BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
BÙI THỊ PHƯƠNG THẢO
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM
CỦA RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ
(POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC - POLYGONACEAE)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
TPHCM - 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
BÙI THỊ PHƯƠNG THẢO
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM
CỦA RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ
( POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC - POLYGONACEAE)
Chuyên ngành : Sản xuất và phát triển thuốc
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
Hướng dẫn khoa học: ThS. Nguyễn Thị Hồng Phúc
TPHCM - 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong
khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Chữ ký sinh viên
SV. BÙI THỊ PHƯƠNG THẢO
LỜI CẢM ƠN
Quãng thời gian đại học 5 năm tại khoa Dược trường Đại học Nguyễn Tất Thành
đã để lại trong tôi rất nhiều kỉ niệm đẹp về thầy cô và bạn bè. Một chặng đường dài
nổ lực và cố gắng cùng chúng bạn, may mắn thay chặng đường cuối ấy tôi được thực
hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Để khóa luận của tôi được hoàn thành không chỉ là sự cố gắng của bản thân mà
còn có rất nhiều sự giúp đỡ động viên từ gia đình, các thầy cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên và bạn bè. Xin gửi ngàn lời cảm ơn tới ba mẹ đã sinh thành và cho con một
cuộc sống thật tốt, cảm ơn các anh chị đã luôn yêu thương em.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
Cô ThS. Nguyễn Thị Hồng Phúc
Cô PGS. TS. Võ Thị Bạch Huệ
Cô TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy
đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn thầy DS. Phan Cảnh Trình, các anh (chị) và các bạn
bộ môn Vi sinh – Ký sinh khoa Dược – ĐH Y Dược Tp. HCM đã hướng dẫn và giúp
đỡ em trong thời gian làm việc tại đây.
Cảm ơn tất cả các Thầy, Cô và Anh, Chị kỹ thuật viên của khoa Dược – Trường
ĐH Nguyễn Tất Thành, đặc biệt là thầy Đoàn Phú Quý, chị Trần Hà Linh kỹ thuật
viên bộ môn Kiểm nghiệm đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.
Cảm ơn tất cả bạn bè của tôi, những người đã đồng hành cùng tôi trong 5 năm qua
và những người bạn cùng làm đề tài khóa luận tốt nghiệp niên khóa 2013 – 2018.
.
MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... v
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1 Tổng quan về dược liệu ..................................................................................... 3
1.1.1 Vị trí phân loại, hình thái và phân bố .......................................................... 3
1.1.2 Bộ phận dùng và công dụng dân gian ......................................................... 4
1.1.3 Thành phần hóa học .................................................................................... 4
1.1.4 Hoạt tính sinh học ........................................................................................ 7
1.2 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về hoạt tính kháng vi sinh vật của
rễ cây cốt khí củ ....................................................................................................... 9
1.3 Tình hình bệnh nhiễm trùng và thuốc điều trị hiện nay ................................... 10
1.3.1 Tình hình bệnh nhiễm vi khuẩn và thuốc điều trị ..................................... 10
1.3.2 Tình hình bệnh nhiễm vi nấm và thuốc điều trị ........................................ 11
1.4 Tổng quan về vi khuẩn và vi nấm gây bệnh trên người .................................. 12
1.4.1 Escherichia coli ........................................................................................ 12
1.4.2 Pseudomonas aeruginosa .......................................................................... 13
1.4.3 Staphylococcus aureus .............................................................................. 13
1.4.4 Candida albicans ....................................................................................... 14
1.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật .......................................... 15
1.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật ......................................................... 15
1.5.2 Xác định giá trị MIC ................................................................................. 15
1.5.3 Kỹ thuật hiện hình sinh học ....................................................................... 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 16
2.1 Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 16
2.1.1 Nguyên liệu ............................................................................................... 16
i
2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm .............................................................................. 16
2.1.3 Môi trường nuôi cấy và thử hoạt tính kháng vi sinh vật ........................... 16
2.1.4 Hóa chất, dung môi ................................................................................... 17
2.1.5 Dụng cụ, trang thiết bị ............................................................................... 18
2.2 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 19
2.2.1 Khảo sát sơ bộ thực vật học rễ cốt khí củ.................................................. 19
2.2.2 Lựa chọn dung môi chiết xuất rễ cốt khí củ .............................................. 21
2.2.3 Khảo sát việc chiết tách cao toàn phần và tách phân đoạn với dung môi có
độ phân cực khác nhau từ rễ cốt khí củ. ............................................................. 21
2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cốt khí củ .............................. 23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 26
3.1 Kết quả ............................................................................................................. 26
3.1.1 Khảo sát thực vật học rễ cây cốt khí củ ..................................................... 26
3.1.2. Lựa chọn dung môi chiết xuất .................................................................. 29
3.1.3 Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn .............................................. 31
3.1.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật ......................................................... 31
3.2 Bàn luận ........................................................................................................... 38
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 40
4.1 Kết luận ............................................................................................................ 40
4.2 Kiến nghị.......................................................................................................... 40
ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ tiếng Anh Chữ viết đầy đủ tiếng Việt
Chloroform CHCl3
Extended - spectrum beta – Mở rộng phổ beta – lactamases ESBL lactamases
Ethyl acetat EtOAc
Hepatitis B virus Virus viêm gan B HBV
Intensive care unit Đơn vị hồi sức tích cực ICU
Minimal bactericidal Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC concentratiol
Methanol MeOH
MIC Minimal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu
Meticilline - resistant Staphylococcus aureus kháng MRSA Staphylococcus aureus kháng sinh meticilline
Meticilline - susceptible Staphylococcus aureus còn MSSA Staphylococcus aureus nhạy với kháng sinh meticilline
Sắc ký lớp mỏng SKLM
Therapeutic index Chỉ số điều trị TI
Thuốc thử TT
World Health Organization Tổ chức y tế thế giới WHO
Dimethyl sulfoxide DMSO
Dược điển Việt Nam DĐVN
Optic density Mật độ quang học OD
Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU
Human immunodeficiency virus Hội chứng suy giảm miễn dịch HIV infection mắc phải ở người
iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Sơ đồ phân loại thực vật cây cốt khí củ ....................................................... 3
Hình 1.2 Toàn cây (A), lá và hoa (B), rễ (C) của cây cốt khí củ ................................ 4
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học emodin, chrysophanol và physion ................................... 5
Hình 1.4 Cấu trúc các chất thuộc nhóm stilbenoids có hoạt tính kháng virus ............ 9
Hình 1.5 Escherichia coli .......................................................................................... 12
Hình 1.6 Pseudomonas aeruginosa .......................................................................... 13
Hình 1.7 Staphylococcus aureus ............................................................................... 13
Hình 1.8 Candida albicans ....................................................................................... 14
Hình 2.1 Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn ......................... 20
Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn ..................................... 22
Hình 3.1 Rễ cốt khí củ ............................................................................................... 26
Hình 3.2 Soi bột rễ cốt khí củ ................................................................................... 27
Hình 3.3 Phản ứng hóa học định tính alkaloid, coumarin và tanin ........................... 28
Hình 3.4 Phản ứng hóa học định tính anthranoid, saponin, chất khử và acid hữu cơ
................................................................................................................................... 28
Hình 3.5 Sắc ký đồ hệ dung môi Toluen - EtOAc (93:7) ......................................... 29
Hình 3.6 Sắc ký đồ hệ dung môi CHCl3 - EtOAc (11:1) .......................................... 30
Hình 3.7 Sắc ký đồ hệ dung môi MeOH - EtOAc - H2O (13,5:100:10) ................... 30
Hình 3.8 Kết quả vòng kháng khuẩn MSSA ............................................................. 32
Hình 3.9 Kết quả vòng kháng khuẩn MRSA ............................................................ 33
Hình 3.10 Kết quả vòng kháng khuẩn C. albicans ................................................... 33
Hình 3.11 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn n - hexan ............................................ 36
Hình 3.12 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn chloroform ......................................... 36
Hình 3.13 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn ethyl acetat ........................................ 37
Hình 3.14 Sắc ký lớp mỏng cao toàn phần, n - hexan, chloroform, ethyl acetat và cao
nước. .......................................................................................................................... 37
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Các chất đã được phân lập từ cây Cốt khí củ .............................................. 6
Bảng 2.1 Các vi si sinh vật thử nghiệm .................................................................... 16
Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi .................................................................................... 17
Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng ................................................................................ 18
Bảng 2.4 Bảng đối chiếu đường kính vòng kháng vi sinh vật .................................. 24
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học rễ cốt khí củ ................................... 27
Bảng 3.2 Khối lượng cao toàn phần và cao phân đoạn ............................................. 31
Bảng 3.3 Đường kính vòng ức chế vi sinh vật của cao toàn phần và cao phân đoạn
(mm) .......................................................................................................................... 34
Bảng 3.4 Kết quả MIC của cao toàn phần và các cao phân đoạn trên vi khuẩn MSSA
và MRSA (mg/ml) ..................................................................................................... 35
Bảng 3.5 Bảng kết quả giá trị Rf ............................................................................... 37
v
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - Năm học 2017 – 2018
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA RỄ CÂY CỐT
KHÍ CỦ (POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC - POLYGONACEAE)
Bùi Thị Phương Thảo
Hướng dẫn khoa học: ThS. Nguyễn Thị Hồng Phúc
Mở đầu: Bệnh lý về nhiễm trùng ngày một thay đổi do các vi sinh vật biến đổi theo hướng bất
lợi. Tình trạng kháng kháng sinh là vấn đề của y tế toàn cầu hiện nay. Vì vậy, việc đi tìm những
loại kháng sinh mới thực sự cần thiết. Xuất phát từ vấn đề trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu
“KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA RỄ CÂY CỐT KHÍ
CỦ POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC - POLYGONACEAE”.
Đối tượng nghiên cứu: Rễ của cây cốt khí củ, tên khoa học Polygonum cuspidatum Sieb. et
Zucc họ Polygonaceae.
Phương pháp nghiên cứu: Chiết xuất cao với dung môi ethanol 80 % (TT). Khảo sát khả năng
kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và đánh giá MIC trên các chủng
vi khuẩn thử nghiệm. Xác định vết cho hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật hiện hình sinh học.
Kết quả: Cao toàn phần và các cao phân đoạn cho khả năng kháng tốt chủng MSSA, MRSA
và C. albicans, với MIC từ 0,45 – 4,55 mg/ml. Cao phân đoạn n – hexan và chloroform cho
nồng độ MIC thấp nhất đối với hai chủng vi khuẩn MSSA và MRSA (MIC = 0,45 mg/ml).
Bằng kỹ thuật hiện hình sinh học đã xác định được vết số 4 (Rf = 0,80) trên sắc ký đồ cho khả
năng kháng MSSA.
Kết luận: Cao toàn phần và cao phân đoạn của rễ cây cốt khí củ có tiềm năng lớn trong việc
tìm ra các ứng dụng điều trị chống lại các chủng vi sinh vật đề kháng thuốc.
Từ khóa: Cốt khí củ, dịch chiết cồn, cao phân đoạn, kháng vi khuẩn, kháng vi nấm.
Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2017 - 2018
ANTIMICROBIAL AND ANTIFUNGAL ACTIVITIES OF THE ROOT OF
POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC – POLYGONACEAE
Bui Thi Phuong Thao
Supervisor: M.S Nguyen Thi Hong Phuc
Introduction: Infection diseases is changing because bacteria is also changing by day, and it
certainly is not a good change. Antibiotic resistance is a global health problem. Therefore,
finding new antibiotics are a matter of urgency, from that issue we had done the research
“ANTIMICROBIAL AND ANTIFUNGAL ACTIVITIES OF THE ROOT OF POLYGONUM
CUSPIDATUM SIEB. ET ZUCC – POLYGONACEAE”.
Materials: The dried root of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc, Polygonaceae.
Methods: The antibacterial activities of the extracts and fractions were determined by the well
diffusion agar and minimum inhibitory concentration (MIC) methods. Using bioautography to
identify traces for antimicrobial activity.
Results: Morphological description and identification of constituents are the same as in the
Viet Nam pharmacopoeias, volume V. Major chemical compositions: Anthranoid, flavonoid,
coumarin and tanin. 80 % Ethanol is selected as a solvent to extract roots. All the crude extract
and fractions possesses a broader antibacterial spectrum and greater antibacterial activities
against MSSA, MSRA and C. albicans, with a range of MIC values between 0,45 – 4,55
mg/mL. The n - hexan and chloroform fractions of the ethanol extracts had lowest MIC (0,45
mg/mL) on MSSA and MRSA. By bioautography we found out that track 4 (Rf = 0,80) had
antimicrobial activitives against MSSA.
Conclusion: The crude extract and fractions from Polygonum cuspidatum may provide a
promising antibacterial agent for therapeutic applications against drug - resistant bacteria.
Keywords: Polygonum cuspidatum, ethanol extract, fractions, antimicrobial activity,
antifungal activity.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội ngày càng phát triển kéo theo đó là những hệ luỵ lớn như: ô nhiễm môi
trường, sự biến đổi của khí hậu, ô nhiễm thực phẩm,...Con người ngày nay cũng chịu
tác động bởi rất nhiều yếu tố bên ngoài vì vậy mà bệnh tật cũng ngày một gia tăng về
số lượng và biến đổi về độc tính đặc biệt là các bệnh nhiễm trùng.
Tình trạng kháng kháng sinh là vấn đề của y tế toàn cầu hiện nay. Theo “Báo cáo
sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008-2009”
mức độ kháng kháng sinh phổ biến trong nhóm vi khuẩn Gram âm bao gồm:
Acinetobacter sp., P. aeruginosa, E. coli và Klebsiella sp, khoảng 30-70 % vi khuẩn
Gram âm kháng các kháng sinh cephalosporin thệ hệ 3 và 4, xấp xỉ 40-60 % kháng
với các kháng sinh nhóm aminoglycosides và fluoroquinolones. Có tới 40 % các
chủng Acinetobacter sp. giảm nhạy cảm với imipenem [3]. Trong số các nước thuộc
mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP), Việt Nam có
mức độ kháng penicillin cao nhất (71,4 %) và kháng erythromycin (92,1 %) [34]. 75
% các chủng Pneumococci kháng với 3 loại kháng sinh trở lên [22].
Xuất phát từ thực tiễn nan giải trên việc nghiên cứu tìm ra phương thuốc mới điều
trị bệnh nhiễm trùng mang tính cấp thiết. Đầu tư nghiên cứu phát triển nguồn nguyên
liệu hóa dược, dược liệu là chía khóa để giải quyết hữu hiệu thực trạng này. Tuy
nhiên, với điều kiện kinh tế, kỹ thuật của một nước đang phát triển như Việt Nam,
việc sản xuất nguyên liệu hóa dược còn nhiều hạn chế. Thêm vào đó, Việt Nam giàu
tiềm năng cây thuốc, vì vậy việc nghiên cứu và phát triển thuốc từ dược liệu tạo thuận
lợi để ngành công nghiệp dược nước ta phát triển theo hướng hiện đại hóa các thuốc
y học cổ truyền, thuốc có nguồn gốc dược liệu và tận dụng nguồn tài nguyên dược
liệu.
Từ lâu, dân gian đã sử dụng cốt khí củ làm thuốc hạ cholesterol, chống ho, giãn
phế quãn, cầm máu, ức chế tụ cầu,…Các stilben trong cốt khí củ, đặc biệt là
resveratrol có tác dụng làm giảm LDL, chống oxi hóa, ngăn chặn sự phát triển của
ung thư da, làm giảm tổn thương ở tổ chức gan. Lấy nền tảng từ kinh nghiệm dân
1
gian và một số công trình nghiên cứu về cây cốt khí củ, chúng tôi tiến hành đề tài
“Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của rễ cây cốt khí củ Polygonum
cuspidatum Sieb. Et Zucc - Polygonaceae” với các mục tiêu cụ thể như sau:
1. Khảo sát thực vật học rễ cốt khí củ.
2. Khảo sát việc chiết tách cao toàn phần và tách phân đoạn với dung môi có độ
phân cực khác nhau từ rễ cốt khí củ.
3. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cốt khí củ.
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về dược liệu
1.1.1 Vị trí phân loại, hình thái và phân bố
Cốt khí củ còn gọi là huyết đan, tử kim long, ban trượng căn, hổ trượng căn, điền
thất. Tên khoa học: P. cuspidatum Sieb. et Zucc. Theo phân loại thực vật học cốt khí
củ thuộc:
Giới: Thực vật
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Polygonales
Họ: Polygonaceae
Phân họ: Polygonoideae
Chi: Polygonum
Loài: Polygonum cuspidatum
Hình 1.1 Sơ đồ phân loại thực vật cây cốt khí củ
Cốt khí củ có nguồn gốc ở vùng Đông Á, sau lan xuống khắp các vùng cận nhiệt
đới và nhiệt đới, bao gồm Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào và một
vài nơi khác. Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở vùng núi cao, từ 1000 - 1600 m và
được trồng rải rác trong nhân dân ở vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ [10].
Cốt khí củ là cây nhỏ sống lâu năm, cao 0,50 – 1 m. Trên thân và cành thường có
những đốm tím hồng. Lá mọc so le, cuống ngắn, bóng và có màu hồng. Phiến lá hình
trứng rộng, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới màu nhạt hơn, dài 5 – 12 cm rộng 3,5 – 8
cm, đỉnh lá có mũi nhọn. Bẹ chìa ngắn. Hoa mọc thành chùm ở nách lá. Hoa nhỏ màu
trắng. Hoa đực 8 nhị, hoa cái có bầu 3 góc. Qủa 3 cạnh màu nâu đỏ [20].
Cốt khí củ ưa sáng, ưa ẩm, nhưng ráo nước (úng ngập dễ làm thối củ) thường mọc
thành khóm trong các thung lũng, nơi gần nguồn nước. Cây sinh trưởng mạnh từ mùa
xuân đến mùa thu, bắt đầu cho thu hoạch củ từ tháng 9 trở đi.
3
Hình 1.2 Toàn cây (A), lá và hoa (B), rễ (C) của cây cốt khí củ
1.1.2 Bộ phận dùng và công dụng dân gian
Củ cốt khí là rễ phơi hay sấy khô của cây cốt khí củ. Dược liệu có mặt ngoài nâu
xám, sần sùi, nhăn nheo theo chiều dọc, có các mấu đốt và gióng, mặt cắt ngang màu
vàng bẩn, lõi gần như rỗng, phần không rỗng có màu nâu sẫm. Chất nhẹ, hơi cứng,
mùi không rõ, vị hơi đắng [2].
Theo y học cổ truyền, rễ cốt khí củ có vị đắng, tính ấm. Quy kinh can, tâm bào với
công năng hoạt huyết thông kinh, chỉ thống, trừ phong thấp, thanh thấp nhiệt, tiêu
viêm, sát khuẩn. Ở Việt Nam rễ cốt khí củ thường được dùng để chữa tê thấp, tổn
thương đau đớn do bị ngã, bị thương, là một vị thuốc thu liễm cầm máu.
1.1.3 Thành phần hóa học
Thành phần hóa học nổi bật của rễ cốt khí củ là hai nhóm chất chính chiếm hàm
lượng lớn là các anthranoid (chủ yếu là anthraquinon) và các stilbenoid. Đây là các
thành phần hóa học quyết định cho nhiều hoạt tính có giá trị của cốt khí củ như kháng
khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa, phòng ngừa bệnh tim mạch… Bên cạnh đó nó
cũng bao gồm nhiều nhóm hợp chất khác như flavonoid, phenylpropanoid, phenol,
quinone, acid amin, bổ trợ với hai nhóm hợp chất chính làm cho cốt khí củ có hoạt
tính sinh dược học cao. Rễ chứa các dẫn chất anthranoid ở dạng tự do và dạng kết
hợp glycosid với hàm lượng 0,1 – 0,5 %. Các thành phần đã được xác định:
chrysophanol, emodin, physcion, emodin 8 - 𝛽 – glucosid. Ngoài các dẫn chất
4
anthranoid trong rễ còn có polydatin là một stilben glucoside khi thủy phân cho
resveratrol. Trong rễ còn có tanin [20]. Dựa vào các kỹ thuật phân tích phổ 3 hợp chất
đã được phân lập từ cao ether dầu hỏa và cao ethyl acetat của rễ Cốt khí (Polygonum
cuspidatum Sieb. et Zucc.). Dựa vào các kỹ thuật phân tích phổ UV, EIMS, H-NMR
và C-NMR người ta nhận thấy hai trong ba hợp chất này được xác định là emodin và
physcion. Hợp chất thứ ba được định tính sơ bộ là một dẫn chất của resveratrol [21].
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học emodin, chrysophanol và physion
5
Một số nhóm chất đã được phân lập từ rễ cốt khí củ được thể hiện trong bảng 1.1
Bảng 1.1 Các chất đã được phân lập từ cây Cốt khí củ [31]
Nhóm Stt Chất được phân lập chất
Quinones Physcion 1
Emodin 2
Fallacinol 3
Questin 4
Anthraglycoside A 5
6 Stilbenes Resveratrol
7 Polydatin
8 Resveratrol-4′-O-glucoside
9 Resveratrol 4-O-D-(2′-galloyl)glucopyranoside
10 Resveratrol 4-O-D-(6′-galloyl)glucopyranoside
Flavonoid 11 Rutin
12 Quercetin
13 Querectin-3-O-arabinoside
14 Quercitrin
15 Hyperoside
Counmarin 16 Coumarin
và ligans 17 7-Hydroxy-4-methoxy-5-methylcoumarin
18 Sodium (−)-lyoniresinol-2a-sulfate
19 Sodium (+)-isolaricireinol-2a-sulfate
Hợp chất 20 Protocatechuic acid
khác 21 2,5-Dimethyl-7-hydroxy chromone
22 Torachrysone-8-O-d-glucoside
23 5,7-Dihydroxy-1(3H)-isobenzofuranone
6
1.1.4 Hoạt tính sinh học
1.1.4.1 Chống oxy hóa
Các nhà khoa học Chin-Yuan Hsu, Yu-Pei Chan và Jeli Chang đã nghiên cứu chiết
xuất ethanol của P. cuspidatum có khả năng chống oxy hóa. Các kết quả cho thấy giá
trị IC50 (nồng độ ức chế 50 % gốc tự do DPPH) của chiết xuất P. cuspidatum là 110
μg/ml thấp hơn so với (+) – catechin và L – ascorbic trong phương pháp dọn gốc tự
do DPPH. Trong phương pháp dọn các gốc superoxide là 3,2 μg/ml và 8 μg/ml trong
phương pháp peroxid hóa lipid. Kết quả này tốt hơn hẳn so với IC50 của (+) – catechin
trong phương pháp dọn các gốc superoxide là 40 μg/ml và 17 μg/ml trong phương
pháp peroxid hóa lipid. Dịch chiết P. cuspidatum còn có khả năng bảo vệ ADN trước
tác nhân UV và H2O2 gần như hoàn toàn với liều 5000 μg/ml. Các tổng phenol và
hàm lượng flavonoid của dịch chiết là 641,1 ± 42,6 mg/g và 62,3 ± 6,0 mg/g [25].
