Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Balanophora J.R. & G.forst. ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,

THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG

KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ LOÀI

THUỘC CHI Balanophora J.R.&G.FORST.

Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,

THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG

KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ LOÀI

THUỘC CHI Balanophora J.R.&G.FORST.

Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 62.72.04.06

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Viết Thân

2. TS. Nguyễn Quốc Bình

HÀ NỘI, NĂM 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng

dẫn của PGS.TS. Nguyễn Viết Thân và TS. Nguyễn Quốc Bình. Các số liệu, kết

quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ

công trình nghiên cứu nào của các tác giả khác.

Tác giả

Nguyễn Thanh Tùng

Mục lục

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3

1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Balanophora

J.R.&G.Forst. ...................................................................................................... 3

1.1.1. Vị trí phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst. .................................... 3

1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Balanophora J.R.&G.Forst. ............................... 4

1.1.3. Các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G. Forst. và phân bố ................. 5

1.1.4. Một số khóa phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst. ...................... 11

1.2. Tổng quan các nghiên cứu về thành phần hóa học chi Balanophora

J.R.&G.Forst. .................................................................................................... 15

1.2.1. Các tanin thủy phân được ..................................................................... 15

1.2.2. Các acid hydroxybenzoic và dẫn chất .................................................. 19

1.2.3. Các Phenylpropanoid đơn giản ............................................................ 20

1.2.4. Các hợp chất lignan .............................................................................. 24

1.2.5. Các coumarin ........................................................................................ 27

1.2.6. Các flavonoid ........................................................................................ 28

1.2.7. Các terpenoid ........................................................................................ 30

1.2.8. Các steroid ............................................................................................ 32

1.2.9. Các nhóm hợp chất khác ...................................................................... 33

1.3. Tổng quan về công dụng, tác dụng sinh học chi Balanophora J.R.&G.Forst.

........................................................................................................................... 33

1.3.1. Công dụng của các loài thuộc chi Balanophora .................................. 33

1.3.2. Nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học chi Balanophora ......... 34

1.3.3. Nghiên cứu tại Việt Nam về tác dụng sinh học chi Balanophora ........ 40

1.4. Tổng quan về một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm thường dùng

và một số mô hình liên quan ............................................................................. 42

1.4.1. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm in vitro ................... 42

1.4.2. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm in vivo .................... 43

1.4.2.1. Các mô hình gây viêm cấp và bán cấp .............................................. 44

1.4.2.2. Một số mô hình gây viêm mạn tính .................................................... 45

1.4.3. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin

oxidase ............................................................................................................. 46

1.4.3.1. Một số mô hình in vitro ...................................................................... 47

1.4.3.2. Một số mô hình in vivo ...................................................................... 47

Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU ....................................................................................................... 48

2.1. Nguyên vật liệu ......................................................................................... 48

2.1.1. Mẫu nghiên cứu .................................................................................... 48

2.1.1.1. Nguyên liệu cho nội dung nghiên cứu về hóa học ............................. 48

2.1.1.2. Nguyên liệu cho nội dung nghiên cứu về tác dụng sinh học và độc

tính ................................................................................................................... 49

2.1.2. Hóa chất, dung môi............................................................................... 50

2.1.3. Động vật thí nghiệm ............................................................................. 51

2.2. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 51

2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 53

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu thực vật ........................................................ 53

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học..................................... 54

2.3.2.1. Định tính các nhóm chất trong các loài nghiên cứu ......................... 54

2.3.2.2. Phân lập hợp chất từ các loài nghiên cứu ......................................... 54

2.3.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất được phân lập ................. 55

2.3.2.4. Triển khai sắc ký lớp mỏng một số loài nghiên cứu .......................... 55

2.3.2.5. Phân tích thành phần hóa học sử dụng sắc ký lỏng kết nối khối

phổ .................................................................................................................... 56

2.3.2.6. Phân tích thành phần triterpenoid trong phân đoạn n-hexan của các

loài nghiên cứu sử dụng sắc ký khí kết nối khối phổ ....................................... 56

2.3.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần ................ 56

2.3.3. Phương pháp đánh giá một số tác dụng in vitro .................................. 58

2.3.3.1. Phương pháp đánh giá tác dụng kháng viêm thông qua ức chế sản

sinh NO ............................................................................................................ 59

2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym xanthin oxidase in

vitro .................................................................................................................. 60

2.3.4. Phương pháp đánh giá tác dụng sinh học in vivo ................................ 61

2.3.4.1. Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng

cấp acid uric bằng kali oxonat ........................................................................ 61

2.3.4.2. Đánh giá tác dụng kháng viêm cấp trên mô hình gây phù bằng

carrageenan ..................................................................................................... 63

2.3.4.3. Phương pháp đánh giá tác dụng kháng viêm trên mô hình gây viêm

màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat ........................................... 65

2.3.4.4. Đánh giá độc tính cấp ....................................................................... 67

2.4. Xử lý số liệu .............................................................................................. 68

2.5. Địa điểm thực hiện .................................................................................... 69

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 70

3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật ................................................................ 70

3.1.1. Kết quả nghiên cứu về hình thái thực vật và xác định tên khoa học các

mẫu nghiên cứu ................................................................................................ 70

3.1.1.1. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BFI .................... 70

3.1.1.2. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BFG ................... 72

3.1.1.3. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BS ...................... 74

3.1.1.4. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BT ...................... 76

3.1.2. Kết quả nghiên cứu về hình thái hạt phấn các loài nghiên cứu ........... 78

3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học ................................................................. 85

3.2.1. Định tính các nhóm chất ....................................................................... 85

3.2.2. Kết quả phân lập các hợp chất từ một số loài nghiên cứu ................... 87

3.2.2.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ Dó đất (Balanophora

fungosa subsp. indica) ..................................................................................... 87

3.2.2.2. Kết quả chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Dó đất sần

(Balanophora fungosa var. globosa) ............................................................... 93

3.2.2.3. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Balanophora

tobiracola ......................................................................................................... 87

3.2.2.4. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Balanophora

subcupularis ................................................................................................... 103

3.2.3. Kết quả phân tích sử dụng sắc ký lỏng kết nối khối phổ .................... 105

3.2.5. Kết quả phân tích sử dụng sắc ký khí ghép nối khối phổ ................... 121

3.3. Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học ............................................... 125

3.3.1. Kết quả sàng lọc một số tác dụng in vitro của cắn methanol các loài

nghiên cứu ...................................................................................................... 125

3.3.1.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxid của cắn

methanol các loài nghiên cứu ........................................................................ 125

3.3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cắn

methanol các loài nghiên cứu ........................................................................ 127

3.3.2. Kết quả đánh giá một số tác dụng trên in vivo cao chiết Dó đất ....... 129

3.3.2.1. Tác dụng hạ acid uric huyết thanh .................................................. 129

3.3.2.2. Tác dụng kháng viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng

carrageenan ................................................................................................... 130

3.3.2.3. Tác dụng kháng viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp

gối bằng tinh thể natri urat ............................................................................ 131

3.3.3. Kết quả đánh giá độc tính cấp cao chiết Dó đất ................................ 132

3.3.3.1. Thử nghiệm thăm dò ........................................................................ 132

3.3.3.2. Thử nghiệm chính thức .................................................................... 133

Chương 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 135

4.1. Về kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật ............................................... 135

4.1.1. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học .................................... 135

4.1.2. Đặc điểm hiển vi ................................................................................. 138

4.2. Về kết quả nghiên cứu thành phần hóa học ............................................ 139

4.2.1. Kết quả định tính sơ bộ ....................................................................... 139

4.2.2. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất ...................................... 139

4.2.3. Sử dụng các phương pháp sắc ký trong nghiên cứu ........................... 140

4.2.3.1. Sắc ký lớp mỏng ............................................................................... 141

4.2.3.2. Sắc ký khí ......................................................................................... 142

4.2.3.3. Sắc ký lỏng kết nối khối phổ ............................................................ 145

4.3. Về kết quả đánh giá tác dụng sinh học và độc tính cấp ......................... 147

4.3.1. Về tác dụng sinh học của cao chiết dược liệu .................................... 147

4.3.2. Về độc tính cấp ................................................................................... 148

4.3.3. Về tác dụng sinh học của một số hợp chất được xác định trong các loài

nghiên cứu ...................................................................................................... 148

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 151

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ/ký Chữ đầy đủ, giải nghĩa hiệu viết tắt

AA Acid arachidonic

Angiosperm Phenology Group (Nhóm phát sinh chủng loài thực APG vật hạt kín)

Anisaldehyd – acid sulphuric (thuốc thử hiện màu dùng cho sắc AS ký lớp mỏng)

B. Balanophora (viết tắt tên chi)

CC Column chromatography (Sắc ký cột)

COX DPPH Cyclooxygenase 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium

DMSO Dimethylsulfosid

FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò)

Gas chromatography – Mass spectrometry (Sắc ký khí kết nối GC-MS khối phổ)

HHDP Hexahydroxydiphenoyl-

High performance Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng HPTLC hiệu năng cao)

High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng HPLC cao)

IC50 Inhibitation concentration at 50% (Nồng độ ức chế tối đa 50%)

KO Kali oxonat

LD50

LOD Lethal dose 50% (Liều gây chết trung bình) Limit of detection (giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of quantification (giới hạn định lượng)

5-lipooxygenase Lipopolysaccharid LOX LPS

Mass spectrometry (phổi khối lượng phân tử) MS

National Institute of Standard and Technology (Viện tiêu chuẩn NIST và công nghệ quốc gia - Hoa Kỳ)

NMR Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)

NO Nitric oxid

Natural products-polyethylene glycol reagent (thuốc thử sử dụng NP/PEG cho sắc ký lớp mỏng, tạo ra huỳnh quang sáng ở UV 365 nm)

Organization for Economic Cooperation and Development (Tổ OECD chức hợp tác và phát triển kinh tế)

Preparative Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng điều PTLC chế)

Retention factor (hệ số lưu giữ trong sắc ký lớp mỏng) Rf

RI rentention indices

SC50 Scavenging concentration at 50% (Nồng độ trung hoà được 50% gốc tự do)

SKĐ Sắc ký đồ

subsp./ssp. subspecies (phân loài/loài phụ)

subgen. subgenus (phân chi)

TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

Thực vật chí varietas (thứ) (tiếng latin) TVC var.

Vườn quốc gia VQG

xanthin oxidase XOD

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Tên bảng Trang Ký hiệu

Các loài thuộc chi Balanophora trên thế giới và khu vực Bảng 1.1 5 phân bố

Phân bố của các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam Bảng 1.2 10

Bảng 1.3 13

Danh sách các các loài thuộc chi Balanophora trong một số khóa phân loại Các hợp chất tanin thủy phân được phân lập từ chi Bảng 1.4 16 Balanophora

Các acid hydroxybenzoic và dẫn chất phân lập từ chi Bảng 1.5 20 Balanophora

Các phenylpropanoid đơn giản phân lập từ chi Bảng 1.6 21 Balanophora

Bảng 1.7 Các lignan phân lập từ chi Balanophora 24

27

Bảng 1.8 Các coumarin phân lập từ chi Balanophora Bảng 1.9 Các flavonoid phân lập từ chi Balanophora 28

30

Bảng 1.10 Các terpenoid phân lập từ chi Balanophora Bảng 1.11 Các steroid phân lập từ chi Balanophora 32

Tác dụng dọn gốc tự do DPPH của các loài thuộc chi Bảng 1.12 36 Balanophora

Bảng 1.13 Một số mô hình in vitro nghiên cứu tác dụng kháng viêm 42

Bảng 1.14 Các mô hình gây viêm cấp và bán cấp 44

Bảng 1.15 Một số mô hình gây viêm mạn tính 45

Bảng 1.16 Một số mô hình đánh giá tác dụng hạ acid uric in vivo 47

Khối lượng mẫu nghiên cứu và cắn toàn phần, cắn phân Bảng 2.1 49 đoạn dùng trong nghiên cứu

Thang điểm đánh giá mức độ viêm khớp dựa trên triệu Bảng 2.2 66 chứng

73

86

Bảng 3.3 111

Bảng 3.4 123 Bảng 3.1 Dữ liệu về hạt phấn các mẫu nghiên cứu Bảng 3.2 Kết quả định tính thành phần hóa học các mẫu nghiên cứu Các hợp chất được xác định trong phân đoạn ethyl acetat các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ Các hợp chất triterpenoid được xác định trong phân đoạn n-hexan của các mẫu nghiên cứu sử dụng GC-MS

Bảng 3.5 Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh NO của cắn 125 methanol các mẫu nghiên cứu

Bảng 3.6 Giá trị IC50 hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxid (NO) trên 126

Bảng 3.7 118

128 Bảng 3.8

tế bào RAW của các mẫu nghiên cứu Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cắn methanol các mẫu nghiên cứu Ảnh hưởng của cao chiết Dó đất đến nồng độ acid uric huyết thanh chuột trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat Ảnh hưởng của cao chiết Dó đất lên mức độ phù bàn chân

chuột trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng Bảng 3.9 129

carrageenan

Tác dụng kháng viêm của cao chiết Dó đất trên mô hình

Bảng 3.10 gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat 131

trên chuột cống trắng

Bảng 3.11 Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ 132

Tỉ lệ chết chuột nhắt trắng và giá trị LD50 của Cao chiết Dó Bảng 3.12 133 đất

Bảng 4.1 136

So sánh đặc điểm thực vật mẫu các loài thuộc chi Balanophora trong luận án Thống kê về việc phân lập các hợp chất từ các loài thuộc 139 Bảng 4.2 chi Balanophora

Thống kê kết quả phân lập 6 hợp chất triterpenoid Bảng 4.3 142 pentacyclic từ các loài thuộc chi Balanophora

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Ký hiệu Tên hình vẽ, đồ thị Trang

Cấu trúc hóa học các nhóm thế trong các tanin thủy phân Hình 1.1 16 được phân lập từ chi Balanophora

Một số acid hydroxybenzoic và dẫn chất phân lập từ chi Hình 1.2 19 Balanophora

Một số phenyl propanoid đơn giản phân lập từ chi Hình 1.3 21 Balanophora

Hình 1.4 Một số lignan phân lập từ chi Balanophora 25

Hình 1.5 Một số coumarin phân lập từ chi Balanophora 27

Khung cấu trúc các flavonoid phân lập từ chi Hình 1.6 30 Balanophora

Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế XOD in Hình 2.1 60 vitro

Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric máu Hình 2.2 62 trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat

Quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng kháng

Hình 2.3 viêm cấp in vivo trên mô hình gây phù bàn chân chuột 64

bằng carrageenan

Quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng kháng Hình 2.4 66 viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối

Sơ đồ tóm tắt các nội dung và phương pháp nghiên cứu

Hình 2.5 69 của luận án

Hình 3.1 71

Hình 3.2 71

Hình 3.3 73 Hình thái mẫu BFI (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen) Hình vẽ mẫu Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen Hình thái mẫu BFG (Balanophora fungosa var. globosa (Jungh.) B.Hansen)

Hình 3.4 74 Hình vẽ mẫu Balanophora fungosa var. globosa (Jungh.) B. Hansen

Hình 3.5 Hình thái mẫu BS (Balanophora subcupularis P.C. Tam) 75

Hình 3.6 Hình vẽ mẫu Balanophora subcupularis P.C.Tam 75

Hình 3.7 Hình thái mẫu BT (Balanophora tobiracola Makino) 77

Hình 3.8 Hình vẽ mẫu Balanophora tobiracola Makino 77

Hình 3.9 Hình thái hạt phấn các loài thuộc chi Balanophora 73

Hình 3.10 Vi phẫu “củ” mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) 80

Vi phẫu “củ” mẫu BFG (Balanophora fungosa var. 80 Hình 3.11 globosa)

Hình 3.12 Vi phẫu “củ” mẫu BS (B. subcupularis) 81

Hình 3.13 Vi phẫu “củ” mẫu BT (B. tobiracola) 81

Hình 3.14 Vi phẫu lá mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) 82

Vi phẫu lá mẫu BFG (Balanophora fungosa var. Hình 3.15 82 globosa)

Hình 3.16 Vi phẫu lá mẫu BS (B. subcupularis) Hình 3.17 Vi phẫu lá mẫu BT (B. tobiracola)

83 83 83 Hình 3.18 Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica)

Hình 3.19 Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BFG (B. fungosa var. 84 globosa)

Hình 3.20 Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BS (B. subcupularis) 85

Hình 3.21 Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BT (B. tobiracola) 85

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BFI (Balanophora 88 Hình 3.22 fungosa subsp. indica)

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BFG (Balanophora Hình 3.23 94 fungosa var. globosa)

Hình 3.24 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BT (B. tobiracola) 101

Hình 3.25 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BS (B. subcupularis) 103

Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn n-hexan của các Hình 3.26 116 loài nghiên cứu

Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các loài nghiên cứu triển khai

với hệ dung môi cloroform–toluen–methanol–amoniac

25 % (10:3:6:1) quan sát ở: a. λ = 254 nm, b. Ánh sáng 117 Hình 3.27

thường sau khi phun thuốc thử AS, c. λ = 366 nm sau khi

phun thuốc thử AS

Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các loài nghiên cứu triển khai

với hệ dung môi toluen – ethyl acetat – acid formic

Hình 3.28 (14:10:1) quan sát ở a. λ = 254 nm, b. λ = 366 nm sau khi 119

triển khai, c. λ = 366 nm sau khi hiện màu bằng thuốc

thử NP/PEG

Sắc ký đồ GC-MS phân đoạn n-hexan của các loài thuộc 122 Hình 3.29 chi Balanophora

Hình 4.1 Cơ chế phân mảnh một số mảnh ion đặc trưng của lupeol 143

Cơ chế phân mảnh một số mảnh ion đặc trưng của lupeol 143 Hình 4.2 acetat

ĐẶT VẤN ĐỀ

Họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) là một họ thực vật bậc cao với 16 chi,

khoảng hơn 40 loài cây thảo, sống ký sinh [132]. Ở Việt Nam có 2 chi bao gồm

chi Sơn dương (Rhopalocnemis Jungh.) với duy nhất một loài (R. phalloides

Jungh.) và chi Dó đất (Balanophora J.R. & G. Forst.) với 7 loài, 1 phân loài và 1

thứ [4], [12]. Ở Trung Quốc, các loài trong chi Balanophora đã được sử dụng làm

dược liệu từ hàng ngàn năm nay với các tác dụng chủ yếu như bổ thận, cầm máu,

điều trị viêm gan [137]. Ở Việt Nam, các loài thuộc chi Balanophora thường được

gọi với tên Dó đất, Nấm ngọc cẩu, hay Tỏa dương và cũng được sử dụng với mục

đích khác nhau [6].

Trong ba loài được ghi nhận sử dụng làm thuốc ở Việt Nam, Dó đất hoa

thưa (Balanophora laxiflora Hemsl.) là loài được tập trung nghiên cứu nhiều cả

về thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học, trong đó đáng chú ý là tác

dụng kháng viêm [1] được đánh giá trên các mô hình in vitro và in vivo. Phân

đoạn ethyl acetat và cao toàn phần loài B. laxiflora thể hiện tác dụng kháng viêm

in vivo trên các mô hình gây phù chân chuột và mô hình tạo u hạt ở cả 2 mức liều

150 mg/kg và 300 mg/kg. Một số hợp chất phân lập từ loài này cũng thể hiện tác

dụng kháng viêm in vitro đáng chú ý. Bên cạnh đó, loài B. laxiflora cũng thể hiện

tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase và hạ acid uric [2],[9]. Như đã biết, nồng

độ acid uric trong máu tăng cao thời gian dài có thể dẫn tới tình trạng kết tinh và

lắng đọng tinh thể urat tại khớp và gây ra bệnh gút cấp với triệu chứng điển hình

là viêm, sưng, nóng, đỏ, đau. Ngoài ra, theo các nghiên cứu trên thế giới, một số

loài cũng thể hiện tác dụng kháng viêm khá tốt như: B. spicata [32], B. polyandra

[52]. Như vậy, có thể thấy các loài thuộc chi Balanophora có tiềm năng kháng

viêm đáng chú ý, trong đó có cả khả năng ngăn chặn nguy cơ xảy ra viêm do bệnh

1

gút.

Kết hợp khảo sát ban đầu và tham khảo tài liệu cho thấy chi Balanophora ở

Việt Nam khá đa dạng về loài, dưới loài; có những loài chưa được ghi nhận ở Việt

Nam. Do những sự tương đồng nhất định về hình thái, thực tế thường có sự nhẫm

lẫn khi thu hái hoặc sử dụng trộn lẫn các loài thuộc chi Balanophora, bao gồm cả

các loài đã được ghi nhận dùng làm thuốc và các loài cùng chi khác. Do đó, cần

một nghiên cứu tương đối có tính hệ thống về đặc điểm thực vật, thành phần hoá

học cũng như một số tác dụng sinh học của các loài này để làm rõ hơn sự đa dạng

về loài, tiềm năng phát triển và sử dụng hợp lý. Đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm

thực vật, thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc

chi Balanophora J.R.&G. Forst. ở Việt Nam” là cần thiết.

Đề tài được tiến hành với các mục tiêu như sau:

1. Xác định chính xác tên khoa học, mô tả đặc điểm thực vật một số loài thuộc

chi Balanophora ở Việt Nam.

2. Nghiên cứu thành phần hóa học các loài thu được.

3. Đánh giá một số hoạt tính in vitro của cắn chiết các loài nghiên cứu và lựa chọn

một loài có hoạt tính tốt để đánh giá tác dụng kháng viêm, hạ acid uric.

Để thực hiện mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung:

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái một số loài thuộc chi Dó đất ở Việt Nam, giám

định tên khoa học các mẫu nghiên cứu. Nghiên cứu đặc điểm hiển vi bao gồm vi

phẫu củ, vi phẫu lá và đặc điểm bột, hình thái hạt phấn.

- Nghiên cứu thành phần hóa học các loài thu được: chiết xuất cao chiết tổng,

phân đoạn với các dung môi n-hexan và ethyl acetat. Nghiên cứu thành phần hóa

học của cao chiết tổng và các phân đoạn sử dụng các phương pháp: phân lập và

xác định cấu trúc, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng ghép nối khối phổ,

sắc ký khí kết nối khối phổ.

- Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh nitric oxid trên tế bào RAW264.7 và tác dụng

ức chế xanthin oxidase in vitro của cao chiết tổng. Trên cơ sở đó, lựa chọn một

2

loài có hoạt tính tốt để nghiên cứu trên các mô hình in vivo và độc tính cấp.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Balanophora

J.R.&G.Forst.

1.1.1. Vị trí phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst.

Chi Dó đất (Balanophora J.R. & G. Forst.) là một trong 16 chi của họ Dó

đất (Balanophoraceae Rich.) [73]. Với số lượng loài đã được ghi nhận là khoảng

21 loài, 1 phân loài và 3 thứ, đây là chi có số lượng loài lớn nhất trong họ Dó đất

(gồm khoảng 40 loài).

Đã có một số nghiên cứu phân loại họ Dó đất dựa trên cơ sở đặc điểm hình

thái đề cập đến vị trí phân loại của họ Dó đất. Trong đó, 2 công trình được nhiều

nhà nghiên cứu thực vật sử dụng là Flowering plants của Armen Takhtajan (2009)

[108] và The Families and Genena of Vascular Plants của K. Kubitzki (Vol. XII

- 2014) [73]. Theo đó, vị trí phân loại họ Dó đất như sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)

Liên bộ Dó đất (Balanophoranae)

Bộ Dó đất (Balanophorales)

Họ Dó đất (Balanophoraceae)

Trong khi đó, theo hệ thống phân loại APG IV (2016) của Nhóm phát sinh

chủng loài thực vật hạt kín (Angiosperm Phenology Group - APG), họ

Balanophoraceae Rich. được đặt trong bộ Đàn hương (Santalales), thuộc

Superasterids, Eudicots (Hai lá mầm), Angiosperms [30].

Do những bằng chứng mà hệ thống APG IV đưa ra chưa thuyết phục, chưa

xác định được chính xác vị trí của họ Dó đất trong bộ Đàn hương. Vì vậy, quan

điểm họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) thuộc bộ Dó đất (Balanophorales) theo

3

A. Takhtajan (2009) và K. Kubitzki (2014) là phù hợp cho việc xác định vị trí họ

Dó đất ở Việt Nam. Tuy nhiên cũng không phủ nhận mối quan hệ của họ này với

bộ Đàn hương (Santalales).

1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Balanophora J.R.&G.Forst.

a, Đặc điểm hình thái thực vật

Cây màu đỏ, nâu hoặc vàng đến trắng ngà, cao tới 30 cm, thường ký sinh

trên rễ của cây gỗ, thân rễ dạng củ, mặt ngoài sù sì, dạng hình gần cầu hoặc hình

trụ, thường phân nhánh; cuống cụm hoa mang lá; 2 – 20 lá, lá dạng vảy, mọc

vòng, đối, mọc cách, thành hai hàng hoặc hình xoắn ốc; phần lớn các loài có hoa

đơn tính khác gốc, một số ít là đơn tính cùng gốc, đài hoa tiêu giảm hoặc không

rõ. Hoa tập trung thành bông nạc, hình trứng hay hình cầu; ở những loài hoa đơn

tính cùng gốc, các hoa đực mọc lẫn với hoa cái hoặc mọc ở phía dưới hoặc trên

các hoa cái. Các hoa đực mọc đối xứng tỏa tia, ít khi đối xứng hai bên, đối diện

với những lá bắc ngắn, cụt bao hoa 3, 4-5 hoặc 6 (-14) thùy; bao phấn đối diện

với các thùy bao hoa, chỉ nhị dính với nhau (mà trong đó các bao phấn đã được

2-3 lá noãn hợp thành bầu thượng 1 ô, bầu hình thuôn hay hình thoi và một vòi nhụy

hợp nhất); hạt phấn hình gần cầu; hoa cái rất nhỏ, không có bao hoa, bộ nhuỵ gồm

thon dài. Quả bế 1 hạt [73].

b, Hình thái hạt phấn

Hạt phấn các loài thuộc chi Balanophora có kích thước nhỏ với kích thước

hạt phấn các loài dao động trong khoảng từ 10 – 25 µm.

Dựa trên cấu trúc hạt phấn, B. Hansen chia các loài thuộc chi Balanophora

thành 2 phân chi: 1) phân chi (subgen.) Balania gồm các loài có hạt phấn không

có rãnh lỗ: B. involucrata, B. harlandii, B. wrightii, 2) phân chi (subgen.)

Balanophora gồm các loài có hạt phấn có 3-4 đến nhiều cửa: B. fungosa subsp.

fungosa, B. fungosa subsp. indica, B. dioica, B. elongata, B. papuana, B. lowii,

B. reflexa, B. abbreviata, B. laxiflora [55].

4

c, Nhiễm sắc thể

Các nghiên cứu về số lượng nhiễm sắc thể của các loài thuộc chi

Balanophora được tiến hành khá sớm. Năm 1913, Ernst đưa ra số lượng nhiễm

sắc thể ở loài B. elongata là n = 16. Đến năm 1928, Kuwada nghiên cứu loài B.

japonica với kết quả số lượng nhiễm sắc thể 2n dao động từ 94–112. Rao (1932)

công bố loài B. fungosa subsp. indica có số lượng nhiễm sắc thể n = 16. Zweifel

(1939) quan sát thấy số lượng nhiễm sắc thể n = 16 trên loài B. abbreviata. Đến

năm 1942, Wanatabe tiến hành nghiên cứu trên loài B. japonica và cho rằng loài

này có số lượng nhiễm sắc thể là 2n = 56, thay vì 2n = 112 như dữ liệu Ernst đã

công bố năm 1913 [55]. Các nghiên cứu trên cho thấy, nhiễm sắc thể ở mỗi loài

trong chi Balanophora có thể tương đồng hay khác nhau.

1.1.3. Các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G. Forst. và phân bố

Cho tới thời điểm hiện tại, chi Balanophora được ghi nhận gồm 21 loài, 1

phân loài và 3 thứ chủ yếu ở châu Phi, châu Úc, từ vùng ôn đới đến nhiệt đới châu

Á và các đảo Thái Bình Dương. Tại Trung Quốc có khoảng 12 loài [120]. Danh

sách các loài bao gồm tên khoa học, tác giả, tên đồng nghĩa và khu vực phân bố

được trình bày trong bảng 1.1.

Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Balanophora trên thế giới và khu vực phân bố

TT Tên khoa học Tên đồng nghĩa Phân bố

Ấn Độ, Trung Quốc,

Balanophora laosensis Đông Nam Á, Châu Balanophora 1 Lecomte, Balanophora Phi, Madagascar, abbreviata Blume zollingeri Fawc. Quần đảo Thái Bình

Dương [120]

5

Balanophora affinis Griff., Đông Bắc Ấn Độ, Balanophora Balanophora alveolata Nêpal, Bhutan, 2 dioica Griff., Balanophora Myanma, Trung R.Brown ex Royle. hookeriana Hemsl. Quốc, [120]

Balanophora maxima

Balanophora Jungh., Balanophora 3 Inđônêxia [120] elongata Blume hansenii Hambali, B.

dioica Ito

Balanophora Balanophora ungeriana elongata var. Inđônêxia (Tây Java) 3b Valeton ungeriana (Val.) [55]

B.Hansen

Balanophora Balanophora involucrata 4 fargesii (Tiegh.) Trung Quốc [120] var. rubra Hook.f. Harms

Balanophora forsteri Trung Quốc (Đài

Tiegh., Balanophora Loan), , Nhật Bản,

micholitzii Ridl., Inđônêxia, Niu Ghi- B. fungosa 5a Balanophora mariannae nê, Philippin, J.R.&G. Forst. Hosok., Balanophora Australia, Quần đảo

kuroiwai (Makino) Thái Bình Dương

Makino [120]

Balanophora indica var.

globosa (Jungh.) Bân,

B. fungosa var. Balanophora globosa Inđônêxia (Java),

5b globosa (Jungh.) Jungh., Balanophora Việt Nam (Cúc

B.Hansen gigantea Wall. ex Fawc., Phương)

Balanophora ramosa

6

Fawc.

Balanophora indica (Arn.) Ấn Độ, Myanma, Griff., Balanophora Balanophora Trung Quốc, Thái annamensis S.Moore, fungosa subsp. Lan, Inđônêxia, Lào, 5c Balanophora fungosa var. indica (Arn.) Malaixia, Philippin indica (Arn.) B.Hansen, B.Hansen (Luzon), Thái Bình Balanophora gracilis Dương (Guam) [120] Tiegh.

Balanophora Balanophora indica var.

5d fungosa var. minor minor Eichler Ấn Độ, Thái Lan

(Eichler) B.Hansen

Balanophora harlandii

var. spiralis P.C.Tam, Ấn Độ (Assam), Balanophora Balanophora harlandii Trung Quốc, Thái 6 harlandii Hook.f. var. mutinoides (Hayata) Lan [120].

F.W.Xing

Balanophora Balanophora involucrata Ấn Độ, Nêpal, involucrata var. flava Hook.f., Bhutan, Trung Quốc, 7 Hook.f. & Balanophora involucrata [120] Thomson var. cathcartii Hook.f.

Balanophora B. japonica var. nipponica Nhật Bản [79] [83] 8 japonica Makino (Makino) Ohwi

7

Balanophora Ấn Độ, Thái Lan B. fasciculata Tiegh., B. 9 latisepala (Tiegh.) [53], Campuchia, thorelii Lecomte Lecomte Malaixia, [54].

B. formosana Hayata, B.

hongkongensis K.M.Lau, Trung Quốc, Thái Balanophora N.H.Li & S.Y.Hu, B. Lan [120], Lào, Việt 10 laxiflora Hemsley rugosa P.C.Tam, B. Nam [12]

spicata Hayata

Balanophora lowii 11 Malaixia [54] Hook.f.

Balanophora Balanophora kiusiana 12 Nhật Bản [80][83] nipponica Makino Ohwi

Balanophora Balanophora incarnata 13 Malaixia [54] papuana Schltr. Elmer

Nepal, Bhutan, Balanophora 14 Myanma, Trung polyandra Griff. Quốc [120]

Balanophora Balanophora fasciculigera 15 Malaixia [54] reflexa Becc. Suess. & Heine

Balanophora Trung quốc [120], 16 subcupularis Nhật Bản [84] P.C.Tam

Balanophora Trung Quốc, Nhật 17 B. wrightii Makino tobiracola Makino Bản [120]

Balanophora Quần đảo Cook (đảo 18 wilderi Setch. Rarotonga)

Balanophora

19 yakushimensis Nhật Bản [83][57]

8

Hatus.

Balanophora

coralliformis 20 Philipin (Luzon) [93] Barcelona,

Tandang & Pelser

Balanophora

aphylla Luu, H.Đ Việt Nam (VQG Tà 21 Tran & H.C. Đùng) [114]

Nguyen

Ở Việt Nam, trong cuốn Thực vật chí đại cương Đông Dương (Flore

Générale de L’Indo – Chine) - tập V (1915) [131], H. Lecomte đã mô tả 7 loài

của chi duy nhất (Balanophora) trong họ Dó đất ở Đông Dương (Việt Nam, Lào,

Campuchia). Nghiên cứu này cũng đã xây dựng khóa phân loại của các loài trong

chi này, tuy nhiên cho tới nay, nhiều loài đã trở thành tên đồng nghĩa (synonym).

Năm 1973, trong cuốn Thực vật chí Campuchia, Lào, Việt Nam (Flore du

Cambodge du Laos et du Viêt-Nam) [130], B. Hansen đã ghi nhận sự có mặt của

2 chi thuộc họ Dó đất (Balanophoraceae) ở khu vực 3 nước Đông Dương trong

đó chi Balanophora với 5 loài bao gồm B. abbreviata, B. harlandii, B. laxiflora,

B. latisepala, B. fungosa subsp. indica và chi Rhopalocnemis có duy nhất 1 loài.

Phạm Hoàng Hộ trong “Câycỏ Việtnam” (1992) [12], mô tả ngắn gọn 6 loài

thuộc họ Dó đất (Balanophoraceae) với 5 loài thuộc chi Balanophora (trong đó

loài Balanophora fungosa có 1 thứ và 1 phân loài) và 1 loài thuộc chi

Rhopalocnemis.

Danh lục thực vật Việt Nam (Nguyễn Tiến Bân, 2005) [4], ghi nhận sự có

mặt của 7 loài thuộc chi Balanophora, trong đó ghi nhận thêm 1 thứ của loài

Balanophora indica là Balanophora indica var. globosa, trước đây thứ này mới

chỉ được tìm thấy ở Java (Inđônêxia). Trong đó, đáng chú ý là loài Dó đất cúc

9

phương (B. cucphuongensis), đây là loài được GS. Nguyễn Tiến Bân công bố năm

1996, là loài đặc hữu của Việt Nam, mới chỉ thấy ở Vườn quốc gia Cúc Phương

(Ninh Bình) và có tên trong Sách đỏ Việt Nam (2007) [5]. Tuy nhiên, tài liệu mô

tả gốc cũng như các mẫu vật của loài này cho đến vẫn chưa được tìm thấy.

Năm 2020, nhóm nghiên cứu của Lưu Hồng Trường và cộng sự đã công bố

một loài mới thuộc chi Dó đất cho khoa học: Balanophora aphylla Luu, H.Đ Tran

& H.C. Nguyen. Loài này có nhiều điểm tương đồng với loài Dó đất đài rộng (B.

latisepala), nhưng là loài duy nhất không có lá trong chi Balanophora [114].

Thông tin về địa điểm phân bố các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.

Forst. ở Việt Nam được trình bày trong bảng 1.2.

Bảng 1.2. Phân bố của các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam

TT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố

1

Hà Nội, Hà Nam, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Kon Tum, Lâm Đồng, Ninh Thuận, An Giang Balanophora fungosa J.R.&G.Forst. subsp. indica (Arn.) B. Hansen Dó đất, Dương đài nam, Dương đài nấm, Tỏa dương, Chu ca ra.

Dó đất sần 2

Balanophora fungosa var. globosa (Jungh.) B. Hansen Ninh Bình (Vườn quốc gia Cúc Phương), Inđônêxia (Java), Hà Giang.

(Tiegh.) 3 Dó đất hình cầu, Xà cô Balanophora latisepala Lecomte Thanh Hóa, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, An Giang

Hà Giang, Kon Tum 4 Balanophora laxiflora Hemsl.

Nấm đất, Dó đất hoa thưa, Dương đài hoa thưa, Cu chó, Xà cô, Net din, Tang din

10

Ninh Bình, Quảng Nam 5 Balanophora abbreviata Blume Dương đài ngắn, Cu chó đồng châu

6 Dó đất đồng châu Ninh Bình, Kon Tum Balanophora fungosa J.R.&G. Forst.

(VQG Cúc 7 Dó đất thuôn Balanophora elongata Bl. Ninh Bình Phương)

(VQG Cúc 8 Dó đất cúc phương Ninh Bình Phương) Balanophora cucphuongensis N.T. Ban

9 Đắc Nông (VQG Tà Đùng) [114] Balanophora aphylla Luu, H.Đ Tran & H.C. Nguyen

1.1.4. Một số khóa phân loại chi Balanophora J.R.&G.Forst.

Ở Việt Nam, khóa phân loại tới các loài thuộc chi Balanophora được H.

Lecomte xây dựng từ năm 1915 trong Bộ Thực vật chí đại cương Đông Dương

(Flore General de L'Indo-chine). Năm 1972, Bertel Hansen, nhà thực vật học

người Đan Mạch, đã xuất bản chuyên khảo về chi Balanophora, trong đó có các

nghiên cứu tương đối chuyên sâu về thực vật của 14 loài thuộc chi Balanophora

[55]. B. Hansen cũng là tác giả của khóa phân loại tới các loài thuộc chi

Balanophora trong Thực vật chí Campuchia, Lào và Việt Nam (Flore du

Cambodge, du Laos et du Viêt-nam) xuất bản bởi Bảo tàng lịch sử tự nhiên học

Paris hay trong Thực vật chí Thái Lan (1970), Thực vật chí Malesiana (1974) sẽ

được trình bày ở dưới.

Bên cạnh đó, khóa phân loại chi Balanophora trong Thực vật chí Trung

Quốc theo quan điểm phân loại của Shumei Huang và Jin Murata cũng được trình

bày trong phần tổng quan này.

H. Lecomte xây dựng khóa phân loại của 7 loài thuộc chi Balanophora ở

khu vực Đông Dương trong cuốn Thực vật chí đại cương Đông Dương (1915)

[131] (phụ lục 1.1). Đây là một trong những công trình nghiên cứu đầu tiên ở khu

11

vực bán đảo Đông Dương về phân loại chi Balanophora. Tuy nhiên, cho đến thời

điểm hiện nay thì khóa phân loại này đã không còn phù hợp. Trong các loài trình

bày trong khóa phân loại này, chỉ duy nhất B. latisepala là tên được chấp nhận

rộng rãi hiện nay; các tên còn lại là tên đồng nghĩa (theo website

www.theplantlist.org [141]). Cụ thể, B. pierrei, B. gracilis, B. sphaerica là tên

đồng nghĩa của loài B. fungosa subsp. indica; B. thorelii, B. fasciculata là tên

đồng nghĩa của loài B. latisepala trong khi B. laoensis là tên đồng nghĩa của loài

B. abbreviata.

Năm 1970, trong Thực vật chí Thái Lan, khóa phân loại tới các loài, phân

loài, các thứ của chi Balanophora được B. Hansen xây dựng [53] (phụ lục 1.2).

Khóa phân loại này được xây dựng để xác định các loài thuộc chi Balanophora ở

Thái Lan, tuy nhiên cũng có những thông tin có giá trị để ứng dụng trong phân

loại các loài ở Việt Nam với một số loài trong tài liệu này cũng là các loài được

ghi nhận có ở Việt Nam.

Năm 1973, B. Hansen đã xây dựng khóa phân loại của 5 loài thuộc chi

Balanophora ở khu vực 3 nước Campuchia, Lào và Việt Nam (trước đây gọi là

bán đảo Đông Dương) trong bộ Thực vật chí Campuchia, Lào, Việt Nam [130]

(phụ lục 1.3). Khóa phân loại này là một tài liệu có giá trị sử dụng trong phân loại

các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam. Tuy nhiên, số lượng loài được liệt

kê trong khóa phân loại này chưa thật sự đầy đủ.

Trong Thực vật chí Malesiana (1976), B. Hansen công bố khóa phân loại

tới các loài thuộc chi Balanophora ở khu vực các nước: bán đảo Mã Lai,

Inđônêxia, Philippin và Niu Ghi-nê [54] (phụ lục 1.4). Đây có thể coi là khóa

phân loại cuối cùng của ông về chi Thực vật này. Khóa phân loại tới các loài

thuộc chi Balanophora trong Thực vật chí Malesiana (1976) được B. Hansen xây

dựng dựa trên cơ sở chuyên khảo về chi Balanophora do ông xuất bản năm 1972.

Khóa phân loại này áp dụng cho cả trường hợp cụm hoa đơn tính cùng gốc và đơn

tính khác gốc, cho cả trường hợp chỉ có hoa đực hoặc chỉ có hoa cái. Khóa phân

12

loại tương đối phù hợp trong việc phân loại các loài thuộc chi Balanophora ở Việt

Nam, các đặc điểm quan trọng dùng trong khóa gồm: hình dáng cụm hoa, cấu trúc

hoa đực, cách sắp xếp của lá, đây là các đặc điểm tương đối dễ nhận biết, thuận

tiện cho việc phân loại hình thái các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam.

Khóa phân loại tới các loài thuộc chi Balanophora trong Thực vật chí Trung

Quốc được xây dựng bởi Huang Shumei và Jin Murata với 12 loài [120] (phụ lục

1.5). Khóa phân loại của thực vật chí Trung Quốc giúp xác định các mẫu của các

loài thuộc chi Balanophora trong cả trường hợp cụm hoa đơn tính cùng gốc và

chỉ có hoa đực hoặc chỉ có hoa cái với cụm hoa đơn tính khác gốc. Trong trường

hợp chỉ có cụm hoa cái, đặc điểm quan trọng để phân biệt đó là hình dáng, kích

thước của bông mo (hay vảy bảo vệ) của cụm hoa. Khóa phân loại này cung cấp

một số thông tin giá trị khi phân loại các loài thuộc chi Balanophora, đặc biệt

thông tin một số loài được công bố sau này như: Balanophora subcupularis P.C.

Tam (1980).

Danh sách các loài thuộc chi Balanophora trong các khóa phân loại theo

các tài liệu trên được trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3. Danh sách các các loài thuộc chi Balanophora trong một số khóa phân loại

TT Tài liệu Tác giả phân loại Tên chấp nhận hiện nay Tên các loài trong khóa phân loại

fungosa

B. latisepala B. subsp. indica

1 H. Lecomte

B. latisepala

Thực vật chí đại cương Đông Dương (Flore General de L'Indo-chine) (1915)

fungosa 2 B. Hansen Thực vật chí Thái Lan (1970)

13

B. latisepala B. pierrei, B. gracilis, B. sphaerica B. thorelii, B. fasciculata B. laoensis B. abbreviata B. harlandii B. fungosa subsp. indica var. indica B. fungosa subsp. indica var. minor B. abbreviata B. abbreviata B. harlandii B. subsp. indica B. fungosa var. minor

3 B. Hansen

Thực vật chí Campuchia, Lào, Việt Nam (1973) fungosa

fungosa.

B. latisepala B. laxiflora B. papuana B. abbreviata B. harlandii B. laxiflora B. latisepala B. subsp. indica B. abbreviata B. reflexa B. latisepala B. elongata B. lowii B. papuana B. subsp. indica 4 B. Hansen Thực vật chí Malesiana (1976)

B. fungosa var. globosa

B. elongata

B. latisepala B. laxiflora B. papuana B. abbreviata B. harlandii B. laxiflora B. latisepala B. fungosa subsp. indica B. abbreviata B. reflexa B. latisepala B. elongata B. lowii B. papuana B. fungosa. subsp. indica var. indica B. fungosa subsp. indica var. globosa B. elongata var. elongata B. elongata var. ungeriana B. abbreviata B. dioica B. elongata var. ungeriana B. abbreviata B. dioica

B. elongata B. elongata

B. fargesii B. fargesii

B. fungosa B. fungosa

B. harlandii B. harlandii 5 H. Shumei & J. Murata Thực vật chí Trung Quốc (2003) B. indica

B. involucrata B. fungosa subsp. indica B. involucrata

B. laxiflora B. laxiflora

B. polyandra B. polyandra

14

B. subcupularis B. subcupularis

B. tobiracola B. tobiracola

1.2. Tổng quan các nghiên cứu về thành phần hóa học chi Balanophora

J.R.&G.Forst.

Chi Balanophora là chi có số lượng loài nhiều nhất trong họ Dó đất. Cho

tới thời điểm hiện tại, các nghiên cứu về thành phần hóa học chi này đã tiến hành

trên các loài sau: B. simaoensis, B. polyandra, B. spicata, B. fungosa, B. harlandii,

B. japonica, B. laxiflora, B. tobiracola, B. papuana, B. abbreviata, B. latisepala,

B. involucrata và B. indica. Trong các loài đã nêu ở trên, cần chú ý hai loài B.

simaoensis và B. indica hiện nay chỉ là tên đồng nghĩa của loài B. fungosa subsp.

indica (theo website www.theplantlist.org [141]). Các hợp chất đã phân lập được

chủ yếu thuộc các nhóm sau: tanin thủy phân được, các acid hydroxybenzoic và

dẫn chất, các hợp chất có khung phenylpropanoid (bao gồm các phenylpropanoid

đơn giản, lignan, coumarin), các flavonoid, terpenoid, sterol và một số hợp chất

mới được phân lập gần đây.

1.2.1. Các tanin thủy phân được

Các tanin thủy phân được phân lập từ các loài thuộc chi Balanophora khá

nhiều và đa dạng dạng với khoảng hơn 50 hợp chất đã được phân lập (Bảng 1.4)

trong đó có một số hợp chất lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên. Cấu trúc chung của

chúng là một hoặc nhiều các nhóm galloyl-, hexahydroxydiphenoyl- (HHDP-),

caffeoyl- và coumaroyl- gắn với phần polyol trung tâm là β-D-glucopyranose bởi

các liên kết ester [117].

