Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ kỹ thuật hóa học: Xây dựng phương pháp định lượng tannins tổng trong thực vật bằng kỹ thuật đo quang

ƯƠ NG

ƯỜ Ệ Ộ B CÔNG TH Ạ Ọ TR Ộ NG Đ I H C CÔNG NGHI P HÀ N I

Ậ Ố Ệ Ỹ Ậ Ệ

Ạ Ọ KHÓA LU N T T NGHI P Đ I H C CÔNG NGH K THU T HÓA H CỌ

Ị ƯỢ Ổ Ự XÂY D NG PH

ƯƠ Ự NG PHÁP Đ NH L Ằ Ậ NG TANNINS T NG TRONG Ậ Ỹ TH C V T B NG K THU T ĐO QUANG

Ạ ẫ ộ ướ Ễ Ế ng d n : PGS. TS. NGUY N TI N Đ T

Ầ

Ạ ự Ị

Ọ ớ Cán b h Ả TS. TR N QUANG H I ệ Sinh viên th c hi n : PH M TH HOA Mã sinh viên : 1141120183 L p : ĐH CN HÓA H C 3 K11

ộ Hà N i 2020

Ờ Ả Ơ L I C M N

ướ ử ờ ả ơ ự Tr c tiên, em xin g i l ắ ố i c m n chân thành và s tri ân sâu s c đ i

ầ ả ườ ả gi ng viên khoa Hóa Tr ạ ọ ng Đ i h c Công v i ớ TS. Tr n Quang H i

ệ ậ ộ ỡ Nghi p Hà N i đã giúp đ em trong quá trình làm khóa lu n.

ễ ế ắ Em xin g i l ử ờ ả ơ sâu s c đ n i c m n ạ ế PGS. TS. Nguy n Ti n Đ t

ứ ể ệ ệ ọ Trung tâm Nghiên c u và Chuy n giao công ngh , Vi n Hàn Lâm Khoa h c

ệ ệ ế ướ ỉ ả ề ẫ ạ và Công ngh Vi t Nam đã h t lòng h ế ng d n, ch b o, truy n đ t ki n

ứ ệ th c kinh nghi m quý báu cho em .

ả ơ ấ ả ạ ủ ộ ỡ C m n gia đình, t t c b n bè đã luôn ng h , giúp đ và là ch ỗ

ữ ầ ồ ộ ự d a tinh th n, ngu n đ ng viên cho em trong nh ng lúc khó khăn.

ặ ượ ự ỡ ậ Trong quá trình làm báo cáo này m c dù đã đ c s giúp đ t n tình

ế ứ ố ắ ứ ư ạ ờ ộ và h t s c c g ng nh ng do trình đ và th i gian nghiên c u còn h n ch ế

ể ượ ữ ế nên không th tránh đ ậ ậ c nh ng thi u sót. Vì v y, em kính mong nh n

ượ ỉ ả ủ ế ầ đ c ý ki n đóng góp ch b o c a các quý th y cô.

ả ơ Em xin chân thành c m n!

ộ Hà N i, ngày 28 tháng 5 năm 2020

Sinh viên

ạ ị Ph m Th Hoa

Ụ

M C L C

ớ ạ ệ i h n phát hi n (Limit of detection) LOD: Gi

ớ ạ ị ượ i h n đ nh l ng (Limit of quantitation) LOQ: Gi

ệ ắ ỏ HPLC: S c ký l ng hi u năng cao (High performance liquid

chromatography)

ạ ử UV: T ngo i

ả ế VIS: Kh ki n

ACN: Acetonitril

TFA: Trifluoroacetic

ứ ệ ộ ọ AOAC: Hi p h i các nhà hóa h c phân tích chính th c (Association of

Official Analytical Chemists).

MeOH: Methanol

Ụ

Ả

DANH M C HÌNH NH

Ụ

Ả

Ể

DANH M C B NG BI U

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

M Đ UỞ Ầ

ệ ộ ướ ự ả ậ ạ Vi t Nam là m t n ớ c có th m th c v t đa d ng và phong phú v i

ự ậ ề ượ ử ụ ị ệ ề nhi u loài th c v t, đ c s d ng trong phòng và đi u tr b nh, cũng nh ư

ứ ỏ ườ ề ổ ưỡ b d ng nâng cao s c kh e cho con ng i. Có nhi u loài th c v t đ ự ậ ượ c

ạ ượ ư ộ ượ ổ ế ọ ví nh là m t lo i d ệ c li u đ c dùng ph bi n trong y h c dân gian làm

ự ậ ứ ề ấ ố thu c. Các nghiên c u cho th y, tanin có trong nhi u loài th c v t nh : ư ổ i,

ư ụ ạ ạ ọ ề chè xanh, măng c t... Tanin có nhi u ho t tính sinh h c nh : ho t tính

ẩ ấ ố ố kháng khu n, kháng n m, ch ng kh i u, kháng virut... nên nó đ ượ ứ c ng

ệ ạ ộ ọ ụ d ng khá r ng rãi trong y h c hi n đ i ngày nay.

ể ị ượ ủ ề ấ Ngày nay, đ xác đ nh hàm l ự ng c a các ch t trong nhi u loài th c

ư ề ệ ậ ạ ớ ổ ỹ ậ v t, nhi u k thu t phân tích m i và hi n đ i nh quang ph UV Vis,

ổ ạ ượ ụ HPLC, quang ph đ o hàm… đã đ ệ c áp d ng vào vi c phân tích. Trong

ổ ươ ượ ử ụ ộ đó, quang ph UV Vis là ph ng pháp đ c s d ng r ng rãi vì nó có đ ộ

ệ ậ ạ nh y cao, phân tích thu n ti n.

ệ ệ ể ậ ớ ớ ạ Song song v i vi c tìm ra các kĩ thu t m i thì vi c ki m tra l i giá tr ị

ươ ụ ả ớ ộ ộ ủ c a ph ậ ả ng pháp phân tích v i m c đích đ m b o đ chính xác, đ tin c y

ứ ụ ủ ươ ủ ố ệ c a s li u phân tích và tăng tính ng d ng c a ph ự ng pháp đó trong th c

ề ễ ấ ậ ọ ọ ươ ti n cũng r t quan tr ng. Vì v y, tôi ch n đ tài ự “Xây d ng ph ng pháp

ượ ổ ậ ỹ . ị đ nh l ự ậ ằ ng tannins t ng trong th c v t b ng k thu t đo quang’’

ủ ề ự ụ ươ ị ượ M c tiêu c a đ tài: Xây d ng ph ng pháp và đ nh l ổ ng tanin t ng

ế ừ ự ậ ằ ươ ộ ố ẫ trong m t s m u cao chi th c v t b ng ph t t ổ ng pháp đo quang ph .

ứ ộ N i dung nghiên c u:

Xây d ng ph

ự ươ ị ượ ự ổ ng pháp đ nh l ậ ằ ng tanin t ng trong th c v t b ng

ươ ổ ị ớ ạ ph ng pháp đo quang ph . Xác đ nh gi ệ i h n phát hi n (LOD) và

7 MSV:

ớ ạ ị ượ ủ ươ gi i h n đ nh l ng (LOQ) c a ph ng pháp.

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

Áp d ng ph

ụ ươ ượ ể ị ự ượ ng pháp đã đ c xây d ng đ đ nh l ổ ng tanin t ng

8 MSV:

ế ộ ố ẫ trong m t s m u cao chi t trà hoa vàng.

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ƯƠ

Ổ

CH

NG 1: T NG QUAN

Ổ

Ề

1.1 T NG QUAN V TANIN

ệ ấ 1.1.1 Khái ni m, tính ch t [1]

* Khái ni m:ệ

ượ ữ ấ ợ ị Tanin đ ự c đ nh nghĩa là ‘‘nh ng h p ch t polyphenol có trong th c

ượ ệ ươ ệ ớ ộ ị ậ v t, có v chát đ c phát hi n d ng tính v i thí nghi m thu c da’’ và

ượ ị ượ ứ ộ ấ ụ ự ẩ ộ ố đ c đ nh l ng d a vào m c đ h p ph trên b t da s ng chu n. C ch ơ ế

ộ ượ ả ề ề ạ thu c da đ c gi i thích do tanin có nhi u nhóm OH phenol, t o nhi u dây

ủ ế ạ ớ ử ố n i hydro v i các m ch polypeptid c a protein. N u phân t ớ tanin càng l n

ự ế ợ ố ượ ặ ớ ử ừ thì s k t h p v i protein càng ch t. Kh i l ng phân t ộ dao đ ng t 5000

20000 đvc.

ữ ế ớ Hình 1.: Liên k t hidro gi a tanin v i protein

* Tính ch t:ấ

ườ ấ ấ ữ ễ Tanin th ự ng là nh ng ch t r t phân c c, d tan trong dung môi phân

ư ồ ự c c nh c n, aceton, methanol, propylene glycon, glycerin etylacetat …

ự ư ầ ỏ không tan trong các dung môi kém phân c c nh : hexan, benzen, d u h a …

1.1.2 Phân lo i ạ

ự ấ ạ ọ ể D a vào c u trúc hóa h c có th chia tanin làm 2 lo i chính: tanin

9 MSV:

ủ ư ụ th y phân và tanin ng ng t .

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

ủ Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ 1.1.2.1 Tanin th y phân [1]

ượ ượ ạ ọ ủ Tanin th y phân đ c còn đ c g i là tanin pyrogallic. Lo i này có

ủ ữ ể ặ ặ ằ ằ nh ng đ c đi m sau: Khi th y phân b ng axit ho c b ng enzym tanase thì

ả ầ ườ ườ ầ ườ ườ gi i phóng ra ph n đ ầ ng và ph n không đ ng. Ph n đ ng th ng là

ặ ườ ệ ụ ườ ầ glucose, đôi khi g p đ ặ ng đ c bi t ví d đ ng hamamelose. Ph n không

ả ườ ặ ph i đ ố ớ ng là các axit. Axit hay g p là axit gallic. Các axit gallic n i v i

ể ạ ố ầ nhau theo dây n i depsid đ t o thành axit mdigallic, mtrigallic v.v... Ph n

ườ ả ườ ầ ố ớ ố đ ng và ph n không ph i đ ng n i v i nhau theo dây n i este (không

ả ố ườ ữ ạ ph i dây n i acetal) nên ng i ta coi tanin lo i này là nh ng pseudo

glycosid.

10 MSV:

Axit gallic Axit m digallic

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

Axit m trigallic

ấ ạ ủ Hình 1.: C u t o c a axit gallic, axit m digallic và axit m trigallic

ấ ặ ủ ư ạ Tính ch t đ c tr ng c a tanin lo i này là:

ở ẽ ượ ủ ế ấ + Khi c t khô 180 200°C s thu đ c pyrogallol là ch y u.

ẽ ặ ớ + Khi đun nóng v i HCl s cho axit gallic ho c axit ellargic.

ế ủ ớ + Cho k t t a bông v i chì axetat 10 %.

ố ắ ế ủ ớ + Cho k t t a màu xanh đen v i mu i s t (III).

ườ ễ ướ + Th ng d tan trong n c.

ụ ề ấ ủ ượ ủ * Ví d v c u trúc c a các tanin th y phân, đ ậ c phân l p trong

ự ậ th c v t:

ứ ự ộ ậ Năm 2005, Masturah Markom và các c ng s đã nghiên c u phân l p

ượ ạ ủ ủ đ c 3 lo i c a tanin th y phân: axit gallic, axit ellagic, corilagin trong cây

ệ ạ Di p H Châu ( Phyllanthus urinaria) [17].

