Luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Đinh Thị Thu Lê

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DUNG HỢP

TẾ BÀO TRẦN ĐỂ CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY

KHÁNG VIRUS PVY Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Đinh Thị Thu Lê

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DUNG HỢP

TẾ BÀO TRẦN ĐỂ CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY

KHÁNG VIRUS PVY Ở VIỆT NAM

Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. GS. TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA

2. GS. TS. NGUYỄN QUANG THẠCH

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn

khoa học của GS.TS. Hoàng Đình Hòa và GS.TS. Nguyễn Quang Thạch. Các số liệu,

kết quả nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được tác giả công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày ………. tháng …… năm 2020

Tác giả luận án

Đinh Thị Thu Lê

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận án tiến sĩ, em đã nhận được sự giúp đỡ và động viên của

các thày, cô và tập thể.

Lời đầu tiên, cho phép em được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới

GS.TS. Hoàng Đình Hòa – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, GS.TS. Nguyễn Quang

Thạch – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, là những người thày đã trực tiếp hưỡng dẫn, định hướng và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thày, cô trong bộ môn Công nghệ Sinh

học, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã dạy dỗ, động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian là nghiên cứu sinh của bộ môn.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thày, cô, anh chị và bạn Đỗ Thị Thu Hà, Vũ Thị

Hằng – Phòng Công nghệ phân tử & Công nghệ Vi sinh, Viện Sinh học Nông nghiệp,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và sát cánh bên em trong quá trình thực hiện luận án tại đơn vị.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cơ quan chủ quản – Trường Đại học Mở Hà Nội, khoa

Công nghệ Sinh học đã bố trí thời gian, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án của mình.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên tinh

thần, khích lệ những lúc khó khan để tôi vượt qua và hoàn thành luận án.

Hà Nội, ngày ……. tháng ….. năm 2020

Đinh Thị Thu Lê

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................... vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ .................................................................. ix

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 5 1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây ............................................................................. 5

1.1.1 Nguồn gốc............................................................................................................... 5

1.1.2. Phân loại ................................................................................................................ 5

1.1.3. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam ....................................... 6

1.2 Giới thiệu khoai tây chế biến chip ............................................................................ 9

1.3 Tìm hiểu về virus hại khoai tây ............................................................................... 10

1.3.1 Giới thiệu chung ................................................................................................... 10

1.3.2. Giới thiệu về PVY ............................................................................................... 12

1.3.3 Tác hại của PVY đến sản xuất khoai tây .............................................................. 14

1.4 Các hướng nghiên cứu khắc phục bệnh virus hại khoai tây ............................... 15

1.4.1 Xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh .................................... 15 1.4.2 Thanh lọc vệ sinh đồng ruộng, nhổ bỏ các cây nhiễm virus .............................. 19

1.4.3 Chọn tạo giống kháng bệnh virus ....................................................................... 20

1.5

Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kháng virus .......................................... 20

1.5.1 Phương pháp chọn tạo giống truyền thống ......................................................... 21

1.5.2. Phương pháp công nghệ sinh học ........................................................................ 22

Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 51

2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 51

2.1.1. Các dòng khoai tây nghiên cứu ........................................................................... 51 2.1.2. Hóa chất ............................................................................................................... 53 2.1.3. Thiết bị ................................................................................................................. 53 2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 54

2.2.1. Nội dung 1: Xác định các thông số tối ưu cho quy trình dung hợp khoai tây từ các nguyên liệu nhị bội (2n = 2x), tứ bội (2n = 4x) và khoai tây dại (pnt2G, trn3G, blb2G)

....................................................................................................................................... 54 2.2.2. Nội dung 2: Xác định và đánh giá các thể lai soma của các tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n = 2x) ...................................................................................................... 56

iii

2.2.3. Nội dung 3: Xác định các thể lai soma của các tổ hợp dung hợp giữa khoai tây dại

(2n = 2x) và khoai tây trồng (2n = 4x). Đánh giá khả năng kháng PVY của chúng. ...... 56 2.2.4. Nội dung 4: Đánh giá con lai backcross (BC1) của thể lai soma (khoai tây dại và

khoai tây trồng) với khoai tây trồng .............................................................................. 56

2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 58

2.3.1. Tách tế bào trần ................................................................................................... 58 2.3.2. Dung hợp tế bào trần ........................................................................................... 59 2.3.3. Xác định con lai bằng đếm độ bội flow cytometry ............................................. 60 2.3.4. Chiết tách DNA tổng số ...................................................................................... 60

2.3.5. Xác định con lai bằng sinh học phân tử .............................................................. 61

2.3.6. Lây nhiễm nhân tạo PVY .................................................................................... 62

2.3.7. Kiểm tra gen kháng PVY của các con lai soma bằng chỉ thị phân tử .............. 62

2.3.8. Đánh giá các đặc tính nông sinh học ................................................................... 63 2.3.9. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh. ........................................................................... 63

2.3.10. Lai lại (backcross) giữa một số tổ hợp khoai tây có triển vọng với khoai tây trồng.

....................................................................................................................................... 65

2.3.11. Các chỉ tiêu theo dõi .......................................................................................... 65

2.3.12. Xử lý số liệu ...................................................................................................... 67

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 68

3.1. Xác định các thông số tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần giữa các dòng khoai tây

nhị bội, khoai tây dại và khoai tây trồng ....................................................................... 68

3.1.1. Nghiên cứu các thông số tách tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội, khoai

tây dại, khoai tây trồng phục vụ cho dung hợp tế bào trần........................................... 68

3.1.2. Xác định các thông số dung hợp tế bào trần ....................................................... 73

3.1.3. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp ............................................... 79 3.2. Xác định và đánh giá các thể lai soma của tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n =

2x)

............................................................................................................................ 82

3.2.1. Tạo con lai ........................................................................................................... 82 3.2.2. Xác định độ bội thể của cây tái sinh.................................................................... 83 3.2.3. Xác định con lai soma bằng đo chỉ thị phân tử ................................................... 85

3.2.4. Đánh giá phẩm chất củ của các con lai soma trong điều kiện chậu vại .......... 88 3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng trong các con lai soma từ vật liệu nhị bội ... 90 3.3. Xác định các thể lai soma của tổ hợp dung hợp giữa khoai tây dại (2n=2x) và khoai tây trồng (2n = 4x). Đánh giá khả năng kháng virus PVY của chúng .......................... 92 3.3.1. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng bằng đo độ bội thể ....................................................................................................................................... 93

3.3.2. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khai tây bằng chỉ thị phân tử ................. 94

3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng PVY trong các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng .......................................................................................................... 95

3.3.4. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai

tây trồng bằng lây nhiễm nhân tạo ................................................................................ 97

3.3.5. Đánh giá các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng về các tính trạng nông sinh học và phẩm chất củ ..................................................................................... 98 3.4. Đánh giá con lai backcross (BC1) của thể lai soma (khoai tây dại và khoai tây trồng) với khoai tây trồng ....................................................................................................... 104

3.4.1. Lai hữu tính giữa các con lai soma (của khoai tây dại và khoai tây trồng) với các

giống khoai tây trồng và chọn lọc các con lai có đặc tính mong muốn ...................... 104

3.4.2. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng và kiểm gia sự có mặt của gen kháng PVY bằng chỉ thị phân tử ............................. 113 3.4.3. Khảo sát diện hẹp các dòng lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng ..................... 114 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 125

4.1. Kết luận ................................................................................................................ 125

4.2. Đề nghị ................................................................................................................. 125

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................... 127

CỦA LUẬN ÁN ......................................................................................................... 127

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 128 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 139

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

6 - benzyl amino purine

Backcross

BC1

CNSH

Công nghệ sinh học

Công thức

DAS – ELISA

Double Antibody Sandwich –

Enzyme linked imunosorbent assay

DNA

Deoxyribonucleic acid

ELISA

Enzyme – linked imunosorbent assay

FAO

Food and Agriculture Organization

Gibberellic Acid

GA3

IAA

Indole-3-acetic acid

KLCTB

Khối lượng củ trung bình

LSD

Least significant difference

Murashige and Skoog

NAA

Naphthaleneacetic acid

NSLT

Năng suất lý thuyết

NSTT

Năng suất thực thu

NST

Nhiễm sắc thể

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction

PEG

Polyethylene glycol

PVY

Potato virus Y

SSR

Simple sequence repeat

Tế bào

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Mười lăm quốc gia sản xuất khoai tây nhiều nhất thế giới năm 2019 ......... 7

Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây của Việt Nam ......................... 8

Bảng 1.3. Hệ thống sản xuất các cấp giống khoai tây trên đồng ruộng tại Canada ... 16

Bảng 1.4. Tiêu chuẩn ruộng giống khoai tây Việt Nam ............................................ 18

Bảng 1.5. Thời gian chọn tạo giống khoai tây theo phương pháp truyền thồng ...... 22

Bảng 1.6. Tóm tắt kết quả quá trình chọn tạo giống khoai tây thông qua dung hợp protoplast các loài Solanum (1985 - 2016) ................................................................ 31

Bảng 2.1. Các vật liệu đã thu thập, nguồn gốc, độ bội và các tính trạng mong muốn phục vụ cho lai soma ................................................................................................. 51

Bảng 2.2. Trình tự và nhiệt độ gắn mồi sử dụng trong phân tích PCR chọn lọc con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng ............................................................... 61

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ macerozyme và cellulase trong dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội (Tế bào trần /ml môi trường) ........... 68

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần thu được ............................................................................................................. 71

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến mật độ tế bào trần thu được từ mẫu lá .. 72

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần tạo xung điện đến khả năng tạo mô sẹo của tổ hợp B186 (+) B208 và tổ hợp trn3G (+) Delikat ................................ 73

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ đến khả năng kết dính thành hàng của tế bào trong quá trình dung hợp (tế bào/hàng) và khả năng tế bào phân chia sau dung hợp. 75

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp bằng xung điện của tổ hợp nhị bội B186 (+) B208 ................................................................................... 77

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp bằng xung điện của tổ hợp khoai tây dại và khoai tây trồng Trn3G (+) Delikat ....................................... 78

Bảng 3.8. Sự phân chia của các tổ hợp lai nhị bội và tổ hợp lai giữa khoai tây dại và khoai tây trồng trên các môi trường nuôi cấy khác nhau ........................................... 79

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai ................................................................................................................... 81

Bảng 3.10. Kết quả dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai nhị bội sau dung hợp .................................................................................................................................. 83

Bảng 3.11. Kết quả xác định độ bội các con lai sau dung hợp ................................. 83

vii

Bảng 3.12. Kết quả xác định con lai soma của các tổ hợp dung hợp ......................... 85

Bảng 3.13. Một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng lai soma khoai tây và dòng nguyên liệu .................................................................................................................................. 89

Bảng 3.14. Kết quả nuôi cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây trồng sau dung hợp .................................................................................................... 93

Bảng 3.15. Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây trồng sau dung hợp .................................................................................... 93

Bảng 3.16. Kết quả sử dụng marker phân tử trong xác định con lai soma ................ 95

Bảng 3.17: Kết quả mức độ kháng bệnh của các con lai soma 4x sau khi lây nhiễm nhân tạo ..................................................................................................................... 97

Bảng 3.18. Đánh giá các đặc tính nông sinh học của các con lai soma trong điều kiện chậu vại ................................................................................................................... 101

Bảng 3.19. Kết quả lai hữu tính giữa các con lai soma và khoai tây trồng tứ bội .... 104

Bảng 3.20. Khả năng nảy mầm của hạt lai BC1 ....................................................... 105

Bảng 3.21. Đánh giá khả năng kháng bệnh virus của con lai BC1 ở giai đoạn cây con. ................................................................................................................................ 106

Bảng 3.22. Bảng đánh giá hình thái và kiểu sinh trưởng của các con lai BC1 ......... 107

Bảng 3.23. Bảng đánh giá năng suất và hình thái củ của các con lai BC1 ............... 108

Bảng 3.24. Tình hình sinh trưởng, phát triển các vật liệu khảo sát sau 60 ngày trồng . 110

Bảng 3.25. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát .... 111

Bảng 3.26. Đặc tính nông sinh học các dòng/giống khoai tây khảo sát trên điều kiện đồng ruộng .............................................................................................................. 115

Bảng 3.27. Thời gian sinh trưởng qua các giai đoạn của các dòng/giống khoai tây 117

Bảng 3.28. Kết quả đánh giá tình hình sinh trưởng, phát triển của các con lai BC1 và các giống khoai tây trồng vụ đông xuân 2017-2018 ................................................ 118

Bảng 3.29. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát 119

Bảng 3.30. Đặc điểm hình thái củ khoai tây các dòng/giống khảo sát..................... 120

Bảng 3.31 Đánh giá cảm quan về chất lượng củ qua ăn nếm của các dòng/giống khoai tây ........................................................................................................................... 121

Bảng 3.32 Đánh giá hàm lượng chất khô của dòng/ giống khoai tây ...................... 122

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống sản xuất khoai tây giống của Viện Sinh học Nông nghiệp ........... 19

Hình 1.2. Sơ đồ lai khoai tây ......................................................................................... 23

Hình 1.3 Cơ chế làm câm gene nhờ RNAi ................................................................ 47

Hình 1.4. Sử dụng cây chuyển gen amiRNA để tạo cây kháng virus.. ...................... 48

Hình 2.1. Các loài khoai khoai tây dại nhị bội thu thập từ CHLB Đức ..................... 53

Hình 3.1. Hình ảnh tế bào trần của các dòng khoai tây khác nhau với các enzyme phù hợp. ........................................................................................................................... 70

Hình 3.2. Chất lượng tế bào sau dung hợp và sự hình thành macrocallus ở các tần và số lần xung khác nhau. .............................................................................................. 74

Hình 3.3. Hình ảnh tế bào phân tạo hàng trong dung dịch dung hợp dung hợp có nồng độ Ca2+ khác nhau trong quá trình dung hợp của tổ hợp B186 (+) B208 .................. 76

Hình 3.4. Hình ảnh phân chia tế bào sau 5 ngày nuôi cấy ......................................... 79

Hình 3.5 Dung hợp và nuôi cấy các tổ hợp lai sau dung hợp .................................... 82

Hình 3.6. Hình ảnh độ bội của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai ............................ 84

Hình 3.7. Xác đinh con lai soma của tổ hợp A15 (+) A56 với cặp mồi STM 3023 .. 86

Hình 3.8. Xác định con lai soma của tổ hợp B186 (+) B208 với cặp mồi STM 3023 ........ 87

Hình 3.9. Sự khác nhau về số lượng và kích thước củ của một số dòng lai soma sau......... 88

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP 122406 liên kết chặt với gen Rysto trong bố mẹ nhị bội và con lai soma ....................................... 91

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR được cắt với enzym cắt giới hạn EcoRV ......... 92

Hình 3.12. Hình ảnh độ bội thể của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai .................... 94

Hình 3.13. Minh họa kết quả điện di cho phân tích chỉ thị phân tử STM2022 để xác định kiểu gen dị hợp nhân của tổ hợp lai trn 3G (+) Rasant ...................................... 94

Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GP 122406 của ADN các con lai soma và các dòng bố mẹ khoai tây dại và khoai tây trồng ........................................ 96

Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY của các dòng lai soma và dòng bố mẹ khoai tây dại và khoai tây trồng ............................................................. 96

Hình 3.16. Đánh giá các đặc tính nông sinh học của con lai soma và các dòng bố mẹ ....... 98

Hình 3.17. Đánh giá các tính trạng về năng suất và phẩm chất củ của con lai soma và dòng bố mẹ: A- Atlantic; B- 254/1; C- pnt2G ........................................................... 98

Hình 3.18. Các biến dị ở con lai soma....................................................................... 99

Hình 3.19. Hạt nảy mầm đến giai đoạn 2 lá thật của các hạt lai BC1 ...................... 106

Hình 3.20. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY khi chạy cặp mồi GP 122406 ................................................................................................................................ 113

Hình 3.21. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY sau khi cắt bằng enzyme giới hạn EcoRV ....................................................................................................... 113

Hình 3.22. Màu sắc vỏ củ, thịt củ các dòng/giống khảo sát .................................... 121

MỞ ĐẦU

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những cây trồng quan trọng trong

chương trình an ninh lương thực thế giới chỉ sau ngô, lúa mỳ và gạo. Theo thống kê của

tổ chức Nông lương thế giới (FAOSTAT, 2019), diện tích khoai tây trên thế giới năm 2017 đạt 19,30 triệu ha, năng suất trung bình đạt 20,11 tấn/ha, với tổng sản lượng 388,2

triệu tấn. Trong đó, diện tích khoai tây châu Âu chiếm 29,1% và sản lượng chiếm 31,9%; diện tích châu Á chiếm 51,9% và sản lượng chiếm 48,8% (FAOSTAT, 2016).

Tại Việt Nam, khoai tây cũng là cây trồng lý tưởng cho vụ Đông ở Đồng bằng Sông Hồng, tuy nhiên diện tích trồng hiện nay của cả nước chỉ là 20.480 ha với năng suất 14,8

tấn/ha, sản lượng 303 nghìn tấn (FAOSAT, 2017). Có nhiều nguyên nhân cả về mặt kinh

tế lẫn kỹ thuật dẫn đến sự hạn chế phát triển khoai tây ở Việt Nam. Về mặt kinh tế,

nguyên nhân chính là do trồng khoai tây kém hiệu quả so với các cây trồng khác và đầu ra hạn chế (trừ khoai tây chế biến). Về mặt kỹ thuật, nguyên nhân chủ yếu là do hiện

tượng thoái hóa giống gây ra do virus. Bệnh virus hại khoai tây rất phổ biến, dễ lan

truyền thông qua môi giới truyền bệnh (côn trùng trích hút). Khoai tây được trồng và

nhân giống bằng củ, khi cây bị nhiễm virus toàn bộ củ cũng bị lây nhiễm. Củ giống bị

nhiễm virus khi trồng sẽ cho năng suất, chất lượng thấp. Đây chính là hiện tượng thoái hóa

giống khoai tây gây ra do virus [1]. Có nhiều loại virus hại khoai tây, trong đó PVY là một

trong 10 loại virus phổ biến gây tổn thất năng suất nghiêm trọng nhất trong các nước nhiệt

đới trồng khoai tây [2]. Ước tính cứ 1% củ giống bị nhiễm PVY thì sẽ giảm năng suất

khoảng 180kg/ha tương ứng 18 $/ha [3]. Hàng loạt các chiến lược làm giảm hậu quả của

bệnh virus hại khoai tây đã được triển khai như: thay thế giống nhiễm virus bằng giống

sạch hàng năm, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật tiêu diệt vector truyền bệnh. Trong đó,

việc sản xuất giống sạch virus là biện pháp khá phổ biến được thực hiện ở hầu hết các

nước trồng khoai tây quy mô lớn (Pháp, Đức, Hà Lan,…). Việc sản xuất giống sạch virus phải qua nhiều công đoạn phức tạp như nuôi cấy mô nguyên liệu sạch bệnh, nhân

và trồng vật liệu trong điều kiện cách ly, sản xuất củ giống ở các vùng chuyên sản xuất giống rất tốn kém về chi phí, nhân lực và thời gian. Trong các giải pháp khắc phục bệnh virus hại khoai tây, có thể nói biện pháp hiệu quả và có tính bền vững nhất là việc tạo và sử dụng giống kháng virus.

Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kinh điển là phương pháp lai tạo. Phương pháp này vấp phải những khó khăn về mặt di truyền do bộ NST của khoai tây là tứ bội (2n=4x=48). Bộ genome tứ bội (2n=4x=48) tạo ra tỷ lệ phân ly lớn sau lai tạo, quá trình chọn lọc gặp khó khăn với một quần thể rất lớn trước khi tìm được một con lai có tính trạng mong muốn để phát triển thành giống. Thông thường tạo ra một giống khoai tây

mới thời gian chọn lọc đòi hỏi 10 - 12 năm [4]. Chuyển gen kháng bệnh, gen mang các

tính trạng mong muốn vào cây trồng cũng đã và đang được áp dụng trong chương trình chọn tạo giống của nhiều cây trồng. Công nghệ này có thể rút ngắn thời gian chọn tạo

giống khoai tây so với phương pháp chọn tạo giống kinh điển. Tuy nhiên, do những lo

ngại về an toàn sinh học của các thể GMO (Genetically Modified Organism) nên hiện

nay kỹ thuật chuyển gen đang là vấn đề còn nhiều tranh luận. Trước bối cảnh này, việc sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để có thể chuyển và tích hợp các gen mong muốn nổi lên như một giải pháp có tính khả thi cao. Dung hợp tế bào trần trong tạo giống khoai tây đã được Wenzel et al., vào năm 1979 trải qua hơn 40 năm phát triển, kỹ thuật này

đang ngày một hoàn thiện. Với kỹ thuật này có thể i) tạo ra các con lai soma có thể duy

trì những tính trạng mong muốn cho đời sau và là nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác

chọn tạo giống, ii) chuyển 1 gen hoặc tích hợp nhiều gen từ các vật liệu dung hợp, iii)

tái tổ hợp được genome nhân tế bào và tế bào chất, iv) tránh được những luật lệ liên quan đến chuyển gen [5]. Trên thế giới, các nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây gần

đây đã sử dụng các nguồn khoai tây dại như dại S. Tarnii, S. Pinnatisectum, S.

bulbocastanum [6], các dòng khoai tây nhị bội [7, 8] làm vật liệu nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY thông qua dung hợp tế bào trần.

Nhằm góp phần nghiên cứu tạo giống khoai tây (nhất là khoai tây có khả năng chế

biến) mang tính kháng bệnh virus PVY, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp

tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam” đã được thực hiện.

Mục tiêu

Ứng dụng thành công kỹ thuật tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần, xác định con lai soma, chọn lọc con lai backcross (BC1) để tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY có đặc tính nông sinh học mong muốn.

Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung thực hiện trên các đối tượng là các dòng khoai tây nhị bội (2n = 2x = 24), khoai tây dại (2n = 2x = 24) kháng virus PVY, giống khoai tây trồng (2n = 4x = 48)

Thời gian thực hiện: tháng 5/2015 đến tháng 12/2018

Địa điểm nghiên cứu:

Các nội dung nghiên cứu về tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần và chọn lọc con lai soma được thực hiện tại Viện Sinh học Nông nghiệp (Học viện Nông nghiệp Việt Nam); các con lai BC1 được lai tạo và đánh giá tại Sapa; các nghiên cứu về đánh giá tính kháng

virus và đặc tính nông sinh học của các con soma và con lai BC1 được thực hiện tại Viện

Sinh học Nông nghiệp (Học Viện Nông nghiệp Việt Nam) và đồng ruộng Quế Võ - Bắc Ninh.

Những đóng góp mới của đề tài

1) Khẳng định được các thông số tách, nuôi cấy, dung hợp, tái sinh, xác định con lai soma phục vụ cho các nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào

trần trên các vật liệu khoai tây nhị bội (A15, A16, A56, B186, B208), khoai tây dại

(Solanum tarnii, Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum) và khoai tây tứ bội (Rasant, Delikat, Atlantic).

2) Chứng minh và góp phần khẳng định được khả năng duy trì tính kháng bệnh

virus PVY từ các dòng nhị bội của khoai tây trồng Solanum tuberosum và khả năng

chuyển đặc tính kháng bệnh virus từ các loài khoai tây dại Solanum tarnii, Solanum

pinatisectum, Solanum bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum qua dung hợp tế bào trần.

3) Đã tạo ra các dòng khoai tây 47/7, 47/26, 81-2, 131/11 là sản phẩm dung hợp của hai dòng nhị bội Solanum tuberosum và các dòng BC1 13.1300.3; BC1 13.1305.6 là sản phẩm lai lại của con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng. Các dòng này

vừa có khả năng kháng bệnh virus PVY vừa mang các đặc tính nông sinh học quý có

thể sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus PVY có năng suất cao, phẩm chất tốt.

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Đề tài đã chứng minh và góp phần khẳng định khả năng duy trì tính kháng virus và

cải thiện đặc tính nông sinh học của các dòng nhị bội qua dung hợp tế bào trần và khả

năng chuyển đặc tính kháng bệnh virus PVY từ các loài khoai tây dại Solanum tarnii,

Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum khi dung hợp tế bào trần. Con lai soma có thể làm vật liệu khởi đầu trong công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus và mang đặc tính nông sinh học

mong muốn. Đây là những dẫn liệu khoa học quý, mới mẻ phục vụ nghiên cứu, giảng dạy công nghệ tế bào thực vật, công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài luận án đã tạo ra các dòng khoai tây 47/7, 47/26, 81-

2, 131/11 là sản phẩm dung hợp của hai dòng nhị bội Solanum tuberosum và các dòng BC1 13.1300.3; BC1 13.1305.6 là sản phẩm lai lại của con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng. Các dòng này vừa có khả năng kháng bệnh virus, vừa mang các đặc tính nông sinh học quí có thể sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus

có năng suất cao, phẩm chất tốt. Ngoài ra, kết quả của đề tài cũng là cơ sở kỹ thuật để

tham khảo xây dựng quy trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY, mang được

những đặc tính nông sinh học mong muốn thông qua việc sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

1.1.1 Nguồn gốc

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một cây trồng cổ đại. Các bằng chứng về khảo cổ học, lịch sử và ngôn ngữ học cũng như thực vật học đều chứng minh rằng

khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Nhiều loài khoai tây hoang dại còn tồn tại tới ngày nay, đặc biệt ở dãy Andes thuộc Peru, Bolivia [1].

Khoai tây được đem tới Tây Ban Nha và Châu Âu trong thế kỷ thứ 16, nhanh chóng

thích nghi với điều kiện tự nhiên tại đây và sớm trở thành loại thực phẩm chính tại thời điểm mà dân số thế giới tăng nhanh. Khoai tây vào Pháp năm 1600 do hai nhà thực vật

học người Thụy Sỹ C. Bauhin và J. Bauhin mang tới, được trồng rộng rãi vào năm 1773.

Từ Châu Âu khoai tây sang tới Ấn Độ năm 1610, vào Trung Quốc năm 1700 và năm

1766 vào Nhật Bản. Khoai tây đến với Áo, Italia, Đức và các vùng lãnh thổ Châu Âu

vào cuối thế kỷ XVII. Khoai tây được trồng trên quy mô lớn vào những năm 1800 và tới khoảng thế kỷ XIX mới thực sự phổ biến trên các châu lục.

Ở Việt Nam, khoai tây được người Pháp đưa vào trồng năm 1890 ở một số vùng:

Tú Sơn – Hải Phòng, Trà Lĩnh – Cao Bằng (1907), Thường Tín – Hà Tây (Hồ Hữu An,

2005). Hiện nay, khoai tây được trồng tập trung chủ yếu ở Đồng Bằng Sông Hồng, Sapa, Đà Lạt những vùng có khí hậu mát mẻ, ôn hòa… [9].

1.1.2. Phân loại

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc loài S. tuberosum, chi Solanum, họ cà

Solanaceae, bộ Solanales, phân

lớp Asteridae,

lớp Magnoliopsida, ngành

Magnoliophyta. Các loài khoai tây thuộc một chi (genus) rất lớn và rất đa dạng về mặt

di truyền bao gồm 7 loài khoai tây trồng và 228 loài khoai tây dại (Hawkes, 1994). Trong

7 loài khoai tây trồng thì loài Solanum tuberosum có hai loài phụ đặc biệt quan trọng là

S. tuberosum spp. Tuberosum (Tuberosum group) và S. tuberosum spp. Andigena (Andigena group) [10]

Khoai tây trồng (Cultivated potatoes)

Theo Hawkes (1994) có 7 loài khoai tây trồng có mức bội thể khác nhau với số lượng nhiễm sắc thể gốc 12 (x = 12), nằm trong phạm vi từ nhị bội cho tới ngũ bội. Bao gồm các loài nhị bội thể (diploid, 2n = 2x = 24) có S. Stenotonum, S. Ajanhuii và S. Phureja; tam bội thể (triploid, 2n = 3x = 36) có S. Chaucha và S. Juzepczukii; tứ bội thể (tetraploid, 2n = 4x = 48) có S.tuberosum (có 2 loài phụ là S.tuberosum. subsp.

tuberosum và S.tuberosum. subsp. Andigena) và ngũ bội thể (pentaploid, 2n = 5x = 60)

có S. curtilobum. Trong các loài khoai tây trồng, loài phổ biến nhất, quan trọng nhất

được trồng trên khắp thế giới là loài tứ bội S.tuberosum L. (2n = 4x = 48). Tuy nhiên, nền di truyền của của các giống Tuberosum ở Châu Âu và Bắc Mỹ là hẹp trong khi

nhóm giống Andigena (loài phụ Solanum tuberosum subsp andigena) (2n = 4x = 48) trồng ở vùng cao Andes lại giàu về nguồn gen của nhiều tính trạng. [10, 11, 12]

Khoai tây dại (Wild potatoes)

Theo Hawkes (1994) khoai tây có số lượng các loài hoang dại nhiều hơn bất kỳ

một loại cây trồng nào khác (228 loài). Chúng đều chứa cùng bộ NST gốc (x = 12) như

các loài khoai tây trồng nhưng thay đổi trong phạm vi từ nhị bội (2n = 2x = 24) tới lục bội (2n = 6x = 72). Điều rất quan trọng là các dòng khoai tây dại này có phạm vi phân

bố rất rộng rãi nên có tính thích nghi về mặt sinh thái rất lớn. Phạm vi phân bố của chúng

là toàn bộ Nam Mỹ, từ vùng đồng bằng tới vùng núi cao (3000 - 4500m). Với phạm vi

tồn tại cực kỳ rộng lớn, các loài khoai tây dại mang nhiều gen thích ứng với nhiều kiều

kiện ngoại cảnh bất lợi cũng như chống chịu mạnh mẽ với nhiều loại sâu bệnh. Chính

vì thế các loài khoai tây dại là nguồn gen rất phong phú về tính thích ứng với stress phi

sinh học cũng như nguồn gen kháng quan trọng với nhiều loại sâu bệnh phục vụ chọn tạo giống.

1.1.3. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam

1.1.3.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới

Khoai tây được xếp là cây lương thực quan trọng thứ 4 trên thế giới sau ngô, lúa

mì, gạo và khoai tây được coi là cây lương thực không hạt quan trọng nhất với lượng

sản xuất hàng năm đạt 376,8 triệu tấn (năm 2019) và ngày càng được tiêu thụ nhiều

trong vài thập kỷ gần đây (World Potato Statiscs, 2019). Trung Quốc và Nga là hai nước

có mức độ sản xuất khoai tây lớn nhất thế giới, khoảng 96 và 45,5 triệu tấn trong năm 2019.

Bảng 1.1. Mười lăm quốc gia sản xuất khoai tây nhiều nhất thế giới năm 2019

Trung Quốc

96,0

Ấn Độ

45,5

Nga

31,5

Ukraine

23,7

Mỹ

20,0

Đức

11,8

Bangladesh

9,45

Ba Lan

8,2

Pháp

8,0

Thụy Điển

7,33

Belarus

6,41

Anh

6,2

Iran

5,1

Thổ Nhĩ Kỳ

4,8

Peru

4,78

1.1.3.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam

Ở Việt Nam, khoai tây do người Pháp đưa vào năm 1890, sau đó được trồng rộng rãi và tập trung chủ yếu ở lưu vực Đồng bằng sông Hồng. Trong những năm gần đây, sản xuất khoai tây ở nước ta đã có những bước tiến triển đáng kể về diện tích cũng như

năng suất, chất lượng củ. Sô liệu thống kê của FAOSTAT (2018) qua 10 năm, từ năm 2007 đến năm 2017 đã chứng minh điều đó.

STT Quốc gia Khoai tây sản xuất (triệu tấn)

Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây của Việt Nam

giai đoạn 2007 – 2017

Chỉ tiêu Diện tích Năng suất Sản lượng

Năm (hecta) (tấn/ha) (tấn)

36000 372000 10,33 2007

36000 380000 10,56 2008

37000 388000 10,49 2009

29663 352949 11,90 2010

22611 311604 13,78 2011

27585 403717 14,64 2012

23077 313383 13,58 2013

22823 321700 14,10 2014

21767 318321 14,62 2015

21173 302229 14,27 2016

Mặc dù diện tích trồng không mở rộng thêm, nhưng năng suất cây khoai tây không

ngừng tăng lên qua các năm, đặc biệt là trong hai năm gần đây 2016 – 2017, năng suất khoai tây đạt 14,27 và 14,83 tấn/ha. Theo thời gian, cây khoai tây đã và đang khẳng định

vị trí của mình, dần trở thành cây trồng quan trọng trong cơ cấu nông nghiệp của nước ta.

Vấn đề khó khăn nhất hiện nay đối với ngành sản xuất khoai tây đó là giống, đặc

biệt là các giống khoai tây sạch bệnh. Việc sử dụng một cách phổ biến các loại củ giống

có chất lượng thấp để trồng, không sãn có nguồn củ giống tốt với giá cả hớp lý, thiếu những giống ưu tú về năng suất, chất lượng và đặc chống chịu được virus là những nguyên nhân chủ yếu hạn chế việc phát triển cây khoai tây.

Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hầu hết do nông dân tự duy trì từ vụ này sang vụ khác hoặc giống do người dân tự mua không rõ nguồn gốc, do vậy mà

giống không những bị thoái hóa mà còn có tỷ lệ nhiễm bệnh hại cao cộng với hao hụt

20480 303675 14,83 2017

trong bảo quản từ 45 – 60%. Khoai tây trồng chủ yếu bằng con đường nhân giống vô tính

nên tỷ lệ tái nhiễm virus cao. Hơn nữa, trong điều kiện sản xuất ở Việt Nam, củ giống bảo quản trong thời gian dài khoảng 9 tháng (từ tháng 2 – tháng 10), điều kiện nóng ẩm của

mùa hè củ giống bị già sinh lý nhanh chóng, khi trồng khả năng sinh trưởng kém, hậu quả là năng suất và chất lượng củ thấp.

Mặt khác, việc sản xuất và cung ứng giống khoai tây ở Việt Nam còn nhỏ lẻ, chưa

mang tính hệ thống. Trước tình hình đó, cần xây dựng các chương trình nhân giống và

chọn tạo giống khoai tây sạch bệnh, có chất lượng và phẩm chất tốt đáp ứng được nhu cầu của thị trường.

1.2 Giới thiệu khoai tây chế biến chip

Chế biến khoai tây đã được thực hiện từ ít nhất 200 năm sau công nguyên. Các

dạng sản phẩm khoai tây chế biến là khoai tây chiên kiểu Pháp, chip khoai tây, khoai tây đông lạnh, khoai tây khử nước (khoai tây ở dạng bột, bột thô, mảnh lát, vảy...)

Món khoai tây chiên là một trong số những món ăn phổ biến nhất trên thế giới và

rất được giới trẻ ưa chuộng. Là một món “snack” được yêu thích, nhưng những miếng

khoai tây chiên đầu tiên lại không có hình dạng như loại khoai tây mỏng, mặn và chiên

giòn được đóng gói như chúng ta vẫn thấy bây giờ. Kỹ nghệ "chip khoai tây" bành

trướng lần đầu tiên năm 1962 tại CHLB Đức tại tỉnh Köln - Cologne, dưới nhãn hiệu "Chio".

Hoa Kỳ là nước sản xuất chip khoai tây hàng đầu trên thế giới. Cam kết của Hoa

Kỳ về sản phẩm khoai tây khử nước chất lượng cao nhất, khoai tây khử nước Hoa Kỳ không sử dụng các sản phẩm phụ của khoai tây từ các chế biến khác.

Cùng với việc tiêu thụ ngày càng tăng của khoai tây thì giá trị thương mại của các

loại khoai tây chế biến cũng tăng theo xu thế thị trường và đã có giá trị lớn hơn nhiều

các loại khoai tây tươi. Chỉ tính năm 2002 tại châu Âu, thu nhập từ các nhà chế biến

chip khoai tây là 4,5 tỷ Euro trong một năm. Năm 2005, trên thế giới, nguồn thu từ các sản phẩm khoai tây chip đã lên tới 16,4 tỷ USA chiếm 35,5% so với tổng nguồn thu (46,1 tỷ USA) từ các sản phẩm ăn nhanh [13].

Nhật Bản là nước nhập khẩu khoai tây lớn trên thế giới. Những mặt hàng nước này

nhập khẩu nhiều gồm khoai tây đông lạnh và các sản phẩm khoai tây chế biến khác. Theo số liệu thống kê của Phòng Nông nghiệp nước này, năm 2006 lượng khoai tây đông lạnh nhập khẩu của Nhật tăng 12%, từ 267.895 tấn năm 2005 lên tới 299.327 tấn năm 2006. Lượng nhập khẩu các loại khoai tây chế biến khác cũng tăng 13% [14].

Đối với khoai tây chế biến, ngoài các yếu tố mà khoai tây thông thường phải bảo

đảm (có đầy đủ dinh dưỡng, chất khoáng, cho năng suất cao…) thì còn phải thỏa mãn một số yêu cầu đặc biệt sau: hàm lượng chất khô > 20%, hàm lượng tinh bột > 17%,

hàm lượng đường khử < 0,05%. Nếu hàm lượng đường quá cao khi chế biến, miếng

khoai tây dễ bị cháy xém cạnh, vỡ vụn, không đảm bảo yêu cầu. Kích thước củ khoai

chế biến phải đảm bảo đường kính từ 4,5 - 9 cm, củ tròn để dễ gọt bằng máy, mắt củ nông để không phải gọt quá sâu gây hao hụt, vỏ củ màu vàng nhạy, thịt củ màu trắng, nguyên liệu có khả năng cất giữ lâu [9].

Do các giống khoai tây địa phương của Việt Nam không đáp ứng được các yêu cầu của chế biến nên biện pháp nhập nội giống là biện pháp đầu tiên được đề xuất để

khắc phục tình trạng thiếu giống ở Việt Nam. Nhập nội là khởi điểm của chương trình

chọn tạo giống. Nhập nội là một cách cung cấp các nguồn gen quý, trên cơ sở nguồn vật

liệu đó để chọn tạo ra những giống mới theo ý muốn. Có thể nói nhập nội là phưong pháp chọn tạo giống nhanh nhất, đỡ tốn kém, phù hợp với các nước đang phát triển. Gần

đây, bằng con đường hợp tác khoa học với nước ngoài, chúng ta đã tiến hành chọn lọc, khảo nghiệm những giống nhập nội từ đó chọn ra một số giống thích hợp cho nước ta.

Ở Việt Nam, ngành chế biến khoai tây mới xuất hiện chưa được 10 năm, nhưng

đang phát triển rất mạnh mẽ, mở ra hướng đi cho xuất khẩu khoai tây. Tiêu dùng khoai

tây đang chuyển từ thị trường tiêu thụ tươi sang các sản phẩm chế biến có giá trị gia tăng như khoai tây rán.

Hằng năm, nước ta phải nhập khẩu một lượng lớn khoai tây, năm 2002 nhập

khoảng 100.000 tấn từ Đức, Hà Lan, Mỹ, Singapore để làm giống, ăn tươi và chế biến.

Việc nhập khẩu khoai tây cũng gặp nhiều khó khăn như thuế cao (400.000 đồng/tấn), thủ tục rườm rà, chi phí vận chuyển cao.

1.3 Tìm hiểu về virus hại khoai tây

1.3.1 Giới thiệu chung

Virus hại thực vật là loại nguy hiểm, nó tác động nghiêm trọng đến tất cả các loại cây trồng. Virus có thể có rất nhiều triệu chứng như sự thay đổi về hình dạng bên ngoài

của cây, sắc tố cây, sự hoại tử các bộ phận khác nhau trên cây dấn đến tác động đến sự

phát triển của cây. Trong hầu hết các trường hợp, những điều này là giảm năng suất và chất lượng cây trồng [15].

Bệnh virus là bệnh rất nguy hiểm, khi xâm nhập vào cây, virus sẽ tấn công vào các

tế bào, các cơ quan làm thay đổi các quá trình trao đổi chất của cây, qua đó sẽ làm ảnh hưởng lớn đến năng suất. Khi cây bị nhiễm virus không thể chữa, chỉ có thể nhổ cây bị

hại vứt xa nguồn nước và nơi trồng. Bởi vì virus tồn tại ở các mô sống nên virus rất nguy

hiểm đối với những cây trồng nhân giống vô tính bằng củ tiếp tục nhân lên ở các thế hệ sau. Ngoài ra bệnh virus còn được lan truyền do côn trùng hoặc tiếp xúc cơ giới.

Theo (Vũ Triệu Mân, 1978) [16] và một số tác giả khác cho rằng: virus đã làm

ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và phẩm chất khoai tây, đặc biệt là virus PVY làm giảm năng suất từ 50% - 90%. Chính vì vậy, đến nay dù có nhiều tác nhân gây bệnh hại khoai

tây nhưng virus vẫn là nguyên nhân chủ yếu làm giảm năng suất kinh tế một cách trầm trọng.

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thơ, Nguyễn Phương Đại, Hà Minh Trung, Vũ Triệu Mân (1978 – 1986) về virus khoai tây ở Miền Bắc Việt Nam cho thấy: bệnh virus khoai tây ở Việt Nam do 7 loài virus gây hại chính. Đó là:

Virus Y khoai tây (PVY)

Virus X khoai tây (PVX)

VirusA khoai tây (PVA)

Virus S khoai tây (PVS)

Virus M khoai tây (PVM)

Virus cuốn lá khoai tây (PLRV)

Virus khảm Aucuba khoai tây (PAMV)

Năm 1991 Ủy Ban Quốc Tế về phân loại virus (ICTV–International Committee on

Taxonomy of Viruses) đã xây dựng hệ thống dữ liệu về các nhóm virus gồm đặc điểm của từng nhóm và hệ thống hóa số liệu đo lường (số hóa) các loại virus đó.

Tới năm 2010, 52 loài virus hại thực vật đã được xác định ở Việt Nam, phần lớn

đã được giải trình tự. Trong số này, chủ yếu là các virus thuộc 2 chi: Begomovirus (22

virus) và Potyvirus (18 virus). Đây cũng là 2 chi virus hại thực vật lớn nhất, mỗi chi chiếm khoảng 20% tổng số virus hại thực vật toàn thế giới [17].

Với loài S. Tuberosum L. phát hiện tác nhân virus gây bệnh chính như sau:

• PLRV – Peters phát hiện năm 1967 ở Hà Lan, ra nhiều triệu chứng khác nhau. Loại virus này gây hại mạnh ở Châu Âu. Khả năng giảm năng suất từ 40 - 90%. Ở Việt Nam khoai tây ít bị nhiễm virus này [13].

• PVY – Smith phát hiện năm 1931 tại Anh. Nhóm này gồm 3 dòng chính: PVYO gây bệnh quan trọng ở khắp thế giới, PVYN gây ra các vết chết hoại trên gân lá thuốc lá, PVYC ít nguy hiểm, không phổ biến trên thế giới. Bên cạnh đó mới phát hiện ra PVYNTN, PVYNW, PVYZ.PVYNTN. Virus Y kết hợp với virus PLRV sẽ gây hại rất nặng

ở Châu Âu. Khả năng gây giảm năng suất từ 50 – 90%. Riêng virus Y đặc biệt gây hại nặng ở các vùng trồng khoai tây có khí hậu nóng kèm một vụ lạnh như ở Việt Nam [15].

• PVA – Nhóm virus này khá phổ biến trên thế giới, Murphy và Mckay phát hiện ở Eire năm 1932. Trong nhóm này phát hiện có 2 dòng chính: Dòng A1 cảm ứng phản

ứng siêu nhạy ở loài S. tuberosum.cv King Edward, ngược lại dòng A2 thì không. Virus này gây hại giảm năng suất trên 50% [13].

• PVX – phát hiện ở Anh bởi Smith (1931). Theo Cockerham (1970) PVX được chia thành 4 nhóm dựa trên phản ứng của gen trội tạo HR: PVX1, PVX2, PVX3, PVX4, ngoài ra mới phát hiện PVXHB gây giảm năng suất từ 10 – 25% [18].

• PVV – Rozendaal phát hiện ở Nertherland năm 1971, gây hại nhiều ở Châu Âu và Nam Mỹ, không có sự phân chia thành các nhóm. Qua phân tích Cp (Coat protein) chỉ ra isolate ở Châu Âu có sự cảm ứng HR ở loài S. tuberosum cv Pentlvà Dell.

• PVM – Schltz và Folson phát hiện năm 1923 tại Mỹ, khá phổ biến và gây ra vài triệu chứng lạ. Theo Vũ Triệu Mân (1984) cho biết hai giống khoai tây ở Nga đã bị nhiễm virus PVM làm giảm năng suất tới 60 – 70%.

• PVS – Được phát hiện ở Nertherland vào năm 1952, gây hại ít làm giảm năng

suất từ 10 – 15% thường gây hại khi kết hợp với các virus khác.

1.3.2. Giới thiệu về PVY

Virus khoai tây Y (PVY) là một loại virus gây bệnh thực vật thuộc họ Potyviridae,

và là loại virus thực vật gây hại trầm trọng nhất đến sản xuất khoai tây. Sự nhiễm PVY

của cây khoai tây dẫn đến nhiều triệu chứng khác nhau tùy thuộc vào chủng virus. Các

triệu chứng này nhẹ nhất là mất sản lượng, nhưng bất lợi nhất là 'bệnh đốm hoại tử củ

khoai tây (PTNRD). Các đốm vàng hoại tử khiến khoai tây không thể bán được và do

đó có thể dẫn đến mất thu nhập đáng kể. Do khoai tây nhân giống theo phương pháp vô

tính, nên việc lan truyền bệnh virus từ thế hệ trước sang thế hệ sau ngày một tăng, dẫn

đến hiện tượng thoái hóa giống do virus. Việc nhiễm PVY được truyền qua các vectơ rệp gây ra hiện tượng thoái hóa giống khoai tây. Tốc độ thoái hóa giống càng nhanh ở các nước có khí hậu nhiệt đới, rệp là vecto truyền bệnh virus sinh sôi nẩy nở nhanh trong điều kiện ấm áp. Chính vì thế, sau một vài thế hệ trồng, người sản xuất phải thay thế giống cũ bằng giống mới sạch bệnh. Để làm việc này, các nước sản xuất khoai tây lớn đều phải xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh rất tốn kém. Việc cây khoai tây bị nhiễm virus ngày càng gia tăng trong vài năm qua đã dẫn đến thiệt hại đáng

kể cho ngành khoai tây. Sự gia tăng nhiệt độ trung bình của mùa đông do hậu quả của

sự nóng lên toàn cầu cũng dẫn đến sự gia tăng số lượng rệp, do đó dẫn đến sự gia tăng sự phân bố của virus.

Vật chủ, chủng và triệu chứng của virus Y trên khoai tây

PVY thuộc giống Potyvirus, là chi lớn nhất của virus thực vật và có thể là chi virus

có khả năng phá hoại mạnh nhất trên cây khoai tây. [19] Chi này bao gồm hơn 200 loài gây thiệt hại đáng kể trong lĩnh vực nông nghiệp. [20] PVY lây nhiễm cho nhiều loài

thực vật quan trọng về kinh tế, bao gồm khoai tây (Solanum tuberosum), thuốc lá

(Nicotiana tabacum), cà chua (Solanum lycopersicum) và tiêu (Capsicum spp.). Khả

năng chống lại sự lây nhiễm PVY của cây chủ là thấp trong nhiều trường hợp. Ruộng khoai tây bị nhiễm PVY có thể bị giảm năng suất từ 10 - 100% [21].

PVY có nhiều chủng khác nhau, tùy theo các triệu chứng gây ra ở các loài cây

khoai tây khác nhau. Theo truyền thống, ba chủng PVY chính được công nhận: PVYC,

PVYN và PVYO. PVYC ban đầu được gọi là Potato Virus C, là virus đầu tiên được

công nhận và được xác định vào những năm 1930. [22] PVYC gây ra các mô hình khảm

nhẹ hoặc vệt ố. Không giống như các chủng PVY khác, các chủng PVYC không lây

truyền qua rệp [ 23]. Dòng PVY thứ hai là PVYN [24]. PVYN dẫn đến hoại tử lá và

gây hại nhẹ hoặc thậm chí không gây hại cho củ. Dòng thông thường của PVY được ký

hiệu là PVYO. Chủng này gây tổn thương củ nhẹ và không gây hoại tử lá [25]. Cả

PVYN và PVYO đều có thể lây truyền qua rệp. Ở Châu Âu, hai chủng này đã được

chứng minh là đã tái tổ hợp để tạo thành PVYNTN [26]. PVYNTN gây bệnh đốm vòng

hoại tử củ khoai tây (PTNRD). Những củ bị hư hại do PTNRD trở nên không thể bán được do đó gây hại lớn hơn so với việc bị nhiễm bởi các chủng khác.

Một số đặc điểm của virus Y:

Theo Vũ Triệu Mân (2018) [27], virus Y có dạng hình sợi nhỏ, cong queo, dài

khoảng 720 - 730nm, đường kính 11m và có cấu trúc xoắn. Sợi virus Y có đặc điểm thường cuốn lại với nhau, ít bị tách rời.

Đặc điểm chống chịu của virus Y: Theo Gogan (1970), ngưỡng pha loãng của dịch

cây bệnh khoản 10 – 2 – 10 - 3. Nhiệt độ phòng thí nghiệm (in vitro) có thể giữ đặc tính lây bệnh giọt từ 48 - 72h. Theo Peter Wildy (1971), Q10 của virus Y là 50 - 600C.

