Xây dựng kỹ thuậ t RT – PCR phát hiện viêm gan siêu vi C

ỹ

ự

ồ

ờ

ậ

ị

ủ

ệ

ằ

ạ

( 2 )

Hoàng Hi u Ng c

Xây d ng k thu t RT – PCR phát hi n viêm gan siêu vi C đ ng th i đ nh ệ genotype HCV b ng lai trên v ch dò đ c hi u c a thanh inoLIPA ặ ạ

ọ ( 1 ) , Ph m Hùng Vân ế

Tóm t tắ

(1-8 ). Qui trình kỹ ướ ng

ơ ư ữ ị ớ ệ ụ ự ộ ị ặ ấ ậ ề ị ồ ậ ể ệ ủ ặ ể ệ ủ Xây d ng k thu t RT – PCR đ phát hi n HCV đ ng th i xác đ nh ki u gen c a virus viêm gan C ủ ậ ậ ự ỹ ng pháp nghiên c u: ươ ắ ủ ệ ẩ ượ ng pháp lai trên v ch dò đ c hi u INOLiPA do g n s n ch t đánh d u biotin tr ươ ể ạ ộ ằ ồ ặ ả ấ ệ ấ ườ ằ ẫ ờ 3/2005 đ n 7/2005, đ ế ị ệ ỹ ệ ử ằ ừ ớ ỹ ủ ữ ậ ả ẩ ỹ ậ ẽ ế ụ ị ượ ế ế ả ẫ ẫ ể ế ụ ị ườ ậ ẫ ư c k t qu 45 m u HCV (+) và 15 m u HCV (-) nh ng không th ti p t c đ nh genotype HCV vì không có k thu t Nested PCR và k thu t do chúng tôi xây d ng đ u xác ậ ừ ỹ ự ề ấ ỹ c genotype và cho k t qu genotype gi ng nh nhau. ả ư ố ệ ằ ắ ồ ỹ ị ử ệ ế ạ ả ự ng và Nested PCR. ề Viêm gan siêu vi C là m t trong nh ng nguyên nhân gây x gan và ung th gan Đ t v n đ : thu t RT – PCR nh m phát hi n, xác đ nh genotype HCV do chúng tôi xây d ng v i m c đích giúp đ nh h ằ và theo dõi đi u tr viêm gan siêu vi C. ị M c tiêu: ỹ ờ ự ụ b ng k thu t lai trên v ch dò đ c hi u c a thanh InoLipa c a Bayers. ạ ằ ứ Chúng tôi xây d ng k thu t RT – PCR dùng m i đ c hi u cho vùng 5’ không mã Ph ỹ c đ nh hóa c a b gen HCV có g n biotin đ phát hi n RNA HCV. Sau đó, nh ng s n ph m PCR này đ ữ ị ệ c đó. 45 genotype b ng ph ắ ẵ ướ ặ ng, l y trong m u huy t thanh HCV (+) và 15 m u HCV (-) đã xác đ nh b ng k thu t RT – PCR thông th ấ ậ ẫ ế ớ c ti n hành th nghi m phát hi n RNA HCV b ng qui trình k thu t m i th i gian t ậ ỹ ế ượ ng và k thu t Nested PCR c a Bayer. Nh ng s n ph m PCR có HCV cùng v i k thu t RT – PCR thông th ườ ng pháp lai. (+) s ti p t c đ nh genotype b ng ph ằ ươ ả V i m i qui trình PCR, chúng tôi đ u thu đ K t qu : ề ỗ ớ k thu t PCR thông th ban đ u. Các m u HCV (+) t ừ ỹ ầ ch t đánh d u biotin. Các m u HCV (+) t ẫ ậ ấ đ nh đ ế ượ ị ậ Qui trình k thu t RT – PCR phát hi n RNA HCV b ng m i có g n biotin và đ nh genotype HCV K t lu n: ậ ế b ng ph ng pháp lai trên v ch do chúng tôi xây d ng và th nghi m đã thành công, cho k t qu chính xác ằ ươ nh đ i v i k thu t RT – PCR thông th ậ ư ố ớ ỹ ườ

