hình acetyl hoá chậm. Trên quần thể bệnh

nhân Nhật và Đài Loan, bệnh nhân có kiểu hình chuyển hóa INH chậm có thể bị

nhiễm độc gan cao hơn 28 lần so với những bệnh nhân có kiểu hình chuyển hóa

nhanh [50]. Một nghiên cứu của Hàn Quốc cũng chỉ ra rằng kiểu hình acetyl hóa

chậm có nguy cơ nhiễm độc gan cao gấp 3 - 8 lần khi điều trị bằng INH so với kiểu

chuyển hóa nhanh. Wang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp 14 nghiên

cứu khác trên 474 trường hợp và 1446 nhóm chứng đã cho thấy mối liên quan đáng

kể giữa các chất acetyl hóa chậm và nguy cơ nhiễm độc gan do INH [57]. Tại Việt

Nam, nghiên cứu gần đây của Phạm Thị Hồng Nhung và cộng sự (2011) trên 100

người Việt Nam khỏe mạnh bằng phân tích đa hình gen của NAT2 cho thấy người

Việt Nam có loại hình acetyl hóa nhanh chiếm tỷ lệ lớn [46].

Enzyme NAT2 có vai trò quan trọng trong việc giúp cơ thể tránh khỏi các

phản ứng quá khích với thuốc và môi trường. NAT2 có khả năng hoạt hóa sinh học,

giải độc nhiều thuốc và các hóa chất độc hại, bao gồm cả các hợp chất gây ung thư.

Các nghiên cứu trong hơn 50 năm trở lại đây đã chứng minh được tầm quan trọng

của việc xác định kiểu hình acetyl hóa ở các cá thể mắc lao hoặc một số cá thể phơi

nhiễm với các tác nhân ung thư. Việt Nam hiện đang đứng thứ 14/30 nước có gánh

nặng bệnh lao cao nhất thế giới, chính vì vậy việc xác định kiểu hình acetyl hóa

không chỉ có thể giúp các nhà lâm sàng định hướng trong xác định liều Isoniazid

cho mỗi cá thể khi điều trị lao mà còn cung cấp nguồn dữ liệu về yếu tố di truyền để

có thể đánh giá những yếu tố nguy cơ đối với người mắc bệnh lao, đặc biệt là mắc

lao kháng Isoniazid.

15

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Dụng cụ, trang thiết bị

Thiết bị chính: Hệ thống cấy nhanh BACTEC MGIT 960 hoặc 320

(BD,Mỹ), Tủ an toàn sinh học cấp II (Telstar), Máy ly tâm lạnh đủ tiêu chuẩn an

toàn sinh học, đủ lực ly tâm > 3000g (Mỹ), Máy lắc (Scientifica, Châu Âu), tủ lạnh

âm, tủ lạnh mát (Panasonic, Nhật), cân (Shinko, Nhật), Tủ ấm hoặc buồng ấm

(Memmert, Đức), Kính hiển vi (Olympus, Nhật), Nồi hấp ướt (Tomy, Nhật), Máy

soi chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver Scientific, Anh), Máy

PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li

tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức), Máy quang phổ NP80 (Nanophotometer,

Đức), Máy làm đá vảy (Fiocchetti, Ý).

Dụng cụ, vật tư: Lam kính trứng, ống thủy tinh vô trùng, lọ nhựa chia vạch

vô trùng, pipet nhựa chia vạch, pipet tự động loại 2-100µL và 1000µl và đầu côn vô

trùng, ăng nhựa vô trùng, ống bi vô trùng, găng tay, khẩu trang N95.

2.1.2. Hóa chất, môi trường

Các hóa chất chính dùng cho phân lập, nuôi cấy và kháng sinh đồ lao:

Dung dịch khử nhiễm và dung dịch đệm photphat, Bộ nhuộm Ziehl-Neelsen, Bộ

sinh phẩm nuôi cấy lỏng MGIT bao gồm: tube BBL MGIT 7mL; BACTEC MGIT Growth Supplement 15ml; BBL MGIT PANTA; BD MGITTM TBcID test nhanh

định danh MTB, Sinh phẩm làm kháng sinh đồ lỏng PZA: Tube MGIT960 PZA,

BACTEC MGIT 960 PZA Supplement, Giá code AST, Lọ kháng sinh PZA 8000

µg/ml, Độ đục chuẩn 0.5 McFarland, Độ đục chuẩn 1.0 McFarland, Nước cất vô

trùng, Môi trường LJ có và không có kháng sinh.

Các hóa chất chính cho phân tích đa hình di truyền gen NAT2: E.Z.N.A

blood DNA Mini kit (hãng Omega-Biotek), Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid,

(EDTA) Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix), TAE 1X, 5X DNA

loading dye (hãng ThermoScientific), Gene Ruler Ladder DNA marker (hãng

16

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

ThermoScientific), Lambda DNA/HindIII Ladder (hãng ThermoScientific), Tris

base (hãng Bio basic), axit acetic (hãng Merck), Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT, nước khử ion (hãng Omega Biotek), Kapa2GTM Robust HotStart

ReadyMix (2X) (hãng Kapabiosystems).

2.2. Đối tƣợng nghiên cứu

2.2.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu tại 03 bệnh viện: Bệnh viện Bệnh

phổi Trung ương, Bệnh viện Lao phổi Hà Nội, Bệnh viện 74 Trung ương từ tháng

3/2017 đến 6/2018 đáp ứng các tiêu chuẩn sau:

Tuổi >= 16

Chẩn đoán ban đầu: lao phổi mới hoặc lao phổi tái trị

Kết quả Genxpert MTB+/RIF-

Chỉ định điều trị phác đồ có INH.

Điều trị nội trú tại bệnh viện

Chấp thuận tình nguyện tham gia nghiên cứu

Chuẩn đoán xác định: lao phổi có bằng chứng vi khuẩn - nuôi cấy dương tính

và định danh Mycobacteria tuberculosis;

2.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS

- Phụ nữ có thai hoặc đang cho con bú

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Cỡ mẫu

Nghiên cứu tiến cứu kết hợp hồi cứu, sử dụng phương pháp lấy mẫu thuận

tiện. Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn theo tiêu chuẩn mục 2.2.1 và đối tượng tự

nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu. Thu nhận mẫu từ tháng 3/2017 đến tháng

6/2018 cho tới khi cỡ mẫu đạt 125.

17

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

2.3.2. Thu thập mẫu bệnh phẩm

Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đáp ứng 5 tiêu chuẩn đầu tiên trong mục

2.2.1 sẽ được lấy đờm (3-5ml) theo đúng hướng dẫn của Chương trình chống lao

quốc gia (2017) để nuôi cấy và theo dõi kết quả nuôi cấy và định danh. Kết quả

định danh là MTB thì sẽ được gửi mẫu đến Khoa Vi sinh và Labo tham chiếu Quốc gia của Bệnh viện Phổi trung ương để lưu mẫu tại -700C chờ làm kháng sinh

Mẫu đờm nuôi cấy, định danh MTB tại Bệnh viện Phổi Hà Nội

đồ đặc và lỏng.

Gữi mẫu MGIT dương

Nuôi cấy, định danh và phân lập làm kháng sinh đồ tại khoa Vi sinh và Labo Lao chuẩn Quốc Gia - Bệnh viện Phổi Trung ương

Mẫu đờm nuôi cấy, định danh MTB tại Bệnh viện K74

Hình 2.1: Sơ đồ thu mẫu và luân chuyển mẫu tại 3 bệnh viện

2.3.3. Quy trình nuôi cấy đờm trên môi trường lỏng BACTEC MGIT

Nguyên lý: Một lớp huỳnh quang được đưa vào bên trong lớp silicon nằm ở

đáy ống có đường kính 16x100 mm. Chất huỳnh quang nhạy với sự hiện diện của

Oxy hòa tan trong môi trường. Nồng độ oxy ban đầu có trong ống làm bất hoạt

huỳnh quang. Sau đó khi vi sinh vật hô hấp tiêu thụ oxy làm giảm lượng oxy dẫn

đến sự phát quang. Ống môi trường được đưa vào hệ thống BACTEC MGIT 960/320 được ủ liên tục ở 370C và tín hiệu huỳnh quang được giám sát 60 phút/lần. Máy báo dương bằng tín hiệu đèn và âm thanh khi trong ống chứa từ khoảng 105 - 106 CFU/mL. Sau 42-56 ngày nếu không có tín hiệu huỳnh quang được thu nhận thì

máy sẽ báo âm tính.

18

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Hình 2.2: Hệ thống BACTEC MGIT 960

Các bƣớc tiến hành: 3-5 ml đờm có nhày mủ được thu thập trong ống

falcon 50ml. Mẫu đờm của bệnh nhân được khử tạp bằng dung dịch NaCl-NaOH

với thể tích pha là 1:1, voltex, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút sau đó thêm dung dịch NaCl-NaOH cho đến khi đầy 40 ml rồi ly tâm 3000 rpm/15 phút ở 100C, gạn dịch

nổi và bổ sung 0,5 ml dung dịch đệm nuôi cấy để thu huyền dịch. Huyền dịch sau

đó được đưa vào ống MGIT đã bổ sung thêm các yếu tố tăng trưởng (PANTA

supplement), kháng sinh, kháng nấm và nuôi cấy trong hệ thống BACTEC MGIT

960/320. Kết quả cấy được theo dõi trong vòng 42 ngày, mẫu bệnh phẩm sẽ được

máy tự động ghi nhận kết quả. Cách nhận định kết quả được tóm tắt ở bảng 2.1.

Bảng 2.1: Nhận định kết quả nuôi cấy MGIT

Máy báo Nhuộm soi Định danh Kết quả

Dương Vi khuẩn khác, nấm Ngoại nhiễm

AFB cuộn thừng, AFB Dương tính M.tuberculosis

complex

Âm tính NTM*

AFB vụn Âm tính NTM*

Âm tính Âm tính Không thấy cặn vụn

Có cặn vụn hoặc nhuộm soi dương tính làm theo quy trình ống

dương

* NTM: Non-tuberculosis Mycobacteria (Mycobacteria ngoài lao)

19

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

2.3.4. Phương pháp kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một

Việc thực hiện kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một được thực hiện

bằng 02 phương pháp: kháng sinh đồ trên môi trường lỏng được thực hiện cho

Pyrazinamid (PZA), kháng sinh đồ trên môi trường đặc được thực hiện cho 4 thuốc

chống lao còn lại là Rifampicin (RMP), Isoniazid (INH), Ethambutol (EMB),

Streptomycin (SM). Quá trình làm kháng sinh đồ được thực hiện trong phòng an toàn

sinh học có áp lực âm và tủ an toàn sinh học cấp độ II, theo quy trình chuẩn của Labo

Lao chuẩn quốc gia tại Bệnh viện Phổi Trung ương.

2.3.4.1. Phương pháp xác định tính kháng Pyrazinamide (PZA) trên môi trường

lỏng

Nguyên lý: Hệ thống BACTEC MGIT 960 được dùng làm thử nghiệm

kháng sinh đồ PZA. Dựa trên chỉ số growth unit (GU), hệ thống tự động so sánh

lượng vi khuẩn mọc ở ống chứa thuốc kháng sinh với ống chứng không chứa thuốc

kháng sinh, máy tự động phân tích kết quả. Chủng vi khuẩn thử nghiệm được pha

theo tỷ lệ quy định, cấy vào môi trường lỏng MGIT không có và có PZA và đưa vào

hệ thống nuôi cấy. Hệ thống sẽ giám sát liên tục sự phát phát quang của ống cấy

dựa trên đơn vị sinh trưởng GU. Kết quả kháng sinh đồ được báo cáo trong vòng 4-

21 ngày khi ống chứng đạt 400 GU, dựa trên so sánh định lượng sự phát triển của vi

khuẩn lao trong ống chứng và ống có thuốc PZA. Ống có thuốc PZA GU < 100 là

nhạy cảm; GU > 100 là kháng thuốc. Mỗi mẻ kháng sinh đồ trong ngày với cùng lô hóa chất được kiểm tra chất lượng bằng chủng chuẩn H37RV 100 và được thực hiện như chủng thử nghiệm.

Các bƣớc tiến hành

Chuẩn bị môi trường: Chuẩn bị 02 ống (ống chứng và ống thử nghiệm)

chứa MGIT960 PZA có bổ sung 0,8ml yếu tố sinh trưởng, ghi đầy đủ thông tin

bệnh nhân và ngày xét nghiệm lên ống. Pha PZA 8000µg/ml trong 2.5 ml nước cất

vô trùng. Lấy 100 µl PZA bổ sung vào ống MGIT thử nghiệm.

