Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MINH NGỌC

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG

QUY TRÌNH TỔNG HỢP

BERBERIN CLORID

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MINH NGỌC

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG

QUY TRÌNH TỔNG HỢP

BERBERIN CLORID

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM

& BÀO CHẾ

MÃ SỐ: 62720402

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Đình Luyện

HÀ NỘI – 2020

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là một phần công trình nghiên cứu của một tập thể mà tôi là thành viên. Tôi được toàn bộ các thành viên đồng ý cho phép sử dụng các số liệu trong luận án. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác.

NCS. Nguyễn Minh Ngọc

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Đình Luyện người Thầy đã nhiệt tình hướng dẫn, hết lòng giúp đỡ, dìu dắt, chỉ bảo, động viên, khích lệ tôi để tôi có động lực hoàn thành luận án này.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Văn Hải, TS. Nguyễn Văn Giang, TS. Nguyễn Thị Hường, TS. Đào Nguyệt Sương Huyền đã quan tâm đặc biệt, hỗ trợ tôi đa cho tôi trong quá trình nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Đăng Hòa, GS.TS. Nguyễn Hải Nam, PGS.TS. Từ Minh Koóng, PGS.TS. Đàm Thanh Xuân, PGS.TS. Đinh Thị Thanh Hải đã cho tôi những gợi ý quý báu trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn toàn thể các Thầy, Cô giáo tại Bộ Môn công nghiệp Dược, trường Đại Học Dược Hà Nội, Ban giám hiệu trường Cao Đẳng Dược TW Hải Dương, Bộ môn Bào chế, Phòng nghiên cứu khoa học, phòng tài chính kế toán trường Cao Đẳng Dược TW Hải Dương, đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến sự giúp đỡ, cộng tác của các Thầy cô, anh chị của Quý cơ quan: Cục khoa học công nghệ và đào tạo – Bộ Y Tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, Viện Hóa Học - Viện Hàn lâm khoa học và Công Nghệ Việt Nam, Khoa hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý – Đại học Dược Hà Nội.

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, Phòng tổ chức Cán bộ, các Phòng chức năng, Bộ môn chuyên ngành công nghệ Dược phẩm và Bào chế thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Song Hà, PGS.TS.Nguyễn Thị Thanh Duyên, TS. Đỗ Hồng Quảng, TS. Nguyễn Trần Linh, TS. Đỗ Huy Hoàng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn các học viên cao học, các thế hệ sinh viên dược

đã cùng tôi làm việc để hoàn thành được những kết quả trong luận án.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bố mẹ, anh chị người thân và bạn bè đã luôn động

viên, giúp đỡ tôi suốt những năm qua.

NCS. Nguyễn Minh Ngọc

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................... 1

DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................... 3

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ............................................................... 6

ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 2

1.1. Khái quát chung về berberin clorid ........................................................ 2

1.1.1. Đặc điểm cấu trúc hóa học ................................................................... 2

1.1.2. Tính chất hóa lý ................................................................................... 3

1.1.3. Ứng dụng trong lâm sàng..................................................................... 4

1.1.4. Tác dụng dược lý ................................................................................. 5

1.2. Phương pháp sản xuất berberin .............................................................. 9

1.2.1. Phương pháp chiết xuất từ dược liệu ................................................... 9

1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học ......................................................... 10

1.3. Phân tích và lựa chọn phương pháp tổng hợp berebrin ..................... 20

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 23

2.1. Nguyên liệu, thiết bị ................................................................................ 23

2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................ 23

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................ 24

2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 26

2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 26

2.3.1. Tổng hợp hóa học và tinh chế sản phẩm, khảo sát các thông số tối ưu ...................................................................................................................... 26

2.3.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết ................................................... 28

2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học ............................................ 28

2.3.4. Phương pháp đánh giá chất lượng nguyên liệu berberin clorid ......... 28

2.3.5. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định của nguyên liệu tổng hợp được ...................................................................................................................... 29

2.3.6. Phương pháp thử độc tính cấp của nguyên liệu tổng hợp được ........ 30

Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ ...................................................... 32

3.1. Xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm .................................................................................................................... 32

3.1.1. Phương pháp tổng hợp berberin clorid thông qua trung gian homopiperonylamin hydroclorid ................................................................. 32

tổng hợp berberin clorid

từ 2,3- 3.1.2. Phương pháp mới dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim ... 52

3.1.3. So sánh các phương pháp tổng hợp berberin clorid ở quy mô phòng thí nghiệm .......................................................................................................... 56

3.2. Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc hóa học của các chất tổng hợp được ........................................................................................... 56

3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết ......................................................................... 56

3.2.2. Khẳng định cấu trúc sản phẩm tổng hợp được .................................. 58

3.3. Xây dựng quy trình tinh chế berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V ................................................... 65

3.3.1. Quy trình tiến hành ............................................................................ 65

3.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng .......................................................... 65

3.3.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh chế theo tiêu chuẩn DĐVN V ... 66

3.4. Xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid quy mô 100 g/mẻ ............................................................................................................ 68

3.4.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal ........... 68

3.4.2. Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4-methylendioxy- β-nitrostyren (61) ......................................................................................... 68

Tổng

hợp

3.4.3. 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3- dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) ........................................................................................... 75

3.4.4. Tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3- dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) ..................................... 76

3.4.5. Tinh chế sản phẩm berberin thô đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V ở quy mô 100 g/mẻ.......................................................................... 77

3.5. Xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid quy mô 500 g/mẻ ............................................................................................................ 80

3.5.1. Giai đoạn 1 - tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal ...................................................................................................... 80

3.5.2. Giai đoạn 2 - tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4- methylendioxy-β-nitrostyren (61) với tác nhân khử Fe ............................... 83

3.5.3. Giai đoạn 3 - tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3- dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) ........................................................................................... 86

3.5.5. Giai đoạn 4 - tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N- (2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) .............................. 89

3.5.6. Tinh chế sản phẩm berberin quy mô 500g/mẻ .................................. 92

3.6. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp .. 94

3.7. Kết quả nghiên cứu độ ổn định và thử độc tính cấp của nguyên liệu berberin tổng hợp ..................................................................................... 97

3.7.1. Kết quả nghiên cứu độ ổn định .......................................................... 97

3.7.2. Kết quả thử độc tính cấp của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được .................................................................................................................... 101

Chương 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 111

4.1. Một số bàn luận về quy trình tổng hợp ............................................... 111

4.1.1. Về quy trình tổng hợp quy mô thí nghiệm....................................... 111

4.1.2. Về phương pháp tổng hợp berberin mới .......................................... 116

4.1.3. Về quy trình tổng hợp quy mô 500g/mẻ .......................................... 121

4.2. Bàn luận về quá trình tổng hợp hóa học, tinh chế và độ ổn định của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được ......................................... 127

4.2.1. Về các quá trình tổng hợp chất trung gian và sản phẩm cuối .......... 127

4.2.2. Cấu trúc hóa học của các hợp chất tổng hợp được .......................... 139

4.3. Về độ ổn định của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được ........... 144

4.5. Về tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được .................................................................................................................. 148

4.6. Về độc tính cấp của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được ........ 148

Kết luận Và kiến nghị ...................................................................................... 151

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Acetyl Acetyl coenzym-A carboxylase Ac ACC

Acetylcholinesterase AChE

Acid deoxyribonucleic Tiêu chuẩn phân tích (Analytical Reagent) ADN AR

AMPK Protein kinase được hoạt hóa bởi adenosin monophosphat

(Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase)

Berberin clorid Butyrylcholinesterase BBR BChE

n-Butyl Bu

Cyclooxygenase COX

Tỷ trọng biểu kiến db

Dicloromethan DCM

Dược điển Việt Nam DĐVN

Dimethyl sulfoxid DMSO

đơn vị Carbon đvC

Ethyl Et

Đường huyết lúc đói (Fasting Blood Glucose) FBG

Hemoglobin A1c HbA1c

Hydroxypropyl methyl cellulose HPMC

Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) LDL

Thụ thể lipoprotein tỉ trọng thấp LDLR

Phân tử gồm lipid và polysaccharid (Lipopolysaccharide) LPS

Tỉ lệ khối lượng trên điện tích Monoamin-oxidase Acid ribonucleic thông tin (Messenger Ribonucleic Acid) m/z MAO mARN

Kháng nguyên biệt hóa myeloid (Myeloid Differentiation) MD

Methyl Megahertz Proteinkinase kim loại trong chất nền ngoại bào (Matrix Metalloproteinkinase) Phổ khối (Mass Spectrometry) Me MHz MMP MS

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) Đường huyết sau bữa ăn (Postprandial blood glucose) PBG

Phenyl

Hệ số lưu giữ (Retention factor) Sắc ký lớp mỏng Ph Rf SKLM

Đái tháo đường typ 2 T2MD

Tổng nồng độ cholesterol toàn phần (Total Cholesterol) TC

Acid trifluoroacetic Triglycerid TFA TG

Tetrahydrofuran THF

Thời gian tiềm tàng Tlag

Thụ thể giống Toll (Toll - like receptor) TLR

p-Toluensulfonyl (tosyl) Ts

OECD Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (Organization for

Economic Cooperation and Development;)

Hội đồng quốc tế về hài hòa các yêu cầu kỹ thuật về dược phẩm ICH

cho con người (International Conference on Harmonization)

Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose 50%) LD50

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Danh mục dung môi, hóa chất .................................................................. 23 Bảng 2.2. Danh mục thiết bị, dụng cụ ....................................................................... 24 Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp chất 61 theo 2 phương pháp .......................................... 35 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol nitromethan/piperonal tới hiệu suất phản ứng .................................................................................................... 35 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất phản ứng ............ 36 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng ........... 37 Bảng 3.5 Kết quả tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) theo 5 phương pháp ........................................................................................................................... 42 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa NaBH4 và 3,4- methylendioxy-β-nitrostyren (61) đến hiệu suất phản ứng. .............................. 43 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của xúc tác cho phản ứng khử hóa ............... 44 Bảng 3.8 Kết quả tổng hợp chất 31 theo 2 phương pháp .......................................... 46 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa aldehyd và chất 6a.......... 47 Bảng 3.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các bazơ khác nhau đến hiệu suất phản ứng ngưng tụ ..................................................................................................... 47 Bảng 3.11 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng ......... 48 Bảng 3.12 Kết quả tổng hợp berberin clorid (1) theo 2 phương pháp ...................... 50 Bảng 3.13 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol đến hiệu suất phản ứng ..................... 50 Bảng 3.14 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng ..................... 51 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân khử hóa đến hiệu suất phản ứng tổng hợp 63 ................................................................................................ 54 Bảng 3.16. So sánh các phương pháp tổng hợp berberin clorid từ các nguyên liệu khác nhau .......................................................................................................... 56 Bảng 3.17 Đặc điểm sắc ký lớp mỏng của các hợp chất tổng hợp được .................. 56 Bảng 3.18 Nhiệt độ nóng chảy của các hợp chất tổng hợp được .............................. 57 Bảng 3.19 Kết quả phân tích cấu trúc 61 .................................................................. 58 Bảng 3.20 Kết quả phân tích cấu trúc 62 .................................................................. 59 Bảng 3.21 Kết quả phân tích cấu trúc 63 .................................................................. 60 Bảng 3.22 Kết quả phân tích cấu trúc 25a ................................................................ 61 Bảng 3.23 Kết quả phân tích cấu trúc 6a .................................................................. 62 Bảng 3.24 Kết quả phân tích cấu trúc 31 .................................................................. 63 Bảng 3.25 Kết quả phân tích cấu trúc 1 .................................................................... 64 Bảng 3.26 Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất kết tinh Berberin clorid ............. 66

Bảng 3.27 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quy trình tinh chế ........................................ 66 Bảng 3.28 Kết quả kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V ........................................................................................................................ 67 Bảng 3.29 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 61 với tác nhân NaOH ở quy mô 100 g/mẻ ................................................................................ 68 Bảng 3.30 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 6a .................... 69 Bảng 3.31 Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng ........................................................ 71 Bảng 3.32 Kết quả khảo sát tỷ lệ mol chất 61 : sắt ................................................... 72 Bảng 3.33 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng ....................................................... 72 Bảng 3.34 Kết quả khảo sát dung môi ...................................................................... 73 Bảng 3.35 Kết quả khảo sát tỷ lệ alcol : nước........................................................... 73 Bảng 3.36 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình cải tiến tổng hợp chất 6a quy mô 100g/mẻ............................................................................................................. 74 Bảng 3.37 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 31 .................... 76 Bảng 3.38 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 100 g/mẻ............................................................................................................ 77 Bảng 3.39 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tinh chế chất 1 ....................... 77 Bảng 3.40 Kết quả kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V ........................................................................................................................ 79 Bảng 3.41 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 61 với tác nhân NaOH ở quy mô 500 g/mẻ ................................................................................ 81 Bảng 3.42 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 6a bằng quy trình cải tiến sử dụng bột sắt ở quy mô 500 g/mẻ ..................................................... 84 Bảng 3.43 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 31 ở quy mô 500 g/mẻ................................................................................................................... 86 Bảng 3.44 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 1 ở quy mô 500 g/mẻ................................................................................................................... 89 Bảng 3.45 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tinh chế chất 1 ....................... 92 Bảng 3.46 Tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp ................... 95 Bảng 3.47 Kết quả kiểm nghiệm nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được ở quy mô 500g/mẻ............................................................................................................. 96 Bảng 3.48 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1A ở điều kiện lão hóa cấp tốc .................................................................................................. 98 Bảng 3.49 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1B ở điều kiện lão hóa cấp tốc .................................................................................................. 98

Bảng 3.50 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1C ở điều kiện lão hóa cấp tốc .................................................................................................. 99 Bảng 3.51 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1A ở điều kiện dài hạn ............................................................................................................. 100 Bảng 3.52 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1B ở điều kiện dài hạn ............................................................................................................. 100 Bảng 3.53 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1C ở điều kiện dài hạn ............................................................................................................. 100 Bảng 3.54 Mô tả tình trạng chuột ở các lô sau dùng mẫu thử nguyên liệu berberin clorid - mẫu 1 .................................................................................................. 102 Bảng 3.55 Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ sau khi uống nguyên liệu berberin chlorid ............................................................................................................. 108 Bảng 3.56 Tỉ lệ chết chuột nhắt trắng và giá trị LD50 của mẫu thử nguyên liệu berberin chlorid ............................................................................................................. 109 Bảng 4.1. Những cải tiến trong nâng cấp quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 500g................................................................................................................. 121 Bảng 4.2 Các phương pháp tổng hợp berberin clorid thông qua hợp chất trung gian 6 ......................................................................................................................... 126 Bảng 4.3 Kết quả so sánh phổ 1H-NMR berberin tổng hợp được và phổ chuẩn của berberin clorid ................................................................................................. 143 Bảng 4.4 Kết quả so sánh phổ 13C-NMR berberin tổng hợp được và phổ chuẩn của berberin clorid ................................................................................................. 143 Bảng 4.5 Tổng hợp giá trị LD50 của nguyên liệu berberin ...................................... 150

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp berberin ............................................................. 2 Hình 1.2. Phản ứng khử berberin ................................................................................ 4 Hình 1.3. Phản ứng thủy phân berberin trong môi trường kiềm ................................. 4 Hình 1.4. Sơ đồ tổng hợp berberin của Amé Pictet và Alfons Gams ....................... 10 Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp berberin của T. Kametani và cộng sự .............................. 11 Hình 1.6. Sơ đồ tổng hợp berberin của Viện Y học cổ truyền Trung Quốc ............. 12 Hình 1.7. Sơ đồ tổng hợp berberin của W. Liu ......................................................... 13 Hình 1.8. Sơ đồ tổng hợp berberin của Z. X. Chen .................................................. 14 Hình 1.9. Sơ đồ tổng hợp berberin của Xiaolin Bian (2006) và Peng Yang (2008) . 15 Hình 1.10. Sơ đồ tổng hợp berberin của Alice Gatland ............................................ 16 Hình 1.11. Sơ đồ tổng hợp berberin của Virshinha Reddy ....................................... 17 Hình 1.12. Sơ đồ tổng hợp berberin của Chen Cheng .............................................. 18 Hình 1.13. Sơ đồ tổng hợp berberin của Chen Cheng .............................................. 19 Hình 1.14. Sơ đồ tổng hợp berberin qua hợp chất trung gian 6a (dạng muối hydroclorid của amin 6) .................................................................................... 20 Hình 1.15. Sơ đồ phân tích tổng hợp ngược berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd ........................................................................................................................... 22 Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp berberin clorid từ vanilin ................................................. 27 Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) ....................................................................... 27 Hình 3.1. Sơ đồ tổng hợp berberin từ piperonal quy mô phòng thí nghiệm ............ 52 Hình 3.2. Sơ đồ tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim .............................................................................. 52 Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal ........................................................................................................... 82 Hình 3.4. Sơ đồ quy trình tổng hợp 6a từ 61 ........................................................... 85 Hình 3.5. Sơ đồ quy trình tổng hợp amin 31 từ amin 6a ......................................... 88 Hình 3.6. Sơ đồ quy trình tổng hợp berberin clorid (1) từ amin 31 .......................... 91 Hình 3.7. Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid .................................................. 93 Hình 3.8. Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid ................................................... 94 Hình 3.9. Đồ thị dự đoán tuổi thọ của nguyên liệu berberin clorid ở điều kiện dài hạn. .................................................................................................................. 101 Hình 4.1. Sơ đồ tóm tắt các phương pháp tổng hợp berberin qua chất trung gian amin (6) .................................................................................................................... 112

Hình 4.2. Các phương pháp tổng hợp homopiperonylamin .................................... 114 Hình 4.3. Cơ chế phản ứng hình thành 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) từ 2,3- dimethoxybenzaldehyd ................................................................................... 118 Hình 4.4 Cơ chế phản ứng demethyl vanilin bằng AlCl3/pyridin ........................... 128 Hình 4.5. Cơ chế phản ứng đóng vòng methylenoxyd của 25a .............................. 129 Hình 4.6. Cơ chế phản ứng ngưng tụ piperonal và nitromethan ............................. 130 Hình 4.7. Quá trình khử hóa nitrostyren 61 thành muối amin 6a sử dụng hệ khử NaBH4/CuCl2 .................................................................................................. 131 Hình 4.8. Cơ chế phản ứng khử nối đôi trong phân tử 61 bằng NaBH4 ................. 132 Hình 4.9. Cơ chế phản ứng hình thành 31 từ (6a) ................................................... 136 Hình 4.10. Cơ chế phản ứng hình thành berberin clorid (1) từ 31 .......................... 138 Hình 4.11. Sắc ký đồ HPLC sản phẩm berberin clorid ........................................... 145 Hình 4.12. DSC mẫu berberin clorid bán trên thị trường ....................................... 146 Hình 4.13. DSC mẫu berberin clorid tổng hợp được .............................................. 147

ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin là một hóa dược phổ biến dùng để sản xuất thuốc cho điều trị các

bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn đường ruột và ức chế tình trạng kích thích co thắt

nhu động ruột. Berberin được sử dụng rộng rãi tại Việt Nam từ những năm 1960 làm

thuốc chữa lỵ và nhiễm khuẩn đường ruột. Ngoài ra, berberin còn có trong thành phần

của một số loại thuốc khác như thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do

tác nhân kích thích bên ngoài và thuốc điều trị bệnh đau mắt hột. Hiện nay, rất nhiều

tác dụng khác của berberin được nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng như giúp ngăn

ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm và chống lại tác hại của vi khuẩn tả, hạ đường huyết,

làm giảm mạnh lượng cholesterol, triglycerid và xơ vữa, nhưng không gây ra tác dụng

phụ điển hình như các statin. Berberin ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào

ung thư mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của các tế bào bình thường [89]. Ngoài

ra, berberin còn có tác dụng bảo vệ tim mạch, đồng thời có tác dụng chống trầm cảm

[82].

Nhu cầu về berberin ngày càng tăng. Tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng berberin

cũng rất lớn. Trên thế giới ngành công nghiệp dược đang phải đối mặt với việc khai

thác tràn lan quá mức các loại dược liệu mà chưa có chiến lược bảo tồn hợp lý, nguồn

nguyên liệu chiết xuất berberin đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt [1]. Việc canh tác

truyền thống tại các vùng trồng dược liệu chứa berberin hiện nay cũng không đáp ứng

được nhu cầu của thị trường thuốc hiện tại [6], [8]. Trên thế giới, các quốc gia như

Nhật Bản, Trung Quốc đã tổng hợp và thương mại hóa chế phẩm berberin tổng hợp

từ rất lâu. Các nghiên cứu tổng hợp berberin đã được các nhà khoa học trên thế giới

phát triển trong nhiều thập kỉ nay. Chúng tôi thấy rằng sản xuất berberin bằng con

đường tổng hợp hóa học nhằm đảm bảo sự ổn định, bền vững nguồn nguyên liệu là

rất triển vọng và thiết thực. Vì vậy, chúng tôi thực hiện luận án “Nghiên cứu xây

dựng quy trình tổng hợp berberin clorid” với 2 mục tiêu sau:

1. Xây dựng được quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 500g/mẻ đạt tiêu

chuẩn dược dụng.

2. Đánh giá được độc tính cấp và độ ổn định của sản phẩm berberin clorid tổng

1

hợp được.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Khái quát chung về berberin clorid

1.1.1. Đặc điểm cấu trúc hóa học

- Công thức phân tử: [C20H18NO4]+Cl- (M = 371,86 đvC)

- Công thức cấu tạo [92]:

- Tên khoa học: 9,10-dimethoxy-5,6-dihydro[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquino[3,2-a]

isoquinolin-7-ium clorid.

- Dạng dược dụng của berberin được quy định trong Dược điển Việt Nam V [4],

Dược điển Nhật bản XVII [92] là muối berberin clorid dihydrat. Ngoài ra, nó còn có

dạng dược dụng là muối berberin tannat, berberin sulfat [92].

Trong thực vật, berberin được sinh tổng hợp từ L-tyrosin, một trong 20 acid

amin cơ sở trong các quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào.

2

Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp berberin

Trong quá trình sinh tổng hợp berberin [32] hai phân tử tyrosin tham gia vào

hai quá trình phản ứng khác nhau để tạo ra hai sản phẩm trung gian là L-3,4-

dihydroxyphenylalanine (L -DOPA) và acid 4-hydroxypyruvic. Các sản phẩm trung

gian trên đều tham gia vào quá decarboxyl hóa để tạo thành dopamin và 4

hydroxyphenylacetaldehyd tương ứng.

Hợp chất dopamin và 4-hydroxy-phenylacetaldehyd tham gia phản ứng ankyl hóa

amino để tạo thành (S) -norcolaurin tương tự như phản ứng Mannich. Sản phẩm được

metyl hóa nhóm amin và ether hóa đồng thời bằng S-Adenosylmethionin (SAM) tạo

thành (S) - reticulin. Sản phẩm của quá trình sinh tổng hợp này tham gia vào quá trình

oxi hóa amin bậc 3 tạo thành ion iminium, sau đó nhóm iminium tham gia phản ứng

đóng vòng nội phân tử (phản ứng Mannich) vị trí ortho tạo thành X . Sau đó, hợp chất

X tham gia phản ứng chuyển vị xeto – enol để tạo thành (S)-scoulerin, và tiếp tục bị

metyl hóa bởi SAM để tạo thành (S)–tetrahydrocolumbamin. Hợp chất này bị oxy

hóa để tạo thành hợp chất metylenedioxy vòng. Từ ortho -methoxyphenol, O2, enzym

NADPH và cytochrom P-450, tạo thành (S)-canadin. Cuối cùng, (S)-canadin bị oxy

hóa thành berberin.

1.1.2. Tính chất hóa lý

a. Tính chất vật lý

- Berberin clorid là tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi, vị rất đắng [4].

- Berberin clorid tan trong nước theo tỷ lệ 1/400, tan tốt trong nước nóng, ethanol,

không tan trong cloroform và ether. Berberin không có carbon bất đối nên không có

đồng phân quang học [11], [52].

- Dạng bazơ [C20H18O4N]+OH- có nhiệt độ nóng chảy là 145℃ [52].

- Berberin clorid dạng dihydrat có nhiệt độ nóng chảy là 191-192℃ [54], dạng

khan nước là 204-206℃ (phân hủy).

b. Tính chất hóa học

- Dạng bazơ có khả năng tạo muối với các acid khác nhau, việc tạo muối berberin

không giống như các alcaloid khác mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim

loại, nghĩa là có loại phân tử nước [6].

3

[C20H18O4N]+OH- + HCl [C20H18O4N]+Cl- + H2O

- Berberin clorid tham gia phản ứng trao đổi [55]:

[C20H18O4N]+Cl- + NaOH [C20H18O4N]+OH- + NaCl

- Phản ứng cộng nucleophil vào liên kết đôi C = N+ [3], [55]:

[C20H18O4N]+Cl- + NaCN [C20H18O4N]+CN- + NaCl

- Nhân thơm có chứa N của berberin clorid có thể bị khử bởi các tác nhân khác

nhau tạo thành hydro alcaloid không màu theo hình 1.2.

Hình 1.2. Phản ứng khử berberin

- Berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh, vòng chứa nguyên tử N

không vững bền, trong môi trường kiềm mạnh dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd

gọi là berberinal theo hình 1.3.

Hình 1.3. Phản ứng thủy phân berberin trong môi trường kiềm

1.1.3. Ứng dụng trong lâm sàng

- Berberin có hoạt tính kháng khuẩn, chống viêm được chỉ định trong lâm sàng để

điều trị nhiễm trùng đường ruột, tiêu chảy, lỵ, viêm ống mật [19], [29], [107], giúp

ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm [33], [39].

- Berberin có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng ức chế sự phát triển của các chủng

vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) bao gồm Staphylococcus aureus, Shigella

antidysenteria, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Escherichia coli [52], [102],

[115].

- Tác dụng điều trị nhiễm khuẩn của berberin là do khả năng liên kết với các protein

4

amyloid trong màng sinh học, làm gián đoạn sự ổn định của nó và tăng cường hoạt

tính kháng khuẩn của kháng sinh, đồng thời cạnh tranh với LPS để gắn với TLR4 /

MD-2, qua đó ức chế quá trình viêm trong nhiễm trùng [18].

1.1.4. Tác dụng dược lý

Berberin lần đầu tiên được phân lập từ cây Xanthoxylon cava vào năm 1926. Dịch

chiết từ các loài thực vật có chứa hoạt chất này đã được mô tả có khả năng điều trị

các bệnh lý liên quan đến đường tiêu hóa như bệnh tả và các bệnh tiêu chảy do vi

khuẩn trong y học dân gian truyền thống của người Mỹ, Trung Quốc và Nhật Bản

trong nhiều thế kỉ. Các nghiên cứu chỉ ra rằng berberin có khả năng ức chế khá nhiều

chủng vi khuẩn gram dương như Staphylococcus aureus, Staphylococcus

cholermidis, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis và các chủng vi khuẩn gram âm

như Aspergdlus fumigatus, Plasmodium falciparum. Berberin có khả năng làm giảm

kích thích co thắt nhu động ruột do vi khuẩn cũng như có hoạt tính ức chế tế bào ung

thư. Một số nghiên cứu trước đây đã đưa ra kết luận hoạt tính sinh học của hợp chất

này dựa trên tương tác giữa các ion iminium trong cấu trúc dị vòng liên hợp của

berberin có thể phản ứng với các acid amin trong enzym của các thụ thể trong vi sinh

vật.

1.1.4.1. Tác dụng hạ đường huyết

Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên 36 người mắc bệnh đái tháo đường loại 2

được phân ngẫu nhiên điều trị bằng berberin hoặc metformin trong một thử nghiệm

3 tháng. Tác dụng hạ đường huyết của berberin tương tự như của metformin. Nhóm

điều trị bằng berberin giúp giảm đáng kể hemoglobin A1c (HbA1c từ 9,5% xuống

7,5%), đường huyết lúc đói (FBG từ 10,6 ± 0,9 mmol/L xuống 6,9 ± 0,5 mmol/L),

đường huyết sau bữa ăn (PBG từ 19,8 ± 1,7 mmol/L xuống 11,1 ± 0,9 mmol/L) [111].

Tác dụng hạ đường huyết của berberin dựa trên nhiều cơ chế khác nhau như bảo

vệ và phục hồi chức năng tế bào đảo tụy, tăng cường biểu hiện mARN insulin

receptor, giảm tình trạng kháng insulin [34], [56], [109], [118]. Trong tế bào gan, tế

bào mỡ, berberin làm tăng tiêu thụ hoặc hấp thu glucose khi không có insulin có thể

là do sự kích thích glycolysis, có liên quan đến sự ức chế quá trình oxy hóa trong ty

5

thể [50], [108], [110]. Berberin cũng có thể hoạt động như một chất ức chế α-

glucosidase. Nó ức chế các hoạt động disacaridase và giảm vận chuyển glucose qua

biểu mô ruột [76], [77].

1.1.4.2. Tác dụng cải thiện trí nhớ

Alzheimer là chứng mất trí nhớ phổ biến nhất, đặc biệt ở người cao tuổi, hiện đang

trở thành vấn đề sức khỏe được quan tâm trên toàn cầu. Đây là bệnh gây tử vong ở

người cao tuổi đứng hàng thứ 6 hiện nay và là một trong những bệnh tốn kém nhất

cho xã hội ở các nước phát triển. Berberin có thể được xem là một tác nhân đầy hứa

hẹn để ứng dụng trong điều trị bệnh Alzheimer do hợp chất này sở hữu các tác dụng

sinh học như chống oxy hóa, ức chế AChE và BChE, ức chế monoamin-oxidase

(MAO), giảm sự kết tập mảng β-amyloid và hạ cholesterol. Thử nghiệm cho thấy sử

dụng berberin đường uống với liều 50 mg/kg thể trọng, một lần mỗi ngày, trong 14

ngày, cải thiện đáng kể tình trạng suy giảm trí nhớ trong mô hình gây bệnh Alzheimer

trên chuột [42], [43], [45], [46].

Trong một mô hình chuột bị suy giảm trí nhớ gây ra bởi việc bơm acid ibotenic,

sự tồn tại của các tế bào hình chóp và hạt được tăng lên rất nhiều trong vùng

hippocampus (vùng liên quan tới khả năng lưu trữ, xử lý thông tin trong não) khi

dùng berberin. Trong một mô hình chấn thương của dây thần kinh chuột, bốn tuần

sau khi sử dụng berberin (20 mg/kg, một lần mỗi ngày trong 1 tuần), độ dày của các

sợi trục được cải thiện khoảng 1,4 lần ở gốc xa của vết thương [38].

