vietnam medical journal n01 - MARCH - 2020
178
đồng tử giãn liệt. Các đánh giá về độ mở góc
không thấy khác biệt giữa các hình thái đóng góc
NĐT và MMP. Dấu hiệu quan trọng có giá trị
chẩn đoán hình thái là dấu hiệu lạc đà 2 bướu
với độ đặc hiệu trên 90%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Thị Thu Hiền (2012). Ứng dụng máy
siêu âm sinh hiển vi đánh giá sự thay đổi bán phần
trước nhãn cầu sau laser cắt mống mắt chu biên
điều trị dự phòng Glôcôm góc đóng nguyên phát,
Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú.
2. Nguyễn Văn Độ, Phạm Thị Thu Thy (2016).
Kết quả lâu dài phương pháp tạo hình góc tiền
phòng bằng laser trong điều trị glôcôm góc đóng
nguyên phát, Luận Văn Thạc Sỹ, Trường Đại Học Y
Hà Nội
3. Chelvin C.A, Sng MBBChir, FRCS(Ed), et al.
(2014). Pretreatment Anterior Segment Imaging
During Acute Primary Angle Closure:Insights into
Angle Closure Mechanisms in the Acute Phase.
American Academy of Ophthalmology. 21:119-125.
4. Paul J Foster.FRCSEd, Jamyanjav Baasanhu.
MD, Poul Helge Alsbirk. MD, et al. (1996).
Glaucoma in Mongolia: a population-based survey
in Hövsgöl Province, northern Mongolia. Archives
of ophthalmology. 114(10):1235-1241.
5. Yi-an You. MD, Le-ru Zhu. MD, Ji-quan Wen.
MD, et al. (2015). Ultrasound Biomicroscopic
Evaluation of Uveal Effusion in Acute Primary Angle
Closure. J Glaucoma. 24:656–661.
6. Jian-Gang Yang, Jian-Jun Li, Hua Tian, et al.
(2017). Uveal effusion following acute primary
angle-closure: aretrospective case series. Int J
Ophthalmol .10(3):406-412.
7. Gazzard G, Friedman DS, Devereux JG, et al.
(2003). A prospective ultrasound biomicroscopy
evaluation of changes in anterior segment
morphology after laser iridotomy in Asian eyes.
Ophthalmology. 110(3): 630-8.
8. Kiuchi Y, Kanamoto T, Nakamura T (2009).
Double hump sign in indentation gonioscopy is
correlated with presence of plateau iris
configuration regardless of patent iridotomy. J
Glaucoma.18(2):161-4.
XÂY DỰNG KỸ THUẬT MULITPLEX PCR KHUẾCH ĐẠI 14 CHỈ THỊ STR
ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI
BỆNH HEMOPHILIA A
Đng Tiến Trường*, Nguyn Trường Giang*, Nguyn Duy Bắc*
TÓM TẮT45
Mục tiêu: Xây dựng kỹ thuật Mulitiplex-PCR, ứng
dụng trong PGT-M bệnh Hemophilia A. Phương pháp
nghiên cứu: Sử dụng phần mềm tin sinh xác định Tm;
Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi bằng phản ứng PCR đơn;
Tối ưu nồng độ primer của phản ứng Multiplex PCR dựa
trên tín hiệu trên kết quả điện di mao quản. Kết quả
và kết luận: Xây dựng và tối ưu hóa được kỹ thuật
Mutiplex PCR khuếch đại đồng thời 14 cặp chỉ thị STR
với nồng độ các cặp primer từ 0,15-0,7µM, ở Ta là
60oC. Quy trình được thiết lập đáp ứng yêu cầu phân
tích di truyền trước chuyển phôi bệnh Hemophilia A.
Từ khóa:
Multiplex PCR, chỉ thị STR, Hemophilia A.
SUMMARY
ESTABLISHMENT OF MULTIPLEX-PCR OF
14 STR MARKERS FOR PGT-M HEMOPHILIA A
Objective: Establish Multiplex PCR reaction which
is applied for preimplantation genetic testing for the
monogenic disorder (PGT-M) in Hemophilia A.
