Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của cây nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.), họ nho (Vitaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN DƯỢC LIỆU

PHÙNG THANH LONG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,

THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA

CÂY NHO RỪNG (Vitis heyneana Roem. & Schult.),

HỌ NHO (VITACEAE)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN DƯỢC LIỆU

PHÙNG THANH LONG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,

THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA

CÂY NHO RỪNG (Vitis heyneana Roem. & Schult.),

HỌ NHO (VITACEAE)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 9720206

Người hướng dẫn khoa học :

1. PGS.TS. Đỗ Thị Hà

2. TS. Hà Vân Oanh

HÀ NỘI, 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình khoa học của riêng tôi dưới sự hướng

dẫn của PGS.TS. Đỗ Thị Hà và TS. Hà Vân Oanh. Kết quả được trình bày trong luận

án là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

khác.

Tác giả luận án

NCS. Phùng Thanh Long

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được rất nhiều sự

giúp đỡ quý báu từ các Thầy Cô giáo, các Nhà khoa học từ nhiều đơn vị, cùng đồng

nghiệp, gia đình và bạn bè.

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đỗ Thị Hà

và TS. Hà Vân Oanh, hai người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình

và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thế Cường, TS. Đỗ Thị

Nguyệt Quế, TS. Trần Thị Hiền cùng các thầy cô giáo, các nhà khoa học công tác tại

Viện Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

nghiên cứu.

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc, Phòng Khoa

học và Đào tạo, thư viện Viện Dược liệu đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành

luận án này.

Luận án được hỗ trợ một phần kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu cơ chế tác dụng

chống viêm của một số hợp chất oligostilbenoid phân lập từ các loài Nho dại (Vitis

sp.) thu hái ở miền bắc Việt Nam, mã số 106.YS.05-2014.26”, do đó, tôi cũng xin gửi

lời cảm ơn tới Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đã tạo

điều kiện để tôi thực hiện luận án này.

Lời sau cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình và bạn bè đã

luôn động viên và chia sẻ giúp tôi đạt được kết quả ngày hôm nay.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

NCS. Phùng Thanh Long

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3

1.1. Tổng quan về chi Nho Vitis L. ................................................................................. 3

1.1.1. Thực vật ................................................................................................................. 3

1.1.2. Thành phần hóa học ............................................................................................... 5

1.1.3. Tác dụng sinh học ................................................................................................ 27

1.2. Tổng quan về loài Nho rừng ................................................................................... 36

1.2.1. Đặc điểm thực vật của Nho rừng ......................................................................... 36

1.2.2. Thành phần hóa học của Nho rừng ...................................................................... 37

1.2.3. Tác dụng và công dụng của Nho rừng ................................................................. 39

1.3. Tổng quan về viêm ................................................................................................ 40

1.3.1. Khái niệm viêm .................................................................................................... 40

1.3.2. Các chất trung gian trong phản ứng viêm ............................................................ 40

1.3.3. Một số mô hình đánh giá tác dụng chống viêm ................................................... 45

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 49

2.1. Đối tượng nghiên cứu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ ................................................. 49

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 49

2.1.2. Nguyên liệu.......................................................................................................... 49

2.1.3. Động vật thực nghiệm ......................................................................................... 49

2.1.4. Thuốc thử, hóa chất, dung môi ............................................................................ 49

2.1.5. Máy móc, thiết bị ................................................................................................. 50

2.2. Địa điểm nghiên cứu............................................................................................... 51

2.2.1. Địa điểm nghiên cứu thực vật.............................................................................. 51

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu hóa học .............................................................................. 51

2.2.3. Địa điểm nghiên cứu tác dụng sinh học .............................................................. 51

2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 52

2.3.1. Thu thập, xử lý mẫu nghiên cứu ...................................................................... 52

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thực vật học ................................................................ 52

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học ..................................................... 52

2.3.4. Phương pháp nghiên cứu một số tác dụng sinh học ............................................ 52

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 59

3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật ................................................................... 59

3.1.1. Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học ................................................... 59

3.1.2. Đặc điểm vi phẫu ................................................................................................. 61

3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu........................................................................................ 63

3.2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học ................................................................ 65

3.2.1. Kết quả định tính ................................................................................................. 65

3.2.2. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất ................... 66

3.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học .................................................................. 100

3.3.1. Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm ......................................................... 100

3.3.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau ............................................................. 106

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................... 108

4.1. Về thực vật ............................................................................................................ 108

4.2. Về hóa học ............................................................................................................ 109

4.2.1. Về định tính ....................................................................................................... 110

4.2.2. Về chiết xuất và phân lập .................................................................................. 110

4.3. Về tác dụng chống viêm và giảm đau .................................................................. 118

4.3.1. Tác dụng chống viêm in vitro ............................................................................ 118

4.3.2. Tác dụng chống viêm và giảm đau in vivo ....................................................... 122

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 126

KẾT LUẬN ................................................................................................................ 126

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................... 127

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .....................................................

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Giải thích Kí hiệu

Acid arachidonic AA

Proteinkinase B Akt

AMPK Adenosin monophosphat-activated protein kinase

Activator protein -1 AP-1

Activating transcription factor (yếu tố hoạt hóa phiên mã) ATF

Chuột SHR Spontaneously hypertensive rat (một dòng chuột được phát triển để

nghiên cứu về bệnh cao huyết áp)

Cyclooxygenase COX

Correlated Spectroscopy (Phổ tương quan) COSY

Dichloromethan DCM

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DEPT

ElectroSpray Ionisation (kỹ thuật ion hóa phun mù điện) ESI

β-ᴅ-glucopyranosyl Glc

GLUT 4 Glucose transporter type 4

HDL High density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng cao)

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương quan dị nhân đa liên

1H-NMR

kết)

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ

hạt nhân proton)

Heme oxygenase - 1 HO-1

Heteronuclear Single Quantum Coherence (Phổ tương tác dị nhân lượng HSQC

tử đơn)

IκB kinase IKK

Interleukin IL

Inducible nitric oxide synthetase iNOS

Low density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng thấp) LDL

Lipopolysaccharid LPS

MAPK Mitogen-activated protein kinase (Protein kinase hoạt hóa phân bào)

Malondialdehyd MDA

Matrix metallopetidase MMP

Mass spectrometry (Phổ khối lượng) MS

[3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl) 2,5- diphenyl-tetrazolium bromid] MTT

Nuclear factor kappa B (yếu tố nhân kappa B) NF-κB

Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 NrF2

Nitric oxid NO

Nitric oxid synthase NOS

Prostaglandin E2 PGE2

PGHS Prostaglandin endoperoxid H synthase

Phosphatidylinositide-3-kinase PI3K

Acid ribonucleic RNA

Reactive nitrogen species (Các chất hoạt động chứa nitơ) RNS

Reactive oxygen species (Các chất hoạt động chứa oxy) ROS

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

Sirtuin SIRT

Superoxide dismutase SOD

Số thứ tự STT

Tumor growth factor (yếu tố tăng trưởng khối u) TGF

Toll-like receptor 4 TLR-4

Tài liệu tham khảo TLTK

Tumor necrosis factor (yếu tố hoại tử khối u) TNF

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh thái và vùng phân bố của các loài Nho ở Việt Nam ............... 4

Bảng 1.2. Các monomer stilbenoid (1-13) phân lập từ các loài thuộc chi Nho .............. 7

Bảng 1.3. Các dimer stilbenoid (14-52) đã phân lập từ các loài thuộc chi Nho ............. 8

Bảng 1.4. Các trimer stilbenoid (53-71) phân lập từ các loài thuộc chi Nho ................ 13

Bảng 1.5. Các tetramer stilbenoid (72-96) phân lập từ các loài thuộc chi Nho ............ 15

Bảng 1.6. Các pentamer, hexamer stilbenoid (97-100) phân lập từ các loài thuộc chi Nho

....................................................................................................................................... 18

Bảng 1.7. Một số hợp chất flavonoid (101-134) được tìm thấy trong chi Nho ............. 20

Bảng 1. 8. Một số hợp chất phenol (135-146) khác thuộc chi Nho .............................. 24

Bảng 1.9. Một số hợp chất không phenol khác (164-175) phân lập từ chi Nho ........... 26

Bảng 1.10. Các hợp chất đã được phân lập từ loài Nho rừng V. heyneana................... 37

Bảng 3.1. Kết quả định tính phần trên mặt đất của loài Nho rừng ................................ 65

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH1 ........................................................... 70

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH2 ........................................................... 71

Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH3 ........................................................... 72

Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH4 ........................................................... 74

Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH5 ........................................................... 76

Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH6 ........................................................... 78

Bảng 3.8. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH7 ........................................................... 79

Bảng 3.9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH8 ........................................................... 83

Bảng 3.10. Dữ liệu phổ của hợp chất VH9 ................................................................... 88

Bảng 3.11. Dữ liệu phổ của hợp chất VH10 ................................................................. 90

Bảng 3.12. Dữ liệu phổ của hợp chất VH11 ................................................................. 92

Bảng 3.13. Dữ liệu phổ của hợp chất VH12 ................................................................. 94

Bảng 3.14. Dữ liệu phổ của hợp chất VH13 ................................................................. 95

Bảng 3.15. Dữ liệu phổ của hợp chất VH15 ................................................................. 97

Bảng 3.16. Dữ liệu phổ của hợp chất VH16 ................................................................. 98

Bảng 3.17. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế COX-2 của cao ethanol 96% và 3 cao phân

đoạn phần trên mặt đất Nho rừng ................................................................................ 100

Bảng 3.18. Tác dụng chống viêm cấp của cao VHE trên mô hình gây phù bàn chân chuột

bằng carrageenan ......................................................................................................... 105

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của VHE lên khối lượng u hạt ............................................... 106

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của cao VHE lên số cơn đau quặn ......................................... 106

Bảng 4.1. Các tác dụng sinh học của E-resveratrol ..................................................... 113

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc chung của các monomer stilbenoid phân lập từ chi Nho .................. 6

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các monomer stilbenoid 1-13 phân lập từ chi Nho ....... 6

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các dimer stilbenoid 14-52 phân lập từ chi Nho ......... 12

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của các trimer stilbenoid 53-71 phân lập từ chi Nho ........ 14

Hình 1.5. Cấu trúc khung của một số tetramer stilbenoid phân lập từ chi Nho ............ 15

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của một số tetramer stilbenoid 72-96 phân lập từ chi Nho

....................................................................................................................................... 18

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của các pentamer, hexamer stilbenoid 97-100 từ chi Nho 19

Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất phenol 135-146 khác ........................ 24

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của một số sterol 147-163 thuộc chi Nho ....................... 26

Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất không phenol khác 164-175 thuộc chi

Nho ................................................................................................................................ 27

Hình 1.12. Sơ đồ cơ chế viêm theo con đường NF-κB [201], [202], [203] ................. 44

Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của loài Nho rừng ........................................................... 60

Hình 3.2. Đặc điểm hoa của loài Nho rừng ................................................................... 60

Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân loài Nho rừng ............................................................ 62

Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu lá loài Nho rừng ................................................................ 63

Hình 3.5. Đặc điểm bột thân loài Nho rừng .................................................................. 64

Hình 3.6. Đặc điểm bột lá loài Nho rừng ...................................................................... 65

Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH1 ............................................................. 70

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH2 ............................................................. 71

Hình 3.9. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH3 .... 72

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH4 .. 74

Hình 3.11. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH5 .. 76

Hình 3.12. Cấu trúc hóa học và các tương tác COSY (─), HMBC chính (→) của hợp

chất VH6 ........................................................................................................................ 78

Hình 3.13. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH7 .. 79

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học và các tương tác COSY, HMBC chính của hợp chất VH8

....................................................................................................................................... 82

Hình 3.15. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH9 .. 88

Hình 3.16. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH10 90

Hình 3.17. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH11 92

Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH12 ......................................................... 94

Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH13 ......................................................... 95

Hình 3.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH14 và VH15 .......................................... 96

Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH16 ......................................................... 98

Hình 3.22. Ảnh hưởng của cao chiết ethanol 96% và 3 phân đoạn từ phần trên mặt đất

Nho rừng lên mức độ biểu hiện COX-2 mRNA. ......................................................... 100

Hình 3.23. Ảnh hưởng của các hợp chất tinh khiết phân lập từ Nho rừng lên mức độ biểu

hiện COX-2 và sự sản sinh PGE2 trên đại thực bào RAW264.7 ................................ 102

Hình 3.24. Ảnh hưởng của VH6 lên mức độ biểu hiện COX-2, iNOS ....................... 104

Hình 4.1. Giả thuyết cơ chế chống viêm của hợp chất VH6 ....................................... 121

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3. 1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ phần trên mặt đất loài Nho rừng .......... 66

Sơ đồ 3. 2. Sơ đồ phân lập các chất tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat của loài Nho

rừng (V. heyneana) ........................................................................................................ 68

Sơ đồ 3. 3. Sơ đồ phân lập các chất tinh khiết từ phân đoạn n-hexan của loài Nho rừng

(V. heyneana) ................................................................................................................. 69

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đất nước Việt Nam với 54 dân tộc cùng hàng ngàn năm lịch sử đã tích lũy được

một kho tàng tri thức y học dân gian vô cùng phong phú. Nhiều cây thuốc đã được người

dân địa phương sử dụng hiệu quả trong một thời gian dài nhưng lại rất ít phổ biến do

chủ yếu được lưu truyền trong cộng đồng bằng hình thức truyền miệng. Ở các tỉnh phía

Bắc Việt Nam, loài Nho rừng hay còn gọi Nho lông hay Nho năm góc, có tên khoa học

là Vitis heyneana Roem. & Schult. từ lâu đã được người dân sử dụng như một vị thuốc

[1], [2]. Cây phân bố ở một số quốc gia Châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Campuchia

[1], [2], [3]. Ở nước ta, Nho rừng chủ yếu được tìm thấy ở các tỉnh miền núi phía Bắc

như Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai [1], [2]. Trong y học dân gian, toàn cây Nho rừng

được sử dụng để chữa phong thấp, an thai, giải nhiệt. Ở Trung Quốc và Campuchia,

người dân tại đây dùng rễ Nho rừng để trị sởi, đau nhức xương khớp, viêm phế quản,

bệnh lậu, chữa kinh nguyệt không đều, làm thuốc lợi tiểu [2].

Mặc dù đã được sử dụng từ lâu trong y học dân gian để điều trị các chứng bệnh

liên quan đến viêm (phong thấp, đau nhức xương khớp, viêm phế quản,…) tuy nhiên

cho đến nay ở nước ta chưa có nghiên cứu nào về loài này, bao gồm cả nghiên cứu về

thực vật, hóa học và tác dụng chống viêm. Trên thế giới, cũng có rất ít nghiên cứu về

loài Vitis heyneana. Từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần

hóa học và tác dụng chống viêm của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. &

Schult.), họ Nho (Vitaceae)” được thực hiện để tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng

cũng như góp phần phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ loài này.

Đề tài được thực hiện với 3 mục tiêu chính:

1. Mô tả đặc điểm thực vật của cây Nho rừng.

2. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Nho rừng.

3. Đánh giá được tác dụng chống viêm của cao chiết và các hợp chất stilbenoid

và oligostilbenoid phân lập từ cây Nho rừng.

Để thực hiện được 3 mục tiêu này, đề tài được tiến hành với những nội dung như sau:

1. Về thực vật:

- Mô tả đặc điểm hình thái và khẳng định tên khoa học của mẫu nghiên cứu.

- Xác định đặc điểm giải phẫu và đặc điểm vi học của thân và lá của cây Nho

rừng.

2. Về hóa học:

- Định tính một số nhóm chất chính trong cây Nho rừng.

- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân

lập từ cây Nho rừng.

3. Về tác dụng sinh học:

- Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của cao chiết cồn, cao phân đoạn và

một số hợp chất stilbenoid và oligostilbenoid được phân lập từ cây Nho rừng.

- Đánh giá tác dụng chống viêm và giảm đau in vivo của phân đoạn tiềm năng

sau khi sàng lọc.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về chi Nho Vitis L.

1.1.1. Thực vật

1.1.1.1. Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [4], chi Nho có vị trí phân loại như sau:

Giới Thực vật (Plantae)

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân Lớp Hoa hồng (Rosidae)

Bộ Nho (Vitales)

Họ Nho (Vitaceae)

Chi Nho (Vitis L.)

1.1.1.2. Đặc điểm hình thái

Chi Nho có những đặc điểm chung như sau: Dây leo, thân thường hóa gỗ ở phần

gốc; tua cuốn đối diện với lá, thường xẻ đôi ở đỉnh. Lá đơn, mọc cách, phiến lá nguyên

hoặc có thùy, lá kèm sớm rụng. Cụm hoa dạng chùy, đối diện với lá. Hoa tạp tính, mẫu

5: dài hình chén, mép nguyên hoặc lượn sóng; cánh hoa 5, dính nhau ở đỉnh thành mũ;

bầu 2 ô, mỗi ô 2 noãn, núm nhụy hơi phình to. Quả mọng hình cầu hoặc bầu dục. Hạt 2-

4, hình trứng ngược, gốc có mỏ ngắn, mặt lưng và bụng thường có gờ và hố nhỏ [1], [5],

[6].

1.1.1.3. Sinh thái và phân bố

Trên thế giới, chi Nho có khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới đến

cận nhiệt đới.

Ở Việt Nam, chi này có 6 loài, gồm 4 loài bản địa: V. balansana Planch., V.

flexuosa Thunb., V. heyneana Roem. & Schult., V. retordii Roman du Caill. ex Planch.

và 2 loài nhập trồng: V. larbusca L. và V. vinifera L. [1].

Đặc điểm sinh thái và vùng phân bố của các loài Nho ở Việt Nam được trình bày

tại bảng 1.1.

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh thái và vùng phân bố của các loài Nho ở Việt Nam [1]

STT Tên khoa học

Tên thường gọi

Sinh thái

Vùng phân bố

Ra hoa tháng 4-6, quả chín tháng 6-8. Thích

Nguồn gốc từ Trung Mỹ, được trồng khắp nơi trên đất

V. larbusca L.

Nho chồn

nghi ở vùng đất khô hạn, nắng nhiều.

nước ta.

Ra hoa từ tháng 2-4, quả chín tháng 6-8.

heyneana

Nho rừng, Nho ngũ

Cao Bằng (Ngân Sơn), Lạng Sơn, Quảng Ninh (Hạ Long),

Mọc rải rác ven rừng, trên các trảng cây bụi

Roem. & Schult.

giác, Nho do

Ninh Bình, Nghệ An (Pù Mát), Ninh Thuận (Cà Ròm).

và vách đá trên đảo.

retordii

Ra hoa tháng 4-6, quả chín tháng 6-8. Mọc

Cao Bằng (Nguyên Bình), Quảng Ninh (Hạ Long), Ninh

Roman du Caill.

Nho dại

rải rác ven rừng, trên các trảng cây bụi và

Bình, Đắk Lắk (Krong Pắc).

ex Planch.

vách đá trên đảo.

Nguồn gốc từ Tây Nam Á và Đông Nam Âu, được trồng ở

Thường ra hoa tháng 4-6, thu hoạch quả

V. vinifera L.

Nho

khắp nơi trên nước ta, nhưng chủ yếu ở các tỉnh duyên hải

tháng 8-10.

Nam Trung Bộ.

Phú Thọ (Thanh Sơn, Tx. Phú Thọ), Thái Nguyên, Vĩnh

Ra hoa tháng 5-7, quả chín tháng 7-9. Mọc

Nho rừng, Nho đất,

Phúc, Hà Nội (Ba Vì), Quảng Ninh (VQG. Bái Tử Long),

balansana

rải rác ven rừng, ven đường đi, sông suối,

Nho

tía,

Nho

Hải Phòng, Ninh Bình (Chợ Gềnh, Cúc Phương), Hà Tĩnh

Planch.

trên các trảng cây bụi, quanh làng bản và

balansa

(Kỳ Anh), Quảng Bình, Quảng Trị (Đông Hà), Thừa Thiên

trên các đảo đá.

Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa (Nha Trang).

flexuosa

Nho cong queo, Nho

Ra hoa tháng 4-6, quả chín tháng 6-8. Mọc

Sơn La (Mộc Châu), Thừa Thiên Huế (Bạch Mã), Tây

Thunb.

dịu, Nho dại

rải rác ven rừng.

Ninh (Cày Cổng).

1.1.1.4. Khóa phân loại các loài thuộc chi Nho ở Việt Nam

1A. Cành non, tua cuốn, cuống và mặt dưới lá, cụm hoa phủ lông tơ dày dạng tơ

nhện màu trắng, nâu hoặc vàng.

2A. Quả hình bầu dục. Cành non, tua cuốn, cuống và mặt dưới lá, cụm hoa phủ

lông tơ nhện màu trắng ........................................................ 1. V. labrusca.

2B. Quả hình cầu. Cành non, tua cuốn, cuống và mặt dưới lá, cụm hoa phủ lông

tơ nhện màu nâu hoặc vàng.

3A. Đường kính quả 1,3-1,5 cm. Vỏ hạt nhẵn, mặt bụng của hạt có 2 rãnh

dọc. Thân và nhánh non có lông cứng và lông cứng dạng tơ nhện. Mép

lá có 8-15 đôi răng cưa .............................................. 2. V. heyneana.

3B. Đường kính quả 0,8-1cm. Vỏ hạt có nhiều nếp nhăn, mặt bụng của hạt

gờ hình móng ngựa. Thân và nhánh non không có lông cứng. Mép lá

có 20-30 đôi răng cưa ................................................... 3. V. retordii.

1B. Cành non, tua cuốn, cuống và mặt dưới lá, cụm hoa nhẵn hoặc có rất ít lông.

4A. Đường kính quả 1,5-2cm. Phiến lá có 3-5 thùy, mép lá có răng cưa to, thô

và không đều nhau ................................................................ 4. V. vinifera.

4B. Đường kính quả nhỏ hơn 1cm. Phiến lá nguyên, mép có răng cưa nhỏ và

đều nhau.

5A. Bao phấn hình bầu dục. Hạt hình trứng ngược. Phiến lá dày, gốc lá hình

tim, mép lá có 15-20 đôi răng cưa ............................ 5. V. balansana.

5B. Bao phấn hình gần tròn. Hạt hình tim. Phiến lá mỏng, gốc lá cụt hoặc

lõm, mép lá có 5-10 đôi răng cưa ........................... 6. V. flexuosa [1].

1.1.2. Thành phần hóa học

1.1.2.1. Nhóm hợp chất phenol

a. Các hợp chất stilbenoid

Cho đến nay đã có gần 100 stilbenoid được phân lập và xác định cấu trúc từ các

loài thuộc chi Nho. Các stilbenoid bao gồm monomer stilbenoid, dimer stilbenoid và

oligomer stilbenoid.

❖ Các monomer stilbenoid

Trong số gần 100 stilbenoid đã phân lập từ chi Nho, có 13 hợp chất là monomer

stilbenoid 1-13. E-resveratrol (7) là chất phổ biến nhất được tìm thấy trong thành phần

của 12 loài Nho. Các hợp chất còn lại chủ yếu là các dẫn xuất methoxy, dẫn xuất glycosid

của resveratrol và piceatannol với 2 dạng đồng phân cis và trans. Các hợp chất 11 và 12

là các stilbenoid có sự xuất hiện của vòng γ-lactam trong cấu trúc. Trong 13 monomer

stilbenoid đã phân lập, có 12 monomer stilbenoid được tìm thấy trong thành phần hóa

học của loài V. vinifera. Tên và cấu trúc hóa học của các monomer stilbenoid đã phân

lập từ các loài thuộc chi Nho được trình bày trong bảng 1.2 và hình 1.2.

Hình 1.1. Cấu trúc chung của các monomer stilbenoid phân lập từ chi Nho

R1

R2

R3

R4

Glc

1

2

9

CH3

3

6 10 CH3 H

R Glc H

R1

R2

R3

R4

4

Glc

5

CH3

7

8

Glc

11

13

12

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các monomer stilbenoid 1-13 phân lập từ chi Nho

Bảng 1.2. Các monomer stilbenoid 1-13 phân lập từ các loài thuộc chi Nho

STT

Tên hợp chất

Loài

Bộ phận

TLTK

V. coignetiae

Quả

E-Astringin (1)

[7], [8]

V. vinifera

Quả

V. amurensis

Lá, thân

E-Piceatannol

[7], [9], [10], [11],

V. coignetiae

Quả

(Astringinin) (2)

[12]

V. vinifera

Thân, quả

V. heyneana

Rễ

V. labrusca

Quả

[3], [9], [12], [13],

Z-Piceid (3)

V. rotundifolia

Quả

[14]

V. vinifera

Quả, lá, quả

V. amurensis

Lá, thân

V. coignetiae

Quả

[7], [9], [10], [13],

E-Piceid (4)

V. labrusca

Quả

[15], [16]

V. rotundifolia

Quả

V. vinifera

Lá, quả, thân

V. coignetiae

Quả

E-Pterostilben (5)

[9], [17]

V. vinifera

Lá, quả

V. labrusca

Quả

Z-Resveratrol (6)

[9], [17], [18], [19]

V. rotundifolia

Quả

V. vinifera

Lá, thân, quả

V. amurensis

Lá, thân, rễ

V. betulifolia

Thân

V. chunganensis

Toàn cây

V. coignetiae

Quả và lá

[9], [10], [12], [13],

V. davidii

Thân

[15],

[16],

[20],

V. labrusca

Quả, lá, thân

E-Resveratrol (7)

V. heyneana

Thân

[21], [22]

V. riparia

Lá, rễ

V. berlandieri

Rễ

V. rotundifolia

Quả

V. thunbergii

Thân

V. vinifera

Quả, rễ, lá

E-Resveratrol 2-C-glucosid (8) V. vinifera

Rễ, quả

[13], [23]

E-Rhapontigenin (9)

V. coignetiae

Quả

[7]

Isorhapontigenin (10)

V. vinifera

Quả

[24]

11 E-Resveratrol 4-γ lactam (11)

V. vinifera

Chồi non

[25]

12 E-Resveratrol 2-γ lactam (12)

V. vinifera

Chồi non

[25]

2,4,6-Trihydroxyphenanthren-

V. vinifera

Quả

[13]

2-O-glucosid (13)

❖ Các dimer stilbenoid

Cho đến nay, đã có 39 hợp chất dimer stilbenoid 14-52 được phân lập từ chi Nho,

trong đó có 26 hợp chất được tìm thấy trong thành phần hóa học của loài V. vinifera.

Các hợp chất chủ yếu là các dimer của resveratrol, phổ biến nhất là các dẫn xuất của

viniferin, pallidol và ε-viniferin. Tên và cấu trúc hóa học của các dimer stilbenoid từ các

loài thuộc chi Nho được trình bày trong bảng 1.3 và hình 1.3.

STT

Bảng 1.3. Các dimer stilbenoid 14-52 đã phân lập từ các loài thuộc chi Nho

Tên hợp chất

Loài

Bộ phận

(+)-Ampelopsin A (14)

V. amurensis V. betulifolia V. coignetiae V. heyneana V. thunbergii V. vinifera

Lá, thân, rễ Thân Toàn cây Thân Rễ, thân Thân

TLTK [10], [11], [16], [22], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]

(+)-Balanocarpol (15)

V. heyneana

Thân

[33]

Ampelopsin D (16)

[32], [34]

(+)-Ampelopsin F (17)

[10], [16], [23], [27], [30]

V. amurensis V. vinifera V. amurensis V. coignetiae V. thunbergii V. vinifera

Rễ Lá Lá, thân Toàn cây Rễ Thân

Amurensin A (18)

V. amurensis

Rễ

[22]

Betulifol A (19)

V. betulifolia

Thân

[29]

Gnetin A (20)

[34], [35]

V. flexuosa V. wilsoniae

Thân Thân

Isoampelopsin F (21)

V. amurensis

Thân

[11]

(-)-Malibatol A (22)

V. vinifera

Thân

[23]

10 Pallidol (23)

V. amurensis V. vinifera V. heyneana

Thân Lá, thân, quả Quả

[11], [14], [15], [19], [36], [37]

3,3′′-diglucosid

V. vinifera

Quả

[13]

11 Pallidol (24)

12 Pallidol 3-O-glucosid (25) V. vinifera

Quả

[13]

13 Parthenocissin A (26)

V. vinifera

Quả

[19]

14 Quadrangularin A (27)

V. vinifera

Lá

[36]

15 Scirpusin A (28)

V. vinifera

Thân

[38]

(+)-Viniferether A (29)

V. vinifera

Rễ

[39]

(+)-Viniferether B (30)

V. vinifera

Rễ

[39]

(31)

18 Viniferifuran

(amurensin H)

[27], [40], [41]

Rễ Rễ Thân

V. amurensis V. thunbergii V. vinifera

19 E-δ-Viniferin (32)

V. vinifera

Lá, quả

[17], [18]

20 Z-δ-Viniferin (33)

V. vinifera

Lá

[17]

21 Z-ε-Viniferin (34)

V. vinifera

Lá, quả

[17], [36]

V. amurensis

Lá, thân, rễ

V. berlandieri V. betulifolia

Rễ Thân

V. chunganensis V. cinerea V. coignetiae V. davidii

Toàn cây Rễ Toàn cây Thân

22 E-ε-Viniferin (35)

V. flexuosa V. acerifolia

Thân Rễ

[10], [11], [12], [15], [17], [18], [23], [27], [28], [29], [30], [32], [34], [35], [36], [42]

V. riparia V. berlandieri

Lá, rễ Rễ

V. rupestris V. thunbergii

Rễ Rễ, thân

V. vinifera

Lá, thân, rễ, quả

V. wilsoniae

Thân

V. heyneana

Thân

V. vinifera

Lá

[36]

23 Z--Viniferin (36)

V. vinifera

Lá

[36]

24 E--Viniferin (37)

25 Z-ε-Viniferin diglucosid

V. vinifera

Quả

[13]

(38)

26 E-ε-Viniferin diglucosid

V. vinifera

Quả

[13]

(39)

V. betulifolia

[29], [43]

ε-Viniferindiol (40)

V. coignetiae

Thân Thân

28 Vitisinol A (41)

V. thunbergii V. heyneana

Rễ Rễ

V. thunbergii

Rễ

29 Vitisinol B (42)

[44]

V. thunbergii

Rễ

30 Vitisinol C (43)

V. thunbergii

Rễ

31 Vitisinol D (44)

[45]

(+)-Vitisinol E (45)

V. vinifera

Vỏ thân

V. thunbergii

Rễ

[27]

33 Vitisinol E (46)

V. thunbergii

Rễ

[27]

34 Vitisinol G (47)

V. vinifera

Chồi non

[25]

V. vinifera

Chồi non

[25]

(5R)-5-(3-(3,5-dihydroxy- phenyl)-6-hydroxy-2-(4- hydroxyphenyl)-4-((E)-4- hydroxystyryl)-2,3- dihydrobenzofuran-5- yl)pyrrolidin-2-on (48) (5S)-5-(3-(3,5- dihydroxyphenyl)-6- hydroxy-2-(4- hydroxyphenyl)-4-((E)-4- hydroxystyryl)-2,3- dihydrobenzofuran-5- yl)pyrrolidin-2-on (49)

37 Amurensin O (50)

V. amurensis

Rễ

[46]

38 Leachianol F (51)

V. vinifera

Thân

[47]

39 Leachianol G (52)

V. vinifera

Thân

[47]

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các dimer stilbenoid 14-52 phân lập từ chi Nho

❖ Các trimer stilbenoid

Theo các công bố trên thế giới, đã có 19 hợp chất trimer stilbenoid 53-71 được

phân lập từ chi Nho, trong đó có 7 hợp chất được tìm thấy từ loài V. vinifera. Một trimer

mới của resveratrol - wenchowenol (69) đã được phân lập và xác định cấu trúc từ loài

V. wenchowensis [48]. Tên và cấu trúc hóa học của các trimer stilbenoid từ các loài

thuộc chi Nho được trình bày trong bảng 1.4 và hình 1.4.

Bảng 1.4. Các trimer stilbenoid 53-71 phân lập từ các loài thuộc chi Nho

Bộ phận

TLTK

STT

Tên hợp chất

1 Ampelopsin C (53)

[27], [28], [29], [30], [31], [44]

2 Ampelopsin E (54)

[35], [42]

3 4

Z-Ampelopsin E (55) Z-Amurensin B (56)

E-Amurensin B (57)

6 Amurensin C (58) 7 Amurensin D (59)

[27] [16] [10], [16], [21], [42] [49] [49]

8 Amurensin G (60)

[10], [16], [21]

9 Gnetin H (61)

[10], [12] [16], [21]

Thân Toàn cây Thân Thân Rễ, thân Rễ Thân Thân Rễ Lá, thân Lá, thân, rễ Toàn cây Rễ Rễ Lá, thân, rễ Toàn cây Lá, thân Rễ Toàn cây Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Lá, thân Lá Lá

[36] [36] [36]

α-Viniferin (65)

Lá

[36]

(+)-Viniferol D (66)

Loài V. betulifolia V. coignetiae V. davidii V. heyneana V. thunbergii V. amurensis V. davidii V. wilsoniae V. thunbergii V. amurensis V. amurensis V. chunganensis V. amurensis V. amurensis V. amurensis V. chunganensis V. amurensis V. berlandieri V. chunganensis V. cinerea V. acerifolia V. riparia V. rupestris V. vinifera 10 E-trans-Miyabenol C (62) V. vinifera V. vinifera 11 E-cis-Miyabenol C (63) 12 Z-trans-Miyabenol C (64) V. vinifera V. riparia V. vinifera V. vinifera V. coignetiae V. thunbergii V. wenchowensis V. vinifera V. heyneana

14 15 Vitisin E (67) 16 Vitisin F (68) 17 Wenchowenol (69) 18 Z-cis-Miyabenol C (70) 19 Quinquangularol (71)

Thân Thân Rễ Thân và rễ Chồi non Thân, rễ

[50] [51] [27] [48] [52] [53]

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của các trimer stilbenoid 53-71 phân lập từ chi Nho

❖ Các tetramer stilbenoid

Cho đến nay, đã có 25 hợp chất tetramer stilbenoid 72-96 được tìm thấy trong

thành phần hóa học của các loài thuộc chi Nho. Hopeaphenol (81) là hợp chất tetramer

duy nhất có trong rượu. Ngoài ra, 12 hợp chất khác cũng đã được phân lập từ rễ, thân

và lá của loài V. vinifera. Tên và cấu trúc hóa học của các tetramer stilbenoid từ các loài

thuộc chi Nho được trình bày trong bảng 1.5 và hình 1.6.

Hình 1.5. Cấu trúc khung của một số tetramer stilbenoid phân lập từ chi Nho

Bảng 1.5. Các tetramer stilbenoid 72-96 phân lập từ các loài thuộc chi Nho

STT

Tên hợp chất

Loài

Bộ phận

TLTK

[36]

1 Ampelopsin H (72)

V. vinifera

Lá

[42]

2 Amurensin I (73)

V. amurensis

Rễ

[42]

3 Amurensin J (74)

V. amurensis

Rễ

[42]

4 Amurensin K (75)

V. amurensis

Rễ

[42]

5 Amurensin L (76)

V. amurensis

Rễ

[42]

6 Amurensin M (77)

V. amurensis

Rễ

[54]

7 Davidol A (78)

V. davidii

Thân

[34]

Flexuosol A (79)

V. flexuosa

Thân

Rễ

V. amurensis

Thân

9 Heyneanol A (80)

V. betulifolia

[28], [29], [42]

Thân

V. heyneana

Rễ

V. amurensis

Thân

V. betulifolia

V.chunganensis

Toàn cây

[3], [21], [23],

10 Hopeaphenol (81)

Thân

V. flexuosa

[29], [34], [42]

Rễ

V. heyneana

V. vinifera

Lá, thân, rễ, quả

V. amurensis

Rễ

[23], [36], [42],

Isohopeaphenol (82)

V. vinifera

Lá và thân

[55]

V. thunbergii

[27], [44]

Rễ

12 Miyabenol A (83)

V. vinifera

[36]

Lá

13 Vaticanol C (84)

(+)-Viniferol A (85)

V. vinifera

[23]

Thân

(+)-Viniferol B (86)

V. vinifera

[55]

Thân

(+)-Viniferol C (87)

V. vinifera

[55]

Thân

(+)-Viniferol E (88)

V. vinifera

[39]

Rễ

V. amurensis

Rễ

(+)-Vitisifuran A (89)

[41], [42]

V. vinifera

Thân

(-)-Vitisifuran B (90)

[41]

Thân

V. vinifera

V. amurensis

Lá, rễ, thân

V. betulifolia

Thân

V. chunganensis

Toàn cây

[10], [21], [23],

V. coignetiae

Toàn cây

[26], [28], [29],

[30], [31], [34],

Thân

V. davidii

20 Vitisin A (91)

[38], [42], [54]

Thân

V. flexuosa

V. thunbergii

Rễ, thân

Thân

V. vinifera

Thân

V. wilsoniae

V. coignetiae

Toàn cây

[30]

21 Z-Vitisin A (92)

Rễ

V. amurensis

Rễ

V. berlandieri

Rễ

V. cinerea

V. coignetiae

Thân

[26], [32], [43]

V. acerifolia

Rễ

22 E-Vitisin B (93)

Rễ

V. riparia

Rễ

V. rupestris

Thân, rễ

V. thunbergii

Thân, rễ

V. vinifera

V. amurensis

Rễ

[43], [56]

23 Z-Vitisin B (94)

V. coignetiae

Thân

V. thunbergii

Rễ

[44], [57]

24 E-Vitisin C (95)

V. vinifera

Thân

V. coignetiae

25 Vitisin D (96)

Thân

[51]

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của một số tetramer stilbenoid 72-96 phân lập từ chi Nho

❖ Các pentamer và hexamer stilbenoid

Có 2 pentamer stilbenoid 97-98 và 2 hexamer stilbenoid 99-100 đã được phân lập

từ 3 loài Nho là V. amurensis, V. chunganensis và V. vinifera. Tên và cấu trúc hóa học

của các hợp chất này được trình bày trong bảng 1.6 và hình 1.7.

Bảng 1.6. Các pentamer, hexamer stilbenoid 97-100 phân lập từ các loài thuộc chi Nho

STT

Tên chất

Loài

Bộ phận TLTK

1 Amurensin E (97)

V. amurensis

Rễ

[49]

2 Amurensin F (98)

V. amurensis

Rễ

[49]

Chunganenol (99)

V. chunganensis Toàn cây

[21]

4 Viniphenol A (100) V. vinifera

Thân

[58]

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của các pentamer, hexamer stilbenoid 97-100 từ chi Nho

Như vậy, đã có 100 hợp chất stilbenoid được phân lập và xác định cấu trúc từ các

loài thuộc chi Nho. Trong số 100 hợp chất này, có 13 hợp chất monomer stilbenoid 1-

13, 39 hợp chất dimer stilbenoid 14-52, 19 hợp chất trimer stilbenoid 53-71, 25 hợp chất

tetramer stilbenoid 72-96, 2 hợp chất pentamer stilbenoid 97-98 và 2 hợp chất hexamer

stilbenoid 99-100.

b. Các hợp chất flavonoid

Ngoài stilbenoid, các hợp chất flavonoid cũng đã được tìm thấy trong các loài Nho.

Từ quả của loài V. vinifera, người ta đã phát hiện các flavonoid thuộc nhóm flavan-3-

ol, flavonol và anthocyanin [59], [60], [61], [62]. Trong đó, các hợp chất có hàm lượng

cao là catechin (103), epicatechin (104), quercetin (103), rutin (106) và kaempferol

(107) [59], [62]. Tên và cấu trúc của các hợp chất flavonoid thuộc chi Nho được trình

bày tại bảng 1.7 và hình 1.9.

2 0

Hình 1.8. Cấu trúc của một số khung flavonoid thuộc chi Nho

Bảng 1.7. Một số hợp chất flavonoid (101-134) được tìm thấy trong chi Nho

Cấu trúc hóa học

STT

Tên chất

Loài

Bộ phận

TLTK

Kh

R1

R2

R3

R4

ung

V. vinifera

Quả

[61]

Astilbin (101)

V. vinifera

Quả

[61]

Engeletin (102)

V. labrusca

Quả

[37], [59],

II,

Catechin (103)

V. vinifera

Quả, thân

[61], [62],

V. amurensis

Quả

[63], [64]

V. davidii

Quả

V. heyneana

[37], [59],

V. vinifera

II,

Epicatechin (104)

V. davidii

Quả

[61],

[64]

V. heyneana

II,

V. davidii

Quả

[37]

Epigallocatechin (105)

V. heyneana

II,

V. davidii

Quả

[37]

Epicatechin-3-O-gallat (106)

V. heyneana

V. labrusca

Quercetin (107)

III OH

Quả

[62]

V. vinifera

2 1

V. vinifera

Quercetin 3-glucosid (108)

III OH

Glc

V. davidii

Quả

[37], [61]

V. heyneana

V. vinifera

Quercetin 3-glucuronid (109)

III OH

Glcu

V. davidii

Quả

[37], [61]

V. heyneana

V. labrusca

Quả

[62]

10 Rutin (110)

III OH

Rut

V. vinifera

Quả

V. labrusca

Quả

[62]

11 Kaempferol (111)

III H

V. vinifera

Quả

12 Kaempferol 3-glucosid (112)

III H

Glc

V. vinifera

Quả

[61]

13 Kaempferol 3-galactosid (113)

III H

V. vinifera

Quả

[61]

Gal

V. vinifera

14 Delphinidin-3-O-glucosid (114)

IV OH

Glc

Quả

[37], [60]

V. heyneana

V. vinifera

15 Cyanidin-3-O-glucosid (115)

IV H

Glc

V. davidii

Quả

[37], [60]

V. heyneana

V. vinifera

Peonidin-3-O-glucosid (116)

IV H

Quả

[37], [60]

CH3 Glc

V. heyneana

17 Malvidin-3-O-glucosid (117)

V. vinifera

Quả

[60]

IV OCH3 CH3 Glc

2 2

18 Cyanidin-3-O-coumaroylglucosid (118)

IV H

CGlc H

V. heyneana Quả

[37]

Peonidin-3-O-coumaroylglucosid (119)

IV H

V. heyneana Quả

[37]

CH3 CGlc H

V. davidii

20 Malvidin-3-O-coumaroylglucosid (120)

Quả

[37]

IV OCH3 CH3 CGlc H

V. heyneana

V. davidii

21 Delphinidin-3,5-O-diglucosid (121)

IV OH

Glc

Quả

[37]

V. heyneana

22 Cyanidin-3,5-O-diglucosid (122)

IV H

Glc

Glc V. heyneana Quả

[37]

V. davidii

Glc

Quả

[37]

IV OCH3 H

Petunidin-3,5-O-diglucosid (123)

V. heyneana

V. davidii

Peonidin-3,5-O-diglucosid (124)

IV H

Glc

Quả

[37]

CH3 Glc

V. heyneana

V. davidii

25 Malvidin-3,5-O-diglucosid (125)

Glc

Quả

[37]

IV OCH3 CH3 Glc

V. heyneana

26 Delphinidin-3-O-acetylglucosid-5-O-glucosid (126)

IV OH

AGlc Glc V. heyneana Quả

[37]

27 Cyanidin-3-O-acetylglucosid-5-O-glucosid (127)

IV H

AGlc Glc V. heyneana Quả

[37]

Petunidin-3-O-acetylglucosid-5-O-glucosid (128)

AGlc Glc V. heyneana Quả

[37]

IV OCH3 H

Delphinidin-3-O-coumaroylglucosid-5-O-glucosid

V. davidii

IV OH

CGlc Glc

Quả

[37]

(129)

V. heyneana

30 Cyanidin-3-O-coumaroylglucosid-5-O-glucosid (130)

IV H

CGlc Glc V. heyneana Quả

[37]

2 3

V. davidii

Petunidin-3-O-coumaroylglucosid-5-O-glucosid (131)

CGlc Glc

Quả

[37]

IV OCH3 H

V. heyneana

Peonidin-3-O-coumaroylglucosid-5-O-glucosid (132)

IV H

[37]

CH3 CGlc Glc V. heyneana Quả

33 Delphinidin-3-O-coumaroylglucosid (133)

IV OH

CGlc H

V. heyneana Quả

[37]

V. davidii

34 Malvidin-3-O-coumaroylglucosid-5-O-glucosid (134)

Quả

[37]

IV OCH3 CH3 CGlc Glc

V. heyneana

c. Các hợp chất phenol khác

Từ quả của các loài thuộc chi Nho, người ta đã phân lập được 10 acid phenol và 2

hydroxy phenol. Tên và cấu trúc hóa học của các hợp chất này được trình bày tại bảng

1.8 và hình 1.9.

R2

R1

135

136

Glc

137

Glc

140 R

138

139

141 R1

R2

142 OH

OCH3

143 144 OH

146

145

Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất phenol 135-146 khác

thuộc chi Nho

Bảng 1.8. Một số hợp chất phenol 135-146 khác thuộc chi Nho

STT

Tên chất

Loài

Bộ phận

TLTK

Acid gallic (135)

V. vinifera

Quả, thân

[61], [63]

Acid 4-glucosid gallic (136)

V. vinifera

Quả

[61]

Acid 3-glucosid gallic (137)

V. vinifera

Quả

[61]

Trans-acid caftaric (138)

V. vinifera

Quả

[61]

Trans-acid coutaric (139)

V. vinifera

Quả

[61]

Cis-acid coutaric (140)

V. vinifera

Quả

[61]

2-Hydroxy-5-(2-hydroxy-ethyl)-

V. vinifera

Quả

[61]

phenylglucosid (141)

V. davidii

Quả

[37]

Acid ferulic (142)

V. heyneana

V. davidii

Quả

[37]

Acid coumaric (143)

V. heyneana

V. davidii

Quả

[37]

10 Acid caﬀeic (144)

V. heyneana

V. davidii

Quả

[37]

11 Acid cinnamic (145)

V. heyneana

Thân

[33]

2-(4-hydroxyphenyl)-2,3- dihydrobenzo[b]furan-3,4,6-triol (146)

1.1.2.2. Nhóm hợp chất non-phenol

a. Các hợp chất sterol

Một nghiên cứu gần đây cho thấy, 6 sterol đã được nhận diện và định lượng trong

dầu hạt Nho của loài V. vinifera, V. amurensis và V. davidii bao gồm: campesterol (147),

stigmasterol (148), β-sitosterol (149), sitostanol (150), △5-avenasterol (151) [65], [66].