Zukin (1976) cho biết, virus giữ được tính độc trong lá tươi 6 ngày (ở điều kiện phòng thí nghiệm). Nếu giữ lá tươi ở một lớp CaCl2 ở 40C có thể giữ virus trong 6 tháng. Dùng lá khô ở điều kiện động lạnh có thể bảo quản virus PVY tới 11 tháng. Virus Y có sức chống chịu kém trong điều kiện in vitro.

Virus Y truyền bệnh nhờ phương pháp tiếp xúc giọt dịch và truyền bệnh nhờ côn

trùng môi giới kiểu không bền vững, bệnh truyền bệnh nhờ một số loài rệp thuộc họ Aphididae chủ yếu là rệp Myzuz persicae Sulze. Và các rệp Myzus ornatus,

Macrosyphum euphorbiae, Aulacorthum circumflexum, Aphis naturlli và Aphis gossypii (Kennedy-day và Eastop, 1962).

Rệp hút bệnh khoảng 10 - 30 giây. Virus Y không cần qua thời kỳ tiềm ẩn trong

cơ thể rệp mà có thể truyền ngay trong 15 giây vào cây khỏe. Virus sống trong cơ thể rệp lâu nhất là 2 giờ (Gibbs và Harrison, 1975)

Ký chủ của virus Y có khoảng 60 loài cây, chủ yếu thuộc họ cà (Solanaceae) rồi đến họ rau muối (Chenopodiaceae) và họ đậu (Fabaceae) (Thornberry, 1966). Nhiều họ

cây khác cũng bị bệnh. Cây chỉ thị quan trọng nhất là Solanum demissum hybride A6, trong điều kiện truyền bệnh trên lá cắt rời ở nhiệt độ 200C, cường độ ánh sáng 1200 - 1400 lux, lá cây sẽ tạo các vết đốm vòng khuyên có màu xám đen. Ngoài cây A6 còn có

thể dùng các cây khác: Chenopodium amarniticolor, C.quinoa và một vài giống

Nicandra physaloides, Nicotiana repanda, N. Rustica, N. Glutinosa, N.tabacum, Physalis floridana, Capsicum frutescents.

1.3.3 Tác hại của PVY đến sản xuất khoai tây

Virus khoai tây Y (PVY) là một trong 10 loại virus hại thực vật nguy hiểm nhất

thế giới [28]. PVY cũng là tác nhân chính gây hại cho cây thuốc lá và cây tiêu, nó ít gây nguy hại hơn cho cây cà chua và cà tím [29, 30, 31].

Do những tác động quan trọng của nó đến sản xuất khoai tây nên có rất nhiều

chương trình quy mô lớn được thực hiện để kiểm soát sự bùng nổ PVY như là các biện

pháp dự phòng, kiểm soát tác nhân truyền bệnh, chọn tạo giống khoai tây kháng. Để làm

giảm bệnh virus thì không chỉ khoanh vùng những tổn thất trực tiếp trong sản xuất mà

còn những tổn thất gián tiếp như là việc tăng chi phí sản xuất (ví dụ như củ giống, đào

tạo và máy móc), chi phí cho các chương trình kiểm soát và quản lý dịch bệnh (kiểm soát virus, cấp chứng nhận, thanh lọc, thử nghiệm virus và các công cụ quản lý) và một vài chi phí về môi trường và xã hội (thất thoát tài nguyên, thay đổi văn hóa và sự nhiễm tạp của môi trường). Có một báo cáo chỉ ra, cả tổn thất trực tiếp và gián tiếp do PVY

gây ra ước tính khoảng 34 triệu đô la Mỹ mỗi năm ở bang Idaho (USA) [32]. Nó được ước tính là cứ mỗi 1% củ giống bị nhiễm PVY thì sẽ làm giảm năng suất của khoảng 180 kg/ha, quy đổi ra là mất khoảng 18$/ha [3].

Thiệt hại lớn nhất do PVY gây ra đó là khi củ giống đã bị nhiễm bệnh trước khi trồng (nhiễm thứ cấp) và khi thực vật bị nhiễm virus từ củ giống, năng suất sẽ giảm từ

10 – 80% [33, 34]. Có một nghiên cứu trên 30 giống bị nhiễm PVY từ củ được trồng ở chậu vại đã chứng minh rằng năng suất bị giảm từ 50 – 85% [35].

1.4 Các hướng nghiên cứu khắc phục bệnh virus hại khoai tây

Có 3 chiến lược chính để ngăn chặn tác hại của bệnh virus hại khoai tây:

✓ Xây dựng hệ thống sản xuất khoai tây giống sạch bệnh, cung cấp giống sạch cho

sản xuất thay thế giống đã thoái hóa.

✓ Thanh lọc vệ sinh đồng ruộng, nhổ bỏ các cây nhiễm bệnh virus, tránh lây lan ra

quần thể nhằm duy trì tình trạng sạch bệnh của ruộng sản xuất.

✓ Chọn tạo giống kháng bệnh virus. Phát triển nhanh các giống có tính kháng, có các đặc tính nông sinh học ưu tú cho sản xuất. Đây là hướng có ý nghĩa quan trọng và mang tính bền vững nhất, nhưng cũng không dễ dàng thực hiện.

1.4.1 Xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh

Để ngăn chặn và làm chậm quá trình thoái hóa giống gây ra do virus, hầu như ở

tất cả các nước trồng khoai tây đều phải xây dựng hệ thống sản xuất giống sạch bệnh.

Trong đó, tiêu chuẩn hàng đầu của củ giống là phải sạch bệnh virus. Người sản xuất chỉ

được phép sử dụng giống đã được xác nhận. Sau một số thế hệ trồng, do bị nhiễm virus,

củ giống bị thoái hóa năng suất, phẩm chất giảm dần bắt buộc phải thay thế bằng giống

mới sạch bệnh. Hệ thống sản xuất giống tốt sẽ góp phẩm giảm thiểu quá trình thoái hóa giống vì đây là một trong những hạn chế hàng đầu đối với năng suất khoai tây [36, 37]

Thông thường, hệ thống giống gồm đầu vào là giống sạch bệnh hoàn toàn, được

nhân trong phòng cấy mô gọi là giống gốc (basic seed) hay còn gọi là giống thế hệ G0.

Giống này tiếp tục nhân trong nhà màn hay nhà kính bằng công nghệ thủy khí canh cho

các cây và củ nhỏ nếu hoàn toàn sạch bệnh cũng được xem là thế hệ G0. Cây và củ nhỏ

G0 tạo ra được nhân tiếp trong điều kiện nhà màn hay đồng ruộng cách ly với nguồn

bệnh để tạo ra thế hệ G1, G2, G3... Trong điều kiện các nước trồng khoai tây có khí hậu

nhiệt đới như Việt Nam, rệp phát triển mạnh, khoai tây nhiễm virus nhanh, thoái hóa nhanh, đến thế hệ G3 là khoai đã chuyển xuống cấp xác nhận và đưa vào sản xuất khoai ‘thịt” chứ không thể tiếp tục nhân để làm giống. Ở các nước Châu Âu, Bắc Mỹ, khí hậu

lạnh, rệp không phát triển, khoai tây có thể nhân tới thế hệ 9, 10 mà vẫn còn giữ chất

lượng sạch bệnh cao. [38]. Thời gian nhân giống càng ngắn, số thế hệ nhân càng ít, củ giống tạo ra càng có độ thoái hóa thấp, nhưng giá thành sản xuất giống càng cao.

Có thể tham khảo hệ thống sản xuất và các cấp giống của Canada, một nước trồng

khoai tây tiên tiến ở Bắc Mỹ, cho đến tận thế hệ thứ 6 giống mới bắt đầu đưa vào dây truyền sản xuất khoai thương phẩm. Thế hệ thứ 7 mới tính là giống xác nhận. Thời gian

nhân giống được kéo dài trong khi chất lượng sạch bệnh vẫn được duy trì dẫn đến giảm giá thành sản xuất giống rất nhiều. [39]

Trong khi ở các nước nhiệt đới trồng khoai tây như Việt Nam, các năm đầu do phải

nhân từ cây cấy mô, trong điều kiện nhà màn nhà lưới chi phí cao, lại không thể triển

khai được ở qui mô lớn, số củ giống tạo ra không nhiều, thời gian chỉ được kéo dài 2 - 3 thế hệ, chính vì thế hệ thống sản xuất giống rất khó thực hiện và giá thành củ giống sạch bệnh rất cao.

Bảng 1.3. Hệ thống sản xuất các cấp giống khoai tây trên đồng ruộng tại Canada

Pre –elite (siêu nguyên chủng)

Thế hệ giống thứ nhất

Elite 1 (nguyên chủng 1)

Thế hệ giống thứ 2

Elite 2 (nguyên chủng 2)

Thế hệ giống thứ 3

Elite 3 (nguyên chủng 3)

Thế hệ giống thứ 4

Elite 4 (nguyên chủng 4)

Thế hệ giống thứ 5

Foundation (giống nền )

Thế hệ giống thứ 6

Certified (giống xác nhận)

Thế hệ giống thứ 7

Trung Quốc là nước có diện tích trồng khoai tây lớn nhất thế giới (5 triệu ha). Các

nhà khoa học và quản lý cũng cho rằng, việc xây dựng hệ thống sản xuất khoai tây giống

sạch bệnh có ý nghĩa quyết định đến sản xuất khoai tây của Trung Quốc. Gần đây họ đề

xuất việc phát triển hệ thống sản xuất khoai tây giống 3G. (Kaiyun Xie 2010 , 3G Seed

Potato System in China CIP Beijing Liaison Office ). Các tác giả đã phân chia giống

thành 3 thế hệ (3G) và cũng là 3 cấp giống khác nhau. G1 là thế hệ 1 (pre basic) bao gồm các củ minituber, micro- tuber, củ nhỏ sản xuất từ in vitro, được trồng trong điều kiện cách ly. Tiêu chuẩn chung là sạch bệnh 100% và có khối lượng củ từ 1 - 20g. G2

là thế hệ 2 (basic) sử dụng củ G1 làm giống, sản xuất trong điều kiện chuẩn vùng núi cao, mật độ rệp thấp, khí hậu lạnh, không có bệnh thuộc đối tượng kiểm dịch, cách ly

tốt, khoai thịt và các giống khác phải cách xa ít nhất 800m. Tiêu chuẩn: sạch bệnh nấm, khuẩn, virus < 1%, khối lượng củ 25 - 75g/củ. G3 là thế hệ 3 (certified- giống xác nhận) sử dụng củ G2 (basic) làm giống, sản xuất trong điều kiện chuẩn: vùng núi cao, mật độ rệp thấp, khí hậu lạnh, không có bệnh thuộc đối tượng kiểm dịch, cách ly tốt, khoai thịt và các giống khác phải cách xa ít nhất 800m. Tiêu chuẩn là sạch bệnh nấm, khuẩn, virus < 5%, khối lượng củ 25 - 100g/củ .

Cấp giống Thế hệ giống

Theo các tác giả Trung Quốc, việc tạo chu kỳ sản xuất ngắn để dễ kiểm tra chất lượng, kiểm tra bệnh virus. Việc kiểm tra được thực hiện rất nghiêm ngặt đối với các cây giống gốc in vitro cũng như quá trình nhân nhanh in vitro trong phòng thí nghiệm. Kiểm tra từng phần đối với thế hệ giống G1 bởi ELISA test trong nhà màn. Kiểm tra bằng mắt ở thế hệ G2 và G3 trên đồng ruộng. Việc phân cấp 3G sẽ rất thuận lợi cho hệ thống đăng ký giống sản xuất và thuận lợi cho việc sử dụng và quản lý thẻ xác định cấp giống. Theo tính toán, nhu cầu sản xuất khoai tây giống của Trung Quốc sẽ như sau: Với diện tích trồng 5 triệu ha, mỗi ha cần 2.25 tấn, nếu năng suất củ giống 22.5 tấn/ha sẽ cần 11,25 triệu tấn G3 (500,000 ha); 1,125 triệu tấn G2 (50,000 ha) 4,5 - 6,0 tỷ củ minituber G1 (trồng 90,000 - 120,000 củ minituber/ha). Hệ thống 3G cũng nhận nhu cầu cây in vitro và củ G1 (minituber) làm tăng đáng kể chi phí. Cần nghiên cứu giảm giá thành qua tăng hiệu quả sản xuất các cây in vitro và củ minituber. Các học giả Trung Quốc đưa ra kết luận :

- 3G là sự lựa chọn bắt buộc để cải tiến chất lượng giống hiện nay cho Trung

Quốc.

- Hệ thống 3G rút ngắn chu kỳ sản xuất giống và tạo nên khả năng kiểm tra chất

lượng giống tốt trong toàn bộ chu kỳ.

- Chi phí để sản xuất G2 sẽ tăng lên đáng kể do sử dụng một lượng lớn của minituber. Điều này sẽ được bù lại bằng cách cải tiến hiệu quả sản xuất cây in vitro và trợ giá giống.

Qua các thông tin trên cho thấy, vai trò của chất lượng giống mà thực chất là độ sạch bệnh của củ giống trong đó bệnh virus đóng vai trò quan trọng hàng đầu trong sản xuất khoai tây.

Việt Nam hiện đang tồn tại hai hệ thống sản xuất khoai tây giống chính :

Hệ thống sản xuất khoai tây giống ở Đà Lạt (1500 m so với mặt biển)

Hệ thống này căn bản dựa trên các bước sau đây:

1) Nhân nhanh giống sạch bệnh trong ống nghiệm (in vitro) ở phòng thí nghiệm.

2) Chuyển các cây sạch bệnh từ trong ống nghiệm ra cấy tại nhà lưới để tạo các

bồn cây mạ.

3) Cắt ngọn ở bồn cây mạ và làm cho các ngọn cắt trở thành các cây con có rễ ở

các bầu cây nhỏ với mật độ là 1 cây/ 1 bầu ở nhà lưới.

4) Chuyển các cây con đã có bộ rễ đủ tiêu chuẩn ra trồng tại đồng ruộng cách ly

để sản xuất củ giống G1.

5) Trồng các củ giống G1 trên đồng ruộng cách ly để sản xuất củ giống G2 nhằm cung cấp cho sản xuất. Với hệ thống sản xuất khoai tây giống này, năm 1982, khoảng 2,5 triệu cây con (rooted cuttings) đã được sản xuất bởi 10 gia đình nông dân. Những năm gần đây, Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây-Rau và Hoa (PVFC) Đà Lạt cũng đã sản xuất các cây con theo phương pháp nói trên với quy mô khoảng 300.000- 1.000.000 cây con/năm. Hệ thống sản xuất khoai tây giống ở Đà Lạt cho đến nay vẫn đang được vận hành một các có hiệu quả, thể hiện rõ được tính tiên tiến, bền vững, đơn giản và sự độc đáo nổi tiếng trên thế giới.

Những năm gần đây, thông qua sự hợp tác giữa Bộ môn Cây có củ, thuộc Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Cây có củ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm với Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa Đà Lạt, Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam, mỗi năm, khoảng 200.000 củ mini của giống Atlantic và giống Sinora đã được sản xuất tại Đà Lạt để chuyển ra nhân giống tại Đồng bằng Bắc Bộ. Hệ thống nhân giống này đã và đang chứng tỏ là có hiệu quả tốt và có nhiều triển vọng. [40].

Hệ thống sản xuất khoai tây giống ở Đồng bằng Bắc bộ (5 m so với mặt biển)

Hệ thống này đã được nghiên cứu xây dựng ở Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông ngghiệp Việt Nam được Nguyễn Quang Thạch và cộng sự nghiên cứu và phát triển từ những năm 1980 đến nay. Hệ thống bao gồm các bước chủ yếu sau đây:

1) Nhân nhanh các vật liệu sạch bệnh in vitro trong phòng thí nghiệm

2) Nhân nhanh các vật liệu sạch (ngọn cắt) bệnh từ các cây in vitro thông qua công

nghệ khí canh (aeroponics) ở nhà lưới

3) Sản xuất củ giống mini từ ngọn cắt thông qua công nghệ khí canh (aeroponics)

hoặc từ các cây con trồng trên giá thể hỗn hợp đất mùn ở nhà lưới

4) Sản xuất củ giống nguyên chủng ở đồng ruộng cách ly và 5) Sản xuất củ giống xác nhận ở đồng ruộng cách ly. Những năm gần đây, tại Viện Sinh học Nông nghiệp, mỗi năm khoảng 1 triệu củ mini đã được sản xuất theo hệ thống này. Hệ thống này đã thể hiện sự vận hành có hiệu quả, mang tính khả thi cao, đã và đang được được ứng dụng và phát triển ngày càng rộng rãi ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam..

Bảng 1.4. Tiêu chuẩn ruộng giống khoai tây Việt Nam

Chỉ tiêu

Xác nhận

Siêu nguyên chủng (G0)

Nguyên chủng (G1)

100

Độ thuần ruộng giống (% số cây đồng nhất)

Virus nặng (cuốn lá Y, A hỗn hợp) (% số cây không lớn hơn)

0,2

Virus nhẹ (X,S,M ) (% số cây không lớn hơn)

Virus tổng số (% số cây không lớn hơn)

0,2

0,0

0,5

Héo xanh (Pseudomonas rastoni) (% số cây không lớn hơn)

(Quyết định 57999/QĐ/BNN-KHCN 29.12.2003)

Chú thích: Theo số liệu báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu làm chủ công nghệ và

xây dựng mô hình công nghiệp sinh học sản xuất giống khoai tây, rau và hoa sạch bệnh Mã số: KC.04.02/06-10 [41].

Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống sản xuất khoai tây giống của Viện Sinh học Nông nghiệp

1.4.2 Thanh lọc vệ sinh đồng ruộng, nhổ bỏ các cây nhiễm virus

Để có giống khoai tây sạch bệnh virus, từ năm 1919, Limasset, Cornuet và

Kassanis đã áp dụng phương pháp nuôi cấy mô ở đỉnh sinh trưởng (meristeme). Năm 1977, R. Nozeran đã sáng tạo ra phương pháp nhân nhanh khoai tây in vitro. Từ đó đến

nay kỹ thuật này đã không ngừng phát triển, đặc biệt như kỹ thuật nhân nhanh ngọn cây khoai tây cấy mô trên bồn mạ của các tác giả Nguyễn Văn Uyển và Peter Vander Zaag tại Đà lạt cũng như kỹ thuật nhân cây in vitro trên bồn khí canh của Viện Sinh Học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Vấn đề quan trọng là làm thế nào để duy trì

độ sạch virus của các cây được nhân ra khi trồng trên đồng ruộng. Hệ thống chọn lọc vệ

sinh đồng ruộng nhổ bỏ cây bệnh nhằm chống bệnh lây lan đã được thiết lập ở Hà Lan, sau đó sang Pháp và đến các nước khác [27]. Hệ thống thanh lọc vệ sinh đồng ruộng

được hình thành, đến nay sau hơn 90 năm hệ thống này đã thành nhiều dạng khác nhau.

Trung tâm khoai tây quốc tế CIP đã áp dụng biện pháp vệ sinh chọn lọc ở nhiều nước

Đông Nam Á như Băng la đét, Philippin, Indonesia... và đã thu được một số kết quả. Ở nước ta, phương pháp này là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có hiệu quả cao và duy trì được chất lượng giống, qua đó ổn định năng suất khoai tây.

Về kỹ thuật thanh lọc đồng ruộng có các khâu chính sau: Tổ chức đội thanh lọc giống gồm những người giàu kinh nghiệm, quan sát triệu chứng và giám định chính xác

cây khoai tây bị bệnh virus hay nấm khuẩn để nhổ bỏ. Các cây cần nhổ bỏ quan trọng

nhất là các cây bị bệnh virus (khảm lá, xoăn lùn, cuốn lá), cây bệnh héo xanh vi khuẩn

và các bệnh khác. Thời điểm quan sát cần thực hiện ít nhất 3 lần: 30, 50, 70 ngày sau trồng. Thời gian quan sát tránh lúc nắng gắt, trời mưa hoặc chiều tối thiếu ánh sáng. Tốt

nhất tiến hành vào đầu giờ buổi sáng khi vừa đủ ánh sáng để quan sát. Khi quan sát đứng

quay lưng về hướng mặt trời. Cần tuân thủ nguyên tắc: “Kiểm tra và thanh lọc ở ruộng có cấp giống cao nhất trước.”

Kết quả điều tra của dự án hợp tác Việt Đức phát triển khoai tây (Menz, 2006) cho

thấy tỷ lệ bệnh virus trên khoai tây trồng ở đồng ruộng Việt Nam gia động từ 20 - 70%. Theo tính toán, nếu vụ 1 có 0,63% cây bệnh thì vụ 4 sẽ có 21,98% cây bệnh. Điều đó

cho thấy bệnh virus hại khoai tây ở Việt Nam là rất nghiêm trọng, việc thanh lọc vệ sinh đồng ruộng nhất là ruộng giống rất cần thiết.

Ngoài biện pháp thanh lọc vệ sinh đồng ruộng, việc áp dụng một số biện pháp

trồng trọt cũng có hiệu quả khắc phục sự thoái hóa khoai tây do nhiễm virus.

• Chọn vùng trồng thích hợp, vùng có khí hậu ôn hòa, mát mẻ, thường xuyên có

gió chống rệp. Tránh trồng lại ở các vùng đất đã trồng cây họ cà trước đó.

• Chủ động phòng trừ môi giới truyền bệnh, áp dụng biện pháp kỹ thuật cạnh

tác,biện pháp phòng trừ tổng hợp và biện pháp sinh học để phòng trừ.

1.4.3 Chọn tạo giống kháng bệnh virus

Chọn tạo giống kháng virus, phát triển nhanh các giống có tính kháng virus đồng thời mang các đặc tính nông sinh học ưu tú cho sản xuất là hướng có ý nghĩa quan trọng và mang tính bền vững nhất trong các chiến lược chống lại tác hại của bệnh virus. Tuy nhiên, chiến lược này đòi hỏi thời gian và không dễ dàng thực hiện.

1.5 Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kháng virus

1.5.1 Phương pháp chọn tạo giống truyền thống

Các phương pháp lai tạo khoai tây truyền thống thường được áp dụng như kỹ thuật

lai tạo, lai lại (backcross), đột biến và chọn lọc [42].

Nhược điểm của phương pháp truyền thống là những khó khăn về mặt đặc tính di

truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum). Đó là bộ gen của khoai tây trồng trọt ở thể tứ bội tetraploid (2n = 4x = 48 nhiễm sắc thể), gây ra sự phân ly sau lai tạo với

một quần thể rất lớn, rất phức tạp, đòi hỏi quá trình chọn lọc tốn rất nhiều công sức. Quá

trình này đòi hỏi tối thiểu 10 năm để có được một giống lai ra đời. Ngoài ra, nhiều đặc

tính chống chịu do nhiều gen quy định sẽ có thể mất dần trong quá trình chọn lọc ở các thế hệ tiếp sau.

Mặt khác, các gen chống chịu stress sinh học (bệnh virus, nấm, khuẩn...) hoặc phi

sinh học (hạn, ngập, mặn...) hầu hết có từ nguồn khoai tây dại khác loài có độ bội và mức EBN khác nhau (endosperm balance number) không thể thực hiện lai hữu tính thông thường nên cần có sự can thiệp của các phương pháp mới trong chọn taọ giống khoai tây.

Đó là các phương pháp công nghệ sinh học. Có 4 nhóm phương pháp công nghệ sinh học

chính được sử dụng là: Phương pháp dung hợp tế bào trần, phương pháp chọn tạo giống

có sự trợ giúp của chỉ thị phân tử, phương pháp chuyển gen và phương pháp chỉnh sửa genome.

Bảng 1.5. Thời gian chọn tạo giống khoai tây theo phương pháp truyền thồng

Năm Chọn lọc Số lượng dòng Số củ chọn từ một dòng

- Lai ban đầu - 1

1 2 100,000+ Quan sát quần thể lớn, chọn lọc dòng có khả năng hình thành củ tốt

1 3 50,000+

Chọn cây kháng virus và tuyến trùng, chọn củ có hình dạng và màu sắc phù hợp, loại bỏ những kiểu gen chín muộn

4 4 8,000 Đánh giá chất lượng chế biến và khả năng kháng tuyến trùng

5 1,000 50 Chọn lọc như tiêu chí năm thứ 4

6 500 250 Chọn lọc tính kháng ghẻ, virus, tuyến trùng và dị dạng

7 100 500 Chọn lọc như năm thứ 6

8 10 1,250 Chọn lọc như năm thứ 6

9 4 2,000 Khảo nghiệm quốc gia

(Nguồn [43])

Khảo nghiệm quốc gia, bắt đầu sản xuất giống 1 100,000 10 và 11

1.5.2. Phương pháp công nghệ sinh học

1.5.2.1 Dung hợp tế bào trần

a. Giới thiệu chung về dung hợp tế bào trần

Một trong những lĩnh vực quan trọng nhất cho sự phát triển công nghệ nuôi cấy

mô tế bào thực vật đã được chứng minh là công nghệ tách, nuôi cấy và dung hợp tế bào

trần. Thành tựu gần đây là các ứng dụng của công nghệ nuôi cấy tế bào trần thành cây

hoàn chỉnh; dung hợp tế bào trần để tạo các thể lai mang các đặc tính mong muốn. Năm

1960, Cooking và cộng sự đã chứng minh được rằng có thể sử dụng enzyme để phân

giải thành tế bào thực vật một cách dễ dàng, điều này có ý nghĩa vô vùng to lớn đối với

di truyền học tế bào thực vật bậc cao. Nuôi cấy tế bào trần được áp dụng không chỉ cho

dung hợp tế bào trần mà còn cho kỹ thuật ADN ngoại lai, cơ quan tử, vi khuản và virus.

Do đó, kỹ thuật tách, nuôi cấy tế bào trần đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu rất quan

trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Những khâu quan trọng của kỹ thuật này bao

gồm: tách, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần; dung hợp tế bào trần; chọn lọc các thể lai soma.

Tế bào trần và sự phát triển tế bào trần

Tế bào trần (protoplast) là phần của tế bào nằm trong thành tế bào, có khả năng co

nguyên sinh và có thể được tách rời khỏi thành tế bào bằng phương pháp cơ học hoặc

emzym. Tế bào trần được bao bọc bởi màng nguyên sinh, nó có thể tái tạo lại thành tế

bào mới và phân chia. Tế bào trần có thể tách từ mô hoặc từ các cơ quan thực vật như lá, rế, hạt phấn hoặc mô sẹo (callus)...

Có thể tóm tắt quá trình phát triển kỹ thuật tế bào trần (prptoplast) đến năm 2015

qua tổng quan của Saurabh Bhatia (2015) [44] như sau:

Năm 1880, Hanstein nêu ra tên gọi protoplast để chỉ các vật chất sống được bao

quanh bởi màng tế bào.

Năm 1892, Klercker Klercker là người đầu tiên phân lập protoplast từ tế bào co

nguyên sinh của cây Stratiotes aloides bằng vi phẫu cơ học.

Năm 1927, Küster chứng minh rằng trong quá trình chín của trái cây, thành tế bào đã bị thủy phân để lại các protoplast tự do. Ông đề xuất nên sử dụng phương pháp sinh lý học theo cơ chế này để phân lập protoplast.

Năm 1931, Chambers phân lập protoplast từ các mô của củ hành tây (vảy hành được ngâm trong 1 M sucrose cho đến khi protoplast co lại thì tiến hành tách protoplast).

Hình 1.2. Sơ đồ tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần

Năm 1960, Cocking là người đầu tiên sử dụng enzyme để giải phóng protoplast.

Năm 1971, Nagata và Takebe đã phát triển kỹ thuật tạo các dòng vô tính tế bào từ

các protoplast phân lập được của cây thuốc lá.

Năm 1972, Carlson và cộng sự là người đầu tiên tạo ra con lai soma của hai loài

Nicotiana khác nhau (N. glauca × N. langsdorfii). Ông cũng đã chứng minh hiệu quả của việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy protoplast trong nghiên cứu di truyền.

Năm 1972, Potrykus và Durand đã báo cáo sự hình thành mô sẹo từ các protoplast

đơn lẻ của Petunia (hoa dã yên thảo).

Năm 1974, Vasil và Vasil báo cáo về sự tái sinh của cây thuốc lá và cây Petunia

từ protoplast và bắt đầu nuôi cấy protoplast ngô.

Năm 1975, Shepard và Roger đã đề xuất phương pháp phân lập một số lượng lớn

protoplast của thuốc lá trong điều kiện nồng độ thẩm thấu của dung dịch gây co nguyên sinh bên ngoài tương đối thấp.

Năm 1977, Potrykus và cộng sự báo cáo sự hình thành mô sẹo từ protoplast của

ngô.

Năm 1980, Veronica phân lập protoplast từ Aspergillus fumigatus bằng cách sử

dụng hỗn hợp enzyme phân giải tách từ Trichoderma harzianum.

Năm 1984, Glimelius phân lập protoplast từ mô sẹo của Brassica với hiệu quả cao

trong môi trường chứa casein thủy phân và nồng độ cao của auxin.

Năm 1986, Firoozabady và Deboer Phân lập protoplast của bông (từ lá mầm và

tán lá). Chứng minh được năng suất và khả năng tồn tại của protoplast, sự tái tạo thành

tế bào và sự phân chia tế bào bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố như: kiểu gen, tuổi mô và

điều kiện sinh trưởng của cây, hỗn hợp và nồng độ enzyme phân giải thành tế bào, thời gian ủ và môi trường nuôi cấy.

Năm 1986, Yamada và cộng sự báo cáo đã tạo được calli từ protoplast của giống

lúa Fujiminori (Oryza sativa L.) và tái sinh cây lúa thành công.

Năm 1988 Wei và Xu đã tách thành công protoplast từ các lá mầm chưa trưởng thành của sáu giống đậu tương (Glycine max L.). Protoplast được nuôi cấy trong môi

trường lỏng KP8 bổ sung 0,2 mg/ L 2,4-D, 1 mg/ L NAA, và 0,5 mg/ L ZT. Đã tái sinh thành công 87 cây từ protoplast của bốn giống đậu tương và thu được hạt có khả năng trồng lại.

Năm 1988, Lührs và Lörz đã phân lập được protoplast từ huyền phù tế bào lúa

mạch và nghiên cứu tiềm năng tái sinh của chúng.

Năm 1988, Harris và cộng sự tách được protoplast từ huyền phù tế bào bao phấn

lúa mì (Triticum aestivum L. cv. Chris).

Năm 1990, Li và Murai đề xuất quy trình tái sinh cây từ protoplast của giống lúa

(O. sativa L.) Nipponbare và Đài Bắc 309.

Năm 1992 Hayakawa và cộng sự đã chuyển gen mã hóa protein vỏ của virus sọc

lúa vào protoplast của hai giống lúa Japonica bằng phương pháp xung điện.

Năm 1995, Jain và cộng sự đề xuất quy trình cải tiến để tái sinh cây từ protoplast lúa Indica và Japonica bằng cách trải protoplast nuôi cấy có nguồn gốc từ huyền phù tế bào phôi trên bề mặt màng lọc có nhúng agarose của Lolium multiflorum và O. ridleyi, kết hợp với việc sử dụng môi trường tái sinh chồi chứa maltose.

Năm 2004, Rosenbluh và cộng sự thực hiện việc chuyển các histon lõi vào

protoplast Petunia, chứng minh khả năng sử dụng protoplast như một công cụ để đưa các đại phân tử vào tế bào thực vật .

Năm 2007, Yoo và cộng sự đề xuất sử dụng protoplast của Arabidopsis như một

hệ thống tế bào đa năng để phân tích biểu hiện gen nhất thời.

Năm 2008, Yang và cộng sự phân tích hồ sơ biểu hiện của các gen liên quan đến

quá trình tái tạo thành tế bào trong quá trình nuôi cấy protoplast ở bông .

Gần đây (2018), hàng loạt tác giả đã sử dụng tế bào trần để thực hiện quy trình

chỉnh sửa gen ở thực vật. [45]

Tách tế bào trần

hoàn toàn lộ ra. Màng sinh chất là hàng rào duy nhất giữa bên trong tế bào thực vật sống

và môi trường bên ngoài. Để tách được tế bào trần người ta có thể sử dụng hai phương

pháp tách cơ học và tách bằng enzyme. Tách cơ học là làm cho tế bào trần ở trạng thái

co nguyên sinh sau đó tác động cơ học để giải phóng tế bào trần. Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều mặt hạn chế: chỉ áp dụng trên một vài đối tượng thực vật; mật độ tế bào trần thu được không cao; khả năng tái sinh yếu. Phương pháp tách tế bào trần bằng

enzyme đã khắc phục được những nhược điểm trên. Hiện nay, phương pháp enzyme được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao.

Tách tế bào trần bằng enzyme là một phương pháp an toàn thường được thực hiện trong một dung dịch đơn giản có độ thẩm thấu cao (chất có tác dụng bổ sung áp suất thẩm thấu trong thực vật hoặc nuôi cấy tế bào thực vật, ví dụ, sucrose), cùng với các enzyme phân hủy thành tế bào. Một hỗn hợp enzyme xenlulaza và pectinaza được sử dụng cho mục đích này. Như vậy có thể tách tế bào trần bằng ba phương pháp:

Các tế bào trần rất dễ vỡ do không còn thành tế bào, màng sinh chất bên ngoài

Phương pháp cơ học: Phương pháp cơ học phân lập tế bào trần lần đầu tiên được

thực hiện bởi Klercker.

Phương pháp enzyme tuần tự: Phương pháp enzym tuần tự được Takebe và những

người khác sử dụng lần đầu tiên vào năm 1968

Phương pháp hỗn hợp enzyme: Nagata và Takebe đã báo cáo sự tái sinh thực vật đầu tiên từ các nguyên sinh chất cô lập vào năm 1971 và kể từ đó điều này đã đạt được ở 330 loài thực vật bậc cao (hạt trần 10, cây đơn tính 32, cây đơn tính 288) [44]

Trong phương pháp enzyme hỗn hợp, cả hai enzyme được sử dụng cùng nhau để giảm thời gian ủ và khả năng nhiễm. Power and Cocking đã sử dụng phương pháp này

để phân lập nguyên sinh chất từ một số ngành khoa học thực vật và nó cho năng suất rất tốt, cao tới 2,5 × 106 protoplast/ gram mô lá [46].

Quy trình tách tế bào trần điển hình có thể bao gồm một số giai đoạn như:

✓ Tiền xử lý mô lá trong môi trường phòng thí nghiệm. ✓ Xử lý co nguyên sinh tách tế bào trần ra khỏi vách tế bào. ✓ Phân giải thành tế bào thực vật bằng enzyme cellulase và pectinase. ✓ Loại bỏ các enzyme phân giải thành tế bào và các mảnh vụn tế bào bằng cách lọc

và rửa bằng ly tâm.

Nuôi cấy tế bào trần

Tế bào trần sau khi tách được nuôi cấy trên môi trường dĩnh dưỡng thích hợp có khả năng tái tạo lớp thành tế bào mới, phân chia và tạo cây hoàn chỉnh. Những yêu cầu về mặt dinh dưỡng cho việc nuôi cấy tế bào trần gần giống với môi trường nuôi cấy mô tế bào. Vì không có thành nên tế bào trần dễ dàng tiếp nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường, do vậy môi trường nuôi cấy nói chung cần giảm bớt các chất vô cơ.

Các phương pháp nuôi cấy nói chung đã được nhiều tác giả công bố trong đó có phương pháp nuôi cấy dịch huyền phù và giọt. Tế bào trần được hòa lơ lửng trong môi trường lỏng ở mật độ khoảng 105 protoplast/ml trong hộp chứa một lớp mỏng môi trường và nuôi cấy trong điều kiện tĩnh. Quá trình nuôi cấy giọt đã được phát triển bởi Kao et al. (1974) [47]. Theo phương pháp này các tác giả đã đặt một giọt (khoảng 50µl) dịch huyền phù tế bào trần (với mật độ 104 - 105 protoplast/ml) trong đĩa petri nhựa, quấn paraphin và nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu.

Một phương pháp khác cũng được sử dụng là nuôi cấy trong thạch. Một thể tích dịch huyền phù có protoplast được trộn với một thể tích tương đương của thạch (1 - 2%) và giữa ở trong 450C trong bẻ ấm trong một thời gian nhất định, sau đó lấy 5ml hỗn hợp này đổ vào hộp lồng, quấn paraphin xung quanh và tiến hành nuôi cấy.

Bên cạnh các phương pháp đã nêu trên người ta còn sử dụng một số các phương pháp nuôi cấy protoplast khác như nuôi cấy trong buồng vi nuôi cấy hay nuôi cấy hỗ trợ.

Kao et al., (1975) đã cải tiến môi trường cơ bản để nuôi cấy protoplast đơn dòng của loài Vicia hajastana cho nhiều loài khác để tái sinh protoplast. Thông thường môi trường nuôi protoplast chứa 3 - 5% sucrose nhưng với một vài loài (nhu thuốc lá) trong môi trường lượng đường thấp hơn 1%. Vitamin cũng được sử dụng cho môi trường nuôi protoplast tương tự như trong môi trường cơ bản. Cả hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng (Auxin và Cytokinin) cũng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào trần ở những tỷ lệ khác nhau, ảnh hưởng đến sự tái tạo thành tế bào và sự phân chia của tế bào. Nguồn Auxin ảnh hưởng đến khả năng hình thành callus từ tế bào trần (2,4D, α-NAA hay IAA). Cytokinin thường được sử dụng là BA, Kinetin, 2-Pi hay Zeatin. Tỷ lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường của mỗi loài khác nhau để kích thích sự phân chia hình thành callus của các tế bào trần.

Duy trì áp suất thẩm thấu cho môi trường nuôi cấy là yếu tố cần thiết cho sự ổn định, khả năng sống và sự phát triển tiếp theo của tế bào trần. Trong quá trình tách, nuôi cấy tế bào trần đều phụ thuộc vào sự ổn định của áp suất thẩm thấu, nó sẽ hạn chế sự vỡ tế bào cho đến khi tái tạo thành tế bào. Áp suất thẩm thấu trong môi trường nuôi cũng quan trọng như trong dung dịch enzyme bao gồm sorbitol, manitol, glucose hay sucrose. Với tế bào trần của các cây họ ngũ cốc, đậu thì cả sorbitol và manitol được chứng minh là thích hợp tạo áp suất thẩm thấu ổn định, còn với tế bào trần của các cây khoai tây, đậu hoa, dứa và sắn thì sucrose là tốt hơn glucose hay manitol, còn với tế bào trần của thuốc lá thì cả galactose và fructose đều được sử dụng để tạo áp suất thẩm thấu. Áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi dần được giảm bởi việc thêm định kỳ vài giọt môi trường mới để các tế bào trần tái tạo thành và phân chia tạo callus.

Tái sinh tế bào trần

Các tế bào trần sau khi nuôi cấy thường có biểu hiện phình to tế bào chất, tăng kích thước và phát sinh hầu hết các bào quan (chủ yếu là lục lạp) tụ thành đám quanh nhân (có thể quan sát rõ ràng qua kính hiển vi). Tỷ lệ và độ thành thục của protoplast phụ thuộc vào nhiều yếu tố: giai đoạn tách và phân hóa của tế bào tách protoplast, điều kiện tách protoplast và tính đặc thù của loài thực vật. Quá trình tái tạo thành tế bào có thể diễn ra ngay vài giờ sau khi tách và có thể hoàn thiện sau 2 - 7 ngày. Sau khi thành tế bào được tái tạo hoàn chỉnh, các tế bào trần không còn giữa nguyên hình cầu như ban đầu.

Những phân tích mới đây về thành tế bào (quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang) cho thấy: khi thành tế bào vừa mới được hình thành, chúng sẽ xuất hiện những sợi vi

bào gắn kết một cách lỏng lẻo các tế bào đứng cạnh nhau. Quá trình này cần thiết phải cung cấp một nguồn cacbon ngoại sinh vào môi trường nuôi cấy. Nếu như áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy ổn định thì sẽ không kích thích được sự tái tạo thành tế bào.

Sau khi tái tạo thành tế bào, các tế bào trần tăng kích thước và phân chia sau 2 - 7 ngày. Sau đó chúng vẫn tiếp tục phân chia và tạo thành các cụm đa bào (những cụm đa bào này là kết quả của sự tái tạo thành và sự phân chia tế bào. Sự phân chia tiếp tục xảy ra sau 1 - 3 tuần nuôi cấy và bắt đầu hình thành macrocallus. Sau đó chuyển sang môi trường không có áp suất thẩm thấu (môi trường rắn) để tạo callus. Các callus này có thể tiếp tục phát sinh thành các cơ quan phân hóa (rễ, lá…) hay tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình phân chia tế bào trần để hình thành callus phụ thuộc vào loại, nồng độ và tỷ lệ Auxin/Cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy; thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.

Các tế bào trần được nuôi cấy trong đĩa petri nhỏ ( 3.5cm hoặc  5cm) với môi trường lỏng phù hợp trong điều kiện tối 250C. Sau 3 - 4 tuần có thể thấy các microcallus xuất hiện. Các microcallus này sẽ được cấy chuyển sang đĩa petri lớn ( 9cm) chứa môi trường cứng Cul-medium [48]. Các đĩa petri này được đặt trong phòng nuôi với quang chu kỳ là 16h chiếu sáng/ngày, nhiệt độ là 220C.

Sau 3 - 8 tuần có thể thu được các marcocallus với kích thước 0,5 - 1,5mm nằm trên bề mặt thạch. Các marcocallus được cấy chuyển tiếp sang môi trường tái sinh RJM [49], đặt trong điều kiện nuôi cấy macrocallus. Khoảng 8 - 12 tuần sau khi cấy chuyển, marcocallus sẽ tái sinh thể chồi. Các thể chồi được chuyển sang môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) để tạo cây hoàn chỉnh.

Dung hợp tế bào trần

Dung hợp tế bào trần hay tạo thể lai soma là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của nuôi cấy tế bào. Quá trình dung hợp tế bào trần được kích thích để hòa trộn 2 bộ gen của 2 loài vào với nhau trong đó có thể là lai cùng loài, lai khác loài, khác gen hay thậm chí khác giới (điều mà không thể thực hiện được bằng phương pháp lai thông thường). Thực tế là các tế bào trần sau khi được tách ra, thành tế bào bị phân giải, chúng rất dễ dàng hòa trộn vào với nhau trong điều kiện in vitro.

Công nghệ dung hợp tế bào trần đã mở ra một cánh cửa mới cho công nghệ chuyển gen, các nghiên cứu sự biểu hiện của gen, tính bền vững của một số tính trạng và cả những biến đổi ở mức độ tế bào. Quá trình dung hợp tế bào trần có thể xảy ra một cách tự phát hay do kích thích bằng một số nhân tố như cơ học, hóa học hay vật lý (gọi chung là dung hợp do kích thích).

- Dung hợp tự phát:

Sau khi các tế bào trần được tách ra (từ mô callus nuôi cấy hay các tế bào sinh dưỡng) dưới dạng huyền phù nhờ các enzyme phân giải thành tế bào, các sợi liên bào (yếu tố kết nối giữa các tế bào tiếp giáp nhau) sẽ bị đứt gãy, từ đó kích thích các tế bào tiến sát lại gần nhau và xảy ra quá trình dung hợp tự phát hình thành lên các tế bào đa nhân (2 - 40 nhân).

Kiểu dung hợp này thường hay gặp ở các tế bào callus, với những tế bào có kích thước trung bình, hiếm gặp ở những tế bào sinh dưỡng (mô lá). Chính vì vậy quá trình dung hợp tự phát sẽ không thể tái sinh được cây hoàn chỉnh mà khả năng phân chia rất ít. Hơn nữa, trong quá trình tách tế bào trần hay cấy huyền phù tế bào thường làm cho các tế bào co nguyên sinh mạnh, hoặc làm đứt gãy cả nhóm sợi liên bào, điều này làm giảm hiệu suất dung hợp. Do đó kiểu dung hợp này ít được sử dụng.

- Dung hợp do kích thích: sử dụng các nhân tố cơ học, hóa học hay điện năng để kích thích sự dung hợp tế bào trần.

Phương pháp dung hợp bằng cơ học: Dùng micropipet trộng đều hồn hợp hai loại tế bào trần của cùng một loài hay khác loài. Đầu tip của pipet được giới hạn một cách không hoàn toàn, các tế bào trần được hút lên hút xuống nhiều lần để tạo thành áp lực dòng chảy nén chúng lại để kích thích sự dung hợp. Quá trình này dễ làm tổn thương tế bào.

Hai đối tượng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới một cách

tự phát hoặc được cảm ứng bởi tác nhân như hóa chất (dung hợp hóa chất polyethylen

glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điện-electrofusion). Đối với cây

khoai tây người ta đã sử dụng cả hai phương pháp trên. Tuy nhiên so với phương pháp

dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xung điện được áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả

cao hơn hơn do thao tác đơn giản, tốc độ nhanh, hiệu suất dung hợp cao trong cùng một

thời điểm và ít gây độc đối với tế bào. Phương pháp dung hợp bằng hóa chất PEG thường

gây độc cho tế bào trần do không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng tái sinh sau này.

Các cơ chế cơ bản mà các tế bào trần có thể được dung hợp với nhau bằng điện đã được Zimmermann U (1982) [50] tiến hành thử nghiệm. Trong quá trình phản ứng điện phân, các tế bào trần bị phân tán lơ lửng trong môi trường có độ dẫn điện thấp và chịu

trường dòng điện xoay chiều (AC) tần số cao (500 KHz - 1,5 MHz) khiến chúng sắp xếp theo quy trình 'điện di'. Sau đó, xung điện được tạo ra bằng cách áp dụng một xung dòng điện một chiều (DC) ngắn, gây ra sự phá vỡ màng nhất thời do đó làm cho các protoplast tiếp xúc hợp nhất với nhau. Trong phản ứng dung hợp điện, tế bào trần được đặt vào một hộp nhỏ có chứa các điện cực và đặt một hiệu điện thế nhất định, tế bào trần sẽ tự xếp thành chuỗi giữa các điện cực. Tạo xung AC và DC thay thế là hai bước cần thiết

để phản ứng dung hợp điện xảy ra. Kỹ thuật phản ứng xung điện ngày nay đã trở nên

phổ biến và mang lại nhiều ưu điểm hơn phản ứng tổng hợp hóa học. Cho đến nay, hầu hết các giống lai soma đã được tái sinh là kết quả của dung hợp bằng xung

điện [44]. Phản ứng xung điện sẽ là kỹ thuật dung hợp tế bào trần được sử dụng rộng rãi nhất.

Chọn lọc các con lai soma

Sản phẩm sau dung hợp là hỗn hợp gồm: Các dạng bố hoặc mẹ dùng để lai, các

thể lai đồng hợp (do các tế bào của cùng 1 loài kết hợp lại với nhau - homozygous)

và thể lai dị nhân (các tế bào khác loài kết hợp lại với nhau - hetezygous) do quá trình dung hợp xảy ra ngẫu nhiên và không kiểm soát được. Chính vì vậy, việc chọn lọc chính

xác con lai soma trong hỗn hợp sản phẩm sau dung hợp là rất cần thiết. Có rất nhiều

phương pháp để chọn lọc con lai soma khác nhau, có thể xếp vào hai nhóm là chọn lọc

ở mức tế bào và chọn lọc ở mức cây hoàn chỉnh. Tùy từng loại cây trồng mà có thể áp

dụng các phương pháp khác nhau, tuy nhiên thường thì chọn lọc con lai ở giai đoạn cây hoàn chỉnh cho hiệu quả cao hơn.

Với những tiến bộ về kỹ thuật dung hợp, kỹ thuật xác định con lai soma như xác

định độ bội nhờ Flow cytometry thay cho phương pháp đếm nhiễm sắc thể, các kỹ thuật

phân tử xác định con lai heterozygote, các kỹ thuật lai nhiễm sắc thể FISH... đã cho phép

phân tích sâu sắc kết quả tổ hợp thể nhiễm sắc của các con lai soma. Hàng loạt con lai

soma khoai tây, đặc biệt giữa khoai tây dại và khoai tây trồng đã được thực hiện thành

công. Một số lượng lớn khoai tây lai soma đã được tạo ra thông qua sự dung hợp

protoplast giữa loài thông thường và các loài dại như S. acaule, S. berthaultii, S.

brevidens, S. bul- bocastanum, S. cardiophyllum, S. chacoense, S. Circaefo- lium, S.

commersonii, S. etuberosum, S michoacanum, S. melongena, S. nigrum, S. phureja, S.

pinnatisectum, S. tuberosum, S. sanctae-rosae, S. Spegazzinii, S. stenotomum, S. tarnii,

S. torvum, S. vernei, S. verrucosum, ... (Bảng 1.6). Sau khi tái sinh, các con lai soma

được xác định thông qua các phương pháp khác nhau như xác định độ bội nhờ Flow

cytometry, đếm số lượng nhiễm sắc thể, số lượng tế bào bảo vệ, lai FISH - huỳnh quang

tại chỗ và lai GISH - genom tại chỗ), isozyme, chỉ thị phân tử (ví dụ: RAPD, RFLP,

ISSR, SSR, AFLP và công nghệ mảng đa dạng DArT), kiểu hình (ví dụ: tán lá, tính trạng

thân, lá, hoa, củ) và khả năng sinh hạt phấn. Các giống lai soma cũng được phân tích

các loại tế bào chất (W / α, T / β, W / γ, W / δ và S / ε) dựa trên bào quan (lục lạp và

mito-chondria) các dấu hiệu cụ thể của bộ gen như được mô tả bởi Lössl et al. (2000).