Trong đó: nhóm hydroxyl tại vị trí C(1) thường được ester hóa với các dẫn

xuất của acid cinnamic (caffeoyl-, cinnamoyl-, coumaroyl- hoặc feruloyl-). Tại vị

trí C(3) và C(4) thường được ester hóa với acid gallic. Các nhóm hydroxyl tại

C(4),C(6) thường được diester hóa với hexahydroxydiphenoyl (HHDP-). Nhóm

15

hydroxyl ở vị trí C (2) thường không bị ester hóa.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học các nhóm thế trong các tanin thủy phân được phân lập

từ chi Balanophora

Bảng 1.4. Các tanin thủy phân được phân lập từ các loài thuộc chi Balanophora

TT Tanin thủy phân được Nguồn

B. involucrata [100] 1,2,3,6-tetra-O-galloyl- D-glucopyranose 1

1,3,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose B. japonica [135] 2

B. japonica [135] 1,2,4-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose 3

1,3,4-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose 4

polyandra 1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose 5

B. harlandii [116], B. japonica [135] B. laxiflora [18] [101], [115], B. B. japonica [135] B. japonica [135] B. japonica [66] 1,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose 3,4,6-tri-O-galloyl-D-glucopyranose 6 7

1,2-di-O-(E)-caffeoyl-β-D-glucopyranose B. japonica [135] 8

1,3-di-O-(E)-caffeoyl-β-D-glucopyranose B. japonica [135] 9

16

10 1,3-di-O-(E)-caffeoyl-4,6-(S)-HHDP-β-D- glucopyranose B. laxiflora [101], B. japonica [135]

B. japonica [135] 11 1,3-di-O-caffeoyl-4-O-galloyl-β-D- glucopyranose

12 1,3-di-O-galloyl-β-D-glucopyranose

B. harlandii [116], B. laxiflora [101], B. japonica [135], B. polyandra [115], B. involucrata [100] B. japonica [135] 13 1,4-di-O-galloyl-β-D-glucopyranose

B. japonica [66] 14

B. involucrata [101] 15

B. japonica [135] 16

B. japonica [135] 17 2,6-di-O-galloyl-D-glucopyranose 1-O-(E)-caffeoyl-1,3-di-O-galloyl-D- glucopyranose 3-O-(E)-caffeoyl-1,4-di-O-galloyl-β-D- glucopyranose 1-O-(E)-caffeoyl-3,4-di-O-galloyl-β-D- glucopyranose

18 1-O-(E)-caffeoyl-4,6-di-O-galloyl-β-D- glucopyranose B. laxiflora [101], B. japonica [135], B. polyandra [115]

B. fungosa [92] 19

B. japonica [135] 20 1-O-(E)-caffeoyl-3,4,6-tri-galloyl-β-D- glucopyranose 6-O-(E)-caffeoyl-1,3,4-tri-O-galloyl-β-D- glucopyranose

21 1-O-(E)-caffeoyl-3-O-galloyl-β-D- glucopyranose

22 1-O-(E)-caffeoyl-4-O-galloyl-β-D- glucopyranose

23 1-O-caffeoyl-6-O-galloyl-β-D- glucopyranose B. harlandii [116], B. spicata [135], B. japonica [92], B. fungosa [92], B. laxiflora [58], B. simaoensis [47] B. involucrata [100], B. harlandii [139], B. japonica [135], B. laxiflora [112] B. harlandii [139], B. japonica [135], B. laxiflora [112]

B. polyandra [115] 24 3-O-(E)-caffeoyl-1-O-galloyl-β-D- glucopyranose

17

25 1-O-galloyl-4,6-[(S)-HHDP]-β-D- glucopyranose B. japonica [135], B. polyandra [115]

26 3-O-galloyl-4,6-[(S)-HHDP]-β-D- glucopyranose

27 1,3-di-O-galloyl-4,6-(S)-HHDP-D- glucopyranose

28 1-O-(E)-caffeoyl-3-O-galloyl-4,6-(S)- HHDP-β-D-glucopyranose

29 1-O-(E)-caffeoyl-4,6-(S)-HHDP-β-D- glucopyranose

B. japonica [66], B. polyandra [115] B. involucrata [100], B. laxiflora [101] [58], B. japonica [135], B. polyandra [111] [115] B. laxiflora [101], B. japonica [135], B. fungosa [92], B. simaoensis [47], B. involucrata [100] B. japonica [135], B. fungosa [92], B. laxiflora [58], B. simaoensis [47]

B. fungosa [92] 30

31 B. japonica [135], B. fungosa [92]

B. fungosa [92] 32 1-O-(E)-coumaroyl-3-galloyl-4,6-(S)- HHDP-β-D-glucopyranose 1-O-(E)-coumaroyl-4,6-(S)-HHDP-β-D- glucopyranose 1-O-(E)-coumaroyl-3,4,6-tri-galloyl-β-D- glucopyranose

B. involucrata [100] 33 1-O-(E)-p-coumaroyl-D-glucopyranose

B. harlandii [116] 34 1-O-(E)-p-coumaroyl-3-O-galloyl-β-D- glucopyranose

B. fungosa [92] 35 1-O-(E)-cinnamoyl-3-galloyl-4,6-(S)- HHDP-β-D-glucopyranose

B. fungosa [92] 36 1-O-(E)-cinnamoyl-4-galloyl-β-D- glucopyranose

B. japonica [66] 37 1,3-di-O-galloyl-6-O-(S)- brevifolincarboxyl-β-D-glucopyranose

B. japonica [66] 38

[115], 39 polyandra B. B. japonica [67]

18

B. polyandra [115] B. involucrata [100], 1-O-(E)-caffeoyl-6-O-(S)- brevifolincarboxyl-β-D-glucopyranose 1-O-[(E)-caffeoyl]-4,6-[1,1'-(3,3',4,4'- tetrahydroxydibenzofurandicarboxyl)]-β- D-glucopyranose 1-O-galloyl-β-D-glucopyranose 3-O-galloyl-β-D-glucopyranose 40 41

42 6-O-galloyl-β-D-glucopyranose B. harlandii [116], B. laxiflora [101], B. japonica [66], B. polyandra [115] B. laxiflora [101], B. involucrata [100]

B. japonica [67] 43 balanophotanins A

B. japonica [67] B. japonica [66] B. japonica [66] B. polyandra [115] B. polyandra [115] B. papuana [62] B. papuana [62] 44 45 46 47 48 49 50 balanophotanins C balanophotanins F balanophotanins G balapolyphorin A balapolyphorin B papuabalanols A papuabalanols B

1.2.2. Các acid hydroxybenzoic và dẫn chất

Trong các loài thuộc chi Balanophora còn có một số các acid

hydroxybenzoic cùng các dẫn chất của chúng (bảng 1.5). Trong đó acid gallic

(51) là hợp chất được phân lập nhiều nhất từ các loài thuộc chi. Cấu trúc các hợp

chất được trình bày trong hình 1.2.

19

Hình 1.2. Một số acid hydroxybenzoic và dẫn chất phân lập từ chi Balanophora

Bảng 1.5. Các acid hydroxybenzoic và dẫn chất phân lập từ chi Balanophora

Các acid

TT hydroxybenzoic Nguồn

& dẫn chất

B. laxiflora [101], B. harlandii [139], B. polyandra acid gallic 51 [115], B. simaoensis [136], B. involucrata [100]

B. polyandra [115], B. laxiflora [10][96] 52 methyl gallat

acid ellagic B. simaoensis [136] 53

Invonoid D B. involucrata [118] 54

Invonoid E B. involucrata [118] 55

B. simaoensis [46], B. involucrata [118] 56 Brevifolin

brevifolin B. involucrata [118] 57 carboxylic acid

methyl brevifolin B. involucrata [90][118] 58 carboxylat

ethyl brevifolin B. involucrata [118] 59 carboxylat

1.2.3. Các Phenylpropanoid đơn giản

Hơn 30 hợp chất phenyl propanoid đơn giản (60 – 94) đã được phân lập từ

chi Balanophora, bao gồm một số hợp chất như acid p-coumaric, acid caffeic,

acid cinnamic, coniferin, acid ferulic (Hình 1.3) và các dẫn chất của chúng [117].

20

(Bảng 1.6)

Hình 1.3. Một số phenyl propanoid đơn giản phân lập từ chi Balanophora

Bảng 1.6. Các phenylpropanoid đơn giản phân lập từ chi Balanophora

TT Phenyl propanoid đơn giản Nguồn

B. laxiflora [101], B. simaoensis

acid caffeic [136], 60

B. japonica [66], B. involucrata [100]

acid caffeic ethyl ester B. spicata [135], B. japonica [66], 61 (= ethyl caffeat) B. laxiflora [86]

acid caffeic methyl ester B. japonica [66], B. laxiflora [10][96] 62 (= methyl caffeat)

B. harlandii [116], B. laxiflora [96] 64 methyl caffeat

1-O-(3'-O-β-D-

glucopyranosyl)-(E)-caffeoyl- B. japonica [66] 64

β-D-glucopyranose

1-O-(E)-caffeoyl-β-D- B. laxiflora [101][58], B. harlandii 65 glucopyranose [116][139], B. polyandra [115],

6-O-(E)-caffeoyl-β-D- B. japonica [66] 66 glucopyranose

21

67 1-O-(E)-caffeoyl-β-gentiobiose B. japonica [66], B. polyandra [115]

2-O-(E)-caffeoyl-1-O-p-(E)- B. japonica [66] 68 coumaroyl-β-D-glucopyranose

B. polyandra [113], B. abbreviata acid cinnamic 69 [61], B. tobiracola [64]

B. polyandra, B. fungosa [92] 70 methyl cinnamat

4-hydroxy-3-methoxy B. laxiflora [10] 71 cinnamaldehyd

B. laxiflora [10] 72 methyl 4-hydroxy cinnamat

l-O-trans-Cinnamoyl glucosid B. polyandra [91][113] 73

4'-hydroxy-3'-

methoxycinnamoyl-β-D- B. polyandra [115] 74

glucopyranose

p-hydroxycinnamic-β-D- B. fungosa [92] 75 glucopyranose

p-hydroxycinnamoyl-β-D- B. polyandra [113] 76 glucopyranose

B. laxiflora [96][101], B. fungosa

[92], 77 Acid p-coumaric B. abbreviata [61], B. involucrata

[100]

B. japonica [26] 78 methyl p-coumarat

B. harlandii [116], B. laxiflora [101],

B. polyandra [115], B. fungosa [92], coniferin 79 B. involucrata [78], B. japonica [66],

B. abbreviata [61]

22

methyl 4-O-β-D- B. laxiflora [37] 80 glucopyranosyl coniferyl ether

B. japonica [129] 81 balajaponin B

B. japonica [129] 82 balajaponin C

B. japonica [129] 83 balajaponin D

B. japonica [129] 84 balajaponin E

balaxiflorin B B. laxiflora [101] 85 = (6'-O-(E)-caffeoyl coniferin)

4-O-(6'-O-p-coumaroyl-β-D-

glucopyranosyl)-coniferyl B. latisepala [70], B. laxiflora [112] 86

aldehyd

B. latisepala [70], B. japonica [129], coniferyl aldehyd-β-D-glucosid 87 B. laxiflora

coniferyl aldehyd (= ferulic B. abbreviata [61], B. laxiflora [24], 88 aldehyd) B. papuana [62], B. japonica [129]

B. polyandra [115], B. involucrata 89 methyl coniferin [78], B. simaoensis [46][134]

B. simaoensis [134] 90 Butylconiferin

acid ferulic B. involucrata [100] 91

epoxyconiferyl alcohol B. laxiflora [86] 92

B. laxiflora [86] 93 Salicifoliol

methyl 4-O-β-D- B. laxiflora [37] 94 glucopyranosylconiferyl ether

Trong các hợp chất trên, balajaponin B, balajaponin D, balajaponin E đều

có 2 đơn vị coniferin liên kết tại các vị trí khác nhau, lần lượt là: giữa C(9) và

C(9’), C(8) và C(9’), C(6) và C(9’), hợp chất balajaponin C là dẫn xuất methyl

hóa của balajaponin E. Ngoài ra, từ loài B. laxiflora, trans-p-coumaroyl aldehyd,

23

epoxyconiferyl alcohol và salicifoliol và đã được phân lập [24][86].

1.2.4. Các hợp chất lignan

Lignan là các dimer được tạo nên bởi 2 đơn vị phenylpropanoid (C6-C3)

liên kết với nhau ở vị trí nguyên tử carbon thứ hai (β - β’) của chuỗi bên. Khoảng

hơn 20 hợp chất lignan đã được phân lập từ các loài thuộc chi Balanophora (95

– 118). (Bảng 1.7)

Các lignan phân lập từ chi Balanophora chủ yếu gồm các hợp chất có khung

Pinoresinol, Lariciresinol, Balanophonin, Isolariciresinol và dẫn chất của chúng

(Hình 1.4). Trong bảng 1.6, Các hợp chất từ 95 – 100 là các monoexpoxy lignan

trong khi các hợp chất từ 101 – 117 là các bisepoxy lignan. Các hợp chất từ 108

– 111 là các neolignan, đây là một nhóm riêng biệt trong phân loại lignan với

dimer không được hình thảnh bởi liên kết C-β-C-β’. Các hợp chất từ 112 – 116 là

các dihydronaphtalen lignan. Từ loài B. laxiflora, đã phân lập được dimethyl

6,9,10 trihydroxybenzo[kl] xanthen-1,2-dicarboxylat (117), đây là một

benzo[kl]xanthen lignan. Ivonoid A (118) là một nor-lignan đã được phân lập từ

loài B. involucrata. Bên cạnh đó, một hợp chất có khung benzopyran cũng được

phân lập từ loài B. fungosa (119). Danh sách các hợp chất lignan được phân lập

từ các loài thuộc chi Balanophora phân loại theo các phân nhóm được trình bày

trong bảng 1.7.

Bảng 1.7. Các lignan phân lập từ chi Balanophora

TT Lignan Nguồn

Monoepoxy lignan

B. japonica[56],

B. harlandii [139], (-)-lariciresinol 95 B. abbreviata [61],

24

B. laxiflora [37]

B. laxiflora [101], lariciresinol-4'-O-β-D-glucosid 96 B. polyandra [115]

lariciresinol-4-O-β-D-glucosid B. polyandra [115] 97

B. involucrata 98 secoisolariciresinol-4-O-β-D-glucopyranosid [100]

8R, 8'R)-9-O-galloyl B. laxiflora [101] 99 balaxiflorin A = (7'S,

lariciresinol-4'-O-β-D-glucopyranosid (= B. laxiflora [24] 100 Balnophoron (7'S,8'R,8S)-9'-acetyl-3,3′- dimethoxy-4,4′-dihydroxy-7',9-epoxylignan-7′-on)

Bisepoxy lignan

B. laxiflora

[37][96],

B. polyandra (+)-pinoresinol 101

[115],

B. abbreviata [61]

B. harlandii [139],

B. papuana [62],

B. abbreviata [61], (-)-pinoresinol 102

B. involucrata

[118]

B. japonica [67], (-)-pinoresinol-β-D-glucosid 103 B. abbreviata [61]

B. spicata [135], (+)-pinoresinol-di-O-β-D-glucopyranosid 104 B. japonica [67]

B. laxiflora [101], (+)-pinoresinol-O-β-D-glucopyranosid 105 B. japonica [67]

25

B. involucrata (+)-5-hydroxypinoresinol 106 [118]

B. involucrata Ivonoid C 107 [118]

Neo lignan

B. japonica [56] 108 Balanophonin

B. japonica [67] 109 balanophonin 4-O-β-D-glucopyranosid

B. latisepala [70] 110 7 S, 8R dehydrodiconferyl alcohol

B. involucrata Ivonoid B 111 [118]

Dihydronaphtalen lignan

B. involucrata 112 7-burse lignan [118]

B. abbreviata [61],

B. laxiflora

Isolariciresinol [37][101], B. 113

involucrata [100],

[118]

B. laxiflora [101],

B. polyandra Isolariciresinol-4-O-β-D-glucosid 114 [115],

B. abbreviata [61]

B. laxiflora [112] Isolariciresinol 9-O-β-D-glucopyranosid 115

B. laxiflora [107] 116 Balanophorosid B

benzo[kl]xanthen lignan

dimethyl 6,9,10 trihydroxybenzo[kl] xanthen -1,2- B. laxiflora [96] 117 dicarboxylat

26

Nor-lignan

B. involucrata Ivonoid A 118 [118]

Benzopyran

119 3,3'-bis(3,4-dihydro-6-methoxy-2 H-1-benzopyran) B. fungosa [92]

Hình 1.4. Một số lignan phân lập từ chi Balanophora

1.2.5. Các coumarin

Tới thời điểm hiện tại, mới chỉ có 04 hợp chất coumarin (120 – 123) được

phân lập và xác định cấu trúc từ các loài thuộc chi Balanophora, bao gồm

balajaponin A, scopoletin, phyllanthusiin E và phyllanthusiin E methyl ester

(Bảng 1.8). Cấu trúc hóa học các coumarin kể trên được trình bày trong hình 1.5.

Bảng 1.8. Các coumarin phân lập từ chi Balanophora

Coumarin Nguồn

27

TT 120 balajaponin A B. japonica [98] 121 scopoletin B. laxiflora [96] 122 phyllanthusiin E B. involucrata [118] 123 Phyllanthusiin E methyl ester B. involucrata [118]

Hình 1.5. Một số coumarin phân lập từ chi Balanophora

1.2.6. Các flavonoid

Số lượng các flavonoid trong chi Balanophora là không nhiều với khoảng

hơn 30 flavonoid đã được phân lập (bảng 1.9). Dựa trên khung cấu trúc, các hợp

chất này có thể được phân loại thành các nhóm: dihydrochalcon (124 – 152),

flavanon (153 – 161), 3-hydroxy flavanon (162 – 165), auron (166) và flavan-3-

ol (167) (Hình 1.6) [117].

Bảng 1.9. Các flavonoid phân lập từ chi Balanophora

Flavonoid TT Nguồn

Dihydro chalcon

B. involucrata [90] 124

B. involucrata [110] 125

B. involucrata [110] 126 (E)-3,4,2',4',6'-pentahydroxychalcon-2'-O-β- D-glucopyranosid 3,4,2′,6′-tetrahydroxy-dihydrochalcon-4′-O- (6″-galloyl)-β-D-glucopyranose 3,4,2′,6′-tetrahydroxydihydroflavon-4′-O-β-D- glucopyranose

127 Phloretin 4'-O-β-D-glucosid B. harlandii [116], B. tobiracola [109]

4'-O-[3'-O-galloyl-4',6'-O-(S)- B. tobiracola [109] 128

B. involucrata [110] 129

4'-O-[3'-O-galloyl-4',6'-O-(S)- B. tobiracola [109] 130 Phloretin HHDP]-β-D-glucosid Phloretin 4”-O-[4′, 6′-O-(S)-HHDP]-β-D- glucosid Phloretin HHDP]-β-D-glucosid

28

131 3-hydroxyphloretin B. harlandii [116], B. tobiracola [64]

132 3-hydroxyphloretin-4'-O-β-D-glucosid

B. harlandii [116], B. tobiracola[109][6 4] B. harlandii [94] 133 3-hydroxyphloretin-2'-O-β-D-glucosid

B. involucrata [110] 134

B. involucrata [110] 135

136 B. harlandii [116], B. tobiracola [109]

B. tobiracola [109] 137

B. tobiracola [109] 138

139 3-hydroxyphloretin 4'-O-[4'',6''-O-(S)-HHDP]- β-D-glucopyranosid 3-hydroxyphloretin 4'-O-[6''-O-galloyl]- β-D - glucopyranosid 3-hydroxyphloretin 4'-[4'',6''-di-O-(S)-HHDP- β-D-glucosid] 3-hydroxyphloretin 4'-O-(3'',4''-di-O-galloyl)- β-D-glucosid 3-hydroxyphloretin 4'-O-(4'',6''-di-O-galloyl)- β-D-glucosid 3-hydroxyphloretin 4'-O-(6''-O-galloyl)-β-D- glucosid

140 3-hydroxyphloretin 4'-O-[3''-O-galloyl-4'',6''- O-(S)-HHDP]-β-D-glucosid B. harlandii [116], B. tobiracola [109] B. tobiracola [109], B. harlandii [116], B. involucrata [100]

B. tobiracola [109] 141 3-hydroxyphloretin 4'-O-(3'',4''-di-O-galloyl)- β-D-glucosid

B. harlandii [94] 142 3-methoxyphloretin-2'-O-β-D-glucosid

B. harlandii [94] 143 3-methoxyphloretin-4'-O-β-D-glucosid

144 3-methoxyphloretin-2',4'-O-β-D-diglucosid

phloridzin 145

146 3-hydroxy-phloridzin

hesperetin dihydrochalcon 4'-β-D-glucosid 147

B. harlandii [94] B. involucrata [90], B. harlandii [94] B. involucrata [90] B. harlandii [116], B. tobiracola [64] B. laxiflora [96] 148

B. involucrata [110] 149

β-hydroxydihydrochalcon 4,2′,6′-trihydroxy-dihydrochalcon-4′-O- (6″-galloyl)-β-D-glucopyranose balanochalcon sieboldin sieboldin-3’-ketocarboxylic acid B. laxiflora [96] B. involucrata [100] B. involucrata [100]

29

eriodictyol eriodictyol 7-(6''-O-galloyl-β-D-glucosid) B. involucrata [100] B. harlandii [116] 150 151 152 Flavanon 153 154

B. involucrata [100] 155

156 B. harlandii [116], B. involucrata [90]

eriodictyol-7-O-β-D-glucopyranosid (2R/2 S)-eriodictyol (= 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-2,3-dihydro-5,7- dihydroxy-4 H-1-benzopyran-4-on) (2R/2 S)-eriodictyol 5-O-β-D-glucopyranosid 157

(2R/2 S)-eriodictyol 7-O-β-D-glucopyranosid 158

B. involucrata [90] B. harlandii [116], B. tobiracola [109], B. involucrata [90] B. involucrata [91] 159

B. involucrata [110] 160

B. involucrata [110] 161 naringenin (S)-5,7,3′,5′-tetrahydroxy-flavanon-7-O-(6″- galloyl)-β-D-glucopyranose (S)-5,7,3′,5′-tetrahydroxy-flavanon-7-O-β-D- glucopyranose

3-hydroxy flavanon kaempferol 162

quercetin 163

quercimeritrin glucodistylin B. spicata [133] B. simaoensis [136], B. laxiflora [96] B. simaoensis [136] B. involucrata [100]

aureusidin-4-O-β-D-glucopyranosid B. involucrata [90]

catechin B. spicata [135] 164 165 Auron 166 Flavan-3-ol 167

Hình 1.6. Khung cấu trúc các flavonoid phân lập từ chi Balanophora

1.2.7. Các terpenoid

Các terpenoid phân lập từ các loài thuộc chi Balanophora có thể được chia

30

làm các nhóm: triterpenoid pentacyclic (168 – 184), iridoid (185 – 188) và các

sesquiterpenoid (189 – 191) (Bảng 1.10). Các triterpenoid pentacyclic phân lập

được bao gồm các khung kiểu lupan, oleanan và ursan [117]. Từ phân đoạn n-

hexan của loài B. laxiflora, Nguyễn Thị Hồng Anh và cộng sự đã phân lập (21β)-

22-hydroxyhopan-3-on, (21α)-22-hydroxyhopan-3-on cùng hai hợp chất đã được

phân lập từ chi Balanophora trước đây là lupeol và β-amyrin [3].

Bảng 1.10. Các terpenoid phân lập từ chi Balanophora

Nguồn

TT Terpenoid Triterpenoid pentacyclic

168 B. simaoensis, B. spicata, B. laxiflora, B. dioica, B. polyandra [137], B. involucrata, B. indica

B. spicata [135] [137], B. simaoensis [137] 169 Balanophorin A (=β-amyrin palmitat) Balanophorin B (=lupeol palmitat)

B. spicata [135], B. indica

B. involucrata [140], B. laxiflora [3] 171 170 Lupenon Lupeol (= monogynol B)

172 Lupeol acetat

B. harlandii [139], B. polyandra [137], B. indica [85], B. involucrata [140], B. japonica [125] B. spicata [135] 173 Monogynol A

A 3- B. simaoensis [133] 174 Monogynol palmitat

175 Olean-12-en-3,11-dion B. tobiracola [124]

B. abbreviata [124], B. indica [124] 176 Taraxastenon

B. abbreviata [124], B. indica [124] 177 Taraxasterol

B. involucrata [140] 178 Ursa-12-en-11-on-3- oloctocosat

179 β-amyrin

180 β-amyrin acetat

181 β-amyrin stearat

B. laxiflora [3], B. involucrata [140], B. simaoensis [133] B. spicata [135], B. japonica [98], B. indica [85], B. simaoensis [137] B. simaoensis, B. spicata, B. laxiflora, B. dioica, B. polyandra [137] B. indica, B. simaoensis

31

B. laxiflora [3] 183 182 β-amyron (21β)-22- hydroxyhopan-3-on

B. laxiflora [3] 184 (21α)-22- hydroxyhopan-3-on

Iridoid

B. spicata [133]

185 geniposid 186 shanzhiosid methyl ester B. spicata [133]

6'-O-β- B. latisepala [70] 187 loganin glucopyranosid

B. laxiflora [107] 188 balanolaxin

Sesquiterpenoid

Balanophora fungosa subsp. indica [27] 189 Balanoindicosid A

Balanophora fungosa subsp. indica [27] Balanophora fungosa subsp. indica [27] 190 Balanoindicosid B 191 Balanoindicosid C

1.2.8. Các steroid

Từ chi Balanophora J.R.&G.Forst., đã có một số steroid được phân lập (192

– 196) (bảng 1.11).

Bảng 1.11. Các steroid phân lập từ chi Balanophora

TT Sterol Nguồn

B. harlandii [139] 192 Clerosterol

B. harlandii [139] 193

Clerosterol-3-O-(6'-O- palmitoyl)-β-D- glucopyranosid

194 Daucosterol B. simaoensis [134], B. laxiflora [3][10] [112], B. involucrata [140]

[115], B.

195 β-sitosterol

B. polyandra simaoensis [134], B. involucrata [140], B. japonica [98], B. laxiflora [3][112]

32

B. involucrata [140] 196 β-sitosteryl glucosid-3'- O-linoleat

1.2.9. Các nhóm hợp chất khác

Từ loài B. involucrata, đã phân lập 1 glycosid cyanogenic: proacacipetalin

6’-O-β-D-glucopyranosid.

Acid palmitic được phân lập từ loài B. simaoensis. Từ loài B. polyandra, 4-

hydroxybenzyl-β-D-glucosid được phân lập.

Từ loài B. laxiflora, đã phân lập được một số hợp chất khác: 1-

Hexacosanoylglycerol [10], 5-hydroxymethylfurfural [37][86], Balanophorosid

A, Balanophrosid B [107], p-hydroxybenzaldehyd, piceol [24] và 1-O-(3-

methylbutyl)-6-O-β-D-xylopyranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranose [112].

Từ phần trên mặt đất loài Balanophora fungosa, hai hợp chất butenolid là

balanolid A và balanolid B đã được phân lập [128].

1.3. Tổng quan về công dụng, tác dụng sinh học chi Balanophora

J.R.&G.Forst.

1.3.1. Công dụng của các loài thuộc chi Balanophora

Ở Trung Quốc, từ xa xưa trong Y học cổ truyền, các loài thuộc chi

Balanophora được sử dụng làm thuốc bổ thận, cầm máu, điều trị viêm gan [137].

Ở Vân Nam, toàn cây loài B. laxiflora được dùng trị hư lao xuất huyết, đau lưng,

lở trĩ [7].

Ở Việt Nam, theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của Võ Văn Chi, toàn cây

loài B. latisepala được đồng bào miền núi Ninh Thuận sắc uống chữa bệnh nấc

cụt, loài B. laxiflora được dùng làm thuốc bổ máu, phục hồi sức khỏe, chữa nhức

mỏi chân tay, loài B. fungosa subsp. indica được đồng bào dân tộc thường dùng

cây sắc nước uống làm thuốc trị bệnh đau bụng, đau toàn thân, có người dùng như

vị Tỏa dương làm thuốc ngâm rượu uống bổ tinh, cường tráng, mạnh gân cốt [7].

Theo tài liệu “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của GS. Đỗ Tất Lợi,

Tỏa dương hay Củ gió đất, Củ ngọt núi, Hoa đất, Cu chó, Cây không lá, Xà cô,

33

có tên khoa học là Balanophora sp., được người dân sử dụng làm thuốc bổ máu,

kích thích ăn ngon miệng, hồi phục sức khỏe, chữa nhức mỏi chân tay, đau bụng,

hồi phục sức khỏe cho phụ nữ sau khi sinh [13].

Một số bài thuốc sử dụng Dó đất (Tỏa dương) [19]:

1. Bài thuốc bổ thận tráng dương dùng cho người cao tuổi (nam) dương hư,

thận suy, yếu mệt, liệt dương, di tinh, kém ăn, mất ngủ: Tỏa dương 10 g, Nhân

sâm 12 g, Hoàng kỳ 16g, Đỗ trọng 16g, Nhục thung dung 8g, Thỏ ty tử 12g, Xà

sàng tử 12g, Phúc bồn tử 12g, Đương quy 12g, Bạch truật 12g, Thục địa 16g, Ba

kích 12g, Dâm dương hoắc 12g, Lộc nhung 12g, Kỷ tử 12g, Đại táo 5 quả, Long

nhãn 10g, Cam thảo 6g, Xuyên khung 8g, Hà thủ ô đỏ 12g. Tất cả cho vào 750

ml nước vào sắc kỹ còn 250 ml chia 3 lần uống trong ngày. Uống 7-10 thang.

2. Chữa liệt dương: Tỏa dương 12g, Thục địa 15g, Sơn thù nhục 15g, Sơn

dược 15g, Phục linh 12g, Câu kỷ 15g, Nhục thung dung 12g, Dâm dương hoắc

30g, Ba kích nhục 12g, Bạch sâm 12g, Táo nhân (sao) 12g, Thỏ ty tử 12g, Thiên

môn đông 9g, Lộc nhung 6g, Cam thảo 9g. Tất cả đem tán mịn trộn mật làm hoàn,

mỗi viên 9g, mỗi ngày uống 3 lần, mỗi lần 1 viên, uống với nước đun sôi để nguội.

Kiêng thức ăn tanh, lạnh.

3. Thuốc bổ máu, chữa đau nhức, mới ốm dậy: Tỏa dương 2kg, Long nhãn

1kg, Sâm cau 1kg, Bá bệnh 500g, Thiên niên kiện 200g, Tỏa dương, Sâm cau sao

kỹ, tất cả cho vào lọ kín, cho rượu vừa ngập, ngâm 1-2 tháng, mỗi ngày uống 1-

2 chén.

4. Thuốc chữa thiếu máu, phục hồi sức khỏe, chữa nhức mỏi người, chân

tay: Tỏa dương 1kg, Ba kích 1kg, Ngũ gia bì 1kg, Nhung hươu 100g, các vị thuốc

cắt nhỏ, sấy khô, trộn đều, nghiền thành bột mịn, mỗi ngày uống 5-10g, chia làm

2 lần.

1.3.2. Nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học chi Balanophora

Các loài thuộc chi Balanophora đã được nghiên cứu về các tác dụng sinh

học sau: Hoạt động dọn gốc tự do, tác dụng ức chế HIV, tác dụng hạ đường huyết,

34

kháng viêm, giảm đau, tác dụng hạ acid uric máu.

a, Hoạt động dọn gốc tự do

Hoạt động dọn gốc tự do là hoạt tính được nghiên cứu nhiều nhất của chi

Balanophora, chủ yếu trên gốc tự do DPPH và sử dụng chứng dương là acid

ascorbic. Đối tượng nghiên cứu có thể là cắn toàn phần hoặc cắn các phân đoạn

từ toàn cây của các loài thuộc chi Balanophora. Tổng hợp các nghiên cứu nhìn

chung cho thấy các tanin thủy phân trong chi Balanophora có tác dụng dọn gốc

tự do mạnh.

Các nghiên cứu về hoạt tính dọn gốc tự do của các loài thuộc chi

Balanophora được tiến hành trong khoảng thời gian từ 2006-2010. Kết quả chính

của các nghiên cứu này được thể hiện trong bảng 1.12.

Năm 2006, trong nghiên cứu của Kai-Jin Wang và cộng sự, cắn dịch chiết

aceton 80% của loài Balanophora polyandra đã cho thấy hoạt tính dọn gốc tự do

mạnh (SC50 = 14,48 µg/ml) với gốc tự do DPPH. Từ cắn aceton 80%, nhóm

nghiên cứu cũng đã phân lập và đánh giá tác dụng dọn gốc tự do của 22 hợp chất.

Kết quả cho thấy các tanin thủy phân từ loài này cùng acid gallic và methyl gallat

có tác dụng dọn gốc tự do mạnh [115].

Năm 2009, từ thân rễ hay “củ” của loài B. harlandii, Wang và cộng sự đã

phân lập 19 hợp chất. Các hợp chất này được bao gồm: tanin thủy phân được,

dihydrochalcon, flavanon và các phenolic đơn giản và được đánh giá tác dụng

dọn gốc tự do với acid ascorbic được sử dụng làm chứng dương. Hầu hết các hợp

chất cho thấy hoạt tính dọn gốc tự do DPPH rõ ràng. Trong đó, tanin thủy phân

được có nhóm galloyl trong phân tử và dihydrochalcon với catechol (=benzen-

1,2-diol) giống như vòng B cho thấy hoạt tính cao hơn acid ascorbic [116].

Nghiên cứu của She GM và cộng sự cũng trong năm 2009 cho thấy cắn dịch

chiết aceton 80% của cây tươi mang hoa cái của loài B. laxiflora thể hiện hoạt

tính dọn gốc tự do DPPH đáng kể (SC50 = 16,4 µg/ml). Các hợp chất phân lập

được từ cắn này cũng được đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH, kết quả cho

35

thấy các tanin thủy phân có hoạt tính mạnh hơn các hợp chất phenolic khác, các

phenolic ở dạng glycosid có nhóm galloyl hay caffeoyl gắn vào cho thấy hoạt tính

mạnh hơn so với các hợp chất phenolic tương ứng. Với các acid phenolic, số

lượng nhóm OH có vai trò quan trọng với hoạt tính dọn gốc tự do [101].

Năm 2010, nghiên cứu của Deng Jing và cộng sự về tác dụng dọn gốc tự do

DPPH của cắn ethanol, ether dầu hỏa, cloroform, ethylacetat, n-butanol, phân

đoạn nước, polysaccharid toàn phần tan trong nước và trong kiềm từ loài B.

spicata cho thấy tất cả các cắn này đều thể hiện hoạt tính dọn gốc tự do DPPH

mạnh, đặc biệt là cắn ethyl acetat, n-butanol và polysaccharid toàn phần tan trong

nước thể hiện tác dụng tương đương với acid ascorbic trong đó cắn ethyl acetat

còn thể hiện tác dụng mạnh hơn (SC50 = 6,0 µg/ml) [39].

Bảng 1.12. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH của các loài thuộc chi Balanophora

TT Năm Kết quả & kết luận Loài nghiên cứu

1 2006 Balanophora polyandra [115]

2 2009

Balanophora harlandii [116]

36

- Cắn aceton 80% (SC50 = 14,48 µg/ml) - Đánh giá tác dụng 22 hợp chất được phân lập: Tanin thủy phân được {1,3-di-O-galloyl-4,6- [(S)-HHDP]-β-D-glucopyranose (SC50 = 8,4 ± 0,2 µM); 1-O-galloyl-4,6-[(S)-HHDP ]-β-D- glucopyranose (SC50 = 13,0 ± 0,3 µM); 3-O- galloyl-4,6-[(S)-HHDP]-β-D-glucopyranose (SC50 = 15,3 ± 0,3 µM)} Acid gallic (SC50 = 12,1 ± 0,2 µM), methyl gallat (19,3 ± 0,2 µM) - Đánh giá tác dụng 19 hợp chất được phân lập thuộc 4 nhóm: Tanin thủy phân có nhóm galloyl trong phân tử {1-O-[(E)-p-coumaroyl]-3-O-galloyl-β-D- glucopyranose (SC50 = 29,6 ± 0,2 µM); 3-O- galloyl-D-glucopyranose (SC50 = 20,8 ± 0,3 µM); 1,3,4-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose (SC50 = 16,2 ± 0,3 µM); 1,3-di-O-galloyl-β-D- glucopyranose (SC50 = 11,8 ± 0,4 µM); 1-O- caffeoyl-3-O-galloyl-β-D-glucopyranose (SC50 = 17,3 ± 0,3 µM)} Dihydrochalcon với catechol như vòng B {3- hydroxyphloretin 4’-β-D-glucosid (SC50 = 23,6

3 2009

Balanophora laxiflora [101]

± 0,1 µM); 3-hydroxyphloretin 4’-[3’’-O- galloyl-4’’,6’’-di-O-(S)-HHDP-β-D-glucosid] (SC50 = 8,2 ± 0,1 µM); 3-hydroxyphloretin 4’- (6’’-O-galloyl-β-D-glucosid) (SC50 = 9,2 ± 0,1 µM); 3-hydroxyphloretin 4’-[4’’,6’’-di-O-(S)- HHDP-β-D-glucosid] (SC50 = 10,3 ± 0,1 µM); 3-hydroxyphloretin (SC50 = 10,3 ± 0,1 µM) Các hợp chất trên thể hiện tác dụng mạnh hơn acid ascorbic (SC50 = 39,5 ± 0,1 µM) - Cắn aceton 80% (SC50 = 16,4 µg/ml) - Các hợp chất được phân lập Tanin thủy phân có hoạt tính mạnh hơn các hợp chất phenolic khác (SC50 từ 4,2 ± 0,1 µM đến 10,4 ± 0,1 µM) Phenolic glycosid có nhóm galloyl hay caffeoyl gắn vào [balaxiflorin A (SC50 = 21,1 ± 0,6 µM); balaxiflorin (= 6’-O-E-caffeoyl coniferin) (SC50 = 10,3 ± 0,3 µM)] cho thấy hoạt tính mạnh hơn so với các hợp chất phenolic tương ứng [lariciresinol 4’-O-β-D-glucopyranosid (SC50 = 242 ± 4 µM); coniferin (SC50 = 389 ± 6 µM)] - Với các acid phenolic, số lượng nhóm OH có vai trò quan trọng với hoạt tính dọn gốc tự do

b, Tác dụng kháng viêm và giảm đau

Đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng viêm và giảm đau của các loài

trong chi Balanophora. Các tác dụng này có thể liên quan đến công dụng của các

loài Balanophora trong dân gian như chữa nhức mỏi chân tay, đau toàn thân.

Năm 2003, thử nghiệm tiến hành trên mô hình mâm nóng của Ruan cho

thấy cao chiết methanol loài B. involucrata thể hiện tác dụng giảm đau, kháng

viêm tốt. Tác dụng giảm đau mạnh và tốt hơn so với chứng dương diclofenac.

Trên thử nghiệm đau quặn bằng acid acetic cho thấy cả hai mức liều của cao chiết

(20 g/kg và 12,5 g/kg) đều làm giảm số cơn đau quặn và kéo dài thời gian xuất

37

hiện trở lại cơn đau. Trong khi đó, tác dụng kháng viêm nghiên cứu trên mô hình

phù tai do xylol và tăng tính thấm mao mạch ở bụng của chuột. Kết quả cho thấy

cao chiết ức chế rõ rệt tình trạng sung tai ở chuột do xylol [138].

Trên cơ sở đó, năm 2006, Ruan và cộng sự sử dụng mô hình mâm nóng và

thử nghiệm đau quặn bằng acid acetic trên chuột nhắt trắng để sàng lọc các phân

đoạn cao chiết loài B. involucrata. Kết quả cho thấy phân đoạn n-butanol thể hiện

tác dụng giảm đau hiệu quả [97].

Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Chen và cộng sự đã đánh giá tác dụng

kháng viêm và giảm đau của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn của loài B.

spicata trên in vivo và của một số hợp chất phân lập từ phân đoạn n-hexan của

loài này trên in vitro. Kết quả cho thấy về tác dụng kháng viêm trên mô hình gây

phù chân chuột bằng carrageenan sử dụng chứng dương là indomethacin, dịch

chiết toàn phần loài B. spicata (ở các mức liều 50, 100, 250 mg/kg thể trọng) cũng

như dịch chiết các phân đoạn (ở mức liều 100 mg/kg) đều làm giảm mức độ phù

chân từ 1 giờ đến 5 giờ sau khi dùng carrageenan. Phân đoạn n-hexan thể hiện tác

dụng tốt hơn các phân đoạn khác trong khi lupeol acetat phân lập từ phân đoạn n-

hexan của loài này cũng cho thấy tác dụng giảm phù đáng kể ở liều 100 mg/kg,

tương đương với chứng dương indomethacin [32].

Năm 2020, Guo và cộng sự đánh giá tác dụng kháng viêm đại tràng của cao

chiết ethanol 70 % và cao phân đoạn polysaccharid loài B. polyandra trên mô

hình gây viêm đại tràng chuột cống bằng dextran sulfat sodium (DSS). Kết quả

cho thấy cao chiết ethanol 70 % loài B. polyandra ở mức liều 1000 mg/kg ức chế

đáng kể quá trình rút ngắn ruột kết trong khi cao chiết ethanol 70 % và cao phân

đoạn polysaccharid của loài này ở mức liều 1000 mg/kg làm giảm mức độ nghiêm

trọng viêm ruột kết ở đại tràng và giảm điểm số viêm ruột kết, giảm sự biểu hiện

của interleukin - 1β, yếu tố hoại tử khối u (TNF-α và enzyme tổng hợp nitric oxid

cảm ứng (iNOS) trên đại thực bào RAW264.7 gây bởi LPS [52].

38

c, Tác dụng hạ acid uric huyết thanh

Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Shang-Tse Ho và cộng sự đã đánh giá tác

dụng hạ acid uric máu của dịch chiết loài B. laxiflora trên chuột gây tăng acid uric

máu bằng Kali oxonat. Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase (XOD) in vitro

của cắn toàn phần và các phân đoạn ethylacetat, n-butanol, nước cho thấy phân

đoạn ethyl acetat của loài này thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase mạnh hơn

các phân đoạn còn lại. Bên cạnh đó, 2 hợp chất phân lập được từ phân đoạn ethyl

acetat của loài này là 1,3-di-O-galloyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-

glucopyranose (GHDGP) và 1-O-(E)-caffeoyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-

D-glucopyranose (CHDGP) cũng thể hiện tác dụng ức chế XOD mạnh.

Trên chuột gây tăng acid uric bằng kali oxonat, phân đoạn ethylacetat từ

loài nghiên cứu cũng như 2 hợp chất GHDGP và CHDGP cho thấy tác dụng giảm

nồng độ acid uric huyết thanh lần lượt là 23, 38, 53 % trong khi chứng dương

allopurinol giảm 83 % nồng độ acid uric huyết thanh [59].

d, Tác dụng kháng virus

Một tác dụng cũng đã được nghiên cứu của các loài thuộc chi Balanophora

đó là tác dụng ức chế HIV. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất 1,2,6-tri-O-

caffeoyl-β-D-glucopyranose (TCGP); 1,3-di-O-caffeoyl-4-O-galloyl-

glucopyranose (DCGGP) và 1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose (TGGP)

phân lập từ các loài B. japonica, B. laxiflora, B. harlandii có khả năng ức chế

mạnh HIV-1 liên quan đến đích gp41. Về cơ chế tác dụng, TCGP và DCGGP ức

chế sự hòa màng của pseudovirus HIV-1 với tế bào đích với giá trị IC50 lần lượt

là 5,5 ± 0,2 và 5,3 ± 0,1 µg/ml trong khi TGGP ức chế hình thành bó xoắn 6 HIV

gp41 với IC50 = 1,37 ± 0,19 µg/ml và ức chế sự hòa màng HIV qua trung gian

gp41 với màng tế bào đích [103] [122].

Sun và cộng sự đã đánh giá tác dụng ức chế neuraminidase (NA) in vitro

của các phân đoạn loài B. involucrata. Kết quả cho thấy phân đoạn ethyl acetat

thể hiện tác dụng mạnh nhất. Sử dụng hệ thống UHPLC-QToF-MS và kỹ thuật

39

docking để xác định các hợp chất cho hoạt tính ức chế cúm của cao chiết và tìm

ra các chất ức chế NA có nguồn gốc tự nhiên. Kết quả cho thấy, trong 20 hợp chất

được phát hiện trong phân đoạn ethyl acetat, quercitrin và phlorizin thể hiện tác

dụng ức chế NA tốt với IC50 lần lượt là 311,76 và 347,32 µmol/L [104].

e, Tác dụng hạ đường huyết

Nghiên cứu Jin-ying Tian và cộng sự năm 2007 đánh giá tác dụng hạ đường

huyết của dịch chiết ethanol 95% loài B. polyandra trên chuột gây tiểu đường

bằng alloxan cho thấy dịch chiết này có thể làm giảm đáng kể cả nồng độ đường

trong máu lúc đói và lúc no của chuột. Ở thử nghiệm dung nạp glucose đường

uống ở chuột tiểu đường bình thường và chuột tiểu đường gây ra bởi alloxan, dịch

chiết loài B. polyandra làm giảm cả nồng độ đường huyết cao nhất cũng như diện

tích dưới đường cong gây ra do dung nạp glucose [113].

Năm 2005, Tanaka và cộng sự đã phân lập và đánh giá tác dụng ức chế α-

glucosidase một số hợp chất từ loài B. tobiracola. Kết quả cho thấy các 3”-

galloyl-4”,6”-HHDP ester của các dihydrochalcon (phloretin và 3-

hydroxyphloretin) thể hiện tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh [109].

1.3.3. Nghiên cứu tại Việt Nam về tác dụng sinh học chi Balanophora

Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu trên loài Balanophora laxiflora. Các

tác dụng đã được nghiên cứu bao gồm tác dụng trên sinh sản, tác dụng hạ acid

uric, tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng viêm.