Chuẩn bị chủng làm kháng sinh đồ: Các chủng làm kháng sinh đồ được

kiểm tra là chủng thuần. Huyền dịch vi khuẩn được chuẩn bị bằng cách gặt chủng

cho vào ống có bi thủy tinh vô trùng và vài giọt nước cất, voltex trong 2-3 phút để

chủng được hòa tan hoàn toàn, ủ 15 phút sau đó thêm nước cất trộn đều, điều

chỉnh huyền dịch có độ đục hơn chuẩn Mac Farland 1.0. Sau 20 phút, chuyển phần

20

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

nước nổi sang ống vô trùng khác. Thêm nước cất, điều chỉnh huyền dịch có độ đục

tương đương độ đục chuẩn Mc Farland 0.5. Pha tiếp huyền dịch với nước cất tỷ lệ

1:5, dùng huyền dịch này làm kháng sinh đồ. Lấy 1ml huyền dịch đã pha loãng 1:5

ở bước trên tiếp tục pha loãng với nước cất tỷ lệ 1:10 để được huyền dịch cấy vào

ống MGIT960 PZA làm ống chứng GC.

Cấy huyền dịch vi khuẩn vào môi trường kháng sinh đồ: Dùng Pipet tự

động hút 0,5ml huyền dịch chuẩn bị cho ống GC vào ống chứng GC. Dùng Pipet tự

động húy 0,5ml huyền dịch pha loãng tỷ lệ 1:5 vào ống thử nghiệm PZA. Vặn chặt

nắp mỗi ống và đảo ngược ống 3-4 lần để đồng nhất dung dịch. Xếp 2 ống vào giá

code AST theo đúng thứ tự: GC-PZA. Đưa giá code AST vào máy BACTEC

MGIT960 và ghi các thông tin vào sổ kháng sinh đồ.

Đọc kết quả kháng sinh đồ: Máy báo kết quả kháng sinh đồ tại thời điểm

ống chứng GC đạt 400GU trong vòng 4-21 ngày. Ngưỡng kháng là 100GU. Kết quả

kháng sinh đồ có thể được thông báo một trong ba trường hợp:

+ Kết quả nhạy (S): ống thử nghiệm PZA có mức GU < 100

+ Kết quả kháng (R): ống thử nghiệm PZA có mức GU > 100

+ Kết quả không kết luận được (X) báo lỗi: ống thử nghiệm GU >400 và thời

gian máy báo < 4 ngày có thể do pha huyền dịch đặc hoặc chủng nhiễm trùng; lỗi

GU<200 có thể do một số chủng kháng thuốc đặc hiệu mọc chậm hoặc huyền dịch

vi khuẩn quá loãng. Trong trường hợp này kiểm tra lại các bước và thực hiện lại

kháng sinh đồ.

a. Nhạy b. Kháng

Hình 2.3: Kháng sinh đồ PZA

21

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

2.3.4.2. Phương pháp xác định tính kháng INH; RMP; SM; EMB trên môi

trường đặc

Nguyên lý phƣơng pháp kháng sinh đồ tỷ lệ: Xác định tỷ lệ phần trăm số

lượng khuẩn lạc vi khuẩn lao mọc trên môi trường có chứa các loại thuốc chống lao

ở nồng độ tối thiểu so với số vi khuẩn lao mọc trên môi trường đối chứng không

chứa thuốc. Xác định sự kháng của vi khuẩn lao với từng loại thuốc bằng cách so

sánh tỷ lệ trên với ngưỡng kháng. Nếu trên hoặc bằng ngưỡng là vi khuẩn kháng;

dưới ngưỡng là vi khuẩn nhạy cảm. Nồng độ thuốc và ngưỡng kháng thuốc chống

lao được trình bày ở bảng 2.2. Mỗi mẻ kháng sinh đồ trong ngày được làm cùng 03

chủng kiểm tra, cách thức làm giống như chủng thử nghiệm: Chủng chuẩn H37RV 100; chủng chứng kháng RS (kháng RMP và SM), chủng chứng kháng HE (INH và

EMB).

Bảng 2.2: Nồng độ thuốc và ngƣỡng kháng thuốc kháng lao hàng 1

trên môi trƣờng đặc

Nồng độ thuốc µg/ml Ngƣỡng kháng (%) Tên thuốc

Isoniazid 0.2 1

Streptomycin 4.0 1

Rifampicin 49.0 1

Ethambutol 2.0 1

Các bƣớc tiến hành

Chuẩn bị môi trường: Chuẩn bị dung dịch Malachite green 2%, dung dịch

LJ cơ bản, dung dịch trứng. Ở bảng 2.3, thuốc dạng bột được tính toán để pha trong

nước cất vô trùng hoặc trong propylene tùy loại thuốc tạo thành dung dịch thuốc

(1). Sau đó dung dịch thuốc (1) sẽ được pha tiếp với nước cất vô trùng để tạo thành

những dung dịch có nồng độ thấp hơn rồi bổ sung vào môi trường LJ với thể tích

phù hợp để đạt được nồng độ thuốc cuối cùng trong môi trường là 0,2 µg/ml cho

INH; 40 µg/ml cho RMP; 4 µg/ml cho SM; 2 µg/ml cho EMB, 500 µg/ml cho PNB

(Para nitrobenzoic acid) (ống đối chứng kiểm tra chủng xác định MTB).

22

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Bảng 2.3: Hƣớng dẫn pha dung dịch thuốc (1)

Số mg thuốc mỗi loại tính Hòa tan trong Dung dịch thuốc

theo độ tinh khiết (1)

10 ml nước cất vô trùng Dung dịch INH (1)

2 ml dung môi Propylen Dung dịch RMP (1)

 8 ml nước cất vô

trùng

10 ml nước cất vô trùng Dung dịch SM (1)

10 ml nước cất vô trùng Dung dịch EMB (1)

20 ml dung môi Dung dịch PNB (1)

Propylen

Mỗi chủng thử nghiệm chuẩn bị: 04 ống môi trường LJ (2 ống ghi 10-2; 2 ống ghi 10-4); 04 ống môi trường LJ có chứa kháng sinh (INH, RMP, SM, EMB) và

ống PNB. Ghi rõ các thông tin ký hiệu chủng, ngày thực hiện trên các ống.

Các chủng làm kháng sinh đồ được kiểm tra là chủng thuần đã được định

danh; chủng nguyên thủy 3-4 tuần tuổi có nhiều hơn 5 khuẩn lạc; chủng cấy truyền

2 tuần tuổi.

Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: Dùng ăng nhựa lấy vi khuẩn lao từ ống

nuôi cấy cho vào ống có bi thủy tinh vô trùng và vài giọt nước cất. Voltex trong 2-

3 phút để chủng được hòa tan hoàn toàn. Chờ 15 phút. Thêm 2-4 ml nước cất vô

trùng trộn đều để 15 phút. Dùng pipet vô trùng hút huyền dịch phía trên nhỏ dần

vào ống chứa 10ml nước cất vô trùng, trộn đều, điều chỉnh huyền dịch độ đục tương đương Mac Farland 1.0. Ta được huyền dịch nồng độ 100. Pha 100 µl huyền dịch 100 và ống chứa 99ml nước cất vô trùng, trộn đều được nồng độ 10-2, tiếp tục pha loãng trong nước cất để thu được nồng độ 10-4. Huyền dịch 10-2 và 10-4 được

sử dụng để làm kháng sinh đồ

23

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Cấy chủng làm kháng sinh đồ: Dùng pipet vô trùng cấy vào ống môi trường có kháng sinh 0,1 ml huyền dịch vi khuẩn 10-4, nhẹ nhàng láng đều huyền

dịch trên ống môi trường chứa kháng sinh. Hai ống LJ không chứa kháng sinh cấy huyền dịch vi khuẩn 10-4; 2 ống LJ không chứa kháng sinh khác cấy huyền dịch vi khuẩn 10-2. Sau đó, vặn lỏng nắp ống môi trường, đặt ống cấy lên khay, mặt môi trường quay lên trên, đặt khay vào tủ ấm 370C. Kiểm tra ngoại nhiễm sau khi ủ ấm

24 giờ, 72 giờ, 1 tuần và vặn nắp ống khi mặt môi trường đã khô và tiếp tục cho

vào tủ ấm.

Hình 2.4: Chuẩn bị huyền dịch làm kháng sinh đồ đặc

Đọc kết quả kháng sinh đồ: Đánh giá kết quả ở 2 thời điểm là sau 28 ngày

và 42 ngày nuôi cấy. Chủng chuẩn H37RV nhạy với các thuốc kháng lao; Chủng

chứng kháng RS: kháng với Rifampicin và Streptomycin; Chủng chứng kháng HE: Kháng với Isoniazid và Ethamtanol; Các ống môi trường LJ 10-2 phải có số khuẩn lạc > 200 khuẩn lạc; Các ống môi trường LJ 10-4 phải có khuẩn lạc; Ống PNB

không có khuẩn lạc, nếu mẫu nào có khuẩn lạc thì cần phải kiểm tra lại định danh

chủng thử nghiệm.

Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc: Đánh giá trên tất cả 9 ống môi trường cụ

thể như sau:

24

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Bảng 2.4: Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc dựa vào khuẩn lạc

Đặc điểm Kết quả

Không thấy khuẩn lạc Âm tính

< 20 khuẩn lạc Dương tính: ghi cụ thể số khuẩn lạc

20 - 100 khuẩn lạc Dương tính: 1+

100 - 200 khuẩn lạc Dương tính: 2+

200 - 500 khuẩn lạc Dương tính: 3+

>500 khuẩn lạc Dương tính: 4+

Nhiễm trùng hoặc nấm Ngoại nhiễm

Nhận định kết quả kháng thuốc: So sánh số lượng khuẩn lạc trên ống môi trường LJ có thuốc và ống môi trường không có thuốc LJ 10-4. Tỷ lệ 1% được gọi là

ngưỡng kháng.

Tuỳ thuộc kết quả so sánh để đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao

theo các trường hợp như bảng 2.5:

Bảng 2.5: Đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao

Ngày thứ 28

Kết qủa vi khuẩn mọc trên ống thuốc Ngày thứ 42

Kết luận tính kháng

Ủ ấm tiếp Nhạy cảm Nhạy cảm

Khuẩn lạc không mọc trên môi trường chứa thuốc

Kết quả sơ bộ: nhạy cảm

Kháng Trả kết quả Kháng

Ủ ấm tiếp Nhạy cảm Nhạy cảm

Tỷ lệ phần trăm khuẩn lạc lớn hơn hoặc bằng ngưỡng kháng Tỷ lệ phần trăm số khuẩn lạc nhỏ hơn ngưỡng kháng quả rõ

Kết chưa ràng Kháng Kháng

25

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Làm lại kháng sinh đồ sớm nhất có thể trong các trường hợp: vi khuẩn không mọc trên ống chứng; số lượng khuẩn lạc trên ống môi trường LJ 10-2 < 200 khuẩn

lạc; tỷ lệ kháng xấp xỉ ngưỡng kháng; ngoại nhiễm. Các trường hợp ngoại nhiễm

hoặc lẫn vi khuẩn ngoài lao sẽ được phát hiện trong khoảng thời gian một tuần sau

khi thực hiện cấy kháng sinh đồ.

2.3.5. Phân tích kiểu gen NAT2 để xác định kiểu hình acetyl hóa isoniazid

Thu thập, vận chuyển và bảo quản mẫu máu

Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đáp ứng 5 tiêu chuẩn đầu tiên trong mục

2.2.1 sẽ được lấy mẫu máu cho phân tích gen NAT2 vào ngày điều trị thứ 10 -14.

Mỗi bệnh nhân được lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống có chất chống đông EDTA

ghi đầy đủ thông tin gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu. Mẫu được vận

chuyển bằng hộp giữ lạnh đựng mẫu chuyên dụng về phòng thí nghiệm Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội bảo quản ở -300C cho đến khi thực hiện các

bước tiếp theo.

Tách chiết, kiểm tra và định lƣợng ADN

ADN được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng kit E.Z.N.A

blood DNA Mini (Mỹ). Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết được định

lượng bằng máy đo Nano Photometer-implen NP80: đo mật độ hấp thụ quang ở

bước sóng 260 nm (A260) và 280 nm (A280). DNA được cho là có độ tinh sạch cao

khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0. Chất lượng DNA còn được kiểm

tra bằng điện di trên gel agarose 1,2%.

Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR

Gen NAT2 sẽ được xác định các SNP (NAT2*5, NAT2*6, NAT2*7) bằng

phương pháp PCR- giải trình tự gen. Đầu tiên, DNA tổng số được sử dụng để nhân

dòng đoạn gen NAT2 có độ dài 1093 bp sử dụng cặp mồi 5'-GGA ACA AAT TGG

ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3’ [56]. Các thành phần

phản ứng được trình bày ở bảng 2.6.

26

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Bảng 2.6: Thành phần tối ƣu cho phản ứng nhân dòng gen NAT2

Nồng độ Thể tích 1 phản ứng (25 µL) Thành phần

Nước khử ion 10

1X 12.5

Master Mix Kapa2G Robust Hotstart DNA polymerase

Mồi xuôi 10 µM 0,3 µM 0,75

Mồi ngược 10 µM 0,3 µM 0,75

DNA 1

Tối ưu phản ứng PCR: Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, các

thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA đã được tiến hành biến tính với 95 oC trong 3 phút, sau đó thực hiện 35 chu kỳ (95 oC trong 15s, 58 oC trong 15s, 72oC trong 1 phút), giai đoạn kết thúc ở 72oC trong 10 giây và bảo quản ở 4oC. Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng trên gel agarose 1,5%, sử dụng thang

chuẩn O Gene Ruler Ladder DNA marker/Massruler Express Forward DNA Ladder

Mix để xác định kích thước sản phẩm.

Xác định kiểu gen NAT2 bằng phƣơng pháp giải trình tự

20 µL sản phẩm PCR đã được kiểm tra trên gel agarose sẽ được gửi đến hãng

First base (Malaysia ) để giải trình tự bằng cách sử dụng cùng 1 mồi (5'-GGA ACA

AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3’) cho cả

đoạn gen NAT2. Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version

7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi bệnh nhân. Các đọc như sau: mỗi nucleotit được

thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da

trời, G: màu đen, T: màu đỏ). Tại vị trí cho mỗi nucleotit, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu

thì bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị

hợp tử.

2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu

Dữ liệu nghiên cứu được phân tích thống kê sử dụng phần mềm SPSS 16.0.

Thống kê mô tả được trình bày, các thuật toán phân tích t-student và ANOVA được

sử dụng để phân tích các biến định lượng, kiểm định chi-square được sử dụng cho

phân tích bảng tương liên và so sánh tỷ lệ.

27

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

2.3.7. Đạo đức nghiên cứu y học

Nghiên cứu đảm bảo các quy định về đạo đức trong thiết kế thử nghiệm lâm

sàng của Bộ Y tế. Bệnh nhân trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ

về mục đích và mục tiêu nghiên cứu, cũng như lợi ích của nghiên cứu và những ảnh

hưởng bất lợi của nghiên cứu tới bệnh nhân. Những bệnh nhân tham gia nghiên cứu

sẽ được kí bản đồng thuận tham gia nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút khỏi

nghiên cứu bất cứ lúc nào. Các thông tin của bệnh nhân được đảm bảo bí mật tuyệt

đối và chỉ được sử dụng cho mục đích nghiên cứu.

Nghiên cứu đã được thông qua tại Hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại học

Quốc gia Hà Nội trước khi triển khai thực hiện. Mẫu bệnh án và phiếu xác nhận tự

nguyện tham gia nghiên cứu của bệnh nhân được thu thập đầy đủ.

28

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao đối với thuốc kháng lao hàng một

3.1.1. Đặc điểm chung của quần thể bệnh nhân nghiên cứu

Bảng 3.1: Thông tin chung của quần thể nghiên cứu

Chỉ số Thể lao Xác suất

Lao mới Lao tái trị p ( ̅ SD) hoặc

(n=69) (n=56) %

63,8/36,2 87,5/12,5 0,002 Nam/Nữ

0,003 41,11 14,70 48,79 13,58 Tuổi (năm)

0,539 18,91 18,65 BMI

Từ tháng 3/2017 đến tháng 6/2018 chúng tôi ghi nhận trong số bệnh nhân

đến khám và điều trị tại 03 bệnh viện (Bệnh Phổi Hà Nội, K74 Trung ương; Phổi

Trung ương) có 125 bệnh nhân được chuẩn đoán lao phổi và được thực hiện test

GenXpert MTB+/RIF- để loại trừ nhanh lao đa kháng. Có 69 bệnh nhân lao phổi

mới (chiếm 55,2%) và 56 bệnh nhân lao phổi tái trị (44,8%) trong đó chủ yếu là lao

tái phát (53 bệnh nhân). Giữa hai nhóm lao phổi mới là lao phổi tái trị có sự khác

biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ giới tính nam/nữ (p< 0.05).

Về mặt giới tính, mặc dù phụ nữ trong quá trình sống có nhiều thời điểm dễ

mắc lao hơn như thời kỳ có thai, nuôi con nhỏ, mãn kinh… nhưng các nghiên cứu

trong và ngoài nước đều đưa ra nhận định nam giới có số lượng người mắc lao cao

hơn nữ giới nhưng tỷ lệ nam/nữ lại khác nhau tùy theo nghiên cứu. Nam giới được

cho là có nguy cơ tiếp xúc nguồn lây nhiều hơn nữ giới, cường độ làm việc cao hơn,

có nhiều mối quan hệ xã hội rộng rãi, đồng thời có nhiều thói quen có hại như

nghiện rượu, hút thuốc. Theo báo cáo của WHO (2018) năm 2017 trên toàn thế giới

có khoảng 6 triệu nam giới mắc bệnh lao, trong khi đó chỉ chỉ xấp xỉ 3,2 triệu nữ

giới mắc lao. Nghiên cứu tổng hợp của WHO mới đây cũng cho thấy số lượng nam

giới mắc lao cao hơn so với nữ giới ở hầu hết các nghiên cứu ở các nước có thu

29

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

nhập thấp và trung bình [26]. Ở Việt Nam, năm 2006-2007, chương trình chống

lao quốc gia đã thực hiện điều tra tình hình mắc lao toàn quốc cho thấy tỷ lệ mắc lao

của nam giới cao hơn nữ giới là 4-5 lần [3]. Ở nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ

nam/nữ là 2,9, cao hơn không đáng kể trong một số nghiên cứu trong nước khác ở

mức 2,4 lần [12], [20]. Điều này có thể giải thích do nghiên cứu chỉ giới hạn trong

bệnh nhân lao phổi, số lượng nghiên cứu chưa đủ lớn và do những năm gần đây sự

phát triển điều kiện kinh tế - xã hội - nhận thức của người dân làm tăng cơ hội tiếp

cận hệ thống y tế của phụ nữ.

Tỷ lệ chênh lệch nam/nữ ở nhóm lao phổi mới là 1,76 xấp xỉ tỷ lệ 1,92

trong nghiên cứu của Hoàng Thị Phượng (2009) [13]. Tỷ lệ nam/nữ ở nhóm lao

phổi tái trị của nghiên cứu là 7,0 cao hơn so với trong nghiên cứu của Hoàng Hà

(4,0) (2009) [4]. Sự khác biệt về tỷ lệ nam/nữ giữa hai nhóm lao phổi tái trị và lao

phổi mới trong nghiên cứu mang ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Tỷ lệ nam giới trong

nhóm lao phổi tái trị cao hơn so với nữ giới rất nhiều. Nguyên nhân có thể là do

nam giới thường không có kiên nhẫn để tuân thủ quá trình điều trị, cùng những

yếu tố nguy cơ cao như hút thuốc, nghiện rượu vì vậy thường dẫn đến sự tái phát.

Tại Việt Nam chúng tôi chưa tìm được công bố nào trong các nghiên cứu báo cáo

về mối quan hệ giữa giới tính trong nhóm lao phổi mới và lao tái trị. Nhận định

này có thể là lưu ý quan trọng với bác sỹ điều trị, đặc biệt lưu ý các đối tượng

bệnh nhân nam trong quá trình điều trị để đảm bảo đạt được kết quả điều trị cao

nhất ngay từ lần đầu.

Độ tuổi trung bình trong nghiên cứu của nhóm lao phổi tái trị (48,79) cao

hơn nhóm lao phổi mới (41,11). Sự khác biệt về độ tuổi trung bình giữa hai

nhóm có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Điều này phản ánh mối quan hệ giữa độ tuổi

và tình trạng mắc lao mới thấp hơn lao tái trị. Sự khác biệt giữa hai nhóm có thể

là do ở người lớn tuổi tình trạng đề kháng chung của cơ thể kém hơn so với

người trẻ tuổi. Vì vậy những quần thể vi khuẩn nằm ngủ trong cơ thể sẽ có cơ

hội tái hoạt động, mặt khác cũng dễ làm cho người lớn tuổi dễ ngoại nhiễm vi

khuẩn lao hơn người trẻ.

30

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Chỉ số khối cơ thể (BMI) trung bình của nhóm lao phổi mới là 18,91 và của

nhóm lao phổi tái trị là 18,65. BMI trung bình của hai nhóm là tương đương nhau.

Đây là mức BMI ở gần ngưỡng bình thường theo chỉ số dinh dưỡng (18,5). Chỉ số

này cũng tương tự như trong nghiên cứu của Hoàng Thị Phượng (2009) là

18,71[13].

Hình 3.1: Biểu đồ dinh dƣỡng theo BMI của hai nhóm bệnh nhân

Phân loại tình trạng dinh dưỡng theo chỉ số BMI của người Việt Nam (theo

WPRO), ở người Việt Nam trưởng thành từ 25-64 tuổi, có tỷ lệ tình trạng thiếu cân

20,9%; tình trạng bình thường 62,9%; tình trạng thừa cân 9,7% và béo phì 6,6% [2].

Chỉ số BMI của bệnh nhân nghiên cứu nằm trong 3 nhóm: gầy (thiếu cân), bình

thường và thừa cân. Không có bệnh nhân tình trạng béo phì ở cả hai nhóm lao. Điều

này phù hợp với nghiên cứu của Tverdal khi nghiên cứu 1.717.655 người trên 14

tuổi trong 8-19 năm, tỷ lệ mắc lao phổi giảm khi tăng BMI, tỷ lệ giống nhau cho cả

hai giới và mọi lứa tuổi [23]. Một nghiên cứu khác trên diện rộng kéo dài 20 năm

tại Hoa Kỳ, loại bỏ các trường hợp đã mắc lao trước khi nghiên cứu cũng đưa ra

nhận định tỷ lệ mắc lao ở những người có chỉ số BMI thấp (<18,5) cao hơn ở những

người có chỉ số BMI bình thường, cao và rất cao [41]. Tuy nhiên nghiên cứu gần

đây tại Hàn Quốc trong vòng 5 năm từ 2007 đến 2013, các bệnh nhân mắc lao trước

đó được loại trừ cũng cho thấy chỉ số BMI tăng có thể làm giảm nguy cơ mắc lao

31

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

nhưng chỉ số BMI rất cao (>30) lại không làm giảm nguy cơ mắc lao ở phụ nữ trẻ

[39]. Còn trong đa phần các nghiên cứu tại Việt Nam, những thống kê về mối liên

quan giữa chỉ số BMI và người mắc lao đều cho thấy những người mắc lao phần lớn

có chỉ số BMI thấp [13]. Điều này có thể được giải thích do các nghiên cứu tại Việt

Nam phần lớn là nghiên cứu tại thời điểm bệnh nhân đã bị lao, khi đó bệnh nhân đã

có tình trạng suy kiệt cơ thể ảnh hưởng đến cân nặng. Ngoài ra cũng có thể do điều

kiện dinh dưỡng ảnh hưởng đến chỉ số BMI liên quan đến điều kiện lao động của

những người nhiễm lao. Vì vậy để có thể đưa ra những nhận định đúng về mối liên

quan giữa chỉ số BMI và tình trạng mắc lao tại Việt Nam cần có các nghiên cứu

nhiều năm đo được BMI trước khi nhiễm lao.

3.1.2. Tình hình kháng thuốc chống lao hàng 1 ở các bệnh nhân lao phổi

3.1.2.1. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn lao

Bảng 3.2: Thời gian nuôi cấy và đơn vị sinh trƣởng của vi khuẩn lao

Chỉ số Thể lao Xác suất

Lao mới Lao tái trị p ( ̅ SE)

(n=69) (n=56)

0,018 210,35 10,37 250,61 13,65 Thời gian nuôi cấy

(giờ)

0,711 2285,0 658,57 1915,3 748,70 Đơn vị sinh trƣởng

(GU)

Thời gian nuôi cấy trung bình (giờ) ở nhóm lao phổi mới (210) thấp hơn

nhóm lao phổi tái trị (250) (p< 0,05). Đơn vị sinh trưởng GU giữa hai nhóm không

có sự khác biệt. Có sự dao động lớn giữa các cá thể về đơn vị sinh trưởng và thời

gian nuôi cấy ở trên cả hai nhóm.

