Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần Alkaloid, Flavonoid của lá, tâm sen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID

CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

TP Hồ Chí Minh – Năm 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID

CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM

Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

Mã số: 62.72.04.10

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. TRẦN HÙNG

2. PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN

TP Hồ Chí Minh – Năm 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả được

trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công

trình nào khác.

Người cam đoan,

Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC .................................................................................................................. i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................... iii

DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... v

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ ................................................... viii

MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4

1.1. Thực vật học về Sen ............................................................................................ 4

1.2. Hóa học về Sen .................................................................................................... 7

1.3. Chiết xuất- phân lập các alkaloid, flavonoid trong lá và tâm Sen ..................... 12

1.4. Các phương pháp phân tích thành phần alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen . 16

1.5. Tác dụng sinh học của lá, tâm Sen ..................................................................... 19

1.6. Công dụng của Sen ............................................................................................. 21

1.7. Chất đối chiếu ................................................................................................... 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 25

2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................ 25

2.2. Nguyên vật liệu – Dung môi, hóa chất, thuốc thử – Trang thiết bị ................... 25

2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................... 28

2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................. 47

3.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen .... 47

3.1.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá và tâm Sen .................................. 47

3.1.2. Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen ...................... 48

3.1.3. Phân lập alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen ................................................. 48

3.1.4. Xác định độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen ...... 60

3.1.5. Xác định cấu trúc các chất phân lập được ....................................................... 61

3.2. Thiết lập một số chất đối chiếu alkaloid, flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen ..... 80

3.3. Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid

có trong lá và tâm Sen ............................................................................................... 85

3.4. Ứng dụng các qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid,

flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen ....... 104

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .................................................................................... 108

4.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc cấu trúc các alkaloid, flavonoid phân lập

từ lá và tâm Sen ....................................................................................................... 108

4.2. Qui trình định tính, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có trong

lá và tâm Sen ........................................................................................................... 117

4.3. Ứng dụng qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid, flavonoid

có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm từ lá, tâm Sen ..................................... 124

4.4. Đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen ................................................................ 127

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitrile

ASEAN Association of Southeast Asian Nations

(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á)

Chất đối chiếu CĐC

Capillary electrophoresis (Điện di mao quản) CE

Corr Area Corrected Area (Diện tích pic được chuẩn hóa)

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

Capillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng) CZE

doublet (đỉnh đôi) d

Dấu vân tay DVT

DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ IV

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DEPT

Differential Scanning Calorimetry (Quét nhiệt vi sai) DSC

DMSO Dimethylsulfoxide

ĐDĐ Điện di đồ

DTAB Dodecyltrimethylammonium bromide

Electrospray Ionization (Ion hóa phun mù electron) ESI

Electro-osmotic flow (Dòng điện thẩm) EOF

FCPC Fast centrifugal partition chromatography (Sắc ký phân bố

ly tâm nhanh)

GLP Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng

hiệu năng cao)

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

ICH International Conference on Harmonization

IR Infrared (Hồng ngoại)

i-ProOH Isopropanol

J Coupling constant (Hằng số ghép)

LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry

(Sắc ký lỏng ghép khối phổ)

LDL Low density lipoprotein

LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantitation

MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 (Tế bào ung thư vú dòng MCF-7)

MS Mass Spectrometry (Khối phổ)

NACE Non aqueous capillary electrophoresis

Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) NMR

Photo Diode Array (Dãy diod quang) PDA

Petroleum ether (ether dầu hỏa) PE

PCRS Primary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học sơ cấp)

Phòng thí nghiệm PTN

Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) RSD

singlet (Đỉnh đơn) s

Sắc ký đồ SKĐ

Secondary Chemical Reference Standard SCRS

(Chất đối chiếu hóa học thứ cấp)

Sodium Dodecyl Sulfate SDS

Supercritical Fluid Extraction (Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn) SFE

SKLM Sắc ký lớp mỏng

Triethylamin TEA

Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng) TGA

Tetrahydrofuran THF

Tài liệu tham khảo TLTK

Thuốc thử TT

UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến)

VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Nelumbo .................................................................... 4

Bảng 1.2. Các alkaloid khung aporphin có trong lá Sen ............................................ 8

Bảng 1.3. Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong lá Sen .............................. 8

Bảng 1.4. Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong tâm Sen ......................... 10

Bảng 1.5. Các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có trong tâm Sen .................... 11

Bảng 1.6. Tóm tắt các nghiên cứu phân lập alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen ........... 12

Bảng 1.7. Tóm tắt các nghiên cứu định lượng alkaloid, flavonoid lá và tâm Sen............ 16

Bảng 2.1. Nơi thu hái nguyên liệu lá và tâm Sen loài Nelumbo nucifera G. ........... 26

Bảng 2.2. Nơi thu hái nguyên liệu lá Sen loài N. Lutea Willd và Victoria regia. ........ 26

Bảng 2.3. Các chế phẩm có chứa lá và tâm Sen. ...................................................... 26

Bảng 2.4. Khảo sát dung môi chiết alkaloid, flavonoid từ lá, tâm Sen. ................... 30

Bảng 2.5. Điều kiện tiến hành VLC phân đoạn A2 và tủa F từ lá Sen. .................... 33

Bảng 2.6. Điều kiện tiến hành sắc ký cột cao A3, cao N lá Sen. ............................. 34

Bảng 2.7. Điều kiện tiến hành sắc ký cột phân đoạn NP5, NP8, cao EF tâm Sen ... 34

Bảng 2.8. Điều kiện tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 phân đoạn F1, F6, F8 . 35

Bảng 2.9. Các điều kiện dung môi hai pha không đồng tan dự kiến thăm dò cho

FCPC phân đoạn P-2 ................................................................................................. 36

Bảng 3.1. Kết quả chiết cắn toàn phần từ lá, tâm Sen .............................................. 47

Bảng 3.2. Kết quả chiết alkaloid, flavonoid toàn phần từ lá, tâm Sen ..................... 47

Bảng 3.3. Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen ................ 48

Bảng 3.4. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A2, lá Sen. .................................... 50

Bảng 3.5. Kết quả thu hứng LN-1 từ phân đoạn A2-1 ............................................. 50

Bảng 3.6. Kết quả thu hứng LN-2, LN-8 từ phân đoạn A2-2 ................................. 50

Bảng 3.7. Kết quả thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3 .................................. 51

Bảng 3.8. Kết quả thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8 ............................................. 51

Bảng 3.9. Kết quả thu hứng LN-6, LN-7 từ phân đoạn A2-6 .................................. 51

Bảng 3.10. Kết quả thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11 và A2-12 ......................... 52

Bảng 3.11. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A3 lá Sen .................................... 52

Bảng 3.12. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao N lá Sen ...................................... 52

Bảng 3.13. Kết quả sắc ký cột silica gel trên tủa F, lá Sen ....................................... 53

Bảng 3.14. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F1 .............................................. 53

Bảng 3.15. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-2,3 .......................................... 54

Bảng 3.16. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-7 ............................................. 54

Bảng 3.17. Kết quả thu hứng LF-2 và LF-4 từ F7-3 ................................................ 54

Bảng 3.18. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F8 .............................................. 54

Bảng 3.19. Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen .............. 55

Bảng 3.20. Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP5, tâm Sen ................... 57

Bảng 3.21. Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP8, tâm Sen ................... 57

Bảng 3.22. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn P ............................................... 58

Bảng 3.23. Kết quả FCPC phân đoạn P-2 ................................................................ 58

Bảng 3.24. Kết quả Sephadex LH-20 của phân đoạn n-Bu ..................................... 58

Bảng 3.25. Kết quả các phân đoạn sau SPE từ n-Bu II ............................................ 59

Bảng 3.26. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao EF, tâm Sen ................................ 59

Bảng 3.27. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn EF-8, tâm Sen ........................... 59

Bảng 3.28. Độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen ........... 60

Bảng 3.29. Dữ liệu phổ UV, MS của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 .............................. 61

Bảng 3.30. Dữ liệu phổ 13C- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 ........................... 61

Bảng 3.31. Dữ liệu phổ 1H- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 ............................ 62

Bảng 3.32. Dữ liệu phổ 13C và 1H-NMR của LN-5 .................................................. 63

Bảng 3.33. Dữ liệu phổ UV, MS của LN-8, LN-9 ................................................... 64

Bảng 3.34. Dữ liệu phổ 13C và 1H- NMR của LN-8, LN-9. ..................................... 64

Bảng 3.35. Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-1, EN-2, EN-3................................... 65

Bảng 3.36. Dữ liệu phổ 13C và 1H- NMR của EN-1, EN-2, EN-3. ......................... 66

Bảng 3.37. Dữ liệu phổ UV, IR, MS của các alkaloid EN-4, EN-5 ......................... 67

Bảng 3.38. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-4 ................................................ 67

Bảng 3.39. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-5 ................................................. 69

Bảng 3.40. Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 ........................ 74

Bảng 3.41. Dữ liệu phổ 13C-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 ............................ 75

vii

Bảng 3.42. Dữ liệu phổ 1H-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 ............................. 75

Bảng 3.43. Dữ liệu phổ UV, MS của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 ..................... 76

Bảng 3.44. Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 .................... 76

Bảng 3.45. Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 .................... 77

Bảng 3.46. Dữ liệu phổ UV, MS của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 ............ 78

Bảng 3.47. Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 .......... 78

Bảng 3.48. Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 ........... 79

Bảng 3.49. Kết quả khảo sát hàm ẩm bằng phương pháp TGA và nhiệt độ

nóng chảy, độ tinh khiết bằng phương pháp DSC (n=3) .......................................... 81

Bảng 3.50. Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết

HPLC-PDA của 06 CĐC .......................................................................................... 82

Bảng 3.51. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC

của 06 CĐC ............................................................................................................... 82

Bảng 3.52. Kết quả xác định miền giá trị, độ đúng, độ chính xác của qui trình

phân tích các nguyên liệu thiết lập CĐC ................................................................... 82

Bảng 3.53. Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký các nguyên liệu thiết lập CĐC ... 83

Bảng 3.54. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử của các CĐC ............... 84

Bảng 3.55. Kết quả đánh giá đồng nhất lô của quá trình đóng lọ các CĐC ............. 84

Bảng 3.56. Kết quả đánh giá liên PTN của các nguyên liệu thiết lập CĐC ............. 85

Bảng 3.57. Kết quả xác định giá trị ấn định của các CĐC sau khi đóng gói ........... 85

Bảng 3.58 Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian,

độ đúng qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong mẫu nguyên liệu lá sen

(NN-1a) bằng phương pháp CE-PDA/MS ................................................................. 90

Bảng 3.58. Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong

lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM .................................................................... 100

Bảng 3.59. Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong

lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM .................................................................... 101

Bảng 3.60. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC-PDA ................... 102

viii

Bảng 3.61. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC/PDA ................. 102

Bảng 3.62. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA ................ 103

Bảng 3.63. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC/PDA .............. 103

Bảng 3.64. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE/PDA ...................... 104

Bảng 3.65. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE/PDA ................... 104

Bảng 3.66. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS .................. 104

Bảng 3.67. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS .............. 105

Bảng 3.68. Kết quả xác định hàm lượng các alkaloid (mg/100 mg) có trong mẫu

nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera; Nelumbo lutea và Victoria regia bằng

phương pháp CE-PDA/MS và HPLC-PDA ............................................................ 106

Bảng 3.69. Kết quả xác định hàm lượng của các alkaloid (mg/100 mg) có trong

07 mẫu chế phẩm từ lá Sen loài N. nucifera bằng phương pháp CE-PDA/MS và

HPLC-PDA ............................................................................................................. 106

Bảng 3.70. Kết quả xác định hàm lượng các flavonoid (mg/100mg) có trong mẫu

nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera; Nelumbo lutea và Victoria regia bằng

phương pháp CE-PDA và HPLC-PDA ................................................................... 107

Bảng 3.71. Kết quả xác định hàm lượng của các flavonoid (mg/100 mg) có trong

06 mẫu chế phẩm từ lá Sen loài N. nucifera bằng phương pháp CE-PDA và

HPLC-PDA ............................................................................................................. 107

Bảng 4.1. Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 05 alkaloid

LN-1, LN-2, LN-3, LN-4, LN-5 ............................................................................ 114

Bảng 4.2. Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 05 alkaloid

EN-1, EN-2, EN-3, EN-4, EN-5 ............................................................................ 115

Bảng 4.3. Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 04 alkaloid

EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 ....................................................................................... 116

Bảng 4.4. Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 02 alkaloid

LN-9, LN-10 ........................................................................................................... 117

Bảng 4.5. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong

lá Sen (N. nucifera) Việt Nam................................................................................. 127

Bảng 4.6. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong

tâm Sen (N. nucifera) Việt Nam ............................................................................. 127

Bảng 4.7. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất

có trong lá Sen (N. nucifera) Việt Nam .................................................................. 127

Bảng 4.8. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất có

trong tâm Sen (N. nucifera) Việt Nam .................................................................... 127

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh loài Sen hồng và Sen trắng .............................................................. 4

Hình 3.1. SKLM của 09 alkaloid phân lập từ lá Sen ................................................ 49

Hình 3.2. SKLM của cao A1, A2, A3 lá Sen ........................................................... 49

Hình 3.3. SKĐ 06 lần tiêm mẫu thu hứng LN2, LN8 .............................................. 51

Hình 3.4. SKLM 08 flavonoid phân lập từ lá Sen .................................................... 53

Hình 3.5. SKLM các alkaloid phân lập từ tâm Sen .................................................. 56

Hình 3.6. SKLM các phân đoạn NP5, NP8, P tâm Sen............................................ 56

Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 ...................................... 62

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của LN-5 ....................................... 63

Hình 3.9. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của LN-8, LN-9 ............................ 65

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của EN-1, EN-2, EN-3 ............................................... 67

Hình 3.11. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-4 ..................................... 69

Hình 3.12. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-5 ..................................... 70

Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 .................................... 75

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học của LF-1, LF-5, LF-6, LF-7, LF-8, TF-1 ................... 77

Hình 3.15. Cấu trúc hóa học của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 ................... 79

Hình 3.16. Điện di đồ của hỗn hợp chuẩn 07 alkaloid và mẫu thử dịch chiết

toàn phần alkaloid lá sen ở điều kiện thích hợp ........................................................ 87

Hình 3.17. Điện di đồ CE-MS của mẫu hỗn hợp chuẩn 07 alkaloid (TIC) và mẫu

thử lá Sen NN-1a (TIC/EIC) ở điều kiện thích hợp................................................... 87

thử lá Sen, tương ứng điện di đồ CE-MS ....................................................................... 89

Hình 3.18. Phổ MS của nuciferin, 2-O-nornuciferin, norarmepavin, armepavin trong mẫu

Hình 3.19. Kiểm tra độ tinh khiết pic pronuciferin .................................................. 90

alkaloid và mẫu thử thêm hỗn hợp chuẩn ...................................................................... 90

Hình 3.20. Điện di đồ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần lá Sen, hỗn hợp 07 chuẩn

Hình 3.21. Điện di đồ mẫu hỗn hợp chuẩn 08 flavonoid và mẫu thử dịch chiết

flavonoid toàn phần lá Sen ........................................................................................ 91

Hình 3.22. SKĐ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần lá Sen, hỗn hợp 04 chuẩn

alkaloid ở điều kiện sắc ký thích hợp ........................................................................ 92

mẫu thử lá Sen (d), mẫu thử thêm chuẩn (e). ................................................................. 93

Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu pha động (a), mẫu hỗn hợp chuẩn (b), dung môi pha mẫu (c),

mẫu thử thêm chuẩn và kiểm tra độ tinh khiết pic nuciferin ........................................ 93

Hình 3.24. Phổ UV-Vis của nuciferin trong (1) mẫu chuẩn, (2) mẫu thử lá Sen, (3)

Hình 3.25. SKĐ hỗn hợp 06 chuẩn flavonoid (1), mẫu thử dịch chiết flavonoid

toàn phần lá Sen (2), ở điều kiện sắc ký thích hợp ................................................... 94

Hình 3.26. Điện di đồ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần tâm Sen, hỗn hợp 09

chuẩn alkaloid ở điều kiện điện di thích hợp ............................................................ 95

Hình 3.27. Điện di đồ CE-MS của mẫu hỗn hợp chuẩn 09 alkaloid (TIC) và mẫu

thử tâm Sen NN-1a (TIC/EIC) ở điều kiện điện di thích hợp ................................... 96

pronuciferin trong mẫu thử tâm Sen, tương ứng điện di đồ CE-MS ................................. 97

Hình 3.28. Phổ MS của isoliensinin N2’-oxyd, isoliensinin N2-oxyd, isoliensinin,

Hình 3.29. Điện di đồ mẫu thử dịch chiết flavonoid toàn phần tâm Sen, hỗn hợp 06

chuẩn flavonoid ở điều kiện điện di thích hợp .......................................................... 98

phần tâm Sen ở điều kiện sắc ký thích hợp .................................................................... 99

Hình 3.30. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp 07 chuẩn alkaloid và mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn

toàn phần tâm Sen ở điều kiện sắc ký thích hợp ........................................................... 100

Hình 3.31. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp 06 chuẩn flavonoid và mẫu thử dịch chiết flavonoid

xii

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ trình tự các nội dung nghiên cứu ................................................... 29

Sơ đồ 2.2. Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid từ lá Sen

bằng chiết phân bố lỏng-lỏng .................................................................................... 31

Sơ đồ 2.3. Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid từ

tâm Sen bằng chiết phân bố lỏng-lỏng ...................................................................... 32

Sơ đồ 2.4. Chiết xuất cao N từ cắn B bằng phương pháp tạo tủa với TT Bertrand .. 33

Sơ đồ 3.2. Qui trình chiết alkaloid toàn phần mẫu nguyên liệu lá Sen .................... 87 Sơ đồ 3.3. Qui trình chiết flavonoid toàn phần mẫu nguyên liệu lá Sen .................. 91

MỞ ĐẦU

Có nhiều con đường để tạo ra thuốc phục vụ điều trị và chăm sóc sức khỏe

con người, trong đó các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên là một lĩnh vực được các

nhà nghiên cứu phát triển dược phẩm trên thế giới quan tâm, nghiên cứu bởi

nhiều lợi thế của chúng. Có nhiều cách tiếp cận trong phát triển thuốc có nguồn gốc

tự nhiên. Đó là phát hiện các hoạt chất và phát triển chúng theo các tiêu chuẩn của

dược phẩm hiện đại phương tây và chứng minh tác dụng của dược liệu, bài thuốc

của y học cổ truyền như là một thể thống nhất như nó vốn có và dùng các kỹ thuật

hiện đại để đảm bảo, nâng cao hiệu quả điều trị của chúng. Với xu hướng này,

những cây thuốc lâu nay được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, trong y học cổ

truyền, bên cạnh việc được đánh giá tác dụng trị liệu, đang rất được quan tâm

nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các phương pháp theo dõi, đánh giá

thành phần, hàm lượng các chất chính, để có thể đánh giá, đảm bảo chất lượng, tiêu

chuẩn hóa cho các sản phẩm, sử dụng trong chăm sóc sức khỏe một cách an toàn,

hiệu quả và khoa học.

Việt Nam được thiên nhiên ban tặng một thảm thực vật xanh rộng khắp trên

mọi miền đất nước, là điều kiện rất thuận lợi trong việc nghiên cứu và phát triển các

thuốc có nguồn gốc dược thảo. Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam, cây Sen

(Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbonaceae) đã gắn liền với cuộc sống tâm linh

cũng như thường nhật của người Việt. Sen tượng trưng cho sự tinh khiết và trường

thọ, nhưng cũng hết sức bình dị và hữu dụng trong cuộc sống hàng ngày. Sen có ở

khắp mọi miền đất nước, nhưng phổ biến nhất có lẽ ở vùng Miền tây Nam bộ mà

nổi tiếng nhất là ở Đồng Tháp Mười, nơi được xem là xứ sở Sen. Sen là một trong

số ít các dược thảo mà tất cả các bộ phận đều được sử dụng và đều là những vị

thuốc quí, có giá trị. Danh y Hải Thượng Lãn Ông đã viết: “Cây mọc từ dưới bùn

đen mà không ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm trong lành của trời đất nên củ, lá,

hoa, tua, vỏ quả, ruột đều là thuốc hay”. Từ xưa nhân dân ta đã biết dùng ngó Sen,

quả Sen làm thực phẩm. Lá Sen, tâm Sen, gương Sen, nhị Sen dùng làm thuốc cổ

truyền để điều trị mất ngủ, hồi hộp, cao huyết áp, tiêu chảy mãn tính, cảm nắng, béo

phì, di tinh, cầm máu[1],[3],[8].

Các nghiên cứu dược lý đã chứng minh dịch chiết lá Sen có nhiều hoạt tính

sinh học in vivo như: an thần [45], chống béo phì [66], [103], , giảm cholesterol

trong máu [33], [38], [78], chống oxy hóa [27],[70], hạ đường huyết [25],[65], chống lại sự

phát triển của tế bào ung thư [64]…Dịch chiết tâm Sen có hoạt tính an thần [104],

hạ đường huyết[25],[96], hạ huyết áp[88], chống loạn nhịp tim [30],[108], ức chế kết tập

. Các hoạt tính sinh học này ít nhiều đều liên quan đến

tiểu cầu [100], kháng HIV [99]

sự hiện diện của thành phần alkaloid và flavonoid có trong lá, tâm Sen.

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học chiết tách và phân tích, trên thế giới đã có

những công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và phân tích định tính,

định lượng một số thành phần alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen. Trong lĩnh vực

phân tích cũng đã có một vài nghiên cứu của các tác giả Trung quốc và Ấn độ ứng

dụng phương pháp HPLC, CE để định lượng một vài chất trong số các thành phần

chính của Sen trong dược liệu, chế phẩm hay dịch sinh học.

Tại Việt Nam hiện nay, việc sử dụng lá, tâm Sen trong điều trị bệnh ngày càng

trở nên phổ biến. Thế nhưng các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học,

cũng như các phương pháp định tính, định lượng các chất chính có trong lá, tâm Sen

bằng các phương pháp phân tích hóa lý hiện còn rất hạn chế. Do đó, việc nghiên

cứu thành phần hóa học alkaloid, flavonoid và thiết lập các chất đối chiếu phục vụ

cho việc định tính, định lượng alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong lá, tâm

Sen Việt Nam là một việc làm cấp thiết.

Với những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để

phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm Sen và các chế phẩm”

được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:

1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen

bằng phương pháp sắc ký và phổ nghiệm.

2. Thiết lập và xây dựng tiêu chuẩn một số alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học

để dùng làm chất đối chiếu phục vụ cho công tác kiểm nghiệm.

3. Xây dựng các qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời các alkaloid,

flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng các phương pháp HPLC và CE.

4. Áp dụng các phương pháp đã xây dựng để định tính, đánh giá thành phần,

hàm lượng các alkaloid và flavonoid trong lá, tâm Sen được thu hái từ các tỉnh,

thành khác nhau và trong chế phẩm từ Sen có trên thị trường.

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. THỰC VẬT HỌC VỀ SEN

1.1.1. Chi Nelumbo và vị trí phân loại của chi

Chi Nelumbo thuộc họ Sen- Nelumbonaceae trước đây được xếp cùng với

họ Súng- Nymphaeaceae. Tuy nhiên, ngày nay được tách ra riêng thành họ Sen,

với một chi duy nhất là Nelumbo với hai loài Nelumbo nucifera Gaertn. (Sen hồng,

phổ biến ở Việt Nam và một số nước Châu Á như Trung quốc, Ấn độ, Srilanka,

Nhật Bản, Thái Lan, Úc) và Nelumbo lutea Willd (Sen trắng, phổ biến ở

Đông Bắc Mỹ )[1],[8].

Theo hệ thống phân loại APG II năm 2003 và của Amen Takhtajan năm 2009 [14],

vị trí phân loại của chi Nelumbo được trình bày trong Bảng 1.1.

Phân giới Ngành Lớp

Phân lớp Liên bộ Bộ Họ Chi

Cormobionta (Thực vật bậc cao) Magnoliophyta (Ngành Ngọc Lan) Magnoliopsida (Lớp Ngọc Lan) Ranunculidae (Phân lớp Sen) Proteanae Nelumbonales (Bộ Sen) Nelumbonaceae Nelumbo

Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Nelumbo

1.1.2. Cây Sen - Nelumbo nucifera

Loài Sen Nelumbo nucifera Gaertn. có một số đồng danh khác là: Nelumbium

nelumbo (L.) Druce, Nelumbium nuciferum Gaertn, Nelumbium speciosum Willd.

Trong tiếng Việt, Sen còn được biết với tên là Sen hồng, Liên. Trong tiếng Anh,

Sen được gọi với tên thông dụng nhất là lotus nhưng còn được biết với các tên khác

như Chinese water - lily, Indian lotus, Egypian bean.[3]

Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbo lutea Willd.

Hình 1.1. Hình ảnh loài Sen hồng và Sen trắng (nguồn: Wikipedia)

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Cây thân rễ mang củ mọc khá sâu trong đáy hồ, sống nhiều năm. Thân rễ hình trụ

mọc bò lan trong bùn thường gọi là ngó Sen, có ngăn ngang; thân và cuống lá

có bộng to dài. Lá (liên diệp) hình tròn, hình khiên to, có cuống dài vươn lên khỏi

mặt nước, cuống có thể dài 0,5 tới 1,5 hay 2 m. Phiến lá có dạng đĩa, với mép lượn

sóng, màu lục hoặc xanh lục, thường có lớp sáp rộng trên bề mặt, rộng 20 – 80 cm

có gai nhỏ, đính ở giữa phiến lá, mép lá uốn lượn. Hoa rất đẹp, rộng tới 20 – 30 cm,

màu hồng tím, trắng có mùi thơm. Hoa đều, lưỡng tính. Lá đài 4 - 5, cánh hoa nhiều,

hướng lên và trải ra, nhị nhiều bao phấn hai ô, nứt theo kẽ dọc. Nhiều lá noãn chứa

trong một đế hoa loe ra thành hình nón ngược gọi là gương Sen, mỗi lá noãn có

1-2 tiểu noãn. Quả bế màu xanh hình bầu dục, rời nằm sâu trên gương Sen chứa

15 - 25 quả bế, chứa một hạt không nội nhũ.

Hạt màu trắng, dài 1,3 - 1,5 cm, phần ngoài mỏng và cứng, màu lục tía, phần giữa

mềm chứa tinh bột màu trắng ngà và bên trong là lá mầm dầy có màu xanh sẫm

(tâm Sen). Tâm Sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá đầu tiên; rễ mầm

không rõ; thân mầm màu xanh, dài 3 - 4 mm, tiết diện bầu dục, nhẵn bóng, 2 lá

đầu tiên, 1 to, 1 nhỏ, cuống lá mầm màu xanh, hình móc câu, tiết diện đa giác, dài

1,8 - 2 cm, phiến lá mầm hai mép cuộn vào giữa tạo thành một đoạn dài 6-7 mm.

Các loài trong chi Nelumbo có hoa giống với các loài hoa Súng trong họ

Nymphaeaceae (họ Súng). Tuy nhiên, lá của các loài Sen có thể phân biệt được với

lá của các loài trong họ Súng do có hình khiên (lá tròn), trong khi đó Nymphaeaceae

có vết khía hình chữ V đặc trưng từ mép lá vào tâm của lá. Quả ở trung tâm

chứa hạt của các loài cũng có đặc trưng phân biệt và được gọi là bát Sen [1],[3],[7],[8].

1.1.2.2. Sinh thái - phân bố

Trong thời kỳ cổ đại, Sen đã từng là loại cây mọc phổ biến dọc theo bờ sông Nile ở

Ai Cập cùng với một loài hoa súng có quan hệ họ hàng gần gũi có tên gọi dài dòng

là hoa Sen xanh linh thiêng sông Nile (Nymphaea caerulea). Từ Ai Cập, Sen đã

được đem đến vùng lãnh thổ Assyria và sau đó được trồng rộng rãi khắp các vùng

Ba Tư, Ấn Độ và Trung Quốc.

Hiện nay, Sen được phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á, Úc và Châu Mỹ,

hiếm hoặc đã tuyệt chủng tại Châu Phi. Do ưa khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt

đới, nên Sen cũng được trồng nhiều ở hầu hết các nước khu vực

Đông Nam Á đến Nam Á như: Campuchia, Thái Lan, Malysia, Ấn Độ và các tỉnh

phía nam Trung Quốc [3].

Ở Việt Nam, chỉ có một loài mọc hoang dại chủ yếu ở vùng Đồng Tháp Mười thuộc

tỉnh Đồng Tháp và An Giang. Theo nhân dân địa phương cây Sen mọc trong trạng

thái tự nhiên đã có từ lâu đời. Bên cạnh quần thể hoang dại, Sen cũng là cây trồng

quen thuộc ở các tỉnh đồng bằng và trung du, suốt từ Nam đến Bắc, dùng làm thuốc,

thức ăn và làm cảnh. Sen được trồng nhiều nhất ở Đồng Tháp. Mùa hoa: tháng 5 - 6,

mùa quả: tháng 7 – 9 [8].

1.1.2.3. Đặc điểm vi học

Lá: Biểu bì trên gồm một lớp tế bào hình chữ nhật nhỏ, mặt ngoài có núm lồi lên,

có lỗ khí. Biểu bì dưới giống biểu bì trên, nhưng tế bào dài hơn, vách hóa mô cứng,

cutin dày. Mô mềm giậu có một lớp tế bào xếp sát biểu bì trên, chạy từ phiến lá

xuyên qua gân giữa. Mô dày góc gồm nhiều tế bào đa giác gần tròn, xếp thành đám

sát biểu bì dưới. Ở giữa gân có 2 bó libe gỗ to, những bó libe gỗ nhỏ xếp rải rác

xung quanh. Mỗi bó libe gỗ có sợi bao bọc, gỗ phía trên, libe phía dưới, bao quanh

là 1- 2 lớp tế bào hình đa giác, kích thước nhỏ, hóa mô cứng thành vòng [7].

Bột dược liệu

Bột lá Sen: có màu lục nhạt, soi kính hiển vi quan sát thấy các đặc điểm sau [6]:

Mảnh biểu bì trên gồm nhiều tế bào hình nhiều cạnh, kích thước không đều, màng ít

ngoằn ngoèo, mang lỗ khí ở dạng biến thiên. Màng phía ngoài biểu bì có nhiều núm

lồi lên. Núm nhìn phía dưới mặt là những vòng tròn nhò, rải rác có những núm bị

tách khỏi biểu bì, hình ba cạnh hay hình chuông. Mảnh biểu bì dưới gồm tế bào

màng ngoằn ngoèo. Sợi màng hơi dày, khoang rộng kèm mảnh mạch. Mảnh mạch

vạch, mạch xoắn, mạch mạng. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai, đường kính 20- 36

µm. Mô mềm chứa diệp lục. Bột tâm Sen: Bột màu vàng xanh, mảnh mô mềm chứa

hạt tinh bột. Hạt tinh bột hình cầu hoặc hình trứng, đường kính 4- 6 µm [2],[7].

1.1.2.4. Bộ phận dùng – thu hái và chế biến

Tất cả các bộ phận dùng của cây Sen đều có giá trị sinh học cao, được dùng làm

thuốc trong y học cổ truyền và được đưa vào Dược điển một số nước [7],[8]

Lá Sen (Folium Nelumbinis): lá bánh tẻ, thu hái vào mùa thu, bỏ cuống,

phơi khô. Quả (Fructus Nelumbinis): thu hái lúc quả chín (liên thạch), hạt còn màng

đỏ bên ngoài (liên nhục). Tâm Sen (Plumula Nelumbinis): chồi mầm trong hạt Sen

(liên tâm). Gương Sen (Receptaculum Nelumbinis): đã lấy quả đem phơi khô

(liên phòng). Tua Sen (Stamen Nelumbinis): bỏ hạt gạo ở đầu, phơi khô (liên tu).

Thân rễ (Nodus Nelumbinis rhizomatis) còn gọi là liên ngẫu hay ngó Sen,

thu hái quanh năm.

1.2. HÓA HỌC VỀ SEN

1.2.1. Hóa học của lá Sen

Lá Sen chứa nhiều hợp chất khác nhau trong đó nhóm alkaloid và flavonoid được

xem là hai thành phần chính chiếm tỉ lệ tương đối lớn và cho tác dụng sinh học

chủ yếu. Ngoài ra, các hợp chất khác như: tanin, saponin, đường khử, các acid

hữu cơ (acid palmitic, acid citric, acid tartric, acid succinic, acid ascorbic,…),

các terpen steroid (β-sitostenon, stigmasta-4,22-dien-3-on,…), các tinh dầu

trans-caryophyllen, trans-isolimonen, 4-methyl-1-isopropyl-3-cyclohexen-1-ol,

camphor, 2-acetylen-1-alcohol, chất béo, sáp, chất nhày cũng được tìm thấy trong

lá Sen. [7], [114],[116]

1.2.1.1. Thành phần alkaloid

Hàm lượng alkaloid toàn phần của lá Sen chiếm từ 0,77 - 0,84% tùy theo điều kiện

khí hậu, thổ nhưỡng. Có khoảng 15 alkaloid đã được xác định. Các alkaloid trong

lá Sen có cấu trúc isoquinolin bao gồm các phân nhóm aporphin, proaporphin,

benzylisoquinolin và bisbenzylisoquinolin.

Alkaloid khung aporphin: các alkaloid có cấu trúc aporphin chiếm phần lớn về tỉ lệ

cũng như số lượng trong alkaloid toàn phần của lá Sen. Các alkaloid đã biết thuộc

nhóm này được trình bày ở Bảng 1.2.

Bảng 1.2. Các alkaloid khung aporphin có trong lá Sen[7], [8],[10], [114], [117]

CTPT

R1

R2

R3

Nuciferin

-CH3 -CH3 -CH3 -H

-CH3 -CH3 -H -CH3

-CH2- -CH2-

-CH3

N-nor-nuciferin O-nor-nuciferin Lirinidin Roemerin Anonain Dehydronuciferin Dehydroroemerin

C19H21NO2 C18H19NO2 C18H19NO2 C18H19NO2 C18H17NO2 C17H15NO2 C19H19NO2 C18H15NO2

-CH2-

-CH3 -H -CH3 -CH3 -CH3 -H -CH3 -CH3

Dehydroanonain

-H

C17H13NO2

-CH2-

Alkaloid khung proaporphin: alkaloid thuộc nhóm này chỉ có một alkaloid là

pronuciferin (C19H21NO3). Chất này có thể chuyển thành nuciferin trong

môi trường acid.[17], [43]

pronuciferin nuciferin

Alkaloid khung benzylisoquinolin: alkaloid thuộc nhóm này trong lá Sen được biết

với 04 alkaloid điển hình là armepavin, N-norarmepavin, N-methyl coclaurin

và N-methyl isococlaurin.

Bảng 1.3. Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong lá Sen [36], [83], [92]

CTPT

R1

R2

R3

C19H23NO2

Armepavin

-CH3

C18H21NO3

N-methyl coclaurin

-H

-CH3

C18H21NO3

N-methyl isococlaurin

-H

-CH3

N-norarmepavin

-H

C18H21NO3

-CH3

Alkaloid khung bisbenzylisoquinolin: alkaloid thuộc nhóm này trong lá Sen được

biết với neferin, isoliensinin với hàm lượng thấp. Cấu trúc hai chất này được trình

bày ở Bảng 1.5[7].

Ngoài ra, trong lá Sen còn có cepharadion B và lysicamin [114].

Liriodenin Lysicamin Cepharadion B

Tính chất của một số alkaloid chính trong lá Sen [114], [116]

Nuciferin: dạng base, là tinh thể hình lăng trụ không màu, tnc: 163-164 oC,

góc quay cực ở 27o là +145 o (c = 0,67 %; EtOH), phát huỳnh quang xanh lục sáng

ở 245 nm. Phổ UV có ba cực đại hấp thu trong dung môi EtOH lần lượt là

311 nm, 271 nm và 232 nm với giá trị logɛ lần lượt là 3,83; 4,32 và 4,36.

N-nornuciferin: dạng base là một chất lỏng như dầu, dạng muối chlorid là tinh thể

không màu, tnc: 156 – 157 oC, góc quay cực ở 27 o là +144 o (c = 0,5 %; EtOH). Phổ

UV có ba cực đại hấp thu trong dung môi EtOH lần lượt là 311 nm, 271 nm, 230

nm với giá trị logɛ lần lượt là 3,67; 4,43 và 4,37.

27= + 20 o (c= 0,2%; MeOH). Phổ UV có ba cực đại hấp thu

N-norarmepavin: kết tinh ở dạng muối oxalat là tinh thể hình kim không màu,

tnc: 209 – 210 o C, αD

trong dung môi EtOH lần lượt là 254 nm, 283 nm, 227 nm.

1.2.1.2. Thành phần flavonoid

Hàm lượng flavonoid toàn phần của lá Sen từ 0,67-0,89 % có khi lên đến

1,64 % tùy theo điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng. Có khoảng 16 flavonoid đã được

xác định trong lá Sen. Flavonoid trong lá Sen thuộc các nhóm flavonol, flavon,

catechin, leucoanthocyanidin, trong đó hàm lượng cao nhất được tìm thấy là

quercetin 3-O-β-D-glucuronid [7], [8]

Nhóm flavonol: Chiếm tỉ lệ lớn trong các flavonoid với hàm lượng nhiều hơn của

các aglycon như: myricetin, quercetin, kaempferol, isorhamnetin và các glycosid

với đường glucosyl, rhamnosyl như: myricetin 3-O-β-D-glucopyranosid, quercitrin,

isoquercitrin, hyperin, rutin, kaempferol 3-O-β-D-glucosepyranosid,

isorhamnetin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl, isorhamnetin 3-O-β-D-glucopyranosid,

isorhamnetin 3-O-α-D-lyxopyranosyl-O-β-D-glucopyranosid.[7], [99], [118], [39]

Nhóm flavon: Các dẫn chất flavon chiếm tỉ lệ nhỏ với hàm lượng thấp của luteolin

và luteolin O-β-D- glucopyranosid. [109]

Nhóm catechin: Các dẫn chất catechin điển hình là catechin. [7], [29], [39]

Nhóm leucoanthocyanidin: Các dẫn chất leucocyanidin điển hình là

leucodelphenidin, leucocyanidin chiếm hàm lượng rất thấp trong lá Sen [7] .

1.2.2. Hóa học của tâm Sen

Hầu hết các nghiên cứu về thành phần hóa học của tâm Sen đều tập trung vào các

alkaloid, là thành phần chính chiếm tỉ lệ lớn và được cho là có nhiều tác dụng sinh

học nhất trong tâm Sen. Chỉ có một vài công trình nghiên cứu về thành phần

flavonoid và các chất khác trong tâm Sen như: asparagin, tanin, triterpen,

đường khử, các acid hữu cơ [7], [8].

1.2.2.1. Thành phần alkaloid của tâm Sen

Tâm Sen có hàm lượng alkaloid toàn phần khoảng từ 0,85 - 0,96 % và thay đổi

theo điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng. Có khoảng 12 alkaloid được biết trong tâm Sen,

bao gồm các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin, tetrahydroisoquinolin,

benzylisoquinolin, aporphin, proaporphin. Hàm lượng alkaloid cao nhất trong tâm

Sen, được tìm thấy là isoliensinin hoặc neferin tùy vùng khí hậu và thổ nhưỡng[7],[8].

Alkaloid khung benzylisoquinolin: Các alkaloid thuộc nhóm này được trình bày

trong Bảng 1.4.

Bảng 1.4. Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong tâm Sen [8], [24],[34], [35], [48]

CTPT

R3

R4

R2

R1

N-methyl coclaurin

-H

C19H23NO2

-CH3

N- demethyl coclaurin

-H

C19H23NO2

N-methyl isococlaurin

-H

C19H23NO2

-CH3

Lotusin

-H

C19H23NO2

-CH3

Alkaloid khung aporphin và proaporphin: Các dẫn chất này bao gồm nuciferin,

roemerin và pronuciferin[17], [43].

Alkaloid khung bisbenzylisoquinolin: Các alkaloid thuộc nhóm được trình bày

trong Bảng 1.5.

Bảng 1.5. Các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có trong tâm Sen [7], [15], [18] , [23]

CTPT

R

R1

R2

Neferin

-H

C38H44N2O6

-CH3

Liensinin

-H

C37H42N2O6

-CH3

Isoliensinin

-H

C37H42N2O6

-CH3

Alkaloid khung tetrahydroisoquinolin: chỉ có một dẫn chất duy nhất là

methylcorypallin [8].

Alkaloid khác: Các dẫn chất này bao gồm proto alkaloid kiểu phenylalkylamin [7].

Cinnamoyl-4-(2-aminoethyl)phenol

Tính chất của một số alkaloid phân lập từ tâm Sen [34],[36],[110]

Neferin: Công thức phân tử: C38 H44N2O6. Khối lượng phân tử: 624,77. Bột kết tinh

màu trắng, tnc: 60 – 61 oC. Góc quay cực: -100 o (c = 0,24%; MeOH).

Neferin dạng base tan nhiều trong dung môi hữu cơ kém phân cực, kém tan

trong nước, max: 282 nm (MeOH).

Liensinin: Công thức phân tử: C37H42N2O6. Khối lượng phân tử: 610,74. Dạng rắn

màu trắng vô định hình, tnc: 95 – 99 o C. Góc quay cực: +15,85 o (c = 0,88%;

aceton). Liensinin dạng base tan nhiều trong dung môi hữu cơ kém phân cực,

kém tan trong nước, max: 278 nm (MeOH).

Isoliensinin: Công thức phân tử: C37H42N2O6. Khối lượng phân tử: 610,74.

Dầu không màu hoặc tinh thể vàng nhạt. tnc: 69 – 71 oC. Góc quay cực: +50,68 o

(c = 0,30%; aceton). Isoliensinin dạng base tan nhiều trong dung môi hữu cơ

kém phân cực, kém tan trong nước, max: 284 nm (MeOH).

1.2.2.2. Thành phần flavonoid

Cho đến nay, mới chỉ có một vài nghiên cứu về thành phần flavonoid trong tâm Sen.

Các flavonoid được biết trong tâm Sen thuộc nhóm flavonol (rutin, kaempferol,

hyperin) và nhóm catechin (catechin) [16],[24].

1.3. CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN ALKALOID VÀ

FLAVONOID TRONG LÁ, TÂM SEN

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới về chiết xuất và phân lập các

alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, từ những kỹ

thuật đơn giản đến phức tạp, như được trình bày trong Bảng 1.6.

Bảng 1.6. Tóm tắt các nghiên cứu về chiết xuất phân lập alkaloid, flavonoid trong

lá và tâm Sen.

STT TLTK

Hợp chất phân lập được

Kỹ thuật ứng dụng

Phân lập alkaloid từ lá Sen loài Nelumbo lutea Willd.

động:

pha

tính,

[48]

Nuciferin, armepavin, N-norarmepavin, N-nornuciferin

Phân lập nuciferin và N-nornuciferin bằng sắc ký cột cổ điển (pha tĩnh: alumina trung benzen- aceton). Phân lập (-)-N-norarmepavin bằng 2 phương pháp: kết tinh dưới dạng muối oxalat và sắc ký cột (pha tĩnh: alumina trung tính, pha động: aceton- methanol). Phân lập được (±)-armepavin bằng sắc ký lớp mỏng chế hóa kết hợp sắc ký cột với điều kiện sắc ký như phân lập (-)-N- norarmepavin.

2 3 4

[62] [63] [83]

[46]

[5]

Nuciferin

[6],[9] Nuciferin

[99]

(R)-Coclaurin, N-methyl coclaurin, (S)-Norcoclaurin

[53]

[117]

Phân lập alkaloid từ lá Sen loài Nelumbo nucifera Gaertn. Sắc ký cột cổ điển pha thuận Nuciferin, roemerin Sắc ký cột pha thuận cổ điển Nuciferin, nor-nuciferin, roemerin Sắc ký cột pha thuận cổ điển dl-Armepavin Sắc ký cột pha thuận cổ điển. Pronuciferin, liriodenin, annonain, demethyl coclaurin Sắc ký lớp mỏng điều chế với bản mỏng silica gel G và hệ dung môi khai triển tuyệt đối-amoniac toluen-aceton-cồn (45:45:7:3) Sắc ký cột pha thuận cổ điển Sắc ký cột với với các loại pha tĩnh khác nhau: Dianion HP20, Sephadex LH- 20, MCI-gel CHP20P. Hệ dung môi rửa giải là H2O-MeOH (10 :1) HPLC điều chế Sắc ký cột sử dụng resin hấp phụ kích thước lớn

Nuciferin (độ tinh khiết >98%) Nuciferin, N-Nornuciferin, O-nornuciferin

[50]

Nuciferin, O-nornuciferin, roemerin Màng nhũ tương lipid

[86]

Nuciferin, roemerin, N-methylasimilobin, anonain

dụng

sử

O-nornuciferin

[72]

Anonain, pronuciferin, N-nornuciferin, nuciferin, nornuciferin

Sắc ký cột cổ điển với hệ dung môi benzen-aceton, pha silica gel, tĩnh với pha tĩnh alumina Chiết bằng cồn 90% acid (pH 2) ở 80 oC, cao cồn được hòa tan trong HCl 0,25 %, kiềm hóa và xử lý dịch kiềm qua nhựa trao đổi anion để thu dịch alkaloid sạch hơn. Sau đó qua cột cổ điển hấp phụ để thu 5 alkaloid.

[116]

Kết hợp phương pháp chiết phân bố, nhựa trao đổi ion và sắc ký cột cổ điển

[122]

Nuciferin, liriodenin, 2-hydroxy-1-methoxyaporphin, pronuciferin, dehydroroemerin, dehydronuciferin, roemerin Nuciferin, N-nornuciferin, O-nornuciferin

[43]

N-Nornuciferin, armepavin, anonain, pronuciferin, nuciferin

Chiết hỗ trợ siêu âm dựa trên pha lỏng ionic (ILMAE) Sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) với hệ dung môi của 2 pha gồm PE- EtOAc-MeOH-nước (3:5:3:5) cho N-nornuciferin, armepavin và 1:5:1:5 cho anonain, pronuciferin và nuciferin.

[44]

Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn CO2 (2 giờ, 70 oC, áp suất 30 Mpa)

Nuciferin, dehydronuciferin, N-nornuciferin, O-nornuciferin, roemerin,

từ hệ

tan

[118]

(5:5:2:8),

Nuciferin (1020 mg), O-nornuciferin (120 mg), roemerin (96 mg)

[92]

Nuciferin (45,3 mg; 96%), roemerin (26,6 mg; 92%), N- demethylarmepavin (7,4 mg; 90%)

Sắc ký ngược dòng liên tục với vùng pH xác định (pH-Zone-reﬁning CCC) với hai pha không đồng PE-EtOAc-MeOH-nước thêm triethylamin (10 mM) vào pha hữu cơ trên như là chất lưu giữ và HCl 5 mM vào pha nước như là chất rửa giải. Sắc ký ngược dòng liên tục với vùng pH xác định với hai pha không đồng tan từ hệ hexan: EtOAc-MeOH-H2O (1:6:1:6) thêm triethylamin (10 mM) vào pha hữu cơ trên như là chất lưu giữ (retainer), và HCl 5 mM vào pha nước như là chất rửa giải

Sắc ký cột cổ điển

[119]

[82]

HPLC điều chế với cột Symmetry Prep C18, pha động: nước-acetonitril, tốc độ dòng 5 mL/phút

Sắc ký cột cổ điển

[66]

[75]

HSCCC: Hệ thống hai pha n-hexan- EtOAc- MeOH- H2O (1:5:1:5). Xác định độ tinh khiết bằng HPLC/PDA Sắc ký cột cổ điển

Phân lập flavonoid từ lá Sen loài Nelumbo nucifera Gaertn. Quercetin, myricetin, kaemferol-3O- glc, isoquercitrin, luteolin 7-O-glc Isoquercitrin, hyperosid, astragalin. Catechin, quercetin, isoquercitrin, hyperosid, rutin, astragalin. Isoquercitrin: 6 mg (96%) Hyperosid: 9,1 mg (97,5%) Astragalin: 3 mg (98,3%) Quercetin 3-O-D-GlcA, rutin Quercetin 3-O-D-GlcA: 6,1 mg HSCCC: Hệ thống hai pha EtOAc-

[78] [81]

5 6

Ethanol- H2O- acid acetic (4:1:5:0,025). Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC.

[10]

Sắc ký cột cổ điển pha thuận

[109]

Kết hợp sắc ký cột cổ điển pha thuận silica gel, cột Sephadex LH-20 và kỹ thuật HSCCC

(97 %) Astragalin: 20,2 mg (95,4 %) Myricetin 3-O-β-D-glucopyranosid: 14,18 mg (96,2 %) Thiết lập chất đối chiếu, kaempferol, nuciferin (độ tinh khiết 98,9 %) 10 Octacosanol; 3,7,8-trimethoxy-1- hydroxy xanthon; rhamnetin 3-O-β- D-glucopyranosid; chrysoeriol 7-O- β-D-glucosid (9); quercetin 3-O-β- D-glucopyranosid; hyperosid; quercetin 3-O-rutinoside; astragalin;; isorhamnetin 3-O-α-D- lyxopyranosyl-β-D- glucopyranoside; isorhamnetin 3-O- β-D-glucopyranoside; isorhamnetin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl; β-D- glucopyranosid; quercetin; kaempferol; dehydronuciferin; roemerine; stigmast-7-en-3-O-β-D- glucopyranosid

STT TLTK

Phân lập alkaloid từ tâm Sen loài Nelumbo nucifera Gaertn. Kỹ thuật ứng dụng

Sắc ký cột cổ điển pha thuận

[18]

Sắc ký cột cổ điển pha thuận

[61]

Hợp chất phân lập được Liensinin, kết tinh dưới dạng muối liensinin perchlorat Isoliensinin, kết tinh dưới dạng muối isoliensinin HCl

[32]

Nuciferin, pronuciferin, lotusin

[35]

Lotusin, demethyl coclaurin

[85]

Isoliensinin, neferin, methylcorypallin

[107]

Phương pháp chiết phân bố lỏng- lỏng kết hợp sắc ký cột pha thuận cổ điển Dịch chiết n-butanol được nạp lên cột trao đổi cation Amberlit CG-50 Chiết phân bố lỏng - lỏng kết hợp sắc ký cột pha thuận cổ điển dùng pha tĩnh Al2O3 với hệ dung môi benzen - chloroform Chiết phân bố lỏng - lỏng kết hợp sắc ký cột pha thuận cổ điển

[114]

Lotusin, nuciferin, neferin, pronuciferin, liensinin và isoliensinin Liensinin perclorat và isoliensinin hydroclorid.

[95]

Neferin, isoliensinin

[76]

Chiết phân bố lỏng - lỏng kết hợp sắc ký cột pha thuận cổ điển Sắc ký cột nhanh (FC) pha tĩnh silica gel, hệ dung môi: benzen- EtOAc-TEA (7:2:1) Sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) với hệ dung môi hai pha sử dụng EtOAc-CCl4 - MeOH-H2O (1:6:4:1)

Sắc ký cột nhanh pha thuận

[54]

Liensinin (100 mg), isoliensinin (95 mg), neferin (350 mg) với độ tinh khiết trên 95 % Neferin với độ tinh khiết 98,85 %

[36]

Neferin, liensinin và isoliensinin

[106] Neferin, liensinin, isoliensinin

Sắc ký cột pha thuận cổ điển với dung môi rửa giải chloroform- methanol, nồng độ methanol tăng dần từ 1% đến 20% Sắc ký cột trao đổi ion trên 3 loại nhựa (AKS-W, AB-8 và H21)

[56]

[57]

Liensinin, isoliensinin, neferin

[55]

Neferin

[87]

Pronuciferin

[18]

Liensinin

[74]

pha

[118]

Neferin, liensinin, isoliensinin Chiết hỗ trợ vi sóng, sử dụng chất lỏng ionic Tinh khiết hóa dịch chiết tâm Sen qua 2 cột trao đổi ion AKS –W và D72 Sắc ký cột trao đổi ion LSA-5B, rửa giải bởi ethanol 50% Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn CO2 kết hợp sắc ký cột cổ điển Chiết phân bố lỏng - lỏng kết hợp sắc ký cột pha thuận cổ điển Sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) với hệ dung môi hai pha: n-hexan-EtOAc- MeOH- H2O (5:8:4:5) Sắc ký ngược dòng tốc độ cao, hệ dung môi hai n-hexan-EtOAc-MeOH-H2O (5:5:2:8) với pha hữu cơ thêm triethylamin 10 mM và pha nước thêm HCl 5 mM.

[15]

Sắc ký cột cổ điển với hệ dung môi khai triển CHCl3- MeOH-NH4OH.

Neferin (58,4 mg), liensinin (18,4 mg), isoliensinin (19,6 mg) Liensinin (118 mg), isoliensinin (151 mg), neferin (572 mg, độ tinh khiết trên 95 %) Neferin, isoliensinin, liensinin và nelumboferin, nelumborin A và B

Qua các tài liệu trên nhận thấy hầu như tất cả các kỹ thuật chiết xuất từ cổ điển

đến hiện đại đã được sử dụng để chiết alkaloid, flavonoid có trong lá và tâm Sen

(Nelumbo nucifera Gaertn.):

Chiết xuất các cao alkaloid, flavonoid toàn phần

- Thu alkaloid toàn phần: hầu hết các nghiên cứu đều tiến hành chiết

nguyên liệu Sen ban đầu theo phương pháp cổ điển là chiết ngâm lạnh, ngấm

kiệt hoặc chiết hồi lưu (HRE) với MeOH, EtOH (70 - 96%) hoặc với cồn acid

để thu alkaloid toàn phần dạng muối, sau đó tiến hành kiềm hóa (NH4OH,

NaOH) và chiết phân bố với chloroform, ether, n-butanol và cô dưới áp suất

giảm. Một số trường hợp làm ẩm dược liệu với kiềm (NH4OH) và chiết trực tiếp

bằng dung môi hữu cơ để thu alkaloid toàn phần dạng base.

- Thu flavonoid toàn phần: thường được chiết bằng MeOH, EtOH (70 – 96 %)

hoặc có thể tẩm nguyên liệu với H2SO4 2 % sau đó chiết với EtOAc để thu được

hầu hết các dạng của flavonoid. Sau đó làm bay hơi MeOH (cồn) hay EtOAc

để thu được cao đặc.

- Một số nghiên cứu đã áp dụng các phương pháp chiết hiện đại hơn nhằm

cải thiện hiệu suất chiết, rút ngắn thời gian chiết cũng như thu những phân đoạn

chứa alkaloid hay flavonoid sạch hơn như:

o Chiết hỗ trợ vi sóng (MAE) [105], chiết hỗ trợ vi sóng (ILMAE) với dung môi

là chất lỏng ionic [122]

o Sử dụng nhựa resin hấp phụ kích thước lớn [117]

o Màng nhũ tương lipid [50]

o Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn [87],[46]

Phân lập các alkaloid, flavonoid từ cao toàn phần

Sau khi thu được các alkaloid, flavonoid toàn phần, nhiều phương pháp đã được

áp dụng cho việc phân lập các thành phần chính này trong đó phương pháp sắc ký

được sử dụng phổ biến với các loại pha tĩnh khác nhau như: silica gel, Sephadex

LH-20, Diaion HP-20, trao đổi ion, silica gel pha đảo,… với các hệ dung môi

triển khai khác nhau từ phân cực trung bình đến phân cực.

1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID,

FLAVONOID TRONG LÁ VÀ TÂM SEN.

Để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen phương pháp

phân tích thế tích, sắc ký lớp mỏng, UV-Vis đến các phương pháp hiện đại hơn như

sắc ký lỏng hiệu năng cao với các loại đầu dò khác nhau hay phương pháp điện di

mao quản đã được áp dụng và được trình bày trong Bảng 1.7.

Bảng 1.7. Tóm tắt các nghiên cứu định tính và định lượng alkaloid, flavonoid trong

lá và tâm Sen.

STT TLTK

Đối tượng phân tích

Phương pháp ứng dụng

Định tính và định lượng alkaloid trong lá Sen loài Nelumbo nucifera

[2]

Alkaloid toàn phần

Phương pháp chuẩn độ thể tích acid –base Phương pháp SKLM- mật độ quang kế - Silica gel GF 254 có chứa NaOH 0,5 % - Hệ dung môi CHCl3- EtOAc-MeOH-H2O

[126]

(30:40:20:10)

Nuciferin

- Bước sóng phát hiện 272 nm - Giới hạn phát hiện của nuciferin: 0,5

μg/mL

Phương pháp HPLC-DAD-ESI/MS - Cột VP-ODS (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) - Pha động: Acetonitril- nước chứa 0,1 %

[90]

triethylamin

N-nornuciferin, O-nornuciferin, Nuciferin, Roemerin

[60]

Nuciferin

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút - Bước sóng phát hiện: 280 nm Phương pháp HPLC/PDA - Kromasil C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm)

- Pha động: H2O-ACN-TEA-acid acetic

băng (70,6:27:1,6:0,78)

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút; nhiệt độ cột: 25

- Bước sóng phát hiện: 280 nm - LOD của nuciferin 26,4 μg/mL Phương pháp HPLC/PDA - Hypersil C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) - Pha động: ACN-TEA 0,1%, rửa giải

[124]

gradient

- Nhiệt độ cột: 35 oC; tốc độ dòng: 1

2-hydroxyl–1- Methoxyaporphin, Pronuciferin, Nuciferin, roemerin

mL/phút

- Bước sóng phát hiện: 270 nm Phương pháp HPLC/PDA - Cột C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) - Pha động: H2O-ACN-acid acetic băng-

[84]

Nuciferin

TEA (27:60:3:1)

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút; - Bước sóng phát hiện: 272 nm Phương pháp HPLC/PDA - Diamonsil C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) - Pha acid

động: MeOH-dung

dịch

[113]

trifluoroacetic 0,01%, rửa giải gradient.

soát liệu

Định tính điểm chỉ alkaloid, nuciferin được dùng làm chất đánh dấu sinh học để xác định các thành phần khác. Áp dụng để kiểm chất lượng nguyên lá Sen.

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - Nhiệt độ cột: 20 oC - Bước sóng phát hiện: 270 nm. Định tính và định lượng flavonoid trong lá Sen loài Nelumbo nucifera

[127]

- Định tính bằng SKLM - Định lượng bằng HPLC/PDA

Định tính và định lượng quercetin và nuciferin để chuẩn hóa chất lượng lá Sen.

