TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THU TRANG
NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật HÀ NỘI - 2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THU TRANG
NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học: TS. CAO BÁ CƯỜNG
HÀ NỘI - 2019
LỜI CẢM ƠN
Bằng tất cả tình cảm của mình em xin gửi lời biết ơn đến thầy giáo
Cao Bá Cường, người đã không quản khó khăn vất vả đã nhiệt tình chỉ dẫn
em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Em cũng muốn gửu lời cám ơn của mình đến những thầy cô trong
khoa Sinh – KTNN nói chung và thầy, cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và
Ứng dụng nói riêng đã tạo điều kiện tốt nhất cũng như tận tình chỉ dẫn em để
em có thể thực hành các bước thí nghiệm để hoàn thiện được khóa luận này.
Vì là lần đầu tiên thực hiện nghiên cứu khoa học, tri thức còn nhiều
yếu kém nên không thể không gặp phải sai sót. Em mong muốn nhận được
thật nhiều những chỉ dạy hữu ích từ các thầy, cô cũng như các bạn để khóa
luận tốt nghiệp của em được chau chuốt và tốt hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thu Trang
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định rằng: đây chính là đề tài dó bản thân thực hiện
dưới sự giúp đỡ của TS. Cao Bá Cường. Những trích dẫn trong khóa luận lấy
từ các công bố chính thức và được ghi chú rõ ràng, mạch lạc. Các số liệu và
kết quả được ghi trong khóa luận là chính xác, không giả dối, không giống khi
được so các kết quả đã từng công bố.
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thu Trang
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Vật liệu cellulose VLC
G. xylinus Gluconacetobacter
Hestrin - Schramm HS
Môi trường 1 (môi trường chuẩn) MT1
Môi trường 2 (môi trường nước dừa) MT2
Môi trường 3 (môi trường nước vo gạo) MT3
Neomycin sunfate NS
Phosphate buffered saline PBS
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................. 3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 3
5. Ý nghĩa khoa ho ̣c và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 3 6. Dự kiến kết quả nghiên cứu ....................................................................... 4
NỘI DUNG ....................................................................................................... 5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 5
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ........................ 5
1.1.1. Cấu trúc của vật liệu cellulose (VLC) .............................................................. 5
1.1.2. Tính chất của màng từ VLC ................................................................. 5
1.1.3. Ứng dụng của màng từ VLC ................................................................ 5
1.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulose................................................................. 6
1.2.1. Vi khuẩn G. xylinus ............................................................................................... 6
1.2.2. Đặc điểm hình thái của G. xylinus .................................................................... 6
1.2.3. Đặc điểm sinh trưởng của G. xylinus ............................................................... 6
1.2.4. Môi trường nuôi cấy G. xylinus .......................................................... 7
1.3. Thuốc Neomycin sunfate ........................................................................ 8
1.3.1. Công thức cấu tạo ..................................................................................................... 8
1.3.2. Tính chất lý học và hóa học ................................................................................. 9
1.3.3. Chỉ định và chống chỉ định ................................................................................... 9
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .......................... 10
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................................. 10
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ................................................................. 11
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 12
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 12
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 12
2.2.1. Chuẩn bị màng từ VLC ........................................................................................ 12
2.2.2. Chế tạo màng từ VLC nạp thuốc Neomycin sunfate ............................... 16
2.2.3. Phương pháp xử lý thống kê .............................................................................. 17
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 18
3.1. Thu màng từ VLC và tinh chế màng .................................................... 18
3.1.1. Thu màng từ VLC từ các môi trường lên men ........................................... 18
3.1.2. Tinh chế màng từ VLC ........................................................................................ 18
3.2. Phương trình đường chuẩn Neomycin sunfate trong PBS (pH= 7,4) ... 19
3.3. Xác định lượng thuốc NS nạp vào màng từ VLC ................................. 19
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 22
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 23
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần của các môi trường lên men thu màng từ VLC ............ 7
Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy G. Xylinus ..................................................... 13
Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4 ................................................ 16
Bảng 3.1. Kết quả thu màng từ VLC tươi (n = 3). .......................................... 18
Bảng 3.2. Tỷ lệ hấp thụ thuốc NS vào màng từ VLC lên men trong môi
trường nước vo gạo ......................................................................... 20
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của neomycin sunfate ......................................... 8
Hình 2.1. Quy trình tạo màng từ VLC tinh khiết ............................................ 14
Hình 3.1. Hình ảnh màng từ VLC sau khi được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm
trung tâm NCKH & CGCN trường ĐHSP Hà Nội 2. ..................... 18
Hình 3.2. Phương trình đường chuẩn. ............................................................. 19
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ở những năm trở lại đây, theo nhiều sự nghiên cứu người ta đã có sự
quan tâm hơn đến vấn đề dùng nguyên vật liệu sinh học trong các loại sản
phẩm chăm sóc sức khỏe nhờ khả năng tái tạo, phân hủy sinh học và tương
thích sinh học của chúng. Một trong số đó có khả năng đáp ứng được những
ưu điểm trên và đang dần phổ biến tới đó là cellulose. Vật liệu này có những
điểm ưu việt hơn so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [12]. Vì vậy,
màng từ vật liệu cellulose (VLC) là đối tượng của các nhà khoa học trong
nước cũng như nước ngoài về nhiều nghiên cứu ứng dụng khoa học và công
nghệ khác nhau. Đây là một loại nguyên liệu mới, được áp dụng rộng rãi
trong tương đối nhiều lĩnh vực khác nhau. Nổi bật là trong lĩnh vực y học,
màng từ VLC đã được ứng dụng làm thuốc chống viêm và giảm đau, ví dụ
như khi bị phong thấp, bị thâm tím, căng bắp thịt, đau thắt lưng cấp và thoái
hoá khớp. Không những vậy, nó còn được sử dụng nhằm chấm dứt các cơn
đau bụng kinh. Tại nước ta, các nghiên cứu và ứng dụng màng từ VLC trong
đời sống vẫn còn khá là mới mẻ.
