TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH –KTNN
======
NGUYỄN VÕ HÀ THU
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
HÀ NỘI, 2019
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH –KTNN
======
NGUYỄN VÕ HÀ THU
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
ThS. Phạm Thị Kim Dung
HÀ NỘI, 2019
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa, các thầy, cô giáo trong Sinh – KTNN, các thầy cô giáo ở Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S Phạm Thị Kim Dung là ngƣời đã theo sát và hƣớng dẫn em trong quá trình hoàn hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Do lần đầu tiên làm nghiên cứu khoa học về mặt kiến thức em vẫn còn nhiều hạn chế, nên việc thiếu sót là không thể tránh khỏi. Vì vậy em rất mong sự góp ý của quý thầy, cô cũng nhƣ các bạn sinh viên để khóa luận cuả em hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Võ Hà Thu
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi đƣợc hƣớng dẫn bởi Th.S Phạm Thị Kim Dung. Những số liệu kết quả này là hoàn toàn trung thực không trùng lặp với đề tài khác. Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Võ Hà Thu
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài .......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Tổng quan về chủng vi khuẩn .................................................................... 3
1.1.1. Vị trí, phân loại của Gluconacetoacter xylinus ....................................... 3
1.1.2. Đặc điểm của Gluconacetoacter xylinus ................................................. 3
1.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus ..................................... 3
1.1.4. Đặc điểm cấu trúc màng tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus ................. 4
1.1.5. Tính độc đáo của màng cellulose vi khuẩn ............................................. 4
1.1.6. Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn .................................................. 5
1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac natri ......................................................... 5
1.2.1. Sơ lƣợc về thuốc Diclofenac natri ........................................................... 5
1.2.1.1. Công thức ............................................................................................. 5
1.2.1.2. Nguồn gốc và tính chất ........................................................................ 6
1.2.1.3. Dƣợc động học và tác dụng.................................................................. 6
1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri ................. 7
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri trên thế giới ..................................................................................................................... 7
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri tại Việt Nam ................................................................................................................... 7
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................................................................... 9
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................. 9
2.1.1 Chủng vi khuẩn ........................................................................................ 9
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................. 9
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 9
2.2. Phạm vi, nội dung nghiên cứu, địa điểm, thời gian nghiên cứu .............. 10
2.2.1. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 10
2.2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 10
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 10
2.2.4. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 10
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 10
2.3.1. Phƣơng pháp chế tạo vật liệu cellulose ................................................. 10
2.3.1.1. Lên men thu vật liệu cenlulose từ môi trƣờng nƣớc vo gạo ............. 11
2.3.1.2. Xử lý vật liệu cenllulose trƣớc khi hấp thụ thuốc .............................. 11
2.3.1.3. Đo độ dày màng ................................................................................. 12
2.3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu màng cellulose ........................... 12
2.3.2. Xây dựng đƣờng chuẩn. ........................................................................ 13
2.3.3. Xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào vật liệu cellulose ................... 14
2.3.4. Phƣơng pháp xử lý thống kê ................................................................. 15
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 16
3.1. Kết quả tạo các loại vật liệu cellulose ...................................................... 16
3.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của thuốc Diclofenac natri ........................... 18
3.3. Khối lƣợng thuốc Diclofenac natri hấp thu vào màng ............................. 21
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 24
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac natri .................................. 6
Hình 3.1. Màng dày 0,5 cm ............................................................................. 16
Hình 3.2. Màng nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo ............................... 17
Hình 3.3. Màng dày 0,5 cm ............................................................................. 17
Hình 3.4. Màng tinh chế .................................................................................. 18
Hình 3.5. Màng gạo tinh khiết 0, 5 cm; d = 1,5 cm ........................................ 18
Hình 3.6. Phƣơng trình đƣờng chuẩn Diclofenac natri OD = 283 .................. 19
Hình 3.7. Rút mẫu đo 1 giờ ............................................................................. 20
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men tạo vật liệu cenlulose ..................................... 11
Bảng 3.1. Giá trị OD của màng sau các khoảng thời gian .............................. 20
Bảng 3.2. Lƣợng thuốc Diclofenac natri hấp thụ vào màng gạo sau 2 giờ .... 21
Bảng 3.3. Hiệu suất hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng gạo sau 2 giờ..