[39]

Phương pháp HPLC/PDA - Phenomenex C18 (25 cm x 2 mm, 3 µm) - Pha động: ACN-H2O chứa acid formic

Quercetin, rutin, quercetin- glc, quercetin-gal, quercetin 3-O-GlcA.

đồng

thời

[51]

Định lượng isoquercitrin và hyperin

0,1%, rửa giải gradient Phương pháp HPLC/PDA - Nova-Pak C18 (3,9 mm × 150 mm, 5 µm) - Pha động: ACN-acid formic 0,1% (87:13) - Tốc độ dòng: 1,0 m/phút - Bước sóng phát hiện: 255 nm - Nhiệt độ cột: 34°C - Định tính bằng LC/ESI-MS/MS - Định lượng bằng HPLC-PDA/MS o Cột Sunfire C18 (4,6x 150 mm; 3,5 µm) o Pha động: HCOOH 0,5%- ACN chứa

0,1% acid formic, rửa giải gradient.

[71]

quer

Định tính 13 flavonoid Định thời đồng lượng quercetin, rutin, quer 3-O- 3-O-glcA, glc, 3-O-glc, kaempferol isorhamnetin 3-O-glc

Thế ion hóa: 3,5 kV Tốc độ dòng khí mang (N2): 11 lít/phút Nhiệt độ dòng khí : 350 oC; Áp suất đầu phun: 45 psi

o Bước sóng phát hiện: 350 nm o Điều kiện MS:

Định tính và định lượng alkloid tâm Sen loài Nelumbo nucifera

[107]

Phương pháp HPLC/UV - Phenomenex-silica (4,6 x 250 mm, 5 µm) - Pha

DCM-isopropyl-DEA

động:

Định lượng đồng thời neferin, liensinin, isoliensinin

(70:30:0,2).

- Bước sóng phát hiện: 282 nm Phương pháp HPLC tạo cặp ion - Cột Tosoh TSK-Gelods-80TM (4,6 mm x

250 mm, 10 µm)

[79]

Liensinin

- Pha động: MeOH- nước- acid acetic băng 5mM

octansulfonat

natri

10mM- (55:45:0,6:10: 5)

- Nhiệt độ cột: 40 oC; tốc độ dòng: 1

mL/phút

- Bước sóng phát hiện: 282 nm Phương pháp SKLM- mật độ quang

[89]

Định lượng đồng thời neferin và liensinin

Phương pháp HPLC-PDA - ZOBRAX SB-C18 (4,6 x 150 mm, 5 µm) - Pha động: ACN-triethylamin- H3PO4

[22]

Định lượng đồng thời liensinin, isoliensinin, neferin

(25:75:0,1)

- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút - Bước sóng phát hiện: 282 nm Phương pháp HPLC tạo cặp ion - Cột Hibar RT C18 (4,6x 250 mm; 5 µm) - Pha động: nước-ACN-acid acetic (55:45:1)

[69]

chứa 4 g natri lauryl sulfat/l

Lotusin, liensinin, isoliensinin, neferin

- Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút - Nhiệt độ cột: 30 oC - Bước sóng phát hiện: 282 nm Phương pháp HPLC-PDA-MS/MS - Monochrome C18 (4,6 x 200 mm, 10 µm) - Pha động: ACN-dung dịch đệm (0,2% acid acetic và 0,1% TEA trong nước) (16:84) - Tốc độ dòng: 1,4 mL/phút, chia dòng 0,2 mL/phút với MS và 1,2 mL/phút với PDA.

[23]

Liensinin, isoliensinin và neferin

- Nhiệt độ cột: 30 oC - Bước sóng phát hiện: 282 nm - Thể tích tiêm: 20 µl - Thế mao quản phun điện tử: 55 eV - Thế áp dụng: 10 kV - Khí khô N2 ở 300 oC, kiểu positive Điện di mao quản với đầu dò điện hóa - Cột mao quản dài 52 cm, đường kính

[93]

Nuciferin, rutin, hyperosid

trong 25 µm - Điện thế: 15 kV - Dung dịch đệm: Na2B4O7 50 mM và

NaH2PO4 100 mM (pH = 7,25)

- Giới hạn phát hiện của nuciferin, rutin, hyperosid lần lượt là 0,02; 0,05 và 0,04 μg/mL

[21]

Định lượng liensinin, isoliensinin, neferin.

Phương pháp HPLC/PDA - Cột Hypersil BDS (4,6 x 250 mm; 5 μm)

- Pha động: H2O-ACN (46∶54) pH 11

điều chỉnh bằng ethylendiamin)

Kiểm soát hàm lượng ba Alkaloid có trong các bài thuốc dân gian.

[111]

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - Bước sóng phát hiện: 282 nm Phương pháp MEKC với chất hoạt động bề mặt TTAB. - Dung dịch đệm NaH2PO4 40 mM (pH 6,4)

Liensinin, isoliensinin, neferin

chứa TTAB 10 mM và MeOH 15 % - Sử dụng nội chuẩn tetrahydropalmatin Phương pháp điện di mao quản vùng - Dung dịch đệm natri acetat 80 mM và

[94]

Lotussin, liensinin, isoliensinin, neferin

ammonium acetat 40 mM trong MeOH (pH 5,4)

- Dùng chuẩn nội ephedrin, LOD: 1,5 ppm

Định tính và định lượng flavonoid trong tâm Sen loài Nelumbo nucifera

[19]

Định lượng catechin, rutin, kaempferol, hyperin

- Phương pháp MEKC, đầu dò điện hóa - Hệ đệm borat 60 mM (pH 8,0) chứa SDS 20 mM. Điện thế: 16 kV. Giới hạn phát hiện: 6,90 x 10-8 g/mL.

Qua các tài liệu nghiên cứu phân tích định tính, định lượng các alkaloid, flavonoid

có trong lá, tâm Sen trên nhận thấy:

Phân tích định tính

Từ phản ứng hóa học với các thuốc thử đặc trưng để định tính alkaloid và

flavonoid toàn phần, đến việc ứng dụng kỹ thuật SKLM cho việc sơ bộ định tính

từng thành phần riêng lẻ dựa vào Rf.

Kỹ thuật HPLC với thông số thời gian lưu (tR) và kỹ thuật điện di mao quản với

thông số thời gian di chuyển (tM ) cũng đã được sử dụng như một giá trị định tính

cho mỗi chất trong cùng điều kiện sắc ký hay điện di xác định...

Thêm vào đó, một số công bố đã sử dụng đầu dò khối phổ (MS) ghép nối với hệ

thống sắc ký lỏng, giúp định tính mỗi alkaloid, flavonoid có trong các nền mẫu

phức tạp (tâm và lá sen) với độ nhạy, độ chính xác và tính đặc hiệu cao cao hơn

thông qua việc xác định số khối đặc trưng của mỗi chất.

Tuy nhiên, chưa có công trình sử dụng phương pháp điện di mao quản ghép nối

đầu dò khối phổ để định tính alkaloid, flavonoid với độ nhạy, tính đặc hiệu,

độ chính xác cao cho một lượng nhỏ mẫu phân tích ban đầu (10-20 nL).

Phân tích định lượng

Phương pháp chuẩn độ thể tích acid – base có tính chọn lọc, độ chính xác,

độ nhạy kém như đã được một vài tác giả ứng dụng để định lượng alkaloid

toàn phần có trong lá sen qui về nuciferin hay tâm sen qui về neferin.

Phương pháp bán định lượng như TLC-scanning cũng đã được ứng dụng để

định lượng neferin và isoliensinin trong tâm sen hay nuciferin trong lá Sen, phương

pháp này có cải thiện về độ nhạy và tính đặc hiệu nh7ng độ chính xác vẫn thấp.

Phần lớn các nghiên cứu còn lại các tác giả đều sử dụng phương pháp

HPLC/PDA hay LC/PDA/ESI-MS để định lượng các alcaloid, flavonoid trong lá và

tâm Sen. Việc xây dựng qui trình định lượng đồng thời một vài alkaloid, flavonoid

trong lá, tâm Sen bằng LC/PDA/MS đảm bảo gần như hoàn toàn các yêu cầu về độ

nhạy, tính đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng. Tuy nhiên, với yêu cầu định lượng đồng

thời từ sáu thành phần trở lên trong nền mẫu phức tạp như dịch chiết lá, tâm sen thì

phương pháp LC sẽ gặp nhiều khó khăn trong việc xử lý mẫu nếu không sử dụng

hỗ trợ kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) nhằm cải thiện tốt độ phân giải giữa các pic,

nhưng ngược lại độ chính xác, tỉ lệ phục hồi của qui trình định lượng cũng

bị giảm theo. Do đó, phương pháp điện di mao quản được áp dụng để cải thiện độ

phân giải do cơ chế tách chủ yếu dựa vào điện tích của các chất. Thêm vào đó,

phương pháp này có thể tách tốt các đồng phân, tiêu tốn lượng rất nhỏ dung môi,

mẫu phân tích và thời gian phân tích nhanh mà vẫn thỏa mãn những yêu cầu về tính

đặc hiệu, độ chính xác và độ đúng nên đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu

định lượng alcaloid, flavonoid có trong lá tâm Sen trong những năm gần đây...

Tuy nhiên, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào ứng dụng kỹ thuật

CE/PDA/MS để định tính và định lượng alcaloid, flavonoid trong lá, tâm sen để

tăng độ nhạy, tính đặc hiệu. Đây là một trong mục tiêu mà nghiên cứu trong luận án

sẽ hướng tới.

1.5. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SEN

1.3.1. Tác dụng sinh học của lá Sen

Tác dụng trên lipid máu

Hiệu quả cải thiện bệnh tăng lipid máu ở người uống dịch chiết nước lá Sen:

Kết quả cho thấy dịch chiết nước lá Sen có hiệu quả rất tốt trong việc giảm lipid

máu ở nhóm dùng thuốc mà không có tác dụng phụ nào [33].

Hiệu quả chống béo phì của dịch chiết nước lá Sen ở chuột. Dịch chiết lá Sen làm

ức chế hoạt động của men α-amylase và lipase; điều hòa tăng chuyển hóa lipid

thông qua UCP3 mRNA [103].

Dịch chiết nước lá Sen giàu polyphenol làm giảm xơ vữa động mạch [38].

Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng sốt rét

Quercetin có trong dịch chiết lá Sen có tác dụng kháng khuẩn. [125].

Tác dụng kháng sốt rét và kháng nấm của (R)-roemerin và N-methylasimilobin

trong lá Sen. Tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét của N-methyl asimilobin và

(R)-roemerin được tìm thấy ở nồng độ IC50 lần lượt là 0,2 và 4,8 mg/mL [86].

Tác dụng chống oxy hóa: Hiệu quả chống oxy hóa của flavonoid trong lá Sen.

Dịch chiết methanol được tách làm ba phân đoạn: ethyl acetat, n-butanol và nước.

07 flavonoid được phân lập từ phân đoạn nước (catechin, quercetin, quercetin 3-O-

β-D-glc, quercetin 3-O-β-D-gal, quercetin 3-O-β-D-GlcA, kaempferol 3-O- β-D-glc,

myricetin 3-O- β-D-glc) có hiệu lực ức chế sự oxy hóa LDL[128].

Tác dụng kháng HIV: Tác dụng kháng HIV của alkaloid từ dịch chiết lá Sen

Nelumbo nucifera. Thử nghiệm cho thấy các alkaloid (+)-1-(R)-coclaurin và (-)-1-

(S)-norcoclaurin có tác dụng kháng HIV rõ rệt. Các alkaloid khung

benzylisoquinolin, aporphin và bisbenzyl isoquinolin khác bao gồm liensinin,

neferin, isoliensinin và nuciferin cũng có hiệu lực kháng HIV [99].

Tác dụng trên đường huyết: Dịch chiết lá Sen và thành phần catechin kích thích

tiết insulin. Trong đó quercetin 3-O-β-D-glucuronid và quercetin 3-O-β-D-

glucopyranosid được xác định là những chất đánh dấu sinh học có vai trò chính

trong tác dụng này[128].

Nuciferin kích thích sự tiết insulin từ tế bào beta - so sánh với glibenclamid.

Kết quả cho thấy nuciferin có tác dụng kích thích sự tiết insulin, làm giảm hàm

lượng glucose trong máu. So sánh với glibenclamid cho thấy nuciferin có tác dụng

tăng tiết insulin mạnh hơn và an toàn hơn cho tế bào beta [65].

Tác dụng trên tim mạch: Lá Sen có tác dụng bảo vệ đối với các rối loạn nhịp tim

gây nên do calci clorid, làm giảm số chuột chết và chuột bị rung tâm thất.

Liều 400 mg/kg/ngày cho tác dụng tốt đối với loạn nhịp do isoproterenol[67].

Tác dụng kháng ung thư: Dịch chiết lá Sen giàu flavonoid ức chế sự tăng sinh tế

bào ung thư vú in vitro và in vivo. Các polyphenol được xác định trong dịch chiết

lá Sen bao gồm acid gallic, rutin, quercetin đáp ứng tốt với các tế bào MCF-7 [64].

Tác dụng bảo vệ gan: Dịch chiết lá Sen giàu flavonoid cải thiện sự hư hại gan trên

in vivo gây bởi chế độ ăn chứa nhiều chất béo. Sự bổ sung dịch chiết lá Sen giúp cải

thiện một cách hiệu quả sự hư hại trong chuyển hóa lipid gây bởi chế độ ăn nhiều

chất béo, làm giảm sự tích tụ lipid ở gan giúp bảo vệ gan và hạ lipid trong máu [52].

1.3.2. Tác dụng sinh học của tâm Sen

Tác dụng của neferin, isoliensinin và liensinin

Trên đường huyết: Neferin kích thích sự nhạy cảm insulin ở chuột kháng insulin [96].

Neferin được chứng minh có hiệu quả tương tự rosiglitazon trong việc làm giảm

nhanh lượng glucose huyết, insulin huyết, triglycerid và kích thích sự nhạy insulin

trên chuột kháng insulin một cách rõ ràng.

Tác động hạ đường huyết và hạ lipid huyết. Neferin (10 mg/kg) và dịch chiết tâm

Sen (500 mg/kg) được sử dụng qua đường uống có khả năng hạ đường huyết và

hạ lipid huyết ở mô hình thử nghiệm[129].

Tác dụng trên tim mạch: Neferin có hiệu quả trên hoạt động điện tim ở mèo.

Kết quả neferin và quinidin có hiệu quả tương tự trên hoạt động điện tim [49].

Neferin có hiệu quả trên sự kết tập tiểu cầu liên quan đến sự điều hòa cân bằng

TXA2/PGI2, cAMP/cGMP [100].

Trên thần kinh trung ương: Ảnh hưởng của dịch chiết tâm Sen và neferin lên hệ

thần kinh trung ương trên chuột thử nghiệm. Neferin, alkaloid chính trong dịch

chiết methanol từ tâm Sen có tác dụng ức chế trung tâm vận động [104].

Trên huyết học: Hiệu quả của liensinin trên huyết động học của chuột.

Tác dụng chống loạn nhịp của liensinin trên huyết động học tương tự verapamin và

tốt hơn quinidin [130]. Alkaloid trong dịch chiết ethanol từ tâm Sen như (S)-

armepavin, pronuciferin, liensinin, isoliensinin, cinnamoyl-4-(2-aminoethyl) phenol

có tiềm năng rất lớn cải thiện thực nghiệm viêm tiểu cầu thận hình liềm tự miễn[91].

Tác dụng chống oxy hóa: Khả năng chống oxy hóa và dập tắt gốc tự do.

Các polyphenol trong tâm Sen có hoạt tính ức chế tác dụng của DPPH, là chất sinh

gốc tự do [131].

1.6. CÔNG DỤNG CỦA SEN

Sen từ lâu đã được Đông Y sử dụng như là một vị thuốc chữa được nhiều bệnh,

có rất nhiều bài thuốc từ Sen được ghi trong các y văn cổ xưa và được truyền trong

nhân gian cho đến hôm nay. Tâm Sen (Liên tâm) vị đắng tính lạnh vào kinh tâm có

tác dụng thanh tâm, hạ nhiệt chữa băng huyết, thổ huyết, di tinh, mộng tinh,

mất ngủ. Lá Sen (Liên diệp) có vị đắng, tính mát, vào 3 kinh can, tì, vị có tác dụng

thanh thử, lợi thấp, tán ứ, chỉ huyết, thủy chí phù thũng, lôi đầu phong. Hạt Sen

(Liên nhục) có vị ngọt, tính bình vào 3 kinh tâm, tỳ, thận có tác dụng bổ tì,

dưỡng tâm, chữa di tinh mất ngủ, thần kinh suy nhược. Hoa Sen (Liên hoa, Hà hoa)

vị ngọt đắng, tính ấm có tác dụng an thần, cầm máu. Gương Sen (Liên phòng)

vị chát, tính mát, có tác dụng cố sáp, cầm máu. Ngó Sen (Liên ngẫu) vị ngọt, tính

[7]

mát, bổ âm, an thần. Tua nhị đực của hoa Sen (liên tu) chữa băng huyết thổ quyết,

di mộng tinh

Một số bài thuốc Đông Y có chứa tâm Sen:

Chữa tiểu đường: tâm Sen 8 g, thạch cao sống 20 g, các vị Sa sâm, Mạch môn,

Thiên môn, Thạch học, hoài sơn sống, Ý dĩ sống 12 g sắc uống hàng ngày.

Chữa suy nhược cơ thể ở người có bệnh đường hô hấp, viêm phế quản mãn tính, lao:

tâm Sen 10 g, Đan bì, Ý dĩ, Sinh địa, Bạch thược, Đảng sâm, mỗi vị 12 g; Qui bản,

Mạch môn, Ngũ vị tử, mỗi vị 10 g; Trần bì, chích cam thảo mỗi vị 6 g, đại táo 4 quả.

Sắc uống, ngày uống 1 thang.

Một số bài thuốc Đông Y có chứa lá Sen:

Trị mất ngủ: lá Sen liều 15-20 g/ngày, dạng thuốc sắc uống.

Khử ứ tán huyết: lá Sen tươi 80 g, Trắc bá diệp 16 g, Ngải diệp sao đen 12 g,

Sinh địa 40 g. Ngày dùng 15-20 g dưới dạng thuốc sắc hoặc hoàn tán [7].

1.7. CHẤT ĐỐI CHIẾU (CĐC)

1.7.1. Mục đích sử dụng chất đối chiếu hóa học

Theo ISO 13528 [41]. CĐC hoá học được sử dụng vào bốn mục đích chính:

- Thẩm định phương pháp và độ không chắc chắn của một phép đo.

- Xác minh khả năng áp dụng đúng đắn của một phương pháp.

- Hiệu chuẩn thiết bị

- Kiểm tra chất lượng và đảm bảo chất lượng.

Trong lĩnh vực kiểm tra chất lượng thuốc, các phương pháp phân tích trong các

Dược điển hiện hành có yêu cầu chất đối chiếu hoá học trong các phép thử sau:

- Định tính: phản ứng hóa học, phổ hồng ngoại, quang phổ, sắc ký lớp mỏng.

- Thử tạp chất liên quan: các phương pháp sắc ký, quang phổ.

- Định lượng: sắc lỏng hiệu năng cao, quang phổ.

- Hiệu chuẩn thiết bị phân tích: hệ thống LC hay GC, hệ thống quang phổ.

- Thẩm định qui trình phân tích, thẩm định phương pháp.

- Trong đo lường: hiệu chuẩn pH, hiệu chuẩn độ hoà tan

- Đánh giá thử nghiệm thành thạo

1.7.2. Thiết lập chất đối chiếu

1.7.2.1. Thiết lập chất đối chiếu gốc (PCRS)

Quy trình thiết lập PCRS gồm các bước như đánh giá nhu cầu và mục đích sử dụng,

lựa chọn nguyên liệu, xây dựng phương pháp kiểm nghiệm, xác định hàm lượng,

đóng gói - phân phối, thực hiện theo tài liệu hướng dẫn do WHO ban hành [123] .

Tùy vào mục đích sử dụng mà hàm lượng của chất đối chiếu và số lượng phòng thí

nghiệm tham gia đánh giá khác nhau. Với phép thử định tính và thử tinh khiết chỉ

cần 1 phòng thí nghiệm đạt GLP hoặc ISO/IEC 17025 và hàm lượng có thể chỉ

khoảng 90% với phép thử định lượng và hiệu chỉnh thiết bị thì ít nhất là 3 phòng

thí nghiệm và hàm lượng là 99,5% hoặc cao hơn.

Các chất đối chiếu đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sản xuất và đảm bảo

chất lượng của ngành Dược. Nhưng trên thực tế, các PCRS của Anh, Mỹ, Quốc tế,

Châu Âu lại quá đắt cho nhu cầu phân tích hay nghiên cứu thường qui. Do đó,

PCSR được các Hội đồng Dược điển của khu vực, quốc gia hoặc các PTN đạt chuẩn

thiết lập trên cơ sở của quy trình thiết lập chất đối chiếu thứ cấp[123].

Lựa chọn phương pháp phân tích để đánh giá PCRS

Các phương pháp lựa chọn để đánh giá các CĐC chia thành 2 nhóm[123]:

- Nhóm các phương pháp định tính: Thường dùng phổ IR. Trường hợp

không có CĐC liên kết hoặc thiếu các dữ liệu về các đặc tính của CĐC, cần phải

xác minh nhận dạng chất đó bằng một số kĩ thuật dùng để mô tả đặc tính một

chất mới, như nghiên cứu tinh thể học, phổ NMR, MS, phân tích nhóm chức và

các phương pháp khác có thể, để đảm bảo một CĐC được mô tả đặc tính đầy đủ.

- Nhóm các phương pháp định lượng: Các phương pháp cần chất CĐC ngoài như

sắc ký, quang phổ. Các phương pháp chỉ phụ thuộc vào tính chất động học nội

tại của chất như phương pháp phân tích độ hòa tan của các thành phần rắn trong

dung môi, quét nhiệt vi sai.

1.7.2.2. Thiết lập chất đối chiếu thứ cấp (SCRS)

- Việc thiết lập SCRS dựa trên PCRS thường được tiến hành do nhu cầu thực tế,

khi nguồn PCRS không đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng trong công tác nghiên

cứu và đảm bảo chất lượng thuốc. Giá trị ấn định (GTAĐ) của SCRS thông

thường được xử lý thống kê từ kết quả của 3 PTN độc lập tham gia thiết lập chất

đối chiếu[41]. Một SCRS của khu vực hay quốc gia có thể được coi là chất chuẩn

gốc để thiết lập chất chuẩn PTN của các PTN hoặc các nhà sản xuất dược phẩm.

Trong trường hợp này, các chất chuẩn khu vực hay quốc gia được gọi là

chuẩn liên kết.

- Theo qui định của ASEAN, chương trình đánh giá lại chất đối chiếu ASEAN

(ACRS) được thiết kế để phát hiện các dấu hiệu sớm của quá trình phân hủy

bằng các kĩ thuật phân tích phù hợp (sử dụng lượng mẫu ít, tiến hành nhanh,

độ nhạy cao). Đối với ACRS tần suất đánh giá lại được qui định như sau:

3 năm đối với CĐC dùng cho phép thử hóa học, 2 năm đối với CĐC dùng cho

phép thử vi sinh, 1 năm đối với các chất đặc biệt nhạy cảm. Chương trình đánh

giá lại thường bao gồm thử nghiệm:

o Xác định hàm lượng nước, mất khối lượng khi sấy khô.

o Xác định tạp chất bằng HPLC hoặc SKLM.

o Xác định hàm lượng chất chính.

o Xác định độ tinh khiết bằng DSC.

Khi kết quả xác định lại GTAĐ có sai khác từ 1% trở xuống so với giá trị ban đầu

thì không phải điều chỉnh GTAĐ trên chứng chỉ phân tích, nếu việc xác định lại

GTAĐ cho thấy sai khác trên 1% so với GTAĐ ban đầu thì phải công bố

điều chỉnh lại GTAĐ trên chứng chỉ phân tích.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Thành phần alkaloid và flavonoid trong lá và tâm Sen của cây Sen -

Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae.

2.2. Nguyên vật liệu - Dung môi, hóa chất - Trang thiết bị

2.2.1. Nguyên vật liệu

2.2.1.1. Nguyên liệu chính cho nghiên cứu

Nguyên liệu 128 kg lá Sen tươi và 48 kg tâm Sen tươi loài Nelumbo nucifera

được thu hái vào tháng 09 năm 2009 tại ấp 4, thị trấn Mỹ Thọ, thành phố Cao Lãnh,

tỉnh Đồng Tháp phục vụ cho việc chiết xuất, phân lập alcaloid và flavonoid.

Việc xác định loài Nelumbo nucifera được thực hiện tại liên Bộ môn

Thực Vật Dược - Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược Cần Thơ. Nguyên liệu lá,

tâm Sen sau khi thu hái được phơi khô trong mát, loại tạp cơ học lẫn vào, được xay

thành bột với cỡ hạt ≤ 2 mm, thu được 32 kg bột lá Sen và 40 kg bột tâm Sen được

bảo quản trong thùng nhựa chống ẩm, để nơi khô, mát, được kiểm tra đạt yêu cầu về

độ ẩm theo DĐVN IV trước khi sử dụng.

2.2.1.2. Nguyên liệu khảo sát thành phần, hàm lượng các alkaloid, flavonoid

Để đánh giá và so sánh thành phần, hàm lượng các alkaloid và flavonoid,

nguyên liệu lá và tâm Sen loài Nelumbo nucifera được thu hái tại hai thời điểm khác

nhau dựa vào kinh nghiệm dân gian là tháng 7/2011 (mùa sen từ tháng 7-9 hàng

năm) và tháng 12/2010 (nghịch mùa sen) ở các tỉnh, thành phố tại Việt Nam.

Các mẫu lá Sen loài Nelumbo lutea (Sen trắng), Victoria regia. (Nymphaeaceae).

Các mẫu thu hái được định danh tại liên Bộ môn Thực Vật Dược - Dược liệu, khoa

Dược, Đại học Y Dược Cần Thơ bằng cách so sánh với mô tả hình thái thực vật

trong các tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành. 32 mẫu lá Sen (100 g/ mẫu)

và 32 mẫu tâm Sen (50 g/mẫu) sau khi thu hái được loại tạp cơ học, phơi khô, xay

thành bột thô và bảo quản trong điều kiện phù hợp.

Bảng 2.1: Nơi thu hái nguyên liệu lá và tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn)

Lá Sen (NN)

Tâm Sen (NE)

Vùng thu hái

Nam bộ (1)

Trung bộ (2)

Bắc bộ (3)

LS-1: Thị trấn Mỹ Thọ, Đồng Tháp, LS-2: P. Xuân Khánh, Q. Ninh Kiều, Tp. Cần Thơ, LS-3: Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang, LS-4: Xã An Biên, Kiên Giang, LS-4: Huyện Chợ mới, An Giang, LS-5: Huyện Mỹ Tú, Sóc Trăng, LS-6: Q. Bình chánh, TP.HCM, LS-7: P. Phú Cường, Tp.Thủ Dầu Một, Bình Dương, LS-8: P. Hiệp Ninh, tỉnh Tây Ninh. LS-9: P. Quang Trung, TP. Kontum LS-10: Q. Hải Châu, TP. Đà Nẵng, LS-11: P. An Tây, TP. Huế, LS-12: P. Bến Thủy, TP. Vinh. LS-13: P. Quản An, Q. Tây Hồ, Hà Nội, LS-14: P. Hoàng Diệu, Tp.Thái Bình, LS-15: P. Lam Sơn, TP. Hưng Yên, LS-16: P. Ninh xá, Tp.Bắc Ninh.

TS-1: Thị trấn Mỹ Thọ, Đồng Tháp, LS-2: P. Xuân Khánh, Q. Ninh Kiều, Tp. Cần Thơ, TS-3: Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang, TS-4: Xã An Biên, Kiên Giang, TS-4: Huyện Chợ mới, An Giang, TS-5: Huyện Mỹ Tú, Sóc Trăng, TS-6: Q. Bình chánh, TP.HCM, TS-7: P. Phú Cường, Tp.Thủ Dầu Một, Bình Dương, TS-8: P. Hiệp Ninh, tỉnh Tây Ninh. TS-9: P. Quang Trung, TP. Kontum TS-10: Q. Hải Châu, TP. Đà Nẵng, TS-11: P. An Tây, TP. Huế, TS-12: P. Bến Thủy, TP. Vinh. TS-13: P. Quản An, Q. Tây Hồ, Hà Nội, TS-14: P. Hương Sơn, Tp. Thái Nguyên, TS-15: P. Lam Sơn, TP. Hưng Yên, TS-16: P. Ninh xá, Tp.Bắc Ninh. Bảng 2.2. Nơi thu hái nguyên liệu lá Sen loài N. Lutea Wild và Victoria regia

Victoria regia Lindl (Nymphaeaceae) Chùa Phước Kiển, tỉnh Đồng Tháp

Lá sen Nơi thu hái

Nelumbo lutea Willd P. Xuân Khánh, Q. Ninh Kiều, Tp. Cần Thơ

Thời gian

07/2011

Chế phẩm chứa lá và tâm Sen

Các mẫu thuốc, thực phầm chức năng được khảo sát có hạn dùng được qui định từ

2-3 năm tùy loại. Tất cả đều có hạn dùng trước tháng 10.2014.

Bảng 2.3: Các chế phẩm có chứa lá và tâm Sen

Tên chế phẩm

Tên công ty sản xuất, địa chỉ

Số lô

Thành phần (mg)

Mã sản phẩm

M-1 Agimexpharm

Viên nang ngủ ngon Angidormi

041012

M-2

Viên nang Goodnight

Công ty tư vấn Y Dược Quốc tế

131012

M-3

Khối lượng (mg) 25 80 70 5 30 30 30 30 500 400

Cao tâm Sen Cao Lạc tiên Cao Vông nem Melatonin Cao tâm Sen Cao Câu đằng Cao Lạc tiên Cao Vông nem Tâm Sen Lạc tiên

Viên nang Thất diệp an thần

Công ty Nam Dược

051111

M-4

Công ty Danapha

Viên bao đường Dưỡng tâm an thần

050712

M-5

Viên bao đường Go’dhealth

Cộng ty Bonne Sante

030512

M-6

Viên nang dưỡng tâm an thần

030712

Công ty TNHH dược phẩm, thương mại Thành công

M-7 Công ty OPC

11019

Viên nén bao film Mimosa

183 175 15 91,25 91,25 35 250 15 15 125 180 600 638 3 30 150 180 600 600 638 10 200

M-8

Viên nang mềm Herbsal

HD pharma (WHO-GMP)

230612

M-9

Viên bao đường Lopassi

230912

Công ty Dược phẩm Trường Thọ

M-10

120811

Công ty Hoàng Duy

Trà túi lọc Sen lạc tiên (30% lá Sen)

M-11

210412

Hoài sơn Liên nhục Liên tâm Lá dâu Lá vông Đông trùng hạ hảo Lạc tiên Tâm sen Toan táo nhân Thổ Phục Linh Sen lá Vông nem Trinh nữ Melatonin Rotundin sulfat Bình vôi lá Sen Lạc tiên Vông nem lá Trinh nữ Cao khô lá Sen Cao khô vông nem, lạc tiên, đương quy, bình vôi. 500 Lá sen 700 Lá vông 500 Lạc tiên 100 Tâm sen 1000 Bình vôi 30% Lá Sen 30% Lá Vông 40% Lạc Tiên 70% 30%

Trà lá Sen tâm thảo

Công ty TNHH Tâm thảo

Lá sen Cam thảo, cỏ ngọt

Trà Sen

M-13

071012

Cộng ty cổ phần Dược Sơn

900 600 75 25

Lá sen Giảo cổ lam Hoa nhài Cỏ ngọt

2.2.2. Dung môi, hóa chất, thuốc thử

Hoá chất, dung môi để chiết xuất, phân lập đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích:

n-hexan, benzen, chloroform, dichloromethan, aceton, ethyl acetat, ethanol,

n-butanol, methanol, amoniac, acid sulfuric, acid hydrocloric, natri hydroxyd,

ammonium chlorid, natri sulfat khan, silica gel (40-63 µm)…

Dung môi và hóa chất dùng cho HPLC và CE: acetonitril, methanol, triethylamin,

SDS, α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, THF, isopropanol, ammonium formiat,

ammonium acetat, dinatri tetraborat, acid phosphoric, acid formic là loại tinh khiết

dùng cho sắc ký lỏng do Merck sản xuất.

Thuốc thử (TT) các hợp chất tự nhiên: Dragendorff, Valse-Mayer, Bouchardat,

Bertrand, FeCl3 1% trong cồn,...

2.2.3. Trang thiết bị

- Hệ thống sắc ký phân bố ly tâm nhanh FCPC- Kromaton-A

- Hệ thống điện di mao quản Agilent G7100A, đầu dò DAD

- Hệ thống LC-MS/MS Micro Quattro API ESCi Multi-mode Ionization

- Hệ thống LC-MS Bruker Esquire 3000 plus ion trap

- Hệ thống máy Shidmadzu LC-MS/IT-TOF

- Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FTNMR

- Hệ thống HPLC Dionex Ultimate 3000, detector VWD 3400 RS bán điều chế

với hệ thống thu hứng mẫu tự động AFC-3000

- Hệ thống HPLC Hitachi Elite L 2000, detector DAD L- 2455

- Thiết bị phân tích nhiệt trọng lực Mettler Toledo TGA/DSC 1 STARe System

- Thiết bị quét nhiệt vi sai TA Instruments Model Q-200

- Máy quang phổ UV-Vis Hitachi U-2800

- Máy quang phổ hồng ngoại Bruker FTIR-α

- Máy đo điểm chảy Stuart SMP3; Đèn soi UV Spectroline Model CM-10

Và các trang thiết bị, dụng cụ thông thường dùng trong phòng thí nghiệm.

2.3. Địa điểm nghiên cứu

- Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp. HCM: Bộ môn Dược liệu; Trung tâm Đào tạo

và Nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc tự nhiên.

- Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ: Các Liên bộ môn

Hóa phân tích - Kiểm nghiệm; Thực vật - Dược liệu; Hóa dược - Hóa lý.

- Viện Dược liệu, Đại học Innsbruck, Cộng hòa Áo

- Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. HCM: Khoa Thiết lập Chất đối chiếu- Chất chuẩn;

Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm.

- Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm Tp. Cần Thơ

- Công ty cổ phần Dược phẩm OPC

2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các nội dung nghiên cứu được trình bày tóm tắt ở sơ đồ 2.1

Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập và

tinh chế các alkaloid, flavonoid trong lá và tâm Sen.

Xác định độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid

phân lập được (≥ 95%)

Xác định cấu trúc các chất alkaloid, flavonoid bằng

phổ nghiệm (UV, IR, MS, NMR)

Thiết lập chất đối chiếu từ

các alkaloid và flavonoid phân lập

Xây dựng qui trình định lượng alkaloid, flavonoid

trong lá và tâm Sen bằng phương pháp LC và CE

Ứng dụng xác định đặc tính Ứng dụng định lượng alkaloid,

điểm chỉ của các alkaloid và flavonoid trong nguyên liệu và

flavonoid có trong lá, tâm Sen chế phẩm từ lá, tâm Sen

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ trình tự các nội dung nghiên cứu

2.4.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid có trong

lá và tâm Sen

2.4.1.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá, tâm Sen

Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật trong lá Sen được thực hiện theo

quy trình phân tích của I. Ciuley được cải tiến bởi ĐHYD TP. HCM.

Định tính thành phần hóa học trong dịch chiết dược liệu dựa vào phản ứng

tạo tủa, tạo màu đặc trưng của các nhóm hợp chất.

Định tính thành phần alkaloid, flavonoid trong dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng và

hiện màu với thuốc thử Dragendorff, FeCl3 1% trong cồn.

2.4.1.2. Chiết cao chiết toàn phần alkaloid và flavonoid từ lá, tâm Sen

Khảo sát dung môi chiết

Khảo sát dung môi chiết được thiết kế theo Bảng 2.4 cho cả lá và tâm Sen.

Bảng 2.4. Khảo sát dung môi chiết alkaloid, flavonoid từ lá, tâm Sen.

Bình

Làm ẩm

Khối lượng

Dung

Thể tích

Thời gian

nón

30 phút

tâm Sen, lá

môi

(ml)

ngâm (giờ)

Sen (g)

không

Nước

100

không

Cồn 45%

100

không

Cồn 70%

100

không

Cồn 90%

100

không

Cồn 96 %

100

Acid tartric 1%

Nước

100

Acid tartric 1%

Cồn 45%

100

Acid tartric 1%

Cồn 70%

100

Acid tartric 1%

Cồn 90%

100

Acid tartric 1%

Cồn 96 %

100

Bột lá, tâm Sen được chiết bằng phương pháp ngâm lạnh lần lượt với các

dung môi trên, so sánh khối lượng cắn toàn phần và khối lượng tủa thu được khi

cho phản ứng với thuốc thử Valse Mayer và phản ứng Cyannidin. Từ đó,

chọn được dung môi thích hợp dùng trong chiết xuất alkaloid và flavonoid [12].

Chiết cao chiết toàn phần alkaloid và flavonoid từ lá Sen

Qui trình chiết xuất cao chiết toàn phần alkaloid và flavonoid từ lá Sen được trình

32 kg bột lá Sen

+ Dung môi chiết thích hợp, ngâm lạnh, trung hòa dịch chiết đến pH=5.

+ Cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

Dịch chiết đậm đặc (25 lít)

bày trong sơ đồ 2.2.

Tủa B (1290 g)

+ Thêm H2SO4 2% đến pH =1-2,

TT. Bertrand 5%

+ Chiết loại tạp với PE,

+ Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

Dịch chiết pH = 1-2

Cao alkaloid N (71,3 g)

Chiết với EtOAc, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

Dịch acid pH = 1-2

Tủa F (130,6 g)

+ Thêm NH4OH (đđ) đến pH = 3-4,

+ Chiết CHCl3, thu hồi CHCl3 dưới áp suất giảm

Dịch nước pH = 3-4

Cao A1 (57,4 g)

+ Thêm NH4OH (đđ) đến pH 5-6,

+ Chiết CHCl3, thu hồi CHCl3 dưới áp suất giảm

Dịch nước pH = 5-6

Cao A2 (102,6 g)

+ Thêm NH4OH (đđ) đến pH 8-9,

+ Chiết CHCl3, thu hồi CHCl3 dưới áp suất giảm

Dịch kiềm pH = 8-9

Cao A3 (50,8 g)

Sơ đồ 2.2. Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid

từ lá Sen bằng chiết phân bố lỏng-lỏng.

Chiết cao chiết toàn phần alkaloid và flavonoid từ tâm Sen

Qui trình chiết suất cao chiết toàn phần alkaloid và flavonoid từ tâm Sen được

40 kg bột tâm Sen

+ Dung môi chiết thích hợp, ngâm lạnh, trung hòa dịch chiết đến pH=5.

+ Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm.

Dịch chiết đậm đặc (30 lít)

+ Thêm H2SO4 2% đến pH =1-2, chiết phân bố loại tạp với PE.

+ Dịch acid để lạnh qua đêm, có kết tủa thô, lọc kết tinh

Dịch lọc acid pH = 1-2

trình bày trong Sơ đồ 2.3.

Kết tủa thô EN-1 (17,6 g)

Chiết với EtOAc, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

Cao EF (125,4 g)

Dịch lọc acid pH = 1-2

NH4OH 25% đến pH = 10-11, chiết với CHCl3

Dịch kiềm

Dịch chiết CHCl3

Chiết với NaOH 2% x 3 lần

Chiết với n-BuOH Cô áp suất giảm

Lớp CHCl3

Phân đoạn n-Bu (33,6 g)

Dịch NaOH

Cô áp suất giảm

+ Trung hòa đến pH 9 bằng NH4Cl 10%, + Chiết với CHCl3, cô áp suất giảm

Phân đoạn NP

Phân đoạn P (63,4 g)

+ Thêm H2SO4 2%, điều chỉnh đến pH=5 với NH4OH 25%, + Chiết với CHCl3, cô áp suất giảm

Phân đoạn NP5 (135,7 g)

Dịch chiết pH 5

+ Điều chỉnh đến pH=8 với NH4OH 25%, + Chiết với CHCl3, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Dịch chiết pH 8

Phân đoạn NP8 (112,5 g)

Sơ đồ 2.3. Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid

từ tâm Sen bằng chiết phân bố lỏng-lỏng.

Phương pháp tạo tủa alkaloid lá Sen với TT. Bertrand thu cao N

Cho alkaloid trong tủa B kết tủa với thuốc thử chung của alkaloid là Bertrand.

Alkaloid được hoàn nguyên bằng cách kiềm hóa với NaOH 2 % và

490 g tủa B

Acid sulfuric 2%, lọc

Dịch chiết nước acid

TT. Bertrand 5%

Tủa với TT. Bertrand

chiết với chloroform.

+ Tủa được rửa với nước acid sulfuric 0,5%

+ Ly tâm 9600 vòng/phút x 20 phút, làm khô

+ Rửa tủa lần lượt với CHCl3, EtOAc

Tủa Bertrand sau xử lý + Hòa trong NaOH 2% + Chiết với CHCl3

Cao N (21,3 g)

Sơ đồ 2.4. Chiết xuất cao N từ cắn B bằng phương pháp tạo tủa với TT. Bertrand

2.4.1.3. Phân lập các alkaloid và flavonoid từ lá và tâm Sen

Cao A1, A2, A3, cao N, tủa F của lá Sen và các phân đoạn NP5, NP8, P, n-Bu, cao

EF của tâm Sen được sử dụng để phân lập hợp chất tinh khiết.

Sắc ký cột chân không

Mục đích: tách cao A2, tủa F từ lá Sen thành các phân đoạn đơn giản hơn.

Bảng 2.5. Điều kiện tiến hành VLC phân đoạn A2 và tủa F từ lá Sen

Cao A2

Tủa F

60 x 6

30 x 9

22,6

25,6

600

Tiến hành Kích thước cột: dài (cm) x đường kính trong (cm) Khối lượng mẫu (g) Khối lượng silica gel (40-63µm) sử dụng (g)

Dung môi hòa tan mẫu

MeOH

Nhồi cột

Nhồi khô

Nạp mẫu Thể tích hứng phân đoạn (ml) Dung môi rửa giải ban đầu

CHCl3 Nhồi ướt và ổn định cột bằng CHCl3 Nạp mẫu lỏng 250 100% CHCl3

Dung môi rửa giải tiếp theo

CHCl3- EtOAc với bước tăng dung môi EtOAc từ 0,5-1%

nm;

254

365,

TT.

FeCl3,

Kiểm tra alkaloid, flavonoid trong các phân đoạn

Nạp mẫu khô 250 100% CHCl3 CHCl3-EtOAc; EtOAc- MeOH với bước tăng dung môi EtOAc hay MeOH phù hợp UV flavonoid: EtOAc-MeOH-H2O-acid formic (100:17:13:0,5)

Gộp phân đoạn giống nhau

UV 365, 254 nm, alkaloid: TT. Dragendorff, CHCl3- MeOH - NH4OH (96:4:0,5) Các phân đoạn có thành phần giống nhau trên SKLM được gộp chung, thu hồi dung môi, thu kết tinh hay kết tủa nếu có.

Sắc ký cột cổ điển

Mục đích: phân lập alkaloid từ cao A3, cao N, phân đoạn NP5, NP8 và

flavonoid từ cao EF.

Bảng 2.6. Điều kiện tiến hành sắc ký cột cổ điển các cao A3, cao N lá Sen

Cao A3

Cao N

60 x 6

10,6

21,30

500

CHCl3 Nhồi ướt và ổn định cột bằng CHCl3

Nạp mẫu lỏng

Nạp mẫu khô

Tiến hành Kích thước cột: dài x đường kính trong (cm) Khối lượng mẫu (g) Khối lượng silica gel (40–63 µm) (g) Dung môi hòa tan mẫu Nhồi cột Nạp mẫu Thể tích hứng phân đoạn (ml) Dung môi rửa giải ban đầu Dung môi rửa giải tiếp theo Kiểm tra alkaloid, flavonoid trong các phân đoạn

15 100% CHCl3 CHCl3-MeOH với bước tăng dung môi phân cực từ 0,5-1 % UV 365, 254 nm, alkaloid: Dragendorff, CHCl3–MeOH-NH4OH (96:4:0,5)

Thu gom phân đoạn giống nhau

Các phân đoạn có thành phần giống nhau trên SKLM được gộp chung, thu hồi dung môi, thu kết tinh hay kết tủa nếu có.

Bảng 2.7. Điều kiện tiến hành sắc ký cột cổ điển phân đoạn NP5, NP8,

cao EF tâm Sen.

Phân đoạn NP5, NP8

Cao EF

60 x 6

25,70 (NP5); 22,5 (NP8)

25,6

700

350

Tiến hành Kích thước cột: dài x đường kính trong (cm) Khối lượng mẫu (g) Khối lượng silica gel (40-63µm) (g) Dung môi hòa tan mẫu Nhồi cột

CHCl3 Nhồi ướt

MeOH Nhồi khô

Nạp mẫu lỏng

Nạp mẫu khô

Nạp mẫu Thể tích hứng phân đoạn (ml) Dung môi rửa giải ban đầu

15 100% CHCl3

Dung môi rửa giải tiếp theo

tăng dung môi

CHCl3- EtOAc, MeOH, H2O với bước nước thấp.

TT.

FeCl3,

Kiểm tra alkaloid, flavonoid trong các phân đoạn

UV 365, 254 nm, flavonoid: EtOAc-MeOH-H2O-acid formic (100:17:13:0,5)

NP5: hệ CHCl3-MeOH NP8: hệ aceton- MeOH với bước tăng dung môi MeOH từ 0,25-0,5 %. UV 365, 254 nm, alkaloid: TT. Dragendorff, CHCl3-MeOH-NH4OH (96:4:0,5) Các phân đoạn có thành phần giống nhau trên SKLM được gộp chung, thu hồi dung môi, thu kết tinh hay kết tủa nếu có

Thu gom phân đoạn giống nhau

Sắc ký cột trên Sephadex LH-20

Mục đích: Phân tích và phân lập các chất từ các phân đoạn sắc ký cột:

Thu phân đoạn alkaloid P1-P3 từ phân đoạn P và n-Bu1 và n-Bu3 tinh khiết hơn

từ n-BuOH. Phân lập flavonoid từ phân đoạn F1, F6, F8 của tủa F; phân đoạn

EF-1-2 từ cao EF.

Bảng 2.8. Điều kiện tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 các phân đoạn

F1, F6, F8; EF-1-2; phân đoạn P và n-Bu.

Cột Sephadex

LH-20

Kiểm tra phân đoạn thu hứng

Phân đoạn

Dung môi hòa tan mẫu

Cột Sephadex LH-20 MeOH (1,2 m x 3 cm)

hệ

dung môi

x x x

DCM-aceton (85:15) (1,2 m x 3 cm)

F1 MeOH F6 MeOH MeOH F8

formic

UV 365, 254 nm; TT. FeCl31%/cồn SKLM với EtOAc-MeOH-H2O-acid (100:17:13:0,5)

x x x

EF-1 MeOH EF-2 MeOH MeOH n-Bu

dung môi

với

dung môi

DCM- aceton (85:15)

UV 365, 254 nm; TT. Dragendorff hệ SKLM EtOAc-MeOH-NH4OH (6:2:2). UV 365, 254 nm, TT. Dragendorff SKLM hệ CHCl3-MeOH-NH4OH (90:10:0,5)

Sắc ký lỏng bán điều chế

Mục đích: phân lập alkaloid từ phân đoạn A2-1,A2-2, A2-3, A2-6, A2-8, A2-11,

A2-12 của cao A2, phân đoạn n-BuII và flavonoid từ EF-3 của cao EF tâm sen,

phân đoạn F6-3 của tủa F lá sen.

Điều kiện sắc ký

- Cột sắc ký: Phenomenex Synergi Fusion (250 x 10 mm; 5 µm); Phenomenex

Synergi RP-Max (250 x 10 mm; 5 µm); Phenomenex Synergi Fusion (250 x 4,6

mm; 5 µm); Phenomenex Synergi RP-Max (250 x 4,6 mm;

Alkaloid: TEA 0,05% trong nước (pH được điều chỉnh từ 7-10 bằng dung dịch

acid acetic 50%): ACN với chế độ dung môi, đẳng dòng hay gradient.

Flavonoid: acid formic 0,1 % pha trong nước, ACN, MeOH được khảo sát với

chế độ dung môi, đẳng dòng hay gradient.

- Thể tích tiêm mẫu: 50 – 500 µL. Tốc độ dòng: 2 – 5 ml/phút.;

- Nhiệt độ cột: 20 - 40 oC.

- Bước sóng phát hiện: được lựa chọn dựa trên phổ UV-Vis

của nhóm hợp chất cần phân tích.

- Mẫu được hòa tan trong methanol hoặc pha động ở nồng độ 1-3 mg/mL,

hỗ trợ bằng siêu âm. Sau đó mẫu được lọc qua màng lọc milipore 0,45μm

trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký.

- Hứng các phân đoạn dựa vào các pic trên sắc ký đồ. Kiểm tra các phân đoạn

alkaloid và flavonoid bằng SKLM (soi UV 254, 365 nm và thuốc thử

Dragendorff hoặc FeCl3), HPLC-PDA phân tích. Các phân đoạn có thành phần

giống nhau được gộp chung, cô thu hồi dung môi.

Sắc ký phân bố ly tâm nhanh (FCPC)

Mục đích: phân lập alkaloid có độ phân cực mạnh từ phân đoạn P-2.

Một số hệ dung môi hai pha không đồng tan được thăm dò sao cho sự phân bố của

các alkaloid cần tách khác nhau rõ ràng trên hai pha.

Bảng 2.9. Các điều kiện dung môi hai pha không đồng tan dự kiến thăm dò cho

FCPC phân đoạn P-2.

Hệ dung môi hai pha

Pha động Pha tĩnh

Pha dưới

Pha trên

Pha trên Pha trên

Đánh giá sự phân bố của alkaloid trên hai pha + SKLM với hệ dung môi CHCl3-MeOH-NH4OH (90:10:0,5) +TT. Dragendorff + HPLC-PDA (dự kiến)

EtOAc-CHCl3-MeOH-H2O (1:6:4:1) CHCl3-MeOH-HCl 0,1 M (4:4:2) Pha dưới Pha dưới CHCl3- Aceton- MeOH- HCl 0,1 M (6:1:2:1)

Pha trên

Pha dưới

Pha dưới Pha dưới

Pha trên Pha trên

Pha dưới

Pha trên

Cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) Pha động: ACN-TEA 0,05%, rửa giải gradient Mẫu tiêm: pha trên và pha dưới được cô đến cắn và hòa tan trong MeOH, lọc qua màng lọc 0,45µm

n-hexan-EtOAc-MeOH: H2O (3:5:3:5) CHCl3-ACN-TEA 0,2% (4:2:3) CHCl3- MeOH- TEA 0,2% (4:2:3) CHCl3-MeOH- H2O- NH3 (4:2:2:0,5)

Tiến hành hứng các phân đoạn (thể tích 15 mL/phân đoạn) ứng với các

hệ dung môi. Các phân đoạn có thành phần giống nhau trên SKLM được

gộp chung, cô thu hồi dung môi, cân khối lượng kết tinh hay tủa thu được.

2.4.1.4. Xác định độ tinh khiết và cấu trúc chất phân lập

Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Tiến hành sắc ký lớp mỏng hoạt chất phân lập được với 3 hệ dung môi khác nhau,

có độ phân cực sao cho 3 sắc ký đồ cho 3 vết có Rf lần lượt nằm trong khoảng 0,3;

0,5 và 0,8. Nếu sắc ký đồ chỉ có một vết sắc ký dưới đèn 254, 365nm và với thuốc

thử Dragendorff hay FeCl3/cồn và VS của chất phân lập được trên cả 3 hệ dung môi

thì chất phân lập được xem là tinh khiết SKLM[5].

Phương pháp HPLC/PDA

- Hòa tan chất phân lập được bằng MeOH của Merck để được dung dịch có nồng

độ khoảng 1000 ppm. Tiến hành sắc ký với điều kiện thích hợp.

- Kiểm tra độ tinh khiết của pic cũng như đánh giá % tinh khiết chất phân lập

bằng cách áp dụng phương pháp qui về 100% diện tích pic[5].

Xác định cấu trúc chất phân lập

Nếu các chất có độ tinh khiết sắc ký trên 95% thì sẽ được tiến hành đo phổ UV-Vis,

IR, MS và NMR (1H, 13C, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY) để xác định

cấu trúc và so sánh với các dữ liệu phổ đã công bố (nếu có).

2.4.2. Thiết lập một số chất đối chiếu alkaloid, flavonoid phân lập

từ lá và tâm Sen

Các alkaloid, flavonoid được lựa chọn để thiết lập chất đối chiếu phải là những chất

đại diện, chiếm hàm lượng lớn trong cây, có tác dụng sinh học cũng như có qui

trình phân lập ổn định, khối lượng phân lập được nhiều (> 500 mg) với độ tinh khiết

sắc ký cao (> 95%) để thiết lập chất đối chiếu (CĐC). Các bước thực hiện dựa theo

hướng dẫn của các tài liệu do ASEAN ấn bản về quy trình thiết lập CĐC,

cụ thể như sau:

2.4.2.1. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng CĐC

- Dữ liệu chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập

hồ sơ nhận dạng CĐC. Việc nhận dạng chất dựa vào:

 So sánh phổ của chất phân tích với phổ chất chuẩn trong cùng điều kiện.

 So sánh thông tin phổ, dữ liệu hóa lí, hằng số vật lí của chất với tài liệu khoa

học hoặc thông tin đã công bố. Tập hợp các dữ liệu chuẩn đó có thể khẳng

định được hợp chất là đúng đối tượng nghiên cứu.

- Các phương pháp được sử dụng để xây dựng bộ dữ liệu gồm có:

 Đo điểm chảy

 Đo phổ tử ngoại khả kiến (dung môi MeOH); đo phổ hồng ngoại

(trong KBr); đo phổ khối lượng (MS).

 Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR (1H, 13C, DEPT) và 2D-NMR

(COSY, HMBC, HSQC).

2.4.2.2. Xây dựng qui trình xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập

chât đối chiếu

Phương pháp HPLC/PDA

Mỗi CĐC được xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký với các điều kiện

phân tích tương ứng với từng mẫu.

Quy trình được khảo sát tính phù hợp của hệ thống và thẩm định theo đúng

yêu cầu của quy trình phân tích định lượng bằng HPLC.

Áp dụng phương pháp HPLC và qui về 100% diện tích pic để xác định

độ tinh khiết của CĐC.

Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng và/hoặc nhiệt vi sai (TGA/DSC)

Xác định độ tinh khiết và hàm ẩm. Gia nhiệt tốc độ 1 oC/ phút đến qua khỏi nhiệt

độ nóng chảy của mẫu khoảng 50 oC, lưu lượng dòng khí nitơ 50 ml/ phút.

Mỗi mẫu xác định 3 lần, lấy kết quả trung bình.

2.4.2.3. Xây dựng TCCS đánh giá nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu

- Căn cứ vào tính chất lý - hóa của nguyên liệu thiết lập CĐC và các CTCL

thông thường của CĐC gốc để xây dựng các CTCL của CĐC

cần thiết lập. Chất đối chiếu đạt yêu cầu như CĐC hóa học thứ cấp dùng cho

phép thử định lượng. Các chỉ tiêu chất lượng (CTCL) và phương pháp đánh giá

được xây dựng dựa trên

 Tham khảo DĐVN và các dược điển quốc tế để lựa chọn phương pháp phù

hợp đánh giá các CTCL.

 Khảo sát lựa chọn chương trình sắc kí thích hợp để định lượng và xác định

tạp chất.

 Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu: theo hướng dẫn ICH

- Các CTCL đề xuất xây dưng bao gồm: tính chất, độ ẩm, định tính,

độ tinh khiết và tạp chất liên quan.

Yêu cầu kỹ thuật

Tính chất: Mô tả dạng định hình, mùi vị, độ tan của CĐC.

Độ ẩm: Được xác định theo phụ lục 9.6 DĐVN4 hoặc bằng phương pháp

phân tích nhiệt trọng lượng (TGA).

Định tính

Nhóm I: Phổ IR của CĐC phải có các dao động đặc trưng cho cấu trúc hóa học của

CĐC đó và phù hợp với các dữ liệu đã công bố.

Nhóm II: Điểm chảy và năng suất quay cực của CĐC thực hiện theo hướng dẫn của

phụ lục 6.7 và 6.4, DĐVN4 hoặc sử dụng phương pháp phân tích nhiệt vi sai.

Nhóm III: Dựa vào dữ liệu phổ học của CĐC phân lập được: UV, IR, MS, NMR.

Độ tinh khiết

Phương pháp HPLC/PDA: Xác định độ tinh khiết sắc ký bằng phương pháp HPLC-

PDA (190-800nm), % độ tinh khiết của CĐC được tính bằng phương pháp qui về

100% diện tích pic. Diện tích của pic chính phải trên 95 % so với tổng diện tích các

pic trên SKĐ. Bỏ qua pic của pha động và pic có S/N < 2/1.

Phương pháp phân tích nhiệt vi sai (DSC): xác định độ tinh khiết của hợp chất dựa

vào biến thiên nhiệt độ trong mẫu.

Tạp chất liên quan

Lượng tạp chất được xác định bằng số lượng các pic tạp trên sắc ký đồ

HPLC-PDA. Hàm lượng tạp được đánh giá dựa trên tổng diện tích các pic phụ (nếu

có) so với tổng diện tích các pic bao gồm cả pic chính của CĐC. Bỏ qua pic của pha

động và pic có S/N < 2/1, hàm lượng tạp chất phải dưới 5 % so với tổng diện tích

các pic trên SKĐ.

2.4.2.4. Thiết lập CĐC

Các chất thiết lập CĐC sau khi được đánh giá đạt yêu cầu chất lượng được đóng

thành từng lọ nhỏ có khối lượng thích hợp. Sử dụng lọ thủy tinh nâu hàn kín, có lớp

đệm teflon đạt tiêu chuẩn chất lượng theo quy định, dán nhãn tạm ghi tên hoạt chất

và đánh số thứ tự từng lọ. Việc đóng gói được thực hiện trong glove-box: nạp khí

nitơ 99,99%; độ ẩm tương đối trong buồng đóng ≈ 40%.

