Luận án tiến sĩ Sinh học: Đánh giá hoạt động của một số gen liên quan đến tổng hợp, tích lũy tinh bột và thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HỒNG

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HỒNG

ĐÁ NH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔ NG HỢP, TÍCH LŨY TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HỒNG

ĐÁ NH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔ NG HỢP, TÍCH LŨY TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Bích Ngọc

Viện Công nghệ sinh học 2. PGS.TS. Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ sinh học

HÀ NỘI - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của

PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS. Chu Hoàng Hà.

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã

được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của

các đồng tác giả; phần còn lại chưa ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong

luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Tác giả

Nguyễn Thị Minh Hồng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS.

Chu Hoàng Hà đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Bên cạnh đó, tôi xin

chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu của Phòng Công nghệ tế bào thực vật,

phòng Công nghệ ADN ứng dụng của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trung tâm tài nguyên thực vật, Trung tâm

nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc, Trại thực nghiệm sinh học Cổ

Nhuế đã tạo điều kiện cho tôi được tiến hành đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong

khuôn khổ đề tài: “Khai thác và phân lập nguồn gen có sẵn của tập đoàn giống

sắn Việt Nam nhằm phát triển các giống sắn có khả năng chống chịu bệnh và

năng suất cao bằng công nghệ gen” thuộc nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa

học và công nghệ, Bộ Khoa học và Công nghệ; thời gian thực hiện từ 6/2012

đến 6/2015 do PGS.TS. Phạm Bích Ngọc làm chủ nhiệm.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, và

Bộ phận phụ trách đào tạo đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập, nghiên cứu

và hoàn thiện luận án.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Hồng Đức

Thanh Hóa, Lãnh đạo khoa và cán bộ trong bộ môn Khoa học cây trồng, Bảo vệ

thực vật, khoa Nông Lâm Ngư nghiệp, ĐH Hồng Đức đã tạo điều kiện thuận lợi để

tôi yên tâm công tác, học tập và hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Minh Hồng

MỤC LỤC

1 MỞ ĐẦU

4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4

1.1. Cây sắn và một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn ............. 4 4

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại..................................................................................... 4 4

1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền ........................................................ 5 5

1.1.3. Giá trị của cây sắn ............................................................................................. 8 8

1.1.4. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam............................................. 9 9

1.1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn ................................. 13 13

1.1.6. Một số hướng cải tạo giống sắn hiện nay ....................................................... 15 15

1.2. Quá trình hình thành và tích luỹ tinh bột ở cây sắn ......................................... 19

1.2.1. Cấu tạo và vai trò của tinh bột ở thực vật ....................................................... 19 19

1.2.2. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan ....................................... 20 20

1.3. Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống sắn biến đổi gen ........ 27 27

1.3.1. Hệ thống nuôi cấy in vitro cây sắn .................................................................. 27 27

1.3.2. Một số phương pháp chuyển gen ở sắn ........................................................... 32 32

1.3.3. Một số nghiên cứu tạo cây sắn biến đổi gen ................................................... 35 35

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 43 43

2.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 43 43

2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................................. 43 43

2.1.2. Chủng vi khuẩn, vector ................................................................................... 43 43

2.1.3. Hoá chất và thiết bị thí nghiệm ....................................................................... 43 43

2.1.4. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 44 44

2.1.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................... 45 45

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 45 45

2.2.1. Lựa chọn giống sắn và phân nhóm các giống sắn dựa vào các chỉ tiêu đánh giá .............................................................................................................................. 45 45

2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử ................................................................. 45 45

2.2.3. Phương pháp phân lập gen và promoter ......................................................... 51 51

2.2.4. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen ................................................. 52 52

54 2.2.5. Kỹ thuật canh tác, chăm só c các giố ng sắn phu ̣c vu ̣ cho nghiên cứ u ............. 54

iii

2.2.6. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................................... 54 54

2.2.7. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ........................ 55 55

2.2.8. Phương pháp phân tích sự có mặt của gen chuyển ......................................... 56 56

2.2.9. Phương pháp phân tích sự biểu hiện của cây chuyển gen ............................... 57 57

2.2.10. Phương pháp phân tích và xử lí số liệu ......................................................... 60 60

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 61 61

3.1. Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột ....................................................................................... 61 61

3.1.1. Lựa chọn các giống sắn sử dụng ..................................................................... 61 61

3.1.2. Thu mẫu và xử lý mẫu sắn .............................................................................. 62 62

3.1.3. Tách chiết ARN tổng số .................................................................................. 62 63

3.1.4. Tổng hợp cDNA từ ARN tổng số của lá, củ sắn trong các giai đoạn phát triển khác nhau và đánh giá chất lượng cDNA ................................................. 64 64

3.1.5. Thu thập thông tin, thiết kế các cặp mồi thích hợp để phân tích sự biểu hiện của một số gen liên quan tới sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột ....................... 65 65

3.1.6. Phân tích cơ sở dữ liệu về biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp đường và các tiền chất cho tổng hợp tinh bột trên lá và củ sắn ......................................................................................................................... 66

3.2. Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hợp tinh bột và thiết kế vector chuyển gen ..........................................................................................

3.2.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu ............................................................................... 75 66 75 75

3.2.2. Phân lập gen SSIV ở sắn ................................................................................. 76 76

3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen ............................................................................. 82 82

3.3. Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá ............................................................................ 87

3.3.1. Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen chuyển ....................................................................................................................... 87

3.3.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển ................................................................ 92 87 87 91

87 3.3.1. Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen chuyển ....................................................................................................................... 87

3.3.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển ................................................................ 92 92

3.4. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn .............. 99 99

3.4.1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây sắn .................................................... 99 99

3.4.2. Xây dựng và tối ưu quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua gen GUS ......................................................................................................................... 106 106

113

3.4.3. Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột ............. 113 Chương 4. BÀ N LUẬN KẾ T QUẢ ...................................................................... 118 118

4.1. Sự biểu hiện của các gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất tinh bột............................................................................................................. 118

4.2. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây thuốc lá .............................................................................................................................. 122 122

4.3. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn ............ 124 124

4.3.1. Hệ thống tái sinh cây sắn .............................................................................. 124 124

4.3.2. Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua A. tumefaciens ................................... 126 126

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 130 130

TÓM TẮT TIẾNG ANH…………………………………………………… 131

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ…………………………………………...…….. 136

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 137 137

DANH MỤC CÁC BẢNG

Giá trị dinh dưỡng của sắn 9 Bảng 1.1

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng sắn của các vùng trên thế giới trong năm 2014 – 2015 10

Bảng 1.3 Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của Việt Nam từ năm 2010 – 2014 12

29 Bảng 1.4 Một số công trình nghiên cứu tái sinh invitro ở cây sắn

Tổng kết một số công trình công bố về chuyển gen vào cây sắn 36 Bảng 1.5

Bảng 3.1 Đặc điểm của một số giống sắn sử dụng trong phân tích biểu hiện gen 62

Bảng 3.2 Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu RNA tổng số tách chiết từ lá và củ các giống sắn 63

Bả ng 3.3 Cơ sở dữ liê ̣u các gen liên quan đến quá trình sinh tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t ở sắn 66

Trình tự các cặp mồi để khuếch đại các gen quan tâm 75 Bảng 3.4

Bảng 3.5 Trình tự các cặp mồi nhân dòng gen liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột và thiết kế vector chuyển gen 76

Bảng 3.6 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen SSIV ở giống KM140 so với gen tham chiếu 78

Bảng 3.7 Vị trí sai khác trong trình tự axit amin suy diễn của protein SSIV của gen phân lập 79

Bảng 3.8 Chuyển cấu trúc gen pK7WG2D-35S: SSIV:T35S và pBI121- C54: SSIV:NOST vào thuốc lá………………………………... 90

Bảng 3.9

Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong lá và trong rễ cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S ở các dòng chuyển gen 97

Bảng 3.10 Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong rễ cây thuốc lá chuyển gen pBI121 – C54: SSIV: NOST ở các dòng chuyển gen 98

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu và môi trường đến khả năng tạo mô sẹo (sau 3 tuần) 100

102 Bảng 3.12 Tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi trên môi trường CI

104 Bảng 3.13 Tỷ lệ phôi soma tạo cây con

105 Bảng 3.14 Khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu quả chuyển gen giống sắn KM140 108

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của Kanamycin đến khả năng sống sót của mô sẹo chuyển gen GUS ở giống sắn HB80 và KM140 109

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của Kanamycin đến tỷ lệ ra rễ của chồi giống sắn HB80 và KM140 110

Bảng 3.18 Tạo cây sắn HB80 và KM140 chuyển gen GUS thông qua A.tumefaciens 111

114 Bảng 3.19 Chuyển gen pBI121- C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 2.1 Hình 2.2

Đặc điểm cây sắn (Manihot esculenta Crantz) Một số phương pháp phổ biến tạo cây sắn biến đổi gen Công thức hóa học của tinh bột Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan Quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma ở cây sắn Kết quả tạo mô sẹo phôi hoá ở giống sắn TME 14 Trình tự đoạn cmyc và vị trí của các mồi PCR Quá trình canh tác và thu hoa ̣ch các giố ng sắn quan tâm ta ̣i Tra ̣i thực nghiê ̣m sinh học Cổ Nhuế phu ̣c vu ̣ nghiên cứ u Quy trình kiểm tra hàm lượng tinh bột trong lá bằng phương pháp nhuộm iodine

6 18 20 21 31 32 53 54 58 59 Hình 2.3 Hình 2.4

Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ lá cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ rễ cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121 – C54:SSIV: NOST Hình ảnh minh họa vị trí lá và củ sắn

Hình 2.5 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 RNA tổng số tách chiết từ các mẫu củ (A) và lá các giống sắn (B) Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen actin từ cDNA sắn Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPS qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR

Hình 3.5 Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPL qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR

Hình 3.6 Phân tích mức độ biểu hiện gen GBSS qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR

Hình 3.7 Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSI, SSIII, SSIV qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 60 62 63 64 67 68 69 71

Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSII qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR

Hình 3.8 Hình 3.9 Phân tích mức độ biểu hiện của gen SBE qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR

Tách dòng đoạn gen SSIV từ củ sắn Tách dòng promoter C54 ở sắn Thiết kế vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S Thiết kế vector pBI121/cmyc Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST 72 74 77 81 83 84 85 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14

viii

Hình 3.15 Quy trình chuyển gen vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

Hình 3.16 Một số hình ảnh chuyển các gen quan tâm vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A.tumefaciens

Hình 3.17

Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D- 35S:SSIV:T35S bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R

Hình 3.18 Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121- C54:SSIV:NOST

Hình 3.19 Hình 3.20 Hình 3.21 Kết quả Southern blot các mẫu thuốc lá chuyển gen SSIV Ả nh điện di RNA tổng số được tách từ các mẫu thuốc lá chuyển gen Kết quả PCR nhân gen actin từ cDNA của lá từ một số dòng thuốc lá chuyển gen

Hình 3.22 Điê ̣n di sản phẩm RT-PCR của các gen SSIV ở các dòng thuốc lá chuyển gen tương ứng

Hình 3.23 Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S

Hình 3.24 Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI 121 – C54:SSIV: NOST

Hình 3.25 Mô sẹo từ các nguồn nguyên liệu khác nhau Hình 3.26 Các khối mô sẹo phân hóa các giai đoạn mô phôi khác nhau ở 5 giống sắn thí nghiệm

Hình 3.27 Hình 3.28 Chồi và cây sắn tái sinh từ mô sẹo phôi hóa Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biến nạp gen GUS ở giống sắn HB80 và KM140

Hình 3.29 Một số hình ảnh chuyển gen GUS vào giống sắn HB80 và KM140 Hình 3.30 Một số hình ảnh chuyển gen pBI121-C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140

Hình 3.31 Hình 3.32 Cây sắn giống KM140 chuyển gen SSIV được trồng ở nhà lưới Điện di DNA tổng số các dòng sắn chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST

Hình 3.33 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với cặp mồi promoter C54F/SSIV-R

Hình 3.34 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với cặp mồi virF/R 88 89 91 91 92 93 94 95 96 98 101 103 106 107 112 115 115 116 116 117

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

µl Microliter

µM Micromolar

2.4D axit 2,4-diclophenoxiaxetic

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

AGPase ADP-glucose pyrophosphorylase

AS Acetosyringone

6 – Benzyl amino purine BAP

Base pair cặp bazơ nitơ bp

cDNA Complementary DNA

CG Chuyển gen

CIAT International Center for Tropical Agriculture Trung tâm nông nghiệp nhiệt đới quốc tế

Cetyltrimethylammonium bromide CTAB

Cs, et al., Cộng sự, đồng tác giả

DBE enzyme phân rã tinh bột Debranching enzyme

DNA Deoxiribonucleic Acid

Đỏ ĐF Đỏ địa phương

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

EtBr Ethidium Bromid

FEC Friable embryo callus Mô sẹo phôi hóa

GBSS granule-bound synthetase enzyme tổng hợp amylose

β –Glucuronidase gene Gen GUS GUS

HSPs Heat shock proteins

Indol -3- butyric acid IBA

Kilo base Kb

6 – fufuryl amino purine Kinetin

Kanamycin Km

KM140 KM140 (KM98-1 x KM36)

Môi trường LB Luria –Bertani LB

M Thang chuẩn Marker

mRNA RNA thông tin messenger RNA

MS Môi trường MS Murashige and Skoog

MTCL

Mg Miligam

mg/L; mg/mL; ng/g Miligam/lit; miligam/mililit; nanogam/gam

NAA α – Napthyl acetic acid

nptII Neomycin photphotranspherase gene

OD Optical density Mật độ quang học

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

Picloram

4-amino-3,4,5 tricloro pyridine - 2- cacboxylic acid

RM Rooted Medium Môi trường ra rễ

RT-PCR Realtime polymerase chain reaction

SBE Starch branching enzyme enzyme phân nhánh tinh bột

SS Starch synthase Enzyme sinh tổng hợp tinh bột

SSIV Starch synthase IV Enzyme sinh tổng hợp tinh bột nhóm IV

T-DNA Transfer-DNA DNA vận chuyển

Trắng HB Trắng Hòa Bình

Trắng NA Trắng Nghệ An

Working package Nội dung WP

WT Dòng không chuyển gen

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là một trong những loại cây lương thực

chủ lực quan trọng nhất đối với nhiều nước trên thế giới do chúng khả năng cung

cấp carbonhydrate cao, thậm chí trong các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như lượng

mưa thấp, hạn hán hoặc đất nghèo dinh dưỡng.

Hiện nay, trong bối cảnh biến đổi khí hậu làm trái đất nóng lên, nước biển

dâng cao, đe dọa an ninh lương thực thế giới và sự cạn kiệt của nguồn nguyên liệu

hóa thạch thì cây sắn được coi là cây trồng đem lại giải pháp kép nhằm đạt cả hai

mục tiêu: góp phần đảm bảo an ninh lương thực và cung cấp nguyên liệu cho công

nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học, từng bước thay thế nhiên liệu hóa thạch.

Trong kế hoạch 5 năm 2015 - 2020, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

đưa ra chủ trương giảm diện tích trồng sắn và nâng cao năng suất trồng sắn. Kế

hoạch đề ra là diện tích trồng sắn duy trì ổn định khoảng 500.000 ha vào năm 2015

và ổn định diện tích 450.000 ha vào năm 2020, năng suất đạt khoảng 21 tấn/ha. Nếu

đạt được theo kế hoạch với mức sản lượng 11 triệu tấn thì vẫn sẽ xảy ra tình trạng

tranh mua nguyên liệu giữa các nhà máy sản xuất ethanol với các nhà máy thức ăn

chăn nuôi, nhà máy sản xuất tinh bột sắn và lượng sắn dùng cho xuất khẩu.

Tinh bột là thành phần quan trọng đối với thực vật cũng như là nguồn lương

thực và nguyên liệu công nghiệp. Hiện nay, việc cải tiến cây trồng theo hướng tăng

hàm lượng tinh bột là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng và luôn được

các nhà khoa học quan tâm hàng đầu. Do vậy, các nghiên cứu tìm hiểu về con

đường tổng hợp và phân hủy tinh bột ở cây trồng nói chung và đối với sắn nói riêng

sẽ góp phần thúc đẩy mục tiêu cải tạo hàm lượng tinh bột.

Như vậy, ứng dụng công nghệ sinh học nhằm xây dựng hệ thống tái sinh in

vitro và chuyển gen tạo cây sắn có hàm lượng tinh bột cao, phù hợp với mục đích

sử dụng phục vụ cho công nghiệp và xuất khẩu là một vấn đề cấp thiết ở nước ta.

Ngoài ra, các hướng nghiên cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử và di truyền học ở

cây sắn chưa được quan tâm và phát triển nhiều. Đặc biệt, chưa có những nghiên

cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử nhằm khai thác nguồn gen quý sẵn có từ các

giống sắn tại Việt Nam, phục vụ cho công tác cải tạo giống sắn bằng công nghệ gen.

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đề xuất nhiệm vụ nghiên cứu “Đá nh giá hoa ̣t đô ̣ng củ a mô ̣t số gen liên quan đến tổ ng hơ ̣p, tích lũy tinh bô ̣t và thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Bước đầu đã chuyển được gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV dưới

sự điều khiển của promotor đặc hiệu C54 vào giống sắn KM140 nhờ A.tumefaciens

thông qua FEC.

3. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên

quan đến trao đổi chất tinh bột.

Nội dung 2: Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t, thiết

kế vector chuyển gen.

Nội dung 3: Đánh giá khả năng tổng hợp tinh bô ̣t củ a gen SSIV trên cây thuốc

lá mô hình.

Nội dung 4: Chuyển gen SSIV vào cây sắ n.

4. Những đóng góp mới của luận án

+ Đã phân lập và đánh giá được hoạt động của gen SSIV liên quan đến quá

khả năng tổng hợp tinh bột từ lá và củ sắn.

+ Đã thu được những dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pB121-

C54:SSIV-cmyc:NOST với mức độ tích lũy hàm lượng tinh bột cao hơn so với

những dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S từ 19,7

– 48,1% và cao hơn 15,6 – 65,7% so với cây đối chứng.

+ Đây là công trình đầu tiên chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

SSIV dưới sự điều khiển promoter đặc hiệu ở củ C54 vào mô sẹo phôi hóa (FEC)

của giống sắn KM140 thông qua A. tumefaciens. Kết quả bước đầu thu được 7 dòng

sắn chuyển gen dương tính khi kiểm tra với PCR.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

5.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này bao gồm các gen và hệ thống

các vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp tinh

bột, được phân lập từ các giống sắn quan trọng đã được đánh giá chỉ tiêu nông sinh

học tại Việt Nam; cấu trúc vector mang gen đích, chủng vi khuẩn chứa vector mang

gen đích, chủng vi khuẩn chứa vector chuyển gen và các quy trình đánh giá hoạt

động gen chuyển ở mức độ sinh học phân tử. Hơn nữa, hoạt động của các cấu trúc

vector chuyển gen SSIV có tăng khả năng tích lũy tinh bột còn được đánh giá, kiểm

tra thông qua biến nạp vào cây mô hình thuốc lá, cây sắn giống KM140. Đây chính

là tiền đề để phát triển các nghiên cứu ứng dụng tạo nên cây sắn chuyển gen mang

tính trạng có lợi.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn

Đây là đề tài nghiên cứu đầu tiên áp dụng công nghệ gen, công nghệ sinh học

hiện đại nhằm tạo giống sắn năng suất cao tại Việt Nam dựa trên cơ sở khảo sát,

nghiên cứu hệ gen của chính các giống sắn thu thập tại Việt Nam. Do vậy, phạm vi

ứng dụng của đề tài không chỉ ở chuyển gen tăng cường khả năng tổng hợp tinh bột

vào sắn mà còn có thể ứng dụng ở các cây lương thực dự trữ tinh bột khác như

khoai tây, khoai lang.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY SẮN VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG

TINH BỘT Ở SẮN

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại

1.1.1.1. Nguồn gốc

Với những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định cây sắn có nguồn gốc ở

vùng nhiệt đới của châu Mỹ Latinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài

người trồng cách đây 5000 năm. Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật

củ sắn đã được tìm thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước công nguyên ở

Venezuela và khoảng 2000 năm trước công nguyên ở vùng ven biển Peru. Trong

khi đó, những lò nướng bánh sắn phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước

công nguyên đã được tìm thấy ở phía Bắc Colombia và những hạt tinh bột có tuổi

khoảng năm 900 - 200 trước công nguyên trong những phần hóa thạch được phát

hiện tại Mexico cùng một số di tích khảo cổ học khác chứng tỏ cây sắn đã xuất

hiện và được trồng như một loại cây nông nghiệp từ rất lâu đời (Rogers, 1965). Ở

Châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ XVII, Việt Nam và một số

nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ XVIII. Tuy nhiên, đến thế kỷ

XIX, nghề trồng sắn và tiêu thụ sắn mới thực sự phát triển với sự du nhập các kỹ

thuật chế biến ở Brazin bởi các nô lệ. Từ đó đến nay, diện tích, năng suất và sản

lượng sắn ngày một tăng (Trần Ngọc Ngoạn, 2007).

1.1.1.2. Phân loại

Chi Manihot bao gồm những cây có hoa, hạt kín, có hai lá mầm, họ thầu

dầu. Vào năm 1651 Bauhin là người đầu tiên đã dùng danh từ Manihot để chỉ

chi này khi ông mô tả một mẫu cây đã được một thày tu Pháp A. Thevet mang từ

Brazin về, ông đặt tên loài là Manihot theveti. Có thể cho rằng loài cây đó hiện

nay người ta gọi tên là Manihot esculenta Crantz (Rogers, 1965).

Năm 1776, Crantz công bố sự mô tả loài với tên Manihot esculenta, căn cứ

vào một mẫu cây Merian mang về từ Surinam năm 1726. Sau đó nhiều tác giả

đã nghiên cứu về chi Manihot với các cách phân nhóm khác nhau. Đến năm 1938,

Cifferi trở lại cách gọi tên của Crantz, ông dùng lại tên loài M.esculenta và

không còn phân biệt giữa sắn đắng và sắn ngọt, ông cung cấp một quan niệm về

các giống trồng phổ biến (cultivar). Bảng phân loại cuối cùng của Rogers và

Appan (1973) là kết quả của một công trình nghiên cứu rất đầy đủ về chi

Manihot, tiến hành trong 20 năm với phương pháp phân loại số lượng.

1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền

1.1.2.1. Đặc điểm hình thái

* Thân cây

Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ 1 - 3 m. Chiều cao của cây phụ thuộc vào

giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng. Thân sắn có

khả năng phân cành, tuy sự phân cành có ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của cây.

Thân và cành già đã hoá gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng. Số lượng thân

phụ thuộc vào cách đặt hom và số mắt trên hom. Về mặt cấu tạo, lớp cắt ngang thân

sắn có bốn lớp: trong cùng là lõi xốp, tế bào rất lớn; tiếp đến là tầng gỗ; mô mềm của

vỏ và ngoài cùng là lớp biểu bì rất mỏng. Khi nhân vô tính sắn người ta sử dụng các

đoạn hom lấy từ thân cây, vì vậy ngoài việc lựa chọn các đoạn hom đẹp, sạch bệnh,

phải giữ cho lớp biểu bì không bị sây sát vì lớp này có chức năng bảo vệ cho hom

không bị mất nước (Tribadi và cs., 2010; Ceballos & Cruz, 2012).

* Lá sắn

Lá sắn là loại lá đơn mọc xen kẽ trên thân, gồm hai phần cuống lá và phiến lá.

Cuống lá dài từ 3 - 30 cm với nhiều màu sắc khác nhau tuỳ theo giống (màu vàng,

xanh vàng, hồng, đỏ tươi). Phiến lá thường chia 5 - 7 thuỳ nhưng cũng có khi không

chia thuỳ. Lá của cây sắn mọc từ hạt thì phiến lá thường nguyên vẹn hoặc chí thuỳ

không đều. Các cây mọc từ hom, từ chỗ phân cành số thuỳ của phiến lá thường

giảm. Cấu tạo phiến lá gồm một lớp biểu bì phía trên có tầng cutin dày, tầng mô

dậu, tầng mô hổng và biểu bì. Mặt dưới có rất nhiều khí khổng đường kính khoảng

30 µm và có khoảng 700 lỗ/mm (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Tribadi và cs., 2010).

Hình 1.1: Đặc điểm cây sắn (Manihot esculenta Crantz)

Chú thích: A. Cây sắn khi trồng ở ruộng; B. Củ sắn khi thu hoạch; C. Cụm hoa; D. Quả sắn; E. Hạt sắn; F. Cây con nảy mầm từ hạt; G. Thân sắn dùng để trồng cây.

(Nguồn: Liu và cs., 2011)

* Hoa sắn

Hoa sắn là hoa đơn tính cùng gốc, mọc thành cụm, có cuống mọc ra từ chỗ

phân cành, ngọn thân. Một số giống sắn không có hoa do không có sự phân hoá

hoa hoặc do mầm hoa rụng đi. Những cụm hoa sinh ra từ những cành thấp thường

rụng sớm. Cụm hoa gồm một trục dài 2 - 10 cm và các trục bên hợp lại thành chuỳ

(Trần Ngọc Ngoạn, 2007).

Hoa cái có năm lá đài và có màu sắc sặc sỡ, ngoài rìa có lông. Giữa hoa cái có

một bầu hoa 6 cánh, chứa 3 lá noãn nằm ở trên đài. Trên bầu có 3 vòi nhuỵ ngắn với

đầu nhuỵ uốn cong. Hoa đực có 5 lá đài dính với nhau trên một nửa chiều dài, nhẵn

ở bên trong và có lông ở phía ngoài. Có khoảng 8 - 10 nhị đực xếp thành hai vòng

và mọc lên từ các thuỳ của mỗi đĩa phía dưới. Bao phấm mềm, hạt phấn 3 ngăn, dày

dính, màng ngoài hạt phấn có gai nhỏ (Ceballos and Cruz, 2012).

Số lượng hoa của mỗi giống sắn không giống nhau, thường hoa đực sẽ nhiều

hơn hoa cái nhưng hoa cái lại thường nở trước hoa đực để tránh hiện tượng tự thụ

phấn. Hoa cái nở cuối cùng thường nở cùng với hoa đực nở đầu tiên trên cây. Hoa

đực thường nở vào giữa trưa còn hoa cái thường khép lại vào cuối buổi chiều. Bao

phấn bắt đầu mở trước khi hoa nở khoảng 2 giờ và mở hoàn toàn trước khi hoa nở 1

giờ, sau đó phát tán nhờ gió hoặc côn trùng với phạm vi thụ phấn trong khoảng 30

cm. Tuổi thọ của hạt phấn là 1 tuần còn thời gian tiếp nhận hạt phấn của đầu nhuỵ

trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo, chuyển sang màu nâu, khô đi

và rụng chậm nhất sau 1 ngày. Thời gian từ lúc thụ phấn đến thụ tinh kéo dài từ 8 -

19 giờ (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos and Cruz, 2012).

* Quả và hạt

Quả sắn thuộc loại quả nang, mở khi chín, đường kính 1 - 1,5 cm. Quả có 3 ngăn

được tạo thành từ 6 cánh của bầu hoa, mỗi ngăn chứa 1 hạt. Màu sắc quả thường biến

đổi từ lục nhạt, hơi vàng dến lục hay đỏ tía. Cuống quả phình lên ở chỗ tiếp xúc với

quả. Sau khi chín, quả tự mở chỉ còn lại trục giữa của quả. Hạt sắn hình trứng, tiết diện

hơi giống hình tam giác. Hạt có vân hoặc những vết màu đỏ nâu trên nền kem hoặc

xám nhạt (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos & Cruz, 2012).

* Rễ sắn

Rễ sắn có thể mọc ra từ hạt hoặc từ hom (đoạn thân cây được lựa chọn giữ lại làm

giống cho vụ kế tiếp). Rễ mọc từ hạt bắt đầu là một rễ mọc thẳng cắm xuống đất sau đó

các rễ phụ mọc ra, cả rễ cọc và rễ phụ đều có khả năng phát triển thành củ. Rễ mọc ra

từ hom đầu tiên thì mọc ngang sau đó cũng cắm thẳng xuống đất, rễ sắn có hai chức

năng chính là đồng hoá và dự trữ. Rễ đồng hoá thường cắm sâu trong lòng đất có thể

dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng và giúp cho cây vững chắc. Rễ dự trữ (rễ

củ) do các rễ con tập trung dinh dưỡng mà thành. Khi cây mới ra rễ thì có rất nhiều rễ

con nhưng sau đó chỉ có một số rễ con được tập trung dinh dưỡng phát triển thành củ.

Củ sắn thường có dạng hình trụ có thể dài tới 30 cm, có thể có hoặc không có cuống củ

(Ceballos & Cruz, 2012).

1.1.2.2. Đặc điểm sinh thái

Cây Sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc chi Manihot, họ Euphorbiaceae

sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh đến nhiều khu vực khác nhau trên thế

giới (Allem., 2002). Sắn được phân bố phổ biến từ 33o vĩ Bắc đến 33o vĩ Nam.

Sắn được biết đến với hơn 100 tên gọi khác nhau, phụ thuộc vào địa lý nơi trồng.

Ở Mỹ Latinh, sắn có tên gọi là yucca (tiếng Tây Ban Nha) hoặc mandioca (tiếng

Bồ Đào Nha).

Cây sắn yêu cầu khoảng nhiệt độ tối thích khá rộng từ 20 – 40oC. Yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến tuổi thọ lá và chỉ số diện tích lá. Khi nhiệt độ tăng từ 20 – 24oC,

tuổi thọ của lá giảm nhưng tăng số lá mới hình thành. Là cây ưa sáng, cây sắn thích

hợp với thời gian chiếu sáng 12h/ngày để tích luỹ tinh bột về củ (Keating và cs.,1998).

1.1.2.3. Đặc điểm di truyền

Chi Manihot thuộc họ thầu dầu, có tới hơn 300 chi và 8000 loài hầu hết là

cây nhiệt đới. Đặc điểm của họ thầu dầu là thường hay có mạch, nhựa mủ. Chi

Manihot thuộc nhóm Manihotae. Tất cả các loài trong chi đều có số lượng nhiễm

sắc thể 2n= 36.

Rogers & Appan (1973) đã xây dựng một bảng phân loại cho 98 loài thuộc

chi Manihot, phân thành 17 nhóm. Sự nhận dạng các loài và các nhóm dựa vào sự

phân tích nhiều mặt của đặc điểm hình thái ở các bộ phận trên mặt đất. Nhờ vào

bảng phân loại người ta đã lập được một bảng nhận dạng các loài trong chi.

1.1.3. Giá trị của cây sắn

Sắn là một trong 3 cây lương thực quan trọng nhất thế giới sau lúa và ngô

(Kim và cs., 2010). Củ sắn có hàm lượng tinh bột cao với khoảng 84 - 87% khối

lượng khô, là nguồn cung cấp carbonhydrate cho hơn 500 triệu người ở các

vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới cũng như hơn 1 tỷ người trên thế giới. Trong củ sắn

cũng có một số loại axit amin chứa lưu huỳnh tuy lượng không nhiều và hàm

lượng thấp các protein, chất béo, một số chất khoáng (P, K, Mg,...) và vitamin

(B1, B2,...) (Trần Ngọc Ngoạn, 2007).

Bên cạnh vai trò cung cấp tinh bột làm thức ăn cho người và động vật, sắn

còn góp phần vào sự đa dạng về kinh tế và tạo cơ hội cho phát triển công nghiệp

nhẹ, công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học với hơn 80 quốc gia có khả

năng phát triển ngành công nghiệp từ sắn (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Abrahamian

& Kantharajah, 2011). Tinh bột sắn được dùng để sản xuất các loại bánh, kẹo, bột

ngọt, mì ăn liền, làm phụ gia dược phẩm và đặc biệt, sắn được sử dụng làm nguồn

nguyên liệu quan trọng để sản xuất cồn sinh học đem lại hiệu suất và hiệu quả

kinh tế cao. Thân sắn dùng để sản xuất nấm, nguyên liệu cho công nghiệp

xenlulozơ và nguyên liệu để sản xuất một số sản phẩm khác như màng phủ sinh

học, chất giữ ẩm, bao bì và phụ gia dược phẩm (Trần Ngọc Ngoạn, 2007).

Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng của sắn

Thành phần

Sắn 30 - 40 27 - 36 0,5 - 2,5 0,5 - 2,0 1,0 0,5 0,5 - 1,5 17 50 607 Cyanogenes 22 - 25 5 - 50 15 -29 700 - 1100

Tỷ lệ chất khô (%) Hàm lượng tinh bột (%) Đường tổng số (% FW) Đạm tổng số (%FW) Chất xơ (%FW) Chất béo (%FW) Chất khoáng (%FW) Vitamin A (mg/100gFW) Vitamin C (mg/100gFW) Năng lượng (KJ/100g) Yếu tố hạn chế dinh dưỡng Tỷ lệ trích tinh bột (%) Kích thước hạt bột (micron) Amylose (%) Độ dính tối đa (BU) Nhiệt độ hồ hóa (OC) 49 -73

(Nguồn: Christopher et al., 1995)

Giá trị chủ yếu của cây sắn là hàm lượng tinh bột tập trung ở rễ (củ). Củ sắn

giàu chất bột, năng lượng, khoáng, vitamin C, hạt bột sắn nhỏ mịn, độ dính cao

nhưng nghèo chất béo và nhất là nghèo đạm, hàm lượng các acid amin không cân

đối, thừa arginin nhưng thiếu các acid amin chứa lưu huỳnh. Tùy theo giống sắn, vụ

trồng, số tháng thu hoạch sau trồng và kỹ thuật phân tích mà tổng số vật chất khô và

hàm lượng đạm, béo, khoáng, xơ, đường, bột có sự thay đổi.

1.1.4. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam

1.1.4.1. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới

Theo nghiên cứu thị trường sắn toàn cầu của Tổ chức Lương thực và Nông

nghiệp Quốc tế (FAO) và Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực thế giới (IFPRI),

với tầm nhìn đến năm 2020 sản lượng sắn toàn cầu ước đạt 275,10 triệu tấn, trong

đó sản xuất sắn chủ yếu ở các nước đang phát triển là 274,7 triệu tấn, các nước đã

phát triển khoảng 0,4 triệu tấn. Mức tiêu thụ sắn ở các nước đang phát triển dự báo

đạt 254,60 triệu tấn so với các nước đã phát triển là 20,5 triệu tấn. Khối lượng sản

phẩm sắn toàn cầu sử dụng làm lương thực thực phẩm dự báo nhu cầu là 176,3 triệu

tấn và thức ăn gia súc 53,4 triệu tấn. Tốc độ tăng hàng năm của nhu cầu sử dụng sản

phẩm sắn làm lương thực, thực phẩm và thức ăn gia súc đạt tương ứng là 1,98% và

0,95%. Hiện nay, Châu Phi vẫn là khu vực dẫn đầu sản lượng sắn toàn cầu với dự

báo sản lượng năm 2020 sẽ đạt 168,6 triệu tấn. Trong đó, khối lượng sản phẩm sử

dụng làm lương thực thực phẩm là 77,2%, làm thức ăn gia súc là 4,4%. Châu Mỹ

Latinh giai đoạn 1993 - 2020, ước tính tốc độ tiêu thụ sản phẩm sắn tăng hàng năm

là 1,3%, so với châu Phi là 2,44% và châu Á là 0,84 - 0,96%. Cây sắn tiếp tục giữ

vai trò quan trọng trong nhiều nước châu Á, đặc biệt là các nước vùng Đông Nam Á

- nơi cây sắn có tổng diện tích đứng thứ ba sau lúa và ngô và tổng sản lượng đứng

thứ ba sau lúa và mía (Hoàng Kim, 2013).

Bảng 1.2: Diện tích, năng suất, sản lượng sắn của các khu vực trên thế giới

trong năm 2014 – 2015

Khu vực

Diện tích (ha)

2014 Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (tấn)

Diện tích (ha)

2015 Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (tấn)

23.939.301

11,004

263.439.862 24.225.200

11,157 270.278.871

Thế giới

17.260.853

8,364

144.365.483 17.526.870

8,376 146.810.039

Châu Phi

2.473.942

12,344

30.537.649

2.542.061

12,921

32.844.935

Châu Mĩ

4.183.664

21,104

88.293.119

4.134.373

21,859

90.372.457

Châu Á

20.842

11,688

243.611

21.896

11,483

251.440

Châu Đại Dương

(Nguồn: http://faostat3.fao.org)

Theo thống kê của Faostat (2015) tổng sản lượng sắn trên thế giới là 270,2

triệu tấn, tập trung chủ yếu ở châu Phi với xấp xỉ 147 triệu tấn (tăng khoảng 2,5

triệu tấn so với năm 2014), trong đó Nigeria là nước có tổng sản lượng cao nhất thế

giới là 54,8 triệu tấn, năng suất trung bình 70 tấn/ha. Châu Á có sản lượng là 90,3

triệu tấn (cao hơn 2 triệu tấn so với năm 2014), trong đó Ấn Độ là nước có tổng sản

lượng cao nhất với 8,1 triệu tấn và năng suất 35,6 tấn/ha. Trong khi ở châu Mĩ sản

lượng là 32,8 triệu tấn (cao hơn 2,3 triệu tấn đạt được 2014), với năng suất trung

bình 21,8 tấn/ha (Bảng 1.2). Diện tích canh tác sắn trên thế giới vẫn tăng trong

những năm gần đây (chỉ có ở Châu Á là giảm nhẹ).

1.1.4.2. Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam

Sắn được trồng khá phổ biến ở Việt Nam và đã từ lâu được xem là cây lương

thực và thức ăn gia súc quan trọng sau lúa và ngô. Sắn chủ yếu dùng để bán

(48,6%), dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến thủ công (16,8%) và khoảng

12,2% dùng tiêu thụ tươi (Trần Ngọc Ngoạn, 2007). Bắt đầu từ những năm 2000,

cây sắn đã được chuyển đổi từ một cây lương thực sang cây công nghiệp. Sắn có

những ưu điểm phù hợp với các hộ nông dân nhỏ và nghèo như: dễ trồng, hợp nhiều

loại đất, chịu được đất nghèo dinh dưỡng và các mùa khô hạn, ngoài ra sắn có thể

nằm trong đất từ 7 tháng đến 2 năm sau khi trồng và thu hoạch khi cần thiết, vốn

đầu tư thấp, phù hợp khả năng kinh tế với nhiều hộ gia đình nông dân nghèo, thiếu

lao động, tận dụng đất để lấy ngắn nuôi dài. Tại Việt Nam, sắn được canh tác phổ

biến ở hầu hết các tỉnh của các vùng sinh thái nông nghiệp từ Bắc đến Nam. Diện

tích sắn trồng nhiều nhất ở vùng Đông Nam Bộ, vùng Tây Nguyên, vùng núi và

trung du phía Bắc, vùng ven biển Nam Trung Bộ và vùng ven biển Bắc Trung Bộ.

Thông thường, sắn được trồng chính vụ vào khoảng từ tháng 2 đến tháng 4 và thu

hoạch sau khoảng 7 - 10 tháng tùy thuộc điều kiện khí hậu từng vùng. Theo thông

báo tại Hội nghị toàn cầu về cây sắn 2011 tại Thái Lan thì từ năm 2000 đến 2010,

diện tích trồng sắn của Việt Nam đã tăng từ 237,6 nghìn ha tới 560,4 nghìn ha, năng

suất tăng từ 8,36 tấn/ha đến 16,90 tấn/ha và sản lượng tăng từ 1,99 lên tới 9,45 triệu

tấn. Hiện tại 70% sản lượng là dành cho xuất khẩu. Năm 2010, mặc dù năng suất

sắn vẫn đạt ở mức cao khoảng 17,0 tấn/ha nhưng sản lượng sắn cả nước chỉ đạt 8,52

triệu tấn, tức giảm 0,4% so với năm 2009 do diện tích trồng sắn đã giảm 2,5% còn

560.000 ha. Dự kiến năm 2020 diện tích giảm còn 450.000 ha nhưng năng suất tăng

21,0 tấn/ha.

Bên cạnh đó sắn cũng là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu và tiêu thụ trong

nước, là nguyên liệu chính để chế biến bột ngọt, bio-ethanol, mì ăn liền, bánh kẹo,

siro, nước giải khát, bao bì, ván ép, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học và chất

giữ ẩm cho đất. Mỗi năm Việt Nam xuất khẩu trên 4 triệu tấn sản phẩm từ cây sắn,

đứng thứ hai khu vực, sau Thái Lan. Tuy nhiên, tỷ lệ hao hụt trong thu hoạch, vận

chuyển còn rất lớn, chiếm khoảng 10% tổng sản lượng. Toàn quốc hiện có trên 60

nhà máy chế biến tinh bột sắn với tổng công suất khoảng 3,8 triệu tấn củ tươi/năm

và nhiều cơ sở chế biến sắn thủ công rải rác tại hầu hết các tỉnh trồng sắn. Việt Nam

hiện sản xuất mỗi năm khoảng 800.000 – 1.200.000 tấn tinh bột sắn, trong đó trên

70% xuất khẩu và gần 30% tiêu thụ trong nước.

Bảng 1.3: Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của Việt Nam từ năm 2010 – 2016

Năm

Diện tích (nghìn ha) 489,0 558,2 551,8 554,1 552,7 567,9 569,9

Năng suất (tấn/ha) 17,3 17,7 17,6 17,9 18,5 18,6 19,1

Sản lượng (nghìn tấn) 8595,6 9897,9 9735,7 9757,6 10209,8 10739,9 10931,8

2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016

(Nguồn: https://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=717)

Trung Quốc là thị trường đầu ra lớn nhất cho các sản phẩm sắn xuất khẩu của

Việt Nam trong năm 2010, chiếm tới 94,8% tổng kim ngạch xuất khẩu sắn lát. Tuy

nhiên, năm 2010 nhu cầu tiêu dùng sắn cho các ngành chế biến trong nước tăng

mạnh khiến nguồn cung dành cho xuất khẩu giảm. Theo báo cáo thường niên

ngành sắn và tinh bột sắn Việt Nam năm 2015 và triển vọng 2016 của AgroMonitor,

tổng cầu sắn củ tươi dành cho các ngành sản xuất trong nước năm 2015 là khoảng

10,73 triệu tấn gồm: i) Sản xuất ethanol; ii) Tiêu dùng cho người và sản xuất thức

ăn chăn nuôi: 3,67 triệu tấn; iii) Sản xuất tinh bột sắn: 1,8 triệu tấn; iv) Lượng sắn

củ tươi còn lại dành cho xuất khẩu chỉ vào khoảng 200.000 tấn.

Việt Nam trong thời gian gần đây đang phát triển chính sách E5, E10 và

yêu cầu sản xuất từ 100 đến 150 triệu lít mỗi năm. Thủ tướng Chính phủ đã phê

duyệt "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm

2025" nhằm mục đích để sản xuất nhiên liệu sinh học và một phần thay thế nhiên

liệu truyền thống. Điều này sẽ đóng góp vào an ninh năng lượng và bảo vệ môi

trường. Tập đoàn dầu khí Việt Nam có kế hoạch xây dựng ba nhà máy sắn sản

xuất ethanol ở miền Bắc (Phú Thọ), miền Trung (Quảng Ngãi) và miền Nam

(Bình Phước) với tổng công suất dự kiến khoảng 300 triệu lít mỗi năm. Để thực

hiện lộ trình sử dụng xăng sinh học E5 như đã đề ra năm 2015 cần khoảng gần 4

triệu tấn sắn tươi; năm 2020 cần khoảng 5,5 triệu tấn và đến năm 2025 cần khoảng

6,8 - 8,0 triệu tấn. Nếu căn cứ vào mức sản lượng sắn như hiện tại thì vào năm

2025, khi tất cả các nhà máy đều đi vào hoạt động với công suất tối đa, cả nước sẽ

thiếu khoảng 2,2 - 2,5 triệu tấn sắn tươi nguyên liệu.

Sự phát triển của ngành sắn hiện nay cho thấy nhu cầu cấp bách trong công tác

hoạch định chiến lược phát triển dài hạn cho ngành này, trong đó có tính đến các

khía cạnh cân đối cung cầu về xuất khẩu, nguồn cung nguyên liệu thức ăn chăn

nuôi, sản xuất ethanol, quỹ đất và đặc biệt cần có các hướng đầu tư nghiên cứu để

tăng năng suất của cây sắn tại Việt Nam.

1.1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn

1.1.5.1. Giống

Hàm lượng tinh bột trong củ sắn là yếu tố chất lượng quan trọng quyết định

giống có được chấp nhận hay không. Trong quá trình chọn tạo giống sắn các dòng

có hàm lượng tinh bột < 25% sẽ không được lựa chọn.

Hàm lượng tinh bột là tính trạng rất khó cải thiện bằng các biện pháp kỹ

thuật canh tác tuy nhiên lại bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian thu hoạch,

giống, lượng mưa… Mỗi giống có khả năng giữ tinh bột ở mức độ khác nhau, tuỳ

thuộc vào khả năng đó mà có thể phân ra giống ngắn ngày, trung ngày, dài ngày.

Tại Việt Nam, kết quả khảo sát ở 250 giống sắn đã thống kê được 34 giống

sắn có hàm lượng tinh bột cao (28 - 29,5%): SM 937-26; KM313-3; Gòn... (Phạm

Bích Ngọc., 2016), (Phu ̣ lu ̣c 1). Những giống có đặc tính quý này cần được lưu giữ

để làm nguồn gen cho các nghiên cứu tiếp theo: chọn bố mẹ cho các phép lai, làm

nguồn vật liệu đột biến tạo biến dị có lợi trong công tác chọn giống (Nguyễn Hữu

Hỷ và cs., 2012).

1.1.5.2. Yếu tố quang hợp

Sản phẩm thu hoạch chủ yếu ở cây sắn là củ. Ngay sau trồng 28 ngày, một

lượng lớn hạt tinh bột đã được hình thành ở mạch gỗ của từng nhu mô rễ củ. Tuy

nhiên, việc phân tích trong thời gian này không có khả năng phân biệt được giữa rễ

và củ mà sau này nhờ vào quá trình tích lũy tinh bột để trở thành củ và còn một số

rễ vẫn chỉ là rễ thường. Vào khoảng 6 tuần sau khi trồng, một số rễ củ bắt đầu lớn

lên một cách nhanh chóng. Số củ được quyết định từ 2 - 3 tháng sau trồng và ít có

sự thay đổi trong quá trình sinh trưởng ở hầu hết các giống sắn. Các tác giả cho rằng

củ bắt đầu tích lũy khi sự cung cấp hydratcacbon vượt quá yêu cầu sinh trưởng của

thân lá (Keating và cs., 1998).

Một trong những đặc điểm khác biệt của cây sắn so với cây ngũ cốc khác là

cây sắn có sự phát triển đồng thời giữa phát triển thân lá và tích lũy tinh bột vào củ.

Có nghĩa sản phẩm quang hợp được phân phối cho duy trì và phát triển thân lá mới

và phình to của củ. Như vậy, năng suất sắn củ phụ thuộc vào khả năng quang hợp

của lá và sự phân phối vật chất khi hình thành cho các bộ phận khác nhau của cây.

Có thể nói là có sự cạnh tranh giữa bộ phận trên mặt đất và dưới mặt đất về sử dụng

sản phẩm của quang hợp.

1.1.5.3. Nhiệt độ, ánh sáng

Cây sắn yêu cầu khoảng nhiệt độ tối thích khá rộng từ 20 – 40oC. Yếu tố nhiệt

độ ảnh hưởng đến tuổi thọ lá và chỉ số diện tích lá. Khi nhiệt độ tăng từ 20 – 24oC,

tuổi thọ của lá giảm nhưng tăng số lá mới hình thành (Keating và cs.,1998). Từ đó

tác động đến quan hệ giữa quang hợp và hô hấp của cây, năng suất của củ.

Trong điều kiện ngày dài đêm ngắn cây sắn thường tăng cường tích lũy tinh

bột về củ. Độ dài ngày thích hợp để tích lũy tinh bột về củ là 12h/ngày. Khi bị che

bóng 60% ánh sáng so với không che bóng, năng suất củ bị giảm tới 36% (Keating

và cs., 1998)

Mặc dù sắn là cây trồng chịu hạn, thậm chí có thể hạn kéo dài tới 5 - 6 tháng.

Song hạn hán kéo dài làm năng suất củ bị giảm đáng kể. Do chỉ số diện tích lá giảm

nhanh trong điều kiện khô hạn (CIAT 1987-1989) dẫn đến năng suất củ khô trung

bình giảm 14%, năng suất thân lá giảm 38%, năng suất sinh vật học giảm 22%, hệ

số thu hoạch tăng 9%. Nhưng cũng có những dòng sắn biểu thị khả năng chịu hạn

tốt như dòng CM4013-l, năng suất củ khô trong điều kiện thiếu nước đạt tới 11,5

tấn/ha, tăng 0,6 tấn/ha so với một số dòng sắn trồng trong điều kiện không thiếu

nước (CIAT, 1992). Các dòng có khả năng thích ứng với điều kiện thiếu nước và đủ

nước thường có chỉ số diện tích lá cao hơn chỉ số diện tích lá tối ưu.

1.1.5.4. Thời vụ

Sắn là cây hàng năm có thời gian sinh trưởng dài, thời vụ trồng có các điều

kiện khí hậu khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh trưởng và năng suất

củ. Ở châu Á nói chung có hai thời vụ chính để trồng sắn là vào đầu mùa mưa và

cuối mùa mưa. Vụ thứ nhất thường bắt đầu trồng vào từ giữa tháng 4 đến đầu tháng

5. Vụ thứ hai trồng vào tháng 8 và tháng 9. Ở nước ta, những nghiên cứu về thời vụ

trồng sắn ở các tỉnh miền Nam (khí hậu ấm quanh năm, có hai mùa mưa và mùa

khô rõ rệt) đã rút ra kinh nghiệm quý là cần chuẩn bị đất trước khi mùa mưa bắt

đầu, khi có những trận mưa đầu mùa cần nhanh chóng trồng sắn và năng suất sắn

giảm rõ rệt khi trồng sắn muộn (Trần Ngọc Ngoạn, 2007). Hiện tượng sắn hai năm

trên vườn sẽ làm giảm hàm lượng tinh bột đáng kể vì lúc này quá trình phân giải

tinh bột ở củ sắn phát triển mạnh, kích thước phần lõi tăng nhanh, thịt củ hoá gỗ, sẽ

ảnh hưởng nhiều đến chất lượng tinh bột ở củ sắn.