Cuối cùng, các con lai soma được kiểm tra sự hiện diện của các tính trạng mục tiêu trong điều kiện đồng ruộng hoặc điều kiện kiểm soát và nhiều tính trạng khác

b. Tính ưu việt của phương pháp dung hợp tế bào tần trong chọn tạo giống khoai tây

Dung hợp tế bào trần hay lai soma hay nhằm mục đích tăng cường nguồn gen khoai

tây bằng cách đưa gen từ các loài hoang dã vào khoai tây trồng (Helgeson et al. 1993).

Có thể kể ra các ưu điểm của phương pháp này so với các phương pháp truyền thống

và chuyển gen :

(i)

Tạo ra các con lai soma hữu thụ với các đặc điểm mục tiêu của các loài

Solanum dại.

(ii) Cho phép dễ dàng chuyển các tính trạng đơn gen và đa gen trong cùng một

bước.

(iii) Dung hợp sẽ dẫn đến sự tái tổ hợp các bộ gen nhân và cả bộ gen tế bào chất -

điều mà phương pháp lai hữu tính không thể thực hiện.

(iv) Tránh được các vấn đề về quy định an toàn sinh học liên quan đến gen chuyển

khi thực hiện kỹ thuật tạo giống bằng chuyển gen .

Với những ưu điểm đó, trong vòng 40 năm qua, đặc biệt trong 10 năm gần đây,

hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây thông qua dung hợp tế bào trần đã được tiến hành khá mạnh mẽ.

c. Các nghiên cứu về chọn tạo giống khoai tây qua dung hợp tế bào trần

Có thể tóm tắt các công trình nghiên cứu về chọn tạo giống khoai tây sử dụng kỹ

thuật dung hợp tế bào trần trên thế giới từ năm 1985 – 2016 thông qua bảng dưới đây:

Bảng 1.6. Tóm tắt kết quả quá trình chọn tạo giống khoai tây thông qua dung hợp protoplast các loài Solanum (1985 - 2016)

Tính trạng mục

Phương pháp xác định

Tài liệu tham

Bố mẹ lai/ dung hợp soma

tiêu

con lai soma

khảo

1. S. acaule (+) S. tuberosum

S. tuberosum (4x) dihaploid

Đếm nhiễm sắc thể, RFLP, mẫu phân ly và

S. acaule dihaploid (2x)

Kháng virus khoai tây X (PVX)

Yamada et al. (1997, 1998)

(2x)

họ BC1

S. acaule (4x) and dihaploid (2x)

Rokka et al. (1998, 2005)

S. tuberosum (4x) and dihaploid (2x)

RAPD, Flow cytometry, kiểu hình, hàm lượng glycoalkaloid aglycone, nuôi cấy bao phấn và họ BC1

Kháng bệnh thối vòng do vi khuẩn (Clavibacter spp.) Và virus sâu cuốn lá khoai tây (PLRV)

Glycolkaloids

Đánh giá kiểu hình

S. acaule dihaploid (2x)

S. tuberosum (4x)

Kozukue et al. (1999)

2. S. berthaultii (+) S. tuberosum

Isozyme, tế bào học,

S. tuberosum

S. berthaultii (2x)

dihaploid (2x)

Serraf et al. (1991), Bidani et al. (2007), Nouri-Ellouz et al. (2016)

ISSR, phân tích DNA tế bào ,Flow cytometry kiểu hình, hàm lượng chất dinh dưỡng (Na, Cl và K) và tính trạng củ

Kháng côn trùng, PVY, mầm bệnh trong đất (Fusarium, Pythium và Rhizoctonia spp.) và chịu mặn

3. S. brevidens (+) S. tuberosum

Austin et al.

Đếm nhiễm sắc thể, phân

S. brevidens (2x)

S. tuberosum (4x)/dihaploid (2x)

PVY, PLRV, mốc sương, bạc lá sớm, thối nhũn do vi khuẩn (Erwini spp.) Và kháng sương giá

tích isozyme, RFLP, kiểu hình, phân tích RAPD, quy trình lai lại chéo ngược (BC1, BC2 và BC3), phân tích RFLP và FISH và thử nghiệm thực địa

(1985a, b, 1986, 1988), Gibson et al. (1988), Fish et al. (1988), Rokka et al. (1994), Polgar et al. (1999), Chen et al. (1999b), Tek et al. (2004)

Preiszner et al.

S. brevidens (2x)

PLRV và khả năng chống stress

S. tuberosum (4x)

(1991), Fehér et al. (1992), Xu et al. (1993)

lạnh

Phân tích Isozyme, nhuộm nhiễm sắc thể, kiểu hình, phân tích đa biến, chiếu xạ tia X, phép lai nam và kiểu hình

S. brevidens (2x)

S. tuberosum (4x)

Kháng thối mềm do vi khuẩn (Erwini spp.)

McGrath et al. (1996, 2002), McGrath and Helgeson (1998)

Phân tích phân ly, các thế hệ con lai chéo (BC1, BC2 và BC3), và phân tích huỳnh quang lai tại chỗ (FISH)

Ahn and Park (2013)

S. brevidens (2x)

S. tuberosum (4x)

Đếm số lượng nhiễm sắc thể, các thế hệ con BC1 và BC2 và kiểu hình

Kháng bệnh vảy thông thường (Streptomyces spp.)

Laurila et al. (2001)

S. brevidens (2x)

Glycoalkaloids

S. tuberosum (4x)

GISH và Sắc ký khí - khối phổ (GC-MS) phân tích và cấu tạo bộ gen của các giống lai soma

4. S. bulbocastanum (+) S. tuberosum

Kháng tuyến trùng

S. bulbocastanum (2x)

S. tuberosum (4x)

(Meloidogyne spp.)

Đếm nhiễm sắc thể, phân tích isozyme, kiểu hình, khả năng lai và tính trạng củ

Austin et al. (1993), Mojtahedi et al.(1995)

Oberwalder et al. (1997, 1998)

S. bulbocastanum (2x)

S. tuberosum haploids (2x)

Kháng bệnh mốc sương

Chiếu xạ tia X, Flow cytometry và phân tích RFLP

S. bulbocastanum (2x)

S. tuberosum (4x)

Kháng bệnh mốc sương

RFLP, RAPD và các thế hệ con lai (BC1 và BC2) và phân tích bản đồ gen

Helgeson et al. (1998), Naess et al.(2000, 2001)

Tế bào học (đếm nhiễm

Rakosy-Tican et al. (2015)

S. bulbocastanum (2x)

S. tuberosum (4x)

Kháng bệnh virus PVY

sắc thể và GISH), Flow cytometry, phân tích AFLP và SSR, khả năng sinh sản, kiểu hình và lai

Szezerbakowa

S. bulbocastanum

S. tuberosum

Kháng bệnh mốc

(2x)

dihaploid (2x)

sương

Tái sinh thực vật, RAPD, Flow cytometry và kiểu hình

et al. (2000, 2001, 2003a), Bołtowicz et al. (2005), Greplová et al. (2008)

ISSR, DNA tế bào chất,

Iovene et al.

S. bulbocastanum

S. tuberosum

Kháng bệnh mốc

(2x)

dihaploid (2x)

sương

lai tại chỗ bộ gen (GISH), phân tích thể bội và nuôi cấy bao phấn

(2007, 2012), Aversano et al. (2009)

5. S. cardiophyllum (+) S. tuberosum

Shi et al. (2006)

S. cardiophyllum (2x)

S. tuberosum (4x)

Kháng bệnh mốc sương

RAPD, đếm nhiễm sắc thể và kiểu hình

S. cardiophyllum (2x)

S. tuberosum (4x)

Thieme et al. (2004, 2010)

Kháng bệnh mốc sương, PVY và bọ khoai tây Colorado

SSR, AFLP, Flow cytometry, kiểu hình và khả năng sinh sản của con lai

Chandel et al. (2015)

S. cardiophyllum (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Kháng bệnh mốc sương

RAPD, ISSR, SSR, AFLP, loại tế bào chất (bộ gen lục lạp và ty thể), Flow cytometry, kiểu hình và khả năng sinh sản của con lai

6. S. chcoense (+) S. tuberosum

S. chcoense (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Cheng et al. (1995)

Khả năng kháng bọ khoai tây Colorado

Các dấu hiệu hình thái, sinh hóa (sắc tố anthocyanin) và isozyme

Cai et al. (2004),

S. chcoense (2x)

S. tuberosum (4x)

Guo et al. (2010), Chen et al. (2013)

Kháng bệnh héo do vi khuẩn (Ralstonia spp.)

RAPD, Flow cytometry, bộ gen nhân và tế bào chất, tính ổn định của bộ gen, hành vi sinh học của tế bào mẹ hạt phấn và phân tích SSR

7. S. circaefolium (+) S. tuberosum

Máy đo dòng chảy, phân

S. tuberosum

Kháng bệnh mốc

S. circaefolium (2x)

dihaploid (2x)

sương

Oberwalder et al. (1997, 2000)

tích RFLP và khả năng sinh sản của các giống lai

8. S. commersonii (+) S. tuberosum

S. commersonii (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

RAPD, thể dị bội (số lượng lục lạp trong tế bào bảo vệ khí khổng, số lượng nhiễm sắc thể và máy đo dòng chảy), kiểu hình, khả năng sinh sản,

Cardi et al. (1993, 1999, 2002), Cardi (1998); Nyman and Waara (1997), Waara

Bệnh héo Verticillium, thối mềm củ (Erwinia spp.) và khả năng chống chịu sương giá

phân loại tế bào, phân tích phía nam và DNA bào quan, các thế hệ con

et al. (1998), Bastia et al. (2000, 2001),

BC1 và F2, phân tích đa biến, AFLP và phân tích DNA bào quan

Carputo et al. (2000), Barone et al. (2002), Scotti et al. (2003, 2004)

Khả năng chống

S. commersonii

S. tuberosum

(2x)

dihaploid (2x)

vi khuẩn héo và khả năng chịu lạnh / đóng băng

RAPD, isozyme, đếm nhiễm sắc thể, tự lai / lai xa, các thế hệ con lai (BC1 và BC2) và kiểu hình

Kim et al. (1993), Laferriere et al. (1999), Kim-Lee et al. (2005), Chen et al. (1999a, c)

9. S. etuberosum (+) S. tuberosum

Novy and

DNA bộ gen và lục lạp,

S. etuberosum (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

PVY, PLRV và kháng rệp đào xanh

RFLP, GISH, tế bào học, kiểu hình, đặc điểm củ, các thế hệ con lai (BC1, BC2 và BC3) và các thử nghiệm thực địa

Helgeson (1994a, b), Dong et al. (1999), Novy et al. (2002, 2007), Gillen and Novy (2007)

S. etuberosum (2x)

Kháng PVY

S. tuberosum dihaploid (2x)

Thieme et al. (1999, 2004), Gavrilenko et al. (2003)

Isozyme, đánh dấu SSR, GISH và các thế hệ con lai chéo (BC1 và BC2) và phép đo Flow cytometry

RAPD, SSR, Flow

S. etuberosum (2x)

Kháng PVY

Tiwari et al. (2010, 2015c)

S. tuberosum dihaploid (2x)

cytometry, loại tế bào chất và kiểu hình

10. S. melongena (+) S. tuberosum

Mức độ đơn bội (số

S. tuberosum

Chống héo vi

S. melongena (2x)

Yu et al. (2013)

dihaploid (2x)

khuẩn

lượng nhiễm sắc thể và đo dòng tế bào), SSR, GISH karyotypes và phân tích DNA tế bào chất

11. S. × michoacanum (+) S. tuberosum

S. × michoacanum (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Kháng bệnh mốc sương

RAPD, SSR, CAPS, mức độ đơn bội (số lượng tế bào bảo vệ và Flow cytometry), kiểu hình, khả năng sinh sản và các thế hệ con F1 và BC1

Szczerbakowa et al. (2010), Smyda et al. (2013), Smyda- Dajmund et al. (2017)

12. S. nigrum (+) S. tuberosum

Tái sinh thực vật, RAPD,

S. nigrum (6x)(non- tuberous)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Kháng bệnh mốc sương

đo Flow cytometry, kiểu hình và lai giống

Szczerbakowa et al. (2000, 2001, 2003b, 2011), Zimnoch- Guzowska et al. (2003)

S. nigrum (6x)

Kháng atrazine

S. tuberosum (4x)

Số lượng nhiễm sắc thể và kiểu hình

Binding et al. (1982)

S. tuberosum

Horsman et al. (1997)

–

S. nigrum (6x) complex species

(4x) and dihaploid (2x)

Isozyme, Flow cytometry, các dấu hiệu và kiểu hình có thể lựa chọn

13. S. phureja (+) S. tuberosum

Phương pháp nhuộm

S. tuberosum

Kháng bệnh mốc

S. phureja (2x)

dihaploid (2x)

sương

Puite et al. (1986), Mattheij and Puite (1992)

diacetate Fluorescein, tế bào học, số lượng nhiễm sắc thể và kiểu hình

Fock et al.

(2000)

S. phureja (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Chống héo vi khuẩn

Isozyme, RAPD, SSR, đoflow cytometry, bộ gen lục lạp và kiểu hình

S. phureja monoploids

Quang kỳ dài

S. phureja monoploids (1x)

(1x)

Lightbourn and Veilleux (2007), Lightbourn et al. (2007)

SSR, đo flow cytometry, đánh giá hiện trường, đa hình khuếch đại theo trình tự cụ thể (S-SAP) và phân tích đánh dấu dựa trên retrotransposon

14. S. pinnatisectum (+) S. tuberosum

S. pinnatisectum (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Kháng bệnh mốc sương

Menke et al. (1996)

Đo dòng tế bào, RFLP, kiểu hình và tính trạng củ

Kháng bệnh mốc sương

S. pinnatisectum (2x)

Sidorov et al. (1987)

S. tuberosum dihaploid (2x) and S. phureja (2x)

γ-Chiếu xạ, phân tích isozyme, đếm nhiễm sắc thể và phân tích ADN lục lạp

Isozyme, RAPD, Flow

S. tuberosum

Kháng bệnh mốc

Thieme et al.

dihaploid (2x)

sương

(1997)

cytometry, tế bào học, kiểu hình, khả năng chéo và khả năng sinh sản

S. pinnatisectum (2x) and Hybrid clone (S. pinnatisectum×S. bulbocastanum)

S. pinnatisectum (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Kháng bệnh mốc sương

RAPD, tế bào học và kiểu hình

Szczerbakowa et al. (2005)

S. pinnatisectum (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Kháng bệnh mốc sương

RAPD, đoflow cytometry và kiểu hình

Greplová et al. (2008)

S. pinnatisectum (2x)

S. tuberosum (4x)

Kháng bệnh mốc sương

SSR, phân tích DNA bào quan và kiểu hình

Polzerová et al. (2011)

S. pinnatisectum (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Kháng bệnh mốc sương

Sharma et al. (2011), Sarkar et al. (2011), Tiwari et al. (2013a), Luthra et al. (2016)

Hệ thống truyền điện hiệu quả, RAPD, SSR, loại tế bào chất, Flow cytometry, kiểu hình, thử nghiệm trên thực địa, tiềm năng lai tạo và lai tạo (thế hệ con cháu BC1)

15. S. tuberosum (+) S. tuberosum

Austin et al.

S. tuberosum dihaploid (2x)

Kháng PVX và PVY

Đếm nhiễm sắc thể, isozyme và kiểu hình

(1985b), Thach et al. (1993)

S. tuberosum

Bất dục đực tế bào

Kiểu hình, hình thái hoa

S. tuberosum (4x)

Perl et al. (1990)

(4x)

chất

và giống khoai tây thật

Khả năng chống

S. tuberosum dihaploid (2x)

Isozyme và các dấu hiệu kiểu hình

Möllers and Wenzel (1992)

lại Globodera spp. và thuốc diệt cỏ metribuzin

S. tuberosum dihaploid (2x)

Đánh dấu kiểu hình, đếm nhiễm sắc thể, hình thái hoa và phân tích RAPD

Khả năng chống lại tuyến trùng nang khoai tây và bệnh mốc sương

Cooper-Bland et al. (1994), Rasmussen et al. (1996, 1998)

Kháng PLRV,

Rokka et al.

S. tuberosum

dihaploid (2x)

PVY, mốc sương và thối nhũn (Erwiniai spp.)

(1994, 2000), Valkonen and Rokka (1998)

Phân tích RAPD, đếm nhiễm sắc thể, Flow cytometry kiểu hình, khả năng sinh sản và lai ngược

S. tuberosum dihaploid (2x)

Nouri-Ellouz et al. (2006)

Kháng PVY và thối rữa bảo quản (Pythium aphanidermatum)

Phân tích isoenzyme, đếm nhiễm sắc thể, vi khối, SSR, ISSR và phân tích DNA bào quan

16. S. sanctae-rosae (+) S. tuberosum

S. sanctae-rosae

S. tuberosum

Harding and

(2x)

(4x)

Millam (2000)

Khả năng kháng tuyến trùng nang khoai tây

SSR, cấu hình ti thể RFLP và phân tích bộ gen bào quan

17. S. spegazzinii (+) S. tuberosum

S. spegazzinii (2x)

Chiếu xạ tia X, điều chế

S. tuberosum

Rasmussen et al. (1997, 2000)

(4x) and dihaploid (2x)

and Hybrid clone (2x) (S. microdontum x S. vernei)

vi mô, phân loại tế bào kích hoạt huỳnh quang (FACS), bộ gen tế bào chất và phân tích RAPD

18. S. stenotomum (+) S. tuberosum

Mức độ đơn bội, khả năng tồn tại của hạt phấn, isozyme, SSR, DNA lục lạp, chiết xuất protein, xét nghiệm

S. stenotomum (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Chống héo vi khuẩn

Fock et al. (2001)

carboxylase, phân tích Western blot, phân tích microtuberization và sinh hóa (sucrose và glucose)

19. S. tarnii (+) S. tuberosum

S. tarnii (2x)

S. tuberosum (4x)

Thieme et al. (2004, 2008)

Phân tích flow cytometry, SSR, AFLP và BC1

Bệnh mốc sương, bọ hung khoai tây Colorado và kháng PVY

20. S. torvum (+) S. tuberosum

S. torvum (2x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Chống héo Verticillium

Isozyme, các dấu hiệu hình thái và kiểu hình

Jadari et al. (1992)

21. S. vernei (+) S. tuberosum

Isoenzyme, RAPD,

S. tuberosum

Trabelsi et al.

S. vernei (2x)

Salt tolerance

dihaploid (2x)

(2005)

ISSR, DNA bào quan, đoflow cytometry và kiểu hình

22. S. verrucosum (+) S. tuberosum

S. verrucosum (2x)

Kháng PLRV

S. tuberosum dihaploid (2x)

Carrasco et al. (2000)

RAPD, đếm lục lạp, kiểu hình và thử nghiệm thực địa

23. S. villosum (+) S. tuberosum

Tarwacka et al. (2013)

S. villosum (4x)

S. tuberosum dihaploid (2x)

Kháng bệnh mốc sương

Sản xuất RAPD, GISH và các loại oxy phản ứng (ROS) bằng cách phân tích mầm bệnh

S. brevidens, S. commersonii, S. etuberosum and S. villosum are non-tuberous wild potato species. Cytoplasm types are described as: (i) ALC1/ALC3: 381 bp (T/β), 622 bp (W/α and W/γ); (ii) ALM1/ALM3: 1.2 kb (W/α and W/γ); (iii) ALM4/ALM5: 1.6 kb (T/β), 2.4 kb (W/α); and (iv) ALM6/ALM7: 2.4 kb (W/γ) (Lössl et al. 2000)

(Nguồn [51])

d. Ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần trong chọn tạo giống khoai tây kháng virus trên thế giới và Việt Nam

Trên thế giới:

Đối với hướng tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần giữa hai hay nhiều dòng mang đặc tính kháng tỏ ra có nhiều ưu điểm: Tổ hợp được bộ genome

của cả hai bố mẹ tạo thành một cấu trúc genome dị hợp tử mới, không có sự biệt lập trong quá trình giảm phân, rút ngắn thời gian chọn tạo, khắc phục những rào cản về mặt di truyền trong lai hữu tính… Cho nên trở thành công cụ đầy hứa hẹn phục vụ chương trình chọn tạo giống cây khoai tây kháng virus.

Việc cải tiến tính kháng virus PVY (một loại virus hại chủ yếu ở khoai tây) là một

chiến lược lớn nhằm giảm thiểu việc sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật. Tính kháng cực kỳ cao (extremely resistance) đối với loại virus này thể hiện ở khả năng kìm hãm sự

nhân lên của virus tại các tế bào xâm nhiễm [52]. Tính kháng này được chuyển từ loài

khoai tây dại S. stoloniferum vào các giống khoai tây trồng S. tuberosum của Châu Âu qua 3 - 7 thế hệ lai backcross với cây mẹ mang gen RTsto [53]. Tính kháng với virus cũng được chuyển vào khoai tây trồng bằng các thao tác gen song mức độ kháng là không hoàn toàn hoặc chỉ có thể kháng với một chủng của virus PVY trên trồng ruộng. Hơn nữa việc chuyển gen có hạn chế với chương trình chọn tạo giống khoai tây. Do đó việc

sử dụng các loài khoai tây dại như một nguồn gen kháng virus là mối quan tâm của các

nhà chọn tạo giống cây trồng bằng phương pháp lai soma. Các nhà chọn tạo giống khoai

tây đã sử dụng các gen có liên quan đến tính kháng virus PVY từ các loài khoai tây dại

(Solanum demissum Lindly, S. hougasii Correll, S. stoloniferum Achlechtendal & Bouche, S. tuberosum L. ssp. Andigena và S. chacoense để đưa vào nguồn gen khoai tây trồng

bằng phương pháp dung hợp tế bào trần. Tuy nhiên, các loài khoai tây dại này rất khó để

lai với khoai tây trồng và lai hữu tính với khoai tây trồng thì chưa được biết đến. Để khắc

phục những khó khăn trong lai hữu tính, lai soma được sử dụng để dung hợp protoplast

giữa loài dại này với giống khoai tây trồng Delikat (một giống rất nhạy cảm với virus).

Các con lai soma không có biểu hiện bị nhiễm virus sau khi lây nhiễm nhân tạo với 6

chủng PVY quan trọng nhất ở điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng [6]. Điều này chứng

tỏ rằng tính kháng virus PVY đã được chuyển từ loài dại vào khoai tây trồng bằng dung

hợp protoplast. Sau đó, lai backcross giữa các con lai soma với giống khoai tây trồng Delikat nhạy cảm với virut, tất cả các dòng lai BC1 đều không có biểu hiện nhiễm virus PVY khi lây nhiễm với tất cả các chủng của virus này. Trong các dòng lai BC2, các kiểu gen kháng và nhạy cảm đã được chọn lọc.

Tùy thuộc vào thành phần gen của con lai soma mà biểu hiện một số các biến đổi

về tính trạng hình thái và phản ứng lại sự xâm nhiễm virus PVX bởi vector [54]. Một số con lai soma được lai lại thành công với dòng khoai tây trồng mà vẫn biểu hiện tính kháng Hàng loạt con lai soma của S. etuberosum và S. tuberosum và dòng BC1 thể hiện kháng tốt với PVY và tính rất kháng với PVX [55]. Nghiên cứu của Polgar et al. (năm

2002) đã tạo được 150 dòng lai soma giữa thứ khoai tây Hungari và S. brevidens cùng một vài thế hệ BC. Kết quả cho thấy rằng tất cả con lai và hầu hết dòng BC biểu hiện mức kháng cao với virus PVY và PLRV.

Sơ đồ tạo giống khoai tây nổi tiếng của Wenzel (năm 1979) bằng dung hợp tế bào trần bao gồm các khâu: chọn lọc các đặc tính mong muốn ở bố mẹ (haploid, 1x) sau đó

tạo cây dihaploid (2x), lai tạo các cây dihaploid (có các đặc tính khác nhau) để tạo con

lai 2x tổ hợp được các đặc tính mong muốn của bố mẹ. Sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào để tổ hợp các đặc tính mong muốn ở các dạng 2x. Kết quả thu được con lai soma 4x

(tetraploid). Các dòng lai soma này được chọn lọc để phát triển thành giống có đặc tính mong muốn.

Theo định hướng này đã có hàng loạt công trình của các tác giả nhằm giải quyết

từng khâu của sơ đồ tạo giống trên: các công trình về nghiên cứu kỹ thuật giảm độ bội

của khoai tây tứ bội xuống nhị bội khi lai khoai tứ bội với dòng dại Solanum phureja;

các công trình nghiên cứu về hoàn thiện kỹ thuật tách protoplast và dung hợp protoplast khoai tây theo các phương pháp hoá học, điện học (Thomas 1981, Bokelmann, Roest

1983. Eduard Chani et al (2000) đã áp dụng công nghệ dung hợp protoplast và nuôi cấy

bao phấn để tạo các cây đơn bội. Các con lai soma được tạo ra từ tổ hợp lai giữa Solanum

phureja Juz.&Buk. và S. chacoense Bitt. Nuôi cấy hạt phấn của các con lai này để tạo 1 họ cây đơn bội. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn như điều kiện trồng

cây cho bao phấn; phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy; điều kiện nuôi cấy; kiểu

gen; thời gian lấy bao phấn... Đa số các cây tái sinh đều là cây nhị bội, điều này chứng

tỏ rằng có một số alen đã bị đào thải trong thể dị hợp ở cây cho hạt phấn. Trong các cây

tái sinh, các thể đồng hợp cũng được xác định thành công bằng chỉ thị phân tử SSR với 8 cặp mồi.

Trong giai đoạn những năm 80 đến 90, các nghiên cứu nhằm phát triển các phương

pháp tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các thể lai soma được tiến hành rất mạnh mẽ

[7, 48, 56, 57, 58, 59, 60]. Các công trình nghiên cứu tạo các con lai soma tổ hợp được

các đặc tính kháng bệnh virus từ bố mẹ đã chọn lọc (2x) cũng được rất nhiều tác giả

nghiên cứu thành công. Các tác giả này thừa nhận có thể tổ hợp được các đặc tính kháng

bệnh (virus PVY, PVX, mốc sương, rệp) của bố mẹ vào con lai soma và các đặc tính

này có thể quan sát rõ trên đồng ruộng. Tuy nhiên những dòng con lai soma có nhiều biến dị trên đồng ruộng cần phải chọn lọc.

Thạch và cộng sự (năm 1993) đã chọn lọc thành công 14 dòng khoai tây nhị bội S. tuberosum mang gen kháng Rx hoặc Ry hoặc cả hai, biểu hiện tính kháng rất cao với

virus PVX, PVY, điều này rất ý nghĩa để tiến hành nghiên cứu dung hợp tế bào trần giữa chúng nhằm tạo thể lai soma mang đặc tính kháng bệnh virus. Các tổ hợp chọn cho dung hợp hầu hết tạo thể lai tứ bội (tetraploid), một số kết quả khác gần 50% là thể lục bội (hexaploid) và thể bội không hoàn chỉnh (aneuploid). Đặc biệt một tổ hợp lai thu được có tới 94% dòng lai soma, trong khi đó những tổ hợp khác chỉ có 2% là dòng lai soma. Đa số các con lai soma thu được có biểu hiện tính kháng virus của cả hai đối tượng khoai

tây dung hợp, con lai được xác định bằng kỹ thuật RFLP và phân tích isozyme với 2 loại enzym esterase và peroxidase.

Với sự phát triển không ngừng của các công nghệ hiện đại kết hợp với các kỹ thuật

truyền thống, các gen kháng hai loại virus PVY và PVX đã được xác định thông qua các

nghiên cứu di truyền và chỉ thị phân tử [52]. Các trình tự liên quan đến khả năng kháng virus ở khoai tây đã được xác định. Bên cạnh đó, hơn 5881 SSRs ở khoai tây đã được

tìm thấy. Đây chính là những cơ sở dữ liệu quan trọng để ứng dụng các kỹ thuật của

công nghệ sinh học hiện đại (tin sinh học, chỉ thị phân tử) nhằm nhanh chóng tạo các

giống khoai tây theo định hướng mong muốn. D.Milbourne et al (năm 1998) [61] đã thành công trong việc phân lập, đánh giá và lập bản đồ SSR cho khoai tây. Các nhà

nghiên cứu đã thiết kế và tổng hợp thành công 120 cặp mồi với vị trí chính xác trên

ADN của khoai tây được thiết kế và tổng hợp. Đây là những giữ liệu rất quan trọng cho

nghiên cứu di truyền ở khoai tây trong tương lai. Kế thừa những kết quả này, Ye –So Song et al (năm 2005) [62] đã xây dựng thành công bản đồ gen Rysto (gen kháng cực kỳ cao với virus PVY), gen này nằm trên nhiễm sắc thể số XII của khoai tây. 12 marker của gen Rysto đã được sử dụng để phân tích đa hình của 106 giống khoai tây của Đức, Ba lan, Thụy sỹ. Locus của gen Rysto đã được xác định nằm trên nhiễm sắc thể số XII bằng mồi STM0003. Sử dụng các dòng khoai tây nhị bội tạo ra từ nuôi cấy hạt phấn sơ

cấp để phát triển các chỉ thị phân tử đã được chứng minh. Đây là nguồn marker tiềm năng cho chương trình chọn tạo giống khoai tây có các đặc tính mong muốn.

Gần đây, có nhiều hướng nghiên cứu mới là sử dụng nguồn gen khoai tây dại

có đặc tính kháng bệnh và dịch hại (virus, Phytophtora infestan, rệp truyền bệnh... ) rất

điển hình làm nguyên liệu dung hợp trực tiếp với các dòng khoai tây trồng để tạo các

con lai soma mang đặc tính chống chịu virus mốc sương và rệp truyền bệnh. Các dòng

lai này sẽ được sử dụng làm vật liệu lai lại (BC) với chính bố mẹ của chúng. Kết quả tạo

ra các dòng khoai tây trồng trọt mang đặc tính kháng bệnh virus rõ rệt cùng với các đặc

tính nông sinh học tốt của bố mẹ. Đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại để chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai hữu tính: S. chacoense [63]; S.niggrum [64]; S.brevidens [56, 65]; S.circaeifolium [66]; S.berthaultii [67]; S. khasianum, S.aculeatissimum [68]; S.pinnatisectum [69]; S.bulbocastanum [6, 56, 69, 70, 71]

Ở Việt Nam:

Mặc dù thế giới đang tiến rất nhanh và đạt được khá nhiều thành tựu trong chọn

tạo giống khoai tây kháng bệnh và sâu hại bằng công nghệ dung hợp tế bào trần. Xong ở Việt Nam, cho đến nay công nghệ này vẫn còn hết sức mới mẻ. Chúng ta chưa thành

công trong việc tạo giống thông qua lai tạo truyền thống; chưa sử dụng các phương pháp

Công nghệ Sinh học hiện đại; chưa có bộ vật liệu phong phú mang các tính trạng quý như mang gen kháng virus, mốc sương, chống chịu với các stress phi sinh học (abiotic

stress). Sản xuất khoai tây ở Việt Nam đang gặp 2 vấn đề nan giải: (1) Chưa xây dựng

được hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh tại chỗ nhằm cung cấp chủ động củ

giống sạch bệnh cho sản xuất với giá thành được sản xuất chấp nhận. Các giống khoai tây sử dụng trong sản xuất chủ yếu vẫn phải nhập nội; (2) Còn có rất nhiều khó khăn và hạn chế trong công tác chọn tạo giống khoai tây phù hợp với điều kiện sinh thái Việt Nam có năng suất cao, phẩm chất tốt (ăn tươi hoặc chế biến) và đặc biệt có đặc tính

kháng bệnh nhất là bệnh virus gây thoái hóa giống khoai tây và bệnh mốc sương vào cuối vụ đông gây thiệt hại về năng suất nghiêm trọng.

Hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây lâu nay ở Việt Nam chủ yếu vẫn là

công tác nhập nội và khảo nghiệm, trên cơ sở đó đề xuất các giống phù hợp cho sản xuất. Cùng với những tiến bộ và thành tựu đạt được của thế giới trong nghiên cứu cải

tạo giống cây trồng bằng dung hợp tế bào trần, Việt Nam đang dần kế thừa và bắt đầu

nghiên cứu kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo giống khoai tây kháng virus và bệnh cũng như một số dịch hại nguy hiểm khác.

Ở Việt Nam hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây có sử dụng kỹ thuật dung

hợp tế bào trần đã được bắt đầu tiến hành. Nguyễn Thị Phương Thảo và cs (2009) đã thu thập, đánh giá một số dòng khoai tây nhị bội về đặc tính nông sinh học và đặc tính

kháng virus. Nhóm tác giả trên cũng đã dung hợp thành công giữa các dòng khoai tây

nhị bội tạo ra các con lai soma tứ bội. Trong số các con lai soma tứ bội tạo ra đã chọn

lọc được 02 dòng con ai triển vọng mang khả năng kháng bệnh virus Pvy và mang các

đặc tính nông sinh học quý đang được phát triển thành giống sản xuất thử [72]. Tiếp tục

hướng nghiên cứu này, Hoàng Thị Giang & cs (2013; 2014) [73] đã tạo thành công các

tổ hợp lai dung hợp giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng. Con lai

soma tổ hợp được đặc tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại và các đặc tính nông học quý từ khoai tây trồng. Đây là hướng đi quan trọng để tạo vật liệu khởi đầu cho chương trình chọn tạo giống khoai tây của Việt Nam.

1.5.2.2 Phương pháp chuyển gen

Tính kháng bắt nguồn từ gen CP (CPMR - Coat Protein Mediated Resistance)

Việc chuyển gen sinh protein vỏ virus vào khoai tây để tạo giống kháng virus, đây là hướng nghiên cứu đầu tiên về tính kháng virus bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh. Trong đó, Hemenway (1988) đã chuyển nạp thành công gen Cp của PVX vào khoai tây, thu được kết quả tạo khoai tây chống chịu virus PVX.

Tính kháng CPMR thường là tính kháng đặc hiệu dòng virus, nhưng không phải

tất cả. Chúng có thể kháng được nhiều dòng virus khác và ít nhất là kháng với chính dòng virus mang gen chuyển đó.

Một số dòng chuyển gen Cp đã được kiểm tra về đặc tính kháng virus trên đồng

ruộng và đã xác nhận kháng virus: PLRV ở Austrailia, ở Mỹ, ở Canada; kháng virus PVX ở Thụy Sỹ và ở Hà Lan [74].

Tuy nhiên, tính kháng CPMR chỉ có hiệu quả với nhóm virus xâm nhập qua lây

nhiễm cơ giới, không kháng được nhóm virus truyền qua tuyến nước bọt của côn trùng đối với trường hợp kháng dòng virus PVY và kháng TRV.

Tính kháng bắt nguồn từ protein di chuyển

Virus mã hóa một số loại protein di chuyển hỗ trợ sự lây lan của virus trong cây.

Khi đó các phân tử protein này chính là mục tiêu trong tạo giống kháng virus.

Năm 1996, Tacke đã chuyển trình tự gen ORF của virus PLRV sang cây khoai tây,

gen này mã hóa cho protein pr17 giúp virus di chuyển trong mạch phloem. Dòng khoai

tây chuyển gen có biểu hiện đột biến protein pr17 thì kháng được với virus PVX, PVY.

Ngược lại, dòng không có đột biến trên thì chỉ kháng virus PLRV nhưng không kháng

PVX và PVY. Khi tiến hành kiểm tra về tính kháng với virus PLRV của các cây chuyển

gen thấy được lượng kháng nguyên (virus) trong cây giảm rõ rệt. Qua nghiên cứu này Tacke chứng minh tính kháng PLRV được kiểm soát ở mức RNA, trong khi đó tính kháng

PVX và PVY là tính kháng bắt nguồn từ protein được mã hóa của tác nhân gây bệnh. Do

đó, những cây tích lũy protein này sẽ kháng được sự lây nhiễm của nhiều loại virus khác nhau, PVY và PVX. Cơ chế kháng này không mang tính đặc hiệu dòng virus.

Tính kháng bắt nguồn từ gen tái bản

Năm 1990, nhà khoa học Golemboski đã chuyển vùng gen polymerase của virus

TMV (Tobacco Mosaic tobamovirus) vào cây khoai tây, gen này tạo ra tính kháng virus

theo cơ chế “tính kháng bắt nguồn từ gen tái bản polymerase”. Tiếp đó, hàng loạt nghiên cứu về chuyển các kiểu gen polymerase của RNA virus và tương tự như cơ chế kháng

trên đối với nhiều loại virus khác nhau, virus PVX [59], kháng PVY (Audy et al. 1994). Nguyên lý của phản ứng kháng là sự ức chế quá trình tái bản của virus [75]. Nghiên cứu

của Monsanto (năm 1994) đã chuyển vùng gen polymerase PLRV vào khoai tây. Các dòng chuyển gen biểu hiện toàn bộ gen chuyển polymerase và kháng tốt với virus PLRV. Cho tới nay cơ chế kháng này vẫn chưa được hiểu rõ ràng.

Tạo giống khoai tây kháng vector truyền virus

Bệnh virus lây lan qua tiếp xúc cơ giới, truyền qua vector (côn trùng, tuyến trùng)...

trong đó côn trùng là tác nhân truyền bệnh chính. Nên ngoài việc tạo giống kháng virus cần tạo giống kháng côn trùng truyền virus. Tính kháng côn trùng truyền bệnh virus dựa

trên tổ hợp nhiều yếu tố khác nhau: Yếu tố hóa sinh và đặc điểm hình thái (có lông), đặc biệt là thành phần glycoalkaloid.

Theo nghiên cứu Tingey et al. (1978) [76] và Sinden (1982) [77] cho biết hàm

lượng glycoalkaloid có mối liên hệ với tính kháng vector truyền bệnh virus, nếu hàm

lượng càng cao tính kháng càng mạnh và ngược lại. Hợp chất này gây độc với một số loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng (beetle-insect) ăn lá [78].

Một số loài khoai tây dại S. berthaultii, S. polyadenium, S. wittmackii và S. tarijense

có đặc điểm mang nhiều lông, có tuyến dính trên lá và thân do đó làm giảm tính ăn của

loài rệp Macrosiphum persicae nên đã hạn chế sự truyền bệnh virus, nhất là virus PVY

[79]. Ngoài ra tính kháng côn trùng truyền bệnh virus còn phụ thuộc vào tuổi cây trong

từng loài, đối với nhóm khoai tây dại S. brevidens các lá non và lá trưởng thành rất ít bị

rệp tấn công ngược lại lá non của S. etuberosum lại dễ bị tấn công hơn lá già nên rất dễ bị nhiễm virus (Valkonen, 1992a).

Về yếu tố hóa sinh, liên quan đế men phân giải các hợp chất nào đó trong ruột côn

trùng. Trong cây mang đặc tính kháng côn trùng sẽ sản xuất ra một số enzyme và protein

đặc hiệu khi côn trùng ăn vào trong ruột sẽ gây ức chế quá trình tiêu hóa của chúng, làm cho sâu có biểu hiện chán, ngán ăn, sau vài ngày có thể chết.

Phương pháp tạo giống kháng côn trùng truyền bệnh virus cũng rất có ý nghĩa tuy

nhiên chỉ phù hợp với nhóm sâu non ăn lá, ăn thân, ít có ý nghĩa với nhóm côn trùng trưởng thành.

Đối với phương pháp chuyển gen cũng gặp không ít rắc rối bởi khi chuyển gen kháng virus vào cây chúng có thể không biểu hiện tính kháng [18, 80, 81, 82] mà còn xuất

hiện các sản phẩm phụ (protein) từ gen chuyển gây rối loạn hoạt động của cây chủ. Nhược điểm của phương pháp chuyển gen là mang tính kháng đặc hiệu dòng virus, dễ bị phá vỡ tính kháng khi lây nhiễm virus với nồng độ cao, chỉ có ý nghĩa với nhóm virus lây nhiễm cơ giới mà không có hiệu quả với nhóm virus truyền qua tuyến nước bọt của côn trùng [83, 84].

Tính kháng theo cơ chế làm câm gen hậu phiên mã nhờ RNAi (interference RNA)

RNAi là cơ chế điều khiển hoạt hóa gene và hầu hết các sinh vật nhân chuẩn có

thể gây knock out (mất hoàn toàn biểu hiện của một gene) hoặc knock down (làm giảm hoạt hóa gene tùy tình huống). Sự phát hiện ra cơ chế RNAi được khởi đầu từ những

nghiên cứu từ 1928 của Wingard về hiện tượng hồi phục của cây thuốc lá sau khi bị

nhiễm virus đốm vòng (ringspot) và đặc biệt bởi công trình của Andrew Fire và Craig Mello khi phát hiện vai trò các RNA interference trong tuyến trùng C. elegans.

Khi đưa RNA thông tin của virus dưới dạng sợi kép xâm nhập vào tế bào cây, sợi

RNA kép này sẽ bị cắt bởi phức hợp enzyme RNAase có tên gọi chung là dicer thành các đoạn ngắn gọi là small interference RNA (siRNA) chứa từ 21 – 23 nucleotide. Các

đoạn siRNA sẽ lại tiếp tục được kết hợp với một phức hợp enzyme tên gọi là Agronaute

(tổ hợp của protein và enzyme phân giải RNA). Phức hợp giữa siRNA và Agronaute

được gọi tên là RISC - phức hợp cảm ứng làm câm gene (RNA-induced silencing complex). Đoạn kép siRNA sẽ bị Agronaute phân giải một mạch đơn (mạch khuôn,

tương ứng với RNA thông tin ban đầu), mạch còn lại là mạch đối bản nằm trên

Agronaute tạo thành một tổ hợp sẵn sàng nhận RNA thông tin của virus xâm nhập (sợi

đơn) theo cơ chế bổ sung. Khi RNA thông tin của virut đã kết hơp với đối bản của siRNA của phức hợp RISC, chúng sẽ bị phân giải. Kết quả là RNA virus sẽ bị phân giải

hoàn toàn. Có thể làm rõ cơ chế tác động của RNAi theo sơ đồ Hình 1.3 Dựa theo cơ

chế này, người ta có thể xác định trình tự RNA của virus gây bệnh sau đó thiết kế thành

mạch kép RNA của virus, chuyển vào tế bào cây. RNA mạch kép của virus trong tế bào

của cây sẽ bị phân giải tạo các siRNA rồi tiếp tục hình thành phức hợp RISC với

Agronaute. Khi virus gây bệnh xâm nhập, chúng sẽ bị phức hợp RISC phân giải. Kết

quả là cây kháng được bệnh virus. Chỉ một lượng nhỏ RNAi đã đủ gây bất hoạt, RNAi

được nhân bản và có vai trò xúc tác. Cũng có thể tạo các siRNA virus rồi chuyển vào

cây mà không cần thiết kế và chuyển đoạn RNA kép virus dài như đã trình bày. Dựa

trên cơ chế này người ta đã nghiên cứu tạo các giống kháng virus theo công nghệ siRNA.

Đã tạo thành công các giống thuốc lá kháng virus CMV, PVY, TMV, cà chua kháng

virus cucumber mosaic virus (CMV), tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). Cây khoai tây kháng PVY [85 Missiou et al., 2004]

Hình 1.3 Cơ chế làm câm gene nhờ RNAi

Chuyển gen kháng virus dựạ theo công nghệ microRNA

Cùng theo cơ chế RNAi còn có cách tiếp cận khác để phát triển thực vật kháng các virus khác nhau là kỹ thuật chuyển gene tạo các thực vật sản xuất microRNA

(miRNA) gây cản trở sự nhân lên của virus. Khác với siRNA, các miRNA thường có

nguồn gốc nội sinh, có vai trò trong sự điều hòa gen trong cơ thể cũng như kháng lại các

nguồn DNA lạ. Các nhà khoa học đã sử dụng PCR để nhân một chuỗi nhỏ tiền chất có

thể xử lý để tạo ra một miRNA dài từ 20 đến 24 nucleotide bổ sung cho RNA virus. Các

miRNA nhân tạo mới được tổng hợp (amiRNA) tham gia phức hệ làm câm gene RISC, RNA virus khi liên kết với RISC sẽ bị phân giải.

[Nguồn 86]

Hình 1.4. Sử dụng cây chuyển gen amiRNA để tạo cây kháng virus. Cây sẽ tạo ra pre- amiRNA, khi được xử lý, nhắm vào một RNA virus cụ thể để phân hủy RNA virus.

Nhược điểm của phương pháp chuyển gen

✓ Nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng không thể chuyển vào cây trồng bằng công nghệ gen do chúng được kiểm soát bởi đa gen; hoặc các gen kiểm soát các

tính trạng mong muốn vẫn chưa được biết đến.

✓ Nhiều gen rất khó để tách ra được và nhân dòng thành công. ✓ Do khoai tây là cây lương thực, thực phẩm nên vẫn còn nhiều tranh cãi về sử

dụng sản phẩm chuyển gen (GMO).

1.5.2.3 Phương pháp chỉnh sửa gen

Biến nạp gen trên thực vật đã trở thành một công cụ nghiên cứu chức năng gen hữu hiệu trong thời gian gần đây. Không những thế, kỹ thuật này còn là chìa khóa trong

việc phát triển các thế hệ cây trồng biến đổi gen đang được sử dụng rộng rãi trong canh tác. Trong vài năm trở lại đây, sự phát triển của công nghệ chỉnh sửa hệ gen đã mở ra một cách tiếp cận mới trong cải thiện di truyền cây nông nghiệp [88].

Công nghệ chỉnh sửa genome sử dụng các công cụ phân tử tạo ra một hay nhiều điểm đứt gãy trên một genome đích. Khi xuất hiện các điểm đứt gãy, cơ chế sửa chữa tổn thương của DNA sẽ được kích hoạt. Nhờ đó, điểm đứt gãy có thể được sửa chữa

[Nguồn 87]

bằng hình thức kết nối không tương đồng (nonhomologous end-joining, NHEJ) hoặc tái

tổ hợp tương đồng (homology-directed repair, HDR). Các dạng đột biến được tạo ra khá đa dạng, chủ yếu là đột biến mất đoạn, ngoài ra còn có chèn đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn

và đột biến điểm. Đột biến xảy ra ở những vùng trình tự có chiều dài khác nhau, làm

lệch khung của gen mã hóa hoặc các vị trí điều hòa cis- trong vùng khởi động, dẫn đến

hiện tượng bất hoạt gen, giúp cho nghiên cứu chức năng gen trong tế bào. Sửa chữa thông qua hình thức HDR chỉ xảy ra khi tại vị trí đứt gãy có mặt các đoạn DNA có trình tự tương đồng với hai đầu đứt gãy, vì thế, phương thức HDR có thể được sử dụng để gây đột biến điểm đặc biệt hoặc chèn chuỗi mong muốn thông qua cơ chế tái tổ hợp [89]

. Tuy nhiên, NHEJ lại là cơ chế sửa chữa rất nhanh do không cần đoạn DNA tương đồng

nên được tế bào “chọn” ưu tiên sử dụng, điều này giải thích tại sao các nghiên cứu GE đạt được tỷ lệ HDR xảy ra rất thấp.

Gần đây, cấu trúc phân tử dùng cho công nghệ GE đã sử dụng nhóm các đoạn lặp xuôi ngược ngắn giống nhau và cách nhau đều đặn (clustered regularly interspaced short

palindromic repeat, CRISPR). CRISPR được chia làm một vài nhóm dựa vào sự tham

gia của nuclease Cas và cấu trúc đoạn lặp lại trong CRISPR [90]. Trong đó, phổ biến

nhất là CRISPR loại II có sự tham gia của một endonuclease mang vùng tương đồng với

enzyme resolvase (RuvC) và vùng Histidine-Asparagine-Histidine (H-N-H domain), được gọi là Cas9 (CRISPR associated protein 9) [89, 90, 91].

Từ năm 2013, những công bố đầu tiên về ứng dụng CRISPR/Cas chỉnh sửa genome

thực vật đã được ghi nhận trên một số cây lương thực quan trọng như lúa gạo [92], cao

lương (Sorghum bicolor) [93], ngô [94] và lúa mì [95]. Trong đó, hệ thống CRISPR/Cas

đã được chứng minh có biểu hiện ổn định trong các thế hệ tiếp theo của A. thaliana [96]

và lúa gạo [89]. Do đó, CRISPR/Cas đã nhanh chóng được áp dụng rộng rãi trong GE của nhiều loài thực vật.

Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Jia đã sử dụng phương pháp CRISPR/Cas để gây

đột biến gen CsPDS - mã hóa enzyme phytoene desaturase trên cây cam ngọt (Citrus

sinensis). Công bố đã ghi nhận tỷ lệ gây đột biến gen CsPDS khi sử dụng hệ thống này đạt khoảng 3,2 - 3,9%, không tìm thấy đột biến lệch đích, kết quả là tạo ra dòng cam

ngọt đột biến không xuất hiện đốm trắng trên lá [97]. Trên lúa mì, phương pháp TALEN và CRISPR/Cas đã được sử dụng đồng thời để bất hoạt 3 locus MLO, mã hóa cho protein gây ức chế khả năng kháng bệnh phấn trắng. Khi sử dụng CRISPR/Cas, không có dòng đột biến cả 3 allen TaMLO được tạo ra (chỉ có 4 dòng mang đột biến ở những vị trí khác nhau của allen TaMLO-A1), trong khi phương pháp TALEN đã thu được dòng cây

chuyển gen bị bất hoạt 3 allen, TaMLO-A1, TaMLO-B1 và TaMLOD1, cây chuyển gen có khả năng kháng lại bệnh phấn trắng .

