Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÝ THỊ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN

TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN

NHI TRUNG ƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

L LÝ THỊ THANH HÀ

THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN

TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN

NHI TRUNG ƯƠNG

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trần Vân Khánh

Trường Đại học Y Hà Nội

2. GS.TS. Trương Nam Hải

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này tôi đã nhận được sự hỗ trợ, tạo điều kiện của rất

nhiều người đã thông cảm, sẻ chia, động viên và giúp đỡ tôi. Tôi xin được trân

trọng cảm ơn và luôn luôn ghi nhớ!

Tôi vô cùng biết ơn PGS. TS. Trần Vân Khánh, Phó giám đốc Trung tâm gen

và protein, Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý tận tình cho tôi trong quá

trình thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. Trương Nam Hải, Viện Công nghệ sinh

học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi

trong thời gian qua.

Tôi xin được cảm ơn các vị lãnh đạo Bệnh viện Nhi Trung Ương và Khoa Di

truyền và Sinh học phân tử, đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình thực hiện

nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Phòng công nghệ gen Viện nghiên cứu tế

bào gốc và công nghệ gen Vinmec đã giúp đỡ trong những chặng đường đã qua. Tôi

thực sự xúc động và tự hào bởi sự hỗ trợ nhiệt tình, sự động viên, chia sẻ của các

các đồng nghiệp tại nơi đây tôi đang công tác, đã giúp tôi hoàn thành nhiệm vụ và

nghiên cứu này!

Bố, mẹ là những người đã mang tôi đến với cuộc sống;chồng và các con của

tôi đã luôn động viên và yêu thương vô bờ bến! Tôi xin được chia sẻ thành quả này

với bố, mẹ và gia đình tôi. Họ là động lực để tôi luôn luôn cố gắng không ngừng.

Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018

Tác giả

Lý Thị Thanh Hà

sLỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các

cộng sự khác.

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được

công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các

đồng tác giả.

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018

Tác giả

Lý T Lý Thị Thanh Hà

hị Thanh Hà

iii

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4

1.1. Cấu trúc và các dạng phân tử Hemoglobin ................................................ 4

1.1.1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường ..................................................... 4

1.1.2. Các dạng phân tử hemoglobin ....................................................................... 5

1.2.1. Khái niệm ............................................................................................. 6

1.2.2. Dịch tễ học bệnh  thalassemia ............................................................. 6

1.2.3. Cơ chế bệnh sinh .................................................................................. 6

1.2.4. Đặc điểm lâm sàng bệnh β thalassemia ................................................. 9

1.2.5. Đặc điểm cận lâm sàng bệnh  thalassemia ........................................ 10

1.2.6. Chẩn đoán bệnh  thalassemia ............................................................ 10

1.2. Bệnh  thalassemia ...................................................................................... 6

1.3.1. Cấu trúc gen  globin .......................................................................... 11

1.3.2. Các dạng đột biến trên gen  globin và một vài cơ chế đột biến

trong tổng hợp chuỗi  globin ............................................................. 13

1.3.3. Tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình .............................................. 15

1.3.4. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định các đột biến gen β globin ...... 16

1.3.5. Phát hiện người lành mang gen bệnh .................................................. 22

1.3. Đột biến gen  globin ................................................................................. 11

1.4.1. Dịch nước ối (Amniotic fluid sampling) ............................................. 24

1.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia ............................................... 23

1.4.2. Mẫu gai rau (Chorionic villus sampling - CVS) ........................................... 24

1.4.3. Chẩn đoán tiền phôi (Pre-implantation genetic diagnosis - PGD) ................ 26

1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh  thalassemia tại Việt Nam .......................... 26

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 28

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 28

2.2.1. Nhóm bệnh nhân bị bệnh  thalassemia thể nặng ............................... 28

2.2.2. Nhóm người mang gen bệnh  thalassemia ....................................... 28

2.2.3. Nhóm làm chẩn đoán trước sinh ......................................................... 29

2.2. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 28

2.3. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân ................................................................ 29

2.4.1. Trang thiết bị ...................................................................................... 29

2.4.2. Hóa chất ............................................................................................. 29

2.4. Trang thiết bị cần thiết .............................................................................. 29

2.5. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 32

2.6.1. Thu thập mẫu máu và tách DNA từ mẫu máu ngoại vi ....................... 32

2.6.2. Kỹ thuật tách DNA tổng số từ máu ngoại vi và tế bào ối .................... 33

2.6.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ........................................ 33

2.6.4. Kỹ thuật PCR xác định đột biến trên gen β globin .............................. 34

2.6.5. Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến trên gen β globin............. 36

2.6.6. Kỹ thuật Gap PCR .............................................................................. 37

2.6.7. Nuôi cấy tế bào ối ............................................................................... 37

2.6. Quy trình xác định đột biến gen  globin ................................................. 32

2.7. Vấn đề đạo đức .......................................................................................... 38

2.8. Sơ đồ nghiên cứu ....................................................................................... 39

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 40

3.1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu ................................................................ 40

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA ...................................................................... 40

3.2. Kết quả xác định đột biến gen β globin .................................................... 40

3.2.3. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen

bệnh  thalassemia. ............................................................................. 67

3.2.2. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân mắc  thalassemia thể nặng ......... 48

3.2.4. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia ............................... 81

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................... 88

4.1. Vai trò của kỹ thuật Multiplex ARMS PCR, giải trình tự gen và

4.1.1. Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR ......................................................... 88

4.1.2. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger ........................................................ 90

4.1.3. Kỹ thuật Gap PCR .............................................................................. 91

Gap PCR trong chẩn đoán xác định bệnh  thalassemia ........................ 88

4.2. Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến các đột biến gen  globin trên

4.2.1. 09 đột biến sàng lọc bằng kỹ thuật Multiplex PCR ............................. 91

4.2.2. Đặc điểm và tỷ lệ đột biến gen β globin trên bệnh nhân  thalassemia

tại bệnh viện Nhi Trung ương. ............................................................ 92

4.2.3. Một số ca không điển hình có lâm sàng đặc biệt ................................. 93

nhân  thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương .................................. 91

4.3. Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến gen  globin trên người mang gen

 thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương ........................................... 97

4.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia ............................................. 100

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 103

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ................................................................................... 104

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH .................................................... 105

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 116 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR Polymerase Chain Reaction, phản ứng đồng trùng hợp

C-ARMS-PCR Combine-Amplification Refractory Mutation System-PCR,

GAP-PCR PCR khoảng cách

RT-PCR Reverse transcrip PCR

MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification

Sequencing Giải trình tự gen

Multiplex Phản ứng đa mồi

Allele specific oligonucleotide dot blot, lai đặc hiệu oligo ASO

Reserve dot blot, lai ngược RDB

RE - PCR Restriction enzyme – PCR, phản ứng PCR sử dụng enzyme

cắt giới hạn

Hemoglobin Hb

Carbon dioxide CO2

Carbon monoxide CO

Nirtric oxide NO

Oxygen O2

Chuỗi alpha 

Chuỗi beta β

Chuỗi gamma γ

Chuỗi delta δ

vii

Chuỗi epsilon ε

Chuỗi zeta ζ

Hemoglobin A (2β2)

Hemoglobin A2 (2δ2)

Hemoglobin Gower1 (ζ2ε2)

Hemoglobin Gower2 (2ε2)

Hemoglobin Porland (ζ2γ2)

Hemoglobin F (2γ2)

HPFH Hội chứng tồn dư huyết sắc tố bào thai di truyền

HPLC Điện di hemogobin bằng sắc ký lỏng cao áp

/ Người mang gen  kết hợp mang gen  thalassemia

/E Người mang gen  kết hợp mang gen HbE

RBC (1012/L) Red Blood Cells, số lượng hồng cầu

HGB (g/dL) Khối lượng hemoglobin (g/dL)

HCT (%) Hematocrit (%)

MCV (fL) Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu

MCH (pg) Mean Corpuscular Hemoglobin, số lượng hemoglobin trung

bình hồng cầu (pg)

MCHC (%) Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ

hemoglobin trung bình hồng cầu (%)

cffDNA Cell free fetal DNA, ADN tự do của thai nhi

NIPD Non invasive Prenatal Diagnosis, chẩn đoán trước sinh

không xâm lấn

viii

PGD Pre-implantation genetic diagnosis, chẩn đoán tiền làm tổ

IVF In vitro fertilization, thụ tinh ống nghiệm

EQA External Quality Assessment, tổ chức ngoại kiểm

WHO World Health Organization, tổ chức y tế thế giới

TIF Thalassemia International Fondation, Hiệp hội Thalassemia

quốc tế

BV Nhi TƯ Bệnh Viện Nhi Trung Ương

DT-SHPT Khoa Di truyền - Sinh Học Phân Tử

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường .......................................... 5

Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh  thalassemia ........................................... 11

Bảng 1.3. Kiểu hình, kiểu gen bệnh  thalassemia .............................................. 16

Bảng 1.4. Các kĩ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong phát hiện đột biến

gây bệnh  thalassemia. ...................................................................... 17

Bảng 1.5. Tình hình mang gen bệnh  thalassemia tại Việt Nam ......................... 26

Bảng 1.6. Tỉ lệ các loại đột biến  thalassemia ở người Việt Nam....................... 27

Bảng 2.1. Tên và trình tự mồi sử dụng trong quy trình xác định 09 đột biến

trên trên gen β globin .......................................................................... 31

Bảng 2.2. Các bước sàng lọc trên gene β globin .................................................. 34

Bảng 2.3. Bộ mồi sử dụng trong kỹ thuật giải trình tự gen β globin .................... 36

Bảng 3.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo các nhóm ..................................... 40

Bảng 3.2. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân 

thalassemia .......................................................................................... 41

Bảng 3.3. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân 

thalassemia theo vị trí đột biến ............................................................ 42

Bảng 3. 4. Kiểu gen và kiểu hình của 214 bệnh nhân  thalassemia ..................... 43

Bảng 3.5. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin trên đối tượng người

mang gen bệnh. ................................................................................... 69

Bảng 3.6. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết

sắc tố của bệnh nhân mã số WBbT110706 .......................................... 74

Bảng 3.7. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết

sắc tố của bệnh nhân mã số PWBbT120505M .................................... 75

Bảng 3.8. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết

sắc tố của bệnh nhân mã số WBbT150926. ......................................... 77

Bảng 3.9. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết

sắc tố của bệnh nhân mã số PWBbT120505F ...................................... 78

Bảng 3.10. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết

sắc tố của 3 gia đình có kiểu gen kết hợp  và  thalassemia. ............. 80

Bảng 3.11. Kết quả số lượng và tỷ lệ thai nhi chẩn đoán trước sinh. ..................... 83

Bảng 3.12. Kết quả tần số và tỷ lệ alen đột biến trong chẩn đoán trước sinh cho

thai nhi ................................................................................................ 83

Bảng 3.13. Tần số và tỉ lệ kiểu gen đột biến xuất hiện ở 178 thai nhi .................... 84

Bảng 4.1. Các đột biến gen β globin phổ biến ở một số quần thể trên thế giới. .... 92

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường ......................................... 4

Hình 1.2. Sơ đồ cơ chế bệnh sinh trong Thalassemia ........................................... 8

Hình 1.3. Cấu trúc và quá trình tổng hợp chuỗi β globin .................................... 13

Hình 1.4. Nguyên lý kĩ thuật ARMS-PCR ......................................................... 18

Hình 1.5. Thủ thuật chọc ối trong chẩn đoán trước sinh. .................................... 24

Hình 1.6. Thủ thuật lấy bệnh phẩm trong chẩn đoán trước sinh ......................... 25

Hình 2.1. Quy trình xác định đột biến gen  globin ........................................... 32

Hình 2.2. Sơ đồ mồi quy trình xác định đột biến gen β globin ........................... 37

Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................... 39

Hình 3.1. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT081203

có đột biến CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-TAG) ............................ 45

Hình 3.2. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT081203 phát hiện

kiểu gen CD41/42(-TCTT) (A) và CD17 (AAG-TAG) (B) ................ 46

Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT081203 với

đột biến dị hợp tử CD41/42(-TCTT) (A) và CD17 (AAG-TAG) (B). .... 47

Hình 3.4. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713

có đột biến IVS1-1 (G-T) ................................................................... 48

Hình 3.5. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 phát hiện

kiểu gen IVS1-1(G-T) ........................................................................ 49

Hình 3.6. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713

có đột biến IVS2-654 (C-T) ............................................................... 49

Hình 3.7. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 phát hiện

kiểu gen IVS2-654(C-T) .................................................................... 50

Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT140713

với đột biến dị hợp tử IVS1-1 (G-T) (A) và IVS2-654 (C-T) (B) ........ 51

Hình 3.9. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504

có đột biến -28(A-G) .......................................................................... 51

xii

Hình 3.10. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 phát hiện

kiểu gen -28(A-G) .............................................................................. 52

Hình 3.11. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504

có đột biến CD71/72(+A) ................................................................... 53

Hình 3.12. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 phát hiện

kiểu gen CD71/72(+A) ....................................................................... 54

Hình 3.13. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT130504 với

đột biến dị hợp tử CD71/72 (+A) ....................................................... 55

Hình 3.14. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215

có đột biến -28(A-G) .......................................................................... 55

Hình 3.15. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215 phát hiện

kiểu gen -28(A-G) .............................................................................. 56

Hình 3.16. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215

có đột biến IVS1-5 (G-C) ................................................................... 57

Hình 3.17. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215 phát hiện

kiểu gen IVS1-5 (G-C) ....................................................................... 57

Hình 3.18. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310

có đột biến CD41/42(-TCTT) ............................................................. 58

Hình 3.19. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310 phát hiện

kiểu gen CD41/42(-TCTT) ................................................................. 59

Hình 3.20. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310

có đột biến CD95 (+A) ....................................................................... 59

Hình 3.21. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310 phát hiện

kiểu gen CD95 (+A) ........................................................................... 60

Hình 3.22. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT090304

có đột biến CD41/42(-TCTT) ............................................................. 61

Hình 3.23. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT090304 phát hiện

kiểu gen CD41/42(-TCTT) ................................................................. 61

xiii

Hình 3.24. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT090304 phát hiện

kiểu gen HbE (GAG-AAG)-CD26 ..................................................... 62

Hình 3.25. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT090304 với

với đột biến dị hợp tử HbE (GAG-AAG)-CD26 ................................. 63

Hình 3.26. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với

đột biến dị hợp tử c.441-442ins AC .................................................... 64

Hình 3.27. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với

đột biến dị hợp tử c.-140C>T ............................................................. 64

Hình 3.28. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với

đột biến dị hợp tử c.-138C>T ............................................................. 65

Hình 3.29. Kết quả xác định đột biến gen của bệnh nhân mã số

PWBbT120505F và gia đình. ............................................................. 66

Hình 3.30. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ máu ngoại vi của các

đối tượng nghiên cứu. ........................................................................ 68

Hình 3.31. Kết quả điện di bước 1 sàng lọc 4 đột biến CD41/42(-TCTT),

CD17(AAG-TAG), IVS1-1(G-T), -28 (A-G) của cặp bố mẹ có mã

số WBbT090803 và WBbT090804 .................................................... 71

Hình 3.32. Kết quả điện di bước 2 sàng lọc 4 đột biến IVS2-654(C-T),

CD71/72(+A), IVS1-5(G-C), CD95 (+A) của cặp bố mẹ có mã số

WBbT090803 và WBbT090804 ......................................................... 72

Hình 3.33. Kết quả điện di bước 3 sàng lọc đột biến HbE (CD26) của cặp bố

mẹ có mã số WBbT090803 và WBbT090804 .................................... 72

Hình 3.34. Kết quả điện di tìm kiểu gen đột biến của người mẹ mã số

WBbT090804. Thay hình khác .......................................................... 73

Hình 3.35. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp của bệnh nhân mã

số WBbT110706 ................................................................................ 75

Hình 3.36. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp của bệnh nhân mã

số PWBbT120505M .......................................................................... 76

xiv

Hình 3. 37. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp của bệnh nhân mã

số WBbTS150926 .............................................................................. 77

Hình 3.38. Kết quả điện di phát hiện đột biến mất đoạn lớn ở người bố.

Hình 3.39. Kiểu gen kết hợp đột biến gen β globin và α globin của 3 gia đình

có các con vừa bị Beta thalassemia thể nặng và phù thai di Alpha

thalassemia thể nặng. ......................................................................... 81

Hình 3.40. Quy trình chẩn đoán trước sinh cho bệnh Beta thalassemia ................ 82

Hình 3.41. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân sản phụ mã số

AFbT120605, Nguyễn Thị Th. ........................................................... 85

Hình 3.42. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân sản phụ mã số

AFbT110705, Hà Thị V. .................................................................... 86

Hình 3.43. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân sản phụ mã số

AFbT121061 Nguyễn Phương D. ....................................................... 86

Hình 3.44. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình sản phụ mã số

AFbT150302, Lò Thị Bích Th. ........................................................... 87

ĐẶT VẤN ĐỀ

Beta thalassemia (β Thalassemia) là một bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể

thường, gây thiếu máu tan máu phổ biến ở Việt Nam, gây ra bởi đột biến gen Beta

globin ( globin) nằm trên nhiễm sắc thể (NST) 11 (NC Khanh 1985). Tần suất

mang gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc Kinh là 1,49%, Mường 20,6%, Tày

11%... (Saovaros Svasti, Hieu et al. 2002). Bệnh nhân là những người mang 2 đột

biến gen  thalassemia (đồng hợp tử) hoặc  thalassemia kết hợp với HbE. Biểu

hiện lâm sàng là da xanh, niêm mạc nhợt, biến dạng xương, gan lách to, xạm da...

do hồng cầu của bệnh nhân dễ bị phá hủy và tăng tạo máu ngoài tủy (BV Viên

2001).

Việc quản lý bệnh nhân β Thalassemia bao gồm vấn đề về phòng ngừa các

trường hợp bệnh mới, điều trị các bệnh nhân Thalassemia thể nặng bằng truyền máu

thường xuyên và tầm soát, phát hiện người mang gen. Điều trị bệnh β thalassemia

chủ yếu bằng truyền máu, thải sắt suốt đời hoặc chữa trị bằng ghép tế bào gốc, liệu

pháp gen đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và phải có nguồn tế bào gốc phù hợp. Việc

này gây ra gánh nặng về kinh tế và tâm lý cho các gia đình có người nhà bị bệnh β

Thalassemia, cũng như cho toàn xã hội. Vì vậy việc phòng bệnh được xem là chiến

lược trong việc giải quyết vấn đề Thalassemia trong cộng đồng. Biện pháp phòng

ngừa bệnh β Thalassemia hữu hiệu nhất hiện nay là chẩn đoán trước sinh, nhằm

phát hiện các thai nhi bị bệnh đối với những cặp vợ chồng đã có con bị bệnh muốn

sinh con trong các lần tiếp sau hoặc những cặp vợ chồng trước hoặc sau khi kết hôn

đều đã được chẩn đoán là người mang gen bệnh. Đột biến trên gen β globin phần

lớn là đột biến điểm. Mỗi chủng tộc hoặc dân tộc khác nhau lại mang đột biến và

tần suất khác nhau. Bệnh β Thalasemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm

lâm sàng và các xét nghiệm huyết học. Tuy nhiên, các xét nghiệm di truyền phân tử

xác định các đột biến trên gen β globin là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán

trước sinh bệnh β thalassemia.

Phân tích kiểu gen không chỉ giúp khẳng định chẩn đoán trong một số trường

hợp xét nghiệm thành phần Hb không điển hình mà còn giúp chẩn đoán thể bệnh

nặng và trung gian, là cơ sở để lên kế hoạch điều trị tốt hơn cho bệnh nhân. Phân

tích kiểu gen là cơ sở thiết yếu cho thực hành tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn di truyền

cho các cặp vợ chồng là người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh β

Thalassemia, giúp giảm tỷ lệ ca bệnh mới ra cộng đồng. Đây được xem là biện pháp

phòng bệnh hiệu quả nhất và cần thiết để ngăn ngừa và giảm bớt nguy cơ sinh ra

các em bé mắc thể bệnh nặng. Phân tích kiểu đột biến gen còn giúp nghiên cứu về

kiểu đột biến gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc (Weatherall 2007).

Ở các quốc gia khác trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về tần suất đột

biến gen và nghiên cứu lâm sàng ở các dân tộc khác nhau như ở người Thái Lan,

Philippin, Malaysia, Trung Quốc, Hàn Quốc (Kazazian, Dowling et al. 1986, Park,

Lee et al. 2002, Peng, Liu et al. 2003, Tan, George et al. 2004, Viprakasit,

Tanphaichitr et al. 2004). Đã có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen

là kiểu hình trên bệnh nhân  thalassemia (Galanello, Ruggeri et al. 1983,

Galanello, Barella et al. 2002, Gabbianelli, Morsilli et al. 2008, Sripichai,

Munkongdee et al. 2008, Sharma and Saxena 2009, Viprakasit, Lee-Lee et al. 2009,

Nuinoon, Makarasara et al. 2010). Thái Lan là một trong những nước làm tốt tư vấn

di truyền và chẩn đoán trước sinh với hơn 10 trung tâm (Dhamcharee, Romyanan et

al. 2001).

Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về bệnh  thalassemia nhưng chủ yếu là

các nghiên cứu về lâm sàng, tần suất bệnh thông qua xét nghiệm điện di huyết sắc

tố. Gần đây đã có một số nghiên cứu về tần suất bệnh dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng

cao áp (HPLC), về tần suất mang gen dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử nhưng mô

hình nghiên cứu và số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu còn chưa lớn, chưa đủ

để đưa ra con số tỷ lệ đột biến đặc trưng của người Việt Nam nói chung và của

người miền Bắc nói riêng. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đột biến gen β globin và

chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương” được

thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu sau:

1. Phát hiện đặc điểm đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia và

người mang đột biến dị hợp tử bằng các kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMS-

PCR và giải trình tự gen Sanger.

2. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật sinh học phần

tử từ tế bào ối.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CẤU TRÚC VÀ CÁC DẠNG PHÂN TỬ HEMOGLOBIN

1.1.1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường

Thalassemia là rối loạn di truyền do bất thường trong quá trình tổng hợp

hemoglobin mà nguyên nhân là sự thay đổi tỷ lệ tổng hợp các chuỗi globin. Bình

thường 2 loại chuỗi α globin và “không α” globin cặp đôi với nhau theo tỷ lệ 1:1,

đột biến gen làm giảm hoặc ngừng sản xuất một loại chuỗi globin nhất định hoặc

một vài chuỗi (α, β, γ, δ) sẽ gây ra sự mất cân bằng giữa các chuỗi globin. Loại

chuỗi globin được tổng hợp bình thường trở nên dư thừa vì không được cặp đôi, sẽ

tích tụ trong tế bào hồng cầu và gây phá hủy hồng cầu. Thông thường người ta chia

bệnh thalassemia ra làm 2 loại, nếu giảm hoặc không tổng hợp chuỗi α globin sẽ

gây bệnh α thalassemia và rối loạn tổng hợp chuỗi β globin sẽ gây thể bệnh β

thalassemia.

Hình 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường

(Nguồn: http://www.tutorialpoint.org/ProvaBiswas/HB_page1.html)

Hemoglobin (Hb), hay còn gọi là huyết sắc tố, là chất chứa trong các tế bào hồng cầu, có nhiệm vụ vận chuyển oxy từ phế nang đến tổ chức và vận chuyển chuyển hóa của tổ chức là H+ và CO2 đến thận và phổi để đào thải. Cấu trúc phân tử Hb gồm hai phần: phần Globin và phần HEM. Phần Globin có bản chất protein, đặc trưng cho từng loài. Ở người, phần globin được cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, giống và gắn với nhau từng đôi một. Mỗi chuỗi polypeptide gắn với 1 HEM. Vì

vậy, mỗi phân tử Hb có 2 đôi chuỗi polypeptide và 4 HEM, có khả năng vận chuyển 4 phân tử oxy.

1.1.2. Các dạng phân tử hemoglobin

Trong quá trình phát triển của cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có

sự chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống.

Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả Igram, Schoeden

và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptide ra các loại sau đây: Chuỗi

alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (), chuỗi delta (δ), chuỗi epsilon (ε ), chuỗi

theta (ζ).

Các chuỗi (ζ) và chuỗi (ε) chỉ tồn tại ở những tuần đầu của thời kỳ bào thai,

sau đó nhanh chóng được thay thế bằng chuỗi (α), (β), (), (δ). Các chuỗi này tồn tại

suốt cuộc đời ở các mức độ khác nhau. Ở người trưởng thành gặp chủ yếu là chuỗi

(α), (β) một số ít chuỗi (δ) và rất ít chuỗi (). Các loại chuỗi (β), (), (δ) đều kết

hợp từng cặp với chuỗi (α) nên các loại chuỗi đó còn gọi chung là các chuỗi

“không α”.

Bảng 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường

Loại Hb

Thành phần

Thời kỳ xuất hiện

globin

Bào thai 6 tuần, Hb ở người bình thường

HbA1

α2 β2

Thai nhi gần sinh, Hb ở người bình thường

HbA2

α2δ2

Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi

HbF

α2γ2

Phôi thai 2-3 tuần, trong 2 tháng đầu của thai

Hb Gower 1

ζ2ε2

Xuất hiện và có cùng Hb Gower 1

Hb Gower 2

α2ε2

Phôi thai 2 - 3 tuần đầu

Hb PorlDNA

ζ2γ2

Bình thường mỗi phân tử Hb có 2 cặp chuỗi polypeptide ở phần globin. Các

loại Hb khác nhau có các thành phần chuỗi polypeptide khác nhau. Gen α globin

hoạt động tương đối sớm, ngay từ cuối tháng đầu của thời kỳ bào thai và tồn tại

trong suốt quá trình phát triển của cá thể. Trong khi đó, tổ hợp gen β globin hoạt

động thay đổi theo từng giai đoạn phát triển và có sự thay thế một cách trình tự

chuỗi này bằng chuỗi khác

1.2. BỆNH  THALASSEMIA

1.2.1. Khái niệm

Thalassemia là nhóm bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng

bởi sự suy giảm hoặc thiếu hụt tổng hợp chuỗi α hoặc β globin trong phân tử

Hemoglobin (Cao and Galanello. 2010). Tùy theo sự thiếu hụt xảy ra ở chuỗi α hay

β globin mà được gọi là bệnh α hay β Thalassemia. Đây là một trong các bệnh di

truyền phổ biến nhất trên thế giới và là nguyên nhân gây thiếu máu, tan máu hàng

đầu ở trẻ em.

1.2.2. Dịch tễ học bệnh  thalassemia

Theo ước tính của hiệp hội Thalassemia quốc tế (TIF), thế giới hiện nay có

khoảng 1,5% dân số thế giới là người lành mang gen bệnh β Thalassemia, và có

khoảng 100.000 trẻ sơ sinh với bệnh thiếu máu β thalassemia được sinh ra mỗi

năm (Colah, Gorakshakar et al. 2010). Bệnh thiếu máu β Thalassemia xảy ra phổ

biến nhất ở các nước Địa Trung Hải, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung Á và

Đông Nam Á, tập trung chủ yếu tại châu Phi, Ấn Độ và Đông Nam Á, trong đó có

Việt Nam.

1.2.3. Cơ chế bệnh sinh

Trong hội chứng Thalassemia có một hiện tượng chung nhất là sự thiếu hụt

một loại chuỗi polypeptit của phần globin, gây ra dư thừa tương đối loại chuỗi kia

(Cousens, Gaff et al. 2010). Hiện tượng này xảy ra ở các mức độ rất khác nhau phụ

thuộc vào từng thể bệnh, song hậu quả của nó gây ra:

- Giảm tổng hợp Hb do thiếu phần globin

- Mất cân bằng giữa các chuỗi α và “không α”

Người bình thường có hai gen β globinnằm trên 2 NST tương đồng số 11

(β/β). Nếu một trong hai gen này bị đột biến (dị hợp tử β+ thalassemia hoặc β0

thalassemia), được gọi là người mang gen bệnh hay còn gọi là thể nhẹ. Nếu đột biến

xảy ra ở cả hai gen trên hai NST được gọi là thể trung gian hoặc thể nặng tùy thuộc

vào mức độ gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β globin.

Tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả hai giới nam và nữ. Nếu bố và mẹ là mang

gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần sinh thai nhi là người lành

mang gen bệnh là 50%, thai nhi là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen

bệnh là 25%, thai nhi mắc bệnh β thalassemia thể nặng là 25%.

Hiện tượng thứ nhất: giảm tổng hợp Hb

Là hậu quả trực tiếp của việc thiếu hụt tổng hợp phần globin do thiếu một

loại chuỗi polypeptit nào đó nên làm giảm tổng hợp Hb. Biểu hiện là hồng cầu

nhược sắc và tăng sinh các hồng cầu non trong tủy. Ở các thể nhẹ, sự mất cân bằng

giữa chuỗi α và chuỗi β không nặng nề nên biểu hiện sự giảm tổng hợp Hb là không

rõ rệt.

Hiện tượng thứ hai: mất cân bằng giữa 2 loại chuỗi globin do thiếu hụt

một loại chuỗi globin nào đó.

Việc thiếu hụt một loại chuỗi globin này sẽ gây ra sự dư thừa tương đối loại

kia. Trong bệnh β Thalalassemia do thiếu hụt chuỗi β gây ra dư thừa chuỗi α globin.

Do tính chất lý hóa của các chuỗi α và “không α” khác nhau nên những rối

loạn do các chuỗi dư thừa gây ra cũng khác nhau. Các chuỗi α dư thừa tạo thành các

hạt tủa xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu. Với hồng cầu ở

máu ngoại vi, những hạt tủa này làm cho màng hồng cầu mất độ mềm dẻo, hồng cầu

trở thành tế bào cứng nên khó vượt qua các “màng lọc” ở lách. Mặt khác nó cũng

làm cho màng này tăng diện tiếp xúc, dễ bị các tác nhân oxy hóa và phá hủy. Đồng

thời còn làm thay đổi tính thấm của màng hồng cầu nên kali ở bên trong tế bào thoát

ra ngoài huyết tương. Những tác hại trên của các hạt tủa làm hồng cầu bị vỡ sớm

gây nên hiện tượng tan máu. Còn ở tủy xương, các hạt tủa trên gắn lên nguyên sinh

chất và màng của các hồng cầu non, làm cho hồng cầu bị chết trước khi trưởng

thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu non trong tủy, gây nên các biến dạng

xương, tăng hấp thu sắt gây ra nhiễm sắt cho cơ thể

Hình 1.2. Sơ đồ cơ chế bệnh sinh trong Thalassemia

(Nguồn : Dương Bá Trực. 1996).

Hiện tượng các hồng cầu non bị chết sớm không đến được giai đoạn trưởng

thành như trên gọi là hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu quả. Đây là cơ chế chủ

yếu gây ra những biến đổi về lâm sàng và huyết học ở những bệnh nhân β

Thalassemia thể nặng.

Việc đột biến gen dẫn đến không tổng hợp hoặc giảm tổng hợp chuỗi 

globin, thay vào đó là tăng sự tổng hợp các chuỗi  và các chuỗi  để tạo ra thành

HbF (22), tăng tổng hợp các chuỗi  và các chuỗi  để taọ thành HbA2 ( 22).

Vì vậy, người mang gen bệnh hoặc người bị bệnh  thalassemia sẽ có chỉ số HbF và

HbA2 cao hơn bình thường. Nếu cả hai gen  globin đều bị đột biến dần đến mất

chức năng hoàn toàn, không sản xuất được chuỗi  globin, khi đó gọi là 0

thalassemia, người bệnh không có HbA1. Nếu một trong hai gen  globin bị đột

biến nhưng vẫn sản xuất chuỗi  globin khi đó gọi là + thalassemia.  thalassemia

phối hợp với HbE tạo thành thể phối hợp  thalassemia/HbE. Thể này có hồng cầu F

từ 10-80% và HbE.

1.2.4. Đặc điểm lâm sàng bệnh β thalassemia

1.2.4.1. Thể nhẹ

Người mang  Thalassemia thể nhẹ thường chỉ mang 1 đột biến gen 

Thalassemia. Biểu hiện lâm sàng: có thiếu máu nhẹ, MCV nhỏ, HbA2 tăng cao từ

3,5 đến 8,0%; HbF thường nhỏ hơn 5%. Những đối tượng này không cần điều trị,

truyền máu.

1.2.4.2. Thể trung gian

Bệnh nhân  Thalassemia thể trung gian mang 2 đột biến gen  Thalassemia.

Biểu hiện lâm sàng: thiếu máu nhẹ hơn thể nặng nên thường phát hiện bệnh sau 2

tuổi. Nhiều trường hợp không cần phải truyền máu định kỳ, chỉ truyền máu khi Hb

< 70g/L. Xét nghiệm thường có Hb >7g/dl, HbF 20 - 100%, HbA2 < 7%. Bệnh nhân

cũng có thể biểu hiện bệnh rõ như lách to, gan to, biến dạng xương mặt, chậm phát

triển nếu bệnh diễn biến lâu và không được truyền máu đủ. Người có HbE/ 

Thalassemia thường cũng biểu hiện bệnh như thể trung gian. Các trường hợp 

Thalassemia thể trung gian là thể rất ít gặp, rất dễ bỏ sót vì các chỉ số dùng cho mục

đích sàng lọc bệnh Thalassemia không đặc trưng.

1.2.4.3. Thể nặng

 Thalassemia đồng hợp tử đa số là thể nặng, bệnh thường được phát hiện

sớm dưới 2 tuổi, thiếu máu nặng rõ, đòi hỏi phải truyền máu định kỳ, thường 2 - 4

tuần/ 1 lần. Xét nghiệm Hb thường < 7g/dl, HbA2 < 4; HbF >50%. Nếu không được

điều trị hoặc điều trị không đầy đủ sẽ biểu hiện rõ trên lâm sàng: bộ mặt huyết tán

mạn tính với mũi tẹt, gò má cao, bướu trán, bướu đỉnh, gan lách to, xạm da. Ở giai

đoạn muộn còn có các biến chứng như: chậm dậy thì, đái tháo đường, loãng xương,

suy tim... Những bệnh nhân này thường có tuổi thọ nhỏ hơn 20 tuổi (Khanh.1985,

Old, Traeger-Synodinos et al. 2005, Weatherall 2005). Một số trường hợp HbE/ 

Thalassemia biểu hiện như thể nặng.

1.2.5. Đặc điểm cận lâm sàng bệnh  thalassemia

1.2.5.1. Xét nghiệm công thức máu

Xét nghiệm công thức máu là xét nghiệm cơ bản đầu tiên trong việc phát

hiện người mang gen và bị bệnh Thalassemia nói chung và bệnh  thalassemia nói

riêng. Kết quả của xét nghiệm công thức máu đưa lại các chỉ số về thể tích trung

bình hồng cầu (MCV), số lượng huyết sắc tố trung bình tìm thấy trong các tế bào

hồng cầu của cơ thể (MCH), lượng huyết sắc tố trong một thể tích máu (Hb). Với

người mang gen bệnh hoặc bị bệnh Thalassemia, các chỉ số này đều giảm, mức độ

giảm phụ thuộc vào tùy từng dạng đột biến và số lượng đột biến xảy ra.

1.2.5.2. Điện di huyết sắc tố hemoglobin

Mục đích phương pháp điện di huyết sắc tố là tìm ra thành phần các

hemoglobin, đặc biệt chỉ ra các thành phần hemoglobin bất thường. Kết hợp với kết

quả của xét nghiệm công thức máu, sẽ bước đầu định hướng được thể bệnh

Thalassemia thường gặp. Đối với việc chẩn đoán bệnh Beta thalassemia, người

mang gen bệnh thường có chỉ số HbA2 ≥ 3,5%, chỉ số HbF tăng cao khi kiểu gen

của bệnh nhân là kết hợp dị hợp tử hai đột biến hoặc đồng hợp tử cùng một đột biến

nào đó. Hiện nay, phương pháp điện di huyết sắc tố Cellulo acetat pH 6,8 được sử

dụng rất phổ biến, cho phép xác định thành phần hemoglobin trong mẫu máu của

bệnh nhân. Tuy nhiên, đối với các trường hợp Beta thalassemia không điển hình,

phương pháp này không chỉ ra được các hemoglobin bất thường chiếm tỉ lệ ít, dẫn

đến việc có thể chỉ điểm cho các xét nghiệm chẩn đoán xác định không đúng

hướng.

Điện đi huyết sắc tố bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là một

phương pháp lý tưởng để khắc phục các nhược điểm trên, và cũng là phương pháp đã

được nhiều nơi sử dụng trong các chương trình sàng lọc người mang gen trong cộng

đồng cũng như sàng lọc sơ sinh.

1.2.6. Chẩn đoán bệnh  thalassemia

Theo tiêu chuẩn của hội Thalassemia quốc tế (TIF) 2003, chẩn đoán bệnh 

thalassemia ban đầu dựa vào các biểu hiện lâm sàng: tan máu, thiếu máu ở các mức

độ nhẹ, trung bình và nặng (Old, Traeger-Synodinos et al. 2005). Có thể có vàng da,

gan lách to, chậm lớn, bộ mặt thalassemia. Có thể có tiền sử truyền máu hoặc chưa

từng phải truyền máu.