Chất chiết xuất ethanol và ethyl acetat của P. cuspidatum có tác dụng đáng kể đối
với các gốc DPPH và hydroxyl. Tổng hàm lượng phenolic của P. cuspidatum là
276,78 ± 39,31 và 231,73 ± 5,04 mg/ml. Cả hai chất chiết xuất đều cho tác động bảo
vệ chống lại sự phân rã sợi DNA do gốc hydroxyl gây ra [27].
1.1.4.2 Ngừa ung thư
Chiết xuất ethanol và ethyl acetat của rễ P. cuspidatum gây ra quá trình tự chết tế
bào apoptosis và ức chế sự tăng trưởng ở các dòng tế bào A549 và H1650, điều này
cho thấy rằng chất chiết xuất từ rễ P. cuspidatum có tác dụng chống tăng sinh trên tế
bào ung thư phổi ở người [27].
1.1.4.3 Trị đái tháo đường
Protein kinase AMP đóng vai trò trung tâm trong việc điều tiết chuyển hóa glucose
và lipid, do đó nó được coi là một mục tiêu trị liệu mới cho hội chứng chuyển hóa
như bệnh đái tháo đường type 2. Resveratrol đã được chỉ rõ là làm tăng hấp thu
glucose trong tế bào C2C12 thông qua kích hoạt protein kinase AMP, nó làm giảm
HG-do superoxid sản xuất thông qua việc tăng SIRT1 trong bạch cầu đơn nhân, đây
là một dấu hiệu cho thấy tiềm năng trị đái tháo đường của resveratrol [30,37].
1.1.4.4 Giảm đau, chống trầm cảm
7
Ở Việt Nam, độc tính cấp và tác dụng giảm đau, an thần của cốt khí củ cũng đã
được nghiên cứu, theo đó ở liều 80 g/kg ở chuột nhắt trắng gấp 200 lần liều dùng lâm
sàng, cốt khí củ vẫn chưa gây ra độc tính cấp, đây cũng là liều tối đa cho chuột cống
uống được. Kết quả nghiên cứu về tác dụng giảm đau cho thấy cốt khí củ giảm đau
theo kiểu Morphin (tác động lên vỏ não và trung tâm dưới vỏ gây ra một phản ứng
kích thích hệ thống giảm đau) và theo cơ chế ngoại biên. Ngoài giảm đau, cốt khí củ
còn có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, làm giảm các hoạt động của chuột
nhưng không gây ngủ, làm giảm đáp ứng kích thích tiếng động, ánh sáng, ức chế
được một phần trạng thái hưng phấn do cafein gây ra [14].
Tác dụng chống trầm cảm của resveratrol thể hiện ở việc làm gia tăng đáng kể
serotonin và noradrenaline ở mức liều 40 hoặc 80 mg/kg ở các vùng não, có thể liên
quan đến kích hoạt serotonergic và noradrenergic, ức chế hoạt động của monoamin
oxidase A (MAO-A ) [36].
1.1.4.5 Kháng virus
Một nghiên cứu khác của các chất từ chiết xuất cồn và nước của P. cuspidatum.
chống lại virus viêm gan HBV trong tế bào HepG2. Chiết xuất ethanol của P.
cuspidatum có thể ức chế vào việc sản xuất HBV với liều tối thiểu hiệu quả là
10 μg/ml. Chiết xuất nước của P. cuspidatum cũng có thể ức chế sự sản xuất HBV ở
liều cao 30 μg/ml. Sự biểu hiện của HBsAg được tăng lên đáng kể trong cả chiết xuất
ethanol và chiết xuất nước nhưng nó phụ thuộc vào liều và thời gian. Nhưng chiết
xuất nước ở mức liều cao lại ức chế sự biểu hiện của HbeAg, dịch chiết nước chỉ có
thể làm tăng HbeAg ở mức liều 3 μg/ml [23].
Chiết xuất ethanol 70 % của P. cuspidatum cho thấy tác dụng ức chế chống lại sự
hình thành đồng bộ hóa HIV-1 ở nồng độ không độc tế bào trên in vitro với EC50
(nồng độ ức chế 50 % sự sao chép của virus) là 13,94 ± 3,41 µg/ml. Thông qua phân
đoạn có hoạt tính sinh học, 20 hợp chất phenolic, bao gồm tám chất trong nhóm
stilbenoids, được phân lập từ rễ của P. cuspidatum. Kết quả cho thấy các hợp chất 1,
13, 14 và 16 biểu hiện hoạt tính kháng virus khá mạnh chống lại tế bào cytopathic do
HIV-1 gây ra trên các tế bào lympho C8166 ở nồng độ không gây độc tế bào, với giá
8
trị EC50 (nồng độ ức chế 50% sự sao chép của virus) là 4,37 ± 1,96 µg/ml, 19,97 ±
5,09, 14,40 ± 1,34 µg/ml và 11,29 ± 6,26 µg/ml và giá trị của chỉ số trị liệu (TI) lần
lượt là là 8,12, lớn hơn 10,02, lớn hơn 13,89 và lớn hơn 17,71 [26].
Hình 1.4 Cấu trúc các chất thuộc nhóm stilbenoids có hoạt tính kháng virus
1.2 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về hoạt tính kháng vi sinh vật
của rễ cây cốt khí củ
Trong thời gian nghiên cứu chúng tôi tìm kiếm được một số công trình nghiên cứu
ngoài nước về hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cây cốt khí củ.
Nghiên cứu thử kháng khuẩn được thực hiện trên ba chủng Gram dương B. cereus, L. monocytogenes, S. aureus, hai chủng Gram âm E. coli và S. anatum. Người ta thấy
rằng các chủng vi khuẩn Gram dương nhạy cảm hơn so với chủng vi khuẩn Gram âm, chúng bị ức chế sự tăng trưởng ở nồng độ thấp và cũng có thể bị tiêu diệt trong đó S. aureus bị ức chế mạnh nhất, tiếp theo đó là L. monocytogenes và B. cereus với MIC
156,3 – 312,5 μg/mL và MBC 312,5 – 1250 μg/ml. Đối với chủng vi khuẩn Gram âm
S. anatum nhạy cảm hơn E. coli, MIC và MBC đối với Gram âm phải đạt hơn 2500
μg/ml [32].
9
Nghiên cứu trên chủng vi khuẩn kháng thuốc khác gồm có S. aureus, A. baumannii
và P. aeruginosa nhận thấy phân đoạn ethyl ether (EE) của chiết xuất ethanol có phổ
kháng khuẩn rộng hơn và hoạt tính kháng khuẩn lớn hơn với các giá trị MIC từ 0,1 -
3,5 mg/ml. Chiết xuất EE cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất và phổ kháng khuẩn
rộng đối với các chủng S. aureus, A. baumannii và P. aeruginosa với các vùng ức
chế trung bình là 26,00 mm, 20,33 mm và 17,00 mm. Chiết xuất ethyl acetat cho hoạt
tính kháng khuẩn hơi thấp hơn so với chiết xuất EE [35].
P. cuspidatum đã được sử dụng trong y học dân gian Hàn Quốc để cải thiện vệ
sinh răng miệng, khi nghiên cứu trên 2 chủng vi khuẩn cư trú và gây bệnh tại khoang
miệng Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus người ta thấy rằng dịch chiết
cốt khí củ cho khả năng kháng khuẩn rộng với MIC 0,50 – 4,00 mg/ml, MBC cao gấp
hai đến bốn lần MIC [33].
1.3 Tình hình bệnh nhiễm trùng và thuốc điều trị hiện nay
1.3.1 Tình hình bệnh nhiễm vi khuẩn và thuốc điều trị
Trong các biến chứng của đái tháo đường liên quan tới nhiễm trùng thì nhiễm
trùng da và mô mềm đang trở thành nguyên nhân hàng đầu gây tàn tật và tử vong.
Nghiên cứu của Vũ Ngọc Hiếu và Phạm Hồng Nhung thực hiện trên 487 bệnh nhân
đái tháo đường có bệnh phẩm nhiễm trùng da và mô mềm dương tính với vi tại Bệnh
viện Bạch Mai. Tỉ lệ vi khuẩn gram âm chiếm 55,7 %. Tỉ lệ phân lập được đa tác
nhân là 14,7 %. Tác nhân hàng đầu phân lập được là S. aureus (34,2 %). Tỉ lệ S.
aureus kháng methicillin (MRSA) là 53,7 %. Tất cả các chủng S. aureus và hầu hết
các chủng Enterococcus spp. còn nhạy vancomycin. Đa số các vi khuẩn thuộc họ
Enterobacteriaceae còn nhạy với nhóm carbapenem và amikacin. P. aeruginosa có tỉ
lệ kháng kháng sinh nhóm carbapenem tương đối cao, còn khá nhạy với piperacillin-
tazobactam và amikacin [12]. Tại khoa ICU bệnh viện Nhân Dân Gia Định khi lấy
mẫu bệnh phẩm của 220 bệnh nhân để phân tích. Kết quả cho thấy đề kháng kháng
sinh thường gặp là ceftriaxone 88 %, ceftazidime 80 %, ciprofloxacin 77 %, cefepim
75 %, levofloxacin 72 %. Nhìn chung, tỉ lệ đề kháng cho từng kháng sinh một là 93
%, kháng cùng lúc hai loại kháng sinh 87 %. Ba tác nhân vi khuẩn chính yếu phân
10
lập được là A. baumannii , K. pneumoniae , P. aeruginosa.[19].