Ngoài ra, 10 hợp chất sterol khác cũng đã được nhận diện và định lượng trong dầu hạt

Nho của loài V. vinifera bao gồm: cholesterol (152), brassicasterol (153), 24-methylen

cholesterol (154), campestanol (155), ∆7-campesterol (156), ∆5,23-stigmastadienol

(157), clerosterol (158), ∆5,24-stigmastadienol (159), ∆7-stigmasterol (160), ∆7-

avenasterol (161) [65]. Trong một nghiên cứu khác, hợp chất daucosterol (162) cũng đã

được phân lập từ thân của loài V. vinifera [63]. Các hợp chất stigmasterol (148), β-

sitosterol (149) và β-sitostenon (163) còn được phân lập từ thân của loài V. heyneana

[33]. Cấu trúc hóa học của một số sterol trong chi Nho được trình bày trong hình 1.10.

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của một số sterol 147-163 thuộc chi Nho

b. Các hợp chất triterpenoid

Một số hợp chất triterpenoid đã được phân lập từ loài V. vinifera và V. heyneana

bao gồm Acid oleanoic (164), Acid betulinic (165), Lupeol (166), β-Amyrin (167),

Betulin (168), 25,26,27-trinor-3β,24-dihydroxycycloartan (169), Cycloart-23-en-3β,25-

diol (170) [33], [63], [67]. Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được trình bày ở hình

1.11.

c. Các hợp chất khác

Ngoài các nhóm chất đã kể trên, một số hợp chất thuộc nhóm megastigman và một

số cấu trúc khác cũng đã được phân lập từ loài V. vinifera và V. heyneana. Tên gọi và

công thức cấu tạo của các hợp chất này được trình bày tại bảng 1.9 và hình 1.11.

Bảng 1.9. Một số hợp chất không phenol khác 164-175 phân lập từ chi Nho

Bộ

STT

Tên chất

Loài

TLTK

phận

(3S,5R,6R,9R)-Megastigman-3,5,6,9-tetrol 9-O-

V. heyneana

Lá

[67]

β-ᴅ-glucopyranosid (171)

Actinidioionosid (172)

V. heyneana

Lá

[67]

(6S,9R)-roseosid (173)

V. heyneana

Lá

[67]

Icarisid B5 (174)

V. heyneana

Lá

[67]

Icarisid B1 (175)

V. heyneana

Lá

[67]

Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của các hợp chất triterpenoid 164-170

và mộ số hợp chất khác 171-175 thuộc chi Nho

Như vậy, các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Nho chủ

yếu tập trung trên loài V. vinifera và V. amurensis. Trong đó, stilbenoid là nhóm chất

chính trong thành phần hóa học của các loài này.

1.1.3. Tác dụng sinh học

Y học dân gian từ lâu đã sử dụng thân và lá của các loài Nho làm thuốc tiêu sưng,

chống viêm, trị đau nhức xương khớp, đòn ngã tổn thương [2]. Tuy nhiên, cho đến nay

ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về tác dụng dược lý của các loài Nho bản địa. Trong

khi đó, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cho thấy cao chiết và các hợp chất phân lập

được từ các loài thuộc chi Nho có tác dụng chống viêm cũng như có tác dụng trên các

bệnh lý liên quan đến yếu tố trung gian gây viêm như ung thư, tim mạch, đái tháo đường

và thoái hóa thần kinh.

1.1.3.1. Tác dụng chống viêm

Những công bố gần đây cho thấy, cao chiết toàn phần và các hợp chất tinh khiết

đã được phân lập từ chi Nho có tác dụng chống viêm trên nhiều mô hình khác nhau.

a. Hợp chất resveratrol

Trong số các hợp chất được phân lập từ các loài Nho, hợp chất resveratrol (7) được

các nhà khoa học quan tâm nhiều nhất. Các nghiên cứu in vitro cho thấy, resveratrol có

tác dụng ức chế sự biểu hiện của COX-2 cũng như ức chế hoạt tính của enzym này [68],

[69]. Mặt khác, resveratrol cũng thể hiện tác dụng chống viêm và ức chế biểu hiện của

COX-2 trên nhiều mô hình in vivo, ví dụ như trong mô hình gây viêm đại tràng trên

chuột cống [70], mô hình gây viêm đại tràng bằng dextran sulfat sodium (DSS) [71],

[72], [73], mô hình gây khối u trên da chuột bằng 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat

(TPA) [74], mô hình gây parkinson bằng 6-hydroxydopamin (OHDA) [75], mô hình

Randall-Selitto làm tăng ngưỡng phản ứng đau của chuột bằng carrageenan [76], mô

hình gây viêm khớp bằng lipopolysaccharrid (LPS) [77], mô hình gây viêm tụy cấp bằng

natri taurocholat [78] và một số mô hình in vivo khác [79], [80], [81], [82].

Cơ chế chống viêm của resveratrol (7) khá đa dạng, thông qua nhiều con đường

khác nhau. Hợp chất này có khả năng ức chế quá trình sản sinh các cytokin tiền viêm

như TNFα, IL-1β, IL-6 hay IL-8 [83], [84], [85], và các matrix metallopetidase như

MMP-2, MMP-3, MMP-9 và MMP-13 [31], [69], [86], [87]. Trong nhiều thử nghiệm,

các nhà khoa học nhận thấy resveratrol không chỉ ức chế quá trình sản sinh PGE2 và NO

mà còn làm giảm nồng độ protein và mRNA gây cảm ứng COX-2 và iNOS [68], [70],

[71], [73], [76], [88]. Ngoài ra, resveratrol còn có khả năng ức chế sự kích hoạt tín hiệu

NF-κB. Thông qua việc ức chế phản ứng phosphoryl hóa tiểu đơn vị p65 và IκBα kinase;

hợp chất này ức chế quá trình chuyển vị vào nhân tế bào của NF-κB và ức chế hoạt động

phiên mã tạo ra các protein viêm [69], [73], [78], [79], [89].

b. Hợp chất piceatannol và pterostilben

Hợp chất piceatannol (2) là dẫn xuất của resveratrol, cũng có khả năng chống viêm

trên nhiều đích tác dụng. So với resveratrol (7), piceatannol (2) có tác dụng chống oxy

hóa mạnh hơn (lên đến 1250 lần), do hợp chất này có nhiều hơn 1 gốc hydroxyl, tạo

điều kiện cho sự hình thành gốc semiquinon [90], [91], [92]. Cũng vì lí do này,

piceatannol thể hiện tác dụng tốt hơn resveratrol trong việc cảm ứng heme oxygenase-1

(HO-1), một yếu tố quan trọng điều hòa quá trình sản sinh các cytokin viêm ở đại thực

bào [93], [94]. Nhìn chung, piceatannol thể hiện tác dụng chống viêm in vitro mạnh hơn

resveratrol trên các đích tác dụng như iNOS, COX-2, NF-κB và AP-1 [95], [96], [97],

[98], [99], [100]. Trên động vật thực nghiệm, piceatannol được báo cáo có tác dụng ức

chế sự sản sinh các cytokin (TNFα, IL-8) và ức chế phản ứng phosphoryl hóa MAPKs.

Cùng với đó, khả năng ức chế biểu hiện COX-2 và iNOS và khả năng ức chế hoạt động

của AP-1 và sự chuyển vị của NF-κB cũng được quan sát thấy ở biểu bì của chuột trong

mô hình gây tăng trưởng khối u bằng chất kích thích phát triển khối u TPA [99]. Ngoài

ra, không chỉ thể hiện khả năng ức chế biểu hiện COX-2, iNOS và hoạt động NF-κB,

piceatannol còn có tác dụng tăng cường hoạt động của Nfr2 và biểu hiện HO-1 trên mô

hình viêm đại tràng [101], [102].

Cùng với piceatannol, pterostilben (5) cũng thể hiện tác dụng chống viêm trên

nhiều mô hình in vitro và in vivo. Trên các nghiên cứu in vitro, hợp chất này có khả

năng bất hoạt tín hiệu NF-κB thông qua ức chế quá trình chuyển vị vào nhân, ngừng quá

trình sản sinh các cytokin tiền viêm (TNFα, IL-1β, IL-6, IL-18) và NO [86], [103], [104],

[105], [106], [107], [108]. Theo một nghiên cứu khác, pterostilben cũng có tác dụng ức

chế hoạt động enzym 5-lipoxygenase (5-LOX) [109]. Trên mô hình gây viêm khớp (gây

ra bởi Mycobacterium trên chuột cống Lewis), pterostilben thể hiện tác dụng làm giảm

số lượng bạch cầu và ức chế quá trình sản sinh ROS [110]. Hợp chất này cũng có khả

năng làm giảm sự biểu hiện của iNOS và COX-2 trên mô hình gây ung thư đại tràng ở

chuột [79]. Tương tự, mức độ cảm ứng NO, MDA và TNFα cũng giảm xuống sau khi

cho chuột sử dụng pterostilben trên mô hình ung thư gan [111]. Cùng với đó, pterostilben

cũng được báo cáo có tác dụng ức chế sản sinh NO và các cytokin tiền viêm trên mô

hình viêm thần kinh [104].

c. Các hợp chất khác và cao chiết toàn phần

Ngoài resveratrol, pterostilben và piceatannol, nghiên cứu về tác dụng chống viêm

của các hợp chất khác từ chi Nho còn rất ít. Ngoại trừ malvidin-3-O-glucosid (117), một

anthocyanin chủ yếu từ quả của loài V. vinifera, đã được chứng minh có khả năng làm

giảm hoạt động phiên mã của gen mã hóa chất trung gian gây viêm, qua đó ức chế sự

sản sinh TNFα, IL1, IL-6 và iNOS cũng như có tác dụng chống viêm khớp mạn tính trên

chuột [112], các hợp chất khác chủ yếu được nghiên cứu dưới dạng hỗn hợp trong cao

chiết.

Một nghiên cứu gần đây cho thấy, cao chiết rễ loài V. vinifera, trong đó thành phần

chính là E-ε-viniferin (35) và vitisin A (91), có tác dụng cảm ứng mạnh protein và

mRNA của HO-1 và giảm mức độ biểu hiện gen của iNOS và IL-1β [113]. Trong một

nghiên cứu khác, phân đoạn giàu polyphenol từ rượu vang của loài V. vinifera cũng thể

hiện khả năng ức chế sự kích hoạt yếu tố NF-κB và AP-1 [114]. Cao chiết methanol từ

nhiều phần khác của loài V. thunbergii (thân, cành, lá và rễ) cũng đã được đánh giá tác

dụng chống viêm thông qua khả năng ức chế sản sinh PGE2. Trong đó, cao chiết từ phần

thân cho hoạt tính tốt nhất. Từ phần cao chiết này, các nhà khoa học phân lập được 6

stilben, trong đó resveratrol (7) làm giảm đáng kể hoạt tính COX-2, sự sản sinh PGE2,

MMP-3, MMP-13, sự hấp thu PGE2 huyết thanh in vivo ở thỏ. Tuy nhiên, nghiên cứu

này cũng cho thấy, tác dụng hiệp đồng của tất cả các stilbenoid trong cao chiết mạnh

hơn đáng kể so với tác dụng đơn lẻ của từng hợp chất [31]. Một nghiên cứu đáng chú ý

khác chỉ ra rằng, các procyanidin từ hạt của loài V. amurensis có tác dụng ức chế các

yếu tố tiền viêm iNOS và COX-2, liên quan đến con đường NF-κB và p38 MAPK [115].

Ngoài ra, các cao chiết methanol từ thân các loài V. thunbergii, V. flexuosa và V.

kelungensis cho thấy khả năng ức chế sản sinh NO trong đại thực bào RAW 264.7 bị

kích thích bởi LPS với các giá trị IC50 lần lượt là 214; 159 và 132 µg/ml [33].

1.1.3.2. Tác dụng trên tim mạch

a. Tác dụng trên thành động mạch và hạ huyết áp

Nghiên cứu tác dụng trên thành động mạch của hợp chất E-resveratrol (7) trên

chuột Wistar Kyoto và chuột huyết áp cao SHR đã được Behbahani J. và cộng sự báo

cáo. Theo đó, khi cho chuột Wistar Kyoto uống E-resveratrol ở mức liều 2,5 mg/kg/ngày

trong vòng 10 tuần có tác dụng làm giảm độ giòn của thành động mạch. Cũng ở mức

liều trên, E-resveratrol làm giảm quá trình thu hẹp lumen, giảm sự khuyếch đại tín hiệu

ERK và sự biểu hiện của kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh trong thành động mạch

của chuột SHR. Các tác dụng này của hợp chất E-resveratrol có thể là do khả năng giảm

stress oxy hóa cũng như tăng cường hoạt tính của protein kinase G [116]. Nghiên cứu

Thandapilly S. J. và cộng sự cho thấy, khi cho chuột SHR uống E-resveratrol ở mức liều

2,5 mg/kg/ngày trong vòng 10 tuần giúp ức chế sự phát triển của bệnh tim phì đại, ngăn

chặn quá trình rối loạn tâm thu và tâm trương. Tuy nhiên, ở mức liều này, E-resveratrol

không có tác dụng hạ huyết áp [117]. Ở mức liều cao hơn 200 mg/kg/ngày (4 tuần), E-

resveratrol có tác dụng hạ huyết áp cũng như cải thiện rối loạn chức năng nội bào. Tác

dụng này được chứng minh do khả năng tăng cường sự hình thành NO nội bào của hợp

chất E-resveratrol [118].

Ở một nghiên cứu khác, tác dụng bảo vệ tim mạch của E-resveratrol và cao chiết

V. vinifera trên 75 bệnh nhân tại Bệnh viện Đại học Morales Meseguer (Tây Ban Nha)

đã được báo cáo [119]. Theo đó, sau 12 tháng điều trị, E-resveratrol và cao chiết V.

vinifera làm giảm protein phản ứng C siêu nhạy (-26%, p = 0,03), giảm TNF-α (-19,8%,

p = 0,01), giảm tỷ lệ IL-6/IL-10 (-24%, p = 0,04), giảm chất ức chế hoạt hóa plasminogen

(-16,8%, p = 0,03), tăng adiponectin (6,5%, p = 0,07) nhưng không xuất hiện bất cứ tác

dụng phụ nào trong quá trình thử thuốc. Như vậy, E-resveratrol và cao chiết V. vinifera

đã được chứng minh giúp giảm quá trình viêm cũng như phân huỷ fibrin, hai tác nhân

quan trọng liên quan đến các bệnh về tim mạch [119].

Tác dụng hạ huyết áp trên người của hợp chất E-pterostilben (5) cũng đã được

nghiên cứu bởi Riche D. M. và cộng sự. Nghiên cứu được tiến hành trên 80 bệnh nhân.

Khi cho các bệnh nhân uống E-pterostilben ở mức liều 125 mg/ lần, 2 lần/ ngày, trong

6-8 tuần giúp làm giảm chỉ số huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương. Ở mức liều thấp

hơn, 50 mg/1 lần, 2 lần/ngày, trong 6-8 tuần, E-pterostilben không có tác dụng này [120].

b. Giảm kết tập tiểu cầu

Sự kết tập tiểu cầu là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra bệnh huyết

khối do xơ vữa động mạch. Hợp chất E-resveratrol (7) đã được chứng minh có tác dụng

ức chế sự kết tập tiểu cầu ở các nghiên cứu trên người cũng như động vật [121], [122],

[123]. Hợp chất này ở nồng độ 50 µg/ml có khả năng ức chế sự kết tập tiểu cầu gây ra

bởi ollagen, epinephrin và thromboxan. Tác dụng này có thể là do khả năng ức chế quá

trình tạo ra enzym COX-1, NO, ức chế tín hiệu MAPK và tín hiệu phosphoinositid [124].

Tương tự như hợp chất E-resveratrol, E-pterostilben (5) cũng đã được chứng minh

có tác dụng ức chế sự kết tập tiểu cầu cũng như ức chế quá trình sản sinh NO trong tiểu

cầu [125].

c. Tác dụng trên tổn thương do thiếu máu cục bộ và tái tưới máu

Cản trở lưu thông dòng máu có thể gây nên thiếu máu cục bộ và tổn thương do tái

tưới máu (ischemia-reperfusion injury). Đây là một trong những nguyên nhân gây ra

bệnh mạch vành.

Nghiên cứu của Ray P. S. và cộng sự cho thấy, E-resveratrol (7) có khả năng làm

giảm quá trình thiếu máu cục bộ và tái tưới máu thông qua tác dụng giảm canxi nội bào,

ngăn chặn quá trình gây chết tế bào theo chương trình (apotosis) và tăng cường sự hoạt

động của các enzym có khả năng dập tắt các gốc tự do như SOD [126], [127]. Ngoài ra,

khả năng hoạt hóa enzym AMPK và cảm ứng enzym NOS cũng được cho là cơ chế làm

giảm quá trình thiếu máu cục bộ và tái tưới máu của E-resveratrol [128], [129].

Trên tế bào tim mạch H9c2, E-pterostilben (5) thể hiện tác dụng bảo vệ, chống lại

các tổn thương do giảm oxy máu thông qua kích hoạt và tăng cường sirtuin 1 (SIRT1)

[130]. SIRT1 là một enzym deacetyl hóa protein phụ thuộc nicotinamid adenin

dinucleotid NAD+. SIRT1 kích hoạt peroxisome proliferator-kích hoạt thụ thể gamma

coactivator 1-alpha (PGC-1α) thông qua quá trình deacetyl hóa, từ đó cải thiện chức

năng ty thể và khả năng oxy hóa [131]. Trong nghiên cứu gây tổn thương do thiếu máu

cục bộ và tái tưới máu trên chuột, hợp chất E-pterostilben có khả năng cải thiện chức

năng tim mạch, giảm các tác nhân gây stress oxy hóa, các cytokin viêm và hoạt tính của

myeloperoxidase [132].

Nghiên cứu của Hung L. M. và cộng sự về tác dụng chống lại tổn thương do thiếu

máu cục bộ và tái tưới máu của E-piceatannol trên chuột cho thấy, hợp chất này có tác

dụng giảm hiện tượng rung thất (một rối loạn nhịp tim xảy ra khi có các xung động điện

bất thường và tim đập nhanh). Tác dụng này có thể liên quan đến khả năng giảm sự hình

thành lactat dehydrogenase và tăng sự hình thành NO trong động mạch cảnh của E-

piceatannol [133].

d. Giảm xơ vữa động mạch

Các nghiên cứu đã công bố cho thấy, E-resveratrol giảm sự tích tụ lipid [134], điều

chỉnh biểu hiện gen liên quan đến sự hình thành và phân giải lipid [135]. Ngoài ra, hợp

chất này cũng đã được chứng minh có khả năng ức chế quá trình chết theo chương trình

của tế bào nội mô mạch máu gây ra bởi LDL đã bị oxy hóa [136], [137].

Tương tự, một hợp chất stilbenoid khác phân lập được từ chi Nho là E-pterostilben

cũng có khả năng ức chế sự chết theo chương trình của tế bào nội mô mạch máu gây ra

bởi LDL đã bị oxy hóa [108]. Hợp chất này cũng có tác dụng giảm xơ vữa động mạch

gây ra bởi chất béo trên chuột thông qua ức chế các cytokin viêm như TGFβ, TNF-α,

IL-1β và IL-6 [138]. Ngoài ra, E-pterostilben còn ức chế sự tăng sinh của các tế bào cơ

trơn mạch máu, một nguy cơ gây xơ vữa động mạch, thông qua điều chỉnh kinase Akt

[139].

Trong một nghiên cứu về các stilbenoid từ loài V. amurensis, hợp chất amurensin

G (60) có khả năng làm giãn mạch vành và tăng cường lưu thông mạch vành thông qua

tăng cường quá trình phosphoryl hóa eNOS và ức chế sự hình thành NO [140]. Một hợp

chất stilbenoid khác từ Nho là E-piceatannol (2) ở mức liều 15-45 mg/kg) cũng có tác

dụng làm giảm lượng LPS huyết tương, LDL cholesterol và quá trình peroxy hóa lipid

[141]. Ngoài ra, cao chiết toàn phần từ loài V. thunbergii cũng làm giảm nồng độ lipid

trong huyết tương và ngăn ngừa xơ vữa trên mô hình thỏ tăng cholesterol máu nhờ khả

năng hoạt hóa hoạt hóa AMPK, một protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình

chuyển hóa glucose và lipid [142] .

1.1.3.3. Tác dụng chống đái tháo đường

Hợp chất resveratrol (7) đã được chứng minh có tác dụng ngăn chặn sự tăng đường

huyết trên chuột thông qua tăng cường hấp thu glucose và sự vận chuyển GLUT 4 tới

màng tế bào [143]. Hợp chất này ức chế sự sản sinh ROS và các gốc tự do nitơ (RNS)

.-, OH., H2O2, MDA, tăng cường sự hình thành các enzym chống oxy hóa như

như O2

SOD, catalase, glutathion peroxidase, ức chế các tác nhân gây viêm như NF-κB, TNF-

α, IL-1β, IL-4 và IL-6 trên các mô hình động vật thực nghiệm [144]. Ngoài ra, E-

resveratrol cũng có khả năng tăng độ nhạy của insulin, tăng khả năng dung nạp glucose,

kích hoạt gen SIRT1 (phụ thuộc AMPK) [145].

Bên cạnh các nghiên cứu trên tế bào và động vật, hợp chất E-resveratrol cũng được

đánh giá tác dụng chống đái tháo đường trên người. Nghiên cứu lâm sàng trên 62 bệnh

nhân ở bệnh viện Trung ương Ootacamund (Ấn Độ) cho thấy, việc sử dụng E-resveratrol

ở mức liều 250 mg/ngày trong vòng 3 tháng làm giảm các chỉ số đường huyết trên các

bệnh nhân tiểu đường type 2 [146]. Nghiên cứu của Movahed A. và cộng sự trên 70

bệnh nhân tại Đại học Y khoa Bushehr (Iran) cũng cho thấy, sử dụng E-resveratrol ở

mức liều 1 g/ngày trong vòng 45 ngày, làm giảm lượng đường trong máu, haemoglobin

A1c, huyết áp tâm thu, tăng chỉ số HDL cholesterol [147]. Ngoài hợp chất E-resveratrol,

E-pterostilben cũng đã được chứng minh có thể tăng cường khả năng kiểm soát đường

huyết thông qua tăng cường hoạt tính của glucokinase và tăng hấp thu glucose trên mô

hình chuột bị tiểu đường [148].

Cùng với resveratrol, các nghiên cứu khác về tác dụng chống đái tháo đường của

cao chiết các loài Nho cũng đã được thực hiện. Một nghiên cứu năm 2012 cho thấy cao

chiết từ Nho thu hái ở vùng California, Mỹ thể hiện tác dụng tăng dung nạp glucose và

tác dụng chống viêm mạn trên chuột gây béo phì bởi chế độ ăn giàu chất béo [149].

Theo một nghiên cứu khác, cao chiết từ hạt Nho cũng có khả năng làm giảm tính kháng

insulin trên chuột [150].

1.1.3.4. Tác dụng giảm thoái hóa thần kinh

Các bệnh lý thoái hóa thần kinh như Parkinson và Alzheimer đều liên quan đến rối

loạn chức năng của ty thể và stress oxy hóa, dẫn tới suy giảm chức năng và chết nơ-ron

thần kinh [151].

Tác dụng giảm thoái hóa thần kinh của các stilbenoid từ Nho chủ yếu do tác dụng

chống oxy hóa và chống viêm mang lại [152], [153], [154]. Hợp chất E-resveratrol (7)

bảo vệ nơ-ron thần kinh khỏi tác nhân ROS và chống lại bệnh Parkinson gây ra bởi 1-

methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) trên chuột thông qua khả năng dập

tắt gốc tự do OH. [155]. Hợp chất này cũng đã được báo cáo có tác dụng bảo vệ các nơ-

ron dopamin trước tác nhân LPS thông qua ức chế sự kích hoạt NF-κB trong tế bào thần

kinh [156].

Bệnh Alzheimer còn liên quan đến sự tích tụ thành những mảng keo của β-amyloid

xung quanh các tế bào thần kinh. Trong đó, β-amyloid hiện diện với hàm lượng lớn sẽ

làm giảm lượng chất trung gian dẫn truyền thần kinh acetylcholin, một yếu tố cần thiết

cho trí nhớ. Các nghiên cứu cho thấy β-amyloid gây oxy hóa các nơ-ron do tăng cường

quá trình oxy hóa protein, acid deoxyribonucleic (ADN) và peroxy hóa lipid [157]. E-

resveratrol (7) được cho là có tiềm năng điều trị đối với bệnh Alzheimer do khả năng

làm giảm các mảng amyloid trong não [158]. Ngoài E-resveratrol, các hợp chất

stilbenoid khác phân lập từ chi Nho như E-piceatannol (2), (+)-ampelopsin A (14),

vitisinol C (43) và viniphenol A (100), cũng đã được chứng minh có tác dụng giảm thoái

hóa thần kinh thông qua khả năng ức chế hoạt động của β-amyloid [52], [58], [159]. Tác

dụng bảo vệ các nơ-ron thần kinh khỏi các tác nhân oxy hóa của E-pterostilben (5) cũng

đã được Yang Y. và các cộng sự báo cáo [154].

Bên cạnh đó, các nghiên cứu tác dụng bảo vệ thần kinh trên chuột của E-resveratrol

(7) đã được tiến hành. Hợp chất này ở mức liều 15-30 mg/kg/ngày trong vòng 7 ngày

có tác dụng bảo vệ tổn thương do thiếu máu não, thông qua giảm lượng MDA, khôi

phục hoạt động SOD, tăng sự biểu hiện của Nrf2 và HO-1, giảm sự biểu hiện của

caspase-3 [160]. E-resveratrol cũng đã được báo cáo có tác dụng giảm sự chết của các

nơ-ron thần kinh trên mô hình gây thiếu máu não cục bộ trên chuột. Cơ chế được xác

định thông qua việc kích hoạt tín hiệu PI3K-Akt và giảm sự biểu hiện của glycogen

synthase kinase-3β [161]. Ở một nghiên cứu khác, sử dụng E-resveratrol với mức liều

25 mg/kg/ngày (8-12 tuần) giúp làm giảm lượng MDA, tăng hoạt động SOD, tăng lượng

glutathion và giúp cải thiện trí nhớ trên chuột [162].

Gần đây, hợp chất E-pterostilben (5) cũng được chứng minh có tác dụng cải thiện

trí nhớ và nhận thức trên chuột trong mô hình gây suy giảm trí nhớ bởi streptozotocin.

Tác dụng này có được có thể là do khả năng gia tăng các chất chống oxy hóa não (enzym

catalase, SOD, glutathion) và tăng cường khả năng tiết acetylcholin của E-pterostilben

[163].

1.1.3.5. Tác dụng chống ung thư

Một số hợp chất từ chi Nho đã được chứng minh có tác dụng chống ung thư. Hợp

chất E-resveratrol (7) có khả năng chuyển hóa pha II của các chất gây ung thư, qua đó

tăng cường khả năng thải trừ chúng ra khỏi cơ thể [164]. E-Resveratrol ngăn chặn sự

phát triển của tế bào ung thư thông qua ức chế sự hoạt động của các yếu tố phiên mã và

tăng trưởng như p53, ATF3 [165].

Cùng với E-resveratrol, E-pterostilben (5) có tác dụng trên nhiều dòng tế bào ung

thư như ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư tuyến tụy, ung thư gan và ung thư

trực tràng [166], [167]. Cơ chế tác dụng của các hợp chất này được xác định do khả

năng kích thích quá trình gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis), chống tăng sinh,

dừng chu kỳ tế bào và ức chế sự tạo mạch [166], [167], [168].

Một số hợp chất khác thuộc chi Nho như E-piceatannol (2), Z-resveratrol (6) hay

amurensin G (60) cũng đã được đánh giá tác dụng chống ung thư. Hợp chất E-

piceatannol có khả năng làm giảm sự tăng sinh và xâm lấn của tế bào ung thư gan

AH109A thông qua dừng chu kỳ tế bào, gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis)

và chống oxy hóa [169]. E-Piceatannol cũng được báo cáo có tác dụng ức chế sự di căn

của tế bào ung thư tuyến tiền liệt và ung thư vú [170], [171]. Bên cạnh đó, hợp chất Z-

resveratrol (6) và amurensin G (60) thể hiện tác dụng chống ung thư trên tế bào ung thư

bạch cầu chuột L1210, ung thư máu người K562 và ung thư trực tràng HTC116 [10].

Ngoài ra, hợp chất amurensin G cũng có khả năng chống tạo mạch máu, ức chế đáng kể

sự phát triển của khối u trên dòng tế bào ung thư vú kháng tamoxifen TAMR-MCF-7

[172] và giảm kháng thuốc chống ung thư [173].

1.2. Tổng quan về loài Nho rừng

Tên khoa học: Vitis heyneana Roem. & Schult.

Đồng danh:

Vitis ficifolia var. pentagona Pamp.

Vitis heyneana subsp. heyneana (Batalin) H. Hara

Vitis kelungensis Momiy.

Vitis lanata Roxb.

Vitis pentagona Diels & Gilg

Vitis pentagona var. honanensis Rehder

Vitis quinquangularis Rehder

Vitis thunbergii var. yunnanensis Planch. ex Franch.

Cho đến nay, có rất ít các nghiên cứu về loài Nho rừng V. heyneana Roem. &

Schult. được công bố. Các nghiên cứu này chủ yếu liên quan đến đặc điểm hình thái

thực vật và thành phần hóa học.

1.2.1. Đặc điểm thực vật của Nho rừng

Dây leo dài tới 10 m, thân và nhánh non có lông cứng và lông tơ như nhện màu

vàng, sau đó nhẵn, có màu nâu đen; cuống, mặt dưới lá và cụm hoa có lông tơ như tơ

nhện màu vàng nhạt; tua cuốn đối diện lá, xẻ đôi ở đỉnh. Lá đơn, mọc cách, cuống lá dài

1,5-6 cm, thường ngắn hơn nhiều so với phiến lá; phiến lá hình bầu dục hoặc hình trứng,

cỡ 4-15 x 3-11 cm, nguyên hoặc có 3 thùy nông, gốc lá cụt hoăc lõm, hiếm khi hình tim,

mép lá có 8-15 đôi răng cưa nhọn, chóp lá nhọn, thường có mũi; gân lá hình chân vịt,

gân từ gốc lá 5, gân giữa có 4-6 đôi gân bên, gân cấp 3 thường song song, nổi rõ ở mặt

dưới; lá kèm hình trứng, dài 3-5 mm, sớm rụng. Cụm hoa dạng chùy, đối diện với lá,

dài 4-15 cm, các nhánh bên phía dưới rất dài, cuống cụm hoa dài 1-4 cm, cuống hoa dài

2-3 mm, không có lông; nụ hoa hình chứng ngược, dài xấp xỉ bằng cuống hoa, không

có lông. Hoa tạp tính, mẫu 5, đài hình chén, mép nguyên hoặc lượn sóng; cánh hoa hình

trứng ngược, dính nhau ở đỉnh thành mũ, rụng khi hoa nở; nhị đối diện cánh hoa, chỉ

nhị mảnh, cỡ 1 mm, bao phấn 2 ô hình dầu dục, cỡ 0,5 mm ở hoa đực và hoa lưỡng tính,

ở hoa cái bao phấn tiêu giảm; triền mỏng, mép có thùy nông; bầu hình trứng, vòi nhụy

hình trụ ngắn, núm nhụy không phình to ở hoa cái, ở hoa đực bầu tiêu giảm còn lại triền

hình đĩa. Quả mọng hình cầu, đường kính 1,3-1,5 cm, khi chín màu tím đen. Hạt hình

trứng ngược, dài 8-10 mm, đỉnh tròn, gốc thuôn nhọn [1], [5].

1.2.2. Thành phần hóa học của Nho rừng

Các công bố đến nay cho thấy, đã có 58 hợp chất được xác định phân bố ở các bộ

phận của loài Nho rừng V. heyneana như thân, rễ, lá, quả. Trong đó 13 hợp chất

stilbenoid được phân lập chủ yếu từ thân và rễ, 1 hợp chất phenol, 3 hợp chất sterol và

3 hợp chất triterpenoid được phân lập từ thân, và 2 triterpenoid cùng 5 hợp chất

megastigman được phân lập từ lá Nho rừng. Các hợp chất phenol (flavonoid và acid hữu

cơ) đã được xác định có trong cao chiết quả Nho rừng bằng phương pháp sắc kí hiệu

năng cao kết hợp khối phổ. Các hợp chất được trình bày tại bảng 1.10.

Bảng 1.10. Các hợp chất đã được phân lập từ loài Nho rừng V. heyneana

TT

Nhóm cấu trúc

Tên chất

Bộ phận

TLTK

Z-Piceid (3)

Rễ

[3]

Monomer

E-Resveratrol (7)

Thân, rễ

[12], [53]

(+)-Ampelopsin A (14)

Thân

[28]

(+)-Balanocarpol (15)

Thân

[33]

Amurensin A (18)

Thân, rễ

[53]

Dimer

Pallidol (23)

Quả

[37]

Stilbenoid

E-ε-Viniferin (35)

Thân

[28], [33]

Vitisinol A (41)

Rễ

[44]

Ampelopsin C (53)

Thân

[28]

Trimer

Quinquangularol (71)

Thân, rễ

[53]

Heyneanol A (80)

Thân

[28]

Tetramer

Hopeaphenol (81)

Rễ

[3]

Vitisin A (91)

Thân, rễ

[53]

Catechin (103)

Flavonoid

Quả

[37]

Epicatechin (104)

Epigallocatechin (105)

Epicatechin-3-O-gallat (106)

Quercetin 3-glucosid (108)

Quercetin 3-glucuronid (109)

Delphinidin-3-O-glucosid (114)

Cyanidin-3-O-glucosid (115)

Peonidin-3-O-glucosid (116)

Cyanidin-3-O-coumaroylglucosid

(118)

Peonidin-3-O-coumaroylglucosid

(119)

Malvidin-3-O-coumaroylglucosid

(120)

Delphinidin-3,5-O-diglucosid (121)

Cyanidin-3,5-O-diglucosid (122)

Petunidin-3,5-O-diglucosid (123)

Peonidin-3,5-O-diglucosid (124)

Malvidin-3,5-O-diglucosid (125)

Delphinidin-3-O-acetylglucosid-5-

O-glucosid (126)

Cyanidin-3-O-acetylglucosid-5-O-

glucosid (127)

Petunidin-3-O-acetylglucosid-5-O-

glucosid (128)

Delphinidin-3-O-

coumaroylglucosid-5-O-glucosid

(129)

Cyanidin-3-O-coumaroylglucosid-

5-O-glucosid (130)

Petunidin-3-O-coumaroylglucosid-

5-O-glucosid (131)

Peonidin-3-O-coumaroylglucosid-5-

O-glucosid (132)

Delphinidin-3-O-coumaroylglucosid

(133)

Malvidin-3-O-coumaroylglucosid-

5-O-glucosid (134)

Acid ferulic (142)

Acid coumaric (143)

Acid caﬀeic (144)

Các hợp chất phenol

Acid cinnamic (145)

khác

2-(4-hydroxyphenyl)-2,3-

dihydrobenzo[b]furan-3,4,6-triol

(146)

Stigmasterol (148)

β-Sitosterol (149)

Thân

[33]

β-Sitostenon (163)

Acid betulinic (165)

Lupeol (166)

Triterpenoid

β-Amyrin (167)

Betulin (168)

25,26,27-trinor-3β,24- dihydroxycycloartan (169)

Cycloart-23-en-3β,25-diol (170)

Lá

[67]

(3S,5R,6R,9R)-Megastigman- 3,5,6,9-tetrol-9-O-β-ᴅ- glucopyranosid (171)

Actinidioionosid (172)

Các hợp chất khác

(6S,9R)-Roseosid (173)

Icarisid B5 (174)

Icarisid B1 (175)

1.2.3. Tác dụng và công dụng của Nho rừng

Nho rừng đã được sử dụng khá phổ biến trong y học dân gian Việt Nam cũng như

các nước lân cận. Theo Võ Văn Chi [2], Nho rừng có vị hơi đắng, chua, tính bình. Rễ,

vỏ rễ có tác dụng điều kinh hoạt huyết, thư cân hoạt lạc, chỉ huyết. Toàn cây chỉ huyết,

khu phong thấp, an thai, thanh nhiệt. Lá thanh nhiệt, lợi thấp, tiêu thũng, giải độc. Ở

Trung Quốc và Campuchia, người dân tại đây dùng rễ Nho rừng để trị đòn ngã tổn

thương, gân cốt tê đau, viêm phế quản, bệnh lậu, chữa kinh nguyệt không đều và làm

thuốc lợi tiểu.

Mặc dù đã được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền, tuy nhiên ngoài nghiên

cứu của Huang và cộng sự (2011) các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Nho rừng còn

khá hạn chế. Theo nhóm nghiên cứu của Huang, cao chiết methanol từ thân cây Nho

rừng có khả năng ức chế sản sinh NO trong đại thực bào chuột bị kích thích bởi LPS với

IC50 là 132 µg/ml. Cao phân đoạn ethyl acetat cũng thể hiện tác dụng chống viêm thông

qua khả năng ức chế sản sinh NO 50% ở nồng độ 50 µg/ml và ức chế 90% ở nồng độ

100 µg/ml. Ngoài ra, cao ethyl acetat cùng với hai hợp chất E-ε-viniferin (34) và 2-(4-

hydroxyphenyl)-2,3-dihydrobenzo[b]furan-3,4,6-triol (146) còn có tác dụng bảo vệ gan

bị tổn thương bởi CCl4, tác dụng tương tự silymarin và resveratrol [33].

1.3. Tổng quan về viêm

1.3.1. Khái niệm viêm

Khái niệm viêm (inflammation), có nguồn gốc từ tiếng latin “inflammatio” có

nghĩa là đốt cháy, là một quá trình quan trọng trong hệ miễn dịch của cơ thể, nhằm loại

bỏ hoặc sửa chữa các mô bị tổn thương và vô hiệu hóa tác nhân có hại, sau đó khôi phục

lại cân bằng nội môi [174], [175], [176]. Trong phản ứng viêm, các hợp chất trung gian

gây viêm như bradykinin, serotonin, histamin, prostaglandin và nitric oxid được giải

phóng và gây ra các triệu chứng lâm sàng điển hình như sưng, nóng, đỏ, đau [177].

Viêm có thể chia làm 2 dạng chính là viêm cấp tính và viêm mạn tính. Viêm cấp

tính là đáp ứng tức thì của hệ miễn dịch chống lại mầm bệnh và tổn thương mô. Đây là

một quá trình tự giới hạn nhanh, được trung gian bởi các eicosanoid và các amin hoạt

mạch, làm tăng chuyển động của huyết tương và bạch cầu tới vị trí bị nhiễm bệnh [178].

Các triệu chứng của viêm cấp tính là sưng, nóng, đỏ, đau, phù và mất chức năng hoạt

động [177], [179]. Viêm cấp tính diễn ra trong thời gian ngắn, và thường được coi như

một biện pháp tự điều trị của cơ thể [180]. Trong giai đoạn đầu của đáp ứng viêm, các

chất trung gian tiền viêm như prostaglandin và leukotrien đóng vai trò quan trọng [181].

Tuy nhiên, sự tiến triển từ viêm cấp tính sang viêm mạn tính trong nhiều căn bệnh phổ

biến lại liên quan đến sự gia tăng các chất trung gian gây viêm này [182].

1.3.2. Các chất trung gian trong phản ứng viêm

1.3.2.1. Vai trò của acid arachidonic

Các chất trung gian mạnh của phản ứng viêm đều là các chất dẫn xuất của acid

arachidonic (AA), một acid béo không bão hòa có nguồn gốc từ màng phospholipid tế

bào. Trong điều kiện bình thường nồng độ AA tự do bên trong tế bào khá thấp [183].

Khi xuất hiện kích thích như chấn thương cơ học, cytokin và các yếu tố tăng trưởng, AA

được giải phóng khỏi màng phospholipid bởi enzym phospholipase [184].

Quá trình chuyển hóa acid arachidonic diễn ra theo một trong bốn con đường chính

sau đây: Một là con đường cyclooxygenase (COX), bao gồm sự tạo thành prostaglandin

(PG), thromboxan (Tx), và prostacyclin. Hai là con đường lipoxygenase (LOX), trong

đó tạo ra leukotrien (LT) và lipoxin. Ba là con đường cytochrom P450 monooxygenase,

trong đó có sự hình thành acid epoxyeicosatrienoic và hydroxy-eicosatetraenoic. Và

bốn là con đường peroxy hóa lipid, trong đó tạo ra isoprostan [177].

1.3.2.2. Con đường COX

COX giúp acid arachidonic chuyển thành endoperoxid, bao gồm các chất trung

gian hóa học để sản xuất prostaglandin và thromboxan [185], [186].

a. Các dạng của COX

COX còn được biết đến với tên gọi là prostaglandin endoperoxid H synthase

(PGHS) và tồn tại dưới 2 dạng: PGHS-1 (COX-1) và PGHS-2 (COX-2), với vai trò xúc

tác quá trình oxy hóa AA thành prostanoid [187]. COX-1 và COX-2 là hai hệ thống tổng

hợp prostanoid riêng biệt với các chức năng sinh học khác biệt biệt. Trong khi, COX-1

tồn tại trong hầu hết các mô động vật có vú, đóng vai trò trong việc sản xuất PG, kiểm

soát các quá trình sinh lý bình thường. Ngược lại, COX-2 là một enzyme cảm ứng chịu

trách nhiệm sản xuất các PG gây viêm và đau [188].

b. Vai trò của COX-2 trong viêm và ung thư

COX-2 là nguồn chính xúc tác tạo ra prostanoid trong viêm [189]. Các prostanoid

là các chất trung gian hóa học đóng vai trò quan trọng trong quá trình viêm. Trong các

mô viêm, quá trình sinh tổng hợp của chúng gia tăng đáng kể và góp phần phát triển tín

hiệu của chứng viêm cấp [190].

COX-2 bị kích thích mạnh bởi các yếu tố tăng trưởng, cytokin, endotoxin, các phân

tử tiền viêm và các promoter khối u, và chịu trách nhiệm chính cho quá trình sản xuất

PG trong chứng viêm cấp và viêm mạn tính [191]. Sự biểu hiện quá mức của COX-2 có

liên quan đến nồng độ cao của PGE2 và đã được chứng minh trong một số bệnh lý u ác

tính vú, phổi, da, cổ tử cung, đầu và cổ [192].

1.3.2.3. Con đường NOS

NOS xúc tác biến đổi L-arginin thành L-citrullin, đồng thời tạo ra NO, một gốc

tự do thể khí [193]. Hợp chất này hoạt động như một phân tử truyền tải gen đặc biệt

trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý quan trọng [194], [195], [196]. Quá trình tạo ra

nitric oxid được xúc tác bởi 3 isozym NOS tương đồng, trong đó eNOS và nNOS và có

nhiệm vụ sản xuất ra NO với nồng độ thấp để điều chỉnh huyết áp và các chức năng thần

kinh. Ngược lại iNOS kích thích bởi cytokin sẽ sản sinh ra một lượng lớn NO trong các

tế bào viêm đã được kích hoạt [197].

NO được tổng hợp từ L-arginin bởi iNOS là một chất trung gian đa chức năng liên

quan đến quá trình giãn mạch trong phản ứng viêm và là một chất tín hiệu quan trọng

cũng như gây độc tế bào. Sự sản sinh quá mức gốc tự do này sẽ dẫn đến gây bệnh cho

mô chủ, bởi NO có thể liên kết với các gốc tự do superoxid khác gây tổn thương đến

chức năng tế bào [195], [198]. iNOS được biểu hiện ở nhiều loại tế bào khác nhau trong

điều kiện bình thường và bệnh lý, bao gồm các đại thực bào, tế bào thần kinh đệm, tế

bào keratinocyt, tế bào gan, và tế bào biểu mô mạch máu. Với các tác nhân kích thích

nhiễm trùng và kích thích tiền viêm, lượng protein iNOS được sinh ra rất cao để tạo

thành NO trong phạm vi micromol, trong khi đó lượng NO sản sinh từ các enzym nNOS

và eNOS là hằng số và chỉ ở phạm vi nanomol [194]. Sự biểu hiện của iNOS có thể

được điều chỉnh bởi các tác nhân như interferon-γ, IL-1β, TNF-α, LPS và stress oxy hoá

[199].

1.3.2.4. NF-κB và mối quan hệ giữa COX-2 và iNOS trong phản ứng viêm

Tín hiệu nuclear factor kappa B (NF-κB) đóng vai trò trung tâm trong việc điều

chỉnh phản ứng viêm thông qua sự phiên mã gen tiền viêm COX-2 và iNOS. Mặc dù ở

tế bào bình thường, yếu tố này ở trạng thái bất hoạt, nhưng trong tế bào ung thư yếu tố

này ở trạng thái hoạt hóa. Sự hoạt hóa này gây ra bởi các chất kích thích khác nhau (như

các mitogen, các cytokin viêm và LPS), các chất gây ung thư, và các sản phẩm gen trung

gian hình thành khối u [200], [201].

NF-κB hiện diện trong tế bào chất ở dạng phức hợp không hoạt động kết hợp với

một protein ức chế là IκB. Sự tiếp xúc của tế bào với kích thích viêm kích động sẽ làm

cho phức hợp NF-κB / IκB phân ly bởi phản ứng phosphoryl hóa IKK (IκB kinase), sau

đó phosphorylates IκB ở Ser-32 và Ser-36, theo sau là sự thoái hóa proteosomal của IκB.