Nguyễn Thanh Hương và cộng sự đã có những nghiên cứu về hoạt tính

androgen của cao lỏng Tỏa dương (B. laxiflora) trên chuột cống đực non thiến và

chuột cống đực trưởng thành [17] cũng như đánh giá ảnh hưởng của cao chiết

nước Tỏa dương lên hành vi tình dục chuột cống đực trưởng thành [15]. Cụ thể,

cao lỏng Tỏa dương thể hiện hoạt tính androgen rõ rệt thông qua làm tăng nồng

độ testosteron trong máu và tăng khối lượng các cơ quan sinh dục phụ, tác dụng

phụ thuộc liều. Trong khi đó, trên chuột cống đực trưởng thành, cao chiết làm

tăng ham muốn tình dục, tăng hiệu quả giao cấu ở cả 3 mức liều (0,28 g/kg; 1,4

40

g/kg và 2,8 g/kg), tác dụng phụ thuộc vào thời gian dùng thuốc. Bên cạnh đó, độc

tính sinh sản và độc tính di truyền của dịch chiết nước Tỏa dương trên chuột nhắt

trắng cũng được đánh giá [14], [16].

Nhóm tác giả Nguyễn Thị Hồng Anh cũng đóng góp những nghiên cứu có

giá trị về tác dụng sinh học loài B. laxiflora. Trên mô hình gây tăng acid uric cấp

bằng kali oxonat, cao toàn phần B. laxiflora với liều 300 mg/kg/ngày, uống liên

tục trong 5 ngày có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt

trắng thực nghiệm, tỷ lệ giảm so với chứng bệnh là 30,2%. Bên cạnh đó, cao toàn

phần với liều 300 mg/kg thể hiện khả năng ức chế hoạt độ xanthin oxidase ở gan

chuột nhắt trắng với phần trăm ức chế là 8,3%, cơ chế tác dụng hạ acid uric có

thể do sự ức chế XOD [9]. Cao ethanol 80% và các cao chiết phân đoạn n-hexan,

ethyl acetat và cắn nước của loài B. laxiflora được sàng lọc tác dụng ức chế

xanthin oxidase in vitro. Phân đoạn ethyl acetat thể hiện tác dụng vượt trội trong

số các phân đoạn thử và khi so sánh với cao toàn phần (IC50 = 7,53 µg/ml). Trong

số 4 hợp chất phân lập từ phân đoạn này, hợp chất (21α)-22-hydroxyhopan-3-on

thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase mạnh nhất với giá trị IC50 = 26,79 µg/ml

và theo cơ chế ức chế không cạnh tranh [2].

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Anh cũng đã có những nghiên cứu

về tác dụng chống oxy hóa và kháng viêm trên thực nghiệm của Tỏa dương (B.

laxiflora). Cụ thể, trong cả hai thử nghiệm in vitro sàng lọc tác dụng dọn gốc tự

do DPPH và superoxid, phân đoạn ethyl acetat và cao toàn phần đều thể hiện tác

dụng và được đánh giá tác dụng kháng viêm in vivo bao gồm cả các mô hình gây

viêm cấp và mạn. Ở cả 2 mức liều 150 mg/kg và 300 mg/kg, cao toàn phần và

phân đoạn ethyl acetat loài này đều thể hiện tác dụng ức chế mức độ phù bàn chân

chuột tại các thời điểm 1, 3, 5, 7 giờ sau khi gây viêm trên mô hình gây viêm cấp;

cao toàn phần và cao phân đoạn ethyl acetat liều 300 mg/kg ức chế cả u hạt tươi

và khô, liều 150 mg/kg chỉ thể hiện tác dụng ức chế u hạt tươi trên mô hình gây

41

viêm mạn [1]. Một số hợp chất được phân lập từ loài này, bao gồm piceol và

ferulic aldehyd có thể có những đóng góp nhất định cho tác dụng kháng viêm

[24].

Như vậy, có thể thấy các nghiên cứu về tác dụng sinh học của chi

Balanophora ở Việt Nam chủ yếu được tiến hành trên loài B. laxiflora. Trong khi

đó, số lượng các loài cùng chi là khá nhiều, trên thực tế vẫn được sử dụng trộn

lẫn hoặc do nhầm lẫn.

1.4. Tổng quan về một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm thường

dùng và một số mô hình liên quan

Quá trình viêm đã được Celsus mô tả cách đây 2000 năm bằng bốn từ La-

tinh: rubor, calor, tumor và dolor (đỏ, nóng, sưng, đau). Quá trình viêm có các

giai đoạn khác nhau: giai đoạn đầu là do sự tăng tính thấm thành mạch dẫn đến

sự tiết dịch từ máu vào khoảng kẽ, giai đoạn thứ hai do sự xâm nhập của bạch cầu

từ máu vào các mô và giai đoạn thứ ba do sự hình thành u hạt. Theo đó, các xét

nghiệm và thử nghiệm kháng viêm nên được chia thành tình trạng viêm cấp tính,

viêm bán cấp và mãn tính [60].

1.4.1. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm in vitro

Việc sử dụng các mô hình in vitro trong sàng lọc các dược liệu có tiềm năng

kháng viêm sẽ giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Một số mô hình in vitro thường

dùng được trình bày trong bảng 1.13. Ngoài ra còn rất nhiều mô hình in vitro khác

được sử dụng trong nghiên cứu cơ chế kháng viêm [60], tuy nhiên các mô hình

này chưa được triến khai nhiều ở Việt Nam do cần nhiều yêu cầu về thiết bị, điều

kiện thí nghiệm.

Bảng 1.13. Một số mô hình in vitro nghiên cứu tác dụng kháng viêm

TT Nguyên tắc/Mục đích Tên mô hình

42

Mô hình ức chế giải phóng NO trên tế bào Nitric oxid (NO) là một chất trung gian hóa học, khi xảy ra viêm nhiễm, sẽ dẫn đến tăng một loạt các protein và tín hiệu. iNOS xúc tác sinh NO là cơ chế bệnh sinh chính của Thông số đánh giá % ức chế sản sinh NO và Tỷ lệ % tế bào sống

đại thực bào RAW264.7

sót ở các nồng độ, từ tính đó được giá trị IC50

sinh sản sẽ

Mô hình ức chế COX

Tỷ lệ % ức chế enzym COX ở các nồng độ, từ đó tính toán IC50

viêm nhiễm. Việc giảm sản xuất NO là mục tiêu tiềm năng để đánh giá tác dụng kháng viêm. Tế bào Đại thực bào RAW264.7 khi được kích thích phản ứng viêm bằng LPS sẽ giải phóng NO, định lượng NO giải phòng bằng thuốc thử Griess. [42] Cyclooxygenase (COX) là một trong hai enzym chính trong quá trình viêm phụ thuộc con đường acid arachidonic (AA). Theo đó, con đường COX ra prostaglandin và thromboxan. Khả năng ức chế COX được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm sàng lọc chất ức chế COX bằng xét nghiệm miễn dịch enzym theo hướng dẫn của nhà sản xuất [68]

sinh

Mô hình ức chế LOX linoleic Tỷ lệ % ức chế enzym LOX ở các nồng độ, từ đó tính toán IC50

Tương tự COX, 5-lipooxygenase (LOX) là một trong hai enzym chính trong quá trình viêm phụ thuộc con đường AA. Con đường 5-LOX ra eicosanoid và sản leucotriens. Hoạt tính ức chế LOX được nghiên cứu với acid làm cơ chất và enzym lipoxidase, ngoài ra có thể sử dụng enzym lipoxygenase tái tổ hợp ở người [74] [82]

Trong các phương pháp kể trên, mô hình ức chế giải phóng NO trên đại thực

bào RAW 264.7 có ưu điểm là độ nhạy cao và đặc hiệu [126]cũng như chi phí

không quá đắt. Trong khi đó, các mô hình ức chế COX và LOX là các mô hình

có tính đặc hiệu cao, chi phí tốn kém nên phù hợp sử dụng trong tìm hiểu cơ chế

kháng viêm của thuốc.

1.4.2. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng kháng viêm in vivo

Dựa trên nguyên nhân gây viêm, tiến triển của phản ứng viêm và các triệu

chứng lâm sàng, các mô hình viêm thực nghiệm được tạo ra để nghiên cứu tác

43

dụng kháng viêm.

1.4.2.1. Các mô hình gây viêm cấp và bán cấp

Dựa trên tiến triển của quá trình viêm, các mô hình gây viêm cấp và bán

cấp sau đây đã được thiết kế để đánh giá tác dụng kháng viêm của thuốc. (Bảng

1.14)

Bảng 1.14. Các mô hình gây viêm cấp và bán cấp

TT Nguyên tắc/Mục đích Thông số đánh giá Tên mô hình

Gây ban đỏ bằng tia cực tím trên chuột lang [60] Dựa vào phương pháp tính điểm để đánh giá mức độ ban đỏ trên chuột: 0 = không ban đỏ 1 = ban đỏ yếu 2 = ban đỏ mạnh 3 = ban đỏ rất mạnh

Gây tăng tính thấm thành mạch [60] Đường kính của các khu vực ngấm thuốc nhuộm được đo bằng milimét. Phần trăm ức chế ở các động vật được điều trị so với nhóm chứng được tính toán.

Gây phù tai chuột bằng oxazolon [60] Giá trị trung bình của sự gia tăng trọng lượng được tính toán cho từng nhóm được điều trị và so sánh thống kê với nhóm đối chứng. Mô hình được Wilhelmi mô tả lần đầu năm 1949, trong đó phenylbutazon và các NSAIDs có khả năng làm chậm sự phát triển ban đỏ do tia UV. Sau đó, phương pháp đã được mở rộng và cải tiến bằng các kích thích khác Đánh giá khả năng ức chế của các loại thuốc chống lại sự gia tăng tính thấm thành mạch do một chất gây viêm gây ra. Sự gia tăng tính thấm có thể được nhận biết bằng sự xâm nhập của các vị trí tiêm trên da với thuốc nhuộm Evans. Mô hình do Evans tiến hành lần đầu năm 1971, dựa trên phản ứng quá mẫn chậm của cơ thể với oxazolon, kết quả là kích thích làm vỡ hạt tế bào MAST, giải phóng các chất trung gian gây phù.

Gây phù tai chuột bằng dầu Ba đậu [60] Mô hình do Tonelli và cộng sự đề xuất năm 1965. Dầu ba đậu dùng tại chỗ gây giải phóng histamin là chất gây giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch và gây phù.

44

Hiệu quả điều trị được xác định bằng cách biểu thị sự gia tăng trọng lượng của tai được điều trị theo tỷ lệ phần trăm trọng lượng của tai đối chứng một bên.

như men phù

Gây phù chân chuột [60] Tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột biểu thị mức độ viêm cấp được tính toán. Từ đó tính % tỷ lệ % ức chế phù. Đánh giá khả năng của thuốc ức chế phù bàn chân sau của chuột sau khi tiêm các chất kích thích gây bia, formaldehyd, dextran, albumin trứng, carrageenan, kaolin…

Mô hình gây viêm màng phổi [60]

Viêm màng phổi là một hiện tượng viêm rỉ dịch phổ biến ở người. Gây viêm màng phổi trên động vật thí nghiệm bằng các chất kích thích.

Tính giá trị trung bình của thể tích dịch rỉ viêm ở mỗi lô và so sánh. Xác định một số thông số: số lượng bạch cầu trong dịch rỉ bằng máy đếm, hoạt tính enzym lysosom, trong fibronectin, PGE2.

Mô hình tạo túi u hạt [60] Giá trị trung bình của dịch rỉ của các nhóm được tính toán và so sánh sử dụng các phương tiện thống kê.

Mô hình tạo túi u hạt do Selye giới thiệu năm 1953 và được Robert và Nezamis cải tiến năm 1957. Dầu ba đậu được sử dụng như một chất kích thích gây ra tình trạng viêm bán cấp tương tự tình trạng viêm vô khuẩn do tăng một thể tích lớn dịch thoát mạch.

Mô hình gây viêm màng hoạt dịch bằng urat [60]

Một hệ thống tính điểm được áp dụng trong đó các triệu chứng viêm từ đau nhức, đi khập khiễng và đôi khi là dáng đi 3 chân đến dáng đi hoàn toàn bằng 3 chân được cho điểm từ 1+ đến 4+.

Sự lắng đọng của natri urat trong bệnh gút đã được biết đến. Faires và McCarty (1962) sau khi tiêm hỗn dịch natri urat 20 mg vào khớp gối của chính họ đã phải trải qua những cơn đau dữ dội và sự kiệt sức giống như một cơn gút cấp. Dựa trên kinh nghiệm này, họ đã phát triển thành mô hình để thử nghiệm các hợp chất kháng viêm.

1.4.2.2. Một số mô hình gây viêm mạn tính

Một số mô hình gây viêm mạn tính được trình bày trong bảng 1.15, bao gồm

45

mô hình gây u hạt thực nghiệm và mô hình gây viêm đa khớp thực nghiệm.

Bảng 1.15. Một số mô hình gây viêm mạn tính

TT Tên mô hình Nguyên tắc/Mục đích Thông số đánh giá

Mô hình gây thực u hạt nghiệm [60]

Khi đưa vào cơ thể vật lạ không có khả năng hấp thu như amian, bông… sẽ dẫn đến phản ứng của cơ thể là tập trung nhiều loại tế bào tạo ra mô bào lưới và nguyên bào sợi bao quanh vật lạ này, tạo thành một khối u gọi là u hạt thực nghiệm. Quá trình này tương tự với tiến triển của một viêm mạn tính. Một thuốc có khả năng ức chế hình thành u hạt sẽ góp phần điều trị các bệnh viêm mạn tính. trọng Tính lượng thực của u hạt và trọng lượng trung bình các lô. Từ đó tính tỷ lệ % ức chế u hạt của lô thử so với lô chứng.

Mô hình gây viêm đa thực khớp nghiệm [60]

Mô hình gây viêm đa khớp thực nghiệm bằng chất bổ trợ Freund (là hỗn hợp các vi khuẩn Mycobacterium đã chết được pha trong parafin lỏng hoặc dầu khoáng hoặc dầu thực vật) được thực hiện bởi Newbould B.B. Khi tiêm hỗn hợp này vào trong cơ thể chuột cống sẽ gây hội chứng giống viêm khớp. Ngoài ra, một mô hình gây viêm đa khớp thực nghiệm khác bằng Mycoplasma arthritis, theo phương pháp của Ward và Russel (1962), Wiesinger (1964).

trung Tỉnh bình tỷ lệ % tăng độ dày chuột chân trước khi tiêm và 13 ngày sau khi tiêm chất bố trợ. Từ đó tính tỷ lệ % ức tăng độ chế dày của lô thử so lô với chứng.

1.4.3. Một số mô hình nghiên cứu tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin

oxidase

Như đã biết, nồng độ acid uric trong máu tăng cao trong thời gian dài có thể

gây ra tình trạng các tinh thể urat kết tinh, lắng đọng lại các khớp và gây ra bệnh

gút cấp tính với nhiều triệu chứng, trong đó điển hình là tình trạng đau khớp dữ

dội và viêm, sưng tấy, nóng ở quanh khớp. Do đó, những thuốc hay dược liệu có

tác dụng hạ acid uric cũng góp phần ngăn chặn nguy cơ xảy ra tình trạng viêm do

bệnh gút. Trong các phương pháp, việc giảm tổng hợp acid uric là phương pháp

46

được ưa chuộng.

1.4.3.1. Một số mô hình in vitro

Mô hình in vitro được sử dụng nhiều nhất trong sàng lọc các dược liệu và

các hợp chất có tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase là mô hình đánh

giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro [88].

Xanthin oxidase xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthin và xanthin thành

acid uric. Có thể xác định sự tạo thành acid uric từ xanthin bằng phương pháp

quang phổ hấp thụ.

Xác định % ức chế xanthin oxidase ở các nồng độ khác nhau. Từ đó tính

toán giá trị IC50

1.4.3.2. Một số mô hình in vivo

Một số mô hình đánh giá tác dụng hạ acid uric trên in vivo được trình bày

trong bảng 1.16

Bảng 1.16. Một số mô hình đánh giá tác dụng hạ acid uric in vivo

TT

1 Tác dụng lợi tiểu và tăng đào thải acid uric trên chuột

Thông số đánh giá Bài tiết nước tiểu được tính bằng ml/kg. Acid uric, creatinin và ion bài tiết được tính bằng mmol/kg và được biểu thi bằng % so với nhóm chứng.

2

Tác dụng hạ acid uric trên mô hình gây tăng acid uric trên chuột bằng allantoxanamid Giá trị trung bình của nồng độ acid uric trong huyết tương tại các khoảng thời gian khác nhau và giá trị trung bình của acid uric đào thải sau 6 và 24 giờ được so sánh với nhóm chứng.

3

Tên mô hình Nguyên tắc/Mục đích Sự bài tiết acid uric qua thận gồm 3 thành phần: khả năng lọc cầu thận, sự tái hấp thu sau đó ở ống thận và sự bài tiết qua thận. Ở nhiều loài, uricase chuyển hóa acid uric thành allatoin. ức Allantoxanamid chế uricase và làm tăng acid uric tổng hợp nội sinh. Gây tăng acid uric huyết thanh của chuột bằng kali oxonat là một chất ức chế uricase.

47

Tác dụng hạ acid uric trên mô hình gây tăng acid uric trên chuột bằng kali oxonat Nồng độ acid uric và các chất điện giải trong máu và nước tiểu của động vật được điều trị bằng thuốc hay mẫu thử được so sánh thống kê với nhóm chứng.

Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu

2.1.1. Mẫu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là toàn cây của các loài thuộc chi Balanophora

J.R.&G.Forst. Mẫu thu được bao gồm cả cây mang hoa đực và cây mang hoa cái

(cây đơn tính khác gốc) hoặc cây mang cả hoa đực và hoa cái (cây đơn tính cùng

gốc).

- Mẫu ký hiệu BFI (15 kg tươi) được thu tại tỉnh Lào Cai, thị xã Sapa

(22°19’35”N; 103°48’21”E) vào tháng 1 năm 2017.

- Mẫu ký hiệu BFG (20 kg tươi) được thu tại tỉnh Lâm Đồng, VGQ Bidoup-Núi

Bà, (12°05’23”N; 108°27’10”E) vào tháng 1 năm 2016.

- Mẫu ký hiệu BS (2,5 kg tươi) được thu tại tỉnh Điện Biên, huyện Mường Lay

(22°03’56”N; 103°06’13”E) vào tháng 11 năm 2017.

- Mẫu ký hiệu BT (3 kg tươi) được thu tại tỉnh Lạng Sơn, huyện Bắc Sơn

(21°53’33’’N; 106°22’57’’E) vào tháng 1 năm 2018.

Trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, so sánh với tài liệu gốc và tài

liệu chuyên khảo, so với các tiêu bản đang lưu giữ tại các phòng tiêu bản thực vật

ở Việt Nam, xác định tên khoa học, xử lý danh pháp các mẫu nghiên cứu. Các

mẫu nghiên cứu sau khi thu hái được rửa sạch, một phần bảo quản trong hỗn hợp

ethanol-nước (1:1), một phần được xử lý ép tiêu bản lưu trữ, phần còn lại được

cắt lát, sấy khô trong tủ sấy có thông gió. Các mẫu được bảo quản trong các túi

PE kín để tiến hành nghiên cứu về hóa học (định tính bằng các phản ứng hóa học,

chiết xuất và phân lập hoạt chất, phân tích sắc ký) và đánh giá tác dụng sinh học

in vitro và in vivo.

2.1.1.1. Nguyên liệu cho nội dung nghiên cứu về hóa học

Từ toàn cây đã phơi khô của các mẫu nghiên cứu, ngâm chiết với methanol

48

3 lần thu được cắn methanol. Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn

methanol toàn phần. Phân tán cắn methanol trong nước và phân đoạn lần lượt với

các dung môi n-hexan và ethyl acetat. Sau đó các phân đoạn n-hexan và ethyl

acetat được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn tương ứng. Phần

nước còn lại được cô thu cắn nước.

Bảng 2.1. Khối lượng mẫu nghiên cứu và cắn toàn phần, cắn phân đoạn dùng trong nghiên cứu

Khối lượng cắn toàn phần Khối lượng cắn n-hexan Khối lượng cắn ethyl acetat

245 g 18 g 152 g

550 g 22 g 274 g

25 g 7 g 8 g

30 g 6 g 10 g Mẫu nghiên cứu (khối lượng khô) BFI (B. fungosa subsp. indica) (2,8 kg) BFG (B. fungosa var. globosa) (3,4 kg) BS (B. subcupularis) (205 g) BT (B. tobiracola) (200 g)

Cắn phân đoạn ethyl acetat được lựa chọn để phân lập các chất sử dụng sắc

ký cột, bên cạnh đó xác định một số thành phần có trong mẫu nghiên cứu sử dụng

hệ thống sắc ký lỏng khối phổ.

Phân đoạn n-hexan cũng được lựa chọn cho nghiên cứu thành phần hóa học

sử dụng một số phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí kết nối khối

phổ.

2.1.1.2. Nguyên liệu cho nội dung nghiên cứu về tác dụng sinh học và độc tính

Cắn chiết methanol của các mẫu nghiên cứu được sử dụng cho đánh giá một

số tác dụng in vitro.

Trên cơ sở kết quả đánh giá một số tác dụng in vitro (sẽ trình bày ở phần

kết quả), loài Dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen) được

lựa chọn để chiết xuất và đánh giá một số tác dụng kháng viêm in vivo và độc tính

49

cấp.

2.1.2. Hóa chất, dung môi

- Hóa chất dùng cho nghiên cứu đặc điểm hiển vi: javen, cloramin B, acid acetic,

xanh methylen, đỏ son phèn, nước cất, glycerin.

- Dung môi chiết xuất, phân đoạn và triển khai sắc ký cột: methanol, n-hexan,

ethyl acetat, aceton, dicloromethan là dung môi công nghiệp; nước cất hai lần;

acetronitril (Merck): đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích HPLC;

cloroform (CDCl3), methanol (MeOD), dimethylsulfosid (DMSO-d6), aceton-d6

đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích NMR.

- Bản mỏng tráng sẵn TLC silica gel 60 F254, HPTLC silica gel 60 F254 và RP-

HPTLC (Merck, Đức) dùng cho sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng hiệu năng

cao. Một số thuốc thử dùng cho sắc ký lớp mỏng bao gồm thuốc thử NP/PEG và

thuốc thử anisaldehyd. Hóa chất pha thuốc thử NP/PEG bao gồm 2-Aminoethyl

diphenyl borinat và Polyethylen glycol cung cấp bởi Sigma-Aldrich (Mỹ). Thuốc

thử Folin-Ciocalteu được cung cấp bởi Merck (Đức).

- Silica gel pha thường có cỡ hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh, Merk); silica

gel pha đảo RP-18, sephadex LH-20

- Chất đối chiếu sử dụng cho phân tích sắc ký bao gồm acid gallic, acid caffeic,

acid cinnamic, acid p-coumaric, kaempferol và lupeol được cung cấp bởi

Biopurify Phytochemical Ltd. (Trung Quốc).

- Tế bào RAW264.7 cung cấp bởi ATCC (American Type Culture Collection,

Manassas, VA, USA).

- Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium),

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), thuốc thử

Griess, LPS (lipopolysacharid) được mua từ nguồn Sigma-Aldrich (nay là Merck

KGaA, Darmstadt, CHLB Đức), Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).

- Acid uric ≥ 99%, dạng tinh thể, dùng cho nghiên cứu phát triển, Carrageenan,

50

Kali oxonat 97%, dùng cho nghiên cứu và phát triển, được mua từ Sigma Aldrich.

- Allopurinol (Zyloric 100): số lô G1987, hạn sử dụng tháng 02/2021. Diclofenac

(Voltaren 50 mg): số lô KM497, hạn sử dụng tháng 03/2021. Đây là các thuốc

được sử dụng làm chứng dương trong các mô hình dược lý để đánh giá tác dụng

in vivo của cao chiết. Cardamonin, Allopurinol được sử dụng làm chứng dương

trong các mô hình đánh giá tác dụng in vitro.

- Bộ hóa chất định lượng acid uric gồm hóa chất phản ứng và acid uric chuẩn

(BioSystems).

- Natri carbonat khan, natri hydroxyd, natri carboxymethyl cellulose (Na-CMC)

đạt tiêu chuẩn phân tích.

2.1.3. Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, cân nặng từ 18-22

g do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp.

Chuột cống trắng chủng Wistar, cả hai giống, khỏe mạnh, cân nặng 140-200

g do Học viện Quân y cung cấp.

Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm, ánh sáng tự

nhiên ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức

ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do tại

phòng nuôi động vật thí nghiệm của Bộ môn Dược lực, trường Đại hoc Dược Hà

Nội.

2.2. Thiết bị nghiên cứu

- Kính hiển vi quang học Leica, kính lúp soi nổi Stereo Blue (Euromex).

- Dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm

- Cột sắc ký sử dụng là cột thủy tinh với các chiều dài và đường kính khác nhau

(Φ 1 – 10 cm).

- Phổ cộng hưởng từ nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) đo trên máy Bruker

51

AM500 FT-NMR và máy Bruker Avance III HD (Bruker, Rheinstetten, Đức).

- Phổ khối lượng phân giải thường ESI-MS đo trên máy: + AGILENT 1260 LC-

MS single quadrupole system. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy

LTQ Orbitrap XLTM- Mass spectrometter tại Khoa hóa – trường Đại Học Khoa

học Tự Nhiên, máy API-Q-STAR PULSAR of Applied Biosystem, SCIEX X500

Q-TOF tại Viện Hóa Học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và

hệ thống HPLC-Q-ToF-MS tại Bộ môn Vệ sinh thực phẩm, Đại học Khoa học tự

nhiên Estonia. Hệ thống bao gồm máy sắc ký lỏng 1290 Inifinity (Agilent

Technologies, Waldbronn, Germany) kết hợp với khối phổ Agilent 6450 Q-TOF

được trang bị nguồn ion hóa phun mù điện tử Jetstream.

- Hệ thống sắc ký lỏng kết nối khối phổ phân giải cao (LC-HRMS) tại Trung tâm

Nghiên cứu và chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam. Hệ thống bao gồm máy sắc ký lỏng Exion LCTM kết hợp với khối phổ

X500R QTOF (Sciex, Mỹ).

- Hệ thống sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) tại Bộ môn Dược liệu bao gồm

hệ thống sắc ký khí Agilent 7890A kết nối với detector khối phổ 5975 inert XL.

Cột sắc ký sử dụng là cột DB-5MS (30m x 250 µm x 0.25 µm).

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) (CAMAG, Thụy Sĩ) tại Bộ

môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội. Hệ thống bao gồm máy tính có

cài đặt phần mềm visionCATs kết nối với bộ phận chấm mẫu CAMAG Linomat

5, bộ phận triển khai sắc ký tự động ADC-2, hệ thống chụp ảnh sắc ký Visualizer

II, hệ thống sấy hiện màu bản mỏng TLC plate heater (CAMAG, Thụy sĩ).

- Các dụng cụ sử dụng để pha mẫu, lấy mẫu và xét nghiệm: micropipet và đầu

côn tương ứng, ống microtube, dụng cụ thủy tinh, chày, cối sứ, mao quản, bơm

kim tiêm, ống nghiệm các loại.

- Máy sinh hóa TC-3300 Plus, máy đo thể tích bàn chân chuột Plethysmometer

LE 7500 (Letica Scientific Instruments)

52

- Thiết bị Infinite F50 (Tecan, Männedorf, Thụy Sỹ).

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu thực vật

- Tham khảo tài liệu nghiên cứu các loài Dó đất ở Việt Nam, nghiên cứu tiêu bản

các loài thuộc chi Dó đất ở các phòng tiêu bản thực vật ở Việt Nam để tìm hiểu

mùa ra hoa và các điểm phân bố.

- Tổ chức thu thập mẫu các loài Dó đất vào thời điểm ra hoa tại các điểm phân bố

đã được xác định theo phương pháp của Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) [20].

- Quan sát, chụp ảnh cây, mô tả các đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu. Lưu

ý một số đặc điểm quan trọng để phân biệt: cây đơn tính khác gốc hay đơn tính

cùng gốc; cấu trúc và bề mặt “củ” (do thân thoái hóa tạo thành); số lượng, cách

sắp xếp của lá trên cuống cụm hoa; hình dáng cụm hoa; vị trí của hoa đực so với

hoa cái, hoa đực (không cuống/có cuống, số lượng cánh hoa, bao phấn…), hoa

cái (cấu trúc, kích thước, vị trí…). Thiết bị sử dụng bao gồm: Kính lúp soi nổi,

máy ảnh kỹ thuật số, thước kẻ chia vạch đến 0,5 mm. Xác định tên khoa học của

các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp hình thái so sánh, tham khảo các tài liệu

như Thực vật chí Campuchia, Lào, Việt Nam (1973) [130], Thực vật chí

Malesiana (1976) [54], Thực vật chí Thái Lan (1970) [53], tài liệu chuyên khảo

về chi Balanophora của B. Hansen (1972) [55] và Thực vật chí Trung Quốc

(1988) [120].

- Sử dụng kính hiển vi quang học để nghiên cứu hình thái hạt phấn của các loài

Balanophora. Hạt phấn được xử lý theo phương pháp acetolyse của G. Erdtman

(1960) [45]. Khi quan sát hạt phấn trên kính hiển vi Leica có kết nối camera, hình

dạng và bề mặt hạt phấn là những đặc điểm quan trọng cần lưu ý, khi phân tích

hình thái hạt phấn cần quan sát hạt phấn ở hai vị trí là vị trí cực và vị trí xích đạo.

Xác định và đo kích thước trục xích đạo hoặc đường kính lớn nhất của hạt phấn

(E), đường thẳng nối liền hai cực của hạt phấn hay trục cực (P) và tính tỷ lệ P/E

để sơ bộ xác định hình dạng và kích thước hạt phấn. Với mỗi mẫu, phép đo thực

53

hiện trên ít nhất 5 hạt phấn để lấy giá trị trung bình.

- Mô tả đặc điểm vi phẫu “củ” và lá: cắt vi phẫu “củ” và lá của các mẫu nghiên

cứu bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay. Chọn các lát cắt mỏng, nguyên vẹn, tẩy

bằng cloramin B, rửa bằng nước, tẩy sạch cloramin B bằng acid acetic 5%. Sau

đó vi phẫu được nhuộm theo phương pháp nhuộm kép với xanh methylen và đỏ

son phèn. Lên tiêu bản trong glycerin, quan sát dưới kính hiển vi và mô tả đặc

điểm của vi phẫu, chụp ảnh.

- Đặc điểm bột: toàn cây sau khi sấy khô được tán thành bột, rây qua rây kích

thước 180 µm. Lên tiêu bản bột trong nước, quan sát dưới kính hiển vi, mô tả các

đặc điểm của bột, chọn các đặc điểm điển hình để chụp ảnh.

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.2.1. Định tính các nhóm chất trong các loài nghiên cứu

Toàn cây đã cắt lát, phơi khô của các loài nghiên cứu được nghiền thành bột

thô. Định tính các nhóm hợp chất chính trong các mẫu nghiên cứu bằng các phản

ứng hóa học theo các tài liệu: Dược liệu học 1 [21], Dược liệu học 2 [18], Phương

pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc [11].

2.3.2.2. Phân lập hợp chất từ các loài nghiên cứu

Quá trình phân lập hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat chủ yếu sử dụng

phương pháp sắc ký cột (CC) kết hợp với một số phương pháp sắc ký khác như

sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC). Việc theo dõi các phân đoạn trong quá trình

sắc ký cột cũng như các chất phân lập được thực hiện bằng sắc ký lớp mỏng trên

bản mỏng.

Các thông số cụ thể của các phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu:

- Sắc ký cột (CC):

+ Cột sắc ký sử dụng là cột thủy tinh với các chiều dài và đường kính khác nhau.

+ Pha tĩnh: silica gel pha thuận cỡ hạt 63 – 200 µm hoặc 40 – 63 µm, sephadex

54

LH20

+ Pha động: lựa chọn dung môi rửa giải là hỗn hợp của một số dung môi như:

dicloromethan, methanol, nước, ethylacetat, aceton, n-hexan.

- Sắc ký lớp mỏng (TLC):

+ Bản mỏng sau khi triển khai sẽ được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở các bước

sóng λ = 254nm và λ = 366nm. Sau đó bản mỏng có thể dược nhúng/phun trong

dung dịch vanillin-acid sulfuric và sấy ở nhiệt độ 110 ºC trong khoảng thời gian

từ 3 – 5 phút để hiện màu các vết.

- Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC): Trong một số trường hợp như cần phân lập

các chất với lượng rất ít hoặc để tinh chế, phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế

có thể được sử dụng.

2.3.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất được phân lập

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ khối (MS) và

phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).

2.3.2.4. Triển khai sắc ký lớp mỏng một số loài nghiên cứu

Sắc ký lớp mỏng của các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G. Forst. được

triển khai sử dụng hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao.

Sử dụng CAMAG Linomat 5 để đưa mẫu lên bản mỏng. Bản mỏng được

triển khai trong bình đôi CAMAG hoặc có sử dụng hệ thống ADC-2 cho phép

kiểm soát các thông số của quá trình sắc ký. Sắc ký đồ dịch chiết/cắn các loài

nghiên cứu sau khi triển khai ở một số hệ dung môi thích hợp được chụp ảnh ở

các bước sóng λ = 254nm, λ = 366nm và sau khi dẫn xuất hóa/hiện màu bằng

thuốc thử thích hợp. Dữ liệu hình ảnh được phân tích về số lượng, vị trí các vết,

cường độ các vết sử dụng phần mềm visionCATs và có thể là các kết quả bước

đầu nhằm xây dựng các “finger printing” cho các loài nghiên cứu. Bên cạnh đó,

từ kết quả sắc ký lớp mỏng cũng có thể sơ bộ xác định sự tương đồng/khác biệt

55

về thành phần hóa học các loài hoặc các taxa cùng chi.

2.3.2.5. Phân tích thành phần hóa học sử dụng sắc ký lỏng kết nối khối phổ

Phương pháp sắc ký lỏng kết nối khối phổ phân giải cao hai lần khối phổ

được sử dụng để sơ bộ xác định các hợp chất phenolic trong cắn phân đoạn ethyl

acetat của các mẫu nghiên cứu. Để chuẩn bị mẫu phân tích, 10 mg cắn của mỗi

mẫu được hòa trong methanol, sau đó lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm để

phân tích.

2.3.2.6. Phân tích thành phần triterpenoid trong phân đoạn n-hexan của các loài

nghiên cứu sử dụng sắc ký khí kết nối khối phổ

Hệ thống sắc ký khí kết hợp khối phổ được sử dụng để xác định sự có mặt

của các hợp chất triterpenoid trong phân đoạn n-hexan của các loài thuộc chi

Balanophora. Cắn phân đoạn n-hexan của các loài nghiên cứu (10 mg) được hòa

tan trong 5 mL hỗn hợp n-hexan – cloroform (1:4). Sau đó hỗn hợp được chiết

pha rắn qua cột silica gel để thu được dung dịch sử dụng cho phân tích sắc ký khí

ghép nối khối phổ.

Khí mang sử dụng là khí helium, tốc độ dòng 1 mL/min. Một số thông số

hệ thống được cài đặt như sau: nhiệt độ inlet và transfer line là 300 °C, chương

trình nhiệt độ lò cột bắt đầu từ 200 °C và giữ trong 3 phút, sau đó tăng nhiệt độ

với tốc độ 2 °C/phút tới 300 °C. Tổng thời gian phân tích mẫu là 53 phút. Detector

khối phổ được cài đặt để quét các mảnh ion trong khoảng m/z 40-550 với điện thế

ion hóa 70 eV.

Các thành phần được xác định bằng cách so sánh phổ khối với dữ liệu trong

thư viện NIST 08 sử dụng phần mềm NIST MS search 2.0 và các chất đối chiếu.

2.3.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần

Polyphenol là nhóm các hợp chất hóa học có chứa hai hay nhiều nhóm chức

hydroxyl (-OH) gắn với vòng hydrocarbon thơm. Các loài thuộc chi Balanophora

J.R.&G.Forst. chứa lượng lớn các hợp chất polyphenol bao gồm các tanin thủy

56

phân được, một số acid phenolic (acid hydroxybenzoic và acid hydroxycinnamic)

và các lignan... Các hợp chất này có liên quan đến một số tác dụng đã được nghiên

cứu trên một số loài thuộc chi Balanophora như tác dụng dọn gốc tự do, tác dụng

hạ đường huyết... Hàm lượng polyphenol có thể ảnh hưởng đến chất lượng và tác

dụng của dược liệu. Do đó chúng tôi tiến hành định lượng polyphenol toàn phần

bằng phương pháp quang phổ hấp thụ sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu theo tài

liệu [102] có hiệu chỉnh cho phù hợp. Thuốc thử Folin Ciocalteu 10% được pha

trong nước. Phương pháp sử dụng để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần

trong mẫu cao đánh giá tác dụng in vivo (EBF). Cách tiến hành cụ thể như sau:

Dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 2,5 mg acid gallic chuẩn, hòa

tan bằng methanol trong bình định mức 25 mL, thêm methanol vừa đủ đến vạch.

Pha loãng để được dãy dung dịch chuẩn nồng độ 20 µg/mL, 40 µg/mL, 60 µg/mL,

80 µg/mL, 100 µg/mL.

Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,1 g cao, hòa tan bằng methanol

trong bình định mức 50 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch. Hút 1 ml dịch thêm

vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ được dung dịch mẫu thử.

Tiến hành: Thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% pha trong nước. Lần lượt cho 1

mL mỗi dung dịch acid gallic chuẩn (nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 µg/mL) vào bình

định mức 10 mL, thêm 2,5 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% và để phản ứng

trong 5 phút. Sau đó thêm vào 5 mL dung dịch Na2CO3 2%, định mức bằng nước

cất hai lần. Sau 60 phút phản ứng ở nhiệt độ phòng, xác định độ hấp thụ bằng máy

đo quang phổ ở bước sóng 754,5 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Giá trị A

được ghi nhận và tiến hành xây dựng đường tuyến tính để xác định hàm lượng

polyphenol toàn phần. Mẫu thử được tiến hành theo quy trình tương tự.

Khoảng nồng độ tuyến tính: Khoảng tuyến tính được xác định dựa trên dãy

dung dịch gallic chuẩn nồng độ 20 – 100 µg/mL. Yêu cầu đường hồi quy có dạng

đường thẳng, hệ số r2 ≥ 0,99. Mẫu trắng chuẩn bị song song.

57

Định lượng polyphenol trong các mẫu thử

C =

D − b a

Nồng độ dung dịch đo quang được tính theo công thức:

Trong đó:

C: Nồng độ dung dịch đo quang (µg/mL);

a, b: hệ số của phương trình đường chuẩn của acid gallic;

D là độ hấp thụ quang của dung dịch đo quang của mẫu thử ở bước sóng

754,5 nm;

Từ đó, hàm lượng polyphenol toàn phần sẽ được tính bằng cách quy về

lượng tương đương với chất chuẩn acid gallic. Kết quả được biểu diễn bằng số

mg tương đương acid gallic trong 1 g dược liệu khô tuyệt đối (mg GAE/g dược

C x 10−3x V x K

liệu), theo công thức:

Mdl x (100−a)x 10−2 (mg GAE/g dược liệu)

X =

Trong đó:

X: Hàm lượng polyphenol toàn phần của mẫu thử (mg GAE/g dược liệu);

C: Nồng độ dung dịch đo quang của mẫu thử (µg/mL);

V: Thể tích dung dịch (25 mL); K: Hệ số pha loãng;

Mdl : Khối lượng dược liệu (g); a: Độ ẩm dược liệu (%).

Thẩm định phương pháp:

Phương pháp được mô tả được thẩm định về độ phù hợp hệ thống, khoảng

tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng

(LOQ) cũng như độ vững theo hướng dẫn của ICH [63].

2.3.3. Phương pháp đánh giá một số tác dụng in vitro

Một số mô hình in vitro được sử dụng để sơ bộ đánh giá tác dụng của cắn

methanol các mẫu nghiên cứu, qua đó lựa chọn một mẫu có tiềm năng cho nghiên

cứu in vivo. Cao chiết methanol của mỗi mẫu được pha trong DMSO ở các nồng

58

độ 100, 50, 30, 10, 3 µg/mL.

2.3.3.1. Phương pháp đánh giá tác dụng kháng viêm thông qua ức chế sản sinh

NO

Tác dụng ức chế sản sinh nitric oxid được đánh giá trên mô hình tế bào

RAW 264.7 dựa trên các tài liệu đã công bố [38] [41].

oC, 5% CO2, 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphat. Sau đó dịch tế bào

Tế bào RAW 264.7 được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường DMEM ở 37

được chuyển lên phiến 96 giếng với mật độ 2,5 × 105 tế bào/giếng. Tế bào được

kích thích với 2 µL LPS (0,1 mg/mL) trong 24 giờ và bổ sung thuốc/mẫu thử ở

các nồng độ khác nhau. Cardamonin được sử dụng làm đối chứng dương. Dịch

huyền phù của tế bào được ủ với thuốc thử Griess, NaNO2 ở các nồng độ khác

nhau để xây dựng đường chuẩn. Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo ở 570

nm.

Phần trăm ức chế được tính theo công thức:

I%= ([XTB]mẫu - [XTB]LPS)/([XTB]ĐC - [XTB]LPS) x100

Trong đó: [XTB] là nồng độ NO trung bình tính dựa trên đường chuẩn

NaNO2.

Bên cạnh đó, tỷ lệ sống sót của tế bào cũng được tính toán. Phần tế bào còn

lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính in vitro được bổ sung dung dịch

MTT (0,5mg/mL trong PBS), ủ 4 giờ trong tủ ấm ở 37 oC với 5 % CO2. Sau đó

hút bỏ hết môi trường trên bề mặt. Sản phẩm chuyển hóa dạng tinh thể formazan

được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich) và đo mật độ

quang ở λ = 540 nm hoặc 720 nm trên thiết bị Infinite F50 (Tecan, Männedorf,

Thụy Sỹ).

Tỷ lệ sống sót của tế bào CS% (Cell survival) tính theo % so với đối chứng:

Tỷ lệ ức chế tế bào (%) = [(OD[mẫu]/OD[đối chứng (-)]) x 100] ± 𝜎

59

Độ lệch chuẩn:

2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym xanthin oxidase in vitro

Hoạt tính ức chế enzym xanthin oxidase in vitro được đánh giá dựa trên

phương pháp được mô tả bởi Noro và cộng sự [88] có sự điều chỉnh cho phù hợp

với điều kiện thực tế phòng thí nghiệm.

Nguyên tắc: Hoạt độ enzym xanthin oxidase (XOD) được xác định bằng

phương pháp đo quang dựa trên phản ứng oxy hóa xanthin thành acid uric có sự

xúc tác của enzym xanthin oxidase:

Hoạt độ XOD tỷ lệ với lượng acid uric định lượng được bằng phương pháp

đo quang ở bước sóng 290 nm

Tiến hành:

Hoà tan các cắn dịch chiết dược liệu trong DMSO để thu được dung dịch

gốc có nồng độ 10mg/ml. Dung dịch gốc tiếp tục được pha loãng bằng đệm

phosphat thành các dung dịch có nồng độ 10 μg/ml, 50 μg/ml và 100 μg/ml để

thực hiện các phản ứng enzym. Đánh giá tác dụng ức chế enzym XOD in vitro

trên đĩa UV 96 giếng đáy phẳng Costar 3635, đo độ hấp thụ ở 290nm trên hệ

thống ELISA gồm máy đọc khay (Biotek) và máy ủ lắc khay (Awareness).

Quy trình thí nghiệm được trình bày ở hình 2.1.

60

Hình 2.1. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế XOD in vitro

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

I (%) =

x 100%

ΔODchứng − ΔODthử ΔODthử

Thông số đánh giá:Tính I (%) ức chế tính theo công thức:

(Trong đó ΔOD: độ hấp thụ quang; ΔODchứng = ODchứng – ODtrắng chứng;

ΔODthử = ODthử – ODtrắng thử)

Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cắn methanol toàn phần của

các mẫu nghiên cứu được đánh giá dựa trên giá trị IC50, là giá trị nồng độ (tính

toán theo lý thuyết) tại đó mẫu thử ức chế 50% sự tạo thành acid uric trong hỗn

hợp phản ứng so với mẫu chứng. Xác định IC50 của mẫu nghiên cứu cùng ± SD

hoặc khoảng tin cậy bằng phương pháp phân tích hồi quy sử dụng phần mềm

Graphpad prism 8.0 và SPSS 22.

Allopurinol được sử dụng làm chứng dương.

2.3.4. Phương pháp đánh giá tác dụng sinh học in vivo

Lựa chọn loài Dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen)

cho nội dung đánh giá một số tác dụng in vivo. 300 gam bột thô của loài Dó đất

(chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô 4,84 %), được chiết hồi lưu với ethanol 70%

3 lần, mỗi lần 1200 mL trong 2 giờ, gạn thu lấy dịch chiết. Gộp các dịch chiết,

lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 117,28 gam cao chiết

ethanol Dó đất (EBF), chỉ tiêu về mất khối lượng do làm khô của cao chiết là

18,35 %. Cao chiết EBF được đánh giá hàm lượng polyphenol toàn phần. Kết quả

nghiên cứu cho thấy hàm lượng polyphenol tương đối cao (250,23 ± 0,19 mg

GAE/g) trong cao chiết EBF.

2.3.4.1. Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng cấp

acid uric bằng kali oxonat

Đánh giá tác dụng hạ acid huyết thanh của cao chiết ethanol của một loài

nghiên cứu trên mô hình gây tăng cấp acid uric bằng kali oxonat (KO) trên chuột

61

nhắt trắng [8], [72]. Liều cao chiết ethanol sử dụng trong nghiên cứu: từ liều Dó

đất sử dụng trong dân gian là 6-12 gam dược liệu/50 kg/ngày, tính toán và ngoại

suy sang liều sử dụng trên động vật nghiên cứu. Lựa chọn 3 mức liều 300, 600 và

900 mg/kg để tiến hành nghiên cứu với chuột nhắt trắng.

Thiết kế thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên vào 6 lô:

- Lô 1 (lô chứng): uống dung môi pha thuốc Na-CMC 0,5% + tiêm KO.