1.1.4.3. Tác dụng hạ lipid máu

Trong một nghiên cứu của 32 bệnh nhân điều trị hạ lipid máu bằng cách sử dụng

berberin 500 mg, hai lần mỗi ngày trong 3 tháng. Ở những bệnh nhân này, giảm đáng

kể LDL, triglycerid, và tổng số cholesterol (giảm 25% LDL, 35% chất béo trung tính

và giảm 29% cholesterol toàn phần). Trong một nghiên cứu khác kéo dài 2 tháng với

63 bệnh nhân, sử dụng berberin 500 mg hai lần mỗi ngày, giảm LDL trung bình

23,8%. Kết hợp của simvastatin 20 mg mỗi ngày và berberin, LDL hạ xuống trung

bình 31,8% [17], [78]. Nghiên cứu phân tích meta thực hiện bởi Hui Dong và cộng

sự đối với 14 thử nghiệm lâm sàng trên 1068 người tình nguyện, cũng chỉ ra rằng

nồng độ lipoprotein cholesterol giảm rõ rệt khi được điều trị bằng berberin [31]. So

6

sánh với simvastatin, berberin cũng cho hiệu quả điều trị tương tự: TC, LDL, TG

giảm lần lượt 21,8%; 23,8%; 22,1% đối với berberin và 9,1%; 14,3%; 11,4% đối với

simvastatin. Mặt khác, berberin còn cho tác dụng hiệp đồng khi kết hợp với

simvastatin [51].

Sử dụng đơn độc berberin hoặc kết hợp với các chế độ ăn kiêng khác giúp giảm tỷ

lệ LDL trung bình từ 20% đến 30%, đồng thời có hiệu quả cho những bệnh nhân

không dung nạp statin, bệnh nhân đề kháng với liệu pháp statin giúp mở ra các

phương pháp điều trị thay thế cho những bệnh nhân không được chỉ định liệu pháp

statin [53], [51]

Cơ chế hạ lipid máu của berberin có thể thông qua quá trình hoạt hóa AMPK.

Protein kinase hoạt hóa adenosine monophosphate (AMPK), điều chỉnh chuyển hóa

năng lượng bằng cách kích hoạt các con đường tạo ATP như glycolysis và oxy hóa

acid béo, ức chế các con đường tiêu thụ ATP như tạo acid béo và tổng hợp cholesterol.

AMPK thúc đẩy chuyển vị acid béo bằng cách phosphoryl hóa hoặc bất hoạt acetyl -

CoA carboxylase (ACC), làm giảm ảnh hưởng của malonyl - CoA, một chất ức chế

quá trình chuyển vị, berberin giúp hoạt hóa AMPK nên giúp hạ lipid máu. Ngoài ra,

thông qua quá trình hoạt hóa AMPK, berberin còn ức chế tổng hợp và bài tiết TG,

cholesterol [17], [88], [100], [101], [106].

1.1.4.4. Tác dụng chống ung thư

Đã có rất nhiều báo cáo về tác dụng chống ung thư của berberin. Các nghiên cứu

đã chỉ ra rằng berberin có thể ức chế sự tăng sinh của các tế bào khối u, thông qua

tương tác với các mục tiêu và cơ chế khác nhau. Berberin có thể làm thay đổi biểu

hiện của gen gây ung thư và các gen liên quan đến gây ung thư, bằng cách điều chỉnh

lại hoạt động của adenosine protein kinase hoạt hóa monophosphate (AMPK).

Berberin kích hoạt phosphoryl hóa gen ức chế khối u p53 trong các tế bào cơ trơn

mạch máu. Berberin cũng ức chế các enzym liên quan đến gây ung thư .

Năm 2004, berberin được chứng minh là một chất nhạy cảm của các tế bào u thần

kinh đệm, làm tăng sự thành công của xạ trị trong các khối u não [98]. Berberin tăng

cường hoạt động của carmustin, một loại thuốc hóa trị thường được sử dụng trên các

khối u não. Berberin khi dùng đơn độc, tỷ lệ tiêu diệt tế bào trong nuôi cấy là 91% so

7

với carmustin là 43%. Khi cả hai được kết hợp, tỷ lệ hiệu quả lên đến 97% [116].

Berberin nhạy cảm với các tế bào ung thư phổi [60], gây độc tế bào đối với các tế

bào ung thư cổ tử cung [61], ức chế sự tăng trưởng tế bào trong các tế bào ung thư

tuyến tụy bằng cách gây tổn thương ADN [68].

Berberin ngăn chặn sự phát triển của tế bào và gây ra quá trình apoptosis (chết tế

bào ung thư) trong các tế bào ung thư vú một cách đơn độc, hoặc tác dụng hiệp đồng

với curcumin [99]. Năm 2016, một nghiên cứu của Trường Y khoa Lan Châu Đại học

ở Trung Quốc cho thấy rằng berberin có thể tác động tới enzym AMPK nên có thể

tiêu diệt các tế bào ung thư vú.

Một nghiên cứu năm 2017 cho thấy, berberin có thể ức chế sự di căn và xâm lấn

của các tế bào ung thư đại trực tràng trong cơ thể và in vitro theo ba cách: ức chế

(COX-2), giảm phosphoryl hóa và ức chế biểu hiện MMP [59]. Trong năm 2011, một

đánh giá về tác dụng chống ung thư của berberin kết luận: đây là một tác nhân chống

ung thư có triển vọng, an toàn với một số công dụng trị liệu tiềm năng [30].

1.1.4.5. Tác dụng khác

Berberin có lợi ích đối với tim mạch do nó có tác dụng giảm lượng đường và

cholesterol trong máu. Cả hai yếu tố này đều có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh mạch

vành. Nó cũng kích thích sự giải phóng nitric oxid, một chất có thể giãn động mạch,

làm tăng lưu lượng máu, giảm huyết áp và chống xơ cứng động mạch [20], [66],

[103]. Các đặc tính chống viêm mạnh của berberin cũng rất tốt cho viêm phổi, đặc

biệt là viêm phổi do virus cúm, đồng thời berberin còn có tác dụng bảo vệ chức năng

gan, thận [11], [104].

1.1.4.5. Chế phẩm của berberin

Hiện nay, có nhiều chế phẩm của berberin với tên biệt dược và công dụng khác

nhau [122]

✓ Armolipid Plus: viên nén chứa cao khô Berberis aristata 588 mg, tương đương

500 mg berberin clorid, công dụng giảm cholesterol, triglycerid trong máu,

ngăn ngừa xơ vữa động mạch (Rottapharm S.p. A – Milan, Italy).

✓ Berzecin: viên nang cứng 100 mg berberin clorid, thuốc điều trị tiêu chảy

8

(Công ty Hataphar – Việt Nam).

✓ Antesik: viên nang cứng 50 mg berberin clorid, thuốc điều trị tiêu chảy (Công

ty cổ phần Dược TW Mediplantex – Việt Nam).

✓ Becnau: viên nén bao phim 100 mg berberin clorid, thuốc điều trị tiêu chảy

(Công ty cổ phần Dược phẩm 2/9 – Nadyphar, Việt Nam).

✓ Loberin: viên nén bao phim 25 mg berberin clorid thuốc điều trị tiêu chảy

(Công ty cổ phần Dược phẩm Nam Hà, Việt Nam).

✓ Gynopic: thuốc bột pha dung dịch vệ sinh Berberin Clorid 0.025 g, phòng và

trị một số bệnh ở cơ quan sinh dục: viêm âm đạo, viêm tử cung, bệnh bạch

đới, ngứa âm hộ. Khử mùi hôi, tẩy sạch các chất bẩn sau ngày hành kinh và

sinh đẻ. Công ty Dược và trang thiết bị Y tế Bình Định (Bidiphar) – Việt Nam.

1.2. Phương pháp sản xuất berberin

1.2.1. Phương pháp chiết xuất từ dược liệu

Trong tự nhiên, berberin có trong thân rễ một số loài thực vật như hoàng bá

(Phellodendron amurense Rupr.) với hàm lượng 2,5%, hoàng liên chân gà (Coptis

chinensis Franch.) với hàm lượng 4%, hoàng liên gai (Berberis wallichia DC.) với

hàm lượng 3-4%, vàng đắng (Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr.) với hàm

lượng 3,5% và lá táo ta (Ziziphus mauritiana lam.) [1], [8]. Hiện nay, berberin được

sản xuất chủ yếu bằng con đường chiết xuất từ thân và rễ cây vàng đắng do hàm lượng

berberin trong cây khá cao, phương pháp tiến hành đơn giản, nguồn nguyên liệu rẻ

tiền, dễ kiếm [6].

Việc đánh giá khả năng sản xuất sinh khối rễ của công nghệ khí canh so với trồng

bằng địa canh truyền thống đã được nghiên cứu tại Việt Nam trên đối tượng cây

Hoàng liên gai. Kết quả thu được cho thấy, sinh khối rễ cây hoàng liên gai thu được

sau trồng 1 năm trong hệ thống khí canh cao gấp 3,43 lần, so với trồng bằng phương

pháp địa canh truyền thống. Trong hệ thống khí canh, cây Hoàng liên gai sinh trưởng

tốt nhất khi nồng độ dinh dưỡng đặt ở mức 1.300 - 1.600 µs/cm với chế độ phun thích

hợp nhất là phun 10 giây, nghỉ 15 phút [9]. Phương pháp cho kết quả khá khả quan

để cải tiến nguồn nguyên liệu berberin, tuy nhiên nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô

9

phòng thí nghiệm.

Nhiều phương pháp chiết tách berberin đã được ứng dụng vào sản xuất công

nghiệp. Phương pháp chiết xuất thường được sử dụng là chiết bằng dung dịch H2SO4

0,4% hoặc dung dịch nước vôi trong [3], [7].

1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học

1.2.2.1. Phương pháp tổng hợp của Amé Pictet và Alfons Gams (1911)

Năm 1911, hai tác giả Amé Pictet và Alfons Gams đã đưa ra quy trình tổng hợp

berberin theo sơ đồ hình 1.4 như sau [79]:

Điều kiện phản ứng: (a) PCl5; (b) KOH; (c) P2O5, 68 - 70oC; (d) Sn, HCl; (e)

HCHO, HCl, Br2, CS2.

Hình 1.4. Sơ đồ tổng hợp berberin của Amé Pictet và Alfons Gams

Hợp chất acyl clorid 5 thu được bằng cách clor hóa acid 2-(3,4-dimethoxyphenyl)

acetic (4) bằng PCl5. Sau đó ngưng tụ 5 với homopiperonylamin (6) trong môi trường

kiềm thu được amid 7. Đun nóng 7 với với P2O5 ở 68 - 70℃ thu được 8. Khử hóa 8

bằng thiếc trong HCl thu được 9. Đem 9 ngưng tụ với HCHO, chất sinh ra cho tác

dụng với brom và cacbon disulfid tạo thành berberin (1) [79].

Nhược điểm: Sử dụng tác nhân nhạy cảm với nước như PCl5, P2O5; quy trình

nhiều giai đoạn khó nâng cấp tổng hợp ở quy mô lớn.

1.2.2.2. Phương pháp của T. Kametani và cộng sự (1969)

Năm 1969, T. Kametani và cộng sự đưa ra quy trình tổng hợp berberin theo sơ đồ

10

hình 1.5 như sau [49]:

Điều kiện phản ứng: (a) 170℃ , 4h; (b) POCl3, 2h; (c) NaBH4, 1h; (d)

HCl/EtOH, 3h; (e) HCHO, HCl, 3h; (f) Zn, NaOH, 2h; (g) CH2N2, 48h; (h) I2, 1h.

Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp berberin của T. Kametani và cộng sự

Ngưng tụ ester 10 với homopiperonylamin (6) thu được amid 11. Đem 11 phản

ứng tiếp với POCl3 trong 2h thu được sản phẩm đóng vòng 12. Khử hóa 12 bằng

NaBH4 thu được 13. Loại bỏ nhóm bảo vệ benzyl của 13 bằng HCl đặc trong EtOH

thu được 14. Chất 14 tham gia phản ứng Mannich đóng vòng tạo hợp chất 15. Xử lý

15 với Zn trong NaOH giúp loại bỏ nhóm thế (Br) thu được 16. Sản phẩm 16 được

methyl hóa trong nitromethan, chất thu được phản ứng với I2 thu được berberin iodid.

Hiệu suất cả quy trình là 3% [49].

Nhược điểm: Quy trình nhiều giai đoạn, hiệu suất thấp, sử dụng nhiều hóa chất

đắt tiền (POCl3, NaBH4).

1.2.2.3. Phương pháp của Viện Y học cổ truyền Trung Quốc (1980)

Năm 1980, Viện Y học cổ truyền Trung Quốc đưa ra quy trình tổng hợp berberin

11

từ phenol qua 17 bước theo sơ đồ hình 1.6 [121]:

Điều kiện phản ứng: (a) Cl2/C6H6, 24 - 28℃ ; (b) NaOH/CuSO4; (c) HCl;

(d) DCM/NaOH, 110 - 115℃ ; (e) 1,3,5-Trioxan. HCl; (f) AcOH,

hexamethylentetramin; (g) AcOH/H2O; (h) ClCH2CO2CH3, CH3ONa/CH3OH; (i)

(j) AcOH; (m) 2,3- NaOH/CH3OH; (k) NH3/CH3OH; (l) H2/Ni;

dimethoxybenzaldehyd, H2/Ni; (n) HCl/EtOH; (o) Glyoxal, CuSO4, NaCl, Ac2O,

AcOH; (p) CaO/H2O; (q) HCl/H2O.

Hình 1.6. Sơ đồ tổng hợp berberin của Viện Y học cổ truyền Trung Quốc

Xuất phát từ phenol (18) trải qua các quá trình clo hóa và thủy phân tạo hợp chất

catechol (21). Từ 21 phản ứng với diclomethan trong NaOH được 22, cho 22 tương

tác với 1,3,5-trioxan thu 23, sau đó kết hợp với hexamethylentetramin thu sản phẩm

24. Xử lý 24 với acid acetic thu được piperonal (25). Cho 25 ngưng tụ với

ClCH2CO2CH3, sau đó thủy phân trong môi trường kiềm và xử lý với acid acetic thu

được aldehyd 28. Ngưng tụ 28 với NH3 tạo thành imin 29, khử hóa 29 bằng H2 xúc

12

tác Ni thu được homopiperonylamin (6). Tiếp theo, 6 được ngưng tụ với 2,3-

dimethoxybenzaldehyd tạo imin rồi khử bằng H2, xúc tác Ni cho 30. Muối

hydroclorid của 30 tham gia phản ứng đóng vòng với glyoxal được 32. Xử lí trong

điều kiện thích hợp sẽ thu được berberin clorid (1). Hiệu suất toàn bộ quy trình là

15%.

Ưu điểm: Độ tinh khiết cao (trên 99%) so với phương pháp chiết xuất (97%). Năm

1981, xí nghiệp dược phẩm Đông Bắc (Trung Quốc) đã sản xuất berberin theo quy

trình này với sản lượng 30 tấn/năm.

Nhược điểm: Quy trình phức tạp, hiệu suất thấp, chi phí lớn, sử dụng nhiều tác

nhân gây ô nhiễm môi trường như benzen, dimethyl sulfoxid nên năm 1994, phương

pháp này đã bị ngừng lại [58], [121].

1.2.2.4. Phương pháp của W. Liu (1981)

Nghiên cứu của W. Liu và cộng sự tập trung vào rút ngắn giai đoạn chuyển hợp

chất 23 thành homopiperonylamin (6), đồng thời xuất phát từ nguyên liệu ban đầu là

catechol nên rút ngắn giai đoạn điều chế, giảm lượng hóa chất dung môi, nâng cao

hiệu suất (tăng 20% so với viện y học cổ truyền Trung Quốc) [58], [121].

Quy trình tổng hợp được thể hiện trên sơ đồ hình 1.7 [67]:

Điều kiện phản ứng: (a) DCM, NaOH, H2O, Bu4NBr, 90 - 100℃ ; (b) 1,3,5-

trioxan, HCl, PCl3, 70 - 90℃ ; (c) NaCN, NaOH, Bu4NBr, H2O; (d) NH3, H2/Ni,

CH3OH; (e) 2,3-dimethoxybenzaldehyd, H2/Ni, CH3OH; (f) Glyoxal, CuCl2, NaCl,

Ac2O, AcOH; (g) NH3, H2O.

Hình 1.7. Sơ đồ tổng hợp berberin của W. Liu

Catechol (21) được đem phản ứng với DCM trong môi trường kiềm thu được chất

13

22. Alkyl hóa 22 với 1,3,5-trioxan, HCl, PCl3 ở nhiệt độ 70 - 90℃ thu được 23. Thực

hiện phản ứng thế (-Cl) của 23 bởi (-CN) sau đó khử hóa bằng H2 xúc tác Ni thu được

chất 6. Ngưng tụ 6 với 2,3-dimethoxybenzaldehyd, sau đó khử hóa tiếp bằng H2 xúc

tác Ni thu được 30. Đem 30 tạo phản ứng đóng vòng với glyoxal sau đó xử lý với

NH3 thu được berberin.

Nhược điểm: Quy trình sử dụng hợp chất cyanid độc hại (NaCN) khó đảm bảo

tính an toàn dược học trong sản xuất công nghiệp.

1.2.2.5. Phương pháp của Z. X. Chen (2007)

Năm 2007, Z. X. Chen và các cộng sự đã nghiên cứu quy trình sản xuất berberin

gồm 6 giai đoạn đi từ nguyên liệu 2,3-dimethoxylphenylmethanol (34) hình 1.8. Quy

trình này đã được đưa vào sản xuất trong công nghiệp bởi công ty dược phẩm

Changzhou Yabang, Trung Quốc [58], [119]. Hiệu suất toàn bộ quy trình là 67%

trong đó mỗi giai đoạn đều đạt hiệu suất trên 90%.

Điều kiện phản ứng: (a) NaOH 30%, (CH3)2SO4, 80℃ ; (b) (CH2O)n/HCl, toluen,

30℃ ; (c) NaCN, (Bu)4NBr, toluen, 100℃ ; (d) CH3OH, H2SO4, hồi lưu; (e)

homopiperonylamin (6), 170℃ ; (f) PCl5, DCM, 40℃ .

Hình 1.8. Sơ đồ tổng hợp berberin của Z. X. Chen

2,3-dimethoxylphenylmethanol (34) được methyl hóa bằng dimethyl sulfat trong

dung dịch NaOH 30% ở 80℃ trong môi trường kiềm thu được 35. Tiếp theo 35 cho

phản ứng với paraformaldehyd và HCl trong toluen ở 30℃ thu được 36. Thực hiện

phản ứng thế (-Cl) bằng (-CN) thu được 37, thêm tiếp CH3OH, H2SO4 thu được ester

38. Ngưng tụ 38 với homopiperonylamin (6) thu được amid 39 rồi thực hiện phản

14

ứng đóng vòng 39 với PCl5 và DCM thu được berberin (1).

Ưu điểm: Hiệu suất cao, đã được đưa vào sản xuất trong công nghiệp.

Nhược điểm: Sử dụng hợp chất cyanid độc hại (NaCN), tác nhân nhạy cảm với

nước (PCl5).

1.2.2.6. Phương pháp của Xiaolin Bian (2006) và Peng Yang (2008)

Sử dụng chất ban đầu là homopiperonylamin (6), hai tác giả X. Bian (2006) [14]

và P. Yang (2008) [106] đã độc lập đưa ra quy trình tổng hợp berberin theo sơ đồ

hình 1.9 như sau:

Điều kiện phản ứng: (a) 2,3-dimethoxylbenzaldehyd, 100℃ , 8h; (b) NaBH4,

MeOH, 5h, 60 - 80%; (c) (CHO)2, HCOOH, CuSO4, 5h; (d) CaO, MeOH, H2O, 2h;

(e) HCl, EtOH, 0,5h.

Hình 1.9. Sơ đồ tổng hợp berberin của Xiaolin Bian (2006) và Peng Yang

(2008)

Tạo imin 40 bằng cách ngưng tụ 6 với 2,3-dimethoxyl benzaldehyd ở 100℃ trong

8h. Sau đó 40 được khử hóa với NaBH4 trong methanol trong 5h được 30. Lấy 30

cho phản ứng với glyoxal, CuSO4 trong acid formic tạo thành berberin dưới dạng

muối format. Hòa tan sản phẩm trong methanol và nước, cho phản ứng với CaO rồi

chuyển về dạng berberin clorid bằng HCl trong ethanol [14], [106].

Ưu điểm: Ít giai đoạn, hiệu suất cao, có thể nghiên cứu nâng cấp quy mô tổng hợp.

1.2.2.7. Phương pháp của Alice Gatland (2014)

Năm 2014, Alice Gatland và cộng sự thuộc Phòng thí nghiệm Hóa học - Trường

đại học Oxford đã đề xuất quy trình tổng hợp berberin từ aldehyd 41 và acid 42 sử

dụng xúc tác chứa Pd với hiệu suất 50% [35]. Quy trình được trình bày ở sơ đồ hình

15

1.10 như sau:

Hình 1.10. Sơ đồ tổng hợp berberin của Alice Gatland

Aryl bromid 43 thu được bằng cách methyl hóa 41 rồi bảo vệ nhóm aldehyd bằng

ethylenglycol, xúc tác TsOH. Khử hóa acid 42 bằng BH3, tạo ester pivaloat rồi thực

hiện phản ứng acyl hóa Friedel-Craft với Ac2O và ZnCl2 thu được 44.

Hợp chất 43 và 44 kết hợp tạo hợp chất 45 bằng phản ứng aryl hóa với xúc tác

Cs2CO3 và (Amphos)2PdCl2. Xử lý 45 với NH4Cl ở 90℃ thu được isoquinolin 46.

Tiếp tục tăng nhiệt độ lên 110℃ để loại nhóm pivaloat thu được berberin. Kiềm hóa

bằng NaOH rồi chiết với DCM, xử lí dịch chiết với HCl thu được berberin clorid tinh

khiết. Bên cạnh đó, có thể tiến hành phản ứng one-pot sử dụng dung môi THF, EtOH

và H2O để thu được berberin clorid từ hợp chất 43 và 44 với hiệu suất 40%. Hiệu suất

toàn bộ quy trình là 68% tính theo 41 hoặc 50% tính theo 42 [35].

Nhược điểm: Nguyên liệu tổng hợp đắt tiền, không sẵn có, phản ứng tiến hành

16

phức tạp, khó triển khai nâng cấp ở quy mô lớn.

1.2.2.8.Phương pháp của Virshinha Reddy (2015)

Năm 2015, V. Reddy và cộng sự đưa ra phương pháp tổng hợp berberin gồm 4 giai

đoạn, hiệu suất toàn bộ quá trình đạt 32% như sơ đồ hình 1.11 [83]:

Điều kiện phản ứng: (a) Bu4NF, THF, 1h; (b) PdCl2(PPh3)2, CuI, Et3N, 70℃

, 3h; (c) NH4OAc, AgNO3, t-BuOH, 15h; (d) PPh3, DCM:CCl4 (1:2), 12h.

Hình 1.11. Sơ đồ tổng hợp berberin của Virshinha Reddy

Dẫn xuất của 2-alkynylarylethanol (49) thu được bằng cách thủy phân loại nhóm

bảo vệ của 48 với tetrabutylamoni fluorid, hiệu suất 88%. Tiến hành phản ứng

Sonogashira giữa 49 với 2,3-dimethoxy-5-bromo benzaldehyd 50 thu được hợp chất

51, hiệu suất 65%. Isoquinolin 52 tạo thành bởi phản ứng đóng vòng 51 sử dụng xúc

tác AgNO3 và NH4OAc trong alcol tert-butylic, hiệu suất 78%. Cuối cùng, thực hiện

phản ứng Apel 52 chuyển thành berberin, hiệu suất 72% [83].

Nhược điểm: Nguyên liệu 48 không sẵn có, sử dụng xúc tác đắt tiền, dung môi

độc hại (CCl4), hiệu suất còn thấp, khó triển khai nâng cấp ở quy mô lớn.

1.2.2.9. Phương pháp của Chen Cheng (2016)

Năm 2016, Chen Cheng và cộng sự đưa ra phương pháp tổng hợp berberin xuất

phát từ nguyên liệu ban đầu là pyrocatechol, hiệu suất toàn bộ quá trình đạt 13,6%

17

như sơ đồ hình 1.12 [24]:

Điều kiện phản ứng: (a) CH2Cl2, DMSO, NaOH, 80℃ , 4h; (b) (CH2O)n, HCl,

PhCH3, 0 - 5℃ , 9h; (c) C2H5ONa, CH2(COOC2H5)2, 60℃ , 9h; (d) NaOH, HCl,

reflux, 6h; (e) C6H5Cl, 130℃ , 5h; (f) HCONH2, 180℃ , 8h; (g) NaClO, C2H5OH,

NaOH, 0 - 80℃ , 24h; (h) 2,3-dimethoxybenzaldehyd, CH3OH, NaBH4, 70 - 105℃ ,

10,5h; (i) HCOOH, CHOCHO, CuSO4, 60℃ , 4,5h.

Hình 1.12. Sơ đồ tổng hợp berberin của Chen Cheng

Đầu tiên catechol (21) phản ứng với CH2Cl2 trong dung môi DMSO, môi trường

kiềm ở nhiệt độ 80℃ trong 4h thu được 22. Alkyl hóa 22 với paraformaldehyd,

toluen, acid clohydric đậm đặc ở 0 - 5℃ trong 9h được 23. Cho 23 phản ứng với

C2H5ONa, CH2(COOC2H5)2 ở 60℃ trong 9h thu được ester 53. Thủy phân ester 53

với NaOH, HCl hồi lưu trong 6h thu được dẫn xuất của acid malonic 54. Cho 54 phản

ứng với C6H5Cl ở 130℃ trong 5h thu được dẫn xuất của acid propionic 55. Amid 56

được tạo thành bằng phản ứng giữa 55 và formamid ở 180℃ trong 8h. Loại bỏ nhóm

CO của amid 56 bằng NaClO, C2H5OH, NaOH giữ ở 0 - 80℃ trong 24h thu được

homopiperonylamin (6). Đem 6 ngưng tụ với 2,3-dimethoxybenzaldehyd, khử hóa

bằng NaBH4 thu 30, sau đó đóng vòng 30 với glyoxal thu berberin clorid (1).

Nhược điểm: Quy trình gồm nhiều giai đoạn, hiệu suất thấp, khó triển khai nâng

18

cấp ở quy mô lớn.

1.2.2.10. Phương pháp của Chen Cheng (2017)

Năm 2017, Chen Cheng và cộng sự tiếp tục đưa ra phương pháp tổng hợp berberin

gồm 5 giai đoạn, hiệu suất toàn bộ quá trình đạt 33% xuất phát từ 1,2-

methylenedioxybenzen như sơ đồ hình 1.13 [23]:

Điều kiện phản ứng: (a) (Boc)2O, Et3N, CH2Cl2, r.t., 4h; (b) CAN, LiBr,

CH3CN, 32℃ , 8h; (c) Mg, I2, THF, CuBr•SMe2, 0℃ , 20 phút; (d) TFA, CH2Cl2,

r.t.,17h; (e) 2,3-dimethoxybenzaldehyd, CH3OH, NaBH4, 70 - 105℃ , 10,5 h; (f)

HCOOH, CHOCHO, CuSO4, 60℃ , 4,5h.

Hình 1.13. Sơ đồ tổng hợp berberin của Chen Cheng

Sản phẩm thế brom 59 thu được bằng cách cho 22 phản ứng với acetonitril, LiBr,

CH3CN ở 32℃ , trong 8h, hiệu suất đạt 77%. Ziridin (57) ngưng tụ với di-tert-butyl

dicarbonat trong môi trường diclometan và triethylamin khuấy trộn ở nhiệt độ phòng

trong 4h thu được 58, hiệu suất đạt 93%. Tiếp theo tạo thuốc thử Grignard và cho 58

tác dụng 59 thu được 60, hiệu suất đạt 78%. 60 đem cho phản ứng với acid

trifluoroacetic, CH2Cl2 ở nhiệt độ phòng trong 17h thu được 6 với hiệu suất đạt 94%.

Ngưng tụ 6 với 2,3-dimethoxybenzaldehyd tạo imin sau đó khử bằng NaBH4 thu được

30, hiệu suất đạt 96%. 30 đóng vòng với glyoxal trong môi trường acid formic và

CuSO4 ở 60℃ trong 4,5h thu được 1, hiệu suất đạt 60%.

Nhược điểm: Sử dụng hóa chất đắt tiền, dẫn chất cyanid độc hại (CH3CN), khó

19

triển khai nâng cấp ở quy mô lớn.

1.3. Phân tích và lựa chọn phương pháp tổng hợp berberin

Trước mục tiêu cấp thiết về sản xuất lượng lớn berberin đáp ứng nhu cầu dược

phẩm trong nước, luận án tập trung nghiên cứu cải thiện các phương pháp tổng hợp

berberin ở quy mô 500g/mẻ. Phân tích các con đường tổng hợp berberin, nhận thấy.

Trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu sản xuất berberin bằng phương

pháp tổng hợp hóa học. Dựa vào cấu trúc của phân tử và các nghiên cứu tổng hợp

berberin đã công bố trước đó, có thể nhận thấy rằng phần lớn các tác giả đều tiến

hành ngưng tụ các hợp chất mang khung cấu trúc 1,3-benzodioxol và 1,2-

dimethoxybenzen sau đó đóng vòng để tạo ra nhân isoquinolin (nguồn nitơ gắn trực

tiếp vào một trong hai khung cấu trúc trên) và tiếp tục các phản ứng khác để tạo ra

cấu trúc phân tử của berberin. Một trong những hợp chất mang khung 1,3-

benzodioxol được nhiều tác giả lựa chọn cho chuỗi tổng hợp là homopiperonylamin

(6) (nhóm chức amin cung cấp dị tố nitơ cho nhân isoquinolin). Tuy nhiên,

homopiperonylamin (6) là một amin dạng lỏng, rất dễ bị oxy hóa đồng thời khó xác

định các thông số vật lý đặc trưng. Xuất phát từ điều này, luận án đã chuyển dạng

amin (base) về dạng amin hydroclorid (6a) với mục đích để tăng độ ổn định, thuận

lợi hơn trong bảo quản và đánh giá chất lượng. Hợp chất này được tổng hợp theo 4

hướng chính bao gồm: i) khử hóa dẫn chất nitril, ii) khử hóa nitrostyren, iii) thoái

phân Hoffman, iv) imin hóa khử homopiperonal (hình 1.14).

Hình 1.14. Sơ đồ tổng hợp berberin qua hợp chất trung gian 6a (dạng muối

20

hydroclorid của amin 6)

Trước hết chúng tôi lựa chọn phương pháp tổng hợp 6a đi từ nguyên liệu ban

đầu là piperonal (25) và vanilin. Sở dĩ lựa chọn piperonal (25) là do những ưu điểm

về trữ lượng, giá thành rẻ. Đặc biệt, nguyên liệu này có thể tổng hợp từ nhiều nguyên

liệu sẵn có, rẻ tiền như vanilin.

Trong đó, phương pháp tổng hợp 6a qua trung gian nitrostyren (61) cho thấy

nhiều ưu điểm: ít giai đoạn phản ứng, nguyên liệu sẵn có, có thể nâng cấp được quy

trình tổng hợp ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây chủ yếu sử dụng

lithi nhôm hydrid (LiAlH4) làm tác nhân khử, cho hiệu suất chưa cao (62%) và tiến

hành ở điều kiện tương đối khắc nghiệt. Do đó luận án cải tiến quy trình tổng hợp 6a

từ nguyên liệu piperonal (25) qua chất trung gian nitrostyren 61. Điểm mới của luận

án là quy trình tổng hợp hợp chất trung gian 61 nitrostyren bằng phản ứng liên hoàn

gồm quá trình cộng tạo liên kết C-CH2NO2 – phản ứng Henry và quá trình đề hydrat

loại nước. Theo như tham khảo các tài liệu, phản ứng này chưa được nhắc đến trong

bất cứ tài liệu tham khảo nào liên quan đến tổng hợp toàn phần berberin.