11 MSV:

axit ellagic

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

corilagin

ấ ạ ủ

Hình 1.: C u t o c a axit ellagic và corilagin ư ụ 1.1.2.2 Tanin ng ng t [1]

ư ụ ượ ọ ỷ Tanin ng ng t hay còn đ c g i là tanin không thu phân đ ượ c,

ấ ộ ữ tanin pyrocatechic hay phlobatanin. Các ch t thu c nhóm này là nh ng

ườ ượ ạ ự ư ơ ị polyflavonoid th ng đ c t o thành do s ng ng t ụ ừ t các đ n v flavan

ặ 3ol ho c flavan3,4 diol.

ữ ể ặ Tanin nhóm này có nh ng đ c đi m sau:

ấ ỏ ễ ạ ướ ủ ụ ặ D i tác d ng c a axit ho c enzym d t o thành ch t đ tanin hay

ấ ướ ủ ự ẩ ả phlobaphen. Phlobaphen r t ít tan trong n ệ c là s n ph m c a s trùng hi p

ượ ọ hoá kèm theo oxy hoá, do đó tanin nhóm này còn đ c g i là phlobatanin.

ộ ố ượ ủ ư ặ ư ỏ ệ ỏ Phlobaphen là đ c tr ng c a m t s d ế c li u nh v Canh ki na, v Qu .

ấ ượ Khi c t khô thu đ c pyrocatechin là chính.

ố ắ ế ủ ậ ớ Cho k t t a màu xanh lá đ m v i mu i s t (III).

ế ủ ớ ướ Cho k t t a bông v i n c brom.

12 MSV:

ướ ơ Khó tan trong n c h n tanin pyrogallic.

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ư ụ ặ Tanin ng ng t hay g p trong các chi Acacia, Camellia, Cinchona,

Cinnamomum, Rheum, Salix ...

flavan 3 ol flavan 3,4 diol

ấ ạ ủ Hình 1.: C u t o c a các flavanol

ụ ề ấ ư ủ ậ * Ví d v c u trúc c a các tanin ng ng t ụ ượ , đ ự c phân l p trong th c

v t:ậ

ự ứ ậ ộ Năm 2000, Kang. J. H và các c ng s đã nghiên c u phân l p EGCG

ầ ạ (epigallocatechin gallate) có trong trà xanh (Camellia sinensis), ban đ u lo i

ộ ắ ử ụ ằ ấ ỏ ỏ b caffein b ng chloroform. Sau đó s d ng hai c t s c ký l ng áp su t cao

ị ử ả ằ ệ ẩ (HPLC) chu n b r a gi i b ng h dung môi (axit axetic: acetonitril: n ướ c)

13 MSV:

ượ ế ơ ể đ thu đ ớ ộ c EGCG v i đ tinh khi t h n 98%. [24]

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ấ ạ ủ Hình 1.: C u t o c a epigallocatechin gallate

ậ ượ ự ứ ộ Năm 2001, Xueli Cao và các c ng s đã nghiên c u phân l p đ c hai

ấ ừ ch t: GCG (Gallocatechin gallate), ECG (Epicatechin gallate) t trà xanh

ử ụ ằ ắ ố ượ ớ (Camellia sinensis) b ng cách s d ng s c ký phân b ng c dòng v i hai

ợ ướ ỗ h n h p dung môi (ethyl acetate: ethanol: n c; hexane: ethyl acetate:

14 MSV:

ướ n c). [25]

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ấ ạ ủ Hình 1.: C u t o c a epicatechin gallate

ấ ạ ủ Hình 1.: C u t o c a gallocatechin gallate

ọ ủ ạ 1.1.2 Ho t tính sinh h c c a tanin

ọ ủ ướ ấ ợ ứ Theo các nghiên c u khoa h c c a n c ngoài thì tanin là h p ch t có

15 MSV:

ề ạ ọ nhi u ho t tính sinh h c.

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

ạ ẩ Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ 1.1.2.1 Ho t tính kháng khu n

ẩ ủ ạ ượ ậ ừ ướ Các ho t tính kháng khu n c a tanin đã đ c công nh n t tr c đây

ố ớ ủ ẩ ấ ấ ộ ượ và đ c tính c a tanin đ i v i vi khu n, n m và n m men đã đ c nhà khoa

ơ ế ượ ề ế ấ ứ ọ h c Scalbert nghiên c u [6]. Các c ch đ c đ xu t cho đ n nay đ gi ể ả i

ồ ứ ủ ủ ế ạ ẩ thích ho t tính kháng khu n c a tanin bao g m c ch các enzym c a vi

ự ủ ế ể ẩ ạ ộ ẩ khu n ngo i bào, tác đ ng tr c ti p lên quá trình chuy n hóa c a vi khu n

ự ứ ự ử ế ạ thông qua s c ch quá trình photphoryl oxy hóa, s kh ion kim lo i gây

ủ ế ự ổ ủ ra s thay đ i hình thái c a t ấ bào và tăng tính th m c a màng [7]. Các

ứ ằ ỉ ế ủ ế ậ ằ b ng ch ng đã ch ra r ng màng t ộ ơ bào vi sinh v t là n i ch y u tác đ ng

ứ ế ủ ớ ế ủ ấ ộ ổ ế c ch c a tanin [8]. Do tính k t t a v i protein là m t tính ch t ph bi n

ấ ả ẩ ủ ạ cho t t c các tanin, cho nên ho t tính kháng vi khu n c a các loài vi sinh

ẽ ế ủ ặ ầ ấ ọ ậ v t có liên quan ch t ch đ n thành ph n hóa h c và c u trúc c a tanin.

ạ 1.1.2.2 Ho t tính kháng virút

ượ ứ ứ ạ Tanin đã đ c các nhà nghiên c u ch ng minh có ho t tính đáng k ể

ạ ộ ố ạ ư ễ ả ị ở ố ch ng l i m t s lo i vi rút, nh vi rút gây suy gi m mi n d ch ng ườ i

ả (HIV), vi rút adeno và norovirus [9]. Vào năm 1991, tác gi G.T. Tan và các

ụ ứ ự ứ ế ằ ộ c ng s đã ch ng minh tanin gây tác d ng c ch HIV1 b ng cách sao

ượ ự ế ộ chép ng c vi rút [10]. Đ n năm 2011, S. Ciesek và các c ng s cũng đã

ế ượ ự ậ ứ ứ ch ng minh epigallocatechin trong trà xanh c ch đ ủ c s xâm nh p c a

ề ạ vi rút viêm gan C [11]. Tanin có nhi u ho t tính kháng vi rút khác nhau tùy

ầ ấ ộ ọ thu c vào thành ph n và c u trúc hóa h c.

ố ạ 1.1.2.3 Ho t tính ch ng viêm

ứ ạ ố Tanin có các ho t tính ch ng viêm khác nhau. Các nghiên c u in vitro

ả ự ằ ộ ỉ ủ c a tác gi X. Terra và các c ng s năm 2007, đã ch ra r ng tanin t ừ ạ h t

ệ ế ả ấ ớ nho làm gi m b nh viêm th p kh p [12]. Đ n năm 2014, M. Park và các

16 MSV:

ự ứ ư ụ ế ấ ừ ạ ộ c ng s ch ng minh tanin ng ng t chi t xu t t h t mâm xôi đen có kh ả

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

ế ế ứ ố Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ năng ch ng viêm, c ch t bào RAW 264.7 do lipopolysacarit gây ra trong

ả ấ ấ ộ quá trình s n xu t NO m t ch t trung gian gây viêm [13].

ố ạ 1.1.2.4 Ho t tính ch ng oxy hóa

ấ ợ ượ ứ ọ Các h p ch t phenolic đã đ ấ c các nhà khoa h c nghiên c u là ch t

ớ ầ ế ệ ả ố ch ng oxy hóa hi u qu [14]. Tanin v i h u h t là các nhóm hydroxyl s ẽ

ẽ ấ ạ ố ớ ấ ễ ị d b oxy hóa nh t, do đó chúng s có ho t tính ch ng oxy hóa l n nh t

ủ ạ ố ượ ứ ụ ộ [15]. Ho t tính ch ng oxy hóa c a tanin đ c ng d ng r ng rãi trong lĩnh

ế ể ư ệ ừ ệ ề ệ ạ ự v c y t đ ngăn ng a các b nh v tim m ch, b nh ung th , b nh loãng

ươ x ng [16].

ộ ố ươ ị ượ 1.1.3 M t s ph ng pháp đ nh l ng tanin

ế ớ ề ọ ứ ế ể Có nhi u nhà khoa h c trên th gi i ti n hành nghiên c u đ xác

ượ ố ượ ề ự ậ ị đ nh hàm l ng tanin trong nhi u đ i t ử ụ ng th c v t khác nhau. S d ng

ươ ư ệ ẩ ắ ộ ỏ ộ ố m t s ph ng pháp nh : chu n đ , đo quang, s c ký l ng hi u năng

cao…

ươ ẩ ộ 1.1.3.1 Ph ng pháp chu n đ [23]

ươ ể ị ủ ượ Theo ph ng pháp c a AOAC (1980), đ đ nh l ng tanin, ph ươ ng

ượ ự ư ệ ấ ị pháp đ c th c hi n nh sau: L y 5 ml d ch chi ế ượ t đ ớ c hòa tan v i 12,5 ml

ị ướ ỗ ợ ượ ộ ớ ẩ dung d ch indigocarmin và 375 ml n c. H n h p đ c chu n đ v i dung

ể ừ ớ ị d ch KMnO màu xanh sang màu vàng v i màu ị 4 làm dung d ch chuy n t

ạ ở ề ể ị ổ ồ h ng nh t ủ vi n. Th tích c a dung d ch KMnO ể 4 là t ng th tích hàm

ể ả ồ ị ượ l ầ ầ ng tanin bao g m c các thành ph n khác (Y). Đ xác đ nh thành ph n

ả ấ ị ế ớ ị khác không ph i tanin (X), l y 50ml dung d ch chi t v i 25 ml dung d ch

ỗ ợ ượ ấ ượ gellatin. H n h p đ ế c làm m cho đ n khi gellatin đ c hòa tan hoàn toàn

ượ ứ ế ạ ớ ố ị ị sau đó đ ạ c làm l nh và đ nh m c đ n v ch v i dung d ch mu i bão hòa,

ộ ỗ ị ợ thêm 50 ml dung d ch axit và NaCl bão hòa và 5 g b t cao lanh. H n h p

17 MSV:

ượ ắ ấ ọ ọ ọ ị đ ộ c l c 15 phút và l c qua màng l c whatman 1. L y 12,5 ml d ch l c tr n

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

ướ ể Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ ị ớ v i 12,5 ml th tích dung d ch indigo carmin và 375 ml n ộ ớ ẩ c. Chu n đ v i

4 cho t

ị ớ ể ạ ồ ị dung d ch KMnO i khi chuy n thành dung d ch màu h ng nh t nh ư

ướ ủ ể ị ượ ử ụ ể ẩ tr c. Th tích c a dung d ch KMnO c s d ng đ chu n đ ộ ự 4 th c đ

ượ ị ủ tanin đ c tính theo giá tr c a Y và X:

ẩ ị 1mL dung d ch chu n KMnO ị 4 = 0,595 ml dung d ch axit oxalic 0,1N

ị 1mL dung d ch axit oxalic 0,1N = 0,0042 g tanin.

ả ự ế ộ Năm 2015, tác gi Jyotismita Khasnabis và các c ng s đã ti n hành

ị ượ ạ ằ ươ xác đ nh hàm l ng tanin trong các lo i trà khác nhau b ng ph ng pháp

oC trong 5 phút.