1.1.6. Một số hướng cải tạo giống sắn hiện nay

1.1.6.1. Cải tạo giống sắn bằng kỹ thuật lai hữu tính

CIAT (Trung tâm quốc tế nông nghiệp nhiệt đới) là nơi bảo tồn nguồn gen

giống sắn đứng đầu của thế giới. Hiện tại CIAT đã thu thập, bảo quản được 5.782

mẫu giống sắn và đăng ký tại FAO gồm 5.138 mẫu sắn lai của CIAT, 163 mẫu

giống sắn vùng Châu Á, 19 mẫu giống sắn vùng Châu Phi (Hoàng Kim, 2011).

Trong đó có 35 loài hoang dại được thu thập nhằm sử dụng lai tạo ra giống sắn

kháng sâu bệnh hoặc giàu protein. Những nguồn gen giống sắn nêu trên đã được

CIAT bảo tồn và đánh giá cẩn thận về khả năng cho năng suất, giá trị dinh dưỡng,

thời gian sinh trưởng, khả năng chống chịu sâu bệnh hại cũng như thích ứng với sự

thay đổi của môi trường. Từ đó chọn ra những cặp bố mẹ phục vụ cho công tác cải

tiến giống sắn để trao đổi và lưu giữ nguồn gen với các nước.

Hầu hết những nghiên cứu đối với cây sắn hiện nay tập trung chủ yếu vào việc

chọn tạo các giống sắn có năng suất cao, thời gian sinh trưởng ngắn thông qua các

phương pháp lai tạo truyền thống. Một trong những yếu tố chính góp phần hiệu quả

trong việc nâng cao năng suất và sản lượng sắn là sự tăng cường nghiên cứu, nhập

nội, lai tạo, ứng dụng công nghệ mới trong việc chọn tạo và nhân giống sắn lai

(Trần Công Khanh và cs., 2008). Trước năm 1990, Gòn, H34 và Xanh Vĩnh Phú là

những giống sắn phổ biến ở Việt Nam. Từ năm 1986 đến năm 1993, Trung tâm

Hưng Lộc đã thu thập và tuyển chọn được 3 giống sắn mới là HL20, HL23 và HL24

được canh tác mỗi năm ở các tỉnh phía Nam khoảng 70 000 – 80 000 ha (Trần Công

Khanh và cs., 2009). Giai đoạn 1991 - 2005, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp

miền Nam phối hợp với Chương trình sắn Việt Nam và CIAT đã nhập nội, tuyển

chọn và giới thiệu cho sản xuất 5 giống sắn tốt: KM60, KM94, KM95, SM937-26,

KM98-1 (Trần Công Khanh, 2008). Tổng diện tích các giống sắn mới ở Việt Nam

năm 2005 ước tính đạt 270.000 ha, chiếm 69,2% tổng diện tích sắn của cả nước.

Năm 2007, giống sắn lai KM140 được phát triển bởi các nhà khoa học tại Viện

Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam. Ưu điểm của giống KM140 là thời

gian sinh trưởng ngắn 7-10 tháng, hàm lượng bột tương đương KM94 (tỷ lệ tinh bột

trong củ là ~ 28%), dạng củ đẹp, thịt củ màu trắng, ít đắng, dạng cây thẳng (Trần

Công Khanh và cs., 2008). Hiện nay một số vùng trồng sắn ở Việt Nam: Quảng

Ngãi, Phú Yên, Kon Tum, Tây Ninh,… đã xuất hiện sắn nhiễm bệnh chổi rồng và

đang có nguy cơ bùng phát do người dân có thói quen canh tác những giống cũ, bị

nhiễm bệnh qua hom giống.

Cho tới nay những phương pháp lai tạo truyền thống và việc áp dụng chỉ thị

phân tử đã thành công trong việc tạo ra những giống sắn mới có phẩm chất cao. Tuy

nhiên, trong thực tiễn sản xuất các phương pháp lai tạo truyền thống vẫn còn tồn tại

những vấn đề khó giải quyết tuyệt đối để phát triển và cải tạo cây sắn theo hướng

mong muốn (Phạm Bích Ngọc., 2016).

1.1.6.2. Chọn tạo giống mới bằng phương pháp xử lý đột biến – chọn dòng

Ở Việt Nam, sắn cùng lúa và ngô là ba cây trồng được ưu tiên nghiên cứu phát

triển trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp & Phát triển

Nông thôn. Năm 2013, diện tích trồng sắn toàn quốc đạt 544,30 ngàn ha, năng suất

củ tươi bình quân 17,89 tấn/ha, sản lượng 9,74 triệu tấn (FAOSTAT, 2014). So với

năm 2000, sản lượng sắn Việt Nam đã tăng gấp 3,93 lần, năng suất sắn đã tăng lên

gấp hai lần. Tuy nhiên, năng suất sắn của Việt Nam còn thấp hơn so với một số

nước Đông Nam Á như: Lào (25,17 tấn/ha), Indonesia (22,86 tấn/ha), Thái Lan

(21,82 tấn/ha). Do vậy, để đáp ứng được nhu cầu tăng năng suất và phát triển cây

sắn của cả nước một cách bền vững thì nhất thiết phải có một bộ giống sắn phong

phú cho năng suất và chất lượng cao, thích hợp với nhiều vùng sinh thái của Việt

Nam. Tuy nhiên, trong trường hợp nếu sử dụng phương pháp lai hữu tính truyền

thống có thể mất từ bảy đến tám năm mới tạo ra một giống sắn mới. Do vậy, chọn

tạo giống sắn bằng phương pháp đột biến cũng được xem là một trong các phương

pháp nhằm khắc phục các hạn chế của phương pháp lai tạo. Gần đây phương pháp

chọn tạo giống sắn bằng phương pháp xử lý đột biến bằng nguồn phóng xạ Coban60

đã được đánh giá qua thế hệ M4 có 4 dòng triển vọng đạt năng suất củ tươi cao nhất

vượt đối chứng 30 - 50 % ở dòng KM94-14-4, KM140-3, KM 98-5-10-2 NS, KM

140-5- 4 và rút ngắn thời gian chọn tạo giống sắn mới đã được nghiên cứu thành

công ở Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Hưng Lộc - Viện Khoa học Kỹ thuật

Nông nghiệp Miền Nam (Phạm Thị Nhạn, Nguyễn Hữu Hỷ, 2015).

1.1.6.3. Áp dụng công nghệ sinh học trong tạo cây sắn chuyển gen

Năm 1996, 3 nhóm nghiên cứu độc lập đồng thời công bố kết quả chuyển gen

thành công vào cây sắn. Việc cải thiện chất lượng giống sắn và tạo giống mới

thông qua các phương pháp công nghệ sinh học đã mở ra một hướng mới nhờ

phương pháp tái sinh hiệu quả cây con từ mô sẹo của cây sắn chuyển gen sau khi

đồng nuôi cấy với A. tumefaciens (Li và cs., 1996). Bên cạnh đó là kết quả của quá

trình tạo mô sẹo phôi hóa các giống sắn TMS 60444, Adira 4, Thai 5 và M7, từ đó

tạo được cây sắn hoàn chỉnh từ các mô này. Đặc biệt, nghiên cứu đã làm giảm đáng

kể quá trình hình thành cây từ mô sẹo của giống sắn TMS60444 mang gen chuyển

bằng cả 2 kĩ thuật, thông qua hệ thống A. tumefaciens và súng bắn gen (Raemakers

và cs., 1996). Và sau đó quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua kĩ thuật bắn

gen mục tiêu vào mô sẹo nhằm tạo nguyên liệu cho quá trình chọn lọc tế bào mang

gen chuyển. Kết quả tạo được cây chuyển gen từ các tế bào này đã được thử

nghiệm với các gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase (nptII) và

beta- glucuronidase (uidA) nuôi trong môi trường chọn lọc, sau đó phân tích phân

tử. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, DNA ngoại lai có thể tồn tại trong hệ gen của sắn

một cách bền vững và lâu dài (Schöpke và cs., 1996).

Hình 1.2. Một số phương pháp phổ biến tạo cây sắn biến đổi gen

(Nguồn: Taylor và cs., 2004)

Taylor và cs., 2004 đã mô tả 4 hệ thống hiện đang sử dụng để chuyển gen

vào sắn (Hình 1.2). Ở cả bốn hệ thống này đã sử dụng 4 loại mô đích khác nhau

làm đối tượng chuyển gen: Mô lá chưa trưởng thành, các cấu trúc phôi, mảnh lá

mầm và mô sẹo phôi hóa. Mô lá chưa trưởng thành và các cấu trúc phôi chỉ có

thể chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens trong khi đó mảnh lá mầm hay

mô sẹo phôi hóa có thể sử dụng thêm súng bắn gen để chuyển gen. Sau khi

chuyển gen, mô đích được tái sinh trên môi trường chọn lọc để tạo cây hoàn

chỉnh mang gen cần chuyển. Các đánh giá phân tích cả 4 hệ thống chuyển gen cho

thấy mỗi hệ thống trên đều có những ưu, nhược điểm riêng. Mặc dù vậy, các nhà

khoa học thường ưu tiên lựa chọn phương pháp chuyển gen sử dụng A.

tumefaciens thay vì súng bắn gen vì lí do sử dụng A. tumefaciens có chi phí thấp

hơn và cho kết quả ổn định hơn. Khoảng 50% số cây chuyển gen thu được

thông qua A. tumefaciens mang 1 bản gen cần chuyển trong khi con số này chỉ

là 10% khi sử dụng súng bắn gen.

Nhờ sự phát triển phương pháp chuyển gen sử dụng A. tumefaciens có cải

tiến để chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa, kết quả cho tần suất biến nạp và tái

sinh cây chuyển gen cao hơn các phương pháp cũ. Cho đến nay, đây vẫn là phương

pháp được sử dụng phổ biến để chuyển gen mong muốn vào cây sắn. Cũng như chọn

tạo giống ở các cây trồng khác, một trong các vấn đề quan trọng đối với chọn

giống sắn là làm sao tích hợp được gen đích mong muốn vào một nguồn gen phù

hợp. Đây cũng là một khó khăn với công tác tạo giống sắn bằng phương pháp

chuyển gen vì lý do các giống sắn phản ứng khác nhau trong điều kiện nuôi

cấy in vitro, đặc biệt là trong quá trình tạo mô đích phục vụ biến nạp. Do đó, việc

nghiên cứu khả năng tái sinh và tạo mô đích phục vụ biến nạp là cần thiết trên các

giống sắn triển vọng.

1.2. QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH VÀ TÍCH LUỸ TINH BỘT Ở CÂY SẮN

1.2.1. Cấu tạo và vai trò của tinh bột ở thực vật

1.2.1.1. Cấu tạo tinh bột

Tinh bột, công thức hóa học (C6H10O5)n là một polysacarit carbohydrate chứa tỷ

lệ phần trăm amilose và amilopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ

lệ này thường từ 20:80 đến 30:70. Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác nhau có tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau. Chúng đều là các polymer carbohydrat phức tạp của glucose (công thức phân tử là C6H12O6). Tinh bột được thực vật tạo ra trong tự nhiên từ các quả, củ như: ngũ cốc. Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác. Ngoài sử dụng làm thực phẩm, tinh bột còn được dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, rượu,

băng bó xương...

B. Cấu trúc phân tử amylopectin A. Cấu trúc phân tử amylose (glucose-α-1,4-glucose)

Hình 1.3. Công thức hóa học của tinh bột (Nguồ n: https://doi.org/10.1094/1891127012.001)

1.1.1.2. Vai trò của tinh bột ở thực vật

Ở thực vật, các cơ quan không diễn ra quá trình quang hợp như thân, rễ, qủa

và hạt, sucrose có thể được chuyển thành tinh bột dự trữ trong một loại plastid

chuyên biệt gọi là amyloplasts. Tinh bột lưu trữ được tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn

phát triển khác của cây. Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài người

phần lớn là cơ quan lưu trữ tinh bột ở thực vật. Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc

(gạo, ngô, lúa mì, lúa mạch, lúa miến… ) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các

loại củ thân (khoai tây, khoai lang, khoai mỡ), rễ củ (sắn, khoai môn) và hạt cây họ

đậu. Hầu hết tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn

cho chăn nuôi. Tuy nhiên nhu cầu sử dụng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một

tăng lên. Đặc biệt tinh bột sắn đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu

sinh học trong tương lai do đặc tính dễ lên men.

1.2.2. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan

1.2.2.1. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột

Sinh tổng hợp tinh bột là một quá trình phức tạp, có sự tham gia biểu hiện

của nhiều gen và có sự khác biệt giữa các loài khác nhau và bộ phận khác nhau của

cây về các yếu tố quy định quá trình chuyển hoá tinh bột, cấu trúc của tinh bột và sự

thuỷ phân tinh bột.

Quá trình tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan bao gồm ba bước quan trọng xảy ra

trong lục lạp và thể vô sắc: i) cung cấp glucose-6-phosphate (Glc-6-P) vào trong các

thể lạp, ii) tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P, và iii) tổng hợp tinh bột từ

ADPG (Zeeman, 2010). Bước đầu tiên là sự tổng hợp ADPG từ Glc-1-P và ATP

được xúc tác bởi ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase). Một khi được hoạt

hóa, starch synthase (SS) chuyển ADPG tới đầu không khử của α-1,4 glucan để tạo

thành các sợi α-1,4 glucan. Tiếp theo, các sợi α-1,4 glucan được dùng như là các cơ

chất cho các enzyme phân nhánh của tinh bột (BE hoặc Q-enzyme) tạo ra các liên

kết sợi α-1,6 là amylopectin. Cuối cùng amylopectin được tinh thể hóa tạo thành

tinh bột dưới tác động của các enzyme phân rã (DPE), phosphorylase (P-enzyme)

và glucanotransferase (D-enzyme). Ngoài ra, UDP-glucose: protein

glucosyltransferase hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa) cũng được dự đoán tham gia

vào bước đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột (Zeeman, 2010).

Hình 1.4. Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan

(Nguồn: https://www.jic.ac.uk/STAFF/trevor-wang/images/full/starchpath2.jpg)

1.2.2.2. Một số gen liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột

Quá trình sinh tổng hợp tinh bột ở thực vật được bắt đầu từ việc chuyển hoá

glucose - 1 - P và ATP thành ADP - glucose dưới sự xúc tác của ADP - glucose -

pyrophosphorylase (AGPase). ADP - glucose là một monomer cho quá trình sinh

tổng hợp tinh bột với sự tham gia của nhiều enzyme tiếp theo. GBSS (Granule -

bound starch synthase) đảm nhận quá trình tổng hợp amylose và SS (I - IV) giữ vai

trò sinh tổng hợp nên amylopectin. Ngoài ra, bên cạnh các enzyme SS, còn có các

enzyme xúc tác quá trình phân nhánh SBE (Starch branching enzyme) hay enzyme

phân huỷ tinh bột tham gia vào quá trình điều hoà hàm lượng tinh bột ở thực vật

(Geigenberger, 2011).

* Nhóm gen AGP

Enzym AGPase là một trong những enzym quan trọng, xúc tác cho bước đầu

tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột và đã được chứng minh là enzym điều hòa,

điều chỉnh tốc độ phản ứng của toàn bộ chu trình sinh tổng hợp glycogen ở vi khuẩn

và tinh bột ở thực vật. Một loạt đột biến của gen AGPase Escherichia coli (glgC16)

mã hóa cho các dạng điều khiển khác nhau của enzyme này đã được dùng để biểu

hiện mạnh ở plastid trong cây khoai tây chuyển gen, một vài dòng đã có khả năng

tích luỹ tinh bột cao hơn dòng không chuyển gen là 60% (Hostettle., 2014). Tuy

nhiên, với các cây khác như sắn, ngô và các loài khác việc tăng tinh bột không đạt

được mức như vậy. Các nỗ lực khác trong việc làm tăng hàm lượng tinh bột ở các

cây ngũ cốc sử dụng các thể đột biến của tiểu đơn vị lớn AGP là phần đóng góp nhỏ

vào hoạt động xúc tác của enzyme nhưng giữ vai trò quan trọng trong việc xác định

các tính chất điều khiển của enzyme này. Giroux và cs., (1996) đã thu được các

dòng ngô biểu hiện Sh2r6hs (một biến thể đột biến của gen mã hóa cho tiểu đơn vị

lớn của AGP), mã hóa cho một enzyme không nhạy cảm dị lập thể. Hàm lượng tinh

bột trong các dòng này cao hơn khi so sánh với các dòng đối chứng, tuy nhiên %

tinh bột trong hạt không tăng lên thay vào đó khối lượng các hạt tăng lên một cách

đáng kể (Giroux và cs., 1996). Trong nghiên cứu gần đây, Li và cs., (2011) đã chỉ ra

sự biểu hiện gen BT2 mã hóa cho tiểu đơn vị bé của APG cây ngô hoặc SH2 mã

hóa cho tiểu đơn vị lớn của APG cây ngô dẫn đến việc tăng cường khối lượng hạt

và hàm lượng tinh bột.

Hoạt tính của AGPase, enzym tổng hợp tinh bột trong củ ở giống sắn Fuxuan

(F01) có hàm lượng tinh bột cao hơn một cách đáng kể khi so sánh với giống sắn

Huanan (H124) có hàm lượng tinh bột thấp trong cả hai giai đoạn hình thành hệ

thống rễ và phần củ. Tuy nhiên, hoạt tính của enzym amylase trong rễ của F01 thấp hơn

khi so sánh với H124 trong trong hai giai đoạn này. Các kết quả chỉ ra rằng khả năng

tổng hợp tinh bột cao, khả năng phân giải tinh bột thấp ở trong rễ có liên quan mật thiết

đến sự tích lũy tinh bột cao trong củ ở các giai đoạn phát triển (Li và cs., 2016).

Mặc dù cơ chất sử dụng cho quá trình tổng hợp tinh bột, sucrose, glucose và

fructose có hàm lượng khác nhau ở các mô khác nhau của cây sắn, nhưng điều này

cũng không chỉ ra được sự thay đổi về khả năng phát triển một cách đồng bộ hoặc

có trật tự vì chúng có thể được chuyển đổi lẫn nhau một cách liên tục trong suốt quá

trình tổng hợp tinh bột (Geigenberger., 2011). Ở lá của cả hai giống sắn F01 và

H124, mỗi giai đoạn phát triển hàm lượng đường sucrose thấp hơn nhiều so với

hàm lượng glucose và fructose, điều này có nghĩa là đường sucrose sau khi tổng

hợp ở lá được chuyển ra ngoài một cách kịp thời và vận chuyển qua thân vào rễ.

Không tìm thấy đường sucrose trong dịch nhựa của hệ thống phloem của thân ở hai

giai đoạn tạo củ và tạo tinh bột hoàn chỉnh. Trong khi đó, hàm lượng của fructose

và glucose rất cao trong dịch nhựa của hệ thống phloem của thân tương ứng với giai

đoạn tương tự như trên. Điều này chỉ ra rằng một phần đường sucrose bị phân giải

thành glucose và fructose trong giai đoạn vận chuyển qua thân. Không có fructose

nhưng một lượng lớn hơn glucose được phát hiện trong dịch nhựa hệ thống phloem

của thân ở giai đoạn tạo tinh bột hoàn chỉnh biểu thị fructose đã bị biến đổi một

phần thành glucose (Geigenberger., 2011).

* Nhóm gen GBSS

Các gen SS của thực vật bậc cao mã hóa bởi 5 nhóm gen ký hiệu là GBSS,

SSI, SSII, SSIII, và SSIV. GBSS gắn chặt với hạt tinh bột và chịu trách nhiệm tổng

họp amylose. Các đột biến khác nhau của SS (thường gọi là SS hòa tan) tạo ra các

chuỗi amylopectin (1 dạng tinh bột đã polyme hóa) có thể tan hoặc trong các plastic

hoặc một phần hòa tan một phần gắn với hạt tinh bột. Số liệu di truyền và sinh hóa

chỉ ra rằng mỗi đột biến enzyme SS có các cấu thành khác nhau và vai trò nhất định

trong tổng hợp amylopectin. Keeling và cs., (1998) đã chỉ ra rằng các enzyme SS có

vai trò trong quá trình tổng hợp tinh bột, kiểm soát thông lượng của dòng chảy cho

đến một thể thống nhất. Điều này chứng tỏ thực tế hoạt động xúc tác tối đa của SS ở

quá trình trao đổi chất thông qua quá trình tổng hợp tinh bột ở một vài cơ quan dự

trữ tinh bột đã chứng minh rằng SS là nhân tố chủ chốt trong việc điều chỉnh quá

trình tổng hợp tinh bột. Vì vậy, đây là hướng nghiên cứu tối ưu trong quá trình tạo

ra các cây trồng có hàm lượng tinh bột cao sử dụng công nghệ gen. Tuy nhiên, việc

biểu hiện của gen SS lại đang ít khi được sử dụng để làm tăng quá trình tích lũy tinh

bột. Điều này, chủ yếu là do sự hiện diện khác nhau của các lớp enzym SS trong cây

trồng tương tác với nhau tạo thành một phức hợp protein và giữ vai trò cụ thể trong

quá trình kiến tạo nên các hạt tinh bột (Hennen-Bierwagen và cs., 2008). Do đó,

những thay đổi trong việc biểu hiện một SS đơn lẻ có thể dẫn đến các hiệu ứng sâu

sắc và khó lường không chỉ trong cấu trúc của hạt tinh bột mà còn trong hàm lượng

tinh bột, bên cạnh đó các đồng phân SS có vai trò đặc trưng nhưng phục thuộc lẫn

nhau trong quá trình tổng hợp tinh bột. Vấn đề này được chứng minh bằng các kết

quả thu được ở các cây khoai tây chuyển gen biểu hiện enzym glycogen synthase

E.coli (Enzym xúc tác cho phản ứng tương tự như SS) ở củ có hàm lượng tinh bột ít

hơn so với các củ đối chứng. Thêm vào đó, tinh bột ở các củ chuyển gen có sự thay

đổi về thuộc tính cấu trúc. Roldán và cs., (2007) đã báo cáo các đột biến SSIV T-

DNA chỉ tích lũy tinh bột trong một hạt lớn ở các lục lạp A.thaliana. Bên cạnh đó,

Szydlowski và cs., (2009) chỉ ra rằng các đột biến A.thaliana SSIII/SSIV T-DNA

tích lũy tinh bột vô cùng ít. Các dữ liệu tổng thể cho thấy rằng SSIV giữ vai trò

quan trọng trong quá trình khởi động hình thành hạt tinh bột và quá trình tích lũy

tinh bột, là yếu tố thiết yếu để hình thành số lượng đều đặn của các hạt tinh bột

được tìm thấy ở các cây đối chứng. Phân tích việc phân phối chiều dài chuỗi

amylopectin trong các cây đột biến và cây chuyển gen mất các đột biến enzyme SS

đặc trưng đã dẫn tới kết luận rằng nhóm SSI, SSII, và SSIII đóng vai trò trong việc

kéo dài các chuỗi ngắn, trung bình và dài tương ứng (Zeeman, 2010). Thành phần

amylose của tinh bột được tổng hợp bởi GBSS. Các cây đột biến và chuyển gen

thiếu enzyme này là cần thiết để tạo ra cây không có amylose. Các hạt tinh bột

không có amylose vẫn có hình thái bình thường, điều đó chứng tỏ rằng amylopectin

là cần thiết cho việc hình thành hạt. GBSS khác các đột biến khác nhau của enzyme

SS ở chỗ vị trí đặc biệt đối với các hạt và kiểu phản ứng. Không giống các biến thể

synthase của tinh bột, GBSS chuyển các gốc glucosyl từ thực vật bậc cao.

Bên cạnh các gen đã được nghiên cứu, gen SSIV đã và đang được nghiên cứu

ứng dụng nhằm tăng hiệu quả của quá trình sinh tổng hợp tinh bột. Nhiều nghiên

cứu gần đây cho cho thấy SSIV giữ vai trò quan trọng trong khởi đầu quá trình hình

thành các hạt tinh bột (Szydlowski và cs., 2009). Để đánh giá sự ảnh hưởng của việc

bất hoạt gen SSIV đến quá trình sinh tổng hợp ở cây thuốc lá cho thấy khi chuyển

gen MUT - SSIV xuất hiện các kiểu hình sinh trưởng kém hơn so với đối chứng.

Mặt khác, hàm lượng polysaccharide dự trữ không khác biệt so với cây đối chứng.

Tuy nhiên, các cây chuyển gen đã có sự suy giảm về số lượng hạt tinh bột, cùng

với đó là sự gia tăng về kích thước của các hạt tinh bột trong lá (Roldan và cs.,

2007). Để loại bỏ hoạt động của SSIV trong có việc làm giảm số lượng các hạt

tinh bột và hàm lượng tinh bột ở lá A.thaliana gợi ý rằng số lượng các hạt tinh bột

có thể đại diện cho một bước điều chỉnh trong việc kiểm soát sự tích lũy tinh bột

(D'Hulst & Mérida, 2010). Xác nhận giả thiết này, Gámez-Arjona et al., (2011)

báo cáo rằng các sự biểu hiện SSIV làm tăng hàm lượng tinh bột ở lá A.thaliana.

Hàm lượng tinh bột cao được tích lũy vào thời điểm cuối ngày được huy động

hoàn toàn trong suốt đêm ở các cây biểu hiện gen SSIV, điều này cho phép hình

thành một tỷ lệ tinh bột cao khi so sánh với các cây đối chứng. Gámez-Arjona và

cs., (2011) cũng chỉ ra rằng việc biểu hiện gen SSIV dẫn đến việc tăng kích thước

hạt tinh bột và hàm lượng tinh bột ở các củ khoai tây chuyển gen được trồng trong

nhà kính và ngoài đồng ruộng. Tiếp theo đó là công trình nghiên cứu những cây

thuốc lá đột biến khuyết gen SSIV bên cạnh sự suy giảm số lượng hạt tinh bột/ lục

lạp ở lá trưởng thành còn gây ra hiện tượng không tạo thành tinh bột và gia tăng

hàm lượng ADP - glucose ở lá non (Matilda và cs., 2013).

Trong các báo cáo mới đây, việc điều khiển sự biểu hiện của các gen SS

(starch synthase) đã được chứng minh có khả năng tăng sự tích luỹ tinh bột. Tuy

nhiên có rất ít nghiên cứu về nhóm gen này do có nhiều lớp gen SS (I - IV) khác

nhau trong thực vật. Các lớp gen này được cho là tương tác với nhau trong một

phức hợp protein và đóng một vai trò đặc biệt trong việc tổng hợp cấu trúc cuối

cùng của hạt tinh bột. Do đó, những thay đổi trong việc biểu hiện của một gen SS

có thể dẫn tới các ảnh hưởng phức tạp. Điều này được chứng minh rõ nét qua các

kết quả thu được trên khoai tây chuyển gen glycogen synthase có nguồn gốc từ vi

khuẩn. Củ của các cây khoa tây chuyển gen này tích luỹ lượng tinh bột ít hơn so với

củ các cây khoai tây có cấu trúc, đặc tính đã bị biến đổi. Shewmaker và cs., (1994)

đã chỉ ra rằng SS lớp IV có liên quan đến sự khởi đầu hình thành hạt tinh bột và có

thể điều khiển số lượng hạt tinh bột trong lục lạp ở lá cây A.thaliana. Việc loại bỏ

protein này dẫn đến sự giảm sút tinh bột trong lá và toàn bộ tinh bột trong một lục

tạp được tích luỹ trong một hoặc hai hạt tinh bột khổng lồ (Rolda’n và cs., 2007).

Mặt khác, Subasinghe (2013) khi nghiên cứu ảnh hưởng của việc biểu hiện quá mức

gen SSIV đã làm tăng sự tích luỹ tinh bột trong cả cơ quan quang hợp và cơ quan

dự trữ. Như vậy, việc tăng cường biểu hiện gen SSIV hứa hẹn là một hướng đi làm

tăng hàm lượng tinh bột tích luỹ trong cả cơ quan tự dưỡng và dị dưỡng bằng con

đường công nghệ sinh học.

* Nhóm gen SBE

Bên cạnh SS còn có gen SBE (Starch branching enzyme) tham gia vào quá

trình sinh tổng hợp tinh bột. Quá trình phân nhánh của amylopectin xảy ra đồng thời

với quá trình kéo dài chuỗi. Quá trình phân nhánh được xúc tác bởi enzyme phân

nhánh (BE). Enzyme này cắt chuỗi α-l,4-glucan sẵn có và chuyển đoạn cắt mang 6

đơn vị glucose hoặc nhiều hơn tới vị trí C6 của gốc glucosyl ở chuỗi glucan khác.

BE của thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I và II. Nhóm I vận chuyển các chuỗi

dài hơn. Phân tích di truyền chỉ ra rằng hai nhóm BE có vai trò đặc biệt trong tổng

hợp amylopectin.

* Nhóm gen DBE

Ngoài các enzym tổng hợp tinh bột còn có các enzyme phân huỷ. Enzym khử

phân nhánh DBE (De-branching enzym) có khả năng làm mất các điểm phân nhánh

và có vai trò quan trọng trong việc quyết định cấu trúc của amylopectin. Ở thực vật

có hai loại DBE: isoamylase (ISA) và limitdextrinase (LDA, hay còn gọi là

pullulanase). Hai loại này khác nhau bởi trình tự amino acid và cơ chất, ISA có 3

nhóm ISA1, ISA2, và ISA3; ISA1 và ISA2 liên quan chặt với tổng hợp

amylopectin. Vai trò cơ bản của LDA và ISA3 là phân hủy tinh bột. ISA1 hoạt động

mạnh nhất khi cơ chất là các chuỗi glucan tương đối dài như là các amylopectin bị

hòa tan, trong khi đó LDA và ISA3 có hoạt tính cao với các chuỗi glucan ngắn như

β-limit dextrins. ISA2 dường như không có hoạt tính xúc tác mà tác dụng điều tiết

hoặc ổn định ISA1 chứ không tham gia trực tiếp vào quá trình hủy phân nhánh

(Burton và cs., 2002). Trong các cây đột biến hoặc chuyển gen thiếu hụt ISA1, tinh

bột dạng hạt bị giảm, thậm chí không có và thay thế một phần bởi các glucan tan

trong nước. Hiện tượng này quan sát được ở một số thực vật, ví dụ như ở nội nhũ

non của ngũ cốc, lá A.thaliana và củ khoai tây. Trong A.thaliana và khoai tây việc

mất hoạt tính ISA2 có ảnh hưởng giống như mất hoạt tính của ISA1 (Wattebled và

cs., 2008). Đột biến thiếu hoạt tính DBE (tức là đột biến đồng thời 4 gen: isal, isa2,

isa3, ida), khi đột biến xảy ra sẽ không phát hiện được sự có mặt của các hạt tinh

bột ở lá. Kết quả này hoàn toàn đồng nhất với ý kiến cho rằng hoạt tính DBE là cần

thiết cho việc sinh tổng hợp tinh bột.

1.3. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN TẠO GIỐNG

SẮN BIẾN ĐỔI GEN

1.3.1. Hệ thống nuôi cấy in vitro cây sắn

1.3.1.1. Phương thức nuôi cấy

Phương thức tái sinh cây sắn in vitro có thể phát sinh thông qua sự phát sinh

cơ quan trực tiếp (mảnh lá, đỉnh sinh trưởng, chồi nách) hoặc tái sinh thông qua mô

sẹo, phôi soma, mô sẹo phôi hoá. Tuy nhiên, cho đến nay phương thức tái sinh cây

sắn thông qua mô sẹo phôi hóa đang phổ biến hơn cả.

1.3.1.2. Nguyên liệu

Về cơ bản, đặc tính sinh lý mô cấy càng giống tế bào phôi bao nhiêu thì khả

năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu. Vì vậy, tế bào và mô non là mô

cấy triển vọng nhất (Lê Trần Bình và cs., 1997). Tuy nhiên, nguyên liệu thực vật

dùng để nuôi cấy in vitro rất đa dạng: có thể từ thuỳ lá non (Li và cs., 1996), từ

đỉnh chồi của cây con (Zhang., 2000; Đỗ Xuân Đồng và cs., 2012), từ chồi nách

(Evans và cs., 2015; Nguyễn Văn Đồng và cs., 2014), từ mảnh lá, chồi đỉnh và

chồi nách (Bull và cs., 2009)… Hiện nay, hệ thống tái sinh cây sắn in vitro đã

được tiến hành và nghiên cứu trên nhiều giống sắn, chủ yếu sử dụng để tái sinh

cây chuyển gen (Bảng 1.4).

1.3.1.3. Môi trường nuôi cấy

Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch sử

phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cơ sở cho việc xây dựng các môi

trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho quá trình

sinh trưởng và phát triển của cây. Đã có rất nhiều loại môi trường được nghiên

cứu phù hợp cho việc nuôi cấy từng loài, từng bộ phận và tùy theo mục đích nuôi

cấy. Cho đến nay có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng đã được xây dựng và

thử nghiệm có kết quả.

Theo các nghiên cứu đã công bố, môi trường nuôi cấy in vitro cây sắn được

tiến hành chủ yếu trên nền môi trường MS hoặc MS biến đổi (Raemakers và cs.,

2001); môi trường CAM, môi trường CIM (Bull và cs., 2009; Evans và cs., 2015).

1.3.1.4. Điều kiện nuôi cấy

Yêu cầu về nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển ở các loài không như nhau.

Tuy vậy, nhiệt độ phòng thí nghiệm luôn được duy trì 25oC – 28oC. Đối với nuôi

cấy in vitro cây sắn, các điều kiện về nhiệt độ không có nhiều khác biệt với các điều

kiện nuôi cấy mô thông thường, nhiệt độ tối ưu là 28oC và độ ẩm thích hợp là 70 -

80% (Bull et al., 2009).

Ánh sáng ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.

Cường độ ánh sáng phổ biến cho nhiều loại thực vật dao động 1000 - 5000 lux. Với

cường độ ánh sáng lớn hơn thì chồi sinh trưởng chậm lại và tăng cường quá trình

tạo rễ. Đối với quá trình nuôi cấy tạo mô sẹo hay phôi soma của mía, các công trình

đều ghi nhận trong điều kiện tối hoàn toàn, đến giai đoạn tái sinh và ra rễ thì mới

đưa ra điều kiện sáng (Biradar và cs., 2009).

Bảng 1.4 : Một số công trình nghiên cứu tái sinh in vitro ở cây sắn

Nguyên liệu

Giống sắn

Tác giả

thực vật

Phương thức tái sinh

Thuỳ lá non

Li và cs, 1998

Tái sinh qua phôi soma

Mcol 22, MPer 183 và TMS60444

Đỉnh sinh trưởng, lá non

Sofiari và cs, 1997

Tái sinh qua phôi soma

Mcol 22, Mcol 1505, TMS 90853

Mcol 22

Đỉnh sinh trưởng

Groll và cs., 2001

Tái sinh qua phôi soma

Đỉnh sinh trưởng

Taylor và cs., 2001

Tái sinh qua phôi soma

TMS 60444, TME 127, TME 8, TME 203, TME 282

Nanzhi 188

Thuỳ lá non

Tái sinh qua phôi soma

Guohua and Qiusheng, 2002

MCOL 22 và TMS60444

Chồi nách

Tái sinh qua phôi soma

Zhang and Puonti – Kaerlas, 2005

Hankoua và cs., 2005

TME1, TME2, TME 5, TME 8, TME 12.

Đỉnh sinh trưởng và thuỳ lá non

Tái sinh qua phôi soma

TME8, TME 594, TME 596

Đỉnh chồi nách và thuỳ lá non

Tái sinh qua phôi soma

Atehnkeng và cs., 2006

Hankoua và cs., 2006

TME13, TME 91, TME 92, 127

Đỉnh sinh trưởng và thuỳ lá non

Tái sinh qua phôi soma

Chồi đỉnh, chồi nách

Feitosa và cs., 2007

Tái sinh qua phôi soma

Agua Moma, Amansa Burro, Aparecida, Mata Fome, Rosa, Saica, Rosinha và Hanatee

KU 50, Hanatee

Saelim và cs., 2006

Đỉnh sinh trưởng và thuỳ lá non

Tái sinh qua phôi soma

Mcol22, T5, KU 50

Zhang và cs., 2001

Đỉnh sinh trưởng và thuỳ lá non

Tái sinh qua phôi soma

CMC 40, TME 203, TME 208

Zhang và cs., 2006

Đỉnh sinh trưởng và thuỳ lá non

Tái sinh qua phôi soma

TMS60444

Bull và cs., 2009

Mảnh lá, đỉnh sinh trưởng, đỉnh chồi nách

Tái sinh qua phôi soma

Beena và cs., 2014

TME 3, TME 4, TMS 3 0572, H 165

Đỉnh chồi nách và thuỳ lá non

Tái sinh qua phôi soma

KM140, KM94

Đỉnh chồi

Tái sinh qua phôi soma

Đỗ Xuân Đồng và cs., 2014

TMS60444, KM 140

Chồi nách

Tái sinh qua phôi soma

Nguyễn Văn Đồng và cs., 2014

TME 14

Chồi nách và thuỳ lá non

Evans và cs., 2015

Tái sinh qua phôi soma

1.3.1.5. Hệ thống nuôi cấy

* Tái sinh trực tiếp

Con đường nghiên cứu tổ hợp của các chất điều hoà sinh trưởng đến hiệu quả

tái sinh cây và chuyển gen ở 5 giống sắn (Colombia No.800, Lianbera, Venezuela

No.255, Ecuado No.133 and Mexico No.35) đã được nghiên cứu khi nuôi cấy mô

phân sinh đỉnh trên môi trường MS có bổ sung BA, GA3, NAA ở nồng độ 5.10-7;

10-7; 10-6. Kết quả GA3 kết hợp với NAA dẫn đến sự hình thành rễ và BA kết hợp

với NAA tạo mô sẹo và hình thành chồi (Kartha và cs., 1973). Tương tự ở 4 giống

sắn MCol 22; MCol 155; Mper 183; TMS 60.444 môi trường phù hợp cho tái sinh

chồi là MS bổ sung 1.0 mg/l BA và 0.5 mg/l IBA với tỷ lệ tái sinh trung bình 8,7

chồi / mẫu cấy (Li và cs., 1998). Đỉnh sinh trưởng là nguyên liệu tái sinh rất phổ

biến, Biradar và cs., (2009); Rupinder và cs., (2017) đã sử dụng đỉnh sinh trưởng

của giống mía CoC-671 làm nguyên liệu nuôi cấy. Quá trình nuôi cấy khởi đầu,

đỉnh sinh trưởng trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BAP, sau 7-10 ngày, đa

chồi bắt đầu xuất hiện và nhân nhanh cá thể.

* Tái sinh qua mô sẹo và phôi soma

Phôi soma được tạo thành trên môi trường có bổ sung Auxin với nồng độ thấp

hơn so với quá trình hình thành mô sẹo. Sau quá trình tái sinh, số lượng chồi được

tăng theo cấp số nhân. Trong các công trình chuyển gen, một trong những yếu tố

quan trọng nhất để chuyển gen thành công là phải có hệ thống tái sinh in vitro hiệu

quả. Phôi soma được ứng dụng nhiều nhất trong công nghệ chuyển gen, vì phôi

được tạo ra với số lượng lớn trong một thời gian ngắn, khả năng tái sinh cao trong

các điều kiện chuyển gen khác nhau.

Cho đến ngày nay, hầu hết các công trình nghiên cứu chuyển gen đều dựa trên

hiệu quả tái sinh thông qua phôi soma (Rupinder, 2015; 2017), ngoài ra phôi soma

được ứng dụng trong việc lựa chọn các biến dị soma, trong kỹ thuật tạo đột biến gen

(Suprasanna & Bapat, 2006; Suprasanna và cs., 2007). Tỷ lệ hình thành phôi soma

đạt cao nhất (82 ± 1.7%) ở giống sắn KM94 trên môi trường MS có bổ sung 12

mg/l Picloram (Đỗ Xuân Đồng và cs., 2012); đạt 92,22% ở giống sắn KM 140

trên môi trường MS có bổ sung 12 mg/l Picloram (Tống Thị Hường và cs., 2017).

Hệ thống tái sinh qua mô sẹo, phôi soma được cho là có nhiều ưu điểm hơn so

với phương thức tái sinh trực tiếp và đã được nhiều tác giả tập trung nghiên cứu với

mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu quả ở các giống sắn khác nhau. Tuy

nhiên, sự phát sinh phôi soma và tái sinh cây với tỷ lệ cao chỉ giới hạn ở một vài

giống sắn. Cây sắn TMS 60444 đã được tái sinh cơ quan từ đỉnh sinh trưởng, chồi

nách, thuỳ lá non được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 10 mg/l BAP. Kết

quả đã hình thành các mô sẹo trong 2 tuần và giảm đi sự xuất hiện các mô sẹo dễ

hỏng (Bull và cs., 2009).

Mô thực vật (Từ cây sắn khỏe mạnh 1-2 tháng tuổi)

Tạo mô sẹo trên môi trường bổ sung auxin Trong điều kiện tối

Tạo phôi soma trên môi trường bổ sung auxin nồng độ thấp Trong điều kiện tối

Tái sinh cây Môi trường bổ sung các chất thuộc nhóm cytokinin, điều kiện sáng

Ra rễ (Bổ sung auxin) Trong điều kiện sáng

Hình 1.5: Quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma ở cây sắn

Bên cạnh đó kỹ thuật tạo mô sẹo phôi hoá (FEC) không những có thể tạo ra

giống cây sạch bệnh mà còn có thể nghiên cứu phát sinh hình thái phôi vô tính,

nhân sinh khối tế bào dịch lỏng, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống

lai tứ bội thể, nghiên cứu chuyển gen và bảo quản nguồn gen. Mô sẹo phôi hoá

được xem là loại mô mà khi tái sinh sẽ tạo ra chồi bình thường với tỷ lệ nhiều

nhất so với các cấu trúc mô khác. Ở giống sắn TMS 60444 tỷ lệ tạo mô sẹo phôi

hoá là 64% (Nguyễn Văn Đồng và cs., 2014); giống KM 297 mô sẹo phôi hoá

đạt 30 ± 3% khi nuôi cấy trên môi trường MS + 8 mg/l picloram (Vũ Văn Kiên,

Nguyễn Du Sanh, 2011) và ở giống sắn TME14 đạt tỷ lệ mô sẹo phôi hoá cao

(51 – 75%) (Evans và cs., 2015).

Hình 1.6. Kết quả tạo mô sẹo phôi hoá ở giống sắn TME 14 (Nguồn: Evans và cs., 2015)

Ở nước ta, các nghiên cứ u in vitro về cây sắn mớ i chỉ tâ ̣p trung vào viê ̣c nhân nhanh, duy trì tính tra ̣ng tố t, sa ̣ch bê ̣nh... nhằm thu đươ ̣c giố ng sắn vớ i năng suất, sản lươ ̣ng, chất lươ ̣ng đáp ứ ng yêu cầu củ a các nhà trồ ng tro ̣t (Nguyễn Thị Thuý

Hằng và cs., 2011). Tuy nhiên, công tác cho ̣n ta ̣o giố ng sắn mớ i bằng công nghê ̣ chuyển gen hiê ̣n cò n rất mớ i ở Viê ̣t Nam. Kết quả nghiên cứ u chuyển gen cò n rất khiêm tố n, đă ̣c biê ̣t là chuyển gen tăng hàm lượng tinh bột vào sắn. Hiện nay, có mô ̣t số ít nghiên cứu bướ c đầu tạo mô sẹo phôi hoá phục vụ chuyển gen (Vũ Văn Kiên và Nguyễn Du Sanh, 2011; Đỗ Xuân Đồng và cs., 2012; Nguyễn Văn Đồng và

cs., 2014) và một công trình nghiên cứu chuyển gen kháng nấm Chitinase

gluconase vào cây sắn (Quách Vũ Quỳnh Hương và cs., 2006).

1.3.2. Một số phương pháp chuyển gen ở sắn

Những công trình nghiên cứu chuyển gen vào cây sắn được xây dựng với hai

phương pháp khác nhau: phương pháp dùng súng bắn gen (Schopke và cs.,

Raemakers và cs., 1996; Munyikwa và cs., 1998; Zhang và cs., 2000a; Zhang &

Puonti-Kaerlas., 2000; Bùi Lan Anh và cs., 2008) và chuyển gen nhờ

Agrobacterium (Li và cs., 1996; Gonzalez và cs., 1998; Sarria và cs., 2000; Zhao và

cs., 2011) đã được nghiên cứu thành công. Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp vào

cây sắn đầu tiên đã cho một số kết quả nhất định. Tuy nhiên, nhược điểm của

phương pháp này là phải xử lí mô/tế bào trước khi thao tác dẫn tới tỉ lệ tái sinh sau

chuyển gen thấp. Hơn nữa, khả năng chèn vào bộ gen thấp nên gen chuyển thường

có nhiều bản sao và khả năng di truyền cho thế hệ tiếp theo không cao. Bên cạnh đó

phương pháp chuyển gen qua Agrobacterium dựa trên một cơ chế tự nhiên, gen

chuyển được định hướng gắn vào bộ gen, thao tác đơn giản đang được sử dụng phổ

biến trong chuyển gen thực vật, trong đó có cây sắn.

1.3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen

Trong một số nghiên cứu cuối thế kỷ XX, súng bắn gen đã được sử dụng để

chuyển gen cho cây sắn nhờ kỹ thuật gen được gắn vào hạt có kích thước micro và

bắn vào tế bào huyền phù có khả năng tạo phôi nhằm tạo nguyên liệu cho quá trình

chọn lọc tế bào mang gen chuyển. Thử nghiệm với các gen mã hóa cho

neomycin phosphotransferase (nptII) và beta- glucuronidase (uidA) được nuôi

trong môi trường chọn lọc sau đó phân tích phân tử, nghiên cứu đã chỉ ra rằng

DNA ngoại lai có thể tồn tại trong hệ gen của sắn bền vững và lâu dài. Từ các tế

bào này nuôi cấy tái sinh thành cây chuyển gen bằng sự thành thục của phôi trong

môi trường thích hợp. Kết quả là 6 dòng cây chuyển gen cho thấy dương tính với

thuốc thử GUS và paromomycin được tái tạo, hai trong số đó đã được xác nhận

bằng phân tích Southern blot (Schopke và cs., 1996).

Cũng đã có một số công bố kết quả chuyển gen bằng súng bắn gen như: giống

sắn TMS60444 với các plasmid pHB1 và pJIT100 (Munyikwa và cs., 1998), chuyển

gen vào lá mầm soma của các giống sắn: CMC40, MPer183, MCol22 và

TMS60444 (Zhang và cs., 2003; 2006 ) hay chuyển gen bar – gen kháng thuốc diệt

cỏ nhờ sử dụng súng bắn gen để đưa DNA vào các mảnh lá cây sắn (Bùi Lan Anh

và cs., 2008) tuy nhiên phương pháp này khá tốn kém và khả năng tạo ra các thể

khảm (Schopke và cs., 1996).

1.3.2.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A.tumefaciens

Chuyển gen thông qua A.tumefaciens là phương pháp chuyển gen gián tiếp hữu

hiệu đầu tiên dùng để chuyển gen thực vật. Phương pháp này dùng Ti – plasmid của A.

tumefaciens làm vector đưa DNA vào tế bào. Trước đây các nhà nghiên cứu cho rằng,

hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ A.tumefaciens là không dễ dàng và có hiệu quả thấp

đối với các thực vật lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như

lúa, lúa mì, ngô. Phương pháp chuyển gen này thường được dùng cho các loại cây hai

lá mầm vì A.tumefaciens mẫn cảm với các loại cây này và có tần suất chuyển nạp gen

cao hơn nhiều so với cây một lá mầm (Nguyễn Đức Thành., 2003). Tuy nhiên, hiện

nay việc chuyển gen thông qua A.tumefaciens trở thành công cụ hữu hiệu trong công

nghệ chuyển gen thực vật, kể cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Đây là phương

thức chuyển gen có hiệu quả hơn hẳn các phương pháp chuyển gen trực tiếp và gián

tiếp khác do dễ sử dụng, ít tốn kém, hiệu quả chuyển gen cao mà số lượng bản copy đi

vào hệ gen ít, thường chỉ có một bản sao tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển

gen và không gây thương tổn tế bào (Anwar và cs., 2011).

Đối với cây sắn, trên thế giới đã có nhiều công trình chuyển gen thành công

nhờ A.tumefaciens mở ra một hướng mới trong cải thiện chất lượng giống sắn và

tạo giống mới thông qua các phương pháp công nghệ sinh học được công bố: Li

và cs., (1996) đã đưa ra được phương pháp tái sinh hiệu quả cây con từ mô sẹo

giống sắn MCol22 sau khi đồng nuôi cấy với A.tumefaciens; Gonzalez và cs.

(1998) thành công khi chuyển gen nptII, uidAint vào mô sẹo phôi hoá ở giống sắn

TMS60444. Reamakers và cs., (1996) đã tạo được mô sẹo phôi hóa của các giống

sắn TMS 60444, Adira 4, Thai 5 and M7, từ đó tạo cây sắn hoàn chỉnh từ các mô

này. Đặc biệt, nghiên cứu đã làm giảm đáng kể thời gian hình thành cây từ mô

sẹo của giống sắn TMS60444 mang gen chuyển bằng cả 2 kĩ thuật, thông qua hệ

thống A.tumefaciens và súng bắn gen (Raemakers và cs., 2001). Nhờ cải tiến

phương pháp sử dụng A. tumefaciens để chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa (Li và

cs.,1996), các kết quả nghiên cứu về sau đã thu được kết quả chuyển gen với tần

suất biến nạp và tái sinh cây chuyển gen cao hơn các phương pháp trước đó. Hiện

nay, đây vẫn là phương pháp được sử dụng phổ biến để chuyển gen mong muốn vào

cây sắn (Bull và cs., 2009; Zhao và cs., 2011; Evans và cs., 2015).

Ở Việt Nam, hiện nay phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens đã sử

dụng rộng rãi để chuyển gen vào cây trồng và đạt được một số thành tựu đáng kể.

