Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây keo lai phân lập được ở Xuân Mai, Chương Mỹ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

.................oo0oo...................

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

T ỂN ỌN NG N Ứ T Ố ỦNG Ạ N Ả N NG N ẤT NG N ỐNG NẤ G ỆN TRÊN CÂY KEO N Ậ ĐƢ Ở XUÂN MAI ƢƠNG Ỹ - HÀ N I

NGÀNH

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ

: 7420201

Giáo viên hướng dẫn : Th.s Nguyễn Thị Minh Hằng

Sinh viên thực hiện : Bùi Văn Tuấn

Mã sinh viên : 1453071774

Lớp : K59B – CNSH

Khóa học : 2014 - 2018

Hà Nội, 2018

LỜI CẢ ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận đƣợc rất

nhiều sự động viên, khích lệ cũng với sự hƣớng dẫn nhiệt tình và chu đáo của

các cô, chú, anh chị và cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh

Hóa sinh, thuộc Viện Công nghệ sinh học m nghiệp Trƣờng Đại học Lâm

nghiệp Việt Nam.

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn s u sắc tới Th.s. Nguyễn Thị

Minh Hằng – GV Viện Công nghệ sinh họcLâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm

nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo hƣớng dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành báo

cáo Luận văn tốt nghiệp.

Nhóm tôi cũng ch n thành cảm ơn tập thể cán bộ, công nhân viên Viện

Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam đã

quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành báo cáo một cách

tốt nhất.

Cuối cùng cả nhóm xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã tạo

điều kiện động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện.

Hà Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2018

Sinh viên thực hiện

ùi ăn Tuấn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

NH MỤ HIỆU H VI T TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................ 1

HƢỢNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3

1.1. Tổng quan về cây keo............................................................................................. 3

1.1.1 Tình hình trồng keo lai tại Việt Nam .................................................................. 3

1.1.2. Các bệnh do nấm hại gây ra trên cây keo lai..................................................... 3

1.2. Giới thiệu về xạ khuẩn ........................................................................................ 5

1.2.1. Vị trí phân loại và sự phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên ............................... 5

1.2.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn .................................................................... 7

1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................................................................ 10

1.3. Phƣơng pháp ph n loại xạ khuẩn ........................................................................ 11

1.3.1. Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống ....................................................... 11

1.3.2. Phân loại theo phƣơng pháp hiện đại ............................................................... 13

1.4. Đại cƣơng về chất kháng sinh.............................................................................. 13

1.4.1. Chất kháng sinh (Antibiotic) ........................................................................... 13

1.4.2. Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh ............................................................... 14

1.4.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn ..................................................... 15

1.4.4. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn............................................. 16

1.5. Ứng dụng của chất kháng sinh ............................................................................ 17

1.5.1. Ứng dụng trong y học ....................................................................................... 17

1.5.2. Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y ...................................... 18

1.6. Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật ........................................................ 20

1.6.1. Ƣu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme ............................................ 20

1.6.2. Tuyển chọn các chủng sinh enzyme cao từ tự nhiên .................................... 21

1.6.3. Một số enzyme phổ biến có nguồn gốc từ vi sinh vật .................................. 22

hƣơng 2 NGUYÊN IỆU - MỤC TIÊU – NỘI UNG PHƢƠNG PH P

NGHIÊN CỨU ............................................................................................................. 23

2.1. Nguyên liệu ........................................................................................................... 23

2.1.1. Mấu đất ............................................................................................................... 23

2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................ 23

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất ............................................................................ 23

2.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 24

2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 24

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 25

2.4.1. Phƣơng pháp ph n lập nấm bệnh ..................................................................... 25

2.4.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn từ đất ........................................................... 25

2.4.3. Phƣơng pháp thuần khiết và bảo quản giống .................................................. 27

2.4.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh ................................................... 27

2.4.5. Phƣơng pháp lên men thu sinh khối tế bào xạ khuẩn ..................................... 28

2.4.6. Xác định hoạt tính enzyme của xạ khuẩn bằng phƣơng pháp khuếch tán trên

đĩa thạch ........................................................................................................................ 29

2.4.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................................ 29

hƣơng 3 T QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 30

3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn ................................................................................... 30

3.1.1. Phân lập xạ khuẩn .............................................................................................. 30

3.1.2. Phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu ............................................................ 31

3.1.3. thuần khiết và lƣu trữ giống XK phân lập đƣợc ............................................. 33

3.2. Phân lập, thuần khiết và lƣu trữ giống nấm gây bệnh trên cây keo lai ............ 33

3.2.1. Phân lập nấm gây bệnh ..................................................................................... 33

3.2.2. Thuần khiết và bảo quản chủng giống ............................................................. 34

3.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh ................................ 35

3.3.1. Tuyển chọn sơ bộ ban đầu bằng phƣơng pháp thỏi thạch ............................. 35

3.3.2. Tuyển chọn các chủng XK có HTKS cao ....................................................... 37

3.5. Thử nghiệm hoạt tính enzyme ngoại bào của 2 chủng XK tuyển chọn .......... 41

3.5.1. Xác định hoạt tính của các loại enzyme ngoại bào ........................................ 41

3.6. Nghiên cứu đặc điểm hình thái 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính

enzyme cao ................................................................................................................ 42

3.6.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của 2 chủng XK tuyển chọn ........................... 42

3.6.2. Quan sát đặc điểm hình thái và cuống sinh bào tử của một số chủng xạ

khuẩn dƣới k nh hiển vi ............................................................................................... 43

K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ .................................................................................... 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

N Ụ Ệ Ữ T TẮT

CFU Colony Forming Unit

BVTT Bảo vệ thực vật

GI Môi trƣờng Gause I

VSV Đ Vi sinh vật kiểm định

HSKS Hệ sợi kh sinh

HSCC Hệ sợi cơ chất

TB Tế bào

VSV Vi sinh vật

CMC Cacborxyl Methy cellulose

CKS hất háng sinh

HTKS Hoạt t nh kháng sinh

XK Xạ khuẩn

HTSH Hoạt t nh sinh học

VK Vi khuẩn

G Gram

G(+) Gram dƣơng

G(-) Gram âm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. háng sinh đƣợc phát hiện qua các năm [6] ............................................ 14

Bảng 3.1. Sự phân bố của xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau ............................... 30

Bảng 3.2. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu ........................... 31

Bảng 3.3 HTKS của 27 chủng XK với 3 chủng nấm LPT1, LPT2 và LPT3 ........ 35

Bảng 3.4. HTKS của 27 chủng xạ khuẩn theo nhóm màu ....................................... 36

Bảng 3.5. HTKS của 2 chủng XK tuyển chọn bằng phƣơng pháp thỏi thạch ...... 37

Bảng 3.6 HTKS của 2 chủng X đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng GI lỏng ở các

khoảng thời gian khác nhau ........................................................................................ 38

Bảng 3.7. Hoạt tính enzyme của 2 chủng XK ........................................................... 41

Bảng 3.8. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 2 chủng XK tuyển chọn ................... 43

Bảng 3.9: Kết quả quan sát cuống sinh bảo tử và hình dạng bào tử của 2 chủng

XK tuyển chọn (dƣới HV trƣờng ở vật kính X40) ................................................ 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn [44] ............................................................................... 7

Hình 1.2. Hình dạng cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng Streptomyces

cinereoruber subp [6] .................................................................................................. 10

Hình 3.1. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu ...................................... 32

Hình 3.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của một số chủng XK theo nhóm màu 32

Hinh3.3 Một số chủng X đƣợc thuần khiết ........................................................... 33

Hình 3.4: Nấm bệnh ph n lập trên môi trƣờng P ................................................ 34

Hình 3.5: ác chủng nấm bệnh đã đƣợc thuần khiết ................................................ 34

Hình 3.6 HTKS của chủng xạ khuẩn X ĐV12 lên 3 chủng nấm gây bệnh.......... 39

Hình 3.7 HTKS của chủng xạ khuẩn X Đ 9 lên 3 chủng nấm gây bệnh ............ 39

Hình 3.8. HTKS của 2 chủng XK kháng nấm hại cấy keo lai ................................ 40

Hình 3.9. Hoạt tính enzym của dịch lên men 2 chủng X đã tuyển chọn ............. 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nƣớc nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa ẩm lƣợng

mƣa lớn, nền nhiệt độ và độ ẩm không khi cao là điều kiện hết sức thuận lợi

cho vi sinh vật phát triển trong đó có rất nhiều các loại vi sịnh vật có hại gây

ảnh hƣởng tới đời sống con ngƣời và đặc biệt là với quá trình sản xuất nông

nghiệp. Có rất nhiều vi sinh vật gây bệnh cho động vật, thực vật và theo ghi

nhận hàng năm g y thiệt hại lớn cho ngành sản xuất nông – lâm – ngƣ nghiệp.

Để giảm thiểu sự nguy hại của vi sinh vật gây bệnh chúng ta đã sử dụng 1

lƣợng lớn chất bảo vệ thực vật hóa học tuy đem lại hiệu quả nhanh và tức

thời xong hệ lụy của nó để lại không hề nhỏ. Các chất độc hóa học khó tan,

lắng đọng, gây ô nhiễm nguồn nƣớc không kh đất... ảnh hƣởng xấu tới cuộc

sống con ngƣời và sinh vật.

Chính vì vậy tại Hội nghị tƣ vấn khu vực h u Thái Bình ƣơng của

F O năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của trƣơng trình

IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lƣợc là sử dụng tác nhân sinh học

để hạn chế sự phá hoại của vi sinh vật gây bệnh. Một trong những hƣớng giải

quyết tối ƣu đƣa ra là sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh chất

kháng sinh, chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Xạ khuẩn là một trong các

chủng vi sinh vật sinh kháng sinh đƣợc quan t m hàng đầu, bởi khả năng sinh

chất kháng sinh với hàm lƣợng lớn đa dạng và hoạt tính cao. Trong tổng số

các chất kháng sinh đƣợc ghi nhận sinh ra từ vi sinh vật thì có tới 80% là do

xạ khuẩn, trong số đó có những kháng sinh có khả năng kháng nấm gây bệnh

Keo lai là tên gọi viết tắt của giống lai tự nhiên giữa hai loài keo tai

tƣợng (Acacia mangium) và keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Giống lai

này đƣợc Messrs Hepbum và Shim phát hiện năm 1972 trong những hàng cây

trồng ven đƣờng. Năm 1978 khi xem xét các mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản

thực vật ở Queensland ( ustralia) Pedkey đã xác nhận đó là giống lai tự nhiên

giữa keo tai tƣợng và keo lá tràm. Trong tự nhiên keo lai cũng đƣợc phát hiện

ở Papu NewGuinea (Turn bull,1986; Grinfin, 1988)[27], eo lai đã đƣợc

nghiên cứu nhân giống thành công bằng hom (Griffin, 1991). Năm 1996 diện

tích trồng cây Keo lai khoảng 15.000ha thì đến hết năm 2004 diện tích trồng

c y eo lai đã hơn 127.000ha đến nay ƣớc tính diện tích trồng Keo lai

khoảng 200.000ha. Nhƣng bên cạnh đó hàng năm nấm g y bệnh trên c y keo

lai g y hậu quả rất nặng nề ảnh hƣởng lớn tới năng suất cũng nhƣ chất lƣợng

sản phẩm c y giống, việc sử dụng thuốc hóa học BVTT gây ảnh hƣởng xấu

tới sức khỏe con ngƣời, vật nuôi và môi trƣờng sống. Vì vậy việc sử dụng

các chế phẩm sinh học từ VSV là rất cần thiết và việc tìm kiếm các chủng xạ

khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm g y bệnh thực vật có tầm

quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật x y dựng một nền

nông nghiệp an toàn và bền vững.