Cellulose vi khuẩn (CV) được tạo ra từ Gluconacetobacter xylinum có
cấu trúc hóa học không có nhiều điểm khác biệt của cellulose thực vật nhưng
khi xét một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học, khả năng thấm hút
nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả
năng phục hồi độ ẩm ban đầu,... Vì vậy, VLC được ứng dụng trong rất nhiều
lĩnh vực như: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y
học,... đáng quan tâm hơn cả là trong sự kiểm soát các hệ thống vận chuyển
thuốc. VLC đã được dùng như trong một số hệ thống để phân phối thuốc.
Amin et al. đã báo cáo việc sử dụng màng từ VLC làm màng bọc cho
paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả nhận được là
1
màng từ VLC giúp cho thuốc được giải phóng một cách liên tục điều đó giúp
hiệu quả khi dùng thuốc được cao hơn. Gần đây hơn, Huang et al. nghiên cứu
việc dùng màng từ VLC cho việc kiểm soát in vitro của berberine. Ngoài
thẩm thấu qua da, thí nghiệm điều khiển khả năng giải phóng thuốc qua màng
từ VLC còn được thử nghiệm mô phỏng trong dạ dày, ruột. Những kết quả
nhận về đã chỉ ra rằng thuốc được giải phóng không nhanh.
Neomycin Sulfate là chất ưa nước tan trong nước aminoglycoside
kháng sinh và canxi kênh protein chất ức chế liên kết với ức chế ribosome
prokaryotic dịch, và có hiệu quả cao chống lại Gram dương và Vi khuẩn
Gram âm (Waksman, 1950; Xue và cộng sự, 2010). Nó thường được sử dụng
để phòng ngừa vi khuẩn ô nhiễm của các tế bào nuôi cấy và để điều trị ở
nhiều nhiễm trùng mắt, da và đường tiêu hóa (Zejc & Gorczyca, 2002; Patel,
Dave, 2015; Darwhekar, Jain, Choudhary, 2012). Neomycin sulfate ức chế
DNase I gây ra DNA suy thoái (Xue và cộng sự, 2010).
Nước vo gạo là loại chất khá quen thuộc trong đời sống của con
người. Ngoài ra nước vo gạo còn có giá thành rất rẻ và dễ tìm kiếm. Do vậy,
ta nên dùng nước vo gạo để làm môi trường lên men những vi khuẩn quan
trọng cho quá trình nghiên cứu.
Với mục tiêu là nghiên cứu xây dựng được hệ thống VLC nạp thuốc
thuốc giúp Neomycin sunfate vẫn nguyên vẹn trong môi trường acid, làm hạn
chế hơn những tác dụng không mong muốn của thuốc trong việc chữa bệnh.
Vì vậy tôi quyết định lựa chọn đề tài này để nghiên cứu:
“Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Neomycin sulfate của vật liệu
cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường
nước vo gạo”.
2
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc của VLC, tìm ra được những yêu
cầu cần có để màng hấp thụ thuốc ở lượng lớn nhất.
- Tạo màng từ VLC từ môi trường nước vo gạo.
- Xây dựng được hệ thống hấp thụ thuốc Neomycin sunfate vào màng
từ VLC ở một số trường hợp khác nhau về kích thước, độ dày màng, nhiệt độ.