Trong quy trình trên amin 6a được tạo ra bằng cách khử hóa hợp chất 3,4-

methylendioxy-β-nitrostyren (61) với tác nhân khử thông thường là NaBH4. Ưu điểm

của tác nhân này là hiệu suất cao có thể khử cả nối đôi và nhóm nitro của hợp chất

61. Tuy nhiên tác nhân này có nhược điểm là đắt tiền, dễ hút ẩm nên khó bảo quản,

thao tác, hơn nữa trong quy trình trên sử dụng lượng lớn NaBH4 (tỷ lệ mol gấp 8,5

lần so với chất 2) nên khi nâng cấp quy mô lớn khó kiểm soát do sinh hydro mạnh.

Luận án cũng tập trung cải tiến phản ứng này. Phản ứng khử tạo hợp chất amin 6 gồm

hai bước khử: khử nối đôi và khử nhóm nitro. Trong giai đoạn khử nitro sẽ lựa chọn

tác nhân khác thay thế nhằm giảm lượng NaBH4 sử dụng, nhóm tác nhân khử được

lựa chọn là kim loại/acid vì giá thành rẻ. Một số kim loại (Fe, Zn, Al…) có thể khử

nitro với hiệu suất tốt. Dựa vào các nghiên cứu công bố trước đó và điều kiện phòng

thí nghiệm nhóm nghiên cứu đã lựa chọn các tác nhân khử sau: Al/NH4Cl [73],

21

Fe/CH3COOH [62], Fe/NH4Cl [84], Zn/CH3COOH, Zn/NH4Cl [94].

Bằng cách phân tích tổng hợp ngược phân tử berberin, luận án đã tiến hành dự

đoán tổng hợp berberin đi từ amin 31 và có thể thu được amin 32 từ phản ứng ngưng

tụ của (2,3-dimethoxyphenyl)methanamin (63) và homopiperonal như hình bên dưới,

amin 63 có thể tổng hợp qua con đường khử hóa 2,3-dimethoxybenzaldehydoxim

(62), đi từ nguyên liệu ban đầu 2,3-dimethoxybenzaldehyd.

63

31

62

Hình 1.15. Sơ đồ phân tích tổng hợp ngược berberin từ 2,3-

dimethoxybenzaldehyd

Phương pháp đối chứng được lựa chọn thực hiện là phương pháp tổng hợp amin

63 qua con đường khử hóa 2,3-dimethoxybenzaldoxim, đi từ nguyên liệu ban đầu

2,3-dimethoxybenzaldehyd. Điểm mới của phương pháp tổng hợp này là thay đổi vị

trí của nhóm amin so với quy trình phía trên từ cấu trúc phức tạp dựa trên phân tử

piperonal sang một cấu trúc đơn giản hơn của dimethoxybenzaldehyd. Chúng tôi dự

kiến giải pháp này có thể được thực hiện dễ dàng hơn thay vì qua trung gian

homopiperonylamin (6a).

Các kết quả nghiên cứu được lựa chọn theo các tiêu chí về hiệu suất quy trình, khả

năng thu hồi sản phẩm, đánh giá tác động môi trường nếu có trước khi tiến hành thực

hiện các quy trình ở các quy mô lớn hơn, tối đa là 500 g/mẻ. Sản phẩm thu được được

đánh giá chất lượng theo các tiêu chuẩn dược điển, đánh giá độ ổn định trong điều

kiện lão hóa cấp tốc, điều kiện dài hạn và đánh giá độ an toàn thông qua thử độc tính

22

cấp.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu

Một số dung môi, hóa chất sử dụng để thực hiện luận án được trình bày trong bảng

2.1.

Bảng 2.1. Danh mục dung môi, hóa chất

TT Hóa chất Tiêu chuẩn Xuất xứ

1. 2,3-Dimethoxybenzaldehyd AR Bỉ

AR Trung Quốc 2. Aceton

AR Trung Quốc 3. Acid acetic

AR Nga 4. Acid formic 85%

5. Acid hydrocloric đặc DĐVN V Trung Quốc

AR Trung Quốc 6. Amoni acetat

AR Trung Quốc 7. Amoniac

8. Berberin clorid chuẩn 95,5 % DĐVN V Việt Nam

BP 2005 Trung Quốc 9. Cloroform

DĐVN V Việt Nam 10. Cồn 96%

AR Trung Quốc 11. Dicloromethan

AR Trung Quốc 12. Diethyl ether

AR Trung Quốc 13. Dimethylformamid

AR Trung Quốc 14. Đồng clorid

AR Trung Quốc 15. Đồng sulfat

AR Việt Nam 16. Ethanol 96%

AR Trung Quốc 17. Ethanol tuyệt đối

AR Trung Quốc 18. Ethyl acetat

For synthesis Bỉ 19. Glyoxal 40%

Dược dụng Trung Quốc 20. HPMC

AR Trung Quốc 21. Kali carbonat

23

AR Việt Nam 22. Khí nitơ

TT Hóa chất Tiêu chuẩn Xuất xứ

23. Natri borohydrid AR Trung Quốc

24. Natri hydroxyd AR Trung Quốc

25. Natri sulfat khan AR Trung Quốc

26. n-BuOH (n-butanol, butanol) AR Trung Quốc

27. Nhôm clorid khan AR Trung Quốc

28. Niken(II) clorid hexahydrat AR Trung Quốc

29. Ninhydrin AR Trung Quốc

30. Nitromethan AR Trung Quốc

31. Nước cất DĐVN V Việt Nam

32. Parafin Dược dụng Trung Quốc

33. Piperonal AR Merck

34. Pyridin AR Trung Quốc

35. Toluen AR Trung Quốc

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong luận án được trình bày ở bảng 2.2.

Bảng 2.2. Danh mục thiết bị, dụng cụ

TT Thiết bị, dụng cụ Xuất xứ

Đức 1. Bản mỏng silica gel 60 F254

Wise (Hàn Quốc) 2. Bếp bọc cho bình cầu 20 Lít

Wise (Hàn Quốc) 3. Bếp bọc cho bình cầu 10 Lít

Wise (Hàn Quốc) 4. Bếp bọc cho bình cầu 6 Lít

Lenz (Đức) 5. Bình cầu 20 Lít

Lenz (Đức) 6. Bình cầu 10 Lít

Lenz (Đức) 7. Bình cầu 6 Lít

Lenz (Đức) 8. Bình cầu 3 cổ 1000 mL

Lenz (Đức) 9. Bình cầu 3 cổ 500 mL

Lenz (Đức) 10. Bình cầu 3 cổ 250 mL

24

Lenz (Đức) 11. Bình cầu 3 cổ 100 mL

TT Thiết bị, dụng cụ Xuất xứ

Bình lọc, phễu lọc hút chân không Buchner đường 12. Trung Quốc kính 15-35 cm

13. Bình sắc ký Trung Quốc

14. Bộ lọc hút chân không Trung Quốc

15. Bộ phản ứng có áo nhiệt, dung tích 5 Lít Chemglass (Mỹ)

16. Bơm tạo chân không vòi nước Trung Quốc

Các dụng cụ thí nghiệm phụ trợ khác: pipet, cốc có 17. mỏ, ống nghiệm, đũa/phễu thủy tinh, mao quản…

18. Cân đồng hồ Trung Quốc

Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ chính xác 19. Thụy Sỹ 0,01 g

20. Cân kỹ thuật SARTORIUS TE212 Đức

21. Cân kỹ thuật Satorius Đức

22. Cân phân tích SARTORIUS BP12 Đức

23. Cân xác định hàm ẩm nhanh Ohaus Trung Quốc

24. Đèn cồn Trung Quốc

25. Đèn sấy hồng ngoại Đức

26. Đèn soi UV sắc ký CN6 Đức

27. Thiết bị Dean-stark Lenz (Đức)

28. Giấy lọc Việt Nam

Thụy Sỹ 29. Máy cất quay chân không Buchi R210

30. Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ

31. Máy đo pH INOLAB Đức

32. Máy đo quang UV- VIS Sp 3000 NaNo Đức

33. Máy khuấy cơ IKA Đức

34. Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Đức

35. Máy siêu âm Ultrasonic LC60H Đức

25

36. Nhiệt kế thủy ngân Đức

TT Thiết bị, dụng cụ Xuất xứ

37. Phễu lọc Đức

38. Tủ hotte Unilab Model TH 1300 Trung quốc

39. Tủ lạnh LG Hàn Quốc

40. Tủ sấy chân không WiseVen Hàn Quốc

41. Tủ sấy Memmert UF75 Đức

42. Tủ vi khí hậu Newzealand

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp và tinh chế berberin clorid ở quy mô phòng thí nghiệm:

Tổng hợp berberin clorid và các chất trung gian từ nguyên liệu vanilin qua trung

gian piperonal (25)

Tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd và homopiperonal thông qua

hợp chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62)

- Kiểm tra độ tinh khiết, xác định cấu trúc hóa học của berberin clorid tổng hợp

được và các chất trung gian.

- Nghiên cứu tối ưu hóa và lựa chọn phương pháp tổng hợp berberin clorid để nâng

cấp quá trình tổng hợp.

- Tinh chế nguyên liệu berberin tổng hợp được đạt tiêu chuẩn dược dụng quy mô

phòng thí nghiệm.

- Nâng cấp quy mô tổng hợp berberin clorid ở quy mô 100 g/mẻ và 500 g/mẻ.

- Kiểm nghiệm nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được theo tiêu chuẩn Dược

điển Việt Nam V.

- Nghiên cứu độ ổn định của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được ở điều kiện

dài hạn.

- Thử độc tính cấp của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Tổng hợp hóa học và tinh chế sản phẩm, khảo sát các thông số tối ưu

- Sử dụng các phản ứng hóa học cơ bản trong tổng hợp hóa dược.

- Sử dụng các phương pháp kết tinh, phân đoạn, lọc..để tinh chế sản phẩm đạt yêu

26

cầu.

- Quá trình tổng hợp berberin clorid được tiến hành đi từ 2 hướng sau:

Tổng hợp berberin clorid và các chất trung gian từ nguyên liệu vanilin qua trung

gian piperonal (25) theo sơ đồ sau:

Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp berberin clorid từ vanilin

Tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd và homopiperonal thông qua hợp

Glyoxal, CuSO4

chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) theo sơ đồ sau:

Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất

27

trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62)

2.3.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

Sản phẩm được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và đo

nhiệt độ nóng chảy.

Sắc ký lớp mỏng

- Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck).

- Pha động: Hệ dung môi khai triển sử dụng

▪ n-hexan : EtOAc = 3,0 : 7,0.

▪ CH2Cl2 : CH3OH = 90,0 :1,0.

▪ n-BuOH : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5.

Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc hiện

màu bằng dung dịch ninhydrin 0,1% trong ethanol hoặc dùng hơi iod.

Đo nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy đo bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ).

2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Các sản phẩm tổng hợp được xác định cấu trúc thông qua các số liệu phổ khối

lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-

NMR).

Phổ khối lượng: Đo trên máy LC-MS/MS-Xevo, tại phòng Phân tích khối phổ,

Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tại khoa Hóa học,

Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, chế độ đo ESI.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Đo trên máy Bruker AV 500, tần số 500 MHz (đối

với 1H-NMR), 125 MHz (đối với 13C-NMR) tại khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa

học tự nhiên, đại học Quốc gia Hà Nội, dung môi DMSO-d6, CDCl3.

2.3.4. Phương pháp đánh giá chất lượng nguyên liệu berberin clorid

- Đánh giá chất lượng của sản phẩm tổng hợp được theo tiêu chuẩn DĐVN V.

- Hàm lượng berberin clorid được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng so sánh

với mẫu chuẩn.

Pha động: Hòa tan 3,4 g kali dihydrophosphat và 1,7 g natri laurylsulfat trong hỗn

28

hợp nước - acetonitril (1:1) và pha loãng thành 1000 mL với cùng dung môi.

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,010 g chế phẩm, hòa tan trong pha động

và pha loãng thành 100,0 mL với cùng dung môi.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,010 g berberin clorid chuẩn, hòa tan

trong pha động và pha loãng thành 100,0 mL với cùng dung môi.

Dung dịch phân giải: Hòa tan 1 mg berberin clorid chuẩn và 1 mg palmatin clorid

chuẩn trong 10 mL pha động.

Điều kiện sắc ký:

Cột kích thước (25 cm x 4 mm) được nhồi pha tĩnh có kích hạt 5 µm).

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 345 nm.

Nhiệt độ cột: 40℃ .

Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lưu của berberin khoảng

10 phút.

Thể tích tiêm: 10 µl.

Cách tiến hành:

Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký dung dịch phân giải, thứ tự

rửa giải lần lượt là pic palmatin và pic berberin, độ phân giải giữa hai pic không nhỏ

hơn 1,5.

Tiêm riêng biệt 5 lần dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic

berberin không lớn hơn 1,5 %.

Tiến hành sắc ký các dung dịch thử và dung dịch chuẩn.

Tính hàm lượng berberin clorid, C20H18NO4Cl, trong chế phẩm dựa vào diện tích

pic trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng C20H18NO4Cl

trong berberin clorid chuẩn.

Yêu cầu: Hàm lượng berberin trong chế phẩm từ 95,0 % đến 102,0 % theo tiêu

chuẩn Dược Điển Việt Nam V.

2.3.5. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định của nguyên liệu tổng hợp được

Nghiên cứu đánh giá độ ổn định của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được

trong bao bì PE (2 lần) theo thông tư 32/2018/TT-BYT và theo hướng dẫn của ICH-

29

Q1A(R2) ở hai điều kiện:

Điều kiện lão hoá cấp tốc:

- Nhiệt độ: 40 ± 2℃ .

- Độ ẩm tương đối: 75 ± 5%.

- Tần suất lấy mẫu: 0 tháng, 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, 6 tháng.

Điều kiện dài hạn:

- Nhiệt độ: 30 ± 2℃ .

- Độ ẩm tương đối: 75 ± 5%.

- Tần suất lấy mẫu: 3 tháng/lần (năm thứ nhất), 6 tháng/lần (năm thứ hai).

Hàm lượng của berberin clorid và hàm lượng tạp chất được đánh giá bằng phương

pháp HPLC.

2.3.6. Phương pháp thử độc tính cấp của nguyên liệu tổng hợp được

2.3.6.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Mẫu nguyên liệu berberin clorid được phân tán đều trong nước cất, tạo thành các

dịch có nồng độ thích hợp với các liều thử theo thiết kế.

a. Động vật nghiên cứu

- Chuột nhắt trắng trưởng thành, giống cái, khối lượng 18 - 22 g, do Viện Vệ sinh

dịch tễ Trung ương cung cấp.

- Động vật được nuôi ổn định tại điều kiện phòng thí nghiệm Bộ môn Dược lực,

Trường ĐH Dược Hà Nội. Nhiệt độ nuôi 22oC±3, 30% 30% ≤ độ ẩm ≤ 70%. Chuột

được nuôi ở ánh sáng theo chu trình 12 giờ sáng/tối và thời gian nuôi 5 ngày trước

khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh

dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do.

b. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

- Cân phân tích 10-4 A&D, GR200 (Nhật Bản).

- Cân kĩ thuật 10-2A&D, EK410i (Hàn Quốc).

- Các dụng cụ bắt giữ động vật, bơm, kim đầu tù cho động vật uống.

2.3.6.3. Phương pháp tiến hành

Phương pháp thử độc tính cấp theo hướng dẫn của Bộ Y tế và OECD.

a) Thiết kế thí nghiệm

30

- Nguyên tắc và các bước tiến hành:

Chuột nhắt trắng, giống cái, được nhịn ăn 3 giờ trước khi thí nghiệm. Kiểm tra cân

nặng trước khi thử nghiệm. Cho chuột dùng mẫu thử nhiều lần trong vòng 24 giờ,

mỗi lần cách nhau 2 giờ. Sau lần cuối cùng uống mẫu thử 2 giờ, chuột được cho ăn

trở lại. Theo dõi các biểu hiện của chuột trong vòng 14 ngày sau khi dùng mẫu thử:

theo dõi liên tục trong vòng 4 giờ, theo dõi thường xuyên trong vòng 72 giờ sau khi

uống chế phẩm thử lần cuối.

- Thử nghiệm thăm dò:

Tiến hành trên một số nhóm, 2 động vật thí nghiệm/ nhóm, cho uống một số mức

liều nhằm xác định khoảng liều cho thử nghiệm chính thức.

- Thử nghiệm chính thức:

Sau khi thử nghiệm thăm dò, động vật thí nghiệm được chia thành từng lô, mỗi lô

10 động vật. Mỗi lô được cho uống một mức liều. Thông thường, thiết kế thí nghiệm

với lô đầu uống liều tối đa không gây chết động vật và lô cuối cùng uống liều tối thiểu

gây chết toàn bộ động vật (nếu thử nghiệm thăm dò cho thấy sản phẩm có độc tính

gây chết động vật) hoặc dùng liều tăng dần đến liều tối đa mà chuột dung nạp được

bằng đường uống (nếu thử nghiệm thăm dò cho thấy sản phẩm không gây chết động

vật).

b) Theo dõi, đánh giá

- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế; màu sắc da và niêm mạc

(mũi, tai, đuôi); tiết dịch mũi, miệng; phản xạ với kích thích; tình trạng lông, phân,

nước tiểu…

- Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống.

- Số động vật chết: xác định tỉ lệ động vật chết ở các lô trong vòng 72 giờ để tính

toán LD50.

- Khi có động vật chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng. Nếu có dấu

hiệu đáng nghi ngờ mà không xác định được rõ nguyên nhân, nếu cần, làm thêm vi

thể để xác định nguyên nhân.

- Tiếp tục theo dõi động vật đến 14 ngày sau khi uống chế phẩm thử.

c) Phương pháp xử lý số liệu

31

Xác định LD50 bằng phương pháp phân tích hồi qui probit trên phần mềm SPSS.

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ

3.1. Xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm

3.1.1. Phương pháp tổng hợp berberin clorid thông qua trung gian

homopiperonylamin hydroclorid

3.1.1.1. Tổng hợp piperonal từ nguyên liệu vanilin

Demethyl hóa tạo 25a

Phân tán đều 9,7 g (72,4 mmol) AlCl3 khan trong dung dịch gồm 10,0 g (65,74

mmol) vanilin trong 100 mL DCM vào bình cầu 3 cổ dung tích 250mL, lắp sinh hàn,

nhiệt kế và khuấy từ, làm lạnh bên ngoài bằng nước đá. Khuấy mạnh và nhỏ giọt từ

từ cho đến hết 22,9 g (290,0 mmol) pyridin vào hỗn hợp phản ứng sao cho nhiệt độ

được duy trì khoảng 30-35℃. Tiếp tục khuấy mạnh khối phản ứng thu được dung

dịch vàng nhạt. Sau đó, khối phản ứng được đun hồi lưu trong 28 giờ (⁓ 45-50℃),

trong quá trình đun khối phản ứng chuyển dần sang màu đen. Sau khi kết thúc phản

ứng, hỗn hợp được làm lạnh về nhiệt độ phòng, thêm dần dung dịch HCl 10% đến

pH = 3 (chú ý kiểm soát nhiệt độ trong quá trình thêm acid HCl không quá 25℃).

Gạn bỏ pha hữu cơ (chứa vanilin chưa phản ứng), pha nước thu được sau đó được

chiết với diethyl ether 3 lần, mỗi lần 30 mL. Làm khan bằng Na2SO4, lọc bỏ natri

sulfat. Cất kiệt dung môi, thu cắn và rửa với DCM, để khô ngoài không khí được 25a.

Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn, màu nâu

- Khối lượng: 8,0 g

- Hiệu suất: 87,0 %

- Nhiệt độ nóng chảy: 153,4 - 155,5℃

- Rf = 0,17 (CHCl3 : CH3OH = 9 : 1)

32

Methylen hóa aldehyd 25a tạo piperonal (25)

Hòa tan 5,0 g (36,2 mmol) 3,4-dihydroxybenzaldehyd trong 50 mL DMF vào bình

cầu 3 cổ dung tích 250mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế và khuấy từ. Sau đó, thêm 19,8 g

(143,4 mmol) K2CO3; 0,5 g (6,25 mmol) CuO; 20 mL (⁓329,8 mmol) DCM vào hỗn

hợp trên, khuấy đều. Đun nóng khối phản ứng đến 110-120℃ trong 5h. Kết thúc phản

ứng, thêm nước cất vào hỗn hợp phản ứng rồi chiết với diethyl ether. Rửa dịch chiết

ether lần lượt với HCl 10%, NaOH 10%, nước. Sau khi làm khan bằng Na2SO4, lọc

bỏ natri sulfat, cất loại dung môi thu được cắn. Kết tinh lại trong ethanol 70%, sấy

khô thu được piperonal.

Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn, màu hơi vàng, mùi thơm

- Khối lượng: 3,6 g

- Hiệu suất: 66,2 %

- Nhiệt độ nóng chảy: 35,8 - 38,4℃

- Rf = 0,49 (n-hexan : ethyl acetat = 3 : 7)

3.1.1.2 Tổng hợp amin 6a từ nguyên liệu piperonal

a. Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal (25)

* Phương pháp 1:

Sử dụng tác nhân amoni acetat, theo tác giả Vinogradova [95], sơ đồ phản ứng như

sau:

Thêm lần lượt 1,00 g (6,67 mmol) piperonal; 0,45 mL (8,34 mmol) nitromethan;

0,29 g (3,77 mmol) amoni acetat và 5,0 mL acid acetic băng vào bình cầu 3 cổ dung

tích 100 mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế và khuấy từ. Khuấy và đun ở nhiệt độ 120℃ trong

33

1,5 giờ. Kết thúc phản ứng, rót hỗn hợp nóng vào nước đá. Lọc tủa thô, hòa tan tủa

trong 5,0 mL hỗn hợp dung môi ethanol: aceton tỉ lệ 2:1 (v/v), thêm 0,03 g than hoạt,

khuấy, lọc bỏ than hoạt để tẩy màu. Lọc thu dịch, để kết tinh qua đêm trong tủ lạnh.

Sau đó, lọc lấy tủa, sấy khô thu được 61 tinh khiết.

Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn, màu vàng, tinh thể hình kim.

- Khối lượng: 0,78 g (hiệu suất đạt 60,6%).

- Nhiệt độ nóng chảy: 159,1 - 161,5℃ (tài liệu[95]: 153 - 154℃ ).

- Rf = 0,8 (CH2Cl2 : MeOH = 90,0 : 1,0).

* Phương pháp 2

Sử dụng tác nhân là NaOH, theo tác giả Vogel [96] và Brendan Phillips [81] sơ đồ

1. MeNO2,MeOH,NaOH, 0oC

phản ứng như sau:

Thêm lần lượt 1,00 g (6,67 mmol) piperonal; 0,36 mL (6,67 mmol) nitromethan

và 10,0 mL methanol vào bình cầu 3 cổ dung tích 100 mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế và

khuấy từ, khuấy đều. Làm lạnh hỗn hợp phản ứng về 0℃ bằng nước đá muối và

thêm từ từ 0,8 mL dung dịch NaOH 10,5M khuấy trộn trong 30 phút. Sau khi quá

trình thêm NaOH kết thúc, pha loãng khối phản ứng với 10,0 mL nước lạnh và rót

vào 45,0 mL dung dịch HCl 4%, kết hợp khuấy mạnh thấy xuất hiện tủa vàng. Lọc

tủa thô, hòa tan tủa trong 5,0 mL hỗn hợp dung môi ethanol: aceton tỉ lệ 2:1, thêm

0,03 g than hoạt, khuấy, lọc bỏ than hoạt để tẩy màu. Lọc thu dịch, để kết tinh qua

đêm trong tủ lạnh. Sau đó, lọc lấy tủa, sấy khô thu được 61 tinh khiết.

Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn, màu vàng, tinh thể hình kim.

- Khối lượng: 0,97 g (hiệu suất đạt 75,4%).

- Nhiệt độ nóng chảy: 159,5 - 162,0℃ (tài liệu [95]: 153 - 154℃ ).

34

- Rf = 0,8 (CH2Cl2 : MeOH = 90,0 : 1,0).

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp chất 61 theo 2 phương pháp

Hợp chất 61 Phương pháp Khối lượng(g) Hiệu suất (%) to

nc (℃)

1 0,78 60,6 159,1 - 161,5

2 0,97 75,4 159,5 - 162,0

Qua bảng khảo sát các phương pháp tiến hành phản ứng, nhận thấy phương pháp

2 cho hiệu suất tốt hơn, đồng thời tiến hành đơn giản, đi từ các tác nhân rẻ tiền, thời

gian tiến hành nhanh. Vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp 2 để khảo sát các thông

số phục vụ việc nâng cấp quy mô lớn hơn.

* Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

+ Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol piperonal và nitromethan

Giữ nguyên điều kiện phản ứng và lượng các chất như thí nghiệm ban đầu, chỉ thay

đổi tỷ lệ mol piperonal và nitromethan thông qua sự thay đổi lượng nitromethan dùng

cho phản ứng. Sản phẩm được đánh giá bằng SKLM với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH

(90,0 : 1,0). Kết quả khảo sát thu được theo bảng 3.2.

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol nitromethan/piperonal tới

hiệu suất phản ứng

Hợp chất 61 Tỷ lệ mol Nitrometha TT nitromethan/ Khối lượng Hiệu suất n (mL) to

nc (℃)

piperonal (g) (%)

158,0 - 160,0 55,27 0,28 1 0,8 : 1,0 0,71

159,1 - 161,7 65,58 0,32 2 0,9 : 1,0 0,84

159,5 - 162,0 75,38 0,36 3 1,0 : 1,0 0,97

159,5 - 161,8 78,49 0,39 4 1,1 : 1,0 1,01

159,5 - 161,5 81,61 0,43 5 1,2 : 1,0 1,05

159,5 - 161,8 82,38 0,46 6 1,3 : 1,0 1,06

35

159,3 - 161,7 83,16 0,50 7 1,4 : 1,0 1,07

Qua bảng khảo sát nhận thấy khi tăng tỷ lệ nnitromethan : npiperonal thì hiệu suất phản

ứng tăng. Tuy nhiên, từ mức tỷ lệ 1,2 : 1,0 thì mức độ tăng hiệu suất không đáng kể.

Do đó, chúng tôi lựa chọn nnitromethan : npiperonal = 1,2 : 1,0 để vừa đảm bảo hiệu suất

cũng như tiết kiệm được hóa chất.

+ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Giữ nguyên các điều kiện phản ứng, chọn tỷ lệ nnitromethan : npiperonal = 1,2 : 1,0 đồng

thời thay đổi thời gian phản ứng sau khi thêm NaOH. Sản phẩm được đánh giá bằng

SKLM với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (90,0 : 1,0). Kết quả khảo sát thu được theo

bảng 3.3.

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất phản ứng

Hợp chất 61 Thời gian TT Hiệu suất (phút) Khối lượng (g) to

nc (℃)

(%)

1 1,01 158,5 - 161,0 78,50 20

2 1,05 159,5 - 161,5 81,61 30

3 1,10 159,5 - 161,4 85,49 40

4 1,11 159,0 - 161,0 86,27 50

5 1,11 159,5 - 162,0 86,27 60

Qua bảng khảo sát trên nhận thấy thời gian tối ưu của NaOH khi cho thêm là 40

phút. Bởi đây là khoảng thời gian cần thiết để lượng sản phẩm trung gian tạo ra tối

đa. Nếu ít hơn thì lượng chất trung gian tạo ra ít nên hiệu suất thấp còn nếu nhiều hơn

thì không có sự khác biệt đáng kể.

+ Khảo sát ảnh hưởng của dung môi

Giữ nguyên điều kiện phản ứng, thay đổi các thông số đã tối ưu đồng thời khảo sát

ảnh hưởng của dung môi đến phản ứng. Sản phẩm thu được được đánh giá bằng

SKLM với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (90 : 1). Kết quả khảo sát thu được theo

36

bảng 3.4.

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng

Hợp chất 61 TT Dung môi Khối lượng (g) to Hiệu suất (%)

nc (℃)

1 Ethanol 1,11 159,5 - 161,5 86,27

2 Methanol 1,10 159,5 - 161,8 85,49

Qua bảng 3.4 trên nhận thấy sử dụng dung môi là ethanol cho hiệu suất tương

đương methanol, nhưng ưu điểm là đỡ độc hại hơn nên chọn ethanol làm dung môi

phản ứng.

b) Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4-methylendioxy-β-

nitrostyren (61)

Homopiperonylamin (6) là một amin dạng lỏng, rất dễ bị oxy hóa đồng thời khó

xác định các thông số vật lý đặc trưng. Xuất phát từ điều này, luận án đã chuyển dạng

amin (base) về dạng amin hydroclorid (6a) với mục đích để tăng độ ổn định chuyển

dạng sản phẩm từ thể lỏng sang thể rắn nhằm thuận lợi hơn trong bảo quản và đánh

giá chất lượng.

* Phương pháp 1

Sử dụng hệ khử là NiCl2/NaBH4 qua hai giai đoạn theo sơ đồ:

Giai đoạn 1

Cho 30 mL THF khan, 6 mL ethanol tuyệt đối và 1,5 g (39,7 mmol) NaBH4 vào

bình cầu 3 cổ dung tích 250 mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế, làm lạnh bên ngoài bằng nước

đá và khuấy từ, khuấy đều. Thêm từ từ dung dịch gồm 2,9 g (15,0 mmol) 58 trong 60

mL THF sao cho nhiệt độ được duy trì không quá 30℃ . Khuấy trong 1 giờ 30 phút

tại nhiệt độ phòng. Kết thúc phản ứng, tiến hành loại dung môi rồi thêm 18 mL

37

methanol.

Giai đoạn 2

Chuẩn bị xúc tác Ni2B: Hòa tan hoàn toàn 6,00 g niken clorid hexahydrat

(NiCl2.6H2O) trong 20 mL methanol. Thêm từ từ 2,54 g NaBH4, khuấy đều. Làm lạnh

hỗn hợp phản ứng và sục N2 trong 30 phút.

Đổ toàn bộ xúc tác được chuẩn bị ở trên vào khối phản ứng ở giai đoạn 1. Thêm

từ từ 2,3 g NaBH4. Khuấy trong 2h, nhiệt độ 20℃ . Kết thúc phản ứng, thêm 60 mL

dung dịch HCl 10%, lọc loại xúc tác. Dịch lọc được cất tới khô. Hòa tan cắn trong

nước, lọc thu lấy dịch. Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 20% tới giá trị pH = 10-

11 rồi chiết với CH2Cl2. Làm khan dịch chiết CH2Cl2 bằng Na2SO4, cất loại dung môi

thu được homopiperonylamin. Hòa tan cắn trong IPA rồi thêm dung dịch HCl 37%

cho đến pH = 1 - 2. Dung dịch sau đó được thêm diethyl ether đến khi xuất hiện tủa

và làm lạnh qua đêm. Lọc tinh thể, sấy chân không ở 50℃ trong 5 giờ thu được 6a.

Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng

- Khối lượng: 2,3 g

- Hiệu suất: 72,6%

- Nhiệt độ nóng chảy: 208,0 - 210,0℃ (tài liệu [79]: 213 - 214℃ ).

- Rf = 0,56 (n-BuOH : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5).

* Phương pháp 2

Sử dụng hệ khử là NiCl2/NaBH4 theo tác giả Osby & Ganem [63] và một số cải

tiến với sơ đồ phản ứng như sau:

Hòa tan hoàn toàn 3,68 g (15,5 mmol) NiCl2.6H2O trong 300 mL methanol vào

bình cầu 3 cổ dung tích 100 mL, lắp sinh hàn, khuấy từ. Thêm từ từ 1,76 g (46,5

mmol) NaBH4, chú ý sự tạo bọt. Thêm từ từ 5,0 g (25,91 mmol) hợp chất nitro 61

vào khuấy trộn trong 30 phút sau đó thêm tiếp từng phần nhỏ 4,1 g NaBH4 5 phút

38

một lần chú ý sự tạo bọt. Sau 15 phút, hỗn hợp phản ứng đã được lọc và rửa với 50,0

mL methanol. Bốc hơi dịch lọc, lấy cắn, thêm vào đó 100 mL dung dịch H2SO4 10%.

Dịch acid được chiết với 3x25 mL CH2Cl2. Pha nước được thêm dung dịch NaOH

25% cho tới pH = 11 - 12 rồi đem chiết với 3x50 mL CH2Cl2 thu pha hữu cơ. Sau đó

đem làm khan với Na2SO4 lọc và bốc hơi dung môi đến cắn. Hòa tan cắn trong IPA

rồi thêm dung dịch HCl 37% cho đến pH = 1 - 2. Dung dịch sau đó được thêm diethyl

ether đến khi xuất hiện tủa và làm lạnh qua đêm. Đem lọc, thu được sản phẩm muối

amin clorid (6a).

Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng.

- Khối lượng: 3,52 g (hiệu suất đạt 67,4%).

- Nhiệt độ nóng chảy: 207,0 - 210,0℃ (tài liệu [63] : 213 - 214℃ ).

- Rf = 0,56 (n-BuOH : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5).

* Phương pháp 3

Sử dụng hệ khử là CuCl2/NaBH4 theo tác giả Jademyr [44] với sơ đồ phản ứng như

sau:

Thêm từ từ 5,0 g (25,91 mmol) hợp chất nitro 61 vào hỗn dịch (đã được sục khí

N2) của 7,36 g NaBH4 trong IPA (83,0 mL) và nước (41,5 mL) vào bình cầu 3 cổ

dung tích 100 mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế, và khuấy từ,. Sau đó thêm từng giọt 1,3 mL

CuCl2 2M vào hỗn hợp phản ứng. Nâng nhiệt độ hỗn hợp phản ứng lên 80℃ (duy trì

trong 30 phút). Để hỗn hợp phản ứng về nhiệt độ phòng, thêm 52,0 mL dung dịch

NaOH 25% khuấy trộn đến khi xuất hiện sự tách pha. Pha IPA được lấy riêng, pha

nước sau đó chiết với IPA (3x78,0 mL). Dịch chiết sau đó được gộp lại, làm khan với

Na2SO4, sau đó đem lọc. Thêm HCl đặc cho đến khi pH = 1-2. Bốc hơi dung môi thu

cặn xám, sau đó thêm aceton khuấy trộn trong 1h. Lọc khối phản ứng và rửa với

aceton thu được chất rắn màu trắng.

39

Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng.

- Khối lượng: 4,02 g (hiệu suất đạt 77,0%).

- Nhiệt độ nóng chảy: 210,0 - 212,0℃ (tài liệu [79]: 213 - 214℃ ).

- Rf = 0,56 (n-BuOH : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5).

* Phương pháp 4

Phản ứng khử hóa từ hợp chất 61 ra hợp chất 6a chia làm 2 giai đoạn: Khử nối đôi và khử nhóm nitro. Giai đoạn khử nối đôi sử dụng tác nhân NaBH4 và khử bằng kim loại/H+ cho giai đoạn khử nhóm nitro. Các hệ khử được khảo sát bao gồm: Fe/NH4Cl, Fe/CH3COOH, Zn/NH4Cl, Zn/CH3COOH và Al/NH4Cl.

Giai đoạn 1: Khử nối đôi. Sục khí nitơ vào 50,0 ml MeOH vào bình cầu 3 cổ dung

tích 250 mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế, làm lạnh bên ngoài bằng nước đá và khuấy từ,

sau đó thêm 3,00 g chất 61 (15,5 mmol) khuấy đều tạo thành hỗn dịch, thêm từ từ

1,47 g NaBH4 (38,9 mmol) vào hỗn dịch trên khuấy đều trong 30 phút ở nhiệt độ 0 -

5oC thu được dung dịch đồng nhất. Điều chỉnh pH của hỗn hợp trên về pH = 6 - 7

bằng dung dịch HCl đặc. Chiết dịch phản ứng với EtOAc (3 x 15,0 ml), lấy pha hữu

cơ, rửa pha hữu cơ lần lượt với nước muối bão hòa và nước. Làm khan bằng Na2SO4

khan, khuấy, lọc bỏ natri sulfat. Cất loại dung môi thu được cắn (A).

Giai đoạn 2: Khử nhóm nitro

* Phương pháp 4a. Fe/NH4Cl

Hòa tan cắn A thu được trong 50,0 ml MeOH (B) vào bình cầu 3 cổ dung tích 250

mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế và khuấy từ,, cân 3,32 g NH4Cl (62,2 mmol), hòa tan trong

khoảng 5,0 ml nước cất, cho dung dịch amoniclorid trên vào dung dịch B. Nâng nhiệt

độ hỗn hợp trên khoảng 50 - 60 oC, sau đó thêm 4,35 g bột sắt (77,7 mmol), khuấy

trộn phù hợp duy trì nhiệt độ 50 - 60 oC. Thực hiện phản ứng trong 4 giờ. Sau khi kết

thúc phản ứng, lọc lấy dịch, bã sắt được rửa với nước và MeOH, lọc gộp lấy dịch lọc.

Dịch lọc được kiềm hóa bằng NaOH 10% đến pH = 9 - 10. Sau khi kiềm hóa chiết

dịch với DCM (3 x 50,0 ml), lấy pha hữu cơ. Pha hữu cơ được rửa với dung dịch

NaCl bão hòa, sau đó rửa lại với nước cất và thêm Na2SO4 làm khan, khuấy và lọc bỏ

40

natri sulfat. Cất loại dung môi rắn thu được thêm 20,0 ml aceton, điều chỉnh pH = 1

- 2 bằng dung dịch HCl đặc, xuất hiện tủa trắng, làm lạnh để qua đêm, sau đó lọc lấy

tủa, sấy thu được muối hydroclorid của amin 1.

* Phương pháp 4b. Fe/CH3COOH

Cắn A thu được thêm 50,0 ml acid acetic, vào bình cầu 3 cổ dung tích 250 mL,

lắp sinh hàn và khuấy từ. Thêm 4,35 gam bột sắt (77,7 mmol), khuấy trộn phù hợp,

đun hồi lưu trong vòng 4 giờ. Sau khi phản ứng, lọc lấy dịch, rửa bã với nước, dịch

lọc được gộp lại điều chỉnh pH = 9 - 10 bằng dung dịch NaOH 10%, sau khi chỉnh

pH dịch xuất hiện tủa, lọc loại tủa lấy dịch. Dịch được chiết với DCM (3 x 50,0 ml),

sau đó rửa với nước muối bão hòa sau đó rửa lại với nước. Làm khan bằng Na2SO4,

cất loại dung môi. Rắn thu được cho thêm 20 ml aceton, điều chỉnh pH = 1 - 2 bằng

dung dịch HCl đặc, làm lạnh qua đêm, lọc thu lấy tủa.

* Phương pháp 4c. Zn/NH4Cl

Cắn A thu được thêm 50,0 ml MeOH vào bình cầu 3 cổ dung tích 250 mL, lắp

sinh hàn, nhiệt kế, làm lạnh bên ngoài bằng nước đá và khuấy từ. Hòa tan 3,32 g

NH4Cl (62,2 mmol) trong 10 ml nước cất rồi thêm vào hỗn hợp trên, cho thêm 5,05

g bột kẽm (77,7 mmol), khuấy trộn phù hợp. Nâng nhiệt độ khối phản ứng lên 50 -

60 oC, phản ứng tiến hành trong 4 giờ. Khối phản ứng sau khi phản ứng xong để về

nhiệt độ phòng, sau đó lọc lấy dịch, bã kẽm được rửa bằng nước, gộp dịch. Dùng

dung dịch NaOH 10% chỉnh pH = 9 - 10, xuất hiện tủa, lọc loại tủa, dịch sau đó được

chiết với DCM (3 x 50,0 ml), lấy pha hữu cơ, rửa lần lượt với nước muối bão hòa và

nước cất. Làm khan bằng Na2SO4, khuấy, lọc bỏ natri sulat. Cất loại dung môi, rắn

thu được hòa tan trong 20,0 ml aceton, sau đó chỉnh pH = 1 - 2 bằng dung dịch HCl

đặc, làm lạnh thu đươc tủa trắng, lọc lấy tủa.

* Phương pháp 4d: Zn/CH3COOH

Cắn A thu được thêm 50,0 ml acid acetic và 5,05 g bột kẽm (77,7 mmol) vào

bình cầu 3 cổ dung tích 250 mL, lắp sinh hàn và khuấy từ, đun hồi lưu trong vòng 4

giờ. Phản ứng được đề nguội xuống nhiệt độ phòng và thực hiện tương tự như quy

41

trình xử lý phản ứng khử với Zn/NH4Cl.

* Phương pháp 4e: Al/NH4Cl

Cắn A thu được thêm 50,0 ml MeOH vào bình cầu 3 cổ dung tích 250 mL, lắp

sinh hàn, nhiệt kế và khuấy từ, hòa tan 3,32 g NH4Cl (62,2 mmol) trong 5,0 ml nước

cất rồi thêm vào hỗn hợp trên, cho thêm 2,10 g bột kẽm (77,7 mmol), khuấy trộn phù

hợp. Nâng nhiệt độ khối phản ứng lên 50 – 60 oC, phản ứng tiến hành trong 4 giờ.

Khối phản ứng sau khi phản ứng xong để về nhiệt độ phòng, sau đó lọc lấy dịch, bã

kẽm được rửa bằng nước, gộp dịch. Dùng dung dịch NaOH 10% chỉnh pH = 9 - 10,

xuất hiện tủa, lọc loại tủa, dịch sau đó được chiết với DCM (3 x 50,0 ml), lấy pha hữu

cơ, rửa lần lượt với nước muối bão hòa và nước cất. Làm khan bằng Na2SO4 khan,

khuấy lọc bỏ natri sulfat. Cất loại dung môi, rắn thu được hòa tan trong 20,0 ml

aceton, sau đó chỉnh pH = 1-2 bằng dung dịch HCl đặc, làm lạnh thu được tủa trắng,

lọc lấy tủa.

- Kết quả

- Cảm quan: Sản phẩm là chất rắn màu trắng.

- Hệ số lưu Rf = 0,6 (hệ n–BuOH : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5).

- Khối lượng, hiệu suất, nhiệt độ nóng chảy, được ghi dưới bảng sau.

Bảng 3.5 Kết quả tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) theo 5

phương pháp

Chất 6a Phương Hệ xúc tác pháp Khối lượng (g) Hiệu suất (%) to

nc (oC)

NiCl2/NaBH4 1 2,20 72,6 208,0 - 210,0 (2 giai đoạn)

NiCl2/NaBH4 2 3,52 67,4 207,0 - 210,0 (cải tiến)

3 4,02 77,0 210,0 - 212,0 CuCl2/NaBH4

4a 2,42 77,0 212,5 - 213,9 Fe/NH4Cl

4b 2,21 70,5 212,1 - 214,7 Fe/CH3COOH

4c 2,36 75,3 213,2 - 214,7 Zn/NH4Cl

42

4d 2,31 73,7 212,6 - 214,5 Zn/CH3COOH

4e 2,27 72,4 213,6 - 214,7 Al/NH4Cl

NaBH4/NH4Cl 5 2,39 76,2 212,6-213,7 (onepot)

Qua bảng 3.5 nhận thấy phương pháp 3 cho hiệu suất cao hơn đồng thời qua thực

nghiệm nhận thấy phương pháp 3 có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp còn lại: Sử

dụng dung môi là nước nên an toàn không sợ cháy nổ (do phản ứng sinh nhiệt), lượng

chất khử sử dụng ít hơn, dung môi hữu cơ ít độc hại hơn, tinh chế dễ dàng hơn. Do

vậy, phương pháp 3 được lựa chọn để khảo sát tối ưu các thông số khi nâng cấp quy

mô tổng hợp.

* Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

+ Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa NaBH4 và 3,4-methylendioxy-β-

nitrostyren

Giữ nguyên các điều kiện phản ứng và lượng các chất như thí nghiệm ban đầu, chỉ

thay đổi tỷ lệ mol 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren và NaBH4 thông qua sự thay đổi

lượng NaBH4 dùng cho phản ứng. Sản phẩm thu được được đánh giá bằng SKLM

với hệ dung môi n-butanol : acid acetic : H2O (9,0 : 2,0 : 2,5). Kết quả khảo sát được

thể hiện trên bảng 3.6.

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa NaBH4 và 3,4-

methylendioxy-β-nitrostyren (61) đến hiệu suất phản ứng.

Hợp chất 6a Tỷ lệ T NaBH4 mol NaBH4 Khối lượng Hiệu suất (g) T to

nc (℃)

/61 (g) (%)

208,0 - 211,0 77,01 7,36 7,5 : 1,0 4,02 1

208,5 - 211,0 80,84 7,85 8,0 : 1,0 4,22 2

210,0 - 212,0 91,00 8,34 8,5 : 1,0 4,75 3

210,0 - 212,0 91,18 8,83 9,0 : 1,0 4,76 4

210,0 - 212,0 91,57 9,32 9,5 : 1,0 4,77 5

Qua bảng khảo sát trên nhận thấy khi tăng lượng NaBH4 lên thì quá trình khử diễn

43

ra hoàn toàn hơn nên hiệu suất cao hơn. Khi tỷ lệ mol NaBH4 vượt quá 8,5 thì sự sai

khác về hiệu suất không nhiều. Do đó, tỷ lệ mol chúng tôi lựa chọn giữa NaBH4 và

3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) khi nâng cấp quy trình là 8,5 : 1,0.

+ Khảo sát ảnh hưởng của xúc tác cho phản ứng khử hóa nhóm nitro

Giữ nguyên các điều kiện phản ứng và lượng các chất như thí nghiệm ban đầu, chỉ

thay đổi xúc tác khử. Sản phẩm thu được được đánh giá bằng SKLM với hệ dung môi

n-butanol : acid acetic : H2O (9,0 : 2,0 : 2,5). Kết quả khảo sát thu được theo bảng

3.7.

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của xúc tác cho phản ứng khử hóa

Hợp chất 6a TT Xúc tác khử Khối lượng (g) to Hiệu suất (%)

nc (℃)

1 2,71 208,0 - 210,0 51,92 NiCl2

2 4,75 210,0 - 212,0 91,00 CuCl2

3 4,02 209,5 - 212,0 77,01 CuSO4

Khi dùng cùng 1 tỷ lệ mol (1 : 10) giữa dạng muối của kim loại khử và hợp chất

nitro thì muối CuCl2 và CuSO4 tỏ ra ưu thế vượt trội so với muối NiCl2, trong đó dạng

muối CuCl2 tỏ ra rất hiệu quả nên được lựa chọn khi nâng cấp quy trình.

3.1.1.3 Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-

amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a)

a. Khảo sát, lựa chọn điều kiện phản ứng

Phương pháp 1

Theo tác giả Chen Cheng và cộng sự [86] cùng một số cải tiến sơ đồ phản ứng như

sau.

Cho 2,02 g (0,01 mol) homopiperonylamin hydroclorid (6a); 1,66 g (0,01 mol)

2,3-dimethoxybenzaldehyd; 0,48 g (0,012 mol) NaOH; 0,8 g (0,0056 mol) Na2SO4

44

và 14,0 mL methanol vào vào bình cầu 3 cổ dung tích 100 mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế

và khuấy từ, khuấy đều. Cất quay hết methanol, giữ hỗn hợp phản ứng ở 105℃ trong

2h, để nguội bổ sung thêm 10,0 mL methanol rồi thêm từ từ vào khối phản ứng 0,40

g NaBH4 (1,1 mol). Tiếp tục đun hồi lưu trong 6h. Kết thúc phản ứng, thêm nước cất

để hòa tan phần chất rắn rồi chiết với ethyl acetat. Dịch chiết được làm khan bằng

Na2SO4, lọc bỏ natri sulfat. Tiến hành cất loại dung môi. Hòa tan cắn bằng methanol,

thêm dung dịch HCl 37% tới pH = 1-2. Tiếp tục cô đến cắn. Rửa chất rắn với diethyl

ether để loại tạp rồi kết tinh lại trong aceton, sấy khô thu được 31.

Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn, màu trắng.

- Khối lượng: 1,85 g (hiệu suất đạt 52,63%).

- Nhiệt độ nóng chảy: 85,0 - 88,5℃ (tài liệu [86]: 73,0 - 74,0℃ ).

- Rf = 0,74 (n-BuOH : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5).

Phương pháp 2

Theo tác giả M. Hansen [41] và một số cải tiến

1,01 g (C2H5)3N (0,01 mol) đã được thêm vào hỗn dịch của 2,02 g

homopiperonylamin hydroclorid (6a) (0,01 mol) và 1,66 g 2,3-

dimethoxylbenzaldehyd (0,01 mol) trong ethanol (10,0 mL) vào bình cầu 3 cổ dung

tích 100 mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế, khuấy từ. Đun hồi lưu trong 1h. Thêm vào khối

phản ứng 0,1 g KOH, tiếp tục đun hồi lưu trong 2h. Sau đó thêm từ từ 0,76 g NaBH4

(0,02 mol) vào hỗn hợp phản ứng và khuấy trộn trong 0,5h. Hỗn hợp phản ứng sau

đó được cô đặc dưới áp suất giảm và phần còn lại được thêm hỗn hợp CH2Cl2:H2O

(30,0 mL, 1:1). Pha hữu cơ sau đó được tách ra còn pha nước được chiết với CH2Cl2

(2x15,0 mL). Dịch chiết hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khô với Na2SO4, lọc và bốc

hơi dưới áp suất giảm. Cắn sau đó được hòa tan trong 2,0 mL ethanol và thêm dung

45

dịch HCl (36,5%) từ từ cho đến pH = 1-2. Hỗn hợp sau đó được bổ sung 5,0 mL IPA;

2,0 mL diethylether và giữ trong tủ lạnh qua đêm. Tinh thể sau đó được thu lại bằng

cách lọc dưới áp suất giảm và thu được sản phẩm mong muốn.

Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng.

- Khối lượng: 2,24 g (hiệu suất đạt 63,73%).

- Nhiệt độ nóng chảy: 85,5 - 88,7℃ (tài liệu [41]: 73,0 - 74,0℃ ).

- Rf = 0,74 (n-BuOH : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5).

Bảng 3.8 Kết quả tổng hợp chất 31 theo 2 phương pháp

Hợp chất 31 Phương pháp Khối lượng chất (g) Hiệu suất (%) to

nc (℃)

1 1,85 52,63 85,0 - 88,5

2 2,24 63,73 85,5 - 88,7

Qua bảng so sánh 3.8 nhận thấy phương pháp 2 cho hiệu suất cao hơn, thời gian

tiến hành ngắn hơn. Do vậy, phương pháp 2 được lựa chọn để khảo sát tối ưu các

thông số khi nâng cấp quy mô lớn hơn.

b. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa 2,3-dimethoxylbenzaldehyd và

homopiperonylamin hydroclorid (6a)

Giữ nguyên các điều kiện phản ứng và lượng các chất như thí nghiệm ban đầu, chỉ

thay đổi tỷ lệ mol giữa aldehyd và 6a thông qua sự thay đổi lượng aldehyd dùng cho

phản ứng. Sản phẩm thu được được đánh giá bằng SKLM với hệ dung môi n-butanol

46

: acid acetic : H2O (9,0 : 2,0 : 2,5). Kết quả khảo sát thu được theo bảng 3.9.

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa aldehyd và chất 6a

Hợp chất 31 Tỷ lệ mol TT Aldehyd (g) Khối Hiệu suất aldehyd/6a to

nc (℃)

lượng (g) (%)

1 1,33 0,8 : 1,0 1,81 85,0 - 88,5 51,49

2 1,49 0,9 : 1,0 2,01 85,4 - 89,1 57,18

3 1,66 1,0 : 1,0 2,24 85,5 - 88,7 63,72

4 1,83 1,1 : 1,0 2,45 85,7 - 88,5 69,70

5 1,99 1,2 : 1,0 2,45 85,5 - 88,5 69,70

6 2,16 1,3 : 1,0 2,46 85,7 - 88,9 69,98

Qua bảng khảo sát chúng tôi lựa chọn tỷ lệ mol phù hợp giữa aldehyd và

homopiperonylamin hydroclorid (6a) là 1,1 : 1,0.

Khảo sát ảnh hưởng của các bazơ khác nhau dùng trong phản ứng

Giữ nguyên các điều kiện phản ứng và lượng các chất như thí nghiệm ban đầu,

lượng aldehyd đã được lấy theo tỷ lệ tối ưu (naldehyd : naminclorid = 1,1 : 1,0) đồng thời

thay đổi tác nhân kiềm hóa. Sản phẩm thu được được đánh giá bằng SKLM với hệ

dung môi n-butanol : acid acetic : H2O (9,0 : 2,0 : 2,5). Kết quả khảo sát thu được

theo bảng 3.10.

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các bazơ khác nhau đến hiệu suất

phản ứng ngưng tụ

Hợp chất 31 TT Tác nhân Khối lượng (g) to Hiệu suất (%)

nc (℃)

1 NaOH 1,75 85,0 - 88,5 49,79

2 Triethylamin 2,45 85,7 - 88,5 69,70

3 2,28 86,0 - 89,2 64,86 CH3ONa

47

Sử dụng triethylamin cho hiệu suất phản ứng tốt nhất.

Khảo sát ảnh hưởng của dung môi

Giữ nguyên các điều kiện phản ứng và lượng các chất như thí nghiệm ban đầu,

lượng aldehyd đã được lấy theo tỷ lệ tối ưu (naldehyd : nmuối amin = 1,1 : 1,0) đồng thời

thay đổi dung môi. Sản phẩm thu được được đánh giá bằng SKLM với hệ dung môi

n-butanol : acid acetic : H2O (9,0 :2,0 : 2,5). Kết quả khảo sát theo bảng 3.11.

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng

Hợp chất 31

TT Dung môi

Khối lượng (g) to Hiệu suất (%)

nc (℃)

1 Ethanol 2,45 85,7 - 88,5 69,70

2 Methanol 2,54 85,7 - 88,2 72,26

Toluen 3 3,02 85,8 - 88,2 85,92

Toluen/ethanol 4 3,12 86,0 - 88,1 88,76 (9:1)

Nhận thấy hiệu suất phản ứng tăng rõ rệt khi sử dụng toluen, điều này có thể giải

thích bởi giai đoạn quan trọng nhất quyết định hiệu suất phản ứng là giai đoạn tạo

imin. Sự có mặt của toluen giúp tạo hỗn hợp đẳng phí và nước có thể tách ra khỏi

khối phản ứng bằng bộ dụng cụ Dean-stark.

3.1.1.4 Tổng hợp berberin clorid (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-

dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31)

a. Khảo sát, lựa chọn điều kiện phản ứng

Phương pháp 1:

Theo tác giả Chen Cheng và cộng sự [71] cùng một số cải tiến : sử dụng dung môi

48

là acid formic 85%.

Cho 20,0 mL acid formic 85% (530,43 mmol); 2,0 g CuSO4 (12,5 mmol) khan vào

bình cầu 3 cổ dung tích 100 mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế, khuấy từ, khuấy đều. Đun

nóng hỗn hợp đến nhiệt độ 50 - 55℃ trong 60 phút. Thêm 1,0 g 31 (2,85 mmol);

0,72 mL glyoxal 40% (5,86 mmol). Duy trì nhiệt độ khối phản ứng 100℃ trong 5h.

Kết thúc phản ứng, để nguội về nhiệt độ phòng. Cất loại dung môi. Bổ sung 10,0 mL

aceton, lọc lấy dịch. Thêm vào dịch lọc 10,0 mL HCl đặc, để kết tinh qua đêm. Lọc

lấy tủa, tẩy màu bằng than hoạt và kết tinh lại trong ethanol 96%, sấy khô thu được

berberin clorid.

Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn, màu vàng

- Khối lượng: 0,58 g (hiệu suất đạt 54,87%).

- Nhiệt độ nóng chảy: 187,0 - 191,5℃ (tài liệu [71]: 191 - 192℃ )

- Rf = 0,49 (n-BuOH : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5).

Phương pháp 2

Sử dụng dung môi là acid acetic

Thêm 1,45 mL anhydrid acetic (15,3 mmol); 3,95 mL acid acetic (68,5 mmol); 0,58

g CuCl2 (4,28 mmol); 0,34 g NaCl (5,7 mmol) đã được làm nóng tới 80 - 90℃ vào

bình cầu 3 cổ dung tích 100mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế và khuấy từ. Thêm từ từ 0,72

mL glyoxal 40% (5,86 mmol) vào hỗn hợp phản ứng đun hồi lưu trong 20 phút, sau

đó làm lạnh bình phản ứng xuống dưới 90℃ và thêm từ từ 1,0 g 31 (2,85 mmol) vào

hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưu trong 2h (112 - 114℃ ). Acid acetic sau đó được loại

bỏ khỏi hỗn hợp phản ứng bằng cách cất quay dưới áp suất giảm (còn lại khoảng 3,0

mL), tiếp đó thêm khoảng 6,0 mL nước và duy trì nhiệt độ 80℃ khuấy trộn trong 20

49

phút rồi lọc nóng thu tủa ngay lập tức. Tủa sau đó được đưa vào bình cầu 100 mL và

pha loãng trong 20,0 mL nước cất, sục 0,27 g khí amoniac (15,7 mmol) duy trì ở 25

- 30℃ trong 10 phút. Lọc lấy dịch, rửa 2 lần với 5,0 mL nước lạnh. Thêm vào dịch

lọc 5,0 mL HCl đặc, để kết tinh qua đêm. Lọc lấy tủa, tẩy màu bằng than hoạt và kết

tinh lại trong ethanol 96%, sấy khô thu được berberin clorid.

Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn, màu vàng.

- Khối lượng: 0,65 g (hiệu suất đạt 61,50%).

- Nhiệt độ nóng chảy: 191,5 - 193,0℃ (tài liệu [60]: 191 - 192℃ ).

- Rf = 0,49 (n-BuOH : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5).

Bảng 3.12 Kết quả tổng hợp berberin clorid (1) theo 2 phương pháp

Berberin clorid (1) Phương pháp Khối lượng chất (g) Hiệu suất (%) to

nc (℃)

1 0,58 54,87 191,0 - 193,0

2 0,65 61,50 191,5 - 193,0

Qua bảng so sánh 3.12 nhận thấy phương pháp 2 cho hiệu suất cao hơn, thời gian

tiến hành ngắn hơn nên phương pháp 2 được lựa chọn để khảo sát tối ưu các thông

số khi nâng cấp quy mô lớn hơn.

a. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa glyoxal và 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-

yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31)

Giữ nguyên các điều kiện phản ứng và lượng các chất như thí nghiệm ban đầu, chỉ

thay đổi tỷ lệ mol giữa glyoxal và 31 thông qua sự thay đổi lượng glyoxal dùng cho

phản ứng. Sản phẩm thu được được đánh giá bằng SKLM với hệ dung môi n-butanol

: acid acetic : H2O (9,0 : 2,0 : 2,5). Kết quả khảo sát thu được theo bảng 3.13.

Bảng 3.13 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol đến hiệu suất phản ứng

Berberin clorid (1) Glyoxal Tỷ lệ mol TT (mL) glyoxal:31 Khối lượng Hiệu to

nc (℃)

50

suất (%) (g)

1 0,36 1,0 : 1,0 0,57 191,0 - 194,0 53,93

2 0,54 1,5 : 1,0 0,60 192,5 - 193,5 56,77

3 0,72 2,0 : 1,0 0,65 192,0 - 194,0 61,50

4 0,90 2,5 : 1,0 0,69 191,5 - 192,5 65,28

5 1,08 3,0 : 1,0 0,70 192,7 - 194,0 66,23

6 1,26 3,5 : 1,0 0,70 190,5 - 193,0 66,23

Dựa trên bảng và đồ thị chúng tôi lựa chọn tỷ lệ mol phù hợp để phản ứng có hiệu

suất tốt, đồng thời tiết kiệm hóa chất là nglyoxal : nchất 31 = 2,5: 1,0.

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng sau khi thêm hợp chất 31

Giữ nguyên các điều kiện phản ứng và lượng các chất như thí nghiệm ban đầu, chỉ

thay đổi nglyoxal : nchất 31 = 2,5 : 1,0 và thời gian phản ứng sau khi thêm hợp chất 31.

Sản phẩm thu được đánh giá bằng SKLM với hệ dung môi n-butanol : acid acetic :

H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5. Kết quả khảo sát thu được theo bảng 3.14.

Bảng 3.14 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng

Berberin clorid (1)

Thời gian phản ứng TT sau khi thêm 31 (h) Khối lượng Hiệu suất to

nc (℃)

(%) (g)

191,2 - 193,8 49,20 0,52 1,0 1

192,5 - 193,5 57,72 0,61 1,5 2

191,5 - 192,5 65,28 0,69 2,0 3

191,5 - 192,8 65,49 0,69 2,5 4

192,0 - 193,7 65,86 0,69 3,0 5

Dựa trên bảng và đồ thị nhận thấy thời gian ngắn phản ứng diễn ra chưa hoàn toàn

nên hiệu suất thấp. Thời gian phản ứng tối ưu là 2h, nhiều hơn không có sự khác biệt

về mặt hiệu suất phản ứng.