- Lô 2 (lô chứng sinh lý): uống dung môi pha thuốc Na-CMC 0,5%

- Lô 3 (lô chứng dương): uống thuốc đối chiếu allopurinol 10 mg/kg + tiêm KO.

- Lô 4 (cao Dó đất 1): uống cao chiết Dó đất liều 300 mg/kg + tiêm KO.

- Lô 5 (cao Dó đất 2): uống cao chiết Dó đất liều 600 mg/kg + tiêm KO.

- Lô 6 (cao Dó đất 3): uống cao chiết Dó đất liều 900 mg/kg + tiêm KO.

Chuột được cho uống dung môi pha thuốc, thuốc đối chiếu hoặc mẫu thử

với thể tích 0,1 ml/10 g chuột vào 1 giờ nhất định trong 4 ngày liên tục. Trước

khi uống thuốc hoặc dung môi 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống

nước bình thường.

Gây tăng acid uric: Ngày thứ năm, chuột ở các lô được tiêm màng bụng kali

oxonat với liều 500 mg/kg một giờ trước khi uống thuốc lần cuối.

Lấy mẫu xử lý máu: Sau khi cho chuột uống thuốc 2 giờ, lấy máu từ xoang

hốc mắt chuột, để lắng tự nhiên trong khoảng 1 giờ ở nhiệt độ phòng rồi đem ly

tâm với tốc độ 3.500-4000 vòng/phút trong 10 phút. Định lượng acid uric bằng

phương pháp đo quang ở bước sóng 520 nm trên máy sinh hóa TC -3300 Plus.Quy

trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.2.

62

Hình 2.2. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric máu trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat

Thông số đánh giá:

Tác dụng hạ acid uric huyết thanh được đánh giá thông qua tỷ lệ giảm nồng

độ acid uric của lô thử với lô chứng:

I (%) = x 100 Cc − Ct Cc

Trong đó:

Cc, Ct: Nồng độ acid uric huyết thanh của lô chứng và lô thử (µmol/l);

I (%): Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng.

2.3.4.2. Đánh giá tác dụng kháng viêm cấp trên mô hình gây phù bằng

carrageenan

Tác dụng kháng viêm cấp của cao chiết được đánh giá trên mô hình gây phù

bằng carrageenan theo Winter trên chuột chống trắng [119].

Thiết kế thí nghiệm

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên vào 4 lô:

- Lô 1 (lô chứng bệnh): uống dung môi pha thuốc Na-CMC 0,5%.

- Lô 2 (lô chứng dương): uống diclofenac liều 20 mg/kg.

- Lô 3 (cao Dó đất 1): uống cao chiết Dó đất liều 350 mg/kg.

- Lô 4 (cao Dó đất 2): Uống cao chiết Dó đất liều 500 mg/kg.

Chuột được uống dung môi pha thuốc, diclofenac, mẫu thử với cùng thể tích

0,1 ml/10 g cân nặng vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 4 ngày trước

khi gây viêm. Trước khi dùng chế phẩm 90 phút, chuột không được ăn nhưng

được uống nước bình thường. Vào ngày thứ năm, một giờ sau khi uống Na-CMC

0,5%, diclofenac hoặc mẫu thử lần cuối cùng, chuột được gây viêm bằng cách

tiêm 0,1 ml hỗn dịch carrageenan 1 % đã được chuẩn bị vào dưới da gan bàn chân

sau bên phải của từng chuột. Đo thể tích bàn chân sau bên phải của chuột tới khớp

cổ chân bằng máy đo thể tích bàn chân chuột Plethysmometer LE 7500 (Letica

63

Scientific Instrucments) tại các thời điểm: trước khi tiêm carrageenan (Vo), sau

khi tiêm carrageenan một giờ (V1), ba giờ (V3), năm giờ (V5) và bảy giờ (V7). Quy

trình tiến hành thí nghiệm được mô tả ở hình 2.3.

Hình 2.3. Quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng kháng viêm cấp in

vivo trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan

Thông số đánh giá

- Thể tích bàn chân sau bên phải của từng chuột.

ΔV (%) =

x 100

Vt − Vo Vo

- Mức độ phù bàn chân sau bên phải của từng chuột được tính theo công thức:

Trong đó:

∆V (%): Mức độ phù bàn chân sau bên phải chuột tại thời điểm t giờ sau khi tiêm

carrageenan.

Vo: Thể tích bàn chân sau bên phải chuột tại thời điểm trước khi tiêm carrageenan.

Vt: Thể tích bàn chân sau bên phải chuột tại thời điểm t giờ sau khi tiêm

64

carrageenan.

- Phần trăm ức chế phù của lô thử/lô chứng dương so với lô chứng bệnh được tính

I (%) =

𝑥 100

ΔVc − ΔVt ΔVc

theo công thức:

Trong đó:

I (%): Phần trăm ức chế phù của lô thử/lô đối chiếu so với lô chứng bệnh.

∆Vc: Mức độ phù bàn chân chuột trung bình của lô chứng bệnh.

∆Vt: Mức độ phù bàn chân chuột trung bình của lô thử/lô chứng dương.

2.3.4.3. Phương pháp đánh giá tác dụng kháng viêm trên mô hình gây viêm màng

hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat

Áp dụng mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat

của McCarty và Faires [49].

Chuẩn bị hỗn dịch tinh thể natri urat. Hòa tan 0,4 g (0,01 mol) natri hydroxyd

trong 400 ml nước cất. Thêm 1,68 g (0,01 mol) acid uric, khuấy đều, siêu âm đến

khi acid uric tan hoàn toàn. Để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Lọc hút chân không

thu được tinh thể natri urat, rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý lạnh. Sấy khô bằng

tủ sấy ở 60oC. Cân tinh thể natri urat khô, nghiền mịn và tạo lại hỗn dịch bằng

nước muối sinh lý ngay trước khi làm thí nghiệm. Hỗn dịch natri urat thu được có

nồng độ 48 mg/ml.

Thiết kế thí nghiệm

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên vào 4 lô:

- Lô 1 (lô chứng bệnh): uống dung môi pha thuốc Na-CMC 0,5%.

- Lô 2 (lô chứng dương): uống diclofenac liều 20 mg/kg.

- Lô 3 (cao Dó đất 1): uống cao chiết Dó đất liều 350 mg/kg.

- Lô 4 (cao Dó đất 2): uống cao chiết Dó đất liều 500 mg/kg.

Chuột được uống dung môi pha thuốc, diclofenac hoặc mẫu thử với cùng

thể tích 0,1 ml/10 g chuột vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 4 ngày

65

trước khi gây viêm. Ngày thứ 5, chuột được uống các chế phẩm lần cuối. Một giờ

sau khi uống thuốc, chuột được tiêm 0,05 ml hỗn dịch natri urat vào khớp gối

chân sau, bên phải của chuột.

Quan sát đồng thời quay video ghi lại biểu hiện di chuyển của từng chuột

trên mặt phẳng tại ba thời điểm sau khi tiêm 4, 5, 6 giờ. Quy trình tiến hành thí

nghiệm được mô tả ở hình 2.4.

Hình 2.4. Quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng kháng viêm trên mô

hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối

Thông số đánh giá

Điểm mức độ viêm khớp chân chuột dựa trên triệu chứng vào thời điểm 4,

5, 6 giờ sau khi tiêm natri urat tính theo thang điểm được mô tả trong bảng 2.2.

Ba quan sát viên được thống nhất cách đánh giá điểm đau trước khi làm thực

nghiệm chính thức và áp dụng phương pháp làm mù trong quá trình làm thực

nghiệm. Kết quả cuối cùng được ghi nhận từ kết quả của 3 quan sát viên độc lập.

Khi có mâu thuẫn, xem lại video để đánh giá kiểm chứng.

Bảng 2.2. Thang điểm đánh giá mức độ viêm khớp dựa trên triệu chứng

Triệu chứng Mô tả Điểm

66

1 Không thể hiện rõ triệu chứng Chuột không có hoặc không thể hiện rõ biểu hiện di chuyển bất thường

Đi khập khiễng 2

Chuột đi tập tễnh trong toàn bộ thời gian di chuyển, chân có khớp bị đau vẫn tham gia vào quá trình di chuyển

3 Đi bằng ba chân không liên tục Chân đi tập tễnh nhưng thỉnh thoảng chân có khớp bị đau không thể tham gia vào quá trình di chuyển, phải kéo lê hoặc co chân

4 Đi hoàn toàn bằng ba chân Chân có khớp bị đau không thể tham gia vào quá trình di chuyển, không thể cử động khớp bị viêm, phải kéo lê hoặc co chân

2.3.4.4. Đánh giá độc tính cấp

Đánh giá độc tính cấp trên chuột nhắt trắng theo hướng dẫn tại thông tư kèm

quyết định 371/BYT-QĐ của Bộ Y tế về “Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu

lực của thuốc cổ truyền” [6] và hướng dẫn số 420 của OECD [89]. LD50 được tính

theo phương pháp của Litchfield-Wilcoxon (1949) [75].

Thiết kế thí nghiệm

Chuột nhắt trắng, giống cái, được nhịn ăn 3 giờ trước khi thí nghiệm. Kiểm

tra cân nặng trước khi thử nghiệm.

- Cách dùng: đưa mẫu thử theo đường uống với thể tích tối đa 0,2 mL/10 g chuột

/ lần.

- Sau khi uống thuốc 2 giờ, chuột được cho ăn trở lại, uống nước bình thường.

- Sau khi thăm dò trên một số chuột hạn chế (thử nghiệm thăm dò), động vật thí

nghiệm được chia thành từng lô, mỗi lô 10 động vật (thử nghiệm chính thức). Tùy

theo kết quả của thử nghiệm thăm dò để lựa chọn các mức liều cho thử nghiệm

chính thức. Thông thường, thiết kế thí nghiệm với lô đầu uống liều tối đa không

gây chết động vật nào và lô cuối cùng uống liều tối thiểu gây chết toàn bộ động

67

vật.

- Theo dõi động vật trong vòng 14 ngày sau khi dùng mẫu thử (theo dõi liên tục

trong vòng 4 giờ, theo dõi thường xuyên trong vòng 72 giờ sau khi uống chế phẩm

thử lần cuối).

Theo dõi đánh giá

- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi),

lông, tiết dịch, phản xạ với kích thích, phân, nước tiểu…

- Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống.

- Số động vật chết: xác định tỉ lệ động vật chết ở các lô trong vòng 72 giờ để tính

toán LD50.

- Khi có động vật chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng. Nếu có dấu

hiệu đáng nghi ngở mà không xác định được rõ nguyên nhân, nếu cần, làm thêm

vi thể để xác định nguyên nhân.

- Tiếp tục theo dõi động vật cho đến 14 ngày sau khi uống chế phẩm thử.

Như vậy, từng đối tượng mẫu nghiên cứu cụ thể được lựa chọn cho các nội

dung nghiên cứu của luận án. Sơ đồ tóm tắt các nội dung và phương pháp nghiên

cứu của luận án được trình bày trong hình 2.5.

2.4. Xử lý số liệu

Số liệu được lưu trữ và xử lý bằng phần mềm Graphpad prism 8.0 và SPSS

version 20.0.

Xác định LD50 (nếu có) bằng phương pháp phân tích hồi qui probit trên phần

mềm SPSS.

Đối với các số liệu tuân theo phân phối chuẩn, kết quả được biểu diễn dưới

dạng Mean ± SE (Mean: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn). Sử dụng phân tích

one - way ANOVA kèm hậu kiểm để so sánh giá trị trung bình giữa các lô.

Đối với các số liệu không tuân theo phân bố chuẩn, dữ liệu được biểu diễn

dưới dạng trung vị và khoảng (giá trị cực đại – giá trị cực tiểu), sử dụng kiểm định

Kruskal wallis để so sánh giữa các lô, test Mann-Whitney U để so sánh kết quả

68

giữa hai lô. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt các nội dung và phương pháp nghiên cứu của luận án 2.5. Địa điểm thực hiện

- Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội.

- Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội.

- Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

- Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam.

69

- Bộ môn Vệ sinh thực phẩm, Đại học Khoa học tự nhiên Tartu, Tartu, Estonia

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật

3.1.1. Kết quả nghiên cứu về hình thái thực vật và xác định tên khoa học các

mẫu nghiên cứu

Trong số các mẫu nghiên cứu, có một phân loài (subsp.) và một thứ (var.)

của cùng một loài đã được biết trong các tài liệu về thực vật ở Việt Nam; hai loài

còn là các loài ghi nhận mới cho hệ thực vật Việt Nam. Các loài nghiên cứu đã

được mô tả chi tiết và minh họa bằng ảnh chụp.

Tiêu bản mẫu các loài hiện lưu tại Phòng tiêu bản của Khoa sinh học -

Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội (ký hiệu HNU), Bộ

môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (ký hiệu HNIP), Phòng Tài nguyên

thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam (ký hiệu IEBR/TNTV). Các mẫu được giám định tên khoa

học tại Phòng Tài nguyên thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và Bảo

tàng thiên nhiên Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

3.1.1.1. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BFI

Đặc điểm hình thái: Cây đơn tính khác gốc. Thân thoái hóa thành khối

dạng củ, đơn hoặc tập trung thành khối phân nhánh từ gốc; củ đơn hình cầu, rộng

từ 0,5-5 cm; bề mặt thô đến hạt mịn, có các mụn hình sao. Lá 10-20, xếp xoắn,

xếp lợp, đỉnh tù, hơi cong. Hoa đực tập trung thành dạng bông nạc hình trứng –

elip, mang các hoa mở rộng, đối xứng tỏa tròn. Hoa đực có cuống nhỏ, dài 6-10

cm; thùy 4-5(-6); thùy 5-7 mm, hình elip, đỉnh nhọn; chỉ nhị nằm trên một đế hoa

ngắn, hơi bị nén xuống, dài khoảng 3 mm; bao phấn 4-5, hình móng ngựa. Hoa

cái tập trung thành dạng bông nạc hình trứng hoặc hình cầu rộng 1.5-3.5 cm, dài

1.5-5 cm, hoa cái rất nhỏ mọc trên trục chính của cụm hoa và quanh chân của vảy

70

bảo vệ; vảy bảo vệ hoa cái dài khoảng 1300 µm, phần dưới vảy bảo vệ hình trụ,

rộng khoảng 200-300 µm, phần trên vảy bảo vệ hình trứng ngược, đỉnh hơi bị cắt

cụt, dài khoảng 600-800 µm, rộng 400-600 µm. (Hình 3.1)

Hình 3.1. Hình thái mẫu BFI (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen) 1. Cây mang cụm hoa đực; 2. Cây mang cụm hoa cái; 3,4. Hoa đực; 5. Các hoa cái (5b) và vảy bảo vệ (5a); 6. Các lá xếp xoắn trên trục cụm hoa; 7. Bề mặt “củ”có các mụn hình sao

71

Hình 3.2. Hình vẽ mẫu Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen 1. Cây mang cụm hoa cái, 2. Cây mang cụm hoa đực, 3. Hoa đực, 4. Các hoa cái và vảy bảo vệ

Dựa trên đặc điểm hình thái, đối chiếu với khóa phân loại chi Balanophora

trong các tài liệu Thực vật chí Malesiana [54], chuyên khảo về chi Balanophora

của B.Hansen (1972) [38], tên khoa học mẫu ký hiệu BFI được giám định là:

Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen, 1972, Dansk Bot. Ark.

28(1): 100, tên đồng nghĩa: Balanophora annamensis S.Moore, Balanophora

simaoensis S.Y.Chang & P.C.Tam, Balanophora fungosa var. indica (Arn.)

B.Hansen, Balanophora indica (Arn.) Griff.

Tên Việt Nam: Dó đất, Dương đài nam, Tỏa dương, Chucara (Ninh Thuận).

Phân bố: Hà Nội (Ba Vì), Hà Nam, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Kon Tum, Lâm

Đồng, Ninh Thuận, An Giang. Nước ngoài: Ấn Độ, Myanma, Trung Quốc, Thái

Lan, Inđônêxia, Lào, Malaixia, Philippin (Luzon), Thái Bình Dương (Guam).

Mẫu tham khảo: Cao Bằng (Ba Bể), Averyanov, Hiep, Huyen, Zanina, CB-

44 (VN)

Tiêu bản mẫu nghiên cứu được lưu tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học

Dược Hà Nội (HNIP/18637/21), Phòng Tài nguyên Thực vật – Viện sinh thái và

tài nguyên sinh vật (IEBR/TNTV-04), Khoa sinh học – Trường Đại học Khoa học

tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (HNU 024069) và Bảo tàng thiên nhiên Việt

Nam (BFI).

3.1.1.2. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BFG

Đặc điểm hình thái: Cây đơn tính khác gốc (cụm hoa đơn tính), có màu đỏ. Thân

thoái hóa thành khối dạng củ, đường kính khoảng 3-4 cm. Bề mặt củ thô, sần sùi

tạo thành các khối nhiều cạnh, đường kính khoảng 5 mm, không quan sát thấy các

mụn hình sao. Cuống cụm hoa mọc từ thân, ngắn và chắc, chiều dài 1-5 cm. Lá

10-12, xếp xoắn, xếp lợp, áp sát vào cuống cụm hoa và phần phía dưới cụm hoa,

che phủ khoảng 2/3 cụm hoa, đỉnh hơi nhọn. Hoa đực tập trung thành dạng bông

nạc hình trứng-elip có kích thước 3-8 cm x 2,5-6 cm. Hoa đực có cuống nhỏ, dài

72

6-10 cm, đối xứng tỏa tròn; thùy 5-6(-7), hình elip hẹp, đỉnh nhọn, 5-7 mm; lá bắc

cụt. thùy. Chỉ nhị nằm trên một đế hoa ngắn, hơi bị nén xuống, dài khoảng 3 mm.

Bao hoa 5-6, hình móng ngựa. Hoa cái tập trung thành dạng bông nạc 2,5-3,5 cm

x 3,5-4,5 cm, hình cầu, bị nén xuống. Vảy bảo vệ kích thước có thể dài tới 2000

µm với phần phía dưới hình trụ rộng khoảng 200 µm và phần phía trên hình trứng

hoặc hình trứng ngược, rộng 600-900 µm. Các hoa cái nằm trên trục chính cụm

hoa cũng như phần dưới của vảy bảo vệ (Hình 3.2).

Trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, đối chiếu với khóa phân loại chi

Balanophora trong các tài liệu Thực vật chí Malesiana [54], chuyên khảo về chi

Balanophora của B.Hansen (1972) [38], tên khoa học của mẫu ký hiệu BFG được

giám định là Balanophora fungosa var. globosa (Jungh.) B.Hansen, 1972, Dansk

Bot. Ark. 28(1): 109, tên đồng nghĩa: Balanophora indica var. globosa (Jungh.)

Bân, Balanophora globosa Jungh.

73

Hình 3.3. Hình thái mẫu BFG (Balanophora fungosa var. globosa (Jungh.) B.Hansen) 1. Cây mang cụm hoa cái; 2. Cây mang cụm hoa đực; 3. Cụm hoa đực; 4. Cụm hoa cái; 5. Các hoa cái (5b) và vảy bảo vệ (5a); 6,7. Hoa đực đối xứng tỏa tròn; 8,9. Lá; 10. Bề mặt “củ” với các khối đa giác, không có mụn hình sao

Hình 3.4. Hình vẽ mẫu Balanophora fungosa var. globosa (Jungh.) B. Hansen 1. Cây mang cụm hoa đực, 2. Hoa đực, 3. Các hoa cái và vảy bảo vệ, 4. Cây mang cụm hoa cái

Tên Việt Nam: Dó đất sần.

Phân bố: Hà Giang (Quản Bạ), Ninh Bình (VQG Cúc Phương), Lâm Đồng

(Lạc Dương, VQG Bidoup - Núi Bà). Nước ngoài: Inđônêxia (Java).

Tiêu bản mẫu nghiên cứu được lưu tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học

Dược Hà Nội (HNIP/18641/21), Phòng Tài nguyên Thực vật – Viện sinh thái và

tài nguyên sinh vật (IEBR/TNTV-05), Khoa sinh học – Trường Đại học Khoa học

tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (HNU 024066) và Bảo tàng thiên nhiên Việt

Nam (BFG).

3.1.1.3. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BS

Đặc điểm hình thái: Cây đơn tính cùng gốc. Thân thoái hóa thành khối

dạng củ; màu nâu vàng, phân nhánh hoặc tập trung thành khối nhỏ, gần hình cầu,

đường kính 1,5 - 2,0 cm, bề mặt có mụn hạt và rải rác nốt sần hình sao màu vàng.

Cuống cụm hoa hơi đỏ, kích thước 2 - 6 × 0,3 - 0,5 cm. Lá 5-8, xếp xoắn, hình

trứng rộng, 0,6 - 1,2 × 0,8 - 1,0 cm, đỉnh tù, hơi lõm. Hoa đực và hoa cái tập trung

với nhau thành dạng bông nạc hình elip, kích thước 0,8 - 2 × 0,5 - 0,8 cm. Hoa

74

đực mọc ở phần gốc của cụm hoa, đối xứng tỏa tròn, đối diện với bẹ hoa có hình

dạng khác nhau; cuống hoa ngắn, đường kính 0,8 mm; thùy thường 4, hình elip

đến hình trứng rộng, đỉnh nhọn hoặc cắt cụt, kích thước nhỏ hơn 1,5 mm. Hoa cái

mọc ở gốc vảy bảo vệ và trên trục chính cụm hoa (Hình 3.3).

Hình 3.5. Hình thái mẫu BS (Balanophora subcupularis P.C. Tam) 1. Toàn cây, 2. Bề mặt củ, 3. Cụm hoa lưỡng tính; 4. Hoa đực; 5. Các hoa cái (5b) và vảy bảo vệ (5a) ; 6. Cuống cụm hoa mang lá

75

Hình 3.6. Hình vẽ mẫu Balanophora subcupularis P.C.Tam 1. Toàn cây, 2. Các hoa đực, 3. Các hoa cái và vảy bảo vệ

Dựa trên đặc điểm hình thái, đối chiếu với khóa phân loại chi Balanophora

trong Thực vật chí Trung Quốc, tên khoa học mẫu ký hiệu BS được giám định là

Balanophora subcupularis P.C.Tam, 1982, Fl. Fujianica 1:602. Đây là loài ghi

nhận mới cho hệ thực vật Việt Nam.

Phân bố: Hà Giang (Quản Bạ), Điện Biên (Mường Lay), Lạc Dương (Lâm

Đồng). Nước ngoài: Trung Quốc (Phúc Kiến), Nhật Bản (Kumamoto).

Tiêu bản mẫu nghiên cứu được lưu tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học

Dược Hà Nội (HNIP/18638/21), Phòng Tài nguyên Thực vật – Viện sinh thái và

tài nguyên sinh vật (IEBR/TNTV-03), Khoa sinh học – Trường Đại học Khoa học

tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (HNU 024068).

3.1.1.4. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học mẫu BT

Đặc điểm hình thái: Cây đơn tính cùng gốc, màu vàng nhạt đến đỏ sẫm.

Thân thoái hóa thành khối dạng củ, phân nhánh, bề mặt sần sùi; nhánh phụ đường

kính 1,0-2,0 cm. Lá 4-8, dạng vảy, hình thuôn dài tới hình trứng thuôn, đỉnh tù,

màu vàng nhạt, kích thước 1-6 x 0,5-0,7 cm. Hoa đực và hoa cái tập trung trên

cùng cụm hoa dạng bông nạc, hình trứng thuôn dài đến hình trứng, tù, che phủ

dày đặc bởi các hoa cái và vảy bảo vệ. Hoa đực nằm rải rác giữa hoa cái và vảy

bảo vệ, có cuống nhỏ; thùy hoa đực 3, hình trứng, kích thước < 1,5 mm; bao phấn

3, mở ngang. Hoa cái có màu vàng nhạt hoặc hơi đỏ, nằm trên trục chính của hoa.

(Hình 3.7)

Dựa trên đặc điểm hình thái, đối chiếu với khóa phân loại chi Balanophora

trong Thực vật chí Trung Quốc, tên khoa học mẫu BT được xác định là

Balanophora tobiracola Makino, 1910, Bot. Mag. (Tokyo) 24: 290, tên đồng

nghĩa: Balanophora wrightii Makino, Balanophora harlandii var. spiralis

P.C.Tam. Đây là loài ghi nhận mới cho hệ thực vật Việt Nam.

Phân bố: Lạng Sơn (Bắc Sơn). Nước ngoài: Trung Quốc, Nhật Bản.

Tiêu bản mẫu nghiên cứu được lưu tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học

76

Dược Hà Nội (HNIP/18640/21), Phòng Tài nguyên Thực vật – Viện sinh thái và

tài nguyên sinh vật (IEBR/TNTV-07), Khoa sinh học – Trường Đại học Khoa học

tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (HNU 024068).

Hình 3.7. Hình thái mẫu BT (Balanophora tobiracola Makino) 1,2. Toàn cây mang cụm hoa lưỡng tính (2a); 3. Hoa đực mọc chen giữa các hoa cái và vảy bảo vệ; 4. Hoa đực; 5. Các hoa cái (5b, 5d) và vảy bảo vệ (5a, 5c);6. Cuống cụm hoa mang lá; 7. Lá

77

Hình 3.8. Hình vẽ mẫu Balanophora tobiracola Makino 1. Toàn cây; 2,3,4. Hoa đực; 5. Các hoa cái và vảy bảo vệ

3.1.2. Kết quả nghiên cứu về hình thái hạt phấn các loài nghiên cứu

Kết quả quan sát cho thấy hạt phấn của các mẫu nghiên cứu đều có dạng hạt

nhỏ (Hình 3.9). Dữ liệu về hình dạng và kích thước hạt phấn của các mẫu nghiên

cứu được trình bày trong bảng 3.1.

Hình 3.9. Hình thái hạt phấn các loài thuộc chi Balanophora BFI: B. fungosa subsp. indica (a: VT cực, b: VT xích đạo), BFG: B. fungosa var. globosa (a: VT cực, b: VT xích đạo), BS: B. subcupularis (a: VT cực, b: VT xích đạo), BT: B. tobiracola

Bảng 3.1. Dữ liệu về hạt phấn các mẫu nghiên cứu

E (µm)* P(µm)** Mẫu P/E Min TB Max Min TB Max

78

BFI (B. fungosa 17,99 19,58 20,62 11,21 14,8 17,53 0,76 subsp. indica)

BFG (B. fungosa 16,94 19,70 22,33 15,39 16,24 17,58 0,82 var. globosa)

BS 13,02 13,81 15,23 15,15 16,05 17,84 1,16 (B. subcupularis)

BT (B. tobiracola) 19,37 20,72 22,13

*E: kích thước trục xích đạo hoặc đường kính lớn nhất

**P: kích thước trục cực

Min: kích thước nhỏ nhất, Max: kích thước lớn nhất, TB: kích thước trung bình

Từ bảng kết quả, có thể thấy hạt phấn các loài thuộc chi Balanophora đều

có kích thước nhỏ (10 – 25 µm). Hình dạng hạt phấn có sự khác nhau giữa các

loài trong chi, được mô tả qua hình ảnh chụp từ vị trí cực và vị trí xích đạo (Hình

3.8). Trong đó hạt phấn các loài B. fungosa subsp. indica, B. fungosa var. globosa,

B. subcupularis có phân biệt rõ mặt phẳng cực và mặt phẳng xích đạo. Hạt phấn

của loài B. fungosa subsp. indica, B. fungosa var. globosa khi nhìn từ vị trí cực

có hình tam giác trong khi nhìn từ vị trí xích đạo có hình cầu-dẹt (0,74 < P/E <

0,88). Hạt phấn loài B. subcupularis ở vị trí cực có hình tam giác lồi, ở vị trí xích

đạo có dạng dài (1,14 < P/E < 1,3). Trong khi đó hạt phấn của loài B. tobiracola

không phân biệt mặt phẳng cực và mặt phẳng xích đạo, hạt phấn có hình cầu.

3.1.3. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hiển vi các loài nghiên cứu

3.1.3.1. Đặc điểm vi phẫu củ các loài nghiên cứu

a, Vi phẫu “củ” mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica)

Củ có cấu tạo gồm: 1-3 hàng tế bào kiểu biểu bì, có kích thước to nhỏ khác

nhau. Phía trong là mô mềm có hình đa giác, bên trong chứa các khối nhựa. Các

bó libe-gỗ nằm rải rác trong mô mềm. Mỗi bó libe-gỗ có cấu tạo gồm gỗ ở phía

trong được bao bởi libe, ngoài cùng là các lớp tế bào mô mềm bao quanh libe-gỗ

có kích thước nhỏ hơn taọ thành một vòng rõ. (Hình 3.10)

79

b, Vi phẫu “củ” mẫu BFG (Balanophora fungosa var. globosa)

Củ có cấu tạo đơn giản với 4-6 hàng tế bào kiểu biểu bì ở bên ngoài. Các

tế bào kiểu biểu bì có thành phía ngoài hơi dày lên. Các tế bào mô mềm xếp sít

nhau, bên trong có các khối nhựa hình tròn. Bó libe-gỗ được sắp xếp thành một

vòng tròn trong mô mềm. Mỗi bó có libe bên ngoài, bên trong là gỗ và các tế bào

mô mềm trung tâm. Các tế bào xung quanh bó libe-gỗ với kích thước nhỏ hơn,

bắt màu xanh và tạo ra một ranh rới rõ ràng. (Hình 3.11)

Hình 3.11. Vi phẫu “củ” mẫu BFG (B. fungosa var. globosa) 1. Tế bào kiểu biểu bì, 2. Mô mềm, 3. Khối nhựa, 4. Gỗ, 5. Libe, 6. Mô mềm bao quanh bó libe-gỗ

Hình 3.10. Vi phẫu “củ” mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) 1. Tế bào kiểu biểu bì, 2. Mô mềm, 3. Khối nhựa, 4. Gỗ, 5. Libe, 6. Mô mềm bao quanh bó libe-gỗ c, Vi phẫu “củ” mẫu BS (Balanophora subcupularis)

Củ có cấu tạo đơn giản, ngoài cùng là 3-5 hàng tế bào kiểu biểu bì (1). Phía

trong mô mềm (2) chiếm chủ yếu, rải rác có các bó libe-gỗ. Các tế bào kiểu biểu

bì có thành hơi dày lên. Tế bào mô mềm hình đa giác. Trong mô mềm, có thể có

các khối nhựa (3). Các bó libe-gỗ nằm rải rác trong mô mềm. Trong mỗi bó, libe

(6) ở phía ngoài bao quanh gỗ (5) ở phía trong. Các tế bào mô mềm bao quanh bó

libe-gỗ (4) bắt màu xanh, tạo thành một vòng rõ. (Hình 3.12)

80

d, Vi phẫu “củ” mẫu BT (Balanophora tobiracola)

Củ có cấu tạo đơn giản, ngoài cùng là 1-3 hàng tế bào kiểu biểu bì. Phía

trong mô mềm chiếm chủ yếu, rải rác có các bó libe-gỗ. Các tế bào kiểu biểu bì

có thành hơi dày lên. Tế bào mô mềm hơi dài. Trong mô mềm, có thể có các khối

nhựa. Các bó libe-gỗ nằm rải rác trong mô mềm, đôi khi tập trung lại gần nhau.

Trong mỗi bó, libe ở phía ngoài bao quanh gỗ ở phía trong. Các tế bào mô mềm

bao quanh bó libe-gỗ bắt màu xanh, tạo thành một vòng rõ. (Hình 3.13)

Hình 3.12. Vi phẫu “củ” mẫu BS (B. subcupularis) 1. Tế bào kiểu biểu bì, 2. Mô mềm, 3. Khối nhựa, 4. Mô mềm bao quanh bó libe-gỗ, 5. Gỗ, 6. Libe Hình 3.13. Vi phẫu “củ” mẫu BT (B. tobiracola) 1. Tế bào kiểu biểu bì, 2. Mô mềm, 3. Khối nhựa, 4. Mô mềm bao quanh bó libe-gỗ, 5. Gỗ, 6. Libe

3.1.3.2. Đặc điểm vi phẫu lá các loài nghiên cứu

a, Vi phẫu lá mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica)

Ngoài cùng là một hàng tế bào biểu bì có hình dạng, kích thước không đều,

xếp sít nhau, phía ngoài phủ cutin. Phía trong mô mềm chiếm chủ yếu, có các bó

libe-gỗ nhỏ nằm rải rác. Trong mỗi bó, gỗ ở phía trong được bao quanh bởi libe.

81

(Hình 3.14)

b, Vi phẫu lá mẫu BFG (B. fungosa var. globosa)

Ngoài cùng là một hàng tế bào biểu bì. Các tế bào mô mềm có kích thước

không đều, trong mô mềm có thể quan sát thấy các khối nhựa hình tròn. Các bó

libe-gỗ nhỏ nằm rải rác. Mỗi bó libe-gỗ có cấu tạo gồm các libe phía ngoài bao

quanh gỗ phía trong. (Hình 3.15)

c, Vi phẫu lá mẫu BS (B. subcupularis)

Ngoài cùng là một hàng tế bào biểu bì phía ngoài phủ cutin. Phía trong mô

mềm chiếm chủ yếu, kích thước không đều. Rải rác có các bó libe-gỗ nhỏ. Các

khối nhựa hình tròn rải rác trong mô mềm. (Hình 3.16)

d, Vi phẫu lá mẫu BT (B. tobiracola)

Ngoài cùng là một hàng tế bào biểu bì kích thước không đều, phía ngoài

phủ cutin. Phía trong mô mềm chiếm chủ yếu, các tế bào mô mềm thành mỏng.

Rải rác có các bó libe-gỗ nhỏ. (Hình 3.17)

82

Hình 3.14. Vi phẫu lá mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) 1. Biểu bì trên, 2. Mô mềm, 3. Gỗ, 4. Libe, 5. Biểu bì dưới Hình 3.15. Vi phẫu lá mẫu BFG (Balanophora fungosa var. globosa) 1. Biểu bì trên, 2. Gỗ, 3. Libe, 4. Mô mềm; 5. Khối nhựa, 6. Biểu bì dưới

Hình 3.16. Vi phẫu lá mẫu BS (B. subcupularis) 1.Biểu bì trên, 2. Mô mềm, 3. Khối nhựa, 4. Libe-gỗ, 5. Biểu bì dưới Hình 3.17. Vi phẫu lá mẫu BT (B. tobiracola) 1.Biểu bì trên, 2. Mô mềm, 3. Libe-gỗ, 4. Biểu bì dưới

3.1.3.3. Đặc điểm bột các loài nghiên cứu

a, Đặc điểm bột toàn cây mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica): Bột màu vàng nâu,

mùi đặc trưng, vị chát. Quan sát trên kính hiển vi thấy: Mảnh tế bào kiểu biểu bì

(1); các mảnh mô mềm chứa khối nhựa (2, 3); tế bào cứng (4); mảnh mang màu

(5). Vảy bảo vệ (6). Vòi nhụy thuôn dài (7). Rải rác có hạt phấn (8). (Hình 3.18)

83

Hình 3.18. Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) 1. Mảnh biểu bì; 2,3. Mảnh mô mềm; 4. Tế bào cứng ; 5.Mảnh mang màu; 6. Vảy bảo vệ; 7. Vòi nhụy; 8. Hạt phấn hoa

b, Đặc điểm bột toàn cây mẫu BFG (B. fungosa var. globosa): Bột màu nâu, mùi

đặc trưng, vị chát. Quan sát trên kính hiển vi thấy: Các mảnh mô mềm tế bào

thành mỏng (1), đôi khi mang mảnh mạch (3). Rải rác có các tế bào cứng (2), tinh

thể canxi oxalat hình khối (4). Sợi dài, đơn lẻ (5). Mảnh vảy bảo vệ màu nâu đỏ

(6). Nhụy dài (7). Có thể quan sát thấy các hạt phấn (8). (Hình 3.19)

Hình 3.19. Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BFG (B. fungosa var. globosa) 1. Mảnh mô mềm; 2. Mảnh biểu bì; 3. Mảnh mô mềm mang mảnh mạch; 4. Tinh thể canxi oxalat; 5. Sợi; 6. Tế bào cứng; 7. Vòi nhụy; 8. Hạt phấn hoa

c, Đặc điểm bột toàn cây mẫu BS (B. subcupularis): Bột màu nâu nhạt, mùi đặc

trưng, vị chát. Quan sát trên kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì (1), các mảnh mô

mềm (2,3,5). Sợi dài, tập trung thành bó (4); rải rác có các vòi nhụy dài (6). Hạt

phấn hoa tập trung thành đám (7) hoặc rải rác, hình tam giác khi quan sát ở vị trí

cực (8). (Hình 3.20)

d, Đặc điểm bột toàn cây mẫu BT (B. tobiracola): Bột màu vàng nâu, không mùi,

vị chát. Quan sát trên kính hiển vi thấy: Các mảnh mô mềm tế bào thành mỏng

(1,4,5). Các hoa cái chỉ có một vòi nhụy, tập trung thành đám (2). Vảy bảo vệ hoa

cái (3). Mảnh mạch xoắn (6), mảnh biểu bì (7). Hạt phấn hoa hình tròn (8). (Hình

84

3.21)

Hình 3.20. Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BS (B. subcupularis) 1. Mảnh biểu bì; 2,3,5. Mảnh mô mềm; 4. Bó sợi; 6. Vòi nhụy hoa cái; 7,8. Hạt phấn

Hình 3.21. Một số đặc điểm bột toàn cây mẫu BT (B. tobiracola) 1,4,5. Mảnh mô mềm; 2. Các vòi nhụy; 3. Vảy bảo vệ; 4,5. Mảnh mô mềm; 6. Mảnh mạch; 7. Mảnh biểu bì; 8. Hạt phấn 3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học

3.2.1. Định tính các nhóm chất

Kết quả định tính cho thấy thành phần hóa học chính trong các loài thuộc

85

chi Dó đất bao gồm: tanin, acid hữu cơ, triterpen. Bên cạnh đó một số mẫu có

phản ứng dương tính yếu với thuốc thử flavonoid. Kết quả cụ thể trình bày trong

bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học các mẫu nghiên cứu

Nhóm chất Phản ứng/Thí nghiệm BFI BFG BS BT

Thí nghiệm tạo bọt – – – – Saponin

– – – – Anthranoid P/ư Borntraeger

P/ư Cyanidin – – + + Flavonoid

P/ư với kiềm + + + +

+ + + + P/ư với FeCl3

P/ư với TT Diazo + + + +

Mở đóng vòng lacton ± ± ± ± Coumarin

Quan sát huỳnh quang ± ± ± ±

+ + + + Tanin P/ư với TT FeCl3 5%

P/ư với chì acetat 10% + + + +

P/ư với gelatin 1% + + + +

P/ư với TT Mayer – – – – Alcaloid

P/ư với TT Bouchardat – – – –

P/ư với TT Dragendorff – – – –

+ + + + Acid hữu cơ P/ư với Na2CO3

+ + + + Đường khử P/ư với TT Fehling

P/ư với TT Ninhydrin - - - - Acid amin

- - - - Caroten P/ư với H2SO4

P/ư Liebermann + + + + Triterpen

Chú thích: (+): Phản ứng dương tính yếu, (–): Phản ứng âm tính, (±) không rõ

86

ràng

3.2.2. Kết quả phân lập các hợp chất từ một số loài nghiên cứu

3.2.2.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ Dó đất (Balanophora fungosa

subsp. indica)

Dược liệu đã sấy khô của loài Dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica)

(BFI) được xay thành bột (2.8 kg), sau đó được ngâm chiết bằng methanol (10 lít

x 3 lần). Dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết

methanol 245 g. Một phần cao chiết được giữ lại để đánh giá các tác dụng in vitro

cũng như một số nội dung nghiên cứu khác. Phần cao chiết còn lại được chia thành

02 mẻ, mỗi mẻ được phân tán với nước (1,5 lít) rồi chiết phân đoạn lần lượt với

n-hexan (1 lít x 3 lần) và ethyl acetat (1 lít x 3 lần). Gộp các dịch chiết n-hexan

và ethyl acetat, tiến hành thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, kết quả thu được

các cao chiết tương ứng n-hexan (17,9 g), ethyl acetat (152 g) và lớp nước.

Tiến hành sắc ký cột silica gel (Φ 8,5 cm) đối với cao ethyl acetat, rửa giải

với hệ dung môi gradient dicloromethan – methanol (1,10, 20, 40, 80 và 100 %

methanol, V = 1000 ml cho mỗi hệ dung môi) thu được 6 phân đoạn ký hiệu

BFE1-6.

Phân đoạn BFE2 (2 g) được sắc ký qua cột silica gel (40 g, Φ 3,0 cm) với

hệ dung môi rửa giải dicloromethan – ethyl acetat (10:1, v/v) thu được hai phân

đoạn BFE2.1 và BFE2.2. Tiếp tục tinh chế BFE2.1 (250 mg) qua cột sắc ký silica

gel với hệ dung môi rửa giải dicloromethan – methanol (30:1, v/v) thu được

BdD2.7 (12,5mg).

Sắc ký cột silica gel phân đoạn BFE4 (0,5 g) rửa giải với hệ dung môi

Dicloromethan – methanol – nước (6:1:0,1, v/v/v) (V = 700 ml) thu được hai phân

đoạn BFE4.1 và BFE4.2. Phân đoạn BFE4.2 (50 mg) được đưa lên cột sắc ký

silica gel (2 g, Φ 1,3 cm) rửa giải với hệ dung môi Dicloromethan – methanol –

nước (8:1:0,05,v/v/v) (V = 600 ml) thu được hai hợp chất sạch tương ứng: BdD5.6

87

(12,4 mg) và BdD5.9 (7,2 mg). (Hình 3.22).

Dựa trên các dữ liệu phổ (phổ NMR, phổ khối lượng phân tử), cấu trúc các

hợp chất được xác định.

Hình 3.22. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BFI (Balanophora fungosa subsp. indica)

Hợp chất BdD2.7: (+)-pinoresinol

Hợp chất BdD2.7 thu được dưới dạng bột màu trắng. Số liệu phổ của

1H NMR (500 MHz, MeOH): δH 6.93 (2H, s, C2,2’-H); 6.82 (2H, d, J = 8.5

BdD2.7:

Hz, C6,6ʹ-H), 6.77 (2H, d, J = 8.0 Hz, C5,5ʹ-H), 4.67 (2H, d, J = 3.5 Hz, C7,7ʹ-H),

4.18 – 4.15 (2H, dd, J = 7.0, 8.5, H-9a, H-9ʹa), 3.80 (2H, d, J = 1.5 Hz, H-9b, H-

88

9’b), 3.78 (6H, s, 2 x MeO), 3.05 (2H, m, C8,8ʹ-H).

13C NMR (125 MHz, MeOH): 133.6 (C-1, C-1’), 110.7 (C-2, C-2’), 148.7

(C-3, C-3’), 146.9 (C-4, C-4’), 115.9 (C-5, C-5’), 119.8 (C-6, C-6’), 87.0 (C-7, C-

7’), 55.0 (C-8, C-8’), 72.3 (C-9, C-9’).

Trên phổ proton xuất hiện tín hiệu của 3 proton thuộc vòng thơm tại δH 6.93

(2H, s, C2,2’-H); 6.82 (2H, d, J = 8.5 Hz, C6,6ʹ-H), 6.77 (2H, d, J = 8.0 Hz, C5,5ʹ-H),

một nhóm oximetin được xác định tại 4.67 (2H, d, J = 3.5, C7,7ʹ-H). Một nhóm

oximetylen được xác định tai vị trí δH 4.18 – 3.80 (4H, m,C9,9’-H) và một nhóm

metin tại δH 3.05 (2H, m,C8,8’-H). Tại độ dịch chuyển δH 3.78 (6H, s, 2 x MeO)

xuất hiện tín hiệu của một nhóm methoxy .

Trên phổ 13C và phổ DEPT xuất hiện tín hiệu của 10 nguyên tử cacbon trong

đó có 6 cacbon thuộc vòng thơm với độ dịch chuyển từ 110.7 – 148.7 ppm. Hai

nhóm metin và metylen đính với oxy được xác định tại 87.0 (C-7, C-7ʹ) và 72.3

(C-9, C-9ʹ); gợi ý cho ta sự xuất hiện của khung benzofuran. Một nhóm methoxy

được xác định tại δC 56.2.

Phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện pic ion [M+H]+ ở m/z 359,1496, điều này

gợi ý rằng hợp chất BdD2.7 có CTPT C20H22O6; số lượng hydro và cacbon này

gấp đôi số hydro và cacbon trên phổ 1H và 13C-NMR. Như vậy có thể nhận định

hợp chất BdD2.7 có trục đối xứng bậc 1 trong phân tử.

9’ của các lignan furofuran 8H chịu ảnh hưởng trực tiếp từ cấu hình tương đối của

Theo các nghiên cứu gần đầy, độ dịch chuyển hóa học của của ΔδH-9 và ΔδH-

C-7/C-8 và C-7’/C-8’ [99]. Sự sai khác về độ dịch chuyển hóa học của H2-9 và

H2-9’(ΔδH-9 và ΔδH-9’) đều có giá trị trung bình (~0.37 ppm) gợi ý cấu hình (I) 7-

H/8-H trans, 7’-H/8’-H trans [99].Theo các nghiên cứu gần đầy, độ dịch chuyển

hóa học của của ΔδH-9 và ΔδH-9’ của các lignan furofuran 8H chịu ảnh hưởng trực

tiếp từ cấu hình tương đối của C-7/C-8 và C-7’/C-8’ [99]. Từ các dữ kiện phân

tích trên kết hợp so sánh tài liệu đã công bố [40][99] có thể nhận định BdD2.7 là

(+)-pinoresinol. Đây là cấu hình thường gặp trong tự nhiên so với cấu hình (-)-

89

pinoresinol [28].

