ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
NGUYỄN THỊ SINH
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC FLAVONOID TỪ LOÀI BÙM BỤP [Mallotus apelta (Lour.) Muell. – Arg.]
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
HÀ NỘI - 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
NGUYỄN THỊ SINH
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC FLAVONOID TỪ LOÀI BÙM BỤP [Mallotus apelta (Lour.) Muell. – Arg.]
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
KHÓA: QH2015.Y
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN XUÂN NHIỆM
ThS. HÀ THỊ THANH HƯƠNG
HÀ NỘI- 2020
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Nghiên cứu cấu trúc,
Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá
trình nghiên cứu, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các
nhà khoa học, bạn bè và gia đình.
Em xin trân trọng bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh
biển cùng tập thể cán bộ của Viện về sự quan tâm, ủng hộ to lớn và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn thầy cô trong khoa Y Dược – Đại học Quốc gia
Hà Nội đã tạo điều kiện và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dạy bảo em trong suốt quá
trình học tập ở trường và hoàn thiện khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sự cảm phục và kính trọng nhất tới
PGS.TS. Nguyễn Xuân Nhiệm và ThS. Hà Thị Thanh Hương - những người Thầy
đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Em trân trọng và biết ơn sâu sắc tới tất cả mọi người trong gia đình, bạn bè
đã động viên, khích lệ giúp em trong quá trình học tập và làm khóa luận.
Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này, mặc dù đã hết sức cố gắng
nhưng chắc chắn còn có những thiếu sót. Vì vậy, em kính mong nhận được sự đóng
góp ý kiến của quý thầy, cô và các bạn để khóa luận em được hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm cảm ơn!
Hà Nội, tháng 06 năm 2020
Sinh viên
Sinh
Nguyễn Thị Sinh
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13C-NMR
Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải
1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance
nuclear magnetic Carbon -13 resonance spectroscopy Phổ cô ̣ng hưở ng từ ha ̣t nhân carbon 13
spectroscopy Phổ cô ̣ng hưở ng từ ha ̣t nhân proton
D-HBV Duck hepatitis B virus Virut viêm gan B trên vịt
DMSO Dimethyl sulfoxid
ESI-MS ionization mass Electrospray spectrum
Glc Glucose Phổ khối lượng ion hóa phun mù điê ̣n tử
HepG2 Hepatocyte carcinoma cell Tế bào ung thư gan
HL-60 Human promyelocytic leukemia cell Tế bào ung thư máu người
HMBC mutiple bond Heteronuclear correlation Phổ tương tác di ̣ ha ̣t nhân qua nhiều liên kết
HSQC single quantum Heteronuclear correlation Phổ tương tác di ̣ hạt nhân qua 1 liên kết
Inhibitory concentration at 50% IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm
Human epidmoid carcinoma KB Tế bào ung thư biểu mô người
Kí hiệu KH
Nuclear factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B NF-B
Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Reversed-phase C18 Pha đảo C18 RP18
Rhabdosarcoma Ung thư màng tim RD
Thin layer chromatography TLC
Sắc ký lớp mỏ ng Tài liệu tham khảo TLTK
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
1.1. Giới thiệu về chi Mallotus .................................................................................. 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật ............................................................................................. 3
1.1.2. Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền các loài thuộc chi Mallotus ............. 4
1.2. Giới thiệu về loài M. apelta ................................................................................ 4
1.2.1. Đặc điểm thực vật ............................................................................................. 4
1.2.2. Sinh thái và phân bố .......................................................................................... 5
1.2.3. Thành phần hóa học .......................................................................................... 5
1.2.3.1. Các hợp chất diterpen .................................................................................... 5
1.2.3.2. Các hợp chất coumarinolignoid ..................................................................... 7
1.2.3.3. Các hợp chất benzopyran ............................................................................... 8
1.2.3.4. Các hợp chất flavonoid ................................................................................ 11
1.2.3.5. Các hợp chất alcaloid .................................................................................. 12
1.2.3.6. Các hợp chất steroid .................................................................................... 12
1.2.3.7. Các hợp chất triterpenoid ............................................................................ 13
1.2.4. Tác dụng sinh học ........................................................................................... 14
1.2.4.1. Tác dụng hỗ trợ và điều trị ung thư ............................................................. 14
1.2.4.2. Hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn ............................................................. 15
1.2.4.3. Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, ức chế miến dịch.............................. 15
1.2.5. Công dụng .................................................................................................... 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 17
2.1. Mẫu thực vật ..................................................................................................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 17
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất .............................................................. 17
2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................................ 17
2.2.1.2. Sắc ký cột (CC) ............................................................................................. 17
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc ...................................................................... 17
2.2.2.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................................................ 17
2.2.2.2. Điểm nóng chảy (Mp) ................................................................................... 18
2.2.3. .Dụng cụ và thiết bị tách chiết ........................................................................ 18
2.2.4. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất ......................... 18
2.3. Hóa chất ........................................................................................................ 18
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 20
3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất ....................................................... 20
3.1.1. Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn.......................................................... 20
3.1.1. Phân lập các hợp chất ..................................................................................... 20
3.2. Kết quả xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được ........................... 21
3.2.1. Hợp chất MA1: Vitexin ................................................................................... 21
3.2.2. Hợp chất MA2: apigenin-7-O-β-D-glucosid ................................................... 23
3.2.3. Hợp chất MA3: apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid
25
3.3. Thảo luận kết quả ............................................................................................. 27
3.3.1. Vitexin………………………………………………………………………………...27
3.3.2. Apigenin-7-O-β-D-glucosid ............................................................................ 28
3.3.3. Apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid ...................... 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 29
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Mallotus đặc hữu của Việt Nam ........................ 3
Bảng 1.2. Các hợp chất diterpen (1-5) từ loài M. apelta ................................ 6
Bảng 1.3. Các hợp chất coumarinolignoid (6-12) từ loài M. apelta ....................... 7 Bảng 1.4. Các hợp chất benzopyran (13-24) từ loài M. apelta ....................... 8
Bảng 1.5. Các hợp chất flavonoid (25-26) ..................................................... 11
Bảng 1.6. Các hợp chất alcaloid (27-28) ....................................................... 12 Bảng 1.7. Các hợp chất steroid (29-32) ......................................................... 12
Bảng 1.8. Các hợp chất triterpenoid (33-35)................................................. 13
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất MA1 và hợp chất tham khảo ....... 22
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của chất MA2 và chất tham khảo ..................... 24 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của chất MA3 và chất tham khảo ..................... 25
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh loài M. apelta ................................................................... 4
Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất diterpen (1-5)............................................... 7
Hình 1.3. Cấu trúc các hợp chất coumarinolignoid (6-12) ............................. 8 Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất benzopyran (13-24) ................................... 11
Hình 1.5. Cấu trúc các hợp chất flavonoid (25-26) ....................................... 11
Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất alcaloid (27-28) ......................................... 12 Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất steroid (29-32) ........................................... 13
Hình 1.8. Cấu trúc các hợp chất triterpenoid (33-35) ................................... 14
Hình 3.1. Sơ đồ chiết, phân lập các hợp chất từ loài M. apelta .................... 21
Hình 3.2. Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của hợp chất MA1 ........ 22 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất MA2 ............................................. 24
Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất MA3 ............................................. 25
MỞ ĐẦU
Điều kiện tự nhiên và khí hậu đặc trưng và đa dạng giữa vùng miền, đã
đem lại cho đất nước Việt Nam một hệ sinh thái thực vật phong phú. Bên cạnh
đó, Việt Nam cũng là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khoẻ. Theo
các nhà khoa học, Việt Nam có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó,
hơn 4.000 loài được sử dụng làm dược liệu và thuốc chữa bệnh [1]. Vai trò của nguồn tài nguyên cây thuốc ngày càng được nâng cao do có tiềm năng to lớn
trong việc nghiên cứu phát triển các loại thuốc trong điều trị bệnh.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), việc sử dụng các loại thuốc thảo dược
truyền thống đã trở nên quan trọng hơn, ngay cả trong y học phương Tây [27]. Hướng nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các cây thuốc
truyền thống đang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm. Đó là những
nghiên cứu cơ bản về xác định thành phần hóa học và tìm ra hoạt chất thể hiện hoạt
tính tác dụng chữa bệnh và nâng cao sức khỏe con người. Cho đến nay, trên thế giới
đã tìm ra nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên sử dụng làm thuốc để điều trị và
nâng cao sức khỏe.
