Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano nhằm tăng sinh khả dụng của curcumin dùng theo đường uống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ n

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THỊ HỒNG ÁNH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

HỆ TIỂU PHÂN NANO NHẰM TĂNG

SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN

DÙNG THEO ĐƯỜNG UỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THỊ HỒNG ÁNH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

HỆ TIỂU PHÂN NANO NHẰM TĂNG

SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN

DÙNG THEO ĐƯỜNG UỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 62720402

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Trần Linh

PGS.TS. Nguyễn Văn Long

HÀ NỘI, NĂM 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công

trình nào khác.

Dương Thị Hồng Ánh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

TS. Nguyễn Trần Linh

PGS. TS. Nguyễn Văn Long

Những người thầy đã nhiệt tình hướng dẫn và hết lòng giúp đỡ tôi trong thời

gian làm luận án vừa qua.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Võ Xuân Minh, PGS.

TS. Nguyễn Đăng Hòa, PGS.TS. Phạm Ngọc Bùng, PGS. TS. Phạm Thị Minh Huệ,

PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến cùng toàn thể các thầy cô giáo, kỹ thuật viên Bộ môn

Bào chế và Bộ môn Công nghiệp Dược đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi

cho tôi hoàn thành luận án này. Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ của KTV. Đinh Đại

Độ cùng các thầy cô giáo Bộ môn Dược lý.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm tương đương sinh học-Viện kiểm nghiệm

thuốc trung ương, Khoa Hóa học-Trường Đại học khoa học tự nhiên-Đại học Quốc

gia Hà Nội, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành

những nội dung thực nghiệm trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Nhà trường cùng các chuyên

viên phòng Đào tạo Sau đại học đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập

và nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn

ở bên, giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án

Hà Nội, ngày 26 tháng 9 năm 2017

Dương Thị Hồng Ánh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2

1.1. CURCUMIN ..................................................................................................... 2

1.1.1. Nguồn gốc .................................................................................................. 2

1.1.2. Công thức ................................................................................................... 2

1.1.3. Tính chất lý hóa .......................................................................................... 2

1.1.4. Độ ổn định .................................................................................................. 4

1.1.5. Định tính và định lượng ............................................................................. 4

1.1.6. Tác dụng dược lý ........................................................................................ 4

1.1.7. Sinh khả dụng ............................................................................................. 4

1.2. MỘT SỐ BIỆN PHÁP CẢI THIỆN SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN

DÙNG ĐƯỜNG UỐNG .......................................................................................... 6

1.2.1. Biện pháp làm tăng độ tan và tốc độ hòa tan của curcumin ....................... 6

1.2.2. Biện pháp làm giảm chuyển hóa và thải trừ của curcumin qua đường tiêu

hóa ...................................................................................................................... 15

1.2.3. Một số chế phẩm nano chứa curcumin sử dụng biện pháp tăng sinh khả

dụng thương mại hóa .......................................................................................... 22

1.3. MỘT SỐ MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN

DÙNG ĐƯỜNG UỐNG ........................................................................................ 23

1.3.1. Nghiên cứu in vitro ................................................................................... 23

1.3.2. Nghiên cứu ex vivo ................................................................................... 26

1.3.3. Nghiên cứu in situ .................................................................................... 27

1.3.4. Nghiên cứu in vivo.................................................................................... 28

Chương 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................. 31

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ......................... 31

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................... 33

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 34

2.3.1. Thẩm định phương pháp định lượng ........................................................ 34

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tiền công thức (Preformulation) ...................... 41

2.3.3. Bào chế hệ tiểu phân nano ........................................................................ 46

2.3.4. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định ........................................................ 53

2.3.5. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo trên chuột thí nghiệm ....... 54

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 56

3.1. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ........................ 56

3.2. NGHIÊN CỨU TIỀN CÔNG THỨC ............................................................. 73

3.2.1. Kết quả nghiên cứu tính chất của dược chất ............................................ 74

3.2.2. Kết quả nghiên cứu độ ổn định hóa học của dược chất ở trạng thái rắn .. 76

3.2.3. Kết quả nghiên cứu tương tác dược chất-tá dược .................................... 77

3.3. NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO .................................... 79

3.3.1. Xây dựng công thức bào chế hỗn dịch nano curcumin ............................ 79

3.3.2. Xác định một số thông số trong quy trình bào chế hỗn dịch nano ........... 84

3.3.3. Xác định một số thông số trong quy trình bào chế bột phun sấy chứa nano

............................................................................................................................ 86

3.3.4. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức và thông số

trong quy trình bào chế đến đặc tính của tiểu phân nano ................................... 86

3.3.5. Tối ưu hóa công thức và một số thông số trong quy trình bào chế .......... 92

3.4. NGHIÊN CỨU NÂNG QUY MÔ BÀO CHẾ VÀ DỰ KIẾN TIÊU CHUẨN

CHẤT LƯỢNG ..................................................................................................... 94

3.4.1. Xây dựng công thức bào chế tiểu phân nano curcumin ở quy mô 5

gam/mẻ ............................................................................................................... 94

3.4.2. Khảo sát các thông số trọng yếu, giai đoạn trọng yếu trong quy trình bào

chế hệ tiểu phân nano curcumin quy mô 5 g/mẻ ................................................ 96

3.4.3. Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano curcumin quy mô 5 g/mẻ

.......................................................................................................................... 102

3.4.4. Dự kiến tiêu chuẩn chất lượng ............................................................... 109

3.5. THEO DÕI ĐỘ ỔN ĐỊNH ........................................................................... 110

3.6. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG ................................................ 114

3.6.1. So sánh sinh khả dụng của hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano curcumin

.......................................................................................................................... 114

3.6.2. Xác định các thông số dược động học của chất gốc curcumin và

tetrahydrocurcumin trên chuột sau khi uống hỗn dịch nano curcumin ............ 118

Chương 4. BÀN LUẬN ......................................................................................... 122

4.1. VỀ HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA CURCUMIN ..................................... 122

4.2. VỀ BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CURCUMIN ............................... 122

4.2.1. Yếu tố công thức .................................................................................... 123

4.2.2. Phương pháp và thiết bị bào chế ............................................................ 127

4.2.3. Quy trình bào chế ................................................................................... 128

4.3. VỀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO ........................................... 133

4.4. VỀ ĐỘ ỔN ĐỊNH ........................................................................................ 140

4.5. VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO

CURCUMIN ........................................................................................................ 141

4.5.1. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng .................................................... 141

4.5.2. Nghiên cứu đánh giá SKD in vivo .......................................................... 147

4.6. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................. 149

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................. 150

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA : Analysis of variance (Phân tích phương sai)

AUC : The area under the curve (Diện tích dưới đường cong)

BCS : Biopharmaceutics Classification System

(Hệ thống phân loại Sinh dược học)

: Maximum concentration (Nồng độ thuốc tối đa)

Cmax CMC : Carboxy methylcellulose

Cre : Cremophor RH40

CUR : Curcumin

DC : Dược chất

EMA : European Medicines Agency

(Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu)

FDA : Food and Drug Administration

(Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm)

GBC : Glibenclamid

GTTB : Giá trị trung bình

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HQC : High quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao)

IS : Internal standard (Chất chuẩn nội)

KTTP : Kích thước tiểu phân

KTTPTB : Kích thước tiểu phân trung bình

kl/kl : Khối lượng/khối lượng

kl/tt : Khối lượng/thể tích

LC-MS : Liquid chromatography-Mass spectrometry

(Sắc ký lỏng khối phổ)

LC- : Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

MS/MS (Sắc ký lỏng khối phổ/khối phổ)

LLOQ : Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới)

LQC : Low quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp)

LSD : Least Significant Difference Test (Kiểm định sự khác nhau

có ý nghĩa thống kê tối thiểu)

: Matrix factor (Hệ số ảnh hưởng của nền mẫu) MF

: Medium quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình) MQC

: Mean residence time (Thời gian lưu thuốc trung bình) MRT

Na CMC : Natri carboxy methylcellulose

: Polydispersity index (Chỉ số đa phân tán) PDI

: Polyethylen glycol PEG

: P-glycoprotein P-gp

PLGA : Poly (acid lactic co-glycolic)

: Poloxamer Pol

: Alcol polyvinic PVA

: Poly vinylpyrolidon PVP

: Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) RSD

: Standard deviation (Độ lệch chuẩn) SD

: Standard error (Sai số chuẩn) SE

SEM : Scanning Electron Microscope

(Kính hiển vi điện tử quét)

: Sinh khả dụng SKD

: Supplement quality control (Mẫu kiểm tra bổ sung) SQC

TBME : Tert-butyl methylether

: Tetrahydrocurcumin THC

: Time of maximum plasma drug concentration Tmax

(Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa)

TPGS : D-alpha-tocopheryl poly (ethylen glycol) succinat 1000

tt/tt : Thể tích/thể tích

: Thời gian bán thải

: Thời gian lưu

t1/2 tR Tw : Tween

ULOQ : Upper Limit of Quantification (Giới hạn định lượng trên)

US-FDA : The United States-Food and Drug Administration

(Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc Mỹ)

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Một số phương pháp bào chế nano tinh thể ................................................ 9

Bảng 1.2. So sánh ưu, nhược điểm của nano tinh thể so với nhũ tương nano và

micel polyme ........................................................................................... 21

Bảng 1.3. So sánh ưu điểm của một số dạng trung gian chứa dược chất ít tan ........ 22

Bảng 1.4. Một số chế phẩm nano chứa curcumin sử dụng biện pháp tăng SKD

thương mại hóa ........................................................................................ 23

Bảng 2.1. Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 31

Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 32

Bảng 2.3. Điều kiện khối phổ của phương pháp LC-MS/MS định lượng curcumin

và tetrahydrocurcumin trong huyết tương ............................................... 37

Bảng 2.4. Thành phần hỗn dịch nano curcumin mẻ 1 và 5 gam ............................... 46

Bảng 2.5. Các giai đoạn trọng yếu và các thông số trọng yếu trong từng giai đoạn

của quy trình bào chế bột phun sấy chứa nano curcumin ........................ 48

Bảng 2.6. Kế hoạch lấy mẫu ..................................................................................... 49

Bảng 2.7. Điều kiện bảo quản và thời điểm lấy mẫu trong nghiên cứu theo dõi độ ổn

định .......................................................................................................... 54

Bảng 2.8. Thành phần hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano chứa curcumin ............. 54

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống HPLC ............................... 57

Bảng 3.2. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp HPLC định lượng curcumin

................................................................................................................. 59

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp ..................................... 59

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống LC-MS/MS (n = 6) .......... 60

Bảng 3.5. Kết quả đánh giá tính đặc hiệu-chọn lọc của phương pháp LC-MS/MS (n

= 6) ........................................................................................................... 61

Bảng 3.6. Tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic CUR/IS và nồng độ CUR trong huyết

tương (n = 8) ............................................................................................ 62

Bảng 3.7. Tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic THC/IS và nồng độ THC trong huyết

tương (n = 8) ............................................................................................ 63

Bảng 3.8. Kết quả xác định giá trị giới hạn định lượng dưới LLOQ của phương

pháp LC-MS/MS định lượng curcumin và tetrahydrocurcumin trong

huyết tương (n = 6) .................................................................................. 64

Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày (n = 6) và khác ngày

(n = 18) về nồng độ curcumin của phương pháp định lượng .................. 65

Bảng 3.10. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày (n = 6) và khác

ngày (n = 18) về nồng độ tetrahydrocurcumin của phương pháp định

lượng ........................................................................................................ 66

Bảng 3.11. Độ thu hồi curcumin và tetrahydrocurcumin của phương pháp định

lượng (n = 6) ............................................................................................ 67

Bảng 3.12. Độ thu hồi chuẩn nội glibenclamid của phương pháp (n = 6) ................ 68

Bảng 3.13. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiễm chéo trong phương pháp LC-

MS/MS định lượng curcumin và tetrahydrocurcumin trong huyết tương

(n = 6) ...................................................................................................... 68

Bảng 3.14. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu trong phương pháp định lượng

curcumin và tetrahydrocurcumin trong huyết tương (n = 6) ................... 69

Bảng 3.15. Kết quả đánh giá độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc (n = 3) .............. 70

Bảng 3.16. Độ ổn định của dung dịch chuẩn nội làm việc trong 4 giờ (n = 3) ......... 70

Bảng 3.17. Độ ổn định của curcumin và tetrahydrocurcumin trong mẫu huyết tương

ở nhiệt độ phòng sau 4 giờ (n = 6) ........................................................... 71

Bảng 3.18. Độ ổn định của mẫu sau xử lý bảo quản trong buồng tiêm mẫu trong 26

giờ (n = 6) ................................................................................................ 72

Bảng 3.19. Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông-rã (n = 6) ............. 72 Bảng 3.20. Độ ổn định của mẫu huyết tương bảo quản ở -30oC (n = 6) .................. 73

Bảng 3.21. Một số đặc tính của curcumin ................................................................. 75

Bảng 3.22. Kết quả theo dõi độ ổn định của curcumin trong một số điều kiện khắc

nghiệt (n = 3) ........................................................................................... 77

Bảng 3.23. Kết quả đánh giá tương tác dược chất-tá dược sau 1 tháng ở điều kiện

lão hóa cấp tốc (n = 3) ............................................................................. 78

Bảng 3.24. Thành phần các mẫu hỗn dịch nano sử dụng chất diện hoạt khác nhau . 79

Bảng 3.25. Thành phần các mẫu hỗn dịch nano sử dụng các polyme thân nước ..... 81

Bảng 3.26. Thế zeta của các mẫu hỗn dịch nano sử dụng các polyme khác nhau .... 82

Bảng 3.27. KTTPTB và PDI của bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng tỷ lệ

PVP/curcumin khác nhau ........................................................................ 83

Bảng 3.28. Độ hòa tan của các mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng tỷ lệ

PVP/curcumin khác nhau ........................................................................ 84

Bảng 3.29. Ký hiệu và các mức của biến độc lập ..................................................... 87

Bảng 3.30. Ký hiệu và các mức của biến phụ thuộc ................................................. 87

luyện cho các biến đầu ra ........................................................... 92

Bảng 3.31. Kết quả luyện mạng neuron nhân tạo bằng phần mềm FormRules 2.0 .. 88 Bảng 3.32. Giá trị R2

Bảng 3.33. KTTPTB và PDI của hỗn dịch nano và bột phun sấy chứa nano

curcumin bào chế theo công thức tối ưu (n = 3) ...................................... 93

Bảng 3.34. Thành phần của bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng các chất

mang khác nhau ....................................................................................... 95

Bảng 3.35. Kết quả đánh giá KTTPTB, PDI và mất khối lượng do làm khô của bột

phun sấy chứa nano curcumin sử dụng các chất mang khác nhau (n = 3)

................................................................................................................. 95

Bảng 3.36. Kết quả xác định diện tích bề mặt của mẫu nguyên liệu và mẫu

curcumin 5 gam sau nghiền khô 6 giờ ..................................................... 97

Bảng 3.37. Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân curcumin ở giai đoạn nghiền ướt

mẻ 5 gam với bi zirconi oxyd 0,8 và 0,65 mm (n = 3) ............................ 98

Bảng 3.38. Kết quả đánh giá KTTP của mẫu curcumin mẻ 5 gam ở giai đoạn nghiền

ướt tần số 30 Hz trong thời gian khác nhau (n = 3) ................................. 99

Bảng 3.39. Kết quả đánh giá KTTPTB và PDI của hỗn dịch curcumin mẻ 5 gam

khuấy với tốc độ 18000 và 22000 vòng/phút (n = 3) ............................ 101

Bảng 3.40. KTTPTB và PDI của các mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin (n = 3)

............................................................................................................... 104

Bảng 3.41. Kết quả đánh giá hiệu suất phun sấy và mất khối lượng do làm khô và

khối lượng riêng biểu kiến của bột phun sấy chứa nano curcumin ....... 107

Bảng 3.42. Hàm lượng curcumin trong bột phun sấy (n = 3) ................................ 108

Bảng 3.43. Kết quả đánh giá độ tan của curcumin và bột phun sấy chứa nano

curcumin (n=3) ...................................................................................... 108

Bảng 3.44. Phần trăm curcumin hòa tan từ 3 mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin ở

quy mô 5 gam (n=3) .............................................................................. 109

Bảng 3.45. Dự kiến tiêu chuẩn chất lượng của bột phun sấy chứa nano curcumin 109

Bảng 3.46. Kích thước tiểu phân nano curcumin sau 9 tháng bảo quản ở điều kiện

thực (n = 3) ............................................................................................ 111

Bảng 3.47. Kích thước tiểu phân nano curcumin sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện

lão hóa cấp tốc (n = 3) ........................................................................... 111

Bảng 3.48. Phần trăm curcumin trong bột phun sấy bảo quản ở điều kiện thực và lão

hóa cấp tốc so với ban đầu (n = 3) ......................................................... 113

Bảng 3.49. Độ hòa tan của 3 mẫu bột phun sấy chứa tiểu phân nano sau 9 tháng ở

điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc ........................... 114

Bảng 3.50. Nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch quy

ước chứa curcumin ................................................................................ 115

Bảng 3.51. Nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch nano

chứa curcumin........................................................................................ 116

Bảng 3.52. Một số thông số dược động học của curcumin trên chuột uống hỗn dịch

quy ước và hỗn dịch nano tính toán không dựa trên mô hình ngăn ...... 117

Bảng 3.53. Nồng độ chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin sau khi uống hỗn dịch

nano curcumin ....................................................................................... 118

Bảng 3.54. Báo cáo  một số thông số dược động học của curcumin và

tetrahydrocurcumin trên chuột uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một

ngăn có chuyển hóa ............................................................................... 121

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của curcumin ................................................................. 2

Hình 1.2. Dạng hỗ biến ceto-enol của curcumin ......................................................... 3

Hình 1.3. Quá trình chuyển hóa của curcumin trong đường tiêu hóa ......................... 5

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế hỗn dịch nano curcumin ..................................... 47

Hình 2.2. Sơ đồ vị trí lấy mẫu trong buồng nghiền bi và cốc khuấy ........................ 49

Hình 2.3. Mô hình một ngăn có chuyển hóa ............................................................. 55

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ curcumin .... 56

Hình 3.2. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

curcumin .................................................................................................... 58

Hình 3.3. Hình ảnh tiểu phân curcumin quan sát qua kính hiển vi điện tử quét với độ

phóng đại 5000 lần ..................................................................................... 74

Hình 3.4. Độ hòa tan của curcumin trong môi trường dung dịch HCl 0,1 N, nước và

dung dịch đệm phosphat pH 6,8 chứa 0,2% Tween 80 ............................. 76

Hình 3.5. KTTPTB và PDI của các mẫu hỗn dịch nano curcumin sử dụng chất diện

hoạt khác nhau (n = 3) ............................................................................... 79

Hình 3.6. KTTPTB và PDI của hỗn dịch nano curcumin sử dụng Tween 80 với các

tỷ lệ khác nhau (n = 3) ............................................................................... 80

Hình 3.7. KTTPTB và PDI của hỗn dịch nano sử dụng các polyme thân nước khác

nhau (n = 3) ................................................................................................ 82

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn kích thước tiểu phân trung bình và hệ số đa phân tán của

các mẫu hỗn dịch nano khuấy với tốc độ khác nhau (n = 3) ..................... 85

Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn KTTPTB của hỗn dịch nano curcumin khuấy với tốc độ

15000 và 18000 vòng/phút trong thời gian khác nhau (n = 3) .................. 85

Hình 3.10. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80/curcumin và nhiệt độ

khí vào đến kích thước tiểu phân trung bình (cố định các yếu tố tỷ lệ

PVP/curcumin 55% và tốc độ phun dịch 3ml/phút) .................................. 89

Hình 3.11. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80/curcumin và tỷ lệ

PVP/curcumin đến hệ số đa phân tán (cố định các yếu tố nhiệt độ khí vào 70oC và tốc độ phun dịch 3 ml/phút) ......................................................... 90

Hình 3.12. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80/curcumin và tỷ lệ

PVP/curcumin đến phần trăm curcumin hòa tan sau 10 phút (cố định các yếu tố nhiệt độ khí vào 70oC và tốc độ phun dịch 3 ml/phút) ................... 90

Hình 3.13. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ khí vào và tốc độ phun dịch

đến hiệu suất quá trình phun sấy (cố định các yếu tố tỷ lệ Tween

80/curcumin 10% và tỷ lệ PVP/curcumin 55%) ........................................ 91

Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn phần trăm curcumin hòa tan của các mẫu nguyên liệu,

mẫu tối ưu thực tế và dự đoán ................................................................... 93

Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn KTTPTB và Span của curcumin mẻ 5 gam nghiền khô

với tần số 30Hz trong thời gian khác nhau (n = 3) .................................... 96

Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn KTTPTB và Span của mẫu nghiền khô mẻ 5 gam ở hai

tần số 30 và 15 Hz trong 6 giờ (n = 3) ....................................................... 97

Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn kích thước tiểu phân curcumin mẻ 5 gam trong giai

đoạn nghiền ướt ở hai tần số nghiền 15 và 30 Hz (n = 3)........................ 100

Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn KTTPTB và PDI của hỗn dịch nano khuấy với tốc độ

18000 vòng/phút trong thời gian khuấy khác nhau (n = 3) ..................... 101

Hình 3.19. Hình ảnh chụp SEM của một số tá dược, hỗn hợp vật lý phun sấy, mẫu

trắng phun sấy và bột phun sấy chứa nano curcumin .............................. 103

Hình 3.20. Hình ảnh chụp hình thái tiểu phân nano curcumin sau khi rửa loại tá

dược ......................................................................................................... 104

Hình 3.21. Phổ nhiễu xạ tia X của mẫu curcumin, mẫu trắng phun sấy và bột phun

sấy chứa nano curcumin........................................................................... 105

Hình 3.22. Giản đồ nhiệt vi sai của curcumin, một số tá dược và bột phun sấy chứa

nano curcumin .......................................................................................... 106

Hình 3.23. Phổ hồng ngoại của curcumin, một số tá dược, hỗn hợp vật lý và bột

phun sấy chứa nano curcumin ................................................................. 107

Hình 3.24. Hình ảnh chụp SEM của mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin và nano

curcumin được rửa loại tá dược sau 9 tháng ở điều kiện thực và 6 tháng ở

điều kiện lão hóa cấp tốc .......................................................................... 110

Hình 3.25. Phổ nhiễu xạ tia X của bột phun sấy chứa nano curcumin sau 9 tháng ở

điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc ............................. 112

Hình 3.26. Đường cong nồng độ curcumin-thời gian của hai nhóm chuột uống hỗn

dịch quy ước và hỗn dịch nano ................................................................ 116

Hình 3.27. Đồ thị biểu diễn nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống

hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa ...................... 119

Hình 3.28. Đồ thị dạng logarit biểu diễn nồng độ curcumin trong huyết tương chuột

sau khi uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa . 119

Hình 3.29. Đồ thị biểu diễn nồng độ tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột

sau khi uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa . 120

Hình 3.30. Đồ thị dạng logarit biểu diễn nồng độ tetrahydrocurcumin trong huyết

tương chuột sau khi uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có

chuyển hóa ............................................................................................... 120

ĐẶT VẤN ĐỀ

Curcumin là một thành phần hoạt tính có trong thân rễ một số loài nghệ, đặc

biệt là Nghệ vàng (Curcuma longa L.). Hợp chất này có nhiều tác dụng dược lý như

chống lại quá trình đông máu, chống nghẽn mạch, chống oxy hóa, chống lại sự tăng

sinh, chống viêm và chống ung thư… [11]. Tuy nhiên, curcumin thuộc nhóm IV

trong hệ thống phân loại sinh dược học (BCS), ít tan và bị chuyển hóa, thải trừ

nhanh khi dùng đường uống [9], [89], [104].

Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã đề cập đến một số biện pháp cải

thiện sinh khả dụng của curcumin dùng đường uống theo nhiều hướng: tăng độ tan

và độ hòa tan của curcumin, tăng tính thấm qua đường tiêu hóa hoặc giảm chuyển

hóa, thải trừ của curcumin… Để đạt được những mục tiêu trên, curcumin có thể

được bào chế dưới dạng hệ phân tán rắn [84], hệ nano tinh thể [30], hệ tiểu phân

nano polyme [72], hệ tiểu phân nano lipid rắn [42], hệ micel chất diện hoạt, hệ tự

nhũ hóa [86], phức hợp phospholipid [35], liposome [94]… Trong số các biện pháp

trên, bào chế dưới dạng hệ tiểu phân nano được coi là biện pháp làm tăng độ tan và

độ hòa tan của curcumin, hướng tới cải thiện sinh khả dụng đường uống của

curcumin một cách hiệu quả. Hệ tiểu phân nano có thể dễ dàng ứng dụng vào các

dạng thuốc rắn dùng đường uống.

Tại Việt Nam, một số chế phẩm chứa nano curcumin trên thị trường đang được

quảng cáo quá mức cần thiết. Trong đó, các đặc tính của tiểu phân nano khả năng

hấp thu của curcumin vẫn còn nhiều vấn đề chưa rõ ràng. Do đó, việc tiến hành một

nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano mang tính khoa học, trong đó đánh giá được

khả năng hấp thu của curcumin dùng đường uống là vấn đề cấp thiết.

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano

nhằm tăng sinh khả dụng của curcumin dùng theo đường uống” được thực hiện với

các mục tiêu chính sau:

1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano chứa

curcumin.

2. Đánh giá được sinh khả dụng của hệ tiểu phân nano curcumin trên chuột

thí nghiệm.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. CURCUMIN

1.1.1. Nguồn gốc

Curcumin (CUR) có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp. Trong tự nhiên,

curcumin là thành phần chính của curcuminoid. Curcuminoid là hỗn hợp gồm 3

thành phần trong đó curcumin chiếm khoảng 77%, demethoxycurcumin chiếm

khoảng 17% và bis-demothoxycurcumin chiếm khoảng 3% [89].

1.1.2. Công thức

- Công thức phân tử: C21H20O6

- Khối lượng phân tử: 368,38

- Tên khoa học: 1,7-bis (4–hydroxy– 3-methoxyphenyl) -1,6– heptadien-

3,5-dion.

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của curcumin [89]

1.1.3. Tính chất lý hóa

 Đặc tính lý học

- Hình thức: bột kết tinh hoặc vô định hình màu vàng

- Độ tan: curcumin ít tan trong nước (độ tan 11 ng/ml trong môi trường pH 5,5

[75]), tan một phần trong methanol, tan tốt trong aceton, dimethylsulfoxyd, ethanol

và cloroform [89].

- Nhiệt độ nóng chảy 183oC [33].

- Dạng thù hình: curcumin kết tinh ở ba dạng thù hình, dạng 1 tồn tại dạng cấu

trúc tinh thể đơn tà, dạng 2 và 3 tồn tại ở dạng cấu trúc tinh thể trục thoi. Sự khác

nhau giữa dạng đơn tà (dạng 1) và dạng trục thoi (dạng 2 và 3) ở hình dạng phân tử

curcumin và tương tác do liên kết hydro với các phân tử curcumin bên cạnh.

Curcumin dạng phân tử đơn tà có hình dạng phẳng, còn dạng trục thoi phân tử có

hình dạng cong và hơi xoắn. Dạng trục thoi 2 và 3 khác nhau ở hướng ceto-enol của

phân tử curcumin. Ở dạng 2, nhóm ceto-enol ở hai phân tử theo hướng cis, trong khi

ở dạng 3, nhóm ceto-enol ở dạng trans. Về hình thái tiểu phân, tiểu phân curcumin

dạng đơn tà có hình kim, còn dạng trục thoi có hình thái tiểu phân giống hạt gạo

hoặc hình cầu. Ngoài ra, curcumin còn có thể ở dạng vô định hình [97].

- Dung dịch curcumin trong methanol hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng

430 nm và dung dịch curcumin trong aceton hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng

khoảng 415-420 nm.

 Đặc tính hóa học

- Curcumin có tính acid, pKa của curcumin lần lượt là 7,8, 8,5 và 9,0 [75],

[98].

- Xét trên phương diện hóa học, curcumin là một hợp chất ít tan chứa hai vòng

phenolic, mỗi vòng có một nhóm thế methoxy ether ở vị trí ortho. Hai vòng

phenolic kết hợp với nhau qua một liên kết hepten chưa bão hòa ở vị trí ortho cũng

chứa nhóm α, β diceton ở carbon số 3 và 5. Nhóm diceton có thể bị chuyển dạng

thuận nghịch giữa dạng enolic và cetonic (hình 1.2). Sự chuyển dạng phụ thuộc vào

pH. Dạng bis-ceto tồn tại chủ yếu trong môi trường acid và trung tính, còn dạng

enol chiếm ưu thế trong môi trường kiềm [89]. Ở dạng bis-ceto, carbon vị trí số 4

của liên kết hepten có chức năng như một chất cho proton mạnh, còn dạng enol

đóng vai trò như một chất cho electron. Điều này làm cho curcumin có đặc tính

chống oxy hóa [89].

Dạng ceton Dạng enol

Hình 1.2. Dạng hỗ biến ceto-enol của curcumin

- Dung dịch curcumin có màu vàng tại pH 2,5 - 7 và màu đỏ ở pH > 7 [33].

1.1.4. Độ ổn định

Tại pH kiềm, curcumin kém ổn định. Sản phẩm chính của quá trình phân hủy

này là trans-6-(4’-hydroxy-3’-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexanal, feruloyl

methan, acid ferulic và vanillin. Trong môi trường acid, sự phân hủy của curcumin

chậm hơn, khoảng dưới 20% curcumin phân hủy trong 1 giờ [89].

Khi tiếp xúc với ánh sáng, curcumin bị phân hủy và thoái hóa thành anillin,

acid vanillic, aldehyd ferulic và acid ferulic [89].

1.1.5. Định tính và định lượng

Theo chuyên luận “Curcuminoids” của Dược điển Mỹ USP 39, để định tính,

có thể dựa vào vị trí và màu sắc của các vết curcumin, desmethoxycurcumin và

bisdesmethoxycurcumin so với chuẩn trong phương pháp sắc ký lớp mỏng hoặc căn

cứ vào vị trí của các pic sắc ký trong phương pháp HPLC. Hàm lượng các thành

phần curcumin, desmethoxycurcumin và bisdesmethoxycurcumin trong nguyên liệu

curcuminoid và trong chế phẩm bào chế chứa curcuminoid có thể định lượng bằng

phương pháp HPLC [96].

Riêng đối với curcumin, hàm lượng curcumin trong các chế phẩm bào chế và

trong môi trường thử độ hòa tan có thể định lượng bằng phương pháp quang phổ

hấp thụ UV-Vis [47] hoặc HPLC [77].

1.1.6. Tác dụng dược lý

Một số nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng cho thấy: curcumin có tác dụng

chống oxy hóa, chống viêm và chống ung bướu… Ngoài ra, curcumin còn có tác

dụng tiềm năng với hầu hết các bệnh mạn tính bao gồm cả ung thư, thần kinh, tim

mạch, bệnh phổi... [11], [83].

1.1.7. Sinh khả dụng

Vấn đề khó khăn đối với việc sử dụng curcumin trên lâm sàng là sinh khả

dụng (SKD) thấp. Nghiên cứu dược động học của curcumin được báo cáo bởi Yang

K. và cộng sự cho thấy: nồng độ tối đa curcumin trong huyết tương chuột cống sau

khi uống liều 500 mg/kg là 0,06 ± 0,01 g/ml, chứng tỏ SKD đường uống chỉ

khoảng 1% [109]. Tương tự, theo nghiên cứu của Shoba G. và cộng sự, nồng độ

curcumin cao nhất trong huyết tương là 1,35 ± 0,23 g/ml sau 1 giờ dùng đường

uống với liều 2 g/kg trên chuột cống, trong khi người tình nguyện khỏe mạnh (khối

lượng 50-75 kg) uống liều đơn 2 g curcumin (4 viên nang 500 mg), nồng độ trong

huyết tương rất thấp, chỉ khoảng 0,006 ± 0,005 g/ml trong 1 giờ [90]. Trong

nghiên cứu đánh giá SKD trên chuột cống của Allam A. N. và cộng sự, với liều 340

mg/kg trên chuột cống, lượng curcumin không hấp thu trong nhung mao ruột và

lượng tìm thấy trong tế bào nhày khá lớn, trong khi lượng curcumin trong huyết

tương không thể tìm thấy. Điều này còn chứng tỏ curcumin có tính thấm kém qua

hệ thống dạ dày-ruột [8].

Sau hấp thu, curcumin bị chuyển hóa qua gan (chuyển hóa lần đầu). Sự

chuyển hóa curcumin thông qua liên hợp glucuronid, sulfat và quá trình khử thông

qua alcol dehydrogenase, tạo ra nhiều chất chuyển hóa như dihydrocurcumin,

tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, hexahydrocurcuminol, acid ferulic, acid

dihydroferulic, curcumin glucuronid và curcumin sulfat [9]. Sau đó, curcumin bị

thải trừ nhanh ở dạng liên hợp với glucuronid và sulfat. Khoảng 60-70% curcumin

Curcumin

Khử hóa

Curcumin glucuronoid

Dihydrocurcumin

Dihydrocurcumin glucuronoid

Khử hóa

Tetrahydrocurcumin

glucuronoid

dùng đường uống được thải trừ qua phân [9], [89].

Hình 1.3. Quá trình chuyển hóa của curcumin trong đường tiêu hóa [57]

Như vậy, hấp thu curcumin từ ruột kém có thể do độ tan thấp, tốc độ hòa tan

chậm nên dược chất hòa tan không hoàn toàn. Ngoài ra, curcumin còn bị phân hủy

trong môi trường sinh lý của hệ thống dạ dày ruột, tốc độ chuyển hóa và thải trừ

nhanh. SKD của curcumin thấp, dẫn đến việc sử dụng trong điều trị hạn chế.

1.2. MỘT SỐ BIỆN PHÁP CẢI THIỆN SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN

DÙNG ĐƯỜNG UỐNG

Nhiều công trình nghiên cứu về dược động học của curcumin cho thấy: độ tan

thấp, chuyển hóa mạnh và thải trừ nhanh là các lý do chính dẫn đến SKD của

curcumin thấp. Do đó, các biện pháp cải thiện SKD của curcumin chủ yếu tập trung

các biện pháp làm tăng độ tan, mức độ hòa tan và giảm chuyển hóa hoặc sử dụng

chất ức chế quá trình chuyển hóa của curcumin và giảm thải trừ, kéo dài thời gian

lưu thông trong đường tiêu hóa của curcumin. Để đạt được mục tiêu này, các nghiên

cứu trên thế giới đã đề cập đến các biện pháp cải thiện SKD của curcumin như sau:

1.2.1. Biện pháp làm tăng độ tan và tốc độ hòa tan của curcumin

Để cải thiện độ tan và tốc độ hòa tan của curcumin, các công trình nghiên cứu

đã đề cập đến các biện pháp làm thay đổi đặc tính vật lý của DC như giảm KTTP

xuống kích cỡ nanomet (bào chế hệ nano tinh thể) và tạo dạng bào chế trung gian

chứa curcumin như hệ phân tán rắn, hệ micel, vi nhũ tương, nhũ tương nano, hệ tự

nhũ hóa hoặc dạng liên hợp.

1.2.1.1. Bào chế hệ nano tinh thể

Nano tinh thể dược chất là tinh thể với kích thước dưới 1000 nm, mang cả đặc

tính của tiểu phân nano và tinh thể [5], [43].

Tiểu phân nano tinh thể có thể cải thiện độ tan, độ hòa tan và tăng SKD của

DC do những đặc điểm nổi trội như sau:

 Tăng độ tan

Độ tan của dược chất (DC) phụ thuộc vào đặc tính lý hóa của DC, môi trường

hòa tan và nhiệt độ. Tuy nhiên, điều này chỉ đúng với tiểu phân DC có KTTP cỡ vài

micromet. Với các tiểu phân DC với kích thước nhỏ hơn 1-2 m, độ tan phụ thuộc

vào KTTP. Độ tan tăng lên khi KTTP giảm xuống dưới 1000 nm. Điều này có thể

giải thích theo phương trình Kelvin và Ostwald-Freundlich [44].

Phương trình Kelvin (1) biểu thị mối quan hệ giữa KTTP và áp suất hòa tan

của tiểu phân:

ln (1)

Trong đó: ρr là áp suất hòa tan của tiểu phân bán kính r, ρ∞ là áp suất hòa tan

của tiểu phân lớn ban đầu, γ là sức căng bề mặt, R là hằng số khí, T là nhiệt độ tuyệt

đối, r là bán kính tiểu phân, Mr là khối lượng phân tử, ρ là tỷ trọng của tiểu phân.

Ở trạng thái hòa tan bão hòa, phân tử hòa tan và phân tử tái kết tinh cân bằng.

Khi giảm KTTP, áp suất hòa tan tăng. Do đó, cân bằng chuyển dịch về phía hòa tan

nên độ tan bão hòa tăng [44].

Phương trình Ostwald-Freundlich (2) biểu thị mối quan hệ giữa độ tan bão hòa

và KTTP:

(2)

,ρ

∝

log

Trong đó: Cs là độ tan bão hòa, Cα là độ tan của tiểu phân lớn, σ là sức căng bề

mặt, V là thể tích mol, R là hằng số khí, T là nhiệt độ tuyệt đối, ρ là tỷ trọng tiểu

phân, r là bán kính tiểu phân.

Theo phương trình trên, độ tan bão hòa của DC tăng khi giảm KTTP. Tuy

nhiên, điều này chỉ áp dụng với các tiểu phân có kích thước nhỏ hơn 1-2 m, đặc

biệt là tiểu phân kích thước nhỏ hơn 200 nm [43], [44].

Việc bào chế hệ nano tinh thể có thể làm cho đặc tính kết tinh của tiểu phân

DC thay đổi, chuyển từ trạng thái kết tinh sang trạng thái vô định hình [69], [108].

Tinh thể nano ở trạng thái vô định hình có độ tan cao hơn so với tinh thể nano ở

trạng thái tinh thể có kích thước tương đương. Vì vậy, tinh thể nano ở trạng thái vô

định hình được coi là sự kết hợp lý tưởng giúp tăng độ tan của DC [43], [44].

 Cải thiện tốc độ hòa tan

Theo phương trình Noyes-Withney (3):

(3)

Trong đó: dM/dt là tốc độ hòa tan của DC, D là hệ số khuếch tán, S là diện

tích bề mặt tiểu phân, Cs là độ tan bão hòa của DC, C là nồng độ DC xung quanh

tiểu phân, h là bề dày lớp khuếch tán.

Như vậy, theo phương trình trên, tốc độ hòa tan của các tinh thể nano tăng có

thể do tăng diện tích bề mặt, giảm bề dày lớp khuếch tán và tăng độ tan [43], [44].

 Tăng khả năng kết dính vào bề mặt hoặc màng tế bào

So với tiểu phân micro, DC nano tinh thể có đặc điểm nổi trội vì chúng có thể

tăng khả năng kết dính vào bề mặt hoặc màng tế bào. Sự tăng kết dính của nano do

tăng diện tích tiếp xúc của các tiểu phân kích thước nhỏ. Cơ chế kết dính của nano

tinh thể có thể giải thích theo thuyết tĩnh điện (lực hút tĩnh điện giữa tiểu phân và bề

mặt màng nhày) và thuyết hấp thụ (liên kết hydro và van der Waals giữa bề mặt tiểu

phân và màng nhày) [27], [44].

 Cải thiện SKD đường uống

Nano tinh thể có thể cải thiện hấp thu của DC theo hai cơ chế. Thứ nhất, dưới

dạng nano tinh thể, DC có thể tăng độ tan và tốc độ hòa tan, do đó tăng chênh lệch

nồng độ giữa nhung mao ruột và máu. Vì vậy, DC được hấp thu bằng cách khuếch

tán thụ động tăng [27], [44]. Thứ hai, tiểu phân nano tinh thể có thể bám dính vào

màng nhày của hệ thống dạ dày ruột. Do sự kết dính này, DC có chênh lệch nồng độ

cao hơn và kéo dài thời gian lưu, thời gian tiếp xúc trong hệ thống dạ dày ruột [27],

[44].

Phương pháp bào chế hệ nano tinh thể

Để bào chế tiểu phân nano DC, có thể đi từ tiểu phân lớn nghiền mịn thành

tiểu phân nano (phương pháp “top-down”) hoặc đi từ phân tử nhỏ kết tủa thành tiểu

phân nano lớn hơn (phương pháp “bottom-up”). Một số phương pháp bào chế nano

tinh thể được trình bày ở bảng 1.1.

Onoue S. và cộng sự bào chế hệ nano tinh thể curcumin bằng phương pháp

giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền ướt với bi polystyren, sử dụng tá

dược hydroxypropyl cellulose và natri lauryl sulfat. Hệ tiểu phân nano tinh thể thu

được có KTTP khoảng 250 nm, hệ số đa phân tán 0,3-0,4. Kết quả đánh giá đặc tính

kết tinh và giản đồ nhiệt vi sai cho thấy: hệ nano tinh thể vẫn tồn tại ở trạng thái kết

tinh. Độ hòa tan của hệ nano tinh thể curcumin được cải thiện đáng kể so với tinh

thể curcumin ban đầu. Sinh khả dụng đường uống của hệ nano tinh thể trên chuột

cao hơn, với giá trị Cmax và AUC cao gấp 3-5 lần so với curcumin ban đầu. Đặc biệt,

Bảng 1.1. Một số phương pháp bào chế nano tinh thể

STT Phương pháp Nguyên tắc Ưu nhược điểm

Sử dụng lực phân chia là lực va chạm, Đơn giản, áp dụng được cho cả DC có độ tan thấp hoặc

nén ép, mài mòn và lực ma sát do tương không tan. Tuy nhiên, chi phí thiết bị đắt tiền, dễ nhiễm

tác giữa tiểu phân với thành buồng VSV, tạp từ thiết bị mài mòn và hạn chế về kích thước Nghiền

nghiền, giữa các bi với nhau và giữa buồng nghiền [15].

tiểu phân-tiểu phân [64], [65], [71].

Sự giảm KTTP trong quá trình nghiền Thời gian nghiền kéo dài (có thể tới hàng ngày), năng 1 khô do ma sát, sự cọ mòn, va chạm và lượng đầu vào cao gây nóng thiết bị và ảnh hưởng đến độ Nghiền khô đứt gãy của tương tác tiểu phân-tiểu ổn định của DC nhạy cảm với nhiệt, các viên bi có thể bị

phân hoặc tiểu phân với thiết bị [64]. mài mòn do va chạm với thành buồng nghiền tạo ra tạp.

Nghiền ướt là quá trình giảm KTTP Được sử dụng nhiều hơn nghiền khô để tránh tác động của

Nghiền ướt trong đó tiểu phân rắn được phân tán nhiệt và rút ngắn thời gian nghiền, đồng thời trực tiếp tạo

vào môi trường lỏng [64]. ra dạng bào chế.

Tiểu phân DC được phân chia bằng Phương pháp này tạo ra ít tiểu phân kích thước micro, ít

cách nén qua một khe hẹp dưới áp lực nhiễm tạp, khắc phục nhược điểm của hai phương pháp

cao trong các thiết bị đồng nhất hóa. nghiền và kết tủa, năng suất cao, áp dụng được với DC Đồng nhất

2 Lực phân chia tiểu phân chủ yếu là lực nhạy cảm với nhiệt, có thể thu được hỗn dịch nano ít có sự hóa áp suất

nén ép và va đập [5]. khác nhau giữa những lô mẻ, dễ dàng tái sản xuất. Tuy cao

nhiên, đòi hỏi số vòng đồng nhất hóa cao và DC nên ở

dạng siêu mịn [15].

Hai lực tác động chủ yếu của quá trình Quy trình bào chế đơn giản và dễ áp dụng với các DC ít Đồng nhất là lực ly tâm gây va chạm cơ học vào tan trong nước và dầu. Tuy nhiên, phương pháp này tốn 3 hóa nhờ lực phần stato và lực phân cắt được tạo ra thời gian và khó nâng cấp lên quy mô lớn, hệ tiểu phân thu phân cắt lớn trong vùng hỗn loạn giữa roto và stato. được còn chứa nhiều tiểu phân thô.

Đơn giản, thiết bị không phức tạp, thu được kết tủa mịn, DC được hòa tan trong một dung môi, kết tủa tạo thành có thể ở dạng vô định hình, chi phí thấp, sau đó phối hợp với một dung môi khác hiệu quả, không nhiễm tạp, tránh sử dụng năng lượng cao, 4 không hòa tan DC hoặc phối hợp với Kết tủa không biến tính DC. Tuy nhiên, khó lựa chọn dung môi, một dung dịch. DC bị kết tủa do phản khó kiểm soát KTTP, khó triển khai sản xuất lớn và DC dễ ứng hóa học [5]. bị kết tụ trở lại.

Hòa tan DC trong carbon dioxyd ở áp

suất cao trong bình khí nén, sau đó xả Sử dụng dung môi carbon dioxyd siêu tới hạn là dung môi carbon dioxyd để áp suất giảm đột ngột Dùng carbon không cháy, không độc, giá thành rẻ, nhiệt độ tới hạn trung 5 hoặc hòa tan DC trong dung môi, bơm dioxyd siêu tới bình. Tuy nhiên, phương pháp này phần lớn tạo tiểu phân carbon dioxyd siêu tới hạn, dung môi hạn micro [5]. chuyển sang carbon dioxyd làm kết tủa

DC [5].

hệ nano tinh thể ổn định về mặt quang hóa ở trạng thái rắn. Như vậy, phương pháp

bào chế nano tinh thể được coi là phương pháp hiệu quả tăng SKD của curcumin

với độ ổn định quang hóa cao [67].

Gao Y. và cộng sự bào chế hỗn dịch nano curcumin 1% với chất diện hoạt D-

alpha-tocopheryl poly (ethylen glycol) succinat 1000 (TPGS) 1% bằng phương

pháp đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn với tốc độ 26000 vòng/phút trong 3 phút.

Hỗn dịch nano tiếp tục được đồng nhất hóa áp suất cao và đông khô với chất mang

manitol 5%. Hỗn dịch nano thu được có KTTP khoảng 210,2 nm với SKD được cải

thiện đáng kể so với hỗn dịch curcumin [30].

Donsi F. và cộng sự đã nghiên cứu bào chế hỗn dịch nano curcumin bằng

phương pháp giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền kết hợp với đồng

nhất hóa áp suất cao. Hỗn dịch nano với KTTP 500 nm được loại dung môi theo hai

phương pháp đông khô và phun sấy với tá dược maltodextrin tỷ lệ 30% (kl/kl). Kết

quả giản đồ nhiệt vi sai cho thấy: mẫu bột phun sấy chứa nano chỉ còn một tỷ lệ nhỏ

curcumin tồn tại ở trạng thái kết tinh. Về tốc độ hòa tan, sau 20 phút bột phun sấy

chứa nano đạt độ hòa tan là 1,75 mg/l, trong khi mẫu nguyên liệu chỉ đạt được nồng

độ là 0,75 mg/l sau 20 phút còn mẫu đông khô phải sau 60 phút thử mới đạt nồng độ

là 1,5 mg/l [24].

1.2.1.2. Bào chế hệ phân tán rắn

Hệ phân tán rắn là hệ phân tán của DC (hoặc ở trạng thái phân tử hòa tan trong

dạng vô định hình hoặc (bán) kết tinh) trong một chất mang trơ có khả năng tăng độ

tan và tốc độ hòa tan của DC ít tan.

Cơ chế làm tăng tốc độ hòa tan do giảm kích thước tiểu phân (KTTP) đến mức

độ rất mịn có thể đến mức độ phân tử, tăng tính thấm ướt nhờ sự có mặt chất mang

thân nước và chất diện hoạt. Ngoài ra, do cấu trúc xốp, diện tích bề mặt đặc hiệu

tăng cũng như thay đổi trạng thái kết tinh của DC sang trạng thái vô định hình dẫn

đến tốc độ hòa tan tăng [60].

Hệ phân tán rắn chứa curcumin được bào chế với tá dược Solutol HS15 có khả

năng tăng độ tan cũng như độ ổn định của curcumin. Hệ phân tán rắn chuyển

curcumin sang dạng vô định hình và kết hợp ở dạng micel, do đó tránh sự thủy phân

trong môi trường nước và ổn định về mặt vật lý trong thời gian 12 tuần. Tốc độ giải

phóng DC in vitro ở môi trường đệm phosphat pH 6,8 cho thấy: hệ phân tán rắn

curcumin: Solutol HS15 (1:10) cải thiện độ hòa tan với khoảng 90% DC giải phóng

trong vòng 1 giờ. Trong thử nghiệm trên động vật, SKD của hệ phân tán rắn được

cải thiện khi dùng đường uống so với curcumin. Giá trị Cmax của hệ phân tán rắn

chứa curcumin gấp 106 lần và AUC012 giờ cao hơn khoảng 5 lần so với curcumin

tinh khiết. Sự tăng SKD này có thể do tăng độ tan và tránh được sự phân hủy

curcumin trong hệ thống dạ dày ruột. Hơn nữa, chất mang Solutol HS15 là chất diện

hoạt có thể tăng tính thấm qua biểu mô ruột, nới rộng các liên kết chặt ở màng tế

bào và ức chế P-gp và CYP450 dẫn đến tăng nồng độ trong tế bào và thời gian lưu.

Do đó, bào chế dưới dạng hệ phân tán rắn là một phương pháp hiệu quả nhằm giải

quyết vấn đề liên quan đến độ tan, độ ổn định và SKD của curcumin [84].

Theo Trần Anh Kiệt và cộng sự, việc sử dụng chất mang Poloxame 407 với tỷ

lệ 9:1 so với curcumin trong hệ phân tán rắn bào chế bằng phương pháp nóng chảy,

tốc độ hòa tan curcumin được cải thiện [51].

1.2.1.3. Bào chế micel

Micel là sự kết tụ của phân tử chất diện hoạt hoặc đồng polyme lưỡng thân

phân tán tạo hệ keo lỏng với kích thước tiểu phân từ 10 đến 100 nm. Đặc tính chức

năng của micel dựa vào đồng polyme lưỡng thân, tạo thành cấu trúc lõi-vỏ có kích

thước nano trong môi trường nước. Phần lõi kỵ nước tạo thành vùng chứa các DC

kỵ nước, trong khi phần vỏ thân nước ổn định phần lõi kỵ nước và làm cho polyme

tan trong nước [5].

Do có cấu trúc lõi-vỏ, micel polyme là hệ đưa thuốc triển vọng với các DC ít

tan và SKD thấp. Phần lõi kỵ nước bên trong đóng vai trò như một kho chứa đối với

DC ít tan. Hệ micel polyme tăng SKD đường uống của DC do bảo vệ DC khỏi môi

trường khắc nghiệt trong hệ thống dạ dày-ruột, giải phóng DC một cách kiểm soát ở

vị trí đích, kéo dài thời gian lưu trong ruột bằng cách kết dính sinh học [107].

Dạng micel có thể kết hợp với tiền thuốc của curcumin. Phân tử curcumin có

một nhóm hydroxyl đính trên mỗi vòng benzen. Trong điều kiện thích hợp, nhóm

hydroxyl phản ứng mạnh với nhóm carboxyl dẫn đến mất proton. Trong phương

pháp này, acid hyaluronic được sử dụng để liên hợp với curcumin thông qua phản

ứng hóa học. Micel được coi như chất mang trong đó curcumin được đưa vào phần

lõi kỵ nước. Kết quả nghiên cứu cho thấy: độ tan của curcumin tăng gấp 1100 lần so

với curcumin tự nhiên. Phương pháp này được coi là phương pháp triển vọng để

tăng độ tan và SKD của curcumin [54].

1.2.1.4. Bào chế vi nhũ tương

Vi nhũ tương là các hỗn hợp đẳng hướng quang học, thành phần gồm dầu,

nước và các chất diện hoạt kết hợp với đồng diện hoạt. Các DC kỵ nước có thể được

hòa tan trong pha dầu của vi nhũ tương D/N [63].

Vi nhũ tương chứa curcumin được tác giả Hu L. và cộng sự bào chế với công

thức tối ưu được lựa chọn gồm Capryol 90 (pha dầu), Cremophor RH40 (chất diện

hoạt) và dung dịch nước Transcutol P (chất đồng diện hoạt) có thể tăng độ tan của

curcumin lên 32,5 mg/ml. Nghiên cứu dược động học của vi nhũ tương được tiến

hành trên chuột và so sánh với hỗn dịch tương ứng. Vi nhũ tương sau khi pha loãng

có khả năng ổn định tốt và không có hiện tượng kết tinh. Cmax và AUC của vi nhũ

tương tăng đáng kể khi so sánh với hỗn dịch. SKD tương đối của curcumin ở vi nhũ

tương cao gấp 22,6 lần so với hỗn dịch. Sự tăng SKD của curcumin có thể do tăng

độ tan. Ngoài ra, do có tính kết dính cao, các giọt vi nhũ tương tiếp xúc với hệ

thống dạ dày ruột trong thời gian dài, do đó thúc đẩy quá trình vận chuyển DC qua

màng trong hệ thống dạ dày ruột. Các giọt vi nhũ tương được bắt giữ dễ dàng, kéo

dài thời gian lưu. Điều đó chứng tỏ vi nhũ tương curcumin có thể là dạng thuốc

triển vọng tăng SKD đường uống của curcumin [39].

1.2.1.5. Bào chế nhũ tương nano

Hệ nhũ tương nano có ưu điểm ổn định nhiệt động học tốt hơn hỗn dịch và

nhũ tương quy ước, trong suốt, dễ bào chế và có đặc tính riêng vì sử dụng dung môi

hòa tan cả DC thân nước và kỵ nước. Hơn nữa, vì kích thước giọt nhỏ, phân tử DC

trong nhũ tương nano có thể qua màng tế bào, dẫn đến tăng nồng độ trong huyết

tương và SKD [41].

Kumar A. và cộng sự bào chế hệ nhũ tương nano chứa curcumin với mục tiêu

tăng SKD bằng cách tăng độ tan và tính thấm ruột. Nhũ tương nano có đường kính

trung bình nhỏ khoảng 67 ± 6 nm với thế zeta khoảng -37 ± 2,5 mV. Thế zeta này

chứng tỏ nhũ tương nano ổn định trạng thái phân tán trong thời gian dài. Kết quả

đánh giá hấp thu ex vivo cho thấy: sự hấp thu DC qua ruột đối với nhũ tương nano

cao hơn so với hỗn dịch ban đầu. AUC của nhũ tương nano có sự khác biệt đáng kể

so với hỗn dịch curcumin. SKD của nhũ tương nano curcumin gấp khoảng 11,88 ±

0,47 lần so với hỗn dịch curcumin. Điều này có thể được giải thích do sự phân tán

của các giọt dầu kích thước nhỏ hơn 100 nm trong nhũ tương nano. Chất diện hoạt

không ion hóa không chỉ cải thiện độ tan và độ hòa tan của curcumin mà còn làm

tăng tính thấm qua tế bào biểu mô. Nhũ tương nano bào chế được ổn định về mặt

vật lý và hóa học trong 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc [52].

1.2.1.6. Bào chế hệ tự nhũ hóa tạo nhũ tương hoặc vi nhũ tương

Hệ tự nhũ hóa được sử dụng trong bào chế với ưu điểm cải thiện SKD đường

uống. Cơ chế tăng hấp thu DC của hệ tự nhũ hóa do tăng độ tan in vivo của DC, kéo

dài thời gian lưu trong dạ dày, thúc đẩy vận chuyển bạch huyết ruột, tăng tính thấm

thành ruột, giảm chuyển hóa và hoạt động của bơm ngoại bào ở thành dạ dày ruột

[81].

Setthacheewakul S. và cộng sự đã nghiên cứu bào chế hệ tự nhũ hóa tạo vi nhũ

tương dạng lỏng và dạng pellet nhằm cải thiện độ tan, tốc độ hòa tan và hấp thu in

vivo dùng đường uống của curcumin. Curcumin tự vi nhũ hóa dạng lỏng và dạng

pellet nhanh chóng chuyển thành dạng vi nhũ tương D/N với KTTP trong giới hạn

tương ứng 25,8-28,8 nm và 29,6-32,8 nm. Tốc độ giải phóng in vitro của hệ tự nhũ

hóa chứa curcumin dạng lỏng và pellet cao gấp khoảng 16 lần curcumin tự do

(curcumin giải phóng từ hệ tự vi nhũ hóa khoảng 80% cao hơn so với dạng dung

dịch curcumin chỉ có 5%). Hệ tự vi nhũ hóa curcumin dạng lỏng và pellet tăng hấp

thu curcumin tương ứng gấp 14 và 10 lần so với hỗn dịch curcumin. Như vậy, hệ tự

vi nhũ hóa dạng lỏng và pellet là giải pháp triển vọng tăng SKD của curcumin do

tăng độ tan và độ hòa tan [86].

1.2.1.7. Bào chế dạng liên hợp

Một số dạng liên hợp của curcumin với các phân tử nhỏ (đặc biệt là các acid

amin) và các polyme thân nước tổng hợp và tự nhiên có thể làm tăng độ tan của

curcumin. Một số acid amin như prolin, glycin, leucin, isoleucin, alanin,

phenylalanin, phenyl glycin, valin, serin và cystein có thể kết hợp với curcumin.

Liên hợp với acid amin này tăng độ tan của curcumin lên đến 1-10 mg/ml [68].

1.2.2. Biện pháp làm giảm chuyển hóa và thải trừ của curcumin qua đường

tiêu hóa

Bên cạnh các biện pháp cải thiện SKD của curcumin bằng cách làm tăng độ

tan và tốc độ hòa tan, có thể sử dụng các biện pháp làm giảm chuyển hóa và thải trừ

của curcumin qua đường tiêu hóa. Các biện pháp có thể áp dụng là bào chế dưới

dạng hệ nano chứa chất mang hoặc phối hợp với các chất ức chế quá trình chuyển

hóa của curcumin.

