‘’’
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== ĐỖ HOÀNG LAN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
OMEPRAZOLE NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
HÀ NỘI - 2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== ĐỖ HOÀNG LAN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
OMEPRAZOLE NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học
ThS. Ngô Thị Hải Yến
HÀ NỘI - 2019
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Ngô Thị Hải Yến – người đã truyền cảm hứng, động lực cũng như bảo ban em trong quãng thời gian làm khóa luận.
Em cũng xin gửi tới các thầy giáo, cô giáo, cán bộ, công nhân viên của Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 nói chung cũng như của khoa Sinh – KTNN nói riêng lời cảm ơn chân thành nhất.
Để gặt hái được thành quả như ngày hôm nay, không thể không nhắc đến sự giúp đỡ, động viên và luôn luôn ủng hộ của gia đình, thầy cô, bạn bè đã giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
Vì em mới lần đầu tham gia nghiên cứu khoa học nên trong quá trình thực hiện vẫn còn nhiều bỡ ngỡ, thiếu sót. Em mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn để em hoàn thành khóa luận một cách tốt hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Đỗ Hoàng Lan
LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đề tài khóa luận tốt nghiệp này do chính em thực hiện qua quá trình nghiên cứu thực tiễn dưới sự dạy dỗ, chỉ bảo của cô Ngô Thị Hải Yến. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong khóa luận này là chính xác, không trùng khớp với các kết quả của các tác giả đã công bố trước đây.
Nếu những điều em nói trên đây là sai, em xin chịu hoàn toàn mọi trách
nhiệm.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Đỗ Hoàng Lan
MỤC LỤC
PHẦN MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích của nghiên cứu .............................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................... 3
5. Tính mới của đề tài ........................................................................................ 3
PHẦN NỘI DUNG .......................................................................................... 4
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN .......................................................................... 4
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter xylinus trong sinh giới ..................................................................................................................... 4
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter xylinus trong sinh giới ......... 4
1.1.2. Đặc điểm phân loại .............................................................................. 4
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái, tế bào học ...................................................... 4
1.1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá ............................................................. 5
1.1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy ......................................................................... 5
1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus ........... 6
1.2. Giới thiệu về màng BC ............................................................................... 7
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của màng BC ......................................................... 7
1.2.2. Cấu trúc kết tinh màng BC................................................................... 8
1.2.3. Tính chất của màng BC ........................................................................ 8
1.2.4. Đặc tính của màng BC ......................................................................... 9
1.2.5. Ứng dụng của BC ................................................................................. 9
1.3. Tổng quan về thuốc .................................................................................... 9
1.3.1. Tên khoa học và cấu tạo ....................................................................... 9
1.3.2. Loại thuốc và dạng thuốc ................................................................... 10
1.3.3. Tính chất lý hóa.................................................................................. 10
1.3.3.1. Lý tính .......................................................................................... 10
1.3.3.2. Hoá tính ........................................................................................ 10
1.3.4. Dược lý và cơ chế tác dụng ................................................................ 10
1.3.5. Dược động học ................................................................................... 11
1.3.6. Tác dụng của thuốc ............................................................................ 11
1.3.7. Tác dụng phụ của thuốc ..................................................................... 11
1.4. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu ......................................... 12
1.4.1. Tình hình nghiên cứu màng BC ......................................................... 12
1.4.1.1. Trên thế giới ................................................................................. 12
1.4.1.2. Trong nước ................................................................................... 12
1.4.2. Tình hình nghiên cứu về Omeprazole natri ....................................... 13
1.4.2.1. Trên thế giới ................................................................................. 13
1.4.2.2. Trong nước ................................................................................... 14
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................ 15
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15
2.1.1. Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu .............................. 15
2.1.2. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 15
2.2. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 15
2.3. Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian .............................................. 15
2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 16
2.4.1. Phương pháp chế tạo màng BC .......................................................... 16
2.4.1.1. Lên men tạo màng BC từ môi trường nước vo gạo ..................... 16
2.4.1.2. Xử lý vật liệu BC trước khi hấp thụ thuốc .................................. 17
2.4.1.3. Xác định pH của vật liệu BC tinh chế ......................................... 17
2.4.1.4. Xác định lượng vật liệu BC tạo thành ......................................... 17
2.4.1.5. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu BC ........................................ 18
2.4.2. Quét phổ hấp thụ của thuốc Omeprazole natri .................................. 19
2.4.3. Chế tạo màng BC nạp thuốc .............................................................. 19
2.4.3.1. Xây dựng đường chuẩn của thuốc Omeprazole natri .................. 19
2.4.3.2. Nạp thuốc Omeprazole natri vào màng BC ................................. 20
2.4.5. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu BC......................... 20
2.4.6. Phương pháp xử lý thống kê .............................................................. 21
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 22
3.1. Tạo màng BC và thu màng BC thô từ môi trường nước vo gạo .............. 22
3.2. Tinh chế màng BC ................................................................................... 23
3.3. Quét phổ và xây dựng phương trình đường chuẩn của thuốc .................. 23
3.4. Đường chuẩn hấp thụ của thuốc Omeprazole natri .................................. 24
3.5. Hấp thụ thuốc vào màng BC .................................................................... 26
3.6. Kết quả hấp thụ thuốc của màng BC lên men từ nước vo gạo ................ 26
CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................. 29
4.1. Kết luận .................................................................................................... 29
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 30
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc của BC ................................................................................ 8
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Omeprazole ................................................ 10
Hình 3.1: Màng BC được tạo ra từ môi trường nước vo gạo .......................... 22
Hình 3.2: Màng BC với các độ dày khác nhau ............................................... 22
Hình 3.3: Màng BC tinh chế ........................................................................... 23
Hình 3.4: Phổ hấp thụ tử ngoại của thuốc Omeprazole natri .......................... 24
Hình 3.5: Phương trình đường chuẩn của thuốc Omeprazole natri ................ 25
Hình 3.6: Nạp thuốc vào màng BC ................................................................. 26
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo ........................................ 6
Bảng 2.1: Môi trường lên men màng BC ........................................................ 16
Bảng 2.2: Các thí nghiệm hấp thụ thuốc ......................................................... 20
Bảng 3.1: Mật độ quang của dung dịch thuốc ở các nồng độ (n = 3) ............. 24
Bảng 3.2: Giá trị OD trung bình của màng BC khi hấp thụ thuốc (n = 3)...... 26
Bảng 3.3: Khối lượng thuốc hấp thụ và hiệu suất hấp thụ của màng BC trong 2 giờ (n = 3) ..................................................................................................... 27
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ Tên viết tắt
Cellulose vi khuẩn BC
Gluconacetobacter xylinus G.xylinus
Acetobacter xylinum A.xylinum
Optical Density OD
Vòng/phút v/p
PHẦN MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Thế kỷ 21 – là thế kỷ phát triển đỉnh cao của công nghệ trong đó có công nghệ sinh học. Một trong các lĩnh vực của công nghệ sinh học mà hiện nay người ta đang tiến hành thực nghiệm đó chính là nghiên cứu kỹ thuật sinh y dược học của một số loại thuốc trên một loại màng sinh học được gọi tắt là màng BC.
Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi sinh vật hóa dưỡng, thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc. Khi đem chủng vi khuẩn này nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng, sau một thời gian sẽ xuất hiện một lớp màng trên bề mặt của môi trường. Lớp màng này đó chính là màng cellulose được tạo ra từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter hay còn gọi là màng sinh học BC.
Cấu trúc cellulose có ở đa số thực vật có thể coi như là lớp màng bảo vệ cho thực vật. Ở một số loài vi khuẩn cũng có khả năng sản sinh ra cellulose ví dụ điển hình như chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus. Tuy có cùng cấu trúc cellulose nhưng cấu trúc cellulose ở vi khuẩn lại khác xa so với cấu trúc cellulose ở thực vật. Cellulose vi khuẩn có những đặc tính vượt trội hơn mà ở cellulose thực vật không có. Một số đặc tính có thể kể đến như: Cellulose vi khuẩn có khả năng thấm hút nước cao, độ bền cơ học tốt, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao hơn cellulose của thực vật,… Chính những đặc tính trên đã tạo nên một cellulose vi khuẩn với cấu trúc độc đáo. Vì vậy, người ta đã ứng dụng các đặc tính của màng BC vào nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ thực phẩm, công nghệ nano, y học,…
Một trong những bệnh phổ biến thường gặp ở con người có thể kể đến là đau dạ dày. Khi xã hội ngày càng phát triển, hiện đại hơn thì đi kèm với nó cũng là sự phát triển của các ngành khoa học. Đặc biệt, trong lĩnh vực y học đã nghiên cứu ra rất nhiều loại thuốc có khả năng hạn chế cũng như chữa trị các bệnh về dạ dày và Omeprazole natri cũng là một trong những thuốc có khả năng đó.
1
Đây là nhóm thuốc có khả năng ức chế bơm proton. Omeprazole natri điều trị được các bệnh liên quan đến dạ dày và thực quản. Khi sử dụng thuốc
này, nó có tác dụng làm giảm lượng axit do dạ dày tiết ra, giảm các triệu chứng ợ nóng cũng như ho dai dẳng. Đồng thời, omeprazole natri có khả năng ngăn ngừa các vết loét dạ dày, chữa lành các tổn thưởng do axit gây ra trong dạ dày và thực quản,…. Bên cạnh việc có khả năng chống lại nhiều bệnh nhưng omeprazole natri lại có một số hạn chế có thể kể đến như: không bền trong môi trường axit, dễ bị sinh biến đổi ở gan và có thể cuất hiện một số tác dụng phụ khi sử dụng thuốc đó là: buồn nôn, hắt hơi, ợ nóng, sốt,…
Có thể thấy nước vo gạo là sản phẩm dễ kiếm, giá thành rẻ, xuất phát từ tự nhiên. Ngoài ra, trong thành phần của nước vo gạo chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, có các vitamin thuộc nhóm B và E và một số thành phần có lợi khác. Do đó, nước vo gạo có thể coi là môi trường phát triển tương đối thuận lợi cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus.
Để khắc phục những hạn chế của omeprazole natri cũng như việc tăng cường hiệu suất của thuốc, người ta đã tiến hành nghiên cứu để tạo ra màng BC từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus. Đó là lí do em chọn đề tài “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc omeprazole natri của vật liệu
cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước vo gạo”
2. Mục đích của nghiên cứu
Nghiên cứu việc sử dụng màng BC để hấp thụ thuốc Omeprazole natri,
nhờ đó có thể giảm tối đa các hạn chế của thuốc.
Tạo điều kiện cho chủng vi khuẩn G.xylinus phát triển trong môi trường
nước vo gạo. Từ đó thu được màng BC và tiến hành nạp thuốc vào màng.
Tìm ra được điều kiện nào lượng thuốc hấp thu vào màng BC đạt hiệu
quả cao nhất.
3. Nội dung nghiên cứu
Tạo màng BC và tinh chế màng trước khi tiến hành các thí nghiệm.
Tiến hành nạp thuốc vào màng BC.
Khảo sát sự hấp thụ thuốc của màng BC để từ đó tìm ra điều kiện nào
2
là tối ưu nhất.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Các sản phẩm có nguồn gốc từ BC đem lại rất nhiều hiệu quả cho con
người.
Trong điều kiện môi trường nuôi cấy tĩnh, có thể đánh giá khả năng hấp thụ thuốc Omeprazole natri của màng BC. Từ đó, giảm bớt các hạn chế của thuốc giúp cho hiệu quả sử dụng thuốc tăng cao.
Sau khi khảo sát được khả năng hấp thụ thuốc của màng BC trên thuốc
omeprazole natri, có thể tiến hành nghiên cứu trên các loại thuốc khác.
Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu việc sử dụng màng BC để hấp thụ thuốc trong phòng thí nghiệm từ đó giảm được những hạn chế không cần thiết khi nghiên cứu Omeprazole natri dạng thương mại.
Sau khi tiến hành nghiên cứu, có thể giảm giá thành của vật liệu, giúp
cho người nghèo vẫn có thể mua được.
5. Tính mới của đề tài
Cung cấp các thông số về khả năng hấp thụ thuốc Omeprazole natri của
màng BC.
Sau khi khảo sát được khả năng hấp thụ thuốc của màng BC trên thuốc
3
Omeprazole natri, có thể tiến hành nghiên cứu trên các loại thuốc khác.
PHẦN NỘI DUNG
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter xylinus trong sinh giới
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter xylinus trong sinh giới
Theo hệ thống danh pháp quốc tế 1990, Acetobacter xylinum là tên gọi
chính thức.
Theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology” (1957) thuộc họ
“Acetobacter xylinum được xếp vào chi Acetobacter, Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes”. [12]
Đến năm 1974, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology”, “Acetobacter xylinum lại được coi như là một loài phụ của Acetobacter aceti, thuộc chi Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc”. [13]
Năm 1984 theo Bergey [2], Acetobacter xylinum được xếp vào chi Acetobacter, thuộc họ Acetobacteraceae. Họ vi khuẩn này gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter.
Theo Bergey (2005) [14], Acetobacter xylinum được đổi tên thành Gluconacetobacter xylinus và xếp vào chi Gluconacetobacter thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae. Họ này gồm 6 chi: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconobacter, Gluconacetobacter và Kozakia.
1.1.2. Đặc điểm phân loại
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái, tế bào học
G.xylinus có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, có thể di động hoặc không. Nhóm vi khuẩn này không có khả năng sinh bào tử, thường đứng riêng lẻ hoặc tập hợp với nhau thành một chuỗi. Khi tế bào nhuộm Gram, các đặc điểm nhuộm có thể thay đổi. Điều này có thể giải thích là do các tế bào của vi khuẩn già đi hay do sự thay đổi của môi trường.
4
Khi chất dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy không đủ hoặc đã cạn
kiệt, G.xylinus sẽ biến đổi hình thái của mình thành các dạng khác nhau để thích nghi với điều kiện sống. Tuy nhiên, nếu quá trình này diễn ra trong thời gian dài sẽ dẫn đến các chủng vi khuẩn bị thoái hóa, các hoạt tính sinh học của vi khuẩn bị giảm một cách đáng kể.