Xét nghiệm công thức máu và diện di Hb đóng vai trò quan trọng trong chẩn

đoán bệnh ban đầu. Tất cả các trường hợp mắc bệnh đều có biểu hiện thiếu máu ở

các mức độ khác nhau: Hb 2,6-13,3g/dl; MCV<80fl, MCH<27pg. Cụ thể được trình

bày ở bảng 1.2.

Trước đây, bệnh  thalassemia được chẩn đoán xác định dựa vào đánh giá

chỉ số chuỗi α/β globin, khi chỉ số này tăng lớn hơn 1. Hiện nay chẩn đoán xác định

bệnh  thalassemia được chủ yếu dựa vào xét nghiệm di truyền phân tử phát hiện

đột biến gen β globin.

Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh  thalassemia.

Triệu chứng

Công thức máu

Hb

Điện di huyết

Kiểu gen

lâm sàng

MCV(fL), MCH(pg)

(g/dl)

sắc tô

+ β/ β

hoặc

MCV ↓

Thể nhẹ

10-13

HbA2 ↑, HbF↑

MCH ↓

0 β/ β

MCV ↓

Thể trung bình

7-10

HbA2 ↑, HbF↑↑

+ β

+ / β

MCH ↓

+ β

0 / β

hoặc

MCV ↓↓

Thể nặng

HbA2 ↑, HbF↑↑↑

MCH ↓↓

0 β

0 / β

1.3. ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN

1.3.1.Cấu trúc gen  globin

Bệnh β thalassemia là bệnh di truyền lặn theo nhiễm sắc thể thường. Gen mã

hóa cho chuỗi β globin nằm trên nhánh ngắn của NST số 11, vị trí 11p15.5, mỗi

NST chứa một gen β globin. Gen dài 1600 cặp base, mã hóa cho 146 acid amin.

Cho đến nay có hơn 200 đột biến đã được tìm thấy trên gen β globin. Dựa

vào ảnh hưởng của đột biến đến việc tổng hợp chuỗi β globin, đột biến trên gen β

globin được chia làm 2 nhóm: nhóm gây mất hoàn toàn số lưỡng chuỗi β globin,

làm mất chức năng của gen β globin gọi là nhóm β0 globin và nhóm làm giảm số

lượng chuỗi β globin được xếp vào nhóm đột biến gây β+globin. Đột biến trên gen

β globin mang tính chủng tộc, có nghĩa là mỗi nhóm dân tộc, vùng địa lý khác

nhau mang một nhóm đột biến khác nhau đặc trưng cho từng nhóm đó với tỷ lệ

khác nhau.

Cấu trúc gen β globin gồm các phần sau:

a. Vùng promotor hay vùng 5’ (vùng điều khiển): có trình tự nhận biết và vị

trí gắn với enzym RNA polymerase và các yếu tố phiên mã, promotor có chức năng

kiểm soát hoạt động của gen. Người ta quy ước vị trí nucleotid đầu tiên được phiên

mã sang mRNA (thường là Adenin) là +1, các nucleotid của vùng mang thông tin di

truyền mang dấu dương (về phía đầu 3’ hay downstream), các nucleotid vùng điều

khiển mang dấu âm (về phía đầu 5’ hay upstream). Trong cấu trúc của gen β globin,

vùng promotor kéo dài từ vị trí – 95 đến – 26 của gen. Có các trình tự quan trọng là

hộp TATA (ở vị trí -28 đến -31), hộp CCAAT (vị trí -72 đến -76) giúp các ribosom

nhận biết đúng vị trí khởi đầu dịch mã trên mRNA trong quá trình dịch mã.

b. Điểm khởi đầu phiên mã: có trình tự nucleotid ACATTTG, đây là vị trí

gắn của phân tử 7 methylguanosin để tạo “mũ” ở đầu 5’ phân tử mRNA’ Mũ là yếu

tố cần thiết cho các ribosom nhận biết trong sự khởi đầu dịch mã và tránh cho

mRNA không bị phân hủy bởi các enzym nuclease.

c. Bộ ba mở đầu: là ATG (sẽ phiên mã thành AUG ở mRNA), định vị sau

điểm khởi đầu phiên mã 50 cặp base. Đoạn 50 cặp base xen giữa điểm khởi đầu

phiên mã và bộ ba mở đầu là vùng không dịch mã, gọi là vùng 5’ UTR.

d. Exon thứ nhất: gồm 90 cặp base, mã hóa cho acid amin 1-30 của chuỗi β

globin.

e. Intron thứ nhất: gồm 130 cặp base, là đoạn không mang mã di truyền cho

β globin. Cấu trúc của intron này rất quan trọng, giúp hoàn thiện phân tử tiền

mRNA thành mRNA trưởng thành và đi ra bào tương để tổng hợp protein.

f. Exon thứ hai: gồm 222 cặp base, mã hóa cho acid amin 31-104.

g. Intron thứ hai: cấu tạo gồm 850 cặp base, không mã hóa cho cấu trúc của

phân tử β globin.

h. Exon thứ ba: gồm 126 cặp base, mã hóa cho acid amin 105-146 của chuỗi

β globin.

i. Bộ ba kết thúc: là TAA, bộ ba này được phiên mã thành UAA ở phân tử

mRNA. Ribosom sẽ tách ra tại vị trí này và phân tử protein được giải phóng.

j. Vùng không dịch mã 3’ (3’ UTR): mặc dù được phiên mã nhưng không

được dịch mã trong cấu trúc của protein. Có trình tự nucleotid là AATAAA, là vị trí

gắn đuôi poly A (gồm khoảng 200 đến 300 phân tử adenyl) để hoàn thiện phân tử

mRNA. Quá trình này giúp mRNA di chuyển ra bào tương và tham gia tổng hợp

protein.

Hình 1.3. Cấu trúc và quá trình tổng hợp chuỗi β globin

(Nguồn: https://678.com.vn/di-truyen-y-hoc/6.php)

1.3.2. Các dạng đột biến trên gen  globin và một vài cơ chế đột biến trong tổng

hợp chuỗi  globin

1.3.2.1 Đột biến trên gen  globin

a. Đột biến điểm

Khác với đột biến trên gen  globin chủ yếu là đột biến mất đoạn lớn, đột

biến trên gen  globin chủ yếu là đột biến điểm. Các đột biến này phân bố ở các

vùng khác nhau của gen như:

- Đột biến điểm tại vùng promotor

- Đột biến tại vùng cắt nối

- Đột biến trong các exon

- Đột biến ở vùng intron

- Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A

b. Đột biến mất đoạn lớn

Ngoài đột biến điểm, đột biến mất đoạn lớn xảy ra trên toàn cụm gen 

globin là đột biến hiếm gặp cũng đã được công bố (Thein and Weatherall 1989).

Đột biến mất đoạn 619bp tại vùng 3’ gen  globin là đột biến đã được tìm thấy ở Ấn

Độ và Pakistan (Spritz, Orkin. 1982). Các đôt biến mất đoạn lớn hiếm gặp khác

thông thường sẽ mất toàn bộ cả vùng 5’ promoter sẽ có chỉ số HbA2 và HbF tăng.

Cả hai thể mất đoạn lớn tồn dư huyết sắc tố (HPFH) và  đều do đột biến mất đoạn

cả hai gen  và  globin.

Đến nay, có hơn 200 đột biến đã được công bố. Mỗi nhóm dân tộc mang 1

nhóm đột biến đặc trưng cho từng nhóm dân tộc ấy. Bên cạnh đó, theo ước tính vẫn

có khoảng 1% đột biến gen  globin vẫn chưa xác định được (Thein. 1998).

1.3.2.2. Một vài cơ chế đột biến trong tổng hợp chuỗi  globin (Kazazian. 1990)

- Đột biến ảnh hưởng đến quá trình sao mã: các đột biến này có thể là các

thay đổi bộ ba mã hoá amino axit thành bộ ba kết thúc làm quá trình tổng hợp

mARN bị dừng lại gây 0 globin. Nếu đột biến này thuộc dạng thêm hoặc bớt vài

nucleotide ở vùng mã hoá sẽ gây lệch khung đọc mã hoá cho mARN. Nếu đột biến

này nằm trong bộ ba mã hoá mở đầu thì cũng sẽ gây ra ảnh hưởng tương tự. Một số

nghiên cứu đã chỉ ra rằng vị trí của đột biến vô nghĩa và đột biến gây lệch khung

đọc sẽ dẫn đến các biểu hiện lâm sàng. Ví dụ, kiểu gen dị hợp tử của đột biến xảy ra

ở vùng trình tự trước (exon 1 và 2) sẽ gần như không có biểu hiện lâm sàng, tuy

nhiên nếu đột biến với đột biến xảy ra ở vùng sau (late), tình trạng thiếu máu sẽ có

biểu hiện nặng hơn (Thein. 1998).

- Đột biến ảnh hưởng đến quá trình dịch mã: các đột biến này có thể làm mất

đi vị trí cắt nối thông thường, hoặc tạo ra vị trí cắt nối mới hình thành chuỗi mARN

bất thường gây dừng sản xuất chuỗi  globin. Các đột biến thuộc nhóm này có thể ở

vị trí khác như intron, exon gây ra việc giảm tổng hợp chuỗi  globin gây +

thalassemia.

+ Đột biến IVS1-1 (G-T) : xảy ra ở vùng intron 1, tại vùng cắt nối gây 0

globin. Đột biến là một trong các đột biến thường gặp ở Pakistani (Khateeb,

Moatter et al. 2000).

+ Đột biến c.-138 (C-T) gây + thalassemia. (Neishabury, Azarkeivan et al.

2011), (Chaudhary, Dhawan et al. 2017).

- Đột biến ảnh hưởng đến quá trình nối mARN: đột biến trên gen gây sai

hỏng mARN. Tuỳ thuộc vào phần của điểm nối còn nguyên vẹn hoặc bị biến đổi

hoàn toàn mà dẫn đến + thalassemia hay 0 thalassemia.

1.3.3. Tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình

Tương quan kiểu gen tạo ra kiểu hình rất đa dạng. Trước hết kiểu hình nặng

hay nhẹ phụ thuộc vào kiểu đột biến  Thalassemia. Thông thường đồng hợp tử 2

đột biến 0 là nặng nhất, còn nhẹ nhất là ++/++. Tuy vậy, kiểu hình còn bị ảnh

hưởng bởi các yếu tố khác như kết hợp với gen  Thalassemia, hoặc bị ảnh hưởng

các gen khác QTLs-Xmn1-G site, HbS1L- MB, BCL11A. Các yếu tố này làm cho

bệnh  Thalassemia bớt nặng hơn (Galanello, Ruggeri et al. 1983, Galanello,

Barella et al. 2002, Gabbianelli, Morsilli et al. 2008, Giordano, Bakker-Verwij et al.

2009, Nuntakarn, Fucharoen et al. 2009, Viprakasit, Lee-Lee et al. 2009). Một số

yếu tố làm bệnh nặng hơn như SNPs (Nuinoon, Makarasara et al. 2010). Kiểu gen

0/0 thường có kiểu hình thể nặng, kiểu gen ++/++ thường có kiểu hình thể trung

gian (Taher, Musallam et al. 2010). Mức độ biểu hiện nặng của bệnh có thể bị thay

đổi do kiểu gen mang đột biến kết biến  thalassemia, dẫn đến tăng số lượng chuỗi

 globin (Weatherall, Wainscoat et al. 1985).

Bảng 1.3. Kiểu hình, kiểu gen bệnh  thalassemia

(Nguồn: Musallam, Rivella et al. 2013)

Kiểu hình

Lâm sàng

Kiểu gen 0/ hoặc +/

- Triệu chứng lâm sàng

Nhẹ

-gen  tổn thương mức độ nhẹ và trung bình)

không rõ ràng - Hồng cầu nhỏ nhược sắc

- 0/+, +/+, với gen tổn thương

mức độ nhẹ - 0/+, +/, +/ với gen  tổn

thương mức độ trung bình - 0/0, +/+, 0/+ và xóa

đoạn hoặc không xóa đoạn 

Trung gian

thalassemia - 0/0, +/+, 0/+ và có khả

năng tăng tổng hợp chuỗi 

- Biểu hiện lâm sàng muộn - Thiếu máu nhẹ, trung bình - Không phụ thuộc truyền máu - Độ nặng lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến nặng

- Các thể xóa đoạn của 

thalassemia và tồn tại huyết sắc tố bào thai - +/ hoặc +/ và đa tổng

hợp chuỗi 

- Biểu hiện lâm sàng sớm

Nặng

00, ++, 0/+

- Thiếu máu nặng - Phụ thuộc truyền máu

1.3.4. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định các đột biến gen β globin

Với sự phát triển của sinh học phân tử, hiện nay có nhiều phương pháp giúp

xác định các đột biến gây bệnh β thalassemia như phương pháp giải trình tự gen, lai

các đoạn nucleotid đặc hiệu alen (allele-specific oligonucleotide hybridization-

ASO), hệ thống khuếch đại đột biến (amplification refractory mutation system-

ARMS), phản ứng khuếch đại chuỗi đặc hiệu allele (allele-specific PCR), kỹ thuật

đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (restriction fragment length polymorphism-

RFLP), kỹ thuật kéo dài chuỗi đơn (single bp extension-SBE), kỹ thuật đa hình hình

dạng các đoạn đơn (single-strDNA conformation polymorphism- SSCP), kỹ thuật

điện di trên gel theo gradient biến tính (denaturing gradient gel electrophoresis-

DGGE), kỹ thuật điện di trên gel phụ thuộc nhiệt độ và thời gian (temporal

temperature gel electrophoresis- TTGE),...

Bảng 1.4. Các kĩ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong phát hiện

đột biến gen gây bệnh  thalassemia.

Tác giả

. ĐỘT BIẾN ĐÃ BIẾT

Realtime PCR

(Pornprasert and Sukunthamala. 2010) (Cremonesi, Ferrari et al. 2007) (Colosimo, Guida et al. 2003)

(Winichagoon, Saechan et al. 1999)

Microarrays dHPLC (denaturing high performance) ARMS (amplification refractory mutation system) (Bartlett. 2003) RDB (reverse dot blots) MS-PCR (multiplexing mutagenically separated PCR )

(Chang, Chen et al. 1992)

(Craig, Barnetson et al. 1994)

(Chang, Chen et al. 1992) (Conner, Reyes et al. 1983)

RFLP (restriction fragment length polymorphism analysis) A-RFLP (artificial-restriction fragment length polymorphism) ASO (allele specific oligonucleotide) ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN ĐÃ BIẾT

Realtime PCR

Gap-PCR

(Pornprasert and Sukunthamala 2010) (Faa, Rosatelli et al. 1992)

ĐỘT BIẾN CHƯA BIẾT

MLPA (multiplex ligation-dependent probe

amplification) DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) Chemical cleavage of mismatch

(Harteveld, Voskamp et al. (2005) (Gorakshakar, Pawar et al. 1999) (Dianzani, Forrest et al. 1991)

Có rất nhiều labo trên thế giới đã ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử

trong việc phát hiện các đột biến gây β thalassemia và việc chẩn đoán trước sinh đã

được tiến hành rộng rãi. Việc lựa chọn phương pháp nào tùy thuộc vào mục đích

nghiên cứu, ứng dụng và điều kiện của từng labo và quốc gia đó.

Từ 2010, việc ra đời của máy giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation

Sequecing) đã tạo ra một cuộc cách mạng trong việc giải trình tự gen, nâng cao

năng suất phân giải, tìm đột biến và cho cái nhìn toàn diện về tỷ lệ đột biến cho bất

cứ bệnh di truyền nào (Aziz, Ahmed et al. 2017), (Chaudhary, Dhawan et al..

2017), (He, Song et al. 2017).

1.3.4.1. Amplification refractory mutation system (ARMS-PCR)

Kỹ thuật ARMS-PCR sử dụng để phát hiện sự có mặt của alen mang đột biến

điểm đã biết. Mỗi phản ứng sử dụng các mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với

alen đột biến và một mồi chung ngược chiều với mồi đặc hiệu alen. Như vậy, trong

mỗi phản ứng cho một đột biến điểm đã biết sẽ bao gồm hai phản ứng khuếch đại,

sử dụng cùng một khuôn DNA. Trong đó, một sản phẩm sẽ được khuếch đại từ mồi

đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến (mồi đột biến) hoặc alen bình

thường (bình thường), và sản phẩm còn lại được khuếch đại từ một mồi chung

ngược chiều với mồi đặc hiệu allen. Sự hiện diện của các alen đột biến được biểu

hiện bằng sản phẩm DNA khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước.

Hình 1.4. Nguyên lý kĩ thuật ARMS-PCR

1.3.4.2. Restriction enzym (RE-PCR)

Đây là một phương pháp hay được sử dụng để phát hiện đột biến trên gen β

globin vì phần lớn đột biến trên gen này là đột biến điểm (Chang, Chen et al. 1992).

Sản phẩm PCR được cắt bằng enzym giới hạn có thể bị cắt hoặc không bị cắt tùy

vào tại vị trí đó có xuất hiện đột biến hay không. Tuy nhiên, hạn chế của phương

pháp này là chỉ phát hiện được từng đột biến riêng lẻ, không tiến hành xác định

được nhiều đột biến trong cùng 1 phản ứng. Hơn nữa giá thành của enzyme cắt khá

cao nên thời gian thực hiện sẽ bị kéo dài hơn, giá thành cao hơn.

1.3.4.3. GAP-PCR

Kỹ thuật sử dụng hai mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch xuôi và mạch

ngược trong vùng DNA chứa đoạn gen bị mất. Với các đột biến mất đoạn có kích

thước nhỏ hơn 1 kb, cặp mồi sẽ tạo ra hai sản phẩm, đoạn nhỏ hơn là sản phẩm từ

allen bị mất đoạn. Với những đột biến mất đoạn lớn, khoảng cách giữa hai mồi quá

lớn để có thể khuyếch đại được alen bình thường, mà chỉ có thể khuyếch đại sản

phẩm từ alen mang đột biến mất đoạn. Trong trường hợp này alen bình thường sẽ

được khuyếch đại thông qua một điểm đứt gãy của đột biến, sử dụng một mồi theo

nguyên tắc bổ sung với trình tự bị mất và một mồi khác theo nguyên tắc bổ sung với

đoạn DNA còn lại. Với alen bình thường, khoảng cách giữa hai mồi quá lớn nên

không tạo ra được sản phẩm PCR. Với alen có đột biến, khoảng cách này đủ ngắn

để tạo nên sản phẩm PCR đặc hiệu cho đột biến mất đoạn ấy.

Kỹ thuật GAP-PCR, hay còn gọi là PCR khoảng cách được sử dụng để phát

hiện lớn, hiếm gặp trên gen β globin, thường là các đột biến mất đoạn toàn bộ gen β

globin và các vùng gen bên cạnh (Craig, Barnetson et al. 1994, Xu, Li et al. 2000),

Bartlett. 2003, Harteveld, Voskamp et al. 2005). Đây là kỹ thuật nhanh, đơn giản,

tuy nhiên hạn chế của kỹ thuật này là cần phải biết được điểm đứt gãy mới thiết kế

được cặp mồi tương ứng.

1.3.4.4. Giải trình tự gen Sanger

Nguyên tắc của phương pháp Sanger là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn, hơn

kém nhau 1 nucleotide, được kết thúc bằng các ddNTPs đã được đánh dấu huỳnh

quang. Chuỗi được liên tục kéo dài do sự kết hợp ngẫu nhiên của các ddNTP, kèm theo

sự có mặt của DNA polymersase và mồi là các chuỗi oligonucleotid dài khoảng 20bp

được thiết kế theo nguyên tắc bổ sung với vùng DNA đích cần quan tâm. Thông

thường các ddNTP được đánh dấu 4 màu huỳnh quang khác nhau. Đối với phương

pháp này, hệ thống điện di thường sử dụng là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch

điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu

huỳnh quang tương ứng, từ đó máy sẽ nhận diện được các nucleotid, từ đó biết được

trình tự của DNA đích. Phương pháp này cho phép xác định hầu hết các đột biến điểm,

đột biến mất đoạn nhỏ hoặc lặp đoạn của gen. Các phân tử này sẽ được tách nhau ra

trong quá trình điện di mao quản. Mục đích của phương pháp này là để phát hiện

các đột biến điểm. Đây được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán các bệnh lý di

truyền Thein, Hesketh et al. (1989).

Trong quy trình chẩn đoán bệnh  thalassemia, vì phần lớn các đột biến trên

gen β globin là đột biến điểm nên phương pháp giải trình tự gen Sanger được áp

dụng.

Phương pháp này có ưu điểm là có thể phát hiện toàn bộ đột biến trên gen β

globin trong cùng 1 phản ứng, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

1.3.4.5. Kỹ thuật Hybrdization StripAssay

Kỹ thuật lai phân tử StripAssay là phương pháp kết hợp của kỹ thuật

Multiplex PCR và lai DNA ngược. Trên thanh lai Strip có đính nhiều đầu dò để

phát hiện đồng thời nhiều đột biến và xác định kiểu gen đồng hợp/dị hợp của đột

biến (Winichagoon, Saechan et al. 1999). Các đầu dò đặc hiệu cho alen đột biến và

alen bình thường được gắn cố định trên các dải nitrocenlullose có màng nilon. Sản

phẩm DNA được đánh dấu bằng biotin-16-dUTP trong các phản ứng khuếch đại.

Các sản phẩm này được lai với các đầu dò đặc hiệu alen đột biến và alen bình

thường. Sau khi rửa, sản phẩm lai đặc hiệu ở trên băng vạch của thanh lai được phát

hiện bằng mắt thường (Conner, Reyes et al. 1983).

1.3.4.6. Kỹ thuật ASO (allele specific oligonucleotide)

Kỹ thuật dot blot (DB) hoặc reserve dot blot (RDB) lần lượt được (Saiki,

Walsh et al. 1989), sử dụng một mạch đơn trong phân tử DNA của trình tự đã được

xác định (oligoprobe) để lai với phân tử DNA thứ hai chứa trình tự đích theo

nguyên tắc bổ sung (target) với mức độ ổn định tùy thuộc vào chiều dài của các cặp

base tham gia vào phản ứng. Cả hai phương pháp DB và RDB có điểm chung là đều

cần khuếch đại đặc hiệu một đoạn DNA, là đoạn cần được lai với ASO probe đã

được cố định sẵn trên màng (RDB) hoặc probe đã được đánh dấu phóng xạ được cố

định trên màng dạng dot blots có sẵn (DB). Tuy nhiên hai phương pháp này có

những điểm khác nhau. Đối với DB, mỗi một probe trong một phản ứng cần được

lai và rửa trong một điều kiện khác nhau, và có thể phát hiện một loại đột biến của

nhiều mẫu trên cùng một màng. Ngược lại đối với RDB sử dụng probe không đánh

dấu phóng xạ, thì các đột biến khác nhau chỉ cần lai và rửa tại cùng một điều kiện,

và cho phép phát hiện nhiều đột biến của cùng một mẫu trên cùng một màng.

1.3.4.7. Kỹ thuật Real time PCR

Phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực (Real time PCR) hay còn được gọi là

phản ứng tổng hợp chuỗi định lượng là một kĩ thuật về sinh học phân tử được sử

dụng trong phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain

reaction-PCR), kĩ thuật này được sử dụng nhằm khuếch đại và cùng lúc xác định

được số lượng của phân tử DNA đích.

Quy trình thí nghiệm theo nguyên tắc thông thường của phản ứng tổng hợp

chuỗi, trong đó đặc điểm chính là đoạn DNA được nhân lên sẽ được phát hiện trong

thời gian thực (real time). Đây là phương pháp tiếp cận mới so với phản ứng PCR

thông thường khi mà sản phẩm chỉ được xác định khi phản ứng đã kết thúc. Hai

phương pháp phổ biến để xác định được sản phẩm trong PCR định lượng đó là: (1)

các dye phát huỳnh quang không đặc hiệu gắn vào bất kỳ đoạn DNA mạch đôi nào

đó, và (2) các đầu dò DNA đặc hiệu có chứa các đoạn oligonucleotide đã được đánh

dấu với chất báo cáo phát huỳnh quang, từ đó cho phép phát hiện chỉ khi có sự lai

giữa đầu dò với một trình tự bổ sung với nó, nhằm định lượng được RNA thông tin

(mRNA) và các RNA không mã hóa trong các tế bào cũng như các mô.

1.3.4.8. Kỹ thuật Micoarray

DNA microarray (thông thường được biết đến với tên gọi DNA chip hay

chip sinh học) là một tập hợp các điểm DNA siêu nhỏ được gắn trên một giá thể

rắn. Các nhà khoa học sử dụng DNA microarray để đo một cách đồng thời mức độ

biểu hiện của lượng lớn gen hoặc các vùng đa gen của hệ gen. Mỗi điểm DNA chứa

hàng picomoles (10-12 moles) của một trình tự gen đặc hiệu, được biết đến như các

mẫu dò (probes hoặc reporters hay oligos). Chúng có thể là một đoạn ngắn của một

gen hoặc một yếu tố DNA khác, được sử dụng để lai với một DNA hoặc RNac (hay

RNA anti-sense) (được gọi là đích) dưới điều kiện nghiêm ngặt. Sự lai mẫu dò –

đích thường được phát hiện và định lượng bởi các chất đánh dấu huỳnh quang

(fluorophore-labeled), bạc (silver-labeled) hoặc sự phát quang bằng phản ứng hóa

học (chemiluminescence-labeled) để xác định mức độ lặp lại của các trình tự acid

nucleic trong đích.

Nguyên lý hoạt động mấu chốt của microarray là sự lai giữa hai chuỗi

DNA, đặc tính của trình tự acid nucleic là bắt cặp bổ sung một cách đặc hiệu với

chuỗi còn lại do hình thành liên kết hydro giữa các cặp bazơ nitơ bổ sung. Sau

khi rửa các trình tự gắn không đặc hiệu, chỉ có những chuỗi bắt cặp mạnh mẽ sẽ

được giữ lại. Các trình tự đích được đánh dấu huỳnh quang gắn với đầu dò cho

tín hiệu phụ thuộc vào điều kiện lai (ví dụ như nhiệt độ) và điều kiện rửa sau lai.

Độ mạnh của tín hiệu tại một điểm phụ thuộc vào lượng mẫu đích gắn với đầu

dò. Microarray sử dụng định lượng tương đối khi mà cường độ của một điểm đặc

trưng được so sánh với điểm giống như vậy ở trong điều kiện khác nhau

(Tritipsombut, Sanchaisuriya et al. 2012).

Kĩ thuật này hiện nay đang rất thu hút được rất nhiều sự quan tâm, ứng dụng

của các nhà sinh học. Tuy nhiên vì giá thành cao, đồng thời yêu cầu thiết bị máy

móc đắt nên chưa được phổ biến rộng rãi.

1.3.5. Phát hiện người lành mang gen bệnh

Mục tiêu của sàng lọc là phát hiện người mang gen β globin bị đột biến hay còn

gọi là người mang gen bệnh, từ đó biết nguy cơ sinh con bị bệnh của các cặp vợ chồng

nếu đồng thời là người mang gen bệnh. Các cặp vợ chồng này sẽ được tư vấn di truyền,

nguy cơ sinh con bị bệnh của mỗi lần sinh là 25%.

Người mang gen bệnh  thalassemia hay còn gọi là người lành mang gen

bệnh (carrier) là những người chỉ mang một đột biến dị hợp tử trên gen β globin.

Nguy cơ mắc bệnh của các anh chị em ruột của bệnh nhân bị  thalassemia thể nặng

là 25%, do đó các thành viên trong của gia đình có bệnh nhân β thalassemia nên

được tiến hành xét nghiệm di truyền để sàng lọc đột biến gen β globin. Những thành

viên này không những nên làm sàng lọc các đột biến đã được chỉ điểm trên bệnh

nhân thể nặng trong gia đình, mà còn phải sàng lọc các đột biến khác trong số các

đột biến thường gặp của vùng miền đó để tránh bỏ qua các đột biến gây + . Các đột

biến này có thể tạo kiểu hình là thể trung gian ở biểu hiện lâm sàng, rất khó phân

biệt với thể nhẹ của người mang gen chỉ bị 1 đột biến trên gen β globin.

Có hai phương pháp sàng lọc: sàng lọc quần thể và sàng lọc đích. Sàng lọc quần thể

được áp dụng cho quần thể lớn bằng các kĩ thuật sàng lọc đơn giản, thuận tiện. Đối

tượng cho sàng lọc quần thể thường là các cặp vợ chồng chuẩn bị cưới, phụ nữ có

thai hoặc trẻ em ở các trường mẫu giáo, trung học. Sàng lọc đích chỉ nên thực hiện

trên các đối tượng bệnh nhân đã qua sàng lọc quần thể, là người có nguy cơ bị bệnh

hoặc là người mang gen bệnh. Việc đưa ra 1 tập hợp các đột biến hay gặp trong 1

quần thể nhất định và kỹ thuật thực hiện sàng lọc đột biến ở mức độ sinh học phân

tử rất quan trọng để có tính khả thi khi thực hiện trên số lượng quần thể lớn

(Mitchell, Capua et al. 1996, Lau, Chan et al. 1997, Ma, Chan et al. 2001)

1.4. CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA

Hiện nay chưa có biện pháp điều trị đặc hiệu bệnh  thalassemia. Các bệnh

nhân bị  thalassemia thể nặng cần được truyền máu và thải sắt thường xuyên,

ảnh hưởng đến sự phát triển thể chất lâu dài (NC Khanh, Thu et al. 1990, BDTrực.

1996, Wonke. 2001, HV Ngọc. 2007, Viprakasit, Lee-Lee et al. 2009, Cao and

Galanello. 2010, Colah, Gorakshakar et al. 2010, Weatherall. 2010, Surapon.

2011, Sivalingam, Looi et al. 2012). Việc điều trị này rất tốn kém gây gánh nặng

cho gia đình bệnh nhân và xã hội.

Bệnh  thalassemia hoàn toàn có thể dự phòng được bằng cách sàng lọc và

chẩn đoán xác định những người mang gen bệnh để được tư vấn di truyền trước hôn

nhân và chẩn đoán trước sinh. Với cặp vợ chồng nếu phát hiện thấy là người mang

gen bệnh sẽ có nguy cơ sinh em bé bị bệnh thể nặng. Chẩn đoán trước sinh cho thai

nhi có nguy cơ cao mắc β thalassemia thể nặng chỉ đã biết các thông tin về đột biến

của bố mẹ và sàng lọc trên các đột biến đã được chỉ điểm. Chẩn đoán trước sinh cho

thai nhi có nguy cơ mắc các bệnh di truyền đều thực hiện dựa trên phân tích DNA

của thai nhi. Nguồn DNA phổ biến được sử dụng trong chẩn đoán trước sinh được

tách chiết từ mẫu dịch ối sau nuôi cấy. Có hai phương pháp lấy mẫu để thực hiện

xét nghiệm chẩn đoán trước sinh là phương pháp có can thiệp và phương pháp

không can thiệp thai. Phương pháp có can thiệp là sử dụng mẫu bệnh phẩm là dịch

nước ối và mẫu gai rau của sản phụ. Phương pháp không can thiệp là phương pháp

sử dụng các kĩ thuật siêu âm, xác định đột biến thai nhi từ mẫu máu của mẹ nhờ các

DNA tự do của thai....

1.4.1. Dịch nước ối

Từ những năm 1960, kỹ thuật chọc hút dịch ối đã được áp dụng cho chẩn

đoán trước sinh khi thai ở ba tháng giữa của thai kỳ (15-19 tuần). Hiện nay vẫn

đang là kỹ thuật có xâm lấn phổ biến nhất được sử dụng để chẩn đoán trước sinh

các thai nhi có nguy cơ mắc bệnh di truyền. Kỹ thuật này nhanh chóng được nhân

rộng trên toàn thế giới với tính an toàn được cải thiện rõ rệt khi kết hợp dưới

hướng dẫn của siêu âm. Chọc hút dịch ối trở thành thủ thuật được thực hiện

thường quy bắt đầu từ tuần thai thứ 16. Khoảng 16-20ml được hút ra từ buồng ối

bao xung quanh thai nhi, thông qua một kim nhỏ xuyên qua thành bụng dưới

hướng dẫn của siêu âm.

Tỷ lệ tai biến do thủ thuật chọc ối ở tuần thai thứ 16 được thông báo vào

khoảng 0,5-1% (Tongsong, Wanapirak et al. 1998), nhưng trên thực tế tỷ lệ này có

thể thấp hơn nhiều ở các trung tâm lớn với nhiều kinh nghiệm. Chọc ối ở ba tháng

đầu của thai kỳ được coi là có nguy cơ sảy thai cao hơn so với chọc ối ở ba tháng

giữa. Bất lợi chính của thủ thuật chọc ối là thời điểm chẩn đoán muộn. Số lượng

dịch ối đôi khi không đủ lượng DNA cần thiết cho chẩn đoán, cần phải nuôi cấy tế

bào cho đến khi đủ lượng tế bào cần thiết, làm chậm thêm thời gian trả kết quả

(Tabor, Philip et al. 1986).

Hình 1.5. Thủ thuật chọc ối trong chẩn đoán trước sinh.

(Nguồn: http://sangloctruocsinh.vn)

1.4.2. Mẫu gai rau

Mục tiêu của sinh thiết gai rau (CVS) là để thu được một mẫu bệnh phẩm

nhỏ từ bánh rau đang phát triển, nơi mang cùng một bản chất di truyền với thai nhi.

Sinh thiết gai rau được thực hiện bằng một catheter đi qua cổ tử cung với những

thai từ 10-11 tuần tuổi (Schutz, Bredow et al. 1985). Gần đây, sinh thiết gai rau

xuyên thành bụng được ứng dụng ngày càng rộng rãi. Phương pháp này sử dụng

kim sinh thiết xuyên qua thành bụng dưới hướng dẫn của siêu âm, hút ra một mảnh

gai rau nhỏ. Thủ thuật có thể được áp dụng cho thai ở bất kỳ thời điểm nào bắt đầu

từ 11 tuần tuổi trở lên. Hiện nay, với sự phát triển của siêu âm với độ phân giải cao,

thủ thuật sinh thiết gai rau qua thành bụng có thể được thực hiện cho thai từ 6 tuần

tuổi, và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Mẫu bệnh phẩm gai

rau có nhiều ưu thế, do có thể thực hiện ở ngay ba tháng đầu của thai kỳ. Điều này

giải quyết được vấn đề tâm lý cho các sản phụ không phải chờ đợi kết quả chẩn

đoán muộn, và nguy cơ về biến chứng và tâm lý khi phải dừng thai ở tuần thai lớn.

Kỹ thuật này cũng cho phép thu nhận được nhiều tế bào của thai nhi hơn so với

những loại bệnh phẩm khác, và kết quả của chẩn đoán sẽ thu được cũng sẽ nhanh

hơn, chỉ trong vài ngày. Nguy cơ gây sảy thai của thủ thuật CVS được thông báo

nằm trong khoảng từ 0,5-4,5% (Rhoads, Jackson et al. 1989). Tuy nhiên, nguy cơ

này thay đổi còn tùy thuộc vào mức độ thành thạo của người thực hiện, và số lần

sinh thiết để có được đủ số lượng bệnh phẩm. Nếu thủ thuật được thực hiện bởi

người có kinh nghiệm, tỷ lệ sảy thai có thể giảm xuống 0,5-1% (Jauniaux, Watson

et al. 2000)

Hình 1.6. Thủ thuật lấy bệnh phẩm trong chẩn đoán trước sinh

(Nguồn: http://sangloctruocsinh.vn)

1.4.3. Chẩn đoán tiền phôi

Chẩn đoán trước sinh thông thường, dù bằng phương pháp phân tích DNA

hay bằng siêu âm, thì cũng chỉ thực hiện được khi thai khoảng 11-18 tuần. Quyết

định phải đình chỉ thai trong trường hợp thai bệnh thường rất khó khăn cho gia

đình, đặc biệt khi thai đã ở vào kỳ giữa của thai kỳ. Ngoài ra, các cặp vợ chồng khi

có vấn đề về sinh sản, hoặc đã có tiền sử phải đình chỉ thai sau khi chẩn đoán trước

sinh phát hiện thai bệnh, có thể muốn cân nhắc về khả năng làm chẩn đoán tiền phôi

và chỉ những phôi được chẩn đoán không mắc bệnh mới được lựa chọn để đưa vào

tử cung của người mẹ. Người mẹ có nhu cầu làm PGD sẽ cần trải qua một đợt điều

trị nội tiết để kích thích có được nhiều trứng, sau đó trứng sẽ được thu hoạch để đưa

vào làm thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF). Phôi được nuôi cấy trong

60h đến giai đoạn 8 phôi bào. Sau đó 2 tế bào blastocytes được sinh thiết khỏi từng

phôi và được đưa vào từng tube eppendorf riêng biệt cho chẩn đoán di truyền.