Tiếp theo, NF-κB chuyển vị từ tế bào chất sang nhân. Trong nhân tế bào, NF-κB thúc

đẩy quá trình phiên mã số lượng lớn các gen mục tiêu mã hoá các enzym gây viêm, bằng

cách liên kết với yếu tố cis-acting κB (Hình 1.13). Trong số các chất điều hòa phiên mã

trong vùng promoter của iNOS và COX-2, NF-κB dường như là yếu tố phiên mã thiết

yếu nhất cho sự biểu hiện của các enzym viêm trong các tế bào bị kích thích bởi LPS

[201], [202], [203], [204], [205]. Vì sự biểu hiện và hoạt động của cả iNOS và COX-2

đều gây ra bởi các tác nhân tiền viêm giống nhau và có những điểm tương đồng trong

sinh lý bệnh, người ta đã đề xuất rằng việc ức chế cả iNOS và COX-2 sẽ tạo ra tác dụng

chống viêm mạnh nhất. Do đó, iNOS và COX-2 là đích tiếp cận đầy hứa hẹn trong chống

viêm cũng như phòng ngừa ung thư [206].

LPS

TLR4

IKK

IκB

Chuyển vị

Protein NF-κB P65 P5 COX-2, iNOS

Thoái hóa IκB

COX-2, iNOS

Phiên mã gen COX-2, iNOS

mRNA

NF-κB P65 P5

Nhân tế bào

Hình 1.12. Sơ đồ cơ chế viêm theo con đường NF-κB [201], [202], [203]

1.3.3. Một số mô hình đánh giá tác dụng chống viêm

1.3.3.1. Mô hình in vitro

a. Tế bào và thử nghiệm gây độc tế bào của mẫu thử

Tế bào đại thực bào chuột thường được sử dụng trong các nghiên cứu đánh giá

tác dụng chống viêm in vitro. Bởi đây là những tế bào thiết yếu được hình thành và

chuyên biệt từ các monocyte để đáp ứng với các kích thích gây bệnh. Nhiều dòng tế bào

đại thực bào đã được sử dụng, phổ biến nhất là dòng RAW264.7, dòng J774, hay dòng

NR8383 [110], [118], [56].

Tế bào đại thực bào được nuôi cấy ở môi trường thích hợp. Sau đó, người ta đánh

giá tác dụng gây độc tế bào của mẫu thử. Thử nghiệm MTT assay được sử dụng phổ

biến. Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào cơ chế ức chế sự phát triển của tế bào

trên hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể của tế bào sống sót còn lại sau khi

được xử lý với các mẫu thử. Enzym này biến đổi tetrazolium có màu vàng nhạt thành

formazan có màu vàng đậm, cơ chế phát hiện dựa trên sự đo màu ở bước sóng λ = 570

nm [86].

b. Các đích nghiên cứu

*Các protein: Về bản chất, phần lớn các chất trung gian trong đáp ứng viêm là các

protein, ví dụ như COX-2, PGE2, iNOS và các cytokin viêm như IL-1β và TNF-α, nên

có thể được định tính và định lượng dựa trên nguyên tắc phản ứng kháng nguyên – kháng

thể. Cụ thể, tế bào đại thực bào được xử lý trước với mẫu thử trong 2h và ủ với LPS

(1μg/mL) trong 24 h. Nồng độ các protein trên trong dịch tế bào được phân tích bằng

phương pháp Western blot [69] hoặc bộ kit ELISA [69]

*NO: Để định lượng nồng độ NO, người ta sử dụng thuốc thử Griess gồm 1%

sulfanilamid, 0,1% N-1-naphthylenediamin dihydrochlorid và 2,5% acid phosphoric.

Đầu tiên, các tế bào được xử lý với mẫu thử trong 2 giờ rồi sau đó ủ với LPS (1 μg/mL).

Sau quá trình ủ, các dịch môi trường trên được trộn lẫn với thuốc thử Griess. Độ hấp thụ

của hỗn hợp được đo ở 540 nm với một đầu đọc microplate. Nồng độ nitrit được tính

theo đường chuẩn của dung dịch nitrit [58], [56].

* Mức độ biểu hiện gen gây viêm: Để tìm hiểu sâu hơn về cơ chế chống viêm, các nghiên

cứu gần đây thường đánh giá mức độ biểu hiện gen gây viêm thông qua định lượng

mRNA. Bằng phương pháp RT-PCR, các tác giả có thể đánh giá mức độ biểu hiện

mRNA của iNOS, COX-2, TNF-α và IL-6 [69], [118].

c. Các phương pháp đo lường

*Phương pháp định lượng RT- PCR

Kỹ thuật định lượng RT-PCR được nhiều tác giả sử dụng để định lượng mRNA của

TNF-α, COX-2, iNOS, qua đó đánh giá mức độ ức chế biểu hiện gen của mẫu thử.

Trong sinh học phân tử, PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một trình tự xác định

ADN nhờ enzym. Đối với ARN, vì không thể đóng vai trò làm khuôn mẫu trực tiếp cho

PCR nên cần thêm bước phiên mã ngược (reverse transcription – RT) để ARN chuyển

thành ADN bổ trợ (cADN) và trở thành khuôn mẫu thích hợp cho PCR. Kết hợp hai

phương pháp này tạo thành phương pháp PCR phiên mã ngược (RT-PCR). Một cải tiến

khác của kĩ thuật PCR truyền thống là PCR thời gian thực. Đây là một phương pháp

đáng tin cậy và hiệu quả để xác định và đo lường các sản phẩm được tạo ra trong suốt

mỗi chu kì PCR. Trong các nghiên cứu gần đây, kĩ thuật PCR thời gian thực được kết

hợp với PCR phiên mã ngược được sử dụng để định lượng mRNA liên quan đến mức

độ biểu hiện gen gây viêm [68], [101], [42].

Về nguyên tắc, hàm lượng sản phẩm của PCR bắt đầu tăng cao từ chu kỳ ngưỡng (Ct).

Do đó, một phương pháp tương đối phổ biến và hiệu quả để xác định mức độ biểu hiện

gen là dựa vào độ chênh lệch giữa Ct của gen đích và Ct của gen tham chiếu (gen biểu

hiện ổn định trong tất cả các tế bào ở các giai đoạn phát triển khác nhau). Từ đó, tính tỉ

lệ biểu hiện của gen đích trên mẫu thử so với mẫu chứng.

* Phương pháp Western blot:

Đây là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tính đặc hiệu của kháng thể để phát hiện

protein kháng nguyên. Phương pháp này cho phép phát hiện một protein xác định trong

một hỗn hợp phức tạp nhiều protein khác nhau [210]. Phương pháp này thường được

tiến hành theo các bước cơ bản như sau: Xử lý mẫu: Sau khi nuôi cấy, các tế bào được

thu gom và rửa. Các tế bào sau đó được dung giải và ly tâm. Phần dung dịch phía trên

được thu thập và nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford; Điện di

protein: Phần dung dịch đem đun sôi và điện di trên gel; Chuyển protein sang màng lai

nitrocellulose: Protein trong gel được chuyển sang màng nitrocellulose; Quá trình lai:

Màng lai đã cố định protein được lai với kháng thể sơ cấp, đây là kháng thể của protein

cần phát hiện. Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp

tục gắn kháng thể thứ cấp có gắn enzym phân hủy cơ chất tạo màu; Phát hiện vị trí lai:

Các ban protein được phát hiện bằng cách sử dụng chất tăng cường phát quang hóa học

[211], [212]

*Phương pháp miễn dịch gắn kết enzym liên kết (ELISA)

Hiện nay, để định lượng các chất trung gian gây viêm như PGE2 và các cytokin,

người ta sử dụng bộ kit ELISA theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nguyên tắc ELISA

cạnh tranh là phản ứng cạnh tranh xảy ra giữa kháng nguyên (trong mẫu thử) cạnh tranh

với kháng nguyên (được đánh dấu) để liên kết với một lượng kháng thể giới hạn, mà

trước đó kháng thể này đã được đưa lên một pha rắn. Sau khi phản ứng cân bằng, người

ta rửa sạch các kháng nguyên không liên kết và đo tín hiệu từ phần đánh dấu. Các bước

thử được thực hiện theo hướng dẫn của kit thử. Tín hiệu đo được tỷ lệ nghịch với nồng

độ chất phân tích trong mẫu [57].

*Phương pháp đánh giá hoạt tính phiên mã gen bằng thí nghiệm phân tích hoạt

động luciferase

Thí nghiệm phân tích hoạt động luciferase thường được sử dụng để đánh giá hoạt

tính phiên mã gen đối với NF-kB. Để thực hiện thí nghiệm này, vùng gen khởi động của

gen cần nghiên cứu được sao chép lên vector biểu hiện gen luciferase. Sau đó, các vector

này được đưa vào tế bào để xảy ra quá trình phiên mã và dịch mã. Cuối cùng, người ta

thu thập và phân giải tế bào để giải phóng ra các protein (bao gồm cả luciferase). Thêm

vào đó luciferin cùng điều kiện thích hợp, nhờ xúc tác của enzym luciferase, luciferin

sẽ chuyển hóa thành oxyluciferin kèm theo sự phát sáng. Sử dụng thiết bị thích hợp để

đo cường độ ánh sáng và tính toán kết quả.

1.3.3.2. Mô hình in vivo

Để khẳng định tác dụng của mẫu thử, người ta thường tiến hành thêm các nghiên

cứu in vivo. Các mô hình thử nghiệm chống viêm in vivo phổ biến bao gồm: mô hình

gây phù chân chuột [214], mô hình gây viêm khớp [79], mô hình gây tràn dịch màng

bụng [1] và mô hình tạo u hạt [215].

Khi đánh giá tác dụng chống viêm, các tác giả cũng thường đồng thời đánh giá

tác dụng giảm đau vì đau cũng là một trong những triệu chứng điển hình khi viêm. Một

số thử nghiệm giảm đau in vivo thường gặp như: mô hình gây đau quặn bằng acid acetic

[216], mô hình gây đau bằng formalin [108] hay mô hình gây đau bằng mâm nóng [70].

Nhìn chung các thử nghiệm chống viêm, giảm đau in vivo đều tương đối phổ biến

và thường quy, do vậy trong phần tổng quan, chúng tôi không trình bày sâu về những

thử nghiệm này.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Phần trên mặt đất loài Nho rừng mọc tự nhiên tại xã Bản Mế, huyện Si Ma Cai,

tỉnh Lào Cai, được thu hái vào tháng 9/2016.

2.1.2. Nguyên liệu

Mẫu nghiên cứu là phần trên mặt đất loài Nho rừng mọc tự nhiên tại xã Bản Mế,

huyện Si Ma Cai, tỉnh Lào Cai, được thu hái vào tháng 9/2016. Mẫu được lưu tại Phòng

Tiêu bản Thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội (HN) và được TS.

Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định.

Mẫu nghiên cứu sau khi thu hái, được sấy ở nhiệt độ 40 - 50ºC đến khi đạt độ ẩm

khoảng 5%. Làm nhỏ mẫu đến kích thước phù hợp và bảo quản trong túi kín.

2.1.3. Động vật thực nghiệm

- Chuột cống trắng chủng Wistar khỏe mạnh, cân nặng 150 - 180 g do Học viện Quân

Y cung cấp.

- Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino khỏe mạnh, cân nặng 18 - 20 g do Viện Vệ

sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.

Động vật được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng, ánh sáng tự nhiên, cho ăn bằng

thức ăn chuẩn, uống nước tự do. Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện thí nghiệm tại

Bộ môn Dược lực - Đại học Dược Hà Nội tối thiểu 5 ngày trước khi bắt đầu nghiên cứu.

2.1.4. Thuốc thử, hóa chất, dung môi

- Hóa chất cho nghiên cứu thực vật: Javen, đỏ carmin, xanh methylen, nước cất.

- Các dung môi dùng trong chiết xuất như methanol (MeOH), n-hexan, EtOH, ethyl

acetat (EtOAc), aceton, dichloromethan (DCM) là dung môi công nghiệp đã cất lại; các

dung môi dùng cho kết tinh, tinh chế là dung môi tinh khiết của Trung Quốc.

- Các dung môi, hóa chất dùng trong định tính đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam

- Silica gel 60 (sắc ký cột pha thường), cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm (Merck); silica gel

pha đảo YMC (30 − 35 μm, FuJisilisa Chemical Ltd); MIC, Sephadex, bản mỏng silica

gel G F254 (Merck), RP18 (Merck).

- Chất gây viêm lipopolysaccharid (LPS, cat: L4391), meloxicam (cat: M3935) và

MTT (cat: M2128) của hãng Sigma (St. Louis, MO, Mỹ).

- Tế bào RAW264.7 từ trung tâm lưu trữ tế bào ở Mỹ (ATCC, Rockville, MD); 3-

(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid, a tetrazol-MTT) do công ty hóa

chất Roche (USA) cung cấp.

- Kháng thể β-actin của hãng Sigma (St.Louis, MO, cat: A5316, Mỹ).

- Huyết thanh bò, DMEM, RPMI, trypsin từ Gibco BRL (Grand Island, NY, Mỹ).

- COX-2 (1:1000, cat: 610204) và heat shock protein 90 (HSP90) (1:1000, cat

610418) từ BD Biosciences (Mỹ).

- Kháng sinh penicillin, streptomycin (100 µg/ml), NaCl, Tris-HCl, NP40 của hãng

Sigma (St. Louis, MO, Mỹ).

- Kháng thể chuột thứ cấp hoặc thỏ thứ cấp liên hợp HRP (1:5000 hoặc 1:10000)

của hãng Cell Signaling (Mỹ).

- 5-Bromo-2′-deoxy-uridine (BrdU) labeling và kit phát hiện của Roche (Mannheim,

Germany).

- ELISA kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, Mỹ) để đo PGE2.

- BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, Mỹ).

- Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) kit (cat. 34095, Pierce West

Femto, Thermo Fisher Scientific, Mỹ).

- Plasmid NF-κB, thuốc thử LipofectAMINE2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA,

Mỹ).

- microRNeasy kit mini (Qiagen, 217.004, Germany) .

- Quantifast SYBR Xanh RT-PCR (Qiagen, 204.156, Germany).

- Thuốc thử chuyển gen Oligofectamine (Life Technologies, Mỹ).

- Thuốc chứng dương: Indomethacin 25 mg của Domesco, aspirin 100 mg của

Traphaco, Prednisolon 5 mg của Dược phẩm Nam Hà.

- Các hóa chất dùng trong nghiên cứu dược lý thực nghiệm: Acid acetic (Merck,

Đức), carrageenan (Sigma Aldrich), Na-CMC 0,1% (Sigma Aldrich, Mỹ).

2.1.5. Máy móc, thiết bị

2.1.5.1. Các thiết bị dùng trong nghiên thực vật học

Các thiết bị dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: Kính hiển vi quang học Leica,

kính lúp soi nổi Leica, máy ảnh kỹ thuật số Canon.

2.1.5.2. Các thiết bị và máy móc dùng trong nghiên cứu hóa học

- Cột sắc ký các loại

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Đức)

- Tủ sấy Memmert (Memmert, Mỹ)

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa, Thụy

Sĩ)

- Đèn UV-Vilber lourmat (Vilber, Pháp)

- Máy siêu âm Power sonic 405 (Hwashin, Hàn Quốc)

- Máy đo:

+ Điểm nóng chảy: GALLENKAMP (Sanyo, Nhật Bản)

+ Góc quay cực: JASCO V-550 UV/Vis spectrometer (Tokyo, Nhật Bản)

+ Phổ khối lượng phun mù điện: Varian Agilent 1100LC-MSD

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR (Bucker, Mỹ)

của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.5.3. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu hoạt tính sinh học

- Máy đo quang microplate reader (Varioskan, Thermo Electron Co., Mỹ).

- Máy chụp western blot và PCR (LAS 4000, Nhật Bản).

- Máy UV-VIS 1800 dải đo 190 - 800 nm (Shimadzu, Nhật Bản)

- StepOnePlus RT-PCR cycler, Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific, Mỹ)

- Bộ Western blot (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, Mỹ).

2.2. Địa điểm nghiên cứu

2.2.1. Địa điểm nghiên cứu thực vật

- Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu.

- Phòng Thực vật - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu hóa học

- Khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu.

- Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3. Địa điểm nghiên cứu tác dụng sinh học

- Khoa Khoa học Y khoa Thực nghiệm, Khoa Y, Đại học Lund, Thụy Điển.

- Bộ môn Dược lực – Đại học Dược Hà Nội.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Thu thập, xử lý mẫu nghiên cứu

- Thu thập mẫu nghiên cứu ở phía Bắc Việt Nam.

- Sấy mẫu dược liệu ở nhiệt độ 40 - 50ºC đến khi đạt độ ẩm khoảng 5%.

- Xử lý mẫu đến kích thước phù hợp và bảo quản trong túi kín cho tới khi đưa vào

nghiên cứu.

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thực vật học

- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật.

- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản.

- Phương pháp hình thái so sánh được áp dụng để xác định loài. Các mẫu nghiên cứu

được so sánh và đối chiếu với khóa phân loại và bản mô tả trong các tài liệu [1], [5], [6].

- Áp dụng phương pháp vi học để nghiên cứu cấu tạo giải phẫu và đặc điểm bột dược

liệu các bộ phận rễ, thân, lá của loài [207].

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.3.1. Phương pháp định tính

Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa

học đặc trưng [208], [209].

2.3.3.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất

- Dược liệu được chiết bằng phương pháp hồi lưu với EtOH 96%; phân đoạn bằng

các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần (n-hexan và EtOAc).

- Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột; theo dõi các phân đoạn bằng

sắc ký lớp mỏng.

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý và các

dữ liệu phổ bao gồm: Điểm chảy, góc quay cực riêng, phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại

(UV), phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, đồng thời so

sánh với dữ liệu phổ của hợp chất đã biết.

2.3.4. Phương pháp nghiên cứu một số tác dụng sinh học

2.3.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu

➢ Tác dụng chống viêm in vitro

- Chuẩn bị cao ethanol 96% (VH) và các cao phân đoạn (n-hexan - VHH, ethyl acetat

- VHE và cao nước - VHW) của cao EtOH 96% phần trên mặt đất của Nho rừng theo

phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3.2.

- Chuẩn bị một số hợp chất stilbenoid và oligostilbenoid từ cao phân đoạn VHE của

Nho rừng bằng phương pháp sắc kí cột.

➢ Tác dụng giảm đau, chống viêm in vivo:

Chuẩn bị cao VHE theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3.2

2.3.4.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống viêm

➢ Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro

a. Đánh giá khả năng ức chế mức độ biểu hiện COX-2 mRNA bằng kỹ thuật RT – PCR

− Nuôi cấy tế bào: Tế bào RAW264.7 được nuôi cấy ở 37°C, 5% CO2 trong môi trường

* Tiến hành:

RPMI có chứa 10% huyết thanh bào thanh bò FCS 1% kháng sinh penicillin (100 đơn

vị/ml) và streptomycin (100 μg/ml). Đối với tất cả các thí nghiệm, các tế bào được nuôi

đến mật độ 80-90% và chịu không quá 20 lần phân chia tế bào.

− Chuẩn bị mẫu:

+ Mẫu chứng (C): Tế bào RAW264.7 không được kích thích viêm bằng LPS hay

cao chiết và được ủ với DMSO (1% thể tích DMSO/ thể tích môi trường tế bào).

+ Mẫu đối chứng dương: Tế bào RAW264.7 được kích thích viêm bằng LPS pha

với DMSO đạt nồng độ 5 µg/ml và không bổ sung cao chiết.

+ Mẫu thử (T): Tế bào RAW264.7 được kích thích viêm bằng LPS pha với DMSO

đạt nồng độ 5 µg/ml và bổ sung cao chiết (cao chiết tổng, cao n-hexan, cao ethyl acetat,

cao nước) pha trong DMSO đạt nồng độ 50 µg/ml.

− Tách RNA tổng số và định lượng RT - PCR

Tế bào nuôi cấy được thu gom, rửa và ly giải trong 700 ul Qiazol và sau đó kỹ

thuật cô lập RNA được thực hiện bằng microRNeasy kit mini theo hướng dẫn của nhà

sản xuất. Phản ứng RT-PCR được thực hiện bằng cách sử dụng bộ Quantifast SYBR

Xanh RT-PCR. Các điều kiện phản ứng được sử dụng theo đúng hướng dẫn của nhà sản

xuất. Các xét nghiệm sau Quantitect Primer đã được sử dụng để phát hiện mRNA: COX-

2 (Ptgs2), Mm_GADPH. Trình tự các đoạn mồi là độc quyền của Qiagen.

* Tính kết quả:

Tính theo công thức của Livak

R = 2-ΔΔCt

Trong đó:

R: tỉ lệ biểu hiện của gen đích trên mẫu thử so với mẫu chứng

ΔΔCt = [Ct(T/Tg) - Ct(T/Ref)] - [Ct(C/Tg) - Ct(C/Ref)]

Với:

Ct(T/Tg): Chu kỳ ngưỡng của gen đích COX-2 trong mẫu thử

Ct(T/Ref) : Chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu GADPH trong mẫu thử

Ct(C/Tg): Chu kỳ ngưỡng của gen đích COX-2 trong mẫu chứng

Ct(C/Ref): Chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu GADPH trong mẫu chứng

Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 6 lần. Kết quả thí nghiệm được hiển thị bằng

trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (M  SE).

b. Đánh giá khả năng ức chế mức độ biểu hiện COX-2 và iNOS bằng phân tích Western

blot

*Tiến hành:

Tế bào đại thực bào RAW264.7 được bổ sung 5 µg/ml LPS ủ trong 18 h có hoặc

không có các chất được phân lập. Các tế bào được thu và rửa sạch với nước muối đệm

phosphat lạnh (PBS). Các tế bào được ly giải trên băng trong 30 phút trong 100 ul dung

dịch ly giải [60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol]. Dịch chiết tế bào sau đó

được đun sôi trong 5 phút (100°C) và ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 30 phút. Nồng

độ dịch chiết tế bào được xác định bằng phương pháp BCA và điện di trên gel SDS –

polyacrylamid 10%. Sau khi điện di kết thúc, protein trong gel được chuyển sang màng

nitrocellulose, sau đó được ủ với kháng thể nguyên cấp (COX-2 1:1000, iNOS 1:1000 và

β-actin 1:5000). Màng sau đó được ủ thêm với kháng thể thứ cấp peroxidase liên hợp

(chuột hoặc thỏ 1:4000).

* Tính kết quả:

Mật độ các băng protein được phát hiện bằng dung dịch west femto, hình ảnh được

phát hiện và phân tích bằng máy LICOR [213].

c. Đánh giá khả năng ức chế mức độ sản sinh PGE2 bằng phương pháp miễn dịch gắn kết

enzym liên kết (ELISA)

* Tiến hành:

Bước 1: Sàng lọc độc tính của mẫu thử trên dòng tế bào RAW264.7 để lựa chọn

nồng độ tối đa mà không thể hiện độc tính trên tế bào cho các thử nghiệm sau.

Bước 2: Các tế bào RAW264.7 được nuôi trong 6 ngày trong môi trường RPMI

có bổ sung 10 % huyết thanh phôi bò.

Bước 3: Tế bào được tách ra, rửa và pha lại trong môi trường mới rồi chuyển vào

đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/giếng qua đêm.

Bước 4: Thêm vào các giếng mẫu cần thử với nồng độ thích hợp trong 24 h. LPS

được sử dụng là chất đối chứng. Sau 24 giờ ủ với các chất thử, hàm lượng PGE2 trong

môi trường được định lượng bằng phương pháp ELISA.

* Tính kết quả:

Đánh giá hoạt tính ức chế PGE2 dựa vào kết quả đo mật độ quang của chất thử

với mẫu trắng được xử lý bằng DMSO thay cho chất thử.

mật độ quang của mẫu thử % ức chế của mẫu thử = × 100 % mật độ quang của đối chứng dương

d. Đánh giá khả năng ức chế hoạt tính phiên mã NF-kB bằng thí nghiệm phân tích hoạt

động luciferase

* Tiến hành:

Bước 1: Các tế bào RAW264.7 được nuôi trong 6 ngày trong môi trường RPMI

có bổ sung 10 % huyết thanh phôi bò.

Bước 2: Tế bào được tách ra, rửa và pha lại trong môi trường mới có chứa FCS

rồi chuyển vào đĩa 12 giếng với mật độ 5x105 tế bào/giếng qua đêm.

Bước 3: Chuẩn bị COX-2 plasmid 2 ug + Hilymax 8 ul được trộn đều trong 70

ul môi trường RPMI không chứa FCS, kháng sinh và được ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút

trong ống nghiệm nhựa nhỏ. Hỗn hợp này được sử dụng cho 1 giếng thí nghiệm và trộn

đều cẩn thận từng giếng với hỗ hợp.

Bước 4: Thêm vào các giếng mẫu cần thử với nồng độ thích hợp và LPS 1ng/ml

trong 24 h. Sau 24 giờ ủ với các chất thử, COX-2 luciferase được được bằng phản ứng

phát quang.

* Tính kết quả:

mật độ luminescent của mẫu thử Tác dụng của mẫu thử = mật độ luminescent của DMSO

e. Đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO

* Tiến hành:

Đo độ hấp thụ của mẫu thử ở 540 nm so với mẫu chuẩn: 20 µL thuốc thử Griess

+150 µL mẫu thử +130 µL nước khử ion. Ủ hỗn hợp trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.

Chuẩn bị mẫu đối chứng trắc quang bằng cách trộn 20 µL + thuốc thử Griess +

280 µL nước khử ion.

Đo độ hấp thụ của các mẫu thử so với mẫu chuẩn trong máy đo quang phổ.

* Tính kết quả:

mật độ quang của mẫu thử Tác dụng của mẫu thử = mật độ quang của DMSO

➢ Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống viêm in vivo

❖ Đánh giá tác dụng chống viêm cấp

* Tiến hành:

- Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên làm 4 lô. Các lô chuột được cho uống thuốc

hoặc dung môi với cùng thể tích 1 ml/100 g chuột vào thời điểm 24 h và 1 h trước khi

gây viêm như sau:

+ Lô 1 (lô chứng bệnh): Uống NaCMC 0,5% với liều 1 ml/100 g cân nặng.

+ Lô 2 (lô đối chiếu): Uống indomethacin (kí hiệu IDM) pha trong NaCMC

0,5% với liều 10 mg/kg.

+ Lô 3 (lô thử liều 1): Uống VHE với liều 85 mg/kg cân nặng.

+ Lô 4 (lô thử liều 2): Uống VHE với liều 250 mg/kg cân nặng.

- Gây viêm bàn chân chuột bằng cách tiêm dưới da bàn chân carrageenan 1% pha

trong NaCl 0,9%.

- Đo thể tích chân chuột ở các thời điểm 2 h, 3 h, 4 h và 6 h sau khi gây viêm.

- So sánh mức độ phù chân chuột của các lô dùng thuốc so với lô chứng dùng dung

môi pha thuốc để đánh giá tác dụng chống viêm của thuốc.

* Tính kết quả:

- Tỷ lệ phù chân chuột được tính theo công thức:

Trong đó:

∆V%: Tỉ lệ tăng thể tích bàn chân chuột V0: Thể tích chân chuột trước khi gây viêm Vt: Thể tích chân chuột sau khi gây viêm t giờ

Vt - V0 ∆V% = x 100 V0

- Tỉ lệ ức chế phù chân chuột được tính theo công thức:

I% = x 100 Trong đó: ∆Vchứng, ∆Vthử là mức độ tăng thể tích bàn chân chuột trung bình tại cùng thời điểm ở mẫu chứng và mẫu thử, tương ứng.

∆Vchứng - ∆Vthử ∆ Vchứng ❖ Đánh giá tác dụng chống viêm mạn

* Tiến hành:

- Chuột cống trắng, cả hai giống, khoẻ mạnh được chia ngẫu nhiên làm 4 lô, mỗi lô

10 con.

+ Lô 1 (lô chứng bệnh): Uống Na CMC 0,1% với liều 1 ml/100 g cân nặng

+ Lô 2 (lô chứng dương): Uống prednisolon với liều 5 mg/kg

+ Lô 3 (lô thử liều1): Uống VHE với liều 85 mg/kg cân nặng

+ Lô 4 (lô thử liều 2): Uống VHE với liều 250 mg/ kg cân nặng

- Gây viêm mạn bằng cấy viên bông tẩm carrageenan 1% (20 ± 1 mg/con chuột) đã

được tiệt trùng (ở 60ºC trong 2 giờ).

- Sau khi cấy u hạt, cho chuột uống liên tục 7 ngày. Ngày thứ 8 tiến hành giết chuột

bằng ether, bóc tách u hạt, cân khối lượng ướt của hạt rồi đem sấy ở 60ºC đến khối lượng

không đổi (khoảng 18 giờ). Cân u hạt khô.

Trong đó:

* Tính kết quả: Tỷ lệ ức chế u hạt được tính theo công thức:

Tc - Tt

I% = x 100%

I: Tỷ lệ ức chế u hạt Tc: Trọng lượng trung bình khối u hạt ở lô chứng bệnh Tt: Trọng lượng trung bình khối u hạt ở lô thử

2.3.4.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng giảm đau

* Tiến hành:

- Chuột nhắt trắng được chia làm 4 lô.

+ Lô 1 (lô chứng bệnh): Uống NaCMC 0,5% với liều 0,1 ml/10 g cân nặng.

+ Lô 2 (lô đối chiếu): Uống aspirin liều 240 mg/kg.

+ Lô 3 (lô thử liều 1): Uống VHE với liều 150 mg/kg.

+ Lô 4 (lô thử 2): Uống VHE với liều 450 mg/kg.

- Cho chuột uống thuốc hoặc dung môi vào thời điểm 24h và 1h trước khi gây đau.

Gây đau quặn bằng cách tiêm màng bụng dung dịch acid acetic 1% với liều 0,1 ml/10g

chuột. Ngay sau khi tiêm dung dịch acid acetic 1%, đếm số cơn đau quặn trong từng 5

phút một đến phút thứ 30. So sánh số cơn đau quặn ở từng thời điểm của các lô dùng

thuốc so với lô chứng dùng dung môi pha thuốc để đánh giá tác dụng giảm đau của

thuốc.

* Tính kết quả:

Trong đó:

Tính tỷ lệ % giảm số cơn đau quặn theo công thức:

Dc - Dt

A% = x 100%

A% là tỷ lệ giảm số cơn đau quặn của lô uống mẫu thử; Dc là số cơn đau quặn của lô chứng; Dt là số cơn đau quặn của lô uống mẫu thử.

2.3.4.4. Xử lý số liệu

- Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học,

sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel.

- Kết quả thí nghiệm được hiển thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (M

 SE) (M: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn).

- Đánh giá, so sánh thống kê giữa các lô thí nghiệm bằng phương pháp t- test student

hoặc một chiều phân tích của học sinh phương sai (ANOVA) để so sánh nhiều nhóm.

Sự khác biệt được coi là đáng kể khi p < 0,05. Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p

< 0,05.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật

3.1.1. Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học

Dây leo, thân và nhánh non có lông tơ như tơ nhện màu vàng - trắng, sau đó nhẵn;

cuống, mặt dưới lá và cụm quả có lông tơ như tơ nhện màu nâu vàng; tua cuốn đối diện

với lá, xẻ đôi ở đỉnh, phủ lông tơ dạng mạng nhện dày đặc lúc non, sau nhẵn. Lá đơn,

mọc so le; lá kèm rụng sớm, có vết lá kèm ở gốc cuống lá; cuống lá dài 2-6 cm, phủ lông

tơ dạng mạng nhện dày đặc, ngắn hơn rất nhiều so với phiến lá; phiến lá hình bầu dục

hoặc hình trứng, kích thước 4-10 x 3-7 cm, nguyên hoặc có 3 thùy nông; gốc lá hình

tim hoặc cụt, mép lá có 19-22 đôi răng cưa nhọn, đỉnh nhọn hoặc có mũi nhọn; gân lá

hình chân vịt, gân từ gốc lá 5, gân giữa có 5-7 cặp, gân cấp 3 song song, nổi rõ ở mặt

dưới, hơi lõm ở mặt trên; mặt dưới lá phủ lông tơ màu nâu xám, mặt trên có lông tơ dạng

mạng nhện lúc non, sau nhẵn (Hình 3.1). Cụm hoa dạng chùy, đối diện với lá, dài đến

12 cm, các nhánh bên phía dưới dài đến 4 cm, các nhánh bên ngắn dần, cuống cụm hoa

dài 2,5-3 cm, cuống hoa dài khoảng 2 mm, không có lông; nụ hoa hình trứng ngược,

khoảng 2 x 1,6 mm, đỉnh tròn, không có lông. Hoa mẫu 5-6 hoặc 7; đài hình chén, không

chia thùy hoặc thùy rất ngắn; cánh hoa hình trứng ngược hoặc giáo, khoảng 2 x 0,6-0,8

mm, nhẵn, màu xanh, dính nhau ở đỉnh thành mũ, rụng ngay khi hoa nở; số nhị bằng số

cánh hoa, mọc đối diện với cánh hoa, chỉ nhị mảnh, nhẵn, dài 1 mm, bao phấn hai ô,

đính gốc, màu vàng nhạt, khoảng 0,6 x 0,5 mm; bầu hình trứng, màu xanh, nhẵn, khoảng

1,5 x 1,1 mm, vòi nhụy ngắn, núm nhụy màu trắng, tròn hoặc chia thùy nông, mép tua

(Hình 3.2). Cụm quả chùm kép, đối diện lá, dài 10-15 cm, cuống cụm quả dài 3-4 cm,

chia nhiều nhánh, các nhánh phía dưới dài hơn các nhánh phía trên. Quả mọng hình cầu,

kích thước không đều trong cùng một cụm, đường kính 0,9-1,4 cm, khi chín màu tím

đen, nhẵn, vị rất chua. Hạt 3-4 trong một quả, hình trứng ngược, đỉnh tròn, gốc thuôn

nhọn, hơi xẻ 2, kích thước khoảng 6 x 4 mm; vỏ hạt nhẵn, mặt lưng có một đốm màu

nâu ở giữa với đường sọc màu vàng nâu kéo dài qua đỉnh sang hết mặt bụng đến gốc

hạt, mặt bụng có hai rãnh dọc xuất phát từ đỉnh hạt đến gần đỉnh, khía sâu vào hạt (Hình

3.1).

Chú thích: a. Cành mang lá, chùm quả; b. Thân già; c. Thân non; d. Tua cuốn; e. Lá; f. Gốc lá; g. Chóp lá; h. Chùm quả; i. Quả; j. Quả (cắt ngang); k. Hạt (mặt bụng); l. Hạt (mặt lưng); m. Hạt (cắt ngang); n. Hạt (cắt dọc).

Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của loài Nho rừng

Chú thích: a. Cụm hoa; b. Một phần cụm hoa; c. Nụ hoa; d. Tràng hoa (mẫu 5 - 6 - 7); e. Tràng hoa; f-g-h. Hoa đã bỏ tràng, bộc lộ bộ nhị và nhụy (nhìn từ mặt bên, dưới, trên); i. Bầu.

Hình 3.2. Đặc điểm hoa của loài Nho rừng

Đối chiếu với bản mô tả ghi trong các tài liệu phân loại thực vật, loài Nho rừng

được sơ bộ xác định thuộc chi Vitis L., họ Nho (Vitaceae) và được TS. Nguyễn Thế

Cường – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam

giám định tên khoa học là Vitis heyneana Roem. & Schult., họ Nho (Vitaceae). Mẫu

mang số hiệu TL07 được lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện khoa học

và Công nghệ Việt Nam.

3.1.2. Đặc điểm vi phẫu

➢ Đặc điểm vi phẫu thân

Vi phẫu có thiết diện tròn. Từ ngoài vào trong gồm: Biểu bì cấu tạo bởi 1 hàng tế

bào hình tròn xếp sát nhau, vách ngoài phủ 1 lớp cutin mỏng, thỉnh thoảng có lông che

chở đơn bào (1). Tiếp theo là mô dày tập trung thành từng đám, gồm khoảng 20 hàng tế

bào, có vách dày bằng cellulose, dày lên ở các góc (2). Mô mềm rất mỏng gồm 1-2 hàng

tế bào hình đa giác, hình tròn, kích thước lớn sắp xếp lộn xộn nhau tạo thành các khoảng

gian bào (3). Sợi (4) gồm khoảng 10 hàng tế bào màng dày hóa gỗ, xếp tạo thành hình

cung phía trên bó dẫn. Mô dẫn tạo thành từng bó riêng biệt, gồm libe (5) và gỗ (6) tiếp

xúc nhau ở một mặt, libe ở phía ngoài và gỗ ở phía trong, tạo nên bó chồng, giữa các bó

mô dẫn là tia ruột. Mô mềm ruột ở trong cùng cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác kích

thước lớn, thành mỏng, xếp lộn xộn (7). Tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm rải rác ở

mô mềm libe và mô mềm ruột (8), tinh thể calci oxalat hình kim có nhiều ở mô mềm

ruột (9) (Hình 3.3).

Chú thích: 1. Biểu bì; 2. Mô dày; 3. Mô mềm vỏ; 4. Sợi; 5. Libe; 6. Gỗ; 7. Mô mềm ruột

8. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 9. Tinh thể calci oxalat hình kim.

Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân loài Nho rừng

➢ Đặc điểm vi phẫu lá

Gân lá: Mặt trên hơi lõm. Mặt dưới lồi thành hình cung. Từ dưới lên trên gồm:

Biểu bì dưới (1) cấu tạo bởi 1 hàng tế bào hình tròn xếp xít nhau, vách ngoài phủ 1 lớp

cutin mỏng, thỉnh thoảng có lông che chở đơn bào (11). Mô dày dưới phân bố ở toàn bộ

mặt gân dưới gồm khoảng 3 hàng tế bào, vách dày lên đều đặn xung quanh tế bào (2).

Mô mềm gồm các tế bào hình tròn, kích thước lớn, xếp lộn xộn nhau để hở các khoảng

gian bào (3). Mô dẫn tạo thành bó, bó to nhất ở dưới biểu bì trên, gồm libe ở trên (5), gỗ

ở dưới (4). Mô cứng (6) gồm 2-3 hàng tế bào, nằm ngay trên libe. Mô dày trên tập trung

thành đám, gồm khoảng 8 hàng tế bào, vách dày lên đều đặn xung quanh tế bào (7). Biểu

bì trên (8) gồm 1 hàng tế bào hình tròn xếp sát nhau (Hình 3.4).

Phiến lá: Cấu tạo bởi biểu bì trên (8) và biểu bì dưới (1). Mô giậu gồm 1 hàng tế

bào hình chữ nhật xếp sát nhau (9). Mô khuyết (10) gồm những tế bào không đều, để hở

những khoảng gian bào lớn, rỗng, chứa đầy khí. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai (11)

nằm rải rác trong mô khuyết và tinh thể calci oxalat hình kim (12) nằm trong mô giậu

(Hình 3.4).

1 2

13

11

3

4

5

10 6 12

9 7 8

Chú thích: 1. Biểu bì dưới; 2. Mô dày dưới; 3. Mô mềm; 4. Gỗ; 5. Libe; 6. Mô cứng; 7. Mô dày

trên;8. Biểu bì trên; 9. Mô giậu; 10. Mô khuyết; 11. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 12. Tinh

thể calci oxalat hình kim; 13. Lông che chở.

Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu lá loài Nho rừng

3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu

➢ Đặc điểm bột thân

Bột màu xám, không mùi, không vị. Soi trên kính hiển vi có các đặc điểm sau:

Tinh thể calci oxalat hình kim dài khoảng 60-80 µm (1), hình cầu gai kích thước khoảng

25 x 25 µm (7) và hình khối kích thước khoảng 10 x 10 µm (9). Hạt tinh bột hình chuông

kích thước khoảng 20 x 25 µm (2). Sợi (3). Mảnh mạch xoắn (4) và mảnh mạch điểm

(8). Mảnh mô mềm gồm các tế bào hình đa giác, xếp lộn xộn (5). Lông che chở đơn bào

dài khoảng 300 µm (6) (Hình 3.5).

1

2

3

5

4

6

9

7

8

xoắn;5. Mảnh mô mềm; 6. Lông che chở đơn bào; 7. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 8. Mạch điểm; 9. Tinh thể calci oxalat hình khối. ➢ Đặc điểm bột lá

Hình 3.5. Đặc điểm bột thân loài Nho rừng Chú thích: 1. Tinh thể calci oxalat hình kim; 2. Hạt tinh bột hình chuông; 3. Sợi; 4. Mạch

Bột màu xám, không mùi, không vị. Soi bột trên kính hiển vi có các đặc điểm sau:

Tinh thể calci oxalat hinh kim dài khoảng 60-80 µm (1a, 1b) và hình cầu gai kích thước

khoảng 25 x 25 µm (5) riêng lẻ hoặc tập trung thành đám. Mảnh mạch xoắn (2) và mạch

điểm (3a, 3b). Hạt tinh bột đơn, hình tròn đường kính khoảng 25 µm (4). Lông che chở

đơn bào dài khoảng 300 µm (7) (Hình 3.6).

1

2

3

4

6

7

5

Hình 3.6. Đặc điểm bột lá loài Nho rừng Chú thích: 1a,1b. Tinh thể calci oxalat hình kim; 2. Mạch xoắn; 3a,3b. Mạch điểm; 4. Hạt tinh bột; 5. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 6. Mảnh mạch; 7. Lông che chở. 3.2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học

3.2.1. Kết quả định tính

Định tính các nhóm chất chính trong phần trên mặt đất của loài Nho rừng cho

thấy sự có mặt của các nhóm chất như flavonoid, tanin, acid amin, đường khử,

polysaccharid, chất béo và sterol (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Kết quả định tính phần trên mặt đất của loài Nho rừng

STT

Nhóm chất

Phản ứng

Kết quả

Phản ứng với TT Mayer

Alcaloid

Phản ứng với TT Dragendorff

Phản ứng với TT Bouchardat

Phản ứng Liebermann-Burchardat

Glycosid tim

Phản ứng Legal

Phản ứng Baljet

3 Anthranoid

Phản ứng Bourntraeger

Phản ứng Cyanidin

++

Flavonoid

Phản ứng với kiềm

+

Phản ứng với FeCl3 5%

++

Phản ứng mở và đóng vòng lacton

Coumarin

Hiện tượng huỳnh quang

Phản ứng tạo bọt

Saponin

Phản ứng Salkowski

Phản ứng Liebermann-Burchardat

Phản ứng với FeCl3 5%

++

Phản ứng với gelatin 1%

+

Tanin

Phản ứng với chì acetat 10%

++

Phản ứng với đồng acetat

++

8 Acid hữu cơ

Phản ứng với Na2CO3

9 Acid amin

Phản ứng với Ninhydrin 3%

10 Đường khử

Phản ứng với TT Fehling

11 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol

12 Chất béo

Vết mờ trên giấy bóng kính

Sterol

Phản ứng Liebermann-Burchardat

++

14 Caroten

Phản ứng với H2SO4 đặc

(-) Phản ứng âm tính; (+) Phản ứng dương tính; (++) Phản ứng dương tính rõ

3.2.2. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất

Quá trình chiết xuất, phân lập các hợp chất từ phần trên mặt đất loài Nho rừng được

tóm tắt trong sơ đồ 3.1, sơ đồ 3.2, và sơ đồ 3.3.

Phần trên mặt đất Nho rừng (1,5 kg)

Chiết hồi lưu EtOH 96%, 3 lần x 3h

Cắn EtOH 96% (68,11 g)

Phân tán trong nước, lắc lần lượt với n- hexan và EtOAc

Cắn n-hexan (VHH, 7,83 g)

Cắn EtOAc (VHE, 39,16 g)

Cắn nước (VHW, 13,43 g)

Sơ đồ 3. 1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ phần trên mặt đất loài Nho rừng

Phần trên mặt đất loài Nho rừng được phơi khô, cắt nhỏ (1,5 kg) và chiết hồi lưu

với ethanol 96% (3 h × 3 lần × 36 l). Lọc, gộp dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới

áp suất giảm thu được cắn ethanol (VH, 68,11 g). Phân tán cắn trong nước nóng (tỉ lệ

1:1), chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi là n-hexan và ethyl acetat. Các phân lớp

được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cắn tương ứng là n-hexan

(VHH, 7,83 g), ethyl acetat (VHE, 39,16 g) và cắn nước (13,43 g).

Cắn VHE (34,0 g) được tiến hành phân lập bằng sắc kí cột pha thường, rửa giải

với hệ dung môi DCM-MeOH (100:1-1:100, v/v), thu được 7 phân đoạn (VHE1-VHE7).

Phân đoạn VHE4 (1,5 g) được phân lập trên cột sắc ký pha thường sử dụng hệ dung môi

rửa giải DCM-MeOH (20:1, v/v) thu được hợp chất VH4 (13,0 mg) và 4 phân đoạn

(VHE4.1-VHE4.4). Phân đoạn VHE4.2 (200,0 mg) được rửa bằng hệ DCM-MeOH (1:1,

v/v) thu được hợp chất VH1 (50,0 mg). Phân đoạn VHE4.3 (150 mg) được rửa giải trên

cột Sephadex với hệ dung môi MeOH-H2O (2:1, v/v) thu được 2 hợp chất VH5 (13,0

mg) và VH6 (40,0 mg). Phân đoạn VHE5 (1,2 g) được phân lập trên cột sắc ký pha

thường sử dụng hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH (15:1, v/v) thu được 10 phân đoạn

(VHE5.1-VHE5.10). Phân đoạn VHE5.3 (100 mg) rửa giải trên cột Sephadex với hệ

dung môi MeOH-H2O (5:1, v/v) thu được hợp chất VH7 (25,0 mg). Phân lập phân đoạn

VHE5.4 (500 mg) trên cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH-H2O (1:2,

1:1, 2:1, v/v) thu được 3 hợp chất VH8 (25,0 mg), VH10 (13,0 mg) và VH9 (22,0 mg),

cùng 5 phân đoạn (VHE5.4.1-VHE5.4.5). Phân đoạn VHE5.4.3 (120 mg) rửa giải trên

cột MCI với hệ dung môi MeOH-H2O (3:2, v/v) thu được hợp chất VH11 (14,0 mg).