Các tài liệu tổng quan cho thấy, bệnh virus hại khoai tây đặc biệt là virus PVY là

vấn đề bức xúc xảy ra ở tất cả các nước trồng khoai tây. Hướng nghiên cứu tạo giống

kháng PVY bằng dung hợp tế bào trần là hướng đi đúng đắn có tính khả thi, đặc biệt có thể chuyển nguồn gen siêu kháng PVY từ khoai tây dại vào khoai tây trồng điều mà các

phương pháp lai hữu tính truyền thống không thể thực hiện. Tuy nhiên, hướng nghiên

cứu này còn hoàn toàn mới mẻ ở Việt Nam. Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung

hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam là rất cần thiết, có tính mới và có ý nghĩa cao, cả về mặt khoa học lẫn thực tiễn.

Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Các dòng khoai tây nghiên cứu

Các dòng dòng khoai tây nhị bội A15, A16, A56, B186, B208 (2n = 2x=24) do Trung tâm nghiên cứu khoai tây của Viện nghiên cứu Tài nguyên cây trồng- Bavaria- Cộng hòa liên bang Đức cung cấp (Bảng 2.1).

Các dòng khoai tây dại kháng PVY: S. tarnii, S. Pinnatisectum, S. bulbocastanum thu thập từ Ngân hàng Gen khoai tây quốc tế tại Đức (The Leibniz Institute of Plant

Genetics and Crop Plant Research, IPK, Genebank) và được lưu trữ lại Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (Bảng 2.1).

Các giống khoai tây trồng có năng suất cao và đạt tiêu chuẩn chế biến và thích nghi

với điều kiện khí hậu ở Việt Nam (Bảng 2.1).

Các giống khoai tây Atlantic, Solara, Diamant, KT2 và KT3 trồng phổ biến ở Việt

Nam được dùng làm giống đối chứng trong các thí nghiệm đánh giá các đặc tính nông sinh học, năng suất và phẩm chất củ.

Bảng 2.1. Các vật liệu đã thu thập, nguồn gốc, độ bội và các tính trạng

mong muốn phục vụ cho lai soma

Giống/loài

Dạng vật liệu

Ký hiệu

Độ bội

Nguồn gốc (Ngân hàng gen, công ty, Viện nghiên cứu)

Các tính trạng mục tiêu cho chọn tạo giống

Khoai

tế

pnt2G 2x

Kháng PVY

Solanum pinnatisectum

tây dại

Ngân hàng gen Khoai tây quốc IPK, CHLB Đức

Solanum tarnii

trn3G 2x

Kháng PVY

tế

Khoai tây dại

Ngân hàng gen Khoai tây quốc IPK, CHLB Đức

Khoai

tế

blb2G 2x

Kháng PVY

Solanum bulbocastanum

tây dại

Ngân hàng gen Khoai IPK, tây quốc CHLB Đức

Atlantic

4x Mỹ

Năng suất cao, chất lượng củ tốt

Khoai tây trồng

Giống/loài

Dạng vật liệu

Ký hiệu

Độ bội

Nguồn gốc (Ngân hàng gen, công ty, Viện nghiên cứu)

Các tính trạng mục tiêu cho chọn tạo giống

Delikat

Công Ty NORIKA, CHLB Đức

Năng suất cao, chất lượng củ tốt

Khoai tây trồng

Rasant

Công Ty NORIKA, CHLB Đức

Năng suất cao, chất lượng củ tốt

Khoai tây trồng

Kháng PVY

A15

Dòng nhị bội

Viện nghiên cứu tài trồng- nguyên cây Bavaria- CHLBĐ

Kháng PVY

A16

Dòng nhị bội

Viện nghiên cứu tài nguyên cây trồng- Bavaria- CHLBĐ

Kháng PVY

A56

Dòng nhị bội

Viện nghiên cứu tài nguyên cây trồng- Bavaria- CHLBĐ

Kháng PVY

B186

Dòng nhị bội

Viện nghiên cứu tài nguyên cây trồng- Bavaria- CHLBĐ

Kháng PVY

B208

Dòng nhị bội

Viện nghiên cứu tài nguyên cây trồng- Bavaria- CHLBĐ

B

C

Hình 2.1. Các loài khoai khoai tây dại nhị bội thu thập từ CHLB Đức

A

Chú thích: A- S. pinnatisectum; B- S. tarnii; C- S. bulbocastanum

2.1.2. Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô (môi trường MS (Musashige and Skoog, 1962)

phụ lục 1)

Hóa chất để tách tế bào trần (phụ lục 2)

Hóa chất dung hợp tế bào trần (phụ lục 3)

Hóa chất nuôi cấy và tái sinh tế bào trần (phụ lục 4)

Hóa chất tách chiết ADN (phụ lục 5)

Hóa chất PCR (phụ lục 6)

Các mồi SSR sử dụng để chọn lọc con lai soma do Công ty Bio-Rad laboratories,

Inc cung cấp [98].

Hóa chất lây nhiễm nhân tạo (phụ lục 7)

Hóa chất test ELISA (Agdia, Inc.)

2.1.3. Thiết bị

Tủ cấy vô trùng Lab Caire HFL; nồi hấp vô trùng; máy xung điện Electro Square Porator ECM 830; Máy PCR Eppendorf; thiết bị điện di Run-one Electrophoresis, máy khử trùng Satorious, máy xác định độ bội Cell Lab QuantaTM Flow cytometry (Beckman Counter)...

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Nội dung 1: Xác định các thông số tối ưu cho quy trình dung hợp khoai tây từ các nguyên liệu nhị bội (2n = 2x), tứ bội (2n = 4x) và khoai tây dại (pnt2G, trn3G, blb2G)

Do có nhiều tổ hợp lai nên khối lượng công việc lớn và thu được rất nhiều kết.

Trong khuôn khổ đề tài, luận án đã chọn ra 2 tổ hợp lai từ các tổ hợp bố mẹ nhị bội là B186 (+) B208 và tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây trồng trn3G (+) Delikat để trình bày kết quả.

2.2.1.1 Nghiên cứu các thông số tách tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại, khoai tây trồng phục vụ cho dung hợp tế bào trần

Thí nghiệm: Nghiên cứu ảnh hưởng của dung dịch enzyme khác nhau (tỷ lệ Macerozyme/Cellulase (M/C)) đến hiệu suất tách tế bào trần

Dung dịch enzyme 1: 0,2% Macerozyme, 0,8% Cellulase

Dung dịch enzyme 2: 0,2% Macerozyme, 0,6% Cellulase

Dung dịch enzyme 3: 0,1% Macerozyme, 0,8% Cellulase

Dung dịch enzyme 4: 0,1% Macerozyme, 0,6% Cellulase

Thí nghiệm: Ảnh hưởng của thời gian ủ trong dung dịch enzyme đến hiệu suất tách tế bào trần

CT1: 13h

CT2: 14h

CT3: 15h

CT4: 16h

Thí nghiệm: Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến mật độ tế bào trần thu được từ

mẫu lá

CT1: 2 tuần sau cấy

CT2: 3 tuần sau cấy

CT3: 4 tuần sau cấy

CT4: 5 tuần sau cấy

2.2.1.2. Xác định các thông số dung hợp tế bào trần

Thí nghiệm: Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế bào

sau dung hợp

Mật độ 2 x 105 tế bào/ml để tiến hành dung hợp tế bào trần với các thông số dung

hợp khác nhau về số lần xung và tần số xung điện:

CT1 : Tần số 700 kHz với 2 lần xung

CT2 : Tần số 800 kHz với 2 lần xung

CT3 : Tần số 900 kHz với 2 lần xung,

CT4 : Tần số 1.000 kHz với 1 lần xung

Thí nghiệm: Ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ của dung dịch dung hợp đến hiệu suất

dung hợp

Sử dụng mật độ 2 x 105 tế bào/ml để tiến hành dung hợp tế bào trần với các thông số

dung hợp khác nhau về số lần xung và tần số xung điện:

CT1: 10-5M

CT2: 10-4M

CT3: 10-3M

CT4: 10-2M

Thí nghiệm: Ảnh hưởng mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp

CT1:1 x105 tế bào trần/ml

CT1:2 x105 tế bào trần/ml

CT1:3 x105 tế bào trần/ml

CT1:4 x105 tế bào trần/ml

CT1:5 x105 tế bào trần/ml

2.2.1.3. Xác định quy trình tái sinh tế bào trần sau dung hợp của các tổ hợp nghiên cứu

Thí nghiệm: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái sinh

microcallus của các tổ hợp lai sau dung hợp

Các sản phẩm sau dung hợp được nuôi cấy trên điều kiện môi trường lỏng với các thành phần môi trường khác nhau: môi trường VKM II [98], Medium A* [99], KM8P* [100].

Thí nghiệm: Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi

của các tổ hợp lai

Các microcallus trên môi trường là kết quả của thí nghiệm trước được chuyển sang môi trường cul-medium [49] để tạo macrocallus, các macrocallus này được chuyển sang các môi trường tái sinh khác nhau: RJM [59]; MSO [101]; K8P [102].

2.2.2. Nội dung 2: Xác định và đánh giá các thể lai soma của các tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n = 2x)

a. Tạo con lai

b. Xác định độ bội thể của cây tái sinh

c. Xác định con lai soma bằng đo chỉ thị phân tử

d. Đánh giá phẩm chất củ của các con lai soma

e. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng trong các con lai soma

f. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo

2.2.3. Nội dung 3: Xác định các thể lai soma của các tổ hợp dung hợp giữa khoai

tây dại (2n = 2x) và khoai tây trồng (2n = 4x). Đánh giá khả năng kháng PVY của chúng.

a. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng bằng đo độ bội thể

b. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây bằng chỉ thị phân tử

c. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng PVY trong các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng

d. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng bằng lây nhiễm nhân tạo

c. Đánh giá các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng về các tính trạng nông sinh học và phẩm chất củ

2.2.4. Nội dung 4: Đánh giá con lai backcross (BC1) của thể lai soma (khoai tây dại và khoai tây trồng) với khoai tây trồng

2.2.4.1. Lai hữu tính giữa các con lai soma (của khoai tây dại và khoai tây trồng) với các giống khoai tây trồng và chọn lọc các con lai có đặc tính mong muốn

a. Chọn lọc con lai

b. Chọn lọc các con lai BC1 có khả năng kháng virus PVY

c. Chọn lọc các con lai BC1 có các đặc tính nông sinh học mong muốn

d. Đánh giá các con lai BC1 sau thanh lọc

2.2.4.2. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng và kiểm tra sự có mặt của gen kháng PVY bằng chỉ thị phân tử

2.2.4.3. Khảo sát diện hẹp các dòng lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Tách tế bào trần

Theo quy trình Cooking E.C (1960) và có cải tiến theo Thach et al. (1993) và Thieme (1997)

1. Nhân 10 - 20 cây in vitro/mỗi kiểu gen “bố mẹ” trong bình thủy tinh từ 3 - 4 tuần tuổi, trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng và 220C; để các nguyên liệu này trong tối trước khi tiến hành các thí nghiệm dung hợp.

2. Ngắt và thái nhỏ lá cây in vitro bằng một lưỡi dao sắc nhọn trong một đĩa petri chứa 10ml dung dịch rửa II (Washing solution II hay còn gọi là dung dịch gây co nguyên

sinh), ủ trong dung dịch co nguyên sinh 10 -15 phút, sau đó loại bỏ dung dịch này và bổ sung dung dịch enzyme (Enzyme solution), quấn parafilm.

Cách tính lượng enzyme:

- Bổ sung 10ml dịch co nguyên sinh vào đĩa petri, quấn parafilm rồi mang đi cân (m1), sau đó ngắt lá cây in vitro vào đĩa, lại quấn parafilm và đem đi cân (m2). Khối lượng lá cây in vitro cần tách m = m2 - m1). Vậy thể tích enzyme cần lấy = m x 10 (ml).

3. Ủ đĩa petri trong tối và qua đêm tại nhiệt độ phòng (20 - 220C) trong thời gian 14 - 16 giờ; kết thúc giai đoạn này, quan sát các tế bào dưới kính hiển vi, ghi lại chất lượng tế

bào trần (trong một vài trường hợp tùy thuộc vào từng kiểu gen, có thế chuyển các đĩa petri vào lắc trong thời gian 5 - 15 phút).

3. Lọc dịch huyền phù tế bào qua rây rọc 2 lớp (100/50µm) vào 1 lọ vô trùng; dùng pipet hút 5 - 10ml dung dịch nổi (Rinsing Solution); sau đó bổ sung dịch huyền phù tế

bào trần vào các ống ly tâm (từ bước này phải làm việc trên đá để tránh gây tổn thương tế bào trần).

4. Ly tâm lần 1 (15 phút, 50g = 600 rpm)

5. Dùng một pippet vô trùng hút cẩn thận lớp dịch nổi phía trên cùng vào một ống ly lâm khác, bổ sung 10ml dung dịch rửa I (Washing Solution I) và đem ly tâm lần 2 (8 phút, 80g = 700 rpm).

6. Tế bào trần kết tủa xuống phía đáy, loại bỏ lớp dịch bên trên, bổ sung 10 ml dung dịch rửa II (Washing Solution II) rồi đem ly tâm lần 3 (8 phút, 80g = 700 rpm).

7. Hút bỏ dịch phía trên, bổ sung dung dịch dung hợp (Fusion Solution) hoặc môi trường nuôi (tùy mục đích thí nghiệm) và tính mật độ tế bào trần.

Dùng một pipet hút một lượng nhỏ dịch huyền phù tế bào trần vào một buồng đếm hồng cầu (Thomahaemocytometer)

Ví dụ: Dòng 1 (1ml): 29 tế bào trần = 3,0 x 105 Pp.

Dòng 2 (0,5 ml): 18 tế bào trần = 2,0 x 105 Pp.

Muốn pha loãng mật độ của dòng 1 thành mật độ 20 Pp.

(29 : 20) x 1 ml = 1,45 (hút thêm 1,45 ml môi trường nuôi vào dịch huyền phù tế bào trần ta có 2,45 ml huyền phù tế bào trần ở mật độ 2,0 x 105 Pps).

Chỉ tiêu đánh giá: mật độ tế bào trần = số tế bào trần thu được/ml.

2.3.2. Dung hợp tế bào trần (Thieme et al., 2008) [6]

1. Trộn huyền phù tế bào trần của 2 dòng bố mẹ theo tỷ lệ 1:1

Ví dụ: Dòng 1 – 29 tế bào trần ; dòng 2 – 18 tế bào trần

Dòng 1: dòng 2 = 29 : 18 = 1 : 1,6 (v/v)

Trộn một phần của dòng 1 + 1,6 phần của dòng 2 rồi đem ly tâm (8 phút, 80g =

700 rpm). Làm việc trên đá.

2. Sử dụng máy xung điện (electrofusion machine) của công ty Krϋss, Đức. Đặt buồng dung hợp vào dưới kính hiển vi trong một tủ cấy vô trùng; trước khi dung hợp và trong quá

trình dung hợp phải khử trùng buồng xung điện bằng cồn 70%; hút 400 µm hỗn hợp tế bào trần trong dung dịch dung hợp (Fusion Solution) vào buồng xung điện.

3. Khởi động máy xung điện với các thông số như sau:

Trường AC Xung Số lần Trước-AC-Sau

V

KHz

V

µs No

S

0,0

800-1000 120 10-15

2,0

Khi bật AC

18 - 20

800

120 10

2,0

4. Sau một pha cực nhanh theo một chương trình đã được cài đặt sẵn, dưới tác dụng của luồng xung điện, các tế bào trần kết hợp với nhau (có thể quan sát được dưới kính hiển vi), khi chương trình ngừng lại, dùng pipet hút dịch tế bào trần vào đĩa petri (Ø = 3,5 cm) và bổ sung 1,8 ml môi trường nuôi: VKM II hoặc VKM II + BSA; quấn parafilm rồi đem nuôi cấy ở điều kiện 250C và tối.

2.3.3. Xác định con lai bằng đếm độ bội flow cytometry

Phương pháp đánh giá độ bội bằng máy Cell Lab QuantaTM Flow cytometry

(Beckman Counter) theo phương pháp của Viện nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Julius Kühn Institut (JKI) - Groß Lüsewitz- CHLB Đức).

Trước tiên cần chuẩn bị mẫu theo các bước sau, rồi tiến hành thí nghiệm trên máy

đã được cài đặt sẵn các chương trình chạy.

- Bước 1: Cân khoảng 50 mg mẫu lá từ cây in vitro để vào đĩa Petri sạch

- Bước 2: Bổ sung vào đĩa petri 0,5ml dung dịch Cystain UV ploidy. Dùng dao sắc

băm nhỏ mẫu.

- Bước 3: Tiếp tục thêm 1,5ml dung dịch Cystain UV ploidy vào đĩa, sau đó ủ mẫu

trong 5 phút ở điều kiện phòng.

- Bước 4: Dùng giấy lọc lọc lấy dung dịch mẫu, đưa vào ống đựng mẫu chuẩn.

- Bước 5: Đặt ống mẫu vào máy Partec Flow Cytometry. Áp dụng quy trình chuẩn

để vận hành máy đo mẫu và nhận được kết quả.

- So sánh kết quả với mẫu chuẩn nhị bội (2n = 2x=24) để kết luận về mức đa bội

của các mẫu cần đánh giá.

2.3.4. Chiết tách DNA tổng số

DNA tổng số của các mẫu được tách từ lá theo phương pháp CTAB có cải tiến

theo Heldák et al., 2007 [103]. 500mg lá non được nghiền tạo dịch đồng nhất trong 3ml

2× CTAB buffer và ủ trong 1h ở nhiệt độ 60°C. Tiến hành ly tâm tube mẫu ở 3000g trong 5 phút ở nhiệt độ 4OC. Sau đó bổ sung chloroform/isoamyl alcohol (24:1) một lượng bằng với thể tích của dịch nghiền mẫu và trộn đều giữ trong 5 phút trên đá. Sau

khi li tâm ở 3000g trong 20 phút, dịch trong được chuyển sang ống nghiệm mới và bổ

sung 10mg/ml Rnase. Dịch được ủ trong 1h ở nhiệt độ phòng, sau đó lặp lại với

chloroform/isoamyl alcohol và li tâm. DNA được kết tủa bằng isopropanol theo tỷ lệ 2:3, ly tâm tube ở 12000rpm trong 15 phút. Sau đó hút bỏ nước phía trên và rửa tủa DNA bằng ethanol 70% (3 lần), sau đó để khô tự nhiên trong 30 phút.

Hàm lượng và độ tinh khiết của mẫu DNA thu được sẽ được đánh giá bởi máy đo quang phổ (spectrophotometer) NanoDrop 8000 (Thermo Scientific), sau đó dung dich DNA được pha loãng đến 20 ng/μl.

2.3.5. Xác định con lai bằng sinh học phân tử

Các dòng 4x (tái sinh từ tổ hợp nhị bội) và dòng 6x (tổ hợp khoai tây dại và khoai

tây trồng) tái sinh sau dung hợp tiếp tục được đánh chọn lọc con lai heterozygous. Các bước tiến hành như sau:

Các con lai ngẫu nhiên sau dung hợp được xác định bằng các chỉ thị phân tử SSR. Phản ứng PCR (20µl) bao gồm: 1 x assay buffer (50 mM MgCl2, 160 µM dNTPs; 1,5U Taq polymerase (Pomega, Madison, WI); 0,1 µM mỗi loại mồi và 50 ng mẫu ADN,

được bọc bởi 1 giọt dầu vô cơ nhẹ (light mineral oil). Phản ứng PCR lặp lại 40 chu kỳ với: 1 phút ở 95 0C, 2 phút ở 55 0C, 1,5 phút ở 72 0C và 1 chu kỳ với 5 phút ở 720C.

Các sản phẩm nhân được phân tách trên gel điện di agarose Metaphor 3% (FMC Bioproducts pockland, Meck) với 1 x TBE buffer tại 90 V trong 4 giờ; Nhuộm các bản gel điện di với ethidium bromide (10 mg ml-1) trong 20 phút rồi chụp ảnh dưới tia UV và đọc kết quả.

Khi sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi SSR không thể hiện sự đa hình giữa bố mẹ và

con lai của chúng, tiếp tục sử dụng phản ứng SSR có gắn huỳnh quang (Biomers net

GMbD

cung

cấp)

và

sử

dụng

hệ

thống GenomeLab GeXP 8800

Beckman GenomeLab Coulters) để phân tích kết quả. Với phương pháp này có thể phân biệt các sản phẩm PCR khác biệt tới 1 bp.

Bảng 2.2. Trình tự và nhiệt độ gắn mồi sử dụng trong phân tích PCR chọn lọc con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng [61, 104, 105]

STT Tên mồi (SSR) Trình tự mồi (Forward/Reverse) Nhiệt độ gắn mồi

STM 2022 GCGTCAGCGATTTCAGTACTA 1 640C

TTCAGTCAACTCCTGTTGCG

STM 3023 AAGCTGTTACTTGATTGCTGCA 2 600C

GTTCTGGCATTTCCACTCAGAGA

STIIKA TTCGTTGCTTACCTACTA 3 510C

CCCAAGATTACCACATTC

2.3.6. Lây nhiễm nhân tạo PVY

Nguồn virus PVY được thu thập từ mẫu nhiễm ngoài đồng ruộng. Mẫu virus được

kiểm định tại Trung tâm bênh cây nhiệt đới - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam và lưu giữ tại Viện Sinh học Nông nghiệp.

Phương pháp lây nhiễm nhân tạo với virus PVY theo mô tả của Kado (1972) [106] và Hill (1984) [107]

- Nghiền lá bị bệnh bằng chày, cối sứ sạch theo tỷ lệ: Đệm phosphate và khối

lượng lá (2ml:1g).

- Thổi bột cacboradum 600 mesh lên lá cây.

- Dùng que bông sát nhẹ dịch chiết virus lên lá theo chiều từ cuống lá đến đỉnh lá.

- Rửa sạch lá đã lây nhiễm bằng cách phun nước sạch.

- Lây nhiễm mỗi dòng 10 cây, lây trên lá đang phát triển tốt. Lây vào lúc chiều

mát, thời gian lây nhanh (khoảng 15 phút) để đảm bảo khả năng lây nhiễm virus.

Sau khi lây nhiễm 15 ngày quan sát triệu chứng biểu hiện của từng dòng và kiểm

tra bằng kit test DAS – ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme – linked

imunosorbent assay) do hãng agdia cung cấp (Reagent Set for Potato virus Y (PVY), 96

testwells SRA 20001/0096) hoặc sử dụng kit test nhanh (que test virus ImmunoStrip®

for Potato virus Y (PVY)- agdia inc.). Kết quả được đọc trên máy đọc DAS-ELISA ở bước sóng 405nm.

Trước khi lây nhiễm nhân tạo tiến hành kiểm tra tình hình sạch bệnh của các dòng

con lai, dòng bố mẹ nhị bội, cây chỉ thị (thuốc lá), một giống khoai tây trồng không

kháng virus PVY ở đây thí nghiệm sử dụng giống KT3. Kết quả cho thấy tất cả các

dòng/giống trước khi lây nhiễm nhân tạo đều sạch bệnh. Tính tỷ số OD dòng/OD (-) đối

với mỗi cây trong từng dòng. Nếu tỷ số này < 2 thì cây khoai tây đó không nhiễm bệnh virus PVY, nếu tỷ số này > 2 thì cây khoai tây đó bị nhiễm PVY.

2.3.7. Kiểm tra gen kháng PVY của các con lai soma bằng chỉ thị phân tử

Tính kháng bệnh virus PVY của các con lai soma được đánh giá bằng phương pháp chỉ thị phân tử CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic sequences). Nguyên lý của phương pháp này là phát hiện sự có mặt hay không đoạn cắt sau khi cho tác động enzyme cắt giới hạn với sản phẩm PCR được nhân bản bởi một cặp mồi ứng với một locus đặc

hiệu. Trong trường hợp cụ thể này, việc phát hiện khả năng kháng bệnh virus PVY sẽ được thực hiện qua các bước:

- Thể tích phản ứng 25 μl bao gồm: 1× PCR buffer (20mM Tris-HCl, 50mM KCl), 0.2mM dNTPs, 3.0mM MgCl2, 300nM primer, 1 U Taq DNA polymerase và 30 ng DNA. Chu kỳ phản ứng PCR: gồm 40 chu kỳ trong đó 94°C trong 20s, 60°C trong 25s và 72°C trong 1 phút.

- Sau phản ứng PCR, tiến hành kiểm tra sản phẩm đã nhân được qua điện di trên

gel Agarose 1% , nếu xuất hiện vạch băng 406bp, sản phẩm PCR sẽ tiếp tục được tinh sạch (tủa bằng Ethanol 100% và rửa).

- Sản phẩm PCR tinh sạch được ủ với enzyme cắt giới hạn EcoRV (2h - 37oC)

- Điện di sản phẩm kiểm tra kết quả. Nếu sản phẩm có mặt hai đoạn cắt với kích

thước 200bp và 206bp chứng tỏ đoạn 406bp đã có mặt trình tự nhận biết của enzyme giới hạn EcoRV. Từ đó nhận biết được các dòng có tính kháng virus PVY.

Cặp mồi sử dụng trong các thí nghiệm phát hiện gen kháng virus PVY của các con lai soma khoai tây và “bố mẹ” do Công ty Bio-Rad laboratories, Inc cung cấp [43] và các enzyme cắt giới hạn nếu cần

Tên mồi

Trình tự mồi

Nhiệt độ gắn mồi

CAATTGGCTCCCGACTATCTACAG/

620C

GP122406

(EcoRV)

ACAATTGCACCACCTTCTCTTCAG

2.3.8. Đánh giá các đặc tính nông sinh học

Trong điều kiện chậu vại:

Bố mẹ và các con lai soma sau chọn lọc được nhân trong điều kiện in vitro, sau 4 tuần

nuôi cấy sẽ được chuyển ra ngoài in vivo để đánh giá chọn lọc các con lai soma triển vọng

cho năng suất cao và đạt tiêu chuẩn chế biến. Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (RCB) với 9 cây/lần lặp, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Trên điều kiện đồng ruộng

Củ của các con lai triển vọng sau khi được đánh giá trong điều kiện chậu vại sẽ được đánh giá tiếp trên điều kiện đồng ruộng về khả năng sinh trưởng phát triển, năng

suất. Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh RCB với 3 lần nhắc lại, diện tích mỗi ô thí nghiệm 30 m2.

2.3.9. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh.

Phương pháp định lượng đường khử (phương pháp iod-Ixekutz)

Nguyên liệu: dịch chiết được chuẩn bị theo phương pháp Bertrand.

Tiến hành: lấy 2 bình tam giác bình 1 (đối chứng), bình 2 (thí nghiệm).

Cho vào bình 1: 5ml nước cất, bình 2: từ 2-5ml dịch chiết đường, cho vào mỗi bình 10ml K3Fe(CN)6 0,05N. Đun sôi 1 phút trên bếp điện, để nguội. Cho vào mỗi bình 10ml hỗn hợp (ZnSO4 + KI), 10ml CH3COOH 10%.

Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,05N cho đến màu vàng rơm. Thêm 3 giọt tinh bột (dung

dịch chuyển màu xanh), chuẩn độ tiếp cho tới khi có màu trắng sữa hoàn toàn.

Phương pháp định lượng tinh bột

Nguyên tắc: dưới tác dụng của axit tinh bột được thủy phân hoàn toàn thành đường

glucose. Định lượng đường khử suy ra hàm lượng tinh bột.

Nguyên liệu: 2g củ khoai tây.

Tiến hành: Nghiền nhỏ 2g nguyên liệu, trộn đều chuyển sang cốc. Cho vào cốc

100ml nước cất, khuấy đều từ 45 - 60 phút. Sau đó lọc bằng phễu có giấy lọc. Tráng cốc và rửa tinh bột nhiều lần bằng nước cất để loại toàn bộ đường khử khỏi tinh bột.

Chuyển phễu lọc chứa tinh bột sang bình 250ml, dùng đũa thủy tinh nhỏ chọc

thủng giấy lọc, chuyển tinh bột xuống bình cầu bằng nước cất (80 - 100ml). Sạu đó cho

125ml HCl 25% vào bình. Đặt bình vào nồi cách thủy, đun sôi 3 - 4h, thỉnh thoảng lắc

đều. Sau khi kết thúc thủy phân tinh bột, làm nguội bình, trung hòa dịch thủy phân bằng

NaOH 10%, dùng giấy quỳ thử sao cho dung dịch thủy phân không thừa kiềm. Sau đó

cho thêm 1 - 2 giọt HCl 25% để dung dịch thủy phân đã được trung hòa có độ axit yếu.

Chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100ml, dùng nước cất định mức tới mức của bình. Khuấy đều, lọc dung dịch, dung dịch lọc trong suốt để định lượng đường khử.

Phương pháp xác định hàm lượng chất khô

Dụng cụ đo tỷ trọng: Rổ, quả cầu có móc, thước đo tỷ trọng, thanh sắt điều chỉnh

tỷ trọng, thùng nước chứa 500 lít

+ Chuẩn bị:

Khoai cần được rửa sạch, không có đất bám trên bề mặt khoai.

Điều chỉnh dụng cụ đo tỷ trọng trước khi sử dụng:

1. Đặt thanh sắt vào trong rổ sắt, gắn thanh sắt sao cho thanh sắt luôn ở trong rổ khi điều chỉnh thước đo ở trong nước. Chú ý: có thể buộc nhẹ thanh sắt vào thành rổ để thanh sắt không bị trôi trong nước.

2. Gắn thước đo, quả cầu móc và rổ chứa thanh sắt, sau đó thả nhẹ nhàng vào thùng chứa nước cho đến khi nó được thả nổi tự do. Khi nổi tự do, ở trạng thái cân bằng,

điều chỉnh thước đo tỷ trọng sao cho vạch mép nước trùng với vị trí 17% potato

solids (chỉ số phía bên trái của thước đo tỷ trọng).

3. Nhấc hệ thống đo lên, bỏ thanh sắt ra khỏi hệ thống. Cân đúng 3,6kg khoai tây

và nhẹ nhàng cho vào rổ.

4. Cho toàn bộ hệ thống chứa khoai tây vào thùng chứa nước, thả tay nhẹ nhàng cho

hệ thống nổi tự do.

5. Khi hệ thống ở trạng thái cân bằng, ghi lại kết quả chỉ số specific gravity (S.G-

chỉ số phía bên phải của thước đo tỷ trọng).

6. Tính hàm lượng chất khô theo công thức:

% chất khô = S.G x 207.47 – 204.16

2.3.10. Lai lại (backcross) giữa một số tổ hợp khoai tây có triển vọng với khoai tây trồng.

Bước 1: Thu hạt phấn của khoai tây trồng (dòng bố)

Tiến hành lấy bao phấn từ những bông hoa đã nở. Đem phơi khô 2 ngày dưới ánh

sáng đèn sợi đốt sau đó tiến hành thu hạt phấn.

Bước 2: Khử đực các dòng nhận phấn (dòng mẹ)

Chọn những chùm hoa có nụ to đều, loại bỏ nhị hoa (khử đực) 1 ngày trước khi

tiến hành lai tạo.

Bước 3: Thụ phấn

Một ngày sau khi khử đực thì thụ phấn cho các chùm hoa của các dòng nhận phấn.

Sau đó đeo biển và bao kín các chùm hoa bằng các túi thoáng khí.

Bước 4: Bảo quản quả lai và thu hạt lai:

Thu các quả bị rụng trong quá trình nuôi dưỡng quả, đem phơi khô dưới ánh sáng

tán xạ, để quả trong điều kiện 21ºC trong 1 - 2 tháng, rồi bảo quản quả ở nhiệt độ 4 -

8ºC. Đối với các quả lai sinh trưởng, phát triển tốt trên cây mẹ, sau 2 - 3 tháng hạt chín sinh lý thu hoạch quả và bảo quản hạt ở 4 - 8ºC.

2.3.11. Các chỉ tiêu theo dõi

Chỉ tiêu theo dõi của các nội dung nghiên cứu tách: mật độ tế bào được đếm trên

buồng đếm hồng cầu (Marienfeld)

Mật độ tế bào trần = số tế bào trần thu được/ml.

Chỉ tiêu theo dõi của các nội dung nghiên cứu dung hợp:

- Thời gian tế bào bắt đầu phân chia (ngày)

- Thời gian xuất hiện các microcallus (ngày)

- Số lượng các macrocallus/ đĩa petri.

tỷ lệ các con lai có độ bội 2x (%), 4x (%), 6x (%), hỗn bội (%)

Chỉ tiêu theo dõi của nội dung nghiên cứu tái sinh sau dung hợp

- Thời gian xuất hiện phân chia (ngày), thời gian xuất hiện macrocallus (ngày). - Tỷ lệ tái sinh - Chất lượng chồi (khỏe/yếu/trung bình).

Chỉ tiêu theo dõi của nội dung đánh giá các đặc tính nông sinh học: Theo dõi và đánh

giá các đặc tính sinh trưởng, phát triển, hình thái, các yếu tố cấu thành năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất bao gồm các chỉ tiêu cụ thể như sau:

- Chiều cao cây (cm)

- Số lá/cây

- Thời gian sinh trưởng: từ lúc trồng - đến lúc tàn cây

- Hình thái về lá, thân, củ, độ sâu mắt ngủ, màu vỏ củ, màu thịt củ (Theo quy chuẩn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (QCVN 01- 69:2011/BNNPTNT) (Phụ lục 8).

- Các chỉ tiêu năng suất: khối lượng củ/khóm, khối lượng trung bình củ (g/củ), số củ/khóm, phân loại kích thước củ (đo bằng thước pannet, nhỏ= ф<3cm, trung

bình= 3< ф< 5cm, to= ф> 5cm, không đạt= củ khuyết tật, sâu bệnh,...), Năng suất

lý thuyết (NSLT), Năng suất thực thu (NSTT)

o Số củ trung bình/khóm (củ) =

o Khối lượng củ trung bình/khóm (g) =

Tổng số củ Tổng số cây theo dõi

o Khối lượng củ trung bình/củ (g/củ) =

Tổng khối lượng củ Số khóm theo dõi

NSLT = (Khối lượng củ trung bình/khóm) x Mật độ cây/m.2 (mật độ khoai tây

~5-6 khóm/m2)

- Năng suất thực thu (NSTT) (g/m2): Cân khối lượng củ thu được trên diện tích

1m2

Tổng khối lượng củ Số củ theo dõi

2.3.12. Xử lý số liệu

Các số liệu trong thí nghiệm đánh giá chất lượng củ (hàm lượng tinh bột, vitamin

C, hàm lượng đường đường khử), tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần được xử lý theo chương trình EXCEL.

Số liệu trong các thí nghiệm đánh giá các đặc tính nông sinh học của các con lai

(các chỉ tiêu: chiều cao cây, số củ trung bình/ khóm, khối lượng củ trung bình/khóm) được phân tích xử lý thống kê để đánh giá sự sai khác có ý nghĩa ở mức α = 0,05 theo phần mềm IRISTAT 4.0.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định các thông số tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần giữa các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại và khoai tây trồng

Việc nghiên cứu tách, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần khoai tây đã được rất nhiều

tác giả quan tâm từ những năm cuối của thế kỷ trước [44]. Tiếp sau đó là các nghiên cứu

của tác giả Deimling et al. (1988) [58], Moller et al. (1992) [49] nhằm hoàn thiện kỹ thuật tách nuôi cấy và dung hợp khoai tây thể nhị bội. Tuy nhiên, kỹ thuật này phụ thuộc

rất nhiều vào đối tượng nghiên cứu (là các dòng khoai tây nguyên liệu) chính vì vậy mỗi

đối tượng cần được nghiên cứu một cách cụ thể với các thông số tách, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần.

3.1.1. Nghiên cứu các thông số tách tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại, khoai tây trồng phục vụ cho dung hợp tế bào trần

3.1.1.1 Ảnh hưởng của dung dịch enzyme khác nhau (tỷ lệ Macerozyme/Cellulase (M/C)) đến hiệu suất tách tế bào trần

Các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại và khoai tây trồng khác nhau sẽ có cấu

tạo thành phần mô và vách tế bào khác nhau (tỷ lệ cellulose, pectine...). Nên việc xác

định loại dung dịch enzyme có tỷ lệ enzyme phân giải cellulose và pectine phù hợp với từng dòng để cho hiệu suất tế bào trần thu được tối đa là rất cần thiết.

Các kết quả thí nghiệm được thể hiện trên Bảng 3.1:

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ macerozyme và cellulase trong dung dịch enzyme đến mật

độ tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội (Tế bào trần/ ml môi trường)

Dung dịch enzyme

Tên dòng Dạng vật liệu

E1

E3

E4

E2

(TB x105/ml)

A15 Nhị bội 3,69 ± 0,24 2,54 ± 0,09 0,55 ± 0,05 0,12 ± 0,01

A16 Nhị bội 4,12 ± 0,16 1,15 ± 0,07 2,65 ± 0,09 0,35 ± 0,03

A56 Nhị bội 1,09 ± 0,05 1,59 ± 0,09 2,95 ± 0,05 0,74 ± 0,05

B186 Nhị bội 3,60 ± 0,16 2,35 ± 0,11 0,68 ± 0,05 0,22 ± 0,01

B208 Nhị bội 3,55 ± 0,08 1,07 ± 0,04 0,43 ± 0,02 0,10 ± 0,00

pnt2G Khoai tây dại 1,61 ± 0,11 3,12 ± 0,09 0,86 ± 0,04 1,21 ± 0,04

trn3G Khoai tây dại 3,73 ± 0,08 1,62 ± 0,10 1,04 ± 0,06 0,34 ± 0,01

blb2G Khoai tây dại 3,65 ± 0,09 1,52 ± 0,04 1,01 ± 0,07 0,33 ± 0,01

Delikat 0,10 ± 0,00 2,86 ± 0,12 3,01 ± 0,11 1,14 ± 0,09 Khoai tây trồng

Rasant Khoai tây 3,80 ± 0,05 1,91 ± 0,11 0,78 ± 0,01 0,10 ± 0,00

trồng

Ghi chú: Dung dịch enzyme 1: 0,2% Macerozyme, 0,8% Cellulase

Dung dịch enzyme 2: 0,2% Macerozyme, 0,6% Cellulase

Dung dịch enzyme 3: 0,1% Macerozyme, 0,8% Cellulase

Dung dịch enzyme 4: 0,1% Macerozyme, 0,6% Cellulase

Từ kết quả Bảng 3.1 cho thấy: Các loại dung dịch enzyme khác nhau có ảnh hưởng

khác nhau đến hiệu quả tách tế bào trần. Để tách tế bào trần có hiệu suất cao nhất, mỗi dòng khoai tây nhị bội cần một loại dung dịch enzyme phù hợp.

Dung dịch E1 có tỷ lệ 0,2% Macerozyme, 0,8% Cellulase có thể được sử dụng để

tách tế bào trần của các dòng cây A16, A15, B186, B208, trn3G, Rasant. Khi ủ mẫu lá

bằng dung dịch enzyme này các dòng khoai tây trên cho hiệu quả tách tế bào trần cao nhất, dịch tế bào trần thu được với mật độ tế bào dày đặc (3,55 x 105 tế bào trần/ml). Các tế bào trần tròn đẹp, ít vỡ.

Đối với các dòng cây pnt2G, Delikat dung dịch, enzyme thích hợp nhất cho tách

tế bào trần là dung dịch E2: 0,2% Macerozyme, 0,6% Cellulase. Tế bào trần thu được căng tròn, ít vỡ và có mật độ cao (trên 3 x 105 tế bào trần/ml).

Dung dịch E3: 0,1% Macerozyme, 0,8% Cellulase cho hiệu quả tách cao nhất với dòng cây A56 (2,95 x105 tế bào trần/ml) và Atlantic (2,8 x105 tế bào trần/ml). Dung dịch E4: 0,1% Macerozyme, 0,6% Cellulase không phải là dung dịch tối ưu để tách tế bào trần. Hiệu suất tách tế bào ở tất cả các dòng khoai tây nghiên cứu đều thấp.

Một số hình ảnh tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội sau tách được thể hiện

trong Hình 3.1.

Atlantic 1,11 ± 0,08 0,92 ± 0,05 1,24 ± 0,06 2,81 ± 0,08 Khoai tây trồng

A56 (E3)

B 208 (E1)

A15 (E1)

B186 (E1)

blb2G (E1)

A16 (E1)

Rasant (E1)

Delikat (E21)

pnt2G (E2)

trn3G (E1)

3.1.1.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzyme đến hiệu suất tách tế bào trần

Các kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzyme có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tách tế bào trần. Thời gian ủ không đủ thu được mật độ tế bào trần thấp, trong khi thời gian ủ dài sẽ gây độc cho tế bào, làm cho tế bào bị vỡ nát (do enzyme macerozyme rất độc với tế bào). Thí nghiệm đã tiến hành ủ các mẫu lá của

các dòng nhị bội (đã được cắt nhỏ và xử lý qua dung dịch gây co nguyên sinh) ở các thời gian ủ trong dung dịch enzyme khác nhau dao động trong khoảng 13 - 16h. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.2:

Hình 3.1. Hình ảnh tế bào trần của các dòng khoai tây khác nhau với các enzyme phù hợp.

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần thu được

Thời gian 13h 14h 15h 16h

Dòng (TB x105/ml) (TB x105/ml) (TB x105/ml) (TB x105/ml)

A15

1,44 ± 0,06 2,86 ± 0,05 3,39 ± 0,11 2, 61 ± 0,05

A16

3,45 ± 0,05 1,09 ± 0,04 2,93 ± 0,03 4,01 ± 0,06

A56

1,24 ± 0,03 2,98 ± 0,02 3,40 ± 0,12 3,35 ± 0,07

B186

2,45 ± 0,05 4,56 ± 0,04 3,81 ± 0,07 2,76 ± 0,12

B208

2,54 ± 0,10 2,08 ± 0,05 4,38 ± 0,05 3,95 ± 0,06

pnt2G

3,46 ± 0,15 0,52 ± 0,01 1,74 ± 0,03 2,81 ± 0,06

trn3G

2,91 ± 0,08 1,01 ± 0,04 2,33 ± 0,04 3,62 ± 0,12

blb2G

2,41 ± 0,09 1,24 ± 0,04 2,63 ± 0,05 3,43 ± 0,11

Delikat

3,04 ± 0,07 1,24 ± 0,03 2,84 ± 0,04 3,55 ± 0,05

Rasant

3,18 ± 0,04 4,13 ± 0,10 3,83 ± 0,07 2,83 ± 0,16

Atlantic

Kết quả cho thấy, thời gian ủ mô lá trong dung dịch enzyme có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tách tế bào trần, thời gian ủ thích hợp với các dòng dao động từ 15 ± 1 giờ.

Thời gian ủ thích hợp cho các mô lá của các dòng khác nhau là khác nhau.

Thời gian ủ mẫu lá thích hợp cho các dòng B186, B208, Rasant là 14 giờ. Ở thời gian ủ này mẫu lá cho số lượng tế bào trần thu được là cao nhất, lần lượt là 4,56 x 105; 4,38 x 105; 4,13 x 105 tế bào trần/ml. Thời gian ủ cũng ảnh hưởng rõ rệt đến chất lượng tế bào trần thu được. Khi thời gian ủ tăng lên 15 - 16 giờ thì lượng tế bào trần thu được giảm dần, số lượng tế bào vỡ cao.

Với các dòng A15, A16, A56, trn3G, blb2G, Delikat, Atlantic 15 giờ là thời gian ủ thích hợp nhất, số lượng tế bào trần được giải phóng cao hơn cả (mật độ tế bào trần thu được của các dòng trên khi ủ mẫu lá trong 15 giờ lần lượt là 3,39 x 105; 4,01x105 ; 3,40 x 105; 3,62 x 105; 3,43 x 105; 3,55 x 105; 3,59 x 105 tế bào /ml).

Riêng pnt2G thời gian ủ thích hợp dài nhất: 16 giờ. Ở thời gian ủ này lượng tế bào

trần thu được cao nhất đạt 3,46 x 105 tế bào /ml.

2,77 ± 0,10 1,92 ± 0,02 2,52 ± 0,04 3, 59 ± 0,04

3.1.1.3. Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến mật độ tế bào trần thu được từ mẫu lá

Các dòng được nhân in vitro trên môi trường MS (Murashige and Skoog 1962) sau

đó dùng 1g lá/dòng ủ với 10ml enzyme thích hợp trong thời gian 15 h với các độ tuổi cây in vitro khác nhau để tách tế bào trần ở các độ tuổi khác nhau (2 tuần, 3 tuần, 4 tuần và 5 tuần).

Kết quả trình bày ở Bảng 3.3:

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến mật độ tế bào trần thu được từ mẫu lá

Tuổi cây 2 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần

(TB x105/ml) (TB x105/ml) (TB x105/ml) (TB x105/ml) Dòng

A15 0,14 ± 0,02 3,69 ± 0,02 3,39 ± 0,08 2,45 ± 0,06

A16 1,59 ± 0,04 4,12 ± 0,06 4,01 ± 0,07 2,01 ± 0,07

A56 0,34 ± 0,02 2,95 ± 0,03 3,40 ± 0,03 1,55 ± 0,04

B186 0,85 ± 0,03 3,60 ± 0,09 2,91 ± 0,05 1,87 ± 0,02

B208 0,28 ± 0,02 3,55 ± 0,09 3, 94 ± 0,07 2,06 ± 0,04

pnt2G 0,47 ± 0,01 2,54 ± 0,20 3,27 ± 0,05 2,14 ± 0,10

trn3G 0,47 ± 0,01 2,98 ± 0,10 3,48 ± 0,02 2,55 ± 0,22

blb2G 0,28 ± 0,01 2,99 ± 0,10 3,74 ± 0,08 2,72 ± 0,12

Delikat 1,95 ± 0,03 2,60 ± 0,12 3,91 ± 0,07 2,37 ± 0,07

Rasant 1,28 ± 0,02 2,59 ± 0,28 3,14 ± 0,04 2,02 ± 0,05

Kết quả cho thấy: lá từ cây có thời gian nuôi cấy khác nhau (tuổi cây in vitro) có

ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả tế bào trần.

Nếu lá của cây dùng để tách tế bào trần quá non (≤ 2 tuần tuổi) thì mật độ tế bào trần thu được rất thấp, tỷ lệ tế bào trần vỡ cao. Mật độ tế bào trần thu được cao nhất khi sử dụng lá để tách tế bào trần ở cây in vitro có 3 - 4 tuần tuổi. Khi tách tế bào trần từ lá của cây ở độ tuổi trên 5 tuần tuổi thì hiệu suất tế bào trần thấp hơn so với mật độ tế bào trần thu khi tách ở mẫu của cây in vitro 3 – 4 tuần tuổi.

Như vậy, độ tuổi lá của cây in vitro thích hợp nhất để tách tế bào trần cho tất cả các dòng là 3 - 4 tuần tuổi. Trong đó, các dòng A15, A16, B186 cho mật độ tế bào trần

Atlantic 1,26 ± 0,04 2,94 ± 0,13 4,02 ± 0,27 2,09 ± 0,03

cao nhất khi tách ở 3 tuần tuổi (3,69 x 105, 4,12 x 105, 3,60 x 105 tế bào trần /ml theo thứ tự); các dòng còn lại (A56, B208, trn3G, pnt2G, blb2G, Delikat, Atlantic, Rasant) cho mật độ tế bào trần cao nhất khi sử dụng mẫu lá từ cấy có 4 tuần tuổi.

3.1.2. Xác định các thông số dung hợp tế bào trần

3.1.2.1 Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung điện đến chất lượng tế bào sau dung hợp

Do có nhiều tổ hợp lai nên khối lượng công việc là lớn và thu được nhiều kết. Trong khuôn khổ thời gian cho phép, luận án đã chọn ra 2 tổ hợp lai từ các tổ hợp bố mẹ

nhị bội là B186 (+) B208 và tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây trồng trn3G (+) Delikat để trình bày.

Tiến hành dung hợp tế bào trần ở mật độ 3 x 105 tế bào/ml trong dung dịch dung hợp với các thông số dung hợp khác nhau đã được các tác giả công bố. Chất lượng tế bào thu được sau xung được thể hiện qua Bảng 3.4:

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần tạo xung điện đến khả năng tạo mô sẹo

của tổ hợp B186 (+) B208 và tổ hợp trn3G (+) Delikat

STT CT Thời gian tế bào phân chia (ngày) Thời gian xuất hiện microcallus (ngày) Số lượng macrocallus/đĩa

Tổ hợp B186 (+) B208

1 CT1 3 29,8 21,5

2 CT2 2 18,9 73,4

3 CT3 4 22,5 37,6

4 CT4 4 28,3 29,2

Tổ hợp trn3G (+) Delikat

1 CT1 5 27,3 19,5

2 CT2 2 18,2 70,8

3 CT3 4 28,7 24,6

Chú thích: CT1: 700 kHz + 2 lần xung; CT2: 800 kHz + 2 lần xung;

CT3: 900 kHz + 2 lần xung; CT4: 1000KHz + 1 lần xung

4 CT4 4 30,3 28,8

Chất lượng tế bào của tổ hợp B186 (+) B208 sau dung hợp được thể hiện qua Hình

ảnh 3.2

CT2

CT3

CT1

CT4

CT2

CT1

CT3

CT4

Hình 3.2. Chất lượng tế bào sau dung hợp và sự hình thành macrocallus ở các tần và số lần xung khác nhau.