Hiện nay, việc đưa chẩn đoán tiền phôi cho các bệnh lý di truyền đã trở nên

rộng rãi và thành công ở rất nhiều nước phát triển. Ở Việt Nam, đã triển khai thành

công với 1 số bệnh lý di truyền như: β thalassemia,  thalassemia, Hemophilia A,

loạn dưỡng cơ Duchenne…

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH  THALASSEMIA TẠI VIỆT NAM

Các nghiên cứu về  thalassemia ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào tỷ lệ

mang gen bệnh, các thay đổi về huyết học, lâm sàng và điều trị bệnh. Chúng tôi tìm

được những tài liệu hữu ích sau đây.

Bảng 1.5. Tình hình mang gen bệnh  thalassemia tại Việt Nam

Nghiên cứu

Địa phương

Dân tộc

Tỷ lệ mang gen bệnh (cid:0) thalassemia

Số nghiên cứu

Nguyễn Công Khanh

Hà Nội

Việt

401

1,49

Nguyễn Công Khanh

Miền Bắc

Tày

119

11,0

Mường

266

20,6

Bùi Văn Viên và CS

Nùng

7,1

Nguyễn Công Khanh

Thái

236

11,4

Đ.T.M Cầm và CS

Pako

228

8,33

Nguyễn Đắc Lai

Vân Kiều

2,56

Dương Bá Trực

Êđê

371

1,0

10,7

Nùng và Tày

Vũ Thị Bích Vân

Thái Nguyên

Hoàng Văn Ngọc

Thái Nguyên

Tày

9,6

Dao

9,8

Nguyễn Thị Kiều Giang

Thái Nguyên

Tày

300

Nguyễn Khắc Hân Hoan Miền Nam

44.439

0,52

Kinh

Trần Thị Thúy Minh

Êđê

588

0,2

561

M’mông

3,7

(Nguồn: NC Khanh. 1985, Thu et al. 1990, BV Viên. 2001, HVNgọc. 2007,

NKHHoan. 2013, TTTMinh. 2015).

Tuy nhiên các nghiên cứu về đặc điểm phân tử về kiểu của bệnh, kiểu gen

trên đối tượng là người mang gen bệnh, bệnh nhân  thalassemia nhằm ứng dụng

vào chẩn đoán trước sinh chưa nhiều và với cỡ mẫu không nhiều.

Tổng hợp các nghiên cứu về kiểu gen β globin của người Việt Nam từ các

nghiên cứu của Filon.2000, LT Hao. 2001 và Svasti. 2002 bước đầu cho thấy đặc điểm

của các loại đột biến  thalassemia mô tả ở bảng 1.6.

Bảng 1.6. Tỉ lệ các loại đột biến  thalassemia ở người Việt Nam.

Nghiên cứu

Tổng số

Svasti

Hao

Filon

Đột biến

Alen

Tỉ lệ (%)

2002

2001

2000

(n = 120)

n = 68

n = 23

n = 29

CD41/42 –TCTT

36,7

CD 17 AAG>TAG

28,3

CD 95 +A

9,2

IVS 2-654 C>T

6,7

CD 71/72 +A

6,7

-28 A>G

5,0

IVS 1-1 G>T

4,2

Không rõ

2,5

(Nguồn: Filon, Oppenheim et al. 2000, Hao, Pissard et al. 2001, Saovaros Svasti,

Hieu et al. 2002)

CHƯƠNG 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành tại Bệnh Viện Nhi Trung Ương trong thời gian từ

1/2013 đến tháng 12/2017.

Địa điểm thu thập mẫu máu: Khoa Di truyền và sinh học phân tử, Bệnh viện

Nhi Trung ương.

Địa điểm thu thập mẫu dịch ối: Bệnh viện phụ sản Hà Nội và phụ sản Trung

ương.

2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.2.1. Nhóm bệnh nhân bị bệnh  thalassemia thể nặng

Nhóm bệnh nhân bị bệnh  thalassemia thể nặng đã được chẩn đoán sàng lọc

dựa trên các kết quả cận lâm sàng: công thức máu tổng quát và điện di huyết sắc tố.

Các bệnh nhân này thường có biểu hiện lâm sàng: da xạm, gương mặt điển hình bị

Thalassemia, xương mặt có thể biến dạng, truyền máu thường xuyên tùy thuộc từng

cá thể, độ tuổi bắt đầu truyền máu tùy thuộc kiểu gen…

Số lượng bệnh nhân thể nặng đã thu thập được mẫu trong nghiên cứu này là

214 bệnh nhân.

2.2.2. Nhóm người mang gen bệnh  thalassemia

Nhóm người mang gen bệnh  thalassemia. Nhóm này phần lớn là bố mẹ của

các bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định bằng phương pháp sinh học phân tử,

phát hiện đột biến gây bệnh trên gen β globin. Phần còn lại là những đối tượng nghi

ngờ là người mang gen bệnh dựa vào sàng lọc theo phương pháp của nhóm 1.

Số lượng người mang gen bệnh đã thu thập được mẫu trong nghiên cứu này

là 354 người.

2.2.3. Nhóm làm chẩn đoán trước sinh

Các cặp vợ chồng đã có con đầu đã được chẩn đoán xác định mắc 

thalassemia thể nặng và đã xác định được đột biến trên gen β globin.

Số lượng thai phụ tham gia chẩn đoán trước sinh trong nghiên cứu này

là 178.

2.3. TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN BỆNH NHÂN

Theo tiêu chuẩn của tổ chức Thalassemia quốc tế TIF 2003 (Cappellini,

Cohen et al. 2014) đã được trình bày ở bảng 1.2.

2.4. TRANG THIẾT BỊ CẦN THIẾT

 Box an toàn sinh học bậc 1

 Máy ly tâm cho ống ly tâm 1.5 mL

 Tủ lạnh -20C, -80C, 4C

 Máy ổn nhiệt 56C

 Máy PCR (Eppendorf)

 Hệ thống điện di nằm ngang

 Máy lắc

 Pipettes, 20 uL, 200 uL và 1 mL

 Ống PCR 0.2ml và 0.5 mL

 Ống Eppendorf 1.5 mL

 Filter tip 100ul, 100ul, 10ul

2.4.1. Trang thiết bị

 QiaAmp DNA blood mini kit

2.4.2. Hóa chất

250 phản ứng/ kit. QIAGEN (Đức). CAT. NO. 51106

 100% Ethanol

Lưu trữ tại phòng Tách chiết DNA. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

1000ml/ Chai. Merck (Đức)

Lưu trữ tại phòng Tách chiết DNA. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

 70% Ethanol:

Pha 700ml Ethanol và thêm nước đến 1000ml.

 Nước không chứa Nuclease (DNAase/ RNAase free water)

Lưu trữ tại phòng Điện di. Bảo quản ở nhiệt độ -20oC

1000ml/ Chai. QIAGEN (Đức). CAT. NO. 129115

 2X PCR Master mix green

Lưu trữ tại phòng Pha hóa chất. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

25ml/lọ. Promega

 Agarose

Lưu trữ tại phòng Pha hóa chất. Bảo quản ở nhiệt độ -20C.

 10X Blue juiceTM (Loading dye)

500g/ Chai. BIONEER. CAT.NO. C9100-1

INVITROGEN. CAT. NO. 10816-015

 Ultra pureTM 10X TBE buffer

Lưu trữ tại phòng Điện di. Bảo quản ở nhiệt độ 40o C.

1000ml/ Chai. INVITROGEN. CAT. NO. 15581-044

 Ethidium Bromide

Lưu trữ tại phòng Điện di. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

10mg/ml. INVITROGEN. CAT. NO.

 100bp DNA Ladder (1.0UG/UL)

Lưu trữ tại phòng Điện di. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

10ug/ 50ul. INVITROGEN. CAT. NO. 15628-019.

Pha Ladder theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

 Qiaquick PCR purification

Lưu trữ tại phòng Điện di. Bảo quản ở nhiệt độ 4oC

250 reactions/ packet. QIAGEN. CAT. NO.

 Mồi (5'-3') INVITROGEN

Lưu trữ tại phòng Điện di. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Pha mồi lưu trữ (stock) nồng độ 100uM và mồi sử dụng (working) nồng độ

10uM dùng trong các phản ứng.

Lưu trữ tại phòng Pha hóa chất. Bảo quản ở nhiệt độ -20C.

Bảng 2.1. Tên và trình tự mồi sử dụng trong quy trình xác định 09 đột biến

trên gen β globin

Tên mồi

Trình tự mồi

Thal B

5’-ACC TCA CCC TGT GGA GCC AC-3’

CD17N

5’-CAC CAC CAA CTT CAT CCA CGT TCA CCA T-3’

CD17M

5’-CTC ACC ACC AAC TTC ATC CAC GTT CAG CTA-3’

IVS1-1N(G-T)

5’-AAA CCT GTC TTG TAA CCT TGA TAC CAAC-3’

IVS1-1M(G-T)

5’-TTA AAC CTG TCT TGT AAC CTT GAT ACG AAA-3’

IVS1-5N

5’-CCT TAA ACC TGT CTT GTA ACC TTG ATAC-3’

IVS1-5M

5’-CTC CTT AAA CCT GTC TTG TAA CCT TGT TAG-3’

-28N

5’-CAG GAG CCA GGG CTG GGC ATAA-3’

-28C

5’-CAGGGCAGTAACGGCAGACTTC-3’

-28M

5’-GCA ATA GAT GGC TCT GAC CTG ACTAC-3’

CD41/42N

5’-GAG TGG ACA GAT CCC CAA AGG ACT CAA AGA-3’

CD41/42M

5’-GAG TGG ACA GAT CCC CAA AGG ACT CAA CCT-3’

CD26 N (HbE)

5’-TAA CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG GGC CTC-3’

CD26 M (HbE)

5’ -TAA CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG GGC GTT-3’

Thal HBE

5’- GTTTACCTCACCCTGTGGAGCCAC-3’

IVS2-654N (C-T)

5’-GAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAATGC -3’

IVS2-654 M

5’-GAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAACGT -3’

THAL F

5’-TAGAAATTGGACAGCAAGAAAGC-3’

BTC95N

5'-TGAGTGAGCTGCACTGTGACAAG-3'

BTC95M

5'-ACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAAG-3'

BT-C

5'-TTCTCTGTTTCCCATTCTAAACT-3'

Thal C

5’-TTCGTCTGTTTCCCATTCTAAACT-3’

CD71N

5’-CATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAG -3’

CD71M

5’-CATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAAG -3’

2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu cắt ngang: nghiên cứu trên các thành viên gia đình (bố, mẹ, con

đầu), thai phụ có thai lần tiếp theo và có mong muốn thực hiện chẩn đoán trước sinh

cho thai nhi.

2.6. QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN

Hình 2.1. Quy trình xác định đột biến gen  globin

2.6.1. Thu thập mẫu máu và tách DNA từ mẫu máu ngoại vi

* Quy trình thu thập mẫu máu ngoại vi

Đối với với nhóm bệnh nhân và người mang gen bệnh: lấy 2ml máu ngoại vi

tĩnh mạch, vô trùng và chống đông bằng EDTA 1,5mg/ml.

* Quy trình thu thập mẫu ối

Để tiến hành chẩn đoán trước sinh, mẫu bệnh phẩm là 15-20ml mẫu dịch

ối của thai phụ được chọc hút vô trùng dưới sự hướng dẫn của siêu âm. Tuần thai

thích hợp để thực hiện xét nghiệm này là 16-18 tuần thai. Dịch ối được đựng

trong ống falcon vô trùng và bảo quản trong ở 4oC tối đa trong 24 giờ trước khi

cấy tế bào.

2.6.2. Kỹ thuật tách DNA tổng số từ máu ngoại vi và tế bào ối

- Tách DNA tổng số từ máu ngoại vi sử dụng bộ kít tách DNA thương mại

QIAgen DNA blood minikit (Đức) được thực hiện như sau:

- Cho 20µl Protease QIAGEN vào mỗi ống ly tâm 1.5ml, sau đó cho tiếp

200µl mẫu máu vào trong ống. Thêm 200µl dung dịch đệm AL rồi trộn đều hỗn hợp

trên bằng máy lắc trong 15 giây. Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 56ºC trong 10 phút.

- Thêm 200µl Ethanol (96-100%). Chuyển hỗn hợp trên vào cột lọc

QIAamp.

- Ly tâm cột lọc 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch nổi và chuyển cột lọc

sang ống 2ml sạch.

- Rửa 2 lần, mỗi lần thêm 500µl dung dịch đệm AW, ly tâm ống 8000 vòng/

phút trong 1 phút. Sau đó bỏ dịch nổi, chuyển cột lọc sang ống 2ml sạch khác.

- Thêm 200µl dung dịch AE vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau

đó ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút thu DNA tổng số.

- DNAts sau khi tách chiết được đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Nano

drop (Thermo). Nồng độ DNAts >30ng. Độ tinh sạch 260/280 = 1.7-1.9

2.6.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Agarose 1% được đun sôi để tan hết, để nhiệt độ hạ xuống 50-60oC, đổ dung

dịch này vào khay gel đã cài sẵn các giếng lược thích hợp. Sau khi đổ khoảng 30

phút, gel đã đông cứng, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TBE1x ngập

gel khoảng 2mm. Mẫu DNA được trộn cùng với đệm tra mẫu với tỷ lệ thích hợp,

được đưa vào các giếng trên bản gel.

Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ

dòng điện 60-80mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue có trong

đệm tra mẫu để ngừng chạy với thời gian thích hợp.

Nhuộm DNA bằng EtBr (nồng độ 10µg/ml) trong thời gian 20 phút trên máy

lắc nhẹ, sau đó rửa bằng nước cất và soi trên máy soi gel. Quan sát và chụp ảnh: Gel

được quan sát dưới ánh sáng tím UV ở bước sóng 320 nm. Sản phẩm PCR sẽ quan

sát thấy dạng các vạch sáng.

2.6.4. Kỹ thuật PCR xác định đột biến trên gen β globin

Multiplex ARMS PCR là phương pháp được thiết lập để xác định 09 đột biến

điểm. Đối với bệnh β thalassemia, 09 loại đột biến điểm thường gặp được phát hiện

bằng kỹ thuật này là CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-TAG), IVS1-1(G-T), -28(A-

G), IVS2-654(C-T), CD71/72(+A), IVS1-5(G-C), CD95(+A) và HbE (AAG-GAG)-

CD26.

Bảng 2.2. Các bước sàng lọc trên gene β globin

Loại đột biến

Mồi đặc hiệu Mồi chung

Độ dài (bp)

Bước sàng lọc

Thal B

CD17 AAG-TAG CD41/42 –TTCT -28 A>G IVS1-1 G>T

CD17M CD41/42M -28M IVS1-1M

240 439 107 281

IVS1-5 G>C CD71/72 +A IVS2-654 C>T CD95 + A

IVS1-5M CD71/72M IVS2-654M CD95M

285 241 382 163

Thal B Thal C Thal F BTC

CD26 (GAG>AAG)

HbE-M

Thal HbE

271

09 đột biến này được chia thành 3 bước sàng lọc đồng thời.

Bước 1: Sàng lọc 4 đột biến CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-TAG), IVS1-

1(G-T), -28(A-G).

Bước 2: Sàng lọc 4 đột biến IVS2-654(C-T), CD71/72(+A), VIS-5(G-C), CD

95(+A).

Bước 3: Sàng lọc đột biến HbE (AAG-GAG)-CD26.

Đột biến được phát hiện qua Multiplex ARMS-PCR được xác định kiểu gen

bằng ARMS-PCR. Đột biến CD26 của HbE được phát hiện trực tiếp bằng ARMS-

 Pha hỗn hợp PCR theo phản ứng sau:

Multiplex ARMS 1 (Xác định 4 đột biến: CD41/41, -28, CD17, IVS1-1)

PCR nếu có HbE dương tính với điện di huyết sắc tố.

Bộ đầu dò 1 (10x)

Tên mồi

Thể tích (µl)

CD41/42M

CD17M

-28M

IVS1-1M

460

dH2O

500 Tổng thể tích

Tm = 60oC

Hóa chất

Hãng sản xuất

Thể tích /mẫu (ul)

Invitrogen

dH2O

Promega

Master mix 2x Green

Invitrogen

Bộ đầu dò 1 (10x)

Qiagen

Q-Solution

DNA

21 Tổng

Multiplex ARMS 2 (Xác định 4 đột biến: IVS2-654, CD71/72, IVS1-5,

CD95)

Bộ đầu dò 2 (10x)

Tên mồi

Thể tích (µl)

IVS2-654M

CD71/72M

IVS1-5M

Cd95M

460

dH2O

500 Tổng thể tích

Tm= 58oC

Hóa chất

Hãng sản xuất

Thể tích /mẫu (ul)

Invitrogen

dH2O

Promega

Master mix 2x Green

Invitrogen

Bộ đầu dò 2 (10x)

Qiagen

Q-Solution

DNA

21 Tổng

ARMS PCR xác định kiểu gen các đột biến

Tm = 64oC

Hóa chất

Hãng sản xuất

Thể tích / mẫu (ul)

Invitrogen

9.5

dH2O

Master mix 2x Green

Promega

12.5

Mồi đặc hiệu

Invitrogen

0.5

Mồi chung

Invitrogen

0.5

DNA

Tổng

25

2.6.5. Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến trên gen β globin

Quy trình thực hiện gồm 3 phản ứng PCR khuếch đại trình tự đoạn gen β

globin 1 (exon 1, 2, một phần intron 2), đoạn gen β globin 2 (intron 2), đoạn gen β

globin 3 (một phần intron 2 và exon 3) có kích thước tương ứng và sử dụng các cặp

mồi theo bảng 2.3.

Bảng 2.3. Bộ mồi sử dụng trong kỹ thuật giải trình tự gen β globin

HBB1 764bp

HBB2 738bp

HBB3 758bp

Tên mồi

HBBseq F1 + R1

HBBseq F2 + R2

HBBseq F3 + R3

Sản phẩm PCR được tinh sạch, pha loãng và thực hiện phản ứng Cycle

sequencing sử dụng 2 mồi (xuôi và ngược) giải trình tự cho mỗi sản phẩm PCR.

Sản phẩm Cycle sequencing sau tinh sạch được tiến hành điện di mao quản

trên máy ABI 3500 để giải trình tự.

Sử dụng phần mềm Recall (http://pssm.cfenet.ubc.ca/) hoặc phần mềm

Codon Code Aligner (đã được cài trên máy tính) để nối các trình tự thu được với

các mồi riêng biệt thành một trình tự gen β globin hoàn chỉnh và xác định các

nucleotide.

Phân tích dữ liệu trình tự thu được so sánh với trình tự nucleotide và axit

amin tham khảo của ngân hàng Gene Bank (NG_000007.3)

Hình 2.2. Sơ đồ mồi quy trình xác định đột biến gen β globin

2.6.6. Kỹ thuật GAP PCR

Kỹ thuật GAP PCR là kỹ thuật sử dụng 1 mồi xuôi và 1 mồi ngược gắn ở hai

bên ranh giới của cùng DNA đứt gãy. Với alen bình thường, khoảng cách giữa hai

mồi quá lớn nên không tạo ra được sản phẩm PCR. Với alen có đột biến, khoảng

cách này đủ ngắn để tạo nên sản phẩm PCR đặc hiệu cho đột biến mất đoạn ấy.

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ mồi double Gap PCR theo thiết

kế của Xu Xm và cộng sự để phát hiện mất đoạn toàn bộ gen β globin gây tồn dư

huyết sắc tổ thể SEA như sau:

Mồi xuôi: F1 5'-TGGTATCTGCAGCAGTTGCC-3' (nucleotide ở vị trí

68021 đến 68040, NG_000007 trên ngân hàng GenBank)

Mồi ngược: F4 5'-AGCCTCATGGTAGCAGAATC-3' (nucleotide ở vị trí

2543 đến 2524, AF289203 trên ngân hàng GenBank)

Mồi ngược: F5 5'-ATTGTTGAGTTGCAGGATCG-3' (nucleotide ở vị trí

1879 đến 1998, AF289203 trên ngân hàng GenBank)

Mục đích sử dụng cặp mồi này để phát hiện đột biến mất đoạn toàn bộ gen β

globin có chiều dài 2,3kb. Với mẫu không có đột biến sẽ có sản phẩm PCR có kích

thước 565bp, với mẫu bị đột biến sẽ có sản phẩm PCR tương ứng là 376 bp.

2.6.7. Nuôi cấy tế bào ối

Kỹ thuật này là bước được thực hiện trong quy trình chẩn đoán trước sinh.

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối có hai mục đích chính là làm tăng số lượng tế bào ối để

đáp ứng cho nhu cầu xét nghiệm chẩn đoán và giúp loại bỏ các tế bào máu mẹ lẫn

trong dịch ối, để có được dòng tế bào ối tinh sạch.

a. Nuôi cấy tế bào ối trong chai nuôi cấy

- Ly tâm ống đựng dịch ối ở tốc độ 1800 vòng/phút trong 5 phút. Bỏ phần dịch

nổi, kiểm tra lại phần cặn tế bào.

- Chuyển toàn bộ dung dịch chứa cặn tế bào ối từ ống vào trong chai có 3ml môi

trường nuôi cấy. Đặt chai nuôi cấy vào trong tủ ấm, 5% CO2, 37oC.

- Thay môi trường lần 1 sau 72h - 96h tùy vào tình trạng bám dính và phát triển

của tế bào nuôi cấy qua kiểm tra dưới kính hiển vi soi ngược. Kiểm tra sự phát

triển của các cụm tế bào ối để quyết định thời điểm thu hoạch.

b. Thu hoạch tế bào ối từ flask

- Thông thường thời điểm thu hoạch là sau 8-10 ngày nuôi cấy.

- Hút hết dịch nổi bằng pipet Pasteur nhựa trong chai nuôi cấy và chuyển vào ống

ly tâm vô trùng 15ml.

- Cho 2ml Trypsin EDTA 1x vào trong chai nuôi cấy, ủ ở 37oC trong 3 phút.

- Kiểm tra lượng tế bào đã tách khỏi bề mặt chai nuôi cấy dưới kính hiển vi.

- Thêm 1,5ml môi trường nuôi cấy vào để tráng đều bề mặt chai nuôi cấy, và

chuyển hết dịch nổi vào ống dịch tế bào ở trên. Ly tâm ống dịch tế bào ở 1800

vòng/phút trong 5 phút. Lặp lại thêm 01 lần nữa.

- Loại bỏ phần dịch nổi đến 200µl, chuyển sang bước tách chiết DNA.

c. Tách DNA từ tế bào ối: Sử dụng kỹ thuật tách chiết DNA tổng số bằng QiaAmp

DNA mini kit, đã được trình bày ở phần 2.5.2

2.7. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC

Đề tài tuân thủ chặt chẽ vấn đề đạo đức trong nghiên cứu Y sinh. Nghiên cứu

được tiến hành dựa trên sự tự nguyện tham gia của các gia đình có bệnh nhân được

chẩn đoán mắc  thalassemia trên lâm sàng, các cặp vợ chồng được xác định là

người mang gen bệnh  thalassemia.

Các xét nghiệm phân tích gen chỉ thực hiện khi có sự đồng ý của bệnh nhân

và gia đình bệnh nhân. Các thông tin về bệnh nhân và gia đình bệnh nhân, kết quả

chẩn đoán hoàn toàn được bảo mật.

2.8. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu

Các bệnh nhân được chẩn đoán  thalassemia thể nặng sẽ được xác định

đột biến gen bằng kỹ thuật Multiplex PCR và ARMS PCR để phát hiện 09 đột

biến thường gặp. Nếu đột biến của bệnh nhân nằm ngoài 09 đột biến thường gặp,

sẽ được tiếp tục sàng lọc bằng kỹ thuật giải trình tự gen, nhằm phát hiện đột biến

trên toàn bộ gen  globin. Với những trường hợp có chỉ số cận lâm sàng chỉ số

HbF cao, nghi ngờ bị tồn dư huyết sắc tố F, sẽ tiếp tục được sàng lọc phát hiện

đột biến mất đoạn lớn. Các gia đình đã có tiền sử sinh con đầu bị  thalassemia

thể nặng, cần phát hiện kiểu gen của bố và mẹ, sau đó tiến hành chẩn đoán trước

sinh cho thai phụ.

Trong nghiên cứu này số lượng bệnh nhân thể nặng là 214, người nghi ngờ

mang gen là 354, và số thai phụ tham gia chẩn đoán trước sinh là 178 trường hợp.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU

Bảng 3.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo các nhóm

Nhóm nghiên cứu

Tỷ lệ (%)

n

Bệnh nhân thể nặng  thalassemia

214

28,6

Người nghi ngờ mang gen bệnh

354

47,4

Thai phụ được chỉ định làm

chẩn đoán trước sinh

178

Tổng

746

100

Nhận xét: Nhóm nghiên cứu này được chia làm 3 nhóm: nhóm bệnh nhân 

Thalassemia, nhóm người mang gen bệnh và nhóm sản phụ tiến hành làm xét

nghiệm chẩn đoán trước sinh.

Trong tổng số 746 người tham gia nghiên cứu, có 214 bệnh nhân thể nặng,

chiếm tỷ lệ 28,6%, 354 người mang gen, chiếm tỷ lệ 47,4% và 178 sản phụ, chiếm

tỷ lệ 24%.

3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN β GLOBIN

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA

Tất cả các mẫu DNA thu được của bệnh nhân nghiên cứu đều có nồng độ

trong khoảng 50-70ng/µl, độ tinh sạch ở bước sóng 260/280nm trong khoảng 1,8-

2,0. Như vậy, các mẫu DNA được tách chiết có chất lượng tốt để thực hiện cho các

quy trình phân tích tiếp theo (phụ lục 1).

3.2.2. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân mắc  thalassemia thể nặng

Quy trình thực hiện xét nghiệm xác định đột biến của bệnh nhân mắc 

thalassemia thể nặng được thực hiện theo quy trình kỹ thuật (SOP): Quy trình xét

nghiệm chẩn đoán bệnh  thalassemia – 09 đột biến của Khoa Di truyền và sinh học

phân tử, Bệnh viện Nhi Trung ương. Quy trình này đã được Văn phòng công nhận

chất lượng BOA (Bureau of Accreditation) cấp chứng chỉ đạt tiêu chuẩn

ISO15189:2012.

Để tiến hành phát hiện đột biến gen β globin trên 214 bệnh nhân 

Thalassemia thể nặng, kỹ thuật Multiplex ARMS PCR với 3 bộ Multiplex ARMS

PCR 1, 2, 3 được áp dụng để xác định đột biến nằm trong 09 đột biến thường gặp,

sau đó kỹ thuật ARMS PCR được áp dụng để xác định kiểu gen của từng đột biến

đã được phát hiện bằng kỹ thuật Multiplex ARMS PCR. Những đột biến không

được phát hiện bằng 2 kỹ thuật trên sẽ được giải trình tự toàn bộ gen β globin để

xác định đột biến điểm. Chúng tôi cũng áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen để kiểm

tra các kết quả đại diện cho từng đột biến được phát hiện đột biến bằng kỹ thuật

Multiplex ARMS PCR và ARMS PCR. Kết quả được thể hiện như sau:

3.2.2.1. Tần số và tỷ lệ các đột biến gen β globin

Bảng 3.2. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân  thalassemia

Các đột biến gen

Vị trí

Tần số

Tỷ lệ

STT

β globin

(Exon/Intron)

(n=428)

(%)

CD41/42(-TCTT)

Exon 2

118

27,57

CD17(AAG-TAG)

Exon 1

129

30,1

HbE (GAG-AAG)-CD26

Exon 2

21,4

-28(A-G)

Promotor

3,27

CD71/72(+A)

Exon 2

5,14

IVS1-1(G-T)

Intron 1

5,37

IVS1-5(G-C)

Intron 1

1,63

IVS2-654(C-T)

Intron 2

4,23

CD95(+A)

Exon 2

0,47

Các đột biến hiếm

0,93

gặp khác

Trong nghiên cứu này, nghiên cứu đã phát hiện được 100% bệnh nhân có đột

biến gen. Về phân bố tần suất theo từng dạng đột biến gen, nghiên cứu đã phát hiện

thấy 214/214 bệnh nhân có kết hợp 2 đột biến gen β globin, chiếm tỷ lệ 99,9%.

Nhóm đột biến CD17 (AAG-TAG), CD41/42(-TCTT), HbE (GAG-AAG)- CD26

chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là 30,1%, 27,57% và 21,4%.

Bảng 3.3. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân  thalassemia

theo vị trí đột biến

Vị trí

Tần số

Tỷ lệ

(Exon/Intron)

(n=428)

(%)

Promotor

3,27

(-28 A-G)

Exon 1

129

30,14

CD17(AAG-TAG)

Intron 1

IVS1-1 (G-T)

IVS1-5(G-C)

Exon 2

HbE (GAG-AAG)

CD41/42(-TCTT)

234

54,6

CD71/72(+A)

CD95(+A)

Intron 2

4,2

Các đột biến hiếm gặp khác

0,7

Nhận xét: Các đột biến phân bố ở các vùng gen như: vùng promotor, vùng

Exon 1, Intron 1, Exon 2, Intron 2, Exon 3. Tỷ lệ gặp đột biến điểm cao nhất ở vùng

Exon 2 chiếm tỷ lệ 54,6%.

Dùng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger đã phát hiện được 3 đột biến điểm

hiếm gặp và chưa có công bố ở mức độ sinh học phân tử ở Việt Nam: c.-138 C-T;

c.-140 C-T; c.440-441 dupAC.

Đặc biệt, với kĩ thuật Duplex Gap PCR, đã phát hiện được trường hợp đột

biến mất đoạn lớn thuộc nhóm đột biến hiếm gặp ở nhóm bệnh  thalassemia gây

tồn dư huyết sắc tố bào thai ở người trưởng thành. Đột biến mất đoạn lớn dạng

HPFH thể SEA là đột biến mất đoạn toàn bộ gen β globin và 1 số vùng gen liên

quan bên cạnh, độ lớn 2,3kb.

Bảng 3. 4. Kiểu gen và kiểu hình của 214 bệnh nhân  thalassemia

Số

Kiểu hình

lượng

STT

Kiểu gen kết hợp

Kiểu gen

Tỉ lệ (%)

lâm sàng

ca

bệnh

Kiểu gen β/HbE

β0/HbE

Thể nặng

18.69

CD17-HbE

β0/HbE

Thể nặng

CD41/42-HbE

16.8

β+/HbE

Thể nặng

CD71/72-HbE

3.27

β0/HbE

Thể nặng

IVS1-5-HbE

1.4

β0/HbE

Thể nặng

IVS1-1-HbE

0.93

Thể nặng,

-28-HbE

β+/HbE

trung gian

0.93

HbE-IVS2-654

β+/HbE

Thể nặng

0.47

Kiểu gen đồng hợp tử, dị hợp tử 2 đột biến

CD41/42-CD17

β0/ β0

Thể nặng

11.68

CD41/42-CD41/42

β0/ β0

Thể nặng

9.34

CD17-CD17

β0/ β0

Thể nặng

8.87

CD17-IVS2-654

β0/ β+

Thể nặng

4.2

CD41/42-CD71/72

β0/ β+

Thể nặng

3.73

CD17- -28

β+/ β+

Thể nặng

3.27

CD17-CD71/72

β0/ β+

Thể nặng

2.8

IVS1-1-IVS1-1

β0/ β0

Thể nặng

1.86

IVS1-1-IVS2-654

β0/ β+

Thể nặng

1.86

CD41/42-IVS1-1

β0/ β0

Thể nặng

1.4

CD41/42-28

β0/ β+

Thể nặng

1.4

CD17-IVS1-1

β0/ β0

Thể nặng

1.4

CD41/42-IVS2-654

β0/ β+

Thể nặng

0.93

CD17-IVS1-5

β0/ β0

Thể nặng

0.93

CD41/42-CD95

β0/ β+

Thể nặng

0.47

IVS1-1-CD95

β0/ β+

Thể nặng

0.47

β+/ β+

Thể nặng

-28-CD71/72

0.47

β+/ β+

Thể nặng

-28-IVS2-654

0.47

Đột biến hiếm gặp

c.-138 C>T- CD41/42

β+/β0

Thể nặng

0.47

c.-140 C>T –CD17

β+/β0

Thể nặng

0.47

c.441-442ins AC-CD41/42

β+/β0

Thể nặng

0.47

2,3kb deletion/IVS2-654

β+/ β+

Thể trung gian

0.47

Nhận xét: Xác định kiểu gen của 214 bệnh nhân mắc  thalassemia thể nặng,

tỉ lệ tìm thấy đột biến là 214/214 bệnh nhân (100%). Nghiên cứu này đã xác định

được 26 kiểu gen là kết hợp của các đột biến nằm trong nhóm 09 đột biến phát hiện

bằng kỹ thuật Multiplex PCR và ARMS PCR chiếm 98,12%, 4/214 (1,88%) trường

hợp phát hiện đột biến điểm hiếm gặp trên người Việt Nam, được phát hiện bằng kĩ

thuật giải trình tự gen Sanger và Gap-PCR

3.2.2.2. Kỹ thuật multiplex ARMS PCR xác định đột biến CD41/42(-TCTT), CD17

(AAG-TAG), IVS1-1(G-T), -28(A-G), IVS2-654(C-T), CD71/72(+A), IVS1-5(G-C),

CD95(+A) và HbE (AAG-GAG)-CD26.

Bằng việc áp dụng các kỹ thuật multiplex ARMS PCR và ARMS PCR,

chúng tôi đã phát hiện được 214/214 bệnh nhân có đột biến. Chúng tôi phát hiện

được cả 9 loại đột biến thường gặp trên gen β globin với các kiểu gen khác nhau với

các kiểu gen đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kết hợp. Bên dưới là hình ảnh minh họa đại

diện các đột biến khác nhau. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen để kiểm

tra ngẫu nhiên một số đột biến được phát hiện bằng kỹ thuật Multiplex ARMS PCR

và ARMS PCR. Kết quả cho thấy có sự tương đồng giữa 2 phương pháp phát hiện.

Bệnh nhân 1: Bệnh nhân có đột biến CD41/42(-TCTT) và CD17 (AAG-TAG):

Bằng việc sử dụng Multiplex ARMS PCR 1 để phát hiện 4 đột biến

CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-TAG), IVS1-1(G-T), -28 (A-G), chúng tôi phát

hiện thấy bệnh nhân mã số WBbT081203 có đột biến CD41/42(-TCTT) và CD17

(AAG-TAG) (hình 3.1)

M ĐC (‐) ĐC1 (+) ĐC2 (+) BN H2O

439bp: CD41/42 (‐TCTT)

281bp: IVS1‐1 (G‐T) 240bp: CD17 (AAG‐TAG)

107bp: ‐28 (A‐G)

Hình 3.1. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT081203 có

đột biến CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-TAG)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến

ĐC1 (+): Mẫu chứng có đột biến CD41/42(-TCTT) và CD17 (AAG-TAG)

ĐC2 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS1-1(G-T), -28(A-G)

BN: Mẫu bệnh nhân được phát hiện có đột biến CD41/42(-TCTT) và CD17 (AAG-TAG).

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai. Mẫu chứng không đột biến không xuất hiện vạch (ĐC -) và 2 mẫu

chứng có đột biến (ĐC1+, ĐC2+) xuất hiện 2 vạch đặc hiệu tương ứng với kích

thước đã được tính toán chứng tỏ quy trình PCR đạt yêu cầu. Mẫu bệnh nhân (BN)

xuất hiện 2 vạch tương ứng với 2 đột biến CD41/42(-TCTT) và CD17(AAG-TAG)

giống như mẫu chứng (ĐC1+) chứng tỏ bệnh nhân có 2 đột biến này.

Chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật ARMS PCR với cặp mồi CD17 (AAG-

TAG) và CD41/42(-TCTT) để xác định kiểu gen của bệnh nhân (hình 3.2).

ĐC (‐) ĐC (+) BN H2O M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB

439bp ‐ CD41/42 (‐TCTT)

ĐC (‐) ĐC (+) BN H2O M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB

240bp: CD17 (AAG‐TAG)

Hình 3.2. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT081203 phát hiện kiểu gen

CD41/42(-TCTT) (A) và CD17 (AAG-TAG) (B)

M: Marker 100bp

ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến

ĐC (+): Mẫu chứng có đột biến

BN: Mẫu bệnh nhân

H2O: Mẫu nước không chứa DNA

BT: bình thường ĐB: Đột biến.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai. ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến chỉ xuất hiện vạch với mồi bình

thường, trong khi đó mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện vạch ở cả mồi bình thường và

mồi đột biến tương tự như mẫu chứng có đột biến (ĐC +) chứng tỏ bệnh nhân có

đột biến dị hợp tử của cả 2 đột biến CD41/42(-TCTT) (A) và CD17 (AAG-

TAG) (B).

CD41/42 (‐ TCTT)

CD41/42 TCTT

Bệnh nhân mã số WBbT081203

Người bình thường

CD17 (AAG)

CD17 (AAG-TAG)

Người bình thường

Bệnh nhân mã số WBbT081203

Kết quả giải trình tự gen 2 đột biến dị hợp tử CD41/42(-TCTT) và CD17 (AAG-TAG):

Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT081203 với với

đột biến dị hợp tử CD41/42(-TCTT) (A) và CD17 (AAG-TAG) (B).