Kiểm định và thấy được khả năng hấp thụ thuốc trong các trường hợp đó.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng và tinh chế màng từ VLC
- Kiểm định được khả năng hấp thụ thuốc từ thí nghiệm đã xây dựng.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng hấp thụ thuốc Neomycin sulfate của
màng từ VLC lên men từ nước vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng -
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
5. Ý nghi ̃a khoa ho ̣c và ý nghi ̃a thư ̣c tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
+ Nghiên cứu tìm hiểu khả năng của màng từ VLC trong việc hấp thụ
thuốc tại chỗ.
+ Đánh giá những khả năng của màng từ VLC hấp thụ thuốc Neomycin
sunfate từ đó có thể định hướng nghiên cứu trên nhiều loại thuốc khác nhau.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
+ Sử dụng màng từ VLC làm hệ thống hấp thụ thuốc Neomycin sulfate
định hướng tạo ra hệ thống giúp giảm bớt được những yếu kém trong việc
điều trị của Neomycin sunfate.
3
+ Từ hệ thống màng từ VLC đã hấp thụ thuốc tìm ra màng hấp thụ
thuốc tốt hơn
6. Dự kiến kết quả nghiên cứu
- Tạo được màng từ VLC từ chủng Gluconacetobacter xylium lên men
từ môi trường nước vo gạo.
- Cung cấp một số thông tin về khả năng giải phóng thuốc Neomycin
sunfate qua màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo.
4
NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Cấu trúc của vật liệu cellulose (VLC)
VLC được cấu tạo từ các chuỗi polyme β-1,4-glucopyranose không
phân nhánh. Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy rằng cấu trúc hóa học
cơ bản của VLC giống cellulose ở thực vật (plant cellulose - PC). Tuy nhiên
chúng cũng không giống nhau về cấu trúc đại thể. Theo AJ. Brown (1886),
VLC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5
nm, kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó, nhiều bó
hợp lại thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 – 8 nm.
1.1.2. Tính chất của màng từ VLC
Màng từ VLC với nhiều tính chất độc đáo sau:
- Mức độ mất nước và để thất thoát nước là kém
- Độ tinh sạch cao
- Có thể dễ dàng bị phân hủy bởi một số vi sinh vật.
1.1.3. Ứng dụng của màng từ VLC
VLC được ứng dụng rộng rãi và phổ biến trong lĩnh vực công nghệ
khác nhau như: công nghiệp dệt, mỹ phẩm, thực phẩm, công nghệ giấy, công
nghệ pin,... đặc biệt ở trong lĩnh vực y học. Trong lĩnh vực y học, màng từ
VLC sau khi thu được từ quá trình nuôi cấy tĩnh được nghiên cứu và sử dụng
làm da nhân tạo. Ở Brazil, màng từ VLC ướt tinh sạch được sản xuất và bán
ra thị trường như một loại da nhân tạo dùng đắp lên các vết thương. Tại
trường Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng
màng từ VLC có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng được thí nghiệm trên thỏ.
5
Kết quả rất khả quan khi màng VLC giúp vết thương lành nhanh và ngăn cản
sự nhiễm trùng của vết thương. Ngoài ra, sản phẩm VLC còn được ứng dụng
làm màng băng vết thương, trong phẫu thuật, ghép mô ghép cơ quan nội tạng.
1.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulose
Cellulose vi khuẩn là sản phẩm của qúa trình tổng hợp của nhiều vi
sinh vật khác nhau nhưng được biết đến hơn cả phải nhắc đến chủng G.
xylinus. Cấu trúc của cellulose sẽ là không giống nhau cho từng loại vi sinh
vật. Chủng G. xylinus là vi khuẩn sinh tổng hợp mang lại kết quả khả quan
nhất và được con người chú trọng nghiên cứu nhiều hơn cả bởi những đặc
tính tốt của nó: tạo lượng cellulose lớn và có cấu trúc cellulose phù hợp cho
nhiều mục đích sử dụng khác nhau.
1.2.1. Vi khuẩn G. xylinus
G. xylinus là vi khuẩn thuộc họ Acetobacteraceae. G. xylinus có khả
năng được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như từ nước hoa quả hay từ
một vài các loại thực vật như cây cọ ở phần lá hay thạch dừa....
1.2.2. Đặc điểm hình thái của G. xylinus
Đặc điểm của G. xylinus có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong. Với
kích thước chiều ngang khoảng 0,6 – 0,8 μm, dài khoảng 2 – 3 μm, vi khuản
không sinh bào tử và thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, không có khả năng di
chuyển, được sắp xếp riêng rẽ thành từng chuỗi nhưng khi tế bào không còn
trẻ hoặc do các nhân tố môi trường nuối cấy thay đổi thì sẽ làm cho hình dạng
có thể bị biến đổi như: bị phình to, phân nhánh hoặc không phân nhánh...