Đánh giá đồng nhất lọ

Phòng thí nghiệm đánh giá: chọn phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP hoặc

ISO 17025 để tiến hành đánh giá đồng nhất lô.

Thực hiện tại Khoa Thiết lập chất chuẩn- chất đối chiếu (PTN-1),

Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm (PTN-2), Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh

và Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thực phẩm mỹ phẩm Cần Thơ (PTN-3).

Lấy mẫu: sử dụng cách lấy ngẫu nhiên theo phần mềm Excel, số lọ được lấy để

kiểm tra: lọ, trong đó N là số lọ đóng được.

Xác định hàm lượng: áp dụng quy trình xác định độ tinh khiết để tiến hành xác định

hàm lượng, mỗi lọ được kiểm tra 2 lần, thống kê kết quả thu được.

Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon

Đánh giá đồng nhất giữa các lọ: đánh giá theo ISO Guide 35 [41]. Các lọ được xem là

đồng nhất khi

Sr: độ lệch chuẩn lăp lại; n: số lần lặp lại của kết quả đo

ubb: độ không đảm bảo đo từ độ đồng nhất giữa các lọ

Thực tế khó đạt được yêu cầu trên nên có thể áp dụng công thức chuyển đổi sau

để tính ubb

MSwithin: trung bình bình phương trong từng nhóm

vMSwithin: bậc tự do của trung bình bình phương trong từng nhóm

Các lọ được xem là đồng nhất khi thỏa mãn bất đẳng thức:

Sbb: độ lệch chuẩn của độ đồng nhất giữa các lọ

MSamong: trung bình bình phương giữa các nhóm

Đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ theo phương pháp thống kê phân tích ANOVA

một yếu tố, so sánh 2 giá trị Ftn và Ftc

o Nếu Ftn< Ftc: kết quả giữa các mẫu là đồng nhất

o Nếu Ftn> Ftc: kết quả giữa các mẫu là không đồng nhất

Đánh giá liên phòng thí nghiệm

Thành phẩm sau khi đóng gói và đánh giá đồng nhất lô đạt yêu cầu được lấy mẫu

ngẫu nhiên và tiến hành định lượng tại hai phòng thí nghiệm độc lập.

Các phòng thí nghiệm được lựa chọn để gửi mẫu phải đạt tiêu chuẩn GLP hoặc

ISO/IEC 17025. Mỗi phòng thí nghiệm sẽ nhận được sáu lọ mẫu ngẫu nhiên kèm

theo qui trình phân tích và các tài liệu liên quan. Trước khi phân tích, mỗi phòng thí

nghiệm sẽ đánh giá lại tính phù hợp của hệ thống. Nếu đạt yêu cầu, tiến hành xác

định độ tinh khiết trên 6 mẫu đã nhận, mỗi mẫu nên được kiểm tra 2 lần

để tránh sai số.

Các phòng thí nghiệm được lựa chọn để gửi mẫu là Khoa kiểm nghiệm mỹ phẩm

(PTN-1) và Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu (PTN-2) thuộc

Viện kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM.

Mỗi phòng thí nghiệm sẽ trả lời kết quả độc lập trên sáu lọ mẫu gởi. Tập hợp

[41].

các kết quả của hai phòng thí nghiệm tham gia (n = 12), đánh giá kết quả

theo ANOVA, so sánh 2 giá trị Ftn và Ftc

- Trường hợp 1: Ftn ≤ Ftc → kết quả trung bình của 2 phòng thí nghiệm khác nhau

không có ý nghĩa, qui trình phân tích có độ lặp lại cao, độ tinh khiết chất phân

tích không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá.

- Trường hợp 2: Ftn ≥ Ftc → kết quả trung bình của 2 phòng thí nghiệm khác nhau

có ý nghĩa, qui trình phân tích có độ lặp lại thấp, độ tinh khiết chất phân tích

thay đổi tùy vào mỗi phòng thí nghiệm tham gia đánh giá.

Xác định giá trị ấn định- giá trị công bố

Ba phòng thí nghiệm tham gia đánh giá các nguyên liệu alkaloid, flavonoid

thiết lập CĐC phân lập từ lá, tâm Sen là: Khoa thiết lập chất chuẩn và CĐC, Khoa

Kiểm nghiệm mỹ phẩm Viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM và Trung tâm kiểm

nghiệm thuốc, thực phẩm, mỹ phẩm Cần Thơ.

Tiến hành xác định giá trị ấn định (công bố) trên phiếu kiểm nghiệm (CoA) [123]

Các giá trị:

x* : trung vị của xi (xi : là giá trị định lượng x tại lần đo i)

s* = 1,483 x trung vị của |xi - x*|

Xác định các giá trị:  = 1,5s*. Khi đó:

xi* = x* - δ nếu xi < x* - δ x* + δ nếu xi > x* + δ x* nếu x* - δ < xi < x* + δ Tính toán các giá trị mới:

với p : tổng các giá trị có kết quả z-score < 2,0

Giá trị ấn định x* (n) được chọn khi giá trị s* không thay đổi sau n lần tính

(lấy 3 số lẻ phía sau dấu phẩy), sử dụng giá trị ấn định x*(n) để đánh giá từng kết

quả phân tích theo test-z, loại bỏ các kết quả phân tích có |z| > 2,0.

Chọn các giá trị |z| ≤ 2,0; tính giá trị trung bình. Sau đó, xác định độ không

đảm bảo đo:

Lập hồ sơ chất chuẩn, dán nhãn lọ chuẩn và kèm phiếu kiểm nghiệm[1]. Bảo quản ở

nhiệt độ 2 - 8 0C, tránh ánh sáng.

2.4.3. Xây dựng qui trình định lượng các alkaloid và flavonoid trong

lá và tâm Sen

Các flavonoid và alkaloid đã được thiết lập chất đối chiếu hay được kiểm tra đạt

độ tinh khiết sắc ký trên 95%, sẽ được sử dụng làm chất đối chiếu trong

định tính, định lượng.

2.4.3.1. Phân tích thành phần alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng

phương pháp điện di mao quản (CZE-PDA-MS hay CZE-PDA)

Các nội dung khảo sát bao gồm các thông số điện di ảnh hưởng đến hiệu năng tách

như: bản chất dung dịch đệm, nồng độ, pH của dung dịch đệm, dung môi hỗ trợ,

điện thế, nhiệt độ mao quản, v.v.

Đánh giá độ phân giải và hệ số bất đối nhằm tìm ra điều kiện điện di thích hợp.

Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống và đánh giá qui trình định lượng alkaloid,

flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng phương pháp điện di mao quản (CE)

theo hướng dẫn của ICH.

Qui trình định lượng đồng thời alkaloid có trong lá Sen hay tâm Sen bằng kỹ

thuật CZE-PDA-MS

Chuẩn bị mẫu thử: 0,5 g mẫu nguyên liệu lá hay tâm Sen có thể được chiết bằng

MeOH, EtOAc, nước acid hoặc kiềm hóa bằng vài giọt NH4OH 25% và chiết bằng

CHCl3,…với sự hỗ trợ của siêu âm đến khi chiết kiệt alkaloid. Dịch chiết được tách

riêng bằng ly tâm và được bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm. Cắn được hòa tan

trong MeOH và lọc qua màng lọc 0,45 µm vào bình định mức 10 mL, MeOH được

bổ sung đến 10 ml.

Chuẩn bị mẫu hỗn hợp chuẩn: Dung môi hòa tan mẫu đối chiếu là MeOH với

nồng độ (ppm) thay đổi tùy theo qui trình phân tích và hàm lượng alkaloid,

flavonoid có trong mẫu nguyên liệu.

Thiết bị: hệ thống CE Agilent G7100A, đầu dò PDA, có giao diện ghép khối phổ.

Cột mao quản silica nung chảy chiều dài hiệu dụng 62 cm (với đầu dò PDA),

90 cm (với đầu dò MS), đường kính trong 50 µm.

Điều kiện điện di khảo sát:

- Dung dịch đệm: amoni acetat, amoni formiat..., với nồng độ khảo sát từ

20 -100 mM. pH được điều chỉnh từ 7,5-10 bằng TEA.

- Dung môi hỗ trợ: ACN, MeOH, THF, isopropanol,…;

- Chất diện hoạt: SDS, CTAB, DTAB,…

- Điện thế: 20-30 kV; nhiệt độ mao quản: 15-40 oC

- Bước sóng phát hiện: 225, 254, 272, 284 nm

Điều kiện khối phổ khảo sát: Đầu dò MS Brucker Esquire 3000 plus ion trap.

ESI positive, khí bao (N2): 2-10 psi, khí làm khô (N2): 4 lít/ phút, nhiệt độ

250 oC, điện thế đầu phun: 2,5-5 kV, chất lỏng bao MeOH-H2O (1:1) với 0,6 % acid

acetic băng.

Qui trình định lượng đồng thời flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng kỹ thuật

CZE-PDA

Mẫu thử: 0,5 g mẫu nguyên liệu lá hay tâm Sen có thể được chiết bằng MeOH,

EtOH, EtOAc, acid hóa bằng vài giọt H2SO4 2% và chiết bằng EtOAc, với sự hỗ trợ

siêu âm và ly tâm đến khi chiết kiệt flavonoid, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm,

hòa tan cắn bằng MeOH và lọc qua màng lọc 0,45 µm vào bình định mức 10 mL,

bổ sung MeOH vừa đủ, lắc đều.

Thiết bị: hệ thống CE Agilent G7100A, đầu dò PDA. Cột mao quản silica

nung chảy, chiều dài hiệu dụng 62 cm, đường kính trong 50 µm.

Điều kiện điện di khảo sát:

- Dung dịch đệm: borat, formiat, phosphat...với nồng độ khảo sát từ 20-100 mM.

pH được điều chỉnh từ 7,5-10 bằng acid boric 5%

- Dung môi bổ trợ: ACN, MeOH, THF, isopropanol,…

- Chất diện hoạt: SDS, CTAB,…; tác nhân đối quang: α-, β-cyclodextrin…

- Điện thế: 20-30 kV; nhiệt độ mao quản: 15-40 oC

- Bước sóng phát hiện: 210, 220, 254 nm

2.4.3.2. Phân tích thành phần alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng

phương pháp HPLC-PDA

Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến hiệu năng tách trong sắc ký lỏng pha đảo như:

bản chất pha tĩnh; thành phần, pH và tỷ lệ dung môi pha động; kiểu rửa giải, nhiệt

độ cột; bước sóng phát hiện,…Tiến hành đánh giá độ phân giải và hệ số bất đối để

tìm điều kiện sắc ký thích hợp. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống và đánh giá qui

trình định lượng theo hướng dẫn của ICH.

Qui trình định lượng đồng thời alkaloid có trong lá Sen hay tâm Sen bằng kỹ

thuật HPLC-PDA

Chuẩn bị mẫu thử: 0,5 g mẫu nguyên liệu lá hay tâm Sen có thể được chiết bằng

cồn, cồn acid, nước acid, hoặc kiềm hóa bằng amoniac rồi chiết với dung môi

CHCl3 với sự hỗ trợ của siêu âm, nhiệt…, dịch chiết được loại tạp bằng n-hexan,

kiềm hóa bằng ammoniac đến pH 8-9, chiết bằng CHCl3 đến khi chiết kiệt alkaloid,

dung môi được bốc hơi dưới áp suất giảm, cắn được hòa tan bằng MeOH hoặc pha

động và lọc qua màng lọc 0,45 µm vào bình định mức 10 mL, bổ sung MeOH hoặc

pha động vừa đủ.

Chuẩn bị mẫu hỗn hợp chuẩn: Dung môi hòa tan mẫu chuẩn là với nồng độ (ppm)

thay đổi tùy theo qui trình phân tích và hàm lượng alkaloid, flavonoid có trong mẫu

nguyên liệu.

Điều kiện sắc ký khảo sát:

- Cột sắc ký: Phenomenex Lunar C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm)

Phenomenex Gemini C8 (250 x 4,6 mm; 5 μm)

Phenomenex Synergi C18- fusion (250 x 4,6 mm; 4 μm)

- Pha động: ACN - TEA 0,1% trong nước được điều chỉnh pH 7-11 bằng acid

acetic 50%. Chương trình rửa giải đẳng dòng hay gradient

- Nhiệt độ cột: 20-40 oC; thể tích tiêm mẫu: 5-30 μL

- Bước sóng phát hiện: 225, 254, 272, 284 nm

Qui trình định lượng đồng thời flavonoid có trong lá Sen hay tâm Sen bằng kỹ

thuật HPLC-PDA

Chuẩn bị mẫu thử: 0,5 g mẫu nguyên liệu lá hay tâm Sen có thể được chiết bằng

MeOH, EtOH, EtOAc, acid hóa bằng vài giọt H2SO4 2% và chiết bằng

EtOAc,…với sự hỗ trợ của siêu âm, nhiệt…, đến khi chiết kiệt flavonoid, dung môi

được bốc hơi dưới áp suất giảm, cắn được hòa tan bằng MeOH hoặc pha động và

lọc qua màng lọc 0,45 µm vào bình định mức 10 mL, bổ sung MeOH hoặc

pha động vừa đủ. Điều kiện sắc ký khảo sát:

- Cột sắc ký: sử dụng cột sắc ký tương tự như trên.

động: hỗn hợp dung môi ACN, MeOH, acid formic - Pha

0,1% trong nước được rửa giải theo kiểu đẳng dòng hay gradient

- Nhiệt độ cột: 20-40 oC; thể tích tiêm mẫu: 5-30 μL

2.4.3.3. Xác định các đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen

- Bước sóng phát hiện: 210, 220, 254 nm

Phương pháp SKLM

Mẫu thử: Alkaloid, flavonoid toàn phần (NN-1a) từ lá Sen, và NE-1a từ tâm Sen,

được chiết dựa trên qui trình chiết thích hợp tìm được từ mục 2.4.6. Mẫu đối chiếu:

mẫu hỗn hợp chuẩn tâm Sen phải có các vết alkaloid, flavonoid chính là những chất

có hàm lượng cao trong cây, đại diện và có tác dụng sinh học tương ứng.

Phương pháp HPLC và CE

Từ kết quả ứng dụng qui trình định lượng để xác định thành phần alkaloid,

flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu lá, tâm Sen được thu hái vào mùa thu hái

khác nhau từ ba vùng miền khác nhau của Việt Nam, tiến hành xác định đặc tính

điểm chỉ cho lá, tâm Sen của từng vùng, miền, mùa thu hái dựa trên thành phần

alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen.

Đánh giá: dựa trên SKĐ, ĐDĐ xác định thời gian lưu (tR/LC) hay thời gian

dịch chuyển (tM/CE) và diện tích đỉnh của các pic chính cũng như tỷ lệ

diện tích đỉnh giữa các pic chính của alkaloid, flavonoid trong mẫu nguyên liệu

nhằm rút ra các đặc tính điểm chỉ của nguyên liệu lá, tâm Sen ghi nhận sự khác

nhau về thành phần, tỉ lệ các chất theo đặc điểm khí hậu, thổ nhưỡng,

vùng thu hái, mùa thu hái.

2.4.4. Ứng dụng qui trình định lượng để định tính, định lượng các alkaloid,

flavonoid có trong lá, tâm Sen và chế phẩm

Qui trình định tính, định lượng đã xây dựng được áp dụng để đánh giá

đặc tính điểm chỉ và hàm lượng các alkaloid và flavonoid có trong nguyên liệu

lá, tâm Sen được thu hái từ những vùng thu hái khác nhau về thổ nhưỡng,

khí hậu và các chế phẩm thuốc hay thực phẩm chức năng được bào chế từ hai

nguyên liệu này.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid

từ lá và tâm Sen

3.1.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá và tâm Sen

Định tính các nhóm hợp chất theo quy trình chiết của I. Ciuley cho thấy trong lá Sen

có chứa chủ yếu alkaloid, flavonoid, triterpenoid, chất béo, saponin, tannin.

Trong tâm Sen chứa chủ yếu các alkaloid, flavonoid, polyphenol, saponin, chất béo,

triterpenoid, tannin, acid hữu cơ.

3.1.2 Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen

3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết: Kết quả được trình bày ở Bảng 3.1 và 3.2

Bảng 3.1. Kết quả chiết cắn toàn phần từ lá, tâm Sen

Bình

Dung môi chiết

Cắn toàn phần lá Sen (g) 0,8652

Cắn toàn phần tâm Sen (g) 1,6435

Nước

2 3 4 5 6 7 8 9 10

1,1424 1,1614 0,7829 0,6035 1,5210 1,7031 1,6441 1,1948 1,3516

1,4684 1,5977 1,2973 0,9851 1,7922 1,7732 1,6102 1,5927 1,4896

Cồn 45 % Cồn 70% Cồn 90% Cồn 96 % Nước acid tartric 1 % Cồn 45% acid tartric 1 % Cồn 70% acid tartric 1 % Cồn 90% acid tartric 1 % Cồn 96% acid tartric 1 %

Bảng 3.2. Kết quả chiết alkaloid, flavonoid toàn phần từ lá, tâm Sen

Dung môi chiết

Tủa alkaloid lá Sen với TT. Mayer(g)

Phản ứng cyanidin dịch chiết lá Sen

Phản ứng cyanidin dịch chiết tâm Sen

Tủa alkaloid tâm Sen với TT. Mayer(g) 0,424 0,4403 0,4501 0,3343 0,1506 0,4681 0,5013 0,5627 0,4424 0,3144

+ + + + + ++ ++ +++ ++ ++

0,0962 0,1763 0,1740 0,1746 0,1151 0,1341 0,185 0,2087 0,1899 0,1938

+ + ++ ++ ++ ++ ++ ++++ +++ ++

Nước Cồn 45 % Cồn 70% Cồn 90% Cồn 96 % Nước acid tartric 1 % Cồn 45% acid tartric 1 % Cồn 70% acid tartric 1 % Cồn 90% acid tartric 1 % Cồn 96% acid tartric 1 %

Nhận xét: Dung môi cồn 70% acid tartric 1 % được lựa chọn làm dung môi chiết

xuất cho lá và tâm Sen.

3.1.2.2. Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid lá và tâm Sen

Chiết xuất lá, tâm Sen bằng cồn 70% acid tartric 1% theo Sơ đồ 2.2, 2.3 và 2.4

thu được các cao toàn phần alkaloid A1, A2, A3 (theo gradient pH), cao N và tủa F

từ lá Sen; phân đoạn NP8, P, n-Bu, tủa EF và tủa thô EN-1 từ tâm Sen.

Từ các cao này, tiến hành ứng dụng phương pháp chiết phân bố lỏng- lỏng và các

phương pháp sắc ký để phân lập được 10 alkaloid và 08 flavonoid từ lá Sen;

11 alkaloid và 06 flavonoid từ tâm Sen.

3.1.3. Phân lập các alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen

3.1.3.1. Phân lập alkaloid, flavonoid từ lá Sen

Phương pháp chiết phân bố lỏng- lỏng và sắc ký (sắc ký cột pha thuận, Sephadex LH-

20, sắc ký lỏng bán điều chế pha đảo) đã được ứng dụng cho các phân đoạn alkaloid,

flavonoid thu được từ sơ đồ chiết 2.2 để phân lập được 18 hợp chất bao gồm

10 alkaloid và 08 flavonoid có độ tinh khiết (≥ 95 %) được trình bày ở Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen

Hợp chất tinh khiết đã phân lập

Cao toàn phần

Cao phân đoạn

STT Kí hiệu

Tên hợp chất phân lập

A1 (57,4 g)

Cao Cf-1 A2-1

A2-2

A2-3

A2 (102,6 g) Sử dụng 22,6 g cao A2 cho phân lập

A2-8 A2-11; A2-12

A2-6

Khối lượng (mg) 745,8 83,4 384,3 114,5 84,3 109,5 58,5 80,6 64,5 57,6

LN-1 LN-1 LN-2 LN-8 LN-2 LN-3 LN-4 LN-5 LN-6 LN-7

1 2 3 4 5 6 7 8

A3-3

42,6

LN-9

A3 (50,8 g) Sử dụng 10,6 g cao A3 cho phân lập

N (71,3 g)

sử dụng 21,3 g cho phân lập

A3-4 N2 N6, N7 N10 N14

nuciferin nuciferin 2-O-nornuciferina pronuciferina 2-O-nornuciferina caaverina asimilobina apoglaziovinb nor-armepavina armepavina pronuciferin N-oxidb isoliensinina nuciferin 2-O-nornuciferin caaverin apoglaziovin

94,3 1688,4 342,2 24,4 20,2

LN-10 LN-1 LN-2 LN-3 LN-5

11 12

LN-6 LN-7 LF-1 LF-2

LF-3

Tủa F (130,6) Sử dụng 25,6g cho phân lập

N16 N21,N23 F1-4 F7-3.2 F7-2, F8-2 F7-3.3 F1-2 F1-5 F8-3 F2, F3

norarmepavin armepavin quercetin isoquercitrin quercetin 3-O-β- D-GlcAa hyperina isorhamnetina kaempferola rutina catechina

LF-4 LF-5 LF-6 LF-7 LF-8

58,4 49,8 134,6 76,5 468,2 104,8 14 55,8 15 34,4 16 38,3 17 121,6 18 56,3 a: hợp chất lần đầu tiên được phân lập trong lá Sen loài Nelumbo nucifera tại Việt Nam b: hợp chất lần đầu tiên được công bố trong cây Sen.  Phân lập alkaloid

UV 254

UV 365

Dragendorff

Hình 3.1. SKLM 09 alkaloid phân lập từ lá Sen với hệ dung môi

DCM-MeOH-NH4OH (96:4:0,5)

A1 A2 A3

A1

A1 A2

A3

TP

A2 A3

TP

Hình 3.2. SKLM cao A1, A2, A3 lá Sen với hệ dung môi

DCM-MeOH-NH4OH (96:4:0,5)

Phân lập LN-1 đến LN-8 từ cao A2

Cao A2 được nạp lên cột silica gel pha thuận theo mục 2.4.3.1. Kết quả các phân đoạn

sau triển khai cột được trình bày ở Bảng 3.4 (SKLM tham khảo PL-1.1)

Bảng 3.4. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A2, lá Sen.

Phân đoạn

A2-1 A2-2 A2-3 A2-4 A2-6 A2-7 A2-8 A2-10 A2-11 A2-12

Dung môi rửa giải cột (CHCl3-EtOAc) (100: 0) (100: 0) (100: 0) (99: 0,5) (99:1) (98:2) (97:3) (97:3) (96:4) (96:4)

Khối lượng phân đoạn (mg) 360,8 1340,0 963,5 515,7 526,8 1075,5 367,8 1045,3 352,4 256,4

Các phân đoạn này tiếp tục được phân lập trên hệ thống máy sắc ký lỏng

bán điều chế Thermo Scientific Ultimate 3000, có bộ phận thu hứng mẫu tự động

để thu các alkaloid tinh khiết.

Phân lập LN-1 từ phân đoạn A2-1

Kết quả thu hứng LN-1 từ phân đoạn A2-1 được trình bày ở Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả thu hứng LN-1 từ phân đoạn A2-1

Thời gian thu hứng mẫu

Pic

Kết quả

Thành phần trên TLC

F1 F2 F3

Bắt đầu (phút) 5,13 6,25 7,00

Kết thúc (phút) 5,50 6,80 7,25

Alkaloid Alkaloid Alkaloid+tạp

Không kết tinh LN-1 (83,4 mg) Không kết tinh

Phân lập LN-2, LN-8 từ phân đoạn A2-2

Kết quả thu hứng LN-2, LN-8 từ phân đoạn A2-2 được trình bày ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả thu hứng LN-2, LN-8 từ phân đoạn A2-2

Pic

Kết quả

Kết thúc

Thành phần trên TLC

F1 F2 F3

Thời gian thu hứng mẫu Bắt đầu (phút) 7,50 11,30 17,30

(phút) 8,50 13,25 18,00

Alkaloid Alkaloid Alkaloid+ tạp

LN-8 (114,5 mg) LN-2 (384,3 mg) Không kết tinh

LN-8

LN-2

Hình 3.3. SKĐ HPLC 06 lần tiêm mẫu thu hứng LN-2, LN-8

Phân lập LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3

Kết quả thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3 được trình bày ở Bảng 3.7.

SKĐ thu hứng LN-2, LN-3 tham khảo PL-1.3.

Bảng 3.7. Kết quả thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3.

Peak

Kết quả

Thành phần trên TLC

Bắt đầu (phút)

Thời gian thu hứng mẫu Kết thúc (phút) 9.30 13.80

8.20 12.25

F1 F2

Alkaloid Alkaloid

LN-2 (84,3 mg) LN-3 (109,5 mg)

Phân lập LN-4 từ phân đoạn A2-8

Kết quả thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8 được trình bày ở Bảng 3.8 (PL-1.4)

Bảng 3.8. Kết quả thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8.

Kết quả

Pic

Thời gian thu hứng mẫu Bắt đầu (phút) 14,4

Kết thúc (phút) 16,8

Thành phần trên TLC Alkaloid

LN-4 (58,5 mg)

Phân lập LN-6, LN-7 từ phân đoạn A2-6

Kết quả thu hứng LN-6, LN-7 từ phân đoạn A2-6 được trình bày ở Bảng 3.9.

Kết quả

Pic

Thành phần trên TLC

Thời gian thu hứng mẫu Bắt đầu (phút) 8,1 10,2 15,4

Kết thúc (phút) 9,4 11,3 17,0

Alkaloid Alkaloid Alkaloid

LN-6 (64,5 mg) LN-7 (57,6 mg) Không kết tinh

F1 F2 F3

Bảng 3.9. Kết quả thu hứng LN-6, LN-7 từ phân đoạn A2-6.

Phân lập LN-5 từ phân đoạn A2-11 và A2-12

Kết quả thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11,12 được trình bày ở Bảng 3.10.

SKĐ thu hứng LN-5 (tham khảo PL-1.5).

Bảng 3.10. Kết quả thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11 và A2-12

Kết quả

Pic

Thời gian thu hứng mẫu Bắt đầu (phút) Kết thúc

Thành phần trên TLC

15,0

Alkaloid

LN-5 (80,6 mg)

(phút) 16,4

Phân lập LN-9 và LN-10 từ cao A3

Cao A3 được nạp lên cột silica gel pha thuận theo mục 2.4.3.2. Kết quả các phân đoạn

sau triển khai cột được trình bày ở Bảng 3.11. (SKLM tham khảo PL-1.2)

Bảng 3.11. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A3 lá Sen

Phân đoạn

Sau tinh chế (mg)

A3-1 A3-2 A3-3 A3-4

Dung môi rửa giải cột CHCl3-MeOH (100: 0) (99: 1) (97:3) (95:5 )

Khối lượng phân đoạn (mg) 1278,6 858,7 345,7 534,7

Alkaloid+ tạp Alkaloid + tạp LN-9 (42,6) LN-10 (94,3)

Phân lập alkaloid từ cao N

Cao N thu được theo sơ đồ 2.2. tiếp tục được nạp lên cột silica gel pha thuận theo

mục 2.4.3.2. Kết quả các phân đoạn sau triển khai cột được trình bày ở Bảng 3.12

(SKLM phân đoạn tham khảo PL-1.6)

Bảng 3.12. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao N.

Sau tinh chế (mg)

Dung môi rửa giải cột CHCl3-MeOH 100 :0

Khối lượng phân đoạn (mg) 1065,6

Phân đoạn N1

Alkaloid+tạp

N2 N5 N6, N7 N10 N11 N12 N13 N14 N16 N18 N20 N21 N22 N23

99,5 : 0,5 99,0 : 1,0 99,0 : 1,0 99,0 : 1,0 99,0 : 1,0 99,0 : 1,0 99,0 : 1,0 98,0 : 2,0 95,0 : 5,0 95,0 : 5,0 95,0 : 5,0 95,0 : 5,0 95,0 : 5,0 95,0 : 5,0

1569,7 634,9 961,4 267,8 231,6 156,7 208,5 129,6 118,7 432,6 354,3 134,6 286,3 286,3

LN-1 (1688,45) Alkaloid+tạp LN-2 (342,2) LN-3 (24,4) Alkaloid+tạp Alkaloid+tạp Alkaloid+tạp LN-6 (58,4) LN-7 (49,8) Alkaloid+tạp Alkaloid+tạp LN-5 (20,2) Alkaloid+tạp Alkaloid+tạp

FeCl3 5%

UV 254

UV 365 365nm

 Phân lập flavonoid từ tủa F

Hình 3.4. SKLM 08 flavonoid phân lập từ lá Sen với hệ dung môi

EtOAc-MeOH-H2O-HCOOH (100:17:13:0,5)

Tủa F chứa flavonoid toàn phần được nạp lên cột silica gel pha thuận. Kết quả các

phân đoạn sau triển khai cột được trình bày ở Bảng 3.13 (SKLM phân đoạn

tham khảo PL-1.7).

Bảng 3.13. Kết quả sắc ký cột silica gel trên tủa F, lá Sen

Khối lượng

Dung môi rửa giải cột

Phân đoạn F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9

CHCl3-EtOAc (60:30) CHCl3-EtOAc (50:50) CHCl3-EtOAc (50:50) CHCl3-EtOAc (20:80) CHCl3-EtOAc (0:100) EtOAc-MeOH (99:1) EtOAc-MeOH (80:20) EtOAc-MeOH (50:50) EtOAc-MeOH (20:80)

phân đoạn (mg) 905,8 734,2 306,4 1070,2 486,9 1065,3 1265,4 1160,3 689,7

Phân lập LF-1, LF-5, LF-6 từ phân đoạn F1

F1 được cô tới cắn, hòa tan trong methanol, tiến hành sắc ký rây phân tử trên cột

Sephadex LH-20 (100% MeOH). Kết quả được trình bày ở Bảng 3.14.

Bảng 3.14. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F1

Khối lượng

Phân đoạn F1-2

phân đoạn (mg) 915,8

Tính chất phân đoạn trên SKLM 01 Flavonoid + tạp

Sau tinh chế (mg) LF-5 (34,4)

F1-3

734,2

02 Flavonoid + tạp

Flavonoid+ tạp

F1-4

306,4

02 Flavonoid + tạp

LF-1 (134,6)

F1-5

270,2

01 Flavonoid LF6+ tạp

LF-6 (38,3)

Phân lập LF-8 từ phân đoạn F2, F3

F2, F3 có đặc tính giống nhau nên được gộp chung để nạp cột Sephadex LH-20,

thu được 03 phân đoạn. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.15.

Bảng 3.15. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-2,3

Khối lượng

Phân đoạn F2,3-1 F2,3-2 F2,3-3

phân đoạn (mg) 127,8 436,8 164,2

Tính chất phân đoạn trên SKLM Tạp 01 flavonoid + tạp 02 flavonoid + tạp

Sau tinh chế (mg) Tạp LF-8 (56,3) Flavonoid+ tạp

Phân lập LF-2, LF-3, LF-4 từ phân đoạn F7

F7 được cô tới cắn, hòa tan trong methanol, tiến hành sắc ký trên cột Sephadex

LH-20 thu được 4 phân đoạn. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.16.

Bảng 3.16. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-7

Khối lượng

Sau tinh chế (mg) Tạp

Tính chất phân đoạn trên SKLM Tạp 01 Flavonoid +tạp 03 Flavonoid + tạp 02 Flavonoid+ tạp

LF-3 (468,2) 03 Flavonoid + tạp 02 Flavonoid+ tạp

Phân đoạn F7-1 F7-2 F7-3 F7-4

phân đoạn (mg) 127,8 689,8 194,2 206,4

Phân đoạn F7-3 được triển khai trên sắc ký lỏng pha đảo bán điều chế. Kết quả được

trình bày ở Bảng 3.17.

Bảng 3.17. Kết quả thu hứng LF-2 và LF-4 từ F7-3

Pic

Sau tinh chế (mg)

Thời gian thu hứng mẫu Bắt đầu (phút) Kết thúc (phút)

F7-3.2 F7-3.3

6,1 8,2

7,6 9,2

Thành phần trên TLC Flavonoid Flavonoid

LF-2 (76,5) LF-4 (55,8)

Phân lập LF-3, LF-7 từ phân đoạn F8

F8 được cô tới cắn, hòa tan trong methanol, tiến hành sắc ký rây phân tử trên cột

Sephadex LH-20 (100% MeOH). Kết quả được trình bày ở Bảng 3.18.

Bảng 3.18. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F8.

Khối lượng

Phân đoạn F8-1 F8-2 F8-3 F8-4

phân đoạn (mg) 208,5 267,2 224,8 206,4

Tính chất phân đoạn trên SKLM 01 Flavonoid + tạp 01 Flavonoid + tạp 01 Flavonoid + tạp 02 Flavonoid+ tạp

Sau tinh chế (mg) 01 Flavonoid + tạp LF3 (104,8) LF7 (121,6) 01 Flavonoid + tạp

3.1.3.2. Phân lập alkaloid, flavonoid từ tâm Sen

Các phân đoạn alkaloid, flavonoid thu được từ sơ đồ chiết 2.3. được áp dụng

phương pháp lắc phân bố lỏng- lỏng và các kỹ thuật sắc ký khác nhau (sắc ký cột pha

thuận, Sepahdex LH-20, sắc ký phân bố ly tâm nhanh, sắc ký lỏng bán điều chế pha

đảo) để thu được 11 alkalloid, 6 flavonoid tinh khiết (> 95%) từ tâm Sen được

trình bày trong Bảng 3.19.

Bảng 3.19. Tổng kết các hợp chất tinh khiết phân lập từ tâm Sen

Hợp chất tinh khiết đã phân lập

Cao

Cao toàn phần

phân đoạn

STT

Kí hiệu

Tên

Khối lượng (mg)

Dịch pH 1-2

EN-1

isoliensinin3

17.600

NP5 (135,7 g) Sử dụng 25,7 g cho phân lập

NP8 (112,5 g) Sử dụng 22,5 g cho phân lập

Kết tủa thô EN-1 (23,8 g), tinh chế lại NP5-2 NP5-3 NP5-5 NP5-6 NP8-2 NP8-3 NP8-5 NP8-6

2 3 4 5 6 7 8 9

EN-10 EN-11 EN-3 EN-8 EN-1 EN-2 EN-7 EN-6 EN-4

60,2 102,4 253,6 183,8 748,5 127,8 78,5 81,4 94,7

nuciferin2 pronuciferin2 neferin N-methyl coclaurin3 isoliensinin3 liensinin3 armepavin2 nor-armepavin2 isoliensinin N2’-oxid1

P-2

EN-5

52,8

isoliensinin N2-oxid1

EN-9

lotussin3

P (63,4 g) Sử dụng 18,4 g cho phân lập n-Bu (33,6 g) Sử dụng 10,6g cho phân lập

n-Bu-II Tủa C EF-2 EF-4 EF-6

12 13 14

TF-1 TF-2 TF-3

70,7 87,5 27,6 39,7 185,9

EF-7

TF-4

42,8

Cao EF (125,4 g) Sử dụng 25,4 g cho phân lập

TF-5

45,6

EF-8

TF-6

68,7

calycosin2 isorhamnetin2 vitexin2 scutellarein 7-O-β-D- GlcA methyl ester2 quercitrin2 quercetin 3-O-β-D- GlcA2

1: hợp chất lần đầu tiên được công bố trong thực vật. 2: hợp chất lần đầu tiên được phân lập trong tâm Sen. 3: Hợp chất lần đầu tiên được phân lập trong tâm Sen loài Nelumbo nucifera tại Việt Nam.

UV 254

Dragendorff

UV 365

Hình 3.5. SKLM các alkaloid phân lập từ tâm Sen với hệ dung môi

DCM-MeOH-NH4OH (90:10:0,5)

 Phân lập alkaloid từ tâm Sen

Tinh chế EN-1 từ kết tủa thô của dịch acid pH 1-2

Phần kết tủa thô được hòa tan trong một lượng vừa đủ H2SO4 loãng, lọc qua phễu

thủy tinh xốp, để kết tinh trong tủ lạnh, lọc lấy tinh thể và rửa nhanh bằng nước lạnh

đến khi dịch rửa trung tính, rửa tinh thể với MeOH lạnh, sấy khô trong tủ sấy chân

không. Tiến hành kết tinh lại trong dịch acid như trên hai lần thu được tổng cộng

17,6 g tinh thể hình kim, màu trắng (tinh thể EN-1).

Tách các phân đoạn alkaloid NP5, NP8, P theo gradient pH

Qui trình chiết thu các phân đoạn alkaloid toàn phần theo gradient pH tâm Sen được

tiến hành theo sơ đồ 2.4. Kết quả SKLM tách các phân đoạn được trình bày

ở Hình 3.6. (SKLM hệ 96:10:0,5 tham khảo phụ lục 1.8)

Hình 3.6.. SKLM các phân đoạn NP5, NP8, P tâm Sen với hệ dung môi

DCM-MeOH-NH4OH (96:4:0,5)

Phân lập EN-3, EN-8, EN-10, EN-11 từ phân đoạn NP5

Phân đoạn NP5 chứa chủ yếu các alkaloid kém phân cực đến phân cực trung bình,

nên kỹ thuật sắc ký cột pha thuận với pha tĩnh là silica gel với hệ dung môi rửa giải

CHCl3-MeOH theo mục 2.4.3.2. Kết quả các phân đoạn thu được sau khi triển khai

sắc ký cột được trình bày ở Bảng 3.20 (SKLM tham khảo PL-1.9).

Bảng 3.20. Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP5, tâm Sen.

Phân đoạn

Dung môi rửa giải cột CHCl3- MeOH 100: 0 99,5: 0,5 99: 1 97: 2 96:4

Khối lượng phân đoạn (mg) 1780,8 279,7 386,5 515,7 826,8

Sau tinh chế (mg) Tạp EN-10 (60,2) EN-11 (102,4) EN-3 (253,6) EN-8 (183,8)

NP5-1 NP5-2 NP5-3 NP5-5 NP5-6

Phân lập EN-1, EN-2, EN-6, EN-7 từ phân đoạn NP8

Phân đoạn NP8 được dự đoán chứa chủ yếu các alkaloid phân cực khung

benzylisoquinolin nằm ở phần giữa và dưới của bản mỏng nên kỹ thuật sắc ký cột

với pha tĩnh là silica gel được triển khai với hệ dung môi aceton- MeOH theo

mục 2.4.1.3. Kết quả các phân đoạn thu được sau khi triển khai cột sắc ký được trình

bày ở Bảng 3.21 (SKLM tham khảo PL-1.10).

Bảng 3.21. Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP8, tâm Sen.

Khối lượng

Phân đoạn

NP8-1 N8P-2 NP8-3 NP8-4 NP8-5 NP8-6

Dung môi rửa giải cột (Aceton-MeOH) 100: 0,00 100: 0,50 100: 0,75 100: 1,50 100: 2,00 100: 2,50

phân đoạn (mg) 1780,8 1437,5 294,5 1231,4 215,7 265,8

Sau tinh chế (mg) Tạp EN-1 (748,5) EN-2 (127,8) Alkaloid + tạp EN-7 (78,5) EN-6 (81,4)

Phân lập EN4 và EN5 từ phân đoạn P

Phân đoạn P chứa chủ yếu các alkaloid phân cực, được cô tới cắn, hòa tan trong

hỗn hợp DCM: aceton (70:30) và tiến hành sắc ký rây phân tử trên cột Sephadex

LH-20 với hệ dung môi DCM: aceton (70:30) thu được 4 phân đoạn. Kết quả được

trình bày trong Bảng 3.22.

Bảng 3.22. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn P

Tính chất phân đoạn

Alkaloid+ tạp Alkaloid EN-6 và EN-7 Alkaloid+ tạp Alkaloid+ tạp

Sau tinh chế (mg) Alkaloid+ tạp Alkaloid+ tạp Alkaloid+ tạp Alkaloid+ tạp

Phân đoạn P-1 P-2 P-3 P-4

Khối lượng phân đoạn (mg) 1986,7 976,5 2670,5 1287,7

Phân đoạn P-2 chứa các alkaloid phân cực mạnh, tiếp tục được phân lập bằng

phương pháp sắc ký phân bố ly tâm nhanh (FCPC) với hệ dung môi hai pha không

đồng tan thích hợp được lựa chọn là CHCl3-MeOH-TEA 0,2% (12:5:3) trong đó pha

động được lựa chọn là pha dưới và pha tĩnh là pha trên (tham khảo kết quả thăm dò

SKLM ở PL- 1.12). Kết quả được trình bày ở Bảng 3.23.

Bảng 3.23. Kết quả FCPC phân đoạn P-2 (tham khảo SKLM ở PL- 1.13)

Khối lượng

Sau tinh chế

Phân đoạn sau FCPC P2-1 P2-2 P2-3 P2-4

phân đoạn (mg) 334,6 209,8 135,6 196,7

Tính chất phân đoạn Tạp+ alakloid 01 alkaloid + tạp 01 alkaloid + tạp 02 alkaloid+ tạp nhiều

Tạp+alkaloid EN-4 (94,7 mg) EN-5 (52,8 mg) Tạp+alkaloid

Phân lập EN--8 từ phân đoạn n-Bu

Phân đoạn n-Bu được cô thu hồi dung môi, cắn thu được hòa trong dung dịch

H2SO4 2%, chỉnh về pH 1-2, chiết phân bố loại tạp lần lượt với cloroform, ethyl. Dịch

nước acid được tận chiết với n-butanol. Cô dịch n-butanol đến cao đặc (16,5 g).

Hòa tan 6,5 g cao n-Bu trong 10 mL methanol, loại muối kết tinh.

Dịch MeOH được cô thu hồi dung môi để nạp cột Sephadex LH-20: Mẫu: 6,5 g cao

n-Bu hòa tan trong 10 ml MeOH, mỗi lần nạp 2,5 ml. Pha tĩnh: 100 g Sephadex

LH-20 (100% MeOH), tốc độ dòng 1mL/phút. Thu các ống nghiệm (10 ml mỗi phân

đoạn). Kết quả được trình bày trong Bảng 3.24.

Bảng 3.24. Kết quả Sephadex LH-20 của phân đoạn n-Bu

Khối lượng

Phân đoạn

Sau tinh chế (mg) Alkaloid + tạp Alkaloid + tạp (365 nm) Tạp

phân đoạn (mg) 864,5 2125,4 326,7

n-Bu I n-Bu II n-Bu III

Tính chất phân đoạn Alkaloid + tạp Alkaloid + tạp Tạp Phân đoạn n-Bu II chứa alkaloid rất phân cực được dự đoán là alkaloid bậc 4 có

ít tạp, tắt quang ở UV 254 nm nên được chọn qua cột SPE trao đổi ion (Cột Strata-X- 61

CW loại 500 mg/6ml), hòa tan 4 g mẫu n-Bu II trong 20 ml đệm ammonium acetat

0,1 M, thu được 120,5 mg tủa (C). Để riêng tủa (C), dùng phần dịch để nạp cột,

mỗi lần nạp 2 ml. Kết quả thu được 2 phân đoạn được trình bày ở Bảng 3.25

(SKLM PL-1.11).

Bảng 3.25. Kết quả các phân đoạn sau SPE từ n-Bu II

Dung môi rửa giải cột

MeOH acid formic 5 % /MeOH

Khối lượng phân đoạn (mg) 423,5 664,8

Sau tinh chế (mg) Tạp EN-8 (70,7 mg)

Phân đoạn n-Bu IIA n-Bu IIB

Tủa C được rửa nhiều lần với đệm Amoni acetat 0,1 M trên phễu thủy tinh xốp đến

khi dịch rửa không màu. Sau đó tủa C được kết tinh lại trong MeOH nóng, sấy chân

không đến khô. Kết quả thu được 87,5 mg chất tinh khiết EN-8.

 Phân lập flavonoid từ tâm Sen

Cao EF chứa flavonoid toàn phần tâm Sen được nạp lên cột silica gel pha thuận

theo mục 2.4.3.2. Kết quả các phân đoạn sau triển khai cột được trình bày

ở Bảng 3.26.

Bảng 3.26. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao EF, tâm Sen

Dung môi rửa giải cột (Cf–EtOAc) 95:5 88:12 84:16 49:51 48:52

Khối lượng phân đoạn (mg) 293,6 150,8 240,2 223,5 224,2

Sau tinh chế (mg) Tạp TF-1 (27,6 mg) TF-2 (39,7 mg) TF-3 (185,9 mg) TF-4 (42,8 mg)

Phân đoạn EF-1 EF-2 EF-4 EF-6 EF-7

Phân lập TF-5, TF-6 từ các phân đoạn EF-8 bằng sắc ký rây phân tử

EF-8 được cô tới cắn, hòa tan trong methanol, tiến hành sắc ký rây phân tử trên cột

Sephadex LH-20 (100% MeOH). Kết quả các phân đoạn sau triển khai cột được

trình bày ở Bảng 3.27.

Bảng 3.27. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn EF-8

Khối lượng

Tính chất phân đoạn

tạp 01 Flavonoid + tạp tạp 01 Flavonoid + tạp

Sau tinh chế (mg) tạp TF-5 (45,6) tạp TF-6 (68,7)

Phân đoạn EF8-1 EF8-2 EF8-3 EF8-4

phan đoạn (mg) 125,5 157,4 194,7 213,5

3.1.4. Xác định độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen

10 alkaloid, 08 flavonoid, phân lập từ lá Sen và 11 alkaloid, 06 flavonoid từ tâm Sen

được tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM và HPLC/PDA. Kết quả được

trình bày ở Bảng 3.28.

Bảng 3.28. Độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid, phân lập từ lá và tâm Sen

(Nelumbo nucifera Gaertn.).

Tinh khiết trên HPLC/PDA (%)

STT

PTN-4

Trung bình

Chất phân lập

PTN-1 ISO/GLP 99,3

PTN-3 ISO 17025 99,24

PTN-2 ISO/GLP 99,43

97,83

98,93

LN-1

Tinh khiết SKLM + +

96,57

96,65

96,49

96,85

96,64

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

LN-2 LN-3 LN-4 LN-5 LN-6 LN-7 LN-8 LN-9 LN-10 LF-1 LF-2 LF-3 LF-4 LF-5 LF-6 LF-7 LF-8 EN-1 EN-2 EN-3 EN-4 EN-5 EN-6 EN-7 EN-8 EN-9 EN-10 EN-11 TF-1 TF-2 TF-3 TF-4 TF-5 TF-6

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

97,81 96,24 95,23 95,25

97,80 97,05 96,16 95,15

99,25 95,57 95,62 95,57 96,21 98,52 99,10 98,02 98,72 99,34 99,69 96,93 96,85 96,60 96,30 95,88 98,24 95,83 97,38 97,20 98,44 98,72

99,20 96,25 95,87 95,49 95,87 97,36 98,54 98,58 98,48 98,96 97,65 98,63 98,86 99,54 97,12 97,10 96,50 96,81 95,78 98,10 96,27 98,16 96,52 98,45 97,23 98,34 98,40 97,82 98,70 98,14 98,10 97,89 97,65

99,22 95,91 95,75 95,53 96,04 97,36 97,23 98,20 98,50 99,03 97,82 98,68 99,10 99,62 97,03 96,98 96,60 96,13 95,52 98,20 95,89 98,16 96,52 98,45 97,23 98,34 98,40 97,60 98,70 97,67 98,27 98,31 97,65

Nhận xét: Độ tinh khiết các chất phân lập được đều trên 95 % khi được kiểm tra bằng

SKLM và HPLC/PDA.

3.1.5. Xác định cấu trúc các alkaloid và flavonoid phân lập

3.1.5.1. Xác định cấu trúc các alkaloid

Các tính chất lý hóa và các kết quả phổ học (UV, IR, MS, NMR) để xác định cấu trúc

LN-1, LN-2, LN-3, LN-4, LN-5, LN-9, LN-10, được khảo sát và trình bày ở các

Bảng 3.29, 3.30, 3.31, 3.32.

Hợp chất LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 (dữ liệu phổ tham khảo PL-2.1, 2.2, 2.3, 2.4)

25, UV, MS của các alkaloid LN-1, LN-2, LN-3, LN-4.

nc, 𝛼𝐷

Bảng 3.29. Dữ liệu to

LN-2

Cảm quan

LN-1 Tinh thể hình lăng trụ không màu.

Tinh thể hình khối, không màu.

LN-3 Tinh thể hình rẽ quạt, màu trắng.

LN-4 Tinh thể hình kim, màu nâu nhạt.

Dễ tan trong CHCl3, MeOH, không tan trong nước.

121-123 0C

Độ tan to nc

[𝛼]

162-163 0C -145,6 0 (0,5%; EtOH)

173-174 0C -140,5 0 (0,5%; EtOH)

203-204 0C -176 0 (0,5%;MeOH)

24 𝐷 UV/MeOH λmax (nm)

Dạng phổ UV của alkaloid khung aporphin 310, 272, 232

IR (υ , cm-1)

2992, 2805, 1421,1372, 757

3296, 2995,805, 1587, 1448, 756

3398, 2967, 1616, 1339, 756

3315,2978, 2810, 1607, 1358, 757

[M+H]+ 282,32

[M+H]+ 268,20

ESI-MS (+) ESI-MS (-) M Công thức nguyên Độ bất bão hòa

[M+H]+ 296,01 [M+Na]+ 318,05 295,01 C19H21NO2 10

281,25 C18H19NO2 10

267,20 C17H17NO2 10

[M+H]+ 268,15 [M-H]- 266,10 267,11 C17H17NO2 10

Bảng 3.30. Dữ liệu phổ 13C- NMR (CDCl3, 125 MHz) LN-1, LN-2, LN-3, LN-4.

δC, ppm

Vị trí C C-1 C-1a C-2 C-3 C-3a C-4 C-5 N-CH3 C-6a C-6b C-7 C-7a C-8 C-9 C-10 C-11 C-11a

LN-1 145,2 s 126,9 s 152,0 s 111,3 d 128,7 s 29,2 t 53,3 t 43,9 q 62,3 d 128,0 s 35,1 t 136,5 s 127,8 d 127,3 d 127,0 d 128,3 d 132,2 s

LN-2 142,9 s 125,7 s 148,1 s 114,1 d 129,8 s 28,9 t 53,4 t 43,9 q 62,4 d 127,6 s 35,0 t 131,9 s 127,2 d 128,1 d 127,5 d 127,3 d 136,4 s

LN-3 141,4 s 119,1 s 145,9 s 110,0 d 124,1 s 29,1 t 43,4 t - 53,6 d 129,3 s 37,6 t 132,5 s 127,7 d 126,7 d 126,9 d 128,4 d 135,9 s

LN-4 143,7 s 125,9 s 149,3 s 115,1 d 126,0 s 27,6 t 42,4 t - 53,2 d 128,6 s 36,2 t 131,8 s 127,8 d 127,4 d 127,7 d 128,1 d 135,1 s

60,2 q 55,9 q

60,4 s -

- 56,2 s

60,2 s -

1-OCH3 2-OCH3

Bảng 3.31. Dữ liệu phổ 1H- NMR (CDCl3, 500 MHz) LN-1, LN-2, LN-3, LN4.

δH m (J, Hz)

Vị trí H LN-1 6,63 s H-3

LN-2 6,68 s 3,13 d (6,0) 2,65 m

LN-4 6,69 s 3,03 m 2,70 m

H-4

3,16 m 2,68 dd (16,5; 3,5)

H-5

eq: 3,03 m ax: 2,51 m 2,54 s

eq: 3,03 m ax: 2,49 m 2,54 s

LN-3 6,59 s 2,97 m 2,66 m 3,36 m 3,01 m -

N-CH3

H-6a

3,01 m

3,02 m

3,86 dd (9,5; 4,5)

2,98 m 2,71 m 3,89 dd (14,5; 4,5)

H-7

2,72 m 2,84 m

eq: 3,08 dd (13,5; 4,0) ax: 2,25 t (13,5)

3,09 dd (9,5; 4,0) 2,63 m

7,25 m 7,22 m 7,30 m 8,4 d (7,5) 3,66 s 3,88 s

7,31 d (8,0) 7,26 m 7,22 m 8,26 d (8,0) 3,57 s -

eq: 2,84 dd (9,0; 5,0) ax: 2,73 t (13,5) 7,23 m 7,31 m 7,19 m 8,39 d (8,0) - 3,91 s

7,25 m 7,33 m 7,22 m 8,3 d (8,0) 3,60 s

H-8 H-9 H-10 H-11 1-OCH3 2-OCH3

So sánh dữ liệu phổ 13C và 1H của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 với các tài liệu đã

công bố LN-1[25],[43],[114], LN-2[114], LN-3[31], [114], LN-4 [31],[32] lần lượt là nuciferin,

2-O-nornuciferin, caaverin, asimilobin, là những alkaloid khung aporphin. Trong đó,

caaverin, asimilobin, 2-O-nornuciferin lần đầu tiên được công bố trên lá Sen

Việt Nam. Cấu trúc hóa học của 04 alkaloid được trình bày ở Hình 3.7.

Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4

Hợp chất LN-5 (dữ liệu phổ UV, IR, MS, NMR, tham khảo PL- 2.5)

Mô tả: Tinh thể hình kim màu trắng, kém tan trong CHCl3, dễ tan trong EtOAc

và MeOH, góc quay cực riêng ở 24 oC là 162,4 o.

UV/MeOH: λmax (nm) 308, 276, 264.

IR (KBr) ( υ , cm-1): 3490, 2852, 1305, 1136, 1031, 826,753.

ESI-MS (ES+): m/z = 298,21 [M +H]+ và m/z = 267,08 [M –OCH3]+ ; m/z = 235

[M-OH-CH3-OCH3]+, LN-5 có khối lượng phân tử 297,21 và công thức nguyên

C18H19NO3 với độ bất bão hòa là 10.

Bảng 3.32. Dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR, COSY, HMBC của LN-5.

LN-5 (DMSO-d6, máy 500 MHz)

HMBC

δH m (J, Hz)

Vị trí C C-1 C-1a C-2 C-3 C-3a

DEPT C C C CH C

δC 141,7 119,6 146,7 110,3 123,0

C1; C2;C6b

COSY H4 H3; H5 C6b;C3a

C-4

28,5

CH2

C4;C6a; N-CH3

C-5

52,9

CH2

C-6a C-6b

CH C

62,6 127,6

H7 H6; H8 C6a;C7a

C-7

33,6

CH2

126,2 128,1 113,3 155,4 115,5 133,1 55,9 43,6

6,66 s eq: 2,94 m ax: 2,57 dd (11,0; 2,5) eq: 2,34 m ax: 2,94 m 2,80 dd (10,0; 3,5) eq: 2,22 t (13,5) ax: 3,00 dd (9,5; 4,0) 7,04 d (8,0) 6,58 dd (5,5; 2,5) 7,80 d (2,5) 3,81 s 2,41 s

C-7a C-8 C-9 C-10 C-11 C-11a 2-OCH3 6-N-CH3

C CH CH C CH C CH3 CH3

H7; H9 C7; C10;C7a C7a; C10;C11 H8 C1a;C7a; C9;C10 C2 H3 H5

So sánh dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR với các tài liệu đã công bố[31],[32].

LN-5 là apoglaziovin, một alkaloid khung aporphin lần đầu tiên được công bố trên

cây Sen. Cấu trúc hóa học của LN-5 và các tương tác xa được trình bày ở Hình 3.7.

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của LN-5

Hợp chất LN-8 và LN-9 (dữ liệu phổ UV, MS, NMR, tham khảo PL- 2.6,2.7)

25, UV, MS của các alkaloid LN-8, LN-9.

nc, 𝛼𝐷

Bảng 3.33. Dữ liệu về cảm quan, to

Tính chất Mô tả

LN-8 Tinh thể hình kim không màu, dễ tan trong CHCl3, MeOH, tan ít trong nước

LN-9 Dạng bột vô định hình, màu trắng, dễ tan trong CHCl3, MeOH, không tan trong nước.

+ 99,5 o (0,5%; CHCl3)

24 𝐷

+ 20,6 o (0,5%; CHCl3) 132-133 oC

Dạng phổ UV với các alkaloid khung proaporphin 212, 232, 282

[𝛼] to UV/MeOH λmax (nm) IR (υ , cm-1)

ESI-MS (+) ESI-MS (-) ESI-MS/MS (+) Khối lượng phân tử Công thức nguyên Độ bất bão hòa

[M+H]+ 312,25 [M+ Na]+ 334,45 282, 268, 253 311,25 C19H21NO3 10

3424, 2847, 1619, 1289, 986 [M+H]+ 328,26 [M-O]+ 311,41 311, 282, 268, 253 327,26 C19H21NO4 10

Bảng 3.34. Dữ liệu phổ 13C và 1H- NMR (DMSO-d6, máy 500 MHz) LN-8, LN-9

LN-9

δC 143,6 s 152,6 s 111,8 d

LN-8 δH m (J, Hz) 6,77 (1H, s)

δH m (J, Hz) δC 144,2 s 153,1 s 112,3 d 6,81 (1H, s)

COSY

C 1 2 3

134,7 s 127,6 s

133,9 s 127,9 s

HMBC C1; C2; C3a; C3b; C4

3a 3b

27,0 t

2,77 (2H, m)

24,5 t

C3; C3a; C3b; C5 H5

4

54,3 t

66,9 t

C3a; C3b; C6a

5

65,0 d 46,8 t

75,8 d 42,7 t

H7 H6a

6a 7

C3a; C13a C6a; C8; C13; C13a,C12

154,2 d

2,78 (2H, m) 3,03 (1H, m) 2,37 (1H, m) 5,23 (1H, m) 2,28 (1H, m) 2,18 (1H, t, 11,0) 154,4 d 7,05 (1H, dd

C1; C4a; C6

8

10,0; 2,5)

127,4 d

127,1 d 6,29 (1H, dd

C11; C13

9

10,0; 2,0)

185,2 s 126,5 d

186,5 s 126,0 d 6,17 (1H, dd

C1; C8a; C10 C9; C13

H12

10 11

10,0; 2,0)

150,8 d

149,9 d 7,17 (1H, dd

C7; C8; C10; C13 H11

12

50,7 s 132,2 s

3,03 (1H, m) 2,37 (1H, m) 3,44 (1H, m) 2,28 (m, 1H) 2,14 (1H, t, 11,0) 7,05 (1H, dd 10,0; 2,5) 6,29 (1H; dd, 10,0; 2,0) 6,17 (1H, dd, 10,0; 2,0) 7,16 (1H, dd 10,0; 2,5)

10,0; 2,5)

49,4 s 133,0 s

60,2 q

3,48 (3H,s)

57,5 q 3,48 s

13 13a 1-OCH3

56,1 q 43,2 q

3,74 (3H, s) 2, 25 (3H, s)

56,7 q 3,74 s 59, 5 q 3,20 s

C2 C3b;C5; C6a

2-OCH3 6-NCH3

So sánh dữ liệu phổ của 13C và 1H của LN-8[59],[87] , LN-9[59] với các tài liệu đã công

bố. LN-8, LN-9 lần lượt là pronuciferin và pronuciferin N-oxid, là những alkaloid

khung proaporphin. Trong đó, pronuciferin N-oxid lần đầu tiên được công bố trên

cây Sen. Cấu trúc hóa học của 02 alkaloid này được trình bày ở Hình 3.9.