Tóm tắt lại, quy trình tổng hợp berberin clorid với quy mô phòng thí nghiệm

51

từ nguyên liệu ban đầu là piperonal, hiệu suất đạt 45,44% theo sơ đồ sau:

1 6a

25

2 61

2 1

2 31

0

2

Hình 3.1. Sơ đồ tổng hợp berberin từ piperonal quy mô phòng thí nghiệm

3.1.2. Phương pháp mới tổng hợp berberin clorid từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd

qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim

Với mục đích khảo sát con đường mới tổng hợp berberin, luận án đề xuất quy trình

tổng hợp mới thay thế việc sử dụng chất trung gian piperonal bằng hợp chất 2,3-

dimethoxybenzaldoxim (63) từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd. Quy trình tổng hợp như

Glyoxal, CuSO4

sau, gồm 4 bước:

Hình 3.2. Sơ đồ tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất

52

trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim

3.1.2.1. Tổng hợp 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd

(bước 1)

Hợp chất 62 được tổng hợp từ 2,3- dimethoxybenzaldehyd theo phản ứng:

Hòa tan 0,7 g (0,01 mol) NH2OH.HCl vào 13,0 ml ethanol 96o và 8,0 ml nước vào

bình cầu 3 cổ dung tích 100mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế và khuấy từ. Bổ sung 1,65 g

(0,01 mol) 2,3-dimethoxybenzaldehyd vào hòa tan trong dung dịch trên. Thêm từ từ

dung dịch gồm 0,8 g (0,02 mol) NaOH trong 3,0 ml nước vào hỗn hợp và đun hồi lưu

trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng, đổ hỗn hợp phản ứng vào nước lạnh và acid hóa bằng

H2SO4 35% thu được kết tủa trắng, lọc rửa bằng nước lạnh, sấy khô thu được 1,62 g

chất rắn màu trắng 62.

Kết quả

- Cảm quan: chất rắn màu trắng

- Khối lượng 1,62g (hiệu suất 89,50 %)

- Nhiệt độ nóng chảy 99 – 100,2oC

- Rf = 0,67 (dung môi CH2Cl2: CH3OH = 20:1)

3.1.2.2. Tổng hợp (2,3-dimethoxyphenyl)methanamin (63) từ 2,3-

dimethoxybenzaldoxim (62)

Hòa tan 1,80 g (0,01 mol) 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) trong 10,0 ml acid

acetic vào bình cầu 3 cổ dung tích 100mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế, khuấy từ, khuấy

đều. Thêm 1,63 g (0,025 mol) bột kẽm vào hỗn hợp trên. Khuấy đều và đun hồi lưu

trong 30 phút. Sau phản ứng, cất loại dung môi dưới áp suất giảm. Chất rắn còn lại

53

được hòa tan trong 10,0 ml nước và chiết với DCM (3 x 15,0 ml). Kiềm hóa dịch

nước thu được bằng NaOH 25% đến pH = 10-11 rồi chiết bằng DCM (3 x 15,0 ml).

Làm khan dịch chiết DCM bằng Na2SO4 khan, khuấy và lọc bỏ natri sulfat, cất loại

dung môi. Hòa tan chất rắn còn lại bằng 2,0 ml IPA, acid hóa bằng HCl đặc đến pH

= 1-2, sau đó thêm diethylether đến khi dung dịch vẩn đục. Để kết tinh trong tủ lạnh

cho kết tinh hoàn toàn. Lọc, sấy khô thu được 1,74 g tinh thể màu trắng, hình que

ngắn.

Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn màu trắng

- Khối lượng 1,74g (hiệu suất 85,63 %)

- Nhiệt độ nóng chảy 164 – 165,1oC

- Rf = 0,46 (dung môi CH2Cl2: CH3OH = 8:2)

Khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân khử hóa đến hiệu suất tổng hợp (2,3-

dimethoxyphenyl)methanamin (63) từ 62.

Để lựa chọn tác nhân khử hóa giúp nâng cao hiệu suất phản ứng tổng hợp 63 từ

62. Chúng tôi tiến hành khảo sát với các tác nhân: NaBH4, NiCl2/CH3OH, Zn/HCl và

Zn/CH3COOH. Kết quả được trình bày trong bảng sau.

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân khử hóa đến hiệu

suất phản ứng tổng hợp 63

Thời STT Tác nhân Nhiệt độ Dung môi Hiệu suất gian

82,2% 6h 0-5oC 1 NaBH4, NiCl2 CH3OH

Zn/HCl 50,0% 1h 25oC 2 CH3OH

Đun hồi 0,5h 85,6% 3 Zn/CH3COOH CH3COOH lưu

Tác nhân NaBH4, NiCl2 , có giá thành cao, hoạt động tốt trong điều kiện thí

nghiệm ở nhiệt độ thấp (0-5oC) cho hiệu suất cao 82,2% tuy nhiên phản ứng xẩy ra

chậm trong 6h do phản ứng sinh bọt và tỏa nhiệt mạnh làm giảm tốc độ cung cấp tác

nhân vào hệ phản ứng. Trong khi đó, với tác nhân Zn/HCl cho sản phẩm đơn chất

trên sắc kí bản mỏng, phản ứng xẩy ra nhanh chóng trong 1h, tuy nhiên khó tách chiết

54

hợp chất đầu ra khỏi sản phẩm và hiệu suất đạt 50 %. Tác nhân Zn/CH3COOH cho

sản phẩm tinh khiết với hiệu suất cao, thời gian phản ứng ngắn 0,5h nhưng cần đun

hồi lưu để nâng cao tốc độ phản ứng và hiệu suất lên đến 85,6%. Do đó, chúng tôi

lựa chọn tác nhân này để tiến hành phản ứng khử hóa tổng hợp 63 từ 62.

3.1.2.2. Tổng hợp 2-(1,3-benzodioxol -5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin

hydrochlorid (31) từ (2,3-dimethoxyphenyl)methanamin (63)

Hỗn hợp gồm 0,70 ml triethylamin, 0,82 g (0,005 mol) homopiperonal, 1,02 g

(0,005 mol) hợp chất 63 trong 15,0 ml toluen và 2,0 ml ethanol trong bình cầu 3 cổ

dung tích 100mL, lắp sinh hàn, nhiệt kế và khuấy từ.. Sau đun hồi lưu 1h, thêm vào

khối phản ứng 0,11 g (0,002 mol) KOH, khuấy đều và đun tiếp trong 3h. Sau đó, tiến

hành cất loại toluen, hòa tan chất rắn bằng 5,0 ml methanol, thêm từ từ 0,50 g (0,013

mol) NaBH4 vào hỗn hợp phản ứng và khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1h. Phản ứng

kết thúc, thêm 20,0 ml hỗn hợp DCM:H2O (1:1). Chiết pha nước với DCM (3 x 15,0

ml). Làm khan dịch chiết DCM bằng Na2SO4, cất loại dung môi. Hòa tan chất rắn

còn lại bằng 2,0 ml methanol, acid hóa bằng HCl đặc đến pH = 1-2, sau đó thêm

diethylether đến khi dung dịch vẩn đục. Để kết tinh trong tủ lạnh cho kết tinh hoàn

toàn. Lọc, sấy khô thu được 1,4 g hợp chất 31.

Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng - Khối lượng sản phẩm: 1,4g - Hiệu suất: 79,52%.

Tổng hợp berberin (1) từ 2-(1,3-benzodioxol -5-yl)-N-(2,3-

dimethoxybenzyl)ethan -1-amin hydrochlorid (31) được thực hiện theo phương pháp

số 2 được nhắc đến trong mục 3.1.1.4

Như vậy, berberin clorid được tổng hợp bằng phương pháp mới từ 2,3-

55

dimethoxybenzaldehyd với hiệu suất 36,23% qua 4 giai đoạn phản ứng.

3.1.3. So sánh các phương pháp tổng hợp berberin clorid ở quy mô phòng thí

nghiệm

Từ kết quả nghiên cứu quá trình tổng hợp berberin clorid ở quy mô phòng thí

nghiệm từ nguyên liệu vanillin, piperonal, homopiperonal và 2,3-

dimethoxybenzaldehyd chúng tôi phân tích để lựa chọn nâng cấp quy trình tổng hợp

berberin clorid ở quy mô 100 g/mẻ.

Tổng hợp berberin clorid từ nguyên liệu được so sánh theo bảng sau đây

Bảng 3.16. So sánh các phương pháp tổng hợp berberin clorid từ các nguyên

liệu khác nhau

Nguyên liệu Vanillin Piperonal Homopiperonal Chỉ tiêu

6 4 4

Số giai đoạn phản ứng

26,17% 45,44% 36,23%

suất cao toàn quá

Hiệu nhất trình

300.000 vnd/kg 700.000vnd/kg 600.000 vnd/kg

Giá nguyên liệu đầu vào

Qua bảng trên cho thấy, phương pháp tổng hợp đi từ nguyên liệu khác nhau đều có những ưu điểm để tiến hành quy mô tổng hợp lớn hơn. Con đường đi từ vanillin cần thêm 2 phản ứng nữa để tổng hợp được piperonal nên có thể chủ động được nguồn piperonal. Do vậy, chúng tôi tiến hành nâng cấp quy mô với nguyên liệu đi từ piperonal để hiệu suất toàn phần của quá trình cao hơn.

3.2. Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc hóa học của các chất tổng

hợp được

3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết

Sắc ký lớp mỏng:

Các sản phẩm trung gian và sản phẩm cuối cùng của quy trình tổng hợp được kiểm

tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng. Đặc điểm sắc ký của các hợp chất được tóm

tắt trong bảng 3.17.

56

Bảng 3.17 Đặc điểm sắc ký lớp mỏng của các hợp chất tổng hợp được

Hợp chất Đặc điểm sắc ký Pha động Rf

0,80 Một vết, màu vàng 61 CH2Cl2: CH3OH = 90 : 1

0,67 Một vết 62 CH2Cl2: CH3OH = 20: 1

0,46 Một vết 63 CH2Cl2: CH3OH = 8: 2

Một vết, hiện màu tím với thuốc n-BuOH : AcOH : H2O 0,56 6a = 9,0 : 2,0 : 2,5 thử Ninhydrin

n-BuOH : AcOH : H2O 0,74 31 Một vết = 9,0 : 2,0 : 2,5

25a Một vết 0,17 (CHCl3:CH3OH = 9:1)

Một vết, phát huỳnh quang vàng, n-BuOH : AcOH : H2O 1 0,49 trùng chất chuẩn. = 9,0 : 2,0 : 2,5

Nhiệt độ nóng chảy

Giá trị nhiệt độ nóng chảy các hợp chất được tóm tắt ở bảng 3.18.

Bảng 3.18 Nhiệt độ nóng chảy của các hợp chất tổng hợp được

Hợp chất Nhiệt độ nóng chảy (℃) Tài liệu tham khảo

61 159,5 - 161,5 153 – 154oC [95]

62 99 - 100,2 98 - 100 [50]

63 164 - 165,1

6a 210,0 - 212,0 213 – 214 [79]

31 86,0 - 88,1 73,0 - 74,0 [86]

25a 153,4 - 155,5

191,2 - 192,4 (dạng dihydrat) 191 – 192 [71]

1 204,0-206,0 (dạng khan, kết

tinh trong diethyl ether)

Khoảng chảy của các chất tổng hợp được trong khoảng hẹp (1-2℃). Kết quả

57

này cho thấy berberin tổng hợp và các chất trung gian khá sạch. Kết quả đo nóng chảy cũng chỉ ra, sản phẩm thu được theo quy trình đề xuất ở dạng berberin dihydrat.

3.2.2. Khẳng định cấu trúc sản phẩm tổng hợp được

Sản phẩm 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren ((E)-5-(2-nitrovinyl)benzo[d][1,3]dioxol,

61)

Kết quả phân tích phổ MS, IR, 1H-NMR, 13C-NMR của 61 được trình bày lần lượt

trong bảng 3.19.

Bảng 3.19 Kết quả phân tích cấu trúc 61

ESI-MS (MeOH) [Phụ lục

11] m/z: 194,15 [M+H]+

IR (KBr) [Phụ lục

14] Nhóm chức Đỉnh hấp thụ đặc

trưng (ῡ, cm-1)

3116 C-Hanken

C-H no 2920

1485 và 1327 -NO2

[Phụ lục

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)

12] δ (ppm), số H, dạng tín hiệu, vị trí H

6,14 (2H, s, H-2); 7,04 (1H, d, J = 8,0

Hz, H-7);

7,40 (1H, dd, J1 = 8,0 Hz, J2 = 1,5 Hz, CTPT: C9H7NO4

H-6); KLPT (đvC): 193,16

7,55 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-4); 8,07

(1H, d, J = 13,5 Hz, H-1’); 8,14 (1H,

d, J = 13,5 Hz, H-2’)

[Phụ lục

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)

δ (ppm), vị trí C 13]

102,52 (C-2); 108,01 (C-7); 109,31

(C-4);

124,91 (C-6); 128,22 (C-5); 136,68

58

(C-2’);

140,05 (C-1’); 148,71 (C-7a); 151,42

(C-3a)

Ghi chú: δ: Độ chuyển dịch hóa học được lấy theo giá trị trung bình (ppm);s:

singlet; d: doublet; dd: doublet doublet; t: triplet; q: quartet.

Sản phẩm 2,3- dimethoxybenzaldoxim (62)

Kết quả phân tích phổ MS, IR, 1H-NMR, 13C-NMR của 62 được trình bày lần lượt

trong bảng sau

Bảng 3.20 Kết quả phân tích cấu trúc 62

ESI-MS (MeOH) [Phụ

lục 31] m/z: 181,90 [M+H]+

IR (KBr) [Phụ

lục 37] Nhóm Đỉnh hấp thụ đặc trưng

chức (ῡ, cm-1)

O-H 3178; 2991

C-H no 2947; 2827

C=N 1627; 1600

C=C 1575; 1473

thơm

C-O 1269; 1219

[Phụ

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)

CTPT: C9H11NO3

lục 32] δ (ppm), số H, dạng tín hiệu, vị KLPT (đvC): 181,19

trí H

11,29 (1H, s, OH-); 8,24 (1H, s,

H-1); 7,27 (1H, dd, J1 = 4,0 Hz, J2

= 5,5 Hz,

H-5’); 7,07-7,05 (2H, 2d,

59

J = 4,0 Hz, J’ = 5,5 Hz,

H-4’, H-6’); 3,81 (3H, s, H-7’);

3,74 (3H, s, H-8’)

[Phụ

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)

δ (ppm), vị trí C lục 35]

152,63 (C-3’); 146,94 (C-2’);

143,37 (C-1); 126,30 (C-1’);

124,20 (C-6’); 116,89 (C-4’);

113,55 (C-5’); 60,90 (C-7’);

55,69 (C-8’).

Sản phẩm (2,3-dimethoxyphenyl)methanamin (63)

Kết quả phân tích phổ MS, IR, 1H-NMR, 13C-NMR của 63 được trình bày lần lượt

trong bảng sau

Bảng 3.21 Kết quả phân tích cấu trúc 63

ESI-MS (MeOH) [Phụ

lục 38] m/z: 168,20 [M+H]+

[Phụ IR (KBr)

lục 41] Nhóm Đỉnh hấp thụ đặc trưng (ῡ,

chức cm-1)

NH3+ 2966; 2621

C-H

no 2819

CTPT: C9H14ClNO2

C=C KLPT (đvC): 203,67 1620; 1585; thơm 1508; 1479

C-O 1278; 1224;

60

1078

[Phụ

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)

lục 39] δ (ppm), số H, dạng tín hiệu, vị trí H

8,33-8,10 (2H, 2 br.s, NH2);

7,13-7,02 (3H, m, H-4’, H-5’, H-6’);

4,00 (2H, d, J = 1,5 Hz, H-1); 3,84

(3H, s, H-8’); 3,81 (3H, s, H-7’).

[Phụ

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)

δ (ppm), vị trí C lục 40]

152,73 (C-2’); 147,18 (C-3’)

127,80 (C-1’); 124,57 (C-6’)

121,80 (C-5’); 113,97 (C-4’)

60,92 (C-7’); 56,32 (C-8’);

37,44 (C-1).

Sản phẩm 3,5-dihydroxybenzaldehyd (3,4-dihydroxybenzaldehyd, 25a)

Kết quả phân tích phổ MS, IR, 1H-NMR, 13C-NMR của 25a được trình bày lần

lượt trong bảng 3.22.

Bảng 3.22 Kết quả phân tích cấu trúc 25a

[Phụ ESI-MS (MeOH)

lục 5] m/z:137,41 [M-H]-

[Phụ

1H-NMR (500 MHz, CDCl3)

lục 6] δ (ppm), số H, dạng tín hiệu, vị trí H

9,81 (1H, s, H-7); 7,42 (1H, d, J = 1,5 Hz; H-3);

7,40 (1H, dd, J3-5 = 1,5 Hz; J5-6 = 8,0 Hz; H-5);

7,02 (1H, d, J = 8,0 Hz; H-6) CTPT: C7H6O3

[Phụ

13C-NMR (125 MHz, CDCl3)

KLPT (đvC):

lục 9] δ (ppm), vị trí C 138,12

191,86 (C-7); 151,84 (C-1); 145,24 (C-2);

129,13 (C-4); 125,61 (C-5); 118,42 (C-6);

61

114,84 (C-3)

Homopiperonylamin hydroclorid (2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethan-1-amin

hydroclorid, 6a)

Kết quả phân tích phổ MS, IR, 1H-NMR, 13C- của 6a được trình bày lần lượt trong

Bảng 3.23.

Bảng 3.23 Kết quả phân tích cấu trúc 6a

ESI-MS (MeOH) [Phụ

lục 15] m/z: 166,18 [M-Cl]+

IR (KBr) [Phụ

lục 18] Nhóm Đỉnh hấp thụ đặc trưng (ῡ, cm-1)

chức

3053 C-Hthơm

+

C-H no 2972 và 2885

2042 NH3

[Phụ

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)

δ (ppm), số H, dạng tín hiệu, vị trí H lục 16]

2,82 (2H, m, H-1); 2,96 (2H, pseudo.singlet,

H-2);

5,99 (2H, s, H-2’); 6,71 (1H, d, J = 8,0 Hz, CTPT: C9H12ClNO2

H-7’); 6,86 (1H, dd, J1 = 8,0 Hz, J2 = 2,0 KLPT (đvC): 201,69

+)

Hz, H-6’); 6,87 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-4’);

8,21 (3H, br.s, NH3

[Phụ

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)

δ (ppm), vị trí C lục 17]

33,03 (C-2); 39,01 (C-1); 101,28 (C-2’);

108,79 (C-7’); 109,54 (C-4’); 122,18 (C-6’);

131,58 (C-5’); 146,42 (C-7’a); 147,84 (C-

3’a)

Sản phẩm 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin

62

hydrochlorid (31)

Kết quả phân tích phổ MS, IR, 1H-NMR, 13C-NMR của 31 được trình bày lần lượt

trong bảng 3.24.

Bảng 3.24 Kết quả phân tích cấu trúc 31

ESI-MS (MeOH) [Phụ

lục 19] m/z: 316,30 [M-Cl]+

IR (KBr) [Phụ

lục 25] Nhóm Đỉnh hấp thụ đặc trưng (ῡ, cm-1)

chức

C-O 1043, 1190 và 1240

C = 1440, 1492 và 1631

Cthơm

N-H+ 2773

2937 C-Hno

N-H 3450

[Phụ

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)

δ (ppm), số H, dạng tín hiệu, vị trí H lục 20]

2,82 (2H, t, J = 8,0 Hz, H-2); 3,01 (2H,

br.s, H-1); 3,72 (3H, s, H-7’’); 3,75 CTPT: C18H22ClNO4

(3H, s, H-6’’); 4,04 (2H, s, H-1’’’); KLPT (đvC): 351,83

5,90 (2H, s, H-2’); 6,62 (1H, d, J = 8,0

Hz, H-7’); 6,77 (1H, s, H-4’); 6,78 (1H,

d, J = 8,0Hz, H-6’); 7,02 - 7.05 (3H, m,

H-4’’, H-5’’, H-6’’); 8,94 - 9,01 (2H,

2s, N+H2)

[Phụ

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)

δ (ppm), vị trí C lục 23]

31,43 (C-2); 44,79 (C-1); 48,35 (C-

1’’’); 56,31 (C-7’’); 61,06 (C-6’’);

63

101,33 (C-2’); 108,84 (C-7’); 109,49

(C-4’’); 114,36 (C-4’); 122,12 (C-5’’);

122,89 (C-6’’); 124,61 (C-6’); 125,83

(C-1’’); 131,42 (C-5’); 146,47 (C-3’’);

147,61 (C-7’a); 147,87 (C-3’a); 152,73

(C-2’’)

Sản phẩm berberin clorid (1)

Kết quả phân tích phổ MS, IR, 1H-NMR, 13C-NMR của 1 được trình bày lần lượt

trong bảng 3.25.

Bảng 3.25 Kết quả phân tích cấu trúc 1

ESI-MS (MeOH) [Phụ

lục 26] m/z: 336,25 [M-Cl]+

IR (KBr) [Phụ

lục 25] Nhóm Đỉnh hấp thụ đặc trưng (ῡ, cm-

1)

chức

C-O 1105 và 1276

C = 1459 và 1631

Cthơm

C-H 2913

no

O-H 3440

[Phụ

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)

C20H18ClNO4 δ (ppm), số H, dạng tín hiệu, vị trí H lục 27] KLPT (đvC): 371,82 3,12 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-5); 3,98

(3H, s, H-2’); 4,01 (3H, s, H-1’); 4,85

(2H, t, J = 6,5 Hz; H-6); 6,08 (2H, s,

H-2); 7,00 (1H, s, H-4); 7,71 (1H, s,

H-14); 7,92 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-11);

8,11 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-12); 8,87

64

(1H, s, H-13); 9,81 (1H, s, H-8)

[Phụ

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)

δ (ppm), vị trí C lục 28]

26,80 (C-5); 55,65 (C-6); 57,55 (C-

2’); 62,41 (C-1’); 102,56 (C-2);

105,92 (C-14); 108,91 (C-4); 120,69

(C-13); 120,93 (C-8a); 121,88 (C-

13b); 124,01 (C-11); 127,23 (C-12);

131,16 (C-4a); 133,46 (C-12a); 137

(C-13a); 144 (C-10); 145,95 (C-8);

148,21 (C-14a); 150,29 (C-3a); 150,87

(C-9)

3.3. Xây dựng quy trình tinh chế berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm đạt

tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V

3.3.1. Quy trình tiến hành

Thêm 5,0 g berberin clorid vào bình cầu dung tích 250 mL có chứa sẵn 100,0 mL

ethanol 96%, đun cách thủy ở 75-80℃ đến khi tan hết. Thêm tiếp 0,1 g than hoạt,

đun khoảng 15 phút, sau đó đem lọc nóng qua phễu Buchner thu dịch lọc. Dịch lọc

thu được để lạnh về nhiệt độ phòng, sau đó để kết tinh qua đêm ở nhiệt độ 5-10℃ .

Lọc lấy tinh thể trên phễu Buchner, rửa tinh thể 2 lần bằng ethanol 70% lạnh. Sấy

khô ở 60℃ thu sản phẩm berberin clorid (1).

Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn, màu vàng.

- Khối lượng: 4,5 g (hiệu suất tinh chế đạt 95,0%).

- Nhiệt độ nóng chảy: 191,3 - 192,2℃ (tài liệu [71]: 191 - 192℃ ).

- Rf = 0,49 (n-BuOH : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5).

3.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

a. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi kết tinh

Giữ nguyên các điều kiện phản ứng và lượng các chất như thí nghiệm ban đầu, chỉ

65

thay đổi dung môi kết tinh. Sản phẩm thu được được đánh giá bằng SKLM với hệ

dung môi n-butanol : acid acetic : H2O (9,0 : 2,0 : 2,5). Kết quả khảo sát thu được

theo bảng 3.26.

Bảng 3.26 Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất kết tinh Berberin clorid

Berberin clorid (1) TT Dung môi Khối lượng (g) to Hiệu suất (%)

nc (℃)

1 Ethanol 4,5 191,3 - 192,2 95,0%

2 Methanol 4,4 191,4 - 192,4 94,0%

Sử dụng hai dung môi không có sự khác biệt đáng kể về hiệu suất tinh chế. Tuy

nhiên, sử dụng dung môi là ethanol ít độc hại hơn, giá thành rẻ hơn nên ethanol được

lựa chọn làm dung môi kết tinh.

b. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh

Giữ nguyên các điều kiện phản ứng và lượng các chất như thí nghiệm ban đầu, chỉ

thay đổi nhiệt độ kết tinh. Sản phẩm thu được được đánh giá bằng SKLM với hệ dung

môi n-butanol : acid acetic : H2O (9,0 : 2,0 : 2,5). Kết quả khảo sát thu được theo

bảng 3.27.

Bảng 3.27 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quy trình tinh chế

Berberin clorid (1) Nhiệt độ Thời gian TT Hiệu suất kết tinh (℃) kết tinh (h) to

nc (℃)

(%)

5-10 5 191,3 - 192,2 96,0% 1

25-30 24 191,3 - 192,2 85,0% 2

Kết tinh ở nhiệt độ thấp giúp rút ngắn thời gian hình thành các tinh thể kết tinh mà

hiệu suất đạt được lại tương đương nhau. Do vậy, chúng tôi lựa chọn điều kiện kết

tinh là ở nhiệt độ 0-5℃ trong 5h.

3.3.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh chế theo tiêu chuẩn DĐVN V

Sản phẩm được kiểm tra độ tinh khiết và tiến hành kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn

66

Dược điển Việt Nam V tại bảng 3.28.

Bảng 3.28 Kết quả kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển

Việt Nam V

Chỉ tiêu và tiêu Yêu cầu Kết quả chuẩn áp dụng

1. Tính chất Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị

đắng. Tan trong nước nóng, khó tan trong Đúng

cloroform, không tan trong ether.

2. Định tính

A. Phản ứng hóa Chế phẩm phải thể hiện phản ứng định Đúng học tính của berberin clorid.

B. Phổ IR Phổ hấp thụ hồng ngoại của chế phẩm

phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại Đúng

của berberin clorid chuẩn.

3. Giới hạn acid Phải đạt quy định. Đạt

4. Tạp chất liên Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, tổng

quan diện tích các pic phụ không được lớn hơn Đạt (Phương pháp diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung

dịch đối chiếu. HPLC)

Không được quá 0,048%. 5. Sulfat Đạt

6. Kim loại nặng Không được quá 30 phần triệu. Đạt

7. Nước Đạt (Phương pháp Karl Từ 8% đến 12%. (11,5%) Fischer)

8. Tro sulfat Đạt Không được quá 0,10% (0,10%)

9. Định lượng Chế phẩm phải chứa từ 95,0% đến Đạt (Phương pháp 102,0% hàm lượng berberin clorid, (97,6%) HPLC) C20H18NO4Cl, tính theo chế phẩm khan.

Sản phẩm berberin clorid tổng hợp được đạt tiêu chuẩn chất lượng theo quy định

67

Dược điển Việt Nam V.

3.4. Xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid quy mô 100 g/mẻ

3.4.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal

Thêm lần lượt 300,0 g (2,0 mol) piperonal; 135 mL (2,4 mol) nitromethan và

2000,0 mL ethanol vào bình cầu 6 L, lắp thiết bị Dean-stark, khấy từ, khuấy đều.

Làm lạnh hỗn hợp về 0℃ bằng nước đá muối và thêm từ từ cho đến hết 360,0 mL

dung dịch NaOH 10M trong 40 phút. Sau khi quá trình thêm NaOH kết thúc, khối

phản ứng được khuấy thêm 30 phút nữa, pha loãng với 300,0 mL nước lạnh và rót

vào bình cầu chứa sẵn 2,8 lít dung dịch HCl 4%, kết hợp khuấy mạnh thấy xuất hiện

tủa vàng. Lọc thu tủa, kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi ethanol : aceton tỉ lệ 2:1,

sấy khô thu được sản phẩm 61 là tinh thể màu vàng, hình kim.

Tiến hành lặp lại quy trình 3 lần ta thu được kết quả như trên bảng 3.29

Bảng 3.29 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 61 với tác

nhân NaOH ở quy mô 100 g/mẻ

Dd Hợp chất 61 Piperonal NaOH CH3NO2 TT (g) (mL) 10M HS KL (g) to

nc (℃)

(mL) (%)

300,0 135,0 360 330,0 85,5 158,0 - 160,0 1

300,0 135,0 360 334,6 86,7 158,5 - 160,0 2

300,0 135,0 360 331,6 85,9 157,9 - 160,0 3

135,0 360 TB 300,0 332,0±2,3 86,1±0,6

Từ bảng 3.29 cho thấy quá trình tổng hợp chất 61 từ piperonal cho hiệu suất ổn

định (86,1±0,6%), p-value > 0,05 (khác biệt giữa các lô mẻ không có ý nghĩa thống

kê).

3.4.2. Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4-methylendioxy-β-

68

nitrostyren (61)

Thêm 2,5 lít IPA, 1,5 lít nước cất vào bình cầu 6 L, lắp thiết bị Dean-stark, khấy

từ, khuấy đều, sục khí nitơ. Thêm nhanh 357,0 g (10,1 eq) NaBH4 vào bình cầu và

khuấy cho tan hết. Sau đó thêm từng phần cho đến hết 330,0 g (2,0 eq) chất 61 vào

hỗn hợp, nhiệt độ phản ứng được duy trì khoảng từ 45 - 55℃ . Sau khi toàn bộ lượng

chất 61 đã thêm hết, bổ sung tiếp 194,0 g NaBH4 (6,0 eq) vào hỗn hợp phản ứng,

khuấy cho đến khi mất màu vàng. Thêm tiếp 950,0 mL dung dịch CuCl2 2M (0,2 eq)

từng giọt vào khối phản ứng và nhiệt độ phản ứng được duy trì 75 - 80℃ trong 30

phút (đun cách thủy bên ngoài). Sau khi phản ứng hoàn thành (theo dõi bằng SKLM

với hệ dung môi n-butanol : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5) hỗn hợp phản ứng được

đưa về nhiệt độ phòng, thêm 1000,0 mL dung dịch NaOH 25%, khuấy đều thấy xuất

hiện sự tách pha. Pha IPA được lấy riêng, pha nước sau đó chiết với IPA (3x600 mL).

Dịch IPA sau đó được gộp lại, làm khan bằng với Na2SO4 sau đó đem lọc. Điều chỉnh

pH bằng dung dịch HCl đặc cho đến khi pH = 1. Làm lạnh hỗn hợp xuống 10℃ và

lọc loại phần không tan. IPA sau đó được cất loại dưới áp suất giảm thu được cắn

màu xám. Phân tán cắn thu được trong 200,0 mL aceton, khuấy trong 1 giờ. Lọc tủa,

rửa tủa bằng aceton lạnh và sấy thu được sản phẩm homopiperonylamin hydroclorid

(6a) là chất rắn màu trắng.

Tiến hành lặp lại quy trình 3 lần ta thu được kết quả như trên bảng 3.30.