Thời gian nuôi cấy được tính từ lúc mẫu được đưa vào máy nuôi cấy đến lúc máy báo dương khi nồng độ trong ống nuôi cấy đạt 105 - 106 CFU/mL. Nồng độ vi

khuẩn trong ống phụ thuộc vào nồng độ vi khuẩn ban đầu của mẫu, vì vậy thời gian

nuôi cấy của các mẫu sẽ khác nhau. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh,

32

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

thời gian nuôi cấy tỷ lệ nghịch với số lượng khuẩn lạc được tính trên số CFU/mL

[27], [24]. Chỉ số thời gian nuôi cấy trong môi trường MGIT sẽ tạo điều kiện thuận

lợi cho việc đánh giá định lượng Mycobacterium tuberculosis, đặc biệt là trong việc

đánh giá sớm hiệu quả trong điều trị.

3.1.2.2. Kết quả kháng sinh đồ vi khuẩn lao

Sau 42 ngày, kết quả kháng sinh đồ đặc với 4 loại thuốc RMP, INH, SM,

EMB sẽ được kết luận dựa trên kết quả vi khuẩn mọc trên ống môi trường thử

nghiệm. Hình 3.2 là kết quả kháng sinh đồ đặc với bốn loại thuốc kháng lao INH,

RMP, SM, EMB của một số chủng trong nghiên cứu.

Kháng INH, RIF, EMB; Nhạy SM Kháng SM; Nhạy INH, RIF, EMB

Kháng INH, RIF, SM; EMB Nhạy INH, RIF, SM, EMB

Hình 3.2: Một số hình ảnh kết quả kháng sinh đồ trên môi trƣờng đặc

33

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Đối với kháng sinh đồ lỏng PZA trong vòng 21 ngày máy sẽ tự động báo kết

quả. Các kết quả kháng sinh đồ đặc và lỏng được ghi nhận và phân tích với từng

loại thuốc. Hình 3.3 thể hiện tỷ lệ số thuốc kháng mỗi loại của 5 loại thuốc kháng

lao hàng một INH, RMP, EMB, SM, PZA

Tỷ lệ số lượng thuốc bị kháng của 5 loại thuốc INH, RMP, EMB, SM, PZA

0% 2.4%

2.4%

12.8%

21.6%

, 60.8%

Nhạy tất cả các thuốc Kháng 1 thuốc

Kháng 2 thuốc

Kháng 3 thuốc

Kháng 4 thuốc

Kháng 5 thuốc

Hình 3.3: Biểu đồ tỷ lệ số thuốc kháng mỗi loại

Trong số 125 chủng vi khuẩn lao phân lập được từ bệnh nhân nghiên cứu có

60,8% chủng nhạy với tất cả các thuốc kháng lao hàng 1. Có 21,6% chủng kháng 1

loại thuốc bất kỳ; 12,8% kháng với 2 loại thuốc bất kỳ; không có chủng nào kháng

với 3 loại thuốc bất kỳ và có 2,4% kháng với 4 thuốc bất kỳ (tương đương 3/125

chủng). Đặc biệt có 3 chủng (2,4%) kháng toàn bộ 5 thuốc kháng lao hàng 1.

Bảng 3.3: Tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm lao mới và lao tái trị

Tình trạng kháng thuốc Thể lao Xác suất

chống lao (n, %) Lao mới Lao tái trị

(n=69) (n=56)

54 (71,1%) 22 (39,3%) Nhạy tất cả thuốc χ2=20,931

p=0,000 15 (21,7%) 34 (60,7%) Kháng thuốc bất kỳ

(1 hoặc nhiều hơn)

34

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Tỷ lệ kháng với một thuốc bất kỳ giữa hai nhóm lao phổi tái trị và lao phổi

mới có sự khác biệt rõ rệt và mang ý nghĩa thống kê (p<0,05) Tỷ lệ kháng một

thuốc bất kỳ ở nhóm lao phổi tái trị (60,7%) cao hơn so với nhóm lao phổi mới

(21,7%). Và 3 chủng vi khuẩn kháng cả 5 thuốc chống lao hàng một đều thuộc

nhóm lao tái trị (2,4%). Tỷ lệ kháng thuốc chung là 39,2%.

Theo WHO (2015), Việt Nam xếp thứ 14/27 quốc gia có số lượng bệnh nhân

đa kháng nhiều nhất, chiếm 1,7% toàn cầu. Với các thuốc chống lao hàng một INH,

RIF, SM, EMB, PZA sau hơn nửa kỷ được sử dụng đã xuất hiện các chủng vi khuẩn

kháng gần hết các loại thuốc theo các mức độ khác nhau. Từ năm 1997 đến nay,

Chương trình chống lao quốc gia đã tiến hành 4 lần điều tra tỷ lệ kháng thuốc chống

lao trên toàn quốc. Năm 1996, điều tra kháng thuốc lần thứ nhất cho thấy ở bệnh nhân

lao mới tỷ lệ kháng thuốc chung là 32,5%, tỷ lệ đa kháng thuốc là 2,5%. Năm 2002

điều tra kháng thuốc lần 2, tỷ lệ đa kháng thuốc là 3% ở lao mới và 23,5% ở lao tái

trị. Năm 2005-2006 điều tra kháng thuốc toàn quốc lần 3, kháng thuốc chung là

30,9%; ở nhóm lao tái trị tỷ lệ lao kháng thuốc là 58,9%; đa kháng thuốc là 19,3% ;

kháng INH 43,5%và SM là 50,7%; và đa kháng thuốc 2,7% ở lao mới [14]. Còn theo

nghiên cứu của Hoàng Thị Phượng (2009) có 31,6% bệnh nhân kháng thuốc bất kỳ

(56/177). Như vậy tỷ lệ kháng thuốc chung của nghiên cứu là 39,2% có xu hướng cao

hơn số với tỷ lệ của toàn quốc. Điều này có thể do bệnh nhân trong nghiên cứu này là

các bệnh nhân tại 3 bệnh viện thuộc khu vực Hà Nội, nơi tập trung đông dân cư, và là

những cơ sở điều trị bệnh nhân lao kháng thuốc. Đây cũng là một dấu hiệu đáng lưu ý

trong chương trình hành động phòng chống lao quốc gia, để có biện pháp hạn chế tối

đa sự lây lan lao của bệnh lao, đặc biệt là lao kháng thuốc.

Nghiên cứu của Nguyễn Văn Chính năm 2016 trên hồ sơ của 287 bệnh nhân

kháng thuốc tại Hà Nội được chương trình phòng chống lao quản lý, cho thấy tỷ lệ

lao kháng thuốc ở nhóm tái trị là 92,68%, ở nhóm bệnh nhân mới là 7,32% ; tỷ lệ

kháng 4 loại thuốc chung là 34%; kháng 3 loại là 10,65%; kháng 2 loại là 19,35%;

kháng 1 loại là 36% [1]. Tỷ lệ này có phần cao hơn so với nghiên cứu của chúng tôi

(60,7%) mặc dù đối tượng nghiên cứu cùng thuộc địa bàn Hà Nội và chúng tôi cũng

không thu nhận được chủng vi khuẩn nào có kháng đồng thời ba loại thuốc. Điều

này có thể giải thích do đối tượng của chúng tôi được nghiên cứu tiến cứu, không bị

35

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

loại bỏ các trường hợp kháng thuốc như như nghiên cứu trên hồ sơ bệnh nhân

kháng thuốc. Tỷ lệ kháng thuốc bất kỳ của 295 bệnh nhân lao phổi tái trị ở Bệnh

viện Lao và Bệnh phổi Trung ương và Bệnh viện Lao phổi thái nguyên là 82,4 %

[4]. Tỷ lệ này cũng cao hơn so với chúng tôi, có thể do đối tượng của chúng tôi

cũng đã được loại bỏ các trường hợp kháng Rifampicin bằng Genxpert MTB/RIF. Ở

bệnh nhân lao mới, so với số liệu điều tra kháng thuốc toàn quốc lần thứ 4 thì tỷ lệ

kháng thuốc chống lao bất kỳ hàng 1 là 32,7% cao hơn so với kết quả nghiên cứu

của chúng tôi (21,7%) [52]. Ngoài những lý do trong việc lựa chọn đối tượng

nghiên cứu, sự thay đổi này có thể là một dấu hiện tốt cho thấy tình trạng giảm tỷ lệ

kháng thuốc chống lao hàng một ở Việt Nam.

Ngoài ra, trong nghiên cứu này cũng chỉ ra sự khác biệt về tỷ lệ kháng thuốc

giữa nhóm lao phổi tái trị và lao phổi mới. Sự khác biệt này hoàn toàn phù hợp với

giả thuyết các nguyên nhân làm gia tăng tính kháng thuốc của vi khuẩn lao do sự

tiếp xúc với các thuốc trong lần điều trị trước. Vì vậy trong quá trình điều trị, theo

dõi những bệnh nhân lao phổi tái trị cần phải có theo dõi về tính kháng thuốc chống

lao hàng một kịp thời để có thể điều chỉnh phác đồ phù hợp.

Bảng 3.4: Kết quả kháng sinh đồ với từng thuốc chống lao hàng một

Thuốc Thể lao

Sự mẫn cảm với thuốc Xác suất P

INH

RIF

SM

EMB

PZA

Nhạy (n, %) Kháng (n, %) Nhạy (n, %) Kháng (n, %) Nhạy (n, %) Kháng (n, %) Nhạy (n, %) Kháng (n, %) Nhạy (n, %) Kháng (n, %) Lao mới (n=69) 58 (84,1%) 11 (15,9%) 68 (98,6%) 1 (1,4%) 60 (87,0%) 9 (13,0%) 68 (98,6%) 1 (1,4%) 68 (98,6%) 1 (1,4%)

Nhạy (119; 95,2 %) 68 (98,6%)

Đa kháng (RIF và INH) χ2=11,108 p=0,001 χ2=3,784 p=0,089 χ2=15,588 p=0,000 χ2=3,784 p=0,089 χ2=2,610 p=0,172 χ2=3,784 p=0,089 Kháng (6; 4,8%) 1 (1,4%) Lao tái trị (n=56) 32 (57,1%) 24 (42,9%) 51 (91,1%) 5 (8,9%) 31 (72,8%) 25 (44,6%) 51 (91,1) 5 (8,9%) 52 (92,9%) 4 (7,1%) 51(91,1%) 5 (8,9%)

36

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Có sự khác biệt rõ rệt và mang tính thống kê về tỷ lệ nhạy/kháng INH và SM

giữa hai nhóm lao phổi mới và lao phổi tái trị (p< 0.05) Tỷ lệ kháng INH ở nhóm

lao phổi tái trị là 42,9% và ở nhóm lao phổi mới là 15,9%. Tỷ lệ kháng RMP, EMB,

PZA ở hai nhóm lao phổi mới và lao phổi tái trị không có sự khác biệt (p>0.05). Tỷ

lệ kháng RMP, kháng EMB ở lao phổi mới là 1,4%; ở nhóm lao phổi tái trị là 8,9%.

Tỷ lệ kháng PZA ở lao phổi mới là 1,4%; ở nhóm lao phổi tái trị là 7,1%. Tỷ lệ đa

kháng chung trong nghiên cứu này là 4,8 % (6 trường hợp) và cũng không có sự

khác biệt rõ ở cả hai nhóm lao phổi mới (1,4%) và lao phổi tái trị (8,9%).