Hình 3.9. Cấu trúc hóa học của LN-8, LN-9.

Hợp chất EN-1, EN-2, EN-3, EN-4, EN-5 (dữ liệu phổ UV, IR, MS, NMR,

tham khảo PL- 2.8, 2.9, 2.10, 2.11, 2.12).

Các tính chất lý hóa và các phép phổ nghiệm (UV, IR, MS, NMR) để xác định

cấu trúc EN-1, EN-2, EN-3, EN-4, EN-5 được khảo sát và trình bày ở các Bảng

25, UV, IR, MS của các alkaloid

3.35, 3.36, 3.37, 3.38, 3.39.

nc, 𝛼𝐷

Bảng 3.35. Dữ liệu về cảm quan, to

EN-1, EN-2, EN-3.

EN-1

EN-2

Tính chất Cảm quan

EN-3 Dạng bột trắng mịn, dễ tan trong CHCl3, MeOH -100,4 o (0,5%; MeOH), 93-94 oC

+15,5 o (0,5%; aceton) 74-75 oC

+53,6 o (0,5%; MeOH) 70-71 oC

𝛼𝐷 to nc UV/MeOH λmax (nm)

Dạng phổ UV của alkaloid khung bibenzylisoquinolin 212, 225, 285

IR (υ, cm-1)

3421, 2935, 1612, 1461, 1372, 1249, 1134, 805

212, 225, 282 3386, 2958, 1614, 1515, 1276, 1125, 806 [M+H]+ 611,28

212, 225, 283 3450, 2960, 1620, 1520, 1252, 1125, 805 [M+H]+ 611,28

ESI-MS (+) ESI-MS (-)

[M+H]+ 625,20 [M-H]- 623,26

503, 418, 297, 206, 190, 121

ESI-MS/MS (+)

624,20 C38H44N2O6 18

Khối lượng phân tử Công thức nguyên Độ bất bão hòa

489, 418, 314, 296, 192, 121. 610,28 C37H42N2O6 18

503, 282, 206, 190, 121 610,28 C37H42N2O6 18

Bảng 3.36. Dữ liệu phổ 13C; 1H- NMR (CDCl3, máy 500 MHz) EN-1, EN-2, EN-3.

EN-1

C 1 1’ 2-NCH3 2’-NCH3 3 3’

EN-1 64,4 d 64,7 d 43,1 q 42,9 q 47,6 t 46,7 t

δC EN-2 65,1 d 64,7 d 42,7 q 41,8 q 48,2 t 45,3 t

26,7 t

26,5 t

26,2 t

4’

25,9 t

21,9 t

25,3 t

EN-3 64.4, d 3,65 m 64,8 d 3,57 m 42,8 q 2,36 s 42,6 q 2,48 s 3,08 m 47,3 t 2,78 m 46,8 t eq:2,81 m ax:2,62 m eq:2,78 m ax:2,49 m

55,5 q 3,56 s 55,7 q 3,78 s

130,6 s 130,6 s 130,6 s 129,2 s 129,1 s 129,2 s 148,9 s 148,7 s 149,0 s 145,7 s 146,4 s 146,4 s 55,5 q 55,5 q 55,7 q 55,8 q 142,5 s 143,3, s 143,0, s 143,4 s 147,3 s 147,2 s 55,9 q 55,9 q

120,0 d 119,9 d 120,1 d 6,41 s 111,6d 110,9 d 110 6 d 6,12 s 131,1 s 131,1 s 131,2 s 125,8 s 125,5 s 125,8 s

40,1 t

40,9 t

40,7 t

39,8 t

40,1 t

39,9 t

3,06 m 2,72 m 2,93 m 2,80 m

55,1 q 3,75 s

4a 4a’ 6 6’ 6-OCH3 6’-OCH3 7 7’ 7’-OCH3 8 8’ 8a 8a’ H-9 eq H-9 ax H-9’eq H-9’ax 10 10’ 12’ 13 13’ 13-OCH3 14 14’ 15 15’

131,3 s 131,3 s 131,5 s 131,8 s 131,5 s 132,0 s 144,6 s 144,7 s 144,8 s 157,8 s 155,6 s 157,8 s 145,2 s 145,5 s 145,5 s 55,1 q - 113,9 d 115,7 d 113,5 d 6,70 d (8,2) 115,9 d 115,4 d 115,4 d 6,81 d (8,0) 130,3 d 130,4 d 130,5 d 6,87 d (8,0) 119,5 d 119,4 d 119,3 d 6,49 d (2,5)

δH m (J, Hz) EN-2 3,69 m 3,50 m 2,55 s 2,49 s 3,12 m 2,97 m eq:2,84 m ax:2,67 m eq:2,95 m ax:2,59 m 3,87 s 3,49 s 3,80 s 6,45 s 5,96 s 3,14 m 2,69 m 3,08 m 2,62 m - 6,77 d (8,2) 6,75 d (8,0) 6,96 d (8,5) 6,53 d (2,5)

EN-3 3,62 m 3,59 m 2,49 s 2,45 s 3,13 m 2,81 m eq:2,81 m ax:2,62 m eq:2,83 m ax:2,52 m 3,54 s 3,80 s 3,82 s 6,39 s 6,01 s 3,02 m 2,76 m 2,98 m 2,82 m 3,73 s 6,70 d (8,0) 6,85 d (8,0) 6,90 d (9,0) 6,55 d (2,0)

So sánh dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR của EN-1, EN-2, EN-3 với các tài liệu đã

công bố EN-1[15], [61],[68],[95], EN-2[15],[68], EN-3[15],[95] lần lượt là isoliensinin, liensinin

và neferin trong đó isolienin và liensinin lần đầu tiên được công bố trong tâm Sen

Việt Nam. Cấu trúc hóa học của 03 alkaloid này được trình bày ở Hình 3.10.

25, UV, IR, MS của alkaloid EN-4, EN-5.

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của EN-1, EN-2, EN-3.

nc, 𝛼𝐷

Bảng 3.37. Dữ liệu cảm quan, to

Tính chất

EN-4 Kết tinh trong DCM-aceton (30:70)

EN-5 Kêt tinh trong CHCl3,.

Cảm quan

Dạng bột vô định hình, không màu. Dễ tan trong MeOH,

kém tan trong CHCl3

+75.5 o (0,5%; MeOH)

+79,4 o (0,5%; MeOH)

24 𝐷

77-78 oC

81-82 oC

Dạng phổ UV với các alkaloid khung bibenzylisoquinolin 209, 225, 282

[𝛼] to UV/MeOH λmax (nm) IR (υ, cm-1)

ESI-TOF

ESI-MS/MS (+)

Khối lượng phân tử Công thức nguyên Độ bất bão hòa

3386, 2925, 2836, 2790, 1611, 1512, 1270, 1117, 956, 826 [M+H]+ 627,3133 610,31; 418,20 296,99; 208,10; 192,14; 121,20 626,3133 C37H42N2O7 18

3546, 3378, 2952, 2833, 1613, 1464, 1326, 1128, 965, 812. [M+H]+ 627,2691 610,26; 505,23; 313,17; 192,16; 121,03 626,2691 C37H42N2O7 18

Bảng 3.38. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-4.

EN-4 (CD3OD, máy 500 MHz)

HMBC

COSY

NOESY

C

δC

δH, m (J, Hz)

66,0 d

3,66 m

C4a

79,1 d 42,7 q 55,6 q

1’ 2-NCH3 2’-NCH3

H1, H3, H9, 2-N-CH3 H9’, 2’-N-CH3 H1, H3 H1, H3 ,H9, H11 H1’, H3’ H1’, H3’, H9’

C9’, C10’, C8’a H9’ C1, C3 C1’, C3’

47,8 t

C1, C4, C4a

H2, H4 H1, H4,

62,2 t

3’

C1’, C4’a

H2’, H4’ 2’-N-CH3

26,7 t

C3, C3, C5

H3, H5 H3 H1, 2-N-CH3

25,9 t

4’

C4’a , C5’

H3’, H5’ H1’, H3’, 2-N-CH3

4,41 dd (7,5; 3,0) 2,52 s 3,22 s H3eq: 3,18 m H3ax: 2,76 m H3’eq: 3,44 m H3’ax: 3,33 m H4eq: 2,9 m H4-ax: 2.73 m H4’eq: 3,2 m H4’ax 2,75 m

130,9 s 126,5 s

4a 4a’

114,1 d

6,79 s

C4 ,C6, C7

5’

112,3 d

6,62 s

C4’, C7’, C8’a H4’

150,6 s 146,2 s 56,4 q 56,5 q 144,2, s 148,8 s 120,3 d 112,3 d 130,9 s 122,9 s

6 6’ 6-OCH3 6’-OCH3 7 7’ 8 8’ 8a 8a’

C6 C7’ C1, C6, C7,C8a C6’, , C7’, C4a’

40,3 t

C10, C15

39,2 t

9’

H1’

132,5 s 129,1 s 131,6 d 119,6 d

3,78 s 3,80 s 6,06 s 6,35 s H9eq: 3,08 dd (13,6; 4,0) H9ax :2,72 m H9’eq: 3,58 dd (14,6; 3,0) H9,ax: 2,97 dd (14,6; 7,9) 6,91 d (8,5) 6,21 d (1,7)

10 10’ 11 11’

C10’, C11’, C8a’ C12, C13, C14 H12 C12’, C13’, C15’

114,7 d

6,68 d (8,5)

C10, C13, C14 H14

H4, 6-OCH3 H4’, 6’-OCH3, 2’-N-CH3 H5 H5’, H8’ H1, H9, H11, H1’,H9’, H11’ H1, H8, H11, H15 2-N-CH3 H1’, H8’, H11’ 2’-N-CH3 H1, H9, H12 H1’,H8, H8’ H9’ H11, H14’ , 13-OCH3 H8, H11, H12

H11 , H12

H15’

12’ 13 13’ 13-OCH3 14 14’ 15

146,6 s 159,4 s 147,7 s 55,6 q 114,7 d 117,8 d 131,6 d

3,70 s 6,68 d (9,0 ) 6,84 d (8,2) 6,91 d (8,5)

C13 C10, C12, C13 H12, H15 H11, H14’,13-OCH3 C10’, C12’ C12, C13, C14 H11, H14 H1 H15’, H9, H12

15’

125,5 d

6,77 d (2,0)

C9’ ,C11’, C13’

H15, 2’-N-CH3

H11’, H14’

Hình 3.11. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-4

Bảng 3.39. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-5.

EN-5 (CD3OD, máy 500 MHz)

HMBC

COSY

C

δC

δH, m (J, Hz)

79,7 d 4,43 d (6,5) 65,7 d 3,68 m 55,0 q 3,30 s 42,7 q 2,47 s

1 1’ 2-NCH3 2’-NCH3

C9 C3’,C8’, C10’, C8’a C1, C4

H9 H9’ H1, H3 H1’, H3’ H2, H4

62,4 t

NOESY H3, H9, 2-N-CH3 H9’, 2’-N-CH3 H1, H3ax, H9 H1’, H3’, H9’ H1, H4, 2-N-CH3

C1’, C4’, C4’a

H2’, H4’

48,3 t

3’

2’-N-CH3

C3, C5

H3, H5

26,4 t

C3’, C4’a, C5’

H3’, H5’

26,3 t

4’

H3eq: 3,74 m H3ax: 3,51 m H3’eq: 3,08 m H3’ax: 2,69 m H4eq: 3,34 m H4ax: 3,06 m H4’eq: 2,80 m H4’ax: 2,57 m

4a 4a’ 5 5’ 6 6’ 6-OCH3 6’-OCH3 7 7’

127,6 s 129,9 s 113,6 d 6,88 s 112,7 d 6,58 s 151,4 s 147,9 s 56,4 q 3,82 s 56,5 q 3,82 s 145,3 s 145,7 s

C6, C7, C8a C4’, C7’

H4 H4’

H3, H5, 2-N-CH3 H1’, H5’, 2-N-CH3 H4, 6-OCH3 H4’, 6’-OCH3 H5 H5’, H8’

8 8’ 8a 8a’

H1, H9 , H11 H1’,H9’, H11’

119,6 d 6,20 s 115,5 d 6,22 s 126,9 s 125,7 s

C1, C7, C4a C1’, C6’, , C7’, C4’a’ C1, C11, C15

38,8 t

H1, H8, H11, H15

9’

40,4 t

C1’, C11’, C15’

H1’

H1’, H8’, H11’

C9, C12, C13 C9’, C10’, C12’, C13’ C10, C11, C13, C14 C12, C13, C14 C10, C12, C13 C10’, C12’, C13’ C9, C10, C13, C14

H1, H8, H9, H12 H1’, H8’, H9’ H11, 13-OCH3 H11 H11,13-OCH3 H15’ H1, H9, H12

10 10’ 11 11’ 12 12’ 13 13’ 13-OCH3 14 14’ 15 15’

H9eq: 3,66 m, H9ax: 2,83 m H9’eq: 3,08 m H9’ax: 2,79 m 132,0 s 131,3 s 130,0 d 6,93 d (8,5) 120,6 d 6,29 d (1,5) 115,2 d 6,70 d (8,50) 145,4 s 159,9 s 147,3 s 55,6 q 3,69 s 115,2 d 6,70 d (8,5) 117,5 d 6,78 d (8.5) 130,0 d 6,93 d (8,5) 126,3 d 6,75 dd (8,2; 1,5) C11’, C13’

H12 H14 H12, H15 H15’ H11, H14 H11’, H14’ H14’, H9’

Hình 3.12. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-5

Biện giải cấu trúc hai hợp chất mới EN-4 và EN-5

Hợp chất EN-4 và EN-5 được chiết xuất bằng dung môi cồn acid và được phân lập

bằng các kỹ thuật sắc ký cột Sephadex LH-20 với dung môi 100% MeOH; hệ

DCM-Aceton (30:70). Sau đó, tiến hành phân lập bằng phương pháp sắc ký phân bố

ly tâm nhanh (FCPC) từ phân đoạn alkaloid phân cực. Trên SKLM với hệ

CHCl3- MeOH-NH4OH (85:15:0,5) EN-4 và EN-5 cho hai vết rất phân cực phía dưới

bản mỏng, tách nhau hoàn toàn, dương tính với thuốc thử Dragendorff và cách xa các

vết isoliensinin, liensinin, neferin. Từ đó, có thể kết luận EN-4 và EN-5 là hai alkaloid

rất phân cực trong tâm Sen.

EN-4 kết tinh trong DCM-Aceton (30:70) và EN-5 kết tinh trong CHCl3, cả hai đều

là dạng bột mịn màu trắng, dễ tan trong MeOH.

Phổ UV/MeOH của EN-4 và EN-5 đều cho dãy I (235-215) và dãy II (275-230) với

hai cực đại hấp thu là 283 và 225 nm giống với đặc tính phổ UV của các alkaloid

khung bisbenzylisoquinolin đã biết trong Sen (isoliensinin, liensinin, neferin).

Phổ IR của EN-4 và EN-5 có dạng tương tự và đều cho thông tin của các nhóm chức

-OCH3, -OH, -N-CH3, -C=C- nhân thơm..., giống với alkaloid isoliensinin.

Tuy nhiên, có sự xuất hiện trên phổ IR của EN-4 và EN-5 đỉnh khác biệt ở số sóng

956 cm-1 (EN-4) và 965 cm-1 (EN-5), đặc trưng cho liên kết -N=O (-N→O)[16],[132].

Phổ ESI-MS-TOF và MS2 (được trình bày trong Bảng 3.37) đã cung cấp thêm thông

tin quan trọng cho việc xác định cấu trúc EN-4 và EN-5.

Phổ ESI-TOF kiểu positive cho thấy EN-4 có phân tử lượng là 626,3133 và EN-5

có phân tử lượng là 626,2691 khác 16 đvC tương ứng với m/z của nguyên tử O so

với các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin (isoliensinin, liensinin có phân tử lượng

là 610,28) đã được công bố từ tâm Sen[95],[118].

Phổ ESI-MS2 của EN-4 và EN-5 đều thấy xuất hiện phân mảnh m/z 610,31 và 610,27

theo thứ tự trong phổ phân mảnh từ ion mẹ m/z 627,3133 và 627,2691 [M+H]+.

Do đó, có thể sơ bộ kết luận đã có một oxi bị phân mảnh trong quá trình này và cấu

trúc của EN-4 và EN-5 đã có thêm một nguyên tử oxygen so với m/z 610,28.

Thêm vào đó, các phân mảnh khác thu được trong phổ phân mảnh (418,08; 296,15;

192,18; 121,08) giống với các phân mảnh thu được khi đo khối phổ ESI-MS2 cho

hợp chất EN-1 (isoliensinin) trên thực nghiệm cũng như so sánh tài liệu

tham khảo[68],[95]. Từ các dữ kiện về SKLM, UV, IR và MS, EN-4 và EN-5 được dự

đoán hình thành từ phân tử isoliensinin liên kết với một nguyên tử O vào N tạo thành

hợp chất isoliensinin N-oxid (tham khảo kết quả ESI-TOF và ESI-MS2 của EN-4,

EN-5 ở các PL- 2.11, 2.12)

Việc dự đoán cấu trúc của EN-4 và EN-5 như trên sẽ được khẳng định bằng kết quả

đo phổ 1D và 2D-NMR của EN-4 và EN-5.

Phổ 13C, DEPT từ Bảng 3.41 và 3.42 cho thấy trong cấu trúc của hai hợp chất này

- 13 carbon bậc IV, thuộc các carbon của vòng thơm với 7 carbon mang nhóm thế

oxy tương ứng với các C-6, 6’; C-7,7’; C-13,13’; C-12’.

gồm có 37 C trong đó:

- 13 carbon bậc III, trong đó có 11 Carbon thuộc vòng thơm và 2 carbon sp3

ứng vị trí C-1,1’.

- 3 nhóm methyl đặc trưng của nhóm methoxy (δc 56,4-56,6 ppm), 01 nhóm

- 06 carbon bậc II lai hóa sp3.

chuyển khác hơn bình thường δc 55,56.

methyl đặc trưng của nhóm N-methyl (δc 42,7) và 01 nhóm methyl có độ dịch

Phổ 1H, HSQC, HMBC từ Bảng 3.41 và 3.42 cho thấy EN-4 và EN-5 có 42H trong

phân tử trong đó:

- 03 tín hiệu đơn (s) (δH 3,7-3,8) có cường độ mạnh ứng với các proton 6-OCH3;

6’-OCH3; 13-OCH3

- 02 tín hiệu đơn (s) có δH 2,52 và 3,22 có cường độ mạnh ứng với các proton

2-N-CH3; 2’-N-CH3.

- 04 tín hiệu đơn có δH 6,1-6,8 có cường độ trung bình ứng với các proton

H-5, 5’ và H-8,8’.

- 06 tín hiệu đôi (d) với J đa phần 8-9 Hz ứng với H-11,12, 14, 14’, 15; H-12

có J= 1.7Hz.

- Các tín hiệu còn lại đều là mũi đa (m)

Nhận xét: Số lượng và bậc cũng như độ dịch chuyển hóa học của các carbon trong

[68],[95],[118]. Chỉ có ba vị trí của C có sự khác biệt về độ chuyển dịch hóa học

EN-4 và EN-5 gần như tương tự isoliensinin ở Bảng 3.39 và các tài liệu đã công bố

so với isoliensinin:

- EN-4: C-1’ (79,1/64,7); 2’-N-CH3 (55,6/42,9); C-3’(62,2/46,7)

- EN-5: C-1 (79,7/64,4); 2 -N-CH3 (55,0/43,1) C-3 (62,4/47,6)

EN-4 và EN-5 không chỉ có cùng 42 proton mà các proton này còn có độ dịch chuyển

hóa học, hằng số ghép và vị trí gắn với C cũng tương tự như hợp chất isoliensinin.

Chỉ có ba vị trí của H có sự khác biệt về độ chuyển dịch hóa học so với isoliensinin

- EN-4: H-1’ (4,41/3,57); 2’-N-CH3 (3,22/2,36); H-3’(3,44/2,78)

- EN-5: H-1 (4,44/3,65); 2 -N-CH3 (3,3/2,48) H-3 (3,74/3,08)

Điều này được dự đoán là do nguyên tử O đã tham gia liên kết phối trí với N trong

nhóm N-methyl ở vị trí số 2’ (EN-4) và 2 (EN-5) tạo thành nhóm N-oxid (N→O)

trên vòng no, làm thay đổi môi trường điện tử xung quanh nó do hiệu ứng rút điện

tử về phía O dẫn đến sự giảm chắn và gây hiệu ứng giảm trường (downfield) với

C-1,1’; 2,2’-N-CH3; C-3,3’ H-1,1’; 2,2’-N-CH3; H-3,3’[16], [132].

Phổ Cosy của EN-4 cho thấy H1’ có J (7,5; 3,0) là do tương tác ae và ee giữa

H1’ và H9’. Do đó, H1’ có hướng e. Công thức isoliensinin có liên kết C1’ và C9’ là α

nên H1’ là β. Như vậy H1’ có dạng (e, β). Hơn nữa, phổ Noesy của EN-4 cho

tương tác cùng phía giữa H1’ và H9a’ nên cấu hình của EN-4 tương tự isoliensinin ở

C1’ (PL- 2.11). Biện giải tương tự cho các vị trí C1 trong EN-4 và C1, C1’ cho EN-5.

So sánh dữ liệu phổ 13C và 1H-NMR của EN-4, EN-5 với các tài liệu đã

công bố[68],[95] về isoliensinin kết hợp với dữ liệu phổ 2D- HSQC, HMBC, NOESY

và UV, IR, MS2 có thể khẳng định hợp chất EN-4 và EN-5 là alkaloid khung

bisbenzylisoquinolin với tên gọi được đề nghị là EN-4: isoliensinin N2’-oxid và

EN-5: isoliensinin N2-oxid lần đầu tiên được phân lập từ dược liệu.

Cấu trúc hai hợp chất này được xác định là những hợp chất mới khi tra cứu trên

Sci-Finder ngày 03/08/2015.

Hợp chất EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 (Phổ UV, MS, NMR tham khảo PL-2.13, 2.14)

Các tính chất lý hóa và các kết quả phổ học (UV, IR, MS, NMR) để xác định

cấu trúc EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 được khảo sát và trình bày ở các

Bảng 3.40, 3.41, 3.42.

25, UV, IR, MS của các alkaloid EN-6, EN-7, EN-8, EN-9.

nc, 𝛼𝐷

Bảng 3.40. Dữ liệu to

EN-6

EN-8

tan

Cảm quan

EN-7 Bột màu nâu nhạt, dễ tan trong CHCl3 và EtOAc.

EN-9 Tinh thể hình kim ngắn, màu vàng nhạt. Dễ tan trong MeOH, H2O, không tan trong CHCl3.

Tinh thể hình lăng trụ, không tan màu, dễ trong CHCl3, MeOH, không tan trong nước.

[𝛼]24 𝐷

Tinh thể hình kim, không màu, dễ trong CHCl3, MeOH, không tan trong nước. -81 o (0,5%; MeOH) 218-219 oC

-104,5 o (0,5%; MeOH) 145-146 oC

-90,5 o (0,5%;M eOH) 181-182 oC

-19,5 o (0,5%; MeOH) 202-203 oC

to UV/MeOH λmax (nm)

Dạng phổ UV của alkaloid khung benzylisoquinolin 209, 226, 283

2798,1616,

IR (υ, cm-1)

1508, 1238, 831

2836, 1611, 1510,1247, 830 [M+H]+ 300,26 [M+Na]+ 322,22 283,22; 236,15; 207,16; 192,16 299,26 C18H21NO3

[M+H]+ 314,26 [M-OCH3]+ 283,30 283,30; 220,52 206,30; 196,14 313,26 C19H23NO3

[M+H]+ 300,43 269,26; 253,34; 206,35;191,23 299,43 C18H21NO3

2860, 1610, 1503, 830 [M+H]+ 313,96 283,07; 269,05 206,32; 176,08 313,96 C19H23NO3

ESI-MS Phân mảnh đặc trưng M CTPT Độ bất bão hòa Bảng 3.41. Dữ liệu phổ 13C-NMR của EN-6, EN-7, EN-8 (CDCl3, 125 MHz) và

EN-9 (CD3OD, 125 MHz).

Vị trí C C-1 2-N-aCH3 2-N-bCH3 C-3 C-4 C-4a C-5 C-6 6-OCH3 C-7 7-OCH3 C-8 C-8a C-9

EN-6 56,7 d - - 40,2 t 29,1 t 129,8 s 111,9 d 147,2 s 56,0 q 147,7 s 55,9 q 109,6 d 127,0 s 41,5 t

δC EN-7 64,9 d 42,3 q - 46,5 t 25,0 t 129,0 s 111,3 d 146,4 s 55,8 q 147,4 s 55,6 q 111,2 d 125,6 s 40,4 t

EN-8 65,0 d 43,1 q 46,3 t 25,2 t 129.1 s 111,6 d 147,0 s 55,7 q 148,7 s - 113,1 d 125,8 s 40,5 t

EN-9 74,4 s 53,0 q 51,4 q 53,0 t 24,4 t 121,8 s 115,8 d 148,3 s - 147,2 s 55,9 q 113,2 d 121,8 s 38,2 t

C-10 C-11; C-15 C-12; C-14 C-13

129,4 s 130,4 d 115,9 d 155,5 s

131,4 s 130,8 d 115,2 d 154,4 s

131,5 s 130,7 d 115,4 d 154,8 s

127,3 s 132,6 d 116,5 d 158,0 s

Bảng 3.42. Dữ liệu phổ 1H-NMR của EN-6, EN-7, EN-8 (CDCl3, 500 MHz) và

EN-9 (CD3OD, 500 MHz).

δH m (J, Hz) EN-7

EN-6

EN-8

4,15 m 2,95 m 3,24 m

EN-9 3,71 dd (13,0; 4,0) 3,45 s 3,16 s 3,94 m 3,6 m

2,76 t (6,0)

3,16 overlapped

3,71 m 2,53 m 2,83 m 3,14 m eq: 2,85 m ax: 2,60 m 6,58 s 3,90 s

6,59 s 3,86 s 3,84 s 6,67 s 3,14 dd (9,5; 4,5) 2,86 m

3,71 dd (8,0; 5,5) 2,52 s 2,82 m 3,23 m 2,88 m 2,61 m 6,56 s 3,84 s 3,57 s 6,03 s 3,12 dd (13,5; 5,5) 2,75 dd (14,0; 8,0) 6,92 d (8,5) 6,66 d (8,5)

6,7 s - 3,42 s 5,69 s 3,64 dd (13,0; 4,0) 2,67 dd (12,5; 11,0) 6,86 (1H, d 8,5) 6,73 (1H, d, 8,5)

6,15 s 3,10 dd (7,5; 5,5) 2,77 dd (7,5; 2,0) 6,87 d (9,0) 6,70 d (9,0)

Vị trí H H-1 2-N-aCH3 2-N-bCH3 H-3eq H-3ax H-4eq H-4ax H-5 6-OCH3 7-OCH3 H-8 H-9eq H-9ax H-11; H-15 7,02 d (8,0) H-12; H-14 6,64 d (8,0) So sánh dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 với các tài liệu đã

công bố. EN-6[36],[99],[114], EN-7[43],[99],[114], EN-8[34],[36],[99]., EN-9[35],[107] lần lượt là

norarmepavin, armepavin, N-methylcoclaurin và lotusin. Trong đó, norarmepavin

và armepavin lần đầu tiên được công bố trong tâm Sen. Cấu trúc hóa học của 04

alkaloid được trình bày ở Hình 3.13.

Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9

3.1.5.2. Xác định cấu trúc các flavonoid

Các tính chất lý hóa và các kết quả phổ học (UV, IR, MS, NMR) để xác định

cấu trúc các flavonoid phân lập lập từ lá Sen (LF-1, LF-2, LF-3, LF-4, LF-5, LF-6,

LF-7, LF-8) và từ tâm Sen (TF-1, TF-3, TF-4, TF-5) được khảo sát và trình bày ở

các Bảng 3.43, 3.44, 3.45, 3.46, 3.47, 3.48.

Hợp chất LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 (Phổ MS, NMR PL-2.16, 2.17, 2.18)

Bảng 3.43. Dữ liệu phổ UV, MS của các flavonoid LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1.

LF-6

LF-8

Cảm quan

LF-1 Dạng bột vô định hình màu vàng sậm.

LF-5 Dạng bột vô định hình, màu vàng nhạt.

TF-1 Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt.

bột Dạng vô định hình, màu vàng tươi.

bột Dạng vô định hình, màu trắng.

Độ tan

Dễ tan trong MeOH, kém tan trong CHCl3, ethyl acetat.

Dễ trong tan MeOH, kém tan EtOAc.

Kém tan trong MeOH, dễ tan trong EtOAc

Dạng phổ UV của khung flavonol

catechin

UV/MeOH λmax (nm)

372, 255, 210

257, 210

257, 215

270, 210

khung isoflavonol 291, 250, 222

ESI-MS

[M-H]- 285,09

[M-H]- 289,05

[M+H]+ 285,23 [M-H]- 283,23

[M+H]+ 303,62 [M-H]- 301,0 179, 153, 137, 121 302,62 C15H10O7

[M+H]+ 317,07 [M-H]- 315,04 316, 301, 287, 245 316,07 C16H12O7

253, 236, 161, 123 284,23 C16H12O5

256, 181, 109 290,05 C15H14O13

269,193, 93 286,09 C15H10O6

Phân mảnh đặc trưng M CTPT Độ bất bão hòa Bảng 3.44. Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1

(DMSO-d6, 125 MHz)

δC

Vị trí C

2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’

LF-1 146,8 s 136,2 s 175,5 s 161,2 s 98,2 d 165,6 s 93,4 d 156,3 s 103,2 s 122,4 s 114,5 d 147,5 s 148,0 s 115,2 d 121,7 d - -

LF-5 146,8 s 135,8 s 175,8 s 160,7 s 98,2 d 163,9 s 93,6 d 156,1 s 103,0 s 121,9 s 111,7 d 147,3 s 148,8 s 115,5 d 121,7 d 55,8 q -

LF-6 146,8 s 135,6 s 175,9 s 160,7 s 98,1 d 163,8 s 93,4 d 156,1 s 103,0 s 121,6 s 129,4 s 115,5 d 159,1 s 115,5 d 129,4 s - -

LF-8 80,9 d 66,3 d 27,8 t 156,1 s 95,1 d 156,4 d 93,8 d 155,3 s 99,0 s 130,6 s 114,5 d 144,8 s 144,8 s 115,0 d 118,4 d

TF-1 153,3 d 123,4 s 174,5 s 127,1 d 115,2 d 161,7 s 102,2 d 157,4 s 116,6 s 124,7 s 116,4 d 146,2 s 147,5 s 112,1 d 119,4 d - 55,0 q

5’-OCH3 4’-OCH3

Bảng 3.45. Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1

(DMSO-d6, 500 MHz).

TF-1

H 2 3

LF-1 - -

LF-5 - -

δH m (J, Hz) LF-6 - -

8,24 s

LF-8 4,47 d (7,0) 3,81 m 2,65 dd (16,0; 5,5) 2,34 dd (16,0; 8,0) -

6,20 d (2,0)

6,20 d (1,5)

5,88 d (2,5)

8 2’ 3’ 4’

6,40 d (2,0) 7,80 d (2,5) - -

6,40 d (2,0) 7,80 d (1,5) - -

6,40 d (1,5) 8,00 d (9,0) 6,90 d (9,0) 8,00 d (9,0)

5,68 d (2,0) 6,72 d (2,0) - -

5’

6,90 d (8,5)

6,90 d (8,0)

6,90 d (9,0)

6,68 d (8,5)

6’

8,00 d (9,0)

6,59 dd (8,0; 2,0)

7,96 d (8,5) 6,92 dd (8,5; 2,0) 6,85 d (2,0) 7,03 d (1,5) - - 6,92 trùng lấp 6,92 trùng lấp - 3,82 s

7,65 dd (8,5; 2,5) - -

7,69 dd (8,5; 2,0) 3,84 s -

- -

3’-OCH3 4’-OCH3

So sánh dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 với các tài liệu

đã công bố LF-1[13],[58], LF-5[58],[77],[112], LF-6[58],[77], LF-8[80],[120], TF-1[120] lần lượt là

quercetin, isorhamnetin, kaempferol, catechin và calycosin. Trong đó,

isorhamnetin và calycosin lần đầu tiên được công bố trên cây Sen. Kaempferol,

catechin lần đầu tiên được phân lập từ lá Sen Việt Nam. Cấu trúc hóa học của 05

flavonoid và rutin được trình bày ở Hình 3.14.

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học của LF-1, LF-5, LF-6, LF-7, LF-8, TF-1

Hợp chất LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3

Bảng 3.46. Dữ liệu phổ UV, MS các flavonoid LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3.

LF-2

LF-3

LF-4

TF-5

TF-4

TF-3

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt Dễ tan trong MeOH, kém tan trong CHCl3, ethyl acetat.

-22,4 (0,5%, EtOH) 190-192 oC

195-196 oC

261-262 oC

Dạng phổ UV của khung flavonol

- Khung flavon

Cảm quan Độ tan [𝛼]24 𝐷 to nc UV/MeOH λmax (nm)

ESI-MS

[M+H]+ 465,05 [M-H]- 463,16

359, 257 [M+Na]+ 501,22 [M-H]- 477,36

[M+H]+ 465,0 [M-H]- 463,15

335, 285 [M+H]+ 477,41 [M-H]- 475,41

338, 269 [M+H]+ 433,10 [M-H]- 431,10

303, 16

303, 17

303, 16

Phân mảnh đặc trưng

286, 383, 192, 93

339, 269, 163, 93

358, 260 [M+H]+ 449,38 [M-H]- 447,38 448, 392, 301, 214 179, 121 448,38

432,10

464,05 C21H20O12

476,41 C21H20O11 C22H20O12 C21H20O10

464,15 C21H20O12

478,36 C21H18O13

M CTPT Độ bất bão hòa Bảng 3.47. Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-3 (CD3OD, 125 M) và LF-2, LF-4,

TF-5 (DMSO-d6, 125 MHz).

LF-2 156,1 s 133,3 s 177,4 s 161,2 s 98,6 d 164,0 s 93,4 d 156,3 s 103,9 s 121,1 s 116,2 d 144,7 s 148,4 s 115,1 d 121,5 d 100,9 d 74,0 d 77,5 d 69,9 d 76,5 d 60,9 t -

LF-3 159,3 s 135,8 s 179,5 s 163,0 s 99,9 d 166,1 d 94,8 d 158,5 s 105,8 s 122,7 s 118,2 d 145,9 s 149,9 s 116,2 d 122,8 d 104,4 d 77,6 d 75,7 d 73,4 d 78,2 d 176,2 s -

δC LF-4 156,1 s 133,4 s 177,4 s 161,2 s 98,6 d 164,1 s 93,5 d 156,3 s 104,5 s 121,1 s 115,5 d 144,7 s 148,4 s 115,1 d 121,7 d 103,2 d 71,5 d 76,0 d 70,0 d 77,2 d 60,5 t -

TF-5 156,1 s 134,0 s 177,7 s 161,3 s 98,7 d 163,8 s 93,6 d 157,1 s 104,2 s 120,8 s 115,7 d 145,7 s 148,4 s 115,5 d 121,0 d 101,5 d 71,3 d 70,0 d 70,5 d 70,4 d 17,4 s -

TF-4 160,9 s 103,8 s 182,1 s 146,0 s 130,5 d 151,8 s 94,3 d 149,0 s 105,8 s 121,7 s 128,7 d 115,8 s 161,1 s 115,8 d 128,7 d 101,1 d 73,1 d 77,3 d 75,9 d 69,7 d 169,1 s 61,4 q

TF-3 162,6 s 102,5 d 182,1 s 160,4, s 98,2 d 164,0 s 104,6 s 156,0 s 104,1 s 121,6 s 129,0 d 115,9 d 161,2 s 115,9 d 129,0 d 73,4 d 70,9 d 78,7 d 81,8 d 70,6 d 63,1 t -

Vị trí C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1” 2” 3” 4” 5” 6” 6”-OCH3

Bảng 3.48. Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-3 (CD3OD, 500 M) và LF-2, LF-4, TF-

5, TF-4, TF-3 (DMSO-d6, 500 MHz).

δH m (J, Hz)

LF-2

LF-3

LF-4

TF-5

TF-4

6,81 s

H H-3 H-6 H-8

6,20 d (2,0) 6,40 d (2,0)

6,20 d (2,0) 6,20 d (2,0) 6,40 d (2,0) 6,40 d (2,0) 7,05 s

H-2’

7,58 m

7,98 d (2,0)

7,65 m

7,30 d (2,0) 7,93 d (8,0)

H-3’

6,93 d (7,0)

H-5’

6,84 d (9,0)

6,88 d (8,5)

6,82 d (9,0) 6,86 d (8,0) 6,93 d (7,0)

H-6’

7,58 m

7,52 d (2,5) 7,24 d (2,0) 7,93 d (8,0)

7,51 dd (8,5; 2,0)

H- 1”

5,46 d (7,5)

5,40 (d, 7,5)

5,38 d (8,0) 5,26 d (2,0) 4,95 d (9,0)

TF-3 6,78 s 6,27 s 8,00 d (9,0) 6,89 d (8,5) 8,02 d (9,0) 4,68 d (10,0)

H-2”

3,26 m

3,63 m

3,50 m

3,83 m

H-3” H-4” H-5”

3,55 m 3,60 m 3.51 m

3,55 m overlapped 3,41 m 3,45 m 3,30 m

3,22 m 3,16 m 3,14 m

3,34 m 3,26 m 3,14 m

3,27 m 3,23 m 3,36 m

H-6”

0,82 d (6,0)

3,58 m 3,31 m

3,76 m 3,52 m

3,08 m 3,08 m 3,24 m 3,58 dd (11,0; 4,0) 3,31m -

3,71 s

H3COOC-

So sánh dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 với các

tài liệu đã công bố LF-2[13],[26], LF-3[42,[47]], LF-4[26], TF-5[13], TF-4[20], TF-3[121]

lần lượt là isoquercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA, hyperin và quercitrin,

scutellarein 7-O-β-D-GlcA methyl ester, vitexin. Trong đó, quercitrin,

scutellarein 7-O-β-D-GlcA methyl ester, vitexin lần đầu tiên được phân lập trên

cây Sen. Quercetin 3-O-β-D-GlcA, hyperin lần đầu tiên được công bố từ lá Sen

Việt Nam. Cấu trúc hóa học của 05 flavonoid này được trình bày ở Hình 3.15.

Hình 3.15. Cấu trúc hóa học của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3.

Hợp chất LF-7

Mô tả: Dạng bột vô định hình màu vàng tươi, dễ tan trong MeOH, kém tan

trong CHCl3. UV/ methanol có ba cực đại ở các bước sóng 359, 267, 257 nm.

ESI-MS (ES-): m/z = 608,69 [M-H]-; (ES+) m/z = 632,84 [M+Na]+. LF-7 có

M= 609,69 và công thức nguyên C27H30O16 với độ bất bão hòa là 13.

1H NMR (CD3OD, 500 MHz) H : 6,21 (1H; d; 2,0 Hz; H-6); 6,43 (1H; d; 2,0 Hz;

H-8); 7,45 (1H; d; H-2’); 6,86 (1H; d; 9,0 Hz; H-5’); 7,40 (1H; dd; 2, 9Hz; H-6’);

5,32 (1H, d, 7,5Hz, H1-Glc); 5,21 (1H, d, 2,0 Hz, H1-Rham).

13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) C: 157,3 (C-2); 134,1 (C-3); 178,2 (C-4); 161,1

(C-5); 99,0 (C-6); 164,5 (C-7); 94,1 (C-8); 158,3 (C-9); 104,3 (C-10); 122,1 (C-1’);

116,2 (C-2’); 145,5 (C-3’); 149,1 (C-4’); 116,0 (C-5’); 121,5 (C-6’); 101,5 (C1-

G); 74,2 (C2-G); 77,3 (C3-G); 72,1 (C4-G); 76,5 (C5-G); 67,2 (C6-G); 102, 3 (C1-

Rh); 70,5 (C2-Rh); 71,2 (C3-Rh); 72,1 (C4-Rh); 69,2 (C5-Rh); 18,6 (C6-Rh).

So sánh dữ liệu phổ của LF-7 với tài liệu đã công bố[13],[28]. LF-7 là rutin.

Nhận xét: Kết quả nghiên cứu của luận án đã phân lập và xác định cấu trúc các

hợp chất như sau:

Từ lá Sen:

- 10 alkaloid: nuciferin, 2-O-nornuciferin, caaverin, asimilobin, apoglaziovin,

norarmepavin, armepavin, pronuciferin, pronuciferin N-oxid, isoliensinin.

- 08 flavonoid: quercetin, isoquercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA, hyperin,

isorhamnetin, kaempferol, rutin, catechin.

Từ tâm Sen:

- 11 alkaloid: isoliensinin, liensinin, neferin, isoliensinin N2’ oxid, isoliensinin

N2 oxid, norarmepavin, armepavin, N-methyl coclaurin, lotusin, nuciferin,

pronuciferin.

- 06 flavonoid: calycosin, isorhamnetin, vitexin, scutellarein 7-O-β-D-GlcA

methyl ester, quercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA.

Trong đó, có 05 alkaloid (nuciferin, pronuciferin, armepavin, norarmepavin,

isoliensinin) và 02 flavonoid (quercetin 3-O-β-D-GlcA, isorhamnetin) hiện diện ở cả

lá và tâm Sen. Do đó, có 35 hợp chất được phân lập nhưng thật sự chỉ có 28 cấu trúc

3.2. Thiết lập chất đối chiếu từ alkaloid, flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen

được xác định.

3.2.1. Xây dựng qui trình xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập CĐC

Các hợp chất được chọn để thiết lập chất đối chiếu gồm: (1) nuciferin, (2)

2-O-nornuciferin, (3) isoliensinin, (4) liensinin, (5) neferin, (6) quercetin 3-O-β-D-

GlcA được phân lập từ lá, tâm Sen.

Xác định hàm ẩm bằng TGA, độ tinh khiết bằng DSC các nguyên liệu thiết lập CĐC

Bảng 3.49. Kết quả khảo sát hàm ẩm bằng phương pháp TGA và nhiệt độ

nóng chảy, độ tinh khiết bằng phương pháp DSC (n=3).

Tên CĐC

Nuciferin O-nornuciferin Isoliensinin Liensinin Neferin Quercetin-3-O-β-D-GlcA

Nhiệt độ nóng chảy TB ( oC) 163,0 173,5 70,5 74,5 93,0 147,0

Độ tinh khiết TB (%) 99,64 97,65 97,91 98,84 99,91 100,0

Hàm ẩm TB (%) 0,415 0,542 0,392 0,186 0,825 1,007

Xác định độ tinh khiết bằng HPLC/PDA

Dựa trên cấu trúc hóa học của các hợp chất nghiên cứu, khảo sát các thông số:

bản chất pha tĩnh, pha động, pH, nhiệt độ, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện,

nhằm tìm ra các điều kiện sắc ký thích hợp xác định độ tinh khiết sắc ký các mẫu

nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.52.

Bảng 3.50. Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết

HPLC-PDA của 06 CĐC.

Pha tĩnh

Tên CĐC

Pha động ACN-TEA 0,1%

Nồng độ mẫu ( µg/mL)

Nhiệt độ cột (o C)

52:48 50:50

Bước sóng phân tích (nm) 272 272

Tốc độ dòng (ml/ phút) 1,0 1,0

Thể tích tiêm mẫu (µl) 10 µl 10 µl

1000

Cột phenomenex Gemini C18 (150 mm x4,6 mm; 5µm)

285 285 285

0,8 0,8 0,8

15 µl 15 µl 15 µl

254

1,0

10 µl

Nuciferin 2-O- nornuciferin Isoliensinin Liensinin Neferin Quercetin 3- O-β-D-glcA

64:36 64:36 60:40 ACN- acid formic 0,1 % (20:80)

Khảo sát tính phù hợp hệ thống:

Tiến hành sắc ký 06 lần liên tiếp trong một lọ mỗi mẫu nguyên liệu thiết lập CĐC.

Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống được trình bày ở Bảng 3.51.

Bảng 3.51. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC

của 06 CĐC.

Rs

As

N

Tên chất khảo sát

tR (phút)

S (µVx giây)

9,59

27649053

1,12

4568

Nuciferin (1)

RSD%

0,32

1,56

1,36

1,76

9,20

28922220

1,20

3689

2-O-nornuciferin (2)

RSD%

0,55

0,82

0,76

1,86

6,82

11869214

0,98

4254

Isoliensinin (3)

RSD%

0,28

1,51

0,81

0,98

6,84

9359757

0,93

5120

Liensinin (4)

RSD%

0,45

1,42

1,46

1,38

6,90

10209918

0,95

3798

Neferin (6)

RSD %

1,24

0,68

0,95

1,64

10,13

5993758

1,16

3218

Quercetin 3-O-β-D- GlcA (7)

RSD %

1,61

0,74

0,49

1,97

1:3,20 2:1,80 1:1,45 2:1,86 1:3,40 2:1,60 1:2,03 2:1,24 1:2,91 2:0,00 1:0,93 2:0,00 1:2,87 2:0,00 1:1,12 2:0,00 1:3,54 2:0,00 1:1,62 2:0,00 1:1,67 2:3,65 1:0,87 2:1,34

1: pic chính so tạp trước nó; 2: pic chính so tạp sau nó

Nhận xét: Qui trình đều đạt tính phù hợp hệ thống.

Thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký các nguyên liệu làm CĐC

bằng HPLC

Tính đặc hiệu: SKĐ mẫu trắng không có tín hiệu tại vị trí thời gian lưu của pic chính

trên SKĐ mẫu thử CĐC.

Miền giá trị, độ đúng, độ chính xác: của qui trình phân tích các nguyên liệu thiết lập

chất đối chiếu được trình bày ở Bảng 3.52.

Bảng 3.52. Kết quả xác định miền giá trị, độ đúng, độ chính xác của qui trình

phân tích các nguyên liệu thiết lập CĐC.

1

2

3

4

5

6 Yêu cầu thẩm định Phương trình hồi qui

y= 1907x 0,9995

y= 10225x 7148x 0,9990 0,9992

y= 6201x 0,9989

y= 1046x 0,9997

y= 1325x 0,9994

15,63-1000

0,76

1,23

1,84

0,52

0,98

0,53

Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính (µg mL-1) Độ chính xác trong ngày, RSD (%) (n=6)

Độ đúng* (n=9)

98,7- 102,3

101,5 103,6

99,8 102,8

98,3 103,5

97,6 102,2

98,8 103,4

*: Tỉ lệ hồi phục trung bình (%)

(1): nuciferin; (2): 2-O-nornuciferin; (3): isoliensinin (4): liensinin; (5): neferin; (6): quercetin 3-O-β-D-GlcA.

Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết 06 nguyên liệu làm chất đối chiếu bằng

phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, miền giá trị rộng, độ chính xác và độ đúng cao.

Do đó có thể áp dụng quy trình này để tiến hành xác định độ tinh khiết của các

nguyên liệu thiết lập CĐC.

Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký 06 nguyên liệu thiết lập CĐC

Tiến hành sắc ký mẫu nguyên liệu theo quy trình đã chọn, chuẩn bị 06 mẫu thử,

mỗi mẫu sắc ký 3 lần. Kết quả cho thấy mẫu nghiên cứu có độ tinh khiết trên 96 %.

Số liệu được trình bày trong Bảng 3.53.

Bảng 3.53. Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các nguyên liệu thiết lập CĐC.

Tên CĐC

Nuciferin O-nornuciferin Isoliensinin Liensinin Neferin Quercetin 3-O-β-D-GlcA

Độ tinh khiết TB (%) HPLC/PDA 99,20 96,60 96,80 96,10 96,03 98,01

RSD (n=3) 0,79 % 1,36 % 2,02 % 1,15 % 1,34 % 0,64 %

Tạp (%) 0,38 2,86 2,81 3,71 1,82 1,58

3.2.2. Xây dựng TCCS đánh giá nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu

Căn cứ vào tính chất lý hóa và mục đích sử dụng của các nguyên liệu thiết lập chất

đối chiếu được dùng cho phép thử định lượng các hợp chất tự nhiên. Áp dụng

kết quả xây dựng qui trình xác định độ tinh khiết mục 3.2.1 và tham khảo chứng chỉ

phân tích của các chất đối chiếu gốc. Dự kiến TCCS của các nguyên liệu làm chất

đối chiếu hóa học là các hợp chất tự nhiên đặc trưng chiết ra từ dược liệu gồm

các chỉ tiêu và phương pháp thử được tóm tắt trong Bảng 3.54.

Bảng 3.54. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử của các CĐC

Mức chất lượng đề nghị

Yêu cầu

Phương pháp thử

1. Tính chất 2. Hàm ẩm 3. Định tính Nhóm I: Phổ IR

Theo TCCS

PL- 3.11

Nhóm II: Nhiệt độ nóng chảy và Năng suât quay cực.

Nhóm III: UV, MS, NMR

4. Định lượng

5. Tạp chất

Dạng vô định hình, màu sắc, mùi vị, độ tan.. Không quá 1% Phải có các dao động đặc trưng theo cấu trúc hóa học của các nguyên liệu dùng thiết lập chất đối chiếu. Điểm nóng chảy phải nằm trong khoảng điểm chảy lí thuyết của chất đó ± 1oC hoặc phù hợp với điểm chảy trong bộ dữ liệu chuẩn. Giá trị NSQC phải nằm trong khoảng lý thuyết của chất đó ± 2o hoặc phù hợp với NSQC trong bộ dữ liệu chuẩn. Dữ liệu phổ UV phải có các λmax đặc trưng và MS phải có số khối đặc trưng của chất. Dữ liệu phổ NMR (13C, 1H, COSY, HSQC, HMBC) phù hợp với bộ dữ liệu chuẩn, dữ liệu phổ đã công bố. Không được thấp hơn 95 % tính theo chế phẩm nguyên trạng. Không được vượt quá 5 % tính theo chế phẩm nguyên trạng, loại những pic có S/N < 2/1.

3.2.3. Đánh giá đồng nhất lọ

Mỗi lọ được đóng 10 mg, tổng số lọ đóng 30 lọ. Sau khi đóng, các ống được bảo quản

ở nhiệt độ từ 2-8 oC. Số lọ đánh giá: 6 lọ. Mỗi lọ được phân tích 2 lần trên cùng một

phương pháp đã được thẩm định. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.55

Bảng 3.55. Kết quả đánh giá đồng nhất lô của quá trình đóng lọ các CĐC.

CĐC

RSD

1 5

3 15

2 10

5 25

6 30

Nuciferin

2-O- nornuciferin

Isoliensinin

4 20 99,35 99,43 99,32 0,3% 3 96,83 96,78 96,85 0,4% 8 96,97 97,05 96,34 0,2%

Mẫu thử Lọ số Hàm lượng % 99,41 98,65 99,27 35 Lọ số 96,79 96,84 96,75 Hàm lượng % 2 Lọ số 96,99 96,56 97,08 Hàm lượng % 87

Liensinin

Neferin

Quercetin 3-O- β-D-GlcA

Lọ số Hàm lượng % Lọ số Hàm lượng % Lọ số Hàm lượng %

14 96,27 97,25 96,28 9 95,50 96,97 95,43 25 97,91 98,10 98,86

26 96,30 96,28 96,26 0,4% 17 95,41 95,38 96,20 0,7% 31 97,90 97,87 97,86 0,5%

Nhận xét: Độ lặp lại tương đối của hàm lượng giữa các lọ trong một lô sản xuất đều

có RSD dưới 1,0%. Do đó, các lọ thành phẩm của lô sản xuất có hàm lượng

đồng nhất. Từ đó kết luận điều kiện đóng gói ổn định và phù hợp.

3.2.4. Đánh giá liên phòng thí nghiệm

Các lọ CĐC được đánh giá tại 2-3 phòng thí nghiệm đạt GLP hoặc ISO 17025:

- Khoa Thiết lập chất chuẩn & Chất đối chiếu - Viện Kiểm nghiệm thuốc

Tp. HCM (PTN-1).

- Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm - Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. HCM (PTN-2).

- Trung tâm kiểm nghiệm thuốc- mỹ phẩm- thực phẩm Tp. Cần Thơ (PTN-3).

Mỗi PTN nhận 6 lọ chất đối chiếu và quy trình phân tích. Độ đồng nhất liên PTN

được đánh giá bằng phép thống kê ANOVA một yếu tố trên 18 kết quả định lượng

của 2-3 PTN tham gia đánh giá.

Kết quả đánh giá liên phòng thí nghiệm và phiếu kiểm nghiệm của các phòng thí

nghiệm được trình bày ở PL- 3.1 đến PL-3.10.

Nhận xét: các giá trị Ftn của các CĐC đều nhỏ hơn Flt = 3,682. Do đó, độ tinh khiết

sắc ký của các CĐC không phụ thuộc vào PTN tham gia đánh giá. Các lọ CĐC

đồng nhất về độ tinh khiết sắc ký.

Bảng 3.56. Kết quả đánh giá liên PTN bằng thống kê Anova của các nguyên liệu thiết

lập CĐC (tham khảo PL-3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 3.10).

Nhận xét

Flt

3,68

Kết quả trung bình của ba PTN giống nhau

CĐC Nuciferin 2-O-nornuciferin Isoliensinin Liensinin Neferin Quercetin 3-O-β-D-glcA

Ftn 2,39 2,68 3,47 1,66 0,20 0,52

Nhận xét: Hàm lượng (%) của các nguyên liệu thiết lập CĐC không phụ thuộc vào

PTN tham gia đánh giá nghĩa là phương pháp phân tích có độ chính xác cao với

giá trị RSD% của độ lặp lại và độ lặp lại nhỏ.

3.2.5. Xác định giá trị ấn định và giá trị công bố

Kết quả hàm lượng công bố của các chất đối chiếu ghi trên chứng chỉ phân tích và số

lượng chất chuẩn thiết lập được trình bày ở Bảng 3.57 (tham khảo PL-3.5 đến 3.10)

Bảng 3.57. Kết quả xác định giá trị ấn định của các CĐC sau khi đóng gói.

STT Nguyên liệu thiết lập CĐC

1 Nuciferin 2 O-nornuciferin Isoliensinin 3 Liensinin 4 5 Neferin 6 Quercetin 3-O-β-D-GlcA

Hàm lượng (%) công bố trên nhãn theo nguyên trạng 99,34 96,54 96,72 96,23 95,94 97,88

Nhận xét: 06 nguyên liệu dùng thiết lập CĐC đủ điều kiện để đăng ký chuẩn

quốc gia với hàm lượng được xác định trên 95% ở tất cả các mẫu tính theo hiện trạng,

các CĐC bảo quản các ở nhiệt độ 2 - 8 oC, tránh ánh sáng.

3.3. Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng alkaloid, flavonoid trong

lá và tâm Sen

3.3.1. Xây dựng qui trình định tính, định lượng alkaloid, flavonoid trong lá Sen

3.3.1.1. Xây dựng và thẩm định qui trình định tính, định lượng đồng thời 07

alkaloid lá Sen bằng phương pháp CE/PDA-MS

Qui trình chiết alkaloid toàn phần có trong mẫu lá Sen

Thực hiện theo sơ đồ chiết 3.2. (SKĐ tham khảo PL- 4.1)

0,5 g bột nguyên liệu lá Sen

+ Làm ẩm với 15 giọt NH4OH 25 %

+ Chiết với 15ml CHCl3 x 3 lần

+ Siêu âm 15 phút, ly tâm: 3500 vòng/phút

Cắn

Dịch CHCl3

Bốc hơi CHCl3

Cắn CHCl3

+ Hòa tan trong 10 ml MeOH

+ Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Mẫu tiêm CE

Sơ đồ 3.2. Qui trình chiết alkaloid toàn phần mẫu nguyên liệu lá Sen

mM trong MeOH/ACN/Nước (70/25/5) với 0,6 % acetic băng, nhiệt độ mao quản 30 oC;

điện thế 25 kV, bước sóng phát hiện 225 nm, kiểu tiêm thủy động học. Thứ tự các pic:

caaverin (1),

isoliensinin (2), armepavin (3), nor-armepavin (4), nuciferin (5),

2-O-nornuciferin (6), pronuciferin (7). ĐDĐ được trình bày ở Hình 3.16 và 3.17.

Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica 62 cm x50 µm i.d; đệm amoni acetat 100

Mẫu dịch chiết alkaloid lá Sen NN-1a

Mẫu hỗn hợp chuẩn 7 alkaloid

ở điều kiện điện di thích hợp.

Hình 3.16. Điện di đồ của hỗn hợp 07 chuẩn alkaloid và mẫu nguyên liệu lá sen (NN-1a).

mM trong MeOH/ACN/Nước (70/25/5) với 0,6% acetic băng; nhiệt độ mao quản: 30 oC;

điện thế: 25 kV; bước sóng phát hiện 225 nm. ESI positive, áp suất khí bao (N2): 4 psi, khí

khô (N2): 4 L/phút, nhiệt độ 250 oC, thế phun: 4,5 kV, chất lỏng bao (methanol-nước 1:1 với

0,6 % acetic acid), tốc độ dòng chất lỏng bao: 0,2 mL/phút.

Điều kiện CE-MS thích hợp: mao quản silica, 50 µm i,d, x 90 cm; đệm amoni acetat 100

Hình 3.17. Điện di đồ CE-MS của mẫu hỗn hợp 07 chuẩn (TIC) và mẫu thử dịch chiết

alkaloid toàn phần lá Sen NN-1a (TIC/EIC) ở điều kiện CE-MS thích hợp.

Hình 3.18. Phổ MS của nuciferin, 2-O-nornuciferin, norarmepavin, armepavin trong mẫu

thử lá Sen, tương ứng điện di đồ CE-MS.