1.2.2.1. Bào chế hệ nano chứa chất mang

Hệ nano chứa chất mang có nhiều ưu điểm nổi trội như bảo vệ DC, giải phóng

DC kéo dài trong đường tiêu hóa, làm chậm sự chuyển hóa và thải trừ của DC. Một

số hệ nano chứa chất mang còn có khả năng kết dính sinh học, kéo dài thời gian tiếp

xúc với bề mặt hấp thu đường tiêu hóa. Do đó, hệ nano chứa chất mang có khả năng

cải thiện SKD của curcumin.

 Bào chế hệ nano polyme

Polyme là nhóm nguyên liệu được sử dụng phổ biến nhất để cấu thành hệ chất

mang dựa trên tiểu phân nano. Tiểu phân nano polyme có thể được tạo thành từ

polyme tổng hợp như poly (acid lactic) và poly (acid lactic co-glycolic) hoặc từ

nguyên liệu tự nhiên như chitosan, collagen…[5]. DC có thể giải phóng theo cách

kiểm soát qua bề mặt hoặc ăn mòn cốt, khuếch tán qua hệ polyme, trương nở hoặc

thay đổi đáp ứng với môi trường cục bộ. Tiểu phân nano polyme curcumin kéo dài

thời gian lưu thông bằng cách kết dính niêm mạc đường tiêu hóa hoặc giải phóng

kéo dài. Hệ nano kết dính sinh học có thể tăng hấp thu qua đường uống bằng cách

khư trú hệ đưa thuốc tại vùng hấp thu tối ưu của đường tiêu hóa, kéo dài thời gian

tiếp xúc với bề mặt hấp thu và sự lưu thông trong đường tiêu hóa, tăng nồng độ DC

tại vị trí hấp thu hoặc bảo vệ DC khỏi sự pha loãng và phân hủy bởi các chất bài tiết

của đường tiêu hóa [72].

Shaikh J. và cộng sự đã bào chế siêu vi cầu poly (acid lactic co-glycolic)

(PLGA) chứa curcumin bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương sử dụng

alcol polyvinic (PVA). Tiểu phân nano thu được có kích thước trung bình khoảng

264 nm, hiệu suất tạo vi cầu khoảng 77% và hiệu suất nạp DC khoảng 15%. Kết quả

thử giải phóng in vitro cho thấy: tiểu phân nano giải phóng DC theo mô hình hai

pha với 24% DC được giải phóng trong 24 giờ đầu và sau đó giải phóng chậm 20%

DC trong 20 ngày tiếp theo. Kết quả đánh giá SKD in vivo trên chuột cho thấy: đối

với hỗn dịch curcumin và hỗn dịch curcumin phối hợp với piperin, không phát hiện

được nồng độ curcumin trong 6 giờ. Nồng độ curcumin trong huyết tương giảm

nhanh, chứng tỏ sự chuyển hóa nhanh của curcumin. Trong khi đó, đối với tiểu

phân nano, nồng độ curcumin trong huyết tương tăng chậm và kéo dài trong thời

gian dài. SKD tương đối của tiểu phân nano curcumin tương ứng gấp 26 và 9,2 lần

so với hỗn dịch đơn giản và dạng hỗn dịch chứa curcumin và piperin [87].

 Bào chế hệ nano lipid

Hệ tiểu phân nano lipid là hệ đưa thuốc đường uống với nhiều đặc điểm nổi

trội, kết hợp ưu điểm của cả ba dạng bào chế liposome, nhũ tương và tiểu phân nano

[79]. Dưới dạng tiểu phân nano, những tiểu phân lipid này có thể kết dính chất nhày

do KTTP nhỏ và tăng thời gian lưu trong đường tiêu hóa. Hơn nữa, tiểu phân nano

lipid cũng có thể bảo vệ DC khỏi phân hủy hóa học và enzym, đồng thời giải phóng

từ từ phân tử DC từ hệ lipid vào máu, dẫn đến tăng hiệu quả điều trị so với DC ban

đầu [74].

Tiểu phân nano lipid rắn có thể khắc phục được một số vấn đề khó khăn của

DC dùng đường uống như độ tan và tính thấm kém, không ổn định trong đường tiêu

hóa và chịu chuyển hóa qua gan lần đầu. Hệ nano lipid rắn dùng đường uống có thể

cải thiện SKD của DC từ 2 đến 25 lần [37]. SKD của dạng nano lipid rắn chứa

curcumin được cải thiện có thể do hấp thu trực tiếp của tiểu phân nano qua hệ thống

dạ dày ruột, do kết dính của nano lipid với bề mặt chất nhày của ruột, tăng tính thấm

do sự có mặt của chất diện hoạt, giảm phân hủy và thải trừ.

Trong nghiên cứu của Ji H. và cộng sự, tiểu phân nano lipid rắn được bào chế

với các tá dược TPGS và Brij 78 nhằm tăng độ tan và SKD của curcumin. Công

thức tối ưu được lựa chọn với KTTP khoảng 135 ± 1,5 nm, giá trị thế zeta -24,7 ±

2,1 mV và hiệu suất nạp DC 91,09 ± 1,23%. Nghiên cứu dược động học in vivo cho

thấy: giá trị AUC0t đối với nano lipid rắn chứa curcumin gấp 12,27 lần so với hỗn

dịch curcumin và SKD tương đối khoảng 942,53%. Trong khi đó, Tmax và t1/2 của

curcumin trong nano lipid rắn đều kéo dài hơn khi so sánh với hỗn dịch curcumin.

Nghiên cứu hấp thu in situ ruột cho thấy: giá trị tính thấm hiệu quả của curcumin

trong nano lipid rắn cải thiện đáng kể so với dung dịch curcumin [42].

 Bào chế phức hợp phospholipid

Phospholipid là chất mang quan trọng đối với một số phân tử DC yêu cầu

kiểm soát giải phóng in vivo do bị thải trừ nhanh trong cơ thể. Bên cạnh đó,

phospholipid an toàn và tương đồng với màng sinh học [3], [48]. Một số nghiên cứu

đã chứng minh rằng việc tạo phức của curcumin với phospholipid sẽ tăng SKD.

Gupta N. K. và cộng sự đã nghiên cứu biện pháp tăng SKD của curcumin bằng

cách tạo phức với phosphatidyl cholin. Kết quả đánh giá ex vivo bằng kỹ thuật bộc

lộ túi bao ruột cho thấy: phức hợp curcumin-phosphatidyl cholin tăng hấp thu đáng

kể so với curcumin khi sử dụng cùng mức liều. Phức hợp cải thiện được dược động

học và tăng hoạt tính bảo vệ gan trên tế bào gan chuột cô lập khi so sánh với

curcumin và hỗn hợp vật lý. Dạng phức hợp curcumin-phosphatidyl cholin có nồng

độ trong huyết tương cao, thải trừ chậm và thời gian bán thải kéo dài hơn trên chuột

khi so sánh với curcumin hoặc hỗn hợp vật lý. Cụ thể, Cmax của curcumin và hỗn

hợp vật lý curcumin-phosphatidyl cholin là 258,64 và 297,32 ng/ml với Tmax tương

ứng 1,72 và 2,03 giờ. Trong khi đó, Cmax của phức hợp curcumin-phosphatidyl

cholin là 803,86 ng/ml với Tmax 2,21 giờ. Sự tăng SKD của phức hợp curcumin-

phosphatidyl cholin có thể do tính thân nước của dạng phức dẫn đến tăng độ tan của

curcumin [35]. Đồng thời, do là một hệ đưa thuốc bản chất lipid, sự hấp thu của DC

thông qua sự kích thích vận chuyển bạch huyết và tương tác với tế bào ruột hoặc tạo

tiểu phân keo với các thành phần muối mật ở dạng micel hòa tan [8].

Zhang J. và cộng sự đã bào chế vi cầu chitosan chứa phytosome curcumin

bằng cách kết hợp hệ polyme và hệ lipid nhằm cải thiện SKD và kéo dài thời gian

lưu của curcumin trong cơ thể. Vi cầu được tạo ra bằng cách đưa phytosome

curcumin vào vi cầu chitosan bằng kỹ thuật gel ion hóa. Vi cầu tạo ra có hình cầu,

KTTPTB 23,21 ± 6,72 m và hiệu suất nạp DC khoảng 2,67 ± 0,23%. Tốc độ giải

phóng in vitro của curcumin từ vi cầu chậm hơn từ vi cầu chitosan ở các môi trường

pH 1,0, 4,0, 6,8 và 7,4. Nghiên cứu dược động học trên chuột cho thấy: vi cầu chứa

phytosome hấp thu tăng 1,67 và 1,07 lần so với phytosome curcumin và vi cầu

curcumin-chitosan. Thời gian bán thải của curcumin dùng đường uống đối với vi

cầu chứa phytosome là 3,16 giờ dài hơn phytosome (1,73 giờ) và vi cầu curcumin

(2,34 giờ). Cmax đối với phytosome curcumin, vi cầu curcumin và vi cầu chứa

phytosome curcumin lần lượt là 142,61, 146,59 và 359,67 ng/ml, so với Cmax của

curcumin là 86,55 ng/ml. Giá trị AUC0∞ của phytosome curcumin, vi cầu

curcumin và vi cầu chứa phytosome curcumin tương ứng gấp 2,80, 3,62 và 7,49 lần

so với curcumin. Điều này cho thấy: hệ vi cầu chứa phytosome đã kết hợp các ưu

điểm của vi cầu chitosan và phytosome, tăng SKD và kéo dài thời gian lưu so với

hệ phytosme curcumin hoặc vi cầu curcumin. Do đó, vi cầu chứa phytosome

curcumin có thể được sử dụng như hệ giải phóng kéo dài đối với các DC ít tan và

SKD thấp [112].

Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Phạm Thị Minh Huệ và cộng sự,

phytosome curcumin được bào chế với tá dược phosphatidyl cholin đậu nành

hydrogen hóa với kích thước dưới 500 nm. Bằng phương pháp DSC, bước đầu

nghiên cứu đã chứng minh được có phản ứng liên kết hóa học giữa curcumin và

phosphatidyl cholin đậu nành hydrogen hóa trong phytosome [3].

 Bào chế liposome

Liposome được tạo thành từ các phospholipid tự nhiên tạo lớp lipid kép. DC

tan trong nước có thể được nạp vào phần lõi nước của lớp phospholipid kép, còn

DC thân dầu được nạp vào lớp vỏ lipid [5]. Sự tăng SKD của liposome chứa

curcumin có thể giải thích do hấp thu trực tiếp của tiểu phân qua hệ thống dạ dày

ruột, tăng tính thấm do sự có mặt của chất diện hoạt, giảm phân hủy, giảm tiếp xúc

với enzym đường tiêu hóa và kéo dài thời gian tiếp xúc với thành ruột do đặc tính

kết dính [94].

Để tăng hấp thu curcumin qua đường uống, liposome curcumin được bào chế

sử dụng lecithin thương mại. Curcumin, hỗn hợp curcumin với lecithin và liposome

curcumin được cho chuột uống với liều 100 mg/kg thể trọng. Kết quả đánh giá các

thông số dược động học đường uống cho thấy: nhóm chuột uống liposome

curcumin có Cmax khoảng 319,2 ± 70,4 g/l, Tmax khoảng 30 phút và AUC0120 phút

là 26502,8 g.phút/l, còn nhóm chuột uống curcumin có Cmax khoảng 64,6 ± 10,7

g/l, Tmax 120 phút và AUC0120 phút là 5342,6 g.phút/l. Điều đó cho thấy:

liposome chứa curcumin có thể tăng hấp thu curcumin qua dạ dày ruột [94].

 Bào chế hệ tiểu phân nano cubosome

Trong số các hệ đưa thuốc từ các lipid lưỡng thân (liposome, micel, pha lục

giác), pha cubic đang được nghiên cứu nhiều hơn do có đặc tính khác so với các pha

khác. Sự khác biệt của pha cubic nằm ở cấu trúc nội tại bền vững về mặt nhiệt động

học, cấu tạo bởi lipid song liên tục, phát triển theo cả 3 hướng trong không gian tạo

nên hai kênh chứa nước liên tục, đan xen nhưng không trộn lẫn nhau [4]. Cubosome

là tiểu phân nano kết tinh được phân tán từ pha cubic [31]. Do diện tích bề mặt thân

lipid lớn, pha cubic thích hợp làm chất mang cho các dược chất kém tan trong nước

và kém ổn định. Curcumin được đưa vào dạng nano cubosome với thành phần tạo

pha cubic là phytantriol, kết hợp với chất diện hoạt F27, phối hợp piperin nhằm tăng

SKD đường uống. Nồng độ curcumin trong huyết tương và trong các mô đối với

cubosme curcumin được so sánh với hỗn dịch chứa curcumin và piperin. Kết quả

cho thấy: đối với nhóm chuột uống hỗn dịch, curcumin được hấp thu chậm hơn, thải

trừ nhanh hơn khi so sánh với nhóm cubosome curcumin. Giá trị Tmax đối với

cubosome curcumin và hỗn dịch chứa curcumin với piperin dùng đường uống tương

ứng là 2,33 và 0,58 giờ. Cmax và AUC của hỗn dịch và hệ cubosome có sự khác biệt

đáng kể. Nồng độ curcumin trong huyết tương của hỗn dịch chứa curcumin và

piperin trong pha thải trừ giảm nhanh, chứng tỏ curcumin bị chuyển hóa nhanh. Tuy

nhiên, đối với cubosome curcumin, nồng độ trong huyết tương kéo dài và tăng

chậm, chứng tỏ sự giải phóng kéo dài của curcumin từ hệ tiểu phân cubosome. SKD

của cubosome curcumin gấp 14,9 lần so với curcumin trong hỗn dịch chứa

curcumin và piperin. Điều đó chứng tỏ cubosome có thể cải thiện đáng kể SKD của

curcumin [99].

1.2.2.2. Phối hợp với các chất ức chế quá trình chuyển hóa của curcumin

Bên cạnh các phương pháp cải thiện SKD đường uống của curcumin bằng

cách đưa vào dạng bào chế đã trình bày ở trên, việc phối hợp curcumin với các chất

ức chế chuyển hóa như piperin, quercetin hoặc silibinin được coi là một giải pháp

thay thế nhằm giảm chuyển hóa curcumin. Cơ chế ức chế chuyển hóa curcumin của

những chất này do ức chế UDP-glucuronosyltranferase, enzym chính trong quá

trình chuyển hóa của curcumin [57]. Do đó, những chất này ức chế không hoạt tính

quá trình glucuronid ở gan và ruột [9]. Một số nghiên cứu cho thấy: so với hỗn dịch

curcumin, sự phối hợp curcumin với piperin có thể tăng SKD trên chuột lên 2,8 lần

[87].

Như vậy, các biện pháp tăng SKD của curcumin đã được đề cập trong các

công trình nghiên cứu theo nhiều hướng nghiên cứu khác nhau. Trong đó, hai

hướng nghiên cứu chủ yếu là cải thiện độ tan, độ hòa tan và giảm chuyển hóa, thải

trừ của curcumin trong đường tiêu hóa.

Về hướng nghiên cứu cải thiện độ tan và độ hòa tan của curcumin, các biện

pháp có thể áp dụng là bào chế dưới dạng hệ nano tinh thể, hệ tự nhũ hóa, vi nhũ

tương, hệ micel hoặc hệ phân tán rắn… Hệ nano tinh thể có ưu điểm phương pháp

bào chế đơn giản, có thể dễ dàng ứng dụng vào thực tiễn, phương pháp bào chế

không ảnh hưởng đến tác dụng dược lý của DC, tỷ lệ DC cao, phù hợp với cả DC ít

tan trong nước và dầu, dễ dàng ứng dụng vào các dạng thuốc rắn dùng đường

uống… Ưu, nhược điểm của hệ nano tinh thể so với một số dạng trung gian khác

được trình bày tóm tắt ở bảng 1.2. Vi nhũ tương khả năng hòa tan cao và cải thiện

tính thấm do sự có mặt của các chất diện hoạt, nhưng lại kém ổn định, thể chất lỏng

khó ứng dụng vào các dạng bào chế dùng đường uống. Tương tự, hệ micel chất diện

hoạt và hệ tự nhũ hóa cũng có khả năng cải thiện độ tan và tính thấm do tỷ lệ chất

diện hoạt sử dụng khá cao. Bên cạnh các nhược điểm của vi nhũ tương, hệ micel

chất diện hoạt và tự nhũ hóa còn có thể gây kích ứng đường tiêu hóa khi dùng

đường uống do tỷ lệ chất diện hoạt cao. Hệ phân tán rắn dễ bào chế, tiểu phân DC

được phân tán trong hệ chất mang có độ xốp cao do đó giải phóng DC nhanh. Hệ

phân tán rắn có thể cải thiện độ tan và tốc độ hòa tan đáng kể hơn so với phương

pháp thay đổi dạng kết tinh của DC, đồng thời hệ phân tán rắn còn làm chậm sự tái

kết tinh hoặc kết tụ của phân tử DC hoặc cụm phân tử do tương tác phân tử và cản

trở không gian trong hệ chất mang [25]. Kỹ thuật tạo hệ phân tán rắn có thể tạo ra

tiểu phân kích thước mịn mà không cần năng lượng đầu vào quá cao [58]. Nhược

điểm của hệ phân tán rắn liên quan đến độ ổn định nhiệt động học. DC ở dạng vô

định hình được tạo ra trong hệ phân tán rắn thường không ổn định về mặt vật lý và

có thể chuyển sang dạng kết tinh trong quá trình bảo quản. Hệ phân tán rắn phải sử

dụng chất mang với tỷ lệ tương đối lớn mới có thể cải thiện được độ tan và độ hòa

tan của DC. Hơn nữa, sự có mặt của chất mang có thể ảnh hưởng đến độ ổn định

của hệ phân tán rắn do đa số các chất mang đều hút ẩm mạnh [58].

Bảng 1.2. So sánh ưu, nhược điểm của nano tinh thể so với nhũ tương nano và

micel polyme

Ưu điểm Nhược điểm Dạng bào chế nano

Hệ nano tinh thể

Kỹ thuật bào chế đơn giản Dễ nâng cấp lên quy mô lớn Cải thiện được tốc độ hòa tan so với DC ban đầu Thích hợp cho dạng bào chế dùng đường uống [18], [59] Khả năng nạp DC cao Giá thành thấp Nhũ tương nano

Có thể kiểm soát giải phóng DC Micel polyme

Năng lượng yêu cầu cao Đòi hỏi chất ổn định Không thích hợp với DC độc và DC có chỉ định điều trị hẹp Chưa có sự kiểm soát quá trình giải phóng DC Xu hướng tách pha Chưa có sự kiểm soát quá trình giải phóng DC Giới hạn trong việc lựa chọn polyme thích hợp Chưa có phương pháp bào chế thích hợp để nâng cấp quy mô

Về hướng nghiên cứu giảm chuyển hóa và thải trừ của curcumin, có thể bào

chế dưới dạng hệ nano chứa chất mang hoặc sử dụng các chất ức chế quá trình

chuyển hóa của curcumin trong cơ thể… Khác với nano tinh thể, hệ nano chứa chất

mang có thể cải thiện độ ổn định, kéo dài thời gian lưu trong đường tiêu hóa và

giảm sự thải trừ nhanh khỏi cơ thể. Hệ nano chứa chất mang còn có nhiều ưu điểm

so với DC ban đầu như tránh tương tác DC với môi trường sinh lý, tăng hấp thu DC

vào mô đích và cải thiện tính thấm vào trong tế bào [74]. Tuy nhiên, phương pháp

bào chế và đánh giá hệ nano chứa chất mang phức tạp hơn và hiệu suất nạp DC có

thể không cao. Một số đặc tính của các hệ nano chứa chất mang và hệ nano tinh thể

được trình bày tóm tắt ở bảng 1.3.

Bảng 1.3. So sánh ưu điểm của một số dạng trung gian chứa dược chất ít tan [37]

Hệ tiểu Hệ nhũ Hệ nano Hệ Hệ nano Đặc tính phân nano tương lipid rắn liposome tinh thể polyme nano

Khả năng vận Chỉ DC chuyển DC ít tan và Có Có Có Có ít tan thân nước

Độ ổn định vật lý Tốt Tốt Vừa Tốt Kém

Độ ổn định sinh học Vừa Tốt Vừa Vừa Kém

Tương tác sinh học Tốt Vừa Tốt Vừa Tốt

Thấp đến Khả năng nạp DC Cao Vừa Cao Cao vừa

Không Đường uống Có thể Có thể Có thể Có thể thể

Căn cứ vào việc phân tích ưu, nhược điểm của các biện pháp đã trình bày ở

trên, biện pháp làm tăng độ tan và độ hòa tan của curcumin bằng cách bào chế dưới

dạng hệ nano tinh thể được coi là biện pháp khả thi hơn cả nhằm cải thiện SKD của

curcumin. Chính vì vậy, nghiên cứu tập trung theo hướng bào chế hệ nano tinh thể.

1.2.3. Một số chế phẩm nano chứa curcumin sử dụng biện pháp tăng sinh khả

dụng thương mại hóa

Hiện nay, các chế phẩm chứa curcumin đã được thương mại hóa có thể là dạng

tiểu phân nano polyme, tiểu phân nano lipid rắn, liposome hoặc micel… Một số chế

phẩm được đưa ra thị trường ngoài nước [61] và tại Việt Nam được trình bày ở

bảng 1.4.

Bảng 1.4. Một số chế phẩm nano chứa curcumin sử dụng biện pháp tăng SKD

thương mại hóa

Công ty

STT Tên chế phẩm nano NanoLiposomal 1 Curcumin NanoLiposomal Nutritionals., USA

N-Curcusorb 2 tương nano chứa

NanocurcTM Pharma, 3

Theracurmin 4 Đặc tính Tiểu phân nano curcumin liposome trong vi nang phospholipid lecithin Nhũ curcumin. Tiểu phân nano polyme chứa curcumin Tiểu phân nano keo

5 Tiểu phân nano lipid rắn

Inc.

Curcumin, CurcuPlus D ULTRA, CurcuPlus D Longvida® Sciences, 6 Tiểu phân nano lipid rắn

Konark Herbals & Health Care, India SignPath Inc., USA Theravalues Corporation, Japan Advanced Orthomolecular Research Canada Verdure USA

7 Ý Phytosome curcumin

Micel curcumin Meriva Curmin Lead Cumar Gold Nano Curma Nafaco, Việt Nam Việt Nam Việt Nam 8 9 10

1.3. MỘT SỐ MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG CỦA

CURCUMIN DÙNG ĐƯỜNG UỐNG

Để đánh giá SKD của curcumin có thể sử dụng các mô hình nghiên cứu SKD

như sau:

1.3.1. Nghiên cứu in vitro

 Đánh giá giải phóng thuốc trực tiếp trong môi trường

Một số công trình nghiên cứu đã sử dụng phương pháp in vitro để khảo sát sơ

bộ xu hướng giải phóng curcumin từ hệ nano trước khi thử in vivo. Môi trường thử

là 900 ml dung dịch natri laurylsulfat 1% [8] hoặc Tween 80 0,05% [67] bằng thiết bị cánh khuấy với tốc độ khuấy và thời gian thử thích hợp ở nhiệt độ 37 ± 0,5oC. Cá

biệt, có nghiên cứu sử dụng một loạt môi trường thử độ hòa tan khác nhau như môi

trường acid hydrocloric 0,1 M (pH 1,0), đệm phosphat pH 4,0, 6,8 và 7,4 chứa

0,5% Tween 80 [112]. Mẫu thử được đưa trực tiếp vào môi trường hoặc đưa vào

viên nang cứng gelatin và đặt vào môi trường thử độ hòa tan. Mẫu lấy ra sau từng

khoảng thời gian xác định được ly tâm 15000 vòng/phút [67]. Đánh giá lượng DC

giải phóng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis [8], quang phổ huỳnh

quang với bước sóng kích thích và phát xạ lần lượt 430 và 550 nm [67] hoặc HPLC

[106].

Ngoài ra, một số nghiên cứu sử dụng thiết bị thử là các ống Eppendorf chứa

môi trường thử và mẫu thử [106], [112]. Các ống được đặt vào thiết bị lắc và duy trì nhiệt độ 37 ± 0,5oC với tốc độ phù hợp. Sau từng khoảng thời gian xác định, lấy các

ống ra và ly tâm. Phân tán trở lại trong dung môi thích hợp để xác định lượng

curcumin giải phóng bằng phương pháp HPLC [106].

Theo Xie X. và cộng sự, sự giải phóng in vitro của hệ tiểu phân nano PLGA

chứa curcumin được tiến hành trong hai môi trường đệm phosphat pH 2,0 và 7,4,

mô phỏng dịch dạ dày và ruột. Kết quả đánh giá khả năng giải phóng cho thấy:

curcumin giải phóng nhanh trong 8 giờ đầu và tiếp tục giải phóng kéo dài. Tuy

nhiên, tốc độ giải phóng của curcumin từ tiểu phân nano trong dịch ruột cao hơn

dịch dạ dày nhân tạo do sự hấp thu chủ yếu của curcumin xảy ra ở ruột [106]. Sự

giải phóng in vitro curcumin chậm và kéo dài dẫn đến hấp thu in vivo kéo dài.

 Đánh giá giải phóng thuốc qua túi thẩm tích

Một số nghiên cứu sử dụng túi thẩm tích với kích thước lỗ xốp cho tiểu phân

có khối lượng phân tử khoảng 3-14 kDa đi qua. Do curcumin ít tan trong nước nên

môi trường khuếch tán có thể là ethanol [87] hoặc dịch dạ dày nhân tạo (dung dịch

muối đệm phosphat điều chỉnh về pH 2,0 bằng acid hydrocloric) và dịch ruột nhân

tạo (dung dịch muối đệm phosphat ở pH 7,4) chứa 0,1% Tween 80 (kl/tt). Vai trò

của Tween 80 để làm tăng độ tan của curcumin trong dung dịch đệm và tránh bám

dính curcumin vào thành ống [42]. Một số nghiên cứu sử dụng môi trường khuếch

tán là dung dịch PEG 400 30% [99] hoặc dung dịch natri laurylsulfat 20% [114]. Túi thẩm tích được đặt trong môi trường ở nhiệt độ 37 ± 0,5oC và sử dụng khuấy từ

với tốc độ khuấy thích hợp [42], [99] hoặc đặt trong giỏ quay của thiết bị hòa tan

hoặc được rung lắc theo chiều ngang bằng thiết bị rung [76]. Định lượng DC giải

phóng qua màng sau từng khoảng thời gian bằng phương pháp HPLC [42] hoặc

quang phổ UV-Vis ở bước sóng 423 nm [52].

Theo Ji H. và cộng sự, sự giải phóng curcumin từ hệ tiểu phân nano lipid rắn

được tiến hành bằng phương pháp sử dụng túi thẩm tích trong môi trường dịch dạ

dày nhân tạo (pH 1,2) và dịch ruột nhân tạo (pH 7,4). Kết quả cho thấy: tốc độ giải

phóng chậm trong cả hai môi trường chứng tỏ curcumin được nạp bên trong lõi

lipid với tỷ lệ cao [42].

 Đánh giá tính thấm qua tế bào Caco-2

Theo nghiên cứu của Yu H. và Huang Q., màng tế bào Caco-2 mô phỏng biểu

mô ruột non được sử dụng để nghiên cứu cơ chế thấm của nhũ tương nano chứa

curcumin. Nhũ tương nano có thể thấm theo hai cơ chế: thứ nhất, nhũ tương nano bị

tiêu hóa bởi lipase, đồng thời, curcumin được hòa tan bởi acid béo-muối mật tạo

micel. Do đó, curcumin hòa tan khuếch tán thụ động qua màng tế bào biểu mô. Thứ

hai, hệ nano nhũ tương với kích thước giọt nhỏ có thể khuếch tán trực tiếp qua

màng ruột. Kết quả đánh giá tính thấm qua màng tế bào Caco-2 chỉ ra rằng: cơ chế

thấm của nhũ tương nano chứa curcumin chủ yếu theo con đường khuếch tán-tiêu

hóa [111].

Nghiên cứu in vitro có ưu điểm đơn giản, ít tốn kém, dễ thiết lập, tính toán kết

quả nhanh và thường được dùng là công cụ xây dựng công thức hoặc để kiểm soát

chất lượng, đảm bảo độ đồng nhất của sản phẩm, lô mẻ và nhà sản xuất. Nghiên cứu

in vitro để thăm dò, sàng lọc trước khi chuyển sang nghiên cứu in vivo và có thể

thay thế cho in vivo nếu chứng minh được có sự tương quan đồng biến. Mặc dù vậy,

do curcumin có độ tan thấp, chuyển hóa và thải trừ nhanh trong cơ thể sống nên

việc sử dụng mô hình đánh giá in vitro để dự đoán in vivo thường khó chính xác.

Trong số các phương pháp đánh giá in vitro nêu trên, phương pháp đánh giá

giải phóng trực tiếp từ môi trường là mô hình phù hợp để đánh giá độ hòa tan của

nano tinh thể. Phương pháp giải phóng in vitro qua túi thẩm tích do sử dụng màng

thẩm tích có thể tạo ra hàng rào đối với quá trình hòa tan, do đó làm chậm tốc độ

hòa tan. Vì vậy, phương pháp này không thích hợp trong đánh giá độ hòa tan mà chỉ

phù hợp với các tiểu phân nano kiểm soát giải phóng. Ngoài ra, các nghiên cứu in

vitro trên màng tế bào Caco-2 có hữu ích trong việc đánh giá tính thấm và cơ chế

thấm.

Mặc dù vậy, việc đánh giá độ hòa tan của nano tinh thể bằng phương pháp thử

giải phóng trực tiếp trong môi trường cũng gặp phải một số khó khăn nhất định.

Curcumin là DC sơ nước, khó phân tán vào môi trường nước, có thể bị kết tụ và

bám dính thành cốc và cánh khuấy. Khi chuyển sang dạng nano tinh thể, hiện tượng

kết tụ vẫn có thể xảy ra do tác động của nhiều yếu tố của quá trình phun sấy. Do đó,

tốc độ hòa tan tại một số thời điểm ban đầu có thể chậm do tiểu phân nano chưa

thấm và nổi trên bề mặt môi trường hòa tan. Tại mỗi thời điểm sau khi lấy mẫu, một

lượng tiểu phân trong môi trường thử có thể bị kéo theo. Do đó, để xác định được

phần trăm curcumin hòa tan cần sử dụng biện pháp thích hợp để loại các tiểu phân

DC kích cỡ nanomet không tan từ mẫu.

1.3.2. Nghiên cứu ex vivo

Một số nghiên cứu về SKD của curcumin sử dụng phương pháp nghiên cứu ex

vivo để đánh giá hấp thu của curcumin trên ruột cô lập.

Theo Kumar A. và cộng sự, mô hình túi ruột lộn ex vivo có thể được sử dụng

là công cụ để nghiên cứu cơ chế và động học của hấp thu thuốc. Trong nghiên cứu

này, chuột được cho nhịn đói 10-12 giờ, uống nước tự do và gây mê bằng ether.

Rạch đường giữa bụng, toàn bộ phần ruột được lấy ra, đặt vào dung dịch Krebs

Ringer (pH 7,4) và được cung cấp oxy. Phần tá tràng được sử dụng trong nghiên

cứu tính thấm, thắt bằng chỉ nilon ở một đầu và lộn ra bởi một que thủy tinh. Dung

dịch Krebs Ringer bên ngoài túi ruột được coi như dịch nhày và dung dịch bên

trong coi như dịch ruột. Lượng curcumin thấm qua ruột sau từng khoảng thời gian

xác định được xác định bằng phương pháp HPLC [52].

Theo nghiên cứu của Gupta N. K. và Dixit V. K., phương pháp đánh giá hấp

thu ex vivo của nhũ tương nano chứa curcumin được tiến hành trên ruột dê. Kết quả

cho thấy: hấp thu ex vivo của phức hợp curcumin và phospholipid cao hơn so với

curcumin tự do [35].

Nghiên cứu ex vivo có ưu điểm đơn giản hơn so với nghiên cứu in vivo. Mô

hình nghiên cứu này có thể sử dụng để nghiên cứu cơ chế và động học quá trình hấp

thu của thuốc trước khi được phân bố và chuyển hóa trong cơ thể. Tuy nhiên, đối

với DC chuyển hóa mạnh qua gan thành một số chất có hoạt tính như curcumin, mô

hình này chưa phản ánh đúng quá trình sinh dược học và dược động học của cơ thể

sống.

1.3.3. Nghiên cứu in situ

Bên cạnh các mô hình nghiên cứu trên, nghiên cứu in situ được đề cập đến

trong nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá đặc tính hấp thu của curcumin.

Trong nghiên cứu của Cui J. và cộng sự, đặc tính hấp thu của hệ tự nhũ hóa

chứa curcumin được đánh giá bằng phương pháp truyền vào ruột in situ. Chuột thí

nghiệm được cho nhịn đói 12 giờ và gây mê. Toàn bộ phần ruột non được bộc lộ,

buộc dây truyền và đưa ống thông dò bằng plastic vào cơ thể. Phần ống thông dò

được rửa bằng dung dịch nước muối sinh lý, gắn vào mô hình chứa một cái bơm

nhu động và xi lanh chứa dung dịch mẫu. Ruột non được giữ nhẹ nhàng để duy trì

cung cấp máu, dung dịch thử được truyền qua ruột một cách tuần hoàn. Sau từng

khoảng xác định, lấy ra dung dịch thử. Mẫu được xử lý và phân tích bằng phương

pháp HPLC [22].

Sự hấp thu qua ruột của hệ nano lipid rắn được Ji H. và cộng sự đánh giá bằng

phương pháp thử khuếch tán in situ. Đồng thời, phương pháp này cũng đánh giá

được cơ chế tăng tính thấm thông qua ức chế P-gp của hệ nano lipid rắn sử dụng các

chất diện hoạt Brij 78 và TPGS [42]. Tương tự, Xie X. và cộng sự cũng sử dụng

nghiên cứu in situ để đánh giá khả năng thấm của curcumin từ hệ tiểu phân nano

PLGA qua ruột và khả năng ức chế P-gp [106]. Sự hấp thu của hỗn dịch nano

curcumin trong hệ thống dạ dày ruột của chuột cống cũng được nghiên cứu theo mô

hình nghiên cứu in situ bởi Gao Y. và cộng sự. Hỗn dịch nano curcumin được hấp

thu theo cơ chế khuếch tán thụ động với 9,20% curcumin được hấp thu trong 2 giờ.

Vùng hấp thu chủ yếu của curcumin trong đường tiêu hóa chuột cống là tá tràng và

hỗng tràng [30]

Mô hình in situ dùng trong nghiên cứu cơ thế thấm hoặc khuếch tán qua màng

tế bào ruột. Giống như mô hình ex vivo, mô hình in situ chưa phản ánh các giai đoạn

đầy đủ của quá trình sinh dược học và dược động học của cơ thể sống.

1.3.4. Nghiên cứu in vivo

Nghiên cứu in vivo dựa trên việc đánh giá nồng độ thuốc trong huyết tương

sau khi uống. Một số nghiên cứu về SKD của curcumin còn định lượng cả curcumin

trong máu và lượng curcumin còn lại trong hệ thống dạ dày ruột chưa được hấp thu

[8] hoặc định lượng cả phần curcumin bài tiết qua phân [22].

Do khả năng thấm kém, độ tan thấp, bị chuyển hóa và thải trừ nhanh trong cơ

thể nên các mẫu huyết tương thường có nồng độ curcumin rất thấp. Vì vậy, trong

nghiên cứu đánh giá SKD của các dạng thuốc chứa curcumin cần lựa chọn đối

tượng thử và phương pháp định lượng curcumin trong huyết tương cần có độ nhạy

cao.

Về đối tượng thử, nghiên cứu SKD đường uống của curcumin được tiến hành

trên chuột cống [39], [42], [55], [87] hoặc chuột nhắt [30], [32], [76], [111]. Bên

cạnh đó cũng có một số nghiên cứu được thực hiện trên người tình nguyện [82].

Nghiên cứu trên chuột có ưu điểm là đơn giản hơn nghiên cứu trên người tình

nguyện về khía cạnh đạo đức, pháp lý và kinh tế. Chuột và người có nhiều điểm

tương tự về hấp thu và mô hình biểu thị sự vận chuyển tương tự ở ruột non nhưng

mức độ biểu thị và mô hình enzym chuyển hóa ở dạ dày ruột có thể khác nhau [13].

Bộ gen của chuột và người giống nhau đến 99%. Chuột cũng là một loài động vật

có vú, dễ sinh sản và rẻ tiền hơn so với các loại động vật khác. Đồng thời, chuột là

động vật dễ nuôi nhốt và bắt giữ bằng tay và sự khác biệt về gen thấp, dẫn đến sai

khác về phạm vi đáp ứng hẹp hơn so với các động vật thí nghiệm khác [93]. Nhược

điểm của việc sử dụng chuột trong nghiên cứu in vivo là sự khác nhau cơ bản giữa

người và chuột về con đường và tốc độ chuyển hóa. Việc cho chuột uống thuốc khó

khăn hơn trên người, thể tích dịch sinh học ít và lấy mẫu khó khăn [93].

Các nghiên cứu đánh giá SKD in vivo đều cho chuột uống mẫu tiểu phân nano

curcumin bằng ống thông vào dạ dày. Các mẫu máu được lấy ra sau từng khoảng

thời gian xác định từ tĩnh mạch đuôi chuột [39], hoặc lấy máu từ đám rối hốc mắt

chuột sau khi gây mê bằng ether [52], [87], có thể lấy bằng cách chọc vào tim [8],

[115]. Máu thu được trộn với thành phần chống đông (heparin [87] hoặc EDTA

[52]) bằng cách lắc và ly tâm thu lấy phần huyết tương. Trong một số trường hợp

không thể lấy mẫu nhiều lần trên một cá thể, có thể lấy mẫu trên một nhóm cá thể

hoặc sử dụng mô hình dược động học quần thể.

Về xử lý mẫu, mẫu huyết tương được chiết bằng dung môi ethyl acetat [115],

methanol [42], ethanol [40] hoặc tert-butyl methyl ether [105]. Ly tâm lấy dịch

trong. Bốc hơi dung môi trong dòng khí nitrogen ở nhiệt độ thích hợp. Phần cắn hòa

tan vào methanol và tiến hành phân tích.

Mẫu huyết tương sau khi xử lý được định lượng curcumin bằng phương pháp

thích hợp [40], [52], [87]. Cá biệt có một số nghiên cứu định lượng cả curcumin và

chất chuyển hóa của curcumin trong huyết tương [19], [55]. Chất chuyển hóa của

curcumin có thể ở dưới dạng tự do hoặc liên hợp dạng glucuronid hoặc sulfat. Khi

đó, mẫu huyết tương được ủ với dung dịch enzym sulfatase và glucuronidase ở 37oC trong 1 giờ để chuyển curcumin sulfat và glucuronid thành curcumin tự do

trước khi chiết [111].

Về phương pháp định lượng, hầu hết các nghiên cứu sử dụng phương pháp

HPLC với ưu điểm nhanh, đơn giản, có độ nhạy cao. Điều kiện tiến hành định

lượng curcumin trong dịch sinh học bằng phương pháp HPLC trong các nghiên cứu

về cơ bản là sử dụng cột C18 ở nhiệt độ thích hợp. Thành phần pha động thường là

các dung môi phân cực như acetonitril, methanol phối hợp với nước. Tốc độ dòng

thường từ 1 đến 2 ml/phút. Phần lớn các nghiên cứu sử dụng detector tử ngoại bước

sóng từ 420-430 nm hoặc detector huỳnh quang với bước sóng kích thích và phát xạ

lần lượt 426 và 536 nm hoặc detector khối phổ. Một số nghiên cứu sử dụng chất

chuẩn nội như β-17-estradiol acetat [87], [103], benzocain [67] hoặc emodin [112].

Bên cạnh đó, một số nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với khối

phổ LC-MS hoặc LC-MS/MS [67].

So với các mô hình nghiên cứu SKD khác, nghiên cứu in vivo cung cấp được

các yếu tố thể hiện sự phản ứng của cơ thể sống với thuốc. Từ đó có thể dự đoán

được các tác dụng, lựa chọn đường dùng, liều dùng trên người. Đánh giá SKD in

vivo là cơ sở lựa chọn thuốc điều trị thay thế. Tuy nhiên, nghiên cứu in vivo có hạn

chế giá thành cao, tốn thời gian và hạn chế về mặt đạo đức sinh học.

Gao Y. và cộng sự đã đánh giá SKD của hỗn dịch nano curcumin trên chuột

nhắt với liều 250 mg/kg. Các thông số dược động học tính toán không dựa trên mô

hình ngăn trên hai nhóm cá thể, mỗi nhóm gồm 27 chuột. Giá trị AUC0∞ của hỗn

dịch nano khoảng 617,82 ± 70,92 g/ml.giờ, gấp 6,80 lần so với hỗn dịch curcumin

(90,12 ± 16,85 g/l.giờ). Cmax đối với hỗn dịch nano curcumin khoảng 174,75 ±

49,05 ng/ml, cao hơn so với hỗn dịch curcumin (12,58 ± 4,28 ng/ml) (p < 0,01)

[30].

Dựa trên cơ sở phân tích trên, để giải quyết vấn đề tăng SKD của curcumin,

nghiên cứu lựa chọn bào chế dưới dạng hệ tiểu phân nano bằng phương pháp giảm

kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóa

nhờ lực phân cắt lớn. Trong điều kiện tiến hành thực nghiệm, nghiên cứu lựa chọn

các điều kiện thử in vitro với thiết bị thử kiểu cánh khuấy và mẫu thử được đưa trực

tiếp vào môi trường hòa tan. Phương pháp đánh giá SKD in vivo dựa trên việc xác

định nồng độ curcumin trong huyết tương chuột nhắt. Do curcumin bị chuyển hóa

mạnh thành nhiều chất chuyển hóa, trong đó có tetrahydrocurcumin và nồng độ các

chất này đều thấp nên các phương pháp định lượng nồng độ thuốc trong huyết

tương được lựa chọn cần đáp ứng được cả yêu cầu độ nhạy, độ chính xác cao. Do

đó, phương pháp LC-MS/MS được lựa chọn.

Chương 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguyên vật liệu

Các nguyên liệu và hóa chất chính được được trình bày ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

Curcumin Ấn Độ Nhà sản xuất 1

VKN thuốc TP HCM Chuẩn làm việc 2 Curcumin chuẩn (95,51%, số lô QT209031215)

Tween 60, 80 Singapore BP 2010 3

Cremophor RH40 Trung Quốc USP 39 4

Poloxame 188 Trung Quốc BP 2015 5

Polyvinyl pyrolidon K30 Trung Quốc BP 2015 6

Alcol polyvinic Trung Quốc BP 2015 7

Manitol Pháp BP 2015 8

Lactose Pháp BP 2015 9

D (+) Trehalose dihydrat Mỹ BP 2015 10

Trung Quốc USP 39 11 Natri carboxy methylcellulose

Carboxy methylcellulose Trung Quốc USP 39 12

Acetonitril J.T. Baker Tinh khiết HPLC 13

Methanol J.T. Baker Tinh khiết HPLC 14

Acid acetic băng Merck Tinh khiết HPLC 15

Mỹ Nhà sản xuất 16

Dược điển VN IV 17 Tetrahydrocurcumin chuẩn (95,00%, số lô JL399035A) Glibenclamid chuẩn (100,10%, số lô 0103129) VKN thuốc Trung ương

Tert-butyl methyl ether Merck Tinh khiết phân tích 18

Acid formic Fluka Tinh khiết LC-MS 19

Nước tinh khiết Việt Nam Dược điển VN IV 20

2.1.2. Thiết bị

Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Thiết bị Nước sản Địa điểm nghiên cứu

xuất

Thiết bị dùng trong bào chế

Đức Trường ĐH Dược HN Máy nghiền bi Retsch MM200

Đức Trường ĐH Dược HN Máy khuấy từ Ika RH B1, 415W

Mỹ Trường ĐH Dược HN Thiết bị đồng nhất hóa nhờ lực phân

cắt lớn Unidrive X1000

Máy phun sấy Buchi mini spray Thụy Sỹ Trường ĐH Dược HN

dryer B-191

Thiết bị dùng để đánh giá

Nhật Bản Viện vệ sinh dịch tễ Trung

ương Kính hiển vi điện tử FESEM Hitachi S-4800

Anh Trường ĐH Dược HN

Máy đo kích thước tiểu phân và xác định phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer Nano ZS90 Malvern

Anh Trường ĐH Dược HN

Máy đo kích thước tiểu phân và khoảng phân bố kích thước tiểu phân Mastersizer 3000E

Mỹ Trường ĐH Bách Khoa HN

Thiết bị đánh giá diện tích bề mặt, thể tích lỗ xốp và đường kính lỗ xốp

Micromeritics Gemini VII 2390 V1.02

Cân xác định mất khối lượng do làm Nhật Trường ĐH Dược HN

khô Moisture analyzer MF50 AD

Máy đo thể tích biểu kiến của hạt và Đức Trường ĐH Dược HN

bột Erweka SVM10

Thiết bị quét nhiệt vi sai DSC 131, Pháp Trường ĐH Quốc gia HN

Setaram Instrumentation

Thiết bị quét phổ nhiễu xạ tia X D8 Đức Trường ĐH Quốc gia HN

Advance, Bruker axs

Thiết bị đo phổ hồng ngoại Nhật Trường ĐH Quốc gia HN

IRAffinity-1S, Shimadzu

Máy đo quang phổ UV/Vis Nhật Trường ĐH Dược HN

Spectrophotometer SP-3000 nano

Thiết bị thử độ hòa tan Erweka-DT Đức Trường ĐH Dược HN

Máy ly tâm lạnh Universal 320 R Đức Trường ĐH Dược HN

Máy siêu âm Ultrasonic Cleaner Set Hàn Quốc Trường ĐH Dược HN

WUC-A22H

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Mỹ Trường ĐH Dược HN

Agilent HPLC 1260

Thiết bị lắc xoáy Vortex ZX3, Velp Mỹ Viện kiểm nghiệm thuốc

Scientifica Trung ương

Thiết bị lắc xoáy ngang Đức Viện kiểm nghiệm thuốc

Reciprocating Shaking 3006, GFL Trung ương

Mỹ

Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Thiết bị bốc hơi dung môi ở áp suất giảm Centrivap solvent system, Labconco

Mỹ

Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Máy sắc ký lỏng Acquity UPLC H- Class, kết hợp khối phổ Xevo TQD, Waters

Tủ lạnh sâu MDF 236, Sanyo Nhật

Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

2.1.3. Động vật thí nghiệm

Động vật thí nghiệm được lựa chọn là chuột nhắt trắng khỏe mạnh, khối lượng

khoảng 20-35 g, khoảng 7 tuần tuổi, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, được cung cấp từ

Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương. Chuột được cho thích nghi với điều kiện phòng thí

nghiệm ít nhất một tuần và cho nhịn đói 12 giờ, chỉ uống nước trước khi tiến hành

thí nghiệm.

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:

- Thẩm định phương pháp định lượng.

- Nghiên cứu tiền công thức.

- Nghiên cứu bào chế và đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano

curcumin.

- Nghiên cứu ảnh hưởng khi nâng quy mô bào chế đến đặc tính của hệ tiểu

phân nano curcumin.

- Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở và theo dõi độ ổn định của hệ tiểu phân nano

curcumin.

- Đánh giá SKD của hệ tiểu phân nano curcumin trên chuột thí nghiệm.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Thẩm định phương pháp định lượng

2.3.1.1. Thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng quang phổ hấp thụ

UV-Vis

Chuẩn bị các dung dịch:

- Dung môi pha loãng (dung dịch Tween 80 0,2%): cân 2,0 g Tween 80 vào

cốc có mỏ, thêm nước cất và đun nóng đến khi tan hoàn toàn. Để nguội và thêm

nước vừa đủ 1000 ml.

- Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 10,0 mg curcumin chuẩn hòa tan

trong 10 ml methanol, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung môi pha loãng

tới vạch, lắc kỹ được dung dịch A (nồng độ 100 g/ml). Hút chính xác 2 ml dung

dịch A cho sang bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha loãng tới vạch và lắc kỹ.

Quét phổ dung dịch curcumin có nồng độ 5 g/ml trong khoảng bước sóng từ

200 đến 600 nm, lựa chọn bước sóng tại đó curcumin đạt cực đại hấp thụ. Từ dung

dịch A pha loãng thành các dung dịch curcumin chuẩn có nồng độ 1; 2; 2,5; 4; 4,5;

5 và 7,5 g/ml. Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn tại bước sóng đã lựa chọn

với mẫu trắng là dung môi pha loãng và xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương

quan giữa độ hấp thụ và nồng độ curcumin.

2.3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao

 Chuẩn bị các dung dịch:

- Dung môi pha loãng: hỗn hợp methanol: acid acetic băng (99:1, tt/tt).

- Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 10,0 mg curcumin chuẩn, hòa tan

trong dung môi pha loãng, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung môi pha

loãng tới vạch và lắc kỹ được dung dịch B. Hút chính xác một lượng dung dịch B,

thêm dung môi pha loãng tạo thành dung dịch có nồng độ 5 µg/ml, lọc qua màng

lọc kích thước lỗ lọc 0,45µm.

- Dung dịch thử được chuẩn bị tương tự như dung dịch chuẩn nhưng thay

curcumin chuẩn bằng một lượng bột phun sấy chứa nano curcumin tương ứng với

10,0 mg curcumin.

 Điều kiện sắc ký:

Qua tham khảo tài liệu [22], [39], [42], [50], [80] kết hợp với khảo sát sơ bộ,

dựa trên điều kiện trang thiết bị hiện có, các điều kiện chạy sắc ký được lựa chọn

trên hệ thống sắc ký Agilent Infinity 1260 như sau: cột sắc ký AQ – C18 250 x 4,6

mm, hạt nhồi 5 µm. Pha động: acetonitril : dung dịch acid acetic 2% (kl/tt) (58:42),

được lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm. Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. Thể

tích tiêm mẫu: 20 µl. Detector UV-Vis phát hiện ở bước sóng 430 nm.

 Thẩm định phương pháp định lượng dựa trên một số tiêu chí:

- Tính thích hợp của hệ thống: tiêm mẫu chuẩn có nồng độ 5 g/ml lặp lại 6

lần qua hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Yêu cầu độ lặp lại về diện tích

pic, thời gian lưu giữa mỗi lần tiêm có giá trị RSD không quá 2% và hệ số bất đối

xứng trong khoảng 0,8-1,5.

- Tính chọn lọc - độ đặc hiệu: chuẩn bị mẫu trắng bằng cách hòa tan Tween

80, PVP và manitol theo tỷ lệ sử dụng trong công thức trong dung môi pha loãng,

mẫu curcumin chuẩn (5 µg/ml) và mẫu thử chứa nano curcumin bào chế theo quy

trình (5 µg/ml). Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã lựa

chọn và ghi lại các sắc ký đồ. Yêu cầu pic của curcumin được nhận diện rõ trên sắc

ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và không xuất hiện pic lạ tại thời điểm trùng với thời

gian lưu của curcumin trên sắc ký đồ của mẫu trắng.

- Khoảng tuyến tính: chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 2,5

đến 15 µg/ml. Tiêm lần lượt các dung dịch vào hệ thống sắc ký theo chương trình

đã chọn. Xác định mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ curcumin. Khoảng

tuyến tính phải có hệ số tương quan r  0,98.

- Độ đúng: chuẩn bị các dung dịch chuẩn và thử chứa nano curcumin ở 3 mức

nồng độ 5, 10 và 15 µg/ml. Lấy 10 ml dung dịch thử, thêm một lượng dung dịch

chuẩn tương ứng khoảng 10, 20 và 30% so với lượng DC có sẵn trong mẫu thử.

Thêm dung môi vừa đủ 20 ml và lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm. Tiêm

mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Yêu cầu phần trăm tìm lại của

các mẫu ở 3 mức nồng độ nằm trong khoảng từ 98-102%.

- Độ chính xác: chuẩn bị 6 mẫu dung dịch thử chứa nano curcumin có nồng độ

5 µg/ml và chạy sắc ký theo chương trình đã lựa chọn ở mục 2.3.1.2. Xác định nồng

độ dung dịch từ phương trình hồi quy tuyến tính. Yêu cầu độ lặp lại về hàm lượng

curcumin trong các mẫu có giá trị RSD không vượt quá 2%.

2.3.1.3. Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời curcumin và chất chuyển

hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột

Chuẩn bị mẫu

Cân chính xác khoảng 5,0 mg curcumin (CUR), hòa tan trong bình định mức

50 ml với dung môi methanol. Cân chính xác khoảng 10,0 mg tetrahydrocurcumin

(THC), hòa tan trong bình định mức 50 ml với dung môi methanol. Hút 1 ml dung

dịch CUR và 0,5 ml dung dịch THC, pha loãng trong bình định mức 20 ml bằng

dung môi methanol. Hút 1 ml, cô bốc hơi dung môi, hòa tan cắn trong 10 ml huyết

tương chuột được dung dịch chứa CUR và THC trong huyết tương có cùng nồng độ

500 ng/ml. Từ dung dịch này, pha loãng bằng huyết tương chuột thành các dung

dịch có nồng độ thích hợp.

Cân chính xác khoảng 25 mg glibenclamid (IS), hòa tan trong bình định mức

100 ml với dung môi methanol. Hút 500 l dung dịch, pha loãng thành 25 ml với

hỗn hợp dung môi methanol-nước (50:50).

Xử lý mẫu

Quy trình xử lý mẫu được tiến hành bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng với

dung môi chiết là tert-butyl methyl ether (TBME) [105]. Cụ thể như sau:

Thêm 10 l dung dịch chuẩn nội vào ống nghiệm chứa 100 l huyết tương

chuột. Lắc xoáy 5 giây. Thêm 3 ml dung môi tert-butyl methyl ether (TBME). Lắc

cơ học ngang 5 phút. Ly tâm 3000 vòng trong 5 phút. Hút lấy 2,5 ml lớp dịch trong

phía trên. Cô bay hơi dung môi bằng thiết bị cô dung môi áp suất giảm ở nhiệt độ

40oC. Hòa tan cắn trong 100 l pha động bằng cách lắc xoáy 30 giây trên thiết bị

lắc cơ học.

Phương pháp định lượng

Mẫu huyết tương sau khi xử lý được định lượng đồng thời CUR và THC bằng

phương pháp LC-MS/MS với các điều kiện sắc ký được xây dựng dựa trên tham

khảo tài liệu [105] kết hợp với khảo sát như sau: cột sắc ký Kinetex C18, kích thước

cột 100 x 2,1 mm, kích thước hạt nhồi 1,7 m. Nhiệt độ cột 40oC. Pha động:

acetonitril: dung dịch acid formic 0,05% (60:40). Tốc độ dòng 0,3 ml/phút. Thể tích

mẫu tiêm 10 l. Điều kiện khối phổ được trình bày ở bảng 2.3.

Bảng 2.3. Điều kiện khối phổ của phương pháp LC-MS/MS định lượng curcumin và

tetrahydrocurcumin trong huyết tương

Dược chất Thông số CUR THC IS

ESI (+) 3,0 36 500 800 26 ESI (+) 3,0 28 500 800 14

Chế độ ion hóa Điện thế đầu phun (kV) Điện thế bộ phận thu mẫu (V) Nhiệt độ bay hơi (oC) Tốc độ khí bay hơi (lít/giờ) Thế phân mảnh ion (V) Ion ban đầu (ion mẹ) Ion tạo thành (ion con) ESI (+) 3,0 18 500 800 28 m/z = 369,03 m/z = 373,05 m/z = 494,20 m/z = 176,98 m/z = 136,96 m/z = 369,12

Quy trình thẩm định phương pháp định lượng đồng thời CUR và THC trong

huyết tương được thực hiện theo hướng dẫn của US-FDA và EMA bao gồm các chỉ

tiêu sau [26], [100]:

 Tính thích hợp của hệ thống

Tiến hành xử lý mẫu huyết tương chứa CUR và THC với cùng nồng độ

khoảng 250 ng/ml và chạy sắc ký lặp lại 6 lần theo các điều kiện sắc ký đã lựa chọn

ở trên. Xác định thời gian lưu, diện tích pic và tính tỷ lệ diện tích giữa các pic CUR

và THC so với pic chuẩn nội. Yêu cầu độ lặp lại về thời gian lưu của các pic CUR

và THC và giá trị tỷ lệ diện tích giữa các pic CUR và THC với chuẩn nội có RSD

nhỏ hơn 5%.

 Tính chọn lọc, đặc hiệu:

So sánh sắc ký đồ của 6 mẫu huyết tương chuột với mẫu huyết tương chuột có

pha chuẩn CUR ở nồng độ LLOQ (0,5 ng/ml) và THC ở nồng độ LLOQ (0,5 ng/ml)

được xử lý theo quy trình ở trên. Yêu cầu pic của CUR và THC phải đảm bảo được

nhận diện rõ ràng, tách khỏi hoàn toàn các pic tạp. Tỷ lệ tín hiệu đo của mẫu LLOQ

so với mẫu trắng lớn hơn ít nhất 5 lần tại thời điểm trùng với thời gian lưu của CUR

và THC và lớn hơn ít nhất 20 lần tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chuẩn

nội.

 Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương chuột và hàm đáp ứng, xác định

khoảng tuyến tính

Chuẩn bị 8 nồng độ của chất chuẩn CUR và THC pha trong huyết tương trắng

có nồng độ 0,5; 2,5; 5; 50; 100; 200; 350 và 500 ng/ml, mỗi nồng độ 2 mẫu độc lập.

Xử lý các mẫu theo quy trình ở trên. Phân tích các mẫu bằng phương pháp LC-

MS/MS. Xác định sự tương quan giữa giá trị tỷ lệ diện tích pic CUR/IS và nồng độ

CUR, giá trị tỷ lệ diện tích pic THC/IS và nồng độ THC có trong mẫu. Tính lại

nồng độ CUR và THC có trong mẫu chuẩn theo phương trình hồi quy đã xây dựng.

