Luận án tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG NGỌC CƯƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP. GÂY BỆNH THỐI NHŨN

TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ

MAI MỰC ỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

KHÁNH HÒA - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG NGỌC CƯƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP. GÂY BỆNH THỐI NHŨN

TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ

MAI MỰC ỐNG

NGÀNH ĐÀO TẠO : CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

MÃ SỐ

: 62540105

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. TRANG SĨ TRUNG

PGS.TS. NGUYỄN ANH TUẤN

KHÁNH HÒA - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả

trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan của mình.

Nha Trang, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Hoàng Ngọc Cương

LỜI CẢM ƠN

Luận án hoàn thành là nhờ có nhà trường, các tổ chức có liên quan tạo điều kiện;

thầy cô, bạn bè, gia đình giúp đỡ và hỗ trợ. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

PGS. TS. Trang Sĩ Trung và PGS. TS. Nguyễn Anh Tuấn đã định hướng, chỉ

dẫn và động viên trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu luận án này.

Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, các Phòng, Ban, Khoa, Viện liên

quan đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận án.

Ban giám hiệu Trường Đại học Bình Dương, Lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh

học đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận án.

TS. Nguyễn Văn Hòa, Ths. Nguyễn Công Minh đã tận tình hướng dẫn, động

viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi trong quá trình thực hiện luận án.

TS. Huỳnh Thanh Tùng, PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa, TS. Khổng Trung Thắng

đã giúp đỡ, chia sẻ nhiều kinh nghiệm quí báu.

Các cán bộ kỹ thuật của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trung tâm

Thí nghiệm Thực hành – Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện trọng

quá trình tiến hành nghiên cứu.

Cuối cùng, xin gửi tấm lòng ân tình tới gia đình, những người thân yêu luôn là

nguồn động viên và chia sẻ mọi khó khăn để luận án được hoàn thành.

Nha Trang, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Hoàng Ngọc Cương

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ ii

MỤC LỤC .................................................................................................................... iii

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT................................................................... vi

DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. viii

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... viii

ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ........................................................................... xii

PHẦN MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 6

1.1. TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP. ĐỂ THU

NHẬN -CHITIN........................................................................................................... 6

1.1.1. Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp. và phế liệu từ mực sau chế biến .. 6

1.1.2. Cấu trúc và thành phần hóa học của nguyên liệu mai mực ống Loligo sp. ..... 7

1.2. TỔNG QUAN VỀ β-CHITIN VÀ CHITOSAN ................................................... 16

1.2.1. Cấu trúc hóa học, nguồn gốc tự nhiên và tính chất của các dạng chitin ........ 16

1.2.2. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan .................................................... 20

1.2.3. Phương pháp thu nhận chitin và chitosan ...................................................... 23

1.2.4. Đặc tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan ............................. 36

1.3. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH ...... 39

1.3.1. Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu cà chua sau thu hoạch ..................... 39

1.3.2. Tổng quan về bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại cà chua sau thu hoạch ......... 41

1.3.3. Giới thiệu về chủng vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối nhũn .................... 42

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 45

2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................................. 45

2.1.1. Mai mực ống Loligo sp. ................................................................................. 45

2.1.2. Trái cà chua Lycopersicon esculetum ............................................................ 45

2.1.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu .................................................................... 46

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 46

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ............................................................................ 46

2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thu nhận β-chitin ................................. 49

iii

2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện deacetyl β-chitin thu nhận chitosan ..... 55

2.2.4. Bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn ........... 62

2.2.5. Bố trí thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây

bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch của β-chitosan ở điều kiện in

vitro và in vivo ................................................................................................. 64

2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU ............................ 71

2.3.1. Phương pháp xác định các thành phần hóa học cơ bản ................................. 71

2.3.2. Phương pháp xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng ............ 71

2.3.3. Phương pháp xác định tính chất của -chitin và chitosan ............................. 71

2.3.4. Phương pháp cắt mạch chitosan ..................................................................... 72

2.3.5. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn ............. 73

2.3.6. Phương pháp chuẩn bị mẫu dịch vi khuẩn Erwinia carotovora ..................... 74

2.3.7. Phương pháp gây bệnh nhân tạo .................................................................... 75

2.3.8. Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro75

2.3.9. Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo 75

2.3.10. Phương pháp xác định tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua ......... 76

2.3.11. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................ 76

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 77

3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MAI MỰC LOLIGO SP ...................................... 77

3.1.1. Thành phần hóa học cơ bản............................................................................ 77

3.1.2. Thành phần khoáng ........................................................................................ 79

3.1.3. Thành phần acid amin .................................................................................... 80

3.2. XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT -CHITIN

TỪ MAI MỰC LOLIGO SP. ........................................................................................ 82

3.2.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến quá

trình khử protein trong mai mực Loligo sp. .................................................... 82

3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng chi tiết các yếu tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH

đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch của sản phẩm β-chitin .................... 84

3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử

của sản phẩm β-chitin ...................................................................................... 85

3.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử

của sản phẩm β-chitin ...................................................................................... 88

3.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và khối lượng

phân tử của sản phẩm β-chitin ......................................................................... 90

3.2.3. Tính chất của sản phẩm β-chitin từ mai mực ống .......................................... 92

3.3. ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN TỪ MAI

MỰC LOLIGO SP. ..................................................................................................... 101

3.3.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của 3 yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian

đến hiệu quả deacetyl -chitin ....................................................................... 101

3.3.2. Ảnh hưởng chi tiết của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu

quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan .................................................... 104

3.3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan

....................................................................................................................... 104

3.3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả deacetyl β-chitin và sự cắt

mạch chitosan ................................................................................................ 107

3.3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan 108

3.3.3. Điều kiện deacetyl lần 2 ............................................................................... 110

3.3.4. Hiệu suất thu nhận và tính chất của sản phẩm chitosan ............................... 111

3.3.5. Đề xuất quy trình thu nhận chitin, chitosan từ mai mực ống Loligo sp. ...... 119

3.4. KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN .......................................... 120

3.4.1. Nghiên cứu phân lập, khẳng định chủng Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên

trái cà chua sau thu hoạch .............................................................................. 120

3.4.2. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro ......................... 127

3.4.3. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo ............................... 131

3.4.4. Đề xuất quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng dung dịch chitosan từ mai

mực Loligo sp. ................................................................................................ 139

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 141

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ....................................... 143

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................... 144

PHỤ LỤC ................................................................................................................... 158

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

AAS Atomic absorption spectrophotometric Phương pháp phổ hấp thu nguyên tử

AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống

ANOVA Analysis of Variance Phân tích phương sai

Chitosan từ β-chitin Chitosan from β-chitin -chitosan

Degree of crystallinity Độ kết tinh χcr

Tomato C95 Giống cà chua C95 C95

Crystalline Index Chỉ số kết tinh CrI

Degree of acetyl Độ acetyl DA

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

Degree of deacetyl Độ deacetyl DD

Deproteinization Quá trình khử protein DP

Demineralization Quá trình khử khoáng DM

Decolorization Quá trình khử màu DC

Ecc Erwinia carotovora subsp. carotovora Erwinia carotovora subsp. carotovora

Eca Erwinia carotovora subsp. atroseptica Erwinia carotovora subsp. atroseptica

Erwinia chrysanthemi Erwinia chrysanthemi Echr

Ethylenediaminetetraacetic acid Ethylenediaminetetraacetic axit EDTA

Fourier Transform Infrared Quang phổ hấp thụ hồng ngoại FTIR

D-glucosamine D-glucosamine GlcN

GlcNAc N-acetyl glucosamine N-acetyl glucosamine

Nồng độ ức chế tối thiểu MIC Minimum Inhibitory Concentration

MHS Mark-Houwink-Sakurada equation Phương trình Mark-Houwink- Sakurada

The average molecular weight Khối lượng phân tử trung bình Mw

NL/DM Material / solvent Nguyên liệu / dung môi

Nd Not detected Không phát hiện

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

OD Optical density Độ hấp phụ quang học

Pl Pectate lyases Enzyme phân giải pectin

Pnl Pectin lyases Enzyme phân giải pectin

Pme Pectin methylesterases Enzyme phân giải pectin

PA Polyamide Bao nylon

PG Potato glucose Môi trường potato glucose

PCR Polymerase chain reaction Phương pháp khuếch đại gen

PDA Potato dextrose agar Môi trường thạch khoai tây

rARN Ribosomal ribonucleic ARN riboxom

SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét

SEC-MALLS Size-exclusion chromatography- Multi-angle static light scattering Phương pháp sắc ký loại trừ kết hợp với phân tán ánh sáng tĩnh đa góc

sp. Species Loài

spp. Species pluriel Nhiều loài

subsp. Subspecies Phân loài

Phần mềm thống kê SPSS Statistical Package for the Social Sciences

SS Sum of Squares Tổng bình phương độ lệch

Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM Transmission Electron Microscope

TpHCM Ho Chi Minh City Thành phố Hồ Chí Minh

TLTK References Tài liệu tham khảo

VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers Hiệp hội chế biến và xuất khẩu Thuỷ sản Việt Nam

VNF Viet Nam Food Công ty Cp Việt Nam Food

XRD X-ray powder diffraction Phổ nhiễu xạ tia X

wt.% Weight percent Phần trăm theo khối lượng

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong nguyên liệu của một số loại phế liệu thủy sản

thông dụng để sản xuất chitin ................................................................................. 8

Bảng 1.2. Thành phần hóa học trong một số mai mực .................................................... 9

Bảng 1.3. Thành phần khoáng của nguyên liệu mai mực ............................................... 9

Bảng 1.4. Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan ...................................... 21

Bảng 1.5. Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl ....................................... 22

Bảng 1.6. Thành phần và tính chất của một số loại chitosan thương mại ..................... 22

Bảng 1.7. Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguyên liệu

khác nhau .............................................................................................................. 30

Bảng 1.8. Nguồn nguyên liệu thủy sản, điều kiện xử lý và loại chitin............................ 32

Bảng 1.9. Điều kiện deacetyl thu nhận chitosan từ các nguồn chitin khác nhau .......... 34

Bảng 1.10. Khối lượng phân tử trung bình (Mw) của chitosan ở các điều kiện deacetyl

khác nhau .............................................................................................................. 36

Bảng 1.11. Bảng tổng hợp các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn (soft rot) .............. 43

Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của mai mực ống Loligo sp .............................. 77

Bảng 3.2. Thành phần khoáng trong mai mực Loligo sp., các loại mực khác và vỏ tôm ..... 79

Bảng 3.3. So sánh thành phần acid amin trong mai mực ống Loligo sp. và kết quả tham

khảo ....................................................................................................................... 80

Bảng 3.4. Tính chất của mai mực ống và sản phẩm β-chitin ........................................ 94

Bảng 3.5. Thành phần khoáng trong mai mực và sản phẩm β-chitin ............................ 95

Bảng 3.6. Hàm lượng acid amin trong mai mực và sản phẩm β-chitin ......................... 95

Bảng 3.7. Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 25oC của β-chitin .. 100

Bảng 3.8. Hiệu suất thu hồi chitin và chitosan ............................................................ 112

Bảng 3.9. So sánh chất lượng của thương mại chitosan và β-chitosan ....................... 113

Bảng 3.10. Hàm lượng acid amin còn lại trong β-chitin và β-chitosan ...................... 114

Bảng 3.11. Thành phần khoáng và kim loại trong mai mực, β-chitin và β-chitosan .. 115

Bảng 3.12. Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 70oC của β-chitosan .. 118

Bảng 3.13. Mẫu cà chua thu nhận từ các chợ nông sản .............................................. 121

Bảng 3.14. Kết quả đánh giá đặc tính sinh hóa sinh lý của các dòng vi khuẩn .......... 123

Bảng 3.15. Khả năng kháng khuẩn Erwinia carotovora của chitosan với khối lượng

phân tử khác nhau và chitosan thương mại (C-120) ........................................... 128

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Thống kê giá trị xuất khẩu mực, bạch tuộc; (a) Mực ống Loligo sp. (b) Mai

mực. ........................................................................................................................ 6

Hình 1.2. Mô hình cấu trúc chitin trong mai mực nguyên liệu . ................................... 10

Hình 1.3. Một kiểu mô phỏng những liên kết hóa học có thể tạo ra giữa chitin với

astaxanthin và các phân tử khác trong nguyên liệu. ............................................. 11

Hình 1.4. Mô hình cấu trúc lớp vỏ tôm. ........................................................................ 11

Hình 1.5. Ảnh quét kính hiển vi điện tử SEM của mai mực ống. ................................. 12

Hình 1.6. Quy trình thu nhận chitin/chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau. .... 13

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học phân tử chitin. .................................................................... 17

Hình 1.8. Sự sắp xếp của chuỗi chitin: (a) α-chitin, (b) β-chitin, (c) γ-chitin. .............. 17

Hình 1.9. Cấu trúc phân tử (a) α-chitin (b) β-chitin. ..................................................... 18

Hình 1.10. Cấu trúc α-chitin và -chitin. ..................................................................... 19

Hình 1.11. Phổ XRD của α-chitin và β-chitin. .............................................................. 19

Hình 1.12. Cấu trúc hóa học của chitosan. .................................................................... 20

Hình 1.13. Sơ đồ quá trình sản xuất chitin/chitosan từ phế liệu thủy sản. .................... 24

Hình 1.14. Phản ứng deacetyl chitin thu chitosan. ........................................................ 33

Hình 1.15. Cà chua bị bệnh thối nhũn (soft rot). ........................................................... 41

Hình 2.1. Nguyên liệu mai mực ống Loligo sp. ............................................................ 45

Hình 2.2. Nguyên liệu cà chua Lycopersicon esculentum. ............................................ 46

Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát. ................................................................. 47

Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và

thời gian đến khả năng khử protein trong mai mực ống nguyên liệu. .................. 49

Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình khử

protein mai mực ống. ............................................................................................ 51

Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thời gian ..................................... 53

Hình 2.7. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến quá trình khử

protein. .................................................................................................................. 54

Hình 2.8. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá ảnh hưởng các yếu tố nhiệt độ, nồng độ

NaOH và thời gian đến quá trình deacetyl -chitin. ............................................. 56

Hình 2.9. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình

deacetyl -chitin. .................................................................................................. 57

Hình 2.10. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nồng độ NaOH đến quá

trình deacetyl -chitin. .......................................................................................... 59

Hình 2.11. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến quá trình

deacetyl -chitin. .................................................................................................. 60

Hình 2.12. Sơ đồ thí nghiệm deacetyl lần 2. ................................................................. 61

Hình 2.13. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau

thu hoạch. .............................................................................................................. 63

Hình 2.14. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây

bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan. ..................................... 64

Hình 2.15. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. của chitosan

ở điều kiện in vitro. ............................................................................................... 66

Hình 2.16. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh thối nhũn của chitosan ở

điều kiện in vivo. ................................................................................................... 67

Hình 2.17. Sơ đồ thí nghiệm so sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn của chitosan từ

mai mực ống và chitosan thương mại. .................................................................. 69

Hình 3.1. Hàm lượng protein còn lại sau quá trình khử protein dưới tác động của 3 yếu

tố (nhiệt độ, nồng độ NaOH, thời gian). ............................................................... 83

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein

và sự cắt mạch β-chitin. .......................................................................................... 86

Hình 3.3. (a) Ảnh của mực ống, (b) mai mực ống và (c) sản phẩm β-chitin. ............... 92

Hình 3.4. Hình SEM chụp bề mặt cắt của (a) mai mực ống và (b) sản phẩm β-chitin. ..... 97

Hình 3.5. Phổ XRD của mai mực ống và sản phẩm β-chitin thu được từ mai mực. ..... 98

Hình 3.6. Phổ FTIR của nguyên liệu mai mực ống và sản phẩm β-chitin. ................... 99

Hình 3.7. Phổ H1 NMR của β-chitin. .......................................................................... 100

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả deacetyl. .. 103

Hình 3.9. Ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến DD và

Mw của chitosan. ................................................................................................. 106

Hình 3.10. Ảnh hưởng của quá trình deacetyl lần 2 đến DD và Mw của chitosan. .......... 110

Hình 3.11. Sản phẩm -chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp. .............................. 111

Hình 3.12. Hình SEM của (a) mai mực ống, (b) β-chitin và (c) chitosan. .................. 115

Hình 3.13. Phổ XRD của mai mực, β-chitin và β-chitosan. ........................................ 116

Hình 3.14. Phổ FTIR sản phẩm chitosan từ (a) β-chitosan, (b) α-chitosan thương mại

và (c) β-chitin. ..................................................................................................... 117

Hình 3.15. Phổ H1-NMR của β-chitosan. .................................................................... 117

Hình 3.16. Phổ SEC-MALLS của β-chitosan. ............................................................ 118

Hình 3.17. Quy trình thu nhận β-chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp. ................ 119

Hình 3.18. Mẫu trái cà chua bệnh thối nhũn thu nhận từ chợ nông sản. ..................... 121

Hình 3.19. (a) Mẫu khuẩn lạc được chọn; (b) Mẫu vi khuẩn nhuộm Gram. ............... 122

Hình 3.20. Trình tự một đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn Erwinia carotovora. .. 124

Hình 3.21. Hình SEM chủng vi khuẩn Erwinia carotovora. ...................................... 125

Hình 3.22. Vết bệnh thối nhũn trên trái cà chua. ......................................................... 125

Hình 3.23. Sơ đồ phát triển bệnh thối nhũn trên cà chua. ........................................... 126

Hình 3.24. (a) Khả năng kháng khuẩn của S-655 và (b) của S-138 ở các nồng độ khác

nhau. C-120 là chitosan thương mại với Mw là120 kDa. .................................... 129

Hình 3.25. Hình TEM của vi khuẩn Erwinia sp. được xử lý trong dung dịch β-chitosan

1% (S-138) trong 60 phút. (a) Vi khuẩn Erwinia carotovora; (b) xử lý sau 15

phút; (c) xư lý sau 30 phút; (d) kết quả sau 60 phút. .......................................... 130

Hình 3.26. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-1740 ở điều kiện in vivo. ............. 132

Hình 3.27. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-655 ở điều kiện in vivo. ............... 133

Hình 3.28. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-138 ở điều kiện in vivo. ............... 134

Hình 3.29. Kích thước vết bệnh bên trong được xử lý S-138 trong (a) 24 giờ , (b) 36 giờ. .. 135

Hình 3.30. So sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn ở điều kiện In vivo của S-138 và

chitosan thương mại C-120 (a) kích thước vết bệnh bên ngoài và (b) kích thước

vết bệnh bên trong. .............................................................................................. 136

Hình 3.31. Kích thước vết bệnh bên trong và bên ngoài khi xử lý chitosan S-138 và

chitosan thương mại C-120 sau 36 giờ. .............................................................. 137

Hình 3.32. Tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua sau khi được xử lý các

loại chitosan có phân tử lượng khác nhau sau thời gian 24 và 72 giờ. ............... 138

Hình 3.33. Quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng chitosan. ........................ 139

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia

sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan

từ mai mực ống.

Ngành: Công nghệ chế biến thủy sản

Mã số: 62540105

Nghiên cứu sinh: Hoàng Ngọc Cương

Khóa: 2011

Người hướng dẫn: PGS.TS. Trang Sĩ Trung

PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn

Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang

Nội dung:

1. Đã xác định được thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực Loligo sp.

thải ra sau quá trình chế biến tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang,

làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo.

2. Đã xác định được điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn

thương mại. Sản phẩm -chitin thu được có khối lượng phân tử trung bình lớn (Mw) và

là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực

kỹ thuật cao. Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn.

3. Đã xác định được điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt tiêu

chuẩn thương mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lượng phân tử lớn.

Sản phẩm chitosan thu được là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo

chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao

như y dược, y sinh và công nghệ thực phẩm. Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản

xuất ở qui mô lớn.

4. Đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái

cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng chitosan có khối

lượng phân tử khác nhau. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong bảo

quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng

khuẩn của chitosan.

NGHIÊN CỨU SINH

Hoàng Ngọc Cương

xii

KEY FINDINGS

Thesis title: Preparation and characterization of chitosan from squid pens and its

antibacterial activity against Erwinia sp. caused soft rot on tomato fruits.

Speciality Aquatic Products Technology :

Code 62540105 :

Ph.D Student : Hoang Ngoc Cuong

Course : 2011

Supervisors : 1. Assoc. Prof. PhD. TRANG SI TRUNG

2. Assoc. Prof. PhD. NGUYEN ANH TUAN

Intitution Nha Trang University :

Key findings:

- The data of chemical composition of the Loligo sp. squid pens in Kien Giang

province will be reported that can be used for futher studies and improve seafood

processing.

- The extraction conditions of -chitin with commercial standard from squid

pens will be reported. The obtained -chitin with a high molecular weight can be used

to prepare chitosan with a high purity and high molecular weight for various

applications. Those extraction conditions can be applied in large scale production.

- The deacetylation conditions of -chitin for chitosan with commercial

standard (Mw > 6338 kDa, DD >90%) will be reported. The obtained chitosan can be

used for biomedicine, biopharmacy, and food technology applications. Those

deacetylation conditions can be applied in large scale production.

- The antibacterial activity of chitosan against Erwinia carotovora caused soft

rot on tomato fruits in vitro and in vivo will be reported. The low moleculer weight of

chitosan is used, the high activity is observed.

Ph.D Student

Hoang Ngoc Cuong

PHẦN MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển nhanh chóng của ngành công nghiệp chế

biến và xuất khẩu thủy sản, hằng năm đã thải ra hàng chục ngàn tấn phế liệu sau chế

biến. Tuy nhiên, hầu hết các phế liệu này chỉ được bán thô hoặc chế biến để tạo ra các

sản phẩm có giá trị kinh tế thấp gây lãng phí tài nguyên, trong khi đây là nguồn

nguyên liệu có thể sản xuất ra các sản phẩm có giá trị gia tăng và chất lượng cao.

Trong đó, hướng nghiên cứu thu nhận và ứng dụng các polyme sinh học tách chiết từ

nguồn phế liệu thủy sản đang rất được quan tâm của các nhà quản lý, nhà khoa học và

doanh nghiệp.

Trong số nhiều sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu thủy sản, chitin và

chitosan (sản phẩm của quá trình deacetyl chitin) là 2 polyme sinh học được chứng

minh có nhiều tính chất đặc biệt như khả năng tương thích sinh học cao, khả năng tạo

màng, tạo gel, tính phân giải chậm, tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn. Do

đó, chitin và chitosan đã và đang được nghiên cứu thu nhận và ứng dụng nhiều trong

các lĩnh vực y dược, y sinh, công nghệ thực phẩm, xử lý môi trường, dệt nhuộm, công

nghệ sinh học. Ước tính mỗi năm có khoảng 10.000 tấn chitin và chitosan đã được sản

xuất, sử dụng trên toàn thế giới nhưng hầu hết được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ

ghẹ. Tuy nhiên, α-chitin/chitosan thường có độ rắn cao, khối lượng phân tử thấp và độ

tinh sạch chưa cao vì bản chất của nguồn nguyên liệu thu nhận là vỏ giáp xác có chức

năng bảo vệ cơ thể sinh vật bên trong nên được cấu tạo rất phức tạp và rắn chắc. Hơn

nữa trong nguyên liệu vỏ giáp xác ngoài thành phần chitin còn chứa nhiều khoáng,

protein và chất màu nên quá trình sản xuất cần qua nhiều công đoạn tách chiết, sử

dụng nhiều hoá chất gây ô nhiễm.

Mai mực ống có chứa hàm lượng khoáng thấp, lượng β-chitin khá cao (> 35%),

chitin này có khối lượng phân tử lớn gấp 3 lần α-chitin và hầu như không chứa các

kim loại nặng như Pb, Hg, As nên có độ tinh khiết cao [36, 79, 95]. Do đó, đây là

nguồn nguyên liệu cần thiết để sản xuất ra loại β-chitin/chitosan có khối lượng phân tử

lớn và độ tinh khiết cao để ứng dụng trong lĩnh vực như tạo gel trong mỹ phẩm, màng

kháng viêm, màng phân giải thuốc, chỉ khâu cấy ghép trong phẫu thuật, kỹ thuật mô

cấy ghép da nhân tạo [54, 89, 151]. Ngoài ra, β-chitin/chitosan đã được chứng minh có

độ rắn thấp, độ xốp cao nên dễ dàng deacetyl và được ứng dụng trong nuôi cấy mô, cố

định tế bào và enzyme, phân giải thuốc chậm mà các tính chất này vượt trội so với α-

chitin/chitosan. Tại Việt Nam, nguồn phế liệu mai mực thải ra sau quá trình chế biến

ước tính đạt khoảng 10-15 tấn/tháng [58, 8]. Tuy nhiên, nguồn phế liệu này chủ yếu là

phơi khô, bán thô với giá thành thấp, do đó gây lãnh phí tài nguyên. Trong khi, đây là

nguồn nguyên liệu quý để thu nhận chitin/chitosan chất lượng cao. Hơn nữa theo chúng

tôi tìm hiểu thì chưa có một nghiên cứu chính thức và có hệ thống đầy đủ nào được công

bố tại Việt Nam về quy trình thu nhận, đánh giá tính chất và ứng dụng β-chitin/chitosan

tách chiết từ mai mực ống.

Xuất khẩu nông sản Việt Nam giai đoạn 2012-2016 ước đạt 15 tỷ USD/năm,

góp phần đáng kể phát triển nền kinh tế. Tuy nhiên, công nghệ sau thu hoạch chưa

được áp dụng hiệu quả nên chất lượng nông sản còn thấp, hạn chế khả năng xuất khẩu,

tỷ lệ thất thoát sau thu hoạch ở mức cao. Trong đó, bệnh thối nhũn trên trái cà chua

gây ra bởi vi khuẩn Erwinia sp. đã và đang gây thiệt hại 10-30% tổng sản lượng sau

thu hoạch [25, 77, 9]. Các hóa chất thường dùng để kháng bệnh này là thủy ngân clorua,

dung dịch formaldehyde, dung dịch natri hypocloric 12%, hydroxymercurinitrophenol

12% và hydromercurichloride phenol 2% [24, 25, 9]. Đây là các hóa chất độc hại đối với

người nông dân và người tiêu dùng nếu không được kiểm soát chặt chẽ. Ngoài ra, một

số kỹ thuật di truyền để kiểm soát bệnh trước và sau thu hoạch cũng được áp dụng.

Tuy nhiên, các kỹ thuật này có giá thành cao và khó triển khai thực tế ở qui mô lớn.

Do đó, những phương pháp sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và an toàn

như chitosan là rất cần thiết. Thực tế, chitosan điều chế từ α-chitin đã được nghiên cứu

và sử dụng để kháng khuẩn và kháng nấm có hiệu quả trong quá trình bảo quản sau thu

hoạch trên nhiều đối tượng như bơ, xoài, nho và ớt [25, 9]. Các kết quả nghiên cứu cho

thấy chitosan thu được từ β-chitin có tính kháng khuẩn và kháng nấm cao hơn so với

thu được từ α-chitin [79, 134]. Do đó, chitosan này được kỳ vọng sẽ có hiệu quả kháng

khuẩn cao đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây ra bệnh thúi nhũn trên trái cà chua.

Từ những vấn đề thực tế được nêu, luận án này tiến hành nội dung “Nghiên cứu

thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà

chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống”. Đây là vấn đề cần thiết làm cơ sở

khoa học để thu nhận các sản phẩm β-chitin và chitosan có giá trị cao từ mai mực ống ở

Việt Nam và nâng cao giá trị kinh tế của nguồn phế liệu mực ống. Đồng thời, chứng

minh và bổ sung đầy đủ hơn về khả năng kháng khuẩn của chitosan từ -chitin làm đa

dạng hóa các ứng dụng của chitosan trong sản xuất nông nghiệp bền vững.

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Thu nhận -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại từ nguồn phế liệu mai mực

Loligo sp. thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu.

2. Sản xuất chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại từ -chitin thu nhận ở trên.

3. Đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của chitosan đối với bệnh thối nhũn trên trái

cà chua sau thu hoạch do vi khuẩn Erwinia sp. gây ra.

Đối tượng nghiên cứu: Luận án nghiên cứu trên đối tượng phế liệu mai mực Loligo

sp. được thu nhận tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang thải ra sau

quá trình chế biến mực ống xuất khẩu ở dạng tươi, có chiều dài từ 12-15 cm, rộng 1,0-

1,5 cm và độ dày trung bình 0,4 - 0,5 mm.

Phạm vi và nội dung nghiên cứu: Để đạt được 3 mục tiêu nghiên cứu, luận án tập

trung nghiên cứu, đánh giá làm rõ 4 nội dung:

1. Xác định thành phần hóa học cơ bản, các acid amin và kim loại của nguồn phế

liệu mai mực Loligo sp.

2. Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nồng độ HCl,

nhiệt độ và thời gian đến quá trình khử protein, khử khoáng để thu nhận sản phẩm -

chitin đạt tiêu chuẩn thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch -

chitin trong quá trình thu nhận.

3. Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian

đến quá trình deacetyl -chitin để thu nhận sản phẩm chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại và

hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan trong quá trình deacetyl.

4. Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà

chua sau thu hoạch tại các chợ đầu mối nông sản. Khảo sát, đánh giá khả năng kháng

khuẩn của -chitosan với khối lượng phân tử khác nhau đối với vi khuẩn Erwinia sp.

gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua ở điều kiện in vitro và in vivo.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

1. Luận án đã xác định được thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực Loligo

sp. tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang, làm cơ sở khoa học cho

các nghiên cứu tiếp theo.

2. Luận án đã xác định được điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu

chuẩn thương mại. Sản phẩm -chitin thu được có khối lượng phân tử lớn và là nguồn

nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực kỹ thuật

cao. Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn.

3. Luận án đã xác định được điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt

tiêu chuẩn thương mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lượng phân tử

lớn. Sản phẩm chitosan thu được là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo

chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao

như y dược, y sinh và công nghệ thực phẩm. Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản

xuất ở qui mô lớn.

4. Luận án đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn

trên trái cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng -chitosan có

khối lượng phân tử khác nhau. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong

bảo quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính

kháng khuẩn của chitosan.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP. ĐỂ THU

NHẬN -CHITIN

1.1.1. Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp. và phế liệu từ mực sau chế biến

Ở Việt Nam, hiện có khoảng 25 loài mực ống thuộc bộ Teuthida, tập trung

nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50 m. Mùa vụ khai thác từ tháng 6 đến tháng 9

(vụ Nam) và tháng 12 đến tháng 4 năm sau (vụ Bắc), trong đó chủ yếu có 4 loài được

đánh bắt với số lượng chiến trên 96% tổng sản lượng, bao gồm: Loligo japonica,

Loligo chinensis, Loligo beka và Todarodes pacificus.

Mực ống Loligo sp. (Hình 1.1a) được phân loại [58]:

Ngành động vật thân mềm Mullusca

Lớp chân đầu Cephalopoda

Bộ mực ống Teuthida

Họ Loliginidae

Chi Loligo

Hình 1.1. Thống kê giá trị xuất khẩu mực, bạch tuộc; (a) Mực ống Loligo sp. (b)

Mai mực.

Mực ống Loligo sp. có giá trị xuất khẩu cao với sản lượng khai thác trên toàn

vùng biển Việt Nam vào khoảng 24.000 tấn/năm. Theo số liệu thống kê của Hiệp hội

chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), hiện nay các mặt hàng từ mực,

bạch tuộc của Việt Nam đang được xuất khẩu sang 25 thị trường trong đó có các thị

trường khó tính như Nhật Bản, Hoa Kỳ, Châu Âu với tổng kim ngạch đạt 390-460

triệu USD/năm, trong đó giá trị xuất khẩu từ mực chiếm 55-65%, ước đạt 165 triệu

USD [1, 8]. Kết quả khảo sát cho thấy cứ sản xuất được 1 tấn mực thành phẩm sẽ thải

ra 0,45 tấn phế liệu, tỷ lệ này phụ thuộc vào loài, kích thước mực nguyên liệu. Hiện

nay, hầu hết các phế liệu này được thu gom và tận dụng để sản xuất các sản phẩm phụ

dùng trong thức ăn chăn nuôi.

Mai mực chiếm tỷ lệ khoảng 0,4-0,5% trọng lượng của toàn thân mực ống nguyên

liệu tươi hoặc 10-15% phế liệu nội tạng mực thải ra sau quá trình chế biến (Hình 1.1b).

Theo số liệu thống kê của Công ty Việt Nam Food thuộc tỉnh Cà Mau (VNF), lượng phế

liệu từ chế biến mực ống được công ty thu mua mỗi tháng khoảng 130 tấn. Do đó,

lượng mai mực thu được ước đạt trung bình 10-15 tấn/tháng. Tuy nhiên, hiện nay

nguồn nguyên liệu này chủ yếu là được phơi khô và bán thô cho các nhà máy chế biến

làm thức ăn chăn nuôi hoặc bán trực tiếp cho các thương lái sang thị trường Trung Quốc

với giá trị thấp.

1.1.2. Cấu trúc và thành phần hóa học của nguyên liệu mai mực ống Loligo sp.

Nguồn nguyên liệu khác nhau dẫn đến qui trình chiết rút chitin có khác nhau, tùy

thuộc vào hàm lượng khoáng và protein có trong phế liệu. Do đó thành phần hóa học

của nguồn nguyên liệu được xem là yếu tố quyết định đến việc lựa chọn qui trình tách

chiết và chất lượng của sản phẩm chitin thu được. Kết quả tổng hợp về thành phần hóa

học một số nguồn phế liệu thủy sản thông dụng để sản xuất chitin hiện nay được trình

bày trong Bảng 1.1. So sánh các thành phần cho thấy, vỏ cua có hàm lượng khoáng

cao nhất, lên đến 56%, trong khi hàm lượng chitin lại thấp nhất, chỉ có 12,9%. Do đó,

việc thu nhận chitin từ vỏ cua gặp nhiều khó khăn trong quá trình loại khoáng trong

khi hiệu quả thu nhận chitin thấp.

Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong nguyên liệu của một số loại phế liệu thủy

sản thông dụng để sản xuất chitin

Thành phần hóa học (%)

TLTK

Nguồn phế liệu

Độ ẩm Protein Khoáng Lipid α-Chitin

Tôm sú (Penaeus monodon)

Phế liệu vỏ đầu tôm

26,8

29,3

0,5

34,9

9,1

[2]

Phế liệu vỏ tôm

42,8

20,8

1,2

36,5

9,7

Vỏ tôm thẻ (Penaeus vannamei)

26,1

26,6

27,3

[158]

Vỏ tôm (Crangon crangon)

40,6

27,1

9,9

17,8

Vỏ tôm (Pandalus borealis)

41,9

29,2

10,2

17,0

[3]

Cua xanh (Callinectes sapidus)

4,5

24,0

56,0

2,0

12,9

Ghẹ chấm (Portunus trituberculatus)

12,9

10,3

57,9

0,3

17,1

Đối với phế liệu vỏ tôm có hàm lượng lipid tương đối cao, ví dụ vỏ tôm

Pandalus borealis (10,2%) do đó cần phải lưu ý công đoạn xử lý lipid. Tuy nhiên,

thông thường lượng lipid này có thể được loại bỏ trong công đoạn khử protein trong

môi trường kiềm. Như vậy, để thu nhận chitin từ nguyên liệu vỏ tôm, cua và ghẹ thì

bắt buộc phải tiến hành quá trình khử khoáng và khử protein.

Thành phần hóa học có trong mai của một loài mực đã được công bố trong các

nghiên cứu trước đây được tổng hợp ở Bảng 1.2. So với các nguồn phế liệu vỏ tôm,

cua và ghẹ, phế liệu mai mực có hàm lượng chitin cao hơn nhiều (khoảng 31-42%)

trong khi đó hàm lượng khoáng lại rất thấp (dưới 2%). Hàm lượng lipid cũng rất thấp

hoặc không phát hiện. Do đó, khi tách chiết thu nhận chitin có thể bỏ qua quá trình

khử khoáng và khử lipid mà chỉ tập trung vào quá trình khử protein.

Bảng 1.2. Thành phần hóa học trong một số mai mực

β-chitin

Protein

Lipid

CaCO3

Khoáng

TLTK

Nguyên liệu

(%)

[47]

2,3

Illex argentinus

31,0

64,0

0,1

Ommastrephes bartrami

[93]

35-40

58,0

[81]

Dosidicus gigas

< 1%

[36]

Loligo lessoniana

36,1

0,025

Loligo formosana

36,5

0,042

Loligo sanpaulensis

[95]

40-42

1,9

Loligo plei

[154]

Loligo vulgaris

40,0

1,7

Khi phân tích thành phần khoáng trong mai mực và trong vỏ tôm thẻ Penaeus

vanamei (Bảng 1.3) cho thấy hàm lượng các nguyên tố Ca, Fe, K, Mg, Na và Zn trong

mai mực thấp hơn rất nhiều lần so trong vỏ tôm. Ví dụ, hàm lượng Ca trong mai mực

Loligo lessoniana là 17,74 ppm trong khi trong vỏ tôm là 4856 pmm, cao gấp 250 lần.

Hơn nữa, đáng chú ý là các kết quả công bố đều cho thấy mai mực không chứa các

kim loại nặng như Hg, Pb và As. Như vậy, phế liệu mai mực ống là nguồn nguyên liệu

tiềm năng để thu nhận -chitin có độ tinh khiết cao.

Bảng 1.3. Thành phần khoáng của nguyên liệu mai mực

Ca

Fe

K Mg Na

Zn

Khoáng

TLTK

Nguyên liệu

(%)

(ppm)

Illex argentinus

1,00

170

210

100

450

[47]

0,04

17,74 7,73

3,30

[36]

Loligo lessoniana; Loligo formosana

Loligo sp.

2,4

1025

255 1220 8540 200

[38]

1,9

94,5

3,5

11,7

[95]

Loligo plei; Loligo sanpaulensis

Vỏ tôm thẻ (Penaeus vanamei)

26,6

4856 15,67 2437

1594 11,8

[2]

Trong nguyên liệu, chitin tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần như

protein, chất khoáng, chất màu, lipid và các hợp chất khác với hàm lượng biến đổi tùy

theo loại nguyên liệu, nên trong quá trình tách chiết, thu nhận chitin cần phải khử các

hợp chất phi chitin này. Có nhiều nghiên cứu công bố về sự tồn tại các liên kết này,

trong đó các nghiên cứu của Rinaudo (2006) và Lavall (2007) cho thấy chitin tồn tại

dưới dạng liên kết với các thành phần khác như protein, cacbonat canxi và nhiều hợp

chất hữu cơ khác dưới dạng phức hợp gây khó khăn cho việc tách chiết và thu nhận

chitin [95, 134].

Hình 1.2. Mô hình cấu trúc chitin trong mai mực nguyên liệu [112, 170].

Tương tự, Armenta (2009) và Nikolov (2010) đã đưa ra mô hình mô tả chitin

trong nguyên liệu được bao bọc bởi các sợi xoắn protein tạo nên cấu trúc vững chắc bảo

vệ cơ thể sinh vật (Hình 1.2 và Hình 1.3) [16, 112], nghiên cứu cho thấy cấu trúc chitin

trong lớp biểu bì có các thuộc tính bất đẳng hướng, các mô khoáng liên kết chặt chẽ với

các sợi chitin-protein tạo nên cấu trúc dạng tấm và được vôi hóa bằng các muối

cacbonat canxi làm cho lớp vỏ có độ cứng chắc bảo vệ cơ thể sinh vật mềm yếu bên

trong.

Hình 1.3. Một kiểu mô phỏng những liên kết hóa học có thể tạo ra giữa chitin với

astaxanthin và các phân tử khác trong nguyên liệu [16].

Các kết quả nghiên cứu Kristbergsson, Einrsson và Peter năm 2003 cũng cho

thấy chitin trong cấu trúc nguyên liệu có các liên kết rất chặt chẽ với các thành phần

khác như protein, cacbonat canxi, lipid, chất màu, khoáng chất và các hợp chất hữu cơ

khác gây khó khăn cho việc nghiên cứu tách chiết và thu nhận chitin (Hình 1.4).

Hình 1.4. Mô hình cấu trúc lớp vỏ tôm [88].

Mai mực ống là thành phần xương sụn bên trong các loài mực ống bao gồm

Loligo lessonicana, Loligo formosana, Loligo vulgaris, Ommasterphes bartrami, và

Illex argentines. Hiện nay, đây là nguồn duy nhất để thu nhận β-chitin [79]. Kết quả

ảnh quét điện tử (SEM) bề mặt mai mực ống nguyên liệu (Hình 1.5) cho thấy các lớp

chitin và protein được phân bố đan xen tạo nên cấu trúc sụn mềm của mai mực ống.

Hình 1.5. Ảnh quét kính hiển vi điện tử SEM của mai mực ống [95].

Như vậy, do hàm lượng các thành phần khoáng và màu trong mai mực rất thấp

hơn so với trong vỏ tôm, cua và ghẹ nên qui trình thu nhận chitin/chitosan từ mai mực

có thể bỏ qua 2 công đoạn khử khoáng và khử màu. So sánh các công đoạn thu nhận

chitin từ các nguồn khác nhau được trình bày trong Hình 1.6.

Qui trình sản xuất chitin thông thường gồm các công đoạn tách protein, tách

khoáng và tẩy màu. Đối với công đoạn tẩy màu ở các nước nhiệt đới như Việt Nam

thường thực hiện kết hợp với quá trình phơi khô trực tiếp sản phẩm chitin dưới ánh

nắng mặt trời. Sau đó quá trình deacetyl chitin được thực hiện nhằm tách nhóm acetyl

thu nhận sản phẩm chitosan (deacetylation). Hiện nay, tất cả các công đoạn trên có thể

thực hiện thông qua 3 phương pháp: Phương pháp hóa học, phương pháp sinh học và

phương pháp kết hợp hóa học và sinh học tùy theo loại nguyên liệu, công nghệ, và yêu

cầu về chất lượng sản phẩm chitin và chitosan mà các điều kiện xử lý sẽ khác nhau.

Hình 1.6. Quy trình thu nhận chitin/chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.

1.1.3. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về thu nhận β-chitin/chitosan

Mặc dù có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về thu nhận và ứng dụng của

chitin và chitosan. Tuy nhiên cho đến nay hầu hết các nghiên cứu này chỉ tập trung vào

thu nhận chitin và chitosan từ vỏ tôm. Chitosan thương mại cũng được thu chính từ vỏ

tôm. Chỉ có một số ít các công trình nghiên cứu thu nhận chitin và chitosan từ các

nguồn khác như cua, ghẹ, nấm và mai mực. Tại Việt Nam chưa có một công trình

nghiên cứu nào trước Luân án này về điều kiện thu nhận chitin và chitosan từ mai

mực. Các nghiên cứu chính đã được công bố ngoài nước liên quan đến đề tài, bao

gồm:

Tolaimate và cộng sự (2000) đã sử dụng mai mực ống Loligo vulgaris để xử lý

thu nhận -chitin. Trong quá trình xử lý, mai mực được loại khoáng trước trong dung

dịch acid HCl 0,55M, tỷ lệ 1/10 (w/v) ở nhiệt độ phòng, quá trình này được lập lại 2

lần, mỗi lần 2 giờ, sau đó tiếp tục khử protein trong dung dịch NaOH 0,3M, tỷ lệ 1/10

(w/v) ở nhiệt độ 80-85C, quá trình này cũng được lập lại 2 lần, mỗi lần 1 giờ. Mục

đích của việc xử lý nhiều lần trong thời gian ngắn là để hạn chế đến mức thấp nhất quá

trình cắt mạch chitin trong khi xử lý. Tuy nhiên, quá trình khử khoáng cũng dẫn đến sự

cắt mạch của chitin. Đồng thời, việc xử lý nước thải của quá trình khử khoáng cũng

dẫn đến tăng chi phí sản xuất và đặc biệt khi áp dụng ở quy mô công nghiệp.

Pawadee Methacanon và cộng sự (2003) thu nhận chitin và chitosan từ loài mực

ống Loligo formosana Sasaki, Thái Lan. Quá trình thu nhận chitin được tiến hành theo

2 bước: khử khoáng được thực hiện trong HCl 0,1M, tỷ lệ 1/10 (w/v) trong 12 giờ ở

nhiệt độ 30oC và khử protein ở NaOH 3M, tỷ lệ 1/10 trong 3 giờ ở 80-85oC. Sau đó,

chitin được tiến hành deacetyl thu nhận chitosan trong điều kiện: NaOH 60%, nhiệt độ

80C và thời gian 2 giờ. Chitosan thu được có DD > 90%. Mặc dù các điều kiện xử lý

khá phù hợp nếu đưa vào sản xuất ở qui mô lớn. Tuy nhiên, quá trình khử khoáng cũng

dẫn đến sự cắt mạch của chitin và cần tiến hành bước xử lý nước thải của quá trình

này.

Chaussard và Alain Domard (2004) đã nghiên cứu thu nhận β-chitin từ mai mực

ống (loligo) đánh bắt tại biển Ả-rập. Chitin thu nhận được từ mai mực thông qua khử

khoáng (HCl 1M, 24 giờ, nhiệt độ phòng) và khử protein (NaOH 1M, 24 giờ, nhiệt độ

phòng). Sản phẩm chitin chứa hàm lượng protein (1,9  1 wt.%) và khoáng (0,1 wt.%).

Mặc dù kết quả phân tích ICP cho thấy hàm lượng khoáng trong mai mực nhỏ (2,4

wt.%) nhưng các tác giả vẫn tiến hành bước khử khoáng. Điều này cũng có thể dẫn

đến sự cắt mạch chitin và tăng chi phí sản xuất, xử lý nước thải.

Chandumpai và cộng sự (2004) đã tách chiết và đánh giá tính chất β-chitin thu

được từ mai của mực Loligo lessoniana và Loligo formosana. Qui trình thu nhận bỏ

qua bước khử khoáng. Quá trình khử protein (NaOH 1M, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch

1:13 (w/v), 50oC, 5 giờ). Sản phẩm chitin có hàm lượng khoáng không phát hiện với

hiệu suất thu hồi chitin là 35 – 38%. Quy trình thu nhận đã bỏ qua bước khử khoảng

bằng dung dịch HCl sẽ giảm sự cắt mạch của chitin, giảm chi phí sản xuất.

Quá trình deacetyl tiến hành trong dung dịch NaOH 50% (w/v), tỷ lệ nguyên

liệu/dung dịch 1:15 (w/v), 100oC và 8 giờ. Sản phẩm chitosan có khối lượng phân tử

9,50  0,12 x 106 Da (Loligo lessoniana) 9,69  0,10 x 106 Da (Loligo formosana) và

độ deacetyl là gần 90% đối với cả 2 loài sau thời gian 8 giờ. Mặc dù sản phẩm thu

được có khối lượng phân tử và độ deacetyl cao nhưng việc xử lý ở nhiệt độ cao có thể

gây cắt mạch chitosan và tăng chi phí sản xuất.

Rodrigo L. Lavall và cộng sự (2007) đã nghiên cứu thu nhận chitin trên mai

mực của 2 loài Loligo plei và Loligo sanpaulensis thu nhận ở Brazil. Kết quả nghiên

cứu cho thấy hàm lượng chitin trong mai mực chiếm 40-42% tổng trọng lượng khô

tuyệt đối, do hàm lượng khoáng trong mai mực nguyên liệu thấp nên chỉ cần xử lý

kiềm 2 lần là đủ điều kiện hàm lượng khoáng còn lại trong chitin nhỏ hơn 1%. Tuy

nhiên, tác giả mới dừng lại ở việc thu nhận chitin, đánh giá tính chất hóa lý của sản

phẩm thu được mà chưa có nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện thu nhận đối với sự

cắt mạch của chitin, quá trình deacetyl thu nhận chitosan, tính chất sinh học của các

sản phẩm.

Barwin Vino và cộng sự (2011) đã công bố kết quả điều kiện thu nhận -chitin

và chitosan từ mai mực ống Doryteuthis sibogae tại Ấn Độ. Mai mực sau khi rửa sạch,

sấy khô, cắt nhỏ và khử khoáng trước ở điều kiện dung dịch HCl 2N ở nhiệt độ phòng,

thời gian 24 giờ với tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch HCl là 1/5. Sau quá trình khử

khoáng mai mực được rửa sạch đến trung tính và tiếp tục được xử lý khử protein trong

điều kiện NaOH 1N ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 24 giờ với tỷ lệ nguyên liệu và

dung dịch là 1/5. Kết quả đánh giá cho thấy hàm lượng -chitin đạt 33% và hàm lượng

protein từ 60-65% tổng trọng lượng khô tuyệt đối mai mực nguyên liệu, và có DD >

45%. Hàm lượng khoáng còn lại rất thấp, cụ thể: Mn (0.260ppm), Cu (0.905ppm), Mg

(11.01ppm) và Ca (24ppm). Quá trình deacetyl được thực hiện trong dung dịch NaOH

40% ở nhiệt độ 110C, trong 6 giờ với tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch là 1/5. Chitosan

thu được có màu trắng, có DD > 78%. Trong nghiên cứu này, tác giả đã tiến hành quá

trình khử khoáng bằng HCl. Do đó, nó cũng dẫn đến cắt mạch chitin, tăng chi phí sản

xuất. Ngoài ra, quá trình deacetyl tiến hành ở nhiệt độ cao, chitosan thu được có độ

deacetyl thấp cũng là các nhược điểm của phương pháp thu nhận.

Youn và cộng sự (2012, 2013) đã có những nghiên cứu khá đầy đủ về thu nhận

chitin và chitosan từ mai mực Todarodes pacifica thu tại Hàn Quốc. Điều kiện tối ưu

cho quá trình thu nhận chitin: khử protein trong dung dịch NaOH 3%, thời gian 30

phút, nhiệt độ 121oC, áp suất 15 psi, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10; khử khoáng

trong dung dịch HCl 1N, thời gian 30 phút, nhiệt độ phòng, tỷ lệ nguyên liệu/dung

dịch là 1/10. Chitin thu được có hàm lượng protein (6,29% Nitơ) và khoáng thấp

(0,25%). Điều kiện deacteyl thu nhận chitosan: dung dịch NaOH 35-45%, thời gian

15-60 phút, nhiệt độ 121oC, áp suất 15 psi, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10. Độ

deacetyl của chitosan thu được là 87,1-96,2%. Mặc dù, sản phẩm thu được có chất

lượng tốt nhưng do quá trình xử lý ở nhiệt độ (121oC) và áp suất cao (15 psi), có khử

khoáng bằng HCl sẽ dễ dẫn đến cắt mạch chitin và chitosan, đồng thời khó khắn khi áp

dụng sản xuất ở qui mô công nghiệp.

Jung và cộng sự (2011, 2012, 2013) có những nghiên cứu hệ thống và tương đối

đầy đủ về thu nhận, đánh giá tính chất của chitin và chitosan từ mai mực Dosidicus

gigas thu tại công ty chế biến của Hoa Kỳ (Dosidicus LLC). Điều kiện tối ưu cho quá

trình thu nhận chitin: khử protein trong dung dịch NaOH 5%, thời gian 72 giờ, nhiệt

độ phòng, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10; bỏ qua quá trình khử khoáng. Quá trình

deacteyl thu nhận chitosan tiến hành theo hai phương pháp: (1) dung dịch NaOH 50%,

thời gian 6 giờ, nhiệt độ 90oC thu được chitosan có độ deactyl 97%, (2) dung dịch

NaOH 40%, thời gian 4 giờ, nhiệt độ 90oC thu được chitosan có độ deactyl 86%. Sản

phẩm chitin và chitosan có chất lượng tốt. Các tính chất hóa lý đã được đánh giá và

hoạt tính sinh học của chitosan thu được gồm hoạt tính kháng khuẩn (E. Coli và L.

innocua) và tính chất chống oxy hóa đã được khảo sát. Tuy nhiên, các nghiên cứu này

chỉ tập trung vào một đối tượng mai mực (Dosidicus gigas), các nghiên cứu hoạt tính

sinh học mới chỉ dừng lại ở nghiên cứu in vitro.

1.2. TỔNG QUAN VỀ β-CHITIN VÀ CHITOSAN

1.2.1. Cấu trúc hóa học, nguồn gốc tự nhiên và tính chất của các dạng chitin

Chitin là thành phần chính trong cấu trúc lớp vỏ của động vật chân đốt như vỏ

tôm, cua, ghẹ; trong xương của động vật thân mềm như mai mực, trong tảo và trong

thành vách tế bào nấm, nấm men [47, 93, 109]. Chitin được cấu tạo từ các đơn vị N-

acetyl-D-glucosamine (NADG) liên kết với nhau bằng các liên kết β-1,4-glucozid

được mô tả ở Hình 1.7.

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học phân tử chitin.

Dựa trên nguồn gốc và cấu trúc hóa học, chitin được chia làm 3 dạng: Dạng α-

chitin đã được thương mại hóa và có nguồn thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ. Trong

khi dạng β-chitin thu nhận từ mai mực và dạng γ-chitin thu nhận từ vách tế bào nấm,

nấm men [10, 36, 57, 80, 85, 95]. Ba dạng chitin này khác nhau về số mạch chitin, sự

sắp xếp các mạch này và kích thước của chúng trong mỗi đơn vị cấu trúc (Hình 1.8).

Cụ thể, α-chitin gồm các mạch chitin sắp xếp song song ngược chiều nhau (Hình 1.8a)

và được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua và vỏ ghẹ. Còn β-chitin gồm các mạch chitin sắp

xếp song song cùng chiều (Hình 1.8b), có tính hydrat hóa cao và được thu nhận chủ

yếu từ mai mực ống. Trong khi, γ-chitin là sự kết hợp của 2 dạng α và β (Hình 1.8c) và

thường được thu nhận từ vách tế bào nấm và vách tế bào vi khuẩn. Các cấu trúc khác

nhau dẫn đến tính chất cũng khác nhau. Cụ thể, α-chitin có độ rắn tinh thể (CrI) cao

nhất, còn β-chitin thì có độ rắn thấp nhất.

Hình 1.8. Sự sắp xếp của chuỗi chitin: (a) α-chitin, (b) β-chitin, (c) γ-chitin.

Sự khác biệt này ảnh hưởng đến đến tính hydrat hóa, độ rắn tinh thể của từng

dạng chitin, do đó ảnh hưởng đến khả năng khử gốc acetyl và dạng cấu trúc mạch tinh

thể trong dung môi hòa tan, điều này quyết định các tính chất chức năng sinh học đặc

biệt là khả năng kháng khuẩn của chúng [36, 93, 169].

Cấu trúc phân tử và các liên kết chính của hai dạng -chitin và β-chitin được

biểu diễn trong Hình 1.9. Từ cấu trúc phân tử có thể thấy chitin có cấu trúc chặt chẽ

nên rất khó bị hòa tan trong các dung môi khác nhau. Thực tế, chitin chỉ hòa tan được

trong một số dung dịch acid đậm đặc như HCl, H3PO4 và dimethylacetamide (DMAc)

chứa 5% lithium chloride.

Hình 1.9. Cấu trúc phân tử (a) α-chitin (b) β-chitin [21, 57].

Đặc biệt, các liên kết hydro nội phân tử giữa các nhóm hydroxyl và acetamide

được mô tả cụ thể hơn trong Hình 1.10. Trong đó cho thấy, các chuỗi chitin là tổ chức

ở dạng tấm sắp xếp song song và chúng được liên kết chặt chẽ với nhau thông qua các

liên kết hydro nội phân tử của các nhóm amin và carbonyl (C-O ··· NH) chạy dọc theo

một trục và có khoảng cách khoảng 0,47 nm. Đáng lưu ý là trong cấu trúc của α-chitin

có một số liên kết hydro giữa các tấm dọc theo trục b của các mạch đơn vị do các

nhóm hydroxymethyl của chuỗi liền kề, tính năng đặc biệt này không được tìm thấy

trong cấu trúc của β-chitin [94,100,106]. Điều này đã tạo ra sự khác biệt về cả tính

chất hóa lý và hoạt tính sinh học của các dạng α-chitin và β-chitin. Nghiên cứu trước

đây cũng chỉ ra rằng β-chitin có tính trương nở với nước cao hơn so với α-chitin [53].

Hình 1.10. Cấu trúc α-chitin và -chitin [134].

Chitin tự nhiên có độ deacetyl dao động trong khoảng từ 8-12%, phân tử lượng

trung bình lớn hơn 1 triệu dalton. Tuy nhiên, chitin chiết rút từ vi sinh vật thì có phân

tử lượng thấp, chỉ khoảng vài chục ngàn dalton. Khi đun nóng chitin trong dung dịch

NaOH đặc thì chitin bị khử gốc acetyl tạo thành chitosan. Khi đun nóng chitin trong

dung dịch HCl đặc thì chitin sẽ bị thủy phân tạo thành các phân tử glucosamine có

hoạt tính sinh học cao.

Hình 1.11. Phổ XRD của α-chitin và β-chitin [95].

Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) trong Hình 1.11 cho thấy độ kết tinh của của α-chitin

(85%) từ vỏ ghẹ cao hơn nhiều so với độ kết tinh của β-chitin (72%) từ mai mực ống

[95]. Các nghiên cứu đã chứng minh độ kết tinh, kích thước của tinh thể và mức độ

định hướng của các mạch có ảnh hưởng rất lớn đến lượng nước hấp thụ trong mạng

lưới polyme cũng như độ tan của chúng [68, 79, 95, 112, 123]. Vì vậy, nó sẽ ảnh

hưởng đến những ứng dụng tiềm năng của chitin như trong hệ dẫn thuốc, màng chữa

lành vết thương nơi mà ái lực với nước đóng vai trò rất quan trọng. Hơn nữa, sự khác

biệt giữa -chitin và β-chitin dẫn đến sự khác nhau về các tính chất hóa lý của

chitosan thu được khi tiến hành quá trình deacetyl. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng

chitosan thu được từ β-chitin có độ rắn thấp và độ xốp cao được nghiên cứu và ứng

dụng trong nuôi cấy mô, cố định tế bào và enzyme [76, 87, 89]. Hoạt tính kháng khuẩn

và kháng nấm của β-chitosan cũng được chứng minh tốt hơn -chitosan [42, 79, 148].

Ngoài ra, khi sản xuất chitosan mạch ngắn để tăng độ kháng nấm, kháng khuẩn thì

nguyên liệu β-chitin dễ thực hiện cắt mạch hơn vì tính xốp cao, độ rắn thấp, độ trương

cao.

1.2.2. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan

Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl khỏi

mạch chitin còn gọi là quá trình deacetyl hoá, vì vậy chitosan là polyme chứa rất nhiều

các đơn vị Glucosamine nên có rất nhiều nhóm amin. So sánh cấu trúc hóa học phân tử

của chitin và chitosan được trình bày trong Hình 1.12. Công thức cấu tạo của chitosan

gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon vi trí

thứ 2.

Hình 1.12. Cấu trúc hóa học của chitosan.

Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốt

trong các acid hữu cơ thông thường như acid formic, acid acetic, acid propionic, acid

citric, acid lactic.

Hằng số phân li acid (pKa) của chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8 nên khi hoà tan

trong môi trường acid loãng chitosan tạo thành dung dịch keo dương, đây là một điểm

rất đặc biệt vì đa số các keo polysaccharit tự nhiên tích điện âm. Trong khi chitosan

tích điện dương nên có khả năng bám dính bề mặt trên các ion tích điện âm, có khả

năng tạo phức với các ion kim loại và tương tác tốt với các polyme tích điện âm [6].

Ngoài ra, loại dung môi acid cũng ảnh hưởng đến các hoạt tính sinh học của chitosan

khi hòa tan. Beverlya và cộng sự (2008) đã cho thấy chitosan trong dung môi axit

acetic có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với acid lactic.

Một số dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan được trình bày ở Bảng

1.4. Tuy nhiên cần chú ý là chitosan không hoà tan trong nước, trong dung dịch kiềm

và cồn.

Bảng 1.4. Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan [7]

Nồng độ thường sử dụng (%) Dung môi

Acid acetic 1-2

Acid formic 1-2

Acid lactic 1-2

Acid propionic 1-2

Acid HCl 0,25-0,5

Acid citric 5-10

Acid glutamic 1-3%

Acid ascorbic 1-2%

Các đặc tính như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, hấp phụ kim

loại, kết dính với chất béo, tính kháng khuẩn, kháng nấm, mang DNA, phân giải

chậm,… của chitosan phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa. Chitosan có độ deacetyl

càng cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, tạo phức với kim loại càng tốt. Tương tự,

khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan cao hơn ở các mẫu chitosan có độ

deacetyl cao. Cụ thể, khả năng kháng khuẩn tốt đối với chitosan có độ deacetyl trên

90%. Tuy nhiên, khả năng hút nước của chitosan thì giảm đi khi tăng độ deacetyl. Kết

quả nghiên cứu của Trung (2010) cho thấy khả năng hút nước của chitosan có độ

deacetyl hóa thấp (75%) đạt đến 659% cao hơn nhiều so với chitosan có độ deacetyl

hóa cao chỉ đạt 486% [6, 7].

Bảng 1.5. Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl [144]

Chitosan với độ deacetyl khác nhau Tính chất 75% 87% 96%

Độ nhớt (cP) 111,2  9,5 103,4  7,9 107,3  9,6

Tính thấm nước (%) 659  33 472  35 486  29

Độ tan (%) 99,4  0,1 99,6  0,3 99,5  0,2

Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại chitosan với tính chất và chất lượng

rất khác nhau, thể hiện rất rõ ở hàm lượng protein, khoáng, độ deacetyl và độ nhớt

(Bảng 1.5 và 1.6) do đó các tính chất công nghệ cũng rất khác nhau.

Độ deacetyl của chitin và chitosan (DD) là một thông số quan trọng, đặc trưng

cho tỉ lệ liên kết giữa 2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose với 2-amin-2-deoxy-D-

glucopyranose trong phân tử chitin và chitosan. Chitin có độ deacetyl thấp còn

chitosan thì có độ deacetyl cao, tức là chứa nhiều nhóm amin.

Bảng 1.6. Thành phần và tính chất của một số loại chitosan thương mại [43]

Sản Hàm lượng Hàm lượng Độ deacetyl Mật độ khối Độ nhớt

phẩm nitơ (%) khoáng (%) (%) (g/ml) (cP)

1 7,13 ± 0,00 0,3 ± 0,1 90,6 ± 0,0 0,26 ± 0,02 120 ± 3

2 7,16 ± 0,03 0,2 ± 0,1 89,9 ± 1,1 0,38 ± 0,01 444 ± 6

3 7,14 ± 0,08 1,0 ± 0,2 83,0 ± 0,0 0,28 ± 0,00 1928 ± 11

4 6,91 ± 0,28 0,2 ± 0,1 72,5 ± 0,0 0,38 ± 0,01 72 ± 3

5 7,00 ± 0,05 1,7 ± 0,3 86,9 ± 1,1 0,20 ± 0,01 768 ± 8

Ngoài độ deacetyl thì sự phân bố của các nhóm glucosamine cũng ảnh hưởng

đến tính chất của chitosan [111]. Cụ thể, chitosan phân bố dạng rời rạc thì dễ tan hơn

chitosan phân bố dạng khối.

+ Dạng phân bố rời rạc (random) của phân tử chitosan:

D-D-A-D-D-A-D-D-D-D-A-D-D-A-D-D-A-D-D-D-A-D-D-D-D-

+ Dạng phân bố dạng khối (block) của phân tử chitosan:

D-D-D-D-D-D-D-A-A-A-A-A-D-D-D-D-D-D-D-D-A-A-A-D-D-

Trong đó: D: D-glucosamine, A: N-acetyl glucosamine

Khối lượng phân tử trung bình của chitosan (Mw) là một thông số cấu trúc quan

trọng, nó quyết định tính chất của chitosan như khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel,

khả năng hấp phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật. Chitosan có phân

tử lượng càng lớn thì có độ nhớt càng cao. Thông thường, phân tử lượng của chitosan

nằm trong khoảng từ 100.000 dalton đến 1.200.000 dalton [43]. Phân tử lượng của

chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin, điều kiện deacetyl và thường thì rất khó kiểm

soát. Tuy nhiên, chitosan có phân tử lượng thấp thì thường có hoạt tính sinh học cao hơn

nên có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học. Chitosan có phân

tử lượng lớn có khả năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt. Độ

nhớt của chitosan phụ thuộc vào phân tử lượng. Chitosan có phân tử lượng thấp có độ

nhớt từ 30-200 cps và chitosan có phân tử lượng lớn hơn 1 triệu dalton có độ nhớt lên đến

3000-4000 cps. Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc vào độ deacetyl, cường

độ ion, pH, nhiệt độ.

1.2.3. Phương pháp thu nhận chitin và chitosan

Trong nguyên liệu, chitin liên kết chặt chẽ với các thành phần như protein,

khoáng, chất màu, lipid và các hợp chất khác dưới dạng các phức hợp với hàm lượng

biến đổi tùy theo loại nguyên liệu. Do đó để thu nhận chitin thì cần phải khử các hợp

chất phi chitin này. Hiện nay có 3 phương pháp thu nhận chitin và chitosan được sử

dụng (Hình 1.13).

Hình 1.13. Sơ đồ quá trình sản xuất chitin/chitosan từ phế liệu thủy sản.

1.2.3.1. Phương pháp hóa học

+ Nguyên tắc: Sử dụng các hóa chất vô cơ (ví dụ: HCl, NaOH, KOH) trong các

bước khử khoáng, khử protein và deacetyl thu nhận chitin và chitosan.

+ Ưu và nhược điểm: quá trình phản ứng nhanh, đơn giản, dễ thực hiện ở quy mô

lớn. Tuy nhiên, sản phẩm chitin và chitosan thường bị cắt mạch mạnh bởi các acid và

baz vô cơ. có phân tử lượng thấp, độ nhớt thấp, dư lượng hóa chất lớn. Hơn nữa,

những quá trình này thường sử dụng một lượng lớn hóa chất và nước, do đó sẽ tạo ra

một lượng lớn chất thải hóa học độc hại gây ô nhiễm môi trường và ăn mòn thiết bị

[13, 18, 55, 84, 86, 4, 5].

+ Một số nghiên cứu đã công bố: Các nghiên cứu đánh giá chi tiết về các

phương pháp xử lý hóa học khác nhau để thu nhận chitin từ phế thải động vật giáp xác,

nhuyễn thể đã được thực hiện từ năm 1954 đến 1993 [113]. Naznin và cộng sự (2005)

đã khảo sát các điều kiện khác nhau cho quá trình khử khoáng (DM) và khử protein

(DP) để thu chitin từ vỏ tôm (Metapenaeus monoceros) và quá trình đánh giá cho thấy

đầu tiên protein được tách ra khỏi nguyên liệu bằng cách xử lý với natri hydroxit

(NaOH) hoặc kali hydroxit (KOH) ở nhiệt độ cao, nồng độ kiềm thường là từ 1% đến

10% với nhiệt độ từ 30°C đến 100°C, khi tiến hành quá trình khử protein độc lập với

quá trình khử khoáng là tốt nhất. Thời gian phản ứng thường được sử dụng khác nhau

từ 30 phút đến 12 giờ [110]. Shahidi và cộng sự (1991) và Synowiecki và cộng sự

(2000) đã công bố điều kiện tối ưu cho quá trình khử protein (DP) vỏ cua và vỏ tôm đã

được báo cáo là 1-2% KOH ở 90°C với tỷ lệ dung dịch kiềm là 1:20 (w/v), khoảng

thời gian tối thiểu là 1 giờ, đây là thời gian cần thiết để loại bỏ 90% protein và sau 2

giờ khử sẽ loại bỏ hầu hết các protein trong nguyên liệu [141, 150].

Việc loại bỏ canxi cacbonat, canxi phosphat và các muối khoáng khác trong vỏ

phế thải thủy sản thường được thực hiện trong môi trường acid HCl loãng, ở nhiệt độ

phòng trong thời gian từ 2-3 giờ [113]. Để giảm thiểu những biến đổi của chitin trong

quá trình thu nhận, việc sử dụng của ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) cho DM

hoặc kết hợp DP và DM đã được đề xuất bởi Foster, Hackman (1957) và Austin

(1981) [17, 61].

1.2.3.2. Phương pháp sinh học

+ Nguyên tắc: Sử dụng các enzyme hoặc acid hữu cơ từ visinh vật trong các

bước khử khoáng, khử protein và deacetyl thu nhận chitin và chitosan.

+ Ưu và nhược điểm: Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng enzyme hoặc

vi sinh vật lên men khi để thủy phân, loại protein thì sản phẩm chitin, chitosan thu

được có phân tử lượng lớn và độ nhớt cao hơn so với sản phẩm thu được từ quy trình

xử lý hóa học. Tuy nhiên, các quy trình thủy phân protein bằng enzym hoặc sử dụng

quá trình lên men đều có nhược điểm là không tách triệt để protein, thông thường

lượng protein còn lại trong chitin tương đối cao từ 6-12%. Ngoài ra, chi phí xử lý bằng

enzym thường cao hơn xử lý bằng phương pháp hoá học, quá trình lên men thì cần

nhiều thời gian từ 5-14 ngày. Đây chính là một số khó khăn chính khi triển khai ở quy

mô lớn trong quá trình sản xuất chitin. Tổng hợp các nghiên cứu cho thấy, từ những

năm 1960, một số nghiên cứu đã ứng dụng enzym protease để thủy phân protein trong

phế liệu giáp xác đã được thực hiện bởi Takeda và Abe (1962), Takeda và Katsuura

(1964) [113]. Những năm tiếp theo và gần đây, sử dụng enzyme càng được quan tâm,

thể hiện qua các nghiên cứu của Shimahara và Takiguchi (1988) đã dùng enzym

protease vi sinh vật từ Pseudomonas maltophilia để khử protein trong vỏ tôm, cua.

Enzym proteinase từ cá ngừ tại pH 8,6 và 37,5oC, papain tại pH 5,5 – 6,0 và 37,5oC,

hoặc proteinase vi sinh ở pH 7,0 và 60oC trên 60 giờ cũng đã được nghiên cứu thủy

phân protein trong quá trình sản xuất chitin. Sau khi xử lý với enzym, hàm lượng

protein còn lại trong chitin khoảng 5% [92]. Nellie Gagne và cộng sự (1993) đã dùng

hai enzym protease là chymotrypsin và papain để thủy phân protein trong phế liệu tôm

đã được khử khoáng để thu hồi chitin. Các điều kiện tối ưu cho công đoạn khử protein

bằng chymotrypsin là nhiệt độ trong khoảng 40oC, pH 8,0 và tỷ lệ enzym với phế liệu

tôm (E/W) là 7:1000 (w/w). Với papain, nhiệt độ là 38oC, pH 8,7 và E/W là 10:1000

(w/w). Lượng protein còn lại trong phế liệu tôm sau khi khử protein là khá thấp, cụ thể

là 1,3 và 2,8% đối với các mẫu xử lý chymotripsin và papain [62]. Synowiecki và cộng

sự 2000 dùng enzym alcalase để thủy phân protein từ phế liệu tôm Crangon, thu hồi

được 64,3% protein. Sử dụng protease để thay thế cho NaOH khắc phục được các hạn

chế của việc sử dụng hóa chất [150].

Một số nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm quá trình khử khoáng bằng lên men

lactic hoặc sử dụng các axit hữu cơ như axit lactic, axit acetic thu nhận từ các quá trình

sinh học. Charoenvuttiham và cộng sự 2006 đã sử dụng hỗn hợp axit hữu cơ (0,25M

HCOOH và 0,25M C6H8O7 theo tỷ lệ 1:2, v/v) là 1:28 (w/v) để tách khoáng đạt được

độ tinh sạch của chitin thu được là 88,1 1,8%. Mahmoud và Ghaly (2006) đã dùng

các axit hữu cơ (lactic axit và acetic axit) từ quá trình lên men nước váng sữa để khử

khoáng của vỏ tôm, cua. Kết quả cho thấy hiệu quả của việc dùng lactic axit hoặc axit

acetic để khử khoáng tương đối cao, tuy có thấp hơn khi khử khoáng bằng HCl. Điều

kiện thích hợp để khử khoáng bằng axit hữu cơ: tỷ lệ nguyên liệu và axit là 1:20, nhiệt

độ 24oC, thời gian 2 giờ. Với điều kiện trên, khoáng được khử khỏi vỏ tôm đạt 97,4%

đối với lactic axit , 86,4% đối với axit acetic [65].

Ngoài ra, phương pháp lên men axit lactic là một trong những phương pháp ứng

dụng công nghệ sinh học để sản xuất chitin [82, 129, 131, 162]. Quá trình chiết rút

chitin từ phế liệu tôm dùng vi sinh vật để tạo axit và enzym protease trong các công

đoạn khử khoáng và khử protein từ vỏ tôm. Axit lactic được sinh ra từ glucose, tạo

môi trường pH thấp trong quá trình ủ xilô để ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây

hư hỏng phế liệu [142]. Axit lactic phản ứng với các hợp chất calcium carbonate trong

vỏ giáp xác, hình thành kết tủa calcium lactate, bị loại ra sau khi rửa, giúp loại bỏ

khoáng khỏi vỏ. Quá trình khử protein xảy ra chủ yếu do các enzym protease được tạo

ra từ các chủng vi sinh vật Lactobacillus cấy vào và từ hệ enzym tồn tại trong phế liệu

tôm, cua [26, 46, 142]. Một số loại vi sinh vật đã được nghiên cứu gồm có

Lactobacillus plantarum [130], Pseudomonas aeruginosa và Pseudomonas

maltophilia [162], Bacillus subtilis [171], Lactobacillus paracasei [142],

Lecanicillium fungicola [128] và Penicillium chrysogenum [119].

Hiệu quả của quá trình lên men dùng vi khuẩn sinh axit lactic phụ thuộc vào

những yếu tố như lượng vi sinh vật cho vào, nồng độ glucose bổ sung vào, pH ban đầu

và pH trong quá trình nuôi cấy, nồng độ và loại axit được dùng và thời gian lên men.

Tất cả các yếu tố trên đã được Rao và cộng sự (2000) nghiên cứu trong quá trình sản

xuất chitin bằng phương pháp lên men vi sinh [130]. Kết quả cho thấy, bổ sung 5%

glucose vào phế liệu tôm đã thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn lactic và quá trình lên

men tốt hơn. Trong 4 loại axit dùng để điều chỉnh độ pH từ thời điểm bắt đầu lên men

và trong suốt quá trình lên men, axit acetic và axit citric có hiệu quả nhất. Phế liệu tôm

được lên men với 10% Lactobacillus plantarum cấy vào, bổ sung 5% glucose, pH 6,5

điều chỉnh bằng axit acetic, hiệu suất khử protein là 75%, khử khoáng được 86%. Nếu

thay thế axit acetic bằng axit citric thì hiệu suất khử protein là 88% và khử khoáng là

90%. Trong quá trình lên men này, hiệu suất khử khoáng và chất lượng của các sản

phẩm thu được rất cao và nếu bổ sung protease thương mại có thể nâng cao hiệu suất

khử protein. Sự hiện diện của vi khuẩn axit lactic trong dịch lỏng lên men sau khi lọc

thì rất bổ ích khi sản xuất thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. Do đó, Rao và cộng

sự kết luận rằng xử lý kết hợp Lactobacillus với axit acetic vẫn duy trì được hiệu quả

kinh tế và mang lại lợi nhuận cao từ quá trình lên men phế liệu tôm.

Quá trình deacetyl bằng phương pháp sinh học được nghiên cứu khá nhiều

nhưng chủ yếu thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm [14, 102, 103, 132, 143, 152].

Chitin deacetylase (CDA) thu nhận từ nấm Absidia coerulia được sử dụng để thử

nghiệm deacetyl chitin. Áp dụng enzyme để deacetyl chitin có nhiều ý nghĩa như nâng

cao chất lượng sản phẩm chitosan (đặc biệt là độ nhớt và phân tử lượng), tránh sử

dụng hóa chất đậm đặc (NaOH đặc), hạn chế ô nhiễm môi trường. Các kết quả cho

thấy quá trình deacetyl bằng CDA chủ yếu thực hiện đối với chitin đã deacetyl một

phần (partially deacetylated chitin), còn đối với chitin tự nhiên thì còn quá trình

deacetyl bằng CDA không hiệu quả. Hiệu quả deacetyl của CDA sẽ được tăng lên nếu

chitin được xử lý giảm độ rắn trước khi deacetyl bằng CDA.

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu đã ứng dụng protease (papain, Alcalase,

Protamex, Flavourzyme) để khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu thủy

sản. Điều kiện xử lý khử protein bằng enzyme Flavourzyme. Tuy nhiên, các nghiên

cứu này chỉ mới triển khai ở quy mô phòng thí nghiệm và kết quả nghiên cứu cho thấy

sử dụng enzym không khử triệt để được protein từ phế liệu thủy sản và hàm lượng

protein còn lại ở mẫu chitin khá cao (6-9%). Vì vậy, để triển khai ở quy mô sản xuất

lớn cần nghiên cứu thêm để nâng cao hiệu quả quy trình có sử dụng enzym và thử

nghiệm ở quy mô lớn.

1.2.3.3. Phương pháp cải tiến kết hợp phương pháp hóa học và sinh học

+ Nguyên tắc: Kết hợp sử dụng các acid vô cơ và enzyme hoặc acid hữu cơ từ

visinh vật trong các bước khử khoáng, khử protein và deacetyl thu nhận chitosan.

+ Ưu và nhược điểm: Việc nghiên cứu cải tiến quy trình sản xuất chitin từ phế

liệu thủy sản bằng việc kết hợp xử lý sinh học (dùng protease) và thu hồi hỗn hợp

protein và astaxanthin là rất cần thiết, góp phần hình thành và phát triển ngành công

nghiệp xử lý phế liệu thủy sản theo hướng bền vững, giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

Một số nghiên cứu đã công bố:

Shrinivas Rao và cộng sự (2007) đã sản xuất chitin bằng phương pháp cải tiến,

sản phẩm chitin thu được có chất lượng cao hơn so với phương pháp hóa học, thể hiện

qua hàm lượng protein và tro còn lại dưới 1%, thấp hơn rất nhiều so với mẫu chitin sản

xuất bằng phương pháp hóa học. Với hàm lượng protein và khoáng còn lại trong mẫu

chitin thấp <1%, chitin sản xuất theo quy trình cải tiến đã đáp ứng được yêu cầu chất

lượng của chitin công nghiệp [144]. Chitosan sản xuất bằng quy trình cải tiến có các

chỉ tiêu chất lượng tốt hơn so với mẫu chitosan sản xuất từ chitin của quy trình hóa học

truyền thống; cụ thể chitosan từ chitin của quy trình cải tiến có hàm lượng protein và

tro thấp hơn, độ tan tốt hơn và độ đục thấp so, đặc biệt độ nhớt của mẫu chitosan sản

xuất bằng quy trình cải tiến cao hơn rất nhiều so với mẫu chitosan sản xuất bằng

phương pháp hóa học. Độ nhớt của chitosan khi sử dụng enzyme để khử protein trong

quá trình sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản cũng đạt được khi sử dụng papain [2, 5].

Dựa trên các nghiên cứu trước đây và mục tiêu nghiên cứu của đề tài nhằm ứng

dụng vào sản xuất ở qui mô công nghiệp và phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt Nam

hiện nay, nghiên cứu này chọn phương pháp hóa học để thu nhận chitin và chitosan.

Để lựa chọn điều kiện thu nhận phù hợp với đối tượng mai mực, luận án tiến hành

phân tích các kết quả nghiên cứu công bố liên quan, bao gồm:

1.2.3.1. Điều kiện khử protein

Như đã trình bày ở trên, hàm lượng protein khá cao có trong tất cả các nguyên

liệu sử dụng để thu nhận chitin. Hơn nữa, liên kết cộng hóa trị giữa chitin và protein

(Hình 1.3) là rất chặt chẽ. Do đó, để thu nhận được chitin thì phải tiến hành khử

protein bằng cách phá vỡ các liên kết giữa protein và chitin. Quá trình khử này có thể

thực hiện với các hóa chất khác nhau như NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3,

Ca(OH)2 hoặc các enzyme thủy protein như chymotrypsin, alcalase và flavourzyme [3].

Tuy nhiên, trong thực tế NaOH là được sử dụng nhiều nhất với nồng độ dung dịch từ 1

đến 10% ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ cao, có khi sử dụng áp suất và nhiệt độ lên đến

120C, thời gian xử lý từ vài giờ đến vài ngày. Tùy theo tính chất của nguyên liệu mà

chúng ta có thể chọn chế độ để khử protein phù hợp. Các thông số có ảnh hưởng chủ

yếu đến điều kiện tách chiết thu nhận chitin bao gồm: Nồng độ dung dịch tác nhân khử

(ví dụ NaOH), nhiệt độ phản ứng, thời gian thủy phân và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi.

Một số điều kiện khử protein từ các nguồn nguyên liệu khác nhau được trình bày trong

Bảng 1.7.

Bảng 1.7. Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguyên

liệu khác nhau

Nguồn NaOH Nhiệt độ Thời gian Tỷ lệ TLTK

(oC) (giờ) NL/DM

Vỏ tôm 4% 70 24 1/10 [120]

Vỏ tôm đỏ 10% 75 2 1/5 [37]

Vỏ tôm sú 6% 70 3 1/10 [12]

Mai mực 3M 80-85 3 1/10 [106]

Mai mực 1,2% 80-85 1 1/10 [154]

Mai mực 1M 50 5 1/13 [36]

Vỏ tôm tít 4% 70 12 1/10 [153]

Mai mực 1,2% 80-85 1 1/10 [95]

Mai mực 1N 30 24 1/5 [23]

Nồng độ chất thủy phân (NaOH) sử dụng ảnh hưởng đến chất lượng chitin và

chitosan thu được, nồng độ NaOH cao thì hiệu quả thủy phân protein cao, thời gian

phản ứng rút ngắn và hàm lượng protein còn lại trong sản phẩm chitin thấp. Tuy nhiên,

khi sử dụng nồng độ chất thủy phân cao gây ra hiện tượng cắt mạch sản phẩm chitin.

Thông thường nồng độ kiềm sử dụng là 3-5% tùy theo tính chất của nguyên liệu. Để

đáp ứng yêu cầu chất lượng của chitosan công nghiệp thì hàm lượng protein còn lại

trong sản phẩm chitin phải nhỏ hơn 1%.

Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong quá trình khử protein, ở nhiệt độ thường

quá trình tách protein diễn ra chậm, thời gian thủy phân từ 1 ngày đến vài ngày. Khi

nâng nhiệt độ xử lý thì thời gian cần thiết để tách protein giảm đáng kể. Để tăng hiệu

quả tách protein, trong nhiều nghiên cứu quá trình tách protein được lập lại nhiều lần.

Tuy nhiên, cần phải lưu ý là sử dụng nhiệt độ cao hoặc thời gian xử lý dài sẽ dẫn đến

quá trình cắt mạch của sản phẩm chitin thu được.

Ngoài ra, để tăng cường hiệu quả của quá trình tách protein thì trong quá trình xử

lý cần thực hiện khuấy đảo. Hơn nữa, kích thước của nguyên liệu cũng ảnh hưởng đến

hiệu quả tách protein, do đó trong rất nhiều qui trình sản xuất chitin, phế liệu được

nghiền nhỏ đến kích thước từ 2-5 mm.

Do độ kết tinh của β-chitin thấp hơn -chitin nên khả năng hấp thụ nước lên

mạng lưới polyme của mai mực tốt hơn so với vỏ tôm. Vì vậy, khi sử dụng cùng điều

kiện khử protein thì hiệu quả của quá trình thu nhận β-chitin sẽ cao hơn, đồng thời sản

phẩm chitin thu được sẽ có độ tinh khiết cao hơn.

1.2.3.2. Điều kiện khử khoáng

Các phế liệu như vỏ tôm, cua và ghẹ thường chứa một lượng khoáng khá cao,

chủ yếu là muối canxi cacbonat và canxi photphat [2, 3, 158]. Vì vậy, một trong những

công đoạn quan trọng trong qui trình sản xuất chitin từ các nguồn này là công đoạn

khử khoáng. Quá trình khử khoáng có thể thực hiện bằng cách xử lý với các acid vô cơ

(HCl, HNO3, H2SO4) hay các acid hữu cơ (acid formic, acid acetic và acid lactic, EDTA)

hoặc bằng các enzyme đặc hiệu. Tuy nhiên, thông thường quá trình khử khoáng được

thực hiện trong dung dịch HCl loãng ở nhiệt độ phòng theo phản ứng sau:

CaCO3 + 2HCl  CO2 + CaCl2 + H2O

Tương tự như quá trình khử protein, theo các công trình nghiên cứu đã công bố,

chế độ khử khoáng cũng rất đa dạng, nồng độ HCl từ 0,5 N đến 2 N, nhiệt độ từ thấp

đến nhiệt độ phòng. Thời gian từ 0,5 giờ đến 48 giờ tùy theo từng đối tượng nguyên

liệu cụ thể.

Theo các kết quả đã công bố, tốc độ phản ứng của quá trình khử khoáng diễn ra

rất nhanh ở thời gian đầu (trong vòng 30 phút) với hàm lượng khoáng giảm đến 90%,

sau đó quá trình diễn ra rất chậm. Kết quả tương tự cũng được ghi nhận trong nghiên

cứu của No và cộng sự (1989) và Percot và cộng sự (2003) [114, 120]. Theo kết quả

nghiên cứu của Percot, sau 30 giây 98% lượng acid HCl cho vào đã phản ứng, thể hiện

quá trình khử khoáng diễn ra rất nhanh ở giai đoạn đầu. Ngoài ra, khi thực hiện công

đoạn khử khoáng cần lưu ý đến tỷ lệ giữa nguyên liệu/dd acid vì nó ảnh hưởng quyết

định đến hiệu quả khử khoáng. Tỷ lệ nguyên liệu trên dung dịch acid tương ứng 1:15

là tốt nhất khi nồng độ acid sử dụng là 4%. Trong quá trình xử lý acid (khử khoáng)

thường thực hiện ở nhiệt độ thường, kết hợp với khuấy đảo, quá trình này chưa đạt nếu

vỏ còn cứng và không thấy bọt khí nổi lên, cần bổ sung thêm acid.

Trong quá trình khử khoáng có thể xảy ra quá trình cắt mạch chitin, đặc biệt nếu

tiến hành ở nồng độ acid và nhiệt độ cao. Do đó, quá trình khử khoáng chỉ thực hiện ở

nhiệt độ thường hoặc nhiệt độ thấp để hạn chế quá trình cắt mạch polyme. Ngoài ra,

người ta có thể sử dụng EDTA để khử khoáng mà không ảnh hưởng nhiều đến mạch

chitin. Tuy nhiên, việc ứng dụng EDTA để khử khoáng chỉ được thử nghiệm ở quy mô

nhỏ, chưa được áp dụng trên quy mô công nghiệp vì EDTA là một hóa chất tương đối

đắt tiền so với HCl.

Gần đây, một số nghiên cứu đã ứng dụng các acid hữu cơ để tách khoáng như

acid formic, acid acetic và acid lactic. Ở các nghiên cứu này, nồng độ acid sử dụng từ

khoảng dưới 1 M đối với acid formic và acid lactic. Có thể sử dụng các acid này xử lý riêng

hoặc kết hợp. Phương pháp sử dụng acid hữu cơ có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp

sử dụng acid vô cơ như sản phẩm chitin và chitosan thu được có phẩn tử lượng lớn, độ tinh

khiết cao và đây là phương pháp khử khoáng thân thiện hơn với môi trường.

Bảng 1.8. Nguồn nguyên liệu thủy sản, điều kiện xử lý và loại chitin [133, 144, 153]

Nguồn nguyên liệu Loại chitin Số lần xử lý HCl 0,55M Số lần xử lý NaOH 0,3 M Tỷ lệ thu nhận/phế liệu (%) Khử màu H2O2

Cua đỏ (Portunus puber) 3 Có 10 α 5

Cua Nhện (Maia squinado) 3 Có 16 α 3

Tôm Hùm (Homarus vulgaris) 3 Có 17 α 3

Tôm Hùm (Scyllarus arctus) 3 Có 25 α 2

Tôm Sú (Penaeus monodon) 1 (4%) 1(4%) 14-16 Có α

Tôm (Palaemon fabricius) 3 Có 22 α 3

Tôm bọ ngựa (Squilla mantis) 3 Có 24 α 3

Mực (Loligo vulgaris) Không 2 40 β 3

Trong sản xuất chitin, việc thực hiện công đoạn khử khoáng sau khi tách protein

thì sản phẩm chitin cuối cùng sẽ có hàm lượng khoáng còn lại thấp hơn so với sản

phẩm chitin trong qui trình bắt đầu bằng công đoạn tách khoáng trước. Điều này có thể

giải thích là acid HCl sẽ có tác dụng tốt hơn đối với mẫu phế liệu đã qua công đoạn

tách protein, HCl sẽ tiếp xúc tốt hơn với các thành phần khoáng có trong phế liệu, hòa

tan vào trong dung dịch. Tuy nhiên, theo Lertsutthiwong và cộng sự (2002) [97] sản

phẩm chitosan sản xuất từ chitin của qui trình bắt đầu bằng công đoạn khử khoáng sau

đó khử protein có độ nhớt cao hơn. Ngoài ra, để nâng cao chất lượng chitin, người ta

có thể tiến hành khử khoáng nhiều lần với nồng độ acid xử lý thấp. Để xác định chế độ

xử lý khử khoáng phù hợp có thể dùng phương pháp thực nghiệm, kết hợp với tính

toán dựa trên phương trình phản ứng hóa học. Sau công đoạn khử protein và khoáng,

phế liệu được rửa sạch và chuyển sang công đoạn tẩy màu hoặc tiếp tục công đoạn

deacetyl. Bảng 1.8 tổng hợp một số kết quả nghiên cứu về điều kiện thu nhận chitin từ

các nguồn nguyên liệu khác nhau.

1.2.3.3. Điều kiện deacetyl thu nhận chitosan

Quá trình sản xuất chitosan từ chitin được thực hiện bởi công đoạn deacetyl, đây

là quá trình tách nhóm acetyl khỏi phân tử chitin, theo mô tả trong Hình 1.14. Tác

nhân deacetyl có thể là các bazơ mạnh như NaOH và KOH hoặc các enzyme như

chitinase. Trong thực tế, quá trình deacetyl thường được thực hiện bằng cách xử lý

chitin trong dung dịch NaOH hoặc KOH đậm đặc, nồng độ thường sử dụng từ 40-

50%, ở nhiệt độ 100C hoặc cao hơn. Công đoạn deacetyl được thực hiện ở các chế độ

rất đa dạng, phong phú, tùy thuộc vào nguồn chitin và yêu cầu về tính chất của sản

phẩm chitosan.

Hình 1.14. Phản ứng deacetyl chitin thu chitosan.

Ngoài ra, người ta có thể sử dụng acid đặc để thực hiện quá trình deacetyl. Tuy

nhiên, việc xử lý bằng acid đặc thường kèm theo quá trình cắt mạch của polyme, do đó

thực hiện deacetyl trong môi trường kiềm đặc vẫn là phương pháp thường được sử dụng.

Hiệu quả của quá trình deacetyl phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ dung

dịch NaOH, nhiệt độ và thời gian, tổng hợp một số kết quả công bố điều kiện deacetyl

trên các nguồn nguyên liệu khác nhau được trình bày trong Bảng 1.9 [3]. Trong đó, nồng

độ NaOH thường trong khoảng từ 40-60%. Nhiệt độ thường khoảng 90-100oC. Khi nhiệt

độ càng cao thì quá trình deacetyl diễn ra càng nhanh, sản phẩm chitosan thu được có độ

deacetyl cao. Tuy nhiên, nhiệt độ cao ảnh hưởng lớn đến phân tử lượng của chitosan.

Bảng 1.9. Điều kiện deacetyl thu nhận chitosan từ các nguồn chitin khác nhau [3]

Điều kiện deacetyl

Nguồn chitin Thời gian Tỷ lệ Nồng độ kiềm Nhiệt độ (oC) (h) (w/ v)

Tôm hùm 55% KOH 100 – 140 0,5 – 1,5 1:100

47% NaOH 60, 110 1,2x1 – 4 - Cua 40% NaOH 10 -

50% NaOH 100 0,5 – 5 -

50% NaOH 145 – 150 1/12, 1/4 1:10

50% NaOH 60 2 1:4 Tôm sú 50% NaOH 100 0,5x2 1:15

50% NaOH 100 0,75x2 1:15

50% NaOH 95 3 -

50% NaOH 30 24 – 144 1:14

Tôm thẻ 60% KOH 100 1 1:65

50% NaOH 100 2 -

Theo Kiruta (2001) [91] và Jung (2013) [79] khi thực hiện deacetyl với nồng độ

50% NaOH ở nhiệt độ 100oC quá trình deacetyl diễn ra nhanh trong khoảng thời gian

1 giờ đầu, độ deacetyl đạt được 68%. Sau đó, quá trình deacetyl diễn ra chậm lại và

sau 5 giờ tiếp theo sản phẩm chitosan thu được chỉ đạt được 78% DD. Kết quả của

nghiên cứu này cũng cho thấy, sau 2 giờ xử lý độ deacetyl không thay đổi nhiều so với

1 giờ mà chỉ có phân tử lượng của chitosan xử lý sau 2 giờ giảm đáng kể, điều đó cho

thấy, từ sau 1 giờ đến hết 2 giờ, chủ yếu diễn ra quá trình cắt mạch chitosan. Ngoài ra,

nồng độ kiềm cũng ảnh hưởng đến chất lượng chitosan. Nếu nồng độ kiềm quá cao thì

sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt và phân tử lượng của chitosan. Tuy nhiên, nếu nồng độ

kiềm xử lý nhẹ dẫn đến sản phẩm chitosan sẽ không tan hoặc tan không hoàn toàn. Tỷ

lệ giữa chitin và dung dịch kiềm thường dùng là 1:10, trong một số nghiên cứu sử

dụng tỷ lệ 1:15.

Mặt khác, nếu chitin ban đầu không được chiết rút trong điều kiện phù hợp như

xử lý tách khoáng ở nồng độ acid HCl quá cao, thời gian dài thì chitin bị cắt mạch dẫn

đến sau quá trình deacetyl chitosan thu được có phân tử lượng và độ nhớt thấp. Kích

thước của chitin ban đầu càng nhỏ thì quá trình deacetyl hóa diễn ra nhanh và sản

phẩm chitosan thu được có chất lượng cao hơn (độ nhớt, phân tử lượng, độ tan tốt

hơn). Để hạn chế sự cắt mạch chitin trong quá trình deacetyl hóa, người ta thực hiện

công đoạn này trong môi trường khí nitơ để hạn chế sự tiếp xúc với oxy không khí.

Kết quả nghiên cứu của Bough và cộng sự 1978 khẳng định khi deacetyl hóa trong

môi trường khí nitơ thì tạo ra sản phẩm chitosan có phân tử lượng và độ nhớt cao hơn

sản phẩm chitosan được deacetyl hóa trong môi trường không khí [28].

Các kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng, để đạt được độ deacetyl cao trên

90% thì cần thực hiện quá trình deacetyl nhiều lần [79, 93, 173]. Kết quả nghiên cứu

của Jung 2013 cho thấy muốn thu được chitosan thành phẩm đạt độ deacetyl trên 94%

thì cần phải thực hiện công đoạn deacetyl ở nồng độ kiềm (NaOH, KOH) 40-50%,

nhiệt độ 90oC và xử lý 2 lần từ 4-6 giờ. Thực hiện quá trình deacetyl một lần khó đạt

được độ deacetyl cao trên 90% vì giai đoạn cuối của quá trình deacetyl tốc độ tách

nhóm acetyl diễn ra rất chậm. Tuy nhiên, sau khi rửa sạch mẫu và tiếp tục deacetyl thì

quá trình deacetyl diễn ra nhanh hơn và đạt được độ deacetyl cao. Bảng 1.10 trình bày

sự ảnh hưởng của điều kiện của quá trình deacetyl đến khối lượng phân tử của sản

phẩm chitosan thu được.

Bảng 1.10. Khối lượng phân tử trung bình (Mw) của chitosan ở các điều kiện

deacetyl khác nhau [106]

Điều kiện xử lý Phân tử lượng *102 (kDa)

NaOH 40%, 80oC, 120 phút 8,74

NaOH 40%, 100oC, 60 phút 4,58

NaOH 60%, 80oC, 60 phút 10,9

NaOH 60%, 80oC, 120 phút 8,87

NaOH 60%, 100oC, 60 phút 4,53

NaOH 60%, 100oC, 120 phút 3,22

Tuy nhiên, cần phải lưu ý là chế độ deacetyl ảnh hưởng lớn đến phân tử lượng và

độ nhớt của sản phẩm chitosan, chế độ deacetyl càng cao (nồng độ NaOH cao, nhiệt độ

cao, thời gian dài) thì chitosan thu được có phân tử lượng thấp. Do đó, để đạt được độ

nhớt cao, phân tử lượng lớn thì thực hiện quá trình deacetyl ở chế độ phù hợp, không

nên sử dụng nồng độ NaOH quá cao, nhiệt độ quá cao.

1.2.4. Đặc tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan

Các kết quả công bố của Campana-Fillho (2007) và Kumirska (2010) cho thất

hoạt tính sinh học của chitosan từ -chitin và chitosan từ α-chitin có sự khác nhau là

do nhiều nguyên nhân. Đầu tiên là do nguồn gốc thu nhận khác nhau -chitin từ mai

+) trong mạch chitosan hòa tan

mực và α-chitin từ vỏ tôm cua ghẹ [10, 34, 90]. Thứ hai là do cấu trúc nội bộ liên phân

tử như sự tương tác giữa các nhóm amin proton (NH3

trong môi trường acid làm thay đổi khả năng tương tác của chitosan với màng tế bào vi

khuẩn do đó ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan [159].

Chitosan có khả năng ức chế nhiều chủng vi sinh vật như vi khuẩn Gram âm,

Gram dương và vi nấm. Khả năng ức chế vi sinh vật của chitosan phụ thuộc vào độ

deacetyl (DD) và phân tử lượng trung bình (Mw) [44, 99, 105, 148, 175]. So với chitin,

chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt hơn vì chitosan tích điện dương ở vị

trí C thứ 2, ở pH nhỏ hơn 6. Chitosan có độ deacetyl cao trên 85% thì có khả năng

kháng kháng khuẩn, kháng nấm tốt. Chitosan có phân tử lượng dưới 2000 dalton thì

khả năng ức chế vi sinh vật cao, chitosan có phân tử lượng trên 9000 dalton thì có khả

năng ức chế vi sinh vật kém [20, 79, 100, 165, 173].

Chitosan được hòa tan trong các dung môi hữu cơ như acid acetic, acid lactic và

được sử dụng để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm. Chitosan có khả năng ức chế

Staphylococcus aureus [98], Bacillus cereus [148], Escherichia coli và Listeria

monocytogenes [100, 148, 173], Botrytis cinerea [20], Bacillus cereus và Bacillus

subtilis [148], Alternaria kikuchiana Tanaka và Physalospora piricola Nose [105],

Penicillium digitatum, Penicillium italicum, Botrydiplodia lecanidion và Botrytis

cinerea [41]. Nồng độ ức chế của chitosan phụ thuộc vào loại chitosan, loài vi sinh

vật, điều kiện áp dụng và nồng độ thường sử dụng trong khoảng 0,0075% đến 1,5%.

Ngoài ra, các dẫn xuất của chitosan cũng có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn tốt. N-

carboxymethylchitosan ở nồng độ 0,1-5 mg/ml trong môi trường pH = 5,4 làm giảm

khả năng sinh độc tố aflatoxin của Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus

Shahidi và cộng sự 1999 [140].

Theo Wang (1992) nhận thấy rằng nồng độ chitosan cao (1% - 1,5%) sẽ bất hoạt

hoàn toàn sự phát triển của Staphylococcus aureus sau thời gian ủ 2 ngày, trong môi

trường pH 5,5 [161]. Ngoài ra, tác giả Chung (2005) đã nghiên cứu thấy rằng nồng độ

chitosan lớn hơn 0,005% có khả năng ức chế hoàn toàn Staphylococcus aureus [45].

Kết quả này phù hợp với kết quả của nhóm tác giả Darmadji và Izumimoto (1994) khi

khảo sát sự ảnh hưởng của chitosan lên quá trình bảo quản thịt [52]. Rabea và cộng sự

(2003) [125] cũng nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn của các loại môi trường nuôi cấy

vi khuẩn với các nồng độ chitosan khác nhau, kết quả nhận thấy đối với Bacillus

cereus thì nồng độ chitosan ức chế là 0,02%, còn đối với Escherichia coli và Proteus

vulgaris phát triển rất yếu ở nồng độ chitosan là 0,005% và hoàn toàn ức chế ở

0,0075%.

Hiệu quả ức chế Escherichia coli của chitosan đã được nghiên cứu và công bố rất

nhiều. Wang và cộng sự 2009 đã nghiên cứu thấy rằng Escherichia coli bị kìm hãm

hoàn toàn sau 2 ngày nuôi cấy với nồng độ chitosan 0,5% và 1% ở pH 5,5 và với nồng

độ chitosan cao hơn 1% thì vi khuẩn sẽ bị kìm hãm hoàn toàn chỉ trong 1 ngày [163].

Trong khi đó, Darmadji và Izumimoto (1994) [52] cho rằng khi sử dụng chitosan ở

nồng độ cao hơn 0,1% mới có khả năng kìm hãm sự phát triển của Escherichia coli.

Simpson và cộng sự lại cho rằng chỉ cần nồng độ chitosan 0,0075% cũng đã có khả

năng kìm hãm sự phát triển của Escherichia coli. Các kết quả khác nhau như vậy có

thể giải thích là do bản thân chitosan ban đầu được sử dụng của các nhóm nghiên cứu

có độ deacetyl hóa (DD) và khối lượng phân tử trung bình (Mw) không giống nhau. Độ

deacetyl và phân tử lượng của chitosan lại ảnh hưởng rất lớn đến khả năng kháng

khuẩn của nó.

No 2002, Zheng (2003) và Jung (2010) [78, 115, 175] đã nghiên cứu ảnh hưởng

của các phân tử lượng Mw khác nhau của chitosan và oligo chitosan đến khả năng

kháng khuẩn trên nhiều loại vi khuẩn Gram dương và Gram âm, kết quả thấy rằng khối

lượng phân tử của chitosan càng thấp thì chitosan có khả năng kháng khuẩn càng cao.

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan mạnh hơn ở vi khuẩn Gram âm hơn là vi khuẩn

Gram dương. Chỉ số nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) của chitosan biến động

trong khoảng 0,05-1% tùy thuộc vào khối lượng phân tử và loại vi khuẩn. No cũng

khẳng định rằng hoạt tính kháng khuẩn của chitosan thể hiện tốt hơn ở môi trường pH

thấp.

Tính kháng khuẩn của chitosan liên quan đến pH của môi trường và các yếu tố

khác trong môi trường, nhưng trước hết liên quan đến các đặc tính của chitosan như độ

deacetyl, chiều dài mạch hay khối lượng phân tử trung bình (mức độ polyme hóa),...

Như vậy, việc chọn loại chitosan có hoạt tính kháng khuẩn tốt là quan trọng trước khi

chúng ta tìm hiểu các yếu tố tác động khác có trong vật liệu và điều kiện ảnh hưởng

đến hoạt tính kháng khuẩn của chitosan. Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan có hiệu

quả trong việc ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, khả năng kháng khuẩn của

chitosan phụ thuộc vào khối lượng phân tử, nồng độ, độ nhớt, loại vi khuẩn. Với 0,1%

chitosan có phân tử lượng 746 kDa có hiệu quả cao trong kháng Escherichia coli.

Ngoài ra chitosan có khối lượng phân tử 40 kDa có khả năng ức chế vi khuẩn

Staphylococcus aureus và Escherichia coli ở nồng độ 0,5%.

Hiện tại một số cơ chế đã được đề xuất để quan sát đặc tính kháng vi khuẩn của

chitosan và các dẫn xuất. Cơ chế được chấp nhận phổ biến nhất giải thích rằng vách tế

bào vi khuẩn tích điện âm dễ dàng phản ứng với phân tử chitosan tích điện dương, làm

biến đổi tính thấm tế bào, làm biến dạng và tổn thương màng tế bào. Hiệu ứng này

tăng theo thời gian dẫn đến phá hũy lớp màng ngoài (outer membrane), lớp

peptidoglycan và lớp màng sinh chất (plasma membrane) của màng tế bào vi khuẩn

Gram âm từ đó làm thoát ra các dịch nội bào (ví dụ như : protein, nucleicaxit, glucose

và dehydrogenase lactate) làm chết tế bào vi khuẩn. Quá trình tác động này thường

diễn ra rất nhanh (trong vài giờ). Thêm vào đó, chitosan có khả năng phân giải sinh

học và không gây độc đối với tế bào động vật hữu nhũ. Phổ kháng khuẩn của chúng

rộng, bao gồm cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Tuy nhiên, cần chú ý là khả

năng tuyệt vời này bị hạn chế do tính tan hạn chế của chitosan (không tan trong môi

trường pH > 7,0). Bên cạnh đó, độ nhớt cao của dung dịch chitosan cũng là một trở

ngại, gây kết tụ protein ở điều kiện pH sinh lý.

1.3. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH

1.3.1. Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu cà chua sau thu hoạch

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) thuộc họ Cà Solanaceae, chi

Lycopersicon là loại quả phổ biến được tiêu dùng rộng rãi với số lượng lớn. Ngoài giá

trị kinh tế, cà chua và các sản phẩm chế biến từ cà chua còn là nguồn dinh dưỡng giàu

acid folic, vitamin C, kali, và quan trọng hơn là hợp chất carotenoid (tiền vitamin A có

hoạt tính kháng oxy hóa), trong đó có mặt nhiều nhất là lycopene, sau đó là β-carotene,

γ-carotene và phytoene [118, 124].

Mặc dù hiện nay đã có nhiều sự phát triển về loại giống có chất lượng tốt, thời

hạn bảo quản dài, cũng như sự cải tiến về công nghệ bảo quản sau thu hoạch, nhưng ở

các nước đang phát triển như Lào, Việt Nam và Campuchia tổn thất nông sản sau thu

hoạch là rất lớn do nhiều nguyên nhân như: thu hoạch không đúng thời điểm, kỹ thuật

thu hoạch, xử lý và bảo quản không đúng cách, bao gói và hệ thống vận chuyển kém,

thiếu các kho bảo quản, thiếu kỹ thuật chế biến nên tỷ lệ thối hỏng và tổn thương cơ

học cao. Bốn yếu tố chính được quan tâm trong và ngay sau khi thu hoạch cà chua là

độ chín thu hoạch, thời gian thu hoạch, phương pháp thu hoạch và xử lý trái đã thu

hoạch tại ruộng. Bất kỳ sự thiếu sót nào đối với những yếu tố này đều dẫn đến giảm

chất lượng trái, thậm chí là tổn thất hoàn toàn.

Cà chua được thu hoạch khi trái đã thuần thục về mặt sinh lý, vỏ còn xanh hoặc

ngả màu, hoặc chín hoàn toàn tùy vào mục đích sử dụng. Đối với những thị trường ở

xa hoặc đòi hỏi thời gian tồn trữ lâu, cà chua được thu hoạch khi còn xanh hoặc ửng

đỏ (đang chuyển màu). Cà chua là loại trái hô hấp đột biến, nghĩa là trái cà chua khi

thu hoạch đã thuần thục nhưng còn màu xanh nên có thể chín tiếp tự nhiên và có thể

đạt đến chất lượng tối ưu. Ngược lại, quả non sẽ không đạt được màu sắc và hương

thơm tốt, và sẽ dễ dàng bị hư hỏng sau thu hoạch [118]. Khi thu hoạch không cần thiết

phải loại đi phần cuống nhỏ, làm lộ ra phần cuối cuống, đây là nơi trao đổi khí chủ yếu

của trái, làm thoát hơi nước, gây mất nước và giảm khối lượng, là lối vào của O2 và lối

ra của CO2 vì thế làm tăng cường độ hô hấp và các hoạt động trao đổi chất khác. Một

việc khác cần lưu ý khi thu hoạch là tránh những thao tác làm tổn thương vật lý như

các vết cắt, lỗ thủng hoặc vết trầy xước. Ngoài việc ảnh hưởng đến chất lượng cảm

quan, các tổn thương vật lý còn làm tăng sự mất nước và tốc độ chín, và dẫn đường

cho vi sinh vật xâm hại.

Suslow (2005) [149] đã đưa ra chỉ số chất lượng tiêu chuẩn phân loại và tuyển

chọn cho các giống cà chua khác nhau, trước hết là dựa trên sự tương đồng về hình

dáng và không có khuyết tật, hư hỏng. Kích cỡ không phải là yếu tố để tuyển chọn

chất lượng nhưng ảnh hưởng nhiều đến chất lượng về mặt thương phẩm. Các chỉ số

chất lượng này như sau:

+ Hình dạng: có cùng một kiểu hình dạng (hình tròn, hình cầu, hình cầu dẹt).

+ Màu sắc tương đồng: từ đỏ cam đến đỏ đậm, vàng nhạt.

+ Biểu hiện bên ngoài: Trơn mịn, sẹo cuống nhỏ, không có các vết rạn nứt, rám

nắng, vết thương do côn trùng, vết thương cơ giới, hoặc vết bầm tím.

+ Độ cứng: Chịu được áp lực. Không bị biến dạng do chín nẫu.

Tiêu thụ sản phẩm, đây là khâu quan trọng cuối cùng của hoạt động sau thu

hoạch giữa người sản xuất hoặc người vận chuyển với người mua hoặc người tiêu

dùng. Những hoạt động xử lý sau thu hoạch quyết định chất lượng cuối cùng của sản

phẩm cung cấp cho người tiêu dùng chất lượng tốt nhất có thể. Sản phẩm phải có bề

ngoài hấp dẫn như tươi, không bị khuyết tật, chất lượng cao. Cần có những xử lý thích

hợp, không chỉ quan tâm đến riêng sản phẩm mà còn phải chú ý đến thao tác của

người xử lý.

1.3.2. Tổng quan về bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại cà chua sau thu hoạch

Theo Wakil và Sherifah Monilola (2011) [160] đã khảo sát cho thấy bệnh thối

nhũn (soft rot) do vi khuẩn gây hại trên các loại rau củ quả như carot, cà chua, hành

tây và khoai tây sau thu hoạch tại các chợ làm thất thoát từ 10-30% tổng sản lượng.

Nghiên cứu cũng cho thấy sự đa dạng các vi khuẩn gây bệnh thối nhũn, trong đó có 76

loài thuộc 3 chi: Erwinia, Pseudomonas và Xanthomonas, trong đó Erwinia spp. là chi

có tần suất xuất hiện rất cao 64,48% chủ yếu là các chủng Erwinia carotovora

(27,63%), Erwinia herbicola (11,84%), Erwinia chrysanthemi (10,4%), Erwinia

artroseptica (9,1%) và Erwinia amylovora (5,3%).

Hình 1.15. Cà chua bị bệnh thối nhũn (soft rot).

Bệnh chủ yếu do vi khuẩn Erwinia spp. gây thối nhũn trên các loại rau, củ, quả

sau thu hoạch, bệnh phát triển thích hợp ở nhiệt độ (25-35°C) trong điều kiện ẩm ướt

[66, 77]. Trên cà chua, vi khuẩn thâm nhập qua các tế bào bị tổn thương và phát triển

vết bệnh nhanh chóng cả về đường kính và chiều sâu, các khu vực bị ảnh hưởng trở

nên nhũn mềm và chảy nước trong khi bề mặt vết bệnh trở nên đổi màu, có thể xuất

hiện nếp nhăn hoặc phồng rộp. Biên độ gây tổn thương thường là chậm lúc đầu nhưng

sau đó trở nên rất nhanh, các mô trong khu vực bị ảnh hưởng bị phân hủy chảy nước,

các vết nứt phát triển và bề mặt vết bệnh trở nên nhầy nhụa, kèm theo mùi hôi hoặc

mùi lưu huỳnh đó là đặc trưng của bệnh. Trường hợp tiếp xúc với không khí vết bệnh

có thể chuyển sang màu xám hoặc màu nâu sẫm (Hình 1.15).

Hiện nay để kiểm soát bệnh thối nhũn trên rau củ quả sau thu hoạch, ngoài các

biện pháp bảo quản sau thu hoạch, kiểm soát dịch hại thì yêu cầu kỹ thuật xử lý phải

tránh việc sử dụng thuốc trừ sâu tổng hợp theo định hướng sinh thái để phát triển nền

nông nghiệp bền vững [72]. Theo Okonkwo (1995) và Bartz (1981) kiểm soát một

phần sự phát triển của bệnh là có thể bằng cách tránh làm bị thương củ, quả và rễ cây

trồng trong quá trình chăm sóc, làm cỏ, thu hoạch, vận chuyển và lưu trữ [22, 116].

Rahman 1991 đã cho thấy lưu trữ trong điều kiện khô mát là phương pháp hiệu quả

được nhiều nhà nghiên cứu đề nghị sử dụng để hạn chế bệnh thối nhũn do vi khuẩn

[127].

Việc sử dụng các hóa chất như thủy ngân clorua, dung dịch formaldehyde, dung

dịch natri hypoclorit 1,2%, hydroxymercurinitrophenol 12% và hydromercurichloride

phenol 2% trong 37,51 lít nước dường như loại bỏ các tác nhân gây bệnh thối nhũn từ

bề mặt của củ, quả sau thu hoạch [145]. Ngoài ra việc sử dụng kỹ thuật di truyền để

kiểm soát bệnh sau thu hoạch vẫn còn ở giai đoạn thử nghiệm mặc dù bước đầu đã có

một số kết quả nghiên cứu được báo cáo. Một số protein và peptide với hoạt tính

kháng khuẩn đã được thử nghiệm làm tăng khả năng phòng thủ của cơ thể gọi là quá

trình kích kháng, làm tăng cường khả năng chống vi khuẩn trong cây chuyển các gen

mã hóa một số loại protein và peptide, tuy nhiên công nghệ thực hiện các phương pháp

di truyền cao và tốn kém, vượt ra ngoài tầm với của nông dân trung bình [30, 35, 75],

[15]. Hiện nay chưa có biện pháp hiệu quả để kiểm soát bệnh thối nhũn do vi khuẩn

gây ra trên rau củ quả sau thu hoạch do khả năng dễ bị lây nhiễm bởi các tác nhân gây

bệnh [29, 139].

1.3.3. Giới thiệu về chủng vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối nhũn

Chi Erwinia spp. thuộc họ Enterobacteria là dòng vi khuẩn yếm khí tuỳ ý gây

bệnh thối nhũn (soft rot) trên nhiều loại cây trồng và rau, củ, quả sau thu hoạch như

khoai tây, cà chua, cải bắp, dứa, ớt, cà rốt, hành tây, súp lơ, hướng dương, cây xương

rồng và trên cây thuốc lá [19, 9]. Như các chi khác thuộc họ Enterobacteria, chi

Erwinia spp. là dòng vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, hình que, có thể di chuyển

bằng các tiêm mao [77, 145] và là dạng vi khuẩn gây bệnh cơ hội có phổ ký chủ rất

rộng và khả năng lây nhiễm rất mạnh khi ở môi trường cận nhiệt đới và ôn đới [155].

Các nghiên cứu cho thấy các chủng gây bệnh chủ yếu trong chi này là Erwinia

carotovora subsp. carotovora (Ecc), Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca) và

Erwinia chrysanthemi (Echr) [122, 145, 156].

Khả năng Erwinnia spp. phá hủy thành tế bào thực vật, làm vết bệnh lan rộng,

mềm và phân rã là do tác động của các enzyme ngoại bào. Robert và Blanchette

(1994) xác định các enzyme endo-β-1-4 arabinase và endo-β-1-4-xylanases được tạo ra

bởi Erwinia spp. có khả năng thủy phân thành phần carbohydrate của thành tế bào

thực vật [27]. Các enzyme khác bao gồm nhóm cellulase có pH tối ưu gần 7, phá hủy

vách tế bào thực vật endohydrolysis của liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong cellulose,

lichenin và ngũ cốc. Nhóm cellulase hoạt động trong sự kết hợp với các enzym ngoại

bào khác để tấn công thành tế bào sơ cấp và thứ cấp của ký chủ [156]. Các enzyme

pectinase như pectate lyases (Pl), pectin lyases (Pnl) và pectin methylesterases (Pme)

cũng được Alghisi (1995) và Toth (2001) đề cập [11, 155]. Saarilahti (1990) đã cho

thấy nhóm polygalacturonases có pH tối ưu là 5,5 và nhiệt độ tối ưu 35-45ºC tấn công

các liên kết α-1,4-glycosidic trong pectate [136].

Bảng 1.11. Bảng tổng hợp các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn (soft rot)

Tên Ký chủ TLTK

Erwinia carotovora

subsp. atroseptica Khoai tây, cà chua. [64]

subsp. betavasculorum Củ cải, hướng dương, khoai tây, astiso. [64]

Khoai tây

subsp. brasiliensis Nhiều ký chủ [56]

subsp. carotovora Rau diếp, tỏi, cần tây. [69]

subsp. odorifera [69]

Erwinia chrysanthemi

pv. dieffenbachia (2, 3) Chuối, cà chua, dứa, cẩm chướng, khoai

lang, chuối, ngô.

pv. dianthicola (1, 7, 9) Cẩm chướng, rau diếp xoăn, actisô, cà

chua, khoai tây. [63]

pv. paradisiaca (3) Chuối, ngô.

pv. zeae (3, 8) Ngô, dứa, khoai tây, gạo, chuối, hoa cúc,

thuốc lá.

Hoa cúc, atisô, rau diếp xoăn, hướng pv. chrysanthemi (5, 6)

dương, cà chua.

Erwinia spp. là dòng vi khuẩn tuỳ ý yếm khí, có thể tồn tại ở các điều kiện môi

trường khác nhau. Không giống như các loài vi khuẩn khác, chúng không có khả năng

tạo bào tử để có thể tăng khả năng tồn tại khi gặp điều kiện sống không thuận lợi. Tuy

nhiên chúng thường tồn tại trong hạt giống, nguyên liệu nông sản bị nhiễm bệnh, trong

quá trình canh tác, lưu trữ bảo quản và trong đất nông nghiệp tự nhiên [53, 67, 136]. Vi

khuẩn này cũng được tìm thấy trong rễ của một số loại cỏ dại, cây trồng và nước tưới

[71, 135]. Côn trùng và gió đã tham gia vào sự lây lan của Erwinia spp., nông sản khi

bị côn trùng tấn công hoặc bị tổn thương do tác nhân cơ học sẽ tạo điều kiện tốt cho vi

khuẩn này xâm nhập gây bệnh, từ đó chúng sẽ lây nhiễm khắp nơi do đó côn trùng

cũng là nguyên nhân trong việc gây ra các tác nhân gây bệnh thối nhũn [145], [86].

Sự xâm nhập của Erwinia spp. gây bệnh thông qua các lỗ tự nhiên hoặc các vết

thương và chấn thương trong quá trình chăm sóc như làm cỏ, thu hoạch và trong quá

trình côn trùng tấn công. Quá trình lây nhiễm và phát triển của vi khuẩn gây thối nhũn

được xác định bởi ba yếu tố: số lượng nguyên liệu, mật độ vi khuẩn gây bệnh và điều

kiện môi trường [145]. Nhiệt độ và độ ẩm là yếu tố quan trọng trong phát triển bệnh và

làm ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của vi khuẩn, trong đó độ ẩm được coi là yếu tố

quyết định quan trọng nhất cho sự tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn [104, 107].

Schober và Zadoks (1999) cho thấy nhiệt độ và nguồn nước trong quá trình sản xuất

củ, quả sau thu hoạch và bảo quản là những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự

tồn tại, phát triển và nhiễm trùng bởi vi khuẩn gây thối nhũn, nhiệt độ thích hợp cho

Erwinia spp. từ 20-38C [138].

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Mai mực ống Loligo sp.

Mai mực ống Loligo sp. được thu nhận tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc

tỉnh Kiên Giang ở dạng tươi, có chiều dài từ 12-15 cm, rộng 1,0-1,5 cm và độ dày

trung bình 0,4 - 0,5 mm (Hình 2.1). Sau khi thu nhận, mai mực tươi được rửa sạch loại

tạp chất, đóng bao PA hút chân không và cấp đông - 4C cho đến khi được xử lý ở

phòng thí nghiệm. Khi sử dụng, mai mực được rửa sạch và sấy ở 60C qua đêm (16

giờ), sau đó được xay kích thước (3 - 5 mm) làm mẫu trong quá trình thí nghiệm.

Hình 2.1. Nguyên liệu mai mực ống Loligo sp.

2.1.2. Trái cà chua Lycopersicon esculetum

Cà chua thuộc Bộ: Solaneae; Chi: Lycopersicon; Loài: Lycopersicon esculentum

(Hình 2.2). Trái cà chua sau thu hoạch được chọn sử dụng trong suốt quá trình thực

hiện thí nghiệm có tên khoa học là Lycopersicun esculetun Mill [73], quả tròn thuộc

giống C95 đây là giống cà chua lai, được trồng phổ biến ở nước ta do có năng suất

cao, ngắn ngày và có thể trồng trái vụ. Mẫu được lựa chọn, thu mua tại các chợ đầu

mối nông sản Bình Dương, Thủ Đức (TpHCM) và Nha Trang đạt tiêu chuẩn TCVN

4845:2007.

Cà chua là loại trái hô hấp đột biến, nghĩa là trái cà chua khi thu hoạch đã thuần

thục về mặt sinh lý nhưng vỏ còn màu xanh hoặc ngả màu nên có thể chín tiếp tự

nhiên và có thể đạt đến chất lượng tối ưu [118]. Do đó mẫu trái cà chua khi thu nhận

vỏ có xanh hoặc ửng đỏ (đang chuyển màu) có kích thước đồng đều, không có khuyết

tật, không bị các vết thương vật lý như vết dập, vết cắt, lỗ thủng hoặc vết trầy xước.

Hình 2.2. Nguyên liệu cà chua Lycopersicon esculentum.

2.1.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu

Hóa chất dùng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết, trong đó hóa chất dùng

trong quá trình thu nhận chitin, chitosan như: NaOH, HCl và các hóa chất dùng trong

phân tích các chỉ tiêu chất lượng đều do công ty Mecrk, Đức sản xuất. Các loại hóa

chất đều được bảo quản theo đúng yêu cầu của nhà sản xuất ghi trên bao bì.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Sơ đồ tổng quát các bước nghiên cứu trong phạm vi luận án được trình bày ở

Hình 2.3. Quá trình nghiên cứu xác định điều kiện thu nhận β-chitin và chitosan từ phế

liệu mai mực ống Loligo sp. được thực hiện bằng phương pháp hóa học dựa trên cở sở

các kết quả nghiên cứu đã công bố của Chandumpai 2004 [36], Jung 2013 [79], Kurita

1993 [93], Lavall 2007 [95], Domard 2011 [55], Cortizo 2008 [47], Chaussard 2004

[38] và Abdou 2008 [10]. Việc sử dụng dung dịch NaOH để khử protein thu nhận -

chitin và deacetyl thu nhận chitosan trên cơ sở sử dụng nồng độ NaOH thấp nhất để

hạn chế tối đa quá trình cắt mạch chitin trong quá trình xử lý và có thể ứng dụng kết

quả nghiên cứu trên quy mô sản xuất lớn đem lại hiệu quả thiết thực.

Giải thích quy trình:

Mai mực ống được thu nhận tại nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang

ở dạng tươi thải ra sau quá trình chế biến có chiều dài từ 12-15cm, rộng 1-1,5cm và độ

dày trung bình 0,4-0,5mm. Sau khi thu nhận, mai mực ống được rửa sạch, đóng bao

PA hút chân không, vận chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản lạnh 4C cho đến

khi xử lý làm mẫu cho quá trình nghiên cứu. Mẫu mai mực ống ở phòng thí nghiệm

được rửa sạch, sau đó sấy qua đêm (16 giờ) ở nhiệt độ 60oC đến khi mẫu có độ ẩm đạt

dưới 10% thì dừng sấy, thu mai mực ống khô và xay nhỏ ở kích thước 3-5mm. Sau khi

xử lý, mẫu được tiến hành xác định các thành phần hóa học cơ bản như: protein,

khoáng, lipid, các acid amin và thành phần khoáng.

Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát.

Trên cơ sở xác định thành phần hóa học của nguyên liệu mai mực ống Loligo sp.,

mẫu mai mực sau xử lý được tiến hành khử các thành phần phi chitin như: protein,

khoáng, lipid để thu nhận β-chitin.

+ Khử protein: Mẫu mai mực được tiến hành khử protein trong môi trường

NaOH. Các yếu tố tác động đến quá trình được khảo sát, đánh giá như: nồng độ

NaOH, nhiệt độ khử và thời gian khử. Mục đích cần đạt được sau xử lý là hàm lượng

protein còn lại sau khử đạt dưới 1% và mạch β-chitin thu được ít bị phân cắt nhất trong

quá trình xử lý.

+ Khử khoáng: Mai mực được tiến hành khử các thành phần khoáng trong môi

trường acid HCl. Các yếu tố tác động đến quá trình khử được khảo sát, đánh giá: nồng

độ HCl, nhiệt độ khử và thời gian khử. Mục đích cần đạt được sau xử lý là hàm lượng

khoáng còn lại sau khử đạt dưới 1% và mạch β-chitin thu được ít bị phân cắt nhất

trong quá trình xử lý.

Sản phẩm -chitin sau xử lý được thu nhận và đánh giá các chỉ tiêu như độ tinh

sạch, khối lượng phân tử trung bình (Mw), độ deacetyl (DD), đặc điểm cấu trúc (phổ

nhiễu xạ tia X - XRD, phổ hồng ngoại - FTIR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân - NMR)

và một số tính chất lý - hóa quan trọng khác.

+ Deacetyl: Sản phẩm -chitin được deacetyl trong môi trường NaOH. Các yếu tố

ảnh hưởng đến quá trình deacetyl như: nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian được khảo

sát, đánh giá. Mục đích của quá trình deacetyl là sản phẩm thu được có độ deacetyl trên

90% (DD > 90%) và mạch chitosan ít bị phân cắt nhất trong quá trình xử lý.

+ Đánh giá kháng khuẩn: Tiến hành phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây

bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch. Các mẫu cà chua bệnh được thu nhận từ

các chợ đầu môi nông sản, sau đó tiến hành phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây

bệnh thối nhũn theo qui tắc Koch và các đặc tính sinh lý, sinh hóa được mô tả bởi Mân

(2007) và Janse (2005) [77, 9].

Từ đó khảo sát, đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan từ mai mực ống:

Sản phẩm chitosan từ mai mực ống sẽ được cắt mạch bằng H2O2, phương pháp được

mô tả bởi Liu (2006) và Huang (2012) [74, 100]. Các sản phẩm chitosan thu được sau

xử lý cắt mạch có phân tử lượng rất khác nhau từ 6831-138 kDa. Các chitosan này

được đánh giá khả năng kháng khuẩn đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn

trên cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo.

2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thu nhận β-chitin

2.2.2.1. Thí nghiệm tổng quát, đánh giá ảnh hưởng của 3 yếu tố: nồng độ NaOH,

nhiệt độ và thời gian đến khả năng khử protein trong mai mực ống nguyên liệu

Dựa trên cở sở các kết quả nghiên cứu đã công bố Chandumpai 2004 [36], Jung

2013 [79], Kurita 1993 [93] cho thấy điều kiện thu nhận β-chitin từ phế liệu mai mực

được thực hiện bằng phương pháp hóa học (NaOH, KOH) đều phụ thuộc 3 thông số cơ

bản là nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian xử lý. Do đó để đánh đánh giá sơ bộ ảnh

hưởng của 3 yếu tố này đối với nguyên liệu mai mực Loligo sp. sơ đồ bố trí thí nghiệm

được trình bày ở Hình 2.4.

Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt

độ và thời gian đến khả năng khử protein trong mai mực ống nguyên liệu.

Mục đích: Thăm dò và đánh giá được mức tác động của 3 yếu tố: nhiệt độ, nồng

độ NaOH và thời gian đến quá trình khử protein, với yêu cầu mẫu mai mực sau quá

trình khử có hàm lượng protein còn lại đạt dưới 1% đáp ứng yêu cầu của 1 sản phẩm

chitin thương mại. Đây là cơ sở để chọn khoảng tác động của từng yếu tố, từ đó bố trí

thí nghiệm đánh giá tác động từng yếu tố đến quá trình khử.

Mô tả thí nghiệm: Tiến hành 3 lô thí nghiệm khử protein trong mai mực Loligo

sp. ở 3 mức nhiệt độ 30C, 60C và 90C với nồng độ NaOH thay đổi từ 3-5% theo

thời gian với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) là 1/10 (w/v). Mẫu sau xử lý được

rửa trung tính, sấy ở nhiệt độ 60oC qua đêm (12 giờ) và kiểm tra hàm lượng protein

còn lại, các bước tiến hành cụ thể như sau:

+ Ở nhiệt độ 30oC: Mẫu mai mực được tiến hành khử protein trong môi

trường NaOH ở các mức nồng độ: 3%, 4% và 5% (w/v) theo thời gian với tỷ lệ nguyên

liệu/dung môi (1/10, w/v). Quá trình khử được định kỳ khuấy đảo sao cho nguyên liệu

tiếp xúc đều dung môi. Định kỳ theo thời gian: 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ,

72 giờ tiến hành thu mẫu, rửa sạch trung tính, sấy khô ở nhiệt độ 60oC qua đêm (12

giờ) sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại.

+ Ở nhiệt độ 60oC: Mẫu mai mực được tiến hành xử lý trong môi trường

NaOH ở các mức nồng độ: 3%, 4% và 5% (w/v) với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

(1/10,w/v), mẫu được ủ ở nhiệt độ 60  2oC theo thời gian. Quá trình khử được định

kỳ khuấy đảo sao cho nguyên liệu tiếp xúc đều dung môi. Định kỳ theo thời gian: 2

giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ tiến hành thu mẫu, rửa sạch trung tính, sấy khô

ở nhiệt độ 60oC qua đêm (12 giờ) sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein và hàm

lượng khoáng còn lại.

+ Ở nhiệt độ 90oC: Tương tự như quá trình xử lý mẫu ở nhiệt độ 60oC, mẫu

mai mực được tiến hành xử lý trong môi trường NaOH ở các mức nồng độ: 3%, 4% và

5% (w/v) với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1/10, w/v), mẫu được ủ ở nhiệt độ 90  2oC

theo thời gian. Quá trình khử được định kỳ khuấy đảo sao cho nguyên liệu tiếp xúc

đều dung môi. Định kỳ theo thời gian: 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ tiến

hành thu mẫu, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60oC qua đêm (12 giờ) và tiến hành xác

định hàm lượng protein và khoáng còn lại.

2.2.2.2. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ khử đến quá trình

khử protein

Từ kết quả đánh giá sơ bộ mức tác động của 3 yếu tố: nhiệt độ, nồng độ NaOH

và thời gian đến quá trình khử protein được trình bày ở Hình 2.4. Tiến hành cố định 2

yếu tố: nồng độ NaOH ở mức 4% (w/v) và thời gian khử ở mức 12 giờ. Mẫu mai mực

được xử lý khử protein ở các mức nhiệt độ: 70oC  2, 75oC  2, 80oC  2, 85oC  2,

90oC  2 được trình bày Hình 2.5.

Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình

khử protein mai mực ống.

Mục đích: Chọn được mức nhiệt độ thích hợp cho quá trình khử, sao cho hàm

lượng protein còn lại sau quá trình khử trong β-Chitin dưới 1%.

Mô tả thí nghiệm: Bố trí 5 lô thí nghiệm khử protein trong mai mực Loligo sp. ở

các mức nhiệt độ khác nhau: 70oC; 75oC; 80oC; 85oC và 90oC. Mỗi 5g mai mực ống

được xử lý với 500 ml NaOH 4% trong cốc 1000 ml với tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch

NaOH (1/10, w/v) và được ủ ở một mức nhiệt độ được xem là 1 thí nghiệm. Mỗi lô

được được thực hiện 3 thí nghiệm lại để lấy kết quả trung bình, định kỳ khuấy đảo để

nguyên liệu mai mực tiếp xúc hoàn toàn với dung môi. Mẫu sau khi xử lý được rửa

sạch (trung tính), sấy ở nhiệt độ 60oC qua đêm (12 giờ), sau đó xác định hàm lượng

protein và khối lượng phân tử trung bình của chitin sau xử lý.

2.2.2.3. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố thời gian khử

Sau khi xác định mức nhiệt độ thích hợp cho quá trình khử protein được trình

bày ở mục 2.2.2.2 và Hình 2.5. Tiếp tục cố định yếu tố thời gian khử ở mức 12 giờ,

tiến hành khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến quá trình khử protein.

Mục đích: Chọn được mức thời gian thích hợp cho quá trình khử, sao cho hàm

lượng protein còn lại trong mẫu sau quá trình khử dưới 1% và khối lượng phân tử

trung bình của chitin ít bị phân cắt nhất dưới tác động của các yếu tố khử.

Mô tả thí nghiệm: Bố trí 6 lô thí nghiệm khử protein trong mai mực Loligo sp. ở

các mức thời gian khác nhau: 4 giờ; 6 giờ; 8 giờ; 10 giờ; 12 giờ và 14 giờ. Mỗi 5g mai

mực ống được xử lý với 500 ml NaOH 4% trong cốc 1000 ml với tỷ lệ nguyên

liệu/dung dịch NaOH (1/10, w/v) và được ủ ở mức nhiệt độ đã được xác định theo kết

quả của mục 2.2.2.2 và Hình 2.5 được xem là 1 thí nghiệm. Mỗi lô được được thực

hiện 3 thí nghiệm lại để lấy kết quả trung bình, định kỳ khuấy đảo để nguyên liệu mai

mực tiếp xúc hoàn toàn với dung môi. Mẫu sau khi xử lý ở các mức thời gian được

rửa sạch (trung tính), sấy ở nhiệt độ 60oC qua đêm (12 giờ), sau đó xác định hàm

lượng protein và khối lượng phân tử trung bình của chitin sau xử lý.

Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thời gian

đến quá trình khử protein.

2.2.2.4. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nồng độ NaOH

Sau khi xác định mức nhiệt độ thích hợp cho quá trình khử protein theo kết quả ở

mục 2.2.2.2 và mức thời gian thích hợp theo kết quả ở mục 2.2.2.3. Tiến hành khảo

sát, đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nồng độ NaOH đến quá trình khử protein.

Mục đích: Chọn được mức nồng độ NaOH thích hợp cho quá trình khử, sao cho

hàm lượng protein còn lại trong mẫu sau quá trình khử dưới 1% và khối lượng phân tử

trung bình của chitin ít bị phân cắt nhất dưới tác động của các yếu tố khử.

Hình 2.7. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến quá trình

khử protein.

Mô tả thí nghiệm: Bố trí 5 lô thí nghiệm khử protein trong mai mực Loligo ở các

mức nồng độ NaOH khác nhau: 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%. Mỗi 5g mai mực ống được

xử lý với 500 ml dung dịch NaOH trong cốc 1000 ml với tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch

NaOH (1/10, w/v) và được ủ ở mức nhiệt độ thích hợp đã được xác định theo kết quả

của mục 2.2.2.2 và ở mức thời gian khử thích hợp đã được xác định ở mục 2.2.2.3

được xem là 1 thí nghiệm. Mỗi lô được thực hiện 3 thí nghiệm lập lại để lấy kết quả

trung bình, định kỳ khuấy đảo để nguyên liệu mai mực tiếp xúc hoàn toàn với dung

môi. Mẫu sau khi xử lý ở các mức nồng độ NaOH được rửa sạch (trung tính), sấy ở

nhiệt độ 60oC qua đêm (12 giờ), sau đó xác định hàm lượng protein và khối lượng

phân tử trung bình (Mw) của chitin sau xử lý.

2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện deacetyl β-chitin thu nhận chitosan

2.2.3.1. Thí nghiệm tổng quát, đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ

và thời gian đến quá trình deacetyl -chitin

Mục đích: Thăm dò và đánh giá được mức tác động của 3 yếu tố: nhiệt độ, nồng

độ NaOH và thời gian đến quá trình deacetyl, với yêu cầu sản phẩm chitosan thu được

sau quá trình khử có độ deacetyl trên 90%. Đây là cơ sở để chọn khoảng tác động của

từng yếu tố, từ đó bố trí thí nghiệm chi tiết đánh giá khoảng tác động từng yếu tố đến

quá trình deacetyl.

Mô tả thí nghiệm: Tiến hành 3 lô thí nghiệm deacetyl -chitin ở 3 mức nhiệt độ

30C, 60C và 90C với nồng độ NaOH thay đổi từ 30-60% theo thời gian với tỷ lệ

NL/DM (1/10, w/v). Mẫu sau xử lý được rửa trung tính, sấy ở 60oC qua đêm (12 giờ)

và tiến hành đánh giá độ deacetyl của sản phẩm chitosan thu được, các bước tiến hành

cụ thể như sau:

+ Ở nhiệt độ 30oC: Mẫu -chitin được tiến hành deacetyl trong môi trường

NaOH ở các mức nồng độ: 30%, 40%, 50% và 60% (w/w) theo thời gian với tỷ lệ

nguyên liệu/dung môi (1/10, w/v). Mẫu được để ở nhiệt độ thường và trong quá trình

khử được định kỳ khuấy đảo sao cho nguyên liệu tiếp xúc đều dung môi. Định kỳ theo

thời gian: 3 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ, 48 giờ, 54 giờ, 60

giờ, 66 giờ và 72 giờ tiến hành thu mẫu, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60oC qua đêm

(12 giờ), sau đó tiến hành xác định độ deacetyl và khối lượng phân tử trung bình của

sản phẩm chitosan thu được.

+ Ở nhiệt độ 60oC: Mẫu -chitin được tiến hành xử lý deacetyl trong môi

trường NaOH ở các mức nồng độ: 30%, 40%, 50% và 60% (w/w) với tỷ lệ nguyên

liệu/dung môi (1/10, w/v), mẫu được ủ ở nhiệt độ 60  2oC theo thời gian. Quá trình

khử được định kỳ khuấy đảo sao cho nguyên liệu tiếp xúc đều dung môi. Định kỳ theo

thời gian: 3 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ, 48 giờ tiến hành

thu mẫu, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60oC qua đêm (12 giờ) và tiến hành xác định độ

deacetyl của sản phẩm chitosan thu được.

Hình 2.8. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá ảnh hưởng các yếu tố nhiệt độ,

nồng độ NaOH và thời gian đến quá trình deacetyl -chitin.

+ Ở nhiệt độ 90oC: Tương tự như quá trình xử lý mẫu ở nhiệt độ 60oC, mẫu

-chitin được tiến hành xử lý deacetyl trong môi trường NaOH ở các mức nồng độ:

30%, 40%, 50% và 60% (w/w) với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1/10, w/v), mẫu được

ủ ở nhiệt độ 90  2oC theo thời gian. Quá trình khử được định kỳ khuấy đảo sao cho

nguyên liệu tiếp xúc đều dung môi. Định kỳ theo thời gian: 3 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ

và 24 giờ tiến hành thu mẫu, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60oC qua đêm (12 giờ) và

tiến hành xác định độ deacetyl của sản phẩm chitosan thu được.

2.2.3.2. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình

deacetyl -chitin

Từ kết quả đánh giá sơ bộ mức tác động của 3 yếu tố: nhiệt độ, nồng độ NaOH

và thời gian đến quá trình deacetyl được trình bày mục 2.2.3.1 và Hình 2.8. Tiến hành

cố định 2 yếu tố: nồng độ NaOH ở mức 50% (w/w) và thời gian khử ở mức 10 giờ với

tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch NaOH (1/10, w/v). Mẫu -chitin được xử lý deacetyl ở các

mức nhiệt độ: 60oC ± 2, 70oC ± 2, 80oC ± 2, 90oC ± 2 được trình bày Hình 2.9.

Hình 2.9. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình

deacetyl -chitin.

Mục đích: Chọn được mức nhiệt độ thích hợp cho quá trình deacetyl, sao cho

độ deacetyl (DD) của sản phẩm chitosan thu được trên 90% và khối lượng phân tử

trung bình (Mw) ít bị phân cắt nhất dưới tác động của các yếu tố khử.

Mô tả thí nghiệm: Bố trí 4 lô thí nghiệm deacetyl -chitin ở các mức nhiệt độ

khác nhau, mỗi 5g β-chitin từ mai mực ống được xử lý với 50 ml NaOH 50% trong cốc

250 ml với tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch NaOH (1/10, w/v) và được ủ ở các mức nhiệt độ.

Mỗi lô được được thực hiện 3 thí nghiệm lại để lấy kết quả trung bình, định kỳ khuấy

đảo để nguyên liệu sao cho tiếp xúc hoàn toàn với dung môi. Mẫu sau khi xử lý được

rửa sạch đến trung tính, sấy ở nhiệt độ 60oC qua đêm (12 giờ), sau đó xác định độ

deacetyl (DD) và khối lượng phân tử trung bình (Mw) của sản phẩm chitosan thu được.

2.2.3.3. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nồng độ NaOH đến quá

trình deacetyl -chitin

Sau khi xác định mức nhiệt độ thích hợp cho quá deacetyl ở mục 2.2.3.2 và

Hình 2.9. Tiếp tục cố định yếu tố thời gian khử ở mức 10 giờ, tiến hành khảo sát, đánh

giá ảnh hưởng của yếu tố nồng độ NaOH đến quá trình deacetyl.

Mục đích: Chọn được mức nồng độ NaOH thích hợp cho quá trình deacetyl sao

cho sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl (DD) trên 90% và có khối lượng phân

tử trung bình ít bị phân cắt nhất dưới tác động của các yếu tố khử.

Mô tả thí nghiệm: Bố trí 4 lô thí nghiệm deacetyl -chitin ở các mức nồng độ

NaOH khác nhau, mỗi 5g -chitin được xử lý với 50 ml NaOH trong cốc 250 ml với tỷ

lệ nguyên liệu/dung dịch NaOH (1/10, w/v) ở các mức nồng độ khác nhau: 40%, 45%,

50%, 55% (w/w). Mỗi lô được được thực hiện 3 thí nghiệm lại để lấy kết quả trung

bình, định kỳ khuấy đảo để nguyên liệu tiếp xúc hoàn toàn với dung môi. Mẫu sau khi

xử lý được rửa sạch đến trung tính, sau đó sấy ở nhiệt độ 60oC qua đêm (12 giờ), sau

đó mẫu được xác định độ deacetyl (DD) và khối lượng phân tử trung bình (Mw) của

sản phẩm chitosan thu được.

Hình 2.10. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nồng độ NaOH đến

quá trình deacetyl -chitin.

2.2.3.4. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến quá trình

deacetyl β-chitin

Sau khi xác định mức nhiệt độ thích hợp cho quá deacetyl ở mục 2.2.3.2 và

mức nồng độ NaOH thích hợp ở mục 2.2.3.3. Tiến hành khảo sát, đánh giá ảnh hưởng

của yếu tố thời gian đến quá trình deacetyl.

Mục đích: Chọn được mức thời gian thích hợp cho quá trình deacetyl sao cho sản

phẩm chitosan thu được có độ deacetyl (DD) trên 90% và có khối lượng phân tử trung

bình (Mw) của chitosan thu được ít bị phân cắt nhất dưới tác động của các yếu tố khử.

Hình 2.11. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến quá

trình deacetyl -chitin.

Mô tả thí nghiệm: Bố trí 6 lô thí nghiệm deacetyl -chitin ở các mức thời gian

khử khác nhau, mỗi 5g -chitin được xử lý với 50 ml NaOH ở các mức thời gian: 4

giờ, 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ trong cốc 250 ml với tỷ lệ nguyên liệu/dung

dịch NaOH (1/10, w/v) và được xử lý ở mức nhiệt độ thích hợp đã được xác định theo

kết quả của mục 2.2.3.2 và mức nồng độ NaOH thích hợp đã được xác định ở mục

2.2.3.3 được xem là 1 thí nghiệm. Mỗi lô được thực hiện 3 thí nghiệm lập lại để lấy kết

quả trung bình, định kỳ khuấy đảo để nguyên liệu tiếp xúc hoàn toàn với dung môi.

Mẫu sau khi xử lý được rửa sạch đến trung tính, sấy ở nhiệt độ 60oC qua đêm (12 giờ),

sau đó xác định độ deacetyl (DD) và khối lượng phân tử trung bình (Mw) của sản phẩm

chitosan thu được.

2.2.3.5. Bố trí thí nghiệm deacetyl lần 2

Vì mục đích nghiên cứu của Luận án là chọn điều kiện deacetyl sao cho có thể

ứng dụng sản xuất ở quy mô lớn do đó các yếu tố tác động như nhiệt độ, nồng độ

NaOH và thời gian khử đều phải phù hợp với yêu cầu sản xuất thực tế:

- Sử dụng nồng độ NaOH thấp nhất có thể để hạn chế thấp nhất lượng chất thải

thải ra môi trường sau xử lý, cũng như hạn chế thấp nhất chi phí sản xuất và chi phí xử

lý chất thải.

- Mức nhiệt độ sử dụng phải phù hợp sản xuất thực tế (dưới 100oC) vì nếu sử

dụng nhiệt độ trên 100oC ở qui mô sản xuất lớn các thì yêu cầu kỹ thuật của các thiết

bị sản xuất phải cao, đắt tiền.

Hình 2.12. Sơ đồ thí nghiệm deacetyl lần 2.

- Vì lý do hiệu quả kinh tế nên thời gian xử lý không quá dài, ngoài ra nếu kéo

dài thời gian xử lý thì khối lượng phân tử trung bình của chitin, chitosan đều bị ảnh

hưởng rất lớn làm hạ thấp chất lượng sản phẩm.

Dựa trên các kết quả thực nghiệm cho thấy nếu muốn thu nhận được sản phẩm

chitosan có độ deacetyl trên 90% và hạn chế thấp nhất quá trình cắt mạch thì việc thực

hiện phương pháp deacetyl nhiều lần là phù hợp. Nội dung này cũng đã được các kết

quả của Jung 2013, Kiruta 1993 và Broussignac 1968 công bố trên các tạp chí có uy

tín [31, 79, 93]. Từ những lý do trên sơ đồ bố trí thí nghiệm deacetyl lần 2 được trình

bày ở Hình 2.12.

Mô tả thí nghiệm: Mẫu -chitin được xử lý deacetyl trong môi trường NaOH,

dưới tác động của các yếu tố, các gốc acetyl trong mạch chitin bị khử. Tuy nhiên quá

trình khử sẽ chậm và khó đạt mức deacetyl trên 90%, do đó mẫu chitosan sau khi

deacetyl lần 1 sẽ được rửa sạch đến trung tính và tiếp tục deacetyl lần 2.

2.2.4. Bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn

Dựa trên các kết quả nghiên cứu của Janse 2005 [77], Winslow 2003 [164] và

Simeon 2006 [145]. Quá trình phân lập vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn (soft rot)

trên trái cà chua sau thu hoạch được bố trí theo sơ đồ Hình 2.13.

Để xác định bệnh, cần thiết phải khẳng định sự có mặt của vi khuẩn trong mô bệnh,

phân lập từ mô bệnh để nuôi cấy vi khuẩn thuần khiết, sau đó lây bệnh nhân tạo để xác

định tính gây bệnh của chúng trên kí chủ theo quy tắc Koch. Tiếp tục nghiên cứu xác định

rõ đặc tính hình thái, sinh trưởng (khuẩn lạc) và phản ứng sinh hóa để có cơ sở phân loại,

giám định loại (giống) và loài vi khuẩn cần chẩn đoán.

Dựa trên các kết quả nghiên cứu đã được công bố của Janse 2005 [77], Simeon 2006

[145] và Gnanamanickam 2006 [66]. Các mẫu cà chua bị bệnh thối nhũn được thu thập ở

nhiệt độ thường (30-32°C) trong điều kiện ẩm ướt. Việc thu thập các mẫu cà chua bị

bệnh được thực hiện thành nhiều đợt, tại các chợ nông sản đầu mối khác nhau. Các

mẫu cà chua bệnh sau khi thu nhận được bao giấy và vận chuyển về phòng thí nghiệm.

Các mẫu cà chua này tiếp tục được bảo quản trong điều kiện thường đến khi vết bệnh

có biểu hiện rõ theo mô tả bệnh học sẽ được chọn làm mẫu phân lập vi khuẩn.

Mô tả bệnh học: Các mẫu trong quá tình bảo quản ở điều kiện thường có vết bệnh

phát triển nhanh chóng cả về đường kính và chiều sâu, các vùng bị ảnh hưởng trở nên

nhũn mềm và chảy nước do các tế bào bị tổn thương, trong khi bề mặt vết bệnh trở nên

đổi màu, có thể xuất hiện nếp nhăn hoặc phồng rộp. Mức độ gây tổn thương lúc đầu chậm

nhưng sau đó tổn thương rất nhanh, các mô trong trái cà chua bị ảnh hưởng bị phân hủy

chảy nước, các vết nứt phát triển và bề mặt vết bệnh trở nên nhầy nhụa, kèm theo mùi hôi

hoặc mùi lưu huỳnh. Trường hợp tiếp xúc với không khí vết bệnh có thể chuyển sang màu

xám hoặc màu nâu sẫm.

Hình 2.13. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua

sau thu hoạch.

2.2.5. Bố trí thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp.

gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch của β-chitosan ở điều kiện in

vitro và in vivo

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát:

Hình 2.14. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp.

gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan.

Các kết quả thảo luận về hoạt tính kháng khuẩn của chitosan trong các điều kiện

khác nhau cho thấy hiệu quả kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào khối lượng phân tử

trung bình (Mw), nồng độ chitosan sử dụng, nguồn gốc thu nhận của chitosan thử nghiệm

tùy theo đối tượng vi sinh cần kháng. Theo Sukmark 2011 [148] chitosan có DD > 95% từ

mai mực cho hiệu quả kháng khuẩn tốt hơn từ vỏ cua và vỏ tôm đối với cả vi khuẩn Gram

âm và Gram dương (ví dụ như: Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus aureus,

Bacillus subtilis), oligo chitosan từ mai mực (50-80 kDa) cho kháng khuẩn tốt nhất. Guan,

Fu, & Zhu (1997) cho thấy rằng chitosan tác động kháng khuẩn càng lớn khi trọng lượng

phân tử thấp (Mw). Một nghiên cứu khác của Xia và cộng sự 1996 đã chứng minh rằng

hiệu quả kháng khuẩn trên Escherichia coli của chitosan có Mw thích hợp là 1,5 kDa

[166]. Do đó trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, các bước đánh giá khả năng kháng khuẩn

của chitosan từ mai mực ống đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua

sau thu hoạch được trình bày ở Hình 2.14.

Mô tả quy trình:

Chuẩn bị chitosan: Sản phẩm chitosan được thu nhận từ mai mực Loligo sp. ở

mục 2.2.3 có độ deacetyl trên 90% và khối lượng phân tử trung bình (Mw) cao sẽ được

cắt mạch bằng H2O2 theo phương pháp mô tả bởi Liu 2006 và Huang 2012 và được

trình bày ở mục 2.3.4. Các sản phẩm chitosan thu được sẽ có khối lượng phân tử trung

bình giảm dần.

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan ở điều kiện in vitro và in vivo: Các

chitosan sau khi cắt mạch có các khối lượng phân tử khác nhau được hòa tan trong

dung dịch acid acetic 1% (v/v) ở các nồng độ khác nhau và được sử dụng để đánh giá

khả năng kháng khuẩn của chitosan ở điều kiện in vitro và in vivo. Quá trình đánh giá

kháng khuẩn được so sánh với 3 mẫu đối chứng như: Mẫu chitosan thương mại do

Công ty Sigma-Aldrich, Hòa Kỳ sản xuất có độ deacetyl (DD) 79-81% và khối lượng

phân tử (Mw) 120 kDa; Mẫu dung dịch acid acetic 1%và mẫu nước cất.

2.2.5.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chi tiết đánh giá khả năng kháng khuẩn của

chitosan đối với vi khuẩn Erwinia sp. ở điều kiện in vitro

Mục đích: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan từ mai mực Loligo sp. ở

các khối lượng phân tử trung bình (Mw) khác nhau đối với vi khuẩn Erwinia sp. ở điều

kiện in vitro được mô tả ở Hình 2.15.

Mô tả thí nghiệm: Sản phẩm chitosan từ mai mực Loligo sp. được thu nhận từ kết

quả nghiên cứu ở mục 2.2.3 có độ deacetyl (DD) trên 90% và có khối lượng phân tử

trung bình Mw cao được cắt mạch bằng H2O2 theo phương pháp được mô tả bởi Liu

2006 và Huang 2012 được trình bày ở mục 2.3.4. Bốn loại chitosan thu được đều có độ

deacetyl (DD) trên 90% và có khối lượng phân tử trung bình khác nhau.

Các chitosan này được hòa tan trong dung dịch acid acetic 1% ở các mức nồng

độ: 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1%, 1,25%, 1,5%. Quá trình hòa tan chitosan được để

sau 24 giờ để chitosan tan hoàn toàn.

Mẫu vi khuẩn Erwinia sp. được nuôi trong môi trường potato glucose lỏng (PG)

ở điều kiện nhiệt độ 30oC trên máy lắc 120 vòng/phút, sau 24 giờ dung dịch vi khuẩn

được pha loãng điều chỉnh đến độ hấp thu 0,25 tại bước sóng 610 nm, số lượng vi

khuẩn được xác định 2,1103 CFU/ml bằng phương pháp cấy đếm khuẩn lạc Nan liu

2006 [100].

Hình 2.15. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. của

chitosan ở điều kiện in vitro.

Mô tả thực nghiệm: Tiến hành lấy 0,1 ml dịch chitosan và 0,1 ml dịch vi khuẩn

trộn đều và cấy trang trên mặt thạch môi trường potato dextrose agar (PDA) được

chuẩn bị trên đĩa petri 950 mm. Các đĩa thạch sau khi cấy được nuôi ủ ở nhiệt độ 30oC

sau thời gian 24 giờ được soi đếm khuẩn lạc và đánh giá khả năng kháng khuẩn của

chitrosan. Quá trình đánh giá được so sánh với các mẫu đối chứng như: mẫu chitosan

thương mại (Sigma-Aldrich) có độ deacetyl (DD) 79-81% và có khối lượng phân tử

trung bình (Mw) 120 kDa, mẫu acid acetic 1% và mẫu nước cất. Các nghiệm thức đều

lập lại 3 lần để lấy giá trị trung bình.

2.2.5.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chi tiết đánh giá khả năng kháng bệnh thối nhũn

trên cà chua sau thu hoạch do vi khuẩn Erwinia sp. của chitosan ở điều kiện in vivo

Mục đích: Đánh giá khả năng kháng bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia sp. trên

trái cà chua sau thu hoạch của chitosan ở các mức khối lượng phân tử khác nhau.

Hình 2.16. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh thối nhũn của

chitosan ở điều kiện in vivo.

Chuẩn bị dung dịch chitosan: Ba mẫu chitosan từ mai mực ống được đánh giá

đều có độ deacetyl (DD) trên 90% và có khối lượng phân tử giảm dần. Các mẫu

chitosan này được hòa tan trong dung dịch acid acetic 1% ở các mức nồng độ: 0,2%,

0,4%, 0,6%, 1%, 1,5%. Các dịch chitosan này đều được chuẩn pH = 5-5,5 trước khi

đánh giá khả năng kháng bệnh thối nhũn trên trái cà chua.

Chuẩn bị mẫu trái cà chua: Trái cà chua được chọn, rửa sạch để ráo, xử lý cồn

75%, sau đó được nhúng qua dịch chitosan đã chuẩn bị. Các mẫu này được để ráo 24 giờ

trước khi gây bệnh nhân tạo.

Chuẩn bị mẫu vi khuẩn gây bệnh: Mẫu vi khuẩn Erwinia sp. được nuôi trong môi

trường potato glucose lỏng (PG) ở điều kiện nhiệt độ 30oC trên máy lắc 120 vòng/phút,

sau 24 giờ làm dịch vi khuẩn gây bệnh.

Mô tả thực nghiệm: Dùng kim mũi mát chấm vào phần đầu trái cà chua đã xử lý

chitosan tạo vết thương có kích thước (ngang 1mm, sâu 2mm), sau đó dùng micropipet

cho 5l dịch vi khuẩn đã chuẩn bị vào vết thương. Các mẫu bệnh được đặt trong hộp

nhựa vô trùng, có lót giấy ẩm phía dưới tạo độ ẩm, các hộp nhựa được để ở nhiệt độ

thường và theo dõi kích thước vết bệnh theo phương pháp được mô tả bởi Meng và

cộng sự 2010) [105]. Quá trình đánh giá được so sánh với các mẫu đối chứng như:

mẫu chitosan thương mại (Sigma-Aldrich) có độ deacetyl (DD) 79-81% và có khối

lương phân tử trung bình (Mw)= 120 kDa, mẫu acid acetic 1% và mẫu nước cất. Các

nghiệm thức đều lập lại 3 lần để lấy giá trị trung bình.

2.2.5.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm so sánh đánh giá khả năng kháng bệnh của

chitosan từ mai mực ống và chitosan thương mại (Sigma-Aldrich)

Mục đích: Đánh giá khả năng kháng bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia sp. gây ra

đối với trái cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực Loligo sp. và chitosan thương

mại.

Chuẩn bị dung dịch chitosan: Mẫu chitosan từ mai mực ống có độ deacetyl (DD)

trên 90% và có khối lượng phân tử trung bình (Mw) tương đương với Mw của chitosan

thương mại và mẫu chitosan thương mại có độ deacetyl (DD) 79-81% và Mw = 120

kDa. Hai mẫu chitosan này được hòa tan trong dung môi acid acetic 1% ở mức nồng

độ 1,5%, sau đó các dịch chitosan này đều được chuẩn pH = 5-5,5 trước khi đánh giá

khả năng kháng bệnh thối nhũn trên trái cà chua.

Chuẩn bị trái cà chua: Trái cà chua được chọn, rửa sạch để ráo, xử lý cồn 75%,

sau đó được nhúng qua dịch chitosan đã chuẩn bị. Các mẫu cà chua sau khi nhúng dịch

chitosan sẽ được để ráo 24 giờ trước khi gây bệnh nhân tạo.

Chuẩn bị mẫu vi khuẩn gây bệnh: Mẫu vi khuẩn Erwinia sp. được nuôi trong môi

trường potato glucose lỏng (PG) ở điều kiện nhiệt độ 30oC trên máy lắc 120 vòng/phút,

sau 24 giờ làm dịch vi khuẩn gây bệnh.

Hình 2.17. Sơ đồ thí nghiệm so sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn của chitosan

từ mai mực ống và chitosan thương mại.

Mô tả thực nghiệm: Dùng kim mũi mát chấm vào phần đầu trái cà chua đã xử lý

chitosan tạo vết thương có kích thước (ngang 1mm, sâu 2mm), sau đó dùng micropipet

cho 5l dịch vi khuẩn đã chuẩn bị vào vết thương. Các mẫu bệnh được đặt trong hộp

nhựa vô trùng, có lót giấy ẩm phía dưới tạo độ ẩm, các hộp nhựa được để ở nhiệt độ

thường. Định kỳ theo thời gian 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ đo kích thước vết bệnh

bên trong và bên ngoài. Quá trình đánh giá được so sánh với các mẫu đối chứng nước

cất. Các nghiệm thức đều lập lại 3 lần để lấy giá trị trung bình.

2.2.5.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng tổng hợp phenol của trái cà

chua sau khi xử lý chitosan

Hình 2.18. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng tổng hợp phenol của trái cà chua

sau khi xử lý chitosan.

Chuẩn bị dung dịch chitosan: Ba mẫu chitosan từ mai mực ống được đánh giá

đều có độ deacetyl (DD) trên 90% và có khối lượng phân tử 1740 kDa, 655 kDa và

138 kDa được hòa tan trong dung dịch acid acetic 1% ở nồng độ 1,5%. Các dịch

chitosan này đều được chuẩn pH = 5-5,5 trước khi xử lý trên trái cà chua.

Chuẩn bị mẫu vi khuẩn gây bệnh: Mẫu vi khuẩn Erwinia sp. được nuôi trong môi

trường potato glucose lỏng (PG) ở điều kiện nhiệt độ 30oC trên máy lắc 120 vòng/phút,

sau 24 giờ làm dịch vi khuẩn gây bệnh.

Mô tả thực nghiệm: Trái cà chua được chọn có kích thước và độ chín đồng đều,

rửa sạch để ráo, xử lý cồn 75%, sau đó được nhúng qua các dịch chitosan đã chuẩn bị,

các mẫu này được để ráo 24 giờ sau đó dùng kim mũi mát gây bệnh nhân tạo trên trái cà

chua. Sau khi xử lý, trái cà chua được định kiểm tra tổng hàm lượng phenol sau 24 giờ và

72 giờ bảo quản.

2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU

2.3.1. Phương pháp xác định các thành phần hóa học cơ bản

- Xác định hàm lượng ẩm theo chuẩn AOAC 1990.

- Xác định hàm lượng khoáng theo chuẩn AOAC 1990.

- Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Folch [60].

- Xác định hàm lượng chitin bằng phương pháp Rao và cộng sự [144].

- Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Biuret và MicroBiuret (Phụ lục

1 và 2).

2.3.2. Phương pháp xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng

- Xác định thành phần acid amin: phân tích phương pháp GC với một bộ kit (GC-

EZ: FAAST) để phân tích acid amin tự do theo chuẩn AOAC.

- Xác định thành phần khoáng: Thành phần khoáng được phân xác định bằng

phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử AAS theo chuẩn AOAC (2000).

2.3.3. Phương pháp xác định tính chất của -chitin và chitosan

- Xác định hàm lượng protein còn lại (hàm lượng protein > 3%): được xác định

bằng phương pháp Biuret, nội dung chi tiết được trình bày ở Phụ lục 1.

- Xác định hàm lượng protein còn lại trên chitin (hàm lượng protein < 3%): bằng

phương pháp MicroBiuret được mô tả bởi Aye và Stevens 2006 [18], nội dung chi tiết

được trình bày ở Phụ lục 2.

- Xác định độ acetyl (DA) hoặc deacetyl (DD) của chitin: được xác định dựa vào đo

độ hấp phụ quang học sau khi thủy phân mẫu với H3PO4 theo Hein và cộng sự 2008 [70].

- Phân tử lượng trung bình (Mw) của chitin được xác định thông qua độ nhớt nội

và tính theo công thức Mark–Houwink theo Einbu và cộng sự 2007 [57], nội dung chi

tiết được trình bày ở Phụ lục 3.

- Phổ nhiễu xạ tia X (XRD): đo trên máy PANalytical, X’Pert-PRO –MPD, sử

dụng tia chiếu xạ CuKα (λ = 1,54A) với hiệu điện thế 40kV và cường độ 40mA, góc

quét 4 < 2θ < 44, bước quét 0,05, tốc độ quét 1/min, ở nhiệt độ 25C.

- Phổ hấp phụ hồng ngoại (FTIR): đo trên máy Nicolet iS10, Thermo Scientific,

bước sóng từ 548–4000cm-1.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: đo 1H NMR (400 MHz, Bruker) sử dụng

dung môi DCl và D2O.

- Kính hiển vi điện tử SEM: được chụp trên máy Hitachi S-4800.

- Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM: được chụp trên máy H7600 (Hitachi,

Tokyo, Japan) ở mức điện thế 100 kv.

- Độ hòa tan của chitosan: được phản ánh thông qua mức độ hòa tan của 1g mẫu

trong 100ml dung dịch acid acetic 1% theo thủ tục được Samar và cộng sự 2013 [137]

có điều chỉnh, nội dung chi tiết được trình bày ở Phụ lục 4.

- Xác định độ kết tinh của chitin, chitosan: được xác định thông qua chỉ số kết

tinh (CrI - Crystalline Index) theo phương pháp được mô tả bởi Pareek và cộng sự

2013 [117] và mức độ kết tinh (χcr - Degree of Crystallinity) theo phương pháp được

Chebotok và cộng sự 2007 [40], nội dung cụ thể được trình bày ở Phụ lục 5.

2.3.4. Phương pháp cắt mạch chitosan

Sản phẩm chitosan ban đầu (CTS-1) có độ deacetyl DD = 91-93% và khối lượng

phân tử trung bình (Mw = 6831 kDa) được xử lý trong dung dịch NaOH 0,2% (w/v) ở

nhiệt độ phòng trong 8 giờ với tỷ lệ 1/15 (w/v), quá trình này sẽ giúp chitosan trương nở

cấu trúc mạch giúp H2O2 tiếp xúc tốt nhất trong cấu trúc mạch chitosan. Sau đó cho H2O2

10% (v/v) với tỷ lệ 1/10 (w/v) vào chitosan đã xử lý trương nở, theo thời gian: 3 giờ, 5

giờ, 7 giờ. Sau đó mẫu được đưa về pH = 10, lọc chitosan kết tủa, các mẫu chitosan

được thu nhận, sấy 60oC qua đêm (12 giờ). Các sản phẩm chitosan thu được có khối

lượng phân tử khác nhau được trình bày trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Tính chất các chitosan sau cắt mạch

Thời gian cắt mạch Chitosan DD (%) Mw (kDa) (giờ)

CTS-TM - 79-81 120

CTS-1 - 91-93 6831

CTS-2 3 91-93 1740

CTS-3 5 91-93 655

C-120: Chitosan thương mại (Sigma-Aldrich) có DD 79-81% và Mw 120 kDa.

CTS-4 7 91-93 138

2.3.5. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn

- Phương pháp lựa chọn khuẩn lạc, chủng vi khuẩn: Mẫu cà chua bệnh được rửa

cồn, cắt đôi bằng dao vô trùng, sau đó lấy 1g phần thịt cà chua tại ranh giới bị bệnh cho

vào ống nghiệm chứa 5ml nước cất vô trùng, lắc đều. Sau 30 phút dùng pipet lấy 50l

dịch vi khuẩn cho lên mặt thạch PDA (đĩa petri 90mm) sau đó dùng que cấy trang trên

mặt thạch. Mẫu được đem ủ ở điều kiện nhiệt độ 30C, sau thời gian 24-48 giờ quan sát

và lựa chọn các khuẩn lạc phát triển trên mặt thạch. Theo mô tả của Janse 2005 [77] và

Mân 2007 [9] khuẩn lạc Erwinia sp. khi nuôi cấy trên môi trường PDA trong điều kiện

pH trung tính ở nhiệt độ từ 27-30C có màu trắng xám, hình tròn hoặc hình bầu dục

không đều, bề mặt khuẩn lạc nhầy ướt. Quá trình được thực hiện lập lại trên các mẫu bệnh

để chọn được các khuẩn lạc thuần khiết làm cơ sở cho các công đoạn tiếp theo. Sau đó

tiến hành nhuộm Gram và kiểm tra khả năng di động các dòng vi khuẩn được chọn, theo

Janse 2005 vi khuẩn Erwinia sp. có tế bào hình gậy (0,5-1,0 x 1,0-3,0 mm) đơn độc hoặc

tạo thành cặp, Gram âm, ưa khí tùy tiện, di động bằng chu mao.

- Đánh giá khả năng phân giải pectin trên môi trường CVP (Crystal Violet

Pectate): Việc thử nghiệm các chủng trên môi trường CVP sẽ đánh giá được khả năng

phân giải pectin của chúng [77]. Chuẩn bị môi trường CVP, dùng que cấy lấy chấm lên

khuẩn lạc chủng cần thử nghiệm, sau đó chấm 4 đến 6 chấm trên mặt thạch CVP, ủ ở

nhiệt độ 30ºC trong 48 giờ, quan sát khuẩn lực phát triển đánh giá kết quả. Các chủng có

khả năng phân giải pectin sẽ tạo thành các hố trên mặt thạch và hóa lỏng pectate trên môi

trường CVP, hình thành trên bề mặt hố là lớp pectin tinh khiết trong quá trình phát triển

của vi khuẩn [77], [172].

- Đánh giá khả năng lên men-oxy hóa glucose (Oxidative-Fermentative): Pha môi

trường PG lỏng phân vào mỗi ống nghiệm 15ml và được vô trùng, sau đó cho vào mỗi

ống nghiệm 2 giọt bromothymol blue đã được lọc qua màng lọc 0,2µm. Cấy 1 vòng

que cấy vi khuẩn vào ống nghiệm sau đó phủ 1 lớp parafil lên bề mặt môi trường và

nuôi cấy ở 30C trong 48 giờ. Tiến hành quan sát sự thay đổi màu của môi trường để

xác định kết quả. Theo Janse 2005 [77], việc thực hiện thí nghiệm khả năng lên men-

oxy hóa glucose nhằm loại các chủng vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas spp. (hiếu khí

bắc buộc) và Pseudomonas spp. (hiếu khí) từ đó nhận diện chủng thuộc chi Erwinia

sp. (hiếu khí tùy tiện). Thí nghiệm nhằm mục đích xác định các vi khuẩn Gram âm có

khả năng chuyển hóa carbohydrate (glucose) trong điều kiện lên men kỵ khí hoặc hiếu

khí. Trong điều kiện lên men kỵ khí, acid pyruvat chuyển hóa thành 1 loạt các sản

phẩm acid tùy thuộc vào loại quá trình lên men. Hàm lượng các acid tạo thành trong

suốt quá trình lên men tăng lên sẽ làm cho chất chỉ thị bromthymol chuyển từ màu

xanh sang màu vàng trong điều kiện có hoặc không có mặt oxygen.

- Đánh giá khả năng oxy hóa tryptophan thành các hợp chất hữu cơ chứa vòng

indol: Môi trường pepton broth được chuẩn bị và cho vào mỗi ống nghiệm 5ml và

được vô trùng. Lấy một vòng que cấy vi khuẩn cấy vào môi trường và ủ ở 30C trong 48

giờ. Sau 48 giờ mỗi ống nghiệm cho 5 giọt thuốc thử Kovacs’s, lắc đều, để yên rồi đọc kết

quả thí nghiệm. Ống dương tính (+) sẽ có 1 lớp màu tím hoặc đỏ phía trên bề mặt môi

trường, ống âm tính (-) sẽ không tạo màu tím hoặc đỏ. Loài Ecc không có khả năng oxy

hóa tryptophan thành các hợp chất hữu cơ chứa vòng indol như Indole, Skatole (methyl

indole) và indole-acetate trong khi Echr thì có khả năng này [77].

- Đánh giá khả năng nhạy cảm với Erythromycine: Môi trường PDA sau khi khử

trùng được bổ sung erythromycine với hàm lượng 15µg/đĩa thạch (20 ml/đĩa). Vi khuẩn

được cấy điểm trên mặt thạch để kiểm tra khả năng phát triển sau 48 giờ ở nhiệt độ

thường. Loài Ecc không nhạy cảm với erythromycine trong khi Echr thì nhạy cảm với

kháng sinh này [77], [122].

- Phương pháp giải trình tự 16s rARN: Sau khi tiến hành các bước thí nghiệm loại

trừ, các dòng vi khuẩn đáp ứng yêu cầu xem như được nghi ngờ là Erwinia sp., được gửi

đến phòng xét nghiệm Nam Khoa, TpHCM để tiến hành định danh bằng phương pháp

khuếch đại gen PCR, giải trình tự gen mã hóa 16s rRNA và tra cứu trên BLAST

SEARCH.

2.3.6. Phương pháp chuẩn bị mẫu dịch vi khuẩn Erwinia carotovora

Mẫu vi khuẩn Erwinia sp. sau khi phân lập được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường

PG lỏng sau 24 giờ ở nhiệt độ 30C. Mẫu được pha loãng và do OD ở 610 nm đạt giá trị

0,25, với kết quả mày mẫu dịch vi khuẩn đạt 2,1 x 103 tế bào/ml [100].

2.3.7. Phương pháp gây bệnh nhân tạo

Mẫu vi khuẩn Erwinia sp. được nuôi trong môi trường PG lỏng ở điều kiện phòng,

trên máy lắc 120 vòng/phút, sau 24 giờ mẫu được pha loãng và do OD ở 610 nm đạt giá

trị 0,25 dùng làm dung dịch vi khuẩn gây bệnh, với kết quả mày mẫu vi khuẩn đạt 2,1 x

103 tế bào/ml.

Các mẫu trái cà chua nguyên liệu được rửa sạch, để ráo, rửa cồn 75% trong 3 phút.

Dùng kim mũi giáo nhọn châm vào mẫu trái cà chua ngay phần đầu của trái, chiều sâu và

chiều rộng vết chấm cố định là 1 x 2 mm, sau đó cho 5 l dịch vi khuẩn Erwinia sp. đã

chuẩn bị vào vết thương. Các mẫu được phân thành 3 lô được ủ trong hộp nhựa đã khử

trùng (16 x 26 cm), dưới đáy hộp có đặt 1 lớp giấy tiệt trùng được làm ẩm bằng nước cất

vô trùng để tạo độ ẩm, các hộp được đặt ở điều kiện phòng, mỗi mẫu lập lại 3 lần và có 1

mẫu làm đối chứng. Tiến hành theo dõi kích thước vết bệnh bên trong, bên ngoài theo thời

gian và mô tả triệu chứng bệnh [49, 101, 157].

2.3.8. Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in

vitro

Phương pháp đánh giá theo Zheng 2003 [175]: Các đĩa petri 950 mm đổ môi trường

PDA được chuẩn bị. Cho 0,1 ml dịch chitosan và 0,1 ml dịch vi khuẩn trộn đều sau đó

cho cấy trang trên mặt thạch, mẫu đối chứng dùng 0,1 ml nước cất và 0,1 ml dịch vi

khuẩn trộn đều, mỗi nồng độ chitosan được lập lại 3 lần. Các đĩa được ủ ở 30C sau 24

giờ sau đó đếm khuẩn lạc tính hiệu suất theo công thức:

Trong đó: N1 và N2 là số khuẩn lạc trên đĩa không và có

chitosan ở các nồng độ.

2.3.9. Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo

Mẫu trái cà chua sau thu hoạch được rửa sạch để ráo, xử lý cồn 75%, sau đó được

nhúng vào các dung dịch chitosan cần đánh giá đã được chỉnh pH = 5-5,5 và để ráo sau 24

giờ, dùng kim châm gây vết thương (1 x 2 mm) trên đầu trái cà chua. Tiến hành nuôi cấy

tăng sinh vi khuẩn Erwinia sp. trong môi trường PG sau 24 giờ, pha loãng để đạt 2,1 x 103

tế bào/ml, sau đó cho 5 l dịch vi khuẩn Ecc vào vết thương. Ủ mẫu bệnh trong các hộp

nhựa vô trùng được giữ ẩm ở nhiệt độ phòng. Tiến hành dùng thước đo cặp 1/10 để theo

dõi kích thước vết bệnh bên trong và bên ngoài. Hiệu quả kháng bệnh các các chitosan

được so sánh dựa trên mẫu đối chứng không nhúng chitosan và mẫu nhúng dung dịch

chitosan thương mại ở các nồng độ tương ứng.

2.3.10. Phương pháp xác định tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua

Tổng hàm lượng phenol trong trái cà chua được xác định bằng phương pháp so màu,

dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu được mô tả bởi Liu và cộng sự 2007 [99]. Lấy 0,5g mô

thịt trái cà chua, nghiền nhỏ. Sau đó cho vào 5 ml mathanol 70% và ủ ở 70oC trong 10

phút. Mẫu được ly tâm 4200 vòng/phút trong 30 phút. Mẫu được pha loãng đến 10 ml để

xác định tổng hàm lượng phenol. Lấy 50 l dịch mẫu đã pha loãng, sau đó thêm vào 250

l thuốc thử Folin-Ciocalteu đã pha loãng tỷ lệ (1:10). Sau 5 phút thêm vào 200 l dung

dịch Na2CO3 (75g/l) và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, sau đó tiến hành do mẫu ở bước

sóng 760 nm. Kết quả được tham chiếu trên đường chuẩn acid Gallic, kết quả tổng hàm

lượng phenol được tính theo mg acid Gallic / 100g trái tươi.

2.3.11. Phương pháp xử lý số liệu

+ Sử dụng phần mềm SPSS phân tích ANOVA kết hợp với Duncan test để so

sánh giá trị trung bình của các mẫu nghiên cứu. Số liệu báo cáo là giá trị trung bình

của 3 lần phân tích, giá trị p < 0,05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.

+ Sử dụng phần mềm Visio 2013 để vẽ các sơ đồ khối.

+ Sử dụng Origin Pro 8.5.1 để vẽ đồ thị, các phổ FTIR, XRD.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MAI MỰC LOLIGO SP

Tiến hành thí nghiệm theo mô tả ở mục 2.2.1, mai mực Loligo sp. sau khi thu

nhận được rửa sạch để loại tạp chất, sau đó sấy ở 60C trong 12 giờ và xay đến kích

thước 3-5 mm. Kết quả xác định thành phần hóa học của nguyên liệu sau quá trình tiền

xử lý ở trên được trình bày ở Bảng 3.1, Bảng 3.2 và Bảng 3.3.

3.1.1. Thành phần hóa học cơ bản

Bảng 3.1 trình bày hàm lượng các thành phần chính của nguyên liệu mai mực

Loligo sp. bao gồm chitin, protein, lipid và khoáng.

Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của mai mực ống Loligo sp

Chitin Protein Lipid Khoáng Nguyên liệu (%) (%) (%) (%)

[47]

35,8 57,2 1,9 1,37 Kết quả Mai mực (Loligo sp.) luận án  1,75  2,32  0,21  0,17

Mai mực (Illex argentinus) 31 64 2,3 1

[93]

[38]

Mai mực (Ommastrephes 35-40 58 - - bartrami)

Mai mực (Loligo sp.) 32-37 47,5 2,5 2,4

[36]

Mai mực (Loligo lessoniana 36-37 - 0,04 - và Loligo formosana)

[95]

Mai mực (Loligo plei và 40-42 - 1,9 - Loligo sanpaulensis)

[158]

 Giá trị trong bảng được tính trung bình từ kết quả 3-5 lần thí nghiệm theo trọng lượng khô tuyệt đối.

Vỏ tôm thẻ chân trắng 29,4 24,3 2,2 26,5 (Penaeus vanamei)

Kết quả cho thấy phế liệu mai mực Loligo sp. có hàm lượng β-chitin là 35,8%.

Giá trị này cao hơn nhiều so với hàm lượng α-chitin có trong vỏ đầu tôm thẻ Penaeus

vanamei là 29,4% [158], vỏ cua Callinectes sapidus là 12,9% và vỏ ghẹ chấm

Portunus trituberculatus là 17,1% [3]. Trong khi đó, kết quả này tương tự với kết quả

đánh giá của Chandumpai 2004, Kiruta 1993 và Lavall 2007 trên mai mực thuộc các

loài Loligo lessoniana, Loligo formosana, Loligo plei và Loligo sanpaulensis với hàm

lượng -chitin từ 35-42% [36, 93, 95]. Như vậy, phế liệu mai mực Loligo sp. thu nhận

tại các nhà máy chế biến thủy sản thải ra sau quá trình chế biến ở tỉnh Kiên Giang có

chứa một lượng lớn β-chitin và là nguồn nguyên liệu lý tưởng để thu nhận β-chitin.

Ngoài ra, kết quả phân tích cũng cho thấy hàm lượng khoáng có trong mai mực

Loligo sp. là rất thấp với 1,37%. Giá trị này thấp hơn nhiều khi so sánh với hàm lượng

khoáng có trong vỏ tôm thẻ Penaeus vanamei với 26,5%. Tuy nhiên, so với các kết

quả đánh giá này cũng tương tự với một số kết quả đã công bố trước đây đối với mai

các loài mực khác như Loligo lessoniana, Loligo formosana (0,05%) [36]; Loligo

sanpaulensis (1,9%) [95]; Todarodes pacifica (0,8%) [173]; Illex argentines (0,1%)

[47] và Dosidicus gigas (<1%) [81]. Đây là thông số rất quan trọng có ảnh hưởng đến

việc lựa chọn quy trình chiết rút và thu nhận -chitin. Đó là việc xem xét bỏ qua quá

trình khử khoáng khi thu nhận β-chitin từ mai mực. Nó vừa tránh được việc sử dụng

hóa chất, vừa tránh được quá trình cắt mạch chitin. Trong thực tế, Jung 2013 [79] và

Chandumpai 2004 [36] đã dựa trên kết quả phân tích thành phần mai mực và bỏ qua

bước khử khoáng bằng acid HCl trong quá trình tách chiết thu nhận β-chitin từ mai

mực. Việc bỏ qua bước khử khoáng còn có ý nghĩa khi sản xuất ở qui mô lớn, do làm

giảm thời gian và chi phí sản xuất cũng như làm giảm nguồn chất thải sau quá trình

khử khoáng gây ô nhiễm môi trường.

Như vậy, dựa trên kết quả phân tích thành phần hóa học cơ bản trong mai mực

ống Loligo sp. cho thấy các thành phần như chitin, khoáng, protein, lipid có trong phế

liệu mai mực ống Loligo sp. khá khác biệt so với trong phế liệu vỏ tôm cua ghẹ. Trong

đó, hàm lượng protein rất cao (57,2%) nhưng hàm lượng khoáng rất thấp (1,37%) so

với các phế liệu vỏ tôm, cua, ghẹ với protein (15-26%) và khoáng (26-35%). Do đó, có

cơ sở để xem xét có thể bỏ qua bước khử khoáng và tập trung chủ yếu vào bước khử

protein trong quy trình tách chiết, thu nhận chitin từ mai mực ống Loligo sp..

3.1.2. Thành phần khoáng

Việc xác định cụ thể các khoáng chất có trong nguyên liệu sẽ giúp cho việc đánh

giá phần nào bản chất nguyên liệu, lựa chọn tác nhân khử protein và độ tinh khiết của

sản phẩm thu được. Kết quả phân tích thành phần khoáng trong mai mực ống Loligo

sp. được trình bày trong Bảng 3.2. Theo đó, hàm lượng các thành phần Ca, Mg, Fe đều

cao hơn đáng kể so với các kết quả của Chaidumpai 2004 khảo sát trên loài Loligo

formosana, Loligo lessoniana [36] và Lavall 2007 trên loài Loligo plei, Loligo

sanpaulensis [95] điều này có thể là do sự khác biệt về loài, môi trường khu vực sống,

tuổi trưởng thành của mực nguyên liệu cũng như thời điểm mùa vụ đánh bắt.

Bảng 3.2. Thành phần khoáng trong mai mực Loligo sp., các loại mực khác và vỏ tôm

Thành phần (ppm)

Nguyên liệu

Ca Fe K Mg Na Zn

Kết quả Mai mực (Loligo sp.) 254 17,12 29,3 20,8 152,3 206 luận án

- Mai mực (Illex argentinus) 170 - 210 100 450 [47]

Mai mực (Loligo lessoniana - 17,74 7,73 - 3,30 - [36] và Loligo formosana)

Mai mực (Loligo sp.) 1025 30 255 1220 8540 200 [38]

Mai mực (Loligo plei và - 94,5 3,5 - 11,7 - [95] Loligo sanpaulensis)

Mai mực (Ommastrephes - 344 4 19 121 170 [93] bartrami)

Vỏ tôm (Penaeus vanamei) 3254 24,6 2381 - 2125 17,4 [2]

Khi so sánh với nguyên liệu vỏ tôm, mai mực chứa thành phần Ca là rất thấp

(254 ppm) so vỏ đầu tôm thẻ Penaeus vanamei (3254 ppm) hoặc vỏ tôm thể Penaeus

vanamei (4856 ppm) [2]. Do đó, có thể suy ra hàm lượng thành phần CaCO3 trong mai

mực Loligo sp. là rất thấp so với hàm lượng CaCO3 trong vỏ tôm Penaeus aztecus

(48,9%), tôm Penaeus durarum (42,2%), vỏ cua (66,5%) [10]. Điều này khẳng định

quá trình thu nhận -chitin từ mai mực Loligo sp. sẽ thuận lợi hơn và là cơ sở để xem

xét bỏ qua quá trình khử khoáng bằng acid HCl như trong quy trình thu nhận chitin

thông thường hiện nay từ vỏ tôm, cua, ghẹ. Ngoài ra, không phát hiện thấy thành phần

các kim loại nặng như Hg, Pb, As trong mai mực Loligo sp. Kết quả này cũng tương tự

các kết quả công bố của Jung 2013, Chaidumpai 2004, Chaussard 2004, Lavall 2007.

Điều đó khẳng định, mai mực là nguồn nguyên liệu tốt để thu nhận sản phẩm -chitin

và chitosan có độ tinh khiết cao và có thể được sử dụng trong các lĩnh vực như y dược,

y sinh và thực phẩm.

Như vậy, trong mai mực ống Loligo sp. có chứa một lượng rất nhỏ các khoáng

chất bao gồm cả CaCO3. Hơn nữa mai mực không phát hiện chứa các kim loại nặng.

Do đó, qui trình tách chiết thu nhận chitin từ mai mực sẽ thuận lợi hơn, kinh tế hơn do

rút ngắn thời gian và giảm lượng hóa chất sử dụng so với việc khử các thành phần phi

chitin trong vỏ tôm, cua và ghẹ. Hơn nữa, sản phẩm chitin thu được sẽ có độ tinh khiết

cao hơn, đáp ứng cho thu nhận chitosan sau này cũng như để ứng dụng đối với con

người như trong thực phẩm và y dược.

3.1.3. Thành phần acid amin

Thành phần acid amin được xem là một tạp chất có trong sản phẩm chitin và

chitosan điều chế từ các nguồn tự nhiên, đặc biệt là nguyên liệu thủy sản. Các acid

amin này ảnh hưởng rất lớn đến việc ứng dụng của chitin và chitosan. Ví dụ, chúng có

thể gây dị ứng cho người sử dụng, làm giảm độ tan, giảm chất lượng của sản phẩm

chitin và chitosan. Kết quả phân tích thành phần acid amin có trong nguyên liệu mai

mực ống Loligo sp. được trình bày trong Bảng 3.3.

Bảng 3.3. So sánh thành phần acid amin trong mai mực ống Loligo sp. và kết quả

tham khảo

Thành phần

Kết quả luận án Các kết quả tham khảo Acid amin

Mai mực Mai mực Vỏ tôm Vỏ tôm

Loligo sp. T. pacifica P. vannamei P.vannamei

(g/100g) (g/100g) (g/100g) (g/100g)

[158] [173, 174] [2]

Alanine 4,53 4,91 1,13 1,62

Glycine 4,39 4,63 2,92 1,66

Valine 3,83 3,55 0,65 0,79

Leucine 2,60 4,09 0,13 1,15

Isoleucine 1,58 1,61 0,53 -

Threonine 1,51 2,45 0,65 -

Serine 1,60 2,03 0,59 0,54

Proline 5,98 4,99 - 0,94

Aspartic acid 4,65 4,53 1,56 1,93

4-Hydroxyproline

Methionine 0,53 0,32 0,35 0,12

0,00 - - -

Acid glutamic 1,57 2,35 2,04 3,04

Phenylalanine 1,13 1,74 0,71 0,33

Lysine 2,78 2,37 0,11 1,01

Histidine 6,40 6,17 0,28 0,19

Hydroxylysine 0,00 - -

Tyrosine 6,68 6,13 0,53 0,74

Tổng cộng 49,76 54,91 12,18 14,06

Theo đó, trong nguyên liệu mai mực Loligo sp. các thành phần như Alanine,

Proline, Tyrosine và Histidine chiếm tỷ lệ lớn nhất (4,39-6,68 g/100g) trong khi các

thành phần khác như Leucine, Isoleucine, Serine, Proline, Methionine, Glutamic acid,

Phenylalanine có tỷ lệ thấp hơn (0,53-2,6 g/100g). Kết quả này phù hợp với kết quả

công bố của Youn 2013 [174] về thành phần acid amin trong mai mực Todarodes

pacifica tuy nhiên có sự chênh lệch nhỏ giữa các thành phần, điều này có thể là do

khác nhau về đặc điểm giống loài mực và độ tuổi trưởng thành của mực.

Nếu so sánh với thành phần acid amin của vỏ tôm thẻ Penaeus vanamei được

công bố của Dương 2014 và Trung 2012 cho thấy có sự chênh lệch lớn về hàm lượng

các acid amin. Cụ thể, hầu hết các thành phần aicd amin như: Alanine, Valine,

Leucine, Isoleucine, Aspartic acid, Lysine, Histidine và Tyrosine của mai mực ống đều

lớn hơn gấy 3-6 lần so với trong vỏ tôm thẻ. Tuy nhiên, một số ít các acid amin như

Glutamic, Phenylalanine là xấp xỉ gần nhau. Nhìn chung, tổng hàm lượng acid amin

trong mai mực Loligo sp. (49-55g/100g) lớn hơn gấp 3-4 lần tổng hàm lượng acid

amin có trong vỏ tôm thẻ Penaeus vanamei (12-14 g/100g).

Tóm lại, nguyên mai mực ống có chứa một số thành phần acid amin có hàm

lượng khá cao so với trong nguyên liệu vỏ tôm thẻ. Điều này cho thấy, cần tập trung

cho quá trình khử protein để loại bỏ các acid amin trong quy trình tách chiết, thu nhận

chitin. Từ đó có thể thu được chitin và chitosan tinh khiết hơn và có khả năng sử dụng

các sản phẩm này cho nhiều ứng dụng đòi hỏi chitin và chitosan có độ tinh khiết cao.

3.2. XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT -

CHITIN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP.

3.2.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến

quá trình khử protein trong mai mực Loligo sp.

Để có cơ sở tiến hành các khảo sát chi tiết, chúng tôi tiến hành khảo sát sơ bộ

trong một khoảng rộng ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thu nhận chitin từ mai

mực ống. Dựa trên kết quả xác định thành phần hóa học có trong nguyên liệu mai mực

ống Loligo sp. ở mục 3.1 và các nghiên cứu đã công bố trước đây về tách chiết, thu

nhận chitin từ mai mực và vỏ tôm (Bảng 1.7) làm cơ sở để xác định điều kiện khử

protein có trong mai mực nguyên liệu.

Bố trí thí nghiệm cụ thể được mô tả ở mục 2.2.2.1 và Hình 2.4. Tiến hành 3 lô thí

nghiệm ở 3 mức nhiệt độ 30C, 60C và 90C để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ

NaOH (3-5%) và thời gian khử đến quá trình khử protein trong mai mực Loligo sp.. Tỷ

lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) được giữ cố định trong tất cả các thí nghiệm là 1/10

(w/v). Mẫu xử lý định kỳ theo thời gian sẽ được thu nhận, được rửa trung tính và kiểm

tra hàm lượng protein còn lại. Kết quả được trình bày trong Hình 3.1 và Phụ lục 3.1.

Kết quả trình bày ở Hình 3.1 cho thấy quá trình khử protein thực hiện ở nhiệt độ

30oC đạt hiệu quả rất thấp. Mặc dù, quá trình khử tiến hành sau 72 giờ thì hàm lượng

protein ở tất các các nồng độ khảo sát vẫn cao hơn 1%. Hơn nữa, quan sát thí nghiệm

cho thấy sản phẩm chitin thu được bị phân rã và có độ nhớt giảm mạnh sau thời gian

72 giờ khử. Điều này có thể giải thích do sự thấm nước hoàn toàn vào trong tấm mai

mực và xảy ra sự cắt mạch chitin. Do đó, cần tiến hành ở nhiệt độ cao hơn thì hiệu quả

khử mới đạt yêu cầu (hàm lượng protein còn lại dưới 1%), đồng thời rút ngắn thời gian

phản ứng và giảm sự cắt mạch chitin. Hơn nữa, với điều kiện này sẽ rất khó để triển

khai sản xuất ở qui mô lớn do thời gian sản xuất kéo dài, cắt mạch lớn.

Hình 3.1. Hàm lượng protein còn lại sau quá trình khử protein dưới tác động của

3 yếu tố (nhiệt độ, nồng độ NaOH, thời gian).

Khi tiến hành quá trình khử ở nhiệt độ 60oC thì hiệu quả khử tăng đáng kể đồng

thời rút ngắn được thời gian nhiều so với khi tiến hành ở 30oC. Cụ thể, chỉ sau 12 giờ

thì hàm lượng protein còn lại là 1,7; 1,4 và 1,05% khi dùng các dung dịch NaOH ở các

nồng độ 3, 4 và 5%, tương ứng. Tuy nhiên, có thể thấy mặc dù có cải thiện đáng kể với

thời gian khử là 12 giờ nhưng hiệu quả khử vẫn chưa đạt yêu cầu với hàm lượng

protein còn lại nhỏ hơn 1%. Do vậy, để rút ngắn thời gian và đạt được hiệu quả khử thì

cần tiến hành ở nhiệt độ cao hơn.

Khi tiến hành quá trình khử ở nhiệt độ 90oC thì hiệu quả khử tăng hơn và giảm

thời gian tương đối so với tiến hành ở 60oC. Cụ thể, chỉ sau 8 giờ thì hàm lượng

protein còn lại là 1,5; 0,9 và 0,6% khi dùng các dung dịch NaOH ở các nồng độ 3, 4 và

5%, tương ứng. Theo đó, nếu tiến hành khử ở nhiệt độ này thì chỉ cần dùng nồng độ

NaOH là 4% thì có thể đạt được yêu cầu sản phẩm sau 8 giờ khử. Tuy nhiên, khi tiến

hành ở nồng độ 3% thì dù thời gian khử là 12 giờ thì hiệu quả khử (1,3%) vẫn chưa đạt

yêu cầu với hàm lượng protein còn lại nhỏ hơn 1%. Do vậy, cần có thêm các nghiên

cứu trong khoảng nhiệt độ này để rút ngắn thời gian và đạt được hiệu quả khử theo yêu

cầu. Các kết quả thu được ở trên cũng khá tương đồng với những kết quả đã được công

bố trước đây của Kiruta 1993 và Gupta 2010 [48, 68, 93, 108, 123].

Như vậy, để đạt được mục tiêu yêu cầu về hiệu quả của quá trình khử protein (hàm

lượng protein còn lại nhỏ hơn 1%), đồng thời giảm thời gian khử, giảm sự cắt mạch

chitin và có thể được áp dụng vào sản xuất ở qui mô lớn thì nên tiến hành các khảo sát

chi tiết thêm trong khoảng ảnh hưởng của nồng độ NaOH 3-5 %, nhiệt độ từ 70-90oC

trong khoảng thời gian 4-14 giờ với tỷ lệ nguyên liệu giữ cố định là (1/10, w/v).

3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng chi tiết các yếu tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH

đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch của sản phẩm β-chitin

Cơ chế quá trình khử protein trong mai mực bằng NaOH ở các điều kiện phản

ứng khác nhau liên quan trược tiếp đến bản chất liên kết chitin-protein và cấu trúc mai

mực. Theo Brine và cộng sự (1982), các liên kết giữa chitin-protein có thể chia thành 4

nhóm, bao gồm: liên kết bazơ Schiff, acetal (O-glycosidic), amide (N-glycosidic và N-

acylglucosaminyl) và các liên kết cộng hóa trị. Ba loại liên kết đầu đóng góp 68-91%

tượng tác chitin-protein. Các liên kết cộng hóa trị đóng góp 32-9% và rất khó bị loại

bỏ trong quá trình khử protein. Về mặt không gian, các mạch và sợi chitin được phân

bố trong nền protein (Hamodrakas, 2002). Các sợi chitin bao bọc bởi protein, các sởi

nhỏ lại tập hợp thành sợi lớn hơn và mỗi sợi lớn hơn này lại được bao bọc bởi protein.

Cuối cùng các sợi lớn này sẽ tạo thành các lớp chitin và các lớp này cấu thành nên mai

mực, như mô tả trong Hình 1.2 và Hình 1.5.

Do đó, trong quá trình khử protein, tốc độ khử sẽ có sự khác nhau đáng kể phụ

thuộc vào thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng và nồng độ NaOH. Các phân tử

protein tồn tại giữa các lớp chitin sẽ bị khử trước, các protein liên kết với chitin của

các sợi bên trong có sự liên kết và bao bọc chặt chẽ hơn và khó bị khử hơn rất nhiều.

Do đó, quá trình thủy phân protein ở các lớp sâu bên trong đòi năng lượng hoạt hóa

lớn hơn và tương tác nhiều hơn hay nói các khác cần nhiệt độ cao hơn, thời gian dài

hơn, nồng độ NaOH cao hơn. Cụ thể, khi nhiệt độ tăng thì động năng chuyển động của

các phần tử OH - (tách ra từ NaOH) sẽ lớn, dẫn đến sự cắt các liên kết giữa chitin-

protein mạnh hơn. Với thời gian phản ứng lâu hơn và nồng độ NaOH cao hơn, các ion

OH- có thời gian đi sâu hơn vào cấu trúc chặt chẽ của chitin-protein ở các lớp bên

trong. Do đó, hiệu quả khử protein tăng lên nhưng chậm hơn giai đoạn đầu và ở nồng

độ NaOH thấp. Tuy nhiên, sự cắt mạch chitin lại xảy ra mạnh hơn do sự tương tác lớn

giữa tác nhân OH- với các phân tử chitin tự do.

Kết quả đánh giá ảnh hưởng chi tiết các yếu tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ

NaOH đến hiệu quả khử protein và quá trình cắt mạch của sản phẩm β-chitin được

trình bày trong Hình 3.2.

3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử

của sản phẩm β-chitin

Từ kết quả đánh giá sơ bộ điều kiện khử protein ở mục 3.2.1, tiến hành 5 lô thí

nghiệm khử protein từ mai mực Loligo sp. ở các mức nhiệt độ 70, 75, 80, 85 và 90C.

Quá trình khử protein được thực hiện ở nồng độ NaOH 4% (w/v), thời gian khử 12 giờ

với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1/10, w/v), mẫu sau khi xử lý được rửa trung tính, tiến

hành đánh xác định hàm lượng protein còn lại và khối lượng phân tử trung bình (Mw).

Kết quả được trình bày trong Hình 3.2a và Phụ lục 3.2.

Từ Hình 3.2a và Phụ lục 3.2 cho thấy, khi tăng nhiệt độ thì hiệu quả khử tăng nhưng quá trình cắt mạch chitin cũng tăng. Cụ thể, khi tăng nhiệt độ từ 70 lên 90oC thì

hàm lượng protein còn lại và khối lượng phân tử trung bình của chitin giảm từ DD =

1,65% và Mw = 8550 kDa xuống còn DD = 0,3% và Mw = 5040 kDa, tương ứng. Để

đạt mục tiêu đặt ra là hàm lượng protein còn lại < 1% thì chỉ cần tiến hành ở nhiệt độ 80oC. Ở nhiệt độ này, hàm lượng protein còn lại và khối lượng phân tử trung bình của

chitin lần lượt là DD = 0,7% và Mw = 8330 kDa.

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử

protein và sự cắt mạch β-chitin.

Khi so sánh điều kiện ảnh hưởng của cùng nhiệt độ đến hiệu quả khử protein và

sự cắt mạch polyme trong quá trình thu nhận chitin từ mai mực với các nguồn khác

như vỏ tôm, cua và ghẹ thì thấy rằng hiệu quả khử đối với mai mực tốt hơn nhiều. Ví

dụ, Chang và cộng sự 1997 [37] khử protein thu nhận chitin từ vỏ tôm đỏ Synuchus sp.

ở điều kiện NaOH 10%, thời gian 6 giờ, nhiệt độ 75oC. No và Mayers 1995 [113] khử

protein thu nhận chitin từ vỏ tôm hùm ở điều kiện NaOH 10%, thời gian 5 giờ, nhiệt

độ 100oC. Chien và cộng sự 2016 [42] khử protein thu nhận chitin từ vỏ cua

Chionoecetes sp. ở điều kiện NaOH 4%, thời gian 3 giờ, nhiệt độ 100oC. Điều này có

thể giải thích do cấu trúc và thành phần nguyên liệu ban đầu như độ đóng rắn của vỏ

tôm, cua, ghẹ cao hơn do có hàm lượng khoáng lớn hơn so với mai mực. Chitin có

trong vỏ tôm, cua và ghẹ là dạng -chitin với độ rắn cao hơn, trong khi chitin trong

mai mực là dạng β-chitin với độ rắn thấp hơn.

Khi phân tích các giá trị trung bình về hàm lượng protein còn lại sau quá trình

khử theo chuẩn Duncan (α= 0,005) cho thấy các giá trị tại các mức nhiệt độ khác nhau

đều có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Hàm lượng protein còn lại sau khử tỷ lệ

nghịch với nhiệt độ sử dụng trong quá trình khử, khi tăng nhiệt độ khử thì hiệu suất

khử protein càng tăng hay hàm lượng protein còn lại trong mai mực càng giảm. Mục

tiêu nghiên cứu đạt được khi nhiệt độ ở mức 80C, 85C và 90C, ở các điều kiện khử

này các mẫu thu được đều có hàm lượng protein còn lại đều dưới 1% và lần lượt đạt

mức là 0,66%, 0,37% và 0,3%. Tuy nhiên khi so sánh giá trị trung bình theo chuẩn

Duncan (α= 0,005) thì hàm lượng protein còn lại của các mức nhiệt độ 85C và 90C

không có sự khác biệt.

Khi so sánh các giá trị trung bình của khối lượng phân tử trung bình (Mw) -

chitin trong quá trình khử theo chuẩn Duncan (α= 0,005) cho thấy các giá trị Mw ở các

mức nhiệt độ 70, 75 và 80C không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê, điều này

chỉ rõ khi quá trình khử được thực hiện ở điều kiện NaOH 4%, thời gian khử 12 giờ, tỷ

lệ NL/DM (1/10, w/v) thì yếu tố nhiệt độ tăng từ 70-80oC đều không làm cắt đáng kể

mạch chitin trong quá trình khử, với các giá trị lần lượt là 8545, 8460 và 8320 kDa.

Các giá trị Mw ở các mức nhiệt độ 80, 85 và 90C đều có sự khác biệt mang ý nghĩa

thống kê. Khối lượng phân tử trung bình (Mw) của -chitin thu được giảm khi tăng

nhiệt độ khử, như vậy ở cùng điều kiện khử khi nhiệt độ khử tăng trên 80C sẽ làm

cho khối lượng phân tử trung bình giảm rất nhanh từ 8320 kDa ở 80oC xuống còn

7341 kDa ở 85C và 6093 kDa ở 90C.

Từ đó cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả của quá trình khử

protein và tính chất của sản phẩm thu được. Có thể giải thích điều này, khi nhiệt độ

tăng thì các ion OH- (từ NaOH) sẽ chuyển động nhanh hơn, sự tương tác giữa OH- và

bề mặt mai mực và liên kết giữa protein và chitin cũng nhiều hơn. Do đó, sự cắt mạch

liên kết trên xảy ra nhanh và mạnh hơn. Mặt khác, ở nhiệt độ cao cũng có thể dẫn đến

sự cắt mạch chitin trong môi trường kiềm. Ngoài ra, khi tiến hành sản xuất ở qui mô

lớn phải đáp ứng yêu cầu năng lượng cũng như máy móc thiết bị để gia nhiệt, do đó sẽ

có thể làm tăng giá thành của sản phẩm thu được.

Như vậy, yếu tố nhiệt độ có sự tương tác mạnh với hàm lượng protein còn lại và

khối lượng phân tử trung bình của -chitin sau quá trình khử. Đặc biệt khi yếu tố nhiệt

độ tăng trên mức 80oC sẽ làm quá trình cắt mạch xảy ra mạnh mẽ trong khi hiệu suất

khử protein lại rất thấp. Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy để đạt được mục tiêu

nghiên cứu là thu được sản phẩm -chitin có hàm lượng protein dưới 1% và hạn chế

thấp nhất quá trình cắt mạch chitin trong quá trình khử thì nhiệt độ thích hợp để khử

protein là 80oC. Do đó, Mức nhiệt độ thích hợp được chọn là 80oC cho các thí nghiệm

nghiên cứu tiếp theo.

3.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử

của sản phẩm β-chitin

Tại cùng điều kiện nhiệt độ khử và nồng độ NaOH, thì kéo dài thời gian sẽ dẫn

đến sự hấp thụ hoàn toàn nước và gây trương nở các mạch polymer trong mai mực.

Khi đó, hiệu quả khử protein sẽ tăng nhưng sự cắt mạch polymer cũng sẽ nhiều hơn.

Ngoài ra, khi tiến hành sản xuất ở qui mô lớn, càng kéo dài thời gian thì chi phí sản

xuất sẽ càng tăng, do đó sẽ làm tăng giá thành của sản phẩm thu được.

Từ kết quả đánh giá sơ bộ điều kiện khử protein ở mục 3.2.1 và kết quả xác định

được nhiệt độ khử thích hợp để khử protein ở mục 3.2.2.1, tiến hành 6 lô thí nghiệm

khử protein từ mai mực Loligo sp. ở các mức thời gian khử 4, 6, 8, 10, 12 và 14 giờ.

Các điều kiện khác được giữ cố định gồm nồng độ NaOH 4% (w/v), nhiệt độ 80C với

tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1/10, w/v), mẫu sau khi xử lý được rửa trung tính, tiến

hành đánh xác định hàm lượng protein còn lại và khối lượng phân tử trung bình (Mw).

Kết quả được trình bày trong Hình 3.2b và Phụ lục 3.3.

Kết quả phân tích trong Hình 3.3b cho thấy, ở điều kiện khảo sát thì hiệu quả khử

protein tăng nhanh từ 4 giờ (4,35%) đến 6 giờ (1,85%) sau đó giảm dần và đạt mục

tiêu đặt ra sau 10 giờ (0,9%). Trong khi đó, khối lượng phần tử trung bình của chitin

thu được gần như không giảm nhiều từ 4 giờ (8630 kDa) cho đến 8 giờ (8240 kDa) và

sau đó giảm khá nhanh đến 14 giờ (5120 kDa). Như vậy, để đảm bảo hiệu quả cắt

mạch và tính chất mạch dài của sản phẩm chitin thì nên chọn thời gian khử là 10 giờ.

Khi so sánh với quá trình thu nhận chitin từ vỏ tôm thì nhận thấy rằng, nếu tăng

các điều kiện về nhiệt độ, nồng độ NaOH thì thời gian khử protein nhanh chóng hơn.

Ví dụ, Percot và cộng sự 2003 [120] khử protein thu nhận chitin từ vỏ tôm

Parapenaeopsis sp. ở điều kiện NaOH 4%, nhiệt độ 70oC cần thời gian 24 giờ để đạt

hiệu quả khử 99% protein. Nguyên nhân cũng có thể được giải thích do cấu trúc và

thành phần khác nhau giữa vỏ tôm và mai mực như giải thích ở mục 3.2.2.

Khi phân tích và so sánh các giá trị trung bình về hàm lượng protein còn lại sau

quá trình khử tại các mức thời gian khử khác nhau theo chuẩn Duncan (α = 0,005) cho

thấy các giá trị tại các mức thời gian 10, 12 và 14 giờ không có sự khác biệt về hiệu

xuất khử. Điều này cho thấy ở cùng điều kiện khử nhiệt độ 80C, nồng độ NaOH 4%

thì quá trình khử protein đạt hiệu quả trong thời gian 10 giờ khử, nếu tiếp tục kéo dài

thời gian khử thì hiệu suất khử thay đổi không đáng kể.

Khi phân tích và so sánh giá trị trung bình về khối lượng phân tử (Mw) của -

chitin ở các mức thời gian theo chuẩn Duncan (α= 0,005) cho thấy các giá trị có sự

khác biệt mang ý nghĩa thống kê. Kết quả phân tích ở Hình 3.2b cũng cho thấy khối

lượng phân tử của -chitin giảm khi kéo dài thời gian khử và giảm mạnh khi thời gian

khử vượt trên 8 giờ. Cụ thể ở mức 8238 kDa sau 8 giờ khử xuống còn 7010 kDa sau

10 giở khử và quá trình cắt mạch tiếp tục tăng mạnh khi thời gian khử tiếp tục kéo dài.

Như vậy, yếu tố thời gian khử có sự tương tác mạnh với hàm lượng protein còn

lại và khối lượng phân tử chitin sau quá trình khử (P = 0,000). Từ các kết quả phân

tích chỉ rõ, quá trình khử protein phải sau 10 giờ thì hàm lượng protein còn lại mới

đạt mục tiêu nghiên cứu dưới 1%, tuy nhiên quá trình cắt mạch chitin cũng xảy ra

nhanh sau 8 giờ xử lý. Vì vậy để hạn chế tối đa quá trình cắt mạch chitin thì thời gian

khử thích hợp là 10 giờ. Do đó, chúng tôi chọn thời gian khử là 10 giờ cho các thí

nghiệm sau.

3.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và khối lượng

phân tử của sản phẩm β-chitin

Nồng độ NaOH có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả của quá trình khử protein

cũng như quá trình cắt mạch chitin xảy ra trong quá trình khử. Như đã trình bày trong

phần mục 1.1.2, trong mai mực thành phần chitin và protein có liên kết rất chặt chẽ với

nhau thông qua liên kết cộng hóa trị (Hình 1.3). Do đó, khi tăng nồng độ NaOH thì số

lượng các ion OH- tăng lên, sự tương tác giữa OH- và bề mặt mai mực và liên kết giữa

protein và chitin cũng nhiều hơn. Do đó, sự cắt liên kết giữa chitin và protein trong

mai mực xảy ra nhanh và mạnh hơn. Tuy nhiên, sự cắt mạch chitin cũng mạnh hơn

trong môi trường kiềm mạnh. Ngoài ra, khi tiến hành sản xuất ở qui mô lớn dùng

nhiều NaOH sẽ tăng giá thành sản xuất và tăng chi phí cho quá trình xử lý nước thải,

do đó sẽ có thể làm tăng giá thành của sản phẩm thu được.

Từ kết quả đánh giá sơ bộ điều kiện khử protein ở mục 3.2.1 và xác định được

nhiệt độ và thời gian khử thích hợp để khử protein trong mai mực ống Loligo sp. ở

mục 3.2.2.1. và mục 3.2.2.2. Tiến hành tiến hành 5 lô thí nghiệm khử protein từ mai

mực Loligo sp. ở nhiệt độ 80C, thời gian khử 10 giờ với tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch

(1/10, w/v), các lô thí nghiệm được thực hiện lần lượt ở các mức nồng độ NaOH: 3;

3,5; 4; 4,5 và 5%. Mẫu sau khi xử lý được rửa sạch đến trung tính, tiến hành đánh xác

định hàm lượng protein còn lại và khối lượng phân tử trung bình (Mw) của chitin thu

được. Các kết quả được trình bày trong Hình 3.2c và Phụ lục 3.4.

Kết quả phân tích cho thấy, ở cùng điều kiện nhiệt độ khử 80oC và sau thời gian

khử 10 giờ thì quá trình khử protein rất hiệu quả ở nồng độ NaOH từ 3,5% trở lên. Cụ

thể ở các mức nồng độ NaOH 3,5; 4; 4,5 và 5% hàm lượng protein còn lại trong mẫu

sau khử lần lượt là 0,93; 0,63; 0,33 và 0,23%. Tuy nhiên, khi mức nồng độ NaOH tăng

trên 4% thì quá trình cắt mạch chitin xảy ra đáng kể, khối lượng phân tử trung bình

của chitin Mw = 8545 kDa ở mức NaOH 4% đã bị phân cắt xuống còn 7940 kDa ở

mức NaOH 4,5% và chỉ còn 6320 kDa khi nồng độ NaOH tăng ở mức 5%. Do đó,

chúng tôi chọn nồng độ NaOH 4% là nồng độ phù hợp nhất để khử protein khi thu

nhận chitin từ mai mực.

Khi so sánh các giá trị trung bình của hàm lượng protein còn lại sau quá trình

khử ở các mức nồng độ NaOH khác nhau cho thấy các giá trị có sự khác biệt mang ý

nghĩa thống kê, tuy nhiên các giá trị tại mức nồng độ NaOH 4,5% và 5% không có sự

khác biệt, điều này cho thấy việc tăng nồng độ NaOH từ 4,5% lên 5% không có ý

nghĩa đối với quá trình khử protein ở cùng điều kiện nhiệt độ khử 80oC và thời gian

khử 10 giờ. Kết quả cho thấy để hàm lượng protein còn lại dưới 1% đạt mục tiêu

nghiên cứu thì nồng độ NaOH phải đạt mức 4%.

Khi so sánh các giá trị trung bình về khối lượng phân tử trung bình (Mw) của -

chitin ở các mức nồng độ NaOH khác nhau theo chuẩn Duncan (α= 0,005) cho thấy có

sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê ở tất cả các giá trị. Khối lượng phân tử -chitin

giảm khi tăng tăng nồng độ NaOH và quá trình cắt mạch xảy ra mạnh mẽ khi nồng độ

NaOH tăng trên 4,5%, cụ thể khối lượng phân tử của chitin từ 7940 kDa ở NaOH

4,5% xuống còn 6320 kDa ở NaOH 5%.

Như vậy, yếu tố nồng độ NaOH có sự tương tác mạnh với hàm lượng protein còn

lại và khối lượng phân tử trung bình của -chitin trong quá trình khử. Với điều kiện

khử là nhiệt độ 80oC và thời gian khử 10 giờ, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi nguyên

liệu/dung môi (1/10, w/v) thì hiệu suất khử chỉ đạt tối đa khi mức nồng độ NaOH tăng

đến 4,5%, nếu nồng độ NaOH tiếp tục tăng lên 5% thì hiệu xuất khử vẫn không cho

thấy sự khác biệt và thực nghiệm cho thấy lúc này chỉ xảy ra quá trình cắt mạch chitin.

Do đó để đáp ứng mục tiêu nghiên cứu là hàm lượng protein còn lại sau quá trình khử

<1% và hạn chế thấp nhất quá trình cắt mạch chitin thì mức nồng độ NaOH thích hợp

cho quá trình khử protein được chọn là 4%.

Tóm lại, từ các kết quả phân tích ở các mục 3.2.1; 3.2.2.1; 3.2.2.2; 3.2.2.3 và phụ lục

3.5 cho thấy 3 yếu tố khảo sát: nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian khử đều có tương

tác mạnh đối với quá trình khử protein trong mai mực ống và quá trình cắt mạch chitin

trong quá trình khử. Khi tăng bất kỳ một trong 3 yếu tố sẽ là thay đổi hàm lượng

protein còn lại và sự cắt mạch chitin trong quá trình khử. Kết quả này là do các mạch

chitin liên kết rất chặt chẽ với các thành phần protein, khoáng thông qua 4 nhóm liên

kết chính: các liên kết cơ sở Schiff, liên kết O-glycosidic, liên kết N-glycosidic (68-

91%) và các liên kết cộng hóa trị rất khó bị phân cắt [37]. Trong môi trường NaOH,

mai mực bắt đầu trương nở cấu trúc và tiếp xúc với NaOH và cắt đứt các liên kết

protein và phức protein chitin từ đó khử dần protein trong mai mực. Tuy nhiên quá

trình cần hỗ trợ của yếu tố nhiệt độ và thời gian để NaOH có thể thấm sâu vào cấu trúc

và khử hoàn toàn protein trong nguyên liệu. Mặt khác, quá trình thấm sâu vào cấu trúc

để khử protein đã làm đứt các liên kết nội giữa các mạch chitin và làm giảm khối

lượng phân tử trung bình của chitin. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu là sản phẩm

chitin thu nhận có hàm lượng protein nhỏ hơn 1%, đồng thời hạn chế quá trình cắt

mạch của sản phẩm chitin, chúng tôi đề xuất điều kiện khử protein là nồng NaOH 4%

ở nhiệt độ 80C trong thời gian 10 giờ. Sản phẩm -chitin thu được có hàm lượng

protein còn lại 0,63% với Mw là 8545 kDa.

Khi so sánh với quá trình thu nhận chitin từ vỏ tôm, cua và ghẹ thì nhận thấy nếu

ở cùng các điều kiện về nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian thì hiệu quả khử protein

đối với mai mực cũng tốt hơn khử protein thu nhận chitin từ vỏ tôm. Nguyên nhân

cũng có thể được giải thích do cấu trúc và thành phần khác nhau giữa vỏ tôm và mai

mực như giải thích ở mục 3.2.2.

3.2.3. Tính chất của sản phẩm β-chitin từ mai mực ống

3.2.3.1. Thành phần và tính chất cơ bản của sản phẩm -chitin

Để đánh giá hiệu quả của quá trình khử protein, tính chất của sản phẩm, chúng ta

cần xác định thành phần hóa học cơ bản của sản phẩm β-chitin thu được sau quá trình

khử. Kết quả đánh giá này sẽ là cơ sở để sử dụng sản phẩm chitin thu được cho các

ứng dụng khác nhau cũng như khi dùng chitin này để điều chế chitosan thông qua quá

trình deacetyl. Sản phẩm chitin dùng để đánh giá ở đây là sản phẩm của quá trình khử

protein tại điều kiện tốt nhất đã khảo sát trong các mục 3.2.1, 3.2.2, 3.2.3 và 3.2.4.

Điều kiện thu nhận β-chitin sau khi xử lý nguyên liệu mai mực ống trong môi

trường NaOH 4%, ở nhiệt độ 80oC trong thời gian khử 10 giờ với tỷ lệ nguyên

liêu/dung môi (1:10, w/v). Các tính chất cơ bản của sản phẩm được trình bày trong

Hình 3.3; Bảng 3.4; Bảng 3.5 và Bảng 3.6.

Hình 3.3. (a) Ảnh của mực ống, (b) mai mực ống và (c) sản phẩm β-chitin.

Hình 3.3 cho thấy, so với mai mực ống có màu hơi vàng và trong suốt thì sản

phẩm -chitin ở dạng bột có màu trắng sáng. Trong thực tế, hiện nay chưa có sản

phẩm -chitin thương mại nên không thể so sánh. Còn sản phẩm -chitin thương mại

cũng có màu trắng sáng tương tự.

Bảng 3.4 cho thấy sản phẩm -chitin thu nhận từ mai mực đáp ứng các chỉ tiêu

chất lượng so với sản phẩm -chitin thương mại và có thể ứng dụng trong các lĩnh vực

dược và thực phẩm do công ty Heppe GmbH (Germany) công bố [146]. Cụ thể, sản

phẩm -chitin thu được có hàm ẩm dưới 10%, có hàm lượng kim loại nặng không phát

hiện, hàm lượng protein còn lại thấp hơn 0,63 %, khối lượng phân tử trung bình cao

(Mw = 8545 kDa) và có độ deacetyl (DD = 19,7%).

Đáng chú ý, mặc dù không qua giai đoạn khử khoáng bằng acid HCl và khử màu

như các quy trình thu nhận chitin thông thường nhưng sản phẩm -chitin vẫn đạt tiêu

chuẩn thương mại với độ tinh khiết cao. Điều này có thể giải thích là do bản chất mai

mực ống chứa các thành phần khoáng rất thấp dưới 2%, kết quả đánh giá thành phần

khoáng trong mai mực (Bảng 3.2) cũng cho thấy thành phần Ca rất thấp (254 ppm) so với

vỏ đầu tôm thẻ có thành phần Ca là 3254 ppm. Vì thế, khi tiến hành xử lý với dung dịch

NaOH thì hành lượng khoáng trên cũng bị loại bỏ. Trong khi đó, Chaussard và Domard

2004 [38] chứng minh rằng trong vỏ tôm thành phần CaCO3 chiếm 20% và quá trình khử

protein trong môi trường NaOH thì thành phần CaCO3 này không bị khử đi nhiều.

Kết quả tương tự đã được công bố đối với mai mực ống khi tiến hành khử protein

trong môi trường NaOH thì thành phần Ca đã giảm đáng kể từ 1025 ppm xuống còn

80 ppm [32]. Tác giả cũng kết luận rằng thành phần Ca trong mai mực ngoài ở dạng

CaCO3 còn tồn tại dưới dạng khác. Trong luận án này, kết quả thực nghiệm cũng cho

thấy hàm lượng Ca trong mai mực là 254 ppm và sau khử protein chỉ còn 10,4 ppm

(Bảng 3.5).

Như vậy, thông qua quá trình khử protein bằng NaOH, các thành phần khoáng

trong mai mực đã bị loại trừ. Sản phẩm -chitin thu được có hàm lượng protein còn lại

rất thấp (0,63%) đáp ứng yêu cầu chất lượng của sản phẩm chitin thương mại. Do đó

chúng tôi đề xuất bỏ qua quá trình khử khoáng bằng acid HCl là hợp lý.

Bảng 3.4. Tính chất của mai mực ống và sản phẩm β-chitin

Tính chất Mai mực Loligo sp. β-chitin

Màu sắc Trong suốt Trắng, sáng

Ẩm (%) < 12 < 10

β-chitin (%) 35,80 ± 1,75 99,30 ± 0,50

Protein (%) 57,20 ± 2,32 0,63 ± 0,02

Lipid (%) 1,90 ± 0,21 Nd

Khoáng (%) 1,37 ± 0,17 Nd

DD (%) - 19,7 ± 1,56

Nd: not detected (không phát hiện).

- 8545 ± 150 Mw (kDa)

Bảng 3.4 cũng cho thấy khối lượng phân tử trung bình (Mw) của β-chitin thu

nhận từ mai mực (8545 kDa) cao hơn rất nhiều so với sản phẩm chitin từ vỏ tôm thẻ

(1652 kDa) [2]. Với khối lượng phân tử cao, chitin từ mai mực sẽ là nguồn chitin nền

lý tưởng cho nhiều ứng dụng khác nhau và dùng để thu nhận chitosan có khối lượng

phân tử lớn dùng cho nhiều mục đích như tạo màng chống viêm chữa bỏng, da nhân

tạo [54, 89], chỉ khâu cấy ghép phẫu thuật [33], màng phủ y sinh [126], điều trị ung

thư mục tiêu (giữ và tích lũy thuốc trong khối u) [151].

Bảng 3.5 trình bày kết quả phân tích hàm lượng các kim loại bao gồm cả những

kim loại nặng độc hại có trong thành phần của mai mực ống nguyên liệu (chưa khử

protein) và sản phẩm -chitin (sau quá trình khử protein). Theo đó, mai mực sau khi

xử lý bằng NaOH 4% ở nhiệt độ 80oC trong thời gian 10 giờ thì hàm lượng các kim

loại còn lại trong sản phẩm chitin thấp hơn rất nhiều. Ví dụ, hàm lượng Canxi còn lại

là 10,4 ppm sau quá trình khử so với trong nguyên liệu ban đầu là 254 ppm. Đặc biệt,

hàm lượng tất cả các nguyên tố kim loại nặng như Pb, As, Cd đều không phát hiện.

Bảng 3.5. Thành phần khoáng trong mai mực và sản phẩm β-chitin

Kết quả luận án Kết quả tham khảo [93]

Thành phần Mai mực Sản phẩm Mai mực β-chitin

Loligo sp. β-chitin

Ca (ppm) 254 10,4 334 12

Fe (ppm) 17 8,2 4 2

K (ppm) 29 4,7 19 6

Mg (ppm) 21 6,3 121 13

Na (ppm) 152 55,4 170 79

Zn (ppm) 206 6,2 - -

Pb (ppm) Nd Nd Nd Nd

As (ppm) Nd Nd Nd Nd

Nd: not detected (không phát hiện).

Cd (ppm) Nd Nd Nd Nd

Bảng 3.6. Hàm lượng acid amin trong mai mực và sản phẩm β-chitin

Kết quả tham khảo [174]

Acid amin Mai mực (g/100g) β-chitin (g/100g)

Alanine Mai mực (g/100g) 4,91 4,53 0,17 β-chitin (g/100g) Nd

Glycine 4,39 0,07 4,63 Nd

Valine 3,83 0,05 3,55 0,018

Leucine 2,60 0,03 4,09 Nd

Isoleucine 1,58 Nd 1,61 Nd

Threonine 1,51 Nd 2,45 Nd

Serine 1,60 0,05 2,03 Nd

Proline 5,98 0,06 4,99 Nd

4,65 0,53 Nd 1,57 1,13 2,78 6,40 0,00 Nd Nd Nd 0,06 0,06 Nd 0,14 Nd 4,53 0,32 - 2,35 1,74 2,37 6,17 - 0,007 Nd - Nd Nd 0,23 0,22 - Acid Aspartic Methionine 4-Hydroxyproline Acid glutamic Phenylalanine Lysine Histidine Hydroxylysine

0,06 0,75 6,13 54,91 Nd 0,499 6,68 49,76

Tyrosine Tổng Nd: not detected (không phát hiện).

So sánh với các kết quả công bố của Kiruta 1993 thu nhận -chitin trên mai mực

Ornmastrephes bartrami [93] và Jung 2013 trên mai mực Dosidicus gigas [79] thì các

thành phần như Ca, K, Na đều có hàm lượng thấp hơn. Điều này có thể lý giải là do sự

khác biệt về loài và tuổi trưởng thành của mực. Hàm lượng các kim loại Fe, Zn đều

dưới mức giới hạn gây độc tính, điều này khẳng định rằng mai mực ống Loligo sp. thật

sự là nguồn nguyên liệu lý tưởng để thu nhận chitin, chitosan tinh khiết có thể ứng

dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao như y dược, y sinh và thực phẩm, kết quả này

cũng tương tự như các công bố trước đây của Chaussard và Domard 2004 [38].

Bảng 3.6 trình bày kết quả phân tích thành phần acid amin có trong mai mực và

còn lại trong -chitin sau quá trình khử protein, đồng thời so sánh với công bố tương

tự trước đây của Youn và cộng sự 2003. Theo đó, khi so sánh với hàm lượng acid amin trước và sau quá trình xử lý NaOH 4%, nhiệt độ 80oC trong thời gian 10 giờ, cho

thấy hầu hết các acid amin đều bị loại bỏ đáng kể. Các thành phần như Alanine,

Proline, Tyrosine và Histidine chiếm hàm lượng cao đều bị khử còn lại dưới 0,05%,

các thành phần khác như Leucine, Isoleucine, Serine, Proline, Methionine, acid

glutamic, Phenylalanine có hàm lượng rất thấp gần như bị khử hoàn toàn sau quá trình

xử lý. Kết quả này phù hợp với kết quả công bố của Youn 2013 về hàm lượng các acid

amin còn lại trong -chitin được thu nhận từ mai mực Todarodes pacifica ở điều kiện

nồng độ NaOH 3%, nhiệt độ 121oC, áp suất 15 psi trong thời gian 30 phút [174].

Như vậy, kết quả thực nghiệm đã cho thấy sau quá trình khử, hàm lượng acid

amin giảm đáng kể từ 49,75 (g/100g) trong mai mực ban đầu xuống còn 0,75 (g/100g)

trong sản phẩm β-chitin. Điều này cho thấy quá trình khử protein đạt hiệu quả, đáp

ứng mục tiêu nghiên cứu và có độ tinh khiết phù hợp cho nhiều ứng dụng khác nhau.

So sánh với kết quả công bố của Youn 2013 thu nhận -chitin từ mai mực Todarodes

pacifica [174] cho thấy hàm lượng các acid amin Alanine, Glycine, Leucine, Serine,

Proline trong sản phẩm -chitin thu được đều cao hơn, tuy nhiên một số acid min khác

lại có hàm lượng thấp hơn như acid Aspartic, Lysine, Histidine. Điều này là do sự

khác biệt về nguồn nguyên liệu, và điều kiện thu nhận chitin.

3.2.3.2. Cấu trúc bề mặt của mai mực và sản phẩm β-chitin

Nghiên cứu cấu trúc bề mặt của mai mực cho biết cấu trúc và sự sắp xếp các

lớp chitin liên kết với protein và sự phân bố của khoáng giữa các lớp chitin trước khi

tiến hành khử protein. Trong khi đó, cấu trúc bề mặt của sản phẩm chitin cho thấy

phần nào độ tinh khiết do không phát hiện thấy các hạt khoáng và độ rắn giảm do các

lớp chitin không còn nguyên vẹn sau xử lý với dung dịch NaOH.

Hình 3.4 là ảnh chụp dưới kính hiển vi quét điện tử (SEM) đối với mặt cắt của

mai mực trước và sau quá trình xử lý với NaOH 4%. Quan sát bề mặt cắt của nguyên

liệu mai mực ống Loligo sp. (Hình 3.4a) thấy rõ các tấm chitin được sắp xếp song song

có định hướng (z) và liên kết chặt chẽ các với các thành phần khác như protein, lipid

và khoáng tạo nên cấu trúc của mai mực. Sau quá trình khử, cấu trúc các tấm chitin

vẫn được bảo toàn nhưng độ dày của chúng lại giảm đáng kể (Hình 3.4b). Điều này có

thể giải thích do các thành phần phi chitin như protein, lipid và khoáng đã được loại bỏ

sau khi xử lý. Đáng chú ý là sau quá trình khử các tấm chitin gần như được bảo toàn

dưới tác động của các yếu tố khử, chứng tỏ không có sự cắt mạch chitin đáng kể xảy

ra. Kết quả tương tự cũng đã được Lavall 2007 khẳng định trên 2 loài mực là Loligo

plei và Loligo sanpaulensis [95].

Hình 3.4. Hình SEM chụp bề mặt cắt của (a) mai mực ống và (b) sản phẩm β-chitin.

3.2.3.3. Độ kết tinh của mai mực và sản phẩm β-chitin

Độ kết tinh của mai mực phụ thuộc nhiều vào hàm lượng khoáng, protein và sự

sắp xếp của các mạch chitin. Thực tế, do hàm lượng khoáng trong mai mực rất thấp (<

2%) nên mai mực có độ rắn thấp hơn rất nhiều so với độ rắn của vỏ tôm, vỏ cua và vỏ

ghẹ. Điều này có ảnh hưởng lớn đến việc lựa chọn phương pháp và điều kiện khử các

thành phần phi chitin để thu nhận chitin từ các nguồn nêu trên. Mặt khác, độ rắn khác

nhau của các dạng chitin sẽ quyết định đến tính chất và khả năng ứng dụng của chúng

trong thực tế. Đồng thời, chitin có độ rắn khác nhau sau khi deacetyl cũng sẽ cho

chitosan với tính chất khác nhau. Độ kết tinh của các vật liệu thường được xác định

thông qua phổ nhiễu xạ tia X (XRD).

Hình 3.5 trình bày phổ nhiễu xạ tia X (XRD) của mai mực ống Loligo sp. và sản

phẩm β-chitin thu được sau quá trình khử protein và khoáng. Kết quả phân tích cho

thấy, trên phổ của cả mai mực nguyên liệu và β-chitin đều xuất hiện 2 peak đặc trưng

cụ thể như sau:

- Một peak xuất hiện tại góc 2θ = 8,1º là peak đặc trưng cho tính chất vô định

hình của chitin. Tuy nhiên, cường độ peak của mai mực thấp hơn của -chitin khá

nhiều chứng tỏ mai mực có độ rắn cao hơn chitin.

- Một peak xuất hiện tại góc 2θ = 19,6º là peak đặc trưng cho tính chất kết tinh

của chitin. Tuy nhiên, cường độ peak của mai mực cao hơn của -chitin khá nhiều một

lần nữa chứng tỏ mai mực có độ rắn cao hơn chitin.

Hình 3.5. Phổ XRD của mai mực ống và sản phẩm β-chitin thu được từ mai mực.

Dựa vào cường độ và diện tích peak kết tinh và vô định hình chúng ta có thể tính

được độ kết tinh tương đối (CrI) của các vật liệu. Ở đây, CrI được tính dựa trên thương

số của diện tích peak kết tinh (19,60) và diện tích của tổng peak kết tinh và peak vô

định hình (8,10) [10]. Kết quả, CrI của nguyên liệu mai mực và sản phẩm β-chitin lần

lượt là 52,5 và 62,1%. Độ kết tinh của sản phẩm chitin cao hơn của mai mực chứng tỏ

hiệu quả của quá trình khử protein.

3.2.3.4. Độ tinh khiết và cấu trúc hóa học của sản phẩm -chitin

Cấu trúc hóa học và độ tinh khiết của sản phẩm -chitin được đánh giá dựa trên

quang phổ hồng ngoại (FTIR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Các phổ này sẽ

cho biết các peak đặc trưng của chitin giống với các peak của chitin chuẩn trong cơ sở

dữ liệu. Nếu có xuất hiện các peak lạ chứng tỏ sản phẩm thu được có chứa các tạp chất.

Hình 3.6. Phổ FTIR của nguyên liệu mai mực ống và sản phẩm β-chitin.

Kết quả phân tích phổ FTIR được trình bày trong Hình 3.6 cho thấy, mẫu -chitin

có xuất hiện tất cả các peak đặc trưng cho chitin tại các bước sóng 3277 cm−1 (O-H),

2877 cm−1 (C-H), 1627 cm−1 (amide I), 1543 cm−1 (amide II), 1374 cm−1 (C-H) và

950–1200 cm−1 (C-O-C and C-O). Không thấy xuất hiện các peak lạ, chứng tỏ sản phẩm

β-chitin thu được có độ tinh khiết cao. Kết quả này cũng tương tự như kết quả của các

công bố trước đây về phổ FTIR của -chitin theo Florek 2009 [59] và Laval 2007 [95].

Trong cấu trúc hóa học của chitin, mỗi đơn vị N-acetyl glucosamine (GlcNAc)

trong mạch polyme có chứa 6 cacbon và 6 hydro trong các liên kết C-H; 4 hydro và 4

oxy trong các nhóm O-H [83]. Để khẳng định sự tồn tại của các hydro trong các liên

kết kể trên, chúng tôi tiến hành phân tích mẫu sản phẩm β-chitin bằng máy cộng

hưởng proton từ hạt nhân (NMR).

Hình 3.7. Phổ H1 NMR của β-chitin.

Kết quả phổ H1-NMR của β-chitin được trình bày trong Hình 3.7 và Bảng 3.7

cho thấy các peak tại độ dịch chuyển hóa học 2,582 – 2,617 ppm tương ứng với 3

protons của nhóm N-acetyl glucosamine (GlcNAc-CH3), các peak tại 3,38 – 3,42 ppm

là proton H-2 của glucosamine (GlcN) và các peak tại 5,41 và 5,03 ppm do dao động

của proton α-H-1-A và β-H-1-A. Các peak ở 5,02 và 4,87 ppm lần lượt là của H-1-D

và H-1-A. Các proton còn lại (H-3; H-4; H-5; H-6) thể hiện trên các peak tại 3,7 - 4,27

ppm. Không có các peak xuất hiện trong khoảng 1 - 1,5 ppm. Điều này cũng khẳng

định độ tinh khiết của sản phẩm -chitin thu được từ mai mực Loligo sp. của quá trình

thu nhận. Kết quả này cũng phù hợp với các công bố trước đây về độ dịch chuyển hóa

học của các proton trong chitin Einbu 2007; Lavertu 2003; Kasaai 2010 và Dahmare

2014 [51, 57, 83, 96] khẳng định sản phẩm thu được là chitin.

Độ dịch chuyển hóa học (δ, ppm) 5,410 – 5,425 5,020 – 5,016 4,838 – 4,870

3,380 – 3,420

3,709 – 4,272

2,582 – 2,617 Bảng 3.7. Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 25oC của β-chitin Loại proton α-H-1-A β-H-1-A + H-1-D H-1-A H2 của GluN H3; H4; H5; H6 HN-COCH3

100

3.3. ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP.

3.3.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của 3 yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời

gian đến hiệu quả deacetyl -chitin

Quá trình deacetyl để chuyển chitin thành chitosan có thể được thực hiện theo hai

điều kiện: (1) phản ứng đồng thể (homogenous) khi chitin và tác nhân deacetyl

(NaOH, KOH, enzyme) ở trạng thái hòa tan trong dung dịch, (2) phản ứng dị thể

(heterogenous) khi chitin ở trạng thái rắn hoặc trương nở và tác nhân deacetyl (NaOH,

KOH, enzyme) được hòa tan trong dung dịch. Cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu

chủ yếu tập trung vào deacetyl trong điều kiện dị thể. Quá trình deacetyl của chitin dị

thể sử dụng tác nhân NaOH phụ thuộc vào các yếu tố chính gồm nồng độ NaOH sử

dụng, dạng hydrat hóa của NaOH, nhiệt độ phản ứng và nồng độ CH3COONa tạo ra

[Lamarque 2007]. Khi sử dụng NaOH nồng độ cao và ở nhiệt độ cao, chitin sẽ bị

trương nở rất nhanh, năng lượng hoạt hóa của quá trình deacetyl cũng giảm. Theo

Lamarque 2007, năng lượng hoạt hóa của quá trình deacetyl dị thể của β-chitin là 80,3

±9,6 kJ/mol (NaOH 30% (w/v), >70oC), 71,0 ±4,0 kJ/mol (NaOH 50% (w/v), <70oC)

40,0 ±3,0 kJ/mol (NaOH 50% (w/v), >70oC). Do đó, phản ứng deacetyl xảy ra nhanh

hơn và hiệu quả hơn ở nồng độ NaOH và nhiệt độ phản ứng cao hơn. Tuy nhiên, khi

tăng nồng độ NaOH lên cao hơn 50% thì năng lượng hoạt hóa này là không giảm. Do

đó, dung dịch NaOH 50% được xem là nồng độ tốt nhất để tiến hành deacteyl chitin.

Ngoài ra, sự tạo thành các dạng hydrat NaOH(H2O)n trong dung dịch cũng có ảnh

hưởng lớn đến hiệu quả của quá trình deacetyl của chitin ở phản ứng dị thể. Tại nhiệt

độ và nồng độ khác nhau sẽ có số phân tử nước (n) khác nhau. Ở nhiệt độ (90oC), nồng

độ (50%) thì số phân tử nước n bằng 1 hoặc 2. Đây là cấu trúc hydrat (ngậm nước) có

ái lực tốt nhất đối với chitin và cho hiệu quả deacetyl cao nhất [Lamarque 2007].

Một yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu quả deacetyl của chitin đó là hàm lượng

muối NaOCOCH3 tạo ra trong quá trình phản ứng. Muối này cũng ngậm nước nên sẽ

làm tăng nồng độ của NaOH trong hệ phản ứng và có thể dẫn đến kết tủa. Do đó, hàm

lượng muối NaOCOCH3 càng cao thì hiệu quả deacetyl sẽ càng kém.

Các cân bằng có thể xảy ra trong quá trình deacetyl giữa chitin, NaOH, nước và

NaOCOCH3 như sau [Lamarque 2007]:

101

Trong luận án này, tương tự như quá trình khử protein để thu nhận β-chitin từ

mai mực. Trước khi tiến hành quá trình deacetyl, chúng tôi cũng dựa trên các công bố

trước đây và tính chất của sản phẩm -chitin thu được trong nghiên cứu này để tiến

hành khảo sát một khoảng rộng ảnh hưởng của các thông số của quá trình deacetyl.

Các yếu tố được khảo sát bao gồm nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian với hàm mục

tiêu là hiệu quả deacetyl của chitin. Cụ thể, tiến hành deacetyl -chitin ở 3 mức nhiệt

độ 30, 60 và 90C trong dung dịch NaOH có nồng độ là 40, 50 và 60% theo thời gian

với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1/10, w/v). Kết quả khảo sát được trình bày trong

Hình 3.8.

Kết quả cho thấy, khi tăng nhiệt độ và nồng độ NaOH thì quá trình deacetyl xảy

ra nhanh và hiệu quả deacetyl tăng. Cụ thể như sau:

a. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Ở nhiệt độ thấp thì quá trình deacetyl diễn ra chậm và hiệu quả deacetyl thấp. Ví

dụ, ở nhiệt độ 30 và 60oC thì hiệu quả deacetyl chỉ đạt 42 và 68% với nồng độ NaOH

40% sau 24 giờ. Mặc dù, khi tăng nồng độ NaOH lên 50% và 60% thì quá trình khử

vẫn không đạt được mục tiêu nghiên cứu là sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl

trên 90%. Tuy nhiên, khi càng tăng nhiệt độ thì hiệu quả deacetyl tăng cao. Với các mẫu

xử lý ở nhiệt độ 90C, thời gian cần thiết để sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl

lớn hơn 90% khi sử dụng nồng độ NaOH 50 và 60% là 12 và 6 giờ, tương ứng.

Như vậy, để đạt được chitosan có độ deacetyl lớn hơn 90% thì nhiệt độ của quá

trình phản ứng phải trên 60oC.

102

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả deacetyl.

b. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH

Khi tăng nồng độ NaOH thì hiệu quả deacetyl tăng. Tuy nhiên, ở tất cả các nồng

độ NaOH 40%, 50% và 60% nếu tiến hành deacetyl tại nhiệt độ 30C và 60C thì độ

deacetyl của chitosan thu được đều không đạt mục tiêu nghiên cứu là trên 90%. Nhưng

với nồng độ NaOH là 50 và 60% khi deacetyl ở nhiệt độ 90C thì chỉ sau 18 và 6 giờ

thì độ deacetyl của chitosan thu được đều đạt mục tiêu nghiên cứu với kết quả lần lượt

là 91 và 95%, tương ứng. Lưu ý, khi nồng độ NaOH là 40% thì dù tiến hành ở nhiệt độ

90oC, sau 18 giờ thì độ deacetyl của chitosan thu được vẫn nhỏ hơn 90%.

Như vậy, để đạt được chitosan có độ deacetyl lớn hơn 90% thì nồng độ dung

dịch NaOH cần dùng phải trên 40%.

c. Ảnh hưởng của thời gian

Kết quả đánh giá cho thấy ở cùng điều kiện deacetyl (cùng nồng độ NaOH và

nhiệt độ), nếu kéo dài thời gian thì hiệu quả deacetyl càng tăng. Tuy nhiên hiệu quả

deacetyl chỉ tăng cao khi điều kiện deacetyl ở nhiệt độ cao (> 60C). Bởi vì, khi tiến

hành quá trình deacetyl ở 30oC thì dù kéo dài thời gian đến 72 giờ, thì với tất cả các

103

nồng độ NaOH 40, 50 và 60% đều không đạt mục tiêu nghiên cứu với hiệu quả

deacetyl trên 90%.

Kết quả này cũng phù hợp với kết quả công bố của Kiruta 1993 và Jung 2013 khi

sử dụng NaOH và Broussignac 1968 khi sử dụng KOH để deacetyl chitin thu nhận

chitosan [31, 79, 93]. Các kết quả công bố cho thấy để thu được sản phẩm chitosan có

DD > 90% thì việc sử dụng nồng độ dung dịch NaOH hoặc KOH phải trên 50% và nhiệt

độ khử trên 90C là điều cần thiết. Ngoài ra, có thể tiến hành quá trình deacetyl lặp lại

từ 2-4 lần.

Như vậy, các yếu tố khảo sát như nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đều có sự

tương tác mạnh đến độ deacetyl sau quá trình khử. Kết quả so sánh các giá trị trung

bình ở các điều kiện deacetyl theo chuẩn Duncan (α= 0,005) cho thấy các giá trị đều

khác biệt mang ý nghĩa thống kê. Trên cơ sở kết quả đánh giá tổng quát ảnh hưởng

của các yếu tố chính đến hiệu quả quá trình deacetyl ở Hình 3.8 cho thấy các yếu tố

nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian tỷ lệ thuận với hiệu quả quá trình deacetyl. Tuy

nhiên để đạt được mục tiêu sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl lớn hơn 90%

và hạn chế thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan thì các khoảng thông số ảnh hưởng

đến quá trình deacetyl của các yếu tố ảnh hưởng được xác định như sau: nồng độ

NaOH (45-55%) và nhiệt độ deacetyl (70-90oC) và thời gian khử (4 - 24 giờ) với tỷ lệ

nguyên liệu/dung dịch là 1/10 (w/v) làm cơ sở khảo sát, đánh giá chi tiết và chọn điều

kiện deacetyl phù hợp để sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl trên 90% và hạn

chế thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan trong quá trình khử.

3.3.2. Ảnh hưởng chi tiết của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến

hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan

Kết quả đánh giá ảnh hưởng chi tiết các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời

gian đến hiệu quả deacetyl β-chitin và quá trình cắt mạch của sản phẩm β-chitosan

được trình bày trong Hình 3.9.

3.3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch

chitosan

Nhiệt độ tăng không chỉ làm tăng tốc độ phản ứng dẫn tới tăng độ deacetyl (DD)

mà còn làm tăng sự cắt mạch của sản phẩm chitosan dẫn tới chitosan thu được có khối

lượng phân tử thấp [79]. Do đó, cần chọn nhiệt độ deacetyl thích hợp sao cho thu được

104

chitosan có độ deacetyl cao và phân tử chitosan ít bị phân cắt nhất. Từ kết quả đánh

giá chất lượng chitin và số liệu khảo sát sơ bộ điều kiện deacetyl, chúng tôi tiến hành

các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình deacetyl ở 50, 60,

70, 80 và 90C. Quá trình deacetyl được thực hiện ở nồng độ NaOH 50%, thời gian

khử 12 giờ với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1/10, w/v), mẫu sau khi xử lý được rửa

trung tính, tiến hành đánh xác định độ deacetyl và khối lượng phân tử trung bình (Mw).

Kết quả được trình bày trong Hình 3.9a. Khi tăng nhiệt độ từ 50 lên 90oC thì DD của

sản phẩm chitosan tăng từ 60,2 lên 90,1% trong khi MW lại giảm từ 7784 xuống còn

5604 kDa.

Khi so sánh các giá trị trung bình độ deacetyl ở các mức nhiệt độ khác nhau theo

chuẩn Duncan (α= 0,005) cho thấy có sự khác biệt khác biệt mang ý nghĩa thống kê.

Nhiệt độ khử càng tăng thì hiệu quả quá trình deacetyl càng tăng, kết quả DD của sản

phẩm chitosan đạt được là 87,9% khi khử ở 80C.

Khi so sánh các giá trị trung bình của khối lượng phân tử trung bình (Mw) của

chitosan sau quá trình khử theo chuẩn Duncan (α= 0,005) cho thấy các giá trị Mw ở các

mức nhiệt độ 70C, 80C và 90C đều có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê, đáng

chú ý là ở mức nhiệt độ trên 70C cho thấy khối lượng phân tử trung bình bị giảm rất

nhanh từ 6824 kDa ở 70C xuống còn 6254 kDa ở 80C và 5604 kDa ở 90C.

Như vậy, yếu tố nhiệt độ có sự tương tác mạnh với độ deacetyl và khối lượng

phân tử trung bình của chitosan trong quá trình deacetyl. Từ các kết quả phân tích ở

trên cho thấy để đạt được mục tiêu nghiên cứu là thu được sản phẩm chitosan có độ

deacetyl cao và hạn chế thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan. Do đó, chúng tôi lựa

chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình deacetyl là 80C để làm các khảo sát sau.

105

Hình 3.9. Ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến DD

và Mw của chitosan.

106

3.3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả deacetyl β-chitin và sự cắt

mạch chitosan

Quá trình deacetyl thường được tiến hành bằng hai phương pháp tùy theo cơ chế

bao gồm quá trình deacetyl dạng rời rạc (random) và quá trình deacetyl dạng khối

[111]. Trong quá trình thứ nhất, chitin được xử lý môi trường kiềm thấp và nhiệt độ

thấp trong môi trường chân không. Sản phẩm chitosan thu được có sự tồn tại của các

nhóm N-acetyl trên toàn mạch polymer. Đối với quá trình deacetyl khối, chitin được

xử lý trong môi trường kiềm đặc và nhiệt độ cao. Sản phẩm chitosan thu được có sự

tồn tại của các nhóm N-acetyl cục bộ trên một số đoạn của mạch polymer. Trong thực

tế, phương pháp deacetyl khối thường được ứng dụng sản xuất chitosan trong quy mô

công nghiệp.

Dựa trên tính chất của chitin và kết quả khảo sát sơ bộ và trong mục 3.3.2.1,

chúng tôi tiến hành các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các mức nồng độ NaOH

với các nồng độ 30, 35, 40, 45, 50 và 55% đến hiệu quả deacetyl và sự cắt mạch của

chitosan. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ 80C, thời gian khử 12 giờ

với tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch (1/10, w/v). Các mẫu sau khi xử lý được rửa trung

tính, tiến hành đánh xác định độ deacetyl và khối lượng phân tử trung bình (Mw). Kết

quả được trình bày trong Hình 3.9b.

Khi so sánh các giá trị trung bình độ deacetyl ở các mức nồng độ NaOH khác

nhau theo chuẩn Duncan (α= 0,005) cho thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê.

Ở cùng điều kiện nhiệt độ 80C và thời gian khử 12 giờ, khi tăng nồng độ NaOH thì

hiệu quả quá trình deacetyl càng tăng, kết quả DD của sản phẩm chitosan đạt được là

83,6% ở NaOH 50% và đạt 85,7% ở NaOH 55%.

Khi so sánh các giá trị trung bình của khối lượng phân tử trung bình (Mw) của

chitosan ở các mức nồng độ NaOH khác nhau sau quá trình khử theo chuẩn Duncan

(α= 0,005) cho thấy các giá trị Mw ở các mức nhiệt độ 35, 40, 45, 50 và 55% đều có sự

khác biệt mang ý nghĩa thống kê. Kết quả đánh giá cũng cho thấy khối lượng phân tử

trung bình bị giảm rất nhanh khi nồng độ NaOH tăng trên 50%, cụ thể Mw 6702 kDa ở

NaOH 50% xuống còn 4916 kDa ở NaOH 55%.

107

Như vậy, yếu tố nồng độ NaOH có sự tương tác mạnh với độ deacetyl và khối

lượng phân tử trung bình Mw của chitosan sau quá trình khử. Các kết quả phân tích cho

thấy ở cùng điều kiện nhiệt độ khử 80C và thời gian khử 12 giờ, khi tăng nồng độ

NaOH thì hiệu quả quá trình deacetyl càng tăng. Tuy nhiên, khi nồng độ NaOH tăng thì

quá trình cắt mạch xảy ra càng mạnh. Do đó, để đạt được mục tiêu nghiên cứu là thu

được sản phẩm chitosan có đô deacetyl cao và hạn chế thấp nhất quá trình cắt mạch

chitosan trong quá trình khử thì nồng độ NaOH thích hợp cho quá trình deacetyl 50%.

3.3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan

Khi cố định các yếu tố nhiệt độ và nồng độ NaOH, nếu kéo dài thời gian thì hiệu

quả deacetyl tăng lên nhưng quá trình cắt mạch chitosan cũng tăng. Do đó, cần chọn

thời gian deacetyl thích hợp sao cho thu được chitosan có độ deacetyl cao và phân tử

chitosan ít bị phân cắt nhất. Trên cơ sở kết quả phân tích tính chất của chitin và đánh

giá ảnh hưởng sơ bộ và ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ và nồng độ NaOH đến quá trình

deacetyl ở mục 3.3.1, 3.3.2.1 và 3.3.2.3. Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm deacetyl ở nhiệt

độ 80C và nồng độ NaOH 50% theo các mức thời gian: 4, 8, 12, 16, 20 và 24 giờ với

tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch (1/10, w/v). Kết quả được thể hiện trong Hình 3.9c.

Khi so sánh các giá trị trung bình độ deacetyl ở các mức nồng độ NaOH khác

nhau theo chuẩn Duncan (α= 0,005) cho thấy các giá trị ở mức thời gian 4 và 8 giờ có

sự khác biệt khác biệt mang ý nghĩa thống kê. Các giá trị ở các mức thời gian từ 12

đến 24 giờ khử đều không có ý nghĩa thống kê, điều này cho thấy ở cùng điều kiện

nhiệt độ 80C và nồng độ NaOH 50% hiệu quả quá trình deacetyl chỉ đạt tốt trong

khoảng 8 giờ khử ban đầu, khi kéo dài thời gian khử thì hiệu quả deacetyl có tăng

nhưng không đáng kể.

Khi so sánh các giá trị trung bình của khối lượng phân tử trung bình (Mw) của

chitosan ở các mức thời gian khử khác nhau sau quá trình khử theo chuẩn Duncan (α=

0,005) cho thấy các giá trị Mw đều có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê. Kết quả

đánh giá cũng cho thấy khối lượng phân tử trung bình bị giảm rất nhanh khi kéo dài

108

thời gian khử, cụ thể Mw = 7567 kDa ở 8 giờ khử xuống còn 7081 kDa ở 12 giờ khử

và tiếp tục giảm nhanh nếu thời gian khử kéo dài.

Như vậy, yếu tố thời gian có sự tương tác mạnh với độ deacetyl và khối lượng

phân tử trung bình Mw của chitosan sau quá trình khử. Các kết quả phân tích cho thấy

ở cùng điều kiện nhiệt độ khử 80C và nồng độ NaOH 50% thì thời gian khử tỷ lệ

thuận với hiệu suất quá trình deacetyl. Quá trình deacetyl xảy ra rất nhanh và hiệu

quả trong 8 giờ đầu và đạt mức DD = 84%. Sau đó quá trình deacetyl xảy ra chậm lại

và chỉ đạt 89,5% sau 24 giờ khử. Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian khử thì quá trình cắt

mạch xảy ra mạnh, do đó để đạt được mục tiêu nghiên cứu là thu được sản phẩm

chitosan có độ deacetyl cao và hạn chế thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan trong

quá trình khử thì thời gian thích hợp cho quá trình deacetyl là 8 giờ.

Tóm lại: Từ các kết quả đánh giá ở trên cho thấy điều kiện deacetyl thích hợp để

sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl cao và hạn chế thấp nhất cắt mạch chitosan

trong quá trình khử là nhiệt độ 80C, nồng độ NaOH 50% với thời gian 8 giờ. Kết quả

cũng cho thấy trong điều kiện này, nếu tăng bất cứ 1 trong 3 yếu tố sẽ đều làm quá

trình cắt mạch chitosan xảy ra. Tuy nhiên, sản phẩm chitosan thu được chỉ đạt độ

deacetyl đạt 84% và có khối lượng phân tử trung bình 7567 kDa.

Để đạt được mục tiêu nghiên cứu với chitosan thu được có DD > 90% có 2 cách:

1. Tăng một trong các yếu tố nhiệt độ hoặc nồng độ NaOH hoặc tăng cả hai

yếu tố này. Tuy nhiên, khi đó thì quá trình cắt mạch xảy ra rất mạnh.

2. Giữ nguyên nhiệt độ và nồng độ đã tiến hành ở trên nhưng tiến hành

deacetyl nhiều lần. Cách này ít gây cắt mạch polymer và có thể dễ dàng thực hiện ở

sản xuất lớn.

Các kết quả công bố của Methacanon 2003 [106], Kiruta 1993 [93], Chandumpai

2004 [36] và Jung 2013 [79] cũng sử dụng 2 phương pháp trên đối với quá trình

deacetyl chitin thu nhận từ vỏ tôm và mai mực.

Thật vậy, trong các nghiên cứu trước đây, để đạt được DD trên 90%, quá trình

deacetyl của chitin thường được thực hiện ở trên 1000C [154], [94], [106]. Tuy nhiên,

việc sử dụng nhiệt độ cao đòi hỏi thiết bị chuyên dụng và khó có thể ứng dụng để sản

109

xuất ở qui mô lớn. Từ kết quả thu được, so sánh đánh giá với các kết quả công bố của

Kiruta 1993 [93] và Jung 2013 [79] làm cơ sở để chúng tôi đề xuất phương án

deacetyl 2 bước. Thứ nhất, β-chitin được deacetyl lần một trong dung dịch NaOH 50

wt.% với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:10 (w/v) trong 8 giờ, mẫu sau khi xử lý được

rửa sạch và tiếp tục deacetyl lần 2 trong dung dịch NaOH 50 wt.% với tỷ lệ nguyên

liệu/dung môi 1:5 (w/v) ở 800C.

3.3.3. Điều kiện deacetyl lần 2

Dựa trên các kết quả phân tích ở trên cho thấy, quá trình deacetyl được thực hiện

hiệu quả ở điều kiện nhiệt độ 80C, nồng độ NaOH 50% trong thời gian khử 8 giờ, nếu

kéo dài thời gian khử thì quá trình cắt mạch chitosan sẽ xảy ra mạnh mẽ ảnh hưởng

đến chất lượng chitosan thu được. Do đó chúng tôi tiến hành ngưng quá trình deacetyl,

mẫu được rửa trung tính và mẫu tiếp tục được deacetyl lần 2 ở điều kiện nhiệt độ 80C,

nồng độ NaOH 50% theo thời gian. Kết quả đánh giá được trình bày trong Hình 3.10.

Hình 3.10. Ảnh hưởng của quá trình deacetyl lần 2 đến DD và Mw của chitosan.

110

Kết quả thể hiện trong Hình 3.10 cho thấy, khi xử lý bước 2 hiệu quả quá trình

deacetyl xảy ra mạnh mẽ và đạt DD = 91,3% chỉ sau 4 giờ khử và DD = 94% sau 20

giờ khử. Tuy nhiên quá trình cắt mạch cũng xảy ra mạnh ở bước 2 đặc biệt là sau 4 giờ

khử đầu tiên Mw = 7567 kDa giảm còn 6831 kDa.

Như vậy, để hạn chế sự cắt mạch trong quá trình deacetyl ở mức thấp nhất và

sản phẩm chitosan thu được có mức DD > 90% thì việc chọn phương án deacetyl 2 lần

là cần thiết. Do đó điều kiện deacetyl được lựa chọn là: Deacetyl bước 1: NaOH 50%,

nhiệt độ 80oC, thời gian khử 8 giờ với tỷ lệ (1/10, w/v), sau đó mẫu được rửa sạch

trung tính và deacetyl tiếp bước 2: NaOH 50%, nhiệt độ 80C, thời gian khử 4 giờ

với tỷ lệ (1/5, w/v). Sản phẩm chitosan thu được có DD = 91,3% và Mw = 6831 kDa.

3.3.4. Hiệu suất thu nhận và tính chất của sản phẩm chitosan

3.3.4.1. Hiệu suất thu nhận và tính chất cơ bản của chitosan

Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi và một số tính chất của chitosan từ mai mực

Loligo sp. được trình bày trong Hình 3.11, Bảng 3.8 và Bảng 3.9.

Hình 3.11. Sản phẩm -chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp.

Kết quả trình bày ở Bảng 3.8 cho thấy, hàm lượng chitosan thu được từ mai mực

ống cao hơn nhiều so với từ vỏ đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) và vỏ tôm

sú (Penaeus monodon). Có thể giải thích điều này là do cấu trúc và độ rắn khác nhau

giữa -chitin và β-chitin. Nếu tiến hành ở cùng điều kiện thì β-chitin bị deacetyl dễ

dàng hơn -chitin và sự cắt mạch chitosan cũng ít hơn. Kết quả này cũng phù hợp với

các nghiên cứu trước đây đối với mai mực Loligo formosana, Loligo lessoniana [36],

111

và mai mực Ornmastrephes bartrami [93]. Như vậy, mai mực ống là nguồn nguyên

liệu tiềm năng để thu nhận chitin và chitosan có khối lượng phân tử cao và dễ dàng áp

dụng vào sản xuất qui mô lớn.

Bảng 3.8. Hiệu suất thu hồi chitin và chitosan

Thành phần (wt.%) Nguyên liệu Chitina Chitosana Chitosanb

Kết quả Mai mực Loligo sp. 35,80 30,32 86,22 luận án

a Phần trăm chitin và chitosan tính theo nguyên liệu khô; b Phần trăm chitosan tính theo khối lượng

chitin khô

Vỏ tôm (Penaeus monodon) 22,18 17,35 78,23 [10]

Tính chất của sản phẩm chitosan từ mai mực ống (-chitosan) được thể hiện

trong Bảng 3.9. So với sản phẩm chitosan thương mại (Sigma-Aldrich), chitosan từ

mai mực ống sau khi thu nhận có độ tinh khiết cao hơn do chứa hàm lượng khoáng và

protein còn lại rất nhỏ (không phát hiện). Sản phẩm -chitosan có màu trắng sáng

(Hình 3.11) với phân tử lượng trung bình Mw 6831 kDa và độ deacetyl DD 91,3 %. Độ

tan của -chitosan là trên 99,7% trong dung dịch acid acetic 1% và độ đục là 9,5 NTU.

Đáng lưu ý, -chitosan thu được có khối lượng phân tử cao, độ tinh khiết cao hơn so

với -chitosan thương mại thu được từ vỏ tôm. Do đó, -chitosan có thể được ứng

dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ cao như tạo màng cho ngành y dược. Đồng thời

-chitosan được dùng làm chitosan nền để cắt mạch tạo thành những chitosan có phân

tử khác nhau tùy theo mục đích sử dụng.

112

Bảng 3.9. So sánh chất lượng của thương mại chitosan và β-chitosan

Chitosan thương mại Sản phẩm β-chitosan Tính chất

Trắng đến trắng vàng Trắng sáng Màu sắc

Khoáng (%) < 1 Nd

Protein (%) < 0,5 Nd

DD (%) > 80 > 91

Độ ẩm (%) < 10 < 8

300 - 700 6831 Mw (kDa)

Độ tan trong 1% AA (%) > 99 > 99,7

Nd: Not detected (không phát hiện).

Độ đục (NTU) 9,5  30

3.3.4.2. Thành phần khoáng và acid amine

Hàm lượng khoáng và acid amin còn lại trong sản phẩm chitosan có ảnh hưởng

đến ứng dụng của nó trong thức tiễn. Đặc biệt, khi ứng dụng cho con người như thực

phẩm và y dược. Thành phần khoáng và acid amin của chitosan được trình bày trong

Bảng 3.10 và Bảng 3.11. Theo Bảng 3.10 cho thấy hàm lượng acid amin còn lại trong

chitosan là rất thấp. Sau quá trình deacetyl, hầu hết các acid amin được loại bỏ khỏi β-

chitosan trừ một lượng rất nhỏ còn lại của histidine, alanine, valine và serine. Kết quả

này tương tự như kết quả công bố của Youn 2013 [173] về hàm lượng acid amin còn

lại trong chitosan từ mai mực Todarodes pacifica.

Bảng 3.11 cho thấy hàm lượng khoáng chứa trong β-chitin và chitosan là rất nhỏ

(không phát hiện), đặc biệt các kim loại nặng như As, Hg, Pb không phát hiện có trong

các mẫu β-chitin và chitosan (số liệu không được thể hiện), kết quả này cũng tương tự

với kết quả của Chandumpai 2004 và Jung 2013.

113

Bảng 3.10. Hàm lượng acid amin còn lại trong β-chitin và β-chitosan

Acid amin β-chitin (ppm) β-chitosan (ppm)

Alanine 0,08 0,17

Glycine 0,07 0,07

Valine 0,07 0,05

Leucine Nd 0,03

Isoleucine Nd Nd

Threonine Nd Nd

Serine 0,06 0,05

Proline 0,03 0,06

Aspartic acid Nd Nd

Methionine Nd Nd

4-Hydroxyproline Nd Nd

Glutamic acid Nd 0,06

Phenylalanine 0,03 0,06

Lysine Nd Nd

Histidine 0,15 0,14

Hydroxylysine Nd Nd

Tyrosine Nd 0,06

Nd: Not detected (không phát hiện).

Tổng cộng 0,49 0,75

Như vậy, sản phẩm -chitin và chitosan từ mai mực ống có độ tinh khiết cao đáp

ứng yêu cầu cho các nghiên cứu ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm và y sinh.

114

Bảng 3.11. Thành phần khoáng và kim loại trong mai mực, β-chitin và β-chitosan

Kim loại (ppm) Khoáng Vật liệu (%) Ca Fe K Mg Na Zn

Mai mực ống 1,37 - - - - - -

β-chitin Nd 10,4 8,20 4,7 6,3 55,4 6,2

Nd: Not detected (không phát hiện).

β-chitosan Nd 7,1 2,78 3,7 2,07 4,5 3,21

3.3.4.3. Cấu trúc bề mặt của chitin và chitosan

Sự khác nhau về tính chất bề mặt của mai mực, β-chitin và chitosan thể hiện

trong Hình 3.12.

Theo đó, bề mặt cắt của mai mực có các tấm chitin được sắp xếp song song xen

kẽ các với các thành phần khác như protein, lipid và khoáng (Hình 3.12a). Sau quá

trình khử thì các tấm chitin vẫn được bảo toàn nhưng độ dày của chúng lại giảm đáng

kể (Hình 3.12b). Điều này có thể giải thích do các thành phần khác như như protein,

lipit và khoáng được loại bỏ sau khi xử lý. Trong khi bề mặt β-chitosan trở nên vô

định hình và cấu trúc các lớp song song bị phá hủy gần như hoàn toàn (Hình 3.12c).

Hình 3.12. Hình SEM của (a) mai mực ống, (b) β-chitin và (c) chitosan.

115

3.3.4.4. Độ rắn tinh thể (CrI)

Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) của mai mực, β-chitin và chitosan biểu diễn trong Hình

3.13. Kết quả cho thấy, trong tất cả các mẫu đều xuất hiện hai peak đặc trưng tại 2θ 7.90

và 19.60. Tuy nhiên, mai mực có cường độ peak cao nhất sao đó đến β-chitin và

chitosan, chứng tỏ mai mực và β-chitin có độ kết tinh cao hơn và quá trình khử protein

và deacetyl đã làm giảm độ kết tinh của vật liệu. Cụ thể, độ kết tinh tương đối (CrI) của

của hai mẫu được tính là thương số của diện tích peak tại 7.90 và tổng diện tích 2 peak

[10]. Kết quả, CrI của mai mực, β-chitin và β-chitosan lần lượt là 72, 62 và 43%.

Hình 3.13. Phổ XRD của mai mực, β-chitin và β-chitosan.

3.3.4.5. Cấu trúc hóa học và độ tinh khiết của chitosan

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (FTIR) sản phẩm chitosan từ mai mực Loligo

sp. và một sản phẩm chitosan thương mại có độ deacetyl (DD ≥75%, Sigma Aldrich)

được thể hiện trong Hình 3.14. Các peak đặc trưng của cả hai mẫu đều tương tự nhau

tại 3428 cm−1 (O-H), 2928-2872 cm−1 (C-H), 1655 cm−1 (amide I), 1593 cm−1 (amide

II), 1318 cm−1 (amide III), và 1028–1070 cm−1 (C-O-C và C-O). Điều này khẳng định

hiệu quả của quá trình deacetyl β-chitin, độ tinh khiết của sản phẩm. Kết quả này

tương tự với một số công bố về phổ của -chitosan [32, 50].

116

Hình 3.14. Phổ FTIR sản phẩm chitosan từ (a) β-chitosan, (b) α-chitosan thương

mại và (c) β-chitin.

Độ tinh khiết của sản phẩm chitosan được khẳng định trong Phổ H1-NMR trình bày

trong Hình 3.15 và Bảng 3.12. Các peak đặc trưng cho chitosan tại 5.10 ppm (H1), 3.2 ppm

(H2), 3.5~3.9 ppm (H3, H4, H5, H6) và 2.0 ppm (NHCOCH3). Không có sự xuất hiện

các peak trong khoảng 1,0 và 2,0 ppm chứng tỏ sự tinh sạch của sản phẩm chitosan thu

được. Kết quả cũng tương ứng với độ dịch chuyển hóa học của các proton của chitosan

từ mực của Subhapradha 2013 [147] và Pereira 2015 [121].

Hình 3.15. Phổ H1-NMR của β-chitosan.

117

Bảng 3.12. Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 70oC của β-chitosan

Loại proton Độ dịch chuyển hóa học (δ, ppm)

H-1-D 5,06 – 5,12

H-1-A 4,81 – 4,97

H-2-D 3,08 – 3,31

3,37 – 4,08 H3; H4; H5; H6

1,96 – 2,13 HN-COCH3

3.3.4.6. Độ phân tán polymer và khối lượng phân tử trung bình Mw của β-chitosan

Để đánh giá khối lượng phân tử trung bình (Mw) và sự phân bố khối lượng tử của

sản phẩm chitosan từ β-chitin, chúng tôi tiến hành đo phổ sắc ký loại trừ kết hợp với

phân tán ánh sáng tĩnh đa góc (SEC-MALLS), kết quả được trình bày ở Hình 3.16. Kết

quả phổ SEC-MALLS cho thấy rõ sự phân bố phân tử lượng của sản phẩm β-chitosan

từ 106 – 108 (g/mol) và kết quả đo xác định khối lượng phân tử trung bình của β-

chitosan Mw = 1740 kDa.

Hình 3.16. Phổ SEC-MALLS của β-chitosan.

118

3.3.5. Đề xuất quy trình thu nhận chitin, chitosan từ mai mực ống Loligo sp.

Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu thu được từ mục 3.2 và 3.3 có thể khẳng

định quy trình thu nhận β-chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp. bằng phương pháp

hóa học có thể ứng dụng để sản xuất ở quy mô lớn và sản phẩm β-chitin và chitosan

thu được có độ tinh khiết cao, ít bị cắt mạch là nguồn nguyên liệu tốt để ứng dụng

trong các lĩnh vực thực phẩm, y sinh và có thể cải biến tạo thành các sản phẩm khác

được đề xuất Hình 3.17.

Hình 3.17. Quy trình thu nhận β-chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp.

119

Mai mực Loligo sp. được thu nhận từ các nhà máy chế biến thủy sản thải ra sau

quá trình chế biến được rửa sạch, sấy ở nhiệt độ 60oC sau 12 giờ, sau đó nguyên liệu

được xay thô ở kích thước 3-5mm.

Mẫu được khử protein trong dung dịch NaOH 4% (w/v), tỷ lệ 1/10 (w/v) ở

nhiệt độ 80oC tron 10 giờ. Trong quá trình khử mẫu được định kỳ khuấy đảo để dung

dịch NaOH tiếp xúc đều, quá trình khử được thực hiện đồng đều và triệt để. Sau khi

kết thúc quá trình khử, mẫu được rửa sạch đến trung tính. Sản phẩm β-chitin thu được

sẽ được sấy ở nhiệt độ 60oC trong 10 giờ.

Sản phẩm chitin sau khi thu nhận sẽ được deacetyl lần 1 trong dung dịch NaOH

50% (w/w) ở nhiệt độ 80oC trong 8 giờ với tỷ lệ chitin/dd NaOH (1/10, w/v). Sau quá

trình khử, mẫu được rửa sạch đến trung tính và tiếp tục deacetyl lần 2 trong dung dịch

NaOH 50% (w/w), tỷ lệ chitin/dd NaOH (1/10, w/v) ở nhiệt độ 80oC trong 4 giờ, mẫu

sau khi xử lý được rửa sạch đến trung tính, sau đó được sấy ở 60oC trong 12 giờ thu

được sản phẩm chitosan.

3.4. KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN

3.4.1. Nghiên cứu phân lập, khẳng định chủng Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn

trên trái cà chua sau thu hoạch

- Kết quả lựa chọn trái cà chua bệnh: Theo khảo sát, đánh giá tại các chợ đầu mối

nông sản, lượng cà chua sau khi được vận chuyển về đến các đại lý đầu mối thường bị

thất thoát từ 10 - 15%, chủ yếu là bị dập, bị tổn thương dưới tác động cơ học trong quá

trình vận chuyển và bảo quản. Tuy nhiên lượng cà chua này thường xãy ra quá trình

thối nhũn rất nhanh sau khi tổn thương, thường trong vòng 1-3 ngày. Nếu không được

xử lý thì quá trình thối nhũn sẽ lây lan qua các trái khác rất nhanh và gây thiệt hại lớn.

Hiện tại phương pháp được các nông dân, thương lái áp dụng là loại bỏ ngay các trái

cà chua bị dập, chảy dịch có mùi thối để tránh ảnh hưởng đến các trái còn lại. Kết quả

sau 3 đợt thu được 24 mẫu ở chợ đầu mối nông sản Thủ Đức TpHCM và 21 mẫu ở chợ

Vĩnh Hải Nha Trang. Sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm, các mẫu tiếp tục được

bảo quản ở điều kiện thường, tiếp tục quan sát đánh giá và chọn được 10 mẫu có biểu

hiện bệnh đặc trưng của bệnh thối nhũn (Bảng 3.15, Hình 3.18). Từ đó tiến hành phân

lập xác định đối tượng gây bệnh, theo Janse 2005 và Mân 2007 vết bệnh thối nhũn trên

trái cà chua sẽ phát triển nhanh ở điều kiện nhiệt độ 30-32oC, các khu vực bị ảnh hưởng

120

trở nên nhũn mềm và chảy nước do các tế bào bị tổn thương, bề mặt vết bệnh trở nên sẫm

màu, có thể xuất hiện nếp nhăn hoặc phồng rộp. Biên độ gây tổn thương thường là chậm

lúc đầu nhưng sau đó trở nên rất nhanh, các mô trong khu vực ảnh hưởng bị phân hủy

chảy nước, các vết nứt phát triển và bề mặt vết bệnh trở nên nhầy nhụa, kèm theo mùi thối

đặc trưng. Trường hợp tiếp xúc với không khí vết bệnh có thể chuyển sang màu xám hoặc

màu nâu sẫm [66, 77, 9].

Bảng 3.13. Mẫu cà chua thu nhận từ các chợ nông sản

Nơi lấy mẫu

Thời gian lấy

Đợt lấy mẫu Đợt 1

Tháng 12/2013

Số lượng mẫu thu nhận 10

Số lượng mẫu được chọn phân lập 2

Chợ nông sản

Đợt 2

Tháng 04/2014

Thủ Đức HCM

Đợt 3

Tháng 09/2014

Đợt 1

Tháng 12/2013

Đợt 2

Tháng 04/2014

Chợ Vĩnh Hải, Nha Trang

Đợt 3

Tháng 09/2014

Hình 3.18. Mẫu trái cà chua bệnh thối nhũn thu nhận từ chợ nông sản.

- Kết quả phân lập lựa chọn khuẩn lạc, nhuộm Gram, đánh giá hình thái và khả

năng di động: Từ 6 đợt thu mẫu, chọn được 10 mẫu cà chua bệnh. Tiến hành xử lý

mẫu và phân lập trên môi trường PDA trong điều kiện pH trung tính ở nhiệt độ từ

30C đã thu được 37 mẫu khuẩn lạc đặc trưng (Hình 3.19a). Các khuẩn lạc được chọn

đều có màu trắng xám đến vàng đục, hình tròn hoặc hình bầu dục không đều, bề mặt

khuẩn lạc lồi nhầy ướt [77, 9]. Kết quả nhuộm Gram 37 dòng vi khuẩn này đã chọn

được 20 dòng vi khuẩn là Gram âm có hình que, hai đầu hơi tròn, kích thước của các

tế bào vi khuẩn đều nằm trong khoảng (0,5-1,0  1,0-3,0m) và có khả năng di động

121

(Hình 3.19b) [77, 9]. Các kết quả này đã loại trừ hầu hết các tác nhân gây bệnh là nấm

và các vi khuẩn Gram dương như Bacillus spp.; Clotridium spp.; Clavibacter spp.,...

các tác nhân vi khuẩn gây bệnh nghi ngờ còn lại thuộc các chi Erwinia spp.;

Pseudomonas spp. và Xanthomonas spp.

Hình 3.19. (a) Mẫu khuẩn lạc được chọn; (b) Mẫu vi khuẩn nhuộm Gram.

- Kết quả đánh giá các đặc tính sinh hóa, sinh lý của chủng phân lập:

+ Khả năng lên men-oxy hóa glucose (Oxidative-Fermentative): Kết quả đánh giá

khả năng sử dụng glucose chuyển hóa thành các acid làm chuyển màu chất chỉ thị

bromothymol từ xanh sang vàng ở cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí của 20 dòng vi

khuẩn được trình bày ở Bảng 3.14. Test sinh hóa này đã loại trừ các dòng vi khuẩn

Xanthomonas spp. có tế bào hình gậy, Gram âm, ưa khí bắt buộc và các dòng

Pseudomonas spp. có tế bào hình gậy, Gram âm, ưa khí. Kết quả đã chọn ra được 11

dòng vi khuẩn thuộc chi Erwinia spp. có khả năng chuyển hóa glucose ở cả 2 điều kiện

yếm khí và hiếu khí.

+ Khả năng phân giải pectin trên môi trường CVP (Crystal Violet Pectate): 11

dòng vi khuẩn được chọn đã được đánh giá khả năng phân giải pectin trên môi trường

CVP, kết quả được trình bình trong Bảng 3.14. Kết quả đánh giá cho thấy có 7 dòng

trong 11 dòng vi khuẩn được chọn có khả năng phân giải pectin, do đó đã loại được

các dòng vi khuẩn: Erwinia amylovora; Erwinia tracheiphila; Erwinia rubrifaciens;

Erwinia salics; Erwinia herbicola; Erwinia chrysanthemi; Erwinia cypripedii; Erwinia

nigrifluens; Erwinia stewartii và Erwinia uredovora không có khả năng phân giải

pectin. Theo Janse 2005 chi vi khuẩn Erwinia spp. có 14 loài bao gồm: Erwinia

carotovora; Erwinia amylovora; Erwinia tracheiphila; Erwinia mallotivora; Erwinia

122

rubrifaciens; Erwinia quercina; Erwinia salics; Erwinia herbicola; Erwinia

rhapontici; Erwinia chrysanthemi; Erwinia cypripedii; Erwinia nigrifluens; Erwinia

stewartii và Erwinia uredovora, trong đó chỉ có các dòng có khả năng phân giải pectin

mới là tác nhân gây bệnh thối nhũn [77].

Bảng 3.14. Kết quả đánh giá đặc tính sinh hóa sinh lý của các dòng vi khuẩn

Chỉ tiêu

Stt Mẫu

Sinh indol

EC11-NT

Lên men hiếu khí (O+) +

Lên men yếm khí (F+) +

Phân giải pectin (+) -

Sinh H2S (+)

(-)

Nhậy cảm với erythromycine (-)

EC15-NT

+

-

EC12-HCM

+

-

EC14-HCM

+

-

EC15-HCM

+

-

+

EC16-HCM

+

-

EC21-HCM

-

+

EC22-HCM

-

+

EC24-HCM

+

-

10 EC25-HCM

+

-

11 EC26-HCM

+

-

12 EC27-HCM

+

-

+

13 EC21-NT

+

-

14 EC24-NT

+

-

15 EC25-NT

+

-

16 EC26-NT

-

+

17 EC32-NT

-

+

18 EC34-NT

+

-

19 EC31-HCM

+

-

20 EC35-HCM

+

-

123

+ Khả năng oxy hóa tryptophan thành các hợp chất hữu cơ chứa vòng indol: Kết

quả đánh giá khả năng sinh H2S và indol của 7 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải

pectin cho thấy cả 7 dòng vi khuẩn được chọn đều có khả năng sinh H2S và không sinh

indol (Bảng 3.14). Căn cứ theo đặc tính sinh hóa, sinh lý được Janse 2005 công bố

(Phụ lục 7) [77], kết quả này đã loại loại được các dòng vi khuẩn thuộc chi Erwinia sp.

nhưng không có khả năng sinh H2S là Erwinia mallotivora và Erwinia quercina.

+ Khả năng nhạy cảm với Erythromycine: Tiếp tục đánh giá khả năng nhạy cảm

với erythromycine đã chọn được 6 dòng trong 7 dòng vi khuẩn được chọn không nhạy

cảm với erythromycine, do đó đã loại được chủng Erwinia rhapontici nhạy cảm với

erythromycine

Như vậy, kết quả đánh giá các đặc tính sinh hóa, sinh lý các dòng vi khuẩn phân

lập cho thấy có 6 dòng vi khuẩn phân lập đáp ứng các yêu cầu, nằm trong nghi ngờ là

Erwinia carotovora.

+ Kết quả giải trình tự 16s rARN: Tiến hành giải trình tự gen 16s rARN 6 chủng

vi khuẩn được chọn. Kết quả giải trình tự một phần gen mã hóa cho tiểu phần

ribosome 16s được tra cứu trên ngân hàng gen của NCBI thông qua chương trình

BLAST SEARCH cho thấy, chủng EC24-NT có độ đồng nhất đạt đến 97% khi đối

chiếu với trình tự gen của chủng CP002038 Dickeya dadantii 3937 ở ngân hàng gen

(Hình 3.20). Như vậy, kết quả phân lập đã xác định được chủng vi khuẩn gây bệnh thối

nhũn trên cà chua sau thu hoạch là Dickeya dadantii 3937 hay Erwinia carotovora.

Ngoài ra, dòng vi khuẩn sau khi được định danh được chụp trên kính hiển vi điện tử

SEM (Hình 3.21) cho kết quả hình que, hai đầu hơi tròn, kích thước của các tế bào vi

khuẩn đều nằm trong khoảng (0,5-1,01,0-3,0m) , kết quả này phù hợp với kết quả

nghiên cứu và mô tả của Janse 2005 và Mân 2007.

Hình 3.20. Trình tự một đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn Erwinia carotovora.

124

Hình 3.21. Hình SEM chủng vi khuẩn Erwinia carotovora.

+ Kết quả đánh giá độc lực gây bệnh của chủng Erwinia carotovora trên trái cà

chua theo quy tắc Koch: Tiến hành gây bệnh nhân tạo trên trái cà chua theo quy tắc

Koch đã được mô tả ở phần 2.3.7. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh trên trái cà

chua của Erwinia carotovora được trình bày trong Hình 3.22 và Hình 3.23.

Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ

Vết bệnh

bên ngoài

Vết bệnh

bên trong

Hình 3.22. Vết bệnh thối nhũn trên trái cà chua.

125

Kết quả đánh giá cho thấy thời gian hình thành vết bệnh đặc trưng trên trái cà

chua là 24 giờ. Quá trình phát triển bệnh cho thấy tỷ lệ trái nhiễm bệnh đạt 100%, tốc

độ phát triển bệnh khá nhanh cụ thể: Tthời gian bắt đầu chủng bệnh cho đến khi trái

thối nhũn hoàn toàn kéo dài 72 giờ, biên độ dao động vết bệnh trên các trái trong cùng

thời gian ổn định. Kết quả đánh giá độc lực gây bệnh của Erwinia sp. ở Hình 3.23 cho

thấy trái cà chua khi bị nhiễm Erwinia carotovora thì vết bệnh sẽ phát triển chậm

trong 24 giờ đầu, sau đó bệnh phát triển rất nhanh và sau 72 giờ bệnh phá hủy hoàn

toàn ký chủ. Bệnh phát triển khá đặc thù, vi khuẩn phá hủy bên trong nhanh và mạnh

hơn vết bệnh biểu hiện bên ngoài.

Hình 3.23. Sơ đồ phát triển bệnh thối nhũn trên cà chua.

Như vậy, từ các mẫu cà chua bệnh thu nhận tại các chợ đầu mối nông sản tại Thủ

Đức, TpHCM và tại chợ Vĩnh Hải, Nha Trang đã chọn được 6 dòng vi khuẩn có hình

que, hai đầu hơi tròn, chiều dài từ 1.0-2.5µm, Gram âm, yếm khí tùy ý, phân giải

pectin, sinh H2S, không tạo indol và không nhạy cảm với erythromycine. Các chủng này

được chủng bệnh trên trái cà chua đều có khả năng gây bệnh thối nhũn đặc trưng, vết

126

bệnh đổi màu nhũn mềm, thịt quả thối nát có màu sậm, vết bệnh chảy dịch mùi thối khó

ngửi. Phân tích trình tự gen 16S rRNA, tra cứu trên Blast Search và chụp SEM cho thấy

chủng EC24-NT phân lập được là Erwinia carotovora. Chủng Erwinia carotovora

(EC24-NT) sau khi phân lập được đánh giá khả năng gây bệnh trên cà chua sau thu

hoạch cho thấy thời gian phát triển bệnh rất nhanh chóng, sau 24 giờ hình thành vết bệnh

đặt trưng và sau 72 giờ bệnh phát triển ăn sâu phá hũy gần như hoàn toàn ký chủ. Đánh

giá cũng cho thấy vết bệnh bên trong phát triển nhanh và mạnh hơn vết bệnh bên ngoài

bề mặt trái.

3.4.2. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro

❖ Kết quả cắt mạch chitosan bằng H2O2

Nhiều kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng chitosan có khối lượng phân tử thấp

sẽ có tính kháng khuẩn cao. Do đó, trước khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của sản

phẩm chitosan, chúng tôi tiến hành cắt mạch chitosan bằng chất oxy hóa khá mạnh. Cụ

thể, sản phẩm chitosan từ mai mực Loligo sp. có độ deacetyl 91,3% và khối lượng phân tử

Mw = 6831 kDa được tiến hành cắt mạch bằng H2O2 theo phương pháp được mô tả của

Liu 2006 và Huang 2012 có chỉnh sửa được mô tả ở mục 2.3.4. Kết quả, thu được 4

loại chitosan có khối lượng phân tử là 6831, 1740, 655 và 138 kDa.

Cơ chế cắt mạch chitosan bằng H2O2 trong môi trường kiềm được giải thích như

(1) H2O2  H+ + HOO-

NaOH  OH-+ Na+ (2)

H+ từ (1) và OH- từ (2) sẽ phản ứng với nhau tạo thành H2O, do đó, phản ứng (1)

có khuynh hướng tạo ra nhiều anion HOO-. Các ion HOO- lại rất kém bền và dễ dàng

phản ứng với H2O2 để tạo ra các gốc tự do theo phương trình sau:

•- + H2O

(3) H2O2 + HOO-  HO• + O2

Gốc tự do HO• là tác nhân oxy hóa mạnh, sẽ lấy nguyên tử hydro trong phân tử

chitosan tại liên kết 1,4-glucozit theo phản ứng sau:

127

(4) (GlcN)m −(GlcN)n + HO• → (GlcN•)m − (GlcN)n + H2O

(5) (GlcN•)m−(GlcN)n + H2O → (GlcN)m + (GlcN)n

Cấu trúc phân tử chitosan không thay đổi sau quá trình cắt mạch nhưng khối

lượng phân tử giảm do liên kết 1,4-glucozit bị cắt.

❖ Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro

Tiến hành 5 lô thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại chitosan

này ở các mức nồng độ: 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 và 1,5% trong môi trường acid

acetic 1%. Kết quả kháng khuẩn Erwinia carotovora của các chitosan ở nồng độ và trọng

lượng phân tử Mw khác nhau ở điều kiện in vitro được thể hiện trong Bảng 3.15.

Bảng 3.15. Khả năng kháng khuẩn Erwinia carotovora của chitosan với khối

lượng phân tử khác nhau và chitosan thương mại (C-120)

Tỷ lệ ức chế  (%)

Mw

Chitosan

Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu

(kDa)

0% 0,1% 0,25% 0,5% 0,75% 1% 1,25% 1,5%

C-120 120 0 10,2 23,2 73,2 94,8 100 100 0

S-6831 6831 0 27,7 57,3 Nd Nd Nd Nd 0

S-1740 1740 0 54,8 82,7 75,1 82,6 99,9 0 0

S-655 655 0 59,3 79,7 86,5 94,9 100 0 0

Nd: thí nghiệm không thực hiện do chitosan S-6831 chỉ có thể hòa tan tối đa ở nồng độ 0,5%

trong acid acetic 1%.

S-138 138 0 42,1 67,2 88,4 98,0 100 100 0

Kết quả cho thấy β-chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của Erwinia

carotovora càng tăng khi sử dụng chitosan có khối lượng phân tử trung bình (Mw) càng

128

thấp và nồng độ chitosan cao. Trong đó, khả năng kháng khuẩn chỉ thể hiện rỏ khi các

chitosan đạt nồng độ từ 0,5% trở lên. Hiệu quả ức chế 100% khả năng phát triển vi

khuẩn Erwinia carotovora đạt được đối với chitosan có Mw trong khoảng 138-655 kDa

ở nồng độ 1,25 và 1,5%. Trong khi mẫu chitosan thương mại cho thấy hiệu quả kháng

khuẩn Erwinia carotovora đạt 100% ở nồng độ 1,25%. Kết quả này phù hợp với các

công bố trước đây của Zeng 2003 [175] và Xu 2007 [168].

Hình 3.24. (a) Khả năng kháng khuẩn của S-655 và (b) của S-138 ở các nồng độ

khác nhau. C-120 là chitosan thương mại với Mw là120 kDa.

Khi so sánh khả năng kháng Erwinia carotovora đối với chitosan thương mại cho

thấy ở cùng nồng độ 1,25%, chitosan S-138 cho hiệu quả kháng 100% khả năng phát triển

của Erwinia carotovora tương đương chitosan thương mại có độ deacetyl 75-85%, Mw =

120 kDa. Kết quả kháng khuẩn được nhìn thấy điều rõ ràng hơn trong Hình 3.24. Theo

đó, chitosan có phân tử lượng trung bình Mw càng thấp sẽ dẫn đến khả năng kháng khuẩn

được tăng cường. Đồng thời kết quả ở Bảng 3.15 cũng khẳng định, ở cùng nồng độ thì β-

chitosan có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn chitosan thương mại thu được từ -chitin.

Điều này có thể được giải thích như sau: chitosan thu được từ β-chitin có độ rắn thấp hơn,

+) cũng mềm mại hơn và

đễ dàng hòa tan và trương nở trong dung dịch. Hơn nữa, khi đã được hòa tan trong dung

dịch acid thì cấu hình của polymer mang điện tích dương (-NH3

dễ dàng tiếp xúc với bề mặt tế bào mang điện tích âm của vi khuẩn hơn so với cấu trúc rất

bền và chặt chẽ của chitosan thu được từ -chitin.

129

Hình 3.25 biểu diễn hình ảnh chụp trên kính hiển vi truyền qua TEM khi vi khuẩn

Erwinia carotovora được xử lý bằng β-chitosan (S-138) ở nồng độ 1% trong dung môi

CH3COOH 1% (w/v) trong thời gian 60 phút. Kết quả cho thấy, đầu tiên sau 15 phút

chitosan gắn lên bề mặt của các tế bào (Hình 3.25b), sau đó màng tế bào bị phá vỡ, sự rò

rỉ của các chất trong tế bào đã được quan sát (Hình. 3.25c) và cuối cùng, bề mặt tế bào của

vi khuẩn Erwinia carotovora dần bị phá hủy hoàn toàn sau 60 phút và các tế bào trở nên

mờ trong dung dịch chitosan (Hình 3.25d). Kết quả này phù hợp với các kết quả của Kong

2010 [87] và Xing 2009 [167].

Hình 3.25. Hình TEM của vi khuẩn Erwinia sp. được xử lý trong dung dịch β-

chitosan 1% (S-138) trong 60 phút. (a) Vi khuẩn Erwinia carotovora; (b) xử lý sau

15 phút; (c) xư lý sau 30 phút; (d) kết quả sau 60 phút.

Sự tương tác giữa chitosan và bề mặt tế bào vi khuẩn đã được nhiều báo cáo

chứng minh:

Tsai và cộng sự (1999) đã kết luận rằng chitosan khi tương tác với bề mặt tế

bào vi khuẩn thông qua các lực tĩnh điện giữa của các nhóm -NH2 của phân tử chitosan

130

+) và bề mặt màng tế bào vi khuẩn mang

bị proton hóa mang điện tích dương (-NH3

điện tích âm. Sự tương tác này làm thay đổi tính thấm thấu của màng tế bào từ đó làm

rò rỉ các thành phần nội bào, chẳng hạn như glucose và lactate dehydrogenase (LDH),

do đó làm chết các tế bào vi khuẩn. Hoạt tính diệt khuẩn của chitosan đối với vi khuẩn

phụ thuộc vào các yếu tố sau:

+ tuổi của tế bào, ảnh hưởng đến điện tích âm trên bề mặt tế bào;

+ nhiệt độ, ảnh hưởng đến cấu trúc bề mặt tế bào và tốc độ phản ứng hóa học;

+ giá trị pH, làm thay đổi số proton của chitosan;

+ muối, tạo phức với chitosan và làm giảm số lượng các nhóm -NH2 của một

phân tử chitosan.

Chung và cộng sự (2004) cho thấy khả năng kháng khuẩn của chitosan trên các

vi khuẩn khác nhau phụ thuộc vào lượng chitosan hấp phụ vào các tế bào vi khuẩn và

khả năng tương tác của chitosan với bề mặt của thành tế bào vi khuẩn. Chitosan hấp

phụ tốt hơn sẽ làm thay đổi cấu trúc của thành tế bào lớn hơn và giảm tính thẩm thấu

+) sẽ tương tác với bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện tích âm. Khi độ

của màng tế bào. Trong dung dịch acid loãng, chitosan mang các nhóm amin tích điện

dương (-NH3

deacetyl càng cao thì tương tác này càng lớn. Do đó, tính diệt khuẩn càng cao.

No và cộng sự (2002) và Kong 2010 chứng minh khối lượng phân tử trung bình

của chitosan càng nhỏ thì khả năng kháng khuẩn càng cao. Khi oligochitosan (LMw)

hoà tan trong dung dịch, chúng có thể xâm nhập qua thành tế bào của vi khuẩn, kết

hợp với DNA, làm ức chế quá trình tổng hợp mRNA và sao chép DNA. Ngoài ra, các

LMw tương tác với bề mặt tế bào tạo thành một lớp không thấm qua khắp tế bào, do

đó ngăn chặn việc vận chuyển các chất tan cơ bản vào tế bào.

3.4.3. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo

Ảnh hưởng của phân tử lượng trung bình (Mw) và nồng độ của β-chitosan lên

bệnh thối nhũn do Erwinia carotovora gây ra trên trái cà chua sau thu hoạch được

đánh giá và thể hiện trong Hình 3.26, Hình 3.27 và Hình 3.28.

131

Hình 3.26. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-1740 ở điều kiện in vivo.

Kết quả đánh giá ở Hình 3.26 đối với β-chitosan có Mw = 1740 kDa cho thấy

khả năng kháng bệnh không hiệu quả và tương tự với mẫu đối chứng khi sử dụng S-

1740 để xử lý ở các nồng độ 0,2%, 0,4% và 0,6% (Hình 3.26). Trong đó, kích thước

vết bệnh ngoài và bên trong đều tương tự như 2 mẫu đối chứng là mẫu xử lý bằng

nước cất và mẫu xử lý bằng acid acetic 1%. Kết quả khẳng định S-1740 hầu như

132

không có khả năng hạn chế sự phát triển của bệnh thối nhũn do Erwinia carotovora

gây ra trên trái cà chua ở tất cả các nồng độ (0,2-0,6%).

Hình 3.27. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-655 ở điều kiện in vivo.

Kết quả khi sử dụng β-chitosan có Mw = 655 kDa ở nồng độ 0,2-0,6% được

đánh giá ở Hình 3.27 cho thấy, bắt đầu có sự khác biệt đối với cả vết bệnh bên ngoài

và bên trong khi xử lý S-655 ở nồng độ 0,6%. Kết quả khẳng định khi xử dụng β-

133

chitosan S-655 ở nồng độ 0,6% có khả năng hạn chế quá trình phát triển bệnh thối

nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra trên trái cà chua, cụ thể kích thước vết

bệnh của cả bên trong và bên ngoài đều nhỏ hơn so với 2 mẫu đối chứng.

Hình 3.28. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-138 ở điều kiện in vivo.

Kết quả khi xử lý β-chitosan có Mw = 138 kDa ở các nồng độ 0,6%; 1% và

1,5% ở Hình 3.28 đều cho thấy, ở các nồng độ xử lý, S-138 đều có khả năng hạn chế

134

quá trình phát triển bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora trên trái cà chua,

cụ thể kích thước ở cả vết bệnh bên ngoài và bên trong đều có sự khác biệt và nhỏ hơn

nhiều so với 2 mẫu đối chứng. Kết quả cũng cho thấy kích thước của vết bệnh cả bên

trong và ngoài giảm đều tỉ lệ nghịch với nồng độ chitosan và ở nồng độ 1,5% cho kích

thước vết bệnh nhỏ nhất (Hình 3.29). Kết quả này có thể so sánh với một số kết quả

báo cáo trước đó, khẳng định chitosan được sử dụng để kiểm soát hiệu quả bệnh thối

trên quả táo, quả kiwi và lê sau thu hoạch của Bautista-Banõs 2006 [24], ở cà rốt theo

Cheah 1997 [39] và ở đu đủ theo Maisuria 2013 [101].

Hình 3.29. Kích thước vết bệnh bên trong được xử lý S-138 trong (a) 24 giờ , (b) 36 giờ.

Khả năng kiểm soát bệnh thối nhũn của chitosan từ mai mực có khối lượng

phân tử trung bình 138 kDa (S-138) và chitosan thương mại Sigma (C-120) được thể

hiện trong Hình 3.30 và Hình 3.31. Kết quả cho thấy cả 2 chitosan 138 kDa và

chitosan thương mại đều có khả năng hạn chế tốt sự phát triển bệnh thối nhũn do vi

khuẩn Erwinia carotovora trên trái cà chua sau thu hoạch. Kích thước vết bệnh khi xử

lý chitosan đều nhỏ hơn nhiều so với mẫu đối chứng theo thời gian thử nghiệm. Cụ thể

Hình 3.31 cho thấy, sau 36 giờ đường kính vết bệnh bên ngoài là 1,36 mm; 1,16 mm

và 1,84 mm và bên trong 1,4 mm; 1,33 mm và 1,41 mm lần lược đối với các mẫu trái

cà chua được xử lý bằng C-120 1,5%, S-138 1,5% và mẫu chứng. Tuy nhiên, không có

sự khác biệt về khả năng kháng bệnh giữa 2 loại chitosan 138 kDa và chitosan thương

mại.

135

Hình 3.30. So sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn ở điều kiện In vivo của S-138

và chitosan thương mại C-120 (a) kích thước vết bệnh bên ngoài và (b) kích thước

vết bệnh bên trong.

Kết quả đánh giá cũng khẳng định rằng, việc xử lý chitosan chỉ có thể kiểm soát

hiệu quả bệnh thối nhũn trên trái cà chua do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra

nhưng không có khả năng trị bệnh, vì kết quả thực nghiệm cho thấy mặc dù đã được

136

xử lý chitoan thì sau 72-96 giờ thì vết bệnh cũng phát triển và vi khuẩn sẽ phá hũy

hoàn toàn ký chủ trong khi ở mẫu đối chứng chỉ cần 48 giờ.

Hình 3.31. Kích thước vết bệnh bên trong và bên ngoài khi xử lý chitosan S-138

và chitosan thương mại C-120 sau 36 giờ.

Như vậy, chitosan từ mai mực Loligo sp. có (DD 91,3% và Mw 138 kDa) đã được

kiểm chứng và cho thấy có khả năng kiểm soát bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia sp.

gây ra trên trái cà chua sau thu hoạch. Kết quả này cũng được nhiều nghiên cứu khẳng

định và cho thấy rằng nhiều loại nấm bệnh, vi khuẩn và virut gây bệnh trước và sau

thu hoạch trên nhiều loại nông sản khác nhau có thể được kiểm soát bằng chitosan.

Ngoài hoạt động của vi khuẩn trực tiếp, các nghiên cứu cũng chứng minh rằng

chitosan gây ra một loạt các phản ứng phòng vệ có liên quan đến hoạt động enzyme

gọi là cơ chế kích kháng. Chitosan đã làm tăng sản xuất glucanohydrolases, các hợp

chất phenolic và tổng hợp các chất phytoalexins có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

hoặc tổng hợp lignin nhằm gia cố vách tế bào, chống lại các tác nhân phá hũy tế bào.

Ngoài ra, chitosan có khả năng tạo thành lớp màng bán thấm nên có thể kéo dài thời

gian bảo quản của trái cây và rau đã xử lý bằng cách giảm thiểu tốc độ hô hấp và giảm

137

lượng nước mất đi. Do đó, chitosan trở thành một loại tác nhân bảo vệ nông sản mới,

hỗ trợ cho mục tiêu của nông nghiệp bền vững. Để khẳng định điều này, luận án đã

tiến hành đánh giá tổng hàm lượng phenol trong các mẫu trái cà chua được xử lý

chitosan và giải thích một phần cơ chế tại sao khi trái cà chua sau khi được xư lý

chitosan có thể kháng được bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia sp. gây ra. Kết quả

đánh giá tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua sau khi được xử lý các loại

β-chitosan có khối lượng phân tử khác nhau theo thời gian 24 và 72 giờ được trình bày

trong Hình 3.32.

Hình 3.32. Tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua sau khi được xử lý

các loại chitosan có phân tử lượng khác nhau sau thời gian 24 và 72 giờ.

Kết quả đánh giá cho thấy trái cà chua sau thu hoạch sau khi xử lý chitosan đều

có tổng hàm lượng phenol cao hơn mẫu đối chứng và các mẫu chitosan có khối lượng

càng thấp thì tổng hàm lượng phenol trong trái cà chua càng tăng. Cụ thể đối với mẫu

trái cà chua sau khi được xử lý chitosan 138 kDa và chitosan thương mại sau 24 giờ có

138

hàm lượng phenol tổng số cao hơn gấp đôi mẫu đối chứng và sau 72 giờ tổng hàm

lượng polyphenol đạt 560-590 g/g. Kết quả nghiên cứu này cho thấy chitosan ngoài

việc tiếp xúc trực tiếp và tiêu diệt vi khuẩn Erwina carotovora thì chitosan còn có khả

năng kích kháng hệ thống đề kháng của bản thân trái cà chua, gia tăng tổng hàm lượng

phenol làm cơ sở gia tăng đề kháng, gia cố vách tế bào để chống lại sự phá hoại của vi

khuẩn gây bệnh. Kết quả này cũng phù hợp với một số kết quả báo cáo trước đó rằng

chitosan được sử dụng để kiểm soát bệnh thối trên quả táo, quả kiwi và lê sau thu hoạch

của Bautista-Banõs 2006 [24], ở cà rốt theo Cheah 1997 [39] và ở đu đủ theo Maisuria

2013 [101].

3.4.4. Đề xuất quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng dung dịch chitosan từ

mai mực Loligo sp.

Từ các kết quả nghiên cứu ở các mục 3.4.1; 3.4.2 và 3.4.3 cho phép đề xuất quy

trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng dung dịch chitosan nhằm hạn chế bệnh thối

nhũn do vi khuẩn Erwinia sp. được mô tả ở Hình 3.33.

Hình 3.33. Quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng chitosan.

139

- Chuẩn bị trái cà chua: Trái cà chua sau khi thu hoạch sẽ được rửa sạch, để ráo.

- Chuẩn bị dung dịch chitosan: Chitosan có khối lượng phân tử 138 kDa được

hòa tan trong dung dịch acid acetic 1% ở nồng độ 1-1,5%, sau đó dung dịch chitosan

này được chuẩn pH về 5-5,5 bằng dung dịch NaOH 5%.

- Xử lý dung dịch chitosan lên trái cà chua: Trái cà chua sau khi xử lý sẽ được

phủ đều dung dịch chitosan bằng cách cho trái cà chua lăn qua 1 băng chuyền có chứa

dung dịch chitosan trong thời gian từ 5 đến 10 giây. Sau đó, trái cà chua được để ráo ở

nhiệt độ phòng.

- Sau xử lý chitosan, trái cà chua được đưa đi bảo quản trong khác kho hoặc đóng

thùng vận chuyển đến nơi tiêu thụ.

140

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. KẾT LUẬN

Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận như sau:

1. Đã xác định được số liệu về thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực Loligo

sp. thải ra sau quá trình chế biến. Trong đó, hàm lượng -chitin là 35,8% so với hàm

lượng mai mực khô tuyệt đối. Hàm lượng này cao hơn nhiều so với hàm lượng -

chitin có trong vỏ tôm thẻ 9,2%. Đặc biệt, hàm lượng khoáng rất thấp (1,38%) và

không chứa các kim loại nặng (Hg, Pb, As). Vì vậy, mai mực ống là nguồn nguyên

liệu tốt để thu nhận chitin có độ tinh khiết cao.

2. Đã xác định được số liệu về điều kiện thu nhận -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại

từ mai mực ống. Trong đó, mai mực được xử lý trong dung dịch NaOH 4% ở nhiệt độ

80C trong thời gian 10 giờ với tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1/10 (w/v), sản phẩm

-chitin thu được có hàm lượng protein còn lại < 1% và hàm lượng khoáng không phát

hiện. Chitin có độ deacetyl 19,7% và khối lượng phân tử trung bình là 8545 kDa. Qui

trình thu nhận bỏ qua bước khử khoáng bằng acid HCl thường sử dụng khi thu nhận

chitin từ vỏ tôm, cua và ghẹ. Điều này cũng hạn chế quá trình cắt mạch chitin xảy ra

khi xử lý với dung dịch acid.

3. Đã xác định được điều kiện deacetyl thu nhận chitosan từ -chitin. Trong đó, chitin

được xử lý lần 1 trong dung dịch NaOH 50% ở nhiệt độ 80C trong thời gian 8 giờ với

tỷ lệ nguyên liệu và dung môi 1/10 (w/v), sau khi mẫu được rửa trung tính, mẫu tiếp

tục xử lý lần 2 trong môi trường NaOH 50% ở nhiệt độ 80C trong thời gian 4 giờ. Sản

phẩm chitosan thu được đạt tiêu chuẩn thương mại với độ deacetyl 91,3% và khối

lượng phân tử là 6831 kDa.

4. Đã xác định được số liệu về khả năng kháng khuẩn của chitosan từ mai mực ống đối

với vi khuẩn Erwinia sp. ở điều kiện in vitro. Kết quả cho thấy chitosan với độ deacetyl

cao và khối lượng phân tử thấp (< 655 kDa) có khả năng kháng khuẩn tốt. Trong đó,

chitosan có độ deacetyl 91,3% và khối lượng phân tử 138 kDa ở nồng độ 1,25% trong

dung dịch acid acetic 1% (w/v) cho kết quả kháng khuẩn tốt nhất.

141

5. Đã xác định được số liệu về khả năng kháng bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu

hoạch do vi khuẩn Erwinia sp. gây ra ở điều kiện in vivo. Kết quả cho thấy chitosan có

khối lượng phân tử 138 kDa với nồng độ trên 0,6% có thể hạn chế hiệu quả sự phát

triển bệnh thối nhũn trên trái cà chua.

2. KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan từ mai mực ống ở

các khối lượng phân tử nhỏ hơn và trên nhiều đối tượng vi khuẩn và nấm gây hại

trên rau quả sau thu hoạch.

2. Do sản phẩm chitin và chitosan thu được từ mai mực có khối lượng phân tử lớn,

hoạt tính kháng khuẩn tốt và độ tinh khiết cao. Do đó, đề xuất chế tạo các màng

chitin và chitosan từ các sản phẩm trên và ứng dụng trong bao gói thực phẩm.

142

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

1. Hoàng Ngọc Cương, Nguyễn Công Minh, Trang Sĩ Trung (2013). “Thu nhận

chitosan từ xương mực phế liệu và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây

bệnh thối nhũn (soft rot) trên cà chua sau thu hoạch”. Hội nghị khoa học Công nghệ

sinh học toàn quốc 2013.

2. Hoang Ngoc Cuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Van Hoa, Trang Si Trung (2016).

“Preparation and characterization of high purity β-chitin from squid pens (Loligo

chenisis)”. International Journal of Biological Macromolecules 93 (2016) 442–447.

3. Hoang Ngoc Cuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Van Hoa, Trang Si Trung (2016).

“High purity and high molecular weight β-chitin from squid pens (Loligo chenisis)”.

11th Asia pacific chitin and chitosan & 5th Indian chitin and chitosan society

symposium, Kochi, Kerala, India, 28-30 September, 2016.

4. Hoang Ngoc Cuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Van Hoa, Khong Trung Thang,

Nguyen Anh Tuan, Trang Si Trung (2017). “Hight molecular weight and high degree

of deacetylation of chitosan prepared from squid pens (Loligo chenisis)”. Journal of

Polymer Materials, Vol. 34, No. 1, 2017, 103-114.

5. Hoang Ngoc Cuong, Huynh Thanh Tung, Nguyen Cong Minh, Nguyen van Hoa,

Pham Thi Dan Phuong, Trang Si Trung (2017). “Antibacterial activity of chitosan

from squid pen (Loligo chenisis) against Erwinia carotovora from soft rot postharvest

tomato fruit”. Journal of Polymer Materials, Vol. 34, No. 1, 2017, 319-330.

143

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Đoàn Lan Phương, Nguyễn Thị Thu, Cầm Thị Ính, Trần Thị Dung, Phạm Quốc

Long (2013), "Nghiên cứu đánh giá chất lượng mực ống Loligo chinenisis Gray

trên vùng đảo Cô Tô", Kỷ yếu Hội nghị Quốc tế - Biển Đông 2012: p. 442-447.

2. Ngô Thị Hoài Dương (2014), "Tối ưu hóa quá trình thu nhận chitin-chitosan từ phế

liệu tôm thẻ chân trắng nhằm nâng cao hiệu quả và chất lượng sản phẩm", Luận án

Tiến sĩ. Đại học Nha Trang.

3. Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Quốc Hiến, Ngô Đại Nghiệp, Trang Sĩ Trung (2013),

"Chitin, chitosan và các dẫn xuất: Hoạt tính sinh học và ứng dụng". Việt Nam:

Nhà Xuất Bản Giáo Dục Việt Nam. 12-80.

4. Trần Thị Luyến (2000), "Hoàn thiện qui trình sản xuất chitin-chitosan và chế biến

một số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu tôm", Báo cáo khoa học đề tài cấp bộ,

Trường Đại học Nha Trang, Bộ Giáo dục và Đào tạo.

5. Trần Thị Luyến (2004), "Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm cấp bộ sản

xuất Chitin, Chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản", B2002-33-01-DA, Bộ Giáo dục

và Đào tạo.

6. Trần Thị Ý Nhi (2011), "Nghiên cứu một số phản ứng biến tính hoá học chitin/

chitosan và khả năng hấp phụ ion kim loại nặng, thuốc nhuộm của sản phẩm chitin/

chitosan đã biến tính", Luận án Tiến sĩ. Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

7. Trang Sĩ Trung, Trần Thị Luyến, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Hằng Phương

(2010), "Chitin - Chitosan từ phế liệu thủy sản và ứng dụng", Nhà Xuất Bản Nông

Nghiệp.

8. Vasep, Bản tin thương mại thủy sản in Hiệp hội chế biến và xuất khẩu Việt Nam.

2017. p. 31-33.

9. Vũ Triệu Mân (2007), "Giáo trình cây bệnh chuyên khoa". Vol. Bảo Vệ Thực Vật.

Đại học Nông nghiệp 1.

144

TIẾNG ANH

10. Abdou E.S., Nagy K.S., Elsabee M.Z. (2008), "Extraction and characterization of

chitin and chitosan from local sources", Bioresource Technology. 99 (5): p. 1359-

1367.

11. Alghisi P., Favaron F. (1995), "Pectin-degrading enzymes and plant-parasite

interactions", European Journal of Plant Pathology. 101 (4): p. 365-375.

12. Alishahi A., Mirvaghefi A., Tehrani M., Farahmand H., Shojaosadati S., Dorkoosh

F., Elsabee M.Z. (2011), "Enhancement and characterization of chitosan extraction

from the wastes of shrimp packaging plants", Journal of Polymers and The

Environment. 19 (3): p. 776-783.

13. Andrade V.S., de Barros Neto B., Fukushima K., de Campos-Takaki G.M. (2003),

"Effect of medium components and time of cultivation on chitin production by

Mucor circinelloides (Mucor javanicus IFO 4570)-A factorial study", Revista

Iberoamericana de Miccologia. 20 (4): p. 149-153.

14. Araki Y., Ito E. (1974), "A pathway of chitosan formation in Mucor rouxii:

enzymatic deacetylation of chitin", Biochemical and biophysical research

communications. 56 (3): p. 669-675.

15. Arce P., Moreno M., Gutierrez M., Gebauer M., Dell’Orto P., Torres H., Acuña I.,

Oliger P., Venegas A., Jordana X. (1999), "Enhanced resistance to bacterial

infection by Erwinia carotovora subsp. atroseptica in transgenic potato plants

expressing the attacin or the cecropin SB-37 genes", American Journal of Potato

Research. 76 (3): p. 169-177.

16. Armenta R.E., Guerrero-Legarreta I. (2009), "Amino acid profile and

enhancement of the enzymatic hydrolysis of fermented shrimp carotenoproteins",

Food Chemistry. 112 (2): p. 310-315.

17. Austin P., Brine C., Castle J., Zikakis J. (1981), "Chitin: New facets of research",

Science. 212 (4496): p. 749-753.

145

18. Aye K.N., Karuppuswamy R., Ahamed T., Stevens W.F. (2006), "Peripheral

enzymatic deacetylation of chitin and reprecipitated chitin particles", Bioresource

Technology. 97 (4): p. 577-582.

19. Aysan Y., Karatas A., Cinar O. (2003), "Biological control of bacterial stem rot

caused by Erwinia chrysanthemi on tomato", Crop Protection. 22 (6): p. 807-811.

20. Badawy M.E., Rabea E.I. (2009), "Potential of the biopolymer chitosan with

different molecular weights to control postharvest gray mold of tomato fruit",

Postharvest Biology and Technology. 51 (1): p. 110-117.

21. Barikani M., Oliaei E., Seddiqi H., Honarkar H. (2014), "Preparation and

application of chitin and its derivatives: a review", Iranian Polymer Journal. 23

(4): p. 307-326.

22. Bartz J.A. (1983), "Infiltration of tomatoes immersed at different temperatures to

different depths in suspensions of Erwinia carotovora subsp. carotovora", Plant

Disease. 66 (4): p. 302-306.

23. Barwin Vino A., Ramasamy P., Vairamani S., Shanmugan A. (2011),

"Physicochemical characterization of biopolymers chitin and chitosan extracted

from squid Doryteuthis sibogae adam, 1954 pen", International Journal Pharm.

Research Development. 2 (12): p. 181-190.

24. Bautista-Baños S., Hernandez-Lauzardo A.N., Velazquez-Del Valle M.G.,

Hernández-López M., Barka E.A., Bosquez-Molina E., Wilson C. (2006),

"Chitosan as a potential natural compound to control pre and postharvest diseases

of horticultural commodities", Crop Protection. 25 (2): p. 108-118.

25. Bautista-Baños S., Romanazzi G., Jiménez-Aparicio A. (2016), "Chitosan in the

preservation of agricultural commodities". 50 Hampshire Street, 5th Floor,

Cambridge, MA 02139, USA: Elsevier.

26. Bautista J., Jover M., Gutierrez J., Corpas R., Cremades O., Fontiveros E., Iglesias

F., Vega J. (2001), "Preparation of crayfish chitin by in situ lactic acid

production", Process Biochemistry. 37 (3): p. 229-234.

27. Blanchette R.A. (1995), "Degradation of the lignocellulose complex in wood",

Canadian Journal of Botany. 73 (S1): p. 999-1010.

146

28. Bough W., Salter W., Wu A., Perkins B. (1978), "Influence of manufacturing

variables on the characteristics and effectiveness of chitosan products. I. Chemical

composition, viscosity, and molecular‐ weight distribution of chitosan products",

Biotechnology and Bioengineering. 20 (12): p. 1931-1943.

29. Bourne W., McCalmont D., Wastie R. (1981), "Assessing potato tubers for

susceptibility to bacterial soft rot (Erwinia carotovora subsp. atroseptica)", Potato

Research. 24 (4): p. 409-415.

30. Bowman A., Bus C., Jellema P., Schepers A. Reducing blackleg spread in potato

by harvesting system. in 10th Triennial Conf European Assoc Potato Res, Aalborg,

Denmark. 1987.

31. Broussignac P. (1968), "Chitosan: A natural polymer not well known by the

industry", Chim. Ind. Genie Chim. 99 (9): p. 1241-1247.

32. Brugnerotto J., Lizardi J., Goycoolea F., Argüelles-Monal W., Desbrieres J.,

Rinaudo M. (2001), "An infrared investigation in relation with chitin and chitosan

characterization", Polymer. 42 (8): p. 3569-3580.

33. Bumgardner J.D., Wiser R., Gerard P.D., Bergin P., Chestnutt B., Marini M.,

Ramsey V., Elder S.H., Gilbert J.A. (2003), "Chitosan: potential use as a bioactive

coating for orthopaedic and craniofacial/dental implants", Journal of Biomaterials

Science, Polymer Edition. 14 (5): p. 423-438.

34. Campana-Filho S.P., de Britto D., Curti E., Abreu F.R., Cardoso M.B., Battisti

M.V., Sim P.C., Goy R.C., Signini R., Lavall R.L. (2007), "Extracao, estruturas e

propriedades de alpha-e beta-quitina", Química Nova. 30 (3): p. 644.

35. Carmona M.J., Molina A., Fernández J.A., López‐ Fando J.J., García‐ Olmedo F.

(1993), "Expression of the α‐ thionin gene from barley in tobacco confers

enhanced resistance to bacterial pathogens", The Plant Journal. 3 (3): p. 457-462.

36. Chandumpai A., Singhpibulporn N., Faroongsarng D., Sornprasit P. (2004),

"Preparation and physico-chemical characterization of chitin and chitosan from the

pens of the squid species, Loligo lessoniana and Loligo formosana", Carbohydrate

Polymers. 58 (4): p. 467-474.

147

37. Chang K.L.B., Tsai G. (1997), "Response surface optimization and kinetics of

isolating chitin from pink shrimp (Solenocera melantho) shell waste", Journal of

Agricultural and Food Chemistry. 45 (5): p. 1900-1904.

38. Chaussard G., Domard A. (2004), "New aspects of the extraction of chitin from

squid pens", Biomacromolecules. 5 (2): p. 559-564.

39. Cheah L., Page B., Shepherd R. (1997), "Chitosan coating for inhibition of

sclerotinia rot of carrots". Vol. Vol. 25. New Zealand Journal of Crop and

Horticultural Science

40. Chebotok E., Novikov V.Y., Konovalova I. (2007), "Kinetics of base

deacetylation of chitin and chitosan as influenced by their crystallinity", Russian

Journal of Applied Chemistry. 80 (10): p. 1753-1758.

41. Chien P.-J., Sheu F., Lin H.-R. (2007), "Coating citrus (Murcott tangor) fruit with

low molecular weight chitosan increases postharvest quality and shelf life", Food

Chemistry. 100 (3): p. 1160-1164.

42. Chien R.-C., Yen M.-T., Mau J.-L. (2016), "Antimicrobial and antitumor activities

of chitosan from shiitake stipes, compared to commercial chitosan from crab

shells", Carbohydrate Polymers. 138: p. 259-264.

43. Cho Y.I., No H.K., Meyers S.P. (1998), "Physicochemical characteristics and

functional properties of various commercial chitin and chitosan products", Journal

of Agricultural and Food Chemistry. 46 (9): p. 3839-3843.

44. Choi B.-K., Kim K.-Y., Yoo Y.-J., Oh S.-J., Choi J.-H., Kim C.-Y. (2001), "In

vitro antimicrobial activity of a chitooligosaccharide mixture against

Actinobacillus actinomycetemcomitans and Streptococcus mutans", International

Journal of Antimicrobial Agents. 18 (6): p. 553-557.

45. Chung Y.-C., Su Y.-P., Chen C.-C., Jia G., Wang H.-l., Wu J.G., Lin J.-G. (2004),

"Relationship between antibacterial activity of chitosan and surface characteristics

of cell wall", Acta Pharmacologica Sinica. 25: p. 932-936.

46. Cira L.A., Huerta S., Hall G.M., Shirai K. (2002), "Pilot scale lactic acid

fermentation of shrimp wastes for chitin recovery", Process Biochemistry. 37 (12):

p. 1359-1366.

148

47. Cortizo M.S., Berghoff C.F., Alessandrini J.L. (2008), "Characterization of chitin

from Illex argentinus squid pen", Carbohydrate polymers. 74 (1): p. 10-15.

48. Cuong H.N., Minh N.C., Van Hoa N., Trung T.S. (2016), "Preparation and

characterization of high purity β-chitin from squid pens (Loligo chenisis)",

International Journal of Biological Macromolecules. 93: p. 442-447.

49. Czajkowski R., Perombelon M.C., van Veen J.A., van der Wolf J.M. (2011),

"Control of blackleg and tuber soft rot of potato caused by Pectobacterium and

Dickeya species: a review", Plant Pathology. 60 (6): p. 999-1013.

50. Czechowska-Biskup R., Jarosińska D., Rokita B., Ulański P., Rosiak J.M. (2012),

"Determination of degree of deacetylation of chitosan-comparision of methods",

Prog. Chem. Appl. Chitin Its Deriv. 17: p. 5-20.

51. Dahmane E.M., Taourirte M., Eladlani N., Rhazi M. (2014), "Extraction and

characterization of chitin and chitosan from Parapenaeus longirostris from

Moroccan local sources", International Journal of Polymer Analysis and

Characterization. 19 (4): p. 342-351.

52. Darmadji P., Izumimoto M. (1994), "Effect of chitosan in meat preservation",

Meat Science. 38 (2): p. 243-254.

53. De Boer S., Copeman R., Vruggink H. (1979), "Serogroups of Erwinia carotovora

potato strains determined with diffusible somatic antigens", Phytopathology. 69

(3): p. 16319.

54. Ding F., Deng H., Du Y., Shi X., Wang Q. (2014), "Emerging chitin and chitosan

nanofibrous materials for biomedical applications", Nanoscale. 6 (16): p. 9477-

9493.

55. Domard A. (2011), "A perspective on 30 years research on chitin and chitosan",

Carbohydrate Polymers. 84 (2): p. 696-703.

56. Duarte V., De Boer S., Ward L., Oliveira A. (2004), "Characterization of atypical

Erwinia carotovora strains causing blackleg of potato in Brazil", Journal of

Applied Microbiology. 96 (3): p. 535-545.

149

57. Einbu A. (2007), "Characterisation of chitin and a study of its acid-catalysed

hydrolysis", PhD diss., Norwegian University of Science and Technology,

Trondheim.

58. FAO S.C.f.F.P. (2010), "Family Loliginidae", Cephalopods of The World. 2 (4).

59. Florek M., Fornal E., Gómez-Romero P., Zieba E., Paszkowicz W., Lekki J.,

Nowak J., Kuczumow A. (2009), "Complementary microstructural and chemical

analyses of Sepia officinalis endoskeleton", Materials Science and Engineering:

C. 29 (4): p. 1220-1226.

60. Folch J., Lees M., Sloane-Stanley G. (1957), "A simple method for the isolation

and purification of total lipids from animal tissues", Journal of Biological

Chemistry. 226 (1): p. 497-509.

61. Foster A., Hackman R. (1957), "Application of ethylenediaminetetra-acetic acid in

the isolation of crustacean chitin", Nature. 180 (4575): p. 40-41.

62. Gagné N. (1993), "Production of chitin and chitosan from crustacean waste and

their use as a food processing aid".

63. Gardan L. (2005), "Transfer of Pectobacterium chrysanthemi (Burkholder et al.

1953)", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 55

(14151427): p. 0.02791-0.

64. Gardan L., Gouy C., Christen R., Samson R. (2003), "Elevation of three

subspecies of Pectobacterium carotovorum to species level: Pectobacterium

atrosepticum sp. nov., Pectobacterium betavasculorum sp. nov. and

Pectobacterium wasabiae sp. nov", International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology. 53 (2): p. 381-391.

65. Ghaly A., Mahmoud N. (2006), "Optimum Conditions for Measuring

Dehydrogenase Activity of", American Journal of Biochemistry and

Biotechnology. 2 (4): p. 186-194.

66. Gnanamanickam S.S. (2006), "Plant-associated bacteria". Vol. 1. Heidelberg,

Germany: Springer.

67. Gudmestad N.C., Secor G.A. (1983), "The bionomics of Erwinia carotovora in

North Dakota", American Potato Journal. 60 (10): p. 759-771.

150

68. Gupta N.S. (2010), "Chitin: Formation and diagenesis". Vol. 34. Springer Science

& Business Media.

69. Hauben L., Moore E.R., Vauterin L., Steenackers M., Mergaert J., Verdonck L.,

Swings J. (1998), "Phylogenetic position of phytopathogens within the

Enterobacteriaceae", Systematic and Applied Microbiology. 21 (3): p. 384-397.

70. Hein S., Ng C.H., Stevens W.F., Wang K. (2008), "Selection of a practical assay

for the determination of the entire range of acetyl content in chitin and chitosan:

UV spectrophotometry with phosphoric acid as solvent", Journal of Biomedical

Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 86 (2): p. 558-568.

71. Helias V., Andrivon D., Jouan B. (2000), "Internal colonization pathways of

potato plants by Erwinia carotovora ssp. atroseptica", Plant Pathology. 49 (1): p.

33-42.

72. Herren H.R. (1994), "Cassava pest and disease management: An overview",

African Crop Science Journal. 2.4: p. 345-353.

73. Heuvelink E. (2005), "Tomatoes". Vol. vol. 13. CABI Publ., Oxfordshire, UK

74. Huang J., Zhao D., Hu S., Mao J., Mei L. (2012), "Biochemical activities of low

molecular weight chitosans derived from squid pens", Carbohydrate polymers. 87

(3): p. 2231-2236.

75. Hultmark D. (1993), "Immune reactions in Drosophila and other insects: a model

for innate immunity", Trends in Genetics. 9 (5): p. 178-183.

76. Inbaraj B.S., Tsai T.-Y., Chen B.-H. (2016), "Synthesis, characterization and

antibacterial activity of superparamagnetic nanoparticles modified with glycol

chitosan", Science and Technology of Advanced Materials.

77. Janse J.D. (2005), "Phytobacteriology: principles and practice". British Library,

London, UK: CABI Publishing is a division of CAB International.

78. Jung E.J., Youn D.K., Lee S.H., No H.K., Ha J.G., Prinyawiwatkul W. (2010),

"Antibacterial activity of chitosans with different degrees of deacetylation and

viscosities", International Journal of Food Science & Technology. 45 (4): p. 676-

682.

151

79. Jung J. (2013), "New development of β-chitosan from jumbo squid pens

(Dosidicus gigas) and its structural, physicochemical, and biological properties".

80. Jung J., Zhao Y. (2011), "Characteristics of deacetylation and depolymerization of

β-chitin from jumbo squid (Dosidicus gigas) pens", Carbohydrate research. 346

(13): p. 1876-1884.

81. Jung J., Zhao Y. (2012), "Comparison in antioxidant action between α-chitosan

and β-chitosan at a wide range of molecular weight and chitosan concentration",

Bioorganic & Medicinal Chemistry. 20 (9): p. 2905-2911.

82. Jung W., Jo G., Kuk J., Kim Y., Oh K., Park R. (2007), "Production of chitin from

red crab shell waste by successive fermentation with Lactobacillus paracasei

KCTC-3074 and Serratia marcescens FS-3", Carbohydrate Polymers. 68 (4): p.

746-750.

83. Kasaai M.R. (2010), "Determination of the degree of N-acetylation for chitin and

chitosan by various NMR spectroscopy techniques: A review", Carbohydrate

Polymers. 79 (4): p. 801-810.

84. Khor E. (2014), "Chitin: fulfilling a biomaterials promise". 225, Wyman Street,

Waltham, MA 01803, USA: Elsevier's Science and Technology Rights

Department in Oxford, UK.

85. Kim S.-K. (2010), "Chitin, chitosan, oligosaccharides and their derivatives:

biological activities and applications". CRC Press.

86. Kloepper J., Schroth M. (1981), "Relationship of in vitro antibiosis of plant

growth-promoting rhizobacteria to plant growth and the displacement of root

microflora", Phytopathology. 71 (10): p. 1020-1024.

87. Kong M., Chen X.G., Xing K., Park H.J. (2010), "Antimicrobial properties of

chitosan and mode of action: A state of the art review", International Journal of

Food Microbiology. 144 (1): p. 51-63.

88. Kristbergsson K., Einarsson J.M., Hauksson S., Peter M.G., Gislason J. (2003),

"Recent developments in deacetylation of chitin, and possible applications in food

formulations", Trans Atlantic Fisheries Technology. Iceland: Reykjavik.

152

89. Kumar P.S., Raj N.M., Praveen G., Chennazhi K.P., Nair S.V., Jayakumar R.

(2012), "In vitro and in vivo evaluation of microporous chitosan

hydrogel/nanofibrin composite bandage for skin tissue regeneration", Tissue

Engineering Part A. 19 (3-4): p. 380-392.

90. Kumirska J., Czerwicka M., Kaczyński Z., Bychowska A., Brzozowski K.,

Thöming J., Stepnowski P. (2010), "Application of spectroscopic methods for

structural analysis of chitin and chitosan", Marine Drugs. 8 (5): p. 1567-1636.

91. Kurita K. (2001), "Controlled functionalization of the polysaccharide chitin",

Progress in Polymer Science. 26 (9): p. 1921-1971.

92. Kurita K. (2006), "Chitin and chitosan: functional biopolymers from marine

crustaceans", Marine Biotechnology. 8 (3): p. 203.

93. Kurita K., Tomita K., Tada T., Ishii S., Nishimura S.I., Shimoda K. (1993), "Squid

chitin as a potential alternative chitin source: Deacetylation behavior and

characteristic properties", Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry.

31 (2): p. 485-491.

94. Lamarque G., Viton C., Domard A. (2004), "Comparative study of the first

heterogeneous deacetylation of α-and β-chitins in a multistep process",

Biomacromolecules. 5 (3): p. 992-1001.

95. Lavall R.L., Assis O.B., Campana-Filho S.P. (2007), "β-Chitin from the pens of

Loligo sp.: Extraction and characterization", Bioresource Technology. 98 (13): p.

2465-2472.

96. Lavertu M., Xia Z., Serreqi A., Berrada M., Rodrigues A., Wang D., Buschmann

M., Gupta A. (2003), "A validated 1 H NMR method for the determination of the

degree of deacetylation of chitosan", Journal of pharmaceutical and biomedical

analysis. 32 (6): p. 1149-1158.

97. Lertsutthiwong P., How N.C., Chandrkrachang S., Stevens W.F. (2002), "Effect of

chemical treatment on the characteristics of shrimp Chitosan", Journal of Metals,

Materials and Minerals. 12 (1): p. 11-18.

153

98. Liu H., Du Y., Wang X., Sun L. (2004), "Chitosan kills bacteria through cell

membrane damage", International Journal of Food Microbiology. 95 (2): p. 147-

155.

99. Liu J., Tian S., Meng X., Xu Y. (2007), "Effects of chitosan on control of

postharvest diseases and physiological responses of tomato fruit", Postharvest

Biology and Technology. 44 (3): p. 300-306.

100. Liu N., Chen X.-G., Park H.-J., Liu C.-G., Liu C.-S., Meng X.-H., Yu L.-J.

(2006), "Effect of Mw and concentration of chitosan on antibacterial activity of

Escherichia coli", Carbohydrate Polymers. 64 (1): p. 60-65.

101. Maisuria V.B., Nerurkar A.S. (2013), "Characterization and differentiation of

soft rot causing Pectobacterium carotovorum of Indian origin", European

Journal of Plant Pathology. 136 (1): p. 87-102.

102. Martinou A., Bouriotis V., Stokke B.T., Vårum K.M. (1998), "Mode of action of

chitin deacetylase from Mucor rouxii on partially N-acetylated chitosans",

Carbohydrate research. 311 (1): p. 71-78.

103. Martinou A., Kafetzopoulos D., Bouriotis V. (1995), "Chitin deacetylation by

enzymatic means: monitoring of deacetylation processes", Carbohydrate

Research. 273 (2): p. 235-242.

104. Membré J., Burlot P. (1994), "Effects of temperature, pH, and NaCl on growth

and pectinolytic activity of Pseudomonas marginalis", Applied and

Environmental Microbiology. 60 (6): p. 2017-2022.

105. Meng X., Yang L., Kennedy J.F., Tian S. (2010), "Effects of chitosan and

oligochitosan on growth of two fungal pathogens and physiological properties in

pear fruit", Carbohydrate Polymers. 81 (1): p. 70-75.

106. Methacanon P., Prasitsilp M., Pothsree T., Pattaraarchachai J. (2003),

"Heterogeneous N-deacetylation of squid chitin in alkaline solution",

Carbohydrate Polymers. 52 (2): p. 119-123.

107. Mildenhall J.P., Prior B., Trollope L.A. (1981), "Water relations of Erwinia

chrysanthemi: growth and extracellular pectic acid lyase production",

Microbiology. 127 (1): p. 27-34.

154

108. Minh N.C., Cuong H.N., Phuong P.T.D., Schwarz S., Stevens W.F., Van Hoa N.,

Trung T.S. (2016), "Swelling-assisted reduction of chitosan molecular weight in

the solid state using hydrogen peroxide", Polymer Bulletin: p. 1-11.

109. Muzzarelli R.A., Jeuniaux C., Gooday G.W. Chitin in nature and technology. in

International Conference on Chitin and Chitosan 1985: Senigallia, Italy). 1986.

Plenum Press.

110. Naznin R. (2005), "Extraction of chitin and chitosan from shrimp (Metapenaeus

monoceros) shell by chemical method", Pakistan Journal of Biological Sciences.

8 (7): p. 1051-1054.

111. Nemtsev S., Gamzazade A., Rogozhin S., Bykova V., Bykov V. (2002),

"Deacetylation of chitin under homogeneous conditions", Applied Biochemistry

and Microbiology. 38 (6): p. 521-526.

112. Nikolov S., Petrov M., Lymperakis L., Friák M., Sachs C., Fabritius H.O., Raabe

D., Neugebauer J. (2010), "Revealing the design principles of high‐ performance

biological composites using ab initio and multiscale simulations: The example of

Lobster Cuticle", Advanced Materials. 22 (4): p. 519-526.

113. No H.K., Meyers S.P. (1995), "Preparation and characterization of chitin and

chitosan - a review", Journal of Aquatic Food Product Technology. 4 (2): p. 27-

52.

114. No H.K., Meyers S.P., Lee K.S. (1989), "Isolation and characterization of chitin

from crawfish shell waste", Journal of Agricultural and Food Chemistry. 37 (3):

p. 575-579.

115. No H.K., Park N.Y., Lee S.H., Meyers S.P. (2002), "Antibacterial activity of

chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights",

International Journal of Food Microbiology. 74 (1): p. 65-72.

116. Okonkwo J., Ene L., Okoli O. (1995), "Potato production in Nigeria", National

Root Crops Research Institute, Umudike Umuahia, Abia State, Nigeria. 109.

117. Pareek N., Vivekanand V., Agarwal P., Saroj S., Singh R.P. (2013),

"Bioconversion to chitosan: A two stage process employing chitin deacetylase

155

from Penicillium oxalicum SAE M-51", Carbohydrate Polymers. 96 (2): p. 417-

425.

118. Parnell T., Suslow T., Harris L. (2004), "Tomatoes: safe methods to store,

preserve, and enjoy". University California Division of Agriculture and Natural

Resources Publications.

119. Patidar P., Agrawal D., Banerjee T., Patil S. (2005), "Optimisation of process

parameters for chitinase production by soil isolates of Penicillium chrysogenum

under solid substrate fermentation", Process Biochemistry. 40 (9): p. 2962-2967.

120. Percot A., Viton C., Domard A. (2003), "Optimization of chitin extraction from

shrimp shells", Biomacromolecules. 4 (1): p. 12-18.

121. Pereira A.G., Muniz E.C., Hsieh Y.-L. (2015), "1 H NMR and 1 H–13 C HSQC

surface characterization of chitosan–chitin sheath-core nanowhiskers",

Carbohydrate polymers. 123: p. 46-52.

122. Perombelon M., Van Der Wolf J. (2002), "Methods for the detection and

quantification of Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Pectobacterium

carotovorum subsp. atrosepticum) on potatoes: a laboratory manual", Dundee,

Scotland: Scottish Crop Research Institute Occasional Publication, (10).

123. Pillai C., Paul W., Sharma C.P. (2009), "Chitin and chitosan polymers:

Chemistry, solubility and fiber formation", Progress in Polymer Science. 34 (7):

p. 641-678.

124. Preedy V.R., Watson R.R. (2008), "Tomatoes and tomato products: Nutritional,

medicinal and therapeutic properties". Science Publishers, Enfield, New

Hampshire, USA.

125. Rabea E.I., Badawy M.E.-T., Stevens C.V., Smagghe G., Steurbaut W. (2003),

"Chitosan as antimicrobial agent: Applications and mode of action",

Biomacromolecules. 4 (6): p. 1457-1465.

126. Radhakumary C., Nair P.D., Reghunadhan Nair C., Mathew S. (2012),

"Chitosan‐ graft‐ poly (vinyl acetate) for hemodialysis applications", Journal of

Applied Polymer Science. 125 (3): p. 2022-2033.

156

127. Rahman A., Brecht J., Sargent S. Influence of initial temperature on development

of bacterial soft rot in inoculated tomato fruit. in Proc. Fla. State Hort. Soc.

1991.

128. Ramírez-Coutiño L., del Carmen Marín-Cervantes M., Huerta S., Revah S.,

Shirai K. (2006), "Enzymatic hydrolysis of chitin in the production of

oligosaccharides using Lecanicillium fungicola chitinases", Process

Biochemistry. 41 (5): p. 1106-1110.

129. Rao M., Guyot J., Pintado J., Stevens W. (2002), "Improved conditions for

lactobacillus fermentation of shrimp waste into chitin", Advance in chitin

science. 5: p. 40-44.

130. Rao M., Munoz J., Stevens W. (2000), "Critical factors in chitin production by

fermentation of shrimp biowaste", Applied Microbiology and Biotechnology. 54

(6): p. 808-813.

131. Rao M., Tuyen M., Stevens W., Chandrkrachang S. (2001), "Deproteination by

mechanical, enzymatic and Lactobacillus treatment of shrimp waste for

production of chitin", Chitin and chitosan: chitin and chitosan in life science.

Kodansha, Tokyo: p. 301-304.

132. Rao M.S., Stevens W.F. (2005), "Chitin production by Lactobacillus

fermentation of shrimp biowaste in a drum reactor and its chemical conversion to

chitosan", Journal of chemical technology and biotechnology. 80 (9): p. 1080-

1087.

133. Rhazi M., Desbrieres J., Tolaimate A., Alagui A., Vottero P. (2000),

"Investigation of different natural sources of chitin: influence of the source and

deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan",

Polymer International. 49 (4): p. 337-344.

134. Rinaudo M. (2006), "Chitin and chitosan: Properties and applications", Progress

in Polymer Science. 31 (7): p. 603-632.

135. Romantschuk M. (1992), "Attachment of plant pathogenic bacteria to plant

surfaces", Annual Review of Phytopathology. 30 (1): p. 225-243.

157

136. Saarilahti H., Heino P., Pakkanen R., Kalkkinen N., Palva I., Palva E. (1990),

"Structural analysis of the pehA gene and characterization of its protein product,

endopolygalacturonase, of Erwinia carotovora subspecies carotovora",

Molecular Microbiology. 4 (6): p. 1037-1044.

137. Samar M.M., El-Kalyoubi M., Khalaf M., El-Razik M.A. (2013),

"Physicochemical, functional, antioxidant and antibacterial properties of chitosan

extracted from shrimp wastes by microwave technique", Annals of Agricultural

Sciences. 58 (1): p. 33-41.

138. Schober B.M., Vermeulen T. (1999), "Enzymatic maceration of witloof chicory

by the soft rot bacteria Erwinia carotovora subsp. carotovora: the effect of

nitrogen and calcium treatments of the plant on pectic enzyme production and

disease development", European Journal of Plant Pathology. 105 (4): p. 341-

349.

139. Serrano C., Arce-Johnson P., Torres H., Gebauer M., Gutierrez M., Moreno M.,

Jordana X., Venegas A., Kalazich J., Holuigue L. (2000), "Expression of the

chicken lysozyme gene in potato enhances resistance to infection by Erwinia

carotovora subsp. atroseptica", American journal of potato research. 77 (3): p.

191-199.

140. Shahidi F., Arachchi J.K.V., Jeon Y.-J. (1999), "Food applications of chitin and

chitosans", Trends in Food Science & Technology. 10 (2): p. 37-51.

141. Shahidi F., Synowiecki J. (1991), "Isolation and characterization of nutrients and

value-added products from snow crab (Chionoecetes opilio) and shrimp

(Pandalus borealis) processing discards", Journal of Agricultural and Food

Chemistry. 39 (8): p. 1527-1532.

142. Shirai K., Guerrero I., Huerta S., Saucedo G., Castillo A., Gonzalez R.O., Hall

G.M. (2001), "Effect of initial glucose concentration and inoculation level of

lactic acid bacteria in shrimp waste ensilation", Enzyme and Microbial

Technology. 28 (4): p. 446-452.

143. Shrestha B., Blondeau K., Stevens W.F., Hegarat F.L. (2004), "Expression of

chitin deacetylase from Colletotrichum lindemuthianum in Pichia pastoris:

158

purification and characterization", Protein expression and purification. 38 (2): p.

196-204.

144. Shrinivas Rao M., Aye Nyein K., Si Trung T., Stevens W.F. (2007), "Optimum

parameters for production of chitin and chitosan from squilla (S. empusa)",

Journal of Applied Polymer Science. 103 (6): p. 3694-3700.

145. Simeon A.U. (2006), "Bacterial soft rot of tubers induced by Erwinia spp.

(Jones)".

146. Struszczyk H., Pośpieszny H., Gamzazade A. (2002), "Chitin and chitosan",

Polish-Russian Monograph, (1).

147. Subhapradha N., Ramasamy P., Shanmugam V., Madeswaran P., Srinivasan A.,

Shanmugam A. (2013), "Physicochemical characterisation of β-chitosan from

Sepioteuthis lessoniana gladius", Food chemistry. 141 (2): p. 907-913.

148. Sukmark T., Rachtanapun P., Rachtanapun C. (2011), "Antimicrobial activity of

oligomer and polymer chitosan from different sources against foodborne

pathogenic bacteria", Kasetsart Journal (Natural Science). 45: p. 636-643.

149. Suslow T., Cantwell M. (2009), "Tomato: recommendations for maintaining

postharvest quality", Produce Facts. Davis: Postharvest Technology Research &

Information Center.

150. Synowiecki J., Al-Khateeb N.A.A.Q. (2000), "The recovery of protein

hydrolysate during enzymatic isolation of chitin from shrimp Crangon crangon

processing discards", Food Chemistry. 68 (2): p. 147-152.

151. Ta H.T., Dass C.R., Dunstan D.E. (2008), "Injectable chitosan hydrogels for

localised cancer therapy", Journal of Controlled Release. 126 (3): p. 205-216.

152. Tokuyasu K., Ono H., Ohnishi-Kameyama M., Hayashi K., Mori Y. (1997),

"Deacetylation of chitin oligosaccharides of dp 2–4 by chitin deacetylase from

Colletotrichum lindemuthianum", Carbohydrate research. 303 (3): p. 353-358.

153. Tolaimate A., Desbrieres J., Rhazi M., Alagui A. (2003), "Contribution to the

preparation of chitins and chitosans with controlled physico-chemical

properties", Polymer. 44 (26): p. 7939-7952.

159

154. Tolaimate A., Desbrieres J., Rhazi M., Alagui A., Vincendon M., Vottero P.

(2000), "On the influence of deacetylation process on the physicochemical

characteristics of chitosan from squid chitin", Polymer. 41 (7): p. 2463-2469.

155. Toth I., Avrova A., Hyman L. (2001), "Rapid identification and differentiation of

the soft rot erwinias by 16S-23S intergenic transcribed spacer-PCR and

restriction fragment length polymorphism analyses", Applied and Environmental

Microbiology. 67 (9): p. 4070-4076.

156. Toth I., Sullivan L., Brierley J., Avrova A., Hyman L., Holeva M., Broadfoot L.,

Perombelon M., McNicol J. (2003), "Relationship between potato seed tuber

contamination by Erwinia carotovora ssp. atroseptica, blackleg disease

development and progeny tuber contamination", Plant Pathology. 52 (2): p. 119-

126.

157. Toth I., Van Der Wolf J., Saddler G., Lojkowska E., Hélias V., Pirhonen M.,

Elphinstone J. (2011), "Dickeya species: an emerging problem for potato

production in Europe", Plant Pathology. 60 (3): p. 385-399.

158. Trang Sĩ Trung, Phạm Thị Đan Phượng (2012), "Bioactive compounds from by-

products of shrimp processing industry in Vietnam", Journal of Food and Drug

Analysis. 20 (1): p. 195.

159. Tsai G.-J., Su W.-H. (1999), "Antibacterial activity of shrimp chitosan against

Escherichia coli", Journal of Food Protection®. 62 (3): p. 239-243.

160. Wakil S.M., Oyinlola K.A. (2011), "Diversity of pectinolytic bacteria causing

soft rot disease of vegetables in Ibadan, Nigeria", Journal of Applied Biosciences.

38: p. 2540-2550.

161. Wang G.-H. (1992), "Inhibition and inactivation of five species of foodborne

pathogens by chitosan", Journal of Food Protection®. 55 (11): p. 916-919.

162. Wang S.-L., Chio S.-H. (1998), "Deproteinization of shrimp and crab shell with

the protease of Pseudomonas aeruginosa K-187", Enzyme and Microbial

Technology. 22 (7): p. 629-633.

160

163. Wang S.-L., Yang C.-W., Liang T.-W., Peng J.-H., Wang C.-L. (2009),

"Degradation of chitin and production of bioactive materials by bioconversion of

squid pens", Carbohydrate Polymers. 78 (2): p. 205-212.

164. Winslow (2003), "Diagnosis protocols for organisms to plants", SMT Project

SMT-4-CT98-2252.

165. Wiśniewska-Wrona M., Niekraszewicz A., Ciechańska D., Pospieszny H.,

Orlikowski L.B. (2007), "Biological properties of chitosan degradation

products", Polish Chitin Society, Monograph. 12: p. 149-156.

166. Xia W., Wu Y. (1996), "Functional properties of chitooligosaccharides", J. Wuxi

Univ. Light Ind. 15: p. 297-302.

167. Xing K., Chen X.G., Kong M., Liu C.S., Cha D.S., Park H.J. (2009), "Effect of

oleoyl-chitosan nanoparticles as a novel antibacterial dispersion system on

viability, membrane permeability and cell morphology of Escherichia coli and

Staphylococcus aureus", Carbohydrate Polymers. 76 (1): p. 17-22.

168. Xu J., Zhao X., Wang X., Zhao Z., Du Y. (2007), "Oligochitosan inhibits

Phytophthora capsici by penetrating the cell membrane and putative binding to

intracellular targets", Pesticide Biochemistry and Physiology. 88 (2): p. 167-175.

169. Xu Y., Gallert C., Winter J. (2008), "Chitin purification from shrimp wastes by

microbial deproteination and decalcification", Applied microbiology and

biotechnology. 79 (4): p. 687-697.

170. Yang F.-C., Peters R.D., Dies H., Rheinstädter M.C. (2014), "Hierarchical, self-

similar structure in native squid pen", Soft Matter. 10 (30): p. 5541-5549.

171. Yang J.-K., Shih L., Tzeng Y.-M., Wang S.-L. (2000), "Production and

purification of protease from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean

wastes☆", Enzyme and Microbial Technology. 26 (5): p. 406-413.

172. Yap M.-N., Barak J.D., Charkowski A.O. (2004), "Genomic diversity of Erwinia

carotovora subsp. carotovora and its correlation with virulence", Applied and

Environmental Microbiology. 70 (5): p. 3013-3023.

161

173. Youn D.K., No H.K., Prinyawiwatkul W. (2013), "Preparation and

characterisation of selected physicochemical and functional properties of

β‐ chitosans from squid pen", International Journal of Food Science &

Technology. 48 (8): p. 1661-1669.

174. Youn D.K., No H.K., Prinyawiwatkul W. (2013), "Preparation and characteristics

of squid pen β‐ chitin prepared under optimal deproteinisation and

demineralisation condition", International Journal of Food Science &

Technology. 48 (3): p. 571-577.

175. Zheng L.-Y., Zhu J.-F. (2003), "Study on antimicrobial activity of chitosan with

different molecular weights", Carbohydrate Polymers. 54 (4): p. 527-530.

162

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1.1. Phương pháp Biuret: Xác định hàm lượng protein còn lại trong chitin, chitosan

Phụ lục 1.2. Phương pháp Micro-Biuret: Xác định hàm lượng protein còn lại trên chitin, chitosan

Phụ lục 1.3. Phương pháp xác định độ deacetyl của chitin và chitosan

Phụ lục 1.4.

Phương pháp xác định khối lượng phân tử trung bình (Mw) của chitin, chitosan

Phụ lục 1.5. Phương pháp xác định độ hòa tan của chitosan

Phụ lục 1.6. Phương pháp xác định chỉ số kết tinh và mức độ kết tinh

Phụ lục 2.1. Số liệu đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của 3 yếu tố (nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian) đến quá trình khử protein

Phụ lục 2.2. Số liệu đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình khử protein

Phụ lục 2.3. Số liệu đánh giá ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến quá trình khử protein

Phụ lục 2.4. Số liệu đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nồng độ naoh đến quá trình khử protein

Phụ lục 3.1. Số liệu đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của 3 yếu tố (nhiệt độ, nồng độ naoh và thời gian) đến quá trình deacetyl

Phụ lục 3.2. Số liệu đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình deacetyl

Phụ lục 3.3.

Số liệu đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nồng độ naoh đến quá trình deacetyl

Phụ lục 3.4. Số liệu đánh giá ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến quá trình deacetyl

Phụ lục 3.5. Số liệu deacetyl lần 1

Phụ lục 3.6. Kết quả kháng khuẩn trong điều kiện in vivo

Phụ lục 3.7. Đặc tính sinh hóa, sinh lý của erwinia spp.

PHỤ LỤC 1.1. PHƯƠNG PHÁP BIURET: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN

CÒN LẠI TRONG CHITIN, CHITOSAN

Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, liên kết peptide của phân tử protein phản ứng

với thuốc thử biuret tạo ra phức chất màu tím hoặc xanh tím. Cường độ màu của dung

dịch phản ánh số lượng liên kết peptide. Thông qua đường chuẩn protein ta có thể xác

định được hàm lượng protein ở trong mẫu.

Hóa chất, thuốc thử: Bovine serum albumin (BSA) chuẩn, dung dịch NaOH 4% và

dung dịch thuốc thử Biuret: Hòa tan 1.5 g Copper Sulfate (CuSO4) và 6.0 g sodium

potassium tartrate (KNaC4H4O6. 4H2O) trong 500 ml nước cất, khuấy đều và cho thêm

300 ml NaOH 10%. Dung dịch trên được khuấy trộn đều rồi làm đầy đến 1000 ml

bằng nước cất.

Tiến hành: Ngâm 5 g mẫu trong dung dịch NaOH 4% với tỷ lệ 1: 10 (w/v) sau đó ủ ở

950C trong 6 giờ. Sau khi ủ, phần bả và phần dịch lỏng được tách riêng bằng lọc chân

không, dùng nước cất rửa sạch phần bả. Thu toàn bộ phần dịch và phần nước rửa làm

đầy đến 100ml. Sau khi trộn đều, tiến hành lấy khoảng 10ml dung dịch và lọc qua giấy

lọc Whatman No1. Dung dịch sau lọc được xác định hàm lượng protein bằng phương

pháp Biuret với chất chuẩn là Bovine Serum Albumin. Hàm lượng protein trong mẫu

ban đầu được xác định bằng công thức:

Trong đó:

V: Tổng thể tích dịch lọc (ml)

C: nồng độ protein trong dịch lọc (mg/ml), được suy ra từ phương trình đường

chuẩn có dạng y=0,049x+0,002 (R2=0,999) với chất chuẩn Bovine Serum Albumin và

kết quả đo mật độ quang của dịch lọc ở bước sóng 570nm.

m: Khối lượng mẫu ban đầu (g)

W: Hàm ẩm của mẫu (g)

1000: hệ số chuyển đổi từ đơn vị mg sang g

PHỤ LỤC 1.2. PHƯƠNG PHÁP MICRO-BIURET: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG

PROTEIN CÒN LẠI TRÊN CHITIN, CHITOSAN

Trộn đều 1g chitin, chitosan với 10mL dung dịch NaOH 3%, sau đó gia nhiệt

lên 80oC trong khoảng 12h, làm nguội hỗn hợp đến nhiệt độ phòng và tiến hành lọc

để thu dịch lọc. Dịch lọc sau đó được ly tâm trong 15 phút ở tốc độ 5000 vòng/phút,

gạn lấy phần dịch nổi và pha loãng sao cho nồng độ protein nằm trong khoảng 0,05-

0,5gL-1. Lấy 4 ml trộn đều với 200µL thuốc thử Micro-Biuret và đo mật độ quang ở

bước sóng 330nm.

Cách pha thuốc thử Micro-Biuret: Hòa tan 173g Natri citrate và 100g Natri

carbonate trong nước ấm (nhiệt độ <100oC), tiếp đến hòa tan 17,3g đồng sulphate

trong 100ml nước và trộn hai dung dịch lại với nhau. Định mức toàn bộ đến thể tích

1000ml bằng nước cất. Hàm lượng protein trong mẫu ban đầu được xác định bằng

công thức:

Trong đó:

V: Tổng thể tích dịch lọc (ml)

C: Nồng độ protein trong dịch lọc (mg/ml), được suy ra từ phương

trình đường chuẩn có dạng y=1,5506x+0,0043 (R2=0,9999) và kết quả đo mật độ

quang của dịch lọc ở bước sóng 330nm.

m: Khối lượng mẫu ban đầu (g)

W: Hàm ẩm của mẫu (g)

1000: hệ số chuyển đổi từ đơn vị mg sang g

PHỤ LỤC 1.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ DEACETYL CỦA CHITIN VÀ

CHITOSAN [70]

Độ deacetyl của chitin, chitosan được xác định bằng phương pháp đo độ hấp

phụ quang học theo thủ tục được giới thiệu bởi Hein và cộng sự. Hòa tan 0,1g chitin,

chitosan trong 20ml dung dịch H3PO4 85% ở 60oC trong 40 phút. Lấy 1ml dung dịch

trên pha loãng với nước cất đã khử ion (25-30 lần tương ứng với mẫu phân tích là

chiosan hay chitin) và giữ tiếp trong 2 giờ ở 600oC. Dung dịch sau đó được làm nguội

và xác định mức độ hấp phụ quang học ở bước sóng 210nm. Độ deacetyl (DD) của

chitin, chitosan được tính theo công thức (2.3).

Trong đó:

w: lượng mẫu khô tuyệt đối có trong một ml dung dịch (mg/ml)

microMolNAG: hàm lượng N-acetyl glucosamine trong một ml dung dịch mẫu

đo, được xác định từ mức độ hấp phụ quang học đo được và phương trình đường

chuẩn y=862,6x+0,054, (R2=0,999).

microMolGlcN: hàm lượng D-glucosamine trong một ml dung dịch mẫu đo

được xác định theo công thức (2.4).

Các hệ số 0,20321 và 0,16117 là hệ số chuyển đổi từ đơn vị µmol/ml sang đơn

vị mg/ml và ngược lại của N-acetyl glucosamine và D-glucosamine, tương ứng.

PHỤ LỤC 1.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ TRUNG

BÌNH (MW) CỦA CHITIN, CHITOSAN

Phân tử lượng trung bình độ nhớt của chitin, chitosan từ mai mực ống được xác

định theo phương pháp được mô tả bới Chandumpai 2004 và Jung 2013 [36, 79].

Cân 15mg chitin đã nghiền (0,2 mm) trộn đều với 5,5g dung dịch NaOH 40%

đã được làm lạnh. Giữ hỗn hợp trong tủ lạnh khoảng 72 giờ, kiểm tra và lắc nhẹ

khoảng 1 lần/ngày. Sau 72 giờ, bổ sung 16,5 g nước đá, dùng đũa thủy tinh khuấy cho

đến khi chitin tan hết. Tiến hành lọc dung dịch thu được bằng bộ lọc chân không, sử

dụng giấy lọc GF/D có kích thước lỗ lọc là 2,7 m và đầu lọc 5 m. Sau lọc thu được

dung dịch chitin gốc có nồng độ 0,75 mg/mL dung dịch NaOH 10% (tương đương

0,075%). Tiếp tục pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ trong

khoảng từ 0,0375-0,5mg/ml.

Đối với mẫu chitosan sử dụng dung môi CH3COOH 0,17M, và dung dịch gốc

có nồng độ 0,3% (w/v) và pha loãng thành các dung dịch có nồng độ từ 0,3-1,5mg/ml.

Đo mẫu: Theo dõi thời gian chảy của dung môi và các mẫu đã pha loãng có

nồng độ xác định trên thiết bị ViscoSystem® AVS 470 của hãng Schott, sử dụng nhớt

kế Ubbelohde Type 562-20 và 567-20 tương ứng cho mẫu chitin và chitosan ở nhiệt độ

20oC. Nhớt kế được làm sạch và sấy khô hoàn toàn sau mỗi lần đo.

Tính kết quả: Phân tử lượng trung bình độ nhớt được xác định dựa vào đồ thị

biểu diễn mối quan hệ giữa độ độ nhớt nội theo nồng độ dung dịch mẫu và phương

trình Mark-Houwink: . Giá trị của các hằng số trong phương trình MHS

đối với chitin:

Đối với chitin trong dung môi NaOH 10%: K = 0,1 (mL/g) và a = 0,68.

Đối với chitosan trong dung môi CH3COOH 0,17M: K = 1,81 x 103 (mL/g) và a

= 0,93.

PHỤ LỤC 1.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ HÒA TAN CỦA CHITOSAN

Độ hòa tan của chitosan được xác định theo phương pháp được Samar và cộng

sự giới thiệu, có điều chỉnh. Cân chính xác 1 ,0g chitosan cho vào 100ml acid

acetic 1%; khuấy đều trong 60 phút để chitosan tan hoàn toàn, sau đó tiến hành lọc

qua giấy lọc Whatman No1, phần không tan trên giấy lọc được rửa nhiều lần bằng

nước cất, để ráo, và sấy đến khối lượng không đổi ở 60oC trong 4h. Độ hòa tan của

chitosan được xác định theo công thức:

Trong đó: M: Khối lượng chitosan (1,0 g); A: Khối lượng phần không tan cùng

với giấy lọc sau sấy (g); B: Khối lượng giấy lọc trước khi lọc, đã sấy đến khối lượng

không đổi (g).

PHỤ LỤC 1.6. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ KẾT TINH VÀ MỨC ĐỘ

KẾT TINH

Chỉ số kết tinh (CrI - Crystalline Index) được xác định theo phương pháp

được mô tả bởi Pareek và cộng sự [179] với các công thức:

và

Trong đó I020 và I110 là cường độ cực đại (arbitray units) của phổ nhiễu xạ tại

vị trí 020 và 110 tương ứng khi góc chiếu 2θ ≈ 9o và 2θ ≈ 20o; Iam là cường độ của

phổ nhiễu xạ vô định hình khi góc 2θ ≈ 16o. Sử dụng phần mềm OriginPro 8 xử lý dữ

liệu phổ nhiễu xạ tia X để xác định cường độ chiếu xạ tại các vị trí ứng với góc chiếu

xạ 2θ ≈ 9o, 16o; và 20o. Mức độ kết tinh (χcr - Degree of Crystallinity) được tính theo

phương pháp được Chebotok và cộng sự [59] giới thiệu:

Trong đó Stot là tổng vùng diện tích có cấu trúc tinh thể trên phổ Nhiễu xạ tia X

(2θ=4o-44o) và Sam là diện tích của vùng vô định hình trên phổ tương ứng. Sử dụng

phần mềm OriginPro 8 xử lý dữ liệu phổ nhiễu xạ tia X để xác định diện tích của vùng

có cấu trúc tinh thể và vô định hình.

PHỤ LỤC 2.1. SỐ LIỆU ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ ẢNH HƯỞNG CỦA 3 YẾU TỐ

(NHIỆT ĐỘ, NỒNG ĐỘ NAOH VÀ THỜI GIAN) ĐẾN QUÁ TRÌNH KHỬ PROTEIN

XỬ LÝ ANOVA Ở 30oC:

Thời gian NaOH 3% NaOH 4% NaOH 5%

24 5.5 4.6 2.9

36 4.2 3.7 2.1

48 3.5 2.9 1.6

60 3.1 2.5 1.3

72 2.8 2.4 1.1

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Protein

Source Type III Sum df Mean Square F Sig.

of Squares

Corrected Model 31 8.522 232.284 264.174a .000

875.160 Intercept 875.160 23854.920 .000 1

.137 Laplai .069 1.869 .163 2

91.789 Thoigian 18.358 500.394 .000 5

165.256 Nongdo 41.314 1126.128 .000 4

Thoigian * 6.992 .350 9.529 .000 20 Nongdo

2.128 Error .037 58

1141.462 Total 90

266.302 Corrected Total 89

a. R Squared = .992 (Adjusted R Squared = .988)

XỬ LÝ ANOVA Ở 60oC:

Thời gian NaOH 3% NaOH 4% NaOH 5%

6.5 2 4.8 5.3

5.5 4 3.3 4.0

3.9 6 2.6 3.1

2.3 8 1.2 2

1.7 10 1.1 1.4

1.7 12 1.0 1.4

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Protein

Source Type III Sum df Mean Square F Sig.

of Squares

Corrected Model 115.347a 31 3.721 129.309 .000

Intercept 251.837 1 251.837 8751.956 .000

Laplai .903 2 .451 15.686 .000

Thoigian 33.667 5 6.733 234.001 .000

Nongdo 77.431 4 19.358 672.727 .000

Thoigian * 3.347 20 .167 5.815 .000 Nongdo

Error 1.669 58 .029

Total 368.853 90

Corrected Total 117.016 89

a. R Squared = .986 (Adjusted R Squared = .978)

XỬ LÝ ANOVA Ở 90oC:

Thời gian NaOH 3% NaOH 4% NaOH 5%

4.5 2 3.6 4.1

2.5 4 1.6 2.2

1.9 6 1.1 1.5

1.5 8 0.6 0.9

1.3 10 0.4 0.7

1.3 12 0.4 0.7

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Protein

Source Type III Sum df Mean Square F Sig.

of Squares

Corrected Model 246.013a 31 7.936 313.686 .000

372.100 1 Intercept 372.100 14708.178 .000

.713 2 Laplai .356 14.085 .000

113.288 5 Thoigian 22.658 895.598 .000

126.940 4 Nongdo 31.735 1254.405 .000

Thoigian * 5.072 20 .254 10.024 .000 Nongdo

1.467 58 Error .025

619.580 90 Total

247.480 89 Corrected Total

a. R Squared = .994 (Adjusted R Squared = .991)

PHỤ LỤC 2.2. SỐ LIỆU ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NHIỆT ĐỘ ĐẾN QUÁ TRÌNH KHỬ PROTEIN

Nhiet Protein còn lại Mw do

1.8 1.65 8360 8550 8725 1.55 70

1.65 1.55 1.4 8675 8465 8240 75

0.5 0.8 0.7 8170 8328 8462 80

0.35 0.25 0.5 6730 6630 6830 85

0.4 0.2 0.3 5155 5040 5255 90

Nhietdo Pro Độ lệch Mw Độ lệch

1.67 0.13 8545 183 70

1.53 0.13 8460 218 75

0.67 0.15 8320 146 80

0.37 0.13 6730 100 85

0.30 0.10 5150 108 90

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Protein Source df Mean Square F Sig.

Type III Sum of Squares

78.289 762.722 78.289 .000 .000 .000

1.266 12.331 1.266 .016 5.063a 12.331 5.063 .162 17.555 5.224 4 1 4 10 15 14

Corrected Model Intercept Nhietdo Error Total Corrected Total a. R Squared = .969 (Adjusted R Squared = .957)

Protein

Duncan Nhietdo N

Subset 2 3 1

.3000 .3667

.6667

3 3 3 3 3

1.000 1.5333 1.6667 .228 .535

90.00 85.00 80.00 75.00 70.00 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .016. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. b. Alpha = 0.05.

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Mw Source df Mean Square F Sig.

Type III Sum of Squares

4 26352060.000a 6588015.000 266.529 .000

.000 .000

6588015.000 24717.800 830527215.000 26352060.000 247178.000 857126453.000 26599238.000 1 830527215.000 33600.370 4 266.529 10 15 14

Corrected Model Intercept Nhietdo Error Total Corrected Total a. R Squared = .991 (Adjusted R Squared = .987)

Duncan Nhietdo N

Subset 2 3

1 5150.0000

6730.0000

3 3 3 3 3

1.000 1.000 8320.0000 8460.0000 8545.0000 .125

90.00 85.00 80.00 75.00 70.00 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 24717.800. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. b. Alpha = 0.05.

PHỤ LỤC 2.3. SỐ LIỆU ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ THỜI GIAN ĐẾN QUÁ TRÌNH KHỬ PROTEIN

Thoigian Protein còn lại Mw

4.74 3.9 4.35 8530 8650 8763 4

2 1.85 1.75 8350 8180 8520 6

1.35 1.3 1.35 8454 8240 8020 8

1.15 0.65 0.9 7150 7010 6870 10

0.55 0.65 0.7 6060 6140 5980 12

0.65 0.45 0.5 5220 5020 5120 14

Thoigian Protein Độ lệch Mw Độ lệch

4.33 0.42 8648 117 4

1.87 0.13 8350 170 6

1.33 0.15 8238 217 8

0.90 0.1 7010 140 10

0.63 0.08 6060 80 12

0.53 0.10 5120 100 14

Thời gian:

Tests of Between-Subjects Effects

df Mean Square F Sig. Dependent Variable: Protein Source

Type III Sum of Squares

6.094

134.172 46.048 1013.777 134.172 .000 .000 .000

6.094 .045 30.472a 46.048 30.472 .545 77.065 31.017 5 1 5 12 18 17

Corrected Model Intercept Thoigian Error Total Corrected Total a. R Squared = .982 (Adjusted R Squared = .975)

Protein

Duncan Thoigian N Subset

1 2 3 4

.5333 .6333 .9000

1.3333

1.8667

3 3 3 3 3 3

1.000 .067 4.3300 1.000

14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 1.000 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .045. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

Khối lượng phân tử trung bình:

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Mw Source df Mean Square F Sig.

Type III Sum of Squares

5 30447885.611a 6089577.122 290.977 .000

.000 .000

6089577.122 20928.056 942894262.722 30447885.611 251136.667 973593285.000 30699022.278 1 942894262.722 45054.079 5 290.977 12 18 17

Corrected Model Intercept Thoigian Error Total Corrected Total a. R Squared = .992 (Adjusted R Squared = .988)

Duncan Thoigian N

Subset 3 5 4 2

6060.0000

7010.0000

8238.0000 8350.0000

1 3 5120.0000 3 3 3 3 3

1.000 1.000 1.000 .362 8647.6667 1.000

14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 20928.056.

PHỤ LỤC 2.4. SỐ LIỆU ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NỒNG ĐỘ NAOH ĐẾN QUÁ TRÌNH KHỬ PROTEIN

NaOH Protein còn lại Mw

2.1 2.2 2.4 9130 9305 9465 3.0

1 1 0.8 9110 9220 8994 3.5

0.65 0.5 0.75 8685 8405 8545 4.0

0.35 0.35 0.3 7860 8025 7935 4.5

0.2 0.25 0.25 6440 6320 6200 5.0

NaOH Protein Độ lệch Độ lệch Mw

2.23 0.15 9300 168 3.0

0.93 0.12 9108 113 3.5

0.63 0.13 8545 140 4.0

0.33 0.03 7940 83 4.5

0.23 0.03 6320 120 5.0

Nồng độ NaOH:

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Protein Source df Mean Square F Sig.

Type III Sum of Squares

1.959

180.831 11.441 1056.062 180.831 .000 .000 .000

1.959 .011 7.836a 11.441 7.836 .108 19.385 7.944 4 1 4 10 15 14

Corrected Model Intercept NaOH Error Total Corrected Total a. R Squared = .986 (Adjusted R Squared = .981)

Protein

Duncan NaOH N Subset

1 2 3 4

.2333 .3333

.6333

.9333

3 3 3 3 3

1.000 .267 1.000 2.2333 1.000

5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .011.

Khối lượng phân tử trung bình:

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Mw Source df Mean Square F Sig.

Type III Sum of Squares

4 17239245.600a 4309811.400 263.849 .000

.000 .000

4309811.400 16334.400 1019106821.400 17239245.600 163344.000 1036509411.000 17402589.600 1 1019106821.400 62390.221 263.849 4 10 15 14

Corrected Model Intercept NaOH Error Total Corrected Total a. R Squared = .991 (Adjusted R Squared = .987)

Duncan NaOH N Subset

1 2 3 4

6320.0000

7940.0000

8545.0000

3 3 3 3 3

1.000 1.000 9108.0000 9300.0000 .096 1.000

5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 16334.400.

PHỤ LỤC 3.1. SỐ LIỆU ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ ẢNH HƯỞNG CỦA 3 YẾU TỐ (NHIỆT ĐỘ, NỒNG ĐỘ NAOH VÀ THỜI GIAN) ĐẾN QUÁ TRÌNH DEACETYL

Nhiệt độ 30C NaOH 50% 35 40 45 50 53 55 61 65 72 75 77 80 81 NaOH 40% 33 35 38 40 42 44 45 48 54 57 58 58 60 NaOH 60% 40 50 55 60 65 69 72 76 78 83 85 86 - Nhiệt độ 60C NaOH 50% 50 60 67 72 75 80 86 86.6 - - - - - NaOH 40% 41 50 60 66 68 74 79 83 83 - - - - NaOH 60% 55 70 80 87 88.6 - - - - - - - - Nhiệt độ 90C NaOH 50% 60 80 90 91.3 - - - - - - - - - NaOH 40% 52 65 70 80 88 88.2 - - - - - - - NaOH 60% 68 95 95.5 - - - - - - - - - - Thời gian 3 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

PHỤ LỤC 3.2. SỐ LIỆU ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NHIỆT ĐỘ ĐẾN QUÁ TRÌNH DEACETYL

Nhietdo Giá trị trung bình Độ lệch chuẩn

DD Mw DD Mw

2.6 192 50 60.2 7784

1.3 182 60 65.7 6976

1.6 288 70 75.6 6824

0.4 0.6 182 328 80 90 87.9 90.1 6254 5604

Độ deacetyl (DD):

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: DD Source df Mean Square F Sig.

Type III Sum of Squares

520.177

210.371 86518.446 34989.888 210.371 .000 .000 .000

520.177 2.473 2080.710a 86518.446 2080.710 24.727 88623.882 2105.437 4 1 4 10 15 14

Corrected Model Intercept Nhietdo Error Total Corrected Total a. R Squared = .988 (Adjusted R Squared = .984)

Duncan Nhietdo N Subset

3 4 2

1 60.2667 65.7667 75.6667

3 3 3 3 3 1.000 87.9333 90.1000 .122 1.000

50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 Sig. 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 2.473. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. b. Alpha = 0.05.

Khối lượng phân tử trung bình (Mw):

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: DD Source df Mean Square F Sig. Type III Sum of Squares

4 8002667.600a 2000666.900 33.952 .000

.000 .000

2000666.900 58926.267 671123958.826 8002667.600 589262.672 679715889.098 8591930.272 1 671123958.826 11389.216 4 33.952 10 15 14

Corrected Model Intercept Nhietdo Error Total Corrected Total a. R Squared = .931 (Adjusted R Squared = .904) DD

Duncan Nhietdo N Subset

1 2 3 4

5604.3300 6254.3300

6824.3300 6976.6700 3 3 3 3 3 1.000 1.000 .460 7784.9200 1.000

90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 58926.267. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. b. Alpha = 0.05.

PHỤ LỤC 3.3. SỐ LIỆU ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NỒNG ĐỘ NAOH ĐẾN QUÁ TRÌNH DEACETYL

NaOH Giá trị trung bình Độ lệch chuẩn

DD Mw DD Mw

2.7 0 30 43.3 8100

2.1 0 35 45.27 8100

1.9 246 40 59.73 7423

3.6 238 45 75.83 7211

1.7 213 50 83.57 6702

1.5 294 55 85.67 4916

Độ deacetyl (DD):

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: DD

Source df Mean Square F Sig.

Type III Sum of Squares

1065.255

188.382 77369.978 13682.258 188.382 1065.255 .000 .000 .000

5.655 5326.277a 77369.978 5326.277 67.857 82764.113 5394.134 Corrected Model Intercept NaOH Error Total Corrected Total 5 1 5 12 18 17

a. R Squared = .987 (Adjusted R Squared = .982)

Duncan NaOH N Subset

2 4 3

1 43.3000 45.2700

59.7300

75.8300

3 3 3 3 3 3

.330 1.000 83.5700 85.6700 .301

30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 1.000 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 5.655.

Khối lượng phân tử trung bình (Mw):

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Mw

Source df Mean Square F Sig.

Type III Sum of Squares

21123039.072a 5 4224607.814 101.304 .000 Corrected Model

Intercept 901100161.214 1 901100161.214 21607.913 .000

NaOH 21123039.072 5 101.304 .000

Error 500427.877

4224607.814 41702.323 Total 922723628.164

12 18 17 Corrected Total 21623466.949

a. R Squared = .977 (Adjusted R Squared = .967)

Duncan

NaOH N Subset

1 2 3 4

4916.0000 55.00

6702.3300 50.00

45.00

7211.0000 7423.0000 40.00

8100.0000 30.00

8100.0000 3 3 3 3 3 3 35.00

1.000 1.000 .228 1.000 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

Based on observed means.

The error term is Mean Square(Error) = 41702.323.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

b. Alpha = 0.05.

PHỤ LỤC 3.4. SỐ LIỆU ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ THỜI GIAN ĐẾN QUÁ TRÌNH DEACETYL

Giá trị trung bình Độ lệch chuẩn

DD 2.37 0.79 1.15 1.39 1.46 1.92 Mw 184 187 136 167 56 101 Thời gian 4 8 12 16 20 24 DD 62.9 84.0 87.1 88.1 89.1 89.5 Mw 7753 7567 7081 6512 5669 4963

Độ deacetyl (DD):

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: DD

Source df Mean Square F Sig.

Type III Sum of Squares

314.906

123.383 125365.266 49119.188 123.383 314.906 .000 .000 .000

2.552 1574.528a 125365.266 1574.528 30.627 126970.422 1605.155 Corrected Model Intercept Thoigian Error Total Corrected Total 5 1 5 12 18 17

a. R Squared = .981 (Adjusted R Squared = .973)

Duncan Thoigian N

3 Subset 2

1 62.9300

84.0000

3 3 3 3 3 3

1.000 87.1000 88.1000 89.1000 89.5000 .113 1.000

4.00 8.00 12.00 16.00 20.00 24.00 Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 2.552. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. b. Alpha = 0.05.

Khối lượng phân tử trung bình (Mw):

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Mw

Source df Mean Square F Sig.

Type III Sum of Squares

18151139.516a 5 3630227.903 168.102 .000 Corrected Model

Intercept 781955712.771 1 781955712.771 36209.328 .000

Thoigian 18151139.516 5 3630227.903 168.102 .000

Error 259145.062 21595.422 12

Total 800365997.349 18

Corrected Total 18410284.577 17

a. R Squared = .986 (Adjusted R Squared = .980)

Duncan

Thoigian N Subset

1 2 3 4 5

24.00 3 4963.0000

20.00 5669.3300 3

16.00 3 6512.3300

12.00 3 7081.0000

8.00 3 7567.3300

4.00 3 7753.3300

Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 .147

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

Based on observed means.

The error term is Mean Square(Error) = 21595.422.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

b. Alpha = 0.05.

PHỤ LỤC 3.5. SỐ LIỆU DEACETYL LẦN 1

Thời Giá trị trung bình Độ lệch chuẩn gian

DD Mw DD Mw

72.9 7753 1.3 184 4

84.0 7567 0.3 187 8

87.1 7081 0.9 36 12

88.1 6512 1.3 167 16

89.0 5669 0.5 56 20

89.5 4963 0.9 101 24

SỐ LIỆU DEACETYL LẦN 2

Thời Giá trị trung bình Độ lệch chuẩn gian

DD Mw DD Mw

91.3 6831 1.0 36 4

92.7 5589 1.1 167 8

94 4745 1.3 56 12

94.2 3521 1.4 187 16

PHỤ LỤC 3.6. KẾT QUẢ KHÁNG KHUẨN TRONG ĐIỀU KIỆN IN VIVO

b a

Vết bệnh bên trong và bên ngoài trái cà chua ở thời điểm 36 giờ được xử lý với dung dịch chitosan S-138 có trọng lượng phân tử 138 kDa ở nồng độ 0,6%.

0% NC 0% NC

1.5%

0.6% 0.6% 1% 1.5% 1%

ĐC

Kích thước vết bệnh bên trong và kích thước vết bệnh bên ngoài tại thời điểm 72 giờ sau khi chủng bệnh được xử lý với dung dịch chitosan S-138 ở các nồng độ (0; 0,6; 1; 1,5%).

Kích thước vết bệnh bên ngoài và kích thước vết bên trong trái cà chua tại thời điểm 36 giờ sau khi chủng bệnh được xử lý với chitosan 1,5%, chitosan thương mại (M), chitosan S-138 (N), trái không xử lý dung dịch chitosan (ĐC).

PHỤ LỤC 3.7. ĐẶC TÍNH SINH HÓA, SINH LÝ CỦA ERWINIA SPP.

Theo Janse 2005, chương 2, trang 48.