ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
LÊ THỊ HẢO
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HỆ DẪN THUỐC
NANO PACLITAXEL PHỐI HỢP CURCUMIN
VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG LÊN
CÁC TẾ BÀO UNG THƯ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC
KHÓA: QH-2012
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
1. TS. HÀ PHƯƠNG THƯ
2. PGS.TS. DƯƠNG THỊ LY HƯƠNG
Hà Nội – 2017
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể Khoa Y Dược, Đại
học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ để em hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô đã giảng dạy không
những về mặt kiến thức mà còn cả kinh nghiệm để em có một kiến thức nền vững
chắc trong suốt 5 năm học vừa qua.
Tiếp theo em xin bày tỏ sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc đến:
1. TS. Hà Phương Thư – Trưởng phòng vật liệu nano Y Sinh, Viện Hàn Lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2. PGS.TS Dương Thị Ly Hương – Bộ môn Dược lý – Dược Lâm Sàng,
Khoa Y – Dược Đại học Quốc Gia Hà Nội.
3. Ths. Đỗ Hải Đoan, Phòng vật liệu nano Y Sinh, Viện Hàn Lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.
Đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cũng như tạo những điều kiện về tài
liệu tham khảo, phòng thí nghiệm cũng như kinh phí của đề tài để em có thể hoàn
thành khóa luận này trong những điều kiện tốt nhất.
Em xin cảm ơn đề tài cấp viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
MS. VAST03.04, 2016-2017 (chủ nhiệm TS. Hà Phương Thư) đã tài trợ kinh phí
giúp em thực hiện đề tài nghiên cứu của mình.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn bộ các anh chị thuộc Viện Hàn Lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đặc biệt các anh chị thuộc phòng vật liệu nano Y
Sinh đã giúp đỡ, hỗ trợ em trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn quan
tâm động viên, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Dù đã rất cố gắng nhưng khóa luận của em vẫn khó tránh khỏi những thiếu
sót. Vì vậy em rất mong nhận được những ý kiến phản hồi từ phía các thầy cô để
khóa luận thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn!
Sinh Viên
Lê Thị Hảo
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu Diễn giải
CMC Nồng độ micel tới hạn
CUR Curcumin
DCM Dichloromethan
EE% Hiệu suất mang thuốc
EtOH Ethanol
FDA Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ
FTIR Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier
L-LA L-lactic acid
NF-κB Yếu tố nhân Kappa B
PCL Poly- caprolacton
PEG Poly ethylen glycol
PGA Poly glycolic acid
PLA Poly Lactid
PLGA Poly lactic-co-glycolic acid
TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua
TPGS Tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat
DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên Hình
Trang
STT
Hình 1
5
Hình 2
6
Cơ chế nhắm đích bị động và chủ động của hệ phân phối thuốc có kích thước nano Cấu tạo của axit olic
Hình 3 ức độ biểu hiện của thụ thể olat trên các mô 7
thường và khối u
Hình 4 ột số hệ phân phối thuốc cấu trúc nano 10
Hình 5 11
Cấu trúc mixen tạo nên bởi copolyme (dạng di- block) không mang thuốc (a) và mang thuốc (b)
Hình 6 12
Hình 7 Công thức hóa học của PTX Công thức hóa học của Cur 13
Hình 8 Hình 9 15 16
Cấu trúc của L-LA Công thức của TPGS
Hình 10 Công thức của copolyme PLA-TPGS Hình 11 Hình ảnh của các hạt nano (PTX+Cur)/PLA- 17 17
TPGS
Hình 12 Copolyme PLA-TPGS được tạo bởi monome L- 19
Hình 13 23
Hình 14 24
28
Hình 15
Hình 16 30
Hình 17 LA và TPGS. Phổ hồng ngoại FTIR của nano (Cur+PTX)- PLA-TPGS-Fol với 5 tỉ lệ khác nhau giữa PLA và TPGS Phổ hồng ngoại FTIR của (1) Cur, (2) PTX, (3) Acid folic, (4) PLA-TPGS 1:1 và (5) (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol với tỉ lệ PLA- TPGS 1:1 Hình ảnh FESEM của nano (Cur+PTX)-PLA- TPGS-Fol với 5 tỉ lệ khác nhau giữa PLA và TPGS (a) 1:1, (b) 2:1, (c) 1:3, (d) 2:1, (e) 3:1 Thế zeta của hạt nano (Cur +PTX) PLA-TPGS- Fol tại các tỉ lệ của PLA và TPGS: 1:3 (a), 1:2 (b), 1:1 (c), 2:1 (d), 3:1 (e) Phương trình đường chuẩn của Cur và PTX 31
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng Trang STT
Bảng 1 20
Tỉ lệ và khối lượng của PLA và TPGS thực nghiệm
Bảng 2 Các dao động đặc trưng của các chất 21
Bảng 3 Các dao động đặc trưng của các chất 25
Bảng 4 28
Thế zeta của hệ nano tại 5 tỉ lệ khác nhau của PLA-TPGS
Bảng 5 Hiệu suất bọc thuốc của Curcumin và Paclitaxel 31
Bảng 6 32
Kết quả gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào được chọn
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về ung thư ................................................................................ 3
1.2. Tổng quan về hệ phân phối thuốc mới - hệ nano ...................................... 4
1.2.1. Cơ chế hướng đích của hệ phân phối thuốc nano .................................. 5
1.2.2. Các vật liệu có thể dùng để tạo ra chất mang nano ............................... 8
1.3. Hệ phân phối thuốc nano mang đồng thời Paclitaxel và Curcumin dựa
trên copolyme PLA-TPGS ((Cur+PTX)-PLA-TPGS) .................................... 11
1.3.1. Paclitaxel ............................................................................................... 12
1.3.2. Curcumin ............................................................................................... 13
1.3.3. Tác dụng hiệp đồng của Curcumin và Paclitaxel ................................. 14
1.3.4. Tổng quan về hệ micel copolyme PLA-TPGS ....................................... 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 19
2.1. Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu .......................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 19
2.2.1. Tổng hợp copolyme PLA-TPGS ............................................................ 19
2.2.2. Chuẩn bị dung dịch TPGS gắn với folat ............................................... 21
2.2.3. Tổng hợp hạt nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS gắn folat ........................ 21
2.2.4. Hiệu suất bọc thuốc (EE%) ................................................................... 22
2.2.5. Đánh giá các đặc trưng vật liệu ............................................................ 23
2.2.6. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ........................................................ 23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................. 24
3.1. Tính đặc trưng vật liệu ............................................................................. 24
3.1.1. Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FTIR) ............................. 24
3.1.2. Hình thái và kích thước ......................................................................... 27
3.2.3. Thế zeta ................................................................................................. 29
3.2. Hiệu suất bọc thuốc (EE %) ..................................................................... 32
3.3. Thử nghiệm gây độc tế bào ...................................................................... 33
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư hiện nay vẫn đang là một trong các nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu trên thế giới. Sự phát triển của ung thư trong những năm gần đây đang
thực sự là một mối lo ngại lớn đối với các quốc gia trên thế giới và thu hút được
quan tâm rất lớn, không chỉ trong cộng đồng khoa học, đặc biệt là dược sĩ, các
nhà sinh học và hóa học, mà còn trong cộng đồng nói chung. Việc chữa trị ung
thư tiêu tốn rất nhiều công sức và tiền bạc. Tuy nhiên, các thuốc điều trị ung thư
truyền thống thường thiếu tính đặc hiệu đối với những tế bào ung thư và có độ
tan trong nước thấp. Chúng không những tiêu diệt tế bào ung thư mà còn tiêu
diệt cả những tế bào khỏe mạnh của cơ thể, do đó không đem lại hiệu quả chữa
trị cao và gây nên nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng. Do đó, nhu cầu cấp bách là
cần phát triển phương pháp điều trị ung thư không có hoặc rất ít tác dụng phụ
đến các tổ chức lành. Sự phát triển vượt trội của công nghệ nano trong thời gian
gần đây đã tạo ra những bước tiến đáng kể trong tất cả các lĩnh vực của khoa học
công nghệ. Trong ngành dược, các hệ phân phối thuốc nano đã cho thấy những
ưu thế vượt trội so với những hệ phân phối thuốc truyền thống. Các hệ phân phối
thuốc nano có thể hướng đích tác dụng chọn lọc tới các tế bào, khối u ung thư
theo hai cơ chế: hướng đích thụ động và hướng đích chủ động, nhờ đó giảm
thiểu tối đa tác dụng phụ của thuốc đến mô lành đồng thời tăng hiệu quả điều trị,
giảm liều thuốc cần sử dụng.
Song song với đó, sử dụng kết hợp các loại thuốc trong điều trị ung thư
cũng được xem như là một hướng tiếp cận đầy tiềm năng. Phối hợp thuốc
trong điều trị ung thư có thể tạo nên tác dụng hiệp đồng, giúp tăng hiệu quả trị
liệu, giảm thiểu tác dụng phụ, giảm liều dùng, ngăn chặn hoặc giảm hiện
tượng kháng đa thuốc.