Abstracts

Setting up the RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by hybrilizing PCR products on specific inoLIPA strip. Background: Hepatitis C virus is one of reasons that causes cirrhosis and hepatic cell carcinoma. The new RT – PCR technique is set up to detect HCV and determine its genotypes with the aim of orientating and following treatment of HCV. Objectives: Setting up RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by hybrilizing PCR products on specific Inolipa stripe. Method: The primers bound to biotin were designed specifically to 5’ noncoding region of HCV genome and detected RNA HCV by using RT – PCR. These PCR products then can be used to find HCV genotypes by hybridizing to immobilized probes on nitrocellulose stripes. 45 serum samples with HCV (+) and 15 serum samples with HCV (-), which had been known by ordinary RT – PCR, will be tested by new RT – PCR technique, ordinary RT - PCR and Nested PCR. Then PCR products with HCV (+) will be determined HCV genotypes. Results: From each process, we gather 45 positive samples with HCV and 15 negative samples as before. Positive HCV PCR products from ordinary RT – PCR can not be followed to find out HCV genotypes. Positive HCV PCR products from the last two processes can be used to determine HCV genotypes and results from them are the same. Conclusion: The new RT – PCR technique set up to detect HCV and determine its genotypes is success. The results from it are similar to from ordinary RT – PCR and Nested PCR.

ñònh ñieàu trò ñaëc hieäu cuõng nhö theo doõi ñöôïc hieäu quaû ñieàu trò thì vieäc xaùc ñònh kieåu gen HCV trong maùu cuõng raát quan troïng. Vieäc öùng duïng kyõ thuaät PCR trong phaùt hieän nhöõng taùc nhaân vi sinh vaät ñaõ vaø ñang ñöôïc söû duïng ôû Vieät Nam. Beân caïnh nhieàu giaù trò lôïi ích hôn so vôùi caùc xeùt nghieäm huyeát thanh chaån ñoaùn, vaán ñeà giaù caû cuûa kyõ thuaät naøy laïi laø moät yeáu toá caàn ñöôïc quan taâm 2B Môn Vi Sinh, Khoa Y, Đ i H c Y

1B môn Hóa sinh, Khoa Y, Đ i H c Y D c TP. HCM.

ạ ạ ộ ọ ượ ọ ộ

Đ t v n đ ặ ấ ề Hieän nay, vieâm gan sieâu vi C laø moät beänh lyù ñöôïc nhieàu nhaø laâm saøng, dòch teã hoïc cuõng nhö nghieân cöùu y hoïc ñaëc bieät quan taâm. Nhöõng nghieân cöùu treân theá giôùi cho thaáy coù söï töông quan roõ reät giöõa beänh gan maõn tính, xô gan vaø ung thö teá baøo gan vôùi nhieãm HCV (1-8) – thaäm chí coù lieân quan ñeán töøng type HCV rieâng bieät (9,10). Ngoaøi ra, ñeå coù ñöôïc chæ chính, *Tác gi ả D c TP. HCM ượ

1

caân nhaéc. Vì theá, chuùng toâi tieán haønh xaây döïng moät qui trình kyõ thuaät RT – PCR nhaèm phaùt hieän vaø xaùc ñònh genotype HCV vôùi mong muoán tìm hieåu ñoä tin caäy vaø söï chính xaùc cuûa kyõ thuaät naøy treân nhöõng maãu beänh phaåm so vôùi nhöõng qui trình khaùc hieän ñang ñöôïc söû duïng. Chuùng toâi cuõng ñaùnh giaù caùc lôïi ích veà maët kinh teá cuûa kyõ thuaät naøy ñeå coù höôùng ñöa ra aùp duïng treân thöïc teá hieän nay taïi caùc phoøng thí nghieäm coù trang bò PCR.