Việc sử dụng thuốc có nguồn gốc hóa dược để điều trị tuy có nhiều kết quả khả
quan nhưng lại làm tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh. Thảo dược
đang ngày càng chứng minh được vai trò quan trọng của chúng trong y học như là
một giải pháp an toàn sinh học, thay thế cho các thuốc hóa học tổng hợp. Các loại cao
chiết của cây môn ngọt đều cho hiệu quả tương đương hoặc cao hơn so với thuốc
kháng sinh ampicillin (ở nồng độ 5 µg/ml) đối với khả năng ức chế loài vi khuẩn E.
coli [6]. Các loại cao của cây huyền diệp, tô mộc, đơn đỏ, mò hoa trắng, sài đất, mỏ
quạ, bồ công anh, xuân hoa đều có khả năng ức chế vi khuẩn in vitro tốt đối với 2 loài
vi khuẩn Staphylococcus spp. và Streptococcus spp., trong đó sài đất và mò hoa trắng
có khả năng ức chế vi khuẩn tốt nhất [9]. Tnh dầu cây kinh giới ở Thừa Thiên Huế
cũng cho hoạt tính kháng vi khuẩn S. aureus và E. coli [17].
1.3.2 Tình hình bệnh nhiễm vi nấm và thuốc điều trị
Theo nghiên cứu của Hà Tuấn Minh và Lê Hữu Doanh tại Bệnh viện Da liễu Trung
ương thì nấm miệng chủ yếu là do nấm Candida, trong đó C. albicans là nguyên nhân
chính. Nghiên cứu thực hiện trên 69 bệnh nhân bị nhiễm nấm miệng thì phân lập được
9 loại Candida gồm C. albicans (71 %), C. tropicalis (8,70 %), C. parpsilosis (5.80
%), C. krusei (4,35 %), C. lusitaniae (4,35 %), C. glabrata (2,90 %), C. guilliemondi
(1,45 %), C. flumata (1,45 %), C. pelliculosa (1,45 %). Đánh giá hiệu quả của kháng
sinh chống nấm nystatin là (100 %) và amphotericin B (100 %), econazole (63,27 %),
miconazole (61,22 %), itraconazole (44,90 %), ketoconazole (38,78 %), fluconazole
(24,49 %) chống lại C. albicans. Thuốc bị kháng nhiều nhất là fluconazole 8,16 %,
tiếp theo là itraconazole 6,12 %, miconazole và ketoconazole cùng 4,08 %[16].
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà và cộng sự đã phát hiện và xác định các
chủng nấm gây nhiễm nấm máu tại Bệnh viện Bạch Mai. Kết quả nghiên cứu cho
thấy tỉ lệ nhiễm nấm máu trên tổng số bệnh nhân cấy máu dương tính là 9,80 %. Các
chủng nấm gây bệnh chủ yếu được phân lập từ Khoa ICU chiếm 22 % là Candida sp.
đứng hàng thứ tư (7,90 %) trong tổng số chủng vi sinh vật gây bệnh và là tác nhân
gây bệnh thường gặp nhất ở các bệnh nhân nhiễm trùng huyết do nhiều căn nguyên.
11
Căn nguyên chính gây nhiễm nấm máu là Candida sp. (83,60 %), trong nhóm đó có
các loài thường gặp là C. albicans (38,20 %) và C. tropicalis (36,10 %), ngoài ra còn
gặp Talaromyces marneffei (6,00 %) và Pichia ohmeri (4,30 %) [8].
Các bệnh nhiễm nấm hiện nay được điều trị chủ yếu bằng các loại thuốc tân dược
như nystatin, fluconazole, ketoconazole…, nhưng các loại thuốc này cũng đang gặp
phải tình trạng đề kháng. Vì vậy việc nghiên cứu các loại dược thảo có khả năng
kháng nấm là rất cần thiết: Phân lập được chất hydroxychavicol từ lá cây trầu không
kháng lại C. albicans với MIC = 0,512 mg/ml [7]. Các tinh dầu quế, sả chanh, húng
quế, bạc hà đều cho tác dụng kháng S. cerevisiae và A. niger [15]. Tinh dầu cây kinh
giới cũng được nghiên cứu và chứng minh có khả năng kháng được C. albicans [17].
1.4 Tổng quan về vi khuẩn và vi nấm gây bệnh trên người
1.4.1 Escherichia coli
Phân ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacterí
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Escherichia
Loài: Escherichia coli [1, 18]. Hình 1.5 Escherichia coli
Escherichia do Escherich phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Giống này gồm nhiều loài,
trong đó E. coli có vai trò quan trọng nhất. E. coli thuộc họ vi khuẩn đường ruột
(Enterobacteriaceae) là trực khuẩn Gram âm, hiếu kỵ khí tùy tiện. Kích thước trung
bình từ 2 – 3 μm x 0,5 μm, trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong
môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E. coli có
vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động. E.coli phát triển dễ dàng trên các
môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ từ 5 – 40 oC. Trong điều kiện thích hợp
E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút. Trong đường
tiêu hóa E. coli chiếm khoảng 80 % các vi khuẩn hiếu khí. Nhưng E. coli cũng là vi
khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm
12
đường tiết niệu, viêm đường mật, đứng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn
huyết. E. coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm
khuẩn vết thương [5].
1.4.2 Pseudomonas aeruginosa
Phân ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacterí
Bộ: Pseudomonadales
Họ: Pseudomonadaceae
Chi: Pseudomonas Hình 1.6 Pseudomonas aeruginosa Loài: Pseudomonas aeruginosa [1]
P. aeruginosa còn gọi là trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn Gram âm, thẳng hoặc hơi
cong nhưng không xoắn, hai đầu tròn. Kích thước từ 0,5 – 1,0 μm x
oC. Trong môi trường đặc có thể gặp hai loại khuẩn lạc một loại to, nhẵn, bờ trải dẹt,
1,5 – 5,0 μm. [5]. Chúng mọc ở biên độ nhiệt rộng (10 – 44 oC), nhưng tối ưu ở 35
giữa lồi lên và một loại khác thì xù xì [11].
Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện. Khi cơ thể bị suy
giảm miễn dịch, bị mắc các bệnh ác tính hoặc mạn tính, dùng lâu dài corticoid,…. thì
dễ mắc bệnh nhiễm trùng nội sinh hoặc ngoại sinh do trực khuẩn mủ xanh. Trực
khuẩn mủ xanh từ môi trường bên ngoài xâm nhập vào cơ thể qua các vết thương hở
(nhất là vết bỏng). Tại chỗ xâm nhập, chúng gây viêm có mủ, nếu cơ thể suy giảm
sức đề kháng, chúng có thể xâm nhập vào và gây viêm các phủ tạng hoặc gây bệnh
toàn thân [5].
1.4.3 Staphylococcus aureus
Giới: Prokaryote
Phân nghành: Firmicute
Lớp: Firmibacteria
Họ: Micrococceae
Chi: Staphylococcus
Loài: Staphylococcus aureus [1] Hình 1.7 Staphylococcus aureus
13
S. aureus là một trong 3 loài có vai trò quan trọng trong y học S. epidermidis và
S. saprophyticus. Giống Staphylococcus thuộc nhóm vi khuẩn tụ cầu, Gram dương
thường sống ký sinh trên da lỗ mũi và đường hô hấp trên của người.
S. aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng có đường kính từ 0,8 – 1,0 μm và đứng thành
hình chùm nho, bắt màu Gram dương, không có lông và nha bào, thường không có
vỏ. Tụ cầu vàng gây bệnh cho người suy giảm đề kháng hoặc chúng có nhiều yếu tố
độc lực. Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều
loại bệnh khác nhau như: Nhiễm khuẩn ngoài da do tụ cầu vàng ký sinh ở da và niêm
mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua các lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới
da, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp, nhiễm khuẩn bệnh viện
do tụ cầu.
1.4.4 Candida albicans
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Phân ngành: Saccharomycotina
Lớp: Saccharomycetes
Bộ: Saccharomycetales
Họ: Saccharomycetaceae
Chi: Candida Hình 1.8 Candida albicans
Loài: Candida albicans
Đặc tính sinh lý của C. albicans: C.albicans có thể phát triển tốt ở 20 – 38 oC, pH
từ 2,5 – 7,5, hình dạng tế bào thay đổi từ đơn bào hình bầu dục sang dạng sợi, tế bào
nhuộm Gram dương. Ở một số môi trường nuôi cấy khác nhau thì cấu tạo hình thể
của C.albicans cũng có thay đổi. [28].
Bệnh do nấm Candida gây ra: Candida sống hoại sinh trên cơ thể người khi gặp
điều kiện thuận lợi, nhất là cơ thể giảm sức đề kháng sẽ chuyển sang dạng gây bệnh
do một số yếu tố sau: Yếu tố sinh lý, yếu tố bệnh lý, yếu tố nghề nghiệp. Candida có
thể gây bệnh ở nhiều cơ quan trong cơ thể, cơ quan nông phổ biến là da và niêm mạc.
Bệnh ở niêm mạc như đẹn, viêm thực quản, viêm ruột, viêm âm đạo - âm hộ,… Bệnh
14
trên da như viêm da, viêm móng và viêm quanh móng. Bệnh nội tạng như viêm nội
mạc cơ tim, bệnh đường hô hấp, bệnh Candida lan tỏa. [28].
1.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật
1.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật
Để khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật có thể tiến hành hai phương pháp là phương
pháp đĩa giấy khuếch tán và phương pháp khuếch tán qua giếng thạch. Trong nghiên
cứu này chúng tôi chọn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch.
1.5.2 Xác định giá trị MIC
Việc xác định MIC dựa vào phương pháp pha loãng trong môi trường rắn hoặc
lỏng. Mẫu thử được pha loãng ½ liên tục trong môi trường, sau đó cho vào một lượng
vi khuẩn xác định. Sau thời gian ấp, tìm nồng độ thấp nhất ức chế được sự tăng trưởng
của vi khuẩn khi quan sát bằng mắt thường [4].
1.5.3 Kỹ thuật hiện hình sinh học [24]
Kỹ thuật hiện hình sinh học tiếp xúc: Các bản sắc ký sau khi khai triển bằng hệ
dung môi thích hợp được đặt trên bề mặt thạch đã cấy vi sinh vật để chất thử khuếch
tán. Các vết cho hoạt tính kháng vi sinh vật trên bản SKLM sẽ cho vùng ức chế vi
sinh vật trên đĩa thạch.
Kỹ thuật hiện hình sinh học ngâm: Bản SKLM sẽ đươc ngâm hoặc che phủ bằng
môi trường thạch sau đó vi sinh vật thử nghiệm được cấy lên tấm sắc ký và đem đi ủ.
Sau thời gian thích hợp, vi sinh vật sẽ phát triển trên mặt SKLM tại vị trí không có
chất ức chế .
15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu
Rễ cốt khí củ được thu mua tại đường Hải Thượng Lãn Ông, Quận 5, Tp. Hồ Chí
Minh. Nguyên liệu được định danh dựa vào hình ảnh và tài liệu tham khảo để tránh
nhầm lẫn. Mẫu nguyên liệu sau khi sơ chế được xay nhỏ đến dạng bột thô, bảo quản
trong bao nylon kín.
2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm
Vi sinh vật thử nghiệm do Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, khoa Dược, Đại Học Y
Dược Tp. Hồ Chí Minh lưu trữ và cung cấp.