Chi Ba bét (Mallotus) là một chi khá lớn, gồm khoảng 150 loài, phân bố tại
các khu vực từ Ấn Độ, Sri Lanka đến các nước Đông Nam Á.Trên thế giới, một số
loài thuộc chi Mallotus được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các loại bệnh
khác nhau. Ở Trung Quốc, loài bục núi cao M. japonicus được sử dụng để chữa
bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng và điều hòa các chức phận của bộ máy tiêu hóa nói
chung. Loài bục trườn M. repandus được sử dụng tại Thái Lan để chữa bệnh viêm
dạ dày, viêm đau gan, viêm đau khớp và chữa rắn độc cắn. Ở nước ta, loài bai bái
M. contubernalis làm thuốc chữa các bệnh thấp khớp, u phong, mụn nhọt và ngứa...[5]. Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy các loài thuộc chi Mallotus chứa nhiều hợp chất nhóm flavonoid có hoạt tính tốt như: kháng nấm, kháng ký
sinh trùng, gây độc tế bào, chống oxy hóa,…[24].
Xuất phát từ các cơ sở trên, việc nghiên cứu và khai thác các chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong lĩnh vực Y-Dược từ các nguồn dược liệu ở Việt Nam là rất cần thiết và có ý nghĩa về mặt khoa học cũng như thực tiễn. Vì vậy, em đã lựa chọn loài M. apelta thuộc chi Mallotus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) làm đối tượng
nghiên cứu cho đề tài: “Nghiên cứu phân lập các hợp chất flavonoid từ loài Bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell. –Arg.]”. Với mục đích nghiên cứu thành phần
1
flavonoid có trong loài Bùm bụp và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã
được phân lập.
Nội dung của khóa luận tốt nghiệp bao gồm:
1. Chiết xuất, phân lập một số hợp chất flavonoid từ loài M. apelta bằng các
phương pháp sắc ký;
2. Xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được bằng các phương
pháp vật lý và hóa học.
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về chi Mallotus
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Chi Mallotus (Ba bét) thuộc bộ Malpighiales (Sơ ri), họ Euphorbiaceae
(Thầu dầu), phân họ Acalyphoidae (Tai tượng).
Chi Mallotus là loại cây bụi, bụi trườn hoặc gỗ nhỏ đến cây gỗ; cây thường đơn tính, khác gốc hoặc cùng gốc. Lá xếp xoắn ốc hoặc mọc đối. Cụm hoa đơn tính,
mọc ở đầu cành hay nách lá; thường là chùm hoặc bông, ít khi là chùy. Hoa đơn
tính; đài 2 – 4 (5) thùy, không cánh tràng. Quả nang nhẵn hoặc có lông hình sao
hoặc nhẵn, khi khô nứt làm 3 mảnh. Hạt gần hình cầu hay hình trứng, vỏ nhẵn, bóng
màu đen [5].
Mallotus là chi tương đối lớn trong họ Euphorbiaceae, gồm khoảng 150 loài [5, 24], phân bố rải rác ở vù ng nhiê ̣t đớ i Nam Á và Đông Nam Á như ở Malaysian có 75 loài, Trung Quốc có 40 loài,…[7]. Nơi tập trung sự đa dạng cao nhất của chi
này là vùng nhiệt đới Nam Á và Đông Nam Á [1].
Ở Việt Nam, theo thống kê có 40 loài thuộc chi Mallotus [7, 24] với 7 loài đặc
hữu [7].
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Mallotus đặc hữu của Việt Nam
STT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố
1 Mallotus canii Thin Ba bét gia lai Gia Lai
2 Mallotus chuyenii Thin Ba bét hòa bình Hòa Bình
3 Mallotuseberhardtii Gagnep
Đỏ đọt, ngoát, ngút Các tỉnh miền Trung và miền Nam như Thừa
Thiên Huế, Kiên Giang
4 Mallotushanheoensis Thin Ba bét hòn hèo Các tỉnh miền Nam
5 Mallotuspoilanei Gagnep Si ta Các tỉnh miền Trung
3
6 Mallotussathavensis Thin Ba bét sa thày Kon Tum
7 Mallotus cuneatus Ridl. var. Ba bét nhẵn Các tỉnh phía Bắc
glabratus Thin
1.1.2. Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền các loài thuộc chi Mallotus
Trên thế giới, một số loài thuộc chi Mallotus được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các loại bệnh khác nhau. Ở Trung Quốc, loài bục núi cao M.
japonicus được sử dụng để chữa bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng và điều hòa các chức
phận của bộ máy tiêu hóa nói chung. Loài bục trườn M. repandus được sử dụng tại
Thái Lan để chữa bệnh viêm dạ dày, viêm đau gan, viêm đau khớp và chữa rắn độc
cắn. Ở nước ta, loài bai bái M. contubernalis làm thuốc chữa các bệnh thấp khớp, u phong, mụn nhọt và ngứa [2, 4, 5].
1.2. Giới thiệu về loài M. apelta 1.2.1. Đặc điểm thực vật
Hình 1.1. Hình ảnh loài M. apelta
Tên khoa học: Mallotus apelta (Lour.) Muell.-Arg [1].
Tên Việt Nam: Bùm bụp, bông bét, lá cám, cây ruông, may tap chỉ (Tày), co
po hu (Thái) [1].
Cấp bậc sinh giới [24]: Giới Thực vật: Plantae
Ngành Ngọc Lan: Magnoliophyta Lớp Ngọc Lan: Magnoliophyta
4
Bộ Sơ ri: Malpighiales
Họ Thầu dầu: Euphorbiaceae
Chi: Mallotus
Cây bụi hoặc cây gỗ nhỡ cao 1 – 6 m [21]. Cành non có lông màu vàng nhạt.
Lá mọc so le, hình bầu dục hay hình trứng, nguyên hoặc chia 3 thùy nông, dài
khoảng 20 cm, rộng 12 cm, mép nguyên hoặc khía răng thưa không rõ ràng, gốc hình tim hoặc gần bằng, mặt trên màu lục, mặt dưới phủ lông mềm và phấn màu
trắng, gân lá hình mạng rõ, có 3 – 5 cái tỏa từ gốc, cuống lá dài 10 – 20 cm, có lông.
Hoa đơn tính khác gốc mọc thành bông đuôi sóc, thõng xuống, dài 20 – 50 cm; cụm
hoa đực đôi khi phân nhánh, hoa không cuống, dài có 4 răng, hơi dính nhau ở gốc,
không có tràng, nhị rất nhiều, chỉ nhị nhẵn, không có nhụy lép; cụm hoa cái có đài hợp, 4 – 5 răng, có lông trắng, vòi nhụy 3 – 4, bầu có gai mềm [24]. Quả nang có
nhiều gai mềm phủ đầy lông hình sao màu trắng nhạt, khi chín nứt làm 3 mảnh; hạt
hình trứng, màu nâu đen. Ra hoa tháng 4 – 6, có quả tháng 7 – 9 [5].