1.2.3. Đặc điểm sinh trưởng của G. xylinus
G. xylinus có thể sử dụng được đa dạng nguồn cacbon không giống
nhau và tùy thuộc vào chủng vi khuẩn mà nguồn đường được sử dụng tốt nhất
cũng khác nhau.
6
Nhiệt độ tối thích để chủng G. xylinus phát triẻn được là từ 25°C đến
30°C và pH từ 5,4 đến 6,3.
Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, khi còn non khuẩn lạc mọc riêng
lẻ, nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già tế bào mọc thành
cụm, và chúng mọc theo đường cấy giống.
G. xylinus không thể chịu được pH cao, do vậy mà con người thường
sẽ bổ sung acid acetic và acid citric vào môi trường nuôi cấy nhằm khắc phục
tối thiểu sự nhiễm khuẩn lạ và làm tăng sự tổng hợp cellulose.
1.2.4. Môi trường nuôi cấy G. xylinus
Môi trường nuôi cấy được tổng hợp từ nhiều nguồn dinh dưỡng quan
trọng như nitơ, cacbon hay sulfua, photpho, các yếu tố vi lượng hay tăng
trưởng. Yêu cầu dùng đường của G. xylinus không hề nhỏ và nó nắm một vai
trò thiết yếu trong quá trình tổng hợp VLC
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn G. xylinus tạo VLC được thể hiện ở
bảng 1.1
Bảng 1.1. Thành phần của các môi trường lên men thu màng từ VLC
Các loại môi trường Thành phần MT1 MT2 MT3
Glucose 20 g 20 g 20 g
Pepton 5 g 10 g 10 g
2,7 g Dinatri phosphat (khan) (Na2HPO4)
Acid citric 1,15 g
Cao nấm men 5g
Nước cất 2 lần 1000 ml
7
Diamoni photphat 0,3 g 0,3 g
Amoni sulfat 0,5 g 0,5 g
Nước dừa già 1000 ml
Nước vo gạo 1000 ml
1.3. Thuốc Neomycin sunfate 1.3.1. Công thức cấu tạo
Công thức phân tử: C23H52N6O25S3
Khối lượng phân tử: 908.866 g/mol
Tên IUPAC: (2R,3S,4R,5R,6R)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-
[(1R,2R,3S,4R,6S)-4,6-diamino-2-[(2S,3R,4S,5R)-4-[(2R,3R,4R,5S,6S)-3-
amino-6-(aminomethyl)-4,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3-hydroxy-5-
(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3-hydroxycyclohexyl]oxyoxane-3,4-
diol;sulfuric acid [10]
Công thức cấu tạo:
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của neomycin sunfate
8
1.3.2. Tính chất lý học và hóa học
Ở dạng tinh khiết, neomycin có màu trắng hay trắng ngà, dễ dàng tan
trong nước nhưng lại khó tan trong ethanol 96% [1], [9]. Quang phổ hấp thụ
của neomycin ở bước sóng 277nm [6]
1.3.3. Chỉ định và chống chỉ định
Thuốc này được sử dụng để làm ngăn cản khả năng nhiễm trùng sau
khi phẫu thuật đường ruột.
Neomycin sulfate được sử dụng tại chỗ để điều trị các bệnh ngoài
da.[1]
Neomycin không được tiêm vào cơ thể vì độc tính của thuốc.
Neomycin cũng có thể sử dụng kết hợp với chế độ ăn đặc biệt để điều
trị một vấn đề nghiêm trọng trong não (bệnh não gan). Tình trạng này được
gây ra bởi sự tạo ra không hề nhỏ một vài chất tự nhiên.[7]
Thuốc này được sử dụng để chữa chứng nhiễm khuẩn. Thuốc sẽ
không thể điều trị cho chứng nhiễm virut. Việc sử dụng không theo chỉ dẫn
của bác sĩ hay sủ dụng 1 cách bừa bãi bất kì kháng sinh có thể làm cho tác
dụng của thuốc không được như mong muốn.
Công dụng của thuốc: chữa trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và mắt
do tụ cầu và các khuẩn khác nhạy cảm, thuốc còn được chỉ định để sát khuẩn
đường ruột trước khi phẫu thuật và làm giảm vi khuẩn tạo NH3 trong ruột khi
bị hôn mê gan.[9]
Tác dụng phụ của thuốc neomycin sunfate:
+ Tai bị nặng hơn so với bình thường, khó tiếp nhận âm thanh bên
ngoài.
+ Cảm giác quang cuồng, cơ thể khó chịu chỉ thấy buồn nôn, muốn
ngất xỉu.
9
+ Khả năng di chuyển, giữ thăng bằng kém
+ Tê hoặc ngứa ran dưới làn da
+ Co giật cơ, động kinh ( co giật )
+ Đi tiểu kém so với thường ngày hay đi tiểu không được
+ Thèm ngủ, đầu óc hay quên, cảm xúc vui buồn thất thường, hay
uống nước, không muốn ăn, buồn nôn.