Bảng 2.1 Các vi si sinh vật thử nghiệm
Stt Tên vi sinh vật Mã số
1 Escherichia coli ATCC 25922
2 Meticilline - resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300
3 Meticilline - susceptible Staphylococcus aureus ATCC 29213
4 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
5 Candida albicans ATCC 10231
2.1.3 Môi trường nuôi cấy và thử hoạt tính kháng vi sinh vật
Môi trường 1: Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
Peptone casein 10 g
Glucose 20 g
Agar 15 g
Nước cất 1 lít
16
Môi trường 2: Tryptic Soy Agar (TSA)
15 g Pepton
5 g Pepton đậu nành
5 g NaCl
15 g Agar
1 lít Nước cất
Môi trường 3: Mueller hinton agar (MHA)
2 g Beet extract
17.5 g Acid Digest của Casein
1.5 g Tinh bột
17 g Agar Bios Special
1 lít Nước cất
2.1.4 Hóa chất, dung môi
Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi
Xuất xứ Hóa chất Stt
Trung Quốc Ethanol 50 % 1
Trung Quốc Ethanol 80 % 2
Trung Quốc Ethanol 96 % 3
Trung Quốc n - hexan 4
Trung Quốc Chloroform 5
Trung Quốc Methanol 6
Trung Quốc Ethyl acetat 7
DMSO 8
Cách pha dung môi
Pha dung môi ethanol (TT):
Xách định độ cồn cần pha loãng: Cho lượng cồn cần pha loãng vào ống đong 250
ml. Thả nhẹ nhàng cồn kế vào trong ống đong để yên 2 phút. Đọc và ghi các kết quả
17
nhiệt độ trên nhiệt kế, độ cồn biểu kiến trên cồn kế.
Độ cồn biểu kiến ≥ 56 %, tra bảng Gay – Lussac.
b-c
a-c
Tính lượng cồn cao độ cần dùng X = p x
x: Thể tích cồn cao độ cần lấy (ml)
p: Thể tích cồn cần pha (ml)
a > b > c: Độ cồn thực (%)
Pha dung môi DMSO 10 % (TT):
Dung môi DMSO 10 % (TT) được pha từ dung dịch DMSO 100 % (TT) với dung
môi pha loãng là nước cất.
Pha 5 ml DMSO 10 % (TT): Dùng micropipet hút 4,5 ml nước cất cho vào ống
nghiệm có nắp. Tiếp theo hút 0,5 ml DMSO 100 % (TT) cho vào ống nghiệm. Lắc
ống nghiệm cho DMSO 100 % (TT) phân bố đều.
2.1.5 Dụng cụ, trang thiết bị
Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng
Stt Thiết bị Model Nguồn gốc
1 Bếp cách thủy HH – S6 Trung Quốc
2 CM - 10 Mỹ Đèn UV254, UV365
3 Cân phân tích Sartorius Đức
4 Tủ hood BS - 122 Việt Nam
5 Lò hấp tiệt trùng Hirayama Nhật
6 Tủ vô trùng Esco AVC – 4A1 Mỹ
7 Tủ ấm RI 28 -2 Mỹ
8 Máy vortex 3412EU Đức
Các dụng cụ sử dụng: Bình lắng gạn, pipet, phễu, bình sắc ký, bản mỏng silicagel
60 F254, erlen, becher, ống nghiệm.
18
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát sơ bộ thực vật học rễ cốt khí củ
2.2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái rễ: Mô tả đặc điểm thực vật học dựa trên quan
sát mẫu dược liệu đã chọn.
2.2.1.2 Khảo sát cấu tạo vi học bột dược liệu: Nhận xét cảm quan và quan sát dưới
kính hiển vi và so sánh với tài liệu.
Chuẩn bị bột soi:
Dược liệu được cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ khoảng 60 oC, tán nhỏ, dùng máy xay
nghiền nát thành bột. Rây qua rây số 32 (rây mịn), phần còn lại trên rây được tán, xay
lại và rây tiếp cho đến khi tất cả dược liệu thành bột mịn. Quan sát bột bằng cảm quan
(nhận định màu sắc, mùi vị,…..) trước khi soi kính hiển vi.
Lên tiêu bản dược liệu:
Cho một giọt nước vào giữa phiến kính. Dùng que sạch trộn đều bột, lấy một ít
bột cho vào giữa giọt nước, dùng 1 góc của lá kính (lamelle) khuấy nhẹ để phân tán
bột rồi đật lamelle lại. Dùng ngón tay trỏ di nhẹ trên lamelle để các phân tử của bột
tách rời và phân tán đều, đồng thời loại bớt bọt khí. Loại bỏ phần bột và nước thừa
phía ngoài lamelle bằng khăn giấy, lau sạch mặt lamelle và phiến kính trước khi soi
kính hiển vi.
2.2.1.3 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của bột dược liệu: Dùng phản ứng
hóa học dựa theo phương pháp Ciuley để xác định nhóm hợp chất có trong dịch
chiết [13].
19
Alkaloid Bốc hơi đến cắn, hòa trong nước acid. Phản ứng với thuốc thử chung alkaloid.
Hiện tượng: Có tủa.
Coumarin
Bốc hơi đến cắn. Cho tác dụng với kiềm, soi UV365. Hiện tượng: Tăng cường độ phát quang.
Làm phản ứng Cyanidin. Flavonoid
Hiện tượng: Có màu đỏ.
Phản ứng với dung dịch FeCl3 và dung dịch gelatin muối.
Tanin Dịch chiết cồn
Hiện tượng: Xanh rêu/ xanh đen với FeCl3. Tủa bông với gelatin.
Bốc hơi đến cắn. Hòa trong nước, lắc mạnh. Saponin
Hiện tượng: Bọt bền trên 15 phút.
Phản ứng với thuốc thử Fehling. Hợp chất khử
Hiện tượng: Tủa đỏ gạch.
Thêm một ít tinh thể Na2CO3. Acid hữu cơ Hiện tượng: Có bọt khí.
Hình 2.1 Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn
20
2.2.2 Lựa chọn dung môi chiết xuất rễ cốt khí củ
Khảo sát với 3 dung môi: Ethanol 50 % (TT), ethanol 80 % (TT) và ethanol 96 %
(TT) và tiến hành chiết xuất theo quy trình sau:
Làm ẩm 5 g bột dược liệu với 20 ml mỗi dung môi trong 30 phút. Bổ sung thêm
30 ml dung môi đã chọn và ngâm lạnh trong 24h. Lọc, dịch chiết được cô trên bếp
cách thủy ở nhiệt độ 80 oC đến khi còn khoảng 20 ml.
Dịch chiết trên được dùng để khảo sát hệ dung môi pha động và chọn độ cồn thích
hợp cho chiết xuất.
Mẫu thử: Dùng pipet khắc vạch 10 ml hút 5 ml dịch chiết của từng mẫu, cô cách
thủy ở 80 oC tởi cắn bằng chén sứ. Hòa tan cắn với 2 ml CHCl3.
Chấm khoảng 5 μl dịch chiết lên bản mỏng silica gel 60 F254 và triển khai bằng
các hệ dung môi với tỉ lệ khác nhau. Sau khi khai triển, lấy bản mỏng ra để khô ngoài
không khí hay sấy nhẹ cho bay hết dung môi. Sau đó, phát hiện bằng cách soi UV ở
bước sóng 254 nm và 365 nm. Điều kiện sắc ký lớp mỏng:
Lượng mẫu chấm: 5 μl
Bản silica gel 60 F254
Pha động: Toluen – EtOAc (93:7), CHCl3 – EtOAc (11:1) và MeOH – EtOAc –
H2O (13,5:100:10).
Khai triển 1 lần
Phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm.
2.2.3 Khảo sát việc chiết tách cao toàn phần và tách phân đoạn với dung môi có
độ phân cực khác nhau từ rễ cốt khí củ.
2.2.3.1 Chiết xuất cao toàn phần: Phương pháp ngâm lạnh
Làm ẩm 1 kg bột dược liệu với 500 ml ethanol 80 % (TT) trong 30 phút. Thêm 4,5
lít ethanol 80 % (TT), tiếp tục ngâm lạnh trong 72h. Sau đó, lọc và thu dịch chiết, tiếp
tục chiết lạnh bã dược liệu còn lại với 5 lít ethanol 80 % (TT) trong 72h. Gộp các dịch
chiết và cô thu hồi dung môi, thu được cao toàn phần.
2.2.3.2 Chiết xuất cao phân đoạn
Từ cao toàn phần, lắc với: n – hexan, chloroform, ethyl acetat để phân tách thành
21
các phân đoạn có độ phân cực khác nhau. Cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu
được các cao phân đoạn.
Bột dược liệu
Ethanol 80 % (TT) x 2 lần
Cao toàn phần
Lắc với n – hexan
Dịch nước Cao n – hexan
Lắc với chloroform
Dịch nước Cao chloroform
Lắc với ethyl acetat
Dịch nước Cao ethyl acetat
Cao nước
Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn
22
2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cốt khí củ
2.2.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán
trên đĩa thạch
Nguyên tắc phương pháp: Bơm dung dịch thử vào các giếng đã được đục lỗ. Nếu
chất thử có sự ức chế vi khuẩn sẽ cho vòng ức chế xung quanh đĩa. Dựa vào đường
kính đo vùng ức chế có thể đánh được khả năng kháng khuẩn của mẫu thử.
Chuẩn bị môi trường thử nghiệm: Môi trường sau khi được pha và hấp khử trùng,
cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng và đặt lên mặt phẳng để thạch có bề dày đồng
nhất, khoảng 4 mm. Thể tích môi trường khoảng 20 – 25 ml/đĩa (đĩa có đường kính
90 mm). Để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Chuẩn bị vi sinh vật:
- Vi khuẩn: Sau khi cấy hoạt hóa trên đĩa thạch TSA, ủ ở 37 °C trong 24 giờ, vi khuẩn
được pha trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85 % và phân tán đều bằng máy vortex.
Huyền dịch vi khuẩn được điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bước sóng 625 nm
hoặc được pha loãng với canh thang sao cho nồng độ đục bằng thang McFarland 0,5.
Giá trị này tương đương với khoảng 1 – 2 x 108 CFU/ml.
- Nấm men được hoạt hóa trong môi trường SDA (Candida albicans) trong vòng 48
giờ ở nhiệt độ 37 ℃. Sau đó phân tán trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85 % và
phân tán đều bằng máy vortex. Huyền dịch vi nấm được điều chỉnh về giá trị OD 0,08
– 0,12 tại bước sóng 530 nm hoặc được pha loãng với canh thang sao cho nồng độ
đục bằng thang McFarland 0,5. Giá trị này tương đương với khoảng 1 – 5 x 106
CFU/ml. Vi khuẩn, vi nấm sau khi được pha chế phải được sử dụng trong vòng 30
phút.
Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 100 mg cao toàn phần và cao phân đoạn hòa tan
vào trong 1 ml DMSO 10 % (TT).