Xác định độ đúng bằng cách so sánh với giá trị thực tương ứng của từng nồng độ.

Yêu cầu trong khoảng nồng độ khảo sát, độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ

phải đạt từ 85% đến 115%. Độ đúng của điểm có nồng độ thấp nhất của đường

chuẩn được phép từ 80% đến 120%. Ít nhất 75% số điểm trong dãy đường chuẩn

đạt được tiêu chuẩn trên. Khoảng tuyến tính có hệ số tương quan r  0,98.

 Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Tiến hành xử lý 6 mẫu huyết tương chuột và 6 mẫu huyết tương chứa CUR và

THC cùng nồng độ 0,5 ng/ml (mẫu LLOQ). Chuẩn bị đường chuẩn trong cùng điều

kiện. Phân tích các mẫu bằng phương pháp LC-MS/MS. Xác định lại nồng độ của

các mẫu khảo sát từ phương trình hồi quy đường chuẩn. Tính độ đúng bằng cách so

sánh nồng độ tính được từ đường chuẩn với nồng độ đã pha. Yêu cầu giá trị S/N của

các pic CUR và THC trong các mẫu nồng độ LLOQ lớn hơn 10. Độ đúng phải đạt

từ 80% đến 120% so với nồng độ thực với giá trị RSD nhỏ hơn 20%.

 Xác định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Chuẩn bị 5 lô mẫu huyết tương, mỗi lô gồm 6 mẫu độc lập chứa CUR và THC

ở 4 mức nồng độ LLOQ (0,5 ng/ml), LQC (1,5 ng/ml), SQC (30 ng/ml), MQC (250

ng/ml) và HQC (400 ng/ml).

Chuẩn bị đường chuẩn trong cùng điều kiện, xử lý mẫu và phân tích bằng

phương pháp LC-MS/MS, tính nồng độ CUR và THC trong các mẫu kiểm tra theo

đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Xác định độ đúng trong ngày và khác

ngày của phương pháp bằng cách so sánh nồng độ phân tích được của các mẫu so

với nồng độ thực có trong mẫu. Xác định độ chính xác bằng cách tính độ lệch chuẩn

tương đối RSD% giữa các giá trị phân tích được của mỗi nồng độ. Yêu cầu với mỗi

nồng độ, độ đúng phải đạt từ 85-115% nồng độ thực đã pha. Độ lặp lại tại các nồng

độ có giá trị RSD không quá 15%. Riêng các mẫu ở nồng độ LLOQ, độ đúng đạt

80-120% và RSD không quá 20%.

 Tỷ lệ thu hồi

Tiến hành xử lý các lô mẫu huyết tương chứa CUR và THC ở 4 mức nồng độ

LQC (1,5 ng/ml), SQC (30 ng/ml), MQC (250 ng/ml) và HQC (400 ng/ml) bằng

phương pháp chiết lỏng-lỏng với dung môi TBME, mỗi lô mẫu gồm 6 mẫu độc lập.

Song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha động chứa CUR

và THC có nồng độ tương ứng. Xác định tỷ lệ thu hồi của CUR, THC bằng cách so

sánh kết quả đáp ứng của CUR và THC trong các mẫu có qua chiết tách với đáp

ứng của CUR và THC trong mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua

chiết tách). Tương tự, xác định tỷ lệ thu hồi chuẩn nội bằng cách so sánh diện tích

pic chuẩn nội trong lô mẫu ở nồng độ MQC. Yêu cầu tỷ lệ thu hồi không quá 110%

và không thấp hơn 30%. RSD giữa các đáp ứng của mẫu có qua chiết tách và không

qua chiết tách ở mỗi nồng độ không quá 15%.

 Ảnh hưởng của nền mẫu

Tiến hành xử lý 6 mẫu huyết tương trắng theo phương pháp chiết lỏng-lỏng

với dung môi TBME và thu các dịch chiết nền mẫu. Tiến hành cô bốc hơi dung

môi. Hòa tan cắn trong dung dịch chuẩn CUR và THC ở nồng độ khoảng 1,5 (LQC)

và 400 ng/ml (HQC). Song song chuẩn bị các mẫu chuẩn CUR và THC trong pha

động có cùng nồng độ tương ứng. Tiến hành phân tích LC-MS/MS, xác định diện

tích pic CUR, THC và IS của các mẫu pha trong pha động và mẫu pha trong dịch

chiết nền mẫu. Đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu dựa trên tỷ số MFCUR/MFIS và

MFTHC/MFIS trong đó MFCUR, MFTHC, MFIS lần lượt là tỷ số diện tích các pic CUR,

THC, IS của các mẫu chuẩn pha trong dịch chiết nền mẫu và các mẫu chuẩn pha

trong pha động có nồng độ tương đương. Yêu cầu ở mỗi mức nồng độ, tỷ số

MFCUR/MFIS và MFTHC/MFIS có giá trị RSD nhỏ hơn 15%.

 Nhiễm chéo

Chuẩn bị 6 mẫu huyết tương chứa CUR và THC nồng độ ULOQ (500 ng/ml),

6 mẫu ở nồng độ LLOQ (0,5 ng/ml) và 6 mẫu huyết tương trắng được xử lý theo

quy trình. Tiến hành tiêm vào cột sắc ký xen kẽ 6 mẫu ở nồng độ ULOQ và mẫu

trắng, lặp lại quá trình 6 lần. Tiếp tục tiêm 6 mẫu ở nồng độ LLOQ. Quá trình phân

tích được coi là không nhiễm chéo nếu tỷ lệ tín hiệu đo của mẫu LLOQ so với mẫu

trắng lớn hơn ít nhất 5 lần tại thời điểm trùng với thời gian lưu của CUR và THC và

lớn hơn ít nhất 20 lần tại thời điểm trùng với thời gian lưu của glibenclamid.

 Khảo sát độ ổn định

Mẫu được nghiên cứu độ ổn định bằng cách so sánh nồng độ CUR và THC

trong mẫu sau bảo quản với nồng độ tại thời điểm ban đầu. Tiến hành đánh giá độ

ổn định của dung dịch chuẩn gốc CUR và THC sau 4 giờ ở nhiệt độ phòng và sau 13 ngày bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC, dung dịch chuẩn IS làm việc trong 4 giờ ở nhiệt

độ phòng, mẫu huyết tương chứa CUR và THC ở hai mức nồng độ LQC và HQC

sau rã đông 4 giờ ở nhiệt độ phòng, mẫu sau xử lý trong buồng tiêm mẫu (auto- sampler) sau 26 giờ ở nhiệt độ 20oC và mẫu sau 3 chu kỳ đông – rã và bảo quản ở - 30oC sau 40 ngày. Mẫu được coi là ổn định nếu nồng độ CUR và THC có độ lệch so

với nồng độ ban đầu không quá ±15% và giá trị RSD% giữa các kết quả định lượng

ở mỗi nồng độ phải  15%.

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tiền công thức (Preformulation)

2.3.2.1. Nghiên cứu tính chất của dược chất

a. Đánh giá hình thái và kích thước tiểu phân bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM –

Scanning Electron Microscope )

Nguyên tắc: chùm điện tử quét trên toàn bộ bề mặt của mẫu được thu lại bởi

các đầu dò để biến đổi thành những tín hiệu phản ánh bề mặt và thành phần của

mẫu đưa ra màn hình quan sát. Do cách tạo ảnh, các ảnh SEM có đặc điểm của ảnh

ba chiều.

Tiến hành: phân tán mẫu bột curcumin trên một khung carbon, sau đó phủ một

lớp platin mỏng và đặt vào buồng soi mẫu của thiết bị. Sử dụng kính hiển vi điện tử

FESEM Hitachi S-4800 có độ phóng đại M = 20-800000x, độ phân giải δ = 1,0 nm,

điện áp gia tốc U = 10 kV.

b. Xác định kích thước tiểu phân trung bình và khoảng phân bố kích thước tiểu

phân sử dụng thiết bị Mastersizer 3000E

Mẫu nguyên liệu được phân tán trong môi trường nước chứa 0,1% Tween 80,

pha loãng hỗn dịch đến khi thu được hỗn dịch có độ che mờ khoảng 11-15% (xác

định bởi thiết bị Mastersizer 3000E). Khuấy đồng nhất và siêu âm trên thiết bị đo để

đảm bảo mẫu thử đồng nhất. Tiến hành đo khi mẫu thử không còn bọt khí.

Từ các thông số thu được về kích thước tiểu phân, trung bình KTTP theo thể

tích (d [4,3]) và hệ số Span được sử dụng để đánh giá KTTP và phân bố KTTP.

c. Phương pháp xác định diện tích bề mặt và độ xốp

Nguyên tắc: dựa theo thuyết hấp phụ Brunauer-Emmet-Teller (BET)

Khi bề mặt tiểu phân rắn tiếp xúc với chất khí, lớp hấp phụ được hình thành

trên bề mặt. Lớp hấp phụ cũng được hình thành trên bề mặt lỗ xốp bên trong tiểu

phân và khí bị ngưng tụ trong lỗ xốp. Ở nhiệt độ hằng định, lượng khí hấp phụ hoặc

ngưng tụ trên bề mặt là hàm số của áp suất khí. Dựa vào sự thay đổi áp suất khí,

tính toán được lượng khí hấp phụ hoặc ngưng tụ. Xây dựng đường hấp phụ đẳng

nhiệt theo thuyết BET và xác định diện tích bề mặt theo thuyết BET [2]. Thể tích lỗ

xốp và đường kính trung bình của lỗ xốp được xác định dựa vào quá trình hấp phụ

và phản hấp phụ của khí nitrogen trên bề mặt lỗ xốp.

Tiến hành: Hút chân không và cung cấp nhiệt để làm khô nguyên liệu ở 100oC

và làm sạch bề mặt tiểu phân, lỗ xốp. Khi bề mặt tiếp xúc với khí nitrogen, nitrogen

sẽ hấp phụ lên bề mặt và hệ thống mao quản của mẫu tại nhiệt độ nitrogen lỏng (- 196oC).

d. Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray Diffraction-XRD)

Khi chùm tia X đập vào mặt tinh thể và đi vào trong, mạng tinh thể đóng vai

trò như một cách tử nhiễu xạ đặc biệt. Mật độ và cường độ các pic trong phổ XRD

thể hiện mức độ kết tinh của DC.

Tiến hành: các mẫu được nghiền mịn, đặt vào khay kim loại, đưa vào thiết bị

chiếu tia X với bước sóng tia X tới từ bức xạ Ka của đồng kim loại (Cu) là Cu = 1,5405Å, cường độ dòng điện 40 mA, điện áp 40 kV, góc quét từ 1-50oC, tốc độ quét 2o/phút.

e. Phương pháp giản đồ nhiệt vi sai (Differential Scanning Calorimetry-DSC)

Phương pháp giản đồ nhiệt vi sai cho phép xác định các tính chất chuyển pha

nhiệt của mẫu thông qua việc đo dòng nhiệt tỏa ra (hoặc thu vào) từ một mẫu được

đốt nóng trong dòng nhiệt với nhiệt độ quét ở các tốc độ khác nhau. Mẫu bột được

đặt trong đĩa nhôm đục lỗ kín với lượng 5-10 mg. Các phân tích nhiệt được thực hiện với nhiệt độ quét trong phạm vi 30-300oC và tốc độ gia nhiệt 10oC/phút. Trong

quá trình có sử dụng khí nitrogen.

f. Phương pháp đo phổ hồng ngoại (Fourier Transform Infrared Spectroscopy-

FTIR)

Bức xạ IR được chuyển tới bộ phận phát hiện, được ghi lại thành phổ IR,

thông thường biểu thị dưới dạng độ truyền qua theo số sóng (cm-1).

Lấy khoảng 5-10 mg mẫu phân tích, nghiền mịn và trộn đều với KBr, ép thành

viên mỏng rồi đo phổ IR. Riêng mẫu tá dược Tween 80 được đo phổ IR trực tiếp ở

thể lỏng.

g. Phương pháp định lượng

Hàm lượng curcumin trong nguyên liệu được định lượng bằng phương pháp

quang phổ hấp thụ UV-Vis hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao.

 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis

Chuẩn bị dung môi pha loãng và dung dịch chuẩn như mục 2.3.1.1. Dung dịch

thử được chuẩn bị tương tự như dung dịch chuẩn nhưng thay curcumin chuẩn bằng

curcumin nguyên liệu. Lọc dung dịch qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 m. Đo

độ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu thử tại bước sóng 427 nm, mẫu trắng là dung môi

pha loãng.

Hàm lượng curcumin được tính theo công thức:

x 100% % CUR =

Trong đó DT, Dc: độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn.

mc : khối lượng curcumin chuẩn (mg)

m : khối lượng curcumin thử (mg)

Mỗi mẫu thử làm 3 lần lấy kết quả trung bình.

 Phương pháp HPLC

Chuẩn bị dung môi pha loãng và dung dịch chuẩn như ở mục 2.3.1.2. Chuẩn bị

dung dịch thử tương tự như dung dịch chuẩn nhưng thay curcumin chuẩn bằng 10,0

mg curcumin nguyên liệu. Hàm lượng curcumin được tính toán theo công thức:

x 100%

% CUR =

Trong đó St, Sc: diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAU.giây).

mc : khối lượng curcumin chuẩn (mg)

mt : khối lượng curcumin thử (mg)

Hàm lượng curcumin cũng có thể được tính toán theo phương trình hồi quy

tuyến tính mô tả mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ curcumin xây dựng

theo phương pháp ở mục 2.3.1.2. Mỗi mẫu thử làm 3 lần lấy kết quả trung bình.

h. Phương pháp đánh giá độ tan của curcumin

Phân tán vào mỗi bình nón có nút mài khoảng 0,1 g curcumin trong 100 ml nước tinh khiết. Khuấy từ liên tục trong 24 giờ tại nhiệt độ 25 ± 2oC. Hút dung dịch

thử, lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 5 µm, ly tâm 10 phút với tốc độ 12000

vòng/phút, lấy phần dịch trong, lọc 2 lần qua màng lọc cellulose acetat kích thước

lỗ lọc 0,2 µm. Do nồng độ curcumin bão hòa trong nước quá thấp, không thể xác

định được bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis hay HPLC nên phương

pháp LC-MS/MS được lựa chọn với các điều kiện tham khảo tài liệu kết hợp với

khảo sát sơ bộ như sau [105]:

 Các thông số phần sắc ký lỏng: cột sắc ký XBridge (75 mm x 2,1 mm;

2,5µm). Pha động: acetonitril : dung dịch acid formic 0,05%/nước (tỉ lệ 6:4).

Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 10µl. Nhiệt độ buồng cột: 300C.

 Các thông số của detector khối phổ: chế độ ion hóa ESI (+), nhiệt độ nguồn ion 5000C, năng lượng bắn phá 22 V, năng lượng khí phụ trợ N2 với tốc độ

1000 l/giờ, ion ban đầu m/z = 369,0, ion tạo thành m/z = 177,0

Chuẩn bị mẫu chuẩn curcumin có nồng độ 0,2 g/ml bằng cách pha loãng từ

dung dịch gốc ở mục 2.3.1.2. Tính toán kết quả bằng cách so sánh đáp ứng pic của

mẫu thử và mẫu chuẩn.

i. Phương pháp đánh giá độ hòa tan của curcumin

Mức độ và tốc độ hòa tan của curcumin nguyên liệu được xác định bằng phép

thử độ hòa tan với các điều kiện cụ thể như sau:

- Thiết bị: máy cánh khuấy, tốc độ quay 100 vòng/phút

- Môi trường hòa tan: 900 ml nước chứa 0,2% Tween 80 - Nhiệt độ môi trường hòa tan: 37 ± 0,5oC

- Khối lượng mẫu thử: tương ứng với 5,0 mg curcumin

Cách tiến hành: cho các mẫu thử vào cốc có mỏ chứa một lượng môi trường

thử độ hòa tan, siêu âm 3-4 giây và chuyển vào cốc chứa môi trường thử hòa tan.

Sau các khoảng thời gian 10, 20, 30, 40, 50 và 60 phút, lấy khoảng 10 ml dung dịch

thử, ly tâm 5 phút với tốc độ 12000 vòng/phút. Phần dịch trong được định lượng

curcumin bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis ở bước sóng 427 nm, sử

dụng mẫu trắng là dung dịch Tween 80 0,2%. Sau khi đo quang, rót toàn bộ phần

cắn và phần dịch ly tâm vào cốc thử độ hòa tan.

Chuẩn bị mẫu trắng và mẫu chuẩn tương tự như mục 2.3.1.1. Tính toán kết

quả bằng cách so sánh độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu chuẩn:

x Co

Cn =

Trong đó Cn, Co: nồng độ dung dịch thử và chuẩn (g/ml)

Dn, Do: độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn

Phần trăm curcumin đã hòa tan tại thời điểm t được tính theo công thức:

% CUR = x 100%. Cn x 900 m x 1000

Cn: nồng độ curcumin tại thời điểm t (µg/ml)

m : lượng curcumin thử (mg)

Mỗi mẫu thử được tiến hành 3 lần và lấy kết quả trung bình.

2.3.2.2. Nghiên cứu độ ổn định hóa học của curcumin ở trạng thái rắn

Các mẫu nguyên liệu curcumin được theo dõi ở các điều kiện khắc nhiệt như

- Lọ thủy tinh mở ở điều kiện ẩm và nhiệt trong 7 và 14 ngày (độ ẩm 75 ± 5%,

nhiệt độ 40 ± 2oC).

- Lọ thủy tinh mở ở điều kiện độ ẩm cao 90%, nhiệt độ phòng (sử dụng dung

dịch bão hòa kali nitrat để tạo môi trường có độ ẩm cao) trong 7 ngày.

- Lọ thủy tinh đậy nút cao su và chụp nắp nhôm ở điều kiện nhiệt khô 60oC

trong 7 ngày.

- Tác động cơ học bằng cách nghiền bi trong buồng nghiền với bi inox 6 giờ

Đánh giá thay đổi hình thức bên ngoài bằng cảm quan và xác định lại hàm

lượng curcumin so với ban đầu bằng phương pháp HPLC theo mục 2.3.2.1.g.

2.3.2.3. Nghiên cứu tương tác dược chất-tá dược

Tương tác dược chất-tá dược được đánh giá bằng cách phối hợp dược chất và

tá dược Tween 80, Tween 60, Cremophor RH40, Poloxame 188, poly

vinylpyrolidon (PVP), PVA, manitol, Trehalose, lactose theo tỷ lệ 1:1 hoặc với tá

dược CMC, Na CMC theo tỷ lệ 5:1.

Đối với các chất diện hoạt thể chất lỏng như Tween 80, Tween 60, Cremophor

RH40, tiến hành nghiền ướt 1g curcumin với tá dược theo tỷ lệ trên để tạo bột nhão.

Đối với các polyme và chất mang thân nước, ngâm trương nở hoặc hòa tan trong 1-

2 ml nước tạo dung dịch, lấy một lượng dung dịch tương ứng theo tỷ lệ trên và

nghiền ướt với 1 g curcumin tạo bột nhão.

Bột nhão hoặc hỗn hợp vật lý được đóng vào các lọ thủy tinh và bảo quản ở nhiệt độ 40 ± 2oC và độ ẩm 75 ± 5 % trong 1 tháng, ở trạng thái mở và đóng nắp

(đậy nút cao su, chụp nắp nhôm). Sau thời gian theo dõi, đánh giá thay đổi về hình

thức bên ngoài của các lọ mở nắp. Riêng đối với các lọ đóng nắp, đánh giá hình

thức bên ngoài và hàm lượng curcumin bằng phương pháp HPLC với các điều kiện

ở mục 2.3.2.1.g.

2.3.3. Bào chế hệ tiểu phân nano

2.3.3.1. Phương pháp bào chế

Bào chế hỗn dịch nano curcumin

Hỗn dịch nano được bào chế với công thức cơ bản cho 1 mẻ được trình bày ở

bảng 2.4.

Bảng 2.4. Thành phần hỗn dịch nano curcumin mẻ 1 và 5 gam

Thành phần Curcumin

Chất diện hoạt

Polyme thân nước Chất mang Nước tinh khiết Mẻ 1 g 1 g Thay đổi theo khảo sát nt - 25 ml Mẻ 5 g 5 g Thay đổi theo khảo sát nt nt 125 ml

Hỗn dịch nano curcumin được bào chế bằng phương pháp giảm kích thước

tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền bi kết hợp đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn

theo sơ đồ hình 2.1.

Mô tả quy trình:

Quy trình A (áp dụng với mẻ 1 g)

- Cân DC và tá dược theo tỷ lệ đã định.

- Ngâm trương nở Na CMC hoặc hòa tan polyme (PVP hoặc PVA) trong 25

ml nước tạo dung dịch.

- Nghiền mịn curcumin bằng thiết bị nghiền bi inox, kích thước bi 20 mm, mỗi

mẻ 1 g trong một buồng nghiền, thời gian nghiền 60 phút ở tần số 25 Hz.

- Phối hợp chất diện hoạt thể lỏng (Tween 80, Tween 60 hoặc Cremophor

RH40) hoặc dung dịch chất diện hoạt Poloxame 188 hòa tan trong 1 ml dung

dịch polyme ở trên và nghiền ướt tạo hỗn dịch đặc bằng chày cối, thời gian

nghiền 15 phút.

- Thêm từ từ dung dịch polyme để tạo hỗn dịch curcumin.

- Đồng nhất hóa hỗn dịch nhờ lực phân cắt lớn với tốc độ 18000 vòng/phút

trong thời gian 15 phút (có thể thay đổi phù hợp với điều kiện khảo sát) tạo

hỗn dịch nano.

Quy trình A Quy trình B

Nghiền khô Nghiền khô Curcumin Curcumin (bi inox) (bi inox)

CDH, dung Nghiền ướt (bi Nghiền ướt CDH dịch polyme zirconi oxyd) bằng chày cối

Nước tinh Dung dịch Pha loãng HD Pha loãng HD khiết polyme

Lọc loại bi Đồng nhất hóa qua rây 300

Đồng nhất hóa

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế hỗn dịch nano curcumin

Quy trình B (áp dụng với mẻ 5 g)

- Cân DC và tá dược theo tỷ lệ đã định.

- Hòa tan polyme trong 10 ml nước nóng tạo dung dịch polyme.

- Nghiền mịn curcumin bằng thiết bị nghiền bi inox, kích thước bi 20 mm, mỗi

mẻ 5 g trong mỗi buồng nghiền, với tần số nghiền 15 hoặc 30 Hz và thời

gian thay đổi từ 1 đến 6 giờ.

- Phối hợp chất diện hoạt và dung dịch polyme, nghiền ướt bằng buồng nghiền

chứa 25 g bi zirconi oxyd, kích thước bi 0,65 hoặc 0,8 mm, mỗi buồng

nghiền chứa 5 g DC, tần số nghiền 15 hoặc 30 Hz trong thời gian thay đổi từ

1 đến 6 giờ.

- Pha loãng hỗn dịch đặc bằng 100 ml nước tinh khiết. Lọc loại bi qua rây 300.

- Đồng nhất hóa hỗn dịch nhờ lực phân cắt lớn với tốc độ 18000 vòng/phút

trong thời gian 60 phút, cứ mỗi 15 phút lại cho máy nghỉ 5 phút. Tốc độ và

thời gian đồng nhất có thể thay đổi phù hợp với khảo sát.

Bào chế hệ tiểu phân nano curcumin dạng bột phun sấy

Đối với mẻ 1 g, tiến hành phun sấy hỗn dịch nano thu được ở trên. Đối với mẻ

5 g, hòa tan chất mang thân nước vào 15 ml nước còn lại, phối hợp với hỗn dịch nano. Quá trình phun sấy được tiến hành với các thông số: nhiệt độ đầu vào 96oC,

tốc độ cấp dịch 2 ml/phút và tỷ lệ thông gió 99% (có thể thay đổi phù hợp với điều

kiện khảo sát). Hỗn dịch nano được khuấy từ liên tục trong thời gian phun sấy. Bột

phun sấy được thu hồi trên cả cyclon và bộ phận thu hồi sản phẩm trong phòng kín

với độ ẩm khoảng 30-40%. Bột phun sấy được đóng vào lọ thủy tinh, đậy nút cao su

và chụp nắp nhôm. Các lọ thủy tinh được bọc kín, tránh ánh sáng và bảo quản trong

bình hút ẩm.

2.3.3.2. Kiểm soát các thông số trong quá trình bào chế

Khi tiến hành nâng cấp quy mô bào chế từ 1 g lên 5 g/mẻ, các giai đoạn trọng

yếu trong quy trình bào chế và các thông số trọng yếu trong từng giai đoạn cần được

xác định. Các giai đoạn trọng yếu và thông số trọng yếu được liệt kê trong bảng 2.5.

Bảng 2.5. Các giai đoạn trọng yếu và các thông số trọng yếu trong từng giai đoạn

của quy trình bào chế bột phun sấy chứa nano curcumin

STT Giai đoạn trọng yếu Thông số trọng yếu

1 Nghiền khô

2 Nghiền ướt

3 Đồng nhất hóa

4 Phun sấy  Tần số nghiền  Thời gian nghiền  Tần số nghiền  Thời gian nghiền  Thời gian khuấy  Tốc độ khuấy  Tốc độ phun dịch  Nhiệt độ khí vào

Nghiên cứu được tiến hành với 3 mẻ liên tiếp ở quy mô 5g/mẻ. Xác định các

chỉ tiêu chất lượng trọng yếu cho từng giai đoạn trong quy trình bào chế và kế

hoạch lấy mẫu được trình bày ở bảng 2.6.

Bảng 2.6. Kế hoạch lấy mẫu

STT Giai đoạn Phép thử Giới hạn chấp nhận

Nghiền khô 1  9,00 m

Nghiền ướt 2

3 Đồng nhất hóa  2,00 m < 500,0 nm < 0,550

< 500,0 nm Đo KTTPTB Xác định Span Đo KTTPTB Xác định Span Đo KTTPTB Xác định PDI Đo KTTPTB Chụp SEM

Xác định PDI < 0,550 Kế hoạch lấy mẫu 0,05 g/mẫu x 3 mẫu/mẻ 0,05 g/mẫu x 3 mẫu/mẻ 0,05 g/mẫu x 3 mẫu/mẻ 0,05 g x 3 lần/mẻ Phun sấy

0,1 g

4 1 g/mẻ  12,00 % Nhiễu xạ tia X Quét nhiệt vi sai Phổ hồng ngoại Mất khối lượng do làm khô

Xác định hàm lượng

Thử độ tan

Thử độ hòa tan 0,01 g x 3 lần/mẻ 0,3 g x 3 lần/mẻ 0,01 g x 3 lần/mẻ 40,00-43,50 (%)  95,00% sau 60 phút

Sơ đồ các vị trí lấy mẫu trong buồng nghiền của thiết bị nghiền bi và trong cốc

khuấy được minh họa ở hình 2.2.

b a

Hình 2.2. Sơ đồ vị trí lấy mẫu trong buồng nghiền bi và cốc khuấy

(a) Vị trí lấy mẫu trong buồng nghiền bi

(b)Vị trí lấy mẫu trong cốc khuấy đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn

2.3.3.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano curcumin

a. Đánh giá hình thái và kích thước hệ tiểu phân nano bằng kính hiển vi điện tử

quét (Scanning Electron Microscope-SEM)

Phân tán bột phun sấy chứa tiểu phân nano curcumin vào nước để tạo hỗn dịch

nano. Hỗn dịch nano được ly tâm ở tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút để thu lấy kết tủa, rửa tủa 3 lần bằng nước tinh khiết, làm khô ở nhiệt độ 40-50oC và chụp

SEM. Bột phun sấy chứa nano curcumin được chụp SEM trực tiếp. Cách tiến hành

tương tự như đối với DC (mục 2.3.2.1.a).

b. Đánh giá kích thước tiểu phân trung bình và khoảng phân bố kích thước tiểu

phân hoặc hệ số đa phân tán

Tiến hành đánh giá KTTP và khoảng phân bố KTTP (Span) của mẫu curcumin

trong giai đoạn nghiền khô và nghiền ướt bằng thiết bị đo Mastersizer 3000E. Đối

với mẫu nghiền khô, tiến hành phân tán trong môi trường nước chứa 0,1% Tween

80 tương tự như đối với DC (mục 2.3.2.1.b). Đối với mẫu nghiền ướt, tiến hành

phân tán trong nước tinh khiết.

Hỗn dịch nano trước khi phun sấy và bột phun sấy chứa tiểu phân nano được

tiến hành xác định kích thước và phân bố kích thước bằng thiết bị đo thế zeta và xác

định phân bố KTTP Zetasizer Nano ZS90 Malvern. Nguyên tắc của thiết bị này dựa

trên mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau khi chiếu chùm tia laze vào các tiểu phân có

kích thước khác nhau. Dựa vào mức độ tán xạ của chùm tia sau khi va chạm vào

tiểu phân ta có thể tính được KTTP theo thuyết Mie.

Hỗn dịch nano hoặc bột phun sấy chứa tiểu phân nano được phân tán trong

nước tinh khiết đến nồng độ DC sao cho tốc độ đếm tiểu phân khoảng 150-250

kcps. Hệ số tán xạ ánh sáng của curcumin là 1,42. Ánh sáng tán xạ được đo ở góc 90o.

c. Phương pháp xác định thế zeta

Thế zeta được xác định gián tiếp thông qua linh độ điện di của tiểu phân nano

khi đặt trong điện trường. Tốc độ di chuyển của tiểu phân được xác định thông qua

việc so sánh sự sai khác về pha giữa ánh sáng tán xạ và ánh sáng từ nguồn laze nhờ

ứng dụng định luật Doppler. Hỗn dịch nano curcumin được pha loãng đến nồng độ

tương tự như mẫu đo KTTP trước khi đưa vào máy đo, sử dụng thiết bị Zetasizer

ZS90 Malvern với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng.

d. Đánh giá diện tích bề mặt và độ xốp, phổ nhiễu xạ tia X, giản đồ nhiệt vi sai và

phổ hồng ngoại

Tiến hành tương tự như đối với nguyên liệu curcumin nhưng thay curcumin

bằng bột phun sấy chứa nano curcumin (mục 2.3.2.1.c, d, e, f).

e. Mất khối lượng do làm khô

Mất khối lượng do làm khô được đánh giá bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 100oC, phụ lục 9.6, Dược điển Việt Nam IV [1]. Cân

khoảng 1 g bột phun sấy chứa nano curcumin và sử dụng cân xác định mất khối

lượng do làm khô. Công thức tính phần trăm mất khối lượng do làm khô:

đ đ

x 100% % mất khối lượng do làm khô =

Trong đó mbđ: khối lượng bột phun sấy trước khi đánh giá

ms : khối lượng bột phun sấy sau khi mất khối lượng do làm khô

f. Xác định khối lượng riêng biểu kiến

Xác định trên máy đo thể tích biểu kiến của hạt và bột Erweka SVM bằng

cách gõ 30 lần. Khối lượng bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng cho mỗi lần

đo là 5 g.

dbk =

Khối lượng riêng biểu kiến được tính theo công thức sau:

Trong đó dbk: khối lượng riêng biểu kiến của bột (g/ml).

m : khối lượng bột phun sấy trong ống đong (g) .

V: thể tích biểu kiến của bột sau khi gõ (ml).

g. Hiệu suất của quá trình bào chế

Hiệu suất được đánh giá bằng tỷ lệ giữa khối lượng curcumin tương ứng với

khối lượng sản phẩm thu được và khối lượng curcumin ban đầu:

H% = × 100%

Trong đó msp: khối lượng curcumin tương ứng có trong khối lượng sản phẩm (g)

mbđ: khối lượng curcumin ban đầu (g)

h. Phương pháp định lượng curcumin trong các mẫu nghiên cứu

Hàm lượng curcumin trong các mẫu nghiên cứu được định lượng bằng phương

pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis hoặc HPLC.

 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis

Cách tiến hành tương tự như mục 2.3.1.1 nhưng dung dịch thử được chuẩn bị

bằng cách thay curcumin chuẩn bằng một lượng bột phun sấy chứa nano curcumin

tương ứng với 10,0 mg curcumin. Hàm lượng curcumin trong bột phun sấy chứa

nano curcumin được tính toán theo công thức:

x 100% % CUR =

Trong đó DT, Dc: độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn.

mc : khối lượng curcumin chuẩn (mg)

m : khối lượng bột phun sấy chứa nano curcumin (mg)

Mỗi mẫu thử làm 3 lần lấy kết quả trung bình.

 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chuẩn bị dung môi pha loãng, dung dịch chuẩn, dung dịch thử và tiến hành

chạy sắc ký theo mục 2.3.1.2. Hàm lượng curcumin trong bột phun sấy chứa nano

curcumin được tính toán theo công thức:

x 100%

% CUR =

Trong đó St, Sc: diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAU.giây).

mc : khối lượng curcumin chuẩn (mg)

m : khối lượng bột phun sấy chứa nano curcumin (mg)

Hàm lượng curcumin cũng có thể được tính toán theo phương trình hồi quy

tuyến tính mô tả mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ curcumin xây dựng

theo phương pháp ở mục 2.3.1.2. Mỗi mẫu thử làm 3 lần lấy kết quả trung bình.

i. Phương pháp đánh giá độ tan và độ hòa tan của curcumin trong các mẫu nghiên

cứu

Tiến hành tương tự như đối với nguyên liệu curcumin nhưng thay bằng bột

phun sấy chứa nano curcumin với khối lượng tương ứng (mục 2.3.2.1.h, 2.3.2.1.i).

2.3.3.4. Phương pháp thiết kế thí nghiệm, đánh giá ảnh hưởng của thành phần

công thức, thông số quy trình và tối ưu hóa

 Bố trí thí nghiệm

Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 (Umetrics Inc., USA) để thiết kế thí nghiệm

cổ điển một cách ngẫu nhiên dựa trên nguyên tắc hợp tử tại tâm.

 Phân tích và tối ưu hóa

Ảnh hưởng của các biến đầu vào đến các biến đầu ra và công thức và một số

thông số tối ưu trong quy trình được xác định dựa trên mô hình mạng neuron nhân

tạo bằng phần mềm FormRules 2.0 và INForm 3.1 (Intelligensys Ltd., UK),.

 Chỉ số biểu hiện sự giống nhau f2 theo quy định của FDA

Khi so sánh giữa hai đồ thị hòa tan, giá trị f2 được tính như sau:

x 100 f = 50 xlg1 + (R − T) 1 n

Trong đó Ri: % DC hòa tan tại thời điểm i của mẫu đối chiếu (i = 1, 2, 3…n)

Ti: % DC hòa tan tại thời điểm i của mẫu so sánh (i = 1, 2, 3…n)

Hai đồ thị hòa tan được coi là tương tự nhau nếu f2 nằm trong khoảng 50-100.

Giá trị f2 càng lớn, hai đồ thị càng giống nhau [20].

2.3.3.5. Phương pháp phân tích thống kê

Các số liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

(GTTB ± SD). Sự khác nhau giữa hai nhóm được đánh giá bằng kiểm định t-test. Sự

khác nhau giữa các nhóm được đánh giá bằng phân tích ANOVA một chiều và phân

tích post-hoc (kiểm định LSD) sử dụng phần mềm thống kê SPSS (IBM SPSS

Statistics 20). Giá trị p < 0,05 được coi là có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.

2.3.4. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định

Việc khảo sát độ ổn định được thực hiện dựa theo quy định của ASEAN với

một số điều chỉnh [10]. Cụ thể như sau:

- Đối tượng thử: 3 mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin đạt tiêu chuẩn chất

lượng bán thành phẩm được đóng vào nang số 1 bằng cách cân thủ công, không

dùng tá dược độn, ép vỉ nhôm-nhôm và đựng trong hộp giấy. Hàm lượng curcumin

trong một nang khoảng 40 mg.

- Điều kiện bảo quản và thời điểm lấy mẫu kiểm tra:

Các mẫu viên nang được theo dõi trong các điều kiện ở bảng 2.7.

Bảng 2.7. Điều kiện bảo quản và thời điểm lấy mẫu trong nghiên cứu theo dõi độ ổn

định

Điều kiện bảo quản Nhiệt độ (oC) Độ ẩm tương đối (%) Thời điểm kiểm tra

Điều kiện thực 15-35 60-90 0, 3, 6, 9 tháng

Lão hóa cấp tốc 40 ± 2 75 ± 5 0, 3, 6 tháng

Sau từng khoảng thời gian nhất định, các mẫu bột phun sấy chứa nano

curcumin đóng trong nang được lấy ra và đánh giá một số chỉ tiêu: hình thái tiểu

phân, KTTPTB, PDI, nhiễu xạ tia X, hàm lượng curcumin so với ban đầu, mất khối

lượng do làm khô và độ hòa tan theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.3.

2.3.5. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo trên chuột thí nghiệm

Sinh khả dụng in vivo của hệ tiểu phân nano được tiến hành trên chuột nhắt.

Yêu cầu đối với chuột thí nghiệm được trình bày trong mục 2.1.3.

Chuẩn bị hỗn dịch quy ước curcumin và hỗn dịch nano chứa curcumin với

thành phần như ở bảng 2.8.

Bảng 2.8. Thành phần hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano chứa curcumin

Hỗn dịch quy ước Hỗn dịch nano

Curcumin 1 g 2,37 g

0,04 g

CMC Nước tinh khiết Bột phun sấy chứa nano CUR tương ứng với 1 g CUR CMC vđ 20 ml Nước tinh khiết 0,04 g vđ 20 ml

Đối với hỗn dịch curcumin, tiến hành nghiền đồng thời curcumin, CMC và

thêm dần 2 ml nước tạo hỗn dịch đặc. Phân tán bột nhão vào nước để tạo hỗn dịch

curcumin. Đối với hỗn dịch nano, tiến hành phân tán trực tiếp bột phun sấy chứa

tiểu phân nano vào dung dịch CMC 0,2%. Hỗn dịch được khuấy từ liên tục trong

suốt thời gian cho chuột uống thuốc.

Đối tượng thử là 156 chuột, chia thành hai nhóm, trong đó nhóm 1 (78 chuột)

uống hỗn dịch quy ước và nhóm 2 (78 chuột) uống hỗn dịch nano.

Chuột được cho uống thuốc bằng bơm tiêm có kim đầu tù với liều 500 mg

curcumin/kg chuột (10 ml hỗn dịch/kg chuột), thuốc được bơm thẳng vào dạ dày

chuột. Thể tích hỗn dịch cho uống được hiệu chỉnh theo khối lượng từng chuột. Mỗi

chuột chỉ lấy máu một lần tại một thời điểm và mỗi thời điểm lấy máu trên 6 chuột.

Đối với nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước, chuột được lấy máu tại các thời điểm

5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 120, 240 và 360 phút sau khi uống thuốc. Đối

với nhóm chuột uống hỗn dịch nano, chuột được lấy máu tại các thời điểm 5, 10,

15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 120, 240 và 420 phút sau khi uống thuốc. Máu được

lấy từ vùng tĩnh mạch hốc mắt chuột (khoảng 0,5 ml) và cho vào ống nghiệm chứa

10 l chất chống đông heparin. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, dùng pipet Pasteur tách huyết tương vào ống nhựa Eppendorf và bảo quản ở -30oC cho đến khi

phân tích.

Mẫu được xử lý và định lượng đồng thời curcumin và tetrahydrocurcumin

theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.1.3. Các thông số dược động học được tính toán

theo phương pháp không dựa trên mô hình ngăn, lấy mẫu “rải rác” (sparse

sampling), sử dụng phần mềm Phoenix WinNonLin 7.0 và dựa trên mô hình dược

động học quần thể một ngăn có chuyển hóa, sử dụng phần mềm Phoenix NLME

7.0. Sơ đồ minh họa mô hình một ngăn có chuyển hóa được thể hiện ở hình 2.3.

C

Kem Hình 2.3. Mô hình một ngăn có chuyển hóa

Chú thích:

Ngăn phân bố của chất gốc có nồng độ C, thể tích phân bố V và tổng lượng

thuốc phân bố A1; Ngăn phân bố của chất chuyển hóa có nồng độ Cm, thể tích phân

bố Vm và tổng lượng thuốc phân bố Am; Ka: hằng số tốc độ hấp thu của chất gốc;

Ke: hằng số tốc độ thải trừ của chất gốc; Km: hằng số tốc độ chuyển hóa từ chất gốc

sang chất chuyển hóa; Kem: hằng số tốc độ thải trừ của chất chuyển hóa.

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

Để có cơ sở cho việc nghiên cứu bào chế, đề tài đã tiến hành khảo sát và thẩm

định phương pháp định lượng curcumin bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-

Vis, HPLC và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời curcumin và

tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột bằng phương pháp LC-MS/MS.

3.1.1. Kết quả khảo sát phương pháp định lượng curcumin bằng quang phổ

hấp thụ UV-Vis

3.1.1.1. Phổ hấp thụ UV-Vis của curcumin

Quét phổ dung dịch curcumin chuẩn có nồng độ 5 g/ml trong dung môi nước

chứa 0,2% Tween 80 với khoảng bước sóng từ 200 đến 600 nm. Kết quả ở phụ lục

1.1 cho thấy curcumin trong dung dịch nước chứa 0,2% Tween 80 có một đỉnh hấp

thụ cực đại tại bước sóng 427 nm. Tại bước sóng này, độ hấp thụ của dung dịch

chứa Tween 80, PVP và manitol với tỷ lệ sử dụng trong công thức chỉ khoảng 0,004

± 0,001. Do đó, bước sóng 427 nm được lựa chọn để tiến hành xác định hàm lượng

curcumin trong các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis.

3.1.1.2. Tính tuyến tính

Chuẩn bị dãy dung dịch curcumin chuẩn theo phương pháp trình bày ở mục

2.3.1.1. Đo độ hấp thụ của các dung dịch trên ở bước sóng 427 nm. Kết quả được

trình bày ở phụ lục 1.1 và hình 3.1.

y = 0.131x - 0.029 R² = 0.999

ụ h t p ấ h ộ Đ

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

Nồng độ curcumin (g/ml)

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ curcumin

Kết quả trên cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ

curcumin trong khoảng nồng độ đã khảo sát với hệ số tương quan r ≈ 1. Như vậy,

trong trường hợp nhằm định lượng curcumin trong nguyên liệu, trong chế phẩm bào

chế hoặc xác định độ hòa tan, có thể sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-

Vis.

3.1.2. Kết quả khảo sát thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

So với phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis, HPLC là phương pháp có độ

tin cậy, phát hiện được chính xác nồng độ DC và các pic tạp chất (nếu có). Để đảm

bảo phương pháp định lượng chính xác trong khoảng giới hạn nồng độ DC được

khảo sát, quy trình thẩm định phương pháp được tiến hành dựa theo các chỉ tiêu cơ

bản sau:

3.1.2.1. Độ thích hợp

Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 5 g/ml và tiến hành đánh giá độ thích

hợp theo phương pháp ghi ở mục 2.3.1.2. Kết quả xác định diện tích pic, thời gian

lưu và hệ số bất đối xứng được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống HPLC

STT Hệ số bất đối xứng

1,16 1,17 1,17 1,16 1,16 1,15

1 2 3 4 5 6 TB RSD (%) Thời gian lưu tR (phút) 6,268 6,266 6,263 6,265 6,266 6,270 6,266 0,038 Diện tích pic (mAU.giây) 474,3 474,4 478,8 475,4 473,4 474,1 475,1 0,4

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy: độ lệch chuẩn tương đối của các giá trị thời gian

lưu nhỏ hơn 1% và diện tích pic nhỏ hơn 2%. Các giá trị hệ số bất đối xứng nằm

trong khoảng từ 0,8 đến 1,5. Số đĩa lý thuyết trung bình khoảng 9635. Như vậy,

chương trình sắc ký đã chọn phù hợp để định lượng curcumin trong các mẫu nghiên

cứu.

3.1.2.2. Tính chọn lọc-độ đặc hiệu

Chuẩn bị mẫu trắng, mẫu curcumin chuẩn (5 µg/ml), mẫu thử chứa nano

curcumin như mục 2.3.1.2. Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương

trình đã lựa chọn. Kết quả sắc ký đồ được thể hiện ở phụ lục 1.2 cho thấy: trong

khoảng thời gian 9 phút, trên sắc ký đồ của mẫu dung dịch curcumin chuẩn và mẫu

thử chứa nano curcumin đều có một pic có thời gian lưu 6,27 phút. Trên sắc ký đồ

của mẫu trắng không xuất hiện pic lạ tại thời điểm trùng với thời gian lưu của

curcumin (6,27 phút). Điều đó chứng tỏ pic trên sắc kí đồ là của curcumin, phương

pháp định lượng có độ đặc hiệu cao.

3.1.2.3. Khoảng tuyến tính

Xác định mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ curcumin trong mẫu,

1600

1400

kết quả được thể hiện ở phụ lục 1.2 và biểu diễn ở hình 3.2.

y = 88.41x + 33.78 R² = 0.998

) y â i g .

1200

1000

U A m

800

600

400

200

( c i p h c í t n ệ i D

Nồng độ curcumin (µg/ml)

Hình 3.2. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

curcumin

Kết quả ở hình 3.2 cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng

độ dung dịch chuẩn trong khoảng nồng độ đã khảo sát với hệ số tương quan r =

0,9989.

3.1.2.4. Độ đúng

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và thử chứa nano curcumin như trong mục

2.3.1.2. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp HPLC định lượng curcumin

được trình bày trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp HPLC định lượng curcumin

% chuẩn thêm vào Diện tích pic (mAU.giây) % tìm lại Nồng độ tìm lại (g/ml) Nồng độ thử (µg/ml) Nồng độ chuẩn thêm vào (g/ml)

5 5 0 10 20 30 4,9 4,9 5,1

98,6 98,9 101,9 99,8 1,9 98,4 100,8 10 10 0 10 20 30 240,7 262,5 284,4 308,3 TB RSD (%) 478,3 521,8 567,4 612,8 9,8 10,1 10,1

101,4 100,2 TB RSD (%)

15 15 0 10 20 30 15,0 14,9 15,3

719,7 786,1 851,5 922,2 TB RSD (%) 1,6 100,1 99,4 101,8 100,4 1,2

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: các mẫu đều có phần trăm tìm lại nằm trong

khoảng từ 98,0% đến 102,0%, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao, đảm bảo

phép phân tích tốt khi xác định hàm lượng curcumin trong chế phẩm.

3.1.2.5. Độ chính xác

Pha 6 mẫu dung dịch thử chứa nano curcumin có nồng độ 5 µg/ml. Kết quả

đánh giá độ chính xác theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.1.2. được thể hiện ở

bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp

Độ đúng (%) STT

Khối lượng mẫu thử 0,0240 0,0246 0,0251 0,0239 0,0243 0,0237 Diện tích pic (mAU.giây) 494,1 513,6 520,7 498,9 515,5 502,4

Hàm lượng CUR (%) 41,4 42,0 41,7 41,9 42,6 42,6 42,0 1,1 98,1 99,5 98,8 99,5 101,1 101,0 99,7 1,2 1 2 3 4 5 6 TB RSD (%)

Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy: mẫu thử có hàm lượng trung bình 42,0%, độ

chính xác của các dung dịch nằm trong khoảng 98,1-101,1% với độ lệch chuẩn

tương đối nhỏ hơn 2%. Phương pháp có độ chính xác đạt yêu cầu.

Như vậy, phương pháp HPLC đạt yêu cầu về thẩm định và có thể sử dụng

trong phân tích hàm lượng curcumin và nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm chứa

curcumin.

3.1.3. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng đồng thời curcumin và chất

chuyển hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột

Curcumin sau khi hấp thu theo đường uống sẽ bị chuyển hóa mạnh qua gan

tạo thành một số sản phẩm chuyển hóa trong đó có tetrahydrocurcumin. Vì vậy,

phương pháp được lựa chọn phải định lượng đồng thời được cả CUR và THC trong

huyết tương với độ nhạy tốt. Phương pháp được lựa chọn là LC-MS/MS.

3.1.3.1. Tính thích hợp của hệ thống

Tiến hành chạy sắc ký lặp lại 6 lần mẫu huyết tương chứa CUR và THC với

cùng nồng độ 250 ng/ml sau khi xử lý, xác định các thông số đặc trưng của mỗi pic

và tỷ lệ diện tích giữa các pic DC so với pic chuẩn nội. Kết quả đánh giá tính thích

hợp của hệ thống sắc ký được trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống LC-MS/MS (n = 6)

CUR THC IS Tỷ lệ diện tích

Diện Diện Diện STT CUR/IS THC/IS tR (phút) tích tR (phút) tích tR (phút) tích

1 1,27 315470 1,17 115018 1,48 10527 29,967 10,926

2 1,27 317634 1,17 116720 1,48 10955 28,993 10,654

3 1,27 315451 1,17 114300 1,48 10782 29,258 10,601

4 1,27 322428 1,17 116559 1,48 11147 28,924 10,456

5 1,27 317889 1,17 114400 1,48 11095 28,651 10,311

6 1,27 311557 1,17 112329 1,48 11119 28,021 10,103

TB 1,27 316738 1,17 114888 1,48 10938 28,969 10,509

RSD 0,0 1,1 0,0 1,4 0,0 2,2 2,2 2,7 (%)

Thời gian lưu (tR) của các pic CUR và THC và giá trị tỷ lệ diện tích giữa các

pic CUR và THC với chuẩn nội đều có độ lặp lại tốt (RSD < 5%), chứng tỏ hệ

thống LC-MS/MS ổn định và phù hợp để định lượng đồng thời CUR và THC trong

huyết tương.

3.1.3.2. Tính đặc hiệu-chọn lọc

Chuẩn bị 6 mẫu huyết tương trắng và 6 mẫu chứa hỗn hợp CUR 0,5 ng/ml và

THC 0,5 ng/ml trong huyết tương có chứa chuẩn nội glibenclamid (mẫu LLOQ), xử

lý theo quy trình ghi ở mục 2.3.1.3 và tiến hành định lượng bằng phương pháp LC-

MS/MS. Kết quả được trình bày ở đồ thị phụ lục 1.3 và bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả đánh giá tính đặc hiệu-chọn lọc của phương pháp LC-MS/MS (n

= 6)

Đáp ứng pic mẫu Tỷ lệ đáp ứng pic Đáp ứng pic mẫu trắng S LLOQ LLOQ/mẫu trắng T tại tR của tại tR của tại tR CUR THC IS CUR THC IS T CUR THC của IS

1 115 0 24 723 147 38143 6,3 1589,3 -

2 30 0 9 678 168 37470 22,6 4163,3 -

3 14 0 14 641 159 34270 45,8 2447,9 -

4 31 0 7 736 158 40497 23,7 5785,3 -

5 9 0 15 595 116 34960 66,1 2330,7 -

6 24 0 1 652 - 173 33823 27,2 33823,0

Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng ở phụ lục 1.3, các sắc ký đồ tổng các

ion, sắc ký đồ chọn lọc ion CUR (m/z 369,03176,98), sắc ký đồ chọn lọc ion

THC (m/z 373,05 136,96) và sắc ký đồ chọn lọc ion glibenclamid (m/z 494,2

369,12) đều không xuất hiện pic. Sắc ký đồ chọn lọc ion CUR (m/z 369,03

176,98), sắc ký đồ chọn lọc ion THC (m/z 373,05 136,96) của mẫu huyết

tương trắng thêm chuẩn CUR, THC nồng độ 0,5 ng/ml và chuẩn nội glibenclamid

xuất hiện các pic có thời gian lưu lần lượt là 1,27, 1,17 và 1,48 phút tương ứng với

CUR, THC và glibenclamid (GBC).

Kết quả phân tích ở bảng 3.5 cũng cho thấy: tín hiệu đo của mẫu chứa CUR và

THC ở nồng độ 0,5 ng/ml cao hơn 5 lần tín hiệu đo của mẫu trắng tại thời điểm

trùng với thời gian lưu của CUR và THC (tương ứng 1,27 và 1,18 phút). Tín hiệu

đo của chuẩn nội cao hơn 20 lần tín hiệu đo của mẫu trắng tại thời điểm trùng với

thời gian lưu của chuẩn nội (1,48 phút). Như vậy, phương pháp định lượng lựa chọn

có tính đặc hiệu, chọn lọc đối với CUR và THC.

3.1.3.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa giá trị tỷ lệ diện tích pic

CUR/IS (y1) với nồng độ CUR (x1) và giá trị tỷ lệ diện tích pic THC/IS (y2) với

nồng độ THC (x2) trong huyết tương chuột bằng phương pháp hồi quy tuyến tính, sử dụng hệ số tỷ trọng (1/nồng độ2). Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 và bảng 3.7.

Bảng 3.6. Tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic CUR/IS và nồng độ CUR trong huyết

tương (n = 8)

Đường chuẩn 1 Đường chuẩn 2 Đường chuẩn 3 Nồng

Tỷ lệ Độ đúng Tỷ lệ Độ đúng Tỷ lệ Độ đúng STT độ

CUR/IS CUR/IS CUR/IS (%) (%) (%) (ng/ml)

0,5 0,083 98,7 0,091 95,5 0,035 98,4 1

2,6 0,326 108,8 0,444 116,2 0,148 104,5 2

5,1 0,548 95,0 0,843 113,0 0,291 105,5 3

51,0 5,706 103,9 7,568 103,8 3,180 118,5 4

102,1 11,211 102,3 14,928 102,5 5,184 96,7 5

204,1 22,771 104,0 27,090 93,1 10,148 94,7 6

357,2 36,849 96,3 44,624 87,6 16,999 90,7 7

510,4 49,756 91,0 64,228 88,3 24,372 91,0 8

a = 0,1071 a = 0,1425 a = 0,0525 Phương trình

b = 0,0286 b = 0,0213 b = 0,0082 hồi quy

r = 0,9981 r = 0,9937 r = 0,9953 (y1 = ax1 + b)

Bảng 3.7. Tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic THC/IS và nồng độ THC trong huyết

tương (n = 8)

Đường chuẩn 1 Đường chuẩn 2 Đường chuẩn 3 Nồng

Tỷ lệ Độ đúng Tỷ lệ Độ đúng Tỷ lệ Độ đúng STT độ

(ng/ml) THC/IS THC/IS (%) THC/IS (%) (%)

0,5 0,016 1 97,8 0,017 100,6 0,008 100,8

2,5 0,078 2 114,4 0,064 98,0 0,031 93,2

4,9 0,125 3 93,3 0,121 96,8 0,069 104,3

49,4 1,309 4 100,5 1,289 106,9 0,761 117,8

98,8 2,491 5 95,7 2,447 101,7 1,230 95,2

197,6 5,424 6 104,3 4,574 95,2 2,434 94,2

345,8 9,139 7 100,5 7,962 94,7 4,330 95,8

8 6,367 98,7 494,0 12,161 93,6 12,723 106,0

a = 0,0263 a = 0,0243 a = 0,0131 Phương trình

b = 0,0037 b = 0,0053 b = 0,0014 hồi quy

r = 0,9974 r = 0,9988 r = 0,9964 (y2 = ax2 + b)

Kết quả thẩm định cho thấy: trong khoảng nồng độ từ 0,5 đến 500 ng/ml có sự

tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic CUR/IS với nồng độ CUR, sự tương

quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic THC/IS với nồng độ THC (r > 0,990) và đáp

ứng yêu cầu của đường chuẩn trong phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh

học: trên 75% số điểm của đường chuẩn có độ đúng nằm trong khoảng 85-115%,

nồng độ thấp nhất có độ đúng nằm trong khoảng 80-120%.

3.1.3.4. Giới hạn định lượng dưới

Chuẩn bị 6 mẫu huyết tương chứa CUR và THC với cùng nồng độ khoảng 0,5

ng/ml (mẫu LLOQ). Xác định nồng độ CUR và THC có trong các mẫu bằng

phương trình hồi quy của đường chuẩn tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Kết

quả xác định giới hạn LLOQ của phương pháp được trình bày ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả xác định giá trị giới hạn định lượng dưới LLOQ của phương

pháp LC-MS/MS định lượng curcumin và tetrahydrocurcumin trong huyết tương (n

= 6)

Giá trị S/N Tỷ lệ diện tích pic Nồng độ (ng/ml) Độ đúng (%) của pic STT

CUR/IS THC/IS CUR THC CUR THC CUR THC

1 0,019 0,004 0,6 0,5 116,8 99,9 >10 >10

2 0,018 0,004 0,6 0,6 111,1 117,1 >10 >10

3 0,019 0,005 0,6 0,6 115,1 121,3 >10 >10

4 0,018 0,004 0,6 0,5 111,7 101,2 >10 >10

5 0,017 0,003 0,6 0,4 104,1 85,3 >10 >10

6 0,019 0,005 0,6 0,7 118,9 134,3 >10 >10

TB (%) 113,0 109,8

RSD (%) 4,6 16,1

Kết quả thẩm định cho thấy: giá trị S/N của các pic CUR và THC trong các

mẫu LLOQ (nồng độ 0,5 ng/ml) đều lớn hơn 10. Độ đúng của các mẫu LLOQ có

giá trị trung bình nằm trong khoảng 80-120% với RSD nhỏ hơn 20%. Theo quy

định của US-FDA, nồng độ CUR 0,5 ng/ml và THC 0,5 ng/ml đáp ứng yêu cầu giới

hạn định lượng dưới của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

3.1.3.5. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Phân tích LC-MS/MS các lô mẫu huyết tương LLOQ, LQC, SQC, MQC và

HQC chứa CUR với nồng độ tương ứng 0,5; 1,6; 31,8; 264,6 và 423,4 ng/ml và

THC với nồng độ tương ứng 0,5; 1,5; 29,9; 249,4 và 399,0 ng/ml. Mỗi ngày, tại mỗi

mức nồng độ phân tích LC-MS/MS tối thiểu 6 mẫu. Xác định hàm lượng CUR và

THC có trong mẫu dựa vào đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Xác định

độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh nồng độ định lượng được với nồng độ

thực có trong mẫu. Xác định độ chính xác bằng cách tính toán RSD% giữa giá trị các

lần định lượng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.9 và 3.10.

Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày (n = 6) và khác

ngày (n = 18) về nồng độ curcumin của phương pháp định lượng

LLOQ LQC SQC MQC HQC

Ngày

Ngày thứ nhất

TB RSD

Ngày thứ hai

TB RSD

Ngày thứ 3

TB RSD Nồng độ (ng/ml) 1,8 1,7 1,7 1,6 1,6 1,8 1,7 4,9 1,6 1,7 1,5 1,3 1,5 1,4 1,5 8,2 1,3 1,3 1,4 1,4 1,4 1,5 1,4 7,0 Nồng độ (ng/ml) 30,2 33,6 34,6 36,2 34,7 37,0 34,4 7,0 26,7 30,3 27,8 30,3 26,6 31,9 28,9 7,6 27,6 33,5 27,0 34,1 27,0 33,2 30,4 11,7 Nồng độ (ng/ml) 287,8 283,7 307,7 284,6 288,8 281,1 289,0 3,3 267,5 265,4 260,9 256,2 263,8 263,4 262,9 1,5 276,5 278,0 297,8 282,5 287,8 281,7 282,4 1,7 Nồng độ (ng/ml) 403,3 430,6 443,0 440,7 455,6 475,7 441,5 5,5 362,5 367,5 366,5 364,5 366,6 367,3 365,8 0,5 394,0 411,1 386,8 406,6 389,5 409,3 399,6 2,7

Độ đúng (%) 116,9 110,2 119,4 106,3 110,8 112,0 112,6 4,3 113,4 100,5 84,6 103,3 88,3 97,1 97,9 10,7 112,7 92,6 84,6 86,2 100,3 96,6 95,5 10,8 102,0 Độ đúng (%) 114,0 105,6 105,0 102,9 101,1 112,7 106,9 4,9 106,4 113,2 101,3 88,3 102,7 98,1 101,7 8,2 81,3 82,8 90,0 89,4 92,2 98,1 88,9 7,0 99,2 Độ đúng (%) 95,0 105,8 108,9 114,1 109,1 116,6 108,2 7,0 90,5 102,6 94,4 102,7 90,1 108,2 98,1 7,6 88,4 107,5 86,5 109,4 86,6 106,5 97,5 11,7 101,3 Độ đúng (%) 108,7 107,2 116,3 107,6 109,1 106,2 109,2 3,3 108,9 108,0 106,2 104,3 107,3 107,2 107,0 1,5 106,4 106,9 110,7 108,7 110,7 108,4 108,6 1,7 108,3 Độ đúng (%) 95,2 101,7 104,6 104,1 107,6 112,3 104,3 5,5 92,2 93,5 93,2 92,7 93,2 93,4 93,0 0,5 94,7 98,8 93,0 97,8 93,7 98,4 96,1 2,7 97,8

11,2 10,1 9,7 2,4 6,1 Nồng độ (ng/ml) 0,6 0,6 0,6 0,5 0,6 0,6 0,6 4,3 0,6 0,5 0,4 0,5 0,5 0,5 0,5 10,7 0,6 0,5 0,4 0,4 0,5 0,5 0,5 10,8 TB 3 ngày RSD 3 ngày (%)

Bảng 3.10. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày (n = 6) và khác

ngày (n = 18) về nồng độ tetrahydrocurcumin của phương pháp định lượng

LLOQ LQC SQC MQC HQC

Ngày

Ngày thứ nhất

TB RSD

Ngày thứ hai

TB RSD

Ngày thứ ba

TB RSD Nồng độ (ng/ml) 1,3 1,5 1,3 1,3 1,4 1,4 1,4 5,3 1,3 1,6 1,4 1,3 1,4 1,7 1,5 11,8 1,7 1,6 1,3 1,5 1,2 1,5 1,5 13,5 Nồng độ (ng/ml) 26,1 30,2 27,0 29,7 27,9 32,8 28,9 8,4 26,3 34,6 27,3 34,1 27,0 34,3 30,6 13,5 26,5 33,8 27,3 34,0 27,5 32,5 30,3 11,6 Nồng độ (ng/ml) 271,6 281,6 283,6 262,2 288,3 263,3 275,1 4,0 289,8 295,8 286,7 294,6 271,1 293,1 288,5 3,2 283,4 277,2 284,3 250,6 270,1 270,9 272,8 4,5 Nồng độ (ng/ml) 362,7 363,5 377,6 361,0 385,6 408,8 376,5 4,9 403,8 392,3 408,5 388,6 421,2 405,2 403,3 2,9 390,9 408,8 393,3 406,1 388,8 413,3 400,2 2,6

Độ đúng (%) 100,2 85,9 80,6 110,9 111,4 104,1 98,9 13,0 97,6 87,4 87,8 103,5 83,0 91,2 91,7 8,2 121,4 86,8 82,9 87,3 87,7 87,4 92,3 15,6 94,3 Độ đúng (%) 89,2 98,9 85,6 87,9 94,5 91,8 91,3 5,3 86,8 103,6 92,0 82,5 87,7 111,0 94,0 11,8 110,3 102,8 81,4 97,4 77,3 99,6 94,8 13,5 93,4 Độ đúng (%) 87,4 101,0 90,1 99,2 93,3 109,5 96,7 8,4 84,5 111,4 88,0 109,9 86,9 110,5 98,5 13,5 86,1 109,8 88,6 110,5 89,5 105,6 98,3 11,6 97,9 Độ đúng (%) 108,9 112,9 113,7 105,1 115,6 105,6 110,3 4,0 112,0 114,2 110,7 113,8 104,7 113,2 111,5 3,2 110,5 108,1 110,8 97,7 105,3 105,6 106,3 4,5 109,4 Độ đúng (%) 90,9 91,1 94,6 90,5 96,7 102,4 94,4 4,9 97,5 94,7 98,6 93,8 101,7 97,8 97,4 2,9 95,2 99,6 95,8 99,0 94,7 100,7 97,5 2,6 96,4

12,4 10,4 10,7 4,2 3,7 Nồng độ (ng/ml) 0,5 0,4 0,4 0,5 0,6 0,5 0,5 13,0 0,5 0,4 0,4 0,5 0,4 0,5 0,5 8,2 0,6 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,5 15,6 TB 3 ngày RSD 3 ngày (%)

Kết quả thẩm định cho thấy: ở cả 5 khoảng nồng độ LLOQ, LQC, SQC, MQC

và HQC, phương pháp có giá trị trung bình của độ đúng trong ngày (ngày 1, n = 6)

và khác ngày (3 ngày, n = 18) nằm trong khoảng 85-115%, (trừ nồng độ LLOQ độ

đúng cho phép từ 80 đến 120%) với giá trị RSD nhỏ hơn 15%. Như vậy, phương

pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

theo hướng dẫn của FDA-Mỹ.

3.1.3.6. Tỷ lệ thu hồi

Phân tích các lô mẫu LQC, SQC, MQC, HQC và các mẫu chuẩn pha trong pha

động có nồng độ tương ứng trong cùng điều kiện. Xác định tỷ lệ thu hồi CUR, THC

và chuẩn nội. Kết quả được trình bày ở bảng 3.11 và 3.12.

Bảng 3.11. Độ thu hồi curcumin và tetrahydrocurcumin của phương pháp định

lượng (n = 6)

Mẫu SQC Mẫu MQC Mẫu HQC

STT Mẫu LQC Pha động Huyết tương Huyết tương Pha động Huyết tương Pha động Huyết tương

Pha động Diện tích pic CUR

224588 252856 241621 266655 224580 261567 245311 7,4 325824 320011 321531 309523 307081 308823 315466 2,5 354424 341739 325090 361581 323743 337660 340706 4,5 429268 418010 405323 400220 406409 397715 400000 3,0 965 1237 1126 1196 1168 1282 1162 9,5 1578 1481 1477 1447 1580 1323 1481 6,4 25318 25989 25030 26395 25713 27988 26072 4,0 36577 35365 36224 36239 35490 35383 36000 1,5

94,2 86,9 93,3 102,2

Diện tích pic THC

57306 62782 59431 58908 52488 62641 58926 6,5 102369 102436 100818 99127 97899 99575 100371 1,8 87546 84628 82282 89935 80452 84876 84953 4,0 128145 125678 122800 123433 121420 117968 123241 2,8 304 359 244 308 236 310 294 15,7 510 504 523 466 501 477 497 4,3 6048 6513 6290 6538 6518 6814 6454 4,0 11241 10920 10295 10586 9841 10627 10585 4,6

70,9 73,2 70,5 82,7 1 2 3 4 5 6 TB RSD Độ thu hồi* 1 2 3 4 5 6 TB RSD Độ thu hồi*

(*): Giá trị đã được hiệu chỉnh theo hệ số pha loãng

Bảng 3.12. Độ thu hồi chuẩn nội glibenclamid của phương pháp (n = 6)

STT

Diện tích pic glibenclamid trong các mẫu MQC Mẫu huyết tương 15474 17333 15998 17988 14870 17695 16560 7,8 Mẫu pha động 60402 60617 61140 60920 59670 60270 60503 0,9

1 2 3 4 5 6 TB RSD (%) Độ thu hồi* 32,8

(*): Giá trị đã được hiệu chỉnh theo hệ số pha loãng

Kết quả thẩm định cho thấy: ở cả bốn khoảng nồng độ LQC, SQC, MQC và

HQC phương pháp đều cho tỷ lệ thu hồi CUR trên 85,0% và tỷ lệ thu hồi THC trên

70,0%. Tỷ lệ thu hồi chuẩn nội trên 30,0%. Giá trị RSD giữa các đáp ứng của mẫu

có qua chiết tách và không qua chiết tách ở mỗi nồng độ nhỏ hơn 15%. Như vậy,

quy trình chiết đạt phần trăm tìm lại cao và ổn định, có thể áp dụng được vào thực

nghiệm.

3.1.3.7. Ảnh hưởng của nhiễm chéo

Tiến hành xử lý các mẫu ULOQ, LLOQ và mẫu trắng và chạy sắc ký theo

trình tự mô tả ở mục 2.3.1.3. Tỷ lệ tín hiệu đo mẫu LLOQ/mẫu trắng của CUR,

THC và chuẩn nội được trình bày ở bảng 3.13.

Bảng 3.13. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiễm chéo trong phương pháp LC-

MS/MS định lượng curcumin và tetrahydrocurcumin trong huyết tương (n = 6)

Tỷ lệ đáp ứng pic LLOQ/mẫu trắng STT CUR THC IS

1 - - 4565,9

2 - - 1106,9

3 - - 745,5

4 35,3 10,2 4565,9

5 47,9 51,2 1141,5

6 47,9 30,7 1461,1

(-): đáp ứng pic mẫu trắng bằng 0

Đáp ứng pic CUR, THC ở nồng độ LLOQ cao hơn gấp 5 lần so với đáp ứng

mẫu trắng tại cùng thời điểm trùng với thời gian lưu của CUR và THC. Đáp ứng pic

chuẩn nội cao gấp hơn 20 lần so với đáp ứng mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời

gian lưu của glibenclamid. Điều đó chứng tỏ phương pháp định lượng CUR và THC

đạt yêu cầu về nhiễm chéo.

3.1.3.8. Ảnh hưởng của nền mẫu

Phân tích các mẫu chuẩn CUR và THC pha trong dịch chiết nền mẫu và pha

trong pha động. Xác định giá trị MFCUR, MFTHC, MFIS và tỷ số MFCUR/MFIS,

MFTHC/MFIS. Kết quả được trình bày ở bảng 3.14.

Bảng 3.14. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu trong phương pháp định

lượng curcumin và tetrahydrocurcumin trong huyết tương (n = 6)

MFCUR MFTHC MFIS MFCUR/MFIS MFTHC/MFIS STT LQC HQC LQC HQC LQC HQC LQC HQC LQC HQC

1,28 1,04 1,04 0,96 2,16 1,75 0,59 0,59 0,48 0,55 1

1,30 1,07 1,27 0,98 2,07 1,83 0,63 0,59 0,61 0,53 2

1,28 1,11 1,28 1,02 2,00 1,84 0,64 0,60 0,64 0,55 3

1,33 1,11 1,12 1,02 1,78 1,87 0,75 0,59 0,63 0,55 4

1,30 1,15 1,27 1,06 2,00 1,90 0,65 0,61 0,63 0,56 5

1,27 1,15 1,15 1,08 1,82 2,00 0,70 0,57 0,63 0,54 6

TB 1,29 1,10 1,19 1,02 1,97 1,86 0,66 0,59 0,60 0,55

RSD 1,8 4,0 8,5 4,5 7,4 4,3 8,6 2,0 10,1 1,7 (%)

Kết quả thực nghiệm cho thấy: tỷ số MFCUR/MFIS và MFTHC/MFIS ở cả hai

mức nồng độ thấp và cao có giá trị RSD trong khoảng từ 1,7 đến 10,1% (nhỏ hơn

15%), chứng tỏ quá trình xử lý mẫu phù hợp, nền mẫu không ảnh hưởng đến kết

quả phân tích CUR và THC trong huyết tương.

3.1.3.9. Độ ổn định của curcumin và tetrahydrocurcumin trong quá trình xử lý

mẫu

Độ ổn định của DC trong các mẫu huyết tương được theo dõi trong quá trình

xử lý, phân tích và bảo quản mẫu.

 Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc

Độ ổn định của dung dịch CUR nồng độ khoảng 100 g/ml và THC nồng độ

khoảng 200 g/ml trong thời gian 4 giờ ở điều kiện phòng thí nghiệm và sau 13 ngày ở nhiệt độ 2-8oC được thể hiện ở bảng 3.15.

Bảng 3.15. Kết quả đánh giá độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc (n = 3)

Nồng độ dung dịch chuẩn (g/ml) THC CUR STT Ban Sau 4 giờ Sau 4 giờ

1 2 3 TB RSD (%) Độ lệch (%) đầu 97,0 99,0 98,7 98,3 1,1 Sau 13 ngày 101,5 99,7 101,8 101,0 1,1 2,8 Ban đầu 202,7 207,3 207,0 205,7 1,3 97,9 100,5 99,4 99,3 1,3 1,0 201,2 217,6 215,2 211,3 4,2 2,8 Sau 13 ngày 202,4 206,4 212,5 207,1 2,4 0,7

Độ lệch giữa nồng độ dung dịch CUR và THC chuẩn sau khi để ở nhiệt độ phòng sau 4 giờ và ở nhiệt độ 2-8oC trong 13 ngày so với nồng độ dung dịch lúc

mới pha nhỏ hơn 5%. Như vậy, dung dịch CUR và THC chuẩn ổn định trong thời

gian ngắn ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và ổn định trong thời gian dài 13 ngày ở nhiệt độ 2-8oC.

 Độ ổn định trong thời gian ngắn của dung dịch chuẩn nội làm việc

Dung dịch chuẩn nội làm việc được theo dõi độ ổn định trong 4 giờ ở nhiệt độ

phòng, kết quả trình bày ở bảng 3.16.

Bảng 3.16. Độ ổn định của dung dịch chuẩn nội làm việc trong 4 giờ (n = 3)

Diện tích pic STT

Sau 4 giờ 80522 80443 80905 80623 0,3 Ban đầu 76717 78915 79006 78213 1,7

3,1 1 2 3 TB RSD (%) Độ lệch (%) Độ lệch giữa nồng độ dung dịch chuẩn nội làm việc sau khi để ở nhiệt độ

phòng sau 4 giờ so với nồng độ dung dịch lúc mới pha nhỏ hơn 5%. Như vậy, dung

dịch chuẩn nội làm việc ổn định trong thời gian ngắn.

 Độ ổn định của mẫu huyết tương trong quá trình xử lý mẫu

Bảo quản mẫu huyết tương ở hai nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ phòng,

phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau 4 giờ. So sánh nồng độ của mẫu huyết

tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu. Kết quả được

trình bày ở bảng 3.17.

Bảng 3.17. Độ ổn định của curcumin và tetrahydrocurcumin trong mẫu huyết tương

ở nhiệt độ phòng sau 4 giờ (n = 6)

Nồng độ mẫu LQC (ng/ml) Nồng độ mẫu HQC (ng/ml)

CUR THC CUR THC Mẫu

Ban đầu 1,7 1,5 1,4 1,5 1,5 1,5 1,5 6,0 4 giờ Ban đầu 1,4 1,2 1,6 1,2 1,4 1,6 1,4 11,1 1,6 2,0 1,5 1,6 1,6 1,8 1,7 11,5 4 giờ Ban đầu 1,6 1,7 1,6 1,5 1,8 1,5 1,6 6,1 397,7 395,5 371,9 397,6 378,9 399,4 387,2 3,0 4 giờ Ban đầu 4 giờ 428,3 377,5 375,9 413,8 375,2 371,1 397,8 372,3 351,5 432,0 378,7 376,2 397,7 375,9 383,5 400,2 404,7 368,5 411,6 380,7 371,1 3,8 3,1 2,9

-7,5 -4,4 -4,2 8,1 1 2 3 4 5 6 TB RSD (%) Độ lệch (%)

Kết quả trình bày ở bảng 3.17 cho thấy: nồng độ của mẫu sau khi bảo quản 4

giờ ở nhiệt độ phòng có độ lệch so với mẫu được xử lý ngay không quá 15% và giá

trị RSD% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ đều nhỏ hơn 15%. Như vậy,

CUR và THC trong mẫu huyết tương ổn định ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ.

 Độ ổn định trong buồng tiêm mẫu

So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC bảo quản trong buồng tiêm mẫu sau 26 giờ ở nhiệt độ 20oC với nồng độ của mẫu tiêm ngay sau xử lý. Kết quả

đánh giá độ ổn định trong buồng tiêm mẫu được trình bày ở bảng 3.18 cho thấy:

nồng độ mẫu tiêm lại sau 26 giờ có độ lệch so với nồng độ mẫu tiêm ngay sau xử lý

không quá 15% và giá trị RSD% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ đều

nhỏ hơn 15%. Như vậy, mẫu CUR và THC sau xử lý từ huyết tương được coi là ổn định trong 26 giờ khi bảo quản ở 20oC.

Bảng 3.18. Độ ổn định của mẫu sau xử lý bảo quản trong buồng tiêm mẫu trong 26

giờ (n = 6)

Nồng độ mẫu HQC (ng/ml) Nồng độ mẫu LQC (ng/ml) THC CUR CUR THC Mẫu

Tiêm ngay 1,3 1,3 1,4 1,4 1,4 1,5 1,4 7,0 Sau 26 giờ 1,5 1,6 1,4 1,4 1,4 1,4 1,5 6,6 Tiêm ngay 1,7 1,6 1,3 1,5 1,2 1,5 1,5 13,5 Sau 26 giờ 1,6 1,4 1,5 1,7 1,3 1,7 1,5 9,9 Tiêm ngay 394,0 411,1 386,8 406,6 389,5 409,3 399,6 2,7 Sau 26 giờ 354,4 368,1 352,0 372,3 353,5 376,0 362,7 2,9 Tiêm ngay 390,9 408,8 393,3 406,1 388,8 413,3 400,2 2,6 Sau 26 giờ 386,0 379,0 393,7 389,5 394,0 397,5 389,9 1,7

5,0 4,1 -9,2 -2,6 1 2 3 4 5 6 TB RSD (%) Độ lệch (%)

 Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông-rã

Khảo sát độ ổn định sau ba chu kỳ đông-rã thực hiện trên hai nồng độ LQC và

HQC. So sánh với nồng độ CUR và THC có trong mẫu tiến hành phân tích ngay sau

khi pha. Kết quả được trình bày ở bảng 3.19.

Bảng 3.19. Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông-rã (n = 6)

Nồng độ mẫu LQC (ng/ml) Nồng độ mẫu HQC (ng/ml)

CUR THC CUR THC Mẫu

Ban đầu Sau đông-rã Ban đầu Sau đông-rã Ban đầu Sau đông-rã Ban đầu Sau đông-rã

1,7 1,5 1,4 1,5 1,5 1,5 1,5 6,0 1,4 1,6 1,6 1,6 1,3 1,4 1,5 9,5 1,6 2,0 1,5 1,6 1,6 1,8 1,7 11,5 1,5 1,5 1,7 1,5 1,5 1,4 1,5 6,3 379,7 395,5 371,9 397,6 378,9 399,4 387,2 3,0 444,0 396,2 431,8 390,6 367,8 372,3 400,5 7,8 377,5 375,2 372,3 378,7 375,9 404,7 380,7 3,1 359,3 333,1 357,0 341,3 316,4 325,3 338,8 5,1

1 2 3 4 5 6 TB RSD (%) Độ lệch (%) 0,2 3,4 -11,0

-8,8 Như vậy, CUR và THC trong huyết tương ổn định sau 3 chu kỳ đông-rã.

 Độ ổn định của mẫu huyết tương trong thời gian dài

Nghiên cứu độ ổn định dài hạn của mẫu huyết tương LQC và HQC theo

phương pháp nêu trong mục 2.3.1.3. Kết quả đánh giá nồng độ của mẫu huyết tương

sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu được trình bày ở bảng

3.20. Bảng 3.20. Độ ổn định của mẫu huyết tương bảo quản ở -30oC (n = 6)

Nồng độ CUR (ng/ml) Nồng độ THC (ng/ml) Mẫu LQC

Ban đầu 1,7 1,5 1,4 1,5 1,5 1,5 1,5 6,0 13 ngày 40 ngày Ban đầu 13 ngày 40 ngày 1,6 2,0 1,5 1,6 1,6 1,8 1,7 11,5 1,5 1,6 1,5 1,3 1,5 1,3 1,4 8,0 -14,5 1,7 1,7 1,7 1,7 1,8 1,7 1,7 2,5 13,9 1,4 1,8 1,4 1,5 1,3 1,4 1,5 11,6 -2,0 1,6 1,7 1,8 1,6 1,5 1,5 1,6 7,1 -3,5

1 2 3 4 5 6 TB RSD (%) Độ lệch (%) Mẫu HQC 1 2 3 4 5 6 TB RSD (%) Độ lệch (%) 397,5 393,0 386,3 405,4 382,2 386,5 391,8 2,2 2,9 343,2 320,3 341,4 322,6 325,2 315,0 327,9 3,5 -13,9 379,7 395,5 371,9 397,6 378,9 399,4 387,2 3,0 393,1 395,1 381,1 399,5 376,3 392,0 389,5 2,3 0,6 377,5 375,2 372,3 378,7 375,9 404,7 380,7 3,1 379,9 335,6 371,4 334,9 316,6 324,2 343,8 7,5 -11,2 Nồng độ mẫu sau khi bảo quản ở -30oC sau 40 ngày có độ lệch so với nồng độ

mẫu tại thời điểm ban đầu không quá 15% và giá trị RSD% giữa các kết quả định

lượng ở mỗi nồng độ đều nhỏ hơn 15%. Như vậy, có thể kết luận mẫu CUR và THC

trong huyết tương ổn định ở điều kiện bảo quản đến 40 ngày.

Kết quả thẩm định về độ thích hợp, độ đặc hiệu-chọn lọc, khoảng tuyến tính,

giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ lặp lại, tỷ lệ thu hồi, ảnh hưởng của nền mẫu,

nhiễm chéo và độ ổn định cho thấy: phương pháp đã xây dựng đáp ứng các yêu cầu

của một phương pháp phân tích dùng trong sinh học. Vì vậy, có thể sử dụng phương

pháp này để định lượng CUR và THC trong huyết tương.

3.2. NGHIÊN CỨU TIỀN CÔNG THỨC

Việc đánh giá các đặc tính vật lý, hóa học và cơ học của DC cũng như một số

tương tác dược chất-tá dược có thể xảy ra trong quy trình bào chế được coi là bước

đầu tiên, làm cơ sở để xây dựng công thức, lựa chọn tá dược và phương pháp bào

chế thích hợp.

3.2.1. Kết quả nghiên cứu tính chất của dược chất

Trước tiên, DC curcumin được đánh giá một số tính chất như sau:

3.2.1.1. Hình thái học tiểu phân

Hình ảnh tiểu phân curcumin được đánh giá bằng kính hiển vi điện tử quét

theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2.1.a và được trình bày ở hình 3.3.

5m

Hình 3.3. Hình ảnh tiểu phân curcumin quan sát qua kính hiển vi điện tử quét với

độ phóng đại 5000 lần

Về mặt hình thái học, tiểu phân curcumin ở dạng hình kim với các cạnh sắc và

rõ. Mặc dù hình ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử quét không phản ánh được kích

thước của tiểu phân của toàn bộ mẫu, nhưng kết quả này cũng phần nào dự đoán

được kích thước và hình thái của tiểu phân ban đầu. Với hình thái học như vậy, tiểu

phân curcumin dễ dàng bị phân chia thành các tiểu phân kích thước nhỏ hơn.

3.2.1.2. Phổ nhiễu xạ tia X và phổ hồng ngoại

Hình ảnh phổ nhiễu xạ tia X của curcumin được thể hiện ở phụ lục 2.1 có

nhiều pic với cường độ lớn. Điều đó chứng tỏ curcumin tồn tại chủ yếu ở dạng kết

tinh.

Đồng thời, nhằm nhận biết các nhóm chức đặc trưng của chất, curcumin được

chụp phổ hồng ngoại theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.2.1.f. Hình ảnh phổ hồng

ngoại của curcumin được thể hiện ở phụ lục 2.2.

3.2.1.3. Các đặc tính về kích thước tiểu phân, diện tích bề mặt và độ xốp, giản đồ

nhiệt vi sai, hàm lượng và độ tan

Kết quả đánh giá một số tính chất lý hóa của curcumin theo phương pháp mô

tả ở mục 2.3.2.1 được trình bày ở bảng 3.21.

Bảng 3.21. Một số đặc tính của curcumin

Tính chất lý hóa Đặc điểm

KTTP KTTPTB: 18,07 ± 1,34 m, Span 2,404 ± 0,453

d90 25,8 ± 0,56 m, d50 9,51 ± 0,28 m và d10 4,12 ± 0,15 m

Diện tích bề mặt

và độ xốp

Giản đồ nhiệt vi (phụ lục 2.3) Diện tích bề mặt 1,348 m2/g, thể tích lỗ xốp trung bình 0,005 cm3/g, kích thước lỗ xốp trung bình 123,9 Å (phụ lục 2.4) Một pic thu nhiệt tương ứng với nhiệt độ nóng chảy 198,3oC

sai Enthalpy nóng chảy 126,9 J/g (phụ lục 2.5)

Hàm lượng CUR 95,1 ± 0,3% (phụ lục 2.6) Độ tan (25 ± 2oC) 0,17 ± 0,04 g/ml

3.2.1.4. Độ hòa tan

Hòa tan là bước hạn chế quá trình hấp thu của một số DC ít tan thuộc nhóm II

và IV theo hệ thống phân loại sinh dược học. Curcumin thuộc nhóm IV trong hệ

thống phân loại sinh dược học [104], khó phân tán và bị kết tụ trong nước nên trong

nghiên cứu thử độ hòa tan, chất diện hoạt Tween 80 với nồng độ 0,2% được lựa

chọn để thêm vào môi trường thử. Chất diện hoạt có vai trò đảm bảo điều kiện

“sink” và tránh bám dính tiểu phân vào thành cốc và cánh khuấy. Mặt khác, chất

diện hoạt còn gây thấm cho tiểu phân curcumin ở giai đoạn đầu của thử nghiệm hòa

tan, giảm thiểu sai số gây ra do tiểu phân chưa phân tán vào môi trường hòa tan

giữa các lần thử nghiệm. Độ hòa tan của curcumin trong môi trường dung dịch HCl

0,1 N, nước và đệm phosphat pH 6,8 chứa 0,2% Tween 80 được thể hiện ở hình 3.4

và phụ lục 2.7.

Trong môi trường HCl 0,1 N chứa 0,2% Tween 80, curcumin có độ hòa tan

thấp hơn so với trong môi trường nước và đệm phosphat pH 6,8 chứa 0,2% Tween

80. Dựa vào kết quả này, môi trường nước chứa 0,2% Tween 80 được chọn trong

Môi trường HCl 0,1 N chứa 0,2% Tween 80

30 25 20

nghiên cứu thử độ hòa tan của curcumin.

Môi trường nước chứa 0,2% Tween 80

n a t a ò h R U C %

Môi trường đệm phosphat pH 6,8 chứa 0,2% Tween 80

Thời gian (phút)

(các thời điểm 10 và 20 phút, phần trăm curcumin hòa tan không xác định được vì quá thấp)

Hình 3.4. Độ hòa tan của curcumin trong môi trường dung dịch HCl 0,1 N, nước và

dung dịch đệm phosphat pH 6,8 chứa 0,2% Tween 80

Như vậy, curcumin có KTTPTB ban đầu khá lớn, khoảng phân bố KTTP rộng,

tồn tại ở trạng thái kết tinh, ít tan trong nước và độ hòa tan kém. Do đó, để cải thiện

SKD của curcumin có thể sử dụng biện pháp cải thiện độ tan và độ hòa tan bằng kỹ

thuật bào chế hệ tiểu phân nano.

3.2.2. Kết quả nghiên cứu độ ổn định hóa học của dược chất ở trạng thái rắn

Độ ổn định của nguyên liệu sẽ ảnh hưởng đến độ ổn định và tuổi thọ của dạng

bào chế chứa DC đó. Việc theo dõi độ ổn định của nguyên liệu ở trạng thái rắn có

thể định hướng được tá dược sử dụng trong dạng bào chế, bao bì đóng gói cũng như

điều kiện bảo quản. Curcumin được theo dõi độ ổn định ở các điều kiện khắc nghiệt

như trong mục 2.3.2.2. Đánh giá sự thay đổi hình thức bằng cảm quan, hàm lượng

còn lại và tạp phân hủy bằng phương pháp HPLC, kết quả được trình bày ở bảng

3.22 và phụ lục 2.8.

Bảng 3.22. Kết quả theo dõi độ ổn định của curcumin trong một số điều kiện khắc

nghiệt (n = 3)

Điều kiện khắc nghiệt Thay đổi hình thức % curcumin so với ban đầu Tạp phân hủy (%)

108,1 ± 2,5 - -

100,3 ± 1,7 - -

106,1 ± 1,3 - -

99,6 ± 2,8 - -

- -

Nhiệt khô, 60oC trong 7 ngày, lọ kín Tủ vi khí hậu, 40±2oC, độ ẩm 75±5% trong 7 ngày, lọ mở Tủ vi khí hậu, 40±2oC, độ ẩm 75±5% trong 14 ngày, lọ mở Nghiền bi inox 6 giờ Môi trường có độ ẩm 90% (dung dịch kali nitrat bão hòa), nhiệt độ phòng, 7 ngày

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.22 cho thấy: trong các điều kiện khắc nghiệt

về nhiệt khô và tác động cơ học bằng cách nghiền bi inox, hình thức và hàm lượng

curcumin còn lại sau thời gian theo dõi không có sự thay đổi đáng kể. Trên sắc ký

đồ không có tạp phân hủy khác xuất hiện so với nguyên liệu ban đầu (phụ lục 2.8). Điều đó chứng tỏ curcumin có thể chịu được các điều kiện nhiệt khô ở 60oC và tác

động cơ học trong thời gian theo dõi. Trong môi trường có độ ẩm cao (khoảng 75%

và 90%), mặc dù chưa có sự thay đổi về màu sắc nhưng curcumin dễ bị hút ẩm dẫn

đến hiện tượng vón cục. Điều này có ý nghĩa khi lựa chọn thông số trong quá trình

bào chế, lựa chọn bao bì và điều kiện bảo quản chế phẩm.

3.2.3. Kết quả nghiên cứu tương tác dược chất-tá dược

Khi xây dựng công thức, curcumin được phối hợp với một số tá dược theo quy

trình bào chế thích hợp. Nhằm sàng lọc và lựa chọn một số tá dược trước khi tiến

hành xây dựng công thức, một số nghiên cứu về tương tác giữa curcumin và tá dược

được tiến hành theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2.3. Kết quả đánh giá sự thay đổi

hình thức và hàm lượng còn lại sau 1 tháng bảo quản trong tủ vi khí hậu được trình

bày ở bảng 3.23.

Bảng 3.23. Kết quả đánh giá tương tác dược chất-tá dược sau 1 tháng ở điều kiện

lão hóa cấp tốc (n = 3)

Thay đổi hình thức Lọ mở Lọ đóng

Hàm lượng (%) 96,6 ± 2,6 98,4 ± 3,1 95,3 ± 2,8 103,2 ± 1,4 - - + - Tạp phân hủy (%) - - - - - - - -

Chú thích: (-): không có; (+): có

Tỷ lệ dược chất-tá dược CUR: Tween 80 (1:1) CUR: Tween 60 (1:1) CUR: Cremophor RH40 (1:1) CUR: Poloxame 188: nước (1:1:1) CUR: PVP: nước (1:1:2) CUR: PVA: nước (1:1:1) CUR: Na CMC: nước (5:1:1) CUR: CMC: nước (5:1:1) CUR: manitol: nước (1:1:2) CUR: Trehalose: nước (1:1:2) CUR: lactose: nước (1:1:2) 98,2 ± 2,2 - - 103,1 ± 1,5 97,4 ± 1,8 96,9 ± 1,4 99,4 ± 0,9 - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Khả năng tương tác, tương kỵ của tá dược với DC có thể biểu hiện tức thì,

cũng có thể xảy ra chậm hơn trong quá trình bảo quản. Trong điều kiện khảo sát,

curcumin không tương tác với tá dược Tween 80, Tween 60, Poloxame 188, CMC,

manitol, Trehalose và lactose. Riêng đối với Cremophor RH40, mặc dù có sự thay

đổi về hình thức ở lọ trạng thái mở nắp nhưng kết quả định lượng ở lọ trạng thái

đóng nắp lại cho thấy không có sự thay đổi về hàm lượng curcumin và không xuất

hiện tạp phân hủy. Khi phối hợp curcumin với PVA, mặc dù trong điều kiện lọ mở

nắp có sự thay đổi về hình thức bên ngoài, nhưng ở trạng thái lọ đóng nắp hiện

tượng này không xảy ra. Như vậy, trong điều kiện tiến hành thực nghiệm, không có

tương kỵ nào giữa DC và tá dược khảo sát.

Dựa trên cơ sở nghiên cứu tính chất của DC và tương tác dược chất-tá dược,

với mục tiêu cải thiện SKD của curcumin bằng cách tăng độ tan và tốc độ hòa tan,

nghiên cứu lựa chọn một số nhóm tá dược và phương pháp bào chế để bào chế hệ

tiểu phân nano.

3.3. NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO

3.3.1. Xây dựng công thức bào chế hỗn dịch nano curcumin

Hỗn dịch nano curcumin được bào chế một số nhóm chất được lựa chọn để

xây dựng công thức cơ bản như ở bảng 2.4.

3.3.1.1. Lựa chọn loại chất diện hoạt

Chất diện hoạt có khả năng định hướng trên bề mặt phân cách giữa hai pha

rắn-lỏng tạo thành một lớp đơn, đa phân tử hoặc các ion bao xung quanh các tiểu

phân DC rắn, đồng thời làm giảm sức căng bề mặt, cải thiện tính thấm của các tiểu

phân DC rắn với môi trường phân tán.

Hỗn dịch nano curcumin được bào chế sử dụng các chất diện hoạt khác nhau

với thành phần theo bảng 3.24 bằng phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình A)

Bảng 3.24. Thành phần các mẫu hỗn dịch nano sử dụng chất diện hoạt khác nhau

Thành phần CUR (g) Tw80 (g) Tw60 (g) Cre (g)

1,00 1,00 1,00 1,00 0,10 - - - - 0,10 - - - - 0,10 - Pol (g) - - - 0,10 Nước (ml) 25 25 25 25 Mẫu DH1 DH2 DH3 DH4

Kết quả xác định kích thước tiểu phân trung bình (KTTPTB) và hệ số đa phân

tán (PDI) theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3.3.b được trình bày trong hình

600

0.6

500

0.5

3.5.

)

400

0.4

KTTPTB

I D P

300

0.3

PDI

m n ( B T P T T K

200

0.2

100

0.1

0.0

DH1

DH2

DH4

DH3

Hình 3.5. KTTPTB và PDI của các mẫu hỗn dịch nano curcumin sử dụng chất diện

hoạt khác nhau (n = 3)

Kết quả ở hình 3.5 cho thấy có sự khác biệt về KTTPTB giữa các mẫu sử dụng

chất diện hoạt khác nhau (p< 0,05). Phân tích post-hoc (kiểm định LSD) cho thấy sự

khác nhau đáng kể về KTTPTB giữa mẫu DH1 và các mẫu DH2, DH3, DH4 (p<

0,05). Hỗn dịch nano curcumin sử dụng chất diện hoạt Tween 80 có KTTP nhỏ

nhất. Vì vậy, Tween 80 được chọn trong các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.1.2. Lựa chọn tỷ lệ chất diện hoạt/curcumin

Các mẫu hỗn dịch nano curcumin tiếp tục được bào chế theo phương pháp

trình bày ở mục 2.3.3.1 (quy trình A) sử dụng chất diện hoạt Tween 80 với các tỷ lệ

khối lượng Tween 80 lần lượt là 5, 10, 20 và 50% so với khối lượng curcumin. Kết

quả xác định KTTP và PDI theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.3.b được trình bày

400

0.6

350

0.5

300

0.4

trong hình 3.6.

)

250

200

0.3

I D P

KTTPTB

m n ( B T P T T K

150

0.2

PDI

100

0.1

0.0

10%

50%

20%

Tỷ lệ Tween 80/CUR (%)

Axis Title

Hình 3.6. KTTPTB và PDI của hỗn dịch nano curcumin sử dụng Tween 80 với các

tỷ lệ khác nhau (n = 3)

Kết quả ở hình 3.6 cho thấy sự khác nhau đáng kể về KTTP của mẫu hỗn dịch

sử dụng tỷ lệ Tween 80/curcumin là 5 và 10% (p< 0,05). Khi tăng tỷ lệ Tween

80/curcumin từ 5 lên 10%, KTTPTB của hỗn dịch nano curcumin có xu hướng

giảm. Tiếp tục tăng tỷ lệ Tween 80/curcumin từ 10 lên 20%, KTTPTB có sự thay

đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Với tỷ lệ Tween 80/curcumin là 50%,

KTTPTB của hỗn dịch nano lại tăng, tuy nhiên, hệ số đa phân tán PDI giảm, chứng

tỏ khoảng phân bố kích thước tiểu phân hẹp hơn. Mặc dù vậy, tỷ lệ Tween

80/curcumin trên 20% có thể gây khó khăn cho quá trình phun sấy do nhiệt độ nóng

chảy thấp. Đồng thời, khi tỷ lệ Tween 80 cao, hỗn dịch tạo thành nhiều bọt, điều

này gây khó khăn trong quá trình khuấy trộn ở tốc độ cao. Vì vậy, tỷ lệ Tween

80/curcumin được khảo sát trong khoảng từ 5-15%.

3.3.1.3. Lựa chọn loại polyme thân nước

Hỗn dịch nano được tạo thành kém ổn định về mặt nhiệt động học. Hệ tiểu

phân nano sẽ giảm năng lượng bề mặt bằng cách kết tụ hoặc hòa tan và kết tinh trở

lại của tiểu phân nhỏ hơn thành tiểu phân lớn hơn (kết tụ Ostwald) [12], [71]. Mặc

dù hỗn dịch này đã sử dụng chất diện hoạt nhưng do Tween 80 là phân tử nhỏ, tạo

ra lớp hấp phụ mỏng trên bề mặt tiểu phân và tạo ra sự ổn định không gian giữa các

tiểu phân kém hiệu quả hơn so với các polyme khối lượng phân tử lớn [85]. Vì vậy,

nghiên cứu tiếp tục tiến hành phối hợp Tween 80 với các polyme thân nước. Sự có

mặt của các polyme này trong hỗn dịch nano có thể làm giảm năng lượng bề mặt

tiểu phân bằng cách hấp phụ trên bề mặt tạo thành lớp áo thân nước ngăn chặn quá

trình kết tụ hoặc tạo sự cồng kềnh về mặt không gian và tích điện cho bề mặt tiểu

phân [5].

Hỗn dịch nano curcumin được tiến hành bào chế theo công thức DH1 phối

hợp với các polyme thân nước PVP, Na CMC hoặc PVA. Thành phần các mẫu hỗn

dịch nano được thể hiện ở bảng 3.25.

Bảng 3.25. Thành phần các mẫu hỗn dịch nano sử dụng các polyme thân nước

Thành phần Mẫu CUR (g) Tw (g) PVP (g) Na CMC(g) PVA (g) Nước (ml)

OD 1 1 0,1 - - - 25

OD 2 1 0,1 0,5 - - 25

OD 3 1 0,1 - 0,05 - 25

OD 4 1 0,1 - - 0,5 25

Các mẫu hỗn dịch nano được đánh giá KTTPTB, PDI theo phương pháp trình

bày ở mục 2.3.3.3.b và thế zeta theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3.3.c. Kết

quả đánh giá KTTPTB, PDI và thế zeta của các mẫu hỗn dịch nano được thể hiện ở

600

0.6

500

0.5

hình 3.7 và bảng 3.26.

)

400

0.4

m n (

KTTPTB

300

0.3

I D P

PDI

200

0.2

B T P T T K

100

0.1

0.0

OD1

OD2

OD4

OD3

Hình 3.7. KTTPTB và PDI của hỗn dịch nano sử dụng các polyme thân nước khác

nhau (n = 3)

Bảng 3.26. Thế zeta của các mẫu hỗn dịch nano sử dụng các polyme khác nhau

Giá trị thế zeta (mV) Trong môi trường nước Trong môi trường phân tán gốc

-9,51 -39,50 -21,73 -11,02 -46,52 -22,15

Polyme thân nước PVA Na CMC PVP Kết quả ở hình 3.7 và bảng 3.26 cho thấy mối liên hệ giữa giá trị thế zeta và

KTTPTB của tiểu phân nano thu được. Hỗn dịch nano bào chế sử dụng polyme ổn

định Na CMC có giá trị thế zeta trong môi trường nước và môi trường phân tán gốc

cao hơn so với mẫu hỗn dịch sử dụng PVP hoặc PVA mặc dù tỷ lệ sử dụng thấp

nhất (tỷ lệ Na CMC/curcumin là 0,05%). Kết quả đánh giá KTTPTB cho thấy: hỗn

dịch nano sử dụng Na CMC có KTTPTB cao hơn so với hai mẫu sử dụng PVP và

PVA. Điều này có thể do khối lượng phân tử của polyme Na CMC khá lớn, có thể

hình thành cầu nối polyme làm tăng sự kết tụ tiểu phân. Kết quả này cũng phù hợp

với kết quả nghiên cứu bào chế hỗn dịch nano curcumin của Rachmawati H. và

cộng sự [75].

Khi pha loãng trong môi trường phân tán gốc, giá trị thế zeta của hỗn dịch

nano bào chế với polyme Na CMC lại tăng lên. Sự tăng thế zeta này của lớp

Helmholtz do tăng hấp phụ nhóm carboxylic tích điện âm (COO-) lên bề mặt tiểu

phân hơn so với sự chuyển lớp hấp phụ của chuỗi polyme. Thêm vào đó, nhóm tích

điện âm của Na CMC ở trong và trên bề mặt polyme, dẫn đến tăng điện thế Stern và

tăng thế zeta.

Giá trị thế zeta có thể được sử dụng để dự đoán độ ổn định vật lý của hỗn dịch

vì điện tích bề mặt tiểu phân là một trong những yếu tố quyết định độ ổn định về

mặt vật lý của hệ phân tán. Căn cứ vào kết quả xác định thế zeta, có thể kết luận

rằng các polyme sử dụng đều thích hợp để làm tăng độ ổn định của hỗn dịch nano

curcumin. Tuy nhiên, Na CMC không phải là một lựa chọn thích hợp do có thể dẫn

đến sự mất ổn định do tương tác hình thành cầu nối polyme làm tăng KTTP [75].

Dựa vào kết quả này, PVP được lựa chọn là chất ổn định cho hỗn dịch nano

curcumin.

3.3.1.4. Lựa chọn tỷ lệ polyme thân nước/curcumin

Hỗn dịch nano được bào chế theo công thức DH1 phối hợp với polyme PVP

với tỷ lệ khối lượng PVP/curcumin thay đổi. Hỗn dịch nano được phun sấy theo

phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình A) với các thông số nhiệt độ khí vào 85oC và tốc độ phun dịch 5 ml/phút. Kết quả đánh giá KTTPTB và PDI của mẫu bột

phun sấy chứa nano curcumin với tỷ lệ PVP khác nhau được trình bày ở bảng 3.27

và 3.28.

Bảng 3.27. KTTPTB và PDI của bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng tỷ lệ

PVP/curcumin khác nhau

Tỷ lệ PVP/CUR KTTPTB (nm) PDI Mẫu

0,315 0,388 0,430 0,478 0,346 PS 1 PS 2 PS 3 PS 4 PS5 - 10% 50% 100% 200% 204,5 242,7 263,9 271,7 265,3

Bảng 3.28. Độ hòa tan của các mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng tỷ lệ

PVP/curcumin khác nhau

% hòa tan PS 3 63,45 74,26 83,49 86,23 87,00 89,36 PS 4 74,67 89,38 95,33 98,54 100,57 100,31 PS5 80,34 88,45 91,46 95,50 100,67 100,23 PS 2 58,54 71,45 78,13 82,58 85,22 86,49 PS 1 46,53 58,27 65,64 68,29 70,34 71,45

Thời gian (phút) 10 20 30 40 50 60 Kết quả ở bảng 3.27 và 3.28 cho thấy: tỷ lệ PVP/curcumin ảnh hưởng không

đáng kể đến KTTPTB và PDI của tiểu phân nano curcumin nhưng lại ảnh hưởng

đến độ hòa tan của curcumin trong bột phun sấy. Tỷ lệ này càng cao, tốc độ hòa tan

curcumin từ bột phun sấy càng nhanh. Tuy nhiên, nếu tỷ lệ PVP/curcumin quá cao

có thể ảnh hưởng đến thể chất của khối bột trong quá trình bảo quản do đặc tính của

PVP dễ hút ẩm. Do đó, tỷ lệ PVP/curcumin được lựa chọn trong khoảng 10% đến

100%.

3.3.2. Xác định một số thông số trong quy trình bào chế hỗn dịch nano

3.3.2.1. Lựa chọn tốc độ đồng nhất hóa

Các hỗn dịch nano được bào chế theo công thức OD2 với tốc độ đồng nhất

hóa thay đổi 10000, 15000, 18000 và 22000 vòng/phút trong 15 phút theo phương

pháp mô tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình A). Xác định KTTP và PDI theo phương pháp

mô tả ở mục 2.3.3.3.b. Kết quả được trình bày trong hình 3.8.

Kết quả ở hình 3.8 cho thấy: khi tăng tốc độ đồng nhất hóa, KTTPTB và PDI

của hỗn dịch nano giảm. Tuy nhiên, nếu khuấy ở tốc độ 22000 vòng/phút, hỗn dịch

nhiều bọt ảnh hưởng đến quá trình khuấy trộn. Do đó, các mẫu hỗn dịch nano được

khuấy với tốc độ 15000 hoặc 18000 vòng/phút.

0.7

500

450

0.6

400

)

0.5

350

I D P

300

0.4

250

KTTPTB

0.3

200

PDI

150

0.2

m n ( B T P T T K

100

0.1

10000

15000

18000

22000

Tốc độ đồng nhất hóa (vòng/phút)

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn kích thước tiểu phân trung bình và hệ số đa phân tán của

các mẫu hỗn dịch nano khuấy với tốc độ khác nhau (n = 3)

3.3.2.2. Lựa chọn thời gian đồng nhất

Các mẫu hỗn dịch nano được tiến hành bào chế theo công thức OD2 với tốc

độ đồng nhất hóa 15000 hoặc 18000 vòng/phút và thời gian đồng nhất hóa thay đổi

5, 15, 30 và 45 phút theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình A). Xác định

KTTP và PDI theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.3.b. Kết quả được trình bày

600

15000 vòng/phút

trong hình 3.9.

500

18000 vòng/phút

)

400

m n (

300

200

B T P T T K

100

Thời gian đồng nhất hóa (phút)

Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn KTTPTB của hỗn dịch nano curcumin khuấy với tốc độ

15000 và 18000 vòng/phút trong thời gian khác nhau (n = 3)

Với tốc độ đồng nhất hóa 15000 vòng/phút, sau khoảng 30 phút, hỗn dịch

nano có KTTPTB nhỏ hơn 300 nm. Khi tăng tốc độ đồng nhất hóa lên 18000

vòng/phút, sự khác nhau về KTTPTB có ý nghĩa thống kê giữa các mẫu hỗn dịch

nano khuấy ở các thời điểm khác nhau (p< 0,05). Phân tích post-hoc (kiểm định

LSD) cho thấy: sự khác nhau giữa mẫu khuấy với thời gian 15 phút có ý nghĩa

thống kê so với các mẫu ban đầu, sau 5 và 30 phút (p< 0,05). Mẫu khuấy tốc độ cao

18000 vòng/phút trong 15 phút có KTTPTB nhỏ nhất. Do vậy, các mẫu hỗn dịch

nano có thể được khuấy với tốc độ 18000 vòng/phút trong 15 phút hoặc 15000

vòng/phút trong 30 phút. Tuy nhiên, để rút ngắn thời gian khuấy tốc độ cao, tốc độ

khuấy 18000 vòng/phút trong 15 phút được lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm

tiếp theo.

3.3.3. Xác định một số thông số trong quy trình bào chế bột phun sấy chứa

nano

3.3.3.1. Lựa chọn nhiệt độ khí vào

Dung môi của hỗn dịch nano curcumin trong nghiên cứu này là nước nên khi phun sấy ở nhiệt độ thấp (< 60oC), quá trình bốc hơi diễn ra chậm, tiểu phân có hàm

ẩm lớn, dính ngay tại buồng sấy và cyclon. Ngược lại, khi nhiệt độ quá cao có thể

ảnh hưởng đến độ ổn định của curcumin. Do vậy, qua thực nghiệm lựa chọn khảo sát ở mức nhiệt độ đầu vào là 70 – 100oC.

3.3.3.2. Lựa chọn tốc độ phun dịch

Tốc độ phun dịch phù hợp với tỷ lệ thông gió và nhiệt độ khí vào. Nếu bơm

chậm sẽ làm bột vận chuyển theo luồng gió sang bình hứng bị hút ngược lên theo

khí thải dẫn đến hiệu suất thấp. Nếu bơm nhanh sản phẩm bị dính tại buồng sấy do

không đủ thời gian tiếp xúc giữa dịch phun và khí nóng trước khi sang bình hứng.

Vì vậy, trong nghiên cứu này, tốc độ phun dịch được lựa chọn thay đổi từ 1 đến 5

ml/phút.

3.3.4. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức và thông số

trong quy trình bào chế đến đặc tính của tiểu phân nano

3.3.4.1. Thiết kế thí nghiệm

 Các biến độc lập

Từ các nghiên cứu sơ bộ trên, nhận thấy: tỷ lệ Tween 80/curcumin, tỷ lệ

PVP/curcumin, tốc độ phun dịch và nhiệt độ khí vào có ảnh hưởng tới các đặc tính

tiểu phân nano curcumin. Vì vậy, các thông số trên được chọn là các biến độc lập.

Ký hiệu và các mức của các biến đầu vào được trình bày ở bảng 3.29.

Bảng 3.29. Ký hiệu và các mức của biến độc lập

Tên biến định lượng Ký hiệu Mức dưới (-1) Mức cơ bản (0) Mức trên (1)

5 10 15 X1

10 70 55 85 100 100 X2 X3

1 3 5 X4 Tỷ lệ Tween 80/curcumin (%) Tỷ lệ PVP/curcumin (%) Nhiệt độ khí vào (oC) Tốc độ phun dịch (ml/phút)

 Các biến phụ thuộc

Với mục tiêu bào chế nano tinh thể curcumin với KTTP nhỏ, PDI thấp và cải

thiện tốc độ hòa tan, các biến phụ thuộc được chọn và trình bày ở bảng 3.30.

Bảng 3.30. Ký hiệu và các mức của biến phụ thuộc

Biến phụ thuộc Hiệu suất Kích thước tiểu phân trung bình Hệ số đa phân tán % CUR hòa tan sau 10 phút % CUR hòa tan sau 20 phút % CUR hòa tan sau 30 phút % CUR hòa tan sau 40 phút % CUR hòa tan sau 50 phút % CUR hòa tan sau 60 phút Đơn vị % nm - % % % % % % Ký hiệu Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9  Thiết kế thí nghiệm

Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm theo thiết kế hợp tử tại

tâm, với 4 biến đầu vào cho 23 thí nghiệm và 3 thí nghiệm bổ sung được trình bày ở

phụ lục 3.1.

Các mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin được bào chế theo phương pháp

trình bày ở mục 2.3.3.1 (quy trình A). Sau đó, đánh giá hiệu suất, KTTPTB, PDI và

độ hòa tan của bột phun sấy chứa nano curcumin theo phương pháp ghi ở mục

2.3.3.3. Kết quả được trình bày ở phụ lục 3.2 và 3.3.

Các mẫu nano curcumin thu được đều có kích thước tiểu phân trong khoảng

199,0 – 390,0 nm, hệ số đa phân tán trong khoảng 0,34 – 0,55, hiệu suất trên 30%.

Sự thay đổi tỷ lệ các thành phần trong công thức và thông số quy trình đều ảnh

hưởng đến hiệu suất, KTTPTB, PDI và độ hòa tan của curcumin trong bột phun sấy.

3.3.4.2. Phân tích các yếu tố thuộc về công thức và thông số trong quy trình bào

chế ảnh hưởng đến đặc tính của hệ tiểu phân nano

Mối quan hệ nhân quả giữa các biến độc lập (tỷ lệ Tween 80/curcumin, tỷ lệ

PVP/curcumin, nhiệt độ khí vào và tốc độ phun dịch) và các biến phụ thuộc (hiệu

suất, KTTPTB, PDI và độ hòa tan) được xử lý bằng phần mềm FormRules 2.0 với

các cài đặt như sau:

- Hệ số mô men (momentum): 0,9

- Tốc độ học (learning rate): 0,7

- Tiêu chuẩn lựa chọn mô hình: thẩm định chéo (cross validation)

Kết quả luyện mạng neuron nhân tạo được trình bày ở bảng 3.31 và các quy

luật liên quan nhân quả được trình bày ở phụ lục 3.4.

Bảng 3.31. Kết quả luyện mạng neuron nhân tạo bằng phần mềm FormRules 2.0

Cấu trúc hệ thống

Trọng số sai số thử 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 R2 luyện (%) 80,0 98,1 94,6 98,3 98,8 98,2 97,1 97,4 94,4 X3(3)X1(4)X2(3)X4(3) X1(3)X2(4)X3(2)X4(5) X1(2)X3(3)X4(3)X2(2) X2(3)X4(3)X1(2)X3(2) X2(3)X4(2)X1(2)X3(2) X2(3)X4(3)X1(2)X3(2) X2(4)X4(3)X1(2)X3(2)+X3(3) X2(3)X4(3)X1(2)+X4(4)+X3(3)X1(3) X2(3)X4(3)X1(2)X3(2)

Biến đầu ra Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Để có thể thấy rõ được xu hướng ảnh hưởng của biến độc lập tới các biến phụ

thuộc, tiến hành phân tích một số mặt đáp:

 Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80/curcumin và nhiệt độ khí vào đến kích thước tiểu

phân trung bình

Nếu nhiệt độ khí vào thấp (dưới 88oC), tăng tỷ lệ Tween 80/curcumin từ 5 đến

10%, sẽ làm tăng khả năng gây thấm và gây phân tán của tiểu phân rắn trong hỗn

dịch nano, do vậy KTTPTB của hệ tiểu phân nano curcumin có xu hướng giảm dần.

Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ Tween 80/curcumin trên 10%, nếu nhiệt độ khí vào vẫn thấp (dưới 88oC), KTTPTB lại thay đổi không đáng kể. Nếu nhiệt độ khí vào cao trên 88oC, tăng tỷ lệ Tween 80/curcumin trên 10%, KTTPTB của hệ tiểu phân nano lại

tiếp tục giảm.

KTTPTB

(nm)

Nhiệt độ khí vào (oC)

Tỷ lệ Tween 80/CUR

Hình 3.10. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80/curcumin và nhiệt độ

khí vào đến kích thước tiểu phân trung bình (cố định các yếu tố tỷ lệ PVP/curcumin

55% và tốc độ phun dịch 3ml/phút)

 Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80/curcumin và tỷ lệ PVP/curcumin đến hệ số đa

phân tán

Mặt đáp ở hình 3.11 và luật nhân quả ở phụ lục 3.4 cho thấy: nhìn chung, khi

tăng đồng thời tỷ lệ khối lượng Tween 80 và PVP so với curcumin, hệ số đa phân

tán giảm. Do chất diện hoạt Tween 80 và polyme thân nước PVP làm tăng tính

thấm và khả năng gây phân tán của hỗn dịch nano nên sự có mặt của hai thành phần

này sẽ làm giảm hệ số đa phân tán PDI của hỗn dịch nano.

PDI

Tỷ lệ Tween 80/CUR

Tỷ lệ PVP/CUR

Hình 3.11. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80/curcumin và tỷ lệ PVP/curcumin đến hệ số đa phân tán (cố định các yếu tố nhiệt độ khí vào 70oC và

tốc độ phun dịch 3 ml/phút)

 Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80/curcumin và tỷ lệ PVP/curcumin đến phần trăm

curcumin hòa tan sau 10 phút

Kết quả ở mặt đáp hình 3.12 kết hợp với luật nhân quả ở phụ lục 3.4 cho thấy:

khi tỷ lệ Tween 80/curcumin thấp (dưới 10%), phần trăm curcumin hòa tan sau 10

phút thấp và chỉ tăng nhẹ nếu tỷ lệ PVP/curcumin trên 90%. Khi tỷ lệ Tween

80/curcumin trên 10%, nếu tỷ lệ PVP/curcumin tăng từ 10 đến 60%, phần trăm

curcumin hòa tan sau 10 phút hầu như không thay đổi. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng

tỷ lệ PVP/curcumin, phần trăm curcumin hòa tan sau 10 phút tăng mạnh.