Từ kết quả Bảng 3.4 và Hình 3.2 cho thấy: tần số và số lần xung ảnh hưởng rõ rệt

đến chất lượng tế bào sau dung hợp.

Ở tần số 700 kHz và 2 lần xung (CT1), tế bào thu được sau dung hợp hầu như bị

vỡ nát, những tế bào sống sót sau 3 ngày (với tổ hợp nhị bội B186 (+) B208) và 5 ngày

nuôi cấy (với tổ hợp dòng dại với khoai tây trồng trn3G (+) Delikat) mới có hiện tượng

phân chia và sau hơn 27 ngày microcallus mới hình thành, tỷ lệ hình thành macrocallus

từ microcallus thấp, trung bình chỉ có 21,5 macrocallus/đĩa (B186 (+) B208); 19,5 macrocallus/đĩa (trn3G (+) Delikat).

Tế bào được dung hợp ở các thông số của CT2 (tần số 800 kHz và 2 lần xung), tế bào có tỷ lệ nguyên vẹn cao, thời gian xuất hiện hiện phân chia sớm (sau 2 ngày nuôi cấy), các microcallus hình thành sau 18 ngày nuôi cấy trên môi trường lỏng, số macrocallus hình thành/đĩa nhiều nhất (trung bình 73,4 macrocallus/đĩa với B186 (+) B208 và 70,8 macrocallus/đĩa với trn3G (+) Delikat ).

Khi tăng tần số xung lên 900 kHz và giữ nguyên số lần xung (CT3) thì tỷ lệ tế bào

vỡ tăng, tế bào phân chia muộn hơn so với CT2, số macrocallus hình thành đạt ít hơn so

với CT2. Tương tự, khi dung hợp ở tần số 1000 kHz và 1 lần xung sau hơn 28 ngày tế bào mới bắt đầu phân chia.

Như vậy dung hợp ở thông số 800 kHz và 2 lần xung là thích hợp nhất cho dung

hợp xung điện trên đối tượng là các dòng khoai tây nhị bội và giữa khoai tây dại và khoai tây trồng.

3.1.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ ion Ca2+ của dịch dung hợp (fusion solution) tới hiệu suất dung hợp

Ion Ca2+ là ion dẫn truyền điện tích và là ion không thể thiếu được trong quá trình dung hợp bằng xung điện. Ion Ca2+ giúp tế bào xếp thành hàng, giúp cho hiệu suất dung hợp tế bào cao hơn. Vai trò của Ca2+ trong dung dịch dung hợp đã được Ohno-shosaku và Okada (1984) [108] ghi nhận khi tiến hành dung hợp tế bào L5178 trong dung dịch không bổ sung Ca2+ (monically Ca2+-free) kết quả cho thấy hơn 60% tế bào bị chết và chỉ có một lượng nhỏ tế bào sống sau dung hợp (dưới 10%), nhưng khi sử dụng dung dịch dung hợp có bổ sung 30 µM Ca2+ thì hiệu suất dung hợp đạt 30%, và 70% tế bào phân chia. Vai trò của Ca2+ ngoại bào trong dung hợp xung điện cũng đã được Zimmerman (1982) [50] khẳng định, quá trình dung hợp xung điện tế bào sẽ bị cản trở khi loại bỏ hoàn toàn ion Ca2+ ra khỏi dung dịch dung hợp. Do vậy nghiên cứu nồng độ Ca2+ trong dung dịch dung hợp là một yếu tố quan trọng cho quá trình dung hợp diễn ra. Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua bảng 3.5:

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ đến khả năng kết dính thành hàng của tế bào trong quá trình dung hợp (tế bào/hàng) và khả năng tế bào phân chia sau dung hợp.

Nồng độ Ca2+ (M)

10-5

10-4

10-3

10-2

Thời

STT Tổ hợp lai

Tế bào

gian phân

Tế bào/hàng

/hàng

chia (ngày)

14,2

21,7

3

10,2

1 B186 (+) B208 3,1

3,7

13,6

21,9

3

10,8

Trn3G (+) Delikat

Qua Bảng 3.5 cho thấy nồng độ của Ca2+ có ảnh hưởng rõ rệt đến sự tạo hàng của

tế bào trong quá trình dung hợp xung điện.

Khi nồng độ Ca2+ trong dung dịch dung hợp (fusion solution) là 10-5 M thì tế bào tạo thành hàng ít (3,1 – 3,7 tế bào/ hàng). Trong khi đó, tăng nồng độ Ca2+ lên 10-4 đến 10-3 M thì số tế bào tạo hàng tăng lên một cách đáng kể, số tế bào/hàng ở nồng độ Ca2+ 10-3 M ở cả 2 tổ hợp dung hợp tăng lên đáng kể (21,7 – 21,9 tế bào/hàng) và cao hơn cả khi dung hợp tế bào ở nồng độ Ca2+ 10-4 M (14,3 – 13,6 tế bào/hàng). Như vậy, số tế bào/ hàng tăng khi tăng nồng độ Ca2+ tăng 10-5 M đến 10-3 M trong dung dịch dung hợp.

Mặt khác, khi tăng nồng độ Ca2+ lên 10-2 M lại kìm hãm sự liên kết tạo hàng giữa

các tế bào, số tế bào/hàng giảm chỉ còn 10,2 – 10,8 tế bào/ hàng.

Các kết quả hoàn toàn phù hợp với kết quả công bố của Dimitrova và Christov (1992) [109]. Như vậy nồng độ Ca2+ trong dung dịch dung hợp xung điện dao động từ 10-4 M đến 10- 3 M, thích hợp nhất là 10-3 M.

Chú thích:

A- Hình ảnh tế bào trong dung dịch dung hợp có nồng độ 10-5 M Ca2+

B- Hình ảnh tế bào trong dung dịch dung hợp có nồng độ 10-4 M Ca2+

C- Hình ảnh tế bào trong dung dịch dung hợp có nồng độ 10-3 M Ca2+

D- Hình ảnh tế bào trong dung dịch dung hợp có nồng độ 10-2 M Ca2+

Hình 3.3. Hình ảnh tế bào phân tạo hàng trong dung dịch dung hợp dung hợp có nồng độ Ca2+ khác nhau trong quá trình dung hợp của tổ hợp B186 (+) B208

3.1.2.3 Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp

Tiến hành thí nghiệm dung hợp xung điện tế bào ở mật độ khác nhau để xác định

mật độ thích hợp nhất cho tỷ lệ con lai tetraploid (4x = 48) đối với tổ hợp nhị bội B186 (+) B208, con lai hexaploid (6x = 62) đối với tổ hợp khoai tây dại và khoai tây trồng (trn3G (+) Delikat) cao nhất kết quả được trình bày ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp bằng xung điện của tổ hợp

nhị bội B186 (+) B208

Số macrocallus/ Mật độ xung hợp đĩa* Thời gian xuất hiện Số cây tái sinh** Tỷ lệ cây hỗn bội Tỷ lệ cây 2x (%) Tỷ lệ cây 4x (%) (%) (tế bào/ml) phân chia

(ngày)

1 x 105 3 28,5 ± 0,3 16 ± 1,0 56,25 ± 1,5 25,00 ± 1.5 18,75 ± 2,9

2 x 105 2 75,7 ± 1,5 35 ± 3,8 37,14 ± 0,6 34,29 ± 0,9 28,57 ± 1,5

3 x 105 2 85,6 ± 0,6 46 ± 1,7 13,88 ± 0,1 45,65 ± 0,7 40,47 ± 0,8

4 x 105 2 68,3 ± 1,0 47 ± 3,1 14,90 ± 0,6 31,91 ± 1,0 53,19 ± 0,4

Chú thích: dung hợp với tần số 800 kHz và 2 lần xung

*sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường Cul-medium,

**sau 2-3 tháng nuôi cấy trên môi trường RJM

Từ kết quả Bảng 3.6 cho thấy: mật độ ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân

chia tế bào và tỷ lệ con lai tứ bội tạo thành. Mật độ tế bào tham gia dung hợp càng cao thì tế bào phân chia sớm và tỷ lệ con lai con lai hỗn bội càng tăng.

Ở mật độ dung hợp 1 x 105 tế bào/ml sau 3 ngày tế bào mới phân chia, tỷ lệ con lai tái sinh có độ bội 2x cao nhất (56,25%) trong khi đó con lai có độ bội 4x chỉ đạt đạt 25%.

Khi tăng mật độ dung hợp từ 2x 105 tế bào/ml đến 5 x 105 tế bào/ml, tế bào cảm ứng nhanh và phân chia chỉ sau 2 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ con lai 4x tăng từ 34,29% đến 45,65% khi tăng mật độ dung hợp từ 2 x 105 tế bào/ml đến 3 x 105 tế bào/ml. Tỷ lệ con lai này lại giảm xuống chỉ còn 31,91% và 24,13% khi tăng mật độ dung hợp lên 4 x 105

5 x 105 2 62,6 ± 1,0 29 ± 2,0 10,31 ± 0,5 24,13 ± 2,0 65,56 ± 2,4

và 5 x 105 tế bào/ml. Trong khi đó tỷ lệ con lai hỗn bội lại tăng vọt ở hai mật độ dung hợp này (53,19% và 65,56% con lai là con lai hỗn bội khi dung hợp ở mật độ 4 x 105 tế bào/ml và 5 x 105 tế bào/ml)

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp bằng xung điện của tổ hợp

khoai tây dại và khoai tây trồng Trn3G (+) Delikat

Số cây tái sinh Thời gian xuất hiện Số macrocall (cây) Tỷ lệ cây 4x Tỷ lệ cây 6x Tỷ lệ cây hỗn phân chia us/ đĩa Mật độ dung hợp (tế bào/ Tỷ lệ cây 2x (%) (%) (%) bội (%) ml) (ngày) Sau 4 tuần Sau 8 tuần

1x 105 32,5 ± 0,5 21 ± 1,2 3 25,3 ± 0,9 45,0 ± 1,0 14,4 ± 1,2 15,3 ± 1,6

2 x 105 65,7 ± 0,8 55 ± 1,5 2 16,2 ± 1,4 30,9 ± 1,0 32,3 ± 1,4 20,7 ± 1,8

3 x 105 74,6 ± 0,6 66 ± 2,0 2 10,3 ± 0,7 10,6 ± 0,1 58,4 ± 1,6 20,7 ± 1,4

4x 105 88,3 ± 0,5 81 ± 0,6 2,3 ± 0,4 9,6 ± 0,4 2 61,9 ± 0,8 26,2 ± 0,7

Chú thích: dung hợp với tần số 800 kHz và 2 lần xung

Mật độ cũng ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân chia tế bào và tỷ lệ con lai

lục bội tạo thành. Mật độ tế bào tham gia dung hợp càng cao thì tế bào phân chia sớm và tỷ lệ con lai con lai lục bội (6x) càng tăng nhưng mật độ càng dày thì tỷ lệ cây 8x lại càng cao.

Ở mật độ dung hợp 1 x 105 tế bào/ml, sau 3 ngày tế bào mới phân chia, tỷ lệ con lai tái sinh có độ bội 2x và 4x cao nhất (25,3%, và 45,0%) trong khi đó con lai có độ bội 6x chỉ đạt 14,4%.

Khi tăng mật độ dung hợp từ 2 x 105 tế bào/ml đến 4 x 105 tế bào/ml, tế bào cảm ứng nhanh và phân chia chỉ sau 2 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ con lai 6x lại tăng (32,3% và 61,9%). Khi tăng mật độ tế bào lên 5 x 105 tế bào/ml thì số cây tái sinh bắt đầu giảm, tỉ lệ cây 6x cũng giảm còn 48,2%.

Như vậy mật độ xung cho hiệu quả dung hợp tạo con lai 4x là 3 x 105 tế bào/ml;

con lai 6x là 4 x 105 tế bào/ml.

5 x 105 72,6 ± 0,8 68 ± 2,3 0,0 ± 0,0 2 10,8 ± 0,2 48,2 ± 1,5 41,0 ± 1,7

3.1.3. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp

3.1.3.1. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lỏng sau dung hợp đến sự phân chia và tái sinh microcallus của các tổ hợp lai sau dung hợp

Tế bào trần của các tổ hợp lai sau khi dung hợp được nuôi cấy trên các loại môi

trường lỏng khác nhau: môi trường VKM II (Thieme et al., 1997) [69], Medium A*

(Ehsanpour et al., 2001) [110], KM8P* (Conde Paula et al., 2006) [111] được trình bày ở Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Sự phân chia của các tổ hợp lai nhị bội và tổ hợp lai giữa khoai tây dại và khoai

tây trồng trên các môi trường nuôi cấy khác nhau

Thời gian xuất hiện microcallus (ngày) Số lượng microcallus trung bình/ đĩa petri Thời gian xuất hiện tế bào phân chia (ngày)

Môi trường

B186 (+) trn3G (+) Delikat trn3G (+) Delikat B186 (+) B208 trn3G (+) Delikat B186 (+) B208 B208

VKM II

3 2 12 18 35,7 33,8

7 9 A* 21 - 5,8 -

Chú thích: 10 đĩa petri/ tổ hợp dung hợp được theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên môi trường lỏng trong điều kiện tối, nhiệt độ 20 - 220C;

(-) tế bào không phân chia.

6 5 KM8P* - 28 - 4,7

1

3

2

6

Hình 3.4. Hình ảnh phân chia tế bào sau 5 ngày nuôi cấy

Chú thích: 1. Tế bào trần của B186 (+) B208 trên môi trường VKM II;

2. Tế bào trần của B186 (+) B208 trên môi trường KM8P*;

3. Tế bào trần của B186 (+) B208 trên môi trường A*;

4. Tế bào trần của trn3G (+) Delikat trên môi trường VKMII;

5. Tế bào trần của trn3G (+) Delikat trên môi trường A*;

6. Tế bào trần của trn3G (+) Delikat trên môi trường KM8P*

Trên môi trường A* và KM8P*, thời gian bắt đầu phân chia của tế bào trần của các tổ hợp dung hợp nhị bội (B186 (+) B208) và tổ hợp giữa khoai tây dại và khoai tây

trồng (trn3G (+) Delikat) là 5 và 9 ngày. Tốc độ phân chia tế bào thấp và không đồng

đều. Cụ thể, tổ hợp B186 (+) B208: 28 ngày trên môi trường KM8P*, tổ hợp trn3G (+) Delikat: 21 ngày trên A*, và hầu như các tế bào không có thể phân chia để hình thành

được microcallus và chết sau 2 tuần nuôi cấy. Lượng microcallus trên hai môi trường này cũng rất ít (4,7 - 5,8 microcallus/ đĩa).

Bên cạnh đó, các tế bào trần nuôi cấy trên môi trường VKM II bắt đầu phân chia

chỉ sau 2-3 ngày nuôi cấy, tùy thuộc vào dòng khoai tây nuôi cấy. Sau 3 ngày nuôi cấy,

toàn bộ các dòng đều phân chia và tạo microcallus sau 2 tuần nuôi cấy. Trên môi trường

này các tổ hợp nhị bội, tổ hợp dại và khoai tây trồng đều tạo ra một lượng khá lớn microcallus.

Như vậy, môi trường VKM II là môi trường thích hợp để nuôi cấy tạo microcallus

của tế bào trần sau khi dung hợp.

3.1.3.2. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi của các tổ hợp lai

Các tổ hợp lai sau khi dung hợp phân chia tạo microcallus trên môi trường lỏng

VKM II sau 3 - 4 tuần nuôi cấy, được chuyển sang nuôi cấy trong các đĩa peptri lớn (

9cm), chứa môi trường rắn Cul-medium (Moller et al., 1992) đặt trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng, cường độ ánh sáng 4000 lux và nhiệt độ 210C để tạo macrocallus. Sau 3 - 8 tuần, chuyển các macrocallus vào môi trường tái sinh khác nhau. Thí nghiệm theo dõi 10 đĩa petri/ tổ hợp lai, mỗi đĩa petri cấy 10 macrocallus (đường kính từ 2 – 4 mm). Mỗi callus chỉ lấy 1 chồi đầu tiên và lấy số lượng chồi trung bình/ đĩa. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.9, Hình 3.5.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai

Số lượng chồi tái sinh/chất lượng chồi Tổ hợp lai Môi trường RJM Môi trường MSO Môi trường K8P

B186 (+) B208 7,4/++ 2,6/+ 0,0/

Chú thích: (-) Chồi yếu, màu trắng;

(+) Chồi phát triển trung bình, màu vàng nhạt;

(++) Chồi tốt, mập, xanh

Từ kết quả Bảng 3.9 cho thấy môi trường khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến khả

năng tái sinh tạo chồi của các tổ hợp lai.

Trên môi trường MSO và K8P, các callus của các tổ hợp lai tái sinh kém, số chồi

trung bình/ đĩa chỉ đạt từ 0 - 2,6 chồi/ đĩa và không phải tổ hợp nào cũng tái sinh trên 2

loại môi trường này. Các chồi tái sinh trên các môi trường này thường yếu có màu vàng nhạt.

Mặc khác, trên môi trường RJM, các tổ hợp lai đều có khả năng tái sinh tạo chồi

với số chồi trung bình/ đĩa đạt 7,4 chồi với tổ hợp B186 (+) B208 và 8,4 chồi với tổ hợp trn3G (+) Delikat. Các chồi hình thành sinh trưởng phát triển tốt, thân mập xanh.

trn3G (+) Delikat 8,4/++ 0,0/ 1,8/-

Kết luận:

Từ các thí nghiệm dung hợp, tái sinh đã khẳng định được các thông số dung hợp

và tái sinh như sau:

+ Tần số dung hợp số 800 kHz và 2 lần xung.

+ Nồng độ Ca2+ trong dung dịch dung hợp xung điện thích hợp nhất là 10-3 M.

+ Mật độ tế bào dung hợp thích hợp với tổ hợp khoai tây nhị bội là 3 x 105 tế

bào/ml; với tổ hợp khoai tây dại và khoai tây trồng 4 x 105 tế bào/ml.

+ Các tế bào sau dung hợp được nôi cấy trên môi trường VKM II để tạo

microcallus và tái sinh trên môi trường RJM.

Các thông số này cũng được thể hiện qua Hình 3.5

A

B

C

D

E

F

G

Hình 3.5 Dung hợp và nuôi cấy các tổ hợp lai sau dung hợp

Chú thích: A: Dung hợp protoplast bằng xung điện;

B: Các protoplast kết hợp với nhau nhờ luồng xung điện;

C: Sự phân chia tạo microcallus của các tổ hợp lai trên môi trường VKM II lỏng;

D: Các macrocallus hình thành sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường Cul-medium tạo callus;

E: Các callus hình thành trên môi trường Cul-medium trước khi chuyển sang môi trường tái sinh chồi;

F: Callus tái sinh chồi;

G: Tách chồi trên môi trường MS

3.2. Xác định và đánh giá các thể lai soma của tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n = 2x)

3.2.1. Tạo con lai

Các dòng khoai tây nhị bội sau khi được đánh giá sự sinh trưởng phát triển và khả

năng kháng virus PVY trong điều kiện thời tiết ở Việt Nam, các dòng này được tách và

tạo các tổ hợp dung hợp với các thông số đã được xác định từ các thí nghiệm trước. Có

10 tổ hợp lai được tạo thành từ các nguyên liệu nhị bội chọn lọc (A15, A16, A56, B186,

B208). Tuy nhiên, khả năng tái sinh của các tổ hợp này không đồng đều. Trong khuôn

khổ thời gian cho phép, luận án trình bày kết quả 3 tổ hợp lai có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt nhất để báo cáo.

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.10

Bảng 3.10. Kết quả dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai nhị bội sau dung hợp

Sự tái sinh các tổ hợp lai

TT Tổ hợp lai

Tỷ lệ tái sinh cây (%) Số lượng callus tạo thành đem tái sinh cây (callus) Số lượng cây tái sinh từ callus (cây)

1 A15 (+) A56 1026 ± 11,4 25 ± 1,5 2,43

2 A16 (+) B186 375 ± 8,1 53 ± 3,2 14,13

3 B186 (+) B208 175 ± 9,6 25 ± 2,1 14,28

Kết quả tái sinh của các Bảng 3.10 cho thấy tỷ lệ tái sinh thành cây phụ thuộc vào các tổ hợp lai khác nhau. Tổ hợp B186 (+) B208 có tỷ lệ tái sinh cây/ callus cao nhất đạt 25 cây/ 175 callus đem tái sinh đạt 14,28%; tổ hợp A15 (+) A56 có tỷ lệ tái sinh cây/ callus thấp nhất, đạt 2,43%. Từ 1576 callus của 3 tổ hợp dung hợp đem tái sinh cây thu được 103 cây, đạt tỷ lệ tái sinh trung bình là 6,54%.

Kết quả của phương pháp dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây là tạo ra một tập hợp các cây lai tái sinh từ các tổ hợp dung hợp. Các con lai ngẫu nhiên có thể là đồng hợp nhân (homozygous) hoặc dị hợp nhân (heterozygous). Một khâu quan trọng tiếp theo của kỹ thuật lai soma là phải chọn lọc được chính xác con lai có kiểu gen dị hợp nhân. Nghiên cứu này thực hiện các phương pháp xác định khác nhau (xác định độ bội các cây lai, xác định con lai dị hợp nhân bằng marker phân tử SSR) để từ một quần thể cây lai tái sinh tìm ra con lai soma.

Tổng 1576 103 6,54

3.2.2. Xác định độ bội thể của cây tái sinh

Sử dụng máy Flow cytometry để đo độ bội của các con lai. Kết quả được thể hiện

trên Bảng 3.11, Hình 3.6.

Bảng 3.11. Kết quả xác định độ bội các con lai sau dung hợp

Tổ hợp lai Số cây tái sinh (dòng) Cây nhị bội (cây) Cây tứ bội (cây) Cây hỗn bội (cây)

A15 (+) A56 25 ± 0,6 7 ± 0,6 13 ± 0,6 5 ± 0,6

A16 (+) B186 53 ± 1,7 15 ± 1,0 17 ± 1,0 21 ± 1,7

B186 (+) B208 25 ± 1,2 5 ± 0,6 20 ± 0,6 0 ± 0

Tổng 103 60 26 27

Kết quả Bảng 3.11 cho thấy: trong 103 chồi tái sinh từ callus của 3 tổ hợp lai thì

tỷ lệ các cây lai có độ bội 2n = 4x đạt 60 cây (chiếm 58,3%). Trong 3 tổ hợp dung hợp thì tổ hợp B186 (+) B208 có tỷ lệ con lai tứ bội cao nhất, đạt 80%.

Tổ hợp A15 (+) A56 có tỷ lệ con lai hỗn bội (lục bội, bát bội) cao nhất, chiếm tới

5/25 cây tái sinh, nguyên nhân có thể do mật độ tế bào trần của 2 dòng dung hợp là quá

cao nên có nhiều hơn 2 tế bào trần tiếp xúc và dung hợp, chồi tái sinh sẽ có mức hỗn bội nhiều.

Như vậy, tỷ lệ các con lai có độ bội 2n = 4x thu được chiếm đa số, đạt 58,3% so

với tổng số cây tái sinh.

Mẫu đối chứng chuẩn (2n=2x)

Dòng bố mẹ (2n=2x)

Con lai tứ bội (2n=4x)

Con lai lục bội (2n=6x)

Sử dụng máy flow cytometry đã xác định được 60/103 dòng là con lai tứ bội. Tuy nhiên, đây chỉ là kết quả bước đầu trong việc khẳng định con lai soma tái sinh sau dung

hợp. Các con lai tứ bội có thể được tạo thành do 2 tế bào trần của cùng một dòng “bố” hoặc “mẹ” dung hợp tạo thành, tức là không phải là con lai có kiểu gen dị hợp nhân.

Hình 3.6. Hình ảnh độ bội của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai

Chính vì thế cần xác định chính xác con lai soma bằng phương pháp dùng chỉ thị phân tử.

3.2.3. Xác định con lai soma bằng đo chỉ thị phân tử

Kết quả xác định con

lai soma với mồi STM3023 bằng hệ

thống

GenomeLab GeXP 8800 được thể hiện ở Bảng 3.12.

Bảng 3.12. Kết quả xác định con lai soma của các tổ hợp dung hợp

Tổ hợp lai Số cây tứ bội (2n= 4x) (cây) Số cây lai soma (cây) Tỷ lệ cây lai soma (%)

A15 (+) A56 13 12 92,31

A16 (+) B186 17 8 47,06

B186 (+) B208 20 16 80,00

Kết quả Bảng 3.12 cho thấy trong tổng số 60 cây tứ bội có 36 cây tái sinh là con

lai dị hợp nhân chiếm 60%. Tổ hợp A15 (+) A56 có 13/60 cây là cây tứ bội nhưng lại là

tổ hợp có 12/13 cây là cây lai soma, chiếm tỷ lệ cao nhất (92,31%) trong tổ hợp dung

hợp. Một lượng lớn cây tứ bội tái sinh nhưng lại không phải là cây lai soma, chúng là kết quả của sự dung hợp giữa hai tế bào trần của cùng dòng “bố” hoặc dòng “mẹ”.

Tổng 60 36 60

A 56

A

Somatic hybrid 47/14

B

A 15

C

Chú thích: A- Dòng khoai tây nhị bội “bố” A56;

B- Dòng khoai tây lai soma;

C- Dòng khoai tây nhị bội “mẹ” A15

Hình 3.7. Xác đinh con lai soma của tổ hợp A15 (+) A56 với cặp mồi STM 3023

Hình 3.8. Xác định con lai soma của tổ hợp B186 (+) B208 với cặp mồi STM 3023

Chú thích: A- Dòng khoai tây nhị bội “bố” B208; B- Dòng khoai tây nhị bội “mẹ” B186

C- Các dòng khoai tây lai soma;

Hình 3.8 và 3.9 biểu thị kích thước của các alen của dòng “bố”, dòng “mẹ” và dòng

con lai soma được phát hiện bằng hệ thống điện di mao quản này với mồi STM 3023.

Có thể nhận thấy kích thước các alen của dòng nhị bội “bố mẹ” chỉ hơn kém nhau hai

cặp base: trong tổ hợp A15 (+) A56, bằng phân tích SSR với mồi STM 3023 trên hệ thống GenomeLab GeXP 8800 cho thấy dòng A15 được xác định là có alen với kích

thước 198bp, dòng A56 có kích thước alen ở 196,33bp và con lai soma có cả 2 peak của

dòng “bố mẹ”, 2 alen với kích thước tương đương với kích thước đã xác định được trên alen của dòng “bố” và dòng “mẹ”, tương ứng lần lượt là peak 196,05bp và 197,96bp; tổ

hợp B186 (+) B208 cũng cho kết quả tương tự với tổ hợp A15 (+) A56, các dòng “bố

mẹ” cũng chỉ hơn kém nhau hai cặp base và các con lai soma được xác định cũng có các peak có kích thước alen tương tự với peak của “bố mẹ”.

3.2.4. Đánh giá phẩm chất củ của các con lai soma trong điều kiện chậu vại

Trong nội dung chọn lọc con lai, đã chọn lọc được 36 con lai dị hợp tử tetraploid

(4x). Tuy nhiên, khi tách dòng và đánh giá chọn lọc trong điều kiện in vitro chỉ có 15

dòng của một số tổ hợp cho khả năng sinh trưởng phát triển tốt. Các dòng này được đánh giá các phẩm chất củ trong điều kiện chậu vại.

Kết quả đánh giá các chỉ tiêu hóa sinh được thể hiện qua Bảng 3.13

Hình 3.9. Sự khác nhau về số lượng và kích thước củ của một số dòng lai soma sau dung hợp

Bảng 3.13. Một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng lai soma khoai tây và dòng nguyên liệu

STT Kí hiệu Hàm lượng chất khô (%) Đường khử (%) Tinh bột (%)

Các dòng bố mẹ

A15

20,52

0,25

94,88

A16

17,41

0,25

88,45

A56

20,13

0,18

94,43

B186

18,31

0,21

88,69

B208

17,70

0,20

87,63

Con lai của tổ hợp lai A15 (+) A56

47/7

20,47

0,14

92,97

47/11

20,11

0,45

95,18

47/14

20,35

0,13

92,14

47/24

20,23

0,18

90,01

47/26

22,78

0,13

96,95

Con lai của tổ hợp lai A16 (+) B186

81-2

20,06

0,15

97,46

Con lai của tổ hợp lai B208 (+) B186

21-1

20,57

0,19

90,35

130/2

20,81

0,25

96,68

131/1

16,62

0,39

86,40

131/3

15,97

0,22

89,04

131/4

20,85

0,27

92,76

131/5

19,78

0,42

92,52

131/10

14,03

0,56

88,24

131/11

20,91

0,14

97,42

131/12

20,02

0,41

95,90

Hàm lượng đường khử là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của các giống

khoai tây chế biến. Chỉ tiêu này càng thấp thì càng tốt vì khi chế biến miếng khoai tây không bị đổi màu và nâu hóa.

Tổ hợp lai A15 (+) A56 có hàm lượng đường khử của các con lai dao động từ 0,14

- 0,45 %. Trong đó hai con lai 47/7, 47/14, 47/26 có hàm lượng đường khử thấp hơn cả là 0,14%; 0,13% và 0,13%.

Tổ hợp lai A56 (+) B186 là 81-2 có hàm lượng đường khử tương đối thấp, đạt

0,15%.

Các con lai của tổ hợp lai B186 (+) B208 có hàm lượng đường khử dao động trong khoảng từ 0,14 – 0,56%. Trong đó, con lai có tỉ lệ đường khử thấp nhất là 131/11 đạt 0,14%.

Đối với khoai tây chế biến, ngoài yêu cầu về chỉ tiêu hàm lượng đường khử thấp

thì hàm lượng tinh bột càng cao cũng là yếu tố rất được quan tâm. Củ khoai tây có hàm lượng càng cao thì khi chế biến chip càng giòn, khó gãy, vỡ.

Hàm lượng tinh bột hầu hết các dòng con lai đều bằng hoặc cao hơn dòng nguyên

liệu. Trong đó, đáng chú ý là con lai 47/4, 47/26 của tổ hợp lai A15 (+) A56 có hàm

lượng tinh bột cao đạt 92,97% và 96,95%; con lai 81-2 của tổ hợp lai A56 (+) B186 đạt 97,46%; con lai 131/11 của tổ hợp lai B208 (+) B186 đạt 97,42%.

Kết luận: Như vậy qua đánh giá các tổ hợp lai, những con lai có củ phù hợp với

hướng chế biến khoai tây chip hiện nay là 47/7; 47/26; 81-2; 131/11. Đây là những

dòng có triển vọng về phẩm chất chế biến, cần tiếp tục đánh giá để phục vụ công tác chọn giống.

3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng trong các con lai soma từ vật liệu nhị bội

Kháng virus PVY được chia ra làm 2 nhóm chính: mẫn cảm với PVY

(hypersensitive resistance (HR)) khi bị virus tấn công thì cây có khả năng tạo ra vết hoại

tử để ngăn chặn sự lây lan của virus với các tế bào sống khác của cây, thường do các gen N điều khiển; kháng tốt với PVY (Extreme resistance (ER)) do các gen Ry điều khiển và có khả năng kháng với nhiều chủng PVY. Cây có khả năng kháng tốt PVY thường không có các vết bệnh hoặc có thì rất ít khi lây nhiễm bằng PVY.

Một số gen kháng PVY Rysto, Rychc, Ryadg đã được sử dụng để đánh giá khả năng kháng virus PVY của các dòng khoai tây trồng [112, 52, 113]. Trong các gen kháng PVY, gen Rysto là một gen siêu kháng, có nguồn gốc từ loài S. stoloniferum cho khả năng kháng rất cao đối với nhiều chủng PVY và được sử dụng nhiều trong các chương trình

chọn tạo giống (Iga et al., 2014) [114]. Hơn nữa không chỉ kháng PVY mà gen Rysto còn cho phép các dòng, giống khoai tây chứa nó kháng được một số loại virus khác nữa như PVA, PVV [60].

et al.,

[103]

chỉ

Song et al., (2005) [112] đã định vị được locus của gen Rysto nằm trên nhiễm sắc thể XII và được phát hiện bởi marker STM0003. Marker STM0003 nhân đoạn ADN có ,.. kích thước 111bp cùng nằm trên nhiễm sắc thể số XII và liên kết rất chặt với gen Rysto (2007) Heldák rằng marker STM0003, cũng ra những cặp mồi liên kết chặt với gen kháng Rysto để thể hiện sự đa GP122718 và GP122406 hình giữa các dòng kháng và nhạy cảm với PVY.

Trong nghiên cứu này sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Rysto là GP 122406 nhân được đoạn DNA có kích thước 406 bp, sau dùng enzym EcoV để cắt. Kết quả được thể hiện qua Hình 3.10, 3.11:

Chú thích 1: A15; 2: A16; 3: A56; 4: B208; 5: B186;

6: 47/7; 7: 47/11; 8: 47/14; 9: 47/24; 10: 47/26; 11: 81-2; 12: 21-1; 13: 130/2;

14: 131/1; 15: 131/3; 16: 131,4; 17: 131/5; 18: 131/10; 19: 131/11; 20: 131/12

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP 122406 liên kết chặt với gen Rysto trong bố mẹ nhị bội và con lai soma

Chú thích 1: A15; 2: A16; 3: A56; 4: B208; 5: B186;

6: 47/7; 7: 47/11; 8: 47/14; 9: 47/24; 10: 47/26; 11: 81-2; 12: 21-1; 13: 130/2;

14: 131/1; 15: 131/3; 16: 131,4; 17: 131/5; 18: 131/10; 19: 131/11; 20: 131/12

Từ các kết quả điện di Hình 3.10 và 3.1 cho thấy tất cả các dòng bố mẹ và các dòng con lai soma khoai tây đều chứa gen Rysto (gen siêu kháng). Từ đây, có thể khẳng định rằng con lai soma tạo ra bằng dung hợp tế bào trần có chứa gen kháng virus từ “bố mẹ” của chúng.

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR được cắt với enzym cắt giới hạn EcoRV

3.3. Xác định các thể lai soma của tổ hợp dung hợp giữa khoai tây dại (2n=2x) và khoai tây trồng (2n = 4x). Đánh giá khả năng kháng virus PVY của chúng

Các dòng khoai tây dại và khoai tây trồng tách và tạo các tổ hợp dung hợp với các

thông số đã được xác định từ nội dung tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần của các dòng nghiên cứu. Có 9 tổ hợp được kết hợp từ 3 dòng khoai tây dại và 3 dòng khoai tây trồng. Tuy nhiên, sau quá trình dung hợp, chỉ có 6 tổ hợp lai cho kết quả tái sinh tốt. Sáu tổ hợp lai này và tỷ lệ tái sinh của các tổ hợp được thể hiện qua Bảng 3.14

Bảng 3.14. Kết quả nuôi cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây trồng sau dung hợp

STT Tên tổ hợp lai Số lượng callus tạo ra Số lượng chồi tái sinh Tỷ lệ tái sinh (%)

trn3G (+) Rasant 1 97 25 25,8

trn3G (+) Delikat 2 250 64 25,6

trn3G (+) Atlantic 3 395 2 0,50

pnt2G (+) Atlantic 4 193 23 11,9

pnt2G (+) Delikat 5 53 26 49,06

blb2G + Delikat 6 250 31 12,4

Từ Bảng 3.14 cho thấy các tổ hợp lai khác nhau thì khả năng tạo callus, tái sinh

chồi cũng khác nhau. Các tổ hợp lai trn3G (+) Delikat, pnt3G (+) Delikat, trn3G (+)

Rasant có khả năng tái sinh cao lần lượt là 49,06%, 25,6%, 25,8%. Các chồi này phát

triển tốt, màu xanh. Các chồi này sẽ được tách dòng và đem đi phân tích độ bội và sinh học phân tử để xác định con lai dị hợp tử (herterogyzous).

Tổng 1238 171

3.3.1. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng bằng đo độ bội thể

Sử dụng phương pháp phân tích độ bội thể Flow cytometry để đo độ bội của các

con lai tái sinh của 6 tổ hợp lai. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.15, Hình 3.13.

Bảng 3.15. Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây trồng sau dung hợp

Độ bội (dòng) 2n = Số lượng STT Tên tổ hợp lai chồi tái sinh 2x 4x 6x Hỗn bội (2n>6)

13 5 25 21 1 trn3G (+) Rasant 64

0 3 20 2 2 trn3G (+) Delikat 25

0 1 0 1 3 trn3G (+) Atlantic 2

5 9 9 0 4 pnt2G (+) Atlantic 23

5 10 11 0 5 pnt2G (+) Delikat 26

0 14 15 2 6 blb2G (+) Delikat 31

42 80 26 Tổng 171 23

Chú thích: A- Giống khoai tây trồng (4x), B- Dòng khoai tây dại (2x), C- con lai soma lục bội (6x)

Kết quả cho thấy từ 171 chồi tái sinh sau dung hợp chỉ có 80 cây có độ bội 2n =

6x. Tỷ lệ cây lục bội (2n = 6x) phụ thuộc vào các tổ hợp dung hợp khác nhau. Trong 6

tổ hợp dung hợp thì tổ hợp lai trn3G (+) Delikat cho tỷ lệ cây tái sinh có độ bội 6x là

cao nhất (20/25 dòng) trong khi đó tổ hợp lai giữa trn3G (+) Atlantic không cho kết quả tạo con lai lục bội.

Hình 3.12. Hình ảnh độ bội thể của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai

3.3.2. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khai tây bằng chỉ thị phân tử

Các con lai 6x được xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Dinu and Thieme, 2001)

[100], sử dụng cặp mồi theo Song et al. (2005) [113]. Hình 3.15 minh họa kết quả điện di

cho phân tích chỉ thị SSR sử dụng cặp mồi STM2022 nhằm xác định kiểu gen dị hợp nhân

của các dòng lục bội của tổ hợp lai trn3G (+) Rasant. 25 dòng con lai tái sinh có khả năng

phát triển tốt không bị biến dị của tổ hợp lai dòng dại trn3G và giống Rasant được phân tích có 6 con lai lục bội có kiểu gen dị hợp nhân.

Chú thích: giếng 1- trn3G; giếng 2- Rasant; giếng 3-27 là 25 dòng lai tái sinh của tổ hợp lai trn3G (+) Rasant. Trong đó, có 6 con lai lục bội dị hợp nhân gồm: giếng 6- con lai,

giếng 12- con lai, giếng 20: con lai, giếng 21- con lai, giếng 22- con lai, giếng 24- con lai.

Hình 3.13. Minh họa kết quả điện di cho phân tích chỉ thị phân tử STM2022 để xác định kiểu gen dị hợp nhân của tổ hợp lai trn 3G (+) Rasant

Bảng 3.16. Kết quả sử dụng marker phân tử trong xác định con lai soma

Số cây xác Tỷ lệ con lai soma/dòng Tổ hợp lai Số dòng lục bội Số dòng lai soma Tên mồi xác định con lai (2n= 6x) (Hetezygous) định độ bội tái sinh (%)

trn3G (+) Rasant 64 25 6 9.4 STM2022, STIIKA

trn3G (+) Delikat 25 20 18 72.0 STM2022

trn3G (+) Atlantic 2 0 0 0.0 STM1104

pnt2G (+) Atlantic 23 9 6 26.1 STM3023

pnt2G (+) Delikat 26 11 9 34.6 STM3023

blb2G (+) Delikat 31 15 14 45.2 STM2022

Kết quả bảng 3.16 cho thấy trong số 171 con lai tái sinh có 80 con có độ bội 6x

nhưng chỉ có 53 con có kiểu gen dị hợp nhân. Tùy thuộc vào các tổ hợp lai khác nhau,

tỷ lệ con lai soma của các tổ hợp dung hợp là khác nhau. Tổ hợp lai trn3G (+) Delikat

có 72% số dòng được xác định là dòng lục bội/ tổng số dòng tái sinh trong khi đó tổ hợp trn3G (+) Atlantic không tạo được con lai soma nào.

Tổng 171 80 53

3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng PVY trong các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng

Từ 53 con lai thu được ở trên, chọn lọc được 13 con lai dị hợp tử có khả năng sinh

trưởng phát triển tốt, không bị biến dị trong điều kiện in vitro. Các con lai này được để nhân kiểm tra sự có mặt của gen kháng Rysto, sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP 122406 bản vùng locus đặc hiệu có kích thước 406bp. Sau phản ứng PCR, sản phẩm đã nhân lên ở vạch băng 406bp sẽ tiếp tục được tinh sạch (tủa bằng Ethanol 100% và rửa) và ủ với enzyme cắt giới hạn EcoRV (2h - 37oC). Điện di sản phẩm PCR nếu xuất hiện hai đoạn cắt với kích thước 200bp và 206bp chứng tỏ đoạn 406bp đã có mặt trình tự nhận biết của enzyme giới hạn EcoRV. Từ đó nhận biết được các dòng có tính kháng virus PVY.

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR của các mẫu phân tích với cặp mồi GP

122406 được thể hiện trên Hình 3.14.

Chú thích: Ladder, 1- pnt2; 2- trn3; 3- blb2G; 4- 838/11; 5- 851/2; 6- 2195/2; 7- 2196/4;

8-2235/1; 9- 2044/1; 10- 1/6; 11- 3/9; 12- 248/1; 13- 2281/10; 14- 2283/5; 15- 2292/4; 16- 2295/1; 17- Delikat; 18- Rasant; 19- Atlantic

Kết quả điện di kiểm tra cho thấy toàn bộ các dòng khoai tây phân tích đều thu

được băng ADN có kích thước 406bp.

Sản phẩm PCR thu được trên được tinh sạch và tiếp tục ủ với enzyme giới hạn

EcoRV, sau đó điện di kiểm tra. Kết quả thể hiện qua Hình 3.15.

Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GP 122406 của ADN các con lai soma và các dòng bố mẹ khoai tây dại và khoai tây trồng

Chú thích: Ladder, 1- pnt2; 2- trn3; 3- blb2G; 4- 838/11; 5- 851/2; 6- 2195/2; 7- 2196/4; 8-2235/1; 9- 2044/1; 10- 1/6; 11- 3/9; 12- 248/1; 13- 2281/10; 14- 2283/5; 15- 2292/4; 16- 2295/1; 17- Delikat; 18- Rasant; 19- Atlantic

Quan sát Hình 3.15 cho thấy sản phẩm ủ với EcoRV đều xuất hiện các vạch băng tương ứng với kích thước 200bp và 206bp ở tất cả các giếng khoai tây dại và con lai (từ giếng 1 – 16). Như vậy, tất cả các mẫu ADN của các con lai soma đều có mặt gen kháng virus PVY. Điều đó đồng nghĩa với việc các dòng lai soma đã được chuyển gen kháng bệnh từ dòng khoai tây dại thông qua dung hợp tế bào.

Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY của các dòng lai soma và dòng bố mẹ khoai tây dại và khoai tây trồng

3.3.4. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng bằng lây nhiễm nhân tạo

Các con lai soma và bố mẹ của chúng được đánh giá khả năng kháng virus bằng lây nhiễm nhân tạo. Kết quả lây nhiễm được kiểm tra bằng kit test DAS-ELISA. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.17:

Bảng 3.17. Kết quả mức độ kháng bệnh của các con lai soma 4x sau khi lây nhiễm nhân tạo

Tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ nhiễm STT Dòng N/B STT Dòng N/B

% %

Atlantic 10/10 Con lai của tổ hợp blb2G+Delikat 100 1

100 0 2281/10 0/10 12 2 Delikat 10/10

100 0 2283/5 0/10 13 3 Rasant 10/10

0 0 2292/4 0/10 14 4 pnt2G 0/10

0 0 2295/1 0/10 15 5 trn3G 0/10

0 Con lai của tổ hợp ptn2G (+) Rasant 6 blb2G 0/10

Con lai của tổ hợp trn 3G (+) Delikat 16 2044/1 0/10 0

0 Con lai của tổ hợp trn3G (+) Rasant 7 838/11 0/10

0 0 1/6 0/10 17 8 851/2 0/10

0 0 3/9 0/10 18 9 2195/2 0/10

Con lai của tổ hợp pnt2G (+) Delikat Con lai của tổ hợp pnt2G (+) Atlantic

0 248/1 0/10 0 19 10 2196/4 0/10

Kết quả đánh giá cho thấy tất cả các dòng lai soma và khoai tây dại (trn3G, pnt2G,

blb2G) không bị nhiễm virus, trong khi đó các dòng khoai tây trồng đều bị nhiễm với PVY sau khi lây nhiễm nhân tạo. Điều này chứng tỏ gen kháng virus trong khoai tây dại đã được chuyển sang các dòng lai soma.

0 Thuốc lá 10/10 100 ĐC 11 2235/1 0/10

3.3.5. Đánh giá các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng về các tính trạng nông sinh học và phẩm chất củ

Cùng với khả năng kháng lại các bệnh hại thì khả năng sinh trưởng và phát triển của cây cũng là chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng tới năng suất chất lượng khoai tây

thu được khi trồng. Đây là những dữ liệu quan trọng để các nhà chọn tạo giống xem xét để có thể đề xuất các dòng triển vọng có thể làm giống.

A

B

Hình 3.16. Đánh giá các đặc tính nông sinh học của con lai soma và các dòng bố mẹ

Chú thích: theo thứ tự từ trái sang phải: A: pnt2G; 254/1; Atlantic

B: Delikat;2204/3; pnt2G

A

B

C

Hình 3.17. Đánh giá các tính trạng về năng suất và phẩm chất củ của con lai soma và dòng bố mẹ:

Kết quả Bảng 3.18 cho thấy đa số các con lai tạo ra đều có hình thái tương tự với khoai tây trồng (tuberosum) trừ các con lai 245/6 của tổ hợp lai pnt2G (+) Atlantic; 3/7 của tổ hợp lai trn3G (+) Rasant. Khả năng ra hoa của các con lai soma cũng rất khác

nhau. Đặc biệt, các con lai của tổ hợp blb2G (+) Delikat đều có khả năng ra hoa cao đạt

thang điểm đánh giá từ 5, 7, 9. Tiếp đến là các con 2044/1 của tổ hợp pnt2G (+) Rasant và 2195/2 của tổ hợp pnt2G (+) Delikat đạt điểm 5. Các con lai còn lại chỉ đạt thang

A- Atlantic; B- 254/1; C- pnt2G

điểm 2 - 4. Đây sẽ là những con lai có triển vọng cho chọn tạo giống vì chỉ những con

lai có khả năng ra hoa mới có thể tiếp tục lai trở với khoai tây trồng để chọn tạo được

những giống khoai tây mang đặc tính mong muốn. Các con lai của tổ hợp lai trn 3G (+) Rasant không có khả năng ra hoa.

Do các cây được trồng từ cây in vitro chuyển ra trồng trong điều kiện chậu vại nên

các dòng đạt năng suất, số củ/khóm và khối lượng củ/khóm đạt không cao. Nhiều con lai

soma có số lượng củ trung bình trên khóm đạt từ 4 - 5 củ/khóm như các con lai 248/1 của tổ hợp lai pnt2G (+) Atlantic; 838/11 và 851/2 của tổ hợp lai trn3G (+) Delikat; 2044/1

của tổ hợp lai pnt2G (+) Rasant; 2196/4 của tổ hợp lai pnt2G (+) Delikat. Đồng thời củ của chúng có hình dạng củ đẹp, phù hợp với ăn tươi hoặc chế biến.

Chỉ tiêu khối lượng trung bình củ/khóm (klc TB/khóm) là một yếu tố quan trọng để đánh giá về năng suất của khoai tây trong điều kiện chậu vại. Từ kết quả Bảng 3.18

cho thấy chỉ có một dòng lai soma 851/2 (185g/khóm) của tổ hợp trn3G (+) Delikat cho

năng suất cao hơn so với bố mẹ là khoai tây trồng ở ý nghĩa thống kê, trong khi đó các

dòng soma khác đều cho khối lượng củ/khóm thấp. Điều này có thể là do các dòng dại

thường cho rất ít củ, trọng lượng củ rất thấp, thậm chí một số dòng không có khả khăng

ra củ nên các con lai soma được tạo ra giữa khoai tây dại và khoai tây trồng thường cho

trọng lượng trung bình thấp hơn khoai tây trồng. Để cải thiện về năng suất của các dòng soma, các dòng soma sẽ được lai lại với khoai tây trồng.

Qua quá trình đánh giá có một số một số con lai soma có xuất hiện các biến

dị ở thân, lá, hoa và củ (Hình 3.18). Các biến dị xuất hiện rất đa dạng và khác nhau giữa

các tổ hợp lai khác nhau và khác nhau trong cùng một tổ hợp lai. Nguyên nhân của hiện

tượng này là do các con lai soma được tạo ra từ phép lai dung hợp khác loài giữa khoai

tây dại và khoai tây trồng. Các con lai xa sẽ mang một số đặc điểm hình thái của khoai

tây dại, các đặc điểm này lại khác với khoai tây trồng. Các biến dị này sẽ mất đi khi được lai lại với khoai tây trồng. Các con lai tạo ra sau phép lai lại sẽ dần có các tính

trạng hình thái giống với khoai tây trồng mà không bị mất đi các tính trạng mong muốn ở khoai tây dại.