Bảng 3.30 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 6a

Hợp chất 6a Nitrostyren NaBH4 CuCl2 TT (g) (g) (mL) KL HS to

nc (℃)

(g) (%)

330,0 551,0 950,0 315,0 91,4 209,5 - 211,0 1

69

330,0 551,0 950,0 316,2 91,8 210,0 - 212,0 2

3 330,0 551,0 950,0 315,8 91,7 210,0 - 212,5

TB 330,0 551,0 950,0 315,6±0,2 91,6±0,6

Từ bảng 3.30 cho thấy quá trình tổng hợp chất 6a từ nitrostyren 61 cho hiệu suất

ổn định (91,62±0.6%) ở quy mô 100 g/mẻ, p-value > 0,05 (khác biệt giữa các lô mẻ

không có ý nghĩa thống kê). Tuy nhiên, trong các giai đoạn phản ứng thì quá trình

khử hóa nitrostyren (61) lại nảy ra vấn đề: 1) khó kiểm soát phản ứng phụ (sinh H2

có thể gây trào khối phản ứng), 2) nhiệt độ phản ứng, 3) Sử dụng nhiều NaBH4, đây

là tác nhân đắt tiền và khó bảo quản. Chính vì vậy để khắc phục những nhược điểm

này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu cải tiến quy trình khử khóa nitrostyren 61 để thích

hợp với điều kiện thí nghiệm và dễ dàng nâng cấp quy mô tổng hợp ở quy mô lớn

hơn.

Dựa trên những khảo sát ở quy mô phòng thí nghiệm, Luận án đã sử dụng phương

pháp đã khảo sát ở điều kiện thí nghiệm. Quá trình khử hóa nitrostyren 61 tạo muối

amin 6a qua hai giai đoạn: vẫn dùng NaBH4 cho giai đoạn khử nối đôi, giai đoạn khử

nitro sẽ lựa chọn tác nhân khử Fe/NH4Cl vì cho hiệu suất tốt, xử lý sau phản ứng dễ

dàng, hơn nữa giá thành rẻ nên hệ khử Fe/NH4Cl được lựa chọn để tổng hợp và sản

phẩm amin sau khi khử sẽ được chuyển sang dạng muối hydroclorid.

Do hai giai đoạn đều là phản ứng khử nên nhóm nghiên cứu đề xuất tiến hành

one-pot cho 2 giai đoạn bỏ qua bước xử lý phản ứng sau khi đã khử nối đôi. Dưới đây

là quy trình one-pot

Quy trình one-pot (II): Sục khí nitơ vào 50,0 ml MeOH, sau đó thêm 3,00 g

chất 61 được khuấy trộn tạo thành hỗn dịch, thêm từ từ 1,47 g NaBH4 (38,9 mmol)

vào hỗn dịch trên khuấy đều trong 30 phút ở nhiệt độ 0 - 5 oC thu được dung dịch

đồng nhất. Điều chỉnh pH của hỗn hợp trên về pH = 6 - 7 bằng HCl, khuấy trộn trong

70

15 phút. Cân 3,33 g NH4Cl (62,2 mmol), hòa tan trong khoảng 5,0 ml nước cất. Cho

dung dịch amoniclorid trên vào dung dịch phản ứng trước đó. Nâng nhiệt độ hỗn hợp

trên khoảng 50-60 oC, sau đó thêm 4,35 g bột sắt (77,7 mmol), duy trì nhiệt độ 50 –

60 oC. Thực hiện phản ứng trong 4 giờ.

Xử lý phản ứng: Sau khi kết thúc phản ứng, lọc lấy dịch, bã sắt được rửa bằng

nước, lọc gộp lấy dịch lọc. Dịch lọc được kiềm hóa bằng NaOH 10% đến pH = 9 -

10. Sau khi kiềm hóa chiết với DCM (3 x 50,0 ml), lấy pha hữu cơ. Pha hữu cơ được

rửa với dung dịch NaCl bão hòa, sau đó rửa lại với nước cất và làm khan với Na2SO4.

Cất loại dung môi cắn thu được thêm 20,0 ml aceton, chỉnh về pH khoảng 1 - 2 bằng

HCl, xuất hiện tủa trắng, làm lạnh, lọc thu lấy tủa.

Kết quả:

Cảm quan: Sản phẩm là chất rắn màu trắng

Khối lượng 2,39g

Hiệu suất 76,2

Nhiệt độ nóng chảy 212,6-213,7oC

Săc ký lớp mỏng: Rf = 0,6 (hệ n-butanol : acid acetic : nước = 9,0 : 2,0 : 2,5).

Khảo sát các thông số

Tiến hành khảo sát các thông số bao gồm: nhiệt độ phản ứng, tỷ lệ sắt sử dụng,

dung môi phản ứng, thời gian tiến hành phản ứng. Sau đó xây dựng quy trình với các

thông số đã tối ưu. Dưới đây sẽ trình bày chi tiết các khảo sát này.

a. Nhiệt độ phản ứng

Tiến hành phản ứng theo quy trình II, với tỷ lệ chất 61 : NaBH4 = 1 : 2. Tiến

hành phản ứng với khối lượng chất 61 là 3,00 g (15,5 mmol) được khử bằng 1,18 g

(31,1 mmol). Các khoảng nhiệt độ được khảo sát bao gồm: nhiệt độ phòng, 50 - 60oC

và khi đun hồi lưu. Kết quả được ghi lại bảng dưới đây.

Bảng 3.31 Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng

STT Nhiệt độ phản ứng (oC) Khối lượng sản phẩm (g) Hiệu suất (%) Nhiệt độ nóng chảy (oC)

71

1 Nhiệt độ phòng 2,01 64,1 212,3-214,1

2 50-60 oC 2,46 78,5 212,5-213,9

3 Hồi lưu 2,48 79,1 213,2-214,5

Phản ứng xảy ra ngay ở nhiệt độ phòng tuy nhiên hiệu suất không cao, khi gia

nhiệt hiệu suất phản ứng tăng tuy nhiên đun hồi lưu so với khoảng 50 - 60 oC hiệu

suất tăng không đáng kể, nên điều kiện nhiệt 50 - 60 oC được lựa chọn vì lý do năng

lượng.

b. Tỷ lệ sắt sử dụng

Khảo sát được tiến hành theo quy trình II với lượng NaBH4 sử dụng theo kết

quả khảo sát trước đó, thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 50 - 60 oC. Kết quả khảo sát

được ghi lại dưới bảng sau:

Bảng 3.32 Kết quả khảo sát tỷ lệ mol chất 61 : sắt

Tỷ lệ mol Hiệu suất STT Khối lượng sản phẩm (g) chất 61 : Fe (%) Nhiệt độ nóng chảy (oC)

1 1,0 : 2,5 1,52 212,7-214,3 48,5

2 1,0 : 5,0 2,46 212,5-213,9 78,5

3 1,0 : 7,5 2,57 213,0-214,5 82,0

4 1,0 : 10,0 2,44 213,3-215,1 77,8

Từ kết quả khảo sát cho thấy khi tăng lượng sắt hiệu suất có xu hướng tăng,

tuy nhiên nếu tăng quá nhiều (10 lần) hiệu suất giảm, chính vì thế tỷ lệ chất 61 : sắt

= 1,0 : 7,5 sẽ được lựa chọn để tiến hành các khảo sát tiếp theo.

c. Thời gian phản ứng

Tiến hành phản ứng tương tự với tỷ lệ NaBH4 và sắt, nhiệt độ được chọn từ

kết quả các khảo sát trên.

Bảng 3.33 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng

72

Hiệu suất STT Thời gian phản ứng (giờ) Khối lượng sản phẩm (g) Nhiệt độ nóng chảy (oC) (%)

1 4 2,57 82,0 213,0-214,5

2 8 2,62 83,9 213,1-214,8

3 12 2,65 84,5 213,8-215,5

Thời gian phản ứng tăng, hiệu suất phản ứng tăng nhưng khi tăng đến 12 giờ

hiệu suất tăng không đáng kể. Vì thế nhóm nghiên cứu chọn thời gian phản ứng là 8

giờ cho các khảo sát sau.

d. Dung môi phản ứng

Dung môi sử dụng trong phản ứng là hỗn hợp alcol : nước. Tiến hành khảo sát

dung môi khác nhau: ethanol, methanol, isopropanol và khảo sát tỷ lệ alcol : nước,

các thông số khác theo như kết quả đã khảo sát bên trên.

Bảng 3.34 Kết quả khảo sát dung môi

Khối lượng STT Dung môi Hiệu suất (%) Nhiệt độ nóng chảy (oC) sản phẩm (g)

1 Ethanol 2,27 72,4 212,8-214,1

2 Methanol 2,62 83,9 213,1-214,8

3 Isopropanol 2,25 71,8 212,7-214,0

Từ bản trên chúng tôi nhận thấy MeOH cho hiệu suất tốt, nên nhóm nghiên

cứu lựa chọn MeOH là dung môi và tiến hành khảo sát tiếp theo.

Sau khi lựa chọn được dung môi là MeOH, tiến hành khảo sát tỷ lệ nước:

MeOH, kết quả trình bày dưới bảng sau.

Bảng 3.35 Kết quả khảo sát tỷ lệ alcol : nước

Tỷ lệ Khối lượng STT Hiệu suất (%) Nhiệt độ nóng chảy (oC) alcol : nước sản phẩm (g)

5 : 1 1,87 59,7 212,5-214,7 1

10 : 1 2,62 84,0 213,1-214,8 2

73

15 : 1 2,04 65,1 213,4-214,9 3

Từ kết quả cho thấy với tỷ lệ MeOH : nước = 10 : 1 cho hiệu suất tốt. Lựa chọn

tỷ lệ này xây dựng quy trình tổng hợp amin 6a.

Sau khi khảo sát các thông số tiến hành lặp lại 3 lần theo quy trình

Quy trình: Phân tán 193,1 g (1,0 mol) nitrostyren 61 trong 650 mL ethanol tuyệt

đối vào bình cầu 3 cổ dung tích 500mL, lắp thiết bị Dean-stark, nhiệt kế và khuất từ,

khuấy đều hỗn hợp ở 30℃. Sau đó, vừa khuấy vừa thêm từng phần cho đến hết 75,6

g (2,0 mol) NaBH4 vào khối phản ứng, duy trì nhiệt độ hỗn hợp không quá 30℃ .

Sau khi thêm xong lượng NaBH4 thì khối phản ứng được khuấy thêm 2h nữa (phản

ứng kết thúc khi màu vàng của dung dịch biến mất hoặc theo dõi bằng SKLM). Sau

đó khối phản ứng được điều chỉnh pH về 5 bằng dung dịch HCl 36,5% (chú ý kiểm

soát nhiệt độ không quá 40℃ và sinh khí). Thêm 53,5 g (1,0 mol) NH4Cl vào hỗn

hợp trên và nâng nhiệt độ lên 55-60℃ . Sau đó, khối phản ứng được bổ sung 252,0 g

(4,5 mol) bột Fe, khuấy đều và duy trì nhiệt độ phản ứng trong 5h. Sau khi kết thúc

phản ứng (theo dõi bằng SKLM), khối phản ứng được đưa về nhiệt độ phòng, lọc bỏ

chất rắn không tan (oxid sắt, sắt dư). Dịch phản ứng được chỉnh pH đến 9-10 bằng

dung dịch NaOH 5%. Chiết khối phản ứng bằng EtOAc, sau đó rửa pha hữu cơ bằng

nước muối loãng và làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi thu được

homopiperonylamin bazơ thô. Hòa tan bazơ thô này trong IPA rồi thêm dung dịch

HCl 37% cho đến pH = 1 - 2. Dung dịch sau đó được thêm diethyl ether đến khi xuất

hiện tủa và làm lạnh qua đêm. Lọc tinh thể, sấy chân không ở 50℃ trong 5 giờ thu

được 6a.

Kết quả khối lượng, hiệu suất, nhiệt độ nóng chảy thể hiện ở bảng sau

Bảng 3.36 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình cải tiến tổng hợp chất 6a quy mô 100g/mẻ

Hợp chất 6a Nitrostyren NaBH4 CuCl2 TT (g) (g) (mL) KL HS to

nc (℃)

(g) (%)

74

1 193,1 75,6 252,0 172,6 85,6 207,0 – 210,0

2 193,1 75,6 252,0 172,4 84,9 207,1 – 210,0

3 193,1 75,6 252,0 173,8 85,9 207,0 – 210,0

TB 193,1 75,6 252,0 172,6±0,8 85,6±0,5

Từ kết quả trên cho thấy quy trình cải tiến khử hóa nitriostyren 61 cho hiệu

suất khá cao 85,6±0,5% (p>0,05 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các

mẻ) và giảm đáng kể sử dụng lượng NaBH4 (chỉ sử dụng 2eq trong khi quy trình khử

ở quy mô 100 g/mẻ sử dụng 8,5 eq). Hơn nữa, tác nhân khử nhóm NO2 giai đoạn sau

sử dụng Fe là tác nhân khử rẻ tiền, dễ kiếm, điều kiện phản ứng êm dịu, an toàn do

đó dễ dàng nâng cấp quy trình tổng hợp ở quy mô lớn.

Mặt khác khi tiến hành one-pot thuận tiện khi thao tác, bỏ qua giai đoạn tinh

chế sản phẩm trung gian, giúp tiết kiệm.

3.4.3. Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-

amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a)

100,4 g (C2H5)3N (1,0 mol) được thêm vào hỗn dịch của 200,0 g 6a (1,0 mol) và

180,0 g 2,3-dimethoxybenzaldehyd (1,1 mol) trong bình cầu 2 lít chứa hỗn hợp dung

môi toluen (540,0 mL) và ethanol (60,0 mL), đun hồi lưu trong 1h. Thêm vào khối

phản ứng 6,0 g KOH, tiếp tục đun hồi lưu trong 2h. Sau đó thêm từ từ 76,0 g NaBH4

(2,0 mol) vào hỗn hợp phản ứng và khuấy trộn trong 30 phút. Hỗn hợp phản ứng sau

đó được cô đặc dưới áp suất giảm và phần còn lại được thêm hỗn hợp CH2Cl2:H2O

(400,0 mL, 1:1). Pha hữu cơ sau đó được tách ra còn pha nước được chiết với CH2Cl2

(3x200,0 mL). Dịch chiết hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khô với Na2SO4, lọc và

bốc hơi dưới áp suất giảm. Cắn sau đó được hòa tan trong 200,0 mL ethanol và thêm

dung dịch HCl (36,5%) từ từ cho đến pH = 1-2. Hỗn hợp sau đó được bổ sung 2000,0

mL IPA, 100,0 mL diethyl ether và giữ trong tủ lạnh qua đêm. Tinh thể sau đó được

75

thu lại bằng cách lọc dưới áp suất giảm và thu được sản phẩm mong muốn.

Tiến hành lặp lại quy trình 3 lần ta thu được kết quả như bảng sau.

Bảng 3.37 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 31

Hợp Hợp chất 31 6a chất NaBH4 TT (g) aldehyd (g) HS KL 31 (g) to

nc (℃)

(g) (%)

200,0 180,0 76,0 1 308,6 85,5 - 88,0 88,5

2 200,0 180,0 310,2 76,0 86,0 - 88,2 88,9

3 200,0 180,0 307,4 76,0 86,2 - 88,1 88,1

76,0 TB 200,0 180,0 308,8±1,4 88,5±0,4

Từ bảng 3.37 cho thấy quá trình tổng hợp chất 31 từ homopiperonylamin

hydroclorid (6a) cho hiệu suất ổn định (88,5±0,4%), p-value > 0,05 (khác biệt giữa

các lô mẻ không có ý nghĩa thống kê).

3.4.4. Tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-

dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31)

Thêm vào bình cầu khô dung tích 2000 mL, lắp thiết bị Dean-stark, khấy từ: 290,0

mL anhydrid acetic (2,06 mol); 790,0 mL acid acetic (13,70 mol); 116,0 g CuCl2

(0,86 mol); 68,0 g NaCl (0,58 mol) đã được làm nóng tới 80 - 90℃ . Thêm từ từ 172,0

mL glyoxal 40% (1,4 mol) vào hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưu trong 20 phút, sau đó

làm lạnh bình phản ứng xuống dưới 90℃ và thêm từ từ 200,0 g 31 (0,28 mol) vào

hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưu trong 2h (112 - 114℃ ). Acid acetic sau đấy được loại

bỏ khỏi hỗn hợp phản ứng bằng cách cất quay dưới áp suất giảm (còn lại khoảng

250,0 mL), sau đó thêm khoảng 250,0 mL nước và duy trì nhiệt độ 80℃ khuấy trộn

76

trong 20 phút rồi lọc nóng thu tủa ngay lập tức. Tủa sau đó được đưa vào bình cầu

1000 mL và pha loãng trong 250,0 mL nước cất, thêm 240,0 mL NH3 25% (~3,14

mol) duy trì ở 25 - 30℃ trong 2,5h. Lọc lấy dịch, rửa tủa 2 lần với 250,0 mL nước

lạnh. Thêm vào dịch lọc 400,0 mL HCl đặc, để kết tinh qua đêm. Lọc lấy tủa, tẩy màu

bằng than hoạt và kết tinh lại trong ethanol 96%, sấy khô thu được berberin clorid.

Tiến hành lặp lại quy trình 3 lần ta thu được kết quả như bảng sau.

Bảng 3.38 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp berberin clorid

quy mô 100 g/mẻ

Berberin clorid (1) Chất 31 Glyoxal TT (g) (mL) KL (g) HS (%) to

nc (℃)

1 200,0 172,0 137,5 65,1 191,0 - 193,0

2 200,0 172,0 138,5 65,5 191,5 - 192,5

3 200,0 172,0 136,8 64,7 191,5 - 193,0

TB 200,0 172,0 137,6±0,9 65,1±0,4

Từ bảng 3.38 cho thấy quá trình tổng hợp chất 1 từ 31 cho hiệu suất ổn định

(65,1±0,4%) ở quy mô 100 g/mẻ, p-value > 0,05 (khác biệt giữa các lô mẻ không có

ý nghĩa thống kê).

3.4.5. Tinh chế sản phẩm berberin thô đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V

ở quy mô 100 g/mẻ.

Thêm 137,5 g berberin clorid vào bình cầu dung tích 6000 mL, lắp thiết bị Dean-

stark, cánh khuấy, trong bình có chứa sẵn 2800 mL ethanol 96o, đun cách thủy ở 75℃

đến khi tan hết. Thêm tiếp 3,0 g than hoạt, đun khoảng 15 phút sau đó đem lọc nóng

qua phễu Buchner thu dịch lọc. Dịch lọc thu được để kết tinh 5h trong tủ lạnh. Lọc

lấy tinh thể trên phễu Buchner, rửa tinh thể 2 lần bằng ethanol 96o lạnh. Sấy khô ở

60℃ thu sản phẩm berberin clorid (1).

Tiến hành lặp lại quy trình 3 lần ta thu được kết quả như bảng sau.

Bảng 3.39 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tinh chế chất 1

KL chất 1 trước KL chất 1 sau Hiệu suất to TT

nc (℃)

77

tinh chế (g) tinh chế (g) (%)

1 137,5 130,9 95,2 191,0 - 192,5

2 138,5 132,5 95,7 191,5 - 192,2

3 136,8 130,7 95,5 191,3 - 192,4

TB 137,6±0,9 131,4±1,0 95,4±0,3

Từ bảng 3.39 cho thấy quá trình tinh chế 1 cho hiệu suất ổn định (95,4±0,3%) ở

quy mô 100 g/mẻ, p-value > 0,05 (khác biệt giữa các lô mẻ không có ý nghĩa thống

kê).

Sản phẩm berberin clorid thu được ở quy mô 100 g/mẻ được lấy mẫu kiểm nghiệm

78

theo tiêu chuẩn DĐVN V, kết quả thu được được trình bày bảng sau

Bảng 3.40 Kết quả kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển

Việt Nam V

Chỉ tiêu và tiêu Yêu cầu Kết quả chuẩn áp dụng

1. Tính chất Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị Đúng

đắng. Tan trong nước nóng, khó tan

trong cloroform, không tan trong ether.

2. Định tính

A. Phản ứng hóa học Chế phẩm phải thể hiện phản ứng định Đúng

tính của berberin clorid.

B. Phổ IR Phổ hấp thụ hồng ngoại của chế phẩm Đúng

phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại

của berberin clorid chuẩn.

3. Giới hạn acid Phải đạt quy định. Đạt

4. Tạp chất liên Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, tổng Đạt

quan diện tích các pic phụ không được lớn hơn

(Phương pháp diện tích pic chính trên sắc ký đồ của

HPLC) dung dịch đối chiếu.

5. Sulfat Không được quá 0,048%. Đạt

6. Kim loại nặng Không được quá 30 phần triệu. Đạt

Đạt 7. Nước Từ 8% đến 12%.

(12,0%) (Phương pháp Karl

Fischer)

Đạt 8. Tro sulfat Không được quá 0,10%

79

(0,1%)

Chỉ tiêu và tiêu Yêu cầu Kết quả chuẩn áp dụng

9. Định lượng Chế phẩm phải chứa từ 95,0% đến Đạt

(Phương pháp 102,0% hàm lượng berberin clorid, (95,3%)

HPLC) C20H18NO4Cl, tính theo chế phẩm khan.

Sản phẩm berberin clorid tổng hợp được đạt tiêu chuẩn chất lượng theo quy định

Dược điển Việt Nam V.

3.5. Xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid quy mô 500 g/mẻ

3.5.1. Giai đoạn 1 - tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal

Thêm lần lượt 661,2 g (4,4 mol) piperonal; 297,5 mL (5,3 mol) nitromethan và 5,0

lít ethanol vào bình cầu 2 cổ dung tích 10,0 lít, lắp bếp đun, cánh khuấy và thiết bị

Dean-stark, khuấy đều. Làm lạnh hỗn hợp về 0℃ bằng nước đá muối và thêm từ từ

cho đến hết 794,0 mL dung dịch NaOH 10M trong 90 phút. Sau khi quá trình thêm

NaOH kết thúc, khối phản ứng được khuấy thêm 60 phút nữa, pha loãng với 1,5 lít

nước lạnh và rót vào bình cầu chứa sẵn 7,0 lít dung dịch HCl 4%, kết hợp khuấy mạnh

thấy xuất hiện tủa vàng. Lọc thu tủa, kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi ethanol :

aceton tỉ lệ 2:1, sấy khô thu được sản phẩm 61 là tinh thể màu vàng, hình kim.

80

Tiến hành lặp lại quy trình 3 lần ta thu được kết quả như trên bảng sau.

Bảng 3.41 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 61 với tác

nhân NaOH ở quy mô 500 g/mẻ

Hợp chất 61 dd NaOH Piperonal CH3NO2 TT 10M KL HS (g) (mL) to

nc (℃)

(mL) (kg) (%)

1 661,2 297,5 794 732,4 86,1 158,0 - 160,0

2 645,12 290,3 775 714,6 87,2 158,5 - 160,0

3 659,42 296,7 791 730,4 86,2 157,9 - 160,0

TB 655,2 294,8 786,6 725,8±9,8 86,5±0,6

Từ bảng 3.41 cho thấy quá trình tổng hợp chất 61 từ piperonal cho hiệu suất ổn

định (86,5±0,6%) ở quy mô 500 g/mẻ (p-value > 0,05, khác biệt giữa các lô mẻ không

81

có ý nghĩa thống kê).

Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal

82

3.5.2. Giai đoạn 2 - tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4-

methylendioxy-β-nitrostyren (61) với tác nhân khử Fe

Tiến hành

Phân tán 732,4 g (3,8 mol) nitrostyren 61 trong 2,5 lít ethanol tuyệt đối vào bình

cầu dung tích 10L, lắp bếp đun, cánh khuấy và thiết bị Dean-stark, khuấy đều hỗn

hợp ở 30℃ . Sau đó, vừa khuấy vừa thêm từng phần cho đến hết 286,7 g (7,6 mol)

NaBH4 vào khối phản ứng, duy trì nhiệt độ hỗn hợp không quá 30℃ . Sau khi thêm

xong lượng NaBH4 thì khối phản ứng được khuấy thêm 2h nữa (phản ứng kết thúc

khi màu vàng của dung dịch biến mất hoặc theo dõi bằng SKLM). Sau đó khối phản

ứng được điều chỉnh pH về 5 bằng dung dịch HCl 36,5% (chú ý kiểm soát nhiệt độ

không quá 40℃ và sinh khí). Thêm 202,9 g (1,0 mol) NH4Cl vào hỗn hợp trên và

nâng nhiệt độ lên 55-60℃ . Sau đó, khối phản ứng được bổ sung 955,8 g (17,1 mol)

bột Fe, khuấy đều và duy trì nhiệt độ phản ứng trong 5h. Sau khi kết thúc phản ứng

(theo dõi bằng SKLM), khối phản ứng được đưa về nhiệt độ phòng, lọc bỏ chất rắn

không tan (oxid sắt, sắt dư). Dịch phản ứng được chỉnh pH đến 9-10 bằng dung dịch

NaOH 5%. Chiết khối phản ứng bằng EtOAc, sau đó rửa pha hữu cơ bằng nước muối

loãng và làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi thu được homopiperonylamin

bazơ thô. Hòa tan bazơ thô này trong IPA rồi thêm dung dịch HCl 37% cho đến pH

= 1 - 2. Dung dịch sau đó được thêm diethyl ether đến khi xuất hiện tủa và làm lạnh

qua đêm. Lọc tinh thể, sấy chân không ở 50℃ trong 5 giờ thu được 6a, chất rắn màu

trắng ngà.

83

Tiến hành lặp lại quy trình 3 lần ta thu được kết quả như trên sau.

Bảng 3.42 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 6a bằng quy

trình cải tiến sử dụng bột sắt ở quy mô 500 g/mẻ

Hợp chất 6a

Nitrostyren

NaBH4

NH4Cl

TT

Fe (g)

(g)

(g)

(g)

HS KL (g) to

nc (℃)

(%)

732,4 286,7 202,9 955,8 651,5 85,2 209,5 - 211,0 1

714,6 279,7 198,0 932,6 644,6 86,4 210,0 - 212,0 2

730,4 285,9 202,4 953,2 650,5 85,3 210,0 - 212,5 3

T 725,8 284,2 201,1 947,2 648,8±3,7 85,6±0,7 B

Từ bảng 3.42 cho thấy quá trình tổng hợp chất 6a từ nitrostyren 61 cho hiệu suất

ổn định (85,6±0,7%) ở quy mô 500 g/mẻ (p-value > 0,05, khác biệt giữa các lô mẻ

84

không có ý nghĩa thống kê).

6a

Hình 3.4. Sơ đồ quy trình tổng hợp 6a từ 61

85

3.5.3. Giai đoạn 3 - tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-

dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin

hydroclorid (6a)

335,0 g (C2H5)3N được thêm vào hỗn dịch của 651,5 6a (3,23 mol) và 590,0 g

(3,66 mol) 2,3-dimethoxybenzaldehyd trong hỗn hợp dung môi toluen (1,5 lít) và

ethanol (300,0 mL) vào bình cầu dung tích 10 lít, lắp bếp đun, cánh khuấy và thiết bị

Dean-stark, đun hồi lưu trong 1h. Thêm vào khối phản ứng 18,0 g KOH, tiếp tục đun

hồi lưu trong 2h. Sau đó thêm từ từ 244,2 g NaBH4 (6,46 mol) vào hỗn hợp phản ứng

và khuấy trộn trong 30 phút. Hỗn hợp phản ứng sau đó được cô đặc dưới áp suất giảm

và phần còn lại được thêm hỗn hợp CH2Cl2:H2O (500,0 mL, 1:1). Pha hữu cơ sau đó

được tách ra còn pha nước được chiết với CH2Cl2 (3x300,0 mL). Dịch chiết hữu cơ

sau đó được gộp lại, làm khan với Na2SO4, lọc và bốc hơi dưới áp suất giảm. Cắn sau

đó được hòa tan trong 1,0 lít ethanol và thêm dung dịch HCl (36,5%) từ từ cho đến

pH = 1-2. Hỗn hợp sau đó được bổ sung 5,0 lít IPA, 500,0 mL diethyl ether và giữ

trong tủ lạnh qua đêm. Tinh thể sau đó được thu lại bằng cách lọc dưới áp suất giảm

và thu được sản phẩm mong muốn.

Tiến hành lặp lại quy trình 3 lần ta thu được kết quả như bảng sau.

Bảng 3.43 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 31 ở quy mô

500 g/mẻ

Sản phẩm 31 KL Hợp NaBH4 TT chất 6a chất (g) HS (g) aldehyd (g) KL (g) to

nc (℃)

(%)

86

1 651,5 590,0 244,2 998,9 87,9 85,5 - 88,0

2 644,6 583,8 241,6 999,1 88,8 86,0 - 88,2

3 650,5 589,1 243,8 998,2 87,9 86,2 - 88,1

TB 648,8 587,6 243,2 998,7±0,5 88,2±0,5

Từ bảng 3.43 cho thấy quá trình tổng hợp chất 31 từ homopiperonylamin

hydroclorid (6a) cho hiệu suất ổn định 88,2±0,5% ở quy mô 500 g/mẻ (p-value >

87

0,05, khác biệt giữa các lô mẻ không có ý nghĩa thống kê).

Dung môi

Nước

CH2Cl2

Hình 3.5. Sơ đồ quy trình tổng hợp amin 31 từ amin 6a

88

3.5.5. Giai đoạn 4 - tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-

dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31)

Thêm vào bình cầu khô dung tích 10 lít, lắp bếp đun, cánh khuấy và thiết bị Dean-

stark: 1,5 lít anhydrid acetic (10,0 mol); 4,0 lít acid acetic (68,5 mol); 1,58 kg CuCl2

(4,3 mol); 340,0 g NaCl (2,9 mol) đã được làm nóng tới 80 - 90℃ . Thêm từ từ 860,0

mL glyoxal 40% (7,5 mol) vào hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưu trong 20 phút, sau đó

làm lạnh bình phản ứng xuống dưới 90℃ và thêm từ từ lượng thích hợp chất 31 vào

hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưu trong 2h (112 - 114℃). Acid acetic sau đó được loại

bỏ khỏi hỗn hợp phản ứng bằng cách cất quay dưới áp suất giảm (còn lại khoảng 1,0

lít), sau đó thêm khoảng 1,0 lít nước và duy trì nhiệt độ 80℃ khuấy trộn trong 20

phút rồi lọc nóng thu tủa ngay lập tức. Tủa sau đó được đưa vào bình cầu 6,0 lít và

pha loãng trong 2,0 lít nước cất, thêm 1,2 lít dung dịch NH3 25% (~15,0 mol) duy trì

ở 25 - 30℃ trong 2,5h. Lọc lấy dịch, rửa tủa 2 lần với 1,0 lít nước lạnh. Thêm vào

dịch lọc 2,0 lít HCl đặc, để kết tinh qua đêm. Lọc lấy tủa, tẩy màu bằng than hoạt và

kết tinh lại trong ethanol 96%, sấy khô thu được berberin clorid.

Tiến hành lặp lại quy trình 3 lần ta thu được kết quả như bảng sau.

Bảng 3.44 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 1 ở quy mô

500 g/mẻ

Sản phẩm 1 Glyoxal TT Chất 31 (g) (mL) KL (g) HS (%) to

nc (℃)

1 999,9 860,0 687,5 65,1 191,0 - 193,0

2 999,1 860,0 692,5 65,6 191,5 - 192,5

3 998,2 860,0 684,0 64,8 191,5 - 193,0

89

TB 999,0 860,0 688,0±4,3 65,2±0,4

Từ bảng 3.44 cho thấy quá trình tổng berebrin clorid 1 từ muối amin 31 cho hiệu

suất ổn định 65,2±0,4% ở quy mô 500 g/mẻ (p-value > 0,05, khác biệt giữa các lô mẻ

90

không có ý nghĩa thống kê).