ẩ ẫ ộ ượ ế ệ ộ chu n đ . M u trà đ c chi t trong n ướ ở c nhi t đ 70

ị ế ượ ọ ượ ộ D ch chi c l c qua màng Whatman.1 và đ t đ ớ ố c ly tâm v i t c đ 10000

ọ ị ượ ư ể ị ượ vòng/15 phút. D ch l c đ c l u tr ữ ở oC đ đ nh l 4 ằ ng b ng ph ươ ng

4 v i ch t ch th indigocacmin. Hàm

ộ ớ ẩ ị ấ ớ ỉ ị pháp chu n đ v i dung d ch KMnO

ạ ượ ẫ ị ượ l ng tanin trong các lo i trà đ c xác đ nh: m u trà đen có hàm l ượ ng

ượ tanin là 13,36%, trà xanh có hàm l ng tanin là 2,65%, trà ô long có hàm

ượ l ng 8,66%. [18]

Năm 2009, Maria Atanassova và Valentina ChristovaBagdassarian đã

ế ị ượ ự ậ ạ ti n hành xác đ nh hàm l ằ ng tanin trong các lo i th c v t khác nhau b ng

ươ ẩ ạ ẫ ượ ế ướ ấ ử ph ộ ng pháp chu n đ . Các lo i m u đ c chi t trong n c c t kh ion

ờ ệ ộ ế ọ ị trong th i gian 4 gi ờ ở nhi t đ phòng. Sau đó, ti n hành l c d ch chi ế t,

ượ ộ ằ ẩ ị ấ ớ ị ọ ị d ch l c thu đ c chu n đ b ng dung d ch KMnO ỉ 4 v i ch t ch th indigo

ượ ậ ầ ượ ủ ự ạ cacmin. Hàm l ng tanin c a các lo i th c v t l n l t là: táo (0,58%),

ả ộ ọ ồ ỏ cherry ng t (1,25%), qu m c qua (0,67%), h tiêu đ (0,69%). [26]

ươ ỏ ệ ắ 1.1.3.2 Ph ng pháp s c ký l ng hi u năng cao [3]

ươ ệ ắ ỏ ươ Trong ph ng pháp s c ký l ng hi u năng cao, có 4 ph ng pháp

ượ ườ ị đ nh l ng th ng dùng:

ươ ạ ươ ị ượ ơ ả Ph ẩ ng pháp chu n ngo i: là ph ng pháp đ nh l ng c b n, trong

ả ẫ ử ề ượ ệ c tiên hành s c ký trong cùng đi u ki n.

ề ắ 18 MSV:

ẩ đó c 2 m u chu n và th đ u đ ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

ử ớ ủ ệ ề ệ ặ ẫ Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ Sau đó so sánh di n tích (ho c chi u cao) pic c a m u th v i di n tích

ề ẽ ặ ẫ ẩ ượ ồ ủ (ho c chi u cao) pic c a m u chu n s tính đ ấ ộ ủ c n ng đ c a các ch t

ử ẫ trong m u th .

ươ ẩ ẫ ẩ ẫ ộ Ph ử ữ ả ẫ ng pháp chu n n i: thêm vào c m u chu n l n m u th nh ng

ủ ằ ấ ộ ế ồ ế ượ l ng b ng nhau c a m t ch t tinh khi ắ t, r i ti n hành s c ký trong cùng

ấ ượ ề ữ ệ ừ ữ ẩ ọ ệ đi u ki n. Ch t đ ề ộ c thêm này g i là chu n n i. T nh ng d ki n v :

ề ệ ặ ượ ặ ẩ ồ di n tích (ho c chi u cao) pic và l ẩ ộ ủ ng (ho c n ng đ ) c a chu n, chu n

ử ể ẫ ị ượ ượ ủ ầ ầ ị ộ n i và m u th , có th xác đ nh đ c hàm l ng c a thành ph n c n đ nh

ẫ ượ l ử ộ ng trong m u th m t cách chính xác.

ươ ử ữ ẩ ẫ ượ Ph ng pháp thêm chu n: Thêm vào m u th nh ng l ng đã bi ế t

ẩ ươ ứ ẫ ớ ấ ủ c a các ch t chu n t ầ ng ng v i các thành ph n có trong m u th r i l ử ồ ạ i

ư ử ề ệ ế ẫ ắ ồ ộ ti n hành x lý m u và s c ký trong cùng đi u ki n. N ng đ ch a bi ế t

ử ượ ẫ ộ ượ ự ự ệ ồ ủ c a m u 9 th đ c tính d a vào s chênh l ch n ng đ l ấ ng ch t thêm

ự ủ ệ ề ặ vào và s tăng c a di n tích ho c chi u cao pic.

ươ ệ ẩ ượ ủ ầ Ph ng pháp chu n hoá di n tích: Hàm l ộ ng ph n trăm c a m t

ề ấ ầ ỗ ợ ượ ằ ầ ch t trong h n h p nhi u thành ph n đ c tính b ng t ỷ ệ l ệ ph n trăm di n

ủ ấ ả ủ ệ ầ ớ ổ tích pic c a nó so v i t ng di n tích c a t ắ t c các pic thành ph n trên s c

ký đ . ồ

ả ử ụ ự ộ ươ Tác gi Trupti P. Durgawale và các c ng s đã s d ng ph ng pháp

ể ị ượ ọ ậ HPLC đ xác đ nh hàm l ng tanin trong loài cây h Đ u vào năm 2016.

ứ ử ụ ỗ ợ ộ ắ Công trình nghiên c u s d ng c t s c kí C18, h n h p methanol và n ướ c

ỉ ệ ể ộ ớ ố ộ theo t l th tích 50:50 làm dung môi pha đ ng v i pH = 4,5, t c đ pha

ạ ổ ộ đ ng là 1,0 ml/phút t ạ ướ i b ờ c sóng 270 nm. T ng th i gian ch y là 12 phút.

ế ượ ư ờ ươ ượ ả K t qu thu đ c th i gian l u là 3,1 phút. Ph ng pháp này đã đ c xác

ủ ế ậ ạ ồ ộ nh n và tuy n tính c a axit tannic trong ph m vi n ng đ 060 mg/ml. [19]

ả ử ụ ự ộ ươ Tác gi Tushar Dhanani và các c ng s đã s d ng ph ng pháp

19 MSV:

ị ượ ủ ủ ạ ể HPLC PDA đ xác đ nh hàm l ng c a 5 lo i tanin th y phân: axit gallic

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ (GA), axit corilagin (CL), axit chebulagic (CB), axit ellagic (EA) và axit

ả ỏ chebulinic (CN) trong v qu cây chiêu liêu vào năm 2014. Công trình s ử

ộ ắ ỗ ợ ụ d ng c t s c ký C18, h n h p dung môi ACN (acetonitril) và TFA (0,05%)

ướ ố ộ ộ ế trong n c, t c đ pha đ ng là 1,0 ml/phút t ạ ướ i b c sóng 270 nm. K t qu ả

ượ ầ ượ ủ ủ ư ờ thu đ ạ c th i gian l u c a 5 lo i tanin th y phân l n l t là: GA (2,91

phút), CL (12,09 phút), CB (16,12 phút), EA (17,66 phút), CN (18,59 phút).

ớ ạ ầ ượ ủ ệ LOD (gi i h n phát hi n) c a GA, CL, CB, EA và CN l n l t là 1,0; 0,5;

ớ ạ ị ượ ủ 1,0; 0,5 và 1,0 µg/ml. LOQ (gi i h n đ nh l ng) c a GA, CL, CB, EA và

ầ ượ CN l n l t là 2,5; 1,0; 2,5; 1,0 and 2,5 µg/ml. [22]

ươ 1.1.3.3 Ph ng pháp đo quang

ả ự ử ụ ộ ươ Tác gi Philip Edouard Shay và các c ng s s d ng ph ng pháp đo

ắ ể ử ụ ớ ố ị ộ ấ đ h p th quang v i thu c th butanol HCl s t đ xác đ nh hàm l ượ ng

ư ụ ự ậ ẫ ượ tanin ng ng t trong các loài th c v t năm 2017. M u khô đ c chi ế ằ t b ng

ượ ằ dung môi methanol (300mL) và đ c axit hóa b ng axit trifluoroacetic

ắ ư ứ ẫ (TFA) 0,05%. Các b ướ ượ c đ c tóm t ị t nh sau: 500 µl d ch m u ch a tanin

ụ ử ụ ớ ố ư ng ng t ị cho tác d ng v i 2000µl dung d ch thu c th butanol HCl cho

4Fe(SO4)2 2% trong HCl 2N) và đ

ử ắ ể ủ ố thêm 67mL thu c th s t (NH trong

ả ở ệ ộ ả ứ ủ ượ ờ kho ng th i gian 2,5h nhi t đ 70°C. Màu c a ph n ng đ ệ c phát hi n

ượ ư trên máy quang ph ổ ở ướ b c sóng 550 nm. Hàm l ng tanin ng ng t ụ ượ c đ

ượ ộ ấ ụ ự ượ ủ ệ ẫ ị đ nh l ng d a trên đ h p th quang thu đ ố c c a m u thí nghi m đ i

ớ ườ ế ẩ chi u v i đ ng chu n proanthocyanidin. [20]

ả ế Tác gi OiWah Lau, ShiuFai Luk and HsiaoLan Huang đã ti n hành

ẫ ẫ ị ượ ế xác đ nh tanin m u chè vào năm 1989. M u đ c chi t trong n ướ ở c nhi ệ t

oC, m u đ

ẫ ượ ọ ử ẫ ắ ắ đ 80ộ c l c. Tanin trong m u, kh ion s t (III) thành ion s t (II)

oC trong 20 phút. Sau đó ion s t (II) ph n ng v i thu c th ắ

ở ệ ộ ả ứ ớ ố nhi t đ 80 ử

ở ộ ấ ứ ạ ộ 1,10 phenanthrolin pH 4,4 t o thành m t ph c màu. Đo đ h p th ụ

20 MSV:

ủ ị ự ườ quang c a dung d ch t ạ ướ i b c sóng 540 nm và xây d ng đ ẩ ng chu n trong

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

ớ ộ ố ủ Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ ả kho ng 05,5 µg/mL c a axit tanic v i đ d c 0,213 A/ppm. Hàm l ượ ng

ị ượ tanin trong chè xác đ nh đ c là 9,45%. [21]

Ứ

Ự

Ậ

Ề

1.2 CÁC TH C V T CH A NHI U TANIN

ự ậ ậ ổ ế ấ ợ ố Tanin là nhóm các h p ch t phân b ph bi n trong th c v t b c cao

ở ữ ọ ự ậ ầ ặ nh ng cây hai lá m m, các h th c v t hay g p giàu tanin:

+ Rau răm (polygonaceae)

ậ + Đ u (Fabaceae)

ồ + Hoa h ng (Rosaceae)

+ Sim (Myrtaceae)

+ Cà phê (Rutaceae)

ặ ở ậ ủ ễ ễ ề ạ ộ Tanin có m t nhi u b ph n c a cây: r , thân r (Đ i hoàng), v ỏ

ổ ụ ả ạ ỏ ồ (Chiêu liêu), lá (Cây i), hoa (Hoa h ng), h t (Cau), v qu (Măng c t) …

ộ ố ư ứ ọ M t s cây ch a tanin quan tr ng khác nh : cây S i ( ồ Quercus sp.); cây

Phong (Betula sp.); cây Li u (ễ Salix carpea); cây Thông (Pinus sp.). Hàm

ộ ố ượ ườ ế ừ ượ l ng tanin trong m t s loài d ệ c li u th ng khá cao chi m t 6 35 %,

ệ ộ ử ế ể ượ ứ ặ đ c bi t trong Ngũ b i t có th lên đ n 50 70 % chúng đ ụ c ng d ng

ự ự ệ ề ẩ ọ nhi u trong lĩnh v c y h c và trong ngành công nghi p th c ph m.