Điều tra kháng thuốc lần 4 của chương trình chống lao quốc gia (2011-2012),

tỷ lệ đa kháng thuốc chung là 4%, nhóm tái trị là 23,3% [16]. Và theo thống kê báo

cáo mới nhất của WHO (2018) năm 2017 tỷ lệ đa kháng thuốc ước tính tại Việt

Nam ở bệnh nhân mới là 4,1% và bệnh nhân tái phát là 17%. Như vậy, tỷ lệ đa

kháng ở nhóm lao tái trị trong nghiên cứu này thấp hơn nhiều so với tỷ lệ theo điều

tra kháng thuốc toàn quốc lần thứ 4 cũng như báo cáo mới nhất của WHO (2018) và

một số nghiên cứu trong, ngoài nước khác [4]. Điều này có thể giải thích do nhóm

bệnh nhân lao phổi trong nghiên cứu này đã được loại trừ các trường hợp kháng

RIF bằng xét nghiệm GeneXpert MTB/RIF. Tuy tỷ lệ đa kháng ở nhóm lao phổi tái

trị (8,9%) cao hơn so với nhóm lao phổi mới nhưng sự khác biệt này không có ý

nghĩa thống kê (p>0,05). Như vậy kể cả những bệnh nhân lao phổi mới thì vẫn có

nguy cơ cao nhiễm vỉ khuẩn lao đa kháng. Vì thế việc loại trừ nhanh lao đa kháng

bằng GeneXpert nên được triển khai rộng rãi cả ở bệnh nhân lao mới. Theo thống

kê của WHO năm 2017 mới chỉ có 32% bệnh nhân lao mới và 67% bệnh nhân lao

tái trị được thực test kháng Rifampicin

Trong 5 loại thuốc kháng lao hàng một, tỷ lệ kháng thuốc cao nhất là SM

(44,6%) và tiếp theo là INH (42,9%) trên nhóm lao phổi tái trị. Từ năm 1996-1997,

khi Việt Nam thực hiện điều tra kháng thuốc thuốc toàn quốc lần 1 thì tỷ lệ kháng

INH là 20%; kháng SM là 24%. Đến lần điều tra thứ 4 năm 2011-2012 tỷ lệ này

trên bệnh nhân tái trị là 43,5% kháng INH và 50,7% kháng SM [14]. Như vậy tỷ lệ

37

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

kháng SM và INH trên bệnh nhân tái trị của nghiên cứu thấp hơn so với điều tra

kháng thuốc gần đây và một số nghiên cứu trong nước khác (kháng SM là 79,5%,

kháng INH là 82,2% [6] nhưng lại cao hơn so với các tác giả nước ngoài [28].

Ngoài yếu tố nhạy cảm khác nhau với từng loại thuốc, tỷ lệ này còn có thể do trước

đây theo hướng dẫn của Bộ Y tế, phác đồ điều trị cho bệnh nhân, đặc biệt là bệnh

nhân tái điều trị có sử dụng SM[17]. SM là một thuốc chống lao hàng một dạng

tiêm, bệnh nhân phải đến các cơ sở y tế để thực hiện, nên trong quá trình tuân thủ có

thể không được thực hiện tốt, tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc được biểu

hiện làm tăng tính kháng thuốc trong quần thể. Trong 2 năm trở lại đây SM đã được

đưa ra khỏi các phác đồ điều trị chính, chỉ sử dụng trong các trường hợp đặc biệt.

Cùng với SM, tỷ lệ kháng INH trong nhóm lao phổi tái trị của nghiên cứu

thấp hơn so với nhiều nghiên cứu trong nước khác [4]. Đây có thể là kết quả của

những nỗ lực làm giảm tỷ lệ kháng thuốc trong chương trình chống lao quốc gia.

Nhưng tỷ lệ kháng của INH vẫn thuộc mức cao và cao hơn so với thể giới [28], và

có tỷ lệ cao hơn nhiều lần giữa nhóm lao phổi tái trị và lao phổi mới. Vì vậy cần

phải có các biện pháp giám sát chặt chẽ trong việc sử dụng điều trị INH, để đảm bảo

INH vẫn là nguồn thuốc tốt trong điều trị lao, dự phòng lao.

Trong nghiên cứu này, không phát hiện được trường hợp kháng RMP đơn

độc. Tất cả các trường hợp kháng RMP đều kháng INH (2,4%, 6/125). Một số

nghiên cứu trong nước cho thấy phần lớn (89,95%) các chủng kháng RMP thường

kháng phối hợp Isoniazid [6]. Theo Nguyễn Thị Thu Thái (2017) nghiên cứu trên

700 bệnh nhân tại 3 bệnh viện lớn trên toàn quốc cũng chỉ phát hiện 3 chủng vi

khuẩn lao đơn kháng RMP [19]. Báo cáo năm 2018 của WHO cũng cho thấy trong

số 558.000 kháng RMP thì có 82% kháng RMP kết hợp INH (đa kháng thuốc).

Trong nghiên cứu của chúng tôi 100% chủng kháng RMP kháng kết hợp Isoniazid

(chủng đa kháng MDR-TB).

125 bệnh nhân tham gia nghiên cứu đã được loại trừ kháng RMP bằng xét

nghiệm nhanh GeneXpert MTB/RF và có kết quả MTB+/RIF-. Tuy nhiên xét

38

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

nghiệm tính kháng RMP của các chủng này bằng phương pháp kháng sinh đồ tỷ lệ,

chúng tôi đã phát hiện được 6 trường hợp kháng RMP. Như vậy, theo khuyến cáo

của WHO cũng như của Bộ Y tế, GeneXpert MTB/RIF có thể được dùng để sàng

lọc chuẩn đoán nhanh tình hình kháng RMP. Nhưng trong quá trình điều trị nếu có

nghi ngờ hoặc điều kiện cho phép thì vẫn nên kiểm tra lại bằng kháng sinh đồ.

Đối với tính kháng EMB, chúng tôi không phát hiện được trường hợp kháng

EMB đơn độc. Tỷ lệ kháng EMB ở cả hai nhóm là 4,8%. Tỷ lệ kháng EMB ở nhóm

lao mới là 1,4% không có khác biệt lớn với tỷ lệ 1,1% trong điều tra kháng thuốc lần

thứ nhất năm 1996. Tuy nhiên theo Mai Văn Tuấn (2016) trên nghiên cứu 214 bệnh

nhân lao tại bệnh viện Thừa Thiên Huế tỷ lệ kháng EMB lên đến 7,9%[20]. Tính

kháng của EMB ít được quan tâm tại Việt Nam một mặt vì sự không ổn định trong

xét nghiệm kháng sinh đồ đối với EMB [58], mặt khác mọi nguồn lực được tập trung

vào lao đa kháng. Tuy nhiên, hiện nay đã có nhiều bằng chứng cho thấy tính kháng

EMB có liên quan chặt chẽ với tính đa kháng MDR-TB [58], [38]. Trong nghiên cứu

này, 6 chủng vi khuẩn kháng EMB cũng là những chủng đa kháng MDR-TB. Vì vậy,

cần phải có những thống kê, nghiên cứu về tính kháng EMB phục vụ cho giám sát,

đánh giá điều trị lao, đặc biệt là lao kháng thuốc khi EMB là 1 trong những thuốc của

phác đồ chuẩn điều trị lao đa kháng [18].

Khác với EMB, tính kháng PZA của vi khuẩn lao ít được quan tâm vì sự phức

tạp trong thực hiện xét nghiệm kháng sinh đồ truyền thống. Tại Việt Nam, gần như

không có các báo cáo về tình hình kháng PZA. Các xét nghiệm chỉ định kháng sinh

đồ cho bệnh nhân cũng như các nghiên cứu ít thực hiện với PZA vì xét nghiệm kháng

sinh đồ PZA tương đối phức tạp so với kháng sinh đồ đặc các thuốc kháng lao hàng

một khác [38]. Trong năm 2010-2011, Bệnh viện Phổi Trung ương và bệnh viện

Phạm Ngọc Thạch đã thực hiện nghiên cứu tính kháng PZA trên 1533 chủng

M.tuberculosis phân lập từ 1398 bệnh nhân lao phổi mới và 135 bệnh nhân lao phổi

tái trị. Kết quả cho thấy tỷ lệ kháng PZA là 2,2% (33/1533), trong đó tỷ lệ ở bệnh

nhân lao phổi mới là 1,8% (25/1398) và ở bệnh nhân lao tái trị là 5,9% (8/135). 100%

39

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

các chủng kháng PZA có kháng phối với hợp với các thuốc kháng lao hàng một,

trong đó 100% các chủng vi khuẩn kháng PZA phân lập từ nhóm bệnh nhân tái trị là

các chủng đa kháng; tỷ lệ này ở nhóm bệnh nhân lao phổi mới là 60% [35]. Kết qủa

này phù hợp với kết quả trong các nghiên cứu tương tự của các nhà khoa học trên thế

giới[49]. Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ kháng PZA trên nhóm lao phổi mới

và lao phổi tái trị lần lượt là 1,4% và 7,1%. Tỷ lệ kháng PZA trên nhóm lao phổi tái

trị cao hơn so với nghiên cứu năm 2011. Và 100% chủng PZA ở nhóm lao phổi tái trị

cũng là chủng đa kháng. Ở nhóm lao phổi mới, trong nghiên cứu của chúng tôi không

có đối tượng đa kháng nên có sự sai khác so với nghiên cứu năm 2011. Như vậy có

thể thấy, tính kháng PZA đã có xu hướng gia tăng ở nhóm lao tái trị. PZA vẫn đang là

một trong những thuốc nền tảng trong phác đồ điều trị lao đa kháng và hiện nay

kháng sinh đồ PZA có thể được thực hiện bằng dạng kháng sinh đồ lỏng với kít

thương mại MGIT 960 PZA. Vì vậy cần phải có các biện pháp số liệu giám sát tính

kháng PZA thường xuyên hơn để kịp thời có những điều chỉnh thích hợp trong quá

trình điều trị và kế hoạch phòng chống kháng thuốc.

3.2. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên ngƣời bệnh lao và mối ảnh hƣởng

đến tính kháng thuốc Isoniazid

3.2.1. Kết quả tối ưu quy trình phân tích NAT2

Các mẫu máu thu được từ 125 bệnh nhân được tách DNA theo kit của

Omega, sản phẩm tách chiết điện di trên gel agarose 1,2%. Kết quả điện di sản

phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân (Hình 3.3) cho thấy các sản

phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một băng DNA rõ nét,

chất lượng DNA từ các mẫu khác nhau tương đối đồng đều và ổn định, thể hiện qua

các băng điện di có độ sáng cao tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn.

40

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Base pair 23,130 9,416 6,557 4,361 2,322 2,027

23,1kb

Làn M1: thang chuẩn DNA λ/HindIII; Làn 1 - 16: sản phẩm DNA tổng số của mẫu

Hình 3.3: Kết quả DNA tổng số tách chiết điện di trên gel agarose 1,2%.

Kết quả đo mật độ hấp thụ quang ở 260 nm của sản phẩm DNA tổng số cho

thấy nồng độ DNA thu được dao động từ 20 - 200 ng/µL, chỉ số A260/A280 nằm

trong khoảng từ 1,6 đến 2,2. Như vậy, DNA tổng số thu được ít bị đứt gãy với một

băng duy nhất, đảm bảo tinh sạch và đủ điều kiện để tiến hành phản ứng nhân dòng tiếp theo. Chúng tôi lựa chọn Kapa2GTM Robust Hotstart Ready Mix với ưu điểm là

khả năng khuếch đại gen dù có hiện diện của một số chất ức chế PCR hoặc với các

mẫu DNA có độ tinh sạch thấp. Hình 3.4 là kết quả điện di nhân dòng gen NAT2.

Hình ảnh là một băng sáng rõ nét cho thấy phản ứng PCR đạt hiệu suất và độ đặc

Làn M: O Gene Ruler Ladder DNA marker, Làn (-): đối chứng âm

Làn M: Massruler Express Forward DNA Ladder Mix, Làn (-): đối chứng âm

hiệu cao, đảm bảo điều kiện cho phân tích giải trình tự tiếp theo.

Hình 3.4: Kết quả nhân dòng gen NAT2 của một số mẫu theo điều kiện tối ƣu

41

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Sản phẩm nhân dòng gen NAT2 từ phản ứng PCR ở trên được tinh sạch và

giải trình tự. Kết quả giải trình tự được trình bày ở hình 3.5 cho thấy các pick đại

diện cho các nucleotide có độ phân giải tốt, không bị nhiễu giúp dễ dàng phân tích

kết quả. Hình 3.5 cho thấy tất cả các kiểu gen tổ hợp của các allen kiểu dại (*4) và

các allen khác (*5, *6, *7) đều xuất hiện trong nghiên cứu này.