Gen Cry1A đã được chuyển thành công vào cây hông và cây cải ngọt thông qua A.

tumefaciens EHA 105 để kháng sâu xanh Heliothis armigera (Lê Tấn Đức và cs.,

2007). Thiết kế vector và chuyển gen cryIA (c) thành công vào cây bắp cải đã được

báo cáo (Đặng Trọng Lương và cs., 2001). Cây thuốc lá, lúa, cải ngọt, Paulownia mang

gen kháng sâu đơn cryIA(b), cryIA(c) và gen kháng sâu lai cryIA (b), cryIB kháng được

một số loài sâu thuộc họ cánh vảy (Lê Tấn Đức và cs., 2007). Khả năng tái sinh và biến

nạp thông qua nách lá mầm của 2 giống đậu tương (Glycine max L.) DT12 và DT84

bằng A.tumefaciens cũng đã được nghiên cứu (Nguyễn Thu Hiền và cs., 2010), Cây

xoan ta (Melia azdazach L.) chuyển gen mã hoá gibberellin 20 – oxidase bằng A.

tumefaciens (Đỗ Xuân Đồng và cs., 2011). Quy trình chuyển gen thông qua

A.tumefaciens vào cây xoan ta (Melia azedarach L.) đã được tối ưu với hiệu suất

cao, đạt 81,15% (Bùi Văn Thắng và cs., 2013). Quy trình chuyển gen hiệu quả vào

phôi soma của giống mía ROC22 (Saccharum officinarum L.) thông qua vi khuẩn

A. tumefaciens đã được báo cáo (Phan Thị Thu Hiền và cs., 2015). Nghiên cứu tạo

cây khoai lang chuyển gen kháng bọ hà thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (Vũ Thị

Lan và cs., 2015). Nghiên cứu chuyển gen cry 8Db vào cây khoai lang nhờ vi khuẩn

A. Tumefaciens (Phạm Bích Ngọc và cs., 2015). Tuy nhiên, chuyển gen thông qua

vi khuẩn A. tumefaciens vào một số giống sắn ở Việt Nam mới chỉ có một số ít các

công trình được công bố. Vì vậy, đây là hướng đi cần được sự quan tâm sớm của

các nhà nghiên cứu.

1.3.3. Một số nghiên cứu tạo cây sắn biến đổi gen

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học vào cây sắn, việc khai thác hệ

gen chức năng và sử dụng kỹ thuật di truyền để giải quyết các vấn đề liên quan tới

cải tạo giống sắn đóng vai trò chính trong đẩy mạnh diện tích thâm canh cũng như

ứng dụng trong công nghiệp của cây sắn trên toàn thế giới.

Bảng 1.5: Tổng kết một số công trình công bố về chuyển gen vào cây sắn

Giống

Mô đích

Tài liệu tham khảo

Gen

Phương pháp chuyển gen

Kết quả nổi bật

MCol22

Agrobacterium

Cây CG

Li và cs. 1996

TMS 60444 NCHP

Súng bắn gen

Cây CG

hpt, nptII, uidAint nptII, uidA

Col22

NCHP

Súng bắn gen

luc, pat

Cây CG

TMS 60444 NCHP

Súng bắn gen

Cây CG

luc, AGPase, pat

Scho¨pke và cs. 1996 Raemakers và cs. 1996 Munyikwa và cs. 1998

TMS 60444 NCHP

nptII, uidAint

Cây CG

Gonza´ lez và cs. 1998

MPer183

nptII, bar , uidA Cây CG

Sarria và cs. 2000

Agrobacterium Agrobacterium

Súng bắn gen

hpt, uidAint

Cây CG

Zhang và cs. 2000a

MCol22, TMS60444

TMS60444

NCHP Agrobacterium

Cây CG

Zhang và cs. 2000b

uidAint, hpt, pmi

Cây CG

TMS60444

NCHP

Súng bắn gen

uidAint, hpt, pmi

Zhang and Puonti-Kaerlas 2000

NCHP Agrobacterium

uidAint, hpt

Cây CG

Zhang và cs. 2003b

NCHP Agrobacterium

uidAint, hpt

Cây CG

TMS60444, Adira 4, Thai 5, M7 MCol1505

TMS60444 MSPH Agrobacterium

nptII

Cây CG

Zhang et al. 2003a Siritunga and Sayre 2003

MSPH Agrobacterium

nptII

Cây CG

Siritunga and Sayre 2004

MCol 2215

TMS60444 MSPH Agrobacterium

nptII

Cây CG

TMS60444

NCHP Agrobacterium

nptII

Cây CG

Siritunga and Sayre và cs. 2004 Chellappan và cs. 2004

TMS60444

NCHP Agrobacterium

Cây CG

Zhang và cs. 2005

GBSS-as2 and GBSS-as7

TMS60444

Agrobacterium

nptII

Cây CG

TMS71173

Agrobacterium

nptII

Cây CG

TMS60444

NCHP Agrobacterium

hpt

Cây CG

Raemakers và cs. 2005 Ihemere và cs. 2006 Vanderschuren và cs. 2007a

TMS60444 MSPH Agrobacterium

GUSplus

Quy trình CG Bull và cs. 2009

TMS60444

NCHP Agrobacterium

hpt

Cây CG

Zhang và cs 2010

Zhao và cs. 2011

Agrobacterium KU 50 NCHP Agrobacterium TMS60444 Agrobacterium TMS60444 NCHP Agrobacterium TMS60444 NCHP Agrobacterium TMS60444 TMS60444 NCHP Agrobacterium TMS60444 MSPH Agrobacterium

ipt pCP2 nptII nptII hpt nptII GUS

TMS60444 MSPH Agrobacterium

GFP

Cây CG

TME14

MSPH Agrobacterium

Cây CG

TMS60444 MSPH Agrobacterium

Cây CG

nptII, GUS AtZIP1, AtMTP1

Vanderschuren và cs 2009 Cây CG Saelim và cs. 2009 Cây CG Beltran và cs. 2010 Cây CG Cây CG Abhary và cs. 2011 Cây CG Cây CG Yadav và cs. 2011 Taylor và cs 2012 Cây CG Nguyễn Văn Đồng và cs.2014 Evans và cs. 2015 Gaitán - Solís và cs 2015

Ghi chú: MS: mô sẹo; NCHP: Nuôi cấy huyền phù; MSPH: Mô sẹo phôi hoá; CG: chuyển gen

Trong khoảng thời gian 20 năm tính từ khi cây sắn chuyển gen đầu tiên được

báo cáo đến nay có nhiều thành tựu đáng kể đã thu được trong công tác cải tạo

giống sắn bằng công nghệ chuyển gen. Bên cạnh giống sắn mô hình được sử dụng

phổ biến trong các nghiên cứu, các giống sắn thương mại cũng đã bắt đầu được đưa

vào thử nghiệm.

Hầu hết các công trình đã công bố chuyển gen nhờ Agrobacterium ở sắn đều

chuyển vào giống sắn mô hình TMS60444, gen chuyển là gen GUS và gen chọn

lọc. Chỉ có một số công trình của Munyikwa và cs., (1998); Zhang và cs., (2005) là

có kết quả chuyển vào gen đích (AGPase, GBSS-as2 và GBSS-as7). Sự cải tiến các

đặc điểm này ở cây sắn sẽ đóng vai trò quan trọng, quyết định xu hướng nghiên cứu

trong tương lai (Liu và cs., 2011).

1.3.3.1. Kháng virus và sâu bệnh

Đối với cây trồng được nhân giống vô tính, các bệnh hại do sâu bệnh hoặc

virus có thể được lây truyền thông qua lây nhiễm vào thân và được truyền từ thế hệ

này sang thế hệ khác, là nguyên nhân làm giảm năng suất. Ví dụ: CMD (CMD-

Cassava Mosaic Disease) là bệnh khảm trên sắn do virus gây ra phổ biến ở Châu Phi,

CMD làm giảm năng suất từ 20 - 95% tính trên một diện tích gieo trồng (Legg và

Fauquet., 2004). Để phát triển cây sắn kháng bệnh khảm, các nhà nhân giống đã sử

dụng quần thể giống kháng bệnh này từ cây sắn hoang dại (Manihot glaziovii) để thu

được các giống mới kháng CMD, các giống mới này được trồng rộng rãi ở những

vùng có dịch lớn vùng Châu Phi. Từ đó, sự ảnh hưởng của dịch bệnh này đối với sản

lượng của cây sắn đã được giảm thiểu, nghề trồng sắn bắt đầu được phục hồi. Ngoài

ra, hai vector đã sử dụng là pILTAB9001 và pILTAB9002 mang gen hoang dại và

gen đột biến AC1 của ACMV-Kenya để tạo các dòng chuyển gen vào TMS60444

tăng cường khả năng kháng bệnh khảm ở cây sắn (Chellappan và cs., 2004). Phân

tích khảo nghiệm ban đầu đã cho kết quả các cây được chuyển gen này có khả năng

kháng một số bệnh do geminivirus ở Châu Phi.

Ở cây sắn, bệnh sọc nâu cũng là một bệnh nghiêm trọng do virus gây ra ở

Châu Phi, đặc biệt ở vùng biển miền Đông Châu Phi. Một số phòng thí nghiệm

đang triển khai tạo các dòng sắn chuyển gen kháng bệnh bằng cách chuyển gen mã

hóa cho protein vỏ virus hoặc thông qua siRNA (small interfering RNA) nhằm đảm

bảo sản lượng sắn trong tương lai (Patil và cs., 2011; Yadav và cs., 2011).

Ngoài virus, vi khuẩn gây bệnh ở sắn còn có các côn trùng gây hại như: rệp sáp,

ve bét xanh, sâu đục thân và bướm trắng; giun tròn ký sinh ở nốt rễ cũng là một trong

những tác nhân gây bệnh phổ biến ở cây sắn. Do đó, diện tích thâm canh các giống sắn

có khả năng kháng sâu cũng tăng nhanh. Các protein diệt côn trùng như protein Bt Cry,

chất ức chế protease, chất ức chế α-amylase và lectin thực vật cũng là lựa chọn cho các

hướng nghiên cứu vì sự biểu hiện cao của các sản phẩm này có thể rất tốt để tăng khả

năng kháng côn trùng ở cây sắn chuyển gen (Liu và cs., 2011).

1.3.3.2. Cải thiện khả năng chống stress

Cây sắn là loài cây nhiệt đới, sinh trưởng chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận

nhiệt đới giữa 30 độ Bắc và Nam của xích đạo, ở độ cao dưới 2300 m. Cây sắn dễ bị

ảnh hưởng bởi stress lạnh, khi bị stress lạnh cây thường bị sụt giảm sản lượng củ rất

rõ rệt. Vì vậy, duy trì được cây sắn ở mùa đông là rất khó khăn với người nông dân

vì chúng rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp. Do đó, cải thiện giống sắn có khả năng

chống chịu và phát triển ổn định ở điều kiện nhiệt độ thấp và có thể tăng diện tích

thâm canh cây sắn trong thời gian tới là vấn đề cần thiết. Dựa trên một số nghiên

cứu gần đây cho thấy sự biểu hiện mức độ cao của gen mã hóa cho nhân tố hoạt hóa

phiên mã - nhân tố này liên kết với yếu tố phản ứng ở sự mất nước/C-repeat được điều

hòa bởi promoter cảm ứng nhiệt độ thấp hoặc promoter CaMV 35S có thể cải thiện

đáng kể khả năng chống chịu nhiệt độ thấp ở cây sắn (Zhang và cs., 2011). Ngoài ra,

vấn đề thiếu nước gián đoạn đang xảy ra ở các vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới cũng

là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sinh trưởng và năng suất của cây sắn. Để thích nghi

với sự thay đổi của môi trường, cây sắn thường rụng lá để duy trì sự sống. Công trình

nghiên cứu sử dụng promoter cảm ứng bởi sự già hóa của gen SAG12 ở lá để biểu hiện

gen ipt ở cây sắn chuyển gen cho thấy không chỉ kéo dài thời gian sống mà còn cải tiến

khả năng chống chịu stress hạn hán (Zhang và cs., 2010). Ngoài ra đã có nhiều gen

liên quan đến khả năng chống chịu stress của cây sắn đã được xác định bằng việc sử

dụng các phân tích chuyên sâu ở mức độ gen và mức phiên mã (Li và cs., 2010;

Yang và cs., 2011). Việc xác định chức năng của các gen này sẽ giúp chúng ta hiểu

về cơ chế phân tử tính chống chịu với các yếu tố stress khác nhau của môi trường,

từ đó hình thành nên những nghiên cứu nhằm cải tiến di truyền ở cây sắn.

1.3.3.3. Giảm độc tính cyanide

Siritunga và cs., (2003) sử dụng promoter đặc hiệu ở lá từ cây A.thaliana để

điều khiển sự biểu hiện của antisense của các gen cytocrom P450 (CYP79D1 và

CYP79D2). Hàm lượng linamarin của lá cây chuyển gen giảm từ 60 - 90% so với

đối chứng, giảm tới 99% ở củ khi tiến hành kiểm tra in vitro. Điều này được nhận

định có thể là do sự vận chuyển của linamarin theo chiều từ lá về rễ. Năm 1998 đã

có công bố mức độ và hàm lượng vận chuyển hydroxynitrile lyase ở trong củ sắn

chỉ bằng 6% so với ở trong lá (White và cs., 1998). Sự biểu hiện quá mức của

hydroxynitrile lyase có thể giảm hàm lượng của acetone cyanohydrin trong củ, do

vậy sẽ làm tăng nhanh quá trình giải độc (Siritunga và cs., 2003). Để thực hiện mục

đích trên, cDNA của gen mã hóa cho hydroxynitrile lyase đã được dòng hóa vào

vector chuyển gen MCol2215, gen này ở giữa promoter CaMV 35S và yếu tố kết

thúc là trình tự ribulose bisphotphat carboxylase từ đậu Hà Lan, vector này được sử

dụng để chuyển gen (Siritunga and Sayre., 2004). Trong nghiên cứu này, hoạt động

của hydroxynitrile lyase đã tăng từ 40-135% trong cây chuyển gen và có hàm lượng

800-1300% ở trong rễ, nhưng hàm lượng tổng số của linamarin và lotaustralin trong

toàn bộ cơ thể thực vật không thay đổi. Sau khi thu hoạch, khả năng giải độc của củ

cũng được tăng lên. Ngoài ra, Jørgensen và cs., (2005) đã thiết kế một thí nghiệm

tương tự sử dụng kỹ thuật RNAi và phát hiện ra rằng hàm lượng cyanogenic

glucoside trong củ sắn giảm tới 92%. Các cây sắn chuyển gen hiện đang được

nghiên cứu trồng thử nghiệm ngoài đồng ruộng tại Nigeria.

1.3.3.4. Tăng hàm lượng chất lượng dinh dưỡng

Hàm lượng tinh bột trong củ sắn rất cao trong khi protein lại rất thấp. Tăng

cường hàm lượng protein ở củ sắn có thể cải thiện sự cân bằng về dinh dưỡng và

chế độ ăn kiêng của những người dân sử dụng sắn là nguồn lương thực, như ở

vùng Trung và Tây Phi là vấn đề cần quan tâm. Zhang và cs., (2003) đã công bố

cây sắn chuyển gen cải thiện hàm lượng protein (ASP1), giàu axit amin thiết yếu,

gen này được điều khiển bởi promoter CaMV 35S. Sự biểu hiện của ASP1 ở cả

mức độ RNA và protein có thể được phát hiện ở cây chuyển gen. Kết quả thu

được ở cây chuyển gen đã cho thấy sự gia tăng hàm lượng proline và serine

trong lá; trong khi hàm lượng axit aspartic, alanine và methionine lại giảm xuống

khi so sánh với cây không chuyển gen. Điều này đã định hướng để thực hiện các

nghiên cứu về cải thiện hàm lượng protein trong thời gian tiếp theo. Ngoài ra

một số nhà khoa học đã sử dụng promoter patatin để điều khiển sự biểu hiện của

protein dung hợp zeolin (là sự kết hợp của protein phaseolin từ cây đậu cô ve và

protein γ-zein của ngô), kết quả là hình thành một proteosom ổn định trong lưới

nội chất, làm tăng rõ rệt về hàm lượng axit amin và protein ở trong củ sắn. Ở cây

sắn chuyển gen cũng cho thấy các thành phần biến thể của axit amin và hàm

lượng cyanide dạng khử (Abhary và cs., 2011). Do vậy, phương pháp chuyển gen

để tăng hàm lượng protein ở cây sắn là rất thực tiễn và hữu ích để giảm sự thiếu

hụt protein cho các vùng có nhu cầu.

Cùng với sự hỗ trợ của quỹ Bill và Melinda Gates và 5 năm hỗ trợ của chương

trình cùng hành động toàn cầu, dự án BioCassava Plus đã phát triển được một số

lượng lớn các dòng sắn chuyển gen có thêm nhiều đặc tính: như khả năng kháng

virus, cải thiện hàm lượng protein, gia tăng hàm lượng vitamin A, sắt, kẽm. Một số

dòng đang được khảo sát ở quy mô đồng ruộng (Sayre và cs., 2011). Cùng với sự hỗ

trợ của dự án Harvest Plus, các nghiên cứu về dinh dưỡng ở cây sắn cũng được

khuyến khích như vấn đề nhân giống và làm tăng hàm lượng β-caroten (Oliveira và

cs., 2010).

1.3.3.5. Cải thiện hàm lượng và chất lượng tinh bột

Do sắn là cây trồng có nhiều tinh bột nên chất lượng tinh bột của cây sắn là

một trong những đặc điểm nông học quan trọng nhất. Hàm lượng amylopectin của

củ sắn dao động từ 70 - 80% và hàm lượng amylose từ 20 - 30% phụ thuộc vào kiểu

gen và điều kiện sinh trưởng. Tỷ lệ amylose và amylopectin quy định đặc tính của

các hạt tinh bột và do vậy ảnh hưởng đến chất lượng các sản phẩm bắt nguồn từ tinh

bột được ứng dụng trong các ngành công nghiệp (Ví dụ: dược phẩm, hóa học và sản

xuất giấy, ethanol,…). Quá trình sinh tổng hợp tinh bột được quy định bởi ba

enzyme quan trọng: AGPase, sartch synthase (SS) và starch branching enzyme

(SBE) đã được phân lập (Munyikwa và cs., 1997; Baguma và cs., 2003; Roldan và

cs., 2007; Gamez và cs., 2011; Carciofi và cs., 2012). Các nghiên cứu đã cho thấy

sự ức chế kết quả hoạt động AGPase trong việc chấm dứt một phần hoặc toàn phần

khi tổng hợp tinh bột. Do đó, việc cải thiện hoạt động AGPase có thể góp phần vào

quá trình chuyển hoá đường với tinh bột và sau đó tác động làm tăng hàm lượng

tinh bột ở cây sắn nâng cao năng suất, chất lượng sắn trong tương lai (Ihemere và

cs., 2006; Matilda và cs., 2013; You-Zhi và cs., 2016).

Tóm lại, tinh bột là thành phần quan trọng đối với thực vật cũng như là nguồn

lương thực và nguyên liệu công nghiệp. Cải tiến cây trồng theo hướng tăng hàm

lượng tinh bột là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng và luôn được các

nhà khoa học quan tâm hàng đầu. Do vậy, các nghiên cứu tìm hiểu về con đường

tổng hợp và phân hủy tinh bột ở cây trồng nói chung và đối với sắn nói riêng sẽ góp

phần thúc đẩy mục tiêu cải tạo hàm lượng tinh bột. Và quan trọng hơn, những

nghiên cứu chỉ trên cây mô hình hoặc ở các loài cây lương thực khác sẽ không cung

cấp đủ thông tin cho mục đích này. Bởi vì các quá trình này là khác nhau giữa các

loài, giữa các bộ phận khác nhau của cây, bao gồm các nhân tố điều khiển trao đổi

chất tinh bột, cấu trúc tinh bột và các con đường phân hủy tinh bột khác nhau. Xuất

phát từ cơ sở trên, những gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp tinh bột sẽ được

nghiên cứu ở đối tượng cây sắn ở Việt Nam. Phân lập 1 - 2 gen để thiết kế hệ thống

vector chuyển gen hữu hiệu chuyển vào cây sắn nhằm cải tạo cây sắn theo hướng

tăng hàm lượng tinh bột.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Vật liệu thực vật

- Các giống sắn được thu thập từ các nguồn: Trung tâm Nghiên cứu Thực

nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam.

Trung tâm tài nguyên thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (Phụ lục 1).

- Giống thuốc lá K326 do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ

sinh học cung cấp.

2.1.2. Chủng vi khuẩn, vector

- Chủ ng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58/pGV2260, vi khuẩn Escherichia

coli DH5(α) do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

- Vector tách dòng pBT để tách dòng các đoạn gen quan tâm, vector chuyển

gen pBI121 do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung

cấp; vector pK7WG2D (Ghent Uni. Belgium); vector nhân dòng pENTRTM/D-

TOPO® (Invitrogen) (Phụ lục 3).

2.1.3. Hoá chất và thiết bị thí nghiệm

* Hóa chất dùng cho sinh học phân tử

Dung dịch TAE 1X (40 mM Tris, 20mM acetic acid và 1 mM EDTA);

Agarose 0,8%; Ethidium bromide 0,5 µg/ml, thang ADN 1kb (Thermo); kit tinh

sạch ADN Gene JET gel extraction (Thermo).

Kit tách chiết plasmid (QIAprep Spin Miniprep Kit) của hãng QIAGEN (Đức);

Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen, Cat No: 911791 – 020).

* Hóa chất dùng cho nuôi cấy mô tế bào và thực vật chuyển gen

Các hóa chất đa lượng, vi lượng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng BAP,

kinetin, IBA, NAA, Yeast extract, Bacto pepton, Trypton, NaCl, Agarose, Sucrose,

Tris HCL, EDTA, MgSO4, Glycerol, Glycine betaine, Proline, Kanamycin,

Rifamycin, Cefotaxime, X-gluc và các loại hóa chất thông dụng khác được cung

cấp bởi các hãng như Sigma (Mỹ), Merck (Đức) và Wako (Nhật Bản).

* Thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật và chuyển gen: box cấy vô

trùng, bình nuôi cây, nồi khử trùng, máy nuôi lắc, máy đo pH, máy đo OD. Các

thiết bị dùng trong sinh học phân tử: pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp

ảnh điện di (Amersham Pharmacia Biotech), máy li tâm (Eppendorf), bộ điện di

(Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR System 9700 (Appied

Biosystem), bể ổn nhiệt, máy biến nạp bằng xung điện, máy voltex v.v. cùng các

trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN

ứng dụng và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh

học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

2.1.4. Môi trường nuôi cấy

Môi trường

Thành phần môi trường

LB đặc 5 g/l Yeast extract; 10 g/l trypton; 10g/l NaCl; 16 g/l agar; pH = 7

LB lỏng 5 g/l Yeast extract; 10 g/l trypton; 10g/l NaCl; pH = 7

* Môi trường nuôi cấy và chọn lọc cây sắn chuyển gen

Ký

Môi trường

Thành phần môi trường

hiệu

Tạo mô sẹo

CP MS + 10 mg/l picloram + 20 g/l sucrose + 2,6 g/l gellan, pH = 5,8

Cảm ứng tạo phôi

MS + 5 mg/l picloram + 0,2mg/l IBA + 20 g/l sucrose + 2,8 g/l

CI2

gelan; pH = 5,8

Đồng nuôi cấy

MS + 5 mg/l picloram + 0,2mg/l IBA + 20 g/l sucrose + 2,8

CI2

g/l gelan + 100µM AS; pH = 5,8

MS + 5 mg/l picloram + 0,2mg/l IBA + 20 g/l sucrose + 2,8

Chọn lọc cây

CI2

g/l gelan + 60 mg/l Km + 500 mg/l cefotaxime; pH = 5,8

chuyển gen

MS + 0,3mg/l BAP + 20 g/l sucrose + 2,8 g/l gelan + 60 mg/l

Tái sinh chồi

CN2

Km, pH = 5,8

chuyển gen

Tạo cây hoàn chỉnh MR MS + 20 g/l sucrose + 2,8 g/l gelan + 50 mg/l Km; pH = 5,8

2.1.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: tháng 4/2013 – 10/2017.

Địa điểm: Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào thực

vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ

gen và Trại thực nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Lựa chọn giống sắn và phân nhóm các giống sắn dựa vào các chỉ tiêu

đánh giá

Cùng với sự hỗ trợ của Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng

Lộc, Viện KHKT Nông nghiệp Miền Nam chúng tôi có được kết quả phân loại 250

dòng/giống sắn đại diện 3 nhóm có hàm lượng tinh bột cao (>28%), trung bình (25-28%)

và thấp (<25%) (Phụ lục 1). Sau đó chúng tôi lựa chọn được 4 giống sắn đại diện: 2

giống địa phương là: Đỏ ĐF và Trắng HB và 2 giống sắn lai là: SM937 - 26 và KM140

(KM98-1 x KM36). Lấy mẫu nghiên cứu, phân tích, tổng hợp các chỉ tiêu dựa vào hàm

lượng tinh bột trong lá và củ các giống ở giai đoạn 90 ngày, 180 ngày và 270 ngày.

2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử

2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá và củ sắn theo Garvel có cải tiến

(Garvel and Jarret, 1991). (1) Nghiền 0,1g mô thực vật trong nitơ lỏng, bổ sung 0,75

ml đệm chiết CTAB (100 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 2%

CTAB, 2% PVP), ủ 15 phút ở 65°C. (2) Thêm 0,75ml Chloroform, đảo đều, sau đó

ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. (3) Hút 700 µl dịch pha trên và bổ sung thêm

700 µl Isopropanol lạnh. (4) Đảo nhẹ ống và ly tâm thu cặn DNA 12000 vòng/phút

trong 15 phút. (5) DNA được làm khô và hòa tan vào 50 µl đệm TE. ()6 Chất lượng

DNA được kiểm tra bằng phương pháp điện di gel agarose 0,8% và đo nồng độ

bằng máy đo Nanodrop.

2.2.2.2. Phương pháp tách chiết plasmid

Plasmid được tách từ dịch khuẩn bằng phương pháp li giải kiềm theo Green

and Sambrook, 2012. Plasmid sau khi tách được kiểm tra bằng phương pháp điện di

agarose 0,8% và đo nồng độ bằng máy đo nanodrop.

2.2.2.3. Phương pháp PCR bằng GoTaq® Green Master Mix (promega)

GoTaq® Green Master Mix 2X là dung dịch master mix cho phản ứng PCR đã

được bổ sung dNTPs, Buffer PCR, enzyme và đệm load mẫu. Khi thực hiện phản ứng

PCR cần bổ sung thêm mồi PCR và DNA khuôn. Phản ứng PCR được tiến hành với

tổng thể tích 20 µl gồm: 1 µl DNA, 10 µl DreamTaq PCR Master Mix 2X, 1 µl

mồi xuôi, 1 µl mồi ngược và 7 µl nước khử ion vô trùng. Quá trình nhân gen gồm

các bước sau: 94oC/3 phút; 30 chu kỳ lặp lại các bước 94oC/1 phút, Tm/30 giây,

72oC/1 phút; 72oC/10 phút, bảo quản mẫu ở 4oC.

Trong đó, mẫu DNA là DNA tổng số thực vật, cDNA, plasmid, hoặc tế bào vi

khuẩn (gọi là PCR khuẩn lạc).

Tm được tính Tm(oC) = 64.9 + 41{[(G+C) -16.4]/N)} - 3 (N là chiều dài mồi).

2.2.2.4. Phương pháp PCR bằng Pfu DNA polymerase

Taq DNA polymerase có nhược điểm là khả năng xuất hiện đột biến trong quá

trình tổng hợp sợi mới cao (1 đột biến trên 3700 nucleotide). Như vậy, Taq DNA

polymerase không thích hợp cho nhân bản vùng CDS của gen. Pfu DNA

polymerase được sử dụng như giải pháp thay thế với tỉ lệ sai sót thấp 7.7 × 10^5 tới

1 × 10^6 (Cline et al., 1996). Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 µl

gồm: 5-10 ng DNA, 2,5 µl Pfu Buffer with MgSO4 10X, 0,5 µl Pfu DNA

polymerase, 2,5 µl dNTPs, 0,5 µl mồi xuôi, 0,5 µl mồi ngược và 18,5 µl nước khử

ion vô trùng. Quá trình nhân gen gồm các bước sau: 94oC/3 phút; 30 chu kỳ lặp

lại các bước 94oC/1 phút, Tm/30 giây, 72oC/1 phút; 72oC/10 phút, bảo quản mẫu ở 4oC.

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR tương tự như phương pháp PCR bằng

GoTaq® Green Master

2.2.2.5. Tách chiết RNA tổng số từ củ và lá sắn

Phương pháp tách chiết RNA được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit

PureLink Plant RNA Reagent (Invitrogen) bao gồm các bước chính:

* Nghiền 0,1g mẫu lá/củ trong nitơ lỏng. Bổ sung 0,5ml PureLink®Plant RNA

Reagent lạnh, đảo đều. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.

* Ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở nhiệt độ phòng. Chuyển phần dịch nổi

qua ống ly tâm mới.

* Bổ sung 0,1ml NaCl 5M, trộn đều. Bổ sung thêm 0,3ml Chloroform, trộn

đều. Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút ở 4oC, chuyển pha trên qua ống ly tâm mới.

* Thêm 1 lần thể tích isopropanol, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10

phút. Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút ở 4oC, bỏ phần dịch.

* Bổ sung 1 ml cồn 75%, trộn đều. Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ

phòng, bỏ dịch.

RNA tổng số sau khi tách chiết từ củ và lá sắn tiếp tục được loại bỏ DNA tạp

nhiễm bằng cách xử lý DNAse theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Thermo

Scientific), sau đó được tinh sạch bằng phương pháp tủa sử dụng dung dịch LiCl 7,5

M (Ambion). Thêm tác nhân tủa này vào dung dịch RNA tổng số sao cho nồng độ

cuối cùng của LiCl trong dung dịch RNA đạt 2,5 M, ủ mẫu ở –20oC trong 30 phút.

Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch nổi và rửa tủa RNA với cồn

70% lạnh để loại bỏ lượng muối còn sót lại. Hòa tủa RNA trong nước khử ion đã

được xử lý DEPC.

2.2.2.6. Phương pháp tổng hợp cDNA

cDNA được tổng hợp theo kít “RevertAidTM H Minus First Strand cDNA

Synthesis Kit” (Fermentas). Phản ứng cDNA được thực hiện trong thể tích 20µl gồm

có các thành phần sau: 500 ng RNA tổng số; 1µl mồi ngẫu nhiên (Hexamer). Bổ sung

nước khử ion có xử lý DEPC tới thể tích 12µl. Trộn nhẹ, ủ 65°C/5phút, sau đó đặt

vào đá. Tiếp tục bổ sung các thành phần vào ống phản ứng trên: 4µl đệm Reaction

buffer 5X tổng hợp cDNA; 1µl riboLock Ribonuclease inhibitor (20u/l); 2µl dNTP

(10 mM); 1µl enzyme M-MuLV Reverse Transcriptase (20u/µl). Trộn nhẹ và cho vào

máy spin sau đó chạy chương trình tổng hợp cDNA 25°C/5 phút; 42°C/ 60 phút. Kết

thúc phản ứng ở 70°C/5 phút. Bảo quản cDNA ở -20°C hoặc -70°C. Mẫu cDNA sau

khi tổng hợp được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR.

2.2.2.7. Phương pháp real time RT - PCR

i) Phương pháp xác định các gen mã hóa các enzyme tham gia vào quá trình

sinh tổng hợp tinh bột bằng tìm kiếm dữ liệu DNA và phần mềm phân tích

Các gen trong họ gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp tinh bột được tìm

kiếm trên cơ sở dữ liệu DNA của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) để trích

xuất các trình tự gen tiềm năng. Các trình tự này được sử dụng làm các trình tự truy

vấn (query sequence) để tiếp tục tìm kiếm trình tự cDNA đầy đủ của các gen này ở

cây sắn trên cơ sở dữ liệu Phytozome v10.1 (http://www.phytozome.net/). Các vùng

chức năng bảo thủ (conserved domain) được phát hiện bằng công cụ Pfam, đồng

thời cấu trúc intron/exon của mỗi gen được thu thập từ Phytozome được hiển thị bởi

Gene Structure Display Server (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/).

ii) Phương pháp thiết kế mồi cho real time RT - PCR

Các cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự các vùng bảo thủ của mỗi gen sử

dụng phần mềm Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) (Thornton và Basu,

2011). Để kiểm tra độ đặc hiệu, trình tự các cặp mồi sau khi thiết kế tiếp tục được

phân tích bằng chương trình BLAST để chắc chắn không có sự tương đồng với trình

tự các gen khác của cây sắn.

iii) Real time RT - PCR

Chúng tôi tiến hành các phân tích real time RT-PCR sử dụng SYBR Green.

Với mỗi phép phân tích, chuẩn bị 20 μl hỗn hợp phản ứng gồm 10 μl SYBR Green

Supermix (Bio-Rad), 0,5 μl mồi xuôi và 0,5 μl mồi ngược (nồng độ cuối cùng đạt 5

μM), 8 μl nước khử ion đã được xử lý DEPC và 1 μl cDNA. Các phản ứng real time

RT - PCR được thực hiện trên hệ thống máy CFX96 (CFX96 touch real-time PCR

detection system) của Bio-rad. Phản ứng khuếch đại và các đồ thị phân tích được

hiển thị bằng phần mềm CFX Manager 3.0. Chu trình nhiệt của phản ứng real-time

PCR như sau: 95oC trong 5 phút; lặp lại 40 lần (95oC trong 15 giây, 60oC trong 30

giây và 72oC trong 30 giây) và xác định đường cong nhiệt độ nóng chảy (melting

curve) (95oC trong 15 giây, 60oC trong 30 giây và 15 giây ở 95oC). Các mẫu đối

chứng cũng được thực hiện đồng thời trong mỗi lần chạy: mẫu đối chứng không

chứa khuôn (chứa tất cả các thành phần nhưng không có cDNA) để kiểm tra khả

năng nhiễm của nước, mẫu đối chứng không có sự phiên mã ngược (chứa dung dịch

RNA tổng số) để kiểm tra khả năng nhiễm DNA genome.

iv) Phương pháp xử lý và phân tích số liệu

Ba mẫu (củ hoặc lá) của 3 cây sắn khác nhau thuộc cùng một giống được xem

là 3 bản lặp có ý nghĩa sinh học. Mỗi phản ứng real time RT - PCR được thực hiện

lặp lại 3 lần. Chất lượng độ khuếch đại từ mỗi phản ứng real time RT - PCR được

ước định thông qua các đường cong phân tích hiển thị bằng phần mềm CFX

Manager (phiên bản 3.0) được tích hợp trong máy PCR và các số liệu chu kỳ

ngưỡng Ct được ghi nhận. Mức độ phiên mã của các gen tham gia sinh tổng hợp

tinh bột ở sắn được định lượng tương đối dựa trên gen tham chiếu 18S rRNA theo phương pháp 2-∆∆Ct của Livak (2001).

2.2.2.8. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR và thôi gel

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng GeneJET PCR Purification Kit của hãng

Thermo Scientific như sau: Thêm vào thể tích tương đương Binding buffer, trộn

đều. Cho toàn bộ dịch lên cột ly tâm. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch

qua cột. Thêm vào cột 500 Wash buffer. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ

dịch qua cột. Ly tâm tiếp 13000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột ly tâm sang

ống 1,5 ml. Thêm vào cột ly tâm 30 µl nước khử ion vô trùng, ủ ở nhiệt độ phòng

trong 2 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu lấy dịch.

DNA trên gel agarose được thu hồi bằng cách ủ phân đoạn gel với Binding

buffer tỉ lệ 1:1 để hòa tan gel. Sau đó thực hiện tương tự các bước như bên trên.

2.2.2.9. Phương pháp tách dòng sản phẩm bằng vector pENTR™/D-TOPO

Sản phẩm PCR được gắn vào vector pENTR theo pENTR™/D-TOPO® Cloning kit

Thành phần

Thể tích (µl) 4

STT 1 2 3

1 1 1

Sản phẩm PCR sạch (200 ng) Salt solution TOPO® vector Tổng thể tích

Hỗn hợp phản ứng được ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng (22-23oC). Đặt phản ứng

trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào E.coli One Shot Competent. Bổ

sung 2 µl phản ứng TOPO Cloning vào tế bào khả biến và trộn nhẹ. Ủ trong đá 10

phút. Sốc nhiệt tế bào 30 giây, ở 42oC rồi chuyển ngay ống vào đá. Bổ sung 250 µl

môi trường SOC ở nhiệt độ phòng. Nuôi lắc 200 v/p, 37oC, 1 giờ. Cấy trải 50-200

µl dịch biến nạp lên đĩa môi trường LB đặc chứa 100 µg/ml Kanamycin và ủ qua

đêm ở 37oC.

2.2.2.10. Phương pháp nối hai hoặc nhiều đoạn DNA bằng phản ứng ligase với

T4 DNA ligase

Các phân đoạn DNA đã tinh sạch được ghép nối với nhau để tạo plasmid tái tổ

hợp nhờ T4 DNA ligase, thành phần phản ứng như bảng sau:

Thành phần phản ứng

STT 1 2 3 4 5 Tổng H2O deion Vector đã cắt (50 ng) Đoạn chèn (10-50 ng) T4 DNA ligase Buffer 10X Buffer T4 DNA ligase (1U/µl) Thể tích(µl) 2 2 2 2 2 10

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22oC trong 30 phút. Sau đó đặt hỗn hợp phản

ứng lên đá lạnh và tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α

2.2.2.11. Phương pháp cắt DNA với enzyme cắt giới hạn

Các mẫu DNA hoặc Plasmid được cắt enzyme để tạo đầu đính hoặc để kiểm

tra Plasmid. Thành phần phản ứng như bảng sau:

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 16 H2O

2 Buffer 10X 2

3 BamHI (10 U/µl) 1

4 Mẫu DNA (<10 µg) 1

Tổng 20

Phản ứng cắt được ủ ở 37oC trong ít nhất 2 giờ. Sau khi kết thúc phản ứng, sản

phẩm cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

2.2.2.12. Phương pháp tách dòng sản phẩm PCR bằng vector pBT

Vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ tế bào thực vật thiết kế hoạt động

dựa trên cơ chế TA-cloning vector và Operon Lactose (Phan Trọng Hoàng và cs.,

2005). Để kiểm tra đoạn chèn đã được gắn vào pBT ngoài việc chọn khuẩn lạc xanh

trắng, còn thực hiện thêm kỹ thuật PCR khuẩn lạc và cắt BamHI. PCR khuẩn lạc là

phương pháp thực hiện phản ứng PCR với mẫu khuôn là các tế bào vi khuẩn được

lấy trực tiếp từ khuẩn lạc. pBT vector được thiết kế hai cặp mồi ở hai đầu là pUC18

F/R và M13 F/R. Nếu kiểm tra trực tiếp bằng mồi đặc hiệu cho đoạn cần tách dòng

thì dễ xảy ra hiện tượng dương tính giả do các phân đoạn PCR dư thừa trong quá

trình biến nạp còn sót lại trên đĩa khuẩn. Bởi vậy, sử dụng cặp mồi pUC18 F/R hoặc

M13 F/R là cách tối ưu để loại bỏ dương tính giả. Sản phẩm PCR có thể dài hơn

164 bp nếu sử dụng pUC18 F/R hoặc 124 bp nếu sử dụng M13 F/R.

Cuối cùng cắt plasmid với BamHI là phương pháp tốt nhất để kiểm tra plasmid

và tính nguyên vẹn của vector. Plasmid được cắt bằng BamHI sẽ xuất hiện một băng

cố định (2700 bp) chính là vector pBT và các băng còn lại (đoạn DNA chèn vào).

Tùy thuộc vào việc có điểm cắt BamHI trong đoạn chèn hay không mà ảnh điện di

có thể có từ 2 băng trở lên.

2.2.2.13. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu được với các trình tự

tương ứng trên GenBank (Phụ lục 2)

Xác định trình tự nucleotide: Các mẫu plasmid tái tổ hợp được xác định trình

tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Gentic Analyzer.

Phân tích trình tự: Sử dụng các phần mềm DNAstar, BioEdit, BLAST để so

sánh các trình tự gen.

2.2.3. Phương pháp phân lập gen và promoter

2.2.3.1. Phân lập gen tăng cường tổng hợp tinh bột SSIV

Các gen tăng cường sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột được phân lập từ sắn

bằng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đó được tách dòng

bằng vector pBT hoặc pENTRTM/D-TOPO. Các vector mang các đoạn gen tách

dòng này được tách chiết, giải trình tự và phân tích kết quả.

Tên gen Mồi RT-PCR Độ dài (bp) Vector tách dòng

SSIV SSIV F / SSIV R 3500 pENTRTM/D-TOPO

2.2.3.2. Phân lập promoter điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu ở củ sắn

Khuếch đại Promoter C54 với cặp mồi C54pro/PstI_F và C54pro/XbaI_R từ

DNA tổng số được tách chiết từ lá sắn. Điện di sản phẩm PCR, tinh sạch và tách

dòng đoạn gen kích thước 1051 bp vào vector pBT.

2.2.4. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen

2.2.4.1. Thiết kế vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S bằng kỹ thuật Gateway

Gen SSIV được chèn vào vector pK7WG2D bằng kỹ thật Gateway theo hướng

dẫn của bộ Kit Gateway® LR Clonase™ II. Sản phẩm của phản ứng được sử dụng

để biến nạp vào tế bào khả biến E. coli One Shot TOP10 và chọn lọc trên môi

trường có bổ sung Spectinomycin 100 µg/ml. Để sàng lọc các dòng khuẩn lạc mang

vector tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV mong muốn, chúng tôi thực hiện phản ứng

colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F (5’ –

CCTCTCCTGAACAACCTCCA- 3’) và SSIV-Frag_R (5’ –

GCAAACTTCCCACCTTTTCC- 3’) khuếch đại một đoạn ngắn gần 1 kb của gen

ssiv. Các dòng khuẩn lạc cho kết quả PCR dương tính sẽ được chọn để nuôi cấy và

tiến hành tách chiết plasmid, sau đó cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI.

Vector pK7WG2D/35S/SSIV được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens để phục vụ

chuyển gen.

2.2.4.2. Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV:NOST

Đoạn gen mã hóa cmyc được khuếch đại bằng phản ứng PCR với 3 mồi: cmyc-

HindIII-F1, SacI-cmyc-R3 và cmyc-SacI-R2. Thành phần của phản ứng PCR bao gồm:

Pfu buffer 1X, dNTPs 12,5mM, Pfu DNA polymerase 2,5U, mồi Cmyc-HindIII-F1

20 pM, ScaI-Cmyc-R3 2 pM; Cmyc-SacI-R2 20 pM và H2O. Chu kỳ của PCR như

sau: 72°C/1 phút; 40°C/ 30 giây (2 chu kỳ, bước này để nối các mồi với nhau tạo

đoạn cmyc 80 bp); 55°C/ 20 giây; 72°C/ 20 giây (15 chu kỳ) ; 72°C/ 1 phút; 70°C/5 phút.

Sản phẩm PCR nhân đoạn gen cmyc được gắn vào vector pBI121 sau khi đã xử lý

với hai enzym HindIII và SacI. Vector pBI121/cmyc được nhân dòng trong Ecoli

DH5α, sử dụng kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l. Các dòng khuẩn lạc dương

tính được nuôi lỏng và tách plasmid tái tổ hợp.

Đoạn gen mã hóa promoter C54 được khuếch đại bằng PCR với mồi XmaI-

C54-F và C5Pro/XbaI-R từ pBT:C54, sau đó được tinh sạch và xử lý XmaI và XbaI.

Đoạn gen mã hóa SSIV được khuếch đại bằng phản ứng PCR với mồi XbaI-SSIV-F

và SSIV-ScaI-R, sau đó được tinh sạch và xử lý XbaI và ScaI. Vector pBI-Cmyc

được xử lý với XmaI và ScaI.

Sản phẩm cắt promoter C54, SSIV và vector pBI121/Cmyc được gắn kết với

nhau bằng phản ứng T4 ligase tạo vector pBI121/C54-SSIV, sau đó được nhân dòng

trong Ecoli DH5α, sử dụng kháng sinh chọn lọc Kanamycin 50 mg/l. Các dòng

khuẩn lạc dương tính được chọn lọc bằng phản ứng PCR với mồi XmaI-C54-F và

C54Pro/XbaI-R và kiểm tra sản phẩm cắt emzym giới hạn với XmaI và ScaI.

Phương pháp cắt, nối gen được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Themor

Fisher Scientific).

Hình 2.1. Trình tự đoạn cmyc và vị trí của các mồi PCR

2.2.5. Kỹ thuật canh tá c, chăm só c cá c giố ng sắ n phu ̣c vu ̣ cho nghiên cứ u

Các giố ng sắn SM937-26; Đỏ ĐF, KM140 và Trắng HB được trồng ta ̣i tra ̣i thực nghiê ̣m Cổ Nhuế dướ i cù ng mô ̣t điều kiê ̣n canh tác (Hình 2.2): mỗi giố ng sắ n đươ ̣c trồ ng thành hàng đơn theo luố ng dài 25m, rô ̣ng 1m, khoảng cách giữa các cây là 0,8 m và giữa các hàng là 1,2 m. Các hom sắn đươ ̣c cho ̣n để trồ ng là những hom bánh tẻ không bi ̣ sâu bê ̣nh, chiều dài 15 - 20 cm có từ 3 - 5 mắt, đường kính 3 - 4 cm. Khi hom sắn bật mầm, chỉ để 1 – 2 mầm khoẻ, tỉa bớt các mầm yếu. Lần 1: Sau

trồng khoảng 30 - 45 ngày, làm sạch cỏ và vun xới gốc. Lần 2: Sau trồng khoảng 3

tháng, lúc này cần xới sâu và vun cao để đất tơi xốp, củ phát triển thuận lợi, cây

mọc vững chắc, chống đổ. Khi trồ ng bó n ló t toàn bô ̣ phân hữu cơ và lân. Sau khi trồ ng 50 ngày bó n thú c đa ̣m và kali gần gố c, và tiếp tu ̣c bó n thú c lần 2 là sau 3 tháng kết hơ ̣p vớ i vun cao gố c (Trịnh Xuân Ngọ và Đinh Thế Lộc., 2004).

2.2.6. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Hình 2.2. Quá trình canh tá c và thu hoa ̣ch cá c giố ng sắ n quan tâm ta ̣i Tra ̣i thực nghiê ̣m sinh học Cổ Nhuế phục vụ nghiên cứ u

2.2.6.1. Khử trùng mẫu

Thân sắn non từ các giống sắn: KM140, HB80, Trắng NA, Đỏ ĐF, Trắng HB

được cắt thành các đoạn mang mắt ngủ với kích thước khoảng 1 - 1,5 cm, khử

trùng bằng 0,1% HgCl2 trong 7 phút, tiếp theo loại bỏ HgCl2 và rửa bằng nước cất

vô trùng 5 lần rồi cấy vào môi trường MS (Phụ lục 4). Những chồi non vô trùng

mọc lên từ mẫu cấy tiếp tục cấy chuyển lên môi trường MS có bổ sung 20 g/l sucrose.

2.2.6.2. Nuôi cấy tạo mô sẹo sắn

Nguồn nguyên liệu là đỉnh chồi, mảnh lá non và cuống lá của cây sắn in vitro

khoảng 3 tuần tuổi được sử dụng cho thí nghiệm. Cuống lá và đỉnh chồi được cắt

nhỏ với kích thước khoảng 0,3 - 0,5 cm. Đối với lá non (lá thứ nhất, thứ 2 sát với

đỉnh sinh trưởng) được cắt thành những mảnh nhỏ có kích thước 0,5 x 0,5 cm, bỏ

phần mép lá để thuận lợi cho quá trình tạo mô sẹo. Sau đó, mẫu được cấy lên môi

trường tạo mô sẹo CP (MS + 10 mg/l picloram + 20 g/l sucrose + 2,6 g/l gellan) và

CD (MS + 10 mg/l 2,4D + 20 g/l sucrose + 2,6 g/l gellan).

2.2.6.3. Cảm ứng tạo phôi từ mô sẹo ở sắn

Sau 3 tuần, lựa chọn những mô sẹo có cấu trúc mô chặt, vàng tươi hoặc vàng

nhạt, loại bỏ dịch nhầy và chuyển sang môi trường phát sinh phôi CI1-4. Thành phần

môi trường là: MS + 5 mg/l picloram + (0,1; 0,2; 0,3; 0,4) mg/l IBA + 20 g/l

sucrose + 2,8 g/l gelan; pH 5,8. Đánh giá tỷ lệ phát sinh phôi của 5 giống sắn

nghiên cứu sau 4, 6 và 8 tuần/tổng số mẫu thí nghiệm.

2.2.6.4. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ phôi

Chuyển phôi sang môi trường kích thích phôi nảy mầm CN1-4 (MS + 5 mg/l

picloram + (0; 0,3; 0,6; 0,9) mg/l BAP + 20 g/l sucrose + 2,8 g/l gelan; pH 5,8)

trong 4 tuần và tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường MS trong 3 tuần.

Mẫu được nuôi dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 3000 lux, thời gian chiếu sáng 14 - 16 giờ/ngày, nhiệt độ phòng nuôi cấy 25 ± 2oC. Tất cả các

thí nghiệm được thực hiện 50 mẫu/lần, lặp lại 3 lần/ thí nghiệm.

2.2.6.5. Huấn luyện cây ngoài nhà lưới

Cây sắn tái sinh hoàn chỉnh có số rễ lớn hơn 2 rễ, 4 – 5 lá, xanh đậm, chiều cao đạt

5 - 7 cm được chuyển ra trồng trên giá thể TN1, tuần đầu tránh ánh sáng trực xạ và chăm

sóc ở điều kiện cung cấp đầy đủ nước và dinh dưỡng.

2.2.7. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

2.2.7.1. Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

Mảnh lá thuốc lá cắt thành những mảnh nhỏ có diện tích 1 cm2 được ngâm

trong dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen có OD600 =

0,6 trong 20 phút và được đặt lên môi trường đồng nuôi cấy GM (MS + 1mg/l BAP

+ 30g/l sucrose + 8g/l agar, pH= 5,8), để tối. Sau hai ngày đồng nuôi cấy, chuyển

các mảnh lá lên môi trường tái sinh và chọn lọc chồi GM có bổ sung kháng sinh diệt

khuẩn 500 mg/l cefotaxim và kháng sinh chọn lọc 50 mg/l Kanamycin. Sau 4 - 5

tuần các chồi tái sinh đạt chiều cao khoảng 3cm được chuyển sang môi trường ra rễ

chọn lọc RM (MS + 0,1mg/l IBA + 30g/l sucrose + 8g/l agar + 500mg/l cefotaxime,

50mg/l Kanamycin, pH = 5,8). Sau 3 đến 4 tuần cây phát triển hoàn chỉnh, ra rễ

và có từ 3 - 4 lá thật được chuyển ra bầu có trộn trấu hun và cát với tỉ lệ 1:1. Cây

phát triển với 4 đến 5 lá thật được chuyển ra trồng trong bầu đất chứa giá thể

TN1 (Viện Nông hóa thổ nhưỡng) ở điều kiện nhà kính.