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên theo xu hƣớng của công nghệ

sinh học thế giới hiện nay cũng nhƣ để góp phần khai thác nguồn lợi VSV

phong phú của khu vực Xuân Mai tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Tu n

họn v n hiên u t s h n hu n h năn sinh hất hán

sinh h n nấ ệnh trên o i ph n p ư Xuân Mai -

Chươn Mỹ - Hà N i"

Ƣ NG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây keo

1.1.1 Tình hình trồng keo lai t i Việt Nam

Keo lai là tên gọi viết tắt của giống lai tự nhiên giữa hai loài keo tai

tƣợng (Acacia mangium) và keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Giống lai

này đƣợc Messrs Hepbum và Shim phát hiện năm 1972 trong những hàng cây

trồng ven đƣờng. Năm 1978 khi xem xét các mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản

thực vật ở Queensland ( ustralia) Pedkey đã xác nhận đó là giống lai tự nhiên

giữa keo tai tƣợng và keo lá tràm. Trong tự nhiên keo lai cũng đƣợc phát hiện

ở Papu NewGuinea (Turn bull,1986; Grinfin, 1988) [27]

Hiện nay keo lai đƣợc trồng rất nhiều quốc gia trên thế giới : Australia,

Papua new Guinea va Indonexia , Malaixia, Philippin phù hợp với nhiều ñiều

kiện sinh thái, cây phát triển nhanh, trồng dễ sống, trong một chu kỳ cho một

sinh khối lớn hơn các loài keo khác và chất lƣợng gỗ cũng đẹp.

Sinh trƣởng và sản lƣợng: Qua các số liệu khảo nghiệm và trồng rừng

thực tế thì sinh trƣởng c y keo lai sinh trƣởng rất nhanh và cho sinh khối lớn

hơn rất nhiều so với các loài cây keo bố mẹ và các giống keo lai khác.

Những giống đã qua chọn lọc và khảo nghiệm có thể đạt năng suất 18 -

25 m3/ha/năm ở các tỉnh miền Bắc, 30 - 40m3/ha/năm ở các tỉnh Đông Nam

Bộ [27]. Keo lai có khả năng cố định đạm và khả năng cải tạo đất cao

hơn eo tai tƣợng và Keo lá tràm, phù hợp với điều kiện đất trống đồi núi

trọc ở nƣớc ta, gỗ keo lai có thể làm nguyên liệu giấy ván dăm sử dụng trong

xây dựng đóng đồ mộc… tăng thu nhập đáng kể cho ngƣời trồng rừng. Vì

thế eo lai đang là nhóm cây có diện tích trồng rừng lớn nhất ở nƣớc ta

những năm gần đ y.

Năm 1996 diện tích trồng cây Keo lai khoảng 15.000ha thì đến hết

năm 2004 diện tích trồng c y eo lai đã hơn 127.000ha đến nay ƣớc tính

diện tích trồng Keo lai khoảng 200.000ha.

1.1.2. Các bệnh do nấm h i gây ra trên cây keo lai

Các bệnh do nấm hại gây ra trên cây keo lai gồm 4 loại bệnh tiêu biểu

ệnh phấn trắng lá keo

o nấm Oidium sp g y ra. Nấm bệnh mọc trên bề mặt lá non chồi non

để hút dinh dƣỡng làm cho lá xoăn lại màu n u vàng khô chết nhƣng lá

không rụng.

Bệnh bắt đầu phát sinh vào tháng 11 nặng nhất là tháng 3 - 4. Trong

điều kiện th ch nghi và thời tiết m u bệnh rất dễ l y lan thành dịch.

Sợi nấm có thể qua đông trên đốm vàng của lá già để năm sau x m

nhiễm lá mới.

ệnh thán thƣ (đốm than)

o nấm Colletotrichum gloeosporioi g y ra. Bệnh phát sinh g y hại

trên lá chủ yếu ở đầu ngọn lá và mép lá.

úc đầu lá mất màu rồi lan rộng dần vào phiến lá vết bệnh có thể làm

khô đến nửa lá. Vết bệnh màu n u xám hoặc n u đen trên bề mặt vết bệnh có

các đốm chấm đen nhỏ lúc trời ẩm có thể thấy nhiều bộ màu hồng.

Trên cành non vết bệnh lõm xuống chung quanh có viền đen và giữa

vết bệnh có các chấm đen nhỏ.

Bệnh g y hại c y keo ở vƣờn ƣơm và rừng trồng làm c y sinh trƣởng

chậm. Bệnh phát triển mạnh vào tháng 3 - 5 tháng 6 giảm dần.

ệnh đen thân

o nấm Macrophomina phaseolina Tassi g y ra. Ban đầu gốc biến

thành màu n u lá mất màu xanh bệnh phát triển dần lên ngọn làm lá khô héo

rũ xuống phần vỏ th n co ngót tầng trong vỏ thối đen xốp hoặc dạng bột.

Trong đó mọc nhiều hạch nấm màu đen. Nấm bệnh có thể x m nhiễm

vào phần gỗ phần tủy gỗ biến thành màu n u đen và lan dần đến phần rễ c y

nhổ c y lên chỉ còn lại phần gỗ.

Trong mùa nắng nóng nhiệt độ mặt đất lên cao phần gốc c y bị tổn

thƣơng tạo điều kiện cho bệnh x m nhập g y hại.

Ở những khu vực t ch tụ nhiều nƣớc tỷ lệ c y bệnh càng tăng lên rõ rệt.

Sau thời tiết mƣa phùn 10 - 15 ngày bệnh bắt đầu phát sinh.

Về sau tăng dần đến tháng 10. Nặng nhất là các tháng 6 7 8.

ệnh nấm hồng

o nấm Corticium salmonicolor Berk & Br g y ra ở những vùng có

lƣợng mƣa cao.

Bệnh thƣờng xuất hiện vào đầu mùa mƣa dấu hiệu đầu tiên bằng mắt

thƣờng cũng dễ dàng nhận thấy có những đám màu trắng xuất hiện trên bề

mặt vỏ th n c y hay cành c y ở ph a bị che bóng thƣờng ở vị tr từ 1/5 đến 1/4

chiều cao của c y t nh từ ngọn.

Đến cuối mùa mƣa lớp màu hồng da cam này nhạt dần màu trở nên

màu trắng bẩn vỏ c y bị nứt ra để lộ một phần gỗ sợi nấm x m nhiễm vào

th n cành c y cũng nhƣ toàn bộ lá của của c y từ chỗ bị nấm x m nhiễm lên

đến ngọn bị héo chết có màu n u và không rụng ngay.

Đỉnh ngọn c y bị chết đổ gẫy từ chỗ gốc c y mọc chồi mới. Trƣờng

hợp nặng toàn bộ c y bị chết.

1.2. Giới thiệu về xạ khuẩn

1.2.1. Vị trí phân lo i và sự phân b x khu n trong tự nhiên

Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc Tenericutes (gồm vi

khuẩn gram dƣơng và xạ khuần, thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu

giới nh n sơ (prokaryota) [35].

Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ

Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ 110 chi và 1000 loài trong đó

có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại đƣợc

xếp vào nhóm XK hiếm [12,43]. Streptomyces đặc biệt nhiều trong đất nơi

chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ bằng các enzyme

ngoại bào. Một phần rất lớn các chất kháng sinh đƣợc sử dụng hiệu quả trong

điều trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces, trong đó đƣợc biết đến nhất là

streptomycin, erythromycin, tetracyclin [41].

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh

trƣởng hiếu khí và tạo khuẩn ty ph n nhánh tƣơng tự nhƣ nấm. Tên xạ khuẩn

– actinomycete – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) và

ban đầu xạ khuẩn đƣợc coi là vi nấm vì chúng sinh trƣởng giống với nấm.

Mạng lƣới phân nhánh của thể sợi thƣờng phát triển ở cả bề mặt cơ chất rắn

(tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong (tạo thành hệ sợi cơ chất) [28]. Đ y

là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn.

Xạ khuẩn là VK G(+) có tỷ lệ G+ cao (>55%) trong N . Đa số xạ

khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất nƣớc và xác thực

vật. Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng về mặt sinh thái trong vòng tuần hoàn

tự nhiên. Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó ph n hủy nhƣ

humic acid trong đất [43]. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignhin

bằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và các

peoxidase ngoại bào [34]. Các chủng xạ khuẩn xuất hiện trong môi trƣờng

giàu chất hữu cơ nhƣ các compost ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu

nhiệt (thermophilic) [40], và ở cống rãnh nƣớc thải nơi mà các xạ khuẩn chứa

mycolic acid kết hợp với việc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn định đặc

trƣng [38].

Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30º và pH trung t nh là điều kiện

tối ƣu cho xạ khuẩn phát triển. Mặc dầu vậy, nhiều loài đã đƣợc phân lập ở

các môi trƣờng khắc nghiệt ví dụ nhƣ Arthrobacter ardleyensis ƣa lạnh đƣợc

phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [28] và

Nocardiopis alkaliphila đƣợc phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở

pH 9,5 - 10 [31].

1.2.2. Đặ i m sinh học c a x khu n

1.2.2.1. Đặ i m hình thái

* Khuẩn lạc

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh

mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử khi hình thành bào

tử). Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với đƣờng k nh thay đổi trong

khoảng 0,2 - 1 µm đến 2 - 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [11,13].

ch thƣớc và khối lƣợng hệ sợi thƣờng không ổn định và phụ thuộc

vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Đ y là một trong những đặc điểm phân biệt

khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có

đƣờng kính rất lớn thay đổi từ 5 - 50 µm, dễ quan sát bằng mắt thƣờng.

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thƣờng chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi,

dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc rất đa

dạng: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện

ngoại cảnh.

ch thƣớc và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và tùy

vào điều kiện nuôi cấy nhƣ thành phần môi trƣờng, nhiệt độ độ ẩm… Đƣờng

kính của mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 - 2 mm nhƣng cũng có khuẩn lạc đạt tới

đƣờng kính 1cm hoặc lớn hơn.

Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tƣơng

đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.

Hình 1.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn [12]

Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản

phẩm trong quá trình trao đổi chất nhƣ: S độc tố, enzyme, vitamin, axit

hữu cơ… có thể đƣợc t ch lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay đƣợc

tiết ra môi trƣờng.

* Khuẩn ty

Trên môi trƣờng cơ chất đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2

loại: một loại cắm sâu vào trong môi trƣờng gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ

chất - substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dƣỡng. Một loại

phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial

mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản.

Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhƣng cũng có loại (nhƣ chi

Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi kh sinh. hi đó HS S vừa làm nhiệm vụ sinh

sản vừa làm nhiệm vụ dinh dƣỡng [8].

1.2.2.2. Cấu t o tế bào x khu n

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tƣơng tự VK G(+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế

bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh

chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.

Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lƣới, dày 10 – 20 nm có cấu

tạo tƣơng tự thành tế bào của VK G(+), thành phần chủ yếu là peptidoglucan

tạo nên một lớp vách tế bào tƣơng đối vững chắc. Ph n t ch dƣới kính hiển vi

điện tử thành tế bào XK gồm ba lớp: lớp ngoài cùng dày 60Aº, lớp trong và

lớp giữa dày 50 º. ăn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn

đƣợc chia thành 4 nhóm chính [5,9]:

Nhóm I: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit - 2,6 diaminopimelic

(L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.

Nhóm II: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit meso - 2,6

diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các chi:

Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella…

Nhóm III: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit meso - 2,6 -

diaminopimelic. Thuộc nhóm này có các chi: Dermatophilus,

Geodermatophilus, Frankia…

Nhóm IV: Thành phần ch nh của thành tế bào là axit meso - 2,6 -

diaminopimelic arabinose và galactose. Thuộc nhóm này gồm các chi:

Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…

Thành tế bào có kết cấu dạng lƣới có tác dụng duy trì hình dáng của

khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Ngoài ra thành tế bào X có thể cho phép nhiều

chất nhƣ: hất kháng sinh axit amin và nhiều hợp chất khác có k ch thƣớc

tƣơng đối lớn đi qua một cách dễ dàng. ác chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng

cũng thẩm thấu một cách chọn lọc qua thành tế bào.

Màng sinh chất là lớp tế bào nằm ngay sát dƣới thành tế bào dày

khoảng 7 5 - 10 nm chức năng chủ yếu là điều hòa sự hấp thu các chất dinh

dƣỡng vào tế bào tham gia vào quá trình hình thành bào tử. Tế bào chất của

X gồm một số thành phần chủ yếu nhƣ: thể nh n không bào và thể ẩn

nhập.

Nh n của tế bào X không có cấu trúc điển hình chỉ là nhiễm sắc thể

không có màng bao bọc. hi còn non toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc

thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty.

1.2.2.3. Sự hình th nh o tử hu n

Bào tử xạ khuẩn đƣợc hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn

ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đ y là cơ quan sinh sản đặc trƣng cho

xạ khuẩn. Trên mỗi cuống sinh bào tử mang 30 - 100 bào tử đôi khi có thể

mang tới 200 bào tử. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm

quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn.

Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lƣợn sóng (RF),

dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có

hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của

cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thƣờng có hình trụ,

ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành

dạng lông [10].

Bào tử xạ khuẩn đƣợc bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu

protein với độ dày khoảng 300 - 400Aº chia làm 3 lớp. Các lớp này tránh cho

bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh nhƣ nhiệt độ,

pH… Hình dạng k ch thƣớc chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những

tính trạng tƣơng đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại

xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này có thể có những thay đổi nhất định

khi nuôi cấy trên môi trƣờng có nguồn nitơ khác nhau [14].

Hình 1.2. Hình d n u n sinh o tử v ề ặt o tử h n

Streptomyces cinereoruber subp [6]

1.2.3. Đặ i m sinh lý, sinh hóa

XK thuộc nhóm sinh vật dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng rƣợu, axit hữu cơ ,

lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, muối nitra,

muối amoon ure amino axit pepton để làm nguồn nito. Tuy nhiên khả năng

hấp thụ các chất này không giống nhau ơ các loài hay các chủng khác nhau.

Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu kh ƣa ẩm, một số t ƣa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho X sinh trƣởng là 25 - 300C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ƣu cho sinh tổng hợp S thƣờng chỉ nằm trong khoảng 18 - 280 . Độ ẩm thích hợp đối

với X dao động trong khoảng 40 – 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 – 7,5

XK không có giới tính [44]. Xạ khuẩn có khả năng hình thành enzym và các

S nên đƣợc ƣớng dụng vào nhiều lĩnh vực của đời sống .

Để phân loại xạ khuẩn đến loài ngƣời ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh

lý sinh hóa khác nhƣ khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nito, nhu cầu

các chất k ch th ch sinh trƣởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ

thống enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ƣu khả năng chịu

muối và các yếu tố khác của môi trƣờng, mỗi quan hệ với chất kìm hãm sinh

trƣởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với CKS,

khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất đặc trƣng khác cảu

XK[23].

1.3. Phươn pháp ph n o i x khu n

1.3.1. Phân lo i th o phươn pháp tru ền th ng

Trong các đặc điểm hóa phân loại, thành phần hóa học của thành tế bào đƣợc

coi là đặc điểm quan trọng nhất. ác đặc điểm hóa phân loại khác nhƣ thành

phần đƣờng, menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỉ lệ GC trong

ADN của genom cũng mang t nh đặc

trƣng cho loài và có ý nghĩa quan trọng trong phân lạo XK.

ác đặc điểm sinh lý sinh hóa thƣờng đƣợc kết hợp sử dụng trong phân loại

XK là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nito, nhu câu của các chất

k ch th ch sinh trƣởng, khả năng ph n hủy các chất khác nhau nhờ hệ thống

enzym. Bên cạnh đó các chỉ tiêu khác nhu mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả

năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trƣờng, mối quan hệ với chất kìm

hãm sinh trƣởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với

CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất đặc trƣng khác

của XK cũng đƣợc tiến hành ph n t ch đồng thời [11]

1.3.2. Phân lo i th o phươn pháp hiện i

Các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tƣơng đồng về trình tự

rRNA phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể VSV. Tất cả các loài

VSV trong sinh giới đều sử dụng cùng một cách tổng hợp proteinnhowf các

riboxom. Vì vậy ngƣời ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã

hóa rRNA ở các VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng.

Hiện nay, phân loại X cũng nhƣ vi khuẩn nói chung đƣợc tiến hành dựa trên

so sánh trình tự gen mã hóa cho phân tử 16S rRNA kết hợp với các đặc điểm

khác theo phân loại cổ truyền . các nhà phân loại học thƣờng lấy ngƣỡng 98%

trong độ tƣơng đồng về trình tự 16S rRN để phân biệt hai loài khác nhau.

Bên cạnh đó phép lai N genom cũng thƣờng đƣợc tiến hành nhƣ một thí

nghiệm bổ sung để khẳng định vị trí phân loại đến mức độ loài. Hai chủng

XK (hay vi khuẩn nói chung) đƣợc coi là hai loài riêng biệt nếu chúng có độ

tƣơng đồng về ADN genom thấp hơn 70%. Trong đa số trƣờng hợp, các phân

tích về hóa phân loại và sinh lý, sinh hóa có sự tƣơng đồng cao so với phân

loại theo trình tự 16S rRAN [45,46]

1.4. Đại cƣơng về chất kháng sinh

1.4.1. Chất kháng sinh (Antibiotic)

Theo khái niệm cũ S là sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật mà

ngay ở nồng độ thấp (µg/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh

vật khác một cách chọn lọc (vi khuẩn nấm men nấm mốc…). Thuật ngữ

antibiotic đƣợc bắt nguồn từ chữ Hi ạp: “anti” là kháng lại “bios” là sự

sống. Thuật ngữ này đƣợc Waksman sử dụng vào những năm 1940 để ph n

biệt penicillin với sulfonamit đã đƣợc phát hiện từ những năm 1930. Thuật

ngữ này đƣợc thay đổi sau khi penicillin và các chất kháng khuẩn khác đã

đƣợc cải tiến và tổng hợp mới trong phòng th nghiệm. Ngày nay thuật ngữ

này đƣợc sử dụng phổ biến để chỉ các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên tổng

hợp hoặc bán tổng hợp có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp. Nhiều chất

kháng sinh đƣợc sử dụng nhƣ một chất hóa trị liệu có khả năng kháng virus

tế bào ung thƣ… Tất cả các S đều có t nh độc chọn lọc mỗi S thƣờng

chỉ tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định [10].

1.4.2. Lịch sử nghiên c u chất kháng sinh

háng sinh là thuốc đƣợc con ngƣời dùng chủ yếu để chống các bệnh

truyền nhiễm. ác bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh của

con ngƣời và động vật. ho đến nửa sau thế kỷ 19 ngƣời ta đã phát hiện rằng

vi sinh vật ch nh là thủ phạm g y ra hàng loạt các bệnh truyền nhiễm. o đó

liệu pháp hóa học nhằm vào các VSV g y bệnh đã đƣợc phát triển thành liệu

pháp điều trị ch nh.

Năm 1928 Fleming phát hiện ra penicillin và kháng sinh đã đƣợc

dùng trong điều trị vào những năm 1940. Ngay sau đó penicillin đã trở thành

một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều chiến binh trong chiến tranh

thế giới II [37].

Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960 nhiều kháng sinh mới

đƣợc xác định hầu hết từ xạ khuẩn và đó trở thành thời kỳ vàng son của hóa

liệu pháp kháng sinh (bảng 1.1).

B n 1.1. Khán sinh ư phát hiện qu á nă [6]

Năm đƣợc phát hiện Nƣớc Năm đƣợc phát Nƣớc

hiện

1929 Penicillin Anh 1939 Gramicidin Mỹ

1943 Streptomycin, Bacitracin Mỹ 1945 Cephalosporin Italia

Cloramphenicol 1947 1949 Neomycin Mỹ Mỹ

Oxytetracyclin 1950 1952 Erythromycin Mỹ Mỹ

Vancomycin 1956 1957 Kanamycin Nhật Mỹ

Gentamycin 1963 1966 Docycyclin Mỹ Mỹ

Torbamycin 1971 1972 Cephamycin Mỹ Mỹ

Năm 1944 streptomycin đƣợc phát hiện từ xạ khuẩn đất Streptomyces

griseus. Sau đó đến chloramphenicol tetracyclin các kháng sinh thuộc

nhóm macrolide và glycopeptide [11]. Vào năm 1962 các kháng sinh tổng

hợp nhƣ nalidixic acid thuốc chống VSV có bản chất quinolone cũng đƣợc

tạo ra. Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu đƣợc phổ kháng

VSV rộng hơn hoạt t nh kháng VSV cao hơn v dụ nhƣ các kháng sinh β -

lactam.

Việc phát hiện phát triển và sử dụng các kháng sinh trong điều trị ở

thế kỷ 20 đã làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ năm

1980 số kháng sinh mới đƣợc đƣa vào điều trị giảm hẳn do chi ph phát triển

và thử nghiệm thuốc mới ngày càng lớn. Bên cạnh đó một hiện trạng đáng

báo động là ngày càng tăng các VSV g y bệnh kháng với các kháng sinh

hiện có. o vậy các nghiên cứu cần phải tập trung vào làm thế nào để vƣợt

qua t nh kháng thuốc kháng sinh cũng nhƣ phát hiện các kháng sinh mới có

cơ chế hoạt động khác nhau [30].

1.4.3. Sự hình thành chất kháng sinh x khu n

Một trong những đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình

thành chất kháng sinh. Đa số các S đang dùng trong y học hiện nay có

nguồn gốc từ X trong khoảng 5.500 S đã biết đến hiện nay có tới hơn

4000 chất từ X [2].

Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ

kháng sinh rộng kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trƣởng và phát triển của

nhiều loài VSV khác nhau.

Ngày nay ngƣời ta đã biết S là sản phẩm trao đổi thứ cấp của vi

sinh vật. ẫu vậy vẫn còn nhiều giả thuyết khác nhau về vai trò của S đối

với X . Một số tác giả cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là cơ chế

giúp xạ khuẩn tồn tại trong môi trƣờng tự nhiên sự hình thành S là do sự

cạnh tranh môi trƣờng dinh dƣỡng. ại có giả thuyết cho rằng S chỉ là

sản phẩm thải ra của quá trình trao đổi chất của tế bào… [17] [23].

ó 3 con đƣờng sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn:

- S đƣợc tổng hợp từ 1 chất trao đổi bậc I thông qua một chuỗi

các phản ứng enzyme.

- S đƣợc hình thành từ 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc I khác nhau.

- S đƣợc hình thành bằng cách polime hóa các chất trao đổi bậc I

sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều

S có cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tƣơng tự nhau [6], [7].

1.4.4. Các chất kháng sinh có nguồn g c từ x khu n

Đa số các S đƣợc dùng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn

trong số đó có nhiều chất hiện vẫn đang đƣợc sử dụng tƣơng đối phổ biến

trong thực tiễn.

Streptomycin: Đƣợc Waksman phát hiện ra từ năm 1943 có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces griseus có khả năng chống các V G(+) khá mạnh.

Streptomycin đƣợc sử dụng rất hiệu quả để điều trị các bệnh dịch hạch ho

gà và đặc biệt quan trọng hơn cả là dùng để chữa các bệnh lao [10].

Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng đƣợc tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces fradiae vào năm 1949 có tác dụng chống cả V G(+) và G(-) .

Đặc biệt là chống đƣợc nhiều loài vi khuẩn đã kháng lại với penicillin và

streptomycin [10].

Gentamycin: ó nguồn gốc từ xạ khuẩn Micromonospora purpurea có phổ

kháng sinh rộng có tác dụng chống cả V G(+) nhƣ tụ cầu phế cầu đã

kháng lại penicillin và V G(-) nhƣ màng não cầu lậu cầu. Trong y học

chủ yếu dùng để điều trị các bệnh do nhiễm Pseudomonas [10].

Tetracyclin: à kháng sinh đƣợc tách chiết từ dịch nuôi cấy một số chủng xạ

khuẩn thuộc chi Streptomyces các S này có phổ kháng sinh rộng chống

đƣợc cả V G(+) và G(-) ricketsia và một vài loài virus lớn. Ngoài sử dụng

trong y học tetracyclin còn đƣợc sử dụng trong chăn nuôi - thú y [2], [10].

Cloramphenicol: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezuelae đƣợc

phát hiện vào năm 1947 có hoạt t nh chống đƣợc nhiều V G(+) và G(-).

Ngoài sử dụng trong y học S này còn đƣợc dùng trong chăn nuôi - thú y

và thủy sản [32].

Erythromycin: ó nguồn gốc từ X Streptomyces erythreus là S có phổ

rộng đối với V G(+) đƣợc sử dụng nhiều nhất trong điều trị bệnh viêm

phổi do Mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn [10] [23].

Novobicin: ó nguồn gốc từ X Streptomyces spheroides và Streptomyces

niverus có hoạt t nh mạnh với các V G(+). Đặc biệt có khả năng chống

các tụ cầu đã kháng với penicillin và một số S khác [21].

Amphoterycin B: ó nguồn gốc từ X Streptomyces nodosus đƣợc dùng để

điều chỉnh các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra [23].