Paclitaxel (PTX) là một trong những thuốc điều trị ung thư truyền
1
thống được chiết xuất từ vỏ của cây Taxus brevifolia, dùng để điều trị nhiều
bệnh ung thư như ung thư vú, buồng trứng, phổi …[41]. Tuy nhiên, việc sử
dụng PTX trong điều trị gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng như phản
ứng quá mẫn, gây độc thần kinh, mắt v.v… Điều đó có thể do độ tan trong
nước thấp của PTX cũng như tính chọn lọc đến các tế bào khối u kém [26,41].
Để giải quyết vấn đề này, cần làm tăng độ tan trong nước của PTX và hạn chế
tối đa tác dụng có hại đến cơ thể.
Curcumin(Cur) là một chất polyphenol màu vàng được chiết xuất từ rễ
của cây nghệ (Curcuma longa) sống phổ biến ở vùng khí hậu nhiệt đới Đông
Nam Á [39]. Cur đã được chứng minh không những có tác dụng chống oxy
hóa mạnh mà còn diệt được các tế bào ung thư với rất ít độc tính[3,12,45]. Sự
kết hợp của Cur và PTX cho tác dụng hiệp đồng ức chế sự phát triển của các
khối u do Cur ngăn cản PTX hoạt hóa yếu tố nhân Kappa B, là yếu tố làm bất
hoạt sự chết theo chương trình của tế bào [18]. Hơn nữa, Cur còn có khả năng
ức chế hoạt động của bơm tống thuốc P-Glycoprotein – một trong các cơ chế
của tế bào ung thư kháng lại PTX – nhờ đó tăng hiệu quả trị liệu của PTX.
Tuy nhiên Cur cũng có độ tan trong nước thấp và nhanh bị đào thải ra khỏi cơ
thể nên ứng dụng trong lâm sàng để điều trị ung thư bị giới hạn đáng kể [7].
Bởi những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu
chế tạo hệ dẫn thuốc nano Paclitaxel phối hợp Curcumin và đánh giá tác
động của chúng lên các tế bào ung thư” với mục tiêu:
1). Bào chế hệ nano trên cơ sở copolyme PLA - TPGS mang đồng thời
PTX và Cur và gắn yếu tố hướng đích olat.
2
2). Đánh giá hiệu quả tác động của hệ trên một số tế bào ung thư.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về ung thư
Ung thư là một thuật ngữ chung cho một nhóm lớn các bệnh có thể ảnh
hưởng đến bất kỳ phần nào của cơ thể. Các thuật ngữ khác được sử dụng là
các khối u ác tính và u. ột đặc tính của ung thư là tạo nhanh các tế bào bất
thường phát triển vượt ra ngoài phạm vi thông thường của chúng, và sau đó
có thể xâm nhập vào các bộ phận liền kề của cơ thể và lây lan đến các cơ
quan khác, quá trình thứ hai được gọi là di căn. Di căn là những nguyên nhân
chính gây tử vong do ung thư .
Tỷ lệ ung thư có xu hướng tăng nhanh ở phần lớn các nước trên thế
giới. Tổ chức Y tế thế giới(WHO) nhận định đây là đại dịch đang xảy ra trong
hiện tại. Ước tính mỗi năm trên toàn cầu có hơn 14,1 triệu người mới mắc và
8,2 triệu người chết do ung thư, trong đó gần 70% là ở các nước đang phát
triển và có thể tăng gấp đôi lên 14,6 triệu người vào năm 2035. Số lượng các
trường hợp mới mắc được dự kiến sẽ tăng khoảng 70% trong 2 thập kỷ tới.
Hiện khoảng 23 triệu người đang sống với ung thư. Nếu không có các biện
pháp can thiệp kịp thời thì các con số này sẽ tăng lên 30 triệu vào năm 2020.
Và cũng theo WHO, trong 178 quốc gia, vùng lãnh thổ có tỷ lệ mắc và tử
vong do ung thư nhiều nhất thế giới, Việt Nam đứng thứ 78. Năm bệnh ung
thư phổ biến nhất ở Việt Nam là ung thư gan, phổi, dạ dày, ung thư vú và ung
thư trực tràng [15].
Các phương pháp điều trị ung thư phổ biến hiện nay là phẫu thuật, xạ
trị và hóa trị. Trong hóa trị liệu, các dược chất phổ biến như cisplatin,
mitoxantron, estramustin, doxorubicin, etoposid, vinblastin,
paclitaxel,vinorelbin, hoặc kết hợp các loại thuốc với nhau đã được sử dụng
rộng rãi trong điều trị ung thư và cũng đã cải thiện chất lượng cuộc sống
[8,31,34]. Tuy nhiên, bên cạnh hiệu quả trong diệt tế bào ung thư, các thuốc
này còn gây nhiều tác dụng không mong muốn trên tế bào lành. Do đó, công
3
cuộc tìm kiếm các thuốc mới, các liệu pháp điều trị mới, hoặc phối hợp các
dược chất với nhau để nâng cao hiệu quả điều trị, giảm thiểu tác dụng không
mong muốn vẫn đang là một thách thức đặt ra với các nhà khoa học. Do đó,
một nhu cầu cấp bách là cần tìm ra phương pháp điều trị ung thư không có
hoặc rất ít tác dụng phụ đến các cơ quan bình thường.
1.2. Tổng quan về hệ phân phối thuốc mới - hệ nano
Nhiều hệ phân phối thuốc đã và đang được nghiên cứu và phát triển
nhằm tăng khả năng vận chuyển và giải phóng thuốc tại những vùng khối u
mang bệnh và do đó giảm thiểu những tác động xấu tới những cơ quan của cơ
thể. Trong đó hệ phân phối thuốc nano có tiềm năng ứng dụng rất cao, thu hút
được nhiều sự quan tâm nghiên cứu và phát triển.
Công nghệ nano liên quan đến việc thiết kế, phân tích, bào chế các vật
liệu trong đó có ít nhất một chiều có kích thước từ 1-100 nm. Các vật liệu
nano có diện tích bề mặt lớn so với thể tích, các tính chất hóa, lý, sinh học của
chúng cũng rất khác biệt so với các vật liệu có kích thước lớn. Những tính
chất siêu việt này đã mở ra những cơ hội mới trong việc ứng dụng công nghệ
nano trong các lĩnh vực như y học và sinh học. Nhờ đó, thuật ngữ “y học
nano” đã được hình thành [28]. Mục tiêu của y học nano là áp dụng của công
nghệ nano vào y học cho việc phòng bệnh, chẩn đoán và trị liệu bằng cách
dùng vật liệu nano để thao tác các hệ thống sinh học ở mức độ tế bào hay
xuống thấp hơn nữa ở cấp độ phân tử. Những nghiên cứu trong y học nano
phần lớn liên quan đến việc mang thuốc đến các tế bào bệnh và chẩn đoán
bệnh ở mức phân tử. Với kích thước cỡ nano mét, các hệ phân phối thuốc
nano không chỉ giúp cải thiện tính tan của các thuốc không tan mà còn có khả
năng tập trung thuốc tại vùng khối u thông qua hai cơ chế hướng đích: bị
4
động và chủ động.
Hướng đích chủ động
Tế bào ung thư
Nhập bào
Tế bào nội mô
Hoạt chất có hoạt tính
Giải phóng hoạt chất trong tế bào
Hướng đích bị động
Mạch bạch huyết
Hình 1: Cơ chế nhắm đích bị động và chủ động của hệ phân phối thuốc
có kích thước nano
1.2.1. Cơ chế hướng đích của hệ phân phối thuốc nano
* Hướng đích bị động
Các nhà khoa học đã nhận thấy có sự khác biệt giữa vùng mô bình
thường khoẻ mạnh và mô ung thư, tế bào của vách huyết quản trong vùng mô
khoẻ mạnh có sự liên kết rất khít khao, trong khi đó ở vách huyết quản của
mô ung thư xuất hiện những khoảng hở có kích cỡ khoảng 600-800 nm. Phân
tử thuốc tự do có thể đi xuyên vách thông qua sự thẩm thấu và khuếch tán tự
động, có tác dụng và tiêu diệt các tế bào khỏe mạnh lẫn tế bào ung thư mà
không phân biệt. Ngược lại, nếu thuốc đưa vào cơ thể dưới dạng hạt có kích
thước nano, độ lớn của hạt không cho nó đi qua vách huyết quản của mô bình
thường nhưng có thể chui lọt qua những khoảng hở đi vào khối u ung thư [5].
5
Các nhà toán học còn có thể tính toán hình dạng tối ưu làm sao để hạt có thể
chui qua kẽ hở huyết quản với số lượng tối đa. Từ đó làm gợi ý đến việc
nghiên cứu phát triển các thuốc điều trị ung thư được bọc trong các hạt kích
thước nano nhằm tăng tính hướng đích, dẫn đến tăng hiệu quả điều trị bệnh.
Khi được đưa vào cơ thể, hạt nano mang thuốc sẽ theo hệ thống tuần
hoàn qua mạch máu để đến mô đích. Kích cỡ của hạt mang thuốc là một yếu
tố quan trọng cho việc vận chuyển thuốc. Kích cỡ này phải trong phạm vi từ 4
đến 400 nm. Nếu nhỏ hơn 4 nm, hạt sẽ nhanh chóng bị thải ra theo đường bài
tiết. Nếu lớn hơn 400 nm, hạt sẽ bị hệ thống miễn dịch phát hiện và loại trừ ra
khỏi cơ thể.