Phân đoạn VHE6 (300 mg) được phân lập trên cột Sephadex với hệ dung môi MeOH-

H2O (1:1, v/v) thu được 2 hợp chất VH2 (12,0 mg) và VH3 (25,0 mg). Phân đoạn VHE7

(500 mg) được phân lập bằng sắc kí cột pha đảo, rửa giải với hệ dung môi aceton-nước

(8:2, v/v) thu được hợp chất VH12 (15,0 mg).

Phân tách VHH (6,0 g) bằng sắc kí cột pha thường, rửa giải với hệ dung môi DCM-

MeOH (50:1-30:1, v/v), thu được 12 phân đoạn (VHH1-VHH12). Phân đoạn VHH2

(135 mg) được phân lập bằng sắc kí cột pha đảo, rửa giải với hệ dung môi aceton-nước

(6:1, v/v) thu được hợp chất VH13 (30,0 mg). Phân đoạn VHH3 (2,33 g) được phân tách

bằng sắc kí cột pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexan-aceton (7:1, v/v) thu được

8 phân đoạn (VHH3.1-VHH3.8). Phân đoạn VHH3.3 kết tinh trong aceton thu được hợp

chất VH14 (105,0 mg). Phân đoạn VHH9, VHH10 kết tinh trong aceton, lần lượt thu

được hợp chất VH15 (100 mg) và VH16 (61,0 mg).

DCM-MeOH (100:1-1:100, v/v)

Cao EtOAc (34,0 g)

VHE1

VHE2

VHE3

VHE6 (300 mg)

VHE5 (1,2 g)

VHE4 (1,5 g)

VHE7 (500 mg)

Sephadex, MeOH- H2O (1:1, v/v)

DCM – MeOH (20:1, v/v) Silica gel, DCM – MeOH (20:1, v/v)

C-18, Aceton – Me2CO- H2O H2O (4:1, v/v) (4:1, v/v)

VHE4.1

VHE4.4

VHE4.2 (200 mg)

VHE4.3 (150 mg)

VH2 (12,0 mg)

VH3 (25,0 mg)

VH12 (15,0 mg)

VH4 (13,0 mg)

Sephadex

Silica gel, DCM – MeOH (15:1, v/v) DCM – MeOH (15:1, v/v)

MeOH - H2O (2:1, v/v)

Silica gel, DCM – MeOH DCM – MeOH (1:1, v/v) (1:1, v/v)

VHE5.1

VHE5.2

VH1 (50,0 mg)

VH5 (13,0 mg)

VH6 (40,0 mg)

VHE5.3 (100 mg)

VHE5.4 (500 mg)

VHE5.5- VHE5.10

Sephadex, MeOH- H2O (5:1, v/v)

C-18, MeOH- H2O (1:2, 1:1, 2:1, v/v)

VH7 (25,0 mg)

VHE5.4.4

VHE5.4.5

VHE5.4.1

VHE5.4.2

VH10 (13,0 mg)

VH9 (22,0 mg)

VH8 (25,0 mg)

VHE5.4.3 (120 mg)

MCI, MeOH - H2O (1:1, v/v)

VH11 (14,0 mg)

Sơ đồ 3. 2. Sơ đồ phân lập các chất tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat của loài Nho rừng (V. heyneana)

Cao n-hexan

(6,6 g)

DCM-MeOH (50:1, 40:1, 30:1, v/v)

Silica gel, DCM – MeOH (50:1, 40:1, 30:1 v/v)

VHH1

VHH2

VHH3

VHH4-

VHH9

VHH10

VHH11-

(135 mg)

(2,33 g)

VHH8

VHH12

n-hexan - Me2CO (7:1, v/v) Silica gel, n-hexan - Aceton (7:1, v/v)

Kết tinh, Aceton Rửa / Me2CO

C-18, Me2CO – H2O (6:1, v/v) Aceton – H2O (6:1, v/v)

VH13

VHH3.1-

VHH3.3

VHH3.4-

VH15

VH16

(30 mg)

VHH3.2

(300 mg)

VHH3.8

(100,0 mg)

(61,0 mg)

Kết tinh / Aceton

VH14

(105,0 mg)

Sơ đồ 3. 3. Sơ đồ phân lập các chất tinh khiết từ phân đoạn n-hexan của loài Nho rừng (V. heyneana)

3.2.2.1. Hợp chất VH1

nc: 261-263ºC; ESI-MS m/z: 227,1 [M-H]-; dữ liệu phổ 1H-

Bột kết tinh màu kem; to

và 13C-NMR: Xem bảng 3.2.

Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH1

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH1

a,b H

C/H 1 2, 6 3, 5 4 1′ 2′, 6′ 3′, 5′ 4′ α β

* C 141,3 105,8 159,7 102,7 130,4 128,8 116,5 158,4 127,0 129,4

C 141,3 105,8 159,6 102,7 130,4 128,8 116,5 158,3 127,0 129,4

a,c (độ bội, J = Hz) - 6,47 (2H, d, 2,0) - 6,18 (1H, t, 2,0) - 7,36 (2H, d, 8,5) 6,79 (2H, d, 8,5) - 6,83 (1H, d, 16,0) 6,96 (1H, d, 16,0)

*C của resveratrol đo trong CD3OD, 75 MHz [217]; aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz

Phổ khối ESI-MS có pic ion tại m/z 227,1 [M-H]- (negative) cho biết khối lượng

phân tử của VH1 là M = 228, dự đoán công thức phân tử là C14H12O3, gợi ý là một hợp

chất stilben. Phổ 1H-NMR xuất hiện các cặp tín hiệu proton đặc trưng cho một stilben

khung resveratrol (có hai vòng thơm và một nối đôi) ở δH 6,47 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2,

H-6), 6,18 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4), 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,79 (2H, d, J

= 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,83 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-α), 6,96 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-β),

hằng số tương tác J = 16,0 Hz giữa H- α và H- β chứng tỏ sự tồn tại ở cấu hình trans

của hợp chất resveratrol. Phổ 13C-NMR chỉ rõ sự có mặt của ba carbon vòng thơm liên

kết với hydroxy xuất hiện ở δC 159,6 (C-3, C-5) và 158,3 (C-4′) cùng với 11 carbon lai

hóa sp2 ở trong khoảng δC 102,7-140,9. Trên cơ sở dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR và

tài liệu đã công bố [217], cấu trúc của VH1 được xác định là trans-3,5,4′-

trihydroxystilben hay trans-resveratrol (Hình 3.7).

3.2.2.2. Hợp chất VH2

nc: 223-226ºC; ESI-MS m/z: 413,1 [M+Na]+; phổ

1H- và 13C-NMR: Xem bảng 3.3.

Tinh thể hình kim màu trắng; to

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH2

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH2

a,c (độ bội, J = Hz)

& C 141,3 105,8 159,6 102,7 159,7 105,8 127,0 129,4 129,4 130,4 116,5 158,3

C/H 1 2 3 4 5 6 α β 1′ 2′, 6′ 3′, 5′ 4′ 1ʺ 2ʺ 3″ 4″ 5″

* C 141,5 107,0 159,6 104,1 160,5 108,4 126,7 130,0 130,4 129,0 116,5 158,5 102,5 75,0 78,1 71,5 78,3

C 141,4 107,1 159,6 104,1 160,5 108,4 126,7 130,0 130,3 128,9 116,5 158,4 102,4 75,0 78,1 71,5 78,2

6″

62,6

a,b H - 6,81 (1H, s) - 6,48 (1H, t, 2,0) - 6,64 (1H, s) 6,87 (1H, d, 16,0) 7,04 (1H, d, 16,0) - 7,39 (2H, d, 8,5) 6,79 (2H, d, 8,5) - 4,92 (1H, d, 7,5) 3,49 (1H, m) 3,49 (1H, m) 3,41 (1H, t, 9,0) 3,49 (1H, m) 3,74 (1H, dd, 6,0; 12,0) 3,95 (1H, dd, 2,0; 12,0)

&C của VH1 đo trong CD3OD, 125 MHz, *C của piceid đo trong CD3OD, 150 MHz [218];

aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz

Phổ khối ESI-MS của VH2 cho pic ion tại m/z 413,1 [M+Na]+ (positive) cho biết

1H-NMR của hợp chất VH2 tương tự như hợp chất VH1. Tuy nhiên VH2 còn xuất hiện

khối lượng phân tử của VH2 là M = 390, dự đoán công thức phân tử là C20H22O8. Phổ

thêm các tín hiệu của gốc đường glucose ở H 3,39-4,92. Tín hiệu proton anomer tại H

4,92 với hằng số tương tác cao (J = 7,5 Hz) chứng tỏ rằng cấu hình của gốc đường là β.

Sự chuyển dịch về trường thấp của proton thơm ở vị trí số 2 trong VH2 (H 6,81) so với

VH1 (H 6,47) gợi ý vị trí của gốc đường tại C-2. Phổ 13C-NMR của VH2 xuất hiện

thêm 6 tín hiệu carbon của một gốc đường glucose [C 102,4 (C-1ʺ), 78,2 (C-5ʺ), 78,1 (C-

3ʺ), 75,0 (C-2ʺ), 71,5 (C-4ʺ) và 62,6 (C-6ʺ)] ngoài 14 tín hiệu carbon của khung resveratrol.

Từ các dữ liệu phổ NMR, MS và so sánh với tài liệu tham khảo [218] cho phép xác định

VH2 là trans-resveratrol-3-O-β-ᴅ-glucosid với tên gọi khác là piceid hay polydatin

(Hình 3.8).

3.2.2.3. Hợp chất VH3

nc: 301-302ºC; [α]25

D = +132,9 (MeOH); ESI-MS m/z

Chất rắn màu nâu xám; to

929,3 [M+Na]+; dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR: Xem bảng 3.4.

Hình 3.9. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH3

H

Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH3

a,b H

C/H 1 2, 6 3, 5 4 7 8 9 10, 14 11, 13 12 1′ 2′

* C 133,9 127,9 116,1 157,9 93,8 57,1 147,2 106,9 159,8 102,1 128,8 132,5

*(độ bội, J = Hz) - 7,20 (2H, d, 8,5) 6,83 (2H, d, 8,5) - 5,36 (1H, d, 5,5) 4,41 (1H, d, 5,5) - 6,17 (2H, d, 2,0) - 6,22 (1H, d, 2,0) - 6,08 (1H, d, 2,0)

C 133,7 127,8 116,1 158,0 93,8 57,1 147,1 106,8 159,8 102,1 128,7 132,4

a,c (độ bội, J = Hz) - 7,18 (2H, d, 8,5) 6,83 (2H, d, 8,5) - 5,35 (1H, d, 5,5) 4,39 (1H, d, 5,5) - 6,16 (2H, d, 2,0) - 6,21 (1H, t, 2,0) - 6,09 (1H, d, 2,0)

3′ 4′ 5′ 6′ 7′ 8′ 9′ 10′ 11′ 12′ 13′ 14′ 1″ 2″, 6″ 3″, 5″ 4″ 7″ 8″ 9″ 10″ 11″ 12″ 13″ 14″ 1‴ 2‴, 6‴ 3‴, 5‴ 4‴ 7‴ 8‴ 9‴ 10‴ 11‴ 12‴ 13‴ 14‴

132,8 155,2 115,5 123,7 122,7 131,0 136,6 119,0 162,5 96,6 158,2 104,5 135,4 128,8 115,5 156,0 40,7 41,3 141,2 120,4 158,5 96,1 158,8 110,1 131,1 130,1 116,0 159,5 88,5 49,5 142,3 120,1 160,3 100,9 157,0 105,0

- - 6,72 (1H, d, 8,5) 6,87 (1H, dd, 2,0; 8,5) 6,39 (1H, s) 6,39 (1H, s) - - - 6,22 (1H) - 6,51 (1H, brs) - 7,03 (2H, d, 8,5) 6,66 (2H, d, 8,5) - 5,38 (1H, brs) 5,49 (1H, brs) - - - 6,08 (1H, d, 2,0) - 6,06 (1H, d, 2,5) - 7,14 (2H, d, 8,5) 6,77 (2H, d, 8,5) - 5,88 (1H, d, 11,5) 4,25 (1H, d, 11,5) - - - 6,04 (1H, d, 2,0) - 6,26 (1H, d, 2,0)

132,8 155,2 115,5 123,6 122,6 130,9 136,5 118,9 162,4 96,5 158,3 104,5 135,3 128,7 115,4 156,0 40,6 41,2 141,2 120,1 158,6 96,0 158,8 110,1 131,0 130,0 116,0 159,5 88,4 49,4 142,2 120,0 160,2 100,9 156,9 104,8

- - 6,72 (1H, d, 8,5) 6,87 (1H, dd, 2,0; 8,5) 6,39 (1H, s) 6,39 (1H, s) - - - 6,25 (1H, s) - 6,51 (1H, brs) - 7,03 (2H, d, 8,5) 6,66 (2H, d, 8,5) - 5,36 (1H, brs) 5,48 (1H, brs) - - - 6,08 (1H, d, 2,0) - 6,06 (1H, d, 2,5) - 7,14 (2H, d, 8,5) 6,77 (2H, d, 8,5) - 5,88 (1H, d, 11,5) 4,24 (1H, d, 11,5) - - - 6,06 (1H, d, 2,0) - 6,26 (1H, d, 2,0)

*C, H của và 2-r-viniferin đo trong aceton-d6, 100 MHz/400 MHz [219]; aĐo trong aceton-d6, b125

MHz, c500 MHz

Phổ khối ESI-MS cho peak ion tại m/z 929,3 [M+Na]+ (positive) cho biết khối

lượng phân tử của VH3 là M = 906, cùng với phổ NMR cho thấy công thức phân tử là

C56H42O12, dựa đoán là một tetramer stilben. Phổ 1H-NMR cũng cho tín hiệu đặc trưng

của một tetramer resveratrol với 23 tín hiệu proton của vòng thơm tại δH 6,06-7,18 trong

đó có 3 vòng thơm thế AA′BB′; 1 vòng thơm thế AA′M; hai tín hiệu của methin olefin

δH 6,39 (2H, s, H-7′, H-8′); hai tín hiệu proton oxymethin tại δH 5,88 (1H, d, J = 11,5

Hz, H-7‴), 5,35 (1H, brd, H-7), hai tín hiệu proton methin tại δH 4,39 (1H, d, J = 5,5 Hz,

H-8), 4,24 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-8‴) gợi ý sự xuất hiện của hai vòng benzofuran và hai

tín hiệu proton methin olefin tại δH 5,48 (1H, s, H-8″), 5,36 (1H, s, H-7″). Trên phổ 13C-

NMR cho tín hiệu của 56 carbon tương ứng với một tetramer resveratrol (C14H13O3); kết

hợp với phổ DEPT cho thấy xuất hiện tín hiệu của 12 carbon tại δC 155,2-160,5 đặc

trưng cho carbon vòng thơm bị hydroxyl hóa và 38 carbon lai hóa sp2 với δC 96,0-147,1.

Bốn tín hiệu carbon methin tại δC 40,6-57,1 và hai tín hiệu carbon oxymethin tại δC 93,8

(C-7), 88,4 (C-7‴). Tương tác trên phổ HSQC, HMBC cho phép xác định các vị trí

carbon-proton của bốn đơn vị resveratrol. Trên phổ HMBC xuất hiện sự tương tác giữa

H-7, H-8 với C-10′, C-11′, giữa H-7‴, H-8‴ với C-10″, C-11″ cho thấy sự xuất hiện của

hai vòng benzofuran. Tương tác giữa H-7″ với C-9‴, C-10‴ gợi ý sự xuất hiện của vòng

7 cạnh. Ngoài ra còn có sự tương tác giữa H-8″ và C-3′ gợi ý cho việc xác định cấu trúc

của VH3. Từ kết quả phân tích phổ 1D-, 2D-NMR, MS, so sánh tài liệu [219] có thể

kết luận chất VH3 là 2-r-viniferin (Hình 3.9).

3.2.2.4. Hợp chất VH4

D = +28,9 (MeOH); ESI-MS m/z: 453,1 [M+H]+, 475,2

Chất rắn màu trắng, [α]25

[M+Na]+; dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR: Xem bảng 3.5.

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH4

Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH4

C/H

H

* (độ bội, J = Hz)

H

a,c (độ bội, J = Hz)

C

*

C

a,b

1, 1′

130,5

131,4

7,73 (4H, d, 8,5)

7,57 (4H, d, 8,5)

130,3

2, 6, 2′, 6′

3, 5,

116,7

7,25 (4H, d, 8,5)

6,94 (4H, d, 8,5)

116,6

3′, 5′

159,7

4, 4′

159,3

92,8

7, 7′

5,79 (2H, d, 10,0)

5,47 (2H, d, 11,0)

93,7

48,3

8, 8′

4,81 (2H, d, 10,0)

4,53 (2H, d, 11,0)

48,6

136,8

9, 9′

137,3

121,8

10, 10′

122,5

160,8

11, 11′

160,1

97,3

12, 12′

96,9

6,83 (2H, brs)

6,18 (2H, d, 2,0)

13, 13′

159,7

6,16 (2H, d, 2,0)

6,76 (2H, brs)

104,5

104,3

14, 14′ *C, H của và betulifol A đo trong pyridin-d5, 100 MHz/400 MHz [29]; aĐo trong aceton-d6, b125 MHz,

c500 MHz

Phổ khối ESI-MS xuất hiện các peak ion ở m/z 453,1 [M+H]+, 475,1 [M+Na]+

cho thấy khối lượng phân tử của hợp chất VH4 là M = 452, tương ứng với công thức

phân tử là C28H24O8, gợi ý đây là một dimer stilben. Phổ NMR mang đặc điểm của nhóm

stilben, trong đó phổ 1H-NMR xuất hiện 8 tín hiệu proton, phổ 13C-NMR xuất hiện 14

tín hiệu carbon. Từ phổ MS và số lượng tín hiệu trên phổ NMR, gợi ý đây là một dimer

stilben có cấu trúc đối xứng. Phổ 1H-NMR xuất hiện 6 tín hiệu proton của vòng thơm

đặc trưng cho hai vòng thơm của một đơn vị resveratrol tại δH 7,57 (4H, d, J = 8,5 Hz,

H-2, H-6, H-2′, H-6′), 6,94 (4H, d, J = 8,5 Hz, H-3, H-5, H-3′, H-5′), 6,18 (2H, d, J =

2,0 Hz, H-12, H-12′), 6,16 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-14, H-14′), một tín hiệu proton

oxymethin tại δH 5,47 (2H, d, J = 11,0 Hz, H-7, H-7′) và một tín hiệu proton methin tại

δH 4,53 (2H, d, J = 11,0 Hz, H-8, H-8′) gợi ý sự đóng vòng benzofuran giữa hai đơn vị

resveratrol. Kết hợp phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho thấy tín hiệu đặc trưng cho 3

carbon vòng thơm bị hydroxy hóa tại δC 160,1 (C-11, C-11′), 159,7 (C-13, C-13′), 159,3

(C-4, C-4′) và 9 carbon lai hóa sp2 ở δC 96,9-137,3 đặc trưng cho hai vòng thơm của một

đơn vị resveratrol, một carbon oxymethin tại δC 93,7 (C-7, C-7′) và một carbon methin

tại δC 48,6 (C-8, C-8′). Dựa trên phổ HSQC xác định được vị trí carbon-proton của một

đơn vị resveratrol. Phổ HMBC cho thấy sự tương tác giữa proton H-7, H-8 với C-10′,

cho thấy có sự đóng vòng benzofuran giữa H-7, H-8 của một đơn vị resveratrol và C-

10, C-11 của đơn vị còn lại, đồng thời tương tác giữa proton H-14/H-14′ với C-8/C-8′

gợi ý sự hình thành vòng 6 cạnh giữa 2 đơn vị resveratrol, tạo nên cấu trúc đối xứng. Từ

kết quả phân tích phổ 1D-, 2D-NMR, MS, kết hợp với tài liệu [29], có thể kết luận hợp

chất VH4 là betulifol A (Hình 3.10).

3.2.2.5. Hợp chất VH5

D = +87,5 (MeOH); ESI-MS m/z: 429,1 [M+H]+, dữ liệu phổ

1H- và 13C-NMR: Xem bảng 3.6.

Bột màu vàng; [α]25

Hình 3.11. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH5

Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH5

C/H

C

*

H

* (độ bội, J = Hz)

H

a,c (độ bội, J = Hz)

C

a,b

136,8

136,2

2, 6

129,4

6,90 (2H, d, 8,5)

6,89 (2H, d, 8,5)

128,2

3, 5

115,7

6,62 (2H, d, 8,5)

114,6

156,2

157,1

46,4

3,31 (1H, m)

3,29 (1H, m)

45,6

52,5

3,16 (1H, m)

3,23 (1H, m)

51,7

148,7

147,3

10, 14

107,1

6,12 (2H, d, 2,0)

6,08 (2H, d, 2,5)

106,0

11, 13

159,1

157,9

101,5

6,10 (1H, d, 2,0)

6,07 (1H, d, 2,0)

100,3

1′

129,4

127,9

2′, 6′

129,7

7,36 (2H, d, 8,5)

7,32 (2H, d, 9,0)

128,7

3′, 5′

116,4

6,79 (2H, d, 8,5)

6,75 (2H, d, 9,0)

115,3

4′

159,1

158,5

7′

135,5

6,74 (1H, d, 17,0)

6,71 (1H, d, 16,0)

135,6

8′

129,2

6,88 (1H, d, 17,0)

6,86 (1H, d, 16,0)

127,7

9′

155,1

155,4

10′

131,6

6,16 (1H, s)

6,24 (1H, s)

129,5

11′

201,6

204,2

12′

50,4

3,00 (2H, d, 6,0)

3,01 (1H, m)

49,2

13′

34,6

3,15 (2H, m)

3,11 (1H, m)

33,6

*C, H của và vitisinol C đo trong aceton-d6, 125 MHz/500 MHz [44]; aĐo trong aceton-d6, b125 MHz,

c500 MHz

Phổ khối ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 429,1 [M+H]+ (positive) cho thấy khối

1H-NMR xuất hiện tín hiệu proton của hai vòng thơm AA′BB′ tại δH 6,62 (2H, d, J = 8,5

lượng phân tử của VH5 là M = 428, tương ứng với công thức phân tử là C27H24O5. Phổ

Hz, H-3, H-5), 6,89 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, H-6) và 6,75 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3′, H-

5′), 7,32 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2′, H-6′); tín hiệu δH 6,07 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-12) và

6,08 (2H, d, J = 2,5 Hz, H-10, H-14) đặc trưng cho vòng AA′M. Ngoài ra còn có tín

hiệu multiplet tại δH 3,29 (1H, m, H-7), 3,23 (1H, m, H-8) đặc trưng cho proton methin,

hai tín hiệu proton methylen tại δH 3,01 (2H, m, H-12′) và 3,11 (2H, m, H-13′), một tín

hiệu proton olefinic methin tại δH 6,24 (1H, s, H-10′) đặc trưng cho nối đôi nội vòng,

hai tín hiệu proton olefinic methin tại δH 6,71 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7′), 6,86 (1H, d, J

= 16,0 Hz, H-8′) với hằng số tương tác J = 16,0 cho thấy hai proton liên kết nối đôi với

cấu hình trans. Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu của 1 carbon carbonyl tại δC

204,2, 4 carbon vòng thơm bị hydroxy hóa tại δC 157,1-158,5 và 11 carbon lai hóa sp2

của carbon không no tại δC 106,0-147,3 đặc trưng cho ba vòng thơm, trong đó có 2 vòng

AA′BB′ và một vòng AA′M, ba carbon olefinic methin tại δC 135,6 (C-7′), 127,7 (C-8′),

129,5 (C-10′) và một carbon bậc 4 nối đôi tại δC 155,4 (C-9′) đặc trưng cho một nối đôi

nội vòng và một nối đôi ngoại vòng, hai carbon methylen tại δC 33,6 (C-13′), 49,2 (C-

12′) và hai carbon methin tại δC 51,7 (C-8), 45,6 (C-7). Trên phổ HMBC cho thấy các

carbon - proton methylen, methin và methin olefin nội vòng có tương tác với nhau,

proton methylen δH 3,01 (H-12′) tương tác với carbon carbonyl δC 204,2 (C-11′), proton

methin δH 3,23 (H-8) tương tác với carbon olefinic δC 155,4 (C-9′) gợi ý có sự xuất hiện

của vòng 7 cạnh. Tương tác giữa proton olefin δH 6,86 (H-8′) với carbon olefinic δC

129,5 (C-10′) và carbon methylen δC 33,6 (C-13′) cho thấy nối đôi gắn vào vòng 7 cạnh

tại vị trí carbon nối đôi bậc 4. Từ các dữ liệu phổ, kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo

[44] có thể xác định VH5 là vitisinol C (Hình 3.11).

3.2.2.6. Hợp chất VH6

D = -47,0 (MeOH); ESI-MS m/z: 477,1

Chất rắn màu nâu xám; tºnc: 150-152ºC; [α]25

[M+Na]+; dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR: Xem bảng 3.7.

Hình 3.12. Cấu trúc hóa học và các tương tác COSY (─), HMBC chính (→)

của hợp chất VH6

Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH6

C/H

C

*

H

* (độ bội, J = Hz)

H

a,c (độ bội, J = Hz)

C

a,b

133,6

133,9

2, 6

127,9

7,21 (2H, d, 7,0)

127,9

7,20 (2H, d, 8,5)

3, 5

116,0

6,83 (2H, d, 7,0)

116,2

6,83 (2H, d, 8,5)

157,9

158,2

93,6

5,44 (1H, d, 5,5)

93,9

5,42 (1H, d, 5,5)

57,0

4,46 (1H, d, 5,5)

57,1

4,47 (1H, d, 5,5)

147,1

147,4

10, 14

106,8

6,24 (2H, brs)

107,0

6,24 (2H, s)

11, 13

159,5

159,9

101,9

6,24 (1H, brs)

102,1

6,24 (1H, s)

1′

129,9

2ʹ, 6′

128,4

7,19 (2H, d, 7,0)

128,7

7,17 (2H, d, 8,5)

3ʹ, 5ʹ

116,1

6,74 (2H, d, 7,0)

116,3

6,73 (2H, d, 8,5)

4ʹ

157,9

158,2

7ʹ

129,9

6,91 (1H, d, 16,5)

130,1

6,90 (1H, d, 16,5)

8ʹ

123,2

6,71 (1H, d, 16,5)

123,5

6,71 (1H, d, 16,5)

9ʹ

136,1

136,4

10ʹ

119,5

119,8

11ʹ

162,2

162,5

12ʹ

96,6

96,8

6,33 (1H, d, 2,0)

13ʹ

159,2

159,6

14ʹ

104,0

104,2

6,77 (1H, d, 2,0)

6,72 (1H, m)

*C, H của (-)-trans-ε-viniferin đo trong aceton-d6, 100 MHz/400 MHz [28]; aĐo trong aceton-d6, b125 MHz, c500

MHz

Phổ khối ESI-MS xuất hiện peak ion phân tử ở m/z 477,1 [M+Na]+ cho thấy khối

lượng phân tử của VH6 là M = 454, kết hợp với phổ NMR xác định được công thức

phân tử của hợp chất là C28H22O6, khẳng định hợp chất là một dimer stilben. Phổ 1H-

NMR cho thấy tín hiệu của 13 proton vòng thơm tại δH 6,24-7,20 trong đó có 2 vòng

thơm AA′BB′, 1 vòng ABX và 1 vòng thơm AA′M; 2 tín hiệu của proton methin olefin

δH 6,90 và 6,71 với hằng số tương tác lớn (J = 16,5 Hz) chứng tỏ sự tồn tại ở cấu dạng

trans của một đơn vị resveratrol; 1 tín hiệu proton methin tại δH 4,47 (1H, d, J = 5,5 Hz,

H-8) và 1 tín hiệu proton oxymethin tại δH 5,42 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-7) đặc trưng của

vòng benzofuran. Phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu của 28 carbon, kết hợp với phổ DEPT

cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của 6 carbon tại vùng δC 158,2-162,5 đặc trưng cho carbon

vòng thơm bị hydroxyl hóa và 21 carbon không no lai hóa sp2 δC 96,8-147,4. Một tín

hiệu carbon methin tại δC 57,1 và một tín hiệu carbon oxymethin tại δC 93,9 gợi ý sự

xuất hiện của vòng benzofuran. Tương tác trên phổ HSQC, COSY cho phép xác định

các vị trí carbon-proton của hai đơn vị resveratrol. Trên phổ HMBC cho thấy sự tương

tác giữa H-7, H-8 với C-10′, C-11′ cho thấy sự tạo vòng furan giữa C-7, C-8 của một

đơn vị resveratrol và C-10′, C-11′ của đơn vị resveratrol còn lại. Từ kết quả phân tích

phổ 1D-, 2D-NMR, MS, kết hợp so sánh tài liệu [28] có thể kết luận VH6 là (-)-trans-

ε-viniferin (Hình 3.12).

3.2.2.7. Hợp chất VH7

D = +50,7 (EtOH); ESI-MS m/z: 701,0

Chất rắn màu nâu; tºnc: 231-233oC; [α]25

[M+Na]+; dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR: Xem bảng 3.8.

Hình 3.13. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH7

Bảng 3.8. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH7

C/H

C

*

H

* (độ bội, J = Hz)

H

a,c (độ bội, J = Hz)

C

a,b

131,2

131,8

127,4

7,03 (2H, d, 8,4)

7,01 (2H, d, 8,5)

128,1

2, 6

115,0

6,72 (2H, d, 8,4)

6,72 (2H, d, 8,5)

115,7

3, 5

157,1

158,0

6,08 (1H, brs)

6,06 (1H, s)

85,6

86,3

3,97 (1H, brs)

3,96 (1H, s)

45,6

46,1

139,0

139,6

120,1

120,7

160.2

159,4

6,24 (1H, d, 2,2)

6,25 (1H, d, 1,5)

95,8

96,5

158,7

159,4

6,73 (1H, d, 2,2)

6,72 (1H, m)

105,5

106,2

131,8

1′

132,4

2′, 6′

7,22 (2H, d, 8,4)

7,19 (2H, d, 8,5)

127,5

128,1

3′, 5′

6,77 (2H, d, 8,4)

6,77 (2H, d, 8,5)

115,3

116,1

157,5

4′

158,3

5,95 (1H, d, 10,0)

5,94 (1H, d, 10,0)

89,3

7′

89,9

4,70 (1H, d, 10,0)

4,68 (1H, d, 10,0)

52,1

8′

52,9

137,9

9′

138,6

118,9

10′

119,5

161,0

11′

161,7

6,26 (1H, d, 1,8)

6,24 (1H, d, 2,0)

96,2

12′

96,9

159,9

13′

161,0

6,60 (1H, d, 1,8)

6,60 (1H, d, 2,0)

105,0

14′

105,7

131,5

1ʺ

132,1

7,06 (2H, d, 8,4)

7,04 (2H, d, 8,5)

127,9

2ʺ, 6ʺ

128,5

6,79 (2H, d, 8,4)

6,78 (2H, d, 8,5)

115,3

3ʺ, 5ʺ

116,1

157,7

4ʺ

158,4

4,91 (1H, d, 6,2)

4,91 (1H, d, 6,0)

94,9

7ʺ

95,5

4,62 (1H, d, 6,2)

4,60 (1H, d, 6,0)

54,9

8ʺ

55,6

140,5

9ʺ

141,2

118,1

10ʺ

118,7

160,8

11ʺ

161,4

97,3

12ʺ

98,0

6,22 (1H, d, 2,2)

6,22 (1H, d, 2,0)

158,6

13ʺ

160,6

107,8

14ʺ

108,5

6,00 (1H, d, 2,2)

6,00 (1H, d, 2,0)

*C, H của α-viniferin đo trong aceton-d6, 100 MHz/400 MHz [220]; aĐo trong aceton-d6, b125 MHz,

c500 MHz

Phổ khối ESI-MS xuất hiện peak ion tại m/z 701,0 [M+Na]+ cho thấy khối lượng

phân tử của VH7 là M = 678, kết hợp với phổ NMR xác định được công thức phân tử

của hợp chất là C42H30O9, gợi ý là một trimer stilben. Phổ 1H-NMR cho tín hiệu đặc

trưng của một trimer resveratrol với 12 tín hiệu của 18 tín hiệu proton của vòng thơm

tại δH 6,00-7,19 đặc trưng cho 3 vòng AA′BB′ và 3 vòng AA′M; 6 tín hiệu proton methin

tại δH 3,96-6,06, trong đó có 3 proton oxymethin, gợi ý hợp chất trimer resveratrol liên

kết với nhau tạo thành ba vòng benzofuran. Trên phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của

42 carbon tương ứng với một trimer resveratrol (C14H13O3). Kết hợp với phổ DEPT cho

thấy tín hiệu của 9 carbon tại δC 158,0-161,7 đặc trưng cho carbon vòng thơm bị

hydroxyl hóa và 27 carbon lai hóa sp2 tại δC 96,5-141,2. Sáu tín hiệu carbon methin với

δC 46,1-95,5, trong đó có 3 tín hiệu đặc trưng cho carbon oxymethin xuất hiện ở trường

thấp khẳng định sự có mặt của ba vòng benzofuran trong công thức. Phân tích các tương

tác trên phổ HSQC, COSY, HMBC cho phép xác định các vị trí carbon-proton của ba

đơn vị resveratrol. Trên phổ HMBC cho thấy sự tương tác giữa H-7, H-8 với C-10ʺ, C-

11ʺ, H-7′, H-8′ với C-10, C-11, H-7ʺ, H-8ʺ với C-10′, C-11′, khẳng định sự tạo vòng

benzofuran giữa ba đơn vị resveratrol, từ đó tạo thành vòng 8 cạnh. Từ kết quả phân tích

phổ 1D-, 2D-NMR, MS, kết hợp so sánh tài liệu [220] có thể kết luận VH7 là α-viniferin

(Hình 3.13).

3.2.2.8. Hợp chất VH8

D = -225 (MeOH); ESI-MS: m/z 929,0

Chất rắn màu nâu; tºnc: 256-258ºC; [α]25

[M+Na]+; dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR: Xem bảng 3.9.

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học và các tương tác COSY, HMBC chính của hợp chất VH8

Bảng 3.9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH8

A

B

A

B

C

H

C/ H 1 2, 6 3, 5

B a,c (độ bội, J = Hz) 7,44 (2H, d, 8,8) 6,85 (2H, d, 8,8)

7,46 (2H, d, 8,8) 6,86 (2H, d, 8,8)

a,c (độ bội, J = Hz) 7,47 (2H, d, 9,0) 6,87 (2H, d, 9,0)

a,c (độ bội, J = Hz) 7,44 (2H, d, 8,5) 6,85 (2H, d, 8,0)

a,b C 131,6 129,5 116,1

a,b C 131,7 129,7 116,1

158,5

7 8 9 10 11

5,86 (1H, d, 10,2) 5,15 (1H, brd, 10,2)

5,85 (1H, d, 10,5) 5,09 (1H, d, 10,5)

5,86 (1H, d, 10,5) 5,13 (1H, d, 10,5)

87,4 50,6 142,4 113,6 154,7

87,3 50,7 143,5 113,7 154,7

6,17 (1H, d, 2,0)

6,07 (1H, d, 2,0)

6,16 (1H, d, 2,0)

6,08 (1H, d, 2,0)

101,7

101,6

157,2

157,8

6,46 (1H, brs)

6,40 (1H, brd, 2,0)

105,8

6,48 (1H, d, 1,5)

105,8

6,40 (1H, brs)

1′ 2′

* 130,9 128,9 115,4 157,8/ 157,7 86,7 49,8 141,5 113,0 154,3 101,0/ 100,9 156,8/ 156,7 105,1/ 104,9 45,2 75,02

131,1 129,1 115,4 157,7/ 157,6 86,7 49,8 141,7 113,3 154,1 101,0/ 100,9 156,9/ 156,9 105,1/ 105,1 45,79 75,3

45,8 75,6

46,3 76,0

3′

39,0

39,6

4,75 (1H, m) 3,08 (1H, dd, 2,8; 17,0)

3,8 (1H, m) 2,35 (1H, dd, 2,8; 17,2) 2,26 (1H, dd, 1,4; 17,2)

4,74 (1H, d, 2,0) 3,00 (1H, dd, 2,0; 17,5) 2,72 (1H, dd, 3,5; 17,5)

3,8# 2,40 (1H, dd, 3,5; 17,5) 2,28 (1H, dd, 2,0; 17,5)

4′ 5′

195,0 128,4

195,2 128,1

5,29 (1H, d, 10,0)

196,7 128,8

5,45 (1H, d, 10,0)

5,31 (1H, d, 10,0)

196,8 128,6

6′

153,1

153,6

6,32 (1H, dd, 10,0; 2,0)

154,8

6,45 (1H, d, 10,0)

6,37 (1H, d, 10,0)

155,3

2,68 (1H, dd, 1,6; 17,0) 5,43 (1H, d, 10,0) 6,39 (1H, dd, 10,0; 2,2) 3,87 (1H, t, 11,4) 3,67 (1H, t, 11,4)

7′ 8′ 9′ 10′ 11′

3,8 # 3,6#

3,78 (1H, t, 11,4) 3,61 (1H, t, 11,4)

47,9 49,7 138,3 117,6 160,1

48,2 47,4 139,2 117,3 159,8

3,7 # 3,6 #

12′

6,12 (1H, d, 1,8)

6,14 (1H, d, 1,8)

6,12 (1H, d, 2,0)

6,16 (1H, d, 2,0)

97,1

96,5

13′

157,1

158,5

14′

6,09 (1H, d, 1,8)

6,01 (1H, d, 1,8)

6,00 (1H, d, 2,5)

5,97 (1H, d, 2,0)

109,8

109,6

NI NI

1ʺ 2ʺ 3ʺ

NI NI

131,4

131,2

4ʺ

157,1

156,7

5ʺ 6ʺ 7ʺ

47,3 49,0 138,0 117,2 159,5 96,4/ 96,4 156,5/ 156,4 109,0/ 108,9 131,4 NI NI 156,4/ 156,4 NI NI 62,9

47,7 46,8 138,7 116,9 159,6 95,8/ 95,7 157,9/ 157,2 108,7/ 108,6 131,0 NI NI 155,9/ 155,8 NI NI 56,6

63,4

57,1

NI NI 3,26 (1H, d, 11,4)

NI NI 3,18 (1H, d, 11,4)

3,25 (1H, d, 9,0)

3,19 (1H, d, 11,0)

8ʺ 9ʺ

3,59 (1H, t, 11,4)

3,54 (1H, t, 11,4)

3,6 #

3,5#

57,0 142,1

62,6 139,2

10ʺ

120,6

116,4

11ʺ

162,0

164,1

12ʺ

6,21 (1H, d, 2,0)

6,30 (1H, d, 2,0)

6,21 (1H, d, 1,5)

6,33 (1H, d, 2,5)

96,1

96,3

13ʺ

159,8

158,5

14ʺ

105,7

113,4

6,76 (1H, d, 2,0)

5,76 (1H, d, 2,0)

6,73 (1H, d, 1,5)

5,75 (1H, d, 2,0)

56,5 143,1 119,8/ 119,7 161,7 95,4/ 95,3 159,3/ 159,2 104,9/ 104,8 132,5

62,0 140,80 115,9/ 115,8 163,7 95,8/ 95,7 158,1/ 158,0 112,8/ 112,7 133,6

132,9

134,0

128,2

127,5

127,7

126,9

6,71 (2H, s)

7,19 (2H, d, 8,8)

6,71 (2H, d, 9,5)

7,15 (2H, d, 9,0)

115,2

115,3

6,71 (2H, s)

6,70 (2H, d, 8,8)

116,0

6,67 (2H, d, 9,5)

116,4

6,66 (2H, d, 9,0)

1‴ 2‴, 6‴ 3‴, 5‴

4‴

157,5

157,7

94,1 54,9 146,5

94,1 57,4 148,7

4,93 (1H, d, 4,4) 3,30 (1H, d, 4,4)

5,21 (1H, d, 2,0) 4,59 (1H, d, 2,0)

4,96 (1H, d, 5,0) 3,33 (1H, d, 4,5)

5,18 (1H, d, 2,5) 4,54 (1H, d, 2,5)

107,2

106,3

5,92 (2H, d, 2,0)

6,46 (2H, brs)

5,94 (2H, d, 2,0)

6,39 (2H, d, 2,5)

158,9

160,5

7‴ 8‴ 9‴ 10‴, 14‴ 11‴, 13‴

157,2/ 157,1 93,5 54,5 145,8 106,6/ 106,5 158,3/ 158,2

157,3/ 157,2 93,4 56,6 148,3 105,7/ 105,6 159,8/ 159,7

6,05 (1H, t, 2,0)

6,42 (1H, t, 2,0)

102,1

6,05 (1H, t, 2,3)

102,5

6,44 (1H, t, 2,0)

12‴

101,4/ 101,3

101,8/ 101,7

*C, H của shoreaketon đo trong aceton-d6, 150 MHz/600 MHz [221]; aĐo trong aceton-d6, b125 MHz, c500 MHz,

# Tín hiệu bị che lấp

Phổ khối ESI-MS cho peak ion tại m/z 929,0 [M+Na]+ cho thấy khối lượng phân

tử của hợp chất VH8 là M = 906, tương ứng với công thức phân tử C56H42O12, dự đoán

hợp chất là một tetramer stilben với mức độ chưa bão hòa 36. Các dữ liệu phổ cho thấy

VH8 là một hỗn hợp isomer tetramer resveratrol, trong đó cường độ tín hiệu phổ của

hợp chất A mạnh hơn (tỷ lệ 3/2 so với cường độ tín hiệu của hợp chất B trên phổ proton).

Với mỗi cấu trúc, phổ 1H-NMR cho tín hiệu đặc trưng của một tetramer resveratrol với

21 tín hiệu proton của vòng thơm tại δH 5,94-7,47 trong đó có 3 vòng thơm AA′BB′; 1

vòng thơm AA′M; 2 tín hiệu của proton olefin cấu hình cis: A: δH 6,45 (1H, d, J = 10,0

Hz, H-6′), 5,45 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-5′), B: δH 6,37 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-6′), 5,31

(1H, d, J = 10,0 Hz, H-5′); 9 tín hiệu proton methin tại δH 3,19-5,85, 2 tín hiệu của hai

proton nhóm methylen: A: δH 3,00 (1H, dd, J = 2,0; 17,5 Hz, H-3′), 2,72 (1H, dd, J =

3,5; 17,5 Hz, H-3′), B: δH 2,40 (1H, dd, J = 3,5; 17,5 Hz, H-3′), 2,28 (1H, dd, J = 2,0;

17,5 Hz, H-3′). Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của

một carbon carbonyl tại δC A: 196,7 (C-4′), B: 196,8 (C-4′); 11 carbon tại δC 154,8-164,1

đặc trưng cho carbon vòng thơm bị hydroxyl hóa và 35 carbon lai hóa sp2 tại δC 96,1-

155,3; 6 tín hiệu carbon methin tại δC 47,4-62,6 và 3 tín hiệu carbon oxymethin tại δC

75,6-94,1, 1 tín hiệu carbon bậc 4 tại δC 46,3 (A), 45,8 (B), 1 tín hiệu methylen tại δC

39,6. Tương tác trên phổ 2D-NMR cho phép xác định các vị trí carbon-proton của bốn

đơn vị resveratrol, trong đó xác định được sự xuất hiện của ba vòng benzofuran (Hình

3.14). Trên phổ COSY xuất hiện sự liên kết giữa các carbon no (H-7/H-8, H-2′/H-3′, H-

7′/H-8′/H-7ʺ/H-8ʺ và H-7‴/H-8‴) và giữa cặp olefin (H-5′/H-6′). Vòng cyclohex-2-enon

cũng được xác định dựa trên phổ HMBC, theo tương tác giữa proton methylen với

carbon carbonyl, carbon olefin và giữa proton olefin với carbon bậc 4. Sự sai khác giữa

2 đồng phân được thể hiện qua phổ proton ở vị trí H-7‴/H-8‴ (A: 4,96 (1H, d, 5,0, H-

7‴), 3,33 (1H, d, 4,5, H-8‴); B: 5,18 (1H, d, 2,5, H-7‴), 4,54 (1H, d, 2,5, H-8‴)) cũng

13C-NMR không cho thấy tín hiệu CH-2ʺ, 3ʺ, 5ʺ, 6ʺ do sự cản trở không gian của các

như ở vòng thơm liên kết cho thấy đồng phân quang học ở vị trí H-7‴/H-8‴ . Phổ 1H- và

nhóm thế xung quanh, đặc biệt là vòng cyclohex-2-enon [221]. Từ kết quả phân tích phổ

1D-, 2D-NMR, MS, kết hợp với so sánh tài liệu [221] có thể kết luận VH8 là

shoreaketon (Hình 3.14).

3.2.2.9. Hợp chất VH9

D = +164 (MeOH); ESI-MS m/z: 703,0 [M+Na]+; dữ

Chất rắn màu vàng nâu; [α]25

liệu phổ 1H- và 13C-NMR: Xem bảng 3.10.