Dactinomycin: ó nguồn gốc từ X Streptomyces antibiticus có hoạt t nh

kìm hãm phát triển các khối u ác t nh. Đƣợc dùng để điều trị một số bệnh

ung thƣ [23].

Daunorubixin: ó nguồn gốc từ X Streptomyces coeruleorubidus đƣợc

dùng để điều trị bệnh bạch cầu cấp t nh bệnh Hodgkin [23].

1.5. Ứng dụng của chất kháng sinh

1.5.1. Ứng dụng trong y học

ể từ khi S đƣợc sử dụng và đã cứu sống đƣợc bệnh nh n bị

nhiễm trùng máu năm 1941 [22] đến nay hàng loạt S đã đƣợc phát hiện

và ứng dụng trong y học đã đóng góp một phần không nhỏ trong công tác

phòng và điều trị bệnh tật nhất là các bệnh nhiễm khuẩn của con ngƣời. Nhờ

có các loại thuốc kháng sinh mà con ngƣời đã khống chế và loại bỏ đƣợc

nhiều bệnh nguy hiểm nhƣ dịch tả thƣơng hàn v.v…

Hiện nay các loại bệnh phổ biến do nấm g y ra nhƣ nấm da nấm tóc

móng ch n móng tay… đều sử dụng kháng sinh để điều trị bằng cách bôi

trực tiếp lên da bị nhiễm bệnh hoặc bằng cách uống. ó nhiều loại thuốc

đƣợc sử dụng để điều trị bệnh này nhƣ: nystatin natamicin hamicin

rimocyclin…

Phần lớn các S đƣợc sử dụng trong y học có nguồn gốc từ X

trong đó có tới 1/3 các chất kháng sinh là do xạ khuẩn hiếm sinh ra. Trong y

học kháng sinh có thể đƣợc dùng kết hợp cùng lúc nhiều loại kháng sinh

nhằm mang lại hiệu quả cộng hợp - tăng liều gấp hai của mỗi loại kháng

sinh (khi kết hợp hai S hãm khuẩn) hoặc hiệu quả cộng lực - tăng hiệu lực

của S (khi kết hợp hai S diệt khuẩn) [22].

ăn bệnh ung thƣ là một trong số những bệnh rất nguy hiểm đối với

con ngƣời. Trƣớc đ y thƣờng sử dụng biện pháp xạ trị và phẫu thuật để điều

trị thì ngày nay y học đã biết sử dụng thuốc S trong trƣờng hợp bệnh đã

chuyển sang giai đoạn di căn. Hiện nay y học đã sử dụng thuốc kháng sinh

trong điều trị ung thƣ nhƣ daunorubicin đƣợc dùng trong điều trị bệnh bạch

cầu cấp t nh đối với việc phòng loại bệnh này ngƣời ta đã dùng penicillin G

hay erythromycin. ác thuốc kháng sinh nhƣ mitomycin (do S. cacspitosus

sinh ra) đƣợc dùng trong điều trị ung thƣ vú dạ dày phổi đại tràng [22].

Tuy nhiên cho đến nay chƣa có S nào có thể điều trị các bệnh do

virus g y ra một cách có hiệu quả do virus không chịu tác động của S.

1.5.2. Ứng dụng trong b o vệ thực v t v hăn nuôi thú

hất kháng sinh không chỉ đƣợc sử dụng trong y học để chữa bệnh

cho con ngƣời mà còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong một số lĩnh vực khác

nhƣ: bảo vệ thực vật chăn nuôi bảo quản thực phẩm…

Trong chăn nuôi kháng sinh đƣợc dùng để phòng chữa bệnh và k ch

th ch tăng trọng cho gia súc gia cầm.

Kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dụng ức chế và loại

bỏ sự hoạt động của vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn g y bệnh đƣờng tiêu hóa

và hô hấp trên động vật non làm cho chúng khỏe mạnh tăng trƣởng tốt. Rất

nhiều S đƣợc dùng với mục đ ch này nhƣ tetracyclin, bacitraxin,

monelzin… Ở Việt Nam năm 1982 đã sản xuất chế phẩm biovit 5 và terravit

trên quy mô 12 tấn/năm. ết quả thử nghiệm trên gia súc gia cầm đã tăng

trọng 15 - 25% giảm tiêu tốn thức ăn 8 2% tăng sản lƣợng đẻ trứng ở gà 5 -

7% [1].

Hiện nay biện pháp thƣờng đƣợc sử dụng trong công tác bảo vệ thực

vật chống lại s u bệnh là sử dụng các thuốc hóa học. Nhƣng thuốc hóa học

có nhiều nhƣợc điểm nhƣ hiện tƣợng kháng thuốc của s u bệnh mặt khác lại

g y ô nhiễm môi trƣờng và nhiều chất độc tồn dƣ trong sản phẩm có thể g y

độc cho con ngƣời v.v… Để khắc phục những nhƣợc điểm trên thì việc sử

dụng các S trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh dễ ph n hủy có

t nh đặc hiệu cao chỉ tiêu diệt một hoặc một số s u bệnh nhất định mà

không ảnh hƣởng đến các loài có ch khác và đặc biệt chất kháng sinh còn có

khả năng ức chế các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học. ác kháng sinh

đƣợc dùng để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn g y bệnh cho c y trồng nhƣ các

bệnh khô vằn vàng lụa ở lúa bệnh thối cổ rễ ở các c y có củ… Ngoài ra

S còn đƣợc sử dụng làm chất k ch th ch tăng trƣởng ở những nồng độ

nhất định nhƣ k ch th ch sự nảy mầm của hạt. ác S đƣợc dùng trong

công tác bảo vệ thực vật thƣờng ở dạng bột hoặc dung dịch có bổ sung các

chất độn để tăng độ bền của S. ác S có thể đƣợc trộn lẫn vào đất

phun trực tiếp lên thực vật hoặc dùng trong quá trình xử lý hạt giống để tiêu

diệt các mầm bệnh ở bên trong và bên ngoài hạt.

Ngày nay việc sử dụng các S trong công tác bảo vệ thực vật đƣợc

phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nƣớc Nga Nhật Trung Quốc

Ấn Độ… Năm 1950 Trung Quốc đã tuyển chọn đƣợc chủng Streptomyces

sp. 5406 có khả năng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillium albo – atrum

g y thối rễ ở bông non [19]. Năm 2002 ở Ấn Độ đã ph n lập đƣợc chủng

Streptomyces sp. 201 có khả năng sinh S mới là z – methylheptyl iso –

nicotinate S này có khả năng kháng đƣợc nhiều loại nấm g y bệnh nhƣ

Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium semitectum, Fusarium

moniliforme…[17].

Hiện nay nƣớc ta cũng bắt đầu sử dụng các S có nguồn gốc từ

Trung Quốc Nhật Bản để thay thế dần cho việc sử dụng các chất hóa học

độc hại trong công tác bảo vệ thực vật. Năm 2002 Trung t m công nghệ

sinh học – ĐHQGHN đã ph n lập đƣợc từ đất chủng X Streptomyces sp .

LD30 có khả năng sinh S phổ rộng kháng vi khuẩn và nấm nhƣng mạnh

nhất là chống chủng Pseudomonas solanacearum g y bệnh héo lá ở c y

trồng [4].

Ngoài công tác bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y thì S còn đƣợc

sử dụng trong công nghệ thực phẩm. ùng kháng sinh để bảo quản thực

phẩm vừa rẻ vừa đơn giản vừa không cần trang thiết bị đặc biệt nhƣng vẫn

đảm bảo chất lƣợng thực phẩm. Một số S đƣợc sử dụng trong bảo quản

thực phẩm nhƣ: clotetraciclin nisin subtilin actidion biomicin… Tuy

nhiên, việc sử dụng S trong bảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồn

tại: chất kháng sinh khó ph n hủy và khi tồn dƣ trong thực phẩm có thể g y

ra nhiều mối nguy hiểm cho ngƣời làm xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có

khả năng kháng thuốc làm mất tác dụng của chất kháng sinh trong điều trị.

Vì vậy để khắc phục tồn tại trên việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo

quản thực phẩm cần phải tu n theo đúng nguyên tắc.

1.6. Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật

1.6.1. Ưu thế c a vi sinh v t sinh tổng h p enzyme

Enzyme là những protein đƣợc sản xuất tự nhiên từ thực vật động vật vi

sinh vật có vai trò quyết định quá trình trao đổi chất của tế bào. húng là những

chất xúc tác thúc đẩy tốc độ các phản ứng hóa học mà không làm thay đổi t nh

chất của chúng. Việc sản xuất và sử dụng enzyme đã có từ l u ở nhiều nƣớc trên

thế giới. Tuy nhiên chỉ sau khi con ngƣời chứng minh đƣợc khả năng xúc tác

của enzyme ngoài tế bào thì việc nghiên cứu sản xuất và ứng dụng enzyme mới

thực sự phát triển mạnh mẽ. Ngày nay nhiều loại enzyme đã đƣợc sản xuất ra

với sản lƣợng lớn và đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế khác nhau

nhƣ: công nghiệp thực phẩm dƣợc phẩm dệt hóa chất… Trƣớc đ y con ngƣời

đã tiến hành sản xuất chế phẩm enzyme từ động thực vật với khối lƣợng lớn

(vạn tấn/năm) nhƣng không kinh tế và chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu tiêu dùng do

lƣợng enzyme trong cơ thể động, thực vật rất hạn chế. VSV trái lại có thể tổng

hợp đƣợc một lƣợng lớn các enzyme khác nhau. o vậy VSV là đối tƣợng ch nh

đƣợc sử dụng để sản xuất enzyme trong vòng 30 năm trở lại đ y [25].

Hệ enzyme ở VSV vô cùng phong phú: VSV có thể đồng hóa đƣợc hầu

hết các chất có trong thiên nhiên, từ các hợp chất đơn giản nhƣ: N2, S, Fe, CO2,

CH4… đến các hợp chất hữu cơ phức tạp nhƣ: tinh bột, protein, các pectin,

cellulose… chứng tỏ rằng trong tế bào VSV phải có chứa những hệ enzyme

tƣơng ứng [3]. Điều đó cho phép con ngƣời mở ra khả năng tìm kiếm và chọn

lựa những phức hệ enzyme cần thiết phục vụ cho các nhu cầu công nghệ khác

nhau đặc biệt là các nhóm enzyme không thể khai thác đƣợc từ nguồn động vật

và thực vật.

1.6.2. Tuy n chọn các ch ng sinh enzyme cao từ tự nhiên

VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh để

duy trì sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi. VSV có hệ enzyme

đa dạng và phong phú. Tuy nhiên không phải tất cả các VSV đều có khả năng

sinh enzyme nhƣ nhau ngay cả những chủng cùng một giống cũng không cùng

hoạt tính sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy, khi tuyển chọn VSV để tìm kiếm, lựa

chọn và phân lập chủng có hoạt lực cao trong việc tạo thành enzyme mong muốn

là cần thiết. Ví dụ, muốn lựa chọn các chủng VSV sinh enzyme chịu nhiệt nên

lựa chọn từ suối nƣớc nóng hay bể ủ rác thải; tuyển chọn các VSV sinh enzyme

chịu kiềm, chịu axit phải từ nơi có độ kiềm cao hay axit cao; lựa chọn chủng

sinh amylase thì lựa chọn nơi có nhiều tinh bột; lựa chọn chủng sinh enzyme

chịu mặn thì nên lựa chọn chủng từ nguồn nƣớc biển; lựa chọn chủng sinh

cellulase thƣờng tìm thấy ở các mẫu đất có nhiều xác thực vật bị phân hủy. Nhƣ

vậy, trong tự nhiên, nhiều loại VSV có khả năng sử dụng trong sản xuất đòi hỏi

các bƣớc nghiên cứu công phu, mất nhiều công sức. Tuy hiện nay có nhiều

chủng VSV đã đƣa vào sản xuất nhƣng còn nhiều lĩnh vực đòi hỏi tiếp tục

nghiên cứu tuyển chọn các chủng mới nhằm phục vụ cao nhất cho con ngƣời.

1.6.3. M t s enzyme phổ biến có nguồn g c từ vi sinh v t

Tuy đã biết hơn 1000 loại enzyme khác nhau nhƣng cũng chỉ các enzyme

thủy phân mới đƣợc sử dụng rộng rãi trong hơn 30 ngành kinh tế khác nhau đó

là các enzyme amylase, cellulase và protease. ƣợng các enzyme sản xuất hàng

năm: protease từ vi khuẩn là 500 tấn/năm protease từ nấm mốc là 10 tấn/năm

pectinase là 10 tấn/năm… [26]. Các enzyme này có ứng dụng nhiều trong nông

nghiệp đặc biệt là trong chăn nuôi với mục đ ch là làm tăng giá trị dinh dƣỡng,

tăng hệ số tiêu hóa thức ăn giảm chi phí thức ăn… Các enzyme đƣợc dùng ngày

càng nhiều ở các nƣớc trên thế giới.