+ Sưng, khối lượng cơ thể tăng , cảm thấy khó thở
+ Thở kém.
+ Đau dạ dày nghiêm trọng, tiểu chảy nước hoặc có máu.[7]
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
VLC là sản phẩm được tạo ra từ loài vi khuẩn Gluconacetobacter
xylinus (G. xylinus). Vi khuẩn G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu
khí bắt buộc, hóa dưỡng thuộc chi Acertobacter, họ Acetobacteraceae. Chúng
được tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi khuẩn
này trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng
cellulose thuần khiết và được gọi là màng Bacterial Cellulose.
Màng từ VLC do G. xylinus tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ
hoc với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất lý hóa đặc biệt
như: độ bền, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng
thấm hút nước cao, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì vây, màng từ VLC được
coi là nguồn polymer mới, là một giải pháp trên con đường tìm nguồn nguyên
liệu mới hiện nay.
Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều
trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau. Tác giả Brown, 1989, dùng màng từ
VLC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang
đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989), Jonas và Farad
10
(1998) dùng màng như là một chất để chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các
sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay
thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng từ VLC đã được ứng
dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm
mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con
người.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng từ VLC còn ở mức
độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên
cứu. Các kết quả ứng dụng của màng từ VLC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều
kiện thí nghiệm.
Trong những năm gần đây Phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được G. xylinus
BHN có khả năng tạo màng từ VLC và những nghiên cứu cho thấy màng từ
VLC từ chủng G. xylinus BHN có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là
cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người.
Tại Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Thanh cùng
nhóm nghiên cứu đã thành công với đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng
cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”.
11
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Neomycin sunfate ( 98%) xuất sứ từ Trung Quốc
- Dung môi là NaOH 0,1M và chất phản ứng khác được cung cấp từ
Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng – Trường ĐHSP Hà Nội 2.
- Màng từ VLC lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus).
- Cân kỹ thuật (Sartorius - TE612).
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ).
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức).
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh).
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA.
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức) và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng
khác.
- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng từ VLC:
Đường glucose, Peton, Diamoni photphat, Amoni sunfat, axit citric, NaOH,
HCL, … Đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị màng từ VLC
2.2.1.1. Tạo màng VLC thô
Tạo màng từ VLC từ môi trường HS. Quá trình lên men thu màng từ
VLC thô được thực hiện theo các bước sau: [6], [9].
Bước 1: Chuẩn bị môi trường theo bảng 2.1.
12
Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy G. Xylinus
Thành phần Khối lượng
1000 ml Nước vo gạo
20 g Glucose
2 g KH2PO4
3 g (NH4)2SO4
Pepton 4 g
Acid acetic 5 ml
10% dịch giống G. xylinus
Bước 2: Hấp khử trùng môi trường 113°C trong 15 phút.
Bước 3: Lấy môi trường nước vo gạo ra khử trùng bằng tia cực tím
trong 15 phút rồi để nguội môi trường.
Bước 4: Bổ sung tối thiểu 10% dịch giống và 2% axit acetic, lắc cho
giống phân bố đều trong dung dịch.
Bước 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng bình, ủ tĩnh trong khoảng 6 – 8
ngày ở 26°C.
Bước 6: Thu màng từ VLC thô.
2.2.1.2. Tạo màng từ VLC tinh khiết
Xử lý màng từ VLC thô để thu màng từ VLC tinh khiết theo quy trình
hình 2.1
13
Tách màng từ VLC thô
Ép loại nước
Ngâm trong NAOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCL 3%
48 giờ, rửa và ép
VLC tinh khiết
Hình 2.1. Quy trình tạo màng từ VLC tinh khiết
2.2.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC tinh chế
Kiểm tra mức độ tinh khiết của màng nhằm để chắc chắn rằng màng từ
VLC sau khi xử lý đã được loại các tạp chất. Những tạp chất được khảo sát là
glucose, protein của vi khuẩn và dư lượng pepton trong môi trường nuôi cấy.
2.2.1.4. Xác định các tiêu chuẩn của màng từ VLC tinh chế sử dụng chế tạo
màng nạp thuốc
Màng từ VLC tinh chế dùng để tạo màng nạp thuốc neomycin phải đạt
được những tính chất sau:
Quan sát ta thấy: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da,
có tính che phủ tốt do có khả năng cản khuẩn.
Độ ẩm phù hợp, có thể hút nước và dịch mô.
14
Để đạt các tiêu chuẩn này cần khảo sát:
Độ dày thích hợp của lớp màng từ VLC thô.
Độ ẩm thích hợp của màng từ VLC sau khi đạt các tiêu chuẩn về độ
tinh khiết.