......................................................................................................................... 22
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Màng cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus là một loại màng sinh học đặc biệt có cấu trúc và đặc tính giống với cellulose ở thực vật. Tuy nhiên màng cellulose vi khuẩn khác với màng cellulose thực vật ở: màng cellulose vi khuẩn có đặc tính dẻo dai, bền chắc hơn màng cellulose thực vật do màng cellulose vi khuẩn không chứa các hợp chất cao phân tử nhƣ: ligin, peptin, sáp nến, [9]. … Cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus có một số tính chất hóa lý đặc biệt nhƣ: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nƣớc cao, đƣờng kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, ...Vì vậy, nó đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học, ... đáng chú ý nhất trong sự kiểm soát các hệ thống vận chuyển thuốc [2]
Dùng màng cenlulose vi khuẩn làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy [2]....
Trong lĩnh vực y học, màng cenlulose vi khuẩn đã đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời. Ngoài ra màng cenlulose vi khuẩn đã đƣợc sử dụng nhƣ trong một vài hệ thống để phân phối thuốc, các sợi cellulose vi khuẩn có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trƣờng acid.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên về màng cellulose vi khuẩn. Amin và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng màng cellulose vi khuẩn làm màng bọc cho paracetamol bằng cách phun phủ. Kết quả cho thấy màng cellulose vi khuẩn có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc[3]. Ở nƣớc ta việc nghiên cứu và ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn đang đƣợc quan tâm trong những năm gần đây. Năm 2006, Nguyễn Văn Thanh đã nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose
1
trị bỏng từ vi khuẩn”. Kết quả cho thấy có thể chế tạo màng với quy mô công nghiệp từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm.
của nó mạnh hơn aspirin, nhƣng
Diclofenac, dẫn xuất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không steroid. Diclofenac đƣợc dùng chủ yếu dƣới dạng muối natri. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh. [7]. Natri diclofenac có hoạt tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt do khả năng ức chế đặc hiệu enzym cyclo- oxygenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp prostaglandin, prostacyclin, thromboxane... là các chất trung gian gây đau,sốt. Hoạt tính chống viêm tƣơng đƣơng với indomethacin. Chủ yếu đƣợc sử dụng trong các bệnh xƣơng khớp nhƣ: viêm khớp dạng thấp, viêm bao hoạt dịch, viêm gân, viêm khớp vi tinh thể. Thuốc dễ dàng đƣợc hấp thụ qua đƣờng tiêu hóa khi uống, khi uống lúc đói thuốc đƣợc hấp thụ nhanh hơn [7].
Với mục đích đánh giá đƣợc khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cenlulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cenlulose
tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá đƣợc khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo.
3. Nội dung nghiên cứu
Chế tạo đƣợc vật liệu màng, xử lý vật liệu màng trƣớc khi cho hấp thụ
thuốc, xác định lƣợng màng tạo thành.
Đánh giá khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo.
2
NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về chủng vi khuẩn
1.1.1. Vị trí, phân loại của Gluconacetoacter xylinus
Gluconacetoacter xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, là loại vi khuẩn
hiếu khí, có khả năng sản xuất cellulose ngoại bào[7].
1.1.2. Đặc điểm của Gluconacetoacter xylinus
- Hình thái: có dạng que, hơi cong hoặc thẳng, là nhóm vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử, không di chuyển, sắp xếp riêng rẽ có khi xếp thành chuỗi [7].
- Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Có khả năng oxy hóa ethanol thành acidacetic, có khả năng tổng hợp cellulose, chuyển hóa đƣờng thành axit, có phản ứng với catalase dƣơng tính. Chủng vi khuẩn phát triển tối ƣu ở 25 – 300 C, tăng trƣởng trong khoảng pH từ 3 – 8, ở pH bằng 5,5 là mức pH tối ƣu để sản xuất cellulose.
1.1.3. Môi trường nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus
- Gluconacetoacter xylinus đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng tổng hợp từ các nguồn dinh dƣỡng nhƣ: cacbon, nitơ, photpho, các yếu tố vi lƣợng và các yếu tố tăng trƣởng. Gluconacetoacter xylinus là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ cacbonhydrat. Glucse, fructose, maninol,… là nguồn cacbohydrat chủ yếu mà màng cellulose vi khuẩn này sử dụng. Khi sử dụng Glycerol, galactose, lactose,… thì màng cellulose vi khuẩn này tổng hợp cellulose cho hiệu suất thấp hơn và không nên dùng mannose, cellobiose, acetate,…làm nguồn cacbonhydrat[2]. Tùy thuộc vào các màng cellulose vi khuẩn khác nhau mà ngƣời ta sử dụng các loại đƣờng cũng nhƣ nồng độ các loại đƣờng sao cho hợp lý.