* Hướng đích chủ động:
Cơ chế hướng đích chủ động dựa trên những liên kết đặc hiệu cuả các
thụ thể có mặt trên tế bào ung thư đối với các tác nhân hướng đích đặc hiệu
đối với các thụ thể đó. ối loại tế bào ung thư sẽ có một hoặc nhiều thụ thể
đặc hiệu. Để đạt được khả năng nhắm đích có tính chọn lọc cao, những hệ
phân phối thuốc có thể được gắn với các yếu tố hướng đích như: hormon,
kháng thể, và những dẫn xuất của vitamin [27]. Trong đó hệ gắn thuốc với
axit olic được nghiên cứu ứng dụng nhiều trị liệu ung thư [24].
Axit folic
Hình 2. C u t củ it ic Axit folic (Hình 2) là một vitamin rất cần thiết cho các quá trình
6
sinh tổng hợp nucleotid, vì vậy, nó được sử dụng để kéo dài quá trình sống
của tế bào. Tế bào thường vận chuyển folat qua màng thông qua những thụ
thể của folat (folat-receptor ( )). Những thụ thể của folat ( ) thường được
biểu hiện quá mức ở tế bào ung thư giúp những tế bào ác tính được cung cấp
đầy đủ nhu cầu vitamin cho sự phát triển của chúng [33].
Thụ thể folat (FR) :
Thụ thể olat của người (khối lượng cỡ 38 kDa) bao gồm 3 dạng - ,
- , và - . ỗi dạng có khả năng bám dính khác nhau đối với olat.
Hằng số phân ly KD của mỗi dạng đối với olat lần lượt là: FR- = 0,1 n ,
FR- = 1 n , - = 0,4 n . Hằng số phân ly càng nhỏ cho thấy khả năng
bám dính càng cao. Vì có ái lực cao đối với olat, nên thụ thể - là đối
tượng được nghiên cứu khá kĩ trên các dòng tế bào ung thư. - chỉ biểu
hiện ở mức độ rất thấp trên các mô thường, song lại biểu hiện rất cao ở các
mô thư ác tính như: ung thư buồng trứng, ung thư dạ con, ung thư não,
thận… ức độ biểu hiện của thụ thể olat được biểu hiện qua lượng olat bám
trên một mg protein được tách ra từ các mô, khối u tương ứng. Mức độ biểu
hiện của thụ thể folat ở mô khối u cao hơn nhiều so với mô lành (Hình 3). Các
nhà khoa học có thể tận dụng các đặc điểm này để gắn folat lên các hệ phân
phối thuốc, giúp tăng khả năng bám dính của những hệ dẫn thuốc này lên tế
bào ung thư, qua đó tăng nồng độ của thuốc tại những vùng khối u và giảm
thiểu nồng độ của thuốc tại những cơ quan, tế bào lành.
7
Hình 3: M c độ bi u hiện củ th th t t ên m thư ng và khối u.
Cơ chế: Sau khi bám lên những thụ thể folat nằm trên bề mặt của tế
bào ung thư, những hệ gắn folat sẽ được tiếp nhận và vận chuyển vào bên
trong tế bào, tới những cơ quan nội bào gọi là endosom. Những endosom này
có pH nằm trong khoảng từ 4.3 đến 6.9, phổ biến nhất là 5.0. pH của endosom
có ảnh hưởng tới việc gắn của hệ olat vào thụ thể. Khi pH < 5 một số hệ gắn
folat sẽ bị tách ra khỏi thụ thể folat và tồn tại bên trong tế bào. Một số nghiên
cứu gần đây đã chỉ ra rằng, tổng số hệ gắn folat được nhập bào sẽ gần như tỉ
lệ thuận với số lượng thụ thể folat được biểu hiện trên một tế bào và tốc độ
tiếp nhận những hệ gắn folat của một tế bào ung thư trung bình là 1-3 105
phân tử tế bào giờ [42].
Kết hợp copolyme và folat để tạo ra một hệ phân phối thuốc cấu
trúc nano có khả năng hướng đích chủ động
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành dựa trên việc
kết hợp copolyme và olat để tạo ra các hệ phân phối thuốc nano hướng đích
mang lại nhiều tác dụng có lợi như các liposom, phức hợp polymer-thuốc, hạt
nano lipid, và micel copolymeric. Ví dụ, năm 2011, ing - Fa - Hsieh cùng
đồng nghiệp đã tiến hành tổng hợp hệ phân phối thuốc nano doxorubicin dựa
trên copolyme poly(ethylen glycol)-poly )-poly(ethylen glycol) gắn yếu tố
hướng đích olat ứng dụng trong điều trị ung thư vú [11]. Hay Wang J, Liu W
cùng các cộng sự năm 2011 cũng đã tiến hành tổng hợp hệ phân phối thuốc có
yếu tố hướng đích olat được tổng hợp từ monomethoxy-poly(ethylen glycol)-
b-poly(lactid)-paclitaxel (MPEG-PLA-paclitaxel) và d- -tocopheryl
polyethylen glycol 1000 succinat (TPGS)- olat đã chứng minh acid folic tăng
cường khả năng phân phối thuốc của hệ nano mang thuốc điều trị ung thư đến các tế bào ung thư [47].
1.2.2. Các vật liệu có thể dùng để tạo ra chất mang nano
Để chế tạo được những hệ phân phối thuốc điều trị ung thư có khả năng
8
nhắm đích tới tế bào ung thư như vậy, có hai vấn đề lớn được đặt ra. Thứ
nhất, những loại vật liệu nào phù hợp để có khả năng tạo ra những hệ chất
mang có kích thước nano, có khả năng tương hợp sinh học cao, an toàn cho
người bệnh. Thứ hai, lựa chọn những phối tử nào đặc hiệu đối với những thụ
thể đặc trưng đối với từng loại tế bào ung thư là việc rất quan trọng quyết
định tới khả năng nhắm đích và tính chọn lọc của việc điều trị.
Những hệ vật liệu sử dụng để bào chế những hệ phân phối thuốc phải
có khả năng tương thích sinh học cao, bảo vệ thuốc chống lại các quá trình
chuyển hóa và thải trừ trong cơ thể thông qua sự hoạt động của các loại
enzyme, không gây những phản ứng miễn dịch trong cơ thể và không gây độc
cho cơ thể. Có thể chia những vật liệu được sử dụng trong việc dẫn truyền
thuốc làm 3 loại [23]:
- Các hạt vô cơ có cấu trúc xốp ( hạt SiO2 xốp) hoặc rỗng ( hạt vàng rỗng)
- Các loại polyme thiên nhiên hoặc polyme tổng hợp
- Các hệ mang sinh học: virus
Một số hệ phân phối thuốc được tạo thành từ polyme được liệt kê trong
Hình 4. Trong số đó, các polyme được sử dụng để tạo chất mang nano dưới
dạng polymeric micel. Trong đó các polyme phân hủy sinh học vẫn được sử
dụng rộng rãi hơn cả. Các polyme phân hủy sinh học như poly- caprolacton
(PCL), poly lactid (PLA), poly glycolic acid (PGA), poly e-caprolacton, poly
lactic-co-glycolic acid (PLGA). Những polyme này đã được cục quản lý thực
phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ FDA, chứng minh là phân hủy sinh học, được
sử dụng trong nhiều nghiên cứu do có độc tính thấp với cơ thể. Với tính chất
kỵ nước giúp chúng có khả năng vận chuyển những loại thuốc ít tan trong
nước lớn nhưng đồng thời khả năng phân tán trong nước rất hạn chế, và tốc
độ phân hủy thấp trở thành rào cản để sản xuất hệ phân phối thuốc mới tiên
tiến [46]. Vì vậy, thông thường, khi sử dụng các loại polyme này như một hệ
phân phối thuốc, người ta thường sử dụng các chất nhũ hóa nhằm làm tăng
9
khả năng phân tán của hệ trong môi trường cơ thể, qua đó làm tăng khả năng
lưu thông trong hệ tuần hoàn. ặc dù vậy, khi sử dụng các chất nhũ hóa, kích
thích của hệ mang thuốc thường lớn, không nằm trong vùng kích thước từ
200-800 nm. Vì vậy, chúng dễ bị bắt giữ bởi các đại thực bào và bị phân hủy
bởi các enzyme trong hệ thống bài tiết của cơ thể. Đồng thời, với kích thước
lớn, khả năng phân tán của những hệ phân phối thuốc này vào những vùng
khối u ung thư bị giảm xuống.
Micel polyme
Hạt nano polyme
Phức hợp polyme - thuốc/protein
Phối tử hướng đích
Hoạt chất điều trị
Hình 4: Một số hệ phân phối thuốc c u t úc n n [37]. Để khắc phục nhược điểm này, các nhà khoa học đã tạo ra những
copolyme. Micel copolyme hoạt động như các chất mang nano với nhiều
thuận lợi, chẳng hạn như có độc tính thấp, tính ổn định cao và kích thước nhỏ.
Copolyme lưỡng tính, trong công thức gồm các cấu trúc kỵ nước và ưa nước.