A

B

C

Hình 3.18. Các biến dị ở con lai soma

Chú thích từ trái sang phải:

A: Hình thái cây của giống Atlantic, 248/1 và 245/6.

B: Hoa và nhị của Ransant và các con lai soma 1/6, 3/9 của tổ hợp lai trn3G và Rasant

C: Biến dị hình dạng củ của các con lai soma 1/6 và 3/9 của tổ hợp lai trn3G và Rasant.

100

Bảng 3.18. Đánh giá các đặc tính nông sinh học của các con lai soma trong điều kiện chậu vại

)

h n

t ị

)

ủ c

i à d = 6

/

8 - 1

0 1 - 1

u â s

m ó h k

9 - 1

6 - 1

9 - 1

g n ò d u ệ i

/

m a g (

ủ c

ì

a o h a r

ộ Đ

g n ở ư r t

ỏ v u à M

: ủ c

g n ạ D

ủ g n t ắ m

o a c t ấ r = 9

h t u à M

i á h t h n H

g n ă n ả h K

g n ố i g n ê T

ủ c (

m ó h k B T c l

i s c ứ s / y â c

n ò r t = 1

S

h ý K

m ó h k B T c l K

Atlantic T,+++ 7 3,9a±1,1 128,3a±19,12 3 2 2 2

Rasant T,+++ - - - - - - -

Delikat T,+++ 4 8,03b±2,25 169,6b±18,2 3 3 2 3

S. tarnii trn 3G W,+ - - - - - - -

pnt2G W,++ 4 4,88c±1,4 88,4c±8,8 3 3 8 1 S. pinnatisectum

blb2G W, ++ - - - - - - - S. bulbocastanum

248/1 T,++ - 5,2d±1,2 108,9d±15,4 5 2 4 1 pnt2G (+) Atlantic

2044/1 T,++ 5 4,7e±2 151,1e±19,4 1 5 2 4 pnt2G(+) Rasant

838/11 T, ++ 2 4,56e±1,5 102,2d±11,4 5 4 2 3 trn3G (+) Delikat

101

851/2 T, ++ 2 4,89de±3,6 185,00f±8,3 5 5 4 3 trn3G (+) Delikat

9 2195/2 W,+++ 2 2 3 3 2,2f±0,44 105,6d±14 trn3G (+) Delikat

- 2196/4 T,+++ 5 2 3 1 4,78de±2,5 141,1g±17,9 pnt2G (+) Delikat

9 2235/1 T,+++ 5 2 3 1 3,6a±0,13 97,6h±14,4 pnt2G (+) Delikat

- 1/6 T, ++ 5 8 4 5 2,67f±2,5 98,3h±10 trn3G (+) Rasant

- 3/9 T,++ 5 8 4 3 2,6f±2,56 125,6i±4,1 trn3G (+) Rasant

5 2281/10 T,+++ 5 2 4 3 3,6a±1,3 97,8h±14,4 blb2G (+) Delikat

9 2283/5 T,+++ 3 2 3 3 4,4de±1,8 142,2g±2,94 blb2G (+) Delikat

7 2292/4 T,+++ 3 2 3 5 4,3e±0,8 118,9i±6,4 blb2G (+) Delikat

7 2295/1 T,+++ 5 2 3 3 2,6f±0,3 106,1d±17,9 blb2G (+) Delikat

0,47 7,39 LSD0,05

CV% 7,6 4,7

102

Chú thích: (-) không xác định; (+)= yếu, (++)= Trung bình; (+++) = Khỏe; T = dạng khoai tây trồng, W= dạng dại, các chữ cái a, b,c… khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức α=0,05

103

Kêt luận:

- Đánh giá về khả năng kháng bệnh virus PVY qua lây nhiễm nhân tạo của các con

lai soma cho thấy các con lai soma đều có khả năng kháng bệnh virus PVY. Kết quả này khẳng định rằng đã chuyển thành công gen kháng virus PVY từ khoai tây dại sang các dòng lai soma.

- Qua đánh giá về các đặc tính nông sinh học cho thấy nhiều con lai soma có kiểu hình tương đối giống với khoai tây trồng. Tuy nhiên, cũng tìm thấy một số biến dị ở một

số con lai. Năng suất của các con lai soma cũng thấp hơn khoai tây trồng là bố mẹ nên cần phải tiếp tục chọn lọc và lai trở lại với các giống khoai tây trồng.

3.4. Đánh giá con lai backcross (BC1) của thể lai soma (khoai tây dại và khoai tây trồng) với khoai tây trồng

3.4.1. Lai hữu tính giữa các con lai soma (của khoai tây dại và khoai tây trồng) với các giống khoai tây trồng và chọn lọc các con lai có đặc tính mong muốn

3.4.1.1. Chọn lọc các con lai

Con lai soma 6x được tạo ra từ tổ hợp khoai tây dại và khoai tây trồng thường

mang nhiều biến dị khác xa so với khoai tây trồng. Để tổ hợp được các đặc tính của

khoai tây trồng vào các con lai soma, các con lai soma này thường được lai lại với khoai

tây trồng (sử dụng khoai tây trồng làm bố). Lựa chọn 3 con lai có khả năng ra hoa cao

nhất để làm cây mẹ. Các phép lai hữu tính được tiến hành trên Sapa – Lào Cai vào năm

2016. Các hạt lai được gieo nảy và tiếp tục được đánh giá, sàng lọc tính kháng PVY và

các tính trạng nông sinh học. Các nội dung này được tiến hành tại Sapa - Lào Cai vào

năm 2017 và Viện Sinh học Nông nghiệp - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam vào vụ đông năm 2017 - 2018. Kết quả lai tạo được thể hiện qua Bảng 3.19 và Hình 3.20.

Bảng 3.19. Kết quả lai hữu tính giữa các con lai soma và khoai tây trồng tứ bội

Tổ hợp lai soma

Ký hiệu

Số quả

Số hạt

STT

Cây bố

Ký hiệu

(dòng mẹ)

dòng mẹ

thu được

trn3G (+) Delikat

pnt2G (+) Delikat

1 2195/2 Rasant 178 13.1300 10

trn3G (+) Delikat

2 2235/1 Atlantic 62 13.1301 4

blb2G (+) Delikat

3 2195/2 Delikat 484 13.1302 19

pnt2G (+) Delikat

4 2283/5 Delikat 352 13.1303 18

104

5 2235/1 Delikat 738 13.1304 21

pnt2G (+) Delikat

6 2235/1 Rasant 284 13.1305 23

Kết quả lai hữu tính đã thu được 95 quả lai của 6 tổ hợp lai, đếm được tổng số 2098 hạt lai. Một lượng lớn hạt lai đã được tạo ra, mỗi hạt lai sẽ là một dòng lai BC1 cần được đánh giá cả về các đặc tính nông sinh học cũng như tính kháng bệnh virus, nhằm

đánh giá hiệu quả của phương pháp chọn tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào kết hợp lai hữu tính.

3.4.1.2. Chọn lọc các con lai BC1 có khả năng kháng virus PVY

Để giảm tải công việc chọn lọc khi đánh giá một số lượng lớn hạt lai BC1 (2098 hạt) thì việc sàng lọc tính kháng ở giai đoạn cây con là rất quan trọng. Với bước sàng lọc những cây con sinh trưởng phát triển yếu, không có khả năng kháng virus (qua lây

nhiễm nhân tạo) thì sẽ làm giảm được công lao động, tiết kiệm được thời gian và giúp cho việc theo dõi, đánh giá các thí nghiệm tiếp theo được thuận lợi hơn. Các hạt lai BC1 sau khi được xử lý ngủ nghỉ với GA3 qua đêm được gieo trên nền giá thể mùn tơi xốp. Kết quả đánh giá được trình bày ở Bảng 3.20.

Tổng 2098 95

Bảng 3.20. Khả năng nảy mầm của hạt lai BC1

trn3G (+) Delikat

Dòng Dòng STT Tổ hợp Số hạt gieo Số hạt nảy mầm Số cây khỏe Ký hiệu dòng lai “mẹ” “bố” (hạt) (hạt) mạnh

pnt2G (+) Delikat

1 70 50 16 2195/2 Rasant BC1 1300

trn3G (+) Delikat

2 30 12 9 2235/1 Atlantic BC1 1301

blb2G (+) Delikat

3 60 48 11 2195/2 Delikat BC1 1302

pnt2G (+) Delikat

4 70 36 10 2283/5 Delikat BC1 1303

pnt2G (+) Delikat

5 50 32 4 2235/1 Delikat BC1 1304

6 35 12 5 2235/1 Rasant BC1 1305

105

Tổng 315 190 55

Chú thích: A: Dòng BC1 1300; B: Dòng BC1 1302

Hai tuần sau khi cây con được chuyển sang bầu đất sẽ tiến hành lây nhiễm nhân

tạo PVY. Sử dụng que thử nhanh virus của hãng agdia (ImmunoStrip® for Potato virus Y) để chọn lọc các dòng sạch bệnh. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.21.

Hình 3.19. Hạt nảy mầm đến giai đoạn 2 lá thật của các hạt lai BC1

Bảng 3.21. Đánh giá khả năng kháng bệnh virus của con lai BC1 ở giai đoạn cây con.

Số cây lây nhiễm Số cây sạch virus Tỷ lệ cây sạch virus (%) Ký hiệu dòng lai

16 6 37,5 BC1 1300

9 3 33,3 BC1 1301

11 9 81,8 BC1 1302

10 4 40,0 BC1 1303

4 2 50,0 BC1 1304

5 2 40,0 BC1 1305

Kết quả Bảng 3.21 cho thấy, trong 55 dòng lai được lây nhiễm virus thì có 26 dòng không bị nhiễm bệnh (Bảng 3.21) đạt 47,3%. 26 dòng lai sạch bệnh này sẽ được tiếp tục theo dõi để chọn ra những dòng có tiềm năng năng suất và các đặc tính nông sinh học giống khoai tây trồng.

106

Tổng 55 26 47,3

3.4.1.3. Chọn lọc các con lai BC1 có các đặc tính nông sinh học mong muốn

Các dòng lai BC1 sau khi được chọn lọc kháng virus sẽ được chăm sóc, theo dõi các đặc tính nông sinh học để từ đó chọn lọc ra các dòng lai triển vọng để khảo nghiệm tiếp vụ sau.

Bảng 3.22. Bảng đánh giá hình thái và kiểu sinh trưởng của các con lai BC1

STT Kí hiệu dòng lai Cấu trúc tán Kiểu sinh trưởng Hình thái/sức sinh trưởng

1 Trung gian Đứng T, +++ BC1 1300.3

2 Dạng Lá Nửa đứng T, ++ BC1 1300.6

3 Dạng Lá Nửa đứng T, +++ BC1 1300.9

4 Trung gian Đứng T, +++ BC1 1300.13

5 Trung gian Nửa đứng T, +++ BC1 1300.14

6 Dạng Lá Nửa đứng T, +++ BC1 1300.16

7 Dạng Thân Đứng T, +++ BC1 1301.4

8 Trung gian Bò T, ++ BC1 1301.5

9 Dạng Thân Bò T, ++ BC1 1301.11

10 Dạng Thân Nửa đứng T, ++ BC1 1302.1

11 Dạng Thân Nửa đứng T, +++ BC1 1302.2

12 Trung gian Nửa đứng T, +++ BC1 1302.3

13 Dạng Thân Nửa đứng T, +++ BC1 1302.4

14 Dạng Thân Đứng T, ++ BC1 1302.5

15 Trung gian Nửa đứng T, +++ BC1 1302.6

16 Trung gian Nửa đứng T, ++ BC1 1302.7

17 Trung gian Nửa đứng T, +++ BC1 1302.11

18 Dạng Thân Đứng T, ++ BC1 1302.10

19 Trung gian Nửa đứng T, +++ BC1 1303.2

107

20 Trung gian Đứng T, ++ BC1 1303.3

21 Dạng Lá Bò T, +++ BC1 1303.4

22 Trung gian Đứng T,+++ BC1 1303.6

23 Dạng Lá Nửa đứng T, +++ BC1 1303.22

24 Trung gian Nửa đứng T, +++ BC1 1304.1

25 BC1 1304.3 Trung gian Nửa đứng T, +

26 Dạng Thân Nửa đứng T, +++ BC1 1305.6

Chú thích: Cấu trúc tán: dạng thân, trung gian, dạng lá;

Kiểu sinh trưởng: đứng, nửa đứng, bò;

T: dạng trồng; + yếu; ++ trung bình; +++ khỏe

Kết quả Bảng 3.22 cho thấy: Trong cùng một tổ hợp lai các dòng khác nhau có sự

khác nhau về cấu trúc tán và kiểu sinh trưởng của các dòng lai. Điều này là do sự phân ly của phép lai hữu tính. Các dòng lai BC1 đều có sức sinh trưởng khá tốt, tương đương với khoai tây trồng là Solara, ngoại trừ dòng BC1 1304.3. Dòng này mặc dù có kiểu hình giống với khoai tây trồng, không còn hình dạng giống với khoai tây dại nhưng sức sinh trưởng lại yếu.

Trong khi giống đối chứng (Solara) có cấu trúc tán dạng trung gian thì các con lai có 13/26 dòng BC1 có cấu trúc trung gian (1300.3, 1300.13, 1300.14, 1301.5, 1302.3, 1302.6, 1302.7, 1302.11, 1303.2, 1303.3, 1303.6, 1304.1, 1304.3), 5/26 dòng dạng lá, 8/26 dòng dạng thân.

ĐC Solara Trung gian Nửa đứng T, +++

Bảng 3.23. Bảng đánh giá năng suất và hình thái củ của các con lai BC1

STT Kí hiệu Dạng củ slc/cây (củ) Kltbc/cây (gam) Màu vỏ củ Màu thịt củ Độ sâu mắt ngủ

BC1 1300.3 130,4 Ovan dài Vàng Rất nông 7 1 Vàng nhạt

8 BC1 1300.6 2 120,8 Ovan Tím Vàng TB Sâu

BC1 1300.13

11 3 Kem 120,1 Ovan dài Nâu đỏ Nông BC1 1300.9

BC1 1300.14

11 4 Kem 60,8 Ovan Vàng Nông

BC1 1300.16

16 5 50,8 Ovan Nâu đỏ Vàng TB Nông

3 6 190,8 Ovan dài Vàng Vàng nhạt Nông

108

5 BC1 1301.4 7 170,1 Tròn Vàng Vàng TB Sâu

8 BC1 1301.5 150,7 Ovan Tím 7 Vàng nhạt Trung bình

9 130,4 Ovan Tím đậm Vàng TB 7 BC1 1301.11 Trung bình

120,1 Ovan dài Kem nhạt Vàng nhạt Nông 6 10 BC1 1302.1

13 70,1 Ovan Kem nhạt Vàng nhạt 11 BC1 1302.2 Trung bình

11 60,8 Nâu đỏ Kem Ovan Nông 12 BC1 1302.3

140,8 Nâu đỏ Kem 6 13 BC1 1302.4 Ovan ngắn Trung bình

120,8 Ovan dài Nâu đỏ 8 Nông 14 BC1 1302.5 Vàng nhạt

150,1 Ovan Nâu đỏ 5 15 BC1 1302.6 Vàng nhạt Trung bình

100,7 Tròn Vàng Vàng TB Nông 9 16 BC1 1302.7

17 90,8 Ovan Vàng Vàng nhạt 9 BC1 1302.11 Trung bình

18 50,2 Ovan Vàng Vàng nhạt Nông 12 BC1 1302.10

180,1 Tròn Kem nhạt Kem Nông 4 19 BC1 1303.2

60,5 Ovan Vàng Vàng nhạt Nông 18 20 BC1 1303.3

7 150,3 Ovan Tím Nông 21 BC1 1303.4 Trắng kem

12 100,4 Ovan Vàng TB 22 BC1 1303.6 Đỏ một phần Trung bình

BC1 1303.22

23 180,1 Ovan Vàng Rất sâu 5 Vàng nhạt

5 24 BC1 1304.1 150,6 Ovan Vàng Vàng nhạt Trung bình

20 50,4 Ovan Vàng Vàng nhạt 25 BC1 1304.3 Trung bình

Chú thích: slc/cây: số lượng củ/cây; kltbc/cây: khối lượng trung bình củ/cây

109

5 140,1 Ovan Vàng Vàng TB 26 BC1 1305.6 Trung bình

Số liệu Bảng 3.23 cho thấy các đặc điểm về hình dạng, màu sắc của vỏ củ, thịt củ hay độ sâu mắt ngủ của các dòng con lai BC1 ngày càng hướng về giống trồng xác nhận. Hình dạng củ thu được từ ovan dài, ovan ngắn, ovan đến tròn; không còn xuất hiện dạng

hình thù bất định so với củ của dòng lai soma. Tuy nhiên về số lượng củ trên mỗi cây vẫn còn khá nhiều, có những dòng trên 10 củ (11 - 20 củ/cây), dòng BC1 1304.3 thậm chí có 20 củ/khóm. Số lượng củ trên một cây lớn, dẫn đến khối lượng củ nhỏ, số lượng

củ bé nhiều tương ứng với tỷ lệ củ không đạt tiêu chuẩn làm thương phẩm, hiệu quả kinh tế thu được thấp. Do đó, chỉ những dòng từ 4 - 8 củ/cây là thích hợp nhất cho chọn tạo.

Kết thúc vụ thanh lọc đánh giá các dòng lai BC1, kết quả đánh giá qua hai Bảng 3.22, 3.23 bước đầu đã chọn lọc được những dòng triển vọng nhất để tiếp tục đánh giá

sàng lọc trong vụ tiếp theo cả về đặc tính nông sinh học, năng suất và tính kháng bệnh virus PVY: tổ hợp 1300 thu được hai dòng 1300.3, 1300.6; tổ hợp 1301 thu được 3 dòng 1301.4, 1301.5, 1301.11; tổ hợp 1302 thu được 3 dòng: 1302.4, 1302.5, 1302.6; tổ hợp

1303 thu được 3 dòng: 1303.2, 1303.4, 1303.22; tổ hợp 1304 thu được duy nhất dòng

1304.1; tổ hợp 1305 thu được một dòng 1305.6. Đây sẽ là nguồn vật liệu được sử dụng đánh giá vụ sau.

3.4.1.4. Đánh giá các con lai BC1 sau thanh lọc

190 dòng nảy mầm từ 315 hạt lai đã được thanh lọc để chọn ra 26 dòng có khả

năng sinh trưởng phát triển, đặc điểm nông sinh học giống với khoai tây trồng và sạch

virus khi lây nhiễm nhân tạo. Từ 26 dòng này tiếp tục được đánh giá về đặc điểm hình

thái và thu được 13 dòng có thể phát triển thành dòng/giống tiếp. Củ của 13 dòng này

được tiếp tục trồng trên Sapa - Lào Cai (4/2017) trong điều kiện chậu vại (sử dụng giá

thể xơ dừa) để tiếp tục chọn lọc các dòng triển vọng nhất. Kết quả đánh giá sức sinh trưởng các dòng BC1 triển vọng được thể hiện ở Bảng 3.24.

Bảng 3.24. Tình hình sinh trưởng, phát triển các vật liệu khảo sát sau 60 ngày trồng

STT Dòng/giống Số lá TB/cây Chiều cao cây TB (cm) Số thân TB/khóm

1 BC11300.3 19,36 86,10 5,8

2 BC1 1300.6 17,53 82,11 5,0

3 BC1 1301.4 16,57 80,27 4,0

4 BC1 1301.5 19,56 94,32 4,5

110

5 BC1 1301.11 18,23 89,26 4,4

6 BC1 1302.4 18,26 90,12 5,0

7 BC1 1302.5 17,16 87,56 5,1

8 BC1 1302.6 14,34 87,93 5,0

9 BC1 1303.2 15,48 82,59 5,5

10 BC1 1303.4 20,37 89,68 5,7

11 BC1 1303.22 19,59 93,12 5,1

12 BC1 1304.1 17,23 84,10 4,9

13 BC1 1305.6 19,51 92,21 6,0

14 Rasant 20,37 97,63 5,2

15 Delikat 22,48 92,28 4,5

16 Atlantic 20,67 95,12 5,5

Số liệu Bảng 3.24 cho thấy sự phát triển khá đồng đều giữa các dòng khảo sát và

khá tương đồng so với hai giống khoai tây trồng làm đối chứng. Các dòng lai lại có số

lá trung bình dao động từ 14,34 - 20,37 lá/cây, ở giống trồng là 20,35 đến 22,48 lá/cây; chiều cao trung bình các dòng BC1 thu được từ 80,27 - 94,3cm trong khi ba giống trồng

đạt 91,1 cm - 97,6 cm; số thân trung bình ghi nhận được của các dòng lai lại là 4 - 6

thân/khóm, ở giống trồng là 4,5 - 5,5 thân/khóm. Số liệu cũng chỉ ra có sự khác nhau về

sức sinh trưởng của các dòng trong cùng tổ hợp lai lại nhưng về mặt số liệu sự sai khác

là không quá lớn, do đó để chọn ra dòng triển vọng hơn cần dựa vào các đánh giá tiếp

theo về yếu tố cấu thành năng suất (số củ trung bình/khóm; khối lượng củ trung bình/khóm; phân loại cấp củ).

17 Solara (ĐC) 21,13 91,10 5,0

Bảng 3.25. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát

Phân Loại Củ (%) STT Dòng/giống

Số củ TB/khóm (củ) Khối lượng TB/khóm (gam) Φ >5cm 3cm-Φ-5cm Φ <3cm

1 BC1 1300.3 8,2 642,0 42,4 34,5 14,1

2 6,7 440,0 10,3 55,5 34,2 BC1 1300.6

3 7,3 464,7 22,5 51,8 25,7 BC1 1301.4

4 BC1 1301.5 8,0 540,0 44,5 39,6 15,9

111

5 6,3 386,7 10,4 59,5 30,1 BC1 1301.11

6 4,7 286,7 25,9 32,6 41,5 BC1 1302.4

7 7,0 236,3 5,6 34,6 59,8 BC1 1302.5

8 7,3 316,7 8,3 38,2 53,5 BC1 1302.6

9 6,7 253,3 18,7 38,9 42,4 BC1 1303.2

10 BC1 1303.4 5,3 434,7 43,0 38,1 18,9

11 BC1 1303.22 7,3 420,0 36,6 44,8 18,6

12 6,3 386,7 18,5 49,8 31,7,7 BC1 1304.1

13 BC1 1305.6 8,7 552,6 35,8 39,3 24,9

14 Rasant 5,3 486,7 38,5 34,6 26,9

15 Delikat 8,7 634,0 28,8 46,6 24,6

16 Atlantic 8,0 443,3 27,5 44,2 28,3

Kết quả Bảng 3.25 cho thấy số lượng củ trung bình trên khóm của các dòng BC1 so với giống trồng không có sự sai khác quá lớn, dao động chung từ 4 - 9 củ/khóm, dòng nhiều củ nhất là BC1 1305.6 (8,7 củ), dòng thấp nhất là BC1 1302.4 (4,7 củ). Tuy nhiên, khối lượng củ trung bình trên khóm thì có sự khác đáng kể giữa các dòng lai BC1: 3/13

dòng lai lại (1300.3, 1301.5, 1305.6) có khối lượng trên 500g/khóm; 4/13 dòng (1300.6,

1301.4,1303.4, 1303.22) có khối lượng trên 400g/khóm; 6/14 dòng có khối lượng từ

250g - 390g/khóm. Cùng trong nhóm có khối lượng trung bình củ/khóm đạt trên

400gr/khóm nhưng khi xét về chỉ tiêu phân loại cấp củ hai dòng 1300.6, 1301.4 lại có

tỷ lệ củ nhỏ (Φ <3cm) cao hơn (34,2%, 25,7% theo thứ tự) so với 1303.4, 1303.22 (18,9%, 18,6%).

Xét về khối lượng trung bình củ trên khóm giữa dòng lai lại so với giống trồng: phần lớn các dòng lai BC1 là thấp hơn so với giống trồng; có dòng tương đương; cá biệt có dòng đạt cao hơn hẳn (dòng BC1 1300.3 đạt cao nhất với 642,0 g/khóm). Tuy nhiên,

xét về tỷ lệ củ to và củ trung bình thì các giống trồng chiếm ưu thế hơn so với các dòng lai lại.

17 Solara (ĐC) 9,0 616,7 20,4 54,6 25,0

Qua các thí nghiệm đánh giá về sự sinh trưởng, phát triển, các yếu tố cấu thành năng suất chất lượng giữa các dòng lai lại so với giống “bố” là giống trồng xác nhận bước đầu đã chọn lọc được một số dòng triển vọng nhất: BC1 1300.3, 301.5, 1303.4, 1303.22 và 13.1305.6. Đây là 5 dòng không chỉ có khả năng sinh trưởng, phát triển mạnh mà còn có tiềm năng cao về mặt năng suất. Các dòng này sẽ tiếp tục đánh giá ngoài đồng ruộng, kiểm tra gen kháng bằng chỉ thị phân tử.

112

3.4.2. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng và kiểm gia sự có mặt của gen kháng PVY bằng chỉ thị phân tử

Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Rysto là GP 122406 nhân được đoạn ADN có kích thước 406 bp. Mẫu ADN tổng số của các vật liệu sau tách chiết được chạy PCR với cặp mồi GP 122406 nhằm khếch đại ADN có kích thước 406bp liên kết với gen kháng virus. Một lượng nhỏ của sản phẩm chạy PCR

được lấy ra chạy điện di kiểm tra kết quả trước khi tiến hành ủ với enzyme EcoRV. Kết quả điện di sản phẩm PCR được thể hiện trên Hình 3.20 dưới đây:

Chú thích: 1- dòng 13.1300.3; 2- dòng 13.1301.5; 3- dòng 1303.4;

4- dòng 1303.22; 5- dòng 1305.6; 6- Atlantic; 7– Delikat; 8– Rasant

Sản phẩm PCR thu được ở trên được tinh sạch và tiếp tục ủ với enzyme giới hạn

EcoRV, sau đó điện di kiểm tra. Kết quả thể hiện trên bản điện di sau đây:

Hình 3.20. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY khi chạy cặp mồi GP 122406

Chú thích: 1- dòng 13.1300.3; 2- dòng 13.1301.5; 3- dòng 1303.4; 4- dòng 1303.22; 5- dòng 1305.6; 6- Atlantic; 7– Delikat; 8- Rasant

113

Hình 3.21. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY sau khi cắt bằng enzyme giới hạn EcoRV

Quan sát Hình 3.22 về sản phẩm phản ứng PCR chạy với cặp mồi GP 122406 cho thấy: các mẫu nghiên cứu đều xuất hiện băng vạch tương ứng với các kích thước 406bp.

Sản phẩm PCR đã đảm bảo khuếch đại được đoạn gen mong muốn trong lượng ADN tổng số tách chiết được từ các mẫu đã thu.

Sau khi tiến hành ủ sản phẩm PCR với enzyme cắt giới hạn EcoRV, enzyme này

sẽ nhận biết và cắt đúng vị trí nhận biết đặc hiệu của enzyme này mà chỉ có gen kháng mới có. Từ kết quả Hình 3.23 cho thấy tất cả các dòng BC1 nghiên cứu (dòng 13.1300.3; 2 - dòng 13.1301.5; 3 - dòng 1303.4; 4 - dòng 1303.22; 5 - dòng 1305.6) đều mang gen

kháng virus PVY. Trong khi đó, các giống khoai tây trồng Atlantic Delikat, Rasant mặc

dù lại xuất hiện băng vạch 406bp khi chạy PCR với cặp mồi GP 122406, nhưng khi dùng enzyme cắt đặc hiệu của gen kháng virus thì lại không xuất hiện băng vạch 200bp và

206bp, chứng tỏ các hai dòng khoai tây trồng sử dụng làm dòng “Bố” trong tổ hợp lai backcross không chứa gen kháng virus PVY.

Như vậy có thể nhận thấy gen kháng bệnh virus được truyền từ dòng dại sang con

lai soma thông qua dung hợp tế bào. Các con lai soma được lai lại với giống trồng tạo con lai BC1 và chúng duy trì gen kháng bệnh được truyền từ dòng khoai tây dại sang.

3.4.3. Khảo sát diện hẹp các dòng lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng

Các dòng lai triển vọng lại được tiếp tục đánh giá chọn lọc trên điều kiện đồng

ruộng để đánh giá độ ổn định về hình thái, khả năng sinh trưởng và năng suất. Nội dung

này được thực hiện trên cánh đồng Viện sinh học Nông nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam vào vụ đông 2017 - 2018.

114

Sô thân/khóm

Dòng/giống

Tỷ lệ mọc %

Sức sinh trưởng của cây

Độ đồng đều giữa các khóm

Dạng cây

Màu sắc lá

Màu sắc thân

1300.3

Trung bình

Xanh đậm

Xanh tím

Đứng

5,5

1301.5

Kém

Trung bình

Xanh đậm

Xanh tím

Đứng

4,0

1303.4

Trung bình

Nửa đứng

Xanh đậm

Xanh nhạt

5,5

1303.22

Trung bình

Nửa đứng

Xanh trung bình

Xanh đậm

4,5

1305.6

Trung bình

Nửa đứng

Xanh trung bình

Xanh đậm

6,0

Rasant

100

Trung bình

Nửa đứng

Xanh đậm

Xanh nhạt

5,0

Delikat

100%

Trung bình

Nửa đứng

Xanh đậm

4,5

Atlantic (ĐC)

100%

Trung bình

Đứng

Xanh trung bình

Xanh đậm

5,5

Solara (ĐC)

100%

Trung bình

Đứng

5,0

Xanh đậm

115

Bảng 3.26. Đặc tính nông sinh học các dòng/giống khoai tây khảo sát trên điều kiện đồng ruộng

Theo Bảng 3.26, sự khác nhau lớn nhất nhận thấy ở dòng lai lại so với giống trồng

và giống sử dụng làm “bố” trong phép lai backcross chính là tỷ lệ mọc của củ giống

được trồng trong điều kiện vụ đông năm 2017 - 2018. Trong khi các giống trồng có tỷ lệ mọc đạt 100% thì các dòng BC1 đạt tối đa là 97%, thấp nhất là dòng 1301.5 đạt 91%.

Về sức sinh trưởng và độ đồng đều giữa các khóm thì hầu hết các dòng lai lại đều

tương đương với các giống trồng, ở mức độ trung bình như nhau. Duy có dòng 1301.5 có sức sinh trưởng kém hơn. Đây cũng là dòng có tỷ lệ mọc thấp nhất.

Qua bảng số liệu ta thấy chỉ có 2 dòng 1303.3 và 1301.5 có dạng thân đứng giống

2 giống đối chứng, các dòng/giống còn lại đều là thân nửa đứng. Hầu hết các dòng/giống

đều mang màu sắc thân là xanh riêng 2 dòng 1300.3 và 1301.5 thì lại mang màu sắc thân

là xanh tím. Về màu sắc lá thì hầu hết các dòng/ giống đều mang sắc lá là xanh đậm, tuy nhiên 2 dòng 1300.22 và 1305.6 là mang màu sắc thân trung bình giống với giống đối chứng Atlantic.

Thời gian sinh trưởng của cây dài hay ngắn phụ thuộc vào giống, mùa vụ và theo

từng điều kiện. Thời gian sinh trưởng của khoai tây được tính từ khi trồng đến khi thu

hoạch. Thời gian sinh trưởng của một số giống khoai tây không cố định mà nó thay đổi

theo từng vùng sinh thái khí hậu, từng mùa vụ, kỹ thuật gieo trồng, chế độ thâm canh khác nhau.

Để bố trí cơ cấu luân canh mùa vụ thích hợp cho cây khoai tây, tiến hành theo dõi

thời gian sinh trưởng, thời gian từ trồng đến khi cây mọc mầm, thời gian từ trồng tới khi

hình thành tia củ của các dòng/giống tham gia thí nghiệm, những chỉ tiêu đó được thể hiện ở Bảng 3.27.

116

Bảng 3.27. Thời gian sinh trưởng qua các giai đoạn của các dòng/giống khoai tây

Thời gian từ trồng đến Thời gian từ hình thành tia củ đến Tổng thời gian sinh Dòng/giống Thời gian từ trồng đến hình thành tia củ mọc (ngày) thu hoạch (ngày) trưởng (ngày) (ngày)

18 28 66 112 BC1 1300.3

16 26 67 109 BC1 1301.5

12 24 67 103 BC1 1303.4

12 23 75 110 BC1 1303.22

13 25 62 100 BC1 1305.6

Rasant 10 23 87 120

Delikat 11 22 88 121

Atlantic (ĐC) 12 25 68 105

Qua kết quả theo dõi ở Bảng 3.27 thì thời gian từ trồng tới mọc của các dòng/giống

dao đồng từ trong khoảng 10 - 18 ngày. Trong đó Rasant bắt đầu mọc sớm nhất (sau

trồng 10 ngày). Hai dòng 1300.3 và 1301.5 mọc chậm nhất (16 - 18 ngày), còn lại thì mọc trong khoảng từ 11 - 15 ngày.

Tia củ thực chất là thân ngầm. Sự sinh trưởng của thân ngầm phụ thuộc chặt chẽ

vào các yếu tố ngoại cảnh. Thân ngầm có thể chuyển thành chồi khi gặp điều kiện nhiệt độ và ánh sáng không phù hợp.

Thời gian trồng đến khi hình thành tia củ của các dòng dao động trong khoảng 23

- 28 ngày. Trong đó các giống Delikat bắt đầu hình thành tia củ sớm nhất (22 ngày). Các dòng/giống còn lại có thời gian từ trồng đến hình thành tia củ từ 25 - 27 ngày.

Các dòng/giống tham gia thí nghiệm có thời gian sinh trưởng kéo dài từ khoảng 100 - 120 ngày. Các dòng con lai thời gian sinh trưởng kéo dài từ khoảng 100 - 110 ngày, hai giống Rasant và Delikat có thời gian sinh trưởng dài nhất (120 ngày).

Như vậy, trong khoảng thời gian sinh trưởng khoảng 4 tháng trồng khoai tây, đã thu được một khối lượng sản phẩm lớn, có ý nghĩa và giá trị cao. Do đó, đưa khoai tây vào cơ cấu luân canh tăng vụ ở nước ta là việc làm có ý nghĩa, làm tăng hệ số sử dụng đất cũng như thu nhập của bà con nông dân.

117

Solara (ĐC) 15 24 62 101

Bảng 3.28. Kết quả đánh giá tình hình sinh trưởng, phát triển của các con lai BC1 và các giống khoai tây trồng vụ đông xuân 2017 - 2018

Dòng/giống Số lá/cây Chiều cao cây (cm) Số thân TB/khóm

20,67 85,00 5,5 BC1 1300.3

20,00 94,75 4,0 BC1 1301.5

21,33 88,87 5,5 BC1 1303.4

19,67 95,33 4,5 BC1 1303.22

20,00 93,83 6,0 BC1 1305.6

Atlantic 21,67 95,33 5,5

Solara 22,67 91,75 5,0

Rasant 20,33 98,83 5,0

Delikat 22,33 92,08 4,5

CV% 7,10 8,00 6,5

Theo số liệu trong Bảng 3.28, có thể nhận thấy sự tương đồng của các dòng lai lại

so với các giống trồng: số lá thu được của các dòng lai lại giao động trong khoảng 19 -

22 lá/cây trong khi con số này ở các giống trồng là 20 - 23 lá/cây; chiều cao trung bình

của các dòng lai lại được ghi nhận là từ 85 cm đến 96 cm, số liệu ở các giống trồng là

từ 91 cm đến 99 cm; số thân trung bình trên khóm đếm được của các dòng lai lại là 4 -

6 thân/khóm, ở các giống trồng là 4,5 - 5,5 thân/khóm. Các số liệu này so với số liệu đánh giá vụ xuân năm 2017 ở Sapa cho thấy các dòng BC1 vẫn giữ được các đặc điểm vượt trội về sinh trưởng, phát triển của các giống trồng qua 2 lần đánh giá.

2,51 10,87 0,3 LSD0,05

Các yếu tố hình thành năng suất, phẩm chất củ thu được của các dòng/giống

khảo sát

Những dòng lai BC1 được trồng khảo sát cùng giống khoai tây trồng và các yếu tố cấu thành nên năng suất, củ giống sau thu hoạch được đánh giá về các tiêu chí hình thái, màu sắc, cũng như phẩm chất củ. So sánh đồng thời các tiêu chí này giữa dòng lai BC1 và giống trồng xác nhận để từ đó chọn lọc ra dòng triển vọng nhất giới thiệu cho chương trình chọn tạo.

118

Bảng 3.29. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát

Phân loại củ (%)

Khối lượng TB NSLT NSTT Dòng/giống củ/khóm (tấn/ha) (tấn/ha) Khối lượng TB củ/m2 Φ ≤ 3cm Φ ≥ 5cm (g) 3cm ≤ Φ≤ 5cm (g)

BC1 1300.3 750 3570 45,0 35,7 45,0 37,0 18,0

540 2900 32,4 29,0 35,5 45,5 20,0 BC1 1301.5

310 1730 18,6 17,3 22,5 51,8 25,7 BC1 1303.4

390 2530 23,4 25,3 35,5 42,6 21,9 BC1 1303.22

BC1 1305.6 560 3100 33,6 31,0 48,4 39,5 12,1

Atlantic 460 1530 27,6 29,0 25,9 32,6 41,5

Rasant 460 2900 27,6 15,3 35,3 41,2 23,5

Delikat 670 3130 40,2 35,6 32,7 44,9 22,4

Solara (ĐC) 670 3560 40,2 31,3 37,6 32,6 29,8

CV% 13,4 10,3 0.47

Kết quả Bảng 3.29 cho thấy, khối lượng trung bình củ/ khóm dòng BC1 1300.3 có khối lượng trung bình cao nhất (750 g), cao hơn cả 2 giống trồng là Atlantic và Rasant (460 g). Trong khi đó, so sánh với 2 giống trồng Solara và Delikat mặc dù dòng BC1 1300.3 có khối lượng trung bình củ/khóm cao hơn 2 giống khoai tây trồng này nhưng

sự khác biệt này lại không có ý nghĩa thống kê. Số củ trung bình nhiều, khối lượng trung bình một khóm cao nên đây cũng là dòng có khối lượng củ thu hoạch trên một m2 diện tích trồng cao nhất, đạt 3570 g. Dòng 1305.6 có khối lượng trung bình khóm cao thứ 2 trong 5 dòng lai lại khảo sát, và cũng có khối lượng củ trung bình trên một m2 diện tích cao thứ 2, đạt 3100 g. Khối lượng này tương đương với giống Delikat dùng làm ”bố”, đạt 3130 g.

Khi xét về chỉ tiêu phân loại cấp củ để chọn lọc các củ đủ tiêu chuẩn thương phẩm thì nhận thấy hầu hết các dòng BC1 đều có trên 50% số củ đạt tiêu chuẩn. Trong đó, dòng BC1 1303.4 có số lượng củ đạt tiêu chuẩn cao nhất, trên 70% số củ thu hoạch được và 25,7% số củ có đường kính lớn hơn 5cm. Số liệu này còn cao hơn so với giống Rasant

119

120 470 10.3 LSD0,05

và Delikat, là hai giống khoai tây trồng được dùng là ”bố” trong các phép lai lại. Tuy có tỷ lệ số củ đạt tiêu chuẩn thương phẩm cao nhất nhưng dòng BC1 1303.4 lại là dòng cho năng suất thấp nhất. Tương tự như vậy, giống khoai tây chế biến Atlantic tuy có khối lượng trung bình củ, khối lượng củ trên một m2 thấp nhất nhưng vẫn là giống có tỷ lệ củ thương phẩm cao nhất, đạt 74% và 41,5% số củ có đường kính củ trên 5cm.

Đặc điểm thực vật học củ khoai tây các dòng/giống khảo sát

Đặc trưng hình thái củ là một chỉ tiêu quan trọng, dùng phân biệt giữa các dòng và

đồng thời có ý nghĩa đối với sản xuất hàng hóa phục vụ sản xuất và xuất khẩu phù hợp với thị yếu của người tiêu dùng:

Bảng 3.30. Đặc điểm hình thái củ khoai tây các dòng/giống khảo sát

Mắt ngủ

Dòng/giống Dạng củ

Màu vỏ củ

Màu thịt củ

Độ sâu

Màu sắc

BC1 1300.3 Ovan Vàng nhạt Nông Tím nhạt Tím

Ovan Trắng kem Nông Tím đậm Tím BC1 1301.5

Ovan Vàng nhạt Nông Vàng Vàng BC1 1303.4

Ovan Trắng kem Sâu Vàng Vàng BC1 1303.22

BC1 1305.6 Ovan Trắng kem Nông Vàng Vàng

Atlantic Ovan Trắng Nông Vàng Vàng

Rasant Ovan Nâu đỏ Vàng đậm Nông Hồng

Delikat Ovan Vàng nhạt Nông Vàng Vàng

Bảng 3.30 cho thấy các dòng lai lại vẫn giữ được đúng hình dạng củ của giống

khoai tây trồng, chúng chỉ đa dạng hơn về màu sắc, từ màu mắt ngủ, màu vỏ củ đến màu

thịt củ. Trong khi mầu hết có màu mắt ngủ và vỏ củ mang sắc vàng thì dòng 1300.3, 1301.5 lại có màu tím, tím đậm và tím nhạt. Giống Rasant khác biệt nhất với các giống trồng khi có mắt ngủ màu hồng. Về màu sắc thịt củ, các giống trồng phục vụ ăn tươi (Solara, Rasant, Delikat) có màu thịt củ vàng đậm thì giống Atlantic lại có thịt củ màu trắng phù hợp cho tiêu chuẩn của giống dùng cho chế biến.

120

Solara Ovan Vàng đậm Nông Vàng Vàng

Hình 3.22. Màu sắc vỏ củ, thịt củ các dòng/giống khảo sát

Bảng 3.31 Đánh giá cảm quan về chất lượng củ qua ăn nếm của các dòng/giống khoai tây

Chỉ tiêu

Chất lượng thử nếm sau luộc Độ bở sau luộc Dòng giống

Ngon Dở Bở Ít bở Rất ngon Trung bình Không ngon Không bở

1300.3 + +

1301.5 + +

1303.4 + +

1303.22 + +

1305.6 + +

Delikat + +

Rasant + +

Atlantic (ĐC) + +

121

Solara (ĐC) + +

Qua Bảng 3.31 ta thấy, hầu hết chất lượng củ qua ăn nếm đều ngon và sau luộc thì

bở. Nhất là giống Delikat thì đạt chất lượng củ qua ăn nếm là tốt nhất, củ qua luộc là rất

ngon và bở. Tuy nhiên, có 2 dòng chất lượng củ nếm chưa cao đó là 1301.5 và 1303.4. Hai dòng này đều cho chất lượng củ không ngon và không bở.

Bảng 3.32 Đánh giá hàm lượng chất khô của dòng/ giống khoai tây

Dòng/ giống Hàm lượng chất khô (%)

1300.3 20,94

1301.5 17,98

1303.4 15,92

1303.22 17,95

1305.6 18,97

Rasant 17,98

Delikat 20,94

Atlantic 29,62

Chất khô là sản phẩm của quá trình quang hợp. Qua số liệu theo dõi hàm lượng

chất khô của các dòng/giống nghiên cứu cho thấy các dòng/giống tham gia thí nghiệm

dao động trong khoảng 15,92 - 29,62%. Các dòng thí nghiệm có hàm lượng chất khô

trong khoảng 15,92% - 20,94% với dòng 1303.4 có hàm lượng chất khô thấp nhất

(15.92%), dòng 1300.3 có hàm lượng chất khô cao nhất trong tất cả các dòng khảo sát

(20.94%). Hai giống bố mẹ có hàm lượng chất khô tương đối cao Rasant (17.98%), Delikat (20.94%).

Kết luận:

- Đã khẳng định được gen kháng của khoai tây dại có thể duy trì sang thế hệ BC1

khi lai lại giữa con lai soma và khoai tây trồng.

- Các đặc tính nông sinh học của các con lai soma (6x) giữa khoai tây dại và khoai tây trồng được cải thiện, có các đặc tính giống với khoai tây trồng hơn sau phép lai lại với khoai tây trồng.

- Từ các kết quả thanh lọc, đánh giá ngoài đồng ruộng qua 2 vụ trồng cho thấy con lai BC1 1300.3 và BC1 1305.6 là những con lai triển vọng mang những tính trạng quý và kháng virus. Đây là nguồn vật liệu quý để phát triển thành giống hoặc làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống.

122

Solara (ĐC) 23,02

BÀN LUẬN KẾT QUẢ

Nhiệm vụ của đề tài là tạo ra các dòng/giống khoai tây kháng virus PVY và có các

đặc tính nông sinh học tốt thông qua dung hợp tế bào i) giữa các dòng nhị bội kháng virus PVY, ii) giữa khoai tây dại và khoai tây trồng.

Lai hữu tính khác loài giữa các dòng khoai tây nhị bội dại (nguồn từ Mexico) với

các loài khoai tây trồng gặp một số rào cản về sự cân bằng nội nhũ (EBN- endosperme balance number) và khác nhau về độ bội. Các dòng khoai tây dại thường có độ bội ở thể

nhị bội (2n = 2x = 24) và 1 EBN, trong khi đó các giống khoai tây trồng lại ở thể tứ bội

(2n = 4x = 48) và 2 EBN, do vậy rất khó để lai giữa hai loài này với nhau [115]. Trước

những khó khăn đó, dung hợp tế bào trần là con đường duy nhất để chuyển các gen

kháng của các dòng khoai tây dại sang khoai tây trồng Millam S et al. (1995) [116]; Thieme et al.1997, 2004 [69, 70]; Gavrilenko et al. 2003 [55] mà không vấp phải bất kỳ

các định luật của cây trồng biến đổi gen. Mặt khác, con đường dung hợp tế bào trần giữa

các dòng khoai tây nhị bội kháng virus (có các đặc tính mong muốn) cũng được Wenzel

đề xuất vào năm 1979 [117]. Hướng dung hợp này đã được sử dụng trong nghiên cứu

này để tạo các các dòng lai soma có khả năng kháng virus và đặc tính nông sinh học mong muốn.

Các quy trình tách, dung hợp, tái sinh đã được nhiều tác giả nghiên cứu thành công.

Tuy nhiên, mỗi dòng/giống lại yêu cầu các thông số khác nhau và đã được chỉ ra rằng,

các điều kiện khác nhau ảnh hưởng tới năng suất và khả năng tái sinh của tế bào trần,

do đó cần phải xác định phương pháp và điều kiện cụ thể cho từng loài. Yếu tố quan

trọng cho tách tế bào trần ra khỏi mô lá là trạng thái sinh lý của mô lá, enzyme, thành

phần và nồng độ của các chất ổn định áp suất dung dịch (Yoshio Kikuta, 1986) [118].

Trong luận án này, các thí nghiệm về tách, dung hợp và tái sinh được nghiên cứu để có

thể tối ưu hóa và phù hợp cho từng đối tượng nghiên cứu. Các thí nghiệm về tách, dung hợp và tái sinh được nghiên cứu để có thể tối ưu hóa và phù hợp với từng đối tượng

nghiên cứu. Các kết quả thu được cho thấy mỗi loại dòng vật liệu thích hợp với một loại

enzyme, thời gian ủ mô lá với enzyme là từ 14 - 15h, có dòng lên tới 16h (pnt2G), độ tuổi ở mô lá thích hợp là cây ở độ tuổi 3 - 4 tuần tuổi. Kết quả này cũng có sự tương đồng trong các nghiên cứu của Thieme et al., (2004, 2008) [6, 64] và Nouri-Ellouz et al., (2006) [8] khi nghiên cứu trên các đối tượng là các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại và khoai tây trồng. Khi nghiên cứu ảnh hưởng các thông số dung hợp tế bào trần tới

hiệu suất dung hợp, kết quả cũng cho thấy dung hợp ở tần số 800 kHz với 2 lần xung, nồng độ của chất dẫn điện Ca2+ thích hợp nhất là 10-3 M và mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 3x 105 tế bào/ml với tổ hợp nhị bội, 4x 105 tế bào/ml với tổ hợp khoai

123

tây dại và khoai tây trồng. Các môi trường thích hợp để nuôi cấy tế bào trần sau dung

hợp là môi trường VKM II lỏng, các microcallus tạo thành sẽ được chuyển sang môi

trường cul-medium để tạo các macrocallus (callus), và môi trường tái sinh tạo chồi từ callus của các tổ hợp lai là môi trường RJM.

Trên nguồn vật liệu nhị bội kháng virus (5 dòng), trong khuôn khổ đề tài, đã được

tách tế bào trần và dung hợp tạo 3 tổ hợp lai. Từ 3 tổ hợp này đã tái sinh được 1576

callus và 103 chồi. Các chồi này được tách dòng và đem đi phân tích độ bội bằng máy flow cytometry đã thu được 60 con lai (chiếm 58,3%).