Khuẩn lạc của G.xylinus có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. [3], [8]
1.1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
Đặc điểm sinh lý:
Điều kiện thuận lợi cho G.xylinus phát triển là nhiệt độ từ 25-35C với
pH khoảng 4-6. Tuy nhiên, ngay cả khi điều kiện môi trường thuận lợi, các tế
bào của vi khuẩn vẫn sẽ suy thoái khi nhiệt độ môi trường cán mức 37C.
Vì chủng G.xylinus thuộc nhóm vi khuẩn chịu được axit, nên trong môi trường nuối cấy thường có thêm axit axetic. Sự có mặt của axit này giúp cho các vi khuẩn khó có khả năng nhiễm khuẩn lên các môi trường nuôi cấy.
Đặc điểm sinh hoá:
Có khả năng oxi hóa etanol thành axit axetic, CO2 và H2O.
Tạo thành các bọt khí khi phản ứng với catalase.
Có khả năng chuyển hóa đường glucozo thành axit gluconic, đồng thời
giúp chuyển hóa các phân tử glyxerol thành dihidroaxeton.
Không sinh sắc tố nâu.
1.1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy
Sau một thời gian khi nuôi cấy trên môi trường thạch sẽ hình thành các khuẩn lạc G.xylinus nhẵn hoặc xù xì. Phần rìa của khuẩn lạc có thể gợn sóng hoặc bằng phẳng, màu trong suốt hoặc trắng. Có thể dễ dàng tách các khuẩn lạc khỏi môi trường nuôi cấy vì chúng thường lồi trên bề mặt môi trường.
5
Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng trong điều kiện tĩnh, sau một thời gian trên bề mặt của môi trường dần hình thành một lớp màng sinh học – màng BC. Ngược lại, trong điều kiện nuôi cấy lắc sẽ tạo ra cellulose dạng hạt
với các kích thước khác nhau và phân tán trong môi trường. Vì cấu trúc của cellulose trong từng điều kiện là khác nhau nên đặc tính của chúng trong từng điều kiện cũng là không giống nhau. [12], [18]
1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus
Môi trường thích hợp để chủng vi khuẩn G.xylinus sinh trưởng, phát triển là môi trường tổng hợp có đầy đủ các chất dinh dưỡng thiết yếu như: C, N, S, P,... Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng và các yếu tố tăng trưởng cũng tạo điều kiện cho quá trình sinh trưởng phát triển của vi khuẩn thuận lợi hơn.
Nhu cầu sử dụng đường của G.xylinus là rất lớn, do đó một số sản phẩm như nước dừa già, rỉ đường,... đã được đề xuất làm nguyên liệu nuôi cấy cho G.xylinus.
Nước vo gạo là sản phẩm dễ kiếm, giá thành rẻ, xuất phát từ tự nhiên. Ngoài ra, trong thành phần của nước vo gạo chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, có các vitamin thuộc nhóm B và E và một số thành phần có lợi khác như Fe, Cu, Zn, các axit amin,…. Do đó, nước vo gạo có thể coi là môi trường phát triển tương đối thuận lợi cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus.
Tuy nhiên, không nên sử dụng nước vo gạo khi đã để quá 3 giờ. Do khi để quá lâu dẫn đến tình trạng nước vo gạo bị chua, hàm lượng các chất trong nước vo gạo sẽ bị giảm.
Thành phần chất dinh dưỡng của nước vo gạo được thể hiện ở bảng 1.1.
Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo
Thành phần Khối lượng 100g
Calori 316KJ
Tổng hợp lipit 22g
Chất béo bão hòa 4g
Chất xơ tiêu hóa được 21g
Cacbohydrat 28g
6
Đường 0,9g
Protein 12g
Vitamin E 5mg
Vitamin B6 4mg
Vitamin B1 0,96mg
Canxi 57mg
Thành phần khác
1.2. Giới thiệu về màng BC
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của màng BC
Cellulose vi khuẩn được cấu tạo bởi một chuỗi polime gồm các glucopyranose nối với nhau nhờ liên kết β-1,4-glucan. Tại mỗi điều kiện muôi cấy khác nhau, cấu trúc của BC cũng sẽ khác nhau. Tuy có cùng cấu trúc cellulose nhưng cấu trúc cellulose ở vi khuẩn lại khác so so với cấu trúc cellulose ở thực vật. Cellulose vi khuẩn có những đặc tính vượt trội hơn mà ở cellulose thực vật không có. Một số đặc tính có thể kể đến như: Cellulose vi khuẩn có khả năng thấm hút nước cao, chịu nhiệt tốt, độ bền cơ học tốt, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao hơn cellulose của thực vật, không độc, không gây dị ứng với người sử dụng,…[4]
7
Năm 1886, Brown là nhà khoa học đầu tiên tiến hành tạo màng BC được sản xuất từ vi khuẩn G.xylinus. Theo ông, màng BC được cấu tạo bởi các sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose với đường kính là 1.5nm. Các sợi hemicellulose sẽ tập hợp lại tạo thành một bó. Các bó này lại kết hợp với nhau tạo thành các dãy dài khoảng 100nm, đường kính từ 3-8nm.
Hình 1.1: Cấu trúc của BC
1.2.2. Cấu trúc kết tinh màng BC
Ngày nay, các cấu trúc của BC và dạng kết tinh của cellulose đã được xác định nhờ các kỹ thuật như phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
Trong màng BC gồm có hai loại cấu trúc tinh thể đó là Iα và Iβ. Khi nghiên cứu trong cấu trúc của các sợi cellulose, đều thấy sự xuất hiện của các cấu trúc tinh thể này. Ở cellulose thực vật, các tinh thể Iβ đã có thể thu được hầu hết còn các tinh thể Iα thì ngược lại. Các tinh thể Iα có nhiều trong cấu trúc của BC ( khoảng 64-71%) hơn là trong cấu trúc của các cellulose thực vật (khoảng 20%). [16]
Cấu trúc tinh thể đóng vai trò quyết định các tính chất của cellulose. Tuy nhiên đến hiện tài các đề tài nghiên cứu về mối quan hệ giữa các đặc tính của cellulose và cấu trúc tinh thể của nó vẫn chưa có nhiều.
1.2.3. Tính chất của màng BC
- Màng BC trong suốt, khi sờ vào có cảm giác mềm mại, trơn nhẵn do
có tỉ lệ Iα cao.
- Sức căng, độ bền, độ dai của màng BC tốt, chịu được lực kéo cao.
- Có khả năng hấp thụ nước, giữ nước cao gấp nhiều lần so với trọng
lượng của chính nó.
8
- Tính đến thời điểm hiện tại, là loại màng sinh học không chứa các thành phần như ligin và hemicellulose. Vì vậy, màng BC có thể bị phân hủy hoàn toàn.