10
Trong môi trường nước, chúng có thể tự tập hợp thành những cấu trúc vỏ- lõi
được gọi là micel copolymeric (Hình 5). Lõi kỵ nước có thể được coi như là
vi môi trường để kết hợp các loại thuốc kỵ nước và bảo vệ chúng khỏi bị phá
hủy trong khi lớp vỏ tham gia vào việc ổn định và cải thiện thời gian lưu của
Phần ưa nước Phần kị nước
các micel trong các hệ thống tuần hoàn [9].
Hình 5. C u t úc micel t nên bởi c p yme (d ng di-b ck) kh ng
m ng thuốc ( ) và m ng thuốc (b).
ột số polyme ưa nước như poly lactic acid (PLA) hoặc tocopheryl
polyethylen glycol 1000 succinat (TPGS) có thể được kết hợp để làm tăng tốc
độ phân hủy, giảm tính kỵ nước của các polyme phân hủy sinh học này, để
tạo ra các hệ thống copolymeric micel mới cũng đã được đưa vào nghiên cứu.
1.3. Hệ phân phối thuốc n n m ng đồng th i P c it e và Cu cumin
dự t ên copolyme PLA-TPGS ((Cur+PTX)-PLA-TPGS)
Bên cạnh việc nghiên cứu và phát triển những hệ phân phối thuốc mới,
một loạt các hợp chất tự nhiên có tác dụng chống ung thư kết hợp với các loại
thuốc điều trị ung thư đang được điều trị phổ biến hiện nay vào các hệ phân
phối thuốc nano cũng đang được nghiên cứu, phát triển, trong đó sự kết hợp
giữa Cur và PTX vẫn đang thu hút được nhiều sự quan tâm, nghiên cứu từ các
11
dược sĩ, nhà khoa học.
1.3.1. Paclitaxel
PTX (Hình 6) được chiết xuất từ vỏ cây Taxus brevifolia, là một trong
những chất trị liệu hóa học hiệu quả nhất trong điều trị nhiều loại ung thư, bao
gồm ung thư buồng trứng, vú, đại tràng, bàng quang, thực quản, phổi, đa u tủy
và ung thư Kaposi [41].Tuy nhiên, do độ hòa tan kém (độ tan dưới 0,5mg/L)
và chỉ số điều trị thấp, ứng dụng lâm sàng của PTX là vẫn còn hạn chế. Bệnh
nhân sau khi dùng PTX đều bị rụng tóc, hơn 90% bênh nhân bị suy tủy... Một
số bệnh nhân bị các phản ứng phụ như như sung huyết, ngoại ban (39%), kém
ăn (25%), phù ngoại biên (10%)[13].
Vì vậy, vấn đề đặt ra là làm sao nâng cao tính tan, nâng cao hiệu quả trị
liệu của PTX đồng thời làm giảm những hiệu ứng phụ do loại thuốc này gây
ra. Theo Sang Cheon Lee và cộng sự, copolyme dựa trên poly ethylen glycol
và poly(2-(4-vinylbenzyloxy)-N,N-diethylnicotinamid) đã có tác dụng làm
tăng độ tan của PTX [25].
12
Hình 6. C ng th c hó học củ PTX
1.3.2. Curcumin
Curcumin (Cur) [1,7-Bis (4-hydroxy-3-medithoxyphenyl) -1,6-
heptadien-3,5-dion] (Hình 7), một hợp chất màu vàng phân lập từ thân rễ cây
nghệ Curcuma longa. Cur nhận được sự quan tâm lớn từ các nhà khoa học vì
khả năng phòng ngừa ung thư của nó [6,19].
Hình 7. C ng th c hó học của Cur
Bột nghệ từ lâu đã được sử dụng trong ẩm thực Ấn Độ và trong y học
13
truyền thống châu Á để điều trị chứng khó tiêu hóa và viêm khớp. Curcumin
chiết xuất từ củ nghệ không chỉ là một chất chống oxy hóa mạnh, một hợp
chất chống viêm mà còn có tác dụng phòng và điều trị ung thư. Nhiều sản
phẩm từ curcumin đã được tổng hợp để điều trị ung thư (ung thư ruột, da, vú,
dạ dày, buồng trứng, tuyến tiền liệt, dạ dày, loét tá tràng, vv) [1,2,10,44]. ặc
dù curcumin đã được chứng minh là không độc hại và có các tác dụng chống
ung thư đầy hứa hẹn nhưng ứng dụng của nó vẫn bị hạn chế do khả năng hòa
tan trong nước và sinh khả dụng kém [48]. Theo kết quả nghiên cứu của
Donatella Paolino và các cộng sự được công bố vào năm 2016, sử dụng
copolyme methacrylic có thể làm tăng độ tan cũng như sinh khả dụng đường
uống của curcumin [32].
1.3.3. Tác dụng hiệp đồng của Curcumin và Paclitaxel
Một số nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tìm ra rằng liệu có bất cứ
tác dụng hiệp đồng nào giữa Cur và PTX hay không. Và kết quả của những
nghiên cứu này chỉ ra rằng thực sự giữa chúng có tác dụng hiệp đồng để làm
tăng hiệu quả ức chế khối u qua trung gian NF-kappa B (NF-κB ).
NF-κB là một protein phức tạp, có vai trò kiểm soát sự phiên mã của
ADN, sự sản xuất cytokin, đáp ứng miễn dịch, trong nhiễm trùng virus và khả
năng sống của tế bào.... chúng có mặt trong rất nhiều loại tế bào người và
động vật. Trong các tế bào bình thường, thì NF-κB không được hoạt hóa nên
đáp ứng của tế bào với quá trình apoptosis (quá trình tế bào tự chết theo
chương trình) vẫn diễn ra bình thường. Đó là bởi vì N -κB hoạt hóa sẽ kiểm
soát gen anti-apoptosis đặc biệt là T A 1 và T A 2, do đó loại bỏ hoạt động
của họ enzym caspase - đóng vai trò chính trong các quá trình apoptosis. Việc
ức chế NF-κB có thể làm tế bào ngừng phân chia, tăng trưởng, gây chết hoặc
trở nên nhạy cảm hơn với các thuốc điều trị ung thư [23].
Hầu hết các chất điều trị ung thư đều hoạt hóa NF-kappa B trong đó có
PTX. Và Cur thì đã ức chế PTX trong quá trình hoạt hóa N -kappa B và làm
14
tăng hiệu quả ức chế khối u tăng sinh của PTX trong dòng tế bào ung thư vú
MDA-MB-231. Sự kết hợp của Cur và PTX cho phép suy ra sự ức chế tốt
hơn về sự tăng sinh tế bào, làm tế bào tự chết theo chương trình nhiều hơn khi
so sánh với việc chỉ dùng hoặc PTX hoặc Cur đơn thuần [18].
1.3.4. Tổng quan về hệ micel copolyme PLA-TPGS
PLA
Poly-lactic acid (PLA) (Hình 8) là một polyme phân hủy sinh học và
tương thích sinh học, được sử dụng rộng rãi trong y sinh học để làm cho chất
mang nano an toàn và phân hủy sinh học để điều trị ung thư. Cục Thực phẩm
và Dược phẩm Hoa Kỳ ( DA) đã chấp thuận sử dụng của chúng trong các hệ
thống phân phối thuốc. Các monome của PLA tức là, L-lactic acid (L-LA),
mà có thể được tạo ra một cách hiệu quả bởi việc lên men từ các nguồn tái tạo
được như tinh bột và đường. PLA phân hủy đến monome của nó, L-LA, là
một chất chuyển hóa bình thường của con người [46].
Hình 8. C u t úc củ L-LA
TPGS
TPGS (D- -tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat) (Hình 9)
được DA chấp thuận là dẫn xuất tan trong nước tự nhiên của Vitamin E
(PEGylated vitamin E). TPGS không tích điện và rất ưa nước, được sử dụng
như chất làm tăng độ tan, tăng cường hấp thụ và làm chất mang cho các công
15
thức khác nhau. TPGS chủ yếu được nghiên cứu trong liposom và hạt nano
polyme, giúp tăng cường sự hấp thu của tế bào, tăng khả năng gây độc tế bào
và cho thấy thời gian lưu kéo dài [22,30].
TPGS dễ hấp thụ trong ống tiêu hóa, và ức chế P-glycoprotein là thụ
thể vận chuyển đa thuốc, ở trong ruột tăng cường khả năng gây độc của chất
chống ung thư như doxorubicin, vinblastin, paclitaxel và curcumin [49,50].
Tiềm năng quan trọng đã được chứng minh cho TPGS là trong ứng dụng hạt
nano và các công nghệ dựa trên lipid để phân phối thuốc. Cấu trúc hóa học
của vitamin E TPGS gồm cả phần thân dầu và phần thân nước, dẫn đến nó có
tính chất amphiphilic. Hơn nữa, đuôi alkyl ưa mỡ và phần đầu ưa nước là
cồng kềnh và có diện tích bề mặt lớn. Đặc điểm như vậy khiến nó trở thành
một chất nhũ hóa tốt, có khả năng nhũ hóa một loạt các hệ thống thân nước-
dầu không thể trộn lẫn.