Nhận xét: Tại vị trí CD41/42 của gen β globin ở bệnh nhân do bị mất 4

nucleotid TCTT ở dạng dị hợp tử nên xuất hiện các đỉnh nucleotid chồng lên nhau

(hình 3.3A). Tại vị trí CD17 của gen β globin ở bệnh nhân có sự thay thế nucleotid

A thành T ở dạng dị hợp tử nên xuất hiện đỉnh của nucleotid A và T chồng lên nhau

(hình 3.3B). Như vậy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử CD41/42(-TCTT) và CD17

(AAG-TAG), kết quả này tương đồng với kết quả phân tích bằng kỹ thuật Multiplex

ARMS PCR và ARMS PCR.

Bệnh nhân 2: Bệnh nhân có đột biến IVS1-1 (G-T) và IVS2-654 (C-T):

ĐC2 (+) ĐC1 (+) ĐC (‐) MK

H2O BN

439bp: CD41/42 (‐TCTT)

281bp: IVS1‐1 (G‐T)

240bp: CD17 (AAG‐TAG)

107bp: ‐28 (A‐G)

Phát hiện đột biến 1: IVS1-1 (G-T)

Hình 3.4. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713

có đột biến IVS1-1 (G-T)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến

ĐC1 (+): Mẫu chứng có đột biến CD41/42(-TCTT) và CD17 (AAG-TAG)

ĐC2 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS1-1(G-T), -28 (A-G).

BN: Mẫu bệnh nhân được phát hiện có đột biến IVS1-1(G-T).

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai. Mẫu chứng không đột biến không xuất hiện vạch (ĐC -) và 2 mẫu

chứng có đột biến (ĐC1 +, ĐC2 +) xuất hiện 2 vạch đặc hiệu tương ứng với kích

thước đã được tính toán chứng tỏ quy trình PCR đạt yêu cầu. Mẫu bệnh nhân (BN)

xuất hiện 1 vạch tương ứng với đột biến IVS1-1(G-T) chứng tỏ bệnh nhân có đột

biến này.

Chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật ARMS PCR với cặp mồi IVS1-1(G-T) và

để xác định kiểu gen của bệnh nhân (hình 3.5).

ĐC (‐) ĐC (+) BN H2O M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB

281bp‐ IVS1‐1 (G‐T)

Hình 3.5. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT140713 phát hiện kiểu gen IVS1-1(G-T)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến; ĐC (+): Mẫu chứng có đột biến; BN: Mẫu bệnh nhân; H2O: Mẫu nước không chứa DNA. BT: bình thường; ĐB: Đột biến.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai.

ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến chỉ xuất hiện vạch với mồi bình thường, trong

khi đó mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện vạch ở cả mồi bình thường và mồi đột biến

tương tự như mẫu chứng có đột biến (ĐC +) chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị

hợp tử của đột biến IVS1-1(G-T).

ĐC (‐)

ĐC1 (+) ĐC2 (+)

BN H2O

382bp: IVS2‐654 (C‐T) 285bp:IVS1‐5 (G‐C) 241bp: CD71/72 (+A) 163bp:CD95 (+A)

Phát hiện đột biến 2: IVS2-654 (C-T)

Hình 3.6. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT140713 có đột biến IVS2-654 (C-T)

ĐC1 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS2-654(C-T) và CD71/72(+A)

ĐC2 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS1-5(G-C), CD95(+A).

BN: Mẫu bệnh nhân được phát hiện có đột biến IVS2-654(C-T)).

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị nhiễm

ngoại lai. Mẫu chứng không đột biến không xuất hiện vạch (ĐC -) và 2 mẫu chứng có đột

biến (ĐC1 +, ĐC2 +) xuất hiện 2 vạch đặc hiệu tương ứng với kích thước đã được tính

toán chứng tỏ quy trình PCR đạt yêu cầu. Mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện 1 vạch tương ứng

với đột biến IVS2-654(C-T) chứng tỏ bệnh nhân có đột biến này.

Chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật ARMS PCR với cặp mồi IVS2-654(C-T) để xác

định kiểu gen của bệnh nhân (hình 3.7).

ĐC (‐) ĐC (+) BN H2O M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB

382bp: IVS2‐654 (C‐T)

Hình 3.7. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT140713 phát hiện kiểu gen IVS2-654(C-T)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến; ĐC (+): Mẫu chứng có

đột biến; BN: Mẫu bệnh nhân; H2O: Mẫu nước không chứa DNA. BT: bình thường;

ĐB: Đột biến.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai.

ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến chỉ xuất hiện vạch với mồi bình thường, trong

khi đó mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện vạch ở cả mồi bình thường và mồi đột biến

tương tự như mẫu chứng có đột biến (ĐC +) chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị hợp

tử của đột biến IVS2-654(C-T).

IVS1‐1 (G)

IVS1‐1 (G‐T)

Người bình thường

Bệnh nhân mã số WBbT140713

IVS2‐654 (C)

IVS2‐654 (C‐T)

Người bình thường

Bệnh nhân mã số WBbT140713

Kết quả giải trình tự gen 2 đột biến dị hợp tử IVS1-1 (G-T) và IVS2-654 (C-T):

Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT140713

với đột biến dị hợp tử IVS1-1 (G-T) (A) và IVS2-654 (C-T) (B)

Nhận xét: Tại vị trí IVS1-1 của gen β globin ở bệnh nhân có sự thay thế nucleotid G thành A ở dạng dị hợp tử nên xuất hiện đỉnh nucleotid G và A chồng

lên nhau (hình 3.8A). Tại vị trí IVS-654 của gen β globin ở bệnh nhân có sự thay thế nucleotid C thành T ở dạng dị hợp tử nên xuất hiện đỉnh của nucleotid C và T chồng lên nhau (hình 3.8B). Như vậy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử IVS1-1 (G-T) (A) và IVS2-654 (C-T), kết quả này tương đồng với kết quả phân tích bằng kỹ thuật

Multiplex ARMS PCR và ARMS PCR.

Bệnh nhân 3: Bệnh nhân có đột biến -28(A-G) và CD71/72(+A):

ĐC2 (+) ĐC1 (+) ĐC (‐) MK

H2O BN

439bp: CD41/42 (‐TCTT)

281bp: IVS1‐1 (G‐T)

240bp: CD17 (AAG‐TAG)

107bp: ‐28 (A‐G)

Phát hiện đột biến 1: -28(A-G)

Hình 3.9. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT130504 có đột biến -28(A-G)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến

ĐC1 (+): Mẫu chứng có đột biến CD41/42(-TCTT) và CD17(AAG-TAG)

ĐC2 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS1-1(G-T), -28 (A-G).

BN: Mẫu bệnh nhân được phát hiện có đột biến -28 (A-G).

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai. Mẫu chứng không đột biến không xuất hiện vạch (ĐC -) và 2

mẫu chứng có đột biến (ĐC1 +, ĐC2 +) xuất hiện 2 vạch đặc hiệu tương ứng với

kích thước đã được tính toán chứng tỏ quy trình PCR đạt yêu cầu. Mẫu bệnh

nhân (BN) xuất hiện 1 vạch tương ứng với đột biến -28(A-G) chứng tỏ bệnh

nhân có đột biến này.

Chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật ARMS PCR với cặp mồi -28(A-G) để xác

ĐC (‐) ĐC (+) BN H2O M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB

144bp‐ (‐28 BT)

163bp‐ (‐28 ĐB)

định kiểu gen của bệnh nhân (hình 3.10).

Hình 3.10. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT130504 phát hiện kiểu gen -28(A-G)

M: Marker 100bp;

ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến;

ĐC (+): Mẫu chứng có đột biến;

BN: Mẫu bệnh nhân;

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

BT: bình thường;

ĐB: Đột biến.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai.

ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến chỉ xuất hiện vạch với mồi bình thường, trong

khi đó mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện vạch ở cả mồi bình thường và mồi đột biến

tương tự như mẫu chứng có đột biến (ĐC +) chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị hợp

tử của đột biến -28(A-G).

ĐC (‐) ĐC1 (+) ĐC2 (+)

BN H2O

382bp: IVS2‐654 (C‐T)

285bp:IVS1‐5 (G‐C)

241bp: CD71/72 (+A)

163bp:CD95 (+A)

Phát hiện đột biến 2: CD71/72(+A)

Hình 3.11. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT130504 có đột biến CD71/72(+A)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến

ĐC1 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS2-654(C-T) và CD71/72(+A)

ĐC2 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS1-5(G-C), CD95(+A).

BN: Mẫu bệnh nhân được phát hiện có đột biến CD71/72(+A)

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai. Mẫu chứng không đột biến không xuất hiện vạch đặc hiệu (ĐC -)

và 2 mẫu chứng có đột biến (ĐC1 +, ĐC2 +) xuất hiện 2 vạch đặc hiệu tương ứng

với kích thước đã được tính toán chứng tỏ quy trình PCR đạt yêu cầu. Mẫu bệnh

nhân (BN) xuất hiện vạch tương ứng với đột biến CD71/72(+A) chứng tỏ bệnh

nhân có đột biến này.

Chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật ARMS PCR với cặp mồi CD71/72(+A) để

ĐC (‐) ĐC (+) BN H2O M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB

241bp : CD71/72 (+A)

xác định kiểu gen của bệnh nhân (hình 3.12).

Hình 3.12. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT130504 phát hiện kiểu gen CD71/72(+A)

M: Marker 100bp

ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến

ĐC (+): Mẫu chứng có đột biến

BN: Mẫu bệnh nhân

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

BT: bình thường; ĐB: Đột biến.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai.

ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến chỉ xuất hiện vạch với mồi bình thường, trong

khi đó mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện vạch ở cả mồi bình thường và mồi đột biến

tương tự như mẫu chứng có đột biến (ĐC +) chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị

hợp tử của đột biến CD71/72(+A).

Cd71/72 (+A)

Cd71/72

Người bình thường

Bệnh nhân mã số WBbT130504

Kết quả giải trình tự gen đột biến dị hợp tử CD71/72 (+A):

Hình 3.13. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân

mã số WBbT130504 với đột biến dị hợp tử CD71/72 (+A)

Nhận xét: Tại vị trí CD71/71 của gen β globin ở bệnh nhân có xuất hiện sự

thêm nucleotid A ở dạng dị hợp tử nên xuất hiện đỉnh nucleotid G và A chồng lên

nhau. Như vậy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử CD71/72 (+A), kết quả này tương

đồng với kết quả phân tích bằng kỹ thuật Multiplex ARMS PCR và ARMS PCR.

Bệnh nhân 4: Bệnh nhân có đột biến -28 (A-G) và IVS1-5 (G-C)

Phát hiện đột biến 1: -28 (A-G)

Hình 3.14. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT101215 có đột biến -28(A-G)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến

ĐC1 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS2-654(C-T) và CD71/72(+A)

ĐC2 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS1-1(G-T), -28 (A-G).

BN: Mẫu bệnh nhân được phát hiện có đột biến -28 (A-G).

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai. Mẫu chứng không đột biến không xuất hiện vạch (ĐC -) và 2 mẫu

chứng có đột biến (ĐC1 +, ĐC2 +) xuất hiện 2 vạch đặc hiệu tương ứng với kích

thước đã được tính toán chứng tỏ quy trình PCR đạt yêu cầu. Mẫu bệnh nhân (BN)

xuất hiện 1 vạch tương ứng với đột biến -28(A-G) chứng tỏ bệnh nhân có đột

biến này.

Chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật ARMS PCR với cặp mồi -28(A-G) để xác

ĐC (‐) ĐC (+) BN H2O M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB

144bp‐ (‐28 BT)

163bp‐ (‐28 ĐB)

định kiểu gen của bệnh nhân (hình 3.15).

Hình 3.15. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT101215 phát hiện kiểu gen -28(A-G)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến; ĐC (+): Mẫu chứng có

đột biến; BN: Mẫu bệnh nhân; H2O: Mẫu nước không chứa DNA. BT: bình thường;

ĐB: Đột biến.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai.

ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến chỉ xuất hiện vạch với mồi bình thường, trong

khi đó mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện vạch ở cả mồi bình thường và mồi đột biến

tương tự như mẫu chứng có đột biến (ĐC +) chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị

hợp tử của đột biến -28(A-G).

Phát hiện đột biến 2: IVS1-5 (G-C)

M ĐC (‐) ĐC1 (+) ĐC2 (+) BN H2O

382bp: IVS2‐654 (C‐T)

285bp:IVS1‐5 (G‐C) 241bp: CD71/72 (+A)

163bp:CD95 (+A)

Hình 3.16. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT101215 có đột biến IVS1-5 (G-C)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến

ĐC1 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS2-654(C-T) và CD71/72(+A)

ĐC2 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS1-1(G-T), -28 (A-G).

BN: Mẫu bệnh nhân được phát hiện có đột biến IVS1-5 (G-C).

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai. Mẫu chứng không đột biến không xuất hiện vạch đặc hiệu (ĐC -)

và 2 mẫu chứng có đột biến (ĐC1 +, ĐC2 +) xuất hiện 2 vạch đặc hiệu tương ứng

với kích thước đã được tính toán chứng tỏ quy trình PCR đạt yêu cầu. Mẫu bệnh

nhân (BN) xuất hiện vạch tương ứng với đột biến IVS1-5 (G-C) chứng tỏ bệnh

nhân có đột biến này.

Chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật ARMS PCR với cặp mồi IVS1-5 (G-C) để

ĐC (‐) ĐC (+) BN H2O M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB

285bp ‐ IVS1‐5

xác định kiểu gen của bệnh nhân (hình 3.14).

Hình 3.17. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215

phát hiện kiểu gen IVS1-5 (G-C)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến;

ĐC (+): Mẫu chứng dị hợp tử đột biến IVS1-5(G-C)

BN: Mẫu bệnh nhân;

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

BT: bình thường; ĐB: Đột biến.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị nhiễm

ngoại lai. ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến chỉ xuất hiện vạch với mồi bình

thường, trong khi đó mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện vạch ở cả mồi bình thường và

mồi đột biến tương tự như mẫu chứng có đột biến (ĐC +) chứng tỏ bệnh nhân có

đột biến dị hợp tử của đột biến IVS1-5 (G-C).

Bệnh nhân 5: Bệnh nhân có đột biến CD41/42(-TCTT), CD95 (+A)

ĐC (‐)

ĐC1 (+) ĐC2 (+)

BN H2O

439bp: CD41/42 (‐TCTT)

281bp: IVS1‐1 (G‐T)

240bp: CD17 (AAG‐TAG)

107bp: ‐28 (A‐G)

Phát hiện đột biến 1: CD41/42(-TCTT)

Hình 3.18. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT130310 có đột biến CD41/42(-TCTT)

M: Marker 100bp

ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến

ĐC1 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS2-654(C-T) và CD71/72(+A)

ĐC2 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS1-1(G-T), -28 (A-G).

BN: Mẫu bệnh nhân được phát hiện có đột biến CD41/42(-TCTT).

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai. Mẫu chứng không đột biến không xuất hiện vạch (ĐC -) và 2 mẫu

chứng có đột biến (ĐC1 +, ĐC2 +) xuất hiện 2 vạch đặc hiệu tương ứng với kích

thước đã được tính toán chứng tỏ quy trình PCR đạt yêu cầu. Mẫu bệnh nhân (BN)

xuất hiện 1 vạch tương ứng với đột biến - CD41/42(-TCTT) chứng tỏ bệnh nhân

có đột biến này.

Chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật ARMS PCR với cặp mồi CD41/42(-

M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB

439bp ‐ CD41/42 (‐TCTT)

TCTT) để xác định kiểu gen của bệnh nhân (hình 3.19).

Hình 3.19. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT130310 phát hiện kiểu gen CD41/42(-TCTT)

M: Marker 100bp;

ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến; ĐC (+): Mẫu chứng có đột biến.

BN: Mẫu bệnh nhân

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

BT: bình thường; ĐB: Đột biến.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai. ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến chỉ xuất hiện vạch với mồi bình

thường, trong khi đó mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện vạch ở cả mồi bình thường và

mồi đột biến tương tự như mẫu chứng có đột biến (ĐC +) chứng tỏ bệnh nhân có

đột biến dị hợp tử của đột biến này.

M ĐC (‐) ĐC1 (+) ĐC2 (+) BN H2O

382bp: IVS2‐654 (C‐T)

285bp:IVS1‐5 (G‐C)

241bp: CD71/72 (+A)

163bp:CD95 (+A)

Phát hiện đột biến 2: CD95 (+A)

Hình 3.20. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT130310 có đột biến CD95 (+A)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến

ĐC1 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS2-654(C-T) và CD71/72(+A)

ĐC2 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS1-5(G-C), CD95(+A).

BN: Mẫu bệnh nhân được phát hiện có đột biến CD95(+A).

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị nhiễm

ngoại lai. Mẫu chứng không đột biến không xuất hiện vạch (ĐC -) và 2 mẫu chứng

có đột biến (ĐC1 +, ĐC2 +) xuất hiện 2 vạch đặc hiệu tương ứng với kích thước đã

được tính toán chứng tỏ quy trình PCR đạt yêu cầu. Mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện

1 vạch tương ứng với đột biến CD95 (+A) chứng tỏ bệnh nhân có đột biến này.

Chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật ARMS PCR với cặp mồi CD95 (+A) để

ĐC (‐) ĐC (+) BN H2O M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB

163bp‐CD95

xác định kiểu gen của bệnh nhân (hình 3.21).

Hình 3.21. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT130310 phát hiện kiểu gen CD95 (+A)

M: Marker 100bp

ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến

ĐC (+): Mẫu chứng có đột biến dị hợp tử CD95

BN: Mẫu bệnh nhân

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

BT: bình thường; ĐB: Đột biến.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị nhiễm

ngoại lai.

ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến chỉ xuất hiện vạch với mồi bình thường, trong

khi đó mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện vạch ở cả mồi bình thường và mồi đột biến

tương tự như mẫu chứng có đột biến (ĐC +) chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị hợp

tử của đột biến này.

Bệnh nhân 6: bệnh nhân có đột biến CD41/42 (-TCTT) và HbE (GAG-AAG)-CD26

M ĐC (‐) ĐC1 (+) ĐC2 (+) BN H2O

439bp: CD41/42 (‐TCTT)

281bp: IVS1‐1 (G‐T) 240bp: CD17 (AAG‐TAG)

107bp: ‐28 (A‐G)

Phát hiện đột biến 1: CD41/42 (-TCTT)

Hình 3.22. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT090304 có đột biến CD41/42(-TCTT)

M: Marker 100bp; ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến

ĐC1 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS2-654(C-T) và CD71/72(+A)

ĐC2 (+): Mẫu chứng có đột biến IVS1-1(G-T), -28 (A-G).

BN: Mẫu bệnh nhân được phát hiện có đột biến CD41/42(-TCTT).

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai. Mẫu chứng không đột biến không xuất hiện vạch (ĐC -) và 2 mẫu

chứng có đột biến (ĐC1 +, ĐC2 +) xuất hiện 2 vạch đặc hiệu tương ứng với kích

thước đã được tính toán chứng tỏ quy trình PCR đạt yêu cầu. Mẫu bệnh nhân (BN)

xuất hiện 1 vạch tương ứng với đột biến CD41/42(-TCTT) chứng tỏ bệnh nhân có

đột biến này.

Chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật ARMS PCR với cặp mồi CD41/42(-

ĐC (‐) ĐC (+) BN H2O M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB

439bp ‐ CD41/42 (‐TCTT)

TCTT) để xác định kiểu gen của bệnh nhân (hình 3.23).

Hình 3.23. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT090304 phát hiện kiểu gen CD41/42(-TCTT)

M: Marker 100bp;

ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến; ĐC (+): Mẫu chứng có đột biến dị hợp tử CD41/42.

BN: Mẫu bệnh nhân.

H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

BT: bình thường; ĐB: Đột biến.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai.

ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến chỉ xuất hiện vạch với mồi bình thường, trong

khi đó mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện vạch ở cả mồi bình thường và mồi đột biến

tương tự như mẫu chứng có đột biến (ĐC +) chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị hợp

tử của đột biến này.

Phát hiện đột biến 2: HbE (GAG-AAG)-CD26

ĐC (‐) ĐC (+) BN H2O M BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB M

1

2

3

4

280bp: Cd26‐HbE

N M

N M N M N M

Hình 3.24. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân

mã số WBbT090304 phát hiện kiểu gen HbE (GAG-AAG)-CD26

M: Marker 100bp

ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến; ĐC (+): Mẫu chứng có đột biến dị hợp tử HbE

BN: Mẫu bệnh nhân; H2O: Mẫu nước không chứa DNA.

BT: bình thường; ĐB: Đột biến.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai.

ĐC (-): Mẫu chứng không đột biến chỉ xuất hiện vạch với mồi bình thường, trong

khi đó mẫu bệnh nhân (BN) xuất hiện vạch ở cả mồi bình thường và mồi đột biến

tương tự như mẫu chứng có đột biến (ĐC +) chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị hợp

tử của đột biến này.

HbE (AAG)‐CD26

HbE (AAG‐GAG)‐CD26

Người bình thường

Bệnh nhân mã số WBbT090304

Kết quả giải trình tự gen đột biến dị hợp tử HbE (GAG-AAG)-CD26:

Hình 3.25. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân

mã số WBbT090304 với với đột biến dị hợp tử HbE (GAG-AAG)-CD26

Nhận xét: Tại vị trí CD26 của gen β globin ở bệnh nhân có sự thay thế

nucleotid A thành G ở dạng dị hợp tử nên xuất hiện đỉnh nucleotid G và A chồng

lên nhau. Như vậy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử HbE (GAG-AAG)-CD26, kết

quả này tương đồng với kết quả phân tích bằng kỹ thuật Multiplex ARMS PCR và

ARMS PCR.

3.2.2.3. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân  thalassemia bằng kỹ thuật giải

trình tự gen

Trong nghiên cứu này, 3/214 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử khi phát hiện

đột biến bằng kỹ thuật multiplex ARMS PCR và ARMS PCR. Bệnh nhân thứ nhất

mã số WBbTS150926 được phát hiện có đột biến dị hợp tử CD17 (AAG-TAG),

bệnh nhân thứ 2 mã số PWBbT120505M và bệnh nhân thứ 3 mã số

WBbT110706 đều được phát hiện có đột biến dị hợp tử CD41/42 (-TCTT), kiểu

gen này không tương xứng với biểu hiện trên lâm sàng vì các bệnh nhân β

thalassemia thường có 2 đột biến kết hợp. Chúng tôi tiến hành giải trình tự toàn bộ

gen β globin để xác định đột biến thứ 2. Kết quả cho thấy cả 3 bệnh nhân đều

được phát hiện có đột biến điểm.

Tyr

His

Tyr…

Tyr

His

Stop

Bệnh nhân 1: Bệnh nhân có đột biến dị hợp tử c.441-442ins AC

Bệnh nhân mã số WBbTS150926

Người bình thường

Hình 3.26. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân

mã số WBbTS150926 với đột biến dị hợp tử c.441-442ins AC

Nhận xét: Tại vị trí c.441-442 của gen β globin, ở người bình thường là mã

kết thúc gen, tuy nhiên ở bệnh nhân do thêm 2 nucleotid AC ở dạng dị hợp tử nên

xuất hiện các đỉnh nucleotid chồng lên nhau làm mã kết thúc bị dịch chuyển.

c.‐140 C

c.‐140 C>T

Bệnh nhân mã số PWBbT120505M

Người bình thường

Bệnh nhân 2: Bệnh nhân có đột biến dị hợp tử c.-140C>T

Hình 3.27. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân

mã số WBbTS150926 với đột biến dị hợp tử c.-140C>T

Nhận xét: Tại vị trí c.-140C của gen β globin ở bệnh nhân có sự thay thế

nucleotid C thành T ở dạng dị hợp tử nên xuất hiện đỉnh nucleotid C và T chồng lên

nhau. Như vậy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử c.-140C>T.

c.‐138C>T c.‐140 C

c.‐138C>T c.‐138C>T

Bệnh nhân mã số WBbT110706

Người bình thường

Bệnh nhân 3: Bệnh nhân có đột biến dị hợp tử c.-138C>T

Hình 3.28. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân

mã số WBbTS150926 với đột biến dị hợp tử c.-138C>T

Nhận xét: Tại vị trí c.-138C của gen β globin ở bệnh nhân có sự thay thế

nucleotid C thành T ở dạng dị hợp tử nên xuất hiện đỉnh nucleotid C và T chồng lên

nhau. Như vậy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử c.-138C>T.

3.2.2.4. Phát hiện đột biến mất đoạn lớn gây tồn dư huyết sắc tố bào thai HbF bằng

kĩ thuật Gap PCR

Ca lâm sàng điển hình: Bệnh nhân có đột biến IVS2-654 (C>T) và đột biến

mất đoạn lớn HPFH thể SEA.

Bệnh nhân được chẩn đoán β thalassemia và được chỉ định xét nghiệm gen

tìm đột biến. Bố, mẹ và anh trai cũng được tiến hành xét nghiệm song song. Trước

tiên, kỹ thuật Multiplex ARMS PCR và ARMS PCR được áp dụng để phát hiện 9

đột biến thường gặp. Kết quả cho thấy bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử IVS2-654

(C>T), anh trai bệnh nhân không có đột biến IVS2-654 (C>T), bố bệnh nhân không

có đột biến IVS2-654 (C>T), mẹ bệnh nhân có đột biến dị hợp tử IVS2-654 (C>T).

Multiplex ARMS PCR và ARMS PCR được kiểm tra lại bằng kỹ thuật giải trình tự

gen và cho kết quả tương đồng. Như vậy với kết quả này cho thấy, kiểu đột biến

gen của bệnh nhân không phù hợp với kiểu di truyền của bố và mẹ vì bệnh nhân có

kiểu gen đồng hợp tử thì không thể chỉ có thể nhận 1 alen đột biến IVS2-654 (C>T)

của người mẹ.

IVS2-654

A)

Mẫu DNA của bố: Không phát hiện đột biến trên gen Hbb

Mẫu DNA của con đầu: Không phát hiện đột biến trên gen Hbb

Mẫu DNA của mẹ: Dị hợp tử đột biến điểm IVS2-654(C>T)

Mẫu DNA của con thứ 2: Đồng hợp tử đột biến điểm IVS2- 654(C>T)

Hình 3.29. Kết quả xác định đột biến gen của bệnh nhân

mã số PWBbT120505F và gia đình.

(A) Kết quả giải trình tự gen kiểm tra đột biến.

(B) Kết quả phát hiện đột biến HPFH thể SEA bằng kỹ thuật Gap PCR

Chúng tôi giả thuyết có khả năng bệnh nhân có đột biến mất đoạn lớn và

người bố cũng có đột biến này và truyền cho con. Chúng tôi tiếp tục áp dụng kỹ

thuật Gap PCR để kiểm tra. Kết quả cho thấy bệnh nhân có dị hợp tử đột biến mất

đoạn lớn HPFH dạng SEA và bố bệnh nhân cũng có đột biến biến mất đoạn lớn

HPFH dạng SEA. Như vậy, bệnh nhân có dị hợp tử đột biến kết hợp (IVS2-654

(C>T)/HPFH thể SEA) gồm đột biến IVS2-654 (C>T) nhận từ người mẹ và đột biến

mất đoạn lớn HPFH dạng SEA nhận từ người bố (hình 3.29).

Nhận xét:

Ở hình 3.29A, tại vị trí IVS2-654, mẫu bố và mẫu anh trai chỉ xuất hiện đỉnh

bình thường của nucleotid C chứng tỏ không có đột biến, trong khi đó mẹ xuất hiện

cả đỉnh bình thường của của nucleotid C và đỉnh đột biến của nucleotid T chứng tỏ

mẹ có đột biến dị hợp tử. Bệnh nhân chỉ xuất hiện đỉnh đột biến của nucleotid T

chứng tỏ bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử.

Ở hình 3.29B, mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ không có hiện tượng

nhiễm ngoại lai. Ở mẫu chứng âm tính với đột biến HPFH thể SEA không xuất hiện

vạch, trong khi đó ở mẫu bố bệnh nhân và bệnh nhân xuất hiện vạch đột biến tương

tự như mẫu chứng dương tính với đột biến HPFH thể SEA chứng tỏ bố bệnh nhân

và bệnh nhân có đột biến dạng này.

3.2.3. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen bệnh 

thalassemia.

Các gia đình bệnh nhân có con đầu mắc  thalassemia (đã thực hiện xét

nghiệm sàng lọc và xét nghiệm chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử xác

định được dạng đột biến gen gây bệnh) đều được khai thác thông tin và tiến hành

xây dựng phả hệ để xác định người mang gen bệnh cần phân tích gen β globin, bao

gồm bố và mẹ của bệnh nhân. Ngoài ra, có 1 số bệnh nhân có nghi ngờ là người

mang gen bệnh dựa vào kết quả sàng lọc công thức máu tổng quát và điện di huyết

sắc tố, cũng tham gia vào nghiên cứu này.

Các đối tượng này đều được hỏi ý kiến đồng ý trước khi tham gia, đồng thời

ký tên vào bản cam kết trước khi được lấy mẫu bệnh phẩm thực hiện xét nghiệm

tham gia vào nghiên cứu.

3.2.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số

DNA tổng số từ máu toàn phần được tách chiết bằng phương pháp sử dụng

bộ kit QiAgen blood mini kit (Đức) theo các bước hướng dẫn của nhà sản xuất.

DNA sau khi tách chiết được xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng cách đo phổ

hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 260nm và 280nm và điện di trên gel agarose 1%.

Hình 3.30. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ máu ngoại vi

của các đối tượng nghiên cứu.

Nhận xét: Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ máu ngoại vi của

bệnh nhân Beta thalassemia lên vạch rõ nét, không bị đứt gẫy và đủ chất lượng để

phân tích đột biến. Nồng độ DNA tổng số tách được có giá trị từ 50-70ng/µl và độ

tinh sạch của các mẫu đạt yêu cầu với tỷ lệ mật độ quang đo được ở bước sóng

260/280 nằm trong khoảng 1,8-2,0.

3.2.3.2. Kết quả phát hiện đột biến gen β globin trên đối tượng người mang

gen bệnh

Bảng 3.5. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin

trên đối tượng người mang gen bệnh (n=354).

Vị trí

Tỷ lệ

Các đột biến gen β globin

Tần số alen

(%)

(Exon/Intron)

Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR và ARMS PCR

Exon 2

CD41/42(-TCTT)

30,79

109

Exon 1

CD17(AAG-TAG)

28,25

100

Exon 2

HbE (GAG-AAG )- CD26

24,29

Promotor

-28(A-G)

2,54

Exon 2

CD71/72(+A)

6,21

Intron 1

IVS1-1(G-T)

2,26

Intron 1

IVS1-5(G-C)

0,56

Intron 2

IVS2-654(C-T)

1,13

Exon 2

CD95(+A)

1,69

Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger

Các đột biến điểm hiếm gặp

0.85

Kỹ thuật Gap - PCR

Toàn bộ gen β

Đột biến mất đoạn lớn

0,28

globin(2,3kb)

Không tìm thấy đột biến

0,85

Nhận xét: Trong tổng số 354 người được xác định có nguy cơ là người

mang gen bệnh  thalassemia tham gia nghiên cứu, tỷ lệ phát hiện đột biến ở người

mang gen bệnh là 351/354, chiếm 99,15%.

- Trong 09 đột biến sàng lọc bằng phương pháp Multiplex ARMS PCR và

ARMS PCR, nhóm đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao nhất là CD41/42(-TCTT), CD17

(AAG-TAG), HbE (CD26) với tỷ lệ tương ứng là 30,79%, 28,25% và 24,29%.

- Đã phát hiện 03 đột biến điểm hiếm gặp bằng phương pháp giải trình tự gen

β globin: c.-138 C>T; c.-140 C>T; c.441-442 insAC (Hb Tak). Những trường hợp

mang gen bệnh này là bố hoặc mẹ của các trường hợp bệnh nhân đã được ghi nhận

ở phần kết quả 3.2.2.1.

- Đặc biệt còn phát hiện thấy 01 trường hợp người mang gen bệnh 

thalassemia mang đột biến mất đoạn toàn bộ gen β globin với độ lớn 2,3kb. Đây

cũng là báo cáo đầu tiên ở Việt Nam ở mức độ sinh học phân tử về đột biến này.

- Phát hiện có 02 trường hợp gia đình, có kiểu gen đột biến cả vợ và chồng

đều có kiểu gen đột biến đồng thời gây bệnh  thalassemia và α thalassemia. Biểu

hiện lâm sàng và các kết quả cận lâm sàng chỉ biểu hiện là người mang đột biến trên

gen β globin.

- Phát hiện có 01 gia đình, người mẹ tuy mang 2 đột biến điểm trên gen β

globin là người mang thể  thalassemia trung gian, không có biểu hiện lâm sàng đặc

trưng của người bị bệnh, chỉ số HbF tăng cao (28%).

Các trường hợp nghi ngờ mang gen đã phát hiện thấy đột biến, là người

mang gen bệnh  thalassemia là hoàn toàn phù hợp với các quả cận lâm sàng thể

hiện ở kết quả công thức máu tổng quát và định lượng Hemoglobin bằng xét

nghiệm điện di huyết sắc tố.

- Có 3/354 trường hợp người nghi ngờ mang gen bệnh không phát hiện thấy

đột biến trên gen β globin chiếm tỷ lệ 0,84%.

* Một số hình ảnh đại diện sàng lọc đột biến gen β globin ở người mang gen

bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật Multiplex ARMS PCR và ARMS PCR

Gia đình 1. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen là bố mẹ trong

gia đình đã có con bị đồng thời đột biến CD17(AAG-TAG) và CD26 – HbE (A-G)

Bằng việc sử dụng Multiplex ARMS PCR 1 để phát hiện 4 đột biến CD41/42(-

TCTT), CD17 (AAG-TAG), IVS1-1(G-T), -28 (A-G), chúng tôi phát hiện thấy

bệnh nhân mã số WBbT081203 có đột biến CD41/42(-TCTT) và CD17 (AAG-

TAG) (hình 3.31)

Hình 3.31. Kết quả điện di bước 1 sàng lọc 4 đột biến CD41/42(-TCTT), CD17(AAG-

TAG), IVS1-1(G-T), -28 (A-G) của cặp bố mẹ có mã số WBbT090803 và WBbT090804

M: Marker 100bp

ĐC(-) Mẫu chứng không bị đột biến

ĐC1(+)Mẫu chứng nội kiểm có đột biến CD41/42(-TCTT) và CD17(AAG-TAG)

ĐC2(+)Mẫu chứng nội kiểm có đột biến IVS1-1(G-T), -28 (A-G).

Mẹ: Mẫu ADN của bệnh nhân mã số WBbT090804 bị đột biến (mẹ)

Bố: Mẫu ADN của bệnh nhân mã số WBbT090803 không bị đột biến (bố)

H2O: Mẫu nước nội kiểm không chứa ADN.

Nhận xét: Mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ quy trình không bị

nhiễm ngoại lai. Mẫu chứng không đột biến không xuất hiện vạch (giếng số 1) và

2 mẫu chứng có đột biến (giếng số 2 và 3) xuất hiện 2 vạch đặc hiệu tương ứng

với kích thước đã được tính toán chứng tỏ quy trình PCR đạt yêu cầu. Mẫu người

mang gen của người mẹ (giếng số 4) xuất hiện 1 vạch tương ứng với đột biến

CD17 (AAG-TAG) giống như mẫu chứng (giếng 2) chứng tỏ bệnh nhân có đột

biến này.

Qua sàng lọc bước 1, phát hiện thấy người mẹ mang mã số WBbT090804 có

đột biến CD17 (AAG-TAG), người bố mã số WBbT090803 chưa phát hiện thấy đột

biến. Tiếp tục sàng lọc đột biến cho người bố và tìm kiểu gen cho người mẹ.

Hình 3.32. Kết quả điện di bước 2 sàng lọc 4 đột biến IVS2-654(C-T), CD71/72(+A),

IVS1-5(G-C), CD95 (+A) của cặp bố mẹ có mã số WBbT090803 và WBbT090804

M: Marker 100bp

ĐC (-): Mẫu chứng không bị đột biến

ĐC1(+): Mẫu chứng nội kiểm có đột biến IVS2-654(C-T) và CD71/72(+A)

ĐC2(+): Mẫu chứng nội kiểm có đột biến IVS1-5(G-C) và CD95 (+A)

Mẹ: Mẫu DNA của bệnh nhân mã số WBbT090804 không bị đột biến

Bố: Mẫu DNA của bệnh nhân mã số WBbT0908043 không bị đột biến

H20: Mẫu nước nội kiểm không chứa DNA.

Nhận xét : Mẫu người mang gen của người bố (giếng số 5) không xuất hiện

băng tương ứng nào với các đột biến. Vì vậy, người bố cũng không mang đột biến

nào trong nhóm đột biến thứ 2 này.

Xem xét kết quả sàng lọc đột biến HbE (CD26), kết quả thể hiện ở hình 3.33.