Method: Using bioinformatics software to determine
Tm; Optimize Ta by single PCR reaction; Optimize the
primer concentration of Multiplex-PCR based on the
*Học viện Quân y
Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Duy Bắc
Email: bac_hvqy@yahoo.com
Ngày nhận bài: 3.01.2020
Ngày phản biện khoa học: 20.2.2020
Ngày duyệt bài: 28.2.2020
signal of capillary electrophoresis results. Result and
Conclusion: A Multiplex-PCR of 14 STR markers with
primer concentration from 0.15-0.7µM, at 60oC was
set up successfully. This procedure can be applied in pre-
implantation genetic testing for PGT-M for Hemophilia A.
Key words
: Multiplex PCR, STR marker,
Hemophilia A.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di
truyền. Nguyên nhân do tổn thương gen F8 trên
nhiễm sắc X (Xq28), giảm sản xuất yếu tố VIII,
gây chảy máu không cầm. Tỷ lệ mắc bệnh
khoảng 1/5000 người nam[1]. Điều trị hemophilia
A tốn kém nhưng không giải quyết được nguyên
nhân bị bệnh. Vì vậy, dự phòng không sinh con bị
bệnh hoặc không mang gen bệnh là rất cần thiết.
Gen gây bệnh Hemophilia A rất lớn. Đến nay,
có hơn 2.000 đột biến của gen F8 được xác định.
Trong đó, đột biến đảo đoạn intron 22 và intron
1 chiếm 50% số ca bệnh nặng. Kỹ thuật phân
tích di truyền trước chuyển phôi đơn gen
(Preimplantation Genetic Testing for monogenic
Disease, PGT-M) dựa trên việc xác định trực tiếp
đột biến không thể áp dụng cho các đột biến
đảo đoạn này. Bên cạnh đó, hiện tượng khuếch
đại hỏng alen (Allele DropOut-ADO) ở mẫu tế
bào phôi, được xác định trên 40% các ca chẩn
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 488 - THÁNG 3 - SỐ 1 - 2020
179
đoán trước chuyển phôi [2], có thể dẫn tới chẩn
đoán sai. Ngoài ra, ngoại nhiễm cũng là nguyên
nhân phổ biến thứ hai gây chẩn đoán sai trong
PGT. Do vậy, kỹ thuật phân tích liên kết gen sử
dụng nhiều trình tự lặp ngắn (Short Tandem
Repeat – STR) giúp phân tích di truyền trước
chuyển phôi hemophilia A được ưu tiên lựa chọn
vì giúp kiểm soát ADO và ngoại nhiễm.
Các STR phục vụ PGT-M phải có tính đa hình
cao và nằm gần gen tổn thương để đảm bảo tính
liên kết. Trên thế giới, một số nghiên cứu đã
đánh giá tính đa hình trên quần thể người Brazil
[3, 4], New Zealand [5], Trung Quốc [6, 7], nhằm lựa
chọn các STR phục vụ chẩn đoán trước chuyển
phôi hemophilia A. Sàng lọc được bộ chỉ thị có
tính đa hình cao trong PGT-M giúp xác định được
tổn thương, kiểm soát nhiễm và hiện tượng ADO
là rất quan trọng. Tuy nhiên, PGT-M là qui trình
có tính cá thể hóa cao, lựa chọn được chỉ thị có
thông tin cho từng gia đình. Việc này thường
phải tiến hành phản ứng đơn mồi của tất cả các
chỉ thị và ở tất cả các mẫu. Tiến hành việc này
trên hàng chục chỉ thị và toàn bộ mẫu trong gia
đình gây tốn nhiều thời gian, công sức và hóa
chất. Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến
hành thiết kế phản ứng multiplex PCR khuếch
đại đồng thời 13 chỉ thị để phục vụ cho qui trình
PGT-M bệnh Hemophilia A.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu. Sử dụng mẫu
ADN tách từ máu của người bố không bị bệnh
Hemophilia A và người mẹ mang gen bệnh trong
02 gia đình mang gen, có con bị bệnh.
2.2. Địa điểm nghiên cứu. Nghiên cứu
được thực hiện tại Phòng phân tích ADN, Bộ môn
Giải phẫu – Học viện Quân Y.