Thẩm định qui trình định lượng

Khảo sát tính phù hợp hệ thống

Kết quả độ lệch chuẩn tương đối qua sáu lần tiêm liên tiếp mẫu thử lá Sen (NN-1a)

của các thông số điện di như diện tích pic hiệu chỉnh, thời gian dịch chuyển và

độ phân giải không quá 2% nên qui trình đạt tính phù hợp hệ thống (phụ lục 4.2).

Tính đặc hiệu: được trình bày ở Hình 3.19

Hình 3.19. Kiểm tra độ tinh khiết pic pronuciferin (7)

Hình 3.20. Điện di đồ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần lá Sen, hỗn hợp 07 chuẩn

alkaloid và mẫu thử thêm hỗn hợp chuẩn.

Tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian, độ đúng: Kết quả tóm tắt các

yêu cầu thẩm định được trình bảy ở Bảng 3.58.

Bảng 3.58. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian,

độ đúng qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong mẫu nguyên liệu lá sen

(NN-1a) bằng phương pháp CE-PDA/MS.

Alkaloid

Yêu cầu thẩm định Phương trình hồi qui

4 y= 0,601x +1,20

7 y= 1,374x+ 7,49

6 y= 1,325x +11,24

6,1- 40 1,53 5,09

2 y= 1,948 x+ 3,95 0,9990 3,1- 200 1,28 3,84

3 5 y= y= 1,166x 1,046x 13,14 + 3,37 0,9990 0,9994 0,9995 0,9992 0,9988 18,6- 12,2- 580 1190 0,82 5,47

7,2- 458 1,16 3,48

5,7- 368 0,55 1,83

8,7- 14 1,28 4,26

0,45 1,35

2,76

1,65

2,34

4,12

2,74

3,23

2,51

1,57

2,18

3,24

2,56

1,28

1,89

2,37

1 y= 0,907x + 2,14 Hệ số tương quan 0,9991 Khoảng tuyến tính (µg mL-1) LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1) Độ chính xác trong ngày (n=6) Độ chính xác liên ngày (n=3) Độ đúng* (n=9)

99,2

102,1

102,7

103,4

99,8

98,4

Nhận xét: Qui trình đạt các yêu cầu thẩm định của một qui trình định lượng.

3.3.1.2. Xây dựng và thẩm định qui trình định tính, định lượng đồng thời 08

flavonoid có trong lá Sen bằng phương pháp CE/PDA

Qui trình chiết flavonoid toàn phần có trong mẫu thử lá Sen thích hợp: Thực hiện

0,5 g bột nguyên liệu lá Sen

+ Làm ẩm với 15 giọt H2SO4 2%

+ Chiết với 10ml EtOAc x 3 lần

+ Siêu âm 15 phút, ly tâm: 3500 vòng/phút

Cắn

Dịch EtOAc

Bốc hơi EtOAc

Cắn EtOAc

+ Hòa tan trong 10 ml MeOH

+ Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Mẫu tiêm

theo sơ đồ chiết 3.3. (ĐDĐ tham khảo PL-4.3)

Sơ đồ 3.3. Qui trình chiết flavonoid toàn phần mẫu nguyên liệu lá Sen

Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica 62 cm x 50 µm i.d, dung dịch đệm borax

30 mM hòa tan trong ACN-H2O (85:15) điều chỉnh pH 8.0 bằng acid boric 5%, nhiệt

catechin, 2: isorhamnetin, 3: kaempferol, 4: rutin, 5: isoquercitrin, 6: hyperoside, 7:

quercetin, 8: quercetin 3-O-β-D-GlcA. ĐDĐ được trình bày ở Hình 3.21.

độ mao quản 30 °C, điện thế 30 kV; bước sóng phát hiện: 210 nm. Thứ tự các pic: 1:

Hình 3.21. Điện di đồ mẫu hỗn hợp 08 chuẩn flavonoid và mẫu thử dịch chiết

flavonoid toàn phần lá Sen (NN-1a) ở điều kiện thích hợp.

Thẩm định qui trình định lượng

Khảo sát tính phù hợp hệ thống

Kết quả độ lệch chuẩn tương đối qua sáu lần tiêm liên tiếp mẫu thử lá Sen (NN-1a)

của các thông số điện di như diện tích pic hiệu chỉnh, thời gian dịch chuyển và

độ phân giải không quá 2 % nên qui trình đạt tính phù hợp hệ thống.

Tính đặc hiệu: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic tham khảo PL-4.4

Tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian, độ đúng: Kết quả khảo sát tóm

tắt tham khảo ở PL-4.5.

Nhận xét: Qui trình đạt các yêu cầu thẩm định của một qui trình định lượng.

3.3.1.3. Qui trình định tính, định lượng đồng thời 04 alkaloid lá Sen bằng phương

pháp HPLC/PDA

Qui trình chiết alkaloid toàn phần mẫu thử lá Sen thích hợp

Qui trình chiết thích hợp định lượng đồng thời 04 alkaloid có trong mẫu thử lá Sen

được thực hiện tương tự Sơ đồ chiết 3.2. Mẫu cuối cùng sẽ được tiêm vào hệ thống

HPLC-PDA (tham khảo phụ lục 4.6)

Điều kiện sắc ký thích hợp: (SKĐ được trình bày ở Hình 3.22)

Cột Phenomenex Gemini RP-C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 μm), pha động: ACN –

dung dịch TEA 0,1% được điều chỉnh đến pH 8,5 bằng dung dịch acid acetic 30%,

thể tích tiêm mẫu 20 μl, bước sóng phát hiện: 272 nm. Chương trình mẫu

kiểu gradient.

Thời gian ACN Đệm pH 8,5 Tốc độ dòng

0 15 85 0.8

7 15 85 0.8

8 22 78 1.2

35 22 78 1.2

n i r e f i

c u n r o n

O-

c u n

n i r e f i

- 2

n n i s n e

i l

c u n o r p

o s i

(2)

(1)

Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp 04 chuẩn alkaloid (1) và mẫu thử dịch chiết

alkaloid toàn phần lá Sen (2) ở điều kiện sắc ký thích hợp

Thẩm định qui trình định lượng

Khảo sát tính phù hợp hệ thống: Kết quả độ lệch chuẩn tương đối qua sáu lần tiêm

liên tiếp mẫu thử lá Sen (NN-1a) của các thông số sắc ký như diện tích pic, thời gian

lưu và độ phân giải không quá 2 % nên qui trình đạt tính phù hợp hệ thống.

(e)

(d)

(c)

(b)

(a)

Tính đặc hiệu: Được trình bày ở hình 3.23 và 3.24

Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu pha động (a), mẫu hỗn hợp chuẩn (b), dung môi pha mẫu

(c), mẫu thử lá Sen (d), mẫu thử thêm chuẩn (e).

Hình 3.24. phổ UV-vis của nuciferin trong (1) mẫu chuẩn, (2) mẫu thử lá Sen, (3) mẫu

thử thêm chuẩn và kiểm tra độ tinh khiết pic nuciferin.

Khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian và độ đúng: Kết quả khảo

sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ qui trình phân

tích đồng thời 04 alkaloid lá Sen bằng HPLC-PDA (tham khảo phụ lục-4.7).

Nhận xét: Qui trình đạt các yêu cầu thẩm định của một qui trình định lượng.

3.3.1.4. Qui trình định tính, định lượng đồng thời 06 flavonoid lá Sen bằng phương

pháp HPLC/PDA

Qui trình chiết flavonoid toàn phần mẫu thử lá Sen hích hợp

Qui trình chiết thích hợp định lượng đồng thời 06 flavonoid có trong mẫu thử lá Sen

được thực hiện tương tự Sơ đồ chiết 3.3. Mẫu cuối cùng sẽ được tiêm vào hệ thống

HPLC-PDA (SKĐ tham khảo PL-4.8).

Điều kiện sắc ký thích hợp: (SKĐ được trình bày ở Hình 3.25)

Cột Phenomenex Synergi RP-Fusion (250 mm x 4,6 mm, 4 μm), pha động:

ACN- acid formic 0,1% được điều chỉnh đến pH 8,5 bằng dung dịch acid acetic 30%,

thể tích tiêm mẫu 20 μl, bước sóng phát hiện: 254 nm. Chương trình mẫu

kiểu gradient.

Thời gian ACN Acid formic 0,1% Tốc độ dòng

0 15 0.8 85

10 20 0.8 80

11 25 1.2 75

30 25 1.2 75

n g - D - O - 3 - n i t e c r e u Q

n h c e t a c

l o r e f p m e a k

n i t u R

n i t e c r e u q

n i t e n m a h r o s i

(2)

(1)

Hình 3.25. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp 06 chuẩn flavonoid (1) và mẫu thử dịch chiết

flavonoid toàn phần lá Sen (2) ở điều kiện sắc ký thích hợp.

Thẩm định qui trình định lượng

Khảo sát tính phù hợp hệ thống: Kết quả độ lệch chuẩn tương đối qua sáu lần tiêm

liên tiếp mẫu thử lá Sen (NN-1a) của các thông số sắc ký như diện tích pic, thời gian

lưu và độ phân giải không quá 2 % nên qui trình đạt tính phù hợp hệ thống.

Tính đặc hiệu: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic tham khảo phụ lục 4.9.

Khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian và độ đúng

Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ

qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid bằng HPLC (tham khảo phụ lục 4.10)

Nhận xét: Qui trình đạt các yêu cầu thẩm định của một qui trình định lượng.

3.3.2. Xây dựng qui trình định tính, định lượng alkaloid, flavonoid tâm Sen

3.3.2.1. Xây dựng và thẩm định qui trình định tính, định lượng đồng thời 09

alkaloid tâm Sen bằng phương pháp CE/PDA-MS

Qui trình chiết alkaloid toàn phần mẫu thử nguyên liệu tâm Sen thích hợp

Qui trình chiết thích hợp định lượng đồng thời 09 alkaloid có trong mẫu nguyên liệu

tâm Sen được thực hiện tương tự sơ đồ chiết 3.2 (Điện di đồ phụ lục 4.11)

mM trong MeOH/ACN/Nước (70/25/5) với 0,6% acetic băng; nhiệt độ mao quản 30 oC, điện

thế 25 kV, bước sóng phát hiện 225 nm. Tên pic theo thứ tự: 1: neferin, 2: liensinin,

Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica 62 cm x 50 µm i.d, đệm amoni acetat 100

3: isoliensinin, 4: nor-armepavin, 5: armepavin, 6: nuciferin, 7: isoliensinin N2’-oxid,

8: isoliensinin N2’-oxid, 9: pronuciferin. ĐDĐ được trình bày ở Hình 3.26.

225nm

(2)

225nm

(1)

Hình 3.26. Điện di đồ của mẫu hỗn hợp 09 chuẩn alkaloid (1) và mẫu thử dịch chiêt

toàn phần alkaloid tâm sen (NE-1a) (2) ở điều kiện điện di thích hợp.

mM trong MeOH/ACN/Nước (70/25/5) với 0,6% acetic băng, nhiệt độ mao quản: 30 oC,

điện thế 25 kV, bước sóng phát hiện 225 nm. ESI positive, áp suất khí bao (N2): 4 psi,

khí khô (N2): 4 L/phút, nhiệt độ 250 oC, thế phun: 4,5 kV, chất lỏng bao (methanol-nước 1:1

với 0,6% acetic acid), tốc độ dòng chất lỏng bao: 0,2 mL/phút. Điện di đồ CE-MS

được trình bày ở Hình 3.27.

Điều kiện CE-MS thích hợp: mao quản silica, 90 cm x 50 µm i,d. Đệm amoni acetat 100

Hình 3.27. Điện di đồ CE-MS của mẫu hỗn hợp 09 chuẩn alkaloid (TIC) và mẫu

nguyên liệu tâm Sen NE-1a (TIC/EIC) ở điều kiện CE-MS thích hợp.

100

pronuciferin trong mẫu thử tâm Sen, tương ứng điện di đồ CE-MS.

Hình 3.28. Phổ MS của isoliensinin N2’-oxyd, isoliensinin N2-oxyd, isoliensinin,

Thẩm định qui trình định lượng

Khảo sát tính phù hợp hệ thống: Kết quả độ lệch chuẩn tương đối qua sáu lần tiêm

liên tiếp mẫu thử lá Sen (NN-1a) của các thông số sắc ký như diện tích pic, thời gian

lưu và độ phân giải không quá 2% nên qui trình đạt tính phù hợp hệ thống.

Tính đặc hiệu: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic tham khảo phụ lục 4.12.

Khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian và độ đúng

Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ

qui trình phân tích đồng thời 09 alklaoid tâm Sen bằng CE-PDA-MS (phụ lục 4.13).

Nhận xét: Qui trình đạt các yêu cầu thẩm định của một qui trình định lượng.

3.3.2.2. Qui trình định tính, định lượng đồng thời 06 flavonoid tâm Sen bằng

phương pháp CE-PDA.

Qui trình chiết flavonoid toàn phần mẫu thử nguyên liệu tâm Sen thích hợp

Qui trình chiết thích hợp định lượng đồng thời 06 flavonoid có trong mẫu

101

nguyên liệu tâm Sen được thực hiện tương tự Sơ đồ chiết 3.3 (Phụ lục 4.14).

Điều kiện điện di thích hợp: mao quản silica (62 cm x 50 µm i.d); dung dịch đệm

borax 50 mM hòa tan trong ACN-H2O (25:75) điều chỉnh pH 8.5 bằng acid boric 5%,

nhiệt độ mao quản 30 °C, điện thế 30 kV, bước sóng phát hiện 210 nm. Thứ tự các pic

(1: isorhamnetin, 2: calycosin, 3: quercetin 3-O-β-D-glucuronid, 4: scutellarein 7-O-

β-D-glucuronid metyl ester, 5: vitexin, 6: quercitrin). ĐDĐ được trình bày

(2)

(1)

ở Hình 3.29

Hình 3.29. Điện di đồ của mẫu hỗn hợp chuẩn 06 flavonoid (1) và mẫu thử

dịch chiết flavonoid toàn phần tâm Sen (2) ở điều kiện điện di thích hợp.

Thẩm định qui trình định lượng

Khảo sát tính phù hợp hệ thống: Kết quả độ lệch chuẩn tương đối qua sáu lần tiêm

liên tiếp mẫu thử lá Sen (NN-1a) của các thông số sắc ký như diện tích pic hiệu chỉnh,

thời gian dịch chuyển và độ phân giải không quá 2 % nên qui trình đạt tính phù hợp

hệ thống.

Tính đặc hiệu: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic tham khảo phụ lục 4.15

Khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian và độ đúng

Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ

qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid tâm Sen bằng CE-PDA (Phụ lục 4.16).

Nhận xét: Qui trình đạt các yêu cầu thẩm định của một qui trình định lượng.

102

3.3.2.3. Qui trình định tính, định lượng đồng thời 07 alkaloid tâm Sen bằng

phương pháp HPLC/PDA

Qui trình chiết alkaloid toàn phần tâm Sen thích hợp

Qui trình chiết thích hợp định lượng đồng thời 07 alkaloid có trong mẫu nguyên liệu

tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA được thực hiện tương tự Sơ đồ chiết

3.2 (SKĐ tham khảo PL- 4.17).

Điều kiện sắc ký thích hợp: (SKĐ được trình bày ở Hình 3.30)

cột Phenomenex Synergi RP-Fusion (250 mm x 4,6 mm, 4 μm), pha động: ACN –

TEA 0,1% được điều chỉnh đến pH 9,0 bằng dung dịch acid acetic 10%, thể tích

tiêm mẫu 20 μl, bước sóng phát hiện 282 nm. Mẫu theo chương trình gradient:

Thời gian ACN Đệm pH 9 Tốc độ dòng

0 0 100 1,0

15 8 92 1,0

16 18 82 1.2

21 30 70 1.2

40 30 70 1.2

Hình 3.30. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp 07 chuẩn alkaloid (1: isoliensinin N2’-oxid,

2: isoliensinin N2-oxid, 3: neferin, 4: liensinin, 5: isoliensinin, 6: armepavin,

7: nuciferin) và mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần tâm Sen ở điều kiện

103

sắc ký thích hợp.

Thẩm định qui trình định lượng

Khảo sát tính phù hợp hệ thống

Kết quả độ lệch chuẩn tương đối qua sáu lần tiêm liên tiếp mẫu thử tâm Sen (NN-1a)

của các thông số sắc ký như diện tích pic, thời gian lưu và độ phân giải không quá

2% nên qui trình đạt tính phù hợp hệ thống.

Tính đặc hiệu: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết tham khảo phụ lục 4.18

Khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian và độ đúng

Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ

qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid tâm Sen bằng HPLC-PDA (Phụ lục- 4.19).

Nhận xét: Qui trình đạt các yêu cầu thẩm định của một qui trình định lượng.

3.3.2.4. Qui trình định tính, định lượng đồng thời 06 flavonoid tâm Sen bằng phương

pháp HPLC-PDA

Qui trình chiết flavonoid toàn phần tâm Sen thích hợp

Qui trình chiết thích hợp định lượng đồng thời 06 flavonoid có trong mẫu nguyên

liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA được thực hiện tương tự sơ đồ chiết 3.3.

Mẫu cuối cùng sẽ được tiêm vào hệ thống HPLC-PDA (Phụ lục 4.20).

Điều kiện sắc ký thích hợp: (SKĐ được trình bày ở Hình 3.31)

cột Phenomenex Synergi RP-Polar (250 x 4,6 mm, 4 μm), thể tích tiêm mẫu 20 μL,

bước sóng phát hiện: 254 nm, nhiệt độ cột 35 oC, ACN- Acid formic 0,1% theo

chương trình gradient:

Thời gian ACN acid formic 0,1% Tốc độ dòng

5 5 95 1.0

6 15 85 1.0

15 15 85 1.0

16 25 75 1.2

104

30 25 75 1.2

Hình 3.31. SKĐ mẫu hỗn hợp 06 chuẩn flavonoid (1: quercitrin, 2: vitexin,

3: scutellarein 7-O-β-D-glcA methyl ester; 4: quercetin 3-O-β-D-glcA;

5: calycosin; 6: isorhamnetin) và mẫu thử dịch chiết flavonoid toàn phần tâm Sen

), mẫu thử thêm hỗn hợp chuẩn, dung môi pha động, dung môi pha mẫu

(NE-1a

ở điều kiện sắc ký thích hợp.

Thẩm định qui trình định lượng

Khảo sát tính phù hợp hệ thống: Kết quả độ lệch chuẩn tương đối qua sáu lần tiêm

liên tiếp mẫu thử tâm Sen (NN-1a) của các thông số sắc ký như diện tích pic, thời

gian lưu và độ phân giải không quá 2% nên qui trình đạt tính phù hợp hệ thống.

Tính đặc hiệu: Đạt yêu cầu theo qui định.

Khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian và độ đúng

Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ qui

trình phân tích đồng thời 06 flavonoid có trong trong mẫu nguyên liệu tâm Sen bằng

HPLC-PDA (tham khảo phụ lục 4.21).

Nhận xét: Qui trình đạt các yêu cầu thẩm định của một qui trình định lượng.

3.3.3. Xác định các đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen

3.3.3.1. Phương pháp SKLM

Sử dụng bảng mỏng silica gel F254 tráng sẵn, dài 10 cm, chiều rộng giữa các vết 1 cm,

khai triển một lần ở nhiệt độ phòng. Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid,

105

flavonoid trong lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM được trình bày ở Bảng 3.59.

Bảng 3.59. Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong

lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM.

Yêu cầu

DVT-Flavonoid tâm Sen

Mẫu thử

theo sơ đồ

Mẫu

hỗn hợp CĐC (hòa tan trong MeOH)

DVT-Alkaloid lá Sen NN-1a theo sơ đồ chiết 3.16 LN1nuciferin LN2 o-nornuciferin LN3 caaverin LN4 apoglaziovin LN5 asimilobin LN8 pronuciferin

DVT-Alkaloid tâm Sen NE-1a theo sơ đồ chiết 3.16, tâm Sen EN1 isoliensinin EN2 liensinin EN3 neferin EN4 armepavin EN5 norarmepavin, EN8 lotussin

DVT-Flavonoid lá Sen NN-1a theo sơ đồ chiết 3.21 LF1 quercetin LF2 isoquercitrin LF3 quercetin 3-O- β-D-GlcA, LF4 hyperin, LF7 rutin. LF8 catechin

Hệ dung môi triển khai

CHCl3-MeOH- NH4OH 25% (96:4:0,5)

Đánh giá

Phát hiện UV: 254, 365nm TT; Dragendorff Phải có ít nhất 06 vết alkaloid có cùng màu sắc và tương đương Rf với vết CĐC tương ứng. Xác định tỉ lệ giá trị Rf của các vết còn lại so vết nuciferin.

CHCl3-MeOH- NH4OH 25% (90:10:0,5) UV: 254, 365nm TT; Dragendorff Phải có ít nhất 06 vết alkaloid có cùng màu sắc và tương đương Rf với vết CĐC tương ứng. Xác định tỉ lệ giá trị Rf của các vết còn lại so isoliensinin.

NE-1a chiết 3.21, tâm Sen TF1 calycosin TF2 isorhamnetin TF3 vitexin TF4 scutellarein 3-O-β-D-GlcA TF5 quercitrin TF6 quercetin 3-O-β-D-GlcA EtOAc: Me: H2O:HCOOH (100:17:13:0,5) UV:254, 365nm TT; FeCl3 5 % Phải có ít nhất 06 vết flavonoid có cùng màu sắc và tương đương Rf với vết CĐC tương ứng. Xác định tỉ lệ giá trị Rf của các vết còn lại so vết vitexin .

Giá trị Rf

Rf-LN1= 0,85; Tỉ lệ Rf-LN2= 0,61; 0,72 Rf-LN3= 0,68; 0,80 Rf-LN4= 0,20; 0,24 Rf-LN5= 0,51; 0,60 Rf-LN8= 0,80; 0,94

Rf-EN1= 0,55; Tỉ lệ Rf-EN2= 0,59; 1,07 Rf-EN3= 0,78; 1,42 Rf-EN4= 0,40; 0,73 Rf-EN5= 0,45; 0,82 Rf-EN8= 0,18; 0,33

UV: 254,365nm TT; FeCl3 5 % Phải có ít nhất 06 vết flavonoid có cùng màu sắc và tương đương Rf với vết CĐC tương ứng. Xác định tỉ lệ giá trị Rf của các vết còn lại so vết quercetin-3-O-β- D-GlcA. Rf-LF3= 0,48; Tỉ lệ Rf-LF1= 0,79; 1,65 Rf-LF2= 0,41; 0,85 Rf-LF4= 0,39; 0,81 Rf-LF7= 0,37; 0,77 Rf-LF8= 0,75; 1,56

Rf-TF3= 0,65; Tỉ lệ Rf-TF1=0,88; 1,35 Rf-TF2= 0,81; 1,25 Rf-TF4= 0,49; 0,75 Rf-TF5= 0,44; 0,68 Rf-TF8= 0,42; 0,65

3.3.3.2. Phương pháp HPLC/PDA

Tiến hành xác định đặc tính điểm chỉ lá, tâm Sen dựa trên kết quả mục 3.7.

Mẫu nguyên liệu lá, tâm Sen được lựa chọn cho việc đánh giá là những mẫu được thu

hái trong mùa và đại diện cho ba vùng miền khác nhau của Việt Nam. Kết quả được

106

trình bày ở các Bảng 3.60 đến 3.63.

Bảng 3.60. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần alkaloid

có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC-PDA.

DVT- Alkaloid lá Sen bằng phương pháp HPLC

STT Yêu cầu

Thời gian lưu TB (phút)

Tỉ lệ diện tích đỉnh của các pic alkaloid còn lại so với pic nuciferin NN-2a

NN-3a

NN-1a

Tỉ lệ thời gian lưu các pic alkaloid còn lại so với tR của pic nuciferin

Diện tích pic chính

nuciferin

25,5

1,00

2 3 4

2-O-nornuciferin isoliensinin pronuciferin

22,9 16,6 12,8

0,90 0,65 0,50

7354441 8089532 2,72:10 4,60:10 3,27:10 3,10:10 1,63:10 2,22:10

4706357 3,94:10 2,63:10 0,52:10

Bảng 3.61. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần flavonoid

có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC-PDA.

DVT- HPLC Flavonoid lá Sen

STT Yêu cầu

Thời gian lưu TB (phút)

Tỉ lệ thời gian lưu các pic alkaloid còn lại so với tR pic quercetin 3-O-β-D-GlcA

NN-3a

Tỉ lệ diện tích đỉnh của các pic alkaloid còn lại so với S của pic quercetin 3-O-β-D-GlcA. NN-1a

14,4

1,00

quercetin 3- O-β-D-GlcA catechin isorhamnetin kaempferol rutin quercetin

2 3 4 5 6

17,5 26,3 24,7 12,5 20,3

NN-2a Diện tích pic chính 3896789 3263458 1850976 0,92:10 1,41:10 0,94:10 0,00:10 0,00:10 0,56:10 0,00:10 0,00:10 0,88:10 2,50:10 0,82:10 1,06:10 2,36:10 0,67:10 0,87:10

1,22 1,83 1,72 0,87 1,41 Bảng 3.62. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần alkaloid

có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA.

DVT- Alkaloid tâm Sen bằng phương pháp HPLC/PDA

STT Yêu cầu

Thời gian lưu TB (phút)

Tỉ lệ diện tích đỉnh của các pic alkaloid còn lại so với S của pic isoliensinin NE-1a

NE-3a

Tỉ lệ thời gian lưu các pic alkaloid còn lại so với tR pic isoliensinin

isoliensinin

NE-2a Diện tích pic chính

13,75

1,00

2105630

1741194 1619715

8,05

0,58

1,92:10

2,32:10

3,25:10

9,05

0,66

2,88:10

2,79:10

2,01:10

isoliensinin N2’-oxid isoliensinin N2-oxid neferin liensinin pronuciferin

4 5 6 7

nuciferin

10,95 12,93 25,50 26,68

0,8 0,94 1,85 1,94

7,12:10 3,85:10 1,15:10 0,96:10

6,74:10 3,95:10 0,00:10 0,23:10

9,75:10 4,25:10 0,50:10 0,75:10

107

Bảng 3.63. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA.

DVT- Flavonoid tâm Sen bằng phương pháp HPLC/PDA

STT Yêu cầu

Tỉ lệ diện tích đỉnh của các pic alkaloid còn lại so với S của pic vitexin.

Thời gian lưu TB (phút)

NE-1a tR

NE-2a

NE-3a

Tỉ lệ thời gian lưu các pic alkaloid còn lại so với pic vitexin

Diện tích pic chính

vitexin

8,95

1,00

calycosin

20,94

2,34

1430823 1470568 2,70:10 3,05:10

1192352 2,33:10

isorhamnetin

26,05

2,91

1,94:10

1,35:10

0,00:10

scutellarein 7-O-β-D-GlcA

9,60

1,07

4,72:10

3,51:10

5,01:10

quercetin 3-O-β-D-GlcA

10,55

1,18

6,10:10

4,59:10

6,33:10

quercitrin

0,92

5,27:10

4,05:10

2,10:10

8,23 3.3.3.3. Phương pháp CE-PDA/MS

Bảng 3.64. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE/PDA.

DVT- CE/PDA Flavonoid lá Sen

STT Yêu cầu

Thời gian dịch

chuyển (tM) TB

Tỉ lệ diện tích đỉnh của các pic alkaloid còn lại so với S của pic quercetin 3-O-β-D-GlcA. NN-1a

NN-3a

NN-2a

Tỉ lệ thời gian dịch chuyển các pic alkaloid lại so với còn pic quercetin 3-O-β-D- GlcA

9,70

1,00

quercetin 3- O-β-D-GlcA catechin

5,56

isorhamnetin

Diện tích pic hiệu chỉnh 232,30 1,61:10 0,00:10

142,95 1,12:10 0,00:10

300,2 0,95:10 0,49:10

0,57 0,61

kaempferol

5,95 6,20

0,83:10

0,00:10

0,64

rutin

6,45

1,14:10

0,10:10

2,25:10

0,66

isoquercitin

6,94

1,85:10

2,53:10

4,87:10

0,72

hyperin

7,25

2,09:10

3,54:10

9,12:10

0,75

108

Bảng 3.65. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE/PDA.

DVT- Flavonoid tâm Sen bằng phương pháp CE/PDA

STT Flavonoid

các

Thời gian di chuyển TB (phút)

Tỉ lệ thời gian dịch chuyển pic alkaloid còn lại so với tM pic vitexin

Tỉ lệ diện tích đỉnh của các pic alkaloid còn lại so với S của pic vitexin. NE-1a

NE-3a

vitexin

11,0

1,00

7,45 5,95

0,68 0,54

NE-2a Diện tích pic hiệu chỉnh 2,90:10 2,89:10 0,00:10 1,84:10

147,2 3,53:10 2,35:10

2 3 4

8,95

0,81

6,76:10

4,47:10

6,45:10

calycosin isorhamnetin quercetin 3-O-β-D-GlcA quercitrin

11,95

1,09

5,88:10

3,95:10

7,42:10

Bảng 3.66. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS.

DVT- Alkaloid lá Sen bằng phương pháp CE/PDA-MS

STT Alkaloid

[M-H]+

Tỉ lệ diện tích đỉnh của các pic alkaloid còn lại so với S của pic isoliensinin. NE-1a

NE-3a

NE-2a

Thời gian dịch chuyển (tM) TB (phút)

Tỉ lệ thời gian chuyển dịch các pic alkaloid còn lại so với tM pic isoliensinin

nuciferin

296

12,30

1,00

2 3 4 5 6

caaverin isoliensinin armepavin norarmepavin 2-O-nornuciferin

268 611 314 300 282

10,55 10,90 11,35 11,70 12,65

0,86 0,88 0,92 0,95 1,03

Diện tích pic hiệu chỉnh 228,7 197,31 269,05 1,73:10 0,00:10 0,68:10 3,26:10 3,33:10 2,50:10 3,65:10 1,50:10 2,95:10 3,26:10 2,50:10 4,54:10 4,04:10 2,33:10 3,64:10

Bảng 3.67. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần alkaloid

có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS.

DVT- Alkaloid tâm Sen bằng phương pháp CE/PDA-MS

STT

Alkaloid

[M-H]+

NE-2a NE-3a

Thời gian dịch chuyển (tM) TB (phút)

Tỉ lệ diện tích đỉnh của các pic Tỉ lệ thời gian alkaloid còn lại so với S của pic dịch chuyển các isoliensinin pic alkaloid còn NE-1a lại so với tM pic isoliensinin

isoliensinin

611

10,45

Diện tích pic hiệu chỉnh 209,02 219,47

266,5

626

12,50

1,20

1,76:10

2,25:10 2,85:10

626

13,45

1,29

2,94:10

2,75:10 2,38:10

isoliensinin N2’-oxid isoliensinin N2-oxid

109

4 5 6 7 8

neferin liensinin nuciferin armepavin norarmepavin

625 611 296 314 300

8,45 10,15 11,95 11,35 10,95

0,81 0,97 1,14 1,09 1,05

7,84:10 4,11:10 1,37:10 3,33:10 2,75:10

9,25:10 9,76:10 4,50:10 3,81:10 1,25:10 1,19:10 6,25:10 4,76:10 2,75:10 2,38:10

3.4. Ứng dụng các qui trình định tính, định lượng để phân tích đồng thời các

alkaloid, flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm từ lá, tâm Sen

3.4.1. Phân tích đồng thời các alkaloid, flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và

chế phẩm bào chế từ lá Sen

Áp dụng các qui trình phân tích đã được thẩm định, tiến hành định tính và định lượng

đồng thời 07 alkaloid bằng phương pháp CE-PDS/MS, 08 flavonoid bằng CE-PDA;

04 alkaloid, 06 flavonoid bằng HPLC-PDA có trong 32 mẫu nguyên liệu được

thu hái vào mùa thu hái khác nhau từ ba vùng miền khác nhau của Việt Nam và 06

chế phẩm thuốc và thực phẩm chức năng bào chế từ lá Sen loài Nelumbo nucifera và

mẫu nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo lutea (Sen trắng), Victoria regia (họ Súng).

Từ đó, tiến hành đánh giá so sánh hàm lượng và xác định đặc tính điểm chỉ cho lá Sen

của từng vùng, miền, mùa thu hái dựa trên thành phần alkaloid, flavonoid có trong

lá Sen. Kết quả được trình bày ở các Bảng 3.68 đến 3.71.

Bảng 3.68. Kết quả xác định hàm lượng các alkaloid (mg/100 mg) có trong mẫu

nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera; Nelumbo lutea và Victoria regia bằng

phương pháp CE-PDA/MS và HPLC-PDA. (ĐDĐ tham khảo phụ lục 4.22 đến 4.25)

Alkaloid

N. lutea

V. regia

Phương pháp

caaverin

iso- liensinin

HPLC

armepavin CE

nor- armepavin

0,10 (2,15)

0,07 (1,87)

nuciferin

HPLC

Mẫu lá Sen loài N. Nucifera NN-1a NN-1b NN-2a NN-2b NN-3a NN-3b 0,02 0,09 (2,31) (2,16) 0,08 0,17 (1,45) (1,52) 0,06 0,15 (0,98) (2,05) 0,07 0,19 (1,67) (1,33) 0,17 0,17 (3,40) (2,52) 0,34 0,52 (3,42) (3,21) 0,28 0,50 (1,23) (1,42)

0,03 (3,29) 0,11 (2,43) 0,10 (0,76) 0,13 (2,36) 0,20 (2,14) 0,44 (3,56) 0,38 (3,09)

0,06 (1,82) 0,12 (1,34) 0,11 (1,12) 0,17 (2,34) 0,15 (2,12) 0,44 (2,57) 0,43 (2,02)

0,12 (1,89) 0,10 (1,64) 0,06 (1,76) 0,13 (2,60) 0,48 (2,80) 0,42 (2,05)

0,20 (1,45) 0,18 (1,45) 0,09 (2,21) 0,15 (2,32) 0,60 (3,45) 0,55 (1,15)

110

0,04 (1,64)

0,01 (1,35)

2-O-nor nuciferin

HPLC

0,03 (2,45) 0,08 3,25)

pro- nuciferin

HPLC

0,21 (2,15) 0,23 (2,56) 0,10 (2,34) 0,11 (1,52)

0,13 (3,48) 0,09 (1,78) 0,06 (3,75) 0,07 (2,15)

0,14 (3,62) 0,15 (2,04) 0,06 (3,21) 0,09 (1,26)

0,07 (3,21) 0,07 (1,98) 0,03 (3,22) 0,03 (1,63)

0,16 (3,21) 0,15 (2,14) 0,01 (3,12) 0,02 (2,32)

1,2,3: miền Nam, Trung và miền Bắc Việt Nam, theo thứ tự.

a: thu hái vào mùa sen tháng 07/2011; b: thu hái nghịch mùa sen tháng 12/2010.

(): giá trị độ lệch chuẩn tương đối. Áp dụng cho các Bảng 3.68, 3.69, 3.70, 3.71.

Bảng 3.69. Kết quả xác định hàm lượng các alkaloid (mg/100 mg) có trong 07 mẫu

chế phẩm từ lá Sen loài N. nucifera bằng phương pháp CE-PDA/MS và HPLC-PDA.

Mẫu bào chế từ lá Sen

Alkaloid

M-7 M-8 M-6 M-9 M-10 M-11

caaverin

Phương pháp

- 0,08 (3,01)

isoliensinin

HPLC

M-13 - 0,03 (2,09) 0,06 (1,14)

armepavin

0,08 (2,13)

norarmepavin CE

nuciferin

HPLC

0,04 (2,34) 0,05 (0,89)

0,02 (2,43) 0,03 (1,23)

0,07 (2,12) 0,10 (1,76)

2-O- nornuciferin

HPLC

0,17 (2,83) 0,22 (1,05) 0,11 (1,98) 0,12 (1,34)

pronuciferin

HPLC

- 0,04 (1,97) 0,05 (1,02) 0,09 (1,83) 0,06 (1,41) 0,18 (2,23) 0,16 (1,25) 0,13 (1,47) 0,10 (2,13) 0,04 (1,97) 0,04 (1,05)

- 0,06 (1,56) 0,08 (1,47) 0,03 (3,06) 0,07 (1,32) 0,28 (1,3) 0,25 (1,98) 0,12 (1,82) 0,13 (1,56) 0,06 (1,69) 0,07 (1,56)

0,05 (1,06) 0,19 (2,02) 0,21 (1,45) 0,09 (2,27) 0,08 (1,72) 0,03 (2,09) 0,05 (1,03)

111

Bảng 3.70. Kết quả xác định hàm lượng các flavonoid (mg/100 mg) có trong mẫu

nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera, Nelumbo lutea và Victoria regia bằng

phương pháp CE-PDA và HPLC-PDA. (ĐDĐ tham khảo phụ lục 4.26, 4.27).

Flavonoid

N. lutea

V. regia

Phương pháp

0,05

catechin

HPLC

Mẫu lá Sen loài N. Nucifera NN-1a NN-1b NN-2a NN-2b NN-3a NN-3b 0,05 0,16 (2,46) (2,38) 0,15 (1,86)

0,09 (1,89) 0,10 (1,53)

0,13 (3,05) 0,04 (1,65)

0,21 (3,15) 0,19 (1,92)

0,09 (5,09) 0,07 (1,49)

isorhamnetin

HPLC

-

kaempferol

HPLC

rutin

HPLC

isoquercitrin

hyperin

0,04 (1,32) 0,08 (2,21) 0,09 (1,19)

0,04 (1,57) 0,04 (2,76)

quercetin

HPLC

quercetin 3-O-β-D-GlcA

HPLC

Σ

0,08 (1,56) 0,09 (3,08) 0,14 (1,78) 0,14 (3,09) 0,19 (2,50) 0,17 (1,62) 0,31 (3,24) 0,35 (2,15) 0,09 (2,34) 0,14 (2,42) 1,68 (1,45) 1,60 (1,63) 3,14

0,03 (1,69) 0,04 (2,87) 0,11 (2,12) 0,12 (2,82) 0,02 (4,14) 0,06 (1,76) 0,26 (4,57) 0,27 (3,48) 0,04 (3,75) 0,08 (4,32) 1,34 (2,16) 1,23 (1,97) 2,08

0,13 (2,32) 0,11 (2,43) 0,33 (3,96) 0,46 (3,65) 0,08 (3,24) 0,09 (1,84) 1,30 (1,78) 1,34 (1,86) 2,26

0,08 (2,67) 0,05 (2,05) 0,21 (2,80) 0,28 (3,23) 0,03 (3,20) 0,03 (2,17) 0,54 (0,97) 0,55 (1,91) 0,89

0,18 (3,14) 0,19 (3,12) 0,39 (3,56) 0,53 (3,22) 0,21 (4,12) 0,18 (4,05) 0,80 (2,31) 0,76 (1,54) 1,01

0,15 (3,45) 0,10 (1,86) 0,12 (4,43) 0,23 (3,45) 0,12 (3,78) 0,09 (2,75) 0,44 (0,75) 0,41 (1,39) 0,72

0,18 (1,68) 0,22 (2,76) 0,14

0,17 (2,51) 0,14 (2,89) 0,08

Bảng 3.71. Kết quả xác định hàm lượng các flavonoid (mg/100mg) có trong 06 mẫu

chế phẩm bào chế từ lá Sen loài N. nucifera bằng phương pháp CE-PDA và

HPLC-PDA.

Mẫu bào chế từ lá Sen

Flavonoid

Phương pháp

catechin

M-8 M-6 M-9 M-10 M-11 - -

- -

CE HPLC

M-7 - -

isorhamnetin

HPLC

- - 0,02 (1,56) 0,03 (1,45)

- - 0,04 (2,08) 0,07 (1,63)

112

0,06

kaempferol

HPLC

0,04

0,03 (2,45)

rutin

HPLC

isoquercitrin

hyperin

0,07 (2,45) 0,07 (2,14)

- -

quercetin

HPLC

quercetin 3-O-β-D-GlcA

HPLC

0,12 (2,18) 0,12 (3,44)

0,09 (2,52) 0,08 (2,18)

0,19 (2,23) 0,25 (2,19)

0,08 (1,98) 0,12 (1,23) 0,11 (2,11) 0,11 (2,11) 0,09 (1,23) 0,19 (1,45) 0,02 (2,54) 0,05 (2,01) 0,36 (1,84) 0,34 (1,56)

0,04 (1,78) 0,05 (1,43) 0,11 (3,14) 0,11 (2,38) 0,04 (1,89) 0,03 (1,92) 0,24 (2,64) 0,31 (2,34)

0,05 (2,04) 0,10 (2,14) 0,13 (1,95) 0,13 (1,95) 0,05 (2,14) 0,12 (1,63) 0,06 (2,12) 0,04 (1,23) 0,39 (1,52) 0,41 (1,52)

3.4.2. Phân tích đồng thời các alkaloid, flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu

và chế phẩm bào chế từ tâm Sen

Áp dụng các qui trình phân tích đã được thẩm định, tiến hành định tính và định lượng

đồng thời 09 alkaloid bằng phương pháp CE-PDS/MS, 06 flavonoid bằng CE-PDA;

07 alkaloid, 04 flavonoid bằng HPLC-PDA có trong 32 mẫu nguyên liệu được

thu hái vào mùa thu hái khác nhau từ ba vùng miền khác nhau của Việt Nam và 06

chế phẩm thuốc và thực phẩm chức năng bào chế từ tâm Sen loài Nelumbo nucifera

và mẫu nguyên liệu tâm Sen loài Nelumbo lutea (Sen trắng). Kết quả được trình bày

ở các Phụ lục 4.28; 4.29; 4.30; 4.31.

Nhận xét: kết quả định tính, định lượng các alkaloid, flavonoid có trong nguyên liệu

lá, tâm Sen cho thấy giữa phương pháp HPLC và CE không có sự khác biệt quá lớn.

Tuy nhiên, hàm lượng các thành phần này bị ảnh hưởng nhiều bởi loài, mùa thu hái,

113

vùng khí hậu và thổ nhưỡng.

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN

4.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid

từ lá và tâm Sen

Chiết xuất alkaloid, flavonoid toàn phần từ nguyên liệu lá, tâm Sen

Tùy thuộc nhóm hợp chất cần phân lập, khối lượng chất tinh khiết thu được và

điều kiện thiết bị hiện có, sẽ quyết định phương pháp chiết xuất thích hợp.

Để thiết lập được một vài CĐC alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen,

nghiên cứu này đã sử dụng phương pháp ngâm lạnh cổ điển với dung môi cồn 70%

acid tartric 0,5% được thăm dò và lựa chọn nhằm thu được cao cồn chứa hầu hết

alkaloid dạng muối và flavonoid (kém tan hơn một ít). Sau đó, cao cồn được tiến hành

loại tạp kém phân cực bằng n-hexan ở pH 1-2, tiến hành chiết phân bố lỏng- lỏng với

EtOAc để thu flavonoid toàn phần. Tiếp tục chiết với CHCl3 ở các pH khác nhau để

thu các phân đoạn alkaloid toàn phần có pKa, độ phân cực khác nhau, giúp tận thu cả

hai nhóm hoạt chất có tác dụng sinh học chính trong lá, tâm Sen.

Trong quá trình phân lập alkaloid lá Sen nhận thấy, khi chiết phân bố với CHCl3

(ở pH ≥ 8) để thu tủa alkaloid toàn phần sẽ gặp rất nhiều khó khăn do hiện tượng tạo

quá nhiều nhũ. Đây là một trở ngại rất lớn trong quá trình phân lập vì làm mất mẫu,

tiêu tốn dung môi cũng như thời gian xử lý, điều này có thể lý giải là do trong

thành phần hóa học có rất nhiều chất béo, sáp, tạp màu (lá Sen) và nhày nhựa (lá,

tâm Sen). Để khắc phục điều này, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm

với hai phương pháp chiết đặc hiệu hơn cho alkaloid bằng cách cho tạo cặp ion với

một acid màu hữu cơ như helianthin, sau đó chiết lại cặp ion này bằng dung môi hữu

cơ và chọn phương pháp tạo tủa alkaloid với thuốc thử Bertrand, rửa tủa lần lượt với

CHCl3, EtOAc. Alkaloid trong tủa Bertrand sau xử lý được hòa trong NaOH 2% để

đưa alkaloid về dạng tự do và được chiết lại bằng CHCl3. Hai phương pháp này

không mới, nhưng cách thứ hai đã cho hiệu quả rất tốt khi thu đặc hiệu tất cả alkaloid

từ kém phân cực đến rất phân cực, sạch tạp cũng như tránh được khó khăn của việc

114

tạo nhũ khi chiết với dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm.

Phân lập các alkaloid, flavonoid từ cao toàn phần

Các nghiên cứu đã công bố cho thấy, hầu hết các phương pháp sắc ký đã được

áp dụng cho việc phân lập các alkaloid, flavonoid. Trong đó, sắc ký cột cổ điển

pha thuận silica gel là phương pháp phổ biến nhất được áp dụng với các hệ dung môi

rửa giải từ kém phân cực đến phân cực mạnh. Ngoài ra, một số tác giả đã sử dụng

pha tĩnh nhựa trao đổi ion[35], Diaion HP-20[99], Sephadex LH-20[99],[102] cho phân lập

alkaloid lá Sen. Với các alkaloid phân cực hơn trong tâm Sen sử dụng cột trao đổi

ion với các pha tĩnh AKS-W, AB-8, H21[106], D72 [57], LSA -5B[55]. Tất cả nhằm mục

đích loại các tạp màu, chất nhày, muối và đường cũng như sự lưu giữ đặc hiệu hơn

với alkaloid khung benzylisoquinolin, bisbenzylisoquinolin có trong lá, tâm Sen.

Đặc biệt, phương pháp sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) đã được

áp dụng trong nhiều nghiên cứu phân lập alkaloid, flavonoid từ lá, tâm Sen.

Các hệ dung môi hai pha không đồng tan sử dụng làm pha động và pha tĩnh trong

phân lập alkaloid tâm Sen thường gặp là n-hexan-EtOAc- MeOH-H2O (5:8:4:5)[74]

hoặc pha hữu cơ thêm triethylamin 10 mM và nước thêm HCl 5 mM [118]; hệ EtOAc:

CCl4: MeOH: H2O (1:6:4:1) [76]; EtOAc: Ethanol: H2O: acid acetic (4:1:5:0,025) [81]

hay n-hexan: EtOAc: MeOH: H2O (1:5:1:5)[75] cho phân lập flavonoid lá Sen.

Kết quả nghiên cứu của luận án cũng đã sử dụng các phương pháp sắc ký khác

nhau với nhiều loại pha tĩnh khác nhau như: silica gel; Sephadex LH-20; silica gel

ghép C-18, C-8; trao đổi cation cho việc phân lập các alakloid, flavonoid trong lá, tâm

Sen. Đặc biệt, phương pháp sắc ký phân bố ly tâm nhanh (FCPC) lần đầu tiên được

sử dụng để phân lập hai alkaloid EN-4 và EN-5 (có độ phân cực mạnh) từ tâm Sen.

Trước khi có điều kiện áp dụng phương pháp FCPC, các phương pháp sắc ký

pha thuận, pha đảo và trao đổi cation cũng đã được áp dụng cho phân đoạn

P-2 tâm Sen chứa hợp chất EN-4, EN-5 nhưng kết quả đều không thành công vì các

phân đoạn thu được với các kỹ thuật này đều kéo theo nhiều tạp phân cực.

Trong nghiên cứu này, hai pha không đồng tan thích hợp được lựa chọn là

CHCl3: MeOH: TEA 0,2 % (12:5:3) với pha động là pha dưới và pha tĩnh là pha trên,

115

sau nhiều nghiên cứu thăm dò và đánh giá bằng (SKLM, HPLC/PDA) với các

hệ dung môi hai pha khác nhau theo khuyến cáo của Ito[98] và các tài liệu

tham khảo về Sen[74],[76],[81],[118]. Tuy nhiên, chỉ có hệ dung môi trên là giúp phân lập

thành công hai alkaloid này, có thể việc sử dụng TEA 0,2% đã cải thiện rất rõ về sự

phân bố của EN-4 và EN-5 lên hai pha không đồng tan này do đặc tính rất phân cực

và khả năng tan được trong nước của các gen-alakloid (việc thêm TEA 0,2% không

tìm thấy trong các hướng dẫn cũng như các nghiên cứu khác), có thể đưa ra giả thuyết

nên sử dụng một base hữu cơ như TEA (nồng độ < 1%) thêm vào hệ dung môi không

đồng tan trong các khuyến cáo về hệ dung hay sử dụng trong HSCCC sẽ phù hợp hơn

với các gen-alkaloid. FCPC là một kỹ thuật không quá mới trên thế giới nhưng nhưng

chưa có tại Việt Nam, giúp phân lập nhanh và lượng lớn các chất tùy theo qui mô,

hạn chế lượng dung môi chiết sử dụng, có thể tự động hóa được, áp dụng hiệu quả

cho những thành phần phân cực đến phân cực mạnh.

Bên cạnh đó, trong quá trình nghiên cứu đã thu được 17,6 g isoliensinin (EN-1)

bằng phương pháp kết tinh ở pH và nhiệt độ phù hợp trong quá trình chiết phân bố

lỏng-lỏng theo gradient pH nguyên liệu tâm Sen. Phương pháp này rất đơn giản, dễ

thực hiện, thu được lượng nhiều và tinh chế lại cho độ tinh khiết cao mà khi phân lập

bằng các phương pháp sắc ký gần như không thực hiện được ở qui mô PTN. Hơn nữa,

cũng chưa có công trình nghiên cứu nào được công bố trước đây về phương pháp này.

Qua nghiên cứu này đã rút ra một số kết luận trong việc vận dụng phương pháp

phân lập. Khi tiến hành phân lập hợp chất tinh khiết từ tự nhiên cần có sự hiểu biết về

thành phần các hợp chất có trong dược liệu, tính chất của nhóm hợp chất cần

phân tích, các phương pháp phân tích hiện đại để có thể vận dụng linh hoạt

nhiều phương pháp, cơ chế pha tĩnh khác nhau nhằm thu riêng biệt được thành phần

mong muốn. Tuy nhiên, tùy theo mục tiêu nghiên cứu mà có thể thực hiện bằng những

cách sau: chiết lỏng lỏng cao cồn toàn phần nhằm loại bớt tạp, sau đó triển khai với

cột VLC để thu những phân đoạn tinh khiết hơn, những phân đoạn được đánh giá phù

hợp sẽ tiếp tục cho qua Sephadex LH-20 (100% MeOH hay Aceton- DCM 30:70) và

có thể sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng bán điều chế pha đảo, trao đổi ion hoặc sắc ký

116

phân bố ly tâm nhanh (FCPC) để thu thành phần tinh khiết mong muốn.

Xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid phân lập được từ lá và tâm Sen

Các nghiên cứu thành phần hóa học lá, tâm Sen được thực hiện từ những năm

1960, tập trung chủ yếu vào thành phần alkaloid và flavonoid bởi các tác giả người

Nhật, Đài loan và Trung quốc. Cho đến nay, đã có 15 alkaloid chủ yếu là khung

aporphin, benzylisoquinolin, proaporphin và 16 flavonoid chủ yếu thuộc nhóm

flavonol được xác định từ lá Sen và 16 alkaloid chủ yếu thuộc khung

bibenzylisoquinolin và benzylisoquinolin từ tâm Sen (được trình bày ở mục 1.2.1).

Đây là một thuận lợi nhưng cũng sẽ là khó khăn trong việc phân lập và xác định cấu

trúc các alkaloid, flavonoid mới từ hai đối tượng này. Chỉ có một nghiên cứu về thành

phần flavonoid có trong tâm Sen[16], là một thuận lợi cho việc nghiên cứu phân lập,

định tính, định lượng flavonoid mới từ tâm Sen.

Tại Việt Nam chỉ có các nghiên cứu của Phạm Thanh Kỳ [6],[9] đã phân lập và

xác định cấu trúc của nuciferin và quercetin, isoquercitrin từ lá Sen, và neferin

từ tâm Sen.

Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy alkaloid, flavonoid vẫn là hai thành

phần hóa học chính trong lá và tâm Sen với 28 cấu trúc được xác định. Trong đó,

các alkaloid có khung aporphin, bibenzylisoquinolin, benzylisoquinolin, proaporphin

và flavonoid chủ yếu là khung euflavonoid, có nhóm flavonol dạng aglycon hay

glycosid, chỉ duy nhất một flavonoid khung isoflavonoid là calycosin. Kết quả

này phù hợp với các nghiên cứu đã công bố trước đây. Tuy nhiên, cũng có rất nhiều

điểm mới về thành phần hóa học phân lập được, có 02 alkaloid (pronuciferin N-oxid,

apoglaziovin) và 05 flavonoid (calycosin, vitexin, Scutellarein 7-O-β-D-glcA methyl

ester, quercitrin) lần đầu tiên được công bố phân lập từ cây Sen. Đặc biệt, có 02

alkaloid có cấu trúc hoàn toàn mới lần đầu tiên được phân lập từ thực vật

(isoliensinin N2’-oxid và isoliensinin N2-oxid) và phần lớn các alkaloid, flavonoid còn

lại đều là lần đầu tiên công bố trên lá, tâm Sen Việt Nam. Kết quả này góp phần

hoàn chỉnh về thành phần hóa học của cây Sen trên thế giới và tại Việt Nam,

117

một cây thuốc quí trong kho tàng cây thuốc.

Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng đã chỉ ra những dấu hiệu chung về phổ học (UV,

IR, MS, NMR) giúp dễ dàng định danh các alkaloid thuộc bốn khung trên và flavonoid

nhóm flavonol và dấu hiệu để phân biệt các chất trong cùng khung.

Các alkaloid trong cùng khung có đặc tính phổ UV gần như giống nhau về dạng

phổ cũng như λmax , chỉ một vài trường cực đại hấp thu bị dịch chuyển một vài nm

là do hiệu ứng chuyển dịch cực đại hấp thu về bước sóng dài hơn (redshift) khi trong

phân tử có gắn thêm nhiều nhóm thế mang màu -OH hơn.

Phổ IR cho các tín hiệu đặc trưng cho các nhóm chức hiện diện trong cấu trúc

-OH, -C=O, - O-CH3, -N-CH3, -C=C- nhân thơm…, và gần như giống nhau giữa các

hợp chất trong cùng một khung.

Phổ MS-TOF và MS2 không chỉ là công cụ hỗ trợ đắc lực cho việc xác định

khối lượng phân tử, dự đoán công thức nguyên mà còn giúp khẳng định cấu trúc các

chất trong cùng một khung hay những đồng phân isomer (liensinin, isoliensinin và

isoliensinin N2’-oxid và isoliensinin N2-oxid) dựa vào các phân mảnh đặc trưng của

ion mẹ và ion con.

Thành phần alkaloid

Trong nghiên cứu này, alkaloid phân lập được từ lá và tâm Sen chủ yếu cũng là

bốn khung aporphin, proaporphin, benzylisoquinolin, bibenzylisoquinolin. Trong đó,

khung aporphin chiếm tỉ lệ tương đối lớn trong lá Sen và khung bisbenzylisoquinolin

cho tâm Sen, điều này phù hợp với rất nhiều các nghiên cứu khác đã công bố về thành

phần alkaloid của lá và tâm Sen.

Các alkaloid khung aporphin được phân lập bao gồm: nuciferin, 2-O-

nornuciferin, caaverin, asimilobin và apoglaziovin. Giữa chúng chỉ khác nhau về số

nhóm hay vị trí gắn của -O-CH3, -N-CH3. Phổ 13C và 1H của 05 alkaloid khung

aporphin này cho độ dịch chuyển hóa học của C và H là gần như giống nhau khi đo

trong cùng dung môi và phù hợp với các dữ liệu đã công bố từ các nghiên cứu khác.

Tuy nhiên, chỉ có một vài δC và δH là khác nhau là do ảnh hưởng của hiệu ứng rút điện

118

tử do có hay không sự hiện diện của nhóm -OCH3 hay -N-CH3 trong phân tử gây hiệu

ứng downfield với các C, H xung quanh những nhóm thế này. Đây cũng là dấu hiệu

đặc biệt để nhận biết cũng như phân biệt các chất trong cùng nhóm.

Bảng 4.1. Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 05 alkaloid

LN-1, LN-2, LN-3, LN-4, LN-5.

δc (DMSO-d6)

LN-1 126,9 s 53,3 t 43,9 s 62,3 d 60,2 s 55,9 s

LN-3 119,1 s 43,4 t - 53,6 d - 56,2 s

LN-4 125,9 s 42,4 t - 53,2 d 60,2 s -

Vị trí C C-1a C-5 N-CH3 C-6a 1-C-OCH3 2-C-OCH3

LN-3

LN-4

δc (CDCl3) LN-2 125,7 s 53,4 t 43,9 s 62,4 d 60,4 s - δH (CDCl3) LN-2 2,54 (3H, s) 3,57 (3H, s) -

- - 3,91 (3H, s)

- 3,60 (3H, s) -

LN-5 119,6 s 52,9 t 43,6 s 62,6 d - 55,9 s δH ppm DMSO) LN-5 2,41 (3H, s) - 3,81 (3H, s)

LN-1 Vị trí H N-CH3 2,54 (3H, s) 1-OCH3 3,66 (3H, s) 3,88 (3H, s) 2-OCH3

Các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin được phân lập bao gồm:

isoliensinin, liensinin, neferin, isoliensinin N2’-oxid và isoliensinin N2-oxid. Giữa

chúng chỉ khác nhau về số nhóm hay vị trí gắn của -O-CH3, -N→O.

Phổ 13C và 1H của 03 alkaloid isoliensinin, liensinin, neferin cho độ dịch chuyển

hóa học của C và H là gần như giống nhau khi đo trong cùng dung môi và phù hợp

với các dữ liệu đã công bố từ các nghiên cứu khác[68], [95]. Tuy nhiên, chỉ có một vài

δC và δH là khác nhau là do ảnh hưởng của hiệu ứng rút điện tử do có hay không sự

hiện diện của nhóm -OCH3 trong phân tử gây hiệu ứng downfield với các C, H xung

quanh những nhóm thế này.