Tất cả các thông số này sẽ được khảo sát đồng thời để xác định thông
số thích hợp nhất,...
Khảo sát khả năng cản vi khuẩn của màng từ VLC tinh chế
Khảo sát khả năng cản khuẩn của màng từ VLC và so sánh với vải gạc
vô trùng. Dùng các tấm thạch dinh dưỡng là môi trường phù hợp cho các vi
khuẩn và nấm mốc phát triển. Chia các hộp petri chứa môi trường thạch dinh
dưỡng tiêu chuẩn (môi trường Soybean - casein) thành 3 lô. Chọn màng từ
VLC tinh chế ngẫu nhiên từ các lô thí nghiệm khác nhau. Dùng các loại màng
thử nghiệm che phủ bề mặt các bản thạch:
Lô 1: sử dụng gạc vô trùng.
Lô 2: sử dụng màng từ VLC
Lô 3: lô đối chứng, không phủ màng.
Sau đó, các bản thạch đã phủ màng này được dùng thử nghiệm trong 2
điều kiện:
Thử nghiệm 1: sử dụng 1ml huyền trọc các vi khuẩn Streptococcus
hemolyticus, E. coli trải lên bề mặt của mỗi loại màng ở các lô trên và giữ
trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Sau đó màng được lấy ra và quan sát lượng vi
khuẩn mọc bên dưới màng.
Thử nghiệm 2: để hở các hộp thạch có phủ màng ngoài không khí trong
24 giờ, nơi có nhiều người qua lại, sau đó một nửa số hộp được đưa vào tủ
ấm 37oC ủ trong 48 giờ. Quan sát kết quả bằng cách lật màng và quan sát sự
phát triển của vi khuẩn trên bản thạch. Một nửa số bản thạch còn lại để ở
nhiệt độ phòng trong 7 ngày để quan sát khả năng phát triển của nấm mốc.
15
2.2.2. Chế tạo màng từ VLC nạp thuốc Neomycin sunfate
2.2.2.1. Chuẩn bị bộ đệm
Môi trường đệm Phosphate buffered saline (PBS) [7] được chuẩn bị với
các thành phần và cách pha được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4
Hóa chất Cách pha
Thành phần Khối lượng
Cho hóa chất vào cốc đong. NaCl 0,8 g Thêm đến mức 800 ml bằng nước cất.
KCl 0,2 g Điều chỉnh pH tới 7,4 bằng HCl.
Bổ sung nước tới 1000 ml. 1,44 g Na2HPO4.12H2O
Khử trùng.
0,22 g Na2HPO4
2.2.2.2. Xây dựng đường chuẩn NS
Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại UV để ghi mật độ quang hấp
thụ của thuốc NS
Sử dụng màng gạo với các độ dày khác nhau 0,3; 0,5 ( cm). Với mỗi
độ dày khác nhau của màng lại được hấp thụ ở 1giờ; 1,5 giờ; 2 giờ.
Sử dụng dung môi là PBS (pH = 7,4). Đo UV ở bước sóng 277 nm
(bước sóng hấp thụ cực đại của NS). Ghi kết quả thu được và dựng đường
chuẩn của mẫu.
2.2.2.3. Xác định lượng NS nạp vào màng từ VLC
Dùng máy đo quang phổ UV – 2450 xác định lượng thuốc có trong
dung dịch sau các khoảng thời gian khác nhau, từ đó xác định lượng thuốc
nạp vào màng bằng cách:
(1) mht = m1 – m2 (mg)
16
Trong đó:
mht: khối lượng thuốc đã được hấp thu vào màng.
m1: khối lượng thuốc ban đầu trong dung dịch.
m2: khối lượng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời gian nhất
định màng hấp thu thuốc.
Đánh giá hiệu quả thuốc nạp vào màng được tính theo công thức:
EE (%) = x 100% (2)
Trong đó:
EE (%) là hiệu quả nạp thuốc NS của màng BC.
mht (mg/cm3) là khối lượng thuốc hấp thụ trong 1 đơn vị thể tích
màng.
M0 (mg/cm3) là khối lượng thuốc có trong 1 đơn vị thể tích dung dịch
ban đầu.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại trong ba lần.
2.2.3. Phương pháp xử lý thống kê
Phân tích thống kê về sự khác biệt trong các tính chất xác định của
nhóm được thực hiện qua việc sử dụng Excel với những phân tích một chiều
của phương sai và việc xác định khoảng tin cậy. Các kết quả nghiên cứu được
trình bày dưới dạng “số trung bình ± SD”. Những khác biệt được coi là có ý
nghĩa thống kê khi giá trị p =< 0,05. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3
lần. Sử dụng phần mềm DDsolver để sử lý số liệu, phần mềm Excel giúp xử
lý hình ảnh và sơ đồ [5].