1.2.2. Sinh thái và phân bố
Cây thường mọc ở ven rừng, ven đường, trên sườn đồi núi sau nương rẫy,
trên bãi đất hoang, lên tới độ cao 700 m (so với mực nước biển). Khả năng tái sinh
bằng hạt mạnh, nhất là ở những nơi đất còn tốt và chiếu sáng nhiều, cây mọc từ hạt
sau 2 năm đã có thể ra hoa [1, 5].
Cây phân bố rộng rãi ở miền Nam Trung Quốc và ở các nước Đông Nam Á. Ở Việt Nam, cây phân bố tại Sơn La, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Phú Thọ,
Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Hòa Bình, Ninh Bình, Hà Nam… đến các tỉnh Tây Nguyên,
Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu… [5, 21].
1.2.3. Thành phần hóa học
Theo những công trình đã được công bố cho thấy, thành phần hóa học của
loài M. apelta, bao gồm các nhóm chất chính như: diterpenoid, coumarin, triterpene,
steroid, benzopyran, flavonoid và alcaloid [21, 22]. Các hợp chất hóa học được
phân lập từ các bộ phận khác nhau của loài này.
1.2.3.1. Các hợp chất diterpen
Các nghiên cứu về hóa thực vật loài M. apelta đã được các nhà khoa học
Trung Quốc quan tâm nghiên cứu khá sớm. Năm 1999, nhóm nghiên cứu của các
5
tác giả Cheng X.F. công bố sự phân lập và xác định cấu trúc của 5 hợp chất diterpen
mới (1-5) (Bảng 1.1, Hình 1.2).
Bảng 1.2. Các hợp chất diterpen (1-5) từ loài M. apelta
KH Tên chất Bộ phận TLTK
10-Hydroxycembren-5-one Thân rễ [13, 24] 1
6-Hydroxycembrene-5,10-dione Thân rễ [13, 24] 2
malloapeltene (6,10- Thân rễ [12] 3
dihydroxycembrene-5-one)
2α,4β,15,16- Thân rễ [12] 4
tetrahydroxydolabradane
malloapeltin (4α,15,16- Thân rễ [12] 5
tetrahydroxydolabradane)
6
Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất diterpen (1-5)
1.2.3.2. Các hợp chất coumarinolignoid
Theo các công trình công bố, có 7 hợp chất coumarinolignoid được phân lập
từ loài M. apelta (6-12) (Bảng 1.2, Hình 1.3)
Bảng 1.3. Các hợp chất coumarinolignoid (6-12) từ loài M. apelta
KH Tên chất Bộ phận TLTK
Malloapelin A Thân rễ [24] 6
Cleomiscosin A Thân rễ [5, 11] 7
Cleomiscosin B Thân rễ [24] 8
Malloapelin B Thân rễ [24] 9
Malloapelin C Thân rễ [24] 10
5'-dmethylaquillochin Thân rễ [5, 11] 11
Aquillochin Thân rễ [5, 11] 12
7
Hình 1.3. Cấu trúc các hợp chất coumarinolignoid (6-12)
1.2.3.3. Các hợp chất benzopyran
Có 12 hợp chất benzopyran (13-24) đã được các nhà khoa học phân lập và
xác định cấu trúc từ loài M. apelta (Bảng 1.3, Hình 1.4)
Bảng 1.4. Các hợp chất benzopyran (13-24) từ loài M. apelta
KH Tên chất Bộ phận TLTK
4-Hydroxy-2,6-dimethyl-6-(3,7-dimethyl-2, Lá [8] 13
6-octadienyl)-8-(3-methyl-2-butenyl)-2H-1-
benzopyran-5,7(3H,6H)-dione
4-Hydroxy-2,6,8-trimethyl-6-(3,7-dimethyl-2,6- Lá [8] 14
octadienyl)-2H-1-benzopyran -5,7(3H,6H)-dione
5-Hydroxy-2,8-dimethyl-6-(3-methyl-2-butenyl)- Lá [8] 15
8-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-2H-1-
benzopyran-4,7(3H,8H)-dione
5-Hydroxy-2,6,8-trimethyl-8-(3,7-dimethyl-2,6- Lá [8] 16
octadienyl)-2H-1-benzopyran-4,7(3H,8H)-dione
2,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2,6-dimethyl-8-(3- Lá [8] 17
methyl-2-butenyl)-4H-1-benzopyran-4-one
8
2,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2,8-dimethyl-6-(3- Lá [8] 18
methyl-2-butenyl)-4H-1-benzopyran-4-one
2,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2,6,8-trimethyl-4H- Lá [8] 19
1-benzopyran-4-one
6β-hydroxy-2α,8β-dimethyl-6-(3-methyl-2- Lá [9] 20
butenyl)-8-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-2H-1-
benzopyran-4,5,7(3H,6H,8H)-trione
6β-hydroxy-2α,6α,8β-trimethyl-8-(3,7-dimethyl- Lá [9] 21
2,6-octadienyl)-2H-1-benzopyran-
4,5,7(3H,6H,8H)-trione
8-(1'-Oxo-2'-en-butyl)-5,7-dimethoxy-2,2- Lá [20] 22
dimethyl-2H-1-benzopyran hay malloapelta B
6-(1'-Oxo-3'(R)-hydroxy-butyl)-5,7-dimethoxy- Lá [16] 23
2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran
6-(1'-Oxo-3'(R)-methoxy-butyl)-5,7-dimethoxy- Lá [16] 24
2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran
9
10
Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất benzopyran (13-24)
1.2.3.4. Các hợp chất flavonoid
Qua tài liệu có 2 hợp chất flavonoid được phân lập từ loài này (25-26) (Bảng
1.4, Hình 1.5)
Bảng 1.5. Các hợp chất flavonoid (25-26)
KH Tên chất Bộ phận TLTK
Quercitrin Lá [23] 25
Astilbin Lá [23] 26
Hình 1.5. Cấu trúc các hợp chất flavonoid (25-26)
11
1.2.3.5. Các hợp chất alcaloid
Theo các công trình công bố có 2 hợp chất alcaloid được phân lập từ loài M.
apelta (27-28) (Bảng 1.5, Hình 1.6).
Bảng 1.6. Các hợp chất alcaloid (27-28)
Tên chất Bộ phận TLTK KH
Maloapentine Thân rễ [14] 27
Axit 4,5,4′-trimethyl-ellagic Thân rễ [14] 28
Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất alcaloid (27-28)
1.2.3.6. Các hợp chất steroid
Theo các công trình công bố, có 4 hợp chất steroid được phân lập từ loài M.
apelta (29–32) (Bảng 1.6, Hình 1.7)
Bảng 1.7. Các hợp chất steroid (29-32)
Bộ phận TLTK KH Tên chất
Thân, rễ, lá β-sitosterol [24] 29
Sitosteryl β-D-glucose hay Thân cây, lá [24] 30
daucosterol
Ergosterol Lá [24] 31
Stigmasterol Lá [24] 32
12
Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất steroid (29-32)
1.2.3.7. Các hợp chất triterpenoid
Theo các công trình công bố, có 3 hợp chất triterpenoid được phân lập từ loài
M. apelta (33–35) (Bảng 1.7, Hình 1.8)
Bảng 1.8. Các hợp chất triterpenoid (33-35)
KH Tên chất Bộ phận TLTK
3β,29-dihydroxylupane Thân rễ [24] 33
Erythrodiol-3-acetate Thân rễ [24] 34
Axit acetylursolic Thân rễ [24] 35
13
Hình 1.8. Cấu trúc các hợp chất triterpenoid (33-35)
Như vậy:
Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy thành phần hóa học của loài M. apelta
rất đa dạng và phong phú. Nhiều hợp chất mới, có cấu trúc đặc trưng của loài M.
apelta như một số hợp chất terpen, benzopyran, coumarinolignoid, flavonoid và
steroid. Điều này góp phần tạo cơ sở khoa học lý giải công dụng chữa bệnh theo y
học cổ truyền Việt Nam, Trung Quốc và các quốc gia khác.