Riêng EN-4 và EN-5 có δC và δH gần như là giống với isoliensinin mặc dù đo

trong dung môi CD3OD (do hai hợp chất này dễ tan trong MeOH, kém tan trong

CHCl3), cho độ dịch chuyển hóa học cao hơn từ 1-1,5 ppm. Đặc biệt, hiệu ứng

downfield càng thấy rõ hơn trong hai hợp chất này khi có sự liên kết phối trí của

nguyên tử oxygen vào nhóm -N-CH3. Đây cũng là dấu hiệu đặc biệt để nhận biết

cũng như phân biệt 05 alkaloid trong cùng nhóm bibenzylisoquinolin này (Bảng 4.2).

Isoliensinin và liensinin, isoliensinin N2’-oxid và isoliensinin N2-oxid là hai cặp

119

đồng phân isomer của nhau, chỉ khác biệt về vị trí của O-CH3 ở vị trí C-7’, C-13 và

N-oxid lần lượt là 2-N=O, 2’-N=O tương ứng. Do đó, để phân biệt được hai cặp đồng

phân isomer này có thể dựa vào SKLM cho hai vết tách nhau trên bảng mỏng,

nhiệt độ nóng chảy khác nhau, trên phổ NMR có thể dựa vào sự khác biệt về độ dịch

chuyển hóa học của các C-7’; C-8’; C-13’ với cặp isoliensinin, liensinin và C-1,1’;

2,2’- N-CH3; C-3,3’; H-1,1’; 2,2’-N-CH3; H-3,3’ với cặp soliensinin N2’-oxyd,

isoliensinin N2-oxyd, cũng có thể dựa vào các phân mảnh đặc trưng cho từng chất

khi đo MS2 (tham khảo phụ lục 2.11, 2.12)

Bảng 4.2. Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 05 alkaloid

EN-1, EN-2, EN-3, EN-4, EN-5.

δC

δH, J (Hz)

C 7’ 7’-OCH3 8’ 13 13-OCH3 14

EN-1 143,4 s - 111,6 d 157,8 s 55,1 s 113,9 d

EN-2 147,3 s 55,9 s 110,9 d 155,6 s - 115,7 d

EN-3 147,2 s 55,9 s 110 6 d 157,8 s 55,1 s 113,5 d

EN-1 - 3,75 s

EN-3 3,82 s 3,73 s

δC

EN-2 3,80 s - δH, J (Hz)

C 1 1’ 2-N-CH3 2’-N-CH3 3 3’

EN-1 64,4 d 64,7 d 43,1 s 42.9 s 47,6 s 46,7 d

EN-4 66,0 d 79,1 d 42,7 s 55,6 s 47,8 t 62,2 t

EN-5 79,65 d 65,70 d 55,00 s 42,72 s 62,44 t 48,28 t

EN-1 3,65 m 3,57 m 2,36 s 2,48 s 3,08 m 2,78 m

EN-4 3,66 m 4,41 (dd, 3; 7,5) 2,52 s 3,22 s 3,18 m; 2,76 m 3,44 m; 3,33 m

EN-5 4,44 (dd, 2,0; 8,9) 3,68 m 3,30 s 2,47 s 3,74 m; 3,51 m 3,06 m; 2,68 m

Các alkaloid khung benzylisoquinolin được phân lập bao gồm: norarmepavin,

armepavin, N-methyl coclaurin, lotussin. Giữa chúng chỉ khác nhau về số nhóm hay

vị trí gắn của -O-CH3, -N-CH3 ở các vị trí C-7, 7-OCH3, C-13, 2-Na-CH3, 2b-N-CH3.

Phổ 13C và 1H của 04 alkaloid này cho độ dịch chuyển hóa học của C và H là gần như

giống nhau khi đo trong cùng dung môi và phù hợp với các dữ liệu đã công bố từ các

nghiên cứu khác. Tuy nhiên, chỉ có một vài δC và δH là khác nhau là do ảnh hưởng

của hiệu rút điện tử do có hay không sự hiện diện của nhóm -O-CH3, -N-CH3,

N bậc 4 trong phân tử gây hiệu ứng downfield với các C, H xung quanh những

nhóm thế này. Bảng 4.3 trình bày dấu hiệu trên phổ 13C và 1H để phân biệt 04 alkaloid

120

EN-6, EN-7, EN-8, EN-9.

Bảng 4.3. Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 04 alkaloid

EN-6, EN-7, EN-8, EN-9.

Vị trí C C-1 2-N-aCH3 2-N-bCH3 C-3 C-4 C-6 6-OCH3 7-OCH3 C-8

EN-6 56,7 d - - 40,2 t 29,1 t 147,2 s 56,0 s 55,9 s 109,6 d

EN-8 65,0 d 43,1 s - 46,3 t 25,2 t 147,0 s 55,7 s - 113,1 d

EN-9 74,4 s 53,0 s 51,4 s 53,0 t 24,4 t 148,3 - 55,9 s 113,2 d

δC EN-7 65,0 d 42,3 s - 46,5 t 25,0 t 146,4 s 55,8 s 55,6 s 111,2 d δH, J (Hz)

EN-8

EN-9

Vị trí H H-1 2-N-aCH3 2-N-bCH3

H-3

3,45 (3H, s) 3,16 (3H, s) 3,6 (m) 3,94 (m)

3,71 (dd, 6,0; 4.5) 3,71 (dd, 13,0; 4,0) 2,53 (1H, m) 2,83 (1H, m) 3,14 (1H, m) 3,90 (3H, s)

6-OCH3 7-OCH3 H-8

EN-6 4,15 (dd, 4,5; 9,5) - 2,95 (1H, m) 3,24 (1H, m) 3,86 (3H, s) 3,84 (3H, s) 6,67 (1H, s)

EN-7 3,71 (dd, 5,5; 2,5) 2,52 (1H, m) 2,81 (1H, m) 3,23 (1H, m) 3,83 (3H, s) 3,57 (3H, s) 6,03 (1H, s)

6,15 (1H, s)

- 3,42 (3H, s) 5,69 (1H, s)

Các alkaloid khung proaporphin được phân lập bao gồm: pronuciferin,

pronuciferin N-oxid. Giữa chúng chỉ khác nhau vị trí -N-CH3 có liên kết phối trí với

nguyên tử O. Phổ 13C và 1H của 02 alkaloid này cho độ dịch chuyển hóa học của

C và H là gần như giống nhau khi đo trong cùng dung môi và phù hợp với các dữ liệu

đã công bố từ các nghiên cứu khác. Tuy nhiên, có sự thay đổi độ dịch chuyển hóa học

của C, H ở các vị trí C- 4, 5, 6, 6a, 7 là do ảnh hưởng của hiệu rút điện tử do có sự

hiện diện của nhóm -N→O trong phân tử gây hiệu ứng downfield với các C, H

xung quanh những nhóm thế này. Bảng 4.4 trình bày dấu hiệu trên phổ 13C và 1H để

121

phân biệt 02 alkaloid LN-8, LN-9.

Bảng 4.4. Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 02 alkaloid

LN-8, LN-9.

LN-9 (DMSO- d6, máy 500 MHz)

δH, J (Hz) 5,23 (1H, m) 3,38 3,20 s

δC 24,5 t 66,9 t 75,8 d 42,7 t 59,5 s

δH, J (Hz) 3,44 (1H, m) 3,20 3, 38 s

LN-8 (DMSO- d6, máy 500 MHz) δC C 27,0 t 4 54,3 t 5 65,0 d 6a 46,8 t 7 43,2 s 6-NCH3

Thành phần flavonoid

Kết quả nghiên cứu đã xác định cấu trúc của 12 flavonoid từ lá và tâm Sen, chủ

yếu thuộc nhóm euflavonoid ở dạng aglycon (kaempferol, quercetin, isorhamnetin,

catechin), dạng O-glycosid ở vị trí số 3 (isoquercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA,

hyperin, quercitrin, rutin), vị trí số 7 (scutellarein 7-O-β-D-GlcA methyl ester) hay

dạng C-glycosid vị trí số 8 (vitexin) và một isoflavon dạng aglycon (calycosin).

Trong đó, nhóm flavonol chiếm tỉ lệ tương đối lớn trong lá và tâm Sen, điều này

phù hợp với rất nhiều các nghiên cứu khác đã công bố về thành phần flavonoid của lá

và tâm Sen[66],[75],[82],[84].

Các aglycon nhóm flavonol (quercetin, isorhamnetin, kaempferol) có độ dịch

chuyển hóa học của C, H gần như giống nhau. Giữa chúng được phân biệt dễ dàng

bởi δC 55,8 ppm của 5’- OCH3 (isorhamnetin) và hai tín hiệu đối xứng của kaempferol

ở C-2’, 6’ và C-3’,5’.

Calycosin, là một isoflavonoid với sự thay đổi vị trí gắn vòng B ở vị trí số 3

so với vị trí 2 của euflavonoid đã làm thay đổi lớn đến môi trường hóa học trong

chúng dẫn đến hầu hết δC, δH bị thay đổi. Đặc biệt, dễ nhận thấy sự thay đổi lớn ở

C-2 (153,3/146.8 ppm euflavonoid) và C-3 (123,4/105ppm của C-3 flavon và 135 ppm

CIV-3 flavonol) và H-2 (8,24 s/ 6,5 s của H-3 flavon).

LF-8 (catechin) cấu trúc tương tự như nhóm flavanonol mà không có -C=O

ở vị trí số 4 dẫn đến môi trường hóa học thay đổi rất lớn (upfield rõ) ở các vị trí C-4

(27,8), C-10 (99,0), C-3 (66,3), C-2 (80,9) và H-2 (4,47); H-3 (3,81); H-4

gem (2,65; 2,34 ppm) và cũng dễ dàng phân biệt catechin với epicatechin

122

bởi H-2 (4,7- 5,1; d, 7-8 Hz).

Các 3-O-glycosid nhóm flavonol (isoquercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA,

hyperin, quercitrin) có độ dịch chuyển hóa học của C, H gần như giống nhau. Tuy

nhiên, có thể dể dàng phân biệt quercitrin bởi sự xuất hiện tín hiệu của bộ tứ rhamnosyl

(C2”-C5”) trong khoảng 70-71 ppm và 6”-CH3 (δC 17,4 ppm; δH 0,82 ppm; d;6Hz)

so với 70-78 ppm và 6”-CH2-OH (δC 60,9 ppm;DEPT ) của LF-1, LF-4 và 6”-COOH

(176,2 ppm) của LF-3.

Để phân biệt isoquercitrin (quercetin 3-O-β-D-glucopyranosid) và LF-4

(quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid) có thể dựa vào sự khác biệt của J-C3”-C4”.

Nếu là galactopyranosid sẽ cho Jae > Jee của glucopyranoside. Tuy nhiên, phổ 1H

nhận được trên thực tế không tính được J này do các tín hiệu bị chồng lắp kiểu m,

việc này cũng gặp trong các nghiên cứu khác đã công bố. Theo các nghiên cứu này

phân biệt hai chất này có thể dựa vào δC-1” từ 103-105,8 trong C3-O-gal so với

100-101 ppm trong C3-O-glc[26]. Có thể dùng acid HCl để thủy phân đưa dạng gycosid

vầ dạng aglycon sau đó sẽ phân biệt 02 đường này bằng phương pháp sắc ký giấy.

Với 7-O-glycosid nhóm flavon của TF-4 (scutellarein 3-O-β-D-GlcA methyl

ester) hoặc 8-C-glycosid nhóm flavon có thể được phân biệt với các 3-O-glycosid

(103-104/ 135 ppm của C-3 flavonol) và H-3 flavon (6,78-6,8; s). TF-4 có thể được khẳng

định bởi độ dịch chuyển của C-6” (169,1 ppm ) và 6”-OCH3 (61,4 ppm) và TF-3 bởi

C1”- glycosid (73,4/100-101 ppm của C1”-O-glycosid) và H-1” (4,68; d, 10 Hz) < 5 ppm.

nhóm flavonol bởi C-4 flavon (182,1 so với 177 ppm của C-4 flavonol); C-3 flavon

4.2. Qui trình định tính và định lượng alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen

4.2.1. Qui trình định tính

Trong nghiên cứu của luận án này, để định tính các alkaloid, flavonoid có trong mẫu

nguyên liệu lá và tâm Sen, hầu hết các phương pháp phân tích phổ biến và tin cậy đã

được sử dụng như: SKLM, HPLC-PDA, CE-PDA/MS.

4.2.2. Qui trình định lượng

Các nghiên cứu định tính, định lượng đã công bố cho thấy, những năm thập niên

1980 khi mà các phương pháp phân tích hiện đại chưa phổ biến thì phương pháp phân

tích thể tích và SKLM, quang phổ UV-Vis được sử dụng cho việc định lượng các

123

alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen.

Những thập niên sau đó với sự phát triển và phổ biến của phương pháp sắc ký

lỏng và điện di mao quản ghép với nhiều loại đầu dò khác nhau đã được áp dụng trong

phân tích thành phần alkaloid, flavonoid có trong nguyên liệu lá, tâm Sen cũng như

khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu, mùa thu hái, thời kỳ ra hoa

lên thành phần và hàm lượng alkaloid, flavonoid [82],[19].

Phương pháp HPLC-PDA, LC-PDA-MS

Hầu hết các nghiên cứu đã công bố sử dụng phương pháp HPLC/PDA để định

lượng thành phần alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen. Trong đó:

Pha tĩnh: phần lớn sử dụng cột pha đảo C18, C8 với kích thước thay đổi

(150- 300 mm, 4- 4,6 mm; 5- 10 µm), chỉ có một nghiên cứu sử dụng cột

pha thuận silica gel107].

Đa phần hệ pha động sử dụng cho phân tích alkaloid lá, tâm Sen là ACN- TEA

0,1% điều chỉnh pH 8 - 11 bằng acid phosphoric và sử dụng kiểu rửa giải đẳng dòng

hoặc gradient. Bước sóng phát hiện điển hình 272 nm cho alkaloid lá Sen và 282 hoặc

284 nm cho alkloid tâm Sen, tốc độ dòng từ 0,8 - 1,4 ml/phút, có hay không có sử

dụng điều nhiệt cho cột tùy theo nghiên cứu. Ngoài ra, một vài pha động khác cũng

được sử dụng như: H2O-ACN-TEA-acid acetic băng (70,6:27:1,6:0,78)[60];

(60:27:3:1)[84]; MeOH-nước-acid acetic băng-natri octansulfonat: natri acetat

(55:45:0,6:10 mM:5 mM)[79]; H2O- ACN- acid acetic băng (45:55:1) chứa 4 g natri

lauryl sulfonat [69] nhằm tạo cặp ion với alkaloid giúp việc tách alkaloid đặc hiệu hơn.

Với flavonoid lá Sen, phần lớn các nghiên cứu định lượng sử dụng hệ pha động

ACN-acid formic 0,1% với kiểu rửa giải đẳng dòng hay gradient[39], [51], [127].

Một số nghiên cứu khác đã sử dụng LC-MS/MS cho việc định tính và định lượng

alkaloid, flavonoid[23],[71],[90] giúp tăng độ nhạy, tính đặc hiệu, độ chính xác

của phương pháp. Hệ pha động sử dụng trong trường hợp này là các dung môi

pha động (ACN- TEA 0,1%)[23],[90] dễ bay hơi tạo điều kiện cho việc

ion hóa mẫu dễ dàng.

Dựa vào cấu trúc và tính chất lý hóa của các alkaloid cần phân tích trong lá,

124

tâm Sen cho thấy đây những hợp chất mang tính base hữu cơ với giá trị pKa thay đổi

trong khoảng 4-7,8 và độ phân cực từ trung bình đến phân cực. Do đó, nghiên cứu

định tính, định lượng các alkaloid có trong lá, tâm Sen của luận án đã sử dụng kỹ

thuật HPLC/PDA pha đảo với cột Phenomenex Gemini RP-C18 (250 x 4,6 mm, 5

μm) (cho lá Sen) và Phenomenex Synergi RP-Fusion (250 x 4,6 mm, 4 μm) (cho tâm

Sen) và pha động: ACN – TEA 0,1 % được điều chỉnh đến pH 8,5 (lá Sen) 9,0 (tâm

Sen) bằng dung dịch acid acetic 10%. Mẫu được chạy theo chương trình gradient, thể

tích tiêm mẫu 20 μl, bước sóng phát hiện: 272, 282 nm.

Dựa vào cấu trúc của các flavonoid cần phân tích trong lá, tâm Sen cho thấy

đây là những hợp chất polyphenol mang tính acid yếu với giá trị pKa thay đổi trong

khoảng 3-5 và độ phân cực từ trung bình đến phân cực. Do đó, việc nghiên cứu định

tính, định lượng flavonoid có trong nguyên liệu lá, tâm Sen đã sử dụng kỹ thuật

HPLC/PDA với cột sắc ký Phenomenex Synergi RP-Polar (250 mm x 4,6 mm, 4 μm),

thể tích tiêm mẫu 20 μl, bước sóng phát hiện: 254 nm, nhiệt độ cột 35 oC, pha động:

ACN- acid formic 0,1%. Mẫu được chạy theo chương trình gradient.

Nhận thấy, nghiên cứu này đã sử dụng kỹ thuật HPLC/PDA giống với các

nghiên cứu đã công bố. Tuy nhiên, nghiên cứu này đã sử dụng pha tĩnh, pha động với

pH và chương trình gradient phù hợp hơn để tách đồng thời 04 alakaloid (nuciferin,

2-O-nornuciferin, pronuciferin, isoliensinin); 06 flavonoid (isorhamnetin,

kaempferol, quercetin, catechin, quercetin 3-O-β-D-GlcA, rutin) trong lá Sen và 07

alkaloid ( isoliensinin N2’-oxid, isoliensinin N2-oxid, neferin; liensinin; isoliensinin;

armepavin; nuciferin); 06 flavonoid (quercitrin, vitexin, scutellarein 7-O-β-D-GlcA,

quercetin 3-O-β-D-GlcA, calycosin, isorhamnetin) trong tâm Sen. Đây là những qui

trình định tính, định lượng đồng thời trên các alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen

bằng phương pháp HPLC/PDA mà chưa được công bố bởi tài liệu nào.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách (Rs) và hình dạng pic (As) của

một chất khi phân tích bằng kỹ thuật HPLC/PDA pha đảo như: loại dung môi, tỉ lệ

dung môi và pH của pha động, nhiệt độ cột, dung môi pha mẫu, bước sóng phân tích,

thể tích tiêm mẫu. Qua nhiều khảo sát thực nghiệm thăm dò các yếu tố ảnh hưởng cho

125

thấy, alkaloid chịu ảnh hưởng mạnh bởi yếu tố pH đến cả As và Rs nên việc sử dụng

một kiềm hữu cơ TEA 0,1% (pH 11) được điều chỉnh đến pH 8,5-9,0 bằng acid actic

20% được lựa chọn. Ngược lại, với flavonoid là một acid hữu cơ yếu sử dụng chất

điều chỉnh là acid formic 0,1% là sự lựa chọn tốt nhất, nhằm ion hóa hoàn toàn các

alkaloid, flavonoid (dựa theo phương trình Henderson- Hasselbalch) nhằm cải thiện

hệ số bất đối cũng như khả năng tách của các thành phần này. Tuy nhiên, nền mẫu

nguyên liệu lá và tâm Sen có nhiều thành phần tạp khác nên kỹ thuật gradient được

sử dụng nhằm đảm bảo sự tách hoàn toàn cho các alkaloid, flavonoid cần phân tích.

Bước sóng phân tích 272 và 282 nm cho alkaloid được lựa chọn vì tương ứng với cực

đại hấp thu của alkaloid khung aporphin và benzylisoquinolin. Bước sóng 210 và

254 nm cho flavonoid vì đây là đỉnh hấp thu đặc trưng của nhóm flavonol. Các yếu

tố khảo sát khác như: nhiệt độ cột, dung môi pha mẫu, kiểu chạy đẳng dòng ít ảnh

hưởng đến hai thông số As và Rs trong phân tích alkaloid. Tuy nhiên, với flavonoid

sử dụng điều nhiệt cột (35 oC) giúp cải thiện As của catechin, kaempferol, rutin.

Về mặt thứ tự rửa giải của 07 alakloid, 06 flavonoid trong tâm Sen và 06

flavonoid trong lá Sen đều phù hợp với cấu trúc và tốc độ di chuyển trên SKLM pha

thuận. Ngoại trừ, trường hợp đảo vết của pronuciferin so với isoliensinin trong phân

tích đồng thời 04 alkaloid lá Sen, điều này có thể do cấu trúc khung proaporphin làm

thay quá trình phân bố và ion hóa của nó trên pha tĩnh C18 làm tốc độ di chuyển của

nó nhanh hơn, mặc dù trên SKLM di chuyển nhanh hơn isoliensinin.

Việc sử dụng đầu dò PDA sẽ giúp kiểm tra độ tinh khiết của các pic alkaloid,

flavonoid trong mẫu nguyên liệu lá, tâm Sen cho cả hai phương pháp HPLC/PDA và

CE/PDA bằng cách so sánh sự tương đồng phổ UV của những điểm bất kỳ trên pic

so với phổ UV tại thời lưu của các pic. Với ngưỡng tương đồng 990 và ngưỡng nhiễu

đường nền là 5% chứng tỏ các pic alkaloid này điều đạt độ tinh khiết dựa theo phổ

UV ở điều kiện sắc ký xác định.

Kết quả thẩm định 04 qui trình định lượng đồng thời 04 alkaloid (qui trình 1),

06 flavonoid (qui trình 2) có trong lá Sen; 07 alkaloid (qui trình 3), 06 flavonoid

(qui trình 4) có trong tâm Sen cho thấy cả 4 qui trình đều có tính đặc hiệu cao,

126

R2 > 0,9995 trong khoảng nồng độ khảo sát và đạt yêu cầu về độ chính xác và

độ đúng. Kết quả thẩm định này chứng tỏ rằng qui trình chuẩn bị mẫu thử là ổn định,

các chất phân tích hầu như không bị mất đi nhiều trong quá trình xử lý mẫu. Điều này

sẽ dẫn đến những kết quả phân tích khi áp dụng qui trình này là hoàn toàn chính xác,

đúng và tin cậy.

Phương pháp CE-PDA và CE-PDA/MS

Phương pháp LC-PDA/MS-MS thường được ứng dụng trong phân tích các

alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen. Tuy nhiên, với yêu cầu định lượng đồng thời từ

năm thành phần trở lên trong nền mẫu phức tạp như dịch chiết lá, tâm Sen thì phương

pháp LC sẽ gặp nhiều khó khăn trong việc xử lý mẫu nếu không sử dụng

kỹ thuật SPE. Theo đó, phương pháp điện di mao quản, một phương pháp bổ sung

cho phương pháp LC, đã được nhiều tác giả ứng dụng trong nghiên cứu định tính,

định lượng alkaloid, flavonoid có trong lá và tâm Sen trong những năm gần đây[16],[94],

nhằm phát huy ưu điểm vượt trội về hiệu năng tách của cột mao quản giúp cải thiện

độ phân giải một cách rõ rệt các thành phần phân tích trên nền mẫu phức tạp, tiêu tốn

lượng rất nhỏ dung môi, mẫu phân tích và thời gian phân tích nhanh mà vẫn thỏa mãn

những yêu cầu độ chính xác và độ đúng.

Trong nghiên cứu của luận án, kỹ thuật CZE-PDA/MS đã được ứng dụng

thành công để xây dựng qui trình định tính, định lượng đồng thời 07 alkaloid trong lá

Sen (caaverin, isoliensinin, armepavin, nor-armepavin, nuciferin, nornuciferin, pronuciferin)

(qui trình 1) và 09 alkaloid trong tâm Sen (neferin, liensinin , isoliensinin, nor-

armepavin, armepavin, nuciferin; isoliensinin N2’-oxyd; isoliensinin N2-oxyd;

pronuciferin) (qui trình 2) và kỹ thuật CZE-PDA đã được ứng dụng để xây dựng qui

trình định tính, định lượng đồng thời 08 flavonoid trong lá Sen (catechin,

isorhamnetin, kaempferol, rutin, isoquercitrin, hyperoside, quercetin, quercetin-3-O-

β-D-GlcA) (qui trình 3) và 06 flavonoid trong tâm Sen (isorhamnetin, calycosin,

quercetin-3-O-β-D-GlcA, scutellarein-7-O-β-D-GlcA methyl ester, vitexin,

quercitrin) (qui trình 4). Cho đến nay, cả 04 qui trình phân tích này chưa được tác giả

127

nào công bố. Đặc biệt, kỹ thuật CE-PDA/MS chưa được triển khai nhiều trong việc

phân tích các hợp chất tự nhiên do những hạn chế trong việc lựa chọn dung dịch

điện ly nền và dung môi bỗ trợ, kết nối với đầu dò PDA và MS.

Việc khảo sát điều kiện điện di để tách đồng thời 07 alkaloid có trong lá Sen

là giai đoạn khó khăn và mất nhiều thời gian nhất. Tiến hành khảo sát trên thực nghiệm

các thông số ảnh hưởng đến hiệu năng tách trong điện di mao quản như: loại dung

dịch đệm, nồng độ, pH của dung dịch đệm, dung môi bổ trợ (ACN, MeOH, THF…),

bản chất và nồng độ chất diện hoạt (SDS, DTAB, CTAB…), điện thế áp dụng, nhiệt

độ mao quản, bước sóng phân tích. Sau đó, tiến hành đánh giá trên hai thông số

độ phân giải (Rs) giữa hai pic lân cận và hình dạng pic (As).

Các tài liệu tham khảo về định lượng alkaloid bằng phương pháp CE[94],[111] cho

thấy có thể sử dụng kỹ thuật CZE với các đệm có tính acid làm chất điện ly nền để có

thể proton hóa các alkaloid, để tăng khả năng hòa tan của các thành kém thân nước

người ta thường thêm các dung môi hữu cơ (ACN, MeOH, THF…). Tuy nhiên,

phương pháp MEKC mới được sử dụng phổ biến nhất trong định lượng thành phần

alkaloid do khả năng làm tăng tính chọn lọc trong việc tách các chất thành phần

alkaloid nhờ sử dụng các chất diện hoạt (SDS, CATB, Cholate,…) hay các tác nhân

đối quang (α,β,γ cyclodextrin,…).

Cả hai phương pháp CZE và MEKC, chất điện ly đều được pha trong môi trường

nước. Nhằm mở rộng độ nhạy của phương pháp bằng cách ghép nối hệ thống CE với

đầu dò MS, khi đó việc sử dụng môi trường điện ly thân nước sẽ không còn phù hợp.

Do đó, việc sử dụng môi trường khan (NACE) để có thể ghép nối với khối phổ đã

được phát triển. Theo đó, các dung dịch đệm có tính kiềm, dễ bay hơi (TEA, amoni

acetat, amoni format) thường được lựa chọn cho việc phân tách alkaloid, có thể pha

trong môi trường khan hoặc chứa tối đa 5% nước bằng kỹ thuật CE-PDA cũng như

có thể thực hiện việc kết nối với đầu dò MS dễ dàng. Kết quả khảo sát cho thấy

dung dịch đệm amoni acetat 100 mM được lựa chọn để phân tách các alkaloid trong

lá Sen là phù hợp. Ở nồng độ này, cường độ dòng điện không quá cao (< 40 µA) nên

128

việc kết nối với đầu dò MS là hoàn toàn khả thi.

Giá trị pH đóng vai trò rất quan trọng trong CE do pH ảnh hưởng đến mức độ

ion hóa của chất phân tích nên ảnh hưởng đến linh độ điện di của chất phân tích.

Chính yếu tố này quyết định quá trình tách các chất bằng kỹ thuật CZE. Việc thêm

vào dung dịch điện ly nền acid acetic băng với nồng độ 0,6% trong hỗn hợp

MeOH-ACN (70:30) đã cải thiện độ phân giải giữa các pic (Rs > 2,2). Ở nồng độ này,

các alkaloid có giá trị pKa khác nhau sẽ bị ion hoá ở các mức độ khác nhau, dẫn đến

linh độ điện di khác nhau và kết quả là tất cả các pic alkaloid đều tách hoàn toàn.

Hiện tượng nghẽn cột mao quản thường xảy ra sau nhiều lần tiêm mẫu khi chỉ

sử dụng hỗn hợp dung môi khan nước MeOH-ACN. Nguyên nhân là do dung dịch

điện ly nền có chứa amoni acetat, một muối tan trong nước. Vì vậy việc thêm một

lượng nước (5-15 %) vào dung dịch điện ly nền nhằm khắc phục tình trạng này đã

được thực hiện. Kết quả cho thấy, ở nồng độ nước 5% hiện tượng nghẽn mao quản

đã được khắc phục hoàn toàn. Các khảo sát thay đổi loại dung môi trong dung dịch

điện ly nền (MeOH, ACN, THF, i-ProOH và hỗn hợp dung môi) cho thấy có ảnh

hưởng lớn đến khả năng tách của các alkaloid. Hệ dung môi MeOH-ACN là sự lựa

chọn phù hợp để phân tách các alkaloid. Điều này có thể lý giải là do các thành phần

alkaloid này dễ tan vào ACN hơn so với các dung môi còn lại.

Kết quả nghiên cứu cũng cho thứ tự di chuyển của các alkaloid không giống

với qui luật của SKLM hay HPLC/PDA. Điều này cũng có thể lý giải là do sự tách

trong CE ngoài phụ thuộc sự ion hóa của chất phân tích (pKa) còn phụ thuộc điện

tích, khối lượng phân tử của chất phân tích cũng như cường độ dòng điện thẩm (EOF)

so với sắc ký pha đảo chỉ phụ thuộc vào pKa và độ phân cực của chất phân tích.

Việc ghép nối hệ thống CE với đầu dò khối phổ và thăm dò điều kiện khối phổ

thích hợp cho CE-MS sẽ cung cấp thêm một kênh thông tin định danh và xác định độ

tinh khiết của các pic alkaloid tách được trong qui trình CE/PDA. Sự kết nối hai hệ

thống là một thử thách về mặt kỹ thuật vì trong CE chỉ sử dụng lượng rất nhỏ dung

môi, áp suất hệ thống thấp, chất phân tích tích điện và phân cực khi ra khỏi hệ thống

CE chỉ có thể phù hợp với kỹ thuật ion hoá ESI trong khối phổ. Tuy nhiên, hệ thống

129

CE và đầu dò MS được vận hành bởi 2 nguồn điện thế riêng biệt nên đoạn cuối của

hệ thống CE sẽ bị ảnh hưởng bởi điện thế được thiết lập trong nguồn ESI. Để giải

quyết khó khăn này, một dòng chất lỏng và khí bao cho nguồn ion hoá ESI (CE sprayer

tip) đã được thêm vào. Tốc độ dòng chất lỏng bao và nồng độ chất bổ trợ trong chất

lỏng bao cũng ảnh hưởng độ lặp lại của kết quả phân tích cũng như tránh được việc

nghẽn cột mao quản do áp suất cao của dòng khí, chất lỏng mang lại. Kết quả khảo

sát dòng chất lỏng và khí bao cho thấy hỗn hợp khí bao nitơ và dung môi

methanol – nước (1:1) chứa 0,6% acid acetic với tốc độ dòng 0,2 ml/phút là phù hợp.

Thẩm định qui trình định lượng được tiến hành theo hướng dẫn của ICH. Trong

đó đánh giá tính đặc hiệu với đầu dò PDA cũng tương tự như trong HPLC/PDA đã

trình bày ở trên. Bên cạnh đó, khi ghép nối CE-MS sẽ cho thêm một kênh thông tin

để kiểm tra độ tinh khiết của các alkaloid trong mẫu. Cả 04 qui trình phân tích này

đều có tính đặc hiệu cao; phương trình hồi qui có R2 > 0,9995 và khoảng tuyến tính

rộng, giá trị LOD (0,45-14,32 ppm) và LOQ (1,35-32,46 ppm) đặc trưng cho

phân tích CE với đầu dò PDA. Đặc biệt, hai qui trình phân tích alkaloid trong lá, tâm

Sen bằng CE-PDA-MS có thể đạt giá trị LOD rất nhỏ (45,4. 10-3- 3,6 ng/ml). Độ

chính xác thể hiện qua giá trị RSD và độ đúng thể hiện qua tỉ lệ phục đều đạt yêu cầu.

Qui trình định lượng đồng thời 09 alkaloid trong tâm Sen bằng CE-PDA/MS trong

đề tài có 03 alkaloid (neferin, liensinin, isoliensinin) trùng với tài liệu đã công bố [23]

với giá trị LOD của 3 alkaloid là tương đương với các công trình đã công bố trên.

Tài liệu [111] đã công bố nghiên cứu về định lượng alkaloid nhóm

bisbenzylisoquinolin (neferin, liensinin, isoliensinin) bằng kỹ thuật MEKC với chất

chuẩn nội là tetrahydropalmatin và tài liệu [94] sử dụng kỹ thuật định lượng đồng thời

[16] định lượng đồng thời catechin, rutin, kaempferol, hyperin bằng kỹ thuật MEKC

neferin, liensinin, isoliensinin, sử dụng chất chuẩn nội ephedrin. Trong khi đó, tài liệu

không sử dụng chất chuẩn nội. Bên cạnh đó các bài báo tổng quan [37] về ứng dụng

dụng của phương pháp CE trong phân tích hợp chất tự nhiên cho thấy phần lớn các

trường hợp không dùng chất chuẩn nội.

Ngoài ra, có một tài liệu [111] so sánh kết quả thẩm định qui trình định lượng có

130

và không có chất chuẩn nội, kết cho thấy không có sự khác biệt đáng kể trong kết quả

thẩm định. Do đó, việc sử dụng chất chuẩn nội hay không tùy thuộc vào qui trình xử

lý mẫu, nồng độ chất phân tích, độ lặp lại về thời gian dịch chuyển và diện tích pic

được chuẩn hoá do kỹ thuật tiêm mẫu. Trong đề tài này, tất cả các qui trình phân tích

bằng CE đều đạt yêu cầu theo hướng dẫn của ICH vì vậy việc sử dụng phương pháp

nội chuẩn là không cần thiết.

4.3. Ứng dụng qui trình định lượng để xác định chất lượng nguồn nguyên liệu

và các chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen

Nguyên liệu lá, tâm Sen

Kết quả khảo sát hàm lượng các alkaloid, flavonoid bằng phương pháp

HPLC/PDA và CE-PDA-(MS) trên 32 mẫu nguyên liệu lá và tâm Sen loài

Nelumbo nucifera được thu hái vào mùa thu hái khác nhau từ ba vùng miền khác nhau

của Việt Nam và 01 mẫu nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo lutea (Sen trắng) và

01 mẫu loài Victoria regia (họ Súng) cho thấy hàm lượng các alkaloid, flavonoid có

trong lá, tâm Sen vào mùa thu hái Sen (tháng 6-9 trong năm) cao hơn nghịch mùa thu

hái (các tháng còn lại trong năm), kết quả này góp phần khẳng định thời gian thu hái

Sen theo dân gian là hoàn toàn phù hợp.

Ngoài ra điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu khác nhau của các vùng thu hái (miền

Nam nóng ẩm, mưa nhiều vùng đất phù sa; miền Trung nóng khô, đất cát biển; Cao

Nguyên Trung Bộ khí hậu mát đến lạnh và miền Bắc chủ yếu lạnh, khô...) cũng ảnh

hưởng nhiều đến hàm lượng alkaloid, flavonoid. Alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen

thu hái ở vùng miền Nam có đầy đủ 07 alkaloid phân tích với hàm lượng cao nhất của

2-O-nornuciferin, norarmepavin và pronuciferine. Trong khi đó, alkaloid đại diện

trong lá Sen là nuciferin cùng với isoliensinin có hàm lượng cao nhất vùng miền

Trung, armepavin được tìm thấy với hàm lượng cao nhất ở các tỉnh phía Bắc. Kết quả

nghiên cứu thu được góp phần đưa ra các khuyến cáo cho việc trồng trọt cũng như

việc thu hái lá, tâm Sen để thu được thành phần alkaloid, flavonoid mong muốn với

131

chất lượng tốt nhất.

Bảng 4.5. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong

Có đủ 07 alkaloid

Vùng

caaverin, 2-O-nornuciferin, norarmepavin, pronuciferin

Hàm lượng cao nhất của armepavin

Nam Bộ

***

Hàm lượng Hàm lượng cao nhất của cao nhất của nuciferin và isoliensinin **

***

Trung Bộ Bắc Bộ

** *

* *

*** *

* ***

lá Sen (N. nucifera) Việt Nam.

Bảng 4.6. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong

Hàm lượng cao nhất của isoliensinin, isoliensinin

Vùng

Hàm lượng cao nhất của neferin, isoliensinin N2’-oxid A, pronuciferin

Hàm lượng cao nhất của armepavin

N2-oxid, liensinin, norarmepavin, nuciferin

Nam Bộ Trung Bộ Bắc Bộ

*** ** *

** * ***

* *** **

tâm Sen (N. nucifera) Việt Nam.

Bảng 4.7. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất có trong

Hàm lượng

Hàm lượng cao nhất của isoquercitrin

Hàm lượng cao nhất của quercetin

Vùng

Đủ 08 flavonoid trong lá Sen

cao nhất của catechin

Nam Bộ Trung Bộ Bắc Bộ

*** * *

Hàm Hàm lượng cao nhất của lượng cao nhất quer-3-O- của GlcA; hyperin kaemferol; isorhamnetin *** * *

* ** ***

* *** *

* ** ***

lá Sen (N. nucifera) Việt Nam.

Bảng 4.8. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất có trong

Hàm lượng cao nhất của

Đủ 06 flavonoid trong tâm Sen

vitexin

Hàm lượng cao nhất của quercitrin

Vùng

Hàm lượng cao nhất của calycosin, quercetin 3-O- β-D-GlcA, scutellarein 7-O-β-D-GlcA methyl ester, isorhamnetin *** ** *

** * ***

Nam Bộ Trung Bộ Bắc Bộ

*** ** *

** *** **

*: dấu sao càng nhiều là mức độ lựa chọn ưu tiên càng cao.

132

tâm Sen (N. nucifera) Việt Nam.

Các Bảng trên cho thấy, Sen vùng Nam bộ (điển hình là vùng Đồng tháp muời,

Cần Thơ, Hậu Giang) có chất lượng tốt vì luôn có đủ các thành phần alkaloid,

flavonoid với hàm lượng cao, điều này trên thực tế cũng phù hợp kinh nghiệm của

người nông dân, nếu muốn thu hoạch Sen chất lượng tốt nên trồng trọt và thu hái ở

vùng đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt vùng Đồng tháp mười.

Từ những kết quả nghiên cứu thu được cũng cho thấy 02 alkaloid là nuciferin (0,52%),

2-O-nornuciferin (0,23%) và flavonoid quercetin 3-O-β-D-GlcA (1,62%) là alkaloid

và flavonoid điển hình và có hàm lượng cao nhất trong lá Sen. Trong khi đó,

isoliensinin (0,53%), liensinin (0,2%), neferin (0,41%) là những alkaloid điển hình

và có hàm lượng cao nhất trong tâm Sen. Những kết quả này cũng rất phù hợp với các

nghiên cứu đã công bố[9],[22],23],[39],[90]. Kết quả phân tích thành phần alkaloid,

flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen loài N. lutea và V. regia cho thấy hàm lượng

của các alkaloid, flavonoid điển hình rất thấp (nuciferin: 0,1 và 0,07%;

2-O-nornuciferin: 0,04 và 0,01%; isoquercitrin: 0,08 và 0,04% và quercetin 3-O-β-D-

GlcA: 0,18 và 0,14%) và không tìm thấy sự hiện diện của các alkaloid,

flavonoid khác, điều này cho thấy các alkaloid khung aporphin, benzylisoquinolin,

bisbenzylisoquinolin, proaprphin, quercetin 3-O-β-D-GlcA thường đặc trưng và có

hàm lượng cao hơn cho loài N. nucifera trong họ Sen.

Chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen

Kết quả nghiên cứu cho thấy, các chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen đa phần ở

dạng thực phẩm chức năng, thành phần công thức là sự phối hợp rất nhiều cây thuốc,

trong đó lượng cao cồn của lá, tâm Sen cũng không phải là cao nhất trong công thức.

Do đó, phần lớn các chế phẩm chỉ xác định được hàm lượng của alkaloid, flavonoid

có hàm lượng cao, điển hình như: nuciferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA từ lá Sen và

isoliensinin, vitexin từ tâm Sen với hàm lượng thấp hơn sự tồn tại của nó trong nguyên

liệu rất nhiều, chỉ có các dạng trà lá Sen M-11 và M-13, M-2 và M-3 là tìm thấy được

gần đầy đủ các thành phần alkaloid, flavonoid cần xác định với hàm lượng cũng

133

thấp hơn, điều này có thể là do nguồn nguyên liệu lá Sen có thể thu hái không đúng

mùa Sen, không đúng vùng khí hậu, thổ nhưỡng hoặc do điều kiện bảo quản

nguyên liệu không đạt tiêu chuần.

4.4. Đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen

Xác định đặc tính điểm chỉ dựa trên những thành phần hóa học có tác dụng

sinh học chính (alakloid, flavonoid) cho nguyên liệu lá, tâm Sen của từng vùng, miền

có ý nghĩa rất lớn trong việc định danh, bảo tồn giống và xác định chất lượng nguồn

nguyên liệu đầu vào trong sản xuất, tồn trữ, lưu thông.

Xác định đặc tính điểm chỉ (dấu vân tay-DVT) bằng phương pháp SKLM,

HPLC/PDA, CE-PDA/MS sẽ góp phần đề xuất các đặc tính có thể nhận biết lá và

tâm Sen của từng vùng dựa trên việc đánh giá các giá trị Rf, tR, tM và tỉ lệ của những

thông số này so với pic của thành phần hóa học đại diện cho cây, có hàm lượng cao

và có tác dụng sinh học (nuciferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA cho lá Sen; isoliensinin

và vitexin cho tâm Sen). Thêm vào đó, diện tích đỉnh các chất đại diện cho cây

(là những pic lớn nhất) được qui về thang 10, sau đó lập tỉ số diện tích đỉnh các pic

còn lại so pic chính này, sẽ cũng cố thêm các đặc tính điểm chỉ nêu trên cho

134

lá, tâm Sen mỗi vùng.

KẾT LUẬN

Sau quá trình thực hiện, luận án đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu và đạt được

tất cả các mục tiêu đề ra ban đầu.

1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid

Luận án đã phân lập được 35 hợp chất (21 alkaloid và 18 flavonoid) từ lá và

tâm Sen. Tuy nhiên, chỉ xác định cấu trúc hóa học của 28 hợp chất do có 05 alklaoid

(nuciferin, pronuciferin, armepavin, norarmepavin, isoliensinin) và 02 flavonoid

(isorhamnetin, quercetin 3-O-β -D-GlcA) hiện diện trong cả hai bộ phận dùng này.

Trong số 28 cấu trúc này, bao gồm:

05 alkaloid khung aporphin (nuciferin, 2-O-nornuciferin, caaverin, asimilobin,

apoglaziovin), 02 alkaloid khung proaporpphin (pronuciferin, pronuciferin N-oxid),

04 alkaloid khung benzylisoquinolin (armepavin, norarmepavin, N-methylcoclaurin,

lotusin), 05 alkaloid khung bisbenzylisoquinolin (isoliensinin, liensinin, neferin,

isoliensinin N2’-oxid, isoliensinin N2-oxid).

01 flavonoid dạng aglycon khung isoflavonoid (calycosin), 11 flavonoid khung

euflavonoid với 09 hợp chất nhóm flavonol (quercetin, isorhamnetin, kaempferol,

catechin, isoquercitrin, hyperin, quercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA, rutin) và 02

hợp chất nhóm flavon (vitexin, scutellarein 7- O-β -D-GlcA methyl ester).

- 02 alkaloid là hợp chất mới (EN-4 và EN-5), lần đầu tiên được công bố

phân lập từ hợp chất tự nhiên, cấu trúc được xác định và được đề nghị đặt tên là

isoliensinin N2’-oxid và isoliensinin N2-oxid.

- 05 hợp chất đã được công bố có trong những dược liệu khác nhưng lần đầu tiên

được phân lập từ cây Sen: 02 alkaloid (pronuciferin N-oxid và apoglaziovin);

03 flavonoid (calycosin, scutellarein 7-O-β-D-GlcA methyl ester, vitexin).

- 02 alkaloid lần đầu tiên được công bố từ lá Sen (isoliensinin, norarmepavin);

03 alkaloid (nuciferin, armepavin, norarmepavin) và 03 flavonoid (isorhamnetin,

135

quercitrin, quercetin 3-O-β-D-GlcA) lần đầu tiên được công bố từ tâm Sen.

- Phần lớn các alkaloid, flavonoid phân lập được từ lá, tâm Sen trong nghiên cứu

này đều là lần đầu tiên được công bố tại Việt Nam (ngoại trừ: quercetin,

isoquercitrin, nuciferin, neferin[7],[8], [9], [11])

Luận án đã góp phần xây dựng các bộ dữ liệu phổ học gồm phổ UV, IR, MS, NMR

của 16 alkaloid, 12 flavonoid từ lá và tâm Sen, cơ sở dữ liệu phổ học quan trọng cho

các công trình nghiên cứu thành phần hóa học của cây Sen chi Nelumbo,

họ Nelumboaceae.

2. Thiết lập chất đối chiếu

Độ tinh khiết của 35 hợp chất phân lập đã được xác định bằng phương pháp

SKLM và HPLC/PDA. Tất cả đều có độ tinh khiết trên 95 %.

Lần đầu tiên 06 chất đối chiếu (nuciferin, 2-O-nornuciferin, liensinin, isoliensinin,

neferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA) có nguồn gốc từ các cao chiết lá và tâm Sen

được thiết lập và công bố đạt yêu cầu CĐC hóa học thứ cấp với bộ dữ liệu chuẩn

bao gồm điểm chảy, năng suất quay cực, phổ UV, IR, MS, NMR.

Tiêu chuẩn cơ sở của mỗi CĐC đã được Viện kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM,

Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc mỹ phẩm Tp.Cần Thơ thẩm định.

3. Quy trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời các alcaloid, flavonoid có

trong lá, tâm Sen

Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 08 quy trình phân tích định tính, định lượng đồng

thời các alkaloid hay flavonoid có trong nguyên liệu lá, tâm Sen bằng phương pháp

HPLC/PDA và CE-PDA-MS, bao gồm:

- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 04 alkaloid trong lá Sen bằng phương

pháp HPLC-PDA.

- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 08 flavonoid trong tâm Sen bằng

phương pháp HPLC-PDA.

- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 07 alkloid trong tâm Sen bằng phương

pháp HPLC-PDA.

- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 06 flavonoid trong tâm Sen bằng

136

phương pháp HPLC-PDA và CE-PDA.

- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 07 alkaloid trong lá Sen bằng

phương pháp CE-PDA-MS.

- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 08 flavonoid trong lá Sen bằng

phương pháp CE-PDA.

- Qui trình định tính, định lượng đồng thời 09 alkaloid trong lá Sen bằng

phương pháp CE-PDA-MS

Trong đó:

Hai qui trình định tính, định lượng bằng phương pháp CE-PDA-MS lần đầu tiên

áp dụng cho các alkaloid khung aporphin, proaporphin, benzylisoquinolin,

bisbenzylisoquinolin có trong lá, tâm Sen được công bố.

Hai qui trình định tính, định lượng bằng phương pháp CE-PDA lần đầu tiên áp dụng

cho các flavonoid khung euflavonoid (flavonol, flavon, catechin) và isoflavonoid

có trong lá và tâm Sen được công bố.

Các qui trình định tính, định lượng bằng phương pháp HPLC-PDA, tuy không mới

về mặt kỹ thuật nhưng là lần đầu tiên được công bố với thành phần các alkaloid,

flavonoid có trong mẫu.

Xác định đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen

Lần đầu tiên xây dựng được các SKĐ và điện di đồ DVT bằng phương pháp SKLM,

HPLC-PDA, CE-PDA/MS giúp xác định đặc tính điểm chỉ, nhận dạng lá, tâm Sen

của từng vùng miền tại Việt Nam.

4. Ứng dụng qui trình định lượng để đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu và

các chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen

Các qui trình định tính, định lượng sau khi thẩm định đã được áp dụng để kiểm soát

chất lượng 32 mẫu nguyên liệu lá Sen và 32 mẫu nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo

nucifera) được thu hái vào mùa thu hái khác nhau từ ba vùng miền khác nhau của

Việt Nam và mẫu nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo lutea và loài Victoria regia

(họ Súng). Từ đó đưa ra những khuyến cáo về chất lượng nguồn nguyên liệu lá, tâm

Sen có nhiều giá trị sinh học này cũng như các chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen đang

137

lưu hành trên thị trường.

KIẾN NGHỊ

Các kết quả đạt được nêu trên là cơ sở khoa học để thực hiện các hướng nghiên cứu

tiếp theo cho dược liệu lá, tâm Sen:

1. Trên kết quả các CĐC đã được thiết lập, các quy trình phân tích đã được thẩm

định đã được báo cáo trong nội dung của luận án là những cơ sở khoa học để tiến

hành xây dựng “Chuyên luận dược liệu lá, tâm Sen” cho Dược điển Việt Nam

trong lần xuất bản tới.

2. Khảo sát qui trình chiết cao định chuẩn alkaloid, flavonoid có kiểm soát hàm lượng

của các alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học đã được chứng minh. Từ đó, tiến

hành tối ưu hóa công thức bào chế viên nang chứa cao định chuẩn

alkaloid, flavonoid.

3. Tiến hành thử nghiệm invivo trên các tác dụng mới đang rất được tâm là tác dụng

về kháng khối u, kích thích miễn dịch của alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có

trong tâm Sen và tác dụng hạ đường huyết của alkaloid khung aporphin

138

có trong lá Sen.

1. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Nghiên cứu thành

phần alkaloid trong tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae)”, Tạp chí Y học

Tp.HCM, Tập 15 phụ bản của số 1, 2011, 606 - 611.

2. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Xây dựng qui trình

định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo

nucifera Gaertn Nelumbonaceae) bằng HPLC với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí

Y học Tp.HCM, Tập 15 phụ bản của số 1, 2011, 628 - 632.

3. Do Chau Minh Vinh Tho, Le Ngoc Van Trang, Duong Thi Truc Ly, Nguyen Duc Tuan,

Tran Hung (2011), “Simultaneous Quantitative Determination of Nuciferine and

Neferine in Total Alkaloids Extract from Loti Embryo (Nelumbo nucifera Gaertn.) by

HPLC with PDA Detector”, Proceeding of the seventh Indochina Conference on

Pharmaceutical Sciences, Bangkok, Thailand, December 14-16, 2011, 409-412.

4. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Lữ Thiện Phúc, Mạch Khắc Duy (2012), “Xây dựng qui trình

định lượng, định tính điểm chỉ một số alkaloid chính có trong tâm sen Việt Nam

(Nelumbo nucifera Gaertn) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod

quang”, Tạp chí Y học thực hành, số 852+853, 303-307.

5. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Thị Tường Vi, Nguyễn Thị Phương Cúc (2012),

“Xây dựng qui trình chiết cao chuẩn alkaloid lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn)”,

Tạp chí Y học thực hành, số 852+853, 315-319.

6. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Thị Xuân Thương, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn

(2012), “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời quercetin, kaempferol, catechin và

quercetin-3-O-glucuronid trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”,

Tạp chí Dược học số 3-2012, 17-21.

7. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann

Stuppner (2012), “Quantitative determination of phenolic compounds in Lotus

(Nelumbo nucifera) leaves by capillary zone electrophoresis”, Planta Medica, 78,

1796-1799.

8. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann

Stuppner (2013), “Analysis of alkaloids in Lotus (Nelumbo nucifera) leaves by non

139

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

aqueous capillary electrophoresis using ultraviolett and mass spectrometric detection”,

Journal of Chromatography A, 1302, 174-180.

9. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Tô Yến Ngọc, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn (2013),

“Xây dựng quy trình định lượng đồng thời nuciferin, pronuciferin, o-nornuciferin và

isoliensinin trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học

số 5-2013, 27-31.

10. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann

Stuppner (2013), “Analysis of alkaloids in lotus (nelumbo nucifera gaertn.) embryo by

non-aqueous capillary electrophoresis using ultraviolet and mass spectrometric

detection”, Proceeding of the eighth Indochina Conference on Pharmaceutical

Sciences, Ho Chi Minh city, Vietnam, December 4-5, 2013, 316-321.

11. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann

Stuppner (2013), “Isolation, purification and elucidation of bioactive alkaloids in

plumula nelumbinis of Vietnam”, Proceeding of the eighth Indochina Conference on

Pharmaceutical Sciences, Ho Chi Minh city, Vietnam, December 4-5, 2013, 938-943.

12. Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera,

flavonoids in lotus leaves (nelumbo nucifera Gaertn.)”, Proceeding of the eighth

Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Ho Chi Minh city, Vietnam,

December 4-5, 2013, 952-957.

13. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Huỳnh Phương Thảo, Trần Hùng (2014). “Nghiên cứu phân

lập các alkaloid có tác dụng sinh học trong lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)”.

Tạp chí Y học thực hành, số 944-2014, 49-52.

140

Hermann Stuppner (2013), “Extraction, isolation and elucidation of several

-1-

TÀI LIỆU THAM KHẢO

105, 119.

[2]. Đỗ Huy Bích (2005). Cây thuốc và Động Vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II,

Nhà xuất bản Khoa Học và Kĩ Thuật, tr. 721-726.

[3]. Võ Văn Chi (2004). Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, Nhà xuất bản khoa học và

kỹ thuật Hà Nội, tr. 1776-1777.

[4]. Đặng văn Hòa, Vĩnh Định (2011). Kiểm nghiệm thuốc, Nhà xuất bản Giáo dục

Việt Nam, tr. 135-180.

[5]. Phan Quốc Kinh (1971). “Nghiên cứu chiết xuất alcaloid từ củ bình vôi, lá sen, ô đầu,

hoàng nàn, lá đu đủ, lá cà độc dược”. Đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường, Bộ môn Hóa Dược, Trường Đại Học Dược Hà Nội.

[6]. Phạm Thanh Kỳ, Chu Đình Kính (1997). “Xác minh cấu trúc của nuciferin bằng phương

pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân”, Tạp chí Dược liệu, tháng 12 năm 1997, tr.5-8.

[7]. Phạm Thanh Kỳ (2007). Dược Liệu Học , tập 2, Nhà xuất bản Y học, tr.9-27, 116-119. [8]. Đỗ Tất Lợi (2005). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học

Hà Nội, tr. 783- 786.

[9]. Nguyễn Thị Nhung, Phạm Thanh Kỳ (1997). “Xác định cấu trúc của nuciferin bằng phương pháp phổ khối lượng”, Tạp chí Dược học, tháng 2 năm 1997, tr.19-21. [10]. Nguyễn Thị Nhung, Phạm Thanh Kỳ (1998). “Nghiên cứu thành phần hóa học của lá

sen Nelumbo nucifera Gaertn.”, Tạp chí Dược học (6), 13-18.

từ dược

trong

[11]. Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012). Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế conessin, kaempferol, nuciferin làm chất chuẩn đối chiếu liệu kiểm nghiệm thuốc, Luận án tiến sĩ dược học, Trường Đại Học Dược Hà Nội. [12]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản

Đại học quốc gia TP.HCM, tr.244-255.

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1]. Bộ Y Tế (2010). Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học Hà Nội, tr.882 – 884, tr. PL- 9,

TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI [13]. Aline A., Andriéli C. (2009). “HPLC Analysis and phytoconstituents isolated from ethyl acetate fraction of Scutia buxifolia Reiss. Leaves”, Lat. Am. J. Pharm., 28 (1), pp.121-124.

[14]. AmenTakhtajan (2009). Flowering plants, 2nd Ed, New York: Springer, pp.74-75. [15]. Atsuko Itoh, Tomomi Saito (2011). “Bisbenzylisoquinoline alkaloids from Nelumbo

nucifera”, Chem. Pharm. Bull, 59 (8), pp.947-951.

[16]. Beata Jasiewicz (2008). “NMR Spectra of Sparteine N1-oxide and α-Isosparteine

N-oxide”, Molecules 13, pp.3-10.

[17]. Bernauer K. (1963). “Pronuciferin, ein Benzylisochinolin - Alkaloid mit para-

Cyclohexadienon Gruppierung”, Helv Chim Acta, pp.1783-1785.

[18]. Chao Tse Yuan, Chou Tsan-Quo (1962). “Studies on the alkaloids of embryo loti,

Isolation and characterisation of

liensinine”,

Nelumbo nucifera Gaertn. Scientia sennica, 11 (2), pp.215-219.

[19]. Chen H.G, W. Y. Wang (2007). “Determination of flavonoids in Plumula Nelumbini by micellar electrokinetic capillary electrophoresis with electrochemical detection”, Journal of Capillary Electrophoresis and Microchip Technology, 10(3-4), 57-61.

[20]. Chen B., Li B. (2002). “Glycosides from Erigeron breviscapus”, Acta Botanica Sinica

44 (3), pp.334-348.

[21]. Chen Jin-rong (2009). “Determination of alkaloid in the Plumula nelumbini using differently concocts by HPLC”, Strait Pharmaceutical Journal, 9, 124-127.

[22]. Chen Yi, Luo Shun-De, et als, (2004). “Quantitative analysis of three main alkaloids

the study on characteristic chromatogram”,

in plumula nelumbinis and Chin hosp pharm, 24(4), pp.205-208.

[23]. Chen Y., Guorong F. (2007). “Separation, identiﬁcation and rapid determination of liensine, isoliensinine and neferine from embryo of the seed of Nelumbo nucifera Gaertn by LC/PDA/MS”, Pharm Biomed Anal, 43, pp.99-104.

[24]. Chen J., Liu S., et als (2012). “The application of cation exchange resins in the

flavonoids and alkaloids

total

seed embryo of

separation of from Nelumbo nucifera”, Zhong Yao Cai, 35 (11), pp.1842-1846.

[25]. Chengjun Ma, Jinjun Wang, (2014). “Purification and characterization of aporphine alkaloids from leaves of Nelumbo nucifera Gaertn and their effects on glucose consumption in 3T3-L1 Adipocytes”, Int. J. Mol. Sci. , 15, pp.3481-3494. [26]. Cristiane Pereira,Cleber Bomfim Barreto Júnior (2012). “Flavonoids and a neolignan glucoside from Guarea macrophylla”, Quim. Nova, 35(6), pp.1123-1126. [27]. Chun F. H, Chen T. W., (2011). “Extract of lotus leaf (Nelumbo nucifera) and its active constituent catechin with insulin secretagogue activity”, J. Agric. Food Chem, 59, pp.1087-1094.