% CUR hòa tan 10 phút đầu

Tỷ lệ Tween 80/CUR

Tỷ lệ PVP/CUR

Hình 3.12. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80/curcumin và tỷ lệ

PVP/curcumin đến phần trăm curcumin hòa tan sau 10 phút (cố định các yếu tố nhiệt độ khí vào 70oC và tốc độ phun dịch 3 ml/phút)

Điều này có thể do chất diện hoạt Tween 80 và polyme thân nước PVP có thể

tạo lớp áo thân nước trên bề mặt tiểu phân, làm cho tiểu phân dễ thấm nước hơn và

tăng độ hòa tan của curcumin.

 Ảnh hưởng của nhiệt độ khí vào và tốc độ phun dịch lên hiệu suất của quá trình

phun sấy

Mặt đáp ở hình 3.13 và luật nhân quả ở phụ lục 3.4 cho thấy: khi nhiệt độ khí vào thấp (từ 70 đến 82oC), tốc độ phun dịch ảnh hưởng không đáng kể đến hiệu suất quá trình phun sấy. Nếu nhiệt độ khí vào cao (trên 82oC), nếu tốc độ phun dịch tăng

từ 1,8 đến 3 ml/phút, hiệu suất quá trình phun sấy tăng. Điều này có thể được giải

thích do nhiệt độ cao làm quá trình bốc hơi dung môi trong dịch phun nhanh hơn,

độ ẩm của bột thấp, ít bám dính vào cyclon, lượng bột thu được ở bình hứng nhiều hơn. Với nhiệt độ khí vào cao (trên 82oC), nếu tốc độ phun dịch tiếp tục tăng cao

(trên 3,4 ml/phút), thời gian tiếp xúc của dịch phun với khí nóng giảm đi khiến hàm

ẩm khối bột tăng lên, khối bột bám dính nhiều ở cyclon làm hiệu suất quá trình

phun sấy lại giảm. Do vậy, khi tiến hành phun sấy, cần lựa chọn nhiệt độ khí vào

tương đối cao và tốc độ phun dịch vừa phải (2-3 ml/phút).

Hiệu suất (%)

Nhiệt độ khí vào (oC)

Tốc độ phun dịch (ml/phút)

Hình 3.13. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ khí vào và tốc độ phun dịch

đến hiệu suất quá trình phun sấy (cố định các yếu tố tỷ lệ Tween 80/curcumin 10%

và tỷ lệ PVP/curcumin 55%)

3.3.5. Tối ưu hóa công thức và một số thông số trong quy trình bào chế

Sử dụng phần mềm INForm 3.1 để thiết lập mối liên quan giữa các biến đầu ra

và các biến đầu vào với các cài đặt như sau:

- Thuật toán luyện mạng: lan truyền ngược đàn hồi (resilient backpropagation-

RPROP)

- Hàm truyền lớp ẩn: tan hyperbol

- Hàm truyền lớp ra: tan hyperbol

Kết quả luyện mạng neuron nhân tạo được trình bày ở bảng 3.32.

luyện cho các biến đầu ra

Bảng 3.32. Giá trị R2

Biến Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9

78,8 97,9 94,8 98,0 94,7 98,4 96,7 95,1 95,9 R2

luyện (%)

luyện hầu hết lớn hơn 80% chứng tỏ mạng neuron nhân tạo mô tả chính xác

mối quan hệ giữa biến độc lập và biến phụ thuộc, tạo cơ sở cho việc tối ưu hóa.

Với mục đích bào chế hệ tiểu phân nano nhằm cải thiện độ hòa tan của

curcumin, việc thiết kế công thức và một số thông số trong quy trình bào chế với

điều kiện tối ưu hóa được đặt ra như sau:

 Hiệu suất: Y1 max (hiệu suất càng cao càng tốt)

 KTTPTB: Y2  min (KTTPTB của hệ tiểu phân nano càng nhỏ càng tốt)

 Hệ số đa phân tán: Y3  min (KTTP phân bố trong khoảng càng hẹp càng

tốt)

 Phần trăm curcumin hòa tan: Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9  max (hệ tiểu phân

nano curcumin hòa tan càng nhanh càng tốt)

Qua kết quả xử lý của phần mềm INForm 3.1, công thức và một số thông số

tối ưu trong quy trình bào chế được lựa chọn như sau:

Curcumin 1,00 g

Tween 80 0,12 g

Polyvinyl pyrolidon K30 0,75 g

Nước tinh khiết

Nhiệt độ khí vào vđ 25ml 96oC

Tốc độ phun dịch 2 ml/phút

Hỗn dịch nano và hệ tiểu phân nano được tiến hành bào chế theo phương pháp

ghi ở mục 2.3.3.1 (quy trình A). Kết quả đánh giá KTTPTB, PDI, hiệu suất, mất

khối lượng do làm khô, hàm lượng và độ hòa tan của bột phun sấy chứa nano

curcumin bào chế theo công thức tối ưu được trình bày ở bảng 3.33, hình 3.14 và

phụ lục 3.5.

Bảng 3.33. KTTPTB và PDI của hỗn dịch nano và bột phun sấy chứa nano

curcumin bào chế theo công thức tối ưu (n = 3)

Bột phun sấy chứa nano CUR Chỉ tiêu Hỗn dịch nano CUR Dự đoán CT tối ưu

KTTPTB (nm) 235,6 ± 2,3 222,4 223,1 ± 3,5

PDI 0,372 ± 0,052 0,420 0,326 ± 0,045

Hiệu suất (%) 59,74 62,75

Mất khối lượng do làm khô (%) - 11,43

Dự đoán

Nguyên liệu

Hàm lượng CUR - 52,78 ± 0,13

120

100

Tối ưu

n a t a ò h R U C %

Thời gian (phút)

Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn phần trăm curcumin hòa tan của các mẫu nguyên liệu,

mẫu tối ưu thực tế và dự đoán

Đồ thị ở hình 3.14 cho thấy: hai đồ thị hòa tan của bột phun sấy chứa nano

curcumin thực tế và kết quả dự đoán của phần mềm được coi là giống nhau (f2=

74,5). Đồng thời, bột phun sấy chứa nano curcumin có độ hòa tan được cải thiện rõ

rệt so với nguyên liệu ban đầu.

Như vậy, hệ tiểu phân nano curcumin bào chế theo công thức tối ưu với quy

mô 1 g/mẻ có KTTPTB khoảng 200-300 nm và PDI nhỏ hơn 0,400. Đặc biệt độ hòa

tan của hệ tiểu phân nano bào chế được cải thiện đáng kể so với nguyên liệu ban

đầu.

3.4. NGHIÊN CỨU NÂNG QUY MÔ BÀO CHẾ VÀ DỰ KIẾN TIÊU

CHUẨN CHẤT LƯỢNG

Với mong muốn nâng cấp quy mô bào chế nhằm tạo điều kiện thuận lợi hơn

cho việc đưa tiểu phân nano vào các dạng bào chế thích hợp, hệ tiểu phân nano

curcumin tiếp tục được nghiên cứu bào chế ở quy mô 5 g/mẻ. Vấn đề khó khăn đầu

tiên khi nâng cấp lên quy mô 5 g/mẻ là thể tích buồng nghiền hạn chế, chỉ có thể

đưa một lượng nguyên liệu chiếm khoảng 60% dung tích buồng nghiền. Vì vậy, mỗi

mẻ nghiền khô chỉ tiến hành ở quy mô tối đa 5 g/mẻ. Một vấn đề khó khăn khác là

lựa chọn thiết bị nghiền ướt thích hợp để tiểu phân nano thu được có KTTP phù hợp

và khoảng phân bố KTTP hẹp. Dựa trên khảo sát sơ bộ, thiết bị nghiền bi với buồng

nghiền chứa bi zirconi oxyd được lựa chọn trong giai đoạn nghiền ướt.

Khi nâng cấp từ quy mô bào chế 1 g lên 5 g/mẻ, các thành phần, tỷ lệ các

thành phần trong công thức và một số thông số trong quy trình bào chế có thể được

thay đổi cho phù hợp.

3.4.1. Xây dựng công thức bào chế tiểu phân nano curcumin ở quy mô 5

gam/mẻ

Hỗn dịch nano được bào chế với các thành phần và tỷ lệ các thành phần tương

tự mẻ 1 g. Tuy nhiên, với công thức này, khi chuyển dạng hỗn dịch nano sang bột

phun sấy, bột thu được có hàm ẩm tương đối cao và hiệu suất thấp do bám dính

nhiều vào cyclon. Vì vậy, để nâng cao hiệu suất, có thể thay đổi polyme thân nước

hoặc kết hợp thêm một số chất mang. Thành phần hệ tiểu phân nano curcumin ở

quy mô 5 g/mẻ được trình bày ở bảng 3.34.

Bảng 3.34. Thành phần của bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng các chất

mang khác nhau

CT CUR (g) Tween 80 (g) PVP (g) PVA (g) Manitol (g) Trehalose (g) Lactose (g) Nước (ml)

CM1 CM2 CM3 CM4 CM5 5 5 5 5 5 3,75 1,875 1,875 3,75 3,75 3,75 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 - - 2,5 - - - - - - 2,5 - - - 2,5 - - - -

125 125 125 125 125 Kết quả xác định KTTPTB, PDI và mất khối lượng do làm khô theo phương

pháp mô tả ở mục 2.3.3.3 được trình bày ở bảng 3.35.

Bảng 3.35. Kết quả đánh giá KTTPTB, PDI và mất khối lượng do làm khô của bột

phun sấy chứa nano curcumin sử dụng các chất mang khác nhau (n = 3)

CT KTTPTB (nm) PDI

CM1 CM2 CM3 CM4 CM5 335,7 ± 18,6 326,7 ± 12,6 325,9 ± 18,61 332,7 ± 9,61 346,0 ± 10,17 0,404 ± 0,033 0,394 ± 0,025 0,417 ± 0,032 0,421 ± 0,012 0,385 ± 0,042 Mất khối lượng do làm khô (%) 8,3 7,95 9,35 12,0 13,4

Khi nâng quy mô bào chế từ 1 lên 5 g/mẻ, KTTPTB và PDI của hệ nano tăng.

Đối với mẻ 5 g, khi thay đổi polyme thân nước hoặc thêm chất mang thân nước, hệ

tiểu phân nano thu được có KTTPTB và PDI hầu như không thay đổi, chứng tỏ sự

có mặt của các thành phần này không ảnh hưởng đến KTTP của hệ tiểu phân nano.

Khi phối hợp với PVA, mặc dù mẫu bột phun sấy có hàm ẩm thấp nhưng sau

khoảng 1 tháng bảo quản trong lọ kín, bột dễ bết và hút ẩm nhanh hơn so với những

mẫu còn lại. Khi kết hợp với manitol, Trehalose hoặc lactose, hàm ẩm và hiệu suất

của khối bột sau phun sấy tăng lên. Riêng đối với mẫu có chứa manitol, khối bột

khá tơi xốp, thuận lợi cho việc bảo quản và nghiên cứu chuyển dược chất vào các

dạng bào chế thích hợp. Do vậy, mẫu nghiên cứu sử dụng chất mang manitol được

lựa chọn để tiếp tục khảo sát các thông số trong quy trình bào chế ở quy mô 5 g/mẻ.

3.4.2. Khảo sát các thông số trọng yếu, giai đoạn trọng yếu trong quy trình bào

chế hệ tiểu phân nano curcumin quy mô 5 g/mẻ

Trong quá trình nâng cấp từ quy mô bào chế nhỏ lên quy mô bào chế lớn hơn,

các giai đoạn trọng yếu và các thông số kỹ thuật trọng yếu trong từng giai đoạn

trình bày ở mục 2.3.3.2 cần được khảo sát.

3.4.2.1. Giai đoạn nghiền khô

Ở quy mô bào chế nhỏ, curcumin được nghiền khô trong buồng nghiền với bi

inox kích thước 20 mm. Khi nâng cấp lên quy mô bào chế lớn hơn, thiết bị này vẫn

được lựa chọn trong quá trình nghiền khô. Tuy nhiên, các thông số của thiết bị bao

gồm thời gian và tần số nghiền khô cần được khảo sát cụ thể.

 Ảnh hưởng của thời gian nghiền khô

Các mẫu curcumin được khảo sát thời gian nghiền khô ở tần số 30Hz tại các

thời điểm 1, 2, 3, 4, 5 và 6 giờ. Kết quả đánh giá KTTPTB và khoảng phân bố

KTTP bằng thiết bị Mastersizer 3000E như mục 2.3.3.3.b được trình bày ở hình

3.15.

)

n a p S

KTTPTB

m  ( B T P T T K

Span

Axis Title Thời gian (giờ)

Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn KTTPTB và Span của curcumin mẻ 5 gam nghiền khô

với tần số 30Hz trong thời gian khác nhau (n = 3)

Đồ thị ở hình 3.15 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về KTTPTB giữa

các mẫu nghiền khô với thời gian khác nhau (p< 0,05). Sau 6 giờ nghiền, KTTPTB

có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với các mẫu nghiền khô ở các thời điểm trước 4

giờ (p< 0,05) (phân tích post-hoc-kiểm định LSD). Kết quả chụp hình thái tiểu phân

và xác định KTTPTB sau nghiền khô 6 giờ được trình bày ở phụ lục 4.1 và 4.2.

 Ảnh hưởng của tần số nghiền

Tần số nghiền là một trong những thông số có thể ảnh hưởng đến kích thước

tiểu phân sau khi nghiền. Do vậy, quá trình nghiền khô curcumin bằng bi inox được

tiến hành khảo sát trong 6 giờ ở 2 tần số 15 và 30 Hz theo phương pháp bào chế mô

tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình B). Kết quả đánh giá KTTPTB được trình bày ở hình

3.16.

)

n a p S

KTTPTB

Span

m  ( B T P T T K

5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

Tần số nghiền (Hz) Axis Title

Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn KTTPTB và Span của mẫu nghiền khô mẻ 5 gam ở hai

tần số 30 và 15 Hz trong 6 giờ (n = 3)

Kết quả ở hình 3.16 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về KTTPTB

giữa 2 tần số nghiền 15 và 30Hz (p< 0,05). Với tần số 30Hz, KTTPTB của

curcumin sau 6 giờ nghiền khô khoảng 8,79 ± 0,22 µm và Span 2,6 ± 0,2.

Việc phân chia làm giảm kích thước tiểu phân, dẫn đến làm tăng diện tích bề

mặt. Do đó, mẫu sau khi nghiền khô 6 giờ ở tần số 30 Hz với bi inox được xác định

diện tích bề mặt theo phương pháp ở mục 2.3.3.3.d. Kết quả được trình bày ở bảng

3.36 và phụ lục 4.3.

Bảng 3.36. Kết quả xác định diện tích bề mặt của mẫu nguyên liệu và mẫu

curcumin 5 gam sau nghiền khô 6 giờ

Mẫu

Nguyên liệu Diện tích bề mặt (m2/g) 1,348 Thể tích lỗ xốp (cm3/g) 0,005 Đường kính trung bình của lỗ xốp (Å) 123,9

Nghiền khô 6 giờ 6,570 0,055 301,4

Sau 6 giờ nghiền khô, diện tích bề mặt của DC tăng gấp khoảng 5 lần (diện tích bề mặt mẫu nguyên liệu và mẫu sau nghiền khô lần lượt là 1,348 và 6,570 m2/g,

còn kích thước lỗ xốp tăng khoảng 3 lần. Do vậy, sau khi nghiền, kích thước tiểu

phân giảm, diện tích bề mặt và độ xốp tăng.

Dựa trên cơ sở đó, nghiên cứu được tiến hành với tần số của thiết bị nghiền

bi là 30Hz và thời gian nghiền 6 giờ.

3.4.2.2. Giai đoạn nghiền ướt

Curcumin sau khi nghiền khô 6 giờ trên thiết bị nghiền bi inox được tiếp tục

nghiền ướt với khối lượng bi cố định 25 g mỗi buồng nghiền theo phương pháp ghi

ở mục 2.3.3.1 (quy trình B). Trong giai đoạn này, ảnh hưởng của kích thước bi, tần

số nghiền, thời gian nghiền được khảo sát.

 Ảnh hưởng của kích thước bi

Khảo sát giai đoạn nghiền ướt trong 4 giờ ở tần số 30Hz với hai loại bi kích

thước 0,65 và 0,8 mm. Các mẫu nghiền ướt được đánh giá KTTPTB và khoảng

phân bố KTTP bằng thiết bị Mastersizer 3000E như ở mục 2.3.3.3.b. Sau đó tiếp tục

pha loãng tạo hỗn dịch và đồng nhất hóa với tốc độ 18000 vòng/phút trong 60 phút.

Đánh giá KTTPTB và PDI bằng thiết bị Zetasizer Nano ZS90 Malvern. Kết quả

được trình bày ở bảng 3.37.

Bảng 3.37. Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân curcumin ở giai đoạn nghiền ướt

mẻ 5 gam với bi zirconi oxyd 0,8 và 0,65 mm (n = 3)

Nghiền ướt Đồng nhất hóa Kích thước bi KTTPTB (µm) Span KTTPTB (nm) PDI

0,8 mm 0,96 ± 0,11 2,67 ± 0,26 381,3 ± 22,4 0,437 ± 0,033

0,65 mm 3,045 ± 0,15 394,8 ± 25,09 1,07 ± 0,28

0,475 ± 0,013 Kết quả ở 3.37 cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về KTTPTB

giữa 2 mẫu nghiền ướt với kích thước bi khác nhau (p> 0,05). Sau khi đồng nhất

hóa, cả 2 mẫu đều có KTTPTB nhỏ hơn 500 nm và PDI đều nhỏ hơn 0,55. Do vậy,

sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về KTTPTB khi sử dụng hai loại bi kích

thước khác nhau.

 Ảnh hưởng của quá trình nghiền khô và thời gian nghiền ướt.

Nghiền ướt curcumin sử dụng buồng nghiền chứa bi zirconi oxyd trong các

khoảng thời gian khác nhau với các điều kiện chưa được nghiền khô bằng bi inox

trước đó và có nghiền khô bằng bi inox 6 giờ. Hỗn dịch nano được đồng nhất hóa

với tốc độ 18000 vòng/phút trong 60 phút theo phương pháp ghi ở mục 2.3.3.1 (quy

trình B). Kết quả đánh giá KTTPTB và PDI sau khi nghiền ướt bằng thiết bị

Mastersizer 3000E và sau đồng nhất hóa bằng thiết bị Zetasizer Nano ZS90

Malvern được trình bày trong bảng 3.38.

Bảng 3.38. Kết quả đánh giá KTTP của mẫu curcumin mẻ 5 gam ở giai đoạn

nghiền ướt tần số 30 Hz trong thời gian khác nhau (n = 3)

Nghiền ướt Đồng nhất hóa

Nghiền khô PDI Thời gian (giờ) KTTPTB (µm) Span KTTPTB (nm)

6 giờ, 30 Hz, bi inox 381,3 ± 22,4 0,437 ± 0,033

Không

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 6,32 ± 0,17 2,02 ± 0,07 3,94 ± 0,29 2,69 ± 0,13 2,07 ± 0,09 3,57 ± 0,21 0,96 ± 0,11 2,67 ± 0,26 2,27 ± 0,22 4,86 ± 0,18 1,54 ± 0,07 3,30 ± 0,14 10,44 ± 1,08 1,53 ± 0,15 8,28 ± 0,41 1,47 ± 0,16 4,25 ± 0,04 1,32 ± 0,06 3,16 ± 0,05 1,16 ± 0,04 3040,0 ± 106,0 1,000 ± 0,000 4,84 ± 0,33 1,99 ± 0,05 3,26 ± 0,06 1,90 ± 0,11

Kết quả ở bảng 3.38 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về KTTPTB

giữa mẫu có nghiền khô và không nghiền khô (p< 0,05). Đồng thời, ở các mẫu có

nghiền khô 6 giờ, sau 4 giờ nghiền ướt, KTTPTB có sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê so với các mẫu nghiền ướt với thời gian 1, 2, 3, 5 và 6 giờ (p< 0,05) (phân tích

post-hoc-kiểm định LSD). KTTPTB giảm xuống 0,96 ± 0,11µm sau 4 giờ nghiền

ướt, tuy nhiên nếu tiếp tục nghiền KTTPTB lại tăng lên. Điều đó có thể do trong

quá trình nghiền, tiểu phân được phân chia đến một mức độ nào đó nhưng khi năng

lượng tự do bề mặt quá lớn, sự kết tụ tiểu phân sẽ diễn ra. Kết quả đánh giá

KTTPTB và Span của mẫu nghiền ướt sau 4 giờ được thể hiện ở phụ lục 4.4.

Do vậy, curcumin được nghiền khô trong 6 giờ với thiết bị nghiền bi inox và

tiếp tục nghiền ướt trong 4 giờ với bi zirconi oxyd.

 Ảnh hưởng của tần số nghiền

Các mẫu curcumin sau khi nghiền khô 6 giờ được nghiền ướt trong 4 giờ với

bi zirconi oxyd kích thước 0,8 mm tại 2 tần số 15 và 30Hz theo phương pháp ghi ở

mục 2.3.3.1 (quy trình B). Kết quả đánh giá KTTPTB được trình bày ở hình 3.17.

7

6 )

5 m  (

4

3 15Hz

B T P T T K

2 30Hz

1

0

1

2

3

4

5

6

Thời gian nghiền (giờ) Axis Title Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn kích thước tiểu phân curcumin mẻ 5 gam trong giai

đoạn nghiền ướt ở hai tần số nghiền 15 và 30 Hz (n = 3)

Kết quả ở hình 3.17 cho thấy có sự khác biệt về KTTPTB có ý nghĩa thống kê

giữa 2 tần số nghiền 15 và 30 Hz (p< 0,05). Bắt đầu từ thời điểm 2 giờ trở đi,

KTTPTB ở tần số 30Hz luôn nhỏ hơn tần số 15Hz. Do vậy, tần số 30Hz được lựa

chọn để tiếp tục khảo sát các thông số tiếp theo.

Từ các nghiên cứu tiếp theo, curcumin được nghiền khô với bi inox, thời gian

6 giờ ở tần số 30 Hz và tiếp tục nghiền ướt với bi zirconi oxyd, thời gian 4 giờ ở tần

số 30 Hz.

3.4.2.3. Giai đoạn đồng nhất hóa

Mẫu sau khi nghiền ướt được pha loãng tạo hỗn dịch và tiến hành đồng nhất

hóa theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình B). Khảo sát ảnh hưởng của

tốc độ và thời gian đồng nhất hóa.

 Ảnh hưởng của tốc độ đồng nhất hóa

Khảo sát giai đoạn đồng nhất hóa hỗn dịch nano curcumin trong 60 phút với

tốc độ 18000 và 22000 vòng/phút, nhận thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống

100

kê về KTTPTB giữa hai mẫu khuấy với tốc độ khác nhau (p> 0,05). Khi tăng tốc độ

khấy từ 18000 lên 22000 vòng/phút, KTTP không thay đổi nhiều. Như vậy, tốc độ

18000 vòng/phút được lựa chọn để tiếp tục khảo sát các thông số khác.

Bảng 3.39. Kết quả đánh giá KTTPTB và PDI của hỗn dịch curcumin mẻ 5 gam

khuấy với tốc độ 18000 và 22000 vòng/phút (n = 3)

Tốc độ (vòng/phút) KTTP (nm) PDI

18000 381,3 ± 22,4 0,437 ± 0,073

22000 370,4 ± 34,8 0,438 ± 0,102

 Ảnh hưởng của thời gian đồng nhất hóa

Hỗn dịch nano curcumin được khảo sát thời gian đồng nhất hóa ở các thời

điểm 15, 30, 45, 60, 75 và 90 phút với tốc độ 18000 vòng/phút. Kết quả đánh giá

KTTPTB và PDI bằng thiết bị Zetasizer Nano ZS90 Malvern theo phương pháp ghi

1000

KTTPTB

PDI

0.9

ở mục 2.3.3.3.b được trình bày ở hình 3.18.

I

900 800

0.8

D P

700

0.7

)

0.6

600 500

0.5

400

0.4

m n ( B T P T T K

300

0.3

200

0.2

100

0.1

Thời gian đồng nhất hóa (phút)

Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn KTTPTB và PDI của hỗn dịch nano khuấy với tốc độ

18000 vòng/phút trong thời gian khuấy khác nhau (n = 3)

Đồ thị ở hình 3.18 cho thấy có sự khác biệt về KTTPTB giữa các mẫu khuấy

tốc độ cao với thời gian khác nhau (p< 0,05). Sau 60 phút đồng nhất hóa, KTTP có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với KTTP của mẫu khuấy trong 15, 30, 45, 75

và 90 phút (p< 0,05) (phân tích post-hoc-kiểm định LSD). Sau 60 phút, tiểu phân

101

nano đạt kích thước nhỏ hơn 400 nm. Tuy nhiên, nếu tiếp tục đồng nhất hóa, KTTP

tăng lên. Do đó, hỗn dịch nano được khuấy tốc độ cao trong thời gian 60 phút.

Các thông số trong giai đoạn phun sấy bao gồm nhiệt độ khí vào, tốc độ phun

dịch và tỷ lệ thông gió được giữ nguyên. Sơ đồ quy trình bào chế với các thông số

kỹ thuật và mô tả chi tiết từng giai đoạn trong quy trình bào chế được trình bày ở

phụ lục 5.

3.4.3. Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano curcumin quy mô 5 g/mẻ

Tiến hành bào chế 3 mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin, đánh giá các thông

số kỹ thuật trọng yếu theo kế hoạch lấy mẫu như bảng 2.6 nhằm thu được hệ tiểu

phân nano với các đặc tính mong muốn. Kết quả đánh giá một số đặc tính của hệ

tiểu phân nano ở giai đoạn sau phun sấy được trình bày cụ thể như sau:

3.4.3.1. Hình thái học tiểu phân nano

Hình thái học của tiểu phân được xác định bằng phương pháp ghi ở mục

2.3.3.3.a. Kết quả thể hiện ở hình 3.19.

Kết quả thể hiện ở hình 3.19 cho thấy: PVP ở dạng tiểu phân hình cầu (hình

3.19a), manitol ở dạng hình phiến không đồng nhất (hình 3.19b). Mẫu bột phun sấy

bào chế từ hỗn dịch gồm hỗn hợp vật lý của curcumin-Tween 80-PVP-manitol tồn

tại hỗn độn giữa các tiểu phân hình cầu và hình phiến (hình 3.19c). Mẫu tiểu phân

nano phun sấy không chứa manitol ở dạng hình cầu, bề mặt nhẵn, kết tụ thành từng

đám (hình 3.19e). Điều này chứng tỏ các tinh thể curcumin bị phân tán vào trong

cấu trúc hình cầu của tiểu phân PVP. Khi có mặt manitol, tiểu phân nano vẫn giữ

nguyên hình cầu, trong đó tinh thể manitol tồn tại hỗn độn hoặc bám dính trên bề

mặt tiểu phân PVP (hình 3.19f).

102

a b

5 m

15 m

d c

2 m

5 m

e f

2 m

1 m

Hình 3.19. Hình ảnh chụp SEM của một số tá dược, hỗn hợp vật lý phun sấy, mẫu

trắng phun sấy và bột phun sấy chứa nano curcumin

Chú thích: (a): PVP; (b): manitol; (c): bột phun sấy bào chế từ hỗn dịch

gồm hỗn hợp vật lý của curcumin-Tween 80-PVP-manitol trong nước; (d): bột phun

sấy bào chế từ dung dịch gồm PVP-Tween 80-manitol trong nước (mẫu trắng phun

sấy); (e): bột phun sấy chứa nano curcumin không manitol; (f): bột phun sấy chứa

nano curcumin có manitol.

Kết quả chụp hình thái tiểu phân sau khi rửa loại tá dược theo phương pháp

ghi ở mục 2.3.3.3.a được thể hiện ở hình 3.20.

103

300 nm

Hình 3.20. Hình ảnh chụp hình thái tiểu phân nano curcumin sau khi rửa loại tá

dược

Trên hình chụp, KTTPTB nano curcumin khoảng 300-500 nm và không thấy

có sự xuất hiện của tinh thể với các cạnh sắc và rõ như mẫu nguyên liệu curcumin

ban đầu.

3.4.3.2. Kích thước tiểu phân và hệ số đa phân tán

Đánh giá KTTPTB và PDI của 3 mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin bằng

thiết bị Zetasizer ZS90 Malvern. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.40 và phụ lục 4.5,

4.6 và 4.7.

Bảng 3.40. KTTPTB và PDI của các mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin (n = 3)

Chỉ tiêu chất lượng Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3

336,7 ± 18,6 359,5 ± 17,8 385,8 ± 22,4 KTTP TB

(nm) Chỉ tiêu chấp nhận: KTTPTB < 500 nm

0,387 ± 0,032 0,416 ± 0,040 0,336 ± 0,027 PDI Chỉ tiêu chấp nhận: PDI < 0,550

Sự khác biệt về KTTPTB giữa 3 mẻ có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Phân tích

post-hoc (kiểm định LSD) cho thấy KTTPTB của mẻ 1 có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê so với mẻ 2 và 3 (p< 0,05). Mặc dù vậy, cả KTTPTB và PDI của mẫu

nano sau phun sấy vẫn nằm trong giới hạn cho phép.

104

3.4.3.3. Diện tích bề mặt và độ xốp

Hệ tiểu phân nano được đánh giá diện tích bề mặt và độ xốp theo phương pháp

mô tả ở mục 2.3.3.3.d. Tuy nhiên, diện tích bề mặt của hệ tiểu phân nano không xác

định được theo thuyết BET.

Trạng thái kết tinh được xác định bằng cách phân tích phổ nhiễu xạ tia X. Từ

3.4.3.4. Phổ nhiễu xạ tia X và giản đồ nhiệt vi sai

mật độ và cường độ của các pic trong phổ nhiễu xạ cho biết mức độ kết tinh của tiểu

1 3 0 0

1 2 0 0

1 1 0 0

1 0 0 0

9 0 0

phân nano curcumin. Kết quả phổ nhiễu xạ tia X được trình bày ở hình 3.21.

8 0 0

) s p C

7 0 0

( n L

6 0 0

Curcumin

5 0 0

4 0 0

3 0 0

2 0 0

Mẫu trắng phun sấy

1 0 0

1 0

4 0

2 0

3 0

Bột phun sấy chứa nano curcumin

Góc nhiễu xạ 2- (o)

2 - T h e ta - S c a l e F i l e : N a n o . r a w - T y p e : 2 T h /T h l o c k e d - S t a r t : 1 .0 1 3 ° - E n d : 4 9 . 8 6 5 ° - S t e p : 0 . 0 3 0 ° - S t e p t im e : 0 . 3 s - T e m p . : 2 5 ° C ( R o o m ) - T i m e S t a r t e d : 1 2 s - Y + 3 5 . 0 m m - F i le : H o n g A n h M a u t r a n g .r a w - T y p e : 2 T h / T h lo c k e d - S t a r t : 1 . 0 0 0 ° - E n d : 4 9 . 9 9 0 ° - S t e p : 0 . 0 3 0 ° - S t e p t im e : 0 . 3 s - T e m p . : 2 5 ° C (

Y + 7 0 . 0 m m - F i le : N g u y e n l i e u C u r c u m i n . r a w - T y p e : 2 T h / T h lo c k e d - S t a r t : 1 . 0 0 0 ° - E n d : 6 4 . 9 3 0 ° - S t e p : 0 . 0 3 0 ° - S t e p t im e : 0 .3 s - T e m p .: 2 5 °

Hình 3.21. Phổ nhiễu xạ tia X của mẫu curcumin, mẫu trắng phun sấy và bột

phun sấy chứa nano curcumin

Kết quả được trình bày ở hình 3.21 cho thấy: mẫu nano curcumin có mật độ và

cường độ pic đã giảm đi đáng kể so với mẫu nguyên liệu ban đầu, chứng tỏ mẫu

nano curcumin đã chuyển một phần sang trạng thái vô định hình.

Đồng thời, giản đồ nhiệt vi sai của curcumin, một số tá dược và bột phun sấy

chứa nano curcumin được thể hiện ở hình 3.22 và phụ lục 4.8.

105

)

W m

( t ệ i h n g n ò D

Nhiệt độ (oC)

Hình 3.22. Giản đồ nhiệt vi sai của curcumin, một số tá dược và bột phun sấy chứa

nano curcumin

Giản đồ nhiệt vi sai ở hình 3.22 cho thấy có sự dịch chuyển của pic thu nhiệt

đối với mẫu nano curcumin so với nguyên liệu curcumin ban đầu. Nhiệt độ nóng chảy của curcumin khoảng 198,3oC, trong khi nhiệt độ nóng chảy của mẫu nano curcumin khoảng 169,5oC. Đồng thời, enthalpy nóng chảy của mẫu nano curcumin

là 83,7 J/g, giảm xuống so với nguyên liệu ban đầu (126,9 J/g).

3.4.3.5. Phổ hồng ngoại của hệ tiểu phân nano

Để có thể thấy rõ hơn tương tác giữa curcumin và tá dược ở trạng thái rắn, bột

phun sấy chứa nano curcumin được tiến hành phân tích phổ hồng ngoại. Hình ảnh

phổ hồng ngoại của hệ tiểu phân nano được thể hiện ở hình 3.23, kết hợp với phụ

lục 2.2 và 4.9 cho thấy có sự thay đổi về dao động hóa trị O-H tại số sóng 3502,73 cm-1 trên hình ảnh phổ của hệ tiểu phân nano. Đây có thể do tương tác bởi liên kết

hydro nội phân tử giữa curcumin và PVP, tương tự như kết quả nghiên cứu hệ phân

tán rắn của curcumin và PVP của Kaewnopparat N. và cộng sự [45].

106

(cm-1)

Hình 3.23. Phổ hồng ngoại của curcumin, một số tá dược, hỗn hợp vật lý và bột

phun sấy chứa nano curcumin

3.4.3.6. Hiệu suất, mất khối lượng do làm khô và khối lượng riêng biểu kiến

Hiệu suất phun sấy, mất khối lượng do làm khô và khối lượng riêng biểu kiến

được đánh giá theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.3.e, f và g. Kết quả trình bày ở

bảng 3.41.

Bảng 3.41. Kết quả đánh giá hiệu suất phun sấy và mất khối lượng do làm khô và

khối lượng riêng biểu kiến của bột phun sấy chứa nano curcumin

Mẻ Hiệu suất (%) Mất khối lượng do làm khô (%)

Khối lượng riêng biểu kiến (g/ml) 0,329 ± 0,024 1 65,6 9,35

0,350 ± 0,017 2 64,2 8,87

0,345 ± 0,009 3 65,8 9,67

Chỉ tiêu chấp nhận  60,0%  12,0%  0,250

107

3.4.3.7. Hàm lượng curcumin

Hàm lượng curcumin trong bột phun sấy chứa nano curcumin được định lượng

theo phương pháp ghi ở mục 2.3.3.3.h. Kết quả được trình bày ở bảng 3.42.

Bảng 3.42. Hàm lượng curcumin trong bột phun sấy (n = 3)

Hàm lượng CUR (%) Phương pháp định lượng Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3

Quang phổ hấp thụ UV-Vis 42,29 ± 0,36 41,49 ± 0,42 41,62 ± 0,19

HPLC 42,36 ± 0,24 42,24 ± 0,13 41,82 ± 0,27

40,00-43,50 % Chỉ tiêu chấp nhận

Kết quả ở bảng 3.42 cho thấy: hàm lượng curcumin không có sự khác biệt

đáng kể khi định lượng bằng hai phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis hoặc

HPLC. Hàm lượng curcumin trong bột phun sấy đều nằm trong giới hạn từ 40,00%-

43,50%.

3.4.3.8. Độ tan

Độ tan của hệ tiểu phân nano được đánh giá theo phương pháp mô tả ở mục

2.3.3.3.i và kết quả được trình bày ở bảng 3.43.

Bảng 3.43. Kết quả đánh giá độ tan của curcumin và bột phun sấy chứa nano

curcumin (n=3)

Bột phun sấy chứa nano curcumin Mẫu Nguyên liệu Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3

Độ tan (µg/ml) 0,17 ± 0,04 1,96 ± 0,08 1,91 ± 0,12 1,98 ± 0,10

Độ tan của hệ tiểu phân nano lớn hơn nhiều lần so với nguyên liệu ban đầu,

chứng tỏ hệ tiểu phân nano đã cải thiện được độ tan của curcumin. Đây là một trong

những đặc tính quan trọng của hệ tiểu phân nano được ứng dụng trong bào chế để

tăng SKD của thuốc.

3.4.3.9. Độ hòa tan

Độ hòa tan của 3 mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin được thử theo phương

pháp mô tả ở mục 2.3.3.3.i. Kết quả đánh giá độ hòa tan được trình bày ở bảng 3.44.

108

Bảng 3.44. Phần trăm curcumin hòa tan từ 3 mẻ bột phun sấy chứa nano curcumin

ở quy mô 5 gam (n=3)

% CUR hòa tan

Thời gian (phút) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3

Mấu 1 g tối ưu hóa 73,1 ± 2,5 10 63,8 ± 2,4 66,4 ± 1,8 68,1 ± 1,7

20 78,8 ± 2,6 76,9 ± 1,5 75,8 ± 2,0 83,0 ± 1,1

30 83,2 ±1,7 82,4 ± 0,9 93,6 ± 0,9 90,8 ± 2,6

40 93,5 ± 1,9 89,6 ± 1,5 97,3 ± 1,6 93,2 ± 2,8

50 97,1 ± 0,8 98,1 ± 1,3 99,8 ± 2,1 97,7 ± 1,6

60 100,7 ± 1,0 100,2 ± 2,2 102,7 ± 1,6 102,1 ± 1,5

63,5 63,2 81,5

Tỷ lệ % CUR hòa tan sau 60 phút  95,0% Giá trị f2 Chỉ tiêu chấp nhận

Độ hòa tan curcumin từ 3 mẻ curcumin khác biệt không đáng kể so với mẫu

nghiên cứu ở quy mô 1 g (các giá trị f2> 50) và đạt yêu cầu giới hạn chấp nhận.

3.4.4. Dự kiến tiêu chuẩn chất lượng

Dựa trên những kết quả đánh giá đặc tính hệ tiểu phân nano curcumin từ 3 mẻ

nghiên cứu, một số tiêu chuẩn chất lượng của bột phun sấy chứa nano curcumin

được đề xuất như bảng 3.45. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở được trình bày ở phụ lục 6.

Bảng 3.45. Dự kiến tiêu chuẩn chất lượng của bột phun sấy chứa nano curcumin

Dự kiến tiêu chuẩn Chỉ tiêu

Bột màu vàng, tơi xốp Cảm quan

Kích thước tiểu phân (nm) Hệ số đa phân tán PDI Mất khối lượng do làm khô (%) < 500 < 0,550  12,0

Khối lượng riêng biểu kiến (g/ml)  0,250

Định tính

Sắc ký đồ có 1 pic với thời gian lưu trùng với thời gian lưu của pic curcumin chuẩn 40,00- 43,50 Hàm lượng curcumin trong bột phun sấy (%)

≥ 95,0 % sau 60 phút Độ hòa tan

109

3.5. THEO DÕI ĐỘ ỔN ĐỊNH

Độ ổn định của hệ tiểu phân nano được nghiên cứu ở hai điều kiện đã mô tả ở

mục 2.3.4.

3.5.1. Độ ổn định cấu trúc hệ tiểu phân

Sau 9 tháng bảo quản ở điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc,

hệ tiểu phân nano curcumin được chụp hình ảnh bằng kính hiển vi điện tử quét. Kết

quả thể hiện ở hình 3.24.

a b

2 m

4 m

c d

300 nm

Hình 3.24. Hình ảnh chụp SEM của mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin và nano

curcumin được rửa loại tá dược sau 9 tháng ở điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện

lão hóa cấp tốc

Chú thích: (a): bột phun sấy chứa nano curcumin sau 9 tháng ở điều kiện thực; (b):

bột phun sấy chứa nano curcumin sau 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc; (c):

nano curcumin sau 9 tháng ở điều kiện thực; (d): nano curcumin sau 6 tháng ở điều

kiện lão hóa cấp tốc

110

Kết quả ở hình 3.24 cho thấy: hệ tiểu phân nano vẫn tồn tại ở dạng cấu trúc và

hình thái như ban đầu sau thời gian theo dõi độ ổn định.

3.5.2. Độ ổn định kích thước tiểu phân và khoảng phân bố kích thước tiểu

phân

Sau mỗi 3 tháng, phân tán hệ nano phun sấy vào nước và xác định KTTP bằng

phương pháp ghi ở mục 2.3.3.3.b. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.46 và 3.47.

Bảng 3.46. Kích thước tiểu phân nano curcumin sau 9 tháng bảo quản ở điều kiện

thực (n = 3)

Mẻ Chỉ tiêu 0 Thời gian (tháng) 6 3 9

356,3± 22,2 369,9 ± 12,4 347,2 ± 18,4 359,1 ± 16,7 1

0,400 ± 0,035 0,346 ± 0,035 0,352 ± 0,019 0,365 ± 0,021

415,9 ± 30,8 406,9 ± 30,8 351,5 ± 16,1 363,2 ± 12,3 2

0,444 ± 0,052 0,410 ± 0,043 0,355 ± 0,021 0,355 ± 0,018

379,8 ± 11,7 387,0 ± 11,7 357,2 ± 18,1 361,2 ± 15,5 3

KTTPTB (nm) PDI KTTPTB (nm) PDI KTTPTB (nm) PDI 0,354 ± 0,026 0,321 ± 0,025 0,371 ± 0,021 0,152 ± 0,027

Bảng 3.47. Kích thước tiểu phân nano curcumin sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện

lão hóa cấp tốc (n = 3)

Mẻ Chỉ tiêu

3 Thời gian (tháng) 6 3 0 356,3± 22,2 368,8 ± 16,5 346,8 ± 18,6 0,400 ± 0,035 0,334 ± 0,019 0,405 ± 0,043 415,9 ± 30,8 372,6 ± 17,2 362,3 ± 18,5 0,398 ± 0,022 0,371 ± 0,039 0,366 ± 0,034 379,8 ± 11,7 361,3 ± 0,035 384,3 ± 17,7 0,354 ± 0,026 0,362 ± 0,032 0,352 ± 0,019 KTTPTB (nm) PDI KTTPTB (nm) PDI KTTPTB (nm) PDI

Kết quả cho thấy: ở điều kiện thực, sự khác nhau về KTTPTB của tiểu phân

nano sau phun sấy và sau 3, 6 và 9 tháng có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Phân tích

post-hoc (kiểm định LSD) cho thấy: KTTPTB của mẻ 2 và 3 có thay đổi trong 9

tháng ở điều kiện thực so với ban đầu (p< 0,05), còn KTTPTB của mẻ 1 có sự thay

111

đổi không đáng kể (p> 0,05). Tương tự, ở điều kiện lão hóa cấp tốc, sự khác nhau

về KTTPTB của tiểu phân nano sau phun sấy và sau thời gian theo dõi 3, 6 tháng có

ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Phân tích post-hoc (kiểm định LSD) cho thấy: KTTPTB

của mẫu nano sau 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê so với ban đầu (p< 0,05). Mặc dù vậy, KTTPTB và PDI vẫn nằm trong

giới hạn cho phép.

3.5.3. Độ ổn định đặc tính kết tinh của hệ tiểu phân

Đặc tính kết tinh của hệ tiểu phân nano sau thời gian theo dõi ở hai điều kiện

được đánh giá bằng phổ nhiễu xạ tia X. Kết quả được trình bày ở hình 3.25.

Góc nhiễu xạ 2- (o)

Hình 3.25. Phổ nhiễu xạ tia X của bột phun sấy chứa nano curcumin sau 9 tháng ở

điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc

Kết quả ở hình 3.25 cho thấy: đặc tính kết tinh của hệ tiểu phân nano sau thời

gian theo dõi hầu như không thay đổi.

3.5.4. Mất khối lượng do làm khô

Sau thời gian bảo quản 9 tháng ở điều kiện thực, kết quả xác định mất khối

lượng do làm khô của cả 3 mẻ lần lượt là 9,63, 9,04 và 9,74% và vẫn nằm trong giới

hạn cho phép. Tương tự, kết quả xác định mất khối lượng do làm khô sau 6 tháng ở

112

điều kiện lão hóa cấp tốc cũng vẫn nằm trong giới hạn cho phép. Điều đó chứng tỏ

bao bì vỉ nhôm-nhôm đã hạn chế được sự thấm của hơi ẩm vào bên trong chế phẩm.

3.5.5. Độ ổn định về hàm lượng

Kết quả theo dõi hàm lượng curcumin trong bột phun sấy được trình bày ở

bảng 3.48. Các sắc ký đồ được trình bày ở phụ lục 7.

Bảng 3.48. Phần trăm curcumin trong bột phun sấy bảo quản ở điều kiện thực và

lão hóa cấp tốc so với ban đầu (n = 3)

Điều kiện

Thực

LHCT

Thời gian (tháng) 0 1 3 6 9 1 3 6 Mẻ 1 100 100,90 ± 1,42 98,95 ± 1,60 97,19 ± 1,30 98,20 ± 1,40 98,24 ± 1,82 97,80 ± 1,52 99,24 ± 1,85 % hàm lượng so với ban đầu Mẻ 2 100 101,25 ± 0,71 102,57 ± 0,82 100,34 ± 0,79 99,37 ± 0,54 101,28 ± 0,83 98,68 ± 0,72 98,83 ± 0,71 Mẻ 3 100 101,53 ± 0,84 100,25 ± 0,73 99,38 ± 0,67 98,85 ± 0,69 99,65 ± 0,73 98,14 ± 0,81 98,42 ± 0, 69

Sau 9 tháng bảo quản ở điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc,

hàm lượng curcumin trong bột phun sấy đóng trong viên nang so với ban đầu vẫn

đạt yêu cầu.

3.5.6. Độ ổn định về tốc độ hòa tan

Đánh giá độ hòa tan của hệ tiểu phân nano sau 9 tháng bảo quản ở điều kiện

thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc theo phương pháp trình bày ở mục

2.3.3.3.i. Kết quả được trình bày ở bảng 3.49.

Các hệ số f2 so với ban đầu lớn hơn 50 chứng tỏ độ hòa tan của các mẫu bảo

quản ở điều kiện thực sau 9 tháng và lão hóa cấp tốc sau 6 tháng không có sự thay

đổi đáng kể so với thời điểm ban đầu. Như vậy có thể sơ bộ kết luận hệ tiểu phân

nano đạt chỉ tiêu về độ hòa tan trong thời gian theo dõi.

113

Bảng 3.49. Độ hòa tan của 3 mẫu bột phun sấy chứa tiểu phân nano sau 9 tháng ở

điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc

Điều kiện

c ự h T

Mẻ 1 62,8 ± 2,5 70,2 ± 1,8 81,4 ± 1,5 90,5 ± 2,4 97,6 ± 0,9 100,1 ± 1,0 Mẻ 2 59,9 ± 2,4 70,1 ± 1,1 80,6 ± 1,1 88,8 ± 0,9 95,1 ± 0,9 99,8 ± 1,3 Mẻ 3 65,1 ± 2,8 73,2 ± 2,1 88,4 ± 2,1 92,1 ± 1,8 98,3 ± 1,2 100,2 ± 1,1

70,1 74,6 70,9

T C H L

61,4 ± 2,3 68,2 ± 1,5 78,5 ± 1,1 87,4 ± 0,9 94,3 ± 0,8 98,3 ± 1, 6 58,8 ± 2,7 67,1 ± 2,6 79,2 ± 1,9 88,4 ± 1,1 94,0 ± 0,8 98,3 ± 0,9 62,7 ± 1,9 75,3 ± 2,5 89,4 ± 1,6 93,1 ± 1,9 96,0 ± 0,8 99,8 ± 0,7

61,9 68,5 70,0 Thời gian (phút) 10 20 30 40 50 60 Giá trị f2 so với ban đầu 10 20 30 40 50 60 Giá trị f2 so với ban đầu

3.6. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG

3.6.1. So sánh sinh khả dụng của hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano curcumin

Sinh khả dụng của hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano được đánh giá trên hai

nhóm chuột với bố trí thí nghiệm được trình bày ở mục 2.3.5. Các mẫu huyết tương

chuột thu được sau khi cho uống hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano chứa curcumin

được xử lý và định lượng theo phương pháp mô tả trong mục 2.3.1.3. Kết quả xác

định nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch quy ước

được thể hiện ở bảng 3.50.

114

Bảng 3.50. Nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch quy

ước chứa curcumin

Nồng độ CUR trong huyết tương (ng/ml)

Thời gian (phút) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 60 120 240 360 2,6 0* 1,4 1,0 2,0 2,3 0,6 1,5 1,6 1,8 2,0 1,0 0,3* 2,0 0,8 3,9 1,3 3,1 1,3 2,6 1,1 1,3 1,2 1,0 0,9 0,8 0,7 2,0 2,6 0* 3,2 1,6 0,5 1,5 0,7 2,8 1,5 0,7 0,7 1,6 1,7 0,6 2,6 3,2 1,9 1,5 1,1 1,7 1,3 1,2 4,3** 0,7 GTTB ± SD (ng/ml) 1,7 ± 0,7 1,5 ± 0,5 2,1 ± 1,3 1,5 ± 0,7 2,6 ± 0,8 1,6 ± 0,5 1,2 ± 0,9 1,2 ± 0,2 1,3 ± 0,4 1,5 ± 0,7 1,6 ± 0,5 0,9 ± 0,2 0,8 ± 0,1 1,4 1,4 1,8 1,7 7,4** 5,0** 0,4* 1,0 1,4 0,9 1,7 1,0 0,2* 0,4* 1,8 0,3* 1,0 1,5 0,9 1,8 1,2 1,1 0,9 2,2 0,7 0,8 Chú thích: (*): nồng độ dưới LLOQ; (**): nồng độ cao bất thường

Kết quả ở bảng 3.50 cho thấy: tại hầu hết các thời điểm khảo sát, nồng độ

curcumin trong huyết tương chuột đối với nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước đều

thấp. Một số thời điểm, nồng độ này thấp hơn giới hạn định lượng dưới của phương

pháp định lượng (dưới 0,5 ng/ml). Ngoài ra, tại một số thời điểm (25, 30 và 240

phút), nồng độ curcumin trên một số chuột cao hơn hẳn so với các chuột cùng

nhóm (vượt quá GTTB ± 3SD). Các điểm này đều bị loại bỏ khi xử lý thống kê và

tính toán các thông số dược động học của curcumin trên nhóm chuột uống hỗn dịch

quy ước.

Đối với nhóm chuột uống hỗn dịch nano, kết quả xác định nồng độ curcumin

trong huyết tương chuột ở bảng 3.51 cho thấy: tại tất cả các thời điểm khảo sát,

nồng độ curcumin đều cao hơn so với nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước. Không

có thời điểm nào mà nồng độ curcumin trong huyết tương ở dưới giới hạn định

lượng dưới. Tại một số thời điểm (20 và 25 phút), nồng độ curcumin trên một số

chuột cao bất thường. Những điểm này bị loại bỏ khi xử lý thống kê và tính toán các

thông số dược động học của curcumin trên nhóm chuột uống hỗn dịch nano.

115

Bảng 3.51. Nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch nano

chứa curcumin

Nồng độ CUR trong huyết tương (ng/ml)

22,7 40,2 20,2

Chú thích: (**): nồng độ cao bất thường

Thời gian (phút) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 60 120 240 420 13,6 20,6 31,8 35,5 21,6 40,1 22,0 9,8 12,7 12,2 4,2 11,5 2,8 15,5 16,3 15,8 93,8** 78,6** 18,8 21,4 19,1 6,5 21,5 11,1 11,4 9,5 3,5 20,2 18,2 12,7 21,7 11,5 11,2 10,7 8,9 5,0 21,5 19,0 16,0 44,6 24,1 20,3 20,8 18,3 12,9 12,8 11,3 10,5 5,1 15,9 13,1 12,1 34,8 60,1** 18,0 8,9 17,2 11,9 15,5 7,5 8,9 5,0 8,3 22,2 10,5 35,5 21,3 30,3 39,5 19,7 22,5 10,5 9,6 9,2 6,9 GTTB ± SD (ng/ml) 16,3 ± 5,3 21,9 ± 9,5 17,7 ± 7,7 37,6 ± 4,7 21,2 ± 2,0 24,7 ± 8,8 20,5 ± 10,6 15,5 ± 6,0 15,5 ± 5,1 12,2 ± 1,8 9,1 ± 2,8 9,8 ± 1,0 4,7 ± 1,4

Để có thể minh họa rõ hơn sự khác nhau về nồng độ curcumin trong huyết

tương giữa hai nhóm chuột, các số liệu được biểu diễn dưới dạng đường cong nồng

Hỗn dịch quy ước

Hỗn dịch nano

độ curcumin trung bình theo thời gian. Kết quả thể hiện ở hình 3.26.

) l

g n o r t

40 35 30 25

m / g n ( g n ơ ư t t ế y u h

R U C ộ đ g n ồ N

100

150

250

300

350

400

450

200

Thời gian (phút)

Hình 3.26. Đường cong nồng độ curcumin-thời gian của hai nhóm chuột uống hỗn

dịch quy ước và hỗn dịch nano

116

Kết quả ở hình 3.26 cho thấy: đường cong nồng độ curcumin-thời gian với sai

số lớn, đặc biệt ở những thời điểm trước 60 phút, do các giá trị nồng độ tại mỗi thời

điểm được thu thập từ nhiều cá thể. Tuy nhiên, tại các thời điểm 60, 120, 240 và

420 phút, nồng độ curcumin trong huyết tương ổn định và sai số thấp hơn giữa các

cá thể.

Các thông số liên quan đến hấp thu thuốc qua đường uống trên nhóm chuột

uống hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano được tính toán theo phương pháp không

dựa trên mô hình ngăn, lấy mẫu “rải rác” (sparse sampling). Số liệu thu được trình

bày ở bảng 3.52.

Bảng 3.52. Một số thông số dược động học của curcumin trên chuột uống hỗn dịch

quy ước và hỗn dịch nano tính toán không dựa trên mô hình ngăn

Ghi chú: - Do việc lấy mẫu máu chuột là “rải rác” (sparse sampling) nên giá trị SE không được tính toán với một số

thông số DĐH

- Chỉ xác định AUC0240 phút do tại thời điểm 360 phút đối với hỗn dịch quy ước, nồng độ CUR trong huyết

tương rất thấp

Thông số z (phút-1) Tmax (phút) Cmax (ng/ml) SE Cmax AUC0240 phút (ng/ml.phút) SE AUC0240 phút MRT (phút) Hỗn dịch quy ước 0,003 25 2,6 0,4 326,4 21,3 107,2 Hỗn dịch nano 0,003 20 37,6 2,3 2874,4 118,2 101,7

Kết quả ở bảng 3.52 cho thấy: nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước và hỗn dịch

nano đạt được Cmax sau lần lượt khoảng 25 và 20 phút, chứng tỏ hỗn dịch nano hấp

thu nhanh hơn so với hỗn dịch quy ước. Nồng độ thuốc cực đại trong huyết tương

trên chuột uống hỗn dịch nano cao gấp 14,5 lần, giá trị AUC0240 phút cao gấp 8,8 lần

so với hỗn dịch quy ước. Thời gian lưu trung bình của hỗn dịch quy ước gần tương

tự như đối với hỗn dịch nano. Như vậy, hỗn dịch nano bào chế từ hệ tiểu phân nano

cải thiện SKD của curcumin so với hỗn dịch quy ước. Kết quả này cũng tương tự

kết quả nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của hỗn dịch nano chứa curcumin của

Gao Y. và cộng sự [30]. Một số sắc ký đồ định lượng curcumin và

117

tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột tại thời điểm 10 và 20 phút được trình

bày ở phụ lục 8.1, 8.2, 8.3 và 8.4.

3.6.2. Xác định các thông số dược động học của chất gốc curcumin và

tetrahydrocurcumin trên chuột sau khi uống hỗn dịch nano curcumin

Đối với nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước, nồng độ chất chuyển hóa

tetrahydrocurcumin (THC) rất thấp và hầu hết đều dưới nồng độ LLOQ (0,5 ng/ml).

Riêng đối với nhóm chuột uống hỗn dịch nano, nồng độ chất chuyển hóa THC trên

nhóm chuột uống hỗn dịch nano được trình bày ở bảng 3.53. Kết quả cho thấy:

nồng độ chất chuyển hóa THC trên nhóm chuột uống hỗn dịch nano không cao. Tại

một số thời điểm, nồng độ THC ở dưới giới hạn định lượng dưới.

Bảng 3.53. Nồng độ chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin sau khi uống hỗn dịch

nano curcumin

Nồng độ THC trong huyết tương (ng/ml)

Thời gian (phút) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 60 120 240 420 0,3 5,8 0 6,2** 0 0,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3,5** 0 1,2 0 0 3,9 0 0 0 0 4,0 0 0 2,2 1,8 0 0 1,8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2,5** 0,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,2 0 0,5 1,3 0 1,2 0 0 0 1,0 0 0 0 0 0 3,8 3,7 0 0 0 0 0 0 Chú thích: (**): các chuột bị loại ở bảng 3.51

Các thông số dược động học của CUR và chất chuyển hóa THC trên nhóm

chuột uống hỗn dịch nano được tính toán và xử lý thống kê dựa trên mô hình dược

động học quần thể một ngăn có chuyển hóa (sơ đồ hình 2.3). Do có sự khác nhau về

khối lượng của chuột trong nhóm nên một số thông số dược động học trên chuột có

thể bị ảnh hưởng. Kết quả xử lý bằng phần mềm sau khi chạy các kịch bản hiệp biến

khác nhau cho thấy: mô hình một ngăn có chuyển hóa với hiệp biến khối lượng

chuột ảnh hưởng đến thể tích phân bố, hằng số tốc độ hấp thu và hằng số tốc độ thải

118

trừ là mô hình thích hợp hơn cả với giá trị -2 log-likelihood và AIC nhỏ nhất. Do

đó, mô hình này được lựa chọn để tính toán các thông số dược động học.