Hợp chất BdD5.6: (+)-7,9':7',9-Diepoxy-3-methoxy-4,4'-lignandiol

Hợp chất BdD5.6 thu dưới dưới dạng bột màu trắng. Số liệu phổ của

1H NMR (500 MHz, MeOH): δH 7.22 (2H, dd, J = 1.5, 8.5 Hz, C3ʹ,5ʹ-H), 6.96

BdD5.6:

(1H, d, J = 2.0 Hz, C2ʹ-H), 6.84 – 6.81 (1H, m, C6ʹ-H), 6.80 – 6.77 (3H, m, C2,5,6-

H), 4.72 – 4.71 (2H, m, C7,7ʹ-H), 4.26 – 4.21 (2H, m, H-9a, H-9ʹa), 3.87 (3H, br s,

13C NMR (125 MHz, MeOH): 158.2 (C-4’), 149.1 (C-3), 147.3 (C-4), 133.8

OMe), 3.86 – 3.82 (2H, m, H-9b, H-9’b), 3.16 – 3.13 (2H, m, C8,8ʹ-H);

(C-1), 133.1 (C-1’), 128.7 (C-2’,C-6’), 120.1 (C-6), 116.2 (C-3’, C-5’), 116.1 (C-

5), 111.0 (C-2), 87.6 (C-7), 87.4 (C-7’), 72.6 (C-9), 72.4 (C-9’), 56.4 (OMe), 55.2

(C-8), 49.5 (C-8’)

Trên phổ proton xuất hiện tín hiệu của 7 proton thuộc vòng thơm. Trong đó

có 4 proton thế kiểu A2B2 tại δH 6.97 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2ʹ); 6.84 (1H, dd, J =

2.0, 8.0 Hz, H-6ʹ), 7.23 (2H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, H-3ʹ, H-5ʹ). Tín hiệu của hai

nhóm oxymethin được xác định tại 4.72 – 4.71 (2H, m, C7,7ʹ-H), hai nhóm

oxymethylen được xác định tai vị trí δH 4.26 – 4.21 (2H, m, H-9a, H-9ʹa), 3.86 –

3.82 (2H, m, H-9b, H-9’b). Tại độ dịch chuyển δH 3.87 (3H, br s, OMe) xuất hiện

tín hiệu của một nhóm oxymethyl.

Trên phổ 13C và phổ DEPT xuất hiện tín hiệu của 10 nguyên tử cacbon trong

đó có 6 cacbon thuộc vòng thơm với độ dịch chuyển từ 111.01 – 158.2 ppm. Hai

nhóm methin được xác định tại 87.6 (C-7) và 87.4 (C-7ʹ)) và hai nhóm methylen

đính với oxy 72.4 (C-9ʹ) và 72.6 (C-9); gợi ý cho ta sự xuất hiện của benzofuran.

90

Một nhóm methoxy được xác định tại δC 56.4 ppm.

Từ các phân tích trên cho thấy các tín hiệu thu được từ phổ NMR của

BdD5.6 có sự tương đồng với hợp chất BdD2.7 [(+)-pinoresinol] ngoại trừ thiếu

đi một nhóm methoxy tại vị trí C-3ʹ. Phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện pic ion

[M+H]+ ở m/z 329,3. Điều này gợi ý hợp chất BdD5.6 có CTPT C19H20O5 (M =

328), phù hợp với các phân tích trên phổ NMR.

Cấu hình không gian của hợp chất BdD5.6 có một số khác biệt với cấu hình

của hợp chất (-)-epi-(4-hydroxyphenylguaicyl) tetrahydrodurofuran lignan được

1H NMR của C7-H và C7’-H đều được dịch chuyển về vùng trường thấp (δH 4.72

Casabuono phân lập và xác định cấu trúc [28]. Cụ thể, các tín hiệu proton trên phổ

và 4.71) cho thấy nhóm aryl cùng là equatorial (hướng xích đạo) hoặc axial

(hướng trục). Trong khi đó, với cấu hình epi của hệ diepoxy, các tín hiệu của

proton benzylic H-7 và H-7’ không có sự tương đồng do sự dịch chuyển về các

vùng trường khác nhau [28].

Bên cạnh đó, tính toán giá trị sai khác về độ dịch chuyển hóa học của H2-9

và H2-9’(ΔδH-9 và ΔδH-9’) đều có giá trị trung bình (~0.39 ppm), tương tự hợp chất

BdD2.7. Như vậy, từ các dữ kiện phân tích trên kết hợp so sánh tài liệu đã công

bố [35] có thể xác định BdD5.6 là: (+)-7,9':7',9-Diepoxy-3-methoxy-4,4'-

lignandiol.

Hợp chất BdD5.9: Balanophonin

Hợp chất BdD5.9 phân lập dưới dạng dầu màu vàng. Dữ liệu phổ của

1H-NMR (500 MHz, MeOD): δH 9.59 (1H, d, J = 7.5 Hz, C9’-H), 7.63 (1H,

BdD5.9:

91

d, J = 16 Hz, C7’-H), 7.28 (1H, s, C6’-H), 6.97 (1H, d, J = 2 Hz, C2’-H), 6.85 (1H,

d, J = 2 Hz, C2-H), 6.84 (1H, d, J = 2 Hz, C6-H), 6.80 (1H, d, J = 8.0 Hz, C5-H),

6.71 (1H, dd, J = 8.0, 15.5 Hz, C8’-H), 5.62 (1H, d, J = 6.5 Hz, C7-H), 3.92 (3H,

s, 3’-OCH3), 3.87 – 3.85 (2H, m, C9-H), 3.83 (3H, s, 3-OCH3), 3.59 (1H, dd, J =

13C-NMR (125 MHz, MeOD): δC 196.1 (C-9’), 156.0 (C-7’), 152.9 (C-4’),

6, 12.5 Hz, C8-H).

149.1 (C-3), 147.8 (C-4), 145.9 (C-3’), 133.9 (C-1), 131.2 (C-5’), 129.6 (C-1’),

127.0 (C-8’), 119.9 (C-6), 119.8 (C-6’), 116.2 (C-5), 114.2 (C-2’), 110.6 (C-2),

90.0 (C-7), 64.5 (C-9), 56.8 (3-OCH3), 56.4 (3’-OCH3), 54.5 (C-8).

Phổ NMR cho thấy chất BdD5.9 cho thấy các tín hiệu của một neolignan.

Tín hiệu của hai nhóm metin tại δH 3.59 (1H, dd, J = 6, 12.5 Hz, C8-H)/δC 54.5 và

5.62 (1H, d, J = 6.5 Hz, C7-H)/ δC 90.0, cùng tín hiệu proton của nhóm oxymetylen

(-OCH2-) liên kết với vòng ở δH 3.87 – 3.85 (2H, m, C9-H) cho phép ta khẳng định

sự có mặt của một vòng dihydrofuran, nhận định này được khẳng định thêm bởi

phổ HMBC xuất hiện các tương tác của H-9/C-5’, H-9/C-7 và H-7/C-9, H-7/C-

4’.

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất BdD5.9 xuất hiện tín hiệu của 3 proton

thơm vòng benzen bị thế kiểu ABX tại δH 6.85 (1H, d, J = 2 Hz, C2-H), 6.84 (1H,

d, J = 2 Hz, C6-H), 6.80 (1H, d, J = 8.0 Hz, C5-H) và hai proton vòng thơm khác

tại δH 7,28 (1H, s, C6’-H), 6.97 (1H, d, J = 2 Hz, C2’-H), hai tín hiệu proton singlet

của nhóm methoxy ở δH 3.83 (3H, s, 3-OCH3), 3.92 (3H, s, 3’-OCH3) cùng tín

hiệu proton của nhóm aldehyd tại δH 9.59 (1H, d, J = 7.5 Hz, C9’-H), và tín hiệu

cộng hưởng ngoài vòng tại δH 7.63 (1H, d, J = 16 Hz, C7’-H), 6.71 (1H, dd, J =

8.0, 15.5 Hz, C8’-H) với hằng số tương tác J = 16 Hz đặc trưng cho liên kết -

CH=CH- ngoài vòng. Trên phổ HMBC, tương tác xa giữa các nhóm methoxy ở

δH 3.83 và 3.92 với các nguyên tử cacbon tại 145.9 (C-3’) và 149.1 (C-3).

Công thức phân tử được xác định dựa trên số liệu phổ khối ESI-MS với pic

ion tại m/z 357,09 [M+H]+, vì vậy dự đoán công thức phân tử của BdD5.9 là

92

C20H20O6.

Từ các phân tích phổ ở trên, kết hợp so sánh với tài liệu hợp chất

Balanophonin đã công bố cho thấy sự tương đồng ở tất cả các vị trí, đặc biệt là độ

dịch chuyển hóa học của proton tại C7-H và C8-H; như vậy có thể khẳng định

BdD5.9 là Balanophonin với cấu hình 7S,8R [56].

3.2.2.2. Kết quả chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Dó đất sần (Balanophora

fungosa var. globosa)

Dược liệu đã sấy khô của loài Dó đất sần (Balanophora fungosa var.

globosa) được xay thành bột (3,4 kg), sau đó được ngâm chiết bằng methanol (10

lít x 3 lần). Dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao

chiết methanol 550 g. Một phần cao chiết cũng được giữ lại, phần còn lại được

chia thành 03 mẻ, mỗi mẻ được phân tán với nước (1,5 lít) rồi chiết phân đoạn lần

lượt với n-hexan (1 lít x 3 lần) và ethyl acetat (1 lít x3 lần). Gộp các dịch chiết n-

hexan và ethyl acetat, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao chiết

tương ứng n-hexan (22,38 g), cao ethyl acetat (274 g) và lớp nước. Sơ đồ quy

trình phân lập các hợp chất được trình bày trong hình 3.23.

Tiến hành sắc ký cột silica gel (Φ 7,0 cm) đối với cao ethyl acetat sử dụng

hệ dung môi gradient dicloromethan – methanol (1, 10, 20, 40, 80 và 100 %

MeOH, V = 1000 ml cho mỗi tỷ lệ) thu được 6 phân đoạn ký hiệu BGE1-6.

Phân đoạn BGE3 (10 g) được sắc ký qua cột silica gel (100 g, Φ 5,0 cm) với

hệ dung môi rửa giải dicloromethan – ethyl acetat (1,5:1, v/v) (V = 1500 ml) thu

được hai phân đoạn BGE3.1 và BGE3.2. Tiếp tục tinh chế BGE3.1 (6 g) qua cột

sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải dicloromethan – aceton (3:1, v/v) (V =

1500 ml) thu được 3 phân đoạn ký hiệu BGE3.3 – BGE3.5. Phân đoạn BI2.4 (1,8

g) được triển khai trên cột sắc ký silica gel sử dụng hệ dung môi dicloromethan –

methanol 20:1 (v/v) thu được hợp chất BIL3.6 (1,4 g). Hợp chất BIL7.3.2 (90

mg) thu được khi sắc ký BGE3.5 (1g) trên cột sắc ký silica gel (20 g, Φ 30 mm)

với hệ dung môi rửa giải dicloromethan – methanol – nước (6:1:0,1) (v/v/v) (V =

93

1000 ml). Phân đoạn BGE3.2 (200 mg) được sắc ký qua cột silica gel sử dụng hệ

dung môi dicloromethan – ethyl acetat (15:1, v/v) (V = 500 ml) thu được 2 phân

đoạn BGE3.6 và BGE3.7. Tinh chế BGE3.6 (30 mg) qua các cột sắc ký khác nhau

thu được hợp chất BIL6.2 (3,4 mg). Hợp chất BIL4.5 (45,6 mg) thu được khi tinh

chế lại BGE3.7.

Từ phân đoạn BGE4 (2 g) sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải

dicloromethan – methanol – nước (5:1:0,1) (V = 1000 ml) thu được BI8.4 (300

mg). Từ BI8.4, sử dụng các phương pháp sắc ký kết hợp thu được hợp chất

BIL18.1 (25 mg).

Hình 3.23. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BFG (Balanophora fungosa var. globosa)

94

Hợp chất BIL3.6: (+)-isolariciresinol

Hợp chất BIL3.6 được phân lập dưới dạng bột màu trắng ngà. Số liệu phổ

1H NMR (700 MHz, 25 °C, acetone-d6): δH 7.37 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.77

của BIL3.6:

– 6.75 (2H, m, C2,5-H), 6.65 (1H, s, C2’-H), 6.62 (1H, d, J = 7.8 Hz, C6-H), 6.18

(1H, s, C5’-H), 3.968 (1H, s), 3.961 (1H, s), 3.84 – 3.82 (1H, d, J = 11.2 Hz, C7-

H), 3.79 (3H, s, 3’-OCH3), 3.77 (3H, s, 3-OCH3), 3.71– 3.68 (3H, m, C9’-Ha, C9’-

Hb, C9-Hb), 3.41 – 3.39 (1H, m, C9-Ha), 2.74 – 2.71 (2H, m, C7’-Ha, C7’-Hb),

13C NMR (176 MHz, 25 °C, acetone-d6): 148.2 (C-3), 146.4 (C-3’), 145.8

2.00 – 1.96 (1H, m, C8’-H), 1.82 – 1.79 (1H, m, C8-H);

(C-4), 145.2 (C-4’), 138.5 (C-1), 134.0 (C-6’), 128.5 (C-1’), 122.8 (C-6), 116.9

(C-5’), 115.5 (C-5), 113.6 (C-2), 112.0 (C-2’), 65.9 (C-9’), 62.1 (C-9), 56.2, 56.2

(2 x -OCH3), 48.3 (C-8), 48.1 (C-7), 40.4 (C-8’), 33.7 (C-7’).

Trên phổ 1H-NMR của chất BIL3.6 xuất hiện tín hiệu của 5 proton thuộc

vòng thơm, trong đó có 3 proton thuộc 1 vòng thơm tại δH 6.77 – 6.75 (2H, m,

C2,5-H), 6.62 (1H, d, J = 7.8 Hz, C6-H) và 2 proton thuộc vòng thơm còn lại ở δH

6.65 (1H, s, C2’-H), 6.18 (s, 1H, C5’-H). Ngoài ra phổ 1H-NMR còn chỉ ra sự xuất

hiện của 2 nhóm methoxy có độ dịch chuyển tại 3.77 ppm (3H, s, 3-OCH3) và một

nhóm tại 3.79 ppm (3H, s, 3’-OCH3). Các tín hiệu proton tại δH 7.37 (s, 1H), 7.10

(s, 1H) có thể của các nhóm –OH phenol trong khi 3.968 (1H, s) và 3.961 (1H, s)

có thể là của hai proton thuộc các nhóm –OH nối với C9 và C9’.

Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử cacbon, trong đó có 12

nguyên tử cacbon thuộc 2 vòng thơm với độ dịch chuyển trong khoảng từ 112.0-

148.2 ppm.

Dữ liệu phổ của hợp chất BIL3.6 hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu phổ của

hợp chất (7S,8R,8’R)-(+)-cyclolariciresinol [= (+)-isolariciresinol] đã công bố

trong tài liệu, như vậy có thể nhận định hợp chất BIL3.6 là (+)-isolariciresinol

(C20H24O6) [42].

95

Hợp chất BIL4.5: (+)-pinoresinol

Hợp chất BIL4.5 thu dưới dưới dạng chất bột màu trắng. Số liệu phổ của

1H NMR (700 MHz, 25 °C, DMSO-d6): δH 8.89 (2H, s), 6.89 (2H, d, J = 1.4

BIL4.5:

Hz, C2,2’-H), 6.75 – 6.71 (4H, m, C5,6,5’,6’-H), 4.60 (2H, d, J = 4.2 Hz, C7,7’-H),

4.12 – 4.10 (2H, m), 3.76 (6H, s, 2 x –OCH3), 3.72 (2H, dd, J = 9.1, 3.7 Hz), 3.03

13C NMR (176 MHz, 25 °C, DMSO-d6): 147.5 (C-3,3’), 145.9 (C-4,4’),

– 3.02 (m, 2H, C8,8’-H).

132.2 (C-1,1’), 118.6 (C-6,6’), 115.1 (C-5,5’), 110.4 (C-2,2’), 85.1 (C-7,7’), 70.9

(C-9,9’), 55.6 (-OCH3), 53.6 (C-8,8’).

Trên dữ liệu phổ 1H-NMR của BIL4.5 xuất hiện tín hiệu của các proton đối

xứng thuộc vòng thơm tại δH 6.89 (2H, d, J = 1.4 Hz, C2,2’-H), 6.75 – 6.71 (4H,

m, C5,6,5’,6’-H). Nhóm oxymetin được xác định tại δH 4.60 (2H, d, J = 4.2 Hz, C7,7’-

H). Trong khi đó tại các độ dịch chuyển δH 4.12 – 4.10 (2H, m) và δH 3.72 (2H,

dd, J = 9.1, 3.7 Hz) xuất hiện tín hiệu của các proton thuộc nhóm oxymethylen.

Bên cạnh đó, tín hiệu của nhóm metin được xác định tại δH 3.03 – 3.02 (m, 2H,

C8,8’-H).

Trên phổ 13C-NMR của BIL4.5 cũng xuất hiện tín hiệu của 10 nguyên tử

cacbon trong đó 6 cacbon thuộc vòng thơm với độ dịch chuyển δC từ 110.4 –

147.5. Nhóm methoxy được xác định tại δC 55.6. Ngoài ra, tín hiệu các nguyên tử

cacbon thuộc nhóm oxymetin và oxymethylen của khung benzofuran cũng được

96

xác định tại δC 85.1 và 70.9.

Như vậy, những dữ liệu phổ của BIL4.5 rất tương đồng với các dữ liệu phổ

của hợp chất BdD2.7 phân lập từ loài B. fungosa subsp. indica trong cùng luận

án. Tương tự với hợp chất BdD2.7, sự sai khác về độ dịch chuyển hóa học của

H2-9 và H2-9’(ΔδH-9 và ΔδH-9’) đều có giá trị trung bình (~0.40 ppm). Kết hợp so

sánh với các dữ liệu phổ đã công bố có thể kết luận BIL4.5 là (+)-pinoresinol

[40].

Hợp chất BIL6.2: Methyl caffeat

1H NMR (700 MHz, 25 °C, DMSO-d6): δ 9.37 (2H, br s, -OH); 7.49 (1H, d,

Hợp chất BIL6.2 thu được dưới dạng bột. Số liệu phổ của BIL6.2:

J = 15.4 Hz, C7-H), 7.05 (1H, d, J = 2.1 Hz, C2-H), 7.00 (1H, dd, J = 7.7, 2.1 Hz,

C6-H), 6.76 (1H, d, J = 8.4 Hz, C5-H), 6.27 (1H, d, J = 16.1 Hz, C8-H), 3.68 (3H,

13C NMR (125 MHz, MeOD): δ 127.6 (C-1), 114.8 (C-2), 146.9 (C-3), 146.7

s, -OCH3);

(C-4), 115.1 (C-5), 122.9 (C-6), 149.4 (C-7), 116.4 (C-8), 169.7 (C-9), 51.9

(OCH3).

Phổ 1H NMR của BIL6.2 xuất hiện tín hiệu của nhóm methoxy tại H 3.68

và 3 proton tại vòng thơm tại H 7.05 (1H, d, J = 2.1 Hz, C2-H), 6.76 (d, J = 8.4

Hz, 1H, C5-H), 7.00 (1H, dd, J = 7.7, 2.1 Hz, C6-H). Phổ 1H NMR của BIL6.2

cũng cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của 2 proton olefin tại H 7.49 (1H, d, J = 15.4

Hz, C7-H) và 6.27 (d, J = 16.1 Hz, 1H, C8-H). Dựa vào giá trị hằng số tương tác

spin-spin giữa C7-H/C8-H có kết luận là mạch nhánh có nối đôi là đồng phân hình

học trans. Bên cạnh đó, tín hiệu của 2 proton của nhóm hydroxy trên vòng thơm

97

cũng được ghi nhận tại H 9.37.

Trên phổ 13C và phổ DEPT cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của 10 vạch

cacbon. Trong đó có 1 nhóm methoxy tại δC 51.9 và 6 nhóm metin được xác định

lần lượt tại các vị trí tương ứng δC 114.8 (C-2), 115.1 (C-5), 122.9 (C-6), 149.4

(C-7), 116.4 (C-8), 169.7 (C-9) và 3 cacbon không mang hydro tại δC 127.6 (C-

1), 146.9 (C-3), 146.7 (C-4). Kết hợp với các dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu

tham khảo cho phép kết luận hợp chất BIL6.2 là Methyl caffeat [123].

Hợp chất BIL7.3.2: Acid gallic

Hợp chất BIL7.3.2 thu được dưới dạng chất bột màu nâu. Số liệu phổ của

1H NMR (700 MHz, 25 °C, DMSO-d6): 12.12 (1H, br s, -COOH), 9.14 (3H,

BIL7.3.2:

13C NMR (176 MHz, 25 °C, DMSO-d6): 167.5 (-COOH), 145.4 (C-3, C-5),

br s, -OH), 6.91 (2H, s, C2,6-H);

137.9 (C-4), 120.5 (C-1), 108.7 (C-2, C-6).

Phổ khối lượng phun mù điện tử xuất hiện tín hiệu [M-H]- tại m/z 169 và kết

hợp với phổ 1H-NMR, 13C-NMR có thể dự đoán CTPT C7H6O5, KLPT M=170..

Phổ 1H NMR xuất hiện tín hiệu tại δH 6.91 ppm (2H, s, C2,6-H) có cường độ gấp

đôi, chứng tỏ hai proton này thuộc vòng thơm đối xứng nhau.

Trên phổ 13C NMR xuất hiện tín hiệu của 5 cacbon, trong đó tín hiệu tai

108.7 và 145.4 là chập đôi hoàn toàn phù hợp với các vị trí tương ứng C-2,6 và

C-3,5. Bên cạnh đó tín hiệu đặc trưng của nhóm -COOH cũng được xác định

(167.5 ppm). Bên cạnh đó, các tín hiệu tại 120.5 (C-1), 137.9 (C-4) cũng được

xác định. Dựa vào dữ kiện phổ trên và so sánh với hợp chất acid gallic đã công bố

98

trong tài liệu tham khảo ta xác định được hợp chất BIL7.3.2 là acid gallic [44].

Hợp chất BIL18.1: epipinoresinol 4-O-β-D-glucopyranosid

Hợp chất BIL18.1 thu dưới dưới dạng chất dầu bột màu trắng. Số liệu phổ

1H NMR (500 MHz, MeOD): δH 7.15 (1H, d, J = 8.0 Hz, C5-H), 7.05 (1H,

của BIL18.1:

d, J = 2.0, C2-H), 6.99 (1H, d, J = 1.0 Hz, C2ʹ-H), 6.95 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz,

C6-H), 6.83 – 6.79 (2H, m, C6ʹ-H, C5ʹ-H), 4.91 (d, J = 7.5 Hz, C1”-H), 4.88 (1H, d,

J = 6.0 Hz, C7-H), 4.50 (1H, d, J = 6.5 Hz, C7ʹ-H), 4.16 (1H, d, J = 9.0 Hz), 3.89-

3.88 (6H, -OCH3), 3.87-3.86 (2H, s), 3.83 (1H, t, J = 8.5 Hz), 3.72-3.69 (1H, m),

3.53-3.46 (2H, m), 3.42-3.38 (2H, m), 3.34-3.30 (1H, m, C8-H), 2.97-2.94 (1H,

13C NMR (125 MHz, MeOD):  102.8 (C-1″); 74.9 (C-2″); 77.8 (C-3″); 71.3

m, C8’-H).

(C-4″); 78.2 (C-5″); 62.5 (C-6″), 89.0 (C-7), 83.5 (C-7ʹ), 72.0 (C-9’), 70.7 (C-9)

Phổ 1H NMR của BIL18.1 xuất hiện tín hiệu của một phân tử đường với

proton anome tại δH 4.91 (d, J = 7.5 Hz, C1”-H). Trên phổ proton xuất hiện tín

hiệu 6 proton thuộc vòng thơm tại δH 7.15 (1H, d, J = 8.0 Hz, C5-H), 7.05 (1H, d,

J = 2.0, C2-H), 6.99 (1H, d, J = 1.0 Hz, C2ʹ-H), 6.93 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, C6-

H), 6.83 – 6.79 (2H, m, C6ʹ-H, C5ʹ-H).

Hai nhóm oxymetin được xác định tại δH 4.88 (1H, d, J = 6.0 Hz, C7-H),

4.50 (1H, d, J = 6.5 Hz, C7ʹ-H), 2 nhóm methoxy được xác định tại δH 3.89-3.88

(6H, -OCH3). Bên cạnh đó, xuất hiện tín hiệu của 6 proton khác tại δH 3.53 – 2.94.

Phổ 13C xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử cacbon, trong đó 12 nguyên tử

99

cacbon có tín hiệu tại 110.6 – 151.0 khẳng định sự có mặt của 2 vòng thơm thế

1,3,4. Các tín hiệu điển hình cho phép xác định sự có mặt của một phân tử đường

tại  102.8 (C-1”); 74.9 (C-2”); 77.8 (C-3”); 71.3 (C-4”); 78.2 (C-5”); 62.5 (C-

6”).

Kết quả phân tích phổ khối sử dụng hệ thống LC-Q-ToF-MS ở chế độ ion

âm giúp khẳng định BIL18.1 là một glycosid của một hợp chất lignan pinoresinol,

có công thức phân tử C26H32O11.

Trên phổ 1H NMR, các proton của nhóm methin tại δ 3.34 (C8-H) và 2.97

(C8’-H) được tìm thấy kết hợp với hai proton benzylic tương ứng ở δ 4.88 (C7-H)

và 4.50 (C7’-H); bên cạnh đó với hai cặp proton của nhóm methylen tại δ 3.42 và

3.83 và tại δ 3.72 và 4.16. Những tín hiệu này đặc trưng cho lignan furofuranoid

có cấu hình epi của pinoresinol [43].

Từ các dữ kiện phân tích trên kết hợp so sánh tài liệu hợp chất

epipinoresinol-4-O-β-D-glucopyranosid đã công bố cho thấy sự trùng khớp ở tất

cả các vị trí [43]. Vậy có thể khẳng định BIL18.1 là epipinoresinol-4-O-β-D-

glucopyranosid.

3.2.2.3. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Balanophora tobiracola

Toàn cây đã phơi khô nghiền thành bột của loài Balanophora tobiracola

(200 g) được chiết với methanol (500 mL x 3 lần). Dịch chiết tổng được cất thu

hồi dung môi thu cắn methanol (30 g). Cắn được phân tán trong 300 mL nước và

chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan (3 lần x 300 mL) và ethyl acetat (3 lần x

300 mL). Gộp các dịch chiết n-hexan và ethyl acetat, thu hồi dung môi dưới áp

suất giảm thu được cắn tương ứng n-hexan (6 g) và ethyl acetat (10 g).

Cắn phân đoạn ethyl acetat (10 g) được đưa lên cột sắc ký silica gel (100 g,

Φ 5,0 cm), rửa giải với hệ dung môi gradient 1, 10, 20, 40, 80 và 100% methanol

trong dicloromethan (V = 200 mL cho mỗi tỷ lệ) thu được 6 phân đoạn BTE1-6.

Phân đoạn BTE2 (50 mg) được sắc ký cột silica gel (Φ 2,0 cm) rửa giải bằng 10,

20, 30 và 40 % methanol trong dicloromethan (V = 100 mL cho mỗi tỷ lệ) thu

100

được 2 phân đoạn BTE2.1 and BTE2.2. Hợp chất BT3.1 (4,2 mg) được tinh chế

từ phân đoạn BTE2.2. Phân đoạn BTE5 (35 mg) được sắc ký cột Sephadex LH-

20 (10 g, Φ1,5 cm) rửa giải bằng methanol thu được 3 phân đoạn BTE5.1-BTE5.3.

Hợp chất BT6.1 (3,1 mg) được phân lập từ phân đoạn BTE5.2 sử dụng sắc ký

lớp mỏng điều chế với hệ dung môi cloroform – ethyl acetat – acid formic (7:3:1,

v/v/v). (Hình 3.24)

Dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng phân tử,

các hợp chất được xác định.

Hình 3.24. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BT (B. tobiracola)

Hợp chất BT3.1: acid cinnamic

Hợp chất BT3.1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Số liệu phổ của

1H-NMR (MeOD, 500 MHz) : δ 6.40 (1H, d, J = 16 Hz, C8-H), 7.74 (1H, d,

BT3.1:

J = 16 Hz, C7-H), 7.34-7.33 (3H, m, C3,4,5-H), 7.50 (2H, m, C2,6-H);

MS m/z = 147.04 [M-H]-.

Phổ 1H NMR xuất hiện tín hiệu của 5 proton thuộc vòng thơm tại δ 7.34-

101

7.35 (3H, m, C3,4,5-H), 7.50 (2H, m, C2,6-H). Bên cạnh đó có sự xuất hiện tín hiệu

của 2 proton olefin tại H 7.74 (1H, d, J = 16 Hz, C7-H) và 6.41 (1H, d, J = 16 Hz,

C8-H). Dựa vào giá trị hằng số tương tác spin-spin giữa C7-H/C8-H có kết luận là

mạch nhánh có nối đôi là đồng phân hình học trans. Dữ liệu phổ của hợp chất

BT3.1 hoàn toàn tương đồng với những dữ liệu phổ của acid cinnamic đã được

nghiên cứu trước đây [76]. Phổ khối lượng phân tử cũng phù hợp với công thức

phân tử C9H8O2 của acid cinnamic. Bên cạnh đó, hợp chất này cũng cho thấy sự

tương đồng về Rf với chất đối chiếu acid cinnamic khi triển khai sắc ký lớp mỏng.

Do đó, có thể kết luận BT3.1 là acid cinnamic.

Hợp chất BT6.1: acid caffeic

Hợp chất BT6.1 thu được dưới dạng chất bột màu vàng nhạt. Số liệu phổ

1H NMR (500 MHz, DMSO): δH 9.50, 9.11 (2H, s, -OH), 7.42 (1H, d, J =

của BT6.1:

16 Hz, C7-H), 6.17 (1H, d, J = 16 Hz, C8-H), 7.01 (1H, d, J = 2 Hz, C2-H), 6.96-

6.94 (1H, m, C6-H), 6.75 (1H, d, J = 8 Hz, C5-H).

Phổ khối lượng phân tử FAB-MS m/z 179.01 [M-H]-.

Phổ 1H NMR xuất hiện tín hiệu của 2 proton olefin tại H 7.42 (1H, d, J =

16 Hz, C7-H) và 6.41 (1H, d, J = 16 Hz, C8-H). Dựa vào giá trị hằng số tương tác

spin-spin giữa C7-H/C8-H có kết luận là mạch nhánh có nối đôi là đồng phân hình

học trans. Bên cạnh đó có sự xuất hiện tín hiệu của 3 proton thuộc vòng thơm tại

 7.01 (1H, d, J = 2 Hz, C2-H), 6.96-6.94 (1H, m, C6-H), 6.75 (1H, d, J = 8 Hz,

C5-H). Tín hiệu của 2 proton thuộc nhóm –OH cũng được ghi nhận tại δ 9.50,

9.11 (2H, s, -OH).

Những dữ liệu phổ của hợp chất BT6.1 hoàn toàn phù hợp với dữ liệu đã

102

công bố của acid caffeic [65]. Bên cạnh đó, triển khai sắc ký lớp mỏng so sánh

giữa BT6.1 và acid caffeic cho thấy sự tương đồng. Do đó có thể kết luận BT6.1

là acid caffeic. Đây là một hợp chất thường gặp trong các loài thuộc chi

Balanophora.

Cả 2 hợp chất acid cinnamic, acid caffeic đã được phân lập từ loài B.

tobiracola bởi Ito và cộng sự [64]. Tuy nhiên, đây là lần đầu các hợp chất này

được phân lập từ loài B. tobiracola ở Việt Nam.

3.2.2.4. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Balanophora subcupularis

Toàn cây đã phơi khô nghiền thành bột của loài Balanophora subcupularis

(205 g) được chiết với methanol (500 mL x 3 lần). Thu hồi dung môi thu được

cao chiết methanol (25 g). Cao chiết này được phân tán trong nước (300 mL) và

phân đoạn lần lượt với n-hexan (3 lần x 300 mL) và ethyl acetat (3 lần x 300 mL).

Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết phân đoạn n-hexan (7 g)

và ethyl acetat (8g).

Cao phân đoạn ethyl acetat (8 g) được đưa lên cột sắc ký silica gel (Φ 3,5

cm) rửa giải với 1, 10, 20, 40, 80 và 100% methanol trong dicloromethan (V =

200 ml mỗi hệ dung môi) thu được 6 phân đoạn BSE1-6. Phân đoạn BSE1 được

sắc ký cột silica gel (Φ 1,5 cm) rửa giải bằng dicloromethan thu được hợp chất

S1 (3,3 mg). Phân đoạn BSE5 được sắc ký cột silica gel (Φ 1, 5 cm) rửa giải bằng

0-90 % methanol trong dicloromethan thu được hợp chất S2 (3,5 mg). (Hình 3.25)

103

Hình 3.25. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu BS (B. subcupularis)

Dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng phân tử,

các hợp chất được xác định.

Hợp chất S1: coniferyl aldehyd

1H-NMR (MeOD, 500 MHz) : δ 9.59 (1H, d, J = 8.0 Hz, C9-H), 7.61 (1H,

Hợp chất S1 thu được dưới dạng tinh thể màu vàng. Số liệu phổ của S1:

d, J = 16 Hz, C7-H), 7.27 (1H, s, C2-H), 7.19 (1H, d, J = 8.0 Hz, C6-H), 6.88 (1H,

d, J = 8.5 Hz, C5-H), 6.67 (1H, dd, J = 16 Hz, 8.0 Hz, C8-H), 3.92 (3H, s, -OCH3);

MS m/z = 177.01 [M-H]-.

Phổ 1H NMR xuất hiện tín hiệu của 2 proton olefin tại H 7.42 7.61 (1H, d,

J = 16 Hz, C7-H) và 6.67 (1H, dd, J = 16 Hz, 8.0 Hz, C8-H). Dựa vào giá trị hằng

số tương tác spin-spin giữa C7-H/C8-H có kết luận là mạch nhánh có nối đôi là

đồng phân hình học trans. Bên cạnh đó, tín hiệu proton thuộc nhóm aldehyd cũng

được ghi nhận tại δ 9.59 (1H, d, J = 8.0 Hz, C9-H) cũng như tín hiệu của nhóm

methoxy tại 3.92 (3H, s, -OCH3). Ngoài ra, tín hiệu 3 proton thuộc vòng thơm

cũng được phát hiện tại δ 7.27 (1H, s, C2-H), 7.19 (1H, d, J = 8.0 Hz, C6-H), 6.88

(1H, d, J = 8.5 Hz, C5-H).

Dữ liệu phổ của hợp chất S1 hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu đã công bố

của hợp chất coniferyl aldehyd [106]. Phổ khối lượng phân tử cũng hoàn toàn phù

hợp với công thức phân tử C10H10O3. Do đó có thể kết luận S1 là conifeyl aldehyd.

104

Hợp chất S2: acid gallic

Hợp chất S2 thu được dưới dạng chất bột màu trắng ngà; Số liệu phổ của

1H NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 7.09 (2H, s, H-2,6);

S2:

MS m/z = 168.96 [M-H]-.

Những dữ liệu so sánh cho thấy hợp chất này tương đồng với hợp chất acid

gallic (BIL7.3.2) phân lập từ loài B. fungosa var. globosa [44]. Do đó có thể kết

luận S2 là acid gallic. Đây là một hợp chất thường gặp trong các loài thuộc chi

Balanophora.

Loài B. subcupularis là loài được phát hiện từ năm 1980 tại Phúc Kiến

(Trung Quốc) và gần đây được ghi nhận có ở Việt Nam. Tuy nhiên, đây là lần

đầu tiên thành phần hóa học của loài này được nghiên cứu.

3.2.3. Kết quả phân tích sử dụng sắc ký lỏng kết nối khối phổ

Tổng quan các tài liệu cho thấy có sự tương đồng nhất định trong thành phần

hóa học các loài thuộc chi Balanophora. Các hợp chất được phân lập từ một số

loài cùng chi Balanophora J.R.&G.Forst. có thể kể đến bao gồm các tanin thủy

phân được [1-O-(E)-caffeoyl-3-O-galloyl-β-D-glucopyranose; 1-O-(E)-caffeoyl-

4,6-(S)-HHDP-β-D-glucopyranose; 1,3-di-O-galloyl-4,6-(S)-HHDP-β-D-

glucopyranose; 3-O-galloyl-β-D-glucopyranose; 1,3-di-O-galloyl-β-D-

glucopyranose], các acid hydroxybenzoic và phenyl propanoid đơn giản (acid

gallic, acid caffeic, acid p-coumaric, methyl coniferin, coniferin, acid cinnamic,

1-O-(E)-caffeoyl-β-D-glucopyranose), các lignan (isolariciresinol,

isolariciresinol-4-O-β-D-glucosid, pinoresinol, pinoresinol-β-D-glucosid,

lariciresinol) hay một số flavonoid (eriodictyol 7-O-β-D-glucopyranosid, 3-

hydroxyphloretin, 3-hydroxyphloretin-4'-O-β-D-glucosid) [117].

Trong luận án này, cắn phân đoạn ethyl acetat của 4 mẫu nghiên cứu bao

gồm B. fungosa var. globosa (Jungh.) B.Hansen (BFG), B. fungosa subsp. indica

(Arn.) B.Hansen (BFI), B. tobiracola (BT) và B. subcupularis (BS) được phân

kết nối

105

tích sắc ký lỏng khối phổ sử dụng hệ thống thống sắc ký lỏng Exion LCTM

với detector khối phổ phân giải cao X500R QTOF (Sciex, USA) sử dụng nguồn

ion hóa phun mù điện tử. Cắn được hòa tan trong methanol và lọc qua màng lọc

0,45 µm. Các hợp chất được phân tách sử dụng cột Hypersil GOLD Dim. 150

mm x 2.1 mm, 3µm (Thermo Scientific, USA) trong gradient pha động từng bước

của acid formic 0,1% trong nước (dung môi A) và acid formic 0,1% trong

acetonitril (dung môi B) ở tốc độ dòng 0,4 mL/phút. Chương trình nhiệt độ được

thiết lập như sau: 0-1 phút, 100% A; 1-20 phút, 98% A; 20-25 phút, 2% A. Thể

tích tiêm mẫu là 2,0 µL. Phát hiện MS/MS được thực hiện ở chế độ ion âm trong

khoảng m/z là 50-2000 amu.

(Bảng 3.3). Các hợp chất được sơ bộ xác định dựa trên ion phân tử, các ion

phân mảnh, so sánh với các tài liệu, các cơ sở dữ liệu về khối phổ [142]–[144].

Sự có mặt của một số hợp chất được khẳng định bằng các chất đối chiếu.

3.2.3.1. Acid hydroxybenozic và dẫn chất

Phổ MS/MS của các hợp chất acid hydroxybenzoic có các ion phân mảnh

tại m/z [M-H-COO]– thông qua sự loại bỏ nhóm CO2 (44 Da) [1][2]. Các hợp

chất từ 1-7 được phát hiện trên sắc ký đồ cả 4 mẫu nghiên cứu trong khi hợp chất

8 chỉ được phát hiện trên sắc ký đồ mẫu BT.

Hợp chất 2 được xác định là acid gallic với ion m/z [M-H]– 169,0139 và ion

phân mảnh ở m/z 125 [M-H-COO]–. Sự có mặt của acid gallic được khẳng định

bằng cách so sánh với chất đối chiếu. Các hợp chất 1 (m/z 331,0681) và 3 (m/z

331,0681) được xác định là các glucosid của acid gallic với các ion phân mảnh

m/z 169 [M-H-162]– và m/z 125 [M-H-162-44]–, do sự mất đi phần đường (162

Da) và CO2 (44 Da) [105].

Hợp chất 4 được xác định là methyl gallat với ion m/z [M-H]– 183,0313 và

các ion phân mảnh ở m/z 168 [M-H-CH3]–, 124 [M-H-COOCH3]– [50][105].

Trong khi đó, hợp chất 8 được xác định là ethyl gallat với ion m/z [M-H]–

106

197,0470 và ion phân mảnh m/z 124 [M-H-COOC2H5]–.

Các hợp chất 5 (m/z 291,0156) được xác định là acid brevifolin carboxylic

với ion phân mảnh 247 [M-H-COO]– do sự mất đi nhóm CO2, trong khi đó, hợp

chất 6 (m/z 305,0443) được xác định là methyl brevifolin carboxylat [105].

Hợp chất 7 (m/z 300,9996) với một số ion phân mảnh m/z 284, 229, 201

được xác định là acid ellagic [23].

3.2.3.2. Phenylpropanoid đơn giản

Đã có 11 hợp chất phenyl propanoid đơn giản được xác định, bao gồm chủ

yếu là các acid hydroxycinnamic và dẫn chất. Tương tự các hợp chất acid

hydroxybenzoic, phổ MS/MS của các acid hydroxycinnamic cũng xuất hiện các

ion phân mảnh tại m/z [M-H-COO]–. Các hợp chất 12 (m/z 179,0363), 13 (m/z

163,0405) với các ion phân mảnh tương ứng m/z 135 [50] và 119 được xác định

là acid trans-caffeic và acid p-coumaric; sự có mặt của hai hợp chất được khẳng

định bằng cách so sánh với các chất đối chiếu.

Các hợp chất 9, 10 được dự đoán là các glucosid của acid caffeic với ion

[M-H]– 341,088 và các ion m/z 179, m/z 135, do sự mất đi phần đường (162 Da)

và CO2 (44 Da). Hợp chất 11 với ion m/z [M-H]– 325,0935 được dự đoán là

glucosid của acid p-coumaric với một số ion phân mảnh m/z 163 [M-H-162]– do

sự mất đi phần đường (162 Da) và m/z 119 [M-H-162-44]– do mất đi phần đường

và nhóm CO2.

Hợp chất 14 (m/z 193,0511), được xác định là acid ferulic [105]. Hợp chất

15 (m/z 177,0192), được xác định là coniferyl aldehyd với các ion phân mảnh m/z

162 [M-H-CH3]–, m/z 133 [M-H-CHO-CH3]–. Các hợp chất 14 và 15 được phát

hiện trên sắc ký đồ mẫu BS.

Hợp chất 16 (m/z 193,0516) được xác định là methyl caffeat, với các ion

phân mảnh m/z 178 [M-H-CH3]– và m/z 134 [M-H-COOCH3]–. Hợp chất 17 (m/z

207,0677), được xác định là ethyl caffeat, xuất hiện trên sắc ký đồ 3 mẫu BT,

107

BFI, BFG.

Hợp chất 18 (m/z 147,0460) được xác định là acid cinnamic, được phát hiện

trên sắc ký đồ mẫu BT.

Các hợp chất 10, 11, 12, 13, 16 được xác định trong cả 4 mẫu nghiên cứu.

3.2.3.3. Tanin thủy phân được

Các tanin thủy phân được có cấu trúc gồm các nhóm galloyl-, caffeoyl-,

coumaroyl-, HHDP- liên kết với phân tử đường được phát hiện trên sắc ký đồ các

mẫu nghiên cứu.

Trong các hợp chất được phát hiện, các hợp chất từ 19-22 và 24 là các

gallotanin có cấu trúc gồm 2 đến 4 nhóm galloyl- liên kết với phân tử đường. Hầu

hết các hợp chất này đều có các ion phân mảnh tại m/z [M-H-170]– và m/z [M-H-

152]–, bên cạnh đó có thể có các ion phân mảnh khác như [M-H-170-152]– và [M-

H-170-152-152]– do sự mất đi của acid gallic và một hoặc hai nhóm galloyl- [29].

Các hợp chất 19-21 là các isomer khác nhau của di-O-galloyl-β-D-glucosid

với sự xuất hiện của các ion phân mảnh m/z 313 [M-H-170]– và m/z 331 [M-H-

152]–.

Hợp chất 22 (m/z 635,1205) được xác định là tri-O-galloyl-β-D-glucosid

với phổ MS/MS xuất hiện một số ion phân mảnh có cường độ lớn như m/z 483

[M-H-152]–, m/z 465 [M-H-170]–, m/z 313 [M-H-170-152 [50].

Phổ MS/MS của hợp chất 24 (m/z 787,0996) cũng xuất hiện các ion phân

mảnh tại m/z 635 [M-H-152]–, m/z 617 [M-H-170]–, m/z 465 [M-H-170-152]–,

m/z 313 [M-H-170-152-152]–; hợp chất 24 được xác định là tetra-O-galloyl-β-D-

glucosid [50].

Trong khi đó, các hợp chất 23, 29, 33, 34 được xác định là các tanin thủy

phân được có nhóm hexahydroxydiphenoyl- (HHDP-) (ellagitanin) với sự xuất

hiện của phân mảnh m/z 301 [29]. Các hợp chất này chỉ được xác định trên sắc

108

ký đồ hai mẫu BFI, BFG.

Hợp chất 23 (m/z 643,1258) được xác định là O-caffeoyl-HHDP glucosid

với ion phân mảnh m/z 301 [M-H-180-162]– do sự mất di acid caffeic và phần

đường.

Hợp chất 29 (m/z 627,1329) được xác định là O-p-coumaroyl-HHDP-β-D-

glucosid với một số ion phân mảnh m/z 463 [M-H-164]–, m/z 481 [M-H-146]– do

sự mất đi acid p-coumaric hoặc nhóm p-coumaroyl-.

Hợp chất 33 (m/z 795,1392) được xác định là O-caffeoyl-O-galloyl-HHDP-

β-D-glucosid với một số ion phân mảnh m/z 493 [M-H-302]– do sự mất đi của

nhóm HHDP hay m/z 615 [M-H-180]– do sự mất đi acid caffeic. Một số ion phân

mảnh 169, 179, 301 khẳng định sự có mặt của acid gallic, acid caffeic và HHDP.

Hợp chất 34 (m/z 805,1608) được xác định là di-O-caffeoyl-HHDP-β-D-

glucosid với một số ion phân mảnh m/z 625 [M-H-180]– và m/z 643 [M-H-162]–

do sự mất đi acid caffeic hoặc nhóm caffeoyl-, m/z 445 [M-H-180-180]– do sự

mất đi 2 acid caffeic.

Các hợp chất 25-27 được xác định là các isomer của O-caffeoyl-O-galloyl-

β-D-glucosid với một số ion phân mảnh m/z 313 [M-H-180]–, m/z 331 [M-H-

162]– do sự mất đi acid caffeic hoặc nhóm caffeoyl-, và phân mảnh m/z 341 [M-

H-152]– do sự mất đi nhóm galloyl-.