Hình 3.33. Kết quả điện di bước 3 sàng lọc đột biến HbE (CD26)

của cặp bố mẹ có mã số WBbT090803 và WBbT090804

M: Marker 100bp

ĐC(-): Mẫu chứng nội kiểm không bị đột biến dị hợp tử HbE (CD26)

ĐC(+):Mẫu chứng nội kiểm có đột biến dị hợp tử HbE (CD26)

Mẹ: Mẫu ADN của bệnh nhân mã số WBbT090804 không bị đột biến

Bố: Mẫu ADN của bệnh nhân mã số WBbT090803 bị đột biến.

H20: Mẫu nước nội kiểm không chứa DNA

Nhận xét : Mẫu người mang gen của người bố (giếng số 5) xuất hiện băng

tương ứng với đột biến HbE (CD26). Như vậy, người bố mang đột biến dị hợp tử

đột biến này.

Kết quả điện di minh họa kiểu gen của người mẹ:

Hình 3.34. Kết quả điện di tìm kiểu gen đột biến của người mẹ mã số WBbT090804.

M: Marker 100bp

ĐC(-):Mẫu chứng không bị đột biến

ĐC(+):: Mẫu chứng nội kiểm có đột biến dị hợp tử CD17(AAG-TAG)

Mẹ: Mẫu ADN của bệnh nhân mã số WBbT090804 bị đột biến

Bố: Mẫu ADN của bệnh nhân mã số WBbT090803 không bị đột biến

H20: Mẫu nước nội kiểm không chứa DNA.

Như vậy, qua 3 bước sàng lọc với 09 đột biến điểm bằng kỹ thuật multiplex

ARMS PCR và ARMS PCR, phát hiện thấy người mẹ mã số WBbT090804 có đột

biến CD17 (AAG-TAG) ở dạng dị hợp tử, người bố dị hợp tử đột biến HbE(CD26).

* Kết quả phát hiện đột biến hiếm gặp trên gen β globin ở người mang gen

bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger.

Như phần trình bày kết quả xác định đột biến của bệnh nhân ở phần 3.2.2.1

khi sàng lọc đột biến ở người mang gen bệnh, đồng thời là bố hoặc mẹ của bệnh

nhân thể nặng trên, chúng tôi đã phát hiện ra các đột biến tương ứng. Kết quả cụ thể

như sau:

a. Phát hiện đột biến điểm hiếm gặp HBB: c.-138 C>T của bệnh nhân nghi ngờ là

người mang gen bệnh mã số WBbT110706

Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của

bệnh nhân mã số WBbT110706 được thể hiện ở bảng 3.6.

Bảng 3.6 Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố

của bệnh nhân mã số WBbT110706

Chỉ số Công thức máu

Chỉ số tỉ lệ các thành phần huyết sắc tố (%)

MCV

MCH

Hgb

HbA1

HbA2

HbE

HbF

Khác

(fL)

(pg)

(g/L)

68,2

146

91,2

5,8

3,0

Sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS PCR sàng lọc 09 đột biến điểm theo quy

trình xét nghiệm, tuy nhiên không phát hiện dương tính với bất cứ đột biến nào nằm

trong nhóm này. Chúng tôi nhận thấy, kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức

máu và điện di huyết sắc tố được trình bày ở bảng 3.7 bệnh nhân này có thiếu máu

nhược sắc, hồng cầu nhỏ (MCV, MCH đều giảm rõ rệt), chỉ số HbA2 tăng cao

(>3,5%), nên đây là kết quả sàng lọc rất điển hình của người mang đột biến trên gen

β globin. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục sử dụng kĩ thuật giải trình tự toàn bộ gen β

globin. Kết quả thể hiện ở hình 3.35.

Hình 3.35. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp của bệnh nhân mã số

WBbT110706

Nhận xét: Như vậy, bằng kĩ thuật giải trình tự gen, chúng tôi đã phát hiện

thấy đột biến điểm c.-138C>T ở bệnh nhân mã số WBbT110706. Đột biến này

được phát hiện ở quần thể người da đen. Dựa vào ảnh hưởng của đột biến, đột biến

này được xếp vào nhóm β+, làm giảm quá trình tổng hợp chuỗi β globin. Cơ chế

của việc này là do đột biến c.-138C>T làm giảm phiên mã của gen beta-globin do

giảm các điểm bám với các yếu tố phiên mã.

b. Phát hiện đột biến điểm hiếm gặp HBB: c.-140 C>T của bệnh nhân nghi ngờ là

người mang gen bệnh mã số PWBbT120505M

Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của

bệnh nhân mã số PWBbT120505M được thể hiện ở bảng 3.7

Bảng 3.7. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và

điện di huyết sắc tố của bệnh nhân mã số PWBbT120505M

Chỉ số Công thức máu

Chỉ số tỉ lệ các thành phần huyết sắc tố (%)

MCV(fL) MCH(pg)

Hgb(g/L)

HbA1

HbA2

HbE

HbF

Khác

140

94,3

5,7

Sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS PCR sàng lọc 09 đột biến điểm theo quy

trình xét nghiệm, tuy nhiên không phát hiện dương tính với bất cứ đột biến nào nằm

trong nhóm này. Chúng tôi nhận thấy, kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức

máu và điện di huyết sắc tố được trình bày ở bảng 3.8, bệnh nhân này có thiếu máu

nhược sắc, hồng cầu nhỏ (MCV, MCH đều giảm rõ rệt), chỉ số HbA2 tăng cao

(>3,5%), nên đây là kết quả sàng lọc rất điển hình của người mang đột biến trên gen

β globin. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục sử dụng kĩ thuật giải trình tự toàn bộ gen β

globin. Kết quả thể hiện ở hình 3.36.

Hình 3.36. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp

của bệnh nhân mã số PWBbT120505M

Nhận xét: Đã phát hiện thấy đột biến điểm hiếm gặp c.-140C>T ở bệnh

nhân mã số PWBbT120505M. Đột biến này nằm ở vùng điều hòa gen, gây giảm

phiên mã của gen. Dựa vào ảnh hưởng của nó, đột biến này được xếp vào nhóm đột

biến gây giảm 1 phần tổng hợp chuỗi β globin, nhóm β+ .

c. Phát hiện đột biến điểm hiếm gặp HBB: c.441-442insAC của bệnh nhân mã số

WBbTS150926 Hà Thị Bích Th.

Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của bệnh

nhân mã số PWBbT120505M được thể hiện ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu

và điện di huyết sắc tố của bệnh nhân mã số WBbT150926.

Chỉ số Công thức máu

Chỉ số tỉ lệ các thành phần huyết sắc tố (%)

MCV

MCH

Hgb

HbA1

HbA2

HbE

HbF

Khác

(fL)

(pg)

(g/L)

118

95,2

4,8

Sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS PCR sàng lọc 09 đột biến điểm theo quy

trình xét nghiệm, tuy nhiên không phát hiện dương tính với bất cứ đột biến nào nằm

trong nhóm này. Chúng tôi nhận thấy, kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức

máu và điện di huyết sắc tố được trình bày ở bảng 3.8, bệnh nhân này có thiếu máu

nhược sắc, hồng cầu nhỏ (MCV, MCH đều giảm rõ rệt), chỉ số HbA2 tăng cao

(>3,5%), nên đây là kết quả sàng lọc rất điển hình của người mang đột biến trên gen

β globin. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục sử dụng kĩ thuật giải trình tự toàn bộ gen β

globin. Kết quả thể hiện ở hình 3.45

Hình 3.37. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp

của bệnh nhân mã số WBbTS150926

Nhận xét: Đã phát hiện thấy đột biến Hbb:c.441-442insAC của bệnh nhân

mã số WBbT150926. Đột biến này do bị thêm 2 nucleotide AC vào sau vị trí codon

146 của gen β, làm mất bộ ba kết thúc bình thường ở vị trí codon 147 (TAA) 

chuỗi gen β kéo dài thêm 11 acid amin.

d. Phát hiện đột biến mất đoạn lớn toàn bộ gen β globin độ lớn 2,3kb HPFH dạng

SEA của bệnh nhân mã số PWBbT120505M

Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của

bệnh nhân mã số PWBbT120505F được thể hiện ở bảng 3.9

Bảng 3.9. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và

điện di huyết sắc tố của bệnh nhân mã số PWBbT120505F

Chỉ số Công thức máu

Chỉ số tỉ lệ các thành phần huyết sắc tố (%)

MCV

MCH

Hgb

HbA1

HbA2

HbE

HbF

Khác

(fL)

(pg)

(g/L)

82,2

26,5

157

72,2

2,9

24,9

Sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS PCR sàng lọc 09 đột biến điểm theo

quy trình xét nghiệm, tuy nhiên không phát hiện dương tính với bất cứ đột biến

nào nằm trong nhóm này. Tiếp tục sử dụng kĩ thuật giải trình tự toàn bộ gen β

globin, cũng không phát hiện thấy đột biến nào. Chúng tôi nhận thấy, kết quả sàng

lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố được trình bày ở bảng

3.9, bệnh nhân này không thiếu máu nhược sắc, hồng cầu không khác biệt với

người mang gen β thalassemia điển hình, tuy nhiên chỉ HbF tăng cao rõ rệt

(24,9%), gợi ý đến thể Thalassemia tồn dư huyết sắc tố do mất đoạn toàn bộ vùng

gen β globin và 1 số vùng gen bên cạnh. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục sử dụng kĩ

thuật Gap PCR để sàng lọc đột biến mất đoạn lớn HPFH thể SEA. Kết quả thể

hiện ở hình 3.38.

Hình 3.38. Kết quả điện di phát hiện đột biến mất đoạn lớn ở người bố.

Marker: 100bp

1. Mẫu chứng dương tính với đột biến HPFH dạng SEA 2. Mẫu chứng âm tính với đột biến HPFH dạng SEA 3. Mẫu trắng không chứa ADN 4. Mẫu DNA của bố: dị hợp tử đột biến HPFH dạng SEA (2,3kb)

Nhận xét: Mẫu DNA của người bố có xuất hiện băng cùng kích thước với

mẫu chứng dương tính với đột biến HPFH dạng SEA, chứng tỏ người bố bị đột

biến này.

e. Phát hiện 03 cặp vợ chồng đồng thời mang gen bệnh Beta thalassemia (có con

đầu bị Beta thalassemia thể nặng) kết hợp với gen Alpha thalassemia.

Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của 3 cặp

bố mẹ mang gen bệnh kết hợp hai thể Beta và Alpha thalassemia được thể hiện ở

bảng 3.10

Bảng 3.10. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của 3 gia đình có kiểu gen kết hợp

 và β thalassemia.

Thông tin bệnh nhân

Chỉ số Công thức máu

Chỉ số tỉ lệ các thành phần huyết sắc tố (%)

Tiền sử gia đình

Số thứ tự

Mã số

HbA1

HbA2

HbE

Tên

MCV (fL)

MCH (pg)

Hgb (g/L)

đầu mắc

Lò Thị Bích Th.

70,6

22,7

126

5,0

Lưu Công Ngh.

69,8

21,6

140

78,3

21,7

đầu mắc

Tăng Thị B.

19,5

133

94,3

5,7

Phan Văn H.

64,3

20,9

129

94,1

5,9

đầu mắc

Lò Thị D

77,7

24,8

128

94,2

5,8

Lương Sơn L.

81,8

122

94,3

5,7

- Con thalassemia thể nặng - Có tiền sử đình chỉ thai nghén do phù thai ở tuần thai 19. - Con thalassemia thể nặng - Tiền sử phù thai khi ở tuần thai 22 tuần - Con thalassemia thể nặng - Tiền sử phù thai khi ở tuần thai 25 tuần

Với 3 cặp vợ chồng trên, chúng tôi đã thực hiện quy trình xét nghiệm sàng

lọc 09 đột biến trên gen β globin, và đã phát hiện thấy đột biến của từng thành viên.

Ngoài ra, kết hợp với thông tin lâm sàng của bệnh nhân cung cấp: phù thai ở các

tuần thai 19-25 tuần, chúng tôi đã kết hợp sàng lọc 1 số đột biến mất đoạn lớn

thường gặp với bệnh  thalassemia. Kết quả cụ thể được thể hiện ở các sơ đồ phả hệ

con vừa bị β thalassemia thể nặng và phù thai di α thalassemia thể nặng.

3.2.4. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia

Trong số các cặp bố mẹ đã được chẩn đoán xác định là người mang gen

bệnh β thalassemia, có 177 gia đình đồng ý tham gia tiến hành chẩn đoán trước

sinh cho thai nhi ở lần mang thai tiếp theo. Trong số này có 1 gia đình, sản phụ

mang thai đôi.

3.2.4.1. Quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia

Hình 3.40. Quy trình chẩn đoán trước sinh cho bệnh β thalassemia

Chẩn đoán trước sinh cho thai phụ chỉ được thực hiện khi xác định được kiểu

gen đột biến của bố và mẹ. Xét nghiệm này sẽ chỉ sàng lọc đột biến đã được chỉ

điểm trên bố và mẹ. Nếu thai nhi không phát hiện thấy đột biên nào, được kết luận

là thai không bị bệnh, nếu phát hiện thấy 1 đột biến, sẽ là thai mang gen bệnh. Nếu

thai nhi bị 2 đột biến, sẽ kết luận là thai bị bệnh.

Trong nghiên cứu này số lượng bệnh nhân thể nặng là 214, người nghi ngờ mang

gen là 354, và số thai phụ tham gia chẩn đoán trước sinh là 178 trường hợp.

3.2.4.2. Kết quả tách chiết DNA

Tất cả các mẫu DNA thu được dòng tế bào sau nuôi cấy của sản phụ ở tuần

thai 16-18 tuần đều có nồng độ trong khoảng 30-70ng/µl, độ tinh sạch ở bước sóng

260/280nm trong khoảng 1,8-2,0. Như vậy, các mẫu DNA được tách chiết có chất

lượng tốt để thực hiện cho các quy trình phân tích tiếp theo (phụ lục 1).

3.2.4.3. Kết quả xác định đột biến của thai nhi

Các bước xét nghiệm chẩn đoán trước sinh cho thai nhi được thực hiện quy

trình đã được trình bày ở phần 3.2.4.1. Các đột biến được sàng lọc và chẩn đoán

cho thai nhi là các đột biến đã được xác định có ở bố và mẹ.

Tiến hành xác định đột biến gen β globin trên 178 mẫu DNA được tách chiết

từ dòng tế bào ối của sản phụ.

Kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 3.11.

Bảng 3.11. Kết quả số lượng và tỷ lệ thai nhi chẩn đoán trước sinh.

Số lượng đột biến

Số lượng thai nhi (n=178)

Tỷ lệ (%)

Không bị đột biến

30,3

Bị 1 đột biến

42,1

Bị 2 đột biến

27,6

Nhận xét: Trong số 178 thai nhi được tiến hành chẩn đoán trước sinh, có

54/178 thai nhi không mang đột biến nào, chiếm 30,3%, 75/178 thai nhi (chiếm

42,1%) mang 01 đột biến, 49/178 thai nhi (chiếm 27,6%).

Bảng 3.12. Kết quả tần số và tỷ lệ alen đột biến trong

chẩn đoán trước sinh cho thai nhi

Vị trí

Tần số

Tỷ lệ

Các đột biến gen β globin

(Exon/Intron)

(n=356)

(%)

CD41/42(-TCTT)

Exon 2

14,3

CD17(AAG-TAG)

Exon 1

15,73

HbE (GAG-AAG)- CD26

Exon 2

11,5

-28(A-G)

Promotor

1,12

CD71/72(+A)

Exon 2

3,37

IVS1-1(G-T)

Intron 1

1,4

IVS1-5(G-C)

Intron 1

0,28

IVS2-654(C-T)

Intron 2

0,56

CD95(+A)

Exon 2

0,28

Các đột biến hiếm gặp khác

0,56

Nhận xét: Trong 9 alen đột biến được sàng lọc, các alen có tần xuất cao nhất

là CD17 (AAG-TAG), CD41/42(-TCTT), HbE-CD26, CD71/72(+A) với tỉ lệ lần

lượt là 15,73%, 14,3%, 11,5%, 3,37%.

Có 49/178 thai nhi có mang đồng thời 2 đột biến. Kết quả số lượng và tần số

kiểu gen xuất hiện của từng kiểu gen được thể hiện ở bảng 3.13.

Bảng 3.13. Tần số và tỉ lệ kiểu gen đột biến xuất hiện ở 178 thai nhi

STT

Kiểu gen

Số lượng ca bệnh

Tỉ lệ(%)

CD41/42-CD41/42

8,16

CD41/42-CD17

16,3

CD41/42-IVS1-1

6,12

CD41/42-CD71/72

6,12

CD41/42-HbE

24,4

CD17-HbE

24,4

CD17-IVS2-654

2,1

CD17-CD17

10,2

CD71/72-HbE

2,1

Tổng

Nhận xét: Trong nghiên cứu này, với số lượng 178 thai nhi được tiến hành

làm xét nghiệm chẩn đoán trước sinh, chúng tôi đã ghi nhận được 09 kiểu gen đột

biến. Trong đó kiểu gen có tần suất gặp cao nhất là CD41/42-HBE, CD17-HbE với

tỉ lệ 24,4%, CD41/42-CD17 với tỉ lệ 16,3%, CD17-CD17 với tỉ lệ 10,2% và

CD41/42-CD41/42 với tỉ lệ 8,16%.

4.2.4.4. Sơ đồ phả hệ của 1 số gia đình tiến hành chẩn đoán trước sinh bệnh β

thalassemia

a. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình thai phụ mã số AFbT120605, Nguyễn

Thị Th. (Bố mang đột biến CD17 (AAG-TAG), mẹ mang đột biến CD41/42 (-TCTT)

Hình 3.41. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân sản phụ

mã số AFbT120605, Nguyễn Thị Th.

b. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân sản phụ mã số

AFbT110705, Hà Thị V. (Bố mang đột biến CD71/72(+A), mẹ mang 2 đột biến -

28(A-G) và HbE-CD26).

Hình 3.42. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình

bệnh nhân sản phụ mã số AFbT110705, Hà Thị V.

c. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân sản phụ mã số

AFbT121061, Nguyễn Phương D. (Bố là người mang gen đột biến mất đoạn toàn bộ

gen β globin, HPFH thể SEA, mẹ là người mang gen đột biến IVS2-654(C-T)

Hình 3.43. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình

bệnh nhân sản phụ mã số AFbT121061 Nguyễn Phương D.

d. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình sản phụ mã số AFbT150302, Lò Thị

Bích Th. (Bố và mẹ đều là người mang gen đột biến kết hợp thể Alpha và Beta

thalassemia)

Hình 3.44. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình sản phụ

mã số AFbT150302, Lò Thị Bích Th.

CHƯƠNG 4.

BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. VAI TRÒ CỦA KỸ THUẬT MULTIPLEX ARMS PCR, GIẢI TRÌNH TỰ

GEN VÀ GAP PCR TRONG CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH BỆNH β

THALASSEMIA

4.1.1. Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR

Các đột biến gây bệnh β thalassemia hầu hết là các đột biến đã biết, được xác

định bằng nhiều loại kỹ thuật khác nhau dựa trên nền tảng của kỹ thuật PCR. Quyết

định lựa chọn kỹ thuật nào ứng dụng vào chẩn đoán chủ yếu tuỳ thuộc vào việc xác

định đặc điểm các đột biến gây bệnh phổ biến ở từng quần thể, và tuỳ theo năng lực

của mỗi trung tâm chẩn đoán (Glanello R. 2003). Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa

chọn các kỹ thuật Multiplex ARMS PCR, giải trình tự gen Sanger và GAP-PCR để

phát hiện các đột biến gen β globin gây bệnh β thalassemia.

Cho đến nay, có rất nhiều kỹ thuật đã được ứng dụng trong phát hiện các đột

biến gây bệnh, làm cơ sở cho các ứng dụng chẩn đoán trước sinh cho bệnh lý di

truyền này. Các kỹ thuật đó bao gồm các kỹ thuật phát hiện đột biến điểm đã biết:

Realtime PCR, Microarrays, dHPLC (denaturing high performance), ARMS

(amplification refractory mutation system), RDB (reverse dot blots), RFLP

(restriction fragment length polymorphism analysis), ASO (allele specific

oligonucleotide),…kỹ thuật phát hiện đột biến chưa biết MLPA (multiplex ligation-

dependent probe amplification), DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis),…

kỹ thuật mất đoạn chưa biết: Real time PCR, Gap- PCR,..Hai kỹ thuật tối ưu nhất có

thể hợp nhất tất cả các ưu điểm của các phương pháp trên đó là kỹ thuật sử dụng

con chip Microarray và giải trình tự gen thể hệ mới ( Next Generation sequencing).

Tuy nhiên, giá thành của hai phương pháp này còn quá cao so với mức thu nhập của

người Việt Nam. Vì vậy, để triển khai trên thực tế là rất khó khăn.

Trong số hơn 200 đột biến đã được công bố trên thế giới, phần lớn là đột

biến điểm, phần rất nhỏ còn lại là đột biến mất đoạn lớn. Hơn nữa, đặc điểm của đột

biến của bệnh lý di truyền Thalassemia nói chung và β thalassemia nói riêng là đều

mang tính chủng tộc (Fucharoen, Winichagoon. 2011, Surapon. 2011). Nghĩa là mỗi

nước, nhóm dân tộc, vùng địa lý khác nhau lại mang 1 nhóm đột biến khác nhau đặc

trưng cho nhóm ấy.

Vì vậy việc tìm ra được nhóm đột biến đặc trưng cho từng nước hay một

nhóm dân tộc rất quan trọng để nhanh chóng xác định được đặc điểm ở mức độ sinh

học phân tử của bệnh lý này (Old, Khan et al. 2001). Song song với đó, việc lựa

chọn kỹ thuật sinh học phân tử hợp lý, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu, cho kết

quả chính xác là điều kiện quan trọng để có thể thực hiện được nghiên cứu và triển

khai thành dịch vụ phục vụ các yêu cầu chỉ định của bác sĩ lâm sàng đưa ra.

Với các đột biến điểm đã biết, có hai phương pháp hay được sử dụng nhất là

kỹ thuật dùng enzyme cắt giới hạn (RFLP) và ARMS PCR. Hai kỹ thuật này dùng

để phát hiện các đột biến điểm đã biết. Tuy nhiên với kỹ thuật cắt enzyme giới hạn,

với mỗi phản ứng chỉ phát hiện được 1 đột biến đã biết. Nhưng vậy, với 1 nhóm các

đột biến sẽ cần phải sử dụng nhiều phản ứng PCR liền một lúc, và tiếp tục với thao

tác cắt enzyme sau đó. Ngoài ra, so với kỹ thuật ARMS PCR, việc cắt enzyme là

bước tiếp theo sau bước nhân bản PCR, sẽ mất thêm thời gian để thực hiện, và cũng

sẽ là nguy cơ bị nhiễm các tác nhân gây nhiễm, gây ảnh hưởng đến tính chính xác

của kết quả. Với kỹ thuật PCR, không chỉ dừng lại ở việc phát hiện được 1 đột biến

điểm duy nhất, kỹ thuật này đã được phát triển để có thể phát hiện kết hợp đồng

thời nhiều đột biến điểm trong cùng 1 phản ứng PCR.

Kỹ thuật ARMS-PCR đã được nhiều y văn quốc tế và trong nước (Bartlett

2003, Baig 2007, Thakur 2012, Hoan 2013, Boonyawat, Monsereenusorn et al.

2014, Hanafi, Hassan et al. 2014, Honardoost, Tabatabaeian et al. 2014, Nguyễn

Thị Thanh Hà. 2014, Ly, Truc et al. 2017, Mishra, Patel et al. 2017, Shimbhu,

Mirasena et al. 2017) công bố là một trong các kỹ thuật phổ biến nhất được sử dụng

để phát hiện các đột biến điểm đã biết trong chẩn đoán bệnh β thalassemia. Đây là

kỹ thuật nhanh, đơn giản, không gắn phóng xạ, cho phép sàng lọc nhiều đột biến

khác nhau trong cùng một phản ứng PCR. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn kỹ thuật này

để phát hiện hai đột biến điểm thường gặp.

Kỹ thuật này đã được kiểm định và sử dụng trong quy trình phát hiện 09 đột

biến trên gen β globin của Khoa Di truyền và sinh học phân tử bệnh viện Nhi trung

ương, và được cấp chứng chỉ ISO15189:2012 cho chỉ tiêu xét nghiệm này.

Thực tế hiện nay trên thế giới, đặc biệt với các nước đang phát triển như

Malaysia (Hanafi, Hassan et al. 2014), Ấn Độ (Thakur 2012), Pakistan (Baig

2007), (Abolghasemi, Amid et al. 2007) … vẫn đang tiếp tục sử dụng kỹ thuật

Multiplex PCR này trong việc sàng lọc và chẩn đoán cho bệnh β thalassemia chứng

tỏ những ưu điểm về mặt kỹ thuật và giá thành của kỹ thuật này.

Nhược điểm của kỹ thuật này là đòi hỏi các tiêu chuẩn nghiêm ngặt, cần tối

ưu hoá các điều kiện phản ứng cho từng cặp mồi đặc hiệu với mỗi đột biến. Nếu

không có thể xảy ra âm tính giả hoặc dương tính giả. Phản ứng PCR sẽ chỉ khuyếch

đại được đoạn DNA cần thiết khi có được sự bắt cặp hoàn chỉnh giữa trình tự đích

và mồi. Ngoài ra, trong một quần thể đa dân tộc, với phổ đột biến rộng, thì ARMS-

PCR không phải là kỹ thuật được khuyến cáo đầu tiên để xác định đột biến (Little

2001).

4.1.2. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger

Gen β globin có chiều dài khoảng 1.6kb, gồm 3 exon và 2 intron. Có hơn

200 loại đột biến điểm trên gen β globin đã được công bố (Cai, Bai et al. 2018), ảnh

hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein, dẫn đến không hoặc suy giảm tổng hợp,

hoặc tạo chuỗi β globin không bền vững. Các đột biến này phân bố với tần suất

khác nhau ở các chủng tộc và khu vực khác nhau trên thế giới (Glanello R. 2003).

Đối với các đột biến điểm hiếm gặp, ngoài các đột biến đã được sàng lọc bằng

ARMS PCR chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger để phát hiện. Các

vùng được giải trình tự bao gồm: các vùng mã hóa trên gen β globin, vùng ranh giới

exon-intron, vùng cận promoter. Nghiên cứu của chúng tôi có 3 bệnh nhân mang

đột biến điểm hiếm gặp được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự, chiếm 1,4% trên

tổng số người mang gen bệnh β thalassemia.

4.1.3 Kỹ thuật Gap PCR

Nhược điểm của kỹ thuật giải trình tự gen Sanger là không phát hiện được

các đột biến mất đoạn lớn. Vì thế, trong quy trình xét nghiệm này, chúng tôi có sàng

lọc 1 mất đoạn lớn toàn bộ gen β globin độ lớn 2,3kb. Chúng tôi sử dụng bộ mồi

double Gap PCR theo thiết kế của Xu Xm và cộng sự (Xu, Li et al. 2000) để phát

hiện mất đoạn toàn bộ gen β globin gây tồn dư huyết sắc tổ thể SEA.

Việc kết hợp sử dụng các kỹ thuật phù hợp trong quy trình phát xác định đột

biến gen β globin đã phát hiện được 100% các đột biến trên 214 bệnh nhân β

thalassemia.

4.2. ĐẶC ĐIỂM VÀ TỶ LỆ CÁC ĐỘT BIẾN CÁC ĐỘT BIẾN GEN 

GLOBIN TRÊN NHÂN  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG

ƯƠNG

4.2.1. 09 đột biến sàng lọc bằng kỹ thuật Multiplex PCR

Chúng tôi lựa chọn kỹ thuật Multiplex ARMS PCR phát hiện 9 đột biến

điểm: CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-TAG), IVS1-1(G-T), -28(A-G), IVS2-

654(C-T), CD71/72(+A), IVS1-5(G-C), CD 95(+A) và HbE (AAG-GAG)-CD26 là

bước phân tích gen β globin đầu tiên đối với các bệnh nhân nghi ngờ mắc Beta

thalassemia trên lâm sàng. So sánh nhóm đột biến thường gặp này sàng lọc bằng kỹ

Multiplex PCR và ARMS PCR so với nhóm đột biến do Nguyễn Khắc Hân Hoan và

cộng sự sàng lọc bước đầu, nhóm đột biến đưa ra sàng lọc đầu tiên của chúng tôi có

thêm 2 đột biến là IVS1-5 (G-C) và CD95(+A). Hai đột biến này chúng tôi đã phát

hiện thấy ngay ở bước sàng lọc bằng PCR, dù tỉ lệ phát hiện không cao.

Để chọn 9 đột biến này, chúng tôi tham khảo trên y văn và các nghiên cứu

trước đó, để thấy đây là 9 đột biến gen β globin thường gặp. Theo công bố của

hiệp hội Thalassemia quốc tế (TIF), đột biến CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-

TAG), HbE (AAG-GAG)-CD26 là các đột biến gặp phổ biến ở vùng Đông Nam

Á, các đột biến nằm trong nhóm 9 đột biến được sàng lọc nằm rải rác ở các nhóm

quần thể trên thế giới.

Bảng 4.1. Các đột biến gen β globin phổ biến ở một số quần thể trên thế giới.

(Nguồn: Nguyễn Khắc Hân Hoan. 2013)

Quần thể

Đột biến

Quần thể

Đột biến

Việt Nam

-28 A-G

CD17 AAG-TAG

HbE (AAG-GAG)-CD26

CD41/42 –TCTT

Đông Nam Á

IVS1-5 G-C

Cd71/72 +A

CD41/42 -TTCT

IVS2-654 C-T

CD95 +A

Trung Quốc

-28 A-G

CD8 -AA

CD17 AAG-TAG

CD8/9 +G

HbE (AAG-GAG)-CD26

IVS1-5 G-C

Trung Đông

CD41/42 -TTCT

CD39 CAG-TAG

Cd71/72 +A

CD44 –C

IVS2-654 C-T

IVS2-1 G-A

Địa Trung Hải

IVS1-1 G-A

CD8/9 +G

IVS1-6 T-C

IVS1-1 G-A

IVS1-110 G-A

Ấn Độ

IVS1-5 G-C

CD39 CAG-TAG

CD41/42 -TTCT

IVS2-745 C-G

619 bp deletion

4.2.2. Đặc điểm và tỷ lệ đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia tại

bệnh viện Nhi Trung ương.

Nghiên cứu có số lượng bệnh nhân β thalassemia tham gia đề tài lớn nhất

đến thời điểm này ở khu vực phía Bắc Việt Nam.

Năm 2000, Filon và Dương Bá Trực đã tiến hành trên 23 bệnh nhân Beta

thalassemia thể nặng (Filon, Oppenheim et al. 2000). Năm 2007, Hoàng Văn Ngọc

và cộng sự đã nghiên cứu về các yếu tố tác động đến tình trạng Thalassemia và

bước đầu đưa ra tỉ lệ lưu hành gen β globin ở trẻ em dân tộc Dao và Tày ở Thái

Nguyên (HVNgọc. 2007). Nghiên cứu này thực hiện trên 352 trẻ em ở độ tuổi 3-15,

với phương pháp chẩn đoán sàng lọc bằng công thức máu và điện di huyết sắc tố.

Thực tế, là đối với các nghiên cứu sàng lọc ở mức độ quần thể, số lượng đối tượng

tham gia nghiên cứu sẽ lớn hơn hẳn so với nghiên cứu sàng lọc đích vì số lượng đã

bị thu hẹp lại. Hơn nữa, việc tiến hành nghiên cứu sàng lọc trên quần thể đích với

mục đích phát hiện tỉ lệ alen đột biến β thalassemia sẽ yêu cầu về mặt đầu tư trang

thiết bị, máy móc, hoá chất đắt tiền hơn.

Khả năng thu thập mẫu nghiên cứu này rất khả thi, vì đối tượng là những

bệnh nhân bị β thalassemia thể nặng thường khởi phát bệnh sớm, tuỳ thuộc thể

trạng, điều kiện sống, chế độ chăm sóc. Có những bệnh nhân thể nặng biểu hiện

bệnh từ lúc 1 tuổi, cần truyền máu và thải sắt thường xuyên tại khoa Huyết học lâm

sàng, bệnh viện nhi. Các bệnh nhân và bố mẹ của bệnh nhân nhi này sẽ được thăm

khám, làm xét nghiệm sàng lọc và xét nghiệm chẩn đoán ở mức độ sinh học phân tử

và điều trị đúng hướng.

Trong số 214 bệnh nhân được lựa chọn trong nghiên cứu, tỷ lệ phát hiện

214/214 bệnh nhân có kết hợp 2 đột biến gen β globin, số kiểu gen tìm thấy là 30.

Trong đó, tỷ lệ thể mang đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép 2 đột biến có tỷ lệ cao nhất

là 126/214 (58,8%), Kiểu gen /HbE chiếm tỷ lệ 43%, thể trung gian là 2 (0,93%).

Các kiểu gen có tỷ lệ cao nhất là CD17/HbE, CD41/42/HbE, CD41/42/CD17,

CD41/42/CD41/42 với tỷ lệ lần lượt là: 18,69%, 16,8%, 11,68%, 9,34%.

Với 30 kiểu gen phát hiện được ở 214 bệnh nhân, chứng tỏ kiểu gen của

bệnh nhân β thalassemia rất phong phú. Các kiểu gen này kết hợp với các yếu tố

môi trường sống, điều kiện chữa trị, các tương tác giữa các yếu tố liên quan đến gen

và protein sẽ đưa lại các kiểu hình vô cùng đa dạng (NC Khanh. 1985, Ho, Hall et

al. 1998, Taher, Isma'eel et al. 2006). Thậm chí, bệnh nhân có thể có cùng kiểu gen

nhưng kiểu hình biểu hiện cũng không hoàn toàn giống nhau.

4.2.3. Một số ca không điển hình có lâm sàng đặc biệt

a. Thể Beta thalassemia trung gian có kiểu gen /HbE

Trong 214 bệnh nhân đã được xác định được 2 đột biến trên gen β globin, có

thông thường sẽ tạo ra kiểu hình lâm sàng β

bệnh nhân có kiểu gen kết hợp + /+

thalassemia thể trung gian. Tuy nhiên trong số này, chỉ có 1 bệnh nhân có kiểu gen

phát hiện là -28/HbE mang kiểu hình là thể trung gian, tuy mang 2 đột biến nhưng

không có biểu hiện lâm sàng như sạm da, gan lách to, bộ mặt Thalassemia, cần

truyền máu thường xuyên. Những trường hợp thể β thalassemia thể trung gian là

những trường hợp rất khó phát hiện, rất dễ bỏ sót trong quá trình sàng lọc và chẩn

đoán xác định (Weatherall. 2005, Weatherall. 2007, Cousens, Gaff et al. 2010,

Vichinsky. 2016).

Về kiểu gen /HbE, năm 2014, Boonchai và cộng sự công bố, các kiểu gen

phổ biến phát hiện trên bệnh nhân β thalassemia thể nặng trẻ em ở Thái Lan là

CD41/42(-TCTT)/HbE chiếm 40%, CD17(AAG-TAG)/HbE chiếm 18,3%, IVS1-5/

chiếm 8,3% và IVS2-654 (C-T)/HbE chiếm 8,3%. Tổng cộng tỷ lệ thể /HbE gây

Beta thalassemia thể nặng chiếm tới 75% (Boonyawat, Monsereenusorn et al.

2014). Như vậy, tỷ lệ bệnh nhân β thalassemia mang kiểu gen /HbE sau khi sàng

lọc đích rất cao, phù hợp với số liệu sàng lọc quần thể được đưa ra ở mức độ sàng

lọc quần thể ở Việt Nam (NC Khanh, Thu et al. 1990) cũng như trên thế giới, đặc

biệt là vùng Đông Nam Á (Benz Jr, Berman et al. 1981, Fucharoen and

Winichagoon. 1987, Colah, Gorakshakar et al. 2010).

Thể /HbE gây β thalassemia thể nặng là vấn đề rất cần quan tâm.

CD26(GAG>AAG) HbE là đột biến ở codon 26 thuộc exon 1, GAG (Glutamate)

đổi thành AAG (Lysine). Đột biến này tạo ra chuỗi globin E variant đồng thời tạo ra

vị trí ghép nối bất thường với đầu 5’ của IVS1-1. Kiểu gen dị hợp tử chỉ gây ra

thiếu máu nhẹ. Kiểu gen đồng hợp tử là rối loạn lành tính. Tuy nhiên dị hợp tử kép

HbE và đột biến  Thalassemia gây thiếu máu nặng. HbE là bệnh phổ biến ở Việt

nam, khi kết hợp với gen  Thalassemia sinh ra thể dị hợp tử kép cũng gây HbE/ 

Thalassemia, lâm sàng tương tự như  Thalassemia thể nặng hoặc thể trung gian

(NC Khanh, Thu et al. 1990, BV Viên. 2001, Aziz, Ahmed et al. 2017). Nếu không

phát hiện sớm và điều trị đầy đủ thì biểu hiện ra lâm sàng càng rõ bao gồm: da

xanh, niêm mạc nhợt, gan to, lách to, biến dạng xương (bướu trán, bướu đỉnh, gò

má nhô cao, mũi tẹt), nhiễm sắt, chậm phát triển thể chất... Điều trị bao gồm thải sắt

và truyền máu trong suốt cuộc đời. Bệnh cũng có thể được điều trị bằng phương

pháp ghép tế bào gốc tạo máu nhưng phải có nguồn tế bào gốc phù hợp và chỉ làm

được tại các trung tâm lớn (NC Khanh, Thu et al. 1990, Schrier. 2002, Weatherall.