Với nguồn vật liệu là 3 giống khoai tây dại (Solanum pinnatisectum, Solanum

tarnii, Solanum bulbocastanum và 3 giống khoai tây trồng (Atlantic, Delikat, Rasant)

thu được 6 tổ hợp lai có khả năng tái sinh thành 171 chồi. Từ đây, qua phân tích độ bội và chỉ thị phân tử, đã thu được 13 con lai soma. Các con lai này được đem đi đánh giá

khả năng kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo và đều cho kết quả là có khả năng kháng

virus PVY. Bên cạnh đó, các đánh giá về hình thái và năng suất củ của con lai soma

cũng được tiến hành. Kết quả cho thấy, có nhiều biến dị và sai khác ở củ, thân, hoa của

con lai soma so với khoai tây trồng. Từ đây, chọn ra 3 con lai có khả năng ra hoa cao là 2195/2; 2235/1; 2283/5 để lai lại với các giống khoai tây trồng, thu được 55 con lai BC1. Tiếp tục đánh giá khả năng kháng bệnh của các con lai BC1 bằng lây nhiễm nhân tạo,

thu được 26 con lai có khả năng kháng virus PVY. Với 2 vụ trồng ngoài đồng ruộng, đánh giá khả năng kháng virus cũng như theo dõi chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển, năng

suất và phẩm chất chế biến củ, thu được 2 con lai triển vọng để xuất làm vật liệu cho công tác giống là BC1 1300.3 và BC1 1305.6.

Việc mẫu thí nghiệm là các con lai BC1 được xác định mang gen kháng nhưng vẫn bị nhiễm bệnh dưới áp lực lây nhiễm bệnh nhân tạo cũng đã được ghi nhận trên một số

đối tượng cây khác trong các công bố trước đây. Năm 2013, Phan Hữu Tôn và cs tiến hành nghiên cứu trên 200 mẫu giống cà chua: sử dụng chỉ thị phân tử ADN xác định

gen kháng (Ty1, Ty2, Ty3) và lây nhiễm bệnh nhân tạo để đánh giá tính kháng bệnh vi

rút xoăn vàng lá. Kết quả cho thấy có 7 mẫu chứa gen kháng Ty1, 7 mẫu chứa gen kháng Ty3, trong đó có 2 mẫu chứa đồng thời Ty1 và Ty3. Kết quả lây nhiễm nhân tạo cho thấy 2 mẫu chứa đồng thời gen Ty1 và Ty3 thì kháng hoàn toàn với cả 3 nguồn bệnh lây nhiễm; mẫu 189 chứa gen Ty1 kháng hoàn toàn với nguồn bệnh Hải Phòng, Hưng Yên nhưng chỉ kháng vừa với nguồn bệnh Bắc Giang; mẫu đối chứng cùng mang gen kháng

Ty1 nhưng chỉ kháng tốt với nguồn bệnh Hải Phòng, Hưng Yên và cũng kháng vừa với nguồn bệnh Bắc Giang.

124

Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

1. Đã xây dựng thành công quy trình tách, dung hợp và nuôi cấy tế bào trần của

các dòng khoai tây nhị bội (A16, A15, A56, B186, B208); các dòng khoai tây dại

(S.tarnii, S.pinatisectum, S.bulbocastanum); các giống khoai tây trồng tứ bội

S.tuberosum (Rasant, Delikat, Atlantic). Tùy theo giống, có thể thay đổi thành phần dung dịch hỗn hợp enzyme macerozyme/cellulase theo tỉ lệ 0,2 – 0,8%; 0,2 - 0,6% là

thích hợp để tách tế bào trần; thời gian ủ enzyme 15 ± 1 giờ là tốt nhất với tất cả các

dòng nghiên cứu; tuổi cây in vitro từ 3 - 4 tuần tuổi. Dung hợp bằng phương pháp xung

điện ở tần số 800 kHz, 2 lần xung và mật độ tế bào thích hợp để tiến hành dung hợp là từ 3 x 105 tế bào/ml đến 4x 105 tế bào/ml; môi trường thích hợp để nuôi cấy, tái sinh tế bào trần sau dung hợp là môi trường VKM II lỏng, môi trường tái sinh là RJM.

2. Đã dung hợp 3 tổ hợp của các dòng khoai tây trồng nhị bội (diploid) và tái sinh

cây thành công. Bằng phương pháp xác định độ bội nhờ thiết bị Flow cytometry và

xác định con lai dị nhân (heterozygote) qua phân tích chỉ thị SSR có sử dụng thiết bị

Beckman Genome lab coulters đã xác định được 36 con lai soma tứ bội (tetraploid) dị

nhân. Các con lai đã được đánh giá ở điều kiện chậu vại kết quả chọn được 4 con lai

vừa có khả năng kháng virus PVY, vừa có phẩm chất chế biến chip tốt là 47/7; 47/26;

81-2; 131/11. Kết quả đã khẳng định các bước của quá trình dung hợp và chọn lọc con lai soma.

3. Đã tiến hành dung hợp, tái sinh và chọn lọc con lai soma của các tổ hợp giữa

khoai tây dại nhị bội (diploid) S. tarnii, S. Pinnatisectum, S. bulbocastanum mang gen siêu kháng PVY Rysto với khoai tây trồng tứ bội có đặc tính nông sinh học quý nhưng mẫn cảm với PVY (Atlantic, Delikat, Rasant), chọn tạo dược 13 con lai soma lục bội

(hexaploid). Kết quả lai lại của con lai soma 6x với khoai tây trồng thu được 26 dòng lai sạch bệnh virus. Qua 2 vụ trồng, đã chọn được 02 dòng BC1 có khả năng kháng

virus PVY, mang các đặc tính nông sinh học quý là BC1 1300.3 và BC1 1305.6. Đây sẽ là vật liệu khởi đầu có giá trị cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam.

4. Bằng việc đánh giá khả năng chuyển đặc tính kháng virus qua lai soma và lai lại hữu tính (Backcross) cho thấy, gen siêu kháng PVY Rysto có mặt trong các dòng khoai tây dại đều được chuyển vào con lai soma qua dung hợp tế bào trần, cũng như hiện diện trong con lai BC1 khi được chọn lọc.

4.2. Đề nghị

125

1. Nên đẩy mạnh hướng nghiên cứu dung hợp tế bào trần như một hướng có hiệu

quả trong chọn tạo giống khoai tây, nhằm chuyển các đặc tính quý (kháng bệnh và

kháng stress phi sinh học) từ khoai tây dại vào khoai tây trồng, điều mà các biện pháp

chọn tạo giống truyền thống (lai hữu tính) không thể thực hiện được. Sử dụng các kỹ thuât tách, dung hợp, tái sinh, chọn lọc con lai soma khoai tây mà đề tài đã nghiên cứu thành công.

2. Sử dụng các vật liệu khởi đầu BC1 1300.3 và BC1 1305.6 vào các chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng PVY. Tiếp tục tiến hành lai lại thêm nhiều lần với

khoai tây trồng và chọn lọc theo hướng tăng cường các đặc tính nông sinh học quý (năng suất cao, phẩm chất tốt) và duy trì tính kháng PVY .

126

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

CỦA LUẬN ÁN

1. Đinh Thị Thu Lê, Đỗ Thị Thu Hà, Bùi Thị Phương, Nguyễn Quang Thạch. Đánh giá khả năng tăng cường tính kháng bệnh virus PVY và phẩm chất chế biến chip

của khoai tây sau dung hợp tế bào trần. Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn (14/2015). tr. 40-46.

2. Đinh Thị Thu Lê, Đỗ Thị Thu Hà, Vũ Thị Hằng, Nguyễn Quang Thạch. Đánh giá khả năng kháng bệnh virus PVY và các đặc tính nông sinh học của các dòng ưu tú

được tạo ra từ lai lại giữa con lai soma và khoai tây trồng. Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn (18/2018). tr. 10-17.

127

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Quang Thạch (1993), Một số biện pháp khắc phục sự thoái hóa giống khoai tây (Solanum tuberosum L.) ở vùng Đồng bằng Bắc Bộ. Luận án PTS khoa học nông nghiệp.

Saunders K, Candresse T, Ahlquist P, Hemenway C, Foster GD (2011), Top 10 plant viruses in molecular plant pathology. Mol Plant Patho 12:938-954.

[2] Scholthof K. B, Adkins S, Czosnek H, Palukaitis P, Jacquot E, Hohn T, Hohn B,

Potato virus Y on performance of Russet Burbank, Russet Norkotah, and Shepody potato. Plant Rep 16:995-1004.

[3] Nolte P, Whitworth J, Thornton M. K, McIntosh C.S (2004), Effect of seedborne

opportunities for new technologies. In: Belknap, W.R.; Vayda, M.E.; Park, W. D.

(ed) The Molecular and Cellular Biology of the Potato. CAB International, Wallingford, Oxon, U.K., pp 1-20.

[4] Plaisted R.L, Bonierbale M.W, Yencho G.C, Pineda O, Tingey W.M, Van denBerg J, Ewing E.E, Brodie B.B (1994), Potato improvement by traditional breeding and

Rawat S, Chakrabarti S.K (2017), Progress in somatic hybridization research in

potato during the past 40 years. Plant Cell Tiss Organ Cult. DOI 10.1007/s11240- 017-1327-z

[5] Tiwari J.K, Devi S, Ali N, Satish K.L, Kumar V, Bhardwaj V, Singh Rajesh K,

M, Heimbach U, Thieme T (2008), Novel somatic hybrids (Solanum tuberosum L,

+ Solanum tarnii) and their fertile BC1 progenies express extreme resistance to potato virus Y and late blight. Theor Appl Genet, 116:691–700.

[6] Thieme R, Rakosy-Tican E , Gavrilenko T, Antonova O, Schubert J, Nachtigall

resistance in Solanum tuberosum L, Theor, Appl, Genet, 85: 863-867.

[7] Thach N.Q, Frei U, Wenzel G (1993), Somatic fusion for combining virus

Lakhoua L (2006), Production of potato intraspecific somatic hybrids with improved tolerance to PVY and Pythium aphanidermatum. J. Plant Physiol 163:1321–1332.

[8] Nouri-Ellouz O, Gargouri-Bouzid R, Sihachakr D, Triki MA, Ducreux G, Drira N,

[9] Đỗ Kim Chung (2003), Thị trường khoai tây việt nam. NXB Văn hóa thông tin.

Genetics, edited by J. E. Bradshaw and G.R. Mackay. CAB International 1994.

128

[10] Hawkes J.G (1994), Origin of cultivated potatoes and species relationship. Potato

Potatoes. Potato Genetics, CAB international.

[11] Bradshaw J.E, Mackay G.R (1994), Breeding Strategies for Clonally Propagated

Development Volume I Theory and Technique FEHR. WALTER R , Iowa State University

[12] Hoopes, Robert W, Robert Plaisted (1987), Potato Principle of Cultivar

Brest-224.

[13] Bode, Weideman (1969, 1970), Proc. 4th trienn. Conf. Eur. Ass. Potato Res.,

somatic hybrids between from-tolerant Solanum commersonii and S. tuberosum: characterzation off hybrid plants. Theoretical ang Applied Genetics 87:193-200.

[14] Cardi T, Ambrossio F.D, Consoli D, Puite K.J, Ramulu K.S (1993), Prodution off

[15] Vũ Triệu Mân (1986), Virus hại khoai tây. NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội.

[16] Vũ Triệu Mân (1978), Bệnh virus hại khoai tây. NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội.

Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tr115.

[17] Hà Viết Cường (2010), Virus thực vật, phytoplasma và viroid. Bài giảng, Khoa

Heredity 25: 309–348.

[18] Cockerham G (1970), Genetic studies in resistance to potato virus X and Y.

Food Products Press, The Haworth Press Inc., N.Y.

[19] Jawaid A, Khan A.J, Dijkstra J. (2002), Plant Viruses as Molecular Pathogens.

[20] McDonald J.G Singh R.P (1996), Host range, symptomology and serology of isolates of Potato virus Y (PVY) that share properties with both the PVYN and PVYO strain groups. Amer. Pot. J., 73: 309- 314.

roll virus (PLRV): Literature review for potatoes South Africa. Department of

Zoology and Entomology, Faculty of Natural and Agricultural Sciences,

University of Pretoria.

[21] Warren M, Krüger K, Schoeman A.S (2005), Potato virus Y (PVY) and potato leaf

[22] Salaman R.N (1930), Virus diseases of potato: Streak. Nature, 126: 241.

[23] Blanco-Urgoiti B, Tribodet M, Leclere S, Ponz F, Perez dé San Roman C, Legorburu, F.J, Kerlan C, (1998), Characterization of potato potyvirus y isolates from seed potato batches. Situation of the NTN, Wilga and Z isolates. Eur. J. Pl. Path., 104: 811-819

Solanum virus 2 (Potato virus Y). Ann. Appl. Biol. 27: 65–70.

129

[24] Smith K.M and Dennis R.W.G (1940), Some notes on a suspected variant of

and sequence comparisons of Potato virus Y isolates associated with potato tuber

necrotic ringspot disease. Pl. Path., 51: 117-126.

[25] Boonham N, Walsh K, Hims M, Preston S, North J, Barker I, (2002), Biological

the western USA and their comparison to isolates from Europe and Canada. Arch. Virol., 151: 1055-1074

[26] Lorenzen J.H, Meacham T, Berger P.H, Shiel P.J, Crosslin J.M, Hamm P.B, Kopp H. (2006), Whole genome characterization of Potato virus Y isolates collected in

hại cây trồng Việt Nam. Nhà xuất bản Học Viện Nông nghiệp Việt Nam. 51-52.

[27] Vũ Triệu Mân, Nguyễn Văn Tuất, Bùi Cách Tuyến, Phạm Văn Kim (2018), Bệnh

[28] Shi Y.Z, Chen Q, Li H.Y, Beasley D, Lynch D.R (2006), Somatic hybridization between Solanum tuberosum and S. cardiophyllum. Can J Plant Sci 86: 539-545.

Characterization of a potyvirus from eggplant (Solanium melongena) as a strain of Potato virus Y by N-terminal serology and sequence ralationships. Plant Pathol 48: 648-654.

[29] Bhat A.I, Varma A, Pappu H.R, Rajamannar M, Jain R.K, Praveen S (1999),

isolated from tomato crops in northeast Spain. Eur J Plant Pathol 115: 247-258.

[30] Aramburu J, Galipienso L, Matas M (2006), Characterization of potato virus Y

molecular characteriazation of a recombinant isotate of Potato virus Y associated with a tomato necrotic disease occurring in Italy. J Pl Pathol 92: 131-138.

[31] Mascia T, Finetti-Sialer MM, Cillo F, Gallitelli D, (2010), Biological and

edition), Capital Press.

[32] McIntosh C, O’Connell J (2014), Extract from Potato Grower (February 2014

production. Centre for Agricutural Publishing and Documentation (Pudoc), Wangeningen, pp 1-259.

[33] De Bokx J.A, Van de Want J.P.H (1987), Virus of patatoes and seed potato

on yield of three potato cultivars grown under different nitrogen levels. Plant Dis 90 (1): 73-76.

[34] Whitworth J.L, Nolte P, McIntosh C, Davidson R (2006), Effect of Potato virus Y

[35] Valkonen J.P.T (2007), Viruses: economical losses and biotechnologycal potential. In: Vreugdenhil D (ed) Potato biology and biotechnology, advances and perspectives. Elsevier, Oxford, pp 619-633.

130

[36] Thomas-Sharma S, Abdurahman A, Ali S et al (2015), Seed degeneration in potato: the need for an integrated seed health strategy to mitigate the problem in developing countries. Plant Pathol 65:3–16.

secondarily infected potato plants—an environment dependent underestimated

mechanism in plant virology. Front Plant Sci 8:74

[37] Bertschinger L, Bühler L, Dupuis B et al (2017), Incomplete infection of

bệnh. Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

[38] Nguyễn Quang Thạch (2018), Tài liệu giảng dạy sản xuất khoai tây giống sạch

from the publication titled Guide to Commercial Potato Production on the Canadian Prairies published by the Western Potato Council.

[39] Kirkham D (2003), Seed Potato Act and Regulations. This information is adapterd

chất lượng tốt, kháng bệnh mốc sương có thể sản xuất quanh năm tại Đà Lạt và

vùng phụ cận. Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau & Hoa – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam.

[40] Nguyễn Thế Nhuận (2020), Nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây có năng suất cao,

mô hình công nghiệp sinh học sản xuất giống khoai tây, rau và hoa sạch bệnh. Mã số: KC.04.02/06-10.

[41] Nguyễn Quang Thạch và cs (2010), Nghiên cứu làm chủ công nghệ và xây dựng

Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York, 52.

[42] Kuckuck H., G.Kobabe, G. Wenzel (1985), Grundzüge der Pflanzenzüchtung.

University of London.

[43] Nell William Fish (1988), Somatic hybridation of potato (Solanum tuberosum L.).

Pharmaceutical Sciences.

[44] Saurabh Bhatia (2015), Modern Applications of Plant Biotechnology in

C.W, Yesheng Z, Ru Z, Wan J.C, Chen T.Y, Wen W, Li J.L, Stanton B.G, Ming

C.S (2018), Application of protoplast technology to CRISPR/Cas9 mutagenesis:

from single‐cell mutation detection to mutant plant regeneration. Lant Biotechnol J; 16(7): 1295–1310.

[45] Choun-Sea Lin, Chen T.H, Ling H.Y, Lan Y.L, Jin Y.F, Qiao W.C, Fu H.W, Han

regeneration of Petunia leaf protoplasts

[46] Cocking C, Evelyn M, Frearson J.B, Power E (1972), The isolation, culture and

[47] Kao K.N., Constabel, F., Michauluk M.R., and Gamborg (1974), Plants protoplast fusion and growth of intergeneric hybrid cells. Plata (Berl.). 120. pp. 215-227.

(1985), Isolation, culture and regeneration of protoplasts from potato and several related Solanum species. Plan Science 39, 67-74.

131

[48] Haberlach G.T, Cohen, B.A, Reichert N.A, Baer M.A, Towill L.E, Helgeson J.P

as a tool for potato breeding. Bot Acta. 105. pp. 133-139.

[49] Möllers C, Wenzel G (1992), Somatic hybridization of diploid potato protoplasts

phenomena. Biochim Biophys Acta 694:227–340.

[50] Zimmermann U (1982), Electric field mediated fusion and related electrical

[51] Jagesh K.T, Sapna D, Nilofer A, Satisg K.L, Vinod K, Vinay B, Rajesh K.S, Shashi R, Swarupk C (2018), Progress in somatic hybridization research in potato during the past 40 years. Plant Cell Tiss Organ Cult. 132: 225 – 238.

[52] Solomon-Blackburn, R.M., Barker, H. (2001), A review of host major gene resistance to potato viruses X, Y, A and V in potato genes, genetics and mapped locations. Heredity 86: 8–16.

[53] Song Y, Schwarzfischer A (2008), Development of SSR markers for selection of extreme resistance (RYsto) to PVY and materal pedigree analysis of extremely resistant cultivars. Am J Potato Res. 85. pp. 159-170.

testing of new geneitc sources for virus resistance in potato. Global res Devel1: 271-278.

[54] Thieme R, T.Thomas, U. Heimbach and T.Gavrilenko (2000), Incorporation and

Fertile somatic hybrids of Solanum etuberosum (+) dihaploid Solanum tuberosum

and their backcrossing progenies: relationships of genome dosage with tuber development and resistance to potato virus Y. Euphytica 131: 323-332.

[55] Gavrilenko T, Ramona Thieme, Udo Heimbach and Thomas Thieme (2003),

leafroll virus from Solanum brevidens to Solanum tuberosum by somatic fusion. Plant Sci., 39, 75±82.

[56] Austin, S, Baer, M. A, Helgeson, J. P (1985), Transfer of resistance to potato

Solanum tuberosum protoplasts and the production of somatic hybrids between dihaploid S. tuberosum and S. brevidens. In Vitro Cell Devel. Biol. 23: 575-580.

[57] Fish N, Karp A, and Jones M.G.K (1987), Improved isolation of dihaploid

tetraploid potatoes. Plant breeding 101, 181-189.

[58] Deimling S, Zitzlsperger J and Wenzel G (1988), Somatic fusion for breeding of

[59] Masson J.M, Lecerf M, Rouselle P, Prennee P and Rellettier G (1988), Plant regeneration from protoplasts of diploid potato derived from crosses of Solanum tuberosum with wild Solanum species. Plant Sci. 53. pp. 167-176.

plants produced by electrofusion between dihaploid potatoes: BF15 (H1), Aminca (H6) andCardinal (H3). Plant Cell Rep. 9: 411–414.

132

[60] Chapu.t MH, Sihachakr D, Ducreux G, Marie D, Barghi N (1990), Somatic hybrid

Isolation, characterisation and mapping of simple sequence repeat loci in potato. Mol. Gen. Genet., 259, 233±245.

[61] Milbourne D, Meyer R.C, Collins A.J, Ramsay L.D, Gebhardt C, Waugh R (1998),

Wenzel, Andrea Schwarzfischer (2005), Mapping of extreme resistance to PVY

(Rysto) on chromosome XII using anther-culture-derived primary dihaploid potato lines, Theor Appl Genet 111: 8A3-887.

[62] Ye-Su Song, Leonard Heptimg, Gunther Schweizer, Lorenz Hartl, Gerhaard

hybrids between Solonum tuberosum nad S. chacoense and its F1 sexual progeny. P. 643-644. In: A Jujiwara ed. Proc. 5th Inter. Cong. Plant Tisue and Cell Culture, Japan. Asoc. Plant Tusue Culture, Tokyo.

[63] Butenko, R.G., Kuchko, A.A., Komarnitsky, I. (1982), Some features of somatic

Somatic hybrization of an atrazine-resistant biotype of Solanum nigrum with S.tuberosum. Theor Appl Genet 63: 273-277.

[64] Blinding, H., Jain, S.M., Finger, J., Mordhorst, G., Nehls, R., Gressel, J. (1982),

Austin (1993), Sexual progeny of somatic hybrids between potato and Solanum brevideus: Potential for use in breeding pro-grains. Am Potato J70: 437-452.

[65] Helgeson, J.P., G.T. Haberlach, M.I., Ehlenfeldt, G. Hunt, J.D. Pohlman, and S.

Interspecific hybridization between the cultivated potato Solanum tuberosum subspecies tuberosum L. and the wild species S. circaeofolium subsp. cirsaeifolium

Bitter exhibiting resistance to Phytophthora infestans (Mont.) de Bary and Golbodera pallida (Stone). Behrens TAG 83, 459-466.

[66] Mattheij W.M., Eijlander R., de Koning J.R.A. and Louwes K.M (1992),

Ducreux G (1994), Production and characterization of intergeneric somatic

hybrids through protoplast electrofusion between potato (Solanum tuberosum L.) and Lycopersicum pennellii. Plant Cell Tissue Org. Cult 37: 137–144.

[67] Serraf I.S, Tizroutine M.H. Chaput M, Allot, Mussio I, Sihachakr D, Rossignol L,

[68] Stattmann M, Gerick E, Wenzel G (1994), Interspecific somatic hybryds between Solanum khasianum and S. Aculeatissimum produced by electrofusion. Plant Cell Rep. 13: 193-196.

of somatic hybrids between S.tuberosum L. and late blight resistant Maxican wild potato species. Euphytica 97:189-200.

[69] Thieme R, Darsow U, Gavrilenko T, Dorokhov D, Tiemann H (1997), Production

133

[70] Thieme R., U. Darsow, L. Rakosy - Tican, Z. Kang, T. Gavrilenko, O.Antonova, U.Heimbach, and Thomas T (2004), Use of somatic hybridisation to transfer

resistance to late blight and potato virus Y (PVY) into cultivated Potato. Plant Breeding and Seed Science 50, 113-118.

Characterization of the multiple resistance traits of somatic hybrids between

Solanum cardiophyllum Lindl, and two commercial potato cultivars. Plant Cell Rep 29: 1187-1201.

[71] Thieme, Elena Rakosy, Tican, Marion Nachtigall, Jorg Schubert, Thilo Hammann, Olga Antonova, Tatjana Gavrilenko, Udo Heimbach, Thomas Thieme (2010),

dung hợp tế bào trần. Đề tài thuộc chương trình trọng điểm cấp bộ NN và PTNT. 2007 – 2012.

[72] Nguyễn Thị Phương Thảo (2012), Tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng

hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng. Luận án tiến sĩ, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

[73] Hoàng Thị Giang (2016), Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung

Virus and fungal resistance, from laboratory to field. Trans R Soc B, 342: 271– 278.

[74] Van Den Elzen, Jongedijk P. J. M, Melchers E, and Cornelissen B. J. C (1993),

(1995),

Homology - dependent resistance: Transgenic virus resistance in plants related to homology-dependent gene silencing. Plant J. 7, 1001–1013.

[75] Mueller E, Gilbert J.E, Davenport G, Brigneti G, Baulcombe D.C

resistance to wild potato species to Empoasca fabae (Harris). Amer. Potato J. 55: 577–585.

[76] Tingey W.M, Mackenzie J.D, Gregory P (1978), Total foliar glycoalkaloid and

composition and resistance in Solanum berthaultii. Amer. Potato J. 59: 95-106.

[77] Tingey W.M, Sinden S.L (1982), Glandular pubescence, glycoalkaloid

and other glyoalkaloid in Solanum tuberosum (4x) x S. Chacoense (4x) crosses. Am Potato J. 73: 21-33.

[78] Sanford L.L, Kobayashi R.S, Deahl Simden S.L (1996), Segregation of leptines

potato virus Y. Potato Res. 23: 345-351.

[79] Gunenc Y, Gibson R.W (1980), Effects of glandular foliar hairs on the spread of

134

[80] Jones R.A.C (1990), Strain group specific and virus specific hypersensitive reactions to infection with potyviruses in potato cultivars. Annals of Applied Biology 117: 93–105.

(YYYy) potato virus Y (PVY) immune progenitors derived from Solanum tuberosum ssp. andigena. Am. Potato J., 73, 13±19.

[81] Mendoza H.A, Mihovilovich E.J, Saguma F (1996), Identification of triplex

buildup from Solanum etuberosum to a tuber-bearing Solanum gene pool. Theor. Appl. Genet., 76, 129±135.

[82] Chavez R, Brown C.R, Iwanaga M (1988a), Transfer of resistance to PLRV titer

of tobacco mosaic virus of alfalfa mosaic virus interfere with disease develpmeent of some nonrelated viruses. Phytopathology, 79: 1284-1290.

[83] Anderson, Edwin. J (1989), Transgenic plants the express the coat protein genes

[84] Stark D.M, Beachy R.N (1989), Protection against pytovirus infection in transgenic plants: evidence for broad spectrum resistance. Bio/Technology (in press).

PVY through RAN silencing. Molecular Breeding 14: 185–197.

[85] Missiou et al. (2004), Generation of transgenic potato plants highly resistant to

dụng. Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.

[86] Nguyễn Quang Thạch, Bùi Chí Bửu (2020), Kỹ thuật di truyền nguyên lý và ứng

Aplications of Recombinant DNA.

[87] Glick R, Jack Pasternak J (2017), Molecular Biotechnology, Principles and

CRISPR/Cas trong cải thiện di truyền cây nông nghiệp. Tạp chí Khoa học & công nghệ, số 1, 2018.

[88] Lê Thị Ngọc Quỳnh, Chu Đức Hà, Lê Tiến Dũng (2018), Tình hình ứng dụng

targeting genomes. Nat Biotech 32: 347355.

[89] Sander J.D, Joung J.K (2014), CRISPR-Cas systems for editing, regulating and

evolution of type II CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res 42: 6091-6105. [91] Weeks D.P, Spalding M.H, Yang B (2015), Use of designer nucleases for targeted

gene and genome editing in plants. Plant Biotechnol J. 14: 483-495.

[90] Chylinski K, Makarova K.S, Charpentier E, Koonin E.V (2014), Classification and

[92] Zhang H, Zhang J, Wei P, Zhang B, Gou F, Feng Z, Mao Y, Yang L, Zhang H, Xu N (2014), The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation. Plant Biotechnol J 12: 797-807.

135

[93] Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B, Weeks DP (2013), Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Res 41: e188.

[94] Liang Z, Zhang K, Chen K, Gao C (2014), Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system. J Genet Genomics 41: 63-68.

resistance to powdery mildew. Nat Biotech 32: 947-951.

[95] Wang Y, Cheng X, Shan Q, Zhang Y, Liu J, Gao C, Qiu J-L (2014), Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable

Yang L (2014), Multigeneration analysis reveals the inheritance, specificity, and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 111: 4632-4637.

[96] Feng Z, Mao Y, Xu N, Zhang B, Wei P, Yang D-L, Wang Z, Zhang Z, Zheng R,

Cas9/sgRNA. PLoS One 9: e93806.

[97] Jia H, Wang N (2014), Targeted genome editing of sweet orange using

Solanum dulcamone L. Zpllanzenphysiol. 85. pp. 279-280.

[98] Binding H, Nehts R (1977), Regeneration of isolated protoplasts to plants in

protoplasts of potato (Solanum Tuberosum L.) cultivar delaware using silver thiosulfate (STS). Journal of Sciences of the Islamic Republic of Iran. 12 (2). pp.

103-110.

[99] Ehsanpour A.A and Jones M.G.K (2001), Plant regeneration from mesophyll

Plant Cell and Tissue Culture (Eds Vasil I K and Therpe). Kluwer Academic

Publisher, Dor drencht. pp. 313-329.

[100] Davey M.R, Kumar A and Hammatt N (1994), In vitro culture of legume. In:

from mesophyll protoplasts of Echinacea purpurea. Plant Cell Tissue Organ Cult.

77. pp. 251-255.

[101] Pan Z.G, Lin C.Z, Zobayed S.M.A and Saxena P.K (2004), Plant regeneration

mesophyll protop lasts of white mulberry. Cell Research. 4. pp. 183-189.

[102] Wei Z, Xu Z, Huang X, Xu N and Huang M (1994), Plants regenerated from

for Detection of Extreme Resistance to Potato Virus Y in Tetraploid Potato

(Solanum tuberosum L.) F1 Progenies. Czech J. Genet. Plant Breed., 43 (4): 125– 134.

[103] Heldák J, Bežo M, Štefúnová V, Galliková A (2007), Selection of DNA Markers

[104] Provan J, Powell W, and Waugh R (1996), Microsatellite analysis of relationships within cultivated potato (Solanum tuberosum). Theoretical and Applied Genetics. Volume 92, Issue 8, pp 1078–1084.

Ressourcen. 16. pp. 120-127.

136

[105] Dinu I and Thieme R (2001), Utilization of genentic resources in Solanum for potato breeding through biotechnological methods. Schriften zu Genetischen

Principles and Techniques in Plant Virology, Kado, C.I. and H.O. Agrawal (Eds.). Van Nostrand Reinhold Press, New York, USA., pp: 3-31.

[106] Kado C.I (1972), Mechanical and Biological Inoculation Principles. In:

[107] Hill S. A (1984), Methods in plant virology. Vol. I. Backwell, London. p 167

isolation and culture in agarose droplets. Plant Cell Tiss Org Cult 86:359–366.

[108] Conde P, Santos C (2006), An efficient protocol for Ulmus minor Mill. Protoplast

lymphoma cells by the proteolytic action of proteases. Biochem. Biophys. Res.

Commun. 120, 138–143.

[109] Ohno-Shosaku T, Okada, O. Y (1984), Facilitation of electrofusion of mouse

protoplasts of potato (Solanum Tuberosum L.) cultivar delaware using silver thiosulfate (STS). Journal of Sciences of the Islamic Republic of Iran. 12 (2). pp.

103-110.

[110] Ehsanpour A.A and Jones M.G.K (2001), Plant regeneration from mesophyll

N, Lakhoua L (2006), Production of potato intraspecific somatic hybrids with

improved tolerance to PVY and Pythium aphanidermatum. Plant Physiol, 163(12): 1321 - 32.

[111] Nouri-Ellouz O, Gargouri-Bouzid R, Sihachakr D, Triki M.A, Ducreux G, Drira

(2005), Mapping of extreme resistance to PVY (Rysto) on chromosome XII using anther-culture-derived primary dihaploid potato lines. Theor Appl Genet. 111. pp.

879-887.

[112] Song Y, Heptimg L, Schweizer G, Hartl L, Wenzel G and Schwarzfischer A

N, Lakhoua L (2006), Production of potato intraspecific somatic hybrids with

improved tolerance to PVY and Pythium aphanidermatum. Plant Physiol, 163(12):

1321 - 32.

[113] Nouri-Ellouz O, Gargouri-Bouzid R, Sihachakr D, Triki M.A, Ducreux G, Drira

response to Potato virus Y in potato cultivar Sa´rpo Mira is conferred by the Ny-

Smira gene located on the long arm of chromosome IX. Mol Breeding 34: 471– 480.

[114] Iga T, Florian J, Ingo H, Waldemar M, Jadwiga S (2014), Hypersensitive

wild tuber- and non-tuber-bearing Solanums. Euphytica 109: 51–67.

[115] Jackson S.A and Hanneman R.E (1999), Crossability between cultivated and

integration of protoplast fusion-derived material into a potato breeding programme — a review of progress and problem. Euphytica 85: 451–455.

137

[116] Millam S, Payne L.A and Mackay G.R (1995), The

tuberosum L. plants and a model for their application in breeding programs. Max-

Planck-Institut für Züchtungsforschung (Erwin-Baur-Institut), Köln, Federal Republic of Germany.

[117] Wenzel G (1979), Comparison of single cell culture derived Solanum

tuberosum) lines using transformed antibiotic selection markers. Teruo Ishige

National Institute of Agrobiological Resources, Tsukuba Science City, Tsukuba, Ibaraki 305, Japan.

MỘT SỐ TRANG WEB

http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC

http://www.actahort.org/books/842/842_101.htm

http://www.cipotato.org/potato/facts/growth.asp

http://www.potato2008.org/en/aboutiyp/partners.html

http://www.springerlink.com/content/k7723244186vk482/

http://oregonstate.edu/potatoes/variety.htm

http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/NewsArticles/PotatoVirus.htm

http://www.knowledgescotland.org/briefings.php?id=125

http://www.growingpotatos.org/potato-virus-y/

http://www.fwi.co.uk/academy/article/111051/potato-aphids.html

138

[118] Yoshio Kikuta (1995), Somatic cell fusion between diploid potato (Solanum

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Hóa chất nuôi cây mô: Thành phần môi trường MS (Musashige and Skoog, 1962):

Ghi chú (Lượng lấy cho 1 lít Đơn vị Hóa chất Khối lượng (cho 1 lít dung dịch mẹ) môi trường)

33.00 G NH4NO3

38.00 G KNO3 Đa lượng

50ml/l 7.40 G MGSO4.7H2O

3.40 G KH2PO4

8.80 G 50ml/l CaCl2.2H2O

620.00 mg H3BO4

2230.00 mg MnSO4.4H2O

860.00 mg ZnSO4.4H2O Vi lượng KI 83.00 mg 10ml/l 25.00 mg MoO4Na2.2H2O

2.50 mg CoCl2.6H2O

2.50 mg CuSO4.5H2O

5.56 G FeSO4.7H2O 5ml/l 7.76 G Na2EDTA

Glycine 400.00 mg

100.00 mg B5 5ml/l 100.00 mg B6

20.00 mg B1

Inositol 100.00 mg

Agar 6.00 G

Sacaroza 25.00 G

PH 5.7 - 5.8

Phụ lục 2. Hóa chất tách tế bào trần

Tên dung dịch Thành phần

• Đa lượng, vi lượng và vitamin theo

Dung dịch enzyme (Mollers)

• Riêng nồng độ NH4NO3 là 150mg/l

• 11g/100ml Sucrose

MS (Enzym Solution)

• 1g/100ml (PVP)

• 0.125g/100ml BSA

• 0.2g/100ml Macerozym

• 0.8g/100ml Cellulose

• 0.6g/100ml MES

Polivynylpyrrolidon

• Muối khoáng và vitamin theo MS

• Riêng nồng độ NH4NO3 là 150mg/l

• 110g/l sucrose

Dung dịch nổi (Rinsing Solution)

• Muối khoáng và vitamin theo MS

• Riêng nồng độ NH4NO3 là 150mg/l

• 17g/l NaCl

Dung dịch rửa I (Washing Solution I)

• 9.1g/100ml Mannitol

• 0.01g/l CaCl2

Dung dịch rửa II (Washing Solution II)

Phụ lục 3. Hóa chất dung hợp tế bào trần

Tên dung dịch Thành phần

o 0,4 M Manitol

Dung dịch dung hợp xung điện

o 1,0 mM CaCl2

o pH = 5,6

(Fusion Solution)

(lọc vô trùng)

Phụ lục 4. Hóa chất nuôi cấy và tái sinh tế bào trần

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào trần (VKM II lỏng) (Binding and Nehls, 1977)

Thành phần (mg/l) Môi trường VKM II

KNO3 1480

MgSO4.7H2O 984

CaCl2.2H2O 735

KH2PO4 68

NaFe-EDTA 40

H3BO3 3

MnSO4.H2O 10

ZnSO4.7H2O 2

Na2MoO4.H2O 0.25

CuSO4.5H2O 0.025

CoCl2.6H2O 0.025

KI 0.75

Saccharose 250

Glucose 90000

Mannitol 250

each 250

Sorbitol, Ribose, Xylose, Mannose, Rhamnose, Fructose, Cellobiose

Inositol 100

Na-Pyruvat 20

Fumaric acid 40

Acetic acid 40

Malic acid 40

Ca-Pantothenate 1

Choline choloride 1

Ascorbic acid 2

Nicotinamide 1

Pyridoxine HCl 1

Thiamine HCl 10

Aminobenzoic acid 0.02

Folic acid 0.4

Biotin 0.01

Vitamin A 0.01

Vitamin D3 0.01

Vitamin B12 0.02

0.2 2.4D (Dichlorophenoxyacetic acid)

1 NAA (Naphty lacetate)

0.5 Zeatin

250 Caseinhydrolysate

BSA (Bovine Serum Albumin) (1000) có hoặc không

Môi trường VKM II bán lỏng (nhỏ giọt agar nồng độ 0,65%); Môi trường VKM II rắn

(Agar 0,65%).

20 Coconut milk (mL/L)

Thành phần môi trường A* (Ehsanpour and Amini, 2001)

Môi trường MS (Musashige and Skoog, 1962)

Bổ sung thêm 2 mg/l Kinetin, 2mg/l 2,4-D và 2mg/l α-NAA

Thành phần môi trường KM8P* (Davey et al., 1994)

KM8P* Thành phần

Đa lượng

1900 KNO3

600 NH4NO3

KM8P* Thành phần

MgSO4.7H2O 300

CaCl2.2H2O 600

KH2PO4 170

Sequestrene 330 Fe 28

Vi lượng

H3BO3 3

MnSO4.H2O 10

ZnSO4.7H2O 2

Na2MoO4.H2O 0.25

CuSO4.5H2O 0.025

CoCl2.6H2O 0.025

KI 0.75

Đường

Saccharose 250

Glucose 90000

Mannitol 250

Sorbitol, Ribose, Xylose, Mannose, each 250

Rhamnose, Fructose, Cellobiose

Vitamin

Myo-inositol 100

Na-Pyruvat 20

Citric acid 40

Fumaric acid 40

Malic acid 40

Ca-Pantothenate 1

Choline choloride 1

Ascorbic acid 2

Abssisic acid 0.02

Thành phần KM8P*

Nicotinamide 1

Pyridoxine HCl 1

Thiamine HCl 1

Riboflavin 0.2

Biotin 0.01

Vitamin A 0.01

Vitamin D3 0.01

Vitamin B12 0.02

Các chất khác

Ribose, Xylose, Mannose, each 250

Sorbitol, Rhamnose, Fructose, Cellobiose

0.2 2.4D (Dichlorophenoxyacetic acid)

1 NAA (Naphty lacetate)

Thành phần môi trường nuôi cấy và tái sinh tế bào trần

Thành phần

Môi trường tái sinh callus Cul-medium Môi trường tái sinh chồi RJM- medium

(Haberlach et al., 1985) (Masson et al., 1988)

MS- Đa lượng, vi lượng + +

MS-Vitamins + +

Inositol (mg) 100 100

NaFe-EDTA (mg) 40 40

Glucose (g) 5 0

Saccharose (g) 15 10

Mannitol (g) 30 15

IAA (Indoleacetic acid, mg) 0 0.5

NAA (Naphtyacetate, mg) 0.2 0

Zeatin (mg) 0 1

BAP (Benzy laminopurin, mg) 1 0.5

GA3 (Gibberellic acid, mg) 0 0.2

Agar-Agar (g) 7.5 7.5

Thành phần môi trường K8P (Wei et al., 1994)

Thể tích dung dịch mẹ Tên chất Khối lượng lấy

Phần 1 (200ml) 120mg Ca(NO3)2.4.H2O

180mg KNO3

Phần 2 (200ml) 60mg MgSO4.7H2O

Phần 3 (600ml) 80mg KH2PO4

175mg (NH4)2(SO4)

6mg NaFeEDTA

0.6mg MnSO4.7H2O

1mg Glycine

5mg Nicotinic acid

10mg Thiamine

5mg Pyridoxine

Peptone Soja 500mg

15g Sucrose

5g Agar

1g Geltrite

Thành phần môi trường MSO (Pan et al., 2004)

Môi trường MS (Musashige and Skoog, 1962)

Bổ sung thêm 5 mg/l BA, 2mg/l IBA

Phụ lục 5. Hóa chất chiết tách DNA

• Dung dịch nghiễn mẫu: NaCl 10,37g; CTAB (Cethrimethyl amonium bromind)

0,25g, tổng thể tích 100ml;

• Dung dịch II (CI): Hỗn hợp Chloroform: Isoamylalcohol (24:1);

• Dung dịch TE: 1ml Tris-HCl 1M; 0,2ml EDTA 0,5M, tổng thể tích 100ml, PH=8;

• Ethanol 90% và 70%.

Phụ lục 6. Hóa chất PCR

STT Tên hóa chất Thể tích

1 PCR buffer 10x 1,5µl

2 dNTP 2,5mM 0,15µl

3 Forward primer 10ppmol/µl 0,5µl

4 Reverse primer 10ppmol/µl 0,5µl

5 Nước cất 10,53µl

6 0,12µl MgCl2

7 Taq polymerase 5U/µl 0,2µl

8 DNA tổng số 0,5µl

Tổng 14µl

Phụ lục 7. Hóa chất lây nhiễm nhân tạo

Đệm phosphate buffer: 0.1M K2HPO4, 0.025 M KH2PO4, pH 7.5

Phụ lục 8

Các chỉ tiêu đánh giá các đặc điểm nông sinh học theo QCVN 01 - 69: 2011/BNNPTNT

Các tính trạng đặc trưng của giống khoai tây

Trạng thái

Giai đoạn

Mã số

Mầm: Kích cỡ

Nhỏ

(+)

Lightsprout: Size

Trung bình

Tính trạng biểu hiện

Trạng thái

Giai đoạn

Mã số

Hình cầu

Hình trứng

Mầm: Hình dạng

(*)

Hình nón

Lightsprout: Shape

(+)

Hình trụ

Hình trụ dài

Không có hoặc rất nhạt

Nhạt

Mầm: Mức độ sắc tố antoxian trên gốc mầm

Trung bình

(*)

Đậm

Lightsprout: Intensity of anthocianin coloration of base

Rất đậm

Không có hoặc ít

Mầm: Tỷ lệ màu xanh của sắc tố antoxian trên gốc mầm

Trung bình

(*)

Nhiều

Lightsprout: Proportion of blue in anthocyanin coloration of base

Rất ít

Ít

Mầm: Lông ở gốc mầm

(*)

Trung bình

Lightsprout: Pubescence of base

(+)

Nhiều

Rất nhiều

Nhỏ

Mầm: Kích cỡ phần đỉnh so với gốc

Trung bình

(+)

Lightsprout: Size of tip in relation to base

Lớn

Đóng

Mầm: Dạng đỉnh

Trung bình

(+)

Lightsprout: Habit of tip

Mở

Tính trạng biểu hiện

12. (+)

Cây: Cấu trúc tán

Trung gian

Plant: Foliage structure

Dạng lá (tán lá ken dầy, rất khó nhìn thấy thân

Đứng

13.

Cây: Kiểu sinh trưởng

Nửa đứng

(*)

Plant: Growth habit

Bò

(+)

Dạng thân (tán lá mở, nhìn rõ thân cây)

Trạng thái

Giai đoạn

Mã số

Không có hoặc rất nhạt

14.

(*)

Nhạt

Thân: Sắc tố antoxian

(+)

Trung bình

Stem: Anthocyanin coloration

Đậm

Rất đậm

15.

Nhỏ

Lá: Kích cỡ

(+)

Trung bình

Leaf: Outline size

Rộng

16.

Đóng

Lá: Sự mở

(+)

Trung gian

Leaf: Openness

Mở

17.

Ít

Lá: Lá chét thứ cấp

(+)

Trung bình

Leaf: Presence of secondary leaflets

Nhiều

18.

Nhạt

Lá: Màu xanh

(+)

Trung bình

Leaf: Green color

Đậm

Không có hoặc rất nhạt

19.

Lá: Sắc tố antoxian trên gân chính của mặt trên

Nhạt

(+)

Trung bình

Leaf: Anthocyanin coloration on midrib of upper side

Đậm

Rất đậm

Rất nhỏ

20.

Nhỏ

Đôi lá chét bên thứ 2: Kích cỡ

(+)

Trung bình

Second pair of lateral leaflets: Size

Lớn

Rất lớn

21.

Hẹp

(+)

Đôi lá chét bên thứ 2: Chiều rộng so với chiều dài

Trung bình

Second pair of lateral leaflets: Width

Rộng

Tính trạng biểu hiện

Trạng thái

Giai đoạn

Mã số

in relation to length

Không có hoặc rất thấp

22.

Thấp

Lá chét đỉnh và bên: Mức độ lá hợp.

Trung bình

(*)

Terminal and lateral leaflets: Frequency of coalescence

Cao

Rất cao

Không hoặc rất ít

Ít

23.

Lá chét: Sự lượn sóng của mép

Trung bình

(+)

Leaflet: Waviness of margin

Nhiều

Rất nhiều

Nông

24.

Lá chét: Độ sâu của gân

Trung bình

(+)

Leaflet: Depth of veins

Sâu

Mờ

25.

Lá chét: Độ bóng mặt trên lá

Trung bình

(+)

Leaflet: Glossiness of the upperside

Bóng

Không có

26.

Lá chét: Lông của phiến lá tại đỉnh hoa thị

Có

Leaflet: Pubescence of blade at apical rosette

Không có hoặc rất nhạt

27.

Nhạt

Nụ hoa: Sắc tố antoxian

Trung bình

(+)

Flower bud: Anthocyanin coloration

Đậm

Rất đậm

Rất ngắn

Ngắn

Cây: Chiều cao

28.

Trung bình

Plant: Height

Cao

Rất cao

Tính trạng biểu hiện

Trạng thái

Giai đoạn

Mã số

Không có hoặc rất ít

29.

Ít

Cây: Mức độ ra hoa

Trung bình

(+)

Plant: Frequency of flowers

Nhiều

Rất nhiều

Nhỏ

30.

Chùm hoa: Kích thước

Trung bình

(+)

Inflorescence: Size

Lớn

Không có hoặc rất nhạt

31.

Nhạt

Chùm hoa: Sắc tố antoxian trên cuống hoa

(+)

Trung bình

Đậm

Inflorescence: Anthocyanin coloration on peduncle

Rất đậm

Nhỏ

32.

Cánh hoa: Kích thước

Trung bình

(+)

Flower corolla: Size

Lớn

Không có hoặc rất nhạt

33.

Nhạt

Cánh hoa: Mức độ sắc tố anthocyan ở mặt trong

(*)

Trung bình

(+)

Đậm

Flower corolla: Intensity of anthocyanin coloration on inner side

Rất đậm

34.

Không có hoặc rất ít

Cánh hoa: Tỷ lệ màu xanh của sắc tố antoxian ở mặt trong

(*)

Trung bình

(+)

Nhiều

Flower corolla: Proportion of blue in anthocyanin coloration on inner side

Không có hoặc rất nhỏ

35.

Nhỏ

(*)

Cánh hoa: Khoảng rộng sắc tố antoxian bên trong

Trung bình

(+)

Rộng

Flower corolla: Extent of anthocyanin coloration on inner side

Rất rộng

Tính trạng biểu hiện

Trạng thái

Giai đoạn

Mã số

Rất sớm

36.

Sớm

Cây: Thời gian sinh trưởng

(*)

Trung bình

Plant: Time of maturity

(+)

Muộn

Rất muộn

Tròn

37.

Ovan ngắn

(*)

Củ: Hình dạng

Ovan

(+)

Ovan dài

Tuber: Shape

Dài

Rất dài

Rất nông

Nông

Củ: Độ sâu mắt củ

38.

Trung bình

Tuber: Depth of eyes

Sâu

Rất sâu

Kem nhạt

Vàng

Đỏ

39.

Đỏ một phần

Củ: Màu của vỏ củ

(*)

Xanh

Tuber: Color of skin

Xanh một phần

Nâu đỏ

Màu khác

Trắng

Vàng

40.

Củ: Màu đáy mắt

Đỏ

(*)

Tuber: Color of base of eye

Xanh

Màu khác

Trắng

41.

Củ: Màu thịt củ

Kem

(*)

Vàng nhạt

Tuber: Color of flesh

Vàng trung bình

Tính trạng biểu hiện

Trạng thái

Giai đoạn

Mã số

Vàng đậm

Đỏ

Đỏ một phần

Xanh

Xanh một phần

Màu khác

Chỉ ở giống vỏ màu kem nhạt và vàng:

Không có hoặc rất yếu

Yếu

42.

Củ: Sắc tố antoxian của vỏ phản ứng với ánh sáng

Trung bình

(+)

Khoẻ

Light beige and yellow skinned varieties only:

Rất khoẻ

Tuber: Anthocyanin coloration of skin in reaction to light

Tính trạng biểu hiện

Phụ lục 9: Xử lý số liệu các chỉ số tối ưu của quá trình dung hợp

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ macerozyme và cellulase trong dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội (Tế bào trần/ ml môi trường) BALANCED ANOVA FOR VARIATE E1 FILE MDTB1 28/10/20 23:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 E1 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 41.7044 4.17044 95.81 0.000 2 * RESIDUAL 22 .957597 .435271E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 42.6620 1.33319 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE E2 FILE MDTB1 28/10/20 23:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 E2 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 15.9960 1.59960 73.70 0.000 2 * RESIDUAL 22 .477465 .217030E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 16.4735 .514797 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE E3 FILE MDTB1 28/10/20 23:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 VARIATE V005 E3 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 27.6385 2.76385 267.00 0.000 2 * RESIDUAL 22 .227732 .103515E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 27.8663 .870821 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE E4 FILE MDTB1 28/10/20 23:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 VARIATE V006 E4 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 4.97487 .497487 165.33 0.000 2 * RESIDUAL 22 .661997E-01 .300908E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 5.04107 .157534 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MDTB1 28/10/20 23:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 MEANS FOR EFFECT G$ ------------------------------------------------------------------------------- G$ NOS E1 E2 E3 E4 A15 3 3.69000 2.54000 0.510000 0.120000 A16 3 4.12000 1.15000 2.65000 0.350000 A56 3 1.09000 1.59333 2.95000 0.740000 B186 3 3.60000 2.35000 0.680000 0.220000 B208 3 3.55000 1.07000 0.423333 0.100000 pnt2G 3 1.61000 3.12000 0.860000 1.21000 trn3G 3 3.73000 1.62000 1.04000 0.340000 blb2G 3 3.65000 1.52000 1.01000 0.330000 Delikat 3 2.86000 3.01000 1.14667 0.100000 Rasant 3 3.80000 1.91000 0.780000 0.100000 Atlantic 3 0.920000 1.24000 2.81000 1.11000

SE (N= 3) 0.120454 0.850548E-01 0.587408E-01 0.316706E-01 5%LSD 22DF 0.353272 0.249453 0.172278 0.928850E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MDTB1 28/10/20 23:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ | (N= 33) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | E1 33 2.9655 1.1546 0.20863 7.0 0.0000 E2 33 1.9203 0.71749 0.14732 7.7 0.0000 E3 33 1.3509 0.93318 0.10174 7.5 0.0000 E4 33 0.42909 0.39690 0.54855E-01 12.8 0.0000 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần thu được BALANCED ANOVA FOR VARIATE 13H FILE MDTB2 27/10/20 22:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 13H LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 17.2123 1.72123 408.93 0.000 2 * RESIDUAL 22 .926003E-01 .420911E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 17.3049 .540777 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE 14H FILE MDTB2 27/10/20 22:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 14H LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 23.9867 2.39867 373.73 0.000 2 * RESIDUAL 22 .141200 .641819E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 24.1279 .753997 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE 15H FILE MDTB2 27/10/20 22:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 VARIATE V005 15H LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 3.33792 .333792 16.06 0.000 2 * RESIDUAL 22 .457267 .207849E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 3.79519 .118600 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE 16H FILE MDTB2 27/10/20 22:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 VARIATE V006 16H LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 4.44207 .444207 14.52 0.000 2 * RESIDUAL 22 .673200 .306000E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 5.11527 .159852 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MDTB2 27/10/20 22:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 MEANS FOR EFFECT G$

------------------------------------------------------------------------------- G$ NOS 13H 14H 15H 16H A15 3 1.44000 2.86000 3.39000 2.66000 A16 3 1.09000 2.93000 4.01000 3.45000 A56 3 1.24000 2.98000 3.43333 3.35000 B186 3 2.45000 4.56000 3.81000 2.76000 B208 3 2.08000 4.38000 3.95000 2.54000 pnt2G 3 0.520000 1.74000 2.81000 3.61000 trn3G 3 1.01000 2.33000 3.62000 2.91000 blb2G 3 1.24000 2.63000 3.43000 2.41000 Delikat 3 1.24000 2.84000 3.55000 3.04000 Rasant 3 3.18000 4.13000 3.83000 2.83000 Atlantic 3 1.92000 2.52000 3.59000 2.77000 SE(N= 3) 0.374571E-01 0.462536E-01 0.832363E-01 0.100995 5%LSD 22DF 0.109856 0.135655 0.244119 0.296203 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MDTB2 27/10/20 22:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ | (N= 33) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | 13H 33 1.5827 0.73538 0.64878E-01 4.1 0.0000 14H 33 3.0818 0.86833 0.80114E-01 2.6 0.0000 15H 33 3.5839 0.34438 0.14417 4.0 0.0000 16H 33 2.9391 0.39982 0.17493 6.0 0.0000 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến mật độ tế bào trần thu được từ mẫu lá BALANCED ANOVA FOR VARIATE 2TUAN FILE MDTB3 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 2TUAN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 11.3874 1.13874 655.81 0.000 2 * RESIDUAL 22 .382004E-01 .173638E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 11.4256 .357050 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE 3TUAN FILE MDTB3 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 3TUAN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 8.23596 .823596 16.20 0.000 2 * RESIDUAL 22 1.11867 .508485E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 9.35462 .292332 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE 4 TUAN FILE MDTB3 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 VARIATE V005 4 TUAN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 3.76334 .376334 12.64 0.000 2 * RESIDUAL 22 .654867 .297667E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 4.41821 .138069 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE 5TUAN FILE MDTB3 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4

VARIATE V006 5TUAN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 10 3.32116 .332116 12.82 0.000 2 * RESIDUAL 22 .569800 .259000E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 3.89096 .121593 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MDTB3 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 MEANS FOR EFFECT G$ ------------------------------------------------------------------------------- G$ NOS 2TUAN 3TUAN 4 TUAN 5TUAN A15 3 0.140000 3.69000 3.39000 2.45000 A16 3 1.59000 4.12000 4.01000 2.01000 A56 3 0.340000 2.85000 3.40000 1.55000 B186 3 0.850000 3.60000 2.91000 1.87000 B208 3 0.280000 3.55000 3.94000 2.06000 pnt2G 3 0.470000 2.54000 3.27000 2.14000 trn3G 3 0.470000 2.98000 3.48000 2.55000 blb2G 3 0.280000 2.98333 3.74000 2.72000 Delikat 3 1.95000 2.60000 3.91000 2.37000 Rasant 3 1.28000 2.59000 3.14000 2.02000 Atlantic 3 1.26000 3.02000 3.68667 2.09000 SE(N= 3) 0.240582E-01 0.130190 0.996104E-01 0.929157E-01 5%LSD 22DF 0.705589E-01 0.381828 0.292142 0.272508 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MDTB3 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ | (N= 33) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | 2TUAN 33 0.81000 0.59754 0.41670E-01 5.1 0.0000 3TUAN 33 3.1385 0.54068 0.22550 7.2 0.0000 4 TUAN 33 3.5342 0.37158 0.17253 4.9 0.0000 5TUAN 33 2.1664 0.34870 0.16093 7.4 0.0000 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp bằng xung điện của tổ hợp nhị bội B186 (+) B208 BALANCED ANOVA FOR VARIATE T1 FILE MDTB6 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 T1 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 4 5652.16 1413.04 507.56 0.000 2 * RESIDUAL 10 27.8397 2.78397 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 5680.00 405.714 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE T2 FILE MDTB6 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 T2 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 4 1983.60 495.900 26.10 0.000 2 * RESIDUAL 10 190.000 19.0000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 2173.60 155.257 -----------------------------------------------------------------------------

BALANCED ANOVA FOR VARIATE T3 FILE MDTB6 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 VARIATE V005 T3 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 4 4662.64 1165.66 590.17 0.000 2 * RESIDUAL 10 19.7512 1.97512 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 4682.39 334.456 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE T4 FILE MDTB6 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 VARIATE V006 T4 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 4 909.652 227.413 43.56 0.000 2 * RESIDUAL 10 52.2038 5.22038 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 961.856 68.7040 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE T5 FILE MDTB6 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 VARIATE V007 T5 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 4 4203.66 1050.92 102.64 0.000 2 * RESIDUAL 10 102.387 10.2387 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 4306.05 307.575 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MDTB6 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 MEANS FOR EFFECT G$ ------------------------------------------------------------------------------- G$ NOS T1 T2 T3 T4 M1 3 28.5000 16.0000 56.2500 25.0000 M2 3 75.7000 35.0000 37.1400 34.2900 M3 3 85.6000 46.0000 13.8800 45.6833 M4 3 68.3000 47.0000 14.9000 31.9100 M5 3 62.6000 29.0000 10.3100 24.1300 SE(N= 3) 0.963323 2.51661 0.811402 1.31914 5%LSD 10DF 3.03547 7.92993 2.55676 4.15665 G$ NOS T5 M1 3 18.7500 M2 3 28.5700 M3 3 40.4367 M4 3 53.1900 M5 3 65.5600 SE(N= 3) 1.84740 5%LSD 10DF 5.82123 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MDTB6 27/10/20 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 7 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | T1 15 64.140 20.142 1.6685 2.6 0.0000 T2 15 34.600 12.460 4.3589 12.6 0.0000

T3 15 26.496 18.288 1.4054 5.3 0.0000 T4 15 32.203 8.2888 2.2848 7.1 0.0000 T5 15 41.301 17.538 3.1998 7.7 0.0000 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp bằng xung điện của tổ hợp khoai tây dại và khoai tây trồng Trn3G (+) Delikat BALANCED ANOVA FOR VARIATE MACRO FILE MDTB7 27/10/20 22:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 MACRO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 4 5203.24 1300.81 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 12.6005 1.26005 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 5215.84 372.560 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SC FILE MDTB7 27/10/20 22:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 SC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 4 6244.67 1561.17 72.05 0.000 2 * RESIDUAL 10 216.667 21.6667 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 6461.33 461.524 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE X2 FILE MDTB7 27/10/20 22:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 VARIATE V005 X2 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 4 1279.28 319.821 152.59 0.000 2 * RESIDUAL 10 20.9600 2.09600 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 1300.24 92.8746 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE X4 FILE MDTB7 27/10/20 22:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 VARIATE V006 X4 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 4 3046.34 761.586 584.05 0.000 2 * RESIDUAL 10 13.0397 1.30397 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 3059.38 218.527 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE X6 FILE MDTB7 27/10/20 22:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 VARIATE V007 X6 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 4 4661.56 1165.39 221.05 0.000 2 * RESIDUAL 10 52.7204 5.27204 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 4714.28 336.734 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HD FILE MDTB7 27/10/20 22:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 VARIATE V008 HD

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 4 1168.61 292.152 22.26 0.000 2 * RESIDUAL 10 131.227 13.1227 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 1299.83 92.8452 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MDTB7 27/10/20 22:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 7 MEANS FOR EFFECT G$ ------------------------------------------------------------------------------- G$ NOS MACRO SC X2 X4 M1 3 32.5000 21.0000 25.3000 45.0000 M2 3 65.7000 55.0000 16.0000 30.9000 M3 3 74.6000 66.6667 10.3000 10.6000 M4 3 88.3000 81.0000 2.30000 9.60000 M5 3 72.6000 68.0000 0.000000 10.8000 SE(N= 3) 0.648088 2.68742 0.835863 0.659286 5%LSD 10DF 2.04215 8.46816 2.63384 2.07743 G$ NOS X6 HD M1 3 14.4000 15.2333 M2 3 32.3000 20.7000 M3 3 58.4000 20.7000 M4 3 61.9000 26.2000 M5 3 48.2000 41.0000 SE(N= 3) 1.32565 2.09147 5%LSD 10DF 4.17717 6.59028 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MDTB7 27/10/20 22:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 8 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | MACRO 15 66.740 19.302 1.1225 1.7 0.0000 SC 15 58.333 21.483 4.6547 8.0 0.0000 X2 15 10.780 9.6371 1.4478 13.4 0.0000 X4 15 21.380 14.783 1.1419 5.3 0.0000 X6 15 43.040 18.350 2.2961 5.3 0.0000 HD 15 24.767 9.6356 3.6225 14.6 0.0001 Bảng 3.10. Kết quả dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai nhị bội sau dung hợp BALANCED ANOVA FOR VARIATE CALLUS FILE MDTB10 27/10/20 22:57 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 CALLUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 2 .118800E+07 594001. 211.74 0.000 2 * RESIDUAL 6 16832.0 2805.33 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 .120483E+07 150604. ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAY FILE MDTB10 27/10/20 22:57 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 CALLUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 2 1568.00 784.000 46.12 0.000 2 * RESIDUAL 6 102.000 17.0000

----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1670.00 208.750 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MDTB10 27/10/20 22:57 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 MEANS FOR EFFECT G$ ------------------------------------------------------------------------------- G$ NOS CALLUS CAY THL1 3 1026.00 25.0000 THL2 3 375.000 53.0000 THL3 3 175.000 25.0000 SE(N= 3) 30.5796 2.38048 5%LSD 6DF 105.780 8.23445 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MDTB10 27/10/20 22:57 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CALLUS 9 525.33 388.08 52.965 10.1 0.0000 CAY 9 34.333 14.448 4.1231 12.0 0.0004

Bảng 3.11. Kết quả xác định độ bội các con lai sau dung hợp BALANCED ANOVA FOR VARIATE TS FILE MDTB11 27/10/20 22:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 TS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 2 1605.56 802.778 180.62 0.000 2 * RESIDUAL 6 26.6667 4.44446 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1632.22 204.028 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE X2 FILE MDTB11 27/10/20 22:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 X2 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 2 168.000 84.0000 50.40 0.000 2 * RESIDUAL 6 9.99999 1.66666 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 178.000 22.2500 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE X4 FILE MDTB11 27/10/20 22:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 VARIATE V005 X4 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 2 54.0000 27.0000 16.20 0.004 2 * RESIDUAL 6 10.0000 1.66667 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 64.0000 8.00000 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HD FILE MDTB11 27/10/20 22:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 VARIATE V006 HD

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 G$ 2 771.556 385.778 124.00 0.000 2 * RESIDUAL 6 18.6667 3.11111 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 790.222 98.7778 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MDTB11 27/10/20 22:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 MEANS FOR EFFECT G$ ------------------------------------------------------------------------------- G$ NOS TS X2 X4 HD THL1 3 25.0000 7.00000 14.0000 4.00000 THL2 3 53.3333 15.0000 17.0000 21.3333 THL3 3 25.0000 5.00000 20.0000 0.000000 SE(N= 3) 1.21716 0.745355 0.745356 1.01835 5%LSD 6DF 4.21036 2.57830 2.57831 3.52264 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MDTB11 27/10/20 22:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TS 9 34.444 14.284 2.1082 6.1 0.0000 X2 9 9.0000 4.7170 1.2910 14.3 0.0003 X4 9 17.000 2.8284 1.2910 7.6 0.0044 HD 9 8.4444 9.9387 1.7638 20.9 0.0001

Phụ lục 10. Xử lý số liệu của bảng kết quả các yếu tố cấu thành năng suất, phân loại kích thước củ của các dòng con lai soma và “bố mẹ” của chúng

1. SO CU/CAY (TO HOP A15 (+) A41)

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCU TB FILE SO CU 1 20/ 8/** 21:16

---------------------------------------------------------------- PAGE 1

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

VARIATE V003 SOCU TB TB TB/

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 CONGTHUC$ 3 90.8625 30.2875 151.44 0.000 2

* RESIDUAL 8 1.60001 .200001

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 11 92.4625 8.40568

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SO CU 1 20/ 8/** 21:16

---------------------------------------------------------------- PAGE 2

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

MEANS FOR EFFECT CONGTHUC$

-------------------------------------------------------------------------------

CONGTHUC$ NOS SOCU TB

A15 3 18.5000

A41 3 16.7000

H76 3 12.4000

H79 3 12.1000

SE(N= 3) 0.258199

5%LSD 8DF 0.841962

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SO CU 1 20/ 8/** 21:16

---------------------------------------------------------------- PAGE 3

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHUC|

(N= 12) -------------------- SD/MEAN |$ |

NO. BASED ON BASED ON % | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | |

SOCU TB 12 14.925 2.8993 0.44721 3.0 0.0000

2. KL CU TRUNG BINH/CAY (TO HOP A15 (+) A41)

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLCU/CAY FILE KL CU1 20/ 8/** 21:25

---------------------------------------------------------------- PAGE 1

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

VARIATE V003 KLCU/CAY

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 CONGTHUC$ 3 9058.95 3019.65 135.26 0.000 2

* RESIDUAL 8 178.601 22.3251

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 11 9237.55 839.777

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KL CU1 20/ 8/** 21:25

---------------------------------------------------------------- PAGE 2

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

MEANS FOR EFFECT CONGTHUC$

-------------------------------------------------------------------------------

CONGTHUC$ NOS KLCU/CAY

A15 3 114.900

A41 3 62.3000

H76 3 138.000

H79 3 108.600

SE(N= 3) 2.72795

5%LSD 8DF 8.89557

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KL CU1 20/ 8/** 21:25

---------------------------------------------------------------- PAGE 3

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHUC|

(N= 12) -------------------- SD/MEAN |$ |

NO. BASED ON BASED ON % | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | |

KLCU/CAY 12 105.95 28.979 4.7249 4.5 0.0000

3. SO CU/CAY (TO HOP A15 (+) A56)

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO CU FILE SO CU 2 20/ 8/** 21:42

---------------------------------------------------------------- PAGE 1

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

VARIATE V003 SO CU CU

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 CONGTHUC$ 6 131.931 21.9886 93.85 0.000 2

* RESIDUAL 14 3.28001 .234287

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 20 135.211 6.76057

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SO CU 2 20/ 8/** 21:42

---------------------------------------------------------------- PAGE 2

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

MEANS FOR EFFECT CONGTHUC$

-------------------------------------------------------------------------------

CONGTHUC$ NOS SO CU

A15 3 18.5000

A56 3 10.6000

47/7 3 11.4000

47/11 3 11.3000

47/14 3 12.0000

47/24 3 13.3000

47/26 3 14.2000

SE(N= 3) 0.279456

5%LSD 14DF 0.847651

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SO CU 2 20/ 8/** 21:42

---------------------------------------------------------------- PAGE 3

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHUC|

(N= 21) -------------------- SD/MEAN |$ |

NO. BASED ON BASED ON % | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | |

SO CU 21 13.043 2.6001 0.48403 3.7 0.0000

4. KL CU TRUNG BINH/CAY (TO HOP A15 (+) A56)

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLCU/CAY FILE SO CU 2 20/ 8/** 21:52

---------------------------------------------------------------- PAGE 1

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

VARIATE V003 KLCU/CAY CU CU CU

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 CONGTHUC$ 6 3864.40 644.067 46.00 0.000 2

* RESIDUAL 14 196.020 14.0014

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 20 4060.42 203.021

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SO CU 2 20/ 8/** 21:52

---------------------------------------------------------------- PAGE 2

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

MEANS FOR EFFECT CONGTHUC$

-------------------------------------------------------------------------------

CONGTHUC$ NOS KLCU/CAY

A15 3 114.900

A56 3 108.000

47/7 3 94.0000

47/11 3 133.200

47/14 3 109.600

47/24 3 97.2000

47/26 3 128.300

SE (N= 3) 2.16036

5%LSD 14DF 6.55284

----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SO CU 2 20/ 8/** 21:52

---------------------------------------------------------------- PAGE 3

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHUC|

(N= 21) -------------------- SD/MEAN |$ |

NO. BASED ON BASED ON % | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | |

KLCU/CAY 21 112.17 14.249 3.7418 3.3 0.0000

5. SO CU/CAY (TO HOP A16 (+) B186)

SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE SO CU 4 20/ 8/** 22: 8

---------------------------------------------------------------- PAGE 1

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CONGTHUC$

--------------------------------------------------------------

VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB

SO CU/CA 42.205 10 0.40909 22 103.17 0.000

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SO CU 4 20/ 8/** 22: 8

---------------------------------------------------------------- PAGE 2

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

MEANS FOR EFFECT CONGTHUC$

-------------------------------------------------------------------------------

CONGTHUC$ NOS SO CU/CA

B208 3 23.8000

B186 3 13.2000

21-1 3 12.3000

130/2 3 12.8000

131/1 3 13.3000

131/3 3 12.3000

131/4 3 13.1000

131/5 3 12.0000

131/10 3 12.4000

131/11 3 8.30000

131/12 3 12.5000

SE (N= 3) 0.369275

5%LSD 22DF 1.08303

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SO CU 4 20/ 8/** 22: 8

---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHUC|

(N= 33) -------------------- SD/MEAN |$ |

NO. BASED ON BASED ON % | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | |

SO CU/CA 33 13.273 3.6702 0.63960 4.8 0.0000

6. KL CU TRUNG BINH/CAY (TO HOP B208 (+) B186)

SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE SO CU 4 20/ 8/** 22:17

---------------------------------------------------------------- PAGE 1

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CONGTHUC$

--------------------------------------------------------------

VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB

KLCU/CAY 2911.4 10 9.0965 22 320.06 0.000

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SO CU 4 20/ 8/** 22:17

---------------------------------------------------------------- PAGE 2

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

MEANS FOR EFFECT CONGTHUC$

-------------------------------------------------------------------------------

CONGTHUC$ NOS KLCU/CAY

B208 3 99.3000

B186 3 117.600

21-1 3 138.500

130/2 3 90.8000

131/1 3 96.2000

131/3 3 53.7000

131/4 3 98.7000

131/5 3 23.5000

131/10 3 104.500

131/11 3 113.800

131/12 3 96.4000

SE (N= 3) 1.74131

5%LSD 22DF 5.10700

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SO CU 4 20/ 8/** 22:17

---------------------------------------------------------------- PAGE 3

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHUC|

(N= 33) -------------------- SD/MEAN |$ |

NO. BASED ON BASED ON % | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | |

KLCU/CAY 33 93.909 30.267 3.0160 3.2 0.0000

7. SO CU/CAY (TO HOP A16 (+) B186)

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO CU/CA FILE SO CU 3 20/ 8/** 22:22

---------------------------------------------------------------- PAGE 1

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

VARIATE V003 SO CU/CA

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 CONGTHUC$ 2 61.0400 30.5200 366.24 0.000 2

* RESIDUAL 6 .499999 .833332E-01

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 8 61.5400 7.69250

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SO CU 3 20/ 8/** 22:22

---------------------------------------------------------------- PAGE 2

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

MEANS FOR EFFECT CONGTHUC$

-------------------------------------------------------------------------------

CONGTHUC$ NOS SO CU/CA

A16 3 15.0000

B186 3 13.2000

81/2 3 8.80000

SE (N= 3) 0.166667

5%LSD 6DF 0.576526

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SO CU 3 20/ 8/** 22:22

---------------------------------------------------------------- PAGE 3

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHUC|

(N= 9) -------------------- SD/MEAN |$ |

NO. BASED ON BASED ON % | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | |

SO CU/CA 9 12.333 2.7735 0.28867 2.3 0.0000

8. KL CU TRUNG BINH/CAY (TO HOP A16 (+) B186)

BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLCU/CAY FILE SO CU 3 20/ 8/** 22:27

---------------------------------------------------------------- PAGE 1

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

VARIATE V003 KLCU/CAY CU/CA CU/CA

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 CONGTHUC$ 2 4250.42 2125.21 92.86 0.000 2

* RESIDUAL 6 137.320 22.8867

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 8 4387.74 548.467

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SO CU 3 20/ 8/** 22:27

---------------------------------------------------------------- PAGE 2

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

MEANS FOR EFFECT CONGTHUC$

-------------------------------------------------------------------------------

CONGTHUC$ NOS KLCU/CAY

A16 3 71.5000

B186 3 117.600

81/2 3 117.600

SE (N= 3) 2.76205

5%LSD 6DF 9.55437

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SO CU 3 20/ 8/** 22:27

---------------------------------------------------------------- PAGE 3

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHUC|

(N= 9) -------------------- SD/MEAN |$ |

NO. BASED ON BASED ON % | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | |

KLCU/CAY 9 102.23 23.419 4.7840 4.7 0.0001

9. CHIEU CAO CAY (TO HOP A15 (+) A41)

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCCAY FILE SO CU 1 20/ 8/** 22:46

---------------------------------------------------------------- PAGE 1

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

VARIATE V003 CCCAY TB TB TB TB/

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 CONGTHUC$ 3 18.2700 6.09000 101.50 0.000 2

* RESIDUAL 8 .480001 .600001E-01

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 11 18.7500 1.70455

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SO CU 1 20/ 8/** 22:46

---------------------------------------------------------------- PAGE 2

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

MEANS FOR EFFECT CONGTHUC$

-------------------------------------------------------------------------------

CONGTHUC$ NOS CCCAY

A15 3 4.10000

A41 3 5.30000

H76 3 7.20000

H79 3 6.80000

SE (N= 3) 0.141422

5%LSD 8DF 0.461161

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SO CU 1 20/ 8/** 22:46

---------------------------------------------------------------- PAGE 3

THIET KE KIEU NGAU NHIEN HOAN TOAN

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHUC|

(N= 12) -------------------- SD/MEAN |$ |

NO. BASED ON BASED ON % | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | |

Phụ lục 11: Bảng test ELISA sau lây nhiễm nhân tạo của các dòng soma 4x và bố mẹ của chúng

Trình tự các mẫu khoai tây kiểm tra sau lây nhiễm 15 ngày được tra vào các giếng của bản ELISA 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A41 A41 A41 A41 TL TL 82-1 81-2 H79 H79 A (-) (+) Cây 3 Cây 3 Cây 2 Cây 2 Cây 2 Cây 2 Cây 2 Cây 2 Cây 4 Cây 4

131/3 131/3 B186 B186 B186 B186 B186 B186 47/11 47/11 47/11 47/11 B Cây 5 Cây 5 Cây 4 Cây 4 Cây 2 Cây 2 Cây 3 Cây 3 Cây 2 Cây 2 Cây 1 Cây 1

A41 A41 130/2 130/2 81-2 131/4 131/4 131/1 131/1 TL TL C 81-2 Cây 5 Cây 5 Cây 5 Cây 2 Cây 2 Cây 5 Cây 1 Cây 1 Cây 1 Cây 1 Cây 1 Cây 1

81-2 81-2 81-2 81-2 131/1 131/1 131/11 131/11 130-2 130-2 H79 H79 D Cây 3 Cây 3 Cây 1 Cây 1 Cây 2 Cây 2 Cây 5 Cây 5 Cây 4 Cây 4 Cây 5 Cây 5

H79 H79 131/4 131/4 131/4 131/4 131/11 131/11 131/3 131/3 H79 H79 E Cây 1 Cây 1 Cây 3 Cây 3 Cây 4 Cây 4 Cây 2 Cây 2 Cây 1 Cây 1 Cây 3 Cây 3

47/24 47/24 47/24 47/24 47/24 47/24 47/11 47/11 131/1 131/1 47/11 47/11 F Cây 1 Cây 1 Cây 2 Cây 2 Cây3 Cây 3 Cây 5 Cây 5 Cây 5 Cây 5 Cây 4 Cây 4

A41 A41 131/11 TL TL 130/2 130/2 131/11 131/11 131/1 131/1 G Cây 4 Cây 4 Cây 1 Cây 3 Cây 3 Cây 1 Cây 1 Cây 3 Cây 3 Cây 4 Cây 4

(+): Đối chứng dương, (-): Đối chứng âm. Mỗi cây lặp lại 2 lần.

KT2: Giống khoai tây trồng không kháng PVY.

81-2 81-2 131/1 131/1 131/3 131/3 131/4 131/4 A41 A41 H79 H79 H Cây 4 Cây 4 Cây 3 Cây 3 Cây 4 Cây 4 Cây 2 Cây 2 Cây 1 Cây 1 Cây 2 Cây 2

Trình tự các mẫu khoai tây kiểm tra sau lây nhiễm 15 ngày được tra vào các giếng của bản ELISA 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A16 131/12 131/3 A16 131/5 131/12 131/5 131/12 47/7 47/7 47/7 A Đ/c ( +) Cây 4 Cây 5 Cây 3 Cây 2 Cây 5 Cây 2 Cây 2 Cây 4 Cây 1 Cây 1 Cây 3

A16 131/12 131/3 A16 131/5 131/12 131/5 131/12 47/7 47/7 47/7 B Đ/c (-) Cây 4 Cây 5 Cây 3 Cây 2 Cây 5 Cây 2 Cây 2 Cây 4 Cây 2 Cây 2 Cây 3

A16 131/10 KT3 131/4 131/12 131/5 131/5 131/2 47/7 47/7 47/7 Cây 5 C Cây 1 Cây 4 Cây 5 Cây 3 Cây 3 Cây 4 Cây 3 Cây 4 Cây 4 Cây 5

D 131/10 KT3 131/4 A16 131/12 131/5 131/5 131/2 47/26 47/26 47/7

Cây 1 Cây 4 Cây 5 Cây 5 Cây 3 Cây 3 Cây 4 Cây 3 Cây 2 Cây 2 Cây 5

KT 3 KT3 B186 131/10 131/12 131/10 131/5 B186 47/26 47/26 47/26 E Cây 2 Cây 3 Cây 5 Cây 4 Cây 1 Cây 2 Cây 1 Cây 1 Cây 4 Cây 4 Cây 5

KT 3 KT3 B186 131/10 131/12 131/10 131/5 B186 47/26 47/26 47/26 F Cây 2 Cây 3 Cây 5 Cây 4 Cây 1 Cây 2 Cây 1 Cây 1 Cây 1 Cây 1 Cây 5

131/10 47/11 131/11 A16 A16 KT3 47/24 131/3 47/26 47/26 G Cây 5 Cây 2 Cây 4 Cây 1 Cây 3 Cây 1 Cây 4 Cây 2 Cây 3 Cây 3

(+): Đối chứng dương, (-): Đối chứng âm. Mỗi cây lặp lại 2 lần.

KT2: Giống khoai tây trồng không kháng PVY.

131/10 47/11 131/11 A16 A16 KT3 47/24 131/3 H Cây 5 Cây 2 Cây 4 Cây 1 Cây 3 Cây 1 Cây 4 Cây 2

Trình tự các mẫu khoai tây kiểm tra sau lây nhiễm 15 ngày được tra vào các giếng của bản ELISA 3

B208

21-1

(+)

Cây 4

Cây 1

Cây 3

Cây 5

Cây 2

Cây 4

B208

A15

H76

47/14

(-)

Cây 4

Cây 1

Cây 2

Cây 1

B208

A15

H76

47/14

Cây 1

Cây 2

Cây 4

Cây 3

Cây 2

Cây 3

B208

A15

H76

47/14

Cây 1

Cây 2

Cây 4

Cây 5

Cây 4

B208

A56

H76

47/14

Cây 3

Cây 1

Cây 5

Cây 2

B208

A56

47/14

Cây 3

Cây 1

Cây 5

B208

A56

Cây 5

Cây 2

Cây 3

Cây 4

Cây 5

B208

A56

A54

A56

Cây 5

Cây 2

Cây 3

Cây 4

Cây 5

Wild species: S. pinnatisectum

Phụ lục 12: Các đặc tính hình thái, sinh trưởng và đặc điểm ra hoa của các con lai soma (2044/1; 2235/1, 2196/4, 2195/2) của tổ hợp lai pnt2G (+) Delikat so với các dòng/giống bố mẹ (Delikat, S.pinnatisectum)

Wild species

S.tarnii

Somatic hybrid

838/11

851/2

838/11

Phụ lục 13. Các đặc tính hình thái, sinh trưởng và đặc điểm ra hoa của các con lai soma (851/2; 838/11) của tổ hợp lai trn3G (+) Delikat so với các dòng/giống bố mẹ (Delikat, S.tarnii)

Phụ lục 14. Hình ảnh que thử test virus nhanh (agdia inc)

Phụ lục 15: Các dòng BC1 triển vọng ngoài đồng ruộng khi thu hoạch

BALANCED ANOVA FOR VARIATE NS FILE THU123 2/ 6/18 22:48 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

phan tich nso lieu khoi luong cu tuoi sau thu hoach

VARIATE V003 NS

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 NL 2 .201500 .100750 1.74 0.202 3

2 G$ 9 3.13408 .348231 6.03 0.001 3

* RESIDUAL 18 1.04017 .577871E-01

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 4.37575 .150888

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THU123 2/ 6/18 22:48

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

phan tich nso lieu khoi luong cu tuoi sau thu hoach

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS NS

1 10 3.39000

2 10 3.19000

3 10 3.27500

SE (N= 10) 0.760178E-01

Phụ lục 16: Xử lý thống đánh giá sinh trưởng phát triển, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các con lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng

5%LSD 18DF 0.225860

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS NS

1305.6 3 3.23333

rasant 3 3.20000

delikat 3 3.16667

1303.4 3 3.23333

1303.22 3 2.83333

1301.5 3 3.46667

1300.3 3 3.53333

atlatic 3 4.00000

solara 3 3.35000

SE (N= 3) 0.138789

5%LSD 18DF 0.412362

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THU123 2/ 6/18 22:48

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

phan tich nso lieu khoi luong cu tuoi sau thu hoach

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NL |G$ |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

NS 30 3.2850 0.38844 0.24039 7.3 0.2019 0.0007

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

VARIATE V003 SCK

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 67.3333 7.48148 7.80 0.000 3

2 NL 2 6.06667 3.03333 3.16 0.065 3

* RESIDUAL 18 17.2667 .959259

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 90.6667 3.12644

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KLCK 8/ 6/18 13:51

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS SCK

1305.6 3 10.3333

Rasant 3 8.00000

Delikat 3 9.00000

1303.4 3 7.00000

1303.22 3 7.33333

1301.5 3 8.00000

1300.3 3 9.00000

Atlantic 3 5.33333

Solara 3 8.66667

SE (N= 3) 0.565467

5%LSD 18DF 1.68009

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS SCK

1 10 7.70000

2 10 8.60000

3 10 8.70000

SE (N= 10) 0.309719

5%LSD 18DF 0.920221

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KLCK 8/ 6/18 13:51

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

SCK 30 8.3333 1.7682 0.97942 11.8 0.0001 0.0654

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 .574613 .638459E-01 13.14 0.000 3

2 NL 2 .180467E-01 .902333E-02 1.86 0.183 3

* RESIDUAL 18 .874867E-01 .486037E-02

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 .680147 .234533E-01

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SOLA 6/ 6/18 21:19

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS KLC

1305.6 3 0.563333

Rasant 3 0.460000

Delikat 3 0.676667

1303.4 3 0.310000

1303.22 3 0.390000

1301.5 3 0.536667

1300.3 3 0.750000

solara 3 0.673333

atlantic 3 0.483333

SE (N= 3) 0.402508E-01

5%LSD 18DF 0.119591

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS KLC

1 10 0.505000

2 10 0.556000

3 10 0.503000

SE (N= 10) 0.220463E-01

5%LSD 18DF 0.655027E-01

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SOLA 6/ 6/18 21:19

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

KLC 30 0.52133 0.15314 0.69716E-01 13.4 0.0000 0.1835

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

VARIATE V003 LA

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 33.0750 3.67500 11.31 0.000 3

2 NL 2 6.65000 3.32500 10.23 0.001 3

* RESIDUAL 18 5.85000 .325000

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 45.5750 1.57155

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SOLA 5/ 6/18 12:28

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS LA

1305.6 3 4.50000

Rasant 3 5.50000

Delikat 3 6.00000

1303.4 3 5.50000

1303.22 3 4.50000

1301.5 3 6.00000

1300.3 3 7.00000

solara 3 6.50000

atlantic 3 8.00000

SE(N= 3) 0.329140

5%LSD 18DF 0.977924

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS LA

1 10 5.20000

2 10 6.05000

3 10 6.30000

SE (N= 10) 0.180278

5% LSD 18DF 0.535631

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SOLA 5/ 6/18 12:28

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

LA 30 5.8500 1.2536 0.57009 9.7 0.0000 0.0011

BALANCED ANOVA FOR VARIATE LA FILE SOLA 5/ 6/18 12:20

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

VARIATE V003 LA

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 42.3000 4.70000 9.20 0.000 3

2 NL 2 15.8000 7.90000 15.46 0.000 3

* RESIDUAL 18 9.20000 .511111

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 67.3000 2.32069

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SOLA 5/ 6/18 12:20

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS LA

1305.6 3 9.50000

Rasant 3 9.50000

Delikat 3 8.00000

1303.4 3 9.00000

1303.22 3 8.50000

1301.5 3 8.50000

1300.3 3 10.0000

solara 3 9.50000

atlantic 3 12.0000

SE(N= 3) 0.412760

5%LSD 18DF 1.22637

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS LA

1 10 8.20000

2 10 9.90000

3 10 9.50000

SE (N= 10) 0.226078

5% LSD 18DF 0.671710

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SOLA 5/ 6/18 12:20

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

LA 30 9.2000 1.5234 0.71492 7.8 0.0000 0.0001

BALANCED ANOVA FOR VARIATE LA FILE SOLA 3/ 6/18 21:56

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

VARIATE V003 LA

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 50.5333 5.61481 3.38 0.013 3

2 NL 2 7.46667 3.73333 2.25 0.133 3

* RESIDUAL 18 29.8667 1.65926

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 87.8667 3.02989

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SOLA 3/ 6/18 21:56

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS LA

1305.6 3 15.0000

Rasant 3 14.6667

Delikat 3 15.6667

1303.4 3 15.0000

1303.22 3 14.0000

1301.5 3 15.6667

1300.3 3 15.3333

solara 3 17.0000

atlantic 3 16.3333

SE (N= 3) 0.743698

5% LSD 18DF 2.20964

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS LA

1 10 14.4000

2 10 15.6000

3 10 15.2000

SE (N= 10) 0.407340

5%LSD 18DF 1.21027

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SOLA 3/ 6/18 21:56

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

LA 30 15.067 1.7407 1.2881 8.5 0.0134 0.1326

BALANCED ANOVA FOR VARIATE LA FILE SOLA 3/ 6/18 22: 7

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

VARATE V003 LA

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 42.5333 4.72593 2.20 0.074 3

2 NL 2 26.6667 13.3333 6.21 0.009 3

* RESIDUAL 18 38.6667 2.14815

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 107.867 3.71954

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SOLA 3/ 6/18 22: 7

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS LA

1305.6 3 20.0000

Rasant 3 20.3333

Delikat 3 22.3333

1303.4 3 21.3333

1303.22 3 19.6667

1301.5 3 20.0000

1300.3 3 20.6667

solara 3 22.6667

atlantic 3 21.6667

SE(N= 3) 0.846197

5%LSD 18DF 2.51418

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS LA

1 10 19.4000

2 10 21.4000

3 10 21.4000

SE(N= 10) 0.463481

5%LSD 18DF 1.37707

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SOLA 3/ 6/18 22: 7

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

LA 30 20.733 1.9286 1.4657 7.1 0.0737 0.0089

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCT FILE TTB1 6/ 6/18 17:27

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 12.7083 1.41204 6.84 0.000 3

2 NL 2 6.95000 3.47500 16.83 0.000 3

* RESIDUAL 18 3.71667 .206482

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 23.3750 .806034

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 17:27

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS CCT

1305.6 3 4.00000

rasant 3 6.00000

delikat 3 4.66667

1303.4 3 4.00000

1303.22 3 4.50000

1301.5 3 5.00000

1300.3 3 4.83333

solara 3 5.66667

atlantic 3 4.83333

SE(N= 3) 0.262349

5%LSD 18DF 0.779478

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS CCT

1 10 4.10000

2 10 4.90000

3 10 5.25000

SE (N= 10) 0.143695

5% LSD 18DF 0.426938

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 17:27

----------------------------------------------------------------- :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 4.7500 0.89779 0.45440 9.6 0.0003 0.0001

----------------------------------------------------------------- :PAGE 1

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 258.368 28.7076 2.07 0.090 3

2 NL 2 60.3915 30.1958 2.18 0.140 3

* RESIDUAL 18 249.467 13.8593

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 568.227 19.5940

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 17:53

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS CCT

1305.6 3 32.7500

rasant 3 37.8333

delikat 3 34.1333

1303.4 3 33.1667

1303.22 3 34.5833

1301.5 3 35.5833

1300.3 3 38.0000

solara 3 39.0667

atlantic 3 36.6667

SE (N= 3) 2.14936

5% LSD 18DF 6.38607

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

NL NOS CCT

1 10 33.0750

2 10 36.3600

3 10 35.7000

SE(N= 10) 1.17725

5%LSD 18DF 3.49779

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 17:53

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 35.045 4.4265 3.7228 10.6 0.0900 0.1405

----------------------------------------------------------------- :PAGE 1

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 258.368 28.7076 2.07 0.090 3

2 NL 2 60.3915 30.1958 2.18 0.140 3

* RESIDUAL 18 249.467 13.8593

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 568.227 19.5940 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 17:53

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

G$ NOS CCT

1305.6 3 32.7500

rasant 3 37.8333

delikat 3 34.1333

1303.4 3 33.1667

1303.22 3 34.5833

1301.5 3 35.5833

1300.3 3 38.0000

solara 3 39.0667

atlantic 3 36.6667

SE(N= 3) 2.14936

5%LSD 18DF 6.38607

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS CCT

1 10 33.0750

2 10 36.3600

3 10 35.7000

SE(N= 10) 1.17725

5%LSD 18DF 3.49779

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 17:53

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 35.045 4.4265 3.7228 10.6 0.0900 0.1405

----------------------------------------------------------------- :PAGE 1

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 258.368 28.7076 2.07 0.090 3

2 NL 2 60.3915 30.1958 2.18 0.140 3

* RESIDUAL 18 249.467 13.8593

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 568.227 19.5940

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 17:53

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS CCT

1305.6 3 32.7500

rasant 3 37.8333

delikat 3 34.1333

1303.4 3 33.1667

1303.22 3 34.5833

1301.5 3 35.5833

1300.3 3 38.0000

solara 3 39.0667

atlantic 3 36.6667

SE(N= 3) 2.14936

5%LSD 18DF 6.38607

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS CCT

1 10 33.0750

2 10 36.3600

3 10 35.7000

SE(N= 10) 1.17725

5%LSD 18DF 3.49779

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 17:53

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 35.045 4.4265 3.7228 10.6 0.0900 0.1405

----------------------------------------------------------------- :PAGE 1

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 258.368 28.7076 2.07 0.090 3

2 NL 2 60.3915 30.1958 2.18 0.140 3

* RESIDUAL 18 249.467 13.8593

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 568.227 19.5940

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 17:53

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS CCT

1305.6 3 32.7500

rasant 3 37.8333

delikat 3 34.1333

1303.4 3 33.1667

1303.22 3 34.5833

1301.5 3 35.5833

1300.3 3 38.0000

solara 3 39.0667

atlantic 3 36.6667

SE(N= 3) 2.14936

5%LSD 18DF 6.38607

------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

------------------------------------------------------------------------------

NL NOS CCT

1 10 33.0750

2 10 36.3600

3 10 35.7000

SE(N= 10) 1.17725

5%LSD 18DF 3.49779

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 17:53

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 35.045 4.4265 3.7228 10.6 0.0900 0.1405

----------------------------------------------------------------- :PAGE 1

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 258.368 28.7076 2.07 0.090 3

2 NL 2 60.3915 30.1958 2.18 0.140 3

* RESIDUAL 18 249.467 13.8593

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 568.227 19.5940

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 17:53

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

G$ NOS CCT

1305.6 3 32.7500

rasant 3 37.8333

delikat 3 34.1333

1303.4 3 33.1667

1303.22 3 34.5833

1301.5 3 35.5833

1300.3 3 38.0000

solara 3 39.0667

atlantic 3 36.6667

SE(N= 3) 2.14936

5%LSD 18DF 6.38607

------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS CCT

1 10 33.0750

2 10 36.3600

3 10 35.7000

SE (N= 10) 1.17725

5% LSD 18DF 3.49779

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 17:53

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 35.045 4.4265 3.7228 10.6 0.0900 0.1405

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCT FILE TTB1 6/ 6/18 18: 4

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 83.1274 9.23638 2.86 0.028 3

2 NL 2 70.0685 35.0342 10.85 0.001 3

* RESIDUAL 18 58.0998 3.22777

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 211.296 7.28606

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 18: 4

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS CCT

1305.6 3 28.0000

rasant 3 28.0000

delikat 3 28.0000

1303.4 3 27.6667

1303.22 3 28.2333

1301.5 3 29.0833

1300.3 3 30.3333

solara 3 32.3333

atlantic 3 30.0000

SE(N= 3) 1.03727

5%LSD 18DF 3.08187

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS CCT

1 10 26.7000

2 10 29.2450

3 10 30.3500

SE (N= 10) 0.568135

5% LSD 18DF 1.68801

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 18: 4

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 28.765 2.6993 1.7966 6.2 0.0276 0.0009

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCT FILE TTB1 6/ 6/18 18:52

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCT FILE TTB1 6/ 6/18 19:11

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 350.253 38.9170 2.87 0.027 3

2 NL 2 453.021 226.511 16.69 0.000 3

* RESIDUAL 18 244.337 13.5743

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 1047.61 36.1245

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 19:11

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS CCT

1305.6 3 46.4167

rasant 3 56.0833

delikat 3 52.7833

1303.4 3 47.5000

1303.22 3 47.3333

1301.5 3 51.7500

1300.3 3 54.3500

solara 3 54.8333

atlantic 3 55.5000

SE(N= 3) 2.12715

5%LSD 18DF 6.32007

------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS CCT

1 10 46.4500

2 10 53.1650

3 10 55.6500

SE(N= 10) 1.16509

5%LSD 18DF 3.46164

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 19:11

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 51.755 6.0104 3.6843 7.1 0.0274 0.0001

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 548.604 60.9560 4.18 0.005 3

2 NL 2 379.129 189.565 12.98 0.000 3

* RESIDUAL 18 262.782 14.5990

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 1190.52 41.0523

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 20:13

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS CCT

1305.6 3 63.0833

rasant 3 67.0000

delikat 3 60.8500

1303.4 3 54.3333

1303.22 3 56.4167

1301.5 3 61.5167

1300.3 3 59.0833

solara 3 63.1167

atlantic 3 65.7500

SE (N= 3) 2.20598

5%LSD 18DF 6.55429

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS CCT

1 10 57.3000

2 10 62.6500

3 10 65.9250

SE(N= 10) 1.20826

5%LSD 18DF 3.58993

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 20:13

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 61.958 6.4072 3.8209 6.2 0.0049 0.0004

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 484.443 53.8270 2.24 0.069 3

2 NL 2 387.127 193.563 8.06 0.003 3

* RESIDUAL 18 432.404 24.0225

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 1303.97 44.9646

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 20:34

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

G$ NOS CCT

1305.6 3 76.0833

rasant 3 79.9167

delikat 3 77.1000

1303.4 3 66.6667

1303.22 3 68.4333

1301.5 3 73.2333

1300.3 3 69.5000

solara 3 75.7500

atlantic 3 73.8167

SE(N= 3) 2.82975

5%LSD 18DF 8.40760

------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS CCT

1 10 69.8850

2 10 71.3150

3 10 78.1190

SE(N= 10) 1.54992

5%LSD 18DF 4.60503

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 20:34

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 73.106 6.7056 4.9013 6.7 0.0693 0.0032

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 233.680 25.9645 0.59 0.786 3

2 NL 2 387.698 193.849 4.43 0.027 3

* RESIDUAL 18 787.006 43.7226

* TOTAL (CORRECTED) 29 1408.38 48.5650

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 20:46

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS CCT

1305.6 3 82.0000

rasant 3 84.9333

delikat 3 88.9333

1303.4 3 80.1167

1303.22 3 83.5667

1301.5 3 81.5000

1300.3 3 82.0667

solara 3 82.4667

atlantic 3 84.1867

SE (N= 3) 3.81762

5% LSD 18DF 11.3427

NL NOS CCT

1 10 79.1000

2 10 87.6560

3 10 81.5750

SE (N= 10) 2.09099

5% LSD 18DF 6.21265

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 20:46

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 82.777 6.9689 6.6123 8.0 0.7864 0.0268

VARIATE V003 CCT

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 G$ 9 233.680 25.9645 0.59 0.786 3

2 NL 2 387.698 193.849 4.43 0.027 3

* RESIDUAL 18 787.006 43.7226

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 1408.38 48.5650

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TTB1 6/ 6/18 20:46

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

MEANS FOR EFFECT G$

-------------------------------------------------------------------------------

G$ NOS CCT

1305.6 3 82.0000

rasant 3 84.9333

delikat 3 88.9333

1303.4 3 80.1167

1303.22 3 83.5667

1301.5 3 81.5000

1300.3 3 82.0667

solara 3 82.4667

atlantic 3 84.1867

SE (N= 3) 3.81762

5% LSD 18DF 11.3427

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT NL

-------------------------------------------------------------------------------

NL NOS CCT

1 10 79.1000

2 10 87.6560

3 10 81.5750

SE(N= 10) 2.09099

5%LSD 18DF 6.21265

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TTB1 6/ 6/18 20:46

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |G$ |NL |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

CCT 30 82.777 6.9689 6.6123 8.0 0.7864 0.0268