Hợp chất 28 (m/z 645,1073) được xác định là O-caffeoyl-di-O-galloyl-β-D

glucosid với ion m/z 493 [M-H-152]– do mất đi nhóm galloyl-, m/z 483 [M-H-

162]– do mất đi nhóm caffeoyl-, m/z 323 [M-H-152-170]– do mất đi nhóm galloyl-

và acid gallic.

Hợp chất 30 (m/z 487,1245) được xác định là O-caffeoyl-p-coumaroyl-β-

D-glucosid với ion m/z 323 [M-H-164]– và m/z 341 [M-H-146]– do sự mất đi acid

p-coumaric hoặc nhóm coumaroyl-, ion m/z 325 [M-H-162]– do mất đi nhóm

caffeoyl-. Một số ion phân mảnh m/z 179, 163 góp phần khẳng định sự có mặt

109

acid caffeic và acid p-coumaric.

Hợp chất 31 (m/z 797,1199) được xác định là O-caffeoyl-tri-O-galloyl-β-

D-glucosid với sự xuất hiện các ion phân mảnh m/z 627 [M-H-170]– và m/z 645

[M-H-152]– do sự mất đi acid gallic hoặc nhóm galloyl-, m/z 465 [M-H-170-162]–

do sự mất đi acid gallic và nhóm caffeoyl-, m/z 295 [M-H-170-170-162]– do sự

mất đi 2 acid gallic và nhóm caffeoyl-.

Hợp chất 32 (m/z 503,1432) được xác định là di-O-caffeoyl-β-D-glucosid

với một số ion phân mảnh m/z 341 [M-H-162]–, m/z [M-H-180]– do sự mất đi

nhóm caffeoyl- hoặc acid caffeic.

3.2.3.4. Flavonoid

14 hợp chất flavonoid (35-48) đã được xác định dựa trên các chất đối chiếu

và tài liệu tham khảo. Các hợp chất flavonoid chủ yếu được xác định trên sắc ký

đồ 2 mẫu BS, BT.

Hợp chất 35 (m/z 463,0888) được xác định là quercetin glucosid bằng cách

so sánh với thư viện phổ. Hợp chất này được xác định trên sắc ký đồ 2 mẫu BS,

BT.

Hợp chất 45 (m/z 287,0562) được xác định là eriodictyol [104] trong khi

hợp chất 36 (m/z 449,1095) được xác định là eriodictyol-7-O-glucosid với ion

phân mảnh m/z 287 [M-H-162]– do sự mất đi phần đường (162 Da). Hai hợp chất

này được phát hiện trên sắc ký đồ 2 mẫu BS, BT.

Hợp chất 37 (m/z 615,0988) được xác định là 2”-galloyl hyperin với ion

phân mảnh m/z 301 [M-H-C13H14O9]– do sự mất đi phần đường và nhóm galloyl-

[127]. Hợp chất này được xác định trong mẫu BS, BT.

Hợp chất 39 (m/z 447,0938) được xác định là luteolin glucosid .

Hợp chất 43 được xác định là phlorizin với ion phân mảnh m/z 273 [M-H-

162]– do sự mất đi phần đường (162 Da) hay m/z 167 [M-H-162-106]– do sự mất

đi phần đường (162 Da) và nhóm C7H6O (106 Da). Bên cạnh đó, ion phân mảnh

m/z 125 xuất hiện do sự mất đi nhóm C2H2O từ m/z 167 [121]. Hợp chất 43 được

110

phát hiện trên sắc ký đồ 2 mẫu BS, BT.

Các hợp chất 35, 36, 37, 39, 43, 45 được xác định trên sắc ký đồ cả 2 mẫu

BS, BT.

Các hợp chất 38, 41, 42, 44, 46 được xác định là các dẫn chất của 3-hydroxy

phloretin và được phát hiện trên sắc ký đồ mẫu BT. Hợp chất 38 (m/z 451,1247)

được xác định là 3-hydroxy phloretin O-β-D-glucosid với ion phân mảnh m/z 289

[M-H-162]– do sự mất đi phần đường (162 Da), ion phân mảnh m/z 167 [M-H-

162-122]– do sự mất đi phần đường (162 Da) và nhóm C7H6O2 (122 Da). Hợp

chất 41 (m/z 755,1102) được xác định là 3-hydroxy phloretin-O-(di-O-galloyl)-β-

D-glucosid với ion m/z 603,1340 [M-H-152]– hay m/z 585 [M-H-170]– do sự mất

đi nhóm galloyl- hoặc acid gallic. Hợp chất 42 (m/z 603,1340) được xác định là

3-hydroxy phloretin-O-(O-galloyl-)-β-D-glucosid với một số ion phân mảnh m/z

451 [M-H-152]– do sự mất đi nhóm galloyl- (152 Da) hay m/z 289 [M-H-152-

162]– do sự mất đi nhóm galloyl- (152 Da) và phần đường (162 Da). Các hợp chất

44 (m/z 753,1290) và 46 (m/z 905) được xác định là 3-hydroxy phloretin-O-(O-

HHDP)-β-D-glucosid và 3-hydroxy phloretin-O-(O-galloyl-O-HHDP)-β-D-

glucosid với sự có mặt một số ion phân mảnh m/z 289 và 301, khẳng định sự có

mặt của 3-hydroxy phloretin và nhóm HHDP.

Hợp chất 47 với m/z 271,0625 [M-H]– được xác định là naringenin

[31][104]. Hợp chất 40 (m/z 433,1152) được xác định là naringenin-7-O-glucosid

với ion m/z 271 [M-H-162]– do mất đi phần đường (162 Da). Hợp chất 48 (m/z

285,0402) được xác định là kaempferol [31]. Các hợp chất 40, 47, 48 được xác

định trên sắc ký đồ mẫu BS.

Bảng 3.3. Các hợp chất được xác định trong phân đoạn ethyl acetat các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ

Mẫu TT Thời gian lưu (phút) Hợp chất được dự đoán [M-H]– (m/z) Ion phân mảnh MS2 (m/z)

111

Acid hydroxybenzoic và dẫn chất

2,66 331,0671 1 271, 211, 169 (100), 125, 59 BS, BT, BFG, BFI Acid gallic glucosid isomer I

3,60 Acid gallica 169,0139 2 125, 124, 79 (100), 69 BS, BT, BFG, BFI

5,67 331,0681 169 (100), 125 3 BS, BT, BFG, BFI Acid gallic glucosid isomer II

7,23 Methyl gallat 183,0313 4 BS, BT, BFG, BFI

7,51 291,0156 5 Acid brevifolin carboxylic BS, BT, BFG, BFI

8,27 305,0304 6 BS, BT, BFG, BFI Methyl brevifolin carboxylat

8,35 Acid ellagic 300,9996 7 BS, BT, BFG, BFI

8,44 Ethyl gallat 197,0470 BT 8

168, 124 (100), 106, 78 247 (100), 219, 191, 173, 145, 119 273, 245, 217 (100), 189, 161, 145 284, 229, 201, 185 (100), 173, 145 169, 125, 124 (100), 106, 78, 53

Phenylpropanoid đơn giản

6,14 341,0883 BS, BT 9

233, 203, 179, 161(100), 135, 133

341,0885 6,87 10 179, 161 (100), 135, 133, 59 BS, BT, BFG, BFI

325,0935 7,51 11 BS, BT, BFG, BFI 205, 163, 145 (100), 119, 117, 59

179,0363 135, 134 (100) 7,80 12 BS, BT, BFG, BFI Acid caffeic glucosid isomer I Acid caffeic glucosid isomer II Acid p- coumaric glucosid Acid trans- caffeica

163,0405 8,67 13 119 (100), 93, 65 BS, BT, BFG, BFI Acid p- coumarica

112

BS 8,97 Acid ferulic 193,0511 14 178, 134 (100), 133, 106

9,64 177,0192 BS 15 Coniferyl aldehyd 162 (100), 161, 134, 133

10,00 Methyl caffeat 193,0516 16 BS, BT, BFG, BFI

10,93 Ethyl caffeat 207,0677 17 BT, BFG, BFI 178, 161, 134, 133 (100) 179, 161, 135, 134, 133 (100), 107

11,05 Acid cinnamica 147,0460 103, 77 (100) BT 18

Tanin thủy phân được

5,35 483,0786 BS, BT 19

6,36 483,0780 BS, BT 20

7,01 483,0776 21 BS, BT, BFG, BFI di-O-galloyl-β- D-glucosid isomer I di-O-galloyl-β- D-glucosid isomer II di-O-galloyl-β- D-glucosid isomer III

7,60 635,1205 22 BS, BT, BFG, BFI Tri-O-galloyl- β-D-glucosid

331, 313, 271, 211, 169 (100), 125 331, 313, 271, 211, 193, 169 (100), 125 423, 313, 271, 211, 169 (100), 125 483, 465, 423, 331, 313, 295, 211, 169 (100), 125

7,90 643,1258 BFG, BFI 23 421, 301 (100), 275, 249, 203 O-caffeoyl- HHDP glucosid

8,18 787,0996 24 635, 617 (100), 465, 295, 169 BS, BT, BFG, BFI Tetra-O- galloyl glucosid

8,29 493,1251 BS 25

433, 341, 331, 281, 251, 211, 179, 169 (100), 151, 135

8,40 493,1313 BT 26

113

341, 331, 313, 271, 211, 179, 169 (100), 161 O-caffeoyl-O- galloyl-β-D glucosid isomer I O-caffeoyl-O- galloyl-β-D glucosid isomer II

8,73 493,1597 BFG, BFI 27

341, 331, 313, 271, 179, 169, 161 (100) O-caffeoyl-O- galloyl-β-D glucosid isomer III

8,79 645,1073 28 BS, BT, BFG, BFI O-caffeoyl-di- O-galloyl-β-D glucosid 493, 483, 475, 433, 323, 305, 233, 179, 169 (100), 125

9,80 627,1329 BFG, BFI 29 481, 463, 303, 301 (100), 161

9,51 487,1245 BT 30

9,52 797,1199 31 BT, BFG, BFI O-p- coumaroyl-β- D- HHDP glucosid O-caffeoyl-p- coumaroyl-β- D-glucosid O-caffeoyl-tri- O-galloyl-β-D- glucosid

9,72 503,1432 32 di-O-caffeoyl- β-D-glucosid BT, BFG, BFI

9,99 795,1392 BFG, BFI 33

O-caffeoyl-O- galloyl-HHDP- β-D-glucosid

10,52 805,1608 BFG, BFI 34

di-caffeoyl- HHDP glucosid 341, 325, 323 (100), 179, 163, 161 753, 645, 627 (100), 465, 295, 169 341, 323, 281, 233, 203, 179, 161 (100) 751, 589, 493, 463, 419, 301 (100), 275, 249, 179, 169 643, 625, 463, 445, 341, 301 (100), 275, 249, 179, 161

Flavonoid

8,79 463,0888 BS, BT 35 Quercetin glucosid 316, 301 (100), 300, 178, 151

8,88 449,1095 BS, BT 36 Eriodictyol-7- O-glucosid 287, 175, 151 (100), 135

114

9,05 615,0988 BS, BT 37 2”-Galloyl hyperin 493, 465, 421, 301 (100), 271, 169

9,30 451,1247 BT 38 289, 271, 191, 167 (100), 125 3-hydroxy phloretin O-β- D-glucosid

9,41 447,0938 39 BS, BT, BFI

9,48 433,1152 BS 40 327, 285 (100), 257, 151, 107 271 (100), 177, 151, 119

9,49 755,1102 BT 41

755 (100), 603, 585, 465, 447, 331, 277, 169

9,65 603,1340 BT 42

Luteolin glucosid Naringenin-7- O-glucosid 3-hydroxy phloretin-O- (di-O-galloyl)- β-D-glucosid 3-hydroxy phloretin-O- (O-galloyl-)-β- D-glucosid

10,19 Phlorizin 435,1302 BS, BT 43

603 (100), 481, 451, 439, 313, 289, 191, 169, 167 327, 273, 203, 191, 167 (100), 125

10,30 753,1290 BT 44 463, 301 (100), 289, 167

3-hydroxy phloretin -O- (O-HHDP)-β- D-glucosid

10,63 Eriodictyol 287,0562 BS , BT 45 151, 135 (100), 109, 107, 83, 65

10,867 905,1407 BT 46

861, 603, 433, 313, 301 (100), 289, 275

3-hydroxy phloretin-O- (O-galloyl-O- HHDP)-β-D- glucosid

11,50 Naringenin 271,0625 BS 47

11,62 Kaempferola 285,0402 BS 48

aSự có mặt các hợp chất được khẳng định bằng cách so sánh với hỗn hợp chất đối chiếu

115

229, 177, 151, 119 (100), 107, 65 285 (100), 239, 211, 187, 185, 159, 143

3.2.4. Kết quả triển khai sắc ký lớp mỏng các loài nghiên cứu

Nghiên cứu của Hou Qin-yun và cộng sự năm 2009 so sánh thành phần hóa

học năm loài thuộc chi Balanophora bao gồm B. simaoensis, B. spicata, B.

laxiflora và B. dioica cho thấy các loài này có sự tương đồng về thành phần các

hợp chất ít phân cực với một số hợp chất như Balanophorin A (β-amyrin palmitat),

Balanophorin B (lupeol palmitat), β-amyrin acetat và lupeol acetat được phát hiện

trên sắc ký đồ của tất cả các loài nghiên cứu [137]. Trên cơ sở, chúng tôi tiến hành

sắc ký lớp mỏng so sánh thành phần n-hexan của các loài thuộc chi Balanophora

ở Việt Nam bao gồm B. fungosa (var. globosa & subsp. indica), B. tobiracola, và

B. subcupularis để xác định sự tương đồng về thành phần ít phân cực của các loài

này.

Cắn n-hexan của mỗi loài (50 mg) được hòa tan trong methanol (5 mL) để

chấm sắc ký. Chấm 10 µl thể tích mỗi dung dịch thử (nồng độ 0,2g/ml) trên cùng

bản mỏng pha thường HPTLC silica gel 60 F254 (Merck) hoặc bản mỏng pha đảo

RP-HPTLC sử dụng hệ thống Linomat 5 (CAMAG) và triển khai với hai hệ dung

môi tương ứng là n-hexan – ethyl acetat (5:1) và ethyl acetat – acetonitril (3:2)

[81]. Bản mỏng sau khi triển khai được phun thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric

(AS), sấy hiện màu ở nhiệt độ 110 °C trong 5-10 phút và quan sát, phân tích ở

ánh sáng thường và λ = 366 nm (Hình 3.20).

Kết quả phân tích sắc ký đồ cho thấy sắc ký đồ triển khai trên bản mỏng

HPTLC silica gel 60 F254 của 4 loài đều có 6 vết có Rf tương đồng 0,11; 0,26;

0,40; 0,57; 0,71 và 0.82 với cường độ khác nhau (Hình 3.26A). Trên bản mỏng

pha đảo C18 RP-HPTLC, sắc ký đồ các loài nghiên cứu cũng xuất hiện các vết

tương đồng với 0,13; 0,21; 0,31; 0,59 và 0,61 (Hình 3.26B). Từ các dữ liệu sắc

ký đồ thu được, có thể thấy 4 mẫu thuộc chi Balanophora có những sự tương

đồng nhất định về thành phần các hợp chất ít phân cực, cụ thể là các hợp chất

116

triterpen và sterol.

A. Bản mỏng HPTLC silica gel triển khai với hệ dung môi n- hexan – ethyl acetat (5:1) quan sát ở ánh sáng thường (a) và 366 nm (b)

B. Bản mỏng C18 RP- HPTLC triển khai với hệ dung môi ethyl acetat – acetonitril (3:2) quan sát ở ánh sáng thường (a) và 366 nm (b)

Hình 3.26. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn n-hexan của các loài nghiên cứu

Từ các loài nghiên cứu, một số hợp chất lignan và phenolic được phân lập.

Trong luận án này, các hợp chất acid gallic, acid caffeic, methyl caffeat,

pinoresinol, isolariciresinol và epipinoresinol-4-O-β-D-glucopyranose được hòa

trong methanol và sử dụng triển khai sắc ký lớp mỏng trên cùng bản mỏng với

117

dịch chiết các loài nghiên cứu (Hình 3.27).

Hình 3.27. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các loài nghiên cứu triển khai với hệ dung môi cloroform–toluen–methanol–amoniac 25% (10:3:6:1) quan sát ở: a. λ = 254 nm, b. Ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử AS, c. λ = 366 nm sau khi phun thuốc thử AS*

*Chú thích: BFI: B. fungosa subsp. indica, BFG: B. fungosa var. globosa, BT:

B. tobiracola, BS: B. subcupularis, IL: isolariciresinol, P: pinoresinol, P’:

118

epipinoresinol-4-O-β-D-glucopyranose

SKLM dịch chiết methanol 4 mẫu nghiên cứu và một số hợp chất lignan sử

dụng hệ dung môi cloroform – toluen – methanol – amoniac 25% (10:3:6:1)

(v/v/v/v) [51]. Kết quả cả 3 hợp chất lignan được phân lập và xác định cấu trúc

từ loài B. fungosa var. globosa (BFG) bao gồm: pinoresinol, isolariciresinol và

epipinoresinol-4-O-β-D-glucopyranose đều có các vết tương đồng trên sắc ký đồ

của loài B. fungosa subsp. indica (BFI) (Hình 3.27). Trên sắc ký đồ của 4 mẫu

nghiên cứu có 6 vết tương đồng với Rf 0,33; 0,54; 0,62; 0,73; 0.82; và 0,90 cho

thấy sự tương đồng nhất định giữa các loài cùng chi. Trong các vết tương đồng

nói trên, vết có Rf 0,73 có giá trị Rf và màu sắc tương đồng với pinoresinol (P).

Trong khi đó, sắc ký đồ BFG và BFI có 9 vết tương đồng (tại Rf 0,11; 0,33; 0,46;

0,54; 0,62; 0,65; 0,73; 0,82; và 0,90) gợi ý thành phần hóa học tương đồng của

hai taxa của loài B. fungosa. Các vết có Rf và màu sắc tương đồng với

isolariciresinol (IL) (Rf 0,65) và epipinoresinol-4-O-β-glucopyranose (P’) (Rf

0,46) chỉ được quan sát trên sắc ký đồ của hai mẫu BFI và BFG.

Như vậy, những dữ liệu sắc ký gợi ý rằng hai taxa rất gần của B. fungosa

(BFI và BFG) có thể có những thành phần hóa học rất tương đồng.

Ngoài ra, phân tích SKLM dịch chiết methanol các mẫu nghiên cứu và một

số hợp chất như acid gallic, acid caffeic và methyl caffeat được triển khai với hệ

dung môi toluen – ethyl acetat – acid formic (14:10:1) (v/v/v) [87] (Hình 3.28).

Kết quả cho thấy SKĐ các mẫu đều cho thấy một số vết tương đồng với acid

gallic (Rf = 0,25), acid caffeic (Rf = 0,42) và methyl caffeat (Rf = 0,51). Tuy

nhiên, sự khác nhau về tỷ lệ các vết trên từng mẫu gợi ý sự khác nhau trong hàm

lượng từng thành phần ở mỗi mẫu. Bên cạnh đó, sắc ký đồ của hai mẫu BFI và

BFG có một vết (Rf = 0,45, huỳnh quang xanh dương) không quan sát thấy trên

119

sắc ký đồ 2 mẫu BS và BT.

3* *Chú thích: BFI: B. fungosa subsp. indica, BFG: B. fungosa var. globosa, BT:

B. tobiracola, BS: B. subcupularis, GA: Acid gallic, CA: Acid caffeic, MC:

120

Methyl caffeat

3.2.5. Kết quả phân tích sử dụng sắc ký khí ghép nối khối phổ

Trên sắc ký đồ GC/MS của cả 4 mẫu nghiên cứu đều xuất hiện tín hiệu của

6 hợp chất, phổ khối của từng hợp chất xuất hiện các ion phân mảnh với các giá

trị m/z và cường độ khác nhau. Trên cơ sở so sánh với dữ liệu trong thư viện phổ

NIST 8.0 và chất đối chiếu lupeol, 6 hợp chất trên được xác định là các

triterpenoid thuộc các khung lupan (3 hợp chất) và oleanan (3 hợp chất). Cụ thể,

phổ khối lượng của 6 hợp chất đều có các ion phân mảnh mà m/z không phụ thuộc

vào nhóm thế như 107, 109, 189, 191, 203, 215, là các phân mảnh rất đặc trưng

của các hợp chất triterpenoid. Bên cạnh đó, tùy thuộc vào nhóm thế ở vị trí C-3,

có thể xuất hiện thêm một số ion phân mảnh có m/z khác nhau (Phụ lục 5.1).

Các hợp chất được xác định như sau:

a, Các hợp chất có khung olean: β-amyrin, β-amyron, β-amyrin acetat

β-amyrin (βAm2) có thể dễ dàng được xác định trên sắc ký đồ các loài

nghiên cứu với phổ khối lượng cho pic cơ sở m/z 218 đặc trưng cho các hợp chất

có khung Δ-12 ursan hoặc olean, mảnh ion m/z 203 có cường độ mạnh hơn 3 lần

so với m/z 189; mảnh ion m/z 426 phù hợp với công thức phân tử C30H50O. Loài

B. subcupularis có tỷ lệ % của thành phần này trên sắc ký đồ lớn nhất trong các

loài được nghiên cứu (10,41 %).

β-amyron (βAm1)được rửa giải qua cột sắc ký ngay trước β-amyrin với một

số mảnh đặc trưng tương tự β-amyrin m/z 218, 203, 189 tuy nhiên xuất hiện mảnh

phổ 424 tương ứng với công thức phân tử C30H48O thay vì mảnh ion m/z 426. Hai

loài có tỷ lệ phần trăm diện tích pic của hợp chất này trên sắc ký đồ lớn nhất là B.

fungosa var. globosa (12,31 %) và B. subcupularis (13,06 %).

Trong khi đó, β-amyrin acetat (βAm3) được rửa giải khá lâu sau β-amyrin

(3 phút). Các mảnh ion của β-amyrin acetat khá tương đồng với β-amyrin tuy

nhiên có thêm mảnh ion m/z 43 phù hợp với nhóm acetyl ở vị trí C-3. Đây là thành

121

phần chính trên sắc ký đồ 3 loài B. tobiracola, B. fungosa subsp. indica, B.

fungosa var. globosa (31,96 – 39,82 %), tuy nhiên chiếm tỷ lệ rất thấp trên sắc ký

đồ loài B. subcupularis (0,50 %).

b, Các hợp chất có khung lupan: lupeol, lupenon, lupeol acetat

Lupenon (L1) (1,65 – 11,27 %) và lupeol (L2) (1,20 – 11,25 %) cũng được

xác định trên sắc ký đồ của tất cả các loài nghiên cứu. Lupenon có pic cơ sở m/z

205 và một số mảnh đặc trưng m/z 189, 409 [M+ - CH3]; Sự xuất hiện của mảnh

phổ m/z 424 cũng hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử C30H48O của hợp chất

lupenon. Trong khi đó, lupeol có pic cơ sở m/z 207 và một số mảnh đặc trưng

- CH3], 408 [M+

- H2O], 393 [M+

- CH3 - H2O]. Mảnh phổ m/z 426

m/z 411 [M+

cũng phù hợp với công thức phân tử C30H50O của lupeol. Sự có mặt của lupeol

cũng được khẳng định qua so sánh với thời gian lưu và dữ liệu phổ khối của chất

đối chiếu lupeol, được phân tích trong cùng điều kiện. Tỷ lệ phần trăm hai hợp

chất lupeol và lupenon lớn nhất trong loài B. subcupularis.

Hợp chất rửa giải sau cùng trong các hợp chất triterpenoid pentacyclic được

phát hiện là lupeol acetat (L3). Đây là hợp chất chiếm tỷ lệ lớn trên sắc ký đồ tất

cả các loài nghiên cứu (23,28 – 36,19 %). Phổ khối lượng của lupeol acetat cho

- CH3], 408

pic cơ sở m/z 189. Một số mảnh đặc trưng: m/z 468 [M+], 453 [M+

- CH3COO].

[M+

Cấu trúc hóa học một số hợp chất được xác định cùng sắc ký đồ GC-MS

phân đoạn n-hexan của 4 loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst. được trình

bày ở hình 3.29.

Như vậy, 6 hợp chất triterpenoid pentacyclic được phát hiện trên sắc ký đồ

GC/MS của cả 4 loài nghiên cứu, tuy nhiên có tỷ lệ phần trăm tính theo diện tích

pic tương đối khác biệt. Giá trị RI (retention indices) của các thành phần được

tính toán trên cột DB-5MS sử dụng dãy đồng đẳng alkan được phân tích trong

122

cùng điều kiện. (Bảng 3.4)

Hình 3.29. Sắc ký đồ GC-MS phân đoạn n-hexan của các loài thuộc chi Balanophora

Chú thích: β-amyron (βAm1), β-amyrin (βAm2), lupenon (L1), lupeol (L2), β-

123

amyrin acetat (βAm3), lupeol acetat (L3)

% Area

RIb

CTPT M+

Thành phần

BFI

BFG

BS

BT

2,83

1,03

3249 C30H48O

Bảng 3.4. Các hợp chất triterpenoid được xác định trong phân đoạn n-hexan của các mẫu nghiên cứu sử dụng GC-MS

12,31 13,06

424 (10)

β- amyron

3,94

1,82

1,51

β-amyrin 3278 C30H50O

10,41

426 (6)

Lupenon

4,28

4,23

1,65

3298 C30H48O

11,27

424 (42)

Lupeola

3,04

1,20

1,69

3326 C30H50O

11,25

426 (40)

Các mảnh ion chínhc 218 (100), 203 (62), 44 (26), 219 (19), 189 (16), 207 (14), (14), 95 83 (14), 41 (13), 205 (13), 409 (6) (M+-15) 218 (100), 203 (48), 44 (20), 83 (19), 207 (18), 219 (17), 85 (14), 189 (14), 95 (11), 69 (10), 411 (2) (M+-15) 205 (100), 109 (72), 83 (66), 44 (64), 107 (59), 95 (57), 93 (54), 121 (53), 81 (52), 189 (44), 409 (28) (M+-15), 381 (6) (M+- 43) 207 (100), 83 (70), 189 (69), 95 (67), 44 (65), 135 (62), 109 (61), 107 (60), 121 (58), 93 (58), 411 (18) [M+-15],

124

0,50

3375 C32H52O2

38,95 31,96

39,82

468 (2)

β-amyrin acetat

3426 C32H52O2

23,28 30,65 36,19 30,72

468 (28)

Lupeol acetat

393 (7), 383 (6) 218 (100), 203 (48), 219 (18), 189 (17), 43 (16), 204 (10), 69 (10), 95 (10), 119 (10), 135 (9) 189 (100), 43 (69), 121 (57), 95 (56), 107 (54), 93 (53), 135 (52), 109 (46), 81 (46), 190 (42), 453 (12) [M+-15], 408 (10)

Tổng cộng

76,32 82,17 82,68 76,42 CTPT: Công thức phân tử; M+: mảnh ion phân tử; % Area: phần trăm tính theo diện tích pic. aLupeol được xác định bằng cách so sánh với chất đối chiếu ở cùng điều kiện. bGiá trị RI (rentention indices) tính toán trên cột DB-5MS cCác ion phân mảnh có cường độ lớn nhất (Giá trị trong dấu ngoặc đơn biểu diễn cường độ của mảnh ion so với mảnh ion cơ sở)

3.3. Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học

3.3.1. Kết quả sàng lọc một số tác dụng in vitro của cắn methanol các loài

nghiên cứu

3.3.1.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxid của cắn methanol

các loài nghiên cứu

Tỷ lệ ức chế sản sinh NO (%) trên tế bào RAW264.7 và tỷ lệ tế bào sống

sót (%) của các mẫu cao chiết ở các nồng độ thí nghiệm (3 – 100 µg/mL) được

125

trình bày ở bảng 3.5. Kết quả cho thấy cả 5 nồng độ thử nghiệm của 4 mẫu nghiên

cứu đều không gây độc tính trên tế bào, do đó phù hợp cho đánh giá tác dụng ức

chế sản sinh nitric oxid.

Bảng 3.5. Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh NO của cắn methanol

các mẫu nghiên cứu

STT Tên mẫu Nồng độ mẫu Tỷ lệ tế bào sống sót (%)

Đối chứng (-) - Tỷ lệ ức chế sản sinh NO (%) 100,0±1,3 104,76 ± 0,15

0,3 µM 45,85±2,12 86,47 ± 0,21 Đối chứng (+) 1,0 µM 56,62±0,78 79,93 ± 0,65 [Cardamonin]* 3,0 µM 86,93±0,96 71,8 ± 0,51

LPS - 0,0±0,9 100,0 ± 0,13

100 µg/mL 52,76 ± 0,36 102,95 ±1,36

50 µg/mL 41,91 ± 1,04 106,95 ±1,02

1 BFI 30 µg/mL 39,70 ± 1,10 112,75 ± 0,61

10 µg/mL 34,67 ± 0,33 115,66 ± 0,32

3 µg/mL 28,15 ± 0,64 117,95 ±1,03

100 µg/mL 49,75 ± 0,63 100,49 ± 1,10

50 µg/mL 42,71 ± 1,02 102,95 ±1,11

2 BFG 30 µg/mL 38,19 ± 0,87 104,86 ± 0,91

10 µg/mL 30,15 ± 0,45 105,84 ± 0,34

3 µg/mL 28,15 ± 0,94 111,95 ± 0,89

100 µg/mL 45,73 ± 1,61 99,09 ± 0,52

50 µg/mL 41,21 ± 0,63 104,10 ± 0,08

3 BS 30 µg/mL 35,68 ± 0,45 107,61 ± 0,09

10 µg/mL 31,66 ± 0,78 111,01 ± 0,32

3 µg/mL 29,65 ± 0,72 112,00 ± 0,13

126

4 BT 100 µg/mL 48,74 ± 0,73 101,38 ± 0,72

50 µg/mL 42,71 ± 1,07 102,95 ±1,31

30 µg/mL 37,44 ± 0,43 107,01 ± 0,99

10 µg/mL 31,57 ± 0,56 115,13 ± 0,50

3 µg/mL 27,15 ± 0,38 117,02 ± 0,72

*Cardamonin được sử dụng làm chứng dương

Từ bảng trên, giá trị IC50 hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxid (NO) trên tế

bào RAW264.7 của các mẫu được tính toán. Kết quả trình bày trong bảng 3.6.

Bảng 3.6. Giá trị IC50 hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxid (NO) trên

tế bào RAW của các mẫu nghiên cứu

STT Tên mẫu Giá trị IC50

Đối chứng (cardamonin) 0,61 µM/mL

BFI 87,06 µg/mL 1

BFG >100 µg/mL 2

BS >100 µg/mL 3

BT >100 µg/mL 4

Như vậy, trong 4 mẫu nghiên cứu, mẫu BFI (B. fungosa subsp. indica) có

khả năng ức chế sản sinh NO tốt với giá trị IC50 = 87,06 µg/mL và không gây độc

cho tế bào RAW264.7 ở nồng độ đến 100 µg/mL.

3.3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cắn

methanol các loài nghiên cứu

Cắn methanol các mẫu nghiên cứu được đánh giá tác dụng ức chế xanthin

oxidase in vitro ở 5 nồng độ thí nghiệm, từ 3 – 100 µg/mL. Từ giá trị phần trăm

ức chế (I%) ở 5 nồng độ, giá trị IC50 được tính toán. Kết quả được trình bày trong

bảng 3.7.

Bảng 3.7. Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cắn methanol các mẫu

nghiên cứu

127

Mẫu thử Nồng độ I% IC50 (95% CI)

(µg/mL)

100 µg/mL 120,4

50 µg/mL 78,6 6,043 BFI 30 µg/mL 85,4 (4,12 – 20,64) 10 µg/mL 77,7

3 µg/mL 18,9

100 µg/mL 119,6

50 µg/mL 90,1 8,576 BFG 30 µg/mL 85,4 (2,94 – 19,12) 10 µg/mL 57,2

3 µg/mL 14,9

100 µg/mL 107,8

50 µg/mL 51,3 45,96 BS 30 µg/mL 23,7 (32,57 – 62,53) 10 µg/mL -5,0

3 µg/mL -2,3

100 µg/mL 92,4

50 µg/mL 68,5 23,41 BT 30 µg/mL 47,7 (10,46 – 46,44) 10 µg/mL 37,8

3 µg/mL 2,5

1 µg/mL 92,9

0,5 µg/mL 82,1 0,15 68,3 Allopurinol* 0.3 µg/mL (0,14 - 0,17) 0.1 µg/mL 38,5

128

0.05 µg/mL 20,1

Dựa trên kết quả tính toán giá trị IC50, có thể thấy cắn methanol hai taxa của

loài B. fungosa thể hiện tác dụng tốt hơn so với các mẫu cắn methanol hai loài

ghi nhận mới BS (B. subcupularis) và BT (B. tobiracola). Giá trị IC50 của hai mẫu

BFI và BFG lần lượt là 6,043 và 8,576 µg/mL. Chứng dương allopurinol thể hiện

khả năng ức chế XO in vitro mạnh với IC50 = 0.15 µg/mL.

3.3.2. Kết quả đánh giá một số tác dụng trên in vivo cao chiết Dó đất

Loài Dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen) thể hiện

tác dụng tốt hơn các loài còn lại trong nghiên cứu trên các mô hình in vitro được

đánh giá. Đây cũng là loài có trữ lượng lớn cũng như khu vực phân bố khá rộng

theo tài liệu [4]. Do đó, loài này được lựa chọn cho nội dung nghiên cứu in vivo.

Một số mô hình được lựa chọn để nghiên cứu bao gồm đánh giá tác dụng hạ acid

uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat, đánh giá

tác dụng kháng viêm trên các mô hình gây phù bằng carrageenan cũng như gây

viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng natri urat.

3.3.2.1. Tác dụng hạ acid uric huyết thanh

Thí nghiệm được thực hiện với mục đích xác định tác dụng hạ acid uric

huyết thanh của cao chiết Dó đất. Định lượng nồng độ acid uric huyết thanh chuột

thực nghiệm ở các lô chứng, lô đối chiếu và ba lô thử uống cao chiết Dó đất với

các mức liều 300 mg/kg, 600 mg/kg, 900 mg/kg. Kết quả được trình bày ở bảng

3.8.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của cao chiết Dó đất đến nồng độ acid uric huyết thanh chuột trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat

Nồng độ acid uric Tỷ lệ giảm acid

Lô Liều huyết thanh uric huyết thanh n

(µmol/L) so với chứng (%)

Chứng trắng - 108,90 ± 6,63 - 8

129

Chứng bệnh lý - 235,38 ± 14,53 - 8

8 Allopurinol 10 mg/kg 44,67 ± 6,86** 81,02

7 EBF liều 1 300 mg cao/kg 218,44 ± 24,21 7,20

7 EBF liều 2 600 mg cao/kg 221,67 ± 15,90 5,82

7 EBF liều 3 900 mg cao/kg 28,32 168,71 ± 17,89 **

(**: p < 0,01 so với lô chứng)

Nhận xét:

- Thuốc đối chiếu allopurinol có tác dụng hạ acid uric huyết thanh rõ rệt, tỷ lệ

giảm khi so sánh với lô chứng bệnh lý là 81,02 % (p < 0,01).

- Cao chiết Dó đất liều 900 mg/kg có tác dụng làm hạ acid uric huyết thanh chuột

nhắt trắng trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat. Tỷ lệ giảm nồng

độ acid uric khi so sánh với lô chứng là 28,32% (p < 0,01). Trong khi đó, hai mức

liều 300 mg/kg và 600 mg/kg không thể hiện tác dụng này.

3.3.2.2. Tác dụng kháng viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan

Sử dụng mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan trên chuột cống

trắng để đánh giá tác dụng kháng viêm cấp của cao Dó đất liều 350 mg/kg và 500

mg/kg. Thông số đánh giá là mức độ phù bàn chân chuột và phần trăm ức chế phù

so với lô chứng bệnh tại các thời điếm 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ và 7 giờ sau khi gây

viêm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của cao chiết Dó đất lên mức độ phù bàn chân chuột trên

mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan

Mức độ phù thời điểm sau khi gây viêm Thông Lô Liều số 1 giờ 3 giờ 5 giờ 7 giờ

Chứng ∆V 14,77 ± 36,23 ± 32,09 ± 25,70 ± - (n = 9) (%) 1,38 2,05 1,99 2,04

Diclofenac 20 ∆V 6,2 ± 11,78 ± 9,08 ± 5,77 ±

130

(n = 9) mg/kg (%) 0,65 ** 1,12 ** 1,17 ** 1,11 **

I (%) 58,02 67,49 71,70 77,55

∆V 13,89 ± 27,84 ± 25,77 ± 21,57 ± EBF liều 1 350 (%) 1,91 1,42 ** 1,20 * 1,42 (n = 9) mg/kg I (%) 5,96 23,16 19,69 16,07

∆V 12,59 ± 23,80 ± 19,64 ± 12,47 ± (%) EBF liều 2 500 1,49 1,80 ** 2,10 ** 1,84 ** (n = 9) mg/kg

I (%) 14,76 34,31 38,80 51,48

(*: p < 0,05 so với lô chứng; **: p < 0,01 so với lô chứng; ΔV% là mức độ phù

chân chuột tại thời điểm t. I% là phần trăm ức chế phù so với lô chứng)

Nhận xét:

- Diclofenac liều 20 mg/kg cân nặng có tác ức chế phù bàn chân chuột ở tất cả

các thời điểm nghiên cứu (p < 0,01 so với lô chứng). Tỷ lệ ức chế phù bàn chân

chuột so với lô chứng tại các thời điểm 1, 3, 5, 7 giờ sau khi tiêm carrageenan lần

lượt là 58,02%; 67,49%; 71,70%; 77,55%.

- Cao chiết Dó đất liều 350 mg/kg thể hiện tác dụng ức chế phù bàn chân chuột ở

thời điểm 3 giờ và 5 giờ sau khi tiêm carrageenan, với tỷ lệ ức chế lần lượt là

23,16% (p < 0,05); 19,69% so với lô chứng (p < 0,05)

- Cao chiết Dó đất liều 500 mg/kg thể hiện tác dụng ức chế phù bàn chân chuột

rõ rệt tại các thời điểm 3, 5, 7 giờ sau khi tiêm carragenan, với tỷ lệ ức chế lần

lượt là 34,31%; 38,80%; 51,48%. Khi so sánh tác dụng của cao Dó đất ở hai mức

liều, cao Dó đất liều 500 mg/kg có tác dụng mạnh hơn so với liều 350 mg/kg.

3.3.2.3. Tác dụng kháng viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối

bằng tinh thể natri urat

Sử dụng mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối chuột bằng natri urat

131

với thuốc đối chiếu là diclofenac để đánh giá tác dụng kháng viêm của cao chiết

Dó đất liều 350 mg/kg và 500 mg/kg. Thông số đánh giá là điểm mức độ viêm

khớp chân chuột dựa trên triệu chứng. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10.

Bảng 3.10. Tác dụng kháng viêm của cao chiết Dó đất trên mô hình gây viêm

màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat trên chuột cống trắng

n Lô và mức liều Sau 4 giờ Điểm sau tiêm Sau 5 giờ Sau 6 giờ

7 Chứng 2 (2-4) 3 (2-4) 3 (2-3)

7 Diclofenac liều 20 mg/kg 1 (1-2) ** 1 (1-2) ** 1 (1-2) **

7 EBF liều 350 mg/kg 2 (1-2) * 2 (1-3) 2 (1-3)

7 EBF liều 500 mg/kg 2 (1-2) * 2 (1-2) * 1 (1-3) *

(*: p < 0,05 so với lô chứng; **: p < 0,01 so với lô chứng)

- Diclofenac liều 20 mg/kg có tác dụng kháng viêm tốt, điểm viêm khớp dựa

trên triệu chứng tại tất cả thời điểm đánh giá đều giảm có ý nghĩa thống kê so với

lô chứng (p < 0,01).

- Cao chiết Dó đất liều 350 mg/kg có điểm viêm tại thời điểm 4 giờ sau khi

tiêm natri urat giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05). Cao chiết Dó

đất liều 500 mg/kg có điểm viêm tại tất cả thời điểm quan sát sau khi tiêm natri

urat giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05). Trong đó, tại thời điểm

6 giờ sau khi tiêm có điểm viêm giảm rõ rệt nhất so với lô chứng (1 (1-3), p <

0,05). Như vậy có thể nhận thấy có sự tác dụng phụ thuộc liều của cao chiết Dó

đất trên các mô hình gây viêm.

3.3.3. Kết quả đánh giá độc tính cấp cao chiết Dó đất

3.3.3.1. Thử nghiệm thăm dò

- Sử dụng 10 chuột nhắt trắng, giống cái, chia thành 5 nhóm, mỗi nhóm 2 động

vật và cho uống mẫu thử với liều tăng dần.

- Kết quả: trong vòng 48 giờ sau uống chế phẩm thử, một số chuột có biểu hiện

132

giảm hoạt động, xù lông, da và niêm mạc nhợt nhạt, chết; sau 48 giờ, các chuột

còn sống hồi phục dần; hoạt động, ăn uống dần dần bình thường trở lại; sau 72

giờ xác định được liều thấp nhất gây chết ½ động vật là 18,08 g/ kg. Sau 14 ngày,

các chuột còn lại đều ăn uống, hoạt động bình thường, không có chuột chết thêm.

3.3.3.2. Thử nghiệm chính thức

Dựa trên kết quả của thử nghiệm thăm dò, tiến hành thử nghiệm chính thức

trên 50 chuột, chia thành 5 lô mỗi lô 10 chuột. Các lô chuột được dùng mẫu thử

ở các mức liều tăng dần từ 9,05 g/kg chuột đến liều 39,81 g/kg chuột.

Kết quả về số lượng chuột chết sau 72 giờ ở các lô thí nghiệm sau khi uống

mẫu thử được trình bày trong bảng 3.11.

Bảng 3.11. Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ

Số chuột Liều dùng Thể tích dùng Số chuột chết Lô thực nghiệm (g/ kg chuột) (ml/10g chuột) trong vòng 72 giờ

1 10 9,05 0,1ml x 1 lần 0

2 10 13,56 0,15ml x 1 lần 2

3 10 19,91 0,2ml x 1 lần 6

0,2ml x 1 lần 4 10 27,13 10 0,1ml x 1 lần

0,2ml x 1 lần 5 10 39,81 10 0,2 ml x 1 lần

- Sau khi uống mẫu thử, lô 1 (mức liều 9,05 g cao chiết/kg), chỉ hai chuột có biểu

hiện xù lông trong 6 giờ đầu, sau đó chuột dần hoạt động bình thường, lông mượt,

ăn uống bình thường ở các khoảng thời gian 6-72 giờ và từ 3-14 ngày.

- Từ mức liều 13,56 g cao chiết/kg, đã xuất hiện chuột chết, trong đó, một chuột

bị kích thích, co giật và chết trong 6 giờ đầu, mổ chuột quan sát đại thể thấy tim,

phổi không có bất thường, dạ dày và ruột căng, nhu động nhiều. Trong vòng 6

133

đến 72 giờ sau, một chuột giảm hoạt động, nhợt nhạt, chết.

- Ở các mức liều cao hơn (19,91 – 39,81 g cao chiết/kg), trong vòng 6 giờ đầu,

hầu hết chuột đều có biểu hiện giảm hoạt động, co cụm, xù lông, niêm mạc nhợt

nhạt, không ăn, ít uống nước. Ở các lô 4 và 5, tất cả 10 chuột đều chết rải rác

trong thời gian từ 6-48 giờ; trong khi đó ở lô 3 (liều 19,91 g/kg), có 6 chuột chết.

Mổ chuột quan sát đại thể cho thấy tim, phổi, gan không có bất thường, dạ dày

căng, ruột lép. Với lô 3, các chuột còn lại (04 con) đều hoạt động, ăn uống bình

thường, phân nước tiểu bình thường, niêm mạc hồng hào, lông mượt, phản xạ tốt

với các kích thích trong khoảng thời gian từ 3-14 ngày.

Từ số liệu thống kê số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống mẫu

thử, sử dụng phương pháp phân tích hồi qui probit trên phần mềm SPSS để xác

định LD50, kết quả được trình bày trong bảng 3.12.

Bảng 3.12. Tỉ lệ chết chuột nhắt trắng và giá trị LD50 của Cao chiết Dó đất

Liều

(g/kg) 9,05 13,56 19,91 27,13 39,81

Thông số

n 10 10 10 10 10

Tỉ lệ chết (%) 0 20 100 100 60

17,50 LD50 (g/kg)

KTC 95% (g/kg) 14,83 - 20,44

LD50 của cao chiết được xác định là 17,50 g cao/kg, tương đương 44,76 g

dược liệu/kg. Mức liều 9,05 g cao/ kg chuột là mức liều cao nhất không gây chết

động vật. Mức liều 27,13 g/ kg chuột nhắt trắng là mức liều thấp nhất gây chết

100% động vật nghiên cứu. Biểu hiện độc tính quan sát được trên các lô chuột

thử nghiệm là giảm hoạt động, xù lông, niêm mạc nhợt nhạt. Mức liều sử dụng

càng cao thì thời gian biểu hiện độc tính càng kéo dài. Các chuột sau khi chết

được mổ và quan sát đại thể thấy dạ dày căng phồng. Sau 72 giờ, các chuột còn

134

sống đều hồi phục dần và trở lại ăn uống, hoạt động bình thường.

Chương 4. BÀN LUẬN

4.1. Về kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật

4.1.1. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học

Ở Việt Nam, theo các tài liệu đã công bố, chi Dó đất (Balanophora

J.R.&G.Forst.) có 7 loài, 1 phân loài và 1 thứ. Đây là chi khá đặc biệt về mặt thực

vật, là dạng cây thảo, không chứa diệp lục, sống ký sinh trên rễ các loài khác, thân

thoái hóa thành khối dạng “củ”, đơn tính cùng gốc hoặc khác gốc. Do sự tương

đồng về hình dáng và một số đặc điểm hình thái, trong thực tế thường xảy ra sự

nhầm lẫn giữa các loài trong chi Balanophora. Bên cạnh đó, có một số loài chưa

được ghi nhận trong các tài liệu dẫn tới khó khăn trong việc xác định tên khoa

học các mẫu nghiên cứu thuộc chi này ở Việt Nam. Qua quá trình thu mẫu thực

địa, chúng tôi đã thu được mẫu của một phân loài, một thứ và hai loài thuộc chi

Balanophora J.R.&G.Forst.; trong đó có hai loài ghi nhận mới cho hệ thực vật

Việt Nam bao gồm: B. subcupularis P.C.Tam và B. tobiracola Makino. Như vậy

có thể thấy những kết quả nghiên cứu về hình thái thực vật là những đóng góp

mới đầu tiên của luận án, khẳng định thêm sự phong phú và đa dạng của hệ thực

vật Việt Nam cũng như cung cấp dữ liệu về hình thái với ảnh chụp minh họa, giúp

xác định chính xác tên khoa học các loài nghiên cứu.