* Enzyme amylase: mylase là các enzyme đƣờng hóa, có khả năng ph n

hủy amylose và amylopectin và các polysaccharit tƣơng tự giải phóng glucose.

ác enzyme này có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các

nguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún bánh đa bánh cuốn, chế biến nông sản

ngô, khoai, sắn... Từ các phế thải lƣơng thực này, nhờ các amylase có thể dùng

để sản xuất alcohol. ũng nhờ các enzyme đƣờng hoá α-amylase và

glucoamylase, từ các phế thải lƣơng thực chứa tinh bột của các dây chuyền quy

trình chế biến thức ăn có thể sản xuất màng bao gói có tính chất phân huỷ quang

học và sinh học [32].

* Enzyme cellulase: Trong thập kỷ qua, enzyme thuỷ phân cellulose ngày

càng đƣợc quan tâm. Sự quan tâm này là do các enzyme này có khả năng thủy

phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocellulose và

cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lƣợng thông qua các sản phẩm

đƣờng, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giầu năng lƣợng khác. Thí

dụ: từ các chất thải nhà máy giấy nhƣ các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể

thu nguồn năng lƣợng ethanol [32].

* Enzyme protease: Protease thuộc nhóm enzyme thủy ph n protein đƣợc

sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn trong chế biến cá và

thịt. Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải để sản xuất các

dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dƣỡng cho cá hoặc vật nuôi.

Protease thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bƣớc ban đầu chúng

đƣợc hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thành các liên kết lỏng

trên bề mặt. Sau đó quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm

hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzyme lên bề mặt cơ chất và tạo ra những

phần nhỏ. Chính vì tính chất trên mà protease đƣợc sử dụng, một mặt để tận

dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này không còn là các tác

nhân gây ô nhiễm môi trƣờng, một mặt để xử lý các phế thải protein tồn đọng

trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi không còn mùi hôi thối [35].

hƣơng 2

NG N Ệ - Ụ T – N NG

ƢƠNG NG N Ứ

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Mấu ất

- ác mẫu đất đƣợc thu thập ở lớp đất bề mặt với độ s u từ 5-20 cm tại

các vị tr khác nhau của đất trồng rùng đất trồng keo và đất vƣờn ƣơm keo

giống ở Xu n Mai – hƣơng Mĩ – Hà Nội

- ác mẫu là keo lai bị bệnh tại khu vực Xu n Mai – hƣơng Mĩ – Hà

Nội

2.1.2. Đ i tư n n hiên u

- ác chủng X ph n lập từ đất trồng rừng đất trồng keo và đất vƣờn

thuộc khu vực Xu n Mai – hƣơng Mỹ - Hà Nội

- ác chủng nấm g y bệnh ph n lập đƣợc trên c y keo lai bị nhiễm

bệnh thuộc khu vực Xu n Mai – hƣơng Mỹ - Hà Nội. ý hiệu chủng: LPT1,

LPT2, LPT3.

2.1.3. ụng cụ thiết bị và hóa chất

2.1.3.1. Hóa chất

- Các loại đƣờng chuẩn: glucose, saccharose, lactose, fructose,

mantose…

- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3,

NaCl, FeSO4.7H2O…

- Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl

Methyl ellulose)…

- các hóa chất nhuộm màu hệ sợi, bào tử, cuống sinh bào tử của XK:

tím tinh thể, iot, lugol...

2.1.3.2. Dụng cụ, thiết bị

- Kính hiểm vi quang học Axio

- Tủ ấm ổn nhiệt, tủ sấy

- Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Máy lắc ổn nhiệt

- Nồi hấp khử trùng Hiclave HV – 85 (Hirayama, Nhật)

- Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ)

- Máy đo pH

- Máy ly tâm 5417R (Eppendorf Đức)

- Máy cất nƣớc

- Tủ lạnh

- Lò vi sóng

- Ngoài ra còn sử dụng các dụng cụ thí nghiệm nhƣ bình tam giá ống

falcon, ống eppendorf, ống giữ lạnh sâu, ống nghiệm và đĩa petri và các loại

que cấy ...

2.2. Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập đƣợc một số chủng XK có hoạt tính kháng nấm hại cây keo

lai

- chọn lọc các chủng XK phân lập đƣợc có hoạt tính kháng nấm cao.

2.3. Nội dung nghiên cứu

- Phân lập một số chủng xạ khuẩn có trong đất ở khu vực Xuân Mai –

hƣơng Mỹ – Hà Nội

- Khảo sát và chọn lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng cao với

nấm gây bệnh trên cây keo lai, sản sinh các loại enzym ngoại bào với hoạt

tính mạnh trong điều kiện invitro

- Xác định một số đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn có hoạt tính

kháng sinh cao từ các chủng xạ khuẩn đƣợc tuyển chon.

2.4. hƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Phươn pháp ph n p nấm bệnh

Chọn các mẫu lá keo lai bị bệnh điển hình cắt cho vào túi nilon mang

về phòng thí nghiệm, nếu chƣa sử dụng luôn bảo quản ở tủ lạnh 40C.

Lấy mẫu lá nhiễm bệnh đã lấy về dùng panh, kéo đã vô trùng cắt lá

thành những mảnh nhỏ có k ch thƣớc 0,3x0,3cm rồi dùng panh vô trùng gắp

từng mảnh mô lá bệnh đặt vào môi trƣờng PDA có bổ sung kháng sinh.

Đậy nắp, ghi rõ ngày cấy tên ngƣời cấy, mẫu bệnh (kí hiệu riêng). Nuôi trong tủ ấm nuôi ở 300C, sau 2-3 ngày theo dõi sự phát triển của nấm

gây bệnh trên mội trƣờng.

Khi khuẩn lạc nấm mọc lên ta tiến hành cấy chuyển 2-3 lần trên môi

trƣờng PDA bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm.

Dùng que cấy móc lấy hệ sợi nấm cấy chấm điểm lên 3 vị tr lên đĩa

petri, nuôi trong tủ ấm 300C trong 2-3 ngày để làm sạch chủng nấm.

2.4.2. Phươn pháp ph n p x khu n từ ất

2.4.2.1. Phươn pháp ấy mẫu ất

Dùng dao lấy khoảng 10 - 15 g đất cách bề mặt từ 5 - 20 cm ở các vị trí khác nhau (4 - 5 vị trí) trong 1 vùng 50 m2. Trộn đều các mẫu đất và đựng vào

túi nilông đã khử trùng. Ngoài túi ghi rõ loại đất ngày và nơi lấy mẫu [12].

Đất lấy về đƣợc phân lập ngay hoặc có thể bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C trong thời gian 24 giờ.

2.4.2.2. Phân l p x khu n theo Vinogradski

n 1 g đất cho vào bình nón 50 ml chứa 9 ml nƣớc cất vô trùng, lắc

trên máy lắc 30 phút.

Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5 ml nƣớc vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3… 10-6. Từ mỗi nồng độ

pha loãng, nhỏ 0,1 ml dịch sang đĩa Petri chứa môi trƣờng Gause 1.

Dùng que gạt vô trùng chang đều sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng từ 4 -

7 ngày. Trên mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ khuẩn đƣợc cấy ria 3 pha sang

đĩa Petri chứa môi trƣờng Gause 1 để làm sạch.

Sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng 4 - 7 ngày, từ các khuẩn lạc đƣợc làm

sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trƣờng thạch nghiêng Gause 1,

tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10 - 14 ngày [13].

Theo ISP ( hƣơng trình xạ khuẩn quốc tế), màu sắc khuẩn ty khí sinh

của các chủng xạ khuẩn đƣợc chia thành 8 nhóm màu: nhóm màu trắng, nhóm

màu xám nhóm màu đỏ, nhóm màu vàng, nhóm màu xanh lục, nhóm xanh

màu da trời (Blue), nhóm màu tím và nhóm màu không xác định (X) [17, 18,

36].

2.4.2.3. Phươn pháp ếm s ư ng khu n l c mọ trên ĩ th ch

Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp đếm số lƣợng khuẩn

lạc mọc trong mỗi đĩa Petri để từ đó t nh số lƣợng tế bào trong 1 g đất.

* Cách đếm:

Đếm số khuẩn lạc bằng cách úp sấp đĩa Petri, trên mặt đáy ph a ngoài

của đĩa dùng bút viết k nh đánh dấu các khuẩn lạc đã đƣợc đếm. Nếu số

lƣợng khuẩn lạc nhiều, dùng bút chia mặt đáy thành các phần và đếm số

khuẩn lạc trong từng phần sau đó cộng lại.

hông đếm các đĩa khuẩn lạc mọc quá dày không thể đếm đƣợc hoặc

các đĩa bị nhiễm ảnh hƣởng đến sự phát triển của xạ khuẩn.

* Cách tính kết quả:

Theo lý thuyết: 1 khuẩn lạc đƣợc hình thành từ 1 tế bào. Tuy nhiên trên

thực tế khó có thể xác định đƣợc chính xác là một khuẩn lạc có thể đƣợc hình

thành từ 1 hay nhiều tế bào. Vì vậy để tính tổng số tế bào có trong 1 đơn vị

thể t ch ngƣời ta thƣờng dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1

đơn vị thể t ch” ( FU - Colony Forming Unit).

Nhƣ vậy từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có thể suy ra số lƣợng tế

bào ( FU) có trong 1 g đất theo công thức sau:

CFU/g = A x 1/K x 1/V

Trong đó:

A: Số lƣợng khuẩn lạc trung bình mọc trên các đĩa thạch có cùng

độ pha loãng.

V: Thể tích dịch đất pha loãng đƣợc cấy gạt trên đĩa thạch.

: Độ pha loãng của dịch đất đƣợc cấy trên thạch.

Số FU/1 đĩa Petri đƣợc coi là tốt để tính tổng số FU/1 g đất nếu khi cấy

0,1 ml dịch đất pha loãng trên môi trƣờng đếm đƣợc từ 30 - 300 khuẩn lạc/1 đĩa.

2.4.3. Phươn pháp thuần khiết và b o qu n gi ng

Do mật độ của khuẩn lạc giảm dần theo độ pha loãng của dịch huyền

phù nên ở các đĩa thạch có độ pha loãng thấp, các khuẩn lạc thƣờng mọc tách

rời nhau và có khả năng đƣợc hình thành từ một tế bào riêng rẽ.

Dùng que cấy đã vô trùng lấy tế bào từ các khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa

cấy vào các ống thạch nghiêng có chứa môi trƣờng Gause 1 để vào tủ ấm 28 - 300C trong thời gian từ 4 - 7 ngày sau đó kiểm tra thật kỹ độ thuần chủng của

các chủng giống, loại bỏ các ống bị nhiễm. Giữ các ống giống này trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 - 40 . Để bảo quản giống cho các nghiên cứu tiếp theo,

chúng tôi tiến hành cấy chuyển giống định kỳ 3 tháng một lần trên môi trƣờng

thạch nghiêng Gause 1 trƣớc khi sử dụng cần cấy chuyển giống sang ống

thạch mới [9]. Riêng với các chủng nấm đƣợc giữ trên môi trƣờng PDA, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 2-3 ngày và cất giữ trong tủ lạnh ở 40C.

2.4.4. Phươn pháp á ịnh ho t tính kháng sinh

* Phương pháp thỏi thạch

Đ y là phƣơng pháp để sơ tuyển xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh.

Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause 1, Gause 2, hoặc ISP4

trong đĩa Petri sau 5 - 7 ngày. Nuôi cấy VSV Đ trên các môi trƣờng thích

hợp trong các đĩa Petri (nấm mốc nuôi trên môi trƣờng khoai tây). Dùng

khoan nút chai khoan các thỏi thạch có xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy từ 5 - 7 ngày,

sinh trƣởng tốt, không bị nhiễm. Đặt các thỏi thạch lên bề mặt môi trƣờng thạch đĩa đã cấy VSV kiểm định. Sau đó đặt các đĩa vào tủ lạnh 40C trong vòng 4 - 5 giờ để chất kháng sinh khuếch tán rồi nuôi ở 28 - 300 . Đọc kết

quả sau 24 giờ đối với vi khuẩn kiểm định, 48 - 72 giờ đối với nấm kiểm

định.