17
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thu màng từ VLC và tinh chế màng
3.1.1. Thu màng từ VLC từ các môi trường lên men
Muốn thu màng từ VLC với các độ dày 0,3 - 0,5 cm ta tiến hành từ dịch
nuôi cấy tĩnh G. xylinus sau khoảng 6, 8 ngày. ( hình 3.1).
Hình 3.1. Hình ảnh màng từ VLC sau khi được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm trung tâm NCKH & CGCN trường ĐHSP Hà Nội 2. Màng từ VLC thô được tạo ra với màu trắng ngà, không khó để tách
ra khỏi môi trường nuôi cấy, nhiều nước, có thể chất dẻo dai.
Tiến hành đo kích thước độ dày và đường kính các loại màng bằng
thước kẻ, ta đã thu được kết quả kích thước màng theo bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả thu màng từ VLC tươi (n = 3).
Thời gian nuôi Độ dày môi Độ dày màng thu Lô Kí hiệu cấy (ngày) trường (ml) được (cm)
Màng số 1 6 200 0,3 ± 0,0006 1
Màng số 2 8 200 0,5 ± 0,0012 2
3.1.2. Tinh chế màng từ VLC
Màng từ VLC thô chứa không ít vi khuẩn G. xylinus và môi trường
nuôi cấy cùng những chất chuyển hóa trong quá trình lên men. Quá trình tinh
18
chế nhằm phân tách các tạp chất như pepton, đường còn lại trong môi trường
nuôi cấy và vi khuẩn còn nằm trong màng để thu màng từ VLC tinh chế.
Hiệu quả của quá trình tinh chế được đánh giá dựa vào các phản ứng
hóa học xác định sự có mặt của đường, protein và quan sát dưới kính hiển vi
quang học và kính hiển vi điện tử cho thấy không còn sự có mặt của vi khuẩn
trong màng. Màng từ VLC tinh chế phải có màu trắng trong và không bị thay
đổi màu khi xử lý bằng nhiệt độ cao.
3.2. Phương trình đường chuẩn Neomycin sunfate trong PBS (pH= 7,4)
Đo mật độ quang của các nồng độ NS khác nhau bằng máy quang
phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản) tại phòng thí nghiệm Trung tâm
NCKH & CGCN trường ĐHSP Hà Nội 2, sau đó xử lý bằng phần mềm Excel
cho kết quả phương trình đường chuẩn NS là (hình 3.2): y =0,1574x – 0,0027
R2 = 0,9995
OD277nm
0.05
e t a f l
y = 0.1574x - 0.0027 R² = 0.9995
0.04
u s n
0.03
) l
OD277nm
0.02
Linear (OD277nm)
m / g m
(
0.01
i c y m o e n c ố u h t
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Mật độ hấp thụ OD 277nm
ộ đ g n ồ N
Hình 3.2. Phương trình đường chuẩn.
3.3. Xác định lượng thuốc NS nạp vào màng từ VLC
Tỷ lệ hấp thụ NS vào màng từ VLC được tính theo công thức (3) và
kết quả được trình bày vào bảng 3.3
19
Bảng 3.2. Tỷ lệ hấp thụ thuốc NS vào màng từ VLC lên men trong môi
trường nước vo gạo
Thời
Thời
Độ dày
gian
Thông số
gian
mht
màng
hấp
EE (%)
m2 (mg)
màng
nuôi cấy
(mg/cm3)
(cm)
thụ
(ngày)
(giờ)
h: 0,5cm
0,2831
1,7169
85,84
1
1
d: 9,5cm
± 0,0010
± 0,0010
± 0,0485
S: 70,846cm2
0.2495
1,7505
87.53
1
6
0
1,5
6
0,3
V: 35,423cm3
± 0,0009
± 0,0009
± 0,0451
0,2476
1,7524
87,62
2
2
± 0,0006
± 0,0010
± 0,03
0,2457
1,7543
87,72
8
1
1
± 0,0008
± 0,0008
± 0,0412
8
0,2537
1,7463
87,31
1
0
1,5
0,5
± 0,00052
± 0,0005
± 0,0261
0,2522
1,7478
87,39
2
2
± 0,00064
± 0,00064
± 0,031
8
Chú thích:
h: Chiều dày màng
d: đường kính màng
20
S: diện tích màng
V: thể tích màng
Kết quả cho thấy màng lên men từ môi trường có cao nấm men có tỷ
lệ hấp thụ thuốc cao hơn các loại màng lên men từ môi trường nước dừa và
nước gạo. Kết quả này cũng thấy tương tự trong nghiên cứu của tác giả Diêm
Thị Thùy Dung [2], Ngô Thị Duyên [3]. Bên cạnh đó, nguyên cứu của
Nguyễn Văn Thanh và cộng sự [10] cho thấy trong cấu trúc mạng của VCL
lên men từ môi trường cao nấm men có tỷ lệ đồng nhất cao hơn màng VCL
lên men từ môi trường nước dừa và môi trường nước gạo. Do trong môi
trường cao nấm men có đầy đủ dinh dưỡng thích hợp cho vi khuẩn G. xylinus
sinh trưởng, còn nước dừa vẫn có nhiều tạp chất khác, môi trường nước vo
gạo thiếu một số chất thiết yếu nên vi khuẩn sinh trưởng tạo màng có cấu trúc
các sợi xellulose còn vặn xoắn hay vón cục, dẫn đến khả năng hấp thụ thuốc
thấp hơn màng CNM cùng kích cỡ.