1.2.4. Tác dụng sinh học 1.2.4.1. Tác dụng hỗ trợ và điều trị ung thư
Hoạt tính sinh học của một số hợp chất được phân lập từ các loài thuộc chi Mallotus có hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro trên các dòng tế bào ung thư
màng tim (RD), ung thư gan (Hep-2), ung thư biểu mô (KB) [8, 16, 24].
(23)
Hai hợp chất benzopyran 6-(1'-Oxo-3'(R)-hydroxy-butyl)-5,7-dimethoxy- 6-(1'-Oxo-3'(R)-methoxy-butyl)-5,7- và 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (24) được phân lập từ lá của loài M.
apelta có hoạt tính gây độc tế bào . Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất 6-(1'-
Oxo-3'(R)-methoxy-butyl)-5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (24) có
14
tác dụng gây độc tế bào mạnh trên 2 dòng tế bào ung thư Hep-2 và RD với giá trị
IC50 lần lượt là 0,49 và 0,54 µg/ml, trong khi đó hợp chất 6-(1'-Oxo-3'(R)-hydroxy- butyl)-5,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran (23) cho tác dụng vừa phải trên dòng tế bào ung thư Hep-2 với giá trị IC50 là 4,22 µg/ml [16].
Nghiên cứu cho thấy hợp chất malloapelta B (22) cho thấy tác dụng gây độc
tế bào mạnh đối với 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep-2) và ung thư biểu mô (KB) với giá trị IC50 lần lượt là 0,49 µg/m và 0,54 µg/m [23].
1.2.4.2. Hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn
Nghiên cứu công bố năm 1993 của tác giả Feng L. cho thấy 4 hợp chất
erythrodiol-3-acetate (34), β-sitosterol (29), 3β,29-dihydroxylupane (33) và axit
acetylursolic (35) có hoạt tính kháng khuẩn. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn cho thấy, các hợp chất (29), (33-35) thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn
Staphulococus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, và Bacillus pyocyaneum
[25].
Nhóm các tác giả An T. Y. đã tiến hành nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng
sinh trên các chủng Staphulococus aureus, Micrococus lutens, Pseudomonas
aeruginosa và Escherichia coli của 7 dẫn xuất benzopyran là 4-Hydroxy-2,6-
dimethyl-6-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-8-(3-methyl-2-butenyl)-2H-1-
benzopyran-5,7(3H,6H)-dione (13), 4-Hydroxy-2,6,8-trimethyl-6-(3,7-dimethyl-
2,6-octadienyl)-2H-1-benzopyran -5,7(3H,6H)-dione (14), 5-Hydroxy-2,8-
dimethyl-6-(3-methyl-2-butenyl)-8-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-2H-1-
benzopyran-4,7(3H,8H)-dione (15), 5-Hydroxy-2,6,8-trimethyl-8-(3,7-dimethyl-
2,6-octadienyl)-2H-1-benzopyran-4,7(3H,8H)-dione (16), 2,3-Dihydro-5,7-
dihydroxy-2,6-dimethyl-8-(3-methyl-2-butenyl)-4H-1-benzopyran-4-one (17), 2,3-
Dihydro-5,7-dihydroxy-2,8-dimethyl-6-(3-methyl-2-butenyl)-4H-1-benzopyran-4- one (18), 2,3-Dihydro-5,7-dihydroxy-2,6,8-trimethyl-4H-1-benzopyran-4-one (19). Kết quả thu được cho thấy, chỉ có hợp chất (13) thể hiện hoạt tính trung bình trên
chủng M. lutens với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 7,34 µg/ml [8].
Hợp chất malloapleta B có hoạt tính ức chế yếu tố gây viêm NF-B với giái
trị IC50 = 5,0 µM [23].
1.2.4.3. Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, ức chế miến dịch
Theo nghiên cứu, hợp chất astilbin (26) có hoạt tính chố ng oxy hó a, bảo vê ̣
gan, ứ c chế miễn di ̣ch [6].
15
Các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu khả năng kháng vi rút viêm
gan B in vivo (duck hepatitis B virus: D-HBV) của rễ Bùm bụp trên vịt. Kết quả
nghiên cứu cho thấy, rễ loài này có tác dụng ngăn cản sự phân chia của tế bào D-
HBV in vivo. Mặc dù tác dụng yếu hơn chất đối chứng dương là lamivudine, rễ loài này lại có tác dụng kéo dài hơn [29].
Các coumarino-lignoit malloapelin A (6), B (9), C (10) được đánh giá có
hoạt tính bảo vệ gan trên dòng tế bào gan chuột WB-F344. Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất (6), (9) và (10) đều thể hiện hoạt tính in vitro ở nồng độ 10-4 M và không thể hiện độc tính đáng kể khi so sánh với chất đối chứng dương là bicyclol và
silybin (ức chế 45,5% ở 50 µM), là các hợp chất đã được biết đến với hoạt tính bảo
vệ gan rất mạnh [28].
Như vậy:
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài M. apelta cho thấy loài này thể
hiện nhiều hoạt tính sinh học thú vị như gây độc tế bào ung thư, kháng khuẩn, bảo
vệ gan,…Chính vì thế, việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
các hợp chất được phân lập từ loài Bùm bụp có ý nghĩa rất quan trọng để phục vụ
cho cuộc sống.
1.2.5. Công dụng
Trên thế giới, ở một số nước như Trung Quốc M.apelta được dùng như một
vị thuốc cổ truyền để chữa các bệnh viêm nhiễm, máu trắng và các bệnh về gan và
đường tiêu hoá. Gần đây các nhà khoa học trung quốc còn phát hiện ra dịch chiết
MeOH của cây này có hoạt tính kháng HIV.
Ở Việt Nam theo Võ Văn Chi, M. apelta có vị hơi đắng và chát, tính bình.
Rễ có tác dụng hoạt huyết, bổ vị tràng. Lá và vỏ cây có tác dụng tiêu viêm, cầm
máu. Rễ thường dùng chữa viêm gan mãn tính, sưng gan lá lách, sa tử cung và trực tràng, huyết trắng, phù thũng khi có thai, viêm ruột ỉa chảy, … Lá và vỏ thân chống
nôn, chữa viêm loét hành tá tràng, cầm máu. Ngoài ra còn chữa trị viêm tai giữa, cụm nhọt, các tổn thương và chảy máu [1].
16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mẫu thực vật
Mẫu thân lá cây bùm bụp (M. apelta) được thu hái tại xã Ngọc Thanh, huyện
Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc, được giám định bởi TS. Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.
Mẫu tiêu bản được lưu tại phòng Nghiên cứu cấu trúc -Viện Hóa Sinh Biển & Viện
Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Mẫu thực vật được phơi khô, nghiền nhỏ trước khi đem chiết.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở
hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch axit sulfuric
10% được phân bố đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.
2.2.1.2. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel với kích thước hạt
0,040-0,063 mm (240-430 mesh); pha đảo sử dụng loại RP-18 có cỡ hạt là 30-50
m (Fujisilysia Chemical Ltd.); Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co.,
Ltd.).