Hình 9. C ng th c của TPGS
Hệ micel PLA - TPGS được tổng hợp dựa trên sự kết hợp của monome
acid L-lactic (L-LA) đã được chứng minh là phân hủy sinh học nên an toàn
cho cơ thể [46] và D-a-tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat (TPGS)
có nguồn gốc từ vitamin E. Hệ có cấu trúc vỏ-lõi, với lớp vỏ ưa nước (TPGS)
và phần lõi kị nước (PLA) giúp làm tăng độ tan trong nước của các thuốc có
độ tan thấp. Copolyme PLA-TPGS (Hình 10) đã được ứng dụng vào nhiều hệ
16
phân phối thuốc nano bởi tính an toàn, phân hủy sinh học tự nhiên, khả năng
hướng đích tốt, cũng như dễ dàng tổng hợp được. Thêm vào đó, TPGS được
hấp thu một cách dễ dàng trong đường tiêu hóa và cũng có khả năng ức chế P-
glycoprotein, là một protein vận chuyển đa thuốc từ trong tế bào chất ngược
trở ra để bài tiết vào đường ruột. Do đó cải thiện khả năng gây độc tế bào của
nhiều hợp chất chống ung thư như doxorubicin, paclitaxel và curcumin [4,29].
Hình 10. C ng th c của copolyme PLA-TPGS
Cơ chế m ng thuốc và c p yme PLA- TPGS
Đối với các micel copolyme PLA- TPGS lõi kỵ nước gồm chuỗi PLA
và đuôi alkyl thân nước của TPGS nên có thể bọc nhiều phân tử trị liệu nhỏ kị
nước. Cur và PTX đã được đóng gói vào các lõi vì kị nước của nó thông qua
sự tương tác kỵ nước, lực Van der Waals, vv. cung cấp một bề mặt ổn định
17
giữa thuốc và môi trường nước ngoài [22] (Hình 11).
PTX
18
Hình 11. Hình ảnh củ các h t nano (PTX+Cur)/PLA-TPGS
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, đối tượng nghiên c u
Tế bào:
Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)
Dòng HeLa (HeLa cancer cell line – Dòng tế bào ung thư HeLa)
Dòng LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư biểu mô phổi)
Dòng Vero (Vero cells – Tế bào biểu mô thận khỉ).
Các tế bào trên được lấy từ Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên,
Viện Hàn Lâm.
Hóa chất:
Acid lactic (3,6-dimethyl-1,4-dioxan-2,5-dion, C6H8O4), D-a-
Tocopheryl polyetylen glycol 1000 succinat (C33O5H54, vitamin E TPGS
hay TPGS), N-hydroxysuccinimid (NHS), 1-[3-dimethylamino) propyl]-3-
ethylcarbodiimid hydrochlorid (EDC), Thiếc Octoat (Sn(OOCC7H15)2),
Toluen, Dichlometan, Metanol, Ethanol, Curcumin, Paclitaxel.
Các hóa chất (trừ Cur) đều được mua từ Sigma- Aldrich và đạt độ sạch
phân tích. iêng Cur được mua từ viện hóa học, Viện Khoa học vật liệu, Viện
Hàn Lâm.
PTX được mua từ Sigma- Aldrich và đạt độ sạch phân tích, số lô
1537678.
Nước cất được sử dụng trong suốt quá trình thí nghiệm.
2.2. Phương pháp nghiên c u
2.2.1. Tổng hợp copolyme PLA-TPGS
Copolyme PLA-TPGS (Hình 12) được tổng hợp bằng phương pháp mở
vòng trùng hợp của L-LA và TPGS với sự có mặt của chất xúc tác octoat
thiếc [Sn (Oct)2] [38]. Tóm tắt, L-LA và TPGS với những tỉ lệ xác định được
19
cho vào một bình đáy tròn 50ml, và được hòa tan trong 20ml toluen cũng
được cho vào bình, hỗn hợp được đun nóng và khuấy bằng máy khuấy từ. Khi nhiệt độ đạt đến 110oC, 1ml Sn (Oct)2 (0,5% w / v) được hòa tan trong 10ml toluen và bổ sung vào bình cầu. Duy trì nhiệt độ ở 130oC trong suốt 7 tiếng để
thực hiện phản ứng mở vòng. Sản phẩm thu được sẽ được hòa tan trong
dichloromethan (DC ) và kết tủa trong methanol lạnh, ly tâm để thu được
kết tủa. Tủa thu được sau ly tâm đem sấy qua đêm, cuối cùng thu được
copolyme PLA-TPGS dạng bột màu trắng [17].
Hình 12. C p yme PLA-TPGS được t o bởi monome L-LA và TPGS
Để tối ưu hóa cấu trúc của hệ phân phối thuốc, chúng tôi tiến hành thay
đổi tỉ lệ khối lượng giữa PLA và TPGS để tìm ra tỉ lệ nào có sự kết hợp giữa
hiệu suất bọc thuốc, độ bền của hệ cũng như khả năng tiêu diệt các tế bào
khối u là tốt nhất, phục vụ cho các nghiên cứu về sau. Các mức tỷ lệ
20
PLA:TPGS (w w) được thực hiện trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng sau:
Bảng 1. Tỉ lệ và khối ượng củ PLA và TPGS thực nghiệm
Tỉ lệ PLA: TPGS Khối ượng thử nghiệm(g)
PLA TPGS
1:1 0,2 0,2
1:2 0,2 0,4
1:3 0,2 0,6
2:1 0,4 0,2
3:1 0,6 0,2
2.2.2. Chuẩn bị dung dịch TPGS gắn với folat
Đầu tiên, 100mg TPGS cùng 8,8 mg axit aspartic và 10mg EDC được
hòa tan trong 10ml H2O, phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, sau 24h
khuấy từ sẽ thu được dung dịch TPGS-COOH. Tiếp đó, 35mg axit olic,
11,4mg EDC, 3,96 mg ethylen diamin và 18mg NHS được hòa tan hoàn toàn trong 7ml dung dịch NH4OH 2 và khuấy từ 6h ở 50oC để tạo thành dung
dịch Folat đã hoạt hóa ( ol-NHS) đồng nhất. Sau đó, 100mg EDC và 25mg
NHS được thêm vào dung dịch TPGS-COOH trên, khuấy từ 2h ở nhiệt độ
phòng để thu được dung dịch TPGS-COOH hoạt hóa. Trong bước tiếp theo,
dung dịch này được nhỏ giọt từ từ vào dung dịch Fol-NHS và điều chỉnh pH đến 8. Cuối cùng dung dịch được khuấy từ tại 37oC trong 4h [40].
2.2.3. Tổng hợp hạt nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS gắn folat
Đầu tiên, 10mg copolyme PLA-TPGS được cho vào 10ml DC và
khuấy từ trong 2h. Sau đó 10ml H2O được thêm vào hỗn hợp và tiếp tục
khuấy cho đến khi lớp DCM trở nên trong suốt thì thu lấy lớp nước ở phía
trên và thêm 1g TPGS vào lớp nước. Đồng thời, dung dịch của Cur và PTX
cũng được chuẩn bị bằng cách cho 4mg Cur và 4mg PTX cùng hòa tan vào
10ml EtOH. Tiếp đó dung dịch thuốc được nhỏ từ từ vào lớp nước đã thu phía
trên trong máy rung siêu âm. Sản phẩm sau khi rung siêu âm được khuấy từ
21
trong 24h ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành đuổi dung môi EtOH và thêm
vào 1ml dung dịch Folat đã hoạt hóa, khuấy từ trong 2h để tạo thành hạt nano
(Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol. Hỗn hợp sau cùng được đem đi ly tâm và thu lấy
phần dung dịch phía trên là phần chứa hệ phân phối thuốc nano để tiến hành
các thử nghiệm về sau.
2.2.4. Hiệu suất bọc thuốc (EE%)
Hiệu suất bọc thuốc (EE%) của PTX (hoặc Cur) của hệ nano được tính
toán bởi độ hấp thụ cực đại UV-Vis tại các bước sóng 430 nm (đặc trưng cho
Cur) và 227 nm (đặc trưng cho PTX) [14,20].
Quy trình [16,36]:
Bước 1: Xác định phương trình đường chuẩn Cur và PTX
- Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng (1) bao gồm EtOH : H2O với tỉ lệ 7:3
- Hòa tan hoàn toàn 2,000 mg Cur (PTX) trong 20,0ml dung dịch (1)
thu được dung dịch (2).
- Đường chuẩn bao gồm dãy 5 dung dịch chuẩn được chuẩn bị bằng
cách thêm các thể tích tương ứng của dung dịch (2), sau đó bổ sung cho đủ
10,00ml bằng dung dịch (1) như trong Bảng 2:
Bảng 2. Dãy nồng độ 5 dung dịch chuẩn
STT Thể tích dung dịch 1(ml)
Nồng độ (Cx) (mg/ml)
1 C1= 0,002 0,20
2 C2= 0,004 0,40
3 C3= 0,006 0,60
4 C4= 0,008 0,80
5 C5= 0,01 1,00
Bước 2: Định lượng Cur PTX có trong dung dịch chứa hệ phân
phối thuốc nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol
- Lấy 0,20 ml mỗi dung dịch chứa hệ (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol
tương ứng với 5 tỉ lệ của PLA- TPGS thêm vào 3,50 ml dung dịch EtOH và
22
1,30 ml H2O.