2.2.7.2. Chuyển gen vào cây sắn thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

Đỉnh chồi, mảnh lá, cuống lá được đưa vào môi trường CP, CD cảm ứng tạo mô

sẹo (2 - 3 tuần). Mô sẹo được chuyển sang môi trường CI1-4 để tạo phôi cung cấp nguyên

liệu phục vụ cho chuyển gen (4 - 8 tuần). Lựa chọn phôi ở giai đoạn phôi non, khối mô

vàng tươi, tua dài lây nhiễm với dịch huyền phù A. tumefaciens có bổ sung 100µM AS

trong 10 - 20 phút và đặt trên môi trường đồng nuôi cấy CI1-4 có bổ sung 100µM AS

trong 2 ngày, để tối ở nhiệt độ phòng 25 - 27oC. Sau đó chuyển phôi lên môi trường nuôi

cấy chọn lọc CI1-4 có bổ sung 500 mg/l cefotaxime, 40 - 100 mg/l Km, cấy chuyển hai

tuần/ lần cho tới khi chồi sắn tái sinh. Phôi soma sống sót được nuôi cấy trên môi trường

tái sinh chồi CN1-4 có bổ sung 50 - 100 mg/l Km, nhiệt độ 25 - 27oC (6 - 8 tuần). Chồi

sắn tái sinh được chọn lọc trên môi trường ra rễ chọn lọc (MR) là môi trường MS bổ

sung 50 - 100 mg/l Km, nhiệt độ 25 - 27oC để chọn lọc cây chuyển gen. Những chồi

sống sót được chuyển sang môi trường MS để cây sinh trưởng, phát triển. Khi cây đạt

chiều cao 7 - 8 cm, cây có 4 - 5 lá với bộ rễ khỏe mạnh được trồng trong bầu cùng với

giá thể TN1 và đặt trong bồn sinh trưởng.

2.2.7.3. Xác định nồng độ Kanamycin thích hợp để chọn lọc cây chuyển gen

Các chồi non in vitro của hai giống sắn HB 80 và KM 140 cao khoảng 1- 1,5 cm

được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và môi trường MS bổ sung Km với các nồng độ

0, 40, 60, 80, 100mg/l. Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại, mỗi lần 20 mẫu.

2.2.8. Phương pháp phân tích sự có mặt của gen chuyển

2.2.8.1. Phương pháp PCR

Các dòng cây chuyển gen sau khi trồng trên giá thể đất mùn khoảng 1 tháng có

2 - 3 lá mới, tiến hành thu lá để tách ADN tổng số và thực hiện phản ứng PCR.

DNA được tách theo phương pháp Garvel (Garvel, Jarret, 1991). DNA tổng số

(0,2-1 µg) của các dòng thuốc lá chuyển gen được sử dụng làm khuôn cho phản ứng

PCR. Đồng thời, vector chuyển gen mang các cấu trúc gen chuyển cũng được sử dụng

làm đối chứng dương cho phản ứng, mồi đặc hiệu được chọn cho từng gen (xem phần

kết quả). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%.

2.2.8.2. Kỹ thuật lai Southern Blot

Các dòng cây chuyển gen sau khi cho kết quả dương tính với phản ứng PCR

được trồng tại trại thực nghiệm. Khi cây sinh trưởng phát triển tốt, thu lá để tách

DNA tổng số và thực hiện phản ứng lai Southern.

Southern blot (Edwin Southern., 1975) là một trong những kỹ thuật chuyển DNA

từ gel lên màng lai. Phân tích southern blot nhằm tìm kiếm thông tin về trình tự DNA,

kích thước và số lượng của một chuỗi trình tự đang nghiên cứu trong một hỗn hợp DNA.

Đây là một kỹ thuật cổ điển, các phân đoạn DNA được phân tách dựa vào kích thước

bằng phương pháp điện di agarose, chuyển chúng lên một màng lai có khả năng gắn bám

DNA, các phân đoạn này được lai với mẫu dò được gắn nhãn đánh dấu (phóng xạ, huỳnh

quang, …) và cuối cùng là phát hiện các mẫu dò có gắn nhãn.

Cụ thể: 30 - 50 µg DNA tổng số được tách chiết từ 1g lá thuốc lá chuyển gen được

tinh sạch và xử lý bằng enzyme giới hạn. Các phân đoạn DNA được phân tách trên gel

agarose 1% và chuyển lên màng nilon tích điện dương. Màng sau đó được lai với mẫu dò

được tổng hợp nhờ bộ Kit Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit (Thermo Scientific) với

khuôn DNA là sản phẩm PCR của các gen chuyển. Nhiệt độ lai 42 - 50oC (với dung dịch

lai chứa 50% formamid) và rửa màng ở 65 - 69oC (0,1X SSC). Quy trình hiện màng được

thực hiện theo kit Biotin Chromogenic Detection Kit (Thermo Scientific).

Mẫu dò Tên mẫu Enzyme cắt Nhiệt độ lai (oC) Nhiệt độ rửa màng (oC)

SSIV XbaI 45 65 Phân đoạn 1000 bp cuối gen SSIV

2.2.9. Phương pháp phân tích sự biểu hiện của cây chuyển gen

2.2.9.1. Phân tích sự biểu hiện của gen GUS

Biểu hiện tạp thời hay bền vững của gen GUS được phân tích theo phương

pháp nhuộm hóa mô tế bào của Jefferson và cs., 1987. Các bộ phận khác nhau của

cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-gluc. Sau 24 - 48 giờ

mẫu nhuộm được tẩy hết diệp lục bằng Ethanol 70% và quan sát trên kính lúp soi

nổi. Biểu hiện hoạt động của gen GUS sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản

ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.

2.2.9.2. Phương pháp phân tích tinh bột ở cây thuốc lá

i) Phương pháp nhuộm iodine

Sự biểu hiện của gen SSIV được xác định bằng phương pháp nhuộm và phân

tích hàm lượng tinh bột sử dụng thuốc thử Anthrone khi hòa tan trong acid sulfuric

72% (Yemm và Willis., 1954; Hansen và Moller., 1975). Trong môi trường này,

glucose sẽ tạo dạng vòng 5 cacbon và phản ứng với thuốc thử thông qua nhóm –

Lá chiết diệp lục

Kẹp

Nhúng lá vào nước sôi, 1 phút

Nhúng lá trong cồn sôi Nước sôi

Dung dịch nhuộm Iodine

Đĩa petri

Giấy thấm

CHO tạo ra sản phẩm có màu xanh, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 630nm.

Hình 2.3: Quy trình kiểm tra hàm lượng tinh bột trong lá bằng phương pháp

(http://www.nuffieldfoundation.org/practical-biology/testing-leaves-starch-technique)

nhuộm iodine

Mẫu lá thuốc lá được thu ở cùng một thời điểm và độ tuổi ở các dòng chuyển

gen và WT ở cùng độ tuổi, trong cùng thời gian (nhiệt độ 27oC, độ ẩm 70%, điều

kiện chiếu sáng 16h/ngày, sau đó được sấy khô và loại bỏ diệp lục bằng cách chiết

với acetone 100%. Hàm lượng đường tự do trong mẫu cần được khử với cồn 80%

sau đó tinh bột ở mẫu được thủy phân trong acid để tạo ra các phân tử đường

glucose.

ii) Phương pháp đo hàm lượng tinh bột

Phương pháp đo hàm lượng tinh bột dựa trên phương pháp đo của Hansen and

Moller (Hansen J, Møller IB., 1975).

Hóa chất:

* Anthrone reagent: hòa tan 0,2 g anthrone trong 100 ml H2SO4 72 %.

* Tinh bột chuẩn: chuẩn bị dung dịch gốc tinh bột hòa tan trong dH2O ở nồng

độ 1 mg/ml.

* Acetone 100%, ethanol 80%, HCl 50%.

Các bước thực hiện

• Xây dựng đường chuẩn

- Hòa loãng tinh bột thành các nồng độ khác nhau từ dung dịch gốc (0,1 – 1 mg/ml).

- Thủy phân tinh bột với HCl 50% theo tỷ lệ 500 µl tinh bột/2500 µl HCl 50%. -

Quá trình thủy phân được thực hiện trong 30 phút ở 100oC.

- Dịch thủy phân được điều chỉnh đến tổng thể tích 5 ml với dH2O

Phản ứng với anthrone trong 11 phút ở 100oC, sau đó đo độ hấp thụ và dựng

đường chuẩn ở bước sóng 630 nm.

Kết quả thu được ở hình 2.4 và 2.5

Giá trị đo OD630 Nồng độ tinh bột (mg/ml)

0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 0,030 0,065 0,236 0,327 0,425 0,571 0

Hình 2.4. Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ lá cây

thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S

Nồng độ tinh bột (mg/ml) Giá trị đo OD630

0,05 0,031

0,1 0,087

0,2 0,236

0,3 0,327

0,4 0,425

0,5 0,517

0 0

Hình 2.5. Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ rễ cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121 – C54:SSIV: NOST

 Xác định hàm lượng tinh bột có trong mẫu

- Mẫu thực vật được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi và cân lấy 10

mg/mẫu.

- Nghiền mẫu thành bột mịn, sau đó loại sắc tố quang hợp với aceton 100%

cho đến khi dịch rửa không còn màu. Ly tâm loại dịch ở 10.000 v/ 5 phút.

- Rửa cặn với EtOH 80% ở nhiệt độ 80oC 2 lần, mỗi lần 2,5 ml để loại đường

hòa tan có trong mẫu.

- Cặn mẫu được thủy phân với HCl 50% trong 30 phút ở 100oC.

- Dịch thủy phân được đem phản ứng với anthorne và đo giá trị hấp thụ ở

bước sóng 630nm. Hàm lượng tinh bột có trong mẫu được tính theo đường chuẩn

đã xây dựng.

- Dịch thủy phân được điều chỉnh nồng độ về giá trị OD630 nằm trong khoảng

giá trị khảo sát của đường chuẩn với dung dịch HCl 50%.

2.2.10. Phương pháp phân tích và xử lí số liệu

Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên máy tính

bằng phần mềm Microsoft Excel. Phân tích trình tự nucleotide của gen và trình tự

axit amin của protein bằng phần mềm BioEdit và DNAstar.

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. LỰA CHỌN GIỐNG SẮN VÀ PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC

GEN LIÊN QUAN ĐẾN TRAO ĐỔI CHẤT TINH BỘT

Cùng với sự hỗ trợ của Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp

Hưng Lộc, Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Cây có củ, Viện Khoa học Bắc

Trung Bộ, huyện Bắc Bình, tỉnh Bình Thuận, trường Đại học Thái Nguyên chúng

tôi đã có được các thông tin đầy đủ về đặc điểm nông sinh học của 250 dòng/giống

sắn. Trong đó có 34 dòng sắn triển vọng có hàm lượng tinh bột cao >28%; 77 dòng

có có hàm lượng tinh bột trung bình từ 25 - 28% và 139 dòng có hàm lượng tinh bột

dưới 25% (Phụ lục 1).

Hàm lượng tinh bột trong củ sắn là yếu tố chất lượng quan trọng quyết định

giống được chấp nhận hay không. Giống sắn có chất lượng tốt sẽ cho lượng tinh bột

cao và ngược lại tỷ lệ tinh bột trong củ sắn thấp đồng nghĩa với việc chất lượng

giống sắn đó chưa cao. Tinh bột được tích lũy tăng dần theo quá trình sinh trưởng

của cây. Tinh bột được tích lũy nhiều bắt đầu vào tháng thứ 6 đến tháng thứ 9 sau

trồng sau đó giảm dần và ổn định. Với mục đích đánh giá sự hoạt động của các gen

có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp tinh bột từ các dòng/giống sắn của Việt

Nam. Chúng tôi đã lựa chọn được 2 nhóm sắn (gồm 4 giống) đa ̣i diê ̣n cho nhó m có

hàm lươ ̣ng tinh bô ̣t cao và thấp dựa vào năng suất và chất lượng tinh bột để tiến

hành nghiên cứu nhằm tạo ra giống sắn có hàm lượng tinh bột cao bằng công nghệ gen.

3.1.1. Lựa chọn các giống sắn sử dụng

Cùng với kết quả phân nhóm sắn dựa trên một số chỉ tiêu chung như năng

suất, tỷ lệ chất khô, hàm lượng tinh bột, thời gian thu hoạch (Phụ lục 1) đã lựa chọn

được 4 giống sắn. Trong đó: 3 giống có hàm lượng tinh bột cao và năng suất khác

nhau (SM937-26, Đỏ ĐF và KM140); 1 nhóm có hàm lượng tinh bột thấp và năng

suất thấp (Trắng HB) làm đại diện sử dụng trong thí nghiệm đánh giá hoạt động của

các gen liên quan đến qúa trình sinh tổng hợp tinh bột (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Đặc điểm của một số giống sắn sử dụng trong phân tích biểu hiện gen

Tên giống Năng suất củ tươi (tấn/ha) Hàm lượng tinh bột (%) Thời gian thu hoạch (ngày)

Nhóm : giống có hàm lượng tinh bột cao

45,0 SM937-26 28,5-29,5 252

13,0 Đỏ ĐF 29,5 255

50,5 KM140 26,1-28,4 240

Nhóm: giống có hàm lượng tinh bột thấp

Trắng HB 13,25 15,2 240

3.1.2. Thu mẫu và xử lý mẫu sắn

Sự đồ ng nhất về đô ̣ tuổ i củ a mẫu cũng như vi ̣ trí thu mẫu cũng có ảnh hưở ng rất lớ n đến kết quả đánh giá, so sánh mứ c đô ̣ hoa ̣t đô ̣ng củ a các gen quan tâm. Để phu ̣c vu ̣ cho công tác nghiên cứ u, lá và củ của 4 giống sắn gồ m: SM937-26, Đỏ ĐF, KM140, Trắng HB đại diện cho nhóm có hàm lượng tinh bột khác nhau đã được thu

thập vào các giai đoạn phát triển 90 ngày, 180 ngày và 270 ngày.

A

B

Chú thích: A: Lá sắn trưởng thành thứ 1 từ trên xuống (có cá c thù y lá đã xò e ra

hoà n toà n). B: Phần mô thịt củ giàu tinh bột

Hình 3.1: Hình ảnh minh họa vị trí lá và củ sắn (đánh dấu đỏ) được thu thập

Vi ̣ trí thu mẫu đố i vớ i mẫu lá sắn là lá trưở ng thành (có các thù y lá đã xò e ra hoàn toàn) đầu tiên tính từ ngo ̣n. Trong khi đó , vị trí mô của củ cần thu cho việc

nghiên cứu là phần mô mềm thịt củ, giàu tinh bột hơn các phần còn lại của sắn

(Hình 3.1). 3.1.3. Tách chiết ARN tổng số

Lá và củ của 4 giống sắn gồ m SM937-26, Đỏ ĐF, KM140, Trắng HB đã được

thu thập vào các giai đoạn phát triển 90 ngày, 180 ngày và 270 ngày. RNA tổng số

của các mẫu củ và lá sắn được tách chiết bằng hóa chất chuyên dụng cho việc tách

chiết RNA thực vật (PureLink Plant RNA Reagent) của Invitrogen. Các bước thực

hiện được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4

3

2 M

1 M

1

2

3

4 B

A

Chú thích: M. Macker; 1: SM937-26; 2: Đỏ ĐF; 3: KM140; 4: HB 80

Hình 3.2. RNA tổng số tách chiết từ các mẫu củ (A) và lá các giống sắn (B)

Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số trên gel agarose (Hình 3.2) và đo

nanodrop (Bảng 3.2) cho thấy, RNA tổng số thu được có tính toàn vẹn, không bị

đứt gẫy, đảm bảo hàm lượng và độ tinh sạch cho các thí nghiệm tiếp theo.

Bảng 3.2. Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu RNA tổng số tách chiết từ lá và

củ các giống sắn

TT Tên mẫu A260/A280 A260/A230 Nồng độ RNA tổng số (ng/µl)

SM937-26

Mẫu lá, 90 ngày Mẫu lá, 180 ngày Mẫu lá, 270 ngày Mẫu củ, 90 ngày 1116,41 1088,43 1260,00 1079,82 2,14 2,16 2,11 2,14 2,05 2,09 2,05 2,05

Mẫu củ, 180 ngày Mẫu củ, 270 ngày 1189,24 1074,50 2,12 2,05 2,05 2,00

Đỏ ĐF Mẫu lá, 90 ngày Mẫu lá, 180 ngày Mẫu lá, 270 ngày Mẫu củ, 90 ngày Mẫu củ, 180 ngày Mẫu củ, 270 ngày 1124,00 1263,71 1065,21 1067,73 1187,52 1150,00 2,14 2,15 2,05 2,05 2,05 2,11 2,05 2,09 2,05 2,05 2,09 2,05

1450,22 1178,81 1200,43 1070,65 1045,52 1290,01 2,03 2,14 2,15 2,05 2,10 2,11 1,82 2,34 2,00 2,09 2,05 2,05

KM140 Mẫu lá, 90 ngày Mẫu lá, 180 ngày Mẫu lá, 270 ngày Mẫu củ, 90 ngày Mẫu củ, 180 ngày Mẫu củ, 270 ngày Trắng HB

Mẫu lá, 90 ngày 4 Mẫu lá, 180 ngày Mẫu lá, 270 ngày Mẫu củ, 90 ngày Mẫu củ, 180 ngày Mẫu củ, 270 ngày 1079,00 1050,71 1114,43 1334,62 1079,94 1268,55 2,22 1,95 2,15 1,99 1,62 1,87 1,97 2,08 2,03 1,96 1,51 1,92

3.1.4. Tổng hợp cDNA từ ARN tổng số của lá, củ sắn trong các giai đoạn phát

triển khác nhau và đánh giá chất lượng cDNA

Để đánh giá chất lượng của sản phẩm cDNA, 1µl cDNA được dùng làm

khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi khuếch đại gen actin là Actin_F

(TGCAGACCGTATGAGCAAG) và actin_R (CACCCTTGGAAATCCACATC).

Theo tính toán lý thuyết, cặp mồi này sẽ nhân được đoạn gen có kích thước 150 bp.

Hình 3.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen actin từ cDNA sắn

Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR cho thấy tại các đường chạy đều xuất

hiện một băng DNA sáng sắc nét chứng tỏ gen actin đã được khuếch đại thành công

từ cDNA các mẫu củ và lá sắn. Kết quả đã tổng hợp được nguồn cDNA đủ hàm

lượng và chất lượng từ lá, thân và các giai đoạn phát triển khác nhau của lá, rễ làm

nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo (Hình 3.3).

3.1.5. Thu thập thông tin, thiết kế các cặp mồi thích hợp để phân tích sự biểu

hiện của một số gen liên quan tới sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột

Tinh bô ̣t là một polysacarit carbonhydrate chứa hai thành phần chính là tổ ng hơ ̣p bở i ADP-glucose amylose và amylopectin. Amylose đươ ̣c

pyrophosphorylase (AGP) và granule-bound starch synthase (GBSS) cò n amylopectin đươ ̣c tổ ng hơ ̣p bở i hoa ̣t đô ̣ng phố i kết hơ ̣p củ a AGP, các starch

synthase (SS) và enzyme phân nhánh tinh bột (starch branching enzyme - SBE). Do

đó, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn 4 nhóm gen là ADP-glucose

pyrophosphorylase (AGP), granule-bound starch synthase (GBSSI và GBSSII),

starch synthase (SSI, SSII, SSIII, SSIV) và emzyme phân nhánh tinh bột (SBE) để

kiểm tra và đánh giá sự hoạt động của các gen này ở cấp độ phiên mã bằng phản

ứng real time RT-PCR.

Viê ̣c xác đi ̣nh các thành viên thuô ̣c mỗi nhó m gen liên quan đến quá trình sinh tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t ở sắn như trên để ta ̣o cơ sở dữ liê ̣u cho viê ̣c thiết kế mồ i đươ ̣c thực hiê ̣n bở i 3 bướ c. Bướ c thứ nhất là truy câ ̣p cơ sở dữ liê ̣u NCBI để thu thâ ̣p các trình tự nucleotide củ a các gen AGP, GBSSI, GBSSII, SSI, SSII, SSIII, SSIV và SBE củ a thực vâ ̣t đã đươ ̣c công bố trên ngân hàng gen Genbank. Bướ c thứ 2, bằng công cu ̣ tìm kiếm Local BLAST, sử du ̣ng các trình tự này làm trình tự truy vấn trong cơ sở dữ liê ̣u gen sắ n tải từ Phytozome v10.1 để tìm ra trình tự cDNA đầy đủ củ a các gen giả đi ̣nh tương ứ ng ở sắn. Ở bướ c cuố i cù ng, mỗi trình tự gen giả đi ̣nh đươ ̣c kiểm tra và khẳng đi ̣nh bằng công cu ̣ Pfam tìm các vù ng chứ c năng bảo thủ trên trình tự protein tương ứ ng. Sau khi khảo sát hê ̣ gen, đã xác đi ̣nh đươ ̣c các gen liên quan đến quá trình sinh tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t ở sắn (Bảng 3.3).

Bả ng 3.3. Cơ sở dữ liê ̣u cá c gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp tinh bột ở sắ n

STT Gen Locus Vi ̣ trí AGPS1 Manes.12G067900 Chromosome12:6583306..6588233 1

AGPS2 Manes.13G058900 Chromosome13:6335420..6339941 2

3 AGPL1 Manes.03G182100 Chromosome03:26947393..26950623

4 AGPL2 Manes.18G019600 Chromosome18:1530942..1533519

5 AGPL3 Manes.11G085500 Chromosome11:11864920..11871278

6 GBSSI Manes.02G001000 Chromosome02:117671..121941

7 GBSSII Manes.02G046900 Chromosome02:3606695..3614000

SSI Manes.01G184000 Chromosome01:28273525..28281524 8

SSII-1 Manes.02G046900 Chromosome02:3606695..3614000 9

SSII-2 Manes.01G091700 Chromosome01:21623316..21629007 10

SSIII Manes.16G006900 Chromosome16:682293..693880 11

SSIV Manes.15G118600 Chromosome15:8973978..8983153 12

SBE Manes.05G133800 Chromosome05:17845753..17853349 13

3.1.6. Phân tích cơ sở dữ liệu về biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình

sinh tổng hợp đường và các tiền chất cho tổng hợp tinh bột trên lá và củ sắn

Căn cứ vào bốn thời kỳ sinh trưởng và phát triển của cây sắn: thời kỳ sinh rễ

và mọc mầm, thời kỳ phát triển hệ rễ, thời kỳ phát triển thân lá và thời kỳ phát triển củ,

đã lựa chọn 3 mốc thời gian là 90 ngày, 180 ngày và 270 ngày sau khi trồng (DAP) để

đánh giá sự hoạt động của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp tinh bột sắn ở 2

nhóm giống sắn có hàm lượng tinh bột cao (SM937-26, Đỏ ĐF, KM140) và thấp (Trắng

HB) bằng phương pháp real-time PCR. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng gen

18S rRNA sắn (GenBank: AB233568.1) làm gen tham chiếu để chuẩn hóa mức độ phiên

mã của các gen quan tâm.

AGPase: Ở thực vật bậc cao, AGPase được xác định là enzyme dị lập thể, được

tạo thành từ 2 chuỗi polypeptide riêng biệt là một cặp tiểu đơn vị lớn (large subunit-

AGPL) và một cặp tiểu đơn vị nhỏ (small subunit-AGPS), hai tiểu đơn vị này được

mã hóa bởi các gen khác nhau. Với đối tượng cây sắn đã xác định được 5 gen mã

hóa cho AGPase, trong đó 2 gen mã hóa AGPS (AGPS1, AGPS2) và 3 gen mã hóa

AGPL (AGPL1, AGPL2, AGPL3).

Hình 3.4. Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPS qua các giai đoạn phát

triển ở 4 giống sắn bằng real time RT-PCR

Đối với nhóm gen AGPS, dựa vào kết quả phân tích mức độ biểu hiện của các

gen ở mô lá và củ (Hình 3.4), bước đầu xác định gen AGPS2 hoạt động chủ yếu ở

lá, trong khi đó gen AGPS1 có xu hướng biểu hiện đặc hiệu ở củ. Sự phiên mã của

gen AGPS2 ở lá 2 giống sắn KM140 và Trắng HB có xu hướng giống nhau: giảm

nhẹ hoạt động vào giai đoạn 180 ngày và tăng dần ở giai đoạn 270 ngày; ở giống

sắn Đỏ ĐF và SM937-26, mức độ phiên mã của gen này tăng dần qua các giai đoạn.

So với giai đoạn khởi đầu 90 ngày, ở giai đoạn 270 ngày khi đạt giá trị max, mức độ

phiên mã của AGPS2 ở giống sắn Đỏ ĐF và SM937-26 tăng gấp 2,2 lần và 1,7 lần,

theo thứ tự tương ứng, trong khi ở giống Trắng HB mức độ biểu hiện của gen này

tăng không đáng kể. Giống KM140 có mức độ biểu hiện gen AGPS2 ở lá cao nhất,

tuy nhiên không có sự chênh lệch nhiều so với 2 giống SM937-26 và Trắng HB.

Đáng chú ý là hoạt động của gen AGPS1 ở củ cả 4 giống sắn có sự tăng qua các

thời kỳ và tăng mạnh ở 270 ngày, gấp 3,3 - 4,2 lần so với giai đoạn khởi đầu. Mức

độ phiên mã của gen này ở nhóm giống sắn có hàm lượng tinh bột cao (Đỏ ĐF,

SM937-26 và KM140) có sự chênh lệch đáng kể (gấp 1,4 - 1,7 lần) so với giống

Trắng HB có hàm lượng tinh bột thấp.

Hình 3.5. Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPL qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real time RT-PCR

Đối với nhóm gen AGPL: sự phiên mã của gen AGPL1 chủ yếu diễn ra ở lá,

mức độ phiên mã của gen này cao gấp 11 - 38 lần gen AGPL3 tùy từng giống và

giai đoạn sinh trưởng. Trái lại không phát hiện được sự phiên mã của gen AGPL2 ở

lá cả 2 giống sắn. Mức độ biểu hiện của AGPL1 trong lá có sự tăng nhẹ qua các thời

kỳ, tuy nhiên không có sự khác biệt lớn giữa 2 nhóm giống sắn. Ở mô củ, gen

AGPL2 và AGPL3 hoạt động chủ yếu, trong đó AGPL2 hoạt động mạnh ở giai

đoạn đầu, sau đó mức độ phiên mã giảm dần. Trái lại sự phiên mã của gen AGPL3

khi bước vào thời kỳ phát triển củ và tích lũy tinh bột (giai đoạn 180-270 ngày) có

sự tăng mạnh, gấp từ 3 - 4 lần so với giai đoạn 90 ngày. Sự biểu hiện của gen này

cũng cho thấy mối tương quan với hàm lượng tinh bột ở từng giống. Cụ thể ở giai

đoạn 270 ngày mức độ phiên mã của AGPL3 ở giống Đỏ ĐF và SM937-26 cao gấp

1,2 - 1,4 lần so với giống sắn hàm lượng tinh bột thấp là Trắng HB (Hình 3.5).

Hình 3.6. Phân tích mức độ biểu hiện gen GBSS qua các giai đoạn phát triển ở 4

giống sắn bằng real time RT-PCR

Các kết quả trên cho thấy AGPS1 và AGPL3 chịu trách nhiệm cốt yếu trong

việc tạo thành ADP-glucose làm cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp tinh bột ở củ

sắn. Các gen này cũng cho thấy có liên quan đến mức độ sinh tổng hợp tinh bột ở

các giống sắn.

Các gen GBSS: enzyme GBSS bao gồm 2 dạng chính là GBSSI và GBSSII

chịu trách nhiệm kéo dài chuỗi amylose. Kết quả phân tích mức độ biểu hiện

(Hình 3.6) cho thấy sự biểu hiện của gen GBSSI là đặc hiệu ở mô củ sắn, trái lại

gen GBSSII chịu trách nhiệm chính trong việc tổng hợp amylose ở lá. Trong khi

mức độ phiên mã của gen GBSSII ở lá chỉ tăng không đáng kể qua các thời kỳ

thì gen GBSSI ở cả 4 giống sắn khi bước vào giai đoạn sắn tích lũy tinh bột về

củ (270 ngày) sự phiên mã của gen này có sự tăng đột biến, gấp từ 9 - 12 lần so

với giai đoạn 180 ngày và gấp từ 35 - 55 lần so với giai đoạn 90 ngày. Sự hoạt

động của gen GBSSII ở mô củ cả 4 giống sắn đều thấp, có sự giảm dần qua các

thời kỳ. Ở 270 ngày, mức độ biểu hiện trung bình của GBSSI ở mô củ cao gấp

hơn 55 lần gen GBSSII, tuy nhiên sự phiên mã của GBSSI ở 2 nhóm giống sắn

không cho thấy sự khác biệt đáng quan tâm.

Các gen SS: Thực vật có rất nhiều isoform SS dạng tan chịu trách nhiệm

sinh tổng hợp amylopectin. Sự phân bố của các SS bên trong thể lạp giữa chất

nền và các hạt tinh bột có sự khác nhau giữa các loài, các loại mô và các giai

đoạn phát triển. Dựa trên trình tự axit amin chúng được phân thành 4 lớp là SSI,

SSII, SSIII và SSIV. Trong đó các isoenzyme SSI, SSII và SSIII liên quan đến

sự kéo dài các chuỗi amylopectin. Các bằng chứng sinh hóa cho thấy SSI ưu tiên

kéo dài các chuỗi ngắn nhất với mức độ polyme hóa (DP) từ 4 - 10 đơn vị

glucosyl. SSII chủ yếu kéo dài các chuỗi trung bình (DP từ 12 - 24 đơn vị

glucosyl) và SSIII chịu trách nhiệm các chuỗi dài nhất.

Hình 3.7. Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSI, SSIII, SSIV qua các giai

đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real time RT-PCR

Mô hình biểu hiện của gen SSI và SSIII ở cả 4 giống sắn có sự tương tự nhau

trong quá trình phát triển của củ sắn: mức độ phiên mã tăng nhẹ ở giai đoạn 180

ngày và tiếp tục tăng hơn gấp đôi ở giai đoạn 270 ngày khi quá trình tổng hợp tinh

bột ở củ sắn bắt đầu diễn ra mạnh mẽ (Hình 3.7). Trong khi đó ở mẫu lá, sự biểu

hiện của 2 gen này không có sự biến đổi nhiều qua các thời kỳ, đồng thời mức độ

biểu hiện cũng tương đương nhau. Đối với cả 2 gen SSI và SSIII, kết quả phân tích

ở cả mẫu củ và mẫu lá cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa các giống sắn

có hàm lượng tinh bột khác nhau đồng thời không cho thấy mối tương quan với

hàm lượng tinh bột ở từng giống.

Hình 3.8. Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSII qua các giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real time RT-PCR

Đối với SSII ở sắn chúng tôi xác định được 2 gen mã hóa là SSII-1 và SSII-2,

trong đó gen SSII-2 biểu hiện rất yếu ở củ lại là dạng chính được biểu hiện ở lá còn

gen SSII-1 biểu hiện mạnh và đặc hiệu ở củ. Một điểm khác biệt nổi bật giữa mô

hình biểu hiện của gen SSII-1 ở củ so với 2 gen SSI và SSIII có sự tăng mạnh trong

giai đoạn 270 ngày ở cả 4 giống sắn. Cụ thể mức độ biểu hiện trung bình của SSII-1

trong củ 270 ngày cao gấp 14 lần giai đoạn 180 ngày và gấp 21 lần giai đoạn 90

ngày (Hình 3.8). Khác với ngũ cốc có SSI và SSIII được biết đến là các enzyme

hoạt động chính trong nội nhũ, nghiên cứu ở sắn cho thấy gen SSII-1 biểu hiện

mạnh mẽ hơn cả gen SSI và SSIII. Ở giai đoạn 270 ngày, mức độ phiên mã trung

bình của gen SSII-1 ở củ cao gấp đôi gen SSI và cao hơn 3,5 lần gen SSIII. Tuy

nhiên sự biểu hiện của gen SSII-1 không thể hiện sự chênh lệch đáng kể giữa các

nhóm giống sắn.

Trong số các gen SS được nghiên cứu, gen SSIV có mức độ biểu hiện thấp. Ở

giai đoạn khởi đầu (90 ngày) và giai đoạn tích lũy tinh bột ở củ (270 ngày) mức độ

phiên mã trung bình của gen SSIV chỉ bằng 1/6 và 1/4 gen SSI, theo thứ tự tương

ứng. Tuy nhiên, giống như gen SSIII, sự biểu hiện của gen SSIV ở mẫu củ tại thời

điểm 270 ngày cũng có sự tăng đáng kể (gấp từ 3 - 6 lần giai đoạn 90 ngày, và gấp 2

- 5 lần giai đoạn 180 ngày tùy từng giống). Trong số 2 nhóm, giống sắn chứa hàm

lượng tinh bột thấp Trắng HB có sự biến động về hoạt động của gen SSIV thấp

nhất, đồng thời mức độ phiên mã của gen SSIV ở giống này trong giai đoạn 270

ngày cũng thấp hơn đáng kể 2 giống còn lại. Cụ thể ở những giống hàm lượng tinh

bột cao Đỏ ĐF, SM937-26 và KM140, mức độ phiên mã của gen SSIV trong mẫu

củ cao gấp 3,2 lần và 1,7 lần ở giống Trắng HB. Trong số các gen SS, SSIV là gen

duy nhất cho thấy có sự biến đổi rõ về mức độ biểu hiện ở lá. Trong giai đoạn 270

ngày, mức độ phiên mã của gen SSIV ở lá cao hơn 3 lần giai đoạn 90 ngày và cao

hơn gấp đôi giai đoạn 180 ngày. Đồng thời, cũng giống như củ, sự phiên mã của

gen SSIV trong lá các giống Đỏ ĐF, SM937-26 và KM140 cũng cao gấp 3,3 lần và

2,2 lần so với Trắng HB là giống có hàm lượng tinh bột thấp (Hình 3.7). Những kết

quả này rất đáng quan tâm, cho thấy SSIV có tiềm năng trong việc kiểm soát hàm

lượng tinh bột tạm thời trong lá cũng như tinh bột dự trữ ở thực vật.

Gen SBE: Trong quá trình tổng hợp amylopectin, Starch Branching Enzyme

(SBE) chịu trách nhiệm tạo ra các liên kết α-(1,6) bằng cách cắt các liên kết α-(1,4)

nội tại và chuyển đoạn glucan gồm ≥ 6 gốc glucose đến cùng chuỗi phân tử

amylopectin hoặc chuỗi bên cạnh.

Hình 3.9. Phân tích mức độ biểu hiện của gen SBE qua các giai đoạn phát triển

ở 4 giống sắn bằng real time RT-PCR

Kết quả nghiên cứu 2 nhóm giống sắn qua các giai đoạn phát triển cho thấy có sự

tương tự về xu hướng biểu hiện của gen SBE trong mẫu củ: tăng dần từ giai đoạn 90

ngày đến 180 ngày, và có sự tăng đột biến ở giai đoạn 270 ngày (Hình 3.9). Cụ thể: mức

độ phiên mã của gen SBE ở củ 270 ngày của cả 4 giống tăng khoảng 30 lần so với giai

đoạn 90 ngày. Sự tăng mức độ biểu hiện của SBE cũng được ghi nhận ở mẫu lá, tuy

nhiên sự khác biệt là không nhiều giữa các giai đoạn phát triển (tại thời điểm 270 ngày,

mức độ phiên mã trung bình của gen SBE chỉ gấp gần 2 lần so với giai đoạn khởi đầu 90

ngày). Trong số 4 giống sắn, giống KM140 có sự biểu hiện của gen SBE mạnh nhất ở cả

mô củ (gấp khoảng 1,1-1,3 lần so với giống SM937-26 và Trắng HB) và mô lá (gấp 1,5-

1,8 lần ở giống SM937-26 và Đỏ ĐF). Tuy nhiên sự khác biệt này chưa cho phép giả

định tiềm năng sử dụng SBE trong việc cải tiến hàm lượng tinh bột ở thực vật.

Tóm lại:

Đã xác định được các gen AGPS, AGPL và SSIV ở 4 giống sắn nghiên cứu

làm đại diện cho 2 nhóm là những gen quan trọng góp phần quyết định hàm lượng

tinh bột ở củ sắn bằng phương pháp real time RT-PCR và phương pháp phân tích

tin sinh học. Tuy nhiên, hiện nay chưa có nhiều các công trình nghiên cứu cụ thể

gen SSIV liên quan đến quá trình sinh tổng hợp tinh bột trên cây sắn. Vì vậy, để tìm

hiểu sâu hơn về vấn đề này chúng tôi tiếp tục lựa chọn gen SSIV để phân lập, giải

trình tự, thiết kế vector chuyển gen và đánh giá hoạt động promoter biểu hiện đặc

hiệu ở rễ cây mô hình phục vụ cho công tác chuyển gen tăng cường tổng hợp tinh

bột ở củ sắn sau này.

3.2. PHÂN LẬP GEN SSIV LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG TỔNG HỢP

TINH BỘT VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN

3.2.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho gen

Thông tin về trình tự của gen SSIV mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá

trình sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột ở sắn được khai thác trên cơ sở dữ liệu của

ngân hàng gen quốc tế NCBI tại website http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Đối với gen

SSIV, do kích thước DNA của gen SSIV rất lớn (hơn 8 kb) nên chúng tôi sử

dụng trình tự CDS của gen SSIV sắn trên phytozome với mã

cassava4.1_000719m để thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen SSIV từ cDNA

củ sắn. Trên mồi xuôi có chứa trình tự CACC ở đầu 5’giúp quá trình nối ghép

gen đích vào vector pENTR được đơn giản hóa nhờ phản ứng TOPO cloning -

một phương pháp tạo dòng của Invitrogen. Trình tự mồi được trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Trình tự các cặp mồi để khuếch đại các gen quan tâm

Trình tự nucleotide

Tên đoạn gen

Kích thước đoạn gen (kb)

~ 3.5

Tên cặp mồi SSIV_F EcoRI SSIV_R

CACCATGGCGTCGAAGCTATCGA CGTGGTTTCTG TTAGACCTACTTGCTGCCGCTCTTG Khuếch đa ̣i gen SSIV

Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen SSIV sau khi được khuếch đại bằng các

cặp mồi đặc hiệu sẽ có kích thước tương ứng là 3500 bp và thiết kế các cặp mồi đặc

hiệu phục vụ việc nhân dòng và thiết kế vector chuyển gen mang các gen quan tâm.

Trình tự các cặp mồi được trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Trình tự các cặp mồi nhân dòng gen liên quan đến sinh tổng hợp tinh

bột và thiết kế vector chuyển gen

Tên cặp mồi

Trình tự nucleotide

Tên đoạn gen

Kích thước đoạn gen (kb)

Kiểm tra vector pK7WG2D/SSIV

SSIV-Frag_F CCTCTCCTGAACAACCTCCA SSIV-Frag_R GCAAACTTCCCACCTTTTCC Cmyc HindIII F1

ScaI cmyc R3

c-myc/SacI_R2

Tạo SSIV Cmyc

XbaI-SSVI-F

ATGAAGCTTACGCAGTATCCCGG GATATTCTCAAG CTGAGATGAGTTTCTGTTCAGTA CTTGAGAATATC TACGAGCTCTCACAGATCCTCTTCTGA GATGAGTT ATATCTAGAATGGCGTCGAAGCTATC GACG

Nhân dòng promoter C54

C54pro/XbaI_R

SSIV-ScaI-R TGTAGTACTAGACCTACTTGCTGCCGC XmaI-C54-F AAACCCCGGGTGTGGGCCAACTCCACC C54pro/PstI_F AACTGCAGGGATCCACGGGTGTGGG GCTCTAGAAAGTAAATGGTGAGAAGC AAAGAGG

3.2

Trình tự nucleotide của các cặp mồi đặc hiệu sau khi được thiết kế được đặt

tổng hợp tại tại công ty MWG, CHLB Đức và công ty Epoch Life Science, Hoa Kỳ.

Như vậy, đã thiết kế được 3 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen quan tâm:

SSIV (mã hóa cho starch synthase).

3.2.2. Phân lập gen SSIV ở sắn

3.2.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn

Dựa vào kết quả phân tích mức độ biểu hiện gen ở mục 3.1.6 đã xác định được

gen SSIV là một trong số 3 gen tiềm năng góp phần quyết định hàm lượng tinh bột của

củ sắn và mức độ biểu hiện ở củ và lá ở hai giống sắn Đỏ ĐF, KM140 cao hơn hai giống

còn lại. Vì vậy, đây là lý do để tiếp tục lựa chọn hai giống sắn Đỏ ĐF và KM140 thực

hiện các nghiên cứu tiếp theo.

RNA tổng số được tách chiết từ củ giống sắn Đỏ ĐF, KM140 bằng hóa chất

chuyên dụng cho việc tách chiết RNA thực vật (PureLink Plant RNA Reagent) của

Invitrogen. Các bước thực hiện được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

DNA genome tạp nhiễm sau đó được loại bỏ bằng cách xử lý mẫu với DNAase I và

RNA tổng số được tinh sạch bằng phương pháp tủa sử dụng Lithium chloride

(LiCl). Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số trên gel agarose cho thấy RNA tổng

số thu được có tính toàn vẹn, không bị đứt gẫy, đảm bảo hàm lượng và độ tinh sạch

cho các thí nghiệm tiếp theo (Hình 3.10A).

Chú thích: A. RNA tổng số tách chiết từ củ sắn; B. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen SSIV từ cDNA sắn; C. PCR chọn lọc các dòng khuẩn mang vector pENTR/ SSIV

Hình 3.10. Kết quả tách dòng đoạn gen SSIV từ củ sắn

3.2.2.2. Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV của sắn và tổng hợp cDNA

Để tăng hiệu suất cũng như độ đặc hiệu của phản ứng PCR khuếch đại gen

ssiv từ cDNA sắn, tiến hành tổng hợp cDNA từ RNA tổng số tách chiết từ củ sắn sử

dụng mồi đặc hiệu. Theo đó, cDNA được tổng hợp theo kit “RevertAidTM H

Minus First Strand cDNA Synthesis Kit” (Thermo Scientific).

3.2.2.3. Phân lập, tách dòng, giải trình tự gen SSIV của sắn

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế để khuếch đại gen SSIV từ cDNA sắn đã

tổng hợp bằng phản ứng PCR dưới sự xúc tác của enzyme Pfu DNA polymerase.

Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% cho thấy đã khuếch đại thành công 1

đoạn DNA có kích thước gần 3,5 kb tương đương với kích thước đoạn CDS của gen

SSIV theo lý thuyết (Hình 3.10B).

Bảng 3.6. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen SSIV ở giống KM140

và Đỏ ĐF so với gen tham chiếu

Vị trí 120 155 223 229 253 254 255 282 288 734 841 1268 1353 1574 1622 1761 1982 2520 2913 2941 3051 3086 3094 SSIV Đỏ ĐF G - C C A T - G G G G G A C A T A T G T G G A SSIV KM140 T Mất TAG T A G A Chèn ATT A T G C A G A G C G A A G G A A Gen tham chiếu T - T C A T - A G A C G A A A T G A A T A G G STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Đoạn DNA sau đó được tinh sạch và gắn vào vector pENTRTM/D-TOPO trong

dung dịch muối đệm tạo thành vector pENTR/SSIV. Sản phẩm của phản ứng TOPO

cloning được sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E. coli One Shot TOP10 bằng

phương pháp sốc nhiệt. Sàng lọc các dòng khuẩn lạc trên đĩa biến nạp bằng phương

pháp PCR khuẩn la ̣c sử dụng cặp mồi M13F/R, chọn được 3 dòng khuẩn lạc cho kết

quả dương tính với kích thước băng DNA đúng như tính toán là > 3,5 kb (Hình

3.10C). Sau đó các dòng khuẩn lạc được nuôi lượng lớn để tách chiết plasmid phục

vụ cho việc giải trình tự gen.

Kết quả đọc trình tự gen cho thấy, sản phẩm gen tách dòng từ mẫu nghiên cứu

có kích thước 3189 bp (Phụ lục 2). Trong đó gen phân lập có độ tương đồng với gen

tham chiếu với mã Manes.15G118600 trên phytozome là 99%, khác nhau ở 11 vị trí

(120, 223, 282, 734, 841, 1574, 1982, 2520, 2913, 3051, 3094) đối với giống Đỏ

ĐF và 13 vị trí (229, 253, 254, 288, 734, 1268, 1353, 1622, 1761, 2941, 3051, 3086,

3094) đối với giống KM140 (Bảng 3.6). Trình tự gen phân lập mã hoá cho 1061

axit amin suy diễn, so sánh với trình tự axit amin của gen tham chiếu với mã

cassava4.1_000719m khác nhau ở 3 vi ̣ trí củ a giố ng Đỏ ĐF: vi ̣ trí 280 thay thế E, vi ̣ trí 524 thay thế L, vi ̣ trí 660 thay thế S và khác nhau ở 12 vị trí củ a giố ng KM140 trong đó có: vị trí 51 mất axit amin S, vị trí 76 thay thế S, vị trí 84 thay thế D, vị trí

85 thêm axit amin I, vị trí 95 thay thế D, vị trí 244 thay thế G, vị trí 422 thay thế I,

vị trí 450 thay thế R, vị trí 540 thay thế R, vị trí 979 thay thế L, vị trí 1028 thay thế

K và vị trí 1031 thay thế N (Bảng 3.7).

Bảng 3.7. Vị trí sai khác trong trình tự axit amin suy diễn của protein SSIV của

gen phân lập

Vị trí 51 76 84 85 95 244 280 422 450 524 540 660 979 1028 1031 SSIV Đỏ ĐF S R I - E E E V Q L K S F R D SSIV KM140 Mất S S D Thêm I D G Q I R M R W L K N Gen tham chiếu S R I - E E Q V Q M K W F R D STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Từ các kết quả phân tích trên chứng tỏ đã phân lập thành công gen SSIV từ

giống sắn Đỏ ĐF và KM140. Vì giố ng KM140 hiê ̣n đang là mô ̣t trong những giố ng sắn có năng suất cao, chố ng chi ̣u vớ i sâu bê ̣nh tố t, là giố ng đang phổ biến trồ ng trên

cả nướ c và tỷ lê ̣ giố ng nhau củ a hai giố ng này so vớ i gen tham chiếu là trên 99%.

Do vâ ̣y, chú ng tôi gử i đăng ký trình tự gen SSIV phân lập được từ giống sắn

KM140 trên ngân hàng gen với mã số KT033500.

3.2.2.4. Phân lập promoter điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu ở củ sắn

Dựa vào trình tự promoter C54 đã được công bố trên NCBI (AY217352, Hình

3.11A) đã thiết kế cặp mồi C54pro/PstI_F và C54pro/XbaI_R để nhân dòng bằng

phản ứng PCR. Trên trình tự mồi được bổ sung thêm vị trí cắt các enzyme PstI và

XbaI để thuận tiện cho việc thiết kế vector. Do vậy, quy trình PCR được thực hiện qua hai bước: thứ nhất, chạy 3 chu kỳ ở 550C, sau đó 27 chu kỳ ở 600C. Kết thúc

phản ứng, sản phẩm PCR được điện di và thôi gel để thu hồi sản phẩm PCR đặc

hiệu (Hình 3.11B).

Sản phẩm PCR promoter C54 đã được gắn vào vector pBT. Để kiểm tra khuẩn

lạc dương tính trước khi tiến hành tách dòng gen, chúng tôi tiến hành phản ứng

PCR với mồi pUC18F/R. Khi PCR với mồi PUC18, kích thước sản phẩm PCR thu

được sẽ cao hơn đoạn chèn 164 bp do vị trí mồi PUC18. Vì vậy, phản ứng PCR

khuẩn lạc dương tính khi thu được 1 băng có kích thước ~1215 bp. Kết quả clony-

PCR cho thấy, các khuẩn lạc số 1, 2, 4, 6, 7 dương tính (Hình 3.11.C).

Khuẩn lạc số 1 và 2 được chọn nuôi lỏng và tách plasmid. Để kiểm tra kích

thước đoạn chèn, tiến hành cắt plasmid với enzyme XbaI và PstI. Phản ứng cắt

dương tính khi trên bản điện di kiểm tra xuất hiện hai băng DNA có kích thước như

tính toán ban đầu (băng vector ~2700 bp và băng C54 có kích thước 1047 bp),

plasmid thu được ở cả hai khuẩn lạc số 1 và 2 đều đạt yêu cầu (Hình 3.11.D),

plasmid tách từ khuẩn lạc số 1 được đem đi giải trình tự.

Kết quả phân tích trình tự cho thấy tương đồng đến 99% so với trình tự C54

(AY217353) đã được công bố trên Genbank (NCBI) (Phụ lục 2.3). Ngoài ra, kết

quả phân tích sử dụng phần mềm TSSP (softberry.com) đã chứng minh promoter

C54 mới phân lập có đầy đủ các yếu tố và vùng chức năng so với promoter tham

chiếu (Phụ lục 2.4). Như vậy, chúng tôi đã phân lập thành công promoter C54 điều

khiển biểu hiện gen đặc hiệu ở củ sắn.

Chú thích: A. Sơ đồ Promoter C54 và vị trí mồi PCR. B. Sản phẩm PCR nhân dòng promoter C54. C. Ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với mồi pUC18F/R (1,2,4,6,7 là những dòng dương tính; 3,5,8,9,10,11,12,13,14,15 là những dòng âm tính); D. Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pBT::C54 với enzyme XbaI và PstI

Hình 3.11. Tách dòng promoter C54 ở sắn

Tóm lại:

Từ các kết quả phân tích trên chứng tỏ đã phân lập thành công gen SSIV từ

giống sắn KM140 và Đỏ ĐP. Tuy nhiên, so sánh vị trí sai khác trong trình tự axit

amin suy diễn của protein SSIV ở 2 giống này có sự sai khác không đáng kể (~1%).

Mặt khác, giống sắn KM140 tuy là giống sắn có hàm lượng tinh bột chưa phải cao

nhất (26,1 – 28,4%) nhưng hiện tại là giống sắn có năng suất cao, ít sâu bệnh và

đang phổ biến ở nhiều địa phương trên cả nước. Do vậy đây sẽ là giống sắn được

tiếp tục lựa chọn phục vụ cho các nghiên cứu tạo cây sắn chuyển gen tiếp theo.

Trình tự gen SSIV phân lập được từ giống sắn KM140 đã được đăng kí trên ngân

hàng GenBank với mã số KT033500.