KG Đồng hợp kiểu dại

(NAT2*4*4) Dị hợp đa hình alen (NAT2*4*5/*4*6/*4*7 Đồng hợp đa hình alen (NAT2*5*5/*6*6/*7*7)

/*5*6/*5*7/*6*7)

NAT2 *5

TT CT CC

NAT2 *6

GG GA AA

NAT2

*7

AA GG GA

* NAT2*4 là kiểu gen không chứa các đa hình alen

Hình 3.5: Kết quả đọc kiểu gen NAT2

3.2.2. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao

N-Acetyltransferase 2 đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa của nhiều

loại thuốc và các hợp chất ngoại lai. Hiện nay, thông tin về sự phân bố của các

dạng đa hình gen NAT2 đã được tiến hành nghiên cứu tại nhiều quốc gia trên thế

giới. Phần lớn các nghiên cứu xác định sự phân bố của các alen NAT2 đã được đơn

giản hóa bằng cách chỉ phân tích đối với một số vị trí đa hình làm thay đổi chức

năng NAT2 như NAT2*5, *6, *7 trong tổng số 27 đa hình đơn nucleotide được tìm

42

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

thấy ở NAT2. Đa hình trong NAT2 chịu trách nhiệm về tính đa hình N-acetyl hóa,

trên thế giới được chia thành các dạng acetyl hóa nhanh, trung bình và chậm. Sự

có mặt của bất kỳ hai đa hình alen của NAT2 xác định cho kiểu hình acetyl hóa

chậm, trong khi acetyl hóa trung bình và acetyl hoá nhanh có một hoặc hai alen

kiểu dại tương ứng [29].

Kết quả phân tích tần số alen của 125 mẫu nghiên cứu được trình bày trong

Bảng 3.5. Tần số phân bố của các alen NAT2*5, *6, *7 lần lượt là 6,4%; 31,2% và

16,0%.

Bảng 3.5: Tần số phân bố allen NAT2 ở nhóm lao mới và lao tái trị

Tần số alen Alen

NAT2 Tổng Lao mới Lao tái trị

(n=69*2) (n=125*2) (n=56*2)

116 (0,464) 73 (0,529) 43 (0,384) *4

16 (0,064) 10 (0,072) 6 (0,054) *5

78 (0,312) 38 (0,276) 40 (0,357) *6

40 (0,160) 17 (0,123) 23 (0,205) *7

Xác suất P=0,069

Tổng Lao mới Lao tái trị

116 (0,464) 73 (0,529) 43 (0,384) Alen kiểu dại

134 (0,536) 65 (0,471) 69 (0,616) Đa hình alen

Xác suất P=0,022

Tần số alen kiểu dại và tần số alen NAT2*6 chiếm tỷ lệ lớn nhất (31,2%),

NAT2*5 chiếm tỷ lệ nhỏ nhất (16%). Tỷ lệ phân bố kiểu gen của 3 alen NAT2*5,

NAT*6, NAT*7 không có ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm lao phổi mới và lao phổi

tái trị (p=0,069). Tuy nhiên, nếu xét dưới góc độ tần số alen kiểu dại (NAT2*4) so

với tần số đa hình alen (gồm NAT2*5, *6, *7) thì sự phân bố alen giữa nhóm lao

43

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

phổi mới và lao phổi tái trị sai khác có ý nghĩa (p=0,022). Trong đó đa hình alen

cao trong nhóm lao phổi tái trị (61,6%) cao hơn so với nhóm lao phổi mới

(47,1%). Sự kết hợp các alen này tạo thành 10 kiểu gen khác nhau với tần số phân

bố kiểu gen được trình bày trong bảng 3.6.

Bảng 3.6: Tần số phân bố kiểu gen NAT2 ở nhóm lao mới và lao tái trị

Gen Tần số kiểu gen

NAT2 Tổng Lao mới Lao tái trị

(n=125) (n=69) (n=56)

34 (27,2%) 25 (36,2%) 9 (16,1%) *4*4

7 (5,6%) 5 (7,2%) 2 (3,6%) *4*5

28 (22,4%) 12 (17,4%) 16 (28,6%) *4*6

13 (10,4%) 6 (8,7%) 7 (12,5%) *4*7

1 (1,4%) 0 (0%) 1 (0,8%) *5*5

15 (12%) 8 (11,6%) 7 (12,5%) *6*6

5 (4,0%) 1 (1,4%) 4 (7,1%) *7*7

2 (2,9%) 3 (5,4%) 5 (4,0%) *5*6

2 (1,6%) 1 (1,4%) 1 (1,8%) *5*7

15 (12,0%) 8 (11,6%) 7 (12,5%) *6*7

Xác suất P=0,206

Tần số phân bố của tổ hợp 10 kiểu gen giữa nhóm lao mới và lao tái trị

không có sai khác (p=0,206). Tỷ lệ kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại chiếm tỷ lệ lớn

nhất, tiếp đến là các alen trong tổ hợp của alen *4 và alen *6. Tần số phân bố alen

và tỷ lệ kiểu gen NAT2 cũng được nghiên cứu tại nhiều quần thể người trên thế giới.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ở người da trắng gốc Âu, người Ai Cập, người Ấn

Độ, người Oman, người Maroc thì tần số alen NAT2*5 chiếm tỷ lệ lớn, alen *4, *6

và *7 chiếm tỷ lệ nhỏ [33] . Ví dụ, ở quần thể người Maroc trong nghiên cứu của

Guaoua và cộng sự (2014), tần số phân bố alen *5 chiếm tới 53% và các tổ hợp kiểu

gen của *5 như *5*5, *4*5, *5*6 chiếm gần 70%, điều này hoàn toàn khác biệt với

tỷ lệ phân bố alen và kiểu gen NAT2 ở quần thể bệnh nhân Việt Nam trong nghiên

44

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

cứu này. Nghiên cứu của Toure và cộng sự (2016) trên quần thể bệnh nhân lao

người Senegan (châu Phi) cho thấy xuất hiện các đa hình *4, *5, *6, *7, *12, *14

trong đó tần số phân bố alen *5, *6 chiếm tỷ lệ cao nhất (26,6%) [22]. Các nghiên

cứu trên quần thể người gốc Á như Hàn Quốc, Nhật Bản cho thấy tỷ lệ *5 rất ít, *6,

*7 nhiều hơn. Tuy nhiên, ở người Nhật Bản chủ yếu là *6, *7 chiếm tỷ lệ rất thấp,

còn ở người Hàn Quốc tỷ lệ alen của cả *6 và *7 đều tương đồng với kết quả của

chúng tôi.

Dựa vào kiểu gen, người ta phân loại kiểu hình chuyển hóa gồm kiểu hình

acetyl hóa nhanh (*4*4), kiểu hình acetyl hóa trung bình (*4*5, *4*6, *4*7) và kiểu

acetyl hóa chậm (*5*5, *6*6, *7*7, *5*6, *5*7, *6*7). Trong nghiên cứu của

chúng tôi kiểu hình acetyl hóa trung bình chiếm tỷ lệ cao nhất trong nhóm mẫu

nghiên cứu (38,4%), sau đó là đến kiểu hình acetyl hóa chậm (34,4%). Tỷ lệ kiểu

hình acetyl hóa nhanh chiểm tỷ lệ thấp nhất là 27,4 % (xem Bảng 3.7).

Bảng 3.7: Mối liên quan giữa kiểu hình chuyển hóa với thể lao

Kiểu hình acetyl hóa Thể lao Tổng

của NAT2 Lao mới Lao tái trị

(n=69) (n=56)

25 (36,2%) Nhanh 9 (16,1%) 34 (27,2%)

23 (33,3%) Trung bình 25 (44,6%) 48 (38,4%)

21 (30,4%) Chậm 22 (39,3%) 43 (34,4%)

Xác suất χ2=6,353; p=0,042

Tiến hành phân tích so sánh tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa của NAT2 trên hai

nhóm bệnh nhân lao mới và lao tái trị thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê

(p=0,042). Ở nhóm lao phổi mới có sự phân bố đồng đều giữa các loại kiểu hình:

kiểu hình acetyl hóa nhanh (36,2%), acetyl hóa trung bình (33,3%), acety hóa chậm

(30,4%). Ở nhóm lao phổi tái trị kiểu hình acetyl hóa nhanh chiếm tỷ lệ nhỏ

(16,1%) và hai kiểu hình còn lại có sự phân bố tương đương không khác biệt lớn.

45

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Các nghiên cứu trên thế giới về tỷ lệ kiểu hình chuyển hóa acetyl của NAT2 ở các

quần thể người khác nhau được tổng kết ở bảng 3.8.

Bảng 3.8: Tần số kiểu hình acetyl hóa NAT2 ở các vùng trên thế giới

Khu vực Số lƣợng đối Kiểu hình acetyl hóa NAT2

tƣợng nghiên Chậm Trung Nhanh

cứu (n) bình

Người Châu Âu (da trắng) 5382 0,34 0,58 0,08

Châu Phi 1034 0,40 0,46 0,14

Châu Á 1790 0,37 0,45 0,18

Trung và Nam Mỹ 824 0,52 0,27 0,21

Đông Bắc Á (Trung Quốc, 2062 0,46 0,14 0,40

Hàn Quốc, Nhật Bản)

Ta thấy tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa NAT2 ở quần thể người Châu Âu, Châu

Phi và châu Á nói chung là tương đồng nhau [25, 47] [62] Ở các quần thể này, chủ

yếu là các kiểu hình chuyển hóa Isoniazid chậm và trung bình, kiểu hình chuyển

hóa nhanh chiếm tỷ lệ dưới 20%. Quần thể người Châu Mỹ thì kiểu hình chuyển

hóa trung bình chiếm đa số, tỷ lệ kiểu hình chuyển hóa nhanh và chậm tương

đương nhau. Ngược lại, ở quần thể người khu vực Bắc Á, tỷ lệ kiểu hình chuyển

hóa nhanh và trung bình chiếm trên 80%, số ít có kiểu hình chuyển hóa chậm [33],

[22] . Một nghiên cứu trên bệnh nhân người Thái Lan kháng thuốc chống lao kèm

tổn thương gan cho thấy 71,7% có kiểu hình chuyển hóa chậm, 22,6% có kiểu

hình chuyển hóa trung bình và 5,7% có kiểu hình chuyển hóa nhanh, trong khi đó,

kiểu hình chuyển hóa NAT2 chậm, trung bình, nhanh ở nhóm chứng kháng thuốc

không tổn thương gan lần lượt là 22,4%; 62,4% và 15,3% [63]. Tương tự như

nghiên cứu của Thái Lan, tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa ở quần thể bệnh nhân lao

người Việt Nam trong nghiên cứu này chủ yếu là kiểu hình chuyển hóa trung bình

46

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

và chậm (>70%), dưới 30% có tỷ lệ kiểu hình chuyển hóa nhanh. Ở nhóm lao mới,

có sự phân bố đồng đều giữa các kiểu hình acetyl hóa NAT2, nhưng ở nhóm lao tái

trị, tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa nhanh thấp hơn hẳn hai nhóm còn lại (16%) và tương

tự như phân bố ở người châu Á nói chung và thấp hơn so với quần thể khu vực

Bắc Á (40%). Đánh giá lâm sàng trên một nghiên cứu tại Ma rốc (2014) trên 163

người dân, Guaoua và cộng sự chỉ ra kiểu phổ biến nhất của gen NAT2 trên quần

thể người Ma rốc là mã hóa kiểu hình acetyl hóa chậm (72,39%) và có nguy cơ

cao khi sử dụng các thuốc điều trị lao [33]. Nền tảng di truyền này cho rằng các

thông tin này nên được đưa vào trong việc xác định liều tối thiểu của INH cần

thiết để điều trị bệnh nhân lao Ma rốc, để giảm tác dụng phụ[33]. Một vài nghiên

cứu khảo sát tính đa dạng của kiểu gen NAT2 giữa các quần thể và dân tộc khác

nhau cho thấy kiểu gen NAT2 đã được thay đổi đáng kể trong quá trình chuyển đổi

từ lối sống thợ săn/du mục sang lối sống nông nghiệp/chăn nuôi, dẫn đến thay đổi

chế độ ăn uống và do đó thay đổi chuyển hóa với các loại xenobiotics khác nhau

[22], [31]. Ví dụ, kiểu hình acetyl hóa chậm thường gặp ở các dân tộc Tajik và tần

suất cao của kiểu hình acetyl hóa nhanh hoặc trung gian được quan sát thấy ở các

quần thể người thợ săn ở Tây Nam Phi ( Kung San, Bakola Pygmy, quần thể

Biaka Pygmy) [37]. Tương tự ở Ấn Độ kiểu hình acetyl hóa chậm (dựa trên kiểu

gen) chiếm tỷ lệ cao hơn acetyl hóa nhanh ở những vùng mà chế độ ăn chay chiếm

ưu thế. [51] Điều này được làm rõ hơn bởi các nghiên cứu trên các cộng đồng

khác nhau cho thấy điểm khác biệt, ví dụ NAT2*7 có SNP G857A (K268R)

thường xảy ra ở Nam Ấn Độ và Hàn Quốc nhiều hơn các quần thể khác trong khi

NAT2*5 chứa SNP T341C (I114T) ít gặp ở Hàn Quốc hơn ở châu Âu, Bắc Mỹ, Ấn

Độ và Châu Phi. [66]

3.2.3. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen NAT2 và tình hình kháng INH

Có thể thấy, ở nhóm lao phổi tái trị, tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa nhanh giảm ở

mức đáng kể so sới nhóm lao phổi mới. Điều này có thể đặt ra giả thuyết liệu kiểu

hình acetyl hóa nhanh có phải là một trong những yếu tố gia tăng sự thành công

trong điều trị lao? Xét tỷ lệ phân bố kiểu hình acetyl hóa của quần thể bệnh nhân lao

47

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

trên hai nhóm kháng và nhạy INH trong nghiên cứu chúng tôi cũng không thấy có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9.