- Khối lượng nhẹ, khả năng chịu nhiệt tốt. [5]
- Quan sát màng BC trên kính hiển vi điện tử cho thấy màng có các sợi
cellulose rất nhỏ, mảnh, đồng nhất, liên kết chặt chẽ với nhau. [3]
1.2.4. Đặc tính của màng BC
Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường tĩnh, bề mặt của môi trường sẽ hình thành nên một lớp màng mỏng. Lớp màng này sau khi tinh chế, làm khô sẽ tạo thành sảm phẩm mỏng như giấy có độ dày 0.01-0.5nm.
Một số đặc tính có thể kể đến của màng BC như: có khả năng đàn hồi tốt, khả năng hút và thấm nước cao, chịu được nhiệt, có thể bị phân hủy nhờ các vi sinh vật, khi sử dụng không gây kích ứng, không gây độc cho con người, đặc biệt là màng BC có khả năng cản khuẩn khá tốt. Chính các đặc tính này của màng BC mà ngày nay người ta đã ứng dụng màng BC vào trong rất nhiều các lĩnh vực khác nhau. [3], [8]
1.2.5. Ứng dụng của BC
Một số ứng dụng của màng BC như:
Sử dụng màng BC giúp cho quá trình xử lí nước thải diễn ra dễ dàng hay dùng màng BC để tiến hành nạp thuốc vào màng từ đó giảm bớt hạn chế của một số loại thuốc. [19]
Chế tạo ra mặt nạ dưỡng da cho con người, làm mặt nạ nhân tạo, điều trị các bệnh về tim mạch, làm da tạm thời để thay thế được da trong khi bị bỏng. Ngoài ra có thể sử dụng màng BC để tạo màng nano bọc thuốc. [7], [19]
1.3. Tổng quan về thuốc
1.3.1. Tên khoa học và cấu tạo
- Tên chung quốc tế: Omeprazole
- Tên theo danh pháp IUPAC: 5- methoxy- 2-[[(4 - methoxy - 3,5 -
dimethyl – 2 - pyridinyl) methyl] sulfinyl] - 1H - benzimidazole.
9
- Công thức phân tử: C17H19N3O3S
- Phân tử khối: 345,4
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Omeprazole
1.3.2. Loại thuốc và dạng thuốc
- Loại thuốc: thuộc nhóm thuốc có khả năng ức chế bơm proton, chống
loét dạ dày, tá tràng.
- Dạng thuốc: [1]
+ Viên nang đến ruột mới tan 1mg - 20mg.
+ Lọ bột tiêm 40mg kèm ống dung môi 10ml.
+ Viên bao phim 10 - 20mg.
1.3.3. Tính chất lý hóa
1.3.3.1. Lý tính
Thuốc có dạng bột, màu nâu nhạt. Khó tan trong nước, tan trong dung dịch dicloromethan, tan ít trong ethanol 96% và methanol và tan nhiều trong kiềm loãng. Nóng chảy ở khoảng 1550C kèm theo sự phân huỷ. [6], [9]
1.3.3.2. Hoá tính
Là hợp chất tồn tại ở dạng lưỡng tính, hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại. Các tính chất này ứng dụng trong định tính, định lượng và bào chế thuốc. Độ pH quyết định sự ổn định của omeprazole. Khi cho thuốc vào môi trường kiềm, nó khá bền vững; ngược lại, đối với môi trường axit, nó dễ dàng bị phân hủy. [6]
1.3.4. Dược lý và cơ chế tác dụng
10
Omeprazole là một dẫn xuất của benzimidazole không có hoạt tính ức chế enzym ở môi trường trung tính, nhưng ở pH ≤ 5 Omeprazole được proton
hoá thành 2 dạng acid sulphenic và sulphenamic. Hai chất này gắn thuận nghịch với nhóm sulfohydryl của enzym H+ - K+ - ATPase ở tế bào thành nên ức chế bài tiết acid trên 48 giờ. [6]
1.3.5. Dược động học
Omprazole natri sẽ làm ức chế dạ dày tiết dịch vị do nó có khả năng ức chế các bơm proton. Thuốc hấp thụ tốt nhất ở ruột non sau khoảng từ 3-6 giờ. Sinh khả dụng sau khi uống liều đầu tiên đạt khoảng 35% và đạt tới trên 60% sau khi dùng vài liều. [1]
Liệu lượng sử dụng thuốc quyết định đến khả năng hấp thụ của thuốc. Omeprazole natri liên kết cao với các phân tử protein huyết tương và phân bố đến các mô đặc biệt tại các tế bào thành dạ dày. Chỉ sau 40 phút sử dụng, nồng độ thuốc trong cơ thể đã giảm đi một nửa. Tuy nhiên thuốc có tác dụng ức chế bài tiết kéo dài nên mỗi ngày chỉ cần dùng một lần. [1]
Hầu như chuyển hóa hoàn toàn tại gan, bị đào thải một cách nhanh chóng, chủ yếu qua nước tiểu (80%), phần còn lại theo phân. Một số chất chuyển hóa tuy không có hoạt tính lại tương tác với nhiều thuốc khác do tác dụng ức chế enzyme của cytocrom P450 của tế bào gan. [1]
Với người già hoặc những người thận suy giảm chức năng thì các dược động học không có ý nghĩa. Đối với những người gan bị suy giảm chức năng, sinh khả dụng của thuốc tăng, thời gian bán thải của thuốc giảm đáng kể, nhưng trong cơ thể không thấy sự tích lũy thuốc. [1]
1.3.6. Tác dụng của thuốc
- Điều trị bệnh loét dạ dày – tá tràng.
- Chữa lành các tổn thương dạ dày và tá tràng do axit gây nên.
- Điều trị hội chứng Zollinger - Ellison.
1.3.7. Tác dụng phụ của thuốc
11
Tác dụng phụ thường gặp nhất là buồn ngủ, đau đầu, chóng mặt, rối loạn tiêu hóa. Nặng hơn có thể phát ban, ngứa, một số trường hợp bị rụng tóc, mất ngủ. Nặng nhất có thể gây có thắt phế quản, rối loạn thần kinh, rối loạn
về thị giác, đau cơ, đau khớp,…
1.4. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu
1.4.1. Tình hình nghiên cứu màng BC
1.4.1.1. Trên thế giới
Năm 1989, Brown đã dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, chế tạo vải đặc biệt. Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự (2006) dùng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định protêin hay cho sắc kí. [4]
Không chỉ vậy, màng BC cũng được sử dụng trong việc làm đẹp cho con người. Hamlyn và cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs, (2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã đượng đăng kí bản quyền về làm màng BC từ Acetobacter xylinum dùng trị bỏng. Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ. [4]
1.4.1.2. Trong nước
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng màng BC trong quá trình trị bỏng ngày càng đạt hiệu quả cao. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã có một số công trình nghiên cứu về màng BC từ Acetobacter xylinum và bước đầu nghiên cứu về các đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam. [8]
12
Phương pháp điều trị bỏng từ các loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên đem lại nhiều đặc tính tốt trong việc chữa các vết thương, vết loét và phương pháp đã được áp dụng từ lâu đời. Màng BC cũng có thành phần từ tự nhiên, cho nên việc sử dụng màng BC có thể đem lại nhiều hiệu quả trong việc điều trị bỏng. [11]
Đề tài “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng” của các tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2012) kết quả cho thấy màng BC tạo bởi Acetobacter xylinum BNH2 tổng hợp có sợi cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển vọng ứng dụng làm màng trị bỏng. [3]
1.4.2. Tình hình nghiên cứu về Omeprazole natri
1.4.2.1. Trên thế giới
Hiện nay, nhiều tác giả đã nghiên cứu thực nghiệm hiệu quả của thuốc omeprazole natri trong điều trị các bệnh về dạ dày. Và kết quả nhận được khá khả quan, omeprazole natri là thuốc có hiệu lực giảm tiết acid mạnh, cho hiệu quả giảm triệu chứng nhanh, tỉ lệ lành loét cao.