Trong chuyên khảo năm 1972 của B. Hansen, phân loài Balanophora

fungosa J.R.&G.Forst. subsp. indica tiếp tục được phân chia làm 3 thứ (var.) bao

gồm thứ indica, thứ globosa và thứ minor trong đó thứ indica là thứ phổ biến

trong khi hai thứ còn lại ít gặp hơn. Tên khoa học của Dó đất (BFI) hiện nay được

xác định là B. fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen.

Trong khi đó, Dó đất sần (mẫu BFG), trước đây được xác định là B. globosa

Jungh. và được cho là loài sinh sản vô tính theo quan điểm của Fagerlind (1945)

với chỉ các mẫu mang cụm hoa cái thu được ở Java (Indonesia). Hansen cho rằng

135

loài B. globosa có quan hệ rất gần với phân loài B. fungosa subsp. indica và đã

chuyển loài này thành một thứ: B. fungosa subsp. indica var. globosa như đã nêu

ở trên. Hiện nay theo website www.theplantlist.org, tên khoa học của Dó đất sần

được xác định là thứ B. fungosa var. globosa (Jungh.) B.Hansen.

Trong các công trình “Trích yếu thực vật có mạch Thực vật chí Việt Nam”

[25] (là kết quả hợp tác giữa Viện Sinh thái & tài nguyên sinh vật, Viện hàn lâm

khoa học và công nghệ Việt Nam với Viện Thực vật Kômarốp, Viện Hàn lâm

Khoa học Cộng hòa Liên bang Nga) và “Danh lục thực vật Việt Nam” [4], Giáo

sư Nguyễn Tiến Bân có liệt kê loài Balanophora indica (Arnott.) Griff. var.

globosa (Jungh.) Bân tuy nhiên những thông tin mô tả về đặc điểm thực vật trong

hai tài liệu này còn tương đối hạn chế. Trong luận án này, đặc điểm hình thái thực

vật của loài Dó đất sần với cả cây mang hoa đực và cây mang hoa cái được mô tả

tương đối chi tiết và minh họa bằng ảnh chụp. Đây có thể xem là những đóng góp

mới bước đầu của đề tài về đặc điểm thực vật chi Balanophora.

Mẫu BS được xác định là loài Balanophora subcupularis P.C.Tam (mẫu

BS), đây là loài ghi nhận mới cho hệ thực vật Việt Nam. Loài B. subcupularis

được phát hiện lần đầu ở Phúc Kiến, Trung Quốc, là loài đơn tính cùng gốc với

hoa đực nằm ở gốc của cụm hoa lưỡng tính.

Trong khi đó, mẫu BT được xác định là loài Balanophora tobiracola

Makino và cũng là loài ghi nhận mới cho hệ thực vật Việt Nam. Loài này có hoa

đực với thùy bao hoa 3. Đặc điểm này tương đồng với một số loài cùng chi

Balanophora như B. involucrata, B. fargesii, B. harlandii. Tuy nhiên, loài này

khác biệt với tất cả các loài cùng chi còn lại ở đặc điểm cụm hoa lưỡng tính với

các hoa đực nằm rải rác trên cụm hoa, chen giữa các hoa cái và vảy bảo vệ.

Ở các loài Balanophora, phần “củ” được bao bọc bởi hai loại tế bào mà khi

trưởng thành trở nên rỗng, có thành dày và tụ lại với nhau thành các khối không

đều, hoặc hình thành cụm 4 đến 5 tế bào tảo ra, gọi là các “mụn hình sao”. [73]

Một số đặc điểm có ý nghĩa phân biệt các loài trong luận án được trình bày

136

trong bảng 4.1.

Bảng 4.1. So sánh đặc điểm thực vật mẫu các loài thuộc chi Balanophora trong luận án

Mẫu nghiên cứu

Đặc điểm

BS (B. subcupularis) “Củ” đơn hoặc tạo trung thành khối, bề mặt “củ” có mụn hình sao BT (B. tobiracola) “Củ” phân nhánh; bề mặt “củ” có mụn hình sao

Thân thoái hóa thành khối dạng “củ” Lá BFI (B. fungosa subsp. indica) “Củ” đơn hoặc tập trung thành khối phân nhánh ít/nhiều; bề mặt “củ” có mụn hình sao 15-20, xếp xoắn 4-8, xếp hình xoắn ốc

5-8, xếp hình xoắn ốc hoặc thành hai dãy

Cụm hoa

Đơn tính; hình trứng-elip, màu hồng đến tím

Lưỡng tính, hình nón, trứng-elip hoặc hình trứng;

Hoa đực

Hoa đực đối xứng tỏa tia, thùy 4-5(-6); cuống dài 6-7 mm; cánh hoa nhọn BFG (B. fungosa var. globosa) “Củ” có bề mặt sần sùi thành các khối đa giác; bề mặt “củ” không có mụn hình sao 10-20, xếp xoắn, xếp lợp, áp sát cuống cụm hoa và che phủ một phần cụm hoa Đơn tính; cụm hoa đực hình elip-trứng, cụm hoa cái hình cầu hơi bị nén xuống, màu đỏ Hoa đực đối xứng tỏa tia, thùy 4-6(-7); cuống dài 5- 8 mm; cánh hoa nhọn Lưỡng tính, hình elip, màu đỏ thẫm; hoa đực nằm dưới các hoa cái trên cụm hoa Hoa đực đối xứng tỏa tia, thùy 4-5(-6); cánh hoa nhọn hoặc cắt cụt

Bao phấn Hình móng ngựa, mở dọc Hình móng ngựa, mở dọc Mở dọc Hoa cái Mọc ở gốc của vảy bảo vệ và trên trục chính cụm hoa Mọc ở gốc của vảy bảo vệ và trên trục chính cụm hoa Rải rác, chen giữa các hoa cái và vảy bảo vệ; đối xứng tỏa tia, thùy 3 Mở ngang Mọc trên trục chính cụm hoa

137

Mọc ở gốc của vảy bảo vệ và trên trục chính cụm hoa

4.1.2. Đặc điểm hiển vi

Phấn hoa học có thể có những đóng góp hữu ích trong phân loại thực vật.

Hình thái hạt phấn (bao gồm hình dạng, kích thước, bề mặt màng hạt phấn) ở các

loài khác nhau sẽ khác nhau, vì vậy, có thể dùng là một trong những đặc điểm để

định tên khoa học cũng như xem xét mối quan hệ họ hàng giữa các taxa. Ở Việt

Nam, đây là lần đầu tiên hình thái hạt phấn các loài thuộc chi Balanophora được

nghiên cứu sử dụng kính hiển vi quang học. Kết quả cho thấy hạt phấn của các

loài nghiên cứu thuộc chi Balanophora đều có kích thước nhỏ (< 25 µm) tuy

nhiên có những sự khác biệt về hình thái hạt phấn của các loài. Hạt phấn của Dó

đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen) và Dó đất sần

(Balanophora fungosa var. globosa (Jungh.) B.Hansen) có sự phân biệt mặt

phẳng cực và mặt phẳng xích đạo: hạt phấn quan sát ở mặt phẳng cực có hình tam

giác trong khi ở mặt phẳng xích đạo có hình cầu dẹt. Trong khi đó hạt phấn loài

Balanophora tobiracola Makino có hình cầu, không phân biệt mặt phẳng cực và

mặt phẳng xích đạo.

Trong luận án này, đặc điểm vi phẫu thân thoái hóa thành “củ”, vi phẫu lá

và đặc điểm bột toàn cây của một số loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam được

nghiên cứu, mô tả và minh họa bằng ảnh chụp.

Vi phẫu “củ” của các mẫu nghiên cứu trong luận án có một số điểm tương

đồng. Ngoài cùng của “củ” là một hàng tế bào kiểu biểu bì [71]. Phần phía trong

chủ yếu là mô mềm và các hệ thống mạch, một hệ thống là của riêng các loài

Balanophora và hệ thống còn lại là các bó hợp chứa các mô mạch của các loài

Balanophora và của rễ cây chủ mà các loài này ký sinh. Mỗi bó được bao bọc bởi

một vòng tế bào mô mềm của các loài Balanophora [73]. Các bó hợp này được

quan sát trên vi phẫu “củ” của cả 4 mẫu nghiên cứu.

Trong khi đó, vi phẫu lá của 4 mẫu cũng có một số điểm tương đồng như

không phân biệt phiến lá và gân lá, mô mềm chiếm chủ yếu, rải rác có thể có các

138

bó libe-gỗ.

Ở Ấn Độ, loài B. fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen được bán ở các

chợ dược liệu để thay thế hoặc đôi khi giả mạo dược liệu loài Scindapsus

officinalis (tên Việt Nam: Dây bá, Ráy dây lá lớn) [71]. Có thể dễ dàng phân biệt

dễ dàng nguyên liệu khô của hai loài dựa trên đặc điểm bột, cụ thể bột loài S.

officinalis có đặc điểm hạt tinh bột trong khi các đặc điểm này không được quan

sát khi soi bột loài B. fungosa subsp. indica. Quá trình nghiên cứu đặc điểm bột

các mẫu nghiên cứu cũng không quan sát thấy tinh bột. Một số đặc điểm hiển vi

có thể nhận thấy trong bột các loài thuộc chi Balanophora bao gồm: mảnh mô

mềm tế bào thành mỏng, mảnh vòi nhụy, hạt phấn hoa.

Những dữ liệu về đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột góp phần xác định tính

đúng của dược liệu cũng như sẽ là những thông tin hữu ích cho công tác đảm bảo

chất lượng dược liệu.

4.2. Về kết quả nghiên cứu thành phần hóa học

4.2.1. Kết quả định tính sơ bộ

Kết quả định tính sơ bộ cho thấy các hợp chất tanin, acid hữu cơ và triterpen

là thành phần chính trong các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst. Một số

mẫu nghiên cứu có phản ứng dương tính yếu với thuốc thử flavonoid, dự đoán có

thể có flavonoid trong các mẫu này, tuy nhiên ở hàm lượng thấp.

4.2.2. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

Một số hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc từ các loài thuộc chi

Balanophora. Quá trình phân lập sử dụng các phương pháp kinh điển như sắc ký

cột, sắc ký lớp mỏng điều chế; cấu trúc các hợp chất phân lập được xác định dựa

trên các dữ liệu phổ bao gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng phân

tử cho kết quả có độ tin cậy.

Trong các hợp chất đã được phân lập, hợp chất (+)-7,9':7',9-Diepoxy-3-

139

methoxy-4,4'-lignandiol (BdD5.6) lần đầu tiên được phân lập từ một loài thuộc

chi Balanophora, trong khi đó, các hợp chất khác đã được phân lập và xác định

Bảng 4.2. Thống kê về việc phân lập các hợp chất từ các loài thuộc chi Balanophora

cấu trúc từ một số loài cùng chi (Bảng 4.2).

Hợp chất được phân lập Các loài cùng chi Mẫu nghiên cứu

B. laxiflora [37][96], B. polyandra

[115], B. abbreviata [61], B. harlandii

Pinoresinol BFI, BFG [139], B. involucrata [118],

B. papuana [62]

Balanophonin BFI

B. japonica [56] B. abbreviata [61], B. laxiflora [37]

Isolariciressinol BFG [101], B. involucrata [100],[118]

B. japonica [67], B. abbreviata [61],

BFG Epipinoressinol 4-O-β- D-glucopyranosid B. laxiflora [101]

Acid gallic BFG, BS

Acid cinnamic BT

B. laxiflora [101], B. harlandii [139], B. polyandra [115], B. simaoensis [136], B. involucrata [100] B. polyandra [113], B. abbreviata [61], B. tobiracola [64] B. laxiflora [101], B. simaoensis

[136], B. japonica [66], B. Acid caffeic BT

involucrata [100]

Methyl caffeat BFG

Coniferyl aldehyd BS B. harlandii [116], B. laxiflora [96] B. abbreviata [61], B. laxiflora [24], B. papuana [62], B. japonica [129]

4.2.3. Sử dụng các phương pháp sắc ký trong nghiên cứu

Bên cạnh việc phân lập các hợp chất từ các loài nghiên cứu, đề tài còn sử

dụng các phương pháp sắc ký bao gồm sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí kết nối khối

phổ và sắc ký lỏng kết nối khối phổ để bước đầu xác định cũng như so sánh thành

140

phần hóa học các loài nghiên cứu.

4.2.3.1. Sắc ký lớp mỏng

Trong nghiên cứu dược liệu nhằm xác định tính đúng của dược liệu, sắc ký

lớp mỏng vẫn là phương pháp được sử dụng rộng rãi do sự đơn giản và linh hoạt

của phương pháp. Trong luận án này, phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng

để định tính thành phần triterpenoid trong phân đoạn n-hexan của các loài nghiên

cứu cũng như sơ bộ so sánh thành phần hóa học cắn chiết methanol các loài nghiên

cứu.

Phân đoạn n-hexan của các loài nghiên cứu được triển khai trên bản mỏng

HPTLC silica gel 60 F254 với hệ dung môi n-hexan – ethyl acetat (5 :1) cho thấy

các vết tương đồng về vị trí và màu sắc trên sắc ký đồ của các loài nghiên cứu.

Các vết này được dự đoán là các hợp chất triterpenoid hoặc steroid. Tổng quan

về thành phần hóa học các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.Forst. cho thấy sự

có mặt của một số hợp chất triterpenoid pentacyclic có khung lupan hoặc oleanan

như lupeol, lupenon, lupeol acetat, β-amyrin, β-amyrin acetat, β-amyron cùng một

số hợp chất khác. Tuy nhiên với các hợp chất triterpen nói trên, nếu chỉ dựa trên

sự tương đồng của các vết trên sắc ký đồ các loài triển khai trên bản mỏng silica

gel pha thường thì chưa thể khẳng định sự giống nhau trong thành phần hóa học.

Cụ thể, nghiên cứu của Martelanc cho thấy các hợp chất thuộc cùng nhóm đồng

phân có sự tương đồng về cấu trúc như các triterpenol (α-amyrin, β-amyrin, δ-

amyrin, lupeol và cycloartenol), các ester (lupeol acetat, β-amyrin acetat), các

acid (acid ursolic, acid oleanolic) hoặc các sterol (stigmasterol, β-sitosterol)

thường có Rf tương tự nhau trên bản mỏng pha thường [81].

Trong trường hợp này, sắc ký lớp mỏng phân đoạn n-hexan đồng thời được

triển khai trên bản mỏng pha đảo RP-HPTLC với hệ dung môi ethyl acetat –

acetonitril (3:2). Cũng theo nghiên cứu của Martelanc, bản mỏng pha đảo RP-

HPTLC rất hiệu quả trong việc phân tách các đồng phân hóa học trên bản mỏng,

ví dụ như phân tách α-amyrin, β-amyrin, lupeol cũng như phân tách lupeol acetat,

141

β-amyrin acetat [81]. Kết quả triển khai trên bản mỏng RP-HPTLC cũng cho thấy

các vết tương đồng về Rf và màu sắc trên sắc ký đồ các loài Balanophora. Điều

này cho phép kết luận sự tương đồng về một số thành phần hóa học trong phân

đoạn n-hexan các loài nghiên cứu.

Bên cạnh đó, dữ liệu sắc ký lớp mỏng triển khai với các hệ dung môi khác

nhau so sánh thành phần hóa học của Dó đất (B. fungosa subsp. indica), Dó đất

sần (B. fungosa var. globosa) với 2 loài ghi nhận mới cho hệ thực vật Việt Nam

là B. subcupularis và B. tobiracola cho thấy có những sự tương đồng nhất định

trong thành phần hóa học các loài này. Cụ thể hơn, một số hợp chất như acid

gallic, acid caffeic và methyl caffeat được phát hiện trên sắc ký đồ của cả 4 mẫu

nghiên cứu. Bên cạnh đó, sắc ký đồ triển khai với hệ dung môi cloroform – toluen

– methanol – amoniac (10:3:6:1) cho thấy hai taxa của loài B. fungosa có sự tương

đồng trong thành phần hóa học và có một số khác biệt với hai loài còn lại. Cụ thể

hơn, cả 3 hợp chất lignan được phân lập từ loài B. fungosa var. globosa đều có

vết tương đồng trên sắc ký đồ loài B. fungosa subsp. indica trong khi chỉ

pinoresinol được phát hiện trên sắc ký đồ của các loài nghiên cứu. Đây là lần đầu

tiên phương pháp sắc ký lớp mỏng được triển khai để so sánh thành phần hóa học

các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam.

4.2.3.2. Sắc ký khí

Bằng phương pháp sắc ký khí kết nối khối phổ, 6 hợp chất triterpenoid bao

gồm lupenon, lupeol, lupeol acetat, β-amyron, β-amyrin và β-amyrin acetat đã

được xác định trong phân đoạn n-hexan của các loài nghiên cứu. Các hợp chất

này đều đã được phân lập và xác định cấu trúc từ các loài khác nhau của chi

Balanophora J.R.&G.Forst trong các nghiên cứu trước đây, đặc biệt là từ loài B.

fungosa subsp. indica (tên đồng nghĩa B. simaoensis, B. indica) với lupenon,

lupeol acetat, β-amyrin, β-amyrin acetat, và β-amyron đã được phân lập từ loài

này [117]. Bên cạnh đó, β-amyrin acetat và lupeol được phân lập từ loài B.

tobiracola [64] (Bảng 4.3). Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên các hợp chất này được

142

xác định trong loài B. fungosa var. globosa (BFG) và B. subcupularis (BS).

Bảng 4.3. Thống kê kết quả phân lập 6 hợp chất triterpenoid pentacyclic từ các loài thuộc chi Balanophora

Hợp chất Các loài cùng chi Balanophora đã được nghiên cứu trước đây

lupenon B. spicata [135], B. simaoensis (syn. B. fungosa subsp. indica) [77]

lupeol B. involucrata [140], B. tobiracola [64]

lupeol B. harlandii [139], B. polyandra [137], B. involucrata [140],

acetat B. indica (syn. B. fungosa subsp. indica) [85][77], B. japonica

[125], B. spicata [32]

β-amyrin B. laxiflora, B. involucrata [140], B. simaoensis (syn. B. fungosa

subsp. indica) [133]

β-amyrin B. spicata [135], B. japonica [98], B. fungosa subsp. indica (syn.

acetat B. simaoensis, B. indica) [85] [137], B. tobiracola [64]

β-amyron B. fungosa subsp. indica [77]

Như đã trình bày ở phần kết quả, phổ khối lượng của các hợp chất được xác

định đều có các ion phân mảnh đặc trưng của triterpenoid. Ở đây, chúng tôi làm

rõ hơn cơ chế phân mảnh tạo ra một số ion phân mảnh đặc trưng của hai hợp chất

143

lupeol và lupeol acetat, được trình bày trong hình 4.1 và 4.2.

Hình 4.1. Cơ chế phân mảnh một số mảnh ion đặc trưng của lupeol

144

Hình 4.2. Cơ chế phân mảnh một số mảnh ion đặc trưng của lupeol acetat

4.2.3.3. Sắc ký lỏng kết nối khối phổ

Bên cạnh sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí, phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC) cũng là một phương pháp được sử dụng nhiều trong nghiên cứu

dược liệu. Sự phát triển của các kỹ thuật sắc ký hiện nay cho phép kết hợp sắc ký

lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC) với các thiết bị hiện đại như detector khối phổ

hai lần khối phổ (MS/MS), khối phổ lai tứ cực thời gian bay (Q-TOF) cung cấp

các công cụ vô cùng hữu hiệu và mạnh mẽ trong việc xác định đồng thời các hợp

chất có cấu trúc tương đối phức tạp trong hỗn hợp, đặc biệt là các hợp chất có

nguồn gốc tự nhiên trong dịch chiết dược liệu.

Nghiên cứu của Sun và cộng sự năm 2020 đã sử dụng LC-Q-ToF-MS/MS

để xác định các thành phần trong phân đoạn ethyl acetat của loài B. involucrata

J. D. Hooker với 20 hợp chất được xác định [104]. Trong luận án này, lần đầu

tiên phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối khối phổ được sử dụng để

xác định các thành phần trong dịch chiết các mẫu nghiên cứu bao gồm BFI (B.

fungosa subsp. indica), BFG (B. fungosa var. globosa), BT (B. tobiracola) và BS

(B. subcupularis). Các nhóm hợp chất được xác định bao gồm: acid

hydroxybenzoic, phenylpropanoid đơn giản, tanin thủy phân được và flavonoid.

Từ bảng kết quả phân tích sắc ký lỏng khối phổ (trang 111), có thể thấy có

những sự tương đồng nhất định trong thành phần hóa học phân đoạn ethyl acetat

của các mẫu nghiên cứu. 16 hợp chất bao gồm 7 acid hydroxybenzoic [acid gallic

(2), acid gallic glucosid isomer I, II (1,3), methyl gallat (4), acid brevifolin

carboxylic (5), methyl brevifolin carboxylic (6), acid ellagic (7)], 5

phenylpropanoid đơn giản [acid caffeic glucosid isomer II (10), acid p-coumaric

(11), acid trans-caffeic (12), acid p-coumaric glucosid (13), methyl caffeat (16)]

và 4 tanin thủy phân được [di-O-galloyl-β-D-glucosid (21), tri-O-galloyl-β-D-

glucosid (22), tetra-O-galloyl-β-D-glucosid (24), O-caffeoyl-di-O-galloyl-β-D-

145

glucosid (28)] được xác định trên sắc ký đồ tất cả các mẫu nghiên cứu.

Bên cạnh đó, các dữ liệu phổ khối hai lần gợi ý về sự tương đồng trong

thành phần hóa học của các mẫu BFG, BFI với tổng cộng 24 hợp chất được xác

định trên sắc ký đồ các mẫu thuộc hai taxa của loài B. fungosa. Trong khi các

gallotanin được xác định trong cả 4 mẫu nghiên cứu, các ellagitanin với nhóm

HHDP- như O-caffeoyl-O-galloyl-HHDP glucosid (33), di-caffeoyl-HHDP

glucosid (34) chủ yếu được xác định trong hai mẫu BFI, BFG.

Tổng quan tài liệu cho thấy các hợp chất có cấu trúc tương tự các tanin thủy

phân được kể trên đã được phân lập và xác định cấu trúc từ một số loài cùng chi,

trong đó có loài B. fungosa và B. simaoensis (tên đồng nghĩa của B. fungosa

subsp. indica). Tuy nhiên, do sự hạn chế của dữ liệu phổ khối, do đó chưa thể

khẳng định chính xác vị trí các nhóm thế trên phân tử đường.

Các flavonoid chủ yếu được xác định trên sắc ký đồ hai mẫu BS, BT. Hai

mẫu BS, BT có một số tương đồng về thành phần flavonoid với một số hợp chất

bao gồm quercetin glucosid (35), eriodictyol (45) và eriodictyol-7-O-glucosid

(36), 2”-galloyl hyperin (37), luteolin glucosid (39), phlorizin (43) được phát hiện

trên sắc ký cả 2 mẫu.

Mẫu BS được đặc trưng bởi sự có mặt của một số hợp chất như acid ferulic

(14), coniferyl aldehyd (15), naringenin (47), naringenin-7-O-glucosid (40) và

kaempferol (48)

Trong khi đó, mẫu BT (B. tobiracola) được đặc trưng bởi sự có mặt của

ethyl gallat (8), acid cinnamic (18) và các dẫn chất của 3-hydroxy phloretin như

3-hydroxy phloretin O-β-D-glucosid (38), 3-hydroxy phloretin-O-(di-O-galloyl)-

β-D-glucosid (41), 3-hydroxy phloretin-O-(O-galloyl-)-β-D-glucosid (42), 3-

hydroxy phloretin-O-(O-HHDP)-β-D-glucosid (44), 3-hydroxy phloretin-O-(O-

galloyl-O-HHDP)-β-D-glucosid (46). Tanaka và cộng sự đã phân lập các dẫn chất

của 3-hydroxy phloretin có cấu trúc tương tự trong các nghiên cứu trước đây: 3-

hydroxy phloretin 4’-O-(6”-O-galloyl-)-β-D-glucosid, 3-hydroxy phloretin 4’-O-

146

(3”,4”-di-O-galloyl)-β-D-glucosid, 3-hydroxy phloretin 4’-O-(4”,6”-di-O-

galloyl)-β-D-glucosid, 3-hydroxy phloretin 4’-O-(4”,6”-O-(S)-HHDP)-β-D-

glucosid, 3-hydroxy phloretin 4’-O-(3”-O-galloyl-4”,6”-O-(S)-HHDP)-β-D-

glucosid [109]. Bên cạnh đó, trong chi Balanophora, các dẫn chất 3-hydroxy

phloretin đã được phân lập và xác định cấu trúc từ một số loài khác như

B. harlandii [116], B. involucrata [90] [110]. Đây đều là các loài có bao hoa 3

mảnh, thuộc phân chi Balania theo phân loại của B. Hansen (1972). Như vậy, sự

có mặt của nhóm chất này có thể là đặc trưng về hóa học cho các loài có bao hoa

3 mảnh.

Trong 4 mẫu nghiên cứu kể trên, phân loài B. fungosa subsp. indica (tên

đồng nghĩa B. indica, B. simaoensis) và B. tobiracola đã được nghiên cứu trong

khi thứ B. fungosa var. globosa và loài B. subcupularis chưa được nghiên cứu về

hóa học. Như vậy, những kết quả phân tích GC-MS và LC-MS/MS cung cấp thêm

thông tin về thành phần hóa học của các loài này, bên cạnh việc phân lập và xác

định cấu trúc các hợp chất. Kết quả triển khai các phương pháp sắc ký để phân

tích thành phần hóa học các loài nghiên cứu cho thấy có những sự tương đồng

nhất định trong thành phần hóa học các loài cùng chi hoặc sâu hơn nữa là giữa

các taxa của cùng một loài. Bên cạnh đó, mỗi mẫu nghiên cứu có một số thành

phần khác biệt.

4.3. Về kết quả đánh giá tác dụng sinh học và độc tính cấp

4.3.1. Về tác dụng sinh học của cao chiết dược liệu

Với các mục tiêu đề ra của luận án, chúng tôi sử dụng các mô hình in vitro

bao gồm mô hình ức chế sản sinh NO trên đại thực bào RAW264.7 và mô hình

ức chế xanthin oxidase in vitro để đánh giá tác dụng cắn methanol 4 mẫu nghiên

cứu.

Loài B. fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen với mẫu thu được ở Sapa

(Lào Cai) (BFI) được lựa chọn cho các nghiên cứu in vivo. Các mô hình được sử

147

dụng bao gồm: đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng

acid uric cấp bằng kali oxonat, tác dụng kháng viêm trên 2 mô hình gây viêm cấp

bao gồm mô hình gây phù bằng carrageenan và gây viêm màng hoạt dịch khớp

gối bằng tinh thể natri urat. Ethanol 70% được sử dụng làm dung môi chiết cho

nội dung nghiên cứu in vivo do tính an toàn và khả năng chiết được nhiều nhóm

chất, đặc biệt là các hợp chất phenolic là thành phần chính trong các loài thuộc

chi Balanophora.

Kết quả cho thấy cao chiết ethanol loài này (EBF) có tác dụng hạ acid uric

yếu với duy nhất liều 900 mg/kg thể hiện tác dụng (liều tính trên chuột nhắt trắng).

Trong khi đó, cao chiết EBF thể hiện tác dụng kháng viêm phụ thuộc liều trên hai

mô hình gây viêm với liều 500 mg/kg (liều quy đổi trên chuột cống trắng) thể

hiện tác dụng tại tất cả các thời điểm quan sát.

4.3.2. Về độc tính cấp

Bên cạnh đánh giá một số tác dụng sinh học, đánh giá độc tính cấp của dược

liệu cũng là việc làm cần thiết. Trong thực tế, Dó đất thường được người dân địa

phương ngâm rượu uống với mục đích bổ tinh, bổ máu, giúp mạnh gân cốt. Tuy

nhiên chưa có các công bố về độc tính cấp của loài này. Kết quả đánh giá độc tính

cấp trên mẫu Dó đất thu ở Sapa, Lào Cai cho thấy cao chiết Dó đất biểu hiện độc

tính với giá trị LD50 của cao chiết là 17,50 g/kg (tính trên chuột nhắt trắng). Đây

là một vấn đề cần được chú ý khi sử dụng dược liệu. Mổ chuột quan sát đại thể

thấy tim phổi không có bất thường, dạ dày và ruột căng, nhu động nhiều, do đó

không tiến hành làm quan sát vi thể.

4.3.3. Về tác dụng sinh học của một số hợp chất được xác định trong các loài

nghiên cứu

Một số hợp chất được phân lập hoặc được sơ bộ xác định trong thành phần

các loài Balanophora đã được đánh giá một số tác dụng sinh học in vitro và in

148

vivo trong các nghiên cứu trước đây. Các hợp chất này có thể đóng vai trò nhất

định với các tác dụng đã được đánh giá trên các loài thuộc chi Balanophora

J.R.&G.Forst. trong luận án.

Tổng qua tài liệu cho thấy các hợp chất được phân lập từ chi Balanophora

thể hiện tác dụng chống oxy hóa mạnh, đặc biệt là các tanin thủy phân được với

nhóm galloyl hoặc caffeoyl trong phân tử [101], Số lượng nhóm OH phenol trong

phân tử có vai trò quan trọng với hoạt tính dọn gốc tự do [117]. Bên cạnh đó, acid

gallic và một số ester của nó (methyl gallat, ethyl gallat) cũng thể hiện tác dụng

tốt. Sự có mặt của acid gallic và một số dẫn chất của nó như methyl gallat và các

đồng phân của acid gallic glucosid, di-O-galloyl glucosid, O-caffeoyl-O-galloyl

glucosid hay O-caffeoyl-di-galloyl glucosid trong các loài nghiên cứu trong luận

án đã được khẳng định sử dụng phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hay

các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng kết nối khối phổ.

Với tác dụng hạ acid uric huyết thanh và tác dụng ức chế hoạt độ xanthin

oxidase, một số hợp chất đã biết trong cao chiết Dó đất như acid gallic, acid caffeic

có thể có các đóng góp nhất định. Acid caffeic thể hiện tác dụng hạ acid uric trên

chuột nhắt trắng bị gây tăng acid uric bằng kali oxonat ở mức liều 10 và 15 mg/kg

trong nghiên cứu của Ferraz-Filha. Đồng thời, acid caffeic ở 2 mức liều trên có

khả năng ức chế xanthin oxidase gan chuột lần lượt 29% và 46 % so với lô chứng

[48]. Trong một nghiên cứu in vitro của Chiang, acid caffeic là chất ức chế mạnh

nhất xanthin oxidase trong 6 chất phân lập được và là một chất ức chế không cạnh

tranh [33]. Trong khi đó, acid gallic cũng có tác dụng ức chế enzym xanthin

oxidase với IC50 = 28,47 ± 0,06 µg/ml trong nghiên cứu của tác giả Pyo [95]. Kết

quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy đây là hai hợp chất có mặt trong tất

cả các loài thuộc chi Balanophora được nghiên cứu trong luận án.

Với tác dụng kháng viêm, như đã trình bày ở phần tổng quan, lupeol acetat

cũng như phân đoạn n-hexan của loài B. involucrata thể hiện tác dụng giảm phù

149

đáng kể trên mô hình gây phù chân chuột bằn carrageenan. Hợp chất này đã được

xác định trong phân đoạn n-hexan của các mẫu nghiên cứu trong luận án sử dụng

sắc ký khí kết nối khối phổ.

Cũng liên quan đến tác dụng kháng viêm, acid caffeic và các ester của nó

như methyl caffeat, ethyl caffeat đã được đánh giá tác dụng ức chế sản sinh nitric

oxid với IC50 lần lượt là 21,4 và 11,9 µM [36]. Nghiên cứu của Chiou (2011) cho

thấy trong 18 hợp chất phân lập từ loài B. laxiflora, isolariciresinol, ethyl caffeat

và ferulic aldehyd (hay coniferyl aldehyd) cho thấy hoạt tính kháng viêm tiềm

năng với isolariciresinol là hợp chất thể hiện tác dụng mạnh nhất trên một số mô

hình như ức chế mạnh sản sinh NO do kích thích LPS trong đại thực bào

RAW264.7 (IC50 = 0,87 µM), ức chế hoạt hóa yếu tố hạt nhân-κB (NF-κB) [34].

Ngoài ra, acid gallic và ethyl gallat cũng thể hiện hoạt tính kháng viêm thông qua

nhiều cơ chế khác nhau [69]. Trong các hợp chất kể trên, isolariciresinol đã được

phân lập từ thứ B. fungosa var. globosa trong khi coniferyl aldehyd được phân lập

từ loài B. subcupularis, ethyl caffeat được xác định trong loài B. tobiracola,

methyl caffeat được xác định trong tất cả các mẫu nghiên cứu.

Như vậy các nghiên cứu về hóa học đã cho thấy sự có mặt của nhiều hợp

chất có khung cấu trúc tương tự nhau trong các loài thuộc chi Balanophora

J.R.&G. Forst bao gồm các triterpenoid, các tanin thủy phân được với một hoặc

nhiều nhóm galloyl-, caffeoyl-, coumaroyl- hoặc HHDP- gắn với một phân tử

đường hay các acid hydroxybenzoic, phenylpropanoid đơn giản. Bên cạnh đó, một

số thành phần khác biệt đã được phân lập/xác định trong các mẫu nghiên cứu.

Thành phần và tỷ lệ khác nhau các hợp chất trong các loài nghiên cứu có thể ảnh

150

hưởng đến mức độ biểu hiện các tác dụng dược lý của các mẫu nghiên cứu.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

A. KẾT LUẬN

Về thực vật

Đã mô tả được đặc điểm hình thái một số loài Dó đất (Balanophora) ở Việt

Nam. Đã thu thập, xác định tên khoa học chính xác của 2 loài, 1 phân loài và 1

thứ thuộc chi Balanophora

Đã ghi nhận mới 2 loài cho hệ thực vật Việt Nam bao gồm: B. subcupularis

P.C. Tam và B. tobiracola Makino.

Đã nghiên cứu đặc điểm hình thái hạt phấn các loài nghiên cứu.

Về thành phần hóa học

Đã định tính sơ bộ bằng các phản ứng hóa học thành phần hóa học chính

trong các loài thuộc chi Balanophora.

Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học 10 hợp chất từ phân đoạn ethyl

acetat các loài B. fungosa (var. globosa và subsp. indica), B. tobiracola và B.

subcupularis.

Đã triển khai sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí kết nối khối phổ phân đoạn n-

hexan của các mẫu nghiên cứu. Kết quả cho thấy sự có mặt của 6 hợp chất

triterpenoid pentacyclic trên SKĐ.

Đã triển khai sắc ký lớp mỏng cắn methanol toàn phần các mẫu nghiên cứu

sử dụng một số hệ dung môi khác nhau.

Đã triển khai sắc ký lỏng kết nối khối phổ phân đoạn ethyl acetat các mẫu

nghiên cứu, sơ bộ xác định 48 thành phần trong các mẫu nghiên cứu. Dựa trên kết

quả phân tích, có thể nhận thấy hai taxa của loài B. fungosa (B. fungosa subsp.

indica và B. fungosa var. globosa) có nhiều thành phần tương đồng nhau, có một

số khác biệt với hai loài ghi nhận mới B. subcupularis và B. tobiracola.

Về tác dụng sinh học

Đã đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro cắn methanol của 4

151

mẫu nghiên cứu, mẫu B. fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen và B. fungosa

var. globosa (Jungh.) B.Hansen thể hiện hoạt tính tốt hơn hai mẫu còn lại. Đã

đánh giá tác dụng ức chế sản sinh NO, mẫu B. fungosa subsp. indica thể hiện tác

dụng tốt hơn các mẫu còn lại với IC50 = 87,06 µg/mL. Trên cơ sở đó, loài Dó đất

(B. fungosa subsp. indica) được lựa chọn cho nghiên cứu in vivo.

Chiết xuất cao chiết ethanol 70 % loài Dó đất (B. fungosa subsp. indica) (ký

hiệu EBF). Hàm lượng polyphenol của cao chiết là 250,23 ± 0,19 mg GAE/g.

Trên mô hình gây tăng acid uric huyết thanh trên chuột nhắt trắng, cao chiết EBF

liều 900 mg/kg làm giảm 28,32% (p < 0,01) so với lô chứng trong khi hai mức

liều thấp hơn là 300 mg/kg và 600 mg/kg không thể hiện tác dụng. Với tác dụng

kháng viêm, trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan (trên chuột cống

trắng), cao chiết EBF liều 500 mg/kg thể hiện tác dụng đáng kể ở tất cả các thời

điểm quan sát với mức độ phù giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Trên

mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng natri urat, cao chiết EBF liều

500 mg/kg làm giảm điểm viêm tại tất cả các thời điểm quan sát. Trong khi đó,

liều thấp hơn (350 mg/kg) thể hiện tác dụng chậm hơn và không kéo dài so với

liều 500 mg/kg.

Về độc tính cấp

Đã xác định giá trị LD50 của cao chiết EBF từ Dó đất là 17,50 g/kg thể trọng

(tương đương 44,76 g dược liệu/kg thể trọng), với khoảng tin cậy 95 % là 14,83

– 20,44 g/kg (tính trên chuột nhắt trắng).

B. KIẾN NGHỊ

Chúng tôi có một số đề xuất sau:

- Đánh giá tác dụng kháng viêm in vitro của các hợp chất đã được phân lập.

- Đánh giá độc tính bán trường diễn và đánh giá thêm một số tác dụng sinh học

152

của các loài này để có căn cứ sử dụng an toàn, hiệu quả.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Thị Hồng Anh, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Thùy Dương (2020), Nghiên

cứu tác dụng chống oxy hóa và kháng viêm trên thực nghiệm của Tỏa dương

(Balanophora laxiflora Hemsl., Balanophoraceae), Nghiên cứu Dược

Thông tin thuốc, tập 11, số 4,trang 34–40.

2. Nguyễn Thị Hồng Anh, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Thùy Dương (2017), Tác dụng

ức chế xanthin oxidase in vitro của các phân đoạn và các hợp chất phân lập

từ tỏa dương, Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 4, trang 230–234.

3. Nguyễn Thị Hồng Anh, Nguyễn Thị Thu, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Thùy Dương,

Lê Việt Dũng (2017), Các hợp chất phenolic phân lập từ cặn ethyl acetat

của Tỏa dương, Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1, trang 29–33.

4. Nguyễn Tiến Bân (2005), Danh lục thực vật Việt Nam. Nhà xuất bản Nông

nghiệp, Hà Nội.

5. Nguyễn Tiến Bân (2007), Sách đỏ Việt Nam (Phần 2 - Thực vật). Nhà xuất

bản Khoa học và công nghệ, Hà Nội.

6. Bộ Y tế (1996), Quyết định về việc ban hành quy chế đánh giá tính an toàn

và hiệu lực thuốc cổ truyền.

7. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới) - Tập 1. Nhà xuất

bản Y học, Hà Nội.

8. Nguyễn Thùy Dương (2012), Nghiên cứu tác dụng trên bệnh gút thực

nghiệm của cây Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L. Asteraceae), Luận án

tiến sĩ Dược học, Viện Dược liệu.

9. Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Thị Hồng Anh, Phan Thị Thu Hiền, Đỗ Thị

Hà (2017), Nghiên cứu tác dụng hạ acid uric của Tỏa dương trên động vật

thực nghiệm, Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 1, trang 51–54.

10. Trần Đức Đại, Nguyễn Quyết Tiến, Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Quảng

An, Trương Thị Thanh Nga, Trịnh Thị Thủy, Nguyễn Thị Tuyết, Đặng

Ngọc Quang (2017), Thành phần hóa học của cây Ngọc cẩu (Balanophora

laxiflora Hemsl.) thu tại Tuyên Quang Phần 1 . Thành phần hóa học của các

cặ n chiết ít phân cực, Tạp chí Hóa học, tập 55, số 1, trang 48–51.

11. Nguyễn Văn Đàn (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc. Hà

Nội: Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

12. Phạm-hoàng Hộ (1992), Câycỏ Việtnam, Quyển II, Tập 1. Montréal.

13. Đỗ Tất Lợi (2014), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Hà Nội: Nhà

xuất bản Y học, Hà Nội.

14. Nguyễn Thanh Hương, Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, Phan Anh Tuấn

(2017), Khảo sát độc tính di truyền của dịch chiết nước tỏa dương

(Balanophora laxiflora) trên chuột nhắt trắng, Tạp chí Y học thực hành, tập

7, số 5(1042), trang 52–58.

15. Nguyễn Thanh Hương, Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, Phan Anh Tuấn

(2016), Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết nước tỏa dương lên hành vi tình

dục chuột cống đực trưởng thành, Tạp chí Nghiên cứu y học, tập 100, số 2,

trang 50–57.

16. Nguyễn Thanh Hương, Triệu Văn Túy, Phan Anh Tuấn, Nguyễn Trần Thị

Giáng Hương, Trần Văn Hướng (2017), Khảo sát độc tính sinh sản của dịch

chiết nước tỏa dương (Balanophora laxiflora) trên chuột nhắt trắng, Tạp chí

Y dược học cổ truyền Quân sự, tập 7, số 2, trang 9–16.

17. Nguyễn Thanh Hương, Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, Phan Anh Tuấn,

Trần Văn Hướng (2015), Nghiên cứu hoạt tính androgen của cao lỏng Tỏa

dương (Balanophora laxiflora) trên chuột đực, Tạp chí Nghiên cứu y học,

tập 96, số 4, trang 31–40.

18. Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (2015), Dược liệu học 2. Nhà xuất bản Y học,

Hà Nội.

19. Nguyễn Viết Thân (2020), Cây thuốc Việt Nam và những bài thuốc thường

dùng, tập 1. Hà Nội: Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

20. Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), Các phương pháp nghiên cứu thực vật. Hà Nội:

NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

21. Ngô Vân Thu và Trần Hùng (2011), Dược liệu học 1. Nhà xuất bản Y học,

Hà Nội.

Tiếng Anh

22. Ali, A. et al. (2021), LC-MS/MS-QTOF screening and identification of

phenolic compounds from australian grown herbs and their antioxidant

potential, Antioxidants, vol. 10, no. 11.

23. Ali, A. et al. (2021), Comprehensive profiling of most widely used spices

for their phenolic compounds through lc-esi-qtof-ms2 and their antioxidant

potential, Antioxidants, vol. 10, no. 5.

24. Anh, N.T.H. et al. (2021), Phenolic constituents from Balanophora

laxiflora with their anti-inflammatory and cytotoxic effects, Nat. Prod. Sci.,

vol. 27, no. 1, pp. 49–53.

25. Averyanov, L.V. et al. (1996), Vascular plants synopsis of vietnamese flora,

vol. 2. 1996.

26. Baderschneider, B. and Winterhalter, P. (2001), Isolation and

Characterization of Novel Benzoates, Cinnamates, Flavonoids, and Lignans

from Riesling Wine and Screening for Antioxidant Activity, J. Agric. Food

Chem., vol. 49, no. 6, pp. 2788–2798.

27. Bui, H.T. et al. (2019), Three new muurolane-type sesquiterpene glycosides

from the whole plants of Balanophora fungosa subsp. indica, Nat. Prod.

Res., vol. 34, no. 20, pp. 2964–2970.

28. Casabuono, A.C. and Pomillo, A.B. (1994), Lignans and a stilbene from

Festuca argentina, Phytochemistry, vol. 35, no. 2, pp. 479–483.

29. Chang, Z. et al. (2019), A Comprehensive Review of the Structure

Elucidation of Tannins from Terminalia Linn., Evidence-Based

Complementary and Alternative Medicine, vol. 2019. Article ID 8623909

30. Chase, M.W. et al. (2016), An update of the Angiosperm Phylogeny Group

classification for the orders and families of flowering plants: APG IV, Bot.

J. Linn. Soc., vol. 181, no. 1, pp. 1–20.

31. Chen, Y. et al. (2015), Characterization and quantification by LC-MS/MS

of the chemical components of the heating products of the flavonoids extract

in Pollen typhae for transformation rule exploration, Molecules, vol. 20, no.

10, pp. 18352–18366.

32. Chen, Y. et al. (2012), Balanophora spicata and Lupeol Acetate Possess

Antinociceptive and Anti-Inflammatory Activities In Vivo and In Vitro,

Evidence-Based Complement. Altern. Med., vol. 2012. Article ID 371273

33. Chiang, H.C., Lo, Y.J. and Lu, F.J. (1994), Xanthine oxidase inhibitors from

the leaves of Alsophila spinulosa (Hook) Tryon, J. Enzyme Inhib. Med.

Chem., vol. 8, no. 1, pp. 61–71.

34. Chiou, W.F., Shen, C.C. and Lin, L.C. (2011), Anti-inflammatory principles

from Balanophora laxiflora, J. Food Drug Anal., vol. 19, no. 4, pp. 502–

508.

35. Del Cuenca, M.R. et al. (1991), Monoterpenes and lignans from Mikania

saltensis, J. Nat. Prod., vol. 54, no. 4, pp. 1162–1164.

36. Da Cunha, F.M. et al. (2004), Caffeic acid derivatives: In vitro and in vivo

anti-inflammatory properties, Free Radic. Res., vol. 38, no. 11, pp. 1241–

1253.

37. Dai, T.D. et al. (2018), Chemical constituents of Balanophora laxiflora

Hemsley collected in Tuyen Quang, Vietnam J. Chem., vol. 56, no. 2, pp.

254–259.