Tiến hành khảo sát: Huyền dịch vi khuẩn được trải đều trên mặt thạch bằng que
bông vô trùng. Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay hộp 60°. Lần cuối cùng xoay tròn que bông
xung quanh thành đĩa để vi khuẩn được trải đều. Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản
thạch bằng ống thép không rỉ. Cho vào mỗi lỗ 100 μl dung dịch chất kháng khuẩn.
23
Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp môi trường. Ủ
đĩa thạch trong tủ ấm ở 37 °C.
Đọc kết quả sau 16 – 18 giờ đối với vi khuẩn và 20 – 24 giờ đối với vi nấm. Chất
thử có tác động kháng khuẩn sẽ cho vòng ức chế xung quanh lỗ. Đo và ghi nhận
đường kính vòng ức chế bằng thước kẹp có độ chia nhỏ nhất bằng 0,01 mm. Khả
năng kháng mạnh hay yếu được đánh giá sơ bộ bằng giá trị đường kính vòng ức chế
theo bảng 2.4.
Bảng 2.4 Bảng đối chiếu đường kính vòng kháng vi sinh vật [29]
Đường kính vòng kháng vi sinh vật Mức độ kháng vi sinh vật (mm)
Mạnh ≥ 15
10 - 14 Vừa
< 9 Yếu
0 Không kháng
2.2.4.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật MIC
Những mẫu cao có tác động ức chế sẽ được thử nghiệm tìm MIC bằng phương
pháp pha loãng trong môi trường rắn. MIC là nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng trưởng
của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường.
Nguyên tắc: Việc xác định MIC dựa vào phương pháp pha loãng trong môi trường
rắn. Mẫu thử được pha loãng ½ liên tục trong môi trường thích hợp, sau đó cho vào
một lượng vi khuẩn xác định. Sau thời gian ấp, tìm nồng độ thấp nhất ức chế được sự
tăng trưởng của vi khuẩn khi quan sát bằng mắt thường [4].
Phương pháp: Pha loãng trong môi trường rắn.
Chuẩn bị dung dịch: Hòa tan chính xác lượng cao toàn phần và các cao phân đoạn
trong DMSO 10 % (TT) thành dung dịch mẹ. Từ dung dịch mẹ, pha loãng với môi
trường MHA thành dãy có 10 nồng độ chất thử giảm dần với độ pha loãng là 2.
Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm theo mô tả ở mục 2.2.4.1. Khi sử dụng pha loãng
tiếp với dung môi DMSO 10 % (TT) 10 lần để có mật độ khoảng 107 CFU/ ml.
24
Tiến hành khảo sát: Chấm 1 µl dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt được mật độ vi khuẩn
trên đĩa thạch là 104 CFU/ml. Ủ ở nhiệt độ 35 – 37 °C.
Đọc kết qua sau 16 – 18 giờ. Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự
tạo khóm, nồng độ của đĩa thạch này là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm.
Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp hơn, mẫu cấy
có thể bị nhiễm và thử nghiệm phải được thực hiện lại.
Đọc kết quả: Nồng độ MIC là nồng độ thấp nhất tại đó ức chế vi sinh vật mọc lên
đĩa thạch. Lặp lại 3 lần.
2.2.4.3 Kỹ thuật hiện hình sinh học
Trong nghiên cứu sử dụng kỹ thuật hiện hình sinh học tiếp xúc. Nguyên tắc: Dựa
vào phương pháp khuếch tán trên thạch. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm theo mô tả ở
mục 2.2.4.1.
Tiến hành SKLM mẫu cao phân đoạn n – hexan, chloroform, ethyl acetat: Chấm
2 điểm mẫu cao n – hexan, chloroform, ethyl acetat và triển khai song song trên cùng
một bản mỏng trong cùng điều kiện. Sau khi triển khai 1 điểm chấm được dùng để
phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm, xác định số vết và giá trị Rf. Điểm
chấm còn lại được dùng để phát hiện vết cho hoạt tính kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật
hiện hình sinh học tiếp xúc. Bản mỏng sau khi triển khai, đuổi hết dung môi để nguyên
hoặc cắt ra thành từng mảnh và đặt trên bề mặt thạch đã có trải vi khuẩn thử nghiệm.
Để 12 giờ ở nhiệt độ thấp, sau đó ủ ở điều kiện thích hợp. Các vết cho hoạt tính sẽ
cho vòng ức chế vi khuẩn trên bề mặt.
25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Kết quả
3.1.1 Khảo sát thực vật học rễ cây cốt khí củ
3.1.1.1 Mô tả hình thái
Rễ cốt khí củ hình trụ cong queo, vỏ sần sùi, nhăn nheo, màu nâu xám, có các đốt
lồi lên chia củ thành từng gióng. Những rễ củ to được cắt thành lát mỏng 1 – 2 cm,
phơi khô. Mặt cắt ngang thấy phần vỏ mỏng, phần gỗ dày. Thể chất rắn, có mùi nhẹ,
vị hơi se đắng.
Hình 3.1 Rễ cốt khí củ
3.1.1.2 Đặc điểm bột dược liệu
Bột rễ cây cốt khí củ có màu vàng sẫm, mùi thơm, vị hơi đắng. Các cấu tử được
tìm thấy trong bột rễ cây cốt khí củ: Mảnh mạch vạch, mạch mạng, mảnh bần, hạt
tinh bột và sợi mô cứng.
A B
26
C D
E F
Hình 3.2 Soi bột rễ cốt khí củ
Ghi chú:
(A): Mẫu bột cốt khí củ (D): Sợi mô cứng
(B): Mảnh mạch vạch (E): Hạt tinh bột
(C): Mảnh mạch mạng (F): Mảnh bần
3.1.1.3 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của bột dược liệu
Xách định sơ bộ thành phần hóa học của rễ cốt khí củ ta thu được kết quả cho thấy
rễ cốt khí củ có chứa các nhóm chất: Anthranoid, flavonoid, coumarin và tanin.
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học rễ cốt khí củ
STT Thành phần Nhận biết Kết luận
Alkaloid Thuốc thử chung alkaloid - 1
Anthranoid Phản ứng màu hơ amoniac + 2
Coumarin Phát huỳnh quang + 3
Flavonoid Phản ứng cyanidin + 4
Tanin + 5 FeCl3 5%, gelatin muối
Saponin Phản ứng tạo bọt bền trong môi trường nước - 6
27
Chất khử Thuốc thử Fehling - 7
Acid hữu cơ - 8 Phản ứng với Na2CO3 có sủi bọt
Ghi chú: (-) không có (+) có
C B A
Hình 3.3 Phản ứng hóa học định tính alkaloid, coumarin và tanin
Ghi chú:
(A): Alkaloid với các thuốc thử dragendorff, mayer, bertran, bouchardat
(B): Coumarin
(C): Tanin với thuốc thử gelatin muối và FeCl3 5 %
B D A C E C
Hình 3.4 Phản ứng hóa học định tính anthranoid, saponin, chất khử và acid hữu cơ
Ghi chú:
(A): Anthranoid quan sát mắt thường
(B): Anthranoid quan sát sau hơ amoniac
28
(C): Saponin tạo bọt không bền
(D): Phản ứng định tính chất khử
(E): Phản ứng định tính acid hữu cơ
3.1.2. Lựa chọn dung môi chiết xuất
Tiến hành chiết xuất theo quy trình ở mục 2.2.2, dịch chiết thu được dùng để khảo
sát lựa chọn dung môi chiết xuất. Kết quả sắc ký các hệ dung môi được thể hiện ở
hình 3.3, 3.4 và 3.5.
Kết quả khảo sát sắc ký lớp mỏng các dịch chiết từ ethanol 50 % (TT), ethanol 80
% (TT) và ethanol 96 % (TT), nhận thấy rằng: Với hệ dung môi CHCl3 – EtOAc
(11:1) thì sắc ký đồ của dịch chiết từ ethanol 80 % (TT) cho 2 vết tách rõ ràng và đậm
màu hơn so với dịch chiết từ ethanol 50 % (TT) và ethanol 96 % (TT), nên ethanol
80 % (TT) được chọn làm dung môi chiết xuất cao toàn phần để khảo sát hoạt tính
sinh học. Ghi chú:
(1): Ethanol 96 % (TT) (2): Ethanol 80 % (TT) (3): Ethanol 50 % (TT)
(A): Quan sát bằng mắt thường
(B): Quan sát dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm
(C): Quan sát dưới đèn UV ở bước sóng 365 nm
C B A
(1) (2) (3)
(1) (2) (3)
(1) (2) (3)
Hình 3.5 Sắc ký đồ hệ dung môi Toluen - EtOAc (93:7)
29
A B C
(1) (2) (3)
(1) (2) (3)
(1) (2) (3)
Hình 3.6 Sắc ký đồ hệ dung môi CHCl3 - EtOAc (11:1)
C A B
(1) (2) (3)
(1) (2) (3)
(1) (2) (3)
Hình 3.7 Sắc ký đồ hệ dung môi MeOH - EtOAc - H2O (13,5:100:10)
30
3.1.3 Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn
3.1.3.1 Chiết xuất cao toàn phần
Từ 1 kg bột rễ cốt khí củ chiết bằng phương pháp ngâm lạnh với ethanol 80 %
(TT), lọc và cô trên bếp cách thủy thu được 127,69 g cao toàn phần, hiệu suất quá
trình chiết 12,77 %.
3.1.3.2 Chiết xuất cao phân đoạn
Xử lý sơ bộ cao toàn phần theo quy trình sau: Cân 20 g cao toàn phần, hòa tan với
100 ml nước cất, tiến hành lắc phân bố với dung môi n – hexan sẽ tách ra làm hai
phần là dịch n – hexan (màu vàng) và dịch nước (1). Phân đoạn n – hexan được cô
quay dưới áp suất giảm thu được cao phân đoạn 1 (0,75 g). Dịch nước (1) tiếp tục lắc
phân bố với chloroform thu được dịch chloroform (màu vàng) và phần dịch nước (2),
phân đoạn chloroform được cô quay dưới áp suất giảm thu được cao phân đoạn 2
(0,99 g). Dịch nước (2) được lắc với ethyl acetat thu được dịch ethyl acetat (màu
cam) và dịch nước (3), phân đoạn ethyl acetat được cô quay dưới áp suất giảm thu
được cao phân đoạn 3 (3,56 g). Dịch nước (3) được cô trên bếp cách thủy thu được
cao nước (5,06 g). Khối lượng cao phân đoạn được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Khối lượng cao toàn phần và cao phân đoạn
Ethyl Cao toàn Phân đoạn n-hexan Chloroform Cao nước acetat phần
3,56 20,00 Khối lượng (g) 0,75 0,99 5,06
17,80 Hiệu suất (%) 3,75 4,95 10,12
3.1.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật
3.1.4.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán qua
giếng thạch
Trộn đều lần lượt 100 mg cao toàn phần và cao phân đoạn trong 1 ml DMSO 10
% (TT) để được các dung dịch thử có nồng độ 100 mg/ml. Cho vào mỗi giếng 100 μl
dung dịch chất kháng khuẩn, xác định hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp
khuếch tán qua giếng thạch .