Không chỉ nghiên cứu hiệu quả của việc sử dụng thuốc, các đề tài nghiên cứu nhằm đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn HP có chứa omeprazole natri qua các phác đồ điều trị khác nhau cũng ngày một nhiều hơn. Sau khi nghiên cứu, cho thấy tính kháng thuốc của vi khuẩn là yếu tố quyết định nhiều nhất đến hiệu suất tiêu diệt HP do đó cần lưu ý đánh giá tính kháng thuốc trước khi lựa chọn phác đồ sử dụng cho bệnh nhân. [14]
Năm 1973 khi các nghiên cứu về cimetidine được thông báo, các nhà khoa học thụy điển đã nảy ra ý định gắn vòng Benzylimidazol vào chất này với hy vọng tạo ra một hợp chất mới có tác dụng kháng acid mạnh hơn. Timoprazole ra đời năm 1975 có tác dụng ức chế bài tiết acid khá mạnh và đã xác định được tác dụng này là do sự bất hoạt enzym H+, K+/ATPase.
Tiếp theo đó hàng loạt các thay đổi về công thức hóa học để đến năm 1979 Omeprazole đã dược tổng hợp và được giới thiệu rộng rãi tại hội nghị tiêu hóa toàn thế giới ở Rome 1988 để rồi sau đó được sử dụng rất phổ biến trên lâm sàng.
13
Một số đề tài nghiên cứu liên quan đến thuốc omeprazole như: “Formulation, Characterisation and Stabilisation of Buccal Films for Paediatric Drug Delivery of Omeprazole”. Sajjad Khan, Joshua S. Boateng, John Mitchell and Vivek Trivedi, AAPS PharmSciTech January 2015,
“Preparation and evaluation of floating microspheres of omeprazole microspheres by solvent evaporation method”, Ramya Shivani B. and Krishna Sailaja A, International Journal Available, August 2015,… tuy nhiên hướng ứng dụng tăng sinh khả dụng của thuốc omeprazole natri trên màng BC vẫn còn ít người nghiên cứu.
1.4.2.2. Trong nước
Phùng Thị Vinh, Trịnh Văn Lẩu (2007), Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học viên nang Helinzole (Omeprazol 20G) theo mô hình đơn liều kết hợp đa liều, Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế; Nguyễn Nam Hương (2009), Nghiên cứu bào chế viên nang chứa pellet omeprazol tan trong ruột,...
14
Trần Hữu Giáp, Văn Thị Mỹ Huệ, Cao Thị Huệ, Nguyễn Thị Minh Hằng, Nguyễn Văn Hùng, Châu Văn Minh, Lê Nguyễn Thành, Tạp chí Dược học, T. 55, S. 2 (2015), “Nghiên cứu tổng hợp thuốc ức chế bơm proton omeprazol” đã nghiên cứu thành công tổng hợp omeprazol trong phòng thí nghiệm qua 2 bước tạo chất trung gian sulfid 3 và oxy hóa sulfid tạo omeprazol.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn G.xylinus được mua từ Nhật Bản.
- Thuốc omeprazole natri (95%) xuất sứ từ Ấn Độ.
- Dung môi là dung dịch NaOH 0,1M
- Các hóa chất được cung cấp từ Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng
dụng - Trường ĐHSP Hà Nội 2.
- Màng BC được lên men từ chủng vi khuẩn G.xylinus trong môi trường
nước vo gạo.
2.1.2. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus).
- Cân kỹ thuật (Sartorius - TE612).
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ).
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức).
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh).
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA.
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức).
- Các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.2. Đối tượng nghiên cứu
Khả năng hấp thụ omeprazole natri của các loại vật liệu BC được tạo ra
từ nước vo gạo bằng phương pháp lên men.
2.3. Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian
15
Phạm vi nghiên cứu: thực hiện trên quy mô phòng thí nghiệm.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh lí người và động vật - Viện Nghiên
cứu Khoa học và Ứng dụng – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Thời gian: Tháng 10-2018 đến tháng 4-2019
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp chế tạo màng BC
2.4.1.1. Lên men tạo màng BC từ môi trường nước vo gạo
Bước 1: Chuẩn bị môi trường lên men chủng vi khuẩn theo bảng 2.1
Bảng 2.1: Môi trường lên men màng BC
Thành phần Môi trường gạo
Glucose 20g
Pepton 10g
Diamoni photphat 0,3g
Amoni sulfat 0,5g
Axit axetic 2%
Nước vo gạo 1000ml
Dịch giống 10%
Lưu ý: Đo và hiệu chỉnh pH trong khoảng từ 4-6 băng HCl hoặc
NaOH. Trong điều kiện pH thấp sẽ tránh sự lây nhiễm từ các vi khuẩn khác.
Bước 2: Đem môi trường vừa pha hấp khử trùng trong nồi hấp khử
trùng HV-110/HIRAIAMA Ở 113C trong 15 phút.
Bước 3: Sau khi hấp xong, khử trùng môi trường bằng tia UV trong 15
phút rồi để nguội.
Bước 4: Thêm 10% dịch giống vào môi trường, đem lắc đều để cho
16
dịch giống phân bố hoàn toàn trong dung dịch.
Bước 5: Chuyển dịch sang bình nuôi cấy theo kích thước nghiên cứu, bịt kín miệng của dụng cụ nuôi cấy để tránh nhiễm khuẩn, để trong điều kiện tĩnh trong khoảng 4 - 14 ngày ở 280C.
Bước 6: Khi màng đạt độ dày cần nghiên cứu, tiến hành thu màng và
rửa sạch.
2.4.1.2. Xử lý vật liệu BC trước khi hấp thụ thuốc
- Mục đích: Màng BC sau khi thu chứa rất nhiều tạp chất, do vậy việc xử lí màng BC có tác dụng loại bỏ các tạp chất giúp cho hiệu suất hấp thụ thuốc cao hơn, đồng thời phá hủy và trung hòa các độc tố của vi khuẩn.
- Phương pháp: Sau một thời gian nuôi cấy trong điều kiện tĩnh, thu
được màng BC với các độ dày cần thiết.
+ Màng BC chứa một lượng lớn tạp chất do vậy đem hấp vật liệu trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng sẽ làm cho thành tế bào của vi khuẩn bị phá vỡ đồng thời nội độc tố được giải phóng.
+ Sau khi ngâm NaOH, xả màng dưới vòi nước cho đến khi trắng trong. Kiểm tra bằng quỳ tím nếu màng đạt trung tính là được, thu được BC tinh khiết. [4], [19]
2.4.1.3. Xác định pH của vật liệu BC tinh chế
pH của màng BC sau khi tinh chế phải đạt mức trung tính .Tiến hành đo
pH của dịch chiết bằng máy đo pH.