Hình 3.6. Sơ đồ quy trình tổng hợp berberin clorid (1) từ amin 31

91

3.5.6. Tinh chế sản phẩm berberin quy mô 500g/mẻ

Thêm 687,5 g berberin clorid vào bình cầu dung tích 20 lít có chứa sẵn 14,0 lít

ethanol 96o, đun cách thủy ở 75℃ đến khi tan hết. Thêm tiếp 100,0 g than hoạt, đun

khoảng 15 phút sau đó đem lọc nóng qua phễu Buchner thu dịch lọc. Dịch lọc thu

được đem bốc hơi còn khoảng 3,0 lít, để kết tinh 5h trong tủ lạnh. Lọc lấy tinh thể

trên phễu Buchner, rửa tinh thể 2 lần bằng ethanol 96o lạnh. Sấy khô ở 60℃ thu sản

phẩm berberin clorid (1).

Tiến hành lặp lại quy trình 3 lần ta thu được kết quả như trên bảng 3.45.

Bảng 3.45 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tinh chế chất 1

KL chất 1 trước KL chất 1 sau Hiệu suất to TT

nc (℃)

tinh chế (g) tinh chế (g) (%)

687,5 654,5 95,2 191,0 - 192,5 1

692,5 662,7 95,7 191,5 - 192,2 2

684,0 653,4 95,5 191,3 - 192,4 3

690,2 659,6 95,6 191,3 - 192,4 4*

191,2 - 192,6 685,1 662,4 96,7 5*

680,0 648,7 95,4 191,3 - 192,5 6*

675,8 641,3 94,9 191,2 - 192,4 7*

191,0 - 192,4 689,4 669,4 97,1 8*

TB 685,5±5,5 656,5±8,9 95,7±0,8

*Mẻ 4-8 được tiến hành tổng hợp và tinh chế để đủ khối lượng 5,0 Kg berberin

clorid.

Từ bảng 3.45 cho thấy quá trình tinh chế 1 cho hiệu suất ổn định 95,7±0,8% ở quy

92

mô 500 g/mẻ (p-value > 0,05, khác biệt giữa các lô mẻ không có ý nghĩa thống kê).

EtOH

Hình 3.7. Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid

93

Toàn bộ quy trình tổng hợp và tinh chế berberin quy mô 500g/mẻ được mô hình hóa

Piperonal

86,5%

CH3NO2, NaOH, 0℃ HCl

3,4-methylendioxy-β-nitrostyren

85,6%

NaBH4, EtOH NH4Cl, Fe HCl, IPA

Homopiperonylamin

hydrochlorid

40,7%

2,3-dimethoxybenzaldehyd NaBH4, HCl

88,2%

2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)N-(2,3- dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid

65,2%

Glyoxal, anhydrid acetic Acid acetic, CuCl2 NaCl

Berberin Clorid

Tinh chế

95,7%

Berberin dihydro clorid

đạt tiêu chuẩn DĐVN V

Hình 3.8. Sơ đồ quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid dihydrat

ở sơ đồ sau.

3.6. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp

Sản phẩm bererbin clorid thu được có nguồn gốc tổng hợp hóa học, do vậy chúng

tôi tiến hành xây dựng TCCS của nguyên liệu này để đưa ra một số tiêu chí phù hợp,

đảm bảo chất lượng của nguyên liệu có nguồn gốc tổng hợp.

Nguyên liệu chúng tôi tổng hợp được đều đạt theo các tiêu chí của Dược điển Việt

Nam V và Dược điển Nhật 17. Khi so sánh 2 Dược điển đều có các tiêu chí tương

đồng. Do vậy, Tiêu chuẩn cơ sở này được xây dựng dựa trên 2 Dược điển hiện hành

94

là Việt Nam V và Dược điển Nhật 17.

Các chỉ tiêu đề xuất được trình bày ở bảng 3.46.

Bảng 3.46 Tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu berberin clorid dihydrat tổng hợp

Chỉ tiêu Yêu cầu Phương pháp thử

Tinh thể hay bột kết tinh

màu vàng, không mùi, có

vị rất đắng. Tan trong nước Theo DĐVN V, Dược điển 1. Tính chất nóng, khó tan trong ethanol Nhật (JP17) chuyên luận

và nước, rất khó tan trong nguyên liệu berberin clorid

cloroform, không tan trong

ether.

2. Định tính

Phổ hấp thụ hồng ngoại của Theo DĐVN V, Dược điển a. Phổ hồng chế phẩm phải phù hợp với Nhật (JP17) chuyên luận ngoại phổ hấp thụ hồng ngoại của nguyên liệu berberin clorid berberin clorid chuẩn

Chế phẩm phải thể hiện các b. Phương pháp Theo DĐVN V, chuyên luận phản ứng định tính của hóa học nguyên liệu berberin clorid berberin clorid

Theo DĐVN V, Dược điển 3. Giới hạn Phải đạt yêu cầu quy định Nhật (JP17) chuyên luận acid nguyên liệu berberin clorid

Theo DĐVN V, Dược điển 4. Tạp chất liên Tổng tạp không được quá Nhật (JP17) phương pháp sắc quan 2,0% ký lỏng, chuyên luận nguyên

liệu berberin clorid

Theo DĐVN V, Dược điển

5. Sulfat Không được quả 0,048%. Nhật (JP17) chuyên luận

95

nguyên liệu berberin clorid

Chỉ tiêu Yêu cầu Phương pháp thử

Theo DĐVN V, Dược điển

6. Kim loại nặng Không quá 30 ppm. Nhật (JP17) chuyên luận

nguyên liệu berberin clorid

Theo DĐVN V, Dược điển

Nhật (JP17) phương pháp 7. Nước Từ 8% đến 12% Karl Fischer, chuyên luận

nguyên liệu berberin clorid

Theo DĐVN V, Dược điển

8. Tro sulfat Không quá 0,10% Nhật (JP17) chuyên luận

nguyên liệu berberin clorid

Theo DĐVN V, Dược điển

Nhật (JP17) phương pháp sắc 9. Định lượng 98,0% - 101,0% ký lỏng, chuyên luận nguyên

liệu berberin clorid.

Kết quả kiểm nghiệm qua các lô mẻ thí nghiệm ở các quy mô phòng thí nghiệm,

quy mô 100g/mẻ, quy mô 500 g/mẻ đều đạt và lặp lại theo tiêu chuẩn cơ sở đề xuất.

Bảng 3.47 Kết quả kiểm nghiệm nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được ở

quy mô 500g/mẻ

CHỈ TIÊU VÀ

TIÊU CHUẨN YÊU CẦU KẾT QUẢ

ÁP DỤNG

1. Tính chất Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị Đúng

đắng. Tan trong nước nóng, khó tan trong

cloroform, không tan trong ether.

2. Định tính

A. Phản ứng hóa Chế phẩm phải thể hiện phản ứng định tính Đúng

96

học của berberin clorid.

B. Phổ IR Phổ hấp thụ hồng ngoại của chế phẩm phải Đúng

phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của

berberin clorid chuẩn.

3. Giới hạn Phải đạt quy định. Đạt

acid

4. Tạp chất liên Không quá 2% Đạt

quan

(Phương pháp

HPLC)

5. Sulfat Không được quá 0,048%. Đạt

6. Kim loại Không được quá 30 phần triệu. Đạt

nặng

7. Nước Từ 8% đến 12%. Đạt

(Phương pháp (11%)

Karl Fischer)

8. Tro sulfat Không được quá 0,10% Đạt

(0,04%)

9. Định lượng Chế phẩm phải chứa từ 98,0% đến 101,0% Đạt

(Phương pháp (100,0%) hàm lượng berberin clorid, C20H18NO4Cl,

HPLC) tính theo chế phẩm khan.

Từ bảng trên cho thấy sản phẩm tổng hợp được đạt tiêu chuẩn cơ sở đề xuất.

3.7. Kết quả nghiên cứu độ ổn định và thử độc tính cấp của nguyên liệu berberin

tổng hợp

3.7.1.1. Điều kiện lão hóa cấp tốc

Nghiên cứu đánh giá độ ổn định của nguyên liệu berberin clorid theo hướng

dẫn của ICH-Q1A(R2) ở điều kiện lão hoá cấp tốc trong 6 tháng.

Điều kiện bảo quản

- Nhiệt độ: 40 ± 2℃

97

3.7.1. Kết quả nghiên cứu độ ổn định

- Độ ẩm tương đối: 75 ± 5%

- Tần suất lấy mẫu: 0 tháng, 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, 6 tháng.

Từ kết quả thử độ ổn định, xác định tuổi thọ của nguyên liệu berberin clorid.

Mẫu thử nghiệm

Mẫu thử nghiệm của 3 mẻ sản xuất được đóng gói trong 2 lần túi PE.

- Mẫu số 1: Lô 1A.

- Mẫu số 2: Lô 1B.

- Mẫu số 3: Lô 1C.

Cách tiến hành

Sau từng khoảng thời gian xác định, đánh giá độ ổn định các mẫu dựa trên các

chỉ tiêu: tính chất, định tính, hàm lượng nước, giới hạn tạp chất và hàm lượng.

Tuổi thọ của thuốc được tính toán với sự trợ giúp của phần mềm Minitab 18. Giới

hạn tạp chất và hàm lượng berberin clorid được đánh giá bằng phương pháp sắc

kí lỏng hiệu năng cao HPLC.

Kết quả nghiên cứu các mẫu 1A, 1B, 1C được trình bày tương ứng trong các

bảng 3.48, 3.49, 3.50.

Bảng 3.48 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1A ở

điều kiện lão hóa cấp tốc

Chỉ tiêu

Tính chất Định tính Hàm lượng nước Hàm lượng (%) Tổng Tạp hữu cơ

Thời gian (tháng) 0

Đúng Đúng Đạt Đạt (11,0%) 100,0

Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đạt (11,0%) Đạt (11,1%) Đạt (11,2%) 99,9 99,8 99,6

Đạt 1 Đạt 3 Đạt 6 Bảng 3.49 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1B ở

điều kiện lão hóa cấp tốc

Chỉ tiêu

Tính chất Định tính Hàm lượng nước Hàm lượng (%) Tổng Tạp hữu cơ

Đúng Đúng Đạt Đạt (11,5%) 99,8

Thời gian (tháng) 0

98

1 3 6 Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đạt Đạt Đạt Đạt (11,5%) Đạt (11,6%) Đạt (11,6%) 99,7 99,6 99,5

Mẫu 1C

Bảng 3.50 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1C ở

điều kiện lão hóa cấp tốc

Chỉ tiêu

Tính chất Định tính Tổng Tạp hữu cơ Hàm lượng nước Hàm lượng (%)

Thời gian (tháng) 0

Đúng Đúng Đạt Đạt (11,4%) 99,7

Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đạt (11,5%) Đạt (11,5%) Đạt (11,6%) 99,7 99,6 99,5

đổi đáng kể về các chỉ tiêu chất lượng đã theo dõi.

1 Đạt 3 Đạt Đạt 6 Số liệu độ ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc cho thấy sản phẩm không có biến

3.7.1.2. Điều kiện dài hạn

Nghiên cứu đánh giá độ ổn định của nguyên liệu berberin clorid theo hướng dẫn

của ICH-Q1A(R2)

Điều dài hạn

- Nhiệt độ: 30 ± 2℃ .

- Độ ẩm tương đối: 75 ± 5%.

- Tần suất lấy mẫu: tháng thứ 3, 6, 9, 12

Mẫu thử nghiệm

Mẫu thử nghiệm của 3 mẻ sản xuất được đóng gói trong 2 lần túi PE.

- Mẫu số 1: Lô 1A.

- Mẫu số 2: Lô 1B.

- Mẫu số 3: Lô 1C.

Kết quả nghiên cứu các mẫu 1A, 1B, 1C được trình bày tương ứng trong các bảng

99

3.51, 3.52, 3.53.

Bảng 3.51 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1A ở điều

kiện dài hạn

Chỉ tiêu

Tính chất Định tính Hàm lượng nước Hàm lượng (%) Tổng Tạp hữu cơ

Thời gian (tháng)

Đúng Đúng Đạt Đạt (11,0%) 100,0 0

Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đạt Đạt Đạt Đạt (11,0%) Đạt (11,1%) Đạt (11,1%) 100,0 99,9 99,8 3 6 9

Đúng Đúng Đạt (11,3%) 99,7 Đạt

12 Bảng 3.52 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1B ở điều

kiện dài hạn

Chỉ tiêu

Tổng Tạp hữu cơ Tính chất Định tính Hàm lượng nước Hàm lượng (%)

Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đạt (11,5%) Đạt (11,5%) Đạt (11,6%) Đạt (11,6%) Đạt (11,7%) 99,8 99,8 99,8 99,7 99,7

Thời gian (tháng) Đạt 0 Đạt 3 Đạt 6 Đạt 9 12 Đạt Bảng 3.53 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1C ở điều

kiện dài hạn

Chỉ tiêu

Tính chất Định tính Tổng Tạp hữu cơ Hàm lượng nước Hàm lượng (%)

Thời gian (tháng) 0

Đúng Đúng Đạt Đạt (11,4%) 99,7

Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng Đạt Đạt Đạt Đạt (11,4%) Đạt (11,4%) Đạt (11,5%) 99,7 99,7 99,6 3 6 9

100

Đúng Đúng Đạt Đạt (11,5%) 99,6 12

Hình 3.9. Đồ thị dự đoán tuổi thọ của nguyên liệu berberin clorid ở điều kiện

dài hạn.

Sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn, mẫu nguyên liệu của cả 3 lô sản xuất

không có sự biện đổi nhiều về các chỉ tiêu chất lượng đã thử. Khi sử dụng phần mềm

Minitab 18 để dự đoán tuổi thọ của sản phẩm cho thấy sản phẩm có tuổi thọ dự đoán

là 71,5 tháng. Theo quy định tuổi thọ ngoại suy có thể tới gấp đôi, nhưng không vượt

quá 12 tháng so với khoảng thời gian nghiên cứu dài hạn, phụ thuộc vào sự biến đổi

theo thời gian, mức độ dao động của dữ liệu quan sát được, điều kiện bảo quản đề

xuất và mức độ phân tích thống kê đã thực hiện. Do vậy, có thể sơ bộ kết luận tuổi

thọ của sản phẩm nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được là 24 tháng.

3.7.2. Kết quả thử độc tính cấp của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được

3.7.2.1. Kết quả thử nghiệm thăm dò

- Sử dụng 10 chuột nhắt trắng, giống cái, chia thành 5 nhóm, mỗi nhóm 2 động vật

và cho uống nguyên liệu berberin chlorid với liều tăng dần.

- Kết quả: trong vòng 24 giờ sau uống chế phẩm thử, một số chuột có biểu hiện

giảm hoạt động, hơi dựng lông, da và niêm mạc nhợt nhạt, nằm bẹp, một số động vật

101

chết; sau 24 giờ, các chuột còn sống đều hoạt động, ăn uống bình thường trở lại; sau

72 giờ xác định được liều thấp nhất gây chết 50% động vật là 3,12 g/ kg. Sau 14 ngày,

các chuột còn lại đều ăn uống, hoạt động bình thường, không có chuột chết thêm.

3.7.2.2. Kết quả thử nghiệm chính thức

Dựa trên kết quả của thử nghiệm thăm dò, tiến hành thử nghiệm chính thức trên

các lô chuột, mỗi lô 10 con. Các lô chuột được dùng mẫu thử ở các mức liều tăng dần

từ 1,56 g/kg chuột đến liều 11,25 g/kg chuột.

Tình trạng của các lô chuột nghiên cứu sau khi uống mẫu thử được mô tả trong

bảng 3.54.

Bảng 3.54 Mô tả tình trạng chuột ở các lô sau dùng mẫu thử nguyên liệu

berberin clorid - mẫu 1

Trong 3 - Lô Trong 4 giờ đầu Trong 4 - 72 giờ 14 ngày

1 Sau 60 phút được uống Trong 4 - 6 giờ sau khi cho Trong 3

mẫu thử: có 1 chuột giảm uống mẫu thử, 9/10 chuột hoạt - 14 ngày

hoạt động. động bình thường, lông không sau khi cho

Sau 2 giờ được uống mẫu xù, ăn uống bình thường, phân, uống mẫu

thử: 9/10 chuột hoạt động nước tiểu bình thường, niêm thử, 9 / 10

bình thường, 1 chuột hơi xù mạc hồng hào, phản xạ tốt với chuột hoạt

lông, giảm hoạt động. các kích thích. 1 chuột hầu như động bình

Sau 4 giờ đầu sau khi cho không hoạt động, thể trạng thường,

uống mẫu thử: 9/10 chuột yếu, chết; mổ quan sát đại thể: lông mượt,

hoạt động bình thường, 1 tim, phổi, gan, dạ dày và ruột phân khô,

chuột hơi xù lông, giảm hoạt không thấy bất thường. ăn uống

động. Sau 24 giờ uống mẫu thử, 9/ bình

10 chuột hoạt động bình thường,

thường, lông mượt, ăn uống không có

bình thường, phân, nước tiểu biểu hiện

102

bình thường, niêm mạc hồng khác lạ.

Trong 3 - Lô Trong 4 giờ đầu Trong 4 - 72 giờ 14 ngày

hào, phản xạ tốt với các kích

thích.

Sau 72 giờ uống mẫu thử, 9/

10 chuột còn sống, hoạt động

bình thường, lông mượt, ăn

uống bình thường, phân, nước

tiểu bình thường, niêm mạc

hồng hào, phản xạ tốt với các

kích thích.

2 Sau 60 phút được uống Trong 4 - 6 giờ sau khi cho 7/ 10

mẫu thử: có 1 chuột giảm uống mẫu thử: các chuột giảm chuột còn

hoạt động, hơi xù lông. hoạt động, 2 chuột thể trạng sống đều

Sau 2 giờ được uống mẫu yếu, có 1 chuột chết, mổ quan hoạt động,

thử: 2/10 chuột giảm hoạt sát đại thể: tim, phổi, gan, dạ ăn uống

động, 1 chuột hơi xù lông. dày và ruột không thấy bất bình

Trong 2 - 4 giờ sau khi thường. thường,

uống mẫu thử: có 1 chuột tiêu Sau 8 giờ, có thêm 2 chuột phân, nước

chảy và 1 chuột hầu như chết, các chuột còn lại tăng dần tiểu bình

không hoạt động, thể trạng hoạt động bình thường. thường,

Trong 8 - 20 giờ sau khi cho niêm mạc yếu. uống mẫu thử, 7/10 chuột dần hồng hào,

hoạt động bình thường, lông lông mượt,

không xù, ăn uống bình phản xạ tốt

thường, phân, nước tiểu bình với các

thường, niêm mạc hồng hào, kích thích.

103

phản xạ tốt với các kích thích.

Trong 3 - Lô Trong 4 giờ đầu Trong 4 - 72 giờ 14 ngày

Sau 24 giờ uống mẫu thử, 7/

10 chuột hoạt động bình

thường, lông mượt, ăn uống

bình thường, phân, nước tiểu

bình thường, niêm mạc hồng

hào, phản xạ tốt với các kích

thích.

Sau 72 giờ uống mẫu thử, 7/

10 chuột còn sống hoạt động

bình thường, lông mượt, ăn

uống bình thường, phân, nước

tiểu bình thường, niêm mạc

hồng hào, phản xạ tốt với các

kích thích.

3 Sau 60 phút được uống Trong 4 - 6 giờ sau khi cho 5/ 10

mẫu thử: có 2 chuột giảm uống mẫu thử: các chuột giảm chuột còn

hoạt động, hơi xù lông. hoạt động, 3 chuột thể trạng sống đều

Sau 2 giờ được uống mẫu yếu, có 3 chuột chết, mổ quan hoạt động,

thử: 1/10 chuột giảm hoạt sát đại thể: tim, phổi, gan, dạ ăn uống

động, 1 chuột hơi xù lông, dày và ruột không thấy bất bình

giảm hoạt động. thường. thường,

Trong 2 - 4 giờ sau khi Sau 8 giờ, có thêm 2 chuột phân, nước

uống mẫu thử: có 1 chuột tiêu chết, các chuột còn lại tăng dần tiểu bình

chảy và 2 chuột hầu như hoạt động bình thường. thường,

không hoạt động, thể trạng Trong 8 - 20 giờ sau khi cho niêm mạc

104

uống mẫu thử, 5/10 chuột dần hồng hào, yếu. hoạt động bình thường, lông lông mượt,

Trong 3 - Lô Trong 4 giờ đầu Trong 4 - 72 giờ 14 ngày

không xù, ăn uống bình phản xạ tốt

thường, phân, nước tiểu bình với các

thường, niêm mạc hồng hào, kích thích.

phản xạ tốt với các kích thích.

Sau 24 giờ uống mẫu thử, 5/

10 chuột hoạt động bình

thường, lông mượt, ăn uống

bình thường, phân, nước tiểu

bình thường, niêm mạc hồng

hào, phản xạ tốt với các kích

thích.

Sau 72 giờ uống mẫu thử, 5/

10 chuột còn sống hoạt động

bình thường, lông mượt, ăn

uống bình thường, phân, nước

tiểu bình thường, niêm mạc

hồng hào, phản xạ tốt với các

kích thích.

4 Sau 60 phút được uống Trong 4 - 8 giờ uống mẫu 03

mẫu thử: các chuột giảm hoạt thử, 3/10 chuột tăng dần hoạt chuột còn

động, trong đó, 3 chuột nằm động bình thường, tìm thức ăn sống hoạt

bẹp. và nước uống. Trong khi có động bình

Sau 2 giờ được uống mẫu thêm 5 chuột nằm thể trạng thường, ăn

thử: các chuột giảm hoạt yếu, và chết. Ngay sau khi uống bình

động, 5 chuột hầu như không chuột chết, mổ chuột quan sát thường,

hoạt động, nằm bẹp. đại thể tim, phổi, gan, dạ dày niêm mạc

105

và ruột không thấy bất thường. hồng hào,

Trong 3 - Lô Trong 4 giờ đầu Trong 4 - 72 giờ 14 ngày

Trong 2 - 4 giờ sau khi Sau 24 giờ uống mẫu thử, 3/ lông mượt,

uống mẫu thử: các chuột 10 chuột hoạt động bình phản xạ tốt

giảm hoạt động, có 2 chuột thường, lông không xù, ăn với kích

chết mổ quan sát đại thể: tim, uống bình thường, phân, nước thích, phân,

phổi, gan, dạ dày và ruột tiểu bình thường, niêm mạc nước tiểu

không thấy bất thường; 4 hồng hào, phản xạ tốt với các bình

chuột thể trạng yếu. kích thích. thường.

Sau 72 giờ uống mẫu thử, 3/

10 chuột còn sống hoạt động

bình thường, lông mượt, ăn

uống bình thường, phân, nước

tiểu bình thường, niêm mạc

hồng hào, phản xạ tốt với các

kích thích.

5 Sau 15 - 60 phút uống mẫu Trong 4 - 6 giờ sau khi uống 02 chuột

thử: các chuột giảm hoạt mẫu thử, có thêm 3 chuột chết, còn sống

động. mổ quan sát đại thể: tim, phổi, hoạt động

Trong khoảng 1- 2 giờ gan, dạ dày và ruột không thấy bình

được uống mẫu thử: các bất thường; 3 chuột còn lại gần thường, ăn

chuột giảm hoạt động, nằm như không hoạt động, thể trạng uống bình

bẹp, da và niêm mạc tái; có 2 yếu. thường,

chuột chết, mổ quan sát đại Sau 8 giờ uống mẫu thử, niêm mạc

thể: tim, phổi, gan, dạ dày và thêm 1chuột chết; 2 chuột còn hồng hào,

ruột không thấy bất thường lại giảm hoạt động, lông hơi lông mượt,

Trong 2 - 4 giờ: các chuột xù, ăn uống bình thường, phân, phản xạ tốt

giảm hoạt động, 5 động vật nước tiểu bình thường, niêm với kích

106

thích, phân,

Trong 3 - Lô Trong 4 giờ đầu Trong 4 - 72 giờ 14 ngày

hầu như không hoạt động, da mạc hồng hào dần, phản xạ tốt nước tiểu

và niêm mạc nhợt. với các kích thích. bình

Trong 3 - 4 giờ: có thêm 2 Sau 24 giờ uống mẫu thử, 2/ thường.

chuột chết, mổ quan sát đại 10 chuột hoạt động bình

thể: tim, phổi, gan, dạ dày và thường, lông không xù, ăn

ruột không thấy bất thường; 6 uống bình thường, phân, nước

chuột còn lại giảm hoạt động, tiểu bình thường, niêm mạc

trong đó, 3 động vật hầu như hồng hào, phản xạ tốt với các

không hoạt động. kích thích.

Sau 72 giờ uống mẫu thử, 2/

10 chuột hoạt động bình

thường, lông không xù, ăn

uống bình thường, phân, nước

tiểu bình thường, niêm mạc

hồng hào, phản xạ tốt với các

kích thích.

6 Sau 15 - 60 phút uống mẫu 1/ 10 chuột còn lại ăn uống, 01 chuột

thử: các chuột giảm hoạt hoạt động bình thường. còn sống

động. Sau 24 giờ uống mẫu thử, 1/ hoạt động

Trong khoảng 1- 2 giờ 10 chuột hoạt động bình bình

được uống mẫu thử: các thường, lông không xù, ăn thường, ăn

chuột hầu như không hoạt uống bình thường, phân, nước uống bình

động, da và niêm mạc nhợt, 3 tiểu bình thường, niêm mạc thường,

chuột có biểu hiện hậu môn hồng hào, phản xạ tốt với các niêm mạc

ướt và tiêu chảy; có 4 chuột kích thích. hồng hào,

chết, mổ quan sát đại thể: tim, Sau 72 giờ uống mẫu thử, 1/ lông mượt,

107

10 chuột hoạt động bình phản xạ tốt

Trong 3 - Lô Trong 4 giờ đầu Trong 4 - 72 giờ 14 ngày

phổi, gan, dạ dày và ruột thường, lông không xù, ăn với kích

không thấy bất thường uống bình thường, phân, nước thích, phân,

Trong 2 - 3 giờ: có thêm 4 tiểu bình thường, niêm mạc nước tiểu

chuột chết, mổ quan sát đại hồng hào, phản xạ tốt với các bình

thể: tim, phổi, gan, dạ dày và kích thích. thường.

ruột không thấy bất thường;

các chuột còn lại hầu như

không hoạt động.

Trong 3 - 4 giờ: có thêm 1

chuột chết, mổ quan sát đại

thể: tim, phổi, gan, dạ dày và

ruột không thấy bất thường; 1

chuột còn lại tăng dần hoạt

động, ăn uống bình thường.

Như vậy, biểu hiện độc tính quan sát được trên các lô chuột thử nghiệm là giảm

hoạt động, hơi dựng lông, da và niêm mạc nhợt nhạt, chết. Tùy thuộc mức liều sử

dụng, các tác dụng này có thể xuất hiện sớm, trong vòng 15 - 30 phút, và kéo dài tới

16 giờ sau khi chuột được uống mẫu thử. Các động vật thường chết trong vòng 4-8

giờ sau khi uống mẫu thử. Các chuột còn sống đều hồi phục dần và ăn uống trở lại,

hoạt động bình thường sau 24 giờ.

Kết quả về số lượng chuột chết sau 72 giờ ở các lô thí nghiệm sau khi uống mẫu

thử được trình bày trong bảng 3.55.

Bảng 3.55 Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ sau khi uống nguyên liệu

berberin chlorid

108

Liều dùng Số chuột Số chuột chết Lô (g/ kg thực nghiệm trong vòng 72 giờ chuột)

1 1,56 10 1

2 2,34 10 3

3 3,12 10 5

4 4,69 10 7

5 6,25 10 8

6 11,25 10 9

Từ số liệu thống kê số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống mẫu thử,

sử dụng phân tích hồi qui probit trên phần mềm SPSS để xác định LD50, kết quả được

trình bày trong bảng 3.56.

Bảng 3.56 Tỉ lệ chết chuột nhắt trắng và giá trị LD50 của mẫu thử nguyên liệu

berberin chlorid

Liều (g/kg)

1.56 2,34 3,12 4,69 6,25 11,25

Thông số

n 10 10 10 10 10 10

Tỉ lệ chết (%) 10 30 50 70 80 90

4,0 LD50 (g/kg)

Khoảng tin cậy 95% 2,3 - 5,6 của LD50 (g/kg)

Mức liều 1,56 g/ kg chuột là mức liều thấp nhất gây chết động.

Mức liều 11,25 g/ kg chuột nhắt trắng là mức liều cao nhất cho uống, gây chết 90%

động vật nghiên cứu.

Mức liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) của nguyên liệu berberin

chlorid là 4,0 (2,3 - 5,6) g/kg.

3.7.2.3. Kết luận

Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột nhắt trắng theo đường uống của nguyên liệu

berberin chlorid cho thấy:

Mức liều thấp nhất gây chết động vật nghiên cứu quan sát được (10% động vật

109

nghiên cứu) là 1,56 g/ kg chuột nhắt trắng.

Mức liều cao nhất gây chết động vật nghiên cứu quan sát được (90% động vật

nghiên cứu) là 11,25 g/ kg chuột nhắt trắng.

Mức liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) của nguyên liệu berberin

chlorid là 4,0 (2,3 - 5,6) g/kg.

Biểu hiện độc tính cấp quan sát được trên chuột nhắt trắng bao gồm: giảm hoạt

động, hơi dựng lông, da và niêm mạc nhợt, chết. Tùy thuộc mức liều sử dụng, các tác

dụng này có thể xuất hiện sớm, trong vòng 15 - 30 phút, và kéo dài tới 16 giờ sau khi

chuột được uống mẫu thử. Các động vật thường chết trong vòng 4-8 giờ sau khi uống

mẫu thử. Trên các chuột còn sống, các biểu hiện độc tính đều có thể phục hồi được

110

sau 24 giờ.

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN

4.1. Một số bàn luận về quy trình tổng hợp

4.1.1. Về quy trình tổng hợp quy mô thí nghiệm

Các alkaloid trong tự nhiên được biết đến là một trong những tác nhân gây độc

và là biệt dược chữa trị bệnh lý liên qua đến vi sinh vật trong y học hiện đại cũng như

y học dân gian truyền thống. Các nguồn sinh khối từ thực vật, động vật, côn trùng,

động vật không xương sống và vi sinh vật có chứa các nhóm hợp chất alkaloid đa

dạng và phong phú. Chúng luôn có cấu trúc dị vòng phức tạp với nhiều vòng thơm

và nguyên tử nitơ. Luận án tập trung nghiên cứu tổng hợp qui mô lớn hợp chất

berberin, một trong số ít các isoquinolin alkaloid hiện đang được sử dụng trong y học

lâm sàng như là chất kháng khuẩn và nhiều các tác dụng khác.