[28]. Fatemeh Fathiazad, Abbas Delazar (2006). “Extraction of flavonoids and leaves”, Iranian Journal of

tobacco

quantification of rutin from waste Pharmaceutical Research, 3, pp.222-227.

[29]. Gao Q., Liao H.M (2008). “Extraction essential oil from lotus leaves by supercritical carbon dioxide fluid and analyzing their compounds with GC-MS”, Journal of Mountain Agriculture and Biology, 3, pp.235-239.

[30]. Gu D.F , Li X.L, (2009). “Blockade of HERG K+ channel by isoquinoline alkaloid neferine in the stable transfected HEK293 cells”, Naunyn-Schmied Arch Pharmacol 14, 380, pp.143-151.

[31]. Guinaudeau H.M, LeBoeuf (1983). “Aporphin alkaloids II”, Natural product,

46, pp.326-328.

[32]. Guinaudeau H.M, LeBoeuf (1988). “Aporphin alkaloids IV”, J. Nat. Prod, 3,

pp.389-474.

-2-

[33]. Guan Zhangshun, Wu Jun, (2003). “Effects on water extract of lotus leaf to improve

in human's blood lipids disorder”, Journal of Chenzhou Medical College, 3, pp.235-240.

[34]. Hedeo Koshiyama, Hiroaki Ohkuma (1970). “Isolation of demethylcoclaurine,

an active alkaloid from Nelumbo nucifera”, Chem. Pharm. Bull, 18 (12), pp.2564-2568.

[35]. Hirhoshi Fukurama (1966). “On the alkaloids of Nelumbo nucifera Gaertn. XII.

Alkaloids of Loti embryo”, Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 86, pp.75-77.

[36]. Hiroshi Nakajima, Takao Tanahashi, (2007). “Benzylisoquinoline derivative- or bisbenzylisoquinoline derivative-containing psychotropic agent, analgesic and/or antiphlogistic, and health food”, European patent office, 05767135.6.

[37]. Gotti R. (2011), “Capillary electrophoresis of phytochemical substances in herbal drugs and medicinal plants”, J Pharm Biomed Anal, 55(4), pp.775-801. [38]. Huei-Jane Lee, Chang-Che Chen, et als, (2010). “Water extracts from Nelumbo nucifera leaf reduced plasma lipids and atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits”, Journal of Food Biochemistry, 34, 779-795.

[39]. Hyun Ryul Goo, Jae Sue Choi, (2009). “Simultaneous determination of quercetin and

leaves of Nelumbo nucifera by reversed-phase

the

its glycosides from high-performance liquid chromatography”, Arch Pharm Res 32 (2), pp.201-206.

[40]. ICH Harmonised tripartite guideline (2005). “Validation of analytical procedure: text

and methodology”, pp.1-13.

[41]. International Organisation for standardization 13528 (2005). “Statistical methods for

use in proficiency testing by interlaboratory comparisons”.

[42]. Jerome Rozario M., John Merina A. (2012). “The flavonoid quercetin 3-O-

glucuronide from Nelumbo nucifera”, Research paper chemistry, 2 (1), pp. 6-8.

[43]. Jiang Ning Hu, Bin Shan, (2010). “Application of high-speed counter-current chromatography for the isolation of 5 alkaloids from lotus (Nelumbo nucifera Gaertn) leaves”, Food Sci. Biotechnol, 19(6), pp.1661-1665.

[44]. Juan Xiao, Binqiang Tian, (2010). “Supercritical fluid extraction and identification of isoquinoline alkaloids from leaves of Nelumbo nucifera Gaertn”, European Food Research and Technology, 231(3), pp.407-414.

[45]. Judith Singhuber, Igor Baburin, (2012). “GABAA receptor modulators from Chinese insomnia and anxiety”, traditionally applied against

herbal medicines Phytomedicine, 19, pp.334-340.

[46]. Junichi Kunitomo, Yoshiko Nagai, (1970). “Studies on the alkaloids of Nelumbo nucifera Garetn XIV on the tertiary base”, Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 90(9), pp.1165-1169.

[47]. Klaus Fesser,Ulrike Lindequist (2014). “Chemistry and biology of phenolics isolated

from Myricaria germanica (L.) Desv”, Noha Swilam, pp.76-79.

[48]. Kupchan. S.M, B. Dasgupta, (1963). “The alkaloids of American lotus

Nelumbo lutea”, Tetrahedron, 19, pp.227-232.

-3-

[49]. Li G.R, Qian J Q, et als, (1990). “Effects of neferine on heart electromechanical

activity in anaesthetized cats”, Acta pharmacologica Sinica, 11 (2), pp.185-187.

[50]. Liang Feng, Zhang Chenggong (2007). “Separation and extraction of three alkaloids from Nelumbo nucifera Gaertn using emulsion liquid membrane”, Hunan Normal University, Hunan Province, Peop. Rep. China, 24(6), pp.565-570.

[51]. Lichun Yuan, Bin Liu, (2010). “HPLC determination of hyperin and isoquercitrin in

Nelumbo nucifera Gaertn. of different sources”, Yaowu Fenxi Zazhi, 30 (1), pp.41-44.

[52]. Lin M.C., Kao S.H., et als, (2009). “Improvement for high fat diet-induced hepatic injuries and oxidative stress by flavonoid-enriched extract from Nelumbo nucifera leaf”, J. Agric. Food Chem., 57, pp.5925-5932. [53]. Liu jing- jing, Luo Xu-biao, (2006). “Isolation and purification of nuciferin by

preparative HPLC”, Chinese Traditional and Herbal Drug, pp.70-74.

[54]. Liu Shao, Lei Peng, (2004). “Preparation of reference material of neferin”,

Chine Journal of Modem Medicine, 14(20), pp. 27-29.

[55]. Liu. S, Lei. P., et als, (2007). “Separation and purification processes of alkaloids from lotus plumule with macroporous adsorption resin”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 32 (10), pp.912-915.

[56]. Lu Y., Ma Wenyan, et als, (2008). “Ionic liquid-based microwave-assisted extraction

of phenolic alkaloids from the medicinal plant Nelumbo nucifera Gaertn”, Journal of Chromatography A, 1208, pp.42-46.

[57]. Mang Jixiangl, Guo Jinshengl, (2007). “Isolation and purification of alkaloids from

double-column

nelumbinis

adsorption

chromotography”,

plumula Chinese Journal of Reactive Polymers, 16 (2), pp.119-124.

[58]. Markham K.R. (1975). “Carbon-13 NMR studies of flavonoids I Flavones and

Flavonols”, Tetrahedron, 12, pp.565-569.

[59]. Marisel Araya, Fajardo V., et als, (2009). “Pronuciferine N-Oxide, a proaporphine

N-oxide alkaloid from Berberis coletioides”, J. Nat. Prod., 72, pp.1355-1356.

[60]. Mao Yan-Ni, Jiang Jian-Qin, (2007). “Determination of nuciferine in lotus leaf and

petiole by HPLC”, Strait Pharmaceutical Journal, 3, pp.78-82.

[61]. Masao Tomita, Hiroshi Furukawa, (1965). “Studied on alkaloids of loti embryo. structure of isoliensinine, a new biscoclaurine type alkaloid”, Chem. Pharm. Bull, 13 (1), pp.39-43.

[62]. Masao Tomita, Yasuo Watanabe, (1960). “On the alkaloids of Nelumbo nucifera Gaertn. I”, Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 81, pp.470-473. [63]. Masao Tomita, Yasuo Watanabo, (1960). “On the alkaloids of Nelumbo nucifera Gaertn. II. The structure of nornuciferine”, Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 81, pp.942-947.

[64]. Mon-Yuan Yang, Yun-Ching Chang, et als, (2011). “Flavonoid-enriched extracts

from Nelumbo nucifera leaves inhibits proliferation of breast cancer in vitro and in vivo”, European Journal of Integrative Medicine, 3, pp.153-163.

-4-

[65]. Nguyen K. Hoa, Ta. T. Nhan, et als, (2012). “Nuciferine stimulates insulin secretion from beta cells. An in vitro comparison with glibenclamide”, Journal of Ethnopharmacology, 142, pp.488-495.

[66]. Ohkoshi Emika, Miyazaki Hiromi, (2007). “Constituents from the leaves of Nelumbo nucifera stimulate lipolysis in the white adipose tissue of mice”, Planta medica, 73 (12), pp.1255-1259.

[67]. Quian Jia-Qing, Liu Yuang (2002). “Cardiovascular pharmacological effects of

bisbenzylisoquinoline alkaloid derivatives”, Acta Pharmacol Sin 23 (12), pp.1086-1092.

[68]. Quan D., Li A., et als, (2010). “Semi-preparative high-speed counter-current

from embryo of

the seed of

chromatography separation of alkaloids Nelumbo nucifera Gaertn by pH-gradient elution”, J Sep Sci, 33 (12), pp.1746-1751. [69]. Pan Y., Yang G.M, et als, (2005), et als, (2005). “Determination of four isoquinoline

nelumbini

Plumula

HPLC

simultaneously”,

alkaloids LiShiZhen Medicine and Materia Medica Research, 16(12), pp.1219-122.

[70]. Saengkhae C, Arunnopparat W, (2008). “Antioxidative activity of the leaf of Nelumbo nucifera Gaertn. on oxidative stress-induced erythrocyte hemolysis in hypertensive and normotensive rats”, Thai Journal of Physiological Sciences, 20 (2), pp.70-78.

[71]. Sha Chen, Wu. B.H, et als, (2012). “Analysis of ﬂavonoids from lotus (Nelumbo nucifera) leaves using high performance liquid chromatography/photodiode array detector tandem electrospray ionization mass spectrometry and an extraction method optimized by orthogonal design”, Journal of Chromatography A, 1227, pp.145-153.

[72]. Shan Bin, Deng Ze-Yuan, et als, (2008). “An extracting technology of alkaloids from

lotus leave and analysis of their composition”, Food Science and Technology, 10, pp.132-136.

[73]. Shao Liu, Yi-Zeng Liang, et als, (2008). “Optimization of liensinine, isoliensinine and neferine extraction from the embryo of the seed of Nelumbo nucifera Gaertn”, Separation Science and Technology, 43 (14), pp.3637-3651.

[74]. Shao Liu, Bin Wang, (2009). “Preparative separation and purification of liensinine, isoliensinine and neferine from seed embryo of Nelumbo nucifera GAERTN using high-speed counter-current chromatography”, Journal of Separation Science, 32 (14), pp.2476-2481.

[75]. Shengguo Deng, Zeyuan Deng (2009). “Isolation and puriﬁcation of three ﬂavonoid glycosides from the leaves of Nelumbo nucifera (Lotus) by high-speed counter- current chromatography”, Journal of Chromatography B, 877, pp.2487-2492.

[76]. Shihua Wu, Cuirong Sun, et als, (2004). “Preparative counter-current chromatography isolation of liensinine and its analogues from embryo of the seed of Nelumbo nucifera Gaertn. using upright coil planet centrifuge with four multilayer coils connected in series”, Journal of Chromatography A, 1041, pp.153-162.

-5-

[77]. Sikorska M., Matslowka I. (2001). “Kaempferol, isorhamnetin and their glycosides in

the flowers of Asclepias Syriaca L.”, Acta Poloniac Pharmaceutica, 58(4), pp.269-272.

[78]. Somchit Niumsakul, Duangpen Pattamadilok, (2010). “Chemical constituents of Nelumbo nucifera Gaertn leaf extract exhibiting hypolipidemia activity”, Journal of Thai Traditional & Alternative Medicine, 8 (2), p.145-148.

[79]. Shou Guo-xiang, Liu Bing, (2001). “Determination of liensinine seed of Nelumbo nucifera by ion pair RP-HPLC”, Chinese Traditional and Herbal Drugs, 32 (11), pp.989-990.

[80]. Shu-Hua, Wu Da-Gang, et als, (2003). “A novel flavane from Carapa guianensis”,

Acta botanica sinica, 45 (9), pp.1129-1133.

[81]. Shuangshuang Xu, Yu Sun, et als, (2011). “Separation and purification of flavones from Nelumbo nucifera Gaertn by silica gel chromatography and high-speed counter-current chromatography”, Sepu, 29 (12), pp.1244-1248.

[82]. Tian N, Liu Z, et als, (2007). “Isolation and preparation of flavonoids from the leaves of Nelumbo nucifera Gaertn by preparative reversed-phase high performance liquid chromatography”, Sepu, 25 (1), pp.88-92.

[83]. Tomita M, Watanabe Y. (1961). “On the alkaloids of Nelumbo nucifera Gaertn. IV.

isolation of dl-armepavine”, Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 81, pp.1641-1647.

[84]. Trinh Van Lau, Pham Thanh Ky, et als, (2009). “Research on extraction, isolation, purification and characterization of nuciferine, linarine chlorogenic and myricetine from medicial plants to establish reference standards”. The 6th Indochina conference on pharmaceutical sciences, pp.219-220.

[85]. Tsang- Hsiung Yang,Chi-Ming Chen (1970). “Studies on the alkaloids of loti embryo

of Nelumbo nucifera Gaertn”, Zhongcaoyao Zazhi Bianjibu, 23, pp.235-242.

[86]. Vijai K. Agnihotri, Hala N. ElSohly, et als, (2008). “Constituents of Nelumbo nucifera

leaves and their antimalarial and antifungal activity”, Phytochemistry Letters 1, 89–93, 1, pp.89-93.

[87]. Xiao H, A. H. Chen, et als, (2007). “Isolation and identification of pronuciferine

monomer”, Zhong Yao Cai, 30(3), pp.289-291.

[88]. Xiao J., Zhang H.Y., et als, (2006). “Effects of isoliensinine on angiotensin II-induced proliferation of porcine coronary arterial smooth muscle cells”, Journal of Asian Natural Products Research 8(3), pp.209-216.

[89]. Xu P., Tang G., et als (2002). “Determination of the contents of neferine and liensinine in Plumula nelumbini by TLC scanning”, China Pharmacy, 4, pp.25-27.

[90]. Xubiao Luo, Bo Chen, et als, (2005). “Simultaneous analysis of N-nornuciferine,

O-nornuciferine, nuciferine, and roemerine in leaves of Nelumbo nucifera Gaertn by HPLC-PDA-ESI/MS”, Analytica Chimica Acta, 538, pp.129-133.

[91]. Xiao H., ZhangY. L., et als, (2006). “Effects of isoliensinine on angiotensin II-induced proliferation of porcine coronary arterial smooth muscle cells”, Journal of Asian Natural Products Research 8(3), pp.209-216.

-6-

[92]. Xu Xia, Sun C., et als, (2011). “LC/MS guided isolation of alkaloids from lotus leaves

by pH-zone-refining counter-current chromatography”, Molecules 16 (3), pp.2551-2560.

[93]. Xu Xue-Qin, Yu Li-Shuang, et als, (2008). “Determination of nuciferine,rutin and hyperoside in Plumula nelumbinis by Capillary Electrophoresis with end-column amperometric detection”, Analysis and Testing Technology and Instruments, 3, pp.1213-1216.

[94]. Yang G, Li. W, et als, (2012). “Rapid simultaneous determination of four alkaloids in Lotus plumule by CZE with ephedrine hydrochloride as an internal standard”, Chromatographia, 75, pp.1295-1300.

[95]. Yang J., Zhou K. (2004). “NMR spectroscopic analysis of neferine and isoliensinine”,

Magn Reson Chem, 42 (11), pp.994-997.

[96]. Yang Pan, Cai Baochang, et als, (2009). “Neferine enhances insulin sensitivity in

insulin resistant rats”, Journal of Ethnopharmacology, 124, pp.98-102.

[97]. Yang T.H., Chen Chi-Ming, et als, (1970). “Studies on the alkaloids of loti embryo of Nelumbo nucifera Gaertn”, Zhongcaoyao Zazhi Bianjibu, 23, 235-242. [98]. Yoichiro Ito (2005). “Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography”, Journal of Chromatography A, 1065(2), pp.145-168.

[99]. Yoshiki Kashiwada, Akihiro Aoshima, et als, (2005). “Anti-HIV benzylisoquinoline alkaloids and flavonoids from the leaves of Nelumbo nucifera, and structure - activity correlations with related alkaloids”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 13, 443-448.

[100]. Yu J, Hu W S., (1997). “Effects of neferine on platelet aggregation in rabbits”,

Acta pharmaceutica Sinica, 3 (1), pp.1-4.

[101]. Yuan C.T, Chen T.Q (1962). “Studies on the alkaloids of embryo loti,

Isolation and characterisation of

liensinine”,

Nelumbo nucifera Gaertn. Scientia sennica, 11(2), pp.215-219.

[102]. Yuan L., Liu B. (2010). “HPLC determination of hyperin and isoquercitrin in

Nelumbo nucifera Gaertn. of different sources”, Yaowu Fenxi Zazhi, 30(1), 41-44. [103]. Yuka Ono, Eri Hattori, et als, (2006). “Anti-obesity effect of Nelumbo nucifera leaves extract in mice and rats”, Journal of Ethnopharmacology, 106, pp.238-244. [104]. Yumi Sugimoto, Sachiko Furutani, et als. (2008). “Effects of extracts and neferine from the embryo of Nelumbo nucifera seeds on the central nervous system”, Phytomedicine 15 (2008) 1117–1124, 15, pp.1117-1124.

[105]. Yu Q.F, Zhou W.F (2011). “Study on microwave-assisted extraction of total flavones from Plumula nelumbinis”, Chemistry & Bioengineering, 2, pp.17-20. [106]. Zhang Ji-xiang, Feng Dong-ran (2007). “Isolation and purification of effective

in Plumula nelumbinis by macroporous adsorption resin”,

components Zhong cao yao, 38(12).

-7-

[107]. Zhang Xianzhou, Hu Xueming (1997). “Determination of three alkaloids in embryo bud and embryo root of Nelumbo nucifera Gaertn by HPLC”, Chinese Journal Of Pharmaceutical Analysis, 2, pp.345-348.

[108]. Zhao Z., Zhang Y. (2002). “Effects of lotusine on cyclic nucleotide levels and

contractile function in rat myocardium and rabbit corpus cavernosum”, Zhongguo Yaolixue Yu Dulixue Zazhi, 16, pp.202-205.

[109]. Zhao X.L, Wang Z.M. (2013). “Chemical constituents from

leaves of

Nelumbo nucifera Gaertn”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 38(5), pp.703-708.

determination

separation

surfactant

and

for

[110]. Zhenjia Z., Minglin Z., et als, (2010). “Preparative separation of alkaloids from Nelumbo nucifera leaves by conventional and pH-zone-reﬁning counter-current chromatography”, Journal of Chromatography B, 878, pp.1647-1651. [111]. Zhu J., Zhang H., et als, (2011). “Micellar electrokinetic chromatography using a of cationic rapid bisbenzylisoquinoline alkaloids from embryo of the seed of Nelumbo nucifera Gaertn”, Chromatographia, 73, pp.535-540.

-8-

compounds from Callianthemum taipaicum”, Molecules, 17, pp.4595-4603.

[112]. Wang D.M, Pu W.J. (2012). “A new isorhamnetin glycoside and other phenolic

[113]. Wang Fu-Gang, Liu Bin, et als, (2011), “Fingerprint of Nelumbinis folium by

[114]. Wang. H.M, W. L Yang, (2011). “Chemical constituents from the leaves of

Nelumbo nucifera Gaertn. cv. Rosa-plena”, Chemistry of Natural Compounds, 47 (2), pp.316-318.

[115]. Wang Jialing, (2000). “Process for extracting purified isoliensinine and liensinine

from Plumula nelumbinis”, Tongji Medical Univ, 8, pp.123-125.

[116]. Wang Ling, Liu Bin (2009). “Study on chemical constituents of Folium nelumbinis”,

Natural Product Research and Development, 3, pp.231-235.

[117]. Wang Pu, Xubiao Luo, et als, (2006). “Isolation and purification of aporphine alkaloids from leaves of Nelumbo nucifera with macroporous adsorption resin”, Zhongcaoyao Zazhi Bianjibu, 37(3), pp.355-358.

[118]. Wang Xiao, Liu Jianhua, (2010). “Preparative separation of alkaloids from

Nelumbo nucifera Gaertn by pH-zone-refining counter-current chromatography”, Journal of separation science, 33(4), pp.539-544.

[119]. Wassel G., A Saeed (1996). “Flavonoids of Nelumbo nucifera Gaertn and biological

evaluation”, Egyptian Journal of Pharmaceutical Sciences, 37(6), pp.585-596.

[120]. Wenkert E., Gottlieb H. (1977). “Carbon-13 NMR of flavonoid and isoflavonoid

compounds”, Phytochemistry, 16, pp. 1811-1816.

[121]. Wen P., Han Huiying, (2007). “C-glycosylfavones and aromatic glycosides from Campylotropis hirtella (Franch.) Schindl”, Asian Journal of Traditional Medicines, 2 (4), pp.149-153.

[122]. Wenyan Ma, Yanbin Lu, et als, (2010). “Application of ionic liquids based

extraction

three

alkaloids N-nornuciferine,

of microwave-assisted O-nornuciferine, and nuciferine from lotus leaf”, Talanta, 80, pp.1292-1297

HPLC”, Chinese Traditional Patent Medicine, 8, pp.175-178

[123]. WHO (2006). “General guidelines for the establishment, maintenance and

distribution of chemical reference substances”, pp.64-71.

[124]. Wu Hao, Liu B., (2008). “Quantitative determination of four components in different samples of Nelumbo nucifera by HPLC”, Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine, 33(14), pp.1713-1719.

[125]. Wu M., Xu Z., et als, (2008). “Quercetin in a lotus leaves extract may be responsible for antibacterial activity”, Arch Pharm Res Vol 31, No 5, 640-644, 2008, 31(5), pp.640-644

[126]. Wu Xiao-Ou, Xiong Ying, (2004). “Determination of nuciferine in Nelumbo nucifera

by TLC scaning”, China Pharmacist, 4, pp.7-10.

[127]. Wu Xiao-Ou, Xiong Ying,

(2004). “Study on quality

standard

for

Folium nelumbinis”, Research and Practice of Chinese Medicines, 4, pp.145-149. [128]. Wu X., Jung H.A., Yu J., et als, (2008). “Inhibitory effects of Nelumbo nucifera leaves on rat lens aldose reductase advanced glycation endproducts formation, and oxidative stress”, Food and Chemical Toxicology, 46, pp.3818-3826. [129]. Wu Y, Shang W.B., et als, (2003). “Effect of Plumula nelumbinis and neferine on models of experimental diabetes and obesity”, Journal of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, 4, pp.456-459.

[130]. Wu W., Nong Y., et als, (1992). “Effects of liensinine on hemodynamics in rats and

the physiologic properties of isolated rabbit atria”, Yaoxue Xuebao 27(12), pp.881-885.

[131]. Wyhile A., Rai S., et als. (2006). “Antioxidant activity of Nelumbo nucifera seeds”,

J Ethnopharmacol, 104(3), pp.322-327.

[132]. Wu Tian-Shung., Wang Jhi-Joung., et als, (2002). “New pavine N-Oxide alkaloids from the Stem Bark of Cryptocarya chinensis HEMSL”, Chem. Pharm. Bull 50 (2), pp.157-159.

-9-

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Trang PL

PHỤ LỤC 1. PHÂN LẬP CÁC ALKALOID TRONG LÁ, TÂM SEN

PL-5 PL-5 PL-6 PL-6 PL-6 PL-7 PL-7 PL-8 PL-8 PL-8 PL-8 PL-8 PL-8

PL-1.1. SKLM các phân đoạn sau cột cao A2 lá Sen PL-1.2. SKLM các phân đoạn sau cột cao A3 lá Sen PL-1.3. SKĐ thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3 lá Sen PL-1.4. SKĐ thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8 lá Sen PL-1.5. SKĐ thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11,12 lá Sen PL-1.6. SKLM các phân đoạn sau cột cao N lá Sen PL-1.7. SKLM các phân đoạn từ tủa F lá Sen PL-1.8. SKLM các phân đoạn NP5, NP8, P tâm Sen PL-1.9. SKLM các phân đoạn NP5 tâm Sen sau cột cổ điển PL-1.10. SKLM các phân đoạn NP8 tâm Sen sau cột cổ điển PL-1.11. SKLM phân đoạn n-Bu IIA và n-Bu IIB PL-1.12. SKLM pha trên và pha dưới của phân đoạn P-2 PL-1.13. SKLM các phân đoạn P-2 tâm Sen sau triển khai FCPC

PHỤ LỤC 2. PHỔ UV, MS, NMR CÁC ALKALOID TỪ LÁ SEN

PL-9 PL-11 PL-13 PL-15 PL-16 PL-19 PL-20 PL-22 PL-24 PL-25 PL-27 PL-35 PL-42 PL-44 PL-46 PL-47 PL-48 PL-49

PL-2.1. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid LN-1 PL-2.2. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid LN-2 PL-2.3. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid LN-3 PL-2.4. Phổ MS, NMR của alkaloid LN-4 PL-2.5. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid LN-5 PL-2.6. Phổ MS, NMR của alkaloid LN-8 PL-2.7. Phổ UV, MS, NMR của alkaloid LN-9 PL-2.8. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid EN-1 PL-2.9. Phổ MS, NMR của alkaloid EN-2 PL-2.10. Phổ MS, NMR của alkaloid EN-3 PL-2.11 Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid EN-4 PL-2.12. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid EN-5 PL-2.13. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid EN-6 PL-2.14. Phổ MS, NMR của alkaloid EN-7 PL-2.15. Phổ MS, NMR của alkaloid LF-3 PL-2.16. Phổ MS, NMR của alkaloid LF-5 PL-2.17. Phổ MS, NMR của alkaloid LF-8 PL-2.18. Phổ MS, NMR của alkaloid TF-1

PL-1

PL-50

PL-52

PL-54

PL-59

PL-61

PL-62

PL-63

PL-64

PL-65

PL-66

PL-67

PL-79

PL-80

PL-81

PHỤ LỤC 3. THIẾT LẬP CÁC CĐC ALKALOID, FLAVONOID PHÂN LẬP TỪ LÁ VÀ TÂM SEN PL- 3.1. Phiếu kiểm nghiệm 06 nguyên liệu thiết lập CĐC ở hai PTN đạt tiêu chuẩn GLP & ISO 17025 tại VKN. TPHCM. PL- 3.2. Phiếu kiểm nghiệm xác định độ tinh khiết của các alkaloid phân lập từ lá và tâm Sen tại TTKN Thuốc, MP, TP, Cần Thơ (ISO 17025). PL- 3.3. Phiếu kiểm nghiệm xác định độ tinh khiết của các flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen tại TTKN Thuốc, MP, TP, Cần Thơ (ISO 17025). PL- 3.4. Phiếu kiểm nghiệm xác định NSQC của các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen tại TTKN Thuốc, MP, TP, Cần Thơ (ISO 17025). PL- 3.5. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn định của nguyên liệu thiết lập CĐC LN-1 (nuciferin). PL- 3.6. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn định của nguyên liệu thiết lập CĐC LN-2 (2-O-nornuciferin). PL- 3.7. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn định của nguyên liệu thiết lập CĐC EN-1 (isoliensinin). PL- 3.8. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn định của nguyên liệu thiết lập CĐC EN-2 (liensinin). PL- 3.9. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn định của nguyên liệu thiết lập CĐC EN-3 (neferin). PL- 3.10. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn định của nguyên liệu thiết lập CĐC LF-3 (quercetin-3-O-β-D-GlcA) PL- 3.11. TCCS của các nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu PHỤ LỤC 4. QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC ALAKLOID, FLAVONID TRONG LÁ VÀ TÂM SEN PL- 4.1. Điện di đồ minh họa sự chiết kiệt 07 alkaloid có trong mẫu thử lá Sen, qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong lá sen bằng phương PL-79 pháp CE-PDA/MS. PL- 4.2. Kết quả độ lệch chuẩn tương đối (%) qua sáu lần tiêm liên tiếp mẫu thử lá Sen (NN-1a) qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong lá sen bằng phương pháp CE-PDA/MS. PL- 4.3. Điện di đồ minh họa sự chiết kiệt 08 flavonoid có trong mẫu thử lá Sen, qui trình phân tích đồng thời 08 flavonoid trong lá sen bằng phương pháp CE-PDA. PL- 4.4. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic catechin, qui trình phân tích đồng thời 08 flavonoid trong lá Sen bằng phương pháp CZE-PDA. PL- 4.5. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian, độ đúng qui trình phân tích đồng thời 08 flavonoid trong lá Sen bằng phương pháp CZE-PDA. PL- 4.6. SKĐ minh họa sự chiết kiệt 04 alkaloid có trong mẫu thử lá Sen, qui trình phân tích đồng thời 04 alkaloid trong lá sen bằng phương pháp HPLC-PDA.

PL-2

PL-82

PL-83

trong

alkaloid

thời 09

tích đồng

trình phân

tâm Sen PL-84

PL-84

PL-85

PL-86

PL-87

PL- 4.7. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ qui trình phân tích đồng thời 04 alkaloid trong lá Sen PL-81 bằng phương pháp HPLC-PDA. PL- 4.8. SKĐ minh họa sự chiết kiệt 06 flavonoid có trong mẫu thử lá Sen, qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid trong lá sen bằng phương pháp HPLC-PDA. PL- 4.9. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic quercetin-3-O-β-D-GlcA, qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid trong lá Sen bằng phương pháp PL-82 CZE-PDA. PL- 4.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid trong lá Sen bằng phương pháp HPLC-PDA (NN-1a) (n = 6). PL- 4.11. Điện di đồ minh họa sự chiết kiệt 09 alkaloid có trong mẫu thử tâm Sen, qui trình phân tích đồng thời 09 alkaloid trong lá sen bằng PL-83 phương pháp CE-PDA/MS. PL- 4.12. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic isoliensinin N2-oxyd, qui bằng phương pháp CZE-PDA-MS. PL- 4.13. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ qui trình phân tích đồng thời 09 alkaloid trong tâm Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS (NE-1a) (n = 6). PL- 4.14. Điện di đồ minh họa sự chiết kiệt 06 flavonoid có trong mẫu thử tâm Sen, qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid trong mẫu nguyên liệu tâm sen bằng phương pháp CE-PDA. PL- 4.15. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic calycosin, qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid trong tâm Sen bằng phương pháp CZE-PDA. PL- 4.16. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid trong tâm Sen bằng phương pháp CE-PDA (NE-1a) (n = 6). PL- 4.17. SKĐ minh họa sự chiết kiệt 07 alkaloid có trong mẫu thử tâm Sen, qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong mẫu nguyên liệu tâm sen bằng phương pháp HPLC-PDA. PL- 4.18. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết isoliensinin, qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA. PL- 4.19. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA (NN-1a) (n = 6). PL- 4.20. SKĐ minh họa sự chiết kiệt 06 flavonoid có trong mẫu thử tâm Sen, qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid trong mẫu nguyên liệu tâm sen bằng phương pháp HPLC-PDA.

PL-3

PL-87

PL-88

PL-89

PL-90

PL-91

PL-92

PL-93

PL- 4.21. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và LOQ qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid trong tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA (NE-1a) (n = 6). PL- 4.22. ĐDĐ phân tích đồng thời 07 alkaloid có trong ba mẫu nguyên liệu lá Sen: LS-10 (NN-2a), LS-2 (NN-2a), LS-13 (NN-3a) đại diện cho ba vùng thu hái khác nhau vào mùa Sen (07.2011) bằng phương pháp CE-PDA. PL- 4.23. ĐDĐ phân tích đồng thời 07 có trong mẫu nguyên liệu lá Sen: LS-1 (NN-1a) mùa Sen (07.2011) và LS-1 (NN-1b) nghịch mùa Sen (10.2012) bằng phương pháp CE-PDA. PL- 4.24. ĐDĐ phân tích đồng thời 07 alkaloid có trong mẫu nguyên liệu lá Sen: LS-10 (NN-1a) mùa Sen bằng phương pháp CE-MS. PL- 4.25. ĐDĐ phân tích đồng thời 07 có trong hai mẫu chế phẩm M-6 và M-9 bằng phương pháp CE-PDA. PL- 4.26. ĐDĐ phân tích đồng thời 08 có trong 04 mẫu nguyên liệu lá Sen: LS-1 (NN-1a), LS-6 (NN-1a), LS-11 (NN-2a) và LS-13 (NN-1a) đại diện cho ba vùng thu hái khác nhau vào mùa Sen (07.2011) bằng phương pháp CE-PDA. PL- 4.27. ĐDĐ phân tích đồng thời 08 flavonoid có trong 02 mẫu nguyên liệu lá Sen: LS-3, LS-4 (NN-1a,b) thu hái vào mùa Sen (07.2011) và nghịch mùa Sen (10.2012) bằng phương pháp CE-PDA. PL- 4.28. Kết quả xác định hàm lượng các alkaloid (mg/100mg) có trong mẫu nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) bằng phương pháp CE-PDA/MS và HPLC-PDA. PL- 4.29. Kết quả xác định hàm lượng của các alkaloid (mg/100mg) có trong 05 mẫu chế phẩm bào chế từ tâm Sen (Nelumbo nucifera) bằng phương pháp CE-PDA/MS và HPLC-PDA. PL- 4.30. Kết quả xác định hàm lượng các flavonoid (mg/100mg) có trong mẫu nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) bằng phương pháp CE-PDA và HPLC-PDA. PL- 4.31. Kết quả xác định hàm lượng của các flavonoid (mg/100mg) có trong 05 mẫu chế phẩm bào chế từ tâm Sen (Nelumbo nucifera) bằng phương pháp CE-PDA và HPLC-PDA.

PL-4

PHỤ LỤC 1. PHÂN LẬP CÁC ALAKLOID TRONG LÁ VÀ TÂM SEN

PL- 1.1. SKLM các phân đoạn của cao A2 lá Sen sau VLC với hệ dung môi

DCM: MeOH:NH4OH (96:4:0,5)

PL- 1.2. SKLM các phân đoạn sau cột của cao A3 lá Sen sau với hệ dung môi

DCM-MeOH-NH4OH (96:4:0,5)

TP A3

A3-1 A3-2 A3-3 A3-4

TP A3 A3-1 A3-2 A3-3 A3-4

PL-5

PL- 1.3. SKĐ 06 lần tiêm mẫu thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3 lá Sen

LN3

LN2

PL- 1.4. SKĐ 06 lần tiêm mẫu thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8 lá Sen

LN-4

PL- 1.5. SKĐ 06 lần tiêm mẫu thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11,12 lá Sen

LN-5

PL-6

PL- 1.6. SKLM các phân đoạn sau cột của cao N lá Sen với hệ dung môi

DCM-MeOH-NH4OH (96:4:0,5)

PL- 1.7. SKLM các phân đoạn của tủa F lá Sen sau VLC với hệ dung môi

PL-7

EtOAc-MeOH-H2O-HCOOH (100:17:13:0,5)

PL- 1.9. SKLM các phân đoạn NP5 tâm Sen

tâm Sen

với hệ dung môi

sau cột cổ điển với hệ dung môi

DCM-MeOH-NH4OH (96:10:0,5)

DCM: MeOH:NH4OH (96:4:0,5)

PL- 1.8. SKLM các phân đoạn NP5, NP8,

PL- 1.11. SKLM phân đoạn n-Bu IIA và n-Bu IIB

PL- 1.10. SKLM các phân đoạn NP8 tâm

với hệ dung môi EtOAc-MeOH-H2O-HCOOH

Sen sau cột cổ điển với hệ dung môi

(60:20:20:0,5).

DCM: MeOH:NH4OH (96:10:0,5)

PL- 1.12. SKLM pha trên và pha dưới của

PL- 1.13. SKLM các phân đoạn P-2 tâm Sen sau

phân đoạn P-2 với hệ dung môi hai pha không

khai

FCPC

hệ

dung

môi

đồng tan thích hợp CHCl3- MeOH- TEA 0,2%

triển DCM: MeOH:NH4OH (85:15:0,5)

(12:5:3). Triển khai SKLM với hệ dung

DCM- MeOH-NH4OH (85:15:0,5)

PL-8

PHỤ LỤC 2. PHỔ UV, MS, NMR CÁC CHẤT PHÂN LẬP TỪ LÁ, TÂM SEN

+ [M+H]

[M+ Na]

a 3 - s C

a 1 - s C

3 - d C

2 - s C

1 - s C

5 - t C

7 - t C

4 - t C

a 6 - s C

8 - d C

a 1 1 - s C

0 1 - d C

a 7 - s C

1 1 - d C

3 H C - N - 6

3 H C O - 2

9 - d C

b 6 - s C

3 H C O - 1

PL-9

PL- 2.1. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid LN-1 (nuciferin)

, 3 H C O - 2

, 3 H C O - 1

, 3 H C N - 6

) z H 5 . 6 1 5 . 3 d, d

q e - 7 H ( 8 0 , 3

q e - 5 H ( 3 0 , 3

, a 6 ( 1 0 , 3

x a - 5 H ( 1 5 , 2

x a - 7 H ( 5 2 , 2

, x a - 4 H ( 8 6 , 2

q e - 4 H ( 6 1 , 3

PL-10

+ [M+H]

5 - t C

3 - d C

7 - t C

4 - t C

1 - s C

2 - s C

a 6 - d C

8 - d C

9 - d C

a 7 - s C

a 3 - s C

3 H C - O -

a 1 1 - s C

3 H C - N - 6

b 6 - s C

1 1 - d C 0 1 - d C

a 1 - s C

PL-11

PL- 2.2. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid LN-2 (O-nornuciferin)

) z H 8 d,

, 3 - H

, 9 - H ( 6 2 , 7

, 0 1 - H ( 2 2 , 7

) z H 8 d,

, 8 - H ( 1 3 , 7

, 1 1 - H ( 6 2 , 8

, 3 H C O - 1

, 3 H C - N - 6

, x a - 7 H ( 3 6 , 2

, x a - 4 H ( 5 6 , 2

, q e - 4 H ( 3 1 , 3

a 6 - H ( 2 0 , 3

q e - 5 H ( 3 0 , 3

q e - 7 H ( 9 0 , 3

, x a - 5 H ( 9 4 , 2

PL-12

+ [M+H]

5 - t C

7 - t C

4 - t C

2 - s C

1 - s C

3 - d C

b 6 - s C

a 3 - s C

a 1 - s C

3 H C O -

a 6 - d C

a 7 - s C

a 1 1 - s C

) 1 1 - d C ( 4 , 8 2 1

) 8 - d C ( 7 , 7 2 1

) 0 1 - d C ( 9 , 6 2 1 ) 9 - d C ( 3 , 7 2 1

PL-13

PL- 2.3. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid LN-3 (caaverin)

) z H 8 d,

, 1 1 - H ( 9 3 , 8

) z H 8 d,

, 3 - H ( 9 5 , 6

, 8 - H ( 1 3 , 7

, 8 - H ( 3 2 , 7

, 8 - H ( 9 1 , 7

, 3 H C O - 2

3.5 H t, 1

d, 5, 9 H

) z H 4 1 , 5 . 4 d, d

, x a - 5 H ( 1 0 , 3

, x a - 7 H ( 4 7 , 2

, q e - 7 H ( 4 8 , 2

, q e - 5 H ( 6 3 , 3

, a 6 - H ( 6 8 , 3

x a - 4 H ( 6 6 , 2

q e - 4 H ( 7 9 , 2

PL-14

[M-H]

+ [M+H]

2 - s C

3 - d C

5 - t C

7 - t C

4 - t C

a 7 - s C

a 3 - s C

2 - s C

a 1 - s C

a 6 - d C

3 H C - O -

1 1 - d C

a 1 1 - s C

) 0 1 - d C ( 7 , 7 2 1

) 8 - d C ( 8 , 7 2 1

) 9 - d C ( 4 , 7 2 1

b 6 - s C

, 3 - H

3 H C O -

, 9 - H ( 3 3 , 7

) z H 8 d,

) z H 4 1 , 5 . 4 d, d

, q e - 4 H ( 3 0 , 3

, x a - 7 H ( 1 8 , 2

, q e - 7 H ( 1 4 1 8 , 3

, 0 1 - H ( 2 2 , 7

, x a - 4 H ( 0 7 , 2

, 1 1 - H ( 1 3 , 8

, x a - 5 H ( 1 7 , 2

, 8 - H ( 5 2 , 7

, a 6 - H ( 9 8 , 3

, q e - 5 H ( 8 9 , 2

PL-15

PL- 2.4. Phổ MS, NMR của alkaloid LN-4 (asimilobin)

+ [M+H]

5 - t C

4 - t C

7 - d C

3 - d C

9 - d C

2 - s C

1 - s C

0 1 - s C

a 1 1 - s C

a 1 - s C

a 3 - s C

b 6 - s C

1 1 - d C

a 6 - d C

3 H C - N - 6

3 H C - O - 2

a 7 - s C

8 - d C

PL-16

PL- 2.5. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid LN-5 (apoglaziovin)

) z H 5 , 5 5 , 2

) z H 5 , 2 d

; 3 H C O - 2

; 1 1 - H ( 9 7 , 7

; 9 - H ( 8 5 . 6

; 3 - - H ( 6 6 , 6

H O - 0 1

H O - 1

q e - 5

q e - 4

; 3 H C - N - 6

) z H 5 , 9 ; 4

H ( 5 9 , 2

d d

H ( 4 9 , 2

) z H 5 , 3 1 t

; q e - 7

; x a - 7

) z H 0 1 5 , 3

) z H 5 , 2 d

d d

H ( 0 0 , 3

H ( 2 2 , 2

x a - 4

x a - 5

; 1 1 - H ( 4 0 , 7

H ( 7 5 , 2

H ( 4 3 , 2

; a 6 - H ( 0 8 . 2

PL-17

C-9

C-1a

C-11

C-10

C-7a

H-11

C-11a

C-11

H-8

C-1

C-2

C-1b

C-1a

H-3

H-9

C-11

C-7a

C-6a

6-N-CH3

H-4eq

C-4

H-7eq

H-6a

6-N-CH3

H4-ax

C-6a

C-5

6-N-CH3

H5-ax

H7-ax

C-6a

PL-18

+ [M+H]

7 t - C

5 - t C

4 - t C

3 - d C

1 - s C

1 1 - d C

8 - d C

a 3 - s C

2 - s C

b 3 - s C

0 1 - s C

3 1 - s C

a 6 - d C

3 H C O - 1

3 H C O - 2

a 3 1 - s C

3 H C N - 6

2 1 - d C

9 - d C

, 3 - H ( 7 7 , 6

) 3 H C O - 2 ( 4 7 , 3

) 3 H C O - 1 ( 8 4 , 3

) 3 H C N - 6 ( 5 2 , 2

) z H 0 1 5 , 2 d d

) z H 0 1 2 d d

) z H 0 1 5 , 2 d d

) z H 0 1 2 d d

1 H t, 1

; 2 1 - H ( 6 1 , 7

; 8 - H ( 5 0 , 7

; 9 - H ( 9 2 , 6

; 1 1 - H ( 7 1 , 6

, q e - 7 H ( 8 2 , 2

, x a - 7 H ( 4 1 , 2

, 4 - H 2 ( 7 7 , 2

, q e - 5 H ( 3 0 , 3

, x a - 5 H ( 7 3 , 2

, a 6 H ( 4 4 , 3

PL-19

PL- 2.6. Phổ MS, NMR của alkaloid LN-8 (pronuciferin)

+ [M+H]

4 - t C

a 6 - d C

5 - t C

7 - t C

3 - d C

9 - d C

0 1 - s C

2 - s C

a 3 - s C

1 - s C

b 3 - s C

8 - d C

3 1 - s C

a 3 1 - s C

3 H C - O - 1

3 H C - N - 6

3 H C - O - 2

2 1 - d C

1 1 - d C

PL-20

PL- 2.7. Phổ UV, MS, NMR của alkaloid LN-9 (pronuciferin N-oxid)

, 3 - H ( 1 8 , 6

) z H 0 1 2

d d

) z H 0 1 5 , 2 d d

; 1 1 - H ( 7 1 , 6

; 9 - H ( 9 2 , 6

; 8 - H ( 5 0 , 7

; 2 1 - H ( 7 1 , 7

, a 6 - H ( 3 2 , 5

, 3 H C N - 6

, 3 H C O - 2

, 3 H C O - 1

1 H t, 1

, x a - 7 H ( 5 1 , 2

, q e - 7 H ( 8 2 , 2

, 4 - H ( 8 7 , 2

, x a - 5 H ( 7 3 , 2

, q e - 5 H ( 3 0 , 3

PL-21

+ [M+H]

PL-22

PL- 2.8. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid EN-1 (isoliensinin)

PL-23

+ [M+H]

PL-24

PL-2.9. Phổ MS, NMR của alkaloid EN-2 (liensinin)

+ [M+H]

[503-CH2]

[206-CH3]

[M+ Na]

PL-25

PL-2.10. Phổ MS, NMR của alkaloid EN-3 (neferin)

PL-26

PL-27

PL- 2.11. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid EN-4 (isoliensinin N2’-oxid)

[M+H]

[M-O]

PL-28

PL-29

PL-30

’

8 - C

5 - C

C-11, C-15

H-11, H-15

C-12, C-14

C-13

H-14’

C-12’

C-10’

H-5

C-6

C-7

C-8a

C-4a

H-15’

C-11’

C-12, C-14

C-13’

C-13

H-12, H-14

C-10

C-8a’

C-7’

C-6’

H-5’

H-8’

C-6’

C-7’

C-4a’

H-11’

C-13’

C-12’

C-15’

C-8a

C-6

C-7

C-4a

H-8

PL-31

H-1’

C-8a’

C-10’

6’-O-CH3

C-7’

C-6

6-O-CH3 13-O-CH3

C-13

H-1 H9’eq

H3’eq

H3’ax

C-4a’

2’-N-CH3

C-4a’

C-10

H4’eq H3eq H9eq

C-10’ C-8a’

C-11’

H9’ax H4eq

H3ax

H4’ax H4ax

C-10

H9ax

H-11, H-15

C-9

H-14’

H-5

C-4

C-9’

H-15’

H-12, H-14

H-5’

C-4’

H-8’

C-1’

C-9’

H-11’

C-1

H-8

PL-32

H3’eq

H3’ax

C-4’

2’-N-CH3

C-1’

C-3’

H4’eq

C-1

H3eq H9eq

H9’ax

C-1’

C-3

H4eq

H3ax

C-1

H4’ax H4ax

H9ax

2-N-CH3

C-1

C-3

PL-33

PL-34

[M+H]

[M-O]+

PL-35

PL- 2.12. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid EN-5 (isoliensinin N2-oxid)

13-O-CH3

1 - d C

’ 1 - d C

9 - t C

4 - t C

’ 4 – t C

3 H C - N - 2

3 H C - O - ’ 6

3 H C - O - 6

3 H C - N - ’ 2

5 - d C

’ 5 - d C

’ 8 - d C

’ 7 - s C

7 - s C

’ 4 1 - d C

8 - d C

’ 1 1 - d C

a 8 - s C

’ 0 1 - s C

’ 3 1 - s C

a 4 - s C

0 1 - s C

3 1 - s C

5 1 , 1 1 - d C

4 1 , 2 1 - d C

’ 5 1 - d C

a 4 - s C

’ 2 1 - s C

6 - s C

’ 6 - s C

’ 9 – t C

PL-36

) z H 5 8

) s ;

8 5

) s ;

;

s ’

8 8

) z H 9

6 ( ’

3 9

) z H 5 1

7 6 (

6 (

8 - H

) z H 2 8

8 - H

;

5 - H

;

8 7

5 - H

4 1 - H

6 ( 5 1 - H

6 ( ’

d d

;

4 1 - H

1 1 - H

5 7

6 ( ’

5 1 - H

PL-37

) s ;

) z H 7

) s ;

9 6

2 8

;

) z H 7

3 3

;

) z H

7 4

3 ( 3 H C O

5 6

3 ( 3 H C O - 3 1

- ’ 6

;

3 ( 3 H C N - 2

3 4

2 ( 3 H C N

4 (

- ’ 2

) s ;

1 - H

2 8

m 8 0

m 0 8

’

m 9 7

m 3 8

m 6 6

, q e 3 H

3 ( 3 H C O - 6

m 1 5

’

m 4 7

m 6 0

m 7 5

, q e 4 H

m 9 6

m 4 3

, x a 9 H

, q e 9 H

’

, x a 3 H

, x a 9 H

, q e 3 H

, x a 4 H

’

, x a 4 H

, x a 3 H

, q e 4 H

PL-38

PL-39

PL-40

PL-41

+ [M+H]

[M+ Na]

1 - d C

8 - d C

a 8 - s C

3 H C - O -

1 1 - d C

9 - t C

3 - t C

4 - t C

5 - d C

6 - s C

7 - s C

a 4 - s C

2 1 - d C

0 1 - s C

3 1 - s C

3 H C - O - 6

PL-42

PL- 2.13. Phổ UV, IR, MS, NMR của alkaloid EN-6 (norarmepavin)

d, 8 H

, 8 — H

, 5 — H

; 4 1 , 2 1 - H ( 4 6 , 6

; 5 1 , 1 1 - H ( 2 0 , 7

t, 6 H

, 3 H C O - 6

, 3 H C O - 7

, 4 - H ( 6 7 , 2

d, 4.5, 9.5 H

, 1 - H ( 5 1 , 4

, q e - 9 H ( 4 1 , 3

q e - 3 H ( 4 2 , 3

x a - 9 H ( 6 8 , 2

x a - 3 H ( 4 2 , 3

PL-43

PL- 2.14. Phổ MS, NMR của alkaloid EN-7 (Armepavin)

+ [M+H]

8 - d C

0 1 - s C

3 H C - O - 7

9 - t C

4 - t C

3 - t C

1 - d C

7 - s C

6 - s C

5 - d C

3 1 - s C

a 4 - s C

a 8 - s C

3 H C - O - 6

3 H C - N - 2

5 1 , 1 1 - d C

4 1 , 2 1 1 - d C

PL-44

; 5 1 , 1 1 - H ( 2 0 , 7

d, 8.5 H

, 8 — H

, 5 — H

; 5 1 , 1 1 - H ( 2 0 , 7

; 4 1 , 2 1 - H ( 6 6 , 6

3 H C - N - 2

3 H C - O - 7

3 H C - O - 6

) z H 5 , 3 1 ; 5 , 5

) z H 0 , 4 1 ; 0 , 8 d, d

d, d

, z a - 9 H ( 5 7 , 2

, 1 - H ( 1 7 , 3

x a - 3 H ( 2 8 , 2

q e - 3 H ( 4 2 , 3

q e - 4 H ( 8 8 , 2

, q e - 9 H ( 2 1 , 3

x a - 4 H ( 1 6 , 2

PL-45

[M-H]

5 - s C

’ 4 - s C

’ 3 - s C

8 - d C

6 - d C

’ 1 - s C

7 - d C

4 - s C

3 - s C

” 6 - s C

’ 6 - d C

” 3 - d C

” 2 - d C

” 1 - d C

’ 2 - d C

” 5 - d C

” 4 - d C

’ 5 - d C

9 - s C

0 1 - s C

1 - s C

(H2-H5”) 3,51-3,63; m

d, 2 H

’

d, 8.5 H

’

d, 7.5 H

d, 2, 8.5 H

’

, 8 - H ( 0 4 , 6

, 6 - H ( 0 2 , 6

2 - H ( 8 9 , 7

5 - H ( 8 8 , 6

” 1 - H ( 0 4 , 5

d 6 - H ( 1 5 , 7

PL-46

PL- 2.15. Phổ MS, NMR của alkaloid LF-3 (quercetin 3-O-β-D-GlcA)

PL- 2.16. Phổ MS, NMR của alkaloid LF-5 (isorhamnetin)

[M-H]

’ 4 - s C

2 - s C

7 - s C

9 - s C

5 - s C

3 - s C

6 - d C

8 - d C

’ 3 - s C

’ 5 - s C

’ 2 – d C

’ 6 - s C

’ 1 - s C

0 1 - s C

4 - s C

H C O - ’ 3

) z H

) z H 8

d, 2

d, 1.5 H

’

d, 2, 8.5 H

’

’ 5 - H ( 3 9 , 6

8 - H ( 0 4 , 6

6 - H ( 0 2 , 6

2 - H ( 8 7 , 7

d 6 - H ( 9 6 , 7

PL-47

[M-H]

4 - t C

7 - d C

5 - s C

’ 2 d - C

6 - d C

’ 6 - d C

8 - d C

2 - d C

3 - d C

’ 1 s - C

0 1 s - C

’ 4 - C ; ’ 3 s - C

9 - s C

q e - 4

x a - 4

3 - H ( 1 8 , 3

H ( 5 6 , 2

H ( 4 3 , 2

’

) z H 2 d, 8 - H ( 8 6 , 5

) z H 7 d, 2 - H ( 7 4 , 4

) z H 5 . 2 d, 6 - H ( 8 8 , 5

) z H 2 d, 2 - H ( 2 7 , 6

) z H 5 . 8 d, 5 - H ( 2 7 , 6

) z H 8 , 2 d, d 6 - H ( 9 5 , 6

PL-48

PL- 2.17. Phổ MS, NMR của alkaloid LF-8 (catechin)

[M-H]

0 1 - s C

, 3

2 - d C

8 - d C

’ 6 - d C

’ 5 - d C

4 - s C

7 - s C

9 - s C

’ 1 - s C

’ 2 - d C

6 - d C

’ 4 - s C

’ 3 - s C

5 - d C

3 - s C

H C - O - ’ 4

s) 2 - H ( 4 2 , 8

) z H 2

) z H 5 . 8 , 2

) z H 5 . 1

) z H 5 . 8

d, d

, 8 - H ( 5 8 , 6

, ’ 2 - H ( 3 0 , 7

, 5 - H ( 6 9 , 7

, ’ 6 - H ; ’ 5 - H ; 6 - H ( 2 9 , 6

PL-49

PL- 2.18. Phổ MS, NMR của alkaloid TF-1 (calycosin)

PHỤ LỤC 3. THIẾT LẬP CÁC CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ ALKALOID,

FLAVONOID PHÂN TỪ LÁ, TÂM SEN.

PL-3.1. Phiếu kiểm nghiệm 06 nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu ở hai PTN đạt tiêu

PL-50

chuẩn GLP & ISO 17025 tại VKN. TPHCM.

PL-51

PL- 3.2. Phiếu kiểm nghiệm xác định độ tinh khiết của các alkaloid phân lập từ lá và

tâm Sen tại PTN đạt tiêu chuẩn ISO 17025, TTKN Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm

PL-52

Tp. Cần Thơ.

PL-53

PL- 3.3. Phiếu kiểm nghiệm xác định độ tinh khiết của các flavonoid phân lập từ

lá và tâm Sen tại Trung tâm KN Thuốc- Mỹ phẩm- Thực phẩm Tp. Cần Thơ.

PL-54

PL-55

PL-56

PL-57

PL-58

PL- 3.4. Phiếu kiểm nghiệm xác định năng suất quay cực của các alkaloid, flavonoid

PL-59

phân lập từ lá và tâm Sen tại TT. KN Thuốc-Mỹ phẩm-Thực phẩm Tp. Cần Thơ.

PL-60

PL- 3.5. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn định

của nguyên liệu thiết lập CĐC LN-1 (nuciferin).

YÊU CẦU

Hàm lượng (%) nuciferin tính theo chế phẩm nguyên trạng

PTN-2 99,17 99,47 99,34 99,33 99,33 99,30 99,30 0,10

PTN-3 99,48 99,17 99,17 99,29 99,30 99,16 99,24 0,13

1 2 3 4 5 6 TB RSD

Nguồn sai số

Ftn

Ftc

PTN-1 99,10 99,51 99,55 99,55 99,41 99,44 99,43 0,17 ANOVA bậc tự do

Tổng số bình phương

Bình phương trung bình

Giữa các nhóm Trong từng nhóm Tổng cộng

0,083 0,267 0,350

2 15 17

2,39

3,68

0,042 0,018

Kết quả giá trị ấn định hàm lượng LN-1 (nuciferin) (n = 18)

δ = 1,5s* x* - δ x* + δ

x* 1 0,323 99,007 99,653 99,10 99,51 99,55 99,55 99,41 99,44 99,17 99,47 99,34 99,33 99,33 99,30 99,48 99,17 99,17 99,29 99,30 99,16 99,337 0,140 99,337 0,163

x* 0 99,10 99,51 99,55 99,55 99,41 99,44 99,17 99,47 99,34 99,33 99,33 99,30 99,48 99,17 99,17 99,29 99,30 99,16 99,337 0,140 99,330 0,145

x* 2 0,244 99,093 99,582 99,10 99,51 99,55 99,55 99,41 99,44 99,17 99,47 99,34 99,33 99,33 99,30 99,48 99,17 99,17 99,29 99,30 99,16 99,337 0,140 99,337 0,163

|z| 0,24 0,17 0,21 0,21 0,07 0,10 0,17 0,13 0,00 0,01 0,01 0,04 0,14 0,17 0,17 0,05 0,04 0,18

Hàm lượng trung bình: 99,337% Độ lệch s: 0,163 Độ không đảm bảo đo: 0,048 Trung bình Độ lệch s x* mới s* mới

PL-61

PL- 3.6. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn định

của nguyên liệu thiết lập CĐC LN-2 (2-O-nornuciferin).

YÊU CẦU

(%)

lượng Hàm o-nornuciferin tính theo chế phẩm nguyên trạng

PTN-3 96,58 96,55 96,53 96,69 96,67 96,55 96,65 0,07

PTN-2 96,44 96,45 96,53 96,42 96,45 96,64 96,49 0,10

1 2 3 4 5 6 TB RSD

Nguồn sai số

Ftn

Ftc

PTN-1 96,59 96,65 96,58 96,60 96,45 96,42 96,57 0,10 ANOVA bậc tự do

Bình phương trung bình

Giữa các nhóm Trong từng nhóm Tổng cộng

2 15 17

2,68

3,68

Tổng số bình phương 0,037 0,104 0,142

0,019 0,007 Kết quả giá trị ấn định hàm lượng LN-2 (o-nornuciferin) (n = 18)

δ = 1,5s* x* - δ x* + δ

x* 0 96,58 96,55 96,53 96,69 96,67 96,55 96,44 96,45 96,53 96,42 96,45 96,59 96,65 96,58 96,60 96,45 96,42 96,59 96,541 0,086 96,550 0,111

x* 1 0,167 96,383 96,717 96,58 96,55 96,53 96,69 96,67 96,55 96,44 96,45 96,53 96,42 96,45 96,59 96,65 96,58 96,60 96,45 96,42 96,59 96,541 0,086 96,541 0,098

x* 2 0,147 96,394 96,688 96,58 96,55 96,53 96,69 96,67 96,55 96,44 96,45 96,53 96,42 96,45 96,59 96,65 96,58 96,60 96,45 96,42 96,59 96,541 0,086 96,541 0,098

|z| 0,04 0,01 0,01 0,15 0,13 0,01 0,10 0,09 0,01 0,12 0,09 0,05 0,11 0,04 0,06 0,09 0,12 0,05

Hàm lượng trung bình: 96,541% Độ lệch s: 0,098 Độ không đảm bảo đo: 0,029 Trung bình Độ lệch s x* mới s* mới

PL-62

PL- 3.7. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn định

của nguyên liệu thiết lập CĐC EN-1 (isoliensinin).