Hình 3.15. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH9

Bảng 3.10. Dữ liệu phổ của hợp chất VH9

C/H

C

H

C

H

1 2, 6 3, 5 4 7 8 9 10, 14 11, 13 12 1′ 2′, 6′ 3′, 5′ 4′ 7′ 8′ 9′ 10′ 11′ 12′ 13′ 14′ 1ʺ 2ʺ, 6ʺ 3ʺ, 5ʺ

* 128,9 129,0 116,1 157,4 90,6 53,9 143,0 108,6 158,6 101,6 130,0 128,5 115,0 158,2 133,7 122,3 133,1 121,7 162,3 91,7 162,0 120,3 133,8 127,7 116,1

* (độ bội, J = Hz) 7,02 (2H, d, 8,5) 6,62 (2H, d, 8,5) 5,88 (1H, d, 8,0) 4,68 (1H, d, 8,0) 5,84 (2H, d, 2,0) 5,95 (1H, t, 2,0) 6,95 (2H, d, 8,5) 6,61 (2H, d, 8,5) 6,72 (1H, d, 16,5) 6,59 (1H, d, 16,5) 6,47 (1H, s) 7,21 (2H, d, 8,5) 6,84 (2H, d, 8,5)

a,b 129,1 129,0 116,2 157,4 90,8 53,9 143,0 108,7 158,8 101,8 130,1 128,5 115,1 158,2 133,9 122,4 133,2 121,9 162,4 91,7 162,1 120,4 133,8 127,8 116,2

a,c (độ bội, J = Hz) 7,05 (2H, d, 8,5) 6,64 (2H, d, 8,5) 5,91 (1H, d, 7,5) 4,71 (1H, d, 7,5) 5,87 (2H, d, 2,0) 5,96 (1H, t, 2,0) 6,97 (2H, d, 8,5) 6,63 (2H, d, 8,5) 6,75 (1H, d, 16,5) 6,63 (1H, d, 16,5) 6,50 (1H, s) 7,24 (2H, d, 8,5) 6,86 (2H, d, 8,5)

158,2 94,0 57,7 147,3

5,42 (1H, d, 5,0) 4,53 (1H, d, 5,0)

158,2 94,0 57,9 147,3

5,45 (1H, d, 5,0) 4,56 (1H, d, 5,0)

106,7

6,23 (2H, d, 2,0)

106,9

6,26 (2H, d, 2,5)

159,7

159,8

4ʺ 7ʺ 8ʺ 9ʺ 10ʺ, 14ʺ 11ʺ, 13ʺ 12ʺ

101,9

102,1

6,15 (1H, t, 2,0)

6,17 (1H, t, 2,5)

*C, H của amuresin B đo trong aceton-d6, 125 MHz/500 MHz [22]; aĐo trong aceton-d6, b125 MHz, c500

MHz

Phổ khối ESI-MS xuất hiện peak ion tại m/z 703,0 [M+Na]+ cho thấy khối lượng

phân tử của VH9 là M = 680, kết hợp với phổ NMR cho phép xác định công thức phân

tử của hợp chất là C42H32O9, gợi ý đây là một trimer stilben. Trên phổ 1H-NMR xuất

hiện 19 tín hiệu proton của vòng thơm tại δH 5,87-7,24, trong đó có 3 vòng benzen thế

AA′BB′, 2 vòng benzen thế AA′M; 2 tín hiệu của proton olefin tại δH 6,75 và 6,63 với

hằng số tương tác J = 16,5 Hz chứng tỏ sự tồn tại ở cấu dạng trans của một đơn vị

resveratrol; 4 tín hiệu proton methin tại δH 4,56-5,91, trong đó có 2 tín hiệu của proton

oxymethin tại δH 5,91 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-7), 5,45 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-7ʺ) gợi ý có

hai vòng benzofuran liên kết giữa các đơn vị resveratrol. Trên phổ 13C-NMR cho tín

hiệu của 42 carbon tương ứng với một trimer resveratrol (C14H13O3). Kết hợp với phổ

DEPT cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của 9 carbon tại δC 157,4-162,4 đặc trưng cho

carbon vòng thơm bị hydroxyl hóa và 29 carbon lai hoa sp2 tại δC 91,7-147,3; 4 tín hiệu

carbon methin tại δC 94,0 (C-7ʺ), 90,8 (C-7), 57,9 (C-8ʺ), 53,9 (C-8), trong đó có 2 tín

hiệu carbon oxymethin tại δC 94,0 (C-7ʺ), 90,8 (C-7). Tương tác trên phổ HSQC cho

phép xác định các vị trí carbon-proton của ba đơn vị resveratrol. Trên phổ HMBC cho

thấy sự tương tác giữa H-7, H-8 với C-10′, C-11′, giữa H-7ʺ, H-8ʺ với C-13′, C-14′, cho

thấy sự tạo vòng benzofuran giữa hai đơn vị resveratrol với đơn vị resveratrol còn lại.

Từ kết quả phân tích phổ 1D-, 2D-NMR, MS, kết hợp so sánh tài liệu [22] có thể kết

luận VH9 là amurensin B (Hình 3.15).

3.2.2.10. Hợp chất VH10

D = +194,3 (MeOH); dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR:

Chất rắn màu vàng nâu; [α]25

Xem bảng 3.11.

Hình 3.16. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH10

H

Bảng 3.11. Dữ liệu phổ của hợp chất VH10

C/H 1 2, 6 3, 5 4 7 8 9 10 11 12 13 14 1′ 2′, 6′ 3′, 5′ 4′ 7′ 8′ 9′ 10′ 11′ 12′ 13′ 14′ 1ʺ 2ʺ 3ʺ 4ʺ 5ʺ

* C 130,8 130,0 115,9 158,5 88,5 49,4 142,1 119,7 157,8 100,6 157,0 105,0 134,9 128,8 115,4 155,9 40,5 41,6 140,6 120,4 160,1 96,1 158,8 109,9 133,6 160,4 115,8 129,2 128,9

* (độ bội, J = Hz) 7,12 (2H, d, 8,5) 6,76 (2H, d, 8,5) 5,84 (1H, d, 11,5) 4,26 (1H, d, 11,5) 6,02 (1H, brs) 6,21 (1H, brs) 7,04 (2H, d, 8,5) 6,67 (2H, d, 8,5) 5,47 (1H, d, 3,5) 5,57 (1H, d, 3,5) 6,10 (1H, d, 2,0) 6,14 (1H, d, 2,0) 6,95 (1H, d, 8,5) 7,42 (1H, dd, 2,0; 8,5)

a,b C 130,9 130,1 116,0 158,6 88,5 49,5 142,3 119,7 157,9 100,8 157,2 105,1 134,9 128,8 115,6 156,1 40,6 41,6 140,4 120,5 160,5 96,4 159,0 110,0 133,6 160,9 115,6 129,8 128,8

a,c (độ bội, J = Hz) 7,14 (2H, d, 8,5) 6,78 (2H, d, 8,5) 5,87 (1H, d, 11,5) 4,27 (1H, d, 11,5) 6,03 (1H, d, 2,0) 6,24 (1H, d, 2,0) 7,05 (2H, d, 8,0) 6,68 (2H, d, 8,0) 5,43 (1H, d, 3,5) 5,56 (1H, d, 3,5) 6,13 (1H, d, 2,0) 6,13 (1H, d, 2,0) 6,99 (1H, d, 8,0) 7,47 (1H, dd, 2,0; 8,0)

6ʺ CHO

135,0 190,7

6,66 (1H, 2,0) 9,31 (1H, s)

135,0 190,8

6,70 (1H, 2,0) 9,38 (1H, s)

*C, H của vitisinol B đo trong aceton-d6, 125 MHz/500 MHz [44]; aĐo trong aceton-d6, b125 MHz, c500

MHz

Phổ 1H-NMR cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của proton aldehyd tại δH 9,38 (1H, s,

CHO), 15 tín hiệu proton của vòng thơm δH 6,03-7,47, trong đó có 8 tín hiệu δH 7,14

(2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, H-6), 6,78 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, H-5) và 7,05 (2H, d, J = 8,0

Hz, H-2′, H-6′), 6,68 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3′, H-5′) đặc trưng cho các proton của 2 vòng

AA′BB′, 3 proton tại δH 7,47 (1H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-4ʺ), 6,99 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-

3ʺ), 6,70 (1H, J = 2,0, H-6ʺ) tương tác với nhau theo hệ ABX; 4 tín hiệu proton methin

δH 5,87 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-7), 5,56 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-8′), 5,43 (1H, d, J = 3,5

Hz, H-7′), 4,27 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-8), trong đó có một proton oxymethin 5,87 (1H,

d, J = 11,5 Hz, H-7) gợi ý sự xuất hiện của 1 vòng benzofuran. Phổ carbon kết hợp với

phổ DEPT cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của một carbon aldehyd tại δC 190,8 (CHO), 7

carbon tại δC 156,1-160,9 đặc trưng cho carbon vòng thơm bị hydroxyl hóa, 23 carbon

lai hóa sp2 δC 96,4-142,3, 4 carbon methin tại δC 40,6-88,5 trong đó có một carbon

oxymethin δC 88,5 (C-7). Tương tác trên phổ HSQC và COSY cho phép xác định các vị

trí carbon-proton. Kết hợp với phổ HMBC, từ sự tương tác giữa các proton thơm và các

carbon cho thấy VH10 gồm hai đơn vị resveratrol và một vòng ABX. Tương tác giữa

H-7, H-8 với C-10′, C-11′ và tương tác giữa H-7′ với C-9, C-11 cho thấy sự tạo vòng

benzofuran cũng như sự xuất hiện của vòng 7 cạnh giữa hai đơn vị resveratrol. Tương

tác giữa proton aldehyd với C-4ʺ, C-5ʺ, cũng như tương tác giữa carbon carbonyl với H-

6ʺ cho thấy nhóm CHO gắn vào vị trí số 5 của vòng benzen ABX. Hơn nữa, tương tác

giữa với H-8′ với C-6ʺ gợi ý vòng benzen ABX gắn vào H-8′ của một đơn vị resveratrol.

Từ các dữ liệu phổ, kết hợp với so sánh tài liệu [44], xác định VH10 là vitisinol B (Hình

3.16).

3.2.2.11. Hợp chất VH11

D = -41,9 (MeOH); dữ liệu phổ 1H- và 13C-

Tinh thể hình kim màu vàng; [α]25

NMR: Xem bảng 3.12.

Hình 3.17. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính (→) của hợp chất VH11

H

Bảng 3.12. Dữ liệu phổ của hợp chất VH11

a,c (độ bội, J = Hz) 7,11 (2H, d, 8,0) 6,81 (2H, d, 8,0) 5,31 (1H, d, 5,5) 4,04 (1H, d, 5,5) 6,04 (2H, d, 2,0) 6,20 (1H, t, 2,0) 6,65 (2H, d, 8,5) 6,63 (2H, d, 8,5) 5,55 (1H, d, 5,0) 4,30 (1H, d, 5,0) 6,31 (1H, d, 2,0) 6,21 (1H, d, 2,0) 6,69 (1H, d, 2,0)

C/H 1 2, 6 3, 5 4 7 8 9 10, 14 11, 13 12 1′ 2′, 6′ 3′, 5′ 4′ 7′ 8′ 9′ 10′ 11′ 12′ 13′ 14′ 1ʺ 2ʺ

* C 133,9 128,5 116,3 158,4 94,9 57,8 147,2 107,3 159,6 101,9 132,5 127,8 116,2 158,0 92,3 52,9 142,3 120,3 162,8 96,7 160,4 107,3 131,7 127,0

* (độ bội, J = Hz) 7,01 (2H, d, 8,8) 6,73 (2H, d, 8,8) 5,21 (1H, d, 5,9) 3,85 (1H, d, 5,9) 5,93 (2H, d, 2,2) 6,09 (1H, t, 2,2) 6,60 (2H, d, 8,8) 6,54 (2H, d, 8,8) 5,44 (1H, d, 5,9) 4,22 (1H, d, 5,9) 6,28 (1H, d, 2,2) 6,11 (1H, d, 2,2) 6,54 (1H,brs)

a,b C 133,8 128,0 116,1 158,2 94,1 57,1 146,9 106,9 159,6 102,0 132,2 127,4 116,0 157,7 91,2 52,4 142,2 119,8 162,5 96,5 160,0 106,9 131,0 127,2

132,7 160,0 110,0 130,0 126,7 131,5 137,5 120,3 162,7 96,8 159,4 108,8 134,2 128,0 116,4 158,5 94,9 57,9 147,6

6,56 (1H, d, 8,4) 6,91 (1H, dd, 1,8; 8,4) 5,96 (1H, d, 13,2) 6,06 (1H, d, 13,2) 6,17 (1H, d, 2,2) 6,20 (1H, d, 2,2) 7,12 (2H, d, 8,8) 6,73 (2H, d, 8,8) 5,30 (1H, d, 4,8) 4,27 (1H, d, 4,8)

130,9 159,2 109,8 129,4 126,1 130,9 137,0 120,0 162,3 96,8 159,6 108,3 133,8 127,9 116,2 158,2 94,2 56,9 147,3

6,60 (1H, d, 8,0) 7,00 (1H, dd, 2,0; 8,0) 5,96 (1H, d, 12,5) 6,07 (1H, d,12,5) 6,29 (1H, d, 2,0) 6,26 (1H, d, 2,0) 7,20 (2H, d, 8,5) 6,83 (2H, d, 8,5) 5,37 (1H, d, 5,0) 4,46 (1H, d, 5,0)

107,0

107,2

5,97 (2H, d, 2,2)

6,11 (2H, d, 2,5)

160,0

3ʺ 4ʺ 5ʺ 6ʺ 7ʺ 8ʺ 9ʺ 10ʺ 11ʺ 12ʺ 13ʺ 14ʺ 1‴ 2‴, 6‴ 3‴, 5‴ 4‴ 7‴ 8‴ 9‴ 10‴, 14‴ 11‴, 13‴ 12‴

102,4

102,5

6,06 (1H, t, 2,2)

6,23 (1H, t, 2,5)

*C, H của cis-vitisin B đo trong aceton-d6, 150 MHz/500 MHz [43]; aĐo trong aceton-d6, b125 MHz,

c500 MHz

Phổ 1H-NMR cho tín hiệu đặc trưng của một tetramer resveratrol với 25 tín hiệu

proton của vòng thơm tại δH 6,04-7,20, trong đó có 3 vòng benzen thế AA′BB′ và 2 vòng

benzen AA′M; 2 tín hiệu đặc trưng cho proton olefin tại δH 6,07 và 5,96 với hằng số

tương tác J = 12,5 Hz cho biết nối đôi cấu hình cis; 6 tín hiệu proton methin tại δH 4,04-

5,55 trong đó có 3 proton oxymethin, gợi ý hợp chất tetramer resveratrol liên kết với

nhau tạo thành ba vòng benzofuran. Trên phổ 13C-NMR cho tín hiệu của 56 carbon

tương ứng với một tetramer resveratrol (C14H13O3). Kết hợp với phổ DEPT cho thấy sự

xuất hiện tín hiệu của 12 carbon tại δC 157,7-162,5 đặc trưng cho carbon vòng thơm bị

hydroxyl hóa và 38 carbon lai hóa sp2 nằm trong vùng δC 96,5-147,3, 2 carbon olefin tại

δC 130,9 và 126,1, 6 tín hiệu carbon methin tại δC 52,4-94,2 trong đó có 3 carbon

oxymethin gợi ý sự xuất hiện của ba vòng benzofuran. Tương tác trên phổ HSQC, COSY

cho phép xác định các vị trí carbon-proton của bốn đơn vị resveratrol. Trên phổ HMBC

cho thấy sự tương tác giữa H-7, H-8 với C-10′, C-11′; H-7′, H-8′ với C-3ʺ, C-4ʺ; H-7‴,

H-8‴ với C-10ʺ, C-11ʺ, khẳng định sự tạo vòng benzofuran giữa bốn đơn vị resveratrol.

Từ kết quả phân tích phổ 1D-, 2D-NMR, kết hợp so sánh tài liệu [43] có thể kết luận

VH11 là cis-vitisin B (Hình 3.17).

3.2.2.12. Hợp chất VH12

nc: 198-203°C, ESI-MS m/z: 153,1 [M+H]-; dữ liệu phổ

1H- và 13C-NMR: Xem bảng 3.13.

Dạng bột màu nâu nhạt, to

Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH12

H

Bảng 3.13. Dữ liệu phổ của hợp chất VH12

C/H 1 2 3 4 5 6 7

* C 123,1 115,7 146,1 151,6 117,7 123,9 170,2

a,b C 123,3 115,8 146,1 151,5 117,8 123,9 170,3

a,c (độ bội, J = Hz) 7,43 (1H, d, 2,5) 6,81 (1H, d, 8,5) 7,45 (1H, m)

*C của acid protocatechuic đo trong CD3OD, 125 MHz [222]; aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz

Phổ khối ESI-MS (ion âm) của VH12 cho pic ion giả phân tử tại m/z 153,1 [M-

H]-, tương ứng công thức phân tử C7H6O4 (M = 154,0). Phổ 1H-NMR của VH12 xuất

hiện 3 tín hiệu proton aromatic tại δH 6,81 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,43 (1H, d, J = 2,5

Hz, H-2) và 7,45 (1H, m, H-6). Phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện 7 tín hiệu carbon trong

đó có 1 carbon carboxyl tại δC 170,2 (C-7), 3 carbon không liên kết với hydro tại δC

123,3 (C-1), 146,1 (C-3) và 151,5 (C-4) và 3 carbon methin tại δC 115,8 (C-2), 117,8

(C-5) và 123,9 (C-6), gợi ý sự xuất hiện của vòng benzen thế 1,3,4 trong cấu trúc của

VH12.. Từ những phân tích trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [222], có thể xác

định VH12 là acid 3,4-dihydroxybenzoic hay acid protocatechuic (Hình 3.18).

3.2.2.13. Hợp chất VH13

nc: 58-60°C; dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR: Xem bảng 3.14

Chất bột màu trắng; to

Hình 3.19. Cấu trúc hóa học và các tương tác NOESY chính (↔) của hợp chất VH13

H

Bảng 3.14. Dữ liệu phổ của hợp chất VH13

a,b C 47,7

* C 47,6

C/H 1

30,3

32,6 151,2 52,1 85,2 45,2

32,6 151,2 52,0 85,2 45,1

3 4 5 6 7

30,9

36,2 149,3 139,8

36,2 149,2 139,7

9 10 11

120,2

170,3

170,2

109,7

109,6

112,6

112,7

a,c (độ bội, J = Hz) 2,52 (1H, m) 1,87 (1H, m) 1,95 (1H, m) 2,52 (2H, m) 2,87 (1H, m) 3,96 (1H, t, 9,0) 2,90 (2H, m) 1,42 (1H, m) 2,24 (1H, m) 2,16 (2H, m) 5,49 (1H, d, 3,0) 6,22 (1H, d, 3,5) 5,07 (1H, br d, 2,0) 5,27 (1H, br d, 2,0) 4,82 (1H, s) 4,90 (1H, s)

*C của dehydrocostus lacton đo trong CD3OD, 125 MHz [223]; aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz

Phổ 1H-NMR của VH13 xuất hiện các cặp tín hiệu của 3 nhóm -C=CH2 tại H

5,49 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-12a), 6,22 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-12b); 5,07 (1H, br d, J = 2,0

Hz, H-14a), 5,27 (1H, br d, J = 2,0 Hz, H-14b) và 4,82 (1H, s, H-15a), 4,90 (1H, s, H-

15b); 1 tín hiệu của nhóm hydroxymethin tại H 3,96 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-6) và 11 tín

hiệu của các nhóm -CH, -CH2- nằm trong vùng trường cao H 1,40 - 2,92. Phổ 13C-NMR

kết hợp với phổ DEPT cho thấy, VH13 có 15 carbon trong đó có 1 nhóm carbonyl tại

C 170,3 (C-13), 3 nhóm -C=CH2 tại 151,2 (C-4), 109,7 (C-14); 149,3 (C-10), 112,7 (C-

15) và 139,8 (C-11), 120,2 (C-12); 1 nhóm hydroxymethin tại C 85,2 (C-6); 3 nhóm

methin tại C 52,1 (C-5), 47,7 (C-1), 36,2 (C-9) và 4 nhóm methylen tại C 45,2 (C-7),

32,6 (C-3), 30,9 (C-8) và 30,3 (C-2). Từ những dữ liệu trên, gợi ý VH13 có cấu trúc của

một sesquiterpen lacton khung guaian [223]. Hằng số ghép giữa H-6 và H-7 (J = 9,0 Hz)

xác định hướng trans của 2 proton này [224]. Mặt khác, H-7 trong các khung

guaianolacton tự nhiên được định hướng là alpha, do đó H-6 được định hướng là beta

[225]. Ngoài ra, trên phổ NOESY cho thấy sự tương tác giữa proton H-7 (H 2,90) và

H-5 (H 2,87), giữa H-5 và H-1 (H 2,52) cho phép xác định cấu hình alpha của các

proton H-1 và H-5. Từ những dữ liệu trên, kết hợp với tài liệu [223], có thể xác định

VH13 là dehydrocostus lacton (Hình 3.19). Đây là một hợp chất sesquiterpen lacton

lần đầu tiên được phân lập từ chi Vitis.

3.2.2.14. Hợp chất VH14

nc: 133-135°C, tan trong chloroform, không

Dạng tinh thể hình kim không màu, to

tan trong methanol, không hấp thụ UV. Trên sắc ký bản mỏng, sau khi nhúng dung dịch

H2SO4 10% trong EtOH 96% và hơ nóng trên bếp điện thấy hợp chất này có màu hồng

tươi rồi xanh tím dần. Chấm sắc kí đối chứng có thể khẳng định VH14 là stigmast-5-en-

3-ol hay còn gọi là β-sitosterol (Hình 3.20).

3.2.2.15. Hợp chất VH15

nc: 285°C, tan trong chloroform, không tan

Dạng tinh thể hình kim màu trắng, to

trong methanol, không hấp thụ UV. Trên sắc ký bản mỏng, sau khi nhúng dung dịch

H2SO4 10% trong EtOH 96% và hơ nóng trên bếp điện thấy hợp chất này có màu hồng

sau đó chuyển sang màu tím. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR: Xem bảng 3.15.

Hình 3.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH14 và VH15

H

Bảng 3.15. Dữ liệu phổ của hợp chất VH15

a,c (độ bội, J = Hz) 3,18 (1H, m) 5,37 (1H, t, 2,5) 0,69 (3H, s) 1,01 (3H, s) 0,93 (1H, d, 6,5) 0,82 (1H, t, 7,0) 0,85 (1H, t, 7,0) 0,84 (1H, d, 7,0) 4,41 (1H, d, 7,5) 3,25 (1H, m)

3,42-3,45 (2H, m)

C/H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1′ 2′ 3′ 4′ 5′

* C 36,8 29,0 78,4 38,1 139,9 121,4 31,4 31,4 49,7 36,2 20,5 39,3 41,8 56,3 23,7 27,7 55,5 11,1 18,5 35,6 18,0 33,4 25,4 45,4 28,6 18,1 18,9 22,5 11,1 100,6 73,1 76,1 69,7 75,6

a,b C 37,2 29,5 79,1 38,6 140,2 122,1 31,8 31,8 50,1 36,6 21,0 39,7 42,2 56,7 24,2 28,1 56,0 11,7 19,2 36,0 18,6 33,9 26,0 45,8 29,1 18,9 19,6 23,0 11,8 101,0 73,4 76,3 70,1 75,6

6′

61,1

61,8

3,30 (1H, m) 3,76 (1H, dd, 12,0; 4,0) 3,85 (1H, dd, 12,0; 3,0)

*C của daucosterol đo trong CD3OD & CDCl3, 100 MHz [226];

aĐo trong CD3OD & CDCl3, b125 MHz, c500 MHz

Phổ 1H-NMR của VH15 xuất hiện tín hiệu doublet của proton methin olefin ở δH

5,37 (1H, t, J = 2,5 Hz, H-6), một nhóm hydroxymethin tại H 3,58 (1H, m, H-3), 6

nhóm methyl tại H 0,69 (3H, s, H-18); 1,01 (3H, s, H-19); 0,93 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-

21); 0,81 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27) và 0,85 (3H, t, J =

7,5 Hz, H-29) và tín hiệu của proton anome của gốc đường β-glucose tại H 4,41 (1H,

d, J = 7,5 Hz, H-1ʹ). Phổ 13C-NMR và phổ DEPT xuất hiện tín hiệu của 35 carbon, trong

đó có 2 tín hiệu carbon nằm trong vùng liên kết đôi (một carbon bậc 4 ở δC 140,2 và một

nhóm CH ở δC 122,1), 6 tín hiệu carbon oxymethin ở độ chuyển dịch từ δC 70,1-101,0,

1 tín hiệu carbon oxymethylen ở δC 61,8. Tất cả các dữ liệu phổ đã phân tích cho phép

xác định hợp chất VH15 là một steroid glycosid. Dựa vào các đặc trưng hóa lý, các dữ

liệu phổ kết hợp so sánh tài liệu [226], hợp chất VH15 được xác định là daucosterol

(Hình 3.20).

3.2.2.16. Hợp chất VH16

nc: 316-318°C; tan trong ethanol, methanol, aceton;

Tinh thể hình kim màu trắng; to

không hấp thụ UV; hiện màu tím sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn. Dữ liệu

phổ 1H- và 13C-NMR trình bày tại bảng 3.16.

Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất VH16

H

Bảng 3.16. Dữ liệu phổ của hợp chất VH16

C/H 1 2 3 4 5 6 7 8

* C 38,7 27,4 79,0 38,8 55,3 18,3 34,3 40,7

a,b C 38,7 27,4 79,0 38,9 55,4 18,3 34,4 40,7

a,c (độ bội, J = Hz) 3,18 (1H, dd, 11,0, 5,0)

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

50,5 37,2 20,8 25,5 38,4 42,4 30,5 32,1 56,3 49,2 46,9 150,4 29,7 37,0 28,0 15,3 16,1 16,0 14,7 - 109,7

50,6 37,2 20,9 25,5 38,4 42,5 30,6 32,2 56,3 49,3 46,9 150,4 29,7 37,0 28,0 15,4 16,1 16,0 14,7 179,5 109,7

3,00 (1H, m) 0,97 (3H, s) 0,76 (3H, s) 0,83 (3H, s) 0,94 (3H, s) 0,98 (3H, s) 4,74 (1H, s) 4,61 (1H, s) 1,69 (3H, s)

19,4

30 *C của acid betulinic đo trong CDCl3, 150 MHZ [227]; aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz

Phổ 1H-NMR của VH16 cho tín hiệu cộng hưởng của một proton của nhóm

hydroxymethin ở H 3,18 (1H, dd, J = 5,0; 11,0 Hz, H-3); tín hiệu proton vinylic của

nhóm methylen đầu mạch tại H 4,61 (1H, s, H-29α), 4,74 (1H, s, H-29β), sáu tín hiệu

proton methyl ở H 0,97 (3H, s, H-23), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 0,94 (3H,

s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,69 (3H, s, H-30) và rất nhiều tín hiệu nằm trong vùng

trường cao (0,68 - 2,80 ppm). Các tín hiệu proton trên gợi ý, VH16 là một triterpenoid

khung lupan. Trên phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện các tín hiệu của carbon isopropenyl

C ở 150,4 (C-20) và 109,7 (C-29) cũng gợi ý sự có mặt của một triterpen khung lupan,

một carbon methin tại C 79,0 (C-3) cùng với 6 tín hiệu của carbon methyl và tín hiệu

đặc trưng của nhóm carbon carbonyl ở C 179,5 (C-28) cho thấy có sự oxy hóa một

nhóm methyl của khung lupan thành nhóm carboxyl. Ngoài ra trên phổ DEPT còn chỉ

rõ sự có mặt của 10 nhóm methylen, 5 nhóm methin, 5 carbon bậc 4. Dựa trên phổ

HMBC và so sánh dữ liệu phổ với tài liệu tham khảo [227], cấu trúc của hợp chất VH16

được xác định là acid betulinic (Hình 3.21).

3.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học

3.3.1. Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm

3.3.1.1. Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro

a. Tác dụng chống viêm in vitro của cao chiết phần trên mặt đất loài Nho rừng

Tác dụng chống viêm in vitro của cao chiết EtOH 96% (VH) và các cao phân đoạn

n-hexan (VHH), ethyl acetat (VHE) và phân đoạn nước (VHW) của Nho rừng được thể

hiện qua hình 3.22 và bảng 3.17.

Hình 3.22. Ảnh hưởng của cao chiết ethanol 96% và 3 phân đoạn từ phần trên mặt đất

***: p < 0,001 khi so sánh với lô chứng DMSO, #: p < 0,05 khi so sánh với lô đối chứng

dương LPS.

Nho rừng lên mức độ biểu hiện COX-2 mRNA.

Bảng 3.17. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế COX-2 của cao ethanol 96% và 3 cao

phân đoạn phần trên mặt đất Nho rừng

STT Mẫu

1 Mẫu chứng 2 Mẫu đối chứng dương LPS (5 µg/ml) LPS (5 µg/ml) + VH (50 µg/ml) 3 LPS (5 µg/ml) + VHH (50 µg/ml) 4 LPS (5 µg/ml) + VHE (50 µg/ml) 5 LPS (5 µg/ml) + VHW (50 µg/ml) 6 Mức độ biểu hiện COX-2 mRNA 1,02 ± 0,10 6,25 ± 0,56 *** 2,85 ± 0,31 # 3,78 ± 0,91 2,38 ± 0,47 # 4,86 ± 1,39

100

Trong đó: Tác dụng ức chế COX-2 in vitro được trình bày dưới dạng M ± SE với n = 6, M là giá trị trung bình của các lần thí nghiệm, SE là sai số chuẩn. ***: p < 0,001 khi so sánh với lô chứng, #: p < 0,05 khi so sánh với lô đối chứng dương.

Nhận xét:

Mức độ biểu hiện COX-2 mRNA ở mẫu chứng không thêm lipopolysaccharid xấp

xỉ 1 và khi tế bào bị kích thích viêm bởi LPS 5 µg/ml thì mức độ biểu hiện COX-2

mRNA tăng lên 6,12 lần so với mẫu chứng (p < 0,001).

Cao VHH và VHW ở nồng độ 50 µg/ml làm giảm không đáng kể mức độ biểu hiện

COX-2 mRNA so với nhóm đối chứng dương, mức độ biểu hiện COX-2 mRNA lần lượt

là 3,78 ± 0,91 và 4,86 ± 1,39. Trong khi cao VHE và VH (50 µg/ml) đều làm giảm có

sai số thống kê mức độ biểu hiện COX-2 mRNA so nhóm đối chứng dương, mức độ

biểu hiện COX-2 mRNA lần lượt là 2,38 ± 0,47 (p<0,05) và 2,85 ± 0,31 (p<0,05). Như

vậy có thể thấy, phân đoạn VHE từ phần trên mặt đất Nho rừng thể hiện hoạt tính ức

chế COX-2 in vitro mạnh nhất thông qua làm giảm đáng kể mức độ biểu hiện COX-2

mRNA.

Từ kết quả sàng lọc ban đầu định lượng COX-2 mRNA của cao ethanol 96% và

các cao phân đoạn phần trên mặt đất Nho rừng bằng kỹ thuật RT-PCR trên đại thực bào

RAW264.7 cho thấy, ở liều thử nghiệm 50 μg/ml phân đoạn ethyl acetat (VHE) của cao

chiết ethanol 96% của Nho rừng có tác dụng ức chế mạnh nhất trên đại thực bào

RAW264.7 so với cao chiết ethanol 96% (VH) và 2 cắn phân đoạn n-hexan (VHH) và

cắn nước (VHW) của cao chiết ethanol 96%. Do vậy nghiên cứu hoạt tính sâu hơn tập

trung trên các hợp chất tinh khiết phân lập từ phân đoạn VHE cũng như thử tác dụng

của phân đoạn VHE trên các mô hình in vivo.

b. Tác dụng chống viêm in vitro của các hợp chất tinh khiết phân lập từ Nho rừng

❖ Đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất tinh khiết phân lập từ Nho rừng lên mức độ

biểu hiện gen COX-2 và sự sản sinh PGE2

Các hợp chất tinh khiết thuộc nhóm stilben được phân lập từ Nho rừng (VH2-

VH11, 10 μM) đã được đánh giá ảnh hưởng lên mức độ biểu hiện COX-2 mRNA và sự

sản sinh PGE2 trên đại thực bào RAW264.7 gây kích thích viêm bằng LPS sử dụng kỹ

thuật Western blotting và kỹ thuật RT-PCR định lượng. Các kết quả trong hình 3.23

cho thấy, trong số các chất phân lập được thử nghiệm, (-)-trans-ε-viniferin (VH6) là hợp

chất có tác dụng ức chế biểu hiện COX-2 mRNA được kích thích viêm bởi LPS trong

101

tế bào RAW264.7 mạnh nhất (Hình 3.23A-B). Hơn nữa, xét nghiệm ELISA cũng cho

thấy hợp chất này ức chế mức độ sản sinh PGE2 mạnh nhất trong đại thực bào

RAW264.7 gây tăng sản sinh PGE2 bởi LPS so với các hợp chất được thử nghiệm khác

(Hình 3.23C).

Hình 3.23. Ảnh hưởng của các hợp chất tinh khiết phân lập từ Nho rừng lên mức độ

biểu hiện COX-2 và sự sản sinh PGE2 trên đại thực bào RAW264.7 (A). 18 h sau khi tế bào được phơi nhiễm LPS (5 μg/ml) có hoặc không có mặt chất thử trong đại thực bào RAW264.7, các mẫu được thu và ly giải để đánh giá hoạt tính trên biểu hiện COX-2 và β-actin. (B) Mức độ biểu hiện COX-2 mRNA phân tích bằng qCPR (***p < 0,001 mức ý nghĩa thống kê so sánh

102

với lô chứng DMSO; # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001, các mẫu thử so sánh với lô chỉ dùng chất kích thích viêm LPS, n=5.). (C) So sánh tác dụng của các chất phân lập được ở nồng độ 10 µM mức độ biểu thị PGE2 ở tế bào RAW264.7. Các đại thực bào RAW264.7 được nuôi cấy với LPS nồng độ 5 μg/ml trong 18 h có hoặc không có mặt chất thử nghiệm và hàm lượng PGE2 trong môi trường nuôi cấy được xác định bằng thí nghiệm PGE2-specific ELISA (***p < 0,001 mức ý nghĩa thống kê so sánh với lô chứng DMSO; # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001, các mẫu thử so sánh với lô chỉ dùng chất kích thích viêm LPS, n=5.). ❖ Nghiên cứu cơ chế chống viêm in vitro của hợp chất tiềm năng VH6 ((-)-trans-ε-

viniferin) phân lập từ Nho rừng

* Ảnh hưởng của VH6 lên mức độ biểu hiện của COX-2 mRNA, iNOS và sự sản sinh

PGE2 theo nồng độ trên đại thực bào RAW264.7

Kết quả nghiên cứu sàng lọc cho thấy VH6 (10 µM) có hoạt tính tốt nhất trong số

các hợp chất được sàng lọc. Do vậy, hợp chất này được tiến hành thử nghiệm ở các nồng

độ khác nhau lên mức độ biểu hiện của COX-2, iNOS và sự sản sinh PGE2 khi gây kích

thích viêm bởi LPS trong đại thực bào RAW264.7.

Kết quả cho thấy ở nồng độ 1 - 10 µM, VH6 làm giảm mức độ biểu hiện của COX-

2 và iNOS một cách phụ thuộc nồng độ (Hình 3.24A); ở nồng độ 1 - 30 µM, hợp chất

này cũng làm giảm mức độ biểu hiện của COX-2 mRNA phụ thuộc theo nồng độ (Hình

3.24B). Tác dụng làm giảm sự sản sinh PGE2 một cách đáng kể và theo nồng độ của

VH6 cũng được chỉ ra ở hình 3.24C.

* Ảnh hưởng của VH6 lên sự sản sinh NO và kích hoạt NF-ƙB

Nitrit là sản phẩm cuối cùng ổn định duy nhất của quá trình tự oxy hóa oxit nitric

trong dung dịch nước. Một mối tương quan cao đã được thiết lập giữa sản xuất NO nội

sinh và nồng độ nitrit / nitrat trong huyết tương hay huyết thanh. Do đó, sự cảm ứng

tăng sinh các sản phẩm NO là một nguyên nhân quan trọng gây tăng kết tập tiểu cầu,

kết dính bạch cầu hay tăng sinh tế bào dẫn đến kích thích các phản ứng gây viêm trong

cơ thể.

Kết quả ở hình 3.25A cho thấy ở dải nồng độ 1 - 30 µM, VH6 có tác dụng ức chế

đáng kể sự sản sinh NO trên đại thực bào RAW264.7 gây kích thích sản sinh NO bằng

LPS phụ thuộc theo nồng độ. Đặc biệt, ở nồng độ cao nhất 30 µM, hợp chất này làm

giảm hàm lượng NO gấp hơn 2 lần so với nhóm không được bổ sung VH6.

NF-ƙB được xác định là yếu tố phiên mã quan trọng kiểm soát các yếu tố trung

gian tiền viêm, việc đánh giá ảnh hưởng của VH6 trên hoạt tính NF-ƙB đã được triển

103

khai sử dụng thí nghiệm phân tích hoạt động của gen và kết quả được chỉ ra ở hình

3.25B. Hợp chất VH6 (1 - 30 µM) làm giảm hoạt tính NF-kB phụ thuộc nồng độ (p <

0,05).

Hình 3.24. Ảnh hưởng của VH6 lên mức độ biểu hiện COX-2, iNOS

và sự sản sinh PGE2 phụ thuộc theo nồng độ

(A). Đại thực bào Raw264.7 được bổ sung 5 μg/ml LPS ủ trong 18 h có hoặc không có mặt hợp chất VH6, gặt tế bào và tách chiết protein để đánh giá thay đổi biểu hiệnCOX-2, iNOS và β-actin bằng kĩ thuật western blot. (B) Ảnh hưởng của VH6 lên mức độ biểu hiện của COX-2 gây kích thích viêm bởi LPS được phân tích bằng RT-PCR (p < 0,001 mức ý nghĩa thống kê so sánh với lô chứng DMSO; # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001, các mẫu thử so sánh với lô chỉ dùng chất kích thích viêm LPS, n=5.). (C) Ảnh hưởng của VH6 trên sự sản sinh PGE2. Các đại thực bào RAW 264.7 được nuôi cấy với 5 μg/ml LPS trong 18 h có hoặc không có mặt hợp chất VH6 và nồng độ PGE2 trong môi trường được xác định bằng thí nghiệm PGE2-specific ELISA. (p < 0,001 mức ý nghĩa thống kê so sánh với lô chứng DMSO; # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001, các mẫu thử so sánh với lô chỉ dùng chất kích thích viêm LPS, n=4.).

104

B A

Hình 3.25. Ảnh hưởng của VH6 lên sự sản sinh NO (A) và hoạt tính NF-κB (B) trong

***p < 0,001 mức ý nghĩa thống kê so sánh với lô chứng DMSO; # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001, các mẫu thử so sánh với lô chỉ dùng chất kích thích viêm LPS, n=4.

đại thực bào RAW264.7 phụ thuộc nồng độ

3.3.1.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm in vivo của Nho rừng

a. Tác dụng chống viêm cấp

Kết quả tỷ lệ phù chân chuột ở các thời điểm 2 h, 3 h, 4 h và 6 h sau khi tiêm

carrageenan được trình bày tại bảng 3.18.

Bảng 3.18. Tác dụng chống viêm cấp của cao VHE trên mô hình gây phù bàn chân

chuột bằng carrageenan

Tác dụng chống viêm tại các thời điểm

STT

Lô

n

Liều (mg/ kg)

Thông số

∆V%

Chứng bệnh

∆V%

Thuốc IDM

∆V%

Cao VHE

∆V%

250

Cao VHE

2 h 24,60 ±2,80 8,92 ±2,20** 63,74% 18,47 ±1,84 24,91% 17,83 ±3,30 27,52%

3 h 38,46 ±4,58 14,26 ±1,77** 62, 92% 28,53 ±2,49 25,82% 25,57 ±3,72* 33,52%

4 h 43,11 ±4,89 11,00 ±2,55** 74,48% 30,14 ±2,18* 30,09% 27,57 ±3,04* 36,05%

6 h 41,16 ±4,82 5,03 ±1,48** 87,78% 26,14 ±1,88* 36,49% 24,75 ±2,62* 39,87%

Trong đó: Số liệu được trình bày dưới dạng Trung bình ± Sai số chuẩn *: p < 0,05 và **: p < 0,01 khi so sánh với lô chứng bệnh tại cùng thời điểm

Như vậy, cao VHE liều 85 mg/kg thể hiện tác dụng chống viêm cấp ở thời điểm

4h và 6 h sau khi gây viêm (p <0,05). Trong khi đó, cao VHE với liều 250 mg/kg thể

hiện tác dụng chống viêm cấp ở 3 thời điểm nghiên cứu là 3 h, 4 h và 6 h sau khi gây

105

viêm (p < 0,05). Thuốc đối chiếu indomethacin (IDM) liều 10 mg/kg thể hiện tác dụng

chống viêm rõ rệt tại cả 4 thời điểm nghiên cứu (p < 0,01).

b. Tác dụng chống viêm mạn

Kết quả ảnh hưởng của VHE lên khối lượng u hạt được trình bày tại bảng 3.19.

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của VHE lên khối lượng u hạt

Lô

ST T

MTB ướt (mg)

MTB khô (mg)

Liều (mg/ kg)

% ức chế khi cân ướt

% ức chế khi cân khô

Chứng bệnh

634,22 ± 74,89

103,61 ± 20,04

2 3 4

Prednisolon Cao VHE Cao VHE

5 85 250

296,34 ± 43,92** 496,86 ± 54,77 497,93 ± 53,79

53,28%

40,14 ± 6,31* 77,97 ± 9,92 104,63 ±24,54

61,26%

Trong đó: Số liệu được trình bày dưới dạng Trung bình ± Sai số chuẩn *: p < 0,05 và **: p < 0,01 khi so sánh với lô chứng bệnh Từ bảng 3.19 cho thấy, khối lượng u hạt ở lô dùng prednisolon cả khi cân ướt và

khi cân khô đều nhỏ hơn lô chứng trắng một cách rõ rệt (p < 0,05). Trong khi đó, ở cả 2

mức liều 85 và 250 mg/kg, cao VHE đều không thể hiện tác dụng làm giảm khối lượng

u hạt (cả lúc ướt và lúc khô), với p > 0,05. Như vậy, cao VHE với liều 85 mg/kg và 250

mg/kg cân nặng chuột cống, uống 7 ngày liên tục, không có tác dụng chống viêm mạn

trên mô hình gây u hạt thực nghiệm.

3.3.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau

Kết quả đếm số cơn đau quặn trong từng 5 phút một (trong tổng cộng 30 phút) sau

khi gây đau cho chuột bằng acid acetic của VHE được trình bày ở bảng 3.20.

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của cao VHE lên số cơn đau quặn

Số cơn đau quặn sau khi tiêm acid acetic tại các thời điểm (phút)

STT

Lô

n

Liều mg/kg

Chứng bệnh

2 Aspirin

240

150

Cao VHE

0-5 11,80 ± 1,63 0,09 ± 0,09 ** 4,09 ± 0,74 **

5-10 26,00 ± 2,09 5,55 ± 1,62 ** 15,00 ± 1,98 **

10-15 20,50 ± 1,64 9,09 ± 2,36 ** 10,91 ± 1,58 **

15-20 17,80 ± 0,99 6,55 ± 1,82 ** 8,55 ± 1,49 **

20-25 13,20 ± 1,12 6,91 ± 1,62 ** 5,46 ± 1,07 **

25-30 10,30 ± 0,94 6,09 ± 1,44 * 3,82 ± 0,95 **

106

450

Cao VHE

9,46 ± 1,32 **

7,09 ± 0,83 **

10,82 ± 1,17 **

6,46 ± 0,94 **

6,36 ± 1,24 *

1,00 ± 0,47 ** Trong đó: Số liệu được trình bày dưới dạng Trung bình ± Sai số chuẩn *: p < 0,05 và **: p < 0,01 khi so sánh với lô chứng bệnh

Kết quả trên cho thấy, cao VHE liều 150 mg/kg và 450 mg/kg thể hiện tác dụng

giảm đau rõ rệt tại thời điểm 5 phút sau khi tiêm acid acetic 1% (p < 0,01), tác dụng này

kéo dài đến 30 phút sau khi gây đau.

107

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

Ở Việt Nam, ngoài loài Nho trồng V. vinifera còn có nhiều loài Nho mọc hoang

dại khác phân bố phổ biến ở khu vực miền núi phía bắc như V. labrusca L. (Nho chồn),

V. balansana Planch. (Nho đất, Nho dại nhỏ quả), V. flexuosa Thunb. (Nho dại, Nho

cong queo), V. heyneana Roem. & Schult (V. pentagona Diels et Gilg) (Nho rừng, Nho

lông, Nho năm góc), V. retordii Rom. Caill. ex Planch. (Nho lông hoe), … [1]. Chúng

được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền với tác dụng chống viêm như thuốc cầm máu,

tiêu sưng, chống viêm, trị phong thấp, khớp xương đau nhức, viêm gan vàng da, mụn

nhọt, viêm vú, viêm khớp, tác dụng chống oxy hóa [2]. Hai báo cáo khoa học đã phân

lập được một số chất từ loài V. flexuosa như gnetin A, (+)-epsilon-viniferin, vitisin A,

flexuosol A, hopeaphenol và chứng minh tác dụng chống oxy hóa của chúng [34]. Tuy

nhiên, cho đến nay hầu như vẫn chưa có các nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học

cũng như tác dụng dược lý của các loài Nho này.

Nhằm chứng minh tác dụng chống viêm là tác dụng chính của loài Nho thu hái tại

Miền Bắc Việt Nam, luận án đã tiến hành sàng lọc tác dụng ức chế biểu hiện COX-2

gây viêm bởi LPS trong đại thực bào RAW264.7 của các cao chiết ethanol 96% phần

trên mặt đất của một số loài Nho. Kết quả cho thấy, cao chiết ethanol 96% loài Nho rừng

có tác dụng ức chế COX-2 tốt nhất. Do đó, luận án đã lựa chọn loài Nho rừng để tiến

hành nghiên cứu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của

phần trên mặt đất - đây là phần có tác dụng được dùng theo dân gian.