Cao toàn phần và cao phân đoạn được khảo sát tác động kháng vi sinh vật trên 4
31
vi khuẩn và 1 vi nấm bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch. Kết quả cho
thấy, cao toàn phần và các cao phân đoạn n – hexan, chloroform cho tín hiệu kháng
khuẩn mạnh trên 2 chủng vi khuẩn MSSA, MRSA và nấm mem C. albicans. Trong
đó phân đoạn n – hexan cho tín hiệu kháng tốt trên chủng MSSA (22,93 mm) và C.
albicans (27,32 mm), phân đoạn chloroform lại tốt trên chủng MRSA (18,93 mm).
Cao ethyl acetat cho khả năng kháng khuẩn mạnh trên 2 chủng vi khuẩn MSSA (19,75
mm) và MRSA (19,28 mm), nhưng lại có vòng kháng khuẩn vừa đối với C. albicans
(13,41 mm). Cao nước cho vòng kháng khuẩn với mức độ kháng vừa với MSSA
(14,95 mm) và mạnh với MRSA (15,62 mm).
Cao toàn phần và các cao phân đoạn đều không cho khả năng kháng khuẩn đối với
2 chủng vi khuẩn Gram âm Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa.
Chứng âm là DMSO 10 % (TT) không cho vòng kháng khuẩn.
Ghi chú:
(1) Cao toàn phần (4) Cao ethyl acetat
(2) Cao n – hexan (5) Cao nước
1
1
2
5
6
2
6
3
5
4
3
4
(3) Cao chloroform (6) Chứng âm DMSO 10 % (TT)
Hình 3.8 Kết quả vòng kháng khuẩn MSSA
32
5
2
4
3
6
6
1
1
4
3
5
2
1
1
2
5
5
2
6
6
3
4
4
3
Hình 3.9 Kết quả vòng kháng khuẩn MRSA
Hình 3.10 Kết quả vòng kháng khuẩn C. albicans
33
Bảng 3.3 Đường kính vòng ức chế vi sinh vật của cao toàn phần và cao phân đoạn
(mm)
Vi khuẩn Vi nấm Cao MSSA MRSA Ec Pa Ca
19,86 17,31 - 16,98 - TP
22,93 18,92 - 27,32 - n-hex
18,45 18,93 - 17,27 - CHCl3
19,75 19,28 - 13,41 - EtOAc
14,95 15,62 - - - CN
- - Chứng âm - - -
Ghi chú:
Ec: Escherichia coli (TP): Cao toàn phần
Pa: Pseudomonas aeruginosa (n – hex): Cao phân đoạn n – hexan
Ca: Candida albicans (CHCl3): Cao phân đoạn chloroform
(-): Không xác định được (CN): Cao nước
3.1.4.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật
Để đánh giá chính xác về hoạt tính kháng vi sinh vật của cao toàn phần và các cao
phân đoạn rễ cốt khí củ, chúng tôi tiến hành xác định giá trị MIC trên chủng vi khuẩn
MSSA và MRSA.
Từ kết quả ở bảng 3.4, cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của cao n – hexan và cao
chloroform ở chủng vi khuẩn MSSA, MRSA bằng nhau và bằng 0,45 mg/ml. Khả
năng kháng vi khuẩn MSSA, MRSA của cao ethyl acetat vơi MIC bằng 0,91 mg/ml
là thấp hơn so với cao n – hexan và cao chloroform. Cao toàn phần có MIC bằng 1,14
mg/ml và cao nước có MIC bằng 4,55 mg/ml.
34
Bảng 3.4 Kết quả MIC của cao toàn phần và các cao phân đoạn trên vi khuẩn
MSSA và MRSA (mg/ml)
Vi khuẩn Cao MRSA MSSA
TP 1,14 1,14
n-hex 0,45 0,45
0,45 0,45 CHCl3
EtOAc 0,91 0,91
CN 4,55 4,55
Ghi chú:
(TP): Cao toàn phần (CHCl3): Cao phân đoạn chloroform
(n – hex): Cao phân đoạn n – hexan (CN): Cao nước
3.1.4.3 Xác định chất có hoạt tính kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật tự sinh đồ
Cao phân đoạn n – hexan, chloroform và ethyl acetat được hòa tan trong dung môi
chloroform, đưa lên bản mỏng silicagel 60 F254, khai triển bằng hệ dung môi CHCl3
- EtOAc (11:1), sau đó phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm. Bằng kỹ
thuật hiện hình sinh học trên đối tượng MSSA, chúng tôi đã phát hiện được vết có
hoạt tính kháng vi sinh vật, được thể hiện trong hình 3.11, 3.12 và 3.13.
Khi phát hiện các vết trên bản sắc ký đồ bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm, có
tất cả 4 vết được đánh số từ 1 đến 4 như hình 3.14. Giá trị Rf của các vết được trình
bày ở bảng 3.5
Với phân đoạn n – hexan: Kết quả tự sinh đồ cho thấy vết số 4 (Rf = 0,80) cho
vòng kháng khuẩn.
Với phân đoạn ethyl acetat: Kết quả tự sinh đồ cho thấy vết số 4 (Rf = 0,80) cho
vòng kháng khuẩn.
Dựa trên kết quả tự sinh đồ của cao phân đoạn n – hexan, cao chloroform và cao
ethyl acetat, chỉ có cao phân đoạn n – hexan và cao ethyl acetat cho vết kháng MSSA.
Khi so với sắc ký đồ cả 3 cao đều cho 2 vết số 1 (Rf = 0,28) và vết số 3 (Rf = 0,78).
35
Riêng chỉ cao phân đoạn n – hexan và cao ethyl acetat, có cùng vết số 4 (Rf = 0,80).
4
3
2
1
Kết luận vết số 4 (Rf = 0,80) trên sắc ký đồ cho hoạt tính kháng vi khuẩn MSSA.
3
1
Hình 3.11 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn n - hexan
Hình 3.12 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn chloroform
36
4
3
1
4 3
2
1
TP n-hex CHCl3 Et CN
Hình 3.13 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn ethyl acetat
Hình 3.14 Sắc ký lớp mỏng cao toàn phần, n - hexan, chloroform, ethyl acetat và cao nước.
Bảng 3.5 Bảng kết quả giá trị Rf
Cao Vết số Rf TP n-hex EtOAc CN CHCl3
x x x x 1 0,28
x x 2 0,65
x x x x 3 0,78
x x 4 0,80
37
Ghi chú :
(x) cho vết trên bản mỏng
(TP): Cao toàn phần
(n – hex): Cao phân đoạn n – hexan
(CHCl3): Cao phân đoạn chloroform
(CN): Cao nước
3.2 Bàn luận
Dịch chiết cao ethanol 80 % (TT) khi tiến hành so sánh kết quả thử vi sinh vật với
các tài liệu tham khảo, chúng tôi nhận thấy cao toàn phần có đường kính vòng kháng
khuẩn chủng MSSA (19,86 mm) nhỏ hơn so với kết quả nghiên cứu dịch chiết cao
methanol (TT) của Bin Shan và cộng sự (20,2 mm) [32] và dịch chiết ethanol 96 %
(TT) của Pai We Soo có đường kính vòng kháng chủng MSSA ( 20 – 21 mm) [35].
Cao phân đoạn n – hexan (22,93 mm) lớn hơn kết quả của Pai We Soo (17 – 20 mm),
cao phân đoạn chloroform (18,45 mm) nhỏ hơn so với Pai We Soo (17 – 20 mm).
Đối với cao phân đoạn ethyl acetat (19,75 mm) cũng nhỏ hơn so với kết quả của Pai
We Soo (23 – 26 mm). Phân đoạn cao nước của chúng tôi (14,95 mm) cao hơn của
Pai We Soo (12 – 14 mm). Các chủng vi khuẩn gram âm E. coli và P. aeruginosa trên
dịch chiết cao ethanol 80 % (TT) đều cho kết quả âm tính, về kết quả của Bin Shan
E. coli ( 6,40 mm) và Pai We Soo trên chủng P. aeruginosa ( 11,50 mm).
Dịch chiết cao toàn phần ethanol 80 % (TT) cho giá trị MIC là 1,14 mg/ml lớn hơn
so với dịch chiết cao methanol (TT) của Bin Shan (MIC = 0,31 mg/ml) [32] và dịch
chiết cao ethanol 96 % (TT) của Pai We Soo (MIC = 0,38 mg/ml).
Dựa trên kết quả đường kính vòng kháng khuẩn cho thấy cao n – hexan có khả
năng kháng khuẩn tốt trên vi khuẩn MSSA (22,93 mm) và nấm mem C. albicans
(27,32 mm), cao n – hexan cho giá trị MIC thấp nhất đối với MSSA (0,45 mg/ml). Vì
vậy, chúng tôi cho rằng cao phân đoạn n – hexan có tiềm năng cho việc phân lập chất
tinh khiết cho hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm từ rễ cây cốt khí củ.
Kết quả tự sinh đồ của cao n – hexan, cao chloroform và cao ethyl acetat cho thấy
khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của rễ cây cốt khí củ không phải do một chất
38
cụ thể quyết định tác dụng sinh học mà do nhiều nhóm chất cùng hỗ trợ. Trong đó,
cao phân đoạn n – hexan cho khả năng kháng vi sinh vật tốt vì thế chúng tôi nhận
định các nhóm chất kém phân cực dạng aglycon trong rễ cây cốt khí củ bao gồm:
anthranoid, stilbenoids, flavonoid, coumarin cùng bổ trợ lẫn nhau tạo ra khả năng ức
chế các vi khuẩn MSSA, MRSA và vi nấm C. albicans.
39
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận
Sau 2 tháng thực hiện, đề tài đã hoàn thành các mục tiêu đưa ra và thu được các
kết quả như sau:
1. Định tính sơ bộ dược liệu rễ cây cốt khí củ:
Soi bột và tìm được các cấu tử chính của bột rễ cốt khí củ theo DĐVN V.
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cho thấy trong rễ cây cốt khỉ củ có các
thành phần: Anthranoid, flavonoid, coumarin và tanin.
2. Khảo sát để chọn dung môi chiết xuất: Kết quả đã chọn được ethanol 80 % (TT)
để chiết xuất cao toàn phần và 3 dung môi (n – hexan, chloroform, ethyl acetat)
để tách các phân đoạn và cao phân đoạn đơn giản.
3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của cao toàn phần và các cao phân
đoạn n – hexan, chloroform, ethyl acetat và cao nước của rễ cốt khí củ. Kết quả
cho thấy cao phân đoạn n – hexan cho hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất trên chủng
vi khuẩn MSSA và nấm men C. albicans. Cao phân đoạn ethyl acetat cho hoạt
tính kháng khuẩn tốt trên chủng vi khuẩn MRSA.
4. Xác định nồng độ tối thiếu ức chế vi sinh vật: Kết quả giá trị MIC của cao toàn
phần và các cao phân đoạn n – hexan, chloroform, ethyl acetat, cao nước đối với
chủng vi khuẩn MSSA và MRSA là: 1,14 mg/ml, 0,45 mg/ml, 0,45 mg/ml, 0,91
mg/ml và 4,55 mg/ml. Cao n – hexan cho nồng độ kháng tốt (MIC = 0,45 mg/ml).