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định trên cơ sở sử dụng các
phép xác định thông số vật lý và các phương pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại
đồng thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo. Các phương pháp đo
được sử dụng gồm có:
2.2.2.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ NMR được đo trên máy đo trên máy Brucker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS), tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR.
17
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC.
- Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: DMSO, CD3OD.
2.2.2.2. Điểm nóng chảy (Mp)
Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro – hotstage của Viện Hóa
sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ việt Nam.
2.2.3. .Dụng cụ và thiết bị tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch dược sử
dụng bao gồm:
+ Bình chiết 30 lít
+ Máy cô quay chân không
+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 365 nm
+ Tủ sấy chân không
+ Máy sấy
+ Micropipet
+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế
+ Cột sắc ký pha thường và phao đảo các loại đường kính
+ Dung dịch thuốc thử H2SO4 10%
+ Bếp điện
2.2.4. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất
+ Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy BRUKER Avante 500 với chất chuẩn nội TMS (Tetrametyl Silan) tại Viện Hóa
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
+ Máy đánh siêu âm POWERSON IC 603 của hãng Hwashin Technology,
Korea.
+ Cân phân tích 4 số Ohaus P124 của hãng Ohaus Corporation, USA.
+ Máy cất quay chân không.
+ Tủ hút chân không.
+ Đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm.
2.3. Hóa chất
18
+ Silica gel 60 (0,04 – 0,063 mm) Merck
+ Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30 – 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd)
+ Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC – Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715)
+ Bản mỏng tráng sẵn pha đảo PR18 F254s (Merck)
+ Bản mỏng điều chế pha thường DC - Alufolien 60 F254 (Merck)
+ Các loại dung môi hữu cơ như acetone, ethyl acetate, hexan, methanol,
water, dichloromethane, v.v...
19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất
3.1.1. Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn
Thân lá Bùm bụp (M. apelta) được rửa sạch, phơi khô, làm nhỏ. Cân 5 kg mẫu đã làm nhỏ và được ngâm chiết với 20L dung môi methanol kết hợp với siêu
âm ở nhiệt độ phòng trong 10 giờ, rút lấy dịch chiết lần một. Bổ sung thêm dung
môi ngập dược liệu 2-3cm (20L/lần) và tiếp tục chiết thêm hai lần, thu được dịch chiết lần hai và lần ba.
Gộp dịch chiết 3 lần, lọc các dịch chiết methanol thu được qua giấy lọc đem
cất thu hồi methanol dưới áp suất giảm thu được khoảng 568 g cao chiết tổng
methanol (MA).
Hòa tan 500g cao đặc trong nước ấm, tỷ lệ thể tích cao đặc: nước cất ấm
(1:1) thu được dịch chiết nước. Dịch chiết nước đem chiết với dung môi
dichloromethane, tỷ lệ thể tích dichloromethane: nước ấm (1:1) chiết lặp lại 3 lần,
mỗi lần 500ml dung môi trong 30 phút. Phân đoạn dịch chiết thu được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở nhiệt độ 600C đến cặn. Cặn chiết này được phân bố đều trong nước cất và chiết với CH2Cl2 thu được cặn CH2Cl2 (1A, 250 g) và lớp nước (1B, 318 g).
3.1.1. Phân lập các hợp chất
Phần nước 1B được cất loại bỏ dung môi hữu cơ, sau đó đưa lên cột sắc ký
trao đổi ion với chất hấp phụ là Diaion HP-20 với hệ dung môi tăng dần nồng độ
methanol trong nước (25, 50, 75, 100%) thu được 4 phân đoạn 2A (15g), 2B (10g),
2C (6g) và 2D (7g). Phân đoạn 2C được chạy sắc ký trên cột silica gel pha thuận với hệ dung môi gradien CH2Cl2:MeOH (20:1→0:1) thu được 4 phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là 3A (500 mg), 3B (700 mg), 3C (1,2 g) và 3D (1 g). Phân đoạn 3C được tiến hành sắc ký qua cột RP-18 với hệ dung môi acetone:H2O (1:1,5) thu được 5 phân
đoạn nhỏ hơn ký hiệu là 4A (120 mg), 4B (150 mg), 4C (300 mg), 4D (50 mg) và 4E (150 mg). Hợp chất MA1 (30,4 mg) và MA2 (10,6 mg) thu được từ phân đoạn 4C thông qua sắc ký cột sephadx LH-20, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (1:1). Tiến hành sắc ký phân đoạn 4E qua cột pha đảo YMC PR-18 sử dụng hệ dung môi acetone:H2O (1:3) thu được các phân đoạn 5A (20mg), 5B (30 mg) và 5C (50 mg). Gộp 2 phân đoạn 5A và 5B tiến hành sắc ký bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
20
cao (HPLC) với dung môi 22% acetonitrile ACN:H2O thu được hợp chất MA3 (5,0 mg) ở thời gian lưu của pic 39,7 phút.
Hình 3.1. Sơ đồ chiết, phân lập các hợp chất từ loài M. apelta
3.2. Kết quả xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được
3.2.1. Hợp chất MA1: Vitexin
Chất bột màu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: tnc = 273 – 275 ˚C
Công thức phân tử: C21H20O10, M = 432.
Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6) của hợp chất MA1 và hợp chất
tham khảo xem Bảng 3.1.
21
Hình 3.2. Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của hợp chất MA1
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất MA1 và hợp chất tham khảo
a,cδH (mult, J= Hz)
a,bδC #,aδC 165.0 163.92 103.2 102.41 183.1 182.04 161.7 160.38 99.0 98.14 163.7 162.68 105.4 104.59 157.1 155.98 105.2 104.59 122.7 121.59 129.7 129.00 116.6 115.00 161.3 162.2 116.6 115.00 129.7 129.00
HMBC (H→C) 2,4,10,1′ 5,7,8,10 2,4′,6′ 1′,4′,5′ 1′,2′,3′ 2,2′,4′ 5,6,10 7,8,9 8 - 74.4 71.9 79.9 71.6 82.5 - 73.36 70.84 78.65 70.54 81.80 C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 5-OH 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′
a Đo trong DMSO-d6, b125 MHz, c500 MHz,#δC của vitexin [18].
62.4 61.28 6′′ - 6.76 (s) - - 6.26 (s) - - - - - 8.02 (d, 8.0) 6.89 (d, 8.0) - 6.89 (d, 8.0) 8.02 (d, 8.0) 13.15 (s) 4.69 (d, 10.0) 3.84 (t, 9.5) 3.29 (m) 3.34 (m) 3.26 (m) 3.51 (m) 3.76 (m)
Hợp chất MA1 thu được dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất MA1 thấy có xuất hiện hai cặp tín hiệu doublet tại δH 6,89 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3′, H-5′) và 8,02 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2′, H-6′) đặc trưng cho vòng thơm thế para, tín hiệu hai proton thơm tại δH 6,76 (1H, s, H-3) và 6,26 (1H, s, H-6) cho phép dự đoán đây là một hợp chất flavonoid dạng apigenin. Ngoài ra, trên phổ này
22
cũng quan sát thấy tín hiệu của một proton anome tại δH 4,69 (1H, d, J =10,0 Hz, H-1'') gợi ý trong MA1 có mặt của một gốc đường. Các proton của một cấu tử đường cũng được phát hiện trong vùng tín hiệu δH 3,26 – 4,69 ppm. Đặc biệt, giá trị hằng số tương tác J của proton gắn vào cacbon anome có giá trị cao hơn (J =10,0 Hz) so với các giá trị tương ứng trong trường hợp nối qua liên kết O-glycosid. Điều này gợi ý sự có mặt của
một cấu tử đường nối C-C vào aglycon.