2.3. Primer ca phản ứng Multiplex PCR
Sau khi lựa chọn được các STR đáp ứng tiêu
chí sàng lọc, tiến hành thiết kế mồi khuếch đại
dựa trên trình tự vùng flanking bằng phần mềm
thiết kế Primer3. Cuối cùng, sử dụng công cụ In-
silico PCR tại https://genome.ucsc.edu/cgi-
bin/hgPcr với hệ gen tham chiếu là
GRCh38/hg38 kết hợp phần mềm so sánh trình
tự BLAST trên NCBI nhằm xác định sơ bộ các
allel của loci để loại bỏ các marker có trình tự
mồi bắt cặp với các đoạn lặp Alu và các trình tự
không đặc hiệu trên NST khác, sau đó thiết kế
gắn huỳnh quang cho 1 mồi trong mỗi cặp.
Bảng 1: Thông tin trình tự mồi khuếch đại hệ thống chỉ thị STR:
Cặp mồi
Trình tự mồi (5'-3')
Sản phẩm (bp)
X1a
GGTTTTCCCAGTCACGACGAATGCCCTCTCCGAGTTATTAC
152-172
GTTTCTGAGATTGGTGGCCTTTGAAAC
X2b
GTAAAACGACGGCCAGTGGAAAATTCTCCTCTCCTGCTCC
129-143
CCTTCTTTCTTCAAATGATGCTTGG
X3c
CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGTCAATATGTCTTGGTCTGGC
251-275
GTTTCTCCCATTCTATTCCTAAATAAGATAGC
X4b
GTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTTGGCAGACTCC
175-181
GTTTCCTTTAGAATCACTCTTGGTGTG
X5b
GTAAAACGACGGCCAGTGGAATGCACAGCCTATCCTCC
207-217
GTCAAGGTGTCAAATCCCACG
X6b
GGTTTTCCCAGTCACGACCCACTACCAAATCATTGAGCC
116-128
GGTCCATTAGCTTATGTGAGTC
X8a
GGTTTTCCCAGTCACGACTCAACAAAACTGAACAACTAGAAGG
309-321
AATCTGGATGGCTTCAAGCTC
X9c
CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGACCCTGTACTTTTACCATTGGC
188-198
GTTTCTCAGCAACTCGACTTCTGGC
X10c
CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGGCAATTTCAGATCACTTCTTTC
226-238
GTTTGTTACGGTTTTCTTTGTGGC
X11a
GGTTTTCCCAGTCACGACAATCTATGTGAGTCAGCCCC
179-215
GTTTCTCAAGTAGAAAAGTCCTGTGGC
X12b
GTAAAACGACGGCCAGTGCTGTCTGATACAACTGCTGATAC
234-256
GGGTTAGTGGTACTCAAACAC
X13c
CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCTGCAACTGTGTCACTG
289-319
GTTTCCCTACTGTCTTGACTATTGTGGC
X14a
GGTTTTCCCAGTCACGACGGATTCCAGTGACATTGACTCTATC
235-267
GTATCTACTGTTACATGGACTTGGG
X15c
CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG
133/139
GTTTCTCAACCATCAGAGCTTAAACTGG
vietnam medical journal n01 - MARCH - 2020
180
a: Cặp mồi gắn màu HEX; b: Cặp mồi gắn màu
FAM; c: Cặp mồi gắn màu NED
2.4. Tách chiết ADN. ADN được tách từ
200μl máu hoặc dịch ối bằng bộ kit QIAGEN
Blood mini, theo quy trình chuẩn của nhà sản
xuất (QIAGEN, Đức), ADN tách chiết được lưu
trữ ở -20oC cho tới khi sử dụng.
2.5. Khuếch đại hệ thống marker bằng
phản ứng PCR và Multiplex PCR
- Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi:
Xác định nhiệt
độ nóng chảy Tm của 14 cặp mồi gồm 13 chỉ thị
và 1 cặp primer trên nhiễm sắc thể giới tính, trên
http://sg.idtdna.com/calc/analyzer, nhiệt độ gắn
mồi trung bình trên lý thuyết của các cặp mồi là
61.3oC. Thực hiện PCR đơn mồi theo dải nhiệt độ
55oC – 60oC – 65oC, sử dụng bộ kit HotTag
Master Mix (QIAGEN) với thành phần và nhiệt độ
theo khuyến cáo của nhà sản xuất và phân tích
sản phẩm trên gel agarose 2%.