- Các sản phẩm khác: Rỉ đƣờng, chất thải trong công nghiệp sản xuất phomat, khoai tây, nƣớc mía, nƣớc dừa già,… cũng là nguồn nguyên liệu để nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus
3
1.1.4. Đặc điểm cấu trúc màng tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus
- Màng cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer không phân nhánh
gồm các gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết [3]. Các
chuỗi glucan đƣợc vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành các thớ sợi thứ cấp. Khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong thƣợng tầng ở một loài thực vật thì ngƣời ta thấy sợi thứ cấp là loại sợi tự nhiên mảnh nhất. Các sợi thứ cấp kết lại với nhau tạo thành vi sợi, các vi sợi tạo thành các bó sợi, các bó sợi tạo thành dải sợi. Một dải sợi có chiều dài khoảng 130 – 177 nm và dày khoảng từ 3 – 4 nm.
- Tính đến thời điểm hiện tại Gluconacetoacter xylinus đƣợc đánh giá
là loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose hiệu quả nhất trong tự nhiên
Cấu trúc hóa học cơ bản của màng cellulose vi khuẩn giống với cellulose có nguồn gốc tự nhiên, tuy vậy cấu trúc đại thể của chúng vẫn có sự khác nhau. Ở màng cellulose vi khuẩn các sợi mới sinh ra kết lại với nhau tạo thành sợi sơ cấp, các sợi sơ cấp kết lại tạo thành vi sợi (vi sợi nằm trong bó), cuối cùng các dải sợi đƣợc hình thành. [3]. Cấu trúc của màng cellulose vi khuẩn phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy... Cụ thể cấu trúc hóa học đƣợc trình bày trong hình:
1.1.5. Tính độc đáo của màng cellulose vi khuẩn
- Là loại màng trong suốt, có cấu trúc mạng tinh thể [3].
- Có sức căng, độ bền sinh học cao, kích thƣớc ổn định [3].
4
- Có khả năng hấp thụ nƣớc và giữ nƣớc tốt, có độ xốp chọn lọc. So với các loại cellulose khác thì màng cellulose vi khuẩn có độ tinh sạch cao hơn [3].
- Dễ dàng bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật [3].
- Có khả năng kết sợi và tạo tinh thể tốt, khả năng chịu nhiệt và tính
bền cơ học cao [3].
- Màng cellulose đƣợc tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy, các sản phẩm từ cellulose vi khuẩn đƣợc sản xuất trực tiếp mà không cần qua các bƣớc trung gian [3].
- Đặc biệt có thể tổng hợp cellulose dƣới dạng màng mỏng hay sợi cực
nhỏ nhờ vi khuẩn [3].
1.1.6. Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn
Màng cenlulose vi khuẩn đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau nhƣ:
- Dùng màng cenlulose vi khuẩn làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy [2] ...
- Trong lĩnh vực y học, màng cenlulose đã đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời. Ngoài ra, màng cenlulose đã đƣợc sử dụng nhƣ trong một vài hệ thống để phân phối thuốc, các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trƣờng acid [2].
1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac natri
1.2.1. Sơ lược về thuốc Diclofenac natri
1.2.1.1. Công thức
Diclofenac natri:
5
- Tên khoa học: Natri 2-[(2,6-diclorophenyl)amino]phenyl] acetat, - Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2 - Công thức cấu tạo: [7].
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac natri
- Khối lƣợng phân tử: 318,10 đvC [7]. - Nhiệt độ nóng chảy: 283 - 285oC [7].
1.2.1.2. Nguồn gốc và tính chất
- Nguồn gốc: Có nguồn gốc thảo dƣợc
- Tính chất:
Natri diclofenac là một acid yếu. Tồn tại ở dạng kết tinh hoặc tinh thể trắng[7]. Độ tan: dễ tan trong ethanol 96%, methanol, hơi tan trong nƣớc và acid acetic băng, thực tế không tan trong ether. Độ tan trong nƣớc phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, và các chất có mặt trong môi trƣờng hoà tan [7].
1.2.1.3. Dƣợc động học và tác dụng
- Thuốc dễ dàng đƣợc hấp thụ qua đƣờng tiêu hóa khi uống, khi uống
lúc đói thuốc đƣợc hấp thụ nhanh hơn [7].