Trên phổ 13C-NMR của MA1 xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử cacbon. Trong đó có 6 tín hiệu tại δC 73,36 (C-1′′), 70,84 (C-2′′), 78,65 (C-3′′), 70,54 (C- 4′′), 81,80 (C-5′′), 61,28 (C-6′′) khẳng định sự có mặt của gốc đường glucose và tín
hiệu 15 nguyên tử cacbon δC 163,92 (C-2), 102,41 (C-3), 182,04 (C-4), 160,38 (C- 5), 98,14 (C-6), 162,68 (C-7), 104,59 (C-8), 155,98 (C-9), 104,59 (C-10), 121,59 (C-1′), 129,00 (C-2′, 6′), 115,00 (C-3′, 5′), 161,3 (C-4′) thuộc vào khung flavonoid
có vòng B thế para. So sánh số liệu phổ NMR của MA1 với của hợp chất vitexin
[18] cho thấy sự tương đồng ở các vị trí tương ứng.
Ngoài ra, việc ghi các phổ HSQC và HMBC cũng được thực hiện để có thể
gán một cách chính xác các giá trị độ dịch chuyển hóa học của các vị trí tương ứng. Tương tác HMBC của H-1''glc với C-7, C-8 và C-9 khẳng định sự có mặt của liên kết C-C và vị trí của liên kết này với C-8. Tương tác HMBC của H-6 (δH 6,26) với
C-8, C-10 cũng như tương tác của H-3 (δH 6,76) với C-10, C-1' cũng đã khẳng định sự có mặt của 2 nhóm hydroxyl tại C-5 và C-7, nối đôi tại C2/C3. Thêm vào đó, tương tác HMBC rất rõ của proton 5-OH (δH 13,15) với C-5 (δC 160,38) và tương tác H-1''glc với C-9 (δC 155,98) khẳng định δC của C-9 phải là 155,98 và C-5 phải là 160,38. Từ những dữ liệu trên cho phép xác định hợp chất MA1 là vitexin.
3.2.2. Hợp chất MA2: apigenin-7-O-β-D-glucosid
Chất bột vô định hình màu vàng
Nhiệt độ nóng chảy: tnc = 218 – 220 ˚C
Công thức phân tử C21H20O10, M = 432
Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.2.
23
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất MA2
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của chất MA2 và chất tham khảo
C
#δC 164.2
a,bδC 164.3
a,cδH (Mult, J = Hz) -
2
103.0 103.0 6.84 (1H, s) 3
181.6 182.0 - 4
161.0 161.6 - 5
99.6 99.6 6.43 (1H, d, 1.5) 6
162.8 162.9 - 7
94.9 94.9 6.82 (1H, d, 1.5) 8
156.8 156.9 - 9
105.3 105.3 - 10
121.1 120.9 - 1′
128.1 128.6 7.94 (1H, d, 8.5) 2′, 6′
115.8 116.1 6.92 (1H, d, 8.5) 3′, 5′
160.9 161.1 - 4′
100.3 99.9 5.06 (1H, d, 7.5) 1′′
73.1 73.1 3.26 (1H, dd, 7.5, 9.0) 2′′
77.0 77.2 3.45 (1H, t, 9.0) 3′′
69.9 69.6 3.19 (1H, t, 9.0) 4′′
76.4 76.5 3.29 (1H, m) 5′′
a Đo trong DMSO-d6, b125 MHz, c500 MHz,
60.8 60.6 6′′ 3.71 (1H, d, 11.5) 3.50 (1H, dd, 6.0, 11.5)
#δC của apigenin-7-O-β-D-glucosid [19].
Hợp chất MA2 thu được dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất MA2 thấy có xuất hiện cặp tín hiệu doublet tại δH 6,43 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6) và 6,82 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8) điển hình cho hai proton ở vị trí C-6 và C-
24
8 của vòng A và một proton thơm tại δH 6,84 (1H, s, H-3) của hợp chất flavonoid. Hai cặp tín hiệu doublet khác tại δH 6,92 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′) và 7,94 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′) đặc trưng cho vòng thơm B thế para, cho phép dự đoán
đây là một hợp chất flavonoid dạng apigenin. Ngoài ra, trên phổ này cũng quan sát thấy tín hiệu của một proton anome tại δH 5,06 (1H, d, J =7,5 Hz, H-1'') gợi ý trong MA2 có mặt của một gốc đường.
Phổ 13C-NMR và HSQC củ a hợp chất MA2 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 21 nguyên tử cacbon. Trong đó có 6 tín hiệu tại δC 99,9 (C-1′′), 73,1 (C-2′′), 77,2 (C-3′′), 69,6 (C-4′′), 76,5 (C-5′′), 60,6 (C-6′′) khẳng định sự có mặt của gốc
đường glucose và tín hiệu 15 nguyên tử cacbon δC 164,3 (C-2), 103,0 (C-3), 182,0 (C-4), 161,6 (C-5), 99,6 (C-6), 162,9 (C-7), 94,9 (C-8), 156,9 (C-9), 105,3 (C-10), 120,9 (C-1′), 128,6 (C-2′, 6′), 116,1 (C-3′, 5′), 161,1 (C-4′) thuộc vào khung flavonoid có vòng B thế para. Các dữ kiện phổ 1H, 13C-NMR của MA2 gợi ý đây là một flavonoid dạng apigenin gắn với một đường glucose. So sánh các dữ liệu phổ NMR
của MA2 với hợp chất apigenin-7-O-β-D-glucosid đã được công bố từ loài S.
tenuifolia [19] cho thấy sự tương đồng ở các vị trí tương ứng. Như vậy, từ dữ liệu
trên có thể khẳng định hợp chất MA2 là apigenin-7-O-β-D-glucosid.
3.2.3. Hợp chất MA3: apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid
Chất bột vô định hình màu vàng
Nhiệt độ nóng chảy: tnc = 297 - 298 ˚C
Công thức phân tử C26H28O14, M = 564
Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.3
Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất MA3
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của chất MA3 và chất tham khảo
C
a,cδH (mult., J=Hz)
#δC 167.0
a,bδC 167.1
- 2
25
6.61 (1H, s) 104.2 103.6 3
184.0 184.2 - 4
163.1 164.5 - 5
6.46 (1H, d, 1.5) 101.1 101.0 6
164.8 164.8 - 7
6,77 (1H, d, 1.5) 96.2 95.8 8
159.1 158.9 - 9
107.2 107.0 - 10
123.1 121.9 - 1′
7.85 (2H, d, 8.5) 129.8 129.7 2′,6′
6.90 (2H, d, 8.5) 117.2 117.6 3′, 5′
163.2 164.5 - 4′
Glu
100.2 100.2 5.15 (1H, d, 8.0) 1′′
78.9 78.7 3.71 (1H, dd, 8.0, 9.0) 2′′
78.6 78.4 3.69 (1H, t, 9.0) 3′′
71.5 71.3 3.45 (1H, t, 9.0) 4′′
78.4 78.7 3.71 (1H, m) 5′′
3.95 (1H, dd, 2.0, 12.0) 62.7 62.5 6′′ 3.74 (1H, dd, 5.0, 12.0)
Apio
111.1 110.9 5.48 (1H, d, 1.5) 1′′′
78.3 78.1 3.99 (1H, d, 1.5) 2′′′
80.8 80.7 - 3′′′
4.07 (1H, d, 9.5) 75.6 75.4 4′′′ 3.84 (1H, d, 9.5)
65.9 5′′′
#δC của apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1->2)- β-D- glucopyranosid [15]
3.58 (2H, br s) 66.0 a Đo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz,
Hợp chất MA3 phân lập được dưới dạng bột vô định hình, màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất MA3 thấy có xuất hiện cặp tín hiệu doublet tại δH 6,46 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6) và 6,77 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8) đặc trưng cho hai proton ở vị trí C-6 và C-8 của vòng A và một proton thơm tại δH 6,61(1H, s, H-3) của hợp
26
chất flavonoid. Cặp hai tín hiệu doublet khác tại δH 6,90 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′) và 7,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′) đặc trưng cho vòng thơm B thế para. Tín hiệu proton anome tại δH 5,15 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′) và 5,48 (1H, d, J = 1,5 Hz, H- 1′′′) gợi ý trong hợp chất MA3 có mặt 2 gốc đường.