- Tối ưu hóa nồng độ các mồi.
Sau khi thực
hiện tối ưu hóa phản ứng Multiplex PCR nhằm
xác định nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi để
đạt hiệu quả khuếch đại cao nhất, phản ứng
được tiến hành trong tube PCR tổng thể tích 20µl
bao gồm 10ng genomic DNA, 2X QIAGEN
Multiplex Master Mix (QIAGEN), 0,15 – 0,7µM
mỗi mồi. Chu trình nhiệt thực hiện trên máy PCR
ProFlex 3x32-well (Applied Biosystems), gồm
bước hoạt hóa enzyme ban đầu ở 95oC trong 15
phút, 30 chu kỳ gồm biến tính ở 94oC trong 30
giây, gắn mồi ở 59oC trong 90 giây, kéo dài ở
72oC trong 1 phút và bước kéo dài cuối cùng ở
60oC trong 30 phút.
2.6. Điện di mao quản. Sau khi tiến hành
tối ưu hóa thể tích sản phẩm PCR được biến tính
và điện di mao quản. 10µl tổng thể tích bao gồm
8,5µl đệm điện di Hi-Di Formamide; 0,5µl
GeneScan-500 LIZ và 1,0µl sản phẩm PCR. Biến
tính ở 95oC trong 5 phút.
Phân tích kết quả bằng phần mềm
GeneMaper 5.0.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi
Nhiệt độ gắn mồi trung bình trên lý thuyết
của các cặp mồi là 61.3oC. Kết quả phản ứng
PCR đơn mồi được thể hiện trên hình 1.
Kết quả điện di các sản đơn mồi được thể
hiện trên Hình 1. Kết quả cho thấy cặp mồi X11
và X14 cho sản phẩm tốt nhất ở 65oC, cặp mồi
X12 và X15 đều có tín hiệu sản phẩm đặc hiệu
nhiều ở cả 3 dải nhiệt độ, cặp mồi X13 không có
tín hiệu sản phẩm hoặc chỉ có tín hiệu sản phẩm
không đặc hiệu ở cả 3 dải nhiệt độ.
Hình 1. Kết quả tối ưu hóa các mồi X1 đến
X15 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65
Từ các kết quả tối hóa ở 3 dải nhiệu độ trên,
có thể nhận thấy 14 cặp mồi này có nhiệt độ gắn
mồi tối ưu không đồng nhất nhau. Để khắc phục
điều này, chúng tôi sử dụng QIAGEN Multiplex
PCR Mastermix nhằm tối ưu điều kiện phản ứng
multiplex về cùng một điều kiện nhiệt độ của các
mồi khác nhau theo khuyến cáo của nhà sản
xuất (với nhiệt độ gắn mồi là 60oC), không phụ
thuộc nhiều vào thông số của từng cặp mồi
trong phản ứng.
3.2. Kết quả tối ưu nồng độ gắn mồi cho
phản ứng Multiplex PCR.
Hình 2. Kết quả điện di mao quản phản ứng
PCR đa mồi cho 14 cặp mồi
có cùng nồng độ phản ứng là 0.2 µM
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 488 - THÁNG 3 - SỐ 1 - 2020
181
Kết quả cho thấy có sự xuất hiện sản phẩm
tương ứng về kích thước và màu huỳnh quang
của cả 14 cặp mồi. Tuy nhiên, cường độ tín hiệu
của các cặp mồi này không đồng đều nhau và có
sản phẩm có cường độ tín hiệu khá thấp (dưới
500). Do đó dựa trên các kết quả này, nồng độ
của từng mồi được hiệu chỉnh theo gradient 0.05
µM. Sau nhiều lần hiệu chỉnh, nồng độ phản ứng
của từng cặp mồi trong phản ứng PCR đa mồi
được xác định như bảng 2.