ả ượ ư ậ B ng 1.: Hàm l ộ ố ng tanin trong m t s loài th c v t [5]

ượ ộ ố Hàm l ng tanin (%)

ỏ 7 13

ự M t s loài th c v tậ ả V qu (cây măng c t)ụ Lá (cây i)ổ 7 10

ả ự ỏ V qu (l u) 20 30

ỏ 20 40

21 MSV:

ả V qu (cây chiêu liêu)

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

Ngũ b i tộ ử 43,2

Lá (trà hoa vàng) 15 30

ự ậ ộ ố ứ ề Hình 1.: M t s loài th c v t ch a nhi u tanin

ƯƠ

Ổ

Ị

ƯỢ

1.3 PH

NG PHÁP QUANG PH UV VIS Đ NH L

NG TANIN

ươ 1.3.1 Ph ng pháp phân tích đo quang [2]

ươ ổ ươ Ph ng pháp phân tích quang ph là ph ng pháp phân tích quang

ứ ự ươ ự ủ ứ ệ ọ h c d a trên vi c nghiên c u s t ấ ạ ng tác c a b c x ánh sáng trên ch t

ặ ự ấ ứ ạ ướ ụ ả ộ ộ kh o sát ho c s h p th các b c x d i m t tác đ ng hóa lý nào đó.

ắ ủ ổ 1.3.1.1 Nguyên t c c a phép đo ph UV VIS

ổ ấ ử ụ Ph h p th quang phân t ổ ấ vùng UVVIS (190 800 nm) là ph h p

ụ ủ ấ ở ạ ể ủ ấ ồ ị th c a các ch t tan ộ tr ng thái dung d ch đ ng th c a ch t trong m t

22 MSV:

ấ ị ư ướ dung môi nh t đ nh nh n c, methanol, benzen, toluen, chloroform, hay

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

ử ủ ườ ệ Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ ấ ộ ố m t s ch t mà phân t ề c a nó trong đi u ki n bình th ng nó t n t ồ ạ ở i

ư ạ ệ ượ ự ố ơ tr ng thái h i nh khí CH c phép đo ế 4, NH3, CO2. Vì th mu n th c hi n đ

ự ệ ệ ả ổ ph này chúng ta ph i th c hi n các công vi c sau đây:

 Chu n b dung d ch m u:

ẩ ẫ ị ị

ụ ế ấ ấ ườ ợ N u các ch t phân tích có h p th quang UVVIS: Tr ng h p này ta

ả ạ ộ ợ ị ph i hòa tan nó vào trong m t dung môi phù h p, t o ra dung d ch trong và

ư ộ ố ấ ữ ơ ể ồ đ ng th , nh m t s ch t h u c : Benzen, phenol, nitrophenol, naphthalen,

2CrO4, K2Cr2O7 và KMnO4.

ấ anthracene. Các ch t vô c nh I ơ ư 2, các mu i Kố

ụ ữ ấ ườ ổ ấ Nh ng ch t không có ph h p th quang UVVIS: Tr ợ ng h p này

ủ ế ạ ả ấ ch y u là các ion kim lo i, hay các anion, chúng ta ph i cho các ch t này

ử ụ ộ ớ ố ộ ở ề tác d ng v i m t thu c th R nào đó trong m t dung môi và ệ đi u ki n

ộ ợ ể ạ ụ ứ ề ả ấ ấ ợ thích h p đ t o ra m t h p ch t ph c b n có kh năng h p th quang

ổ ủ ứ ạ ị ượ UVVIS nh y, sau đó đo ph c a dung d ch ph c thu đ c.

ứ ế ẫ ẫ ả ấ N u m u phân tích là ch t khí: Chúng ta ph i ch a m u vào trong

ể ặ ộ ố ồ ổ ơ ẫ m t ng cuvet đóng kín đ đ t vào bu ng đo ph . Hay b m dòng khí m u

ộ ố ộ ằ ớ ị ươ qua cuvet trong khi đo v i m t t c đ h ng đ nh (ph ng pháp đo dòng

 Đo ph : ổ

ch y).ả

(cid:0) ế ẫ Cho m u vào cuvet và chi u chùm sáng kích thích ợ phù h p vào

ấ ầ ủ ể ẫ ợ ị cuvet có dung d ch m u c a h p ch t c n phân tích, đ cho các phân t ử

ứ ủ ụ ả ấ ấ ẩ ứ ạ (cid:0) ch t phân tích hay s n ph m ph c c a nó h p th tia b c x ể ạ , đ t o ra

ổ ấ ủ ụ ế ẫ ấ ph h p th quang UVVIS c a nó. Vì th ch t phân tích (m u phân tích)

ượ ấ ị ự ế ề ố ầ c n đ c đ ng vào ng đo hay cuvet có b dày nh t đ nh (L = 0,5 đ n 2

 Ghi đo ph :ổ

23 MSV:

cm).

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

(cid:0) ọ ộ ổ Thu chùm sáng đi qua cuvet, phân ly ph đó và ch n m t tia sáng ở

ụ ự ạ ủ ổ ủ ấ ấ ườ ị v trí h p th c c đ i c a băng ph c a ch t phân tích và đo c ộ ấ ng đ h p

(cid:0)

ụ ủ ề ệ ấ ọ th quang A ở (cid:0) max c a ch t đó trong các đi u ki n đã ch n, hay quét

ả ộ ể ố ổ (Scan) đ ghi c m t vùng ph mong mu n.

 Hi n th ph , k t qu đo:

ồ ế ệ ả ị

(cid:0) . Vi c này có th đ

ị ộ ấ ụ ể ượ ệ ự Ghi giá tr đ h p th quang A ệ c th c hi n

ư ồ ụ ề ồ ượ ụ ấ ằ b ng nhi u công c khác nhau, nh đ ng h đo năng l ng h p th , máy

ộ ấ ể ướ ạ ụ ệ ế ấ ự t ghi đ ghi đ h p th A ụ (cid:0) d i d ng các pic h p th , hay hi n k t qu ả

ệ ố ủ ằ đo A(cid:0) , b ng máy hi n s (digital), hay ghi vào đĩa c a máy tính, sau đó x ử

ế ươ ầ ầ ế ả ở ạ ằ lý ti p b ng các ch ng trình theo yêu c u c n k t qu đo d ng nào (đ ộ

ụ ề ấ ộ ồ ấ h p th quang A, đ truy n qua T, n ng đ C ộ x ch t phân tích).

ấ ạ ạ ộ ủ ổ 1.3.1.2 C u t o và nguyên lý ho t đ ng c a máy đo quang ph

a) C u t o:

ấ ạ

ổ ử ừ ơ ạ ề ầ ệ ế ả Máy đo quang ph phân t đ n gi n đ n hi n đ i đ u c n có các t

ậ ơ ả ộ b ph n c b n chính sau đây:

ấ ồ ỉ ặ + Ngu n cung c p chùm tia sáng vùng UVVIS, hay ch UV ho c

VIS;

ứ ể ặ ẫ ồ ổ + Bu ng đ t cuvet và cuvet ch a m u đ đo ph ;

ộ ơ ắ ể ệ ổ ọ ầ + B đ n s c (h quang) đ thu ph , phân ly và ch n tia sáng X c n

đo;

+ Detector và modul đi n t ệ ử ;

ị ế ậ ả ị ỉ ổ + Máy trang b ghi nh n và ch th k t qu đo ph .

ổ ượ ị Ngoài ra, máy đo ph còn đ c trang b thêm các thi ế ị ư t b nh :

ộ ấ ẫ ự ộ + B l y m u t đ ng;

24 MSV:

ề ệ ệ ầ ỉ + H máy tính và ph n m m (h UV VIS) hoàn ch nh;

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ươ ậ + Các ch ng trình thu t toán.

ồ  Ngu n sáng:

ụ ử ổ ấ Trong các máy đo ph h p th quang phân t UVVIS (phép đo quang

ụ ườ ườ ạ ồ ồ ấ h p th ) ng i ta th ng dùng lo i đèn ngu n là D2Lamp (đèn h quang

ể ợ hydro), WLamp (đèn s i đi m Wolfram).

 B ph n t o tia sáng đ n s c:

ơ ắ ậ ạ ộ

ượ ắ ơ ể ạ Đ t o đ c tia sáng đ n s c (hay chính xác là vùng sáng có vùng

ổ ẹ ườ ườ ử ph h p) trong máy đo quang ng i ta th ng dùng lăng kính, cách t hay

 Cuvet:

ọ kính l c sáng.

ứ ụ ụ ặ ị Cuvet là d ng c ch a dung d ch phân tích ho c dung môi. Trong

ự ế ườ ặ ụ ấ ệ th c t ta th ng g p cuvet hình tr đáy vuông. Có các ch t li u hay s ử

ủ ự ạ ặ ở ụ d ng là cuvet nh a, th y tinh ho c th ch anh. Khi đo ả ế ổ vùng ph kh ki n

ư ủ ự ọ ở ổ ử nên ch n cuvet nh a hay th y tinh, nh ng khi đo vùng ph t ạ ngo i thì

ế ụ ủ ả ạ ấ ử ấ nh t thi t ph i dùng cuvet th ch anh vì th y tinh h p th tia t ạ ngo i.

ữ ơ ử ụ ự ệ ớ ớ Không s d ng cuvet nh a khi đo v i dung môi h u c . Khi làm vi c v i

ả ậ ắ ơ các dung môi bay h i ph i đ y n p cuvet.

 T bào nhân quang đi n:

ệ ế

ệ ệ ế ậ ộ ồ ế T bào quang đi n là b ph n bi n quang năng thành đi n năng r i

 Detector:

ể ậ ộ chuy n vào b ph n ghi đo.

ể ậ ậ ộ Detector là b ph n thu nh n chùm sáng và chuy n chúng thành tín

ể ệ ườ ệ ộ ượ ử ệ hi u đi n đ đo c ng đ chùm sáng đó. Các tín hi u ghi, đo đ c x lý và

ị ộ ấ ụ ế ả ươ ứ ủ ị cho ra k t qu giá tr đ h p th quang t ng ng c a dung d ch. Ngày nay

ạ ố ề ế ậ ộ ầ h u h t các máy đo quang lo i t t đ u có b ph n ghi đo đ ượ ế ố ớ c k t n i v i

25 MSV:

máy tính.

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

b) Nguyên lý ho t đ ng:

ạ ộ

ệ ố ấ ồ ế Các đèn phát ra ngu n sáng chi u vào h th ng th u kính (h g ệ ươ ng

ẹ ậ ắ ắ ộ ộ ụ ạ h i t ) t o ra chùm sáng tr ng đi qua khe h p vào b ph n tán s c. Khi

ậ ứ ế ắ ắ ị chùm sáng tr ng chi u vào lăng kính ngay l p t c nó b tán s c thành các tia

ơ ắ ề ọ ế ả ấ ạ sáng đ n s c chi u v m i phía. Tia sáng ph n x qua các th u kính g ươ ng

ế ẳ ắ ậ ồ ỏ ộ ậ ộ ph ng ra kh i bu ng tán s c đ n b ph n phân chia chùm sáng, b ph n

ẽ ướ ứ ế ẫ này s h ự ng chùm sáng đ n các cuvet đ ng m u nghiên c u. Detector s ẽ

ể ệ ế ậ ti p nh n và phân tích các chùm sáng qua cuvet, chuy n tín hi u ánh sáng

ế ệ ệ ả ệ thành tín hi u đi n và cho hi n lên máy tính k t qu đo.

ắ ấ ạ ủ ơ ồ ổ Hình 1.: S đ nguyên t c c u t o c a máy đo quang ph

ứ ụ ủ ổ ạ 1.3.1.3 Ph m vi ng d ng c a phép đo ph UVVis

ươ ượ ứ ấ Ph ng pháp đo quang UVVis đã và đang đ ụ c ng d ng r t ph ổ

ế ươ ệ ả ơ ạ bi n. Vì nó là ph ễ ự ng pháp đ n gi n, d th c hi n và máy móc l i không

ệ ợ ị ượ ấ ớ ề ắ ề đ t ti n, phù h p cho vi c phân tích đ nh l ng nhi u ch t v i hàm l ượ ng

ụ ư ỏ nh , ví d nh :

26 MSV:

ể ấ ị Đ xác đ nh các ch t:

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ấ ữ ơ + Phân tích các ch t h u c ;

ố ượ ệ ả ẩ + Phân tích thu c, d ẩ c ph m, s n ph m nông nghi p;

ố ượ ạ ẫ + Phân tích các ion kim lo i trong các đ i t ng m u khác nhau.