Phổ 13C-NMR và HSQC củ a hợp chất MA3 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng
của 26 nguyên tử cacbon. Tín hiệu 15 nguyên tử cacbon tại δC 167,1 (C-2), 103,6
(C-3), 184,2 (C-4), 164,5 (C-5), 101,0 (C-6), 164,8 (C-7), 95,8 (C-8), 158,9 (C-9),
107,0 (C-10), 121,9 (C-1′), 129,7 (C-2′, 6′), 117,6 (C-3′, 5′) và 164,5 (C-4′) thuộc
khung flavonoid có vòng B thế para tương tự như hợp chất MA2. Sự khác biệt duy
nhất là có thêm một phân tử đường. Độ chuyển dịch hóa học tại C-2 tăng nhẹ (73,1
lên 78,7) gợi ý xuất hiện liên kết glycosid ở C-2 của đường glucose. So sánh dữ liệu
phổ NMR của hợp chất MA3 với hợp chất apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-
β-D-glucopyranosid thấy sự phù hợp hoàn toàn [15]. Như vậy, có thể khẳng định
hợp chất MA3 là apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid.
3.3. Thảo luận kết quả
Từ phân lớp nước thu được 3 hợp chất flavonoid dạng flavon. Các howph
chất thuộc nhóm flavon, cũng như một số dẫn xuất tổng hợp của chúng, đã được
chứng minh là thể hiện một số hoạt động sinh học, bao gồm chống oxy hóa, chống
viêm, chống ung thư, chống nhiễm độc gen, chống dị ứng, bảo vệ thần kinh, bảo vệ
tim mạch và kháng khuẩn.
3.3.1. Vitexin
Hợp chất MA1 (vitexin) có mặt trong nhiều loại thực vật và có hoạt tính
chống oxy hóa mạnh. Từ phân đoạn EtOAc của lá cây Gừa, bằng kỹ thuật sắc ký
kết hợp với các phương pháp phổ NMR, MS đã phân lập và xác định được hợp chất
polyphenol là vitexin với độ tinh khiết cao có thể dùng làm chất đối chiếu trong
định tính, định lượng. Trong đó, vitexin lần đầu tiên được báo cáo có trong lá cây Gừa. Đã sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng mô hình DPPH của phân đoạn ethyl acetat, vitexin cho thấy các mẫu thử trên có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Lá Gừa là nguồn nguyên liệu rất có tiềm năng trong sản xuất thuốc chống oxy hóa [3].
27
3.3.2. Apigenin-7-O-β-D-glucosid
Hợp chất này có mặt trong nhiều loài thực vật như Hương nhu Hải Châu (E.
splendens), Kinh giới lá rách (S. tenuifolia), Cùm sọc (K. Striata,… và có hoạt tính chống oxy hóa [10], chống HIV tại IC50 > 100 µg/ml và EC50 = 1,8 µg/ml [26] và chống ung thư [17]. Apigenin-7-O-β-D-glucosid thể hiện hoạt động chống tăng sinh
và chống oxy hóa mạnh đối với các loại oxy phản ứng (ROS) trong ống nghiệm
theo cách phụ thuộc nồng độ. Nghiên cứu in vitro thể hiện hoạt động chống tăng sinh đáng kể chống lại các tế bào khối u ác tính B16F10 sau 24 và 48 giờ
ủ. Apigenin-7-O-β-D-glucosid tăng cường tổng hợp melanogenesis và hoạt động
tyrosinas của các tế bào u ác tính B16F10, đặc biệt gây ra sự biệt hóa của các tế bào
CD34 + đối với dòng hồng cầu và ức chế sự biệt hóa của tủy.
3.3.3. Apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid
Hợp chất apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid có mặt
trong nhiều loài thực vật như Crotalaria anagyroides, Kochujang,…và có hoạt tính
chống oxy hóa [15] và chống Hepatitis B virus (HBV) [30].
Nhằm cung cấp những kiến thức về nguyên liệu lá cây Bùm bụp góp phần
ứng dụng trong chăm sóc sức khỏe, đề tài nghiên cứu đã phân lập được 3 hợp chất
trên, ta thấy đây là nguồn dược liệu rất hữu ích, vì vậy cần nghiên cứu, phát triển
hơn nữa để cây Bùm bụp có thể được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng.
28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận:
Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận: “Nghiên cứu phân
lập các hợp chất flavonoid từ loài Bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell. – Arg.]” đã thu được một số kết quả như sau:
+ Bằng các kỹ thuật sắc ký đã phân lập được 3 hợp chất flavonoid từ dịch
chiết methanol của cây Bùm bụp (Mallotus apelta).
+ Kết hợp với các phương pháp phổ phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HMBC, HSQC) đã xác định được cấu trúc của 3 hợp chất lần lươ ̣t là vitexin (MA1), apigenin-7-O-β-D-glucosid (MA2) và apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid (MA3).
Kiến nghị:
Qua các nguồn tài liệu tham khảo trước có thể thấy loài thuộc chi Mallotus
chứa nhiều hợp chất thuốc nhóm flavonoid có hoạt tính sinh học tốt cho sức khỏe con người. Do đó, em đề nghị tiếp tục nghiên cứu phân lập thêm các hợp chất có trong Mallotus apelta, đưa thêm chất này vào kho tàng dữ liệu các hợp chất thiên lập được. nhiên và đánh giá hoạt tính của các hợp chất phân
29
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Như, Nguyễn Tập &Trần Toàn; (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 2. Võ Văn Chi; (2001), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Công nghệ, Hà Nội.
3. Huỳnh Anh Duy &Huỳnh Ngọc Thụy; (2015), "Phân lập catechin, vitexin và xây dựng quy trình định lượng vitexin từ lá cây gừa (Ficus microcarpa Lf)", Tạp chí Dược học, 55 (4), 50-53.
4. Đỗ Tất Lợi; (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Công nghệ, Hà Nội.
5. Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Lã Đình Mỡi, Phạm Quốc Long, Nguyễn Thị Kim Thanh, Nguyễn Xuân Cường &Nguyễn Hoài Nam; (2009), Chi Mallotus hóa học, hoạt tính sinh học và sắc ký fingerprint, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
6. Lê Ngọc Tân, Đỗ Mạnh Dũng &Phạm Văn Hiển; (2019), "Đi ̣nh lươ ̣ng đồ ng thờ i astilbin và emodin trong bài thuố c GK1 bằ ng phương pháp HPLC", Tạp chí Dược học,59 (6), 16-21.
7. Nguyễn Nghĩa Thìn; (2003), Danh lục các loài thực vật Việt Nam NXB Nông
nghiệp, Hà Nội. Tiếng Anh 8. T. An, L. Hu, X. Cheng &Z. Chen (2001), "Benzopyran derivatives from Mallotus apelta", Phytochemistry, 57 (2), 273-278.