6
- Natri diclofenac có hoạt tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt do khả năng ức chế đặc hiệu enzym cyclo- oxygenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp prostaglandin, prostacyclin, thromboxane... là các chất trung gian gây đau, sốt [7].
Hoạt tính chống viêm của nó mạnh hơn aspirin, nhƣng tƣơng đƣơng
với indomethacin [7].
Chủ yếu đƣợc sử dụng trong các bệnh xƣơng khớp nhƣ: viêm khớp
dạng thấp, viêm bao hoạt dịch, viêm gân, viêm khớp vi tinh thể.
1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri trên thế giới
Nghiên cứu về màng cellulose vi khuẩn từ Gluconacetoacter xylinus và
ứng dụng của nó đã đƣợc nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới.
- Năm 1989 Brown và cộng sự đã sử dụng màng nhƣ một chất để biến đổi độ nhớt, để sản xuất ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng trong cơ chất sinh học, thực phẩm.
- Năm 1998 Jonas, Farad, năm 2006 Czafa và cộng sự đã nghiên cứu
dùng màng cellulose vi khuẩn để làm mặt nạ dƣỡng da và da nhân tạo
Diclofenac natri là thuốc nằm trong danh mục thuốc thiết yếu của 74 nƣớc, phần lớn đƣợc nghiên cứu và sử dụng để chữa các bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm bao dịch, viêm gân,…
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri tại Việt Nam
Ở nƣớc ta việc nghiên cứu và sử dụng màng cellulose vi khuẩn vẫn dừng lại ở mức khiêm tốn, hầu hết các nghiên cứu đang chỉ dừng lại ở bƣớc đầu và ở quy mô phòng thí nghiệm
Hiện nay, ở Việt Nam tình hình điều trị các bệnh viêm khớp ngày càng đƣợc cải tiến. Việc sử dụng màng cellulose vi khuẩn làm tác nhân vận chuyển thuốc vẫn đang đƣợc nghiên cứu và đang là một hƣớng đi mới.
7
Ở nƣớc ta, Diclofenac natri đƣợc sử dụng là một loại thuốc chữa các
bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm bao dịch, viêm gân,…
8
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của màng celllulose vi khuẩn
nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo.
2.1.1. Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Gluconacetoacter xylinus dùng lên men thu nhận vật
liệu celulose đƣợc mua tại Nhật Bản.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Nguyên liệu:
Nƣớc vo gạo, gạc vô trùng
Các loại hóa chất:
+ Diclofenac natri dạng tinh khiết (Việt Nam) + Đƣờng glucose (Việt Nam) + Pepton (Việt Nam) + Nƣớc cất (Việt Nam) + NaOH, HCl, (NH4)2SO4 (Việt Nam) + Acid acetic (Việt Nam) + Metanol (Việt Nam)
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
* Thiết bị:
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản) - Cân phân tích (Sartorius - Thụy Sỹ) - Cân kỹ thuật - Sartorius TE 3102 S - Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA - Buồng cấy vô trùng (Haraeus) - Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức) - Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức) - Máy nƣớc cất 2 lần (Hamilton - Anh)
9
- Bể ổn nhiệt (Đức)
- Máy lắc
- Tủ lạnh, tủ lạnh sâu và các dụng cụ hóa sinh khác
* Dụng cụ:
- Bình định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml
- Pipet 1ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml
- Micropipet 20-200 µl
- Hộp nhựa và đĩa 24 giếng để lên men tạo vật liệu cenlulose vi khuẩn có các kích thƣớc: 10 x 15 cm, 3 x 5 cm, 1,5 x 1,5 cm, bình tam giác, ống nghiệm và các dụng cụ hóa sinh khác.
2.2. Phạm vi, nội dung nghiên cứu, địa điểm, thời gian nghiên cứu
2.2.1. Phạm vi nghiên cứu
Đánh giá khả năng hấp thụ Diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra
từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo.
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo và thu màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng nƣớc vo gạo.
- Nạp Diclofenac natri vào màng.
- Thử nghiệm khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng.
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Phòng Sinh lý ngƣời và động vật, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
- Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
2.2.4. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: 15 tuần
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chế tạo vật liệu cellulose
10
2.3.1.1. Lên men thu vật liệu cenlulose vi khuẩn từ môi trƣờng nƣớc vo gạo
Bước 1: Chuẩn bị môi trƣờng theo bảng 1.
Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men tạo vật liệu cenlulose
Thành phần Hàm lƣợng
Glucose 30 g
Pepton 10 g
Diamoni photphat 0,3 g
Amoni sulfat 0,5 g
Acid acetic 2 %
Nƣớc vo gạo 1000 ml
Dịch giống 10 %
Lƣu ý: pH của môi trƣờng đƣợc đo và hiệu chỉnh bằng HCl hoặc NaOH; pH của môi trƣờng đƣợc đo và hiệu chỉnh = 4-6,pH thấp sẽ tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác.
Bước 2: Hấp khử trùng các môi trƣờng ở 1130C trong 15 phút.
Bước 3: Lấy môi trƣờng ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để
nguội môi trƣờng.
Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống, lắc đều tay cho giống phân bố đều
trong dung dịch.
Bước 5: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thƣớc nghiên cứu, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4 – 14 ngày ở 280C.
Bước 6: Thu vật liệu cellulose thô, rửa sạch chúng dƣới vòi nƣớc.
2.3.1.2. Xử lý vật liệu cenllulose vi khuẩn trƣớc khi hấp thụ thuốc
Mục đích: loại bỏ đƣợc các tạp chất trong môi trƣờng nuôi cấy, đồng
thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn.
11
Phƣơng pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, cellulose tạo thành vật liệu dày ở
mặt môi trƣờng nuôi cấy, ép vật liệu loại bỏ môi trƣờng.
Để thu đƣợc màng tinh chế ta cần thực hiện các bƣớc sau:
+ Tách màng: Trong nuôi cấy tĩnh, cellulose tạo thành vật liệu dày ở mặt môi trƣờng nuôi cấy, ép vật liệu loại bỏ môi trƣờng.
+ Ngâm trong NaOH: Trong vật liệu chứa một lƣợng lớn vi khuẩn, vì vậy, hấp vật liệu trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1 giờ.
+ Ngâm trong HCl: Màng sau khi đƣợc ngâm trong NaOH, rửa sạch bằng nƣớc rồi ép màng. Ngâm màng trong HCl 3% trong 48 giờ.
+ Ngâm nƣớc: Vớt vật liệu đặt dƣới vòi nƣớc chảy đến khi vật liệu trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trƣờng bề mặt vật liệu cenllulose vi khuẩn cần đạt là trung tính, ta thu đƣợc cenllulose vi khuẩn tinh khiết
2.3.1.3. Đo độ dày màng
Độ dày màng đƣợc đo bằng thƣớc kẹp panme, cần đo ở các vị trí khác
nhau. Sau đó tính toán các lần đo ta đƣợc độ dày màng cần lấy.
2.3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu màng cellulose
Mục đích: Nhằm đảm bảo vật liệu màng cellulose vi khuẩn sau khi xử lý đã loại đƣợc các tạp chất có thể gây độc hại. Chất đƣợc khảo sát là đƣờng glucose và protein của vi khuẩn.
* Tìm sự hiện diện của glucose trong vật liệu màng cellulose tinh chế
Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện của đƣờng D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
+ Bƣớc 1. Lấy dịch thử của màng sau khi đã xử lý hóa học. Mẫu đối
chứng là: nƣớc cất và dung dịch đƣờng glucose.
12
+ Bƣớc 2. Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1 ml
thuốc thử Fehling, đun dƣới ngọn lửa đèn cồn từ 10 – 15 phút.
+ Bƣớc 3. Quan sát kết tủa trong ống nghiệm.
*Tìm sự hiện diện của protein trong vật liệu màng cellulose tinh chế
Nguyên tắc: Định tính protein còn lại trong vật liệu bằng phản ứng tạo kết tủa của protein với acid triclor acetic.
Tiến hành: Vật liệu màng cellulose tinh chế đƣợc cắt nhỏ, cho vào 50ml nƣớc cất, lắc kỹ với máy rung siêu âm trong 10 phút. Dùng dung dịch acid triclor acetic 1% để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết vật liệu. Mẫu chứng âm là nƣớc cất và mẫu chứng dƣơng là dung dịch pepton 1% (pepton đã sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn). Phản ứng dƣơng tính khi cho kết tủa đục. So sánh với mẫu chứng âm không chứa protein [3].
Vật liệu màng cellulose tinh chế dùng để tạo vật liệu nạp thuốc
Diclofenac natri phải đạt đƣợc những tính chất sau:
+ Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có
tính che phủ tốt.
+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nƣớc và dịch mô [4].