Nồng độ CUR và THC trên nhóm chuột uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình

một ngăn có chuyển hóa, được biểu diễn lần lượt ở đồ thị hình 3.27, 3.28, 3.29 và

3.30.

) l

m / g n (

R U C ộ đ g n ồ N

Thời gian (phút)

m / g n ( g n ơ ư t t ế y u h g n o r t

R U C ộ đ g n ồ N

Thời gian (phút)

Hình 3.27. Đồ thị biểu diễn nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống

hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa

R U C C g o L

Thời gian (phút)

Hình 3.28. Đồ thị dạng logarit biểu diễn nồng độ curcumin trong huyết tương chuột

sau khi uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa

119

) l

m / g n (

C H T ộ đ g n ồ N

Thời gian (phút)

m / g n ( g n ơ ư t t ế y u h g n o r t

C H T ộ đ g n ồ N

Thời gian (phút)

Hình 3.29. Đồ thị biểu diễn nồng độ tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột

sau khi uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa

C H T C g o L

Thời gian (phút)

Hình 3.30. Đồ thị dạng logarit biểu diễn nồng độ tetrahydrocurcumin trong huyết

tương chuột sau khi uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa

Kết quả tính toán các thông số dược động học dựa trên mô hình đã nêu được

thể hiện ở bảng 3.54.

120

Bảng 3.54. Báo cáo  một số thông số dược động học của curcumin và

tetrahydrocurcumin trên chuột uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có

chuyển hóa

Giá trị Thông số DĐH Đơn vị trung bình

phút-1 65,2 Hằng số tốc độ hấp thu của chất gốc (Ka)

Thể tích phân bố của chất gốc (V) ml 49885,4

Hằng số tốc độ chuyển hóa từ chất gốc sang phút-1 0,00007 chất chuyển hóa (Km)

phút-1 0,003 Hằng số tốc độ thải trừ của chất gốc (Ke)

42,3 Thể tích phân bố của chất chuyển hóa (Vm)

ml phút-1 36,3 Hằng số tốc độ thải trừ của chất chuyển hóa (Kem)

Kết quả ở bảng 3.54 cho thấy có sự chuyển hóa thuận từ CUR thành THC với hằng số tốc độ chuyển hóa 0,00007 (phút-1). Do sự chuyển hóa này, nồng độ CUR

xác định được trong huyết tương rất thấp, dẫn đến SKD thấp.

Như vậy, mặc dù có mức độ chênh lệch nhất định do ảnh hưởng của sai số

giữa các cá thể khác nhau và thời điểm thử khác nhau, cỡ mẫu nghiên cứu còn nhỏ,

nhưng các kết quả thu được đã có ý nghĩa bước đầu cho thấy: SKD của hỗn dịch

nano bào chế được cao hơn so với hỗn dịch quy ước. Đồng thời, dựa vào mô hình

nghiên cứu, hằng số tốc độ chuyển hóa từ chất gốc curcumin sang chất chuyển hóa

tetrahydrocurcumin đã được xác định.

121

Chương 4. BÀN LUẬN

4.1. VỀ HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA CURCUMIN

Curcumin là một DC ít tan thuộc nhóm IV trong hệ thống phân loại sinh dược

học [104]. Mặc dù có nhiều tác dụng dược lý nhưng dạng thuốc dùng đường uống

chứa curcumin vẫn có nhiều vấn đề về SKD. Nguyên nhân do curcumin ít tan và bị

chuyển hóa, thải trừ nhanh. Chính vì vậy, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới

đã nghiên cứu biện pháp làm tăng SKD của curcumin dùng đường uống theo hai

hướng: tăng độ tan, tốc độ hòa tan và giảm chuyển hóa, thải trừ của curcumin.

Trong đó, hướng nghiên cứu biện pháp làm tăng độ tan và tốc độ hòa tan của

curcumin phổ biến hơn cả. Các biện pháp được áp dụng là bào chế dưới dạng hệ

phân tán rắn, hệ nano tinh thể, micel chất diện hoạt, hệ tự nhũ hóa, vi nhũ tương,

nhũ tương nano… Trong số các biện pháp làm tăng độ tan và độ hòa tan trên, hệ

tiểu phân nano tinh thể có nhiều ưu điểm nổi trội, dễ dàng ứng dụng vào các dạng

thuốc rắn dùng đường uống.

Trong nghiên cứu này, hệ tiểu phân nano được bào chế bằng phương pháp

giảm kích thước tiểu phân, sử dụng kỹ thuật nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng

nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn. Đây là phương pháp đơn giản, khả thi, có thể ứng

dụng vào thực tế sản xuất. Trong quá trình nghiền, tiểu phân dược chất bị phân chia

thành các tiểu phân kích thước nhỏ hơn. Các tiểu phân bị phân chia này tiếp xúc với

môi trường nước chứa chất diện hoạt và polyme thân nước, có thể xảy ra hiện tượng

hòa tan từ bề mặt tiểu phân tạo dung dịch bão hòa. Đồng thời, quá trình tái kết tinh

dược chất có thể xảy ra. Hệ tiểu phân nano thu được có thể tồn tại một phần ở trạng

thái kết tinh với KTTP giảm xuống dưới 500 nm. Với những đặc điểm này, hệ tiểu

phân nano có thể cải thiện độ tan và độ hòa tan của curcumin.

4.2. VỀ BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CURCUMIN

Mặc dù công nghệ nano đã được nghiên cứu từ hơn 50 năm gần đây và các

công trình nghiên cứu trên thế giới đã được công bố khá nhiều nhưng số lượng các

sản phẩm bào chế bằng công nghệ nano được ứng dụng trên lâm sàng còn rất ít.

Điều này có thể do nhiều nguyên nhân nhưng điều quan trọng nhất là mỗi DC có

những đặc tính và khả năng ứng dụng vào dạng thuốc nano khác nhau. Vì vậy, quá

122

trình nghiên cứu bào chế dạng nano đối với một DC bất kỳ thường phụ thuộc vào

nhiều yếu tố từ công thức đến kỹ thuật bào chế. Cụ thể như sau:

4.2.1. Yếu tố công thức

4.2.1.1. Chất diện hoạt

Trong quy trình bào chế hệ tiểu phân nano trình bày trong nghiên cứu, chất

diện hoạt được nghiền ướt trực tiếp cùng với DC. Vì vậy, chất diện hoạt tập trung ở

bề mặt phân cách pha cao. Kết quả thực nghiệm cho thấy: sự có mặt của chất diện

hoạt làm giảm đáng kể KTTP do làm giảm sức căng bề mặt phân cách pha rắn-lỏng,

giảm tính sơ nước của curcumin, giúp curcumin dễ dàng phân tán vào môi trường

lỏng. Ngoài ra, chất diện hoạt cũng có thể tạo micel làm tăng độ tan.

Mặt khác, đối với một dạng thuốc dùng đường uống, sự có mặt của chất diện

hoạt cũng làm tăng tính thấm qua đường tiêu hóa. Chất diện hoạt sẽ kết hợp vào lớp

lipid kép của màng, làm thay đổi tính phân cực của màng tế bào, giảm sức căng bề

mặt và tăng khả năng thấm của DC qua màng tế bào biểu mô [22], [52]. Ngoài ra,

các chất diện hoạt còn tác động làm tăng thấm các phân tử DC qua đường kẽ tế bào

do nới rộng các liên kết chặt giữa các tế bào hoặc tương tác với các enzym chuyển

hóa. Một số chất diện hoạt còn ức chế trung gian P-gp làm tăng hấp thu

[42]…Trong nghiên cứu này, với sự có mặt của chất diện hoạt Tween 80, hỗn dịch

nano bào chế từ hệ tiểu phân nano có khả năng thấm qua màng sinh học cao hơn so

với hỗn dịch quy ước trong cùng điều kiện nghiên cứu. Một số nghiên cứu dược

động học của curcumin có đánh giá tốc độ và mức độ thấm của DC cũng như ảnh

hưởng của các tá dược đến khả năng thấm qua màng sinh học [22]. Tuy nhiên, do

mục tiêu nghiên cứu của luận án không tập trung vào việc nghiên cứu dược động

học nên nội dung thực nghiệm này không được tiến hành. Tuy nhiên, đây có thể sẽ

là định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của một số chất diện hoạt đến đặc tính tiểu

phân nano đã được khảo sát. Trong số này, chỉ có Poloxame 188 có nhiệt độ nóng

chảy cao, còn lại đều có nhiệt độ nóng chảy thấp. Điều này gây khó khăn cho quá

trình làm khô bằng phương pháp phun sấy vì thể chất lỏng của chất diện hoạt có thể

ảnh hưởng đến thể chất bột phun sấy. Hơn nữa, nếu chất diện hoạt được sử dụng với

123

nồng độ quá cao, có thể tạo ra các micel, đóng vai trò như chất kết dính giữa tiểu

phân và thúc đẩy hình thành kết tụ trong hỗn dịch [71]. Do đó, tỷ lệ chất diện hoạt

trong công thức cần được nghiên cứu khảo sát vừa đảm bảo đủ để bào chế được hệ

tiểu phân nano có KTTP đạt yêu cầu vừa không ảnh hưởng đến thể chất khối bột.

Trong nghiên cứu này, chất diện hoạt được lựa chọn là Tween 80. Đây là phân tử có

phần đuôi kỵ nước dài chứa các liên kết chưa bão hòa hấp phụ lên bề mặt tiểu phân

DC và phần đầu lớn tạo ra hàng rào năng lượng không gian ngăn cản hiện tượng kết

tụ [12]. Nhược điểm của chất diện hoạt Tween 80 là tạo ra lớp hấp phụ mỏng trên

bề mặt tiểu phân và tạo ra sự ổn định không gian giữa các tiểu phân kém hiệu quả

hơn so với các polyme khối lượng phân tử lớn [85]. Vì vậy, trong nghiên cứu này,

Tween 80 được phối hợp với một polyme thân nước.

4.2.1.2. Polyme thân nước

Quá trình bào chế dạng hỗn dịch nano sẽ tạo ra diện tích bề mặt lớn và do đó

diện tích liên bề mặt lớn, làm thay đổi năng lượng tự do Gibbs. Hỗn dịch nano được

tạo thành kém ổn định về mặt nhiệt động học và có xu hướng giảm tổng năng lượng

bằng cách kết tụ trở lại. Về mặt động lực học, quá trình kết tụ phụ thuộc vào năng

lượng hoạt hóa và năng lượng này bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của polyme ổn định

[101]. Các polyme có tác dụng làm giảm kết tụ tiểu phân do tạo sự cồng kềnh về

không gian và tích điện bề mặt tiểu phân [5]. Do đó, bên cạnh vai trò của chất diện

hoạt, các polyme có vai trò quan trọng đối với hỗn dịch nano. Việc sử dụng kết hợp

chất diện hoạt với polyme có thể hỗ trợ hiệu quả khả năng ổn định hỗn dịch nano

[12].

Mặc dù khá nhiều công trình nghiên cứu về dạng bào chế hỗn dịch nano đã

được công bố, việc đánh giá và so sánh khả năng của các polyme đến khả năng ổn

định của hỗn dịch nano lại hầu như rất ít. Polyme thân nước cùng với chất diện hoạt

tạo ra hàng rào năng lượng, giúp ngăn chặn quá trình kết tụ Ostwald. Điều này được

mô tả bởi thuyết DLVO [71], [101]. Đồng thời, sự có mặt của các polyme còn làm

tăng độ nhớt, tăng năng lượng biến dạng để phá vỡ tiểu phân [71].

Vì vậy, nghiên cứu của luận án đã khảo sát ảnh hưởng của một số polyme

(PVP, PVA và Na CMC) đến sự hình thành và độ ổn định của hỗn dịch nano. Theo

124

kết quả đánh giá KTTPTB, PVP và PVA không ảnh hưởng đến KTTPTB của nano

curcumin, riêng Na CMC lại làm tăng KTTPTB. Xét về bản chất, Na CMC là

polyme có khối lượng phân tử khá lớn (khoảng 90 kDa) và tích điện âm. Sự có mặt

của Na CMC với ái lực cao ổn định theo cơ chế kết hợp cả ổn định không gian và

ổn định điện tích nhưng lại tăng xu hướng hình thành tiểu phân kết tụ lớn do tạo cầu

nối polyme. Do đó, Na CMC không phải là một lựa chọn thích hợp [75].

Trong nghiên cứu của luận án, PVP được chọn để phối hợp với Tween 80 ổn

định hỗn dịch nano. Thực tế, PVP K30 là một polyme có chiều dài chuỗi ngắn hơn

so với các polyme được khảo sát [102]. Nhược điểm của PVP là hút ẩm mạnh, do

đó có thể ảnh hưởng đến độ ổn định của hệ tiểu phân nano. Vì vậy, nghiên cứu đã

đưa ra tỷ lệ PVP ở mức tối thiểu mà vẫn đạt được mục tiêu tăng tốc độ và mức độ

hòa tan curcumin.

Khi sử dụng buồng nghiền với bi zirconi oxyd, tiểu phân DC có thể được

nghiền đồng thời với dung dịch chất ổn định [23], [95], [113] hoặc hỗn hợp bi, DC,

chất ổn định và nước được đưa đồng thời vào buồng nghiền [7] hoặc bào chế hỗn

hợp bột nhão DC và polyme trước, sau đó đưa vào buồng nghiền [53], [102]. Trong

nghiên cứu này, quá trình nghiền ướt được tiến hành theo cách thứ nhất. Một số tác

giả cho rằng nếu thêm chất diện hoạt và polyme vào giai đoạn đầu của quá trình

nghiền ướt sẽ dẫn đến độ nhớt của hỗn dịch lỏng tăng, tốn năng lượng đề nghiền ướt

trong giai đoạn đầu [12]. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu ở mục 3.4.2.1, sau quá

trình nghiền khô, tiểu phân curcumin đã có sự giảm KTTP đáng kể so với ban đầu.

Vì vậy, khi đưa vào giai đoạn nghiền ướt, dung dịch chất diện hoạt và polyme nên

được thêm vào ngay để ổn định kích thước, hạn chế hiện tượng kết tụ tiểu phân do

sự phân chia tiểu phân lớn thành các tiểu phân nhỏ hơn. Mặt khác, chất diện hoạt và

polyme cũng phải cần một thời gian đủ để hấp phụ lên bề mặt tiểu phân, đảm bảo

hầu hết bề mặt của tiểu phân được bao bọc bởi polyme hấp phụ. Do đó, việc thêm

chất diện hoạt và polyme vào giai đoạn đầu có ý nghĩa quan trọng đối với việc hình

thành tiểu phân nano curcumin.

125

4.2.1.3. Chất mang

Hỗn dịch nano sau khi bào chế thường kém ổn định về mặt nhiệt động học cần

được chuyển sang dạng bào chế rắn bằng cách loại dung môi bằng phương pháp

phun sấy. Để đảm bảo thể chất của bột chứa tiểu phân nano sau phun sấy, chất

mang có thể được phối hợp vào hỗn dịch. Sự có mặt của chất mang thích hợp có thể

ảnh hưởng đến đặc tính trơn chảy của tiểu phân bột sau phun sấy và sự phân tán trở

lại trong nước. Trong số các chất mang thường dùng, các loại đường hay được sử

dụng nhiều nhất với tỷ lệ khoảng 2-10% [17].

Tương tự như các tá dược khác sử dụng trong công thức hỗn dịch đem phun

sấy, khi sử dụng các loại đường, nhiệt độ chảy và nhiệt độ hóa thủy tinh là hai thông

số quan trọng cần cân nhắc khi lựa chọn. Qua tham khảo một số thông số đặc trưng

của các loại đường, nhận thấy mặc dù các loại đường đều có điểm chảy cao (trên 140oC), nhưng một số loại đường có nhiệt độ hóa thủy tinh (Tg) thấp thường làm

cho bột phun sấy bị dính (dextrose, saccarose). Ngược lại, sự có mặt của lactose hoặc manitol (Tg> 80oC) làm cho bột trơn chảy tốt. Bột phun sấy chứa lactose

thường có hàm ẩm cao hơn so với bột phun sấy chứa manitol do sự chuyển lactose

từ dạng khan sang dạng monohydrat [17]. Điều này cũng phù hợp với kết quả

nghiên cứu ở mục 3.4.1.

Bên cạnh các chất mang thân nước, các tá dược trơn (chẳng hạn Aerosil) có

thể được sử dụng trong giai đoạn phun sấy để làm giảm sự bám dính của bột phun

sấy vào bề mặt thiết bị. Mặc dù vậy, việc đưa thêm thành phần tá dược chống dính

có thể làm ảnh hưởng đến kết quả đo KTTP của hệ tiểu phân nano do không tách

loại được hoàn toàn Aerosil.

Trong nghiên cứu của luận án, khi thêm manitol vào công thức hỗn dịch trước

phun sấy, bột phun sấy chứa nano thu được có hình thức bên ngoài khá tơi xốp, ít bị

bám dính vào cyclon, thuận lợi cho việc đưa vào các dạng bào chế hơn so với hỗn

dịch không sử dụng manitol. Kết quả lựa chọn chất mang này cũng phù hợp với kết

quả nghiên cứu bào chế bột phun sấy chứa nano curcumin trong một số nghiên cứu

của Donsi F. và cộng sự [24] hoặc Gao Y. và cộng sự [28] hoặc bột phun sấy chứa

nano itraconazol [17].

126

4.2.2. Phương pháp và thiết bị bào chế

4.2.2.1. Về phương pháp bào chế

Do độ tan của curcumin trong hầu hết các dung môi đều rất thấp, khó có thể

lựa chọn dung môi để bào chế hệ tiểu phân nano bằng phương pháp “bottom-up”.

Hơn nữa, do hạn chế của phương pháp này khi nâng cấp lên quy mô 5 g/mẻ, kỹ

thuật “top-down” được lựa chọn. Đây cũng là kỹ thuật có triển vọng với nhiều chế

phẩm thương mại hóa với ưu điểm tỷ lệ DC cao (tỷ lệ tá dược thấp) [34], [43], [65],

[102].

4.2.2.2. Về thiết bị bào chế

Ở quy mô bào chế nhỏ (1 g/mẻ), curcumin được nghiền khô bằng buồng

nghiền với bi inox và nghiền ướt thủ công bằng chày cối. Với các thiết bị được lựa

chọn này, tiểu phân nano tạo thành có KTTPTB khoảng 200-300 nm và PDI dao

động rất lớn (từ 0,2 đến 0,6). Để khắc phục nhược điểm của phương pháp này,

buồng nghiền với bi zirconi oxyd được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu về bào chế

hệ tiểu phân nano. Dựa trên cơ sở này, nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano được

tiến hành theo quy trình B trên quy mô 5 g/mẻ.

Để nâng lên quy mô bào chế lớn hơn, trong giai đoạn nghiền khô, có thể sử

dụng thiết bị nghiền chuyên dụng năng lượng cao. Tốc độ và hiệu suất nghiền phụ

thuộc vào tốc độ quay của buồng nghiền, khối lượng và số lượng bi. Do đó, các

thiết bị nghiền có tốc độ quay lớn, cự ly thanh nam châm gia tốc lớn sẽ có hiệu quả

hơn trong việc nghiền mịn tiểu phân [5]. Trong giai đoạn nghiền ướt, có thể sử dụng

một số thiết bị nghiền ướt đặc biệt như thiết bị nghiền ướt gắn rotor-stato. Thiết bị

này có thể tạo ra tiểu phân có KTTPTB nhỏ hơn so với các thiết bị nghiền ướt thông

thường [12]. Để tăng hiệu suất nghiền và tạo hỗn dịch nano có phân bố KTTP tương

đối đồng nhất, môi trường nghiền thường được bơm tuần hoàn liên tục. Đồng thời,

việc sử dụng một lượng bi có kích thước khác nhau (không đồng nhất) hoặc quá

trình nghiền ở tốc độ cao cũng có thể làm tăng hiệu suất nghiền. Trong giai đoạn

đồng nhất hóa, có thể sử dụng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao. Để tránh

sinh nhiệt, thiết bị nghiền thường được trang bị lớp áo làm mát ở ngoài [5]. Ngoài

127

ra, để kết hợp phân chia và đồng nhất hóa, hiện nay người ta hay dùng đồng nhất vi

hóa lỏng [5].

Khi nâng cấp lên quy mô bào chế 5 g/mẻ, thiết bị nghiền bi inox phù hợp với

giai đoạn nghiền khô, còn thiết bị nghiền bi zirconi oxyd phù hợp với giai đoạn

nghiền ướt. Do thiết bị nghiền bi inox chỉ có một bi với kích thước khá lớn (20 mm)

nên lực tác động của bi lên khối bột chỉ có hiệu quả trong giai đoạn nghiền khô.

Trong khi đó, bi zirconi oxyd với kích thước khá nhỏ không phù hợp cho giai đoạn

nghiền khô vì động năng không đủ lớn. Khi chuyển sang giai đoạn nghiền ướt,

buồng nghiền với bi zirconi oxyd với số lượng bi cỡ vài trăm và kích thước bi nhỏ

(0,65 hoặc 0,8 mm), do đó tạo ra bề mặt tiếp xúc lớn, làm tăng lực mài mòn giữa bi

và nguyên liệu. Do đó, buồng nghiền với bi zirconi oxyd được lựa chọn trong giai

đoạn nghiền ướt.

4.2.3. Quy trình bào chế

4.2.3.1. Giai đoạn nghiền khô

Trong quá trình nghiền khô curcumin bằng buồng nghiền với bi inox, các

thông số cần kiểm soát là lượng DC đưa vào buồng nghiền, thời gian và tần số

nghiền.

Thông thường, lượng DC đưa vào buồng nghiền chiếm khoảng 60% thể tích

buồng nghiền. Lượng nguyên liệu quá lớn có thể tạo hiệu ứng “cái đệm” cản trở quá

trình nghiền. Ngược lại, quá ít nguyên liệu, hiệu suất nghiền giảm và bề mặt buồng

nghiền bị mài mòn [6]. Trong nghiên cứu của luận án, bột curcumin có tỷ trọng thấp

(d = 0,93), việc đưa vào buồng nghiền gặp khó khăn do thể tích buồng nghiền hạn

chế và kích thước bi tương đối lớn (20 mm). Do vậy, quy mô bào chế chỉ có thể

nâng lên gấp 5 lần từ quy mô bào chế nhỏ, khi đó lượng DC mỗi buồng nghiền

khoảng 5 g.

Về thời gian nghiền, trong phạm vi nghiên cứu của luận án, quá trình nghiền

khô được thực hiện trong 6 giờ. Kết quả nghiên cứu ở mục 3.4.2.1 cho thấy: sau 6

giờ nghiền khô, curcumin có KTTP giảm đáng kể so với ban đầu. Trong quá trình

nghiền, tiến hành đảo trộn nguyên liệu trong buồng nghiền sau mỗi khoảng thời

gian nhất định (1 giờ) để đảm bảo bột không bị dính ép vào thành buồng nghiền,

128

vào bề mặt bi và lực nghiền mài phân bố đều trong toàn bộ khối bột. Một vấn đề

cần lưu ý nữa là quá trình nghiền sinh ra nhiệt làm nóng buồng nghiền và có thể ảnh

hưởng đến độ ổn định của curcumin. Vì vậy, sau mỗi khoảng thời gian 1 giờ, cần để

thời gian nghỉ (5-10 phút) để nhiệt độ buồng nghiền giảm.

Về tần số nghiền, nếu tần số nghiền thấp, nguyên liệu chỉ chịu tác động của

lực mài mòn của nguyên liệu vào buồng nghiền. Điều này làm cho nguyên liệu

không được phân chia thành các tiểu phân nhỏ hơn. Nếu tần số nghiền quá cao, các

bi bị ép mạnh vào thành buồng nghiền nên không có lực mài mòn và va chạm. Vì

vậy, với tần số nghiền phù hợp, nguyên liệu chịu tác động của lực mài mòn và lực

va chạm do các bi được đưa lên vị trí tối ưu, rơi xuống va chạm và làm chia nhỏ

nguyên liệu. Thực nghiệm cho thấy: với tần số nghiền nhỏ hơn 10 Hz, việc chia nhỏ

tiểu phân không hiệu quả. Do vậy, quá trình nghiền được khảo sát ở hai mức tần số

15 và 30 Hz. Trong đó, kết quả trình bày ở mục 3.4.2.1 cho thấy: ở tần số 30 Hz,

tiểu phân sau nghiền có KTTP nhỏ hơn trong thời gian khảo sát.

Hình ảnh chụp SEM của curcumin sau nghiền khô ở phụ lục 4.1 cho thấy có

hiện tượng kết tụ thành từng đám của tiểu phân. Điều này có thể giải thích do sau

quá trình nghiền khô, tiểu phân mới tạo ra có KTTP nhỏ hơn, diện tích bề mặt lớn

hơn, dễ hút ẩm dẫn đến hiện tượng kết tụ.

4.2.3.2. Giai đoạn nghiền ướt

Trong quy trình bào chế nano curcumin ở quy mô 1 g, giai đoạn này sử dụng

dụng cụ thủ công còn trong quy trình bào chế ở quy mô 5 g, giai đoạn này sử dụng

buồng nghiền với bi zirconi oxyd. Đối với hệ tiểu phân nano nghiền ướt bằng buồng

nghiền với bi zirconi oxyd, đây được coi là giai đoạn chính làm nhỏ tiểu phân

xuống kích thước nano.

Khác với nghiền khô, kỹ thuật nghiền ướt có sự hiện diện của môi trường

nước ngăn chặn sự kết dính và nén ép của tiểu phân DC vào thành buồng nghiền và

lên bề mặt bi, khắc phục được nhược điểm của giai đoạn nghiền khô, tăng hiệu suất

tạo tiểu phân nano. Môi trường lỏng cũng có thể có vai trò như tá dược bôi trơn và

bao lên bề mặt của tiểu phân mới hình thành thông qua tương tác lý hóa khác nhau

như hấp phụ, tương tác tĩnh điện hoặc tương tác kỵ nước [58], do tạo micel hay bao

129

cơ học nhằm tăng độ ổn định của hỗn dịch [5]. Các polyme và chất diện hoạt được

thêm vào buồng nghiền sẽ hấp phụ lên bề mặt tiểu phân DC ngăn chặn hiện tượng

kết tụ, tăng khả năng gây thấm và phân tán làm giảm kích thước tiểu phân [58].

Ngoài ra, nước có thể đóng vai trò như một chất ức chế sự hình thành dạng vô định

hình do giảm nhiệt độ hóa thủy tinh [88].

Nếu lượng tá dược lỏng quá nhiều sẽ hạn chế lực tác động của bi vào thành

buồng nghiền, cản trở quá trình nghiền. Trong nghiên cứu này, lượng tá dược lỏng

sử dụng khoảng 10 ml vừa đủ để thấm ướt và tạo ra hỗn dịch có độ nhớt nhất định,

dễ nghiền mịn hơn. Tuy nhiên, trong quá trình nghiền ướt, do độ mịn của tiểu phân

DC tăng theo thời gian, dẫn đến tăng độ nhớt của bột nhão, tăng sự bám dính của

nguyên liệu vào buồng nghiền. Đặc biệt, độ nhớt tăng còn làm giảm tốc độ dao

động và năng lượng động lực học của môi trường nghiền và có thể làm giảm độ mịn

của sản phẩm tạo thành. Do đó, độ nhớt tăng dẫn đến hai hiệu ứng ngược chiều

nhau lên sự giảm KTTP. Vì vậy, lượng polyme và chất diện hoạt được thêm vào để

ổn định tiểu phân sau khi nghiền chỉ ở mức tối thiểu [12]. Với sự có mặt của chất

diện hoạt và polyme, lực nghiền mài và khuấy trộn trong buồng nghiền ướt tạo ra

năng lượng để phân tán polyme, phá vỡ sự kết tụ DC, gây thấm và hấp phụ dung

dịch chất ổn định Tween 80 và PVP lên bề mặt tiểu phân DC .

Trong giai đoạn này, ảnh hưởng của kích thước bi đến đặc tính của tiểu phân

nano được khảo sát trên hai loại bi có kích thước khác nhau (0,65 và 0,8 mm). Về

mặt lý thuyết với cùng một lượng bi như nhau, kích thước bi càng nhỏ, diện tích bề

mặt càng lớn và sự cọ mòn, nghiền mài tiểu phân càng lớn. Với kích thước bi nhỏ

hơn, tỷ lệ giảm kích thước tăng do tăng tần số va chạm của các bi kích thước nhỏ

với tiểu phân do số lượng bi lớn hơn [71]. Tuy nhiên, kết quả trình bày ở mục

3.4.2.2 cho thấy: việc sử dụng hai loại bi kích thước khác nhau trong nghiên cứu

này lại không tạo ra sự khác biệt rõ rệt về KTTP DC. Điều này có thể do hai loại bi

kích thước không khác nhau nhiều, hoặc do năng lượng động lực học tạo ra trong

quá trình nghiền ở cùng tần số xác định của bi kích thước lớn (0,8 mm) cao hơn so

với bi kích thước nhỏ (0,65 mm).

130

Một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến KTTP là thời gian nghiền. Thời gian

nghiền ướt phải đủ để phân chia tiểu phân có kích thước lớn thành các tiểu phân nhỏ

hơn và đảm bảo các chất ổn định được hấp thụ lên bề mặt tiểu phân [56]. Thời gian

nghiền kéo dài không hiệu quả vì có thể tạo ra sự tăng nhẹ của KTTP. Kết quả này

cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu bào chế hỗn dịch nano bằng phương pháp

giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền ướt của Liu P. và cộng sự [56].

Kết quả của nghiên cứu cho thấy: với thời gian nghiền ướt 4 giờ, tiểu phân tạo ra

đạt kích thước dưới 1 m. Nếu tiếp tục tăng thời gian nghiền, KTTP có xu hướng

tăng. So với mẫu 1 g nghiền ướt bằng dụng cụ thủ công, mẫu 5 g có KTTPTB lớn

hơn nhưng hệ số đa phân tán PDI lại không cao. Điều này chứng tỏ giai đoạn

nghiền ướt bằng buồng nghiền với bi zirconi oxyd đã làm giảm KTTP đồng nhất

hơn so với giai đoạn nghiền ướt sử dụng chày cối thủ công.

4.2.3.3. Giai đoạn khuấy tốc độ cao

Hỗn dịch đặc sau khi bào chế ở giai đoạn nghiền ướt được pha loãng bằng

nước tạo hỗn dịch. Nhằm tạo ra hỗn dịch có KTTP nhỏ và PDI thấp, một số nghiên

cứu sử dụng thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao [28], [75], [78]. Trong nghiên cứu

này, hỗn dịch được đồng nhất hóa bằng thiết bị tạo lực phân cắt lớn. Tuy nhiên, do

giới hạn về một số thông số của thiết bị nên tốc độ khuấy chỉ khảo sát lên đến được

22000 vòng/phút. Đồng thời thiết bị có thể sinh nhiệt khi thời gian khuấy quá dài.

Đồng thời, bọt khí sinh ra trong quá trình khuấy trộn làm cản trở lực tác động của

cánh khuấy lên hỗn dịch. Bọt khí này do sự hình thành và phá vỡ của bong bóng áp

suất hơi thấp trong dòng chảy chất lỏng. Trong thiết bị đồng nhất hóa cơ học (rotor-

stator), lưỡi dao (rotor) di chuyển theo chất lỏng với tốc độ cao sinh ra các bong

bóng khí [73]. Vì vậy, nghiên cứu đã lựa chọn tốc độ đồng nhất hóa 18000

vòng/phút và thời gian đồng nhất hóa thích hợp đối với hỗn dịch bào chế ở quy mô

nhỏ (mẻ 1 g/25 ml) chỉ cần 15 phút và với quy mô lớn hơn (mẻ 5 g/125 ml) là 60

phút (mục 3.4.2.3).

4.2.3.4. Giai đoạn phun sấy

Các tinh thể nano trong hỗn dịch sau khi bào chế thường không ổn định về

kích thước và dễ bị kết tụ. Vì vậy, hỗn dịch cần được loại dung môi bằng phương

131

pháp thích hợp để đảm bảo độ ổn định của tiểu phân. Phương pháp được lựa chọn là

phun sấy vì đây là phương pháp đơn giản và rẻ tiền, phù hợp cho sản xuất công

nghiệp. Bột phun sấy có thể sử dụng trong các dạng bào chế thể rắn như bột pha

hỗn dịch, viên nén, viên nang cứng ...[34].

Quá trình phun sấy có thể dẫn đến hiện tượng kết tụ của tiểu phân do sự có

mặt của các chất diện hoạt và polyme trong dịch phun sấy. Nhiệt độ khí vào dưới

nhiệt độ chuyển pha của polyme và dưới nhiệt độ nóng chảy của DC. Đồng thời,

nhiệt độ này không ảnh hưởng đến độ ổn định của DC [17]. Trong nghiên cứu của

luận án, hỗn dịch nano curcumin sử dụng Tween 80 là thành phần có điểm nóng

chảy tương đối thấp. Trong khi đó, quá trình phun sấy thường tiến hành ở điều kiện nhiệt độ khí vào khoảng 80-120oC. Ở nhiệt độ cao hơn, tiểu phân chủ yếu thu được

ở buồng phun, trong khi đó, nếu nhiệt độ thấp hơn, tiểu phân có hàm ẩm cao. Theo một số nghiên cứu, nhiệt độ khí vào khoảng 90-100oC thích hợp nhất. Do đó, trong

nghiên cứu này, việc sử dụng Tween 80 trong thành phần dịch phun sấy có thể dẫn

đến hiện tượng kết tụ tiểu phân [71].

Ngoài ra, các thông số khác trong quá trình phun sấy như tốc độ phun dịch, tốc

độ thông khí, đường kính súng phun, áp suất khí nén… đều có thể ảnh hưởng tới

đặc tính của bột phun sấy. Tốc độ phun dịch phải phù hợp với nhiệt độ khí vào và tốc độ thông gió. Trong nghiên cứu này, với nhiệt độ khí vào cao (trên 82oC), nếu

tốc độ phun dịch tăng từ 1,8 đến 3 ml/phút, hiệu suất quá trình phun sấy tăng. Tốc

độ phun dịch được lựa chọn là 2 ml/phút.

Như vậy, qua việc khảo sát các yếu tố thuộc về công thức và thông số quy

trình, nghiên cứu của luận án đã lựa chọn được công thức tối ưu với tỷ lệ Tween

80/curcumin, PVP/curcumin và một số thông số của quy trình bào chế thích hợp với

sự trợ giúp của phần mềm INForm 3.1. Trong phạm vi nghiên cứu của luận án, kết

quả này chỉ mang ý nghĩa học thuật và chỉ đúng trong thiết kế công thức, thiết bị và

quy mô bào chế cụ thể.

132

4.3. VỀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO

4.3.1. Cấu trúc của hệ tiểu phân nano

Hệ tiểu phân nano sau khi bào chế có cấu trúc gần hình cầu trong đó curcumin

được phân tán vào bên trong cấu trúc của polyme thân nước PVP. PVP nóng chảy,

sau đó gel hóa và đông tụ lại tạo cấu trúc hình cầu, “nhốt” tiểu phân curcumin vào

trong. Với cấu trúc này, không thể dựa vào sự hấp phụ khí nitrogen lên bề mặt tiểu

phân theo thuyết BET để xác định KTTP giống như curcumin nguyên liệu và

curcumin sau giai đoạn nghiền khô. Do có sự tạo phức với PVP, một phần hệ tiểu

phân chuyển sang dạng vô định hình. Cấu trúc này của hệ tiểu phân nano tương tự

như cấu trúc của tiểu phân nano raloxifen trong nghiên cứu của Hiep T. T. và cộng

sự [38].

So sánh với hệ tiểu phân nano curcumin bào chế với tá dược PVP bằng

phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao của Rachmawati H. và cộng sự, tiểu phân

nano tồn tại dưới dạng các đám kết tụ xốp hình cầu, giống như bọt với kích thước

khoảng 400 nm [75]. Sự khác nhau này có thể do bản thân nguyên liệu ban đầu có

các đặc tính về kết tinh, hình dạng và kích thước tinh thể khác nhau. Trong nghiên

cứu của Rachmawati H. và cộng sự, curcumin ở dạng phiến hình dạng không xác

định, kích thước không đồng nhất và phân bố kích thước rộng. Khi chuyển sang

dạng nano, tiểu phân nano có kích thước đồng nhất hơn, phân bố kích thước hẹp.

Còn trong nghiên cứu này, curcumin ở dạng tinh thể hình kim, các cạnh sắc và rõ,

với kích thước khá lớn. Khi bào chế dưới dạng hệ tiểu phân nano, trên hình ảnh

chụp sau khi rửa loại tá dược, không còn thấy sự xuất hiện của các tinh thể hình kim

mà chỉ có các tiểu phân có hình dạng gần hình cầu (mục 3.4.3.1). Tuy nhiên, không

loại trừ khả năng sau khi rửa loại tá dược bằng nước, tiểu phân nano curcumin có

thể bị kết tinh trở lại. Điều này có thể làm cho KTTP tăng lên so với KTTP trước

khi rửa loại tá dược.

4.3.2. Kích thước tiểu phân trung bình và hệ số đa phân tán

Một trong những đặc tính quan trọng của tiểu phân nano là kích thước tiểu

phân DC. Kích thước tiểu phân của hỗn dịch nano có thể được xác định bằng nhiều

133

kỹ thuật phân tích khác nhau như nhiễu xạ laze, phổ tương quan photon (tán xạ

laze), đếm tiểu phân và kính hiển vi điện tử quét.

KTTP của hỗn dịch nano thu được bằng phương pháp nhiễu xạ laze và phổ

tương quan photon không giống nhau vì KTTP đo bằng phương pháp nhiễu xạ laze

dựa trên thể tích và đường kính trung bình, còn phổ tương quan photon biểu diễn

dưới dạng kích thước theo cường độ ánh sáng. Kích thước tiểu phân đo bằng

phương pháp nhiễu xạ laze thường cao hơn so với phương pháp tương quan photon.

Theo nhận định của Sepassi S. và cộng sự, nếu sử dụng kỹ thuật nhiễu xạ laze,

KTTP xác định được cao gấp đôi so với kết quả thu được nếu sử dụng phương pháp

phổ tương quan photon [85]. Phương pháp đếm tiểu phân cho số lượng chính xác

tiểu phân trên một đơn vị thể tích đối với từng nhóm tiểu phân kích thước khác

nhau, kỹ thuật này hiệu quả và thích hợp hơn so với phân tích nhiễu xạ laze trong

việc xác định số lượng tiểu phân kích thước micro trong hỗn dịch nano [70]. Tuy

nhiên, phương pháp nhiễu xạ laze có thể xác định khoảng KTTP rộng với giá trị

trung bình trong khoảng nano, thao tác nhanh, dễ thực hiện, chính xác và giá trị

trung bình thu được từ phương pháp nhiễu xạ laze thường chính xác trong khoảng

nano.

Căn cứ vào một số ưu, nhược điểm nhất định của các phương pháp xác định

KTTP kết hợp với điều kiện trang thiết bị hiện có, nghiên cứu của luận án lựa chọn

phương pháp xác định KTTP trong giai đoạn nghiền khô và nghiền ướt bằng nhiễu

xạ laze. Còn trong giai đoạn đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn, KTTP được xác

định bằng phương pháp tán xạ laze.

Để chuẩn bị mẫu, trong phương pháp nhiễu xạ laze, mẫu thử cần được phân

tán trong môi trường đến mức độ che mờ chấp nhận được để xác định KTTP. Trong

phương pháp tán xạ laze, mẫu thử được pha loãng sao cho tốc độ đếm tiểu phân

nằm trong khoảng 150-250 kcps. Nếu tốc độ đếm tiểu phân quá thấp, độ tin cậy của

kết quả đo KTTP thấp, còn nếu tốc độ đếm tiểu phân cao, có thể xảy ra hiện tượng

đa tán xạ, ảnh hưởng đến kết quả đo. Để tránh kết tụ tiểu phân, mẫu thử trong quá

trình nghiền khô được phân tán trong nước chứa Tween 80 với nồng độ thấp 0,1%.

Đối với mẫu thử trong giai đoạn nghiền ướt, giai đoạn đồng nhất hóa và bột thu

134

được sau phun sấy chứa nano curcumin, thực nghiệm cho thấy: nano curcumin phân

tán nhanh và không bị kết tụ trong môi trường nước khi phân tán. Do đó, mẫu thử

được chuẩn bị bằng cách pha loãng hỗn dịch hoặc phân tán bột phun sấy chứa nano

curcumin trong môi trường nước. Một số nghiên cứu còn tiến hành pha loãng mẫu

thử trong môi trường bão hòa hoàn toàn hoặc bão hòa một phần để xác định KTTP

[102]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, KTTP của nano curcumin không bị ảnh

hưởng bởi môi trường pha loãng nên nghiên cứu lựa chọn môi trường phân tán là

nước.

Kết quả xác định KTTP có thể biểu diễn dưới dạng phân bố KTTP theo thể

tích hoặc theo khối lượng. Từ các thông số về KTTP, trung bình momen thể tích

được lựa chọn vì đặc tính nhạy với sự có mặt của các tiểu phân kích thước lớn trong

mẫu và cho biết có bất kỳ tiểu phân có kích thước lớn nào tồn tại trong hỗn dịch

nano thậm chí khi số lượng tiểu phân nhỏ, nhưng khối lượng của các tiểu phân cũng

tương đối lớn.

Việc so sánh về KTTP giữa các nghiên cứu khác nhau không chỉ phụ thuộc

vào phương pháp sử dụng để xác định KTTP mà còn phụ thuộc vào thông số quang

học lựa chọn. Khi thay đổi thông số quang học, KTTP và PDI có thay đổi. Đồng

thời, nếu mẫu có mặt tiểu phân kích thước nhỏ và kỹ thuật phân tích tiến hành trong

chế độ đo KTTP chỉ thích hợp với tiểu phân kích thước nhỏ, sự có mặt của tiểu

phân có kích thước lớn hơn không thể phát hiện được. Vì vậy, giữa các nghiên cứu

khác nhau hoặc thậm chí giữa những lần thực nghiệm khác nhau, KTTP và PDI có

thể khác nhau do nhiều nguyên nhân chưa rõ ràng [49].

Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy: hệ tiểu phân nano thu được ở quy

mô bào chế 5 gam/mẻ có đặc tính về KTTPTB và PDI trước phun sấy và sau phân

tán khoảng 300-500 nm, PDI 0,30-0,55, cao hơn so với mẫu bào chế ở quy mô nhỏ

1 gam/mẻ (mục 3.4.3.2). So với kết quả nghiên cứu bào chế hỗn dịch nano

curcumin của Gao Y. và cộng sự, tiểu phân nano thu được có kích thước tiểu phân

xác định bằng phương pháp phổ tương quan photon khoảng 210,2 nm [29]. Trong

nghiên cứu của Rachmawati H. và cộng sự, tiểu phân nano curcumin có kích thước

tiểu phân khá lớn (500-700 nm) xác định bằng phương pháp phổ tương quan photon

135

với thông số quang học khác với nghiên cứu này (hệ số phản xạ 1,5) [75]. Trong

nghiên cứu của Shaikh J. và cộng sự, KTTPTB của nano curcumin khoảng 334 nm

với PDI 0,25 [66], [75].

Qua phân tích ở trên có thể thấy phương pháp tán xạ laze không thích hợp khi

phân tích mẫu chứa cả các tiểu phân kích thước lớn và nhỏ. Khi xác định KTTP của

mẫu chứa tiểu phân kích thước lớn hơn ở giới hạn micro, có thể sử dụng thiết bị

Mastersizer 3000E hoặc kỹ thuật SEM. Thực tế, các tiểu phân có kích thước tương

đối lớn hơn được quan sát bằng kỹ thuật SEM. Do đó, KTTP được phân tích kết

hợp bằng cả hai kỹ thuật tán xạ laze và chụp SEM .

Khi đưa giá trị KTTP, một thông số quan trọng đi kèm là hệ số đa phân tán

PDI. Giá trị PDI cho biết độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano và hệ số này càng

thấp, hỗn dịch nano càng ổn định. Trong nghiên cứu này, tiểu phân nano bào chế

được có khoảng phân bố kích thước tiểu phân khá lớn. Đây cũng là nhược điểm của

phương pháp phân chia tiểu phân đến kích thước nano đi từ tiểu phân kích thước

lớn.

4.3.3. Phổ nhiễu xạ tia X và giản đồ nhiệt vi sai của hệ tiểu phân nano

Đối với một số DC, quá trình chuyển sang dạng tiểu phân kích thước nano có

thể làm thay đổi trạng thái kết tinh hoặc tạo dạng đa hình. Kết quả của nghiên cứu ở

mục 3.4.3.4 cho thấy: khi chuyển sang dạng nano, curcumin vẫn tồn tại ở trạng thái

kết tinh nhưng tỷ lệ kết tinh đã giảm đi so với ban đầu.

Nhằm xác định rõ hơn các đặc tính kết tinh của curcumin như đặc tính chuyển

pha sang trạng thái thủy tinh, điểm kết tinh và điểm nóng chảy, phương pháp giản

đồ nhiệt vi sai được lựa chọn. Bên cạnh việc xác định trạng thái vật lý của DC,

phương pháp này cũng có thể sử dụng để xác định tương tác dược chất-tá dược có

thể xảy ra trong quá trình bào chế. Sự xuất hiện các pic lạ hoặc sự dịch chuyển pic

thu nhiệt của curcumin trên giản đồ nhiệt vi sai có thể xảy ra khi có mặt các tá dược

khác trong công thức bào chế. Theo kết quả giản đồ nhiệt vi sai trình bày ở mục

3.4.3.4 có thể thấy sự dịch chuyển pic thu nhiệt và sự giảm enthalpy nóng chảy.

Điều này xảy ra có thể do hiệu ứng dung môi của PVP trong quá trình cung cấp

nhiệt. Pic thu nhiệt tương ứng điểm nóng chảy là pic tạo bởi phần curcumin không

136

tạo phức, chứng tỏ dạng kết tinh của curcumin vẫn còn tồn tại trong hệ tiểu phân.

Kết quả này phù hợp với nhận định của một số tác giả khi nghiên cứu về hệ phân

tán rắn chứa PVP [45] và cũng phù hợp với kết luận rút ra từ hình ảnh phổ nhiễu xạ

tia X ở trên. Ngoài pic thu nhiệt, trên giản đồ nhiệt vi sai của hệ tiểu phân nano curcumin còn có một pic ở nhiệt độ 57,4oC do sự có mặt của nước trong hệ tiểu phân và một pic ở 128,2oC do hiệu ứng chuyển pha.

4.3.4. Diện tích bề mặt và độ xốp

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự hấp phụ chất khí lên bề mặt hoặc vào

trong cấu trúc của tiểu phân rắn bằng hấp phụ vật lý hoặc hóa học. Khi tiểu phân

curcumin được phân chia đến kích thước nhỏ nhất định, tổng diện tích bề mặt tăng,

do đó diện tích bề mặt theo thuyết BET tăng.

Sau giai đoạn nghiền khô, tiểu phân curcumin có KTTP giảm và diện tích bề

mặt tăng. Kết quả đánh giá diện tích bề mặt theo thuyết BET ở mục 3.4.2.1 cho thấy

diện tích bề mặt tăng lên khoảng gấp 5 lần. Thực tế, quá trình phân chia tiểu phân

trong giai đoạn nghiền khô thành các tiểu phân kích thước nhỏ hơn làm tăng năng

lượng tự do bề mặt tiểu phân. Các tiểu phân có xu hướng bị kết tụ với nhau ở trạng

thái rắn, do vậy, diện tích bề mặt xác định được có thể không còn chính xác.

Khi chuyển sang dạng tiểu phân nano, diện tích bề mặt lại không xác định

được theo thuyết BET. Điều này có thể do nguyên tắc của phương pháp đánh giá

diện tích bề mặt này dựa theo thuyết BET về sự hấp phụ khí nitrogen lên bề mặt các

lỗ xốp. Đối với mẫu tiểu phân nano, curcumin phân tán vào trong cấu trúc hình cầu

của chất mang PVP có thể gây bít các lỗ xốp trên bề mặt và bên trong tiểu phân, cản

trở sự hấp phụ khí nitrogen. Do những đặc điểm khác biệt hoàn toàn của hệ tiểu

phân nano so với nguyên liệu ban đầu và mẫu nghiền khô, sự hấp phụ khí nitrogen

lên bề mặt tiểu phân trở nên phức tạp và không thể tính toán được.

4.3.5. Độ tan

Một số nghiên cứu đánh giá độ tan của curcumin bằng cách khuấy đến bão hòa

một lượng curcumin trong môi trường nước ở nhiệt độ thích hợp. Sau đó, tiểu phân

curcumin chưa hòa tan được loại bằng cách lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc

0,2 m [47]. Thực tế, cơ chế giữ lại các tiểu phân trên bề mặt màng lọc còn có thể

137

do sự hấp phụ của các tiểu phân trên bề mặt màng lọc, gây bít kín các lỗ lọc hoặc do

cấu trúc của lỗ lọc có thể giữ lại tiểu phân bên trong. Vì vậy, việc sử dụng màng lọc

có kích thước lỗ lọc 0,2 m có thể có hiệu quả trong việc loại bỏ các tiểu phân

curcumin chưa hòa tan. Phương pháp lọc để loại tiểu phân có thể sử dụng độc lập

hoặc kết hợp với phương pháp siêu ly tâm. Với phương pháp này, quá trình tách

loại tiểu phân phụ thuộc vào khối lượng tiểu phân trong dịch ly tâm, tốc độ và thời

gian cần thiết để các tiểu phân sa lắng hoàn toàn. Vì vậy, thời gian ly tâm phải đủ

dài. Tốc độ ly tâm còn phụ thuộc vào bán kính ly tâm, tức là khoảng cách từ vị trí

đặt mẫu đến trung tâm của rotor. Với cùng tốc độ ly tâm như nhau nhưng bán kính

ly tâm lớn, lực tác động lên tiểu phân sẽ lớn. Trong điều kiện hiện có, để tách loại

tiểu phân, có thể lọc qua lọc sơ bộ qua màng lọc kích thước lỗ lọc 5 m nhằm làm

giảm khối lượng tiểu phân đem ly tâm. Quá trình siêu ly tâm được tiến hành với tốc

độ 12000 vòng/phút. Dịch thu được lọc 1 lần qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,2 m

để cho các tiểu phân hấp phụ lên bề mặt màng lọc. Sau đó, dịch lọc được tiếp tục

lọc lần 2 để tăng hiệu quả lọc. Kết quả thực nghiệm cho thấy: với tốc độ ly tâm

12000 vòng/phút và màng lọc kích thước lỗ lọc 0,2 m, dịch lọc thu được trong.

Kết quả đánh giá độ tan của hệ tiểu phân nano ở mục 3.4.3.8 đã phần nào chứng

minh được độ tan của hệ tiểu phân nano cải thiện đáng kể so với nguyên liệu ban

đầu.

4.3.6. Độ hòa tan

Nhiều nghiên cứu về hệ tiểu phân nano đã đề cập đến các thiết bị thử độ hòa

tan đối với hệ tiểu phân nano, nhưng lựa chọn thiết bị nào thích hợp vẫn là vấn đề

chưa rõ ràng. Theo Hang D. và cộng sự, nhược điểm của thiết bị hòa tan kiểu cánh

khuấy là tốc độ hòa tan tại một số thời điểm ban đầu có thể chậm do tiểu phân nano

chưa thấm và nổi trên bề mặt môi trường hòa tan, mặc dù trong môi trường hòa tan

và bản thân trong hệ tiểu phân nano đã có chất diện hoạt. Tiểu phân có kích thước

lớn hơn có đặc tính thấm tốt hơn, do đó, độ hòa tan của nguyên liệu có sự đồng đều

về mức độ hòa tan giữa các lần thử nghiệm cao hơn so với tiểu phân nano. Sự khác

nhau về độ hòa tan của tiểu phân nano do mức độ kết tụ khác nhau và tính thấm

kém do diện tích bề mặt giảm [36]. Đồng thời, quá trình phun sấy hỗn dịch nano

138

cũng có thể gây hiện tượng kết tụ tiểu phân nano, làm chậm tốc độ hòa tan trong

giai đoạn đầu [17]. Với thiết bị hòa tan kiểu giỏ quay, đồ thị hòa tan có tốc độ hòa

tan lớn trong những khoảng thời gian đầu do toàn bộ hệ tiểu phân được nhúng chìm

vào môi trường thử độ hòa tan và giảm dần trong giai đoạn sau. Riêng đối với thiết

bị hòa tan kiểu dòng chảy, hệ tiểu phân được đặt lên giá mang, hạn chế các vấn đề

về khả năng thấm ướt đối với môi trường hòa tan. Khi đó, đồ thị hòa tan gần giống

như đồ thị mô tả theo phương trình Noyes-Whitney [36].

Đối với hệ tiểu phân nano curcumin, theo một số nghiên cứu đã công bố, độ

hòa tan được đánh giá bằng thiết bị cánh khuấy. Để khắc phục nhược điểm của thiết

bị thử độ hòa tan này như đã phân tích ở trên, nghiên cứu của luận án tiến hành

phân tán curcumin hoặc bột phun sấy chứa nano curcumin vào môi trường hòa tan

trước khi thử độ hòa tan bằng cách siêu âm trong 3-4 giây. Phương pháp này cũng

phù hợp với phương pháp thử độ hòa tan đối với hệ tiểu phân nano trong một số

nghiên cứu [17], [21].

Về môi trường thử độ hòa tan, curcumin là DC sơ nước, khó phân tán vào môi

trường nước, có thể bị kết tụ. Vì vậy, môi trường thử độ hòa tan được phối hợp

thêm chất diện hoạt nhằm đảm bảo điều kiện “sink” [38], đồng thời tránh bám dính

tiểu phân vào thành cốc thử. Natri laurylsulfat là chất diện hoạt thường được sử

dụng thêm vào môi trường thử độ hòa tan curcumin [8]. Tuy nhiên, tá dược này có

tính kiềm ảnh hưởng đến độ ổn định của curcumin. Vì vậy, nghiên cứu lựa chọn

chất diện hoạt Tween 80 thêm vào môi trường thử độ hòa tan với nồng độ 0,2%.

Sau khi lựa chọn thiết bị thử và môi trường thử độ hòa tan, một số điều kiện

thử độ hòa tan được thay đổi cho phù hợp. Tốc độ khuấy đặt 100 vòng/phút để đảm

bảo tiểu phân không bị bám dính thành cốc và vào cánh khuấy. Khó khăn lớn nhất

là xác định được độ hòa tan ở những phút đầu tiên do các thời điểm lấy mẫu khá

gần nhau. Để loại các tiểu phân DC không tan từ mẫu, hai phương pháp thông

thường được sử dụng là lọc và ly tâm. Một số tác giả lấy mẫu từ môi trường hòa tan

và tiến hành lọc qua màng lọc cellulose acetat kích thước lỗ lọc 0,2 hoặc 0,45 m

và định lượng curcumin [22]. Tuy nhiên, mỗi lần mẫu được lấy ra lại kéo theo một

lượng tiểu phân chưa hòa tan trong môi trường thử. Đồng thời, khi tiến hành lọc,

139

phân tử DC kỵ nước có thể dễ dàng tương tác với màng lọc. Những vấn đề này có

thể làm ảnh hưởng đến kết quả thử độ hòa tan. Do đó, phương pháp ly tâm với tốc

độ 12000 vòng/phút được sử dụng để tách loại tiểu phân. Phương pháp này cũng

phù hợp với một số phương pháp mô tả trong nghiên cứu thử độ hòa tan của hệ tiểu

phân nano [56]. Để đảm bảo phần cắn không bị mất đi, toàn bộ phần cắn và dịch lọc

rót trở lại môi trường hòa tan.

Kết quả đánh giá độ hòa tan ở mục 3.4.3.9 cho thấy: tốc độ hòa tan tăng nhanh

đặc biệt trong 10 phút đầu do sự có mặt của chất diện hoạt Tween 80 trong bản thân

hệ tiểu phân nano, trong môi trường hòa tan và sự có mặt của polyme thân nước

PVP. Tween 80 là một chất làm tăng độ tan và gây thấm tốt [56]. Tween 80 có khả

năng tạo cấu trúc micel trong môi trường hòa tan. Polyme thân nước PVP tạo phức

với phần curcumin hòa tan dẫn đến độ hòa tan tăng nhanh đặc biệt trong giai đoạn

đầu.

4.4. VỀ ĐỘ ỔN ĐỊNH

Bào chế được hệ tiểu phân nano với các đặc tính mong muốn đã khó nhưng

giữ được ổn định những đặc tính ấy trong thời gian bảo quản còn khó hơn nhiều.

Trong nghiên cứu của luận án, độ ổn định của hỗn dịch nano chỉ được theo dõi sau

24 giờ sau khi bào chế vì hỗn dịch được chuyển sang dạng bột phun sấy ngay sau

đó. Do đó, nghiên cứu chỉ đánh giá độ ổn định của bột phun sấy chứa tiểu phân

nano dưới tác động của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, độ ẩm) cũng như các yếu

tố thuộc về chế phẩm thuốc (tính chất hóa lý của DC và tá dược, dạng bào chế,

thành phần, quy trình bào chế, mức độ kín và bản chất của bao bì đóng gói trực

tiếp).