4.1. Về thực vật

Chi Nho Vitis L. ở Việt Nam gồm có 6 loài (V. balansana, V. labrusca, V.

heyneana, V. retordii, V. vinifera và V. flexuosa) có đặc điểm hình thái tương đối giống

nhau. Chi nho có một số đặc điểm để dễ dàng nhận biết khi gặp ngoài thực địa như: dây

leo, tua cuốn đối diện với lá, xẻ đôi ở đỉnh, lá đơn, mọc cách, cụm hoa dạng chùy. Trong

đó, loài nho rừng (V. heyneana Roem.& Schult.) có những đặc điểm nổi bật để phân biệt

với các loài khác trong chi là: có lông tơ như tơ nhện màu vàng ở cành non, cuống và

mặt dưới lá; vỏ hạt nhẵn, mặt bụng của hạt có hai rãnh dọc. Bên cạnh đó, luận án đã mô

tả chi tiết đặc điểm thực vật của loài nghiên cứu, so sánh, đối chiếu với bản mô tả ghi

trong các tài liệu phân loại thực vật, đặc biệt là dựa trên khoa phân loại của chi theo tài

liệu của Nguyễn Thế Cường và Thực vật chí Trung quốc [1], [5] để xác định đúng tên

108

khoa học của mẫu nghiên cứu Nho rừng là Vitis heyneana Roem.& Schult. Tuy nhiên,

trong quá trình đối chiếu, chúng tôi nhận thấy mẫu nho rừng mà chúng tôi thu hái có đặc

điểm khác biệt nhỏ so với 02 tài liệu tham khảo trên. Cụ thể, trong cuốn cây cỏ Việt

Nam của Phạm Hoàng Hộ [6], và luận án tiến sĩ sinh học của Nguyễn Thế Cường [1],

các tác giả mô tả mép lá loài V. heyneana có 8-15 đôi răng cưa; Trong thực vật chí Trung

Quốc [5], Jun W. và Ren H. mô tả mép lá nho rừng có 9-19 đôi răng cưa. Còn mẫu

chúng tôi thu hái, mép lá có 19-22 đôi răng cưa. Điều này cho thấy chưa có sự thống

nhất về số lượng răng cưa ở mép lá loài nho rừng trong các tài liệu đã nêu. Do vậy,

chúng tôi đề xuất bỏ đặc điểm số lượng mép lá ra khỏi khóa phân loại chi Vitis.Các đặc

điểm nổi bật như lông ở cành và lá, vỏ hạt, mặt bụng của hạt là hoàn toàn đầy đủ để

phân loại các loài thuộc chi Nho ở Việt Nam.

Đây là nghiên cứu đầu tiên và chi tiết về đặc điểm giải phẫu và bột dược liệu của

loài Nho rừng. Để làm rõ hơn nhận định này nhóm tác giả đã tìm hiểu các tài liệu nghiên

cứu và tài liệu y văn nhận thấy cho đến nay mới chỉ có những tài liệu mô tả về đặc điểm

hình thái mà chưa có công bố về đặc điểm giải phẫu. Đặc điểm giải phẫu của thân và lá

của Nho rừng có điểm nhận dạng khá điển hình ở bó dẫn: vi phẫu thân có mô dẫn tạo

thành từng bó chồng riêng biệt, vi phẫu lá có mô dẫn tạo thành bó, bó to nhất nằm ở

dưới biểu bì trên, gồm libe ở trên, gỗ ở dưới. Bột dược liệu cũng có đặc điểm đặc trưng

là bột thân và bột lá đều có tinh thể calci oxalat hình kim.

Như vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng được bộ dữ liệu về đặc

điểm hình thái (thân, lá, hoa), cấu tạo giải phẫu (thân, lá) và đặc điểm vi học bột dược

liệu (thân, lá) của cây Nho rừng (V. heyneana Roem. & Schult.). Đồng thời, trong

chuyên luận của Dược điển Việt Nam V vẫn chưa có chuyên luận về cây Nho rừng. Kết

quả này góp phần xây dựng tiêu chuẩn phục vụ công tác kiểm nghiệm - giám định và

cũng để mở đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về hóa học và tác dụng sinh học về cây

này.

4.2. Về hóa học

Với mục tiêu là chứng minh tác dụng chống viêm của Nho rừng được sử dụng

trong dân gian, luận án tiến hành tìm kiếm các thành phần có tác dụng chống viêm từ

dược liệu Nho rừng bằng phương pháp định tính ban đầu và chiết xuất phân lập các hợp

109

chất từ cao phân đoạn có tác dụng chống viêm được lựa chọn từ kết quả sàng lọc hoạt

tính trên ức chế COX-2 in vitro.

4.2.1. Về định tính

Định tính các nhóm chất chính trong phần trên mặt đất của loài Nho rừng, kết quả

cho thấy, các nhóm chất như flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid,

chất béo và sterol có mặt trong trong thành phần của loài Nho rừng. Kết quả này phù

hợp với các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Nho với nhóm chất chính là

phenol (stilbenoid và flavonoid) - nhóm chất thể hiện các tác dụng đặc trưng của chi.

Đồng thời, các hợp chất phân lập từ phần trên mặt đất của Nho rừng (thân, lá) đã được

báo cáo (mục 1.2.2) cũng thuộc nhóm phenol, sterol; tương ứng với kết quả định tính.

Ngoài ra, trong phần trên mặt đất của Nho rừng có polysaccharid, là những nhóm hợp

chất chưa được nghiên cứu nhiều ở trong chi Nho, theo như các tài liệu đã tra cứu và

tổng hợp ở phần tổng quan, đồng thời đây là nhóm hợp chất có tác dụng tăng cường hệ

thống miễn dịch, vì vậy có thể gợi ý thêm những định hướng nghiên cứu khác về nhóm

polysaccharid ở Nho rừng.

4.2.2. Về chiết xuất và phân lập

Ở nghiên cứu này, chúng tôi phân lập, tinh chế các hợp chất trong loài Nho rừng

dựa trên cơ sở của kết quả nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế COX-2 gây kích thích

viêm bởi LPS trên đại thực bào RAW264.7. Việc thiết kế nghiên cứu hóa học theo định

hướng tác dụng sinh học có nhiều ưu điểm so với cách phân lập hóa học truyền thống

trước đây. Với cách phân lập thuần túy hóa học, các tác giả thường phân lập, tinh chế

hợp chất tinh khiết từ tất cả các phân đoạn, sau đó tiến hành đánh giá một hay nhiều tác

dụng sinh học khác nhau. Trong khi đó, việc phân lập theo định hướng tác dụng sinh

học sẽ giúp giảm thời gian và công sức nghiên cứu do số hợp chất cần phân lập và đánh

giá tác dụng sinh học ít hơn, đồng thời tăng khả năng tìm ra hợp chất có hoạt tính sinh

học mạnh vì các chất đều được phân lập từ các phân đoạn đã được sàng lọc trước đó.

Tuy nhiên, nghiên cứu phân lập dựa trên định hướng tác dụng sinh học cũng phức tạp

hơn so với cách phân lập hóa học truyền thống do cần sự phối hợp, kết nối giữa nhóm

nghiên cứu hóa học và sinh học, đặc biệt là đối với những mô hình đánh giá tác dụng

sinh học hiện đại.

110

Từ định hướng tác dụng sinh học nêu trên luận án này đã tập trung nghiên cứu

thành phần hóa học của cao chiết phân đoạn ethyl acetat của cao chiết cồn 96% phần

trên mặt đất loài Nho rừng. Tuy nhiên, đề tài này cũng đã mở rộng nghiên cứu về thành

phần hóa học phân đoạn n-hexan, do phân đoạn này cũng thể hiện tác dụng chống viêm,

đồng thời góp phần cung cấp thêm dữ liệu khoa học đầy đủ hơn về thành phần hóa học

của loài này.

Từ cao n- hexan và EtOAc của phần trên mặt đất Nho rừng, luận án đã phân lập

được 16 hợp chất, trong đó 12 hợp chất từ cao EtOAc, với 11 hợp chất stilben gồm:

Trans-resveratrol (VH1), piceid (VH2), 2-r-viniferin (VH3), betulifol A (VH4),

vitisinol C (VH5), (-)-trans-ε-viniferin (VH6), α-viniferin (VH7), shoreaketon (VH8),

amurensin B (VH9), vitisinol B (VH10), cis-vitisin B (VH11), và một acid hữu cơ: acid

protocatechuic (VH12); 04 hợp chất từ cao n- hexan, đều thuộc nhóm steroid/terpen,

bao gồm: dehydrocostus lacton (VH13), β-sitosterol (VH14), daucosterol (VH15) và

acid betulinic (VH16). Như vậy, đa số các hợp chất phân lập được thuộc nhóm

stilbenoid. Điều này tương tự như các nghiên cứu trước đây cho thấy nhóm stilbenoid

là thành phần chính của chi Vitis, với gần 100 stilbenoid đã được phân lập từ các loài

thuộc chi nho. Đồng thời, nhóm hợp chất này cũng có tác dụng chống viêm mạnh, phù

hợp với định hướng sàng lọc tác dụng chống viêm của nghiên cứu. Các hợp chất còn lại

thuộc nhóm sterol hoặc triterpenoid cũng phù hợp với các công bố trước đây về thành

phần hóa học của chi nho.

Các hợp chất VH3, VH4, VH5, VH7, VH9, VH10, VH11, VH12, VH15 lần đầu

tiên được phân lập từ loài Nho rừng, hai hợp chất VH8 và VH13 lần đầu tiên được phân

lập từ chi Nho.

Việc xác định cấu trúc tuyệt đối của các hợp chất oligostilben có nhiều trở ngại do

cấu trúc phức tạp với nhiều trung tâm bất đối, cấu trúc không gian phụ thuộc vào các

nhóm thế [36]. Do đó, các cấu trúc lập thể của các oligostilben (VH3-VH10) được ghi

nhận dựa trên so sánh chuyển dịch hóa học của proton và carbon với tài liệu tham khảo.

➢ Hợp chất resveratrol (VH1):

Trans-resveratrol (E-resveratrol) đã được công bố có trong thành phần của rất nhiều

loài đặc biệt là các loài thuộc chi Nho như V. amurensis (lá, thân, rễ), V. betulifolia (thân),

111

V. chunganensis (toàn cây), V. coignetiae (quả và lá), V. davidii (thân), V. labrusca (quả,

lá, thân), V. heyneana (thân), V. riparia (lá, rễ), V. berlandieri (rễ), V. rotundifolia (quả),

V. thunbergii (thân), V. vinifera (quả, rễ, lá) [13], [20], [9], [10], [15], [16], [21], [22],

[12]. Hợp chất này đã được nghiên cứu rất nhiều về hàm lượng (đặc biệt là trong các

loại rượu Nho) cũng như các tác dụng sinh học. Các nghiên cứu về tác dụng sinh học

của hợp chất này được thống kê trong bảng 4.1 với các dụng chính như chống viêm,

chống ung thư, tiểu đường, tác dụng trên tim mạch… Tác dụng chống viêm của

resveratrol đã được quan tâm nghiên cứu trên nhiều mô hình in vitro và in vivo, và cho

thấy có cơ chế chống viêm đa dạng, thông qua nhiều con đường khác nhau.

➢ Hợp chất piceid (VH2):

Hợp chất này đã được phân lập từ một số loài trong chi Nho như: V. heyneana (rễ),

V. labrusca (quả), V. rotundifolia (quả), V. vinifera (quả, lá) [3], [9], [12], [13], [14], V.

amurensis [10] và đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa (ức chế quá trình

peroxid hóa lipid, dọn gốc tự do) [228], ức chế sự tăng sinh của tế bào [229], gây độc tố

chống lại dòng tế bào ung thư L1210 (IC50 28,7 ± 2,81 μM) và K562 (IC50 24,6 ± 0,76

μM) [10], giảm sắc tố, ức chế hoạt động của tyrosinase, ức chế biểu hiện mRNA và

protein của các enzym tyrosinase, tyrosinase-related protein 1, tyrosinase-related protein

2 và yếu tố phiên mã một cách phụ thuộc nồng độ [230].

➢ Hợp chất 2-r-viniferin (VH3):

Hợp chất này đã được phân lập từ thân và lá của V. amurensis [10], [231] với tác

dụng kháng khuẩn (kháng Streptococcus mutans và Streptococcus sanguis) [231] và ức

chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư D‐GBM và DH82 một cách phụ thuộc nồng

độ [232]; dọn gốc tự do (DPPH và ABTS•+) và ức chế sự peroxid hóa lipid [16].

➢ Hợp chất betulifol A (VH4):

Hợp chất betulifol A đã được công bố có trong loài V. betulifolia (thân) [29] và

Parthenocissus tricuspidata [233]. Hợp chất này chưa có các nghiên cứu được công bố

về tác dụng sinh học.

112

Bảng 4.1. Các tác dụng sinh học của E-resveratrol

STT

Tác dụng

Cơ chế/Mô hình/tế bào

Ức chế sự biểu hiện và hoạt tính của COX-2

TLTK [68], [69]

Ức chế quá trình sản sinh các cytokin tiền viêm như TNFα, IL-1β, IL-6 hay IL-8

[83], [84], [85]

Ức chế các matrix metallopetidase như MMP-2, MMP-3, MMP-9 và MMP-13

[31], [69], [86]

In vitro

[68], [70], [71], [73],

Ức chế quá trình sản sinh PGE2, NO, làm giảm nồng độ protein và mRNA gây cảm ứng COX-2 và iNOS

[76], [88]

Ức chế sự kích hoạt tín hiệu NF-κB thông qua việc ức chế phản ứng phosphoryl

[69], [73],

Chống viêm

hóa tiểu đơn vị p65 và IκBα kinase; ức chế quá trình chuyển vị vào nhân tế bào của NF-κB và ức chế hoạt động phiên mã tạo ra các protein viêm

[78], [79], [89],

Mô hình gây viêm đại tràng trên chuột cống

[70]

Mô hình gây viêm đại tràng bằng DSS

[71], [72], [73]

Mô hình gây phát triển khối u trên da chuột bằng TPA

[74]

In vivo

Mô hình gây parkinson bằng OHDA

[75]

Mô hình gây tăng cảm đau bằng carrageenan

[76]

Mô hình gây viêm khớp bằng LPS

[77]

Mô hình gây viêm tụy cấp bằng natri taurocholat

[78]

113

[116]

[117]

[118]

Tác dụng trên thành động mạch và hạ huyết áp

[119]

[124]

Giảm kết tập tiểu cầu

Tác dụng trên tim mạch

[126], [127]

Giảm độ cứng của thành động mạch, quá trình thu hẹp lumen, sự khuyếch đại tín hiệu ERK và sự biểu hiện của kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh trong thành động mạch của chuột SHR Ức chế sự phát triển của bệnh tim phì đại, ngăn chặn quá trình rối loạn tâm thu và tâm trường Hạ huyết áp cũng như cải thiện rối loạn chức năng nội bào Làm giảm protein phản ứng C siêu nhạy, TNF-α, tỷ lệ IL-6/IL-10 và chất ức chế hoạt hóa plasminogen, tăng adiponectin Ức chế sự kết tập tiểu cầu gây ra bởi ollagen, epinephrin và thromboxan (ức chế quá trình tạo ra enzym COX-1, NO, ức chế tín hiệu MAPK và tín hiệu phosphoinositid) Làm giảm quá trình thiếu máu cục bộ và tái tưới máu thông qua tác dụng giảm canxi nội bào, ngăn chặn apotosis và tăng cường sự hoạt động của các enzym có khả năng dập tắt các gốc tự do như SOD

Hoạt hóa enzym AMPK và cảm ứng enzym NOS

[128], [129]

Tác dụng trên tổn thương do thiếu máu cục bộ và tái tưới máu

[134] [135]

Giảm xơ vữa động mạch

[136], [137]

[143]

Chống tiểu đường

[144]

Giảm sự tích tụ lipid Điều chỉnh biểu hiện gen liên quan đến sự hình thành và phân giải lipid Ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào nội mô mạch máu gây ra bởi LDL đã bị oxy hóa Ngăn chặn sự tăng đường huyết trên chuột thông qua tăng cường hấp thu glucose và sự vận chuyển GLUT 4 tới màng tế bào .-, OH., H2O2, MDA, Ức chế sự sản sinh ROS và các gốc tự do nitơ (RNS) như O2 tăng cường sự hình thành các enzym chống oxy hóa như SOD, catalase,

114

[145]

[146]

[147]

glutathion peroxidase, ức chế các tác nhân gây viêm như NF-κB, TNF-α, IL-1β, IL-4 và IL-6 Tăng độ nhạy của insulin, tăng khả năng dung nạp glucose, kích hoạt gen SIRT1 (phụ thuộc AMPK) Làm giảm các chỉ số đường huyết trên các bệnh nhân tiểu đường type 2 Làm giảm lượng đường trong máu, haemoglobin A1c, huyết áp tâm thu, tăng chỉ số HDL cholesterol

[155]

Bảo vệ nơ-ron thần kinh khỏi tác nhân ROS và chống lại bệnh Parkinson gây ra bởi MPTP trên chuột thông qua khả năng dập tắt gốc tự do OH.

[156]

[158]

Tác dụng giảm thoái hóa thần kinh

[160]

[161]

[162]

[164]

Tác dụng chống ung thư

[165]

Bảo vệ các nơ-ron dopamin trước tác nhân lipopolysaccharid (LPS) thông qua ức chế sự kích hoạt NF-κB trong tế bào thần kinh Giảm các mảng amyloid trong não Bảo vệ tổn thương do thiếu máu não, thông qua giảm lượng MDA, khôi phục hoạt động SOD, tăng sự biểu hiện của Nrf2 và HO-1, giảm sự biểu hiện của caspase-3 Giảm sự chết của các nơ-ron thần kinh trên mô hình gây thiếu máu não cục bộ trên chuột Giảm lượng MDA, tăng hoạt động SOD, tăng lượng glutathion và giúp cải thiện trí nhớ trên chuột Chuyển hóa pha II của các chất gây ung thư, tăng cường khả năng thải trừ chúng ra khỏi cơ thể Ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư thông qua ức chế sự hoạt động của các yếu tố phiên mã và tăng trưởng như p53, ATF3

115

➢ Hợp chất vitisinol C (VH5):

Hợp chất vitisinol C đã được phân lập từ loài V. thunbergii [44], V. vinifena [52],

V. repens [234], Paeonia lactiflora [235] và đã được chứng minh là có tác dụng giảm

thoái hóa thần kinh thông qua khả năng ức chế hoạt động của β-amyloid [52], ức chế

BACE-1 với IC50 là 4,01 µM [235], ức chế acid arachidonic (AA) và 9,11-dideoxy-

11α,9α-epoxy-methanoprostaglandin F2α (U46619, TXA2) - gây kết tập tiểu cầu với IC50

lần lượt là 13,4 ± 2,2 và 10,5 ± 3,4 µM; dọn gốc tự do với EC50 là 4,5 ± 0,1 µM [234].

➢ Hợp chất (-)-trans-ε-viniferin (VH6):

(-)-Trans-ε-viniferin có trong thành phần của rất nhiều loài thuộc chi Nho như V.

amurensis (lá, thân, rễ), V. berlandieri (rễ), V. betulifolia (thân), V. chunganensis (toàn

cây), V. cinerea (rễ), V. coignetiae (toàn cây), V. davidii (thân), V. flexuosa (thân), V.

acerifolia (rễ), V. riparia (lá, rễ), V. riparia (rễ), V. berlandieri (rễ), V. rupestris (rễ), V.

thunbergii (rễ, thân), V. vinifera (lá, thân, rễ, quả), V. wilsoniae (thân), V. heyneana (thân)

[10], [11], [12], [15], [17], [18], [23], [27], [28], [29], [30], [32], [34], [35], [36], [42],

với nhiều tác dụng dược lý đã được chứng minh như: Cảm ứng mạnh protein và mRNA

của HO-1 và giảm mức độ biểu hiện gen của iNOS và IL-1β [113]; ức chế BACE-1

(IC50 là 2,21 µM) [235]; tăng SIRT3, kích hoạt AMPK và bảo vệ các tế bào trong mô

hình bệnh Huntington (rối loạn thoái hóa thần kinh di truyền) [236]; chống oxy hóa

[237]; ức chế sự hấp thu noradrenalin, 5-hydroxytryptamin và hoạt động của enzym

monoamin oxydase [238]; giảm sự hấp thu của glucose ở hồi tràng và hỗng tràng [239];

kháng khuẩn (kháng Streptococcus mutans và Streptococcus sanguis với MIC lần lượt

là 5,0 và 12,5 µg/mL) [231].

➢ Hợp chất α-viniferin (VH7):

Hợp chất này có trong thành phần của rất nhiều loài như V. riparia, V. vinifera (lá)

[36], Caragana chamlagu [240], Caragana chamlague [241], Carex humilis [242] với

một số tác dụng sinh học đã được chứng minh như: Chống viêm (ức chế sản sinh NO,

PGE2 và biểu hiện iNOS và COX-2, ức chế hoạt động NF-κB do LPS gây ra thông qua

quá trình khử phospho của PI3K/Akt) [240], [243]; ức chế sự tổng hợp của prostaglandin

H2 [242]; ức chế acetylcholinesterase [241]; ức chế mạnh 7 trong số 9 đồng phân CYP

(trừ CYP2A6 và CYP2E1), ức chế mạnh hoạt động của CY2C19 và CYP3A4 (với giá

trị IC50 tương ứng là 0,93 và 1,2 Μm) phụ thuộc nồng độ [244]; chống oxy hóa (theo

116

phương pháp Ferric Thiocyanate (FTC) và Thiobarbituric Acid (TBA) với phần trăm ức

chế lần lượt là 77,77% và 86,47%) [245]; kháng khuẩn (kháng Staphylococcus aeureus

và Escherichia coli) [245].

➢ Hợp chất shoreaketon (VH8):

Hợp chất này được phân lập lần đầu tiên từ vỏ thân của loài Shorea uliginosa [221].

Ngoài ra, hợp chất này cũng được tìm thấy trong các loài Shorea hemsleyana và Vateria

indica [246], Shorea acuminata [247] và được chứng minh là có tác dụng chống oxy

hóa (dọn gốc tự do DPPH và BCLA với IC50 lần lượt là 1,54 ± 0,10 và 0,11 ± 0,00 µM)

[247], chống virus (ức chế sự nhân len của HSV-1, -2 và virus cúm A) [248].

➢ Hợp chất amurensin B (VH9):

Amurensin B đã được phân lập từ lá, thân và rễ của V. amurensis và trong loài V.

chunganensis [10], [16], [21], [42]. Hợp chất này được chứng minh là có tác dụng dọn

gốc tự do (DPPH và ABTS•+) và ức chế sự peroxid hóa lipid [16].

➢ Hợp chất vitisinol B (VH10):

Hợp chất vitisinol B đã được cô lập từ loài V. thunbergii [44], V. repens [234] và

có tác dụng dọn gốc tự do với EC50 là 3,6 ± 0,1 µM [234].

➢ Hợp chất cis-vitisin B (VH11):

Hợp chất này đã được báo cáo từ loài V. amurensis (rễ), V. coignetiae (thân) [56],

[43], Iris lactea [249] và có tác dụng ức chế đáng kể sự biệt hóa tế bào mỡ và giảm tích

lũy lipid trong các tế bào 3T3-L1. Ngoài ra, cis-vitisin B còn ức chế mạnh mức độ biểu

hiện của các gen đặc hiệu của tế bào mỡ bao gồm PPARγ, CCAAT và FABP4 [249].

➢ Hợp chất acid protocatechuic (VH12)

Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ loài V. heyneana, đã được báo cáo là

có tác dụng chống oxy hóa [250], chống viêm và giảm đau [251].

➢ Hợp chất dehydrocostus lacton (VH13)

Đây là một hợp chất sesquiterpen lacton lần đầu tiên được phân lập từ chi Nho.

Cho đến nay, trên thế giới mới có một công bố tìm thấy 14 hợp chất có khung

sesquiterpen trong vỏ quả của loài V. vinifera [252]. Ngoài ra, chúng tôi chưa tìm thấy

có công bố nào phát hiện các hợp chất sesquiterpen lacton trong chi Nho. Như vậy,

nghiên cứu này lần đầu tiên phân lập được một hợp chất guaian lacton từ chi Nho. Hợp

117

chất dehydrocostus lacton đã được công bố là có tác dụng chống viêm [253], ức chế tế

bào ung thư [254].

➢ Hợp chất β-sitosterol (VH14)

Hợp chất này đã được tìm thấy trong nhiều loài thuộc chi Nho như V. vinifera, V.

amurensis và V. davidii. β-sitosterol cũng được biết đến với tác dụng chống viêm và

giảm đau [255], [256].

➢ Hợp chất daucosterol (VH15)

Daucosterol là hợp chất phổ biến trong thực vật, đã được phân lập ở nhiều loài

thực vật, trong đó có V. vinifera. Tuy nhiên đây là lần đầu tiên phân lập được daucosterol

từ loài Nho rừng. Daucosterol là hợp chất có nhiều tác dụng dược lý như bảo vệ tế bào

thần kinh [257], chống viêm [258] và chống ung thư [259].

➢ Hợp chất acid betulinic (VH16)

Acid betulinic là một triterpenoid cũng đã được phân lập ở nhiều loài khác thuộc

chi Nho như V. vinifera, V. amurensis, V. thunbergii. Cho đến nay, đã có nhiều nghiên

cứu đánh giá tác dụng của acid betulinic, kết quả cho thấy hợp chất có tác dụng chống

viêm [260] và chống ung thư [261].

4.3. Về tác dụng chống viêm và giảm đau

Trong nghiên cứu này, luận án tiến hành đánh giá tác dụng chống viêm in vitro

trên các đích tác dụng là COX-2, NO, PGE2 bằng các kỹ thuật chính như Western blot,

ELISA và định lượng RT-PCR được ứng dụng để đo lường với tác nhân kích thích LPS

trên dòng tế bào RAW264.7. Đối với tác dụng chống viêm in vivo, luận án nghiên cứu

trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan và mô hình tạo u hạt. Đây là các mô

hình thường quy được rất nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng ở Việt Nam. Ngoài “sưng”,

“nóng”, “đỏ” thì một triệu chứng điển hình khác của viêm là “đau”. Vì vậy, khi nghiên

cứu tác dụng chống viêm của dược liệu, luận án đánh giá đồng thời tác dụng giảm đau

trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic.

4.3.1. Tác dụng chống viêm in vitro

Kết quả sàng lọc ban đầu bằng RT-PCR trên gen COX-2 cho thấy ở liều thử nghiệm

50 μg/ml phân đoạn ethyl acetat của cao chiết ethanol 96% của loài V. heyneana có tác

dụng ức chế mạnh nhất trên dòng tế bào RAW264.7 so với cao chiết ethanol 96% và 2

cắn phân đoạn n-hexan và cắn nước của cao chiết ethanol 96%. Kết quả này cũng tương

118

đồng với kết quả nghiên cứu của Huang C.C. và cộng sự trong đánh giá khả năng ức chế

sản sinh NO trong đại thực bào chuột bị kích thích bởi LPS của cao chiết methanol và

các phân đoạn từ thân Nho rừng. Kết quả của nhóm tác giả cũng cho thấy phân đoạn

ethyl acetat cho thấy khả năng ức chế sản sinh NO là tốt nhất [33]. Tác dụng ức chế sự

sản sinh NO từ thân Nho rừng có thể kích thích quá trình ức chế kết tập tiểu cầu, kết

dính bạch cầu và giảm cảm ứng của COX-2.

Kết quả phân lập các hợp chất từ cao EtOAc của Nho rừng cũng thu được 11 hợp

chất stilbenoid và oligostilbenoid đã được phân lập từ Nho rừng, là nhóm chất mục tiêu

mà luận án hướng đến. Do vậy, trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng kháng viêm, các hợp

chất thuộc nhóm này được sử dụng để sàng lọc hoạt tính ức chế biểu hiện gen COX-2

mRNA và ức chế hình thành PGE2 trên đại thực bào RAW 264.7 gây kích hoạt viêm

bằng LPS. Tuy nhiên, hợp chất resveratrol (VH1) đã được rất nhiều tác giả trên thế giới

nghiên cứu về tác dụng chống viêm (mục 1.1.3.1.); do đó, luận án chỉ tiến hành sàng lọc

tác dụng chống viêm của 10 hợp chất còn lại.

Tiến hành đánh giá tác dụng của 10 hợp chất phân lập được từ Nho rừng (VH2-

VH11) ở nồng độ 10 µM và chất chứng dương là meloxicam (20 µM), trên protein

COX-2, biểu hiện mRNA và sản phẩm PGE2 ở tế bào RAW264.7 được kích thích bởi

LPS bằng phương pháp western blotting và kỹ thuật RT-PCR đã chỉ ra rằng, trans--

viniferin (VH6) có khả năng ức chế biểu hiện COX-2 mạnh nhất. Do đó VH6 được

nghiên cứu sâu hơn về cơ chế chống viêm trên tế bào RAW 264.7, mô hình in vitro.

Tế bào RAW 264.7 là dòng tế bào đại thực bào của chuột đóng vai trò là một mô

hình quan trọng để thử nghiệm các chất chống viêm ngày nay. Khi các tế bào đại thực

bào được kích hoạt bởi LPS, một số cytokin được giải phóng và có thể đánh giá. Nitric

oxid (NO) đóng vai trò vừa có lợi vừa có hại cho quá trình viêm. NO được sản sinh từ

các cấu tử NOS (eNOS, hoặc NOS loại I và III ) là cần thiết để duy trì chức năng tế

bào[265]; trong khi đó NO được sản sinh từ việc cảm ứng NOS (iNOS, NOS loại II) là

một trung gian quan trọng của viêm cấp và viêm mạn tính [266], chúng cũng góp phần

vào cơ chế bệnh sinh các mô tổn thương trong sốc tuần hoàn [267]. COX-1 và COX-2

là các isozyme chuyển đổi acid arachidonic thành prostaglandin, tuy nhiên, COX-2 phản

ứng chủ yếu để tạo ra một lượng lớn PGE trong tế bào đại thực bào. Sự biểu hiện quá

mức của COX-2 đã được chứng minh là có liên quan đến viêm mạn tính, các vấn đề của

119

hệ mạch và ung thư [263], [264], [268]. Viêm mạn tính dẫn đến sự cảm ứng một số

enzym trong các mô và tế bào bị tổn thương. Đặc biệt, các enzym cảm ứng tổng hợp

nitric oxid (iNOS ) và COX-2 dẫn đến việc sản sinh quá mức của NO và prostaglandin

tương ứng, được cho là có liên quan đến quá trình bệnh sinh ung thư [269]; COX-2 cũng

đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành khối u dạ dày [270]. Ambs và cộng sự

cũng đã chỉ ra rằng có mối quan hệ chặt chẽ giữa sự hiện diện của iNOS và tần số đột

biến trong các mô của khối u đại tràng [271]. Do đó, việc sản sinh quá mức prostaglandin

và NO có thể được coi như một yếu tố nội sinh và là một promoter của chất sinh ung

thư và các chất ức chế COX-2 hoặc iNOS có thể được ứng dụng như các tác nhân ngăn

ngừa ung thư ở người.

Các vùng gen khởi động của COX-2 chứa NF-кB liên kết, NF-кB được biết đến là

một yếu tố phiên mã quan trọng của gen này [272]. Sự kích thích của tế bào bằng các

yếu tố viêm dẫn đến quá trình phosphoryl hóa phức I-кB/NF-кB và sự giáng hóa của

protein I-кB. Sự giáng hóa này gây phân ly của phức hợp NF-кB từ protein I-кB, cho

phép NF-кB tự do xâm nhập vào nhân tế bào. Từ đó NF-кB trong nhân tế bào tham gia

vào quá tình tổ hợp sao chép và điều chỉnh sự biểu hiện của gen COX-2.

Việc ức chế các sản phẩm trên có thể là phương pháp hiệu quả để điều trị một số

loại nhiễm trùng.

Phương pháp định lượng ELISA xác nhận rằng trans--viniferin (VH6) có khả

năng ức chế sản phẩm PGE2 ở tế bào RAW264.7 mạnh nhất. Do đó, trans--viniferin

được lựa chọn để đánh giá tác dụng ức chế sản phẩm PGE2 bằng phương pháp ELISA

ở các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy, trans--viniferin (1 - 30 µM) có khả năng

ức chế đáng kể sản phẩm PGE2 (p < 0,05) và làm giảm mức độ biểu hiện COX-2 giảm

xuống ở cả nồng độ protein và nồng độ mRNA. Bên cạnh đó, trans--viniferin (1 - 30

µM) ức chế đáng kể sản phẩm NO phụ thuộc nồng độ. Đặc biệt, tại nồng độ cao nhất

(30 µM), hợp chất này có khả năng giảm nồng độ sản phẩm NO gấp hơn 2 lần so với

chứng bệnh. Ngoài ra, trans--viniferin (1 - 30 µg/mL) có khả năng ức chế sự phiên mã

của NF-ƙB kích thích bởi LPS (p < 0,05).

Trans--viniferin đã được báo cáo có tác dụng chống viêm trên mô hình như ức

chế quá trình giải phóng IL-1β và TNF-α, ức chế các phản ứng gây viêm ở tế bào thần

kinh bị tổn thương [273], [274], [275]. Nghiên cứu của Chang và cộng sự (2017) cho

120

thấy, trans--viniferin cho thấy không gây độc tế bào ở nồng độ 1 µM, ít gây độc tế bào

ở nồng độ 10 µM; và cho thấy khả năng ức chế sự sản sinh NO phụ thuộc vào nồng độ

ở khoảng nồng độ 1-10 µM [276]. Kết quả đề tài thu được cũng cho kết quả tương tự,

cho thấy VH6 có tác dụng chống viêm tốt.

(-) - Trans-ε-viniferin lần đầu tiên được phân lập từ V. vinifera và là chất thứ cấp

được sinh tổng hợp từ resveratrol [239]. Resveratrol là hợp chất đã được chứng minh

có tác dụng chống viêm rất tốt, trên nhiều mô hình in vitro, in vivo với nhiều cơ chế

thông qua các con đường tín hiệu như con đường acid arachidonic, NF-ƙB, MAPK, AP-

1,… Các mô hình đánh giá tác dụng chống viêm của VH6 mà luận án sử dụng cũng đã

được nhiều tác giả nghiên cứu đối với resveratrol và cho kết quả tốt [277]. Một hợp chất

khác là α-viniferin (VH7), cũng ức chế sản sinh NO, PGE2 và biểu hiện iNOS và COX-

2, ức chế hoạt động NF-κB do LPS gây ra thông qua quá trình khử phospho của

PI3K/Akt) [240], [243].

NHÂN TẾ BÀO

Hình 4.1. Giả thuyết cơ chế chống viêm của hợp chất VH6

121

Như vậy, luận án đã tìm được chất chống viêm in vitro tiềm năng từ loài Nho

rừng là trans--viniferin thông qua con đường ức chế các chất trung gian trong đáp ứng

viêm là các protein như COX-2, PGE2; NO bằng cách chế sự phiên mã của NF-ƙB; và

các tác dụng này đều phụ thuộc nồng độ (Hình 4.1). Đây là báo cáo đầu tiên cho thấy

khả năng ức chế COX-2, và ức chế sự phiên mã của NF-ƙB của hợp chất này.

4.3.2. Tác dụng chống viêm và giảm đau in vivo

Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro của loài Nho rừng cho thấy hoạt

tính ức chế COX-2 của phân đoạn ethyl acetat của cao chiết cồn VH mạnh nhất trong số

các mẫu cao chiết chiết cồn 96%, cao n-hexan và cao nước sàng lọc trên cùng mô hình.

Từ phân đoạn ethyl acetat của VH nhóm nghiên cứu đã phân lập được 11 hợp chất

stilbenoid và oligostilbenoid từ phân đoạn ethyl acetat và đã đánh giá hoạt tính ức chế

COX-2. Kết quả đã phát hiện được hoạt chất tiềm năng là (+)-trans-−viniferin (VH6).

Do vậy, luận án tiếp tục lựa chọn tác dụng chống viêm và giảm đau in vivo để minh

chứng rõ hơn về cơ chế tác dụng chống viêm của loài Nho rừng.

4.3.2.1. Về liều nghiên cứu

Theo kinh nghiệm dây gian, cây nho rừng được sử dụng 20-25g dược liệu/ ngày

dưới dạng thuốc sắc. Với hiệu suất chiết cao VHE là 2,6%, chúng tôi giả thuyết liều sử

dụng cao VHE có hiệu quả là 12 mg/kg đối với người. Từ đó lựa chọn liều thấp trong

nghiên cứu tác dụng chống viêm in vivo là 85 mg/kg cân nặng chuột cống và 150 mg/

kg cân nặng chuột nhắt. Mức liều thử nghiệm thứ hai gấp 3 lần mức liều thứ nhất.

Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm tại các mức liều này đã xác nhận giả thuyết

trên. Từ đó cho thấy có bằng chứng khoa học về việc sử dụng loài Nho rừng trong chữa

các chứng viêm đau trong dân gian, tương ứng với liều 12 mg/ kg & 36 mg/ kg ở người

với cao VHE.

4.3.2.2. Về mô hình chống viêm cấp

Mô hình được lựa chọn trong đề tài là mô hình gây viêm bằng carrageenan trên

chuột cống trắng. Đây là mô hình được ứng dụng nhiều trong thực nghiệm do dễ áp

dụng và khá nhạy, tác nhân này gây viêm bằng nhiều cơ chế, phản ứng viêm do

carrageenan tạo ra có hai pha do đó cho phép dự đoán các đích tác động mà thuốc thử

hướng tới [278].

122

Khi tiêm carrageenan vào gan bàn chân sau của chuột sẽ nhanh chóng xuất hiện

hiện tượng tăng tính thấm thành mạch, hình thành dịch rỉ viêm và bạch cầu thoát mạch,

chủ yếu là bạch cầu trung tính, vào mô viêm, do đó các triệu chứng lâm sàng như phù,

ban đỏ, và tăng kali máu xuất hiện ngay sau khi tiêm. Quá trình viêm cấp sau khi tiêm

trải qua 2 giai đoạn: giai đoạn đầu (0-2 giờ sau tiêm), tại chỗ tiêm xuất hiện giãn mạch,

giải phóng các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, kinin,…; giai đoạn sau

(2-6 giờ sau tiêm) là quá trình enzym COX cảm ứng, sản xuất bradykinin, protease, PG

và lysosom và các gốc tự do, đồng thời có sự xâm nhập và hoạt hóa bạch cầu trung tính.

Các bạch cầu trung tính di chuyển vào mô viêm sẽ giải phóng vào khoảng gian bào các

gốc tự do oxygen gây độc (như O2ˉ, H2O2 và OHˉ), các gốc oxygen này sẽ phản ứng với

nitơ oxit hình thành các gốc tự do phản ứng (như ONOOˉ, NO2ˉ và NO3ˉ) làm tăng

cường và khuếch đại phản ứng viêm [279]. Các PG có vai trò chính trong sự tiến triển

của phản ứng viêm trong giai đoạn này, khi đó các biểu hiện của viêm sưng đỏ và phù

xuất hiện xuất hiện rõ nhất, đặc biệt trong 3-5 giờ sau gây viêm [280].

Nhóm nghiên cứu chọn mốc quan sát là thời điểm 2, 3, 4, 6 giờ sau gây viêm để

đánh giá tác dụng chống viêm của cao chiết. Kết quả nghiên cứu cho thấy, thể tích bàn

chân chuột sau khi tiêm carrageenan ở các thời điểm nghiên cứu đều tăng có ý nghĩa

thống kê so với thời điểm trước khi tiêm carrageenan ở lô chứng (p<0,01). Như vây,

carrageenan là chất gây viêm rõ rệt cho bàn chân chuột ở các thời điểm nghiên cứu.

Cao VHE liều 85 mg/kg thể hiện tác dụng chống viêm cấp ở thời điểm 4h và 6 h

sau khi gây viêm (p <0,05). Trong khi đó, cao VHE với liều 250 mg/kg thể hiện tác dụng

chống viêm cấp ở 3 thời điểm nghiên cứu là 3 h, 4 h và 6 h sau khi gây viêm (p < 0,05).

Kết quả này gợi ý rằng cao VHE có tác dụng chống viêm cấp ở giai đoạn 2, tức là có tác

dụng ức chế đối với quá trình enzym COX cảm ứng, sản xuất bradykinin, protease và

đặc biệt là PG.

4.3.2.3. Về mô hình chống viêm mạn

Mô hình gây u hạt trên chuột là mô hình đơn giản, dễ thực hiện, kết quả đáng tin

cậy để đánh giá tác dụng của thuốc ức chế chống lại quá trình hoạt hóa, thâm nhiễm và

kết tập của đại thực bào, chống lại quá trình hình thành các tổ chức u hạt trong viêm

mạn. Khi phân tích sinh hóa của u hạt còn giúp cung cấp thêm thông tin các thay đổi

123

chức năng trong viêm mạn tính. Mô hình này thường được sử dụng để đánh giá các loại

thuốc chống viêm mới [278].

Ở cả 2 mức liều 85 và 250 mg/kg, cao VHE đều không thể hiện tác dụng làm giảm

khối lượng u hạt (cả lúc ướt và lúc khô), với p > 0,05, gợi ý rằng cao VHE không có tác

dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt thực nghiệm. Kết quả này có thể do cao

VHE không tác động tới sự hoạt hóa (activation), thâm nhiễm (infiltration) và kết tập

(aggregation) của đại thực bào, chống lại quá trình hình thành các tổ chức u hạt trong

viêm mạn kéo dài.

4.3.2.4. Về mô hình giảm đau

Ngoài “sưng”, “nóng”, “đỏ” thì một triệu chứng điển hình khác của viêm là “đau”.

Vì vậy, khi nghiên cứu tác dụng chống viêm của dược liệu, luận án đánh giá đồng thời

tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic. Mô hình gây đau quặn

sử dụng acid acetic là mô hình gây đau kinh điển đã được nhiều tác giả sử dụng trong

rất nhiều nghiên cứu để sàng lọc tác dụng giảm đau ngoại vi của mẫu thử. Tuy mô hình

này thiếu tính đặc hiệu nhưng đây là mô hình đơn giản, dễ áp dụng trong điều kiện thí

nghiệm để sàng lọc đánh giá tác dụng giảm đau của thuốc.

Acid acetic là một chất kích thích tổng hợp và giải phóng các chất trung gian hóa

học gây viêm đau như histamin, serotonin, bradykinin, các PG và chất P gây kích thích

thần kinh đau [281]. Tác dụng gây đau quặn bởi acid acetic phụ thuộc vào việc sản xuất

các chất trung gian gây viêm như TNFα, IL-1, và PGE2… Cơn đau quặn trên chuột

được biểu hiện bằng việc thóp bụng lại, áp bụng xuống sàn, duỗi dài thân và chân sau.

Việc giảm sản sinh các chất trung gian này giúp giảm kích thích các tế bào thần kinh

cảm giác gây nên triệu chứng đau do đó có tác dụng giảm đau do acid acetic gây ra

[282].

Cao VHE liều 150 mg/kg và 450 mg/kg thể hiện tác dụng giảm đau rõ rệt tại thời

điểm 5 phút sau khi tiêm acid acetic 1% (p < 0,01), tác dụng này kéo dài đến 30 phút

sau khi gây đau. Tác dụng giảm đau này có thể do giảm sản sinh các chất trung gian hóa

học trong phản ứng viêm đau như TNFα, IL-1, các PG…

Như vậy, cao VHE cho thấy tác dụng chống viêm cấp và giảm đau, không cho tác

dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt thực nghiệm. Kết quả này gợi ý cơ chế tác

dụng của cao VHE là do tác dụng ức chế vào các chất trung gian hóa học gây viêm như

124

bradykinin, protease và đặc biệt là PG và ức chế quá trình enzym COX cảm ứng. Tác

dụng chống viêm giảm đau in vivo có thể do phân đoạn ethyl acetat chứa nhiều các hợp

chất stilbenoid là những hợp chất đã được chứng minh có tác dụng ức chế enzym COX-

2 và giảm giải phóng các chất trung gian gây viêm như NO, PGE2. Kết quả này cũng

góp phần tạo cơ sở cho việc sử dụng Nho rừng trong dân gian để trị đòn ngã tổn thương,

gân cốt tê đau, viêm phế quản, bệnh lậu, chữa kinh nguyệt không đều. Từ đó gợi ý tiếp

tục các nghiên cứu lâm sàng tác dụng của cao VHE và hợp chất VH6 đối việc điều trị

các bệnh lý liên quan đến viêm đau xương khớp trong tương lai.

Như vậy, đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu trên đối tượng Nho

rừng đã được sử dụng nhiều trong y học dân gian. Các kết quả của nghiên cứu này góp

phần tiêu chuẩn hóa dược liệu, cung cấp các dữ liệu khoa học cho các nghiên cứu về đối

tượng này trong tương lai, góp phần chứng minh cách sử dụng trong y học cổ truyền và

định hướng phát triển sản phẩm.

125

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN 1. Về thực vật học − Đã mô tả, phân tích đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm giải phẫu thân, lá và xác

định được đặc điểm bột dược liệu thân, lá Nho rừng.

2. Về hóa học − Đã xác định phần trên mặt đất loài Nho rừng có chứa flavonoid, tannin, acid amin,

đường khử, sterol, polysaccharid và chất béo.

− Đã phân lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất từ loài Nho rừng, bao gồm: Trans- resveratrol (VH1), piceid (VH2), 2-r-viniferin (VH3), betulifol A (VH4), vitisinol C (VH5), (-)-trans-ε-viniferin (VH6), α-viniferin (VH7), shoreaketon (VH8), amurensin B (VH9), vitisinol B (VH10), cis-vitisin B (VH11), acid protocatechuic (VH12), dehydrocostus lacton (VH13), β-sitosterol (VH14), daucosterol (VH15) và acid betulinic (VH16). Trong đó, 9 hợp chất, gồm VH3, VH4, VH5, VH7, VH9, VH10, VH11, VH12, VH15 lần đầu tiên được phân lập từ loài Nho rừng, hai hợp chất VH8 và VH13 lần đầu tiên được phân lập từ chi Nho.

3. Về tác dụng sinh học − Đã sàng lọc tác dụng chống viêm của cao chiết cồn và các phân đoạn của phần trên mặt đất Nho rừng, kết quả cho thấy cao ethyl acetat (50 µg/ml) phần trên mặt đất Nho rừng (VHE) ức chế mạnh nhất sự biểu hiện COX-2 gây ra bởi LPS trong đại thực bào RAW264.7.