2.3.2. Xây dựng đường chuẩn.
Phƣơng pháp: Dùng máy quét quang phổ
Sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru - Nhật Bản) để đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến. Máy bao gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm. Chúng tôi sử dụng hai cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu đƣợc làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ±0,005cm. Các cuvet đo đƣợc làm sạch và thao tác thận [1], [4].
* Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: là HCl 0,1N.
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác 300 mg diclofenac natri chuẩn đƣợc chuyển sang bình định mức 100 ml. 20-30 ml 0,1N HCl đã đƣợc thêm vào để hòa tan diclofenac natri. Thể tích đƣợc làm thành 100 ml với
13
dung môi tƣơng tự (A). 10 ml dung dịch (A) đã đƣợc thu hồi và thể tích đƣợc điều chỉnh đến 300 ml (B). Lấy 10 ml từ dung dịch (B) đã đƣợc thu hồi và pha loãng thành 100ml để lấy 10 (µg/ml) trong dung dịch HCl 0,1 N [2], [5].
Pha dãy dung dịch chuẩn chứa thuốc Diclofenac natri trong dung môi HCl 0,1 N ở các nồng độ (µg/ml) khác nhau. Quét phổ dung dịch Diclofenac natri có nồng độ 10 (µg/ml) trong khoảng bƣớc sóng từ 200 đến 800nm, lựa chọn bƣớc sóng tại đó đạt cực đại (λmax) hấp thụ [4]
Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn tại bƣớc sóng đã lựa chọn với mẫu trắng là dung dịch HCl 0,1N và xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn mối tƣơng quan giữa độ hấp thụ và nồng độ Diclofenac natri.
Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – 2450 để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch đã pha nhƣ trên ở hấp thu cực đại (λmax) [4].
Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc Diclofenac natri để xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc. Phƣơng trình tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ Diclofenac natri và độ hấp thụ.
Phƣơng trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có
dạng:
y = ax + b với R2 là hệ số tƣơng quan
Trong đó: y: độ hấp thu của dung dịch tại λ max
x: nồng độ của dung dịch
Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc Diclofenac natri ở các nồng độ khác nhau.
2.3.3. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu cellulose
- Sử dụng vật liệu cellulose đƣợc tạo ra từ nƣớc vo gạo có kích thƣớc 0,5cm và độ dày 0,5 cm và 1 cm đều nhau, đem hấp thụ
+ Mẫu 1. Màng có độ dày 0,5 cm không sấy
+ Mẫu 2. Màng có độ dày 0,5 cm ép nƣớc
+ Mẫu 3. Màng có độ dày 1 cm không sấy
14
+ Mẫu 4. Màng có độ dày 1 cm ép nƣớc
- Cho các mẫu vào các bình tam giác đã chuẩn bị sẵn mỗi bình chứa 100 ml dung dịch thuốc. Sau đó cho vào máy lắc, lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong thời gian 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ và 2 giờ, sau đó lấy mãu dung dịch ra đo bằng máy đo quang phổ bằng máy UV – 2450 để xác định lƣợng thuốc còn lại trong dung dịch tại thời điểm lấy mẫu, từ đó xác định đƣợc nồng độ thuốc, xác định khối lƣợng thuốc còn trong dung dịch m2 lƣợng thuốc hấp thụ vào các vật liệu cellulose theo công thức 1.
mht = m1 – m2 (mg) (1)
Trong đó: mht: khối lƣợng thuốc đã đƣợc hấp thu vào vật liệu
m1: khối lƣợng thuốc ban đầu trong dung dịch
m2: khối lƣợng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời
gian nhất định vật liệu hấp thu thuốc.
- Thực hiện đo 3 lần để lấy giá trị OD trung bình để tính toán. Lấy giá trị OD trung bình thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn, tính đƣợc nồng độ tƣơng ứng
- Hiệu suất thuốc hấp thụ vào màng đƣợc tính theo công thức sau:
(2) EE (%) = Qt - Qd/ Qt x 100%
Trong đó: EE: phần trăm thuốc nạp vào vật liệu.
Qt: Lƣợng thuyết lý thuyết (mg)
Qd: Lƣợng thuốc còn lại (mg)
2.3.4. Phương pháp xử lý thống kê
Các số liệu đƣợc phân tích, xử lý thông qua phần mềm Excel 2013. Kết
quả đƣợc biểu diễn dƣới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn.
Kiểm định giả thiết về giá trị trung bình của các mẫu bằng cách sử dụng test thống kê. Những khác biệt đƣợc coi là có ý nghĩa thống kê khi trị số p < 0,05.