ng ph

V t li u và ph

ươ

áp nghiên c uứ

naøy döïa treân nguyeân taéc duøng moài OP khueách ñaïi moät ñoaïn daøi 300 bp. Sau ñoù duøng saûn phaåm PCR khueách ñaïi baèng moài OP naøy laøm khuoân ñeå chaïy qui trình nested PCR vôùi moài NP ñeå cho saûn phaåm khueách ñaïi daøi #240 bp, cuoái cuøng, saûn phaåm ñöôïc phaùt hieän qua chaïy ñieän di treân thaïch agarose. Saûn phaåm nested PCR coù moät ñaàu gaén biotin do moài NP coù gaén biotin. Nhôø vaäy, saûn phaåm PCR naøy seõ duøng ñeå xaùc ñònh genotype baèng phöông phaùp lai treân vaïch doø ñaëc hieäu HCV – INOLiPA. Caû hai laàn chaïy chöông trình PCR baèng maùy iCycler cuûa BioRad ñeàu theo chu kyø nhieät nhö sau: 94oC trong 1 phuùt; 94oC trong 15 giaây; 55oC trong 30 giaây; 72oC trong 30 giaây; Laäp laïi 40 chu kyø; 72oC trong 5 phuùt. (3) Qui trình PCR vôùi moài gaén biotin: Ñaây laø qui trình PCR do chuùng toâi nghieân cöùu trong ñoù chuùng toâi duøng moät caëp moài ñaëc hieäu cho moät ñoaïn daøi #244 bp taïi ñaàu 5’ khoâng maõ hoùa cuûa boä gen HCV. Moät trong hai ñaàu ñöôïc chuùng toâi gaén chaát ñaùnh daáu biotin. Saûn phaåm ñöôïc chaïy PCR ñeå khueách ñaïi, sau ñoù, coù theå duøng ñeå xaùc ñònh ñöôïc genotype HCV baèng phöông phaùp lai treân vaïch doø ñaëc hieäu cuûa HCV – INOLiPA. Chaïy chöông trình PCR baèng maùy iCycler cuûa haõng BioRad nhö sau: 1 chu kyø 40oC trong 10 phuùt; 1 chu kyø 95oC trong 5 phuùt; 40 chu kyø 94oC trong 30 giaây; 60oC trong 30 giaây; 72oC trong 1 phuùt; 1 chu kyø72oC trong 10 phuùt; Toång thôøi gian thöïc hieän phaûn öùng laø 2 giôø 10 phuùt. Phaùt hieän genotype HCV: Phaùt hieän genotype HCV baèng phöông phaùp lai treân vaïch doø ñaëc hieäu cho genotype cuûa thanh HCV - INOLiPA. Nguyeân taéc kyõ thuaät laø: s aûn phaåm khueách ñaïi ñöôïc bieán tính thaønh nhöõng chuoãi DNA ñôn. Ñaàu 5’ cuûa saûn phaåm khueách ñaïi HCV coù gaén vôùi biotin ñöôïc lai vôùi nhöõng ñoaïn moài ngaén. Ñoaïn moài ngaén naøy moät ñaàu ñöôïc gaén coá ñònh treân giaáy nitrocellulose, ñaàu coøn laïi töï do, coù trình töï nucleotid boå sung vôùi trình töï nucleotid cuûa

ậ ệ Maãu maùu beänh phaåm töø beänh nhaân ñaõ ñöôïc chaån ñoaùn nhieãm HCV seõ ñöôïc taùch chieát huyeát thanh. Maãu huy e á t tha n h khoâ n g nhi e ã m HCV – laø nhöõng maãu löu tröõ ôû -70oC taïi coâng ty Nam Khoa. Caùc maãu naøy ñaõ ñöôïc xaùc ñònh RNA – HCV (-) qua kyõ thuaät RT – PCR phaùt hieän HCV thöïc hieän taïi coâng ty Nam Khoa. Tieán haønh ly trích RNA töø nhöõng maãu huyeát thanh beänh nhaân HCV (+) vaø HCV (-) döïa treân nguyeân taéc duøng Guanidine 14M vaø urea vôùi phenol vaø caùc chaát taåy khaùc ñeå laøm caùc chaát gaây bieán tính protein nhôø ñoù ly trích ñöôïc RNA toaøn phaàn ra khoûi DNA vaø protein. Thöïc hieän RT toå n g hôïp cDNA töø nhöõng maãu RNA ñöôïc ly trích vôùi nguyeân taéc phieân maõ ngöôïc toaøn boä RNA thaønh cDNA baèng moài ngaãu nhieân. Giai ñoaïn naøy duøng kit toång hôïp cDNA cuûa coâng ty Nam Khoa vôùi chu kyø nhieät nhö sau: 25oC trong 5 phuùt; 42oC trong 30 phuùt; 85oC trong 5 phuùt; Thöïc hieän PCR: Chuùng toâi thöïc hieän 3 qui trình ñoàng thôøi. (1) Qui trình PCR vaø moài bình thöôøng: Laø qui trình PCR söû duïng boä kit RT – PCR phaùt hieän HCV cuûa coâng ty Nam Khoa saûn xuaát. Qui trình naøy söû duïng moät caëp moài ñaëc hieäu cho moät ñoaïn daøi #244 bp trong vuøng 5’ khoâng maõ hoùa cuûa boä gen HCV. Sau ñoù, saûn phaåm seõ ñöôïc ñieän di vaø ñoïc keát quaû döôùi aùnh saùng tia cöïc tím. (2) Qui trình Nested PCR vôùi moài OP vaø NP cuûa Bayer: Qui trình

