Luận án Tiến sỹ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học cây màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.F.) và màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

PHAN NHẬT MINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY MÀN MÀN HOA TÍM (Cleome chelidonii L.f.) VÀ MÀN MÀN HOA VÀNG (Cleome viscosa L.)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Tp. Hồ Chí Minh – 2016

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

……..….***…………

PHAN NHẬT MINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CÂY MÀN MÀN HOA TÍM (Cleome chelidonii L.f.)

VÀ MÀN MÀN HOA VÀNG (Cleome viscosa L.)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên

Mã số: 62.44.01.17

Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. Mai Đình Trị

2. PGS. TS. Mai Thanh Phong

Tp. Hồ Chí Minh – 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của:

ố GS.TS. Nguyễn Ngọc Hạnh, TS. Mai Đình Trị và PGS. TS. Mai Thanh Phong.

Các số liệu và kết quả được nêu trong luận án là hoàn toàn trung thực và

chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Phan Nhật Minh

LỜI CẢM ƠN

Luận án được hoàn thành tại Viện Công nghệ Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa Học và

Công Nghệ Việt Nam.

Tôi xin bày tỏ lòng thành kính cố PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hạnh, Thầy đã dìu dắt tôi

thực hiện luận án này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Mai Đình Trị và PGS. TS. Mai Thanh

Phong đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận án này.

Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của: Ths. Đặng Vũ Lương (Phòng NMR -

Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PGS. TS. Đỗ Thị

Hồng Tươi (Bộ môn Dược lý - Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh)

đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận án này.

Tôi cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Hóa học các Hợp chất Tự Nhiên, Phòng Các chất có

Hoạt tính Sinh học - Viện Công nghệ Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ

Việt Nam đã động viên chia sẻ tôi suốt quá trình thực hiện luận án này

Cuối cùng cảm ơn gia đình và người thân đã luôn động viên giúp đỡ tôi hoàn thành

luận án này.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu [α]D br s CCl4 CHCl3 COSY cs d dd DEPT Tiếng Việt Độ quay cực Mũi đơn rộng Phổ tương tác Cộng sự Mũi đôi Mũi đôi đôi Phổ DEPT

DMSO EMEM

Huyết thanh bào thai bò

EtOAc EtOH FCS Gal Glc HepG2 HMBC

HR- ESI-MS

HSQC

Tiếng Anh Specific rotation Broad singlet Carbon Tetrachloride Chloroform Correlation Spectroscopy Doublet Doublet of doublet Detortionless Enhancement by Polarization Transfer Dimethyl Sulfoxide Eagle's Minimum Essensial Medium Ethyl acetate Ethanol Fetal bovine serum Galactose β-D-glucopyranoside Human hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan người Phổ tương tác dị nhân qua Heteronuclear Multiple Bond nhiều nối Coherence Phổ khối lượng phun mù High Resolution ElectroSpray điện phân giải cao Ionisation Mass Spectrometry Phổ tương tác dị nhân qua Heteronuclear Single Quantum một nối Correlation Hertz Phổ hồng ngoại InfraRed International Unit Hằng số ghép Coupling constant Mũi đa Multiplet Methanol 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid) Nuclear Magnetic Resonance Optical density Cộng hưởng từ hạt nhân Mật độ quang Hz IR IU J m MeOH MTT NMR OD

Parts per million α-L-rhamnopyranoside Reserve phase C-18 Single Succinat dehydrogenase Standard error of the mean ppm Rha RP-18 s SDH SEM

Column chromatography Triplet Thin Layer Chromatography UltraViolet Xylose Chemical shift Pha đảo C-18 Mũi đơn Sai số chuẩn của giá trị trung bình Sắc ký cột Số Thứ Tự Mũi ba Sắc ký lớp mỏng Phổ tử ngoại Độ dịch chuyển hóa học SKC STT t TLC UV Xyl δ

iii

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................... 2 1.1. Tổng quan chi Màn màn .......................................................................................... 2 1.2. Mô tả thực vật .......................................................................................................... 3 1.2.1. Màn màn hoa tím ....................................................................................................... 3 1.2.2. Màn màn hoa vàng ..................................................................................................... 3 1.3. Vùng phân bố ........................................................................................................... 4 1.3.1. Màn màn hoa tím ....................................................................................................... 4 1.3.2. Màn màn hoa vàng ..................................................................................................... 4 1.4. Thành phần hóa học ................................................................................................. 4 1.4.1. Màn màn hoa tím ....................................................................................................... 4 1.4.2. Màn màn hoa vàng ..................................................................................................... 5 1.5. Những nghiên cứu về dược tính ............................................................................... 9 1.5.1. Màn màn hoa tím ....................................................................................................... 9 1.5.2. Màn màn hoa vàng ................................................................................................... 10 1.6. Bệnh gan và thuốc bảo vệ gan ................................................................................ 13 1.7. Dòng tế bào HepG2 ................................................................................................ 13 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .................................................................................... 15 2.1. Mẫu thực vật ........................................................................................................... 15 2.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................................. 15 2.2.1. Hóa chất ................................................................................................................... 15 2.2.2. Thiết bị ..................................................................................................................... 15 2.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học .......................................................... 16 2.3.1. Khảo sát khả năng gây độc tế bào in vitro bằng phương pháp MTT ....................... 16 2.3.2. Khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan trên dòng tế bào HepG2 ................................ 17 2.4. Phân lập các hợp chất ............................................................................................. 18 2.4.1. Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa tím ................................................... 18 2.4.2. Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa tím ............................................... 18 2.4.3. Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa vàng ................................................ 20 2.4.4. Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa vàng ............................................ 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .................................................................. 22 3.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập được ..................................................................... 22 3.1.1. Hợp chất 1: Quercetin-7-O-α-L-rhamnopyranoside ................................................. 22 3.1.2. Hợp chất 2: Quercitrin.............................................................................................. 24 3.1.3. Hợp chất 3: Isoquercitrin.......................................................................................... 25 3.1.4. Hợp chất 4: Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside ........ 26

3.1.5. Hợp chất 5:Quercetin-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L-rhamnopyranoside-7-

O-α-L-rhamnopyranoside ........................................................................................... 28 3.1.6. Hợp chất 6: Cleomeside A (Mới) ............................................................................. 31 3.1.7. Hợp chất 7: Quercetin-3-O-[2"-O-(6'''-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranosyl]-α-L-

rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside ......................................................... 33 3.1.8. Hợp chất 8: Cleomeside B (Mới) ............................................................................. 35 3.1.9. Hợp chất 9: Visconoside A (Mới) ............................................................................ 38 3.1.10. Hợp chất 10: Visconoside B (Mới) ........................................................................ 40 3.1.11. Hợp chất 11: Kaempferol-3-O-methylether ........................................................... 43 3.1.12. Hợp chất 12: Kaempferol-3,4'-O-dimethylether .................................................... 45 3.1.13. Hợp chất 13: Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside ............................................ 46 3.1.14. Hợp chất 14: Kaempferol-7-O-α-L-rhamnopyranoside ......................................... 47 3.1.15. Hợp chất 15: Kaempferol-3-O-(4-O-acetyl-α-L-rhamnopyranoside) .................... 49 3.1.16. Hợp chất 16: Kaempferol-3-O-(2,4-O-diacetyl-α-L-rhamnopyranoside) .............. 51 3.1.17. Hợp chất 17: Kaempferol-3,7-O-α-L-dirhamnopyranoside ................................... 53 3.1.18. Hợp chất 18:Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside .. 54 3.1.19. Hợp chất 19:Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside56 3.1.20. Hợp chất 20: Cleomeside C (Mới) ......................................................................... 58 3.1.21. Hợp chất 21: Glycerol monostearate ...................................................................... 61 3.1.22. Hợp chất 22: Ethyl α-galactopyranoside ................................................................ 63 3.1.23. Hợp chất 23: Adenine ............................................................................................ 64 3.1.24. Hợp chất 24: 5-(Hydroxymethyl)-2-furaldehyde ................................................... 65 3.1.25. Hợp chất 25: Emodin-8-O-β-D-glucopyranoside ................................................... 66 3.2. Khảo sát khả năng gây độc tế bào và tác dụng bảo vệ tế bào gan ......................... 68 3.3. Nhận xét chung ....................................................................................................... 74 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 77 KẾT LUẬN ................................................................................................................... 77 KIẾN NGHỊ .................................................................................................................. 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 79 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ..................................................... 89

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1.1: Danh mục các loài có giá trị trong họ Màn màn ở Việt Nam ......................... 2 Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 1 ........................................................................ 23 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 2 ........................................................................ 24 Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 3 ........................................................................ 26 Bảng 3.4: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 4 ....................................................................... 27 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 5 ....................................................................... 30 Bảng 3.6: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 6 ....................................................................... 32 Bảng 3.7: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 7 ....................................................................... 34 Bảng 3.8: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 8 ....................................................................... 36 Bảng 3.9: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 9 ....................................................................... 39 Bảng 3.10: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 10 ................................................................... 41 Bảng 3.11: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 11 ................................................................... 44 Bảng 3.12: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 12 ................................................................... 45 Bảng 3.13: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 13 ................................................................... 47 Bảng 3.14: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 14 ................................................................... 48 Bảng 3.15: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 15 ................................................................... 50 Bảng 3.16: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 16 ................................................................... 52 Bảng 3.17: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 17 ................................................................... 53 Bảng 3.18: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 18 ................................................................... 55 Bảng 3.19: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 19 ................................................................... 57 Bảng 3.20: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 20 ................................................................... 59 Bảng 3.21: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 21.................................................................... 62 Bảng 3.22: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 22.................................................................... 63 Bảng 3.23: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 23.................................................................... 65 Bảng 3.24: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 24.................................................................... 66 Bảng 3.25: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 25.................................................................... 67 Bảng 3.26: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết từ Màn màn hoa tím trên dòng

tế bào HepG2 ......................................................................................................... 69 Bảng 3.27: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết từ Màn màn hoa vàng trên dòng tế bào HepG2 ......................................................................................................... 70 Bảng 3.28: Khả năng gây độc tế bào của các hợp chất trên dòng tế bào HepG2 .......... 71 Bảng 3.29: Tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào gan HepG2 do CCl4 2 mM gây ra sau 24 giờ của các chất phân lập từ cao MeOH lá/thân Màn màn hoa tím và Màn màn hoa vàng ..................................................................................... 72

DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH

Trang Sơ đồ 1: Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa tím ......................................... 18 Sơ đồ 2: Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa tím ..................................... 19 Sơ đồ 3: Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa vàng ....................................... 20 Sơ đồ 4: Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa vàng ................................... 21 Hình 2.1: Màn màn hoa tím ........................................................................................... 15 Hình 2.2: Màn màn hoa vàng ........................................................................................ 15 Hình 3.1: Cấu trúc hóa học hợp chất 1 .......................................................................... 22 Hình 3.2: Cấu trúc hóa học hợp chất 2 .......................................................................... 24 Hình 3.3: Cấu trúc hóa học hợp chất 3 .......................................................................... 25 Hình 3.4: Cấu trúc hóa học hợp chất 4 .......................................................................... 28 Hình 3.5: Cấu trúc hóa học hợp chất 5 .......................................................................... 28 Hình 3.6: Cấu trúc hóa học hợp chất 6 .......................................................................... 31 Hình 3.7: Cấu trúc hóa học hợp chất 7 .......................................................................... 33 Hình 3.8: Cấu trúc hóa học hợp chất 8 .......................................................................... 37 Hình 3.9: Cấu trúc hóa học hợp chất 9 .......................................................................... 38 Hình 3.10: Cấu trúc hóa học hợp chất 10 ...................................................................... 40 Hình 3.11: Cấu trúc hóa học hợp chất 11 ...................................................................... 43 Hình 3.12: Cấu trúc hóa học hợp chất 12 ...................................................................... 45 Hình 3.13: Cấu trúc hóa học hợp chất 13 ...................................................................... 46 Hình 3.14: Cấu trúc hóa học hợp chất 14 ...................................................................... 48 Hình 3.15: Cấu trúc hóa học hợp chất 15 ...................................................................... 49 Hình 3.16: Cấu trúc hóa học hợp chất 16 ...................................................................... 51 Hình 3.17: Cấu trúc hóa học hợp chất 17 ...................................................................... 54 Hình 3.18: Cấu trúc hóa học hợp chất 18 ...................................................................... 54 Hình 3.19: Cấu trúc hóa học hợp chất 19 ...................................................................... 56 Hình 3.20: Cấu trúc hóa học hợp chất 20 ...................................................................... 58 Hình 3.21: Cấu trúc hóa học hợp chất 21 ...................................................................... 62 Hình 3.22: Cấu trúc hóa học hợp chất 22 ...................................................................... 63 Hình 3.23: Cấu trúc hóa học hợp chất 23 ...................................................................... 64 Hình 3.24: Cấu trúc hóa học hợp chất 24 ...................................................................... 66 Hình 3.25: Cấu trúc hóa học hợp chất 25 ...................................................................... 67

vii

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 1 ................................................................... PL-1 Phụ lục 1b: Phổ 1H-NMR hợp chất 1 ........................................................................ PL-1 Phụ lục 1c: Phổ 13C-NMR hợp chất 1 ....................................................................... PL-2 Phụ lục 1d: Phổ DEPT hợp chất 1 ............................................................................. PL-2 Phụ lục 1e: Phổ HSQC hợp chất 1 ............................................................................ PL-3 Phụ lục 1f: Phổ HMBC hợp chất 1 ............................................................................ PL-3 Phụ lục 1g: Phổ COSY hợp chất 1 ............................................................................ PL-4 Phụ lục 2a: Phổ 1H-NMR hợp chất 2 ........................................................................ PL-4 Phụ lục 2b: Phổ 13C-NMR hợp chất 2 ....................................................................... PL-5 Phụ lục 2c: Phổ DEPT hợp chất 2 ............................................................................. PL-5 Phụ lục 2d: Phổ HSQC hợp chất 2 ............................................................................ PL-6 Phụ lục 2e: Phổ HMBC hợp chất 2 ........................................................................... PL-6 Phụ lục 3a: Phổ 1H-NMR hợp chất 3 ........................................................................ PL-7 Phụ lục 3b: Phổ 13C-NMR hợp chất 3 ....................................................................... PL-7 Phụ lục 3c: Phổ DEPT hợp chất 3 ............................................................................. PL-8 Phụ lục 3d: Phổ HSQC hợp chất 3 ............................................................................ PL-8 Phụ lục 3e: Phổ HMBC hợp chất 3 ........................................................................... PL-9 Phụ lục 4a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 4 ................................................................... PL-9 Phụ lục 4b: Phổ 1H-NMR hợp chất 4 ...................................................................... PL-10 Phụ lục 4c: Phổ 13C-NMR hợp chất 4 ..................................................................... PL-10 Phụ lục 4d: Phổ DEPT hợp chất 4 ........................................................................... PL-11 Phụ lục 4e: Phổ HSQC hợp chất 4 .......................................................................... PL-11 Phụ lục 4f: Phổ HMBC hợp chất 4 .......................................................................... PL-12 Phụ lục 4g: Phổ COSY hợp chất 4 .......................................................................... PL-12 Phụ lục 5a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 5 ................................................................. PL-13 Phụ lục 5b: Phổ 1H-NMR hợp chất 5 ...................................................................... PL-13 Phụ lục 5c: Phổ 13C-NMR hợp chất 5 ..................................................................... PL-14 Phụ lục 5d: Phổ DEPT hợp chất 5 ........................................................................... PL-14 Phụ lục 5e: Phổ HSQC hợp chất 5 .......................................................................... PL-15 Phụ lục 5f: Phổ HMBC hợp chất 5 .......................................................................... PL-15 Phụ lục 5g: Phổ COSY hợp chất 5 .......................................................................... PL-16 Phụ lục 6a: Phổ UV-Vis hợp chất 6 ......................................................................... PL-16 Phụ lục 6b: Phổ IR hợp chất 6 ................................................................................. PL-17 Phụ lục 6c: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 6 ................................................................. PL-17 Phụ lục 6d: Phổ 1H-NMR hợp chất 6 ...................................................................... PL-17 Phụ lục 6e: Phổ 13C-NMR hợp chất 6 ..................................................................... PL-18 Phụ lục 6f: Phổ DEPT hợp chất 6 ............................................................................ PL-18 Phụ lục 6g: Phổ HSQC hợp chất 6 .......................................................................... PL-19 Phụ lục 6h: Phổ HMBC hợp chất 6 ......................................................................... PL-19 Phụ lục 6i: Phổ COSY hợp chất 6 ........................................................................... PL-20

viii

Phụ lục 7a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 7 ................................................................. PL-20 Phụ lục 7b: Phổ 1H-NMR hợp chất 7 ...................................................................... PL-21 Phụ lục 7c: Phổ 13C-NMR hợp chất 7 ..................................................................... PL-21 Phụ lục 7d: Phổ DEPT hợp chất 7 ........................................................................... PL-22 Phụ lục 7e: Phổ HSQC hợp chất 7 .......................................................................... PL-22 Phụ lục 7f: Phổ HMBC hợp chất 7 .......................................................................... PL-23 Phụ lục 7g: Phổ COSY hợp chất 7 .......................................................................... PL-23 Phụ lục 8a: Phổ UV-Vis hợp chất 8 ......................................................................... PL-24 Phụ lục 8b: Phổ IR hợp chất 8 ................................................................................. PL-24 Phụ lục 8c: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 8 ................................................................. PL-24 Phụ lục 8d: Phổ 1H-NMR hợp chất 8 ...................................................................... PL-25 Phụ lục 8e: Phổ 13C-NMR hợp chất 8 ..................................................................... PL-25 Phụ lục 8f: Phổ DEPT hợp chất 8 ............................................................................ PL-26 Phụ lục 8g: Phổ HSQC hợp chất 8 .......................................................................... PL-26 Phụ lục 8h: Phổ HMBC hợp chất 8 ......................................................................... PL-27 Phụ lục 8i: Phổ COSY hợp chất 8 ........................................................................... PL-27 Phụ lục 9a: Phổ UV-Vis hợp chất 9 ......................................................................... PL-28 Phụ lục 9b: Phổ IR hợp chất 9 ................................................................................. PL-28 Phụ lục 9c: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 9 ................................................................. PL-28 Phụ lục 9d: Phổ 1H-NMR hợp chất 9 ...................................................................... PL-29 Phụ lục 9e: Phổ 13C-NMR hợp chất 9 ..................................................................... PL-29 Phụ lục 9f: Phổ DEPT hợp chất 9 ............................................................................ PL-30 Phụ lục 9g: Phổ HSQC hợp chất 9 .......................................................................... PL-30 Phụ lục 9h: Phổ HMBC hợp chất 9 ......................................................................... PL-31 Phụ lục 9i: Phổ COSY hợp chất 9 ........................................................................... PL-31 Phụ lục 10a: Phổ UV-Vis hợp chất 10 ..................................................................... PL-32 Phụ lục 10b: Phổ IR hợp chất 10 ............................................................................. PL-32 Phụ lục 10c: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 10 ............................................................. PL-32 Phụ lục 10d: Phổ 1H-NMR hợp chất 10 .................................................................. PL-33 Phụ lục 10e: Phổ 13C-NMR hợp chất 10 ................................................................. PL-33 Phụ lục 10f: Phổ DEPT hợp chất 10 ........................................................................ PL-34 Phụ lục 10g: Phổ HSQC hợp chất 10 ...................................................................... PL-34 Phụ lục 10h: Phổ HMBC hợp chất 10 ..................................................................... PL-35 Phụ lục 10i: Phổ COSY hợp chất 10 ....................................................................... PL-35 Phụ lục 11a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 11 ............................................................. PL-36 Phụ lục 11b: Phổ 1H-NMR hợp chất 11................................................................... PL-36 Phụ lục 11c: Phổ 13C-NMR hợp chất 11 .................................................................. PL-37 Phụ lục 11d: Phổ DEPT hợp chất 11 ....................................................................... PL-37 Phụ lục 11e: Phổ HSQC hợp chất 11 ....................................................................... PL-38 Phụ lục 11f: Phổ HMBC hợp chất 11 ...................................................................... PL-38 Phụ lục 12a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 12 ............................................................. PL-39

Phụ lục 12b: Phổ 1H-NMR hợp chất 12 .................................................................. PL-39 Phụ lục 12c: Phổ 13C-NMR hợp chất 12 ................................................................. PL-40 Phụ lục 12d: Phổ DEPT hợp chất 12 ....................................................................... PL-40 Phụ lục 12e: Phổ HSQC hợp chất 12 ...................................................................... PL-41 Phụ lục 12f: Phổ HMBC hợp chất 12 ...................................................................... PL-41 Phụ lục 13a: Phổ 1H-NMR hợp chất 13 .................................................................. PL-42 Phụ lục 13b: Phổ 13C-NMR hợp chất 13 ................................................................. PL-42 Phụ lục 13c: Phổ DEPT hợp chất 13 ....................................................................... PL-43 Phụ lục 13d: Phổ HSQC hợp chất 13 ...................................................................... PL-43 Phụ lục 13e: Phổ HMBC hợp chất 13 ..................................................................... PL-44 Phụ lục 14a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 14 ............................................................. PL-44 Phụ lục 14b: Phổ 1H-NMR hợp chất 14 .................................................................. PL-45 Phụ lục 14c: Phổ 13C-NMR hợp chất 14 ................................................................. PL-45 Phụ lục 14d: Phổ DEPT hợp chất 14 ....................................................................... PL-46 Phụ lục 14e: Phổ HSQC hợp chất 14 ...................................................................... PL-46 Phụ lục 14f: Phổ HMBC hợp chất 14 ...................................................................... PL-47 Phụ lục 14g: Phổ COSY hợp chất 14 ...................................................................... PL-47 Phụ lục 15a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 15 ............................................................. PL-48 Phụ lục 15b: Phổ 1H-NMR hợp chất 15 .................................................................. PL-48 Phụ lục 15c: Phổ 13C-NMR hợp chất 15 ................................................................. PL-49 Phụ lục 15d: Phổ DEPT hợp chất 15 ....................................................................... PL-49 Phụ lục 15e: Phổ HSQC hợp chất 15 ...................................................................... PL-50 Phụ lục 15f: Phổ HMBC hợp chất 15 ...................................................................... PL-50 Phụ lục 16a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 16 ............................................................. PL-51 Phụ lục 16b: Phổ 1H-NMR hợp chất 16 .................................................................. PL-51 Phụ lục 16c: Phổ 13C-NMR hợp chất 16 ................................................................. PL-52 Phụ lục 16d: Phổ DEPT hợp chất 16 ....................................................................... PL-52 Phụ lục 16e: Phổ HSQC hợp chất 16 ...................................................................... PL-53 Phụ lục 16f: Phổ HMBC hợp chất 16 ...................................................................... PL-53 Phụ lục 16g: Phổ COSY hợp chất 16 ...................................................................... PL-54 Phụ lục 17a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 17 ............................................................. PL-54 Phụ lục 17b: Phổ 1H-NMR hợp chất 17 .................................................................. PL-55 Phụ lục 17c: Phổ 13C-NMR hợp chất 17 ................................................................. PL-55 Phụ lục 17d: Phổ DEPT hợp chất 17 ....................................................................... PL-56 Phụ lục 17e: Phổ HSQC hợp chất 17 ...................................................................... PL-56 Phụ lục 17f: Phổ HMBC hợp chất 17 ...................................................................... PL-57 Phụ lục 17g: Phổ COSY hợp chất 17 ...................................................................... PL-57 Phụ lục 18a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 18 ............................................................. PL-58 Phụ lục 18b: Phổ 1H-NMR hợp chất 18 .................................................................. PL-58 Phụ lục 18c: Phổ 13C-NMR hợp chất 18 ................................................................. PL-59 Phụ lục 18d: Phổ DEPT hợp chất 18 ....................................................................... PL-59

Phụ lục 18e: Phổ HSQC hợp chất 18 ...................................................................... PL-60 Phụ lục 18f: Phổ HMBC hợp chất 18 ...................................................................... PL-60 Phụ lục 18g: Phổ COSY hợp chất 18 ...................................................................... PL-61 Phụ lục 19a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 19 ............................................................. PL-61 Phụ lục 19b: Phổ 1H-NMR hợp chất 19 .................................................................. PL-62 Phụ lục 19c: Phổ 13C-NMR hợp chất 19 ................................................................. PL-62 Phụ lục 19d: Phổ DEPT hợp chất 19 ....................................................................... PL-63 Phụ lục 19e: Phổ HSQC hợp chất 19 ...................................................................... PL-63 Phụ lục 19f: Phổ HMBC hợp chất 19 ...................................................................... PL-64 Phụ lục 19g: Phổ COSY hợp chất 19 ...................................................................... PL-64 Phụ lục 20a: Phổ UV-Vis hợp chất 20 ..................................................................... PL-65 Phụ lục 20b: Phổ IR hợp chất 20 ............................................................................. PL-65 Phụ lục 20c: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 20 ............................................................. PL-65 Phụ lục 20d: Phổ 1H-NMR hợp chất 20 .................................................................. PL-66 Phụ lục 20e: Phổ 13C-NMR hợp chất 20 ................................................................. PL-66 Phụ lục 20f: Phổ DEPT hợp chất 20 ........................................................................ PL-67 Phụ lục 20g: Phổ HSQC hợp chất 20 ...................................................................... PL-67 Phụ lục 20h: Phổ HMBC hợp chất 20 ..................................................................... PL-68 Phụ lục 20i: Phổ COSY hợp chất 20 ....................................................................... PL-68 Phụ lục 21a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 21 ............................................................. PL-69 Phụ lục 21b: Phổ 1H-NMR hợp chất 21 .................................................................. PL-69 Phụ lục 21c: Phổ 13C-NMR hợp chất 21 ................................................................. PL-70 Phụ lục 21d: Phổ DEPT hợp chất 21 ....................................................................... PL-70 Phụ lục 21e: Phổ HSQC hợp chất 21 ...................................................................... PL-71 Phụ lục 21f: Phổ HMBC hợp chất 21 ...................................................................... PL-71 Phụ lục 22a: Phổ 1H-NMR hợp chất 22 .................................................................. PL-72 Phụ lục 22b: Phổ 13C-NMR hợp chất 22 ................................................................. PL-72 Phụ lục 22c: Phổ DEPT hợp chất 22 ....................................................................... PL-73 Phụ lục 22d: Phổ HSQC hợp chất 22 ...................................................................... PL-73 Phụ lục 22e: Phổ HMBC hợp chất 22 ..................................................................... PL-74 Phụ lục 23a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 23 ............................................................. PL-74 Phụ lục 23b: Phổ 1H-NMR hợp chất 23 .................................................................. PL-75 Phụ lục 23c: Phổ 13C-NMR hợp chất 23 ................................................................. PL-75 Phụ lục 23d: Phổ HSQC hợp chất 23 ...................................................................... PL-76 Phụ lục 23e: Phổ HMBC hợp chất 23 ..................................................................... PL-76 Phụ lục 24a: Phổ 1H-NMR hợp chất 24 .................................................................. PL-77 Phụ lục 24b: Phổ 13C-NMR hợp chất 24 ................................................................. PL-77 Phụ lục 24c: Phổ DEPT hợp chất 24 ....................................................................... PL-78 Phụ lục 24d: Phổ HSQC hợp chất 24 ...................................................................... PL-78 Phụ lục 24e: Phổ HMBC hợp chất 24 ..................................................................... PL-79 Phụ lục 25a: Phổ HR-ESI-MS hợp chất 25 ............................................................. PL-79

Phụ lục 25b: Phổ 1H-NMR hợp chất 25 .................................................................. PL-80 Phụ lục 25c: Phổ 13C-NMR hợp chất 25 ................................................................. PL-80 Phụ lục 25d: Phổ DEPT hợp chất 25 ....................................................................... PL-81 Phụ lục 25e: Phổ HSQC hợp chất 25 ...................................................................... PL-81 Phụ lục 25f: Phổ HMBC hợp chất 25 ...................................................................... PL-82 Phụ lục 25g: Phổ COSY hợp chất 25 ...................................................................... PL-82 Phụ lục 26a: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa tím trên tế

bào HepG2 sau 24 giờ ..................................................................................... PL-83

Phụ lục 26b: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa tím trên tế

bào HepG2 sau 48 giờ ..................................................................................... PL-83

Phụ lục 26c: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa tím trên tế

bào HepG2 sau 72 giờ ..................................................................................... PL-84

Phụ lục 27a: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa tím trên tế

bào HepG2 sau 24 giờ ..................................................................................... PL-84 Phụ lục 27b: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa tím trên tế bào HepG2 sau 48 giờ ..................................................................................... PL-85

Phụ lục 27c: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa tím trên tế

bào HepG2 sau 72 giờ ..................................................................................... PL-85

Phụ lục 28a: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa vàng trên tế

bào HepG2 sau 24 giờ ..................................................................................... PL-86

Phụ lục 28b: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa vàng trên tế

bào HepG2 sau 48 giờ ..................................................................................... PL-86

Phụ lục 28c: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết lá Màn màn hoa vàng trên tế

bào HepG2 sau 72 giờ ..................................................................................... PL-87

Phụ lục 29a: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa vàng trên

tế bào HepG2 sau 24 giờ ................................................................................. PL-87

Phụ lục 29b: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa vàng trên

tế bào HepG2 sau 48 giờ ................................................................................. PL-88

Phụ lục 29c: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết thân Màn màn hoa vàng trên

tế bào HepG2 sau 72 giờ ................................................................................. PL-88 Phụ lục 30a: Khả năng gây độc tế bào của các hợp chất trên dòng tế bào HepG2 . PL-89 Phụ lục 30b: Tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào gan HepG2 do CCl4 2

mM gây ra sau 24 giờ của các chất phân lập từ cao MeOH lá/thân màn màn hoa tím và màn màn hoa vàng ................................................................................ PL-89 Phụ lục 31a: Định danh tên khoa học cây Màn màn hoa tím .................................. PL-90 Phụ lục 31b: Định danh tên khoa học cây Màn màn hoa vàng ............................... PL-90 Phụ lục 32a: Kết quả tra Scifinder ngày 26/7/2013 hợp chất cleomeside A ........... PL-91 Phụ lục 32b: Kết quả tra Scifinder ngày 26/12/2013 hợp chất cleomeside B ......... PL-91 Phụ lục 32c: Kết quả tra Scifinder ngày 6/12/2014 hợp chất cleomeside C ........... PL-91 Phụ lục 32d: Kết quả tra Scifinder ngày 7/4/2015 hợp chất visconoside A ............ PL-92 Phụ lục 32e: Kết quả tra Scifinder ngày 28/5/2015 hợp chất visconoside B .......... PL-92

MỞ ĐẦU

Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo Phạm

Hoàng Hộ, thực vật Việt Nam khoảng 12.000 loài cây có mạch, không kể rong, rêu và nấm[6]. Số loài cây thuốc đã thống kê được ở Việt Nam là 3948 loài thuộc 307 họ thực

vật và nấm, chiếm 37,6 % số loài trong tự nhiên.