15
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tạo các loại vật liệu cellulose
Sau 7 ngày nuôi cấy ta thu đƣợc màng có độ dày 0,5 cm và sau 14 ngày ta thu đƣợc màng có độ dày 1 cm. Tại các thời điểm khác nhau ta thu đƣợc các màng có độ dày, mỏng khác nhau là do trong môi trƣờng còn chất dinh dƣỡng các vi khuẩn tiếp tục phát triển tạo các lớp màng có độ dày khác nhau. Sau đây là một số hình ảnh đƣợc chụp lại trong quá trình làm thí nghiệm:
Hình 3.1. Màng dày 0,5 cm
16
Hình 3.2. Màng nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc vo gạo
Hình 3.3. Màng dày 0,5 cm
Màng đƣợc nuôi cấy từ môi trƣờng gạo sau khi tinh chế sẽ đáp ứng các nhu cầu sau: Màng mềm mại, linh hoạt, có độ bền, độ đàn hồi cao, dễ gấp, khi để ngoài không khí không bị khô. Ta có màng tinh chế:
17
Hình 3.4. Màng tinh chế
Để việc nghiên cứu hấp thụ thuốc đƣợc diễn ra dễ dàng ta sử dụng khuôn đục màng thành những màng nhỏ với kích thƣớc 1,5 cm nhƣ hình sau:
Hình 3.5. Màng gạo tinh khiết 0, 5 cm; d = 1,5 cm
3.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của thuốc Diclofenac natri
Ta có phƣơng trình đƣờng chuẩn của Diclofenac natri đƣợc thể hiện ở
hình sau:
18
1,8
1,6
y = 0,2432x - 0,1655 R² = 0,996
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
8
7
3
2
4
6
5
0 Hình 3.6. Phƣơng trình đƣờng chuẩn Diclofenac natri OD = 283
Với: y là giá trị OD tƣơng ứng ở nồng độ x
X là nồng độ % (g/ml)
R2 là hệ số tƣơng quan
Tiến hành đo mật độ quang của các nồng độ của thuốc Diclofenac natri khác nhau bằng máy đo quang phổ UV – 2450 tại Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, sau đó tiếp tục xử lý bằng phần mềm Excel, ta đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn của Diclofenac natri:
y = 0,2432x - 0,1655, R² = 0,996
Sau khi đo đƣợc OD ban đầu, tiếp tục cho màng vào hấp thụ, rút mẫu để tiến hành đo sau các khoảng thời gian 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ và 2 giờ . Ta rút mẫu vào các lọ thủy tinh nhỏ nhƣ hình sau:
19
Hình 3.7. Rút mẫu đo 1 giờ
Giá trị OD sau mỗi lần rút mẫu đƣợc thể hiện qua bảng sau:
Bảng 3.1. Giá trị OD của màng sau các khoảng thời gian
Độ dày màng Đặc điểm của màng Giá trị OD theo thời gian
30 phút 1 giờ 1,5 giờ 2 giờ
0,5 cm Nguyên nƣớc
1,102 0,0021 1,105 0,0016 0,011 0,508 0,0014
20
Ép nƣớc 50%
1,094 0,0025 0,0024 0,0025 0,0026
1 cm Nguyên nƣớc
1,087 0,0016 0,0025 0,0027 0,598 0,0026
Ép nƣớc 50%
1,053 0,0013 0,0015 0,898 0, 0027 0,585 0,0029
3.3. Khối lƣợng thuốc Diclofenac natri hấp thu vào màng
Từ kết quả đo thu đƣợc, ta thấy sau 2 giờ ta nhận đƣợc kết quả tối ƣu nhất, từ đó tính đƣợc khối lƣợng thuốc hấp thụ đƣợc vào màng sau 2 giờ. Kết quả đƣợc ghi lại trong bảng sau:
Bảng 3.2. Lƣợng thuốc Diclofenac natri hấp thụ vào màng gạo sau 2
giờ
Khối lƣợng hấp thụ (mg)
Màng giữ nguyên nƣớc Màng ép nƣớc 50%
0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm
22,27 0,0017 21, 66 0,0014 22, 32 0,0018 21,88 0,002
Số liệu trên bảng 3.2 cho thấy màng dày 0,5 cm, ép nƣớc 50 % hấp thu đƣợc tốt hơn, tiếp đến là màng dày 0,5 cm giữ nguyên, sau đó là màng dày 1 cm, ép nƣớc và cuối cùng là màng dày 1 cm, giữ nguyên. Màng dày 0,5 cm, giữ nguyên hấp thụ ít hơn màng dày 0,5 cm, ép nƣớc là 0,05 mg. Màng dày 1 cm, giữ nguyên hấp thụ ít hơn màng dày 1 cm, ép nƣớc là 0,05 mg. Ta tính đƣợc hiệu suất hấp thụ thuốc theo bảng sau:
21
Bảng 3.3. Hiệu suất hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng gạo
sau 2 giờ
EE %
Màng giữ nguyên nƣớc Màng ép nƣớc 50%
0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm
88,35 0,0033 87,43 0,0044 88,98 0,0083 87,63 0,0024
Số liệu trên bảng 3.3 cho thấy màng dày 0,5 cm, ép nƣớc 50 % có hiệu suất hấp thụ tốt nhất, tiếp đến là màng dày 0,5 cm giữ nguyên, sau đó là màng dày 1 cm, ép nƣớc và cuối cùng là màng dày 1 cm, giữ nguyên. Ta có nhận xét:
- Hiệu suất hấp thụ và khối lƣợng thuốc tỉ lệ thuận với nhau - Đối với các loại màng khác nhau, xét trong cùng một khoảng thời gian hấp thụ thuốc, ta thấy màng có độ dày 0,5 cm hấp thụ thuốc tốt hơn màng có độ dày 1cm do màng có độ dày 1 cm có đƣờng đi của thuốc vào màng dài hơn màng có độ dày 0,5 cm
22
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của màng CVK nuôi cấy trong
môi trƣờng nƣớc vo gạo
- Màng càng mỏng thì khả năng hấp thu thuốc càng tốt - Màng chƣa ép nƣớc hấp thụ ít thuốc hơn so với màng ép nƣớc 50%
Cụ thể: màng dày 0,5 cm, ép nƣớc 50 % hấp thu đƣợc tốt hơn, tiếp đến là màng dày 0,5 cm giữ nguyên, sau đó là màng dày 1 cm, ép nƣớc và cuối cùng là màng dày 1 cm, giữ nguyên.
Hiệu suất hấp thụ và khối lƣợng thuốc tỉ lệ thuận với nhau.
Đối với các loại màng khác nhau, xét trong cùng một khoảng thời gian hấp thụ thuốc, ta thấy màng có độ dày 0,5 cm hấp thụ thuốc tốt hơn màng có độ dày 1cm do màng có độ dày 1 cm có đƣờng đi của thuốc vào màng dài hơn màng có độ dày 0,5 cm.
2. Kiến nghị
Để tăng hiệu quả sử dụng thuốc cần sử dụng thuốc trong các môi
trƣờng thích hợp.
Tiến hành nghiên cứu đề tài trên động vật để đánh giá sinh khả dụng
của thuốc từ hệ thống màng cellulose vi khuẩn mang thuốc.
23
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1]. Nguyễn Cảnh (2004), Quy hoạch thực nghiệm, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[2]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Nhƣ Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn A. xylinum tạo màng Bacteril Cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 50 (4), 453-462
[7]. Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia [9]. Hà Nguyên Phƣơng Anh, Trần Hậu Khang, Nguyễn Duy Hƣng (2014), “Đánh giá hiệu quả của Cimetidin trong phòng tái phát bệnh sùi mào gà tại Bệnh viện Da liễu trung ƣơng”, Tạp chí Da liễu Việt Nam số 16 (7/2014)
Tài liệu tiếng Anh
[3]. Abeer Khattab et al. (2017), “Optimization and Evaluation of Gastroretentive Ranitidine HCl Microspheres by Using Factorial Design with Improved Bioavailability and Mucosal Integrity in Ulcer Model”, AAPS PharmSciTech, 18(4), 957-975.
[4]. Choi Y. et al. (2004), “Preparation and characterization of acrylic acid treated bacterial cellulose cation exchange membrane”, J. Chem. Technol. Biotechnol, 79,79 – 84.
[5]. Nguyen T. X. et al. (2014), “Chitosan - coated nano - liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J. Mater. Chem. B, 2, 7149 – 7159. [6]. Nisha et al. (2013), “Formulation, in-vitro, evaluation and optimization of gi floating tablet of ranitidine HCl.”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(1),1-14 [8]. Stanislaw Bielecki, Alina Krystynowies Marianna, Turkiewies, Halina Kalinowska (1981), "Bacterial cellulose", Technical University of Ldz, Stefanowskieg, Poland, 901-924.
24