38. Dat, N.T. et al. (2012), Sanggenon C and O inhibit NO production , iNOS

expression and NF- κ B activation in LPS-induced RAW264.7 cells,

Immunopharmacol. Immunotoxicol., vol. 34, no. 1, pp. 84–88.

39. Deng, J. et al. (2010), Antioxidant Activity of Extract from Balanophora

spicata Hayata in vitro, Food Sci., vol. 31, pp. 23–25.

40. Deyama, T. et al. (1987), The Constituents of Eucommia ulmoides Oliv. V.

Isolation of Dihydroxydehydrodiconiferyl Alcohol Isomers and Phenolic

Compounds, Chem. Pharm. Bull., vol. 35, no. 5, pp. 1785–1789.

41. Dirsch, V. M. et al. (1998), Effect of allicin and ajoene , two compounds of

garlic, on inducible nitric oxide synthase, Atherosclerosis, vol. 139, pp.

333–339.

42. Eklund, P., SjÖholm, R. and SjÖholm, R. (2002), Synthetic transformation

of hydroxymatairesinol from Norway spruce (Picea abies) to 7-

hydroxysecoisolariciresinol, (+)-lariciresinol and (+)-cyclolariciresinol, J.

Chem. Soc. Perkin 1, vol. 2, no. 16, pp. 1906–1910.

43. El-Domiaty, M.M. et al. (2002), The first report on the occurrence of

furofuranoid lignan glucosides in Acanthaceae, Pharm. Biol., vol. 40, no. 2,

pp. 96–102.

44. Eldahshan, O.A. (2011), Isolation and Structure Elucidation of Phenolic

Compounds of Carob Leaves Grown in Egypt, Curr. Res. J. Biol. Sci., vol.

3, no. 1, pp. 52–55.

45. Erdtman, G. (1960), The acetolysis method-a revised description, Sven Bot

Tidskr, vol. 54, pp. 516–564.

46. Falshaw, C.P. et al. (1969), The spectroscopic identification of coniferin,

Phytochemistry, vol. 8, no. 5, pp. 913–915.

47. Fang, L. et al. (2018), Isolation and Purification of Galloyl, Caffeoyl, and

Hexahydroxydiphenoyl Esters of Glucoses from Balanophora simaoensis

by High-Speed Countercurrent Chromatography and Their Antioxidant

Activities In Vitro, Molecules, vol. 23, no. 8.

48. Ferraz-Filha, Z.S. et al. (2017), Effects of the aqueous extract from

Tabebuia roseoalba and phenolic acids on hyperuricemia and inflammation,

Evidence-based Complement. Altern. Med., vol. 2017.

49. Gerhard, V.H. (2008), Drug Discovery and Evaluation:Pharmacological

Assays. Springer.

50. Gong, J. et al. (2020), Simultaneous determination of gallic acid, methyl

gallate, and 1,3,6-tri-O-galloyl-β-d-glucose from Turkish galls in rat plasma

using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application

to pharmacokinetics study, Biomed. Chromatogr., vol. 34, no. 10, pp. 1–10.

51. Goppel, M. and Franz, G. (2004), Stability control of valerian ground

material and extracts: A new HPLC-method for the routine quantification

of valerenic acids and lignans, Pharmazie, vol. 59, no. 6, pp. 446–452.

52. Guo, C. et al. (2020), Balanophora polyandra Griff. prevents dextran

sulfate sodium-induced murine experimental colitis via the regulation of

NF-?B and NLRP3 inflammasome, Food Funct., vol. 11, no. 7, pp. 6104–

6114.

53. Hansen, B. (1970), Balanophoraceae, in Flora of Thailand, vol. 2, part 1,

pp. 177–181.

54. Hansen, B. (1976), Balanophoraceae, in Flora malesiana Vol 7 part 4, pp.

783–805.

55. Hansen, B. (1972), The genus Balanophora J.R. & G. Forster - A taxonomic

Monograph, in Dansk Botanisk Arkiv 28, 1972, pp. 3–188.

56. Haruna, M. et al. (1982), Balanophonin, a new neo-lignan from

Balanophora japonica Makino., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo)., vol. 30, no.

4, pp. 1525–1527.

57. Hatusima, S. (1971), A new noteworthy species of Balanophora from

Kyushu, Journ. Geobot., vol. 19, pp. 60–62.

58. Ho, S. T. et al. (2010), Screening, determination and quantification of major

antioxidants from Balanophora laxiflora flowers, Food Chem., vol. 122, no.

3, pp. 584–588.

59. Ho, S.T. et al. (2012), The Hypouricemic Effect of Balanophora laxiflora

Extracts and Derived Phytochemicals in Hyperuricemic Mice, Evidence-

Based Complement. Altern. Med., vol. 2012, pp. 1–7.

60. Hock, F.J. (2015), Drug discovery and evaluation: Pharmacological

assays, fourth edition. 2015.

61. Hosokawa, A. et al. (2004), A New Lignan from Balanophora abbreviata

and Inhibition of Lipopolysaccharide (LPS)-induced Inducible Nitric Oxide

Synthase (iNOS) Expression, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo)., vol. 52, no. 10,

pp. 1265–1267.

62. Hosoya, T. et al. (2010), Papuabalanols A and B, new tannins from

Balanophora papuana., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), vol. 58, no. 5, pp.

738–741.

63. ICH (2005), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology.

Geneva, 2005.

64. Ito, K. et al. (1980), Dihydrochalcones from Balanophora tobiracola,

Phytochemistry, vol. 19, no. 3. 1980, pp. 476–477.

65. Jeong, C.H. et al. (2011), Neuroprotective and anti-oxidant effects of caffeic

acid isolated from Erigeron annuus leaf, Chin. Med., vol. 6, no. 1, p. 25.

66. Jiang, Z.H. et al. (2001), Caffeoyl, Coumaroyl, Galloyl, and

Hexahydroxydiphenoyl Glucoses from Balanophora japonica, Chem.

Pharm. Bull. (Tokyo)., vol. 49, no. 7, pp. 887–892.

67. Jiang, Z.-H. et al. (2005), Ellagitannins and lignan glycosides from

Balanophora japonica (Balanophoraceae)., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo).,

vol. 53, no. 3, pp. 339–41.

68. Jiménez-Aspee, F. et al. (2015), Anti-Inflammatory Activity of Copao

(Eulychnia Acida Phil., Cactaceae) Fruits, Plant Foods Hum. Nutr., vol. 70,

no. 2, pp. 135–140.

69. Kahkeshani, N. et al. (2019), Pharmacological effects of gallic acid in health

and disease: A mechanistic review, Iran. J. Basic Med. Sci., vol. 22, no. 3,

pp. 225–237.

70. Kanchanapoom, T. et al. (2001), New glucosides from Thai Medicinal Plant

Balanophora latisepala, Nat. Med., vol. 55, no. 4, pp. 213–216.

71. Kannan, R. and Babu, U.V (2011), Pharmacognostical Studies on

Balanophora fungosa - a Negative Listed Plant., Anc. Sci. Life, vol. 31, no.

1, pp. 22–5.

72. Kong, L.D. et al. (2004), A Chinese herbal medicine Ermiao wan reduces

serum uric acid level and inhibits liver xanthine dehydrogenase and

xanthine oxidase in mice, J. Ethnopharmacol., vol. 93, no. 2–3, pp. 325–

330.

73. Kuijt, J. and Hansen, B. (2015), Balanophorales, in Kuijt, J. & Hansen, B.

(Eds.)The families and genera of vascular plants 12, Flowering plants:

Eudicots; Santalales, Balanophorales, vol. XII, Cham: Springer, 2015, pp.

190–208.

74. Leelaprakash, G. and Mohan Dass, S. (2011), In vitro anti-inflammatory

activity of methanol extract of Enicostemma axillare, Int. J. Drug Dev. Res.,

vol. 3, no. 3, pp. 189–196.

75. Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949), A simplified method of evaluating

dose-effect experiments, J. Pharmacol. Exp. Ther., vol. 96, no. 2, pp. 99–

113.

76. Liu, R., Li, A. and Sun, A. (2004), Preparative isolation and purification of

hydroxyanthraquinones and cinnamic acid from the Chinese medicinal herb

Rheum officinale Baill. by high-speed counter-current chromatography, J.

Chromatogr. A, vol. 1052, no. 1–2, pp. 217–221.

77. Liu, X. et al. (1998), Triterpene constituents from Balanophora indica, Acta

Bot. Yunnanica, vol. 20, no. 3, pp. 369–373.

78. Luo, B. et al. (2007), Studies on chemical constituents of Balanophora

involucrata, Li Shizhen Med Mater. Medica Res, vol. 18, pp. 1929–1930.

79. Makino, T. (1902), Observation on the Flora of Japan., in Botanical

Magazine, Tokyo 16, 1902, p. 212.

80. Makino, T. (1909), Observation on the Flora of Japan, in Botanical

Magazine, Tokyo 23, 1909, p. 59.

81. Martelanc, M., Vovk, I. and Simonovska, B. (2009), Separation and

identification of some common isomeric plant triterpenoids by thin-layer

chromatography and high-performance liquid chromatography, J.

Chromatogr. A, vol. 1216, no. 38, pp. 6662–6670.

82. Mogana, R., Teng-Jin, K. and Wiart, C. (2013), The Medicinal Timber

Canarium patentinervium Miq. (Burseraceae Kunth.) Is an Anti-

Inflammatory Bioresource of Dual Inhibitors of Cyclooxygenase (COX)

and 5-Lipoxygenase (5-LOX) , ISRN Biotechnol., vol. 2013, pp. 1–8.

83. Murata, J. (1990), Agamic Species of Balanophora in Japan, Mem. Natn.

Sci. Mus. Tokyo, vol. 23.

84. Murata, J. (2016), Balanophora subcupularis, J. Japanese Bot., vol. 91, no.

1, pp. 47–48.

85. Narayanan, C.R. et al. (1976), Chemical examination of the rhizomes of

coffee fungus, Balanophora indica, Indian J Chem, vol. 14B, no. 906–907.

86. Nguyen Thi Hong Anh, Do Thi Ha, Nguyen Xuan Nhiem, Tran Hong

Quang, Bui Huu Tai (2018), Chemical Constituents from Water Soluble

Extract of Balanophora laxiflora Hemls. Collected in Vietnam, J. Med.

Mater., vol. 23, no. 3, pp. 136–142.

87. Niranjan, A. et al. (2017), Simultaneous quantification of six phenolic

compounds in various parts of moringa oleifera lam. using high-

performance thin-layer chromatography, J. Planar Chromatogr. - Mod.

TLC, vol. 30, no. 6, pp. 502–509.

88. Noro T., Oda, Y., Miyase, T., Ueno, A., Fukushima, S. (1983), Inhibitors of

Xanthine Oxidase from the Flowers and Buds of Daphne genkwa, Chem

Pharm Bull, vol. 31, no. 11, pp. 3984–3987.

89. OECD (2002), Test No. 420: Acute Oral Toxicity-Fixed Dose Procedure.,

OECD Guidel. Test. Chem. Sect. 4., no. December, pp. 1–14.

90. Pan, J. et al. (2008), Separation of flavanone enantiomers and flavanone

glucoside diastereomers from Balanophora involucrata Hook. f. by

capillary electrophoresis and reversed-phase high-performance liquid

chromatography on a C18 column, J. Chromatogr. A, vol. 1185, no. 1, pp.

117–129.

91. Pan, Y. et al. (2008), Chemical constituents of Balanophora involucrata,

Chin Tradit Herb Drugs, vol. 39, pp. 327–331.

92. Panthama N, Kanokmedhakul, S., Kanokmedhakul, K. (2009), Galloyl and

hexahydroxydiphenoyl esters of phenylpropanoid glucosides,

phenylpropanoids glucosides from rhizome of Balanophora fungosa, Chem

Pharm Bull, vol. 57, pp. 1352–1355.

93. Pelser, P.B., Tandang, D.N. and Barcelona, J.F. (2014), Balanophora

coralliformis (Balanophoraceae), a new species from Mt. Mingan, Luzon,

Philippines, Phytotaxa, vol. 170, no. 4, pp. 291–295.

94. Prakash, I. et al. (2020), Dihydrochalcone Glycosides From Balanophora

harlandii, Nat. Prod. Commun., vol. 15, no. 1, pp. 1–6.

95. Pyo, Y.H., Hwang, J.Y. and Seong, K.S. (2018), Hypouricemic and

Antioxidant Effects of Soy Vinegar Extracts in Hyperuricemic Mice, J.

Med. Food, vol. 21, no. 12, pp. 1299–1305.

96. Quang, D.N. et al. (2018), Balanochalcone, a new chalcone from

Balanophora laxiflora Hemsl., Nat. Prod. Res., vol. 32, no. 7, pp. 767–772.

97. Ruan, H. et al. (2006), Screening the effective fraction of analgesin in

Balanophora involucrata, Her. Med., vol. 25, pp. 383–384.

98. Ruan, H. et al. (2006), Chemical constituents of Balanophora japonica

Makino, Nat Prod Res Dev, vol. 18, pp. 74–75.

99. Shao, S. Y. et al. (2018), An Efficient Method for Determining the Relative

Configuration of Furofuran Lignans by 1H NMR Spectroscopy, J. Nat.

Prod., vol. 81, no. 4, pp. 1023–1028.

100. She, G.M., Zhang, Y.J. and Yang, C.R. (2013), A New Phenolic Constituent

and a Cyanogenic Glycoside from Balanophora involucrata

(Balanophoraceae ), Chem. Biodivers., vol. 10, no. 6, pp. 1081–1087.

101. She, G.M., Zhang, Y.J. and Yang, C.R. (2009), Phenolic Constituents from

Balanophora laxiflora with DPPH Radical-Scavenging Activity, Chem.

Biodivers., vol. 6, no. 6, pp. 875–880.

102. Singleton, V.L., Orthofer, R. and Lamuela-Raventós, R.M. (1999), Analysis

of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means

of folin-ciocalteu reagent, in Methods in Enzymology, Academic Press Inc.,

1999, pp. 152–178.

103. Sun, W. et al. (2008), 1,2,6-tri-O-galloyl- β-D-glucopyranose inhibits gp41-

mediated HIV envelope fusion with target cell membrane, J South Med

Univ, vol. 28, pp. 1127–1131.

104. Sun, X. et al. (2020), Anti-neuraminidase activity of chemical constituents

of Balanophora involucrata, Biomed. Chromatogr., vol. 34, no. 12.

105. Świątek, Ł. et al. (2021), LC-ESI-QTOF-MS/MS analysis, cytotoxic,

antiviral, antioxidant and enzyme inhibitory properties of four extracts of

Geranium pyrenaicum Burm. F.: A good gift from the natural treasure, Int.

J. Mol. Sci., vol. 22, no. 14, pp. 1–26.

106. Sy, L.K. and Brown, G.D. (1999), Coniferaldehyde derivatives from tissue

culture of Artemisia annua and Tanacetum parthenium, Phytochemistry, no.

50, pp. 781–785.

107. Tai, B.H. et al. (2019), Three new constituents from the parasitic plant

Balanophora laxiflora, Nat. Prod. Commun., vol. 14, no. 5, pp. 1–6.

108. Takhtajan, A. (2009), Flowering Plants. 2009.

109. Tanaka, T. et al. (2005), Galloyl, caffeoyl and hexahydroxydiphenoyl esters

of dihydrochalcone glucosides from Balanophora tobiracola,

Phytochemistry, vol. 66, no. 6. 2005, pp. 675–681.

110. Tao, J. et al. (2012), BACE inhibitory flavanones from Balanophora

involucrata Hook.f., Fitoterapia, vol. 83, no. 8, pp. 1386–1390.

111. Tao, R.Y., Ye, F., He, Y.B., Tian, J.Y., Liu, G.T., Ji, T.F., Su, Y. (2009),

Improvement of high-fat-diet-induced metabolic syndrome by a compound

from Balanophora polyandra Griff mice, Eur J Pharmacol, vol. 616, pp.

328–33.

112. Thi Ha Do et al. (2015), Triterpenoids from Balanophora laxiflora Hemsl.,

J. Med. Mater., vol. 20, no. 5, pp. 257–316.

113. Tian, J. et al. (2007), Studies on hypoglycemic effect of extract of

Balanophora polyandra, Chin J Chin Mat Med, vol. 32, pp. 1194–1198.

114. Truong, L.H. et al. (2020), Balanophora aphylla (Balanophoraceae), a new

holoparasitic species from Vietnam, Ann. Bot. Fenn., vol. 57, no. 1–3, pp.

67–70.

115. Wang, K.J., Zhang, Y.J. and Yang, C.R. (2006), New Phenolic Constituents

from Balanophora polyandra with Radical-Scavenging Activity, Chem.

Biodivers., vol. 3, no. 12, pp. 1317–1324.

116. Wang, W. et al. (2009), A New Hydrolyzable Tannin from Balanophora

harlandii with Radical- Scavenging Activity, Helv. Chim. Acta, vol. 92, no.

9, pp. 1817–1822.

117. Wang, X. et al. (2012), Phytochemicals and biological studies of plants

from the genus Balanophora, Chem. Cent. J., vol. 6, no. 1, p. 443.

118. Wei, J. et al. (2017), Phenolic acids from Balanophora involucrata and their

bioactivities, Fitoterapia, vol. 121, no. July, pp. 129–135.

119. Winter, C.A., Risley, E.A. and Nuss, G.W. (1962), Carrageenan-induced

edema in hind paw of the rat as an assay for anti-inflammatory drugs, Proc.

Soc. Exp. Biol., no. 11, pp. 544–574.

120. Wu, C. (1988), Flora of China, vol. 5, p.272-276, Science Press, 1988.

121. Wu, F.P. et al. (2019), Determination of metabolites of phloretin in rats

using UHPLC-LTQ-Orbitrap mass spectrometry, Trop. J. Pharm. Res., vol.

18, no. 10, pp. 2167–2173.

122. Xia, C. et al. (2010), Study of the mechanism of caffeoyl glucopyranoses in

inhibiting HIV-1 entry using pseudotyped virus system, J South Med Univ,

vol. 30, pp. 720–723.

123. Xiang, M. et al. (2011), Isolation, identification and determination of

methyl caffeate, ethyl caffeate and other phenolic compounds from

Polygonum amplexicaule var. sinense, J. Med. Plants Res., vol. 5, no. 9, pp.

1685–1691.

124. Yadagiri, B., Raj, K. and Rao, G.S.R.S. (1984), Triterpenoids from

Balanophora abbreviata and Balanophora indica, J. Nat. Prod., vol. 47, no.

1, pp. 182–182.

125. Yagishita, K. (1956), Isolation and identification of taraxasterol and β-

amyrin from the bird-lime of balanophora japonica makino, J. Agric. Chem.

Soc. Japan, vol. 20, no. 4, pp. 206–210.

126. Yang, T. et al. (2006), Nitric oxide stimulates COX-2 expression in cultured

collecting duct cells through MAP kinases and superoxide but not cGMP,

Am. J. Physiol. - Ren. Physiol., vol. 291, no. 4, pp. 891–896.

127. Zhou, D. et al. (2014), Validated LC-MS/MS method for the simultaneous

determination of hyperoside and 2′′-O-galloylhyperin in rat plasma:

Application to a pharmacokinetic study in rats, Biomed. Chromatogr., vol.

28, no. 8, pp. 1057–1063.

128. Zhou, J. et al. (2019), New butenolides with anti-inflammatory activity

from Balanophora fungosa, Nat. Prod. Res., vol. 6419, pp. 7–12.

129. Zhou, T. et al. (2011), New Phenylpropanoids and In Vitro α -Glucosidase

Inhibitors from Balanophora japonica, Planta Med., vol. 77, no. 05, pp.

477–481.

Tiếng Pháp

130. Hansen, B. (1973), Balanophoraceae, in Flore du Cambodge du Laos et du

Viêt-Nam, Muséum National d’Histoire Naturelle, pp. 49–58.

131. Lecomte, H. (1915), Flore Générale de L’Indo-Chine, Tome Cinquième.

132. Richard, L.C. (1822), Memoire sur une nouvelle famille des plantes, les

Balanophorees, in Mémoires Du Muséum D’Histoire Naturelle 8, pp. 404–

435.

Tiếng Trung

133. 戴忠(2005), 思茅蛇菰和穗花蛇菰的化学成分研究.博士论文. 药化学系

134. 戴忠, 王钢力, 林瑞超 (2006), 思茅蛇菰的化学成分研究(Ⅲ),中草药 37,

1608–1610.

135. 戴忠,冯旺, 王钢力, 刘燕(2006), 穗花蛇菰的化学成分研究a, 期 刊 ：中

国中药杂志 2006年 31卷 21期 页码：1798

136. 戴忠, 王钢力, 刘燕 (2005), 思茅蛇菰的化学成分研究, 中国中药杂

,30(14), 1131–1132.

137. 侯钦云, 戴忠, 程显隆, 林瑞超 (2009), 5种蛇菰的化学成分比较研究, 药

物分析杂志, 29(5), 697–701.

138. 阮汉利 李 娟 赵晓亚 张勇慧 向 明 吴继洲 (2003), 筒鞘蛇菰镇痛抗炎作

用的研究, 中 医 药 学 刊 21 (6 ), 910-911.

139. 滕荣伟 王德祖 杨崇仁 (2000), 蛇菰的化学成分, 期 刊 ：云南植物研究

2000年 22卷 02期 页码：1-3

140. 夏新中,韩宏星,屠鹏飞 (2001), 筒鞘蛇菰的三萜及甾醇成分研究, 期 刊

：中草药 2001年

Internet 141. The plant list [Online]. Avaiable: http://www.theplantlist.org, [Accessed:

31-Dec-2021].

142. MassBank of North America. [Online]. Available:

https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/spectra/search. [Accessed: 14-Feb-

2022].

143. MassBank | Database | Search. [Online]. Available:

https://massbank.eu/MassBank/Search. [Accessed: 14-Feb-2022].

144. PubChem. [Online]. Available: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/.

[Accessed: 14-Feb-2022].

DANH MỤC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyen Thanh Tung, Nguyen Viet Than and Nguyen Quang Hung (2017),

Balanophora subcupularis P. C. Tam (Balanophoraceae): New Record Species

for Flora of Vietnam, J Pharmacogn Nat Prod, 3(2): 142.

doi:10.4172/2472-0992.1000142

2. Nguyen T. Tung, Nguyen V. Than, Nguyen Q. Hung (2017), Pharmacognostic

Identification of Balanophora J.R. Forst & G. Forst (Balanophoraceae) Endemic

in Ha Giang, Viet Nam, Trop J Nat Prod Res, 1(6):236-240.

3. Thanh-Tung Nguyen, Viet-Than Nguyen, Quang-Hung Nguyen (2018), First

record of Balanophora tobiracola Makino (Balanophoraceae) from Viet Nam,

Bioscience Discovery, 9(2):297-301.

4. Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Thị Luyến, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Quang

Hưng (2019), Đặc điểm hình thái thực vật và ba hợp chất lignan phân lập từ loài

dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arnott.) B. Hansen) thu tại Sapa, tỉnh

Lào Cai, Tạp chí Dược học, số 517 năm 59, trang 57-61.

5. Nguyễn Thanh Tùng, Hồ Thu Trang, Nguyễn Quang Hưng, Nguyễn Quốc

Bình, Nguyễn Viết Thân (2019), So sánh hình thái thực vật và hình thái hạt phấn

một số loài thuộc chi Balanophora J. R & G. Forst ở Việt Nam, Tạp chí Dược

học, số 524 năm 59, trang 44-49.

6. Nguyen T. Tung, Duong P. Lan, Ngo T. Hoa, Nguyen T. Duong, Nguyen Q.

Hung, Nguyen V. Than (2020), Hypouricaemic and Anti-Inflammatory Effect of

Ethanol Extract from Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen, Trop

J Nat Prod Res, 4(8):360-364.

7. Nguyen Thanh Tung, Nguyen Quang Hung, Nguyen Thi Luyen, Nguyen Tien

Dat, Tõnu Püssa, Linda Rusalepp, Mihkel Ilisson, and Ain Raal (2021), Chemical

constituents and biological activities of Balanophora fungosa varietas globosa

growing in Vietnam, as well as comparative chromatography with some species

of the genus Balanophora J.R. & G. Forst, Proceedings of the Estonian Academy

of Sciences, 70(1):40–50.

8. Nguyen Thanh Tung, Nguyen Viet Than, Nguyen Quang Hung, Ain Raal

(2021), The Chemical Investigation of Four Balanophora Species and

Cytotoxicity with Inhibition of NO Production, International Journal of

Pharmaceutical Research & Allied Sciences, 10(2):1-9

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1. MỘT SỐ KHÓA PHÂN LOẠI CHI Balanophora

Phụ lục 1.1. Khóa phân loại chi Balanophora trong Thực vật chí đại cương Đông

Dương

Phụ lục 1.2 Khóa phân loại tới các loài thuộc chi Balanophora theo Thực vật chí

Thái Lan

Phụ lục 1.3. Khóa phân loại tới các loài thuộc chi Balanophora theo Thực vật chí

Campuchia, Lào, Việt Nam

Phụ lục 1.4. Khóa phân loại tới các loài thuộc chi Balanophora theo Thực vật chí

Malesiana

Phụ lục 1.5. Khóa phân loại tới các loài thuộc chi Balanophora theo thực vật chí

Trung Quốc

PHỤ LỤC 2. TIÊU BẢN MẪU NGHIÊN CỨU

Tiêu bản mẫu nghiên cứu lưu tại Bảo tàng Sinh học – Trường Đại học Khoa học

tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

PHỤ LỤC 3.

BIÊN BẢN GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC & XÁC NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN

MẪU LƯU TRỮ

3.1. Báo cáo kết quả giám định các mẫu nghiên cứu tại Bảo tàng thiên nhiên Việt

Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.2. Phiếu kết quả giám định mẫu tại Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.3. Giấy xác nhận mã số tiêu bản lưu trữ tại Bảo tàng thực vật (HNU), Khoa Sinh

học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên

3.4. Giấy chứng nhận mã số tiêu bản tại Phòng tiêu bản cây thuốc (HNIP), Bộ

môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội

PHỤ LỤC 4. DỮ LIỆU PHỔ CÁC HỢP CHẤT

Phụ lục 4.1. Phổ hợp chất BdD2.7

Phụ lục 4.2. Phổ hợp chất BdD5.6

Phụ lục 4.3. Phổ hợp chất BdD5.9

Phụ lục 4.4. Phổ hợp chất BIL3.6

Phụ lục 4.5. Phổ hợp chất BIL4.5

Phụ lục 4.6. Phổ hợp chất BIL6.2

Phụ lục 4.7. Phổ hợp chất BIL7.3.2

Phụ lục 4.8. Phổ hợp chất BIL18.1

Phụ lục 4.9. Phổ hợp chất BT3.1

Phụ lục 4.10. Phổ hợp chất BT6.1

Phụ lục 4.11. Phổ hợp chất S1

Phụ lục 4.12. Phổ hợp chất S2

Phụ lục 5. Dữ liệu liên quan đến kết quả phân tích GC/MS phân đoạn n-hexan

của các mẫu nghiên cứu

Phụ lục 5.1. Một số phân mảnh đặc trưng của các triterpenoid

Phụ lục 5.2. Dữ liệu phổ khối của các hợp chất được xác định trong phân đoạn n-

hexan của các mẫu nghiên cứu

PHỤ LỤC 1

MỘT SỐ KHÓA PHÂN LOẠI CHI Balanophora

Phụ lục 1.1

Khóa phân loại chi Balanophora trong Thực vật chí đại cương Đông Dương

A. Hoa đực có 4-7 thùy, bằng nhau, hẹp, phản xạ; nhị hoa của cùng một số như

thùy, nhóm lại thành bộ nhị; bao phấn hình móng ngựa (nhóm Eubalanophora)

a. Hoa đực và hoa cái trên cùng một cụm hoa ..............................1. B. laoensis

b. Hoa đực và hoa cái nằm trên các cây khác nhau.

α. Củ chia nhiều thùy, thường không có vảy, có các mụn cóc rõ; trục hoa

dày; cuống hoa dài 8-12 mm ............................................................2. B. pierrei

β. Củ nhỏ, hơi chia thùy, bề mặt có mụn cóc; trục hoa lá bị đóng băng; hoa

đực màu đỏ .................................................................................... 3. B. gracilis

B. Hoa đực 4 thùy, dị hình, 2 thùy giữa tù và rộng, 2 thùy bên cấp tính và hẹp;

bộ nhị phẳng, ngang, được bao phủ bởi nhiều bao phấn song song, kéo dài từ

mặt này sang mặt khác, trong mọi trường hợp không có hình móng ngựa ở đỉnh

của bộ nhị (Nhóm Balaniella)

a. Hoa đực, không cuống hoặc cuống ngắn; trục hoa kéo dài ....... 4. B. thorelii

b. Hoa đực rõ rệt.

α. Thùy của hoa đực được cung cấp với đường kẻ ngang; sinh sản ngầm dưới

đất ................................................................................................5. B. sphaerica

β. Thùy hoa không kẻ ngang

* Củ đầy mụn hình sao, mụn cóc; cuống 5-6 mm .............6. B. latisepala

** Củ nhiều thùy, không có mụn hình sao, nhiều mụn cóc; cuống hoa dài

1,5-2 mm ................................................................................... 7. B. fasciculata

Phụ lục 1.2

Khóa phân loại tới các loài thuộc chi Balanophora theo Thực vật chí Thái Lan

1. Hoa đực và hoa cái ở cùng một cụm hoa, hoa đực không cuống

................................................................................................... 1. B. abbreviata

1. Hoa đực và hoa cái khác cụm hoa

2. Hoa đực mẫu 3, bao phấn mở ngang, hoa cái chỉ mọc ở trục chính của

cụm hoa, không bao giờ mọc ở phần dưới của bông mo (dễ quan sát bằng kính

lúp cầm tay khi cắt ngang trục cụm hoa)...................................... 2. B. harlandii

2. Hoa đực mẫu 4 - 5 - 6, bao phấn mở dọc, hoa cái mọc ở trục chính của

cụm hoa cũng như mọc ở phần dưới của bông mo

3. Lá mọc xoắn ốc, hoa đực đối xứng tỏa tia, thường mẫu 4 - 5, thùy

bao hoa hình giáo………………………………….3. B. fungosa subsp. indica

a. Củ là một khối phân nhánh từ một điểm, củ đơn gần hình

cầu......................................................................................var. indica

b. Củ gồm nhiều hoặc ít phần hình trụ, hoặc kéo dài tạo thành một

khối....................................................................................var. minor

3. Lá mọc đối hoặc xếp thành hai dãy, hoa đực đối xứng qua trục,

thường mẫu 4 - 6, thùy bao hoa hình trứng, nhọn hoặc cụt

4. Lá xếp thành hai dãy........................................4. B. latisepala

4. Lá mọc đối, chéo chữ thập

5. Lá ôm sát bề mặt trục, hoa đực mẫu 6, cuống hoa không

có hoặc ngắn hơn 1 mm.............................. 5. B. laxiflora

5. Lá choãi ra, hoa đực mẫu 4, cuống hoa dài hơn 2 mm.

Malaya, Sumatra, Borneo, Celebes, Philippines, New

Guinea (type)................................……….. 6. B. papuana

Phụ lục 1.3

Khóa phân loại tới các loài thuộc chi Balanophora theo Thực vật chí

Campuchia, Lào, Việt Nam

1. Hoa đực và hoa cái cùng cụm hoa; hoa đực không cuống….....B. abbreviata

1’. Hoa đực và hoa cái khác cụm hoa

2. Hoa đực 3 thùy; bao phấn mở ngang; hoa cái chỉ nằm trên trục chính

của cụm hoa, không bao giờ nằm trên gốc của vảy bảo vệ.....B. harlandii

2’. Hoa đực có 4-5-6 thùy (hiếm khi 7-14); hoa phấn mở dọc; hoa cái cả

trên trục chính cụm hoa và gốc của vảy bảo vệ

3. Chỉ có hoa đực

4. Hoa đực dị hình, 4 hoặc 6 thùy, hiếm khi 5 hoặc 7-14;

thùy bên hẹp, nhọn; thùy ở giữa rộng, cụt

5. Hoa đực thường có 6 thùy, 2 thùy giữa rộng, cụt, 4

thùy bên hẹp, nhọn; đôi khi 5 hoặc 7-8

thùy…………………………………...…B. laxiflora

5’. Hoa đực thường 4 thùy bao gồm 2 thùy giữa rộng,

cắt ngắn và 2 thùy bên hẹp, nhọn….……B. latisepala

4’. Hoa đực đối xứng tỏa tia với 4 hoặc 5 thùy, hiếm khi 3

hoặc 6, thùy bao hoa hẹp, nhọn....B. fungosa subsp. indica

3’. Chỉ có hoa cái (trong một số trường hợp, khó có thể thiết lập

được khóa phù hợp)

6. Lá đối diện…………………………………B. laxiflora

6’. Lá so le, xếp thành hai dãy hoặc xoắn ốc

7. Lá xếp thành hai dãy; cụm hoa hình elip đến hình

trụ

8. Cụm hoa cái nhọn ở đỉnh; các đường gờ trên

các tế bào đỉnh của vảy bảo vệ cao 0,5-1,5µm;

đầu của các vảy bảo vệ phẳng......... B. laxiflora

8'. Cụm hoa cái tròn ở đỉnh; đường gờ trên các

tế bào đỉnh vảy bảo vệ cao1,5-5µm; đầu của

các vảy bảo vệ tròn........................B. latisepala

7’. Lá xếp xoắn ốc; cụm hoa cái hình cầu hay

elip……………………...……...B. fungosa subsp. indica

Phụ lục 1.4

Khóa phân loại tới các loài thuộc chi Balanophora theo Thực vật chí Malesiana

1. Hoa đực và hoa cái trên cùng một cụm hoa

2. Lá xếp hai dãy. Hoa đực không cuống, song đối xứng hoặc đối xứng hai

bên..............................................................................................6. B. abbreviata

2. Lá xếp xoắn ốc, hiếm khi gần đối. Hoa đực có cuống, đối xứng tỏa

tia....................................................................................................1. B. fungosa

1. Hoa đực và hoa cái khác cụm hoa

3. Khi chỉ có hoa đực (Chú ý: hoa mọc ở đầu hoặc gốc cụm hoa thường

không điển hình, vì không phát triển đầy đủ)

4. Hoa đực đối xứng tỏa tia, mẫu 4 hoặc 5, hiếm khi 3 hoặc 6. Tất

cả các thùy bao hoa hình giáo, nhọn.....1. B. fungosa subsp. indica

4. Hoa đực song đối xứng hoặc đối xứng hai bên, mẫu 4, hiếm khi

mẫu 5 hoặc 7 - 14. Thùy bên bao hoa hẹp, nhọn, thùy giữa bao hoa

rộng, cụt.

5. Cuống hoa 14 - 18 mm, khi hoa nở bị gập/cong xuống.

Thùy bên bao hoa rất hẹp và nhọn, thùy giữa bao hoa rất

rộng, vuông, cụt. Khối nhị (synandricum - bộ nhị với bao

phấn hợp nhất) được nén hoàn toàn theo hướng trước - sau

(Borneo, Malaya)...............................................5. B. reflexa

5. Cuống hoa không có hoặc dài nhất tới 6 mm

6. Lá luôn luôn xếp hai dãy.................7. B. latisepala

6. Lá xếp xoắn ốc, hoặc mọc đối, xếp chéo chữ thập.

7. Lá mọc xoắn ốc, kích thước lá tăng dần từ

gốc lên ngọn thân, những lá trên hình elip, bao

lấy cụm hoa lúc hoa nở. Củ dài và thường phân

nhánh..........................................2. B. elongata

7. Lá mọc đối, xép chéo chữ thập

8. Lá 6 - 8 cặp, kích thước tăng dần từ

gốc lên ngọn thân, lá ở trên cùng hầu hết

hình tròn, dạng mũ, bao bọc hoàn toàn

cụm hoa khi hoa nở. Củ hình cầu, không

phân nhánh (Borneo)..............4. B. lowii

8. Lá 2 - 4 (-5) cặp, tất cả có kích thước

gần bằng nhau; trong trường hợp có 4 lá,

hai đôi thường rất gần nhau, trông như

mọc vòng, choãi ra khi hoa nở. Củ phân

nhánh (3 - 12 nhánh), với các nhánh hơi

kéo dài..............................3. B. papuana

3. Khi chỉ có hoa cái

9. Lá mọc vòng hoặc đối và chéo chữ thập

10. Lá 4, rời nhau, trông như mọc vòng ở phần trên của

thân................................................................3. B. papuana

10. Lá mọc đối và chéo chữ thập

11. Kích thước lá tăng dần từ gốc lên ngọn thân, lá ở

trên cùng hầu hết hình tròn, dạng mũ, bao bọc hoàn

toàn cụm hoa...............................................4. B. lowii

11. Hều hết các lá có kích thước bằng nhau ngoại trừ

cặp lá dưới cùng, 1 - 3 cặp.................... 3. B. papuana

9. Lá xếp hai dãy hoặc mọc xoắn ốc

12. Lá xếp hai dãy..........................................7. B. latisepala

12. Lá mọc xoắn ốc

13. Bông mo không có hoa ở phần dưới (Chú ý: dễ

nhận thấy bắng kính lúp cầm tay khi cắt ngang cụm

hoa) (chỉ có ở Borneo và Malaya)..…….5. B. reflexa

13. Bông mo có hoa ở phần dưới

14. Lá ở trên không bao phủ cụm hoa….1. B.

fungosa. subsp. indica var. indica

14. Lá ở trên bao phủ toàn bộ hoặc một phần

cụm hoa

15. Thân kéo dài, mảnh. Cụm hoa cái

hình elip. Củ phân nhánh liên tục...2. B.

elongata var. elongata

15. Thân ngắn và mập. Củ không kéo dài

16. Cụm hoa cái hình gần cầu -

elip. Lá có sọc thô theo chiều dọc

(chỉ ở Java)............................2. B.

elongata var. ungeriana

16. Cụm hoa cái hình gần cầu, dẹp

rõ ràng. Lá nhẵn (chỉ ở

Java)........................1. B. fungosa

subsp. indica var. globosa

Phụ lục 1.5

Khóa phân loại tới các loài thuộc chi Balanophora theo thực vật chí Trung Quốc

Khóa phân loại với cụm hoa đực:

1a. Lá bắc đối diện hoa hàn liền cạnh nhau vào một phiến/khối lục giác

2a. Lá mọc vòng hoặc hàn liền vào thành một ống...... 9. B. involucarata

2b. Lá gần mọc đối hoặc mọc vòng................................... 11. B. harlandii

1b. Lá bắc đối diện hoa rời hoặc không phát triển

3a. Lá bắc thô sơ hoặc không phát triển

4a. Cụm hoa hình trứng tới elip; hoa đối xứng tỏa tia với thùy bao

hoa đồng hình…………………………………….....1. B. fungosa

4b. Cụm hoa hình trụ tới nón hẹp; hoa đối xứng hai bên với thùy

bao hoa dị hình.......................................................... 8. B. laxiflora

3b. Lá bắc phát triển và mập

5a. Hoa có cuống; bao phấn nứt ngang chia thành ô

nhỏ.....................………………………...………..7. B. polyandra

5b. Hoa có cuống dài; bao phấn thường dạng chữ U

6a. Thùy bao hoa hình trứng, ngắn hơn 2 mm; khối nhị

(synandria) hình bán cầu (loài nghi ngờ ở Trung

Quốc).................................................................. 3. B. dioica

6b. Thùy bao hoa hình giáo, dài hơn 3 mm; khối nhị kéo dài

7a. Hoa đối xứng tỏa tia với thùy bao hoa đồng hình;

bao phấn hình chữ U, thường bằng với số thùy bao

hoa............................................................4. B. indica

7b. Hoa đối xứng hai bên với thùy bao hoa dị hình;

bao phấn thẳng, nhiều hơn nhiều so với số thùy bao

hoa (thường 20 - 30) (loài nghi ngờ ở Trung

Quốc)........................................................5. elongata

Khóa phân loại với cụm hoa lưỡng tính

1a. Hoa đực mọc rải rác giữa hoa cái trên bông mo..................12. B. tobiracola

1b. Hoa đực mọc dưới hoa cái

2a. Cụm hoa màu trắng kem tới xám; hoa đực đối xứng 2 bên...................

…......................................................................................6. B. abbreviata

2b. Cụm hoa màu vàng tới đỏ; hoa đực đối xứng tỏa tia hoặc gần như thế

3a. Lá mọc vòng và hàn liền thành một ống; bông mo hình trứng

ngược tới gần cầu, cuống ngắn..................................10. B. fargesii

3b. Lá mọc so le; bông mo kéo dài, hình đầu

4a. Hoa đực to; thùy bao hoa lớn hơn 3 mm....1. B. fungosa

4b. Hoa đực nhỏ; thùy bao hoa nhỏ hơn 3

mm……………………………………..2. B. subcupularis

Khóa phân loại với cụm hoa cái

1a. Bông mo hình trứng ngược hoặc gần cầu, cuống ngắn; hoa cái chỉ có trên

trục chính của cụm hoa

2a. Lá mọc vòng và hàn liền thành một ống; đỉnh của bông mo có lằn

gợn..................................................................................9. B. involucrata

2b. Lá mọc so le; đỉnh của bông mo nhẵn........................11. B. harlandii

1b. Bông mo kéo dài, hình đầu tới gần đầu; hoa cái ở mọc ở gốc của cuống bông

mo và mọc trên trục chính của cụm hoa

3a. Đỉnh bông mo có nhú (nghi ngờ ở Trung Quốc)...............3. B. dioica

3b. Đỉnh bông mo không có nhú

4a. Lá ở trên to hơn lá ở dưới; cụm hoa cái hình elip rộng, trứng

ngược, hoặc gần cầu

5a. Thân rễ thường dạng chùm tụ thành một khối; cụm hoa

không bị bao bọc bởi lá; đỉnh của bông mo có lằn gợn ngắn,

không dạng lưới..................................................4. B. indica

5b. Thân rễ với các nhánh hình trụ dài; cụm hoa bị bao học

một phần bởi các lá ở phía trên; đỉnh của các bông mo có

lằn gợn dạng mê cung…………………………....5. B.

elongata

4b. Tất cả các lá thường có cùng kích thước; cụm hoa cái hình elip,

thuôn - elip, hoặc thuôn - trứng

6a. Bông mo (Spadicles) tới 2.3 mm............7. B. polyandra

6b. Bông mo (Spadicles) tới 1.5 mm..............8. B. laxiflora

PHỤ LỤC 2.

TIÊU BẢN MẪU NGHIÊN CỨU

Tiêu bản mẫu nghiên cứu lưu tại Bảo tàng Sinh học – Trường Đại học

Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

Mẫu BFI – Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B.Hansen (thu tại Sapa, Lào Cai, tháng 1 năm 2017)

Mẫu BFG – Balanophora fungosa var. globosa (Jungh.) B.Hansen (thu tại VQG Bi-doup Núi Bà, Lạc Dương, Lâm Đồng)

Mẫu BS – Balanophora subcupularis P.C.Tam (thu tại Mường Lay, Điện Biên, tháng 11 năm 2017)

Mẫu BT – Balanophora tobiracola Makino (thu tại Bắc Sơn, Lạng Sơn, tháng 1 năm 2018)

PHỤ LỤC 3.

BIÊN BẢN GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC

& XÁC NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN MẪU LƯU TRỮ

3.1. Báo cáo kết quả giám định các mẫu nghiên cứu tại Bảo tàng thiên

nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.2. Phiếu kết quả giám định mẫu tại Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.3. Giấy xác nhận mã số tiêu bản lưu trữ tại Bảo tàng thực vật (HNU),

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên

3.4. Giấy chứng nhận mã số tiêu bản tại Phòng tiêu bản cây thuốc (HNIP),

Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội

PHỤ LỤC 4.

DỮ LIỆU PHỔ CÁC HỢP CHẤT

Phụ lục 4.1. Phổ hợp chất BdD2.7

Phổ 1H NMR Phổ 13C NMR Phổ DEPT Phổ MS

Phụ lục 4.2. Phổ hợp chất BdD5.6

Phổ 1H NMR Phổ 13C NMR Phổ DEPT Phổ MS

Phụ lục 4.3. Phổ hợp chất BdD5.9

Phổ 1H NMR Phổ 13C NMR Phổ HMBC Phổ HSQC Phổ MS

Phụ lục 4.4. Phổ hợp chất BIL3.6

Phổ 1H NMR Phổ 13C NMR

Phụ lục 4.5. Phổ hợp chất BIL4.5

Phổ 1H NMR Phổ 13C NMR

Phụ lục 4.6. Phổ hợp chất BIL6.2

Phổ 1H NMR Phổ 13C NMR

Phụ lục 4.7. Phổ hợp chất BIL7.3.2

Phổ 1H NMR Phổ 13C NMR

Phụ lục 4.8. Phổ hợp chất BIL18.1

Phổ 1H NMR Phổ 13C NMR Phổ DEPT Phổ MS

Phụ lục 4.9. Phổ hợp chất BT3.1

Phổ 1H NMR Phổ MS

Phụ lục 4.10. Phổ hợp chất BT6.1

Phổ 1H NMR Phổ MS

Phụ lục 4.11. Phổ hợp chất S1

Phổ 1H NMR Phổ MS

Phụ lục 4.12. Phổ hợp chất S2

Phổ 1H NMR Phổ MS

Phụ lục 5. Dữ liệu liên quan đến kết quả phân tích GC/MS

phân đoạn n-hexan của các mẫu nghiên cứu

Phụ lục 5.1. Một số phân mảnh đặc trưng của các triterpenoid

Ghi chú Loại triterpenoid Cấu trúc và khối lượng ion phân mảnh

Khối lượng của mảnh không phụ thuộc vào nhóm thế

và

Lupan Oleanan

Khối lượng của mảnh phụ thuộc vào nhóm thế ở C-3

Lupan

Khối lượng của mảnh không phụ thuộc vào nhóm thế

Olean

Phụ lục 5.2. Dữ liệu phổ khối của các hợp chất được xác định trong phân

đoạn n-hexan của các mẫu nghiên cứu

Phổ GC/MS của β-amyrin

Phổ GC/MS của β-amyron

Phổ GC/MS của β-amyrin acetat

Phổ GC/MS của lupeol

Phổ GC/MS của lupenon

Phổ GC/MS của lupeol acetat