Thông qua việc khảo sát các đặc điểm hóa thực vật, dược tính… của cây thuốc,

chúng ta có thể từng bước lý giải thích việc trị bệnh của thảo dược, đồng thời tiêu

chuẩn hoá các bài thuốc cổ truyền nhằm sử dụng một cách hợp lý, có hiệu quả đồng

thời góp phần bảo tồn cây thuốc dân tộc. Chính vì vậy, việc nghiên cứu hóa học các

hợp chất thiên nhiên định hướng vào hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng.

Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa

L.) mọc hoang khắp Việt Nam. Trong dân gian, Màn màn hoa tím được dùng chữa các

chứng cảm cúm nóng lạnh, nhức đầu, ho hen, và chữa cả rắn cắn, lá dùng chữa viêm

đau thận. Toàn cây Màn màn hoa vàng nấu nước xông chữa nhức đầu. Rễ có tính kích

thích và chống bệnh hoại huyết, bệnh chảy máu chân răng. Quả non ăn kích thích tiêu

hoá. Hạt làm thuốc xoa bóp chữa tê thấp và cũng dùng trị giun.

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu phục vụ y

học nhưng đa số chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát hoạt tính sinh học của các dịch chiết,

và rất ít công trình nghiên cứu chi tiết về thành phần hóa học của các hợp chất có trong

hai loài này.

Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học hai loài Màn màn

hoa tím (Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.), xác định

hoạt tính sinh học hoạt chất phân lập cũng như cao chiết làm cơ sở khoa học cho việc

sử dụng dược liệu hoặc phát hiện ra những hoạt tính mới, góp phần nâng cao giá trị

loại dược liệu này tại Việt Nam. Luận án giới thiệu kết quả nghiên cứu về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.f.)

và Màn màn hoa vàng (Cleome vicosa L.).

Nội dung chính của luận án bao gồm:

1. Phân lập các hợp chất tinh khiết từ hai loài Màn màn hoa tím và Màn màn hoa vàng.

2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.

3. Thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết và các hợp chất phân lập được.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan chi Màn màn

Họ Màn màn (Cleomaceae) phân bố khắp các vùng nhiệt đới và các vùng có khí hậu

nóng ấm trên thế giới. Tại Việt Nam có khoảng 55 loài và thứ, có ý nghĩa kinh tế về

nhiều mặt như: Phần lớn các loài trong họ được sử dụng làm thuốc, làm thức ăn (rau

ăn, lấy quả) cho người và động vật, lấy gỗ, làm cảnh vì có hoa đẹp... Bên cạnh đó, họ

Màn màn còn có giá trị khoa học như được sử dụng nhiều trong nghiên cứu di truyền học, tế bào học…[7]

Bảng 1.1: Danh mục các loài có giá trị trong họ Màn màn ở Việt Nam

STT Tên khoa học Tên Việt Nam LT TP LG LC CDK

Cáp vàng X X X

Cáp to X X X

Bạch hoa X

Cáp gai nhỏ X X

Cáp lá xá lị X X

Cáp hàng rào X

Cáp xiêm X

1 Capparis flavicans Kurz 2 Capparis grandis L. 3 Capparis khuamak Gagnep. 4 Capparis micracantha DC. 5 Capparis pyrifolia Lamk. 6 Capparis sepiaria L. 7 Capparis siamensis Kurz 8 Capparis sikkimensis Kurz Bạch hoa X X

Capparis thorelii var. pranensis 9 Dây độc mộc ô X Gagnep.

Cáp bắc bộ X

X Hồng trâu

Cáp gai đen X X

Màn màn hoa tím X

Màn màn trắng X X X

Màn màn đẹp X

Màn màn gai X

Màn màn vàng X X X

Bún to X X X

10 Capparis tonkinensis Gagnep. 11 Capparis versicolor Griff. 12 Capparis zeylanica L. 13 Cleome chelidonii L.f. 14 Cleome gynandra L. 15 Cleome speciosa Raf. 16 Cleome spinosa Jacq. 17 Cleome viscosa L. 18 Crateva magna (Lour.) DC. 19 Crateva religiosa Forst. f. Bún nước X X X X X

20 Crateva roxburghii R. Br. Mấm núi X X X

21 Crateva unilocularis Buch-Ham. Bún một buồng X X

22 Niebuhria siamensis Kurz Chan chan X

23 Stixis fasciculata Gagnep. Dây tấm cám X X

24 X Stixis scandens Lour. Trứng cuốc

25 Stixis suaveolens Pierre X X

X Tôn nấm Ghi chú: LT: làm thuốc; TP: thực phẩm (làm rau ăn, lấy quả); LG: lấy gỗ; LC: làm

cảnh; CDK: công dụng khác

1.2. Mô tả thực vật

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hai loài thuộc họ Màn màn: Màn màn hoa tím

(Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa L.).

1.2.1. Màn màn hoa tím [6]

Tên Việt Nam: Màn màn tím, màn ri tím, màn ri tía.

Tên khoa học: Cleome chelidonii L.f.

Tên đồng danh: Cleome rutidosperma DC., Polanisia chelidonii (L.f.) DC.

Họ: Cleomaceae, Chi: Cleome

Cây thân thảo cao 20 - 40 cm. Thân có 5 cạnh, ít lông, màu xanh nhạt hay đỏ. Lá

kép ba lá chét, lá giữa lớn hơn, cuống lá dài bằng phiến hay gấp rưỡi phiến lá.

Hoa đơn độc tại nách lá, có cuống dài, lá đài 4, cánh hoa 4, nhị 6, bầu có lông, vòi

nhuỵ ngắn, quả dạng quả cải dài. 1.2.2. Màn màn hoa vàng [1,6]

Tên Việt Nam: Màn màn vàng, sơn tiên.

Tên khoa học: Cleome viscosa L.

Tên đồng danh: Polanisia viscosa (L.) DC., Cleome isocandra L.

Họ: Cleomaceae, Chi: Cleome

Cây thảo sống hằng năm cao đến 80 cm, rễ khỏe, vặn vẹo. Thân và cành hơi khía

rãnh, phủ lông mềm và dính. Lá mọc so le, kép chân vịt gồm 3 - 5 lá chét dài 3 - 4 cm,

rộng 1 - 1,5 cm, hai mặt có lông nhất là ở mặt bên, mép có lông nhỏ dạng mi. Cụm hoa

mọc thành chùm dài ở ngọn, hoa có 4 lá đài màu lục, 4 cánh màu vàng dài 7 - 12 mm,

đài có 4 phiến có lông ở mặt ngoài, tràng có 4 cánh hình trái xoan, 7 - 30 nhị với bao

phấn xanh, chỉ nhị mảnh đính ở dưới bầu, bầu hẹp và thuôn dài. Quả loại quả cải dài

5 - 9 cm, hạt 1,5 mm.

1.3. Vùng phân bố [8]

1.3.1. Màn màn hoa tím

Loài của vùng Ấn Độ - Malaysia, mọc khắp nơi ở nước ta. Mọc hoang tại chỗ đất

thấp, nơi ẩm ướt, bãi trống, dọc đường đi. Ra hoa quanh năm.

Màn màn hoa tím phát triển nhiều ở các tỉnh khu vực Tây Nguyên và các tỉnh thuộc

Nam Bộ, thời gian thu hái cây quanh năm. Tại Đồng Nai và các khu vực lân cận, cây

mọc rất nhiều với trữ lượng lớn. Cây sinh trưởng nhanh, ra hoa quả nhiều.

1.3.2. Màn màn hoa vàng

Màn màn hoa vàng là loại cây nhiệt đới, phân bố chủ yếu ở khu vực Nam và Đông

Nam Á bao gồm Ấn Độ, Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào, Việt Nam và

một số nơi ở phía nam Trung Quốc. Tại Việt Nam, cây phân bố rải rác ở khắp các tỉnh

trung du, đồng bằng và vùng núi thấp. Cây ưa sáng và ẩm, mọc thành đám trên các bãi

đất hoang, dọc đường đi, nương rẫy và các bãi sông. Cây con mọc từ hạt vào cuối mùa

xuân hay đầu mùa hè, sinh trưởng nhanh, ra hoa quả nhiều. Khi chín, quả tự nở và phát

tán hạt ra xung quanh.

1.4. Thành phần hóa học

Nguyễn Tuấn Quang và cs (2011) công bố kết quả nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa

1.4.1. Màn màn hoa tím

học của cây này. Kết quả cho thấy: Trong thân, lá cây có chứa các nhóm hợp chất

antraquinon, flavonoid, chất béo, sterol, saponin, đường khử và protid. Đồng thời, hàm lượng flavonoid toàn phần là 1,07 ± 0,02% tính theo dược liệu khô. [5]

Rahman và cs (2008) phân lập được 2 hợp chất từ cao n-hexane: Acid 2-ethyl-

cyclohex-2-ene-6-hydroxy-methylene-1-carboxylic và acid bentunic.[84]

Mondal và cs (2010) phân lập được β-sitosterol, lupeol và acid bentunic trong cao

CHCl3 của rễ.[70]

Acid bentunic β-Sitosterol Lupeol

Acid 2-ethyl-cyclohex-2-ene-6-hydroxy-methylene-1-carboxylic

1.4.2. Màn màn hoa vàng

Srivastava và cs (1979) đã phân lập naringenin 4'-(xylosyl-β-(1→4)-glucoside.[98] Chauhan và cs (1979) phân lập kaempferol-3-glucuronide-4'-methylether từ rễ.[24] Srivastava và cs (1980) phân lập stigmasta-5,24(28)-diene-3β-O-α-L-rhamnoside.[97] Từ hạt, Ray và cs (1985)[86] phân lập cleomiscosin A-C và Kumar và cs (1988)[54] phân

lập được cleomiscosin D. Jente và cs (1990) phân lập được clemeolide và acid cleomaldeic.[48]

Đỗ Huy Bích và cs (2003) và Mali (2010) đã tổng hợp các tài liệu về thành phần hóa học của cây này như sau:[1, 59] Hạt có 18 % dầu béo gồm hỗn hợp 5 loại acid béo như

acid linoleic, acid palmitic, acid stearic và acid oleic. Trong hạt chứa acid viscosic,

cleosandrin, cleomiscosin A-D. Toàn cây có β-amyrin; 3',4'-dihydroxy-5-methoxy

flavanone-7-O-α-L-rhamnoside, cleomeolide, cleosandrin, acid cleomaldeic; 5,4'-di-O-

methyleriodictyol-7-O-β-D-glucoside, eriodictyol-5-rhamnoside, egost-5-en-3-O-α-L-

rhamnoside, stigmasta-5,24(28)-diene-3β-O-α-L-rhamnoside, naringenin-4'-

galactoside; 3',4',5'-trihydroxyflavanone-7-O-α-L-rhamnoside, dihydrokaempferol-4'-

xyloside, naringenin-4-(xylosyl-β-(1,4)-glucoside), kaempferol-3-glucuronide-4'-

methylether và lupeol. Biwas và cs (2010) phân lập acid 2-amino-9-(4-oxoazetidin-2-yl) nonanoic từ rễ.[15] Jana và cs (2011) đã phân lập trong rễ được acid lactam nonanic.[46]

Senthamilselvi và cs (2012) phân lập được quercetin-3-O-(2''-acetyl)-glucoside từ phân đoạn EtOAc của hoa.[90] Chatterjee và cs (2013) phân lập được nevirapine.[22]

Kapoor và cs (2013) công bố hàm lượng flavonoid (chủ yếu là quercetin và kaempferol) trong lá là 0,71 mg/gdw.[49]

Bainiwal và cs (2013) cho biết, trong rễ, thân và lá có sự hiện diện của protein, steroid,

flavonoid, terpenoid, carbohydrate và tannin. Trong đó, hàm lượng flavonoid có trong

rễ, thân, lá lần lượt là 0,012; 0,013 và 0,019% và hàm lượng phenolic lần lượt là 0,007; 0,024 và 0,057%.[11]

Priyanka và cs (2014) đã phân tích bằng HPLC cho thấy có sự hiện diện của myricetin,

kaempferol-7-O-rutinoside, galacatechin, acid protocatechuic, acid gallic, và acid β- resorcylic trong thân.[83]

Thành phần hóa học của Màn màn hoa vàng được phân loại theo các nhóm sau:

● Acid béo: Acid linoleic, acid oleic, acid palmitic và acid stearic.

● Flavonoid

3',4',5'-Trihydroxyflavanone-7-O-α- L-rhamnoside 3',4'-Dihydroxy-5-methoxyflavanone-7-O-α-L- rhamnoside

Kaempferol-3-glucuronide-4'-methylether 5,4'-Di-O-methyleriodictyol-7-O-β- D-glucoside

Dihydrokaempferol-4'-xyloside Myricetin

Naringenin-4'-galactoside Naringenin 4'-(xylosyl-β-(1→4)-glucoside

H3C

Quercetin 3-O-(2''-acetyl)-glucoside Kaempferol-7-O-rutinoside

Galacatechin Eriodictyol-5-rhamnoside

● Terpen

Clemeolide Acid cleomaldeic

● Triterpenoid

Stigmasta-5,24(28)-diene-3β-O-α-L-rhamnoside Egost-5-en-3-O-α-L-rhamnoside

β-Amyrin Lupeol

● Alkaloid

Nevirapine

● Coumarinolignoid

Cleomiscosin A Cleomiscosin B

Cleomiscosin C Cleomiscosin D

● Các hợp chất khác

Acid gallic Acid viscosic

Acid protocatechuic Acid β-resorcylic

Cleosandrin

Acid lactam nonanic 1.5. Những nghiên cứu về dược tính

1.5.1. Màn màn hoa tím

Bose và cs (2007) công bố cao ethanol và cao phân đoạn diethyl ether có tác dụng

kháng khuẩn và kháng nấm trên Aspergillus niger, Bacillus polymexia, Bacillus

subtilis, Candida albicans, Pseudomonas aerugenosa, Penicillum notatum, Salmonella

typhi, Shigella flexiniry, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis và Vibrio cholerae.[18]

Theo Bose và cs (2007), cao chiết nước có tác dụng lợi tiểu phụ thuộc liều dùng và

có tác dụng kháng vi khuẩn Gram dương và Gram âm phụ thuộc nồng độ.[16]

Mondal và cs (2009) cũng báo cáo về khả năng giảm đau, kháng viêm và hạ sốt của

cao rễ màn màn hoa tím.[71]

Dey và cs (2009) báo cáo cao methanol thể hiện khả năng ức chế khối u trên mô

hình thực nghiệm gây ung thư da và ung thư dạ dày.[28]

Chakraborty và cs (2010) báo cáo cao ethanol và cao nước thể hiện hoạt tính ức chế

gốc tự do in vitro qua các phương pháp thử DPPH, nitric oxid và gốc hydroxyl.[21]

Nguyễn Tuấn Quang và cs (2011) công bố về tác dụng kháng khuẩn của cao chiết

của thân lá trên 5 chủng vi khuẩn gồm Proteus mirabilis, S. typhi, P. aeruginosa, S.

aureus, Bacillus cereus, tác dụng kháng viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân

chuột cống bằng carragenin và tác dụng chống oxy hoá thông qua cơ chế làm giảm lượng MDA và tăng lượng GSH trong gan chuột nhắt trắng.[4]

Nghiên cứu của Bose và cs (2012) cho thấy cao ethanol có hoạt tính kháng sốt rét

có in vitro với giá trị IC50 là 34,4 µg/mL.[19]

Trong nghiên cứu của Battu và cs (2012), dịch chiết của rễ màn màn hoa tím có

hoạt tính kháng oxy hóa và bảo vệ gan in vitro.[13]

Theo Patil và cs (2012), cao EtOAc có tác dụng kháng khuẩn mạnh, ức chế sự tăng

trưởng của nhiều vi khuẩn kháng thuốc.[82]

Mondal và cs (2012) cũng báo cáo về khả năng làm lành vết thương của cao MeOH

và cao nước nhanh hơn so với cao khác với cùng điều kiện nghiên cứu.[72]

Theo Bose và cs (2013) cao EtOH và các cao phân đoạn có tác dụng giảm đau

chống co giật nhờ tác dụng trên hệ thần kinh trung ương.[17]

Ethadi và cs (2013) báo cáo các cao chiết của rễ màn màn hoa tím có tác dụng

kháng viêm và bảo vệ gan.[31]

Sridhar và cs (2014) báo cáo dịch chiết MeOH có tác động kháng nấm C. albicans

mạnh với giá trị MIC là 0,039 mg/mL.[96]

Theo Okoro và cs (2015), cao MeOH uống liều 1.095 mg/kg tác dụng giảm lượng

glucose trong máu trên mô hình chuột bị đái tháo đường do streptozotocin gây ra.[77]

1.5.2. Màn màn hoa vàng

● Tác động kháng khuẩn, kháng nấm

Williams và cs (2003) báo cáo cao chiết n-hexane từ lá và thân có hoạt tính kháng

khuẩn và kháng nấm.[104]

Sudhakar và cs (2006) chứng minh cao EtOH từ lá và hoa có tác dụng kháng khuẩn

trên E. coli, Proteus vulgaris và P. aeruginosa.[99]

Theo Bawankule và cs (2008), uống coumarinolignoid thể hiện tác dụng ức chế chất

hóa học trung gian (chất tiền viêm) và tăng sản xuất chất trung gian kháng viêm.[14]

Trong nghiên cứu của Biswas và cs (2010), hợp chất acid 2-amino-9-(4-oxoazetidin

-2-yl) nonanoic phân lập từ rễ có hoạt tính kháng khuẩn trên P. aeruginosa và S. aureus ở nồng độ 500 ppm.[15]

Theo nghiên cứu của Saradha và cs (2011), cao MeOH và cao nước có hoạt tính

kháng khuẩn in vitro trên 7 chủng vi khuẩn gồm B. subtilis, E. coli, Klebsiella

pneumoniae, P. vulgaris, P. aeruginosa, S. aureus và Streptococcus pneumoniae, trong khi cao nước có tác dụng trên K. pneumoniae, P. vulgaris và P. aeruginosa.[89]

Ahmed và cs (2011) cùng Bose và cs (2011) cho biết cây có hoạt tính kháng viêm,

kháng khuẩn, hạ sốt, tiêu chảy, điều hòa miễn dịch, gây tê cục bộ, trị bệnh sốt rét và trị giun sán.[9, 20]

Nghiên cứu của Dhanalakshmi và cs (2011) cho thấy cao MeOH có tác dụng ức chế

vi khuẩn B. subtilis, S. aureus, E. coli và P. aeruginosa.[29]

Nghiên cứu của Koppula và cs (2011) đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao

MeOH với 4 chủng vi khuẩn (E. carotova, P. marginalis, P. syringe và X. campestris)

và 10 loài nấm (A. alternate, A. flavus, A. niger, A. strictum, B. bicolor, F. oxysporium,

P. expansum, R. solani, T. phaseolina và U. maydis) cho kết quả hoạt tính mạnh nhất

đối với E. carotova, T. phaseolina và A. alternate.[52]

Merekar và cs (2011) cho biết cao MeOH kết hợp cao cây thủy xương bồ có hoạt

tính diệt giun mạnh.[65]

Wake và cs (2011) báo cáo hoạt tính kháng vi sinh vật in vitro của cao chiết từ hạt

với S. aureus, B. subtillis, E. coli, A. niger, S. cerviceae, A. flavous và C. albicans.[101]

Gopal và cs (2012) cho thấy cao MeOH thể hiện hoạt tính kháng u đáng kể trên

chuột được cấy tế bào ung thư Ehrlich Ascites Carcinoma.[33]

Jane và cs (2012) nghiên cứu cho thấy cây Màn màn hoa vàng có khả năng kiểm

soát tác nhân gây bệnh viêm tai giữa, dịch chiết aceton có tác dụng ức chế mạnh với S. pneumoniae và E. coli, tiếp theo là S. aureus, K. pneumoniae và P. aeruginosa.[47]

Islam và cs (2014) nghiên cứu về cao chiết n-hexane, CHCl3 và MeOH của rễ, thân

và hạt trên Tribolium castaneum, Artemia salina và ấu trùng muỗi, kết quả cho thấy

cao chiết CHCl3 và MeOH của thân màn màn hoa vàng kháng T. castaneum cao nhất

với IC50 0,170 bằng 0,248 ppm. Các cao chiết n-hexane và CHCl3 có hoạt tính gây độc

tế bào cao với A. salina (IC50 21,905 và 26,675 ppm sau 30 giờ). Cao chiết CHCl3 từ hạt và rễ kháng ấu trùng muỗi Culex sp. (IC50 185,39 và 272,91 ppm sau 30 giờ).[42]

Sakthivadivel và cs (2014) công bố về phân đoạn n-hexane có tác dụng kháng ấu

trùng muỗi Culex quinquefasciatus với giá trị IC50 là 52,62 và 43,16 mg/L sau 24 giờ

và 48 giờ, kế tiếp là các cao chiết aceton, nước và CHCl3 với giá trị IC50 tương ứng 328,64 và 280,58; 493,44 và 298,76; 509,27 và 434,40 mg/L.[88]

Tomar và cs (2015) nghiên cứu về cao chiết MeOH và aceton từ hạt cho thấy có tác

dụng đối với các chủng vi khuẩn như B. cereus, K. pneumonia, P. vulgaris và

P. aeruginosa. Cao chiết MeOH có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm hơn các cao chiết khác.[100]

● Tác động an thần, hạ sốt

Devi và cs (2003) đánh giá khả năng hạ sốt của cao MeOH do nấm men gây sốt ở

chuột bạch, có hiệu quả trong 5 giờ so với paracetamol.[26]

Parimaladevi và cs (2003) công bố với liều 200 mg/kg cao MeOH có tác dụng giảm

đau trên chuột phù hợp với tác dụng dân gian làm thuốc giảm đau.[81]

Theo Devi và cs (2004), liều 200 - 400 mg/kg của cao MeOH có tác dụng an thần

mạnh trên chuột.[27]

Theo nghiên cứu của Mishra và cs (2010), cao EtOH và cao nước từ hạt có tác động

chống co giật bằng phương pháp sốc điện và pentylenetetrazole trên mô hình chuột nhắt.[66]

● Tác động hạ lipid máu

Jain và cs (2006) nghiên cứu cho thấy cao MeOH của hạt có tác dụng hạ lipid trong

máu và gan trên chuột.[44]

Faheemuddin và cs (2013) công bố với liều 250 và 500 mg/kg của cao MeOH giúp

cải thiện đáng kể sự cân bằng glucose và chất béo trên chuột bị đái tháo đường gây ra bởi streptozotocin trong 5 ngày liên tiếp.[32]

Theo nghiên cứu của Rao và cs (2014), cao chiết EtOH có tác dụng bảo vệ thần

kinh trên chuột bị đái tháo đường gây bởi streptozotocin (STZ), lảm tăng hoạt tính các

enzym kháng oxy hóa (superoxide dismutase (SOD), glutathione (GSH), catalase và

giảm lượng malondialdehyde (MDA) đồng thời giảm qúa trình peroxyd lipid và stress oxy hóa.[85]

Nhóm nghiên cứu của Devi và cs (2015) báo cáo cao chiết MeOH với liều

120 mg/kg làm giảm chỉ số glucose, AST, ALT, ALP, ure, acid uric, creatinin và lipid

ở chuột đái tháo đường do alloxan gây ra so với nhóm đối chứng và tương tự thuốc metformin.[25]

● Hoạt tính bảo vệ gan

Chattopadhyay và cs (2008) báo cáo hai hợp chất coumarinolignoid là cleomiscosin

A và B trong hạt có tác dụng giảm tổn thương gan.[23]

Theo nghiên cứu của Kumar và cs (2009), cao MeOH thể hiện hoạt tính chống xơ

hóa gan trên mô hình chuột bị gây xơ gan bằng CCl4.[55]

Gupta và cs (2009) công bố tác dụng bảo vệ gan của cao chiết EtOH tương tự với

silymarin.[34, 35]

Mobiya và cs (2010) báo cáo về hiệu quả hoạt tính bảo vệ gan của hạt trên chuột bị

gây độc gan bằng paracetamol: Cao EtOH có tác dụng bảo vệ, phòng ngừa tổn thương

tế bào gan do paracetamol. Kết quả nghiên cứu mô bệnh học ở gan chuột cho thấy sự tái sinh của tế bào gan sau khi điều trị với cao EtOH.[68]

Yadav và cs (2010) nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan và đánh giá mức độ an toàn

coumarinnolignoid (cleomiscosin A-C) được phân lập từ hạt. Kết quả cho thấy các coumarinolignoid có hiệu quả bảo vệ gan, chống nhiễm độc gan do CCl4 gây ra.[105]

1.6. Bệnh gan và thuốc bảo vệ gan

Gan là một cơ quan quan trọng của con người, do đó bệnh gan là một trong những

nguyên nhân chính gây tử vong trên thế giới. Có rất nhiều nguyên nhân gây ra bệnh

gan khác nhau như ô nhiễm môi trường, lạm dụng thuốc, điều kiện vệ sinh kém và

điều trị bằng thuốc đặc trị. Một số bệnh gan thường gặp là viêm gan siêu vi, bệnh gan

do rượu, bệnh gan nhiễm mỡ không cồn, bệnh gan tự miễn, bệnh gan chuyển hóa,

thuốc gây tổn thương gan và sỏi mật. Trong đó, nguyên nhân của bệnh gan cấp tính là

sử dụng lâu dài các loại thuốc như paracetamol, zidovudin, lamivudin, CCl4,

thioacetamid. Hầu hết các thuốc gây tổn thương tế bào gan chủ yếu qua cơ chế peroxid

hóa lipid và stress oxy hóa.

Thuốc điều trị bệnh gan bao gồm thuốc tổng hợp và sản phẩm tự nhiên có tác dụng

bảo vệ gan khỏi bị hư hại. Các loại thảo mộc là nguồn quan trọng của thuốc bảo vệ

gan. Hoạt tính sinh học trong các loại thảo mộc như chất chống oxy hóa, loại bỏ gốc tự

do, chống viêm, kháng virus cũng kích thích tái tạo gan có thể là tác nhân như bảo vệ

gan. Tuy nhiên, hầu hết loại thảo mộc có tính bảo vệ gan chủ yếu là do chống oxy hóa

và loại bỏ gốc tự do.

Các hợp chất từ thực vật được xem như là tác nhân bảo vệ gan bao gồm các hợp

chất phenolic (flavanolignan, lignan, phenolic, flavanoid) và terpernoid (lactone

diterpenic, glycosid triterpenic, glycosid irridoid, triterpen). Flavonoid là một trong

những nhóm lớn nhất của các chất chuyển hóa thứ cấp. Các loại thảo mộc có chứa

flavonoid được biết như là một tác nhân bảo vệ gan chính. Flavonoid đã được chứng

minh là chất chống oxy hóa, kháng virus, kháng viêm. Flavonoid có khả năng ổn định

màng tế bào, do đó thể loại bỏ superoxide, các gốc hydroxyl ức chế lipid và peroxid

hóa lipid. Do đó, flavonoid thường được dùng trong các bệnh về gan và có thể bảo vệ tế bào gan.[67]

1.7. Dòng tế bào HepG2

Mô hình in vitro thực hiện trên gan hoặc tế bào gan từ cơ thể và nuôi dưỡng trong

điều kiện dinh dưỡng, nhiệt độ giống môi trường cơ thể động vật hoặc người.

Các tế bào phân lập trong huyền dịch hoặc nuôi cấy sơ cấp thường tăng trưởng

chậm, số lượng tế bào thu được ít, kiểu hình không ổn định, khó nuôi cấy do thu hỗn

tạp nhiều tế bào, đời sống ngắn. Do đó, không thể lặp lại thí nghiệm nhiều lần dẫn đến

hạn chế trong nghiên cứu tác dụng hay độc tính của thuốc. Vì vậy, hiện nay các mô

hình in vitro thường dùng các dòng tế bào có nguồn gốc từ khối ung thư gan người với

đặc điểm phát triển nhanh, tăng sinh không giới hạn, thực hiện thí nghiệm nhiều lần

với độ lặp lại và độ chính xác cao. Trên thế giới, các dòng tế bào gan người được dùng

rộng rãi làm mô hình in vitro trong nghiên cứu sàng lọc các chất có khả năng phòng và

điều trị gan gồm WIF-B9, HepG2, HepRG, Hep3B, Huh7… Trong đó, HepG2 được sử dụng phổ biến do đặc điểm, tính chất, quy trình nuôi cấy đã được biết rõ.[87]

HepG2 là dòng tế bào ung thư biểu mô gan người được phân lập từ khối ung thư

gan của bệnh nhân nam người Mỹ da trắng 15 tuổi. Tế bào HepG2 có hình thái và

chức năng giống với tế bào gan người biệt hóa, thể hiện qua khả năng sản xuất các

protein huyết tương (albumin, transferrin, fibrinogen, α2-macroglobulin, α1-antitrypsin,

plasminogen…), có các biểu hiện về insulin, transferrin, yếu tố tăng trưởng biểu bì,

quá trình chuyển hóa, điều hòa chu kỳ tế bào, sao chép, vận chuyển, chuyển đổi tín

hiệu và đáp ứng tốt với sự kích thích của hormon tăng trưởng của người.