- Tiến hành đo phổ hấp thụ UV-Vis và xác định độ hấp thụ cực đại của
5 dung dịch trên lần lượt ở các bước sóng 430 nm và 227 nm.
- Dựa vào phương trình đường chuẩn của Cur và PTX thu được ở Bước
1 để xác định hàm lượng Cur và PTX có trong dung dịch (Cur+PTX)-PLA-
TPGS-Fol.
Bước 3: Hiệu suất bọc thuốc EE% được tính theo công thức:
Trong đó m = khối lượng
2.2.5. Đánh giá các đặc trưng vật liệu
Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FTIR)
Phổ hồng ngoại của copolyme PLA-TPGS, Cur, PTX và nano (Cur +
PTX)-PLA-TPGS- ol được xác định bằng phương pháp hạt pellet KBr trong
máy đo quang phổ hồng ngoại Perkin Elmer (Perkin Elmer Spectrum Two,
Waltham, assachusetts, U.S.A). Vùng khảo sát nằm trong khoảng 400 - 4000 cm-1 nhằm xác định liệu có tổng hợp thành công hay không hệ micel
(Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol.
Xác định hình thái, kích thước hạt, thế zeta
Hình thái của hệ micel được xác định bằng máy đo SE Hitachi S-
4800. Thế zeta của hạt nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS- ol được đo bởi bằng
phương pháp phổ tán xạ laze động (DLS) trên máy đo thế Zetasize phiên bản
7.03, Malvern instruments Ltd, Malvern, UK.
2.2.6. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào
Phương pháp: Sử dụng phương pháp TT để đánh giá mức độ
sống/chết tế bào ung thư dưới tác dụng của hệ phân phối thuốc nano
(Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol với 5 tỉ lệ khác nhau của PLA-TPGS. Thử
nghiệm gây độc tế bào được tiến hành trên 4 dòng tế bào và tiến hành tại
Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện
23
Hàn Lâm và Khoa học Công nghệ Việt Nam [35].
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Tính đặc t ưng vật liệu
3.1.1. Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FTIR)
Các sản phẩm thu được trong các công đoạn được đặc trưng hóa bằng
phương pháp phân tích T- . Các liên kết đặc trưng của từng hợp chất được
thể hiện qua những dao động đặc trưng của các liên kết đó. Số liệu được trình
bày trong các kết quả thu được tương ứng. Các liên kết mới được hình thành
trong các hợp chất mới đều là những liên kết có mặt trong các hợp chất ban
đầu. Vì vậy, không xuất hiện các peak dao động mới trong các hợp chất mới,
chỉ có sự dịch chuyển về số sóng tương ứng với các liên kết đó.
Hình 13. Phổ hồng ngo i FTIR của nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-
Fol với 5 tỉ lệ khác nh u giữ PLA và TPGS
Nhận xét: Theo Hình 13 cho thấy phổ FTIR của các hạt nano tương
24
ứng với 5 tỉ lệ khác nhau của PLA và TPGS hầu như không có sự khác biệt.
Do đó, chúng tôi chọn phổ hồng ngoại của hệ nano tương ứng với tỉ lệ PLA:
TPGS là 1:1 để bàn luận và đánh giá chung về phổ FTIR cho cả 5 tỉ lệ.
Hình 14. Phổ hồng ngo i FTIR của (1) Cur, (2) PTX, (3) Acid folic,
(4) PLA-TPGS 1:1 và (5) (Cu +PTX)-PLA-TPGS-Fol với tỉ lệ PLA-
TPGS 1:1 .
Nhận xét: Theo Hình 14 và Bảng 3 phổ FTIR của (Cur + PTX)-PLA-
TPGS- ol 1:1 có sự thay đổi rõ ràng so với phổ FTIR của PTX tinh khiết, Cur
tinh khiết, axit olic và PLA-TPGS. Trong hình ảnh FTIR của PLA-TPGS đỉnh tại 1762cm-1 đặc trưng cho nhóm carbonyl (C=O) được dịch chuyển tới 1728 cm-1 trong phổ của (Cur + PTX)-PLA-TPGS-Fol 1:1. PTX được đặc trưng bởi dải C=O và C=C tại các đỉnh lần lượt là 1735 and 1644 cm-1, nhưng chúng có thể bị che bởi dải C=O của PLA-TPGS và Cur (1628 cm-1) . Đỉnh tại 1512 và 1458 cm-1 lần lượt được cho là của nhóm C=C ole ienic của Cur (1512 cm-1 đối với Cur tinh khiết) và vòng phenyl của axit folic (1485cm-1 trong phổ chuẩn). Dải C=C của PLA-TPGS (1546 cm-1) bị che phủ bởi C=C olefienic của Cur, do
25
đó nó không được nhìn thấy trong phổ FTIR của (Cur + PTX)-PLA-TPGS-Fol.
Cuối cùng, đỉnh đặc trưng cho liên kết C-N của PTX bị dịch chuyển từ 1245 đến 1280 cm-1. So với các phổ riêng lẻ PLA-TPGS, Cur, PTX, acid folic, phổ
hồng ngoại T- của hệ phân phối thuốc nano gắn folat chứa tất cả các peak
đặc trưng của PLA-TPGS, Cur, PTX và acid olic. Trong đó, vị trí của các peak
này có sự dịch chuyển so với các peak trong các chất đơn lẻ ban đầu. Tất cả các
phân tích trên chứng minh Cur và PTX đã được bọc thành công bởi khối
copolyme PLA-TPGS gắn folat để tạo thành hệ micel.
Bảng 3. Các d động đặc t ưng củ các ch t
Cur PTX Acid folic Copolyme PLA : (Cur + PTX)-
TPGS PLA-TPGS-Fol
1:1
1735 C=O 1756 C=O 1728 chồng
peak C=O của
PTX và PLA-
TPGS.
1644 C=C 1628 Chồng peak
C=O C=O của Cur và
C=C của PTX
1512 1546 C=C
C=O
olefienic
1485 vòng 1458 C=C của
phenyl folic acid
1245 C-N 1280 C-N của
26
PTX
3.1.2. Hình thái và kích thước
(a)
27
(b)
(c)
28
(d)
(e)
Hình 15. Hình ảnh FESEM của nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol với 5
tỉ lệ khác nh u giữ PLA và TPGS ( ) 1:1, (b) 2:1, (c) 1:3, (d) 2:1, (e) 3:1.
Nhận xét: Theo lý thuyết hạt nano với kích thước nhỏ (dưới 200nm) có
thể kéo dài thời gian lưu thông trong hệ tuần hoàn và thâm nhập dễ dàng vào
khối u thông qua hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lưu (the Enhanced
Permeability and Retention effect) [3], do đó sự xâm nhập của hạt nano vào tế
bào khối u có thể được cải thiện và làm tăng hiệu quả điều trị. Có thể quan sát
rõ ràng từ Hình 15 rằng hạt nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS-Fol hầu hết có
hình cầu với kích thước nhỏ khoảng 100nm và ít kết tập. Nhờ đó các hệ phân
phối thuốc được tạo ra có tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư.
3.2.3. Thế zeta
Bảng 4. Thế zeta của hệ nano t i 5 tỉ lệ khác nh u của PLA-TPGS
Tỉ lệ phối hợp 1:3 1:2 1:1 2:1 3:1
PLA:TPGS
29
Thế zeta (mV) -27.60 -25.90 -15.50 -25.10 -28.40
Thế zeta
(a)
(b)
30
(c)
(d)
(e)
Hình 16. Thế zeta của h t nano (Cur +PTX) PLA-TPGS-Fol t i các
tỉ lệ củ PLA và TPGS: 1:3 ( ), 1:2 (b), 1:1 (c), 2:1 (d), 3:1 (e).
Nhận xét: Sự ổn định của hạt nano có thể được dự đoán thông qua thế
zeta, trị tuyệt đối của thế zeta càng cao thì hệ micel càng bền. Qua kết quả DLS
ở Bảng 4 và Hình 16 cho thấy tất cả hệ nano tổng hợp được đều có điện tích âm
31
nằm trong khoảng -15,5 đến -28,4 mV và được coi là tương đối ổn định.
3.2. Hiệu su t bọc thuốc (EE %)
2
1.8
y = 179.04x + 0.078 R² = 0.9994
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.7
0.6
y = 65.994x - 0.0309 R² = 0.9992
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
Hình 17. Phương t ình đư ng chuẩn củ Cu và PTX
Bảng 5. Hiệu su t bọc thuốc củ Cu và PTX
EE(%)
Cur PTX
32
Tỉ lệ của PLA/TPGS (w/w) 1:3 1:2 1:1 2:1 3:1 Cur được mang (mg/ml) 0,14 0,15 0,17 0,27 0,32 PTX được mang (mg/ml) 0,14 0,16 0,18 0,26 0,33 35,00 37,50 42,50 67,50 80,10 34,70 39,80 44,50 65,30 82,60
Theo kết quả trong Bảng 5, EE % cao nhất cho cả Cur và PTX là ở tỉ lệ
PLA/TPGS 3:1 với lần lượt là 80,10% và 82,60%. Trong khi đó, kết quả EE%
thấp nhất cũng đều là ở tỉ lệ PLA/TPGS 1:3 với chỉ khoảng 35% đối với cả 2
thuốc. Điều này có thể được lý giải bởi vì Cur và PTX đều có tính chất kị
nước nên nó sẽ tương tác với phần lõi kỵ nước PLA của hạt nano. Do đó khi
giảm khối lượng PLA (từ 3:1 đến 1:3) sẽ dẫn tới lượng thuốc được bắt giữ
trong lõi giảm và làm giảm EE%. So sánh EE% giữa 3 tỉ lệ 1:1, 1:2 và 1:3 thì
gần như là tương tự nhau, có thể do ở các tỉ lệ này có lượng PLA ban đầu là
giống nhau.