Về bao bì đóng gói, nếu lựa chọn lọ thủy tinh kín và tránh ánh sáng, hệ tiểu

phân nano sẽ ổn định. Tuy nhiên, với mục đích đánh giá độ ổn định dưới tác động

của các yếu tố trên, hệ tiểu phân nano được đóng trong vỏ nang cứng, ép vỉ nhôm-

nhôm, đựng trong hộp giấy và theo dõi ở hai điều kiện lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40 ± 2oC, độ ẩm 75 ± 5%) trong 6 tháng và điều kiện thực (nhiệt độ 15-35oC, độ ẩm

60-90%) trong thời gian 9 tháng.

140

Về hàm lượng curcumin, mỗi viên nang chứa khoảng 40 mg curcumin, tương

ứng với khối lượng bột phun sấy chứa hệ tiểu phân nano curcumin khoảng 94,8 mg.

So với một số chế phẩm chứa nano curcumin trên thị trường, hàm lượng curcumin

trong mỗi viên nang trong nghiên cứu của luận án cao hơn. Chế phẩm Curma Gold

chứa 150 mg nano curcuminoid, trong đó curcuminoid chiếm khoảng 20%. Hàm

lượng curcumin thực tế trong viên nang mềm Cumar Gold chỉ khoảng 23 mg.

Kết quả của nghiên cứu ở mục 3.5 cho thấy: bột phun sấy chứa tiểu phân nano

ổn định về mặt hình thái, KTTP, đặc tính kết tinh, mất khối lượng do làm khô, hàm

lượng curcumin và độ hòa tan trong thời gian theo dõi. Như vậy, bột phun sấy chứa

tiểu phân nano curcumin có thể được đóng trong viên nang cứng và đựng trong bao

bì vỉ nhôm-nhôm và hộp giấy.

4.5. VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO

CURCUMIN

4.5.1. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng

4.5.1.1. Đối tượng thử, mô hình dược động học và liều dùng

Một số nghiên cứu SKD đường uống của curcumin được tiến hành trên chuột

cống [39], [42], [55], [87] hoặc chuột nhắt [30], [32], [76], [111].

Tại Việt Nam, chuột cống thí nghiệm thường có sự sai khác giữa các cá thể rất

lớn về khối lượng, chế độ nuôi dưỡng, tình trạng sức khỏe và tuổi. Do đó, mặc dù

enzym chuyển hóa trên chuột cống giống với người nhưng kết quả khảo sát tiến

hành xác định nồng độ curcumin sau khi uống trên một số chuột cống cho thấy sự

hấp thu curcumin khác nhau khá lớn giữa các cá thể và giữa các lần thử nghiệm.

Mặt khác, chuột nhắt là đối tượng có sự đồng nhất về cá thể rất lớn về tuổi, chế độ

nuôi dưỡng và tình trạng sức khỏe. Chuột nhắt có khối lượng cơ thể nhỏ hơn nhiều

so với chuột cống. Trong điều kiện thực nghiệm, nghiên cứu lựa chọn đối tượng thử

là chuột nhắt.

Về thời điểm lấy mẫu, nghiên cứu của luận đã khảo sát các thời điểm lấy mẫu

thích hợp tại 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 120, 240 và 360 (hoặc 420 phút).

Do chuột nhắt khá nhỏ nên không thể lấy máu nhiều lần trên cùng một cá thể. Đồng

141

thời, sau khi lấy máu, sức khỏe chuột không còn tốt. Do đó, mỗi chuột được lấy

máu một lần tại một thời điểm.

Về mô hình ngăn, một số nghiên cứu dược động học của curcumin không dựa

trên mô hình ngăn tiến hành trên chuột cống [46], [52], [91] hoặc chuột nhắt [30],

[76], hoặc dựa trên mô hình một ngăn trên chuột cống [110] hoặc chuột nhắt [32],

[111]. Trong nghiên cứu này, do mỗi chuột được lấy máu tại một thời điểm và mỗi

thời điểm 6 chuột nên có thể xử lý số liệu trên một nhóm cá thể. Việc tính toán các

thông số dược động học trên nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano

không dựa trên mô hình ngăn với một nhóm các cá thể, tương tự như nghiên cứu

dánh giá SKD của hỗn dịch nano được tiến hành bởi Gao Y. và cộng sự [30].

Để tính toán các thông số dược động học liên quan đến chuyển hóa, nghiên

cứu sử dụng mô hình một ngăn có chuyển hóa trên quần thể. So với mô hình cá thể,

mô hình dược động học quần thể có nhiều ưu điểm nổi trội do chỉ cần lấy một số

lượng ít mẫu trên mỗi cá thể, có thể phân biệt được sự sai khác trong một cá thể

hoặc giữa các cá thể. Tuy nhiên, mô hình này cũng có nhược điểm cần số lượng lớn

cá thể (thường lớn hơn 40), phân tích thống kê dược động học phức tạp [16]. Do số

lượng cá thể trong mỗi nhóm tương đối ít nên số liệu thu được không đủ để đánh

giá các thông số dược động học dựa trên mô hình dược động học quần thể hai ngăn

và ba ngăn. Vì vậy, nghiên cứu chỉ xác định các thông số dược động học dựa trên

mô hình một ngăn có chuyển hóa.

Đối với DC ít tan, thức ăn cùng với môi trường sinh lý tạo ra ở trạng thái no

cộng với thời gian lưu trung bình trong đường tiêu hóa tăng thường làm tăng SKD

của thuốc. Ngược lại, SKD ở trạng thái đói thường thấp do sự vắng mặt của các tác

nhân làm tăng độ tan có mặt trong thức ăn và dịch mật. Tuy nhiên, khi DC ít tan

được thiết kế dưới dạng hệ phân tán đồng nhất của các tiểu phân kích thước nano,

sự sai khác về SKD do trạng thái no hoặc đói có thể được giảm đến mức tối thiểu

[17]. Vì vậy, nghiên cứu này tiến hành thử trên chuột ở trạng thái đói.

Về liều dùng, trong nghiên cứu về SKD của hỗn dịch nano curcumin của Gao

Y. và cộng sự, liều dùng trên chuột nhắt khoảng 250 mg/kg cân nặng [30]. Trong

nghiên cứu của Zhongfa L. và cộng sự, nhũ tương nano curcumin được đánh giá

142

SKD trên chuột nhắt với liều khá cao 1,8 g/kg [115]. Trong nghiên cứu của luận án,

mức liều được lựa chọn là 500 mg/kg.

4.5.1.2. Vị trí lấy máu

Theo tài liệu tham khảo kết hợp với thực nghiệm, vị trí lấy máu trên chuột có

thể ở tĩnh mạch đuôi, hốc mắt hoặc tĩnh mạch cổ. Máu lấy tại tĩnh mạch đuôi hơi ít

(nhỏ hơn 250 l) thường không đủ để xử lý mẫu và không thể lấy nhiều lần trên

một cá thể. Tại hốc mắt, có thể lấy mẫu qua ống vi mao quản đặt vào phía dưới và

trong của mắt và nhẹ nhàng trượt nhẹ dọc theo nhãn cầu đến vùng đám rối tĩnh

mạch thẳng hàng với ổ mắt. Phương pháp này có ưu điểm hơn so với phương pháp

lấy máu tại tĩnh mạch đuôi vì dễ thực hiện và có thể lấy được thể tích máu lớn trong

thời gian ngắn (10-20 giây), thao tác nhanh, phù hợp với các thời điểm lấy mẫu của

nghiên cứu. Ngoài ra, việc lấy mẫu có thể thực hiện qua một kim nhỏ gắn với ống

đặt vào tĩnh mạch cổ [93]. Máu lấy tại vị trí này thường chứa nhiều huyết cầu.

Dựa trên cơ sở phân tích trên, vị trí lấy máu tại vùng tĩnh mạch hốc mắt phù

hợp hơn cả do các thời điểm lấy mẫu của nghiên cứu khá gần nhau. Tuy nhiên, sau

khi mắt bị thương, nếu tiếp tục lấy máu lần tiếp theo để định lượng nồng độ DC

trong huyết tương thường kết quả không còn chính xác vì sau khi bị tổn thương, cơ

chế sinh lý của cơ thể rất phức tạp, không dự đoán được. Đồng thời, nếu lấy máu

trên cùng cá thể, khoảng cách giữa hai lần lấy mẫu cần được khảo sát để vừa đảm

bảo đánh giá được xu hướng hấp thu của DC vừa đảm bảo đủ thời gian để máu bồi

hoàn. Hơn nữa, sức khỏe của chuột sau một lần lấy máu với lượng máu mỗi lần

khoảng 500-600 l không còn tốt. Vì vậy, trong nghiên cứu của luận án, máu được

lấy tại chỉ một thời điểm trên mỗi chuột.

4.5.1.3. Phương pháp xử lý mẫu

Quá trình chiết DC từ dịch sinh học có thể thực hiện bằng phương pháp chiết

lỏng-lỏng, chiết pha rắn hoặc tủa protein trong huyết tương. Tuy nhiên, nếu chiết

pha rắn cần phải có các cột chứa chất mang tương đối đắt tiền. Thể tích huyết tương

mỗi lần phân tích khá nhỏ (100 l) và hàm lượng curcumin và chất chuyển hóa

THC thấp. Nếu dùng phương pháp tủa protein, protein huyết tương có thể kéo theo

DC làm giảm nồng độ DC trong mẫu. Đồng thời, nếu tủa protein, nền mẫu còn chứa

143

nhiều tác nhân gây hiệu ứng nền khi đồng rửa giải, làm cản trở khả năng ion hóa

của chất cần phân tích ở nguồn ion hóa, ảnh hưởng đến tín hiệu thu được. Vì vậy,

trong trường hợp này, mẫu huyết tương được xử lý bằng phương pháp chiết lỏng-

lỏng và lựa chọn dung môi chiết sao cho quá trình chiết đạt hiệu suất cao nhất. So

với kỹ thuật chiết pha rắn, kỹ thuật chiết lỏng –lỏng bằng dung môi hữu cơ đơn

giản, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt, dễ dàng triển khai tại nhiều phòng thí

nghiệm, mang lại hiệu quả kinh tế cao khi áp dụng trong các nghiên cứu phải phân

tích một số lượng lớn các mẫu huyết tương. Dịch chiết với nồng độ chất cần phân

tích khá thấp được cô bốc hơi dung môi và hòa tan trở lại trong một thể tích nhỏ

dung môi pha động (100 l) để cô đặc mẫu, làm tăng nồng độ DC trong mẫu định

lượng, thuận lợi cho việc phân tích. So với các dung môi chiết đã khảo sát là ethyl

acetat, hỗn hợp diethylether-cloroform, việc xử lý mẫu bằng phương pháp chiết

lỏng-lỏng với dung môi tert-butyl methyl ether cho nền mẫu sạch, tỷ lệ thu hồi CUR

và THC trong huyết tương cao và ổn định. Tuy nhiên, hiệu suất chiết chất chuẩn nội

còn hơi thấp.

4.5.1.4. Chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin

Trên người tình nguyện và chuột thí nghiệm, curcumin sau khi hấp thu qua

đường uống sẽ bị chuyển hóa mạnh qua gan tạo thành nhiều sản phẩm chuyển hóa

như tetrahydrocurcumin, curcumin glucuronid, tetrahydrocurcumin glucuronid. Vì

vậy, việc xác định nồng độ chất chuyển hóa của curcumin có ý nghĩa trong việc

đánh giá hiệu quả điều trị của DC trên lâm sàng.

Thực tế, phần lớn các nghiên cứu đánh giá SKD của curcumin trên thế giới chỉ

tiến hành định lượng curcumin trong huyết tương [40], [52], [87]. Một số ít nghiên

cứu định lượng cả curcumin và chất chuyển hóa trong huyết tương. Trong nghiên

cứu của Zhongfa L. và cộng sự, nhũ tương nano curcumin được đánh giá SKD trên

chuột nhắt. Sau khi uống liều 1,8 g/kg chuột, các chất chuyển hóa chính của

curcumin là curcumin-O- glucuronid, THC và curcumin-O-sulfat có thể phát hiện

trong huyết tương chuột nhắt [115]. Để định lượng được các sản phẩm chuyển hóa

dạng liên hợp phải có chất chuẩn hoặc phải dùng enzym β-glucuronidase và

sulfatase để chuyển dạng liên hợp về dạng tự do [19], [55], [105]. Việc phải thực

144

hiện phản ứng thủy phân trước khi phân tích không những phức tạp, tốn thời gian

mà còn có thể ảnh hưởng đến độ đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích do

hiệu suất của phản ứng phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Trong điều kiện hiện có, nghiên

cứu của luận án đã tiến hành định lượng đồng thời curcumin và sản phẩm chuyển

hóa THC, chưa định lượng được một số dạng liên hợp của curcumin trong huyết

tương. Đây cũng là một trong những nguyên nhân dẫn đến kết quả định lượng

curcumin trong huyết tương khá thấp.

4.5.1.5. Phương pháp phân tích curcumin trong huyết tương bằng phương pháp

LC-MS/MS

Curcumin có SKD thấp, bị chuyển hóa mạnh thành THC. Mặt khác, mẫu

huyết tương lại có nhiều thành phần tạp chất nên việc phân tích, định lượng

curcumin và chất chuyển hóa THC trong huyết tương chuột gặp khó khăn hơn nhiều

so với phương pháp phân tích trong chế phẩm thuốc. Thể tích huyết tương mỗi lần

xử lý mẫu chỉ khoảng 100 l. Nồng độ DC lại khá thấp nên phương pháp phân tích

đòi hỏi độ nhạy cao. Vì vậy, kết hợp nguyên lý tách các DC bằng cột UPLC với các

ưu điểm nổi bật của phương pháp phân tích phổ khối như độ đặc hiệu-chọn lọc, độ

nhạy tốt, phương pháp LC-MS/MS nghiên cứu trong luận án đã phân tích được

đồng thời CUR và THC trong huyết tương ở nồng độ rất thấp (tới 0,5 ng/ml) với độ

đúng, độ chính xác cao. Phương pháp định lượng này cũng có ưu điểm phát hiện

đồng thời CUR và THC trong huyết tương mà không cần yêu cầu hai pic phải tách

khỏi nhau. So với phương pháp HPLC của Ji H, và cộng sự [42], Shaikh J. và cộng

sự [87], phương pháp LC-MS/MS của Wang X.M. và cộng sự [105], Cao Y. và

cộng sự [14], giới hạn định lượng dưới của phương pháp này thấp hơn nhiều (0,5

ng/ml), cho phép xác định được nồng độ DC trong các mẫu huyết tương chuột ở xa

thời điểm dùng thuốc, ứng dụng phù hợp trong các nghiên cứu SKD. Ngoài ra,

phương pháp phân tích trong luận án sử dụng UPLC kết nối với đầu dò khối phổ có

thời gian phân tích ngắn, thích hợp cho việc phân tích mẫu có thể tích nhỏ (100 l)

và số lượng mẫu lớn trong các nghiên cứu SKD.

Bên cạnh các ưu điểm trên, việc sử dụng chuẩn nội còn làm giảm thiểu sai số

trong quá trình phân tích, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy. Thực tế, việc phân

145

tích DC trong dịch sinh học không trực tiếp xác định được chất phân tích trong mẫu

mà chỉ có thể xác định được DC sau khi đã xử lý mẫu, chiết tách DC khỏi mẫu dịch

sinh học. Quá trình chiết tách này gồm nhiều giai đoạn và độ thu hồi DC phụ thuộc

vào nhiều yếu tố. Do vậy, việc sử dụng chuẩn nội trong phương pháp phân tích

trong dịch sinh học là cần thiết. Chuẩn nội được pha loãng trong hỗn hợp dung môi

methanol: nước (1:1) nhằm giảm tỷ lệ methanol, tránh làm kết tủa huyết tương khi

phối hợp.

Kết quả thẩm định cho thấy: phương pháp phân tích CUR và THC trong huyết

tương có tính thích hợp, tính đặc hiệu, độ tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, ảnh

hưởng của nền mẫu, nhiễm chéo, độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày và độ

ổn định đáp ứng được các yêu cầu chung của FDA về thẩm định phương pháp phân

tích trong dịch sinh học.

4.5.1.6. Chế phẩm đối chiếu

Hiện nay trên thị trường, phần lớn các chế phẩm “nano curcumin” chứa thành

phần hoạt chính là curcuminoid phối hợp với piperin. Curcuminoid là hỗn hợp ba

thành phần trong đó curcumin chiếm khoảng 77%. Mặt khác, do sự có mặt của

piperin nên SKD được cải thiện. Do đó, những chế phẩm này không thể sử dụng

làm chế phẩm đối chiếu. Một số chế phẩm bột phun sấy nano curcumin chứa DC

chính là curcumin. Tuy nhiên, khi đánh giá KTTP trên thiết bị đo Zetasizer Nano

ZS90 Malvern và hình ảnh chụp SEM, KTTPTB của các mẫu này khá lớn (trên

1000 nm). Vì vậy, trong nghiên cứu này, hỗn dịch quy ước bào chế từ nguyên liệu

curcumin ban đầu được lựa chọn là chế phẩm đối chiếu.

Do curcumin là một DC ít tan trong nước, khi dùng đường uống, curcumin

khó phân tán vào trong lớp dịch nhày và có thể bị kết tụ thành mảng lớn trong môi

trường nước, do đó SKD thấp [92]. Trong nghiên cứu này, curcumin được phân tán

tạo hỗn dịch quy ước trong môi trường phân tán chứa CMC 0,2% để đảm bảo các

tiểu phân đều được gây thấm và phân tán đồng đều trong môi trường phân tán.

Đồng thời, hỗn dịch được khuấy từ liên tục trong thời gian cho chuột uống.

146

4.5.2. Nghiên cứu đánh giá SKD in vivo

Nghiên cứu SKD của hỗn dịch nano curcumin đã được tiến hành trên chuột

nhắt bởi Gao Y. và cộng sự dựa trên hai nhóm chuột, mỗi nhóm gồm 27 chuột [30].

So sánh với nghiên cứu của Gao Y. và cộng sự, trong nghiên cứu này, số lượng

chuột, số thời điểm lấy mẫu và số mẫu lấy tại một thời điểm nhiều hơn.

Kết quả thực nghiệm cho thấy, tại một số thời điểm, kết quả định lượng nồng

độ DC trong máu chuột cao hơn hẳn so với các chuột cùng nhóm. Điều này có thể

do hấp thu của mỗi cá thể chuột khác nhau hoặc do dưới tác động của enzym tiêu

hóa, chất chuyển hóa chuyển ngược lại thành chất gốc tại một thời điểm nào đó.

Ngoài ra, với cách lấy mẫu mỗi lần trên từng cá thể, sự sai khác giữa các cá thể có

thể lớn. Do đó, một số số liệu nằm ngoài mức giới hạn giá trị trung bình ± 3 lần độ

lệch chuẩn (GTTB ± 3SD) tại từng thời điểm bị loại bỏ.

Kết quả xác định nồng độ CUR và THC trong huyết tương chuột đối với nhóm

chuột uống hỗn dịch quy ước ở mục 3.6.1 cho thấy: nồng độ CUR và THC đều

thấp, chứng tỏ SKD của hỗn dịch quy ước thấp. Nguyên nhân có thể do khi sử dụng

theo đường tiêu hóa, curcumin có thể bám dính vào bề mặt ngoài của lớp nhày trên

đường tiêu hóa và không thể hấp thu qua ruột do độ tan thấp [62]. Khi bào chế dưới

dạng hệ tiểu phân nano, hấp thu curcumin được cải thiện đáng kể do tăng độ tan, tốc

độ hòa tan. Đồng thời, sự có mặt của chất diện hoạt Tween 80 cũng làm tăng tính

thấm của curcumin qua đường tiêu hóa.

Về chất chuyển hóa THC, đối với nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước, nồng

độ chất chuyển hóa rất thấp, hầu như ở dưới nồng độ định lượng dưới. Riêng đối

với nhóm chuột uống hỗn dịch nano, nồng độ THC có mặt trong huyết tương trong

thời gian khảo sát cao hơn. Dựa trên kết quả này, với sự trợ giúp của phần mềm

Phoenix NLME 7.0, hằng số tốc độ chuyển hóa Km đã được xác định dựa trên mô

hình dược động học quần thể một ngăn có chuyển hóa, chứng tỏ có sự chuyển hóa

thuận từ chất gốc curcumin sang THC (mục 3.6.2).

Đối với DC curcumin, độ hòa tan, chuyển hóa và thải trừ là các vấn đề chính

liên quan đến SKD đường uống [111]. Trong nghiên cứu này, hệ tiểu phân nano đã

cải thiện đáng kể độ hòa tan của curcumin. Tuy nhiên, ảnh hưởng của dạng bào chế

147

đến chuyển hóa curcumin lại chưa xác định được vì chưa so sánh được tỷ lệ

curcumin và chất chuyển hóa giữa hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano dùng đường

uống. Nồng độ chất chuyển hóa THC trên chuột dùng đường uống hỗn dịch quy

ước quá thấp để có thể phát hiện được, các chất chuyển hóa dưới dạng liên hợp

glucuronid và sulfat lại chưa định lượng được. Do đó, sự tăng SKD đường uống của

curcumin của hệ tiểu phân nano chủ yếu do sự tăng độ tan và độ hòa tan của

curcumin.

Mặt khác, khi curcumin được hấp thu vào máu, một số chất chuyển hóa của

curcumin có mặt trong máu và một phần nhỏ có thể tìm thấy trong dịch mật. Do đó,

khó có thể làm rõ được sự hấp thu thực sự của curcumin bằng cách xác định

curcumin và chất chuyển hóa của nó trong máu. Để thực hiện được điều này, một số

nghiên cứu dược động học của curcumin tính toán lượng curcumin hấp thu trực tiếp

bằng cách phân tích lượng curcumin không hấp thu trong hệ thống tiêu hóa và

lượng tìm thấy trong phân [22].

Nghiên cứu SKD của thuốc khá phức tạp, tốn kém, khó có thể tiến hành lặp lại

do chi phí, thời gian triển khai và tiến hành phân tích lại các mẫu sinh học sẽ gặp

khó khăn do lượng máu lấy trên mỗi chuột tại một thời điểm hạn chế (khoảng 500-

600 l). Nghiên cứu này đã tiến hành xây dựng phương pháp xử lý mẫu, định lượng

và sơ bộ đánh giá SKD của chế phẩm để có thể khẳng định phương pháp và mô

hình nghiên cứu dễ thực hiện và có thể áp dụng vào thực tiễn.

Mặc dù số lượng chuột thử đảm bảo mỗi thời điểm máu được lấy trên 6 chuột,

nhưng vẫn có những hạn chế nhất định về mức ý nghĩa thống kê phân tích các thông

số dược động học vì thế chưa thể kết luận sâu hơn về SKD của thuốc đã bào chế.

Các kết quả thu được có thể sơ bộ khẳng định hệ tiểu phân nano curcumin đã đạt

mục đích cải thiện SKD đường uống. Đồng thời, nghiên cứu cũng tính toán được

hằng số tốc độ chuyển hóa từ chất gốc curcumin sang chất chuyển hóa THC.

Với mô hình nghiên cứu SKD trên chuột nhắt như trên, đối với đối tượng thử

là người tình nguyện, các thời điểm lấy mẫu cần được thiết kế lại để đảm bảo không

quá gần nhau. Việc lấy máu trên người tình nguyện sẽ dễ dàng hơn và số thời điểm

lấy máu trên mỗi đối tượng thử cũng nhiều hơn so với trên chuột nhắt. Do vậy, có

148

thể lấy mẫu trên một nhóm cá thể, trong đó mỗi cá thể chỉ lấy tại một số thời điểm.

Phương pháp xử lý mẫu và phân tích định lượng curcumin và một số chất chuyển

hóa của curcumin trong mẫu huyết tương cần được khảo sát và thẩm định lại. Nếu

nghiên cứu dược động học được tiến hành trên người tình nguyện, cần quan tâm

đến khía cạnh đạo đức, pháp lý và kinh tế.

4.6. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Đã nghiên cứu xây dựng được công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân

nano curcumin bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật

nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn. Phương pháp

bào chế đơn giản, dễ dàng áp dụng, có thể ứng dụng trong điều kiện thực tiễn ở Việt

Nam.

- Đã xây dựng được mô hình đánh giá SKD của bột phun sấy chứa hệ tiểu phân

nano curcumin dùng đường uống trên chuột thí nghiệm. Mô hình đánh giá này khả thi

và có thể áp dụng cho các nghiên cứu đánh giá SKD đường uống của hệ tiểu phân

nano. Phương pháp đánh giá SKD dựa trên việc định lượng đồng thời chất gốc

curcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột bằng kỹ

thuật LC-MS/MS lần đầu tiên được xây dựng và thẩm định tại Việt Nam. Đây là

phương pháp phân tích đủ độ nhạy, đặc hiệu để xác định nồng độ các chất trong dịch

sinh học với nồng độ thấp (cỡ ng/ml). Kết quả của phương pháp phân tích có thể

ứng dụng trong các nghiên cứu dược động học của curcumin trên động vật thí

nghiệm, tạo tiền đề cho các nghiên cứu dược động học của curcumin trên người. Dựa

trên kết quả thực nghiệm của mô hình này, có thể kết luận hệ tiểu phân nano bào chế

được đã cải thiện sinh khả dụng đường uống của curcumin do làm tăng độ tan, tốc

độ hòa tan và tính thấm của curcumin. Đồng thời, dựa trên cơ sở đó, nghiên cứu đã

xác định được hằng số tốc độ chuyển hóa của chất gốc curcumin sang chất chuyển

hóa tetrahydrocurcumin trên chuột thí nghiệm dựa trên mô hình dược động học

quần thể một ngăn có chuyển hóa.

149

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

KẾT LUẬN

1. Về xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin

Trong nội dung thực nghiệm của đề tài, đã bào chế được hệ tiểu phân nano

curcumin 5 g/mẻ với công thức bào chế: curcumin 5,00 g, Tween 80 0,60 g, PVP

K30 3,75 g, manitol 2,50 g và nước tinh khiết 125 ml.

Hỗn dịch nano được bào chế bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân sử

dụng kỹ thuật nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn

với các thông số: thời gian nghiền khô 6 giờ, tần số nghiền khô 30 Hz sử dụng

buồng nghiền bi inox, thời gian nghiền ướt 4 giờ, tần số nghiền ướt 30 Hz sử dụng

buồng nghiền bi zirconi oxyd, kích thước bi 0,8 mm, đồng nhất hóa 18000 vòng/phút trong 60 phút. Hỗn dịch nano được phun sấy với nhiệt độ khí vào 96oC

và tốc độ phun dịch 2 ml/phút để tạo hệ tiểu phân nano.

Hệ tiểu phân được duy trì ở dạng bột phun sấy với KTTPTB khoảng 336,7 ±

18,6 và PDI 0,387 ± 0,032, trong đó curcumin phân tán trong chất mang PVP. Tiểu

phân nano tồn tại một phần ở dạng kết tinh với tốc độ hòa tan cải thiện đáng kể so

với nguyên liệu ban đầu. Dạng bột phun sấy có tỷ lệ mất khối lượng do làm khô

khoảng 9,35% và khối lượng riêng biểu kiến khoảng 0,329 ± 0,024 g/ml. Hệ tiểu

phân nano nghiên cứu ổn định về hình thái, KTTP, đặc tính kết tinh, mất khối lượng

do làm khô, hàm lượng curcumin và độ hòa tan curcumin trong 9 tháng ở điều kiện

thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc.

2. Về đánh giá sinh khả dụng của hệ tiểu phân nano

Việc đánh giá SKD của thuốc nghiên cứu trên chuột thí nghiệm đã chứng tỏ hệ

tiểu phân nano có khả năng cải thiện SKD của curcumin. Kết quả nghiên cứu bước

đầu này cũng chứng minh được có sự chuyển hóa từ chất gốc curcumin sang chất

chuyển hóa tetrahydrocurcumin trên chuột dùng đường uống.

ĐỀ XUẤT

- Hoàn thiện quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin, nâng quy mô lô

mẻ, hướng tới sản xuất nguyên liệu nano ứng dụng trong các dạng bào chế.

- Đánh giá độ ổn định dài hạn của hệ tiểu phân nano curcumin.

150

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Dương Thị Hồng Ánh, Nguyễn Đình Hà, Nguyễn Trần Linh (2015), “Tối ưu

hóa công thức và một số thông số trong quy trình bào chế tiểu phân nano

curcumin”, Tạp chí Nghiên cứu Dược và thông tin thuốc, tập 6, số 2, trang 2-

2. Dương Thị Hồng Ánh, Thái Thị Hồng Anh, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Trần

Linh (2016), “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano curcumin quy mô 5

gam/mẻ”, Tạp chí Nghiên cứu Dược và thông tin thuốc, tập 7, số 6, trang 28-

33.

3. Dương Thị Hồng Ánh, Hoàng Văn Đức, Lê Thị Thu Huyền, Nguyễn Văn

Long, Nguyễn Trần Linh (2017), “Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương

pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời curcumin và chất chuyển hóa

tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột”, Tạp chí Dược học, tập 57, số

492, trang 50-52 và 73.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Bộ Y tế (2009), "Dược điển Việt Nam IV", tr. PL-182.

2. Phạm Ngọc Bùng, Lê Thị Thu Trang (2014), "Hấp phụ và chất hoạt động bề

mặt", Hóa lý Dược, tr. 257-260.

3. Phạm Thị Minh Huệ, Bùi Văn Thuấn, Đặng Việt Hùng (2015), "Nghiên cứu

bào chế phytosome curcumin", Tạp chí Dược học, 55(3), tr. 14-18.

4. Đào Minh Huy, Phạm Thị Minh Huệ (2016), "Pha cubic và cubosome: Khái

niệm, cấu trúc và ứng dụng", Tạp chí Dược học, 479(56), tr. 59-64.

5. Võ Xuân Minh, Phạm Thị Minh Huệ (2013), Kĩ thuật nano và liposome ứng

dụng trong dược phẩm và mỹ phẩm, Trường Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội,

tr. 1-45.

6. Nguyễn Phúc Nghĩa (2015), "Kỹ thuật xay-nghiền-rây-trộn", Quá trình và

thiết bị trong công nghệ Dược phẩm, tr. 1-20.

Tài liệu tiếng Anh

7. Ain-Ai A., Gupta P. K. (2008), "Effect of arginine hydrochloride and

hydroxypropyl cellulose as stabilizers on the physical stability of high drug

loading nanosuspensions of a poorly soluble compound.", International

Journal of Pharmaceutics, 351(1-2), pp. 282-288.

8. Allam A. N., Komeil I. A., Fouda M. A., et al. (2015), "Preparation,

characterization and in vivo evaluation of curcumin self-nano phospholipid

dispersion as an approach to enhance oral bioavailability", International

Journal of Pharmaceutics, 489, pp. 117-123.

9. Anand P., Kunnumakkara A. B., Newman R. A., et al. (2007),

"Bioavailability of curcumin: problems and promises", Molecular

pharmaceutics, 4(6), pp. 807-818.

10. Asean Guideline on Stability Study of Drug Product (2013), "5th draft".

11. Beevers C. S., Huang S. (2011), "Pharmacological and clinical properties of

curcumin", Botanics: Targets and Therapy, 1, pp. 5-18.

12. Bhakay A., Merwade M., Bilgili E., et al. (2011), "Novel aspects of wet

milling for the production of microsuspensions and nanosuspensions of

poorly water-soluble drugs", Drug Development and Industrial Pharmacy,

37(8), pp. 963-976.

13. Cao X., Gibbs S. T., Fang L., et al. (2006), "Why is it challenging to predict

intestinal drug absorption and oral bioavailability in human using rat model",

Pharmaceutical Research, 23(8), pp. 1675-1686.

14. Cao Y., Xu R. X., Liu Z. (2014), "A high-throughput quantification method

of curcuminoids and curcumin metabolites in human plasma via high-

performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry", Journal of

Chromatography B, 949-950, pp. 70-78.

15. Chang T. L., Zhan H., Liang D., et al. (2015), "Nanocrystal technology for

drug formulation and delivery", Frontiers of Chemical Science and

Engineering, 9(1), pp. 1-14.

16. Charles B. (2014), "Population pharmacokinetics: an overview", Australian

Prescriber, 37(6), pp. 210-213.

17. Chaubal M. V., Popescu C. (2008), "Conversion of nanosuspensions into dry

powders by spray drying: a case study", Pharmaceutical Research, 25(10),

pp. 2302-2308.

18. Chen H., Khemtong C., Yang X., et al. (2011), "Nanonization strategies for

poorly water-soluble drugs", Drug Discovery Today, 16(7/8), pp. 354-360.

19. Chen W., Fan-Havard P., Yee L. D., et al. (2012), "A liquid

chromatography–tandem mass spectrometric method for quantification of

curcumin-O-glucuronide and curcumin in human plasma", Journal of

Chromatography B, 900, pp. 89-93.

20. Costa P., Lobo J. M. S. (2001), "Modeling and comparison of dissolution

profiles", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 13(2), pp. 123-133.

21. Crisp M. P., Tucker C. J., Rogers T. L. (2007), "Turbidimetric measurement

and prediction of dissolution rates of poorly soluble drug nanocrystals",

Journal of Controlled Release, 117, pp. 351-359.

22. Cui J., Yu B., Zhao Y., et al. (2009), "Enhancement of oral absorption of

curcumin by self-microemulsifying drug delivery systems", International

Journal of Pharmaceutics, 371, pp. 148-155.

23. Deng Z., Xu S., Li S. (2008), "Understanding a relaxation behavior in a

nanoparticle suspension for drug delivery applications", International

Journal of Pharmaceutics, 351, pp. 236-243.

24. Donsi F., Wang Y., Li J., et al. (2010), "Preparation of Curcumin Sub-

micrometer Dispersions by High-Pressure Homogenization", Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 58(5), pp. 2848-2853.

25. Douroumis D., Fahr A. (2013), Drug delivery strategies for poorly water

soluble drugs, John Wiley & Sons, Chichester, pp. 1-600.

26. European Medicines Agency (2012), "Guideline on bioanalytical method

validation".

27. Gao L., Zhang D., Chen M. (2008), "Drug nanocrystals for the formulation

of poorly soluble drugs and its application as a potential drug delivery

system", Journal of Nanoparticle Research, 10(5), pp. 845-862.

28. Gao Y., Li Z., Sun M., et al. (2011), "Preparation and characterization of

intravenously injectable curcumin nanosuspension", Drug Delivery, 18(2),

pp. 131-142.

29. Gao Y., Li Z., Sun M., et al. (2010), "Preparation, characterization,

pharmacokinetics, and tissue distribution of curcumin nanosuspension with

TPGS as stabilizer", Drug Development and Industrial Pharmacy, 36(10),

pp. 1225-1234.

30. Gao Y., Wang C., Sun M., et al. (2012), "In vivo evaluation of curcumin

loaded nanosuspensions by oral administration", Journal of Biomedical

Nanotechnology, 8(4), pp. 659-668.

31. Garg G., Saraf S., Saraf S. (2007), "Cubosomes: An Overview", Biological

and Pharmaceutical Bulletin, 30(2), pp. 350-353.

32. Ghosh A., Banerjee T., Bhandary S., et al. (2014), "Formulation of nanotized

curcumin and demonstration of its antimalarial efficacy", International

Journal of Nanomedicine, 9(1), pp. 5373-5387.

33. Goel A., Kunnumakkara A. B., Aggarwal B. B. (2007), "Curcumin as

"Curecumin": from kitchen to clinic", Biochemical Pharmacology, 75(4), pp.

787-809.

34. Gülsün T., Gürsoy R. N., Öner L. (2009), "Nanocrystal technology for oral

delivery of poorly water-soluble drugs", FABAD Journal of Pharmceutical

Sciences, 34, pp. 55-65.

35. Gupta N. K., Dixit V. K. (2011), "Bioavailability enhancement of curcumin

by complexation with phosphatidyl choline", Journal of Pharmaceutical

Sciences, 100, pp. 1987-1995.

36. Hang D., Cutler D. J., Chan H. K., et al. (2008), "What is a suitable

dissolution method for drug nanoparticles?", Pharmaceutical Research,

25(7), pp. 1696-1701.

37. Harde H., Das M., Jain S. (2011), "Solid lipid nanoparticles: an oral

bioavailability enhancer vehicle", Expert opinion on drug delivery, 8(11), pp.

1407-1424.

38. Hiep T. T., Poudel B. K., Marasini N., et al. (2013), "Prepartion and

evaluation of raloxifene-loaded solid dispersion nanoparticle by spray-drying

technique without an organic solvent", International Journal of

Pharmaceutics, 443, pp. 50-57.

39. Hu L., Jia Y., Niu F., et al. (2012), "Preparation and enhancement of oral

bioavailability of curcumin using microemulsions vehicle", Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 60, pp. 7137-7141.

40. Hu L., Shi Y., Li J. H., et al. (2015), "Enhancement of Oral Bioavailability

of Curcumin by a Novel Solid Dispersion System", AAPS PharmSciTech,

16(6), pp. 1327-1334.

41. Huang Q., Yu H., Ru Q. (2011), "Bioavailability and delivery of

nutraceuticals using nanotechnology", Journal of Food Science, 75, pp. 50-

57.

42. Ji H., Tang J., Ren J., et al. (2015), "Curcumin-loaded solid lipid

nanoparticles with Brij78 and TPGS improved in vivo oral bioavailability

and in situ intestinal absorption of curcumin", Drug Delivery, pp. 1-12.

43. Junghanns J. A. H., Muller R. H. (2008), "Nanocrystal technology, drug

delivery and clinical applications", International Journal of Nanomedicine,

3(3), pp. 295 - 309.

44. Junyaprasert V. B., Morakul B. (2015), "Nanocrystals for enhancement of

oral bioavailability of poorly water-soluble drugs", Asian journal of

pharmaceutical sciences, 10, pp. 13-23.

45. Kaewnopparat N., Kaewnopparat S., Jangwang A. (2009), "Increased

Solubility, Dissolution and Physicochemical Studies of Curcumin-

Polyvinylpyrrolidone K-30 Solid Dispersions", International Journal of

Medical, Health, Biomedical, Bioengineering and Pharmaceutical

Engineering 3(7), pp. 137-142.

46. Kakkar V., Singh S., Singla D. (2011), "Exploring solid lipid nanoparticles

to enhance the oral bioavailability of curcumin", Molecular Nutrition &

Food Research, 55, pp. 495-503.

47. Kakran M., Sahoo N. G., Tan I.-L., et al. (2012), "Preparation of

nanoparticles of poorly water-soluble antioxidant curcumin by antisolvent

precipitation methods", Journal of Nanoparticle Research, 14(3), pp. 1-11.

48. Karimi N., Ghanbarzadeh B., Hamishehkar H. (2015), "Phytosome and

liposome: the beneficial encapsulation systems in drug delivery and food

application", Applied food biotechnology, 2(3), pp. 17-27.

49. Keck C. M., Muller R. H. (2008), "Size analysis of submicron particles by

laser diffractometry-90% of the published measurements are false",

International Journal of Pharmaceutics, 355, pp. 150-163.

50. Khatik R., Dwivedi P., Shukla A., et al. (2016), "Development,

characterization and toxicological evaluations of phospholipids complexes of

curcumin for effective drug delivery in cancer chemotherapy", Drug

Delivery, 23(3), pp. 1067-1078.

51. Kiet T. A., Toi V. V., Thanh T. V. (2015), "Investigation of Solid Dispersion Methods to Improve the Dissolution Rate of Curcumin", 5th International

Conference on Biomedical Engineering in Vietnam, pp. 293-297.

52. Kumar A., Ahuja A., Ali J., et al. (2014), "Curcumin-loaded lipid

nanocarrier for improving bioavailability, stability and cytotoxicity against

malignant glioma cells", Drug Delivery, 23(1), pp. 214-229.

53. Lee J., Choi J. Y., Park C. H. (2008), "Characteristics of polymers enabling

nano-comminution of water-insoluble drugs", International Journal of

Pharmaceutics, 355, pp. 328-336.

54. Li J., Shin G. H., Chen X. (2015), "Modified curcumin with hyaluronic acid:

Combination of pro-drug and nano-micelle strategy to address the curcumin

challenge", Food Research International, 69, pp. 202-208.

55. Liu A., Lou H., Zhao L., et al. (2006), "Validated LC/MS/MS assay for

curcumin and tetrahydrocurcumin in rat plasma and application to

pharmacokinetic study of phospholipid complex of curcumin", Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 40, pp. 720-727.

56. Liu P., Rong X., Laru J. (2011), "Nanosuspensions of poorly soluble drugs:

Preparation and development by wet milling", International Journal of

Pharmaceutics, 411, pp. 215-222.

57. Liu W., Zhai Y., Heng X., et al. (2016), "Oral bioavailability of curcumin:

problems and advancements", Journal of Drug Targeting, 24(8), pp. 694-

702.

58. Loh Z. H., Samanta A. K., Heng P. W. S. (2015), "Overview of milling

techniques for improving the solubility of poorly water-soluble drugs", Asian

Journal of Pharmaceutical Sciences, 10, pp. 255-274.

59. Lu Y., Park K. (2013), "Polymeric micelles and alternative nanonized

delivery vehicles for poorly soluble drugs", International Journal of

Pharmaceutics, 453, pp. 198-214.

60. Madgulkar A., Bandivadekar M., Shid T. (2016), "Sugars as solid dispersion

carrier to improve solubility and dissolution of the BCS class II drug:

clotrimazole", Drug Development and Industrial Pharmacy, 42(1), pp. 28-

38.

61. Mahajan Y. R. (2011), "Nanotechnology-enhanced curcumin: symbiosis of

ancient wisdom of east with modern medical science", Nanotech Insights,

2(3), pp. 17-27.

62. Marczylo T. H., Verschoyle R. D., Cooke D. N., et al. (2007), "Comparison

of systemic availability of curcumin with that of curcumin formulated with

phosphatidylcholine", Cancer Chemother Pharmacol, 60(2), pp. 171-177.

63. Mohanty C., Das M., Sahoo S. K. (2012), "Emerging role of nanocarriers to

increase the solubility and bioavailability of curcumin", Expert opinion on

drug delivery, 9(11), pp. 1347-1364.

64. Morales J. O., Watts A. B., Mcconville J. T. (2012), "Mechanical Particle-

Size Reduction Techniques ", Formulating poorly water soluble drugs, New

York, pp. 133-170.

65. Möschwitzer J. P. (2013), "Drug nanocrystals in the commercial

pharmaceutical development process", International Journal of

Pharmaceutics 453, pp. 142-156.

66. Munjal B., Pawar Y. B., Patel S. B., et al. (2011), "Comparative oral

bioavailability advantage from curcumin formulations", Drug delivery and

translational research, 1(4), pp. 322-331.

67. Onoue S., Takahashi H., Kawabata Y. (2010), "Formulation design and

photochemical studies on nanocrystal solid dispersion of curcumin with

improved oral bioavaibility", Journal of Pharmaceutical Sciences, 99, pp.

18711-11881.

68. Parvathy K. S., Negi P. S., Srinivas P. (2010), "Curcumin-amino acid

conjugates: synthesis, antioxidant and antimutagenic attributes", Food

Chemistry, 120, pp. 523-530.

69. Patel M. M., Shah A., Patel N. M., et al. (2011), "Nanosuspension: a novel

approach for drug delivery system", Journal of Pharmaceutical Science and

Bioscientific Research, 1(1), pp. 1-10.

70. Patravale V. B., Date A. A., Kulkarni R. M. (2004), "Nanosuspensions: a

promising drug delivery strategy", Journal of Pharmacy and Pharmacology,

56, pp. 827-840.

71. Peltonen L., Hirvonen J. (2010), "Pharmaceutical nanocrystals by

nanomilling: critical process parameters, particle fracturing and stabilization

methods", The Journal of pharmacy and pharmacology, 62(11), pp. 1569-

1579.

72. Pridgen E. M., Alexis F., Farokhzad O. C. (2015), "Polymeric nanoparticle

drug delivery technologies for oral delivery applications", Expert opinion on

drug delivery, 12(9), pp. 1459-1473.

73. Pro Sicentific Inc. (2017), Mechanical Homogenizers, updated 2017

16/03/2017, available from: http://www.proscientific.com/the-field-of-

homogenizing.

74. Rachmawati H. (2013), "Curcumin nanoforms promise better therapeutic",

International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences, 4(2), pp. 211-

220.

75. Rachmawati H., Shaal L. A., Müller R. H., et al. (2013), "Development of

curcumin nanocrystal: Physical aspects", Journal of Pharmaceutical

Sciences, 102(1), pp. 204-214.

76. Ramalingam P., Ko Y. T. (2015), "Enhanced oral delivery of curcumin from

N-trimethyl chitosan surface-modified solid lipid nanoparticles:

pharmacokinetic and brain distribution evaluations", Pharmaceutical

Research, 32, pp. 389-402.

77. Ravichandran R. (2013), "Studies on dissolution behaviour of

nanoparticulate curcumin formulation", Advances in Nanoparticles, 2, pp.

51-59.

78. Ravichandran R. (2012), "Development of an oral curcumin nanocystal

formulation", Jourmal of Nanotechnology in Engineering anh Medicine, 3,

pp. 1-7.

79. Rodriguez-Aller M., Guillarme D., Veuthey J. L. (2015), "Strategies for

formulating and delivering poorly water-soluble drugs", Journal of Drug

Delivery Science and Technology, 30, pp. 342-351.

80. Sareen R., Jain N., Rajkumari A. (2016), "pH triggered delivery of curcumin

from Eudragit-coated chitosan microspheres for inflammatory bowel disease:

characterization and pharmacodynamic evaluation", Drug delivery, 23(1),

pp. 55-62.

81. Sarpal K., Pawar Y. B., Bansal A. K. (2010), "Self-emulsifying drug delivery

systems: a strategy to improve oral bioavaillability", Current research and

information on pharmaceuticals sciences, 11(3), pp. 42-49.

82. Schiborr C., Kocher A., Behnam D., et al. (2014), "The oral bioavailability

of curcumin from micronized powder and liquid micelles is significantly

increased in healthy humans and differs between sexes", Molecular Nutrition

& Food Research, 58, pp. 516-527.

83. Sebastià N., Soriano J. M., Mañes J., et al. (2012), "Medicinal Properties and

Health Benefits of Curcumin", Curcumin: Biosynthesis, Medicinal Uses and

Health Benefits, pp. 235-248.

84. Seo S. W., Han H. K., Chun M. K. (2012), "Preparation and pharmacokinetic

evaluation of curcumin solid dispersion using Solutol (R) HS15 as a carrier",

International Journal of Pharmaceutics, 424, pp. 18-25.

85. Sepassi S., Goodwin D. J., Drake A. F., et al. (2007), "Effect of polymer

molecular weight on the production of drug nanoparticles", Journal of

Pharmaceutical Sciences, 96(10), pp. 2655-2666.

86. Setthacheewakul S., Mahattanadul S., Phadoongsombut N. (2010),

"Development and evaluation of self-microemulsifying liquid and pellet

formulations of curcumin, and absorption studies in rats", European Journal

of Pharmaceutical and Biopharmaceutics, 76, pp. 475-485.

87. Shaikh J., Ankola D. D., Beniwal. V., et al. (2009), "Nanoparticle

encapsulation improves oral bioavailability of curcumin by at least 9-fold

when compared to curcumin administered with piperine as absorption

enhancer", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 37, pp. 223-230.

88. Sharma P., Denny W. A., Garg S. (2009), "Effect of wet milling process on

the solid state of indomethacin and simvastatin", International Journal of

Pharmaceutics, 380, pp. 40-48.

89. Sharma R. A., Gescher A. J., Steward W. P. (2005), "Curcumin: The story so

far", European Journal of Cancer, 41(13), pp. 1955-1968.

90. Shoba G., Joy D., Joseph T., et al. (1998), "Influence of piperine on the

pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers", Planta

Medica, 64(4), pp. 353-356.

91. Sun M., Zhao L., Guo C., et al. (2012), "Evaluation of an oral carrier system

in rats: bioavailability and gastrointestinal absorption properties of curcumin

encapsulated PBCA nanoparticles", Journal of Nanoparticle Research, 14,

pp. 1-13.

92. Suwannateep N., Banlunara W. (2011), "Mucoadhesive curcumin

nanospheres: biological activity, adhesion to stomach mucosa and release of

curcumin into the circulation", Journal of Controlled Release, 151, pp. 176-

182.

93. Swarbrick J. (1991), Preclinical drug disposition, Marcel Dekker, Inc., New

York, pp. 31-68.

94. Takahashi M., Uechi S., Takara K., et al. (2009), "Evaluation of an Oral

Carrier System in Rats: Bioavailability and Antioxidant Properties of

Liposome-Encapsulated Curcumin", Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 57, pp. 9141-9146.

95. Tanaka Y., Inkyo M., Yumoto R. (2009), "Nanoparticulation of poorly water

soluble drugs using a wet-mill process and physicochemical properties of

the nanopowders", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 57, pp. 1050–

1057.

96. The United States Pharmacopoeia 39-National Formulary 34 (2016),

"Curcuminoids", p. 6582.

97. Thorat A. A., Dalvi S. V. (2015), "Solid-state phase transformations and

storage stability of curcumin polymorphs", Crystal Growth & Design 15, pp.

1757-1770.

98. Tønnesen H. H., Másson M., Loftsson T. (2002), "Studies of curcumin and

curcuminoids. XXVII. Cyclodextrin complexation: solubility, chemical and

photochemical stability", International Journal of Pharmaceutics, 244(1),

pp. 127-135.

99. Tu Y. S., Wu J. W., Zhang J. J., et al. (2014), "Preparation, characterisation

and evaluation of curcumin with piperine-loaded cubosome nanoparticles",

Journal of microencapsulation, 31(6), pp. 551-559.

100. U.S. Department of Health and Human Services-Food and Drug

Administration-Center for Drug Evaluation and Research (2013), "Guidance

for Industry - Bioanalytical method validation ", Draft guidance.

101. Van Eerdenbrugh B., Van Den Mooter G., Augustijns P. (2008), "Top-down

production of drug nanocrystals: Nanosuspension stabilization,

miniaturization and transformation into solid products", International

Journal of Pharmaceutics, 364, pp. 64-75.

102. Van Eerdenbrugh B., Vermant J., Martens J. A. (2009), "A screening study

of surface stabilization during the production of drug nanocrystals", Journal

of Pharmaceutical Science, 98, pp. 2091-2103.

103. Vareed S. K., Kakarala M., Ruffin M. T., et al. (2008), "Pharmacokinetics of

curcumin conjugate metabolites in healthy human subjects", Cancer

Epidemiology Biomarkers & Prevention, 17(6), pp. 1411-1417.

104. Wahlang B., Pawar Y. B., Bansal A. K. (2011), "Identification of

permeability-related hurdles in oral delivery of curcumin using the Caco-2

cell model", European Journal of Pharmaceutical and Biopharmaceutics,

77(2), pp. 275-282.

105. Wang X. M., Zhang Q. Z., Yang Q. Z., et al. (2012), "Validated HPLC–

MS/MS method for simultaneous determination of curcumin and piperine in

human plasma", Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 11(4), pp.

621-629.

106. Xie X., Tao Q., Zou Y., et al. (2011), "PLGA nanoparticles improve the oral

bioavailability of curcumin in rats: characterizations and mechanisms",

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59, pp. 9280-9289.

107. Xu W., Ling P., Zhang T. (2013), "Polymeric micelles, a promising drug

delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs",

Journal of Drug Delivery, 2013, pp. 1-15.

108. Yadav V. G., Singh S. R. (2012), "Nanosuspension: a promising drug

delivery system", An International Research Journal, 3(5), pp. 217-243.

109. Yang K. Y., Lin L., Tseng T., et al. (2007), "Oral bioavailability of curcumin

in rat and the herbal analysis from Curcuma longa by LC-MS/MS", Journal

of Chromatography B, 853, pp. 183-189.

110. Yao G. X., Han G., La W. Y., et al. (2011), "Comparative study on

pharmacokinetics of curcumin extract of rhizoma curcumae longae and

rhizoma wenyujin concisum in rats", Journal of Chinese Medicinal

Materials, 34(1), pp. 88-91.

111. Yu H., Huang Q. (2012), "Improving the oral bioavailability of curcumin

using novel organogel-based nanoemulsions", Journal of Agricultural and

Food Chemistry, 60, pp. 5373-5379.

112. Zhang J., Tang Q., Xu X., et al. (2013), "Development and evaluation of a

novel phytosome-loaded chitosan microsphere system for curcumin

delivery", International Journal of Pharmaceutics, 448, pp. 168-174.

113. Zhang L., Chai G., Zeng X. (2010), "Preparation of fenofibrate immediate-

release tablets involving wet grinding for improved bioavailability", Drug

Development and Industrial Pharmacy, 36, pp. 1054-1063.

114. Zhao L., Du J., Duan Y., et al. (2012), "Curcumin loaded mixed micelles

composed of Pluronic P123 and F68: Preparation, optimization and in vitro

characterization", Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 97, pp. 101-108.

115. Zhongfa L., Chiu M., Wang Y., et al. (2012), "Enhancement of curcumin

oral absorption and pharmacokinetics of curcuminoids and curcumin

metabolites in mice", Cancer Chemotherapy Pharmacology, 69(3), pp. 679-

689.

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng

PHỤ LỤC 2. Một số kết quả nghiên cứu tiền công thức

PHỤ LỤC 3. Một số kết quả nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano curcumin ở quy

mô 1 gam/mẻ

PHỤ LỤC 4. Một số kết quả nâng quy mô bào chế

PHỤ LỤC 5. Quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin

PHỤ LỤC 6. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở

PHỤ LỤC 7. Một số kết quả theo dõi độ ổn định của hệ tiểu phân nano

PHỤ LỤC 8. Một số kết quả nghiên cứu sinh khả dụng của hệ tiểu phân nano chứa

curcumin trên chuột thí nghiệm

PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

Phụ lục 1.1. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng

quang phổ hấp thụ UV-Vis

ụ h t p ấ h ộ Đ

Bước sóng (nm)

Phổ UV-Vis của curcumin trong môi trường nước chứa 0,2% Tween 80

Độ hấp thụ của curcumin trong môi trường nước chứa 0,2% Tween 80 với nồng độ

khác nhau ở bước sóng 427 nm

Nồng độ curcumin 1,0 2,0 2,5 4,0 4,5 5,0 7,5 (g/ml)

0,1 0,24 0,31 0,49 0,57 0,64 0,94 Độ hấp thụ

Xét tính có nghĩa của phương trình hồi quy ở hình 3.1 bằng toán thống kê

Bảng phân tích ANOVA

Bậc Tổng các Bình phương F P tự do bình phương trung bình

0,4915 0,4915 5805,9 Hồi quy 1 0

5 0 0,00008 Số dư mô hình hồi quy

Tổng cộng 6 0,4919

Giá trị Sai số chuẩn t-statistic Giá trị P

Hệ số b -0,029 0,0074 -3,94 0,01

Biến X 0,131 0,0017 76,20 0

Nhận xét:

- Giá trị R2 = 0,999 chứng tỏ có mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ

dung dịch curcumin trong khoảng nồng độ khảo sát.

- Giá trị P < 0,05 chứng tỏ tính có ý nghĩa của phương trình hồi quy.

- Thử giá trị b = 0, t-statistic = -3,94, giá trị P = 0,01 < 0,05. Vậy hệ số b ≠ 0

có ý nghĩa thống kê.

Phụ lục 1.2. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng HPLC

Sắc ký đồ mẫu trắng

Sắc ký đồ mẫu chuẩn curcumin nồng độ 5g/ml

Sắc ký đồ mẫu thử chứa nano curcumin với nồng độ curcumin 5g/ml

Diện tích pic của các dung dịch curcumin có nồng độ khác nhau khi phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nồng độ curcumin 2,5 5,0 6,0 7,5 10,0 12,5 15,0 (g/ml)

Diện tích pic 233,4 473,4 593,6 695,9 916,8 1155,5 1340,1 (mAU.giây)

Xét tính có nghĩa của phương trình hồi quy ở hình 3.2 bằng toán thống kê

Bảng phân tích ANOVA

Bậc tự Tổng các TB tổng các F P do bình phương bình phương

Hồi quy 905646,66 905646,66 2267,76 0 1

Số dư mô hình 1996,78 399,36 5 hồi quy

907643,43 6 Tổng cộng

Giá trị Sai số chuẩn t statistic Giá trị P

Hệ số b 33,78 17,26 1,96 0,1

Biến X 88,41 1,86 47,62 0

Nhận xét:

- Giá trị R2 = 0,998 chứng tỏ có mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

dung dịch curcumin trong khoảng nồng độ khảo sát.

- Giá trị P < 0,05 chứng tỏ tính có ý nghĩa của phương trình hồi quy

- Thử giá trị b = 0, t statistic = 1,96, P = 0,1 > 0,05. Vậy giá trị b ≠ 0 không có

ý nghĩa thống kê.