3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen

3.2.3.1. Thiết kế vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S

Kỹ thuật Gateway là một phương pháp nhân dòng phổ biến và tiện ích dựa trên

cơ sở phản ứng tái tổ hợp đặc hiệu vị trí giữa các điểm chuyên biệt ở DNA của phage

và vi khuẩn được gọi là các điểm gắn. Với kỹ thuật này, một hoặc nhiều gen đích có

thể di chuyển từ dòng gốc vào bất kì vector đích biểu hiện nào theo đúng chiều và

khung đọc chỉ trong một bước thao tác mà không phải sử dụng bất kỳ enzyme cắt giới

hạn nào. Ngoài ra pK7WG2D là một vector thuộc hệ thống Gateway với cấu trúc gồm

1 vùng chứa đoạn xen attR1-ccdB-attR2. Vì vậy, sản phẩm của phản ứng LR là một

plasmid có chứa 1 vị trí tái tổ hợp mang gen đích có chiều mong muốn.

Thành phần và các bước thực hiện phản ứng LR được thực hiện theo hướng dẫn của bộ Kit Gateway® LR Clonase™ II Enzyme Mix của Invitrogen với vector

đích là pK7WG2D và entry clone chính là vector pENTR/SSIV đã thiết kế thành

công. Sản phẩm của phản ứng được sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E. coli

One Shot TOP10 và chọn lọc trên môi trường có bổ sung Spectinomycin 100 µg/ml.

Để sàng lọc các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV mong

muốn cần thực hiện phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F

và SSIV-Frag_R khuếch đại một đoạn ngắn gần 1 kb của gen SSIV. Các dòng khuẩn

lạc cho kết quả PCR dương tính sẽ được chọn để nuôi cấy và tiến hành tách chiết

plasmid, sau đó cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI.

Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng cắt cho thấy đã chọn được các dòng

plasmid tái tổ hợp pK7WG2D-35S:SSIV:T35S cho các băng DNA đúng kích thước

theo tính toán lý thuyết là: 10661bp, 2201bp và 1486bp, chứng tỏ vector pK7WG2D-

35S:SSIV:T35S được thiết kế thành công (Hình 3.12A,B).

Vector chuyển gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S đã thiết kế được sử dụng để

biến nạp vào tế bào khả biến chủng A. tumefaciens. Sản phẩm của quá trình biến

nạp được nuôi trên môi trường YMB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l

Spectinomycin, ủ ở 280C. Sau 2 ngày thu được một lượng lớn khuẩn lạc trên đĩa

thạch. Sau khi sàng lọc bằng phương pháp colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu

SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R, các dòng A. tumefaciens mang cấu trúc chuyển gen

sau đó sẽ được nuôi lỏng trong 3 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc ở

280C qua đêm, sau đó được giữ trong Glycerol 20% và bảo quản trong tủ -840C.

Kết quả điê ̣n di sản phẩm PCR cho thấy một số dò ng khuẩn la ̣c 1, 2, 3, 4, 8 mang xuất hiện băng PCR kích thướ c khoảng 960 bp, đú ng vớ i kích thướ c lý thuyết củ a đoạn gen PCR bằng mồi SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R. Kết quả trên, chứ ng tỏ các dòng vi khuẩn đã mang gen cần chuyển (Hình 3.12C).

Chú thích: A. Kết quả điện di PCR khuẩn lạc sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R. B. Kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pK7WG2D-35S:SSIV:T35S bằng EcoRI. C. Kết quả điện di PCR các dòng khuẩn lạc mang vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S

Hình 3.12. Thiết kế vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S

3.2.3.2. Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV:NOST

Khuếch đại trình tự nucleotide đoạn cmyc bằng phản ứng PCR với 3 mồi

Cmyc-HindIII-F1, SacI-Cmyc-R3 và Cmyc-SacI-R2 từ vector tách dòng mang

AGPopt_cmyc. Trình tự cmyc và vị trí cắt của enzyme đã được tổng hợp dựa vào

phản ứng PCR. Trên ảnh điện di thu được 1 băng đặc hiệu (79 bp) đúng như tính

toán ban đầu (Hình 3.13A).

Vector pBI121 đã được cắt hoàn toàn với enzyme HindIII và SacI. Kết quả

phân tích ảnh điện di cho thấy xuất hiện vector pBI121 đựơc phân cắt thành 2 băng

tương ứng với tính toán ban đầu (12 kb và 2,765 kb) (Hình 3.13B). Phân đoạn 12 kb

đã được tinh sạch để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo. Đoạn cmyc cũng được xử lý

với HindIII và SacI, sản phẩm cắt được tinh sạch bằng kit tinh sạch PCR.

Các phân đoạn 12 kb và 75 bp ở bước 2 đã được nối thành công bằng phản

ứng nối ligase. Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào Ecoli DH5α.

Sản phẩm nối pBI121/cmyc đã được biến nạp thành công vào E.coli DH5α.

Trên vector pBI121 đã có sẵn 2 vị trí mồi M13F và M13R, vì vậy, để kiểm tra kết

quả biến nạp cần phải tiến hành PCR khuẩn lạc với hai mồi trên vector (M13F,

M13R) với hai mồi trên đoạn chèn (Cmyc-SacI-R2, Cmyc-HindIII-F1). Kết quả cho

thấy tất cả các khuẩn lạc đã chọn đều dương tính với PCR khuẩn lạc. Như vậy,

pBI121/Cmyc đã được thiết kế thành công (Hình 3.13C,D).

B

Chú thích: (A) Ảnh điện di sản phẩm PCR tổng hợp cmyc. (B) Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 với HindIII và SacI. (C) Ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc E.coli biến nạp pBI121/cmyc. (D) Sơ đồ vùng T-DNA của vector pBI121/cmyc và vị trí mồi PCR. M50bp: Marker 50 bp.

Hình 3.13. Thiết kế vector pBI121/cmyc

Ở mục 3.2.1.3, promoter C54 đã được tách dòng thành công vào pBT bằng cặp

mồi C54pro/PstI_F và C54pro/XbaI_R. Tuy nhiên để gắn C54 trực tiếp vào pBI-

Cmyc cần tạo được hai điểm cắt XmaI và XbaI ở hai đầu. Vì vậy, trong thí nghiệm

này, mồi XmaI-C54-F được sử dụng thay thế cho C54pro/PstI_F. Phản ứng được

thực hiện với khuôn là plasmid pBT/C54 và enzyme Pfu DNA polymerase.

Khuếch đại gen SSIV bằng phản ứng PCR với mồi XbaI-SSIV-F và SSIV-

ScaI-R. Vùng CDS của SSIV cũng được tổng hợp bằng phản ứng PCR với mồi

XbaI-SSIV-F và SSIV-ScaI-R và enzyme Pfu DNA polymerase. Trên bản điện di,

thu được 1 băng duy nhất 3220 bp (Hình 3.14A).

Khuếch đại promoter C54 bằng mồi XmaI-C54-F và C54Pro/XbaI-R từ DNA

tổng số tách từ lá sắn.

Chú thích: (A) Ảnh điện di sản phẩm PCR gen SSIV. (B) Ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc E.coli biến nạp pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST bằng mồi XmaI-C54- F và C54Pro/XbaI-R. (C) Ảnh diện di sản phẩm cắt pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST với XmaI và ScaI. (D) Ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc Agrobacterium biến nạp pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST bằng mồi XmaI-C54-F và C54Pro/XbaI-R. (E) Sơ đồ vùng T-DNA của vector pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST.

Hình 3.14. Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST

Đoạn promoter C54 được xử lý với enzyme XmaI và XbaI; SSIV với XbaI và

SacI; pBI-Cmyc với XmaI và SacI. Các sản phẩm sau khi xử lý enzyme giới hạn

được tinh sạch bằng kit tinh sạch sản phẩm PCR. Ghép nối sản phẩm cắt Promoter

C54, SSIV và vector pBI121/cmyc ở trên bằng phản ứng ligase 3 đoạn DNA:

Promoter C54 (1kb), SSIV (3220 bp), pBI121/cmyc (12 kb).

Sản phẩm ghép nối ở trên được sử dụng để biến nạp vào E.coli DH5α. Chọn lọc

dòng khuẩn lạc dương tính bằng phản ứng PCR với mồi XmaI-C54-F và C54Pro/XbaI-R.

Kết quả PCR các khuẩn lạc đều dương tính (Hình 3.14B). Như vậy, có thể

bước đầu khẳng định đã tạo được pBI121/C54/SSIV, tuy nhiên để có kết quả chính

xác hơn cần tiến hành xử lý enzyme cắt hạn chế để kiểm tra các phân đoạn.

Xử lý plasmid pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST với enzyme XmaI và ScaI:

Plasmid pBI121- C54:SSIV-cmyc:NOST được tách từ các khuẩn lạc dương tính với

PCR ở bước trên được cắt với XmaI và ScaI. Trên ảnh điện di thu được hai băng tương

ứng với tính toán lý thuyết (12 kb của pBI và 4,2 kb của C54:SSIV), (Hình 3.14C).

Biến nạp pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST vào A. tumefaciens C58: Vector

pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST tách từ 1 khuẩn lạc ở trên được sử dụng để biến nạp vào

A. tumefaciens C58 bằng xung điện, cấy trải khuẩn lên đĩa YEB đã bổ sung 50 mg/l

Kanamycin và 50 mg/l rifampicin. Chọn lọc dòng khuẩn lạc dương tính bằng phản ứng

PCR với mồi XmaI-C54-F và C54Pro/XbaI-R. Kết quả thu được đều dương tính ở tất cả

các khuẩn lạc được chọn (Hình 3.14D). Điều này chứng tỏ đã thiết kế thành công vector

pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST, sẵn sàng phục vụ cho việc chuyển gen (Hình 3.14E).

Tóm lại:

Thiết kế được 2 vector chuyển gen ở thực vật là: pK7WG2D-

35S:SSIV:T35S mang gen mã hóa enzyme tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

dưới sự điều khiển của promoter cố định 35S và pBI121-C54:SSIV:NOST mang

gen mã hóa enzyme tăng cường sinh tổng hợp tinh bột ở củ sắn dưới sự điều

khiển của promoter đặc hiệu C54.

3.3. ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA CÁC VECTOR CHUYỂN GEN SSIV TĂNG

CƯỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT TRÊN CÂY THUỐC LÁ

Do đã lựa chọn gen SSIV để phân lập, giải trình tự, thiết kế vector chuyển gen

(Mục 3.2), bước tiếp theo cần đánh giá hoạt động promoter biểu hiện đặc hiệu ở lá

và rễ cây thuốc lá thông qua 2 cấu trúc vector là: pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và

pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST.

3.3.1. Chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây thuốc lá và đánh

giá hoạt động của gen chuyển

3.3.1.1. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây thuốc lá

Trong chuyển gen thực vật, cây thuốc lá được xem là cây mô hình phục vụ

cho các nghiên cứu đánh giá chức năng gen. Do hệ thống tái sinh và tiếp nhận gen

ngoại lai của cây thuốc rất hiệu quả, thời gian phân hóa từ mô đến tạo cây hoàn

chỉnh khá ngắn, mặt khác cây thuốc lá là cây ngắn ngày, dễ trồng và chăm sóc nên

dễ dàng thu được hạt để nghiên cứu các thế hệ tiếp theo. Bởi vậy, trong nghiên cứu

này đã chọn cây thuốc lá làm cây mô hình để đánh giá các cấu trúc vector chuyển

gen tăng cường sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột đã được thiết kế.

Như đã trình bày ở phần 3.3.2, promoter C54 được chứng minh có liên quan

đến sự biểu hiện đặc hiệu ở mô mạch và quá trình phát triển thứ cấp của rễ dự trữ

nên các cấu trúc chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột dưới sự

điều khiển của 2 cấu trúc gen đã thiết kế sẽ thích hợp cho mục đích chuyển gen vào

sắn trong tương lai. Trong thí nghiệm chuyển gen vào cây mô hình thuốc lá có sử

dụng các cấu trúc chuyển gen đích được thiết kế là: pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và

pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST. Toàn bộ quy trình chuyển gen vào cây thuốc lá

K326 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được trình bày trong hình 3.15 và một số

hình ảnh minh họa ở hình 3.16. Quy trình chuyển gen có tổng thời gian từ 110 –

150 ngày bao gồm 7 bước: Từ chuẩn bị vật liệu chuyển gen, vi khuẩn chuyển gen,

chuyển gen, diệt khuẩn, tái sinh chồi chuyển gen, tái sinh chồi chuyển gen, tạo cây

hoàn chỉnh và đưa cây ra trồng trên giá thể TN1. Kết quả thí nghiệm thu được ở

bảng 3.8.

21 – 28 ngày Chuẩn bị vật liệu chuyển gen Cây thuốc lá in vitro 3 – 4 tuần tuổi

2 – 4 ngày Chuẩn bị vi khuẩn chuyển gen A. tumefaciens Nuôi lỏng vi khuẩn A.tumefaciens OD600nm= 0,6

2 – 3 ngày

Chuyển gen - Nguyên liệu chuyển gen: Mảnh lá bánh tẻ kích thước 1x1 cm - Nhiễm khuẩn: 20 phút - Đồng nuôi cấy 48 giờ trên MT: MS + 1mg/l BAP

21 – 28 ngày Diệt khuẩn Diệt khuẩn bằng dung dịch 500 mg/l cefotaxime

30 – 35 ngày

Tái sinh chồi chuyển gen Tái sinh chồi chuyển gen trên môi trường chọn lọc MS + 1mg/l BAP + 50 mg/l Kanamycine

Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ)

14 – 21 ngày

Chồi cây chuyển lên môi trường ra rễ chọn lọc MS + 0,1NAA + 50 mg/l Kanamycin

20 – 30 ngày

Ra cây trồng trong bầu đất Sử dụng giá thể TN1 hoặc giá thể trấu hun pha cát tỷ lệ 1:1

110 – 150 ngày

Hình 3.15. Quy trình chuyển gen vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

Hình 3.16. Một số hình ảnh chuyển các gen quan tâm vào thuốc lá thông qua vi

khuẩn A.tumefaciens

Bảng 3.8. Chuyển cấu trúc gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và pBI121-

C54:SSIV:NOST vào cây thuốc lá

Gen

Lô thí nghiệm

Số mảnh lá biến nạp

Số cây sống sót khi ra bầu

Số mẫu tạo chồi/MT tái sinh + 50 mg/l Kana

Số chồi ra rễ/MT ra rễ + 50 mg/l Kana

pK7WG2D- 35S:SSIV:T35S

150

77

Tổng

pBI121- C54:SSIV:NOST

150

69

Tổng

Kết quả thống kê cho thấy sau khi chuyển gen vào 300 mảnh lá thuốc lá K326

thông qua A. tumefaciens ở 3 lô thí nghiệm với 2 cấu trúc gen đã được thiết kế đã

thu được 77 cây chuyển gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và 69 cây chuyển gen

pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST trên môi trường chọn lọc bằng kanamycin (Bảng

3.8). Ngược lại, những mảnh thuốc lá không chuyển gen khi cấy trên môi trường

chọn lọc có kanamycin (làm đối chứng), 100% mẫu bị chết và không tái sinh chồi.

Đây là kết quả có tiềm năng cho những cây tái sinh và ra rễ trên môi trường chọn

lọc là những dòng chuyển gen. Lựa chọn 30 chồi cây thuốc lá đã phát triển thành

cây hoàn chỉnh, đủ lớn, cao khoảng 3 - 5 cm được chuyển từ điều kiện nuôi cấy in

vitro ra bầu đất trồng tại nhà kính, phục vụ cho các phân tích tiếp theo (Hình 3.16).

3.3.1.2. Sàng lọc các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phương pháp PCR

PCR là kỹ thuật phổ biến và đơn giản nhất để bước đầu sàng lọc các dòng cây

chuyển gen. Kết quả của phản ứng cho phép khẳng định sự tồn tại hay không của

gen chuyển trong genome của cây kiểm tra. Trong nghiên cứu này, các dòng thuốc

lá chuyển gen với mỗi cấu trúc gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S được thu lá và

pBI121-C54:SSIV:NOST được thu rễ để phân tích PCR với các cặp mồi đặc hiệu

(Hình 3.17, Hình 3.18).

Hình 3.17. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-

Chú thích: ĐC (-): cây không chuyển gen; ĐC(+): plasmid mang gen tương ứng; các dòng chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S (1-13: các dòng S4, S5, S7, S10, S11, S16, S22, S24, S28, S31, S32, S39, S40); M: thang DNA chuẩn 1 kb và 1 kb plus (Thermoscientific)

35S:SSIV:T35S bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R

Hình 3.18. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121-

C54:SSIV:NOST bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu Xmal-C54_F và

Chú thích: ĐC (-): cây không chuyển gen; ĐC(+): plasmid mang gen tương ứng; các dòng chuyển gen cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST (1-11: các dòng C1, C3, C7, C10, C11, C15, C22, S25, C28, C30, C33); M: thang DNA chuẩn 1 kb và 1 kb plus (Thermoscientific)

C54 pro/XbaI_F (1054bp)

Kết quả phản ứng PCR đã thu được 12/13 dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc

pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và 11/11 dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121-

C54:SSIV:NOST. Các dòng này cho kết quả PCR dương tính với cặp mồi SSIV-

Frag_F/R và sản phẩm là đoạn DNA có kích thước tương ứng là 1089 bp.

Đối với các dòng thuốc lá được xác định có mang gen chuyển, nhóm nghiên

cứu đã tiếp tục tiến hành các bước phân tích tiếp theo để đánh giá khả năng hoạt

động của gen chuyển bằng các kỹ thuật sinh học phân tử.

3.3.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển

3.3.2.1. Phân tích các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật Southern blot

Kết quả phân tích Southern blot thành công 7/7 mẫu cây chuyển gen ở cấu trúc

pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và 7/7 mẫu cây chuyển gen mang cấu trúc pBI121-

C54:SSIV:NOST. Trên màng lai sau khi hiện màng, mỗi băng tương ứng với 1 bản

copy vì khi sử dụng enzyme cắt là XbaI (đối với cấu trúc SSIV), điểm cắt của các

enzyme này là duy nhất trên mỗi cấu trúc gen chuyển và nằm ngay tại đầu đoạn gen

đích. Mẫu WT biểu hiện âm tính, chứng tỏ phản ứng lai đặc hiệu, mẫu dò không

liên kết với gen nội sinh.

Chú thích: A: các dòng chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S (1-7: các dòng S5, S7, S11, S24, S32, S31, S40); B: các dòng chuyển gen cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST (các dòng C1, C3, C8, C10, C22, C30, C35); (WT): cây không chuyển gen; (P): plasmid mang gen tương ứng; M: thang DNA 1 kb plus (Thermoscientific)

Với cấu trúc chuyển gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S, kết quả cho thấy ở cả 7

Hình 3.19. Kết quả Southern blot các mẫu thuốc lá chuyển gen SSIV

dòng cây chuyển gen được phân tích đều mang gen chuyển trong đó có 5 dòng (S5,

S7, S11, S32, S40) mang 1 bản copy gen chuyển trong genome, 1 dòng (S24) mang

2 copy và 1 dòng (S31) mang 3 copy (Hình 19A). Với cấu trúc pBI121-

C54:SSIV:NOST, kết quả cho thấy ở cả 7 dòng cây chuyển gen được phân tích đều

mang gen chuyển, trong đó có 4 dòng (C3, C8, C22 và C30) mang 1 bản copy gen

chuyển trong genome, 2 dòng (C1, C35) mang 2 bản copy gen chuyển trong

genome, 1 dòng (C10) mang 3 bản copy trong genome (Hình 3.19B).

3.3.2.2. Đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển bằng RT-PCR

Kết quả tách chiết RNA tổng số từ lá các dòng thuốc lá chuyển gen

Khác với ADN, ARN là loại phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các

ribonuclease (RNase). Hơn nữa các RNase lại có mặt khắp nơi, có hoạt tính rất

mạnh và rất bền (thậm chí việc xử lí nhiệt ở 100oC trong 1 giờ cũng không làm mất

hoạt tính RNase). Từ những lí do đó việc tách chiết ARN đòi hỏi nhiều biện pháp

thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm chứa RNase từ môi trường. Tất cả các dụng cụ

phải được xử lí cẩn thận trước khi tiến hành thí nghiệm: cối chày sứ được xử lý

200oC trong 3 giờ, ống eppendorf, đầu tip… đều được xử lý trong DEPC 0,1%. Các

hóa chất khác được pha trong nước DEPC 0,01%.

Hình 3.20. Ảnh điện di RNA tổng số được tách từ các mẫu thuốc lá chuyển gen

Kết quả điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.20) cho thấy đã tách chiết thành công

RNA tổng số từ lá các dòng thuốc lá chuyển gen. RNA tổng số được tách chiết từ các

mẫu lá đều có các băng chính là 28S rRNA, 18S rRNA và 5S rRNA/5.8S rRNA. Như

vậy, RNA tổng số thu được đảm bảo độ tinh sạch, nồng độ, sự nguyên vẹn phân tử.

Kết quả tổng hợp cDNA

RNA rất dễ bị phân hủy bởi RNase có mặt khắp nơi trong môi trường phòng thí

nghiệm. Vì vậy, việc bảo quản RNA luôn đòi hỏi nghiêm ngặt ở -80oC bởi vì chất

lượng mẫu RNA là nhân tố quan trọng quyết định chất lượng cDNA được tổng hợp.

Trong thí nghiệm này, RNA ngay sau tách chiết và sau khi bảo quản ở -800C

trong hai tuần được sử dụng để tổng hợp cDNA. cDNA tổng số được tổng hợp bằng bộ

kit First Strand cDNA Synthesis Kit của hãng Thermo Scientific sử dụng mồi random

hexamers. Để đánh giá chất lượng của sản phẩm cDNA, 1 µl của cDNA được dùng

làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi khuếch đại gen actin ở thuốc lá là actin_F

(CCATTCTTCGTTTGGACCTT) và actin_R (TTCTGGGCAACGGAACCT). Theo

tính toán lý thuyết, cặp mồi này sẽ nhân được đoạn gen có kích thước gần 200 bp.

Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR (Hình 3.21) cho thấy tại các đường

chạy đều xuất hiện một băng DNA sáng sắc nét đúng kích thước dự tính chứng tỏ

gen actin đã được khuếch đại thành công từ cDNA các dòng thuốc lá chuyển gen.

Như vậy, chúng tôi đã tổng hợp nguồn cDNA từ lá làm nguyên liệu cho thí nghiệm

phân tích sự phiên mã của các gen chuyển trong các dòng thuốc lá chuyển gen.

Hình 3.21. Kết quả PCR nhân gen actin từ cDNA của lá từ một số dòng thuốc lá

chuyển gen, M: thang DNA chuẩn 50 bp (ThermoScientific)

Kết quả đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển bằng RT-PCR

Đối với mỗi cấu trúc gen chuyển, chúng tôi chọn các cây cho kết quả lai

Southern blot dương tính để phân tích sự biểu hiện của gen chuyển.

Sản phẩm cDNA tổ ng hơ ̣p thành công từ RNA đươ ̣c dù ng làm nguyên liê ̣u

cho phản ứ ng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen chuyển SSIV là SSIV-

Frag_F/R. Lượng khuôn cDNA đươ ̣c đưa vào mỗi phản ứ ng là như nhau. Do

vâ ̣y, nếu trong các dòng thuốc lá chuyển gen các gen chuyển hoạt động và được

phiên mã ra RNA thì khi kiểm tra bằ ng RT-PCR sẽ có tín hiê ̣u khuếch đa ̣i có kích thước 1089 bp tương ứng với các gen chuyển SSIV. Ngược lại, nếu gen

chuyển không hoạt động, tức là không có sự phiên mã ra RNA thì mẫu sẽ cho kết

quả âm tính với phản ứng RT-PCR.

Kết quả điê ̣n di sản phẩm RT-PCR cho thấy ở các dòng thuốc lá chuyển gen

các gen chuyển đã được khuếch đại thành công đú ng kích thướ c theo tính toán lý thuyết. Trong khi đó các cây đố i chứ ng không chuyển gen đều cho kết quả âm tính với RT-PCR. Như vậy gen SSIV trong cây thuốc lá chuyển gen đã được phiên mã

tạo ra sản phẩm mRNA. Tuy vậy, mức độ biểu hiện của gen chuyển trong các dòng

cây chuyển gen là khác nhau. Cụ thể, ở dòng S32 chuyển gen SSIV (Hình 3.22)

bằng trực quan có thể thấy mức độ phiên mã của các gen chuyển thấp hơn các dòng

còn lại. Tuy nhiên để đánh giá chính xác mức độ biểu hiện của các gen chuyển cần

thực hiện thêm các phân tích chuyên sâu khác như real-time PCR.

Hình 3.22. Điện di sản phẩm RT-PCR các dòng thuốc lá chuyển gen

Chú thích: ĐC- : cây đối chứng không chuyển gen, ĐC+ : vector chuyển gen mang các cấu trúc gen chuyển, M: thang DNA chuẩn 1 kb (ThermoScientific)

SSIV tương ứng

3.3.2.3. Đánh giá hoạt động của gen chuyển bằng phương pháp phân tích hàm

lượng tinh bột

Trong điều kiện in vitro, cây non được cung cấp đầy đủ dinh dưỡng và ánh sáng,

đặc biệt là có đường, do vậy đánh giá sự tích lũy tinh bột ở lá in vitro là không chính xác.

Thông thường, khi trồng cây trong điều kiện nhà lưới không cần thiết phải chiết lượng

đường tự do khỏi mẫu vì nồng độ đường tự do rất thấp (0,1 - 0,5%). Do vậy, để kết quả

được chính xác nhất cần phải tiến hành trồng tất cả các mẫu trong bồn sinh trưởng để

đảm bảo thống nhất các điều kiện như thời gian chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm… sau đó

tiến hành thu lá ở cùng độ tuổi các dòng chuyển gen và WT ở cùng độ tuổi, trong cùng

thời gian (nhiệt độ 27oC, độ ẩm 70%, điều kiện chiếu 16h sáng/ 8h tối). Tiếp theo, đánh

giá và so sánh sơ bộ hàm lượng tinh bột trong lá của các dòng thuốc lá chuyển gen và

dòng đối chứng WT bằng phương pháp nhuộm iodine.

Đánh giá hoạt động của gen SSIV với cấu trúc K7WG2D-35S:SSIV:T35S ở

các dòng thuốc lá

Kết quả nhuộm iodine ở 7 dòng T0 chuyển gen SSIV (S5, S7, S11, S24, S31,

S32, S40) cho thấy phần lớn các dòng thuốc lá chuyển gen có hàm lượng tinh bột

tích lũy trong lá cao hơn nhiều so với cây đối chứng (WT) do được bắt có màu đậm

hơn và đậm nhất ở dòng S5, S31(Hình 3.23). Như vậy, đây là phương pháp đơn

giản nhưng hữu hiệu để bước đầu sàng lọc, lựa chọn các dòng chuyển gen tiềm năng

để tiếp tục thực hiện bước phân tích định lượng phức tạp và chính xác hơn.

S7

Hình 3.23. Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc

pK7WG2D-35S:SSIV:T35S (S5, S7, S11, S24, S31, S32, S40)

Tiếp theo, những dòng thuốc lá chuyển gen có hàm lượng tinh bột vượt trội đã

được lựa chọn bằng phương pháp nhuộm iodine tiếp tục được lựa chọn để phân tích

dựa trên định lượng hàm lượng tinh bột hay hàm lượng đường hòa tan có trong mẫu

thực vật bằng Anthrone và kết quả dựa vào đồ thị xây dựng đường chuẩn với y =

0,8553x + 0,0193 và R2 = 0,9913 (Mục 2.2.9.2).

Kết quả xác định hàm lượng tinh bột tích lũy trong lá các dòng thuốc lá

chuyển gen cho thấy hầu hết trong lá của các dòng thuốc lá chuyển gen SSIV đều

tích lũy một lượng tinh bột lớn hơn từ 26,9 - 67,9% lượng tinh bột trong lá cây đối

chứng không chuyển gen (Bảng 3.9).

Bảng 3.9: Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong lá và trong rễ cây thuốc lá chuyển

gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S ở các dòng chuyển gen

Tên

dòng Hàm lượng tinh bột/khối lượng mẫu khô (mg/g) Lá Rễ Tỉ lệ tinh bột ở các mẫu tăng so với đối chứng (%) Lá Rễ

gen SSIV

578,117 556,050 517,280 582,715 593,621 546,790 684,115 407,460 41,883 36,467 26,912 43,011 45,688 34,195 67,923 0,000 13,743 27,796 S5 7,608 26,297 S7 10,062 26,897 S11 17,610 28.756 S24 6,822 26,117 S31 15,620 28,255 S32 9,939 26,867 S40 0,000 24,438 WT Ghi chú: WT: cây chưa chuyển gen. S5, S7, S11, S24, S31, S32, S40: các dòng chuyển

Ngoài ra, hàm lượng tinh bột tích lũy trong rễ các dòng thuốc lá chuyển gen

cho thấy hầu hết trong rễ của các dòng thuốc lá chuyển gen SSIV đều tích lũy một

lượng tinh bột lớn hơn từ 6,8 - 17,6% lượng tinh bột trong rễ cây đối chứng không

chuyển gen. Cụ thể ở dòng S24 có hàm lượng tinh bột trong rễ đạt cao nhất

(17,6%), tiếp đến là S32 (15,6%), S5 (13,7%).

Nhìn chung hàm lượng tinh bột tích lũy trong rễ và lá của các dòng chuyển

gen cao hơn từ 6,8 – 45,6% so với các dòng không chuyển gen. Điều này có thể giải

thích vị trí gen chuyển được tích hợp trong genome cây chủ khác nhau dẫn đến sự

sai khác trong hoạt động của gen chuyển, ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp và

tích lũy tinh bột. Bên cạnh đó, các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển

cây như điều kiện chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm, chế độ dinh dưỡng cũng ảnh hưởng

đến sự đồng hóa tinh bột. Kết quả này cho phép khẳng định các dòng thuốc lá

chuyển gen SSIV có mức độ tích lũy tinh bột trong lá và rễ cao hơn cây đối chứng

không chuyển gen.

Đánh giá hoạt động của gen SSIV với cấu trúc pBI 121 – C54:SSIV:NOST ở

các dòng thuốc lá

Tương tự, những dòng thuốc lá chuyển gen pBI 121 – C54:SSIV:NOST được

nuôi dưỡng trong bồn sinh trưởng với các điều kiện tối ưu để thu rễ nhằm đánh giá

hàm lượng tinh bột (Bảng 3.10) và kết quả dựa vào đồ thị xây dựng đường chuẩn với y = 0,9246x + 0,0072 và R2 = 0,99337 (Mục 2.2.9.2).

Bảng 3.10. Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong rễ cây thuốc lá chuyển gen

Tên dòng

Ghi chú: WT: cây chưa chuyển gen; C1, C3, C8, C10, C22, C30, C35: các dòng chuyển

gen SSIV

pBI121 – C54:SSIV:NOST ở các dòng chuyển gen Hàm lượng tinh bột/khối lượng mẫu khô (mg/g) 42,379 39,923 36,410 32,341 33,821 36,404 38,579 25, 565 Tỉ lệ tinh bột ở các mẫu tăng so với đối chứng (%) 65,713 56,162 42,421 26,505 32,305 42,398 50,905 0,000 C1 C3 C8 C10 C22 C30 C35 WT

Hình 3.24. Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121 –

C54:SSIV:NOST (C1, C3, C8, C10, C22, C30, C35)

Kết quả xác định hàm lượng tinh bột tích lũy trong rễ các dòng thuốc lá

chuyển gen cho thấy hầu hết trong rễ của các dòng thuốc lá chuyển gen SSIV đều

tích lũy một lượng tinh bột lớn hơn từ 26,5 - 65,7% lượng tinh bột trong rễ cây đối

chứng không chuyển gen. Nhìn chung hàm lượng tinh bột tích lũy trong rễ ở các

dòng chuyển gen cao hơn so với dòng không chuyển gen. Như vậy, promotor biểu

hiện đặc hiệu ở củ sắn đã biểu hiện khi chuyển vào cây thuốc lá và kết quả thu được

qua quá trình sinh tổng hợp tinh bột đã thể hiện rõ điều đó. Kết quả này cho phép

khẳng định cấu trúc gen pBI 121 – C54:SSIV: NOST các dòng thuốc lá chuyển gen

SSIV có mức độ tích lũy tinh bột trong rễ cao hơn cây đối chứng không chuyển gen.

Tóm lại:

Đây là phương pháp đơn giản nhưng hữu hiệu để bước đầu sàng lọc, lựa chọn

các dòng chuyển gen SSIV thông qua 2 cấu trúc gen: pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và

pBI 121 - C54:SSIV: NOST và đều thu được kết quả ở các cây chuyển gen có hàm

lượng tinh bột cao hơn ở cây đối chứng không chuyển gen. Cụ thể hàm lượng tinh

bột trong rễ tăng 6,8 - 17,6% ở những cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc

pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và tăng 26,5 - 65,7% ở những cây thuốc lá chuyển gen

mang cấu trúc pBI 121 - C54:SSIV: NOST. Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu sử dụng

cấu trúc gen pBI 121 - C54:SSIV: NOST chuyển gen vào cây sắn nhằm mục đích

thu được cây chuyển gen tăng hàm lượng tinh bột.

3.4. CHUYỂN GEN SSIV TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

VÀO CÂY SẮN

Theo nhiều nghiên cứu, để ứng dụng kỹ thuật chuyển gen vào cây sắn thành

công thì công việc quan trọng hàng đầu là phải nghiên cứu hoàn thiện hệ thống tái

sinh cây vì nếu như quá trình biến nạp xảy ra nhưng không tái sinh được thành cây

thì thí nghiệm biến nạp chưa thành công. Cây sắn đã được nghiên cứu hệ thống tái

sinh in vitro từ các nguồn vật liệu rất đa dạng như: thuỳ lá non, đỉnh chồi của cây

con, chồi nách, mảnh lá… nhưng tỷ lệ và chất lượng thu được cây tái sinh thông

qua FEC ở các giống sắn khác nhau trên các môi trường khác nhau là khác nhau.

Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu hoàn thiện hệ thống tái sinh 5

giống sắn ở Việt Nam để phục vụ cho quá trình chuyển gen SSIV sau này.

3.4.1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây sắn

3.4.1.1. Nghiên cứu tạo mô sẹo từ các nguồn vật liệu khác nhau ở cây sắn

Từ những kết quả nghiên cứu cho thấy cả 5 giống sắn đều phát triển hình

thành mô sẹo tốt khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4-D, picloram và đặt

mẫu trong tối. Tuy nhiên, tỷ lệ hình thành mô sẹo của 5 giống sắn nghiên cứu từ

100

đỉnh chồi, lá non, cuống lá ở các giống sắn khác nhau là khác nhau và có sự khác

biệt ở hai môi trường nuôi cấy CP và CD (Bảng 3.11).

Lá non của 5 giống sắn đã được chúng tôi sử dụng để nghiên cứu sàng lọc

nguồn nguyên liệu thực vật phù hợp cho tái sinh cây từ mô sẹo. Kết quả thu được

cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo ở 5 giống sắn nghiên cứu trên môi trường nuôi cấy CP và

CD sau 3 tuần cho tỷ lệ 82,1 – 100% và cao nhất ở giống sắn KM140 (100%).

Ngoài lá non, nguồn nguyên liệu là đỉnh chồi cho kết quả tạo mô sẹo trên 2 môi

trường nuôi cấy ở cả 5 giống sắn sau 3 tuần đều đạt tỷ lệ rất cao (87,2 – 100%). Đặc

biệt ở 2 giống KM140 và HB80 tỷ lệ tạo mô sẹo là 100%.

Tuy nhiên, khi nghiên cứu tạo mô sẹo dựa trên nguồn vật liệu cuống lá kết quả

thu được tỷ lệ tạo mô sẹo thấp hơn khá nhiều so với lá non và đỉnh chồi, tỷ lệ thu

được là 55,12 – 72,32% (trên môi trường CP) và 52,30 – 70,64 % (trên môi trường

CD), mô sẹo chủ yếu hình thành ở 2 đầu cuống và có mầu nâu đen, ướt, nhớt. Bên

cạnh đó, tốc độ sinh trưởng của mô sẹo từ cuống lá chậm hơn so với lá non và đỉnh chồi.

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu và môi trường đến khả năng tạo

mô sẹo (sau 3 tuần)

Tỷ lệ hình thành mô sẹo (%)

Nguyên

Môi trường

liệu

KM140

HB80

Trắng NA

Đỏ ĐF

Trắng HB

Lá non

100,00 ± 0,00

99,20 ± 0,49

89,62 ± 0,44

88,60 ± 0,43

90,04 ± 0,44

CP

Đỉnh chồi

100,00 ± 0,00

100,00 ± 0,00 97,55 ± 0,48

87,24 ± 0,4

90,26 ± 0,45

Cuống lá

72,32 ± 0,35

62,33 ± 0,31

69,73 ± 0,34

64,82 ± 0,32

55,12 ± 0,27

Lá non

100,00 ± 0,00

97,25 ± 0,48

90,36 ± 0,45

86,45 ± 0,43

82,13 ± 0,41

CD

Đỉnh chồi

100,00 ± 0,00

100,00 ± 0,00 92,11 ± 0,46

88,90 ± 0,44

84,35 ± 0,42

Cuống lá

70,64 ± 0,34

60,16 ± 0,30

68,74 ± 0,34

63,16 ± 0,31

52,30 ± 0,26

Lá non, đỉnh chồi sau khi được cảm ứng mô sẹo ở hầu hết các khối mô có màu

trắng kem, vàng tươi, mô sẹo mới hình thành là những hạt nhỏ li ti và xốp, có màu

trắng, vàng nhạt, sinh trưởng tốt trên môi trường CP nhưng ở môi trường CD mô

101

sẹo lại có màu nâu, ướt, nhớt, sinh trưởng khá. Bên cạnh đó, tốc độ sinh trưởng của

mô sẹo từ cuống lá chậm hơn so với tốc độ sinh trưởng từ lá non, đỉnh chồi, mô sẹo

chủ yếu hình thành ở 2 đầu cuống và có mầu nâu đen, ướt, nhớt. Do dó, chúng tôi

không lựa chọn nguồn nguyên liệu này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo (Hình

25A2; B2).

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, nguyên liệu phù hợp nhất để tạo mô

sẹo ở các giống sắn địa phương là đỉnh chồi, tỷ lệ tạo mô sẹo đạt > 80%, mô sẹo

sinh trưởng, phát triển tốt (Hình 25A3, B3). Môi trường CP (MS bổ sung 10 mg/l

Picloram) là phù hợp để đánh giá tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi soma ở 2 nguồn vật

liệu mảnh lá non và đỉnh chồi.

Hình 3.25: Mô sẹo từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

Chú thích: A1, A2, A3: Mảnh lá, cuống lá và đỉnh chồi cấy trên môi trường tạo mô sẹo CP; B1, B2, B3: Mô sẹo của lá, cuống lá và đỉnh chồi trên môi trường CP (sau 3 tuần)

3.4.1.2. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng (Picloram và IBA) đến khả năng

phát sinh phôi

Ở thí nghiệm này, mô sẹo từ đỉnh chồi của 5 giống sắn thu được trên môi

trường CP sau 3 tuần bắt đầu xuất hiện phôi ở giai đoạn đầu tiên được chuyển lên

môi trường CI1-4. Tỷ lệ tạo phôi được thể hiện sau 4, 6, 8 tuần nuôi cấy (Bảng 3.12).

102

Bảng 3.12: Tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi trên môi trường CI1-4

(sau 4, 6, 8 tuần)

Tỉ lệ tạo phôi (%)

Tên giống

Môi trường

4 tuần

6 tuần

8 tuần

KM140

HB80

Trắng NA

Đỏ ĐF

Trắng HB

20,63 ± 0,11 34,90 ± 0,17 23,75± 0,11 30,61 ± 0,15 25,84 ± 0,12 30,42 ± 0,15 35,25 ± 0,17 33,46 ± 0,16 17,22 ± 0,08 21,40 ± 0,12 22,67 ± 0,11 25,45 ± 0,12 15.33 ± 0,23 16,41 ± 0,15 18,92 ± 0,21 20,50 ± 0,33 18,16 ± 0,22 21,91 ± 0,34 24,68 ± 0,18 22,82 ± 0,21

43,80 ± 0,20 57,31 ± 0,28 44,26 ± 0,22 45,92 ± 0,23 56,27 ± 0,26 69,34 ± 0,33 66,38 ± 0,32 60,11 ± 0,31 38,66 ± 0,19 55,32 ± 0,27 40,20 ± 0,20 35,11 ± 0,17 29,64 ± 0,18 32,52 ± 0,26 37,73 ± 0,21 40,27 ± 0,18 33,44 ± 0,22 38,72 ± 0,11 40,50 ± 0,19 41,31 ± 0,25

61,22 ± 0,30 76,40 ± 0,38 68,17 ± 0,34 50,22 ± 0,25 69,76 ± 0,34 80,41 ± 0,41 72,15 ± 0,35 69,32 ± 0,32 59,73 ± 0,29 60,37 ± 0,30 58,24 ± 0,27 50,01 ± 0,23 41,17 ± 0,34 34,53 ± 0,19 46,86 ± 0,25 52,22 ± 0,38 49,78 ± 0,37 50,21 ± 0,26 53,43 ± 0,13 55,57 ± 0,35

CI1 CI2 CI3 CI4 CI1 CI2 CI3 CI4 CI1 CI2 CI3 CI4 CI1 CI2 CI3 CI4 CI1 CI2 CI3 CI4

Trong nghiên cứu, hầu hết các giống sắn có xu thế tăng dần tỷ lệ tạo phôi

soma sau 4,6,8 tuần và đạt cao nhất ở tuần thứ 8. Tuy nhiên tỷ lệ phôi soma ở các

công thức có bổ sung IBA là khác nhau. Giống sắn KM140 và HB80 có tỷ lệ tạo

phôi soma cao nhất trên môi trường CI2 là: 76,40% và 80,41%. Khi nồng độ IBA

tăng lên 0,3 – 0,4 mg/l, khả năng tạo phôi bắt đầu có xu hướng giảm xuống 68,17%

- 50,22% (KM140) và 72,15% - 69,32% (HB80). Tương tự, ở giống Trắng NA, Đỏ

DDF và Trắng HB, tỷ lệ tạo phôi đạt (41,17 - 60,37%). Tuy nhiên, đây là tỷ lệ khá

thấp khi so sánh với 2 giống KM140 và HB80.

Khi tăng nồng độ IBA lên 0,4mg/l khả năng tạo phôi soma có xu hướng giảm

và điều này có thể lý giải rằng nồng độ auxin quá cao đã gây ức chế quá trình phân

103

chia khung tế bào hoặc điều kiện này có thể đã gây ra một phản ứng stress ở các tế

bào gây kìm hãm cũng như làm giảm khả năng tạo phôi soma. Có lẽ do chính sự

tăng auxin và cytokinin nội sinh ở giai đoạn này đã giúp cho sự phát triển phôi tăng cao.

Hình 3.26: Các khối mô sẹo phân hóa các giai đoạn mô phôi khác nhau ở 5

Chú thích: A: KM140; B: HB80; C: Trắng NA; D: Đỏ ĐF; E: HB; 1 bar: 0,1 cm

giống sắn thí nghiệm (sau 6 tuần)

Song song với việc nghiên cứu tỷ lệ tạo phôi soma ở 5 giống sắn (Bảng 3.12)

chúng tôi đã quan sát, đánh giá đặc điểm mô sẹo phôi hoá ở các độ tuổi khác nhau

sau 4, 6, 8 tuần. Ở giống sắn KM140 khối mô màu xanh nhạt, tua dài, chuẩn bị

chuyển sang giai đoạn kéo dài tạo thành cây, HB80 và Trắng HB ở tuần thứ 6 khối

mô vàng tươi, các tế bào không đồng nhất về hình dạng và kích thước; giống Trắng

NA và Đỏ ĐF khối mô có màu trắng kem, hình dạng tua ngắn, mô còn non (Hình

3.26).

Các khối mô vẫn có xu hướng tăng dần ở tuần 4, 6, 8 và sang tuần thứ 8 tỷ lệ

tạo phôi ở các khối mô đạt cao nhất ở mỗi công thức thí nghiệm và mỗi giống. Thời

điểm này mô đã chuyển màu nâu đậm ở giống KM140 và HB80, có nhiều dịch

nhầy, không có hiện tượng gia tăng kích thước; ba giống còn lại Đỏ ĐF, Trắng NA,

Trắng HB xuất hiện màu nâu, đốm đen và khô dần.

Như vậy, tỷ lệ mô sẹo có khả năng phát sinh phôi đạt cao nhất ở giống KM140

và HB80 (76,40 – 80,41%) và thấp nhất ở giống Đỏ ĐF (34,53%) sau 8 tuần .

104

3.4.1.3. Kết quả tạo cây con từ phôi soma

Những cụm phôi trưởng thành sẽ được chuyển lên môi trường thích hợp để

kích thích phôi soma nảy mầm. Sau khoảng 8 - 10 tuần trên môi trường nuôi cấy

cụm phôi hóa bắt đầu bật chồi, lúc này chồi thật xuất hiện và phát triển nhanh. Điều

này chứng tỏ các giống sắn địa phương cũng có khả năng tái sinh thông qua con

đường phôi soma và khả năng tái sinh này rất tốt, thể hiện ở chỗ các chồi tạo thành

có hình thái bình thường, sinh trưởng phát triển mạnh. Trên cả 5 giống sắn các cụm

phôi soma đều có tỷ lệ nảy mầm nhất định ở tất cả các công thức (Bảng 3.13).

Giống HB80 và KM140 có tỷ lệ phôi soma tạo thành cây con cao nhất đạt

68,72 – 81,08% ở môi trường CN2 (MS bổ sung nồng độ 0,3 mg/l BAP) so với môi

trường không bổ sung BAP là 23,60 và 32,02% và tương tự trên giống Trắng NA tỷ

lệ phôi soma tạo thành cây con khi bổ sung 0.3 mg/l BAP là 40,02%.

Bảng 3.13. Tỷ lệ phôi soma tạo cây con (sau 4 tuần)

Tỷ lệ phôi soma tạo thành cây con (%)

Giống

Môi

Trắng NA

Đỏ ĐF

Trắng HB

HB80

KM140

trường

23,60 ± 0,18

32,02 ± 0,16

20,33 ± 0,10

19,22 ± 0,34

20,14 ± 0,22

CN1

68,72 ± 0,30

81,08 ± 0,40

40,02 ± 0,19

25,60 ± 0,17

28,42 ± 0,11

CN2

39,00 ± 0,19

41,73 ± 0,20

32,64 ± 0,16

33,81 ± 0,12

32,76 ± 0,31

CN3

27,07 ± 0,13

38,12 ± 0,19

30,88 ± 0,15

29,27 ± 0,28

35,51 ± 0,24

CN4

Tuy nhiên, ở 2 giống Đỏ ĐF, Trắng HB tỷ lệ tạo cây con ở môi trường CN2 đã

giảm đáng kể (25,60 - 28,42%). Bên cạnh đó, khi tăng nồng độ BAP lên 0,6 mg/l và

0,9 mg/l chúng tôi nhận thấy tỉ lệ cụm phôi trưởng thành tạo cây con có chiều

hướng giảm ở 3 giống KM140, HB80 và Trắng NA nhưng lại tăng ở 2 giống Đỏ ĐF

và Trắng HB. Trên môi trường CN4 chỉ có giống Trắng HB tỷ lệ tạo cây con tăng

lên 35,51%, cả 4 giống còn lại đều giảm. Như vậy, nồng độ BAP không tỷ lệ thuận

với tỷ lệ bật chồi, nồng độ BAP tăng nhưng tỷ lệ bật chồi không tăng mà còn giảm

105

ở 4 giống KM140, HB80, Trắng NA, Đỏ ĐF và tăng nhẹ ở Trắng HB nhưng lại gây

biến dị mẫu chồi, làm ảnh hưởng đến quá trình hình thành và chất lượng cây sắn.

3.4.1.4. Khả năng tạo cây hoàn chỉnh và ra cây

Các chồi tái sinh từ 5 giống sắn đạt chiều cao từ 1,5 cm đến 2,0 cm được

chuyển sang môi trường MS để tạo rễ sau 3 tuần nuôi cấy, khả năng ra rễ nhanh và

đạt tỷ lệ hơn 80% trên cả 5 giống sau 2 tuần và đạt 100% sau 3 tuần. Số lượng rễ

dao động từ 2 đến 3 rễ/chồi, dài 3 - 5 cm/rễ. Những công thức thí nghiệm môi

trường MS có bổ sung chất ĐTST các chồi cây sắn vẫn ra rễ bắt đầu từ tuần thứ 2

nhưng số lượng rễ ít, mập và ngắn. Như vậy, cây sắn phù hợp với ra rễ trên môi

trường MS không cần bổ sung chất điều tiết sinh trưởng. Tuy nhiên để đưa ra được

quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa chúng ta cần đánh giá tỷ lệ tái

sinh cây hoàn chỉnh ở 5 giống sắn thí nghiệm (Bảng 3.14).

Bảng 3.14. Khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa

Giống

Cụm mô sẹo phôi hoá

Thời gian xuất hiện chồi (ngày)

150

Các chỉ tiêu theo dõi Thời gian xuất hiện rễ (ngày) 56,3

Tỷ lệ tái sinh cây hoàn chỉnh (%) 61,5

KM140

20,7

150

23,8

58,7

60,3

HB80

150

24,3

64,2

35,8

Trắng NA

150

28,9

67,5

21,0

Đỏ ĐF

150

27,1

62,8

24,2

Trắng HB

25,0

62,9

41,5

Trung bình

Ở hầu hết các cụm mô sẹo phôi hóa trong quá trình tái sinh thành cây hoàn

chỉnh từ 5 giống sắn khi được nuôi cấy trong môi trường kích thích phôi soma nảy

mầm có bổ sung BAP với nồng độ 0,3mg/l đều có khả năng bật chồi sau 20 – 29

ngày. Tuy nhiên, trong số 750 cụm mô sẹo phôi hóa ở các giống sắn chúng tôi nhận

thấy tỷ lệ tái sinh tạo ra chồi bình thường, phát triển tốt khoảng 40% và các chồi

này tiếp tục được chuyển đến môi trường ra rễ MS (Hình 3.27). Sau khoảng thời

gian 56 - 63 ngày rễ bắt đầu xuất hiện từ các chồi phát triển tốt ở các giống sắn

nghiên cứu và tỷ lệ tái sinh cây hoàn chỉnh từ 21,0 – 61,5%.