Bảng 3.9: Mối liên quan kiểu hình chuyển hóa với tính kháng INH

ở nhóm lao mới và lao tái trị

Kiểu hình Thể lao

acetyl hóa Lao mới Lao tái trị

của NAT2 (n=69) (n=56)

Nhạy INH Kháng INH Nhạy INH Kháng INH

23 (39,7%) 2 (18,2%) 5 (15,6%) 4 (16,7%) Nhanh

16 (27,6%) 7 (63,6%) 15 (46,9%) 10 (41,7%) Trung bình

19 (32,8%) 2 (18,2%) 12 (37,5%) 10 (41,7%) Chậm

Xác suất χ2=5,427; p=0,089 χ2=0,153; p=0,936

Ở nhóm vi khuẩn kháng Isoniazid, kiểu hình acetyl hoá trung bình chiếm cao

nhất (48,6%) và thấp nhất là nhóm kiểu hình acetyl hóa nhanh (17,1%). Kiểu hình

acetyl hóa ở nhóm vi kháng nhạy Isoniazid có sự phân bố đồng đều giữa ba kiểu

hình. Trong khi đó ở nhóm vi khuẩn kháng Isoniazid sự phân này tập trung cao nhất

ở nhóm có kiểu hình acetyl hoá trung bình (48,6%) và thấp nhất ở nhóm có kiểu

hình acetyl hóa chậm. Trong nhóm lao mới, kiểu hình acetyl hóa nhanh có tỷ lệ

nhạy INH (39,7%) cao hơn nhiều so với nhóm kháng INH (18,2%); kiểu hình acetyl

hóa trung bình có tỷ lệ kháng INH (63,6%) cao hơn so với nhóm nhạy INH

(27,6%). Trong nhóm lao mới gần như không có sự khác biệt đáng kể giữa các kiểu

hình acetyl hóa về tỷ lệ kháng/nhạy INH. Như vậy có thể nói tính kháng INH không

có mối liên quan rõ ràng với tần số phân bố kiểu hình acety hóa nhưng có xu hướng

gia tăng tính kháng INH trong nhóm kiểu hình acetyl hóa trung bình và giảm tính

kháng trong nhóm kiểu hình acetyl hóa nhanh với những bệnh nhân mới mắc lao

phổi. Nghiên cứu trên 144 bệnh nhân lao của Sotsuka và cộng sự (2011) cho thấy

kiểu hình chuyển hóa có liên quan tới nồng độ thuốc INH trong huyết thanh bệnh

nhân. Trong nghiên cứu của Sotsuka (2011), nồng độ INH trung bình sau 2 giờ

48

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

uống thuốc cao nhất trong nhóm bệnh nhân kiểu hình acetyl hoá chậm; nồng độ

INH trong nhóm bệnh nhân chuyển hóa nhanh và trung bình thấp hơn 50% và 32%

so với nhóm bệnh nhân chuyển hóa chậm. Tỷ lệ AcINH/INH (chỉ thị của công suất

acetyl hóa) là 2,21 ± 0,95 ở nhóm acetyl hóa nhanh và cao nhất trong ba nhóm. Tỷ

lệ nhiễm độc gan cao nhất ở bệnh nhân với kiểu hình acetyl hóa chậm và thấp nhất

ở những người có kiểu hình acetyl hoá nhanh [65]. Nghiên cứu ở 129 bệnh nhân lao

tại Nhật Bản (2008) cho thấy kiểu hình acetyl hóa nhanh chiếm 46,5%, acetyl hóa

chậm là 9,3%, acetyl hóa trung gian 44,2%. Đồng thời nghiên cứu này còn cho thấy

có sự khác biệt rõ rệt về nồng độ INH tại thời điểm 2 giờ giữa các nhóm bệnh nhân

có kiểu hình acetyl hóa nhanh, acetyl hóa chậm và trung bình [42]. Các nghiên cứu

khác cũng cho thấy có mối liên quan tương tự. Kết quả của tôi nằm trong dữ liệu

tổng thể của một đề tài cấp nhà nước, chúng tôi có đánh giá mối tương quan giữa

nồng độ thuốc với kiểu hình chuyển hóa INH của NAT2. Tuy nhiên, trong khuôn

khổ luận văn này này tôi chỉ dừng lại báo cáo ở bước đầu khảo sát mối tương quan

giữa kiểu hình acetyl hóa NAT2 với dữ liệu nhạy và kháng Isoniazid của vi khuẩn

lao và hiện chưa thấy mối liên hệ rõ rệt (p=0,089).

Tóm lại, kết quả của luận văn này đã đánh giá được về tính kháng thuốc

chống lao hàng một của vi khuẩn lao phân lập và nuôi cấy từ mẫu đờm của bệnh

nhân được chẩn đoán lao phổi. Đồng thời, luận văn cũng đánh giá được tần số phân

bố kiểu gen NAT2 trên quần thể bệnh nhân lao mới và lao tái trị. Bên cạnh đó, luận

văn cũng xác định mối tương quan với tỷ lệ kháng INH của vi khuẩn lao.

49

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đi đến

các kết luận sau:

1. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao với các thuốc chống lao hàng một trên

bệnh nhân lao phổi:

+ Tỷ lệ kháng thuốc chung đối với các thuốc chống lao hàng một là tương

đối cao 39,2%. Tỷ lệ kháng Streptomycin và Isoniazid chiếm tỷ lệ cao đặc biệt ở

nhóm lao phổi tái trị. Lao đa kháng xuất hiện ở bệnh nhân lao phổi mới và lao phổi

tái trị.

+ Xuất hiện chủng vi khuẩn kháng toàn bộ thuốc chống lao hàng một với tỷ

lệ 2,4%.

2. Đa hình di truyền gen NAT2 và mối liên quan tới tính kháng Isoniazid của vi

khuẩn lao trên bệnh nhân lao phổi

2.1. Đa hình di truyền gen NAT2: có sự đa hình di truyền gen NAT2 trong

quần thể nghiên cứu

+ Có sự khác biệt về tần số các alen trong giữa các nhóm bệnh nhân lao phổi

tái trị và lao phổi mới, trong đó tần số alen (NAT*5, *6, *7) ở nhóm lao phổi tái trị

cao hơn so với nhóm lao phổi mới.

2.2. Mối liên quan tới tính kháng Isoniazid

+ Ở bệnh nhân lao phổi mắc vi khuẩn lao nhạy INH có sự phân bố đồng đều

giữa ba loại kiểu hình acetyl hoá. Ở nhóm bệnh nhân lao phổi mắc vi khuẩn lao

kháng Isoniazid, kiểu hình acetyl hoá trung bình chiếm cao nhất (48,6%) và thấp

nhất là nhóm kiểu hình acetyl hóa nhanh (17,1%).

+ Không có mối liên quan rõ ràng giữa tần số tính kháng INH và tần số phân

bố kiểu hình acetyl hóa. Kiểu hình acetyl hóa không phải là yếu tố nguy cơ cho việc

mắc lao bởi các vi khuẩn kháng INH.

50

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

KIẾN NGHỊ

1. Vi khuẩn lao phân lập ở những bệnh nhân có tiền sử điều trị thuốc chống lao có

tính kháng thuốc cao vì vậy việc xác định tính kháng thuốc cho những bệnh nhân

lao tái trị là rất cần thiết.

2. Những kết quả nghiên cứu về gen NAT2 của chúng tôi là một bước đệm quan

trong để tiến hành đánh giá dược động học Isoniazid ở bệnh nhân lao nhằm đưa ra

phác đồ điều trị hợp lý cho từng cá nhân, giảm tải tất cả các vấn đề trong điều trị lao

để hướng tới mục tiêu thanh toán bệnh lao vào sau năm 2030.

51

Khoá 2016-2018

Khoa Sinh học

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Văn Chính (2016), Thực trạng phát hiện - chẩn đoán - điều trị và

quản lý bệnh nhân lao đa kháng thuốc thuộc chương trình chống lao Hà Nội

giai đoạn 2011-2014, Luận văn Thạc sỹ, Đại học Y tế Công Cộng, Hà Nội.

2. Viện dinh dưỡng (2006), Kết quả điều tra thừa cân - béo phì và một số yếu

tố liên quan ở người Việt Nam 25-64 tuổi, truy cập ngày 27/5-2017, tại trang

web http://viendinhduong.vn/vi/dinh-duong-nguoi-lon/ket-qua-dieu-tra-thua-

can---beo-phi-va-mot-so-yeu-to-lien-quan-o-nguoi-viet-nam-25--64-

tuoi.html.

3. Bộ Y tế - Chương trình Chống lao Quốc gia (2007), Kết quả nghiên cứu tỷ lệ

nhiễm lao và mắc lao ở Việt Nam, Đinh Ngọc Sỹ, chủ biên.

4. Hoàng Hà (2009), Nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, sinh

học của vi khuẩn ở bệnh nhân lao phổi điều trị lại, Luận án Tiến sỹ Y học,

Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.

5. Nguyễn Thu Hà (2012), Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng, đột biến gen

rpoB, katG và inhA của vi khuẩn trong lao phổi tái phát, Luận án Tiến sỹ Y

học, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.

6. Nguyễn Thu Hà, Trần Văn Sáng và Đinh Ngọc Sỹ (2011), "Lâm sàng, cận

lâm sàng và tính kháng thuốc của vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao phổi tái

phát", JFran Viet Pneu. 2(3), tr. 63-67.

7. Lê Thị Kim Hoa (2009), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của

lao phổi có vi khuẩn kháng đa thuốc, Luận văn chuyên khoa II, Đại học Y

Hà Nội, Hà Nội.

8. Lê Ngọc Hưng (2008), "Nghiên cứu kháng thuốc của lao phổi tái phát", Tạp

chí Dược học. 1, tr. 18-20.

9. Chu Thị Mão và Hoàng Hà (2007), "Đặc điểm lâm sàng, Xquang và tính chất

vi khuẩn kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi mới AFB(+) tại Thái Nguyên",

Tạp chí Thông tin Y Dược, tr. 153-158.

10. Nguyễn Viết Nhung (2016), Cẩm nang hướng dẫn sử dụng thuốc điều trị

lao, Nhà xuất bản Thanh Niên, Hà Nội.

11. Trường Đại học Y Hà Nội-Bộ môn Lao và Bệnh phổi (2014), Bệnh học Lao,

Trần Văn Sáng và Lê Ngọc Hưng, ed, Nhà Xuất bản Y học Hà Nội,.

12. Nguyễn Tuyết Phong (2008), Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và tình hình

chẩn đoán lao phổi tại bệnh viện lao phổi Hà Giang, Luận văn Thạc sỹ, Học

viện Quân Y, Hà Nội.

13. Hoàng Thị Phượng (2009), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng,

tính kháng thuốc của vi khuẩn ở bệnh nhân lao phổi mới kết hợp bệnh đái

tháo đường, Luận văn Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.

14. Đinh Ngọc Sỹ (2011), "Chiến lược quản lý bệnh lao đa kháng thuốc tại Việt

Nam", Tạp chí khoa học Hội Phổi Pháp - Việt. 2(3), tr. 40-42.

15. Bộ Y tế (2009), Vi khuẩn Y học, Lê Văn Phủng, ed, Nhà xuất bản Giáo dục

Việt Nam Hà Nội.

16. Bộ Y tế (2014), Báo cáo tổng kết hoạt động chương trình chống lao 2013 và

phương hướng hoạt động năm 2014, Chương trình chống lao Quốc Gia, chủ

biên.

17. Bộ Y tế (2015), Hướng dẫn chuẩn đoán, điều trị và dự phòng bệnh lao, Cục

Quản lý Khám chữa bệnh, chủ biên, Hà Nội.