ứ ầ ằ ộ ố ị ấ Xác đ nh thành ph n ph c ch t, đ phân ly, h ng s phân ly.

ố ề ủ ứ ằ ấ ị Xác đ nh h ng s b n c a ph c ch t.

ứ ị ử ấ Xác đ nh nhóm ch c trong phân t ch t.

ủ ứ ụ ạ ổ ọ Ph m vi ng d ng c a phép đo ph UVVis là: Trong y h c, d ượ c,

ệ ẩ ướ ườ ự trong nông nghi p, th c ph m, phân tích n c, phân tích môi tr ng, công

ệ ọ ươ ộ ọ ọ ổ nghi p hóa h c. Song ph ng pháp đo ph UVVis có đ ch n l c kém. Vì

ụ ử ể ố ộ ượ ề ạ ớ m t thu c th có th tác d ng đ ứ c v i nhi u ion kim lo i cùng cho ph c

ự ạ ấ ụ ầ màu có c c đ i h p th trùng nhau, hay g n nhau.

ươ ị ượ 1.3.1.4 Ph ng pháp đ nh l ng

ươ ổ ươ ườ ể ị Trong ph ng pháp đo quang ph , ph ng pháp th ng dùng đ đ nh

ươ ườ ươ ẩ ượ l ng là: ph ng pháp đ ẩ ng chu n và ph ng pháp thêm chu n

a) Ph

ươ ườ ẩ ng pháp đ ng chu n:

ượ ươ ơ ở ị * C s đ nh l ủ ng c a ph ng pháp:

ự ươ ị D a vào ph ậ ng trình đ nh lu t Lambert Beer:

A = (cid:0) .L.C

ộ ấ ủ ụ ầ ị Trong đó: A là đ h p th quang c a dung d ch c n đo, (cid:0) là h s h p th ệ ố ấ ụ

ử ủ ớ ề ề ấ ộ ồ ị phân t ủ , C là n ng đ ch t, L là b dày c a l p dung d ch (b dày c a

cuvet).

ế * Cách ti n hành:

ẩ ẩ ẩ ẫ ị ị ị ộ Chu n b dãy dung d ch chu n và các m u phân tích: Chu n b m t

27 MSV:

ẩ ộ ị ườ ẩ ồ dãy dung d ch chu n có n ng đ chính xác (thông th ị ớ ng chu n b v i 5

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

(cid:0) Cx)

ủ ệ ế ằ ộ ố Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ ồ n ng đ khác nhau n m trong vùng tuy n tính c a m i quan h A

ư ấ ề ệ ề ẫ ớ ườ cùng trong đi u ki n v i m u phân tích, nh ch t n n, môi tr ng pH,...

ứ ề ề ệ ệ ọ ổ ọ ợ Ch n các đi u ki n đo ph : Nghiên c u ch n đi u ki n phù h p

ấ ể ủ ấ ẩ ổ ị nh t đ đo ph UVVIS c a ch t phân tích trong dãy dung d ch chu n và

ư ẫ ố ệ ề ờ m u phân tích, nh các thông s máy đo A ạ x, đi u ki n đo, th i gian đo, lo i

cuvet ...

ổ ấ ụ ẫ ẫ ẩ ổ Đo ph các m u chu n và m u phân tích: Đo ph h p th quang

ủ ệ ề ẩ ẫ ị UVVIS c a dãy dung d ch chu n và m u phân tích theo các đi u ki n đã

ch n.ọ

ườ ừ ẩ ồ ị ị ự D ng đ ng chu n và xác đ nh n ng đ C ặ ộ x: T các c p giá tr A C

ự ứ ủ ẩ ị ườ ệ ọ ẩ ươ t ng ng c a các dung d ch chu n, ta d ng đ ng chu n trong h t a đ ộ

A C, hàm Ax, = f(C).

Cx C

ự ươ ườ ẩ ượ ồ D a vào ph ng trình đ ng chu n: y = ax + b, ta tính đ ộ ủ c n ng đ c a

ẫ các m u phân tích

x) và đ h p th quang (A)

28 MSV:

ầ ượ ộ ồ ộ ấ ụ Trong đó: x, y l n l t là n ng đ (C

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ  Cx =

b) Ph

ươ ẩ ng pháp thêm chu n:

* Nguyên t c: ắ

x trong dãy m uẫ

ụ ẫ ệ ẫ ạ ộ Dùng ngay m t m u phân tích đ i di n (ví d m u C

ế ộ ấ ề ể ẩ ẫ phân tích) làm ch t n n đ pha ch m t dãy m u chu n

ế * Cách ti n hành:

ộ ượ ấ ấ ị ố ượ ẫ L y m t l ng nh t đ nh m u phân tích (theo kh i l ng hay theo

ữ ể ượ ộ ủ ấ ồ th tích) và thêm vào đó nh ng l ng n ng đ c a ch t phân tích (cid:0) C chính

x thì

ư ậ ố ộ ấ ẫ ộ ồ ế xác theo c p s c ng. Nh v y, n u m u phân tích có n ng đ là C

0, C1, C2, C3, C4, C5 nh b ng sau:

29 MSV:

ẽ ẫ ẩ ư ả chúng ta s có dãy m u chu n là C

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ẩ ủ ả ị ươ ẩ B ng 1.: Dãy dung d ch chu n c a ph ng pháp thêm chu n

ẩ STT ẫ Dãy m u chu n ụ λ đo

ộ ấ Đ h p th A đ cượ

Dãy chu nẩ

M0 C0 = CX + 0 A0

M1 A1 C1 = CX + C1

M2 A2 C2 = CX + C2

M3 A3 C3 = CX + C3

M4 A4 C4 = CX + C4

M5 A5 C5 = CX + C5

ẫ Các m u phân tích CX2 AX2

CX3 AX3

CX4 AX4

.... ....

CXn AXn

ị ộ ấ ừ ụ ẩ ị ủ Đo các giá tr đ h p th quang c a dãy dung d ch chu n v a pha ở

ướ ự ạ ượ ị ộ ấ ụ ươ ứ b c sóng c c đ i đ c các giá tr đ h p th quang A t ng ng. V đ ẽ ồ

ị ườ ớ ậ ẩ ẫ ẩ ồ ị th đ ộ x ng chu n theo dãy m u chu n m i l p, sau đó xác đ nh n ng đ C

theo 2 cách:

ườ ắ ụ ề ẩ ạ ng chu n v phía trái, c t tr c hoành t i đâu đó Cách 1: Kéo dài đ

x c n tìm.

ầ chính là giá tr Cị

ộ ẻ ườ ớ ườ ẳ ng th ng song song v i đ ẩ ng chu n, ừ ố ọ Cách 2: T g c t a đ k đ

0 k đ

30 MSV:

ẻ ườ ớ ụ ắ ườ ẳ ừ ể t đi m A ng th ng song song v i tr c hoành c t đ ớ ẳ ng th ng m i

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

ắ ụ ừ ể ẻ ạ ị Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ ạ ự d ng t N k vuông góc và c t tr c hoành t i đi m có giá tr chính là i N, t

ầ Cx c n tìm.

Cx O (cid:0) C1 (cid:0) Cx (cid:0) C2 (cid:0) C3 (cid:0) C4 (cid:0) C (mg/ml)

ồ ị ườ ươ ẩ Hình 1.: Đ th đ ẩ ủ ng chu n c a ph ng pháp thêm chu n

ị ượ ổ ượ ư ụ 1.3.2 Đ nh l ng t ng hàm l ng tanin ng ng t ự ậ ằ trong th c v t b ng

ươ ph ng pháp đo quang

* Nguyên t c: ắ

ấ ẫ ợ ế ụ ự ậ Cho các h p ch t tanin trong m u cao chi ớ t th c v t tác d ng v i

ử ợ ố ố ố ử ắ ử ỗ h n h p hai thu c th : thu c th butanol HCl và thu c th s t

ẽ ị ượ ỏ ị c dung d ch có màu đ . Đo (NH4Fe(SO4)2) trong dung d ch axit s thu đ

ủ màu c a dung d ch ị ở ướ b c sóng 550 nm.

ả ứ ơ ồ S đ ph n ng:

ư ụ ặ ị ỏ Tanin ng ng t + HCl đ c Dung d ch có màu đ

31 MSV:

Butanol

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ư ữ ụ ớ ố ử ả ứ Hình 1.: Nguyên lý ph n ng gi a tanin ng ng t v i thu c th

Ớ Ạ

Ị

ƯỢ

1.4 GI

Ệ I H N PHÁT HI N (LOD) VÀ GI

I H N Đ NH L

Ủ NG (LOQ) C A

ƯƠ

NG PHÁP PHÂN TÍCH [4]

ớ ạ ệ 1.4.1 Gi i h n phát hi n (LOD)

ị Đ nh nghĩa:

ớ ạ ệ ộ ồ ạ ị Gi i h n phát hi n là n ng đ mà t ị i đó giá tr xác đ nh đ ượ ớ c l n

ủ ả ộ ươ ộ ấ ồ ả ơ h n đ không đ m b o đo c a ph ấ ủ ng pháp. Đây là n ng đ th p nh t c a

ệ ượ ể ấ ể ị ư ẫ ch t phân tích trong m u có th phát hi n đ ư c nh ng ch a th đ nh l ượ ng

ượ ươ ị ượ đ ố ớ c (đ i v i ph ng pháp đ nh l ng).

32 MSV:

ị Cách xác đ nh:

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ề ộ ị ươ Có nhi u cách xác đ nh LOD khác nhau tùy thu c vào ph ng pháp

ụ ươ ụ ụ ế ậ áp d ng là ph ng pháp công c hay không công c . Các cách ti p c n có

ể ấ ậ ượ ồ th ch p nh n đ c bao g m:

ộ ệ ự ẩ + D a trên đ l ch chu n:

ư ẫ ắ ầ ắ ẫ ử ẫ Cách 1: Làm trên m u tr ng (m u tr ng có thành ph n nh m u th

ư ấ ẫ ầ nh ng không có ch t phân tích). Phân tích m u 10 l n song song, tính đ ộ

ộ ệ ẩ ẩ ả ệ l ch chu n. Đ l ch chu n này ph i khác 0.

Tính LOD: LOD = + SD0

SD0 =

Trong đó:

ủ ẫ ắ : trung bình c a m u tr ng

ẩ ủ ộ ệ ẫ ắ SD0: đ l ch chu n c a m u tr ng

ử ầ ẫ ẫ ọ ử Cách 2: Làm trên m u th : Làm 10 l n song song. Nên ch n m u th

ộ ấ ụ ế ầ ả ồ có n ng đ th p (ví d , trong kho ng 5 đ n 7 l n LOD ướ ượ c l ng).

ộ ệ ẩ ị Tính LOD: Tính giá tr trung bình , và đ l ch chu n SD

LOD = 3 x SD

SD =

ượ Đánh giá LOD đã tính đ c: tính R = / LOD

ử ế ộ ợ ồ ị • N u 4 < R < 10 thì n ng đ dung d ch th là phù h p và LOD tính

ượ ậ đ c là đáng tin c y

ử ậ ế ả ặ ặ ơ ị • N u R < 4 thì ph i dùng dung d ch th đ m đ c h n, ho c thêm

ử ấ ẩ ộ ị ạ m t ít ch t chu n vào dung d ch th đã dùng và làm l ệ i thí nghi m và tính

l i R ạ

ử ế ả ặ ơ ị • N u R > 10 thì ph i dùng dung d ch th loãng h n, ho c pha loãng

33 MSV:

ử ạ ạ dung th đã dùng và làm l ệ i thí nghi m và tính l i R.