Tuy tại tỉ lệ 1:3 tỷ lệ bọc cả Cur và PTX là thấp nhất, nhưng nồng độ
của Cur là 0,14mg ml cao gấp hơn 12 lần so với độ tan của Cur tinh khiết
trong nước [43] , tương tự là khoảng 1400 lần so với PTX [21]. Như vậy, hệ
micel đã tổng hợp làm tăng đáng kể độ tan của Cur và PTX trong nước.
3.3. Thử nghiệm gây độc tế bà
Bảng 6. Kết quả gây độc tế bà t ên 4 dòng tế bà được chọn
Th
Phần t ăm sống củ các dòng tế bà (%) tích
mẫu S KH (l T Nhận ét mẫu mẫu/ml T Hep-G2 HeLa LU-1 Vero dịch thí
nghiệm
)
Dung - 100 100 100 100 m i
33
Nồng Chứng Dương 1,250,2 độ 5 0,00 2,50,40 29,151,20 (+) PTX tính 0 g/ml
Dương
100 tính 3 1,600,50 3,20,80 79,31,2 27,481,70
dòng TB (Cur+P
86,970, TX)- 50 57,830,80 12,680,90 28,951,40 30 1 PLA-
TPGS 91,661, 25 68,341,30 25,820,70 55,040,60 2:1 70
98,250, 12,5 76,51,30 87,310,30 30,601,50 60
Dương
100 tính 4 0,00 0,00 0,00 0,00
dòng TB (Cur+P
79,111, TX)- 50 52,81,70 2,340,20 4,290,30 90 2 PLA-
TPGS 85,41,6 25 61,650,60 17,061,80 38,581,20 3:1 0
92,50,7 12,5 66,50,40 78,251,90 20,80,30 0
Dương 54,651, 100 tính 3 0,00 0,00 6,30,50 30 dòng TB (Cur+P
79,260, TX)- 50 5,400,60 13,60,40 48,500,70 90 3 PLA-
TPGS 88,20,8 25 69,91,20 11,860,80 16,560,80 1:2 0
92,220, 12,5 82,41,40 25,760,10 20,890,20 40
34
100 Dương 4 (Cur+P 0,00 0,00 60,771, 0,00
90 tính 3 TX)-
dòng TB PLA-
TPGS 81,502, 50 0,00 50,200,90 3,540,20 1:3 20
85,200, 25 0,00 54,801,10 22,400,70 70
96,501, 12,5 0,00 70,971,20 29,500,50 30
Dương 13,201, 100 tính 4 0,00 0,00 0,00 80 dòng TB (Cur+P
75,700, TX)- 50 0,00 0,00 9,801,20 60 5 PLA-
TPGS 93,381, 25 58,10,60 9,041,30 11,330,40 1:1 90
98,50,4 12,5 71,20,90 12,10,70 35,921,50 0
Kết quả thu được được thể hiện trong Bảng 5 cho thấy, cả 5 hệ phân
phối thuốc đều dương tính trên ít nhất 3 dòng tế bào với tỉ lệ tế bào sống sót
thấp hoặc chết hoàn toàn, đôi khi thấp hơn so với dùng PTX đơn thuần. Trong
đó hệ với tỉ lệ PLA:TPGS là 1:1 thì dường như hiệu quả hơn các hệ còn lại vì
nó cho kết quả dương tính trên cả 4 dòng tế bào và tỉ lệ tế bào sống sót thấp
hơn. Qua kết quả thử nghiệm có thể thấy khả năng gây độc tế bào của các hệ
phân phối thuốc đã tổng hợp ở cả 5 tỉ lệ có khả năng gây độc mạnh tới các tế
bào ung thư và rõ ràng đều phụ thuộc vào liều. Do đó, PLA-TPGS kết hợp với
acid olic có thể là một cách hiệu quả, có tiềm năng để cải thiện sự phân phối
thuốc tới đích của các chất điều trị ung thư, qua đó làm giảm thiểu các tác
35
dụng không mong muốn của chúng đến cơ thể người bệnh .
CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Trong nghiên cứu này, hạt nano dựa trên khối copolyme PLA-TPGS
mang đồng thời cả Cur và PTX đã được bào chế thành công. Tất cả 5 hệ phân
phối thuốc tổng hợp được tương ứng với 5 tỉ lệ khác nhau của giữa PLA và
TPGS đều cho kích thước hạt nhỏ nằm trong khoảng 100-200nm, hệ micel có
độ ổn định tương đối. Các hệ nano tổng hợp được đã cải thiện đáng kể độ tan
của cả Cur và PTX.
Hạt nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol tổng hợp được có khả năng gây
độc mạnh lên các dòng tế bào khối u đã thử nghiệm, khả năng gây độc tế bào
đôi khi mạnh hơn khi so sánh với PTX đơn thuần do có yếu tố hướng đích
Folat và kích thước hạt nhỏ.
Tổng hợp từ các kết quả về hiệu suất bọc thuốc, kích thước, thế zeta và
thử nghiệm gây độc tế bào chúng tôi cho rằng hệ nano với tỉ lệ PLA:TPGS là
1:1 là tối ưu nhất. Xét về thế zeta hệ có tỉ lệ PLA:TPGS 1:1 tuy có độ bền
thấp hơn các hệ còn lại nhưng vẫn là một hệ khá ổn định. Hiệu suất bọc thuốc
tốt trên 40%, vì EE % lớn sẽ làm kích thước hạt lớn không thâm nhập được
vào trong các khối u và tế bào. Thêm vào đó, các hạt nano trong hệ này vẫn
có kích thước nhỏ hơn 200nm và khả năng gây độc đến tế bào khối u là tốt
nhất so với 4 hệ còn lại.
Do hạn chế về mặt nguồn lực nên trong thử nghiệm gây độc tế bào
chúng tôi chưa so sánh được hiệu quả gây độc tế bào khi chứng dương là Cur.
Bên cạnh đó thời gian các phân đoạn thí nghiệm thường kéo dài cùng với điều
kiện tài chính không cho phép chúng tôi được lặp lại thí nghiệm nhiều lần.
Sau nghiên cứu này, chúng tôi hy vọng có thể tiến hành thêm các
nghiên cứu liên quan đến việc thay đổi tỉ lệ giữa PLA-TPGS 1:1, Cur và PTX
nhằm tìm ra các xu thế thay đổi của hệ từ đó có thể tối ưu hóa công thức của
hệ nano hơn nữa. Bên cạnh đó, có thể tiến hành lại các thử nghiệm gây độc tế
36
bào để có thể tìm ra giá trị IC50.
1. Aggarwal B B, Kumar A, and Bharti A C (2003), "Anticancer Potential of
Curcumin: Preclinical and Clinical Studies",Anticancer Res, 23 (1A), 363-398.
2. Aggarwal B B, and Shishodia S (2006), "Molecular Targets of Dietary Agents
for Prevention and Therapy of Cancer",Biochem Pharmacol, 71 (10), 1397-1421.
3. Akhand A A, et al. (2001), "Glyoxal and Methylglyoxal Trigger Distinct Signals
for Map Family Kinases and Caspase Activation in Human Endothelial Cells",Free Radic
Biol Med, 31 (1), 20-30.
4. Akhtar N, et al. (2011), "The Emerging Role of P-Glycoprotein Inhibitors in
Drug Delivery: A Patent Review",Expert Opin Ther Pat, 21 (4), 561-576.
5. Alexandru Mihai Grumezescu A F (2017), "Nanostructures for Cancer Therapy",
(4), 197.
6. Anand P, Sundaram C, Jhurani S, Kunnumakkara A B, and Aggarwal B B
(2008), "Curcumin and Cancer: An "Old-Age" Disease with an "Age-Old"
Solution",Cancer Lett, 267 (1), 133-164.
7. Bayet-Robert M, et al. (2010), "Phase I Dose Escalation Trial of Docetaxel Plus
Curcumin in Patients with Advanced and Metastatic Breast Cancer",Cancer Biol Ther, 9
(1), 8-14.
8. Berry W R (2005), "The Evolving Role of Chemotherapy in Androgen-
Independent (Hormone-Refractory) Prostate Cancer",Urology, 65 (6 Suppl), 2-7.
9. Chen J, Xing M M Q, and Zhong W (2011), "Degradable Micelles Based on
Hydrolytically Degradable Amphiphilic Graft Copolymers
for Doxorubicin
Delivery",Polymer, 52 (4), 933-941.
10. Choi H, Chun Y S, Kim S W, Kim M S, and Park J W (2006), "Curcumin Inhibits
Hypoxia-Inducible Factor-1 by Degrading Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator: A
Mechanism of Tumor Growth Inhibition",Mol Pharmacol, 70 (5), 1664-1671.