5. Từ kết quả tự sinh đồ để xách định chất kháng vi sinh vật. Kết quả phát hiện vết
số 4 trên sắc ký đồ cho hoạt tính kháng chủng MSSA.
4.2 Kiến nghị
Kết quả nghiên cứu được từ đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo
của dược liệu này:
1. Mở rộng vùng dược liệu để đánh giá chính xác khả năng kháng vi sinh vật của rễ
cốt khí củ.
2. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao toàn phần của rễ cốt khí củ.
3. Phân lập và xác định cấu trúc của chất cho hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cốt
khí củ.
4. Chiết tách và tinh khiết hóa các chất hóa học đạt tiêu chuẩn làm chất đối chiếu.
40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Thanh Bảo (2008), Vi khuẩn học, Đại học Y Dược Tp.HCM.
2. Đỗ Huy Bích, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, NXB Khoa
Học Kỹ Thuật tr. 529-531.
3. Bộ Y tế - Việt Nam phối hợp với Dự án Hợp tác toàn cầu về kháng kháng sinh
GARP Việt Nam và Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng ĐH Oxford (2008-2009),
"Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện ".
4. Bộ môn Vi sinh - Ký sinh trường Đại học Nguyễn Tất Thành (2015), Gíao
Trình Thực Hành Vi Sinh Học, MIC, tr. 28 - 29.
5. GS.TS Lê Huy Chính (2007), Vi Sinh Vật Y Học, NXB Y Học, Hà Nội, tr. 133
- 141, 165 - 175, 218 - 221, 142 - 147.
6. Nguyễn Đức Độ, Võ Ngọc Thanh, Nguyễn Văn Băn, Phan Thanh Khiêm,
Nguyễn Thị Tâm, Huỳnh Ngọc Thanh Tâm (2017), "Khảo sát đặc tính sinh
hóa và khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây môn ngọt (colocasia
esculenta)", tạp chí khoa học & công nghệ nông nghiệp", Tập 1(2), tr. 265 -
274.
7. Nguyễn Thu Gương, Nguyễn Vũ Giang Bắc, Lê Thị Lệ Uyên, Nguyễn Đinh
Nga (2014), "Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm
có trong cao chiết từ lá trầu không", Y Học TP. Hồ Chí Minh, Tập 18, tr. 235
- 239.
8. Nguyễn Nhị Hà, Phạm Hồng Nhung (2017), "Tình hình nhiễm nấm máu tại
bệnh viện Bạch Mai từ tháng 1/2016 đến tháng 10/2016", Tạp chí nghiên cứu
y học.
9. Nguyễn Thị Thanh Hà, Nguyễn Thanh Hải, Nguyễn Nam Phương, Nguyễn
Văn Thanh (2017), "Tác dụng diệt khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết thảo
dược trên vi khuẩn Staphylococcus spp. và Streptococcus spp. phân lập từ dịch
viêm tử cung bò", Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, tr. 876 - 884.
10. Trần Thanh Hà (2014), "Nghiên cứu thành phần hóa học rễ cây cốt khí củ
(Reynoutria japonica Houtt.) ", tr. 4-5.
11. Phạm Thị Nguyệt Hằng (2014),"Phân lập và khảo sát hoạt tính kháng nấm,
kháng khuẩn của vi sinh vật nội sinh trong cây Muồng Trâu (Cassia alata L.)".
12. Vũ Ngọc Hiếu, Phạm Hồng Nhung (2017), "Mức độ kháng kháng sinh của
một số vi khuẩn thường gặp gây nhiễm trùng da và mô mềm ở bệnh nhân đái
tháo đường phân lập tại bệnh viện Bạch Mai ".
13. PGS. TS. Trần Hùng (2016), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đh Y Dược
Tp. Hồ Chí Minh, tr. 29 - 31.
14. Nguyễn Trần Giáng Hương (2003), "Nghiên cứu độc tính cấp và một số tác
dụng dược lý của cốt khí củ", Tạp chí y học thực hành, tr. 35-38.
15. Liêu Thùy Linh, Ngô Nguyễn Nhật Hà, Phan Thị Kim Liên, Trần Thị Minh
Hà, Nguyễn Thúy Hương, Liêu Mỹ Đông (2017), "Khảo Sát Ảnh Hưởng Của
Tinh Dầu Quế, Sả Chanh, Húng Quế, Bạc Hà Và Tác Dụng Kết Hợp Của
Chúng Tới Saccharomyces cerevisiae và Aspergillus niger", Tạp chí Khoa học
và Giáo dục, Trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm Tp. Hồ Chí Minh, tr.
134 - 127.
16. Hà Tuấn Minh, Lê Hữu Doanh (2016), "Mức độ nhạy cảm với kháng sinh
chống nấm của một số chủng Candida gây bệnh ở miệng", Tạp chí nghiên cứu
y học, tr. 40-46.
17. Đặng Thị Thanh Nhàn,Lê Thị Huyền (2017), "Nghiên cứu thành phần hóa học
và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu cây kinh giới (Elsholtzia
ciliata (Thunb.) Hyland.,)", Tạp chí Khoa học và Giáo dục, Trường Đại học
Sư phạm Huế, tr. 85 - 91.
18. Lê Văn Phủng (2012), Vi khuẩn y học, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
19. Respiratory Society Ho Chi Minh City, Hôị Lao và Bệnh Phổi Việt Nam, Hội
Hô Hấp Việt Nam, Bệnh Viện Chợ Rẫy (2017), "Hội nghị đề kháng kháng
sinh trong viêm phổi cộng đồng và viêm phổi bệnh viện lần thứ 4", tr. 19, 23,
27, 64 - 66.
20. Ngô Thu Vân,Trần Hùng (2011), Dược liệu học, tập 1, NXB Y HỌC, tr. 339-
340.
21. Mai Thị Yến,Võ Văn Lẹo (2011), Khảo sát thành phần hóa học của cốt khí củ
(Polygonum cuspidatum Sieb. Et Zucc.), Tập 15.
Tài liệu tiếng nước ngoài
22. Debby Bogaert, NT Ha, Marcel Sluijter, N Lemmens, Ronald de Groot,PWM
Hermans (2002), "Molecular epidemiology of pneumococcal carriage among
children with upper respiratory tract infections in Hanoi, Vietnam", Journal of
clinical microbiology, 40(11), pp. 3903-3908.
23. Jung-San Chang, Hong-Wen Liu, Kuo-Chih Wang, Mei-Chun Chen, Lien-
Chai Chiang, Yi-Cheng Hua,Chun-Ching Lin (2005), "Ethanol extract of
Polygonum cuspidatum inhibits hepatitis B virus in a stable HBV-producing
cell line", Antiviral research, 66(1), pp. 29-34.
24. Irena M Choma, Edyta M Grzelak (2011), "Bioautography detection in thin-
layer chromatography", Journal of Chromatography A, 1218(19), pp. 2684-
2691.
25. Chin-Yuan Hsu, Yu-Pei Chan,Jeli Chang (2007), "Antioxidant activity of
extract from Polygonum cuspidatum", Biological research, 40(1), pp. 13-21.
26. Hong-Wei Lin, Ming-Xue Sun, Yun-Hua Wang, Liu-Meng Yang, Ying-Ruo
Yang, Ning Huang, Li-Jiang Xuan, Ya-Ming Xu, Dong-Lu Bai,Yong-Tang
Zheng (2010), "Anti-HIV activities of the compounds isolated from
Polygonum cuspidatum and Polygonum multiflorum", Planta medica, 76(09),
pp. 889-892.
27. Yun-Wei Lin, Fu-Jung Yang, Chia-Ling Chen, Wei-Ting Lee, Ruey-Shyang
Chen (2010), "Free radical scavenging activity and antiproliferative potential
of Polygonum cuspidatum root extracts", Journal of natural medicines, 64(2),
pp. 146-152.
28. Dinesh K Maheshwari (2010), Plant growth and health promoting bacteria,
Springer Science & Business Media, pp. 445.
29. DN Muanza, BW Kim, KL Euler,L Williams (1994), "Antibacterial and
antifungal activities of nine medicinal plants from Zaire", International
Journal of Pharmacognosy, 32(4), pp. 337-345.
30. Chang Eun Park, Min-Jung Kim, Jong Hwa Lee, Byung-Il Min, Hyunsu Bae,
Wonchae Choe, Sung-Soo Kim,Joohun Ha (2007), "Resveratrol stimulates
glucose transport in C2C12 myotubes by activating AMP-activated protein
kinase", Experimental & molecular medicine, 39(2), pp. 222.
31. Wei Peng, Rongxin Qin, Xiaoli Li, Hong Zhou (2013), "Botany,
phytochemistry, pharmacology, and potential application of Polygonum
cuspidatum Sieb. et Zucc.: a review", Journal of ethnopharmacology, 148(3),
pp. 729-745.
32. Bin Shan, Yi-Zhong Cai, John D. Brooks, Harold Corke (2008), "Antibacterial
properties of Polygonum cuspidatum roots and their major bioactive
constituents", Food Chemistry, 109(3), pp. 530-537.
33. J. H. Song, T. C. Yang, K. W. Chang, S. K. Han, H. K. Yi,J. G. Jeon (2007),
"In vitro effects of a fraction separated from Polygonum cuspidatum root on
the viability, in suspension and biofilms, and biofilm formation of mutans
streptococci", J Ethnopharmacol, 112(3), pp. 419-25.
34. Jae-Hoon Song, Sook-In Jung, Kwan Soo Ko, Na Young Kim, Jun Seong Son,
Hyun-Ha Chang, Hyun Kyun Ki, Won Sup Oh, Ji Yoeun Suh, Kyong Ran
Peck (2004), "High prevalence of antimicrobial resistance among clinical
Streptococcus pneumoniae isolates in Asia (an ANSORP study)",
Antimicrobial agents and chemotherapy, 48(6), pp. 2101-2107.
35. Pai-Wei Su, Cheng-Hong Yang, Jyh-Ferng Yang, Pei-Yu Su, Li-Yeh Chuang
(2015), "Antibacterial Activities and Antibacterial Mechanism of Polygonum
cuspidatum Extracts against Nosocomial Drug-Resistant Pathogens",
Molecules, 20(6), pp. 11119-11130.
36. Ying Xu, Zhichao Wang, Wenting You, Xiuhua Zhang, Shan Li, Philip A
Barish, Matthew M Vernon, Xia Du, Gaowen Li, Jianchun Pan (2010),
"Antidepressant-like effect of trans-resveratrol: involvement of serotonin and
noradrenaline system", European neuropsychopharmacology, 20(6), pp. 405-
413.
37. Jung-Mi Yun, Alexander Chien, Ishwarlal Jialal, Sridevi Devaraj (2012),
"Resveratrol up-regulates SIRT1 and inhibits cellular oxidative stress in the
diabetic milieu: mechanistic insights", The Journal of nutritional
biochemistry, 23(7), pp. 699-705.