9. Tian-Ying An, Li-Hong Hu, Xiao-Fang Cheng &Zhong-Liang Chen (2003), "Two new benzopyran derivatives from Mallotus apelta", Nat. Prod. Res., 17 (5), 325-328.
"High-performance (2011), 10. Zaixing Chen, Xixiang Ying, Shu Meng, Xu Zhu, Hong Jiang, Qishen Cao, Xuying Li &Fanhao; Meng liquid chromatographic determination and pharmacokinetic study of apigenin-7-O-
β-D-glucoside in rat plasma after intravenous administration", Arch Pharm Res, 34 (5), 741. 11. X. F. Cheng &Z. L. Chen (2000), "Coumarinolignoids of Mallotus apelta",
Fitoterapia, 71 (3), 341-342.
12. Xiao-Fang Cheng &Zhong-Liang Chen (1999), "Three new diterpenoids from Mallotus apelta Muell. Arg", J. Asian Nat. Prod. Res., 1 (4), 319-325. 13. Xiao-Fang Cheng, Zhongliang Chen &Zeng-Mu Meng (1999), "Two new diterpenoids from Mallotus apelta Muell. Arg", J. Asian Nat. Prod. Res., 1 (3), 163-168. 14. Xiao-Fang Cheng, Zeng-Mu Meng &Zhong-Liang Chen (1998), "A pyridine- type alkaloid from Mallotus Apelta", Phytochemistry, 49 (7), 2193-2194.
15. Jin Ho Chung, Heung-Chule Shin, Jeong-Yong Cho, Seong-Koo Kang, Hyoung Jae Lee, Soo-Cheol Shin, Keun-Hyung Park &Jae-Hak Moon (2009), "Isolation and structural determination of free radical scavenging compounds from Korean fermented red pepper paste (Kochujang)", Food Science Biotechnology,18 (2), 463-470.
16. Phan Van Kiem, Nguyen Hai Dang, Ha Viet Bao, Hoang Thanh Huong, Chau Van Minh, Le Mai Huong, Jung Joon Lee &Young Ho Kim (2005), "New cytotoxic benzopyrans from the leaves of Mallotus apelta", Arch. Pharmacal Res., 28 (10), 1131-1134.
17. Masao Kikuchi &Noriko Matsuda (1996), "Flavone glycosides from Lonicera gracilipes var. glandulosa", Journal of natural products,59 (3), 314-315.
18. Jin Hwa Kim, Bum Chun Lee, Jin Hui Kim, Gwan Sub Sim, Dong Hwan Lee, Kyung Eun Lee, Yeo Pyo Yun &Hyeong Bae Pyo (2005), "The isolation and antioxidative effects of vitexin fromAcer palmatum", Archives of pharmacal research,28 (2), 195.
19. Masayoshi Kubo, Hiroshi Sasaki, Tohru Endo, HEIHACHIRO TAGUCHI &ITIRO YOSIOKA (1986), "The Constituents of Schizonepeta tenuifolia BRIQ. II.: Structure of a New Monoterpene Glucoside, Schizonepetoside C", Chemical pharmaceutical bulletin, 34 (8), 3097-3101.
20. Phung Ngan Le, Dinh Chuong Pham, Dai Hai Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Vladimir Dimitrov, Petko Ivanov, Cuong Nguyen Xuan, Hoai Nam Nguyen &Cuu Khoa Nguyen (2017), "Poly (N-isopropylacrylamide)-functionalized dendrimer as a thermosensitive nanoplatform for delivering malloapelta B against HepG2 cancer cell proliferation", Adv. Nat. Sci.: Nanosci. Nanotechnol., 8 (2), 025014/1-025014/7.
21. Xin Chao Liu, Xu Bo Chen &Zhi Long Liu (2014), "Gas chromatography-mass spectrometric analysis and insecticidal activity of essential oil of aerial parts of Mallotus apelta (Lour.) Muell.-Arg. (Euphorbiaceae)", Trop. J. Pharm. Res., 13 (9), 1515-1520.
22. Tailiang Lu, Shengping Deng, Chen Li, Liangdeng Wu, Ruiyun Yang &Jun Li (2014), "A new chromone from the twig of Mallotus apelta", Nat. Prod. Res., 28 (21), 1864-1868.
23. Hoai Nam Nguyen, Hai Dang Nguyen, Van Kiem Phan, Van Chinh Luu, Thi Binh Phan, Dinh Moi La &Van Minh Chau (2007), "Study on benzopyrans and other isolated compounds from Mallotus apelta", Tap Chi Hoa Hoc, 45 (DB), 111-121.
24. C. Riviere, V. Nguyen Thi Hong, Q. Tran Hong, G. Chataigne, N. Nguyen Hoai, B. Dejaegher, C. Tistaert, T. Nguyen Thi Kim, Y. Vander Heyden, M. Chau Van &J. Quetin-Leclercq (2010), "Mallotus species from Vietnamese mountainous areas: phytochemistry and pharmacological activities", Phytochem. Rev., 9 (2), 217-253.
25. XQ Shan, LB Feng &CS Wu (1985), "Chemical constituents of the roots of Mallotus apelt a (Lour.) Muell.-Arg", Zhiwu Xuebao, 2 (27), 192-195.
26. Renjiu Tang, Ke Chen, Mark Cosentino &Kuo-Hsiung Lee (1994), "Apigenin-
7-O-β-D-glucopyranoside, an anti-HIV principle from Kummerowia striata", Bioorg.Med.Chem.Lett, 4 (3), 455-458.
27. J. Viaene, M. Goodarzi, B. Dejaegher, C. Tistaert, A. Hoang Le Tuan, N. Nguyen Hoai, M. Chau Van, J. Quetin-Leclercq &Y. Vander Heyden (2015), "Discrimination and classification techniques applied on Mallotus and Phyllanthus high performance liquid chromatography fingerprints", Anal. Chim. Acta, 877 41-50.
28. Jian-Fu Xu, Zi-Ming Feng, Jian Liu &Pei-Cheng Zhang (2008), "New apelta", Chem. coumarinolignoids from Mallotus hepatoprotective Biodiversity, 5 (4), 591-597.
29. Shu Xu, Zhi-Ping Lü, Hong-Bing Cai, Xiao-Gang Zhang, Qiang Liu &Yan Tan (2006), "Inhibiting effects of root of Mallotus apelta on duck hepatitis B virus", Taylor & Francis, 4 (3), 285-288.
30. Bo Zhang, Ling Lai, Yanjun Tan, Qiuyun Liang, Facheng Bai, Wanting Mai, Qiujie Huang &Yong Ye (2020), "Hepatoprotective effect of total flavonoids of Mallotus apelta (Lour.) Muell. Arg. leaf against carbon
tetrachloride-induced liver fibrosis in rats via modulation of TGF-β1/Smad
and NF-κB signaling pathways", Journal of Ethnopharmacology, 254 112714.
PHỤ LỤC
DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT MA1 (vitexin)
Hình 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất MA1
Hình 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất MA1
Hình 3. Phổ HSQC của hợp chất MA1
Hình 4. Phổ HMBC của hợp chất MA1
DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT MA2
(apigenin-7-O-β-D-glucosid)
Hình 5. Phổ 1H - NMR của hợp chất MA2
Hình 6. Phổ 13C - NMR của hợp chất MA2
Hình 7.Phổ HSQC của hợp chất MA2
DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT MA3
(apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid)
Hình 8. Phổ 1H-NMR của hợp chất MA3
Hình 9. Phổ 13C-NMR của hợp chất MA3
Hình 10.Phổ HSQC của hợp chất MA3