Cho vào bình nón theo tỉ lệ (Khối lượng/thể tích).
Đem bình để vào máy lắc ở nhiệt độ phòng, sau 3 giờ lấy một lượng
dịch chiết ở bình rồi tiến hành đo pH [8], [10].
2.4.1.4. Xác định lượng vật liệu BC tạo thành
Vật liệu BC sau khi được tạo thành sẽ thông qua các công đoạn xử lí để
17
tạo thành BC tinh chế.
Vật liệu BC tinh chế được đặt lên cân sau đó dùng giấy thấm thấm đi
50% hàm lượng nước trong vật liệu BC và khối lượng vật liệu BC tạo thành.
2.4.1.5. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu BC
- Mục đích: Kiểm tra xem vật liệu BC sau khi tinh chế còn chứa các tạp chất hay không bằng cách kiểm tra xem có sự xuất hiện của đường glucozo và protein trong vật liệu.
Tìm sự hiện diện của glucose trong vật liệu BC tinh chế
- Nguyên tắc: Kiểm tra bằng thuốc thử Fehling. Nếu có kết tủa nâu đỏ,
chứng tỏ vật liệu vẫn còn đường glucozo [3].
- Tiến hành:
+ Chuẩn bị 4 ống nghiệm, ống 1 chứa nước cất, ống 2 chứa dụng dịch đường glucozo, ống 3 và ống 4 lần lượt chứa dịch chiết của màng 0.5 cm và 1cm sau khi đã xử lí hóa học.
+ Nhỏ vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch Fehling, ngâm trong cốc
nước nóng.
+ Quan sát hiện tượng trong từng ống nghiệm. Nếu không xuất hiện kết tủa nâu đỏ chứng tỏ màng BC đã được tinh sạch. Ngược lại, nếu xuất hiện kết tủa thì màng BC vẫn còn protein và đem tiếp tục xả nước.
Tìm sự hiện diện của protein trong vật liệu BC tinh chế
- Nguyên tắc: Kiểm tra bằng axit triclo axetic. Nếu có kết tủa, chứng tỏ
còn sót protein.
- Tiến hành:
+ Cắt nhỏ vật liệu BC rồi cho vào 50ml nước cất, lắc trên máy rung
trong 10 phút.
+ Chuẩn bị 3 ống nghiệm, ống 1 chứa nước cất, ống 2 và ống 3 lần lượt
chứa dịch chiết của màng 0.5cm và 1cm.
18
+ Nhỏ dung dịch acid triclor acetic 1% vào từng ống nghiệm, lắc đều.
+ Quan sát hiện tượng, nếu thấy không có xuất hiện kết tủa chứng tỏ màng BC đã được tinh sạch. Ngược lại, nếu xuất hiện kết tủa thì màng BC vẫn còn protein và đem tiếp tục xả nước.
Vật liệu BC sau khi tinh chế phải đạt điều kiện:
+ Vật liệu khi cầm phải có sự mềm mại, dẻo dai, mỏng, khả năng che
phủ tốt.
+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và thấm nước tốt. [15]
2.4.2. Quét phổ hấp thụ của thuốc omeprazole natri
Đem cân 2mg thuốc vào 100ml dung môi NaOH 0.1M. Trong khoảng bước sóng 200 nm đến 400 nm, sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis 2450 để tìm bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc omeprazole natri.
2.4.3. Chế tạo màng BC nạp thuốc
2.4.3.1. Xây dựng đường chuẩn của thuốc Omeprazole natri
Phương pháp: Dùng máy quét quang phổ UV-Vis
Sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru - Nhật Bản) để đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến. Máy bao gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 - 800nm. Sử dụng hai cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ± 0,005cm. Các cuvet đo được làm sạch và thao tác cẩn thận. [19]
Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng là NaOH 0,1M.
Chuẩn bị mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau: Pha dung dịch thuốc ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 0,1mg/ml; 0,2mg/ml; 0,4mg/ml; 0,6mg/ml; 0,8mg/ml và 1mg/ml. Dung môi là NaOH 0,1M.
Tiến hành đo OD của các dung dịch ở bước sóng cực đại bằng máy đo
quang phổ.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc
19
omeprazole natri để xây dựng đường chuẩn của thuốc Omeprazole natri.
Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có
dạng: y = ax + b với R2 là hệ số tương quan
Trong đó: y: Giá trị OD của dung dịch tại λmax
x: nồng độ của dung dịch
Dựng đường chuẩn và phương trình đường chuẩn của thuốc bằng
Microsoft Excel.
2.4.3.2. Nạp thuốc Omeprazole natri vào màng BC
Màng BC sau tinh chế, tiến hành nạp thuốc vào màng. Cho màng BC vào bình 100ml gồm có 20ml dung dịch NaOH 0,1M vào 30mg thuốc omeprazole natri. Sau đó, đặt bình vào máy lắc trong từng trường hợp như ở bảng 2.2. Sau khoảng thời gian 1 giờ, 2 giờ lần lượt rút các dung dịch chiết ở từng bình. Sau đó tiến hành đo quang phổ trên máy UV-2450 để xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng.
Bảng 2.2: Các thí nghiệm hấp thụ thuốc
Nhiệt độ
Đường kính Độ dày của màng Chế độ lắc (vòng/phút) Trường hợp
0.5 cm 100 v/p 40C Trường hợp 1 1 cm 1.5 cm 0.5 cm 120 v/p 50C Trường hợp 2 1 cm
2.4.5. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu BC
Màng BC được hấp thụ thuốc bằng phương pháp hấp thụ sau khi đã
được làm sạch.
Sử dụng vật liệu BC được tạo ra từ nước vo gạo có kích thước đường
kính 1.5cm và độ dày 1cm, 0.5cm, hấp thụ thuốc theo thí nghiệm bảng 2.2.
Lưu ý : Khi cho màng vào hấp thụ phải loại bỏ 50% nước của màng sau
20
đó mới cho màng vào hấp thụ.
Sau khi tham khảo các nghiên cứu ta đã xác định được nhiệt độ và chế
độ lắc tốt nhất cho màng hấp thụ thuốc omeprazole natri.
Sau các mốc thời gian, rút dịch chiết ra cho vào từng lọ nhỏ, rồi thực hiện đo quang phổ bằng máy UV - Vis 2450 để xác định lượng thuốc còn lại trong dung dịch tại thời điểm mà ta tiến hành lấy mẫu. [19]
Sau khi đo quang phổ bằng máy UV - Vis 2450, xác định được nồng độ thuốc, lượng thuốc đã được màng BC hấp thụ sau 1 khoảng thời gian (m2) từ đó tính lượng thuốc hấp thụ vào màng BC theo công thức 1.