Trên thế giới đã nuôi cấy thành công dòng tế bào HepG2 ở các quy mô khác nhau

với điều kiện nuôi cấy thích hợp thu được các tế bào biểu mô phân cực có hình dạng

và chức năng giống như tế bào gan trưởng thành biệt hóa. Nhiều công trình nghiên cứu

về sự giống và khác nhau trong biểu hiện của bộ gen tế bào HepG2 so với tế bào gan

người tươi cho thấy bộ gen của HepG2 tương đồng rất cao so với tế bào gan người bình thường[37, 38, 106]. Với phương pháp microarray phân tích biểu hiện của gần 31.000

gen trong tế bào HepG2 so với tế bào gan người tươi mới phân lập và tế bào gan người

nuôi cấy sơ cấp, nhóm nghiên cứu của Hart cho thấy tỷ lệ tương đồng về biểu hiện bộ

gen giữa HepG2 so với tế bào gan người khoảng 80%. Dưới tác động của các chất

ngoại sinh, HepG2 có đặc tính tương tự như tế bào gan người nuôi cấy sơ cấp trong

biểu hiện các gen mã hóa protein tham gia quá trình vận chuyển, đáp ứng với kích

thích từ môi trường bên ngoài, các quá trình chuyển hóa acid amin, carbohydrat, lipid,

steroid, chu kỳ tế bào, quá trình tăng trưởng, phát triển, biệt hóa của tế bào, truyền thông tin trong tế bào, bài tiết các chất…[40]

Hiện nay, HepG2 được sử dụng làm mô hình nghiên cứu quá trình chuyển hóa ở gan, tác dụng bảo vệ tế bào gan, chống oxy hóa… của hợp chất/dược liệu[41, 43, 45, 93, 95].

Nhiều công trình đã sử dụng dòng HepG2 để khảo sát về tác hại của các gốc tự do và

tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan khi tiếp xúc với các chất độc gan như rượu, chất béo, CCl4 và glucose (bệnh đái tháo đường týp II).[ 60, 62, 63, 64, 73, 74, 75]

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1. Mẫu thực vật

Mẫu thực vật gồm lá và thân cây Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.f.) và Màn

màn hoa vàng (Cleome viscosa L.) được thu hái tại huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương

vào tháng 10 năm 2012.

Mẫu tươi được rửa sạch, phơi khô nơi thoáng mát. Các bộ phận lá và thân được lấy

riêng biệt. Mẫu khô được xay nhỏ thành bột, là nguyên liệu dùng trong nghiên cứu.

Mẫu thực vật được TS. Võ Văn Chi giám định tên khoa học. (Phụ lục 31a, 31b)

Hình 2.1: Màn màn hoa tím Hình 2.2: Màn màn hoa vàng

2.2. Hóa chất và thiết bị

2.2.1. Hóa chất

- Ethanol 96%, Việt Nam - Chloroform, Xilong, Trung Quốc

- n-Hexane, Xilong, Trung Quốc - Ethyl acetate, Xilong, Trung Quốc

- Methanol, Xilong, Trung Quốc - H2SO4, Guanghua, Trung Quốc

2.2.2. Thiết bị

a. Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254

(Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại tại hai bước

sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong EtOH

được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện đến khi hiện màu.

b. Sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo.

Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm. Silica gel pha đảo RP-18.

Ngoài ra, sử dụng chất nhồi cột là nhựa trao đổi ion diaion HP-20 và sephadex LH-20.

c. Phổ khối lượng

Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) đo trên máy Bruker MicroTOF-QII

spectrometer (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) tại Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

d. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz)

được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn

lâm KH & CN Việt Nam với chất chuẩn nội là TMS (tetrametyl silan).

e. Phổ tử ngoại (UV)

Phổ tử ngoại được đo trên máy Jasco V-630 spectrophotometer (Tokyo, Japan) tại

Viện Công nghệ Hoá học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam.

f. Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại được đo trên máy Bruker Tensor 27 FT-IR spectrometer (Bremen,

Germany) tại Viện Công nghệ Hoá học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam.

g. Độ quay cực ([α]D)

Độ quay cực được đo trên máy ADP220 polarimeter (Bellingham + Stanley Ltd.,

RG224BA, UK) tại Viện Công nghệ Hoá học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam.

2.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.3.1. Khảo sát khả năng gây độc tế bào in vitro bằng phương pháp MTT

Nguyên tắc: Tỷ lệ sống của tế bào được xác định qua hoạt tính enzym succinate

dehydrogenase (SDH) của ty thể chỉ có trong tế bào sống. SDH chuyển MTT [3-(4,5-

dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)] thành tinh thể formazan tan

trong dimethyl sulfoxid tạo dung dịch đỏ tía được đo mật độ quang OD tại bước sóng

535 nm hoặc có thể hòa tan formazan trong isopropanol acid hóa tạo dung dịch có

màu, đo OD tại bước sóng 570 nm. Giá trị OD phản ánh số lượng tế bào sống trong mẫu nuôi cấy. [106]

Tiến hành: Các mẫu thử được pha trong DMSO với nồng độ: Cao n-hexane và

EtOAc: 10 mg/mL; cao MeOH: 100 mg/mL; hợp chất tinh khiết: 10 mM. Các dung dịch bảo quản ở -20 oC, rã đông và pha loãng trong môi trường để đạt các nồng độ

khảo sát, lọc vô trùng qua màng lọc 0,22 µm hoặc chiếu UV 60 phút trước khi dùng.

Tế bào HepG2 được nuôi trong môi trường EMEM, bổ sung 10% FCS, 2 mM

L-glutamin, 100 IU/mL penicilin, 100 µg/mL streptomycin. Tế bào được nuôi trong bình nuôi cấy 75 cm2, ủ 37 oC, 5% CO2. Khi tế bào đạt trạng thái đông tụ (độ phủ 70 - 80%), thu tế bào và chia vào đĩa nuôi cấy 96 giếng ở mật độ 4 x 104 tế bào/cm2. Ủ ở 37 oC, 5% CO2 qua đêm để tế bào bám lên bề mặt đĩa nuôi cấy và phát triển ổn định. Thay môi trường và xử lý tế bào với mẫu thử ở nồng độ khác nhau (Cao thử: 25, 50 và

100 µg/mL; hợp chất tinh khiết: 25, 50 và 100 µM) trong 24 giờ. Nồng độ DMSO cuối

cùng trong môi trường là 1%, 0,5% và 0,25% (v/v). Mẫu chứng bổ sung DMSO với

nồng độ tương đương và mẫu đối chứng doxorubicin 10 µg/mL. Thực hiện 6 mẫu cho

1 điều kiện nuôi cấy (ứng với 1 nồng độ). Sau 24, 48 và 72 giờ tiến hành xác định tỷ lệ

tế bào sống bằng phương pháp MTT.

2.3.2. Khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan trên dòng tế bào HepG2

Tế bào HepG2 được nuôi trong môi trường EMEM, bổ sung 10% FCS, 2 mM L-

glutamin, 100 IU/mL penicilin, 100 µg/mL streptomycin. Tế bào được nuôi trong bình nuôi cấy 75 cm2, ủ ở 37 oC, 5% CO2. Khi tế bào đạt trạng thái đông tụ (độ phủ 70 - 80%), thu tế bào và chia vào đĩa nuôi cấy 96 giếng ở mật độ 4 x 104 tế bào/cm2. Ủ ở 37 oC, 5% CO2 qua đêm để tế bào bám lên bề mặt đĩa nuôi cấy và phát triển ổn định.

Thay môi trường và xử lý tế bào với CCl4 2 mM có hoặc không bổ sung các mẫu

thử ở nồng độ 100 µM (DMSO trong môi trường là 1%) hoặc chất đối chứng quercetin

10 µM trong 24 giờ. Các điều kiện nuôi cấy được bố trí cụ thể như sau:

• Mẫu sinh lý: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường bình thường.

• Mẫu chứng DMSO 1%: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường có DMSO 1%.

• Mẫu bệnh lý: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường bổ sung CCl4 2 mM.

• Mẫu bệnh lý chứa DMSO 1%: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường bổ sung

DMSO 1% và CCl4 2 mM.

• Mẫu thử riêng lẻ: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường bổ sung hợp chất tinh

khiết ở nồng độ 100 µM hoặc mẫu đối chứng quercetin 10 µM.

• Mẫu thử tác dụng bảo vệ tế bào gan: Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trường bổ

sung CCl4 2 mM và hợp chất tinh khiết ở nồng độ 100 µM hoặc mẫu đối chứng

quercetin 10 µM.

Ủ 37 oC, 5% CO2 trong 24 giờ, thực hiện MTT khảo sát sự tăng trưởng tế bào.

Hiệu quả bảo vệ tế bào gan đánh giá qua % phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng do

CCl4 2 mM gây ra theo công thức: [2, 45, 80]

HQ (%) = [(ODCCl4 + mẫu thử - ODCCl4)/(ODmẫu chứng - ODCCl4)] x 100

2.4. Phân lập các hợp chất

2.4.1. Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa tím

Lá tươi (40 kg) rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ thu được 5 kg bột khô.

Bột khô (5 kg) được tận trích với EtOH 96% bằng phương pháp ngâm, lọc bỏ bã,

phần dịch chiết được cô loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOH (520 g).

Sau đó, trích pha rắn lần lượt với n-hexane, EtOAc và MeOH, dịch chiết được thu hồi

dung môi thu được cao tương ứng n-hexane (120 g), EtOAc (228 g) và MeOH (170 g).

Từ cao EtOAc (228 g), thực hiện sắc ký cột nhiều lần trên silica gel pha thường với

hệ dung môi n-hexane-CHCl3 với tỉ lệ 5:1, 2:1 và 1:1 thu được hợp chất 21 (20 mg), 22

(15 mg) và 23 (5 mg) tương ứng.

Thực hiện sắc ký cột nhiều lần cao MeOH (170 g) trên silica gel pha thường với hệ

dung môi CHCl3-MeOH-H2O (7:1:0,1) thu được hợp chất 2 (13 mg), hệ dung môi

CHCl3-MeOH-H2O (3:1:0,1) thu được hợp chất 5 (15 mg), 6 (50 mg) và 8 (30 mg).

Sơ đồ 1: Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa tím

2.4.2. Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa tím

Thân cây (75 kg) rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ thu được 8,5 kg bột khô.

Bột khô (8,5 kg) được tận trích với EtOH 96 % bằng phương pháp ngâm, lọc bỏ bã,

dịch chiết được thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOH (970 g). Sau đó

trích pha rắn lần lượt với n-hexane, EtOAc và MeOH, thu hồi dung môi thu được cao

tương ứng.

Sơ đồ 2: Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa tím

Thực hiện sắc ký cột cao MeOH (302 g) trên silica gel với hệ dung môi CHCl3-

MeOH (0 - 100%) thu 7 phân đoạn (M1 - M7).

Tại phân đoạn M2, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3-

MeOH-H2O (10:1:0,1) và silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O (1:5)

thu được hợp chất 25 (12 mg).

Tại phân đoạn M3, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3-

MeOH-H2O (7:1:0,1) và silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O (1:5)

thu được hợp chất 3 (15 mg).

Tại phân đoạn M4, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3-

MeOH-H2O (5:1:0,1) và silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O (1:3)

thu được hợp chất 16 (11 mg) và 19 (6 mg).

Tại phân đoạn M5, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3-

MeOH-H2O (3:1:0,1) thu được hợp chất 7 (33 mg).

Tại phân đoạn M6, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3-

MeOH-H2O (2:1:0,1) thu được hợp chất 20 (17 mg).

2.4.3. Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa vàng

Lá tươi (68 kg) rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ thu được 7,5 kg bột khô.

Bột khô (7,5 kg) được tận trích với EtOH 96% bằng phương pháp ngâm, lọc bỏ bã,

dịch chiết được thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOH (810 g). Sau đó

trích pha rắn lần lượt với n-hexane, EtOAc và MeOH, thu hồi dung môi thu được các

cao tương ứng.

Sơ đồ 3: Phân lập các hợp chất từ lá cây Màn màn hoa vàng

Thực hiện sắc ký cột cao MeOH (400 g) trên silica gel với hệ dung môi CHCl3-

MeOH (0 - 100%) thu 7 phân đoạn (M1 - M7).

Tại phân đoạn M2, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3-

MeOH (10:1) thu được hợp chất 11 (8 mg).

Tại phân đoạn M3, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3-

MeOH-H2O (7:1:0,1) và silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O (1:3)

thu được hợp chất 15 (16 mg).

Tại phân đoạn M4, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3-

MeOH-H2O (6:1:0,1) thu được hợp chất 17 (68 mg) và 18 (2 g).

Tại phân đoạn M5, sắc ký cột nhiều lần với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O

(5:1:0,1) thu được hợp chất 1 (75 mg) và 4 (6,5 g).

Tại phân đoạn M6, sắc ký cột nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi CHCl3-

MeOH-H2O (5:1:0,1) và silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O (1:5)

thu được hợp chất 9 (250 mg).

2.4.4. Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa vàng

Thân cây (65 kg) rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ thu được 7 kg bột khô.

Bột khô (7 kg) được tận trích với ethanol 96% bằng phương pháp ngâm, lọc bỏ bã,

dịch chiết được thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOH khối lượng là

850 g. Sau đó trích pha rắn lần lượt với n-hexane, EtOAc và MeOH, thu hồi dung môi

thu được các cao tương ứng.

Từ cao EtOAc (50 g) thực hiện sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung

môi n-hexane-CHCl3 (10:1) thu được hợp chất 24 (8 mg).

Thực hiện sắc ký cột cao MeOH (100 g) trên silica gel pha thường với hệ dung môi

CHCl3-MeOH-H2O (15:1:0,1) thu được hợp chất 12 (6 mg), hệ dung môi CHCl3-

MeOH-H2O (7:1:0,1) thu được các hợp chất 13 (7 mg) và 14 (22 mg), hệ dung môi

CHCl3-MeOH-H2O (2:1:0,1) thu được hợp chất 10 (40 mg).

Sơ đồ 4: Phân lập các hợp chất từ thân cây Màn màn hoa vàng

Hằng số vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất đã được phân lập được trình bày chi tiết

trong các bảng 3.1 - 3.25.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập được

3.1.1. Hợp chất 1: Quercetin-7-O-α-L-rhamnopyranoside

→ HMBC

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học hợp chất 1

Hợp chất 1 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 471,0885 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

[C21H20O11Na]+ là 471,0903) xác định công thức phân tử là C21H20O11. (Phụ lục 1a)

Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH ppm, J = Hz) (Phụ lục 1b) cho thấy sự hiện

diện của proton tại δH 12,48 ppm (1H, s, 5-OH) đặc trưng cho nối hydrogen nội phân

tử của một nhóm -OH gần nhóm carbonyl trong khung flavone. Đồng thời, có sự hiện

diện hai proton tại δH 6,41 (H-6) và 6,78 (H-8) với hằng số tương tác J = 2,0 Hz trên

vòng A và 3 proton trên hệ ABX δH 7,72 (1H, d; 2,5); 6,89 (1H, d; 8,5) và 7,58 (1H,

dd; 8,5 và 2,5).

Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, δC ppm) (Phụ lục 1c) hợp chất 1 xuất hiện 15

tín hiệu carbon của khung aglycone. Dựa vào các phổ DEPT (Phụ lục 1d) xác định

chúng gồm có 5 CH (δC 120,1; 115,6; 115,2; 98,8 và 94,1) và 10 carbon bậc bốn (δC

176,0; 161,4; 160,3; 155,7; 147,9; 147,5; 145,0; 136,1; 121,8 và 104,6) và nhóm C=O

tại δC 176,0 chứng tỏ cấu trúc khung flavone là quercetin.

Ngoài ra, phổ 1H-NMR cho các tín hiệu của vùng đường tại δH 1,13 - 5,54 ppm. Trong đó, tín hiệu doublet tại δH 1,13 ppm (3H, d; 6,0) cho thấy đơn vị đường là

rhamnose. Tín hiệu proton tại δH 5,54 (1H, d) của carbon anomer với hằng số tương tác spin khá thấp (J = 1,0 Hz) chứng tỏ đây là cấu hình α.

Phổ 13C-NMR cho thấy ngoài 15 tín hiệu carbon của khung flavone hợp chất 1 còn

có thêm 6 tín hiệu carbon của phân tử đường rhamnose là δC 98,4 (C-1''); 69,8 (C-2'');

70,2 (C-3''); 71,6 (C-4''); 70,0 (C-5'') và 17,9 (C-6'').

Trên phổ HMBC (Phụ lục 1f), cho thấy có sự tương quan giữa proton anomer của

đường rhamnose tại δH 5,54 (1H, d; 1,5; H-1'') với carbon C-7 (δC 161,4) cho thấy

đường rhamnose gắn vào khung aglycone tại vị trí C-7. Ngoài ra, trên phổ COSY (Phụ

lục 1g), cho thấy có sự tương tác của các 2 proton liền kề nhau như H-1'' và H-2'', H-2''

và H-3'', H-5'' và H-6'' của phần đường rhamnose. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1

được trình bày trong bảng 3.1.

Như vậy, hợp chất 1 là quercetin-7-O-α-L-rhamnopyranoside. Các kết quả phổ của

hợp chất 1 được xác định dựa vào sự so sánh với dữ kiện phổ đã được công bố.[10]

Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 1

a,c

a,d (J = Hz)

Vị trí δδδδC δδδδH δδδδC a,b [10] HMBC (1H-13C) COSY (1H-1H)

Aglycone

- 2 148,2 147,5

- - 3 4 136,8 136,1 176,7 176,0

5 6 161,0 160,3 98,8 99,1 (5-OH) 12,48 (1H, s) 6,41 (1H, d; 2,0) 5, 7, 8, 10

- 7 162,7 161,4

8 94,8 94,1 6,78 (1H, d; 2,0) 6, 7, 9, 10

- - 9 10 156,4 155,7 105,3 104,6

1' 2' 122,5 121,8 115,9 115,2 - 7,72 (1H, d; 2,5) 2, 3', 4', 6'

- 3' 145,8 145,0

- 4' 148,6 147,9

5' 116,3 115,6 6,89 (1H, d; 8,5) 1', 3', 4' 6'

6' 120,8 120,1 7,58 (1H, dd; 8,5 và 2,5) 2, 2', 4' 5'

Rha 1'' 98,4 99,5 7, 3'', 5'' 5,54 (1H, d; 1,0) 2''

2'' 69,8 70,7 1'', 3'', 4'' 3,85 (1H, br s) 1'', 3''

3'' 70,2 70,9 3,64 (1H, dd; 8,5 và 2,5) 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 4''

4'' 71,6 72,3 3,32 (1H, m) 2'', 3'', 5'', 6'' 3'', 5''

5'' 70,0 70,5 3,42 - 3,48 (1H, m) 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 6''

6'' 18,6 17,9 1,13 (3H, d; 6,0) 5''

4'', 5'' aDMSO-d6, b150 MHz, c125MHz, d500 MHz

3.1.2. Hợp chất 2: Quercitrin

→ HMBC

Hình 3.2: Cấu trúc hóa học hợp chất 2

Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 2

a,b [102]

a,c

a,d (J = Hz)

HMBC (1H-13C) δδδδC δδδδH

Vị trí δδδδC Aglycone

2 158,1 157,2 -

3 4 134,4 180,2 134,2 177,7 - -

5 6 160,8 98,5 161,2 98,7 (5-OH) 12,65 (1H, s) 6,20 (1H, d; 2,0) 5, 7, 8, 10

7 164,4 164,3 -

8 93,4 93,6 6,38 (1H, d; 2,0) 6, 7, 9, 10

9 157,2 156,4 -

10 104,5 104,0 -

1' 2' 120,1 115,8 120,7 115,6 - 7,29 (1H, d; 2,0) 2, 3', 4', 6'

3' 4' 144,9 148,1 145,2 148,4 - -

5' 6' 115,3 120,9 115,4 121,0 6,86 (1H, d; 8,0) 7,25 (1H, dd; 8,5 và 2,0) 1', 3', 4' 2, 2', 4'

Rha 1'' 101,6 101,8 5,25 (1H, br s) 3, 3'', 5''

2'' 70,7 70,3 3,97 (1H, d; 1,0) 1'', 3'', 4''

3'' 70,4 70,5 3,49 (1H, dd; 9,5 và 3,5) 1'', 2'', 4'', 5''

4'' 71,2 71,1 3,19 - 3,24 (1H, m) 2'', 3'', 5'', 6''

5'' 70,1 70,0 3,12 - 3,17 (1H, m) 1'', 3'', 4'', 6''

aDMSO-d6, b100MHz, c125 MHz, d500 MHz

6'' 17,2 17,4 0,81 (3H, d; 6,5) 4'', 5''

Hợp chất 2 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ 1H và 13C-NMR (Phụ lục 2a, 2b) của hợp chất 2 gần giống với phổ của hợp

chất 1. Tuy nhiên, trên phổ HMBC (Phụ lục 2e) có sự khác biệt là proton anomer của đường rhamnose tại δH 5,25 (1H, br s, H-1'') với carbon δC 134,2 (C-3) cho thấy đường

rhamnose gắn vào khung aglycone tại vị trí C-3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 2

được trình bày trong bảng 3.2.

Như vậy, hợp chất 2 là quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside hay còn gọi là

quercitrin. Các kết quả phổ của hợp chất 2 được xác định dựa vào sự so sánh với dữ kiện phổ đã được công bố cho quercitrin.[102]

3.1.3. Hợp chất 3: Isoquercitrin

→ HMBC

Hình 3.3: Cấu trúc hóa học hợp chất 3

Hợp chất 3 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ 1H-NMR và 13C-NMR khung aglycone hợp chất 3 là quercetin tương tự như

hợp chất 2. (Phụ lục 3a, 3b)

Tuy nhiên, trên phổ 1H-NMR xuất hiện thêm các tín hiệu trong vùng đường tại δH

3,17 - 5,46 ppm, trong đó 2 tín hiệu của nhóm -CH2 tại δH 3,35 (1H, s) và 3,56 (1H, d; 11,5). Đồng thời, phổ 13C-NMR kết hợp DEPT cho tín hiệu tại δC 60,9 là nhóm -CH2-,

cho thấy hợp chất 3 có gắn thêm một đơn vị đường glucose.

Trên phổ HMBC (Phụ lục 3e) cho thấy có sự tương tác giữa proton anomer của

đường glucose tại δH 5,46 (1H, d; 7,0; H-1'') với carbon C-3 (δC 133,3) cho thấy đường

glucose gắn vào aglycone tại vị trí C-3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 3 được trình

bày trong bảng 3.3.

Từ các dữ kiện trên, cùng với tài liệu tham khảo[30] cho biết hợp chất 3 là quercetin

3-O-β-D-glucopyranoside hay còn gọi là isoquercitrin.

Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 3

a,c [30]

a,c

a,d (J = Hz)

Vị trí HMBC (1H-13C) δδδδC δδδδC δδδδH

Aglycone 2 156,2 156,1 -

3 4 133,3 177,4 133,3 177,3 - -

5 6 161,2 98,8 161,2 98,7 (5-OH) 12,64 (1H, s) 6,19 (1H, s) 5, 7, 8, 10

7 8 164,6 93,6 165,5 93,5 - 6,39 (1H, s) 6, 7, 9, 10

9 10 156,4 103,9 156,3 103,8 - -

1' 2' 121,2 116,2 121,1 116,1 - 7,57 (1H, s) 2, 3', 4', 6'

3' 4' 144,9 148,6 144,8 148,5 - -

5' 6' 120,9 121,6 115,2 121,6 6,84 (1H, d; 9,0) 7,58 (1H, d; 7,0) 1', 3', 4' 2, 2', 4'

Glc

1'' 3, 3'', 5'' 100,9 100,9 5,46 (1H, d; 7,0)

2'' 3'' 74,1 76,5 74,1 76,5 3,17 - 3,25 (1H, m) 3,17 - 3,25 (1H, m) 1'', 3'', 4'' 1'', 2'', 4'', 5''

4'' 5'' 69,9 77,5 69,9 77,5 3,09 (1H, d; 4,0) 3,09 (1H, d; 4,0) 2'', 3'', 5'', 6'' 1'', 3'', 4'', 6''

aDMSO-d6, b75 MHz, c125 MHz, d500 MHz

4'', 5'' 6'' 61,0 60,9 3,56 (1H, d; 11,5) 3,35 (1H, m)

3.1.4. Hợp chất 4: Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside

Hợp chất 4 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 633,1441 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho [C27H30O16Na]+ là 633,1431) xác định

công thức phân tử là C27H30O16. (Phụ lục 4a).

Phổ 1H và 13C-NMR khung aglycone hợp chất 4 là quercetin tương tự như hợp chất

1 và 3. (Phụ lục 4b, 4c)

Các tín hiệu δH 5,48 (1H, d; 7,5; H-1''); 3,58 (1H, d; 11,5; H-6a''); 3,32 - 3,33 (1H, m, H-6b''); 5,55 (1H, br s, H-1''') và 1,12 (3H, d; 6,0; H-6''') cùng với δC 99,4 (C-1'');

100,7 (C-1'''); 61,0 (C-6'') và 17,9 (C-6''') cho phép xác định trong hợp chất 4 có hai

đơn vị đường lần lượt là glucose và rhamnose.

Bảng 3.4: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 4

a,b

c,d

c,e (J = Hz)

δδδδC δδδδH COSY (1H-1H) HMBC (1H-13C) Vị trí δδδδC [50]

Aglycone

- 159,4 156,7 2

- 135,5 133,6 3

- - 177,6 4

- 162,9 160,9 5

6,43 (1H, d; 2,0) 5, 7, 8, 10 100,4 99,4 6

- 6,79 (1H, d; 2,0) 6, 7, 9, 10 163,3 95,4 161,6 94,3 7 8

- - 157,9 107,1 155,9 105,6

- 7,60 (1H, d; 2,0) 2, 3', 4', 6' 122,7 117,4 121,7 116,3

- - 145,7 149,9 144,8 148,7

115,9 115,2 6,85 (1H, d; 9,0) 1', 3', 4' 6'

123,2 121,0 7,61 (1H, d; 9,0) 2, 2', 4' 5'

103,8 100,7 5,48 (1H, d; 7,5) 3, 3'', 5'' 2''

75,6 71,6 3,32 (1H, d; 3,0) 1'', 3'', 4'' 1'', 3''

77,9 77,6 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 4''

71,2 78,3 69,9 76,5 2'', 3'', 5'', 6'' 1'', 3'', 4'', 6'' 3'', 5'' 4'', 6''

62,5 61,0 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' Glc 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 4'', 5'' 5'' 3,09 (1H, d; 5,0) 3,09 (1H, d; 5,0) 3,22 - 3,24 (1H, m) 3,58 (1H, d; 11,5) 3,32 - 3,33 (1H, m)

99,8 98,4 7, 3''', 5''' 2'''

5,55 (1H, br s) 3,84 (1H, br s) 1''', 3''', 4'''

71,6 71,9 70,0 70,2 1''', 3''' 2''', 4'''

73,4 74,1 3,64 (1H, dd; 9,0 và 3,0) 1''', 2''', 4''', 5''' 2''', 3''', 5''', 6''' 3''', 5'''

71,2 1''', 3''', 4''', 6''' 69,8 4''', 6'''

Rha 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' 6''' 4''', 5''' 17,9 17,9 5'''

3,30 (1H, m) 3,42 - 3,45 (1H, m) 1,12 (3H, d; 6,0) aMeOD-d4, b200 MHz, cDMSO-d6, d125 MHz, e500 MHz

→ HMBC

Hình 3.4: Cấu trúc hóa học hợp chất 4

Trên phổ HMBC (Phụ lục 4f) cho thấy có sự tương tác giữa proton anomer của

đường rhamnose tại δH 5,55 (1H, br s, H-1''') với carbon C-7 (δC 161,6) cho thấy

đường rhamnose gắn vào khung aglycone tại vị trí C-7 và proton anomer của đường glucose tại δH 5,48 (1H, d; 7,5; H-1'') tương quan với carbon C-3 tại δC 133,6 cho thấy

đường glucose gắn vào khung aglycone tại vị trí C-3. Ngoài ra, trên phổ COSY (Phụ

lục 4g), cho thấy có sự tương tác của các 2 proton liền kề nhau của phần đường

rhamnose và glucose. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 4 được trình bày trong bảng 3.4. Từ các dữ kiện trên, cùng với tài liệu tham khảo[50] cho biết hợp chất 4 là quercetin-

3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside.

3.1.5. Hợp chất 5:Quercetin-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L-rhamnopyranoside-

7-O-α-L-rhamnopyranoside

→ HMBC

Hình 3.5: Cấu trúc hóa học hợp chất 5

Hợp chất 5 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ HR-ESI-MS m/z: 779,2027 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho [C33H40O20Na]+ là

779,2010) xác định công thức phân tử là C33H40O20. (Phụ lục 5a)

Khung aglycone hợp chất 5 là quercetin với các tín hiệu proton tại δH 12,57 (1H, s,

5-OH); 7,39 (1H, d; 2,0; H-2'); 7,31 (1H, dd; 8,5 và 2,0; H-6'); 6,89 (1H, d; 8,5; H-5'); 6,75 (1H, d; 2,0; H-8) và 6,43 (1H, d; 2,0; H-6) trên phổ 1H-NMR và tín hiệu của các carbon phổ 13C-NMR tại δC 178,0 (C-4); 161,7 (C-7); 160,9 (C-5); 157,5 (C-2); 156,0

(C-9); 148,8 (C-4'); 145,2 (C-3'); 134,8 (C-3); 121,1 (C-6'); 120,4 (C-1'); 115,6 (C-2');

115,5 (C-5'); 105,7 (C-10); 99,4 (C-6) và 94,5 (C-8). (Phụ lục 5b, 5c)

Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT (Phụ lục 5d) cho thấy hợp chất 5 có các tín hiệu:

1 carbon methylene kề oxy tại δC 60,2 (C-6'"); 2 carbon methyl tại δC 17,4 (C-6") và

17,9 (C-6"") cùng với 3 proton anomer tại δH 5,47 (1H, brs, H-1"); 4,22 (1H, d; 8,0;

H-1'") và 5,53 (1H, d; 1,0; H-1""); 6 proton của 2 nhóm methyl bậc hai tại δH 0,89

(3H, d; 6,5; H-6") và 1,11 (3H, d; 6,0; H-6""); 2 proton của nhóm methylene kề oxy tại δH 3,40 -3,47 (1H, m, H-6a'") và 3,27 (1H, br s, H-6b'") trên phổ 1H-NMR. Vậy hợp

chất 5 là flavonoid glycoside có khung quercetin với 3 đơn vị đường.

Với 2 proton anomer tại δH 5,47 (1H, br s, H-1") và 5,53 (1H, d; 1,0; H-1"") cùng

với 6 proton của 2 nhóm methyl bậc hai tại δH 0,89 (3H, d; 6,5; H-6") và 1,11 (3H, d;

6,0; H-6"") xác nhận 2 đơn vị đường này đều là L-rhamnopyranose. Bên cạnh đó, phổ

COSY và HSQC xác nhận đơn vị đường còn lại là D-glucopyranose. Mặt khác, với

hằng số ghép cặp J của 3 proton anomer tại δH 5,47 (1H, brs, H-1"); 4,22 (1H, d; 8,0;

H-1'") và 5,53 (1H, d; 1,0; H-1""), chứng tỏ các đơn vị đường lần lượt là đường α-Rha,

β-Glc và α-Rha.

Mặt khác, phổ HMBC (Phụ lục 5f) cho thấy proton anomer tại δH 5,49 (1H, brs,

H-1") tương tác với carbon tại δC 134,8 (C-3), chứng tỏ đơn vị đường thứ nhất α-Rha

gắn vào khung aglycone tại vị trí C-3. Proton anomer tại δH 4,22 (1H, d; 8,0; H-1'")

tương tác với carbon methine kề oxy tại δC 81,4 (C-2"), chứng tỏ đơn vị đường thứ hai

β-Glc gắn vào đơn vị đường thứ nhất tại vị trí C-2". Ngoài ra, proton anomer còn lại

tại δH 5,53 (1H, d; 1,0; H-1"") cho tương tác với 1 carbon bậc bốn vòng thơm kề oxy

tại δC 161,7 (C-7), chứng tỏ đơn vị đường thứ ba α-Rha gắn vào khung aglycone tại vị

trí C-7. Trên phổ COSY (Phụ lục 5g), cho thấy có sự tương tác của các 2 proton liền

kề nhau của phần các đường rhamnose và glucose. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 5

được trình bày trong bảng 3.5.

Từ các dữ kiện trên và so sánh với tài liệu đã công bố[12], hợp chất 5 là quercetin-3-

O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L-rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside.

Bảng 3.5: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 5

a,c

a,d (J = Hz)

Vị trí δδδδC δδδδH δδδδC a,b [12] HMBC (1H-13C) COSY (1H-1H)

Aglycone

156,1 135,1 2 3 - - 157,5 134,8

178,0 160,1 4 5-OH 178,0 160,9 - (5-OH) 12,57 (1H, s)

98,6 162,2 6 7 99,4 161,7 6,43 (1H, d; 2,0) - 5, 7, 8, 10

94,5 157,8 8 9 94,5 156,0 6,75 (1H, d; 2,0) - 6, 7, 9, 10

104,2 10 - 105,7

120,8 1' - 120,4

115,8 145,5 2' 3' 115,6 145,2 7,39 (1H, d; 2,0) - 2, 3', 4', 6'

147,6 4' - 148,8

116,0 5' 115,5 6,89 (1H, d; 8,5) 1', 3', 4' 6'

119,5 6' 121,1 7,31 (1H, dd; 8,5 và 2,0) 2, 2', 4' 5'

98,6 80,0 Rha I 1'' 2'' 101,0 81,4 5,47 (1H, br s) 4,12 (1H, d; 2,5) 3, 3'', 5'' 1'', 3'', 4'', 1''' 2'' 1'', 3''

70,4 3'' 70,2 3,59 - 3,63 (1H, m) 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 4''

72,1 4'' 71,7 3,10 - 3,16 (1H, m) 2'', 3'', 5'', 6'' 3'', 5''

70,0 17,8 5'' 6'' 70,4 17,4 3,52 - 3,56 (1H, m) 0,89 (3H, d; 6,5) 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 5'' 4'', 6'' 5''

Glc 1''' 2''' 103,2 106,2 4,22 (1H, d; 8,0) 2'', 3''', 5'''

73,8 2''' 1''', 3''' 73,9 2,94 - 2,98 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 2'''

77,2 3''' 2''', 4''' 76,2 3,10 - 3,16 (1H, m) 1''', 2''', 4''', 5'''

71,3 4''' 3''', 5''' 69,0 3,59 - 3,63 (1H, m) 2''', 3''', 5''', 6'''

77,4 5''' 4''', 6''' 76,5 3,10 - 3,16 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 6'''

4''', 5''' 6''' 5''' 61,3 60,2 3,39 - 3,47 (1H, m) 3,27 (1H, br s)

Rha II 1'''' 99,9 98,4 5,53 (1H, d; 1,0) 7, 3'''', 5'''' 2''''

2'''' 70,2 69,8 3,83 (1H, t; 4,5 và 3,0) 1'''', 3'''', 4'''' 1'''', 3''''

3'''' 70,4 70,1 3,39 - 3,47 (1H, m) 1'''', 2'''', 4'''', 5'''' 2'''', 4''''

4'''' 72,1 71,6 3,33 (1H, br s) 2'''', 3'''', 5'''', 6'''' 3'''', 5''''

5'''' 70,0 70,0 3,39 - 3,47 (1H, m) 1'''', 3'''', 4'''', 6'''' 4'''', 6''''

6'''' 18,1 4'''', 5'''' 5''''

17,9 1,11 (3H, d; 6,0) aDMSO-d6, b22 MHz, c125MHz, d500 MHz

3.1.6. Hợp chất 6: Cleomeside A (Mới)

→ HMBC

Hình 3.6: Cấu trúc hóa học hợp chất 6

25 -0,25 (c 0,01; MeOH).

Hợp chất 6 có dạng vô định hình, màu vàng.

Độ quay cực [α]D

là

Phổ tử ngoại UV (MeOH) λmax: 204, 257 và 350 nm. Phổ IR νmax (MeOH): 3317, 2943, 2831, 1449, 1414, 1114 và 1022 cm-1. Phổ HR-ESI-MS m/z: 797,2134 [M-H]- (tính toán lý thuyết cho [C35H41O21]-

797,2140) xác định công thức phân tử là C35H42O21. (Phụ lục 6a - 6c).

Phổ NMR của hợp chất 6 về cơ bản giống với phổ hợp chất 5. Tuy nhiên, có xuất hiện thêm một nhóm acetyl trên phổ 1H-NMR tại δH 2,04 (3H, s, H-8"") và tín hiệu trên phổ 13C-NMR tại δC 170,0 (C-7"") và 20,9 (C-8""). Thêm vào đó, trên phổ

HMBC, 3 proton của nhóm methyl bậc bốn tại δH 2,04 (3H, s, H-8"") cho tương tác

với carbon carbonyl tại δC 170,0 (C-7""), đồng thời proton methine kề oxy tại δH 4,88

(1H, t; 10,0; H-4"") cũng cho tương tác với carbon này, chứng tỏ phần đường thứ ba

α-Rha đã bị acetyl hóa tại vị trí C-4"". Ngoài ra, trên phổ COSY (Phụ lục 6i), cho thấy

có sự tương tác của các 2 proton liền kề nhau của phần đường rhamnose và glucose.

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 6 được trình bày trong bảng 3.6.

Từ những dữ liệu phổ 1H,13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC và HR-ESI-MS, xác

định hợp chất 6 là quercetin-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L-rhamnopyranoside-

7-O-(4""-acetyl)-α-L-rhamnopyranoside.

Đây là hợp chất mới chúng tôi phân lập được, chưa có tài liệu nào công bố (theo

Scifinder ngày 26/7/2013, phụ lục 32a) và đặt tên là cleomeside A.

Bảng 3.6: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 6

a,c (J = Hz)

a,b

Vị trí δδδδH δC HMBC (1H-13C) COSY (1H-1H)

Aglycone

2 3 157,5 134,9 - -

4 5 178,0 160,9 - -

6 7 99,5 161,3 6,48 (1H, d; 2,0) - 5, 7, 8, 10

8 94,6 6,81 (1H, d; 2,0) 6, 7, 9, 10

9 156,0 -

10 1' 105,9 120,4 - -

2' 3' 115,6 145,3 7,40 (1H, d; 2,0) - 2, 3', 4', 6'

4' 5' 148,9 115,5 - 6,89 (1H, d; 8,5) 1', 3', 4' 6'

6' 2, 2', 4' 5' 121,1 7,33 (1H, dd; 8,5 và 2,0)

3, 3'', 5'' 2'' Rha I 1'' 101,1 5,49 (1H, br s)

2'' 81,4 4,13 (1H, d; 2,0) 1'', 3'', 4'', 1''' 1'', 3''

3'' 70,2 3,91 (1H, s) 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 4''

4'' 71,8 3,12 - 3,16 (1H, m) 2'', 3'', 5'', 6'' 3'', 5''

5'' 6'' 70,4 17,4 3,60 - 3,64 (1H, m) 0,90 (3H, d; 6,0) 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 5'' 4'', 6'' 5''

Glc 1''' 106,2 4,23 (1H, d; 8,0) 2'', 3''', 5''' 2'''

2''' 73,9 2,97 - 3,00 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 2''' 1''', 3'''

3''' 76,2 2,97 - 3,00 (1H, m) 1''', 2''', 4''', 5''' 2''', 4'''

4''' 69,1 3,52 - 3,55 (1H, m) 2''', 3''', 5''', 6''' 3''', 5'''

5''' 76,5 3,12 - 3,16 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 6''' 4''', 6'''

4''', 5''' 6''' 60,3 5''' 3,43 - 3,48 (1H, m) 3,34 (1H, d; 10,0)

Rha II 1'''' 98,0 5,62 (1H, d; 1,0) 7, 3'''', 5'''' 2''''

2'''' 69,7 3,12 - 3,16 (1H, m) 1'''', 3'''', 4'''' 1'''', 3''''

3'''' 4'''' 67,8 73,3 3,85 - 3,87 (1H, m) 4,88 (1H, t; 10,0) 1'''', 2'''', 4'''', 5'''' 2'''', 3'''', 5'''', 6'''', 7'''' 2'''', 4'''' 3'''', 5''''

5'''' 6'''' 67,5 17,5 3,60 - 3,64 (1H, m) 1,03 (3H, d; 6,0) 1'''', 3'''', 4'''', 6'''' 4'''', 5'''' 4'''', 6'''' 5''''

7'''' 170,0 -

aDMSO-d6, b125MHz, c500 MHz

8'''' 20,9 2,04 (3H, s) 7''''

3.1.7. Hợp chất 7: Quercetin-3-O-[2"-O-(6'''-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranosyl]-

α-L-rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside

→ HMBC

Hình 3.7: Cấu trúc hóa học hợp chất 7

Hợp chất 7 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 925,2378 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

[C42H46O22Na]+ là 925,2378) xác định công thức phân tử là C42H46O22. (Phụ lục 7a)

Phổ NMR của hợp chất 7 giống với phổ của hợp chất 5. Bên cạnh đó, có xuất hiện

thêm 4 proton của vòng thơm thế 1,4 đối xứng tại δH 7,39 (2H, d; 8,5; H-5a và H-9a) và

δH 6,68 (2H, d; 8,5; H-6a và H-8a). Trên phổ HMBC các proton này đều cho tương tác

với carbon bậc bốn C-7a tại δC 159,7. Proton tại δH 6,68 (2H, d; 8,5; H-6a và H-8a)

cũng cho tương tác với carbon bậc bốn vòng thơm C-4a tại δC 124,9. Ngoài ra, 2 proton

methine ghép trans đều cho tương tác với carbon carbonyl tại δC 166,3 (C-1a) và

carbon bậc bốn vòng thơm tại δC 124,9 (C-4a), vậy 2 proton methine ghép trans này

nối với nhóm carbonyl và phần còn lại gắn với vòng thơm thế đối xứng, chứng tỏ dây

nhánh này chính là p-coumaroyl.

Hai proton của nhóm methylene kề oxy tại δH 4,17 (1H, dd; 12,0 và 2,5; H-6a''') và

4,07 - 4,13 (1H, m, H-6b''') đều tương tác với carbon carbonyl C-1a tại δC 166,3; chứng

tỏ dây nhánh p-coumaroyl gắn vào đơn vị đường glucose. Dữ liệu phổ NMR của hợp

chất 7 được trình bày trong bảng 3.7.

Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, COSY, HSQC, HMBC (Phụ lục 7b - 7g), các đặc trưng vật lý và so sánh với tài liệu đã công bố[108], xác định

hợp chất 7 là quercetin-3-O-[2"-O-(6'''-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranosyl]-α-L-rhamno

pyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside.

Bảng 3.7: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 7

a,b

a,c (J = Hz)

Vị trí δδδδC δδδδH HMBC (1H-13C) COSY (1H-1H) δδδδC [108]

Aglycone

- - 157,1 134,6 157,0 134,6 2 3

- 177,9 177,9 4

(5-OH) 12,58 (1H, s) 160,9 160,9 5

6,39 (1H, d; 2,0) - 5, 7, 8, 10 99,3 161,6 99,3 161,6 6 7

6,65 (1H, d; 2,0) - 6, 7, 9, 10 94,4 155,9 94,3 155,9 8 9

- 105,6 105,6 10

- 120,3 120,4 1'

7,40 (1H, d; 2,0) 2, 3', 4', 6' 115,5 115,5 2'

- 145,3 145,2 3'

- 6,89 (1H, d; 8,0) 1', 3', 4' 148,7 115,5 148,7 115,5 4' 5' 6'

120,9 7,26 (1H, dd; 8,0 và 2,0) 2, 2', 4' 120,9 6' 5'

Rha I 1'' 100,5 100,7 5,54 (1H, br s) 3, 3'', 5'' 2''

2'' 81,4 81,7 4,17 (1H, d; 3,5) 1'', 3'', 4'', 1''' 1'', 3''

3'' 70,0 69,8 3,83 (1H, s) 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 4''

4'' 71,6 71,6 3,29 - 3,35 (1H, m) 2'', 3'', 5'', 6'' 3'', 5''

5'' 70,4 73,5 3,64 - 3,73 (1H, m) 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 6''

6'' 17,3 17,7 0,94 (3H, d; 6,5) 4'', 5'' 5''

Glc 1''' 105,9 106,1 4,29 (1H, d; 8,0) 2'', 3''', 5''' 2'''

2''' 73,6 71,7 3,26 - 3,29 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 2''' 1''', 3'''

3''' 75,9 75,9 3,11 - 3,20 (1H, m) 1''', 2''', 4''', 5''' 2''', 4'''

4''' 69,5 73,6 3,53 - 3,57 (1H, m) 2''', 3''', 5''', 6''' 3''', 5'''

5''' 73,6 73,5 4''', 6'''

1''', 3''', 4''', 6''' 4''', 5''', 1a 6''' 62,8 64,5 5''' 3,02 - 3,05 (1H, m) 4,17 (1H, dd; 12,0 và 2,5) 4,07 - 4,13 (1H, m)

Rha II 1'''' 98,4 98,5 5,50 (1H, br s) 7, 3'''', 5'''' 2''''

2'''' 69,7 70,2 3,53 - 3,57 (1H, m) 1'''', 3'''', 4'''' 1'''', 3''''

3'''' 70,2 70,0 3,58 - 3,64 (1H, m) 1'''', 2'''', 4'''', 5'''' 2'''', 4''''

4'''' 71,5 70,4 3,41 - 3,47 (1H, m) 2'''', 3'''', 5'''', 6'''' 3'''', 5''''

5'''' 70,0 69,8 3,17 - 3,20 (1H, m) 1'''', 3'''', 4'''', 6'''' 4'''', 6''''

6'''' 17,8 17,9 1,12 (3H, d; 6,5) 4'''', 5'''' 5''''

p-coumaroyl

166,3 166,3 -

113,9 144,5 113,9 144,6 6,21 (1H, d; 16,0) 7,43 (1H, d; 16,0)

124,9 130,0 124,9 130,1 - 7,39 (1H, d; 8,5)

115,5 115,6 6,68 (1H, d; 8,5)

159,6 159,7 -

115,5 130,0 115,6 130,1 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 1a, 3a, 4a 1a, 2a, 4a, 5a, 9a 3a, 7a, 9a 4a, 7a, 8a 4a, 6a, 7a 3a, 5a, 7a

6,68 (1H, d; 8,5) 7,39 (1H, d; 8,5) aDMSO-d6, b125MHz, c500 MHz

3.1.8. Hợp chất 8: Cleomeside B (Mới)

là

Hợp chất 8 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ HR-ESI-MS m/z: 945,2664 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho [C44H49O23]+

25 -0,20 (c 0,01; MeOH).

945,2665) xác định công thức phân tử là C44H48O23.

Độ quay cực [α]D

Bảng 3.8: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 8

Vị trí

a,b

a,c (J = Hz)

δC δH HMBC (1H-13C) COSY (1H-1H)

Aglycone

- - 2 3 158,9 137,1

- - 4 5 179,8 162,9

6 100,5 6,40 (1H, d; 2,0) 5, 7, 8, 10

7 163,2

8 95,6 6,48 (1H, d; 2,0) 6, 7, 9, 10

- 9 157,8

- 10 107,7

- 1' 122,7

2' 3' 117,1 146,5 7,35 (1H, d; 2,0) - 2, 3', 4', 6'

4' 5' 149,9 116,4 - 6,92 (1H, d; 8,0) 1', 3', 4' 6'

123,0 7,24 (1H, dd; 8,0 và 2,0) 2, 2', 4' 5'

6' Rha I 1'' 102,6 5,75 (1H, br s) 3, 3'', 5'' 2''

4,38 (1H, d; 2,0)

2'' 3'' 83,6 71,7 3,91 (1H, dd; 10,0 và 3,0) 1'', 3'', 4'', 1''' 1'', 2'', 4'', 5'' 1'', 3'' 2'', 4''

4'' 5'' 73,6 72,1 3,38 - 3,46 (1H, m) 3,75 - 3,79 (1H, m) 2'', 3'', 5'', 6'' 1'', 3'', 4'', 6'' 3'', 5'' 4'', 6''

6'' 17,7 1,11 (3H, d; 4,0) 4'', 5'' 5''

Glc 1''' 107,1 4,44 (1H, d; 7,5) 2'', 3''', 5''' 2'''

2''' 75,1 3,32 - 3,33 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 2''' 1''', 3'''

3''' 4''' 77,6 72,0 3,38 - 3,46 (1H, m) 3,32 - 3,33 (1H, m) 1''', 2''', 4''', 5''' 2''', 3''', 5''', 6''' 2''', 4''' 3''', 5'''

5''' 75,3 3,38 - 3,46 (1H, m) 4''', 6'''

1''', 3''', 4''', 6''' 4''', 5''', 1a 5''' 6''' 64,5 4,53 (1H, dd; 12,0 và 2,5) 4,07 - 4,11 (1H, m)

Rha II 1'''' 99,8 5,54 (1H, br s) 7, 3'''', 5'''' 2''''

2'''' 71,7 4,07 - 4,11 (1H, m) 1'''', 3'''', 4'''' 1'''', 3''''

70,1 4,01 (1H, dd; 10,0 và 3,0) 1'''', 2'''', 4'''', 5'''' 2'''', 4'''' 3''''

5,05 (1H, t; 10,0) 2'''', 3'''', 5'''', 6'''', 7'''' 3'''', 5'''' 4'''' 75,1

3,75 - 3,79 (1H, m) 1'''', 3'''', 4'''', 6'''' 4'''', 6'''' 5'''' 69,1

1,16 (3H, d; 6,5) 4'''', 5'''' 5'''' 6'''' 17,9

7'''' 172,5 -

8'''' 21,0 2,13 (3H, s) 7''''

p-coumaroyl

168,8 -

114,8 146,3 6,02 (1H, d; 16,0) 7,40 (1H, d; 16,0)

126,9 131,0 - 7,20 (1H, d; 8,5)

116,6 161,0 6,66 (1H, d; 8,5) -

116,6 131,0 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 1a, 3a, 4a 1a, 2a, 4a, 5a, 9a 3a, 7a, 9a 4a, 7a, 8a 4a, 6a, 7a 3a, 5a, 7a

6,66 (1H, d; 8,5) 7,20 (1H, d; 8,5) aDMSO-d6, b125MHz, c500 MHz

Rha II

5""

6""

1""

H3C O

3""

2""

7''''

4""

8'''' H3C

O 5''

1''

Rha I O

6'' H3C

3''

2''

HO 6'''

4'' HO

4'''

5'''

1'''

3'''

2''' Glc

→ HMBC

Hình 3.8: Cấu trúc hóa học hợp chất 8

Phổ IR νmax (MeOH): 3317, 2943, 2831, 1449, 1414, 1114 và 1022 cm-1.

Phổ tử ngoại UV (MeOH) λmax: 208, 262 và 317 nm. (Phụ lục 8a - 8c)

Phổ NMR của hợp chất 8 (Phụ lục 8d - 8i) về cơ bản giống với phổ của hợp chất 7.

Tuy nhiên, trên phổ HMBC có sự xuất hiện thêm 3 proton của nhóm methyl bậc bốn

tại δH 2,13 (3H, s, H-8'''') cho tương tác với carbon carbonyl tại δC 172,5 (C-7''''), đồng

thời proton oxymethine tại δH 5,05 (1H, t; 10,0; H-4'''') cho tương tác với carbon này,

chứng tỏ phần đường thứ ba α-Rha đã bị acetyl hóa tại vị trí C-4''''. Ngoài ra trên phổ

COSY cho thấy có sự tương tác của các proton kề nhau của các phân tử đường. Dữ

liệu phổ NMR của hợp chất 8 được trình bày trong bảng 3.8.

Điều này xác định hợp chất 8 là quercetin-3-O-[2''-O-(6'''-p-coumaroyl)-β-D-

glucopyranosyl]-α-L-rhamnopyranoside-7-O-(4''''-acetyl)-α-L-rhamnopyranoside.

Đây là hợp chất mới chúng tôi phân lập được, chưa có tài liệu nào công bố (theo

Scifinder ngày 26/12/2013, phụ lục 32b) và đặt tên là cleomeside B.

3.1.9. Hợp chất 9: Visconoside A (Mới)

→ HMBC

Hình 3.9: Cấu trúc hóa học hợp chất 9

Hợp chất 9 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 821,2116 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

là 821,2116) xác định công thức phân tử là C35H42O21.

25 -0,94 (c 0,01; MeOH).

[C35H42O21Na]+

Độ quay cực [α]D Phổ IR νmax (MeOH): 3317, 2943, 2831, 1449, 1417, 1114 và 1022 cm-1.

Phổ tử ngoại UV (MeOH) λmax: 257 và 348 nm. (Phụ lục 9a - 9c). Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và HSQC của hợp chất 9 tương tự như hợp chất 6,

cho biết có khung quercetin cùng 2 đơn vị đường rhamnose, 2 đơn vị đường glucose

và 2 nhóm acetyl. (Phụ lục 9d - 9g)

Tuy nhiên, trên phổ HMBC (Phụ lục 9h) cho thấy sự tương quan của các phần này

khác với hợp chất 6.

Các tín hiệu proton anomer của phần đường rhamnose tại δH 5,36 (1H, br s, H-1'') và 5,54 (1H, d; 1,0; H-1'''') lần lượt tương tác với khung quercetin tại C-3 (δC 133,9) và C-7 (δC 161,9); đồng thời proton anomer của phần đường glucose tại δH 4,27 (1H, d; 8,0) tương tác với δC 76,9 (C-3'') của phần đường rhamnose cho biết đường glucose

được nối với rhamnose tại C-3''.

Bảng 3.9: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 9

Vị trí

a,b

a,c (J = Hz)

δC δH HMBC (1H-13C) COSY (1H-1H)

Aglycone

2 - 158,2

3 4 - - 133,9 178,0

5 6 161,1 99,8 - 6,45 (1H, d; 2,0) 5, 7, 8, 10

7 - 161,9

8 94,8 6,76 (1H, d; 2,0) 6, 7, 9, 10

9 - 156,3

10 - 105,9

1' - 120,4

2' 115,8 7,31 (1H, dd; 8,5 và 2,0) 2, 3', 4', 6'

3' 4' - - 145,5 149,1

115,8 121,6 6,93 (1H, d; 8,5) 7,30 (1H, d; 2,0) 1', 3', 4' 2, 2', 4' 6' 5'

5' 6' Rha I 1'' 101,2 5,36 (1H, br s) 3, 3'', 5'' 2''

2'' 3'' 69,7 76,9 4,20 (1H, s) 3,87 (1H, d; 2,5) 1'', 3'', 4'', 1''' 1'', 2'', 4'', 5'', 1''' 1'', 3'' 2'', 4''

4'' 71,5 4,82 (1H, t; 10,0) 2'', 3'', 5'', 6'', 7'' 3'', 5''

5'' 68,5 3,37 (1H, dd; 10,0 và 6,5) 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 6''

6'' 7'' 17,3 170,2 0,74 (3H, d; 6,5) - 4'', 5'' 5''

21,0 1,96 (3H, s) 7''

8'' Glc 1''' 104,8 4,27 (1H, d; 8,0) 3'', 3''', 5''' 2'''

2''' 3''' 73,4 77,0 2,99 (1H, t; 8,5) 3,17 (1H, dd; 9,0 và 8,5) 1''', 3''', 4''', 2''' 1''', 2''', 4''', 5''' 1''', 3''' 2''', 4'''

4''' 70,1 3,10 (1H, t; 9,0) 2''', 3''', 5''', 6''' 3''', 5'''

5''' 76,6 4''', 6'''

1''', 3''', 4''', 6''' 4''', 5''' 6''' 61,2 5''' 3,22 (1H, m) 3,72 (1H, dd; 11,5 và 1,5) 3,54 (1H, dd; 11,5 và 9,0)

Rha II 1'''' 98,6 5,54 (1H, d; 1,0) 7, 3'''', 5'''' 2''''

2'''' 70,0 3,84 (1H, br s) 1'''', 3'''', 4'''' 1'''', 3''''

3'''' 70,4 3,63 (1H, dd; 9,5 và 3,5) 1'''', 2'''', 4'''', 5'''' 2'''', 4''''

4'''' 71,8 3,31(1H, t; 9,5) 2'''', 3'''', 5'''', 6'''' 3'''', 5''''

5'''' 70,3 3,44 (1H, dd; 6,0 và 3,5) 1'''', 3'''', 4'''', 6'''' 4'''', 6''''

6'''' 18,1 4'''', 5'''' 5''''

1,11 (3H, d; 6,0) aDMSO-d6, b125MHz, c500 MHz

Bên cạnh đó, nhóm methyl tại δH 1,96 (3H, s) và nhóm methine kề oxygen tại δH 4,82 (1H, t; 10,0) cùng tương tác với carbon carbonyl tại δC 170,2 (C-7'') cho phép xác định phần đường rhamnose nối tại C-3 bị acetyl hóa tại vị trí C-4'' (δC 71,5). Ngoài ra,

trên phổ COSY (Phụ lục 9i), cho thấy có sự tương tác của các 2 proton liền kề nhau

của phần đường rhamnose và glucose. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 9 được trình

bày trong bảng 3.9.

Từ đó, cấu trúc hợp chất 9 được xác định là quercetin-3-O-[β-D-glucopyranosyl-

(1→3)]-α-L-(4-O-acetyl)-rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside.

Hợp chất 9 là hợp chất mới chúng tôi phân lập được, chưa có tài liệu nào công bố

(theo Scifinder ngày 7/4/2015, phụ lục 32d) và đặt tên là visconoside A.

3.1.10. Hợp chất 10: Visconoside B (Mới)

→ HMBC

Hình 3.10: Cấu trúc hóa học hợp chất 10

25 -1,23 (c 0,01; MeOH).

Hợp chất 10 có dạng vô định hình, màu vàng.

Độ quay cực [α]D Phổ IR νmax (MeOH): 3317, 2943, 2831, 1449, 1416, 1115 và 1022 cm-1. Phổ tử ngoại UV (MeOH) λmax: 249 và 336 nm. (Phụ lục 10a - 10c) Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 1027,2680 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

là 1027,2695) xác định công thức phân tử là C46H52O25.

[C46H52O25Na]+

Bảng 3.10: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 10

Vị trí

a,b

a,c (J = Hz)

δC δH HMBC (1H-13C) COSY (1H-1H)

Aglycone 2 3 156,8 133,2 - -

4 5 177,4 160,5 - -

6 7 99,5 161,7 6,27 (1H, d; 1,5) - 5, 7, 8, 10

8 9 93,6 155,6 6,50 (1H, s) - 6, 7, 9, 10

10 105,3

1' 120,5

2' 3' 115,6 145,4 7,26 (1H, d; 1,5) - 2, 3', 4', 6'

4' 148,8 -

5' 115,2 1', 3', 4' 6,93 (1H, t; 7,5) 6'

6' 2, 2', 4' 121,5 7,33 (1H, dd; 8,0 và 2,0) 5'

Rha I 1'' 2'' 99,9 69,7 5,54 (1H, s) 4,08 (1H, br s) 3, 3'', 5'' 1'', 3'', 4'', 1''' 2'' 1'', 3''

3'' 76,4 3,86 (1H, d; 2,5) 1'', 2'', 4'', 5'', 1''' 2'', 4''

4'' 71,3 4,79 (1H, t; 10,0) 2'', 3'', 5'', 6'', 7'' 3'', 5''

5'' 6'' 68,4 17,1 3,00 - 3,14 (1H, m) 0,66 (3H, d; 6,5) 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 5'' 4'', 6'' 5''

7'' 8'' 169,8 20,8 - 1,94 (3H, s) 7''

Glc

1''' 105,0 4,32 (1H, d; 7,5) 3'', 3''', 5''' 2'''

2''' 73,0 3,00 - 3,14 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 2''' 1''', 3'''

3''' 76,7 3,24 (1H, t; 9,0) 1''', 2''', 4''', 5''' 2''', 4'''

4''' 70,6 3,00 - 3,14 (1H, m) 2''', 3''', 5''', 6''' 3''', 5'''

5''' 74,1 3,60 - 3,65 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 6''' 4''', 6'''

6''' 63,6 5''' 4''', 5''', 1a 4,52 (1H, dd; 11,0 và 8,5) 4,25 (1H, d; 11,0 và 2,0)

Rha II 1'''' 98,6 5,54 (1H, s) 7, 3'''', 5'''' 2''''

2'''' 69,8 3,89 (1H, d; 2,5 Hz) 1'''', 3'''', 4'''' 1'''', 3''''

3'''' 70,3 3,60 - 3,65 (1H, m) 1'''', 2'''', 4'''', 5'''' 2'''', 4''''

4'''' 71,7 3,31 (1H, t; 9,0 Hz) 2'''', 3'''', 5'''', 6'''' 3'''', 5''''

5'''' 69,9 3,40 (1H, dd; 9,0 và 6,0) 1'''', 3'''', 4'''', 6'''' 4'''', 6''''

6'''' 18,0 1,15 (3H, d; 6,0) 4'''', 5'''' 5''''

Sinapinoyl

166,4 -

114,3 145,1 6,30 (1H, d; 15,5) 7,41 (1H, d; 15,5)

123,8 104,9 - 6,50 (1H, s) 3a 2a

147,3 137,8 - - 1a, 3a, 4a 1a, 2a, 4a, 5a, 9a 3a, 4a, 6a, 7a, 9a

147,3 104,9 - 6,50 (1H, s)

55,3 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a -OCH3 3a, 4a, 6a, 7a, 9a 3a, 4a, 5a, 7a, 8a

3,54 (6H, d; 6,5) aDMSO-d6, b125MHz, c500 MHz

Phổ NMR (Phụ lục 10d - 10i) hợp chất 10 về cơ bản giống với phổ của hợp chất 9.

Bên cạnh đó, có xuất hiện thêm 2 proton của vòng thơm thế 1,4 đối xứng tại δH 6,50

(1H, s, H-5a và H-9a). Trên phổ HMBC cho thấy các proton này đều cho tương tác với

3 carbon bậc bốn C-6a (δC 147,3), C-7a (δC 137,8) và C-8a (δC 147,3). Ngoài ra, hai

nhóm methoxyl tại δH 3,54 (6H, d; 6,5) đều cho tương tác với C-6a và C-8a tại δC

147,3, do đó hai nhóm này nối vào vòng thơm ờ C-6a và C-8a. Mặt khác, 2 proton

methine ghép trans đều cho tương tác với carbon carbonyl tại δC 166,4 (C-1a) và

carbon bậc bốn vòng thơm tại δC 123,8 (C-4a), vậy 2 proton methine ghép trans này

một phần nối với nhóm carbonyl, phần còn lại gắn với vòng thơm thế đối xứng, chứng

tỏ dây nhánh này chính là sinapinoyl.

Trên phổ HMBC, hai proton của nhóm methylene kề oxy tại δH 4,52 (1H, dd; 11,0

và 8,5; H-6a''') và 4,25 (1H, d; 11,0 và 2,0; H-6b''') đều tương tác với 1 carbon carbonyl

C-1a tại δC 166,4 chứng tỏ dây nhánh sinapinoyl gắn vào đơn vị đường glucose ở vị trí

C-6. Ngoài ra, phổ COSY cho thấy các tương tác của các proton kề nhau trong các đơn

vị đường. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 10 được trình bày trong bảng 3.10.

Do đó, hợp chất 10 được xác định là quercetin-3-O-[sinapinoyl(1→6)-β-D-gluco

pyranosyl-(1→3)]-α-L-(4-O-acetyl)-rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside.

Hợp chất 10 là hợp chất mới chúng tôi phân lập được, chưa có tài liệu nào công bố

(theo Scifinder ngày 28/5/2015, phụ lục 32e) và đặt tên là visconoside B.

3.1.11. Hợp chất 11: Kaempferol-3-O-methylether

Hình 3.11: Cấu trúc hóa học hợp chất 11

Hợp chất 11 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 323,0520 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

là 323,0531) xác định công thức phân tử là C16H12O6. (Phụ lục 11a)

[C16H12O6Na]+

Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH ppm, J = Hz) (Phụ lục 11b) cho thấy sự

hiện diện của proton tại δH 12,68 ppm (1H, s, 5-OH) đặc trưng cho nối hydrogen nội

phân tử của một nhóm -OH gần nhóm carbonyl trong khung flavone. Đồng thời, các

tín hiệu của 2 proton vòng thơm ghép cặp metha tại δH 6,20 (1H, d; 2,0; H-6) và δH

6,44 (1H, d; 2,0; H-8); và 4 proton vòng thơm ghép cặp ortho tại δH 6,94 (2H, d; 9,0;

H-3' và H-5') và δH 7,93 (2H, d; 9,0; H-2' và H-6') cho thấy có hai vòng thơm, một

vòng mang 4 nhóm thế và một vòng thơm mang 2 nhóm thế đối xứng.

Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, δC ppm) (Phụ lục 11c) cho các tín hiệu của 16

carbon; trong đó có 8 carbon tứ cấp của vòng thơm tại δC 164,1; 161,2; 160,1; 156,3;

155,6; 120,5 và 104,2; một carbon carbonyl tại δC 177,9; sáu carbon methine vòng

thơm tại δC 130,1; 115,6; 98,5 và 93,6; cho thấy hợp chất 11 là flavonoid có vòng A bị

thế tại vị trí C-5 và C-7 và vòng B bị thế tại C-4'.

Trên phổ HMBC (Phụ lục 11f), proton tại δH 6,20 (1H, d; 2,0; H-6) và δH 6,44 (1H,

d; 2,0; H-8) ghép cặp metha với nhau và đều tương tác với carbon vòng thơm tứ cấp

gắn oxygen tại δC 164,1 và carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen tại δC 104,2

nên hai carbon này lần lượt là C-7 và C-10. Hai proton này cũng lần lượt cho tương tác

với hai carbon vòng thơm oxygen hoá tại δC 156,3 và 161,2 nên hai carbon này lần

lượt là C-9 và C-5. Proton tại δH 7,93 (2H, d; 9,0; H-2' và H-6') đều cho tương tác 2

carbon tứ cấp vòng thơm mang oxygen tại δC 160,1 và 155,6; đồng thời proton tại δH

6,94 (2H, d; 9,0; H-3' và H-5') cho tương tác với carbon tứ cấp vòng thơm không mang

oxygen tại δC 120,5 và 1 carbon tứ cấp tại δC 160,1; vậy 2 carbon tứ cấp vòng thơm

mang oxygen này lần lượt là C-4' và C-2, còn carbon tứ cấp còn lại là C-1'. Như vậy,

khung aglycone của hợp chất 11 là kaempferol.

Bảng 3.11: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 11

a,b [76]

δC δC δH

Vị trí 2

c,d 155,6

c,e (J = Hz) -

HMBC (1H-13C) 157,6

139,0 137,6 - 3

179,5 162,4 177,9 161,2 - (5-OH) 12,68 (1H, s) 4 5

99,6 98,5 6,20 (1H, d; 2,0) 5, 7, 8, 10 6

165,1 164,1 - 7

94,6 93,7 6,44 (1H, d; 2,0) 6, 7, 9, 10 8

157,9 156,3 - 9

105,7 104,2 - 10

122,2 120,5 - 1'

131,0 130,1 7,93 (1H, d; 9,0) 2, 1', 3', 4', 6' 2'

116,2 115,6 6,94 (1H, d; 9,0) 1', 2', 4', 5' 3'

160,9 160,1 - 4'

116,2 115,6 6,94 (1H, d; 9,0) 1', 3', 4', 6' 5'

131,0 130,1 7,93 (1H, d; 9,0) 2, 1', 2', 4', 6'

64,4 3,78 (3H, s) 59,6 6' -OCH3

3 aCDCl3-CD3OD, b100 MHz, cDMSO-d6, d125MHz, e500 MHz

Ngoài ra, proton của nhóm methoxyl tại δH 3,78 (3H, s, -OCH3) cho tương tác với

carbon tứ cấp vòng thơm mang oxygen tại δC 137,6 (C-3), nên nhóm methoxyl gắn vào

khung aglycone tại vị trí C-3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 11 được trình bày trong

bảng 3.11.

Tóm lại, từ phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công bố[76], xác định hợp chất 11 là

kaempferol-3-O-methylether.

3.1.12. Hợp chất 12: Kaempferol-3,4'-O-dimethylether

Hình 3.12: Cấu trúc hóa học hợp chất 12

Hợp chất 12 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 337,0675 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

là 337,0688) xác định công thức phân tử là C17H14O6. (Phụ lục 12a)

[C17H14O6Na]+

Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của khung aglycone hợp chất 12 xác định là kaempferol

tương tự như hợp chất 11 (Phụ lục 12b, 12c). Ngoài ra, có thêm 2 nhóm methoxyl tại

δH 3,78 (3H, s, H-11) và 3,85 (3H, s, H-12).

Bảng 3.12: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 12

HMBC (1H-13C) Vị trí δC δC δH

a,b [53] 156,5 139,4 179,5 169,0 97,0 164,8 94,6 157,8 106,3 126,0 131,1 115,3 162,7 115,3 131,1 60,4 55,8

c,d 155,1 137,9 177,9 161,3 98,6 164,4 93,7 156,4 104,2 122,2 129,9 114,2 161,3 114,2 129,9 59,7 55,4

c,e (J = Hz) - - - (5-OH) 12,64 (1H, s) 6,18 (1H, d; 2,0) - 6,38 (1H, d; 2,0) - - - 8,02 (1H, d; 9,0) 7,12 (1H, d; 9,0) - 7,12 (1H, d; 9,0) 8,02 (1H, d; 9,0) 3,78 (3H, s) 3,85 (3H, s)

aaceton-d6, b100 MHz, cDMSO-d6, d125MHz, e500 MHz

5, 7, 8, 10 6, 7, 9, 10 2, 1', 3', 4', 6' 1', 2', 4', 5' 1', 3', 4', 6' 2, 1', 2', 4', 6' 3 4' 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 11 (-OCH3) 12 (-OCH3)

Trên phổ HMBC cho thấy proton nhóm methoxyl tại δH 3,78 (3H, s, H-11) tương

tác với carbon tứ cấp vòng thơm mang oxygen tại δC 137,9 (C-3) và proton nhóm

methoxyl tại δH 3,85 (3H, s, H-12) tương tác với carbon tứ cấp vòng thơm mang

oxygen tại δC 161,3 (C-4') nên nhóm methoxyl gắn vào flavonoid tại vị trí C-3 và C-4'.

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 12 được được trình bày trong bảng 3.12.

Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công bố[53], xác định hợp chất 12 là

kaempferol-3,4'-O-dimethylether.

3.1.13. Hợp chất 13: Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside

→ HMBC

Hình 3.13: Cấu trúc hóa học hợp chất 13

Hợp chất 13 có dạng vô định hình, màu vàng.

Trên phổ NMR, cho biết khung aglycone của hợp chất 13 là kaempferol qua các vị

trí: C-6 tại δH 6,22 (1H, d; 2,0; H-6) và δC 100,0; C-8 tại δH 6,41 (1H, d; 2,0; H-8) và

δC 94,8; C-2' và C-6' tại δH 8,07 (2H, d; 9,0; H-2' và H-6') và δC 132,3; C-3' và C-5' tại

δH 6,91 (2H, d; 9,0; H-3' và H-5') và δC 116,1.

Bên cạnh đó, có sự xuất hiện thêm các tín hiệu trong vùng đường tại δH 3,23 - 5,26

ppm, trong đó nổi bật là 2 tín hiệu tại δH 3,54 (1H, dd; 12,0 và 5,0) và 3,70 (1H, dd; 12,0 và 2,5). Đồng thời, phổ 13C-NMR kết hợp DEPT cho tín hiệu tại δC 62,9 là nhóm

-CH2-, cho thấy có thêm một đơn vị đường là glucose. (Phụ lục 13a - 13c)

Trên phổ HMBC (Phụ lục 13e) có sự tương tác giữa proton anomer của đường

glucose δH 5,26 (1H, d; 7,5; H-1'') với carbon C-3 (δC 135,5) cho thấy đường glucose

gắn vào khung aglycone tại vị trí C-3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 13 được trình

bày trong bảng 3.13.

Như vậy, hợp chất 13 là kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside. Các kết quả phổ của

hợp chất 13 được xác định dựa vào sự so sánh với dữ kiện phổ đã được công bố cho kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside.[102]

Bảng 3.13: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 13

HMBC (1H-13C) Vị trí

b,c

b,d (J = Hz)

δC δH

a,c δC [102]

- Aglycone 2 156,7 159,1

- - 3 4 133,7 177,9 135,5 179,5

- 6,22 (1H, d; 2,0) 5, 7, 8, 10 5 6 161,7 99,1 163,1 100,0

- 7 164,6 166,2

94,1 94,8 6,41 (1H, d; 2,0) 6, 7, 9, 10 8

- 9 156,8 158,6

- 10 104,5 105,7

- 1' 121,4 122,8

2' 131,3 132,3 8,07 (1H, d; 9,0) 2, 1', 3', 4', 6'

3' 4' 115,6 160,4 116,1 161,6 6,91 (1H, d; 9,0) - 1', 2', 4', 5'

5' 6' 115,6 131,3 116,1 132,3 6,91 (1H, d; 9,0) 8,07 (1H, d; 9,0) 1', 3', 4', 6' 2, 1', 2', 4', 6'

Glc 1'' 101,3 104,2 5,26 (1H, d; 7,5) 3, 3'', 5''

2'' 3'' 74,7 76,9 75,8 78,4 3,41 - 3,48 (1H, m) 3,41 - 3,48 (1H, m) 1'', 3'', 4'' 1'', 2'', 4'', 5''

4'' 5'' 70,4 77,9 71,4 78,1 3,33 (1H, m) 3,23 (1H, m) 2'', 3'', 5'', 6'' 1'', 3'', 4'', 6''

aDMSO, bMeOD-d4, c125MHz, d500 MHz

4'', 5'' 6'' 61,3 62,9 3,54 (1H, dd; 12,0 và 5,0) 3,70 (1H, dd; 12,0 và 2,5)

3.1.14. Hợp chất 14: Kaempferol-7-O-αααα-L-rhamnopyranoside

Hợp chất 14 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 455,0930 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

là 455,0954) xác định công thức phân tử là C21H20O10. (Phụ lục 14a)

[C21H20O10Na]+

Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR, cho biết khung aglycone của hợp chất 14 là

kaempferol tương tự như hợp chất 13. (Phụ lục 14b - 14e)

Ngoài ra, phổ 1H-NMR cho các tín hiệu của vùng đường tại δH 1,12 - 5,54 ppm.

Trong đó, tín hiệu doublet tại δH 1,12 (3H, d; 6,0) cho thấy đơn vị đường là rhamnose.

→ HMBC

Hình 3.14: Cấu trúc hóa học hợp chất 14

Bảng 3.14: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 14

Vị trí

c,d

c,e (J = Hz)

δC δH

a,b δC [69]

HMBC (1H-13C) COSY (1H-1H)

Aglycone

- 2 148,0 147,5

- 3 136,9 136,0

- 4 177,1 176,0

5 162,1 160,3 (5-OH) 12,47 (1H, s)

6 7 99,2 165,3 98,8 161,4 6,42 (1H, d; 2,0) - 5, 7, 8, 10

8 9 94,4 158,0 94,3 155,7 6,82 (1H, d; 2,0) - 6, 7, 9, 10

- - 10 1' 104,4 123,5 104,7 121,5

2' 3' 130,5 129,6 8,09 (1H, d; 9,0) 2, 1', 3', 4', 6'

3' 2' 116,2 115,4 6,92 (1H, d; 9,0) 1', 2', 4', 5'

4' 5' 6' 160,2 116,2 159,3 115,4 - 6,92 (1H, d; 9,0) 1', 3', 4', 6'

6' 5' 130,5 129,6 8,09 (1H, d; 9,0) 2, 1', 2', 4', 6'

Rha 1'' 2'' 95,4 72,9 98,4 69,8 5,54 (1H, d; 0,5) 3,85 (1H, s) 7, 3'', 5'' 1'', 3'', 4'' 2'' 1'', 3''

3'' 72,0 70,2 3,62 - 3,66 (1H, m) 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 4''

4'' 74,0 71,6 3,28 - 3,35 (1H, m) 2'', 3'', 5'', 6'' 3'', 5''

5'' 69,0 70,0 3,42 - 3,47 (1H, m) 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 6''

aCD3OD, b100 MHz, cDMSO-d6, d125MHz, e500 MHz Tín hiệu proton tại δH 5,54 (1H, d) của carbon anomer với hằng số tương tác spin khá thấp (J = 0,5 Hz) chứng tỏ đây là cấu hình α.

6'' 18,0 17,9 1,12 (3H, d; 6,0) 4'', 5'' 5''

Phổ 13C-NMR cho thấy: Ngoài 15 tín hiệu carbon của khung flavone, còn có thêm 6

tín hiệu carbon của một phân tử đường rhamnose là δC 98,4 (C-1''); 69,8 (C-2''); 70,2

(C-3''); 71,6 (C-4''); 70,0 (C-5'') và 17,9 (C-6'').

Trên phổ HMBC (Phụ lục 14f) có sự tương quan giữa proton anomer của đường

rhamnose tại δH 5,54 (1H, d; 0,5; H-1'') với carbon C-7 tại δC 161,4 cho thấy đường

rhamnose gắn vào aglycone tại vị trí C-7. Ngoài ra, trên phổ COSY (Phụ lục 14g), cho

thấy có sự tương tác của các 2 proton liền kề nhau của phần đường rhamnose. Dữ liệu

phổ NMR của hợp chất 14 được trình bày trong bảng 3.14.

Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, COSY, các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công bố[69], xác định hợp

chất 14 là kaempferol-7-O-α-L-rhamnopyranoside.

3.1.15. Hợp chất 15: Kaempferol-3-O-(4-O-acetyl-αααα-L-rhamnopyranoside)

→ HMBC

Hình 3.15: Cấu trúc hóa học hợp chất 15

Hợp chất 15 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 497,1046 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

là 497,1059) xác định công thức phân tử là C23H22O11. (Phụ lục 15a)

[C23H22O11Na]+

Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR, cho biết khung aglycone của hợp chất 15 là

kaempferol tương tự như hợp chất 13. (Phụ lục 15b - 15e)

Bên cạnh đó, proton anomer tại δH 5,27 (1H, d; 1,0; H-1'') cùng với tín hiệu nhóm

methyl tại δH 0,69 (3H, d; 6,0; H-6'') cho phép nhận biết được có thêm 1 nhóm đường

rhamnose.

Trên phổ HMBC (Phụ lục 15f), proton anomer tại δH 5,27 (1H, d; 1,0; H-1'') tương

tác với khung aglycone tại δC 133,9 (C-3) cho thấy đường rhamnose gắn vào khung

aglycone tại vị trí C-3.

Ngoài ra, 3 proton của nhóm methyl bậc bốn tại δH 1,99 (3H, s, H-8") cho tương tác

với carbon carbonyl tại δC 169,8 (C-7"), đồng thời proton methine kề oxygen tại

δH 4,69 (1H, t; 10,0; H-4") cũng tương tác với carbon này chứng tỏ phần đường

rhamnose bị acetyl hóa tại vị trí C-4". Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 15 được trình

bày trong bảng 3.15.

Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công bố[61], xác định hợp chất 15 là

kaempferol-3-O-(4-O-acetyl-α-L-rhamnopyranoside).

Bảng 3.15: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 15

HMBC (1H-13C)

a,b [61]

c,d

c,e (J = Hz)

δC δH

Vị trí δC Aglycone

158,2 135,4 179,1 163,2 100,0 166,3 94,8 158,4 105,4 122,4 131,7 116,4 161,2 116,4 131,7 157,3 133,9 177,5 161,1 98,8 164,6 93,8 156,5 103,9 120,3 130,5 115,3 160,1 115,3 130,5 - - - (5-OH) 12,56 (1H, s) 6,20 (1H, d; 1,5) - 6,44 (1H, d; 1,5) - - - 7,73 (1H, d; 8,5) 6,93 (1H, d; 9,0) - 6,93 (1H, d; 9,0) 7,73 (1H, d; 8,5) 5, 7, 8, 10 6, 7, 9, 10 2, 1', 3', 4', 6' 1', 2', 4', 5' 1', 3', 4', 6' 2, 1', 2', 4', 6'

2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' Rha 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 7'' 8'' 102,3 71,5 69,8 74,5 69,0 17,6 170,8 20,9 101,3 69,9 67,8 73,1 67,8 16,9 169,8 20,8 3, 3'', 5'' 1'', 3'', 4'' 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 3'', 5'', 6'', 7'' 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 5'' 7''

5,27 (1H, d; 1,0) 4,01 (1H, br s) 3,22 (1H, m) 4,69 (1H, t; 10,0) 3,68 (1H, dd; 9,5 và 2,5) 0,69 (3H, d; 6,0) - 1,99 (3H, s) aaceton-d6, b100 MHz, cDMSO-d6, d125MHz, e500 MHz

3.1.16. Hợp chất 16: Kaempferol-3-O-(2,4-O-diacetyl-αααα-L-rhamnopyranoside)

→ HMBC

Hình 3.16: Cấu trúc hóa học hợp chất 16

Hợp chất 16 có dạng vô định hình màu vàng. Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 539,1127 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

là 539,1165) xác định công thức phân tử là C25H24O12. (Phụ lục 16a)

[C25H24O12Na]+

Trên phổ 1H-NMR, khung aglycone của hợp chất 16 là được xác định là kaempferol

qua các tín hiệu: δH 12,47 (1H, s, 5-OH); 7,75 (2H, d; 8,5; H-2' và H-6'); 6,94 (2H, d; 8,5; H-3' và H-5'); 6,42 (1H, d; 2,0; H-8) và 6,22 (1H, d; 2,0; H-6) và phổ 13C-NMR:

δC 177,6 (C-4); 164,3 (C-7); 161,2 (C-5); 160,2 (C-4'); 157,4 (C-2); 156,5 (C-9); 133,2

(C-3); 130,5 (C-2' và C-6'); 120,1 (C-1'); 115,4 (C-3' và C-5'); 104,0 (C-10); 97,8

(C-1''); 98,8 (C-6) và 93,8 (C-8). (Phụ lục 16b - 16e)

Bên cạnh đó, proton anomer tại δH 5,40 (1H, d; 1,0) cùng với tín hiệu nhóm methyl

tại δH 0,74 (3H, d; 6,0) cho phép nhận biết được có thêm 1 nhóm đường rhamnose.

Trên phổ HMBC (Phụ lục 16f), proton anomer tại δH 5,40 (1H, d; 1,0; H-1'') tương

tác với khung aglycone tại δC 133,2 (C-3) cho thấy đường rhamnose gắn vào khung

aglycone tại vị trí C-3.

Ngoài ra, 3 proton của nhóm methyl bậc bốn tại δH 2,05 (3H, s, H-8") và 3 proton

của nhóm methyl bậc bốn khác tại δH 1,98 (3H, s, H-10") cho tương tác lần lượt với 2

carbon carbonyl tại δC 169,7 (C-7") và 169,4 (C-9"). Đồng thời, proton methine kề oxy

tại δH 5,32 (1H, dd; 3,5 và 1,5; H-2") tương tác với C-9" tại δC 169,4 và proton methine

kề oxy tại δH 4,61 (1H, t; 6,0; H-4") tương tác với C-7" tại δC 169,7; chứng tỏ phần

đường rhamnose bị acetyl hóa 2 lần tại vị trí C-2" và C-4".

Trên phổ COSY (Phụ lục 16g), cho thấy có sự tương tác của các 2 proton liền kề

nhau của phần đường rhamnose. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 16 được trình bày

trong bảng 3.16.

Tóm lại, từ phổ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công bố[76], hợp chất 16 là kaempferol-3-

O-(2,4-O-diacetyl-α-L-rhamnopyranoside).

Bảng 3.16: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 16

c,d

c,e (J = Hz)

Vị trí δC δH HMBC (1H-13C) COSY (1H-1H)

a,b δC [76]

Aglycone

158,7 157,4 2 -

134,8 179,0 133,2 177,6 3 4 - -

163,2 161,2 (5-OH) 12,47 (1H, s) 5

99,7 98,8 6,22 (1H, d; 2,0) 5, 7, 8, 10 6

- 6,42 (1H, d; 2,0) 6, 7, 9, 10 165,1 94,7 164,3 93,8 7 8

158,0 105,8 156,5 104,0 9 10 - -

122,3 120,1 1' -

2' 131,7 130,5 7,75 (1H, d; 8,5) 2, 1', 3', 4', 6' 3'

116,5 161,2 115,4 160,2 3' 4' 6,94 (1H, d; 8,5) - 1', 2', 4', 5' 2'

116,5 131,7 115,4 130,5 5' 6' 6,94 (1H, d; 8,5) 7,75 (1H, d; 8,5) 1', 3', 4', 6' 2, 1', 2', 4', 6' 6' 5'

Rha 1'' 99,3 97,8 5,40 (1H, d; 1,0) 3, 3'', 5'' 2''

2'' 72,4 71,1 5,32 (1H, dd; 3,5 và 1,5) 1'', 3'', 4'', 9'' 1'', 3''

3'' 68,0 65,8 3,87 (1H, m) 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 4''

4,61 ( 1H, t; 6,0)

4'' 5'' 74,4 69,1 72,9 67,9 3,25 (1H, dd; 10,0 và 6,0) 2'', 3'', 5'', 6'', 7'' 3'', 5'' 4'', 6'' 1'', 3'', 4'', 6''

6'' 17,6 16,9 0,74 (3H, d; 6,0) 4'', 5'' 5''

7'' 170,7 169,7 -

7'' 20,9 8'' 20,4 2,05 (3H, s)

170,2 9'' 169,4 -

aaceton-d6, b100 MHz, cDMSO-d6, d125MHz, e500 MHz

10'' 20,9 20,7 1,98 (3H, s) 9''

3.1.17. Hợp chất 17: Kaempferol-3,7-O-α-L-dirhamnopyranoside

Bảng 3.17: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 17

a,b

Vị trí

a,c

a,d (J = Hz)

δδδδC δδδδH COSY (1H-1H) HMBC (1H-13C) δδδδC [78]

Aglycone

156,2 134,6 177,9 160,1 99,5 161,8 94,6 157,8 105,8 120,4 130,8 115,5 160,2 115,5 130,8 156,1 134,5 177,9 160,9 99,5 161,7 94,6 157,8 105,8 120,3 130,7 115,4 160,2 115,4 130,7 - - - - 6,45 (1H, d; 1,5) - 6,78 (1H, d; 1,5) - - - 7,89 (1H, d; 8,5) 6,92 (1H, d; 8,5) - 6,92 (1H, d; 8,5) 7,89 (1H, d; 8,5) 5, 7, 8, 10 6, 7, 9, 10 2, 1', 3', 4', 6' 1', 2', 4', 5' 1', 3', 4', 6' 2, 1', 2', 4', 6' 3' 2' 6' 5'

5,30 (1H, br s) 3,99 (1H, br s)

101,9 70,3 70,7 71,2 70,1 17,5 101,9 70,1 70,2 3,64 (1H, dd; 9,5 và 3,0) 70,7 71,1 17,5 3,42 - 3,45 (1H, m) 3,13 - 3,17 (1H, m) 0,81 (3H, d; 6,0) 3, 3'', 5'' 1'', 3'', 4'' 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 3'', 5'', 6'' 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 5'' 2'' 1'', 3'' 2'', 4'' 3'', 5'' 4'', 6'' 5''

5,48 (1H, br s) 3,85 (1H, m)

2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' Rha I 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' Rha II 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' 6''' 98,5 70,3 70,7 71,6 69,9 17,9 98,4 69,8 70,3 3,48 (1H, dd; 8,5 và 3,0) 71,6 70,7 17,9 7, 3'', 5'' 1'', 3'', 4'' 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 3'', 5'', 6'' 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 5'' 2'' 1''', 3''' 2''', 4''' 3''', 5''' 4''', 6''' 5'''

3,30 (1H, t; 9,5) 3,42 - 3,45 (1H, m) 1,13 (3H, d; 8,0 Hz) aDMSO-d6, b50 MHz, c125MHz, d500 MHz

Hợp chất 17 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ HR-ESI-MS m/z: 601,1525 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho [C27H30O14Na]+

là 601,1533) xác định công thức phân tử là C27H30O14. (Phụ lục 17a)

→ HMBC

Hình 3.17: Cấu trúc hóa học hợp chất 17

Trên phổ NMR, cho biết khung aglycone của hợp chất 17 là kaempferol tương tự

như hợp chất 16. (Phụ lục 17b -17e)

Bên cạnh đó, 2 proton anomer tại δH 5,30 (1H, br s) và 5,48 (1H, br s) cùng với 2

nhóm methyl tại δH 0,81 (3H, d; 6,0) và 1,13 (3H, d; 8,0) cho phép nhận biết được có

thêm 2 nhóm đường rhamnose.

Trên phổ HMBC (Phụ lục 17f), 2 proton anomer tại δH 5,30 (1H, br s) và 5,48 (1H,

br s) lần lượt tương tác với khung aglycone tại δC 134,5 (C-3) và δC 161,7 (C-7). Ngoài

ra, trên phổ COSY (Phụ lục 17g), cho thấy có sự tương tác của các 2 proton liền kề

nhau của phần đường rhamnose. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 17 được trình bày

trong bảng 3.17. Như vậy, hợp chất 17 là kaempferol-3,7-O-α-L-dirhamnopyranoside.

Các kết quả phổ của hợp chất 17 được xác định dựa vào sự so sánh với dữ kiện phổ đã được công bố cho kaempferol-3,7-O-α-L-dirhamnopyranoside.[78]

3.1.18. Hợp chất 18:Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside

→ HMBC

Hình 3.18: Cấu trúc hóa học hợp chất 18

Hợp chất 18 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 617,1475 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

là 617,1482) xác định công thức phân tử là C27H30O15. (Phụ lục 18a)

[C27H30O15Na]+

Bảng 3.18: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 18

a,b

a,c

a,d (J = Hz)

δδδδC δδδδH HMBC (1H-13C) COSY (1H-1H) δδδδC [94]

Vị trí Aglycone

- - - - 6,44 (1H, br s) - 6,82 (1H, br s) - - - 6,89 (1H, d; 9,0) 8,07 (1H, d; 9,0) - 8,07 (1H, d; 9,0) 6,89 (1H, d; 9,0) 156,8 133,5 177,8 160,9 98,5 161,6 94,5 156,0 105,7 120,8 131,1 115,3 160,3 115,3 131,1 156,8 133,5 177,6 160,9 99,4 161,6 94,5 156,0 105,7 120,7 131,0 115,1 160,1 115,1 131,0 5, 7, 8, 10 6, 7, 9, 10 2, 1', 3', 4', 6' 1', 2', 4', 5' 1', 3', 4', 6' 2, 1', 2', 4', 6' 3' 2' 6' 5'

100,8 74,3 76,5 70,2 77,7 100,8 71,6 77,5 69,9 76,4 3, 3'', 5'' 1'', 3'', 4'' 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 3'', 5'', 6'' 1'', 3'', 4'', 6'' 2'' 1'', 3'' 2'', 4'' 3'', 5'' 4'', 6''

60,9 60,8 4'', 5'' 5'' 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' Glc 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 5,47 (1H, d; 7,5) 3,31 (1H, d; 9,0) 3,09 (1H, m) 3,09 (1H, m) 3,19 - 3,24 (1H, m) 3,56 (1H, dd; 11,0 và 3,5) 3,31 (1H, d; 9,0)

99,5 70,0 70,1 71,7 69,7 18,0 5,55 (1H, br s) 3,84 (1H, s) 3,64 (1H, d; 9,0) 3,19 - 3,24 (1H, m) 3,43 (1H, dd; 9,0 và 6,0) 1,12 (3H, d; 6,5 Hz) 7, 3'', 5'' 1'', 3'', 4'' 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 3'', 5'', 6'' 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 5'' 2''' 1''', 3''' 2''', 4''' 3''', 5''' 4''', 6''' 5''' Rha 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' 6'''

98,4 69,8 70,2 74,2 70,0 17,9 aDMSO-d6, b50 MHz, c125MHz, d500 MHz Phần khung aglycone của hợp chất 18 có các tín hiệu giống với hợp chất 17 trên

phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Bên cạnh đó, 2 proton anomer tại δH 5,47 (1H, d; 7,5) và 5,55 (1H, br s) cùng với 2 tín hiệu tại δH 3,56 (1H, dd; 11,0 và 3,5) và 3,31 (1H, d; 9,0) và một nhóm methyl tại δH 1,12 (3H, d; 6,5) cho biết có một phần đường glucose và

một phần đường rhamnose.

Trên phổ HMBC (Phụ lục 18f), 2 proton anomer tại δH 5,47 (1H, d; 7,5) và 5,55

(1H, br s) lần lượt tương tác với khung aglycone tại δC 133,5 (C-3) và δC 161,6 (C-7)

tương ứng với các vị trí C-3 và C-7. Ngoài ra, trên phổ COSY (Phụ lục 18g), cho thấy

có sự tương tác của các 2 proton liền kề nhau của phần đường rhamnose và glucose.

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 18 được trình bày trong bảng 3.18.

Như vậy, hợp chất 18 là kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-

rhamnopyranoside. Các kết quả phổ của hợp chất 18 được xác định dựa vào sự so sánh

với dữ kiện phổ đã được công bố cho kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L- rhamnopyranoside.[94]

3.1.19. Hợp chất 19:Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside

→ HMBC

Hình 3.19: Cấu trúc hóa học hợp chất 19

Hợp chất 19 có dạng vô định hình màu vàng. Phổ HR-ESI-MS m/z: 617,1475 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho [C27H30O15Na]+

là 617,1482) cho phép xác định công thức phân tử là C27H30O15. (Phụ lục 19a)

Phổ 1H-NMR và 13C-NMR hợp chất 19 có các tín hiệu tương tự với hợp chất 18.

(Phụ lục 19b - 19g)

`Tuy nhiên, trên phổ HMBC (Phụ lục 19f), tín hiệu proton anomer của phần đường glucose tại δH 5,08 (1H, d; 7,5) tương tác với khung aglycone tại C-3 (δC 135,6) và proton anomer của phần đường rhamnose tại δH 4,47 (1H, d; 1,5) tương tác với

glucose tại C-6'' (δC 68,6). Ngoài ra, trên phổ COSY (Phụ lục 19g), cho thấy có sự

tương tác của các 2 proton liền kề nhau của phần đường rhamnose và glucose. Dữ liệu

phổ NMR của hợp chất 19 được trình bày trong bảng 3.19.

Tóm lại, từ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, COSY,

các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công bố[58], xác định hợp chất 19 là

kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside.

Bảng 3.19: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 19

a,b

Vị trí

a,c

a,d (J = Hz)

δδδδC δδδδH COSY (1H-1H) HMBC (1H-13C) δδδδC [58]

Aglycone

157,0 134,1 177,9 161,4 98,6 164,5 93,6 158,1 104,2 121,3 131,0 114,7 160,6 114,7 131,0 159,4 135,6 179,4 163,0 100,1 166,4 95,0 158,6 105,6 122,8 132,4 116,2 161,5 116,2 132,4 - - - - 6,16 (1H, d; 2,0) - 6,34 (1H, d; 2,0) - - - 8,02 (1H, d; 9,0) 6,85 (1H, d; 9,0) - 6,85 (1H, d; 9,0) 8,02 (1H, d; 9,0) 5, 7, 8, 10 6, 7, 9, 10 2, 1', 3', 4', 6' 1', 2', 4', 5' 1', 3', 4', 6' 2, 1', 2', 4', 6' 3' 2' 6' 5'

104,7 5,08 (1H, d; 7,5)

2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' Glc 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 101,1 74,3 76,7 68,3 75,7 3, 3'', 5'' 1'', 3'', 4'' 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 3'', 5'', 6'' 1'', 3'', 4'', 6'' 2'' 1'', 3'' 2'', 4'' 3'', 5'' 4'', 6''

68,6 4'', 5'', 1''' 5'' 6'' 67,1 75,8 3,38 (1H, dd; 11,0 và 9,0) 3,28 (1H, m) 77,3 72,1 3,5 (1H, dd; 1,5 và 3,5) 78,2 3,35 (1H, dd; 11,0 và 9,0) 3,32 (1H, dd; 11,0 và 6,5) 3,75 (1H, dd; 11,0 và 1,0)

102,5 4,47(1H, d; 1,5)

Rha 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' 6''' 100,9 70,0 70,6 72,5 68,3 16,6 6'', 3'', 5'' 1'', 3'', 4'' 1'', 2'', 4'', 5'' 2'', 3'', 5'', 6'' 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 5'' 2''' 1''', 3''' 2''', 4''' 3''', 5''' 4''', 6''' 5'''

71,5 3,21 (1H, dd; 10,5 và 5,0) 3,60 (1H, dd; 3,5 và 1,5) 72,4 74,0 3,24 (1H, dd; 10,5 và 5,0) 69,8 3,39 (1H, m) 1,09 (1H, d; 7,5) 17,9 aMeOD-d4, b100 MHz, c125MHz, d500 MHz

3.1.20. Hợp chất 20: Cleomeside C (Mới)

→ HMBC

Hình 3.20: Cấu trúc hóa học hợp chất 20

Hợp chất 20 có dạng vô định hình, màu vàng. Phổ HR-ESI-MS m/z: 1247,3399 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho [C58H64O29Na]+

là 1247,3431) xác định công thức phân tử là C58H64O29.

Phổ IR νmax (MeOH): 3316, 2943, 2831, 1449, 1417, 1114, 1022 cm-1.

25 -0,29 (c 0,01, MeOH). (Phụ lục 20a - 20c)

Phổ tử ngoại UV (MeOH) λmax: 258 và 356 nm.

Độ quay cực [α]D Các tín hiệu aglycone của kaempferol được khẳng định trên phổ 1H-NMR, cho thấy

tín hiệu tại δH 12,40 (1H, s, 5-OH); 6,53 (1H, s, H-8); 6,29 (1H, d; 3,5; H-6); 7,73 (2H,

d; 8,5; H-2' và H-6') và 6,91 (2H, d; 5,5 và 3,0; H-3' và H-5'). Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu proton δH 6,29 (1H, d; 15,5; H-2a); 7,47 (1H, d; 15,5; H-3a); 6,91 (1H, dd; 5,5 và 3,0; H-5a); 6,40 (1H, d; 8,0; H-8a); 6,74 (1H, d; 8,0; H-9a) và một nhóm -OCH3 tại δH 3,57 (3H, s) ứng với các carbon trên phổ 13C-NMR và

DEPT tại δC 166,5 (C-1a); 113,9 (C-2a); 145,2 (C-3a); 125,1 (C-4a); 110,6 (C-5a); 147,4

(C-6a); 149,1 (C-7a); 115,0 (C-8a); 122,2 (C-9a) và nhóm 10a (-OCH3) tại δC 55,1

chứng tỏ tồn tại một nhóm p-feruloyl. Đồng thời, các tín hiệu của vòng bezene 1,4 thế

tại: δH 7,37 (2H, d; 8,5; H-5b và H-9b); 6,68 (2H, d; 8,5; H-6b và H-8b) và một cặp nối

đôi trans tại δH 6,22 (1H, d; 15,5; H-2b); 7,44 (1H; 15,5; H-3b) tương tác với các

carbon tại δC 166,4 (C-1b); 113,7 (C-2b); 144,5 (C-3b); 124,9 (C-4b); 130,0 (C-5b và C-9b); 115,6 (C-6b và C-8b) và 159,7 (C-7b) trên phổ 13C-NMR và HSQC, cho thấy có

sự hiện diện nhóm p-coumaroyl. (Phụ lục 20d - 20g)

Bảng 3.20: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 20

a,b

a,c (J = Hz)

Vị trí δδδδC δδδδH COSY (1H-1H) HMBC (1H-13C)

Kaempferol

156,2 2 -

133,6 177,4 3 4 - -

160,7 99,3 5 6 - 6,28 (1H, d; 2,0) 5, 7, 8, 10

161,6 7 -

94,0 8 6,53 (1H, d; 2,0) 6, 7, 9, 10

155,7 9 -

105,5 10 -

120,1 1' -

130,5 2' 7,73 (1H, d; 8,5) 2, 1', 3', 4', 6'

115,3 160,2 3' 4' 6,91 (1H, d; 8,5) - 1', 2', 4', 5'

115,3 130,5 6,91 (1H, d; 8,5) 7,73 (1H, d; 8,5) 1', 3', 4', 6' 2, 1', 2', 4', 6'

99,3 5' 6' Rha I 1'' 5,76 (1H, br s) 3, 3'', 5'' 2''

78,6 80,2 2'' 3'' 4,40 (1H, d; 5,5) 3,68 (1H, m) 1'', 3'', 4'', 1''' 1'', 2'', 4'', 5'', 1'''' 1'', 3'' 2'', 4''

69,3 4'' 3,37 (1H, m) 2'', 3'', 5'', 6'' 3'', 5''

69,7 5'' 3,12 (1H, m) 1'', 3'', 4'', 6'' 4'', 6''

17,9 0,87 (3H, d; 6,0) 4'', 5'' 5''

98,6 6'' Rha II 1''''' 5,50 (1H, br s) 7, 3''''', 5''''' 2'''''

69,8 2''''' 3,85 (1H, br s) 1''''', 3''''', 4''''' 1''''', 3'''''

70,4 3''''' 3,63 (1H, m) 1''''', 2''''', 4''''', 5''''' 2''''', 4'''''

73,7 70,0 4''''' 5''''' 3,33 (1H, m) 3,45(1H, dd; 6,5 và 9,0) 2''''', 3''''', 5''''', 6''''' 1''''', 3''''', 4''''', 6''''' 3''''', 5''''' 4''''', 6'''''

17,4 6''''' 1,14 (3H, d; 6,0) 4''''', 5''''' 5'''''

Glc I 1''' 2''' 104,4 73,7 4,48 (1H, d; 7,5) 3,03 (1H, t; 7,5) 2'', 3''', 5''' 1''', 3''', 4''' 2''' 1''', 3'''

3''' 76,5 3,20 (1H, t; 8,0) 1''', 2''', 4''', 5''' 2''', 4'''

4''' 71,6 3,32 (1H, m) 2''', 3''', 5''', 6''' 3''', 5'''

5''' 70,2 3,67 (1H, m) 1''', 3''', 4''', 6''' 4''', 6'''

6''' 63,8 5''' 4''', 5''', 1a 4,33 (1H, m) 4,28 (1H, br s)

104,9 4,42 (1H, d; 7,5) Glc II 1'''' 3'', 3'''', 5'''' 2''''

2'''' 73,9 3,12 (1H, m) 1'''', 3'''', 4'''' 1'''', 3''''

3'''' 4'''' 75,9 70,2 3,27 (1H, m) 3,12 (1H, m) 1'''', 2'''', 4'''', 5'''' 2'''', 3'''', 5'''', 6'''' 2'''', 4'''' 3'''', 5''''

5'''' 74,1 1'''', 3'''', 4'''', 6'''' 4'''', 6''''

6'''' 63,0 5'''' 4'''', 5'''', 1b 3,58 (1H, br s) 4,28 (1H, m) 4,16 (1H, d; 6,0)

p-feruloyl

166,5 -

113,9 145,2 6,29 (1H, d; 15,5) 7,47 (1H, d; 15,5)

125,1 - 3a 2a

110,6 6,91 (1H, d; 8,5)

147,4 149,1 - -

115,0 122,2 6,40 (1H, d; 8,0) 6,74 (1H, d; 8,0)

55,1 3,57 (3H, s) 9a 8a 1a, 3a, 4a 1a, 2a, 4a, 5a, 9a 3a, 7a, 9a 4a, 6a, 7a 3a, 5a, 7a 6a

1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a p-coumaroyl

166,4 113,7 - 6,22 (1H, d; 15,5)

144,5 124,9 7,44 (1H, d; 15,5) -

130,0 7,37 (1H, d; 8,5)

115,6 6,68 (1H, d; 8,5)

159,7 -

115,6 6,68 (1H, d; 8,5)

130,0 1b 2b 3b 4b 5b 6b 7b 8b 9b 1b, 3b, 4b 1b, 2b, 4b, 5b, 9b 3b, 7b, 9b 4b, 7b, 8b 4b, 6b, 7b 3b, 5b, 7b 3b 2b 6b 5b 9b 8b

7,37 (1H, d; 8,5) aDMSO-d6, b125MHz, c500 MHz Phổ 1H-NMR cũng cho thấy tín hiệu tương ứng với các phân tử đường. Hai tín hiệu

proton anomer đã được quan sát tại δH 4,48 (1H, d; 7,5) và δH 4,42 (1H, d; 7,5) và các

tín hiệu carbon tương ứng xuất hiện tại δC 104,4 và 104,9 trên phổ HSQC. Với các số

liệu trên phổ HSQC, COSY và HMBC (Phụ lục 20g - 20i), được xác định là đơn vị

đường glucose. Hằng số J = 7,5 Hz của proton anomer cho thấy cấu hình β của các

đơn vị đường glucose.

Các tín hiệu tại δH 0,87 (3H, d; 6,0) và δH 1,14 (3H, d; 6,0) cùng với hai tín hiệu

proton anomer tại δH 5,76 (1H, br s) và 5,50 (1H, br s) cho thấy sự tồn tại hai đơn vị

đường rhamnoe. Các tín hiệu của proton anomer chứng minh là cấu hình α. Các mối

liên kết các đơn vị đường được xác định bởi các phổ COSY, HSQC và HMBC. Trong

phổ HMBC, tín hiệu proton anomer tại δH 5,76 tương quan với δC 133,6 (C-3) và các

tín hiệu khác tại δH 5,50 tương quan với δC 161,6 (C-7), chỉ ra rằng hai đơn vị đường

rhamnose đã được nối với khung kaempferol tại vị trí C-3 và C-7. Phổ HMBC lần lượt

cho thấy mối tương quan của H-1''' (δH 4,48) đường glucose tại vị trí C-2'' (δC 78,6)

của đường rhamnose, và H-1'''' (δH 4,42) tại vị trí C-3'' (δC 80,2) của đường rhamnose

này, xác định hai phân tử đường glucose đã được nối vào cùng một đơn vị đường

rhamnose tại C-2'' và C-3''. Phổ HMBC cũng cho thấy mối tương quan nhóm

p-feruloyl (C-1a, δC 166,5) với H-6''' (δH 4,33) phân tử đường glucose thứ 1 (Glc I), và

nhóm p-coumaroyl (C-1b, δC 166,4) với H-6'''' (δH 4,28) đường glucose thứ 2 (Glc II),

cho phép xác định hai nhóm p-feruloyl và p-coumaroyl đã được nối vào vị trí

-CH2-OH các đơn vị đường glucose. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 20 được trình bày

trong bảng 3.20.

Từ những dữ liệu phổ 1H-NMR,13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC và HR-ESI-MS,

chúng tôi nhận danh hợp chất 20 là kaempferol-3-O-α-L-[2-O-β-D-(6-p-feruloyl)-3-O-

β-D-(6-p-coumaroyl)-glucopyranosyl]-rhamnopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside.

Hợp chất 20 là hợp chất mới chúng tôi phân lập được, chưa có tài liệu nào công bố

(theo Scifinder ngày 6/12/2014, phụ lục 32c) và đặt tên là cleomeside C.

là

3.1.21. Hợp chất 21: Glycerol monostearate

Hợp chất 21 thu được dạng vô định hình, màu trắng. Phổ HR-ESI-MS m/z: 381,2975 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho [C21H42O4Na]+

381,2980) cho phép xác định công thức phân tử là C21H42O4. (Phụ lục 21a)

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δH ppm, J = Hz) (Phụ lục 21b) cho các tín hiệu

proton: Bốn proton methylene kề oxygen δH 4,13 - 4,22 (2H, m, H-1) và 3,58 - 3,72 (2H, m, H-3); một proton methine kề oxi tại δH 3,92 - 3,95 (1H, m, H-2); hai proton

methylene kề C=O tại δH 2,33 - 2,36 (2H, t; 15,0 và 7,5; H-2'); hai proton methylene tại δH 1,60 - 1,69 (1H, m, H-3'), ba proton methyl tại δH 0,88 (3H, t; 14,0 và 7,0; H-18') và các proton methylene trong vùng từ δH 1,22 - 1,32 ppm.

Hình 3.21: Cấu trúc hóa học hợp chất 21 Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT (Phụ lục 21c, 21d) cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với sự hiện diện của 21 carbon gồm: Một carbon carbonyl δC 174,4 (C-1'); hai carbon methylene kề oxygen δC 63,4 (C-3) và 65,2 (C-1); một carbon methine kề oxi δC 70,3 (C-2); một carbon methyl δC 14,1 (C-18'); một carbon methylene kề C=O δC 31,2 (C-2') và các carbon methylene trong vùng từ δC 22,7 - 34,2. Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp HR-ESI-MS xác định được 15 carbon methylene trong vùng từ δC

22,7 - 34,2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 21 được trình bày trong bảng 3.21.

Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, các đặc trưng vật lý và so sánh với tài liệu đã công bố[57], xác định hợp chất 21 là glycerol

monostearate.

Vị trí δδδδC Bảng 3.21: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 21 δδδδH δδδδC

a,b[57] 65,1

a,c (J = Hz) 4,13 - 4,22 (2H, m)

HMBC (1H-13C) 1', 3, 2

a,b 65,2

70,3 63,3 70,3 63,4 3,92 - 3,95 (1H, m) 3,58 - 3,72 (2H, m) 1, 2

174,4 1 2 3 1' 174,4

34,1 2' 31,2 1' - 2,33 - 2,36 (2H, t; 15,0 và 7,5)

24,9 3' 24,9 1,60 - 1,69 (2H, m) 1'

4'-17' 1,23 - 1,33 (29H, m) 4' → 17' 31,9; 29,7; 22,7 22,7; 31,9; 29,1-29,7

18' 14,1 0,88 (3H, t; 14,0 và 7,0) 17'

14,1 aCDCl3, b125MHz, c500 MHz

3.1.22. Hợp chất 22: Ethyl α-galactopyranoside

Hình 3.22: Cấu trúc hóa học hợp chất 22

Hợp chất 22 thu được dạng vô định hình, màu trắng. Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH ppm, J = Hz) (Phụ lục 22a) xuất hiện tín

hiệu proton của methyl tại δH 1,13 (3H, t; 7,0), proton anomer tại δH 4,63 (1H, d; 3,5)

và tín hiệu các proton của đường trong vùng δH 3,40 - 4,50 ppm.

Bảng 3.22: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 22

HMBC (1H→→→→13C)

b,c

b,d (J = Hz)

Vị trí δC δH

a,c[92] 105,3

δC 98,7 4,63 (1H, d; 3,5) C-1', C-3, C-5

3,53 (1H, dd; 10,0 và 3,5) C-1, C-3, C-4 2 73,6 68,3 2-OH 4,35 (1H, d; 6,0) 2-OH → C-1, C-2, C-3

3,52 (1H, dd; 9,5 và 3,5) C-4 3 75,7 69,6 3-OH 4,45 (1H, d; 5,5) 3-OH → C-3

3,68 (1H, t; 3,5) C-3, C-5 4 71,5 68,8 4-OH 4,28 (1H, d; 4,5) 4-OH → C-3, C-4, C-5

5 77,9 71,1 3,55 (1H, dd; 10,0 và 3,5) C-4, C-6

6 63,8 60,6 H-6b → C-4, C-5 6-OH → C-5, C-6 6a 3,50 (1H, dd; 8,0 và 6,0) 6b 3,42 (1H, dd; 11,5 và 6,0) 6-OH 4,48 (1H, t; 6,0)

1' 67,5 62,3 H-1'a → C-1 1'a 3,62 (1H, dd; 10,0 và 7,0) 1'b 3,37 (1H, dd; 9,5 và 7,0)

aH2O, bDMSO-d6, c125MHz, d500 MHz Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, δC ppm, J = Hz) (Phụ lục 22b) kết hợp với

2' 17,1 15,0 1,13 (3H, t; 7,0) C-1'

phổ DEPT cho các tín hiệu ứng với sự hiện diện của 8 carbon. Trong đó có hai carbon

methylene kề oxigen là C-6 (δC 60,6) và C-1' (δC 62,3), năm carbon methine là C-2

(δC 68,3), C-3 (δC 69,6), C-4 (δC 68,8), C-5 (δC 71,1), C-1 (δC 98,7), một carbon methyl

C-2' (δC 15,0). Dựa vào những dữ liệu phổ trên, dự đoán hợp chất 22 là một đơn vị

đường có 6 carbon và một nhánh ethyl. Bên cạnh đó, proton anomer tại δH 4,63 (1H, d;

3,5) chứng tỏ đơn vị đường này là đường α.

Phổ HSQC (Phụ lục 22d) xác định sự tương quan giữa proton và carbon trên cùng

vị trí. Bốn proton tại δH 4,28 (1H, d; 4,5); 4,35 (1H, d; 6,0); 4,45 (1H, d; 5,5) và 4,48

(1H, t; 6,0) đều không có tương tác với carbon nào nên là proton của nhóm -OH.

Phổ HMBC (Phụ lục 22e) cho thấy 3 proton của nhóm methyl C-2' tại δH 1,23 (3H,

t; 7,0) cho tương tác với carbon methylene C-1' tại δC 62,3 ppm chứng tỏ nhóm methyl

này phải gắn với C-1', vậy nhánh là nhóm ethyl. Proton anomer H-1 tại δH 4,63 (1H, d;

3,5) cho tương tác với carbon methylene C-1' chứng tỏ nhánh ethyl gắn vào đơn vị

đường tại vị trí C-1. Proton methylene kề oxygen H-6b tại δH 3,42 (1H, dd; 11,5 và 6,0)

cho tương tác với carbon tại δC 68,8 và 71,1 ppm. Đồng thời, proton H-1 δH 4,63 (1H,

d; 3,5) cũng cho tương tác với δC 71,1 ppm chứng tỏ δC 71,1 ppm là carbon C-5 và δC

68,8 ppm là carbon C-4. Proton H-5 tại δH 3,55 (1H, dd; 10,0 và 3,5) và proton anomer

H-1 đều cho tương quan với carbon δC 69,6 ppm nên chứng tỏ đó là carbon C-3, và carbon C-2 có δC 68,3 ppm. Dựa vào hằng số ghép cặp trên phổ 1H-NMR cho thấy

J3-4 = 3,5 Hz (ghép ae), J4-5 = 3,5 Hz (ghép ae). Như vậy nhóm OH ở C-4 định hướng ở

trục và proton định hướng ở xích đạo. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 22 được trình

bày trong bảng 3.22.

Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, các đặc trưng vật lý và so sánh với tài liệu đã công bố[92], xác định hợp chất 22 là ethyl α-

galactopyranoside.

3.1.23. Hợp chất 23: Adenine

Hình 3.23: Cấu trúc hóa học hợp chất 23

Hợp chất 23 được phân lập dưới dạng vô định hình, màu trắng. Phổ khố lượng HR-ESI-MS cho đỉnh ion phân tử giả m/z: 136,0635 [M-H]- (tính

là 136,0623) xác định công thức phân tử là C5H5N5. (Phụ

toán lý thuyết cho [C5H4N5]-

lục 23a)

Bảng 3.23: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 23

δC δC

a,b [36] 152,5 151,4

a,b 152,3 151,6

HMBC (1H-13C) 4, 6

a,c (J = Hz) δH 8,10 (1H, s) -

Vị trí 2 4

117,4 155,4 117,3 155,2 - - 5 6

139,4 - 139,5 - 8,08 (1H, s) 7,07 (2H, s) 4, 5 6

8 -NH2 -NH - -

3,39 - 3,42 (1H, br s) aDMSO-d6, b125MHz, c500 MHz Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH ppm, J = Hz) (Phụ lục 23b), hợp chất 23

xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của 2 proton thơm tại δH 8,08 (1H, s) và

8,10 (1H, s), 2 proton amine bậc nhất tại δH 7,06 (2H, s), 1 proton nhóm -NH tại δH

3,39 - 3,42 (1H, br s).

Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, δH ppm, J = Hz) (Phụ lục 23c) cho thấy hợp chất 23 có 5 carbon sp2 : C-2 (δC 152,3); C-8 (δC 139,5); C-4 (δC 151,6); C-5 (δC 117,3)

và C-6 (δC 155,2) với độ dịch chuyển đặc trưng của khung adenine.

Các tương tác của khung adenine được thể hiện rõ trên phổ HMBC, tín hiệu proton

của nhóm -NH2 δH 7,07 (2H, s) tương tác với carbon tại δC 117,3 chứng tỏ là carbon tứ

cấp C-5. Mặt khác, proton tại δH 8,08 (1H, s) tương tác với carbon C-5 nên là proton

H-8 và đồng thời proton H-8 này cũng tương tác với carbon tại δC 151,6 nên khẳng

định được đó là carbon C-4. Proton tại δH 8,10 (1H, s) tương tác với carbon C-4 chứng

tỏ đó là proton H-2 và proton H-2 cũng tương tác với carbon tại δC 155,2 nên chứng tỏ

carbon tại δC 155,2 là carbon C-6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 23 được trình bày

trong bảng 3.23.

Từ các biện luận trên, kết hợp với tài liệu tham khảo[36], xác định hợp chất 23 là

adenine.

3.1.24. Hợp chất 24: 5-(Hydroxymethyl)-2-furaldehyde

Hợp chất 24 thu được dưới dạng dầu, màu vàng. Phổ 1H-NMR (Phụ lục 24a) cho tín hiệu proton của nhóm aldehyde (-CHO) tại δH

9,56 (1H, s), hai tín hiệu proton ghép cặp ortho với hằng số ghép đặc trưng của vòng

furan tại δH 7,23 (1H, d; 3,5) và 6,52 (1H, d; 3,5).

Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT (Phụ lục 24b, 24c) cho tín hiệu sáu carbon, bao

gồm 2 carbon bậc bốn mang oxy tại δC 161,0 và 152,3; 2 carbon methine tại δC 123,2

và 110,0; 2 carbon bậc hai tại δC 57,5 và 1 carbon carbonyl (C=O) tại δC 177,8.

Hình 3.24: Cấu trúc hóa học hợp chất 24

Dựa vào các dữ liệu trên, cho phép dự đoán hợp chất 24 gồm có 1 vòng furan và 2

nhóm thế -CHO và -CH2OH.

Phổ HMBC (Phụ lục 24e) cho thấy proton của nhóm aldehyde (-CHO) tương quan

với carbon bậc bốn vòng thơm mang oxy tại δC 152,3; vậy đây là C-2. Carbon bậc

bốn vòng thơm mang oxygen còn lại tại δC 161,0 là C-5. Hai proton của nhóm -CH2-

cho tín hiệu tại δH 4,70 (2H, s) ngoài tương quan với carbon C-5 (δC 161,0) còn thể

hiện tương quan với carbon bậc ba tại δC 110,0 suy ra đây là tín hiệu của carbon C-4.

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 24 được trình bày trong bảng 3.24.

Dựa vào các bảng số liệu phổ hợp chất 24 và so sánh tài liệu tham khảo[3] khẳng

định hợp chất 24 là 5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyde.

Bảng 3.24: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 24

a,b [3]

Vị trí δδδδC δδδδC

1 2 3 4 5 6 δδδδH a,c (J = Hz) 9,56 (1H, s) - 7,23 (1H, d; 3,5) 6,52 (1H, d;3,5) - 4,70 (2H, s)

a,b 177,8 178,2 152,3 153,4 123,2 123,7 110,0 110,2 161,0 163,0 57,5 57,5 aCDCl3, b125MHz, c500 MHz

3.1.25. Hợp chất 25: Emodin-8-O-β-D-glucopyranoside

là

Hợp chất 25 thu được dạng vô định hình, màu cam. Phổ HR-ESI-MS m/z: 433,1134 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho [C21H21O10]+

433,1134) xác định công thức phân tử là C21H20O10. (Phụ lục 25a)

Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH ppm, J = Hz) (Phụ lục 25b) cho hai cặp tín

hiệu ghép metha của proton thơm; một tại δH 7,46 (1H, br s, H-4) và 7,15 (1H, br s,

H-2) và một tại δH 7,26 (1H, d; 2,5; H-5) và δH 6,97 (1H, d; 1,5; H-7) cùng với một tín

hiệu của nhóm methyl tại δH 2,40 ppm. Đồng thời, tín hiệu proton anomer tại δH 5,02 -

5,10 (1H, m, C-1') và nhóm -CH2- tại δH 3,71 (1H, d; 11,0) và 3,52 (1H, t; 6,0) đặc

trưng của đường β-D-glucopyranoside.

→ HMBC

Hình 3.25: Cấu trúc hóa học hợp chất 25 Bảng 3.25: Dữ liệu phổ NMR hợp chất 25

a,c

a,d (J = Hz)

Vị trí δδδδC

a,b [79] δδδδC

δδδδH

161,7 (1-OH) 13,23 (1H, s) 124,1 7,15(1H, brs) HMBC (1H-13C) COSY (1H-1H) 1 2 162,4 122,1

3 145,4 146,7 -

4 120,4 119,2 7,46 (1H, brs)

5 6 108,2 164,5 108,8 164,8 7,26 (1H, d; 2,5) -

7 8 108,4 161,8 108,5 161,2 6,97 (1H, d; 1,5) -

9 185,7 186,2 -

180,5 181,2 -

110,9 134,7 112,9 136,4 - -

113,1 131,6 114,5 132,1 - -

21,4 21,4 2,40 (3H, s)

101,4 100,9 5,02-5,10 (1H, m) 8, 3', 5' 2'

10 11 12 13 14 -CH3 Glc 1' 2' 73,3 73,3 3,41 - 3,42 (1H, m) 1', 3', 4' 1', 3'

3' 76,3 76,3 3,33 (1H, m) 1', 2', 4', 5' 2', 4'

4' 69,6 69,5 3,23 - 3,26 (1H, m) 2', 3', 5', 6' 3', 5'

5' 77,7 1', 3', 4', 6' 4', 6'

6' 60,4 60,6 5'

77,3 3,41 - 3,42 (1H, m) 3,71 (1H, d; 11,0) 4', 5' 3,50 (1H, t; 6,0) aDMSO-d6, b75MHz, c125MHz, d500 MHz

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT (Phụ lục 25c, 25d) cho 15 tín hiệu carbon đặc

trưng của emodin tại δC 161,7 (C-1); 124,1 (C-2); 146,7 (C-3); 119,2 (C-4); 108,8

(C-5); 164,8 (C-6); 108,5 (C-7); 161,2 (C-8); 186,2 (C-9); 181,2 (C-10); 136,4 (C-11);

112,9 (C-12); 114,5 (C-13); 132,1 (C-14) và 21,4 (-CH3) và 6 tín hiệu carbon glucose

tại δC 100,9 (C-1'); 73,3 (C-2'); 76,3 (C-3'); 69,5 (C-4'); 77,3 (C-5') và 60,6 (C-6').

Phổ HMBC (Phụ lục 25f) cho thấy proton anomer tại δH 5,02 - 5,10 (1H, m, H-1')

tương tác với carbon C-8 tại δC 161,2; điều này khẳng định phần đường glucose gắn

vào khung emodin tại vị trí C-8. Ngoài ra, trên phổ COSY (Phụ lục 25g), cho thấy có

sự tương tác của các 2 proton liền kề nhau của phần đường glucose. Dữ liệu phổ NMR

của hợp chất 25 được trình bày trong bảng 3.25.

Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, COSY, HSQC, HMBC, các đặc trưng vật lý và so sánh với tài liệu đã công bố[79], cấu trúc hợp chất 25 được

xác định là emodin-8-O-β-D-glucopyranoside.

3.2. Khả năng gây độc tế bào và tác dụng bảo vệ tế bào gan

Phương pháp thử nghiệm khả năng gây độc tế bào và tác dụng bảo vệ tế bào gan

của cao chiết/hoạt chất trên dòng tế bào HepG2 được nêu ra trong mục 2.3.

Thử nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Dược lý, Khoa Dược, Đại học Y Dược

Thành phố Hồ Chí Minh.

Các cao chiết n-hexane, EtOAc và MeOH được khảo sát tại 3 nồng độ 25, 50 và 100

µg/mL và ủ với dòng tế bào HepG2, theo dõi sự phát triển của tế bào sau 24, 48 và 72 giờ và được so sánh với hợp chất doxorubicin - hợp chất làm độc tế bào đã biết[56, 107].

Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng 3.26 và 3.27. (Phụ lục 26a-c, 27a-c,

28a-c, 29a-c)

Các hợp chất tinh khiết được khảo sát tại 3 nồng độ 25, 50 và 100 µM và ủ với dòng

tế bào HepG2. Sau 24 giờ, thay môi trường, tế bào được xử lý với CCl4 2 mM có hoặc

không có hợp chất tinh khiết trong 24 giờ và được so sánh với hợp chất quercetin, hợp chất có tác dụng bảo vệ tế bào gan đã biết[39, 51, 103]. Kết quả thử nghiệm được trình bày

trong bảng 3.28 và 3.29. (Phụ lục 30a, 30b)

Bảng 3.26: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết từ Màn màn hoa tím trên dòng tế bào HepG2

% so với mẫu chứng Nồng độ (µg/ml) Cao n-hexane OD570 trung bình ± SEM Cao EtOAc Cao MeOH Cao n-hexane Cao EtOAc

Cao MeOH Thân Lá Thân Lá Thân Chứng Lá Thân Chứng Lá Thân Chứng Lá Thân Lá

93,7 100 110,7 108,3 107,0 126,4 92,3

95,9 50 113,8 107,0 114,7 123,6 91,9 0,243 ± 0,002 0,260 ± 0,006 0,213 ± 0,003 0,216 ± 0,007 0,313 ± 0,012

111,0 102,7 97,9 108,1 86,2 90,0 25 0,288 ± 0,006 0,299 ± 0,007 0,292 ± 0,008 0,281 ± 0,010 0,281 ± 0,008 0,270 ± 0,007 0,228 ± 0,008 0,247 ± 0,007 0,246 ± 0,009 0,269 ± 0,002 0,266 ± 0,004 0,250 ± 0,005 Xử lý tế bào trong 24 giờ 0,293 ± 0,009 0,300 ± 0,010 0,281 ± 0,010 0,289 ± 0,009 0,287 ± 0,002 0,270 ± 0,007 0,263 ± 0,008 0,231 ± 0,007 0,149 ± 0,005 0,149 ± 0,005 DOX 10 56,7 59,3 52,5

95,9 100 110,5 117,8 124,9 158,4 99,7 0,377 ± 0,006 0,402 ± 0,010 0,282 ± 0,005 0,331 ± 0,012 0,420 ± 0,003 0,164 ± 0,006 Xử lý tế bào trong 48 giờ 0,313 ± 0,007 0,265 ± 0,009 0,325 ± 0,006

94,9 98,9 50 97,1 140,1 124,3 107,4 0,341 ± 0,011 0,319 ± 0,004 0,326 ± 0,005

97,7 97,2 118,2 100,3 96,0 96,3 25 0,358 ± 0,010 0,369 ± 0,013 0,367 ± 0,004 0,367 ± 0,005 0,447 ± 0,012 0,424 ± 0,011 0,396 ± 0,006 0,360 ± 0,007 0,351 ± 0,008 0,313 ± 0,010 0,323 ± 0,010 0,314 ± 0,007 0,378 ± 0,011 0,359 ± 0,005 0,112 ± 0,003 DOX 10 0,113 ± 0,004 29,9 31,2 27,9

0,091 ± 0,002 Xử lý tế bào trong 72 giờ

100 126,9 121,4 154,0 152,2 120,3 118,6

99,1 50 98,7 134,2 127,6 120,1 120,8 0,315 ± 0,010 0,353 ± 0,009 0,289 ± 0,012 0,329 ± 0,009 0,339 ± 0,022

95,2 25 97,3 118,2 112,3 130,6 119,5 0,448 ± 0,011 0,395 ± 0,009 0,380 ± 0,017 0,429 ± 0,012 0,394 ± 0,016 0,388 ± 0,011 0,446 ± 0,009 0,442 ± 0,011 0,464 ± 0,011 0,408 ± 0,011 0,408 ± 0,008 0,443 ± 0,012 0,403 ± 0,014 0,410 ± 0,017 0,406 ± 0,010 0,399 ± 0,006 0,441 ± 0,014 0,420 ± 0,012 0,441 ± 0,017 0,393 ± 0,006 DOX 10 0,068 ± 0,001 0,071 ± 0,002 0,076 ± 0,001 17,8 19,3 20,0

Bảng 3.27: Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết từ Màn màn hoa vàng trên dòng tế bào HepG2

Nồng độ

% so với mẫu chứng

(µg/ml)

Cao n-hexane Cao EtOAc Cao MeOH

Cao n-hexane Thân

Chứng Lá

Lá

OD570 trung bình ± SEM Cao EtOAc Thân

Chứng Lá

Thân Lá

Thân

Cao MeOH Thân Chứng Lá Xử lý tế bào trong 24 giờ

99,3

92,9

113,1 112,2 106,2 116,3

100

0,248 ±0,009

0,232 ±0,014

0,234 ± 0,004

0,276 ± 0,009

0,274 ± 0,009

0,244 ± 0,009

0,244 ± 0,011

0,267 ± 0,008

104,6

98,0

109,9 105,7 97,9

115,5

50

0,271 ± 0,008

0,254 ± 0,008

0,250 ± 0,008

0,266 ± 0,008

0,256 ± 0,007

0,242 ± 0,005

0,225 ± 0,013

0,265 ± 0,011

0,230 ± 0,007

99,2 96,7 108,2 108,7

109,8 100,3

25

0,285 ±0,006

0,260 ±0,004

0,264 ± 0,003

0,258 ± 0,010

0,248 ± 0,016

0,250 ± 0,013

0,259 ± 0,012

0,266 ± 0,004

DOX 10

0,186 ± 0,006

0,157 ± 0,004

60,5

69,8

51,7

0,119 ± 0,006 Xử lý tế bào trong 48 giờ

99,2

97,2

108,4 101,4 100,9 103,4

100

0,321 ± 0,009

0,314 ± 0,009

0,268 ± 0,008

0,293 ± 0,011

0,274 ± 0,009

0,271 ± 0,012

0,314 ± 0,008

0,322 ± 0,008

96,0

85,4

105,7 104,6 101,2

99,8

50

0,307 ± 0,012

0,304 ± 0,009

0,291 ± 0,008

0,315 ± 0,010

0,311 ± 0,002

0,347 ± 0,007

0,308 ± 0,011

0,306 ± 0,011

0,312 ± 0,007

99,8

95,4

91,0

88,9 89,4 105,6

25

0,344 ± 0,009

0,329 ± 0,008

0,295 ± 0,014

0,297 ± 0,008

0,329 ± 0,003

0,311 ± 0,005

0,365 ± 0,003

0,332 ± 0,004

0,129 ± 0,003

0,130 ± 0,006

DOX 10

35,7

39,3

36,4

0,114 ± 0,003 Xử lý tế bào trong 72 giờ

100

105,4 121,7 122,3 92,2 131,7 112,3

0,351 ± 0,017

0,405 ± 0,014

0,299 ± 0,019

0,371 ± 0,016

0,279 ± 0,013

0,303 ± 0,014

0,428 ± 0,019

0,365 ± 0,007

106,1

97,2

113,1 108,3 117,8 114,5

50

0,401 ± 0,006

0,368 ± 0,005

0,333 ± 0,011

0,390 ± 0,016

0,374 ± 0,028

0,345 ± 0,012

0,383 ± 0,017

0,372 ± 0,013

0,325 ± 0,008

107,5

97,3

102,1 91,4 112,0 117,2

25

0,398 ± 0,011

0,356 ± 0,020

0,364 ± 0,009

0,381 ± 0,014

0,407 ± 0,015

0,368 ± 0,015

0,378 ± 0,008

0,390 ± 0,017

0,075 ± 0,001

0,066 ± 0,001

0,073 ± 0,002

DOX 10

19,2

19,3

20,3

Bảng 3.28: Khả năng gây độc tế bào của các hợp chất trên dòng tế bào HepG2

% so với mẫu Nồng độ OD570 trung bình Hợp chất Chứng ± SEM chứng (µM)

0,183 ± 0,004 0,191 ± 0,003 Quercetin 10 95,8

100 0,169 ± 0,172 0,161 ± 0,003 68,2

50 0,147 ± 0,139 0,177 ± 0,010 6 78,6

25 0,140 ± 0,132 0,194 ± 0,010 68,2

0,165 ± 0,010 0,161 ± 0,003 100 102,7

50 0,162 ± 0,008 0,177 ± 0,010 8 91,6

25 0,152 ± 0,008 0,194 ± 0,010 78,3

100 0,143 ± 0,006 0,161 ± 0,003 89,0

50 0,153 ± 0,018 0,177 ± 0,010 20 86,3

25 0,406 ± 0,018 0,194 ± 0,010 209,8

100 0,188 ± 0,010 0,161 ± 0,003 116,7

50 0,140 ± 0,003 0,177 ± 0,010 5 78,8

25 0,149 ± 0,009 0,194 ± 0,010 77,0

100 0,187 ± 0,012 0,161 ± 0,003 116,4

50 0,174 ± 0,006 0,177 ± 0,010 4 98,1

25 0,141 ± 0,004 0,194 ± 0,010 72,6

100 0,167 ± 0,012 0,161 ± 0,003 103,6

50 0,166 ± 0,008 0,177 ± 0,010 18 93,8

25 0,164 ± 0,006 0,194 ± 0,010 84,8

100 0,151 ± 0,007 0,161 ± 0,003 94,1

50 0,169 ± 0,008 0,177 ± 0,010 9 95,3

25 0,157 ± 0,003 0,194 ± 0,010 81,0

100 0,175 ± 0,004 0,161 ± 0,003 109,1

50 0,167 ± 0,005 0,177 ± 0,010 10 94,1

25 0,188 ± 0,005 0,194 ± 0,010 97,0

Bảng 3.29: Tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào gan HepG2 do

CCl4 2 mM gây ra sau 24 giờ của các chất phân lập từ cao MeOH lá/thân Màn

màn hoa tím và Màn màn hoa vàng

OD570nm trung bình ± SEM % phòng ngừa

sự ức chế tăng Mẫu thử và nồng độ CCl4 2 mM CCl4 2 mM

trưởng (-) (+)

0,191 ± 0,003 0,157 ± 0,010 Môi trường

Mẫu chứng DMSO 1% 0,161 ± 0,003 0,119 ± 0,004

Hợp chất (100 µM) Màn 0,172 ± 0,009 0,125 ± 0,005 13,3 6 Lá màn 0,165 ± 0,010 0,133 ± 0,003 8 32,3 hoa 0,188 ± 0,010 0,125 ± 0,009 14,1 5 tím 0,143 ± 0,006 0,105 ± 0,008 -34,7 20 Thân

0,187 ± 0,012 0,106 ± 0,005 -33,5 4 Màn

0,167 ± 0,012 0,150 ± 0,006 Lá 18 74,2 màn

0,151 ± 0,007 0,147 ± 0,004 hoa 9 66,5

vàng 0,175 ± 0,004 0,146 ± 0,006 10 Thân 64,1

Đối chứng quercetin 10 µM 0,183 ± 0,004 0,184 ± 0,004 80,3

Kết quả cho thấy: Đa số các cao chiết n-hexane, EtOAc và MeOH từ thân và lá của

Màn màn hoa tím, không làm giảm tỷ lệ tế bào sống ở 3 nồng độ khảo sát 25, 50 và

100 µg/mL so với mẫu chứng có nồng độ DMSO tương đương sau 24, 48 và 72 giờ

tiếp xúc. Trong khi, mẫu đối chứng doxorubicin ở nồng độ 10 µg/mL làm giảm lần

lượt khoảng 40%, 70% và 80% tỷ lệ tế bào HepG2 sống sau 24, 48 và 72 giờ. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với độc tính của doxorubicin.[55, 107]

Đặc biệt, một số cao từ Màn màn hoa tím còn thể hiện tác dụng kích thích tăng

trưởng tế bào, làm tăng tỷ lệ tế bào sống khoảng 25% đến 60% so với mẫu chứng

(p < 0,05). Cụ thể, cao EtOAc từ thân Màn màn hoa tím có tác dụng kích thích sự tăng

trưởng tế bào ở nồng độ 50 và 100 µg/mL tại cả 3 thời điểm khảo sát 24, 48 và 72 giờ.

Trong đó, sau 24 giờ tiếp xúc, cả 2 nồng độ 50 và 100 µg/mL đều làm tăng khoảng

25% tỷ lệ tế bào sống (p < 0,05); sau 48 và 72 giờ, kết quả tương tự nhau: Nồng độ 50

µg/mL làm tăng khoảng 25% - 30%, nồng độ 100 µg/mL làm tăng khoảng 50% - 60%

(p < 0,05). Cao từ lá Màn màn hoa tím cũng tác dụng kích thích tăng trưởng tế bào

HepG2 ở nồng độ 50 và 100 µg/mL, nhưng chỉ có ý nghĩa thống kê sau 48 và 27 giờ

(tăng 25% - 50%, p < 0,05). Ở nồng độ 25 µg/mL, cao EtOAc của cả lá và thân Màn

màn hoa tím đều làm tăng tỷ lệ tế bào sống so với mẫu chứng nhưng không có ý nghĩa

thống kê (p > 0,05).

Đối với cao n-hexane và MeOH từ thân và lá Màn màn hoa tím, sau 24 và 48 giờ,

không làm thay đổi tỷ lệ tế bào sống (p > 0,05). Tuy nhiên, sau 72 giờ, cao n-hexane ở

nồng độ 100 µg/mL từ thân và lá làm tăng lần lượt 21,4% và 26,9% tỷ lệ tế bào sống

so với mẫu chứng (p < 0,05). Sau 72 giờ tiếp xúc, cao MeOH từ cả thân và lá Màn

màn hoa tím làm tăng khoảng 20% - 30% tỷ lệ tế bào sống so với mẫu chứng cả

3 nồng độ 25, 50 và 100 µg/mL (p < 0,05); không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

về tỷ lệ tế bào sống giữa 3 nồng độ này (p > 0,05).

Đối với Màn màn hoa vàng, các cao n-hexane, EtOAc và MeOH không thay đổi tỷ

lệ tế bào sống có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng tương ứng cả 3 nồng độ khảo sát

(25, 50 và 100 µg/mL) sau khoảng thời gian xử lý tế bào khác nhau là 24, 48 và 72 giờ

(p > 0,05), ngoại trừ cao EtOAc, cao MeOH từ lá và cao n-hexane từ thân ở nồng độ

100 µg/mL làm tăng khoảng 20% - 30% tỷ lệ tế bào sống sau 72 giờ (p < 0,05).

Khảo sát hoạt tính của 8 hợp chất phân lập được từ Màn màn hoa tím và Màn màn

hoa vàng, cụ thể là cleomeside A (6), cleomeside B (8), quercetin-3-O-[β-D-

glucopyranosyl-(1→2)]-α-L-rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside (5) từ cao

lá và cleomeside C (20) từ cao thân của Màn màn hoa tím; quercetin-3-O-β-D-

glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (4), kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-

7-O-α-L-rhamnopyranoside (18), visconoside A (9) từ cao lá và visconoside B (10) từ

cao thân của Màn màn hoa vàng. (Sơ đồ 1-4)

Khảo sát khả năng gây độc tế bào với 8 hợp chất ở 3 nồng độ 25, 50 và 100 µM trên

dòng tế bào HepG2 sau 24 giờ (Bảng 3.28) cho thấy ở nồng độ 100 µM, tất cả 8 hợp

chất đều không làm thay đổi tỷ lệ tế bào sống, không thể hiện khả năng gây độc tế bào

HepG2 (p < 0,05). Ở nồng độ 50 µM, đa số các chất làm giảm tỷ lệ tế bào sống không

có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng tương ứng (p > 0,05), ngoại trừ hợp chất 5 và 6

làm giảm tỷ lệ tế bào sống có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Ở nồng độ 25 µM, các hợp

chất 4, 5, 6 và 8 làm giảm khoảng 25% - 30% tỷ lệ tế bào sống (p < 0,05) trong khi

hợp chất 9, 10 và 18 làm thay đổi không đáng kể tỷ lệ này (p < 0,05). Đặc biệt, hợp

chất 20 ở nồng độ 25µM làm tăng tỷ lệ tế bào sống 100 % so với mẫu chứng tương

ứng (p < 0,05).

Dựa trên kết quả thu được, tiến hành khảo sát tác động bảo vệ tế bào gan HepG2

của các hợp chất trên để phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào HepG2 do tác nhân

độc gan CCl4 2 mM gây ra sau 24 giờ bằng phương pháp MTT. Kết quả được trình

bày trong bảng 3.29.

Kết quả cho thấy CCl4 2 mM ức chế sự tăng trưởng của tế bào HepG2, làm giảm tỷ

lệ tế bào sống khoảng 20% - 25% so với mẫu chứng môi trường hoặc môi trường bổ

sung DMSO 1% (p < 0,05). Kết quả này phù hợp với báo cáo trước đây về tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào HepG2 của CCl4 2 mM sau 24 giờ tiếp xúc.[39, 51, 103]

Kết quả cũng cho thấy, dung môi DMSO 1% làm dung môi trung gian để hòa tan

mẫu thử cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của tế bào HepG2. Do đó, để đảm bảo kết quả

chính xác, loại bỏ ảnh hưởng của DMSO, kết quả tác động bảo vệ tế bào gan của các

hợp chất trên được so sánh với mẫu chứng bệnh CCl4 2 mM có bổ sung DMSO 1%

của chất đối chứng quercetin được so sánh với mẫu bệnh xử lý tế bào với CCl4 2 mM.

Về tác dụng bảo vệ tế bào gan, kết quả cho thấy sự ức chế tăng trưởng do CCl4

2 mM gây ra sau 24 giờ được phòng ngừa khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy

quercetin 10 µM (p < 0,01). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với tác dụng bảo vệ tế bào gan của quercetin 10 µM đã được báo cáo trước đây.[39, 51, 103]

Từng hợp chất riêng lẻ không gây độc tế bào, tỷ lệ sống tế bào HepG2 thay đổi

không có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng DMSO 1% (p > 0,05).

Ở nồng độ 100 µM, các hợp chất 8, 9, 10 và 18 thể hiện tác dụng bảo vệ tế bào gan

HepG2 phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào do CCl4 2 mM gây ra sau 24 giờ tiếp

xúc (p < 0,05) trong đó các hợp chất 9, 10 và 18 thể hiện tác dụng bảo vệ tế bào gan

tốt với tỷ lệ phòng ngừa từ 65% đến 75%.

3.3. Nhận xét chung

Màn màn hoa tím và Màn màn hoa vàng là hai loài dược liệu đã được người dân sử

dụng để điều trị bệnh về gan rất hiệu quả. Trên thế giới, có nhiều công bố về hoạt tính

sinh học của hai loài này, tuy nhiên những nghiên cứu về thành phần hóa học hai loài

này chưa có nhiều ở Việt Nam cũng như trên thế giới.

Các hợp chất flavonoid phân lập từ loài Màn màn hoa tím (C. chelidonii L.f.)

R1 R2 R3 R4

Hợp chất

OH Rha OH H 2

OH Glc OH H 3

OH Glc-(1→2)-Rha OH Rha 5

OH Glc-(1→2)-Rha 4-acetyl-Rha OH 6 (Mới)

(6-Coumaroyl)-Glc-(1→2)-Rha OH OH Rha 7

OH (6-Coumaroyl)-Glc-(1→2)-Rha 4-acetyl-Rha OH 8 (Mới)

OH 2,4-Diacetyl-Rha H H 16

OH Rha -(1→6)-Glc H H 19

OH [2-(6-Feruloyl)-3-(6-coumaroyl)-Glc]-Rha H Rha 20 (Mới)

Các hợp chất flavonoid phân lập từ loài Màn màn hoa vàng (C. viscosa L.)

R1 R2 R3 R4

Hợp chất

OH OH H Rha 1

OH OH Glc Rha 4

OH Glc-(1→3)-(4-acetyl)-Rha OH Rha 9 (Mới)

OH Sinapinoyl (1→6)- Glc-(1→3)-(4-acetyl)-Rha Rha 10 (Mới) OH

H H 11 OH CH3

H H 12 OCH3 CH3

H OH Glc H 13

H OH H Rha 14

H OH 4-Acetyl-Rha H 15

H OH Rha Rha 17

H OH Glc Rha 18

21 23 24

22 25

Kết quả nghiên cứu của luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 25 hợp chất,

trong đó có 5 hợp chất mới lần đầu tìm thấy. Thành phần hóa học chính của hai loài

này là các hợp chất flavonoid chủ yếu là dẫn xuất khung quercetin và kaempferol, điều này tương đồng với những nghiên cứu của các tác giả trước đây[5, 49] . Ngoài ra các hợp

chất 2, 3, 5, 7, 11, 12, 13, 15, 16, 21, 22, 23, 24 và 25 mặc dù đã biết từ một số loài

thực vật khác nhưng đây là lần đầu tiên tìm thấy chúng hiện diện trong chi Cleome.

Các hợp chất 1, 4, 14, 17, 18 và 19 được tìm thấy trong các loài C. amplyocarpa, C. brachycarpa, C. chrysantha và C. droserifolia.[91], nhưng đây là lần đầu tìm thấy

trong hai loài Màn màn hoa tím và Màn màn hoa vàng.

Các hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (4) và

kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (18) có hàm lượng

tương đối lớn trong lá Màn màn hoa vàng. Có thể sử dụng các hợp chất này như là

chất chuẩn đối chiếu trong loài Màn màn hoa vàng.

Ngoài ra, kết quả thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan trên các cao chiết và một số chất

phân lập cho thấy đáp ứng trên mô hình thử nghiệm. Tác dụng bảo vệ gan của các cao

chiết và một số hợp chất phân lập từ hai loài Màn màn phù hợp với báo cáo từ nghiên cứu ở Việt Nam của Nguyễn Tuấn Quang và cs[4] cũng như các nghiên cứu trên thế giới. [13, 31, 55,59, 58, 105]

Kết quả nghiên cứu trong luận án góp phần giải thích tác dụng trị viêm gan mạn

tính của dược liệu Màn màn đã được sử dụng trong dân gian[1, 6, 8].

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ hai loài Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng

(Cleome viscosa L.) tại tỉnh Bình Dương, bằng các phương pháp sắc ký, đã phân lập

được 25 hợp chất tinh khiết, các hợp chất phân lập được chủ yếu là flavonoid, trong đó

có 5 hợp chất mới và 20 hợp chất đã biết.

Bằng các phương pháp phổ hiện đại như IR, UV, 1D-NMR, 2D-NMR, MS, HR-MS

đã xác định được cấu trúc 25 hợp chất này như sau.

● Loài Màn màn hoa tím

+ 3 hợp chất mới: Cleomeside A (6), cleomeside B (8) và cleomeside C (20).

+ 10 hợp chất đã biết:

Quercitrin (2), isoquercitrin (3), quercetin 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L-

rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside (5), quercetin-3-O-[2"-O-(6'''-p-

coumaroyl)-β-D-glucopyranosyl]-α-L-rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside

L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside (19), glycerol monostearate (21),

(7), kaempferol-3-O-(2,4-O-diacetyl-α-L-rhamnopyranoside) (16), kaempferol-3-O-α-

ethyl α-galactopyranoside (22), adenine (23) và emodin-8-O-β-D-glucopyranoside

(25).

● Loài Màn màn hoa vàng

+ 2 hợp chất mới: Visconoside A (9) và visconoside B (10).

+ 10 hợp chất đã biết:

Quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (4), quercetin-7-O-

α-L-rhamnopyranoside (1), kaempferol-3-O-methylether (11), kaempferol-3,4'-O-

dimethylether (12), kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside (13), kaempferol-7-O-α-L-

rhamnopyranoside (14), kaempferol-3-O-(4-O-acetyl-α-L-rhamnopyranoside) (15),

kaempferol-3,7-O-α-L-dirhamnopyranoside (17), kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-

7-O-α-L-rhamnopyranoside (18) và 5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyde (24).

Các cao chiết từ thân, lá của cả hai loài đều không có hoạt tính độc tế bào, thể hiện

tác dụng tác dụng kích thích tăng trưởng tế bào khoảng 20% - 30% sau 72 giờ.

Cleomeside A (6), cleomeside B (8), cleomeside C (20), visconoside A (9),

visconoside B (10), quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (4),

quercetin-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L-rhamnopyranoside-7-O-α-L-rhamno

pyranoside (5), kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (18)

đều không thể hiện hoạt tính độc tế bào.

Hợp chất cleomeside C (20) làm tăng tỷ lệ tế bào sống 100% ở nồng độ 25µM.

Các hợp chất cleomeside B (8), visconoside A (9), visconoside B (10) và

kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside (18) thể hiện tác

dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 và phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào do CCl4

2 mM gây ra sau 24 giờ tiếp xúc ở nồng độ 100 µM, trong đó các hợp chất 9, 10 và 18

thể hiện tác dụng bảo vệ tế bào gan tốt với tỷ lệ phòng ngừa 65% - 75%.

KIẾN NGHỊ

Đây là nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính bảo vệ tế bào gan

của Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.f.) và Màn màn hoa vàng (Cleome viscosa

L.) ở Việt Nam. Tiếp tục nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan in vivo trên một số mô hình

gây tổn thương gan bằng paracetamol, cyclophosphamide và ethanol.

Dựa trên các kết quả thu được cho thấy dược liệu Màn màn có khả năng phát triển

thành nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược ở nước ta. Cho nên cần có kế hoạch để

bảo tồn và phát triển loài cây này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

[1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ

Trung Đàm, Phạm Văn Hiểu, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị

Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2003), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”,

Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tập II, tr. 222-223.

[2] Đỗ Thị Hồng Tươi, Lê Thị Thu Vân, Huỳnh Thị Kim Loan (2014), “Xây dựng mô

hình in vitro mô phỏng tình trạng tổn thương tế bào gan bằng tác nhân CCl4 trên dòng

tế bào HepG2”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 18(1), tr. 273-280.

[3] Nguyen Thi Hoai Thu, Lam Phuc Khanh, Nguyen The Duy, Nguyen Thi Kim Chanh,

Nguyen Kim Phi Phung, Poul Erik Hansen (2011), “Chemical constituents from leaves

of Sonneratia alba J.E. Smith (Sonneratiaceae)”, Tạp chí phát triển KH&CN, tập 14, số

T6-2011, tr. 11-17.

[4] Nguyễn Tuấn Quang, Triệu Duy Điệt, Vũ Bình Dương, Chúc Mai Hiên (2011), “Đánh

giá một số tác dụng sinh học của cao thân, lá, cây Màn màn tím (Cleome chelidonii L.

f., Capparaceace)”, Tạp chí Y Dược học quân sự, số 3-2011, tr. 7-13.

[5] Nguyễn Tuấn Quang, Triệu Duy Điệt, Vũ Bình Dương, Nguyễn Trung Hiếu, Chúc

Mai Hiên (2011), “Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học của cây màn màn tím

(Cleome chelidonii L.f.)”, Tạp chí Y Dược học quân sự, số 2-2011, tr. 40-45.

[6] Phạm Hoàng Hộ (2003), “Cây cỏ Việt Nam”, Nhà xuất bản trẻ, tập I, tr. 597-598.

[7] Sỹ Danh Thường (2009), “Tuyển tập báo cáo Hội nghị Sinh thái và Tài nguyên sinh

vật lần thứ 3”, Viện ST&TNSV-Viện KH&CN Việt Nam, 22/10/2009.

[8] Võ Văn Chi (2003), “Từ điển thực vật thông dụng”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ

thuật Hà Nội, tập 1, tr. 711-712.

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH

[9] Ahmed S., Sultana M., Hasan M.M.U., Azhar I. (2011), “Analgesic and antiemetic

activity of Cleome viscosa”, Pak. J. Bot., 43, pp. 119-122.

[10] Ailian Z., Huayi Q., Qi Y., Guolin Z. (2006), “Chemical study on Rostellularia

procumbens”, Chin. J. Appl. Environ. Biol., 12(2), pp. 170-175.

[11] Bainiwal L.K., Vijayvergia P., Vijayvergia R. (2013), “Determination of preliminary

phytoconstituents, total phenolic and flavonoids contents in the roots, leaves and stems

of Cleome viscosa Linn.”, Int. J. Biol. Pharmaceut. Res., 4(12), pp. 891- 895.

[12] Barakat H.H., El-Mousallamy A.M.D., Souleman A.M.A., Awadalla S. (1991),

“Flavonoids of Ochradenus baccatus”, Phytochemistry, 30(11), pp. 3777-3779.

[13] Battu G., Pragada R., Murthy P.P., Rao E.S., Kiran P.M., Srikanth M., Praneeth

V.S.D., Rao T.M. (2012), “In vitro anti-oxidant and hepatoprotective activities of

Cleome chelidonii root extracts”, J. Pharm. Res., 5(6), pp. 3155-7.

[14] Bawankule D.U., Chattopadhyay S.K., Pal A., Saxena K., Yadav S., Faridi U.,

Darokar M.P., Gupta A.K., Khanuja S.P.S. (2008), “Modulation of inflammatory

mediators by coumarinolignoids from Cleome viscosa in female swiss albino mice”,

Inflammopharmacology, 16(6), pp. 272-277.

[15] Biswas S.M., Jana A. (2010), “Bioactivity of acid 2-amino-9-(4-oxoazetidin-2-yl)

nonanoic from the root exudates Cleome viscosa ”, Bio-Research, 8(1), pp. 651-656.

[16] Bose A., Gupta J.K., Dash G.K., Ghosh T., Si S., Panda D.S. (2007), “Diuretic and

antibacterial activity of aqueous extract of Cleome rutidosperma DC.”, Indian J.

Pharm. Sci., 69(2), pp. 292-294.

[17] Bose A., Khuntia A., Gupta J.K., Si S.(2012), “Evaluation of central nervous system

depressant activity of Cleome rutidosperma”, Alt. Med. Studies, 2(8), pp. 38-42.

[18] Bose A., Mondal S., Gupta J.K., Ghosh T., Si S., Debbhuti D. (2007), “A study on

antimicrobial activity of Cleome rutidosperma DC”, J. Nat. Rem., 7(1), pp. 132-134.

[19] Bose A., Smith P.J., Lategan C.A., Gupta J.K., Si S. (2010), “Studies on in vitro

antiplasmodial activity of Cleome rutidosperma”, Drug Res., 67(3), pp. 315-318.

[20] Bose U., Bala V., Ghosh T.N., Gunasekaran K., Rahman A.A. (2011),

“Antinociceptive, cytotoxic and antibacterial activities of Cleome viscosa leaves”,

Braz. J. Pharmacog., 21(1), pp. 165-169.

[21] Chakraborty A.K., Charde M.S., Roy H., Bhanja S., Behera M. (2010),

“Comparative study of antioxidant activity between ethanolic and aqueous extract of

Cleome rutidosperma”, Int. J. Pharm. Sci. Res., 1(11), pp. 112-116.

[22] Chatterjee A., Chattopadhyay S.K., Tandon S., Kaur R., Gupta A.K., Maulik P.R.,

Kant R. (2013), “Isolation of a unique dipyridodiazepinone metabolite nevirapine

during large scale extraction of Cliv-92 from the seeds of Cleome viscosa”, Ind. Crops.

Prod., 45, pp. 395-400.

[23] Chattopadhyay S.K., Kumar S., Kaur R., Tandon S., Rane S. (2008), “Identification

and quantification of two antihepatotoxic coumarinolignoids cleomiscosin A and

cleomiscosin B in the seeds of Cleome viscosa using liquid chromatography-tandem

mass spectrometry”, Biomed. Chromatogr., 23, pp. 340-356.

[24] Chauhan J.S., Srivastava S.K., Srivastava S.D. (1979), “Kaempferide 3-glucuronide

from the roots of Cleome viscosa”, Phytochemistry, 18(4), p. 69.

[25] Devi B.C., Ramesh C. (2015), “Studies on anti-diabetic activity of Cleome viscosa in

alloxan-induced diabetic rats”, S. Am. J. Acad. Res., 2(1), pp. 1-8.

[26] Devi B.P., Boominathan R., Mandal S.C. (2003), “Evaluation of antipyretic potential

of Cleome viscosa Linn. (Capparidaceae) extract in rats”, J. Ethnopharmacol., 87(1),

pp. 11-13.

[27] Devi B.P., Boominathan R., Mandal S.C.(2004), “Studies on psychopharmacological

effects of Cleome viscosa Linn. extract in rats and mice”, Phytother. Res., 18(2), pp.

169-172.

[28] Dey P.S.A., Manavalan R. (2009), “Effect of the methanolic extract of Cleome

chelidonii on drug metabolizing enzymes, antioxidant status, chemomodulatory

efficacy in mice”, J. Basic Appl. Sci., 5(1), pp. 37-46.

[29] Dhanalakshmi, Kumar D.S., Prasad M.S., Koli V., Kumar B. P., Harani A. (2011),

“Antimicrobial activity evaluation of Cleome viscose Linn.”, Eur. J. Exp. Biol., 1(1),

pp.103-105.

[30] El-Sayed M.M., Mahmoud M.A.A., El-Nahas H.A.K., El-Toumy S.A.H., El-Wakil

E.A., Ghareeb M.A. (2010), “Bio-guided isolation and structure elucidation of

antioxidant compounds from the leaves of Ficus sycomorus”, Pharmacology online, 3,

pp. 317-332.

[31] Ethadi S., Pragada R., Battu G. (2013), “Evaluation of anti-inflammatory and

hepatoprotective activities of different extracts of Cleome chelidonii root in albino

rats”, Int. J. Pharma Bio Sci., 4(4), pp. 111-119.

[32] Faheemuddin M.D., Janarthan M., Durraivel S. (2013), “Evaluation of protective

effect of Cleome viscosa extract on diet induced atherosclerosis in diabetic rats”, J.

Chem. Pharm. Sci., 6(4), pp. 238-242.

[33] Gopal Y.V., Ravindernath A., Kalpana G., Reddy V.P. (2012), “Antitumor activity

of Cleome viscosa against Ehrlich Ascites carcinoma (EAC) in Swiss albino mice”, Int.

J. Phyto. Pharm., 2(2), pp. 51-55.

[34] Gupta N.K., Dixit V.K. (2009), “Evaluation of hepatoprotective activity of Cleome

viscosa Linn. extract”, Indian J. Pharmacol., 41(1), pp. 36-40.

[35] Gupta N.K., Dixit V.K. (2009), “Hepatoprotective activity of Cleome viscosa Linn.

extract against thioacetamide-induced hepatotoxicity in rats”, Nat. Prod. Res., 23(14),

pp. 1289-1297.

[36] Hiroyoshi M., Iizuka T., Nagai M., Hoshi K.(2003), “Adenine, an inhibitor of

platelet aggregation from the leaves of Cassia alata”, Biol. Pharm. Bull., 26(9), pp.

1361-1364.

[37] Holden P.R., James N.H., Brooks A.N., Roberts R.A., Kimber I., Pennie W.D.

(2000), “Identification of a possible association between CCl4 induced hepatotoxicity

and interleukin-8 expression”, J. Biochem. Mol. Toxic., 14(5), pp. 283-290.

[38] Houglum K., Ramm G.A., Crawford D.H., Witztum J.L., Powell L.W., Chojkier M.

(1997), “Excess iron induces hepatic oxidative stress and transforming growth factor

beta1 in genetic hemochromatosis”, Hepatology, 26(3), pp. 605-610.

[39] Huang W., Wan C., Zhou S. (2013), “Quercetin - A flavonoid compound from

Sarcopyramis bodinieri with potential apoptotic activity in HepG2 liver cancer cells”,

Trop. J. Pharm. Res., 12(4), pp. 529-533.

[40] Hwang Y.P., Choi J.H., Kim H.G., Khanal T., Song G.Y., Nam M.S., Lee H.S.,

Chung Y.C., Lee Y.C., Jeong H.G. (2013), “Saponins, especially platycodin D, from

Platycodon grandiflorum modulate hepatic lipogenesis in high-fat diet-fed rats and

high glucose-exposed HepG2 cell”, Toxico. Appl. Pharm., 267(2), pp. 174-183.

[41] Iredale J.P. (2007), “Model of liver fibrosis: exploring the dynamic nature of

inflammation and repair in a solid organ”, J. Clin. Invest., 117(3), pp. 539-547.

[42] Islam M.M., Islam M.Z., Shaekh M.P.E., Das P., Chowdhury H.K., Shahik S.M.,

Muzahid N.H., Khan M.A., Ekram A.E. (2014), “Screening of Cleome viscosa (L.) for

dose mortality, insect repellency, cytotoxicity and larvicidal activities in the laboratory

condition”, Int. J. Sci. Eng. Res., 5(1), pp. 2201-2212.

[43] Jabloński J., Hołownia A., Jabłońska E., Moniuszko-Jakoniuk J., Braszko J.,

Iwanowska J., Marcińczyk M. (2005), “The effect of ethanol and nitric oxide on the N-

nitrosodimethylamine formation in HepG2 cells overexpressing CYP2E1”, Hum. Exp.

Toxicol., 24(9), pp. 447-452.

[44] Jain G.C., Agarwal S. (2006), “Favourable effect of Cleome viscosa L. on serum and

hepatic lipids in hyperlipidemic rats”, Asian J. Exp. Sci., 20(2), pp. 331-336.

[45] Jain N.K., Singhai A.K. (2012), “Ameliorative effects of Spinacia oleracea L. seeds

on carbon tetrachloride (CCl4)-induced hepatotoxicity: In vitro and in vivo studies”,

Asian Pac. J. Trop. Biomed., 2(1), pp. S232-S237.

[46] Jana A., Biswas S.M. (2011), “Lactam nonanic acid, a new substance from Cleome

viscosa with allelopathic and antimicrobial properties”, J. Biosci., 36(1), pp. 27-35.

[47] Jane R.R., Patil S.D. (2012), “Cleome viscosa: An effective medicinal herb for otitis

media”, Int. J. Sci. Nat., 3(1), pp. 153-158.

[48] Jente R., Jaklipwic J., Olatunji G.A. (1990), “A cembranoid diterpene from Cleome

viscosa”, Phytochemistry, 29(2), pp. 666-667.

[49] Kapoor B.B.S., Mishra R. (2013), “Flavonoid contents from some Capparidaceous

medicinal plants of North-West Rajasthan”, Indian J. Pharm. Biol. Res., 1(1), pp. 9-11.

[50] Kerhoas L., Aouak D., Cingoz A., Routaboul J.M., Lepiniec L., Einhorn J., Birlirakis

N. (2006), “Structural characterization of the major flavonoid glycosides from

Arabidopsis thaliana seeds”, J. Agric. Food Chem., 54(18), pp. 6603-6612.

[51] Kook D., Wolf A.H., Yu A.L., Neubauer A.S., Priglinger S.G., Kampik A., Welge-

Lussen U.C. (2008), “The protective effect of quercetin against oxidative stress in the

uman RPE in vitro”, Invest. Ophth. Vis. Sci., 49(4), pp. 1712-1720.

[52] Koppula S., Ammani K., Bobbarala V. (2011), “Assessment of medicinal potentials

of Cleome viscosa L. methanol extract”, Int. J. Chem. Anal. Sci., 2(2), pp. 12-14.

[53] Kristanti A.N., Aminah N.S., Tanjung M. (2015), “Phenolic compounds from stem

bark of Saccopetalumhors fieldii Benn”, Der Pharm. Lett., 7(3), pp. 149-152.

[54] Kumar S., Ray A.B., Konno C., Oshima Y., Hikino H. (1988), “Cleomiscosin D, a

coumarino-lignan from seeds Cleome viscosa”, Phytochemistry, 27(2), pp. 636-638.

[55] Kumar S.V., Christina A.J.M., GeethaRani P.V., Nalini G., Chidambaranathan N.

(2009), “Antifibrotic effect of Cleome viscosa Linn on CCl4 induced liver fibrosis”,

Der Pharma Chemica, 1(2), pp. 92-96.

[56] Lee T.K., Lau T.C., Irene O.Ng. (2002), “Doxorubicin-induced apoptosis and chemo

sensitivity in hepatoma cell lines”, Cancer Chemoth. Pharm., 49(1), pp. 78-86.

[57] Li Z.C., Chen Z., Li X.R., Xu Q.M., Yang S.L. (2012), “Chemical constituents in

roots and stems of Physalis alkekengi var. franchetii”, Chin. Trad. Herbal Drugs,

43(10), pp. 1910-1912.

[58] Lima I.C., Nora R., Carvalho M.G., Douglas S.A. (2014), “Distribution and

chemotaxonomic significance of phenolic compounds in Spermacoce verticillata (L.)

G. Mey”, J. Pharm. Pharmacogn. Res., 2(1), pp. 14-18.

[59] Mali R.G. (2010), “Cleome viscosa (wild mustard): A review on ethnobotany,

phytochemistry and pharmacology”, Pharm. Biol., 48(1), pp. 105-112.

[60] Martín-Renedo J., Mauriz J.L., Jorquera F., Ruiz-Andrés O., González P., González-

Gallego J. (2008), “Melatonin induces cell cycle arrest and apoptosis in

hepatocarcinoma HepG2 cell line”, J. Pineal Res., 45(4), pp. 532-540.

[61] Masuda T., Jitoe A., Kato S., Nakatani N. (1991), “Acetylated flavonol glycosides

from Zingiber zerumbet”, Phytochemistry, 30(7), pp. 2391-2392.

[62] McCullough A.J. (2006), “Pathophysiology of nonalcoholic steatohepatitis”, J. Clin.

Gastroenterol., 40(1), pp. 17-29.

[63] Meex S.J., Andreo U., Sparks J.D., Fisher E.A. (2011), “Huh-7 or HepG2 cells:

which is the better model for studying human apolipoprotein-B100 assembly and

secretion?”, J. Lipid Res., 52(1), pp. 152-158.

[64] Mehta K., Balaraman R., Amin A.H., Bafna P.A., Gulati O.D. (2003), “Effect of

fruits of Moringa oleifera on the lipid profile of normal and hypercholesterolaemic

rabbits”, J. Ethnopharmacol., 86(2-3), pp. 191-195.

[65] Merekar A.N., Parjane S.K., Nirmal S.A., Laware R.B., Patel D.S. (2011),

“Synergistic anthelmintic activity of rhizomes of Acorus calamus and aerial part of

Cleome viscosa”, Pharmacology online, 2, pp. 1007-1009.

[66] Mishra A., Mishra A.K., Jain S.K.(2010), “Anticonvulsant activity of Cleome viscosa

seed extracts in Swiss albino mice”, Int. J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 2(1), pp. 177-81.

[67] Mismisuraya M.A., Alwi S.R.W., Chua L.S., Mustaffa A.A. (2015), “Review of

hepatoprotective agents in herbs”, J. Eng. Sci. Technol., Special Issue, pp. 14-24.

[68] Mobiya A.K., Patidar A.K., Selvam G., Jeyakandan M. (2010), “Hepatoprotective

effect of Cleome viscosa L. seeds in paracetamol induced hepatotoxic rats”, Int. J.

Pharm. Biol. Arch., 1(4), pp. 399-403.

[69] Mohammed A.E.I. (2015), “Phytoconstituents and the study of antioxidant,

antimalarial and antimicrobial activities of Rhus tripartita growing in Egypt”, J.

Pharmacogn. Phytochem., 4(2), pp. 276-281.

[70] Mondal S., Dash G.K., Acharyya S. (2010), “Isolation of phytoconstituents from the

roots of Cleome rutidosperma DC”, Drug Inv. Today, 2(1), pp. 92-95.

[71] Mondal S., Dash G.K., Acharyya S., Brahma D.K. (2009), “Analgesic, anti-

inflammatory and antipyretic studies of Cleome rutidosperma DC. roots”, J. Pharm.

Res., 2(5), pp. 819-822.

[72] Mondal S., Suresh P. (2012), “Wound healing activity of Cleome rutidosperma DC.

roots”, Int. Curr. Pharm. J., 1(6), pp. 151-154.

[73] Moya M., Benet M., Guzmán C., Tolosa L., Carmelo G.M., Pareja E., Castell J.V.,

Jover R. (2012), “Foxa1 reduces lipid accumulation in human hepatocytes and is down-

regulated in nonalcoholic fatty liver”, Plos one, 7(1), e30014.

[74] Nair S., Varalakshmi K.N. (2011), “Anticancer, cytotoxic potential of Moringa

oleifera extracts on HeLa cell line”, J. Nat. Pharm., 2, pp. 138-142.

[75] Nakajima K., Yamauchi K., Shigematsu S., Ikeo S., Komatsu M., Aizawa T.,

Hashizume K. (2000), “Selective attenuation of metabolic branch of insulin receptor

down-signaling by high glucose in a hepatoma cell line, HepG2 cells”, J. Biol. Chem.,

275(27), pp. 20880-20886.

[76] Nakatani N., Jitoe A., Masuda T., Yonemori S. (1991), “Flavonoid constituents of

Zingiber zerumbet Smith”, Agric. Biol. Chem., 55(2), pp. 455-460.

[77] Okoro I.O., Umar I.A., Atawodi S.E., Anigo K.M. (2015), “Bioassay-guided

evaluation of the antidiabetic activity of Cleome rutidosperma DC”, Int. J. Pharm.

Pharm. Sci., 7(1), pp. 198-202.

[78] Olszewska M., Wolbis M. (2002), “Further flavonoids from the flowers of Prunus

spinosa L.”, Acta Pol. Pharm., 59(2), pp. 133-137.

[79] Owis A.I. (2012), “Glycosides from Cassia brewsteri flowers growing in Egypt”,

Asian J. Pharm. Life Sci., 2(4), pp. 428-435.

[80] Pareek A., Godavarthi A., Issarani R., Nagori B.P. (2013), “Antioxidant and

hepatoprotective activity of Fagonia schweinfurthii extract induced in CCl4

hepatotoxicity in HepG2 cell line and rats”, J. Ethnopharmacol., 150(3), pp. 973-981.

[81] Parimaladevi B., Boominathan R., Mandal S.C. (2003), “Studies on analgesic

activity of Cleome viscosa in mice”, Fitoterapia, 74(3), pp. 262-266.

[82] Patil R.C., Wavhal S.D., Yadav S.S., Deshpande V.D. (2012), “Antibacterial and

bioenhancing activity of ethyl acetate extract of Cleome rutidosperma leaves”,

J. Pharm. Res., 5(1), pp. 557-559.

[83] Priyanka S., Sayanti G., Monideepa B., Lekhya P.C., Bhaskara R.K.V. (2014),

“Phytochemical composition, antimicrobial, hemolytic activity and HPLC analysis of

ethanolic extract Cleome viscosa stems”, Res. J. Pharm. Tech., 7(10), pp. 1140-1144.

[84] Rahman S.M.M., Munir S., Hossain M.A. (2008), “Phytochemical study of the arial

parts of Cleome rutidosperma DC. Plant”, Indo. J. Chem., 8(3), pp. 459-462.

[85] Rao B.S., Reddy K.E., Parveen K., Narendra B.L., Shekhar S.C., Mangala L. (2014),

“Effects of Cleome viscosa on hyperalgesia, oxidative stress and lipid profile in STZ

induced diabetic neuropathy in Wistar rats”, Pak. J. Pharm. Sci., 27(5), pp. 1137-45.

[86] Ray A.B., Chaitopadhyay S.K., Kumar S. (1985), “Structures of cleomiscosins,

coumarinolignoids of Cleome viscosa seeds”, Tetrahedron, 41(1), pp. 209-214.

[87] Sahu S.C. (2007), “Hepatotoxicity: From genomics to in vitro and in vivo models”,

Wiley, England, pp. 25-28.

[88] Sakthivadivel M., Gunasekaran P., Mathew J., Samraj A., Arivoli S., Tennyson S.

(2014), “Evaluation of larvicidal efficacy of Cleome viscosa L. (Capparaceae) aerial

extracts against Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae)”, Asian Pac. J. Trop.

Dis., 4(2), pp. S795-S798.

[89] Saradha J.K., Rao B.S. (2010), “In vitro antibacterial activity of Cleome viscosa

Linn.”, Pharma Science Monitor, 1(2), pp. 71-78.

[90] Senthamilselvi M.M., Kesavan D., Sulochana N. (2012), “An anti-inflammatory and

anti-microbial flavone glycoside from flowers of Cleome viscosa”, Org. Med. Chem.

Lett., 2(19), pp. 1-5.

[91] Sharaf M., El-Ansari M.A., Saleh N.A.M. (1997), “Flavonoids of Four Cleome and

Three Capparis Species”, Biochem. Syst. Ecol., 25(2), pp. 161-166.

[92] Shimizu Y., Maeda T., Hidaki Y., Tani H., Morita N. (2003), “Identiﬁcation and eﬀect of ethyl galactoside on the properties and baking quality of dough”, Food Res.

Int., 36, pp. 373-379.

[93] Singletary K., MacDonald C., Wallig M., Fisher C. (1996), “Inhibition of 7,12-

dimethylb enzanthracene (DMBA)-induced mamary tumorigenesis and DMBA-DNA

adduct formation by curcumin”, Cancer Lett., 103(2), pp. 137-141.

[94] Song N., Xu W., Guan H., Liu X., Wang Y., Nie X. (2007), “Several flavonoids from

Capsella bursa-pastoris (L.) Medic.”, Asian J. Tradit. Med., 2(5), pp. 218-222.

[95] Soudamini K.K., Unnikrishnan M.C., Soni K.B., Kuttan R. (1992), “Inhibition of

lipid peroxidation and cholesterol levels in mice by curcumin”, Indian J. Physiol.

Pharmacol., 36(4), pp. 239-243.

[96] Sridhar N., Kiran B.V.V.S., Sasidhar D.K., Kanthal L.K. (2014), “In vitro

antimicrobial screening of methanolic extracts of Cleome chelidonii and Cleome

gynandra”, Bangladesh J. Pharmacol., 9(2), pp. 161-166.

[97] Srivastava S.K. (1980), “Stigmasta-5,24(28)-diene-3β-O-α-L-rhamnoside from

Cleome viscosa”, Phytochemistry, 19(11), pp. 2510-2511.

[98] Srivastava S.K., Chauhan J.S., Srivastava S.D. (1979), “A new naringenin glycoside

from Cleome viscosa”, Phytochemistry, 18(12), pp. 2057-2058.

[99] Sudhakar M., Rao Ch.V., Rao P.M., Raju D.B. (2006), “Evaluation of antimicrobial

activity of Cleome viscosa and Gmelina asiatica”, Fitoterapia, 77, pp. 47-49.

[100] Tomar A., Tomar Y., Sati A., Rawat S., Sati S.C. (2015), “Antimicrobial activity of

Cleome viscosa (seed)”, Eur. J. Pharm. Med. Res., 2(4), pp. 271-274.

[101] Wake R.R., Patil N.A., Khadabadi S.S. (2011), “In vitro antimicrobial activity of

extracts of seeds of Cleome viscosa”, Int. J. Pharm. Sci. Res., 2(8), pp. 2232-2236.

[102] Wei Y., Xie Q., Fisher D., Sutherland I.A. (2011), “Separation of patuletin-3-O-

glucoside, astragalin, quercetin, kaempferol and isorhamnetin from Flaveria bidentis

Kuntze by elution-pump-out high-performance counter-current chromatography”,

J. Chromatogr. A, 1218, pp. 6206-6211.

[103] Weng C.J., Chen M.J., Yeh C.T, Yen G.C. (2011), “Hepatoprotection of quercetin

against oxidative stress by induction of metallo thionein expression through activating

MAPK and PI3K pathways and enhancing Nrf2 DNA-binding activity”, New

Biotechnology, 28(6), pp. 768-777.

[104] Williams L.A.D., Vasques E., Reid W., Porter R., Kraus W. (2003), “Biological

activities of extract from Cleome viscosa”, Naturwissenschaften, 90(10), pp. 468-472.

[105] Yadav N.P., Chanda D., Chattopadhyay S.K., Gupta A.K., Pal A. (2010), “Hepato

protective effects and safety evaluation of coumarinolignoids isolated from Cleome

viscosa seeds”, Indian J. Pharm. Sci., 72(6), pp. 759-765.

[106] Yao H.R., Liu J., Plumeri D., Cao Y.B., He T., Lin L., Li Y., Jiang Y.Y., Li J.,

Shang J. (2011), “Lipotoxicity in HepG2 cells triggered by free fatty acids”, Am. J.

Transl. Res., 3(3), pp. 284-291.

[107] Ye N., Qin J., Liu X., Shi W., Lin B. (2007), “Characterizing doxorubicin-induced

apoptosis in HepG2 cells using an integrated microfluidic device”, Electrophoresis,

28(7), pp. 1146-1153.

[108] Zhang Y., Morikawa T., Nakamura S., Ninomiya K., Matsuda H., Muraoka O.,

Yoshikawa M. (2007), “Bioactive constituents from chinese natural medicines. XXV.

New flavonol bisdesmosides, sarmenosides I, II, III, and IV, with hepato protective

activity from Sedum sarmentosum”, Heterocycles, 71, pp. 1565-1576.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

● Phan Nhat Minh, Mai Dinh Tri, Nguyen Tan Phat, Bui Trong Dat, Nguyen Ngoc

Hanh, Ngo Quoc Luan, Ma Thi Thu Thanh & Chung Hoang Huynh (2015), “Two

new flavonol glycosides from the leaves of Cleome chelidonii L.f.”, Journal of

Asian Natural Products Research, 17(4), pp. 338-342.

● Phan Nhật Minh, Mai Đình Trị, Nguyễn Tấn Phát, Nguyễn Ngọc Hạnh, Mã Thị

Thu Thanh, Chung Hoàng Huynh (2014), “Góp phần khảo sát thành phần hóa học

lá Màn màn hoa tím”, Tạp chí Dược liệu, số 2-2014, tr. 106-109.

● Phan Nhật Minh, Mai Đình Trị, Nguyễn Tấn Phát, Nguyễn Ngọc Hạnh (2013),

“Cleomeside A, một coumaroyl flavonol glycoside mới từ lá cây Màn màn tím

Cleome chelidonii L.f.”, Tạp chí Hóa Học, T.51(6ABC), tr. 78-81.

● Phan Nhật Minh, Phạm Thị Thùy Linh, Nguyễn Thị Diễm Thúy, Mai Đình Trị,

Nguyễn Tấn Phát, Lê Tiến Dũng, Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Trọng Tuân,

Nguyễn Ngọc Hạnh (2015), “Phân lập quercetin diglycoside và kaempferol

tetraglycoside và hoạt tính bảo vệ gan của cao methanol thân cây Màn màn hoa

vàng (Cleome viscosa L.) và Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii L.f.) trên mô

hình gan chuột bị gây độc bằng CCl4”, Tạp chí Hóa học, T.53(4e3), tr. 1-6.

● Phan Nhật Minh, Nguyễn Tấn Phát, Lê Tiến Dũng, Nguyễn Việt Thống, Lê Thị

Thùy Dương, Mai Thanh Phong, Mai Đình Trị (2015), “Flavonol glycoside phân

lập từ lá cây Màn màn hoa vàng Cleome viscosa L.”, Tạp chí Hóa học, T.53(6e1,2),

tr. 237-240.