Tất cả 14 cặp mồi đều được ghép vào cùng 1
ống phản ứng QIAGEN Multiplex PCR Mastermix
với cùng một nồng độ phản ứng là 0.2 µM. Kết
quả điện di mao quản được phân tích và điều
chỉnh nồng độ mồi bằng cách tăng nồng độ các
cặp mồi hoạt động yếu, giảm nồng độ các cặp
hoạt động mạnh theo gradient 0,05 µM dựa trên
cường độ tín hiệu sản phẩm khuếch đại.
Bảng 2. Nồng độ mồi trong phản ứng PCR đa mồi
Primer
X1
X2
X3
X4
X6
X8
X9
X10
X11
X12
X13
X14
X15
Màu
FAM
HEX
NED
HEX
FAM
FAM
NED
NED
FAM
HEX
NED
FAM
NED
Nồng
độ(µM)
0.25
0.2
0.4
0.2
0.2
0.7
0.2
0.6
0.4
0.25
0.3
0.3
0.15
Hình 3. Kết quả điện di mao quản phản ứng
PCR đa mồi cho 14 cặp mồi
có nồng độ phản ứng đã hiệu chỉnh
Kết quả điện di cho thấy cường độ tín hiệu sản
phẩm của 14 cặp mồi đã được cải thiện rõ rệt,
hầu hết các chỉ thị đều có 2 tín hiệu sản phẩm có
kích thước khác nhau tương ứng với 2 allele dị
hợp tử với cường độ sản phẩm tương đương
nhau. Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi có:
bước khởi đầu phản ứng ở 95oC trong 15 phút; 30
chu kỳ nhiệt: biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn
mồi ở 60oC trong 90 giây, kéo dài mạch ở 72oC
trong 60 giây. Bước tổng hợp sản phẩm cuối cùng
của các cặp mồi ở 60oC trong 30 phút.
IV. KẾT LUẬN
Đã thiết lập phản ứng multiplex PCR khuếch
đại các chỉ thị STR phục vụ PGT-M bệnh
Hemophilia A.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Steve Keeney, Mike Mitchell, và Anne
Goodeve (2010), Practice Guidelines for the
Molecular Diagnosis of Haemophilia A, UK
Haemophilia Centre Doctors’ Organisation: CMGS
Website.
2. Giuseppe Castaldo, Valeria D'Argenio, Paola
Nardiello, Federica Zarrilli, Veronica Sanna,
Angiola Rocino, Antonio Coppola, Giovanni
Di Minno, và Francesco Salvatore (2007),
Haemophilia A: molecular insights, Clinical
Chemical Laboratory Medicine, số 45(4), tr. 450-
461.
3. FB Machado và E MEDINA‐ACOSTA (2009),
High‐resolution combined linkage physical map of
short tandem repeat loci on human chromosome
band Xq28 for indirect haemophilia A carrier
detection, Haemophilia, số 15(1), tr. 297-308.
4. JD Massaro, CEV Wiezel, YCN Muniz, EM
Rego, LCO De Oliveira, CT MENDES‐JUNIOR,
và AL Simões (2011), Analysis of five
polymorphic DNA markers for indirect genetic
diagnosis of haemophilia A in the Brazilian
population, Haemophilia, số 17(5), tr. e936-e943.
5. AD Laurie, AM Hill, JR Harraway, AP Fellowes,
GT Phillipson, PS Benny, MP Smith, và PM
George (2010), Preimplantation genetic diagnosis
for hemophilia A using indirect linkage analysis and
direct genotyping approaches, Journal of
Thrombosis and Haemostasis, số 8(4), tr. 783-789.
6. QL Ding, YL Lu, J Dai, XD Xi, XF Wang, và HL
Wang (2012), Characterisation and validation of
a novel panel of the six short tandem repeats for
genetic counselling in Chinese haemophilia A
pedigrees, Haemophilia, số 18(4), tr. 621-625.
7. Sabina Shrestha, Sufang Dong, Zuhua Li,
Zhuliang Huang, và Fang Zheng (2016),
Evaluation of factor VIII polymorphic short tandem
repeat markers in linkage analysis for carrier
diagnosis of hemophilia A, Biomedical Reports, số
5(2), tr. 228-232.