106

Chú thích: A,B: cụm chồi đang nảy mầm; C: cây con; D: cây sắn trên môi trường ra rễ

Hình 3.27. Chồi và cây sắn tái sinh từ mô sẹo phôi hóa

Cây sắn hoàn chỉnh được đưa ra khỏi phòng thí nghiệm để cây con dần thích

nghi với điều kiện tự dưỡng bằng cách trồng trong giá thể TN1 và trấu hun với tỉ lệ

6:4, tránh ánh sáng chiếu trực xạ và chăm sóc cây ở điều kiện cung cấp đầy đủ nước

và dinh dưỡng. Tỷ lệ cây sống, sinh trưởng và phát triển tốt khi ra vườn ươm trung

bình ở các giống đạt 95%.

3.4.2. Xây dựng và tối ưu quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua gen GUS

3.4.2.1. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A.tumefaciens (OD 600nm)

Từ những kết quả nghiên cứu về nguồn nguyên liệu và môi trường phù hợp

cho quá trình tạo mô sẹo phôi hóa, chúng tôi lựa chọn đỉnh chồi của giống sắn

KM140 và HB80 do đây là hai giống sắn có khả năng tái sinh tốt, ít sâu bệnh và

thuộc nhóm sắn có năng suất cao (28 - 30 tấn/ha), hàm lượng tinh bột khá (26 -

28%) và hiện đang được trồng phổ biến ở nhiều địa phương trong cả nước. Ngoài

ra, đây là hai giống sắn có khả năng tái sinh từ mô sẹo phôi hóa cao nhất trong 5

giống sắn nghiên cứu (Mục 3.4.1). Do vậy, hai giống sắn này sẽ được chọn là nguồn

nguyên liệu phục vụ cho các thí nghiệm chuyển gen tiếp theo.

Đỉnh chồi của giống sắn KM140 và HB80 khi cho lây nhiễm với chủng vi

khuẩn A. tumefaciens C58 ở những mật độ vi khuẩn là 0,4; 0.6; 0,8; 1,0. Kết quả thu

được cho thấy tỷ lệ biểu hiện gen GUS tạm thời ở các mẫu chuyển gen sau khi đồng

nuôi cấy phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn sử dụng khi biến nạp. Ở mật độ vi khuẩn

OD 600nm = 0,4; 0,8 và 1,0 hiệu quả chuyển gen thấp hơn ở mật độ vi khuẩn OD

600nm = 0,6. Cụ thể, tỷ lệ biểu hiện gen GUS tạm thời ở mật độ OD = 0,4 chỉ đạt

15,0% -19,0%. Tuy nhiên, tỷ lệ biến nạp thấp nhất là ở mật độ OD = 1,0 đạt 7,0 –

107

8,0% . Ở hai giống sắn nghiên cứu HB80 và KM140 tỷ lệ biểu hiện gen GUS tạm

thời cao nhất đạt 33,0 – 46,0% khi nồng độ vi khuẩn OD = 0,6 (Hình 3.28). Ngoài

ra, mức độ biểu hiện gen GUS tạm thời ở nguyên liệu chuyển gen có màu xanh

chàm đặc trưng thể hiện khá rõ (Hình 3.29C, D).

Hình 3.28: Ảnh hưởng của mật độ tế bào vi khuẩn A.tumefaciens đến khả năng

Chú thích: Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần, mỗi lần 50 mẫu. Các thanh trên mỗi cột biểu đồ biểu thị độ lệch chuẩn của giá trị trung bình.

biến nạp gen GUS ở giống sắn HB80 và KM140

3.4.2.2. Xác định thời gian nhiễm A. tumefaciens với mẫu thực vật

Thời gian nhiễm khuẩn là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình

biến nạp gen. Ngoài ra thời gian biến nạp còn phụ thuộc vào từng loài thực vật và

từng loại mô. Trong khi biến nạp phải cần đủ thời gian để vi khuẩn tiếp xúc với mô

thực vật, vi khuẩn có cơ hội để xâm nhập và chuyển gen cần quan tâm. Tuy nhiên,

nếu thời gian lây nhiễm dài sẽ ảnh hưởng tới sức sống của mẫu và ngược lại, thời

gian lây nhiễm ngắn sẽ ảnh hưởng tới hiệu quả chuyển gen.

Các nghiên cứu chuyển gen vào cây sắn được tiến hành trên các nguồn nguyên

liệu khác nhau thì thời gian lây nhiễm khuẩn A. tumefaciens cũng sẽ là khác nhau.

Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát thời gian lây nhiễm vi khuẩn

A.tumefaciens mang gen GUS trong khoảng thời gian 10, 15, 20 phút đối với mô

108

sẹo của giống sắn KM140 để lựa chọn thời gian phù hợp cho các thí nghiệm chuyển

gen (Bảng 3.15).

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu quả chuyển gen

giống sắn KM140

Giống

Số mẫu

Mẫu tạo mô sẹo

Thời gian nhiễm khuẩn

Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) 26,7

Mô sẹo chuyển gen (%) 33,5

HB80

10 phút

33,8

37,1

KM140

44,4

42,2

HB80

15 phút

38,9

46,4

KM140

31,1

29,5

HB80

20 phút

25,0

33,9

KM140

Ở 3 khoảng thời gian lây nhiễm khác nhau thu được số mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ

tạo mô sẹo và số mô sẹo chuyển gen ở 2 giống sắn HB80 và KM140 là khác nhau.

Thời gian nhiễm khuẩn 10 phút cho tỷ lệ tạo mô sẹo 33,5 - 33,7% và đạt cao nhất ở

thời gian nhiễm khuẩn là 15 phút (38,7%). Sau khi tăng thời gian nhiễm khuẩn lên

20 phút đã thu được tỷ lệ tạo mô sẹo có xu hướng giảm (25%). Sau 2 tuần, lấy ngẫu

nhiên 3 - 4 khối mô/đĩa nhuộm với X-gluc để kiểm tra tỷ lệ biểu hiện gen GUS ở

giai đoạn mô sẹo. Kết quả thu được tỷ lệ biểu hiện cao nhất 42,2 - 46,4% ở khoảng

thời gian nhiễm khuẩn 15 phút, các vùng mô sẹo sau khi nhuộm X – gluc bắt màu

xanh tràm đặc trưng là vùng các mô biểu hiện hoạt tính của gen GUS (Hình 3.31).

Do vậy, thời gian nhiễm khuẩn 15 phút là phù hợp cho các thí nghiệm chuyển gen

vào hai giống sắn HB80 và KM140.

3.4.2.3. Xác định nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc mô sẹo và tái sinh chồi

Sau khi lựa chọn được nguồn vật liệu nghiên cứu tối ưu là đỉnh sinh trưởng,

mật độ vi khuẩn A. tumefaciens OD 600 nm = 0,6 và thời gian biến nạp là 15 phút

để chuyển gen cho hai giống sắn HB80 và KM140. Bước tiếp theo để sàng lọc cây

chuyển gen sau biến nạp cần phải bổ sung Km ở nồng độ thích hợp (Bảng 3.16).

109

Từ những kết quả thu được sau khi tiến hành các thí nghiệm chuyển gen GUS

trên môi trường CI2 có bổ sung Km. Chúng tôi nhận thấy khả năng sống sót của các

mô sẹo ở giống sắn sau 4,6,8 tuần có xu hướng giảm dần ở hai giống sắn thí

nghiệm. Tỷ lệ tạo mô sẹo sau 4 tuần đạt cao nhất ở HB80 là 71,74% và KM140 là

74,91 % trên môi trường bổ sung 40 mg/l Km. Sau 6 tuần, tỷ lệ mô sẹo sống sót

giảm đáng kể ở tất cả các công thức trên môi trường 0 mg/l; 80 mg/l; 100 mg/l Km,

các khối mô lúc này chuyển sang màu đen, mềm (0 mg/l Km) hay trắng, cứng (80

mg/l Km; 100 mg/l Km), mô không sinh trưởng được dần bị chết. Tuy nhiên, trên

môi trường bổ sung 60 mg/l Km sau 4 tuần tỷ lệ tạo mô sẹo ở giống sắn HB80 chỉ

đạt trung bình (54,56%) nhưng tỷ lệ mô sẹo sống sót lại đạt cao nhất (35,53 %) sau

6 tuần và (25,11%) sau 9 tuần, những khối mô mềm, xốp, có màu vàng nhạt và có

khả năng tái sinh. Đối với giống sắn KM140 tỷ lệ tạo mô sẹo và mô sẹo sống sót

sau 4,6,8 tuần trên môi trường bổ sung 60 mg/l Km thấp hơn giống HB80 nhưng

cao hơn các công thức bổ sung Km khác, tỷ lệ mô sẹo sống sót sau 8 tuần đạt

20,42%. Như vậy, nồng độ Km phù hợp cho chọn lọc mô sẹo chuyển gen là 60 mg/l

ở cả hai giống sắn HB80 và KM140.

Bảng 3.16: Ảnh hưởng của Kanamycin đến khả năng sống sót của mô sẹo

chuyển gen GUS ở giống sắn HB80 và KM140

Giống

Đặc điểm mẫu

Số mẫu

Km (mg/l)

Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) sau 4 tuần

Tỷ lệ mô sẹo sống sót (%) sau 6 tuần

Tỷ lệ mô sẹo sống sót (%) sau 8 tuần

0,00

Mềm, xốp, đen Mềm, xốp, trắng

HB80

Cứng, vàng Cứng, đen Mềm, xốp, đen Xốp, đen

0,00 0,00 0,00 0,00

KM140

0 40 60 80 100 0 40 60 80 100

50 30,66 ± 3,05 3,82 ± 0,70 250 71,74 ± 3,76 21,80 ± 2,81 8,15 ± 0,75 220 54,56 ±3,20 35,53 ± 2,31 25,11 ± 3.15 Mềm, xốp, vàng nhạt 0,00 190 7,77 ± 0,45 210 0,00 0,00 50 34,18 ± 3,93 0,00 218 74,91 ± 4,57 9,51± 0,7 245 45,83 ± 1,92 26,46 ± 3,52 20,42 ± 3,20 Mềm, xốp, vàng nhạt 197 11,95 ± 1,40 0,00 0,00 150 0,00

Cứng, trắng Cứng, đen

0,00 0,00

110

3.4.2.4. Xác định nồng độ Kanamycin thích hợp cho chọn lọc chồi chuyển gen

Một số mô sẹo đã tái sinh chồi của hai giống sắn HB80 và KM140 cần tiếp tục

được nuôi cấy chọn lọc trên môi trường ra rễ có bổ sung Km từ 0 – 100 mg/l để tạo

cây hoàn chỉnh (Bảng 3.17).

Trên môi trường đối chứng (Km 0 mg/l) khả năng sinh trưởng và tạo rễ của

chồi ở hai giống sắn HB80 và KM140 là 100%. Khả năng tạo rễ cũng như phát

triển của chồi trên môi trường có bổ sung Km từ 50 – 100 mg/l đã có ảnh hưởng

khá rõ rệt. Tỷ lệ sống sót của hai giống sắn HB80 và KM140 ở nồng độ Km

50mg/l đạt 28,33 – 33,33%, chồi sinh trưởng chậm, lá mảnh, hơi vàng hoặc xanh

nhạt. Mặt khác, trên môi trường bổ sung 100 mg/l Km do không hấp thụ được

chất dinh dưỡng nên chồi không tạo được rễ, bị vàng lá và chết sau 30 ngày. Vì

vậy, nồng độ Km thích hợp chọn lọc chồi chuyển gen cho cả hai giống sắn HB80

và KM140 là 50 mg/l.

Bảng 3.17: Ảnh hưởng của Kanamycin đến tỷ lệ ra rễ của chồi sắn HB80 và KM140

Giống Kanamycin

Đặc điểm rễ

Tỷ lệ ra rễ (%)

Đặc điểm chồi (sau 30 ngày)

100,00

Dài, mảnh

Xanh thẫm, lá to

28,33 ± 3,07

Ngắn, mập

Lá mảnh, xanh nhạt

HB80

100

0,00

Không tạo rễ

Lá vàng, chết

100,00

Dài, mảnh, nhiều

Xanh thẫm, lá to

33,33 ± 6,35

Ngắn, mập

Lá mảnh, hơi vàng

KM140

100

0,00

Không tạo rễ

Lá vàng, chết

Chú thích: Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 20 mẫu

3.4.2.5. Tạo cây sắn chuyển gen GUS thông qua A. tumefaciens

Từ những kết quả nghiên cứu tối ưu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu quả

chuyển gen được xây dựng trên quy trình chuyển gen vào giống sắn HB80 và

KM140 thông qua chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58 mang vector chứa gen GUS.

111

Dựa theo quy trình biến nạp vào đỉnh chồi đã xây dựng, chúng tôi có thể đánh giá

được hiệu quả chuyển gen ở hai giống sắn này như sau (Bảng 3.18).

Kết quả thu được trên 3 lô thí nghiệm với tổng số mẫu biến nạp là 868 mẫu

(KM140) và 955 mẫu (HB80). Sau thời gian 3 – 4 tuần số mẫu tạo mô sẹo khá cao

624 mẫu (đạt 71,6%) ở giống KM140 và 715 mẫu (đạt 75,1%) ở giống HB80. Khi

chuyển sang giai đoạn chọn lọc, số phôi soma sống sót thu được 218 mẫu (đạt

25,1%) ở giống KM140 và 186 mẫu (đạt 19,5%) ở giống HB80. Lấy ngẫu nhiên

một số phôi soma sống sót để kiểm tra sự biểu hiện của gen GUS ở mức độ mô hóa,

kết quả cho thấy hầu hết các mô nhuộm X-gluc đầu bắt màu xanh tràm đặc trưng.

Điều này chứng tỏ gen GUS đã chuyển vào các tế bào phôi soma và được nhân lên

trên môi trường nuôi cấy (Hình 3.29 C, D). Tiếp theo, chuyển phôi soma sống sót

lên môi trường môi trường nuôi cấy tái sinh CN, kết quả thu được 54 chồi sắn

(KM140) và 37 chồi (HB80) tái sinh. Những chồi này sau đó chuyển sang môi

trường tạo cây hoàn chỉnh MS để đánh giá khả năng ra rễ, kết quả đã thu được 14

cây giống sắn KM140 và 13 cây giống sắn HB80 chuyển gen ra rễ, hiệu suất tái

sinh đạt 1,36 – 1,61% (14/868 và 13/955). Đỉnh chồi, lá và cuống lá của những cây

chuyển gen mang nhuộm X-gluc thu được 6 cây có màu xanh tràm đặc trưng. Điều

này chứng tỏ đã có 6 cây sắn đã mang gen GUS (Hình 3.29 E, F, G).

Bảng 3.18: Tạo cây sắn HB80 và KM140 chuyển gen GUS thông qua

A. tumefaciens

Giống

Lô thí nghiệm

Số chồi tái sinh

Số mẫu biến nạp 360

Số mẫu phát sinh phôi soma 259

Số phôi soma sống sót 91

Số chồi ra rễ 6

Số cây chuyển gen 3

172

240

KM140

193

268

624

218

54

14

6 Tổng

868

232

310

266

355

HB80

217

290

715

186

37

13

4 Tổng

955

Chú thích: Cây chuyển gen là cây dương tính khi nhuộm X-gluc

112

Chú thích: A: Đỉnh chồi làm vật liệu chuyển gen; B: Mô sẹo chuyển gen trên môi trường chọn lọc; C: Mô sẹo chuyển gen biểu hiện gen GUS của giống sắn HB80 và KM140 (D); E, F:Mẫu biểu hiện tạm thời gen GUS ở lá,thân giống sắn HB80; G: Mẫu biểu hiện tạm thời gen GUS ở đỉnh sinh trưởng giống sắn KM 140, H: Cây sắn tái sinh chồi

Từ các kết quả về tối ưu một số yếu tố trong quy trình chuyển gen, chúng tôi đưa

Hình 3.29: Một số hình ảnh chuyển gen GUS vào giống sắn HB80 và KM 140

ra sơ đồ của quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua A. tumefaciens như sau:

Bước 1: Chuẩn bị vật liệu chuyển gen (2 – 3 tuần)

Nhân chồi giống sắn HB80 và KM140 trên môi trường MS tạo các cây sắn in

vitro nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu đỉnh chồi phục vụ cho chuyển gen.

Vật liệu chuyển gen là đỉnh chồi in vitro 2 - 3 tuần tuổi được cắt thành những mẫu

có kích thước 0,3 - 0,5 cm, đưa vào môi trường CP cảm ứng tạo mô sẹo trong 2 - 3 tuần.

Các mô sẹo sau 2 - 3 tuần bắt đầu xuất hiện phôi được chuyển sang môi

trường CI1-4 để tạo phôi cung cấp nguyên liệu phục vụ cho chuyển gen (4 - 8 tuần).

Bước 2: Chuẩn bị huyền phù A. tumefaciens (2 - 3 ngày)

Nuôi lỏng chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58/pCB mang vector chuyển gen

được nuôi tạo dịch huyền phù chuyển gen vi khuẩn trên môi trường LB lỏng với

mật độ tế bào vi khuẩn OD600nm 0,6; nhiệt độ 28oC.

Bước 3: Chuyển gen (2 - 3 ngày)

Lựa chọn phôi ở giai đoạn phôi non, khối mô vàng tươi, tua dài lây nhiễm với

dịch huyền phù A. tumefaciens trong 15 phút có bổ sung 100µM AS; Thấm khô

113

mẫu và đặt trên môi trường đồng nuôi cấy CI2 có bổ sung 100µM AS trong 2 - 3

ngày trong tối, nhiệt độ phòng 25 – 27oC.

Bước 4: Diệt khuẩn và chọn lọc phôi soma (3 - 6 tuần)

Rửa khuẩn và chuyển phôi lên môi trường nuôi cấy chọn lọc CI2 là môi trường

MS có bổ sung 5mg/l picloram, 0,2mg/l IBA, 500 mg/l cefotaxime, 60 mg/l Km.

Nuôi trong điều kiện ánh sáng, nhiệt độ phòng nuôi từ 25 - 27oC.

Bước 5: Tái sinh chồi chuyển gen (6 - 8 tuần)

Phôi soma sống sót được nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi CN2 là môi

trường MS bổ sung 0,3 mg/l BAP, 60 mg/l Km, cấy chuyển 2 tuần/lần cho tới khi

chồi sắn tái sinh.

Bước 6: Tạo cây hoàn chỉnh

Chồi sắn tái sinh đươc chọn lọc trên môi trường ra rễ chọn lọc (MR) là môi

trường MS bổ sung 50 mg/l Km, nhiệt độ 25 - 27oC để chọn lọc cây chuyển gen.

Bước 7: Ra cây (3 - 4 tuần)

Những chồi sống sót được chuyển sang môi trường MS để cây sinh trưởng,

phát triển. Khi cây đạt chiều cao 7 - 8 cm, cây có 4 - 5 lá với bộ rễ khỏe mạnh được

trồng trong bầu cùng với giá thể TN1 và đặt trong bồn sinh trưởng.

3.4.3. Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

3.4.3.1. Tạo dòng sắn chuyển gen pBI121-C54:SSIV:NOST

Từ những phân tích ở mục 3.2.4 đã đánh giá được những nhóm gen quan trọng liên

quan đến quá trình sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột ở cây sắn, trong đó gen SSIV là gen

tiềm năng góp phần quyết định hàm lượng tinh bột ở củ sắn. Việc áp dụng công nghệ

sinh học lên cây sắn để nghiên cứu sự biểu hiện gen đặc hiệu trên mô hoặc cơ quan là

quan trọng hàng đầu khi muốn cải tiến gen đích. Gen SSIV được cho là có liên quan đến

Pt2L4 - một protein giàu acid gluctamic ở cây sắn, sự phiên mã của gen này chỉ phát hiện

được ở rễ củ và không có ở lá. Kết quả cho thấy promoter C54 hoạt động chủ yếu ở

mạch dây, tầng phát sinh gỗ và mạch gỗ của mô mạch ở lá, cuống lá, thân và hệ thống rễ.

Đặc biệt, sự biểu hiện mạnh của β-glucuronidase được phát hiện trong các tế bào nhu mô

giàu tinh bột ở rễ dự trữ của cây chuyển gen. Những kết quả này chứng minh promoter

114

C54 liên quan đến sự biểu hiện đặc hiệu ở mô mạch và quá trình phát triển thứ cấp của rễ

củ ở sắn. Như vậy, C54 là một promoter tiềm năng trong biểu hiện gen đặc hiệu nhằm

cải thiện tính trạng di truyền ở cây sắn, ví dụ như tăng giá trị dinh dưỡng của củ. Ngoài

ra, kết quả phân tích khả năng tích lũy tinh bột ở cây thuốc lá khi chuyển gen

pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và pBI121-C54:SSIV:NOST thu được hàm lượng tinh bột

trong rễ tăng 6,8 - 17,6% ở những cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-

35S:SSIV:T35S và tăng 27,7 - 65,7% ở những cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc

pBI121 - C54:SSIV:NOST (Mục 3.3.2.3). Do vậy, cần tiếp tục nghiên cứu chuyển gen

pBI121-C54:SSIV:NOST chứa gen SSIV với mục đích tạo cây sắn chuyển gen tăng

cường sinh tổng hợp tinh bột vào giống sắn KM140 do khả năng tái sinh và hiệu quả

chuyển gen GUS ở giống sắn này cũng cao hơn so với các giống khác (Bảng 3.19; Hình

3.30).

Bảng 3.19: Chuyển gen pBI121-C54: SSIV:NOST vào giống sắn KM140

Số mô sống sót trên MTCL

Lô thí nghiệm

Số mẫu

CN

MR

CI

ĐC 1 2 3 4 5 Tổng

50 300 350 300 270 250 1520

Số mẫu tạo mô sẹo trên MT CP 50 297 350 300 265 250 1512

Số mẫu tạo phôi trên MT CI 36 207 249 236 195 188 1111

12 121 134 115 107 95 572

0 7 8 9 7 8 39

Số chồi ra rễ trên MTMS 0 2 2 2 1 2 9

0 3 4 5 3 3 18

Chú thích: ĐC: mẫu không nhiễm A. tumefaciens, MTCL: CI; CN: bổ sung 60 mg/l Km; MR: bổ sung 50 mg/l Km

Chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58 mang cấu trúc vector chuyển gen pBI121-

C54:SSIV:NOST vẫn được áp dụng quy trình chuyển gen như trên, đã tiến hành biến

nạp vào 1520 mẫu và thu được 18 mẫu mô sẹo tái sinh thành cây sau giai đoạn chọn

lọc. Sau đó các cây chuyển gen được chuyển sang môi trường ra rễ và chọn lọc tạo

cây hoàn chỉnh, kết quả thu được 9 cây chuyển gen ra rễ đạt 0,59% (9/1520), (Bảng 3.19).

115

Chú thích: A: Đỉnh sinh trưởng trên môi trường tạo mô sẹo CP; B: Mô sẹo trên môi trường CI; C: Phôi làm vật liệu chuyển gen; D,E: Mẫu trên môi trường chọn lọc CI + cefo 500mg/l + Km 60mg/l; F, G: Mẫu trên môi trường tái sinh CN + Km 60 mg/l; H: Mẫu trên môi trường ra rễ MR + Km 50 mg/l

Hình 3.30: Một số hình ảnh chuyển gen pBI121-C54: SSIV:NOST vào giống sắn KM140

Những cây sắn chuyển gen SSIV mang vector pBI121-C54: SSIV:NOST

nuôi cấy ở môi trường MS trong 3 – 4 tuần, có 4 – 5 lá, lá xanh đậm, cao 7 - 8 cm

với bộ rễ khỏe mạnh được đưa ra trồng trong bầu cùng với giá thể TN1 đặt vào bồn

sinh trưởng 2 – 3 tuần. Các cây chuyển gen sinh trưởng phát triển bình thường,

không có sự khác biệt về hình thái khi quan sát cây chuyển gen với cây không

chuyển gen (Hình 3.31). Sau đó chuyển những cây này sang chậu lớn và trồng trong

nhà lưới.

WTT W T

Hình 3.31: Cây sắn giống KM 140 chuyển gen SSIV được trồng ở nhà lưới

116

3.4.5.2. Phân tích và đánh giá các dòng sắn chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

Trong nghiên cứu này, các dòng sắn chuyển gen với cấu trúc gen pBI121-C54:

SSIV:NOST được thu rễ, tách DNA tổng số và dùng để phân tích PCR với các cặp

mồi promoter C54-F/ SSIV Frag-R. Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng sắn

chuyển gen được thể hiện ở hình 3.32.

Hình 3.32. Điện di DNA tổng số các dòng sắn chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST

Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số cho thấy các băng điện di sáng rõ.

Như vậy DNA tổng số của các dòng sắn chuyển gen đạt tiêu chuẩn để dùng cho

phản ứng PCR tiếp theo. Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi promoter C54-

F/SSIV Frag-R. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR của các dòng sắn chuyển

gen mang cấu trúc pBI121-C54: SSIV:NOST với cặp mồi Promoter C54-F/ SSIV-R.

Kết quả cho thấy rằng 7/9 dòng sắn được kiểm tra có mang cấu trúc gen SSIV. Các

dòng này cho kết quả PCR dương tính và sản phẩm là đoạn DNA có kích thước

tương ứng là 1289 bp (Hình 3.33).

Hình 3.33. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với cặp mồi promoter C54F/ SSIV-R

117

Song song với việc PCR với cặp mồi Promoter C54-F/ SSIV-R, để chắc chắn

rằng các dòng sắn chuyển gen không có sự tồn tại của khuẩn A.tumefacines trong

cây, DNA tổng số của các dòng sắn chuyển gen này tiếp tục được dùng cho phản

ứng PCR với cặp mồi virF/R (Hình 3.34).

Hình 3.34. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với cặp mồi virF/R

Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen cho thấy rằng tất cả

các dòng sắn chuyển gen đều cho kết quả âm tính với cặp mồi virF/R (Hình 3.34).

Điều này chứng tỏ rằng không có sự tồn tại của A.tumefacines trong các dòng sắn

chuyển gen này.

Tóm lại:

Đã nghiên cứu được tối ưu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen

để xây dựng quy trình chuyển gen vào cây sắn, tiến hành chuyển gen GUS vào mô

sẹo phôi hóa từ đỉnh chồi giống sắn HB80 và KM140 và kết quả thu được 0,41 –

0,69% cây sắn chuyển gen. Khi chuyển gen đích SSIV thông qua vector pBI121-

C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140, tỷ lệ cây chuyển gen đạt 0,46%. Điều này

chứng tỏ cây sắn là đối tượng rất khó để chuyển gen so với các đối tượng thực vật

khác. Đây là những kết quả bước đầu khẳng định sự thành công của quy trình

chuyển gen đã được xây dựng và làm tiền đề cho các nghiên cứu chuyển gen tăng

hàm lượng tinh bột vào một số giống sắn ở Việt Nam.

118

Chương 4 BÀ N LUẬN KẾ T QUẢ

Hiện nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải tạo cây sắn theo hướng

các tính trạng có lợi như: năng suất cao, chất lượng phù hợp với mục đích sử dụng

nhằm phục vụ công nghiệp và xuất khẩu là một vấn đề cấp thiết ở nước ta. Các

hướng nghiên cứu ở mức độ sinh học phân tử và di truyền học chưa được quan tâm

và phát triển. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu sâu về sinh học phân tử và di truyền học

nhằm khai thác nguồn gen quý có sẵn tại Việt Nam, phục vụ cho công tác cải tạo

giống sắn bằng công nghệ gen. Để góp phần thực hiện các mục tiêu trên, luận án đã

tiến hành nghiên cứu các nội dung một cách có hệ thống từ đánh giá sự biểu hiện

các gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất tinh bột đến khả năng tăng cườ ng sinh tổng hợp tinh bột của gen SSIV đươ ̣c xác đi ̣nh cây thuố c lá mô hình, sau đó xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và chuyển gen thông qua A.tumefaciens vào mô ̣t số giố ng sắn, bướ c đầu hoàn thiện quy trình chuyển gen SSIV vào cây sắn.

4.1. SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN TRAO ĐỔI CHẤT

TINH BỘT

Tinh bô ̣t có hai thành phần chính là amylose và amylopectin. Cả hai cấu trúc này đều gồ m mô ̣t bô ̣ khung là chuỗi liên kết α-1,4 glucose, trong khi amylose có mứ c đô ̣ polyme hó a DP chỉ từ 1,000 - 5,000 và ít điểm nhánh (chưa đến 0,5% các liên kết α-1,6) thì amylopectin la ̣i là mô ̣t phân tử rất lớ n (DP từ 5,000-50,000) và phân nhánh nhiều (liên kết α-1,6 chiếm 3-4%) (Bresolin và cs., 2006). Amylose đươ ̣c tổ ng hơ ̣p bở i ADP-glucose pyrophosphorylase (AGP) và granule-bound starch synthase (GBSS) cò n amylopectin đươ ̣c tổ ng hơ ̣p bở i hoa ̣t đô ̣ng phố i kết hơ ̣p củ a AGP, các starch synthase (SS) và enzyme phân nhánh tinh bột (starch branching enzyme - SBE). Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn 4 nhóm gen là ADP-glucose pyrophosphorylase (AGP), granule-bound starch synthase (GBSSI và GBSSII), starch synthase (SSI, SSII, SSIII, SSIV) và enzyme phân nhánh tinh bột (SBE) để kiểm tra và đánh giá sự hoạt động của các gen này ở cấp độ phiên mã bằng phản ứng real-time PCR.

119

Viê ̣c xác đi ̣nh các thành viên thuô ̣c mỗi nhó m gen liên quan đến quá trình sinh tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t ở sắ n như trên để ta ̣o cơ sở dữ liê ̣u cho viê ̣c thiết kế mồ i đươ ̣c thực hiê ̣n bở i 3 bướ c. Bướ c thứ nhất là truy câ ̣p cơ sở dữ liê ̣u NCBI để thu thâ ̣p các trình tự nucleotide củ a các gen AGP, GBSSI, GBSSII, SSI, SSII, SSIII, SSIV và SBE củ a thực vâ ̣t đã đươ ̣c công bố trên ngân hàng gen Genbank. Bướ c thứ 2, bằ ng công cu ̣ tìm kiếm Local BLAST searches chú ng tôi sử du ̣ng các trình tự này làm trình tự truy vấn trong cơ sở dữ liê ̣u gen sắn tải từ Phytozome v10.1 để tìm ra trình tự cDNA đầy đủ củ a các gen giả đi ̣nh tương ứ ng ở sắn. Ở bướ c cuố i cù ng mỗi trình tự gen giả đi ̣nh đươ ̣c kiểm tra và khẳng đi ̣nh bằng công cu ̣ Pfam tìm các vù ng chứ c năng bảo thủ trên trình tự protein tương ứ ng. Sau khi khảo sát hê ̣ gen sắn, đã xác đi ̣nh đươ ̣c các gen liên quan đến quá trình sinh tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t ở sắn: AGPS; AGPL; GBSSI; GBSSII; SSI; SSII; SSIII; SSIV; SBE.

AGPase là một trong những enzyme xúc tác cho các bước đầu tiên trong quá

trình tổng hợp tinh bột và đã được chứng minh là enzyme điều hòa quan trọng, điều

chỉnh tốc độ phản ứng của toàn bộ chu trình sinh tổng hợp glycogen ở vi khuẩn và

tinh bột ở thực vật. AGPase xúc tác cho phản ứng biến đổi glucose-1-P và ATP

thành ADP-glucose và pyrophosphate. AGPase được xác định là enzyme dị lập thể,

được cấu tạo bởi hai tiểu phần lớn (AGPL) và hai tiểu phần nhỏ (AGPS) do hai gen

tương tứng mã hóa.Ngoài ra, gen mã hóa AGPase ở sắn cũng đã được phân lập và

giải trình tự thành công (Tichafa và cs., 2001). You – Zhi Li và cs (2016) cũng đã

chứng minh được ở hai giống sắn chính ở Quảng Tây – Trung Quố c là: Huanan 124 (H124) có hàm lươ ̣ng tinh bô ̣t thấp và Fuxuan 01(F01) có hàm lươ ̣ng tinh bô ̣t cao thông qua các phân tích về sự khác biê ̣t củ a hai giố ng sắn này qua bố n giai đoa ̣n phát triển (bắt đầu từ hom thân đến cây trưở ng thành). Kết quả cho thấy sự thay đổi

hàm lượng đường trong lá, thân và rễ dường như không có mối liên quan chặt chẽ

với tổng hàm lượng tinh bột tích lũy ở rễ. Tuy nhiên, khi so sánh H124 với F01 có

hệ thống bó mạch xylem ở các nách lá được sắp xếp nhỏ gọn hơn; lượng callose

xung quanh các lưới rây của hệ thống phloem ít hơn và trong rễ, hoạt tính của

enzym tham gia tổng hợp tinh bột cao hơn nhưng hoạt tính của enzym amylase thấp

120

hơn; sự biểu hiện của các gen liên quan được tăng cường một cách đáng kể; tốc độ

của dòng chảy trong thân cây (SFR) cao hơn. Như vâ ̣y, sự tích lũy hàm lượng tinh

bột cao ở trong rễ là kết quả từ tác động đồng thời của khả năng vận chuyển các

chất trong thân cây một cách mạnh mẽ được đặc trưng bởi SFR, quá trình tổng hợp

tinh bột ở mức độ cao nhưng quá trình phân giải ở mức độ thấp ở trong rễ; sự biểu

hiện các gen vận chuyển đường ở mức độ cao (You – Zhi la và cs., 2016). Trong

nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành phân lập gen AGPase được phân lập từ lá và

củ của 4 giống sắn Đỏ ĐF, SM937-26, KM140 và Trắng HB đại diện cho những

nhóm có hàm lượng tinh bột khác nhau đã được thu thập vào các giai đoạn phát

triển 90 ngày, 180 ngày và 270 ngày. Trong đó AGPS2 hoạt động chủ yếu ở lá và

AGPS1 có xu hướng biểu hiện đặc hiệu ở củ. Đối với gen AGPS1, dựa vào kết quả

phân tích mức độ biểu hiện gen ở lá và củ (Hình 3.4), hoạt động của gen AGPS1 ở

củ cả 4 giống sắn có sự tăng qua các thời kỳ và tăng mạnh ở 270 ngày, gấp 3,3 - 4,2

lần so với giai đoạn khởi đầu. Mức độ phiên mã của gen này ở nhóm giống sắn có

hàm lượng tinh bột cao (Đỏ ĐF, SM937-26 và KM140) có sự chênh lệch đáng kể

(gấp 1,4 - 1,7 lần) so với giống Trắng HB có hàm lượng tinh bột thấp. Hoạt động

của gen AGPS2 ở giai đoạn khởi đầu 90 ngày, 270 ngày khi đạt giá trị max. AGPL3

khi bước vào thời kỳ phát triển củ và tích lũy tinh bột (giai đoạn 180 - 270 ngày) có

sự tăng mạnh, gấp từ 3 - 4 lần so với giai đoạn 90 ngày (Hình 3.5). Kết quả này cũng tương tự khi nghiên cứ u trên hai giố ng sắn H124, F01 cho thấy gen AGPS hoạt động mạnh ở giai đoạn phát triển thân lá (50 - 110 ngày sau trồng) và AGPL

hoạt động động mạnh ở giai đoạn phát triển củ (110 - 240 ngày); (You – Zhi la và

cs., 2016).

Mức độ biểu hiện của gen GBSSI là đặc hiệu ở mô củ sắn, trái lại gen GBSSII

chịu trách nhiệm chính trong việc tổng hợp amylose ở lá (Hình 3.6). Ở 270 ngày,

mức độ biểu hiện trung bình của GBSSI ở mô củ cao gấp hơn 55 lần gen GBSSII.

Sự hoạt động của gen GBSSII ở mô củ cả 4 giống sắn đều thấp, có sự giảm dần qua

các thời kỳ. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu khác cho thấy sự biểu

hiện của gen GBSSI phần lớn bị giới hạn trong mô củ, còn sự phiên mã của gen mã

121

hóa GBSSII chủ yếu khoanh vùng trong lục lạp. Đó là lý do để cho rằng GBSSII

chịu trách nhiệm tổng hợp amylose trong lục lạp (Fujita & Taira, 1998; Vrinten &

Nakamura, 2000).

Nhóm gen SS (SSI, SSII, SSIII và SSIV), trong đó các isoenzyme SSI,

SSII, SSIII liên quan đến sự kéo dài các chuỗi amylopectin và SSIV có liên quan

đến sự khởi đầu hình thành và kiểm soát số lượng hạt tinh bột. Gamez và cs

(2011) đã thu nhận cây thuốc lá có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt hơn cũng

như hàm lượng tinh bột tích lũy trong lá cao hơn 30 - 40% so với cây đối chứng

khi tăng cường biểu hiện gen SSIV (starch sythase IV). Bên cạnh đó, việc biểu

hiện gen SSIV cho phép tăng cường đến 50% hàm lượng tinh bột trong lá vào

thời điểm cuối ngày so với cây đối chứng. Trong các nghiên cứu khác trên đối

tượng ngũ cốc, SSI cũng được xác định là dạng Starch Synthase chính tồn tại

trong nội nhũ (Cao và cs., 1999).

Mức độ phiên mã trung bình của gen SSI ở mẫu củ luôn cao hơn gấp 2,5 lần

so với gen SSIII. Trong khi đó ở mẫu lá, sự biểu hiện của 2 gen này không có sự

biến đổi nhiều qua các thời kỳ, đồng thời mức độ biểu hiện cũng tương đương nhau.

Do vậy, kết quả phân tích ở cả mẫu củ và mẫu lá cho thấy không có sự khác biệt

đáng kể giữa các giống sắn có hàm lượng tinh bột khác nhau đồng thời không cho

thấy mối tương quan với hàm lượng tinh bột ở từng giống. Đối với SSII, mức độ

biểu hiện trung bình của SSII-1 trong củ 270 ngày cao gấp 14 lần giai đoạn 180

ngày và gấp 21 lần giai đoạn 90 ngày. Điều này cho thấy gen SSII-1 biểu hiện mạnh

mẽ hơn cả gen SSI và SSIII. Gen SSIV là gen duy nhất cho thấy có sự biến đổi rõ

ràng về mức độ biểu hiện ở lá. Trong giai đoạn 270 ngày, mức độ phiên mã của gen

SSIV ở lá cao hơn 3 lần giai đoạn 90 ngày và cao hơn gấp đôi giai đoạn 180 ngày.

Đồng thời sự phiên mã của gen SSIV trong lá các giống Đỏ ĐF, SM937-26 và

KM140 cũng cao gấp 3,3 lần và 2,2 lần so với Trắng HB là giống có hàm lượng

tinh bột thấp (Hình 3.7). Kết quả góp phần chứng minh SSIV có tiềm năng trong

việc kiểm soát hàm lượng tinh bột tạm thời trong lá cũng như tinh bột dự trữ ở thực

vật. Đối với gen SBE, mặc dù giống KM140 có sự biểu hiện của gen SBE mạnh

122

nhất ở cả mô củ (gấp khoảng 1,1-1,3 lần so với giống SM937-26 và Trắng HB) và

mô lá (gấp 1,5-1,8 lần ở giống SM937-26 và Đỏ ĐF) nhưng sự khác biệt này chưa

cho phép khẳng định tiềm năng sử dụng SBE trong việc cải tiến hàm lượng tinh bột

ở thực vật.

Từ các kết quả nghiên cứu về sự biểu hiện của các gen liên quan đến trao đổi

chất tinh bột chúng tôi xác định các gen AGPS, AGPL và SSIV là những gen tiềm

năng góp phần quyết định hàm lượng tinh bột của củ sắn.

4.2. CHUYỂN GEN SSIV TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

VÀO CÂY THUỐC LÁ

Quá trình sinh tổng hợp tinh bột ở thực vật được bắt đầu từ việc chuyển hóa

glucose-1-P và ATP thành ADP-glucose dưới sự xúc tác của ADP-glucose-

pyrophosphorylase (AGPase). ADP-glucose là một monomer cho quá trình sinh

tổng hợp tinh bột với sự tham gia của nhiều enzyme tiếp theo. Hiện đã có 5 loại

enzyme tham gia sinh tổng hợp tinh bột ở thực vật được xác định và nghiên cứu.

GBSS (Granule-bound starch synthase) đảm nhận quá trình tổng hợp amylose và SS

(IIV) giữ vai trò sinh tổng hợp nên sợi amylopectin. Ngoài ra, bên cạnh các

enzyme SS, còn có các enzyme xúc tác quá trình phân nhánh SBE (Starch

branching enzyme) hay enzyme phân hủy tinh bột tham gia vào quá trình điều hòa

hàm lượng tinh bột ở thực vật (Geigenberger, 2011)

Bên cạnh các gen đã được nghiên cứu, gen SSIV đã và đang được nghiên cứu

ứng dụng nhằm tăng hiệu quả của quá trình sinh tổng hợp tinh bột. Nhiều nghiên

cứu gần đây cho thấy SSIV giữ vai trò quan trọng trong khởi đầu quá trình hình

thành các hạt tinh bột (Szydlowski và cs., 2009). Roldan và cs (2007) đã đánh giá

ảnh hưởng của việc bất hoạt gen SSIV đến quá trình tổng hợp tinh bột ở cây thuốc

lá. Kết quả cho thấy cây thuốc lá chuyển gen Mut- SSIV xuất hiện các kiểu hình

sinh trưởng kém hơn so với đối chứng. Mặt khác, hàm lượng polysaccharide dự trữ

không khác biệt so với cây đối chứng. Tuy nhiên, các cây chuyển gen có sự suy

giảm về số lượng hạt tinh bột cùng với đó là sự tăng về kích thước của các hạt tinh

bột trong lá (Roldan và cs., 2007). Matilda (2013) cho thấy cây thuốc lá đột biến

123

khuyết gen SSIV bên cạnh sự suy giảm số lượng hạt tinh bột/ lục lạp ở lá trưởng

thành còn gây ra hiện tượng không tạo thành tinh bột và gia tăng hàm lượng ADP-

glucose ở lá non (Matilda và cs., 2013).

Một số nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen các gen tham gia quá trình

sinh tổng hợp tinh bột cũng đã thu nhận được các kết quả khả quan trong cải

thiện hàm lượng tinh bột tích lũy ở thực vật. Gamez và cs (2011) thu nhận cây

thuốc lá có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt hơn cũng như hàm lượng tinh bột

tích lũy trong lá cao hơn 30 - 40% so với cây đối chứng khi tăng cường biểu hiện

gen You – Zhi la và cs (2016). Bên cạnh đó, việc biểu hiện gen SSIV cho phép

tăng cường đến 50% hàm lượng tinh bột trong lá vào thời điểm cuối ngày so với

cây đối chứng (Gamez và cs., 2011). Carciofi và cs (2012) cũng đã thu nhận

dòng mô sẹo lúa mạch có hàm lượng tinh bột cao hơn 4% so với đối chứng khi

tiến hành chuyển gen GBSS.

Kết quả nghiên cứu khi chuyển 2 cấu trúc gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và

pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST được biến nạp vào 300 mảnh lá cây thuốc lá đã thu

được 77 cây chuyển gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và 69 cây chuyển gen pBI121-

C54:SSIV-cmyc:NOST trên môi trường chọn lọc bằng kanamycin (Bảng 3.10). Tiếp

theo, chúng tôi đã phân tích Southern blot thành công 7/7 mẫu cây chuyển gen ở

cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và 7/7 mẫu cây chuyển gen mang cấu trúc

pBI121-C54:SSIV:NOST (Hình 3.19).

Bước đầu nhóm nghiên cứu đã đánh giá hoạt của gen SSIV với cấu trúc

K7WG2D-35S:SSIV:T35S và pBI121-C54:SSIV:NOST ở các dòng thuốc lá và đều

thu được kết quả ở các cây chuyển gen có hàm lượng tinh bột cao hơn ở cây đối

chứng không chuyển gen. Cụ thể hàm lượng tinh bột trong rễ tăng 6,8 – 17,6% ở

những cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và tăng

27,7 - 65,7% ở những cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pBI 121 – C54: SSIV:

NOST (Bảng 3.9; 3.10). Đây là cơ sở để lựa chọn gen SSIV mang cấu trúc pBI 121

– C54: SSIV: NOST chuyển vào cây sắn.

124

4.3. CHUYỂN GEN SSIV TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

VÀO CÂY SẮN

4.3.1. Hệ thống tái sinh cây sắn

Ngoài điều kiện môi trường nuôi cấy thì giống thực vật là một trong các yếu

tố quan trọng quyết định đến sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và

mô thực vật. Bộ phận được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy mô cũng là yếu tố

quyết định hiệu quả của quá trình nuôi cấy. Về lý thuyết, bất kỳ bộ phận nào thu

được từ bất kỳ loài thực vật nào cũng có thể được sử dụng để tạo ra các mô sẹo,

tuy nhiên mức độ thành công của quá trình tạo mô sẹo phụ thuộc vào tính chất

đặc trưng của chúng. Thân cây, lá, rễ, hoa, hạt giống và các bộ phận khác của cây

đều có thể được sử dụng, tuy nhiên những bộ phận cây non thường được sử dụng

và cho hiệu quả cao nhất. Trong nghiên cứu này, chồi nách từ thân cây sắn in

vitro được nuôi cấy để nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa của các giống

sắn bởi khả năng sinh trưởng nhanh hơn hẳn so với các bộ phận khác trong quá

trình nuôi cấy mô.

Với các nghiên cứu trên thế giới, trải qua một thời gian dài tìm hiểu về sự

hình thành các cấu trúc phôi từ mô sẹo thì gần đây các nghiên cứu đều tập trung

vào việc tạo ra mô sẹo phôi hóa. Nhờ sự phát hiện ra cấu trúc này mà các nhà khoa

học trên thế giới đã cải tạo thành công nhược điểm của một số giống sắn hiện có

bằng công nghệ sinh học hiện đại (Zainuddin và cs., 2012).

Phôi soma thường được tạo ra bằng cách sử dụng auxin trong môi trường nuôi

cấy (Williams & Maheswaran,1986). Giữa các auxin khác nhau, 2,4D là một trong

những chất được áp dụng phổ biến nhất để tạo phôi soma. Tạo phôi soma trên môi

trường có bổ sung picloram cũng đã được báo cáo ở nhiều loài cây khác nhau: sắn

(Raemakers và cs., 1997;), lúa mạch (Groll và cs., 2001), lúa mì (Castillo và cs.,

1998; Mendoza & Kaeppler, 2002), kê (Preeti & Kothari, 2004). Danso và cs (2010)

cho rằng cả hai chất 2,4D và picloram đều cho kết quả quá trình tạo phôi soma cao

(90 – 100%), tuy nhiên môi trường có bổ sung picloram cho quá trình tạo phôi soma

nhanh và vượt trội so với môi trường bổ sung 2,4D bởi vì picloram tác động đến

125

thành tế bào và làm giãn tế bào nhanh hơn 2,4D. Feitosa và cs (2007) khi nghiên

cứu khả năng tái sinh của một số giống sắn của Brazil; Nyaboga và cs (2013)

nghiên cứu ở giống sắn TME14 thông qua tạo phôi soma đã chỉ ra cần bổ sung

nồng độ 12 mg/l picloram vào môi trường nuôi cấy cho tỷ lệ tạo phôi cao nhất.

Kone và cs (2015) cũng đã chứng minh được khả năng tất cả 7 giống sắn địa

phương ở Cameroon đều có khả năng tạo phôi với những tỷ lệ khác nhau trên

môi trường có bổ sung Picloram và 2,4D, tuy nhiên kết quả cao nhất khi bổ sung

50 µM/l Picloram. Cả hai auxin thường được sử dụng trong sự tạo ra phôi soma

của sắn (Li và cs., 1996, Taylor và cs., 1996; Zhang & Puonti-Kaerlas., 2005).

Như vậy, tuỳ thuộc vào thành phần môi trường bổ sung các chất thuộc nhóm

cytokinin khác nhau, mỗi khối mô sẹo phôi hóa có thể tạo từ 2 đến nhiều chồi

sau khoảng 4 tuần (Bull và cs., 2009).

Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu sử dụng thân non hoặc các mảnh lá

non ở cây sắn để tạo mô sẹo và các cấu trúc phôi (Đoàn Thị Phương Thùy & Bùi

Trang Việt (2006), (Bùi Lan Anh và cs., 2012), (Vũ Văn Kiên & Nguyễn Du

Sanh., 2011) thu được kết quả tốt nhất khi nghiên cứu trên giống sắn KM 297 cảm

ứng tạo phôi ở môi trường bổ sung 8 mg/l picloram sau 13 ngày; 12 mg/l picloram

sau 14 ngày với giống sắn KM 140 (Tống Thị Hường và cs., 2017). Tuy nhiên cho

đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào phát hiện ra cấu trúc mô sẹo phôi hóa hoàn

thiện cho tất cả các giống sắn. Những nghiên cứu về sắn tại Việt Nam mới chỉ

dừng lại ở việc tạo phôi soma do vậy khi sử dụng các nguyên liệu trên để chuyển

gen thường cho hiệu quả thấp.

Từ các kết quả về xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ cho chuyển gen ở cây

sắn chúng tôi đã thu nhận được những kết quả cụ thể minh chứng cho tỷ lệ tái sinh

không những phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy mà còn phụ thuộc vào mỗi giống.

Các công trình nghiên cứu về hệ thống tái sinh ở cây sắn thường khá phức tạp và

có nhiều giai đoạn nuôi cấy với những thành phần môi trường và điều kiện khác

nhau. Trong nghiên cứu này, hệ thống tái sinh tối ưu nhất cho hai giống HB80 và

KM140 là lựa chọn đỉnh sinh trưởng trên môi trường tạo mô sẹo CP, cảm ứng tạo

126

phôi CI2, phôi soma tạo cây con trên môi trường CN2 và tạo cây hoàn chỉnh trên

môi trường MS. Sau khoảng thời gian 56 – 58 ngày, tỷ lệ cây tái sinh hoàn chỉnh

đạt 60,3 – 61,5% (Bảng 3.14) và có thể sử dụng cho các nghiên cứu chuyển gen

vào hai giống sắn này.

4.3.2. Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua A. tumefaciens

Bull và cs (2009) đã xây dựng hoàn thiện quy trình chuyển gen đáng tin cậy và

dễ hiểu nhờ vi khuẩn A. tumefaciens của các mô sẹo phôi hóa (FEC) và tái sinh cây

chuyển gen ở giống sắn mô hình TMS 60444. Phương pháp chuyển gen nhờ A.

tumefaciens thông qua FEC là một tổ hợp gồm hai hệ thống đã được xem là phương

pháp được sử dụng rộng rãi và hiệu quả nhất để sản xuất cây sắn chuyển gen. Tổ

hợp này ưu việt hơn so với phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen hay chuyển

gen thông qua các khối mô sẹo ở chỗ: thứ nhất là khi sử dụng FEC sẽ giảm được rủi

ro của việc tái sinh cây lai so với quá trình sử dụng phương pháp tái sinh mô, như là

cotyledon (lá mầm); hai là chọn lọc (thường sử dụng kháng kháng sinh) của FEC sẽ

cho kết quả là ít cây non không chuyển gen được tái sinh so với mẫu tái sinh từ chồi

(Li và cs., 2006; Zhang và cs., 2000; ).