Phụ lục 1.3. Một số kết quả thẩm định phương pháp định lượng curcumin và

BL1

1.26

0.37

100

0.24

MRM of 3 Channels ES+ 369.03 > 176.98 (Curcumin) 4.63e3

1.77

1.70

1.45 1.52

1.13

0.90

0.83

1.95

1.04

0.61

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

BL1

100

MRM of 3 Channels ES+ 373.05 > 136.96 (Tetrahydrocurcumin) 893

0.29

1.57

1.80

1.13

0.77

1.09

1.64

1.43

0.83

0.21

1.23

0.92

0.58

0.42

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

BL1

1.68

100

MRM of 3 Channels ES+ 494.2 > 369.12 (Glibenclamid) 189

1.53

0.82

1.44

1.59

1.95

1.80

1.22

0.88

1.30

0.97

0.76

0.28

0.67

0.59

0.46

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

BL1

1.26

100

0.24

MRM of 3 Channels ES+ TIC 5.23e3

0.37

1.77

1.70

1.45

1.58

1.95

1.13

0.83

0.90

1.87

0.61

1.05

Time

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột

Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng

Chú thích:

SKĐ chọn lọc ion curcumin (MRM, m/z: 369,03 176,98): Cửa sổ trên cùng

SKĐ chọn lọc ion tetrahydrocurcumin (MRM, m/z: 373,05 136,96): Cửa sổ thứ hai

SKĐ chọn lọc ion chuẩn nội (MRM, m/z:494,2369,12): Cửa sổ thứ ba

SKĐ tổng các ion (TIC): Cửa sổ dưới

1.27

MRM of 3 Channels ES+ 369.03 > 176.98 (Curcumin) 5.05e3

100

1.93

1.50

1.66 1.74

1.00

0.31

0.73

0.47

0.82

1.00

0.40

0.60

0.80

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

0.20

1.01

100

MRM of 3 Channels ES+ 373.05 > 136.96 (Tetrahydrocurcumin) 8.18e3

0.92

1.76

1.27

1.46

0.73

1.61

0.36

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

0.20

1.48

100

MRM of 3 Channels ES+ 494.2 > 369.12 (Glibenclamid) 1.02e6

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

0.20

1.48

100

MRM of 3 Channels ES+ TIC 1.02e6

Time

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng chứa chuẩn nội

Chú thích:

SKĐ chọn lọc ion curcumin (MRM, m/z: 369,03 176,98): Cửa sổ trên cùng

SKĐ chọn lọc ion tetrahydrocurcumin (MRM, m/z: 373,05 136,96): Cửa sổ thứ hai

SKĐ chọn lọc ion chuẩn nội (MRM, m/z:494,2369,12): Cửa sổ thứ ba

SKĐ tổng các ion (TIC): Cửa sổ dưới

1.27

MRM of 3 Channels ES+ 369.03 > 176.98 (Curcumin) 2.14e6

0.86

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

SST6

1.18

100

MRM of 3 Channels ES+ 373.05 > 136.96 (Tetrahydrocurcumin) 1.11e6

0.89

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

SST6

1.48

100

MRM of 3 Channels ES+ 494.2 > 369.12 (Glibenclamid) 3.13e5

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

SST6

1.27

100

MRM of 3 Channels ES+ TIC 2.24e6

1.18

0.89

1.47

Time

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

SST6 100

Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng chứa curcumin, tetrahydrocurcumin và

chuẩn nội

Chú thích:

SKĐ chọn lọc ion curcumin (MRM, m/z: 369,03 176,98): Cửa sổ trên cùng

SKĐ chọn lọc ion tetrahydrocurcumin (MRM, m/z: 373,05 136,96): Cửa sổ thứ hai

SKĐ chọn lọc ion chuẩn nội (MRM, m/z:494,2369,12): Cửa sổ thứ ba

SKĐ tổng các ion (TIC): Cửa sổ dưới

Faculty of Chemistry, HUS, VNU, D8 ADVANCE-Bruker - Nguyen lieu Curcumin

900

800

700

6 7 1

5 = d

600

500

) s p C

( n L

400

4 3 8

2 9 0 0 1 = d

3 = d

300

5 8 4

3 2 6 3 = d

6 3 1

6 1 9

3 = d

9 4 3

0 7 7 3 = d

6 = d

4 = d

1 1 2 4 = d

5 9 2

1 8 0

3 = d

0 7 3

200

4 2 4 3 = d

7 6 2 3 = d

3 5 0

7 = d

3 = d

1 2 6

4 2 7

9 8 5 4 = d

1 1 = d

3 = d

6 7 1 3 = d

5 = d

4 = d

3 9 8 5 = d

1 9 5

100

2 = d

PHỤ LỤC 2. MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TIỀN CÔNG THỨC

Góc nhiễu xạ 2- (o)

2-Theta - Scale File: N guyen lieu Curcumin.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 1.000 ° - End: 64.930 ° - Step: 0.030 ° - Step time: 0.3 s - Temp.: 25 °C (R oom) - Time Started: 14 s - 2-Theta: 1.000 ° - Theta: 0.500 ° - Chi: 0.00 ° - Phi: 0.00 ° - 00-009-0816 (Q) - Curcumin - C21H20O6 - Y: 36.77 % - d x by: 1. - WL: 1.5406 -

Phụ lục 2.1. Phổ nhiễu xạ tia X của curcumin

)

%

( a u q n ề y u r t ộ Đ

Số sóng (cm-1)

Phụ lục 2.2. Phổ hồng ngoại của curcumin

Phụ lục 2.3. KTTP và Span mẫu nguyên liệu

) g /

3 m c ( ụ h p p ấ h í h k g n ợ ư L

Tỷ lệ áp suất (p/po)

Phụ lục 2.4. Đồ thị đường hấp phụ đẳng nhiệt theo thuyết BET của mẫu nguyên liệu

Figure:

Experiment: Curcumin

Crucible:Al 100 µl

Atmosphere:Ar

03/01/2017

Procedure: 30-300 oC 10C.min-1 (Zone 2)

Mass (mg): 10.37

DSC131

HeatFlow/mW

Exo

10 )

0 W m

-10

-20

( t ệ i h n g n ò D

-30

-40

Peak :198.2812 °C Onset Point :193.2065 °C Enthalpy /J/g : 126.9053 (Endothermic effect)

-50

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250 Furnace temperature /°C

Nhiệt độ (oC)

Phụ lục 2.5. Giản đồ nhiệt vi sai của curcumin

Phụ lục 2.6. Sắc ký đồ của mẫu thử chứa curcumin nguyên liệu

Phụ lục 2.7. Độ hòa tan của curcumin trong các môi trường thử khác nhau

% curcumin hòa tan trong các môi trường thử

Dung dịch đệm Thời gian Dung dịch HCl 0,1 N Nước chứa phosphat pH 6,8 chứa (phút) chứa 0,2% Tween 80 0,2% Tween 80 0,2% Tween 80

30 11,2 15,9 16,4

40 17,5 21,1 21,5

50 20,8 22,6 23,1

60 22,5 26,4 27,5

Phụ lục 2.8. Một số sắc ký đồ theo dõi độ ổn định của nguyên liệu

Sắc ký đồ mẫu curcumin sau 6 giờ nghiền trong buồng nghiền chứa bi inox

Sắc ký đồ mẫu curcumin để ở điều kiện nhiệt độ cao 60oC sau 7 ngày

Sắc ký đồ mẫu curcumin để ở điều kiện nhiệt độ nhiệt độ 40oC và độ ẩm 75% sau

14 ngày

PHỤ LỤC 3. MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CURCUMIN Ở QUY MÔ 1 GAM/MẺ

Phụ lục 3.1. Thiết kế thí nghiệm

CT TWE/CUR PVP/CUR V

1 0,05 0,10 T 70,00 1,00

2 0,15 0,10 70,00 1,00

3 0,05 1,00 70,00 1,00

4 0,15 0,10 100,00 1,00

5 0,05 1,00 100,00 1,00

6 0,15 1,00 100,00 1,00

7 0,05 0,10 70,00 5,00

8 0,05 1,00 70,00 5,00

9 0,15 1,00 70,00 5,00

10 0,05 0,10 100,00 5,00

11 0,15 0,10 100,00 5,00

12 0,15 1,00 100,00 5,00

13 0,05 0,55 85,00 3,00

14 0,15 0,55 85,00 3,00

15 0,10 0,10 85,00 3,00

16 0,10 1,00 85,00 3,00

17 0,10 0,55 70,00 3,00

18 0,10 0,55 100,00 3,00

19 0,10 0,55 85,00 1,00

20 0,10 0,55 85,00 5,00

21 0,10 0,55 85,00 3,00

22 0,10 0,55 85,00 3,00

23 0,10 0,55 85,00 3,00

24 0,15 1,00 100,00 3,00

25 0,05 0,50 85,00 3,00

26 0,15 0,50 85,00 3,00

Phụ lục 3.2. Kết quả đánh giá hiệu suất, KTTPTB và PDI

của bột phun sấy chứa nano curcumin theo 26 công thức đã thiết kế thí nghiệm

CT Hiệu suất (Y1) (%) KTTPTB (Y2) (nm) PDI (Y3)

1 31,30 280,1 0,45

2 42,95 255,9 0,44

3 41,95 274,1 0,47

4 45,20 315,7 0,45

5 48,05 390,0 0,55

6 52,68 199,0 0,34

7 36,52 335,9 0,55

8 40,00 209,9 0,55

9 42,93 219,6 0,41

10 48,69 242,4 0,52

11 49,60 242,7 0,35

12 41,86 209,9 0,38

13 40,00 286,8 0,52

14 49,41 211,4 0,35

15 40,00 371,7 0,51

16 47,62 229,2 0,43

17 37,58 261,0 0,49

18 64,00 243,1 0,44

19 40,00 238,5 0,42

20 48,30 224,0 0,34

21 62,40 286,1 0,47

22 42,42 243,4 0,41

23 43,64 262,4 0,50

24 41,76 210,9 0,37

25 40,20 296,8 0,51

26 49,52 212,4 0,34

Phụ lục 3.3. Kết quả đánh giá độ hòa tan của bột phun sấy nano curcumin bào

chế theo 26 công thức thiết kế thí nghiệm

Y4 (%) Y5 (%) Y6 (%) Y7 (%) Y8 (%) Y9 (%) 83,59 51,78 69,23 76,38 62,83 80,54 1

2 74,07 83,39 86,34 89,37 90,31 93,91

3 75,52 89,49 94,25 98,20 99,17 99,53

4 69,00 77,14 82,31 86,62 88,84 90,93

5 81,73 91,86 95,23 98,55 99,20 99,67

6 77,37 93,64 97,78 99,26 100,74 101,33

7 40,46 58,11 68,12 77,76 81,41 87,59

8 76,37 88,41 95,23 99,57 100,32 100,16

9 73,07 89,24 94,78 98,26 100,03 100,10

10 54,08 68,63 74,65 76,85 79,79 82,00

11 47,49 59,14 64,24 67,15 70,50 71,96

12 81,70 92,93 98,35 99,60 101,26 101,35

13 53,07 69,24 80,78 85,26 87,03 90,15

14 68,82 81,38 84,52 87,66 95,23 98,09

15 59,35 74,37 79,56 82,32 91,03 93,03

16 79,00 89,78 94,23 96,14 98,10 99,63

17 61,45 74,00 82,34 89,54 90,50 91,93

18 67,37 78,06 83,21 86,76 89,44 90,35

19 55,23 64,78 68,52 74,97 77,94 84,26

20 75,41 81,00 83,66 85,30 87,00 88,96

21 63,40 73,13 80,26 85,57 88,00 89,63

22 66,73 73,52 76,00 77,62 79,74 84,00

23 58,08 70,06 78,76 83,32 86,72 89,72

24 81,6 91,93 98,55 99,61 100,26 101,35

25 52,37 68,75 78,08 84,60 86,82 89,50

26 67,87 82,08 84,52 87,76 95,31 98,01

Phụ lục 3.4. Các luật nhân quả

Các luật nhân quả cho biến phụ thuộc Y1 X3(3)X1(4))X2(3)X4(3) Mô hình con: 1 Nếu X3 thấp và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (0,84) hoặc cao (0,16) Nếu X3 thấp và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (0,79) hoặc cao (0,21) Nếu X3 thấp và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (0,68) hoặc cao (0,32) Nếu X3 thấp và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (0,74) hoặc cao (0,26) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (0,60) hoặc cao (0,40) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (0,98) hoặc cao (0,02) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,81) hoặc cao (0,19) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (0,97) hoặc cao (0,03) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (0,86) hoặc cao (0,14) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,85) hoặc cao (0,15) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,75) hoặc cao (0,25) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (0,98) hoặc cao (0,02) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (0,95) hoặc cao (0,05) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 cao (mức 4(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (0,64) hoặc cao (0,36)

Nếu X3 thấp và X1 cao (mức 4(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 cao (mức 4(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 cao (mức 4(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 cao (mức 4(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 cao (mức 4(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (0,92) hoặc cao (0,08) Nếu X3 thấp và X1 cao (mức 4(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 cao (mức 4(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 thấp và X1 cao (mức 4(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (0,64) hoặc cao (0,36) Nếu X3 trung gian và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (0,88) hoặc cao (0,12) Nếu X3 trung gian và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,99) hoặc cao (0,01) Nếu X3 trung gian và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (0,69) hoặc cao (0,31) Nếu X3 trung gian và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,73) hoặc cao (0,27) Nếu X3 trung gian và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,60) hoặc cao (0,40) Nếu X3 trung gian và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (0,50) hoặc cao (0,50) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (0,70) hoặc cao (0,30) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,74) hoặc cao (0,26) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (0,73) hoặc cao (0,27) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,44) hoặc cao (0,56) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (0,48) hoặc cao (0,52) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,50) hoặc cao (0,50) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00)

Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,60) hoặc cao (0,40) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,90) hoặc cao (0,10) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (0,71) hoặc cao (0,29) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 cao (mức 4(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (0,51) hoặc cao (0,49) Nếu X3 trung gian và X1 cao (mức 4(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 cao (mức 4(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 cao (mức 4(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 cao (mức 4(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,45) hoặc cao (0,55) Nếu X3 trung gian và X1 cao (mức 4(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 cao (mức 4(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 cao (mức 4(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 trung gian và X1 cao (mức 4(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (0,94) hoặc cao (0,06) Nếu X3 cao và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (0,62) hoặc cao (0,38) Nếu X3 cao và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (0,47) hoặc cao (0,53) Nếu X3 cao và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (0,62) hoặc cao (0,38) Nếu X3 cao và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (0,49) hoặc cao (0,51) Nếu X3 cao và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 thấp (mức 1(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (0,90) hoặc cao (0,10) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,57) hoặc cao (0,43) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (0,84) hoặc cao (0,16)

Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (0,99) hoặc cao (0,01) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (0,94) hoặc cao (0,06) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,59) hoặc cao (0,41) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 2(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (0,53) hoặc cao (0,47) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (0,60) hoặc cao (0,40) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (0,66) hoặc cao (0,34) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (0,59) hoặc cao (0,41) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,57) hoặc cao (0,43) Nếu X3 cao và X1 trung gian (mức 3(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (0,73) hoặc cao (0,27) Nếu X3 cao và X1 cao (mức 4(4)) và X2 thấp và X4 thấp thì Y1 thấp (0,58) hoặc cao (0,42) Nếu X3 cao và X1 cao (mức 4(4)) và X2 thấp và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,90) hoặc cao (0,10) Nếu X3 cao và X1 cao (mức 4(4)) và X2 thấp và X4 cao thì Y1 thấp (0,45) hoặc cao (0,55) Nếu X3 cao và X1 cao (mức 4(4)) và X2 trung gian và X4 thấp thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 cao (mức 4(4)) và X2 trung gian và X4 trung gian thì Y1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X3 cao và X1 cao (mức 4(4)) và X2 trung gian và X4 cao thì Y1 thấp (0,65) hoặc cao (0,35) Nếu X3 cao và X1 cao (mức 4(4)) và X2 cao và X4 thấp thì Y1 thấp (0,35) hoặc cao (0,65) Nếu X3 cao và X1 cao (mức 4(4)) và X2 cao và X4 trung gian thì Y1 thấp (0,69) hoặc cao (0,31) Nếu X3 cao và X1 cao (mức 4(4)) và X2 cao và X4 cao thì Y1 thấp (0,68) hoặc cao (0,32) Các luật nhân quả cho biến phụ thuộc Y2 X1(3)X2(4)X3(2)X4(5) Mô hình con: 1 Nếu X1 thấp và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,58) hoặc cao (0,42) Nếu X1 thấp và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,78) hoặc cao (0,22) Nếu X1 thấp và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00)

Nếu X1 thấp và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,92) hoặc cao (0,08) Nếu X1 thấp và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (0,28) hoặc cao (0,72) Nếu X1 thấp và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,78) hoặc cao (0,22) Nếu X1 thấp và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,87) hoặc cao (0,13) Nếu X1 thấp và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,62) hoặc cao (0,38) Nếu X1 thấp và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (0,77) hoặc cao (0,23) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,70) hoặc cao (0,30) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,81) hoặc cao (0,19) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,69) hoặc cao (0,31) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,30) hoặc cao (0,70) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,56) hoặc cao (0,44) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,55) hoặc cao (0,45) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,78) hoặc cao (0,22) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (0,81) hoặc cao (0,19) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,75) hoặc cao (0,25) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,51) hoặc cao (0,49) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (0,58) hoặc cao (0,42)

Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,61) hoặc cao (0,39) Nếu X1 thấp và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,52) hoặc cao (0,48) Nếu X1 thấp và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (0,94) hoặc cao (0,06) Nếu X1 thấp và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X1 thấp và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,68) hoặc cao (0,32) Nếu X1 thấp và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,91) hoặc cao (0,09) Nếu X1 thấp và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (0,83) hoặc cao (0,17) Nếu X1 trung gian và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,80) hoặc cao (0,20) Nếu X1 trung gian và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,20) hoặc cao (0,80) Nếu X1 trung gian và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,87) hoặc cao (0,13) Nếu X1 trung gian và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,53) hoặc cao (0,47)

Nếu X1 trung gian và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,82) hoặc cao (0,18) Nếu X1 trung gian và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X1 trung gian và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,71) hoặc cao (0,29) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,73) hoặc cao (0,27) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,64) hoặc cao (0,36) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,88) hoặc cao (0,12) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,84) hoặc cao (0,16) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,73) hoặc cao (0,27) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (0,52) hoặc cao (0,48) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,62) hoặc cao (0,38) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,87) hoặc cao (0,13) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,62) hoặc cao (0,38) Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00)

Nếu X1 trung gian và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,87) hoặc cao (0,13) Nếu X1 trung gian và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,71) hoặc cao (0,29) Nếu X1 trung gian và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 trung gian và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,96) hoặc cao (0,04) Nếu X1 trung gian và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,96) hoặc cao (0,04) Nếu X1 trung gian và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,74) hoặc cao (0,26) Nếu X1 trung gian và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,97) hoặc cao (0,03) Nếu X1 trung gian và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,70) hoặc cao (0,30) Nếu X1 cao và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,65) hoặc cao (0,35) Nếu X1 cao và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,39) hoặc cao (0,61) Nếu X1 cao và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,95) hoặc cao (0,05) Nếu X1 cao và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,52) hoặc cao (0,48) Nếu X1 cao và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,99) hoặc cao (0,01) Nếu X1 cao và X2 thấp (mức 1(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (0,77) hoặc cao (0,23) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,56) hoặc cao (0,44)

Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,79) hoặc cao (0,21) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,77) hoặc cao (0,23) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 2(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (0,53) hoặc cao (0,47) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,78) hoặc cao (0,22) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,89) hoặc cao (0,11) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,79) hoặc cao (0,21) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,85) hoặc cao (0,15) Nếu X1 cao và X2 trung gian (mức 3(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (0,92) hoặc cao (0,08) Nếu X1 cao và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,80) hoặc cao (0,20) Nếu X1 cao và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00)

Nếu X1 cao và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,81) hoặc cao (0,19) Nếu X1 cao và X2 cao (mức 4(4)) và X3 thấp và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (0,89) hoặc cao (0,11) Nếu X1 cao và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 thấp (mức 1(5)) thì Y2 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 2(5)) thì Y2 thấp (0,61) hoặc cao (0,39) Nếu X1 cao và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 3(5)) thì Y2 thấp (0,63) hoặc cao (0,37) Nếu X1 cao và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 trung gian (mức 4(5)) thì Y2 thấp (0,98) hoặc cao (0,02) Nếu X1 cao và X2 cao (mức 4(4)) và X3 cao và X4 cao (mức 5(5)) thì Y2 thấp (0,94) hoặc cao (0,06) Các luật nhân quả cho biến phụ thuộc Y3 X1(2)X3(3)X4(3)X2(2) Mô hình con: 1 Nếu X1 thấp và X3 thấp và X4 thấp và X2 thấp thì Y3 thấp (0,48) hoặc cao (0,52) Nếu X1 thấp và X3 thấp và X4 thấp và X2 cao thì Y3 thấp (0,38) hoặc cao (0,62) Nếu X1 thấp và X3 thấp và X4 trung gian và X2 thấp thì Y3 thấp (0,13) hoặc cao (0,87) Nếu X1 thấp và X3 thấp và X4 trung gian và X2 cao thì Y3 thấp (0,08) hoặc cao (0,92) Nếu X1 thấp và X3 thấp và X4 cao và X2 thấp thì Y3 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X1 thấp và X3 thấp và X4 cao và X2 cao thì Y3 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X1 thấp và X3 trung gian và X4 thấp và X2 thấp thì Y3 thấp (0,88) hoặc cao (0,12) Nếu X1 thấp và X3 trung gian và X4 thấp và X2 thấp thì Y3 thấp (0,96) hoặc cao (0,04) Nếu X1 thấp và X3 trung gian và X4 trung gian và X2 thấp thì Y3 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X1 thấp và X3 trung gian và X4 trung gian và X2 cao thì Y3 thấp (0,24) hoặc cao (0,76) Nếu X1 thấp và X3 trung gian và X4 cao và X2 thấp thì Y3 thấp (0,92) hoặc cao (0,08) Nếu X1 thấp và X3 trung gian và X4 cao và X2 cao thì Y3 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X3 cao và X4 thấp và X2 thấp thì Y3 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 thấp và X3 cao và X4 thấp và X2 cao thì Y3 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X1 thấp và X3 cao và X4 trung gian và X2 thấp thì Y3 thấp (0,16) hoặc cao (0,84) Nếu X1 thấp và X3 cao và X4 trung gian và X2 cao thì Y3 thấp (0,97) hoặc cao (0,03) Nếu X1 thấp và X3 cao và X4 cao và X2 thấp thì Y3 thấp (0,14) hoặc cao (0,86) Nếu X1 thấp và X3 cao và X4 cao và X2 cao thì Y3 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X3 thấp và X4 thấp và X2 thấp thì Y3 thấp (0,52) hoặc cao (0,48) Nếu X1 cao và X3 thấp và X4 thấp và X2 cao thì Y3 thấp (0,92) hoặc cao (0,08) Nếu X1 cao và X3 thấp và X4 trung gian và X2 thấp thì Y3 thấp (0,64) hoặc cao (0,36) Nếu X1 cao và X3 thấp và X4 trung gian và X2 thấp thì Y3 thấp (0,34) hoặc cao (0,66) Nếu X1 cao và X3 thấp và X4 cao và X2 thấp thì Y3 thấp (0,70) hoặc cao (0,30) Nếu X1 cao và X3 thấp và X4 cao và X2 cao thì Y3 thấp (0,67) hoặc cao (0,33) Nếu X1 cao và X3 trung gian và X4 thấp và X2 thấp thì Y3 thấp (0,52) hoặc cao (0,48) Nếu X1 cao và X3 trung gian và X4 thấp và X2 cao thì Y3 thấp (0,16) hoặc cao (0,84) Nếu X1 cao và X3 trung gian và X4 trung gian và X2 thấp thì Y3 thấp (0,67) hoặc cao (0,33)

Nếu X1 cao và X3 trung gian và X4 trung gian và X2 cao thì Y3 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X3 trung gian và X4 cao và X2 thấp thì Y3 thấp (0,71) hoặc cao (0,29) Nếu X1 cao và X3 trung gian và X4 cao và X2 cao thì Y3 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X3 cao và X4 thấp và X2 thấp thì Y3 thấp (0,48) hoặc cao (0,52) Nếu X1 cao và X3 cao và X4 thấp và X2 cao thì Y3 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X1 cao và X3 cao và X4 trung gian và X2 thấp thì Y3 thấp (0,27) hoặc cao (0,73) Nếu X1 cao và X3 cao và X4 trung gian và X2 cao thì Y3 thấp (0,73) hoặc cao (0,27) Nếu X1 cao và X3 cao và X4 cao và thấp thì Y3 thấp (0,95) hoặc cao (0,05) Nếu X1 cao và X3 cao và X4 cao và X2 cao thì Y3 thấp (0,81) hoặc cao (0,19) Các luật nhân quả cho biến phụ thuộc Y4 X2(3)X4(3)X1(2)X3(2) Mô hình con:1 Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y4 thấp (0,73) hoặc cao (0,27) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y4 thấp (0,51) hoặc cao (0,49) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y4 thấp (0,19) hoặc cao (0,81) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y4 thấp (0,31) hoặc cao (0,69) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y4 thấp (0,51) hoặc cao (0,49) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y4 thấp (0,32) hoặc cao (0,68) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y4 thấp (0,22) hoặc cao (0,78) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 cao cao và X3 cao thì Y4 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y4 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y4 thấp (0,67) hoặc cao (0,33) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y4 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y4 thấp (0,83) hoặc cao (0,17) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y4 thấp (0,53) hoặc cao (0,47) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y4 thấp (0,82) hoặc cao (0,18) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y4 thấp (0,38) hoặc cao (0,62) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y4 thấp (0,84) hoặc cao (0,16) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y4 thấp (0,77) hoặc cao (0,23) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y4 thấp (0,54) hoặc cao (0,46) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y4 thấp (0,30) hoặc cao (0,70) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y4 thấp (0,24) hoặc cao (0,76) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y4 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y4 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y4 thấp (0,53) hoặc cao (0,47) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y4 thấp (0,19) hoặc (0,81) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y4 thấp (0,15) hoặc cao (0,85) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y4 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y4 thấp (0,79) hoặc cao (0,21) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y4 thấp (0,11) hoặc cao (0,89) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y4 thấp (0,37) hoặc cao (0,63) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y4 thấp (0,26) hoặc cao (0,74) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y4 thấp (0,00) hoặc cao (1,00)

Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y4 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y4 thấp (0,13) hoặc cao (0,87) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y4 thấp (0,91) hoặc cao (0,09) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y4 thấp (0,21) hoặc cao (0,79) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y4 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Các luật nhân quả cho biến phụ thuộc Y5 X2(3)X4(2)X1(2)X3(2) Mô hình con: 1 Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y5 thấp (0,86) hoặc cao (0,14) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y5 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y5 thấp (0,29) hoặc cao (0,71) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y5 thấp (0,46) hoặc cao (0,54) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y5 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y5 thấp (0,70) hoặc cao (0,30) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y5 thấp (0,29) hoặc cao (0,71) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y5 thấp (0,97) hoặc cao (0,03) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y5 thấp (0,99) hoặc cao (0,01) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y5 thấp (0,95) hoặc cao (0,05) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y5 thấp (0,93) hoặc cao (0,07) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y5 thấp (0,27) hoặc cao (0,73) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y5 thấp (0,30) hoặc cao (0,70) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y5 thấp (0,66) hoặc cao (0,34) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y5 thấp (0,24) hoặc cao (0,76) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y5 thấp (0,11) hoặc cao (0,89) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y5 thấp (0,11) hoặc cao (0,89) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y5 thấp (0,05) hoặc cao (0,95) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y5 thấp (0,06) hoặc cao (0,94) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y5 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y5 thấp (0,15) hoặc cao (0,85) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y5 thấp (0,47) hoặc cao (0,53) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y5 thấp (0,12) hoặc cao (0,88) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y5 thấp (0,02) hoặc cao (0,98) Các luật nhân quả cho biến phụ thuộc Y6 X2(3)X4(3)X1(2)X3(2) Mô hình con: 1 Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y6 thấp (0,85) hoặc cao (0,15) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y6 thấp (0,51) hoặc cao (0,49) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y6 thấp (0,36) hoặc cao (0,64) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y6 thấp (0,47) hoặc cao (0,53) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y6 thấp (0,52) hoặc cao (0,48) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y6 thấp (0,33) hoặc cao (0,67) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y6 thấp (0,23) hoặc cao (0,77)

Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y6 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y6 thấp (0,89) hoặc cao (0,11) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y6 thấp (0,70) hoặc cao (0,30) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y6 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y6 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y6 thấp (0,76) hoặc cao (0,24) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y6 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y6 thấp (0,61) hoặc cao (0,39) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y6 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y6 thấp (0,63) hoặc cao (0,37) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y6 thấp (0,51) hoặc cao (0,49) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y6 thấp (0,43) hoặc cao (0,57) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y6 thấp (0,49) hoặc cao (0,51) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y6 thấp (0,26) hoặc cao (0,74) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y6 thấp (0,22) hoặc cao (0,78) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y6 thấp (0,81) hoặc cao (0,19) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y6 thấp (0,47) hoặc cao (0,53) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y6 thấp (0,13) hoặc cao (0,87) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y6 thấp (0,10) hoặc cao (0,90) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y6 thấp (0,79) hoặc cao (0,21) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y6 thấp (0,02) hoặc cao (0,98) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y6 thấp (0,43) hoặc cao (0,57) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y6 thấp (0,32) hoặc cao (0,68) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y6 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y6 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y6 thấp (0,10) hoặc cao (0,90) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y6 thấp (0,91) hoặc cao (0,09) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y6 thấp (0,11) hoặc cao (0,89) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y6 thấp (0,01) hoặc cao (0,99) Các luật nhân quả cho biến phụ thuộc Y7 X2(4)X4(3)X1(2)X3(2) + X3(3) Mô hình con: 1 Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (0,72) hoặc cao (0,28) Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,19) hoặc cao (0,81) Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,32) hoặc cao (0,68) Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (0,40) hoặc cao (0,60) Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (0,78) hoặc cao (0,22) Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,32) hoặc cao (0,68) Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (0,65) hoặc cao (0,35) Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (0,67) hoặc cao (0,33) Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,70) hoặc cao (0,30) Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,50) hoặc cao (0,50)

Nếu X2 thấp (mức 1(4)) và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (0,70) hoặc cao (0,30) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,99) hoặc cao (0,01) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,52) hoặc cao (0,48) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (0,28) hoặc cao (0,72) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (0,14) hoặc cao (0,86) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,64) hoặc cao (0,36) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,48) hoặc cao (0,52) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (0,15) hoặc cao (0,85) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (0,21) hoặc cao (0,79) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,25) hoặc cao (0,75) Nếu X2 trung gian (mức 2(4)) và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (0,79) hoặc cao (0,21) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,51) hoặc cao (0,49) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (0,52) hoặc cao (0,48) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (0,46) hoặc cao (0,54) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,64) hoặc cao (0,36) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,18) hoặc cao (0,82) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (0,78) hoặc cao (0,22) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (0,99) hoặc cao (0,01) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,49) hoặc cao (0,51) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,68) hoặc cao (0,32) Nếu X2 trung gian (mức 3(4)) và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (0,44) hoặc cao (0,56) Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (0,04) hoặc cao (0,96) Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,03) hoặc cao (0,97) Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,30) hoặc cao (0,70) Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (0,01) hoặc cao (0,99) Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (0,15) hoặc cao (0,85) Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,10) hoặc cao (0,90) Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y7 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y7 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y7 thấp (0,04) hoặc cao (0,96)

Nếu X2 cao (mức 4(4)) và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y7 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Mô hình con: 2 Nếu X3 thấp thì Y7 thấp (0,31) hoặc cao (0,69) Nếu X3 trung gian thì Y7 thấp (0,48) hoặc cao (0,52) Nếu X3 cao thì Y7 thấp (0,40) hoặc cao (0,60) Các luật nhân quả cho biến phụ thuộc Y8 X2(3)X4(3)X1(2) + X4(4) + X3(3)X1(3) Mô hình con: 1 Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 thấp thì Y8 thấp (0,52) hoặc cao (0,48) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 cao thì Y8 thấp (0,22) hoặc cao (0,78) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 thấp thì Y8 thấp (0,14) hoặc cao (0,86) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 cao thì Y8 thấp (0,11) hoặc cao (0,89) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 thấp thì Y8 thấp (0,50) hoặc cao (0,50) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 cao thì Y8 thấp (0,84) hoặc cao (0,16) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 thấp thì Y8 thấp (0,79) hoặc cao (0,21) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 cao thì Y8 thấp (0,31) hoặc cao (0,69) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 thấp thì Y8 thấp (0,46) hoặc cao (0,54) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 cao thì Y8 thấp (0,20) hoặc cao (0,80) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 thấp thì Y8 thấp (0,51) hoặc cao (0,49) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 cao thì Y8 thấp (0,01) hoặc cao (0,99) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 thấp thì Y8 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 cao thì Y8 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 thấp thì Y8 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 cao thì Y8 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 thấp thì Y8 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 cao thì Y8 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Mô hình con: 2 Nếu X4 thấp (mức 1(4)) thì Y8 thấp (0,76) hoặc cao (0,24) Nếu X4 trung gian (mức 2(4)) thì Y8 thấp (0,53) hoặc cao (0,47) Nếu X4 trung gian (mức 3(4)) thì Y8 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X4 cao (mức 4(4)) thì Y8 thấp (0,47) hoặc cao (0,53) Mô hình con: 3 Nếu X3 thấp và X1 thấp thì Y8 thấp (0,62) hoặc cao (0,38) Nếu X3 thấp và X1 trung gian thì Y8 thấp (0,35) hoặc cao (0,65) Nếu X3 thấp và X1 cao thì Y8 thấp (0,35) hoặc cao (0,65) Nếu X3 trung gian và X1 thấp thì Y8 thấp (0,46) hoặc cao (0,54) Nếu X3 trung gian và X1 trung gian thì Y8 thấp (0,53) hoặc cao (0,47) Nếu X3 trung gian và X1 cao thì Y8 thấp (0,20) hoặc cao (0,80) Nếu X3 cao và X1 thấp thì Y8 thấp (0,64) hoặc cao (0,36) Nếu X3 cao và X1 trung gian thì Y8 thấp (0,38) hoặc cao (0,62)

Nếu X3 cao và X1 cao thì Y8 thấp (0,36) hoặc cao (0,64) Các luật nhân quả cho biến phụ thuộc Y9 X2(3)X4(3)X1(2)X3(2) Mô hình con: 1 Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y9 thấp (0,60) hoặc cao (0,40) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y9 thấp (0,51) hoặc cao (0,49) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y9 thấp (0,25) hoặc cao (0,75) Nếu X2 thấp và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y9 thấp (0,35) hoặc cao (0,65) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y9 thấp (0,26) hoặc cao (0,74) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y9 thấp (0,07) hoặc cao (0,93) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y9 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 thấp và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y9 thấp (0,87) hoặc cao (0,13) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y9 thấp (0,47) hoặc cao (0,53) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y9 thấp (0,66) hoặc cao (0,34) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y9 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 thấp và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y9 thấp (1,00) hoặc cao (0,00) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y9 thấp (0,47) hoặc cao (0,53) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y9 thấp (0,76) hoặc cao (0,24) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y9 thấp (0,32) hoặc cao (0,68) Nếu X2 trung gian và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y9 thấp (0,78) hoặc cao (0,22) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y9 thấp (0,52) hoặc cao (0,48) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y9 thấp (0,48) hoặc cao (0,52) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y9 thấp (0,16) hoặc cao (0,84) Nếu X2 trung gian và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y9 thấp (0,30) hoặc cao (0,70) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y9 thấp (0,25) hoặc cao (0,75) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y9 thấp (0,21) hoặc cao (0,79) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y9 thấp (0,80) hoặc cao (0,20) Nếu X2 trung gian và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y9 thấp (0,46) hoặc cao (0,54) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 thấp và X3 thấp thì Y9 thấp (0,06) hoặc cao (0,94) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 thấp và X3 cao thì Y9 thấp (0,06) hoặc cao (0,94) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 cao và X3 thấp thì Y9 thấp (0,79) hoặc cao (0,21) Nếu X2 cao và X4 thấp và X1 cao và X3 cao thì Y9 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 thấp và X3 thấp thì Y9 thấp (0,37) hoặc cao (0,63) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 thấp và X3 cao thì Y9 thấp (0,25) hoặc cao (0,75) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 cao và X3 thấp thì Y9 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 trung gian và X1 cao và X3 cao thì Y9 thấp (0,00) hoặc cao (1,00) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 thấp và X3 thấp thì Y9 thấp (0,04) hoặc cao (0,96) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 thấp và X3 cao thì Y9 thấp (0,91) hoặc cao (0,09) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 cao và X3 thấp thì Y9 thấp (0,04) hoặc cao (0,96) Nếu X2 cao và X4 cao và X1 cao và X3 cao thì Y9 thấp (0,00) hoặc cao (1,00)

Phụ lục 3.5. Một số kết quả đo KTTP và PDI mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin mẻ 1 gam

PHỤ LỤC 4

MỘT SỐ KẾT QUẢ NÂNG QUY MÔ BÀO CHẾ

200 nm

400 nm

Phụ lục 4.1. Ảnh chụp SEM của curcumin sau nghiền khô 6 giờ

Phụ lục 4.2. KTTP và Span mẫu nghiền khô 6 giờ

) g /

3 m c ( ụ h p p ấ h í h k g n ợ ư L

Tỷ lệ áp suất (p/po)

Phụ lục 4.3. Đồ thị đường hấp phụ đẳng nhiệt theo thuyết BET của mẫu nghiền khô 6 giờ

Phụ lục 4.4. KTTP và Span mẫu nghiền ướt 4 giờ

Phụ lục 4.5. KTTP và PDI của mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin ở quy mô 5 gam (mẻ 1)

Phụ lục 4.6. KTTP và PDI của mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin ở quy mô 5 gam (mẻ 2)

Phụ lục 4.7. KTTP và PDI của mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin ở quy mô 5 gam (mẻ 3)

Figure:

Experiment:Nano Curcumin

Crucible:Al 100 µl

Atmosphere:Ar

03/01/2017

Procedure: 30-300 oC 10C.min-1 (Zone 2)

Mass (mg): 10.08

DSC131

HeatFlow/mW

Exo

5

Peak :128.2284 °C Onset Point :117.6043 °C Enthalpy /J/g : 3.1819 (Endothermic effect)

0 )

Peak :57.4114 °C Onset Point :37.2202 °C Enthalpy /J/g : 17.5872 (Endothermic effect)

-5

W m

-10

-15

( t ệ i h n g n ò D

Peak :169.5186 °C Onset Point :163.1709 °C Enthalpy /J/g : 83.7251 (Endothermic effect)

-20

-25

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250 Furnace temperature /°C

Nhiệt độ (oC)

Phụ lục 4.8. Giản đồ nhiệt vi sai của bột phun sấy chứa nano curcumin

)

%

( a u q n ề y u r t ộ Đ

Số sóng (cm-1)

Phụ lục 4.9. Phổ hồng ngoại của bột phun sấy chứa nano curcumin

PHỤ LỤC 5

QUY TRÌNH BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CURCUMIN

QT: .............................. HỆ TIỂU PHÂN NANO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CURCUMIN DƯỢC HÀ NỘI Có hiệu lực từ ngày ký

Quyết định ban hành số: ......................... ngày … tháng … năm ...

CHƯƠNG I. ĐẶC ĐIỂM THÀNH PHẨM

1. Công thức

Nguyên liệu Lượng

Curcumin 5,00 g

Tween 80 0,60 g

Polyvinyl pyrolidon K30 3,75 g

Manitol 2,50 g

Nước tinh khiết 125 ml

2. Tính chất thành phẩm:

Bột kết tinh hoặc vô định hình màu vàng, tơi xốp

3. Trình bày: Bột phun sấy chứa nano curcumin đóng trong lọ thủy tinh kín 6. Bảo quản: Nơi khô, tránh ánh sáng, nhiệt độ dưới 30oC.

Chương II. ĐẶC ĐIỂM NGUYÊN PHỤ LIỆU

Các nguyên liệu có nguồn gốc và tiêu chuẩn theo bảng sau:

STT Nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

Ấn Độ Nhà sản xuất Curcumin 1

Singapore BP 2010 Tween 80 2

BP 2015 3 Polyvinyl pyrolidon K30 Trung Quốc

4 Ethanol tuyệt đối Trung Quốc Dược điển VN IV

5 Manitol Pháp BP 2015

6 Nước tinh khiết Việt Nam Dược điển VN IV

CHƯƠNG III. SƠ ĐỒ CÁC GIAI ĐOẠN BÀO CHẾ

Kiểm soát các giai

đoạn trong quy trình

Curcumin Cân

Tween 80 PVP 10 ml nước tinh khiết Thời gian nghiền 6 giờ

Tần số nghiền 30Hz Nghiền khô (bi inox)

Phối hợp Hòa tan

Thời gian nghiền 4 giờ

Nghiền ướt (bi zircon oxyd) Tần số nghiền 30Hz

100 ml nước tinh khiết

Pha loãng hỗn dịch đặc

Manitol 15 ml nước tinh khiết

Thời gian khuấy 60 phút Đồng nhất hóa

Tốc độ khuấy 18000v/ph

Phối hợp Hòa tan Tốc độ phun dịch 2 ml/ph

Phun sấy

Tỷ lệ thông gió 99% Nhiệt độ khí vào 96oC

Hình thức

Đóng lọ Mất khối lượng do làm khô

dán nhãn KTTPTB

PDI

Hàm lượng

Độ hòa tan

CHƯƠNG IV. ĐẶC ĐIỂM TRANG THIẾT BỊ DÙNG TRONG SẢN XUẤT

Nơi/hãng sản STT Tên máy móc Model Đơn vị Số lượng xuất

Máy nghiền bi 1 MM200 Cái 01 Đức Retsch

Thiết bị đồng nhất

2 hóa nhờ lực phân X1000 Cái 01 Mỹ

cắt lớn Unidrive

Máy phun sấy

3 Buchi mini spray B-191 Cái 01 Thụy Sỹ

dryer

Thiết bị xác định Nano 4 KTTP và phân bố Cái 01 Anh ZS90 KTTP Zetasizer

Thiết bị xác định

5 KTTP và phân bố 3000E Cái 01 Anh

KTTP Mastersizer

Thiết bị đánh giá độ Cái 01 ERWEKA 6 hòa tan

Máy đo quang phổ SP-3000

7 UV/VIS nano Cái 01 Nhật Bản

Spectrophotometer (96W)

Máy đo hàm ẩm 8 MF50 Cái 01 Nhật Bản Moisture analyzer

CHƯƠNG V. MÔ TẢ QUY TRÌNH SẢN XUẤT

Quá trình sản xuất được chia làm 3 giai đoạn:

(1) Chuẩn bị nguyên phụ liệu, dụng cụ

(2) Bào chế

(3) Đóng gói

1. Chuẩn bị nguyên phụ liệu và dụng cụ

 Kiểm tra nguyên phụ liệu

Nguyên liệu được kiểm tra chất lượng trước khi đưa vào sản xuất theo tiêu

chuẩn ghi trong mục II.

 Chuẩn bị dụng cụ

Dụng cụ thủy tinh phải rửa sạch bằng nước tinh khiết, tráng nước cất, sấy

trong tủ sấy cho khô.

 Các thiết bị:

Buồng nghiền, bi inox, bi zirconi oxyd được rửa sạch, sấy khô. Thiết bị phun

sấy phải được vệ sinh và lắp đặt sẵn.

2. Bào chế:

2.1. Cân, đong nguyên phụ liệu theo công thức sau:

Nguyên liệu Lượng

Curcumin 5,00 g

Tween 80 0,60 g

Polyvinyl pyrolidon K30 3,75 g

Manitol 2,50 g

Nước tinh khiết 125 ml

2.2. Tiến hành

2.2.1. Bào chế hỗn dịch nano curcumin

- Bước 1. Nghiền khô

Cho curcumin và bi inox vào buồng nghiền. Cân để hai buồng nghiền có

khối lượng bằng nhau. Lắp buồng nghiền vào thiết bị nghiền. Cài đặt các

thông số: thời gian nghiền 6 giờ ở tần số 30 Hz. Sau mỗi 1 giờ, tiến hành đảo

trộn curcumin trong buồng nghiền. Sau 6 giờ, bột curcumin được lấy ra khỏi

buồng nghiền.

- Bước 2. Nghiền ướt

Đong 10 ml nước tinh khiết. Đun nóng khoảng 60oC. Hòa tan PVP để tạo

dung dịch PVP. Để nguội.

Phối hợp Tween 80 vào dung dịch PVP. Đưa vào buồng nghiền có 5 g

curcumin đã nghiền khô và 25 g bi zircon oxyd, kích thước bi 0,8 mm. Cài

đặt các thông số: thời gian nghiền 4 giờ, tần số 30 Hz.

- Bước 3. Pha loãng hỗn dịch

Pha loãng hỗn dịch đặc bằng 100 ml nước tinh khiết. Lọc loại bi qua rây 300.

- Bước 4. Đồng nhất hóa

Đồng nhất hóa hỗn dịch sử dụng thiết bị đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn

với tốc độ 18000 vòng/phút để tạo hỗn dịch nano, thời gian đồng nhất 60

phút, cứ mỗi 15 phút lại cho máy nghỉ 5 phút.

- Bước 5. Phun sấy

Hòa tan manitol vào 15 ml nước tinh khiết. Phối hợp với hỗn dịch nano. Cài đặt thiết bị phun sấy với các thông số: nhiệt độ đầu vào 96oC, tốc độ cấp dịch

2 ml/phút và tỷ lệ thông gió 99%. Hỗn dịch nano được khuấy từ liên tục

trong thời gian phun sấy.

- Bước 6. Thu sản phẩm

Bột phun sấy được thu hồi trên cả cyclon và bộ phận thu hồi sản phẩm trong

phòng kín với độ ẩm khoảng 30-40%.

2.3. Đóng gói: Trong lọ thủy tinh, nút kín.

3. Bảo quản: Nơi khô mát, tránh ánh sáng.

CHƯƠNG VI. PHƯƠNG PHÁP KIỂM SOÁT-KIỂM NGHIỆM

TT Yêu cầu Nội dung KS-KN Người thực hiện Các giai đoạn cần KS-KN

1 Phòng KN Kiểm tra nguyên liệu Theo tiêu chuẩn ghi trong mục II

2 Cân đong Đúng Người pha chế

3 Nghiền khô Người pha chế

4 Nghiền ướt Người pha chế Định tính Định lượng Khối lượng, thể tích Tần số nghiền Thời gian nghiền KTTP Tần số nghiền Thời gian nghiền KTTP

5 Đồng nhất hóa Người pha chế Tốc độ khuấy Thời gian khuấy KTTP

7 Phun sấy Người pha chế

Tần số nghiền 30 Hz Thời gian nghiền 6 giờ KTTP  9 m Tần số nghiền 30 Hz Thời gian nghiền 4 giờ KTTP  2 m Tốc độ khuấy 18000 vòng/phút Thời gian khuấy 60 phút KTTP < 500 nm PDI < 0,550 Tốc độ phun dịch 2 ml/phút Nhiệt độ khí vào 96oC Tỷ lệ thông gió 99% Hiệu suất phun sấy  60%

lượng

4 Đạt TCCS KN tiểu phân nano curcumin Phòng kiểm nghiệm

Tốc độ phun dịch Nhiệt độ khí vào Tỷ lệ thông gió Hiệu suất phun sấy Cảm quan Mất khối do làm khô Định tính KTTPTB PDI Hàm lượng Độ hòa tan

5 Đóng gói Số lượng Đúng Kiểm soát viên, người pha chế

CHƯƠNG VII. DƯ PHẨM, PHẾ PHẨM

1. Nano phun sấy dư thừa được thu hồi, xử lý.

2. Không có phế phẩm.

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ

PHỤ LỤC 6. TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

(Dự thảo)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HỆ TIỂU PHÂN Số TC:

HÀ NỘI NANO CURCUMIN Có hiệu lực từ ngày ký

Quyết định ban hành số:………….. ngày ………… tháng …….. năm …...

1. YÊU CẦU KỸ THUẬT

1.1. Công thức điều chế: cho 1 mẻ

Curcumin 5,00 g

Tá dược vđ

(Tween 80, polyvinyl pyrolidon K30, manitol, nước tinh khiết)

1.2. Tiêu chuẩn nguyên phụ liệu

Curcumin Đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất

Tween 80 Đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2010

Polyvinyl pyrolidon K30 Đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2015

Manitol Đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2015

Nước tinh khiết Đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

1.3. Chất lượng thành phẩm

1.3.1. Hình thức: Bột kết tinh hoặc vô định hình màu vàng.

1.3.2. Kích thước tiểu phân trung bình và hệ số đa phân tán:

KTTPTB nhỏ hơn 500,0 nm và PDI nhỏ hơn 0,550.

1.3.3. Mất khối lượng do làm khô: không quá 12,0%.

1.3.4. Khối lượng riêng biểu kiến:

Ít nhất 0,250 g/ml

1.3.5. Định tính: Sắc ký đồ chỉ có 1 pic của curcumin

1.3.6. Định lượng: Chế phẩm phải chứa từ 40,00-43,50% curcumin (C21H20O6) so

với tổng khối lượng bột phun sấy.

1.3.7. Độ hòa tan:

Ít nhất 95% curcumin hòa tan sau 60 phút.

2. PHƯƠNG PHÁP THỬ

2.1. Hình thức

Phương pháp thử: thử bằng cảm quan

2.2. Kích thước tiểu phân trung bình và hệ số đa phân tán

Phương pháp thử: phân tán tiểu phân nano curcumin trong nước tinh khiết,

xác định bằng thiết bị đo kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân

Zetasizer ZS 90 Malvern.

2.3. Mất khối lượng do làm khô

Phương pháp thử: phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ cài đặt 100oC, phụ lục 9.6, Dược điển Việt Nam IV. Lượng mẫu thử khoảng 1,00g, xác

định bằng cân xác định mất khối lượng do làm khô.

2.4. Khối lượng riêng biểu kiến

Phương pháp thử: Xác định trên máy đo thể tích biểu kiến của hạt và bột

Erweka SVM theo phương pháp gõ 30 lần. Khối lượng bột phun sấy sử dụng cho

mỗi lần đo là 5 g. Khối lượng riêng biểu kiến được tính theo công thức sau:

dbk =

Trong đó dbk: khối lượng riêng biểu kiến của bột (g/ml).

m : khối lượng bột phun sấy trong ống đong (g) .

V : thể tích biểu kiến của bột sau khi gõ (ml).

2.5. Định tính:

Phương pháp HPLC: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử (ở phần định lượng)

phải có pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic curcumin trong

dung dịch chuẩn.

2.6. Định lượng:

2.6.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis

Thuốc thử

- Methanol

- Tween 80

- Nước cất

Cách tiến hành

 Chuẩn bị các dung dịch:

- Dung môi pha loãng (dung dịch Tween 80 0,2%): cân 2,0 g Tween 80 vào

cốc có mỏ, thêm nước cất và đun nóng đến khi tan hoàn toàn. Để nguội và thêm

nước vừa đủ 1000 ml.

- Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 10,0 mg curcumin chuẩn hòa tan

trong 10 ml methanol, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung môi pha loãng

tới vạch, lắc kỹ được dung dịch có nồng độ 100 g/ml. Hút chính xác 2 ml dung

dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha loãng tới vạch và lắc kỹ.

- Dung dịch thử: cân chính xác lượng bột phun sấy tương ứng với khoảng 10,0

mg curcumin, hòa tan trong 10 ml methanol, chuyển vào bình định mức 100 ml,

thêm dung môi pha loãng tới vạch, lắc kỹ. Hút chính xác 2 ml dung dịch trên vào

bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha loãng tới vạch và lắc kỹ. Lọc qua màng

lọc kích thước lỗ lọc 0,45 m.

 Đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu thử tại bước sóng 427 nm, mẫu trắng là

dung môi pha loãng.

 Tính kết quả

Hàm lượng curcumin được tính theo công thức:

x x 100% % CUR =

Trong đó DT, Dc: độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn.

mc : khối lượng curcumin chuẩn (mg).

m : khối lượng bột phun sấy chứa nano curcumin (mg).

Mỗi mẫu thử được tiến hành 3 lần và lấy kết quả trung bình.

2.6.2. Phương pháp HPLC

Thuốc thử

- Acid acetic băng loại dùng cho HPLC

- Methanol loại dùng cho HPLC

- Acetonitril loại dùng cho HPLC

- Nước cất hai lần

Tiến hành

 Chuẩn bị dung dịch:

- Dung môi pha loãng: hỗn hợp methanol : acid acetic băng (99:1, tt/tt)

- Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 10,0 mg curcumin chuẩn, hòa tan

trong dung môi pha loãng, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung môi pha

loãng tới vạch và lắc kỹ. Từ dung dịch trên, pha loãng thành các dung dịch chuẩn có

nồng độ curcumin từ 2,5 đến 15 µg/ml, lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm.

- Dung dịch thử: cân chính xác một lượng bột phun sấy tương ứng với 10,0 mg

curcumin, hòa tan trong dung môi pha loãng, chuyển vào bình định mức 100 ml,

thêm dung môi pha loãng tới vạch và lắc kỹ. Hút chính xác một lượng dung dịch

trên, thêm dung môi pha loãng tạo thành dung dịch có nồng độ là 5 µg/ml, lọc qua

màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm.

 Điều kiện sắc ký:

- Pha tĩnh: Cột sắc kí AQ – C18 250 x 4,6 mm, hạt nhồi 5 µm

- Pha động: acetonitril : dung dịch acid acetic 2% (kl/tt) (58:42), được lọc qua

màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm.

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

- Detector UV phát hiện ở bước sóng 430 nm.

 Cách tiến hành

Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành chạy sắc ký đối

với dung dịch curcumin chuẩn có nồng độ 5 g/ml, độ lệch chuẩn tương đối của

diện tích pic thu được từ 6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0%.

Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 2,5 đến 15 µg/ml và

dung dịch thử ở trên.

 Tính kết quả

Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả mối tương quan giữa diện

tích pic và nồng độ curcumin. Tính kết quả theo phương trình hồi quy tuyến tính.

Mỗi mẫu thử được tiến hành 3 lần và lấy kết quả trung bình.

2.7. Độ hoà tan:

2.7.1. Thuốc thử

-Tween 80

- Nước tinh khiết

2.7.2. Cách thử

- Thiết bị: máy cánh khuấy

- Môi trường hòa tan: 900 ml nước chứa 0,2% Tween 80

- Tốc độ quay: 100 vòng/phút - Nhiệt độ môi trường hòa tan: 37 ± 0,5oC

- Cách tiến hành: Cho mẫu thử là bột phun sấy chứa nano curcumin tương

ứng với 5,0 mg curcumin vào cốc có mỏ chứa một lượng môi trường thử

độ hòa tan, siêu âm 3-4 giây và chuyển vào cốc chứa môi trường thử hòa

tan. Sau các khoảng thời gian 10, 20, 30, 40, 50 và 60 phút, lấy khoảng 10

ml dung dịch thử, ly tâm 5 phút với tốc độ 12000 vòng/phút. Phần dung

dịch được đo quang phổ hấp thụ UV-Vis ở bước sóng 427 nm, sử dụng

mẫu trắng là dung dịch Tween 80 0,2%. Sau khi đo quang, rót toàn bộ

phần cắn và phần dịch ly tâm vào cốc thử độ hòa tan.

- Chuẩn bị mẫu chuẩn tương tự như phần định lượng. Tính toán kết quả

bằng cách so sánh độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu chuẩn:

Cn = x Co

Trong đó Cn, Co: nồng độ dung dịch thử và chuẩn (g/ml)

Dn, Do: độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn

Phần trăm curcumin đã hòa tan tại thời điểm t được tính theo công thức:

% CUR = x 100%. Cn x 900 m x 1000

Cn: nồng độ curcumin tại thời điểm t (µg/ml) m: lượng curcumin thử (mg)

Mỗi mẫu thử được tiến hành 3 lần và lấy kết quả trung bình.

3. ĐÓNG GÓI - GHI NHÃN – BẢO QUẢN

- Đóng trong bao bì thủy tinh kín - Bảo quản nơi khô mát, tránh ánh sáng - Nhãn đúng quy chế

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

PHỤ LỤC 7. MỘT SỐ KẾT QUẢ THEO DÕI ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO

Phụ lục 7.1. Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau 9 tháng ở điều

kiện thực (mẻ 1)

Phụ lục 7.2. Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau 9 tháng ở điều

kiện thực (mẻ 2)

hụ lục 7.5. Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau 9 tháng ở điều kiện thực (mẻ 3)

Phụ lục 7.3. Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau 9 tháng ở điều

kiện thực (mẻ 3)

Phụ lục 7.4. Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau 6 tháng ở điều

kiện lão hóa cấp tốc (mẻ 1)

Phụ lục 7.5. Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau 6 tháng ở điều

kiện lão hóa cấp tốc (mẻ 2)

Phụ lục 7.6. Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau 6 tháng

ở điều kiện lão hóa cấp tốc (mẻ 3)

PHỤ LỤC 8. MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG CỦA

HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA CURCUMIN TRÊN CHUỘT THÍ NGHIỆM

Phụ lục 8.1. Kết quả phân tích nồng độ curcumin trong huyết tương chuột

sau khi uống hỗn dịch nano 10 phút (chuột số 69, nhóm 2)

Phụ lục 8.2. Kết quả phân tích nồng độ curcumin trong huyết tương chuột

sau khi uống hỗn dịch nano 10 phút (chuột số 70, nhóm 2)

Phụ lục 8.3. Kết quả phân tích nồng độ curcumin trong huyết tương

chuột sau khi uống hỗn dịch nano 20 phút (chuột số 57, nhóm 2)

Phụ lục 8.4. Kết quả phân tích nồng độ curcumin trong huyết tương

chuột sau khi uống hỗn dịch nano 20 phút (chuột số 58, nhóm 2)

Phụ lục 8.5. Phương trình mô tả ảnh hưởng của hiệp biến khối lượng chuột đến

một số thông số dược động học

= ×

×  ×  × 

= ×

Trong đó:

V: Thể tích phân bố của mỗi chuột (ml)

m: khối lượng chuột Ka: hằng số tốc độ hấp thu của mỗi chuột (phút-1) Ke: hằng số tốc độ thải trừ của mỗi chuột (phút-1)

V: thể tích phân bố chung của quần thể

Ka: Hằng số tốc độ hấp thu chung của quần thể

Ke: Hằng số tốc độ thải trừ chung của quần thể

dV: vi phân của thể tích phân bố

dm: vi phân của khối lượng chuột

dKa: vi phân của hằng số tốc độ hấp thu

dKe: vi phân của hằng số tốc độ thải trừ

V, Ka, Ke: giá trị eta