18. Bộ Y tế (2018), Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị và dự phòng bệnh lao, Cục

Quản lý Khám chữa bệnh, chủ biên, Hà Nội.

19. Nguyễn Thị Thu Thái (2017), Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpoB, katG

của vi khuẩn lao kháng đa thuốc, Luận án Tiến Sỹ Y học, Học viện Quân Y.

20. Mai Văn Tuấn (2016), Sự đột biến kháng Rifampicin và Isoniazid của

Mycobacterium Tuberculosis phân lập tại bệnh viện Trung ương Huế, Luận

án Tiến sỹ Y học, Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh.

TIẾNG ANH

21. Kruuner A và các cộng sự. (2002), "Use of molecular techniques to

distinguish between treatment failure and exogenous reinfection with

Mycobacterium tuberculosis", Clin Infect Dis. 35(2), tr. 146-55.

22. Toure A và các cộng sự. (2016), "Prevention of isoniazid toxicity by NAT2

genotyping in Senegalese tuberculosis patients", Toxicology reports. 3(826-

831).

23. Tverdal A (1986), "Body mass index and incidence of tuberculosis", Eur J

Respir Dis. 69(5), tr. 355-62.

24. David B và các cộng sự. (2016), "Serial image analysis of Mycobacterium

tuberculosis colony growth reveals a persistent subpopulation in sputum

during treatment of pulmonary TB", Tuberculosis (Edinb). 98, tr. 110-115.

25. Chen C và các cộng sự. (2001), "N-Acetyltransferase 2 polymorphisms,

cigarette smoking and alcohol consumption, and oral squamous cell cancer

risk", Carcinogenesi. 22(12), tr. 1993-1999.

26. Horton K. C và các cộng sự. (2016), "Sex Differences in Tuberculosis

Burden and Notifications in Low- and Middle-Income Countries: A

Systematic Review and Meta-analysis", PLoS Med. 13(9), tr. e1002119.

27. Pheiffer C và các cộng sự. (2008), "Time to detection of Mycobacterium

tuberculosis in BACTEC systems as a viable alternative to colony counting",

Int J Tuberc Lung Dis. 12(7), tr. 792-8.

28. Tu D, Zhang L và Su J (2000), "Resistance and efficacy of treatment in

relapse pulmonary tuberculosis", Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 23(11),

tr. 666-8.

29. Hein DW và các cộng sự. (2000), "Molecular genetics and epidemiology of

the NAT1 and NAT2 acetylation polymorphisms", Cancer Epidemiol

Biomarkers Prev. 9(1), tr. 29-42.

30. Podgorna E và các cộng sự. (2015), "Variation in NAT2 acetylation

phenotypes is associated with differences in food-producing subsistence

modes and ecoregions in Africa", BMC Evolutionary Biology. 15, tr. 263.

31. Luca F và các cộng sự. (2008), "Multiple advantageous amino acid variants

in the NAT2 gene in human populations", PLoS One. 3(9), tr. 3136.

32. Windmill K. F và các cộng sự. (2000), "Localization of N-acetyltransferases

NAT1 and NAT2 in human tissues", Toxicol Sci. 54(1), tr. 19-29.

33. Soukaina G và các cộng sự. (2014), "Distribution of allelic and genotypic

frequencies of NAT2 and CYP2E1 variants in Moroccan population", BMC

Genet. 15, tr. 156.

34. Gupta V. H và các cộng sự. (2013), "Association of GST null genotypes with

anti-tuberculosis drug induced hepatotoxicity in Western Indian population",

Ann Hepatol. 12(6), tr. 959-65.

35. Pham Thu Hang và các cộng sự. (2011), Pyrazinamide resistance of

Mycobacterium tuberculosis in Viet Nam in 2011, National Lung Hospital,

Viet Nam.

36. Cho HJ và các cộng sự. (2007), "Genetic polymorphisms of NAT2 and

CYP2E1 associated with anti tuberculosis drug-induced hepatotoxicity in

Korean patients with pulmonary tuberculosis", Tuberculosis (Edinb) 87(6),

tr. 551-556.

37. Mortensen HM và các cộng sự. (2011), "Characterization of genetic variation

and natural selection at the arylamine N-acetyltransferase genes in global

human populations", Pharmacogenomics. 12(11), tr. 1545-1558.

38. K G P Hoek và các cộng sự. (2009), "Resistance to pyrazinamide and

ethambutol compromises MDR/XDR-TB treatment", South African Medical

Journal. 99(11).

39. Kim S. J và các cộng sự. (2018), "Association of body mass index with

incident tuberculosis in Korea", PLoS One. 13(4), tr. e0195104.

40. Klein D. J và các cộng sự. (2016), "PharmGKB summary: isoniazid pathway,

pharmacokinetics", Pharmacogenet Genomics. 26(9), tr. 436-44.

41. Cegielski JP, Arab L và Cornoni-Huntley J (2012), "Nutritional risk factors

for tuberculosis among adults in the United States, 1971-1992", Am J

Epidemiol. 176(5), tr. 409-22.

42. Fukino K và các cộng sự. (2008), "Effects of N-acetyltransferase 2 (NAT2),

CYP2E1 and Glutathione-S-transferase (GST) genotypes on the serum

concentrations of isoniazid and metabolites in tuberculosis Patients", The

Journal of Toxicological Sciences. 33(22), tr. 187-195.

43. Van Doorn Hr D.H.P. Kremer K, Vandenbroucke-Grauls Cm, Borgdorff

Mw, Van Soolingen D (2006), "Public health impact of Isoniazid-resistant

Mycobacterium tuberculosis strains with mutation at amino-acid position

315 of katG:a decade of experience in The Netherlands", Clin Microbiol

Infect. 12, tr. 769-775.

44. Stanley L (2008), "Update on the pharmacogenetics of NATs: structural

considerations", Pharmacogenomics. 9(11), tr. 1673-1693.

45. Teixeira R. L và các cộng sự. (2011), "Genetic polymorphisms of NAT2,

CYP2E1 and GST enzymes and the occurrence of antituberculosis drug-

induced hepatitis in Brazilian TB patients", Mem Inst Oswaldo Cruz. 106(6),

tr. 716-24.

46. Dinh Doan Long và các cộng sự. (2011), "Variability in the frequency of

Single nucleotide polymorphisms of N-acetyl transferase (NAT2) gene in

Vietnamese", VNU Journal of Science. 27, tr. 245-250.

47. Majumder M và các cộng sự. (2007), "Polymorphisms at XPD and XRCC1

DNA repair loci and increased risk of oral leukoplakia and cancer among

NAT2 slow acetylators", International Journal of Cancer. 120(10), tr. 2148-

2156.

48. Moller M và Hoal E. G (2010), "Current findings, challenges and novel

approaches in human genetic susceptibility to tuberculosis", Tuberculosis

(Edinb). 90(2), tr. 71-83.

49. Mphahlele M và các cộng sự. (2008), "Pyrazinamide resistance among South

African multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis isolates", J Clin

Microbiol. 46(10), tr. 3459-3464.

50. Ohno M và các cộng sự. (2000), "Slow N-acetyltransferase 2 genotype

affects the incidence of isoniazid and rifampicin induced hepatotoxicity", Int

J Tuberc Lung Dis. 4(3), tr. 256-261.

51. Khan N, Pande V và Das A (2013), "NAT2 sequence polymorphisms and

acetylation profiles in Indians ", Pharmacogenomics. 14(3), tr. 289-303.

52. N.V.Nhung và các cộng sự. (2015), "The fouth national anti-tuberculosis

drug resistance survey in Viet Nam", Int.J.Tubere.Lung Dis. 19(6), tr. 670-

675.

53. World Health Organization (2004), Anti-tuberculosis drug resistance in the

world 1999-2002, The WHO/IUATLD Global Project on Anti-tuberculosis -

Drug Resistance Surveillance, chủ biên, Third Global Report, Geneva.

54. Wang P và các cộng sự. (2016), "Isoniazid metabolism and hepatotoxicity",

Acta Pharm Sin B. 6(5), tr. 384-392.

55. American Society of Health - System Pharmacists (2018), AHFS Drug

information 2018, AHFS.

56. Ensembl Project (1999), truy cập ngày-2018, tại trang web

http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Population?db=core;r=8:18

399844-18400844;v=rs1801280;vdb=variation;vf=1243314.

57. Wang Py và các cộng sự. (2012), "NAT2 polymorphisms and susceptibility

to anti-tuberculosis drug-induced liver injury: meta-analysis", Int J Tuberc

Lung Dis. 16(5), tr. 589-595.

58. Johnson R và các cộng sự. (2006), "Ethambutol resistance testing by

mutation detection", Int J Tuberc Lung Dis 10(1), tr. 68-73.

59. Mitchell J. R và các cộng sự. (1976), "Isoniazid liver injury: clinical

spectrum, pathology, and probable pathogenesis", Ann Intern Med. 84(2), tr.

181-92.

60. Agarwal S, Edward J B và Daniel C (2010), "M.Tuberculosis on Lowenstein

Jensen", Biology Image Library.

61. Huang Y. S và các cộng sự. (2003), "Cytochrome P450 2E1 genotype and

the susceptibility to antituberculosis drug-induced hepatitis", Hepatology.

37(4), tr. 924-30.

62. Morita S và các cộng sự. (1999), "Genetic polymorphisms of drug-

metabolizing enzymes and susceptibility to head-and-neck squamous-cell

carcinoma", Int J Cancer. 80(5), tr. 685-688.

63. Wattanapokayakit S và các cộng sự. (2016), "NAT2 slow acetylator

associated with anti-tuberculosis drug induced liver injury in Thai patients",

Int J Tuberc Lung Dis. 20(10), tr. 1364-1369.

64. Jagielski T và các cộng sự. (2016), "Methodological and Clinical Aspects of

the Molecular Epidemiology of Mycobacterium tuberculosis and Other

Mycobacteria", Clin Microbiol Rev. 29(2), tr. 239-90.

65. Sotsuka T và các cộng sự. (2011), "Association of isoniazid-metabolizing

enzyme genotypes and isoniazid-induced hepatotoxicity in tuberculosis

patients", In Vivo. 25(5), tr. 803-812.

66. Hein D. W (2006), "N-acetyltransferase 2 genetic polymorphism: effects of

carcinogen and haplotype on urinary bladder cancer risk", Oncogene. 25(11),

tr. 1649-1658.

67. WHO (2018), Global Tuberculossi report.

DANH SÁCH BỆNH NHÂN THAM GIA NGHIÊN CỨU Thời gian từ 3/2017 - 6/2018

STT Mã nghiên cứu Tuổi Giới tính Bệnh viện

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 HM01 HM02 HM03 HM04 HM05 HM06 HM07 HM09 HM11 HM13 HM14 HM16 HM17 HM18 HM19 HM21 HM22 HM23 HM24 HM26 HM27 HM28 HM29 HM30 HM31 HM32 HM33 HM34 HM35 HM36 HM39 HM40 HT01 HT02 HT03 HT04 HT05 HT06 HT07 HT08 HT09 22 23 48 49 41 60 59 21 58 58 33 60 25 22 34 28 16 24 41 36 62 46 69 71 32 64 26 28 49 63 53 40 61 51 70 53 35 60 30 45 57 Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội

45 45 54 53 40 45 31 48 40 52 48 55 43 46 56 58 43 40 42 49 28 63 60 49 57 32 55 58 57 54 33 30 47 33 45 29 64 28 39 22 24 24 46 20 45 39 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 HT10 HT11 HT12 HT13 HT14 HT15 HT16 HT17 HT19 HT20 HT21 HT22 HT24 HT25 HT26 HT27 HT28 HT29 HT30 HT31 HT32 HT33 HT34 HT35 HT36 KM01 KM02 KM03 KM05 KM06 KM08 KM09 KM10 KM11 KM12 KM13 KM14 KM15 KM16 KM17 KM18 KM19 KM22 KM23 KM24 KM25 Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện Phổi Hà Nội Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương

88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 KM26 KM27 KM29 KM30 KM31 KM32 KM34 KT01 KT02 KT03 KT06 KT07 KT08 KT09 KT10 KT11 KT12 KT13 KT14 KT15 KT16 KT18 KT20 WM01 WM02 WM03 WM04 WM05 WM06 WM07 WM08 WM09 WM10 WT01 WT02 WT03 WT04 WT05 44 48 24 42 35 21 46 46 82 46 46 71 39 24 80 41 70 61 44 47 45 56 57 59 16 38 55 40 36 38 36 26 69 23 35 27 76 43 Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nữ Nam Nam Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện 74 Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện Phổi Trung ương