− Đã đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau in vivo của cao VHE. Cao VHE có tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù chân chuột (liều 85 mg/kg và 250 mg/kg) và có tác dụng giảm đau rõ rệt trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic (liều 150 mg/kg, 450 mg/kg).

− Đã sàng lọc tác dụng chống viêm của các hợp chất được phân lập từ cao VHE, hợp chất (-)-trans-ε-viniferin (VH6, 10 µM) ức chế mạnh nhất sự biểu hiện COX-2 gây ra bởi LPS trong đại thực bào RAW264.7.

− Đã thăm dò cơ chế chống viêm của VH6, hợp chất này (1 - 10 µM) làm giảm mức độ biểu hiện của COX-2 và iNOS một cách phụ thuộc nồng độ. Hợp chất này (1 - 30 µM) cũng làm giảm mức độ biểu hiện của COX-2 mRNA, sự sản sinh PGE2, NO và làm giảm hoạt tính NF-kB phụ thuộc nồng độ. Như vậy, luận án đã tiến hành nghiên cứu phần trên mặt đất của loài Nho rừng với các đặc điểm hình thái, giải phẫu và vi phẫu bột dược liệu; định tính các nhóm chất hữu cơ, và chiết xuất phân lập các hợp chất từ cao có tác dụng chống viêm mạnh, đồng thời nghiên cứu cơ chế chống viêm của hợp chất tiềm năng.

126

KIẾN NGHỊ − Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng VH6 trong dược liệu nho rừng và cao VHE từ đó xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu phần trên mặt đất loài Nho rừng. − Nghiên cứu tác dụng chống viêm, giảm đau in vivo, độc tính cấp, độc tính bán trường

diễn, trường diễn đối với hợp chất VH6.

− Nghiên cứu phát triển sản phẩm chống viêm từ dược liệu phần trên mặt đất loài Nho

rừng.

127

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Phùng Thanh Long, Đỗ Thị Hà, Hà Vân Oanh, Nguyễn Thị Ngọc Anh, Phạm Thị

Thúy, Nguyễn Thị Trang, Lê Việt Dũng, Phạm Thanh Huyền (2017), “Đặc điểm

thực vật và giải phẫu của cây Nho rừng”, Tạp chí Dược liệu, 22(2), 120-123.

2. Phùng Thanh Long, Nguyễn Thị Thúy An, Đỗ Thị Hà, Đào Trọng Tuấn, Hà Vân

Oanh, Lê Việt Dũng (2017), “Các hợp chất stilbenoid phân lập từ phân đoạn ethyl

acetat phần trên mặt đất cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.)”, Tạp chí

Dược học, 493(57), 59-63.

3. Phùng Thanh Long, Nguyễn Thị Thúy An, Phạm Thị Thúy, Hà Vân Oanh,

Nguyễn Minh Khởi, Đỗ Thị Hà (2017), “Các hợp chất oligostilbenoid phân lập từ

phân đoạn ethyl acetat của phần trên mặt đất cây Nho rừng”, Tạp chí Dược liệu,

22(6), 352-360.

4. Do Thi Ha, Phung Thanh Long, Tran Thi Hien, Dao Trong Tuan, Nguyen Thi

Thuy An, Nguyen Minh Khoi, Ha Van Oanh, Tran Manh Hung, (2018), “Anti-

inflammatory effect of oligostilbenoids from Vitis heyneana in LPS-stimulated

RAW264.7 macrophages via suppressing the NF-κB activation”, Chemistry

Central Journal, 12(1):14.

5. Phùng Thanh Long, Đỗ Thị Hà, Hà Vân Oanh, Đỗ Thị Nguyệt Quế, Nguyễn Thị

Huyền Trang, Đỗ Thị Hoàng Hải (2018), “Tác dụng chống viêm và giảm đau in

vivo của phần trên mặt đất cây Nho rừng”, Tạp chí Dược liệu, 23(2), 94-98.

6. Phùng Thanh Long, Nguyễn Thị Thu, Hà Vân Oanh, Đỗ Thị Hà (2020), “Một

số hợp chất steroid, terpenoid và acid phenolic phân lập từ cây Nho rừng (Vitis

heyneana Roem. & Schult.)”, Tạp chí Dược liệu, 25(6), 337-341.

128

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Thế Cường (2012), Nghiên cứu phân loại họ nho - Vitaceae Juss ở Việt

Nam. Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Luận án tiến sĩ sinh học, 41 - 47.

2. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 2. Việt Nam: Nhà xuất bản

Y học, 356-357.

3. Li Y., Li Z. H., Zhang C. H., Zhang X. D., Cui Z. H., Li M. H. (2013), Chemical

constituents from Vitis heyneana Roem. & Schult, (Vitaceae). Biochemical

Systematics and Ecology, 50: 266-268.

4. Takhtajan A. (2009), Flowing Plants. New York: Springer.

5. Jun W., Ren H. (2007), Flora of China, Vol 12. China: Science Press, Beijing, and

Missouri Botanical Garden Press, St. Louis.

6. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, tập 2. Việt Nam: Nhà xuất bản Trẻ,

476-477.

7. Kim J., Ha T., Ahn J., Kim H., Kim S. (2009), Pterostilbene from Vitis coignetiae

protect H2O2-induced inhibition of gap junctional intercellular communication in

rat liver cell line. Food and Chemical Toxicology, 47(2): 404-409.

8. Bezhuashvili M., Surguladze M. (2020), Stilbenoids-astringin and astringinin of

saperavi grape variety (Vitis vinifera L.) and wine. Plant Archives, 20(1): 2929-

2934.

9. Buiarelli F., Coccioli F., Jasionowska R., Merolle M., Terracciano A. (2007),

Analysis of some stilbenes in Italian wines by liquid chromatography/tandem mass

spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 21(18): 2955-2964.

10. Ha D. T., Chen Q. C., Hung T. M., Youn U. J., Ngoc T. M., Thuong P. T., Kim H.

J., Seong Y. H., Min B. S., Bae K. (2009), Stilbenes and oligostilbenes from leaf

and stem of Vitis amurensis and their cytotoxic activity. Archives of Pharmacal

Research, 32(2): 177-183.

11. Kulesh N. I., Veselova M. V., Fedoreev S. A., Denisenko V. A. (2006),

Polyphenols from Vitis amurensis stems. Chemistry of Natural Compounds, 42:

235-237.

12. Pawlus A. D., Waffo-Téguo P., Shaver J., Mérillon J. M. (2012), Stilbenoid

chemistry from wine and the genus Vitis. Journal International Des Sciences De

La Vigne Et Du Vin, 46(2): 57-111.

13. Baderschneider B., Winterhalter P. (2000), Isolation and characterization of novel

stilbene derivatives from Riesling wine. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 48(7): 2681-2686.

14. Naugler C., Mccallum J., Klassen G., Strommer J. (2007), Concentrations of trans-

resveratrol and related stilbenes in Nova Scotia wines. American Journal of

Enology and Viticulture, 58(1): 117-119.

15. Guebailia H. A, Chira K., Richard T., Mabrouk T., Furiga A., Vitrac X., Monti J.

P., Delaunay J. C., Mérillon J. M. (2006), Hopeaphenol: the first resveratrol

tetramer in wines from North Africa. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

54(25): 9559-9564.

16. Ha D. T., Kim H., Thuong P.T., Ngoc T. M., Lee I., Hung N. D., Bae K. (2009),

Antioxidant and lipoxygenase inhibitory activity of oligostilbenes from the leaf

and stem of Vitis amurensis. Journal of Ethnopharmacology, 125(2): 304-309.

17. Pezet R., Perret C., Jean-Denis J., Tabacchi R., Gindro K., Viret O. (2003), δ-

Viniferin, a resveratrol dehydrodimer: One of the major stilbenes synthesized by

stressed grapevine leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(18):

5488-5492.

18. Vitrac X., Bornet A., Vanderlinde R., Valls J., Richard T., Delaunay J. C., Mérillon

J. M., Teissedre P. L. (2005), Determination of stilbenes (δ-viniferin, trans-

astringin, trans-piceid, cis- and trans-resveratrol, ε-viniferin) in Brazilian wines.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(14): 5664-5669.

19. Vitrac X., Castagnino C., Waffo-Téguo P., Delaunay J. C., Vercauteren J., Monti

J. P., Deffieux G., Mérillon J. M. (2001), Polyphenols newly extracted in red wine

from Southwestern France by centrifugal partition chromatography. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 49(12): 5934-5938.

20. Bisson J., Poupard P., Pawlus A. D., Pons A., Darriet P., Mérillon J. M., Waffo-

Téguo P. (2011), Development of hybrid elution systems for efficient purification

of stilbenoids using centrifugal partition chromatography coupled to mass

spectrometry. Journal of Chromatography A, 1218(36): 6079-6084.

21. He S., Jiang L., Wu B., Li C., Pan Y. (2009), Chunganenol: An unusual

antioxidative resveratrol hexamer from Vitis chunganensis. Journal of Organic

Chemistry, 74(20): 7966-7969.

22. Huang K. S., Lin M. (1999), Oligostilbenes from the roots of Vitis amurensis.

Journal of Asian Natural Products Research, 2(1): 21-28.

23. Yan K., Terashima K., Takaya Y., Niwa M. (2001), A novel oligostilbene named

(+)-viniferol a from the stem of Vitis vinifera 'Kyohou'. Tetrahedron, 57(14): 2711-

2715.

24. Fernández-Marín M. I., Guerrero R. F., García-Parrilla M. C., Puertas B., Richard

T. (2012), Isorhapontigenin: A novel bioactive stilbene from wine grapes. Food

Chemistry, 135(3): 1353-1359.

25. Macke S., Jerz G., Empl M. T., Steinberg P., Winterhalter P. (2012), Activity-

guided isolation of resveratrol oligomers from a grapevine-shoot extract using

countercurrent chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

60(48): 11919-11927.

26. Chen L. G., Wang C. C. (2009), Preparative separation of oligostilbenes from Vitis

thunbergii var. taiwaniana by centrifugal partition chromatography followed by

Sephadex LH-20 column chromatography. Separation and Purification

Technology, 66(1): 65-70.

27. Chiou W., Shen C., Chen C., Lin C., Huang Y. (2009), Oligostilbenes from the

roots of Vitis thunbergii. Planta Medica, 75(8): 856-859.

28. Li W. W., Ding L. S., Li B. G., Chen Y. Z. (1996), Oligostilbenes from Vitis

heyneana. Phytochemistry, 42(4): 1163-1165.

29. Li W. W., Li B. G., Chen Y. Z. (1998), Oligostilbenes from Vitis betulifolia.

Phytochemistry, 49(5): 1393-1394.

30. Oshima Y., Namao K., Kamijou A., Matsuoka S., Nakano M., Terao K., Ohizumi

Y. (1995), Powerful hepatoprotective and hepatotoxic plant oligostilbenes,

isolated from the oriental medicinal plant Vitis coignetiae (Vitaceae). Experientia,

51(1): 63-66.

31. Wang K. T., Chen L. G., Tseng S. H., Huang J. S., Hsieh M. S., Wang C. C. (2011),

Anti-inflammatory effects of resveratrol and oligostilbenes from Vitis thunbergii

var. taiwaniana against lipopolysaccharide-induced arthritis. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 59(8): 3649-3656.

32. Zga N., Papastamoulis Y., Toribio A., Richard T., Delaunay J. C., Jeandet P.,

Renault J. H., Monti J. P., Mérillon J. M., Waffo-Téguo P. (2009), Preparative

purification of antiamyloidogenic stilbenoids from Vitis vinifera (Chardonnay)

stems by centrifugal partition chromatography. Journal of Chromatography B,

877(10): 1000-1004.

33. Huang C. C., Tung Y. T., Cheng K. C., Wu J. H. (2011), Phytocompounds from

Vitis kelungensis stem prevent carbon tetrachloride-induced acute liver injury in

mice. Food chemistry, 125(2): 726-731.

34. Li W., Li B., Chen Y. (1998), Flexuosol A, a new tetrastilbene from Vitis flexuosa.

Journal of Natural Products, 61(5): 646-647.

35. Li W., Li B., Chen Y. (1998), Oligostilbenes from Vitis wilsonae. Chinese Journal

of Applied & Environmental Biology, 4(2): 28-31.

36. Mattivi F., Vrhovsek U., Malacarne G., Masuero D., Zulini L., Stefanini M., Moser

C., Velasco R., Guella G. (2011), Profiling of resveratrol oligomers, important

stress metabolites, accumulating in the leaves of hybrid Vitis vinifera (Merzling x

Teroldego) genotypes infected with plasmopara viticola. Journal of Agricultural

and Food Chemistry, 59(10): 5364-5375.

37. Liang N. N., Pan Q. H., He F., Wang J., Reeves M. J., Duan C. Q. (2013), Phenolic

profiles of Vitis davidii and Vitis quinquangularis species native to China. Journal

of agricultural food chemistry, 61(25): 6016-6027.

38. Kong Q., Ren X., Jiang L., Pan Y., Sun C. (2010), Scirpusin A, a hydroxystilbene

dimer from Xinjiang wine grape, acts as an effective singlet oxygen quencher and

DNA damage protector. Journal of the Science of Food and Agriculture, 90(5):

823-828.

39. Fujii F., He Y. H., Terashima K., Takaya Y., Niwa M. (2005), Three new

stilbeneoligomers from the roots of Vitis vinifera 'Kyohou'. Heterocycles, 65(10):

2461-2469.

40. Huang K., Lin M., Wang Y. (1999), Synthesis of amurensin H, a new resveratrol

dimer from the roots of Vitis amurensis. Chinese Chemical Letters, 10(10): 817-

820.

41. Ito J., Takaya Y., Oshima Y., Niwa M. (1999), New oligostilbenes having a

benzofuran from Vitis vinifera 'Kyohou'. Tetrahedron, 55(9): 2529-2544.

42. Huang K. S., Lin M., Cheng G. F. (2001), Anti-inflammatory tetramers of

resveratrol from the roots of Vitis amurensis and the conformations of the seven-

membered ring in some oligostilbenes. Phytochemistry, 58(2): 357-362.

43. Oshima Y., Kamijou A., Ohizumi Y., Niwa M., Ito J., Hisamichi K., Takeshita M.

(1995), Novel oligostilbenes from Vitis coignetiae. Tetrahedron, 51(44): 11979-

11986.

44. Huang Y. L., Tsai W. J., Shen C. C., Chen C. C. (2005), Resveratrol derivatives

from the roots of Vitis thunbergii. Journal of Natural Products, 68(2): 217-220.

45. Choi Y., Yoo M., Choi C., Cha M., Yon G., Kwon D., Kim Y., Park W., Ryu S.

(2009), A new specific BACE-1 inhibitor from the stembark extract of Vitis

vinifera. Planta Medica, 75(5): 537-540.

46. Yao C. S., Huang K. S., Lin M., Yang Q. Y. (2013), A new stilbene dimer from

Vitis amurensis. Journal of Asian Natural Products Research, 15(6): 693-695.

47. Pflieger A., Waffo Teguo P., Papastamoulis Y., Chaignepain S. (2013), Natural

stilbenoids isolated from grapevine exhibiting inhibitory effects against HIV-1

integrase and eukaryote MOS1 transposase in vitro activities. PLoS One, 8(11):

e81184.

48. Gu B., Xu Y., He S. (2013), A new resveratrol trimer from the roots and stems of

Vitis wenchowensis. Molecules, 18(7): 7486-7491.

49. Huang K. S., Lin M., Yu L. N., Kong M. (2000), Four novel oligostilbenes from

the roots of Vitis amurensis. Tetrahedron, 56(10): 1321-1329.

50. Takaya Y., Terashima K., Yan K., Niwa M. (2003), (+)-Viniferol D, a new

stilbenetrimer from the stem of Vitis vinifera 'Kyohou'. Heterocycles, 60(6): 1433-

1439.

51. Shinoda K., Takaya Y., Ohta T., Niwa M., Hisamichi K., Takeshita M., Oshima

Y. (1997), Vitisins D and E, novel oligostilbenes from Vitis coignetiae stem barks.

Heterocycles, 46(1): 169-172.

52. Chaher N., Arraki K., Dillinseger E., Temsamani H., Bernillon S., Pedrot E.

(2014), Bioactive stilbenes from Vitis vinifera grapevine shoots extracts. Journal

of the Science of Food and Agriculture, 94(5): 951-954.

53. Wu K. X., Zhang J., Gu B., He S., Zhang J. (2016), A new Antioxidative

Resveratrol Trimer from the Roots and Stems of Vitis quinquangularis. Records

of Natural Products, 10(3): 349.

54. Li W., Li B., Chen Y. (1998), Oligostilbenes from Vitis davidii. Chinese Chemical

Letters, 9(8): 735-736.

55. Yan K., Terashima K., Takaya Y., Niwa M. (2002), Two new stilbenetetramers

from the stem of Vitis vinifera 'Kyohou'. Tetrahedron, 58(34): 6931-6935.

56. Lou H. X., Yan Z., Dong-Mei R., Pei-Hong F., Mei J. (2004), Identification of

stilbenoids from the roots of Vitis amurensis and their antioxidative effects.

Chinese Journal of Medicinal Chemistry, 14(4): 202-208.

57. Ito J., Niwa M. (1996), Absolute structures of new hydroxystilbenoids, vitisin C

and viniferal, from Vitis vinifera 'Kyohou'. Tetrahedron, 52(30): 9991-9998.

58. Papastamoulis Y., Richard T., Nassra M., Badoc A., Krisa S., Harakat D., Monti

J. P. (2014), Viniphenol A, a complex resveratrol hexamer from Vitis vinifera

stalks: Structural elucidation and protective effects against amyloid-β-induced

toxicity in PC12 cells. Journal of Natural Products, 77(2): 213-217.

59. Aubert C., Chalot G. (2018), Chemical composition, bioactive compounds, and

volatiles of six table grape varieties (Vitis vinifera L.). Food Chemistry, 240: 524-

533.

60. Chioua A., Panagopouloua E. A., Gatzali F. (2014), Anthocyanins content and

antioxidant capacity of Corinthian currants (Vitis vinifera L. var. apyrena). Food

Chemistry 146: 157-165.

61. Lu Y., Foo L. Y. (1999), The polyphenol constituents of grape pomace. Food

Chemistry, 65(1): 1-8.

62. Ribeiroa L. F., Ribania R. H., Franciscod T. M. G., Soares A. A., Pontarolo R.,

Haminiuk C. W. I. (2015), Profile of bioactive compounds from grape pomace

(Vitis vinifera and Vitis labrusca) by spectrophotometric, chromatographic and

spectral analyses. Journal of Chromatography B, 1007: 72-80.

63. Amico V., Barresi V., Chillemi R., Condorelli D. F., Sciuto S., Spatafora C.,

Tringali C. (2009), Bioassay-guided isolation of antiproliferative compounds from

grape (Vitis vinifera) stems. Natural Product Communications, 4(1): 27-34.

64. Ji M., Li C., Li Q. (2015), Rapid separation and identification of phenolics in crude

red grape skin extracts by high performance liquid chromatography coupled to

diode array detection and tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography

A, 1414: 138-46.

65. Pardo J. E., Fernandez E., Rubio M., Alvarruiz A., Alonso G. L. (2009),

Characterization of grape seed oil from different grape varieties (Vitis vinifera).

European Journal of Lipid Science and Technology, 111: 188-193.

66. Wen X.., Zu M., Hu R., Zhao J., Chen Z., Li J., Ni Y. (2016), Characterisation of

seed oils from different grape cultivars grown in China. Journal of Food Science

and Technology, 53(7): 3129-3136.

67. Cong H. J., Zhang S. W., Wang Y. P., Xuan L. J. (2012), Megastigmane glycosides

and triterpenoids from Vitis quinguangularis Rehd. Biochemical Systematics and

Ecology, 45: 111-114.

68. Martinez J., Moreno J. J. (2000), Effect of resveratrol, a natural polyphenolic

compound, on reactive oxygen species and prostaglandin production. Biochemical

Pharmacology, 59(7): 865-870.

69. Shakibaei M., Csaki C., Nebrich S., Mobasheri A. (2008), Resveratrol suppresses

interleukin-1beta-induced inflammatory signaling and apoptosis in human

articular chondrocytes: potential for use as a novel nutraceutical for the treatment

of osteoarthritis. Biochemical Pharmacology, 76(11): 1426-1439.

70. Martin A. R., Villegas I., La Casa C., de la Lastra C. A. (2004), Resveratrol, a

polyphenol found in grapes, suppresses oxidative damage and stimulates apoptosis

during early colonic inflammation in rats. Biochemical Pharmacology, 67(7):

1399-1410.

71. Larrosa M., Yanez-Gascon M. J., Selma M. V., Gonzalez-Sarrias A., Toti S.,

Ceron J. J., Tomas-Barberan F., Dolara P., Espin J. C. (2009), Effect of a low dose

of dietary resveratrol on colon microbiota, inflammation and tissue damage in a

DSS-induced colitis rat model. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(6):

2211-2220.

72. Sanchez-Fidalgo S., Cardeno A., Villegas I., Talero E., de la Lastra C. A. (2010),

Dietary supplementation of resveratrol attenuates chronic colonic inflammation in

mice. European Journal of Pharmacology, 633(1-3): 78-84.

73. Singh U. P., Singh N. P., Singh B., Hofseth L. J., Price R. L., Nagarkatti M.,

Nagarkatti P. S. (2010), Resveratrol (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene) induces

silent mating type information regulation-1 and down-regulates nuclear

transcription factor-kappa B activation to abrogate dextran sulfate sodium-induced

colitis. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 332(3): 829-

839.

74. Kundu J. K., Shin Y. K., Kim S. H., Surh Y. J. (2006), Resveratrol inhibits phorbol

ester-induced expression of COX-2 and activation of NF-kappa B in mouse skin

by blocking IkappaB kinase activity. Carcinogenesis, 27(7): 1465-1474.

75. Jin F., Wu Q., Lu Y. F., Gong Q. H., Shi J. S. (2008), Neuroprotective effect of

resveratrol on 6-OHDA-induced Parkinson's disease in rats. European Journal of

Pharmacology, 600(1-3): 78-82.

76. Pham-Marcou T. A., Beloeil H., Sun X., Gentili M., Yaici D., Benoit G.,

Benhamou D., Mazoit J. X. (2008), Antinociceptive effect of resveratrol in

carrageenan-evoked hyperalgesia in rats: prolonged effect related to COX-2

expression impairment. Pain, 140(2): 274-283.

77. Elmali N., Baysal O., Harma A., Esenkaya I., Mizrak B. (2007), Effects of

resveratrol in inflammatory arthritis. Inflammation, 30(1-2): 1-6.

78. Ma Z. H., Ma Q. Y., Wang L. C., Sha H. C., Wu S. L., Zhang M. (2005), Effect of

resveratrol on peritoneal macrophages in rats with severe acute pancreatitis.

Inflammation Research, 54(12): 522-527.

79. Chiou Y. S., Tsai M. L., Nagabhushanam K., Wang Y. J., Wu C. H., Ho C. T., Pan

M. H. (2011), Pterostilbene is more potent than resveratrol in preventing

azoxymethane (AOM)-induced colon tumorigenesis via activation of the NF-E2-

related factor 2 (Nrf2)-mediated antioxidant signaling pathway. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 59(6): 2725-2733.

80. Cichocki M., Paluszczak J., Szaefer H., Piechowiak A., Rimando A. M., Baer-

Dubowska W. (2008), Pterostilbene is equally potent as resveratrol in inhibiting

12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate activated NFkappaB, AP-1, COX-2, and

iNOS in mouse epidermis. Molecular Nutrition & Food Research, 52 (S1): S62-

S70.

81. Dvorakova M., Landa P. (2017), Anti-inflammatory activity of natural stilbenoids:

A review. Pharmacol Research, 124: 126-145.

82. Martin A. R., Villegas I., Sanchez-Hidalgo M., de la Lastra C. A. (2006), The

effects of resveratrol, a phytoalexin derived from red wines, on chronic

inflammation induced in an experimentally induced colitis model. British Journal

of Pharmacology, 147(8): 873-885.

83. Bi X. L., Yang J. Y., Dong Y. X., Wang J. M., Cui Y. H., Ikeshima T., Zhao Y.

Q., Wu C. F. (2005), Resveratrol inhibits nitric oxide and TNF-alpha production

by lipopolysaccharide-activated microglia. International Immunopharmacology,

5(1): 185-193.

84. Bureau G., Longpre F., Martinoli M. G. (2008), Resveratrol and quercetin, two

natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by

neuroinflammation. Journal of Neuroscience Research, 86(2): 403-410.

85. Carey A. N., Fisher D. R., Rimando A. M., Gomes S. M., Bielinski D. F., Shukitt-

Hale B. (2013), Stilbenes and anthocyanins reduce stress signaling in BV-2 mouse

microglia. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(25): 5979-5986.

86. Choo Q. Y., Yeo S. C. M., Ho P. C., Tanaka Y., Lin H. S. (2014), Pterostilbene

surpassed resveratrol for anti-inflammatory application: Potency consideration and

pharmacokinetics perspective. Journal of Functional Foods, 11: 352-362.

87. Wood L. G., Wark P. A., Garg M. L. (2010), Antioxidant and anti-inflammatory

effects of resveratrol in airway disease. Antioxidants & Redox Signaling, 13(10):

1535-1548.

88. Chung E. Y., Kim B. H., Hong J. T., Lee C. K., Ahn B., Nam S. Y., Han S. B.,

Kim Y. (2011), Resveratrol down-regulates interferon-gamma-inducible

inflammatory genes in macrophages: molecular mechanism via decreased STAT-

1 activation. Journal of Nutritional Biochemistry, 22(10): 902-909.

89. Csiszar A., Sosnowska D., Wang M., Lakatta E. G., Sonntag W. E., Ungvari Z.

(2012), Age-associated proinflammatory secretory phenotype in vascular smooth

muscle cells from the non-human primate Macaca mulatta: reversal by resveratrol

treatment. The Journals of Gerontology Series A Biological Sciences and Medical

Sciences, 67(8): 811-820.

90. Murias M., Jager W., Handler N., Erker T., Horvath Z., Szekeres T., Nohl H., Gille

L. (2005), Antioxidant, prooxidant and cytotoxic activity of hydroxylated

resveratrol analogues: structure-activity relationship. Biochemical Pharmacology,

69(6): 903-912.

91. Piotrowska H., Kucinska M., Murias M. (2012), Biological activity of piceatannol:

leaving the shadow of resveratrol. Mutation Research, 750(1): 60-82.

92. Szekeres T., Saiko P., Fritzer-Szekeres M., Djavan B., Jager W. (2011),

Chemopreventive effects of resveratrol and resveratrol derivatives. Annals of the

New York Academy of Sciences, 1215(1): 89-95.

93. Jeong S. O., Son Y., Lee J. H., Cheong Y. K., Park S. H., Chung H. T., Pae H. O.

(2015), Resveratrol analog piceatannol restores the palmitic acid-induced

impairment of insulin signaling and production of endothelial nitric oxide via

activation of anti-inflammatory and antioxidative heme oxygenase-1 in human

endothelial cells. Molecular Medicine Reports, 12(1): 937-944.

94. Son Y., Chung H. T., Pae H. O. (2014), Differential effects of resveratrol and its

natural analogs, piceatannol and 3,5,4'-trans-trimethoxystilbene, on anti-

inflammatory heme oxigenase-1 expression in RAW264.7 macrophages.

Biofactors, 40(1): 138-145.

95. Ashikawa K., Majumdar S., Banerjee S., Bharti A. C., Shishodia S., Aggarwal B.

B. (2002), Piceatannol inhibits TNF-induced NF-κB activation and NF-κB-

mediated gene expression through suppression of IκBα kinase and p65

phosphorylation. Journal of Immunology, 169(11): 6490-6497.

96. Islam S., Hassan F., Mu M. M., Ito H., Koide N., Mori I., Yoshida T., Yokochi T.

(2004), Piceatannol prevents lipopolysaccharide (LPS)-induced nitric oxide (NO)

production and nuclear factor (NF)- κB activation by inhibiting IκB kinase (IKK).

Medical Microbiology and Immunology, 48(10): 729-736.

97. Jin C. Y., Moon D. O., Lee K. J., Kim M. O., Lee J. D., Choi Y. H., Park Y. M.,

Kim G. Y. (2006), Piceatannol attenuates lipopolysaccharide-induced NF-κB

activation and NF-κB-related proinflammatory mediators in BV2 microglia.

Pharmacological Research, 54(6): 461-467.

98. Liu D., Kim D. H., Park J. M., Na H. K., Surh Y. J. (2009), Piceatannol inhibits

phorbol ester-induced NF-κB activation and COX-2 expression in cultured human

mammary epithelial cells. Nutrition and Cancer, 61(6): 855-863.

99. Liu L., Li J., Kundu J. K., Surh Y. J. (2014), Piceatannol inhibits phorbol ester-

induced expression of COX-2 and iNOS in HR-1 hairless mouse skin by blocking

the activation of NF-κB and AP-1. Inflammation Research, 63(12): 1013-1021.

100. Zhang S., Yang L., Kouadir M., Tan R., Lu Y., Chang J., Xu B., Yin X., Zhou X.,

Zhao D. (2013), PP2 and piceatannol inhibit PrP106-126-induced iNOS activation

mediated by CD36 in BV2 microglia. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 45(9):

763-772.

101. Youn J., Lee J. S., Na H. K., Kundu J. K., Surh Y. J. (2009), Resveratrol and

piceatannol inhibit iNOS expression and NF-κB activation in dextran sulfate

sodium-induced mouse colitis. Nutrition and Cancer, 61(6): 847-854.

102. Yum S., Jeong S., Lee S., Nam J., Kim W., Yoo J. W., Kim M. S., Lee B. L., Jung

Y. (2015), Colon-targeted delivery of piceatannol enhances anti-colitic effects of

the natural product: potential molecular mechanisms for therapeutic enhancement.

Drug Design, Development and Therapy, 9: 4247-4258.

103. Hou Y., Xie G., Miao F., Ding L., Mou Y., Wang L., Su G., Chen G., Yang J., Wu

C. (2014), Pterostilbene attenuates lipopolysaccharide-induced learning and

memory impairment possibly via inhibiting microglia activation and protecting

neuronal injury in mice. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological

Psychiatry, 54: 92-102.

104. Hou Y., Li N., Xie G., Wang J., Yuan Q., Jia C., Liu X., Li G., Tang Y., Wang B.

(2015), Pterostilbene exerts anti-neuroinflammatory effect on lipopolysaccharide-

activated microglia via inhibition of MAPK signalling pathways. Journal of

Functional Foods, 19: 676-687.

105. Liu J., Fan C., Yu L., Yang Y., Jiang S., Ma Z., Hu W., Li T., Yang Z., Tian T.,

Duan W., Yu S. (2016), Pterostilbene exerts an anti-inflammatory effect via

regulating endoplasmic reticulum stress in endothelial cells. Cytokine, 77: 88-97.

106. Pan M. H., Chang Y. H., Tsai M. L., Lai C. S., Ho S. Y., Badmaev V., Ho C. T.

(2008), Pterostilbene suppressed lipopolysaccharide-induced up-expression of

iNOS and COX-2 in murine macrophages. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 56(16): 7502-7509.

107. Paul S., Rimando A. M., Lee H. J., Ji Y., Reddy B. S., Suh N. (2009), Anti-

inflammatory action of pterostilbene is mediated through the p38 mitogen-

activated protein kinase pathway in colon cancer cells. Cancer Prevention

Research, 2(7): 650-657.

108. Zhang L., Zhou G., Song W., Tan X., Guo Y. (2012), Pterostilbene protects

vascular endothelial cells against oxidized low-density lipoprotein-induced

apoptosis in vitro and in vivo. Apoptosis, 17(1): 25-36.

109. Kutil Z., Pribylova M., Temml V., Schuster D., Marsik P., Susimamani E., Lou J.

D., Vanek T., Landa P. (2014), Effect of dietary stilbenes on 5-lipoxygenase and

cyclooxygenase activities in vitro. International Journal of Food Properties,

18(7): 1471-1477.

110. Perecko T., Drabikova K., Lojek A., Ciz M., Ponist S., Bauerova K., Nosal R.,

Harmatha J., Jancinova V. (2013), The effects of pterostilbene on neutrophil

activity in experimental model of arthritis. BioMed Research International,

106041.

111. El-Sayed el S. M., Mansour A. M., Nady M. E. (2015), Protective effects of

pterostilbene against acetaminophen-induced hepatotoxicity in rats. Journal of

Biochemical and Molecular Toxicology, 29(1): 35-42.

112. Decendit A., Mamani-Matsuda M., Aumont V., Waffo-Teguo P., Moynet D.,

Boniface K., Richard E., Krisa S., Rambert J., Mérillon J. M., Mossalayi M. D.

(2013), Malvidin-3-O-β glucoside, major grape anthocyanin, inhibits human

macrophage-derived inflammatory mediators and decreases clinical scores in

arthritic rats. Biochemical Pharmacology, 86(10): 1461-1467.

113. Esatbeyoglu T., Ewald P., Yasui Y., Yokokawa H., Wagner A. E., Matsugo S.,

Winterhalter P., Rimbach G. (2016), Chemical characterization, free radical

scavenging, and cellular antioxidant and anti-inflammatory properties of a

stilbenoid-rich root extract of Vitis vinifera. Oxidative Medicine and Cellular

Longevity, 8591286.

114. Calabriso N., Scoditti E., Massaro M., Pellegrino M., Storelli C., Ingrosso I.,

Giovinazzo G., Carluccio M. A. (2016), Multiple anti-inflammatory and anti-

atherosclerotic properties of red wine polyphenolic extracts: differential role of

hydroxycinnamic acids, flavonols and stilbenes on endothelial inflammatory gene

expression. European Journal of Nutrition, 55(2): 477-489.

115. Bak M. J., Truong V. L., Kang H. S. (2013), Anti-inflammatory effect of

procyanidins from wild grape (Vitis amurensis) seeds in LPS-induced RAW 264.7

cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 1-11.

116. Behbahani J., Thandapilly S. J., Louis X. L., Huang Y., Shao Z., Kopilas M. A.,

Wojciechowski P. (2010), Resveratrol and small artery compliance and

remodeling in the spontaneously hypertensive rat. American Journal of

Hypertension, 23(12): 1273-1278.

117. Thandapilly S. J., Wojciechowski P., Behbahani J., Louis X. L., Yu L., Juric D.

(2010), Resveratrol prevents the development of pathological cardiac hypertrophy

and contractile dysfunction in the SHR without lowering blood pressure. American

Journal of Hypertension, 23(2): 192-196.

118. Li X., Dai Y., Yan S., Shi Y., Li J., Liu J., Cha L., Mu J. (2016), Resveratrol lowers

blood pressure in spontaneously hypertensive rats via calcium-dependent

endothelial NO production. Clinical and Experimental Hypertension, 38(3): 287-

293.

119. Tomé-Carneiro J., Gonzálvez M., Larrosa M., Yáñez-Gascón M. J., García-

Almagro F. J. (2012), One-year consumption of a grape nutraceutical containing

resveratrol improves the inflammatory and fibrinolytic status of patients in primary

prevention of cardiovascular disease. The American Journal of Cardiology,

110(3): 356-363.

120. Riche D. M., Riche K. D., Blackshear C. T., McEwen C. L., Sherman J. J., Wofford

M. R., Griswold M. E. (2014), Pterostilbene on metabolic parameters: A

randomized, double-blind, and placebo-controlled trial. Evidence-Based

Complementary and Alternative Medicine, 459165.

121. Olas B., Wachowicz B., Holmsen H., Fukami M. H. (2005), Resveratrol inhibits

polyphosphoinositide metabolism in activated platelets. Biochimica et Biophysica

Acta, 1714(2): 125-133.

122. Olas B., Wachowicz B., Saluk-Juszczak J., Zielinski T. (2002), Effect of

resveratrol, a natural polyphenolic compound, on platelet activation induced by

endotoxin or thrombin. Thrombosis Research, 107(3-4): 141-145.

123. Stef G., Csiszar A., Lerea K., Ungvari Z., Veress G. (2006), Resveratrol inhibits

aggregation of platelets from high-risk cardiac patients with aspirin resistance.

Journal of Cardiovascular Pharmacology, 48(2): 1-5.

124. Shen M. Y., Hsiao G., Liu C. L., Fong T. H., Lin K. H., Chou D. S., Sheu J. R.

(2007), Inhibitory mechanisms of resveratrol in platelet activation: pivotal roles of

p38 MAPK and NO/cyclic GMP. British Journal of Haematology, 139(3): 475-

485.

125. Messina F., Guglielmini G., Curini M., Orsini S., Gresele P., Marcotullio M. C.

(2015), Effect of substituted stilbenes on platelet function. Fitoterapia, 105: 228-

233.

126. Ray P. S., Maulik G., Cordis G. A., Bertelli A. A., Bertelli A., Das D. K. (1999),

The red wine antioxidant resveratrol protects isolated rat hearts from ischemia

reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine, 27(1-2): 160-169.

127. Shen M., Wu R. X., Zhao L., Li J., Guo H. T., Fan R. (2012), Resveratrol attenuates

ischemia/reperfusion injury in neonatal cardiomyocytes and its underlying

mechanism. PLoS One, 7(12): e51223.

128. Bradamante S., Barenghi L., Piccinini F., Bertelli A. A., De Jonge R., Beemster

P., De Jong J. W. (2003), Resveratrol provides late-phase cardioprotection by

means of a nitric oxide- and adenosine-mediated mechanism. European Journal of

Pharmacology, 465(1-2): 115-123.

129. Hwang J. T., Kwon D. Y., Park O. J., Kim M. S. (2008), Resveratrol protects ROS-

induced cell death by activating AMPK in H9c2 cardiac muscle cells. Genes &

Nutrition, 2(4): 323.

130. Guo Y., Zhang L., Li F., Hu C. P., Zhang Z. (2016), Restoration of sirt1 function

by pterostilbene attenuates hypoxia-reoxygenation injury in cardiomyocytes.

European Journal of Pharmacology, 776: 26-33.

131. Tang B. L. (2016), Sirt1 and the Mitochondria. Molecules and Cells, 39(2): 87-95.

132. Yu Z., Wang S., Zhang X., Li Y., Zhao Q., Liu T. (2017), Pterostilbene protects

against myocardial ischemia/reperfusion injury via suppressing oxidative/nitrative

stress and inflammatory response. International Immunopharmacology, 43: 7-15.

133. Hung L. M., Chen J. K., Lee R. S., Liang H. C., Su M. J. (2001), Beneficial effects

of astringinin, a resveratrol analogue, on the ischemia and reperfusion damage in

rat heart. Free Radical Biology and Medicine, 30(8): 877-883.

134. Voloshyna I., Hai O., Littlefield M. J., Carsons S., Reiss A. B. (2013), Resveratrol

mediates anti-atherogenic effects on cholesterol flux in human macrophages and

endothelium via PPARγ and adenosine. European Journal of Pharmacology,

698(1-3): 299-309.

135. Gomez-Zorita S., Tréguer K., Mercader J., Carpéné C. (2013), Resveratrol directly

affects in vitro lipolysis and glucose transport in human fat cells. Journal of

Physiology and Biochemistry, 69(3): 585-593.

136. Chang H. C., Chen T. G., Tai Y. T., Chen T. L., Chiu W. T., Chen R. M. (2011),

Resveratrol attenuates oxidized LDL-evoked Lox-1 signaling and consequently

protects against apoptotic insults to cerebrovascular endothelial cells. Journal of

Cerebral Blood Flow & Metabolism, 31(3): 842-854.

137. Lin Y. L., Chang H. C., Chen T. L., Chang J. H., Chiu W. T., Lin J. W., Chen R.

M. (2010), Resveratrol protects against oxidized LDL-induced breakage of the

blood-brain barrier by lessening disruption of tight junctions and apoptotic insults

to mouse cerebrovascular endothelial cells. Journal of Nutrition, 140(12): 2187-

2192.

138. Zhang Y. (2016), Pterostilbene, a novel natural plant conduct, inhibits high fat-

induced atherosclerosis inflammation via NF-κB signaling pathway in Toll-like

receptor 5 (TLR5) deficient mice. Biomedicine & Pharmacotherapy, 81: 345-355.

139. Park E. S., Lim Y., Hong J. T., Yoo H. S., Lee C. K., Pyo M. Y., Yun Y. P. (2010),

Pterostilbene, a natural dimethylated analog of resveratrol, inhibits rat aortic

vascular smooth muscle cell proliferation by blocking Akt-dependent pathway.

Vascular Pharmacology, 53(1-2): 61-67.

140. Hien T. T., Oh W. K., Quyen B. T., Dao T. T., Yoon J. H., Yun S. Y., Kang K. W.

(2012), Potent vasodilation effect of amurensin G is mediated through the

phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase. Biochemical Pharmacology,

84(11): 1437-1450.

141. Llarena M., Andrade F., Hasnaoui M., Portillo M. P., Pérez-Matute P., Arbones-

Mainar J. M. (2016), Potential renoprotective effects of piceatannol in ameliorating

the early-stage nephropathy associated with obesity in obese Zucker rats. Journal

of Physiology and Biochemistry, 72(3): 555-566.

142. Pan C. H., Tsai C. H., Lin W. H., Chen G. Y., Wu C. H. (2012), Ethanolic extract

of Vitis thunbergii exhibits lipid lowering properties via modulation of the AMPK-

ACC Pathway in hypercholesterolemic rabbits. Evidence-Based Complementary

and Alternative Medicine, 436786.

143. Penumathsa S. V., Thirunavukkarasu M., Zhan L., Maulik G., Menon V. P.,

Bagchi D., Maulik N. (2008), Resveratrol enhances GLUT-4 translocation to the

caveolar lipid raft fractions through AMPK/Akt/eNOS signalling pathway in

diabetic myocardium. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 12(6): 2350-

2361.

144. Soufi F. G., Mohammad-Nejad D., Ahmadieh H. (2012), Resveratrol improves

diabetic retinopathy possibly through oxidative stress - nuclear factor κB -

apoptosis pathway. Pharmacological Reports, 64(6): 1505-1514.

145. Um J. H., Park S. J., Kang H., Yang S., Foretz M., McBurney M. W. (2010), AMP-

activated protein kinase-deficient mice are resistant to the metabolic effects of

resveratrol. Diabetes, 59(3): 554-563.

146. Bhatt J. K., Thomas S., Nanjan M. J. (2012), Resveratrol supplementation

improves glycemic control in type 2 diabetes mellitus. Nutrition Research, 32(7):

537-541.

147. Movahed A., Nabipour I., Lieben Louis X., Thandapilly S. J., Yu L.,

Kalantarhormozi M. (2013), Antihyperglycemic effects of short term resveratrol

supplementation in type 2 diabetic patients. Journal of Evidence-Based

Complementary and Alternative Medicine, 851267.

148. Gómez-Zorita S., Fernández-Quintela A., Aguirre L., Macarulla M. T., Rimando

A. M., Portillo M. P. (2015), Pterostilbene improves glycaemic control in rats fed

an obesogenic diet: involvement of skeletal muscle and liver. Food & Function,

6(6): 1968-1976.

149. Chuang C. C., Shen W., Chen H., Xie G., Jia W., Chung S., McIntosh M. K.

(2012), Differential effects of grape powder and its extract on glucose tolerance

and chronic inflammation in high-fat-fed obese mice. Journal of Agricultural and

Food Chemistry, 60(51): 12458-12468.

150. Meeprom A., Sompong W., Suwannaphet W., Yibchok-anun S., Adisakwattana S.

(2011), Grape seed extract supplementation prevents high-fructose diet-induced

insulin resistance in rats by improving insulin and adiponectin signalling pathways.

British Journal of Nutrition, 106(8): 1173-1181.

151. Ruszkiewicz J., Albrecht J. (2015), Changes in the mitochondrial antioxidant

systems in neurodegenerative diseases and acute brain disorders. Neurochemistry

International, 88: 66-72.

152. Fang L., Gao H., Zhang W., Zhang W., Wang Y. (2015), Resveratrol alleviates

nerve injury after cerebral ischemia and reperfusion in mice by inhibiting

inflammation and apoptosis. International Journal of Clinical and Experimental

Medicine, 8(3): 3219-3226.

153. Su Q., Pu H., Hu C. (2016 ), Neuroprotection by combination of resveratrol and

enriched environment against ischemic brain injury in rats. Neurological Research,

38(1): 60-68.

154. Yang Y., Fan C., Wang B., Ma Z., Wang D., Gong B. (2017), Pterostilbene

attenuates high glucose-induced oxidative injury in hippocampal neuronal cells by

activating nuclear factor erythroid 2-related factor 2. Biochimica et Biophysica

Acta, 1863(4): 827-837.

155. Lu K. T., Ko M. C., Chen B. Y., Huang J. C., Hsieh C. W., Lee M. C. (2008),

Neuroprotective effects of resveratrol on MPTP-induced neuron loss mediated by

free radical scavenging. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(16):

6910-6913.

156. Zhang F., Shi J. S., Zhou H., Wilson B., Hong J. S., Gao H. M. (2010), Resveratrol

protects dopamine neurons against lipopolysaccharide-induced neurotoxicity

through its anti-inflammatory actions. Molecular Pharmacology, 78(3): 466-477.

157. Butterfield D. A., Lauderback C. M. (2002), Lipid peroxidation and protein

oxidation in Alzheimer's disease brain: potential causes and consequences

involving amyloid beta-peptide-associated free radical oxidative stress. Free

Radical Biology and Medicine, 32(11): 1050-1060.

158. Marambaud P., Zhao H., Davies P. (2005), Resveratrol promotes clearance of

Alzheimer's disease amyloid-beta peptides. Journal of Biological Chemistry,

280(45): 37377-37382.

159. Biais B., Krisa S., Cluzet S., Da Costa G., Waffo-Teguo P. (2017), Antioxidant

and cytoprotective activities of grapevine stilbenes. Journal of Agricultural and

Food Chemistry, 65(24): 4952-4960.