11. Cuong N-V, Li Y-L, and Hsieh M-F (2012), "Targeted Delivery of Doxorubicin
to Human Breast Cancers by Folate-Decorated Star-Shaped Peg-Pcl Micelle",Journal of
Materials Chemistry, 22 (3), 1006-1020.
12. El-Moselhy M A, Taye A, Sharkawi S S, El-Sisi S F, and Ahmed A F (2011),
"The Antihyperglycemic Effect of Curcumin in High Fat Diet Fed Rats. Role of Tnf-Alpha
and Free Fatty Acids",Food Chem Toxicol, 49 (5), 1129-1140.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
13. Feng S, and Huang G (2001), "Effects of Emulsifiers on the Controlled Release
of Paclitaxel (Taxol) from Nanospheres of Biodegradable Polymers",J Control Release, 71
(1), 53-69.
14. Ghosh M, et al.
(2011), "Curcumin Nanodisks: Formulation and
Characterization",Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine, 7 (2), 162-167.
15. , "Http://Www.Who.Int/Mediacentre/Factsheets/Fs297/En/".
16. , "In Vitro Comparative Studies of Zein Nanoparticles and Composite Chitosan
Thermogels Based Injectable Formulation of Doxorubicin", (2017)Journal of Drug
Delivery Science and Technology.
17. Jiang Z M, et al. (2015), "Crizotinib-Loaded Polymeric Nanoparticles in Lung
Cancer Chemotherapy",Med Oncol, 32 (7), 015-0636.
18. Kang H J, Lee S H, Price J E, and Kim L S (2009), "Curcumin Suppresses the
Paclitaxel-Induced Nuclear Factor-Kappab in Breast Cancer Cells and Potentiates the
Growth Inhibitory Effect of Paclitaxel in a Breast Cancer Nude Mice Model",Breast J, 15
(3), 223-229.
19. Karmakar S, Banik N L, Patel S J, and Ray S K (2006), "Curcumin Activated
Both Receptor-Mediated and Mitochondria-Mediated Proteolytic Pathways for Apoptosis
in Human Glioblastoma T98g Cells",Neurosci Lett, 407 (1), 53-58.
20. Kim M J, et al. (2011), "Preparation, Characterization, Cytotoxicity and Drug
Release Behavior of Liposome-Enveloped Paclitaxel/Fe3o4 Nanoparticles",J Nanosci
Nanotechnol, 11 (1), 889-893.
21. Konno T, Watanabe J, and Ishihara K (2003), "Enhanced Solubility of
Paclitaxel Using Water-Soluble
and Biocompatible
2-Methacryloyloxyethyl
Phosphorylcholine Polymers",J Biomed Mater Res A, 65 (2), 209-214.
22. Kutty R V, et al. (2015), "In Vivo and Ex Vivo Proofs of Concept That
Cetuximab Conjugated Vitamin E Tpgs Micelles Increases Efficacy of Delivered
Docetaxel against Triple Negative Breast Cancer",Biomaterials, 63 58-69.
23. Lassen M M J K M. (2010), "Evolution of Amide Bond Formation," Arkivoc,
189-250.
24. Leamon C P, and Reddy J A (2004), "Folate-Targeted Chemotherapy",Adv
Drug Deliv Rev, 56 (8), 1127-1141.
25. Lee S C, et al. (2007), "Hydrotropic Polymeric Micelles for Enhanced
Paclitaxel Solubility: In Vitro and in Vivo Characterization",Biomacromolecules, 8 (1),
202-208.
26. Miele E, Spinelli G P, Tomao F, and Tomao S (2009), "Albumin-Bound
Formulation of Paclitaxel (Abraxane Abi-007) in the Treatment of Breast Cancer",Int J
Nanomedicine, 4 99-105.
27. Moghimi S M, Hunter A C, and Murray J C (2001), "Long-Circulating and
Target-Specific Nanoparticles: Theory to Practice",Pharmacol Rev, 53 (2), 283-318.
28. Moghimi S M, Hunter A C, and Murray J C (2005), "Nanomedicine: Current
Status and Future Prospects",Faseb J, 19 (3), 311-330.
29. Mu L, and Feng S S (2003), "Plga/Tpgs Nanoparticles for Controlled Release
of Paclitaxel: Effects of the Emulsifier and Drug Loading Ratio",Pharm Res, 20 (11),
1864-1872.
30. Muthu M S, Kulkarni S A, Raju A, and Feng S S (2012), "Theranostic
Liposomes of Tpgs Coating for Targeted Co-Delivery of Docetaxel and Quantum
Dots",Biomaterials, 33 (12), 3494-3501.
31. Oh W K, Tay M H, and Huang J (2007), "Is There a Role for Platinum
Chemotherapy
in
the Treatment of Patients with Hormone-Refractory Prostate
Cancer?",Cancer, 109 (3), 477-486.
32. Paolino D, et al. (2016), "Improvement of Oral Bioavailability of Curcumin Upon
Microencapsulation with Methacrylic Copolymers",Frontiers in Pharmacology, 7 485.
33. Parker N, et al. (2005), "Folate Receptor Expression in Carcinomas and Normal
Tissues Determined by a Quantitative Radioligand Binding Assay",Anal Biochem, 338 (2),
284-293.
34. Petrylak D P (2005), "Future Directions in the Treatment of Androgen-
Independent Prostate Cancer",Urology, 65 (6 Suppl), 8-12.
35. Phan Q T, et al. (2016), "Characteristics and Cytotoxicity of Folate-Modified
Curcumin-Loaded Pla-Peg Micellar Nano Systems with Various Pla:Peg
Ratios",International Journal of Pharmaceutics, 507 (1), 32-40.
36. Phuong Thu H, et al. (2016), "Targeted Drug Delivery Nanosystems Based on
Copolymer Poly(Lactide)-Tocopheryl Polyethylene Glycol Succinate
for Cancer
Treatment",Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, 7 (1),
015001.
37. Prabhu R H, Patravale V B, and Joshi M D (2015), "Polymeric Nanoparticles
for Targeted Treatment
in Oncology: Current Insights",International Journal of
Nanomedicine, 10 1001-1018.
38. Sabharanjak S, and Mayor S (2004), "Folate Receptor Endocytosis and
Trafficking",Adv Drug Deliv Rev, 56 (8), 1099-1109.
39. Shishodia S, Sethi G, and Aggarwal B B (2005), "Curcumin: Getting Back to
the Roots",Ann N Y Acad Sci 206-217.
40. Singh R P, et al. (2016), "Transferrin Receptor Targeted Pla-Tpgs Micelles
Improved Efficacy and Safety in Docetaxel Delivery",Int J Biol Macromol, 83 335-344.
41. Singla A K, Garg A, and Aggarwal D (2002), "Paclitaxel and Its
Formulations",Int J Pharm, 235 (1-2), 179-192.
42. Slastnikova T A, Rosenkranz A A, Zalutsky M R, and Sobolev A S (2015),
"Modular Nanotransporters for Targeted Intracellular Delivery of Drugs: Folate Receptors
as Potential Targets",Current pharmaceutical design, 21 (9), 1227-1238.
43. Song Z, et al. (2011), "Curcumin-Loaded Plga-Peg-Plga Triblock Copolymeric
Micelles: Preparation, Pharmacokinetics and Distribution in Vivo",J Colloid Interface Sci,
354 (1), 116-123.
44. Srivastava K C, Bordia A, and Verma S K (1995), "Curcumin, a Major
Component of Food Spice Turmeric (Curcuma Longa) Inhibits Aggregation and Alters
Eicosanoid Metabolism in Human Blood Platelets",Prostaglandins Leukot Essent Fatty
Acids, 52 (4), 223-227.
45. Srivastava R M, Singh S, Dubey S K, Misra K, and Khar A (2011),
"Immunomodulatory
and
Therapeutic Activity
of
Curcumin",International
immunopharmacology, 11 (3), 331-341.
46. Vijayakumar M R, Muthu M S, and Singh S (2013), "Copolymers of
Poly(Lactic Acid) and D-Alpha-Tocopheryl Polyethylene Glycol 1000 Succinate-Based
Nanomedicines: Versatile Multifunctional Platforms
for Cancer Diagnosis and
Therapy",Expert Opin Drug Deliv, 10 (4), 529-543.
47. Wang J, et al. (2011), "Folate-Decorated Hybrid Polymeric Nanoparticles for
Chemically
and
Physically Combined
Paclitaxel Loading
and Targeted
Delivery",Biomacromolecules, 12 (1), 228-234.
48. Yallapu M M, Jaggi M, and Chauhan S C (2013), "Curcumin Nanomedicine: A
Road to Cancer Therapeutics",Current pharmaceutical design, 19 (11), 1994-2010.
49. Yang K Y, Lin L C, Tseng T Y, Wang S C, and Tsai T H (2007), "Oral
Bioavailability of Curcumin in Rat and the Herbal Analysis from Curcuma Longa by Lc-
Ms/Ms",J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 853 (1-2), 183-189.
50. Zhang Z, and Feng S S (2006), "Nanoparticles of Poly(Lactide)/Vitamin E Tpgs
Copolymer for Cancer Chemotherapy: Synthesis, Formulation, Characterization and in
Vitro Drug Release",Biomaterials, 27 (2), 262-270.