(1) mht = m1 - m2 (mg)
Trong đó: mht: khối lượng thuốc đã được hấp thu vào vật liệu (mg)
m1: khối lượng thuốc ban đầu trong dung dịch (mg)
m2: khối lượng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời
gian nhất định vật liệu hấp thu thuốc (mg)
Hiệu suất thuốc nạp vào vật liệu BC được tính theo công thức 2. [19]
EE (%) = x 100% (2)
Trong đó: EE: Hiệu suất thuốc nạp vào vật liệu (%)
Qt: Khối lượng thuốc lí thuyết (mg)
Qd: Khối lượng thuốc còn lại (mg)
2.4.6. Phương pháp xử lý thống kê
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 để xử lí số liệu thống kê,
phân tích phương sai và xác định khoảng tin cậy.
21
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình, các kết quả được trình bày theo giả định trung bình và độ lệch chuẩn “MEAN ± SD”. Những số liệu chỉ có ý nghĩa thống kê khi p ˂ 0.05.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo màng BC và thu màng BC thô từ môi trường nước vo gạo
Khi nuôi cấy ở điều kiện tĩnh tại nhiệt độ phòng, vi khuẩn G.xylinus sẽ sử dụng các chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy để sinh trưởng và phát triển.
Sau khoảng 7-10 ngày, trên bề mặt của môi trường sẽ hình thành nên
màng BC. Thời gian nuôi cấy dài hay ngắn sẽ quyết định độ dày của màng.
Hình 3.1: Màng BC được tạo ra từ môi trường nước vo gạo
Một khoảng thời gian sau khi màng đạt độ dày 0.5cm và 1cm, thu
màng, rửa sạch.
Màng BC thô với độ dày 1cm Màng BC thô với độ dày 0.5cm
22
Hình 3.2: Màng BC với các độ dày khác nhau
Màng được tạo thành có tính chất dai, nhẵn; màu trắng ngà, khả năng
hút nước và thấm nước tốt.
3.2. Tinh chế màng BC
Sau khi xử lí màng, tiến hành đục màng theo khuôn với đường kính
1.5cm sau đó hấp thụ thuốc vào màng.
Màng BC tinh chế với độ dày 0.5cm Màng BC tinh chế với độ dày 1cm
Hình 3.3: Màng BC tinh chế
Quan sát hình ta có thể thấy, màng BC sau khi xử lí sạch hơn và trắng hơn. Màng BC sau khi tinh chế có sự mềm dẻo, độ bền và độ đàn hồi tốt, hút nước tốt.
3.3. Quét phổ và xây dựng phương trình đường chuẩn của thuốc
23
Quét phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thuốc từ bước sóng 200nm đến 400nm, kết quả tìm được hai cực đại hấp thụ của thuốc tại bước sóng 275nm (OD = 1,214) và 305nm (OD = 2,069) thể hiện ở hình 3.4.
Đ ộ hấ p th ụ qu an g
Bước sóng (nm)
Hình 3.4: Phổ hấp thụ tử ngoại của thuốc Omeprazole natri
Kết quả tìm ra bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc tương tự như kết quả
ghi trong Dược điển Việt Nam là bước sóng 276nm và 305nm.
3.4. Đường chuẩn hấp thụ của thuốc Omeprazole natri
Sử dụng kết quả đo giá trị OD để xây dựng đường chuẩn của thuốc
omeprazole natri.
Bảng 3.1: Mật độ quang của dung dịch thuốc ở các nồng độ (n = 3)
Giá trị OD tại 275 Giá trị trung bình C% Lần 1 Lần 3 Lần 2
10% 0.053 0.054 0.054±0.0015 0.056
20% 0.275 0.274 0.274±0.0006 0.274
40% 0.517 0.516 0.516±0.001 0.515
60% 0.742 0.744 0.742±0.0015 0.741
80% 0.968 0.967 0.967±0.0006 0.967
24
100% 1.21 1.212 1.211±0.0012 1.212
g n a u q ụ h t p ấ h ộ Đ
Nồng độ phần trăm Omeprazole natri (mg/ml)
Hình 3.5: Phương trình đường chuẩn của thuốc Omeprazole natri
Phương trình đường chuẩn của thuốc omeprazole natri là:
y = 0.2311x – 0.1817 (R2 = 0.9998) (3)
Trong công thức (3):
y: Giá trị OD tương ứng với nồng độ x
x: Nồng độ % Omeprazole natri (mg/ml)
25
R2: Hệ số tương quan
3.5. Hấp thụ thuốc vào màng BC
Quá trình hấp thụ thuốc vào màng được thể hiện ở hình dưới đây
Hình 3.6: Nạp thuốc vào màng BC
3.6. Kết quả hấp thụ thuốc Omeprazole natri của màng BC lên men từ nước vo gạo
Bảng 3.2: Giá trị OD trung bình của màng BC khi hấp thụ thuốc (n = 3)
Thời gian hấp thụ
Trường hợp Đường kính Độ dày màng Nhiệt độ 1 giờ 2 giờ
1 cm 0.867±0.001 0.726±0.0012 40C
Trường hợp 1 0.5 cm 0.711±0.001 0.63±0.0015 40C 1.5 cm 1 cm 0.836±0.0008 0.736±0.001 50C
Trường hợp 2 0.5 cm 0.845±0.0005 0.67±0.0016 50C
Qua kết quả đo giá trị OD ở bảng 3.2 có thể thấy rằng sau khi ngâm màng BC trong dung dịch thuốc omeprazole natri 2 giờ thì giá trị OD không đổi ở cả màng 1cm và màng 0.5cm. Điều đó cho thấy màng BC đã hấp thụ đến giá trị cực đại.
Từ giá trị OD tại bảng 3.2, thay giá trị OD vào phương trình đường
26
chuẩn (3) từ đó tìm ra nồng độ % của thuốc omeprazole natri.
Dựa vào công thức tính C% = , tính được khối lượng
thuốc Omeprazole natri có trong dung dịch hay chính là tính đc Qd.
Lấy khối lượng thuốc ban đầu trong dung dịch trừ đi Qd sẽ ra được
lượng thuốc omeprazole natri hấp thụ vào màng BC (mht).
Sau khi tính được mht thay vào công thức (2), từ đó tính được hiệu suất
hấp thụ thuốc vào màng.
Lượng thuốc omeprazole natri hấp thu vào màng sau 2 giờ với từng độ
dày khác nhau được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.3: Khối lượng thuốc hấp thụ và hiệu suất hấp thụ của màng BC trong 2 giờ (n = 3)
y Qd (mg) mht (mg) EE(%) Điều kiện Qt (mg) Độ dày màng
0.63 7.76 22.24 74.15 30 0.5 cm 40C ±0.0015 ±0.0021 ±0.0015 ±0.005
0.726 11.16 18.84 62.81 100v/ p 1 cm 30 ±0.0012 ±0.001 ±0.0016 ±0.0026
0.67 9.33 20.67 68.91 30 0.5 cm 50C ±0.0016 ±0.0027 ±0,0021 ±0.0017
0.736 11.54 18.46 61.52 120v/ p 1 cm 30 ±0.001 ±0.007 ±0.0024 ±0.0023
Từ kết quả của bảng 3.3 ta thấy màng có độ dày khác nhau, điều kiện
lắc khác nhau thì hiệu suất hấp thụ thuốc là không giống nhau.