YÊU CẦU

(%)

lượng Hàm isoliensinin tính theo chế phẩm nguyên trạng

PTN-1 96,63 96,72 97,87 96,67 96,72 97,04 96,94 0,49

PTN-2 96,99 96,98 97,12 97,13 96,97 96,93 97,02 0,10

PTN-3 96,39 96,64 96,67 96,75 96,45 96,71 96,60 0,15

1 2 3 4 5 6 TB RSD

ANOVA

Nguồn sai số

Ftn

Ftc

bậc tự do

Bình phương trung bình

2 15 17

0,30 0,09

3,47

3,68

Giữa các nhóm Trong từng nhóm Tổng cộng

Tổng số bình phương 0,59 1,282 1,88

Kết quả giá trị ấn định hàm lượng EN-1 (isoliensinin) (n = 18)

|z|

δ = 1,5s* x* - δ x* + δ

0,14 0,17 0,19 0,03 0,05 0,17 0,33 0,08 0,05 0,03 0,27 0,33 0,27 0,27 0,35 0,35 0,25 0,22

x* 1 0,400 96,270 97,070 96,58 96,55 96,53 96,69 96,67 96,55 96,39 96,64 96,67 96,75 96,45 96,39 96,99 96,98 97,07 97,07 96,97 96,93 96,715 0,231 96,715 0,262

x* 2 0,393 96,332 97,108 96,58 96,55 96,53 96,69 96,67 96,55 96,39 96,64 96,67 96,75 96,45 96,39 96,99 96,98 97,07 97,07 96,97 96,93 96,715 0,231 96,715 0,262

x* 0 96,58 96,55 96,53 96,69 96,67 96,55 96,39 96,64 96,67 96,75 96,45 96,39 96,99 96,98 97,12 97,13 96,97 96,93 96,721 0,242 96,670

Hàm lượng trung bình: 96,72% Độ lệch s: 0,262 Độ không đảm bảo đo: 0,077 Trung bình Độ lệch s x* mới s* mới

PL-63

PL- 3.8. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn định

của nguyên liệu thiết lập CĐC EN-2 (liensinin).

YÊU CẦU

lượng Hàm liensinin tính theo chế phẩm nguyên trạng

PTN-1 96,28 96,23 96,24 96,18 96,25 96,19 96,23 0,04

PTN-2 96,37 96,25 96,23 96,29 96,15 96,18 96,16 0,13

PTN-3 96,15 96,34 96,45 96,19 96,27 96,40 96,30 0,12

1 2 3 (%) 4 5 6 TB RSD

ANOVA

Tổng số bình phương

bậc tự do

Ftn

Ftc

Nguồn sai số

Bình phương trung bình

0,035 0,160 0,195

2 15 17

3,68

0,02 0,01

1,66

Giữa các nhóm Trong từng nhóm Tổng cộng Kết quả giá trị ấn định hàm lượng EN-2 (liensinin) (n = 18) x* 0

|z|

δ = 1,5s* x* - δ x* + δ

0,02 0,03 0,02 0,08 0,01 0,07 0,11 0,08 0,19 0,07 0,01 0,14 0,11 0,01 0,03 0,03 0,11 0,08

x* 1 0,151 96,094 96,396 96,28 96,23 96,24 96,18 96,25 96,19 96,15 96,34 96,45 96,19 96,27 96,40 96,37 96,25 96,23 96,29 96,15 96,18 96,258 0,086 96,258 0,097

x* 2 0,146 96,112 96,403 96,28 96,23 96,24 96,18 96,25 96,19 96,15 96,34 96,45 96,19 96,27 96,40 96,37 96,25 96,23 96,29 96,15 96,18 96,258 0,086 96,258 0,097

96,28 96,23 96,24 96,18 96,25 96,19 96,15 96,34 96,45 96,19 96,27 96,40 96,37 96,25 96,23 96,29 96,15 96,18 96,258 0,086 96,245

Hàm lượng trung bình: 96,23% Độ lệch s: 0,097 Độ không đảm bảo đo: 0,029 Trung bình Độ lệch s x* mới s* mới

PL-64

PL- 3.9. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn định

của nguyên liệu thiết lập CĐC EN-3 (neferin).

YÊU CẦU

(%)

lượng tính

theo chế

Hàm neferin phẩm nguyên trạng

PTN-1 96,52 95,45 96,47 95,53 95,98 96,26 96,04 0,46

PTN-2 95,91 95,78 96,46 95,39 95,58 96,39 95,92 0,45

PTN-3 95,73 95,71 95,50 96,35 96,47 95,52 95,88 0,44

1 2 3 4 5 6 TB RSD

ANOVA

Ftn

Ftc

Nguồn sai số

bậc tự do

Bình phương trung bình

Giữa các nhóm Trong từng nhóm Tổng cộng

Tổng số bình phương 0,078 2,898 2,976

0,04 0,19

0,20

3,68

2 15 17

Kết quả giá trị ấn định hàm lượng EN-3 (neferin) (n = 18) x* 0

|z|

δ = 1,5s* x* - δ x* + δ

0,58 0,49 0,53 0,41 0,04 0,32 0,03 0,16 0,52 0,55 0,36 0,45 0,21 0,23 0,44 0,41 0,53 0,42

x* 1 0,823 95,022 96,668 96,52 95,45 96,47 95,53 95,98 96,26 95,91 95,78 96,46 95,39 95,58 96,39 95,73 95,71 95,50 96,35 96,47 95,52 95,944 0,418 95,944 0,457

x* 2 0,712 95,233 96,656 96,52 95,45 96,47 95,53 95,98 96,26 95,91 95,78 96,46 95,39 95,58 96,39 95,73 95,71 95,50 96,35 96,47 95,52 95,944 0,418 95,944 0,457

96,52 95,45 96,47 95,53 95,98 96,26 95,91 95,78 96,46 95,39 95,58 96,39 95,73 95,71 95,50 96,35 96,47 95,52 95,944 0,418 95,845

Hàm lượng trung bình: 95,94% Độ lệch s: 0,475 Độ không đảm bảo đo: 0,14 Trung bình Độ lệch s x* mới s* mới

PL-65

PL- 3.10. Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích Anova và xác định giá trị ấn

định của nguyên liệu thiết lập CĐC LF-3 (quercetin-3-O-β-D-GlcA)

YÊU CẦU

(%)

lượng

theo chế phẩm

Hàm quercetin-3O-D-GlcA tính nguyên trạng

PTN-3 97,89 97,81 97,57 97,86 97,85 97,83 97,80 0,12

PTN-3 97,85 97,78 97,76 97,89 98,03 98,10 98,02 0,14

PTN-2 97,96 98,05 98,07 97,95 97,86 97,39 97,81 0,26

1 2 3 4 5 6 TB RSD

ANOVA

Nguồn sai số

Ftn

Ftc

bậc tự do

Bình phương trung bình

Giữa các nhóm Trong từng nhóm Tổng cộng

Tổng số bình phương 0,03 0,48 0,51

0,017 0,032

0,52

3,68

2 15 17

Kết quả giá trị ấn định hàm lượng LF-3 (quercetin-3-O-D-GlcA) (n = 18)

x* 0

|z|

δ = 1,5s* x* - δ x* + δ

0,03 0,10 0,12 0,01 0,15 0,22 0,08 0,17 0,19 0,07 0,02 0,21 0,01 0,07 0,21 0,02 0,03 0,05

97,85 97,78 97,76 97,89 98,03 98,10 97,96 98,05 98,07 97,95 97,86 97,39 97,89 97,81 97,57 97,86 97,85 97,83 97,861 0,173 97,860

x* 1 0,189 97,671 98,049 97,85 97,78 97,76 97,89 98,03 98,10 97,96 98,05 98,07 97,95 97,86 97,67 97,89 97,81 97,67 97,86 97,85 97,83 97,882 0,126 97,882 0,143

x* 2 0,214 97,668 98,096 97,85 97,78 97,76 97,89 98,03 98,10 97,96 98,05 98,07 97,95 97,86 97,67 97,89 97,81 97,67 97,86 97,85 97,83 97,882 0,126 97,882 0,143

Hàm lượng trung bình: 97,88% Độ lệch s: 0,143 Độ không đảm bảo đo: 0,42 Trung bình Độ lệch s x* mới s* mới

PL-66

Có hiệu lực từ:

Khoa Dược Đại học Y- Dược Tp, HCM Bộ môn HPT-KN

PL- 3.11. TCCS của các nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu

TIÊU CHUẨN CƠ SỞ Nguyên liệu NUCIFERIN (C19H21NO2)

Ban hành theo quyết định số: 06 ngày 15 tháng 03 năm 2014

1. Yêu cầu kỹ thuật

Danh pháp quốc tế: (6aR)-1, 2-dimethoxy-6-methyl-5, 6, 6a, 7-tetrahydro-4H-

dibenzo [de, g] quinolone. CTPT: C19H21NO2, M= 295,01.

Nuciferin được phân lập từ cao alkaloid lá Sen (Nelumbo nucifera Gaertn,

Nelumbonaceae) phải chứa trên 95% (C19H21NO2) tính trên nguyên trạng,

1.1. Tính chất: tinh thể hình lăng trụ, không màu, tan tốt trong methanol, cloroform.

1.2. Định tính: có thể chọn một trong các nhóm định tính sau

Nhóm I: Phổ hồng ngoại. Phổ hồng ngoại của nuciferin phải có các dao động

đặc trưng theo cấu trúc hóa học của nuciferin.

25 = -145, 6 o (c= 0,5%; EtOH)

Nhóm II: Nhiệt độ nóng chảy và năng suất quay cực. Điểm nóng chảy của nuciferin

163-164 oC và 𝛼𝐷 Nhóm III: phổ UV, MS và 1H, 13C-NMR.

Phổ UV trong dung môi methanol của nuciferin phải có ba cực đại ở các bước sóng

312, 272, 232 nm. Phổ ESI-MS (ES+) của nuciferin phải có mảnh có m/z = 296,01

[M +H]+ và m/z = 317,99 [M + Na]+. Phổ 13C và 1H-NMR: Độ dịch chuyển hóa học

các carbon và hydro của nucferin được trình bày trong ở Bảng 3.38.

1.3. Tạp chất: Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, trên sắc ký đồ của

dung dịch mẫu thử trong phần định lượng, ngoài pic nuciferin thì tổng diện tích các

PL-67

pic phụ phải dưới 5% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ.

1.4. Định lượng: Xác định độ tinh khiết sắc ký bằng HPLC. Diện tích pic nuciferin

phải trên 95% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ tính trên nguyên trạng.

2. Phương pháp thử

2.1. Tính chất: bằng cảm quan mẫu thử phải đạt các yêu cầu đã nêu

2.2. Định tính:

a. Phổ hồng ngoại: Xác định các dao động đặc trưng trên phổ hồng ngoại

b. Điểm chảy: thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.7. năng suất quay cực

thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.4.

c. Phổ UV: mẫu thử được pha trong MeOH và quét phổ ở thang sóng 200-400nm.

Xác định các bước sóng cực đại với sai số cho phép ±2 nm. Phổ MS: sử dụng bộ

phận ion hóa mẫu kiểu phun điện tử (ESI) và chọn chế độ ES+, thế áp dụng 70eV.

Phổ 1H, 13C-NMR: được đo trên máy có tần số từ 500 MHz, xác định độ dịch

chuyển hóa học của các C và H.

2.3. Tạp chất: Thực hiện theo phần định lượng

2.4. Định lượng:

Chuẩn bị mẫu thử: Pha dung dịch thử 200 ppm trong pha động, Lọc qua màng lọc

0,45 µm, dịch lọc được tiêm vào hệ thống HPLC

Chuẩn bị mẫu trắng: giống như mẫu thử nhưng không có nuciferine,

Điều kiện sắc ký thích hợp: Cột sắc ký pha đảo Phenomenex Gemini C8 (150 x 4,6

mm; 5 µm); pha động: ACN–Triethylamin 0,1% (52:48, tt/tt); bước sóng phát hiện

272 nm; tốc độ dòng: 1 mL/phút; Thể tích tiêm mẫu: 10 µL; nhiệt độ cột: 30 0C;

Thời gian sắc ký: 20 phút.

Kiểm tra tính tương thích hệ thống: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu thử. Phép thử chỉ có

giá trị khi RSD của các thông số sắc ký (tR, S, As, Rs, k’, N) của pic chính trong mẫu

thử phải không quá 2%, trong đó As phải nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và Rs và pic

phụ (nếu có) phải lớn hơn 1,5.

Tiến hành xác định % độ tinh khiết của pic chính và % tạp chất: Tiêm vào hệ thống

dung dịch mẫu thử, diện tích của pic nuciferin phải lớn hơn 95% và các pic phụ có

tổng diện tích pic phải dưới 5% so với tổng diện tích pic trên SKĐ.

PL-68

3. Bảo quản: đóng trong lọ thủy tinh màu nâu. Nhiệt độ từ 2-8 oC.

Có hiệu lực từ:

Khoa Dược Đại học Y- Dược Tp, HCM Bộ môn HPT-KN

TIÊU CHUẨN CƠ SỞ Nguyên liệu O-NORNUCIFERIN (C18H19NO2)

Ban hành theo quyết định số: 06 ngày 15 tháng 03 năm 2014

1. Yêu cầu kỹ thuật

Danh pháp quốc tế: 6a-beta-Aporphin-2-ol, 1-methoxy-

4H-Dibenzo(de,g) quinolin-2-ol, 5,6,6a,7-tetrahydro-1-methoxy-6-methyl-, (R)-.

CTPT: C18H19NO2, M= 281,35. 2-O-nornuciferin được phân lập từ cao alkaloid

lá Sen (Nelumbo nucifera Gaertn, Nelumbonaceae) phải chứa trên 95% (C18H19NO2)

tính trên nguyên trạng,

1.1. Tính chất: tinh thể hình khối, không màu, tan tốt trong cloroform, methanol.

1.2. Định tính: có thể chọn một trong các nhóm định tính sau

Nhóm I: Phổ hồng ngoại. Phổ hồng ngoại của 2-O-nornuciferin phải có các dao động

đặc trưng theo cấu trúc hóa học của 2-O-nornuciferin.

25 = -145o (c= 0,5%; EtOH)

Nhóm II: Nhiệt độ nóng chảy và năng suất quay cực. Điểm nóng chảy của

2-O-nornuciferin: 173-174 oC và 𝛼𝐷 Nhóm III: phổ UV, MS và 1H, 13C-NMR

Phổ UV trong dung môi methanol của 2-O-nornuciferin phải có ba cực đại ở các

bước sóng 312, 272, 232 nm. Phổ ESI-MS (ES+) của o-nornuciferin phải có mảnh

có 282,25 [M +H]+ và m/z = 251,18 [M –OCH3]+. 13C và 1H-NMR: Độ dịch chuyển

hóa học các carbon và hydro của 2-O-nornuciferin được trình bày trong ở Bảng 3.38.

1.3. Tạp chất: Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Trên sắc ký đồ của

dung dịch mẫu thử trong phần định lượng, ngoài pic 2-O-nornuciferin thì tổng diện

PL-69

tích các pic phụ phải dưới 5% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ.

1.4. Định lượng: Xác định độ tinh khiết sắc ký bằng HPLC. Diện tích pic nuciferin

phải trên 95% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ tính trên nguyên trạng.

2. Phương pháp thử

2.1. Tính chất: bằng cảm quan mẫu thử phải đạt các yêu cầu đã nêu

2.2. Định tính:

a. Phổ hồng ngoại: Xác định các dao động đặc trưng trên phổ hồng ngoại

b. Điểm chảy: thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.7. Năng suất quay cực

thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.4.

c. Phổ UV: mẫu thử được pha trong MeOH và quét phổ ở thang sóng 200-400 nm.

Xác định các bước sóng cực đại với sai số cho phép ±2 nm. Phổ MS: sử dụng bộ

phận ion hóa mẫu kiểu phun điện tử (ESI) và chọn chế độ ES+, thế áp dụng 70eV.

Phổ 1H, 13C-NMR: được đo trên máy có tần số từ 500 MHz, xác định độ dịch

chuyển hóa học của các C và H.

2.3. Tạp chất: Thực hiện theo phần định lượng

2.4. Định lượng:

Chuẩn bị mẫu thử: Pha dung dịch thử 200 ppm trong pha động, Lọc qua màng lọc

0,45 µm, dịch lọc được tiêm vào hệ thống HPLC

Chuẩn bị mẫu trắng: giống như mẫu thử nhưng không có 2-O-nornuciferin.

Điều kiện sắc ký thích hợp: Cột sắc ký pha đảo Phenomenex Gemini C8 (150 x 4,6

mm; 5 µm); pha động: ACN–Triethylamin 0,1% (50:50, tt/tt); bước sóng phát hiện

272 nm; tốc độ dòng: 1 mL/phút; Thể tích tiêm mẫu: 10 µl; nhiệt độ cột: 30 oC;

Thời gian sắc ký: 20 phút.

Kiểm tra tính tương thích hệ thống: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu thử. Phép thử chỉ có

giá trị khi RSD của các thông số sắc ký (tR, S, As, Rs, k’, N) của pic chính trong

mẫu thử phải không quá 2%, trong đó As phải nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và Rs và

pic phụ (nếu có) phải lớn hơn 1,5.

Tiến hành xác định % độ tinh khiết của pic chính và % tạp chất: Tiêm vào hệ thống

dung dịch mẫu thử, diện tích của pic 2-O-nornuciferin phải lớn hơn 95% và các pic

phụ có tổng diện tích pic phải dưới 5% so với tổng diện tích pic trên SKĐ.

PL-70

3. Bảo quản: đóng trong lọ thủy tinh màu nâu. Nhiệt độ từ 2-8 oC.

Có hiệu lực từ:

Khoa Dược Đại học Y- Dược Tp, HCM Bộ môn HPT-KN

TIÊU CHUẨN CƠ SỞ Nguyên liệu ISOLIENSININ (C37H42N2O6)

Ban hành theo quyết định số: 06 ngày 15 tháng 03 năm 2014

2. Yêu cầu kỹ thuật

Danh pháp quốc tế: 1-[[4-hydroxy-3-[[(1R)-6-methoxy-1-[(4-

methoxyphenyl)methyl]-2-methyl-3,4-dihydro-1-isoquinolin-7-phenyl]methyl]-6-

methoxy-2-methyl-3,4-dihydro-1-isoquinolin-7-ol. CTPT: C37H42N2O6, M= 610.

Isoliensinin được phân lập từ cao alkaloid tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn,

Nelumbonaceae) phải chứa trên 95% (C37H42N2O6) tính trên nguyên trạng.

3.1. Tính chất: dạng bột vô định hình màu trắng mịn, tan tốt trong MeOH, CHCl3.

3.2. Định tính: có thể chọn một trong các nhóm định tính sau

Nhóm I: Phổ hồng ngoại. Phổ hồng ngoại của isoliensinin phải có các dao động

đặc trưng theo cấu trúc hóa học của isoliensinin.

24 = + 53,6o (c=0,5%; MeOH).

Nhóm II: Nhiệt độ nóng chảy và năng suất quay cực. Điểm nóng chảy của

isoliensinin: 70-71 oCvà 𝛼𝐷 Nhóm III: phổ UV, MS và 1H, 13C-NMR. Phổ UV trong dung môi methanol của

isoliensinin phải có ba cực đại ở các bước sóng 212, 225 và 282 nm. Phổ ESI-MS

(+) có m/z = 611 [M+H] + và các phân mảnh 489, 417, 297, 192, 176, 121 đặc trưng.

Phổ 13C và 1H-NMR: Độ dịch chuyển hóa học các carbon và hydro của isoliensinin

được trình bày trong ở Bảng 3.38.

3.3. Tạp chất: Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Trên sắc ký đồ của

dung dịch mẫu thử trong phần định lượng, ngoài pic isoliensinin thì tổng diện tích

PL-71

các pic phụ phải dưới 5% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ.

1.4. Định lượng: Xác định độ tinh khiết sắc ký bằng HPLC. Diện tích pic nuciferin

phải trên 95% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ tính trên nguyên trạng.

2. Phương pháp thử

2.1. Tính chất: bằng cảm quan mẫu thử phải đạt các yêu cầu đã nêu

2.2. Định tính:

a. Phổ hồng ngoại: Xác định các dao động đặc trưng trên phổ hồng ngoại

b. Điểm chảy: thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.7. Năng suất quay cực

thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.4.

c. Phổ UV: mẫu thử được pha trong MeOH và quét phổ ở thang sóng 200-400 nm.

Xác định các bước sóng cực đại với sai số cho phép ±2 nm. Phổ MS: sử dụng

bộ phận ion hóa mẫu kiểu phun điện tử (ESI) và chọn chế độ ES+,

thế áp dụng 70eV. Phổ 1H, 13C-NMR: được đo trên máy có tần số từ 500 MHz,

xác định độ dịch chuyển hóa học của các C và H.

2.3. Tạp chất: Thực hiện theo phần định lượng

2.4. Định lượng:

Chuẩn bị mẫu thử: Pha dung dịch thử 200ppm trong pha động, Lọc qua màng lọc

0,45 µm, dịch lọc được tiêm vào hệ thống HPLC. Chuẩn bị mẫu trắng: giống như

mẫu thử nhưng không có isoliensinin.

Điều kiện sắc ký thích hợp: Cột sắc ký pha đảo Phenomenex Gemini C8 (150 x 4,6

mm; 5 µm); pha động: ACN–Triethylamin 0,1% (64:36, tt/tt); bước sóng phát hiện

285 nm; tốc độ dòng: 0,8 ml/phút; Thể tích tiêm mẫu: 15 µl; nhiệt độ cột: 30 oC;

Thời gian sắc ký: 20 phút.

Kiểm tra tính tương thích hệ thống: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu thử. Phép thử chỉ có

giá trị khi RSD của các thông số sắc ký (tR, S, As, Rs, k’, N) của pic chính trong

mẫu thử phải không quá 2%, trong đó As phải nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và Rs và

pic phụ (nếu có) phải lớn hơn 1,5.

Tiến hành xác định % độ tinh khiết của pic chính và % tạp chất: Tiêm vào hệ thống

dung dịch mẫu thử, diện tích của pic isoliensinin phải lớn hơn 95% và các pic phụ có

tổng diện tích pic phải dưới 5% so với tổng diện tích pic trên SKĐ.

PL-72

3. Bảo quản: đóng trong lọ thủy tinh màu nâu. Nhiệt độ từ 2-8o C.

Có hiệu lực từ:

Khoa Dược Đại học Y- Dược Tp, HCM Bộ môn HPT-KN

TIÊU CHUẨN CƠ SỞ Nguyên liệu LIENSININ (C37H42N2O6)

Ban hành theo quyết định số: 06 ngày 15 tháng 03 năm 2014

4. Yêu cầu kỹ thuật

Danh pháp quốc tế: 4-{[-6,7-dimethoxy-2-methyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-1-

yl]methyl}-2-{[(1r)-1-(4-hydroxybenzyl)-6-methoxy-2-methyl-1,2,3,4-

tetrahydroisoquinolin-7-yl]oxy}phenol. CTPT: 610. C37H42N2O6, M=

Liensinin được phân lập từ cao alkaloid tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn,

Nelumbonaceae) phải chứa trên 95% (C37H42N2O6) tính trên nguyên trạng,

a. Tính chất: dạng bột trắng mịn, tan tốt trong methanol, cloroform.

b. Định tính: có thể chọn một trong các nhóm định tính sau

Nhóm I: Phổ hồng ngoại. Phổ hồng ngoại của liensinin phải có các dao động

đặc trưng theo cấu trúc hóa học của liensinin.

24 = + 15,5 o (c= 0,5%; aceton)

Nhóm II: Nhiệt độ nóng chảy và năng suất quay cực. Điểm nóng chảy của liensinin:

74-75 oC và 𝛼𝐷 Nhóm III: phổ UV, MS và 1H, 13C-NMR. Phổ UV trong dung môi methanol của

liensinin phải có ba cực đại ở các bước sóng 212, 225 và 283 nm. Phổ ESI-MS (+)

có m/z = 611 [M +H]+ và các phân mảnh 503, 282, 206, 190, 121 đặc trưng.

Phổ 13C và 1H-NMR: Độ dịch chuyển hóa học các carbon và hydro của liensinin

được trình bày trong ở Bảng 3.38.

c. Tạp chất: Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Trên sắc ký đồ của

dung dịch mẫu thử trong phần định lượng, ngoài pic liensinin thì tổng diện tích các

PL-73

pic phụ phải dưới 5% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ,

1.4. Định lượng: Xác định độ tinh khiết sắc ký bằng HPLC. Diện tích pic nuciferin

phải trên 95% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ tính trên nguyên trạng.

2. Phương pháp thử

2.1. Tính chất: bằng cảm quan mẫu thử phải đạt các yêu cầu đã nêu

2.2. Định tính:

a. Phổ hồng ngoại: Xác định các dao động đặc trưng trên phổ hồng ngoại.

b. Điểm chảy: thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.7. Năng suất quay cực

thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.4.

c. Phổ UV: mẫu thử được pha trong MeOH và quét phổ ở thang sóng 200-400 nm.

Xác định các bước sóng cực đại với sai số cho phép ±2 nm. Phổ MS: sử dụng

bộ phận ion hóa mẫu kiểu phun điện tử (ESI) và chọn chế độ ES+,

thế áp dụng 70eV. Phổ 1H, 13C-NMR: được đo trên máy có tần số từ 500 MHz,

xác định độ dịch chuyển hóa học của các C và H.

2.3. Tạp chất: Thực hiện theo phần định lượng

2.4. Định lượng:

Chuẩn bị mẫu thử: Pha dung dịch thử 200 ppm trong pha động, Lọc qua màng lọc

0,45 µm, dịch lọc được tiêm vào hệ thống HPLC

Chuẩn bị mẫu trắng: giống như mẫu thử nhưng không có liensinin.

Điều kiện sắc ký thích hợp: Cột sắc ký pha đảo Phenomenex Gemini C8 (150 x 4,6

mm; 5 µm); pha động: ACN-Triethylamin 0,1% (64:36, tt/tt); bước sóng phát hiện

285 nm; tốc độ dòng: 0,8 ml/phút; Thể tích tiêm mẫu: 15 µl; nhiệt độ cột: 30 oC;

Thời gian sắc ký: 20 phút.

Kiểm tra tính tương thích hệ thống: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu thử. Phép thử chỉ có

giá trị khi RSD của các thông số sắc ký (tR, S, As, Rs, k’, N) của pic chính trong

mẫu thử phải không quá 2%, trong đó As phải nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và Rs và

pic phụ (nếu có) phải lớn hơn 1,5.

Tiến hành xác định % độ tinh khiết của pic chính và % tạp chất: Tiêm vào hệ thống

dung dịch mẫu thử, diện tích của pic liensinin phải lớn hơn 95% và các pic phụ có

tổng diện tích pic phải dưới 5% so với tổng diện tích pic trên SKĐ.

PL-74

3. Bảo quản: đóng trong lọ thủy tinh màu nâu. Nhiệt độ từ 2-8o C.

Có hiệu lực từ:

Khoa Dược Đại học Y- Dược Tp, HCM Bộ môn HPT-KN

TIÊU CHUẨN CƠ SỞ Nguyên liệu NEFERIN (C38H44N2O6)

Ban hành theo quyết định số: 06 ngày 15 tháng 03 năm 2014

4. Yêu cầu kỹ thuật

Danh pháp quốc tế: 4-{[6,7-dimethoxy-2-methyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-1-

yl]methyl}-2-{[(1r)-6-methoxy-1-(4-methoxybenzyl)-2-methyl-1,2,3,4-

tetrahydroisoquinolin-7-yl]oxy}phenol. CTPT: C38H44N2O6, M= 624.

Neferin được phân lập từ cao alkaloid tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn,,

Nelumbonaceae) phải chứa trên 95% (C37H42N2O6) tính trên nguyên trạng.

a. Tính chất: dạng bột vô định hình màu trắng, tan tốt trong methanol và chloroform.

b. Định tính: có thể chọn một trong các nhóm định tính sau

Nhóm I: Phổ hồng ngoại. Phổ hồng ngoại của neferin phải có các dao động đặc trưng

theo cấu trúc hóa học của neferin.

24 = -100 o (c=0,5%; MeOH)

Nhóm II: Nhiệt độ nóng chảy và năng suất quay cực. Điểm nóng chảy của neferin:

90-91 oC và 𝛼𝐷 Nhóm III: phổ UV, MS và 1H, 13C-NMR. Phổ UV trong dung môi methanol của

neferin phải có hai cực đại ở các bước sóng 212, 225 và 285 nm. Phổ ESI-MS (+)

có m/z = 625 [M +H] + và các phân mảnh 503, 418, 297, 206, 190, 121 đặc trưng.

Phổ 13C và 1H-NMR: Độ dịch chuyển hóa học các carbon và hydro của neferin được

trình bày trong ở Bảng 3.38.

c. Tạp chất: Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Trên sắc ký đồ của

dung dịch mẫu thử trong phần định lượng, ngoài pic neferin thì tổng diện tích các pic

PL-75

phụ phải dưới 5% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ,

1.4. Định lượng: Xác định độ tinh khiết sắc ký bằng HPLC. Diện tích pic nuciferin

phải trên 95% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ tính trên nguyên trạng.

2. Phương pháp thử

2.1. Tính chất: bằng cảm quan mẫu thử phải đạt các yêu cầu đã nêu

2.2. Định tính:

a. Phổ hồng ngoại: Xác định các dao động đặc trưng trên phổ hồng ngoại.

b. Điểm chảy: thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.7. Năng suất quay cực

thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.4.

c. Phổ UV: mẫu thử được pha trong MeOH và quét phổ ở thang sóng 200-400 nm.

Xác định các bước sóng cực đại với sai số cho phép ±2 nm. Phổ MS: sử dụng

bộ phận ion hóa mẫu kiểu phun điện tử (ESI) và chọn chế độ ES+,

thế áp dụng 70eV. Phổ 1H, 13C-NMR: được đo trên máy có tần số từ 500 MHz,

xác định độ dịch chuyển hóa học của các C và H.

2.3. Tạp chất: Thực hiện theo phần định lượng

2.4. Định lượng:

Chuẩn bị mẫu thử: Pha dung dịch thử 200 ppm trong pha động, Lọc qua màng lọc

0,45 µm, dịch lọc được tiêm vào hệ thống HPLC

Chuẩn bị mẫu trắng: giống như mẫu thử nhưng không có neferin.

Điều kiện sắc ký thích hợp: Cột sắc ký pha đảo Phenomenex Gemini C8 (150 x 4,6

mm; 5 µm); pha động: ACN-Triethylamin 0,1% (60:40, tt/tt); bước sóng phát hiện

285 nm; tốc độ dòng: 0,8 ml/phút; Thể tích tiêm mẫu: 15 µl; nhiệt độ cột: 30 oC;

Thời gian sắc ký: 20 phút.

Kiểm tra tính tương thích hệ thống: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu thử. Phép thử chỉ có

giá trị khi RSD của các thông số sắc ký (tR, S, As, Rs, k’, N) của pic chính trong

mẫu thử phải không quá 2%, trong đó As phải nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và Rs và

pic phụ (nếu có) phải lớn hơn 1,5.

Tiến hành xác định % độ tinh khiết của pic chính và % tạp chất: Tiêm vào hệ thống

dung dịch mẫu thử, diện tích của pic liensinin phải lớn hơn 95% và các pic phụ có

tổng diện tích pic phải dưới 5% so với tổng diện tích pic trên SKĐ.

PL-76

3. Bảo quản: đóng trong lọ thủy tinh màu nâu. Nhiệt độ từ 2-8 oC.

TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

Có hiệu lực từ:

Khoa Dược Đại học Y- Dược Tp, HCM Bộ môn HPT-KN

Nguyên liệu QUERCETIN 3-O-β-D-GlcA (C21H18O13)

Ban hành theo quyết định số: 06 ngày 15 tháng 03 năm 2014

4. Yêu cầu kỹ thuật

Danh pháp quốc tế: (2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-(3,4-Dihydroxyphenyl)

-5,7- dihydroxy-4-oxochromen-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid.

CTPT: C21H18O13, M= 478,36. Quercetin 3-O-β-D-glucuronid được phân lập từ cao

flavonoid lá Sen (Nelumbo nucifera Gaertn, Nelumbonaceae) phải chứa trên 95%

(C21H18O12) tính trên nguyên trạng,

a. Tính chất: Dạng bột vô định hình, màu vàng nhạt, Tan tốt trong mrthanol, kém

tan trong cloroform, ethyl acetat.

b. Định tính: có thể chọn một trong các nhóm định tính sau

Nhóm I: Phổ hồng ngoại. Phổ hồng ngoại của quercetin 3-O-β-D-GlcA phải có

các dao động đặc trưng theo cấu trúc hóa học của quercetin 3-O-β-D-GlcA.

Nhóm II: Nhiệt độ nóng chảy và năng suất quay cực. Điểm nóng chảy của quercetin

24 3-O-D-GlcA là 146-147 oC và 𝛼𝐷 Nhóm III: phổ UV, MS và 1H, 13C-NMR. Phổ UV trong dung môi methanol của

= +9 o (c= 0,5%; EtOH)

quercetin 3-O-β-D-GlcA phải có ba cực đại ở các bước sóng 359, 257, 210 nm.

Phổ ESI-MS (-) của quercetin 3-O-β-D-GlcA phải có mảnh m/z = 477,36 [M-H]- và

m/z = 501,22 [M+ Na]+. Phổ 13C và 1H-NMR: Độ dịch chuyển hóa học các

carbon và hydro của quercetin 3-O-β-D-GlcA được trình bày trong ở Bảng 3.38.

c. Tạp chất: Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Trên sắc ký đồ của

dung dịch mẫu thử trong phần định lượng, ngoài pic quercetin 3-O-β-D-GlcA

PL-77

thì tổng diện tích các pic phụ phải dưới 5% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ.

1.4. Định lượng: Xác định độ tinh khiết sắc ký bằng HPLC. Diện tích pic nuciferin

phải trên 95% so với tổng diện tích các pic trên SKĐ tính trên nguyên trạng.

2. Phương pháp thử

2.1. Tính chất: bằng cảm quan mẫu thử phải đạt các yêu cầu đã nêu

2.2. Định tính:

a. Phổ hồng ngoại: Xác định các dao động đặc trưng trên phổ hồng ngoại.

b. Điểm chảy: thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.7. Năng suất quay cực

thực hiện theo hướng dẫn DĐVN4- Phụ lục 6.4.

c. Phổ UV: mẫu thử được pha trong MeOH và quét phổ ở thang sóng 200-400 nm.

Xác định các bước sóng cực đại với sai số cho phép ±2 nm. Phổ MS: sử dụng

bộ phận ion hóa mẫu kiểu phun điện tử (ESI) và chọn chế độ ES+,

thế áp dụng 70eV. Phổ 1H, 13C-NMR: được đo trên máy có tần số từ 500 MHz,

xác định độ dịch chuyển hóa học của các C và H.

2.3. Tạp chất: Thực hiện theo phần định lượng

2.4. Định lượng:

Chuẩn bị mẫu thử: Pha dung dịch thử 200 ppm trong pha động, Lọc qua màng lọc

0,45 µm, dịch lọc được tiêm vào hệ thống HPLC

Chuẩn bị mẫu trắng: giống như mẫu thử nhưng không có quercetin 3-O-β-D-GlcA.

Điều kiện sắc ký thích hợp: Cột sắc ký pha đảo Phenomenex Gemini C8 (150 x 4,6

mm; 5 µm); pha động: ACN-acid formic 0,1% (20:80, tt/tt); bước sóng phát hiện 254

nm; tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm mẫu: 10 µl; nhiệt độ cột: 30 oC;

Thời gian sắc ký: 20 phút.

Kiểm tra tính tương thích hệ thống: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu thử. Phép thử chỉ có

giá trị khi RSD của các thông số sắc ký (tR, S, As, Rs, k’, N) của pic chính trong

mẫu thử phải không quá 2%, trong đó As phải nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và Rs và

pic phụ (nếu có) phải lớn hơn 1,5.

Tiến hành xác định % độ tinh khiết của pic chính và % tạp chất: Tiêm vào hệ thống

dung dịch mẫu thử, diện tích của pic liensinin phải lớn hơn 95% và các pic phụ có

tổng diện tích pic phải dưới 5% so với tổng diện tích pic trên SKĐ.

PL-78

3. Bảo quản: đóng trong lọ thủy tinh màu nâu. Nhiệt độ từ 2-8 oC.

PHỤ LỤC 4. ĐẶC TÍNH ĐIỂM CHỈ VÀ QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC

ALAKLOID, FLAVONID TRONG LÁ, TÂM SEN

PL- 4.1. Điện di đồ minh họa sự chiết kiệt đồng thời 07 alkaloid (1: caaverin,

2: isoliensinin, 3: armepavin, 4: nor-armepavin, 5: nuciferin, 6: 2-O-nornuciferin,

7: pronuciferin) có trong mẫu nguyên liệu lá Sen (NN-1a) bằng phương pháp

CE-PDA/MS.

PL- 4.2. Kết quả độ lệch chuẩn tương đối (%) qua sáu lần tiêm liên tiếp mẫu nguyên

liệu lá Sen (NN-1a) qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong lá sen bằng

Alkaloid

phương pháp CE-PDA/MS.

Thông số

Diện tích pic hiệu chỉnh*

Thời gian dịch chuyển (tM) Độ phân giải (RS)

TB RSD (%) TB RSD (%) TB RSD (%)

1 39,6 0,43 10,6 1,22 1,75 2,01

2 74,6 0,87 10,9 1,34 1,80 1,43

3 83,5 1,41 11,4 1,14 3,15 1,64

4 74,6 1,75 11,7 1,59 1,63 1,98

5 228,7 0,98 12,3 1,79 3,45 2,03

6 92,4 1,04 12,6 0,76 1,65 0,97

7 43,9 1,56 15,0 1,82 7,92 0,75

* Tỉ lệ giữa diện tích đỉnh và thời gian dịch chuyển.

PL- 4.3. Điện di đồ minh họa sự chiết kiệt 08 flavonoid (1: catechin, 2: isorhamnetin,

3: kaempferol, 4: rutin, 5: isoquercitrin, 6: hyperoside, 7: quercetin, 8: quercetin

3-O-β-D-GlcA) có trong mẫu nguyên liệu lá Sen (NN-1a)

PL-79

bằng phương pháp CE-PDA.

PL- 4.4. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic catechin, qui trình phân tích đồng thời 08

flavonoid trong mẫu thử lá Sen (NN-1a) bằng phương pháp CZE-PDA.

PL- 4.5. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian,

độ đúng qui trình phân tích đồng thời 08 flavonoid trong mẫu nguyên liệu lá Sen

PL-80

(NN-1a) bằng phương pháp CZE-PDA.

a Độ lệch trong vòng một ngày dựa trên diện tích pic tính theo (n=5).

b Độ lệch trong vòng một ngày dựa trên diện tích pic tính theo (n=3).

PL- 4.6. SKĐ minh họa sự chiết kiệt 04 alkaloid (1: nuciferin, 2: 2-O-nornuciferin,

3: pronuciferin, 4: isoliensinin) có trong mẫu nguyên liệu lá Sen (NN-1a)

bằng phương pháp HPLC-PDA.

PL- 4.7. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD và

LOQ qui trình phân tích đồng thời 04 alkaloid mẫu thử lá Sen (NN-1a) bằng

PL-81

phương pháp HPLC-PDA.

Alkaloid

Yêu cầu thẩm định

Phương trình hồi qui

Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính (µg mL-1) LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1) Độ chính xác trong ngày (n=6) Độ chính xác liên ngày (n=3) Độ đúng* (n=9)

1 y= 40778x 0,9997 6,1-40 0,095 0,37 2,84 1,64 102,6

2 y= 35873x 0,9998 3,1-200 0,25 0,83 2,74 3,12 98,3

3 y= 28864x 0,9998 12,2-580 0,13 0,45 5,38 2,25 97,23

4 y= 40057x 0,9995 5,7-368 0,10 0,33 7,19 1,67 106,17

PL- 4.8. SKĐ minh họa sự chiết kiệt 06 flavonoid (1: catechin, 2: quercetin 3-O-β-

D-GlcA, 3: rutin, 4: quercetin, 5: kaempferol, 6: isorhamnetin) có trong

mẫu nguyên liệu lá Sen (NN-1a) bằng HPLC-PDA.

PL- 4.9. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic quercetin-3-O-β-D-GlcA, qui trình phân

tích đồng thời 06 flavonoid trong mẫu nguyên liệu lá Sen (NN-1a)

(c)

(b)

(a)

bằng phương pháp CZE-PDA.

Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn (a), mẫu dịch chiết flavonoid lá sen (b), mẫu thử

PL-82

thêm chuẩn (c).

(3)

(2)

(1)

Phổ UV-vis của LF-3 (quercetin 3-O-β-D-GlcA): (1) phổ chuẩn, (2) phổ mẫu thử,

(3) phổ mẫu thử thêm chuẩn và kiểm tra độ tinh khiết pic.

PL- 4.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD

và LOQ qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid có trong mẫu nguyên liệu lá Sen

(NN-1a) bằng phương pháp HPLC-PDA (NN-1a) (n = 6).

Yêu cầu thẩm định

Phương trình hồi qui

Hệ số tương quan

Khoảng tuyến tính (µg mL-1)

1 y= 1,91x + 4,12 0,9996 6,3- 400 LOD (µg mL-1) 3,2 LOQ (µg mL-1) 10,7 Độ chính xác trong ngày (n=6) 2,18 Độ chính xác liên ngày (n=3) 1,46 97,8 Độ đúng* (n=9)

2 y= 1,78x + 8,43 0,9997 9,3- 1200 2,4 7,8 1,64 1,58 98,5

3 y= 1,27x + 3,96 0,9995 12,6- 400 6,1 20,3 3,19 2,66 103,3

4 y= 0,53x +1,86 0,9994 6,3- 400 3,2 10,7 2,65 3,17 102,6

5 y= 1,42x +5,25 0,9995 9,3- 300 4,7 15,7 3,28 3,74 103,7

6 y= 1,04x +3,24 0,9993 9,3- 300 4,7 15,7 3,83 3,13 97,4

isoliensinin, 4: nor-armepavin, 5: armepavin, 6: nuciferin, 7: isoliensinin N2’-oxid,

PL- 4.11. Điện di đồ minh họa sự chiết kiệt 09 alkaloid (1: neferin, 2: liensinin, 3:

8: isoliensinin N2’-oxid, 9: pronuciferin) có trong mẫu nguyên liệu tâm Sen (NE-1a)

PL-83

bằng phương pháp CE-PDA/MS.

PL- 4.12. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic isoliensinin N2-oxid trong qui trình

phân tích đồng thời 09 alkaloid có trong mẫu nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) bằng

phương pháp CZE-PDA-MS.

PL- 4.13. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD

và LOQ qui trình phân tích đồng thời 09 alkaloid có trong mẫu thử tâm Sen (NN-1a)

bằng phương pháp CE-PDA/MS (n = 6).

Yêu cầu thẩm định Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính (µg mL-1) LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1) Độ chính xác trong ngày (n=5) Độ chính xác liên ngày (n=3) Độ đúng* (n=9)

Alkaloid (1→ 9) 0,9992 → 0,9998 2,50 → 655,0 1,25 → 4,30 4,16 → 14,32 0,98 → 3,05 1,25 → 2,45 98,3 → 103,5

PL- 4.14. Điện di đồ minh họa sự chiết kiệt 06 flavonoid (1: isorhamnetin,

2: calycosin; 3: quercetin 3-O-β-D-glucuronid; 4: scutellarein 7-O-β-D-glucuronid

metyl ester; 5: vitexin; 6: quercitrin) có trong mẫu nguyên liệu tâm Sen (NE-1a)

PL-84

bằng phương pháp CE-PDA.

PL- 4.15. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic calycosin (2) trong qui trình phân tích

đồng thời 06 flavonoid có trong mẫu nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) bằng phương pháp

CZE-PDA.

PL- 4.16. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng,

LOD và LOQ qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid trong mẫu nguyên liệu

tâm Sen (NE-1a) bằng phương pháp CE-PDA (n = 6).

Yêu cầu thẩm định Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính (µg mL-1) LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1) Độ chính xác trong ngày (n=5) Độ chính xác liên ngày (n=3) Độ đúng* (n=9)

Flavonoid (1→ 6) 0,9990 → 0,9998 25,00 → 75,00 6,25 → 15,75 19,00 → 49,20 1,38 → 3,18 1,63 → 3,42 97,70 → 104,20

PL-85

PL- 4.17. SKĐ minh họa sự chiết kiệt 07 alkaloid (1: isoliensinin N2’-oxid,

2: isoliensinin N2-oxid, 3: neferin, 4: liensinin, 5: isoliensinin, 6: armepavin,

7: nuciferin) có trong mẫu thử nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) bằng phương pháp

HPLC-PDA.

PL- 4.18. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic isoliensinin (5) trong qui trình phân tích

đồng thời 07 alkaloid có trong mẫu thử nguyên liệu tâm Sen (NE-1a)

(3)

(2)

(1)

bằng phương pháp HPLC-PDA.

(1) phổ UV của chuẩn isoliensinin, (2) phổ mẫu thử, (3) phổ mẫu thử thêm chuẩn và

kiểm tra độ tinh khiết pic isoliensinin.

Sắc ký đồ mẫu pha động, dung môi pha mẫu, mẫu hỗn hợp chuẩn, mẫu thử,

PL-86

mẫu thử thêm chuẩn (e).

PL- 4.19. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD

và LOQ qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong tâm Sen bằng phương pháp

HPLC-PDA (NN-1a) (n = 6).

Yêu cầu thẩm định Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính (µg mL-1) LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1) Độ chính xác trong ngày (n=5) Độ chính xác liên ngày (n=3) Độ đúng* (n=9)

Alkaloid (1→ 7 ) 0,9994 → 0,9997 3,125 → 1000 1,56 → 9,75 10,40 → 32,46 1,72 → 4,05 1,58 → 3,31 97,0 → 103,8

PL- 4.20. SKĐ minh họa sự chiết kiệt 06 flavonoid (1: quercitrin, 2: vitexin,

3: scutellarein 7-O-β-D-glcA methyl ester, 4: quercetin 3-O-β-D-glcA, 5: calycosin,

6: isorhamnetin) có trong mẫu nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) bằng phương pháp

HPLC-PDA.

PL- 4.21. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ chính xác trung gian, độ đúng, LOD

và LOQ qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid trong tâm Sen bằng phương pháp

HPLC-PDA (NE-1a) (n = 6).

Yêu cầu thẩm định Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính (µg mL-1) LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1) Độ chính xác trong ngày (n=5) Độ chính xác liên ngày (n=3) Độ đúng* (n=9)

Flavonoid (1→ 6 ) 0,9995 → 0,9999 6,25 → 800 3,125 → 12,5 10,40 → 41,63 1,56 → 3,82 1,79 → 3,56 97,3 → 104,5

PL-87

PL- 4.22. ĐDĐ phân tích đồng thời 07 alkaloid (1: caaverin, 2: isoliensinin,

3: armepavin, 4: norarmepavin, 5: nuciferin, 6: 2-O-nornuciferin, 7: pronuciferin) có trong

ba mẫu nguyên liệu lá Sen: LS-10 (NN-2a), LS-2 (NN-2a), LS-13 (NN-3a)

đại diện cho ba vùng thu hái khác nhau vào mùa Sen (07.2011)

bằng phương pháp CE-PDA.

PL- 4.23. ĐDĐ phân tích đồng thời 07 alkaloid (1: caaverin, 2: isoliensinin,

3: armepavin, 4: norarmepavin, 5: nuciferin, 6: 2-O-nornuciferin, 7: pronuciferin) có trong

mẫu nguyên liệu lá Sen: LS-1 (NN-1a) mùa Sen (07.2011) và LS-1 (NN-1b)

PL-88

nghịch mùa Sen (10.2012) bằng phương pháp CE-PDA.

PL- 4.24. ĐDĐ phân tích đồng thời 07 alkaloid (1: caaverin, 2: isoliensinin,

3: armepavin, 4: norarmepavin, 5: nuciferin, 6: 2-O-nornuciferin, 7: pronuciferin) có trong

PL-89

mẫu nguyên liệu lá Sen: LS-10 (NN-1a) mùa Sen bằng phương pháp CE-MS.

PL- 4.25. ĐDĐ phân tích đồng thời 07 alkaloid (1: caaverin, 2: isoliensinin,

3: armepavin, 4: norarmepavin, 5: nuciferin, 6: 2-O-nornuciferin, 7: pronuciferin) có trong

hai mẫu chế phẩm M-6 và M-9 bằng phương pháp CE-PDA.

PL- 4.26. ĐDĐ phân tích đồng thời 08 flavonoid (1: catechin, 2: isorhamnetin,

3: kaempferol, 4: rutin, 5: isoquercitrin, 6: hyperin, 7: quercetin, 8: quercetin 3-O-β-

D-GlcA) có trong 04 mẫu nguyên liệu lá Sen: LS-1 (NN-1a), LS-6 (NN-1a),

LS-11 (NN-2a) và LS-13 (NN-1a) đại diện cho ba vùng thu hái khác nhau

PL-90

vào mùa Sen (07.2011) bằng phương pháp CE-PDA.

PL- 4.27. ĐDĐ phân tích đồng thời 08 flavonoid (1: catechin, 2: isorhamnetin,

3: kaempferol, 4: rutin, 5: isoquercitrin, 6: hyperin, 7: quercetin, 8: quercetin 3-O-β-

D-GlcA) có trong 02 mẫu nguyên liệu lá Sen: LS-3, LS-4 (NN-1a,b) thu hái vào

mùa Sen (07.2011) và nghịch mùa Sen (10.2012) bằng phương pháp CE-PDA

PL- 4.28. Kết quả xác định hàm lượng các alkaloid (mg/100mg) có trong mẫu nguyên

liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) bằng phương pháp CE-PDA/MS và

HPLC-PDA.

Alkaloid

NE-2b

Mẫu tâm Sen loài N, Nucifera NE-1a 0,40 (1,29)

NE-1b 0,39 (1,26)

NE-2a 0,37 (1,25) 0,32 (2,01)

NE-3b 0,4 (1,05)

NE-3a 0,41(2,16)

neferin

liensinin

isoliensinin

HPLC CE HPLC CE HPLC

armepavin

nuciferin

norarmepavin CE CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE

isoliensinin N2’- oxyd isoliensinin N2- oxyd pronuciferin

0,37 (1,05) 0,21 (1,45) 0,20 (1,02) 0,51 (2,05) 0,52 (1,32) 0,14 (0,52) 0,17 (1,45) 0,16 (1,26) 0,07 (2,04) 0,05 (1,56) 0,09 (1,13) 0,10 (0,65) 0,15 (2,12) 0,15 (0,93) 0,07 (2,14)

0,28 (0,72) 0,17 (2,14) 0,17 (1,13) 0,47 (0,78) 0,46 (056) 0,08 (1,36) 0,15 (2,14) 0,12 (1,05) 0,05 (1,87) 0,03 (1,02) 0,06 (2,57) 0,06 (1,59) 0,10 (2,25) 0,08 (1,07) 0,05 (1,28)

0,29 (0,43) 0,18 (1,34) 0,17 (1,09) 0,40 (1,39) 0,43 (2,31) 0,11 (0,56) 0,25 (1,34) 0,22 (0,75) 0,05 (2,41) 0,03 (1,12) 0,09 (1,45) 0,10 (1,03) 0,11 (2,46) 0,12(1,34) 0,04 (3,21)

0,21 (1,01) 0,15 (1,45) 0,14 (1,03) 0,32 (0,57) 0,40 (3,14) 0,07 (1,89) 0,22 (1,45) 0,18 (0,89) 0,03 (2,23) 0,01 (1,17) 0,07 (1,70) 0,05 (1,05) 0,09 (3,21) 0,05 (1,87) 0,00

0,39 (1,14) 0,16 (2,25) 0,17 (1,18) 0,42 (2,15) 0,40 (1,26) 0,10 (1,98) 0,20 (2,25) 0,18 (1,35) 0,05 (1,65) 0,03 (1,09) 0,12 (1,56) 0,13 (1,21) 0,10(1,21) 0,08(1,03) 0,08 (3,12)

0,32 (0,87) 0,13 (1,42) 0,15 (1,04) 0,40 (1,64) 0,36 (1,07) 0,06 (1,67) 0,17 (1,42) 0,13 (0,81) 0,00 (2,41) 0,00 (1,32) 0,08 (1,51) 0,06 (1,35) 0,06 (1,45) 0,07(0,56) 0,04(2,13)

NE1,2,3: Nguyên liệu tâm Sen thu hái ở miền Nam, Trung và miền Bắc Việt Nam, theo thứ tự.

a: Thu hái vào mùa sen tháng 07/2011; b: thu hái nghịch mùa sen tháng 12/2010

PL-91

PL- 4.29. Kết quả xác định hàm lượng của các alkaloid (mg/100mg) có trong 05 mẫu

chế phẩm bào chế từ tâm Sen (Nelumbo nucifera) bằng phương pháp CE-PDA/MS

và HPLC-PDA.

Mẫu bào chế từ lá Sen

Alkaloid

neferin

liensinin

isoliensinin

norarmepavin armepavin

nuciferin

isoliensinin N2’ -oxid isoliensinin N2-oxid

pronuciferin

CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE CE CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC

M-1 0,11 (2,42) 0,09 (2,07) 0,11 (2,41) 0,10 (1,67) 0,11 (2,13) 0,10 (1,25) - - - - - - - - - -

M-2 0,13 (2,36) 0,14 (1,75) 0,13 (1,98) 0,11 (0,83) 0,18 (1,83) 0,15 (0,79) - - - - - - - - - -

M-3 0,21 (1,93) 0,23 (2,51) 0,17 (2,05) 0,15 (1,34) 0,25 (2,34) 0,28 (1,13) 0,06 (2,54) 0,09 (2,22) 0,05 (2,18) 0,07 (1,87) - - 0,05 (2,09) 0,06 (1,25) 0,04 (1,86) 0,05 (0,94)

M-4 - - - - 0,00 (2,67) 0,00 (1,62) - - - - - - - - - -

M-5 - - - - 0,08 (1,88) 0,10 (0,72) - - - - - - - - - -

PL- 4.30. Kết quả xác định hàm lượng các flavonoid (mg/100mg) có trong mẫu

nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) bằng phương pháp CE-PDA và HPLC-PDA.

Mẫu lá Sen loài N, Nucifera

Flavonoid

NE-1b 0,10 (1,86)

NE-2a 0,11 (1,67)

NE-2b 0,07 (1,79)

NE-3a 0,09 (2,34)

NE-3b 0,08 (2,08)

NE-1a 0,12 (2,32)

calycosin

HPLC

0,11 (1,22)

0,10 (0,43)

0,08 (1,01)

0,07 (1,25)

0,09 (0,98)

0,11 (1,23)

0,06 (2,06)

0,07 (1,26)

0,04 (1,72)

0,00 (1,87)

0,08 (2,15)

isorhamnetin

HPLC

0,04 (1,06)

0,05 (1,54)

0,00 (1,22)

0,00 (1,06)

0,07 (1,85)

vitexin

scutellarein- 7-O-β-D-GlcA

quercitrin

0,34 (2,22) 0,36 (1,38) 0,19 (1,92) 0,17 (1,07) 0,20 (2,23) 0,19 (1,35) 0,23 (2,12) 0,22 (1,34)

0,25 (0,78) 0,24 (0,69) 0,11 (1,89) 0,14 (1,18) 0,14 (1,98) 0,16 (1,02) 0,18 (1,97) 0,17 (1,08)

0,38 (2,39) 0,37 (1,57) 0,16 (2,56) 0,13 (1,39) 0,15 (2,32) 0,15 (1,24) 0,17 (2,32) 0,17 (1,23)

0,27 (2,57) 0,28 (1,14) 0,12 (1,89) 0,09 (1,45) 0,08 (2,13) 0,09 (1,09) 0,10 (2,14) 0,09 (1,19)

0,31 (2,15) 0,30 (1,26) 0,17 (2,05) 0,15 (1,21) 0,23 (1,65) 0,24 (1,09) 0,20 (1,65) 0,19 (1,09)

0,22 (1,85) 0,21 (1,08) 0,10 (2,17) 0,13 (1,53) 0,16 (2,44) 0,17 (1,25) 0,12 (2,04) 0,10 (1,52)

CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC

quercetin- 3-O-β-D-GlcA

PL-92

PL- 4.31. Kết quả xác định hàm lượng của các flavonoid (mg/100mg) có trong 05

mẫu chế phẩm bào chế từ tâm Sen (Nelumbo nucifera) bằng phương pháp CE-PDA

và HPLC-PDA.

Alkaloid

calycosin

isorhamnetin

Mẫu bào chế từ lá Sen M-3 0,10 (1,97) 0,08 (1,28) 0,04 (2,05) -

M-2 - - - -

CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC

M-1 - - - - 0,07 (1,83) 0,08 (0,79) 0,06 (2,09) 0,07 (1,07) - - - -

0,12 (1,83) 0,19 (2,06) 0,11 (0,79) 0,17 (1,35) 0,09 (1,77) 0,15 (2,42) 0,08 (1,04) 0,17 (1,65) 0,10 (2,23) 0,17 (1,89) 0,08 (0,88) 0,16 (1,24) 0,10 (2,08) 0,13 (2,27) 0,08 (1,06) 0,11 (1,45)

M-4 - - - - - - - - - - - -

M-5 - - - - - - - - - - - -

vitexin scutellarein- 7-O-β-D-GlcA quercitrin quercetin- 3-O-β-D-GlcA

PL-93