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ự ệ ễ + D a trên t ỷ ệ l tín hi u trên nhi u (S/N):

ố ớ ử ụ ụ ỉ Cách này ch áp d ng đ i v i các quy trình phân tích s d ng các

ụ ễ ườ ề ườ ụ công c có nhi u đ ng n n. Thông th ng cách tính này áp d ng ph ổ

ế ươ ệ ắ bi n cho các ph ng pháp s c ký, đi n di.

ự ẫ ẫ ẫ ẩ ặ ẫ Phân tích m u (m u th c, m u thêm chu n ho c m u chu n) ẩ ở ồ n ng

ố ầ ể ệ ấ ấ ệ ủ ộ ấ đ th p còn có th xu t hi n tín hi u c a ch t phân tích. S l n phân tích

ầ ị ệ ễ ặ ạ l p l i khác 4 l n. Xác đ nh t ỷ ệ l tín hi u chia cho nhi u (S/N = Signal to

noise ratio),

ệ ủ ề ấ trong đó: S là chi u cao tín hi u c a ch t phân tích

ễ ườ ề N là nhi u đ ng n n

ự ườ ẩ + D a trên đ ng chu n:

ụ ỉ ượ ươ ự ườ Ch áp d ng đ c cho các ph ng pháp có xây d ng đ ẩ ng chu n.

ể ượ ộ ố ủ ự ị ườ ẩ LOD có th đ c xác đ nh d a vào đ d c c a đ ộ ệ ng chu n và đ l ch

ẩ ủ ệ chu n c a tín hi u đo.

LOD =

Trong đó:

ẩ ủ ộ ệ ệ SD: Đ l ch chu n c a tín hi u

ộ ố ủ ườ ẩ a: Đ d c c a đ ng chu n

ị ượ ừ ườ ẩ ị ể ễ Giá tr a có th d dàng tính đ c t đ ng chu n, giá tr SD có th ể

ượ ề ồ đ c tính theo nhi u cách khác nhau, bao g m:

ẩ ủ ộ ệ ự ắ ẫ ắ ẫ D a trên đ l ch chu n c a m u tr ng: Phân tích m u tr ng l p l ặ ạ i

ầ ươ ứ 10 l n và tính SD t ng ng;

ộ ệ ẩ ở ồ ủ ự ẫ ẩ D a trên đ l ch chu n c a m u thêm chu n ỏ ầ ộ n ng đ nh g n

ặ ạ ể ầ ầ ở LOD, l p l i 10 l n (xem ph n ki m tra phía trên) và tính SD;

ủ ự ặ ườ ề ầ ể ẩ ệ ố D a trên h s ch n c a đ ng chu n, làm nhi u l n đ tính SD

34 MSV:

ị ủ c a giá tr b (intercept);

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ộ ệ ủ ự ự ẩ ả ị ớ D a trên đ l ch chu n c a kho ng cách các giá tr đo th c v i

ườ ẩ đ ng chu n.

ớ ạ ị ượ 1.4.2 Gi i h n đ nh l ng (LOQ)

ị Đ nh nghĩa:

ộ ố ủ ử ể ấ ẫ ộ ồ LOQ là n ng đ t i thi u c a m t ch t có trong m u th mà ta có

ượ ươ ế ả ả ộ ể ị th đ nh l ằ ng b ng ph ụ ng pháp kh o sát và cho k t qu có đ ch m

ụ ố ươ ị ượ ỉ mong mu n. LOQ ch áp d ng cho các ph ng pháp đ nh l ố ng. Gi ng nh ư

ụ ề ể ộ ị ừ LOD, có nhi u cách khác nhau đ xác đ nh LOQ, ph thu c vào t ng

ươ ụ ể ọ ợ ph ự ng pháp c th mà l a ch n cho phù h p.

ị Cách xác đ nh:

ệ ể ệ ố ị ườ ế ợ ớ Vi c b trí thí nghi m đ xác đ nh LOQ th ng k t h p v i tính

ư ể ề LOD. Có nhi u cách khác nhau đ tính LOQ nh sau:

ộ ệ ự ẩ ườ ư ầ ợ + D a trên đ l ch chu n: Có hai tr ng h p nh trong ph n tính

ự ử ự ệ ệ ẫ ẫ ắ LOD là th c hi n trên m u tr ng và th c hi n trên m u th .

ư ứ Các công th c tính toán nh sau:

ẫ ắ Tính trên m u tr ng: LOQ = + SD

ử ẫ Tính trên m u th : LOQ = 10.SD

ự ệ ễ + D a trên t ỷ ệ l tín hi u trên nhi u:

ố ớ ử ụ ụ ỉ Cách này ch áp d ng đ i v i các quy trình phân tích s d ng các

ụ ễ ườ ề ươ ự ư công c có nhi u đ ng n n. Cách tính toán hoàn toàn t ng t nh trong

ầ ượ ậ ạ ồ ấ ộ ạ ph n tính LOD. LOQ đ c ch p nh n t i n ng đ mà t ệ ớ i đó tín hi u l n

ễ ườ ề ườ ườ ấ ầ ấ g p 1020 l n nhi u đ ng n n, thông th ng th ng l y S/N = 10.

ự ườ ẩ ươ ự ư ầ + D a trên đ ng chu n: Cách tính t ng t nh trong ph n LOD

ư ứ nh ng theo công th c sau:

35 MSV:

LOQ =

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ƯƠ

Ệ

CH

Ự NG 2: TH C NGHI M

Ụ

Ấ

2.1 D NG C VÀ HÓA CH T

2.1.1 Hóa ch tấ

ấ ẩ : * Ch t chu n

ộ ạ ượ ậ ừ ỏ Proanthocyanidin A2, đ s ch 97,5%, đ c phân l p t ụ v măng c t

ạ ụ ứ ứ ứ t i Phòng Nghiên c u và ng d ng Hóa sinh, trung tâm Nghiên c u và

ệ ệ ệ ể ọ ệ Chuy n giao Công ngh , vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam.

* Dung môi:

Methanol

Dimethyl sulfoxide (DMSO)

ướ ấ N c c t

n butanol

Ethanol 90 %

ấ * Các hóa ch t khác :

ặ ậ Axit clohidric (HCl) đ m đ c 37 %

4Fe(SO4)2.12H2O

ể ắ Amoni s t (III) sunfat tinh th NH

ề ấ ạ ẩ ế Các hóa ch t, dung môi trên đ u đ t tiêu chu n tinh khi t phân tích.

ụ ụ 2.1.2 D ng c thi ế ị t b

* Thi t bế ị:

ổ ấ ụ ử Máy đo quang ph h p th phân t UVVIS _EMCLAB, Đ cứ

ủ Cuvet th y tinh

ộ Cân phân tích Sartorius, Đ cứ (đ chính xác 0,0001 g)

ể B siêu âm

36 MSV:

ể ề B đi u nhi ệ DH WB000106 Haihan t

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ụ Máy cô quay chân không Buchi, R300, Th y Sĩ

ệ ố Hình 2.: H th ng máy đo quang UV Vis

37 MSV:

ệ ố Hình 2.: H th ng máy cô quay chân không

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

38 MSV:

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

* D ng cụ ụ:

Micropipet: 100 1000 (cid:0) l ; 20 200 (cid:0) l

Ố ng đong: 100 ml

Ố ệ ị ng nghi m ch u nhi ệ t

ự ố ử Bình đ ng thu c th

Eppendroff: 1,5 ml

Pipet: 5 ml

ủ Q a bóp cao su

ứ ị Bình đ nh m c 100 ml

ễ Ph u chi ế t

* Pha thu c thố ử:

ử ố ấ Thu c th BuOH HCl (t ỷ ệ l 95: 5): L y chính xác 190 ml n

ặ butanol, sau đó thêm vào 10 ml axit clohidric đ c (37%).

4Fe(SO4)2 2% / HCl 2N):

ử ắ ố Thu c th s t (NH

(cid:0) ấ ặ ồ Pha HCl 2N: L y 16,6 ml axit clohidric đ c, n ng đ ộ

ướ ấ ị ứ ế 37%, thêm n c c t đ nh m c đ n 100 ml.

(cid:0) ể Hòa tan 2,0 g NH4Fe(SO4)2.12H2O trong th tích 100 ml

ừ HCl 2N v a pha.

ị ế * Pha ch dung d ch :

ẩ ố ộ ị ấ Pha dung d ch chu n g c proanthocyanidin A2 : Cân 4 mg b t ch t

ẩ ồ ố chu n proanthocyanidin A2 vào ng eppendroff r i pha trong DMSO

ượ ẩ ố ồ ị (dimethyl sulfoxide) 800 (cid:0) l thu đ ộ c dung d ch chu n g c có n ng đ 5

39 MSV:

mg/ml.

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

(cid:0) ẩ ị Pha dung d ch chu n proanthocyanidin A2: Pha loãng 180 l dung

(cid:0) ừ ủ ẩ ố ượ ẩ ị ị d ch chu n g c trong v a đ 1620 l MeOH thu đ c dung d ch chu n có

ộ ồ n ng đ 500 (cid:0) g/ml.

Ố ƯỢ

Ứ

2.2 Đ I T

NG NGHIÊN C U

ử ụ ứ ẫ ượ ị Các m u Trà hoa vàng s d ng trong nghiên c u đ c xác đ nh tên khoa

ẫ ượ ị ườ h c (ọ Camellia chrysantha), là các m u đ c mua trên th tr ng.

40 MSV:

ế ẫ Quy trình chi t m u:

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ế ẫ t m u lá trà hoa vàng

Ẩ

ơ ồ Hình 2.: S đ quy trình chi Ị Ị 2.3 CHU N B DÃY DUNG D CH CHU N

ẩ ẩ ộ ồ ồ ị ị Chu n b dãy dung d ch chu n g m 9 n ng đ là 0, 20, 60, 100, 150,

200, 300, 400,500 µg/ml.

ệ ừ ế ẩ ị ẩ ị Ti n hành pha dãy dung d ch chu n làm vi c t dung d ch chu n 500

ầ ượ ệ ố ị (cid:0) g/ml: Hút chính xác V ((cid:0) l) MeOH l n l t vào các ng nghi m ch u nhi ệ t,

0 ((cid:0)

ế ế ẩ ươ ứ ớ ti p đó thêm vào ti p chính xác V ị l) dung d ch chu n t ng ng v i các

ộ ắ ượ ẩ ớ ị ồ n ng đ C ( (cid:0) g/ml). M u tr ng đ ẫ ẫ c chu n b song song v i dãy m u

ụ ể ư ẩ ả chu n. C th cách pha loãng nh trong b ng sau:

ng chu n c a proanthocyanidin A2

ả ả B ng 2: B ng dãy đ STT C0 ((cid:0) g/ml) ườ C ((cid:0) g/ml) ẩ ủ V0 ((cid:0) l) VMeOH ((cid:0) l)

0 20 60 100 150 200 300 400 500 0 20 60 100 150 200 300 400 500 500 480 440 400 350 300 200 100 0 Vt ngổ ((cid:0) l) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 500 500 500 500 500 500 500 500 500

Trong đó:

ồ ị proanthocyanidin A2 chu n (ẩ (cid:0) g/ml); ộ ủ Co : N ng đ c a dung d ch

ồ ị ẩ C : N ng đ c a ộ ủ dung d ch ệ proanthocyanidin A2 chu n làm vi c

41 MSV:

((cid:0) g/ml);

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ể ị ố ượ proanthocyanidin A2 g c đ c pha vào ((cid:0) l); V0 : Th tích dung d ch

ể methanol ((cid:0) l); VMeOH : Th tích

ầ ổ ((cid:0) ể V: T ng th tích c n pha l).