Kết quả này sẽ là cơ sở để tiếp tục có các định hướng nghiên cứu tiếp theo

nhằm mục đích tạo được cấu trúc mô sẹo phôi hóa của các giống sắn đang trồng

phổ biến tại Việt Nam.

Như vậy, đỉnh chồi của cây sắn in vitro là một trong những bộ phận trên cây

sắn có khả năng tạo mô sẹo chất lượng nhất (Zainuddin và cs., 2012). Do đó,

chúng được sử dụng được để nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa của các

giống sắn. Bên cạnh đó, các mô hay cơ quan khác cũng có thể được sử dụng để

nuôi cấy tạo mô sẹo, tuy nhiên mức độ thành công lại phụ thuộc vào các yếu tố

khác như giống sắn, hệ thống môi trường nuôi cấy (Đoàn Phương Thùy & Bùi

Trang Việt., 2006). Trên thế giới, các nhà khoa học cũng đã sử dụng nhiều bộ phận

khác nhau trên thân cây sắn để tạo mô sẹo và các loại phôi soma. Tuy nhiên, việc

tạo ra phôi soma chất lượng là yếu tố rất quan trọng để cải tạo các giống sắn bằng

các phương pháp công nghệ sinh học (Opabode và cs., 2014; 2015).

127

Nguyễn Văn Đồng và cs (2014) đã thí nghiệm trên môi trường MMS được

cải tiến dựa trên môi trường dinh dưỡng MS cơ bản có bổ sung 12 mg/l picloram

được thử nghiệm để nuôi cấy mô sẹo của 4 giống sắn: TMS 60444, KM 140, KM

419, HL 2004-28. Kết quả cho thấy, môi trường này phù hợp với giống TMS

60444 trong khi không thích ứng với 3 giống sắn còn lại, điều này thể hiện ở khả

năng sinh trưởng của mô sẹo TMS 60444 ở các giai đoạn sau trong khi mô sẹo của

3 giống còn lại bị thoái hóa và chết dần. Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa trung bình của

giống TMS 60444 lên đến 64,3% nhưng các giống còn lại đều có tỷ lệ 0%.

Lựa chọn những khối mô vàng tươi, tua dài, ngâm mô sẹo phôi hóa từ 10 -

20 phút trong dịch khuẩn chuẩn bị có chứa 100µM AS và đồng nuôi cấy trên môi

trường Co trong thời gian 2 – 3 ngày ở nhiệt độ phòng 25 – 27oC. Khối mô sẹo

phôi hóa sau biến nạp sẽ được nuôi cấy trong môi trường tái sinh có bổ sung chất

chọn lọc để tạo được cây sắn chuyển gen (Hình 3.27). Quy trình này tương tự

như quy trình có trong các nghiên cứu của Zainuddin và cs (2012). Mục tiêu

chung của các quy trình là đều tạo được mô sẹo phôi hóa để làm nguồn nguyên

liệu phục vụ cho chuyển gen mong muốn thông qua vi khuẩn Agrobacterium.

Tuy nhiên, quy trình nghiên cứu của chúng tôi có cải tiến một số thành phần môi

trường ở giai đoạn cảm ứng tạo mô sẹo phôi hóa để chất lượng mô sẹo phôi hóa

tạo ra tốt hơn.

Tỷ lệ giữa Agrobacterium và mật độ tế bào chủ là yếu tố quan trọng ảnh

hưởng đến tần số chuyển T-DNA, nồng độ thấp Agrobacterium có thể làm giảm

hiệu lực tần số chuyển T-DNA, trong khi nồng độ cao của loại vi khuẩn này có

thể ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào thực vật. Vì vậy, việc tập hợp tế

bào mật độ tế bào Agrobacterium tối ưu vào từng giống sắn cho phù hợp là điều

cần thiết để nâng cao hiệu quả chuyển gen. Tỷ lệ biểu hiện gen GUS tạm thời của

hai giống sắn nghiên cứu HB80 và KM140 cao nhất tại nồng độ vi khuẩn OD

600nm= 0,6 đạt 33,0 - 46,0% (Hình 3.28). Kết quả này cũng phù hợp với công

bố khi chuyển gen vào FEC của giống sắn TME 14 có giá trị OD600 là 0,25

(Nyaboga và cs., 2013) và ở giống sắn TMS 60444 có giá trị OD600 là 0,5 (Bull

và cs., 2009). Tương tự khi OD600 = 0,5 lại là nồng độ tối ưu khi chuyển gen

128

htpII kháng hygromyxin và gen chỉ thị GUSA được biểu hiện bởi promotor 35S

trên cây sắn TMS 60444 và 3 giống sắn địa phương: Agric, Oko – iyawo và

Abbey - ife ở Thụy Sĩ của Zainuddin và cs (2012); Ngoài ra, Nguyễn Văn Đồng

và cs (2014) cũng thu được kết quả chuyển gen GFP tối ưu nhất ở OD600 = 0,5

cho giống sắn KM 140.

Gen chọn lọc nptII kháng Km thường được thiết kế trong các vector dùng để

chuyển gen thực vật. Tuy nhiên, mức độ mẫn cảm của mô thực vật với Km thay

đổi phụ thuộc vào giống, loài thực vật. Kanamicin tác động tới các tế bào không

chuyển gen theo cơ chế liên kết với tiểu phần nhỏ của ribosome trong tế bào, ức

chế quá trình sinh tổng hợp protein và các con đường sinh tổng hợp khác liên

quan, trong đó có hoạt động của lục lạp. Mảnh lá, cụm chồi, cây mất khả năng hấp

thu dinh dưỡng, hoạt động của lục lạp bị rối loạn nên sẽ bị vàng và chết dần. Vì

vậy, Km được dùng rộng rãi như một maker chọn lọc các tế bào, mảnh lá, cây

chuyển gen qua các giai đoạn. Ảnh hưởng của Km với nồng độ từ 50 – 100 mg/l

đến khả năng tạo mô sẹo và sự sống sót của mô sẹo chuyển gen đã được nghiên

cứu (Bảng 3.16). Môi trường chọn lọc bổ sung 60 mg/l thu được mô sẹo chuyển

gen sống sót 20,4 - 25,1% sau 8 tuần ở hai giống sắn HB80 và KM140, môi trường

khi bổ sung Km từ 80 – 100 mg/l mô sẹo hình thành nhưng không phát triển được,

cứng vàng rồi chuyển sang đen và 100% mô bị chết sau 8 tuần. Ngoài ra, khi bổ

sung nồng độ 50 mg/l Km vào môi trường ra rễ chọn lọc tỷ lệ ra rễ đạt 28,3 –

33,33% nhưng khi tăng nồng độ lên 100 mg/l Km các chồi vẫn sống sót nhưng

sinh trưởng kém, còi cọc, lá vàng và 100% chồi không tạo rễ, chết sau 30 ngày.

Trong nuôi cấy chọn lọc và tái sinh cây sắn chuyển gen một số nghiên cứu lại

lựa chọn hygromycin như là kháng sinh chọn lọc các mẫu chuyển gen (Bull và cs.,

2009; Zhang và cs., 2000a; Nyaboga và cs., 2013) ở nồng độ 50 mg/ml thông qua

FEC. Yang và đtg (2011) đã sử dụng 10 mg/l hygromycin để tái sinh cây khoai

lang chuyển gen thông qua mô sẹo phôi hóa. Mu và cs (2012) đă sử dụng 20 mg/l

hygromycin để chọn lọc cây ngô chuyển gen trong khi Ghorberl và cs (2010) sử

dụng 100mg/l hygromycin để chọn lọc các cây cam chuyển gen.

129

Để xây dựng quy trình chuyển gen từ những kết quả nghiên cứu tối ưu các

điều kiện ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen chúng tôi đã thu được kết quả tạo

cây sắn chuyển gen cho hai giống sắn HB80 và KM140 (Bảng 3.18). Hiệu suất tái

sinh đạt 1,36 – 1,61% và hiệu suất chuyển gen GUS đạt 0,41 - 0,69%. Đây là kết

quả bước đầu khẳng định sự thành công khi xây dựng quy trình chuyển gen và là

cơ sở cho các bước chuyển gen tăng hàm lượng tinh bột vào cây sắn ở Việt Nam.

Sự biểu hiện của gen ngoại lai trong cây chủ chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố

bao gồm vị trí tích hợp của gen chuyển trong genome vật chủ, số lượng bản copy,

đột biến gen chuyển hoặc những biến đổi về di truyền ngoại gen như hiện tượng

câm gen (gene silencing) (Yang và cs., 2013).

Kết quả PCR 9 dòng sắn chuyển gen với cấu trúc gen pBI121-C54:

SSIV:NOST kết quả cho thấy rằng 7/9 dòng sắn được kiểm tra có mang cấu trúc

gen SSIV. Điều này chứng tỏ 7 cây sắn này đã mang gen chuyển SSIV với hy

vọng những cây sắn này sẽ có hàm lượng tinh bột cao hơn so với cây không

chuyển gen (Hình 3.29). Hiệu quả tái sinh thu được khá thấp ở cây sắn là do sự nảy

mầm kém ở các phôi ở giai đoạn lá mầm. Điều này chúng tôi cũng gặp trong một

số các báo cáo của các phòng thí nghiệm khác. Iheme và cs (2006) đã thu được 26

cây con khi chuyển vào 827 phôi ở giống sắn TMS71173. Tương tự, Chetty và cs

(2013) thu nhận được 33 dòng chuyển gen từ 514 phôi với giống sắn T200 hay

Taylor và cs (2012) thu nhận 14 cây chuyển gen vào phôi của giống sắn

TMS60444. Như vậy cho đến thời điểm này việc chuyển gen vào cây sắn thông

qua mô sẹo phôi hóa (FEC) vẫn là hướng đi của các nhà khoa học trên thế giới.

Tuy nhiên tỷ lệ tạo cây chuyển gen còn thấp và có sự khác biệt rõ giữa các giống

sắn nghiên cứu.

130

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Xác định các gen AGPS, AGPL và SSIV là những gen góp phần quyết

định hàm lượng tinh bột của củ sắn thông qua các phương pháp real time RT-

PCR và phương pháp tin sinh học.

2. Đã thiết kế được 2 vector chuyển gen ở thực vật là: pK7WG2D-35S:

SSIV:T35S mang gen mã hóa SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột dưới sự

điều khiển của promoter cố định 35S, pBI121-C54:SSIV:NOST mang gen mã hóa

enzyme tăng cường sinh tổng hợp tinh bột ở củ sắn dưới sự điều khiển của

promoter đặc hiệu C54.

3. Chuyển 2 cấu trúc vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và pBI121-C54:

SSIV:NOST mang gen SSIV liên quan đến trao đổi chất tinh bột ở thực vật vào cây

thuốc lá. Mức độ tích lũy tinh bột trong rễ của các dòng thuốc lá chuyển gen mang

cấu trúc pBI 121 – C54:SSIV: NOST cao hơn nhiều so với những dòng thuốc lá

chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và cao hơn 27,7 - 65,7% so

với cây WT.

4. Xây dựng quy trình chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV

dưới sự điều khiển promoter đặc hiệu ở củ C54 vào mô sẹo phôi hóa (FEC) của

giống sắn KM140 thông qua A.tumefaciens. Kết quả thu được 7 dòng sắn giống

KM140 dương tính khi kiểm tra với PCR, tỷ lệ cây chuyển gen mang cấu trúc pBI

121 – C54:SSIV: NOST đạt 0,46%.

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục phân tích, đánh giá khả năng tăng cường sinh tổng hợp tinh bột ở

củ những cây sắn chuyển gen còn lại trong điều kiện nhà lưới.

2. Ứng dụng quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua FEC nhờ

A.tumefaciens vào một số giống sắn khác của Việt Nam.

131

ABSTRACT

“ISOLATION AND EVALUATION OF SOME IMPORTANT GENES

INVOLVED IN BIOSYNTHESIS AND STARCH ACCUMULATION

IN CASSAVA "

Cassava is one of the most important crops for many contries due to their

ability to provide high carbohydrates in extreme weather conditions such as low

rainfall, drought or poor soil fertility.

Currently, in the context of climate change that causes global warming, rising

sea levels, threatening world food security and the exhaustion of fossil fuels,

cassava is considered as the prize crop to achieve both goals: contributing to food

security and providing raw materials for the biofuel industry, gradually replacing

fossil fuels.

Starch is one of the most important contents in plant and is key material for

industry. The improvement of plant by increasing starch yield is one of the crucial

strategy for reseachers. Therefore, the study on the synthetic and degradative starch

pathway in plants including cassava will promote the goal that improves the starch

yield.

To the improvement of starch yield, most recent cassava researches mainly use

traditional methods to select and cross-breed new cassava varieties from imported

and local varieties. Whereas, the application of modern biotechnology in cassava

study is staying at an early stage and using simple methods such as tissue culture for

seedling multiplication, rapid multiplication in vitro of some new varieties. Thus,

the application of biotechnology to improve cassava in the direction of

improvement of yield starch to reach industrial and export requests is an urgent

problem in Vietnam.

1. Research objectives of the project

This is the first study that use a vector habouring SSIV gene under the control

of pBI 121 – C54:SSIV: NOST for transformation into Friable embryo callus (FEC)

of KM140 cassava via Agrobacterium tumefaciens.

132

2. Research contents

Content 1: Selection of cassava variety and analysis of the expression of

important genes involved in starch metabolism.

Content 2: Isolation of 1-2 important genes involved in starch synthesis and

transformed vector.

Content 3: Estimation of starch accumulation of 1-2 related genes in model

tobacco.

Content 4: Transformation of transgenic vector habouring genes which

enhance starch accumulation into cassava.

1. Sucessful selection and isolation of SSIV gene related to starch biosynthesis and

accumulated efficiency from leaf and root cassava.

2. Sucessful transformation of 2 transgenic vectors: pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và

pB121-C54:SSIV-cmyc:NOS into tobacco. The starch content in root of transgenic

tobacco transformed with pBI 121 – C54: SSIV: NOST vector was more than its from

transgenic tobacco transformed with pK7WG2D-35S: SSIV:T35S vector from 19,7 % to

48,1%. Starch content in roof of transgenic tobacco transformed with recombinant vectors

was more than wild type from 15,6 % to 65,7%, respectively.

3. This is the first study that use a vector habouring SSIV gene under the control of

C54 promoter for transformation into Friable embryo callus (FEC) of KM140 cassava via

Agrobacterium tumefaciens. The PCR result illustrated that seven transgenic cassava

contained SSIV gene.

3. New contributions of the thesis

4. Results

4.1. Cassava variety selection and analysis of the expression of important genes

involved in starch metabolism

Based on the starch contents, 250 cassava varieties were grouped (3 groups),

and 4 representative varieties were selected for groups: SM937-26 and Red DP

(group 1); KM140 (group 2); White HB (group 3) which represents three sub

groups cultivated at the Co Nhue experimental farm for analysis of gene expression

levels related to starch biosynthesis in cassava.

133

Real time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) method and bioinformatics

analysis method was used to analyze and evaluate the expression of four important

gene groups related to biosynthesis and starch accumulation in four representative

cassava varieties. AGPS, AGPL and SSIV genes were identified as potential genes

that contribute to determine starch content of cassava.

4.2. Results of isolation of SSIV genes involved in starch synthesis and

transgenic vector design

The SSIV gene sequence isolated from the KM140 cassava variety was

registered with Genbank number of KT033500.

Two plant transgenic vectors were constructed including pK7WG2D-35S:

SSIV: T35S that carries the gene encoding the enzyme enhancing starch synthesis

under the control of the CaMV 35S promoter, and pBI121-C54: SSIV: NOST that

carries gene encoding enzyme enhancing starch synthesis in cassava under the

control of specific promoter C54.

4.3. The results of the evaluation of vectors containing SSIV gene in tobacco plants

The two transgenic vectors including pK7WG2D-35S:SSIV:T35S and pBI 121

– C54: SSIV: NOST that contain SSIV gene were transformed into tobacco K326.

The results showed that transgenic plants with higher starch content were obtained

in compared to non-transgenic plants. In detail, starch content in root of transgenic

tobacco transformed with pK7WG2D-35S:SSIV:T35S vector was increased from 6,8

to 17,6%. Whereas, starch content in root of transgenic tobacco transformed with

pBI 121 – C54: SSIV: NOST vector was increased from 26,5 to 65,7% .

134

4.4. Transformation of transgenic vectors habouring SSIV gene in cassava

4.4.1. Development of in vitro regeneration of cassava

The suitable material for somatic embryo production was the shoot top. The

KM140 variety had the highest complete regeneration rate among the five cultivars

(61.2%).

The appropriate medium for callus formation was the MS medium

supplemented with 10 mg / l of Picloram (CP).

The appropriate medium for embryo formation was the MS medium

supplemented with 5 mg/l picloram và 0.2 mg/l IBA (CI2).

The somatic embryo geminating medium was MS medium supplement with

0.3 mg/l BAP (CN2).

The complete plant regeneration medium was MS medium supplement with 1

mg/l CuSO4.

The appropriate material for cassava in the greenhouse was TN1: fumigated

husk with ratio 6: 4. The average survival rate of nurseries was 95%.

4.4.2. Construction and optimization of Gus gene transferring process to

cassava

Top shoot was transferred to the CP medium to induce callus

Callus was transferred to the CI medium to produce embryos as materials for

gene transfer.

The A. tumefaciens C58/pCB - gus plus was grown liquid LB medium reach to

OD600nm = 0.6 at 28oC.

Embryos were selected at early stage with fresh yellow and long-tassel tissue

mass then infected with A. tumefaciens suspension for 15 minutes supplemented

with 100 μM AS; The sample was dried and placed on CI culture medium

supplemented with 100 μM AS for 2 days at room temperature 25 – 27oC.

Embryos were washed to remove the bacterial then transferred to selective

culture medium supplemented with 500 mg/l cefotaxime, 60 mg/l Km, transplanted

every two weeks until regenerated cassava shoots.

135

Survival somatic embryos were cultured on CN shoot regeneration medium

supplemented with 60 mg/l Km, at temperature 25 – 27oC.

Regenerated cassava shoots were selected on selective root regeneration

medium (MR), MS medium supplemented with 50 mg/l Km, at temperature 25 –

27oC to select transgenic cassava.

Survival shoots were transferred to MS medium. When the plants reach a

height of 7 - 8 cm, with 4-5 leaves and healthy roots, they are transferred in pots

with TN1 substrate and placed in the growth tank.

The condition affecting gene transferring efficiency was optimized in order to

complete the gene transferring process in the cassava. The gus gene was transferred

into embryonic callus originated from the shoots of HB80 and KM140 varieties.

The percentage of transgenic plant obtained was from 0.41 to 0.69%.

4.4.3. Generation of SSIV transgenic cassava enhancing starch synthesis

The establishment of the gene transferring process for the KM140 cassava

variety via the A. tumefaciens through FEC has been optimized. The results showed

that the cassava varieties were positive with PCR test, the ratio of transgenic plants

carried 121 - C54: SSIV: NOST vector was 0,46%. These results prove that cassava

is a very difficult target for transformation via A.tumefaciens. These initial results

confirming the successful gene transferring process and is the premise for

transgenic researchs in order to increase starch content in some cassava varieties in

Vietnam.

136

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

1. Nguyen Thi Minh Hong, Le Thu Ngoc, Nguyen Mau Hung, Pham Bich Ngoc,

Chu Hoang Ha (2016) Gene expression profiling of ADP – Glucose

pyrophorylase (AGPase) in sink and source organs of some cassava varieties with

different starch contents in Viet Nam. Tạp chí Công nghệ sinh học 14(4): 673-

682.

2. Nguyễn Thị Minh Hồng, Lê Thu Ngọc, Phạm Bích Ngọc (2017) Khuếch đại

gen ssiv mã hoá cho starch synthase (ss) ở giống sắn KM 140 bằng phương pháp

RT- PCR, Tạp chí KH – ĐH Hồng Đức 34(4): 31 - 44.

3. Nguyễn Thị Minh Hồng, Lê Thu Ngọc, Nguyễn Khắc Hưng, Nguyễn Thị

Thơm, Phạm Bích Ngọc (2017) Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen SSIV

tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thông qua Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa KHTN và CN, 33(1S): 224 - 230.

4. Nguyễn Thị Minh Hồng, Nguyễn Thị Hoài Thương, Phạm Bích Ngọc, Chu

Hoàng Hà (2018) Nghiên cứu tái sinh một số giống sắn (Manihot esculenta

crantz) thông qua mô sẹo phôi hóa. Tạp chí CNSH, 16(1): 119 – 126.

3): 1 – 8.

137

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Abhary M, Siritunga D, Stevens G, Taylor NJ, Fauquet CM (2011) Transgenic

biofortification of the starchy staple cassava (Manihot esculenta) generates a

novel sink for protein. PLOS ONE 6(1): 16-26.

2. Abrahamian P & Kantharajah A (2011) "Effect of Vitamins on in vitro

Organogenesis of Plant". American Journal of Plant Sciences, 2: 669-674.

3. Allem AC (2002) “The origins and taxonomy of cassava” Chapter. 5 in

Hillocks. Cassava: Biology, Production and Utilization, CABI, Wallingford.

United Kingdom: 1–16.

4. Alves AC (2002) “Cassava botany physiology” Chapter. 5 in Hillocks, R. J. et

al. Cassava: Biology, Production and Utilization, CABI, Wallingford. United

Kingdom: 67–89.

5. Anwar N, Junko K, Watarabe A (2011) Transgenic sweet potato expressing

mammalian cytochrome P450. Plant Cell Tiss Organ Cult 105: 219 – 231.

6. Baguma Y, Sun C, Ahlandsberg S, Mutisya J, Palmqvist S, Rubaihyo PR,

Maganbo MJ, Egwang TG, Larsson H, Jansson C (2003) Expression patterns

of the gene encoding starch branching enzyme II in the storage roots of

cassava (Manihot esculenta Crantz). Plant Science. 164:833-839.

7. Biradar S, Biradar D P, Patil V C, Patil, Kambar S S (2009) In vitro plant

regeneration using shoot tip cultures in commercial cultivar of sugarcane.

Karnataka J. Agri. Sci. 22(1): 21-24.

8. Bresolin NS, Li Z, Kosar-Hashemi B, Tetlow IJ, Chatterjee M, Rahman S,

Morell MK, Howitt CA. (2006) Characterisation of disproportionating

enzyme from wheat endosperm. Planta 224: 20–31

9. Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ (2008)

“Xây dựng quy trình biến nạp gen bar – gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây

khoai mì (Manihot esculenta Crantz) bằng phương pháp bắn gen”, Tạp chí

phát triển KH & CN, 11 (1): 90 – 95.

138

10. Bùi Văn Thắng, Đỗ Xuân Đồng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013) Quy

trình chuyển gen thông qua Agrobacterium vào cây xoan ta (Melia

azedarach L.) bằng A. Tumefaciens đạt hiệu suất cao. Tạp chí sinh học 35

(2): 227 - 233.

11. Bull SE, Owiti JA, Niklaus M, Becching JR, Gruissem W, Vanderschunren H

(2009) A. Tumefaciens – mediated transformation of friable embryogenic

calli and regeneration of transgenic cassava. Natrure protocols 4(12) 1845 –

1854.

12. Burton RA, Jenner H, Carrangis L, Fahy B, Fincher GB (2002) Starch granule

initiation and growth are altered in barley mutants that lack isoamylase

activity. Plant J. 31: 97-112

13. Cao H, Imparl-Radosevich J, Guan H, Keeling PL, James MG, Myers AM

(1999) Identification of the soluble starch synthase activities of maize

endosperm. Plant Physiology 120: 205-215.

14. Carciofi M, Blennow A, Nielsen MM, Holm PB, Hebelstrup KH (2012) Barley

callus: a model system for bioengineering of starch in creals. Palnt methods 8: 36.

15. Castillo A M, Egana B, Sanz J M, Cistue L (1998) Somatic

embryogenesis and plant regeneration from barley cultivars grown in

Spain. Plant Cell Rep. 17: 902–906.

16. Ceballos H & Cruz G (2012) "Cassava Taxonomy and Morphology", in

Cassava in the Third Millenium Modern: Production, Processing, Use and

Market System, (Eds). CIAT. Vol. 377, CIAT Publication: Colombia: 15-28.

17. Chellappan P, Masona MV, Vanitharani R, Taylor NJ, Fauquet CM (2004)

Broad spectrum resistance to ssDNA viruses associated with transgene-

induced gene silencing in cassava. Plant Mol. Biol. 56: 601–611.

18. Chetty C C, Rossin C B, Gruissem W, Vanderschuren H, Rey M (2013)

Empowering biotechnology in southern Africa: establishment of a

robust transformation platform for the production of transgenic industry-

preferred cassava. N. Biotechnol. 30: 136–143.

139

19. Cline J, Braman JC and Hogrefe HH (1996) PCR fidelity of Pfu DNA

polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucl. Acid Res. 24:3546–

3551.

20. Danso EK, Elegba W, Oduro V, Kpentey P (2010) Comparative study

of 2,4-D and picloram on friable embryogenic calli and somatic embryos

development in cassava (Malihot esculenta Crantz). IGIB10(2): 94-100.

21. D'Hulst & Mérida (2010) The priming of storage glucan synthesis current

knowledge and new developments. New Phytol 188:13-21.

22. Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà

(2011) Cây xoan ta (Melia azdazach L.) chuyển gen mã hoá gibberellin 20 –

oxidase bằng A. Tumefaciens. Tạp chí Công nghệ sinh học 9(2): 217 – 222.

23. Đỗ Xuân Đồng, Đỗ Hải Lan, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình,

Chu Hoàng Hà (2012) Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây sắn (Manihot

esculenta Crantz) thông qua phôi soma từ đỉnh chồi, Tạp chí Công nghệ sinh

học 10 (3): 527 – 533.

24. Đoàn Thị Phương Thùy và Bùi Trang Việt (2006) Tìm hiểu sự phát sinh

phôi thể hệ từ mô sẹo có nguồn gốc lá khoai mì (Manihot esculenta

Crantz.) dòng cuống trầu. Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số1: 19- 23.

25. Eliana Gaitán-Solís, Nigel Taylor, Dimuth Siritunga, William Stevens,

Daniel Schachtman (2015) Overexpression of the transporters AtZIP1and

AtMTP1in cassava changes zinc accumulation and partitioning. Front. Plant

Sci. 6:492. doi: 10.3389

26. Feitosa T, Bastos JLP, Ponte FA, Juca TL, Campos FAP (2007) Somatic

Embryogenesis in Cassava Genotypes from the Northeast of Brazil

Terezinha Feitosa. Brazilian Archieves Biol Teachnol 50 (2): 201 – 206.

27. Flipse E, Huisman JG, de Vries BJ, Bergervoet JE, Jacobsen E, Visser RG

(1994) Expression of a wild-type GBSS gene introduced into an amylose-

free potato mutant by Agrobacterium tumefaciens and the inheritance of the

inserts at the microsporic level. Theor Appl Genet. 1994 Jun; 88(3-4):369-75.

140

28. Fujita N & Taira T (1998) A56-kda protein in a novel granucle- bound starch

synthase existing in the pericarps, aleurone layer and embryos of immature

seed in diploid wheat (Triticum monococcum L.) Planta 207, 125 -132.

29. Gámez-Arjona F M, Li J, Raynaud S, Baroja-Femandez E, Munc (2011)

Enhancing the expression of starch synthase class IV leves of borth transitory

and long - term storage starch. Plant Biotec: 1049 - 1060.

30. Garvel NJ, Jarret RL (1991) A modified CTAB DNA extraction procedure

for Muss and Lpomoea. Plant Mol Biol Rep 9: 262-266.

31. Geigenberger P (2011) Regulation of starch biosynthesis in response to a

fluctuating enviroment. Plant physiology 15: 1566 - 1577.

32. Gonzalez AE, Scho¨pke C, Taylor NJ, Beachy RN, Fauquet CM (1998)

Regeneration of transgenic cassava plants (Manihot esculenta Crantz)

through Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic suspension

cultures. Plant Cell. Rep 17:827–831

33. Groll J, Mycock DJ, Gray VM, Laminski S (2001) Secondary somatic

embryogenesis of cassava on picloram supplemented Media. Plant Cell Tiss

Org Cult 65: 201-210.

34. Hoang Kim, Nguyen Van Bo, Hoang Long, Nguyen Trong Hien, Hernan

Ceballos and Reinhardt Howeler (2010) Current situation of cassava in

Vietnam. In CIAT (R.H Howeler editor) A New Future for Cassava in Asia:

Its Use as Food, Feed and Fuel to Benefit the Poor, 8th Asian Cassava

Research Workshop October 20-24, 2008 in Vientiane, Lao PDR: 100-112.

35. Hoàng Kim, Nguyễn Đăng Mãi (biên tập) (2011) Sắn Việt Nam: Hiện trạng,

định hướng và giải pháp phát triển những năm đầu thế kỷ 21. Thông tin về

hội thảo sắn Việt Nam lần thứ 10 tại thành phố Hồ Chí Minh ngày 13 -

14/3/2011. Nhà xuất bản Nông nghiệp (chi nhánh phía Nam), 230 trang (sách

chuyên khảo)

141

36. Hobbs S, Kpodar P, Delong CMO (1990) The effect of T-DNA copy

number, position and methylation on reporter gene expression in tobacco

transformants. Plant Molecular Biology 15: 851–864.

37. Hostettler CE (2014) Investigation of starch metabolism in Cassava (Manihot

esculenta Crantz). Dissertation. Swiss Federal Institute of Technology.

38. Hennen-Bierwagen TA, Lin Q, Grimaud F (2008) Starch biosynthenic

enzymes from develop Zea mays endosperm associate in multisubunit

complexes. Plant Physiol 146:1892 – 1908.

39. Ihemere U, Arias-Garzon D, Lawrence S, Sayre R (2006) Genetic modiﬁcation of

cassava for en- hanced starch production. Plant Biotechnol J 4: 453-65.

40. Jørgensen K, Bak S, Busk PK, Sørensen C, Olsen CE, PuontiKaerlas J,

Møller BL (2005) Cassava plants with a depleted cyanogenic glucoside

content in leaves and tubers. Distribution of cyanogenic glucosides, their site

of synthesis and transport, and blockage of the biosynthesis by RNA

interference technology. Plant Physiol. 139: 363–374

41. Kartha K K, Gamborg O L, Constanbel F (1973) Regeneration of cassava

plant from apical meristems. Plant Science Letter: 107 – 113.

42. Keeling PL, Wood JR, Tyson RH, Bridges IG (1998) Starch biosynthesis in

developing wheat grain: evidence against the direct involvement of triose

phosphates in the metabolic path- way. Plant Physiol 1998; 87:311-9.

43. Koehorst-van Putten H, Sudarmonowati H, Herman M, Pereira- Bertram I,

Wolters A, Meima H, Vetten N, Raemakers C and Visser R (2012) "Field

testing and exploitation of genetically modified cassava with low-amylose or

amylose-free starch in Indonesia". Transgenic Research, 21(1): 39-50.

44. Kone M, Oumar D, Behnam K and Vincent N (2015) Somatic

embryogenesis and plant regeneration of cassava (Manihot esculenta Crantz)

landraces from Cameroon. SpringerPlus 2015: 457:477

45. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển (2005) Cây

thuốc lá, lúa, cải ngọt, Paulownia mang gen kháng sâu đơn cryIA(b), cryIA(c) và

142

gen kháng sâu lai cryIA (b), cryIB kháng được một số loài sâu thuộc họ cánh

vảy. Tuyển tập báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc “Công nghệ sinh học

trong nghiên cứu cơ bản”, ĐH Nông nghiệp I, Hà Nội: 201 – 204.

46. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997) Công nghệ sinh học thực

vật trong cái tiến giống cây trồng. Giáo trình cao học nông nghiệp, NXB NN.

47. Legg JP and Fauquet CM (2004) Cassava mosaic geminiviruses in Africa.

Plant Mol. Biol. 56: 585- 599.

48. Li Ning, Zhang Shujuan, Zhao Yajie, Li Bei, Zhang Juren (2011) Over-

expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in

transgenic maize. Planta (2011): 241–250.

49. Li HQ, Sautter C, Potrykus I, Puonti-Kaerlas J (1996) Genetic transformation

of cassava (Manihot esculenta Crantz) Nat. Biotechnol. 14: 126 -138

50. Liu J, Zheng Q, Ma Q, Gadidasu K K, Zhang P (2011) Cassava genetic

transformation and its application in breeding. J. Integr. Plant Biol. 53: 552–569.

51. Malinova I, Steup M, Fettk J (2013) Carbon transitions from either Calvin

cycle or transitory starch to heteroglycans as revealed by14C-labeling

experiments using protoplasts from Arabidopsis. Physiol Plant. (2013)149:

25–44.

52. Maqbool SB & Christou P (1999): Multiple traits of agronomic importance

in transgenic indica rice plants: analysis of transgene integration patterns,

expression evels and stability. Molecular Breeding 5: 471–480.

53. Matilda C T, Marylin P, Kuan J L, Christopher M. H, Regina F, Simona E,

John E L, Samuel C Z, Alison M S (2013) Starch synthase 4 is essential for

coordination of starch granule formation with chloroplast division during

Arabidopsis leaf expansion. New Phytologist (2013) 200: 1064-1075.

54. Mendoza MG & Kaeppler HF (2002) Auxin and sugar effects on callus

induction and plant regeneration frequencies from mature embryos of Wheat

(Triticum aestivum). In vitro Cell. Dev. Biol. 38: 39-45.

143

55. Mu G, Chang N, Xiang K, Sheng Y, Zhang Z, Pan G (2012) Genetic

transformation of Maize female inflowing floral dip method mediated by

Agrobacterium . Biotechnol 11 (3): 178 – 183.

56. Munyikwa T, Langeveld S, Salehuzzaman S, Jacobsen E and Visser R(1998)

Cassava starch biosynthesis: new avenues for modifying starch quantity and

quality. Euphytica 96: 65-75.

57. Munyikwa T, Kreuze J, Fregene M, Suurs L, Jacobsen E, Visser R (2001)

Isolation and characterisation of cDNAs encoding the large and small

subunits of ADP-glucose pyrophosphorylase from cassava (Manihot

esculenta Crantz). Euphitica. June 2001, Volume 120, Issue 1: 71–83.

58. Nguyễn Đức Thành (2003) Chuyển gen thực vật. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà

Nội.

59. Nguyễn Hữu Hỷ, Đinh Văn Cường, Phạm Thị Nhạn, Nguyễn Trọng Hiển,

Nguyễn Viết Hưng (2012) Một số kết quả nghiên cứu sắn giai đoạn 2007 –

2012. Viện KH Kỹ thuật Nông Nghiệp Miền Nam.

60. Nguyễn Thị Thuý Hằng, Hoàng Thị Nga, Trương Thị Hoà, Nguyễn Phùng

Hà (2011) Kết quả đánh giá tập đoàn sắn tại ngân hàng gen cây trồng quốc

gia năm 2010 – 2011. Viện KHNN Việt Nam.

61. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2010) Khả

năng tái sinh và biến nạp thông qua nách lá mầm của 2 giống đậu tương

(Glycine max L.) DT12 và DT84 bằng Agrobacterium. Tạp chí Công nghệ Sinh

học 8(3B): 1305-1310.

62. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lê Tiến Dũng, Tống Thị Hường, Lê

Thị Ngọc Quỳnh, Lê Thị Lý, Vũ Anh Thu, Vũ Hoàng Nam, Vũ Thế Hà, Lê

Huy Hàm, Chikako Utsumin, Yoshinori Utsumin, Motoaki Seki (2014) Kết

quả tạo mô sẹo phôi hoá phục vụ cho chuyển gen vào cây sắn, Tạp chí Nông

nghiệp và phát triển nông thôn, 8(1): 29 – 35.

63. Nyaboga EN, Njiru JM, Tripathi L (2015) Factors influencing somatic

embryogenesis, regeneration, and Agrobacterium - mediated transformation of

144

cassava (Manihot esculenta Crantz) cultivar TME14. Front Plant Sci 6: 411.

64. Nyaboga E, Njiru J, Nguu E, Gruissem W, Vanderschuren H, Tripathi L

(2013) Unlocking the potential of tropical root crop biotechnology in east

Africa by establishing a genetic transformation platform for local farmer-

preferred cassava cultivars. Front. Plant Sci. 4:526. doi: 10.3389.

65. Oliveira RGA, Carvalho MJL, Nutti RM, Carvalho LVJ, Fukuda WG (2010)

“Assessment and degradation study of total carotenoid and ß-carotene in

bitter yellow cassava (Manihot esculenta Crantz) varieties”. African Journal

of Food Science. 4(4): 148–155.

66. Opabode JT, Ajibola OV, Oyelakin OO, Akinyemiju OA (2015) Somatic

embryo‐ genesis and genetic uniformity of regenerated cassava plants from

low‐temperature preserved secondary somatic cotyledons. Biotech. 96:

246 ‐258

67. Opabode JT, Oyelakin OO, Akinyemiju OA, Ingelbrecht IL (2014) Influence

of type and age of primary somatic embryo on secondary and cyclic somatic

embryogenesis of cassava (Manihot esculenta Crantz). British Biotech. J. 4:

254‐269.

68. Opabode JT, Ajibola OV, Oyelakin OO, Akinyemiju OA (2016) Somatic

Embryogenesis and Genetic Uniformity of Cassava Plants Regenerated from

Secondary Somatic Cotyledons Preserved in Osmotic Agents. Plant Tissue

Cult. & Biotech. 26(1): 47‐54.

69. Patil BL, Ogwok E, Wagaba H, Mohammed IU, Yadav JS, Bagewadi B,

Taylor NJ, Kreuze JF, Maruthi MN, Alicai T, Fauquet CM (2011) RNAi-

mediated resistance to diverse isolates belonging to two virus species

involved in cassava brown streak disease. Mol. Plant Pathol. 12(1), 31–41

70. Phạm Bích Ngọc (2016) Khai thác và phân lập nguồn gen có sẵn của tập

đoàn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển các giống sắn có khả năng chống

chịu bệnh và năng suất cao bằng công nghệ gen. Báo cáo tổng kết đề tài cấp

nhà nước. Viện Công nghệ sinh học.

145

71. Pham Bich Ngoc, Vu Thi Lan, Tran Thu Trang, Nguyen Thi Hoai Thuong,

Le Thu Ngoc, Chu Hoang Hà, Le Tran Binh (2015) Agrobacerium-mediated

transformation of cry8Db gene in VietNam sweet potato cultivalr. Jonral of

Life Science 9:262-271

72. Phạm Thị Nhạn, Nguyễn Hữu Hỷ (2015) Nghiên cứu chọn tạo giống sắn

bằng phương pháp xử lý đột biến. Viện KHNN Việt Nam.

73. Phan Thị Thu Hiền, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2015) Quy trình

chuyển gen hiệu quả vào phôi soma của giống mía ROC22 (Saccharum

officinarum L.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí

Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 31, Số 4S

(2015): 108 - 125.

74. Phan Trọng Hoàng, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2005) Sử

dụng enzyme Xcml để thiết kế vector pBI phục vụ tách dòng và đọc trình tự

gen. Tạp chí CNSH 3:459 - 463.

75. Preeti Kaur and Kothari S (2004) In vitro culture of kodo millet: inﬂuence of

2,4-D and picloram incombination with kinetin on callus initiation and

regeneration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 77:73–79.

76. Quách Vũ Quỳnh Hương, Nguyễn Đức Doanh, Nhữ Viết Cường, Hoàng Thị

Ngát, Lê Thị Ánh Hồng (2006) Một số kết quả về chuyển gen kháng nấm

Chitinase gluconase vào cây sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn. 20: 41 – 44.

77. Raemakers CJJM, Sofiari E, Taylor N, Henshaw G, Jacobsen E, Visser RGF

(1996) Production of transgenic cassava (Manihot esculenta Cantz) plants

by particle bombardment using luciferase activity as selection marker. Mol.

Breed. 7, 339–349.

78. Raemakers K, Schreuder M, Munyikwa T, Jacobsen E and Visser R (2001)

"Progress made in FEC transformation of cassava", Euphytica, 120(1):15-24.

79. Raemakers K, Schreuder M, Suurs L, Furrer-Verhorst H, Vincken J- P, de

Vetten N, Jacobsen E, Visser RGF (2005) Improved cassava starch by antisense

146

inhibition of granule-bound starch synthase I. Mol. Breed. 16: 163-172.

80. Rogers D (1965) Some botanical and ethnological consideration of Manihot

esculenta. Ecomomic Botany 19 (4): 369 – 377.

81. Rogers D and Appan S (1973) FloriaNeotropia. Monography No.13 Manihot

Manihotoides (Euphorbiaceac). Hafner Press New York.

82. Roldan I, Wattebled F, Mercedes Lucas M, Delvalle D, Planchot V, Jimenez

S, Perez R, Ball S, Christophe D’Huls, A ngel M (2007) The phenotype of

soluble starch synthase IV defective mutants of Arabidopsis thaliana

suggests a novel function of elongation enzymes in the control of starch

granule formation. The plant journal 49: 492 - 504.

83. Rupinder Kaur and Manish Kapoor (2015) Plant Regeneration Through

Somatic Embryogenesis in Sugarcane. Sugar Tech DOI 10.1007/s12355-

015-0380-3.

84. Rupinder Kaur and Manish Kapoor (2017) In Vitro direct plant regeneration

using shoot tip explants in sugarcane (Saccharum officinarum L.) for rapid

mass cloning. Agric. Sci. Digest., 37(2) 2017: 94-99

85. Sayre R, Beeching J, Cahoon E, Egesi C, Fauquet C, Fellman J, Fregene M,

Gruissem W, Mallowa S, Manary M, MaziyaDixon B, Mbanaso A,

Schachtman DP, Siritunga D, Taylor N, Vanderschuren H, Zhang P (2011)

The BioCassava Plus Program: Biofortification of cassava for sub-Saharan

Africa. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 251–272.

86. Schopke C, Taylor N, Carcamo R, Konan N, Marmey P, Henshaw G,

Beachy R and Fauquet C (1996) Regeneration of transgenic cassava plants

(Manihot esculenta Crantz) from microbombarded embryogenic suspension

cultures. Nature Biotech. 14: 731–735.

87. Shewmaker F, Kryndushkin D, Chen B, Tycko R, Wickner RB (2009). Two

prion variants of Sup35p have in-register β-sheet structures, independent of

hydration. Biochemistry. 48:5074–5082.

147

88. Siritunga D & Sayre RT (2003) Generation of cyanogen-free transgenic

cassava. Planta 217: 367–373.

89. Siritunga D & Sayre RT (2004) Engineering cyanogen synthesis and

turnover in cassava (Manihot esculenta). Plant Mol. Biol. 56: 661- 669.

90. Subasinghe RM (2013) Role and regulation of starch phosphorylase and

starch synthase IV in starch biosynthesis in maize endosperm amyloplasts.

Dissertation. The University of Guelph, Canada.

91. Szydlowski N, Ragel P, Raynaud S, Roldán I, Montero M, Lucas MM

(2009) Starch granule initiation in Arabidopsis requires the presence of

either class IV or class III starch synthase. Plant Cell 21: 2443-57.

92. Taylor N, Chavarriaga P, Raemakers K, Siritunga D, Zhang P (2004)

Development and application of transgenic technologies in cassava.

Plant Mol Biol 56:671–688.

93. Taylor N, Edwards M, Kiernan R, Davey C, Blakesley D and Henshaw G.

(1996) Development of friable embryo genic callus and embryogenic

suspension cultures in cassava (Manihot esculenta Crantz). Nature Biotech.

14: 726–730.

94. Taylor NJ, Gaitán‐Solís E, Moll T, Trauterman B, Jones T, Pranjal A,

Trembley C, Abernathy V, Corbin D, Fauquet CM. (2012). A

high‐throughput platform for the production and analysis of transgenic

cassava (Manihot esculenta) plants. Tropical Plant Biology 5: 127–139.

95. Tống Thị Hường, Vũ Anh Thu, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Văn Đồng (2017)

Kết quả tạo mô sẹo phôi hóa của giống sắn KM 140. Tạp chí NN và PTNN,

chuyên đề giống cây trồng vật nuôi, tập 2: 12/2017: 61 – 66.

96. Trần Công Khanh, Hoàng Kim, Võ Văn Tuấn, Nguyễn Hữu Kỷ, Phạm Văn

Biên, Đào Huy Chiên, Reinhardt Howeler và Hernan Ceballos (2008) Kết

quả chọn tạo và phát triển giống sắn KM140. Tạp chí KHKTNLN. Trường

Đại học Nông Lâm TPHCM, số 1 & 2: 65-71.

97. Trần Ngọc Ngoạn (2007) Cây sắn, NXB Nông nghiệp, HN.

148

98. Tribadi, Suranto & Sajidan (2010) "Variation of morphological and protein

pattern of cassava (Manihot esculenta) varieties of Adira1 and Cabak makao

in Ngawi, East Java ". Bioscience, 2(1): 14-22.

99. Vrinten PL & Nakamura T (2000) Wheat granule-bound starch synthase I

and II are encoded by separate genes that are expressed in different tissues.

Plant Physiology 122: 255–264.

100. Vũ Thị Lan, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2015) Nghiên

cứu tái sinh chồi trực tiếp từ cuống lá và mảnh lá của giống khoai lang

Chiêm Dâu và KB1. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, ĐH QGHN, 31(4S):

177 – 184.

101. Vu Thi Lan, Tran Thu Trang, Nguyen Thi Hoai Thuong, Le Thu Ngoc,

Pham Bich Ngoc, Chu Hoang Ha, Le Tran Binh (2015) Development of

embryogenic regeneration system and its successful utilization for

Agrobacterium-mediated transformation of cry8Db gene into selected

cultivated sweet potato (Ipomoea batatas L.) of Vietnam. Bio – Asia 2015

Conference, 20 – 22 May 2015 @ MaxtriBiopolis, Singapore:49.

102. Vũ Văn Kiên, Nguyễn Du Sanh (2011) Khảo sát sự phát sinh phôi thể hệ ở

khoai mì. Tạp chí Phát triển KH & CN. Tập 14, Số 3.

103. Wattebled F, Planchot V, Dong Y, Szydlowski N, Pontoire B (2008)

Further evidence for the mandatory nature of polysaccharide debranching for

the aggregation of semicrystalline starch and for overlapping functions of

debranching enzymes in Arabidopsis leaves. Plant Physiol. 148:1309-23.

104. White WLB, Arias-Garzon DI, McMahon JM, Sayre RT (1998)

Cayanogenesis in cassava: The role of hydroxynitrile lyase in root cyanide

production. Plant Physiol. 116: 1219–1225.

105. Yang X, Li F, Zhang X, Liu K, Wang Q, Zhang C, Liu C, Zhu W, Shan G,

Chin CK, Fang W (2013) Integration and characterization of T-DNA

insertion in upland cotton. Czech J Genet Plant Breed 49(2): 51-57.

149

106. You-Zhi Li, Jian-Yu Zhao, San-Min Wu, Xian-Wei Fan, Xing-Lu Luo &

Bao-Shan Chen (2016) Characters related to higher starch accumulation in

cassava storage roots. Scientificreports. Dol:10:1038

107. Zainuddin I, Schlegel K, Gruissem W and Vanderschuren H (2012) Robust

transformation procedure for the production of transgenic farmer-preferred

cassava cultivars. Plant Methods 8:24. doi: 10.1186/1746-4811-8-24.

108. Zeeman & Samuel C (2010) Starch: Its Metabolism, Evolution, and

Biotechnological Modification in Plants. Annual Review of Plant Biology 61(1).

109. Zhang P & Puonti-Kaerlas J (2000) PIG-mediated cassava transformation

using positive and negative selection. Plant Cell Rep. 19: 1041–1048.

110. Zhang P, Bohl-Zenger S, Puonti-Kaerlas J, Potrykus I, Gruissem W (2003)

Two cassava promoters related to vascular expression and storage root

formation. Planta 218(2):192-203.

111. Zhang P, Jaynes JM, Potrykus I, Gruissem W, Puonti-Kaerlas J (2003)

Transfer and expression of an artificial storage protein (ASP1) gene in

cassava (Manihot esculenta Crantz). Transgenic Res. 12, 243-250.

112. Zhang P, Wang WQ, Zhang GL, Kaminek M, Dobrev P, Xu J, Gruissem W

(2010) Senescence-inducible expression of isopentenyl transferase extends

leaf life, increases drought stress resistance and alters cytokinin metabolism

in cassava. Plant Biol. 52: 653–669.

113. Zhang Y & Seidel DJ (2011) Challenges in estimating trends in Arctic

surface-based inversions from radiosonde data.Geophys. Res.

Lett.,38,L17806, doi:10.1029.

114. Zhao & Shan-Shan (2011) Development of waxy cassava with different

Biological and physico-chemical characteristics of starches for industrial

applications. Biotechnology and Bioengineering.