2

ñaàu 5’ khoâng dòch maõ ñaëc hieäu cho töøng genotype HCV. Biotin cuûa ñaàu 5’seõ gaén vôùi phöùc hôïp streptavidine – alkalin phosphatase. Cuoái cuøng, saûn phaåm lai ñöôïc phaùt hieän baèng söï xuaát hieän maøu do phöùc hôïp streptavidine – alkalin phosphatse töông taùc vôùi chaát neàn BCIP/NBT chromogen.

Keát qua û

Vôùi nhöõng keát quaû thöû nghieäm do phöông phaùp 1 mang laïi, chuùng toâi khoâng theå tieáp tuïc thöïc hieän xaùc ñònh genotype HCV baèng kyõ thuaät lai treân vaïch vì trong thaønh phaàn cuûa saûn phaåm khoâng coù biotin – moät chaát duøng ñeå phaùt hieän saûn phaåm baèng caùch hieän maøu. Thöû nghieäm ñònh genotype töø phöông phaùp Nested PCR cuûa Bayer vaø phöông phaùp PCR coù moài gaén biotin cuûa chuùng toâi cho keát quaû nhö nhau vì saûn phaåm PCR thu ñöôïc töø hai phöông phaùp ñeàu coù gaén biotin ôû ñaàu 5’. Do ñoù ñeàu coù theå ñöôïc phaùt hieän baèng chaát hieän maøu. Keát quaû phaùt hieän RNA HCV vaø ñònh genotype giöõa phöông phaùp Nested PCR vaø phöông phaùp cuûa chuùng toâi ñaõ ñöôïc trình baøy ôû phaàn treân caøng xaùc ñònh ñoä tin caäy cuûa qui trình PCR coù mo ài ga é n bioti n môùi ñöôïc xaây döïng so vôùi hai qui trình coøn laïi. Nhö vaäy, qui trình kyõ

Vôùi nhöõng maãu huyeát thanh HCV (+) vaø (-) ban ñaàu, chuùng toâi tieán haønh thöïc hieän ñoàng thôøi 3 qui trình PCR noùi treân trong ñoù phöông phaùp PCR coù moài gaén biotin laø cuûa nhoùm nghieân cöùu: Vôùi 45 maãu HCV (+) ban ñaàu, sau khi chaïy RT – PCR baèng ba phöông phaùp, keát quaû ñeàu (+). Vôùi 15 maãu HCV (-) ban ñaàu, sau khi chaïy RT – PCR baèng ba phöông phaùp, keát quaû ñeàu (-). 45 maãu HCV [+] naøy ñeàu ñöôïc tieán haønh xaùc ñònh kieåu gen baèng phöông phaùp lai treân vaïch

25

52,38%

HCV 240 bp

HCV 244 bp

HCV 244 bp

20

15

ïp ô h g øn ô ö r t á o S

10

14,29%14,29%

11,9%

A

B

C

5

2,4%

2,4%

2,4%

Hình 1:

ả

ạ

Kieåu gen

0

1

1b

2a/2c

2a/2c/1b

K t qu HCV [+] trên th ch đi n di, ệ PCR v i ớ ng pháp ươ ng pháp PCR v i ươ ng pháp PCR m i g n

ế ng pháp; A: ph ng, B: Ph ườ ươ

ớ ồ ắ

Bieåu ñoà 1:

Tæ leä phaân boá

v i 3 ph ươ ớ m i bình th ồ m i OP và NP, C: Ph ồ biotin

kieåu gen.

vôùi boä thuoác thöû do haõng BioRad cung caáp vaø keát quaû ñöôïc ñoïc theo thang chuaån cuûa haõng naøy

Caùc keát quaû genotype ñöôïc ghi laïi nhö sau: Kieåu gen 1b chieám tæ leä cao nhaát 22 tröôøng hôïp (52,38%). Tæ leä nhieãm type 1 thaáp nhaát 1 tröôøng hôïp (2,4%). Coù 7 tröôøng hôïp ñoàng nhieãm 2 type (1 tröôøng hôïp nhieãm 1a/1b, 6 tröôøng hôïp nhieãm 2a/2c) vaø 1 tröôøng hôïp ñoàng nhieãm 3 type (2a/2c/1b).