(cid:0) ỗ ị ử ố Thêm vào 500 (cid:0) l m i dung d ch 3000 ộ l thu c th BuOH HCl tr n

(cid:0) ế ậ ề ồ ủ ử ắ ố ộ ề ồ đ u r i thêm ti p 100 l thu c th s t. Tr n th t đ u r i các dung d ch ị ở

90oC trong th i gian 60 phút. ờ

Ẩ

Ị Ẫ 2.4 CHU N B M U PHÂN TÍCH

ế ủ ẫ Camellia ẫ Năm m u cao chi t methanol c a các m u Trà hoa vàng (

ạ Ứ ứ chrysantha) t ụ i phòng Nghiên c u và ng d ng Hóa sinh, trung tâm Nghiên

ể ệ ọ ệ ứ c u và Chuy n giao công ngh , vi n Hàn Lâm Khoa h c và Công ngh ệ

ệ ượ ố ượ Vi t Nam đ c cân chính xác kh i l ng và hòa tan hoàn toàn trong

ớ ồ methanol t ộ i n ng đ 1 mg/ml.

ế ủ ẫ ồ Cân 5 10 mg cao chi t c a 5 m u trà hoa vàng r i pha trong V (µl)

ượ ủ ẫ ồ ộ MeOH thu đ ỗ c m u có n ng đ 1 mg/ml. Hút chính xác 500 µl c a m i

ề ồ ử ẫ ộ ố m u trên, sau đó thêm 3000 µl thu c th BuOHHCl, tr n đ u r i thêm

ử ắ ế ố ị ti p 100 µl thu c th s t. Các dung d ch cũng đ ượ ủ c ờ trong th i gian và

ệ ộ ố ư ẩ ị nhi t đ gi ng nh các dung d ch chu n.

Ị Ẫ

Ẩ

Ả

Ớ Ạ

2.5 CHU N B M U KH O SÁT GI

Ệ I H N PHÁT HI N (LOD) VÀ GI

Ớ Ạ I H N

Ị

ƯỢ

Ủ

ƯƠ

Đ NH L

NG (LOQ) C A PH

NG PHÁP.

ế ầ ớ Ti n hành đo 10 l n song song v i proanthocyanidin A2 (20 (cid:0) g/ml).

ầ ượ ệ ố ị Hút chính xác 480 µl MeOH l n l t cho vào các ng nghi m ch u nhi ệ t,

ệ ủ ế ị ồ r i thêm ti p vào 20 µl dung d ch làm vi c c a proanthocyanidin A2 (500

ề ồ ử ế ố ộ (cid:0) g/ml). Thêm 3000 µl thu c th BuOHHCl, tr n đ u r i thêm ti p 100 µl

ử ắ ố ị ờ ở thu c th s t. Dung d ch cũng đ ượ ủ c trong th i gian 60 phút và nhi ệ ộ t đ

42 MSV:

ồ ế ụ ủ ẫ 90oC, r i ti n hành đo đ h p th quang c a 10 m u. ộ ấ

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ớ ạ ư ệ ị ị Xác đ nh gi i h n phát hi n LOD nh sau: Tính giá tr trung bình và

ẩ ộ ệ đ l ch chu n SD

LOD =

SD =

ứ Công th c tính LOQ:

LOD =

SD =

Ố Ệ

Ử

2.6 X LÝ S LI U

ủ ế ấ ị ượ ả K t qu đo đ ộ h p th ụ quang c a các dung d ch chu nẩ đ ử c x lý

ị ồ ủ ề ầ ộ ừ trên ph n m m Excel. T các giá tr n ng đ và đ ấ ộ h p th ụ quang c a dãy

ị ự ượ ườ ẩ ạ dung d ch proanthocyanidin A2, xây d ng đ c đ ng chu n có d ng y =

ầ ượ ộ ồ ị a.x+b, trong đó: x,y l n l t là n ng đ và đ ấ ộ h p th ủ ụ quang c a dung d ch

ộ ố ủ ườ ệ ố ặ ẩ proanthocyanidin A2, a là đ d c c a đ ng chu n, b là h s ch n.

ự ươ ườ ủ D a vào ph ng trình đ ẩ ng chu n và đ ộ h p thấ ụ quang c a các

ử ể ẫ ị ị ượ ươ dung d ch m u th , có th xác đ nh hàm l ng tanin t ngổ t ng đ ươ ng

ứ ẫ proanthocyanidin A2 trong m u đo theo công th c:

TC =

Trong đó:

ộ ấ ử ủ ụ ẫ Ai là đ h p th quang c a m u th i

ệ ố ặ ủ ườ ệ ố ộ ố ẩ a, b là h s đ d c và h s ch n c a đ ng chu n y = a.x + b

ộ ẫ ồ C là n ng đ m u th ử (mg/ml)

ượ ươ ươ TC: hàm l ng ổ tanin t ng t ng đ ng proanthocyanidin A2, mg

43 MSV:

ProA2E /g m uẫ cao chi t.ế

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ƯƠ

Ả

Ậ

Ế

CH

NG 3: K T QU VÀ TH O LU N

Ả

Ệ

Ế

Ề

Ị

3.1 K T QU XÁC Đ NH ĐI U KI N ĐO QUANG

ề ể ử ụ ự ự ệ ệ ả D a trên tài li u tham kh o [27] và th c nghi m s d ng v th tích

ả ứ ử ố ượ ấ ệ ộ ả ứ ờ thu c th ph n ng, l ng ch t phân tích, nhi t đ và th i gian ph n ng,

ạ ả ả ứ ể ự ề ệ ằ ẩ ọ pha loãng b ng MeOH, đ l a ch n đi u ki n ph n ng t o s n ph m có

ệ ụ ể ư ụ ề ấ ả ấ kh năng h p th quang cao nh t. Đi u ki n c th nh sau:

ư ụ ử ẩ ẩ ố ố ị ị + Chu n b thu c th nh m c 2.3.1 và dung d ch chu n g c, dung

ư ụ ẩ ị d ch chu n nh m c 2.3.2

(cid:0) ả ứ ị ượ ấ ổ ạ + Ph n ng t o màu đ nh l ng tanin t ng: L y 500 l dung d chị

ề ồ ử ẫ ố ộ ế m u, sau đó thêm vào 3000 µl thu c th BuOHHCl, tr n đ u r i thêm ti p

oC trong th i gian 60 phút,

ế ố ệ ộ ờ ử ắ 100 µl thu c th s t. Ti n hành ủ ở nhi t đ 90

ộ ở ệ ộ ể đ ngu i nhi t đ phòng.

ổ ấ ụ ả ẫ ắ ớ Quét ph h p th trong kho ng 400 800 nm v i m u tr ng là

ượ ả ứ ươ ự ư ẫ ổ ấ ử MeOH (đ c làm ph n ng t ng t ụ ủ nh m u th ). Ph h p th c a

44 MSV:

proanthocyanidin A2 thu đ ượ ở c hình 3.1

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ụ ủ

Hình 3.: Ph h p th c a proanthocyanidin A2 ủ ả ổ ấ ướ ế ả ấ ổ ấ c sóng cho th y ph UVVIS c a tanin có h p K t qu kh o sát b

λ ụ ự ượ th c c đ i t ạ ạ ướ i b c sóng = 550 nm, pic thu đ ậ ố c khá cân đ i. Vì v y

ề ệ ọ ị ch n đi u ki n đo quang xác đ nh tanin là:

ượ ấ L ng ch t phân tích: 500 µl

ử ử ể ố ố ố Th tích thu c th : 3000 µl thu c th BuOH HCl, 100 µl thu c th ử

s t.ắ

o = 90oC

ệ ộ ả ứ Nhi t đ ph n ng: t

ờ ả ứ Th i gian ph n ng: t = 60 phút

ộ ấ ướ ụ (cid:0) B c sóng đo đ h p th : = 550 nm

Ế

Ả

Ự

Ả

Ế

Ị

3.2 K T QU XÁC Đ NH KHO NG TUY N TÍNH VÀ XÂY D NG Đ

ƯỜ NG

CHU NẨ

ự ụ ữ ồ ế ế ả ộ ộ ớ ộ ấ Ti n hành kh o sát s ph thu c tuy n tính gi a n ng đ v i đ h p

45 MSV:

ủ ụ ẩ th quang c a proanthocyanidin A2 chu n.

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ế ể ẩ ộ ị ự Sau khi ti n hành pha m t dãy các dung d ch tiêu chu n đ xây d ng

ườ ế ẩ ộ ấ ụ ở ề đ ng chu n ta ti n hành đo đ h p th quang ọ ệ các đi u ki n đã ch n.

46 MSV:

ả ượ ế K t qu đ ả c trình bày trong b ng 3.1 và hình 3.2:

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ả ả ủ ế ế ả ả ị ượ B ng 3.: K t qu kh o sát kho ng tuy n tính c a quy trình đ nh l ng

ộ ấ STT C (µg/ml)

1 2 3 4 5 6 7 8 20 60 100 150 200 300 400 500 ụ Đ h p th quang (A) 0,0949 0,1933 0,3335 0,4566 0,5561 0,7726 0,9637 1,1967

ả ượ Kho ng đ nh l ng 20 500 (µg/ml)

ị R2 0,9952

47 MSV:

ườ ẩ ủ Hình 3.: Đ ng chu n c a proanthocyanidin A2

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

ệ ữ ộ ấ ộ ủ ụ ồ Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ ố M i quan h gi a đ h p th quang (A) và n ng đ c a proanthocyanidin

ượ ể ệ ươ A2 (C) đ c th hi n qua ph ng trình: y = 0,0022 x + 0,0853

Trong đó :

ộ ấ ủ ụ ị y là đ h p th quang c a dung d ch,

ộ ủ ẩ ồ x là n ng đ c a proanthocyanidin A2 chu n.

ệ ố ươ H s t ng quan : R2 = 0,9952.

ậ Nh n xét:

ồ ị ộ ừ ự ả ồ ấ D a trên đ th ta th y kho ng n ng đ t 20 500 (cid:0) g/ml có sự

ộ ấ ụ ữ ế ả ả ờ ộ ồ ồ tuy n tính gi a n ng đ và đ h p th quang là đ m b o. Đ ng th i so

ệ ố ươ ủ ồ ị ớ ớ ạ ậ ấ sánh h s t ng quan R c a đ th v i gi i h n ch p nh n h s t ệ ố ươ ng

2 = 0,9952 0,995 đ t yêu c u. ầ

ệ ấ ả ạ quan theo tài li u tham kh o [4], ta th y R

ủ ế ả ậ ươ ả ằ ừ V y kho ng tuy n tính c a ph ng pháp n m trong kho ng t 20 500

(cid:0) g/ml.

Ả Ớ Ạ

Ế

Ớ Ạ

Ị

3.3. K T QU GI

Ệ I H N PHÁT HI N (LOD) VÀ GI

I H N Đ NH L

ƯỢ NG

Ủ

ƯƠ

(LOQ) C A PH

NG PHÁP

ế ả ị ớ ệ ạ ớ ạ ị ượ K t qu xác đ nh gi i h n phát hi n, gi i h n đ nh l ủ ng c a

48 MSV:

ươ ượ ả ph ng pháp đ c trình bày theo b ng 3.2:

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ế ả ả ị ớ ạ ớ ạ ị B ng 3.: K t qu xác đ nh gi ệ i h n phát hi n (LOD) và gi i h n đ nh

ượ l ng (LOQ)

ồ ộ ấ STT ộ N ng đ (µg/ml)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 ụ Đ h p th quang (A) 0,0949 0,0939 0,1011 0,0896 0,1002 0,0903 0,1015 0,1006 0,0983 0,1001

ộ ệ ẩ 0,0043 Đ l ch chu n (SD)

6,45 LOD (µg/ml)

19,54 LOQ (µg/ml)

ế ả * Tính k t qu :

ộ ệ ẩ Đ l ch chu n:

SD =

= = 0,09705 (n = 10)

 SD = 0,0043

ớ ạ ệ Gi i h n phát hi n (LOD):

LOD = = = 6,45 (µg/ml)

49 MSV:

ớ ạ ị ượ Gi i h n đ nh l ng (LOQ):

LOQ = = = 19,54 (µg/ml) ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

ậ Nh n xét:

ậ ả ớ ạ ủ ệ V y kho ng gi i h n phát hi n (LOD) c a phép đo là 6,45 µg/ml và

ớ ạ ị ượ ủ ề gi i h n đ nh l ợ ng (LOQ) c a phép đo là 19,54 µg/ml đi u này phù h p

ị ồ ự ệ ế ả ộ ớ v i kho ng giá tr n ng đ mà th c nghi m đã ti n hành.