2007, Zhang, He et al. 2015).

b. Thể β thalassemia trung gian có kiểu gen mang đột biến mất đoạn lớn 2,3kb, thể

tồn dư huyết sắc tố thể SEA.

Bình thường mọi cơ thể đều có đủ các gen globin trên nhưng tuỳ từng giai

đoạn phát triển từ khi hình thành phôi mà có các gen khác nhau hoạt động để tạo

nên các loại huyết sắc tố. Huyết sắc tố (Hemogobin - Hb) là thành phần chủ yếu

trong hồng cầu được tạo bởi hai loại chuỗi globin là alpha globin và không alpha

globin. Ở người trưởng thành bình thường có các loại hemoglobin (Hb): HbA1

(α2β2) chiếm thành phần chủ yếu 96-98%; HbA2 (α2δ2) chiếm 1,5-3 %; HbF (α2γ2)

chiếm rất ít, khoảng 0,5-1%. Gặp chủ yếu ở trẻ sơ sinh khoảng từ 55-85%. Hiện

tượng tồn dư huyết sắc tố HbF là do thiếu hụt chuỗi  globin cùng với sự tăng của

chuỗi  globin. Chuỗi  globin này kết hợp cùng với chuỗi α globin tạo thành HbF

(α2γ2) – loại hemoglobin tồn tại chủ yếu ở giai đoạn thai nhi.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm thấy 1 gia đình gồm bố, mẹ, con đầu,

con thứ 2. Theo quy trình xét nghiệm, sàng lọc 09 đột biến thường gặp cho cả gia

đình, thấy người bố không phát hiện thấy đột biến, người mẹ mang dị hợp tử đột

biến điểm IVS2-654 (C>T), người con đầu không có đột biến nào, tuy nhiên ở

người con thứ 2 phát hiện thấy đồng hợp tử đột biến điểm giống của mẹ IVS2-654

(C>T).

So sánh với chỉ số công thức máu và điện di huyết sắc tố của người mẹ và

người con đầu hoàn toàn phù hợp với các chỉ số huyết học và điện di huyết sắc tố

của bệnh nhân. Người bố có chỉ số HbA2 tăng nhẹ (2,9%), HbF tăng cao (24,9%)

Tuy nhiên, ở người con thứ 2, kết quả phát hiện thấy đồng hợp tử đột biến điểm của

người mẹ IVS2-654(C>T), đồng thời với thiếu máu nhược sắc (MCV, MCH giảm)

và huyết sắc tố HbF tăng rất cao (95%). Giải trình tự toàn bộ gen β globin của

người bố và con đầu, chúng tôi không phát hiện thấy đột biến nào. Từ kết quả này

kết hợp cùng các dữ liệu này liên quan đến các đặc điểm lâm sàng của những bệnh

nhân bị tồn dư huyết sắc tố F ở người lớn (Motum, Hamilton et al. 1993, Xu, Li et

al. 2000, Peng, Liu et al. 2003), chúng tôi suy luận rằng có thể có đột biến mất đoạn

lớn bao phủ qua vùng đột biến của người mẹ. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục sàng lọc đột

biến mất đoạn lớn có thể là nguyên nhân gây tình trạng tồn dư huyết sắc tố cho

người bố và người con thứ 2. Áp dụng kỹ thuật double Gap PCR, chúng tôi đã phát

hiện thấy đột biến mất đoạn lớn toàn bộ gen β globin độ lớn 2,3kb ở bố và con thứ

2. Đây là báo cáo đầu tiên về trường hợp mất đoạn này trên bệnh nhân ở Việt Nam.

Đột biến mất đoạn lớn trên gen β globin chiếm tỷ lệ rất nhỏ, và chưa có được biết

đến nhiều trên bệnh nhân Việt Nam. Năm 2000, Xu và cộng sự đã báo cáo trường

hợp này trên bệnh nhân có nguồn gốc là người Campuchia và Việt Nam (Xu, Li et

al. 2000). Về kiểu hình của bệnh nhân mang đột biến này: người bố mang các chỉ số

cận lâm sàng về huyết học và điện di huyết sắc tố như của người bình thường, chỉ

duy nhất chỉ số HbF tăng cao, còn ở người con có thiếu máu nhược sắc rõ ràng, đặc

biệt chỉ số HbF tăng rất cao. Như vậy chỉ số HbF là là chỉ số mang tính chất chỉ

điểm quyết định đối với các trường hợp mang đột biến mất đoạn lớn gây thể tồn dư

huyết sắc tố.

Kiểu hình của người con thứ 2 là thể β thalassemia trung gian. Bệnh nhân

này có thể hiện thiếu máu nhược sắc trên công thức máu, tuy nhiên, không quá thấp

nên không cần điều trị truyền máu và thải sắt thường xuyên. Kiểu hình này khác với

công bố của Peng, các bệnh nhân có kiểu gen này sẽ thể hiện là β thalaasemia thể

nặng, cần phụ thuộc truyền máu (Peng, Liu et al. 2003).

c. Bệnh nhân có kiểu gen kết hợp β và  thalassemia.

Từ kết quả sàng lọc người mang gen của 2 vợ chồng, kết luận hai vợ chồng

là người mang gen bệnh β Thalassemia. Kết hợp với tiền sử sinh con 2 lần β thể

nặng. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả sàng lọc đột biến trên gen β

globin, cả 2 vợ chồng đều là người mang gen đột biến.

Ngoài ra, người mẹ có tiền sử phù thai ở lần mang thai thứ 3, phải đình chỉ

thai nghén lúc 6 tháng. Chính vì vậy, ngoài việc tìm thấy 2 vợ chồng đều mang gen

β thalassemia, cần sàng lọc cả nguy cơ 2 vợ chồng là người mang gen 

thalassemia. Kết quả tìm đột biến gen tìm thấy cả 2 vợ chồng đồng thời là người

mang gen đột biến  thalassemia.

Trên kết quả điện di huyết sắc tố, cả người vợ có MCV= 77fl (<80), HbA2=

5,8% thể hiện là người mang gen β thal điển hình, người chồng có MCV= 81,1fl tức

là ở ngưỡng giới hạn, HbA2= 5,7%, không có HbF. Cả hai kết quả này đều hướng

đến là người mang gen bệnh β thalassemia. Trong trường hợp này nếu không chú ý

đến tiền sử sinh con phù thai lần thứ 3 của gia đình này, rất dễ bỏ qua nguy cơ mang

gen bệnh  thalassemia của cả 2 vợ chồng.

Kết quả xét nghiệm DNA cho thấy, cả vợ và chồng của gia đình này đều là

người mang gen đột biến đồng thời của cả 2 gen  và β thalassemia. Như vậy thai

phụ này vừa có 25% nguy cơ sinh con bị bệnh  thalassemia, vừa có 25% nguy cơ

sinh con mắc β thalassemia thể nặng. Với trường hợp thai nhi của gia đình này, cần

tiến hành tìm đột biến gen đồng thời cho cả 2 gen  và β globin dựa trên các đột

biến đã tìm thấy ở bố và mẹ.

Có rất nhiều thể Thalassemia không điển hình, do nhiều nguyên nhân khác

nhau gây ra. Với trường hợp này là do cả 2 vợ chồng là người mang gen 2 đột biến

đồng thời  và β thalassemia, tuy nhiên trên kết quả sàng lọc chỉ thể hiện là người

mang gen bệnh β thalassemia. Với các trường hợp này, cần chú ý đến tiền sử của

gia đình thai phụ, các chỉ số công thức máu và điện di huyết sắc tố, đặc biệt trong

trường hợp các chỉ số này nằm gần ngưỡng giới hạn và chỉ số HbF.

4.3. ĐẶC ĐIỂM VÀ TỶ LỆ CÁC ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN TRÊN NGƯỜI

MANG GEN  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG.

Trong nghiên cứu này, đối tượng người mang gen được thu thâp chủ yếu là

bố mẹ của các bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định bằng phương pháp sinh học

phân tử, phát hiện đột biến gây bệnh trên gen β globin. Phần còn lại là những đối

tượng nghi ngờ là người mang gen bệnh dựa vào sàng lọc theo phương pháp của

nhóm 1.

Về đặc điểm các đột biến gen β globin ở người mang gen tại bệnh viện Nhi

Trung ương: tất cả các đột biến trong nhóm 09 đột biến thường gặp đều được phát

hiện thấy trong nghiên cứu này bằng kỹ thuật Multiplex ARMS PCR và ARMS

PCR. Đã phát hiện được thấy tổng số 14 đột biến khác nhau trong nhóm người

mang gen bao gồm 09 đột biến điểm thường gặp, 03 đột biến điểm hiếm gặp và 1

đột biến mất đoạn lớn lần đầu được công bố. Điều này chứng tỏ, kiểu đột biến gen

người mang gen bệnh tại bệnh viện Nhi Trung ương khá đa đạng. Cần có các

nghiên cứu với số lượng người mang gen lớn hơn để khảo sát sự đa đạng các kiểu

gen đột biến trên người Việt Nam nói chung và người miền Bắc nói riêng.

Các đột biến có tần số và tỷ lệ cao nhất là CD41/42(-TCTT), CD17(AAG-

TAG) và HbE (GAG-AAG)-CD26. Tỷ lệ này tương đương với kết quả nghiên cứu

của (Hao, Pissard et al. 2001) và (Hoan 2013) đối với nhóm đột biến tìm thấy ở

người miền Nam Việt Nam. So sánh kết quả về tỷ lệ kiểu gen các aen đột biến

thường gặp với nghiên cứu của (Maia G. Doro et al. 2017) trên nhóm đối tượng

nghiên cứu tại miền trung Việt Nam, với số lượng mẫu nghiên cứu là 26 người. 09

đột biến được đưa vào sàng lọc, có 7 đột biến giống với nghiên cứu này, có 2 đột

biến khác là nhóm đột biến IVS1-5(G-C), và IVS2-654(C-T) được thay bằng hai đột

biến CD26(G-T) và CD14/15(+G). Tuy nhiên, hai đột biến này có tỷ lệ phát hiện rất

thấp. Tỷ lệ các alen đột biến thường gặp nhất vẫn là HbE (A>G): 29,2%,

CD17(AAG-TAG): 25% và CD41/42(-TCTT): 29,2%. Trong nghiên cứu của (Hao,

Pissard et al. 2001), khảo sát tình hình đột biến gen  globin ở nhóm người phía

Nam, lần đầu tiên đưa vào nhóm sàng lọc và phát hiện thấy đột biến CD95(+A). Và

trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng tìm thấy đột biến CD95(+A) này ở người

miền Bắc, tuy với tỷ lệ rất nhỏ (1,69%).

So sánh kết quả này với các nghiên cứu khác trên thế giới, theo Haig H.

Kazazian et al 1986, nhóm đột biến sàng lọc gồm -29, -28, CD17, CD41/42,

CD71/72, IVS1-5, IVS2-654 trên quần thể người Trung Quốc và Đông Nam Á cũng

tìm thấy hai đột biến có tỷ lệ cao nhất là CD41/42 và CD17. Kết quả này tương

đương với các nghiên cứu của các tác giả (Filon, Oppenheim et al. 2000, Flatz,

Sanguansermsri et al. 2004, Madan, Sharma et al. 2010, Hassan, Ahmad et al. 2013,

Zhang, He et al. 2015).

Trong nhóm 09 đột biến trên, nằm rải rác ở các vị trí vùng promotor, exon 1,

intron 1, exon 2, intron 2. Như vậy có thể coi đây là vùng hotspot mang đột biến tại

bệnh viện Nhi Trung ương.

Alen đột biến tại codon 26 GAG >AAG vừa tạo globin E variant (tạo HbE)

vừa tạo kiểu hình β thalassemia chiếm tỉ lệ cao thứ 3 trong 14 loại alen đột biến gây

β thalassemia, 24,29% tổng số các đột gen β globin.

9 loại alen β thalassemia khác có tỉ lệ cao là codon 41/42 –TCTT (30,79%),

codon 17 AAG>TAG (28,25%), HbE (24,29%), codon 71/72 +A (6,28%), -28 A>G

(2,54%), IVS 1-1 G>T (2,26%), codon 95 +A (1,96%), IVS 2-654 C>T (1,13%) và

IVS1-5 G-C (0,56%).

Như vậy, 9 loại alen nêu trên chiếm đến 98,02% (489/498) trong tổng số 14

loại alen β thalassemia.

Số loại alen đột biến β thalassemia trong nghiên cứu này nhiều hơn so với

báo cáo trước đây của các tác giả có thể là do cỡ mẫu lớn hơn đủ để xuất hiện các

loại alen đột biến hiếm.

Các nghiên cứu của Filon năm 2000 (n = 29), Hao năm 2001 (n = 23) và

Svasti năm 2002 (n = 68) về đặc điểm phân tử bệnh nhân Thalassemia Việt Nam

(không bao gồm HbE) chỉ phát hiện được 4 – 8 loại alen Thalassemia. Gộp số liệu

của 3 nghiên cứu này thì 7 loại alen đã nêu chiếm 95,2%. Vì cỡ mẫu nhỏ nên số loại

alen đột biến được phát hiện ở 3 nghiên cứu trên ít hơn so với nghiên cứu này.

Có 03 đột biến điểm hiếm gặp là c.-138C>T, c.-140 C>T, c.441-442insAC

(Hb Tak) đã phát hiện thấy bằng kỹ thuật giải trình tự gen  globin. Cả ba trường

hợp này đều là bố hoặc mẹ của bệnh nhân β thalassemia thể nặng, thể hiện rất rõ

ràng trên kết quả công thức máu, điện di huyết sắc tố, cần truyền máu, thải sắt

thường xuyên. Tuy nhiên, khi sàng lọc bằng kỹ thuật multiplex PCR cho nhóm 09

đột biến thì không phát hiện thấy. Vì thế chúng tôi đã tiến hành giải trình tự toàn bộ

100

gen  globin, so sánh với trình tự chuẩn trên ngân hàng gen thế giới và phát hiện

thấy các đột biến hiếm gặp trên. Đột biến c.-138C-T nằm ở vùng promotor, ở thể dị

hợp tử gây giảm tổng hợp chuỗi  globin (+), thiếu máu nhược sắc thể hiện trên

công thức máu, các chỉ số nằm trong khoảng MCV 70-74fL, MCH 23-25pg. Đột

biến này phổ biến ở người da đen, được công bố lần đầu tiên năm 1984 bởi Orkin

SH et al. Đột biến c.-140 C>T được công bố lần đầu tiên trên bệnh nhân người Bồ

Đào Nha năm 1992. Đột biến này nằm ở vùng promotor. Ở thể dị hợp tử, gây giảm

tổng hợp chuỗi  globin.

Trong nghiên cứu này, có 3/354 trường hợp bệnh nhân, có xét nghiệm tầm

soát dương tính, tuy nhiên khi tiến hành sàng lọc đột biến ở mức độ sinh học phân

tử vẫn không phát hiện thấy. Với các trường hợp này cần được theo dõi thêm và

nghiên cứu với các phương pháp sàng lọc khác.

4.4. CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA

Có 178 gia đình tiến hành làm chẩn đoán trước sinh cho thai nhi đồng ý tham

gia vào nghiên cứu này, trong đó có 1 gia đình sản phụ mang thai đôi.

Các gia đình này đều có tiền sử có con đầu bị β thalassemia thể nặng, cần

truyền máu và thải sắt ở các mức độ khác nhau. Các cặp bố mẹ này đều được thực

hiện các xét nghiệm tầm soát bệnh thông qua xét nghiệm công thức máu và điện di

huyết sắc tố. Sau đó, các đối tượng này đều được tiến hành thực hiện xét nghiệm

chẩn đoán xác định bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử. Xét nghiệm chẩn

đoán trước sinh cho thai nhi chỉ được thực hiện khi đã xác định được đột biến của

bố và mẹ.

Ở 178 gia đình được làm chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia, 49/178

thai nhi có kiểu gen dị hợp tử kép 2 đột biến khác nhau hoặc đồng hợp tử với một

đột biến trong 9 đột biến sàng lọc, được kết luận mắc β thalassemia thể nặng. 75

thai nhi có kiểu gen dị hợp tử với một đột biến là người lành mang gen bệnh. 54 thai

nhi không bị đột biến nào trên gen β globin là người bình thường không mang gen

bệnh. Như vậy, trong tổng số 178 gia đình làm chẩn đoán trước sinh, 124 trường

101

hợp mang ít nhất một alen đột biến trên gen β globin. Do β thalassemia thể nặng có

kiểu gen là đồng hợp tử với một đột biến hoặc dị hợp tử kép với hai đột biến từ hai

alen khác nhau, nên tỷ lệ đột biến của từng alen có ý nghĩa quan trọng việc tham gia

cơ chế gây bệnh.

Alen đột biến có tỷ lệ cao nhất: CD17(AAG-TAG): 15,73%, CD41/42 (-

TCTT): 14,3%, HbE (G>A): 11,5%. Tỷ lệ này cũng tương đương với tỷ lệ alen đột

biến của người mang gen β globin ở người Việt Nam trong nghiên cứu của Bùi Văn

Viên và cộng sự.

Kiểu gen có tần số và tỷ lệ cao nhất xuất hiện ở 178 thai nhi là CD17/HbE

(24,4%), CD41-42/CD17 (16,3%), CD4-42/CD41-42 (8,16%). Kết quả này có mối

tương quan hợp lý với kết quả tần suất và tỷ lệ người mang gen bệnh đã trình bày

ở trên.

Trong số 178 trường hợp làm chẩn đoán trước sinh, có 3 trường hợp gia

đình, người bố hoặc người mẹ không mang đột biến nào trong 9 đột biến thường

gặp trên. Đối với trường hợp này, chúng tôi đã giải trình tự gen  globin để tìm các

đột biến hiếm gặp khác. Đột biến được tìm thấy là đột biến điểm HBB: c.-138C>T,

c.-140 C>T, Hb Tak. Giải trình tự gen là kỹ thuật chúng tôi đang triển khai sau

ARMS-PCR, là tiêu chuẩn vàng để sàng lọc tất cả các đột biến đã biết và đột biến

mới trên gen. Có 1 trường hợp gia đình, người bố mang đột biến mất đoạn lớn, và

đã được phát hiện bằng kỹ thuật Gap PCR.

Về thời gian thực hiện xét nghiệm chẩn đoán trước sinh cho thai nhi: thời

gian thích hợp để tiến hành chẩn đoán trước sinh là khi thai nhi được 16-18 tuần

tuổi. Thời điểm này được xem là tương đối muộn ở một số nước trình độ y học

phát triển, do người mẹ nguy cơ cao được tiến hành trước sinh ở tuần thai thứ 8-10

với kỹ thuật sinh thiết gai rau. Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật này chưa được các

đơn vị sản khoa áp dụng, do đó, chọc hút dịch ối là phương pháp duy nhất được áp

dụng. Mẫu dịch ối sau khi thu thập, được nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu của tế

bào ối trong khoảng thời gian từ 10 ngày, với mục đích nhân rộng dòng tế bào ối, và

loại trừ tế bào máu của người mẹ, là nguyên nhân gây ảnh hưởng đến mức độ chính

102

xác của kết quả. Do đó, thời gian trả kết quả chẩn đoán trước sinh cho bệnh beta

thalassemia thông thường sau 14 ngày kể từ thời điểm chọc ối. Trong số 178 gia

đình được làm chẩn đoán trước sinh, có 49 gia đình mà thai nhi được kết luận mắc

beta Thalassemia thể nặng. Chúng tôi đã kết hợp với bác sỹ lâm sàng, cũng như các

đơn vị sản khoa trong việc tư vấn di truyền đối với các gia đình này.

103

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Miêu tả đặc điểm đột biến gen β globin của bệnh nhân  thalassemia và

người mang gen bệnh tại bệnh viện Nhi Trung ương.

- Phát hiện thấy 30 kiểu gen khác nhau ở nhóm bệnh nhân  thalassemia thể nặng

và nhóm kiểu gen có tỉ lệ cao nhất là CD17/HbE (18,69%), CD41/42/HbE (16,8%),

CD41/42/CD17 (11,68%) và xác định được 09 đột biến thường gặp, nhóm đột biến

điểm chiếm tỷ lệ cao nhất là CD41/42(-TCTT) (30,79%), CD17 (AAG-TAG)

(28,25%), HbE (CD26) (24,29%).

- Đã phát hiện 03 đột biến điểm hiếm gặp bằng phương pháp giải trình tự gen β

globin và 01 trường hợp người mang gen bệnh  thalassemia mang đột biến mất

đoạn toàn bộ gen β globin với độ lớn 2,3kb.

2. Chẩn đoán trước sinh cho bệnh  thalassemia

- Đã xây dựng được quy trình chẩn đoán trước sinh.

- Chẩn đoán trước sinh cho 178 thai nhi trong đó 54/178 (30,3%) thai nhi không

mang đột biến, 75/178 (42,1%) thai nhi mang 1 đột biến, 49/178 (27,6%) thai nhi

mang 2 đột biến.

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục phát hiện đột biến trên bệnh nhân  thalassemia, thu thập mẫu với số

lượng lớn và phân rõ theo các vùng địa lý rõ ràng để tìm ra nhóm đột biến đặc trưng

cho các nhóm.

2. Dựa trên kết quả phân tích kiểu gen, nghiên cứu mối liên quan giữa kiểu gen và

3. Đưa việc sàng lọc ở mức độ sinh học phân tử cho gen gây bệnh  thalassemia kết

kiểu hình của các bệnh nhân  thalassemia, giúp tiên lượng và điều trị hiệu quả.

hợp với  thalassemia trong quy trình sàng lọc.

4. Nghiên cứu, thiết kế để tìm các đột biến mất đoạn lớn hiếm gặp trên bệnh nhân 

thalassemia Việt Nam. Đưa bước sàng lọc các đột biến c.-138C>T, c.-140 C>T và

c.441-442insAC là bước tiếp theo trong trường hợp không phát hiện thấy đột biến

trong 09 đột biến thường gặp trên.

104

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ

NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

1. Ha Ly Thi Thanh, Huong Le Thi Thanh, Long Hoang Luong , Thinh Huy

Tran, Su-Ching Liu, Hai Nam Truong , Thanh Van Ta, The - Hung Bui, Van

KhanhTran. (2018). Prenatal diagnosis of a case with SEA-HPFH deletion

thalassemia with whole Hbb gene deletion. Taiwanese Journal of Obstetrics

and Gynecology, Volume 57, Issue 3, Page 435-441

2. Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Dương Bá Trực, Ngô Thị Tuyết

Nhung, Nguyễn Thị Phương Mai, Trần Danh Cường, Lê Thị Thanh Thuý,

Trương Nam Hải, Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh

(2015). Người mang gen Alpha thalassemia kết hợp Beta thalassemia: sàng

lọc người mang gen và chẩn đoán trước sinh tại bệnh viện Nhi Trung ương.

3. Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Dương Bá Trực, Ngô Thị Tuyết

Tạp chí Y học Việt Nam, 434(2): 160-173

Nhung, Nguyễn Thị Phương Mai, Trần Danh Cường, Lê Thị Thanh Thuý,

Trương Nam Hải, Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh

(2015). Áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán trước sinh bệnh

Beta thalassemia tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Tạp chí Y học Việt Nam,

434(2): 170-176

105

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH

STUDY OF  GLOBIN MUTATIONS AND PRENATAL DIAGNOSIS FOR 

THALASSEMIA IN THE NATIONAL CHILDREN' S HOSPITAL

Introduction

Thalassemia is the most common inherited blood disorder in Southeast Asia and is

caused by reduced or absent synthesis of the globin chains of hemoglobin (Hb)

leading to imbalance of the globin chains. Beta-thalassemia is one of the major

types of thalassemia and is caused by a mutation in the  globin gene on

chromosome 11. The clinical and hematological spectrum of beta-thalassemia

ranges from silent carrier to clinically manifested conditions including severe

transfusion dependent beta-thalassemia major and beta-thalassemia intermedia (TI).

In Vietanm, both beta-thalassemia and hemoglobin E (HbE) represent one of the

most common forms distributed in all regions. Most of the severe beta-thalassemia

results from the interaction of beta-thalassemia and HbE.

According to WHO report, thalassemia carriers are estimated to exceed 100 million

persons and some 100 thousand affected babies are born each year. The incidence,

prevalence and clinical forms of thalassemia vary in difference parts o the word.

The disease has a high frequence in regions of the world endemic for malaria,

including the Mediterrranean Basin, African, India, South China, and Southeast

Asia. To date more than 200 mutations producing  Thalassemia have been

characterized, and in general each ethnic group appears to carry its own set of

mutation allen.

The molecular basis of thalassemia has been studied worldwide. More than 200

different  globin gene mutations have been characterized. Most of the  globin

mutations are caused by point mutations, small deletions or insertions within the

coding regions and the exon-intron junctions. The types of the mutation are

typically ethnic specific. In Vietanm, the prevalence of  thalassemia carriers varies

from 1.5-25%. The heterogeneity of the mutations makes it difficult to identify the

mutation in some  thalassemia patients. Various DNA analysis techniques such as

106

dot blot analysis, reverse dot blot, allele specific amplification using amplification

refractory mutation system (ARMS) or direct DNA sequencing have been widely

used to identify  globin gene mutations.

This study aimed to characterize the spectrum of  globin mutations in 

thalassemia carriers and patients who were followed-up in National Children’s

Hospital a tertiary care center for thalassemia patients from Northern Vietnam

regions. After that, we carried the prenatal diagnosis for the families have high risk

of  thalassemia major.

Patients and methods

Patient selection

214 unrelated beta-thalassemia patients, 354 Beta thalassemia carrier and 178

pregnancy women who attended the Hematology Clinic Department of National

Children’s Hospital from January 2012 to December 2017 were enrolled in our

study. The study protocol was approved by the Bureau of Accretation ISO

15289:2012. 214 patients had clinically manifested  thalassemia including 86 with

 thalassemia/HbE and 126 with homozygous or compound heterozygous 

thalassemia and 2 left are  thalassemia intermedia. Patients with homozygous 

thalassemia and  thalassemia/HbE were clinically classified into severe transfusion

dependent thalassemia major and mild TI based on criteria such as age at

presentation, average Hb level at the steady state and transfusion frequency history,

as previously described .

Mutation analysis

After informed consent was obtained, a total of 214 patients and 354 carriers

peripheral blood ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) samples from all

individuals were collected. Amiotic fluids of pregnancy women at 17-19 gestations

were colected. Genomic DNA was extracted from peripheral blood lymphocytes

and amiotic after cultured using an QIAgen blood mini kit according to

manufacturer’s protocol. The beta-globin gene mutations were first characterized

using three sets of multiplex amplification refractory mutation system (M-ARMS)

107

to detect nine common mutations Southeast Asian populations including codon

41/42 (-TCTT), codon 17 (A>T), nucleotide -28 (A>G), IVS-II-654 (C>T), codon

71/72 (+A), IVS-I-1 (G>T) and IVS-I-5 (G>C), CD95 (+A), IVS1-1 (G-T) as

previously described. Unknown beta-thalassemia genes were further characterized

by direct DNA sequencing of all coding regions and exon-intron boundaries to

detect uncommon point mutations and small rearrangements in the beta-globin

gene.  thalassemia alleles that remained uncharacterized by the above Multiplex

ARMS and DNA sequencing methods were subsequently screened by gap-PCR to

detect 2.3 kb deletion of the entire beta-globin gene, previously reported in

Vietnamese person.

Results

1.Frequency and genotype of 214 patients Beta thalassemia

A total of 428  thalassemia alleles from eight homozygous or compound

heterozygous beta-thalassemia patients, 92 beta-thalassemia/HbE patients, 120

heterozygous  thalassemia individuals and 2  thalassemia intermedia were

included in our study. All 214 subjects were from unrelated families and lived in the

North of Vietnam. Of these 212 patients who had clinically manifested 

thalassemia, 99% (212/214) and 1% (2/214) of patients presented with 

thalassemia major and TI, respectively. In the 212  thalassemia major patients,

40.5% (86/212) of patients had  thalassemia/HbE and 56.6% (120/212) of patients

had homozygous or compound heterozygous  thalassemia. Alternatively, all

patients with homozygous or compound heterozygous  thalassemia and 91.2%

(52/57) of  thalassemia/HbE patients in this study presented with severe

transfusion dependent  thalassemia major. Concerning genotype of beta-

thalassemia major patients, the most common genotype was codon 17(A>T)/codon

26 (G>A) or E accounting for 19%, and the second most common was codon 41/42

(-TCTT)/ E accounting for 17% of all  thalassemia major genotypes

108

Table 1 Genotype of 214 clinically manifested  thalassemia patients.

Genotype

Order

N

(%)

CD17-HbE

CD41/42-HbE

CD41/42-CD17

CD41/42-CD41/42

CD17-CD17

CD17-IVS2-654

CD41/42-CD71/72

CD17-28

CD71/72-HbE

CD17-CD71/72

IVS1-1-IVS1-1

IVS1-1-IVS2-654

CD41/42-IVS1-1

CD41/42-28

CD17-IVS1-1

IVS1-5-HbE

CD41/42-IVS2-654

CD17-IVS1-5

IVS1-1-HbE

-28-HbE

CD41/42-CD95

0.46

IVS1-1-CD95

0.46

-28-CD71/72

0.46

-28-IVS2-654

0.46

HbE-IVS2-654

0.46

Rare mutations

1.4

To elucidate the molecular basis of these 428  thalassemia alleles, we first

characterized each patient’s DNA by three sets of Multiplex ARMS. Four hundreds-

twenty four alleles (99%) were identified by this method including 129 alleles

(30.1%) of codon 17 (A>T), 118 alleles (27.57%) of codon 41/42 (-TCTT), ninety-

two alleles (21.4%) of HbE-CD2 (AAG-TAG), twenty-three alleles (5.37%) of

109

IVS1-1 (G>T), twety-two alleles (5.14%) of CD71/72 (+A), seventeen alleles

(4.23%) of IVS2-654 (C>T), fourteen alleles (3.27%) of codon -28(A>G), seven

alleles (1.63%) of IVS1-5 (G>C) and two alleles (0.47%) of CD95(+A). In 4 alleles

(0.93%), neither set revealed  thalassemia mutation. Thus, direct DNA sequencing

of all three coding exons and flanking exon-intron junctions in the  globin gene

was the next step to characterize these 3 alleles. Three uncommon mutations were

detected in three alleles including c.-138 (C>T), C.-140 (C>T), C.441-442ins AC

The remaining alleles, uncharacterized by Multiplex ARMS and DNA sequencing,

were further identified by gap-PCR to detect 2.3 kb deletion and this deletion was

found in one remaining alleles (0.23%).

Table 2 The frequency of beta-thalassemia mutations in 428 alleles

Common  globin gene

Number of alleles (n=428)

Rate (%)

mutations

CD41/42(-TCTT)

27.57

118

CD17(AAG-TAG)

30.1

129

HbE (GAG-AAG)- CD26

21.4

-28(A-G)

3.27

CD71/72(+A)

5.14

IVS1-1(G-T)

5.37

IVS1-5(G-C)

1.63

IVS2-654(C-T)

4.23

CD95(+A)

0.47

Rare mutations

0.93

(A)Hbb: c.-138 C>T (B) Hbb: c.441-442insAC (C) Hbb: c.-140 C>T Figure 2. Three uncommon mutations identified by direct DNA sequencing.

110

In all, 100% of our 428  thalassemia alleles were characterized by a combination

of these techniques including three sets of M-ARMS, direct DNA sequencing and

2.3 kb deletion detection gap-PCR. Excluding the E-globin gene, 13 different 

thalassemia mutations were encountered in the present study.

The most common mutation identified in our study was CD17(AAG-TAG) and

accounted for 30.1%. The 4 bp deletion (-TCTT) in codons 41/42 was the second

and accounted for 27.57% of the alleles. Together, these two common mutations

accounted for more than half (57.67%) of affected alleles. All other common

mutationsaccounted for 41.4% of the alleles.

2. Frequency alleles mutations of 354 carriers

Table 2. The frequency of  thalassemia mutations

Prequency

Mutations in β globin gene

(Exon/Intron)

(%)

Multiplex ARMS PCR and ARMS PCR

CD41/42(-TCTT)

Exon 2

109

30,79

CD17(AAG-TAG)

Exon 1

100

28,25

HbE (GAG-AAG )- CD26

Exon 2

24,29

-28(A-G)

Promotor

2,54

CD71/72(+A)

Exon 2

6,21

IVS1-1(G-T)

Intron 1

2,26

IVS1-5(G-C)

Intron 1

0,56

IVS2-654(C-T)

Intron 2

1,13

CD95(+A)

Exon 2

1,69

Sanger sequecing

Rare mutations

0.85

Gap - PCR

Deletion mutation

Whole Hbb gene(2,3kb)

0,28

Not found

0,85

111

3. Prenatal diagnosis results for 178 families with high risk of  thalassemia major.

Table 3. Amount of fetus with types of mutation.

Number of mutations in

Number of fetus

Rate (%)

(n=178)

 globin gene

1 mutation detected

30.3

No mutation detected

42.1

2 mutation detected

27.6

Table 4. The frequency of  thalassemia mutations in 356 alleles for

prenatal diagnosis.

Number of alleles

Rate

Common  globin

(n=356)

(%)

mutations

CD41/42(-TCTT)

14,3

CD17(AAG-TAG)

15,73

HbE(GAG-AAG)- CD26

11,5

-28(A-G)

1,12

CD71/72(+A)

3,37

IVS1-1(G-T)

1,4

IVS1-5(G-C)

0,28

IVS2-654(C-T)

0,56

CD95(+A)

0,28

Uncommon mutations

0,56

Discussion

This study provided useful information regarding the frequency distribution of 

thalassemia mutations among patients and carriers especially at National

Childrend’s Hospital. Several methods can determine  thalassemia mutations. This

study revealed that Multiplex ARMS detected 09 common mutations and was able

to detect 98.02% of the alleles as in previous reports. Since Multiplex-ARMS can

detect only a given set of mutations specific to the primers employed, direct DNA

sequencing is the next step to identify various point mutations and small

rearrangements in the  globin gene. The disadvantage of DNA sequencing is that

112

large deletions of the gene are undetectable. Thus, gap-PCR is the final step to

detect 2.3 kb deletion, previously reported in Vietnamese. A combination of these

techniques could identify  thalassemia mutations in all 214 pediatric patients in our

study.

In this study, the carrier gene was mainly composed of parents of patients diagnosed

by molecular biology, detecting pathogenic mutations in the globin gene. The

remainder are those suspected of being carriers of the gene based on screening by

group 1.

Characteristics of β globin gene mutations in human gene carriers in northern

Vietnam: all mutations in the group of 09 common mutations were found in this

study using Multiplex ARMS PCR and ARMS PCR . A total of 14 mutations were

detected in the group of genes including nine common site mutations, three rare site

mutations and one major mutation failure. This shows that the type of genetic

mutation of the gene bearing the disease in North Vietnam is quite diverse. More

studies are needed with larger gene carriers to examine the diversity of mutant

genotypes in Vietnamese people in general and Northerners in particular.

The highest frequency and frequency mutations were CD41/42 (-TCTT), CD17

(AAG-TAG) and HbE (GAG-AAG). This is comparable to that reported by Hao

(Pissard et al., 2001) and (Hoan 2013) for the mutant group found in southern

Vietnam. In the study (Hao, Pissard et al., 2001), a study of the globin mutation in

the southern group was first included in the screening group and found a CD95 (+

A) mutation. In this study we also found that the CD95 (+ A) mutation was found in

the North, although very small (1.69%).

Compare this to other studies in the world, according to Haig H. Kazazian et al.

1986, screening mutations including -29, -28, CD17, CD41 / 42, CD71 / 72, IVS1-

5, IVS2 -654 on the Chinese and Southeast Asian populations also found that the

two mutants had the highest rates of CD41 / 42 and CD17. This result is comparable

to the studies of the authors (Filon, Oppenheim et al. 2000, Flatz, Sanguansermsri et

al. 2004, Madan, Sharma et al. 2010, Hassan, Ahmad et al. al. 2015).

113

In group 09 of the above mutation, scattered in the promoter area, exon 1, intron 1,

exon 2, intron 2. This can be considered as a hotspot region of northern Vietnam.

The other nine  thalassemia allenles have a high rate of CD41/42 (-TCTT)

(30.79%) codon 17 (AAG>TAG) (28.25%), HbE (24.29%), codon 71/72 (+A)

(2,28%), -28 A>G (2.54%), IVS 1-1 (G> T) (2.26%), CD95(+A) (1.96%), IVS 2-

654 C> T (1.13%) and IVS1-5 (G-C) (0.56%).

Thus, these nine allele categories accounted for 98.02% (489/498) of the total 14

beta thalassemia alleles.