Keát luaä n

thuaät cuûa chuùng toâi vöøa coù khaû naêng phaùt hieän RNA HCV vöøa taïo ra ñöôïc nhöõng saûn phaåm PCR coù theå tieán haønh ñònh genotype HCV baèng phöông phaùp lai treân vaïch. Vôùi cuøng keát quaû nhö treân, qui trình kyõ thuaät do chuùng toâi thieát keá chæ caàn söû duïng 1 caëp moài ñeå phaùt hieän RNA – HCV so vôùi Bayer phaûi söû duïng 2 caëp moài. Ngoaøi ra, trong thaønh phaàn genotype HCV PCR mix cuûa chuùng toâi coù dUTP vaø UNG ñeå choáng ngoaïi nhieãm coøn trong boä PCR master mix cuûa Bayer thì khoâng. Nhö vaäy, trong muïc tieâu naøy,

3

hepatitis. Hepatology. posttransfusion 1991;14:969 - 974.

3. HOPF U, MOLLER B, KUTHER D, et al. Long- term follow-up of posttransfusion and sporadic chronic hepatitis non-A. non-B and frequency of circulating antibodies to hepatitis C virus (HCV). J Hepatol. 1990;10:69 - 76.

4. KORETZ RL, ABBEY H, COLEMAN E, et al. Non-A. non-B post-transfusion hepatitis. Looking back in the second decade. Ann intern Med. 1993:119:110 - 115.

5. MATTSSON L. SONNERBORG A, WEILAND O. Outcome of acute symptomatic non-A, non-B hepatitis: A 13-year follow-up study of hepatitis C virus markers. Liver.1993;13:274 - 278.

6. SEEFF LB. Natural history of hepatitis C.

Hepatology. l997;26:21S – 28S.

7. TONG MJ, EL-FARRA NS, REIKES AR, et al. Clinical outcomes after transfusion associated hepatitis C. N Engl J Med. 1995;332:1463 – 1466.

J

ñieåm lôùn nhaát maø chuùng toâi ñaït ñöôïc laø khoâng heà bò ngoaïi nhieãm saûn phaåm khueách ñaïi neân keát quaû xaùc ñònh genotype luoân roõ raøng, khoâng coù caùc vaïch maøu taïp nhieãm khieán vieäc ñoïc keát quaû khoù khaên. Ñeå thöïc hieän ñònh genotype HCV döïa treân qui trình kyõ thuaät HCV – INOLiPA cuûa Bayer, kinh phí seõ laø 300.000 VNÑ cho phaùt hieän HCV – RNA, 300.000 VNÑ cho PCR tröôùc khi ñònh type vôùi moài OP vaø NP, 1.300.000 VNÑ cho lai treân vaïch doø ñaëc hieäu. Do ñoù toång giaù thaønh laø 1.900.000 VNÑ. Ñeå ñònh genotype HCV vôùi qui trình cuûa chuùng toâi thì giaù thaønh seõ laø 300.000 VNÑ PCR phaùt hieän vaø ñònh genotype, 1.300.000 VNÑ cho lai treân vaïch doø ñaëc hieäu. Toång giaù thaønh seõ laø 1.600.000, tieát kieäm ñöôïc 300.000 VNÑ so vôùi caùch laøm cuûa Bayers.

8. TREMOLADA F, CASARIN C, ALBERTI A, et al. Long-term follow-up of non-A non-B (type C) post-transfuston hepatitis. Hepatol. 1992;16:273 - 281.

9. BRUNO S. SILINI E, CROSIGNANI A., et al. Hepatitis C virus genotypes and risk of hepatocellular carcinoma in cirrhosis: A prospective study. Hepatology. 1997;25:734 – 758.

Taøi lieä u tha m khaû o . 1. DAVID L.THOMAS, STANLEY M.LEMON. Hepatitis. Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles & Practice of Infectious diseases. Gerald L.Mandell, John E.Bennett. Raphael Dolin. 2000;143:1736 – 1760.

10.MAHANEY. K, TEDESCHI. V., MAERTENS. G., et al. Genotypic analysis of hepatitis C virus in American patients. Hepatology. 1994;20 : 1405.

2. DI BISCEGLIE AM, GOODMAN ZD, ISHAK and chronic

Long-terms clinical follow-up of KG. et al. histopathological

4