Hoạt tính kháng sinh của mỗi chủng xạ khuẩn đƣợc xác định theo kích

thƣớc vòng vô khuẩn: D - d (mm) trong đó là đƣờng kính vòng vô khuẩn,

d là đƣờng kính của thỏi thạch.

* Phương pháp đục lỗ

Đ y là phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh của dịch lên men.

Xạ khuẩn đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng Gause 1 dịch thể trên máy lắc

tròn với tốc độ 220 vòng/phút trong 5 - 7 ngày, thu dịch kháng sinh thô bằng

cách ly tâm dịch lên men ở 5000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng khoan nút

chai khoan lỗ trên bề mặt thạch đã cấy VSV kiểm định trong các đĩa Petri.

Nhỏ vào mỗi lỗ khoan 0,1 ml dịch kháng sinh cần thử. ác bƣớc tiếp theo tiến

hành nhƣ phƣơng pháp thỏi thạch [7, 9, 14].

2.4.5. Phươn pháp ên n thu nh n sinh kh i tế bào x khu n

Từ ống thạch nghiêng, giống đã đƣợc hoạt hóa đƣợc cấy sang các bình

nón có dung tích 250 ml chứa 25 ml môi trƣờng Gause 1 và nuôi lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28 - 300C trong thời gian 5 - 7 ngày. Sau đó thu dịch

lên men, li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu riêng sinh

khối và phần dịch. Tùy theo mục đ ch nghiên cứu mà sử dụng phần dịch

hay phần sinh khối để xác định hoạt tính kháng sinh của dịch lên men hay

của sinh khối tế bào [9].

2.4.6. Xá ịnh ho t tính enzyme c a x khu n bằn phươn pháp hếch

tán trên ĩ th ch

Nuôi cấy X trên môi trƣờng Gause 1 dịch thể trên máy lắc 220

vòng/phút sau 5 - 7 ngày thu dịch enzyme từ môi trƣờng nuôi cấy bằng cách

ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút.

Xác định hoạt tính enzyme bằng phƣơng pháp đục lỗ: dùng khoan nút

chai khoan các lỗ trên môi trƣờng cơ chất. Nhỏ vào các lỗ khoan dịch nuôi cấy xạ khuẩn. Sau đó đặt các đĩa vào tủ lạnh 40C trong vòng 4 - 5 giờ để chất

kháng sinh khuếch tán rồi để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 12 – 24 giờ.

Hiện vòng phân giải bằng các thuốc thử tƣơng ứng: đối với tinh bột hiện bằng

thuốc thử lugol đối với CMC hiện bằng đỏ công gô và đối với casein hiện

bằng axit tricloaxetic (hay comasie blue).

Hoạt t nh enzyme đƣợc xác định bằng giá trị D - d (mm), trong đó

là đƣờng kính vòng thuỷ ph n cơ chất d là đƣờng kính lỗ thạch.

2.4.7. Phươn pháp ử lý s liệu

Kết quả nghiên cứu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học trên

phần mềm excel. Đ y là phần mềm lập trình sẵn, các hàm sử dụng đƣợc dựa

trên những công thức cơ bản của toán thống kê trong đó có công thức:

- Giá trị trung bình ( ):

- Độ lệch chuẩn ( ):

- Sai số m:

hƣơng 3

K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn

3.1.1. Phân l p x khu n

Từ 9 mẫu đất lấy ở độ sâu 5 – 20cm tại các vị trí khác nhau trên khu

vực Xuân Mai – hƣơng Mỹ - Hà Nội, tôi tiến hành pha loãng mẫu nhƣ đã

trình bày ở mục 2.4.2.1 trong phần chƣơng 2 sau khi phân lập XK trên môi

trƣờng GI và đã thu đƣợc 27 chủng xạ khuẩn. Từ 27 chủng XK nêu trên, tôi

tiếp tục tiến hành tinh sạch khuẩn lạc, thuần khiết giống, việc tinh sạch khuẩn

lạc trên môi trƣờng nuôi cấy thích hợp dựa vào các đặc điểm hình thái của

khuẩn lạc đặc điểm màu sắc của hệ sợi HSKS, HSCC của xạ khuẩn.

Kết quả của việc nuôi cấy, phân lập xạ khuẩn tại các địa điểm khác nhau trên

môi trƣờng GI đƣợc thể hiện trong mẫu bảng

B n 3.1. Sự ph n hu n từ á ẫu ất há nh u

Địa điểm Số lƣợng Số chủng CFU Tỉ lệ phân

mẫu phân lập (TB/G) bố chủng

đƣợc XK (%)

2,1.106 14,81 3 4 Đất trồng

rừng

3 3,4.106 33,33 9 Đất trồng

keo

Đất vƣờn 3 5,5.106 51,85 14

Tổng số 9 100 27

Kết quả trên bảng 3.1 cho thấy sự phân bố của xạ khuẩn trong các mẫu

đất là khá phong phú và phụ thuộc nhiều vào đặc điểm, tính chất của từng loại

đất. Xạ khuẩn thƣờng phân bố nhiều ở các loại đất tơi xốp, thoáng khí, giàu

chất hữu cơ. Số lƣợng xạ khuẩn gặp nhiều nhất ở loại đất vƣờn chiếm tới

51,85% trên tổng số, ở đất trồng keo là 33,33% và cuối cùng là đất trồng rừng

có sự phân bố XK thấp hơn chỉ chiếm 14,81%.

Đất vƣờn và đất trồng keo là những loại đất thƣờng xuyên đƣợc cuốc

xới, bổ sung nguồn dinh dƣỡng. Tất cả các đặc t nh này là điều kiện rất thuận

lợi cho sự phân bố của xạ khuẩn. Vì vậy, số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ

loại đất này cũng nhiều nhất. Ngƣợc lại, những loại đất nghèo dinh dƣỡng, có

độ ẩm không thích hợp, xạ khuẩn phân bố rất ít.

3.1.2. Phân b c a x khu n theo nhóm màu

Từ 27 chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc, chúng tôi nhận thấy màu sắc hệ

khuẩn ty rất đa dạng[39], có 6 nhóm màu xuất hiện với số lƣợng và tỷ lệ khác

nhau đƣợc thể hiện trên bảng 3.2, các hình 3.1, Hình 3.2

B n 3.2. S ư n v sự ph n hu n theo nhóm màu

Số lƣợng chủng STT Nhóm màu Tỷ lệ (%) phân lập đƣợc

1 12 44,44 Trắng

Xám 2 7 25,92

Vàng 3 1 3,70

Nâu 4 3 11,11

Xanh 5 2 7,40

Hồng 6 2 7,40

Tổng số 7 27 100

quan sát số liệu Bảng 3.2 cho thấy tỉ lệ nhóm xạ khuẩn có màu trắng là cao

nhất đạt tới 44,44%, tiếp đến là nhóm màu xám 25,92%, màu vàng chiếm tỷ

lệ thấp nhất với 3,70%. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của một số

công trình đã nghiên cứu về XK của các tác giả khác đã công bố [6,26]

Hình 3.1. Tỷ ệ á h n hu n phân theo nhóm màu

Hình 3.2: Đặ i hình thái hu n t s h n XK

theo nhóm màu

3.1.3. thuần khiết v ưu trữ gi ng XK phân l p ư c

Các chủng X sau khi đƣợc thuần khiết bằng phƣơng pháp cấy ziczac

hoạc cấy vạch nhiều lần sẽ đƣợc lƣu trữ trong ống nghiệm trên môi trƣờng GI và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C. Khi tiến hành các thí nghiệm tiếp

theo, cần cấy giống trong ống nghiệm gốc ban đầu, ta cần tiến hành nuôi hoạt

hóa lại các chủng X trên môi trƣờng GI lỏng trong thời gian nhất định,

nhằm giúp các chủng XK phục hồi lại các HTSH ban đầu.

Hinh3.3 M t s h n XK ư thuần hiết

3.2. Kết quả phân lập, thuần khiết và lƣu trữ giống nấm gây bệnh trên

cây keo lai

3.2.1. Phân l p nấm gây bệnh

Dựa theo phƣơng pháp ph n lập các chủng nấm gây bệnh trên cây keo

lai đã nêu ở phần 2.4.1 chƣơng 2. Tôi tiến hành phân lập nấm bệnh và đã thu

đƣợc tổng cộng 3 chủng nấm gây bệnh nghi ngờ là gây ra các bệnh phổ biến

trên cây keo lai, ký hiệu 3 chủng nấm nghi ngờ gây bệnh trên cây keo lai lần

lƣợt là LPT1, LPT2, LPT3.

Hình 3.4: Hình nh nấ ệnh ph n p trên ôi trư n PD

Nấm bệnh phát triển tại các vết mô lá bị bệnh ăn lan ra môi trƣờng.

Dụa vào đặc điểm hình thái khác nhau ở mỗi vết bệnh, tôi tiến hành phân lập

riêng rẽ từng chủng nấm gây bệnh sang các đĩa môi trƣờng PDA khác nhau.

Qua hai lần tinh sạch bằng phƣơng pháp chấm điểm đã thu đƣợc tổng cộng 3

chủng nấm nghi ngờ gây ra bệnh trên các bộ phận lá của cây keo lai.

3.2.2. Thuần khiết và b o qu n ch ng gi ng

Các chủng nấm mốc đã đƣợc phân lập và cấy chuyển nhiều lần, thuần

khiết trên môi trƣờng PDA. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho tới khi chủng

nấm tinh sạch sẽ đƣợc bảo quản trong ống nghiệm thạch nghiêng ở nhiệt độ 40 để sử dụng cho các nghiên cứu sau.

Hình 3.5: Cá h n nấ ệnh ư thuần hiết

3.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh

3.3.1. Tuy n chọn sơ n ầu bằn phươn pháp thỏi th ch

Sau khi phân lập và thuần khiết đƣợc 27 chủng X để tuyển chọn các

chủng XK có HTKS cao, tiến hành kiểm tra sơ bộ HTKS của các chủng XK

bằng phƣơng pháp thỏi thạch với 3 chủng nấm gây bệnh nhƣ đã nêu trong

2.4.4 chƣơng 2. ết quả thể hiện trên Bảng 3.3.

B n 3.3 HTKS 27 h n XK với 3 h n nấ LPT1, LPT2 v LPT3

STT Chủng XK Hoạt tính kháng nấm K = (D-d) (mm)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 X ĐR1 X ĐR2 X ĐR3 X ĐR4 X Đ 1 X Đ 2 X Đ 3 X Đ 4 X Đ 5 X Đ 6 X Đ 7 X Đ 8 Đ 9 X ĐV1 X ĐV2 X ĐV3 X ĐV4 X ĐV5 X ĐV6 X ĐV7 X ĐV8 X ĐV9 X ĐV10 X ĐV11 Đ 12 X ĐV13 X ĐV14 LPT1 4,5±0,17 5,6±0,23 3,4±0,22 3,2±0,18 - 7,8±0,20 - 5,6±0,17 6,5±0,18 - 3,5±0,23 - 15,6±0,17 4,5±0,18 - 4,5±0,32 - 4,5±0,18 - - 3,4±0,23 - 5,5±0,23 3,5±0,32 17,3±0,21 4,3±0,20 - LPT2 - 4,5±0,34 2,7±0,17 - - 4,3±0,18 - 4,7±0,21 4,4±0,20 - 2,6±0,21 - 5,5±0,27 - - 2,5±0,25 - 3,5±0,15 - - 2,5±0,34 - 1,6±0,43 2,7±0,33 6,5±0,18 3,3±0,27 - LPT3 - 6,1±0,23 3,4±0,24 - 3,4±0,23 5,6±0,24 - 5,6±0,32 5,7±0,18 - 1,5±0,34 - 11,3±0,17 - - 6,3±0,12 - 5,7±0,16- - 4,7±0,17 4,5±0,23 - 6,5±0,21 - 12,5±0,18 4,3±0,17 -

Trong bảng 3.3 cho thấy 27 chủng XK không có sự đồng nhất về

HTKS, có 17 chủng XK có HTKS với chủng nấm LPT1, 14 chủng XK có HTKS

với chủng nấm LPT2 và có 15 chủng XK có HTKS với chủng nấm LPT3

B n 3.4. HTKS 27 h n hu n theo nhóm màu

Số chủng Xạ khuẩn có HTKS Tỷ lệ chủng có

STT Nhóm màu phân lập HTKS so với Số Tỷ lệ

đƣợc tổng số (%) lƣợng (%)

1 Trắng 12 6 46,15 22,22

2 Xám 7 3 23,07 11,11

3 Xanh 2 1 7,69 3,70

4 Nâu 3 2 15,38 7,40

5 Hồng 2 0 0 0

6 Vàng 1 1 7,69 3,70

7 Tổng cộng 27 13 100 48,13

Trong tổng số 27 chủng X đã ph n lập đƣợc có tới 13 chủng là cho

cho HTKS với cả 3 chủng nấm gây bệnh chiếm tới 48,13%, so sánh với các

kết quả đã công bố trƣớc đ y thì kết quả nghiên cứu của tôi là tƣơng đối cao .