160. Ren J., Fan C., Chen N., Huang J., Yang Q. (2011), Resveratrol pretreatment

attenuates cerebral ischemic injury by upregulating expression of transcription

factor Nrf2 and HO-1 in rats. Neurochemical Research, 36(12): 2352-2362.

161. Simão F., Matté A., Pagnussat A. S., Netto C. A., Salbego C. G. (2012),

Resveratrol prevents CA1 neurons against ischemic injury by parallel modulation

of both GSK-3β and CREB through PI3-K/Akt pathways. European Journal of

Neuroscience, 36(7): 2899-2905.

162. Ma X., Sun Z., Liu Y., Jia Y., Zhang B., Zhang J. (2013), Resveratrol improves

cognition and reduces oxidative stress in rats with vascular dementia. Neural

Regeneration Research, 8(22): 2050-2059.

163. Naik B., Nirwane A., Majumdar A. (2017), Pterostilbene ameliorates

intracerebroventricular streptozotocin induced memory decline in rats. Cognitive

Neurodynamics, 11(1): 35-49.

164. Signorelli P., Ghidoni R. (2005), Resveratrol as an anticancer nutrient: Molecular

basis, open questions and promises. Journal of Nutritional Biochemistry, 16(8):

449-466.

165. Whitlock N. C., Baek S. J. (2012), The anticancer effects of resveratrol:

modulation of transcription factors. Nutrition and Cancer, 64(4): 493-502.

166. Carter L. G., D'Orazio J. A., Pearson K. J. (2014), Resveratrol and cancer: focus

on in vivo evidence. Endocrine-Related Cancer, 21(3): 209-225.

167. Nutakul W., Sobers H. S., Qiu P., Dong P., Decker E. A., McClements D. J., Xiao

H. (2011), Inhibitory effects of resveratrol and pterostilbene on human colon

cancer cells: A side-by-side comparison. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 59(20): 10964-10970.

168. McCormack D., McFadden D. (2012), Pterostilbene and cancer: Current review.

Journal of Surgical Research, 173(2): 53-61.

169. Kita Y., Miura Y., Yagasaki K. (2012), Antiproliferative and anti-invasive effect

of piceatannol, a polyphenol present in grapes and wine, against hepatoma

AH109A cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 672416.

170. Jayasooriya R. G., Lee Y. G., Kang C. H., Lee K. T., Choi Y. H., Park S. Y.,

Hwang J. K., Kim G. Y. (2013), Piceatannol inhibits MMP-9-dependent invasion

of tumor necrosis factor-α-stimulated DU145 cells by suppressing the Akt-

mediated nuclear factor-κB pathway. Oncology Letters, 5(1): 341-347.

171. Ko H. S., Lee H. J., Kim S. H., Lee E. O. (2012), Piceatannol suppresses breast

cancer cell invasion through the inhibition of MMP-9: involvement of PI3K/AKT

and NF-κB pathways. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(16): 4083-

4089.

172. Kim J. A., Kim M. R., Kim O., Phuong N. T., Yun J., Oh W. K., Bae K., Kang K.

W. (2012), Amurensin G inhibits angiogenesis and tumor growth of tamoxifen-

resistant breast cancer via Pin1 inhibition. Food and Chemical Toxicology, 50(10):

3625-3634.

173. Oh W. K., Cho K. B., Hien T. T., Kim T. H., Kim H. S., Dao T. T., Han H. K.,

Kwon S. M., Ahn S. G., Yoon J. H., Kim T. H., Kim Y. G., Kang K. W. (2010),

Amurensin G, a potent natural SIRT1 inhibitor, rescues doxorubicin

responsiveness via down-regulation of multidrug resistance 1. Molecular

Pharmacology, 78(5): 855-864.

174. Ferrero L. M., Nielsen O. H., Andersen P. S., Girardin S. E. (2006), Chronic

inflammation: importance of NOD2 and NALP3 in interleukin-1β generation.

Clinical and Experimental Immunology, 147: 227-235.

175. Medzhitov R. (2008), Origin and physiological roles of inflammation. Nature, 454:

428-435.

176. Soehnlein O., Lindbom L. (2010), Phagocyte partnership during the onset and

resolution of inflammation. Nature Reviews Immunology, 10: 427-439.

177. Smith H. S. (2006), Arachidonic Acid Pathways in Nociception. The journal of

supportive oncology, 4: 277-287.

178. Serhan C. N., Chiang N., Van Dyke T. E. (2008), Resolving inflammation: dual

anti- inflammatory and pro-resolution lipid mediators. Nature Reviews

Immunology, 8: 49-361.

179. Hortelano S. (2009), Molecular basis of the anti-inflammatory effects of

terpenoids. Inflammation & Allergy-Drug Targets, 8(1): 28-39.

180. Lin W. W., Karin M. (2007). A cytokine-mediated link between innate immunity,

inflammation, and cancer. The Journal of clinical investigation, 117(5): 1175-

1183.

181. Samuelsson B., Dahlen S. E., Lindgren J. Å., Rouzer C. A., Serhan C. N. (1987),

Leukotrienes and lipoxins: structures, biosynthesis, and biological

effects. Science, 237(4819): 1171-1176.

182. Serhan C. N., Yang R., Martinod K., Kasuga K., Pillai P. S., Porter T. F., Spite M.

(2009), Maresins: novel macrophage mediators with potent antiinflammatory and

proresolving actions. Journal of Experimental Medicine, 206(1): 15-23.

183. Brash A. R. (2001), Arachidonic acid as a bioactive molecule. The Journal of

clinical investigation, 107(11): 1339-1345.

184. Stratton M. S., Alberts D. S. (2002), Current application of selective COX-2

inhibitors in cancer prevention and treatment. Oncology, 16(5 Suppl 4): 37-51.

185. Davies G., Martin L. A., Sacks N., Dowsett M. (2002), Cyclooxygenase-2 (COX-

2), aromatase and breast cancer: a possible role for COX-2 inhibitors in breast

cancer chemoprevention. Annals of Oncology, 13(5): 669-678.

186. Vila L., Martinez-Perez A., Camacho M., Buil A., Alcolea S., Pujol-Moix N., Soler

M., Antón R., Souto J. C., Fontcuberta J., Soria J. M. (2010), Heritability of

thromboxane A2 and prostaglandin E2 biosynthetic machinery in a Spanish

population. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, 30(1): 128-134.

187. Morham S. G., Langenbach R., Loftin C. D., Tiano H. F., Vouloumanos N.,

Jennette J. C., Mahler J. F., Kluckman K. D., Ledford A., Lee C. A., Smithies O.

(1995), Prostaglandin synthase 2 gene disruption causes severe renal pathology in

the mouse. Cell, 83(3): 473-482.

188. Masferrer J. L., Zweifel B. S., Manning P. T., Hauser S. D., Leahy K. M., Smith

W. G., Isakson, P. C., Seibert K. (1994), Selective inhibition of inducible

cyclooxygenase 2 in vivo is antiinflammatory and nonulcerogenic. Proceedings of

the National Academy of Sciences, 91(8): 3228-3232.

189. Tapondjou L. A., Lontsi D., Sondengam B. L., Choi J., Lee K. T., Jung H. J., and

Park H. J. (2003), In vivo anti-nociceptive and anti-inflammatory effect of the two

triterpenes, ursolic acid and 23-hydroxyursolic acid, from Cussonia bancoensis.

Archives of Pharmacal Research, 26(2): 143-146.

190. Ricciotti E., FitzGerald G. (2011), Prostaglandins and inflammation.

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 31(5): 986-1000.

191. Luisa M. (2004), Cyclooxygenase-2 (COX-2) in inflammatory and degenerative

brain diseases. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 63(9): 901-

910.

192. Dannenberg A. J., Altorki N. K., Boyle J. O., Dang C., Howe L. R., Weksler B.

B., Subbaramaiah, K. (2001), Cyclo-oxygenase 2: a pharmacological target for the

prevention of cancer. The lancet oncology, 2(9): 544-551.

193. Li X., Atkinson R. N., King S. B. (2001), Preparation and evaluation of new L-

canavanine derivatives as nitric oxide synthase inhibitors. Tetrahedron, 57(30):

6557-6565.

194. Murakami A., Ohigashi H. (2007), Targeting NOX, INOS and COX‐2 in

inflammatory cells: chemoprevention using food phytochemicals. International

journal of cancer, 121(11): 2357-2363.

195. Moncada S., Palmer R. M., Higgs E. A. (1991), Nitric oxide: physiology,

pathophysiology, and pharmacology. Pharmacological Reviews, 43(2): 109-142.

196. Breitbach K., Klocke S., Tschernig T., Rooijen N., Baumann U., Steinmetz I.

(2006), Role of inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase in early

control of Burkholderia pseudomallei infection in mice. Infection and

immunity, 74(11): 6300-6309.

197. Sacco R. E., Waters W. R., Rudolph K. M., Drew M. L. (2006), Comparative nitric

oxide production by LPS-stimulated monocyte-derived macrophages from Ovis

canadensis and Ovis aries. Comparative immunology, microbiology and infectious

diseases, 29(1): 1-11.

198. Griffith O. W., Stuehr D. J. (1995), Nitric oxide synthases: properties and catalytic

mechanism. Annual review of physiology, 57(1): 707-734.

199. Xu W., Liu L. Z., Loizidou M., Ahmed M., Charles I. G. (2002), The role of nitric

oxide in cancer. Cell research, 12(5): 311-320.

200. Aggarwal B. B. (2004), Nuclear factor-kappaB: the enemy within. Cancer Cell,

6(3): 203-208.

201. Israf D. A., Tham C. L., Syahida A., Lajis N. H., Sulaiman M. R., Mohamad A. S.,

Zakaria Z. A. (2010), Atrovirinone inhibits proinflammatory mediator synthesis

through disruption of NF-kB nuclear translocation and MAPK phosphorylation in

the murine monocytic macrophage RAW264.7. Phytomedicine, 17(10): 732-739.

202. Baeuerle P. A., Baltimore D. (1996), NF-κB: ten years after. Cell, 87(1): 13-20.

203. Pahl H. L. (1999), Activators and target genes of Rel/NF-κB transcription factors.

Oncogene, 18(49): 6853-6866.

204. Chao W. W., Hong Y. H., Chen M. L., Lin, B. F. (2010), Inhibitory effects of

Angelica sinensis ethyl acetate extract and major compounds on NF-κB trans-

activation activity and LPS-induced inflammation. Journal of

Ethnopharmacology, 129(2): 244-249.

205. Winston B. W., Krein P., Iqbal S., Huang Y., Mowat C. (1999), TNF alpha-

regulated insulin-like growth factor-I (IGF-I) promoter activity in macrphages.

In American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 159(3): A442.

206. Weinberg J. B. (2000), Nitric oxide synthase 2 and cyclooxygenase 2 interactions

in inflammation. Immunologic research, 22(2): 319-341.

207. Nguyễn Viết Thân (2000), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi. Việt

Nam: Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật.

208. Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học tập 2. Việt Nam: Nhà xuất bản Y học.

209. Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học tập 1. Việt Nam: Nhà xuất bản Y

học.

210. Kost J., Liu L. S., Ferreira J., Langer R. (1994), Enhanced protein blotting from

PhastGel media to membranes by irradiation of low-intensity

ultrasound. Analytical biochemistry, 216(1): 27-32.

211. Ha D. T., Oh J., Khoi N. M. , Tuan D. T. , Dung L. V., Que D. T. N., Lee S. M.,

Jang T. S., Jeong G. S., Na M. (2013), In vitro and in vivo hepatoprotective effect

of ganodermanontriol against t-BHP-induced oxidative stress. Journal of

Ethnopharmacology, 150(3): 875-885.

212. Fan G. W., Zhang Y., Jiang X., Zhu Y., Wang B., Su L., Cao W., Zhang H., Gao

X. (2013), Anti-inflammatory activity of baicalein in LPS-stimulated RAW264.7

macrophages via estrogen receptor and NF-κB-dependent pathways.

Inflammation, 36(6): 1584-1591.

213. Zang M., Xu S., Maitland-Toolan K. A., Zuccollo A., Hou X., Jiang B., Wierzbicki

M., Verbeuren T. J., Cohen R. A. (2006), Polyphenols stimulate AMP-activated

protein kinase, lower lipids, and inhibit accelerated atherosclerosis in diabetic LDL

receptor-deficient mice. Diabetes, 55(8), 2180-2191.

214. Winter C. A., Risley E. A., Nuss G. W. (1962), Carragenin-induced edema in hind

paw of the rat as an assay for anti-inflammatory drug. Proceedings of the Society

for Experimental Biology and Medicine, 111, 554-557.

215. Đỗ Trung Đàm (2017), Thuốc giảm đau chống viêm và các phương pháp nghiên

cứu tác dụng dược lý. Việt Nam: Nhà xuất bản Y học.

216. Koster R., Anderson M., de Beer E. J. (1959), Acetic acid for analgesic screening.

Federation Proceedings, 18: 412.

217. Jin W. Y. (2002), Antioxidant compounds from twig of Morus alba. Natural

Product Sciences, 8(4): 129-132.

218. Kirino A., Takasuka Y., Nishi A., Kawabe S., Yamashita H., Kimoto M., Ito H.,

Tsuji H. (2012), Analysis and functionality of major polyphenolic components of

Polygonum cuspidatum (Itadori). Journal of nutritional science vitaminology,

58(4): 278-286.

219. Zhang Y., Yu B., Sui Y., Gao X., Yang H., Ma T. (2014), Identification of

resveratrol oligomers as inhibitors of cystic fibrosis transmembrane conductance

regulator by high-throughput screening of natural products from chinese medicinal

plants. PLoS One, 9(4): e94302.

220. González-Sarrías A., Gromek S., Niesen D., Seeram N. P., Henry G. E. (2011),

Resveratrol oligomers isolated from Carex species inhibit growth of human colon

tumorigenic cells mediated by cell cycle arrest. Journal of agricultural and food

chemistry, 59(16): 8632-8638.

221. Ito T., Furusawa M., Iliya I., Tanaka T., Nakaya K. I., Sawa R., Kubota Y.,

Takahashi Y., Riswan S., Iinuma M. (2005), Rotational isomerism of a resveratrol

tetramer, shoreaketone, in Shorea uliginosa. Tetrahedron Letters, 46(17): 3111-

3114.

222. Rho T., Yoon K. (2017), Chemical Constituents of Nelumbo nucifera Seeds.

Natural Product Sciences, 23: 253.

223. Yuuya S, Hagiwara H., Suzuki T., Ando M., Yamada A., Suda K., Kataoka T.,

Nagai K. (1999), Guaianolides as immunomodulators. Synthesis and biological

activities of dehydrocostus lactone, mokko lactone, eremanthin, and their

derivatives. Journal of Natural Products, 62(1): 22-30.

224. Li R. J., Guo D. X., Lou H. X. (2013), A new guaiane-type sesquiterpene lactone

from the Chinese liverwort Porella acutifolia subsp. tosana. Chinese Journal of

Natural Medicines, 11(1): 74-76.

225. Shen T., Weng C., Xie W. D., Row K. (2009), A new guaiane sesquiterpene from

Paraixeris pinnatipartita. Journal of Chemical Research-s, 623-624.

226. Lendl A., Werner I., Glasl S., Kletter C., Mucaji P., Presser A., Reznicek G.,

Jurenitsch J., Taylor D. W. (2005), Phenolic and terpenoid compounds from

Chione venosa (sw.) urban var. venosa (Bois Bandé). Phytochemistry, 66(19):

2381-7.

227. Yili A., Aisa H. A., Isaev M. I. (2009), Betulinic acid and sterols from Astragalus

altaicus. Chemistry of natural compounds, 45(4): 592-594.

228. Fabris S., Momo F., Ravagnan G., Stevanato R. (2008), Antioxidant properties of

resveratrol and piceid on lipid peroxidation in micelles and monolamellar

liposomes. Biophysical Chemistry, 135(1-3): 76-83.

229. Su D., Cheng Y., Liu M., Liu D. Z., Cui H., Zhang B., Zhou S., Yang T. H., Mei

Q. B. (2013), Comparision of piceid and resveratrol in antioxidation and

antiproliferation activities in vitro. PloS one, 8(1): e54505.

230. Jeong E. T., Jin M. H., Kim M. S., Chang Y. H., Park S. G. (2010), Inhibition of

melanogenesis by piceid isolated from Polygonum cuspidatum. Archives of

Pharmacal Research, 33(9): 1331-1338.

231. Yim N. H., Trung T. N., Kim J. P., Lee S. M., Na M. K., Jung H. J., Kim H. S.,

Kim Y. H., Bae K. H. (2010), The antimicrobial activity of compounds from the

leaf and stem of Vitis amurensis against two oral pathogens. Bioorganic &

Medicinal Chemistry Letters, 20(3): 1165-1168.

232. Empl M. T., Macke S., Winterhalter P., Puff C., Lapp S., Stoica G., Baumgärtner

W., Steinberg P. (2014), The growth of the canine glioblastoma cell line D‐GBM

and the canine histiocytic sarcoma cell line DH82 is inhibited by the resveratrol

oligomers hopeaphenol and r-2‐viniferin. Veterinary and Comparative Oncology,

12(2): 149-159.

233. Kim H., J., Saleem M., Seo S. H., Jin C. B., Lee Y. S. (2005), Two new antioxidant

stilbene dimers, parthenostilbenins A and B from Parthenocissus tricuspidata.

Planta Medica, 71(10): 973-976.

234. Khine M. M., Franke K., Arnold N., Wessjohann L. A. (2006), Phytochemical

constituents of selected Vitis species. Proceedings of the Workshop on Medicinal

Plants of Bangladesh, 22-26.

235. Choi C. W., Choi Y. H., Cha M. R., Kim Y. S., Yon G. H., Hong K. S., Park W.

K., Ryu S. Y. (2011), In vitro BACE-1 inhibitory activity of resveratrol oligomers

from the seed extract of Paeonia lactiflora. Planta Medica, 77(04): 374-376.

236. Fu J., Jin J., Cichewicz R. H., Hageman S. A., Ellis T. K., Xiang L., Peng Q., Jiang

M., Arbez N., Hotaling K. (2012), trans-ε-Viniferin increases mitochondrial

sirtuin 3 (SIRT3), activates AMP-activated protein kinase (AMPK), and protects

cells in models of Huntington Disease. Journal of Biological Chemistry, 287(29):

24460-24472.

237. Privat C., Telo J. P., Bernardes-Genisson V., Vieira A., Souchard J. P., Nepveu F.

(2002), Antioxidant properties of trans-ε-viniferin as compared to stilbene

derivatives in aqueous and nonaqueous media. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 50(5): 1213-1217.

238. Yáñez M., Fraiz N., Cano E., Orallo F. (2006), (−)-Trans-ε-viniferin, a polyphenol

present in wines, is an inhibitor of noradrenaline and 5-hydroxytryptamine uptake

and of monoamine oxidase activity. European Journal of Pharmacology, 542(1-

3): 54-60.

239. Guschlbauer M., Klinger S., Burmester M., Horn J., Kulling S. E., Breves G.

(2013), trans-Resveratrol and ε-viniferin decrease glucose absorption in porcine

jejunum and ileum in vitro. Comparative Biochemistry and Physiology Part A:

Molecular & Integrative Physiology, 165(3): 313-318.

240. Chung E. Y., Kim B. H., Lee M. K., Yun Y. P., Lee S. H., Min K. R., and K.Y. S.

(2003), Anti-inflammatory effect of the oligomeric stilbene α-viniferin and its

mode of the action through inhibition of cyclooxygenase-2 and inducible nitric

oxide synthase. Planta Medica, 69(08): 710-714.

241. Sung S. H., Kang S. Y., Lee K. Y., Park M. J., Kim J. H., Park J. H., Kim Y. C.,

Kim J. W., Kim Y. C. (2002), (+)-α-viniferin, a stilbene trimer from Caragana

chamlague, inhibits acetylcholinesterase. Biological and Pharmaceutical Bulletin,

25(1): 125-127.

242. Lee S. H., Shin N. H., Kang S. H., Park J. S., Chung S. R., Min K. R., Kim Y. S.

(1998), α-Viniferin: a prostaglandin H2 synthase inhibitor from root of Carex

humilis. Planta Medica, 64(03): 204-207.

243. Dilshara M. G., Lee K. T., Kim H. J., Lee H. J., Choi Y. H., Lee C. M., Kim L. K.,

Kim G. Y. (2014), Anti-inflammatory mechanism of α-viniferin regulates

lipopolysaccharide-induced release of proinflammatory mediators in BV2

microglial cells. Cellular Immunology, 290(1): 21-29.

244. Sim J. H., Jang H. W., Song M., Kim J. H., Lee S. H., Lee S. K. (2014), Potent

inhibitory effect of alpha-viniferin on human cytochrome P450. Food and

Chemical Toxicology, 69: 276-280.

245. Zain W. Z. W. M., Ahmat N., Norizan N. H., Nazri N. A. A. M. (2011), The

evaluation of antioxidant, antibacterial and structural identification activity of

trimer resveratrol from Malaysia’s Dipterocarpaceae. Australian Journal of Basic

and Applied Sciences, 5(5): 926-9.

246. Ito T., Oyama M., Sajiki H., Sawa R., Takahashi Y., Iinuma M. (2012), Absolute

structure of shoreaketone: a rotational isomeric resveratrol tetramer in

Dipterocarpaceaeous plants. Tetrahedron, 68(14): 2950-2960.

247. Muhammad N., Din L. B., Sahidin I., Hashim S. F., Ibrahim N., Zakaria Z., Yaacob

W. A. (2012), Acuminatol and other antioxidative resveratrol oligomers from the

stem bark of Shorea acuminata. Molecules, 17(8): 9043-9055.

248. Ito T., Hayashi K., Nishiguchi M., Hayashi T., Iinuma M. (2018), Resveratrol

oligomer C-glucosides and anti-viral resveratrol tetramers isolated from the stem

bark of Shorea uliginosa. Phytochemistry Letters, 28: 1-7.

249. Tie F. F., Luan G. X., Zhou W. N., Wang Z. H., Shi X. B., Li G., Wang H. L.

(2018), Effects of the oligostilbenes from Iris lactea Pall. var. chinensis (Fisch.)

Koidz on the adipocytes differentiation of 3T3-L1 cells. Die Pharmazie-An

International Journal of Pharmaceutical Sciences, 73(2): 98-103.

250. Shi G. F., An L., Jiang B., Guan S., Bao Y. (2006), Alpinia protocatechuic acid

protects against oxidative damage in vitro and reduces oxidative stress in vivo.

Neuroscience Letters, 403(3): 206-10.

251. Beytur A., Ciftci O., Aydin M., Cakir O., Timurkaan N., Yılmaz F. (2012),

Protocatechuic acid prevents reproductive damage caused by 2,3,7,8-

tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) in male rats. Andrologia, 44 (Suppl 1): 454-

61.

252. May B., Lange B.M., Wüst M. (2013), Biosynthesis of sesquiterpenes in grape

berry exocarp of Vitis vinifera L.: Evidence for a transport of farnesyl diphosphate

precursors from plastids to the cytosol. Phytochemistry, 95: 135-144.

253. Cho J. Y., Baik K. U., Jung J. H., Park M. H. (2000), In vitro anti-inflammatory

effects of cynaropicrin, a sesquiterpene lactone, from Saussurea lappa. The

European Journal of Pharmacology, 398(3): 399-407.

254. Ko S. G., Kim H.P., Jin D.H., Bae H.S., Kim S.H., Park C.H., Lee J.W. (2005),

Saussurea lappa induces G2-growth arrest and apoptosis in AGS gastric cancer

cells. Cancer Letters, 220(1): 11-9.

255. Mahajan S. G., Mehta A. A. (2011), Suppression of ovalbumin-induced Th2-

driven airway inflammation by β-sitosterol in a guinea pig model of asthma. The

European Journal of Pharmacology, 650(1): 458-64.

256. Villaseñor I. M., Angelada J., Canlas A., Echegoyen D. (2002), Bioactivity studies

on beta-sitosterol and its glucoside. Phytotherapy research, 16(5): 417-21.

257. Jiang L. H., Yang N., Yuan L. (2015), Daucosterol protects neurons against

oxygen–glucose deprivation/reperfusion-mediated injury by activating IGF1

signaling pathway. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology,

152: 45-52.

258. Jang J., Kim S. M., Yee S. M., Kim E. M., Lee E. H., Choi H. R., Lee Y. S., Yang

W. K., Kim H. Y., Kim K. H., Kang H. S., Kim S. H. (2019), Daucosterol

suppresses dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. International

Immunopharmacology, 72: 124-130.

259. Zhao C., She T., Wang L., Su Y., Qu L., Gao Y., Xu S., Cai S., Shou C. (2015),

Daucosterol inhibits cancer cell proliferation by inducing autophagy through

reactive oxygen species-dependent manner. Life Sciences, 137: 37-43.

260. Jingbo W., Aimin C., Qi W. (2015), Betulinic acid inhibits IL-1β-induced

inflammation by activating PPAR-γ in human osteoarthritis chondrocytes.

International immunopharmacology, 29(2): 687-692.

261. Fulda S. (2008), Betulinic Acid for cancer treatment and prevention. International

journal of molecular sciences, 9(6): 1096-1107.

262. Ariasnegrete S., Keller K., Chadee K. (1995), Proinflammatory cytokines regulate

cyclooxygenase-2 mRNA expression in human macrophages. Biochemical and

Biophysical Research Communications, 208(2): 582-589.

263. Goetzl E. J., An S. Z., Smith W. L. (1995), Specificity of expression and effects of

eicosanoid mediators in normal physiology and human diseases. The FASEB

Journal, 9(11): 1051-1058.

264. Hla T., Neilson K. (1992), Human cyclooxygenase-2 cDNA. Proceedings of the

National Academy of Sciences, 89(16): 7384-7388.

265. Pörsti I, Paakkari I. (1995), Nitric oxide-based possibilities for pharmacotherapy.

Annals of Medicine, 27(3): 407-420.

266. Kubes P., McCafferty D. M. (2000), Nitric oxide and intestinal inflammation. The

American Journal of Medicine, 109(2): 150-158.

267. Southan G. J., Szabó C. (1996), Selective pharmacological inhibition of distinct

nitric oxide synthase isoforms. Biochemical Pharmacology, 51(4): 383-394.

268. Tsuji S., Tsujii M., Kawano S., Hori M. (2001), Cyclooxygenase-2 upregulation

as a perigenetic change in carcinogenesis. Journal of Experimental & Clinical

Cancer Research: CR, 20(1): 117-129.

269. Zha S., Yegnasubramanian V., Nelson W. G., Isaacs W. B., De Marzo A. M.

(2004), Cyclooxygenases in cancer: progress and perspective. Cancer Letters,

215(1): 1-20.

270. van Rees B. P., Saukkonen K., Ristimäki A., Polkowski W., Tytgat G. N. J.,

Drillenburg P., Offerhaus J. A. (2002), Cyclooxygenase‐2 expression during

carcinogenesis in the human stomach. The Journal of Pathology, 196(2): 171-179.

271. Ambs S., Bennett W. P., Merriam W. G., Ogunfusika M. O., Oser S. M.,

Harrington A. M., Shields P. G., Felley-Bosco E., Hussain S. P., Harris C. C.

(1999), Relationship between p53 mutations and inducible nitric oxide synthase

expression in human colorectal cancer. Journal of the National Cancer Institute,

91(1): 86-88.

272. Díaz-Guerra M. J. M., Velasco M., Martín-Sanz P., Boscá L. (1996), Evidence for

common mechanisms in the transcriptional control of type II nitric oxide synthase

in isolated hepatocytes requirement of NF-κB activation after stimulation with

bacterial cell products and phorbol esters Journal of Biological Chemistry,

271(47): 30114-30120.

273. Vion E., Page G., Bourdeaud E., Paccalin M., Guillard J., Bilan A. R. (2018).

Trans-ε-viniferin is an amyloid-β disaggregating and anti-inflammatory drug in a

mouse primary cellular model of Alzheimer's disease. Molecular and Cellular

Neuroscience, 88: 1-6.

274. Caillaud M., Guillard J., Richard D., Milin S., Chassaing D., Paccalin M., Page G.,

Bilan A. R. (2019), Trans-ε-viniferin decreases amyloid deposits and inflammation

in a mouse transgenic Alzheimer model. PLoS One, 14(2): e0212663.

275. Sergi D., Gélinas A., Beaulieu J., Renaud J., Tardif-Pellerin E., Guillard J.,

Martinoli M. G. (2021), Anti-Apoptotic and Anti-Inflammatory Role of Trans-ε-

Viniferin in a Neuron–Glia Co-Culture Cellular Model of Parkinson’s Disease.

Foods, 10(3): 586.

276. Chang C. I., Chien W. C., Huang K. X., Hsu J. L. (2017), Anti-inflammatory

effects of vitisinol A and four other oligostilbenes from Ampelopsis

brevipedunculata var. hancei. Molecules, 22(7): 1195.

277. Meng T., Xiao D., Muhammed A., Deng J., Chen L., He J. (2021), Anti-

inflammatory action and mechanisms of resveratrol. Molecules, 26(1): 229.

278. Patil K. R., Mahajan U. B., Unger B. S., Goyal S. N., Belemkar S., Surana S. J.,

Ojha S., Patil C. R. (2019), Animal models of inflammation for screening of anti-

inflammatory drugs: Implications for the discovery and development of

phytopharmaceuticals. International journal of molecular sciences, 20(18): 4367.

279. Li L., Ni R., Shao Y., Mao S. (2014), Carrageenan and its applications in drug

delivery. Carbohydrate polymers, 103: 1-11.

280. Necas, J., Bartosikova L. (2013), Carrageenan: a review. Veterinarni medicina,

58(4): 187-205.

281. Hock F. J. (2003), Drug discovery and evaluation: Pharmacological assays. Thụy

Sĩ: Springer.

282. Ribeiro R. A., Vale M. L., Thomazzi S. M., Paschoalato A. B., Poole S., Ferreira

S. H., Cunha F. Q. (2000), Involvement of resident macrophages and mast cells in

the writhing nociceptive response induced by zymosan and acetic acid in mice.

European journal of pharmacology, 387(1): 111-118.

DANH MỤC PHỤ LỤC

Trang

Phụ lục 1. Phiếu giám định tên khoa học của cây Nho rừng ................................................ i

Phụ lục 2. Hình ảnh đối tượng nghiên cứu – phần trên mặt đất loài Nho rừng .................. ii

Phụ lục 3. Dữ liệu phổ của hợp chất VH1 ......................................................................... iii

Phụ lục 4. Dữ liệu phổ của hợp chất VH2 .......................................................................... vi

Phụ lục 5. Dữ liệu phổ của hợp chất VH3 ........................................................................... x

Phụ lục 6. Dữ liệu phổ của hợp chất VH4 ........................................................................ xvi

Phụ lục 7. Dữ liệu phổ của hợp chất VH5 ..................................................................... xxiii

Phụ lục 8. Dữ liệu phổ của hợp chất VH6 ....................................................................... xxx

Phụ lục 9. Dữ liệu phổ của hợp chất VH7 ...................................................................xxxvii

Phụ lục 10. Dữ liệu phổ của hợp chất VH8 .....................................................................xlvi

Phụ lục 11. Dữ liệu phổ của hợp chất VH9 ........................................................................ lv

Phụ lục 12. Dữ liệu phổ của hợp chất VH10 ................................................................... lxii

Phụ lục 13. Dữ liệu phổ của hợp chất VH11 ................................................................ lxviii

Phụ lục 14. Dữ liệu phổ của hợp chất VH12 ................................................................ lxxiii

Phụ lục 16. Sắc kí đồ đối chứng của VH14 và β-sitosterol ....................................... lxxxiii

Phụ lục 17. Dữ liệu phổ của hợp chất VH15 ...............................................................lxxxiv

Phụ lục 18. Dữ liệu phổ của hợp chất VH16 ............................................................ lxxxviii

Phụ lục 1. Phiếu giám định tên khoa học của cây Nho rừng

Phụ lục 2. Hình ảnh đối tượng nghiên cứu – phần trên mặt đất loài Nho rừng

Phụ lục 3. Dữ liệu phổ của hợp chất VH1

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH1

Phụ lục 3.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH1

Phụ lục 3.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH1

Phụ lục 3.3. Phổ DEPT của hợp chất VH1 trong CD3OD

iii

Phụ lục 3.4. Phổ ESI-MS của hợp chất VH1

Phụ lục 3.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH1

Phụ lục 3.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH1

Phụ lục 3.3. Phổ DEPT của hợp chất VH1 trong CD3OD

Phụ lục 3.4. Phổ ESI-MS của hợp chất VH1

Phụ lục 4. Dữ liệu phổ của hợp chất VH2

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH2

Phụ lục 4.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH2

Phụ lục 4.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH2

Phụ lục 4.3. Phổ DEPT của hợp chất VH2 trong CD3OD

Phụ lục 4.4. Phổ ESI-MS của hợp chất VH2

Phụ lục 4.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH2

vii

Phụ lục 4.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH2

viii

Phụ lục 4.3. Phổ DEPT của hợp chất VH2 trong CD3OD

Phụ lục 4.4. Phổ ESI-MS của hợp chất VH2

Phụ lục 5. Dữ liệu phổ của hợp chất VH3

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH3

Phụ lục 5.1. Phổ 1H-NMR (Aceton-d6, 500 MHz) của hợp chất VH3

Phụ lục 5.2. Phổ 13C-NMR (Aceton-d6, 125 MHz) của hợp chất VH3

Phụ lục 5.3. Phổ DEPT của hợp chất VH3 trong Aceton-d6

Phụ lục 5.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH3 trong Aceton-d6

Phụ lục 5.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH3 trong Aceton-d6

Phụ lục 5.6. Phổ ESI-MS của hợp chất VH3

Phụ lục 5.1. Phổ 1H-NMR (Aceton-d6, 500 MHz) của hợp chất VH3

Phụ lục 5.2. Phổ 13C-NMR (Aceton-d6, 125 MHz) của hợp chất VH3

xii

Phụ lục 5.3. Phổ DEPT của hợp chất VH3 trong Aceton-d6

xiii

Phụ lục 5.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH3 trong Aceton-d6

xiv

Phụ lục 5.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH3 trong Aceton-d6

Phụ lục 5.6. Phổ ESI-MS của hợp chất VH3

Phụ lục 6. Dữ liệu phổ của hợp chất VH4

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH4

Phụ lục 6.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH4

Phụ lục 6.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH4

Phụ lục 6.3. Phổ DEPT của hợp chất VH4 trong CD3OD

Phụ lục 6.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH4 trong CD3OD

Phụ lục 6.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH4 trong CD3OD

xvi

Phụ lục 6.6. Phổ ESI-MS của hợp chất VH4

Phụ lục 6.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH4

xvii

Phụ lục 6.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH4

xviii

xix

Phụ lục 6.3. Phổ DEPT của hợp chất VH4 trong CD3OD

Phụ lục 6.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH4 trong CD3OD

xxi

Phụ lục 6.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH4 trong CD3OD

xxii

Phụ lục 6.6. Phổ ESI-MS của hợp chất VH4

Phụ lục 7. Dữ liệu phổ của hợp chất VH5

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH5

Phụ lục 7.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH5

Phụ lục 7.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH5

Phụ lục 7.3. Phổ DEPT của hợp chất VH5 trong CD3OD

Phụ lục 7.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH5 trong Aceton-d6

Phụ lục 7.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH5 trong Aceton-d6

xxiii

Phụ lục 7.6. Phổ ESI-MS của hợp chất VH5

Phụ lục 7.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH5

xxiv

Phụ lục 7.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH5

xxv

xxvi

Phụ lục 7.3. Phổ DEPT của hợp chất VH5 trong CD3OD

xxvii

Phụ lục 1.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH5 trong Aceton-d6

xxviii

Phụ lục 7.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH5 trong Aceton-d6

xxix

Phụ lục 7.6. Phổ ESI-MS của hợp chất VH5

Phụ lục 8. Dữ liệu phổ của hợp chất VH6

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH6

Phụ lục 8.1. Phổ 1H-NMR (Aceton-d6, 500 MHz) của hợp chất VH6

Phụ lục 8.2. Phổ 13C-NMR (Aceton-d6, 125 MHz) của hợp chất VH6

Phụ lục 8.3. Phổ DEPT của hợp chất VH6 trong Aceton-d6

Phụ lục 8.4. Phổ 1H-1H COSY (500/500 MHz) của hợp chất VH6 trong Aceton-d6

Phụ lục 8.5. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH6 trong Aceton-d6

Phụ lục 8.6. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH6 trong Aceton-d6

xxx

Phụ lục 8.7. Phổ ESI-MS của hợp chất VH6

Phụ lục 8.1. Phổ 1H-NMR (Aceton-d6, 500 MHz) của hợp chất VH6

xxxi

Phụ lục 8.2. Phổ 13C-NMR (Aceton-d6, 125 MHz) của hợp chất VH6

xxxii

Phụ lục 8.3. Phổ DEPT của hợp chất VH6 trong Aceton-d6

xxxiii

Phụ lục 8.4. Phổ 1H-1H COSY (500/500 MHz) của hợp chất VH6 trong Aceton-d6

xxxiv

Phụ lục 8.5. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH6 trong Aceton-d6

xxxv

Phụ lục 8.6. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH6 trong Aceton-d6

xxxvi

Phụ lục 8.7. Phổ ESI-MS của hợp chất VH6

Phụ lục 9. Dữ liệu phổ của hợp chất VH7

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH7

Phụ lục 9.1. Phổ 1H-NMR (Aceton-d6, 500 MHz) của hợp chất VH7

Phụ lục 9.2. Phổ 13C-NMR (Aceton-d6, 125 MHz) của hợp chất VH7

Phụ lục 9.3. Phổ DEPT của hợp chất VH7 trong Aceton-d6

Phụ lục 9.4. Phổ 1H-1H COSY (500/500 MHz) của hợp chất VH7 trong Aceton-d6

Phụ lục 9.5. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH7 trong Aceton-d6

Phụ lục 9.6. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH7 trong Aceton-d6

xxxvii

Phụ lục 9.7. Phổ ESI-MS của hợp chất VH7

xxxviii

Phụ lục 9.1. Phổ 1H-NMR (Aceton-d6, 500 MHz) của hợp chất VH7

xxxix

Phụ lục 9.2. Phổ 13C-NMR (Aceton-d6, 125 MHz) của hợp chất VH7

xli

Phụ lục 9.3. Phổ DEPT của hợp chất VH7 trong Aceton-d6

xlii

Phụ lục 9.4. Phổ 1H-1H COSY (500/500 MHz) của hợp chất VH7 trong Aceton-d6

xliii

Phụ lục 9.5. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH7 trong Aceton-d6

xliv

Phụ lục 9.6. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH7 trong Aceton-d6

xlv

Phụ lục 9.7. Phổ ESI-MS của hợp chất VH7

Phụ lục 10. Dữ liệu phổ của hợp chất VH8

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH8

Phụ lục 10.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH8

Phụ lục 10.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH8

Phụ lục 10.3. Phổ DEPT của hợp chất VH8 trong CD3OD

Phụ lục 10.4. Phổ 1H-1H COSY (500/500 MHz) của hợp chất VH8 trong DMSO-d6

Phụ lục 10.5. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH8 trong CD3OD

Phụ lục 10.6. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH8 trong CD3OD

xlvi

Phụ lục 10.7. Phổ ESI-MS của hợp chất VH8

xlvii

Phụ lục 10.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH8

xlviii

Phụ lục 10.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH8

xlix

Phụ lục 10.3. Phổ DEPT của hợp chất VH8 trong CD3OD

Phụ lục 10.4. Phổ 1H-1H COSY (500/500 MHz) của hợp chất VH8 trong DMSO-d6

lii

Phụ lục 10.5. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH8 trong CD3OD

liii

Phụ lục 10.6. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH8 trong CD3OD

liv

Phụ lục 10.7. Phổ ESI-MS của hợp chất VH8

Phụ lục 11. Dữ liệu phổ của hợp chất VH9

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH9

Phụ lục 11.1. Phổ 1H-NMR (Aceton-d6, 500 MHz) của hợp chất VH9

Phụ lục 11.2. Phổ 13C-NMR (Aceton-d6, 125 MHz) của hợp chất VH9

Phụ lục 11.3. Phổ DEPT của hợp chất VH9 trong Aceton-d6

Phụ lục 11.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH9 trong Aceton-d6

Phụ lục 11.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH9 trong Aceton-d6

Phụ lục 11.6. Phổ ESI-MS của hợp chất VH9

lvi

Phụ lục 11.1. Phổ 1H-NMR (Aceton-d6, 500 MHz) của hợp chất VH9

lvii

Phụ lục 11.2. Phổ 13C-NMR (Aceton-d6, 125 MHz) của hợp chất VH9

lviii

Phụ lục 11.3. Phổ DEPT của hợp chất VH9 trong Aceton-d6

lix

Phụ lục 11.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH9 trong Aceton-d6

Phụ lục 11.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH9 trong Aceton-d6

lxi

Phụ lục 11.6. Phổ ESI-MS của hợp chất VH9

Phụ lục 12. Dữ liệu phổ của hợp chất VH10

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH10

Phụ lục 12.1. Phổ 1H-NMR (Aceton-d6, 500 MHz) của hợp chất VH10

Phụ lục 12.2. Phổ 13C-NMR (Aceton-d6, 125 MHz) của hợp chất VH10

Phụ lục 12.3. Phổ DEPT của hợp chất VH10 trong Aceton-d6

Phụ lục 12.4. Phổ 1H-1H COSY (500/500 MHz) của hợp chất VH10 trong Aceton-d6

Phụ lục 12.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH10 trong Aceton-d6

Phụ lục 12.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH10 trong Aceton-d6

lxii

Phụ lục 12.6. Phổ ESI-MS của hợp chất VH10

Phụ lục 12.1. Phổ 1H-NMR (Aceton-d6, 500 MHz) của hợp chất VH10

lxiii

Phụ lục 12.2. Phổ 13C-NMR (Aceton-d6, 125 MHz) của hợp chất VH10

lxiv

Phụ lục 12.3. Phổ DEPT của hợp chất VH10 trong Aceton-d6

lxv

Phụ lục 12.4. Phổ 1H-1H COSY (500/500 MHz) của hợp chất VH10 trong Aceton-d6

lxvi

Phụ lục 12.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH10 trong Aceton-d6

lxvii

Phụ lục 12.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH10 trong Aceton-d6

Phụ lục 13. Dữ liệu phổ của hợp chất VH11

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH11

Phụ lục 13.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH11

Phụ lục 13.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH11

Phụ lục 13.3. Phổ DEPT của hợp chất VH11 trong CD3OD

Phụ lục 13.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH11 trong CD3OD

lxviii

Phụ lục 13.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH11 trong CD3OD

Phụ lục 13.1. Phổ 1H-NMR (Aceton-D6, 500 MHz) của hợp chất VH11

lxix

Phụ lục 13.2. Phổ 13C-NMR (Aceton-D6, 125 MHz) của hợp chất VH11

lxx

Phụ lục 13.3. Phổ DEPT của hợp chất VH11 trong Aceton-D6

lxxi

Phụ lục 13.4. Phổ HSQC (500/125 MHz) của hợp chất VH11 trong Aceton-D6

lxxii

Phụ lục 13.5. Phổ HMBC (500/125 MHz) của hợp chất VH11 trong Aceton-D6

Phụ lục 14. Dữ liệu phổ của hợp chất VH12

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH12

Phụ lục 14.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH12

Phụ lục 14.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH12

Phụ lục 14.3. Phổ DEPT của hợp chất VH12 trong CD3OD

lxxiii

Phụ lục 14.4. Phổ MS của hợp chất VH12

Phụ lục 14.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH12

lxxiv

Phụ lục 14.2. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH12

lxxv

Phụ lục 14.3. Phổ DEPT của hợp chất VH12 trong CD3OD

lxxvi

Phụ lục 14.4. Phổ MS của hợp chất VH12

Phụ lục 15. Dữ liệu phổ của hợp chất VH13

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH13

Phụ lục 15.1. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất VH13

Phụ lục 15.2. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất VH13

Phụ lục 15.3. Phổ DEPT của hợp chất VH13 trong CDCl3

lxxvii

Phụ lục 15.4. Phổ NOESY của hợp chất VH13

Phụ lục 15.1. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất VH13

lxxviii

Phụ lục 15.2. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất VH13

lxxix

lxxx

Phụ lục 15.3. Phổ DEPT của hợp chất VH13 trong CDCl3

lxxxi

lxxxii

Phụ lục 15.4. Phổ NOESY của hợp chất VH13 trong CDCl3

Phụ lục 16. Sắc kí đồ đối chứng của VH14 và β-sitosterol

n-Hexan-Ethyl acetat(6:1) n-Hexan-Aceton(8:1)

lxxxiii

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH20

Phụ lục 17. Dữ liệu phổ của hợp chất VH15

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH15

Phụ lục 17.1. Phổ 1H-NMR (CDCl3 & CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH15

Phụ lục 17.2. Phổ 13C-NMR (CDCl3 & CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH15

lxxxiv

Phụ lục 17.3. Phổ DEPT của hợp chất VH15 trong CDCl3 & CD3OD

Phụ lục 17.1. Phổ 1H-NMR (CDCl3 & CD3OD, 500 MHz) của hợp chất VH15

lxxxv

Phụ lục 17.2. Phổ 13C-NMR (CDCl3 & CD3OD, 125 MHz) của hợp chất VH15

lxxxvi

lxxxvii

Phụ lục 17.3. Phổ DEPT của hợp chất VH15 trong CDCl3 & CD3OD

Phụ lục 18. Dữ liệu phổ của hợp chất VH16

Cấu trúc hóa học của hợp chất VH16

Phụ lục 18.1. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất VH16

Phụ lục 18.2. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất VH16

Phụ lục 18.3. Phổ DEPT của hợp chất VH16 trong CDCl3

lxxxviii

Phụ lục 18.4. Phổ MS của hợp chất VH16

Phụ lục 18.1. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất VH16

lxxxix

Phụ lục 18.2. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất VH16

Phụ lục 18.3. Phổ DEPT của hợp chất VH16 trong CDCl3