Ả Ị

Ế

ƯỢ

Ổ

Ụ

3.4. K T QU Đ NH L

Ư NG T NG TANIN NG NG T TRONG M T S

Ộ Ố

Ẫ

Ế

M U CAO CHI T TRÀ HOA VÀNG

ươ ượ ể ị ự ượ ụ Áp d ng ph ng pháp đã đ c xây d ng đ đ nh l ng hàm l ượ ng

ư ụ ộ ố ẫ ế ế ổ t ng tanin ng ng t có trong m t s m u cao chi t trà hoa vàng. Ti n hành

ư ụ ị ẫ ư ế ẩ ả ẫ ẩ chu n b m u nh m c 3.2.3 và phân tích nh các m u chu n. K t qu xác

ượ ư ổ ụ ượ ị đ nh hàm l ng t ng tanin ng ng t trong trà hoa vàng đ c trình bày theo

ả b ng 3.3:

ế ả ượ ộ ố ẫ ổ ả B ng 3.: K t qu phân tích hàm l ng tanin t ng trong m t s m u cao

ế chi t trà hoa vàng

ồ

N ng đồ ộ (mg/ml) ộ ấ Đ h p th (A)ụ

ượ Hàm l ng tanin ổ ẫ t ng trong m u cao ế chi t (mg ProA2E/g) Ký hi uệ m uẫ ộ ủ N ng đ c a ẫ các m u đo ườ ừ t ng đ chu nẩ (µg/ml)

1,00 0,3371 114,45 114,45 TV1

1,00 0,1892 47,23 47,23 TV2

1,00 0,1378 23,86 23,86 TV3

1,00 0,0975 5,55 5,55 TV4

1,00 0,2517 75,64 75,64 TV5

ậ Nh n xét:

ừ ế ả ả ẫ ấ T k t qu trong b ng 3.3, ta th y m u trà hoa vàng (TV1) có hàm

ấ ẫ ổ ượ l ng tanin t ng cao nh t 114,45 (mg ProA2E/g) và m u trà hoa vàng (TV4)

50 MSV:

ượ ấ ấ ổ ượ có hàm l ng tanin t ng th p nh t 5,55 (mg ProA2E/g). Hàm l ẫ ng m u

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

ấ ẫ ầ ớ Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ ề trà hoa vàng (TV1) cao g p 108,9 l n so v i m u trà hoa vàng (TV4). Đi u

ấ ượ ả ủ ẫ ồ này ph n ánh ch t l ề ố ng c a các m u không gi ng nhau, không đ ng đ u,

51 MSV:

ị ườ ề ẫ ặ ẩ ả m c dù các m u này đ u là s n ph m mua trên th tr ng.

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

Ậ

Ế

K T LU N

ậ ố ự ứ ề ệ ờ Qua th i gian nghiên c u và th c hi n đ tài khóa lu n t ệ t nghi p

ươ ị ượ ổ ự “Xây d ng ph ng pháp đ nh l ự ậ ằ ng tannins t ng trong th c v t b ng

ậ ượ ộ ố ế ả , em đã thu đ c m t s k t qu sau: ỹ k thu t đo quang’’

ị ượ ủ ả ươ 1. Xác đ nh đ ế c kho ng tuy n tính c a ph ớ ng pháp phân tích v i

ẩ ả ằ ừ ượ l ng proanthocyanidin A2 chu n n m trong kho ng t 20 500 (cid:0) g/ml.

ự ườ 2. Xây d ng đ ẩ ng chu n c a ủ proanthocyanidin A2: y = 0,0022 x +

0,0853 v i ớ R² = 0,9952.

ị ượ ớ ạ ệ ớ ạ ị ượ 3. Xác đ nh đ c gi i h n phát hi n và gi i h n đ nh l ủ ng c a

ươ ph ng pháp phân tích:

LOD = 6,45 (cid:0) g/ml,

LOQ = 19,54 (cid:0) g/ml

ượ ẫ ổ ế ị 4. Xác đ nh hàm l ng tanin t ng trong 5 m u cao chi t trà hoa vàng.

ế ấ ả ượ ứ ằ ổ K t qu cho th y hàm l ẫ ng tanin t ng trong 5 m u nghiên c u n m trong

52 MSV:

ừ ả kho ng t 5,55 114,45 (mg ProA2E/g).

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

Ả

Ệ

TÀI LI U THAM KH O

ế ệ Tài li u ti ng Vi ệ t

ậ ầ ượ ệ ườ Giáo trình D c li u h c [1]: Tr n Công Lu n (2016), ọ , Tr ạ ng Đ i

ọ h c Tây Đô, tr. 109 112.

ậ ạ ươ ổ Ph ng pháp phân tích ph phân t [2]: Ph m Lu n (2014), ử, Nhà

ấ ả ộ xu t b n Bách khoa Hà N i, tr. 57 108.

ế ụ ạ ọ ệ ể Ki m nghi m d ượ c ộ [3]: B Y t V khoa h c và đào t o (2005),

ấ ả ọ ph mẩ , Nhà xu t b n Y h c, tr. 104 110.

ự ể ệ ệ ẩ ố ệ [4]: Vi n ki m nghi m an toàn v sinh th c ph m qu c gia (2010),

ẩ ươ ọ ị Th m đ nh ph ng pháp trong phân tích hóa h c và vi sinh v t ậ , Nhà xu tấ

ậ ọ ộ ỹ ả b n khoa h c và k thu t Hà N i, tr. 32 39.

ệ ượ ệ ậ ố ộ Cây thu c và đ ng v t làm thu c ố ở ệ t Vi [5]: Vi n d c li u (2006),

ấ ả ậ ậ ọ ỹ Nam, t p II, Nhà xu t b n khoa h c và k thu t.

ệ ế Tài li u ti ng Anh

[6]: A. Scalbert, (1991), “Antimicrobial properties of tannins”,

Phytochemistry, 30, pp. 38753883

[7]: X.L. Liu, Y.Q. Hao, L. Jin, Z.J. Xu, T.A. McAllister, Y. Wang,

(2013), AntiEscherichia coli O157: H7 properties of purple prairie clover and

sainfoin condensed tannins, Molecules, 18, pp. 21832199

[8]: T.A. Mcallister, T. Martinez, H.D. Bae, A.D. Muir, L.J. Yanke,

G.A. Jones, (2005), “Characterization of condensed tannins purified from

legume forages: chromophore production, protein precipitation, and inhibitory

effects on cellulose digestion”, J Chem Ecol, 31 (9), p. 2049.

[9]: F. Uchiumi, T. Hatano, H. Ito, T. Yoshida, S. Tanuma, (2003),

“Transcriptional suppression of the HIV promoter by natural compounds”,

53 MSV:

Antivir Res, 58 (1), pp. 8998

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

[10]: G.T. Tan, J.M. Pezzuto, A.D. Kinghorn, S.H. Hughes, (1991),

“Evaluation of natural products as inhibitors of human immunodeficiency

virus type 1 (hiv1) reverse transcriptase”, J Nat Prod, 54 (1), p. 143

[11]: S. Ciesek, T. von Hahn, C.C. Colpitts, L.M. Schang, M. Friesland,

J. Steinmann, et al, (2011), “The green tea polyphenol, epigallocatechin3

gallate, inhibits hepatitis C virus entry”, Hepatology, 54, pp. 19471955

[12]: X. Terra, J. Valls, X. Vitrac, J.M. Mérrillon, L. Arola, A. Ardèvol,

et al, (2007), “Grapeseed procyanidins act as antiinflammatory agents in

endotoxinstimulated RAW 264.7 macrophages by inhibiting NFkB signaling

pathway”, J Agric Food Chem, 55, pp. 43574365

[13]: M. Park, H. Cho, H. Jung, H. Lee, K.T. Hwang, (2014),

“Antioxidant and antiinflammatory activities of tannin fraction of the extract

from black raspberry seeds compared to grape seeds”, J Food Biochem, 38

(3), pp. 259270

[14]: C.A. RiceEvans, N.J. Miller, G. Paganga, (1996), “Structure

antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids”, Free

Radic Bio Med, 20 (7), pp. 933956

[15]: W.F. Hodnick, E.B. Milosavljevic, J.H. Nelson, R.S. Pardini,

(1988), “Electrochemistry of flavonoids”, Biochem Pharmacol, 37, pp. 2607

2611

[16]: P.C.H. Hollman, M.B. Katan, (1999), “Dietary flavonoids: intake,

health effects and bioavailability”, Food Chem Toxicol, 37 (910), pp. 937

942

[17]: Masturah Markom, Masitah Hasana, Wan Ramli Wan Daudb,

Harcharan Singh, Jamaliah Md Jahim, (2007), “Extraction of hydrolysable

tannins from Phyllanthus niruri Linn.: Effects of solvents and extraction

54 MSV:

methods”, Separation and Puriﬁcation Technology, 52, pp. 48749

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ

[18]: Jyotismita Khasnabis, Chandan Rai, Arindam Roy, (2015),

“Determination of tannin content by titrimetric method from different types of

tea”, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 7 (6), pp. 238 241.

[19]: Trupti P. Durgawale, Pratik P. Durgawale, Chitra C. Khanwelkar,

(2016), “Quantitative estimation of tannins by HPLC”, Scholars Research

Library, 8 (3), pp. 123 126.

[20]: PhilipEdouard Shay, J. A. Trofymow, C. Peter Constabel, (2017),

An improved butanolHCl assay for quantification of watersoluble, acetone:

methanolsoluble, and insoluble proanthocyanidins (condensed tannins), (63),

pp. 1 11.

[21]: OiWah Lau, ShiuFai Luk, HsiaoLan Huang, (1989),

“Spectrophotometric determination of tannins in tea and beer samples with

iron (III) and 1,10phenanthroline as reagents”, (5), Analyst, pp. 631 633.

[22]: Tushar Dhanani, Sonal Shah, Satyanshu Kumar, (2015), “A

validated highperformance liquid chromatography method for determination

of tanninrelated marker constituents gallic acid, corilagin, chebulagic acid,

ellagic acid and chebulinic Acid in four Terminalia species from India”,

Journal of Chromatographic Science, 53 (4), pp. 625 632.

[23]: AOAC (1980), Official Methods of Analysis. Association of

Analytical Chemists, Arlington, USA.

[24]: J. H. Kang, S. T. Chung, J. H. Go, K. H. Row, (2000),

“Separation of epigallocatechin gallate from Korean green tea by RPHPLC”,

Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, (23), pp. 2739

2749.

[25]: XueLi Cao, Yu Tian, TianYou Zhang, Yoichiro Ito, (2001),

55 MSV:

“Separation and puriﬁcation of three individual catechins from tea polyphenol

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183

ệ ậ ố t

Liquid Chromatography & of Khoa Công ngh Hóa Khóa lu n t nghi pệ mixture by CCC”, Journal

RelatedTechnologies, (24), pp.1723 1732.

[26]: Maria Atanassova, Valentina ChristovaBagdassarian, (2009),

“Determination of tannins content by titrimetric method for comparison of

different plant species”, Journal of the University of Chemical Technology

and Metallurgy,44 (4), pp. 413 415.

[27]: Porter, L.J., Hrstich, L.N., Chan, B.G., (1986), “The conversion

of procyanidins and prodelphinidins to cyanidin and delphinidin”,

56 MSV:

Phytochemistry (25), pp.223 230.

ị ạ SV: Ph m Th Hoa 1141120183