Ở chế độ lắc lắc 100v/p trong 40C dù là màng dày 0.5cm hay 1cm thì
27
luôn có hiệu suất hấp thụ cao hơn so với trong điều kiện 50C với chế độ lắc
120v/p. Kết quả sau khi tiến hành thực nghiệm cũng tương tự kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Xuân Thành. [19]
Cùng độ dày là 0,5cm, khối lượng thuốc hấp thụ vào màng ở 100v/p
trong 40C là 22.24mg nhiều hơn ở điều kiện hấp thụ thuốc tại điều kiện 50C
với chế độ lắc 120v/p là 20.67mg và hiệu suất hấp thụ thuốc đạt 74.15% cao hơn 5.21% so với điều kiện còn lại.
Tương tự ở độ dày là 1cm, lượng thuốc hấp thụ vào màng ở 100v/p
trong 40C là 18.84mg nhiều hơn ở điều kiện hấp thụ thuốc tại điều kiện 50C
với chế độ lắc 120v/p là 18.46mg và hiệu suất hấp thụ thuốc đạt 62.81%, trong khi điều kiện còn lại là 61.52%.
Nguyên nhân do khi lắc mạnh (120 v/p), những phân tử thuốc sẽ bị đẩy ra khỏi màng nhiều hơn. Do vậy, lượng thuốc hấp thụ vào màng sẽ ít hơn khi lắc nhẹ hơn 100 vòng/phút.
Trong 4 thí nghiệm, màng có độ dày 0.5 cm luôn có sự hấp thụ thuốc cao hơn so với màng có độ dày 1cm hay có thể nói màng dày thì hiệu suất hấp thụ thuốc nhỏ hơn màng mỏng. Điều này có thể giải thích rằng: đối với những màng mỏng thì các phân tử thuốc dễ dàng khuyếch tán vào màng hơn do ở màng dày thì các sợi cellulose liên kết với nhau một cách chặt chẽ, còn màng mỏng thì ngược lại. Chính vì vậy đã làm cho các phân tử thuốc khó đi vào các màng có kích thước dày hơn, từ đó làm cho hiệu suất hấp thụ giảm đáng kể.
Từ thí nghiệm thực tiễn có thể rút rằng: màng BC lên men từ môi trường nước vo gạo có hiệu suất hấp thụ thuốc tốt nhất tại màng BC có độ dày
0.5 cm với chế độ lắc 100v/p ở điều kiện 40C. Tại điều kiện này màng BC có
28
khả năng hấp thụ là 22.24 ± 0.0015(mg) với hiệu suất cao nhất đạt 74.15±0.005.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Tạo được màng BC với độ dày 0.5 cm và 1 cm để tiến hành nạp thuốc
Omeprazole natri.
Trong các thí nghiệm ở 2 trường hợp, sự hấp thụ của thuốc đạt hiệu
suất cao nhất là 74.15% trong điều kiện ở nhiệt độ 40C với chế độ lắc
100v/p, nồng độ thuốc làm 30mg/ml với độ dày màng 0.5 cm.
Ngược lại, sự hấp thụ của thuốc đạt hiệu suất thấp nhất là 61.52%
trong điều kiện ở nhiệt độ 50C với chế độ lắc 120v/p, nồng độ thuốc làm
30mg/ml với độ dày màng 1 cm.
Qua thí nghiệm, có thể thấy màng có kích thước 0.5 cm có khả năng
hấp thụ thuốc cao so với màng có độ dày 1cm.
4.2. Kiến nghị
So sánh khả năng hấp thụ thuốc Omeprazole natri từ các môi trường
nuôi cấy khác nhau.
Tiến hành nghiên cứu khả năng hấp thụ của một số loại thuốc khác trên
29
môi trường nước vo gạo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam.
2. Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật, Nxb ĐHQG Hà Nội,
tr. 1-50.
3. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thuỳ Vân, Trần Như Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ (50), trang 453- 462.
4. Đặng Thị Hồng (2007), “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học (BC)”, Luận án thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội.
5. Nguyễn Xuân Thành, Triệu Nguyên Trung, Phan Thị Huyền Vy, Bùi Minh Thy, Phùng Thị Kim Huệ, (2018) “Tối ưu hóa hiệu suất nạp thuốc famotidin của vật liệu cellulose vi khuẩn lên men từ dịch trà xanh theo phương pháp đáp ứng bề mặt và mô hình Box-Behnken”, Tạp chí dược học (501), trang 3.
6. Phạm Tiệp và Vũ Ngọc Thúy (2009), Thuốc biệt dược và cách sử
dụng, NXB Y Hà Nội, trang 639.
7. Nguyễn Thị Nguyệt (2008), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial Cellulose làm mặt nạ dưỡng da”, Luận án thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội.
8. Nguyễn Văn Thanh (Chủ nhiệm) (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng
cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”, Đề tài KH&CN cấp Bộ, Bộ Y tế.
9. Trường Đại học Dược Hà Nội (2003), Bộ môn Hóa dược, Hóa dược
tập 2, trang 30 - 31.
30
10. Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan (2006), “Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng”, Tạp chí Dược học, 361: 18 - 20.
11. Trần Như Quỳnh (2009), “Nghiên cứu một số đặc tính vật lý của màng BC từ Acetobacter xylinum, ứng dụng trong trị bỏng”, Luận văn thạc sĩ vi sinh học ĐHSP Hà Nội.
Tài liệu nước ngoài
12. Alina Krystynowicz, Marianna Turkiewicz, Stanislaw Bielecki, Emilia Klemenska, Aleksander Masny, Andrzej Plucienniczak (2005). Molecularbasis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum, Acta biochimica polonica, Vol. 52, pp. 691-698.
13. Barbara Surma - S’lusarska, Sebastion, Presler, Danielewicz (2008) Characteristics of Bacterial Cellulose Obtained from Acetobacter xylinum culture forapplycation in papermarking. FIBRES TEXTILES in Eastem Europe, vol.16, No.4,pp.108 - 111.
14. Bergey. H, John, G. Holt (1992) Bergey’s manual of determinative
bacteriology, Wolterskluwer health, p.71-84.
15. Choi Y. et al. (2004), “Preparation and characterization of acrylic acid treated bacterial cellulose cation exchange membrane”, J. Chem. Technol. Biotechnol, 79,79 - 84.
16. Greenwalt C. J. et al. (2000), Kombucha, the Fermented Tea: Microbiology, Composition, and Claimed Health Effects, Journal of food protection 63(7): 976-81.
17. Klemm D. et al. (2009), “Nanocellulose materials - different
cellulose, different functionality”, Macromol. Symp, 280, 60 - 71.
18. Li X, Li Z, Zheng J, Shi Z, Li L (2012), “Yeast extract promotes phase shift of bio-butanol fermentation by Clostridium acetobutylicum ATCC824 using cassava as substrate”, Bioresour. Technol, 125: 43-51.
31
19. Nguyen TX. et al. (2014), “Chitosan - coated nano - liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J. Mater. Chem. B, 2, 7149 - 7159.
20. Nisha et al. (2013),“Formulation,
32
in-vitro, evaluation and optimization of gi floating tablet of ranitidine HCl.”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(1),1-14.