Kết quả này cũng cho thấy, sự hình thành CKS của XK phụ thuộc nhiều

vào các yếu tố của môi trƣờng, không phải cứ nhiều chất dinh dƣỡng thì XK

sẽ tổng hợp S hay ngƣợc lại. Đ y cũng là đặc điểm chung cho quá trình

sinh tổng hợp các sản phẩm bậc 2, trong đó có S.

Tỷ lệ các chủng X có HT S cũng khác nhau giữa các nhóm màu, cụ

thể: nhóm màu trắng có tỷ lệ các chủng có HTKS là cao nhất (chiếm

22,22%), tiếp theo là nhóm màu xám (chiếm 11,11%), nhóm màu Nâu (chiếm

7,40%), nhóm màu vàng (chiếm 3,70%), nhóm màu xanh (chiếm 3,70%) và

màu hồng (chiếm 0%). Kết quả này của tôi cũng phù hợp với những nghiên

cứu của một số tác giả [16,20]. Song nếu xét riêng từng nhóm màu, tôi nhận

thấy các nhóm màu vàng, xanh mặc dù số chủng phân lập đƣợc t nhƣng tỷ lệ

số chủng có HT S tƣơng đối cao.

3.3.2. Tuy n chọn các ch ng XK có HTKS cao

Trong quá trình khảo sát và tuyển chọn ban đầu, tôi nhận thấy có 2

chủng XK cho hoạt t nh kháng sinh tƣơng đối mạnh và rõ rệt với các chủng

nấm gây bệnh trong đó có 1 chủng màu trắng sữa, 1 chủng màu xám trắng.

Hoạt tính mạnh nhất là với chủng nấm gây bệnh có ký hiệu LPT1,LPT3

chủng nấm còn lại LPT2 có hoạt t nh nhƣng yếu hơn Vì vậy tôi quyết định

tuyển chọn 2 chủng XK ký hiệu lần lƣợt là: Đ 12 Đ 9 để tiến hành

các thí nghiệm tiếp theo Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng của 2 chủng

XK trên với các chủng nấm gây bệnh đƣợc trình bày trên Bảng 3.5.

B ng 3.5. HTKS 2 h n XK tu n họn ằn

phươn pháp thỏi th h

Chủng nấm Hoạt tính kháng sinh K = (D – d) (mm)

LPT1 LPT2 LPT3 Chủng XK

17,3 ±0,21 6,5 ±0,18 12,5±0,18 Đ 12

15,6 ±0,17 5,5 ±0,27 11,3±0,17 Đ 9

Bảng số liệu trên cho thấy HTKS của 2 chủng X đƣợc tuyển chọn là

tƣơng đối mạnh Ở điều kiện môi trƣờng thạch đĩa, với chủng nấm có ký hiệu

LPT1 chủng ĐV12 cho HTKS cao nhất (17,3mm), tiếp đó X Đ 9(15 6mm)

còn đối với chủng nấm bệnh có ký hiệu LPT2 hầu hết cả 2 chủng XK tuyển

chọn đều cho HTKS thấp, Đối với chủng nấm bệnh LPT3 hai chủng XK cho

HT S tƣơng đối cao với chủng X ĐV12 cho HT S (12 5mm) và chủng

X Đ 9 (11 3mm).

Bƣớc tiếp theo, tiến hành lên men các chủng X này trên môi trƣờng

dịch thể GI lỏng ở các khoảng thời gian nuôi lắc khác nhau, sau 4, 7, 10 và

14 ngày. Sau đó tiến hành kiểm tra HTKS của dịch lên men bằng phƣơng

pháp đục lỗ thạch. Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 3.6

B n 3.6 HTKS 2 h n XK ư nuôi ấ trên ôi trư n GI ỏn á ho n th i i n há nh u

Hoạt tính kháng sinh K = (D - d) (mm)

Chủng nấm Đ 12 Đ 9

4 7 10 14 4 7 10 14

17,8 ±0,21 21,5 ±0,33 13,4 ±0,18 9,3 ±0,29 18,8 ±0,16 20,7 ±0,34 13,8 ±0,15 13,8 ±0,15 LPT1

10,6 ±0,31 15,8 ±0,20 7,5 ±0,12 6,7 ±0,24 9,4 ±0,12 16,3 ±0,29 11,6 ±0,13 4,4 ±0,26 LPT2

19,9 ±0,19 22,7 ±0,16 15,3 ±0,17 13,9 ±0,30 17,7±0,28 19,8 ±0,15 14,8 ±0,11 12,5 ±0,34 LPT3

HTKS khi lên men dịch thể trong môi trƣờng GI lỏng của 2 chủng XK

tuyển chọn đƣợc thể hiện qua 2 biểu đồ trên Hình 3.6 và Hình 3.7.

Hình 3.6 HTKS h n hu n XKĐV12 ên 3 h n nấ ệnh

Hình 3.7 HTKS h n hu n XKĐK9 ên 3 h n nấ ệnh

Kết hợp bảng số liệu Bảng 3.5 và Bảng 3.6 cho thấy HTKS của cả 2 chủng

X đƣợc tuyển chọn đều không thay đổi khi chuyển từ môi trƣờng thạch đĩa

sang môi trƣờng dịch thể. Mặt khác, bảng số liệu 3.6 cho thấy khả năng ức

chế nấm gây bệnh của 2 chủng XK tuyển chọn còn tăng lên khi đƣợc nuôi

trên môi trƣờng dịch thể điều này một lần nữa cho thấy sự ảnh hƣởng rõ rệt

của các yếu tố điều kiện môi trƣờng lên khả năng sinh S của 2 chủng XK

đƣợc tuyển chọn. Điều này có thể đƣợc lý giải do trong điều kiện nuôi lắc các

tế bào sinh trƣởng tốt hơn do sự tiếp xúc với môi trƣờng dinh dƣỡng đồng

đều độ thông thoáng khí tốt nên khả năng sinh ra các hoạt chất sinh học sẽ tốt

hơn trên môi trƣờng nuôi tĩnh (đĩa thạch). Dựa vào bảng số liệu cũng nhƣ

biểu đồ, chúng tôi nhận thấy khoảng thời gian ở ngày thứ 7 của quá trình nuôi

lắc hầu hết 2 chủng XK tuyển chọn đều cho HTKS mạnh nhất, sau khoảng

thời gian đó HT S giảm dần.Tiến hành đồng thời phƣơng pháp sử dụng thỏi

thạch và phƣơng pháp nhỏ dịch lên men của 2 chủng XK tuyển chọn để kiểm

tra HTKS với 3 chủng nấm gây bệnh LPT1, LPT2 và LPT3, kết quả thu đƣợc

đƣợc thể hiện qua Hình 3.8.

Hình 3.8. HTKS 2 h n XK hán nấ h i ấ o i

(A) kháng nấn LPT1

(B) Kháng nấm LPT3

3.5. Thử nghiệm hoạt tính enzyme ngoại bào của 2 chủng XK tuyển chọn

3.5.1. Xá ịnh ho t tính c a các lo i enzyme ngo i bào

Trong quá trình sinh trƣởng, các enzyme đƣợc hình thành trong tế bào

và một số đƣợc tiết ra môi trƣờng xung quanh. Trong quá trình sản xuất

enzyme từ xạ khuẩn chủ yếu là thu nhận các enzyme ngoại bào. Không phải

tất cả các VSV đều có khả năng sinh enzyme nhƣ nhau và ngay cả những

chủng trong cùng một loài cũng không có hoạt t nh nhƣ nhau. Vì vậy, khi

tuyển chọn chủng giống phải tiến hành phân lập, kiểm tra và lựa chọn các

chủng có hoạt tính enzyme mạnh, sinh nhiều enzyme mong muốn theo từng

mục đ ch.

Để tuyển chọn các chủng có hoạt tính enzyme cao trƣớc hết tôi tiến

hành kiểm tra sơ bộ hoạt tính enzyme của 2 chủng XK tuyển chọn với 3 loại

môi trƣờng có bổ sung 3 loại cơ chất là: Tinh bột, CMC (carboxymethyl

celluloza) và asein tƣơng ứng với 3 loại enzyme ngoại bào là: amylase,

cellulase và protease. Hai chủng X này đƣợc nuôi lắc trên môi trƣờng dịch

thể GI là một trong các môi trƣờng lên men thích hợp cho XK. Sau 4 - 5 ngày

thu dịch lên men và tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme bằng phƣơng pháp

đục lỗ thạch. Kết quả xác định hoạt tính enzyme của 2 chủng X đƣợc thể

hiện qua Bảng 3.7

B n 3.7. Ho t tính nz e a 2 h n XK

Hoạt tính enzyme H = (D – d,mm) Chủng XK Amylase CMC-ase Protease

11,5 ±0,31 17,2 ±0,14 6,3 ±0,28 Đ 12

10,1 ±0,27 16,6 ±0,24 5,8 ±0,25 Đ 9

Dựa vào kết quả ở Bảng 3.7 cho thấy cả 2 chủng XK tuyển chọn đều có

hoạt tính enzyme khá đồng đều và ổn định, hoạt tính enzyme amylase ở

mức trung bình và enzym proteaza có hoạt tính thấp hơn riêng hoạt tính

cellulaza ở mức cao. Điều này hoàn toàn phù hợp với 1 số nghiên cứu trƣớc 41

đ y về hoạt tính enzyme của đa số các XK. Do sống chủ yếu trong đất và

thảm thực vật mục nát, thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng cung cấp chủ

yếu là hợp chất cao phân tử của cellulose rất khó phân giải nên hoạt tính

enzyme cellulaza rất cao giúp cho XK có thể phân giải các hợp chất

cellulose phức tạp thành các loại đƣờng đơn đƣờng đa dễ phân giải nhằm

cung cấp chất dinh dƣỡng để sinh trƣởng và phát triển.

Hình 3.9. Ho t tính nz e dị h ên n 2 h n XK tu n họn

3.6. Nghiên cứu đ c điểm h nh thái 2 chủng ạ khuẩn có hoạt tính

enzyme cao

3.6.1. Qu n sát ặ i m khu n l c c a 2 ch ng XK tuy n chọn

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc giúp đánh giá sơ bộ phân loại XK theo

nhóm màu dựa vào yếu tố màu sắc khuẩn lạc, cấu trúc bề mặt, viền, mép, chất

tiết k ch thƣớc… ác chủng đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch đĩa GI trong 7 ngày ở t0 = 300C. Quan sát và ghi nhận hình thái khuẩn lạc mọc trên môi

trƣờng. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 1 chủng X đƣợc thể hiện qua

Bảng 3.7.

B n 3.8. Đặ i hình thái hu n 2 h n XK tu n họn

Đ c điểm hình thái khuẩn lạc

ChủngXK

Màu sắc HSKS Hình ảnh Hình dạng Mép Bề m t

XKĐV12 Màu xám

Khuẩn lạc dính liền nhau Kích thƣớc (mm) 0,5 - 2 Tạo viền dày Tiết sắc tố

Lồi, thành dày xám -

X Đ 9 0,5 - 2,5 -

Màu trắng ngà Tròn đều, khuẩn lạc dính liền nhau Sợi tia nhỏ Lồi, bông xốp, có giọt tiết bề mặt

Chú thích (-): không tiết sắc tố

3.6.2. Qu n sát ặ i hình thái v u n sinh o tử t s h n

hu n dưới ính hi n vi

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin

quan trọng để phân loại X . Để làm cho các chủng XK cần định loại biểu

hiện đầy đủ các đặc điểm ngƣời ta thƣờng xuyên nuôi cấy chúng trên môi

trƣờng dinh dƣỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định.

Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và

nuôi cấy của X đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào

tử. Theo Pridham và cộng sự (1995), cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm:

- RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lƣợn sóng.

- RA cho những cuống sinh bào tử xoắn thô sơ và ngắn.

- S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn.

ác chủng X tinh sạch đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng GI đƣợc tiến

hành quan sát sau 7 - 9 ngày nuôi cấy. ết quả đƣợc thể hiện trên Bảng

3.8.

B n 3.9: Kết qu qu n sát u n sinh o tử v hình d n o tử 2

h n XK tu n họn (dưới KHV trư n v t ính X40)

hủng uống inh bào tử ạng bào tử

X ĐV12 Bầu

dục

X Đ 9 Tròn

Từ các kết quả trình bày trên Bảng 3.9 và các hình ảnh tƣơng ứng cho thấy:

cuống sinh bào tử của 2 chủng X tƣơng đối đa dạng thể hiện: chủng

X ĐV12 cuống sinh bào tử dài và xoắn đơn giản, và có bảo tử hình bầu dục

hơi xoắn chủng X Đ 9 cuống sinh bào tử ngắn, có dạng hình xoắn đơn giản bào tử có hình tròn

K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ

1. K T LUẬN

- Từ 9 mẫu đất thu thập tôi đã ph n lập và thuần khiết đƣợc 27 chủng X .

Tỷ lệ các chủng X theo nhóm màu nhƣ sau: màu trắng 44,44% màu xám

25,92% màu vàng 3,70% màu xanh 7 40% màu n u 11,11% và màu hồng

7,40%.

- Phân lập và thuần khiết đƣợc 3 chủng nấm g y bệnh điển hình trên c y

chè. ý hiệu các chủng: LPT1, LPT2, LPT3, .

- Trong tổng số 27 chủng X đã ph n lập đƣợc có tới 13 chủng XK cho HTKS

với 3 chủng nấm gây bệnh chiểm tới 48,13% tổng số chủng phân lập đƣợc.

- Tuyển chọn đƣợc 2 chủng XK có HTKS mạnh với chủng nấm gây bệnh

LPT1, LPT3 và hoạt tính enzyme ngoại bào cao. Ký hiệu các chủng:

X ĐV12 X Đ 9.

2. KI N NGHỊ

o thời gian tiến hành TN còn hạn chế nên tôi chƣa thực hiện đƣợc

một số nội dung nghiên cứu chuyên s u tiếp theo về các chủng xạ khuẩn này.

Nếu đƣợc tiếp tục nghiên cứu và thời gian cho phép tôi sẽ thực hiện những

công việc nghiên tiếp theo nhƣ:

- Định danh đến tên loài cho 2 chủng xạ khuẩn đã đƣợc tuyển chọn từ khu

vực Xu n Mai bằng kỹ thuật sinh học ph n tử.

- Nghiên cứu những điều kiện tối ƣu cho khả năng sinh S và áp dụng

các phƣơng pháp hiện đại hiện nay trong việc tinh sạch S của 2 chủng xạ

khuẩn đã đƣợc tuyển chọn.

- Thực hiện các kỹ thuật sinh hóa để xác định các chất kháng sinh do xạ

khuẩn sinh ra có khả năng ức chế nấm vi khuẩn.

- hảo sát HT S của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn lên các đối tƣợng VSV

g y bệnh thực vật khác.

- Tiến hành thử nghiệm khả năng đối kháng của 2 chủng xạ khuẩn tuyển

chọn lên nấm g y bệnh trên c y keo lai ngoài thực tế.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TI NG VIỆT

1. Ngô Đình B nh Vi sinh vật học công nghiệp, Trung tâm Khoa học Tự nhiên

và Công nghệ Quốc gia, tr. 53-71, 2005.

2. Nguyễn Văn ách Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa

học và kĩ thuật, tr.17, 2004.

3. Nguyễn Văn ách ê Văn Nhƣơng Cơ sở công nghệ sinh học, tập 4 -

công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục Việt Nam, 2009.

4. Nguyễn Hoàng Chiến, Nghiên cứu chủng xạ khuẩn streptomyces V6 sinh

chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn

Thạc sĩ Sinh học, Hà Nội, 2000.

5. Vi Thị Đoan Chính, Nghiên cứu khả năng nâng cao hoạt tính kháng sinh

của chủng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus

5820 bằng kỹ thuật dung hợp tế bà o trần, Luận án TS sinh học, Viện

công nghệ sinh học, Hà Nội, 2000.

6. Vi Thị Đoan h nh Tuyển chọn và nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng đối

kháng với một số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, Báo cáo

tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp Bộ. Mã số B2009 - TN07 -

02.

7. Nguyễn n ũng Thực tập vi sinh vật học NXB Đại học và Trung học

chuyên nghiệp Hà Nội 1993.

8. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Một số phương pháp nghiên cứu vi

sinh vật học - Tập III, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 1978.

9. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức

Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật

học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 1972.

10. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học -

tập II, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1977.

11. Nguyễn n ũng Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty Vi sinh vật học,

NXB Giáo dục 2007.

12. Nguyễn n ũng Nguyễn Kim Nữ Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu,

Vietscience, 2006.

13. Nguyễn Thành Đạt, Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 1 NXB Đại học sƣ

phạm, 2007.

14. Nguyễn Thành Đạt, K.A. Vinogradva V.A.Poltorac, Tính biến dị bề mặt

bào tử xạ khuẩn sinh choromomycin , Act.A. buraviensis,

microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia cccp, 1974.

15. ƣơng Thị Hƣơng Giang (2011) Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt t nh sinh

học củ một số chủng xạ khuẩn phân ập ở i Pháo – ại T – Thái

16. Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm

gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006.

17. Đỗ Thu Hà ghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân

ập t đất Quảng m – à ẵng luận án tiến sĩ sinh học Hà Nội

2004.

18. Trịnh Ngọc Hoàng, Nghiên cứu t nh đối kháng của xạ khuẩn với một số

VSV gây nhiễm trùng bệnh viện, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, 2009.

19. ê Mai Hƣơng, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập ở Hà

Nội và vùng phụ cận, Luận văn phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1993.

20. Lê Gia Hy, Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, NXB Giáo dục Việt

Nam, 2010.

21. Lê Gia Hy, Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng

sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam,

Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1994.

22. Nguyễn hang Kháng sinh học ứng dụng NXB Y học Hà Nội 2005.

23. Phan Quốc inh Công nghiệp hó chất, Thông tin Kinh tế & Công nghệ,

số 1 2004.

24. Phan Quốc Kinh, Vài nét về tình hình sản xuất hó dược trên thế giới, Tạp

chí công nghiệp hóa chất, số 4, 2002.

25. Nguyễn Xuân Thành, Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Giáo

dục, 2007.

26. Đặng Văn Tiến, Nguyễn Đình Tuấn, Vi Thị Đoan h nh Ngô Đình B nh

Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh kháng vi khuẩn

Xanthomonasoryzae gây bệnh bạc lá lúa. “Báo cáo khoa học Hội nghị

CNSH toàn quốc ” 2009.

27. ê Đình hả, Hà Huy Thịnh và công tác viên, 2005. Giống keo lai và

triển vọng gây trồng. H N NN&PTNT 20 năm đổi mới – Bộ Nông

nghiệp và Phát triển nông thôn

B. TÀI LIỆU TI NG ANH

28. Ashutosh K, Pharmaceutical Microbiology, New Age International (P)

Ltd, pp. 89 – 101, 2008.

29. Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F, Arthrobacter ardleyensis

sp. nov. isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment,

Arch Microbiol, 183, pp. 301- 305, 2008.

30. Fred C. Tenover, Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria,

Amer.J. Med, 119, pp. 3–10, 2006.

31. Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A., Hammouda O., Mousa A.S., Xu

L.H., Jiang C.L., Nocardiopsis alkaliphila sp. nov., a novel alkaliphilic

actinomycete isolated from desert soil in Egypt, Int. J. Syst. Evol.

Microbiol, 54, pp. 247-252, 2004.

32. J.H. Auh, H.Y. Chae, Y.R.Kim, K.H.Shim, S.H. Yoo, K.H. Park,

Modification of Rice Starch by Seclective Degradation of Amylose

Using Alkalophilic Bacillus Cyclomaltodextrinase, J. Agric, Food

Chem, 2006.

33. MA. Elberson, F. Malekzadeh, M.T. Yazdi, N. Kameranpour, M.R. Noori

– Daloii, M.H. Matte, M. Shahamat, R.R. Colwell, K.R. Sower,

Cellulomonas persica sp. nov. and Cellulomonas iranensis sp. nov.,

mesophilic cellulose – degrading bacteria isolated from forest soils, J.

Syst. Evol. Microbiol 50, p.993, 2000.

34. Pasti M. B., Pometto A. P., Nuti M. P., Crawford D. L., Lignin-

solubilizing ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae)

gutt, Appl Environ Microbiol, pp. 2213-2218, 1990.

35. Ramasamy Vijaykumar, Chinnasamy Muthukumar, Nooruddin

Thajuddin, nnamalai Panneerselvam, and Rengasamy

Saravanamuthu, Studies on the diversity of actinomycetes in the Palk

Strait region of Bay of Begal, India, Actinomycetologica, 2007.

36. R. Gupta, O.K Beg, P. Lorenz, Bacterial alkaline proteases: molecular

approaches and industrial applications, Appl. Microbiol. Biotechnol.

59 (1) ,p. 15, 2002.

37. Saga T., Yamaguchi K, History of antimicrobial agents and

resistant bacteria, J Japan Med Assoc, 137, pp. 513 – 517, 2008.

38. Seong C.N., Kim Y.S., Baik K.S., Lee S.D., Hah Y.C., Kim S.B.,

Goodfellow M, Mycolic acid-containing actinomycetes associated with

activated sludge foam, J Microbiol, 37, pp. 66-72, 1999.

39. Shirling E.B., D. Gottlieb, Methods for characterization of streptomyces

species. Vol. 16. No. 3. International Journal of Systematic

Bacteriology.

40. Steger K, PhD. Thesis: Composition of microbial communities in

composts. A tool to assess process development and quality of

the final product. Swedish University of Agricultural Sciences,

Uppsala, 2006.

41. Stuart H, Essential microbiology, John Wiley & Sons Ltd., England, pp.

191 – 369, 2005.

42. Waksman, S.A, The Actinomycetes. Classification, identification and

descriptions of genera and species, vol 2, The Williams &

Wilkins Co., Baltimore, USA, 1961.

43. Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H ,Xu C, Chen GH,

Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on

hepatocellular carcinoma cells in vitro, Transpl Immunol, 2007.

44. Geschva, A. Shurk and W. Romer. (1979), Phosphate inhibition of

secondary metabolism in Streptomyces hygroscopicus and its reversal

by cyclic AMP, Arch. Microbiol.121, p. 91 - 96.

45. Adhikari T. B. (1993), Identification of biovars and races of

Pseudomonas solanacearum and source of resistance in tomato in

Nepa, Plant disease, vol 77, p. 905 - 907.

46. Agrios, G. N. (1997), Plant Pathology, 4th Edition. Academic Press. San

Diego, USA.

TÀI LIỆU INTERNET

47. http://agro.gov.vn/news/chitiet_nghiencuu.aspx?id=54.

48. http://vi.wikipedia.org/wiki/Kh%C3%A1ng_sinh

49. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm.

CÔNG THỨC CÁC LOẠ Ô TRƢỜNG SỬ DỤNG

Công thức môi trƣờng Gause I

hất àm lƣợng

Tinh bột 20 g/l

2 g/l MgSO4.7H2O

2 g/l K2HPO4

1 g/l KNO3

KCl 0,5 g/l

0,1 g/l FeSO4.7H2O

Agar 20 g/l

ôi trƣờng PDA

Khoai tây 200 g/l

Đƣờng glucozo 20 g/l

agar 20 g/l

T môi trƣờng thử hoạt tính enzym

Agar 17 g/l

ơ chất: tinh

bột, CMC, 1g/l

casein

(Carboxymethyl

cellulozo),

Casein

Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây keo lai phân lập được ở Xuân Mai, Chương Mỹ - Hà Nội

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

.................oo0oo...................

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGÀNH

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ

: 7420201

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok

Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây keo lai phân lập được ở Xuân Mai, Chương Mỹ - Hà Nội

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

.................oo0oo...................

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGÀNH

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ

: 7420201

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok