Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

CAO NGỌC MINH TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA CAO CHIẾT CHỨA ALKALOID VÀ FLAVONOID

CHIẾT TÁCH TỪ RỄ CÂY KHỔ SÂM (SOPHORA FLAVESCENS AIT.)

TRỒNG TẠI TÂY NGUYÊN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

CAO NGỌC MINH TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT CHỨA ALKALOID VÀ FLAVONOID CHIẾT TÁCH TỪ RỄ CÂY KHỔ SÂM (SOPHORA FLAVESCENS AIT.) TRỒNG TẠI TÂY NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS. Ngô Đại Nghiệp 2. GS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn

Thành phố Hồ Chí Minh – 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Luận n n y l công tr nh nghi n cứu của tôi ƣ i s hƣ ng ẫn khoa học

của PGS. TS. Ngô Đại Nghiệp v GS. TS. Ho ng Nghĩa Sơn.

C c số liệu kết quả trong luận n l trung th c v m t phần đƣ c công ố

trong c c tạp chí chuy n ngành.

Những trích ẫn v t i liệu tham khảo trong luận n có nguồn gốc x c th c.

Th nh phố Hồ Chí Minh ng y 05 tháng 5 năm 2022

T c giả luận n,

Cao Ngọc Minh Trang

LỜI CẢM ƠN

Lu h h h i i n Sinh học Nhi ới, Học vi n Khoa

học và Công ngh - Vi H h họ g gh Vi N T g

h ghi gi h hi gi ể hoàn thành

lu n án này.

Tôi xin trân trọng c ơ ới:

- PGS. TS. Ng Đ i Nghi GS TS H g Nghĩ Sơ - h g g i Th

h ớ g h họ g i và ọi i i n thu i h

i g h i gi h hi n lu

- PGS. TS. Nguyễn Thị Ph ơ g Th o, TS. Lê Thành Long và các ồng

nghi p ó h ng góp ý quý báu cho tôi trong quá trình nghiên c u và hoàn thi n

lu n án.

- Học vi n Khoa học và Công ngh - Vi H h họ g gh

Vi t Nam, h i n Sinh học Nhi ới, gi i

ki n thu i h i g h họ ghi

- DS. Nguyễn Tiến Hùng – Cty Cổ ph Y D c phẩm Vimedimex 2, ThS.

Nguyễn Huy Vỹ - Trung tâm Kiểm nghi h D ơ g, ThS Nguyễn Khắc M nh –

Vi n Nhi ới M i T ng gi thu th p và hỗ tr phân tích m u trong quá

trình th c hi tài.

- Ban Giám hi u T g Đ i họ ă L g, Ban chủ nhi m khoa CNSH,

Khoa Công ngh , Khoa Công ngh ng dụng và ồ g ghi ủ g h

i i n thu i h i g h i gi ghi i h

T i i g iế ơ ắ h ới gi h g i h và b n bè

h h ng vi i g h họ ghi

Tác giả

Cao Ngọc Minh Trang

iii

MỤC LỤC

Trang

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii

MỤC LỤC ................................................................................................................. iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vi

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... ix

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3

1.1.Tổng quan về th c vật học Khổ Sâm .................................................................... 3

1.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................................. 3

1.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái ................................................................................... 3

1.1.3. Phân bố sinh thái, thu hái và chế biến ............................................................... 4

1.1.4. Thành phần hóa học .......................................................................................... 4

1.1.5. Tác dụng ƣ c lý của Khổ Sâm. ....................................................................... 7

1.2. Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa .............................................................. 10

1.2.1. Gốc t do và stress oxy hóa ........................................................................... 10

1.2.2. Chất kháng oxy hóa ......................................................................................... 12

1.2.3. Hoạt tính kháng oxi hóa của flavonoid trong rễ cây Khổ sâm ........................ 14

1.3. Tổng quan về hoạt tính kháng tế o ung thƣ: ................................................... 15

1.3.1. Quá trình Apoptosis ........................................................................................ 15

1.3.2. Quá trình Necrosis ........................................................................................... 15

1.3.3. Hoạt tính kháng ung thƣ từ rễ Khổ sâm .......................................................... 17

1.3.4. Dòng tế o ung thƣ gan ................................................................................. 18

1.3.5. Dòng tế bào ung thu vú ................................................................................... 19

1.4. Phƣơng ph p x c định matrine và oxymatrine trong Khổ sâm .......................... 21

1.4.1. Định tính v định lƣ ng matrine ..................................................................... 21

1.4.2. Phân lập matrine và oxymatrine làm chất đối chiếu ....................................... 22

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP ........................................................... 23

2.1. Đối tƣ ng nghiên cứu......................................................................................... 23

2.1.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ....................................................................... 23

2.1.2. Vật Liệu ........................................................................................................... 23

2.1.3. Thiết bị sử dụng ............................................................................................... 24

2.2. Phƣơng ph p nghi n cứu .................................................................................... 25

2.2.1. Định anh v đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu .................................................. 25

2.2.2. Chiết xuất ƣ c liệu Khổ sâm định hƣ ng phân lập alkaloid matrine và

oxymatrine ................................................................................................................. 29

2.2.3. Định lƣ ng polyphenol và flavonoid tổng số .................................................. 32

2.2.4. Phƣơng ph p x c định hoạt tính kháng oxy hóa ............................................. 33

2.2.5. Nuôi cấy tế bào ................................................................................................ 34

2.2.6. Hoạt tính kháng tế o ung thƣ HepG2 v BT474 của các cao chiết phân đoạn

từ rễ Khổ sâm ............................................................................................................ 35

2.2.7. Phƣơng ph p thống kê ..................................................................................... 39

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN .................................................................. 40

3.1. Định anh v đánh giá chất lƣ ng ƣ c liệu ..................................................... 40

3.1.1. Định danh loài cây Khổ sâm trồng tại Tây Nguyên ........................................ 40

3.1.2. Đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu ........................................................................ 42

3.2. Kết quả tách chiết m t số hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm ............................ 49

3.2.1. Phân lập Matrine và Oxymatrine bằng phƣơng ph p sắc ký điều chế ............ 49

3.2.2. X c định tổng polyphenol và tổng flavonoi trong ƣ c liệu ........................ 56

3.2.2.1. Định tính thành phần flavonoi trong ƣ c liệu. ......................................... 56

3.2.2.2. Định lƣ ng h p chất polyphenol tổng số (TPC) .......................................... 58

3.2.2.3. Định lƣ ng flavonoid tổng số ...................................................................... 59

3.3. Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết rễ Khổ sâm. ............................. 61

3.4. Kết quả ức chế các tế o ung thƣ ..................................................................... 63

3.4.1. Ảnh hƣởng cao chiết phân đoạn t i s tăng sinh của tế bào HepG2 và BT474.

................................................................................................................................... 63

3.4.2. Ảnh hƣởng của cao CHCl3 lên mật đ tế bào, hình thái tế bào và nhân ......... 66

3.4.3. Ảnh hƣởng của cao CHCl3 lên chu kì tế bào .................................................. 71

3.4.4. Ảnh hƣởng của cao CHCl3 lên quá trình Apoptosis....................................... 73

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 81

1. Kết luận ........................................................................................................ 81

2. Kiến nghị ........................................................................................................ 81

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ........................................................ 82

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ......................................................... 83

PHỤ LỤC .................................................................................................................. 95

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………...………………………………….………...83

PHỤ LỤC…………………………………………………………………………..95

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ABTS : 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid

ACN : Acetonitrile

: AIDS Acquired Immuno-deficiency Syndrome (h i chứng suy giảm

miễn dịch mắc phải)

: AR Analytical Reagent (thuốc thử dùng cho phân tích)

ATCC : American Type Culture Collection (B sƣu tập giống của Mỹ)

BT474 : Breast Tumor 474 (Dòng tế o ung thƣ vú BT474)

: DĐTQ Dƣ c điển Trung Quốc

: DĐVN Dƣ c điển Việt Nam

DMEM : Môi trƣờng Dulbecco's Modified Eagle

: DMSO Dimethylsulfoxide

: DNPH 2,4-dinitrophenylhydrazin

: DPPH• 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

: EA Ethyl acetate

: EDTA Ethylendiamintetraacetic acid disodium salt

EtOH : Ethanol

: FCR Folin–Ciocalteu Reagent (thuốc thử Folin-Ciocalteu)

: FRAP Ferric Re ucing Antioxi ant Power (năng l c khử sắt)

: FV FRAP Value (chỉ số FRAP)

: GAE Gallic acid Equivalent (đƣơng lƣ ng gallic acid)

: GSH Glutathione

HepG2 : Hepatoma G2 (Dòng tế o ung thƣ gan HepG2)

HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao)

HRMS : High Resolution Mass Spectrometry (Khối phổ phân giải cao)

: Inhibition concentration at 50 % (nồng đ ức chế 50 %) IC50

LOD : Loss On Drying (Mất khối lƣ ng do làm khô)

vii

OD : Optical Density (Mật đ quang)

PBS : Phosphate-buffered saline

QE : Quercetin Equivalent (đƣơng lƣ ng quercetin)

RT- PCR: Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction

Retention factor (chỉ số lƣu giữ) : Rf

Reactive Nitrogen Species (Các gốc t do chứa Ni tơ) : RNS

Reactive Oxygen Species (Các gốc t do chứa Oxy) : ROS

SFNP : Sophora Flavescens Nanoparticles

Solid phase extraction (Chiết pha rắn) : SPE

Total Flavonoid Content (hàm lƣ ng flavonoid tổng số) : TFC

Thin layer Chromatography (Sắc ký l p mỏng) : TLC

TPC : Total Phenolic Content (h m lƣ ng h p chất polyphenol tổng

số)

viii

DANH MỤC BẢNG

B ng 1.1: M t số dạng gốc t do ........................................................................... 11

B ng 1.2: Tính chất hóa lý của matrine và oxymatrine ............................................ 21

B ng 2.1: Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu. ........................................... 24

B ng 2.2: Chƣơng tr nh pha đ ng phân tách matrine và oxymatrine ....................... 27

B ng 2.3: Chƣơng tr nh pha đ ng hệ sắc ký điều chế .............................................. 31

B ng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime RT- PCR cho các gene liên quan

t i s chết theo chƣơng tr nh..................................................................................... 37

B ng 2.5: Trình t cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho phản ứng định lƣ ng Realtime

RT- PCR .................................................................................................................... 37

B ng 3.1: Kết quả search last NCBI ....................................................................... 41

B ng 3.2: Kết quả đ ẩm, tro toàn phần và tổng chất chiết của nguyên liệu............ 44

B ng 3.3: Chƣơng tr nh pha đ ng HPLC-UV phân tách matrine và oxymatrine ..... 46

B ng 3.4: Khảo sát tỉ lệ dung môi EtOH chiết matrine và oxymatrine từ rễ Khổ sâm

................................................................................................................................... 48

B ng 3.5: Các thông số thẩm định phƣơng ph p HPLC-UV x c định matrine và

oxymatrine. ................................................................................................................ 48

B ng 3.6: H m lƣ ng matrine và oxymatrine trong cao phân đoạn EtOH 80 %, EA,

CHCl3 v cao nƣ c .................................................................................................... 49

B ng 3.7: Tối ƣu l m sạch dịch chiết ƣ c liệu trên c t OASIC MCX, sử dụng 200

mg cao CHCl3 cho ƣ c khảo sát này. ...................................................................... 50

B ng 3.8: Nhận danh flavonoid trong cao EA bằng HPLC-HRMS ......................... 57

B ng 3.9: Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết rễ Khổ sâm .............. 61

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: B phận trên mặt đất (A) và rễ (B) của Khổ sâm ................................... 4

Hình 1.2: M t số thành phần alkaloid của Khổ sâm ................................................... 5

Hình 1.3: Khung cấu trúc chung của flavonoid ..................................................... 6

Hình 1.4: Phân iệt s kh c nhau giữa Apoptosis v Necrosis . .............................. 16

Hình 1.5: Dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 . ............................................................ 18

Hình 1.6: Dòng tế o ung thƣ vú BT474 ................................................................ 20

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất khảo sát ........................................................... 30

Hình 3.1: (A), (B) hình thái cây Khổ sâm 2 năm tuổi đƣ c trồng tại Đắk Nông và

thu hái vào tháng 3/2016, (C) hoa Khổ sâm, (D) rễ Khổ sâm tƣơi (E) rễ Khổ sâm

phơi khô, (F) mặt cắt ngang của rễ Khổ sâm khô, (G), rễ Khổ sâm khô chặt nhỏ, (H)

b t rễ Khổ sâm. ......................................................................................................... 40

Hình 3.2: (A) Tinh b t vi phẫu và (B) vi phẫu mặt cắt ngang rễ Khổ sâm .............. 42

Hình 3.3: M t số thành phần b t rễ Khổ sâm quan s t ƣ i kính hiển vi quang học

(X10) ......................................................................................................................... 43

Hình 3.4: Phản ứng v i NaOH của rễ Khổ sâm phơi khô ........................................ 44

Hình 3.5: Kết quả định tính alkaloi trong ƣ c liệu ............................................... 46

Hình 3.6: Phƣơng tr nh đƣờng chuẩn matrine và oxymatrine .................................. 47

Hình 3.7: Cấu trúc pha tĩnh c t OASIS MCX .......................................................... 51

Hình 3.8: Sắc ký đồ điều chế matrine và oxymatrine ............................................... 52

Hình 3.9: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của matrine điều chế.

................................................................................................................................... 54

Hình 3.10: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của oxymatrine

điều chế ..................................................................................................................... 55

Hình 3.11: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao chiết EA .................................. 56

Hình 3.12: Tƣơng quan tuyến tính giữa nồng đ gallic acid và đ hấp thu

quang 765 nm. ......................................................................................................... 58

Hình 3.13: Tƣơng quan tuyến tính giữa nồng đ quercetin và đ hấp thu

quang ở 415 nm. ..................................................................................................... 59

Hình 3.14: Phân bố TPC và TFC trong b t rễ Khổ sâm và các loại cao .......... 60

Hình 3.15: Ảnh hƣởng của cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) và H2O (D) lên tế bào

HepG2 ....................................................................................................................... 63

Hình 3.16: Ảnh hƣởng của cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) và H2O (D) lên tế bào

BT474 ........................................................................................................................ 64

Hình 3.17: Ảnh hƣởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên s tăng sinh tế bào

ung thƣ BT474. a c : kh c iệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05). ....................... 64

Hình 3.18: S thay đổi hình thái tế bào HepG2 xử lý v i các mức nồng đ cao chiết

CHCl3 từ rễ Khổ sâm: 3,125 µg/mL (A), 6,25 µg/mL (B), 12,5 µg/mL (C), 25

µg/mL (D), 50 µg/mL (E) và 100 µg/mL (F) đ phóng đại x 100. ......................... 66

Hình 3.19: Đƣờng tuyến tính giữa mật đ tế bào/ giếng v i giá trị OD tƣơng ứng

đƣ c đo tại ƣ c sóng 450 nm. ................................................................................. 66

Hình 3.20: Mật đ tế bào HepG2/giếng khi xử lý v i các mức nồng đ khác nhau

của cao chiết CHCl3 .................................................................................................. 67

Hình 3.21: Tỉ lệ quẩn thể tế bào HepG2 xử lý v i các mức nồng đ cao chiết CHCl3.

(A) Q1: quần thể tế bào necrosis, Q2: quần thể tế o nh thƣờng, Q3: quần thể tế

bào apoptosis s m, Q4: quần thể tế bào apoptosis mu n và (B) *** khác biệt có ý

nghĩa thống k (P ≤ 0,001), ** khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.01). ................ 68

Hình 3.22: Ảnh hƣởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên hình thái nhân. A (0

mg/L) , B (1 µg/mL), C (10 µg/mL), D (100 µg/mL); Thang đo: 30 µm. ................ 69

Hình 3.23: Ảnh hƣởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên hình dạng tròn nhân

(Nuclear round shape). a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05). ................ 70

Hình 3.24: Tỉ lệ tế bào trong pha G0/G1 và G2/M khi đƣ c xử lý v i cao chiết

CHCl3 từ rễ Khổ sâm ở các nồng đ khác nhau........................................................ 71

Hình 3.25: Tỉ lệ tế bào trong pha G0/G1 và G2/M khi đƣ c xử lý v i cao chiết

CHCl3 từ rễ Khổ sâm ở các nồng đ khác nhau. a, b, c, d: khác biệt có ý nghĩa thống

k (P ≤ 0,05). ............................................................................................................. 72

Hình 3.26: S biểu hiện mRNA gene p53, Bcl-2, Caspase 9, Caspase 3 và Bax của

tế bào HepG2 thông qua phản ứng Realtime-PCR sau 24h và 48h cảm ứng bằng

CHCl3 v nhóm đối chứng ........................................................................................ 73

Hình 3.27: Tỉ lệ tế bào nh thƣờng ƣ i s cảm ứng của dịch chiết sau 24h, 48h và

72h so v i nhóm đối chứng (*p<0,05). (Q1: quần thể tế bào necrosis, Q2: quần thể

tế o nh thƣờng, Q3: quần thể tế bào apoptosis s m, Q4: quần thể tế bào

apoptosis mu n) ........................................................................................................ 75

Hình 3.28: Tỉ lệ tế bào apoptosis s m và apoptosis mu n ƣ i s cảm ứng của dịch

chiết sau 24h, 48h và 72h so v i nhóm đối chứng (*p<0,05) ................................... 76

Hình 3.29: Kết quả Western Blot đ nh gi mức đ biểu hiện protein caspase 3 và

caspase 9 .................................................................................................................... 77

Hình 3.30: So sánh s biểu hiện protein caspase 3 và caspase 9 ở c c giai đoạn khác

nhau (p < 0,05) .......................................................................................................... 77

Hình 3.31: Kết quả Western Blot đ nh gi mức đ biểu hiện protein Bax và Bcl-278

Hình 3.32: So sánh s biểu hiện protein Bax và Bcl-2 ở c c giai đoạn khác nhau

(p<0.05) ..................................................................................................................... 79

MỞ ĐẦU

Nghiên cứu sử dụng cây thuốc trong y học cổ truyền hiện nay đang đƣ c

phát triển rất mạnh và có chiều sâu ở Việt Nam. Nằm ở vùng khí hậu nhiệt đ i gió

mùa, Việt Nam đƣ c đ nh gi l nƣ c đứng thứ 16 trên thế gi i về s phong phú,

đa ạng sinh vật trong đó có đ đa ạng về cây thuốc. Để tăng th m tính đa ạng

của cây thuốc Việt Nam và phong phú các bài thuốc trong y học cổ truyền thì việc

di th c m t số cây thuốc có giá trị về trồng và phát triển l m ƣ c liệu cũng l m t

việc làm rất cần thiết.

Trong đó khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) l ƣ c liệu đã đƣ c sử ụng từ

lâu trong y học cổ truyền phƣơng đông để chữa nhiều ệnh nhƣ chống loạn nhịp

tim c c chứng vi m xuất huyết ti u ho l v ký sinh tr ng. Rễ của cây Khổ sâm

(Sophorae Flavescentis Radix) đã đƣ c chứng minh trong thử nghiệm lâm sàng là

không gây đ c đối v i con ngƣời. Các nghi n cứu tr n thế gi i cho thấy cao chiết từ

rễ khổ sâm có chứa c c h p chất alkaloi v flavonoi có hoạt tính kh ng oxy hóa

kh ng vi m kh ng khuẩn v ức chế s ph t triển của m t số ng tế o ung thƣ

nhƣ HepG2, MCF7 và A549. Tuy nhi n cơ chế tăng sinh ị ức chế trong tế bào

HepG2 v BT474 ƣ i t c đ ng của chiết xuất từ rễ Khổ sâm vẫn chƣa đƣ c nghiên

cứu chuyên sâu.

Tại Việt Nam, m t số chế phẩm đƣ c sản xuất từ cây Khổ sâm nhƣ Ninh tâm

vƣơng h tr trong ệnh lý nhịp tim nhanh Nữ vƣơng h tr trong điều trị vi m

nhiễm phụ khoa ở nữ gi i, tuy nhiên chủ yếu nhập nguyên liệu từ Trung Quốc. Hệ

quả là nguồn nguyên liệu còn bị đ ng và các đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu chƣa

kiểm soát chặt chẽ. Hiện nay, khổ sâm đã đƣ c i th c trồng tại Đắk Nông - Tây

Nguy n bởi Công ty Cổ phần Dƣ c phẩm BV Pharma. Từ đó, các nghiên cứu đ nh

giá chất lƣ ng ƣ c liệu nhằm x c định thành phần h m lƣ ng hoạt chất có hoạt

tính sinh học v x c định đ c tính là việc cần phải đƣ c th c hiện giúp chủ đ ng

nguồn ƣ c liệu trong sản xuất v đảm ảo chất lƣ ng nguy n liệu. Trong định

hƣ ng chiến lƣ c của ng nh ƣ c Việt Nam đến năm 2020 v tầm nh n đến năm

2030 cũng đã đề ra mục tiêu phát triển để Việt Nam có thể chủ đ ng đƣ c 60 % về

thuốc v o năm 2020 m trong đó chú trọng đến thuốc có nguồn gốc th c vật. Theo

báo cáo của cục quản lý ƣ c và tổ chức IQVIA năm 2020 thuốc sản xuất trong

nƣ c chiếm 47 % nhu cầu sử dụng.

Tuy vậy ƣ c điển Việt Nam V vẫn chƣa có chuy n luận ri ng về ƣ c liệu

rễ khổ sâm đồng thời hiện nay chỉ có m t v i công tr nh nghi n cứu về ƣ c liệu

khổ sâm tại Việt Nam, gây khó khăn trong đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu thô v chế

phẩm chứa ƣ c liệu n y trong nƣ c v ngoại nhập.

Từ những lý do cấp thiết tr n đề t i: “Nghiên cứu một số hoạt tính sinh

học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm

(Sophora flavescens Ait.)” trồng tại Tây Nguyên” đƣ c th c hiện.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

- Đ nh gi đƣ c m t số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và

flavonoid chiết xuất từ rễ Khổ sâm trồng tại Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu chính của luận án:

- Đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu

- Nghiên cứu tách chiết m t số hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm.

- Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hoá của các cao chiết rễ Khổ sâm.

- Nghiên cứu khả năng kh ng ung thƣ của cao chiết rễ Khổ sâm trên các

dòng tế o ung thƣ gan HepG2 v ng tế o ung thƣ vú BT474.

Tính mới của đề tài:

- Các kết quả đƣ c th c hiện và công bố trong đề tài này là những nghiên

cứu chuy n sâu đầy đủ nhất từ trƣ c t i nay tr n đối tƣ ng th c vật Khổ sâm di

th c đang đƣ c trồng tại Tây Nguyên.

- Lần đầu ti n đ nh gi đƣ c tác dụng kháng oxy hóa và ức chế tăng sinh tế

o ung thƣ gan ung thƣ vú của cao rễ cây Khổ sâm trồng ở Tây Nguyên.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Việc x c định khả năng kh ng oxy hóa v ức chế tăng sinh tế o ung thƣ

gan ung thƣ vú của cao CHCl3 từ rễ cây Khổ sâm đã góp phần khẳng định chất

lƣ ng của cây Khổ sâm đang trồng tại Tây Nguyên.

- Phát hiện và chứng minh ƣ c tính của rễ cây Khổ sâm trồng tại Tây

Nguy n đã góp phần xây d ng chiến lƣ c bảo tồn, phát triển và thƣơng mại hóa cây

Khổ sâm ở Tây Nguyên

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về thực vật học Khổ Sâm

Theo The Plant list, có 62 loài thu c chi Sophora đƣ c chấp nhận và phân bố

chủ yếu tại c c v ng Trung Đông Đông Á, Nam Mỹ và New Zealand [1].

1.1.1. Vị trí phân loại

Tên khoa học: Sophora flavescens Ait.

Tên Việt Nam: Dã hòe, khổ cốt, Khổ sâm cho rễ (phân biệt v i Khổ sâm cho

lá - Croton tonkinensis Gagnep) sơn đậu căn địa sâm…

Theo hệ thống phân loại Takhtajan A.L (2009) cây Khổ sâm có vị trí phân

loại thu c ng nh Ngọc lan (Magnoliophyta) l p Ngọc lan (Magnoliopsi a) phân

l p Hoa hồng (Rosi ae) li n Đậu (Fa anae) Đậu (Fa ales) họ Đậu

(Fabaceae), chi Sophora, loài Sophora flavescens Ait. [2].

1.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái

Khổ sâm là cây bụi nhỏ có c c đặc điểm đặc trƣng nhƣ: Thân cây cao 0,5 -

1,2 m; phân nhiều cành và c nh non có lông tơ rải rác; lá cây kép lông chim lẻ mọc

so le gồm 5 - 10 đôi, lá chét hình mác dài 3 - 4 cm, r ng 1 - 2 cm, dốc thuôn đầu

nhọn hoặc hơi tù, mặt trên nhẵn, mặt ƣ i lông mịn màu xám; hoa màu vàng nhạt,

đ i 5 răng h nh chuông tr ng 5 c nh không đều, nhị 10, rời nhau, bầu có lông mịn

và cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm dài 10 - 20 cm; quả đậu, thắt lại

giữa các hạt, thuôn dài 5 - 12 cm, đƣờng kính 5 - 8 mm, đầu có mỏ thuôn dài; hạt

3-7, hình cầu m u đen; rễ hình trụ dài, vỏ ngoài màu vàng trắng [3, 4].

Theo ƣ c điển Trung Quốc 2015 (DĐTQ), rễ Khổ sâm có dạng hình trụ dài

10 – 30 cm đƣờng kính từ 1 đến 6,5cm và phân nhánh phần phía ƣ i. Bề mặt

ngoài của rễ có màu nâu xám hoặc nâu vàng, có nếp nhăn ọc theo rễ và có các nốt

sần. Vỏ ngoài của rễ có màu vàng, mỏng và nhẵn, dễ gãy và cu n lại, dễ bong tróc.

Mặt cắt rễ có màu vàng trắng, cứng, không dễ gãy, dạng s i có kết cấu xuyên tâm

và có bó mạch không điển h nh trong c c v ng đồng tâm hoặc phân tán rời rạc. Rễ

cây Khổ sâm có vị đắng [5].

Hình 1.1: B phận trên mặt đất (A) và rễ (B) của Khổ sâm [6]

1.1.3. Phân bố sinh thái, thu hái và chế biến

Khổ sâm có nguồn gốc ở Trung Quốc đƣ c di th c vào Việt Nam v o đầu

những năm 1970. Chúng là cây sống lâu năm về m a đông phần trên tàn lụi, phần

gốc còn lại sẽ nảy mầm vào giữa m a xuân năm sau. Cây ƣa s ng ƣa ẩm, thích nghi

v i điều kiện của nƣ c ôn đ i ẩm và vùng nhiệt đ i núi cao, nhiệt đ trung bình năm khoảng 15 oC. Cây trồng ở Sa Pa sinh trƣởng tốt, ra hoa nhiều nhƣng không có

quả [3].

Khổ sâm đƣ c công ty cổ phần sản xuất chế biến nông lâm sản ƣ c liệu

sạch Đắk Nông trồng để lấy ƣ c liệu. Rễ sau khi thu h i đƣ c rửa sạch đất cát, thái

phiến phơi khô, hoặc đem rễ tƣơi ngâm nƣ c vo gạo nếp m t đ m rửa sạch để

trong 3 giờ rồi thái phiến phơi khô [3].

1.1.4. Thành phần hóa học

Các công trình nghiên cứu về cây Khổ sâm chủ yếu từ các nhà khoa học

Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản Nga nơi m lo i cây n y chủ yếu tập trung phân

bố. Tính đến năm 2015 đã có hơn 200 h p chất đƣ c phân lập v x c định cấu trúc

từ ƣ c liệu này bao gồm: 47 alkaloid, 9 terpenoid, 124 flavonoid (3 isoflavanon,

41 flavanon, 15 flavonol, 13 flavanonol, 27 isoflavon, 2 homoisoflavon, 7 chalcon,

2 biflavonoid, 14 pterocarpan), và 26 chất là thành phần khác nhƣ lignan

phenylpropanoid, coumarin và phenolic acid, trong đó hai nhóm hoạt chất chủ yếu

đó là flavonoid và alkaloid [6] .

Kuraramin Isokuraramin Sophocarpin Isosophocarpin

7,11-Dehydromatrin Matrine 9a-Hydroxysophocarpin Sophoridin

Lupanin 9a-hydroxysophoramin Isomatrine Oxysophocarpin

7a-hydroxysophoramin Sophoranol Oxymatrine Leontalbinin N-oxid

9a-hydroxymatrin Mamanin Lamprolobin

Hình 1.2: M t số thành phần alkaloid của Khổ sâm [6]

Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu chiết xuất, phân lập các h p chất trong rễ

Khổ sâm còn hạn chế. M t số tài liệu tham khảo tiếng Việt chỉ viết về Khổ sâm nói

chung, và chủ yếu viết về mô tả h nh th i đặc tính sinh thái, nguồn gốc xuất xứ, hay

bài thuốc đông y có th nh phần Khổ sâm phối h p v i các vị thuốc khác và các ứng

dụng trong dân gian. Năm 2015 Trần Hồng Quang và c ng s tiến hành chiết tách

các flavonoid từ rễ Khổ sâm gồm isoxanthohumol, norkurarinon, kurarinon, 2-

methoxykurarinon, kushenol T, norkurarinol, kuraridin và formononetin [7]. Năm

2019, Phan Nguyễn Trƣờng Thắng và c ng s đã tiến hành phân lập ba h p chất

flavonoid từ rễ Khổ sâm là isoxanthohumol, kurarinon, (2S)-2’-methoxykurarinon

[8].

1.1.4.1. Alkaloid

Alkaloid là thành phần hóa học có hoạt tính chính trong Khổ sâm. Hiện nay

có khoảng 27 alkaloi đã đƣ c phân lập v x c định cấu trúc từ rễ Khổ sâm, 20

alkaloid khác từ các b phận trên mặt đất của Khổ sâm nhƣ hoa và hạt của cây đã

đƣ c báo cáo [9]. C c alkaloi đƣ c phân loại d a vào cấu trúc bao gồm: cấu trúc

kiểu matrine, cấu trúc kiểu cytisin, cấu trúc kiểu anagyrin và cấu trúc kiểu lupinin

(Hình 1.2) [10, 11, 12].

1.1.4.2. Flavonoid

Flavonoid là nhóm l n nhất của h p chất polyphenol và hầu hết đều có màu.

Flavonoid có cấu trúc mạch car on cơ ản là C6 – C3 – C6, trong đó gốc C6 (B) gắn

tại vị trí C3 có nguồn gốc từ con đƣờng shikimic; C6 (A) còn lại có nguồn gốc từ s

h p lại của 3 phân tử acetic acid [13, 14].

Hình 1.3: Khung cấu trúc chung của flavonoid

Từ các b phận của cây Khổ sâm, 124 h p chất nhóm flavonoi đã đƣ c

phân lập nhƣ kushenol A, B, C, E, F, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, U, V, W, X,

kurarinon, isokurarinon, norkurarinon, (2S)-2’-methoxykurarinon, kurarinol,

neokurarinol, norkurarinol, kosamol A, leachianone A, leachianone G,

sophoraflavanone G, 8- lavan ulylkaempferol formononetin v isoxanthohumol đã

đƣ c x c định có tác dụng ƣ c lý in vitro và in vivo [15, 16, 17, 18, 19, 20].

1.1.4.3. Terpenoid h h h

Đến năm 2015 c c nh nghi n cứu đã phân lập đƣ c 9 h p chất triterpen

gồm lupeol lupenone monogynol B β-amyrenol soyasaponin І v sophoraflavosi

І II III IV [6]. M t loạt các h p chất khác, bao gồm m t số lignan nhƣ citrusin A

citrusin B và alaschanioside A phenylpropanoi coumarin v phenolic aci cũng

đã đƣ c phân lập từ rễ Khổ sâm. 12 dẫn xuất dibenzoyl m i (sophodibenzosid A-L)

đã đƣ c tinh chế từ phân đoạn cao chiết n-butanol của Khổ sâm. Các chất khác nhƣ

syringin, corchionosid C, coniferin, piscidic acid và benzyl O-β-D-glucopyranosid

cũng đã đƣ c phân lập từ thân và lá của cây này [21, 22].

1.1.5. Tác dụng dược lý của Khổ Sâm.

Các hoạt chất của Khổ sâm có tác dụng ƣ c lý khác nhau: tác dụng đối v i

trung khu thần kinh, kháng viêm, kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, tác

dụng l i tiểu, tác dụng đối v i huyết áp, tác dụng đối v i dạ dày và ru t. M t số

nghiên cứu m i đây cho thấy chúng còn có khả năng kh ng ung thƣ của tế bào ung

thƣ. Trung tâm quản lý ƣ c phẩm và th c phẩm Trung Quốc về việc chứng nhận

sản xuất thuốc đã liệt kê ra 20 ứng dụng lâm sàng cho các chế phẩm matrine và

oxymatrine. Những ƣ c phẩm này bao gồm: thuốc đạn, viên nén, hạt, viên nang,

cốm, viên nang và thuốc tiêm pha liều đã đƣ c sử dụng ở Trung Quốc để chữa các

bệnh nhiễm trùng và bệnh tim mạch [6]. Ngoài ra, sản phẩm thuốc và th c phẩm

chức năng từ rễ Khổ sâm nhƣ thuốc tiêm Yanshu, Fufang kushen, viên nén Kushen

Pian, th c phẩm bổ sung Kushen Hawaii Pham v Kushen Nature’s Health đƣ c

sản xuất d a trên những thành phần alkaloid của ƣ c liệu này.

1.1.5.1 T ụ g h g i

Các nghiên cứu in vivo và in vitro đã chỉ ra rằng Khổ sâm ức chế phản ứng

vi m v ngăn chặn tình trạng viêm, bao gồm cả việc ức chế sản xuất COX-2, iNOS,

NO, IL-8, IL-6 và TNF-α. Chiết xuất từ rễ Khổ sâm v i liều ng 200 mg/kg ức chế

phản ứng phản vệ a thông qua ƣỡng o (mast cell), giảm s phóng thích

histamine từ ƣỡng o của phúc mạc tr n chu t, tr c tiếp l m giảm iểu hiện của

phorbol 12-myristate 13-axetat (PMA) và giảm kích thích TNF-a, IL-6 và IL-8 bởi

calcium ionophore A23187 [23]. Các hoạt chất đƣ c phân lập từ Khổ sâm nhƣ

7 9 2’ 4’-Tetrahydroxy-8-isopentenyl-5-methoxychalcone có hoạt tính ức chế vi

khuẩn Staphylococcus aureus. Dƣ c phẩm đƣ c bào chế từ rễ Khổ sâm dạng nano

SFNP có khả năng kh ng vi m hiệu quả [24, 25, 26].

1.1.5.2 T ụ g h g h i ị he ễ

Trong dân gian, rễ Khổ sâm đƣ c sử dụng phổ biến điều trị các bệnh dị ứng

nhƣ vi m a ị ứng và hen suyễn. Phân đoạn dịch chiết MeOH của rễ Khổ sâm v i

liều dùng 50 – 200 mg/kg đƣ c chuyển v o cơ thể chu t cho thấy ức chế đ ng kể

chất dẫn truyền thần kinh serotonin liên quan t i ngứa và gãi ở chu t [27]. Wen và

c ng s ứng dụng Khổ sâm đƣa v o dạ dày chu t bị hen suyễn dị ứng trong 17 ngày

cho thấy kết quả giảm đ ng kể s tăng phản ứng đƣờng thở (airway-

hyperreactivity), giảm vi m đƣờng thở và giảm nồng đ các globulin miễn dich IgE,

IL-4 và IL-5 trong nuôi cấy tế bào lách của chu t [28]. Dạng thuốc dung dịch chống

hen suyễn đƣ c bào chế từ rễ Khổ sâm cho thấy khả năng l m giảm đ ng kể dị ứng

tăng phản ứng đƣờng thở ở chu t và ức chế acetylcholine trong co thắt cơ trơn phế

quản [29].

1.1.5.3 T ụ g h g h ẩ , virut

Từ xa xƣa rễ Khổ sâm đã đƣ c dùng làm thuốc trị nhiễm trùng v i tính năng

kháng khuẩn vƣ t tr i. Gần đây cũng đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng

khuẩn của cây Khổ sâm. Dịch chiết xuất nƣ c từ rễ Khổ sâm cho hoạt tính kháng

khuẩn tr n c c đối tƣ ng nhƣ Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Streptococcus sp., Bacillus dysenteriae, Salmonella sp. và Bacillus proteus [30].

Dịch chiết EA rễ Khổ sâm có khả năng ức chế virut Herpes loại I và II (HSV-1 và

2) v i các giá trị EC50 lần lƣ t là 125 mg/mL và 93,37 mg/mL [31]. Ma và c ng s

thí nghiệm trên 40 loại ƣ c liệu trong điều trị bệnh hô hấp và các bệnh truyền

nhiễm đƣờng ru t bằng phƣơng ph p thử nghiệm hiệu ứng tế bào cho thấy hoạt tính

kháng virut của rễ Khổ sâm l vƣ t tr i v i IC50 là 50 mg/mL và chỉ số chọn lọc là

16 [32].

Thử nghiệm ƣ c lý và quan sát lâm sàng cho thấy dịch chiết của rễ Khổ

sâm có tác dụng diệt côn tr ng tr n c c đối tƣ ng nhƣ Trichomonas, bệnh sán máng

(Schistosomiasis) và Toxoplasma gondii [33]. Dịch chiết EtOH từ rễ Khổ sâm cho

thấy hiệu quả giảm s sao chép của T.gondii t i 98,7 % tại liều dùng 0,156 mg/mL

và Neospora caninum t i 98,6 % tại liều dùng 0,16 mg/mL. Dịch chiết aceton của

rễ Khổ sâm tại nồng đ 0,2 g/mL có khả năng chống lại s tăng trƣởng của Candida

albicans ở mức 33 % và Saccharomyces cerevisiae ở mức 23 % [34].

Từ các kết quả cho thấy ngoài ứng dụng làm thuốc trị nhiễm trùng cho con

ngƣời đặc tính kháng khuẩn của rễ Khổ sâm còn có khả năng to l n trong lĩnh v c

bảo quản th c phẩm v ƣ c phẩm chống lại s tấn công từ vi khuẩn.

1.1.5.4 T g ới h h g i h

Tác dụng ch ng lo n nhịp tim

Dịch chiết chứa alkaloi đƣ c phân lập từ rễ Khổ sâm cho thấy tác dụng

chống lại chứng loạn nhịp tim đƣ c t c đ ng từ CHCl3 và isoproterenol gây ra ở

mèo trong trạng thái gây mê. Kết quả tƣơng t thu đƣ c khi thử nghiệm trên chu t

đƣ c t c đ ng do ouabain, BaCl2 và strophanthin. Dịch chiết chứa flavonoi đƣ c

phân lập từ Khổ sâm có tác dụng chống lại rung nhĩ do chloroformind gây ra ở

chu t hay CHCl3 gây ra ở thỏ [35]. Kết quả nghiên cứu khác cho thấy rằng, hàm

lƣ ng flavonoid trong khoảng 125 - 250 mg/mL đƣ c phân lập từ Khổ sâm làm

chậm tần số xung t phát trong tế o cơ tim của chu t sơ sinh v giảm chứng loạn

nhịp tim gây ra bởi strophanthin [36].

Tác dụng ch g ơ hó ơ i

Th c hiện thí nghiệm trên chu t và tiến h nh xơ hóa cơ tim gây ra ằng

isoprenaline (5 mg/kg), dùng liều 200 v 400 mg/kg flavonoi đƣ c phân lập từ

Khổ sâm có tác dụng làm giảm hoạt đ ng của enzyme xúc tác creatine kinase

(enzyme chuyển hóa creatine th nh phosphocreatine) trong m u v tăng hoạt đ ng

của enzyme superoxide dismutase (enzyme phân hủy gốc superoxide) trong tâm thất

trái [37].

Tác dụng hỗ tr ó ơ i

Dịch chiết EtOH từ Khổ sâm có tác dụng làm giảm chỉ số ANP (enzyme

phosphatase kiềm) trong m u tăng đ ng l c học tâm nhĩ bao gồm thể tích tống máu

và áp l c mạch trong nghiên cứu trên thỏ [38].

1.1.5.5 T ụ g i h h iễ ị h

Nhiều nghiên cứu cho thấy Khổ sâm có tác dụng điều hòa hệ miễn dịch tăng

cƣờng sức khỏe v điều trị bệnh. Bổ sung Khổ sâm ở các mức từ 0,025 t i 0,4 %

trong chế đ ăn cho thấy tác dụng tăng lysozyme trong huyết thanh, h tr tan máu

t nhiên, và hoạt đ ng của tăng hoạt đ ng của myeloperoxidate [39]. Liều dùng từ

25 – 100 mg/kg Khổ sâm m i ngày trong thời gian 14 ngày liên tục có tác dụng làm

tăng đại th c bào giúp tiêu diệt khối u H22 kích thích đại th c bào sản sinh NO

dạng hoạt đ ng [40].

1.2. Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa

1.2.1. G c t do và stress oxy hóa

1.2.1.1. G

Gốc t do (free radical) là m t phân tử có thể tồn tại đ c lập, có m t điện tử

chƣa ghép đôi tạo nên m t số tính chất đặc trƣng. Nhiều gốc t do kém ổn định và

có khả năng phản ứng rất mạnh nhƣ m t chất khử hoặc m t chất oxy hóa trong quá

trình cho hoặc nhận điện tử từ các phân tử khác [41]. Các gốc t do chứa oxygen

(ROS) và gốc t do chứa nitrogen (RNS) nhƣ gốc hydroxyl, gốc anion superoxide,

gốc hydrogen peroxide, oxygen nguyên tử, hypochlorite, gốc nitric oxide, và gốc

peroxynitrite có khả năng phản ứng rất mạnh. Chúng có thể ở trong nhân hoặc màng

tế bào gây tổn hại đến c c đại phân tử sinh học nhƣ DNA protein, lipid,

carbohydrate làm tổn thƣơng tế bào và phá vỡ cân bằng n i môi. Tất cả các phân tử

trong cơ thể đều có thể là mục tiêu của gốc t o trong đó protein nucleic acid và

lipid là dễ bị tấn công và gây ra hậu quả nghiêm trọng hơn cả [42, 43, 44, 45].

1.2.1.2. S h h h h g g ơ hể g i

Các gốc t o nói chung v c c ROS nói ri ng đều có thể xuất phát từ các

qu tr nh trao đổi chất thiết yếu nh thƣờng trong cơ thể ngƣời, hoặc từ s t c đ ng

của các yếu tố môi trƣờng nhƣ tia X ozone khói thuốc lá, các chất ô nhiễm trong

không khí hoặc các hóa chất công nghiệp [46]. S hình thành gốc t do diễn ra m t

cách liên tục trong tế bào bởi cả các phản ứng có hoặc không có s xúc tác của

enzyme. Các phản ứng enzyme trong chu i hô hấp tế bào, trong s th c bào, trong

s tổng h p prostaglandin, và trong hệ thống cytochrome P-450 đƣ c coi là nguồn

gốc chính tạo ra các gốc t o trong cơ thể. Trong các phản ứng không có s tham

gia của enzyme, oxy tác dụng v i các h p chất hữu cơ cũng tạo ra gốc t do [47].

1.2.1.3. G g i h họ

Trong sinh học, các phản ứng của gốc t do tạo ra những biến đổi càng bất

l i cho cơ thể khi tuổi c ng cao. Ung thƣ v xơ vữa đ ng mạch l hai căn ệnh hiểm

nghèo điển h nh đƣ c gây ra bởi gốc t o. Giai đoạn khởi đầu v giai đoạn phát

triển của bệnh ung thƣ đều li n quan đến s khiếm khuyết của nhiễm sắc thể và s

khởi đ ng gene ung thƣ có thể là do các phản ứng của gốc t do n i sinh gây ra,

theo cách giống nhƣ o c c ức xạ ion hóa, và dẫn t i hình thành khối u. Ngƣời ta

thấy ở những ngƣời trên tuổi 55, có m t s tƣơng quan rõ rệt giữa tỷ lệ tử vong do

bệnh bạch cầu, ung thƣ c tính ở vú, buồng trứng, tr c tràng v i mức đ tiêu thụ

chất béo và các loại dầu. Điều đó có thể là do s peroxide hóa lipid ở những ngƣời

này xảy ra v i tốc đ cao hơn nh thƣờng [48, 49]. Chứng xơ vữa đ ng mạch do

các phản ứng sinh gốc t do từ thức ăn nhiều lipid xảy ra trên thành mạch hoặc

trong huyết gây ra s tổn thƣơng c c tế bào [50].

B ng 1.1: M t số dạng gốc t do [51]

Gốc tự do Mô tả

O2 Trạng thái khử m t điện tử của phân tử O2, hoạt đ ng yếu nhƣng - có có thể làm phóng thích Fe2+ từ các protein Fe-S và ferritin. O2 (anion thể ghép đôi để tạo ra H2O2 m t cách t sinh, hoặc đƣ c xúc tác superoxide) bởi enzyme, và hình thành gốc OH xúc tác bởi kim loại.

H2O2

(hydrogen Trạng thái khử hai điện tử, hình thành bởi s t phản ứng giữa - hoặc bởi s khử tr c tiếp của O2. Do hòa tan trong lipid các O2

peroxide) nên có thể t khuếch tán qua màng.

•OH

Trạng thái khử a điện tử đƣ c tạo ra từ phản ứng Fenton và s

phân rã của peroxynitrite. Có tính phản ứng rất cao và tấn công (hydroxyl) hầu hết các thành phần trong tế bào.

ROOH Đƣ c tạo ra bởi các phản ứng giữa bức xạ v i lipid.

Các gốc t do hữu cơ có tâm l oxygen. Lipid tham gia vào các

phản ứng peroxid hóa đƣ c tạo thành khi có s hiện diện của

RO• (alkoxy) ROO• (peroxy) oxygen nhờ thêm gốc để hình thành liên kết đôi v loại

hydrogen.

HClO Hình thành từ H2O2 bởi myeloperoxidase, phản ứng rất mạnh

(hypochlorous trong quá trình oxy hóa protein, gồm nhóm thiol, amino và

acid) methionine.

ONOO- Là m t đồng phân của nitric acid đƣ c hình thành từ phản ứng - và NO, tan trong lipid và khả năng phản ứng tƣơng giữa O2 (peroxynitrite) đƣơng v i HClO.

1.2.1.4. S e hó h ở g i

Stress oxy hóa là m t thuật ngữ ng để chỉ tình trạng tổn hại do s oxy hóa

diễn ra có s mất cân bằng giữa tốc đ tạo gốc t do và tốc đ tạo các chất bảo vệ

kháng oxy hóa. Stress oxy hóa làm tổn hại nhiều đại phân tử sinh học nhƣ nucleic

acid, protein, lipid. Stress oxy hóa trong thời gian ngắn có thể diễn ra trong mô bị

tổn thƣơng o s chấn thƣơng nhiễm trùng, bỏng nhiệt đ c tố hoặc do tập thể dục

quá sức. C c mô n y sinh ra c c enzyme nhƣ xanthine oxi ase lipoxygenase,

cyclooxygenase, hoạt hóa các quá trình th c bào, giải phóng các ion t do, các ion

đồng, hoặc phá vỡ các chu i vận chuyển điện tử của quá trình phosphoryl hóa - oxy

hóa và tạo ra ROS lƣ ng l n. Giai đoạn khởi ph t tăng sinh v ph t triển của bệnh

ung thƣ hoặc các tác dụng phụ của quá trình hóa trị và xạ trị đều có li n quan đến

s mất cân bằng giữa ROS và hệ thống phòng vệ kháng oxy hóa. ROS có liên quan

đến các biến chứng của đ i th o đƣờng, các bệnh về mắt ở ngƣời l n tuổi, và các

bệnh do thoái hóa thần kinh nhƣ ệnh Parkinson [52].

Ngƣời ta cho rằng, stress oxy hóa là nguyên nhân gây nên chứng xơ vữa

đ ng mạch, các bệnh về viêm, m t số bệnh ung thƣ v qu tr nh lão hóa. Stress oxy

hóa là m t trong các nguyên nhân chính gây ra các bệnh về vi m nhƣ: vi m kh p,

viêm mạch, viêm cầu thận lupus an đỏ, các triệu chứng của bệnh hô hấp ở ngƣời

l n, bệnh thiếu máu cục b (bệnh tim đ t qu , thiếu máu cục b ở ru t), h i chứng

suy giảm miễn dịch (AIDS), bệnh khí thủng, cấy ghép n i tạng, viêm loét dạ dày,

tăng huyết áp và tiền sản giật, rối loạn thần kinh (Alzheimer Parkinson teo cơ)

nghiện rƣ u, các bệnh li n quan đến hút thuốc lá, và nhiều bệnh khác [53].

1.2.2. Chất kháng oxy hóa

M t chất đƣ c coi là có khả năng kh ng oxy hóa khi nó l m t phân tử đủ

bền và có khả năng cho m t điện tử đến gốc t do và trung hòa nó, từ đó loại trừ

khả năng gây hại của nó. Các chất kháng oxy hóa làm chậm hoặc ngăn chặn các tổn

hại của tế bào chủ yếu nhờ đặc tính bắt gốc t do. Các chất kh ng oxy hóa thƣờng

có phân tử lƣ ng nhỏ, có thể tƣơng t c m t cách an toàn v i các gốc t do và kết

thúc chu i phản ứng trƣ c khi chúng làm hại c c đại phân tử sinh học. Cơ thể có

khả năng sinh ra m t số chất kháng oxy hóa quan trọng nhƣ glutathione u iquinol

và uric acid; chúng đƣ c sinh ra trong quá trình biến ƣỡng nh thƣờng của cơ thể

[54]. M t số chất kháng oxy hóa khác yếu hơn có sẵn trong thức ăn. Mặc dù có

nhiều hệ enzyme trong cơ thể có thể bắt gốc t o nhƣng c c chất inh ƣỡng vi

lƣ ng (vitamins) có hoạt tính kh ng oxy hóa l vitamin E (α-tocopherol), vitamin C

(ascor ic aci ) v β-carotene vẫn rất cần thiết cho cơ thể [55]. Cơ thể chúng ta

không thể sản xuất ra các yếu tố vi lƣ ng này, mà phải lấy từ thức ăn.

1.2.2.1. H h g h g h g hó

Các chất kháng oxy hóa hoạt đ ng nhƣ những yếu tố bắt gốc t do, cho

hy rogen cho điện tử, phân hủy peroxide, dập tắt các oxy nguyên tử, ức chế

enzyme, chất h tr , bắt kim loại. Cả các những chất kháng oxy hóa theo cách có

hoặc không có s xúc tác của enzyme đều tồn tại trong tế bào và ngoài tế o để

khử ROS [56].

1.2.2.2. ơ hế h g ủ h h g hó

Có hai cơ chế chính về t c đ ng của chất kh ng oxy hóa đã đƣ c đề nghị: (1)

L m gi n đoạn chu i phản ứng của gốc t do bằng c ch cho điện tử vào gốc t do

để trung hòa chúng, và (2) s loại bỏ các yếu tố kích hoạt ROS/RNS bằng cách

ngăn chặn s khởi đ ng chu i phản ứng của các gốc t do. Các chất kháng oxy hóa

có thể tạo ra t c đ ng lên hệ thống sinh học bằng nhiều cơ chế kh c nhau nhƣ s

cho điện tử, bắt cặp ion kim loại, nhờ các chất đồng kháng oxy hóa, hoặc bởi s

điều hòa biểu hiện gen [57].

1.2.2.3. h g hó

Chất kháng oxy hóa trong các hệ thống phòng vệ của cơ thể hoạt đ ng ở

nhiều cấp đ khác nhau, từ phòng ngừa, tiêu diệt gốc t do, sửa chữa lại và cuối

cùng là s thích nghi.

C 1: Phòng ngừa

Các chất kháng oxy hóa ở cấp đ này có tác dụng ngăn cản s hình thành gốc

t do. Mặc cơ chế chính xác và vị trí hình thành gốc t do in vivo c n chƣa iết

đƣ c thấu đ o nhƣng qu tr nh phân hủy các hydroperoxide và hydrogen peroxide

đƣ c cảm ứng bởi kim loại có thể là m t trong những nguồn chính sinh ra gốc t

o. Để ngăn chặn những phản ứng này, m t số chất kháng oxy hóa khử các

hy roperoxi e v hy rogen peroxi e th nh nƣ c và các alcol trƣ c khi chúng gây

hại o đó không tạo ra đƣ c gốc t do và m t số ion kim loại t do.

Glutathion peroxidase, glutathione-s-transferase, phospholipid hydroperoxide

glutathione peroxi ase (PHGPX) v peroxi ase đƣ c cho là phân hủy các lipid

hydroperoxide th nh c c alcol tƣơng ứng. PHGPX là thành phần duy nhất có thể

khử các hydroperoxide của các phospholipid màng. Glutathione peroxidase và

catalase khử hy rogen peroxi e th nh nƣ c.

C 2: Bắt g c t do

Các chất kháng oxy hóa bắt và tiêu diệt các gốc t o để chặn s khởi đầu

và/hoặc l m gi n đoạn s lan truyền các chu i phản ứng của chúng. Nhiều chất

kháng oxy hóa có khả năng ắt gốc t do n i sinh trong đó m t số ƣa nƣ c nhƣ:

Vitamin C, uric acid, bilirubin, albumin và các thiol; m t số ƣa lipi nhƣ: vitamin E,

u iquinol. Trong nhóm ƣa lipi vitamin E đƣ c coi là chất kháng oxy hóa tốt hơn

cả.

C 3: Sửa ch a và phục hồi l i ho t tính

Các enzyme thủy giải protein, các proteinase, các protease và các peptidase,

hiện diện trong cytosol và ti thể của tế o đ ng vật, nhận dạng, làm suy giảm, và

loại bỏ c c proteins đã ị oxy hóa ngăn chặn s tích tụ của chúng trong tế bào.

Các hệ thống sửa chữa DNA cũng đóng m t vai trò c c kỳ quan trọng trong

hệ thống phòng vệ chung của tế bào chống lại s tổn hại do oxy hóa. Nhiều loại

enzyme nhƣ c c glycosylase v c c nuclease sửa chữa DNA đã đƣ c biết đến.

M t chức năng quan trọng kh c đƣ c gọi là s thích nghi, s sản sinh và các

phản ứng của gốc t o cũng l tín hiệu cảm ứng cho s hình thành và vận chuyển

các chất kh ng oxy hóa tƣơng ứng đến đúng ngay vị trí tế bào cần [16].

1.2.3. Hoạt tính kháng oxi hóa của flavonoid trong rễ cây Khổ sâm

Flavonoid là m t trong những thành phần có hoạt tính sinh học chính của rễ

Khổ sâm đã đƣ c x c định có tác dụng ƣ c lý in vitro và in vivo [6]. Các dẫn chất

flavonoid có hoạt tính dập tắt các gốc t do ROS, RNS, tiêu biểu nhƣ HOO, ROO,

NO. Flavonoid có thể tạo đƣ c phức v i các ion kim loại mà chính các ion kim loại

này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hoá; bảo vệ tế bào và thể ngăn ngừa các

nguy cơ nhƣ xơ vữa đ ng mạch, tai biến mạch, lão hoá , tổn thƣơng o ức xạ,

thoái hoá gan; kháng viêm bằng cách ức chế con đƣờng tổng h p prostaglandin;

điều hòa nhịp tim v tăng tuần hoàn máu; chống lão suy, rối loạn trí nh , mất tập

trung [15].

Xiang-Lan Piao và c ng s đã ng c c thử nghiệm sinh học chứng minh

đƣ c rằng, cao butanol chiết từ rễ Khổ sâm có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh.

Phƣơng ph p HPLC đƣ c sử dụng ghép MS đã x c định đƣ c cấu trúc của 2 flavonoid là sophoraflavonone và kurarinone, có khả năng ắt gốc t do DPPH• v i

chỉ số IC50 tƣơng ứng là 5,26 và 7,73 µg/mL [14]. Kết quả của nhóm nghiên cứu

Kim. JH và c ng s tiếp tục khẳng định rằng, các flavonoid trong rễ Khổ sâm có

hoạt tính kháng oxy hóa mạnh [58, 59].

1.3. Tổng quan về hoạt tính kháng tế bào ung thƣ:

1.3.1. Quá trình Apoptosis

Apoptosis (s chết theo chƣơng tr nh) l qu tr nh chết có kiểm so t của tế

o ở c c lo i đ ng vật đa o [60]. Quá trình apoptosis iễn ra qua 2 giai đoạn.

Trƣ c hết l s cô đặc nhân v nhiễm sắc chất của tế o v phân cắt tế o th nh

nhiều mảnh nhỏ m l n ề mặt gọi l c c thể apoptotic. Trong giai đoạn thứ hai

c c thể apoptotic đƣ c t ch ra trải qua qu tr nh iến đổi tƣơng t nhƣ s th c bào

in vitro n trong phagosome v ị phân hủy nhanh chóng ởi c c enzyme

lysosome [61, 62]. Apoptosis l c c qu tr nh enzyme hóa c c phần tử đƣ c sắp

theo trật t nhất định m khi đến điểm kết thúc ẫn đến s chết tế o v ly giải

DNA th nh c c đoạn nucleosome đặc trƣng. Qu tr nh apoptosis iễn ra thƣờng

xuy n v xuy n suốt từ giai đoạn ph t triển phôi thai cho đến khi cơ thể trƣởng

thành. Apoptosis đóng vai tr quan trọng trong c c qu tr nh sinh lý kh c của cơ thể

nhƣ s t i cấu trúc mô v điều h a c c phản ứng miễn ịch. Qu tr nh apoptosis đ i

hỏi phải có s chính x c về tín hiệu v phải có s kiểm so t chặt chẽ thông qua m t

mạng lƣ i tín hiệu để có thể phản ứng nhanh v kịp thời đối v i c c tín hiệu n i o

v ngoại o. S suy giảm c c yếu tố tăng trƣởng c c hormone pepti e đặc hiệu s

thay đổi calcium n i o hoặc ngoại o tổn thƣơng DNA chất đ c ty thể có thể

cảm ứng qu tr nh apoptosis. M i tín hiệu kích hoạt sẽ ẫn đến m t con đƣờng kh c

nhau trong apoptosis [63].

1.3.2. Quá trình Necrosis

Necrosis (s chết tế o o hoại tử) l s chết tế o gây ra o tổn thƣơng cấp

tính ở tế o đƣ c gây ra ởi c c yếu tố n ngo i tế o hoặc mô ví ụ nhƣ o

nhiễm tr ng đ c tố hoặc tổn thƣơng. Necrosis xảy ra không tuân theo các con

đƣờng tín hiệu trong apoptosis m nhiều thụ thể sẽ đƣ c hoạt hóa ẫn đến đ nh mất

tính to n vẹn của m ng tế o v c c sản phẩm của s chết tế o sẽ đƣ c ph t t n

v o không gian ngoại o m t c ch không thể kiểm so t [64]. Việc ph t t n c c sản

phẩm n y sẽ khơi m o c c phản ứng vi m ở c c mô xung quanh thu hút c c ạch

cầu v đại th c o ở gần đó đến để ti u iệt chúng ằng c ch th c o. Tuy nhi n

c c chất ti u iệt vi khuẩn m ạch cầu tiết ra cũng đồng thời gây hại đến c c mô ở

xung quanh đó. Việc tổn hại đến c c mô xung quanh n y ngăn cản qu tr nh chữa

l nh o đó những tế o chết o hoại tử m không đƣ c điều trị sẽ h nh th nh n n

những khối mô chết v mảnh vỡ tế o.

Hình 1.4: Phân iệt s kh c nhau giữa Apoptosis v Necrosis [62, 64].

Để phân tích c c tế o apoptosis v necrosis trong quần thể tế o có thể sử

ụng c ch đ nh gi h nh th i ằng việc quan s t ƣ i kính hiển vi trong thời gian

dài (time-lapse microscopy) kỹ thuật flow fluorocytometry hoặc ằng kính hiển vi

điện tử truyền qua. Cũng có những kỹ thuật sinh hóa để phân tích c c marker ề

mặt tế o (phosphati ylserine v tính thấm ề mặt tế o ằng kỹ thuật flow

cytometry) c c phân tử đặc trƣng cho tế o nhƣ c c mảnh DNA ( ằng kỹ thuật

flow cytometry), s hoạt hóa caspase cắt ỏ Bi v s ph t t n cytochrome c ( ằng

kỹ thuật Western lot) [65].

1.3.3. Hoạt tính kháng ung thư từ rễ Khổ sâm

Các nghiên cứu ƣ c lý hiện đại đã chỉ ra rằng: matrine có rất nhiều tác

dụng nhƣ kháng ung thƣ, kháng virus, kháng viêm, bảo vệ gan, chống loạn nhịp

tim, giảm đau hạ sốt, chống sốc phản vệ và trị hen [66, 67, 68, 69].

Oxymatrine đƣ c chứng minh là có các hiệu quả nhƣ l kh ng vi m kháng

ung thƣ, chống tăng huyết áp, chống oxy hóa, chống loạn thần, kháng virus, chức

năng ảo vệ gan, ức chế phản ứng miễn dịch và giảm qu tr nh xơ hóa gan [70, 71,

72]. Các dẫn xuất oxysophocarpin, sophocarpin và lehmannin v i liều 0,2

mmol/mL cho thấy hoạt tính kh ng HBV đ ng kể v i hiệu l c tƣơng ứng là 48,3 %,

57,2 %, 52,6 % và chống s bài tiết HbeAg lần lƣ t là: 24,6 %, 34,6 % và 25,4 %.

Các nghiên cứu th c nghiệm phát hiện cơ chế chống khối u của Khổ sâm,

bao gồm gây ra quá trình chết theo chƣơng tr nh apoptosis khiến tế o ung thƣ

biệt hóa thành tế bào bình thƣờng, ức chế m t số hoạt đ ng của enzyme, ức chế

tổng h p DNA của tế o ung thƣ ảnh hƣởng đến quá trình bắt giữ chu kỳ tế bào và

s i căn của khối u, kiểm soát mức đ biểu hiện của các yếu tố li n quan đến khối

u và ảnh hƣởng đến hoạt đ ng của telomerase. Tuy nhi n điều quan trọng cần lƣu ý

là hầu hết nghiên cứu hoạt đ ng chống khối u đều sử dụng c c phƣơng ph p a

trên in vitro v o đó cần khuyến khích các thử nghiệm in vivo hơn nữa.

Nghiên cứu in vitro cho thấy chiết xuất nƣ c của Khổ sâm, ở nồng đ 100 và

200 μg/mL đã ức chế s phát triển dòng tế o ung thƣ iểu mô (EAC) v i tỷ lệ ức

chế lần lƣ t là 50 % và 66 %. Nghiên cứu khác về chiết xuất EtOH của rễ Khổ sâm

(95 % EtOH, tỷ lệ ƣ c liệu: dung môi chiết là 1: 9, hồi lƣu nhiệt 80 phút) đã chứng

minh ức chế đ ng kể s tăng sinh của tế o HT29 ung thƣ ru t kết v i tỷ lệ ức chế

tƣơng đối cao nhƣ đƣ c phân tích bởi thử nghiệm matrine [73]. Ngoài ra, lectin gắn

v i mannose phân lập từ rễ Khổ sâm đã ức chế rõ rệt s phát triển của tế bào MCF-

7 phụ thu c vào liều lƣ ng và thời gian và v i giá trị IC50 l 20 μg/mL. Dịch chiết

xuất từ Khổ sâm cho thấy tác dụng gây đ c tế bào mạnh mẽ trong các tế bào HeLa

bằng cách gây ra quá trình chết theo chƣơng tr nh rụng theo cách phụ thu c vào thời

gian và liều lƣ ng, và các dịch chiết khác nhau từ Khổ sâm trong khoảng 0 01 đến 5

mg/mL có tác dụng ức chế mạnh đối v i s phát triển của tế bào HeLa [74, 75, 76,

77, 78, 79, 80, 81, 82].

Nghiên cứu in vivo cho thấy c c flavonoi đƣ c phân lập từ rễ Khổ sâm ức

chế s phát triển các dòng tế bào ung thƣ, bao gồm ung thƣ gan H22 sarcoma 180

(S180) ung thƣ phổi Lewis ung thƣ iểu mô vảy ở ngƣời Eca-109 và dòng tế bào

H460 ung thƣ phổi, v i tỷ lệ ức chế lần lƣ t là 40 %, 82,14 %, 59,74 %, 42,71 % và

46,8 % và v i liều dung nạp tối đa ằng đƣờng uống hoặc ti m tĩnh mạch của chiết

xuất l hơn 2 8 g/kg hoặc 0,75 g/kg tƣơng ứng [83, 84, 85].

1.3.4. Dòng tế bào ung thư gan

Theo Dƣ c thƣ quốc gia 2, tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam rất cao. Tỷ lệ

ngƣời mang kháng nguyên bề mặt của HBV (HBsAg) ở ngƣời khỏe mạnh từ 11 %

đến 25 %, tùy theo từng v ng địa lý. Theo ƣ c tính của Tổ chức Y tế thế gi i

(WHO) thì Việt Nam có khoảng 8 triệu ngƣời nhiễm HBV v ung thƣ gan nguy n

phát là nguyên nhân thứ hai gây tử vong ở nam gi i [86].

Hình 1.5: Dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 [87].

Ở nhiều nghiên cứu khoa học, các xét nghiệm lâm sàng chủ yếu d a trên tế

o đ ng vật do chi phí thấp đ lặp lại cao và vấn đề đạo đức sinh học; trong khi

đó c c nghi n cứu lâm sàng trên dòng tế o ngƣời phần l n đều sử dụng tế bào

gan, m t cơ quan trung tâm để th c hiện các cân bằng n i môi hóa học trong quá

trình tổng h p protein và giải đ c cơ thể.

HepG2 là m t dòng tế bào ung thu gan ở ngƣời có nguồn gốc từ bệnh ung

thu biểu mô tế bào gan của m t nam gi i da trắng 15 tuổi và theo hình thái học

chúng thu c loại biểu mô (Epithelial). Qua xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ

(karyotype), MN (modal number) = 55 và có s sắp xếp lại m t nhiễm sắc thể.

Dòng tế o n y thƣờng xuy n đƣ c dùng trong các nghiên cứu in vitro do chúng

có mức đ biệt hóa cao về hình thái học và chức năng ễ xử lý, không chứa virut

và cho kết quả ổn định trong quá trình thí nghiệm [87].

Cơ chế sinh học phân tử của ung thu gan chƣa th c s rõ ràng, nhƣng có a

cơ chế đƣ c công nhận bao gồm:

Cơ chế 1: đầu ti n ung thƣ gan nguy n ph t l khối u có nhiều mạch máu,

biểu hiện của các yếu tố tăng sinh mạch (VEGF) điều này dẫn đến s phát triển của

các thuốc điều trị nhắm trúng đích VEGF và hoặc thụ thể của VEGF (VEGFR).

Cơ chế 2: m t số bằng chứng cho thấy vai trò của các thụ thể yếu tố phát

triển biểu mô (EGFR) hoặc con đƣờng tín hiệu EGF (HER1) trong các chất sinh

ung thƣ v con đƣờng ung thƣ ho của ung thƣ iểu mô tế bào gan. Những thông tin

n y đã ẫn đến việc thăm hiệu quả của m t số thuốc ức chế EGFR nhƣ c c TKI

(erlotinib) và thuốc ức chế kháng thể đơn dòng EGFR (cetuximab).

Cơ chế 3: li n quan đến sinh bệnh ung thƣ gan nguy n ph t l con đƣờng

Raf/MAP kinase- ERK kinase (MEK)/ tín hiệu ngoại o quy định kinase (ERK).

Raf (thụ thể yếu tố kích hoạt) kinase là m t thành phần thiết yếu của con đƣờng

MAP kinase đây l m t cơ chế truyền tín hiệu quan trọng m điều chỉnh các chức

năng của tế o nhƣ tăng trƣởng, chuyển dạng và con đƣờng apoptosis. ERK là

enzyme giáng hoá của con đƣờng MAP kinase đƣ c kích hoạt tr c tiếp bởi Raf

kinase dẫn đến phosphoryl hoá ERK. S b c l quá mức của MEK1 trong các dòng

tế bào ung thƣ gan nguy n ph t ẫn đến s tăng trƣởng u bằng c ch ngăn cản chu

tr nh apoptosis. Th m v o đó c c protein lõi của virus viêm gan C, yếu tố nguy cơ

của ung thƣ gan tăng cƣờng hoạt đ ng của Raf1 trong tế bào gan l m tăng nguy cơ

chuyển dạng ác tính. Những thông tin này tạo cơ sở cho việc sử dụng các thuốc ức

chế Raf kinase trong điều trị ung thƣ gan nguyên phát [88].

1.3.5. Dòng tế bào ung thu vú

Theo Globocan 2018, ung thƣ vú ở Việt Nam là bệnh lý ác tính phổ biến nhất

v i 15.229 trƣờng h p m i đƣ c chẩn đo n hằng năm chiếm 20,6 % c c trƣờng

h p ung thƣ ở phụ nữ và 6.103 trƣờng h p tử vong chiếm 5,3 % c c trƣờng h p tử

vong o ung thƣ ở cả hai gi i sau ung thƣ gan nguy n ph t ung thƣ phổi v ung thƣ

dạ dày [89].

Hình 1.6: Dòng tế o ung thƣ vú BT474 [90].

BT474 là m t dòng tế bào ung thu vú ở ngƣời đƣ c phân lập từ m t ung thu

biểu mô ống xâm lấn của vú từ phụ nữ da trắng 60 tuổi và theo hình thái học chúng

thu c loại biểu mô. Chúng là loại tế bào nữa dị b i (aneuploid) v i phần l n các

nhiễm sắc thể là siêu b i (hypertetraploid). Trong cấu trúc, tế bào này không có m t

số nhiễm sắc thể nhƣ N11 N13 v N22 v m t số nhiễm sắc thể biểu hiện không rõ

r ng nhƣ N9 N14 v N15 so v i các nhiễm sắc thể nh thƣờng. Trong xét nghiệm

nhiễm sắc thể đồ (karyotype), nhiễm sắc thể N7 có mức biểu hiện quá mức. Biểu

hiện đ nh ấu sinh học thiếu nhiễm sắc thể thông qua 9 nhiễm sắc thể sau:

der(14)t(14;?)(q32,?), unknown, iso(13q), der(6)t(6;7)(q21;q21), der(11) t(11;?)-

(14;?), del(11)(p11), unknown, unknown, der(2)t(2;?)(p21;?) [90].

Theo cơ chế sinh học có hai cơ chế chính liên quan t i ung thƣ vú:

Cơ chế 1: yếu tố di truyền chiếm khoảng 10 – 15 % số ca mắc ung thƣ vú.

Các nghiên cứu về gene đƣa ra c c ẫn chứng tại vùng nhiễm sắc thể số 17 (gene

BRCA1 và BRCA2) có liên quan trong yếu tố di truyền [91].

Cơ chế 2: t c đ ng từ s tăng n i tiết tố sinh dục estrogen gây c c t c đ ng

nhƣ iến đổi mô vú nh thƣờng th nh c tính tăng s tiết prolactin (hormon phát

triển tuyến vú) .

1.4. Phƣơng pháp xác định matrine và oxymatrine trong Khổ sâm

1.4.1. Định tính và định lượng matrine

Tính ch t hóa lý của matrine và oxymatrine

B ng 1.2: Tính chất hóa lý của matrine và oxymatrine

Tính chất Matrine [92] Oxymatrine [93]

Công thức phân tử C15H24N2O C15H24N2O2

Khối lƣ ng phân tử 248,36 264,36

(g/mol)

Chất rắn, màu Chất rắn, màu Trạng thái

trắng trắng

Đ hòa tan trong 50,3 494,1

nƣ c (mg/L) Nhiệt nóng chảy (oC) 76 208

Định tính

Khổ sâm có nguồn gốc ở Trung Quốc đƣ c di th c vào Việt Nam v o đầu

những năm 1970 và hiện đƣ c trồng chủ yếu tại Đắk Nông - Tây Nguy n. Dƣ c

điển Việt Nam hiện chƣa có chuy n luận về th c vật Khổ sâm cho rễ. Trong khi đó

chuyên luận trong DĐTQ [5] x c định tính đúng của ƣ c liệu theo: nguồn gốc thu

hái – định danh, mô tả bằng cảm quan mô tả chi tiết b phận dùng (hình dạng, màu

sắc đặc điểm riêng biệt). Nghiên cứu đặc điểm vi học: cắt và làm tiêu bản vi phẫu,

soi b t thân rễ và rễ, mô tả và chụp ảnh. Thử nghiệm định tính bằng sắc ký l p

mỏng cho hai h p chất đ nh ấu sinh học matrine và oxymatrine. Các tiêu chí chất

lƣ ng ƣ c liệu về đ ẩm, tro toàn phần và tổng chất chiết đƣ c.

Đị h ng

Theo DĐTQ phƣơng ph p HPLC-UV đƣ c sử dụng định lƣ ng đồng thời

matrine và oxymatrine trong rễ Khổ sâm.

Điều kiện HPLC-UV nhƣ sau: C t sắc ký pha đảo C18 ( 250 mm × 4,6 mm,

5 µm) chƣơng tr nh rửa giải gồm pha A là acetonitrile và pha B là nƣ c chứa hệ

đệm 0,3 % phosphoric acid/ triethylamine có tỉ lệ pha A : pha B là 4: 96 (v/v) đẳng

dòng tại tốc đ 1 mL/phút, phát hiện ở ƣ c sóng 220 nm.

Phan Nguyễn Trƣờng Thắng và c ng s (2019) đã thẩm định phƣơng ph p

định lƣ ng đồng thời matrine và oxymatrine trong rễ Khổ sâm bằng phƣơng ph p

HPLC-UV sử dụng c t Nucleodur-C18 Isis (250mm x 4,6 mm x 5 µm) đầu dò

PDA ƣ c sóng phát hiện 220 nm, tốc đ dòng 1,0 mL/phút v i pha đ ng gồm pha

A là acetonitrile và pha B là nƣ c chứa hệ đệm 0.3 % phosphoric acid và 0.3 %

triethylamine chạy đẳng dòng tại tỉ lệ pha A : pha B là 2: 98, (v/v). Các kết quả

thẩm định phƣơng ph p matrine v oxymatrine tr n cao to n phần v cao phân đoạn

giàu alkaloi có đ đúng trong khoảng 98 – 102 % v đ chính xác RSD < 2 % [8].

1.4.2. Phân lập matrine và oxymatrine làm chất đối chiếu

Theo yêu cầu GMP của WHO trong sản xuất, việc đ nh gi chất lƣ ng các

cây thuốc và các chế phẩm phải d a v o h m lƣ ng hoạt chất (hoặc chất đ nh ấu

sinh học). Ngo i ra c c lĩnh v c kh c nhƣ trồng trọt, nghiên cứu Khổ sâm cũng cần

theo õi đ nh gi chất lƣ ng các mẫu nghiên cứu. Theo DĐTQ đối v i rễ Khổ

sâm, nhóm hoạt chất đ nh dấu sinh học là matrine và oxymatrine.

Trần Hồng Quang và c ng s (2015) đã tiến hành phân lập ba h p chất

flavonoid từ rễ Khổ sâm là isoxanthohumol, kurarinon, (2S)-2’-methoxykurarinon

[7]. Mẫu b t rễ Khổ sâm đƣ c chiết trong ung môi MeOH sau đó đƣ c chiết tách

phân đoạn qua phân l p dichloromethane và EA. Các dịch chiết phân đoạn đƣ c

tiếp tục t ch phân đoạn bằng sắc ký c t silica v C18 để thu đƣ c các h p chất tinh

khiết. Tiến h nh đo c ng hƣởng từ hạt nhân để nhận diện cấu trúc các h p chất

phân lập đƣ c.

Khả năng ức chế s phát triển m t số dòng tế o ung thƣ của matrine và

oxymatrine rất đƣ c quan tâm hiện nay. Nhiều t c giả đã nghi n cứu về hoạt tính ức

chế s ph t triển của c c ng tế o ung thƣ tr n rễ Khổ sâm trồng ở Trung Quốc

nhƣ Ying Zhang v c ng s (2009) [94], ở Nga nhƣ K. Kalinkevich và c ng s

(2014) [95]. Qua đó chứng minh Khổ sâm là m t trong những loại ƣ c liệu đầy

hứa hẹn nhƣng cần có các nghiên cứu sâu hơn để kiểm tra tính an toàn và giá trị

lâm sàng của các cao hoạt tính, các h p chất tinh khiết từ rễ v để l m rõ cơ chế

hoạt đ ng của chúng, ứng dụng trong sản xuất ƣ c liệu tại Việt Nam.

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

2.1.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu

Đị iểm

- Viện Sinh học Nhiệt đ i Thành phố Hồ Chí Minh. - Trƣờng Đại học Văn Lang. - Trƣờng Đại học Khoa học T nhiên - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí

Minh.

Th i gian:- Từ th ng 11 năm 2015 đến th ng 06 năm 2021.

2.1.2. Vật Liệu

Cây Khổ sâm

Cây Khổ sâm trồng tại Công ty cổ phần sản xuất chế biến nông lâm sản

Dƣ c liệu sạch Đắk Nông, 2 năm tuổi có đƣờng kính rễ l n hơn 1cm đƣ c thu hái

v o th ng 3/2016 v đƣ c định danh bằng kỹ thuật PCR tại công ty TNHH Dịch Vụ

v Thƣơng Mại Nam Khoa. B phận rễ của Khổ sâm đƣ c phơi khô xay mịn và rây

qua cỡ rây 2 mm để thu đƣ c b t ƣ c liệu có kích thƣ c đồng nhất.

Tế g h

Tế bào ung thƣ gan HepG2 v tế o ung thƣ vú BT747 đƣ c mua từ hãng

American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, Mỹ). Các tế o đƣ c

đông lạnh và bảo quản trong nitơ lỏng.

Các hóa ch t sử dụng

- Chất chuẩn matrine và oxymatrine (Sigma aldrich, Mỹ). Acetonitrile loại

tinh khiết HPLC, hexan, chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EA), methanol

(MeOH), aceton, ethanol (EtOH) loại tinh khiết phân tích đƣ c mua của hãng

Scharlau (Tây Ban Nha). Formic acid, triethylamine, HCl 37 % loại tinh khiết phân

tích của hãng Merck.

- Dung dịch Phosphate-buffered Saline (PBS), Trypsin-EDTA 0.25 %,

DMEM/Ham’s F - 12 bổ sung 15 % huyết thanh bò mang thai (FBS) của hãng

Capricorn Scientific (Đức) và 1 % Pen/Strep (Gibco, Mỹ).

- Các b kit gồm có: WST1 (Sigma, Mỹ), FITC Annexin V Apoptosis

Detection (BD Biosciences, Mỹ), ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega, Mỹ), 2x qPCR SyGreen 1-Step Go Hi-ROX kit (PCRBiosystem, Anh) và

Automatic x-ray (873498, Fujifilm, Nhật Bản).

- Tác chất paraformaldehyde 4 % (Nacalai Tesque, Nhật Bản), Triton X100

0,1 % (Sigma-Aldrich, Mỹ), 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Molecular

Probes, Mỹ).

- Các hóa chất sử dụng trong phƣơng ph p Western Blot gồm có dung dịch

đệm ly giải Optiblot LDS Sample Buffer, Gel Precast Gel SDS-PAGE 4-12 %,

dung dịch đệm Optiblot SDS Run Buffer, màng PVDF, dung dịch Blocking Buffer

của hãng Abcam (Mỹ). Kháng thể đƣ c sử dụng bao gồm: Anti-beta Actin

antibody, Anti-alpha Tubulin antibody, kháng thể Anti-GAPDH antibody, kháng

thể thứ cấp Goat Anti-Rabbit IgG (HRP) của hãng Abcam (Mỹ). Các vạch protein

đƣ c hiển thị bằng ECL Western Blotting Substrate Kit của hãng Abcam (Mỹ).

2.1.3. Thiết bị sử dụng

B ng 2.1: các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu.

TT Tên thiết bị Hãng TT Tên thiết bị Hãng

1 Hệ thống sắc ký lỏng Agilent, Mỹ 8 Thiết bị Real-Time Thermo,

HPLC 1200 PCR System Mỹ

2 Hệ thống MS/MS Bruker Đức 9 Giấy lọc Extra Bio-Rad,

micrOTOF-QII Thick Blot Paper Mỹ

3 Hệ thống sắc ký điều Shimazu, 10 Tấm phim CL- Thermo,

chế UFLC 8A Nhật Bản XPosure Film Mỹ

4 Máy quang phổ Promega, 11 Vial đông lạnh Corning,

Gloxmax Mỹ Mỹ

5 M y đo quang phổ Biochrom , 12 M y nƣ c khử ion PG, Anh

NanoVuePlus USA WP710

Spectrophotometer

6 Kính hiển vi huỳnh GE, Mỹ 13 Máy cánh khuấy Đức

quang Cytell IKA RW20

7 Hệ thống phân tích BD, Mỹ 14 Thiết bị siêu âm Đức

flow cytometry Elmasonic S 180 H

BD Accuri C6 Plus

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Định danh và đánh giá chất lượng dược liệu

2 2 1 1 Đị h h i

X c định tính đúng của ƣ c liệu theo DĐTQ [5]: d a vào nguồn gốc thu hái

– định danh. Mô tả bằng cảm quan mô tả chi tiết b phận dùng (hình dạng, màu sắc,

đặc điểm riêng biệt). Nghiên cứu đặc điểm vi học: cắt và làm tiêu bản vi phẫu, soi

b t thân rễ và rễ, mô tả và chụp ảnh.

2.2.1.2. Đị h h h ử ằ g h ơ g h gi i h DNA

Giải tr nh t gen đƣ c th c hiện tại Công Ty TNHH Dịch Vụ v Thƣơng

Mại Nam Khoa ằng phƣơng ph p Sanger tr n m y 3130XL của AIB. Phƣơng ph p

này th c hiện d a trên kỹ thuật PCR kết thúc chu i bằng cách bổ sung deoxy

nucleoti e đã đƣ c biến đổi làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đƣờng

v o DNA quan tâm. Trong ƣ c bổ sung enzyme polumerase xúc tác phản ứng gắn

thêm nucleotide vào mạch đơn của DNA tại vị trí 3’-OH của nucleotide cuối cùng

và phản ứng kéo dài mạch sẽ ngừng lại nếu c c eoxy nucleoti e đƣ c gắn vào

chu i. Phản ứng gắn deoxy nucleotide là ngẫu nhiên nên sau khi kết thúc phản ứng

sẽ thu đƣ c c c đoạn DNA có đ dài khác nhau. Có 4 loại deoxy nucleotide khác

nhau đƣ c sử dụng và m i loại đƣ c gắn màu huỳnh quang kh c nhau đƣ c phân

tách trên hệ thống điện di mao quản và ghi nhận cƣờng đ c c đỉnh sáng này trên

điện i đồ. Từ điện i đồ c c đỉnh cƣờng đ sáng này, máy sẽ so dòng của c c đỉnh

tƣơng ứng v i nhau và phân tích thành trình t của đoạn DNA. Từ dữ liệu phân tích

điện i đồ, th c hiện tải toàn b dữ liệu l n thƣ viện tra cứu dữ liệu Basic Local

Alignment Search Tool (BLAST) và th c hiện thuật toán dò tìm theo xác xuất để

kiểm tra trình t DNA

2.2.1.3 Đ h gi h g i

Các tiêu chí chất lƣ ng ƣ c liệu về đ ẩm, tro toàn phần và tổng chất chiết

đƣ c.

Đ ẩm: tiến h nh x c định đ ẩm mẫu ƣ c liệu theo hƣ ng dẫn trong

DĐVN V, tập 2, phụ lục 9.6 [96]. Cân chính xác khoảng m =1,0 g b t ƣ c liệu

trong m t chén cân đã sấy khô đến khối lƣ ng không đổi (mo, g). Đặt cốc chứa mẫu trong tủ sấy ở nhiệt đ 105 oC – 110 oC, ở áp suất thƣờng, trong thời gian 3 giờ. Lấy

ra để ngu i trong bình hút ẩm chứa silica gel và cân ghi lại khối lƣ ng (m1, g). Tiếp

tục sấy ở điều kiện nhƣ trên t i khi thu đƣ c khối lƣ ng cân m2 chênh lệch không

quá 0,5 g so v i m1.

Phần trăm mất khối lƣ ng do làm khô (% LOD) đƣ c tính theo công thức

(Công thức 2.1) ( ) ( )

Tro toàn ph n: tiến h nh x c định tro toàn phần mẫu ƣ c liệu theo hƣ ng

dẫn trong DĐVN V, tập 2, phụ lục 9.8 [96]. Cân chính xác khoảng m = 2,0 gam b t

ƣ c liệu trong m t chén nung đã đƣ c nung đến khối lƣ ng không đổi và xác định khối lƣ ng bì (m0, gam). Đem nung trong lò nung tại nhiệt đ 450 oC đến khi phần

mẫu đƣ c tro hóa hoàn toàn. Mẫu sau khi để ngu i trong bình hút ẩm và cân xác

định khối lƣ ng (m1, gam). Tiếp tục sấy ở điều kiện nhƣ trên t i khi thu đƣ c khối

lƣ ng cân m2 chênh lệch không quá 0,5 g so v i m1.

Hàm lƣ ng tro toàn phần (A) đƣ c tính theo công thức sau:

(Công thức 2.2) ( ) ( )

Tổng ch t chiế c: tiến h nh x c định tổng chất chiết đƣ c từ mẫu ƣ c

liệu theo hƣ ng dẫn trong DĐTQ [5]. Cân chính xác khoảng m = 4,0 g b t ƣ c

liệu cho vào bình nón nút mài có thể tích 250 mL. Thêm chính xác 100 mL EtOH ở

điều kiện nhiệt đ phòng đậy kín đem cân x c định khối lƣ ng (p) rồi lắc đều m i

30 phút trong 6 giờ. Sau đó để yên ở nhiệt đ phòng trong 18 giờ. Cân x c định

khối lƣ ng và bổ sung EtOH về đúng khối lƣ ng (p). Lắc đều và lọc qua giấy lọc

khô thu lấy dịch lọc. Lấy chính xác 20,0 mL dịch lọc cho vào m t chén cân đã x c

định khối lƣ ng bì (m0 gam) đem ốc hơi cho đến cắn khô trên bếp cách thủy. Tiếp tục sấy ở 105 oC trong 3 giờ. Lấy ra để ngu i trong bình hút ẩm và cân nhanh

để x c định khối lƣ ng (m1, gam). Tiếp tục sấy ở điều kiện nhƣ trên t i khi thu

đƣ c khối lƣ ng cân m2 chênh lệch không quá 0,5 g so v i m1.

Tính hàm lƣ ng tổng chất chiết đƣ c theo công thức:

(Công thức 2.3) ( ) ( )

2.2.1.4. Đị h h ằ g ắ g

C c ƣ c th c hiện đƣ c tiến hành theo DĐTQ [5] nhƣ sau:

Bản mỏng sắc ký: bản mỏng silica gel G60

Dung môi khai triển: NH4OH 25 % - H2O – EtOH – EA (1,5:1:3,5:15).

Mẫu chuẩn: hòa tan 1,0 mg matrine trong 1mL EtOH để thu đƣ c dung dịch

có nồng đ 1,0 mg/mL. Th c hiện tƣơng t v i oxymatrine.

Mẫu thử: lấy khoảng 4 g b t ƣ c liệu cho vào bình nón 50 mL, thêm 15 mL

EA và 0,3 mL dung dịch ammonium hydroxide 25 %, siêu âm trong 30 phút, lọc lấy

dịch.

Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 μL m i dung dịch trên. Sau

khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô trong không khí. Quan sát bản mỏng

bằng nh s ng thƣờng, UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử Dragendorff. Trên sắc

ký đồ của dung dịch thử phải có vết có cùng màu sắc và giá trị Rf v i vết của

matrine, oxymatrine trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu.

2.2.1.5 Đị h g matrine và oxymatrine ằ g h ơ g h HPL -UV

Tham khảo theo DĐTQ [5] và có cải biên. X c định h m lƣ ng matrine và

oxymatrine trong mẫu ƣ c liệu bằng phƣơng ph p phân tích trên HPLC -UV v i

các thông số c i đặt nhƣ sau:

C t: Agilent Eclipse XDB - C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm).

Tốc đ ng: 1 mL/phút.

Thể tích ti m: 5 μL.

Bƣ c sóng ph t hiện: 220 nm.

Pha đ ng gồm có: pha B là acetonitrile và pha A là hệ đệm

HCl/triethylamine pH =3 chƣơng tr nh pha đ ng đƣ c th c hiện nhƣ (Bảng 2.1).

B ng 2.2: Chƣơng tr nh pha đ ng phân tách matrine và oxymatrine

Th i gian ph t) Pha A (% v/v) Pha B (% v/v)

0,0 7,5 92,5

15,0 90,0 10,0

15,1 100,0 0,0

19,0 100,0 0,0

19,1 7,5 92,5

25,0 7,5 92,5

Dung dịch chuẩn:

Chuẩn matrine 1,0 mg/mL: hòa tan 1,0 mg chất chuẩn matrine trong 1,0 mL

MeOH vortex cho tan ho n to n v ảo quản tại 4 oC.

Chuẩn oxymatrine 1,0 mg/mL: hòa tan 1,0 mg chất chuẩn oxymatrine trong

1,0 mL MeOH vortex cho tan hoàn toàn và bảo quản tại 4 oC.

Xây d g ng tuyến tính: tiến hành pha 6 dung dịch chuẩn matrine và oxy

matrine có nồng đ từ 10 đến 600 µg/mL, tiêm lần lƣ t từ điểm chuẩn có nồng đ

thấp t i cao vào hệ thống HPLC-UV.

Đ chính xác (% RSD): cân 0,5 g mẫu ƣ c liệu, th c hiện chiết 6 mẫu lặp

bằng dung môi chiết EtOH 80 %, th c hiện quy trình xử lý mẫuvà ghi sắc ký đồ. Đ

chính xác của phƣơng ph p đƣ c đánh giá thông qua giá trị % RSD.

Đ g: đ nh gi đ đúng a trên phần trăm hiệu suất thu hồi ( % HSTH)

của các mẫu ƣ c liệu đƣ c thêm chuẩn từ h n h p chuẩn matrine và oxymatrine

1000 µg/mL v i các mức thể tích hút lần lƣ t là 1,0; 5,0 và 10 mL để có 3 mức

nồng đ 10 µg/mL, 50 µg/mL và 100 µg/mL. Th c hiện quy trình xử lý mẫu trong

hệ dung môi EtOH 80 %, m i mức đƣ c th c hiện lặp lại 3 lần.

Gi i hạn phát hiện (LOD) và gi i hạn định lƣ ng của phƣơng ph p (LOQ).

Tiến h nh ghi i n đ ao đ ng nền c c đại của 7 sắc ký đồ mẫu ƣ c liệu. Tính

toán LOD và LOQ của phƣơn ph p theo công thƣc sau:

LOD = 3,3 x SD (Công thức 2.4)

LOQ = 10 x SD (Công thức 2.5)

Trong đó SD l đ lệch chuẩn của i n đ ao đ ng nền c c đại của 7 sắc ký

đồ mẫu ƣ c liệu.

Dung dịch thử: cân 0.5 g mẫu ƣ c liệu, tiến hành chiết cao toàn phần v i

100 mL dung môi EtOH : H2O tỉ lệ 8 : 2 (v/v). Các mẫu đƣ c khuấy từ tại tốc đ khuấy 500 vòng/phút và giữ nhiệt ở mức 50 0C trong 24 giờ. Phần dịch chiết đƣ c

lọc thô qua giấy lọc. Lấy 1 mL phần dịch lọc và tiến hành thổi khô hoàn toàn bằng

dòngkhông khí. Hòa tan lại phần cặn bằng 1 mL pha đ ng, lọc qua màng 0,45 µm

và tiêm vào hệ thống HPLC-UV.

Cách tiến hành: ghi sắc ký đồ của các mẫu chuẩn và mẫu thử. D ng đƣờng

chuẩn tuyến tính cho matrine và oxymatrine giữa tín hiệu diện tích mũi sắc ký và

nồng đ c c điểm chuẩn. Tiến h nh định lƣ ng m i mẫu thử v i điều kiện sắc ký

nhƣ tr n. Ghi nhận sắc ký đồ, thời gian lƣu iện tích pic.

Tính toán: x c định h m lƣ ng chất phân lập đƣ c tính theo công thức:

( )

(Công thức 2.6) ( )

Trong đó: C (µg/g) l h m lƣ ng chất phân lập đƣ c có trong mẫu thử

Spic chính là diện tích mũi sắc ký của chất phân tích

b: l tung đ gốc của đƣờng chuẩn tuyến tính

a: là hệ số góc của đƣờng chuẩn tuyến tính

V: là thể tích ung môi ng đề chiết mẫu (mL)

m: khối lƣ ng mẫu (g)

2.2.2. Chiết xuất dược liệu Khổ sâm định hướng phân lập alkaloid matrine và

oxymatrine

2.2.2.1. hiế h i

Quy trình chiết v t ch phân đoạn đƣ c tiến hành theo N. Tanabe cùng c ng

s công bố năm 2016 v có cải biên [97].

Chiết xuất ƣ c liệu: cân 100 g b t ƣ c liệu vào bình chiết 2 L. Thêm 1 L EtOH : H2O tỉ lệ 8 : 2 (v/v) vào bình chiết. Mẫu đƣ c gia nhiệt tại nhiệt đ 50 0C và

khuấy tr n liên tục trong 24 giờ bằng thiết bị cánh khuấy IKA RW20 (Đức) v i tốc

đ 500 v ng/phút. Sau đó lọc phần dịch chiết qua giấy lọc. Phần dung dịch chiết

đƣ c cô quay t i cạn thu đƣ c cao EtOH. Cao EtOH đƣ c phân tán lại trong 200

mL nƣ c và sử dụng cho c c ƣ c tiếp theo.

Thu cao CHCl3: phần cao EtOH đƣ c t ch l p v i 500 mL CHCl3. Phần

CHCl3 thu đƣ c đƣ c cô quay t i cạn để thu đƣ c cao CHCl3.

Thu cao EA: phần cao EtOH sau khi đƣ c t ch l p v i CHCl3 đƣ c tiếp tục

t ch l p v i 500 mL EA. Sau đó cô quay t i cạn để thu đƣ c cao EA.

Phần dịch nƣ c còn lại đƣ c cô cạn t i khô bằng phƣơng ph p gia nhiệt cách

thủy để thu đƣ c cao nƣ c.

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất khảo sát

2.2.2.2. Ti h hế matrine và oxymatrine

Tham khảo theo phƣơng ph p của Wentao Bi và c ng s năm 2010 có s cải

biên [98].

Q h hiế SP i h :

Qu tr nh loại tạp đƣ c th c hiện tr n c t SPE OASIC MCX v i 4 ƣ c:

Bƣ c 1: hoạt hóa c t chiết lần lƣ t v i 6 mL MeOH, 6 mL H2O chứa 0.5 %

dung dịch H2SO4.

Bƣ c 2: cân 1 g cao CHCl3 đƣ c h a tan lại trong 50 mL ung ịch MeOH:

H2O chứa 0.5 % dung dịch H2SO4 tỉ lệ 50: 50 (v/v) Sau đó dùng 5 c t chiết, m i

c t SPE MCX đƣ c chuyển l n 10 mL ung ịch và hút áp suất kém cho toàn b

phần dung dịch di chuyển qua c t SPE.

Bƣ c 3: rửa tạp ằng 1 mL ung ịch MeOH chứa 5 % NH3.

Bƣ c 4: rửa giải ằng 2 mL ung ịch MeOH chứa 5 % NH3.

Gom c c phần ung ịch rửa giải lại v cô đặc lại c n khoảng 2 mL sau đó

lọc qua m ng lọc 0,45 µm trƣ c khi ti m v o hệ thống sắc ký điều chế.

Đi i h h matrine oxymatrine h h g ắ i hế.

Qu tr nh n y đƣ c th c hiện tr n hệ m y UFLC 8A của hãng Shimazu

(Nhật Bản). Mẫu sau khi phân đoạn sơ bằng sắc ký c t v nhận anh phân đoạn

theo mục 2 đƣ c ti m v o hệ thống sắc ký điều chế theo chƣơng tr nh sau:

Pha đ ng: gồm có pha A l H2O chứa 0,1 % formic acid v pha B l

acetonitrile

Pha tĩnh: c t Supelco 250 x 21,2 mm , 10 µm.

B ng 2.3: Chƣơng tr nh pha đ ng hệ sắc ký điều chế

Th i gian ph t) Pha A (% (v/v)) Pha B (% v/v)

0,0 7,5 92,5

15,0 90,0 10,0

15,1 100,0 0,0

19,0 100,0 0,0

19,1 7,5 92,5

25,0 7,5 92,5

Tốc đ ng pha đ ng 10 mL/phút.

Bƣ c sóng 220 nm

Thể tích ti m mẫu 0.4 mL

Số lần tiêm mẫu là 3 lần

2.2.2.3. Nh h matrine matrine h h g HPLC-HRMS

C c chất đƣ c nhận anh tr n hệ thống sắc ký lỏng của hãng Agilent 1200

(Mỹ) ghép v i m y khối phổ phân giải cao micrOTOF – QII của hãng Bruker

(Đức).

Pha đ ng: pha A l H2O chứa 0,1 % formic acid. Pha B l MeOH chứa 0,1 %

formic acid. Chạy đẳng ng tại tỉ lệ pha A: pha B l 30 : 70 (v/v).

Pha tĩnh: c t ACE C18 150 x 4,6 mm, 3,5 µm

Tốc đ ng pha đ ng 0,5 mL/phút.

2.2.3. Định lượng polyphenol và flavonoid tổng số

Định lƣ ng polyphenol tổng số tiến hành theo phƣơng ph p của V.L.

Singleton có cải biến [99] và flavonoid tổng số tiến hành theo phƣơng ph p của

Lamaison v Carnet đề xuất v o năm 1990 [100].

Cân chính xác khoảng m = 5,0 g b t ƣ c liệu, cho vào m t bình nón 100

mL, làm ẩm bằng 5 mL nƣ c cất v để yên 1 giờ. Chiết mẫu 3 lần, m i lần thêm 20

mL EtOH 80 % và siêu âm không gia nhiệt trong vòng 30 phút, rút dịch chiết và lọc

qua giấy lọc vào m t nh định mức 100 mL.

2.2.3 1 Đị h g he ổ g

Đƣờng chuẩn gallic acid đƣ c thiết lập trên dãy nồng đ từ 10 µg/mL đến 50

µg/mL. Hút 0,4 mL từ m i điểm chuẩn và dịch chiết mẫu ƣ c liệu, thêm 1 mL

FCR, vortex kỹ v để yên 5 phút, thêm 1,6 mL Na2CO3 7,5 %, vortex kỹ v để yên

trong tối 30 phút v đo đ hấp thu ở ƣ c sóng 765 nm. Mẫu trắng đƣ c th c hiện

trên dịch chiết mẫu ƣ c liệu nhƣng không thêm dung dịch FCR.

H m lƣ ng TPC đƣ c quy về phần trăm đƣơng lƣ ng galic acid trong mẫu

khô, theo công thức sau :

(Công thức 2.7) ( )

Trong đó: A l đ hấp thu của mẫu thử ở ƣ c sóng 765 nm; m là khối lƣ ng

b t ƣ c liệu, tính bằng gam; LOD là mất khối lƣ ng do làm khô của b t ƣ c liệu,

tính bằng %; a v l đ dốc và hệ số chắn của đƣờng chuẩn tƣơng ứng.

Mẫu thử đƣ c th c hiện lặp lại ba lần và kết quả đƣ c biểu diễn ƣ i dạng

giá trị trung bình ± SD.

2.2.3.2. Đị h g f i ổ g

Đƣờng chuẩn Quercetin đƣ c thiết lập trên dãy nồng đ từ 0,3 µg/mL đến

200 µg/mL. Hút 0,5 mL từ m i điểm chuẩn và dịch chiết mẫu ƣ c liệu, thêm 0,2

mL AlCl3 10 %, 0,2 mL đệm CH3COOK 1M, thêm tiếp 1,5 mL MeOH và 2,6 mL

nƣ c cất. Mẫu đƣ c vortex kỹ để yên trong 30 phút v đo đ hấp thu ở ƣ c sóng

415 nm. Mẫu trắng đƣ c th c hiện trên dịch chiết mẫu ƣ c liệu nhƣng không th m

dung dịch AlCl3.

H m lƣ ng TFC đƣ c tính d a tr n đƣờng chuẩn Quercetin, quy ra phần

trăm đƣơng lƣ ng Quercetin trong mẫu khô, theo công thức sau :

(Công thức 2.8) ( )

Trong đó: A l đ hấp thu của mẫu thử ở ƣ c sóng 415 nm; m là khối lƣ ng

b t ƣ c liệu, tính bằng gam; LOD là mất khối lƣ ng do làm khô của b t ƣ c liệu,

tính bằng %; a v l đ dốc và hệ số chắn của đƣờng chuẩn tƣơng ứng.

Mẫu thử đƣ c th c hiện lặp lại ba lần và kết quả đƣ c biểu diễn ƣ i ạng

gi trị trung nh ± SD.

2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa

2.2.4.1. Thử ghi FRAP

Thử nghiệm theo phƣơng ph p của Benzie và Strain (1996) có cải biên [101].

Thuốc thử FRAP gồm: 300 mM đệm acetate (pH = 3,6), 10 mM TPTZ trong 40

mM HCl và 20 mM FeCl3.6H2O. Dung dịch đƣ c pha ngay trƣ c khi đo tr nh

s ng đo ở ƣ c sóng 593 nm. Vitamin C đƣ c dùng làm chất chuẩn kháng oxy hóa.

Mẫu trắng đƣ c th c hiện trên dịch chiết mẫu ƣ c liệu nhƣng không thêm dung

dịch FRAP.

2.2.4.2. Thử ghi DPPH

Thử nghiệm theo phƣơng ph p của Tailor Chandra Shekhar và c ng s

(2014), có cải biến [102]. Dung dịch DPPH 0 1 mM đƣ c pha trong EtOH. Quét

phổ hấp thu UV-Vis từ 400 nm đến 600 nm để kiểm tra ƣ c sóng hấp thu c c đại,

sau đó điều chỉnh đ hấp thu về 1,00 ± 0,02 tại ƣ c sóng 517 nm ngay trƣ c khi

dùng. Mẫu chứng ƣơng ng vitamin C v quecretin có nồng đ từ 5 – 25 µg/mL.

Mẫu chứng âm là EtOH tuyệt đối. Mẫu trắng đƣ c th c hiện trên dịch chiết mẫu

ƣ c liệu nhƣng không th m ung ịch DPPH.

Hoạt tính bắt gốc t do DPPH (AA %) đƣ c tính theo công thức:

( )

( ) (Công thức 2.9)

Trong đó: Ac l đ hấp thu của mẫu chứng âm, AT l đ hấp thu của mẫu thử,

chuẩn đối chứng và ABL l đ hấp thu của mẫu trắng tƣơng ứng.

Tính giá trị IC50 của mẫu thử và mẫu đối chứng d a v o phƣơng tr nh tuyến

tính giữa nồng đ và hoạt tính kháng oxy hóa của chúng.

2.2.4.3.Thử ghi A TS.+

Thử nghiệm theo phƣơng ph p của Michael Antolovich và c ng s (2002),

có cải biến [103]. Pha các dung dịch I K2S2O8 7,4 mM (2 mg/mL) trong nƣ c và II

ABTS.+ 2,6 mM (1,338 mg/mL) trong nƣ c. Tr n hai dung dịch I và II trên theo tỉ

lệ 1:1, lắc kỹ v để yên trong tối, ở nhiệt đ phòng trong 12 giờ để phản ứng xảy ra

ho n to n v đ hấp thụ của dung dịch đạt mức ổn định. Quét phổ từ 600 – 800 nm

để kiểm tra c c đại hấp thu sau đó điều chỉnh đ hấp thu ở ƣ c sóng 734 nm về

1 00 ± 0 02 ngay trƣ c khi dùng. Mẫu chứng ƣơng ng vitamin C (5 – 25 µg/mL)

và quercetin (3 – 15 µg/mL). Mẫu trắng đƣ c th c hiện trên dịch chiết mẫu ƣ c

liệu nhƣng không th m ung ịch ABTS.

Hoạt tính bắt gốc t do ABTS·+ (AA %) đƣ c tính theo công

thức:

( )

( ) (Công thức 2.10)

Trong đó:Ac l đ hấp thu của mẫu chứng âm, AT l đ hấp thu của mẫu thử,

chuẩn đối chứng, ABL l đ hấp thu của mẫu trắng.

Tính giá trị IC50 của mẫu thử và mẫu đối chứng d a v o phƣơng tr nh tuyến

tính giữa nồng đ và hoạt tính kháng oxy hóa của chúng.

2.2.5. Nuôi cấy tế bào

2.2.5 1 Ph ơ g h gi i g

Giải đông tế o đƣ c th c hiện theo quy trình thao tác chuẩn của Viện Sinh

học Nhiệt đ i. Ống vial chứa tế bào HepG2 và BT474 đông lạnh đƣ c lấy ra khỏi

bình chứa nitơ lỏng v nhanh chóng đƣa v o ể ổn nhiệt 37°C trong 30 giây. Thêm

1 mL môi trƣờng nuôi cấy v o vial v pipet đều, ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 5

phút ở nhiệt đ phòng. Tủa tế b o đƣ c thu nhận sau khi loại bỏ môi trƣờng nuôi

cấy đƣ c tái huyền phù hóa và chuyển sang bình nuôi cấy T25 chứa 4 mL môi

trƣờng nuôi cấy. Các bình nuôi cấy tế o đƣ c chuyển vào tủ nuôi ở nhiệt đ 37°C,

5 % CO2. Thay môi trƣờng sau khoảng 2-3 ngày hoặc đến khi môi trƣờng đổi màu

do tế bào sử dụng hết chất inh ƣỡng trong môi trƣờng nuôi.

2.2.5 2 Ph ơ g h h

Cấy chuyền tế o đƣ c th c hiện theo quy trình thao tác chuẩn của Viện

Sinh học Nhiệt đ i. Tế bào phát triển đến khoảng 90 % diện tích nuôi cấy đƣ c cấy

chuyền v i tỉ lệ 1:2. Sau khi lấy ra bình nuôi cấy tế bào T25 khỏi tủ nuôi, loại bỏ

môi trƣờng và rửa 2 lần v i PBS. M i bình tế o đƣ c xử lý v i 0,5 mL dung dịch

Trypsin-EDTA 0.25 % trong 5 phút ở 37 ºC để tách khỏi bề mặt nuôi cấy. Bổ sung

0,5 mL môi trƣờng nuôi cấy để bất hoạt Trypsin. Tế o đƣ c thu hoạch và ly tâm

v i tốc đ 1500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt đ ph ng để thu tủa tế bào. Tủa tế

bào ở m i bình nuôi T25 đƣ c tái huyền phù hóa bằng 1 mL môi trƣờng nuôi và

đƣ c chia đều ra c c đĩa/ nh nuôi chứa sẵn 2 mL môi trƣờng (đĩa Ø35) 4 mL (đĩa

Ø 60) và 4-5mL (bình nuôi T25). Các flask tế o đƣ c cho vào tủ nuôi ở nhiệt đ

37 °C, 5 % CO2.

2.2.5 3 Ph ơ g h g h

Bảo quản tế bào sau cấy chuyền đƣ c th c hiện theo quy trình thao tác chuẩn

của Viện Sinh học Nhiệt đ i. Tủa tế bào sau khi thu hoạch đƣ c huyền phù hóa v i

1 mL môi trƣờng bảo quản gồm có 950 μL môi trƣờng nuôi cấy và 50 μL môi

trƣờng đông lạnh DMSO. Huyền phù tế o đƣ c chuyển v o vial đông lạnh và trữ

ở -20 °C trong 2 giờ sau đó trữ ở -60 °C trong 24 giờ và cuối cùng chuyển v o nitơ lỏng -196 oC để lƣu trữ.

2.2.6. Hoạt tính kháng tế bào ung thư HepG2 và BT474 của các cao chiết

phân đoạn từ rễ Khổ sâm

2.2.6.1. Tế g h g các cao hiế h

Tế bào HepG2 và BT474 đƣ c giải đông cấy chuyển v lƣu trữ theo trình

bày trong (Mục 2.2.5). Tế o đƣ c cảm ứng v i các cao chiết phân đoạn EtOH,

EA, CHCl3 và H2O từ rễ Khổ sâm ở các mức nồng đ 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50, và

100 µg/mL trong 48 giờ thử nghiệm.

2 2 6 2 Đ h gi g ủ ế ằ g i WST-1

Để đ nh gi mức đ biểu hiện tăng sinh tế bào, tế bào đƣ c cấy truyền vào đĩa 96 giếng v i mật đ 5 × 103 tế bào/giếng. Tế o đƣ c nuôi cấy trong 100 μL môi trƣờng nuôi cấy ở 37 oC và 5 % CO2. M i giếng chứa tế o đƣ c đổ đầy môi

trƣờng nuôi cấy và phủ bằng màng parafin. Tế o đƣ c chia làm 2 nhóm: nhóm

cảm ứng bởi cao CHCl3 từ rễ Khổ sâm v nhóm đối chứng (Control). Sau 48 giờ khi

đƣ c thử nghiệm v i cao chiết Khổ sâm ở các mức nồng đ 1 µg/mL 10 µg/mL, và

100 µg/mL, sức sống tế o đƣ c đ nh gi ằng kit WST1 (Sigma, Mỹ). Thêm 10

μL WST-1 vào m i giếng, ủ trong vòng 3,5 giờ ở 37 °C và 5 % CO2. Lắc 1 phút

trên máy lắc v đo giá trị OD. ở ƣ c sóng 450 nm trên thiết bị Gloxmax. Các thí

nghiệm đƣ c lặp lại 3 lần v nhóm đối chứng đƣ c xử lý v i EtOH 80 % không

chứa cao chiết.

2.2.6.3 Đ h gi h h h i h ế h

Sau 48 giờ xử lý ở các nồng đ cao chiết khác nhau, các tế bào đƣ c loại bỏ

môi trƣờng và rửa 2 lần bằng dung dịch PBS, m i lần 5 phút. Sau đó tế o đƣ c cố

định v i paraformaldehyde 4 % trong 30 phút v đƣ c rửa 2 lần bằng dung dịch PBS, m i lần 5 phút. Tế o đƣ c xử lý v i Triton X 0 1 % qua đ m ở 4 oC. Tế bào

đƣ c rửa 2 lần bằng dung dịch PBS, m i lần 5 phút. Nhân tế o đƣ c nhu m v i

DAPI 2 µg/mL trong 30 phút. Tế o đƣ c rửa 2 lần bằng dung dịch PBS, m i lần 5

phút v quan s t ƣ i kính hiển vi huỳnh quang Cytell để x c định c c đặc điểm

hình thái của nhân.

2.2.6.4. Đ h gi ỉ hế he h ơ g h ủ ế ằ g h ơ g h

Flow cytometry

Tế o đƣ c cấy truyền trong bình nuôi T-25 có mật đ 1 x 105 tế bào/flask.

Phân tích flow cytometry đƣ c tiến hành bằng kit FITC Annexin V Apoptosis

Detection trên thiết bị BD Accuri C6 Plus. Để đ nh gi chu kỳ tăng sinh tế bào, tế

o đƣ c cố định bằng 4 % paraformaldehyde trong 15 phút. Tế o đƣ c rửa hai

lần v i PBS lạnh và huyền phù hóa bằng dung dịch đệm 1 XBD. Nhu m màu tế bào

bằng 5 μL DAPI và tiến hành phân tích chu kỳ tế bào bằng cách đo h m lƣ ng

DNA của tế bào sử dụng flow cytometer.

2.2.6.5. Đ h gi iể hi hi g i ế h he

h ơ g h ủ ế He G2

Tách chiết RNA tổng

RNA tổng của tế o đƣ c tách bằng kit ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep

System. Ống Eppendorf chứa tế bào sau khi thu hoạch đƣ c giữ lạnh ở 4 ºC, và

đƣ c bổ sung 250 μL dung dịch BL + TG Buffer pipette đều để ly giải tế bào. Sau

đó 85 μL Isopropanol 100 % đƣ c cho vào ống tế bào, vortex trong 5 giây. H n

dịch tế bào sau khi ly giải đƣ c cho vào c t Minicolum có chứa màng lọc và ly tâm

v i tốc đ 11.000 vòng/phút trong 30 giây ở 20 ºC. Dịch thải ra qua ống thu đƣ c

loại bỏ. RNA bám trên màng lọc c t Minicolumn đƣ c rửa v i 500 μL dung dịch

RNA Wash Solution bằng cách ly tâm v i tốc đ 11.000 vòng/phút trong 30 giây.

Các mẫu RNA thu đƣ c đƣ c trữ trong nitơ lỏng trƣ c khi tiến hành chạy Realtime

RT- PCR. và đ nh gi đ tinh sạch bằng m y đo quang phổ NanoVue Plus

Spectrophotometer. Các mẫu RNA có tỉ lệ A260/A280 từ 1.8 đến 2.0 đƣ c sử dụng

trong phản ứng Realtime RT - PCR. Các mẫu RNA thu đƣ c đƣ c trữ tại 4 oC nếu phân tích ngay sau đó hoặc -70 oC nếu d trữ lâu trƣ c khi tiến hành chạy Realtime

RT- PCR [104].

Tiến hành phân tích Realtime RT- PCR

B ng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime RT- PCR cho các gene liên

quan t i s chết theo chƣơng tr nh.

Phản ứng Nhiệt độ Th i gian

Chuyển hóa RNA thành DNA 45ºC 15 phút

Tách mạch 2 phút 95ºC

10 giây 95ºC 40 chu kì 15 giây 60°C

71 chu kì 30 giây 60°C

Trữ mẫu 30 phút 4°C

B ng 2.5: Trình t cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho phản ứng định lƣ ng Realtime

RT- PCR

Kích Tài Gene Trình tự cặp mồi thƣớc (bp) liệu

F: 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3’ [105] GAPDH 223 R: 5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

F: 5’-GAGCACTGCCCAACAACAC-3’ [105] p53 251 R: 5’-ATGGCGGGAGGTAGACTGA-3’

F: 5’-TTCTTTGAGTTCGGTGGGG-3’ [105] Bcl-2 194 R: 5’-CAGGAGAAATCAAACAGAGGC-3’

F: 5’-CTTTTGCTTCAGGGTTTCATC-3’ Bax 113 R: 5’-CACTCGCTCAGCTTCTTGGT-3’ [105]

Caspase F: 5’-ATGGAAGCGAATCAATGGAC-3’ [105] 242 R: 5’-ATCACGCATCAATTCCACAA-3’ 3

F: 5’-GCGAACTAACAGGCAAGCA-3’ [105] Caspase 144 9 R: 5’-CCAAATCCTCCAGAACCAAT-3’

Biểu hiện mức đ phiên mã của c c gene mã hóa li n quan đến s chết theo

chƣơng tr nh đƣ c đ nh gi ằng phƣơng ph p Realtime RT- PCR. C c gene đƣ c

đ nh gi ao gồm p53, Bcl-2, Bax, Caspase 3 và Caspase 9 . Gene GAPDH đƣ c sử

dụng để l m đối chứng. Phản ứng Realtime RT- PCR đƣ c chạy bằng máy Real-

Time PCR System, sử dụng kit 2x qPCR SyGreen 1-Step Go Hi-ROX. M i phản

ứng có tổng thể tích là 20 μL bao gồm 1 μL RNA mẫu, 2 μL mồi xuôi v ngƣ c, 10

μL 2X Mix Hi-ROX, 1 μL RTAse, và 6 μL dH2O. Chu trình nhiệt của phản ứng

nhƣ trong (Bảng 2.4). Các cặp mồi đặc trƣng cho c c gene khảo s t đƣ c thể hiện trong (Bảng 2.5). Giá trị Ct của mẫu đƣ c tính bằng phƣơng ph p 2−ΔΔCt [106].

S biểu hiện của gene mục tiêu trong m i nhóm thí nghiệm đƣ c x c định

bằng việc chuẩn hóa giá trị Ct của gene mục tiêu v i gene tham khảo (GAPDH) và nhóm đối chứng. Phân tích s thay đổi biểu hiện gene theo phƣơng ph p 2-∆∆Ct (Livak) (Real-time PCR Applications Guide – Biora s). Phƣơng ph p 2-∆∆Ct giả

định rằng cả gene đích v gene tham chiếu đƣ c khuếch đại v i hiệu quả gần 100 %

và trong phạm vi 5 % của m i gene. Để x c định s khác biệt tƣơng đối trong mức đ biểu hiện của gene đích ở các mẫu khác nhau phƣơng ph p 2-∆∆Ct đƣ c th c hiện

theo c c ƣ c sau:

 Chuẩn hóa giá trị Ct của gene mục tiêu v i gene tham khảo cho cả mẫu thí

nghiệm và mẫu hiệu chỉnh:

∆Ct(mẫu) = Ct(mục tiêu, mẫu) - Ct(tham chiếu, mẫu) (Công thức 2.11)

∆Ct(chuẩn) = Ct(mục tiêu, chuẩn) - Ct(tham chiếu, chuẩn) (Công thức 2.12)

 Chuẩn hóa giá trị ∆Ct của mẫu thí nghiệm v i ∆Ct của mẫu chuẩn:

∆∆Ct = ∆Ct(mẫu) - ∆Ct(chuẩn) (Công thức 2.13)

 Cuối cùng, tỉ lệ biểu hiện đƣ c tính theo công thức:

Tỉ lệ biểu hiện = 2-∆∆Ct (Công thức 2.14)

Kết quả thu đƣ c là s tăng (hay giảm) theo tỷ lệ của gene đích trong mẫu thí

nghiệm tƣơng quan v i mẫu chuẩn v đƣ c chuẩn hóa theo s biểu hiện của gene

tham chiếu. Chuẩn hóa s biểu hiện của gene đích theo gene tham chiếu đắp cho

những khác biệt về lƣ ng tế bào mẫu.

2.2.6.8. Ph ơ g h We e :

Trong n i dung nghiên cứu này, mức đ biểu hiện của các protein p53, Bcl-

2, Bax, Caspase 3 và Caspase 9 đƣ c đ nh gi ằng phƣơng ph p Western Blot.

C c ƣ c th c hiện bao gồm: ly giải protein điện di SDS-PAGE, chuyển màng

PVDF, khóa màng, ủ kháng thể sơ cấp, ủ kháng thể thứ cấp, hiện phim.

Tế bào HepG2 đƣ c ly giải bằng ung ich đệm Optiblot LDS Sample ở bể

ổn nhiệt 70°C trong 10 phút. Protein thu đƣ c từ các mẫu đƣ c chuyển v i lƣ ng

bằng nhau vào các giếng của gel Precast Gel SDS-PAGE 4-12 % v đƣ c điện di

trong dung dịch đệm Optiblot SDS Run trong 2 giờ ở 50 V. Bể điện i đƣ c giữ

lạnh bằng đ gel để tránh s tho i hóa protein. Protein đã đƣ c phân tách trong

Precast Gel SDS-PAGE đƣ c chuyển lên màng PVDF sau đó đƣ c khóa màng qua

đ m ở 4ºC trong Blocking Buffer. Màng PVDF này tiếp tục đƣ c ủ v i kháng thể

sơ cấp trong Blocking Buffer qua đ m ở 4ºC. Các kháng thể đƣ c sử dụng bao gồm:

Anti-Caspase 3 antibody, Anti-Caspase 9 antibody, Anti-Bax antibody và Anti-Bcl-

2 antibody đƣ c pha loãng v i tỉ lệ 1:5000; kháng thể Anti-GAPDH antibody cho

protein GAPDH đƣ c pha loãng v i tỉ lệ 1:10000. Sau khi ủ qua kháng thể sơ cấp,

m ng PVDF đƣ c rửa 3 lần, m i lần 10 phút v i dung dịch TBST. M ng n y sau đó

đƣ c ủ v i kháng thể thứ cấp Goat Anti-Rabbit IgG (HRP) trong Blocking Buffer ở

nhiệt đ phòng trong 1 giờ. Các vạch protein đƣ c hiển thị bằng ECL Western

Blotting Substrate Kit.

Kết quả Western Blot trong nghiên cứu n y đƣ c hiển thị bằng phƣơng ph p

hiện phim sử dụng kit AUTOMATIC X-RAY. Các vạch protein phát huỳnh quang

tr n m ng PVDF đƣ c hiển thị âm bản trên phim. Phần mềm ImageJ (National

Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) đƣ c ng để đo cƣờng đ của các vạch protein

trong kết quả hiện phim [107].

2.2.7. Phương pháp thống kê

Phƣơng ph p one-way analysis of varience (ANOVA) đƣ c sử dụng để đ nh

gi phƣơng sai của giá trị trung bình kèm theo các sai số ƣ i dạng đ lệch chuẩn

(SD) trong các nhóm thí nghiệm. Đ nh gi thống k đƣ c th c hiện bởi phần mềm

Sigma Plot 11.0, các khác biệt có ý nghĩa thống kê tại mức xác xuất 95%, P ≤ 0,05.

Kết quả đƣ c thể hiện ƣ i dạng giá trị trung bình ± đ lệch chuẩn (SD).

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

3.1. Định danh và đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu

3.1.1. Định danh loài cây Khổ sâm trồng tại Tây Nguyên

3 1 1 1 M ặ iể h họ

Hình 3.1: (A), (B) hình thái cây Khổ sâm 2 năm tuổi đƣ c trồng tại Đắk

Nông và thu hái vào tháng 3/2016, (C) hoa Khổ sâm, (D) rễ Khổ sâm tƣơi, (E) rễ

Khổ sâm phơi khô, (F) mặt cắt ngang của rễ Khổ sâm khô, (G), rễ Khổ sâm khô

chặt nhỏ, (H) b t rễ Khổ sâm.

Hình thái cây Khổ sâm trồng tại Đắk Nông có dạng cây bụi nhỏ, chiều cao

trung bình 1,0 m; phân nhiều cành nhánh và c nh non có lông tơ. L cây kép dạng

lông chim, mọc so le gồm 5 - 10 đôi; lá chét hình mác dài 3 - 4 cm, r ng 1 - 2 cm,

dốc thuôn đầu nhọn hoặc hơi t mặt trên nhẵn, mặt ƣ i có lông mịn màu xám

(Hình 3.1 A và B). Hoa màu vàng nhạt, đ i 5 răng h nh chuông tr ng 5 c nh không

đều, nhị 10, rời nhau, bầu có lông mịn và cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành

chùm dài 10 - 20 cm (Hình 3.1 C). Quả dạng đậu, thắt lại giữa các hạt, hình thuôn

dài 5 - 12 cm, đƣờng kính 5 - 8 mm, đầu có mỏ thuôn dài; hạt 3-7, hình cầu, màu

đen.

Rễ hình trụ dài, vỏ ngoài màu vàng trắng. Rễ có hình trụ i thƣờng phân

nhánh ở phần ƣ i, dài 10 – 30 cm đƣờng kính 1 – 6,5 cm (Hình 3.1 D). Phía trong

có màu nâu xám hoặc vàng xám, có nhiều nếp nhăn theo chiều dọc, có những ch

lồi ra ngoài giống tế bào khí khẩu xếp nằm ngang. Vỏ ngoài mỏng, hầu hết bị rách

ra và uốn cong ngƣ c lại, dễ bị tróc ra, bề mặt tiếp xúc m u v ng v trơn nhẵn. Thể

trạng cứng, khó bẻ gãy. Mặt cắt ngang của rễ có màu trắng hơi v ng v i c c đƣờng

vân chạy từ tâm ra ngo i đôi khi thấy có các bó mạch bất thƣờng sắp xếp thành các

v ng đồng tâm hoặc rải rác không theo trật t nào cả (Hình 3.1 F). Mùi dịu nhẹ, vị

c c đắng. B t có màu vàng nhạt m i thơm nhẹ và vị rất đắng (Hình 3.1 H).

Hiện nay, chuyên luận trong DĐVN V [96] m i chỉ đề cập t i Khổ sâm cho

lá và cành (Croton tonkinensis Gagnep) và không có chuyên luận về rễ Khổ sâm.

Kết quả mô tả c c đặc điểm thân, hoa, lá và rễ của cây Khổ sâm đƣ c trồng tại Đắk

Nông phù h p v i mô tả trong chuyên luận của DĐTQ [5].

3 1 1 2 Đị h h i ằ g h ử

B ng 3.1: Kết quả search last NCBI

Mã số lƣu trữ Tỷ lệ Mức đ Kí Lo i định trong ngân nucleoti TT % phủ tƣơng hiệu danh h ng ữ liệu tƣơng đồng đồng gene

Sophora 1 T1 AB127037.1 93 % 96 % 569/595 flavescens

Cây Khổ sâm trồng tại Đắk Nông đƣ c định danh loài thông qua tr nh t

gene đƣ c th c hiện bởi Công Ty TNHH Dịch Vụ v Thƣơng Mại Nam Khoa ằng

phƣơng ph p Sanger tr n m y 3130XL của AIB.

Trình t gene của cây Khổ sâm trồng tại Đắk Nông có 640 nucleotide và

đƣ c trình bày trong (Phụ lục 1). Thông qua thƣ viện Basic Local Alignment

Search Tool (BLAST) và th c hiện thuật toán dò tìm theo xác xuất để kiểm tra trình

t nucleotide [108], cây Khổ sâm trồng tại Đắk Nông đƣ c định danh thu c loài

Sophora flavescens, có mã số lƣu l AB127037.1 v có 595 nucleoti e trong chu i

trình t gene. Phân tích x c định trình t DNA là m t trong những kĩ thuật hiện đại

nhất v có đ tin cậy cao nhất trong phân tích đ nh gi ƣ c liệu. Kết quả phân tích

có đ phù h p cao khi đối chiếu giữa trình t DNA th c nghiệm v i trình t DNA

tr n thƣ viện BLAST có tỷ lệ tƣơng đồng là 569 trên tổng số 595 nucleotide v đạt

đ phủ t i 93 %.

Từ các kiểm tra đã th c hiện, kết luận ƣ c liệu đang nghi n cứu đúng l

ƣ c liệu Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.).

3.1.2. Đánh giá chất lượng dược liệu

3.1.2.1. Soi b và vi h ặ ắ g g

Hình 3.2: (A) Tinh b t vi phẫu và (B) vi phẫu mặt cắt ngang rễ Khổ sâm

L p bần gồm 4 - 8 hàng tế bào xếp song song. Kế tiếp là l p mô mềm mỏng

chứa nhiệu tinh b t tinh b t có hình cầu nhỏ hoặc hình elipse chứa các sẹo, v i

đƣờng kính kính trong khoảng 5 – 35 µm. Tia libe r ng và tách biệt v i tầng phát

sinh libe-g đƣ c sắp xếp th nh c c v ng gi n đoạn, phân biệt rõ vùng libe và vùng

g . Tầng g phân nhánh thành 2 – 4 đƣờng hƣ ng ra ngoài, có mạch g sắp xếp

xuyên tâm và có các tia g r ng có khả năng phân iệt rõ.

B t rễ Khổ Sâm Bó có mang tinh thể

Tinh thể Calcium oxalate Mảnh mô mềm có tế bào thành mỏng

Bó s i Mảnh bần

Mạch vạch Tinh b t

Hình 3.3: M t số thành phần b t rễ Khổ sâm quan s t ƣ i kính hiển vi quang học

(X10)

Khi quan sát dƣ i kính hiển vi quang học, tiêu bản thấy có rất nhiều s i

th nh y thƣờng tập h p thành bó có thể mang tinh thể; mảnh bần; mảnh mô mềm

có các tế bào thành mỏng. Tế bào mô cứng màu vàng nhạt, thành dày. Tinh thể

calcium oxalate hình khối đơn lẻ hay tập trung th nh đ m. Mảnh mạch phần l n là

mạch vạch. Kết quả vi phẫu và soi b t mặt cắt ngang rễ Khổ sâm đƣ c trồng tại

Đắk Nông phù h p v i mô tả trong chuyên luận của DĐTQ [5] và ấn bản kiểm

nghiệm ƣ c liệu bằng phƣơng ph p hiển vi.

3.1.2.2. Ph g ới N OH

Hình 3.4: Phản ứng v i NaOH của rễ Khổ sâm phơi khô

Khi thêm NaOH 40 % lên bề mặt cắt ngang của rễ, ở phần vỏ xuất hiện màu

đỏ-cam và từ từ chuyển th nh m u đỏ máu, bền trong m t thời gian dài; phần lõi

không đổi màu (Hình 3.4). Kết quả ghi nhận đƣ c phù h p v i mô tả trong chuyên

luận của DĐTQ [5].

3.1.2.3. Đị h g ẩ (LOD), h A (%) ổ g h hiế

E (%)

Đ ẩm ƣ c liệu đƣ c th c hiện theo (Mục 2.2.1) và tính toán theo (Công

thức 2.1). Kết quả th c nghiệm là 8,5 % trình bày trong phù h p v i quy định của

DĐTQ là không quá 11,0 %.

Tro toàn phần của ƣ c liệu đƣ c th c hiện theo (Mục 2.2.1) và tính toán

theo (Công thức 2.2). Quy định của DĐTQ là không quá 8,0 %. Kết quả th c

nghiệm là 4.6 % thể hiện s phù h p về hàm lƣ ng tro toàn phần so v i giá trị quy

định nêu trên.

Tổng chất chiết đƣ c từ ƣ c liệu đƣ c th c hiện theo (Mục 2.2.1) và tính

toán theo (Công thức 2.3). Kết quả th c nghiệm tổng chất chiết là 21,8 % phù h p

v i quy định của DĐTQ là không nhỏ hơn 20 0 %.

B ng 3.2: Kết quả đ ẩm, tro toàn phần và tổng chất chiết của nguyên liệu

Chỉ ti u Khối lƣ ng c c giai đoạn SD Kết quả Trung bình

(%) (%) m (g) mo (g) m2 (g)

Đ ẩm 28,3855 1,0206 29,3207 8,4

LOD (%) 33,6478 1,0031 34,5650 8,5 0,01 8,6

30,3948 1,0355 31,3430 8,4

Tro toàn 34,7527 2,0005 34,8535 4,6

phần 34,0474 2,0042 34,1493 4,6 0,04 4,7

A (%) 34,7283 2,0028 34,8286 4,6

Tổng chất 34,7146 3,9994 34,8734 21,7 0 chiết đƣ c 34,1614 4,0149 34,3222 21,8 21,9 0,10 E (%) 34,5023 4,0096 34,6624 21,8

Nhƣ đã tr nh y DĐVN chƣa có chuyên luận về rễ Khổ sâm cho rễ. Trong

khi đó DĐTQ có chuy n luận riêng về tiêu chí chất lƣ ng đ ẩm, tro toàn phần,

tổng chất chiết đƣ c của rễ Khổ sâm nhƣng không có hƣ ng dẫn định lƣ ng. Do đó

c c ti u chí n y đƣ c định lƣ ng và tiến h nh theo hƣ ng dẫn chung đƣ c nêu trong

DĐVN V cho đối tƣ ng mẫu ƣ c liệu. Các kết quả th c nghiệm đƣ c đối chiếu so

sánh v i yêu cầu đƣ c n u trong DĐTQ để đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu v đều

đạt yêu cầu.

3.1.2.4. Đị h h Matrine và oxymatrine

Tiến hành sắc ký l p mỏng theo (Mục 2.2.1.1), kết quả hiện màu bản mỏng

đƣ c thể hiện trên (Hình 3.5)

Hình 3.5: Kết quả định tính alkaloid trong ƣ c liệu

Kết quả định tính m t số alkaloid đƣ c thể hiện trong (Hình 3.5). Mẫu thử

dịch chiết ƣ c liệu cho các vết trên sắc ký l p mỏng có giá trị Rf và màu sắc tƣơng

t v i giá trị Rf và màu sắc các vết matrine, oxymatrine chuẩn. Matrine và

oxymatrine đƣ c xem nhƣ l c c chất đ nh ấu sinh học cho rễ Khổ sâm và kết quả

sắc ký bản mỏng hoàn toàn phù h p v i mô tả trong chuyên luận của DĐTQ [5].

3.1.2.5. Đị h g Matrine và Oxymatrine ằ g h ơ g h HPL -UV

B ng 3.3: Chƣơng tr nh pha đ ng HPLC-UV phân tách matrine và oxymatrine

Th i gian ph t) Pha A* (% v/v) Pha B** (% v/v)

0,0 7,5 92,5

15,0 90,0 10,0

15,1 100,0 0,0

19,0 100,0 0,0

19,1 7,5 92,5

25,0 7,5 92,5

* : pha A là hệ đệm HCl/triethylamine , pH =3; **: pha B là acetonitrile

Theo DĐTQ pha đ ng acetonitrile và hệ đệm 0.3 % phosphoric acid 0.3 %

triethylamine (4:96, v/v) đƣ c sử dụng trong phân tách matrine và oxymatrine trên

hệ sắc ký pha đảo. Theo nghiên cứu đã công ố của Wentao Bi cùng c ng s [98],

để h tr quá trình phân tách matrine và oxymatrine trên c t sắc ký pha đảo cần

thành phần phần pha đ ng chứa chất ghép cặp ion nhƣ trifluoroacetic aci . Keli

cùng c ng s [109] sử dụng triethylamine che các tâm sillanol t do trên c t sắc ký

để loại trừ tƣơng t c thứ cấp giữa gốc silanol t do trên c t v i các tâm –N- trên cấu

trúc của matrine và oxymatrine. Nếu tƣơng t c thứ cấp xảy ra mũi sắc ký của

matrine và oxymatrine có hiện tƣ ng kéo đuôi gây khó khăn cho qu tr nh định

lƣ ng. Từ c c định hƣ ng tr n đề tài sử dụng hệ pha đ ng chứa hệ đệm

HCl/triethylamine, pH =3 cho phân tách matrine và oxymatrine trên c t sắc ký pha

đảo. Thông qua các khảo s t thăm chƣơng tr nh pha đ ng bằng c ch tăng tuyến

tính tỉ lệ pha acetonitrile từ 5 % t i 100 % trong thời gian 20 phút chƣơng tr nh pha

đ ng đƣ c điều chỉnh cho s phân tách matrine và oxymatrine trên c t sắc ký pha

800

Diện tích Đƣ ng chuẩn matrine

600

400

y = 1x + 0 R² = 0,9994

200

C (ug/mL)

200

400

600

800

đảo (Bảng 3.3).

Đƣ ng chuẩn oxymatrine

800

Diện tích

600

400

y = 1x + 4E-08 R² = 0,9994

200

C (ug/mL)

200

400

600

800

Hình 3.6: Phƣơng tr nh đƣờng chuẩn matrine và oxymatrine

D ng đƣờng tuyến tính giữa diện tích mũi sắc ký và nồng đ c c điểm

chuẩn đƣờng chuẩn của matrine và oxymatrine thể hiện trên (Hình 3.6) cho thấy hệ số tƣơng quan R2 đều đạt 0 9994. Điều này cho thấy phƣơng tr nh đƣờng chuẩn

hoàn toàn phù h p v đạt yêu cầu cho phân tích định lƣ ng matrine và oxymatrine

từ các mẫu ƣ c liệu.

Kh o sát dung môi chiết xu t

Tiến hành khảo s t điều kiện chiết xuất cao toàn phần v i 100 mL hệ dung

môi EtOH : H2O trong đó tỉ lệ EtOH tăng ần từ 60 % (v/v) đến 90 % (v/v). Th c

hiện quy trình xử lý mẫu, thông số HPLC đƣ c nêu trong (mục 2.2.2) và m i thí

nghiệm đƣ c th c hiện lặp ba lần. Kết quả h m lƣ ng matrine và oxymatrine trong

c c cao tƣơng ứng đƣ c trình bày trong (Bảng 3.4),

B ng 3.4: Khảo sát tỉ lệ dung môi EtOH chiết matrine và oxymatrine từ rễ Khổ sâm

Tỉ lệ EtOH Hàm lƣợng matrine Hàm lƣợng oxymatrine

(µg/mL) (µg/mL) % (v/v)

60 3,7 ± 1,1 56,2 ± 3,6

70 3,5 ± 1,0 61,3 ± 3,2

80 6,27 ± 0,69 93,9 ± 1,2

90 4,77 ± 0,78 79,8 + 1,5

B ng 3.5: Các thông số thẩm định phƣơng ph p HPLC-UV x c định matrine và

oxymatrine.

Thông số Matrine Oxymatrine

Thời gian lƣu (phút) 10,912 12,948

Y=X

Khoảng tuyến tính (µg/mL) 10,0-600,0 10,0-600,0

Phƣơng tr nh đƣờng chuẩn R2 0,9994 0.9994

% RSD 2,8 3,5

HSTH trung nh (%) mức th m 10 µg/g 91,0 88,3

HSTH trung nh (%) mức th m 50 µg/g 94,1 95,1

HSTH trung nh (%) mức th m 100 µg/g 102,6 99,7

0,61 1,4 SD

2,0 4,5 LOD (µg/g)

6,1 14 LOQ (µg/g)

Khi tăng ần tỉ lệ dung môi EtOH từ mức 60 % (v/v) đến 80 % (v/v), kết quả

cho thấy tại tỉ lệ EtOH 80 % có h m lƣ ng matrine và oxymatrine lần lƣ t là 93,89

µg/mL và 6,7 µg/mL cao hơn so v i các tỉ lệ EtOH khác. Tiếp tục tăng tỉ lệ EtOH

lên 90 % (v/v) nhận thấy h m lƣ ng matrine và oxymatrine có xu hƣ ng giảm v i

kết quả lần lƣ t là 79,8 µg/mL và 4,77 µg/mL. Theo định hƣ ng tách chiết và tinh

chế đơn chất matrine và oxymatrine, dung môi EtOH 80 % đƣ c sử dụng trong quy

trình chiết xuất cho c c ƣ c khảo sát tiếp theo.

Kết quả thẩm định phƣơng ph p cho thấy phƣơng ph p HPLC-UV định

lƣ ng matrine v oxymatrine có đ chính xác % RSD lần lƣ t là 2,8 % và 3,5 %.

Đ đúng của phƣơng ph p d a trên phần trăm hiệu suất thu hồi (% HSTH) của các

mẫu ƣ c liệu thêm chuẩn matrine và oxymatrine có các giá trị trung bình lần lƣ t

là 95,9 % và 94,4 % (Bảng 3.5). Đây l cơ sở quan trọng trong định hƣ ng tách

chiết các cao chiết phân đoạn từ lƣ ng l n ƣ c liệu Khổ sâm cho các n i dung tiếp

theo của đề t i. Đặc biệt là n i ung điều chế matrine và oxymatrine tinh khiết,

cũng nhƣ c c thử nghiệm của cao chiết phân đoạn trên các tế bào HepG2 và BT474.

Quy trình phân tích HPLC-UV đã thẩm định trên mẫu ƣ c liệu đƣ c áp

dụng cho phân tích định lƣ ng matrine và oxymatrine trong các cao chiết phân

đoạn. Qua đó nhằm định hƣ ng chọn cao chiết chứa h m lƣ ng l n hai chất trên

cho n i dung tinh chế chất tinh khiết bằng sắc ký điều chế.

3.2. Kết quả tách chiết một số hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm

3.2.1. Phân lập Matrine và Oxymatrine bằng phƣơng pháp sắc ký điều chế

3.2.1.1 Th hiế h

H m lƣ ng matrine trong cao CHCl3 527,7 mg/g cao hơn gần gấp 5 lần so

v i h m lƣ ng matrine trong cao EtOH 80 % (107,4 mg/g) v h m lƣ ng

oxymatrine trong cao CHCl3 30,5 mg/g cao hơn gần gấp 5 lần so v i h m lƣ ng

oxymatrine trong cao EtOH 6,79 µg/mg. C n h m lƣ ng các alkaloid này trong cao

EA không đ ng kể v đây l phân đoạn cao giàu flavonoid.

Cao phân đoạn đƣ c phân tích HPLC-UV để x c định h m lƣ ng matrine và

oxymatrine và chọn cao phân đoạn cho c c ƣ c tinh sạch và tinh chế matrine và

oxymatrine ở c c ƣ c sau. Quá trình chiết tách trên khối lƣ ng mẫu ƣ c liệu l n

có s thay đổi về kết quả định lƣ ng matrine và oxymatrine trong cao chiết EtOH.

Tuy nhiên, trong quá trình tinh chế đơn chất, có m t số ti u chí đƣ c th c hiện nhƣ

B ng 3.6: H m lƣ ng matrine và oxymatrine trong cao phân đoạn EtOH 80 %, EA,

CHCl3 v cao nƣ c

Hàm lƣợng Nguyên liệu Khối Hàm lƣợng

oxymatrine lƣợng g) matrine

(mg/g) (mg/g)

1,25* B t rễ Khổ 100 18,78*

sâm

6,79 EtOH 80 % 16,12 107,4

30,5 3,2 527,7 CHCl3

KPH (< LOD) EA 2,51 7,0

Nƣ c 10,57 KPH (< LOD) KPH (

((*) tính toán d a trên kết qu trình bày trong (B ng 3.6) và KPH là không phát

hi n)

- Không cần chiết kiệt nhằm giảm thiểu lƣ ng tạp chất trong dịch chiết.

- Cần làm giàu matrine, oxymatrine và làm sạch thành phần nền mẫu trƣ c

khi tiến hành sắc ký điều chế.

- Hứng chất rửa giải từ 50 % mũi sắc ký phía trƣ c t i 50 % mũi sắc ký phía

sau để đảm bảo s tinh khiết của chất tinh chế ở mức cao nhất.

Nhƣ vậy, cao chiết phân đoạn CHCl3 đƣ c sử dụng cho c c ƣ c tinh sạch

và tinh chế matrine và oxymatrine ở ƣ c tiếp theo.

3.2.1.2. Ti h h hiế

Kết quả trình bày trong (Bảng 3.7) cho thấy, tại 1 mL dịch rửa giải đầu tiên

chứa h m lƣ ng matrine và oxymatrine thấp. Do đó 1 mL MeOH chứa 5 % NH3

đầu ti n đƣ c sử dụng làm dung dịch rửa tạp chất khỏi dịch chiết. Lƣ ng matrine và

oxymatrine xuất hiện phần l n trong 2 mL rửa giải tiếp theo, nên 2 mL MeOH chứa

5 % NH3 đƣ c sử dụng làm dịch rửa giải matrine và oxymatrine khỏi dịch chiết.

B ng 3.7: Tối ƣu l m sạch dịch chiết ƣ c liệu trên c t OASIC MCX, sử

dụng 200 mg cao CHCl3 cho ƣ c khảo sát này.

Lần rửa giải bằng Thể tích Hàm lƣợng Hàm lƣợng

rửa giải MeOH chứa NH3 matrine oxymatrine

(µg/mg) (µg/mg)

Lần 1 1 mL 5,4 0,08

Lần 2 1 mL 20,6 1,54

Lần 3 1 mL 63,1 3.28

Lần 4 1 mL 10,2 0,8

Lần 5 1 mL 1,5 0,01

Lần 6 1 mL Không phát hiện Không phát hiện

(

Trong nghiên cứu của Wentao Bi cùng c ng s [98] sử dụng c t chiết pha

rắn (SPE) v i thành phần amino-imidazolium polymer hình thành các liên kết

hy rogen v tƣơng t c - nhằm h tr quá trình tách các tạp chất trong nền mẫu.

Hình 3.7: Cấu trúc pha tĩnh c t OASIS MCX

Tuy nhiên, nghiên cứu này ứng dụng cho phân tích định lƣ ng matrine và

oxymatrine trong mẫu ƣ c liệu. Trong quá trình tinh sạch mẫu cho mục đích tinh

chế, cần c t chiết SPE có ung lƣ ng c t cao hơn để có thể xử lý lƣ ng mẫu l n.

Do đó c t chiết OASIS MCX v i thành phần là polymer polystyren– divinylbenzen

có gắn thêm nhóm chức sulfonic aci tr n v ng thơm đƣ c sử dụng cho mục đích

tinh sạch cao chiết matrine và oxymatrine.

C t SPE làm sạch bằng đa cơ chế có mô h nh pha đảo v tƣơng t c trao đổi

ion, khoảng pH r ng từ 1 - 14. Ngo i c c tƣơng t c không phân c c trong cấu trúc

vòng của matrine và oxymatrine v i pha tĩnh ịch chiết ƣ c liệu đƣ c điều chỉnh

về pH acid bằng H2SO4 để h tr quá trình chuyển trạng thái matrine và oxymatrine

mang điện tích ƣơng tr n c c tâm –N- l m tăng khả năng lƣu giữ trên c t theo

tƣơng t c điện tích. Quá trình rửa giải matrine và oxymatrine khỏi c t đƣ c th c

hiện bằng dung môi hữu cơ trong môi trƣờng kiềm. Tiến hành rửa giải lần lƣ t 1

mL MeOH chứa 5 % NH3 và phân tích matrine, oxymatrine trong dịch rửa giải

nhằm chọn đƣ c điều kiện rửa giải thu đƣ c nhiều matrine và oxymatrine nhất.

3.2.1.3. Ti h hế matrine và oxymatrine ằ g ắ i hế

Hình 3.8: Sắc ký đồ điều chế matrine và oxymatrine

Dịch rửa giải từ quá trình tinh sạch dịch chiết bằng SPE đƣ c tiêm vào hệ

thống HPLC điều chế để phân lập matrine và oxymatrine tinh khiết và tiến hành qua

hai giai đoạn nhƣ sau:

Gi i n 1: kh o sát các thông s sắc ký

C c mũi sắc ký (H nh 3.8) đƣ c hứng phân đoạn vào các ống hứng riêng

biệt. Tiếp theo, tiêm từng phân đoạn thu đƣ c vào hệ thống HPLC-MS để nhận diện

vị trí rửa giải của matrine và oxymatrine trên hệ thống sắc ký điều chế. Matrine

đƣ c rửa giải trong khoảng thời gian 10,2 – 11,4 phút và thời gian lƣu tại 10,5 phút,

oxymatrine đƣ c rửa giải trong khoảng thời gian 14,0 – 15,5 phút và thời gian lƣu

tại 14,3 phút.

C c phân đoạn hứng đơn chất sau quá trình sắc ký điều chế cần đƣ c làm

khan ho n to n để tăng đ tinh khiết của tinh chất. Do đó chƣơng tr nh pha đ ng

đƣ c c i đặt sao cho phân đoạn tinh chất matrine và oxymatrine nằm trong thành

phần pha đ ng chứa lƣ ng l n dung môi hữu cơ.

Sau m t số khảo s t chƣơng tr nh pha đ ng thăm chƣơng tr nh pha đ ng

đƣ c trình bày trong (Bảng 2.2) cho thấy s phân tách tốt giữa matrine và

oxymatrine v i các thành phần nền. Hơn nữa mũi sắc ký của oxymatrine đƣ c rửa

giải gần 15 phút, tại thời gian có tỉ lệ pha đ ng chứa 90 % (v/v) dung môi hữu cơ.

Gi i n 2: tinh chế i e i e ơ h t.

Th c hiện tiêm 3 lần tiêm mẫu vào máy sắc ký điều chế theo chƣơng tr nh tối

ƣu. Để thu đƣ c matrine v oxymatrine có đ tinh khiết cao, th c hiện hứng phân

đoạn tại thời điểm 50 % chiều cao mũi sắc ký phía trƣ c t i 50 % chiều cao mũi sắc

ký phía sau. Toàn b phân đoạn matrine v oxymatrine thu đƣ c, tiến hành thổi

bằng ng khí nito để đuổi b t lƣ ng dung môi hữu cơ. Th c hiện chiết phân l p

bằng CHCl3 để chuyển matrine và oxymatrine qua hữu cơ. Cô quay chân không để

loại CHCl3 và thu phần rắn còn lại chứa đơn chất matrine và oxymatrine.

Chất chuẩn tinh khiết là hóa chất không thể thiếu trong các nghiên cứu hóa

học, sinh học ƣ c học và nhiều nghành khoa học khác. Các chất chuẩn tinh khiết

đa số có giá thành cao, thời gian đặt hàng từ 1 – 2 tháng, gây ảnh hƣởng nhiều t i

kinh phí, tiến đ nghiên cứu và không chủ đ ng đƣ c trong các nghiên cứu chuyên

sâu hơn khi cần lƣ ng l n chất chuẩn tinh khiết. Do đó chủ đ ng đƣ c các chất

chuẩn tinh khiết là rất cần thiết. C c phƣơng ph p phân lập chất bằng sắc ký c t

silica hoặc C18 đƣ c sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm h p chất t nhiên ở

Việt Nam o chi phí đầu tƣ thấp và dễ th c hiện. Tuy nhiên, thời gian chạy sắc ký

c t kéo dài và cần lƣ ng l n dung môi hữu cơ sử dụng cho quá trình phân lập chất.

Trong đề tài này, hệ thống sắc ký điều chế đƣ c sử dụng do có nhiều ƣu

điểm trong quá trình phân lập chất nhƣ:

- Phân lập đồng thời nhiều h p chất trên m t lần chạy mẫu trong m t khoảng

thời gian ngắn.

- Dung lƣ ng c t điều chế l n cho phép tiêm thể tích mẫu l n giúp phân lập

đƣ c lƣ ng l n chất tinh khiết trong m t lần chạy mẫu.

- Sử dụng lƣ ng nhỏ dung môi trong quá trình phân tách chất trên c t.

Các thao tác hứng chất phân lập đƣ c th c hiện t đ ng khi thiết bị sắc ký

điều chế đƣ c tích h p v i b phận hứng mẫu t đ ng. Các chất phân lập đƣ c

hứng vào các ống nghiệm sạch và tiến hành nhận danh và kiểm tra đ tinh sạch

bằng thiết bị sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ phân giải cao (HPLC-HRMS).

Đ tinh sạch đƣ c x c định thông qua phần trăm iện tích mũi tr n sắc ký đồ và các

m/z xuất hiện trên phổ khối.

3.2.1 4 iể i h hiế ủ matrine và oxymatrine i h hế

Hình 3.9: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của matrine điều chế.

Hình 3.10: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của oxymatrine điều

chế

Hòa tan 1,0 mg matrine và oxymatrine tinh chế đƣ c bằng MeOH và tiêm

vào hệ thống HPLC-MS/MS để kiểm tra đ tinh khiết sắc ký và tinh khiết MS.

Matrine tinh chế có tinh khiết sắc ký và tinh khiết MS là 100 % theo sắc ký

đồ và phổ MS (Hình 3.9). Oxymatrine tinh chế có tinh khiết sắc ký và tinh khiết MS

là 100 % theo sắc ký đồ và phổ MS (Hình 3.10).

Lƣ ng matrine điều chế đƣ c l 20,6 mg đ tinh khiết 100 % theo sắc ký đồ

và 100 % theo phổ khối HRMS.

Lƣ ng oxymatrine điều chế đƣ c l 3,4 mg đ tinh khiết 100 % theo sắc ký

đồ và 100 % theo phổ khối HRMS.

Trong đề tài này, matrine và oxymatrine là hai chất đ nh ấu sinh học của

cây Khổ sâm đƣ c điều chế bằng hệ thống sắc ký điều chế v đ nh gi mức đ tinh

sạch bằng thiết bị khối phổ phân giải cao. Kết quả đạt đƣ c có a ý nghĩa quan

trọng:

- Khẳng định chất lƣ ng của Khổ sâm di th c đang đƣ c trồng tại Công ty cổ

phần sản xuất chế biến nông lâm sản Dƣ c liệu sạch Đắk Nông, vùng núi Tây

Nguyên - Việt Nam

- Định hƣ ng cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh v c điều chế các hoạt

chất có hoạt tính sinh học khác từ Khổ sâm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu

thêm về loài th c vật này.

- Định hƣ ng cho các nghiên cứu tr n c c đối tƣ ng ƣ c liệu khác tại Việt

Nam, góp phần nâng cao giá trị ƣ c liệu hơn nữa.

3.2.2. Xác định tổng polyphenol và tổng flavonoid trong dƣợc liệu

Polyphenol và flavonoid là m t trong những thành phần quan trọng nhất và

chiếm tỉ lệ l n trong th c vật nói chung. Đây l những chất chống oxi hóa mạnh và

đóng vai tr quan trọng trong nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của th c vật.

3.2.2.1. Định tính thành phần flavonoid trong dược liệu.

Các hoạt chất flavonoid trong rễ Khổ sâm đóng vai tr quan trọng t i các tác

dụng sinh học đƣ c nêu trong (mục 1.1.5). Trong đó 124 h p chất flavonoid đƣ c

phân lập từ cây Khổ sâm v x c định về cấu trúc cũng nhƣ chứng minh các chức

năng sinh học.

Hình 3.11: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao chiết EA

Trong luận án này, tiến h nh định tính flavonoi trong phân đoạn cao chiết

EA của rễ Khổ sâm bằng phƣơng ph p HPLC-HRMS. Các h p chất thu c nhóm

flavonoi đƣ c nhận diện l cơ sở để củng cố hoạt tính kháng oxy hóa cao của phân

đoạn cao chiết EA của rễ Khổ sâm.

C c flavonoi đƣ c phân tách trên c t sắc ký pha đảo C18 v i pha đ ng gồm

có MeOH và H2O chứa 0.1 % formic acid chạy chƣơng tr nh gra ient pha đ ng từ

10 % đến 100 % MeOH trong 20 phút, giữ 100 % MeOH trong 10 phút. Đầu dò

HRMS th c hiện chế đ scan trong khoảng khối từ 100 đến 1000 Dalton.

B ng 3.8: Nhận danh flavonoid trong cao EA bằng HPLC-HRMS

Phƣơng ph p HRMS có đ đúng m/z rất cao đây cũng l cơ sở quan trọng để

nhận danh chính xác chất phân lập. D a trên ion m/z lý thuyết đƣ c tra từ phần

mềm Isotope pattern của hãng máy Bruker, so sánh v i ion m/z th c nghiệm của

matrine v oxymatrine để nhận danh. S sai khác giữa ion m/z th c nghiệm và ion

m/z lý thuyết cần nhỏ hơn 5 ppm v đ đúng m/z đƣ c tính theo công thức sau:

Đ đúng m/z (ppm) = 106 x (Công thức 3.1)

D a theo các quy tắc kiểm tra tr n 18 flavonoi đƣ c nhận danh và xuất hiện trong

cao EA (Bảng 3.8).

3.2.2.2. Định lượng hợp chất polyphenol tổng số (TPC)

Hình 3.12: Tƣơng quan tuyến tính giữa nồng đ gallic acid và đ hấp thu

quang 765 nm.

Các h p chất polyphenol tập h p lại thành m t họ rất l n các h p chất trao

đổi thứ cấp quan trọng ở th c vật. Các h p chất polyphenol đặc trƣng ởi nhóm –

OH gắn tr c tiếp trên nhân benzen trong công thức cấu tạo của chúng. Nhân benzen

hút điện tử làm cho mật đ điện tử trên nhóm –OH giảm, làm cho nhóm chất này có

tính khử. Ngƣời ta ứng dụng tính chất n y để định lƣ ng chúng. H p chất

polyphenol khử phức h p thuốc thử FCR màu vàng thành màu xanh có c c đại hấp

thu ở khoảng 765 nm v h m lƣ ng của h p chất polyphenol tỷ lệ thuận v i cƣờng

đ m u v đ hấp thu.

Để đ nh gi lại thuốc thử FCR và khả năng tạo màu của nó, sau khi cho phản

ứng v i gallic acid chuẩn và quét phổ UV-vis từ 800 – 400 nm thấy có m t c c đại

ở ƣ c sóng 758,4 nm (Phụ lục 9) điều này cho thấy thuốc thử hoàn toàn phù h p

để sử dụng cho phép thử. M t dãy 5 nồng đ gallic acid từ 1,33 – 2,67 – 4,00 – 5,33

và 6,67 µg/mL đƣ c thiết lập để xây d ng m t đƣờng chuẩn. Sau khi cho phản ứng

v i thuốc thử FCR đo đ hấp thu ở ƣ c sóng 765nm và lập phƣơng tr nh tuyến

tính giữa nồng đ gallic acid và đ hấp thu tƣơng ứng. Phƣơng tr nh tuyến tính thu

đƣ c là y = 0,0894x+0,0372 v i nh phƣơng hệ số tƣơng quan tuyến tính là 0,9986

(Hình 3.12).

Các dung dịch chiết, dung dịch các loại cao đƣ c pha loãng đến nồng đ

thích h p rồi cho phản ứng v i thuốc thử FCR trƣ c khi đo đ hấp thu ở ƣ c sóng

765 nm. D a v o phƣơng tr nh đƣờng chuẩn gallic acid chúng ta tính đƣ c hàm

lƣ ng h p chất polyphenol tổng số theo gallic acid của b t nguyên liệu và các loại

cao.

Kết quả (Hình 3.14) cho thấy, trong các loại cao phân lập từ rễ Khổ sâm,

phân đoạn EA có TPC cao hơn cả (35,93 %); trong cao tổng cồn là 27,95 % và

trong nguyên liệu b t rễ Khổ sâm là 10,87 %.

Kết quả của nhóm nghiên cứu Jyh-Ferng Yang và c ng s (2015) [110] trên

rễ Khổ sâm có nguồn gốc ở Cao H ng Đ i Loan có gi trị tƣơng đƣơng. TPC cao tổng cồn (cồn 90o) đạt 28,62 % trên mẫu khô; trong phân đoạn EA là 36,49 % tính

trên cao khô.

3.2.2.3. Định lượng flavonoid tổng số

Hình 3.13: Tƣơng quan tuyến tính giữa nồng đ quercetin và đ hấp thu

quang ở 415 nm.

Nhóm h p chất flavonoid là m t nhóm h p chất thứ cấp vô cùng quan trọng

ở th c vật, và là m t nhóm l n nằm trong nhóm các h p chất polyphenol ở th c vật.

Chúng có khung cấu trúc đặc trƣng l C6-C3-C6. TFC phản ứng v i AlCl3 tạo ra

màu vàng có c c đại hấp thu ở ƣ c sóng khoảng 400 - 450 nm v đó l cơ sở để

chúng ta định lƣ ng chúng.

Quét phổ hấp thu của quercetin sau khi cho phản ứng v i AlCl3 cho thấy có

m t c c đại tại 433,4 nm. Điều này cho thấy phƣơng ph p v thuốc thử là phù h p.

Chúng tôi sử dụng quercetin (chuẩn DĐVN) để d ng đƣờng chuẩn trên dãy 7

nồng đ từ 0,299 – 0,598 – 1,196 – 2,392 – 4,785 – 9,569 và 19,138 µg/mL.

Phƣơng tr nh tƣơng quan tuyến tính giữa nồng đ quercetin v đ hấp thu tƣơng

ứng thu đƣ c là y=0,0605x+0,0297 v i nh phƣơng hệ số tƣơng quan tuyến tính là

0,9989. Mức đ tuyến tính giữa nồng đ quercetin v đ hấp thu tƣơng ứng là cao,

có thể ng để tính toán kết quả trên mẫu thử (Hình 3.13).

Dịch chiết của b t ƣ c liệu và dung dịch cao tổng cồn cao phân đoạn đƣ c

pha loãng đến nồng đ thích h p trƣ c khi phản ứng v i dung dịch AlCl3 10 % để

tạo m u. Đ hấp thu của các dung dịch thử nằm trong khoảng hấp thu của đƣờng

chuẩn quercetin. Từ đó a v o đƣờng chuẩn để tính h m lƣ ng TFC trong mẫu

thử, quy về quercetin (% QE) và kết quả đƣ c trình bày trong (Hình 3.14).

40 % TFC (%QE) TPC (%GAE)

0

CHCl3 EtOH H2O

EA Cao chiết phân đoạn

Hình 3.14: Phân bố TPC và TFC trong các cao phân đoạn từ rễ Khổ sâm

Trong các loại cao rễ Khổ sâm phân đoạn EA chứa h m lƣ ng TFC cao nhất

(8,42 %), l n gấp khoảng 2 lần so v i TFC của cao tổng cồn. Kết quả của nhóm

nghiên cứu Jyh-Ferng Yang và c ng s (2015) trên rễ Khổ sâm có nguồn gốc ở Cao

H ng Đ i Loan có gi trị tƣơng đƣơng [110]. TFC cao tổng cồn (cồn 90º) đạt 1,89

% trên mẫu khô; trong phân đoạn EA là 4,68 % trên cao khô, l n hơn TFC cao tổng

cồn khoảng 2,5 lần. Có thể thấy rằng EA là dung môi thích h p nhất trong các dung

môi khảo sát cho việc tách chiết các nhóm h p chất polyphenol và flavonoid trong

rễ Khổ sâm. Phân tích tƣơng quan giữa h m lƣ ng TPC và TFC trong mẫu b t rễ

Khổ sâm, các cao tổng cồn v cao phân đoạn, chúng ta thấy có mối tƣơng quan

thuận m t cách rất chặt chẽ v i nhau (R = 0,919; Sig. = 0,01).

3.3. Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết rễ Khổ sâm.

Các gốc t o đƣ c xem là m t trong những yếu tố chính liên quan t i hình

thành, phát triển các bệnh và quá trình lão hóa của con ngƣời. Do đó việc tìm kiếm

các chất chống oxy hóa để loại bỏ các gốc t do thu hút s quan tâm của nhiều lĩnh

v c nghiên cứu nhƣ hóa học, sinh học ƣ c học. M t số sản phẩm chống oxy hóa

dạng tổng h p đã đƣ c đề xuất nhằm ngăn ngừa và loại bỏ gốc t o đã đƣ c sử

dụng nhƣng chúng lại có những tác dụng phụ v đ c tính nhất định. Qua đó c c

chất chống oxy t nhiên vẫn l hƣ ng quan tâm chính của các nhà khoa học nhờ

vào hiệu quả và tính an toàn của chúng. Trong đề tài này, hoạt tính kháng oxy hóa

của các cao chiết rễ Khổ sâm đƣ c khảo s t qua 3 phƣơng ph p thử nghiệm FRAP,

DPPH và ABTS.

B ng 3.9: Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết rễ Khổ sâm

Chỉ số IC50 (µg/mL)

Nguyên liệu Chỉ số FRAP (µmol Fe2+/mg DPPH ABTS·+ mẫu khô

EtOH 80 % 1060 ± 13,92 167,10 ± 6,49 0,935 ± 0,45

1300 ± 8,85 163,97 ± 5,67 0,848 ± 0,87 CHCl3

EA 623,88 ± 11,25 84,41 ± 5,01 1,146 ± 0,06

8152,16 ± 18,98 3790,85 ± 14,39 0,155 ± 2,17 H2O

Vitamin C 18,92 ± 0,23 15,95 ± 0,04 13,834 ± 0,03

Quercetin 18,24 ± 1,30 7,54 ± 1,22 24,962 ± 0,11

Năng l c khử ở phân đoạn cao (EA) cao hơn so v i các loại cao chiết rễ Khổ sâm, m i mg cao khô EA có thể khử Fe3+ để sinh ra 1,146 µmol Fe2+, thấp hơn

khoảng 13 lần so v i vitamin C và 20 lần so v i quercetin. Năng l c khử thấp nhất

là ở phân đoạn nƣ c v i FV = 0,155 µmol/mg. Kết quả nghiên cứu của Yang và

đồng tác giả (2015) cũng cho kết quả tƣơng t năng l c khử của phân đoạn cao EA (0,7 abs/10-3 ppm) cao nhất trong các loại cao rễ Khổ sâm và thấp hơn 26 1 lần so v i vitamin C (18,3 abs/10-3 ppm) [110].

Đối v i khả năng ắt gốc t do DPPH và ABTS·+ cũng nhận thấy phân đoạn

cao EA có khả năng ắt gốc DPPH tốt nhất trong các cao chiết rễ Khổ sâm khảo sát

v i IC50 = 623,88 µg/mL, nhỏ hơn so v i vitamin C và quercetin khoảng 35 lần và

l n hơn cao tổng khoảng 1,6 lần.

Ở khả năng ắt gốc t do ABTS·+, kết quả cũng tƣơng t nhƣ khả năng ắt gốc t o DPPH. Phân đoạn cao EA có khả năng ắt gốc t do ABTS+ thấp hơn 5 3

lần so v i vitamin C v cao hơn khoảng 2 lần so v i cao tổng (phân đoạn cao SA có

chỉ số IC50 = 84,41 µg/mL nhỏ nhất so v i các loại cao rễ Khổ sâm đang khảo sát.

Từ những kết quả khảo sát về khả năng kh ng oxy hóa DPPH ABTS+ và

năng l c khử FRAP nhận thấy các cao chiết phân đoạn từ rễ Khổ sâm đều có khả

năng kh ng oxy hóa. Trong đó cao EA v CHCl3 thể hiện hoạt tính mạnh cao nƣ c

thể hiện hoạt tính thấp. Các nghiên cứu về tác dụng kháng oxy hóa của Khổ sâm

đều đề cập t i hoạt tính kháng oxy hóa mạnh của các h p chất liên quan t i

flavonoid trong Khổ sâm. Xiang-Lan Piao và c ng s (2015) sử dụng phƣơng ph p

HPLC ghép khối phổ (MS) đã x c định đƣ c cấu trúc của 2 flavonoi đó l sophoraflavonone và kurarinone, có khả năng ắt gốc t do DPPH• v i chỉ số IC50

tƣơng ứng là 5,26 và 7,73 µg/mL [14]. Trong (Bảng 3.8) định tính thành phần

flavonoid trong cao chiết EA, hai h p chất sophoraflavonone và kurarinone cũng

đƣ c phát hiện. Năm 2021 Jingjing Li và c ng s th c hiện phân lập đƣ c 28 h p

chất flavonoid từ rễ Khổ sâm và th c hiện khả năng kh ng oxy hóa của các h p chất

này [111]. Trong đó 12 h p chất có hoạt tính kháng oxy hóa rất cao, tốc đ ức chế

gốc t do l n hơn 90 % tại nồng đ 20 µg/mL. Kết quả định tính flavonoid trình

bày trong (Bảng 3.8) cũng đã ph t hiện các h p chất trong cao EA trùng v i công

bố của J. Li và c ng s nhƣ: kushenol, kuraridine, kurarinol. Kết quả nghiên cứu

của Yang v đồng tác giả (2015) cũng cho kết quả về khả năng ắt gốc t do DPPH

của các cao chiết rễ Khổ sâm từ cao đến thấp là cao EA > cao tổng > cao nƣ c.

Trong đó hoạt tính của cao EA mạnh hơn 2 7 lần so v i hoạt tính của cao tổng và

yếu hơn 27 5 lần vitamin C.

Phân tích tƣơng quan giữa các cặp biến số IC50 của DPPH v TFC cũng nhƣ IC50 của ABTS+ v TFC ta đều thấy có tƣơng quan nghịch (hệ số Pearson r<0, 95

%, P = 95%) nghĩa l khả năng ắt gốc t do của các cao rễ Khổ sâm đều có tƣơng

quan thuận v i TFC.

3.4. Kết quả ức chế các tế bào ung thƣ của các loại cao chiết rễ cây Khô sâm

3.4.1. Ảnh hưởng cao chiết phân đoạn tới sự tăng sinh của tế bào HepG2 và

Hình 3.15: Ảnh hƣởng của cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) và H2O (D) lên tế bào

BT474.

HepG2

Thử nghiệm trên dòng tế bào HepG2 thấy rằng không có s khác biệt đ ng

kể về giá trị OD. giữa c c nhóm đƣ c xử lý v i 3,125; 6,25 và 12,5 µg/mL các loại

cao chiết phân đoạn từ rễ Khổ sâm. Từ nồng đ 25 µg/mL cao EA giá trị OD có s

giảm và giảm mạnh ở nồng đ 50 µg/mL (0,65 ± 0,01) và 100 µg/mL (0,22 ± 0,01)

tại mức (p < 0,01). Cao CHCl3 có xu hƣ ng tƣơng t v i các giá trị OD ở nồng đ

50 µg/mL là (0,71 ± 0,04) và 100 µg/mL là (0,22 ± 0,002) tại mức (p < 0,05). Trong

khi đó gi trị OD các nhóm xử lý v i cao EtOH và H2O tại các mức nồng đ khác

nhau không có s khác biệt đ ng kể.

S tăng sinh các tế o đ ng vật có vú đƣ c đ nh gi ởi mức đ hoạt đ ng

của các enzyme trong tế bào. S phân chia qu tr nh đƣ c th c hiện bởi các enzyme

n y để chuyển đổi WST-1 thành formazan, làm s thay đổi các giá trị đ hấp thụ

trong môi trƣờng nuôi cấy. Những thay đổi trong enzyme của tế o ẫn đến s

thay đổi của c c gi trị đ hấp thụ. Gi trị OD. trong môi trƣờng nuôi cấy của

HepG2 ị giảm ở cả hai dịch chiết CHCl3 và EA, và có gi trị IC50 lần lƣ t l 45,92

và 47,08 µg/mL, cho thấy khả năng l m giảm s tăng sinh của tế o HepG2 của

c c cao phân đoạn n y ằng c ch ức chế enzyme dehydrogenease.

Hình 3.16: Ảnh hƣởng của cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) và H2O (D) lên tế bào

BT474

Thử nghiệm trên dòng tế bào BT474 thấy rằng không có s khác biệt đ ng kể

về giá trị OD giữa c c nhóm đƣ c xử lý v i 3,125; và 6,25 µg/mL các loại cao chiết

phân đoạn. Từ nồng đ 12,5 µg/mL đến 100 µg/mL cao EA và CHCl3 có giá trị OD

bắt đầu giảm và giảm đều và không giảm mạnh nhƣ khi xử lý trên tế bào HepG2.

Trong khi đó gi trị OD các nhóm xử lý v i cao EtOH và H2O tại các mức nồng đ

khác nhau không có s khác biệt đ ng kể. Mặc dù các cao chiết EA và CHCl3 từ rễ

Khổ sâm chƣa rõ rệt việc ức chế tăng sinh ng tế bào BT474 nhƣng phân đoạn

CHCl3 cho thấy s ức chế dòng tế bào BT474 thông qua gi trị IC50 là 91,74 µg/mL.

Hình 3.17: Ảnh hƣởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên s tăng sinh tế

o ung thƣ BT474. a c : kh c iệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05).

Để có thể đ nh gi kiểm chứng thêm về khả năng ức chế s tăng sinh tế bào

của phân đoạn cao CHCl3 trên tế bào BT474, các mức nồng đ cao chiết 1, 10 và

100 µg/mL cho thấy mật đ tế bào có xu hƣ ng giảm khi nồng đ cao chiết tăng

(Hình 3.17). Giá trị OD ở nhóm tế o đƣ c xử lý cao chiết CHCl3 có mức nồng đ

1 µg/mL là 1,019 ± 0,003. Giá trị này giảm ở nhóm tế o đƣ c xử lý cao chiết ở

nồng đ 10 µg/mL (0,866 ± 0,045). Giá trị này giảm mạnh nhất ở nhóm tế o đƣ c

xử lý cao chiết ở nồng đ 100 µg/mL (0,340 ± 0,005). Trong khi đó nhóm đối

chứng, giá trị OD tăng gấp gấp đối sau 2 ngày nuôi cấy (2,261 ± 0,030).

Qua đây có thể nhận thấy vai trò quan trọng của các h p chất flavonoid

trong cao EA và các h p chất alkaloi (matrine v oxymatrine) trong phân đoạn cao

CHCl3. Trong nghiên cứu của mình, Jingjing Li và c ng s (2021) [111] đã th c

hiện thử nghiệm cao chiết EA tại mức nồng đ 25 µg/mL t i s tăng sinh tế bào

HepG2 và có giá trị IC50 là 0,6 µM. Trong số 28 h p chất nhóm tác giả phân lập

đƣ c từ rễ Khổ sâm, các nhóm h p chất kurarinol và kushenol có khả năng ức chế

tăng sinh cao nhất điển hình là kushenol A có giá trị IC 50 là 6,85 µM trên tế bào

HepG2. Năm 2010, Xue-Gong Qin và c ng s đã đ nh gi t c đ ng của matrine t i

s tăng sinh của tế bào HepG2 [112]. Tế o HepG2 đƣ c xử lý v i các mức nồng

đ matrine trong thời gian 24 giờ. Kết quả ghi nhận đƣ c mức nồng đ matrine

ƣ i 0,2 mg/mL có t c đ ng ức chế âm. Mức nồng đ matrine từ 0,3 mg/mL bắt

đầu ghi nhận đƣ c t c đ ng ức chế ƣơng tr n tế o HepG2. Điều này cho thấy kết

quả th c nghiệm thử nghiệm ức chế s tăng sinh tế bào HepG2 và BT474 sau khi

cảm ứng v i các mức nồng đ các cao chiết phân đoạn. Khi tăng dần nồng đ cao

CHCl3 (chứa matrine) dẫn đến tăng hiệu quả ức chế tăng sinh tr n c c ng tế bào

HepG2 và BT474.

3.4.2. Ảnh hưởng của cao CHCl3 lên mật độ tế bào, hình thái tế bào và nhân

Tế bào HepG2:

Hình 3.18: S thay đổi hình thái tế bào HepG2 xử lý v i các mức nồng đ cao chiết

CHCl3 từ rễ Khổ sâm: 3,125 µg/mL (A), 6,25 µg/mL (B), 12,5 µg/mL (C), 25

µg/mL (D), 50 µg/mL (E) và 100 µg/mL (F) đ phóng đại x 100.

Hình 3.18 l h nh ảnh hình thái học tế bào HepG2 xử lý v i các mức nồng đ

khác nhau của cao chiết rễ Khổ sâm v đƣ c quan s t ƣ i kính hiển vi ánh sáng.

Xử lý tế bào HepG2 v i các mức 3,125 µg/mL, 6,25 µg/mL và 12,5 µg/mL nồng đ

cao chiết rễ Khổ sâm không dẫn đến thay đổi hình thái tế bào (Hình 3.18 A, B, C).

Mức 25 µg/mL gây ra s thay đổi hình thái trong tế bào HepG2 (Hình 3.18 D). Mức

50 µg/mL và 100 µg/mL nồng đ cao chiết gây ra những thay đổi hình thái rõ rệt

trong tế o HepG2 đƣ c chứng minh bằng s co lại của tế bào (Hình 3.18 E, F).

Hình 3.19: Đƣờng tuyến tính giữa mật đ tế bào/ giếng v i giá trị OD tƣơng ứng

đƣ c đo tại ƣ c sóng 450 nm.

Hình 3.20: Mật đ tế bào HepG2/giếng khi xử lý v i các mức nồng đ khác

nhau của cao chiết CHCl3

Mật đ tế bào HepG2/ giếng sau khi xử lý v i các nồng đ cao chiết CHCl3

bằng thử nghiệm WST-1 và th c hiện đo gi trị OD trên máy GloMax® Explorer

Multimode Microplate Reader tại ƣ c sóng 450 nm. Xây d ng đƣờng tuyến tính giữa các mức mật đ tế bào 5 × 102 , 1 × 103, 5 ×103, 1 × 104, 5 × 104 (đo lặp 3 lần)

v i giá trị OD đƣ c đo tại ƣ c sóng 450 nm. Phƣơng tr nh đƣờng chuẩn ghi nhận đƣ c từ (Hình 3.19) là y = 15589x – 2456,4 và hệ số tƣơng quan R2 là 0.9924. Các

nồng đ khác nhau cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm đƣ c thử nghiệm trên dòng tế

bào HepG2 và ghi nhận giá trị OD m i mẫu thử (lặp lại 3 lần) và tính toán mật đ tế

bào/ giếng d a tr n phƣơng tr nh đƣờng chuẩn. Mẫu đối chứng đƣ c th c hiện trên

tế bào HepG2 không xử lý qua cao chiết CHCl3 (Hình 3.20).

Kết quả cho thấy mật đ tế bào HepG2/ giếng xử lý v i cao chiết CHCl3 từ

mức nồng đ 3 125 đến 12,5 µg/mL không có s thay đổi so v i kết quả mẫu đối

chứng. Mật đ tế bào/ giếng xử lý v i cao chiết CHCl3 từ mức nồng đ 12 5 đến

100 µg/mL giảm mạnh so v i kết quả mẫu đối chứng.

Hình 3.21: Tỉ lệ quẩn thể tế bào HepG2 xử lý v i các mức nồng đ cao chiết CHCl3.

(A) Q1: quần thể tế bào necrosis, Q2: quần thể tế o nh thƣờng, Q3: quần thể tế

bào apoptosis s m, Q4: quần thể tế bào apoptosis mu n và (B) *** khác biệt có ý

nghĩa thống k (P ≤ 0,001), ** khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01).

Mật đ tế bào của HepG2 đƣ c xử lý v i các nồng đ khác nhau của cao

chiết CHCl3 đƣ c thể hiện trên các (Hình 3.21 A v B). Trong đó mật đ phần trăm

tế bào HepG2 từ kết quả đối chứng có giá trị 2,08 ± 0,31 %, và kết quả này thấp hơn

so v i khi xử lý tế bào v i các nồng đ của cao chiết CHCl3. Tại mức xử lý tế bào

v i nồng đ cao CHCl3 6,25 µg/mL, mật đ tế bào HepG2 có giá trị 4,6 ± 1,2 %.

Mật đ phần trăm tế bào HepG2 xử lý v i cao chiết CHCl3 từ mức nồng đ 25 và

50 µg/mL tăng mạnh so v i mẫu đối chứng v i các giá trị lần lƣ t là 29,7 ± 2,1 %

và 36,1 ± 5,7 %.

Tế bào BT474

Hình 3.22: Ảnh hƣởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên hình thái nhân. A (0

mg/L) , B (1 µg/mL), C (10 µg/mL), D (100 µg/mL); Thang đo: 30 µm. (mũi t n

chỉ s phân mảnh của nhân)

Hình 3.22 mô tả đặc điểm hình thái nhân tế o ƣ i ảnh hƣởng của cao

chiết ở các nồng đ kh c nhau. Trong nhóm đối chứng, tế bào BT474 có nhân tròn

đều, không phân mảnh, không có s cô đặc nhiễm sắc chất, nhân con hiện diện

trong nhân tế bào (Hình 3.22 A). Ở nhóm xử lý cao chiết v i nồng đ 1 µg/mL,

nhân tế bào vẫn nguyên vẹn, không phân mảnh, nhân con vẫn hiện diện trong nhân,

tuy nhiên nhiễm sắc chất bắt đầu cô đặc mạnh (Hình 3.22 B). Ở nhóm xử lý cao

chiết v i nồng đ 10 µg/mL, nhân con vẫn hiện diện trong nhân, nhân tế bào bắt

đầu phân mảnh (Hình 3.22C). S phân mảnh nhân biểu hiện rõ trong tế o đƣ c xử

lý v i nồng đ cao chiết 100 µg/mL, nhiễm sắc chất cô đặc mạnh, nhân con không

còn hiện diện trong nhân tế bào (Hình 3.22 D).

Hình 3.23: Ảnh hƣởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên hình dạng tròn nhân

(Nuclear round shape). a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05).

Ngoài ra, m t trong những yếu tố quan trọng trong đ nh gi đặc điểm hình

thái nhân là mức đ tròn của nhân. Kết quả đ nh gi ằng chƣơng tr nh Cell Cycle

của hệ thống kính hiển vi huỳnh quang Cytel cho thấy mức đ tròn của nhân tế bào

BT474 có xu hƣ ng giảm dần khi nồng đ xử lý cao chiết rễ Khổ sâm tăng (H nh

3.23). Giá trị hình dạng tròn của nhân ở nhóm đƣ c xử lý v i cao chiết rễ Khổ sâm

v i nồng đ 1 µg/mL là 0,857 ± 0,005. Giá trị này giảm dần ở các nhóm tế bào

đƣ c xử lý v i nồng đ 10 µg/mL (0,841 ± 0,003), và 100 µg/mL (0,834 ± 0,008),

tuy nhiên không có s khác biệt về mặt thống kê giữa nhóm tế o đƣ c xử lý cao

chiết v i nồng đ 10 µg/mL, và 100 µg/mL. Ở nhóm đối chứng, nhân tế bào có giá

trị hình dạng tròn cao nhất (0,875 ± 0,004).

Năm 2010 Jun-Qiang Zhang và c ng s [113] đ nh gi ảnh hƣởng của

matrine lên hình thái nhân tế bào HepG2. Tế o HepG2 đƣ c xử lý v i matrine tại

mức nồng đ 1 mg/mL quan sát thấy xuất hiện không o trong o tƣơng

(cytoplasmic vacuoles) ƣ i kính hiển vi tƣơng phản pha đảo. Kết quả nghi n cứu

của Jun-Qiang Zhang và c ng s chứng minh rằng cả quá trình t th c bào

(autophagy) v apoptosis đều đƣ c kích hoạt khi tế o HepG2 xử lý ằng matrine.

Qua đây cho thấy mối li n quan giữa h m lƣ ng matrine trong cao chiết CHCl3 có

c c t c đ ng t i h nh th i nhân v h nh th i tế o.

Do đó các nghiên cứu tiếp theo của luận n đƣ c tiến hành trên cao chiết

CHCl3 để có thể thấy đƣ c t c đ ng sinh học chuy n sâu hơn của phân đoạn cao

chiết này.

3.4.3. Ảnh hưởng của cao CHCl3 lên chu kì tế bào

Từ các kết quả th c nghiệm t c đ ng của cao phân đoạn lên s tăng sinh tế

o cũng nhƣ s kiểm chứng t c đ ng của cao chiết lên hình thái tế bào và hình

thái nhân cho thấy phân đoạn cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm có t c đ ng rõ rệt nhất

so v i cao phân đoạn khác trên hai dòng tế bào HepG2 và BT474.

Tế Bào HepG2

Hình 3.24: Tỉ lệ tế bào trong pha G0/G1 và G2/M khi đƣ c xử lý v i cao chiết

CHCl3 từ rễ Khổ sâm ở các nồng đ khác nhau

Sau 48 giờ xử lý v i dịch chiết Khổ sâm, tế bào HepG2 ở pha G0/G1 có xu

hƣ ng giảm, trái lại ở pha G2/M có xu hƣ ng gia tăng rõ rệt. Ở pha G0/G1 tỉ lệ tế

bào HepG2 ở nhóm đối chứng cao hơn 1 15 lần so v i tỉ lệ tế bào HepG2 ở nồng đ

10 µg/mL nhƣng tỉ lệ này không có s khác biệt về mặt thống kê ở pha G2/M ở

cùng nồng đ . Trong khi tỉ lệ tế bào ở nồng đ 100 µg/mL giảm khoảng 1,17 lần so

v i lƣ ng tế bào ở nồng đ 10 µg/mL. Ở pha G2/M khi tế o đƣ c bổ sung dịch

chiết ở nồng đ 100 µg/mL tỉ lệ tế bào ở pha n y tăng l 1 65 so v i nồng đ 10

µg/mL.

Kết quả thử nghiệm chu kỳ tế bào trên HepG2 hoàn toàn phù h p v i kết quả

th c hiện bởi Jun-Qiang Zhang và c ng s [11] khi đ nh gi ƣ i t c đ ng của

matrine cho thấy matrine bắt giữ rõ rệt các tế bào HepG2 trong Pha G0/G1 của chu

kỳ tế o . Qua đó cho thấy rằng s chậm ph t triển của tiến triển chu kỳ tế o có

thể l m t trong những cơ chế tạo n n t c ụng chống tăng sinh của matrine.

Tế bào BT474

Hình 3.25: Tỉ lệ tế bào trong pha G0/G1 và G2/M khi đƣ c xử lý v i cao chiết

CHCl3 từ rễ Khổ sâm ở các nồng đ khác nhau. a, b, c, d: khác biệt có ý nghĩa thống

k (P ≤ 0,05).

Kết quả phân tích chu kì tế bào cho thấy, tỉ lệ tế o phase G0/G1 tăng khi

nồng đ xử lý cao chiết tăng (H nh 3.25). Tỉ lệ tế bào pha ở G0/G1 ở nhóm đối

chứng là 66.62 ± 2,25 %. Tỉ lệ n y gia tăng khi tế o đƣ c xử lý v i cao chiết ở

nồng đ 1 µg/mL (75,82 ± 2,31 %) và 10 µg/mL (7,73 ± 2,10 %), tuy nhiên không

có s khác biệt về mặt thống kê giữa hai nhóm này. Nhóm tế o đƣ c xử lý v i

nồng đ cao chiết 100 µg/mL có tỉ lệ pha G0/G1 cao nhất (90,73 ± 1,89 %).

Ngƣ c lại pha S/M có xu hƣ ng giảm. Tỉ lệ tế bào pha S/M ở nhóm đối

chứng là 24,7 ± 1,72 %. Tỉ lệ này giảm ở nhóm xử lý cao chiết v i nồng đ nồng đ

1 µg/mL (19,82 ± 2,55 %) và 10 µg/mL (17,94 ± 1,96 %), tuy nhiên không có s

khác biệt về mặt thống kê giữa hai nhóm này. Nhóm tế o đƣ c xử lý v i nồng đ

cao chiết 100 µg/mL có tỉ lệ pha S/M thấp nhất (5,74 ± 1,56 %).

3.4.4. Ảnh hưởng của cao CHCl3 lên quá trình Apoptosis

3.4.4.1. Ả h h ở g hiên mã các gene liên quan Apoptosis

Trong nghiên cứu này, s thay đổi biểu hiện gene liên quan t i quá trình

apoptosis đƣ c đ nh gi ở tế o HepG2 đƣ c cảm ứng bởi cao chiết CHCl3.

Hình 3.26: S biểu hiện mRNA gene p53, Bcl-2, Caspase 9, Caspase 3 và Bax của

tế bào HepG2 thông qua phản ứng Realtime-PCR sau 24h và 48h cảm ứng bằng

CHCl3 v nhóm đối chứng

Kết quả phân tích cho thấy s biểu hiện của gene p53 của tế bào HepG2

đƣ c cảm ứng bởi cao chiết CHCl3 sau 24h v 48h đều thấp hơn so v i nhóm đối

chứng (P<0,05). Tuy nhiên s biểu hiện p53 mức phiên mã sau 24h và 48h không

có s khác biệt về mặt thống k . Điều đó cho thấy cao chiết CHCl3 có khả năng cảm

ứng s giảm biểu hiện của mRNA gene p53 mức phiên mã.

S biểu hiện của họ Bcl-2 cũng đƣơc đ nh gi trong tế o HepG2 khi đƣ c

cảm ứng cao chiết CHCl3. Kết quả phân tích realtime RT- PCR cho thấy s biểu

hiện gene Bax mức phi n mã sau 24h tăng mạnh ở tế o HepG2 đƣ c cảm ứng bởi

cao chiết CHCl3 (P < 0,001). Sau 48h, s biểu hiện gene Bax mức phi n mã cũng

tiếp tục tăng mạnh ở tế o HepG2 đƣ c cảm ứng bởi cao chiết CHCl3 (P<0,001).

Điều này chứng tỏ cao chiết CHCl3 cảm ứng s tăng iểu hiện gene Bax trong tế

bào HepG2.

M t gene khác của họ Bcl-2 là gene Bcl-2 cũng đƣ c đ nh gi s biểu hiện

trong tế bào HepG2. Kết quả phân tích cho thấy gene Bcl-2 đều tăng iểu hiện ở tế

bào HepG2 sau 24h và 48h cảm ứng v i cao chiết CHCl3 (P<0,05). Tuy nhiên s

biểu hiện gene Bcl-2 mức phiên mã sau 24h và 48h không có s khác biệt về mặt

thống kê. Kết quả này cho thấy cao chiết CHCl3 kích thích tế o HepG2 tăng iểu

hiện Bcl-2 mức phiên mã. Bax là m t protein tƣơng đồng v i Bcl-2 trong họ Bcl-2,

ở dạng đồng thể (Bax/Bax) hoặc dị thể (Bcl-2/Bax) có vai trò quan trọng trong s

kiểm soát chết theo chƣơng tr nh qua trung gian ty thể. Trong nghiên cứu của

Nakamura và c ng s năm 2003 đã chứng minh rằng, tỉ lệ của Bax so v i Bcl-2 ảnh

hƣởng t i tỉ lệ chết của tế bào [114]. Ở tế o ung thƣ Bcl-2 có t c đ ng làm giảm

biểu hiện của enzyme thủy giải v ngăn qu tr nh cô đặc nhiễm sắc chất cũng nhƣ

s phân mảnh nhân trong quá trình apoptosis. Gene Bax hoạt đ ng mạnh hơn trong

quá trình tế bào chết theo chƣơng tr nh so v i tế o nh thƣờng. Chức năng sinh

học chủ yếu nằm trong chất đối kháng của Bcl-2 dẫn đến tạo thành polymer kép.

Khi tăng ần nồng đ cao chiết và thời gian phản ứng ƣ i t c đ ng của matrine,

quá trình apoptosis của HepG2 ghép v i qu tr nh điều chỉnh tăng (up-regulation)

của gene Bax.

Hai gene thu c họ Caspase là Caspase 3và Caspase 9 cũng đƣ c đ nh gi

trong tế bào HepG2. Kết quả phân tích realtime RT- PCR cho thấy s biểu hiện

gene Caspase 3và Caspase 9 mức phi n mã đều tăng sau 24h cảm ứng cao chiết

trên tế bào HepG2 (P<0,05). Qu tr nh tăng iểu hiện của Caspase 3và Caspase 9

mức phiên mã tiếp tục đƣ c nhận thấy ở tế o HepG2 đƣ c cảm ứng cao chiết

CHCl3 sau 48h. Kết quả trên cho thấy cao chiết CHCl3 có khả năng cảm ứng s tăng

biểu hiện gene Caspase 3và Caspase 9 mức phiên mã.

3.4.4.2. Tỷ ế h h g h gi Flow Cytometry

Hình 3.27: Tỉ lệ tế o nh thƣờng ƣ i s cảm ứng của dịch chiết sau (B) 24h, (C)

48h và (D) 72h so v i (A) nhóm đối chứng (*p<0,05). (Q1: quần thể tế bào

necrosis, Q2: quần thể tế o nh thƣờng, Q3: quần thể tế bào apoptosis s m, Q4:

quần thể tế bào apoptosis mu n)

Từ biểu đồ, ta thấy tỉ lệ tế o nh thƣờng ở c c nhóm đối chứng, 24h, 48h

và 72h đều có s khác biệt đ ng kể. Tỉ lệ này giảm dần theo thứ t từ nhóm đối

chứng đến 24h, 48h và 72h lần lƣ t là 95,75 ± 0,06; 81,42 ± 0,15; 69,09 ± 0,49;

60,71 ± 0,79.

3.4.4.3. A i ớ A i

Hình 3.28: Tỉ lệ tế bào apoptosis s m và apoptosis mu n ƣ i s cảm ứng của dịch

chiết sau 24h, 48h và 72h so v i nhóm đối chứng (*p<0,05)

Từ biểu đồ, ta thấy tỉ lệ tế bào apoptosis s m và apoptosis mu n ở nhóm đối

chứng không có s khác biệt đ ng kể (0,73 ± 0,07 và 0 48 ± 0 08). Đối v i nhóm

24h, tỉ lệ tế bào apoptosis s m l 13 8 ± 0 23 cao hơn khoảng 7,2 lần so v i tỉ lệ tế

bào apoptosis mu n 1 92 ± 0 08. Đối v i nhóm 48h, tỉ lệ tế bào apoptosis s m là

24 97 ± 7 58 cao hơn khoảng 9,4 lần so v i tỉ lệ tế bào apoptosis mu n 2,65 ± 0,09.

Đối v i nhóm 72h, tỉ lệ tế bào apoptosis s m l 32 9 ± 0 82 cao hơn khoảng 9,2 lần

so v i tỉ lệ tế bào apoptosis mu n 3,56 ± 0,09.

3.4.4.4. Ả h h ở g ị h ge e i i

 CASPASE 3 VÀ CASPASE 9

Quan sát kết quả ở (Hình 3.29) cho thấy, các vạch protein caspase 3 và

caspase 9 ở giai đoạn 0h đều rất mờ. Ở giai đoạn 24h và 48h, các vạch protein

caspase 3 đều đậm hơn so v i caspase 9. Sau khi chuyển đổi đ đậm của các vạch

protein caspase 3 và caspase 9 bằng phần mềm chuyên dụng, tiến hành tính giá trị

trung bình c ng và vẽ đƣ c h nh nhƣ (Hình 3.30).

Hình 3.29: Kết quả Western Blot đ nh gi mức đ biểu hiện protein caspase 3 và

caspase 9

Hình 3.30: So sánh s biểu hiện protein caspase 3 và caspase 9 ở c c giai đoạn khác

nhau (p < 0,05)

Kết quả (Hình 3.30) cho thấy, mức đ biểu hiện protein caspase 3 ở giai đoạn

0h là 24436,66 ± 498,21 l n hơn so v i protein caspase 9 là 22277,87 ± 957,72

nhƣng s khác biệt n y không có ý nghĩa về mặt thống kê. Mức đ biểu hiện của

caspase 3 ở giai đoạn 48h l 70220 21 ± 600 55 cao hơn so v i caspase 9 là

67666 52 ± 117 90 nhƣng s khác biệt n y cũng không có ý nghĩa thống kê. Mức

đ biểu hiện của caspase 3 ở 24h là 63941,44 ± 260,98 thấp hơn so v i caspase 9 là

65722,76 ± 414,87 (p < 0,05).

Họ Caspase cũng đóng vai tr quan trọng trong tiến trình apoptosis. Caspase-

3 đƣ c xem nhƣ l nhân tố quan trọng nhất trong nhóm caspase chức năng v đƣ c

hoạt hóa bởi c c caspase trung gian kh c nhƣ caspase-8, caspase-9, và caspase-10.

Ở đ ng vật có vú, caspase-8 là yếu tố khởi xƣ ng giúp hoạt hóa các caspase chức

năng ao gồm thông qua s ly giải có chọn lọc. Caspase-8 bao gồm các domain gây

chết, có thể tƣơng t c v i các domain gây chết có các phân tử trung gian có tính đặc

hiệu v i tín hiệu n i bào và ngoại bào. Sau khi hoạt hóa, caspase-3 có khả năng hoạt

hóa đặc hiệu v i enzyme cắt gi i hạn ICAD ở trạng thái bất hoạt thành trạng thái

hoạt đ ng CAD. Tiếp theo, enzyme CAD phân giải DNA trong nhân và hình thành

những khối cô đặc. Hơn nữa, caspase-3 và caspase-9 đƣ c điều hòa bời protein

APAF-1. Protein này có m t vùng domain có terminal N cho gắn caspase. Khi các

protein APAF-1 đƣ c dimer hóa khi có s hiện diện của dATP và cytochrome C

đƣ c giải phóng từ ty thể, APAF-1 sẽ có thể mang 2 phân tử caspase 9, bằng cách

này có thể hoạt hóa caspase khởi xƣ ng. S hoạt hóa caspase 9 sẽ dẫn đến cảm ứng

s ly giải các protein mục tiêu.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy rằng s biểu hiện mức phiên mã

gene Caspase 3và Caspase 9 gia tăng mạnh. Qu tr nh gia tăng n y cũng đƣ c thể

hiện trong quá trình biểu hiện mức dịch mã của các protein này. Kết quả này chứng

tỏ cao chiết cây rễ Khổ sâm có khả năng cảm ứng s gia tăng iểu hiện của Caspase

9, s gia tăng tăng sẽ kích hoạt s biểu hiện caspase 3 dẫn đến s chết theo chƣơng

trình. S kích hoạt các protein Bax hay Caspase 3 v caspase 9 l m đã ảnh hƣởng

t i sức sống cũng nhƣ s chết theo chƣơng tr nh của tế bào HepG2. S gia tăng iểu

hiện các protein trên dẫn đến làm giảm tỉ lệ tế bào sống. Ngƣ c lại tỉ lệ tế bào trải

qua qu tr nh apoptosis gia tăng khi đƣ c cảm ứng cao chiết trong đó s chết theo

chƣơng trình s m diễn ra rất mạnh và mạnh hơn so v i s chết theo chƣơng tr nh

mu n.

 BAX VÀ BCL-2

Hình 3.31: Kết quả Western Blot đ nh gi mức đ biểu hiện protein Bax và Bcl-2

Quan sát kết quả ở (Hình 3.31) cho thấy, vạch protein Bax ở giai đoạn 0h rất

mờ nhƣng vạch protein Bcl-2 ở c ng giai đoạn rất đậm. Ở giai đoạn 24h, vạch

protein Bax lại đậm hơn so v i protein Bcl-2. Ở giai đoạn 48h, vạch protein Bcl-2

Hình 3.32: So sánh s biểu hiện protein Bax và Bcl-2 ở c c giai đoạn khác nhau

rất mờ còn vạch protein Bax lại rất đậm ở giai đoạn này.

(p<0.05)

Sau khi chuyển đổi đ đậm của các vạch protein Bax và Bcl-2 bằng phần

mềm chuyên dụng, tiến hành tính giá trị trung bình c ng và vẽ đƣ c hình nhƣ (Hình

3.32). Ở giai đoạn 0h, mức đ biểu hiện của protein Bax là 19642,42 ± 61,03 thấp

hơn nhiều so v i s biểu hiện của protein Bcl-2 ở giai đoạn này là 63828,64 ± 48,30

(p < 0 05). Sang giai đoạn 24h, ta thấy s biểu hiện của Bax là 60670,28 ± 696,88

cao hơn không đ ng kể so v i Bcl-2 là 62148,03 ± 383,08. Ở giai đoạn 48h, s biểu

hiện của Bax là 70704,58 ± 446,84 cao hơn nhiều so v i s biểu hiện của Bcl-2 là

24816,12 ± 67,91.

Kết quả Western Blot cho thấy rằng s biểu hiện của Bax gia tăng mạnh ở cả

mức phiên mã và dịch mã. Quá trình biểu hiện ở mức dịch mã gene Bcl-2 cũng

tăng tuy nhi n qu tr nh iểu hiện mức dịch mã protein Bcl-2 lại có xu hƣ ng giảm.

Điều đó cho thấy cao chiết cây rễ Khổ sâm có ảnh hƣởng lên quá trình dịch mã gene

Bcl-2 làm giảm s biểu hiện của gene này. Bên cạnh đó cao chiết rễ Khổ sâm cảm

ứng s gia tăng iểu hiện Bax dẫn đến gia tăng s chiết theo chƣơng tr nh tế bào

HepG2. Họ Bcl-2 đóng vai tr quan trọng trong s kiểm soát s chết theo chƣơng

trình qua trung gian ty thể [115,116]. Gene Bcl-2 đƣ c phát hiện ở vị trí 14 và 18

trong s chuyển vị nhiễm sắc thể của tế bào B. Nhóm gene này là m t trong những

gene gây ung thƣ đƣ c phát hiện đầu tiên, khi mà gene Bcl-2 biểu hiện ở mức cao

thì quá trình apoptosis xảy ra mạnh mẽ hơn so v i quá trình s tăng sinh của tế bào.

Protein Bcl-2 góp phần giảm biểu hiện chu i enzyme thủy giải và ngăn chặn

s cô đặc nhiễm sắc chất cũng nhƣ s phân mảnh nhân, hạn chế s ly giải enzyme

poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) do vậy tế o ung thƣ có thể tồn tại.. Trong

quá trình hoạt đ ng, gene Bcl-2 bị ức chế thì gene Bax đƣ c tăng khả năng iểu

hiện, dẫn đến domain xuyên màng của protein n y đƣ c l ra và di chuyển từ tế bào

chất đến màng ty thể [28][86]. Khi đó điện thế màng của ty thể giảm dẫn đến s

phóng thích cytochrome c đây l ƣ c quan trọng để hoạt hóa chu i truyền tín hiệu

của s chết theo chƣơng trình của tế bào.

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Luận n đã mô tả đặc điểm rễ và b t ƣ c liệu rễ Khổ sâm, vi phẫu học: cắt

l p và làm tiêu bản vi phẫu, soi b t thân rễ và rễ, mô tả và chụp ảnh, sắc ký l p

mỏng định tính các chất đ nh ấu sinh học matrine, oxymatrine. Các kết quả về đ

ẩm h m lƣ ng tro toàn phần v h m lƣ ng chất chiết đƣ c của b t ƣ c liệu rễ

Khổ sâm di th c trồng tại Tây Nguyên – Việt Nam phù h p v i chuyên luận về rễ

Khổ sâm trong DĐTQ. Nghiên cứu chuy n sâu hơn x c định tr nh t gene mẫu th c

vật ằng phƣơng ph p Sanger có nhận diện chính xác mẫu ƣ c liệu dùng trong

nghiên cứu này là Khổ sâm có mã lƣu trong ngân h ng gene l AB127037.1 v i đ

bao phủ trình t DNA là 93 % so v i kết quả đƣ c so s nh tr n thƣ viện BLAST.

Đã tách chiết đƣ c thành phần hoạt chất chính có hoạt tính sinh học là

alkaloid (matrine 20,6 mg, oxymatrine 3,4 mg từ 1 gam cao phân đoạn CHCl3)

trong rễ Khổ sâm di th c v x c định h m lƣ ng matrine và oxymatrine cao nhất

trong phân đoạn cao CHCl3. Nhận anh đƣ c 18 h p chất flavonoid bằng phƣơng

pháp HPLC-HRMS và tổng flavonoid cao nhất trong phân đoạn cao EA (8,42 %).

Kết quả đ nh gi hoạt tính kháng oxy hóa bằng DPPH, ABTS và FRAP trên

phân đoạn cao EA có hoạt tính kh ng oxy hóa cao hơn c c cao phân đoạn khác, v i

các giá trị IC50 tƣơng ứng đạt 623,88 ± 11,25 µg/mL và 84,41 ± 5,01 µg/mL, chỉ số FRAP là 1,146 ± 0,06 µmol Fe2+.

Cao CHCl3 có khả năng ức chế s tăng sinh của các dòng tế bào HepG2 và

BT474 cũng nhƣ ảnh hƣởng lên hình thái nhân tế bào. S ức chế tăng sinh n y iễn

ra do quá trình cảm ứng s chết theo chƣơng tr nh của tế o HepG2 khi đƣ c cảm

ứng bởi cao chiết, thể hiện qua việc tăng iểu hiện c c gene li n quan đến s chết

theo chƣơng tr nh nhƣ Bax, Bcl-2, Caspase 3 và Caspase 9. Nghiên cứu này là

nghiên cứu chuy n sâu đầu tiên khi thử nghiệm ảnh hƣởng của cao phân đoạn trên

các tế bào HepG2 và BT474 trên Khổ sâm di th c.

2. Kiến nghị

- Tiếp tục nghiên cứu các hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính kháng viêm của

các hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm

- Nghiên cứu hoạt tính kh ng ung thƣ trên m t số dòng tế bào khác và trên

mô hình in vivo.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Luận án là công trình khoa học nghiên cứu chuy n sâu đầy đủ nhất từ trƣ c

t i nay tr n đối tƣ ng th c vật Khổ sâm di th c đang đƣ c trồng tại Tây

Nguyên, góp phần đ nh gi đƣ c ƣ c liệu Khổ sâm trồng ở Việt Nam đồng

thời làm phong phú v chủ đ ng nguồn ƣ c liệu cho đất nƣ c.

2. Lần đầu ti n đ nh gi đƣ c ảnh hƣởng của cao chiết rễ Khổ sâm đến mức đ

biểu hiện c c gene đặc trƣng cho s chết theo chƣơng tr nh của tế bào HepG2

và BT474. Đây l cơ sở khoa học ứng dụng nghiên cứu sản xuất ƣ c và th c

phẩm bảo vệ sức khoẻ h tr phòng chống ung thƣ cho ngƣời Việt Nam.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

1. Cao Ngọc Minh Trang, Nguyễn Huy Vỹ Ho ng Nghĩa Sơn Ngô Đại

Nghiệp, Nghiên c u ho t tính kháng oxy hóa của cao chiết từ rễ cây Khổ sâm

(Sophora flavescens Ait.) trồng t i Tây Nguyên – Vi t Nam. Tạp chí Công nghệ

Sinh học, 2017, 15(3A), trang 239-243.

2. Cao Ngoc Minh Trang, Le Thanh Long, Ngo Dai Nghiep, Hoang Nghia

Son, Effect of different Sophora flavescens extracts on proliferation of HepG2 and

BT474 cell lines. International Journal of Current Medical and Pharmaceutical

Research, 2019, ISSN: 2395-6429,Volume 5; Issue 06(A); June 2019; Page No.

4301- 4303

3. Cao Ngoc Minh Trang, Ho Nguyen Quynh Chi, Nguyen Khac Manh,

Hoang Nghia Son, Dai Nghiep - Ngo, Le Thanh Long, The chloroform extracts of

Vietnamese Sophora flavescens Ait. inhibit the proliferation of HepG2 cells through

https://doi.org/10.3390/app12125906

apoptosis induction. Applied Sciences, 2022, Volume 12; Issue 12;

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. The Plant List. Panax. 2010 [cited 2018 24-Sept]; Available from:

http://www.theplantlist.org.

2. Takhtajan A, Flowering Plants, Springer Science & Business Media B.V, Russia,

2009, 352.

3. Võ Văn Chi Từ iển cây thu c Vi t Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà N i, 1997,

622.

4. Đ Huy Bích, Cây thu ng v t làm thu c ở Vi t Nam-T p 1, Nhà xuất bản

khoa học và kỹ thuật, Hà N i, 2004, 89-93.

5. Chinese Pharmacopoeia Commission, The Ph ei f he Pe e’

Republic of China,. Part I. China Medical Science Press, Beijing, China, 2015,

202.

6. H. Xirui, F. Jiacheng, H. Linhong, W. Jinhui, H. Xiaoqiang, Sophora flavescens

Ait.: Traditional usage, phytochemistry and pharmacology of an important

i i hi e e e i i e” Journal of Ethnopharmacology, 2015, 172, 10–

29.

7. T.H. Quang, N.X. Nhiem, H.L. Tuan Anh, B.H. Tai, C.V. Minh, Y.H. Kim, P.V.

Kiem, Flavonoids from the roots of Sophora flavescens. Vietnam Journal of

Chemistry, 2015, 53(2e), 77–81.

8. Phan Nguyễn Trƣờng Thắng, Nguyễn Huỳnh Tâm, Trần Anh Vũ Nguyễn Ngọc

Vinh, Nghiên c u xây dụ g h ơ g h i u chế ịnh chuẩn giàu

alkaloid từ khổ sâm bắc (Sophora flavescens Ait.), Tạp chí Y Dƣ c, 2021, 13,

74-79.

9. D.V. Sandanov, N.A. Pankrushina, Alcaloid content in various parts of Sophora

flavescens, Chem. Nat. Compd, 2011, 47(4), 669-670.

10. S.Y. Zhang, W. Li, H. Nie, M. Liao, B. Qiu, Y.L. Yang, Y. F. Chen, Five new

alkaloids from the roots of Sophora flavescens, Chemistry & biodiversity, 2018,

15 (3).

11. Xiu-Jin Liu, Mei-Ai Cao, Wen-Hai Li, Cheng-Shuo Shen, Shi-Qiang Yan,

Cheng-Shan Yuan, Alkaloids from Sophora flavescens Aition, Fitoterapia, 2010,

81 (6), 524-527.

12. S.T. Lee, D. Cook, R.J. Molyneux, Identification of the quinolizidine alkaloids

in Sophora leachiana, Biochem. Syst. Ecol, 2014, 54, 1–4.

13. Viện ƣ c liệu, Cây thu ng v t làm thu c ở Vi t Nam, T p 2,

NXB. Khoa học - Kỹ thu t, Hà N i, 2004.

14. X.L. Piao, X.S. Piao, S.W. Kim, J.H. Park, H.Y. Kim and Cai SQ, Identification

and characterization of antioxidants from Sophora flavescens, PubMed, 2006, 29

(9):1911-5.

15. Li, H. Liang, T. Yin, B. Wang, and Y.Y. Zhao, Main flavonoids from Sophora

flavescenes, Yaoxue Xuebao, 2008, 43(8), 833–837.

16. X.C. Ma, X.L. Xin, B.J. Zhang, F.Y. Li, K.X. Liu, and D.A. Guo, Structural

determination of flavonoids from Sophora flavescens, Magn. Reson. Chem, 2008,

46 (9), 903–6.

17. X.C. Ma, X.L. Xin, K.X. Liu, B.J. Zhang, F.Y. Li, and D.A. Guo, Simultaneous

Determination of Nine Major Flavonoids in Sophora flavescens by RP-

LC.Chromatographia, 2008, 68, 471- 474.

18. Ding, D. Chen, K.F. Bastow, A.K. Nyarko, X. Wang, and K.H. Lee, Cytotoxic

isoprenylated flavonoids from the roots of Sophora flavescens, Helv. Chim. Acta,

2004, 87(10), 2574–2580.

19. G. Ko, T.H. Kang, N.Y. Kim, S.J. Lee, Y.C. Kim, G.I. Ko, S.Y. Ryu, and B.H.

Lee, Lavandulylflavonoids: A new class of in vitro apoptogenic agents from

Sophora flavescens, Toxicol. Vitr, 2000, 14(5), 429–433.

20. R. Huang et al, "A new flavonoid from Sophora flavescens Ait", Nat Prod Res,

2017, 31 (19), 2228-2232.

21. C. Shen, T.W. Lin, Y.L. Huang, S.T. Wan, B.J. Shien, and C.C. Chen, Phenolic

constituents of the roots of Sophora flavescens, J. Nat. Prod, 2006, 69(8), 1237–

1240.

22. D.N. Olennikov, L.M. Tankhaeva, N.A. Pankrushina, D.V. Sandanov, Phenolic

Compounds of Sophora flavescens Soland. of Russian Origin. Russian Journal of

Bioorganic Chemistry, 2013, 39(7), 755–760.

23. M.H. Hong, J.Y. Lee, H. Jung., D.H. Jin, H.Y. Go, J.H. Kim, B.H. Jang, Y.C.

Shin, S.G. Ko, Sophora flavescens Ait. inhibits the production of pro-

inflammatory cytokinesthrough inhibition of the NF jB/IjB signal pathway in

human mast cell line (HMC-1), Toxicol. in vitr, 2009, 23, 251–258.

24. G.S. Lee, E.S. Kim and S.I. Cho, Antibacterial and synergistic activity of

prenylated chalcone isolated from the roots of Sophora flavescens, Journal of the

Korean Society for Applied. Biol. Chem, 2010, 53 (3), 290 – 296.

25. J. Gou, Y. Zou and J. Ahn, Enhancement of antioxidant and antimicrobial

activities of Dianthus superbus, Polygonum aviculare, Sophora flavescens, and

Lygodium japonicum by pressure-assisted water extraction, Food Science and

Biotechnology, 2011, 20 (1), 283 – 287.

26. Y. Zhang, H. Zhang, P. Yu, Q. Liu, K. Liu and H. Duan, Effects of matrin

against the growth of human lung cancer and hepatoma cells as well as lung

cancer cell migration, Cytotechnology, 2009, 59, 191 – 200.

27. T.Y. Miyamoto, T. Kawasuji, Y. Kuraishi, H. Suzuki, Antipruritic

effects of Sophora flavescens on acute and chronic itch-related responses in

mice, Biol. Pharm. Bull, 2003, 26, 722–724.

28. M.C. Wen., C.K. Huang, K.D. Srivastava, T.F. Zhang, B. Schofield, H.A.

Sampson, X.M. Li, Kushen (Sophora flavescens Ait.), a single Chinese herb,

abrogates airway hyperreactivity in a murine model of asthma. J. Allergy Clin.

Immunol, 2004, 113, 218.

29. N. Yang, B. Liang, K. Srivastava, J. Zeng, J. Zhan, L. Brown, H. Sampson, J.

Goldfarb, C. Emala, X.M. Li, The Sophora flavescens flavonoid compound

trifolirhizin inhibits acetylcholine induced airway smooth muscle contraction,

Phytochemistry, 2013, 95, 259–267.

30. D.L Di, F.Q. Li, L. Chen, G.J. Liu, Study on growth inhibition effect of Radix

Sophora flavescens on bacteria in vitro, Lishizhen Med, 2006,17, 1974.

31. E.R. Woo, J.H. Kwak, H.J. Kim, H. Park, A new prenylated flavonol from the

roots of Sophora flavescens, J. Nat. Prod, 1998, 61, 1552–1554.

32. S.C. Ma, J. Du, P.P.H. But, X.L. Deng, Y.W. Zhang, V.E.C. Ooi, H.X. Xu, Lee,

S.H.S. S.F. Lee, Antiviral Chinese medicinal herbs against respiratory syncytial

virus, J. Ethnopharmacol, 2002. 79, 205–211.

33. K.M. Choi, J.G. Gang, J.S. Yun, Anti-toxoplasma gondii RH strain activity of

herbal extracts used in traditional medicine, Int. J. Antimicrob. Agents, 2008,

32, 360–362.

34. Q. Liu, W. Luyten, K. Pellens, Y. Wang, W. Wang, K. Thevissen, Q. Liang,

B.P. Cammue, L. Schoofs, G. Luo, Antifungal activity in plants from Chinese

traditional and folk medicine. J. Ethnopharmacol, 2012, 143, 772–778.

35. B.F. Zhang, L.Y. Song, L.G. Zhu, Y.L. Liu, X.Q. Li, Anti-arrhythmic effect of

total alkaloids from Sophora flavescens, China J. Chin. Mater. Med, 1985, 10,

229–230.

36. J.Z. Wang, F.L. Sun, H.W. Han, B.H. Zhang, S.H. Yuan, L. Ma, Experimental

study of total flavonoids from Sophora flavescens on cultured myocardial cell

with arrhythmia, Acta Pharmacol. Sin, 1983, 4, 32–35.

37. H.Y. Fan, Y.H. Wang, K. Ren, N. Shen, R.S. Gu, L.J. Zhao, Y. Chang, Effect of

flavonoids from Sophora fiavescens on the myocardial fibrosis induced by

isoprenaline in rats, Pharmacol. Clin. Chin. Mater. Med, 2013, 29, 76–78.

38. J.F Wen, S.N. Jin, G.H. Zho, Y.L. Wang, F. Zhang, X.N. Wang, K.W. Cho,

Effects of Sophora flavescens on the cardiac contractile and secretory functions

and its alterations in the hyperthyroidism. Int. J. Cardiol, 2009, 137, S48.

39. Y.R. Wu., Q.F Gong, H. Fang, W.W. Liang, M. Chen, R.J. He, Effect of

Sophora flavescens on non-specific immune response of tilapia (GIFT

Oreochromis niloticus) and disease resistance against Streptococcus agalactiae.

Fish Shellfish Immunol, 2013, 34, 220–227.

40. L. Bai, L.Y. Zhu, B.S Yang, L.J Shi, Y. Liu, A.M. Jiang, L.L. Zhao, Song. G,

Liu. T.F, Antitumor and immunomodulating activity of a polysaccharide from

Sophora flavescens Ait. Int. J. Biol. Macro-mol, 2012, 51, 705–709.

41. V. Lobo, A. Patil, A. Phatak, and N. Chandra, Free radicals, antioxidants and

functional foods: Impact on human health, Pharmacogn Review, 2010, 4(8),

118-126.

42. T. Liu, A. Stern, L.J. Roberts and J.D. Morrow, The isoprostanes: novel

prostaglandin-like products of the free radical-catalyzed peroxidation of

arachidonic acid, Biomed Sci, 1999, 6(4), 226 – 235.

43. A.J. Lea, Dietary factors associated with death rates from certain neoplasms in

man, Lancet,1966, 2 , 332 – 333.

44. D. Harman, Role of free radicals in aging and disease. , Ann N Y Acad Sci,

1992, 673, 126 – 141.

45. M. Ebadi , Antioxidants and free radicals in health and disease: An introduction

to reactive oxygen species, oxidative injury, neuronal cell death and therapy in

neurodegenerative diseases, Arizona: Prominent Press, 2001.

46. K. Bagchi, S. Puri, Free radicals and antioxidants in health and disease,

Eastern Mediterranean Health J, 1998, 4: 350-360.

47. C.L. Rock, R.A. Jacob and P.E. Bowen, Update o biological characteristics of

the antioxidant micronutrients- Vitamin C, Vitamin E and the carotenoids, J Am

Diet Assoc,1996, 96, 693 – 702.

48. A.L. Rao, M. Bharani and V. Pallavi, Role of antioxidants and free radicals in

health and disease. Adv Pharmacol Toxicol, 2006, 7, 29 – 38.

49. H. Shi, N. Noguchi and E. Niki, Comparative study on dynamics of

antioxidative action of alpha-tocopheryl hydroquinone, ubiquinol, and alpha-

tocopherol against lipid peroxidation, Free Radic Biol Med, 1999, 27(3-4), 334 –

46.

50. M. Levine, S.C. Rumsey, R. Daruwala, J.B. Park and Y. Wang, Criteria and

recommendations for vitamin C intake, JAMA, 1999, 281(15), 1415 – 1423.

51. M. Ebadi, Introduction. Oxidative stress in mitochondria disorders of aging,

Biol Signals Recept, 2001, 10(1-2), 5-13.

52. E. Grotewold, G. Poli, E. Albano, M.U. Dianzani and Basel, Antioxidant

defenses in eukaryotic cells. From basic science to medicine. , Switzerland:

Birkhauser Verlag, 1993, 12, 365 – 373.

53. B.T. Ashok, Rashid Ali, The aging paradox: free radical theory of aging,

Experimental Gerontology, 1999, 34, 293-303

54. B. Frie, R. Stocker and B.N. Ames, Antioxidant defences and lipid peroxidation

in human blood plasma, Proc Natl Acad Sci, 1988, 37, 569 – 571.

55. D. Harman, Role of free radicals in aging and disease. , Ann N Y Acad

Sci, 1992, 673, 126 – 141.

56. A.L. Ra, M. Bharani and V. Pallavi, Role of antioxidants and free radicals in

health and disease. Adv Pharmacol Toxicol, 2006, 7, 29 – 38.

57. M. Ebadi, Introduction. Oxidative stress in mitochondria disorders of aging,

Biol Signals Recept, 2001, 10(1-2), 5-13.

58. J. J. Hee, S.K. Sam, K.H. Sook, S.C. Jae, In Vitro Free Radical and ONOO-

Scavengers from Sophora flavescens, Arch. Pharm. Res, 2005, 28(5), 534-540

59. Chun-Chao Han, Yingzi Wang, Anti-inflammation effects of Sophora flavescens

nanoparticles, Inflammation, 2012; 35(4), 1262-8.

60. X. Cao, S.V. Antonyuk, S.V. Seetharaman, L.J. Whitson, A.B. Taylor, S.P.

Holloway, R.W. Strange, P.A. Doucette, J.S. Valentine, A. Tiwari, L.J. Hayward,

S. Padua, J.A. Cohlberg, S.S. Hasnain and P.J. Hart, Structures of the G85R

variant of SOD1 in familial amyotrophic lateral sclerosis, J Biol Chem. , 2008,

283(23), 16169 – 16177.

61. T. Eisner, D.J. Aneshansley, Biochemistry: The Chemical reactions of Living

Cells, Science, 1990, 248.

62. A. David, Gewirtz, S.E. Holt, Steven Grant , Apoptosis, Senescence, and

Cancer, Humana Press Inc, 2007, 3 – 60.

63. S. Elmore, Apoptosis: a review of programmed cell death, Toxicologic

pathology, 2007, 35(4), 495–516.

64. K. Maeshima, H. Iino, S. Hihara, N. ImamotoN, Nuclear size, nuclear pore

number and cell cycle. Nucleus, 2011, 2(2), 113–118.

65. Aysun Adan, Gunel Alizada, Yagmur Kiraz, Yusuf Baran, Ayten Nalbant,

Flowcytometry: Basic principles and applications, Critical reviews in

Biotechnology, 2016, 37.

66. Q. Shao, X. Zhao, L. Yao, Matrin inhibits the growth of retinoblastoma cells

(SO-Rb50) by decreasing proliferation and inducing apoptosis in a

mitochondrial pathway. Mol. Biol. Rep, 2014, 41, 3475–3480.

67. Y. Zhou, Y. Wu, L. Deng, L. Chen, D. Zhao, L. Lv, X. Chen, J. Man, Y. Wang,

H. Shan, Y. Lu, The alkaloid matrin of the root of Sophora flavescens prevents

arrhythmogenic effect of ouabain. Phytomedicine, 2014, 21, 931–935.

68. L. Guoqiang, D. Jing, W. Hong. et al, Characterization of alkaloids in Sophora

flavescens Ait. by high-performance liquid chromatography–electrospray

ionization tandem mass spectrometry, Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, 2011, 54(5), 1065-1072.

69. C. Luo, H.J. Zhong, L.M. Zhu, X.G. Wu, J.E. Ying, X.H. Wang, W.X. LU, Q.

Xu, Y.L. Zhu, J. Huang, Inhibition of matrin against gastric cancer cell line

MNK45growth and its anti-tumor mechanism, Mol Biol Rep, 2012, 39, 5459–

5464.

70. Guo, T. Zhang,J. Su, K. Wang, X. Li, Oxymatrin targets EGFRp-Tyr845 and

inhibits EGFR-related signaling pathways to suppress the proliferation and

invasion of gastric cancer cells, Cancer Chemother Pharmacol, 2015, 75, 353–

363.

71. Wu, Y. Cai, M. Li, Y. Zhang, H. Li, Z. Tan, Oxymatrin promotes s-phase arrest

and inhibits cell proliferation of human breast cancer cells in vitro through

mitochondria-mediated apoptosis,Biol. Pharm. Bull, 2017, 40(8), 1232–1239

72. Y. Liu, Y. Xu, W. Ji, X. Li, B. Sun, Q. Gao, and C. Su, Anti-tumor activities of

matrin and oxymatrin: Literature review, Tumor Biology, 2014, 35(6), 5111-9.

73. Z.M. Xia, A.M. Wang, S.R. Shen, Effects of Ethanol extract of Radix Sophorae

Flavescentis on Activity of Colon Cancer HT29 Cells, African Journal of

Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 2013, 10(5), 352-355.

74. Y. Wang, W.K. Si, P. Li, and J. Yao, Effects of matrin and oxymatrin on the

proliferation and apoptosis of A549 cells, Academic Journal of Third Military

Medical University, 2004, 26, 778–780.

75. J. Han, M. Sun, Y. Cui et al, Kushen flavonoids induce apoptosis in tumor cells

by inhibition of NF-κ i i multiple receptor tyrosine kinase

activities, Phytotherapy Research, 2007, 21(3), 262–268.

76. W. vanden Berghe, A. de Naeyer, N. Dijsselbloem, J.P. David, D. de

Keukeleire, and G. Haegeman, Attenuation of ERK/RSK2- i e NFκ ge e

expression and cancer cell proliferation by kurarinone, a lavandulyl flavanone

isolated from Sophora flavescens Ait. roots, Endocrine, Metabolic and Immune

Disorders, 2011, 11(3), 247–261.

77. H.Y. Lee, M. Meng, Y. Liu, T. Su, & H.Y. Kwan, Medicinal herbs and

bioactive compounds overcome the drug resistance to epidermal growth factor

receptor inhibitors in non-small cell lung cancer (Review). Oncology Letters,

2021, 22, 646.

78. Ming Wang, Gang Liu, Haiyan Li, Extraction of matrin from Sophora

flavescens Ait. And evaluation of its inhibitory effects on human nasopharyngeal

carcinoma CNE-2 cells, Food Science and Technology, 2018, 38, 333-337.

79. K. Li and H. Wang, Simultaneous determination of matrin, sophoridine and

oxymatrin in Sophora flavescens Ait. by high performance liquid

chromatography, Biomed. Chromatogr, 2004, 18 (3), 178–182.

80. Z. Lin, C.F. Huang, X.S. Liu, et al, In vitro anti-tumour activities of

Quinolizidine alkaloids derived from Sophora flavescens Ait, Basic & clinical

pharmacology & toxicology, 2011, 108(5), 304-309.

81. Y. Zhang, H. Zhang, P. Yu, Q. Liu, K. Liu and H. Duan, Effects of matrin

against the growth of human lung cancer and hepatoma cells as well as lung

cancer cell migration, Cytotechnology, 2009, 59, 191 – 200.

82. Lin, C. F. Huang, X.S. Liu, and J. Jiang, In Vitro Anti-Tumour Activities of

Quinolizidine Alkaloids Derived from Sophora Flavescens Ait, Basic Clin.

Pharmacol. Toxicol, 2011, 108(5), 304–309, 2011

83. M. Sun, H. Cao, L. Sun, S. Dong, Y. Bian, J. Han, L. Zhang, S. Ren, Y. Hu, C.

Liu, L. Xu, and P. Liu, Antitumor activities of kushen: Literature review,

Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2012, 2012, 1-11.

84. Y. Qianqian, C. Nengneng, N. Xiaojun, Identifying 2 prenylflavanones as

potential hepatotoxic compounds in the ethanol extract of Sophora flavescens,

Journal of Food Science, 2013, 78(11), 1830-1834

85. H.W. Yan et al, Eight new biflavonoids with lavandulyl units from the roots of

Sophora flavescens and their inhibitory effect on PTP1B, Bioorg Chem, 2019,

86, 679-685.

86. B Y Tế, D Th Q c Gia Vi t Nam, Hà N i, Nhà xuất bản y học, 2018, 80.

87. American Type Culture Collection, Hep G2, https://www.atcc.org/products/hb-

8065.

88. Nguyễn Thị Thu Hƣờng, Đ h gi ết qu i u trị của thu c Sorafenib trên

b nh nhân ung thu gan nguyên phát, B Giáo dục v đ o tạo Đại học Y Hà n i,

2020.

89. F. Bray, J. Ferlay, I. Soerjomataram, et al., Global cancer statistics:

GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers

in 185 countries. Cancer journal for clinicians, 2018, 68(6), pp. 394-424.

90. American Type Culture Collection, BT-474, https://www.atcc.org/products/htb-

20.

91. M.B. Mark Clemons, M.D. Paul Goss, Estrogen and the Risk of Breast Cancer,

N Engl J Med 2001; 344:276-285.

92. PubChem Compound Summary for CID 91466, Matrine. National Center for

Biotechnology Information 2022, Retrieved.

93. PubChem Compound Summary for CID 114850, Oxymatrine. National Center

for Biotechnology Information, 2022, Retrieved.

94. Y. Zhang, H. Zhang, P. Yu, Q. Liu, K. Liu and H. Duan, Effects of matrine

against the growth of human lung cancer and hepatoma cells as well as lung cancer

cell migration, Cytotechnology, 2009, 59, 191 – 200.

95. K. Kalinkevich, V.E. Karandashov and L.R. Ptitsyn, In vitro study of the anti-

inflammatory activity of some medicinal and edible plants growing in Russia,

Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2014, 40 (7), 752 – 761.

96. B Y Tế, D Điển Vi t Nam V. Hà N i: NXB Khoa Học, 2017, tập 2.

97. N. Tanabe, T. Kuboyama, K. Kazuma, K. Konno, C. Tohda, The Extract of

Roots of Sophora flavescens Enhances the Recovery of Motor Function by

Axonal Growth in Mice with a Spinal Cord Injury. Front Pharmacol, 2016, 14

(6), 326.

98. Wentao Bi, Minglei Tian, Kyung Ho Row, Solid-phase extraction of matrine

and oxymatrine from Sophora Flavescens Ait using amino – imidazolium

polymer, J.Sep.Sci, 2010, 33, 1739-1745.

99. L. Vernon. Singleton, Rudolf Orthofer, R.M. Lamuela-Raventos, Analysis of

total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-

ciocalteu reagent, Methods in enzymology, 1999, 299, 152-178..

100. J.L.C. Lamaison,. and A. Carnet, Teneurs en principaux flavonoids des fleurs

de Crataegeus monogyna Jacq et de Crataegeus laevigata (Poiret D. C) en

fonction de la vegetation, Pharm. Acta. Helv, 1990, 65, 315-320.

101. I.F.F. Benzie, J.J. Strain, The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a

e e f “ i i we ”: he FRAP Analytical biochemistry,

1996, 239 (1), 70-76.

102. Taylor Chandra Shekhar and Goyal Anju, Antioxidant activity by DPPH

radical scavenging method of ageratum conyzoides, American Journal of

Ethnomedicine, 2014, 1(4), 244-249.

103. M. Antolovich, P.D. Prenzler, E. Patsalides, S. McDonald, Methods for testing

antioxidant activity, Analyst, 2002, 127, 183-198.

104. Promega, Technical manual: ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System, 2021,

(https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/

101/reliaprep-rna-cell-miniprep-system-protocol.pdf?rev=047224f4d75 44be9a2

5e944200b5ae3c&sc_lang=en.

105. Y. Chen, J. Liu, B. Yuan, C. Cao, S. Qin, X. Cao, G. Bian, Z.Wang, and J.

Jiang, Methylated Actinomycin D, a Novel Actinomycin D Analog Induces

Apoptosis in HepG2 Cells Through Fas- and Mitochondria-Mediated Pathways,

Molecular carcinogenesis, 2013, 52 (12), 983-996.

106. K.J. Livak, T.D. Schmittgen. Analysis of relative gene expression data using

Real-Time Quantitative PCR and the 2-∆∆ Me h Me h , 2001, 25:402-

408.

107. C.A. Schneider, W.S. Rasband & K.W. Eliceiri, NIH Image to ImageJ: 25

years of image analysis, Nature methods 9, 2012, 7, 671-675.

108. National Library of Medicine, nucleotide Blast search,

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/AB127037.1?report=genbank&log$=n

uclalign&blast_rank=19&RID=75FHP5FS016).

109. Ke Li, Huajuan Wang, Simultaneous determination of matrine, sophoridine

and oxymatrine in sophora flavescens Ait. By high performance liquid

chromatography, Biomed. Chromatogr, 2004, 18, 178-182.

110. J.F. Yang, C.H. Yang, C.C. Wu and L.Y. Chuang, Antioxidant and

antimicrobial activities of the extracts from Sophora flavescens, Journal of

Pharmacognosy and Phytochemistry, 2015, 3(6), 26 – 31.

111. J. Li, Y. Lin, L. He, R. Ou, T. Chen, X. Zhang, Q. Li, Z. Zeng, Q. Long, Two

New Isoprenoid Flavonoids from Sophora flavescens with Antioxidant and

Cytotoxic Activities. Molecules, 2021, 26, 7228.

112. X.G. Qin, Z. Hua, W. Shuang, Y.H. Wang, and Y.D. Cui, ﬀe f i e

HepG2 cell proliferation and expression of tumor relevant proteins in vitro,

Pharmaceutical Biology, 2010; 48(3): 275–281.

113. J.Q. Zhang, Y.M. Li, T. Liu, W.T. He, Y.T. Chen, X.H. Chen, X. Li, W.C.

Zhou, J.F. Yi, Z.J. Ren. Antitumor effect of matrine in human hepatoma G2 cells

by inducing apoptosis and autophagy. World J Gastroenterol. 2010;16(34), 4281-

90.

114. H. Nakamura, Y. Kumei, S. Morita, H. Shimokawa, K. Ohya, K. Shinomiya

Antagonism between apoptotic (Bax/Bcl-2) and antiapoptotic (IAP) signals in

human osteoblastic cells under vector-averaged gravity condition. Ann N Y

Acad Sci, 2003, 1010, 143–147.

115. Y. Liu, Y. Xu, W. Ji, X. Li, B. Sun, Q. Gao, and C. Su, Anti-tumor activities of

matrine and oxymatrine: Literature review, Tumor Biology, 2014.

116. J.Q. Zhang, Y.M. Li, T.Liu et al, Antitumor effect of matrine in human

hepatoma G2 cells by inducing apoptosis and autophagy, World Journal of

Gastroenterology, 1010, 16, 34, 4281–4290.

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: Kết quả giải trình t DNA khuếch đại

GAAATCAGCTATGACGTAAAATCAAGTCCACCGCGTAGGCATTCA

TAAACTGCTCTACYGTAATKCKKAGaCGKAyTARCCCSAMTTTWGDYW

WAATAGTGCATCCCAATAGGGGACGGCCATACTTGTTSAATTTATCTCT

CTCAACTTGGATGCCGTGAGGCGGGCCTTGGAAAGTTTTAACATAAGAA

GTAGGGATTCGCAAATCTTCCAGACGTAAAGCGCGCAGGGCCTTGAACC

CAAATACATTACCTACAATGGAAGTAAACATGTTAGTAACAGAACCTTC

TTCAAAAAGGTCTAAGGGATAAGCTACATAAGCAATAAATTGACTTTCT

TCTCCAGCAACAGGCTCGATGTGATAGCATCGTCCTTTGTAACGATCAA

GACTGGTAAGTCCATCGGTCCACACAGTTGTCCATGTACCAGTAGAAGA

TTCGGCAGCTACCGCGGCACCTGCTTCTTCAGGCGGAACTCCGGGTTGA

GGAGTTACTCGGAATGCTGCTAAGATATCAGTATCTTTGGTTTCATAGTC

AGGAtGYATAATAAGTgCAATTTATgAATCaTTTcAACAaCCcAGCTTKGAA

CYCAACACTTGCTTTAGTCTCTGTTTGTGGTGACATACTGGCCGCCCTTT

PHỤ LỤC 2: Sắc ký đồ chuẩn của matrine

PHỤ LỤC 3: Sắc ký đồ chuẩn của oxymatrine

PHỤ LỤC 4: Sắc ký đồ định lƣ ng matrine và oxymatrine trong mẫu cao

EtOH 60 %

PHỤ LỤC 5: Sắc ký đồ định lƣ ng matrine và oxymatrine trong mẫu cao

EtOH 70 %

PHỤ LỤC 6: Sắc ký đồ định lƣ ng matrine và oxymatrine trong mẫu cao

EtOH 80 %

PHỤ LỤC 7: Sắc ký đồ định lƣ ng matrine và oxymatrine trong mẫu cao

EtOH 90 %

PHỤ LỤC 8: Tính toán khảo sát dung môi chiết mẫu ƣ c liệu định lƣ ng

matrine và oxymatrine.

Mẫu Cao EtOH 60 % Cao EtOH 70 % Cao EtOH 80 % Cao EtOH 90 %

51,20 61,80 95,60 80,20

59,70 64,90 93,30 81,50

57,80 57,10 92,80 77,80

56,23 61,27 93,90 79,83 Hàm lƣ ng matrine

3,6 3,2 1,2 1,5

11,24 12,2 18,8 15,9

3,60 4,90 5,40 4,80

5,10 2,50 7,10 5,70

2,50 3,20 6,30 3,80

Hàm lƣ ng oxymatri ne 3,73 3,53 6,27 4,77

1,07 1,01 0,69 0,78

0,75 0,71 1,25 0,95

Lần 1 (µg/mL) Lần 2 (µg/mL) Lần 3 (µg/mL) Trung bình (µg/mL) đ lệch chuẩn SD Trung bình theo khối lƣ ng (mg/g) Lần 1 (µg/mL) Lần 2 (µg/mL) Lần 3 (µg/mL) Trung bình (µg/mL) đ lệch chuẩn SD Trung bình theo khối lƣ ng (mg/g)

100

PHỤ LỤC 9: Tính toán thẩm định phƣơng ph p HPHỤ LỤCC-UV định

lƣ ng matrine và oxymatrine trong mẫu ƣ c liệu ,

Lần thí nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần thí nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Đ chính x c matrine (µg/mL) 90,9 92,4 98,3 oxymatrine (µg/mL) 5,9 6,1 5,9 LOD - LOQ matrine (µg/mL) 1,7 1,5 1,6 oxymatrine (µg/mL) 2,8 1,6 0,2

Lần 4 Lần 4 95,3 6,3 0,4 0,6

Lần 5 Lần 5

Lần 6 TB SD 94,5 92,8 94,0 2,6 5,9 5,7 6,0 0,2 0,6 0,9 0,2 0,61 2,3 3,8 0,4 1,36

%RSD 2,8 3,5 2,0 4,5

Lần 6 Lần 7 SD LOD (µg/mg) LOQ (µg/mg) 6,1 14

Thêm 10 µg/mL Đ đúng Thêm 50 µg/mL Thêm 100 µg/mL

Lần thí nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB HSTH matrine (µg/mL) 104,6 105 99,8 103,1 91,0 oxymatrine (µg/mL) 16,3 13,9 14,2 14,8 88,3 matrine (µg/mL) 140,7 143,3 139,2 141,1 94,1 oxymatrine (µg/mL) 56,1 50,3 54,2 53,5 95,1 matrine (µg/mL) 198,5 194,3 197,2 196,7 102,6 oxymatrine (µg/mL) 106,3 106,9 103,7 105,6 99,7

101

PHỤ LỤC 10: Phổ UV-vis của gallic acid sau khi phản ứng v i FCR

PHỤ LỤC 11: Phổ UV-vis của Quercetin sau khi phản ứng v i AlCl3

102

PHỤ LỤC 12: Tổng h p dữ liệu đƣờng chuẩn gallic acid

A 765nm

Nồng độ Gallic acid (µg/mL)

0,0000

0,00

0,1490

0,1489

0,1490

0,1492

1,33

0,2800

0,2801

0,2802

0,2798

2,67

0,4000

0,3998

0,4002

0,4001

4,00

0,5200

0,5202

0,5201

0,5198

5,33

0,6250

0,6251

0,6248

0,6251

6,67

PHỤ LỤC 13: Tổng h p dữ liệu đƣờng chuẩn Quercetin

A 415nm

Nồng độ Quercetin (µg/mL)

0,0000

0,00

0,0297

0,0296

0,0298

0,30

0,0528

0,0529

0,0525

0,0529

0,60

0,1022

0,1024

0,1021

1,20

0,1950

0,1951

0,1948

0,1951

2,39

0,3336

0,3335

0,3337

0,3336

4,79

0,6114

0,6115

0,6113

9,57

1,1804

1,1806

1,1802

1,1804

19,14

103

Mẫu m (g)

A 415 nm

̅̅̅̅̅

LOD (%)

D (mL)

TFC (%QE)

C (mg/m L)

0,1956 0,5367 0,5369 0,5365

4,29

PHỤ LỤC 14: Tổng h p dữ liệu các thử nghiệm TFC

0,1302 g n ổ t

24,9

500

0,1965 0,5427 0,5422 0,5423

4,31

0,1308

4,24

0,10

o a C

0,1996 0,5285 0,5285 0,5287

4,13

0,1329

3 l

0,1197 0,3880 0,3870 0,3880

4,95

0,1204 0,3829 0,3833 0,3828

4,85

0,1472

18,2

1000

4,85

0,09

0,1463 C H C o a C

0,1221 0,3815 0,3814 0,3817

4,76

0,1493

0,0837 0,4630 0,4630 0,4620

8,56

18,3

1000

0,0877 0,4682 0,4680 0,4679

8,26

0,1074

8,42

0,15

0,1024 A E o a C

0,0846 0,4622 0,4624 0,4621

8,45

0,1036

0,4603 0,3410 0,3410 0,3420

1,12

t

23,9

500

0,4593 0,3465 0,3464 0,3468

1,14

0,3018

1,12

0,02

0,3024 H O E o a C

0,4689 0,3423 0,3426 0,3425

1,10

0,3081

1,5738 0,3080 0,3080 0,3090

0,29

26,8

250

1,5000 0,3281 0,3280 0,3284

0,33

0,5123

0,31

0,02

0,5375 O 2 H o a C

1,5463 0,3216 0,3217 0,3213

0,31

0,5281

104

Mẫu m (g)

A 765 nm

̅̅̅̅̅

LOD (%)

D (mL)

C (mg/mL)

TPC (%GAE)

0,0156

0,4205 0,4197 0,4197

27,37

PHỤ LỤC 15: Tổng h p dữ liệu của các thử nghiệm TPC

0,1302 g n ổ t

24,9

6250

0,0157

0,4356 0,4353 0,4357

28,35

0,1308

27,95 0,52

o a C

0,1329

0,0160

0,4389 0,4384 0,4391

28,13

0,1463

0,0191

0,4872 0,4873 0,4875

26,30

r o l

0,1472

18,2

6250

0,0193

0,4891 0,4896 0,4893

26,25

26,10 0,29

h C o a C

0,1493

0,0195

0,4870 0,4874 0,4875

25,77

0,0134

0,4741 0,4733 0,4733

36,46

0,1074

18,3

6250

0,0140

0,4779 0,4777 0,4773

35,09

35,93 0,73

0,1024 A E o a C

0,1036

0,0135

0,4756 0,4759 0,4757

36,22

0,3024

0,0368

0,4738 0,4725 0,4725

13,24

t

0,3018

23,9

6250

0,0367

0,4725 0,4726 0,4726

13,25

13,19 0,10

H O E o a C

0,3081

0,0375

0,4758 0,4754 0,4753

13,07

0,0630

0,4229 0,4229 0,4222

6,85

0,5123

26,8

6250

0,0600

0,4198 0,4101 0,4196

7,07

6,95

0,11

0,5375 O 2 H o a C

0,4206 0,4211 0,4202

0,0619

6,93

0,5281 PHỤ LỤC 16: Tổng h p dữ liệu của đƣờng chuẩn Fe2+

A 593nm

0,0000

Nồng độ Fe2+ (µmol/mL) 0,00

0,0120

0,0121

0,10

0,0118

0,0121

0,0870

0,0872

0,20

0,0867

0,0871

0,2090

0,2089

0,40

0,2093

0,2088

0,3420

0,3418

0,60

0,3425

0,3417

0,4820

0,4818

0,80

0,4823

0,4819

0,5840

0,5841

1,00

0,5839

0,5840

105

Mẫu m (g)

A 593 nm

Tbinh SD

LOD (%)

D (mL)

C (mg/mL)

PHỤ LỤC 17: Tổng h p dữ liệu các thử nghiệm FRAP

1 Chỉ số FRAP (µmol/mg) 0,92

0,3985

0,1890 0,1891 0,1891

0,1311

0,1267

24,0

250

0,3852

0,1883 0,1882 0,1881

0,93

0,01

0,95

g n ổ t

o a C

0,3992

0,1928 0,1927 0,1928

0,93

0,1313

2

0,4176

0,74

0,1363

0,1537 0,1537 0,1538

0,76

0,1327

23,4

250

0,4066

0,75

0,01

g n ổ t

0,1524 0,1525 0,1525

o a C

0,4234

0,74

0,1382

3

0,3911

0,1543 0,1544 0,1544 0,2382 0,2383 0,2382

1,13

0,1302

1,13

0,1308

24,9

250

0,3929

0,2389 0,2388 0,2390

1,13

0,00

g n ổ t

o a C

0,3992

0,2421 0,2423 0,2422

1,12

0,1329

0,4787

0,2690 0,2691 0,2690

1,02

0,1463

r o l

1,02

0,1472

18,2

250

0,4816

0,2697 0,2697 0,2698

1,02

0,00

h C o a C

0,4885

0,2726 0,2725 0,2724

1,01

0,1493

0,3346

0,2968 0,2967 0,2965

1,59

1,52

18,3

250

0,3510

0,2976 0,2976 0,2975

1,56

0,04

0,1074

0,1024 A E o a C

0,3386

0,2966 0,2965 0,2965

1,57

0,1036

0,9205

0,4090 0,4091 0,4091

0,77

0,3024

t

0,77

0,3018

23,9

250

0,9187

0,4086 0,4087 0,4086

0,77

0,01

H O E o a C

0,9379

0,4104 0,4105 0,4105

0,76

0,3081

1,5738

0,3337 0,3338 0,3339

0,38

0,39

26,8

250

1,5000

0,3324 0,3325 0,3323

0,38

0,01

0,5123

0,5375 O 2 H o a C

1,5463

0,3346 0,3347 0,3347

0,38

0,5281

n

0,3208 0,3207 0,3209

25,05

25,03

0,0057

250

0,0228

0,3206 0,3203 0,3205

25,05 0,02

0,056 3

0,3209 0,3211 0,3210

25,07

i t e c r e u Q

0,3342 0,3341 0,3341

14,36

i

14,42

0,0103

250

0,0412

0,3357 0,3356 0,3357

14,39 0,03

0,002 3

C n m a t i

0,3349 0,3350 0,3348

14,39

V

106

PHỤ LỤC 18: Tổng h p dữ liệu khả năng ắt gốc DPPH của Vitamin C và

Quercetin

Mẫu

A 517 nm

AA(%)

SD

̅̅̅̅

Nồng độ (µg/mL)

IC 50 (µg/mL)

0,00

14,10

0,02

5,12

25,78

0,02

10,24

Vitamin C

18,92

39,80

0,02

15,36

54,43

0,04

20,47

68,26

0,15

25,59

0,8490 0,7293 0,7291 0,7295 0,6303 0,6302 0,6300 0,5109 0,5111 0,5112 0,3866 0,3872 0,3869 0,2703 0,2701 0,2680

0,00 14,10 14,12 14,08 25,76 25,77 25,80 39,82 39,80 39,79 54,46 54,39 54,43 68,16 68,19 68,43

0,00

0,8260

0,00

0,6718

18,67

18,88

0,62

5,19

0,6740

18,40

0,6643

19,58

0,5587

32,36

32,45

0,18

10,38

0,5563

32,65

0,5589

32,34

0,4739

42,63

Quercetin

19,69

15,57

0,4820

41,65

42,01

0,53

0,4810

41,77

0,4010

51,45

51,57

1,30

20,76

0,3888

52,93

0,4102

50,34

0,3068

62,86

62,72

0,13

25,95

0,3089

62,60

0,3082

62,69

107

̅̅̅̅

PHỤ LỤC 19: Tổng h p dữ liệu khả năng ắt gốc DPPH của cao tổng

Mẫu

A 517 nm

AA(%)

SD

Nồng độ (mg/mL)

IC 50 (mg/mL)

0,00

0,8504

17,47

0,7018

17,31

0,28

0,7032

17,45

0,13

17,57

0,7010

31,51

0,5824

31,36

0,57

0,5837

31,44

0,08

31,44

0,5830

47,13

0,4496

Cao tổng 3

1,06

47,32

0,17

47,47

0,95

0,4467

47,37

0,4476

64,31

0,3035

64,53

1,42

0,3016

64,49

0,16

64,62

0,3009

81,16

0,1602

81,07

1,89

0,1610

81,07

0,09

80,97

0,1618

PHỤ LỤC 20: Tổng h p dữ liệu khả năng ắt gốc DPPH của c c cao phân đoạn

SD

Mẫu

A 517 nm

AA(%)

̅̅̅̅

Nồng độ (mg/mL)

IC 50 (mg/mL)

0,00

0,8440

22,61

0,6532

22,50

0,39

0,6541

22,51

0,10

22,42

0,6548

35,77

0,5421

3 l

35,69

0,77

0,5428

35,66

0,13

35,52

0,5442

1,30

47,18

0,4458

C H C o a C

47,49

1,16

0,4432

47,40

0,19

47,52

0,4429

57,10

0,3621

57,27

1,54

0,3606

57,23

0,11

57,31

0,3603

67,50

1,93

0,2743

66,94

0,55

108

Mẫu

A 517 nm

AA(%)

SD

̅̅̅̅

Nồng độ (mg/mL)

IC 50 (mg/mL)

0,2792

66,92

0,2836

66,40

0,8350

0,00

0,7268

12,96

0,7253

0,10

13,14

13,05

0,09

0,7259

13,07

0,6498

22,18

0,6482

0,21

22,37

22,27

0,10

0,6491

22,26

0,5247

37,16

0,62

0,5235

0,41

37,31

37,25

0,07

A E o a C

0,5238

37,27

0,4246

49,15

0,4278

0,62

48,77

48,98

0,19

0,4257

49,02

0,3120

62,63

0,3101

0,82

62,86

62,75

0,11

0,3110

62,75

0,8350

0,00

0,5992

28,24

0,5978

1,00

28,41

28,38

0,13

0,5971

28,49

0,4321

48,25

0,4275

1,99

48,80

48,51

0,28

0,4303

48,47

t

0,2897

65,31

2,16

0,2826

2,99

66,16

65,39

0,73

H O E o a C

0,2948

64,69

0,1456

82,56

0,1472

3,99

82,37

82,52

0,13

0,1451

82,62

0,0396

95,26

0,0402

4,98

95,19

95,45

0,40

0,0341

95,92

0,8220

0,00

0,7472

9,10

0,7458

2,54

9,27

9,25

0,14

8,15

0,7449

9,38

O 2 H o a C

0,5743

30,13

5,08

30,04

0,08

0,5756

29,98

109

Mẫu

A 517 nm

AA(%)

SD

̅̅̅̅

Nồng độ (mg/mL)

IC 50 (mg/mL)

30,02

0,5752

47,87

0,4285

48,03

7,62

0,4272

48,05

0,19

48,25

0,4254

63,33

0,3014

63,03

10,16

0,3039

63,26

0,20

63,42

0,3007

80,68

0,1588

80,85

12,70

0,1574

80,90

0,25

81,17

0,1548

110

PHỤ LỤC 21: Tổng h p dữ liệu khả năng ắt gốc t do ABTS+ của

Vitamin C và Quercetin

Mẫu

A 734 nm

AA(%)

SD

̅̅̅̅

Nồng độ (µg/mL)

IC 50 (µg/mL)

0,00

5,12

16,81

0,16

10,24

31,66

0,12

Vitamin C

15,95

49,20

0,08

15,36

20,47

63,56

0,16

25,59

79,63

0,08

0,8150 0,6788 0,6765 0,6786 0,5559 0,5576 0,5575 0,4147 0,4138 0,4135 0,2971 0,2982 0,2956 0,1666 0,1661 0,1653

- 16,71 16,99 16,74 31,79 31,58 31,60 49,12 49,23 49,26 63,55 63,41 63,73 79,56 79,62 79,72

0,00

0,8560

0,6208

27,48

3,17

0,6208

27,57

0,16

27,48

0,6184

27,76

0,4648

45,70

6,34

0,4632

45,79

0,09

45,89

0,4641

45,78

0,3340

60,98

Quercetin

7,54

9,51

0,3356

60,79

60,86

0,10

0,3355

60,81

0,2211

74,17

12,68

0,2191

74,30

0,12

74,40

0,2199

74,31

0,1037

87,89

15,85

0,1022

87,96

0,09

88,06

0,1032

87,94

111

PHỤ LỤC 22: Tổng h p dữ liệu khả năng ắt gốc t do ABTS+ của các cao tổng

Mẫu

A 734 nm

AA(%)

SD

̅̅̅̅

Nồng độ (mg/mL)

IC 50 (mg/mL)

0,00

0,05

18,26

0,07

0,10

33,29

0,28

Cao tổng

0,17

46,24

0,13

0,15

0,20

57,68

0,35

0,25

70,40

0,16

0,8650 0,7076 0,7064 0,7071 0,5765 0,5797 0,5749 0,4659 0,4654 0,4638 0,3674 0,3626 0,3681 0,2549 0,2575 0,2556

0,00 18,20 18,34 18,25 33,35 32,98 33,54 46,14 46,20 46,38 57,53 58,08 57,45 70,53 70,23 70,45

PHỤ LỤC 23: Tổng h p dữ liệu khả năng ắt gốc t do ABTS+ của c c cao phân đoạn

Mẫu

A 734 nm

AA(%)

AA tb

SD

Nồng độ (mg/mL)

IC 50 (mg/mL)

0,00

0,8350

0,5148

38,35

0,10

0,5161

38,19

38,32

0,12

0,5141

38,43

0,4766

42,92

0,12

0,4759

43,01

42,99

0,07

3 l

0,4755

43,05

0,3822

54,23

0,16

0,19

0,3807

54,41

54,38

0,13

C H C o a C

0,3800

54,49

0,2648

68,29

0,27

0,2657

68,18

68,26

0,07

0,2645

68,32

0,2343

71,94

0,31

0,2336

72,02

71,98

0,04

0,2340

71,98

0,00

0,8350

0,6751

19,15

0,08

0,02

19,16

0,10

0,6758 0,6741

19,07 19,27

32,38

32,22

0,16

0,04

0,08

50,89

0,11

112

A E o a C

0,12

66,47

0,14

0,16

85,03

0,18

0,00

0,22

21,08

0,16

0,43

31,50

1,01

t

0,82

0,65

42,75

0,26

H O E o a C

0,86

52,57

0,46

1,08

60,96

0,36

0,00

1,63

24,71

0,40

2,17

31,41

1,14

3,79

2,71

37,53

1,63

c ớ ƣ N o a C

3,26

43,94

0,66

4,07

53,11

1,05

0,5646 0,5673 0,5661 0,4105 0,4090 0,4106 0,2812 0,2789 0,2798 0,1235 0,1250 0,1265 0,8350 0,6603 0,6591 0,6576 0,5725 0,5633 0,5802 0,4759 0,4779 0,4803 0,3980 0,3984 0,3916 0,3265 0,3228 0,3287 0,8500 0,6408 0,6362 0,6429 0,5731 0,5924 0,5836 0,5210 0,5468 0,5252 0,4705 0,4815 0,4775 0,4086 0,3956 0,3916

32,06 32,20 50,84 51,02 50,83 66,32 66,60 66,49 85,21 85,03 84,85 - 20,92 21,07 21,25 31,44 32,54 30,51 43,01 42,77 42,48 52,34 52,29 53,10 60,90 61,34 60,63 - 24,61 25,15 24,36 32,58 30,31 31,34 38,71 35,67 38,21 44,65 43,35 43,82 51,93 53,46 53,93

113

PHỤ LỤC 24: KẾT QUẢ WST - 1

1, Dòng tế bào BT474

1 2 3 4 5 6

 Cao CHCl3 Giá trị OD ở từng mẫu thí nghiệm

6,25 µg/mL 12,5 µg/mL

6,92E-01 6,03E-01 Lần 1

6,81E-01 5,81E-01 Lần 2

6,79E-01 5,69E-01 Lần 3 3,125 µg/mL 7,37E- 01 6,85E- 01 6,93E- 01 25 µg/mL 5,15E- 01 4,05E- 01 5,21E- 01 50 µg/mL 4,53E- 01 4,62E- 01 4,05E- 01 100 µg/mL 3,29E- 01 3,72E- 01 3,58E- 01

Thýì Tý, Thaìng MýõÌi 16, 2019, 1:21:24 PM

Passed (P = 0,349) Passed (P = 0,754)

N Missing Mean Std Dev SEM 0 0,705 0,0281 0,0162 0 0,6840,00725 0,00419 0 0,585 0,0171 0,00989 0 0,480 0,0651 0,0376 0 0,440 0,0304 0,0175 0 0,353 0,0219 0,0126

1 2 3 4 5 6 Cách tính giá trị IC50 y = -14,66ln(x) + 116,27 R² = 0,978 IC50 =91,74 One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name 3 Col 1 3 Col 2 3 Col 3 3 Col 4 3 Col 5 Col 6 3 Giá tri OD ở từng mẫu thí nghiệm

6,25 µg/mL 0,5622 0,0132 50 µg/mL 0,426 0,0381 100 µg/mL 0,3983 0,0823 Mean Std

25 µg/mL 0,4536 0,0142 P MS

12,5 µg/mL 0,5141 3,86E-03 F 52,168 <0,001 SS 50,295 0,0590 120,01360,00113 170,308

3,125 µg/mL 0,5777 6,94E-03 Source of Variation DF Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0,001),

114

t Unadjusted P Critical Level Significant? 0,003 0,004 0,004 0,004 0,005 0,005 0,006 0,006 0,007 0,009 0,010 0,013 0,017 0,025 0,050 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,003 0,004 0,008 0,168 0,457 12,813 12,044 9,646 8,877 8,428 8,178 7,409 5,261 4,636 4,385 3,792 3,616 3,168 1,468 0,769 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No Power of performed test with alpha = 0,050: 1,000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0,05 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means Col 1 vs, Col 6 0,352 Col 2 vs, Col 6 0,331 Col 1 vs, Col 5 0,265 Col 2 vs, Col 5 0,244 Col 3 vs, Col 6 0,231 Col 1 vs, Col 4 0,225 Col 2 vs, Col 4 0,203 Col 3 vs, Col 5 0,144 Col 4 vs, Col 6 0,127 Col 1 vs, Col 3 0,120 Col 3 vs, Col 4 0,104 Col 2 vs, Col 30,0993 Col 5 vs, Col 60,0870 Col 4 vs, Col 50,0403 Col 1 vs, Col 20,0211

1 2 3 4 5 6 Cao EA Giá trị OD ở từng mẫu thí nghiệm

Lần 1

Lần 2

Lần 3 3,125 µg/mL 5,86E- 01 5,64E- 01 5,83E- 01 6,25 µg/mL 5,62E- 01 5,85E- 01 5,39E- 01 12,5 µg/mL 5,22E- 01 5,10E- 01 5,10E- 01 25 µg/mL 4,25E- 01 4,66E- 01 4,70E- 01 50 µg/mL 5,01E- 01 3,97E- 01 3,79E- 01 100 µg/mL 2,34E- 01 4,89E- 01 4,71E- 01

Cách tính giá trị IC50 y = -7,719ln(x) + 89,153 R² = 0,9764 IC50 = 159,17

1 2 3 4 5 6

Giá trị OD ở từng mẫu thí nghiệm

12,5 g/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 6,25 µg/mL 100 µg/mL

3,125 µg/mL 0,5777 0,5622 0,5141 0,4536 0,4260 0,3983 Mean

115

0,0132 3,8587e-3 0,0142 0,0381 0,0823 Std 6,9414e- 3

One Way Analysis of Variance Thýì Tý, Thaìng MýõÌi 16, 2019, 2:15:59 PM

Failed (P < 0,050)

75 % 25 %

0,569 0,545 0,510 0,435 0,384 0,293 0,586 0,579 0,519 0,469 0,475 0,485 0 0,583 0 0,562 0 0,510 0 0,466 0 0,397 0 0,471

3,785 No 3,677 Do Not Test 3,569 Do Not Test 1,730 Do Not Test 0,541 Do Not Test 3,244 Do Not Test 3,136 Do Not Test 3,028 Do Not Test 1,190 Do Not Test 2,055 Do Not Test 1,947 Do Not Test 1,839 Do Not Test 0,216 Do Not Test 0,108 Do Not Test 0,108 Do Not Test P<0,05

Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Test execution ended by user request, ANOVA on RanKhổ sâm begun Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on RanKhổ sâmThýì Tý, Thaìng MýõÌi 16, 2019, 2:15:59 PM Data source: Data 1 in Notebook1 Group N Missing Median Col 1 3 Col 2 3 Col 3 3 Col 4 3 Col 5 3 Col 6 3 H = 14,380 with 5 degrees of freedom, (P = 0,013) The differences in the median values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = 0,013) To isolate the group or groups that differ from the others use a multiple comparison procedure, All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Tukey Test): ComparisonDiff of RanKhổ sâm Col 1 vs Col 535,000 Col 1 vs Col 434,000 Col 1 vs Col 633,000 Col 1 vs Col 316,000 Col 1 vs Col 2 5,000 Col 2 vs Col 530,000 Col 2 vs Col 429,000 Col 2 vs Col 628,000 Col 2 vs Col 311,000 Col 3 vs Col 519,000 Col 3 vs Col 418,000 Col 3 vs Col 617,000 Col 6 vs Col 5 2,000 Col 6 vs Col 4 1,000 Col 4 vs Col 5 1,000 Note: The multiple comparisons on ranKhổ sâm do not include an adjustment for ties, A result of "Do Not Test" occurs for a comparison when no significant difference is found between the two rank sums that enclose that comparison, For example, if you had four rank sums sorted in order, and found no significant difference between rank sums 4 vs, 2, then you would not test 4 vs, 3 and 3 vs, 2, but still test 4 vs, 1 and 3 vs, 1 (4 vs, 3 and 3 vs, 2 are enclosed by 4 vs, 2: 4 3 2 1), Note that not testing

116

the enclosed rank sums is a procedural rule, and a result of Do Not Test should be treated as if there is no significant difference between the rank sums, even though one may appear to exist,

1 2 3 4 5 6  Cao EOTH Giá trị OD ở từng mẫu thí nghiệm

Lần 1

Lần 2

Lần 3 3,125 µg/mL 6,50E- 01 6,60E- 01 6,02E- 01 6,25 µg/mL 6,55E- 01 6,61E- 01 6,72E- 01 12,5 µg/mL 6,36E- 01 6,52E- 01 6,88E- 01 25 µg/mL 6,29E- 01 6,56E- 01 6,77E- 01 50 µg/mL 5,71E- 01 5,63E- 01 5,80E- 01 100 µg/mL 4,82E- 01 4,98E- 01 5,24E- 01

Wednesday, October 09, 2019, 12:05:49 PM

Passed (P = 0,763) Passed (P = 0,523)

N Missing Mean Std Dev SEM 0 0,637 0,0313 0,0181

50 µg/mL 100 µg/mL

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name 3 Col 1 3,125 µg/mL 0,6375 0,0181 3,80E-02 0,5012 0,0123 4,06E-02 0,5713 4,84E-03 3,82E-02 25 µg/mL 0,6539 0,0137 3,76E-02 6,25µg/mL 0,6626 5,21E-03 3,66E-02

12,5 µg/mL 0,6588 0,0155 4,12E-02 0 0,6630,00903 0,00521 0 0,659 0,0268 0,0155 0 0,654 0,0238 0,0137 0 0,5710,00839 0,00484 0 0,501 0,0213 0,0123

SS 50,0632 0,0126 120,005740,000478 170,0689 F 26,451 <0,001 P

Mean Std control Col 2 3 3 Col 3 3 Col 4 3 Col 5 Col 6 3 Source of Variation DF Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0,001), Power of performed test with alpha = 0,050: 1,000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0,05 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means Col 2 vs, Col 60,161 Col 3 vs, Col 60,158 t Unadjusted P Critical Level Significant? <0,001 <0,001 0,003 0,004 9,045 8,831 Yes Yes

117

<0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,002 0,003 0,184 0,255 0,377 0,633 0,787 0,834 8,555 7,637 5,119 4,904 4,628 3,926 3,710 1,409 1,194 0,918 0,490 0,276 0,215 0,004 0,004 0,005 0,005 0,006 0,006 0,007 0,009 0,010 0,013 0,017 0,025 0,050 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No No No No No Col 4 vs, Col 60,153 Col 1 vs, Col 60,136 Col 2 vs, Col 50,0914 Col 3 vs, Col 50,0875 Col 4 vs, Col 50,0826 Col 5 vs, Col 60,0701 Col 1 vs, Col 50,0662 Col 2 vs, Col 10,0251 Col 3 vs, Col 10,0213 Col 4 vs, Col 10,0164 Col 2 vs, Col 40,00875 Col 3 vs, Col 40,00492 Col 2 vs, Col 30,00383

 Cao H2O

1 2 3 4 5 6 Giá trị OD ở từng mẫu thí nghiệm

Lần 1

Lần 2

Lần 3 3,125 µg/mL 6,51E- 01 7,08E- 01 6,94E- 01 6,25 µg/mL 6,95E- 01 7,00E- 01 6,96E- 01 12,5 µg/mL 7,06E- 01 7,11E- 01 6,52E- 01 25 µg/mL 7,04E- 01 6,78E- 01 6,49E- 01 50 µg/mL 6,48E- 01 6,33E- 01 6,41E- 01 100 µg/mL 5,07E- 01 5,07E- 01 5,02E- 01

3,125 µg/mL 12,5 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL

0,677

0,5053 0,6409 0,0161 4,28E-03 1,83E-03 4,66E-02 4,52E-02 4,35E-02 6,25µg/mL 0,697 1,63E-03 4,47E-02

0,6898 0,684 Mean 0,0188 Std 0,0172 control 4,52E-02 4,57E-02 One Way Analysis of Variance Wednesday, October 09, 2019, 12:08:41 PM

Data source: Data 1 in Notebook2

Passed (P = 0,100) Passed (P = 0,362)

N Missing Mean Std Dev SEM 0 0,684 0,0298 0,0172 0 0,6970,00283 0,00163 0 0,690 0,0325 0,0188 0 0,677 0,0278 0,0161 0 0,6410,00741 0,00428 0 0,5050,00317 0,00183

MS Normality Test: Equal Variance Test: Group Name 3 Col 1 3 Col 2 3 Col 3 3 Col 4 3 Col 5 Col 6 3 Source of Variation DF Between Groups SS 50,0801 0,0160 F 34,459 <0,001 P

118

120,005580,000465 170,0856

t Unadjusted P Critical Level Significant? 0,003 0,004 0,004 0,004 0,005 0,005 0,006 0,006 0,007 0,009 0,010 0,013 0,017 0,025 0,050 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,008 0,017 0,031 0,063 0,278 0,475 0,480 0,691 0,697 0,747 10,890 10,482 10,152 9,753 7,701 3,189 2,781 2,451 2,052 1,136 0,738 0,729 0,408 0,399 0,330 Yes Yes Yes Yes Yes No No No No No No No No No No

Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0,001), Power of performed test with alpha = 0,050: 1,000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0,05 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means Col 2 vs, Col 60,192 Col 3 vs, Col 60,185 Col 1 vs, Col 60,179 Col 4 vs, Col 60,172 Col 5 vs, Col 60,136 Col 2 vs, Col 50,0561 Col 3 vs, Col 50,0490 Col 1 vs, Col 50,0431 Col 4 vs, Col 50,0361 Col 2 vs, Col 40,0200 Col 2 vs, Col 10,0130 Col 3 vs, Col 40,0128 Col 2 vs, Col 30,00718 Col 1 vs, Col 40,00702 Col 3 vs, Col 10,00581 2, Dòng tế bào HepG2

 Cao CHCl3

1 2 3 4 5 6 Giá trị OD ở từng mẫu thí nghiệm

25 µg/mL 3,125 µg/mL 6,25 µg/mL 12,5 µg/mL

1,45E+00 1,43E+00 1,46E+00 1,34E+00 Lần 1

1,54E+00 1,51E+00 1,45E+00 1,25E+00 Lần 2

1,63E+00 1,59E+00 1,54E+00 1,40E+00 Lần 3 50 µg/mL 6,61E- 01 6,67E- 01 6,33E- 01 100 µg/mL 2,45E- 01 1,95E- 01 2,18E- 01

Công thức tính giá trị IC50 y=-47,01ln(x) + 229,92 R² = 0,9804 3,827=ln(x) IC50 = 45,92

119

1 2 3 4 5 6 Giá trị OD ở từng mẫu thí nghiệm

3,125 µg/mL 1,5389 5,04E-02 6,25 µg/mL 1,5107 0,0459 12,5 µg/mL 1,4856 0,028 50 µg/mL 0,6536 0,0105 25 µg/mL 1,3291 0,0419 Mean Std

100 µg/mL 0,2193 0,0144 Thýì Tý, Thaìng Chiìn 18, 2019, 5:13:04 PM

Passed (P = 0,456)

SEM

Passed (P = 0,086) N Missing Mean Std Dev 0 1,539 0,0873 0,0504 0 1,511 0,0794 0,0459 0 1,486 0,0484 0,0280 0 1,329 0,0726 0,0419 0 0,654 0,0181 0,0105 0 0,219 0,0249 0,0144

P MS

SS 54,603 0,921 120,04500,00375 174,648 F 245,535 <0,001

<0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,001 0,003 0,009 0,307 0,583 26,395 25,831 25,329 22,199 17,708 17,143 16,641 13,511 8,688 4,196 3,632 3,130 1,067 0,564 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name 3 Col 1 3 Col 2 3 Col 3 3 Col 4 3 Col 5 Col 6 3 Source of Variation DF Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0,001), Power of performed test with alpha = 0,050: 1,000 all Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0,05 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means Col 1 vs, Col 6 1,320 Col 2 vs, Col 6 1,291 Col 3 vs, Col 6 1,266 Col 4 vs, Col 6 1,110 Col 1 vs, Col 5 0,885 Col 2 vs, Col 5 0,857 Col 3 vs, Col 5 0,832 Col 4 vs, Col 5 0,675 Col 5 vs, Col 6 0,434 Col 1 vs, Col 4 0,210 Col 2 vs, Col 4 0,182 Col 3 vs, Col 4 0,156 Col 1 vs, Col 30,0533 Col 1 vs, Col 20,0282 Col 2 vs, Col 3 t Unadjusted P Critical Level Significant? 0,003 0,004 0,004 0,004 0,005 0,005 0,006 0,006 0,007 0,009 0,010 0,013 0,017 0,025 0,0251 0,502 0,625 0,050 No

120

 Cao EA

1 2 3 4 5 6 Giá trị OD ở từng mẫu thí nghiệm

25 µg/mL 3,125 µg/mL 6,25 µg/mL 12,5 µg/mL

1,70E+00 1,71E+00 1,80E+00 1,11E+00 Lần 1

1,66E+00 1,71E+00 1,69E+00 1,16E+00 Lần 2

1,66E+00 1,74E+00 1,77E+00 9,99E-01 Lần 3 50 µg/mL 7,52E- 01 7,45E- 01 6,25E- 01 100 µg/mL 2,12E- 01 2,20E- 01 2,17E- 01

Công thức tính giá trị IC50 y=-45,08ln(x) + 223,66 R² = 0,9878 3,852=ln(x) IC50 = 47,08702

1 2 3 4 5 6 Giá trị OD ở từng mẫu thí nghiệm

12,5 6,25 3,125 µg/mL µg/mL µg/mL 1,7222 1,7556 1,6719 1,44E-02 0,0108 0,0339 25 µg/mL 1,0889 0,0476 50 µg/mL 0,7074 0,041 Mean Std

100 µg/mL 0,2165 2,27E-03 Thýì Tý, Thaìng Chiìn 18, 2019, 5:24:31 PM

Passed (P = 0,236)

Passed (P = 0,436)

N Missing Mean Std Dev SEM 0 1,672 0,0249 0,0144 0 1,722 0,0186 0,0108 0 1,756 0,0588 0,0339 0 1,089 0,0824 0,0476 0 0,707 0,0710 0,0410 0 0,2170,00393 0,00227

MS P

F 448,177 <0,001 SS 56,078 1,216 120,03250,00271 176,111

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name 3 Col 1 3 Col 2 3 Col 3 3 Col 4 3 Col 5 Col 6 3 Source of Variation DF Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0,001), Power of performed test with alpha = 0,050: 1,000

121

t Unadjusted P Critical Level Significant? 0,003 0,004 0,004 0,004 0,005 0,005 0,006 0,006 0,007 0,009 0,010 0,013 0,017 0,025 0,050 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,073 0,260 0,447 36,193 35,407 34,225 24,651 23,865 22,682 20,515 15,678 14,892 13,709 11,542 8,973 1,969 1,182 0,786 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes No No No All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0,05 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means Col 3 vs, Col 6 1,539 Col 2 vs, Col 6 1,506 Col 1 vs, Col 6 1,455 Col 3 vs, Col 5 1,048 Col 2 vs, Col 5 1,015 Col 1 vs, Col 5 0,965 Col 4 vs, Col 6 0,872 Col 3 vs, Col 4 0,667 Col 2 vs, Col 4 0,633 Col 1 vs, Col 4 0,583 Col 5 vs, Col 6 0,491 Col 4 vs, Col 5 0,382 Col 3 vs, Col 10,0837 Col 2 vs, Col 10,0503 Col 3 vs, Col 20,0334

 Cao EtOH

3,125 µg/mL 1,4785 0,0119 12,5 µg/mL 1,5288 0,0377 25 µg/mL 1,4162 7,46E-03 50 µg/mL 1,4782 0,0722 100 µg/mL 1,1997 0,0871

6,25µg/mL 1,5232 0,025 1,40E+00 1,36E+00 1,37E+00 1,27E+00 1,09E+00 Mean Std control 1,47E+00

Passed (P = 0,265) Failed (P < 0,050)

N Missing Mean Std Dev SEM 0 1,479 0,0206 0,0119 0 1,523 0,0432 0,0250 0 1,529 0,0652 0,0377 0 1,416 0,0129 0,00746 0 1,478 0,125 0,0722 0 1,200 0,151 0,0871

MS P

F 6,071 0,005 SS 50,228 0,0456 120,09020,00751 170,318

One Way Analysis of Variance Wednesday, October 09, 2019, 10:40:20 AM Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name 3 Col 1 3 Col 2 3 Col 3 3 Col 4 3 Col 5 Col 6 3 Source of Variation DF Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = 0,005), Power of performed test with alpha = 0,050: 0,898

122

Unadjusted P Critical Level Significant? <0,001 <0,001 0,002 0,002 0,010 0,138 0,156 0,396 0,399 0,488 0,491 0,536 0,540 0,938 0,996 0,003 0,004 0,004 0,004 0,005 0,005 0,006 0,006 0,007 0,009 0,010 0,013 0,017 0,025 0,050 Yes Yes Yes Yes No No No No No No No No No No No All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0,05 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means 4,650 Col 3 vs, Col 60,329 4,571 Col 2 vs, Col 60,323 3,940 Col 1 vs, Col 60,279 3,934 Col 5 vs, Col 60,278 3,059 Col 4 vs, Col 60,217 1,591 Col 3 vs, Col 40,113 1,512 Col 2 vs, Col 40,107 0,880 Col 1 vs, Col 40,0623 0,875 Col 5 vs, Col 40,0619 0,716 Col 3 vs, Col 50,0506 0,710 Col 3 vs, Col 10,0503 0,637 Col 2 vs, Col 50,0451 Col 2 vs, Col 10,0447 0,631 Col 3 vs, Col 20,00559 0,0790 Col 1 vs, Col 50,000384 0,00542

 Cao H2O

3,125 µg/mL 1,5333 0,0183 12,5 µg/mL 1,695 0,055 25 µg/mL 1,5982 0,0856 50 µg/mL 1,6272 0,0799 100 µg/mL 1,5019 0,0508

6,25µg/mL 1,6147 0,0523 1,40E+00

Passed (P = 0,916)

SEM

Passed (P = 0,807) N Missing Mean Std Dev 0 1,533 0,0317 0,0183 0 1,615 0,0906 0,0523 0 1,695 0,0953 0,0550 0 1,598 0,148 0,0856 0 1,627 0,138 0,0799 0 1,502 0,0881 0,0508

F SS

P MS 50,07170,0143 1,281 0,334 120,134 0,0112 170,206

Mean Std 1,36E+00 1,37E+00 1,27E+00 1,09E+00 control 1,47E+00 One Way Analysis of Variance Wednesday, October 09, 2019, 10:42:08 AM Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name 3 Col 1 3 Col 2 3 Col 3 3 Col 4 3 Col 5 Col 6 3 Source of Variation DF Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0,334), Power of performed test with alpha = 0,050: 0,095 The power of the performed test (0,095) is below the desired power of 0,800,

123

Less than desired power indicates you are less likely to detect a difference when one actually exists, Negative results should be interpreted cautiously,

PHỤ LỤC 25: Số liệu thử nghiệm mật đ tế bào HepG2/ giếng

Đƣ ng chuẩn

No, Mật đ tế bào/ giếng 5 × 102 1 × 5 ×103 1 × 104 5 × 104

103

0,207 0,229 0,266 0,953 2,587 1

0,186 0,215 0,305 0,900 3,587 2

0,202 0,249 0,284 0,929 3,773 3

trung

bình 0,198 0,231 0,285 0,927 3,316

HepG2 xử lý cao chiết

No, Nồng độ cao chiết CHCl3 (µg/mL)

Control 3,125 6,25 12,5 25 50 100

1,73 1,70 1,71 1,80 1,11 0,75 0,21 1 OD

1,69 1,66 1,71 1,69 1,16 0,74 0,22 2

1,74 1,66 1,74 1,77 1,00 0,63 0,22 3

No, Nồng độ cao chiết CHCl3 (µg/mL)

Control 3,125 6,25 12,5 25 50 100

24813 24356 24558 25973 15084 9567 1155 Mật 1

đ tế 24189 23676 24491 24195 15952 9452 1277 2

bào/ 3 24969 23690 25024 25469 13423 7594 1227 giếng

124

PHỤ LỤC 26: KẾT QUẢ REAL - TIME PCR

1, Gene p53

Δ Ct ΔΔCt 2

3 6,17 6,006667 6,24 5,506667 6,25 5,836667 1 0,87 1,23 0,93 2 0,72 0,49 0,64 3 0,81 0,82 0,86

1 5,703333 5,213333 5,613333

Mean Std 1 1,01 0,11 2 0,62 0,07 3 0,83 0,01

2, Gene Bax

Δ Ct ΔΔCt

5,43 3,376667 5,08 3,116667 4,87 2,996667 85,83 356,23 0,92 0,91 110,15 429,55 97,23 356,23 1,19

11,85333 11,86333 11,47333

1,01 0,09 97,74 7,03 380,67 24,44

Mean Std

3, Gene Bcl – 2

Δ Ct ΔΔCt

7,73 7,926667 7,65 7,626667 7,72 7,756667 0,86 1,21 0,96 2,74 2,08 2,49 2,39 2,11 2,42

9,183333 8,703333 9,033333

Mean Std 1,01 0,10 2,43 0,19 2,31 0,10

4, Gene Caspase 9

ΔΔCt Δ Ct

0,89 0,99 1,13 1,50 1,49 1,67 1,81 1,74 1,82 4,27 3,996667 4,13 3,906667 3,77 3,646667

4,853333 4,703333 4,513333

125

1,00 0,07 1,55 0,06 1,79 0,03

Mean Std

5, Gene caspase 3

Δ Ct ΔΔCt

6,913333 6,763333 6,603333 4,35 5,106667 3,96 4,886667 3,8 4,476667 0,90 1,00 1,11 5,91 6,98 6,98 3,50 3,67 4,37

Mean Std 1,00 0,06 6,62 0,36 3,85 0,27