The number of  thalassemia mutants alluded to in this study was greater than

previously reported by the authors, possibly due to the larger sample size that would

appear to be sufficient for the emergence of alleles.

Studies of Filon in 2000 (n = 29), Hao in 2001 (n = 23) and Svasti in 2002 (n = 68)

for the characterization of patients with thalassemia in Vietnam (excluding HbE)

were only detected 4 - 8 types of alleles - thalassemia. Combination data of these 3

studies, the seven types of allele accounted for 95.2%. Because of the small sample

size, the number of NE subtypes was less in the three studies than in the study.

There are three rare mutations, c.-138C>T, c.-140 C>T, c.441-442insAC (Hb Tak),

that have been identified by the globin gene sequencing technique. All three cases

are parents of patients with severe thalassemia beta, which is very clear on the

results of blood transfusions, pigmentary electrophoresis, blood transfusions,

frequent chelation. However, when multiplex PCR screening for group 9 mutation

was not detected. So we proceeded to sequentially complete the globin genome,

comparing it with the standard sequencing on the gene bank and detecting rare

mutations. The c-138.C>T mutation is located in the promoter region, in

heterozygosum causing a decrease in globin synthesis, hypopituitarism is present on

the blood count, the indices are in the 70-74fL, MCH 23-25pg. This mutation is

common in blacks, first published in 1984 by Orkin SH et al. The mutation c.-140

C>T was first published in a Portuguese patient in 1992. This mutation is located in

the promoter area. In heterozygosity, it reduces globin chain synthesis.

114

In this study, there were 3/354 patients with positive screening tests, however, when

screening for mutations at the level of molecular biology was not detected. These

cases should be monitored further and studied with other screening methods.

178 families performed antenatal prenatal diagnosis to agree to participate in the

study, including one pregnant couple.

These families had a history of having a first child with severe thalassemia major,

requiring blood transfusions and chelation to varying degrees. These parents were

given screening tests through blood transfusions and pigmented electrophysiology.

Subsequently, these subjects were diagnosed with molecular biology. Fetal prenatal

diagnostic testing is only available when the father and mother have been identified.

Of the 178 families diagnosed with  thalassemia, 49/178 had two different mutant

heterozygosities or homozygotes with one mutation in nine screening mutations, 

thalassemia major. 75 fetuses have heterozygous genes with one mutation that is a

healthy carrier of the disease gene. 54 fetuses with no mutation in the  globin gene

are normal people. Thus, out of a total of 178 families with prenatal diagnosis, 124

cases carry at least one mutant allele in the  globin gene.

Alen mutants had the highest rates: CD17(AAG-TAG): 15.73%, CD41/42 (-TCTT):

14.3%, HbE (G> A): 11.5%. This rate is equivalent to the rate of mutant allele of 

thalassemia gene in Vietnamese people in the study of Bui Van Vien et al.

In 178 fetuses, highest frequency alleles is CD17/HbE (24.4%), CD41/42/CD17

(16.3%), CD4/42/CD4142 (8.16 %). This finding correlates well with the frequency

and incidence of disease carriers reported above.

Of 178 cases of prenatal diagnosis, 3 cases of family, father or mother did not carry

any of the nine mutations commonly encountered. In this case, we have sequenced

the globin gene for other rare mutations. Mutations found were HBB point

mutations: c.-138C> T, c.-140 C>T, Hb Tak. Gene sequencing is the technique we

are implementing after ARMS-PCR, which is the gold standard for screening all

known mutations and novel mutations in the gene. There was one family case, the

father carrying the large mutation loss, and was detected by Gap PCR technique.

115

About the time of prenatal diagnostic testing: The appropriate time for prenatal

diagnosis is when the fetus is 16-18 weeks of age. This is considered to be relatively

late in some developed countries, as high-risk mothers are given antenatal care in

the 8-10th week of pregnancy with a biopsy. However, in Viet Nam, this technique

has not been applied by obstetric units, therefore, amniocentesis is the only method

to be used. Amniocentesis after culture was cultured in amniotic fluid-specific

media for a period of 10 days, with the aim of amplifying the amniotic fluid line,

and eliminating maternal blood cells, as a whole. Human factors affect the accuracy

of the results. Therefore, the time to return the prenatal diagnosis for beta

thalassemia is usually 14 days after the amniocentesis. Of the 178 families

diagnosed with antenatal care, 49 families were found to have Beta thalassemia

major. We have partnered with clinicians, as well as obstetric units, to provide

genetic counseling to these families.

116

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Abolghasemi, H., A. Amid, S. Zeinali, M. H. Radfar, P. Eshghi, M. S.

Rahiminejad, M. A. Ehsani, H. Najmabadi, M. T. Akbari and A. Afrasiabi

(2007). Thalassemia in Iran: epidemiology, prevention, and management.

Journal of Pediatric Hematology/Oncology 29(4): 233-238.

2. Aziz, A., W. Ahmed, G. Sarwardi, R. Ara Naznin, J. Rehena and A.

Ferdoushi (2017). Molecular Analysis of Hb-E and Beta-Thalassemia Major

Patients among Bangladeshi Population. Austin J Biotechnol Bioeng 4(4):

1085.

3. Baig, S. M. (2007). Molecular diagnosis of β‐thalassemia by multiplex

ARMS‐PCR: a cost effective method for developing countries like Pakistan.

Prenatal diagnosis 27(6): 580-581.

4. Bartlett, J. (2003). D. Stirling in PCR Protocols edited by JMS Bartlett, D.

Stirling, Humana Press, Totowa.

5. Benz Jr, E. J., B. W. Berman, B. L. Tonkonow, E. Coupal, T. Coates, L.

Boxer, A. Altman and J. Adams 3rd (1981). Molecular analysis of the beta-

thalassemia phenotype associated with inheritance of hemoglobin E (alpha 2

beta2 (26) Glu leads to Lys). Journal of Clinical Investigation 68(1): 118.

6. Boonyawat, B., C. Monsereenusorn and C. Traivaree (2014). Molecular

analysis of beta-globin gene mutations among Thai beta-thalassemia

children: results from a single center study. The application of clinical

genetics 7: 253.

7. Borah, M. S., P. K. Bhattacharya, M. S. Pathak and D. Kalita (2016). A

hospital based study of Hb variant and beta thalassaemia mutational pattern

characterization among the people of Northeast region of India. Annals of

Pathology and Laboratory Medicine 3(3): A134-140.

117

8. Cai, L., H. Bai, V. Mahairaki, Y. Gao, C. He, Y. Wen, Y. C. Jin, Y. Wang,

R. L. Pan and A. Qasba (2018). A universal approach to correct various HBB

gene mutations in human stem cells for gene therapy of beta‐thalassemia and

sickle cell disease. Stem cells translational medicine 7(1):87-97.

9. Cao, A. and R. Galanello (2010). Beta-thalassemia. Genetics in medicine

12(2): 61-76.

10. Cappellini, M.-D., A. Cohen, J. Porter, A. Taher and V. Viprakasit (2014).

Guidelines for the management of transfusion dependent thalassaemia

(TDT), Thalassaemia International Federation Nicosia (CY).

11. Chang, J., P. Chen, S.-S. Chiou, L.-S. Lee, L.-I. Perng and T. Liu (1992).

Rapid diagnosis of beta-thalassemia mutations in Chinese by naturally and

amplified created restriction sites. Blood 80(8): 2092-2096.

12. Chaudhary, S., D. Dhawan, N. Sojitra, P. Chauhan, K. Chandratre, P. S.

Chaudhary and P. G. Bagali (2017). Whole Gene Sequencing Based

Screening Approach to Detect â-Thalassemia Mutations. Biology and

Medicine 9(2).

13. Colah, R., A. Gorakshakar and A. Nadkarni (2010). Global burden,

distribution and prevention of β-thalassemias and hemoglobin E disorders.

Expert review of hematology 3(1): 103-117.

14. Colosimo, A., V. Guida, A. Scolari, A. De Luca, G. Palka, L. Rigoli, A.

Meo, D. C. Salpietro and B. Dallapiccola (2003). Validation of dHPLC for

molecular diagnosis of β-thalassemia in Southern Italy. Genetic testing 7(3):

269-275.

15. Conner, B. J., A. A. Reyes, C. Morin, K. Itakura, R. Teplitz and R. B.

Wallace (1983). Detection of sickle cell beta S-globin allele by hybridization

with synthetic oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of

Sciences 80(1): 278-282.

118

16. Cousens, N. E., C. L. Gaff, S. A. Metcalfe and M. B. Delatycki (2010).

Carrier screening for beta-thalassaemia: a review of international practice.

European Journal of Human Genetics 18(10): 1077-1083.

17. Craig, J., R. Barnetson, J. Prior, J. Raven and S. Thein (1994) Rapid

detection of deletions causing delta beta thalassemia and hereditary

persistence of fetal hemoglobin by enzymatic amplification. Blood 83(6):

1673-1682.

18. Cremonesi, L., M. Ferrari, P. C. Giordano, C. L. Harteveld, M. Kleanthous,

T. Papasavva, G. P. Patrinos and J. Traeger-Synodinos (2007) An overview

of current microarray-based human globin gene mutation detection methods.

Hemoglobin 31(3): 289-311.

19. Dhamcharee, V., O. Romyanan and T. Ninlagarn (2001) Genetic counseling

for thalassemia in Thailand: problems and solutions.

20. Dianzani, I., S. Forrest, C. Camaschella, E. Gottardi and R. Cotton (1991)

Heterozygotes and homozygotes: discrimination by chemical cleavage of

mismatch. American journal of human genetics 48(2): 423.

21. Faa, V., M. Rosatelli, R. Sardu, A. Meloni, C. Toffoli and A. Cao (1992) A

simple electrophoretic procedure for fetal diagnosis of β‐thalassaemia due to

short deletions. Prenatal diagnosis 12(11): 903-907.

22. Filon, D., A. Oppenheim, E. Rachmilewitz, R. Kot and D. B. Truc

(2000) Molecular analysis of β-thalassemia in Vietnam. Hemoglobin

24(2): 99-104.

23. Flatz, G., T. Sanguansermsri, S. Sengchanh, D. Horst and J. Horst (2004)

The ‘Hot Spot’of Hb E [β26 (B8) Glu→ Lys] in Southeast Asia: β‐Globin

Anomalies in the Lao Theung Population of Southern Laos. Hemoglobin

28(3): 197-204.

24. Fucharoen, S. and P. Winichagoon (1987) Hemoglobinopathies in southeast

Asia. Hemoglobin 11 (1): 65-88.

119

25. Fucharoen, S. and P. Winichagoon (2011) Haemoglobinopathies in southeast

Asia. The Indian journal of medical research 134(4): 498.

26. Gabbianelli, M., O. Morsilli, A. Massa, L. Pasquini, P. Cianciulli, U. Testa

and C. Peschle (2008) Effective erythropoiesis and HbF reactivation induced

by kit ligand in β-thalassemia. Blood 111(1): 421-429.

27. Galanello, R., S. Barella, S. Satta, L. Maccioni, C. Pintor and A. Cao (2002).

Homozygosity for nondeletion δ-β0 thalassemia resulting in a silent clinical

phenotype. Blood 100(5): 1913-1914.

28. Galanello, R., R. Ruggeri, E. Paglietti, M. Addis, M. Melis and A. Cao

(1983) A family with segregating triplicated alpha globin loci and beta

thalassemia. Blood 62(5): 1035-1040.

29. Giordano, P. C., M. Bakker-Verwij and C. L. Harteveld (2009) Frequency of

α-globin gene triplications and their interaction with β-thalassemia

mutations. Hemoglobin 33(2): 124-131.

30. Glanello R, E. A., Traeger-Synodinos J, Old JM, Petrou M, Angastiniotis M,

editors (2003) Prevention of thalasaemia and other haemoglobin disorders.

Thalassemia international Federation Publications.

31. Gorakshakar, A., A. Pawar, A. Nadkarni, C. Lu, D. Monhanty, R.

Krishnamoorthy, C. Besmond and R. Colah (1999) Potential of denaturing

gradient gel electrophoresis for scanning of beta-thalassemia mutations in

India. American journal of hematology 61(2): 120-125.

32. Hanafi, S., R. Hassan, R. Bahar, W. Z. Abdullah, M. F. Johan, N. D. Rashid,

N. F. Azman, A. Nasir, S. Hassan and R. Ahmad (2014) Multiplex

amplification refractory mutation system (M-ARMS) for the detection of β-

globin gene mutations among the transfusion-dependent β-thalassemia Malay

patients in Kelantan, Northeast of Peninsular Malaysia. American journal of

blood research 4(1): 33.

120

33. Hao, L. T., S. Pissard, P. Hung Van, C. Lacombe, T. D. Hanh, M. Goossens

and T. D. Kiet (2001) Molecular analysis of β-thalassemia in South Vietnam.

Hemoglobin 25(3): 305-309.

34. Harteveld, C. L., A. Voskamp, M. Phylipsen, N. Akkermans, J. T. den

Dunnen, S. J. White and P. C. Giordano (2005) Nine unknown

rearrangements in 16p13.3 and 11p15.4 causing α and β-thalassaemia

characterised by high resolution multiplex ligation-dependent probe

amplification. Journal of medical genetics 42(12): 922-931.

35. Hassan, S., R. Ahmad, Z. Zakaria, Z. Zulkafli and W. Z. Abdullah (2013)

Detection of β-globin gene mutations among β-thalassaemia carriers and

patients in Malaysia: application of multiplex amplification refractory

mutation system–polymerase chain reaction. The Malaysian journal of

medical sciences: MJMS 20(1): 13.

36. He, J., W. Song, J. Yang, S. Lu, Y. Yuan, J. Guo, J. Zhang, K. Ye, F. Yang

and F. Long (2017) Next-generation sequencing improves thalassemia carrier

screening among premarital adults in a high prevalence population: the Dai

nationality, China. Genetics in Medicine.

37. Ho, P., G. Hall, L. Luo, D. Weatherall and S. Thein (1998) Beta-

thalassaemia intermedia: is it possible consistently to predict phenotype from

genotype?. British journal of haematology 100: 70-78.

38. Hoan, N. K. H. (2013). Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh bệnh

alpha và beta Thalassemia. Luận văn tiến sỹ.

39. Honardoost, M. A., H. Tabatabaeian, M. Akbari and M. Salehi (2014)

Investigation of sensitivity, specificity and accuracy of Tetra primer ARMS

PCR method in comparison with conventional ARMS PCR, based on

sequencing technique outcomes in IVS-II-I genotyping of beta thalassemia

patients. Gene 549(1): 1-6.

40. Jauniaux, E., A. L. Watson, J. Hempstock, Y.-P. Bao, J. N. Skepper and G. J.

Burton (2000) Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative

stress: a possible factor in human early pregnancy failure. The American

journal of pathology 157(6): 2111-2122.

121

41. JM., O. (2003) Screening and genetic diagnosis of haemoglobin disorders.

Blood Rev 17(2): 43-53.

42. Kazazian, H. J., C. E. Dowling, P. G. Waber, S. Huang and W. Lo (1986).

The spectrum of beta-thalassemia genes in China and Southeast Asia. Blood

68(4): 964-966.

43. Kazazian, J. H. (1990). The thalassemia syndromes: molecular basis and

prenatal diagnosis in 1990. Seminars in hematology.

44. Khanh, N. C. (1985). Một số đặc điểm lâm sàng huyết học bệnh Beta

Thalassemia ở người Việt Nam. Luận án PTS Y học.

45. Khanh, N. C., L. T. Thu, D. B. Truc, D. P. Hoa, T. T. Hoa and T. H. Ha

(1990) Beta-thalassemia/haemoglobin E disease in Vietnam. Journal of

tropical pediatrics 36(1): 43-45.

46. Khateeb, B., T. Moatter, A. M. Shaghil, S. Haroon and G. N. Kakepoto

(2000) Genetic diversity of beta-thalassemia mutations in Pakistani

population. The Journal of the Pakistan Medical Association 50(9): 293-296.

47. Lau, Y.-L., L.-C. Chan, Y.-Y. A. Chan, S.-Y. Ha, C.-Y. Yeung, J. S. Waye

and D. H. Chui (1997) Prevalence and genotypes of α and β-thalassemia

carriers in Hong Kong—implications for population screening. New England

Journal of Medicine 336(18): 1298-1301.

48. Little, S. (2001) Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis

of point mutations. Curr Protoc Hum Genet Chapter 9: Unit 9 8.

49. Ma, E. S. K., A. Y. Y. Chan, S. Yin Ha, Y. L. Lau and L. C. Chan (2001)

Thalassemia screening based on red cell indices in the Chinese.

Haematologica.

50. Madan, N., S. Sharma, S. Sood, R. Colah and H. Bhatia (2010) Frequency of

β-thalassemia trait and other hemoglobinopathies in northern and western

India. Indian journal of human genetics 16(1): 16.

51. Mishra, K. K., P. Patel, D. S. Bhukhanvala, A. Shah and K. Ghosh (2017). A

multiplex ARMS PCR approach to detection of common β-globin gene

mutations. Analytical biochemistry 537: 93-98.

122

52. Mitchell, J. J., A. Capua, C. Clow and C. R. Scriver (1996) Twenty-year

outcome analysis of genetic screening programs for Tay-Sachs and beta-

thalassemia disease carriers in high schools. American journal of human

genetics 59(4): 793.

53. Motum, P. I., T. J. Hamilton, R. Lindeman, H. Le and R. J. Trent (1993)

Molecular characterisation of Vietnamese HPFH. Human mutation 2(3):

179-184.

54. Musallam, K. M., S. Rivella, E. Vichinsky and E. A. Rachmilewitz (2013)

Non-transfusion-dependent thalassemias. Haematologica 98(6): 833-844.

55. Neishabury, M., A. Azarkeivan, C. Oberkanins, S. S. Abedini, S. Zamani and

H. Najmabadi (2011). Analyzing 5′ HS3 and 5′ HS4 LCR core regions and

NF-E2 in Iranian thalassemia intermedia patients with normal or carrier

status for beta-globin mutations. Blood Cells, Molecules, and Diseases 46(3):

201-205.

56. Ngọc, H. V. (2007). Nghiên cứu thực trạng bệnh Beta thalassemia và một số

yếu tố liên quan ở trẻ em dân tộc Tày và Dao tại huyện Định Hóa - Tỉnh Thái

Nguyên. Luận văn thạc sĩ y học.

57. Nguyễn Thị Thanh Hà (2014). Chấn đoán trước sinh bệnh di truyền cho thai

ở 27 cặp vợ chồng mang gen Thalassemia tại bệnh viện phụ sản Mekong.

Nghiên cứu Y học, Y Học TP. Hồ Chí Minh Tập 18(số 1): 126-135.

58. Nuinoon, M., W. Makarasara, T. Mushiroda, I. Setianingsih, P. A.

Wahidiyat, O. Sripichai, N. Kumasaka, A. Takahashi, S. Svasti and T.

Munkongdee (2010) A genome-wide association identified the common

genetic variants influence disease severity in β 0-thalassemia/hemoglobin E.

Human genetics 127(3): 303-314.

59. Nuntakarn, L., S. Fucharoen, G. Fucharoen, K. Sanchaisuriya, A.

Jetsrisuparb and S. Wiangnon (2009) Molecular, hematological and clinical

aspects of thalassemia major and thalassemia intermedia associated with Hb

E-β-thalassemia in northeast Thailand. Blood Cells, Molecules, and Diseases

42(1): 32-35.

123

60. Old, J., J. Traeger-Synodinos, R. Galanello, M. Petrou and M. Angastiniotis

(2005) Prevention of thalassaemias and other haemoglobin disorders.

Thalassaemia International Federation Publications 2: 113-116.

61. Old, J. M., S. N. Khan, I. Verma, S. Fucharoen, M. Kleanthous, P. Ioannou,

N. Kotea, C. Fisher, S. Riazuddin and R. Saxena (2001) A multi-center study

in order to further define the molecular basis of β-thalassemia in Thailand,

Pakistan, Sri Lanka, Mauritius, Syria, and India, and to develop a simple

molecular diagnostic strategy by amplification refractory mutation system-

polymerase chain reaction. Hemoglobin 25(4): 397-407.

62. Park, S. S., Y. J. Lee, J. Y. Kim, S. I. Joo, Y. Hattori, Y. Ohba and H.-I.

Cho (2002) β-Thalassemia in the Korean population. Hemoglobin 26(2):

135-145.

63. Peng, C.-T., S.-C. Liu, S.-S. Chiou, P.-L. Kuo, M.-C. Shih, J.-Y. Chang and

J.-G. Chang (2003) Molecular characterization of deletional forms of β-

thalassemia in Taiwan. Annals of hematology 82(1): 33-36.

64. Pornprasert, S. and K. Sukunthamala (2010). "Syto 9 and Sybr Green1 with a high‐resolution melting analysis for prenatal diagnosis of β0

thalassemia/hemoglobin‐E. European journal of haematology 85(5):

424-429.

65. Rhoads, G. G., L. G. Jackson, S. E. Schlesselman, F. F. de la Cruz, R. J.

Desnick, M. S. Golbus, D. H. Ledbetter, H. A. Lubs, M. J. Mahoney, E.

Pergament and et al. (1989) The safety and efficacy of chorionic villus

sampling for early prenatal diagnosis of cytogenetic abnormalities. N Engl J

Med 320(10): 609-617.

66. Saiki, R. K., P. S. Walsh, C. H. Levenson and H. A. Erlich (1989) Genetic

analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific

oligonucleotide probes. Proc Natl Acad Sci USA 86(16): 6230-6234.

67. Saiki, R. K., P. S. Walsh, C. H. Levenson and H. A. Erlich (1989) Genetic

analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific

oligonucleotide probes. Proceedings of the National Academy of Sciences

86(16): 6230-6234.

124

68. Saovaros Svasti, M., T. M. Hieu, T. Munkongdee, P. Winichagoon, T. Van

Be, T. Van Binh and S. Fucharoen (2002) Molecular analysis of β-

thalassemia in South Vietnam. American journal of hematology 71(2): 85-88.

69. Schrier, S. L. (2002) Pathophysiology of thalassemia. Current opinion in

hematology 9(2): 123-126.

70. Schutz, M., V. Bredow, D. Grabow and M. Wehnert (1985) Methods of

chorion sampling for prenatal diagnosis in the 1st trimester of pregnancy

Report of experiences. Zentralbl Gynakol 107(18): 1114-1117.

71. Sharma, V. and R. Saxena (2009) Effect of α-gene numbers on phenotype of

HbE/β thalassemia patients. Annals of hematology 88(10): 1035-1036.

72. Shimbhu, D.,S. Mirasena, M. Sanguansermsri and T. Sanguansermsri (2017)

Rapid detection of β Thalassemia mutations in Thailand using multiplex

ARMS. Asean Journal on Science and Technology for Development 25(2):

321-332.

73. Sivalingam, M., M. Looi, S. Z. S. Zakaria, N. Hamidah, H. Alias, Z. A.

Latiff, H. Ibrahim and R. Jamal (2012) Molecular study and

genotype/phenotype correlation of β thalassemia in Malaysia. International

journal of laboratory hematology 34(4): 377-382.

74. Spritz, R. A. and S. H. Orkin (1982) Duplication followed by deletion

accounts for the structure of an Indian deletion β0 thalassemia gene. Nucleic

acids research 10(24): 8025-8029.

75. Sripichai, O., T. Munkongdee, C. Kumkhaek, S. Svasti, P. Winichagoon and

S. Fucharoen (2008) Coinheritance of the different copy numbers of α-globin

gene modifies severity of β-thalassemia/Hb E disease. Annals of hematology

87(5): 375-379.

76. Surapon, T. (2011). Thalassemia syndrome. Advances in the Study of

Genetic Disorders, InTech.

125

77. Tabor, A., J. Philip, M. Madsen, J. Bang, E. B. Obel and B. Norgaard-

Pedersen (1986) Randomised controlled trial of genetic amniocentesis in

4606 low-risk women. Lancet 1(8493): 1287-1293.

78. Taher, A., H. Isma'eel and M. D. Cappellini (2006) Thalassemia intermedia:

revisited. Blood Cells, Molecules, and Diseases 37(1): 12-20.

79. Taher, A. T., K. M. Musallam, M. Karimi, A. El-Beshlawy, K. Belhoul, S.

Daar, M.-S. Saned, A.-H. El-Chafic, M. R. Fasulo and M. D. Cappellini

(2010) Overview on practices in thalassemia intermedia management aiming

for lowering complication rates across a region of endemicity: the optimal

care study. Blood 115(10): 1886-1892.

80. Tan, J., E. George, K. Tan, T. Chow, P. Tan, J. Hassan, P. Chia, R.

Subramanium, R. Chandran and S. Yap (2004) Molecular defects in the β-

globin gene identified in different ethnic groups/populations during prenatal

diagnosis for β-thalassemia: a Malaysian experience. Clinical and

experimental medicine 4(3): 142-147.

81. Thakur, C. (2012) Experience with Multiplex ARMS (MARMS)-PCR for the

Detection of Common Thalassemia Mutations in India. Cardiovascular and

Hematological Agents in Medicinal Chemistry 10(1): 14.

82. Thein, S., C. Hesketh, J. Brown, A. Anstey and D. Weatherall (1989)

Molecular characterization of a high A2 beta thalassemia by direct

sequencing of single strand enriched amplified genomic DNA. Blood 73(4):

924-930.

83. Thein, S. L. (1998) β-Thalassaemia. Ballière’s Clinical Haematology 11(1):

91-126.

84. Thein, S. L. and D. J. Weatherall (1989) A non-deletion hereditary

persistence of fetal hemoglobin (HPFH) determinant not linked to the

beta-globin gene complex. Progress in clinical and biological research

316: 97-111.

126

85. Tongsong, T., C. Wanapirak, P. Sirivatanapa, W. Piyamongkol, S.

Sirichotiyakul and A. Yampochai (1998) Amniocentesis-related fetal loss: a

cohort study. Obstet Gynecol 92(1): 64-67.

86. Tritipsombut, J., K. Sanchaisuriya, P. Phollarp, D. Bouakhasith, P.

Sanchaisuriya, G. Fucharoen, S. Fucharoen and F. P. Schelp (2012)

Micromapping of Thalassemia and Hemoglobinopathies in Diferent Regions

of Northeast Thailand and Vientaine, Laos People's Democratic Republic.

Hemoglobin 36(1): 47-56.

87. Trực, D. B. (1996). Đặc điểm lâm sàng và huyết học bệnh HbH ở trẻ em Việt

Nam, bước đầu tìm hiểu tần suất alpha thalassemia ở Hà Nội. Luận án phó

tiến sỹ, Đại học Y Hà Nội.

88. Vichinsky, E. (2016) Non-transfusion-dependent thalassemia and

thalassemia intermedia: epidemiology, complications, and management.

Current medical research and opinion 32(1): 191-204.

89. Viên, B. V. (2001). Một số đặc điểm lâm sàng huyết học bệnh HbE. Bước

đầu tìm hiểu tần suất HbE ở người dân tộc Mường tỉnh Hòa Bình. Luận án

Tiến sĩ y học.

90. Viprakasit, V., C. Lee-Lee, Q. T. Chong, K.-H. Lin and A. Khuhapinant

(2009) Iron chelation therapy in the management of thalassemia: the Asian

perspectives. International journal of hematology 90(4): 435-445.

91. Viprakasit, V., V. S. Tanphaichitr, W. Chinchang, P. Sangkla, M. J. Weiss

and D. R. Higgs (2004) Evaluation of alpha hemoglobin stabilizing protein

(AHSP) as a genetic modifier in patients with β thalassemia. Blood 103(9):

3296-3299.

92. Weatherall, D. (2010) Thalassemia as a global health problem: recent

progress toward its control in the developing countries. Annals of the New

York Academy of Sciences 1202(1): 17-23.

127

93. Weatherall, D., J. Wainscoat, S. Thein, J. Old, W. Wood, D. Higgs and J.

Clegg (1985) Genetic and Molecular Analysis of Mild Forms of

Homozygous β‐Thalassemia. Annals of the New York Academy of sciences

445(1): 68-80.

94. Weatherall, D. J. (2005) Keynote address: The challenge of thalassemia for

the developing countries. Annals of the New York Academy of Sciences

1054(1): 11-17.

95. Weatherall, D. J. (2007) Haemoglobin and the inherited disorders of globin

synthesis. Postgraduate Haematology, Fifth Edition: 85-103.

96. Winichagoon, P., V. Saechan, R. Sripanich, C. Nopparatana, S.

Kanokpongsakdi, A. Maggio and S. Fucharoen (1999) Prenatal diagnosis of

β‐thalassaemia by reverse dot‐blot hybridization. Prenatal diagnosis 19(5):

428-435.

97. Wonke, B. (2001). Clinical management of β-thalassemia major. Seminars in

hematology, Elsevier.

98. Xu, X. M., Z. Q. Li, Z. Y. Liu, X. L. Zhong, Y. Z. Zhao and Q. H. Mo

(2000) Molecular characterization and PCR detection of a deletional HPFH:

Application to rapid prenatal diagnosis for compound heterozygotes of this

defect with β‐thalassemia in a Chinese family. American journal of

hematology 65(3): 183-188.

99. Zhang, J., J. He, X.-H. Zeng, S.-J. Ge, Y. Huang, J. Su, X.-M. Ding, J.-Q.

Yang, Y.-J. Cao and H. Chen (2015) Genetic heterogeneity of the β-globin

gene in various geographic populations of Yunnan in Southwestern China.

PloS one 10(4): e0122956.

PHỤ LỤC 01: DANH SÁCH BỆNH NHÂN BETA THALASSEMIA THAM GIA NGHIÊN CỨU VÀ NỒNG ĐỘ DNA

STT

Labcode

Họ và tên

Khác

CD41/42 (- TCTT)

IVS1-1 (G-T)

-28 (A- G)

IVS1-5 (G- C)

CD71/72 (+A)

IVS2-654 (C-T)

CD95 (+A)

Tỷ lệ A260/280

CD17 (AAG- TAG)

HbE (GAG- AAG)

Nồng độ ADN (ng/ul)

1 1 1 1 1 2

1 1

1 2 1 1

1 1 2 2

2 1 1

1 1

2 1 1 2

1 1

1 WBbT07001 2 WBbT07002 3 WBbT07003 4 WBbT08001 5 WBbT080103 6 WBbT081106 7 WBbT081203 8 WBbT090204 9 WBbT090303 10 WBbT090304 11 WBbT090501 12 WBbT090801 13 WBbT090805 14 WBbT090902 15 WBbT091101 16 WBbT091104 17 WBbT091201 18 WBbT100101 19 WBbT100203 20 WBbT100205 21 WBbT100301 22 WBbT100304 23 WBbT100606 24 WBbT100909 25 WBbT100910 26 WBbT101001 27 WBbT101002 28 WBbT101103 29 WBbT101106 30 WBbT101207 31 WBbTT101212

Luyện Nhật M Lan H Nguyễn Văn T Hoàng Hà P Đoàn Phúc T Đào Thị Lan A Đỗ Trí D Nguyễn Thị Yến Nh Nguyễn Trường L Bùi Quốc K Phạm Thị Thuỳ D Hoàng Ngọc Minh H Hoàng Thị La N Lý Phương A Trần Kim K Vũ Tuấn A La Vân A Đinh Quang T Bùi Nguyễn Huyền D Nguyễn Thanh B Hoàng Thị Ngân H Nguyễn Hoàng Tùng S Nguyễn Thị Thu T Lê Mai H Hoàng Công H Lê Hoàng Đ Bế Quang H Nguyễn Minh H Nguyễn Thi Minh P Lê Hà M Linh Mạnh C

1 1 1

61 64 65 66 68 56 58 59 52 63 67 70 65 67 65 56 58 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56

1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2

1 1

1 2

1 1 1 1

1 1 1

1 1

1 1 1

1 1

1 1 1

1 1

1 1 1 1 1 1

1 1 1

32 WBbTT101215 33 WBbT110103 34 WBbT110307 35 WBbT110401 36 WBbT110406 37 WBbT110412 38 WBbT110502 39 WBbT110503 40 WBbT110504 41 WBbT110602 42 WBbT110703 43 WBbT110704 44 WBbT110709 45 WBbT110713 46 WBbT110716 47 WBbT110803 48 WBbT110811 49 WBbT110901 50 WBbT111002 51 WBbT111003 52 WBbT111104 53 WBbT111106 54 WBbT111107 55 WBbT111108 56 WBbT111201 57 WBbT111202 58 WBbT120101 59 WBbT120105 60 WBbT120205 61 WBbT120206 62 WBbT120208 63 WBbT120212 64 WBbT120214 65 WBbT120216 66 WBbT120303 67 WBbT120304 68 WBbT120306

Hoàng Văn N Hà Thị khánh V Đàm Quốc H Triệu Hoàng Ánh T Vũ Tuấn L Đỗ Mai L Đỗ Thị Hương G Bùi Văn L Phạm Hùng N Đinh Tất L Quang M Nguyễn Tuấn N Nguyễn Cẩm N Trần Quốc V Ngô Minh Đ Bùi Thị N Hoàng Anh T Xa Quang H Nguyễn Hà Tuấn K Phạm Tố U Lý Quỳnh M Bùi Quang Đ Lò Đức T Phan Duy Th Bùi Thị Hồng N Tô Việt H Nguyễn Vũ Hà L Phạm Văn C Vũ Xuân Gia K Phạm NGọc Q Nguyễn Thảo C Vũ Thu G Đồng Thị Q Bùi Khánh L Khúc ĐÌnh T Tăng Thế H Lê Văn L

1 1

58 59 52 63 67 70 65 67 65 56 58 52 63 67 70 65 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59

2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2

1 1

1 1 2 1 1 1 1

1 1 1

1 1

1 1 2 1 1 1 1 1

1 2 1

1 1

1 1 1 1

1 1

1 1 2 1

1 1

2 1 1

1 1

69 WBbT120309 70 WBbT120311 71 WBbT120406 72 WBbT120407 73 WBbT120409 74 WBbT120410 75 WBbT120413 76 WBbT120414 77 WBbT120506 78 WBbT120508 79 WBbT120602 80 WBbT120606 81 WBbT120608 82 WBbT120805 83 WBbT120809 84 WBbT120901 85 WBbT121004 86 WBbT121007 87 WBbT121102 88 WBbT121104 89 WBbT121107 90 WBbT130103 91 WBbT130104 92 WBbT130107 93 WBbT130109 94 WBbT130204 95 WBbT130301 96 WBbT130310 97 WBbT130311 98 WBbT130402 99 WBbT130501 100 WBbT130504 101 WBbT130701 102 WBbT130711 103 WBbT130802 104 WBbT130803 105 WBbT130806

Nguyễn Phi H Nguyễn Đức L Nguyễn Huy H Dương Việt A Nguyễn Sinh Đ Đinh Đức A VI Quốc Q Nguyễn Lan P Hán Bông Th Hoàng Thị Minh N Lê Thăng L Lò Nhật L Phùng Văn T Mùi Thị Ngọc K Đinh Quốc T Phùng Diệu L Phùng Văn A Hoàng Đăng D Đinh Thị L Trần Thị H Nguyễn Tuấn N Nguyễn Trung H Bùi Thị Thanh T Vũ Thị Thu H Nguyễn Thành K Bùi Thị Thu D Lê Hoàng G Bùi Khánh L Vi Đức T Nguyễn Mạnh T Vi Thị H Đào Diễm Q Hoàng Hải D Hoàng Văn D Nguyễn Tuấn T Nguyễn Thị Thanh H Vũ Đức D

1 1 1

52 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 52 63 67 70 65 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64

1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8

2 2

1 1

1 1 2 1 2

1 1 2 1

1 1 1 1

1 2

1 1

1 1 1

1 1

1 1 1 2

2 1

1 1

106 WBbT130808 107 WBbT130809 108 WBbT130902 109 WBbT130903 110 WBbT130905 111 WBbT131006 112 WBbT131007 113 WBbT131010 114 WBbT131102 115 WBbT131104 116 WBbT131108 117 WBbT131109 118 WBbT131113 119 WBbT131203 120 WBbT131205 121 WBbT131208 122 WBbT140101 123 WBbT140202F 124 WBbT140203 125 WBbT140302 126 WBbT140304 127 WBbT140401 128 WBbT140404 129 WBbT140502 130 WBbT140505 131 WBbT140605 132 WBbT140606 133 WBbT140609 134 WBbT140610 135 WBbT140701 136 WBbT140702 137 WBbT140703 138 WBbT140709 139 WBbT140713 140 WBbT140714 141 WBbT140715 142 WBbT140804

Nguyễn Văn P Nguyễn Quang T Phạm Việt C Ôn Thị Thúy Đ Đàm Việt T Vũ Mạnh H Phi Hoài A Đinh Văn V Lý Nguyên H Bùi Tiến A Trần Cao N Nguyễn Thành Đ Bàn Anh T Nguyễn Ngọc Mai A Trần Hải Y Hoàng Thảo N Vũ Anh Đ Trần Quý D Bùi Phạm Hoàng L Hoàng Khánh L Lường Triệu V Ngô Phương L Đỗ Bích N Phan Việt H Ma Thị Ngọc M Đặng Thủy L Lường Thị Kim X Phạm Thành L Nguyễn Bảo T Chu Thế H Bùi Diệu Th Chu Quỳnh H Nguyễn Hồ mỹ A Bùi Hoàng A Lưu Mạnh T Trần Mạnh D Bùi Thị Thu H