Đối với màng lên men trong môi trường nước vo gạo có độ dày
0,5cm có tỷ lệ hấp thụ thuốc thấp hơn màng có độ dày 0,3cm ở tất cả các loại
màng. Điều này có thể giải thích rằng: màng có dày hơn thì đường đi của
thuốc vào màng dài hơn nên trong cùng khoảng thời gian hấp thụ thì màng có
độ dày 0,3cm hấp thụ thuốc nhanh hơn, đạt tỷ lệ cao hơn.
21
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Từ những kết quả thu được qua nghiên cứu, chúng tôi thu được những
kết quả sau:
- Thu được màng từ VLC tinh khiết với độ dày 0,3 cm và 0,5 cm thích
hợp với các thí nghiệm đắp trên da.
- Màng từ VLC lên men trong môi trường nước vo gạo có độ dày
0.3cm có khả năng hấp thụ thuốc tốt nhất.
2. Kiến nghị
Mở rộng nghiên cứu tiềm năng của màng từ VLC trong lĩnh vực hấp
thụ thuốc qua da trên một số loại dược phẩm khác.
22
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tài liệu tiếng Việt
[1]. Bộ Y tế (2009), “Dược Điển Việt Nam IV”, NXB Hà Nội 2009
[2]. Bộ Y tế (2013), “Danh mục thuốc tân dược thiết yếu lần thứ VI”,
pp.18
[3]. Phan Thị Thu Hồng và cộng sự (2015),“Sử dụng cellulose tổng
hợp vi khuẩn Acetobacter xylinum để chế tạo vật liệu nhựa composite sinh
học trên nền nhựa polyvinyl alcohol”, Tạp chí phát triển KH&CN, 18 (4):
114-124.
[4]. Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Tường An (2008), “ Thu nhận
Bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định
trên chất mang Cellulose vi kuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi
sơ chế tối thiểu, tạp chí Scien & Technology Development, 11 (9).
[5]. Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh. “Nghiên cứu các đặc
tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị
bỏng”. Tạp chí Dược học số 361/2006, trang 18-20.
[6]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh
(2012), “Nghiên cứu vi khuẩn A. xylinum tạo màng Bacteril Cellulose ứng
dụng trong điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 50 (4), 453-462.
[7]. Đinh Thị Kim Nhung (1998), “Tối ưu hóa thành phần môi trường
dinh dưỡng cho Acetobacter xylinum bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 36(1), 10 – 12.
[8]. Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose
trị bỏng từ Acetobactor xylinum”, đềtài KH&CN cấp Bộ Y tế.
[9]. Nguyễn Xuân Thành, “Đánh giá sự hấp thu Famotidine của
Cellulose được tạo ra từ Acetorbacter Xylinum trong một số môi trường nuôi
cấy”. Tạp chí Khoa học & Công nghệ, 180(04), 199 – 204.
23
2.Tài liệu tiếng Anh
[10]. Anjali. et. al (2016), “ A study of chitosan nanofibers containing
neomycin sulfate for wound healing activity”, 8(11), 128 – 139.
[11]. A suprriya, J Sundaraseelan, BR Srini Murthy and M Bindu
Priya, (2018), “Formulation and Invitro Characterization of Neomycin
Loaded Chitosan Nanoparticles”, Acta scientific pharmaceutical sciences.
[12]. Amin M.C.I.M. et al. (2012), "Bacterial cellulose film coating as
drug delivery system: physicochemical, thermal and drug release properties",
Journal of Sain Malaysiana, 41, 561-568.
[13]. Ataklti Abraha, AV Gholap, Abebe Belay, (2016), “Study Self-
association, Optical Transition Properties and Thermodynamic Properties of
Neomycin Sulfate Using UV-Visible Spectroscopy”, Intermational Journal of
Biophysics, 6(2), 16-20.
[14]. Hanif Ullah, He ́lder A. Santos, Taous Khan, (2016),
“Applications of bacterial cellulose in food, cosmetics and drug delivery”
24