PHỤ LỤC 1

Danh sách và các đặc điểm nông sinh học của các giống sắn thu thập được tại Hưng Lộc, Đồng Nai

Stt Tên giống

Đặc điểm của cây

Màu sắc thịt củ

Tỉ lệ chất khô (%)

Năng suất củ tươi (tấn/ha)

Chiều cao cây (cm)

Thời gian thu hoạch (ngày)

Hàm lượng Tinh bột (%)

KM104-7

15.2

29.67

30.5

Thẳng, nhánh vừa

257

230

Trắng

Trắng HB

15.2

29.67

13.25

Thẳng, 0 nhánh

296

240

Trắng

KM104

17.4

31.32

Thẳng, nhánh ít

275

245

Vàng

KM308-3

18.1

31.84

Thẳng, 0 nhánh

318

245

Vàng

KM241

18.5

32.15

Thẳng, nhánh vừa

357

265

Trắng

KM244

18.6

32.22

Thẳng, nhánh vừa

301

268

Trắng

KM306-3

18.6

32.22

Thẳng, 0 nhánh

291

230

Trắng

KM163

18.7

32.3

Cong, nhánh ít

280

267

Trắng

KM225

18.8

32.37

33.75

Thẳng, 0 nhánh

282

240

Trắng

10 KM28

32.52

19.5

Thẳng, nhánh vừa

295

270

Trắng

11 KM292-2

19.3

32.75

24.25

Thấp xấu, 0 nhánh

321

230

Vàng

12 KM311-1

19.3

32.75

Thẳng, 0 nhánh

302

280

Vàng

13 KM54

19.3

32.75

20.5

Nhánh nhiều

205

279

Trắng

14 KM240

19.5

32.9

Thẳng, nhánh vừa

297

264

Trắng

15 KM276

19.5

32.9

Nhánh

398

257

Trắng

16 KM209-1

19.6

32.97

Thẳng, 0 nhánh

327

240

Trắng

17 KM295

19.6

32.97

21.25

Thẳng, nhánh vừa

332

230

Vàng

18 KM309-1

19.8

33.12

Thẳng, 0 nhánh

329

260

Trắng

19 KM309-5

19.8

33.12

Thẳng, 0 nhánh

310

280

Trắng

20 KM270

33.27

46.5

Thẳng, nhánh cao

373

240

Trắng

21 KM272

33.27

18.25

Đổ ngã, nhánh vừa

246

385

Trắng

22 KM263

20.1

33.35

16.5

Thẳng, 0 nhánh

327

240

Trắng

23 KM95

20.1

33.35

29.5

Nhánh nhiều

250

210

Trắng

150

24 KM258-1

20.2

33.42

22.5

Thẳng, 0 nhánh

350

252

Trắng

25 KM256

20.3

33.5

30.5

Thẳng, nhánh vừa

322

245

Trắng

26 KM269

20.3

33.5

20.25

Thẳng, nhánh vừa

307

245

Trắng

27 KM292-1

20.5

33.65

40.75

Thẳng, 0 nhánh

316

245

Trắng

28 KM307-1

20.5

33.65

Nhánh, xấu

283

240

Trắng

29 KM308-5

20.5

33.65

Thẳng, 0 nhánh

230

294

Trắng

30 KM309-4

20.6

33.72

20.5

Thẳng, 0 nhánh

347

275

Vàng

31 KM47

20.6

33.72

Thẳng, nhánh vừa

288

312

Trắng

32 KM111

20.7

33.8

24.5

Thẳng, nhánh cao

257

240

Vàng

33 KM277

34.02

Thẳng, 0 nhánh

405

240

Trắng

34 KM279-2

34.02

34.5

Thẳng, 0 nhánh

360

230

Trắng

35 KM302-7

34.02

20.5

Thẳng, 0 nhánh

299

265

Trắng

36 KM309-11

34.02

15.5

Thẳng, nhánh vừa

264

247

Trắng

37 KM227

21.2

34.17

Thẳng, 0 nhánh

230

240

Trắng

38 KM267

21.2

34.17

22.75

Thẳng, nhánh vừa

291

240

Trắng

39 KM300-3

21.2

34.17

27.5

Đỗ ngã, 0 nhánh

387

230

Trắng

40 KM302-9

21.2

34.17

23.75

Thẳng, 0 nhánh

314

240

Vàng

41 KM308-1

21.2

34.17

16.75

Thẳng, nhánh vừa

290

255

Vàng

42 KM250-1

21.3

34.25

25.25

Thẳng, nhánh vừa

258

247

Trắng

43 KM303-1

21.3

34.25

18.75

Cong, nhánh vừa

367

248

Vàng

44 KM308-9

21.3

34.25

20.75

Thẳng, nhánh vừa

243

250

Vàng

45 KM54

21.3

34.25

39.5

Cao, nhánh nhiều

373

258

Trắng

46 KM287-2

21.4

34.32

43.25

Thẳng, cao

407

235

Trắng

47 KM289-5

21.4

34.32

40.25

Thẳng, 0 nhánh

343

235

Trắng

48 KM309-3

21.4

34.32

47.5

Thẳng, nhánh vừa

290

277

Vàng

49 KM311-7

21.4

34.32

Thẳng, nhánh cao

286

262

Vàng

Sắn miền nam

21.4

18.8

343

51 KM252

21.5

34.4

24.5

Thẳng, nhánh vừa

373

210

Trắng

52 KM278-2

21.5

34.4

71.25

Thẳng, nhánh vừa

405

245

Trắng

151

403

53 KM299-2

21.5

34.4

24.5

Đổ ngã, thẳng cao

230

Trắng

388

54 KM63-1

21.5

34.4

Thẳng, 0 nhánh

270

Trắng

385

55 KM303-3

21.7

34.55

12.75

Cong, nhánh vừa

245

Trắng

313

56 KM309-9

21.7

34.55

35.5

Thẳng, 0 nhánh

248

Trắng

292

57 KM52

21.7

34.55

18.25

Nhánh nhiều

255

Trắng

244

58 KM308-7

21.9

34.7

Thẳng, nhánh vừa

255

Vàng

337

59 KM61

21.9

34.7

22.5

Thẳng, 0 nhánh

264

Vàng

310

60 KM257

34.77

23.5

Thẳng, nhánh vừa

245

Trắng

266

61 KM261

34.77

Thẳng, nhánh vừa

235

Trắng

272

62 KM278-1

34.77

19.5

Thẳng, 0 nhánh

245

Trắng

257

63 KM254-2

22.1

34.85

Thẳng, nhánh vừa

230

Trắng

312

64 KM306-5

22.1

34.85

Thẳng, 0 nhánh

240

Vàng

272

65 KM309-7

22.2

34.92

33.5

Thẳng, 0 nhánh

256

Trắng

390

66 KM283

22.4

35.07

46.25

Thẳng, nhánh vừa

245

Vàng

242

67 KM308-8

22.4

35.07

Nhánh, xấu

292

Vàng

300

68 KM312-2

22.4

35.07

Thẳng, nhánh cao

265

Trắng

269

69 KM314-10

22.4

35.07

20.5

Nhánh, cây xấu

290

Trắng

307

70 KM02-2

22.5

35.15

29,5

Thấp xấu. nhánh

220

Trắng

412

71 KM297-6

22.5

35.15

Thẳng, nhánh vừa

240

Trắng

307

72 KM314-3

22.5

35.15

17.25

Thẳng, 0 nhánh

330

Trắng

241

73 KM46

22.5

35.15

21.5

Thẳng, nhánh ít

289

Trắng

74 KM 297

22.9

38.8

22.5

256.8

280

339

75 KM304-2

22.9

35.45

27.5

Thẳng, nhánh cao

240

Vàng

335

Sắn dù

22.9

23.8

309

77 KM302-11

35.52

40.75

Thẳng, 0 nhánh

240

Trắng

281

78 KM316-2

35.52

Thẳng, nhánh vừa

327

Trắng

375

79 KM317-3

35.52

21.5

Cao, nhánh nhiều

321

Trắng

257

80 KM60

35.52

Thẳng, nhánh cao

240

Trắng

355

LC 2

39.9

152

234

82 KM307-4

23.1

35.6

Thẳng, 0 nhánh

262

Vàng

292

83 KM310-2

23.1

35.6

22.5

Nhánh nhiều

280

Trắng

257

84 KM258-2

23.2

35.67

22.5

Thẳng, 0 nhánh

254

Trắng

353

85 KM315-2

23.2

35.67

Cao, nhánh nhiều

281

Trắng

346

86 KM318-3

23.2

35.67

Cong, 0 nhánh

314

Trắng

324

87 KM314-1

23.3

35.75

Nhánh nhiều

240

Trắng

347

88 KM314-1

23.3

35.75

0 nhánh, cây xấu

315

Trắng

251

89 KM143

23.4

35.82

24.25

Thẳng, nhánh cao

254

Trắng

308

90 KM246-2

23.4

35.82

Thẳng, nhánh vừa

270

Trắng

297

91 KM30

23.4

35.82

21.75

Thẳng, 0 nhánh

245

Vàng

352

92 KM304-1

23.4

35.82

17.25

Thẳng, 0 nhánh

230

Trắng

274

93 KM248

23.5

35.9

Thẳng, nhánh vừa

270

Trắng

94 KM298-3

23.5

35.9

26.75

Thẳng cao, 0 nhánh

245

Vàng

400

323

95 KM305-1

23.5

35.9

Thẳng, nhánh vừa

245

Trắng

314

96 KM308-2

23.5

35.9

32.75

Thẳng, nhánh vừa

240

Trắng

257

97 KM315-5

23.5

35.9

Thẳng, nhánh vừa

328

Trắng

367

98 KM299-1

23.7

36.05

24.75

Thẳng, nhánh cao

240

Vàng

307

99 KM301-9

23.7

36.05

26.75

Thẳng, nhánh vừa

249

Vàng

336

100 KM305-2

23.7

36.05

31.5

Thẳng, nhánh vừa

240

Trắng

312

101 KM297-5

23.8

36.13

17.25

Thẳng, nhánh vừa

245

Trắng

404

102 KM63-2

23.8

36.13

20.75

Thẳng, nhánh vừa

248

Trắng

284

103 Hòa Mãn 911

36.7

334

104 KM288

36.28

Thẳng, nhánh cao

210

Trắng

323

105 KM306-4

36.28

26.5

Thẳng đẹp,0 nhánh

240

Vàng

354

106 KM318-2

36.28

24.5

Cao, nhánh vừa

316

Trắng

282

107 KM98-1

36.28

21.25

Thẳng, nhánh cao

254

Vàng

292

108 KM98-1

36.28

37.5

Thẳng, nhánh thấp

230

Trắng

308

109 KM98-5

36.28

24,5

Thẳng, nhánh thấp

245

Trắng

110 DT1

24.1

37.8

377.5

153

111 GM 444-2

24.1

38.6

305

112 KM293

24.2

36.43

Thẳng, 0 nhánh

320

240

Trắng

113 KM298-2

24.2

36.43

Thẳng, nhánh vừa

298

274

Vàng

114 KM304-6

24.2

36.43

21.75

Thẳng, 0 nhánh

313

225

Vàng

115 KM309-6

24.2

36.43

Thẳng, nhánh cao

303

373

Trắng

116 KM315-3

24.2

36.43

Cao, 0 nhánh

423

280

Vàng

117 KM43

24.2

36.43

Thẳng, nhánh ít

254

310

Trắng

118 KM228

24.3

36.5

33.5

Thẳng, 0 nhánh

259

240

Trắng

119 KM229

24.3

36.5

32.75

Thẳng, 0 nhánh

315

240

Trắng

120 KM300-2

24.3

36.5

11.5

Hơi cong, nhánh

343

240

Vàng đậm

121 KM301-2

24.3

36.5

10.25

Thẳng, 0 nhánh

343

240

Trắng

122 KM307-2

24.3

36.5

23.75

Thẳng, 0 nhánh

342

240

Trắng

123 KM312-3

24.4

36.58

Nhánh nhiều

275

240

Trắng

124 KM316-1

24.4

36.58

Nhánh, xấu, đổ

394

316

Trắng

125 Sắn xanh

24.4

38.3

18.4

355

126 KM29

24.5

36.65

28.5

Thẳng, 0 nhánh

277

258

Vàng

127 KM294-4

24.5

36.65

Thẳng, nhánh vừa

429

235

Trắng

128 KM301-8

24.5

36.65

26.5

Thẳng, 0 nhánh

328

312

Vàng

129 KM308-4

24.5

36.65

Thẳng, 0 nhánh

320

250

Vàng

130 KM309-10

24.5

36.65

18.5

Thẳng, nhánh vừa

276

254

Trắng

276

131 KM310-6

24.5

36.65

Thẳng đẹp,0 nhánh

268

Trắng

313

132 KM312-4

24.5

36.65

Thẳng, 0 nhánh

265

Vàng

220

133 ORM 35.8

24.5

295

134 Thân đen

24.5

38.6

256

135 KM 35-1

24.6

36.73

Thấp, nhánh, xấu

248

Trắng

445

136 KM273-2

24.6

36.73

Đổ ngã, nhánh

249

Trắng

284

137 KM14-1

24.8

36.88

Thẳng, nhánh cao

264

Trắng

415

138 KM300-1

24.9

36.95

52.5

Hơi cong, nhánh

240

Vàng

251

139 HB 60

37.03

30.5

Thẳng. nhánh cao

254

Trắng

154

225

140 Hòa Mãn 125

37.4

269

Nhánh, xấu

245

Vàng

141 KM302-13

37.03

320

Thẳng, nhánh vừa

265

Vàng

142 KM7

37.03

265

143 LC 1

25.1

365

144 Chuối vàng

25.2

38.8

8.8

335

145 Nêu Co

25.2

36.9

337.5

146 Sắn trắng

25.2

36.9

367.5

25.2

36.9

147 Sắn trắng MN

214

148 DT3

25.3

39.6

317.5

149 HG 2

25.3

37.5

356

150 Rayong 5

25.3

37.25

35.7

Thẳng, nhánh cao

240

Trắng

281

151 KM297-4

25.4

37.33

Thẳng, nhánh ít

273

Vàng

258

152 KM308-10

25.4

37.33

15.25

Thẳng, nhánh vừa

265

Vàng

368

153 KM314-6

25.4

37.33

25.5

Thẳng, nhánh cao

310

Trắng

358

154 KM315-4

25.4

37.33

35.5

Cao, nhánh vừa

315

Trắng

349

155 KM5

25.4

37.33

5.5

Nhánh nhiều

272

Trắng

276

156 KM111-1

25.5

37.4

31.5

Thẳng, nhánh cao

248

Trắng

246

157 KM146

25.5

37.4

Thẳng, 0 nhánh

248

Trắng

320

158 Bún trắng

25.6

36.3

22.5

332

159 KM108

25.7

37.55

31.5

Thẳng, 0 nhánh

280

Vàng

313

160 KM264

25.7

37.55

Thẳng, nhánh vừa

260

Trắng

393

161 KM79

25.7

37.55

Thẳng, 0 nhánh

335

Trắng

162 Sắn đỏ Nghệ

25.7

37.3

18.4

341.5

325

163 KM313-2

25.9

37.7

24.5

Thẳng, 0 nhánh

316

Trắng

367

164 KM318-9

37.78

Thẳng, nhánh vừa

311

Vàng

340

165 KM 21-10

26.1

39.1

297

289

166 KM94

26.1

37.85

53.5

Cong, nhánh ở gốc

330

Trắng

340

167 SC 205

26.1

37.85

25.7

Thẳng, nhánh cao

311

Trắng

155

307

168 KM294-3

26.2

37.93

33.25

Thấp xấu, nhánh

220

Trắng

307

169 KM302-8

26.2

37.93

Thẳng, đẹp

240

Trắng

326

170 KM305-3

26.2

37.93

Thẳng, 0 nhánh

230

Trắng

386

171 KM313-7

26.2

37.93

28.75

Cao, nhánh, đổ

300

Trắng

341

172 KM314-8

26.2

37.93

42.5

Thẳng, nhánh cao

305

Trắng

280

173 HL03

26.3

Cong, nhánh ít

267

Trắng

330

174 Sắn nếp

26.3

37.2

370

175 KM285

26.4

38.08

16.75

Thẳng, 0 nhánh

235

Trắng

173

176 KM68

26.4

38.08

Nhánh, cây xấu

256

Trắng

267

177 KM948-5

26.4

37,65

15.5

Thẳng, 0 nhánh

318

Trắng

225

178 RAY ONG 2

26.4

36,2

24,0

179 SC 205

26.4

37.2

33.6

247.5

292

180 GM 155-7

26.5

39.6

429

181 KM05-1

26.5

38.15

Thẳng, nhánh vừa

235

Trắng

278

182 KM309-2

26.5

38.15

Thẳng, nhánh vừa

268

Vàng

387

183 KM315-1

26.5

38.15

51.5

Thẳng, nhánh cao

284

Trắng

229

184 KM42

26.5

38.15

42.5

Thẳng, nhánh cao

311

Trắng

26.7

36.7

26.7

337.5

185 TB-CCC-8 Sắn cần câu

275

186 KM289-3

26.9

38.45

19.25

Thẳng, nhánh vừa

245

Trắng

297

187 KM312-5

26.9

38.45

Xấu, nhánh

260

Trắng

416

188 KM73

26.9

38.45

14.5

Thẳng, 0 nhánh

318

Trắng

285

189 Sắn trắng

26.9

36.7

27.6

285

190 Sắn đổ

26.9

36.7

3.6

345

191 Chuối đỏ

38.6

22.5

246

192 HB 80

38.53

26.5

Thẳng, 0 nhánh

248

Trắng

285

193 KM140

35.97

50.5

Thẳng, 0 nhánh

240

Trắng

329

194 KM314-4

38.53

Thẳng cao, 0 nhánh

316

Trắng

388

195 KM318-5

38.53

35.5

Cong, nhánh vừa

312

Vàng

267

196 KM318-7

38.53

23.5

Thẳng, nhánh vừa

312

Trắng

156

197 Xanh Hà Bắc

37.5

20,0

193.5

198 Xanh Vĩnh phú

38.6

27.5

331.5

Thẳng, nhánh cao

264

Trắng

199 KM302-1

27.2

38.68

28.75

Thẳng, 0 nhánh

284

312

Vàng

200 KM311-2

27.2

38.68

Nhánh nhiều

250

270

Vàng

201 KM75

27.2

38.68

Thẳng, 0 nhánh

410

312

Trắng

202 HG 1

27.3

38.3

27.6

329

203 HB 80

27.3

38.8

220

300

204 Rayong 9

27.3

38.75

Thẳng, 0 nhánh

267

300

Trắng

205 KM308-6

27.4

38.83

Nhánh, xấu

267

294

Trắng

206 SM 305

27.4

38.83

Thẳng, nhánh ít

290

310

Trắng

207 HL23

27.5

38.08

16.5

Nhánh ở gốc, thẳng

210

283

Trắng

208 DT2

27.6

36.2

17.6

182.5

209 KM 325

27.6

38.6

192.5

210 HL 2003-14

27.7

35.5

16.8

320

211 Canh nông

27.8

35.5

345

212 Sắn Tuyên

27.8

39.1

275

Quang

27.8

39.7

353

213 Trắng Bắc Thái

214 KM 397

27.9

38.4

26.8

185

215 Chuối vàng

18.8

370

216 GON

35.6

17.8

Phân cành cao

Trắng

320

315

217 KM98-5

35.67

37.5

Thẳng, nhánh cao

Trắng

316

248

218 SA 06

28.1

39.6

Thẳng, 0 nhánh

Trắng

321

255

219 Sắn đỏ

28.2

40,0

18,0

283.5

220 TB-CCC-4

28.2

39.5

340

221 KM98-7

28.3

39.5

38.6

Nhánh nhiều

Trắng

405

310

382.5

264

222 KM 98-7

28.32

37.6

255

223 CM40.18.3

28.4

40.8

298.5

224 TB-CCC-2

28.4

39.5

Sắn nếp

157

225 KM313-4

28.5

39.65

Thẳng, 0 nhánh

321

Trắng

358

Nhánh ít, đổ

310

Trắng

226 KM316-4

28.5

39.65

336

Nhánh nhiều

310

Trắng

227 KM318-8

28.5

39.65

349

228 SM 232.10

28.5

40.6

315

229 HB 60

28.6

36.3

195

230 SM 25956.27

28.6

39.5

14.8

255

231 KM310-3

28.7

39.8

30.25

Thẳng, 0 nhánh

275

Trắng

306

263

232 OMR

28.7

40,1

28,8

39.43.27

28.7

39.7

30.8

335

233 Sắn đỏ miền nam

231

234 KM 140

28.9

39.5

315

235 SM 2938-20

28.9

40.8

227

236 RAY ONG 3

37.5

20.8

345

237 Sắn học viện

16.4

238 SM 2554.10

40.1

22.5

262.5

356

239 KM505

29.1

40.11

10.75

Nhánh nhiều

376

Trắng

365

240 KM 104-2

29.2

40.6

16.4

283.5

241 SM 1868.1

29.3

40.8

242 Sắn đỏ ĐF

29.5

41.1

281.5

Thẳng, 0 nhánh

255

Đỏ

283

243 SM937-26

29.5

40.41

Thẳng, 0 nhánh

252

Trắng

305

244 BT (60)

29.6

39.2

340

245 HL 2002-120

29.7

40.7

372.5

246 KM 108-2

29.7

40.2

289

247 SM 1561-2

29.7

37.5

19.6

282.5

248 KM 21-12

29.8

35.5

385

305

249 SM 2956.34

29.9

40.5

13.3

232.5

250 KM 94

27,6

38.3

30.4

335

158

PHỤ LỤC 2

Thông tin về các trình tự nucleotide của các gen/đoạn gen phân lập và đăng ký

ORIGIN

159

1. Starch synthase IV (SSIV) LOCUS KT033500 3224 bp mRNA linear PLN 18-NOV-2015 DEFINITION Manihot esculenta starch synthase IV (SSIV) mRNA, complete cds. ACCESSION KT033500 VERSION KT033500.1 GI:952183002 KEYWORDS . SOURCE Manihot esculenta (cassava) ORGANISM Manihot esculenta Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae; rosids; fabids; Malpighiales; Euphorbiaceae; Crotonoideae; Manihoteae; Manihot. REFERENCE 1 (bases 1 to 3224) AUTHORS Le,N.T., Nguyen,D.V., Nguyen,H.M., Nguyen,H.T.M., Pham,N.B. and Chu,H.H. TITLE Isolation and overexpression of cassava-derived starch synthase class IV for enhanced starch production in plant JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 3224) AUTHORS Le,N.T., Nguyen,D.V., Nguyen,H.M., Nguyen,H.T.M., Pham,N.B. and Chu,H.H. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (08-JUN-2015) Plant Cell Biotechnology, Institute of Biotechnology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi 1000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 1..3224 /organism="Manihot esculenta" /mol_type="mRNA" /db_xref="taxon:3983" 14gene 1..3224 /gene="SSIV" /note="SSIV" 14CDS 1..3186 /gene="SSIV" /codon_start=1 /product="starch synthase IV" /protein_id="ALN98281.1" /db_xref="GI:952183003" /translation="MASKLSTWFLSQGFTALNYNFDTNKQTATRFLLPSHRLLPASCK MRQRNLSSQHKRQQLKKASPEQPPNTVGFHSSGGGGGDDDIGDDDNDSETDSTAVHSV PSLNLDVESNEEVVDVSVDVEHAQHTGANDVERNVDMEHVQDVGAKDLYSLTQEMKTL GIDGAEKLSSIPDEMKPLVLNKDGGEQLSSFQLEDLIGMIRNAEKNILLLNQARVHAL EDLERILAEKEILQGEINVLEMKLAGTDARMKVAAQEKMHVELMEDQLGKLRNELAYR VGNQNKLLNEEAPLIQDSTIQNISEELNSLRAENTSLRTDIEALKRELSNVKDTDERV ITLEKECMQLESSVKDLESKLSVSQEDVSKLSSLKVECKDLWEKVGSLQALLDKATKQ ADQAILVLQQNRDLWKKVDKLEESLEEANIYKLSSEKLQQYNELMQQKIKLLEERLQR SDEEIYSYVQLYQESIQEFQDTLNTLKEESKKKALDEPVDDMPWQFWSHLLLMIDGWL LEKKLTLDDAKLLRDMVWKRERRIHDIYLECREKNEHEAVSMFLKLTSSPKSQGLYVV HIAAEMAPVAKVGGLGDVVTGLGKALQKRGHLVEIILPKYDCMQYDGIGNLRALDVVL ESYFDGKLYKNEVWVGTIEGLPVYFIEPHHPGKFFWRGQFYGEHDDFKRFSFFSRAAL ELLLQAGKKPDIIHCHDWQTAFVAPLYWDIYAPKGLNSARICFTCHNFEYQGSAPASE LASCGLDVQQLNRPDRMQDNSAHDRINPIKGAVVFSNIVTTVSPTYAQEVRTSEGGKG LHSTLNFHAKKFIGILNGIDTDVWNPATDTLLEVQYNANDLQGKAENKIATRQHLGLS TADARQPLVGCITRLVPQKGVHLIRHAIYRTLELGGQFLLLGSSPVAHIQREFEGIAN HFQNHEHIRLVLKYDESLAHSIYAASDMFIIPSIFEPCGLTQMIAMRYGSIPIARKTG GLNDSVLDVDDDTIPLQFRNGYTFLNPDEQGVNSALERAFNHYRNDPESWQQLVQKDM NIDFSWESSASQYEELYSKSVARARAAASRS"

1 atggcgtcga agctatcgac gtggtttctg agtcaagggt tcacagcttt gaactataat 61 tttgacacta ataagcagac agctacgcga ttcttattgc cttcccatcg attgcttcct 121 gcttcttgca aaatgcgaca gcgcaatttg agctctcagc ataagagaca gcagctcaag 181 aaagcctctc ctgaacaacc tccaaatacc gtaggttttc attcgagtgg tggtggtggt 241 ggtgatgatg atattggtga tgatgataat gattccgaaa ctgatagcac agcggtgcat 301 agtgtcccaa gcttgaatct tgatgttgag agtaatgagg aagtcgtcga tgttagcgta 361 gatgtggagc atgctcagca tacgggtgca aatgatgtgg agaggaatgt agatatggaa 421 catgttcaag atgttggtgc aaaagatttg tatagtctca cccaggaaat gaaaactttg 481 ggcatagatg gagcagagaa gctttctagt attcctgatg aaatgaaacc tttggtctta 541 aacaaagatg gtggagaaca actgtcaagc tttcaacttg aggatttgat aggcatgata 601 agaaatgctg agaaaaatat cctgcttctc aatcaagctc gggttcatgc acttgaagat 661 cttgaaagaa ttcttgcaga gaaggaaata ttacaaggag aaattaacgt tttagagatg 721 aaattggcag gaactgatgc aagaatgaaa gttgctgctc aagaaaagat gcatgtagaa 781 ctcatggaag accaattagg aaaactaaga aacgaactgg cttacagggt tgggaatcag 841 aacaaacttt tgaatgagga agcccccttg attcaggaca gcactattca gaacattagt 901 gaggagctca attcattgag ggcagagaat acatctctga ggactgatat agaagcactt 961 aagagggagc ttagtaatgt caaggataca gatgagcgtg ttataacact ggagaaagaa 1021 tgcatgcagt tggagtcttc tgtgaaagac ttggaatcca aactgtcagt ttctcaggaa 1081 gatgtttcaa aattgtctag cttgaaagtt gaatgtaaag acttgtggga aaaggtggga 1141 agtttgcaag cattgttaga taaggcaaca aagcaagcag atcaggctat tctagtgttg 1201 cagcaaaatc gagatctttg gaagaaggtt gataaattgg aagaatcctt ggaagaggcc 1261 aacatctata agttatcgtc agaaaagtta cagcagtata atgagctaat gcagcaaaag 1321 ataaaactat tggaggaacg tcttcaacga tctgatgaag aaatatattc ttatgttcag 1381 ttataccaag aatctataca ggaatttcaa gatacactta atactttgaa agaagaaagc 1441 aagaaaaagg cactagatga acctgtagat gatatgccct ggcaattttg gagtcattta 1501 ttgcttatga ttgatggttg gcttcttgag aagaagctaa cactagatga tgcaaaactg 1561 ttgagagata tggtatggaa aagagagagg cgtattcatg acatatactt agagtgcagg 1621 gaaaagaatg agcatgaagc tgtttctatg tttctcaagc tgacatcatc accaaaaagt 1681 caaggattat atgtcgtcca tattgcagcg gagatggcac cagttgctaa ggttggtggc 1741 ttgggagatg ttgtgaccgg tcttggaaaa gcactccaaa agagaggaca tcttgtggaa 1801 attattctgc caaagtatga ctgcatgcaa tatgatggta ttggcaattt aagggcccta 1861 gatgtggtgt tggaatctta ttttgatgga aaattataca aaaacgaagt atgggttggc 1921 accattgaag gtcttcctgt ttactttatt gagcctcatc accccggcaa gttcttttgg 1981 agagggcagt tctacggaga acatgatgat ttcaaacgct tttcattttt cagccgtgct 2041 gcacttgaat tgcttcttca agctggcaaa aaaccagaca taattcattg ccatgactgg 2101 cagacagctt ttgttgcacc actttattgg gatatatacg ccccaaaagg attgaattca 2161 gctagaatat gttttacctg tcacaacttt gagtaccagg ggagtgcacc agcatcagaa 2221 ttggcatctt gtggacttga tgtccagcag ctaaacagac cagatagaat gcaggacaac 2281 tcagcacatg ataggatcaa tcctattaag ggtgcagtgg tgttctcaaa cattgtgaca 2341 acagtatcac ccacctatgc acaagaagtg cggacttctg agggcggaaa aggtctccat 2401 tcgacgctta actttcatgc caagaagttc attggaatcc taaatggtat tgatactgat 2461 gtgtggaatc ctgcgactga tactcttctc gaagtccagt acaatgctaa cgatcttcaa 2521 ggaaaagcag aaaacaaaat agctacaagg cagcatcttg ggttatcaac tgcagatgct 2581 aggcagccac tggttggctg cataacaaga ttggtgccac agaaaggtgt acatcttatt 2641 agacatgcaa tataccgtac gctggagttg ggaggacaat ttctacttct tggctcaagc 2701 ccagttgcac atatacagag ggaatttgag ggtattgcaa atcactttca gaatcatgag 2761 cacattcggc tggtattgaa gtatgatgaa tctctcgctc attccattta tgcagcatct 2821 gacatgttca tcatcccatc tatctttgag ccttgtggcc ttacacagat gatagcaatg 2881 agatatggtt ccatacccat tgcaagaaaa accggtggtc taaatgatag tgttttggat 2941 gttgatgatg acacaattcc tcttcagttt cgaaatggat atacattctt gaatcctgat 3001 gagcagggag tgaatagtgc tttagaacgt gcatttaacc attataggaa cgatcctgag 3061 agctggcagc agcttgttca aaaggacatg aacatagatt ttagttggga atcttcagca 3121 tcacagtatg aggagctcta ctcaaaatca gtggccagag caagagcggc agcaagtagg 3181 tcttaattat ggtaaatggc attttcatgg aaagccaagg atct

LOCUS AY217353 1084 bp DNA linear PLN 26-JUL-2016 DEFINITION Manihot esculenta glutamic acid-rich protein (c54) gene, promoter region and partial cds. ACCESSION AY217353 VERSION AY217353.1 KEYWORDS .

160

2. promoter C54

SOURCE Manihot esculenta (cassava) ORGANISM Manihot esculenta Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae; rosids; fabids; Malpighiales; Euphorbiaceae; Crotonoideae; Manihoteae; Manihot. REFERENCE 1 (bases 1 to 1084) AUTHORS Zhang,P., Bohl-Zenger,S., Puonti-Kaerlas,J., Potrykus,I. and Gruissem,W. TITLE Two cassava promoters related to vascular expression and storage root formation JOURNAL Planta 218 (2), 192-203 (2003) PUBMED 13680228 REFERENCE 2 (bases 1 to 1084) AUTHORS Zhang,P., Bohl-Zenger,S., Puonti-Kaerlas,J., Potrykus,I. and Gruissem,W. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (12-JAN-2003) Institute of Plant Sciences, ETH Zuerich, Universitaetsstrasse 2, Zuerich CH-8092, Switzerland FEATURES Location/Qualifiers source 1..1084 /organism="Manihot esculenta" /mol_type="genomic DNA" /cultivar="MCol1505" /db_xref="taxon:3983" /note="authority: Manihot esculenta Crantz" gene 962..>1084 /gene="c54" regulatory 962..968 /regulatory_class="TATA_box" /gene="c54" /note="promoter p54/1.0" mRNA 1011..>1084 /gene="c54" /product="glutamic acid-rich protein" CDS 1082..>1084 /gene="c54" /note="expressed during secondary growth of the storage root" /codon_start=1 /product="glutamic acid-rich protein" /protein_id="AAP57706.1" /translation="M" ORIGIN 1 ggatccacgg gtgtgggcca actccaccgc ccaagagaaa acctaaaatg gagaaatttg 61 tcaaagcttt ttcaacttta cagactaggc ataggtcctg gggcaaacag aacagagctc 121 aggacgctgc ctccctgctt gcccacctgg aatcattgtt ctccgcttcc tgcttatgtc 181 atattctccg atgatttttt attttttaat tttgcgtttc tctttctttg caggtaaaat 241 aagcccatct caaattcaga tttgggtaat catgcgattt gagaaacatt atagaaaaaa 301 ggtgatcaac tccaattgtg tgataatttt gtagatgtgg caattaaggt cggtttggct 361 tttataagaa attagaatta accaatttca taattatatc attcatgact attgattata 421 atatctgaca aatcctgtaa tgatttttaa cccatttcag tatgatttac tcatcccatt 481 ctttatggct gcttcaatat acagagttca tgacatgtga atctgaattt aaatattaat 541 ttctctgttt aattaataat taataatcca tttcatataa tttttttaaa ttaattaatt 601 aattaaagaa gaaaataaga agctgggaac atgataataa taaaggtcac ctacattacc 661 gactgcacaa agcacataag cacaaaaaac caaaagaaag atgatggctt agctgaaaaa 721 ggccctccat tatttacact tttcgatcaa aaacaaatat catgggtaat ttaaaaagat

161

781 aaagtacagc ttacttattt gaaaaaaaat ttttaattca cnattcttaa aatgttgatn 841 tattcctatt gattttgatt tcagagagat gtgaggtcaa atcccaagat tcctcttcct 901 taggtagagt tcccacctct ctccctctca catgaagctt actggcctct actcctctct 961 ctatataagc cactctcagt taccctctct ctgcaccaaa tacactctaa gctctctctt 1021 cacttcctct ttgcttctca ccatttactt ttagtttcta tttcattttc tcttgctttc 1081 tatg //

162

3. Trình tự nucleotid và axit amin suy diễn của gen SSIV đã phân lập ở hai giống sắn Đỏ ĐF và KM140

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) ATGGCGTCGAAGCTATCGACGTGGTTTCTGAGTCAAGGGTTCACAGCTTTGAACTATAATTTTGACACTAATAAGCAGACAGCTACGCGATTCTTATTGC MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) CTTCCCATCGATTGCTTCCTGCTTCTTGCAAAATGCGACAGCGCAATTTGAGTAGCTCTCAGCATAAGAGACAGCAGCTCAAGAAAGCCTCTCCTGAACA MeSSIV (Do DF) ...................G................................................................................ MeSSiv (KM140) ..................................................---............................................... 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) ACCTCCAAATACCGTAGGTTTTCATTCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGAT---ATTGGTGATGATGATAATGATTCCGAAACTGAGAGCACAGCGGTG MeSSIV (Do DF) .....................C..............................---..........................G.................. MeSSiv (KM140) ............................A.......................GAT................................T............ 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) CATAGTGTCCCAAGCTTGAATCTTGATGTTGAGAGTAATGAGGAAGTCGTCGATGTTAGCGTAGATGTGGAGCATGCTCAGCATACGGGTGCAAATGATG MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) TGGAGAGGAATGTAGATATGGAACATGTTCAAGATGTTGGTGCAAAAGATTTGTATAGTCTCACCCAGGAAATGAAAACTTTGGGCATAGATGGAGCAGA MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) GAAGCTTTCTAGTATTCCTGATGAAATGAAACCTTTGGTCTTAAACAAAGATGGTGGAGAACAACTGTCAAGCTTTCAACTTGAGGATTTGATAGGCATG MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) ATAAGAAATGCTGAGAAAAATATCCTGCTTCTCAATCAAGCTCGGGTTCATGCACTTGAAGATCTTGAAAGAATTCTTGCAGAGAAGGAAATATTACAAG MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) GAGAAATTAACGTTTTAGAGATGAAATTGGCAGAAACTGATGCAAGAATGAAAGTTGCTGCTCAAGAAAAGATGCATGTAGAACTCATGGAAGACCAATT MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................G..................................................................

163

810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) AGGAAAACTAAGAAACGAACTGGCTTACAGGGTTGGGAATCAGAACAAACTTTTGAATGAGGAAGCCCCCTTGATTCAGGACAGCACTATTCAGAACATT MeSSIV (Do DF) ........................................G........................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) AGTGAGGAGCTCAATTCATTGAGGGCAGAGAATACATCTCTGAGGACTGATATAGAAGCACTTAAGAGGGAGCTTAGTAATGTCAAGGATACAGATGAGC MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) GTGTTATAACACTGGAGAAAGAATGCATGCAGTTGGAGTCTTCTGTGAAAGACTTGGAATCCAAACTGTCAGTTTCTCAGGAAGATGTTTCAAAATTGTC MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) TAGCTTGAAAGTTGAATGTAAAGACTTGTGGGAAAAGGTGGGAAGTTTGCAAGCATTGTTAGATAAGGCAACAAAGCAAGCAGATCAGGCTATTCTAGTG MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) TTGCAGCAAAATCGAGATCTTTGGAAGAAGGTTGATAAATTGGAAGAATCCTTGGAAGAGGCCAACGTCTATAAGTTATCGTCAGAAAAGTTACAGCAGT MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) ..................................................................A................................. 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) ATAATGAGCTAATGCAGCAAAAGATAAAACTATTGGAGGAACGTCTTCAACAATCTGATGAAGAAATATATTCTTATGTTCAGTTATACCAAGAATCTAT MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) ...................................................G................................................ 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) ACAGGAATTTCAAGATACACTTAATACTTTGAAAGAAGAAAGCAAGAAAAAGGCACTAGATGAACCTGTAGATGATATGCCCTGGCAATTTTGGAGTCAT MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) TTATTGCTTATGATTGATGGTTGGCTTCTTGAGAAGAAGCTAACACTAGATGATGCAAAACTGTTGAGAGATATGGTATGGAAAAGAGAGAGGCGTATTC MeSSIV (Do DF) ........................................................................C........................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700

164

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) ATGACATATACTTAGAGTGCAAGGAAAAGAATGAGCATGAAGCTGTTTCTATGTTTCTCAAGCTGACATCATCACCAAAAAGTCAAGGATTATATGTCGT MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .....................G.............................................................................. 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) CCATATTGCAGCGGAGATGGCACCAGTTGCTAAGGTTGGTGGCTTGGGAGATGTTGTGACTGGTCTTGGAAAAGCACTCCAAAAGAGAGGACATCTTGTG MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) ............................................................C....................................... 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) GAAATTATTCTGCCAAAGTATGACTGCATGCAATATGATGGTATTGGCAATTTAAGGGCCCTAGATGTGGTGTTGGAATCTTATTTTGATGGAAAATTAT MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) ACAAAAACGAAGTATGGGTTGGCACCATTGAAGGTCTTCCTGTTTACTTTATTGAGCCTCATCACCCCGGCAAGTTCTTTTGGAGAGGGCAGTTCTACGG MeSSIV (Do DF) .................................................................................C.................. MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) AGAACATGATGATTTCAAACGCTTTTCATTTTTCAGCCGTGCTGCACTTGAATTGCTTCTTCAAGCTGGCAAAAAACCAGACATAATTCATTGCCATGAC MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) TGGCAGACAGCTTTTGTTGCACCACTTTATTGGGATATATACGCCCCAAAAGGATTGAATTCAGCTAGAATATGTTTTACCTGTCACAACTTTGAGTACC MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 2290 2300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) AGGGGAGTGCACCAGCATCAGAATTGGCATCTTGTGGACTTGATGTCCAGCAGCTAAACAGACCAGATAGAATGCAGGACAACTCAGCACATGATAGGAT MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) CAATCCTATTAAGGGTGCAGTGGTGTTCTCAAACATTGTGACAACAGTATCACCCACCTATGCACAAGAAGTGCGGACTTCTGAGGGCGGAAAAGGTCTC MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 2500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

165

MeSSiv (Manes.15G118600.1) CATTCGACGCTTAACTTTCATGCCAAGAAGTTCATTGGAATCCTAAATGGTATTGATACTGATGTGTGGAATCCTGCGACTGATACTCTTCTCGAAGTCC MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) AGTACAATGCTAACGATCTTCAAGGAAAAGCAGAAAACAAAATAGCTACAAGGCAGCATCTTGGGTTATCAACTGCAGATGCTAGGCAGCCACTGGTTGG MeSSIV (Do DF) ...................A................................................................................ MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) CTGCATAACAAGATTGGTGCCACAGAAAGGTGTACATCTTATTAGACATGCAATATACCGTACGCTGGAGTTGGGAGGACAATTTCTACTTCTTGGCTCA MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) AGCCCAGTTGCACATATACAGAGGGAATTTGAGGGTATTGCAAATCACTTTCAGAATCATGAGCACATTCGGCTGGTATTGAAGTATGATGAATCTCTCG MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 2890 2900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) CTCATTCCATTTATGCAGCATCTGACATGTTCATCATCCCATCTATCTTTGAGCCTTGTGGCCTTACACAGATGATAGCAATGAGATATGGTTCCATACC MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 2990 3000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) CATTGCAAGAAAAACCGGTGGTCTAAATGATAGTGTTTTTGATGTTGATGATGACACAATTCCTCTTCAGTTTCGAAATGGATATACATTCTTGAATCCT MeSSIV (Do DF) ............G....................................................................................... MeSSiv (KM140) .......................................G............................................................ 3010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 3090 3100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) GATGAGCAGGGAGTGAATAGTGCTTTAGAACGTGCATTTAACCATTATAGAAACGATCCTGAGAGCTGGCAGCAGCTTGTTCAAAGGGACATGGACATAG MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) ..................................................G..................................A.......A...... 3110 3120 3130 3140 3150 3160 3170 3180 3190 3200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) ATTTTAGTTGGGAATCTTCAGCATCACAGTATGAGGAGCTCTACTCAAAATCAGTGGCCAGAGCAAGAGCGGCAGCAAGTAGGTCTTAATTATGGTAAAT MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 3210 3220 ....|....|....|....|....|.. MeSSiv (Manes.15G118600.1) GGCATTTTCATGGAAAGCCAAGGATCT MeSSIV (Do DF) ........................... MeSSiv (KM140) ...........................

166

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) ASKLSTWFLSQGFTALNYNFDTNKQTATRFLLPSHRLLPASCKMRQRNLSSSQHKRQQLKKASPEQPPNTVGFHSRGGGGGDD-IGDDDNDSETESTAVH MeSSIV (Do DF) ...................................................................................-................ MeSSiv (KM140) .................................................-.........................S.......D..........D..... 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) SVPSLNLDVESNEEVVDVSVDVEHAQHTGANDVERNVDMEHVQDVGAKDLYSLTQEMKTLGIDGAEKLSSIPDEMKPLVLNKDGGEQLSSFQLEDLIGMI MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) RNAEKNILLLNQARVHALEDLERILAEKEILQGEINVLEMKLAETDARMKVAAQEKMHVELMEDQLGKLRNELAYRVGNQNKLLNEEAPLIQDSTIQNIS MeSSIV (Do DF) ...............................................................................E.................... MeSSiv (KM140) ...........................................G........................................................ 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) EELNSLRAENTSLRTDIEALKRELSNVKDTDERVITLEKECMQLESSVKDLESKLSVSQEDVSKLSSLKVECKDLWEKVGSLQALLDKATKQADQAILVL MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) QQNRDLWKKVDKLEESLEEANVYKLSSEKLQQYNELMQQKIKLLEERLQQSDEEIYSYVQLYQESIQEFQDTLNTLKEESKKKALDEPVDDMPWQFWSHL MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .....................I...........................R.................................................. 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) LLMIDGWLLEKKLTLDDAKLLRDMVWKRERRIHDIYLECKEKNEHEAVSMFLKLTSSPKSQGLYVVHIAAEMAPVAKVGGLGDVVTGLGKALQKRGHLVE MeSSIV (Do DF) .......................L............................................................................ MeSSiv (KM140) .......................................R............................................................ 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) IILPKYDCMQYDGIGNLRALDVVLESYFDGKLYKNEVWVGTIEGLPVYFIEPHHPGKFFWRGQFYGEHDDFKRFSFFSRAALELLLQAGKKPDIIHCHDW MeSSIV (Do DF) ...........................................................S........................................ MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) QTAFVAPLYWDIYAPKGLNSARICFTCHNFEYQGSAPASELASCGLDVQQLNRPDRMQDNSAHDRINPIKGAVVFSNIVTTVSPTYAQEVRTSEGGKGLH MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900

167

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) STLNFHAKKFIGILNGIDTDVWNPATDTLLEVQYNANDLQGKAENKIATRQHLGLSTADARQPLVGCITRLVPQKGVHLIRHAIYRTLELGGQFLLLGSS MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) .................................................................................................... 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) PVAHIQREFEGIANHFQNHEHIRLVLKYDESLAHSIYAASDMFIIPSIFEPCGLTQMIAMRYGSIPIARKTGGLNDSVFDVDDDTIPLQFRNGYTFLNPD MeSSIV (Do DF) .................................................................................................... MeSSiv (KM140) ..............................................................................L..................... 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MeSSiv (Manes.15G118600.1) EQGVNSALERAFNHYRNDPESWQQLVQRDMDIDFSWESSASQYEELYSKSVARARAAASRSLWMAFSWKAKDX MeSSIV (Do DF) ......................................................................... MeSSiv (KM140) ...........................K..N..........................................

168

4. Kết quả xác định trình tự promoter C54 đã phân lập (so sánh với trình tự

truy vấn C54 (AY217353)) và kết quả blasn (NCBI)

169

5. Kết quả phân tích promoter C54 bằng phần mềm TSSP

C54 Promoter (sắn đỏ địa phương)

C54 Promoter (Tham chiếu)

> test sequence

Length of sequence- 1041 Thresholds for TATA+ promoters - 0.02, for TATA-/enhancers - 0.04 2 promoter/enhancer(s) are predicted

Length of sequence- 1073 Thresholds for TATA+ promoters - 0.02, for TATA-/enhancers - 0.04 2 promoter/enhancer(s) are predicted

Promoter Pos: 981 LDF- 0.14 TATA box at 947 21.81

Enhancer Pos: 993 LDF- 0.06

Enhancer Pos: 1004 LDF- 0.08

Transcription factor binding sites/RegSite DB:

for promoter at position - 981 815 (+) RSP00005 CTWWWWWWGT

RSP00026

(-)

RSP00026

(-)

RSP00046

RSP00098

979 (+) RSP00016 caTGCAC 876 gcttttgaTGACtTcaaacac 943 (+) atccattcTATATAAGaaacata 794 (+) RSP00117 aattATTTTTAaa

979 (+) RSP00016 caTGCAC 876 gcttttgaTGACtTcaaacac 943 (+) atccattcTATATAAGaaacata 790 (+) cttaatatATTTTTAattattttattctcttaa 794 (+) RSP00117 aattATTTTTAaa

795 (+) RSP00125 aatATTTTTAtt 795 (+) RSP00135 aatATTTTTAtc

RSP00126

(+)

794 (+) RSP00140 aattATTTTTAtt 681 (+) RSP00161 WAAAG

795 (+) RSP00125 aatATTTTTAtt 786 gaaaattttaatATTTTTAtttagtatt 795 (+) RSP00135 aatATTTTTAtc

706 (+) RSP00161 WAAAG 763 (+) RSP00161 WAAAG

794 (+) RSP00140 aattATTTTTAtt 681 (+) RSP00161 WAAAG

769 (+) RSP00161 WAAAG 732 (-) RSP00161 WAAAG

763 (+) RSP00161 WAAAG 732 (-) RSP00161 WAAAG

966 (+) RSP00240 CAGTTA 918 (+) RSP00252 CACATG

774 (-) RSP00265 ACTTTA 711 (-) RSP00305 CCTTTT

826 (-) RSP00308 CAACA 798 (+) RSP00339 RTTTTTR

743 (-) RSP00339 RTTTTTR

864 (+) RSP00383 GGTCAAA 787 (+) RSP00398 TTTGAA

863 (+) RSP00467 tGGTCAatTc 862 (+) RSP00468 ttGGTCAatTc

908 (-) RSP00469 GNGGTG 759 (+) RSP00477 TTTAA

801 (+) RSP00477 TTTAA 820 (-) RSP00477 TTTAA

764 (-) RSP00477 TTTAA 796 (+) RSP00508 gcaTTTTTatca

801 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 800 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca

799 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 798 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca

769 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 745 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca

(-)

RSP00512

712 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 681 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca

681 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 703 cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc

170

(-)

RSP00512

703 cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc for promoter at position - 1004

for promoter at position - 993

815 (+) RSP00005 CTWWWWWWGT 979 (+) RSP00016 caTGCAC

(-)

RSP00026

(-)

RSP00026

876 gcttttgaTGACtTcaaacac

RSP00046

(+) 943 atccattcTATATAAGaaacata

(+)

RSP00098

790 cttaatatATTTTTAattattttattctcttaa

794 (+) RSP00117 aattATTTTTAaa 795 (+) RSP00125 aatATTTTTAtt

794 (+) RSP00117 aattATTTTTAaa

795 (+) RSP00135 aatATTTTTAtc

RSP00126

794 (+) RSP00140 aattATTTTTAtt 706 (+) RSP00161 WAAAG

(+)

795 (+) RSP00125 aatATTTTTAtt 786 gaaaattttaatATTTTTAtttagtatt 795 (+) RSP00135 aatATTTTTAtc

763 (+) RSP00161 WAAAG 769 (+) RSP00161 WAAAG

794 (+) RSP00140 aattATTTTTAtt 763 (+) RSP00161 WAAAG

732 (-) RSP00161 WAAAG 966 (+) RSP00240 CAGTTA

918 (+) RSP00252 CACATG 774 (-) RSP00265 ACTTTA

918 (+) RSP00252 CACATG 826 (-) RSP00308 CAACA

711 (-) RSP00305 CCTTTT 826 (-) RSP00308 CAACA

798 (+) RSP00339 RTTTTTR 743 (-) RSP00339 RTTTTTR

864 (+) RSP00383 GGTCAAA 787 (+) RSP00398 TTTGAA

863 (+) RSP00467 tGGTCAatTc 862 (+) RSP00468 ttGGTCAatTc

908 (-) RSP00469 GNGGTG 759 (+) RSP00477 TTTAA

801 (+) RSP00477 TTTAA 820 (-) RSP00477 TTTAA

764 (-) RSP00477 TTTAA 796 (+) RSP00508 gcaTTTTTatca

801 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 800 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca

799 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca

798 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 769 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca

(-)

RSP00512

745 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 712 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca

745 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 703 cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc

171

Phụ lục 3

Sơ đồ các vector mang gen SSIV được tổng hợp nhân tạo

pK7WG2D-35S:SSIV:T35

pBI121-C54:SSIV:NOST

172

Phụ lục 4

Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962)

STT Thành phần

2 3 4 5 6

CaCl2 CaCl2.6H2O KH2PO4 KNO3 MgSO4 NH4NO3 FeSO4.7H2O EDTA Hoặc FeNaEDTA H3BO3 KI MnSO4.2H2O ZnSO4 CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O NaMoO4.2H2O MnSO4.H2O Glycin Thiamin HCl Myo – innositol Pyridoxine HCl Hàm lượng (mg/l) 332,02 440 170 1900,00 180,54 1650,00 27,8 37,3 36,7 6,2 0,83 16,9 8,6 0,025 0,025 0,25 16,9 2,00 0,10 100,00 0,50

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

173