65 66 68 56 58 59 52 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 52 63 67 70 65 67 65 56 58 59 70 54 55 58

1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9

2 1 2

1 1

Lục Duy N Đỗ Xuân T Lê Bảo Ch Mùi Kiếm H Lò Kim Ch Đinh Nam H Lý Thu H Hoàng Chí Kh Trần Thùy N Lương Mạnh H

1 1

2 1 1

1 1

1 1 1 1 1 2 1

1 1 1

1 1 1 1

1 1 1

1 1

1 1 1

1 1

1 2 1

1 2

143 WBbT140906 144 WBbT140907 145 WBbT140908 146 WBbT141001 147 WbbT141103 148 WbbT141109 149 WBbT140903 150 WBbT140603 151 WBbT141206 152 WBbT141210 153 WBbT141212M Hoàng Thị Hồng D 154 WBbT150202 155 WBbT150304 156 WBbT150305 157 WBbT150306 158 WBbT150401 159 WBbT150407 160 WBbT150501 161 WBbT150507 162 WBbT150609 163 WBbT150702 164 WBbT150704 165 WBbT150801 166 WBbT150802 167 WBbT150803 168 WBbT150804 169 WBbT150807 170 WBbT150811 171 WBbT150814 172 WBbT150901 173 WBbT150905 174 WBbT150906 175 WBbT150907 176 WBbT150908 177 WBbT150909 178 WBbT150910 179 WBbT150915

Vũ Ngọc L Chu Mai U Trần Thị Quỳnh T Hà Trung H Đinh Hoàng Y Lò Huỳnh Q Linh Tâm Đ Nguyễn Thị Hương T Vũ Thị Thúy N Nghiêm Nhật M Nguyễn Đức Th Bùi Lan Nh Hoàng Tú U Mai Ngọc Nh Lường Văn Th Tẩn Văn Tr La Văn Tr Lò Văn Th Ninh Hoàng Thùy D Hoàng Văn T Đỗ Quốc T Đỗ Tuấn L Hoàng Văn Đ Hoàng Trúc M Mè Việt Q Lô Phương T

1 1

56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59 52 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 67 65 56 58 59 70 54 55

1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8

1 1

1 1 1

2 1 1 1 1 2 1

1 1

1 1 1 1 1

1 1 1 2

2 1

2 1 1

1 1

2 2 1 1

1 1 1

Nguyễn Tuấn Đ Trần Đoàn Vân A Quàng Hữu V Hoàng Khánh P Phạm Lê Vân T Vi Ngân D Hà Bảo Ng Nguyễn Đình Q Ngô Duy L Nguyễn Nhật A Lò Thanh Qu Nguyễn Minh T Vì Đức T Vì Hoàng Đ Trần Bảo U Hoàng Nhật L Nguyễn Trọng Ph Bùi Thị Yến Nh Trần Văn Tr Hoàng Lý H Mùi Thị Ngọc K Nguyễn Quỳnh T Nguyễn Quốc V Hà Gia B Nguyễn Trần Phương V Triệu Quang H Hoàng Triệu Thúy M Nghiêm Nhật M Hà Anh S Nguyễn Đức T Phạm Tường V La Phuong Ng

PWBbT120505M Lieu Thi Th

c.-138 C>T c.-140 C>T

1 1 1

Hà Thị Bích Th. Mai Hoa Tường V

58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59 52 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 58 59 52 c.441-442ins AC 67 2,3kb deletion 65

1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2

180 WBbT150917 181 WBbT150918 182 WBbT150920 183 WBbT150921 184 WBbT150922 185 WBbT150924 186 WBbT150925 187 WBbT150928 188 WBbT151003 189 WBbT151102 190 WBbT151201 191 WBbT151202 192 WBbT151205 193 WBbT151206 194 WBbT151207 195 WBbT160103 196 WBbT160107 197 WBbT160108 198 WBbT160201 199 WBbT160303 200 WBbT160305 201 WBbT160403 202 WBbT160503 203 WBbT160601 204 WBbT160701 205 WBbT160702 206 WBbT160703 207 WBbT160704 208 WBbT160707 209 WBbT160807 210 WBbT160904 211 WBbT110706 212 213 WBbTS150926 PWBbT170305 214 Chú thích: 1: dị hợp tử đột biến, 2: đồng hợp tử đột biến, khác: đột biến hiếm gặp nằm ngoài 09 đột biến sàng lọc bằng kỹ thuật ARMS PCR

PHỤ LỤC 02: DANH SÁCH NGƯỜI MANG GEN BỆNH BETA THALASSEMIA THAM GIA NGHIÊN CỨU VÀ NỒNG ĐỘ DNA

STT

Labcode

Họ và tên

Khác

CD41/42 (-TCTT)

CD17 (AAG-TAG)

IVS1-1 (G-T)

-28 (A- G)

IVS1-5 (G-T)

CD71/72 (+A)

IVS2- 654(C-T)

CD95 (+A)

Tỷ lệ A260/280

HbE (GAG- AAG)

1 1 1 1 1 1

1 1

1 1 1 1 1

1 WBbT07004 2 WBbT08002 3 WBbT08003 4 WBbT08006 5 WBbT08007 6 WBbT08008 7 WBbT08009 8 WBbT080901 9 WBbT080902 10 WBbT080101 11 WBbT080102 12 WBbT081102 13 WBbT081103 14 WBbT081104 15 WBbT081105 16 WBbT081201 17 WBbT081202 18 WBbT090202 19 WBbT090203 20 WBbT090301 21 WBbT090302 22 WBbT090305 23 WBbT090306 24 WBbT090502 25 WBbT090803 26 WBbT090804 27 WBbT090805 28 WBbT090901 29 WBbT090903 30 WBbT090904 31 WBbT091102 32 WBbT091103

Bùi Công T Đồng Thị M Bùi Đức Th Phạm Văn Đ Phạm Thị Đ Thân Văn K Giáp Thị M Bùi Thu Th Đinh Văn T Đoàn Hồng Ng Nông Thị Th Hoàng Thị H Nguyễn Trung C Nguyễn Thị C Đào Quốc Đ Đỗ Văn C Đỗ Thị T Trương Thị H Hà Văn T Phạm Thị Minh H Đặng Xuân M Nguyễn Thanh Tr Bùi Xuân Trung K Ngô Uyên Nh Phạm Thế L Dương Thanh H Đào Mai H Nguyễn Văn D Lý Chí Ph Dương Thị H Lại Thị Bích L Trần Minh Kh

Nồng độ ADN (ng/ul) 56 58 68 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 67 65 56 58 57 59 70 54 55 58

1.8 2 1.9 1.9 1.9 1.9 2 1.8 1.8 2 2 1.9 2 1.8 1.8 1.8 2 1.9 1.9 1.9 1.9 2 1.8 2 1.8 1.8 1.8 2 2 1.9 2 1.8

1 1

1 1 1 1

1 1

1 1 1 1

33 WBbT091105 34 WBbT091106 35 WBbT100102 36 WBbT100103 37 WBbT100201 38 WBbT100202 39 WBbT100203 40 WBbT100204 41 WBbT100302 42 WBbT100303 43 WBbT100401 44 WBbT100402 45 WBbT100601 46 WBbT100602 47 WBbT100604 48 WBbT100605 49 WBbT100607 50 WBbT100705 51 WBbT100707 52 WBbT100708 53 WBbT100709 54 WBbT100710 55 WBbT100801 56 WBbT100802 57 WBbT100902 58 WBbT100903 59 WBbT101102 60 WBbT101104 61 WBbT101105 62 PWBbT101102 63 PWBbT101103 64 WBbT101107 65 WBbT101108 66 WBbT101201 67 WBbT101202 68 WBbT101203 69 WBbT101204

Vũ Công Th Nguyễn Thị Thu H Đinh Đức M Vũ Thị Như H Bùi Hồng Ph Nguyễn Hương Gi Nguyễn Mai L Nguyễn Thanh H Hoàng Lê Qu Lê Thị Th Lê Thị V Lý Văn L Trần Ánh H Trần Nho H Cầm Văn T Bạc Thị L Nguyễn Thị L Mông Trường G Giang Văn M Đỗ Thị H Dương Thị T Phạm Văn T Lê Khắc L Phạm Thị H Lê Đức B Lê Thị Thu H Lê Minh T Nguyễn Bá L Nguyễn Thị T Hoàng Thị Ngọc H Nguyễn Văn N Lê Văn H Vi Thị H Nguyễn Thắng L Nguyễn Thu U Nguyễn Văn Đ Nguyễn Thi H

56 67 69 62 61 64 69 62 61 68 56 58 59 52 63 67 70 65 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56

1.8 1.8 2 1.9 1.9 2 2 1.9 1.9 1.9 1.9 2 1.8 2 1.8 1.8 2 2 1.9 2 1.8 1.8 1.8 2 1.9 1.9 1.9 1.9 2 1.8 2 1.8 1.8 2 2 1.9 2

1 1

70 PWBbT101205 71 PWBbT101206 72 PWBbT101207 73 PWBbT101209 74 WBbTT101213 75 WBbTT101214 76 WBbT110101 77 WBbT110102 78 WBbT110201 79 WBbT110202 80 WBbT110203 81 WBbT110204 82 WBbT110205 83 WBbT110301 84 WBbT110302 85 PWBbT110304 86 PWBbT110305 87 WBbT110305 88 WBbT110306 89 PWBbT110402 90 PWBbT110403 91 WBbT110407 92 WBbT110408 93 WBbT110409 94 WBbT110410 95 WBbT110501 96 WBbT110505 97 WBbT110506 98 PWBbT110605 99 PWBbT110606 100 PWBbT110610 101 PWBbT110611 102 PWBbT110612 103 PWBbT110613 104 WBbT110601 105 PWBbT110701 106 PWBbT110702

Lê Vĩnh C Nguyễn Thị Khánh C Phạm Ngọc T Vũ Trường G Linh Văn H Lý Thị M Dương Hồng T Nguyễn Văn L Dương Hồng T Nguyễn Thị Thu H Nguyễn Đức H Vũ Thị Hồng H An Mai Th. Đào Hồng T Hoàng Thị T Lò Văn H Hoàng Thị M Bùi Văn L Bùi Thị V Nguyễn Tuấn D Nông thị Ng Nguyễn Thị V Vũ Chí C Đinh Duy T Chu Thị H Phùng Văn Á Phan Nhật S Hoàng Thị Huyền T Trần Thị Kim B Đỗ Bá L Nguyễn Hữu H Nguyễn Thị H Phạm Văn S Đặng Thu P Trương Văn H Nguyễn Danh T Nguyễn Thị P

58 59 52 67 65 56 58 59 70 54 55 58 69 62 61 69 62 61 64 65 66 68 56 67 65 56 66 68 56 58 59 52 63 67 70 65 67

1.8 1.8 1.8 2 1.9 1.9 1.9 1.9 2 1.8 2 1.8 2 1.9 1.9 2 1.9 2 1.8 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9

1 1

1 1 1

Lò Văn T

1 1

107 (P)WBbT110701 Quang H 108 (P)WBbT110702 Ứng Thi Phương T Phạm Thị N 109 WBbT110707 Lã Xuân S 110 WBbT110710 Ngô Quốc K 111 WBbT110714 Hoàng Thị S 112 WBbT110715 Hoàng Văn T 113 WBbT110805 Nguyễn Thị H 114 WBbT110806 Bùi Phương N 115 WBbT110807 Nguyễn Văn Đ 116 WBbT110808 Phạm Thị H 117 WBbT111004 Nguyễn Văn L 118 WBbT111005 Lương Đinh Cẩm H 119 WBbT111006 Lê Tiến H 120 WBbT111101 Lê Văn C 121 WBbT111102 Khuất Thị X 122 WBbT111103 123 WBbT111106F Bùi Văn Đ 124 WBbT111106M Ngần Thị N 125 WBbT111107F 126 WBbT111107M Quàng Thị D 127 WBbT111108F Phan Anh T 128 WBbT111108M Nguyễn Thị H Tô Mạnh H 129 WBbT111202F 130 WBbT111202M Nông Thị T 131 WBbT111204M Trần Đăng D Vũ Thị Thanh H 132 WBbT111204F 133 WBbT120211F Phạm Văn T 134 WBbT120211M Phạm Mai H 135 PWBbT120214F Đồng Văn T 136 PWBbT120214M Cầm THị D 137 WBbT120215 Bế Hoàng M 138 WBbT120307M Đỗ Thị H Vũ Văn H 139 WBbT120307F 140 WBbT120308 Quách Đình A 141 PWBbT120314M Vũ Thị L 142 PWBbT120314F Hà Công H Bùi Anh S 143 WBbT120401F

65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59 52 63 67 70 65

2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2

Đinh Đức L

1 1

Diệp Ngọc C

Nguyễn Xuân C

1 1

Nguyễn Văn H

Đỗ Duy T Lữ An B

Hà Phương N

1 1

1 1 1

144 WBbT120401M Nguyễn Thuận Á 145 WBbT120404 Nguyễn Thanh Đ 146 PWBbT120405M Ninh Thị H 147 PWBbT120405F Nguyễn Quốc V Dương Văn K 148 WBbT120407F 149 WBbT120407M Nguyễn THị N 150 WBbT120410F 151 WBbT120410M Nguyễn THị T 152 WBbT120411F 153 WBbT120411M Mạc Thị N 154 WBbT120412F 155 WBbT120412M Hoàng THị S 156 WBbT120501F Hán Văn V 157 WBbT120501M Ngô Thị H 158 WBbT120505F Hoàng Văn A 159 PWBbT120507F Lương Khắc C 160 PWBbT120507M Nguyễn Thị Kim T 161 WBbT120607F 162 WBbT120607M Vũ Thị T 163 PWBbT120703F Tô Ngọc N 164 PWBbT120703M Phùng Mỹ L 165 WBbT120801 166 WBbT120803 167 PWBbT120804F Nông Văn B 168 PWBbT120804M Bế Thị D 169 WBbT120807 170 PWBbT120808F Đinh Kim T 171 PWBbT120808M Phạm Thị T 172 WBbT120905 Tống Việt D 173 PWBbT121001M Lưu Thị L 174 PWBbT121001F Đào Văn T 175 PWBbT121002F Trần Văn Q 176 PWBbT121002M Nguyễn Thị T 177 WBbT121005 Đặng Tuấn N 178 PWBbT121101F Nguyễn Quang T 179 PWBbT121101M Đặng Thị M 180 PWBbT121105F Lý Văn T

1 1

67 65 56 58 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59 52 63 67 70 65 67 65 56 58 52 63 67 70 65 67 65 56

2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2

Nguyễn Thị Thu H Bùi Duy H

1 1

Bùi Duy M Nguyễn Đức T

1 1 1

Đào Đ

1 1 1

181 PWBbT121105M Hoàng Thị Ngọc H 182 PWBbT121108F Nguyễn Thế A 183 PWBbT121108M Nguyễn Thị H 184 PWBbT121109F Trần Minh Đ 185 PWBbT121201F Ngô Xuân Đ 186 PWBbT121201M Hà Thị V Hà Mai P 187 PWBbT121202 Nguyễn Thị Mỹ L 188 PWBbT121204 189 WBbT130101 Phan Ngọc B 190 WBbT130108M Hồ Thị T Nguyễn Văn C 191 WBbT130108F 192 WBbT130110 Nguyễn Duy A 193 PWBbT130203F Nguyễn Văn T 194 WBbT130203 195 WBbT130204F 196 WBbT130204M Nguyễn Thị Thu O 197 PWBbT130301F Lê Xuân T 198 PWBbT130301M Đinh Thị T 199 PWBbT130306F Vũ Đình P 200 PWBbT130306M Hồng Thị D 201 PWBbT130401F Hoàng Văn Đ 202 PWBbT130401M Hoàng Thị B 203 PWBbT130403 204 WBbT130404 205 PWBbT130502F Vũ Xuân H 206 PWBbT130502M Nguyễn Thị L 207 WBbT130504F 208 WBbT130504M Phạm Thị Thu T Tô Hồng P 209 WBbT130601 210 WBbT130602F Bế Văn H 211 WBbT130602M Hà Thị S Long Gia H 212 WBbT130603 213 PWBbT130604F Hà Phúc T 214 PWBbT130604M Nông Thị Mai P 215 PWBbT130606F Bùi Văn T 216 PWBbT130606M Bùi Thị T 217 WBbT130702

Lưu Huyền T

58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59 52 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 52 63

1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.9 2 2 1.9 1.8

Trần Minh C

1 1 1

1 1

1 1 1

1 1

Lương Đình T

1 1

Nguyễn Mạnh T

Nguyễn Đình T

218 WBbT130702M Bùi Thị T 219 WBbT130703F 220 WBbT130703M Trần Thị Thanh M 221 PWBbT130705F Cầm Ngọc P 222 PWBbT130705M Hà Thị Kim Ch 223 PWBbT130706F Nguyễn Tuấn Đ 224 PWBbT130706M Hà Hồng Đ 225 PWBbT130707F Nguyễn Thế N 226 PWBbT130707M Đào Thị H 227 PWBbT130708F Trần Anh K 228 PWBbT130708M Nguyễn Thị N 229 WBbT130802F Nguyễn Văn T 230 WBbT130802M Nguyễn Thị Đ Lâm Gia B 231 WBbT130804 Mai Đức T 232 WBbT130805 Hoàng Cẩm C 233 WBbT130807 Hà Văn T 234 WBbT130901 235 WBbT131001 Hà Văn T 236 PWBbT131002F Bùi Văn T 237 PWBbT131002M Bùi Thị S 238 PWBbT131003F Nguyễn Văn M 239 PWBbT131003M Nguyễn Thị H 240 PWBbT131004M Quách Thị T 241 WBbT131005F Lăng Văn N 242 WBbT131005M Mông Thị N 243 PWBbT131008F Nguyễn Xuân T 244 WBbT131009F 245 WBbT131009M Hoàng Thị L 246 PWBbT131103F Bùi Xuân Đ 247 PWBbT131103M Nguyễn Thì H 248 WBbT131105 249 WBbT131106M Đỗ Thanh N 250 WBbT131107F Tạ Quang D 251 WBbT131107M Lầu Thị T 252 WBbT131110F 253 WBbT131110M Diệp Thị M 254 WBbT131111F

Lý Văn Đ

1 1

67 70 65 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59 52 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69

1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9

Nguyễn Văn C

1 1

Hoàng Danh K

Trần Nhất L Nguyễn Minh A Nguyễn Hữu T Lê Thế S

1 1

1 1 1

255 WBbT131111M Lý Thị T 256 WBbT131112F Lý Sìu M 257 WBbT13112M Phòng Thị L 258 WBbT131202F 259 WBbT131202M Dđinh Thị H 260 PWBbT131204F Bùi Văn Đ 261 PWBbT131204M Bùi Thị T 262 PWBbT131206F Lân Văn H 263 PWBbT131206M Lương Thị H Đinh Ngọc T 264 WBbT131207 265 WBbT131209F Giang Văn Đ 266 WBbT131209M Lò Thị T 267 WBbT140611 268 WBbT141207M La Thị O 269 WBbT141208F 270 WBbT141209 271 WBbT141211F 272 WBbT150103F 273 WBbT150104M Nguyễn Lan A Nguyễn Minh Q 274 WBbT1501005 Phan Tuệ M 275 WBbT150201 276 WBbT150301F Lê Xuân H 277 WBbT150302M Mai Thị D Phạm Tố Q 278 WBbT150307 Nguyễn Bá D 279 WBbT150308 Nguyễn Trí K 280 WBbT150403 Lê Thị Minh T 281 WBbT150404 Đinh Lý T 282 WBbT150405F Kha Thị H 283 WBbT150406 Vũ Thi Á 284 WBbT150503 Ngô Minh H 285 WBbT150504 Vũ Huy B 286 WBbT150505 287 WBbT150506 Ngô Nguyên G 288 WBbT150603M Dương Phương Th 289 WBbT150605 290 WBbT150606 291 WBbT150701

Lê Bảo L Nguyễn Văn T Lê Chấn Thiên B

62 61 64 65 52 63 67 70 65 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59 52 67 65 56 58 59 70

2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8

1 1

1 1 1

1 1

1 1 1

1 1

Đỗ Ngọc T Vi Phương L Hoàng Minh Q Đinh Thị Thùy L Dương Hoàng T Hà Thị Bích T Triệu Thừa N Dương Hoàng T Lầu Bảo T Nguyễn Minh T Lê Anh D

Bùi Văn Q

Trần Văn H

1 1

Phạm Khánh M 292 WBbT150709 293 WBbT150710M Mẹ Võ Xuân C 294 WBbT150712 Nguyễn Trần Bảo C 295 WBbT150805 Hoàng Xuân T 296 WBbT150806 Bùi Việt H 297 WBbT150809 Lê Trần Linh A 298 WBbT150810 Hà Thị Bích T 299 WBbT150815 Phạm Anh Đ 300 WBbT150902 Nguyễn Thị H Nguyễn Đình N 301 WBbT150903 302 WBbT150913M Nguyễn Thị M 303 WBbT150912F 304 WBbT150914 305 WBbT150916 306 WBbT150919 307 WBbT150923 308 WBbTS150926 309 WBbT151006 310 WBbTS151101 311 WBbT151103 312 WBbT151106 313 WBbT151107F 314 WBbT151108M Nguyễn Thị N 315 WBbT160105F 316 WBbT160106M Nguyễn Thị T 317 WBbT160110F 318 WBbT160111M Nguyễn Thị T Lê Thị Phương A 319 WBbT160202 Nguyễn Thị C 320 WBbT160203 Nguyễn Văn H 321 WBbT160204 Dương Văn T 322 WBbT160308 Lý Ngọc H 323 WBbT160401 Nguyễn Minh A 324 WBbT160402 Nguyễn Bảo T 325 WBbT160404 326 WBbT160501 Trần Kim A 327 WBbT160603M Hoàng Thi H 328 WBbT160604F

Lục Ích Q

54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59 52 67 65 56 58 59

1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9

1 1

Phạm Anh Đ Bùi Quang T Lương Đức K Tô Văn B Dương Thị Đà Lê Đức M Nguyễn Quốc P Lò Thị T Bùi Thị Anh Th Nguyễn Hoàng Anh T Vương Quốc A

1 1 1 1

Vũ Gia A Bùi Minh N Bùi Thị P Bùi Thị M Nguyễn Phước T Phạm Thanh X Lê Thị Thúy H Trần Thị R

Tô Nguyên H

329 WBbT160607 330 WBbT160708 331 WBbT160801 332 WBbT160802 333 WBbT160803 334 WBbT160805 335 WBbT160901 336 WBbT160902 337 WBbT160903 338 WBbT160905 339 WBbT161001F 340 WBbT161002M Nguyễn Thị Hoa M 341 WBbT161004 342 WBbT161006 343 WBbT161007 344 WBbT161008 345 WBbT161101 346 WBbT161102 347 WBbT161103 348 WBbT161201F 349 WBbT161202M Nguyễn Văn Q 350 WBbT161203 351 PWBbT170305F Mai Huy H 352 WBbT110706M Nguyễn Thu U 353 WBbT150929M Nguyễn Như M 354 WBbTS150926 Cao Hồng Phong

70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 58 59 52 67 65 56 58 59 70 67 56 2.3kb deletion 65 c.-138 C>T 58 c.-140 C>T 59 c.441-442ins AC52

2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9

Chú thích: 1: dị hợp tử đột biến, khác: đột biến hiếm gặp nằm ngoài 09 đột biến sàng lọc bằng kỹ thuật ARMS PCR

PHỤ LỤC 03. DANH SÁCH THAI PHỤ LÀM CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH VÀ NỒNG ĐỘ DNA

STT

Labcode

Họ và tên

Khác

CD41/42 (- TCTT)

IVS1-1 (G-T)

-28 (A- G)

IVS1-5 (G-C)

CD71/72 (+A)

CD95 (+A)

CD17 (AAG- TAG)

HbE (GAG- AAG)

IVS2- 654 (C- T)

Số alen bị đột biến

Nồng độ ADN (ng/ul)

Tỷ lệ A260/2 80

1 1

PAF120102 PAF120105 PAF120201 PAF120202

PAF120205 PAF120206 PAF120302L

0 1 0 0 0 2 2 1 0 1 2 0 2 2 0 1 1 2 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 2

Nguyễn Thị Th Nguyễn Thị Khánh Ch Vi Thị H Nguyễn Thi Thu H Hoàng Thị M Hoàng Thị Ngọc H Hoàng thị T Nguyễn Thi H Nguyễn Thị Thu H Nguyễn Thị M Trần Thị Kim B Chu Thị H Hà Thị V. Phạm Thị L Vũ Thị Hồng H Phạm Thị Ng Lang Thị Ch Ứng Thị Phương Th Nguyễn Thị H Nguyễn Thị H Hoàng Thị S Nguyễn Thị Hồng Nh Ngần Thị Ng Khuất Thị X Nguyễn Thị C Đinh Thị H Nông Thị Th Nguyễn Thị Th Vũ Thị Thanh H Nguyễn Thị H Nông Thị Ng Hoàng Thị H

AFbT110101 1 AFbT110102 2 AFbT110103 3 AFbT110201 4 AFbT110301 5 AFbT110302 6 AFbT110303 7 AFbT110401 8 AFbT110402 9 10 AFbT110601 11 AFbT110703 12 AFbT110702 13 AFbT110705 14 AFbT110706 15 AFbT110707 16 AFbT110801 17 AFbT110803 18 AFbT110805 19 AFbT110901 20 AFbT110903 21 AFbT111001 22 AFbT111101 23 AFbT111203 24 AF120101 25 26 27 28 29 AF120203 30 31 32

65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59 52 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67

1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8

1 2

PAF120302R PAFbT120303 PAFbT120403 PAFbT120404

1 1

PAFbT120409 PAFbT120410 PAFbT120501 PAFbT120502 PAFbT120504 PAFbT120601 PAFbT120602 PAFbT120604

1 1

1 2

Hoàng Thị H Ngô Thị T Cầm thị D Dương THị H Lê Thị Ng Đỗ THị H Ninh Thị H Phạm Mai H Trịnh Thị Q Nguyễn Thuận Á Phạm THị Thảo Ng Mạc Thị Thu N Nguyễn Thị N Nguyễn Thị T Nguyễn Thị Kim T PAFbT120606 Nguyễn Hương G PAFbT120701 Vũ Thị L PAFbT120702 Hoàng THị S PAFbT120703 Liễu THị T PAFbT120709 Phùng Mỹ L PAFbT120801 Đặng Thu P PAFbT120802 Vũ Thị Th PAFbT120803 Ngô Thị H PAFbT120804 PAFbT120806-TrênĐinh Thị T PAFbT120806- DướiNguyễn Văn B PAFbT120902 PAFbT120904 PAFbT121201 PAFbT121202 PAFbT121203 PAFbT130104 PAFbT1300201 PAFbT130302 PAFbT130303 PAFbT130306 PAFbT130305 PAFbT130403

1 1

1 2 1 1 1 2 2 2 0 1 0 1 1 1 1 2 2 0 2 0 0 0 0 0 0 2 1 1 1 2 1 0 2 1 0 2 1

Bế Thị D Phạm Thị T Đặng Thị M Nguyễn Thị T Hoàng Thị Ngọc H Nguyễn Thị H Nguyễn THị V Hồ Thị T Hà Thị V Nguyễn Thị Th Trần Thị Kim B Hồng Thị D

33 34 35 36 37 AFbT120408 38 39 40 41 42 43 44 45 46 AFbT120605 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

69 62 61 61 64 65 66 68 56 58 55 58 56 67 69 62 61 61 64 65 62 61 61 64 65 66 68 56 58 55 58 56 67 69 62 61 64

1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 1.9 1.8

1 1 1

PAFbT130405 PAFbT130407 PAFbT130408 PAFbT130501 PAFbT130502 PAFbT130705 PAFbT130706

2 1

1 1

1 1 1

Hoàng Thị B Nguyễn Thị Thu H Trương Thị Bích H Đinh Thị Th Nguyễn Thị L Hà Thị S Nguyễn Thị Thu H Bùi Thị T Đỗ Văn A Trần Thị Thanh M Nông Thị Mai P Nguyễn Thanh Tr Hà Kim Ch Mạc Kim O Nguyễn Thị Hương G Phạm Thị mai H Phạm Thu T Đào Thị H Nguyễn Thị Đ Nguyễn Thị N Lưu Thị L Hà Hồng Đ Dương Thị V Bùi Thị X Tăng Thị B. Mông Thị N Hoàng Thị Ngọc H Hoàng Thị L Nguyễn Thị H Lầu Thị T Đinh Thị H Phùng Thị L Bùi Thị T Lý Thị T Lương Thị H Diệp Thị M Lò Thị T

1 2 2 1 0 0 1 1 2 2 2 0 1 1 0 1 1 2 2 1 0 2 0 1 2 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 2

70 71 72 73 74 75 76 77 AFbT130707 78 AFbT130710 79 AFbT130711 80 AFbT130712 81 AFbT130713 82 AFbT130718 83 AFbT130719 84 AFbT130720 85 AFbT130804 86 AFbT130805 87 AFbT130806 88 AFbT130903 89 AFbT130907 90 AFbT130906 91 AFbT131009 92 AFbT131010 93 AFbT131011 94 AFbT131012 95 AFbT131013 96 AFbT131104 97 AFbT131201 98 AFbT131202 99 AFbT131205 100 AFbT131207 101 AFbT131208 102 AFbT131209 103 AFbT131210 104 AFbT131213 105 AFbT140102 106 AFbT140104

65 66 68 56 58 59 52 67 65 56 58 59 70 54 55 58 56 67 69 58 56 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59 52 67 65 56 58

1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.9 1.8 2 1.8 1.9 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9

1 1

Lê Thị N Phạm Thị T Dương Thị C Lò Thị D. Lê Thị T Trần Thị Kim B Nguyễn Thị B Bùi Thị P Phạm Thị Thúy N Phạm Thị L Lò Thị Bích T

2 1

1 1

Mông Thị T Trần Thị O Nguyễn Thị H Nguyễn Thị Minh H Hồ Thị Hồng T

Hoàng Thụy M

1 1

1 1 1 1 1 1 2

1 1

Nguyễn Thị T Nguyễn Thị H Trương Thị Bích H Nông Thị Q Trần Thị Th Lê Thị Ng Phạm Thị N Dương Thị B Bùi Thị Ch Hà Hồng Đ La Thị O Lò Thị Bích Th. Nguyễn Thị H Nguyễn Lan A Mông Thị Th Khuất Thi X Lò Thị T

0 0 0 1 2 1 1 0 0 1 0 0 2 2 1 2 1 0 0 2 0 2 2 1 2 1 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1

107 AFbT140204 108 PAFbT140205 109 AFbT14 110 AFbT1413 111 AFbT1414 112 AFbT1415 113 PAFbT140417 114 PAFbT140505 115 AFbT140507 116 PAFbT140602 117 PAFbT140605 118 PAFbT14140604 Nguyễn Thị Thu H 119 AFbT140608 120 PAFbT140609 121 PAFbT140610 122 AFbT140612 123 PAFbT140703 124 PAFbT14140801 Nông Thị N 125 AFbT140802 126 PAFbT14140910 Chu Thị M 127 AFbT140916 128 PAFbT140917 129 AFbT141005 130 PAFbT141006 131 PAFbT14141007 132 PAFbT141009 133 AFbT141205 134 PAFbT141206 135 AFbT140408 136 PAFbT150106 137 AFbT150203 138 AFbT150302 139 AFbT150308 140 AFbT150309 141 AFbT150310 142 AFbT150311 143 AFbT150312

54 55 58 56 67 67 69 62 61 64 65 66 68 56 58 59 52 67 65 56 58 54 55 58 56 67 66 68 56 58 59 52 67 58 59 70 54

1.9 1.8 1.8 2 1.8 1.8 1.9 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 1.8 1.9 1.9 1.8 1.8 2 1.8 2 2 1.9 1.8 1.9 2 2 1.9 2 2 1.9

1 1

1 1 1

1 1

1 1 1

1 1 1 1 1 1

1 1

1 2 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 2 2 0 0 0 0 1 2 1 2 1 2 2 2 0 0 2 2 1 0 1 1 1

144 AFbT150409 145 PAFbT150608 146 AFbT150802 147 AFbT151009 148 AFbT151201 149 PAFbT150202 150 PAFbT150502 151 AFbT150702 152 AFbT150902 153 AFbT151102 154 PAFbT151202 155 AFbT160101 156 AFbT160205 157 AFbT160305 158 AFbT160402 159 AFbT160402 160 AFbT160704 161 AFbT160803 162 AFbT160404 163 AFbT160703 164 AFbT160706 165 AFbT161101 166 AFbT161103 167 AFbT161209 168 AFbT171310 169 AFbT181411 170 AFbT191412 171 AFbT142315 172 AFbT142216 173 AFbT142217 174 AFbT141218 175 AFbT161219 176 AFbT121059 177 AFbT121060 178 AFbT121061

Kha Thị H Lê Thị N Hoàng Thị Nh Trần Thị O Lèo Tố Ng Chu Thị Hồng N Tòng Thị T Dương PHương T Phạm Thị N Hoàng Thị Hồng Phùng Thị Ng Phạm Thị Ng Mạc Thị Thu N Nông Thị N Ngô Thi Th Nguyễn Thị T Nguyễn Thị C Hà Thị Thi Diệp Thị M Hoàng Thị H Triệu Thị L Lò Thi T Dương Thị Đ Nguyễn Thị Hoa M Đỗ Thị T Hoàng Thị H Nguyễn Thị C Đỗ Diệu Th Dương Thị H Dương Thanh H Nguyễn Thanh Tr La Thị V Lã Phương Ng Hà Thị Bích Th Nguyễn Phương D

55 58 56 67 69 62 61 64 56 58 67 65 58 54 56 67 67 61 64 68 56 67 65 56 58 58 56 56 58 59 58 59 55 58 67

1.8 1.8 2 1.8 1.9 2 1.9 1.8 1.9 1.8 2 1.9 1.9 1.9 2 1.8 1.8 1.9 1.8 2 1.9 2 1.9 1.8 1.9 1.8 2 1.9 1.8 1.9 1.9 2 1.8 1.8 1.8

Chú giải: 0: thai nhi không bị đột biến, 1: thai nhi bị 1 đột biến, 2: thai nhi bị 2 đột biến

Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương

Mục tiêu của luận án là phát hiện đặc điểm đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia và người mang đột biến dị hợp tử bằng các kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMSPCR và giải trình tự gen Sanger;...

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÝ THỊ THANH HÀ

LÝ THỊ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN

TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN

NHI TRUNG ƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

L LÝ THỊ THANH HÀ

THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN

TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN

NHI TRUNG ƯƠNG

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trần Vân Khánh

2. GS.TS. Trương Nam Hải

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường

Bảng 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường

Hình 1.2. Sơ đồ cơ chế bệnh sinh trong Thalassemia

Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh  thalassemia.

Triệu chứng

Công thức máu

Hb

Điện di huyết

Kiểu gen

lâm sàng

sắc tô

Hình 1.3. Cấu trúc và quá trình tổng hợp chuỗi β globin

Bảng 1.3. Kiểu hình, kiểu gen bệnh  thalassemia

Kiểu hình

Lâm sàng

Kiểu gen 0/ hoặc +/

Bảng 1.4. Các kĩ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong phát hiện

đột biến gen gây bệnh  thalassemia.

. ĐỘT BIẾN ĐÃ BIẾT

RFLP (restriction fragment length polymorphism analysis) A-RFLP (artificial-restriction fragment length polymorphism) ASO (allele specific oligonucleotide) ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN ĐÃ BIẾT

ĐỘT BIẾN CHƯA BIẾT

Hình 1.4. Nguyên lý kĩ thuật ARMS-PCR

Hình 1.5. Thủ thuật chọc ối trong chẩn đoán trước sinh.

Hình 1.6. Thủ thuật lấy bệnh phẩm trong chẩn đoán trước sinh

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH  THALASSEMIA TẠI VIỆT NAM

Bảng 1.5. Tình hình mang gen bệnh  thalassemia tại Việt Nam

Nghiên cứu

Địa phương

Dân tộc

Tỷ lệ mang gen bệnh (cid:0) thalassemia

Số nghiên cứu

Bảng 1.6. Tỉ lệ các loại đột biến  thalassemia ở người Việt Nam.

Nghiên cứu

Tổng số

Đột biến

Alen

Tỉ lệ (%)

(n = 120)

CHƯƠNG 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Nhóm bệnh nhân bị bệnh  thalassemia thể nặng

2.2.2. Nhóm người mang gen bệnh  thalassemia

Bảng 2.1. Tên và trình tự mồi sử dụng trong quy trình xác định 09 đột biến

trên gen β globin

Hình 2.1. Quy trình xác định đột biến gen  globin

Bảng 2.2. Các bước sàng lọc trên gene β globin

Loại đột biến

Mồi đặc hiệu Mồi chung