Trong số các nghiên cứu được công bố, có 7 nghiên cứu thông qua hợp chất

số 6. Như đã trình bày ở trên thì các nghiên cứu này lựa chọn hợp chất số 6 là mảnh

mang cấu trúc 1,3-benzodioxol, điểm khác nhau cơ bản giữa các phương pháp là

hướng nghiên cứu. Có hai hướng nghiên cứu trong nhóm phương pháp này: hướng

thứ nhất là các tác giả sẽ tập trung để tổng hợp được hợp chất số 6, hướng thứ hai là

lựa chọn các hợp chất khác nhau mang khung cấu trúc 1,2-dimethoxybenzen để

ngưng tụ với hợp chất số 6. Sơ đồ dưới đây tóm tắt các nghiên cứu trong nhóm này

111

(Hình 4.1).

3 bước

catechol

8

18

2 bước

59

23

4 bước

22

4 bước

56

58

33

29

60

6

10

38

7

30

11

39

7 bước

3 bước

1

Hình 4.1. Sơ đồ tóm tắt các phương pháp tổng hợp berberin qua chất trung

112

gian amin (6)

Hướng tổng hợp amin số 6 được nhiều nhà nghiên cứu Trung Quốc quan tâm.

Năm 1980, nhà máy dược phẩm Đông Bắc, Trung Quốc đã đi từ nguyên liệu ban đầu

là phenol (18), trải qua 12 bước phản ứng (đi qua các bước phản ứng tạo các hợp chất

9, 22, 23) để tạo thành imin 29, sau đó khử hóa thu được amin 6, tuy nhiên quy trình

tổng hợp dài, trải qua nhiều giai đoạn, chi phí sản xuất lớn, sử dụng nhiều tác nhân

gây ô nhiễm môi trường như benzen, dimethyl sulfoxid nên năm 1994, phương pháp

này đã bị ngừng lại [58].

Tiếp đó hai nhóm nghiên cứu S. Chen, W. Lin (1981) và C.Chen, Z. Luo, H.

Yang (2016) cùng xuất phát từ catechol (8) sau đó phản ứng với dicloromethan trong

môi trường kiềm thu được chất 1,3-benzodioxol (11), tiếp theo 11 được alkyl hóa với

1,3,5-trioxan, HCl, PCl3 ở nhiệt độ 70 – 90 oC thu được 10. Nhưng từ 10S. Chen, W.

Lin (1981) đã tổng hợp hợp chất nitrile 6, amin 6 được tạo ra bằng cách khử hóa hợp

chất 6 với NH3, H2/Ni (4 bước phản ứng thu được 6 từ catechol) [58], trong khi đó

C.Chen, Z. Luo, H. Yang (2016) tiếp tục trải qua 4 phản ứng tạo hợp chất 56, sau đó

khử hóa thu được amin 6 (7 bước tạo amin 6 từ catechol)[25]

Năm 2017, C. Chen, M. Xu, Q. Zhao từ 1,3 benzodioxol phản ứng với

acetonitril, LiBr, CH3CN ở 32 oC, trong 8 giờ, thu được dẫn chất brom 59 hiệu suất

đạt 77%, chất 59 phản ứng với 58 tạo 60, chất 60 phản ứng với acid trifluoroacetic,

CH2Cl2 ở nhiệt độ phòng trong 17 giờ thu được 6 với hiệu suất đạt 94% [26].

Sau khi tổng hợp thành công amin 6 các tác giả đều tiến hành ngưng tụ với

2,3-dimethoxybenzaldehyd, sau đó khử hóa imin thu được 30, hợp chất 30 phản ứng

với glyoxal thu được berberin. Hai tác giả Xiaolin Bian (2006) và Peng Yang (2008)

lại sử dụng luôn amin 6 làm nguyên liệu đầu vào và tạo berberin tương tự như các tác

giả trên [3], [112].

Theo hướng tổng hợp các hợp chất khung 1,2-dimethoxybenzen để thực hiện

phản ứng ngưng tụ với 6 cũng có một vài nghiên cứu. Năm 1911, Amé Pictet và

Alfons Gams đã tổng hợp từ acid 2-(3,4-dimethoxyphenyl)acetic bằng phospho

pentaclorid[79]. T. Kametani, I. Noguchi, K.Saito, S. Kaneda (1969) lại lựa chọn hợp

113

chất 10 ngưng tụ với 6 [49], Z. X. Chen (2007) tổng hợp 38 từ 2,3-

dimethoxylphenylmethanol qua 4 bước, hiệu suất tổng hợp berberin lên đến 67%

[58].

Như vậy có thể thấy rằng homopiperonylamin (6) là mắt xích trung gian quan trọng

trong các quy trình tổng hợp berberin cũng như một số isoquinolin khác [3], [14],

[6].Homopipernylamin (6) có thể được tổng hợp bằng nhiều con đường khác nhau:

Hình 4.2. Các phương pháp tổng hợp homopiperonylamin

- Từ 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) tiến hành khử hóa sử dụng tác nhân

NaBH4 với xúc tác CuCl2 [9] hoặc NiCl2 [74] đều thu được amin 6.

- Từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethan-1-imin (29) tiến hành khử hóa với H2, xúc

tác niken thu được amin 6 [52].

- Từ tert-butyl (2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethyl)carbamat (60) tác giả Chen

Cheng đem cho phản ứng với acid trifluoroacetic, CH2Cl2 ở nhiệt độ phòng trong

17h thu được 6 đạt hiệu suất 94% [23].

- Từ 3-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)propanamid (56) Loại bỏ nhóm carbonyl của

amid này bằng NaClO, C2H5OH, NaOH giữ ở 0 - 80oC trong 24h thu được

114

homopiperonylamin với hiệu suất 93,2% [24].

- Từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)acetonitril (33): W. Liu và cộng sự đã khử hóa 33

với tác nhân amoniac, H2/Ni trong dung môi methanol thu được amin 6, hiệu suất

phản ứng đạt 90% [23].

Trước hết, luận án lựa chọn phương pháp tổng hợp berberin từ valinin qua chất

trung gian piperonal bởi lẽ hợp chất đầu valinin là hóa chất tổng hợp phổ biến trên

thị trường Việt Nam, có thể dễ dàng thu mua từ các nhà cung cấp trong nước và quốc

tế (300.000 vnđ/kg). Mặt khác việc thay thế valinin bằng sản phẩm trung gian 3,4-

dihydroxybenzaldehyd hoàn toàn khả thi và đảm bảo an toàn trong việc cung ứng

chất đầu của sản xuất berberin do hợp chất 3,4-dihydroxybenzaldehyd cũng được

cung ứng phổ biến qua các nhà sản xuất hóa chất với giá thành phải chăng. Quá trình

chuyển hóa valinin thành 3,4-dihydroxybenzaldehyd trong điều kiện phản ứng mà

các phòng thí nghiệm có thể đáp ứng được dễ dàng với hiệu suất cao.

Các phương pháp tổng hợp berberin clorid và các hợp chất trung gian đều dựa

trên các hóa chất đã được thương mại hóa. Thông thường, giá thành các chất nguyên

liệu ban đầu đều rất cao hoặc cần đòi hỏi nhiều bước tổng hợp, xử lý trước khi đến

được sản phẩm cuối cùng. Điểm mới cần được nhấn mạnh trong luận án này là việc

sử dụng chất đầu quy trình rẻ tiền, dễ kiếm.

Vanilin lần đầu tiên được nhắc đến sử dụng trong quy trình sản xuất berberin.

Valinin là một hóa chất thực phẩm rẻ tiền và sẵn có, được sử dụng rộng rãi trong

nhiều lĩnh vực: phụ gia thực phẩm (60%), hương liệu (20-25%), dược phẩm(5-10%)

và các ngành khác (5-10%). Trong tổng hợp hóa dược, vanilin là chất trung gian quan

trọng để tổng hợp nhiều thuốc điều trị hiện nay như papaverin, L-dopa, L-

methyldopa, trimethoprim,... Vanilin được sản xuất theo 2 phương pháp: chiết xuất

từ vỏ quả cây Vanilla planifolia Andrews hoặc tổng hợp hóa học từ eugenol, lignin

(phụ phẩm ngành công nghiệp bột gỗ) hoặc guaiacol. Mỗi năm có khoảng 12.000 tấn

vanilin được sản xuất trên thế giới, 90% trong số đó có nguồn gốc từ tổng hợp hóa

học, giá trên thị trường 300.000 VNĐ/kg.

Piperonal được sử dụng rộng rãi trong ngành mỹ phẩm đặc biệt là ngành sản xuất

nước hoa nhờ vì nó có mùi hoa anh đào dễ chịu. Ngoài ra, nó còn là nguyên liệu quan

115

trọng trong ngành hóa chất nông nghiệp, hay mạ kim loại. Trong ngành công nghiệp

thực phẩm, piperonal được sử dụng với vai trò là một loại gia vị (phụ gia) và hương

liệu. Piperonal cũng là nguyên liệu ban đầu để tổng hợp tadalafil một thuốc điều trị

tăng huyết áp động mạch phổi. Bên cạnh đó, Piperonal chính là nguyên liệu đơn giản,

phổ biến và phù hợp trong quy trình sản xuất berberin. Piperonal được sản xuất theo

hai phương pháp chính là chiết xuất từ vani, húng quế hoặc tổng hợp hóa học từ safrol,

catechol. Tuy nhiên, hàm lượng piperonal trong thực vật rất ít chưa đáp ứng được nhu

cầu hiện nay, nên phương pháp chiết xuất không được ứng dụng rộng rãi. Trên thực

tế, trong công nghiệp piperonal tổng hợp hóa học chiếm đến 90%, giá thành 700.000

VNĐ/kg.

Quy trình phản ứng được lựa chọn dựa trên sự phù hợp với điều kiện phòng

thí nghiệm và hệ thống thiết bị hỗ trợ tại bộ môn Công nghiệp Dược, trường Đại học

Dược

Bước tổng hợp số 1: Hợp chất trung gian piperonal được điều chế từ vanilin

qua 2 bước phản ứng với hiệu suất cao.

Bước tổng hợp số 2: Hợp chất trung gian piperonal (25) kết hợp với nitrometan

tham gia phản ứng nitroaldol (phản ứng Henry) gồm 2 giai đoạn bao gồm tạo liên

kết cacbon – cacbon để tạo thành hợp chất ß-hydroxyl, kế tiếp sau đó là tạo thành hợp

chất 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) qua phản ứng tách nước.

Bước tổng hợp số 3: hợp chất homopiperonylamin hydroclorid (6a) được lựa

chọn là hợp chất trung gian tiếp theo trong quy trình tổng hợp do tính ổn định của

hợp chất này trong điều kiện khí hậu Việt Nam, khó bay hơi và đễ thao tác. Hợp chất

6a được tổng hợp từ tiền chất 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) thông qua phản

ứng hidro hóa hợp chất chưa nhóm nitro bằng các tác nhân khử Hydro.

Bước tổng hợp số 4: hợp chất 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-

dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) được tổng hợp bằng phương pháp

ngưng tụ imin hợp chất trung gian 6a và 2,3-dimethoxybenzaldehyd, tiếp ngay sau

đó là phản ứng khử hóa nhóm imin tạo thành hợp amin bậc hai dưới dạng muối clorid.

Bước tổng hợp số 5: Berberin thu được từ phản ứng ngưng tụ đóng vòng hợp

chất 31 và oxi hóa tạo hệ liên hợp thơm của berberin và phản ứng acid bazơ tạo muối.

116

4.1.2. Về phương pháp tổng hợp berberin mới

Bằng cách phân tích tổng hợp ngược phân tử berberin, Luận án đề xuất quy

trình tổng hợp mới thay thế việc sử dụng chất trung gian piperonal bằng hợp chất 2,3-

dimethoxybenzaldoxim (63) từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd. Điểm mới của phương

pháp tổng hợp này là thay đổi vị trí của nhóm amin so với quy trình phía trên từ cấu

trúc phức tạp dựa trên phân tử piperonal sang một cấu trúc đơn giản hơn của

dimethoxybenzaldehyd. Quy trình tổng hợp được trình bày tóm lược lại bao gồm 4

bước:

Bước tổng hợp số 1: Hợp chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62)

được tổng hợp từ aldehyd thơm đơn giản 2,3-dimethoxybenzaldehyd bằng phản ứng

ngưng tụ oxim. Đây là phản ứng đi qua 2 giai đoạn: cộng hợp ái nhân vào nhóm

carbonyl, tiếp theo đó có sự dehydrat hóa như hình bên dưới

+ Giai đoạn 1: Cộng nucleophin của hydroxylamin vào nhóm carbonyl.

Cặp e tự do trên nguyên tử N tấn công vào C mang phần điện tích dương

của nhóm -CHO tạo thành tạo thành hợp chất trung gian có cấu trúc tứ diện. Hợp

chất này là hợp chất bền thuộc nhóm anion ankoxy. Phản ứng có sự chuyển trạng

thái lai hóa của carbon từ sp2 sang sp3. Phản ứng xảy ra thuận lợi nhất khi mật độ

e trên nguyên tử N lớn nhất, do đó, hydroxylamin phải ở dạng tự do. Để đảm bảo

điều này, NaOH đã được thêm vào đến pH = 9-10.

+ Giai đoạn 2: Giai đoạn dehydrat hóa tạo sản phẩm với xúc tác acid

Tác nhân NH2OH có hydro gắn với N có cặp electron tự do dễ bị proton

hóa để tách ra với nhóm OH bên cạnh. Giai đoạn dehydrat hóa quyết định tốc độ

phản ứng.

Giai đoạn này cần xúc tác acid, pH càng thấp tốc độ phản ứng càng tăng. Tuy

nhiên, do oxim dễ bị phân hủy trong môi trường acid vô cơ để chuyển thành hợp

chất carbonyl ban đầu và hydroxylamin. Vì vậy, cần tiến hành với nồng độ acid

117

thấp và trong quá trình trung hòa cần làm lạnh và nhỏ từ từ H2SO4 vào.

Hình 4.3. Cơ chế phản ứng hình thành 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) từ 2,3-

dimethoxybenzaldehyd

Bước tổng hợp số 2: khử hóa oxim bằng các nguồn hydro trong môi trường

acid nhằm tạo hợp chất (2,3-dimethoxyphenyl)methanamin (63).

Để khử hóa oxim thành amin, thông thường sử dụng tác nhân LiAlH4 dựa trên

cơ chế vận chuyển ion H-. Nhược điểm của tác nhân này là đắt tiền, dễ bị phân hủy

bởi ẩm (cần tiến hành trong điều kiện khan) và tỏa nhiệt mạnh dễ gây cháy nổ, nguy

hiểm khi tiến hành quy mô lớn.

Các oxim có thể được khử bởi NaBH4 với sự có mặt của xúc tác NiCl2. 6H20

trong dung môi methanol. NaBH4 kết hợp với NiCl2 tạo thành kết tủa đen (Ni2B) kèm

theo sự phát triển mạnh mẽ của khí hydro, giúp làm tăng đáng kể khả năng khử hóa

của NaBH4 như phản ứng sau:

Tuy nhiên cấu trúc thực tế cũng như cơ chế xúc tác của niken borid vẫn chưa

được giải thích rõ. Tác nhân khử này khử hóa cho sản phẩm với hiệu suất cao, dễ

dàng chuẩn bị và xử lý, tuy nhiên, giá thành cao, phản ứng khử xảy ra chậm (6 h),

sinh nhiều tạp và tỏa nhiệt mạnh, khó kiểm soát lượng hydro sinh ra, do đó cần phải

làm lạnh và thêm rất chậm tác nhân vào.

Ngoài ra, oxim cũng được khử dễ dàng bằng các kim loại Zn, Fe, Sn… trong

môi trường acid. Luận án tiến hành khảo sát khả năng khử hóa của kim loại Zn trong

118

môi trường acid clohydrid và acid acetic. Cả hai đều cho sản phẩm tinh khiết. Tuy

nhiên, khi sử dụng HCl, Zn phản ứng với HCl quá nhanh, không kiểm soát được

lượng hydro sinh ra. Mặt khác, các oxim dễ bị phân hủy trong dung dịch acid vô cơ

thành hợp chất carbonyl ban đầu và hydroxylamin. Vì thế, hiệu suất phản ứng khử

hóa thấp. Chúng tôi nhận thấy rằng, khi tiến hành khử hóa bằng Zn trong acid acetic

giúp khắc phục tối đa những nhược điểm của các tác nhân trên như: giảm giá thành,

hạn chế quá trình phân hủy oxim, thao tác dễ dàng hơn, có thể đun hồi lưu rút ngắn

thời gian phản ứng (30 phút), nâng cao hiệu suất khử hóa (85,63%). Vì thế, tác nhân

này đã được lựa chọn để khử hóa 62 thành 63.

Bước tổng hợp số 3: hợp chất 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-

dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) được tổng hợp bằng phương pháp

ngưng tụ imin hợp chất trung gian 63 và aldehyd homopiperonal, tiếp ngay sau đó là

phản ứng khử hóa nhóm imin tạo thành hợp amin bậc hai dưới dạng muối clorid. Về

cơ bản cơ chế phản ứng của bước số 2 tương tự như bước số 4 của phương pháp trước,

chúng tôi lựa chọn chiến lược tổng hợp mới dựa trên homopiperonal nhằm rút gọn

các bước tổng hợp.

Bước tổng hợp số 4: tương tự với bước số 4 của phương pháp tổng hợp từ

piperonal, berberin thu được từ phản ứng ngưng tụ đóng vòng hợp chất 31 và oxi hóa

tạo hệ liên hợp thơm của berberin và phản ứng acid bazơ tạo muối được lặp lại và

không có thêm nghiên cứu sâu hơn.

Mặc dù đã tổng hợp berberin clorid bằng phương pháp mới từ 2,3-

dimethoxybenzaldehyd, những hiệu suất tổng của quá trình còn khiêm tốn 36,23%

qua 4 giai đoạn phản ứng với hiệu suất lần lượt là 89,50%, 85,63%, 79,52%, 59,45%.

Với những điều kiện phản ứng cần phải khảo sát thêm như thay đổi tác nhân kiềm

hóa để có thể tạo hợp chất dễ tan trong nước với Zn2+ trong quá trình khử 62 thành

63, giúp dễ tách chiết. Hay khảo sát các điều kiện phản ứng: tỷ lệ mol các chất ban

đầu, dung môi và các loại bazơ khác nhau, giúp tối ưu hóa quy trình tổng hợp berberin

clorid để tiến tới nâng cao hiệu suất làm để nâng cấp quy trình tổng hợp berberin

clorid.

Đây là con đường tổng hợp mới chưa từng công bố không đi qua trung gian

119

homopiperonalamin (6) mà thông qua trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (63).

Từ những năm 1922, homopiperonal được tổng hợp hóa học bằng phương

pháp ozon từ Safrol. Safron là rất dễ ozon hóa. Phản ứng được thực hiện bằng cách

hòa tan 10 – 15 phần safron trong dung môi khan (anhydric acetic, chloroform, carbon

tetrachlorid…) và khí ozon 2-3% được sục vào 35-37 lit dung dịch trên trong 1 giờ

tại nhiệt độ phòng tạo thành safron-ozonid. Sau đó, loại acid acetic dư bằng cách làm

ấm hỗn hợp 70-80oC trong 1,5 giờ, thêm nước và chiết bằng ether. Hiệu suất của phản

ứng 60 – 65%, giá trên thị trường khoảng 600.000 VNĐ/kg.

Việc bắt đầu quy trình sản xuất berberin dựa trên chất hóa học phổ biển có rất

nhiều ý nghĩa trong công nghiệp dược bởi lẽ điều đó sẽ đảm bảo tính an toàn trong

dây truyền sản xuất cũng như làm hạ giá thành sản phẩm berberin.

Bên cạnh đó, việc sử dụng các phương pháp khác nhau cho cùng một phản

ứng của mỗi bước trong quy trình sản xuất berberin được đánh giá có hiệu quả trong

việc khảo sát các điều kiện phản ứng phù hợp trước và sau khi nâng quy mô mẻ. Các

dữ liệu mô tả mối liên hệ giữa điều kiện phản ứng, hệ xúc tác với giá trị hiệu suất của

phản ứng trong quy mô phòng thí nghiệm lần đầu tiên được thu thập với mục đích

tổng hợp berberin. Kết quả tổng hợp của bộ số liệu sẽ giúp dự đoán quy trình sản xuất

khi mở rộng quy mô mẻ có phù hợp với điều kiện trong nước.

Quy trình mới tổng hợp berberin đổi chỗ nhóm định chức andehyd và amin

cho 2 chất đầu tham gia phản ứng tổng hợp hợp chất 31, quy trình phản ứng được rút

ngắn 1 bước so với quy trình ban đầu. So sánh hiệu suất của mỗi phương pháp và tính

khả thi của mỗi phương pháp cho thấy rằng, mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm

riêng và hoàn toàn có thể thay thế cho nhau, ứng dụng trong điều kiện thực tế khi

nguồn cung ứng chất đầu gặp khó khăn.

Luận án đã ứng dụng phương pháp cung cấp nguồn hydro mới sinh đa dạng

nhằm giải quyết vấn đề giảm giá thành sản phẩm, tăng độ ổn định của quy trình phản

ứng. Trong nghiên cứu tổng hợp các hợp chất hữu cơ, có rất nhiều hợp chất được sử

dụng như là nguồn cung cấp hydro nội sinh vơi đặc trưng hoạt hóa mạnh hơn rất

nhiều lần khí hydro, đồng thời cũng giảm rủi ro cháy nổ khi làm việc với khí hydro.

NaBH4 là một trong những tác nhân khử hóa, cung cấp hidro phổ biển nhưng lại là

120

một chất hóa học nhậy cảm với hơi ẩm và rất khó bảo quản. Bằng cách sử dụng nguồn

hydro hoạt hóa từ phản ứng giữa sắt, nhôm và kẽm với các hợp chất có tính acid,

phản ứng chuyển hóa hợp chất 61 chứa nhóm nitro thành nhóm amin ở hợp chất 6 và

phản ứng chuyển hóa hợp chất 62 thành hợp chất 63 được thực hiện thuận lợi với

hiệu suất cao (tới 90%). Đây là lần đầu tiên các phương pháp cung cấp hydro nội sinh

được nhắc đến trong các công trình nghiên cứu về tổng hợp berberin.

4.1.3. Về quy trình tổng hợp quy mô 500g/mẻ

Khi nâng cấp quy mô lên 500g/mẻ. Luận án đã thận trọng nâng cấp trước ở

quy mô 100g/mẻ và đã lựa chọn giải pháp an toàn đi từ nguyên liệu ban đầu là

piperonal (2) bao gồm 4 giai đoạn phản ứng và 1 giai đoạn tinh chế. Trong đó giai

đoạn số 2 là phản ứng khử với rất nhiều cải tiến quan trọng sử dụng bột Fe/NH4Cl và

kết hợp 2 giai đoạn của phản ứng thành 1 bước (one-pot) để rút ngắn các thao tác

thực hiện phản ứng để tổng hợp hợp chất trung gian quan trọng 6a đã giảm sử dụng

NaBH4 một tác nhân dễ hút ẩm, giả thành cao, gây trào phản ứng ở quy mô lớn hơn,

từ đó giúp giảm giá thành sản xuất và công năng.

Bên cạnh đó, các thiết bị sử dụng cũng được tính toán và lắp đặt phù hợp với

quy mô lớn hơn, các thông số lượng hóa chất sử sụng, thời gian thêm các chất tham

gia phản ứng được tính toán phù hợp để tạo thành các thao tác chuẩn, thể hiện khi

thực hiện các mẻ tổng hợp cho hiệu suất ổn định (kết quả khác biệt không có ý nghĩa

thống kê p>0,05). Những cải tiến khi nâng cấp quy mô tổng hợp berberin clorid quy

mô 500g/mẻ được tổng hợp lại trong bảng sau.

Bảng 4.1. Những cải tiến trong nâng cấp quy trình tổng hợp berberin clorid

quy mô 500g

Phương pháp cũ

Phương pháp cải tiến

Giai đoạn 1: Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal

➢ Tác nhân amoni acetat có ưu điểm

✓ Thay amoni acetat bằng bazơ mạnh (NaOH),

là ít tạo sản phẩm phụ, nhưng phản

hiệu suất nâng được lên 86%.

ứng cần tiến hành ở nhiệt độ sôi

✓ Khi phá hủy muối 61a bằng dung dịch HCl 4%

của acid acetic (khoảng 120℃ ).

cần phải pha loãng muối này bằng nước lạnh,

Nhiệt độ cao hơn 120℃ sẽ làm

đảm bảo nhiệt độ dung dịch không quá 10℃

cho khối phản ứng trở nên keo

và phải cho nhanh vào acid, kết hợp với khuấy

121

nhầy dẫn đến rất khó xử lý và hiệu

trộn mạnh để tránh hình thành sản phẩm phụ

suất thu được không cao (60,6%)

61b (dạng dầu màu vàng). Nếu tiến hành theo

thứ tự ngược (cho acid vào dung dịch 61a) thì

không xảy ra quá trình loại nước tạo alken mà

hầu như chỉ tạo alcol.

Giai đoạn 2: Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a)

➢ Sản phẩm homopiperonyl amin

✓ Chuyển sản phẩm về dạng muối clorid (6a)

(6) rất dễ bị oxy hóa.

nhằm tăng độ ổn định, thuận lợi hơn trong bảo

➢ Tinh chế muối amin 6a sử dụng

quản và đánh giá các thông số vật lý.

HCl khí trong alcol khó thực thiện

✓ Tinh chế muối amin 6a thực hiện với dung dịch

thao tác

nước HCl 36,5%

➢ Tác nhân LiAlH4 đắt tiền, dễ bị

✓ Quy mô phòng nhỏ: Chọn hệ NaBH4/CuCl2 để

phân hủy bởi ẩm (cần tiến hành

nâng cấp quy mô tổng hợp chất 6a. Khi nâng

trong điều kiện khan) và dễ gây

cấp ở quy mô lớn cần chú ý chia NaBH4 thành

cháy nổ khi nâng cấp.

2 phần: ban đầu sử dụng 5,0 eq. NaBH4 để tạo

➢ Tác nhân kim loại như Fe, Zn, Sn

61c, sau đó bổ sung tiếp 3,5 eq. NaBH4 và thêm

trong môi

trường acid (HCl,

dung dịch CuCl2 2M để tránh lượng NaBH4 bị

AcOH),

tuy nhiên phản ứng

phân hủy, gây mất tác nhân. Đồng thời cần sục

thường khó kiểm soát khi tiến

khí trơ để đảm bảo tránh tiếp xúc với oxy và

hành, cho hiệu suất thấp và khó

hơi nước trong không khí làm mất hoạt tính

loại bỏ cation kim loại.

xúc tác. Hiệu suất ổn định 91,1%.

✓ Quy mô lớn: khử hóa để tạo hợp chất nitro 61c

➢ Tác nhân NaBH4/NiCl2 thì lượng

(hình 4.5) từ nitrostyren 61 sử dụng 2 đương

muối NiCl2 sử dụng nhiều (2,0 eq.)

đồng thời phản ứng tỏa nhiệt mạnh

lượng NaBH4. Sau đó tiến hành khử hóa chất

dẫn đến khó kiểm soát lượng khí

61c bằng bột Fe với sự có mặt của NH4Cl.

✓ Giai đoạn 1: Lựa chọn EtOH do dung môi này

H2 sinh ra.

➢ Khi nâng cấp quy trình tổng hợp ở

thân thiện với môi trường và cho hiệu suất tốt

quy mô lớn với hệ này thì xuất

thêm từ từ NaBH4 vào hỗn hợp của chất

hiện nhiều nhược điểm: 1) khó

61/EtOH và khống chế nhiệt độ để giảm sự

hình thành sản phẩm phụ

kiểm soát phản ứng phụ (sinh H2

có thể gây trào khối phản ứng), 2)

✓ Giai đoạn 2: tác nhân Fe/NH4Cl phản ứng tạo

nhiệt độ phản ứng khó khống chế,

sản phẩm chủ yếu là các oxid sắt, phản ứng xảy

122

ra hoàn toàn không bị hình thành các hydroxyd

3) Sử dụng nhiều NaBH4, đây là

tác nhân đắt tiền và khó bảo quản.

kim loại gây cản trở quá trình tách chất khi sử

dụng các tác nhân khác: Rửa sắt trước khi phản

ứng bằng dung dịch acid hydrocloric để làm

sạch bề mặt, đảm bảo không bị oxy hóa, kích

thước tiểu phân sắt càng nhỏ thì bề mặt tiếp xúc

càng lớn, tăng hiệu quả phản ứng, đảm bảo

được khuấy trộn liên tục để tăng tiếp xúc.

✓ Do hai giai đoạn đều là phản ứng khử nên tiến

hành one-pot cho 2 giai đoạn bỏ qua bước xử

lý phản ứng sau khi đã khử nối đôi giúp thuận

tiện khi thao tác, bỏ qua giai đoạn tinh chế sản

phẩm trung gian, giúp tiết kiệm các nguồn lực.

Giai đoạn 3: Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-

1-amin hydrochlorid (31)

➢ Amin 6 khá nhạy cảm với acid,

✓ Sử dụng kiềm để chuyển 6a về dạng amin

bazơ (6)

chỉ một số ít xúc tác bazơ mới có

✓ Tách nước bằng cách sử dụng nhiệt độ, dung

khả năng loại được nước khỏi

môi là hỗn hợp toluen và ethanol (9:1) đun

6b dùng xúc tác acid, bazơ.

hồi lưu, kết hợp với dụng cụ Dean-stark để

➢ Loại nước bằng cách đun nóng

loại nước khỏi khối phản ứng.

trực tiếp 2 chất phản ứng đến

✓ Hiệu suất 65,2 %,

nhiệt độ 100-105℃ ở áp suất

✓ Đảm bảo phản ứng thuận lợi, môi trường

thường hoặc 70-80℃ ở áp suất

phản ứng được giữ ở pH = 9-10 bằng cách

giảm.

bổ sung thêm tác nhân kiềm Triethylamin.

➢ Hiệu suất thu được rất thấp

✓ Hỗn hợp phản ứng chứa imin cần cất loại

(khoảng 40 - 55%).

toluen, bổ sung methanol sau đó mới cho

➢ Quá trình hình thành imin: nếu

thêm NaBH4 để khử hóa.

pH <1 không hình thành, pH <3

✓ Sản phẩm amin được đưa về dạng muối

ảnh hưởng tới mật độ electron

clorid tương tự như phản ứng tạo hợp chất

trên nguyên tử N của amin 6

6a, sử dụng dung dịch HCl trong methanol

123

➢ Do khả năng khử của NaBH4

hoặc ethanol rồi để kết tinh thu được sản

trong dung môi toluen kém

phẩm 31.

➢ Sản phẩm thu được là amin bậc

Những cải tiến này thu được sản phẩm 31

hai rất dễ bị oxy hóa

với hiệu suất ổn định 88% khi nâng cấp

quy trình ở quy mô 100,0 g/mẻ và 500

g/mẻ.

Giai đoạn 4: Tổng hợp berberin

➢ Nước có thể được loại bằng cách

✓ pH của môi trường nên duy trì trong khoảng

làm bốc hơi ở nhiệt độ cao

(pH = 3-4), điều này đảm bảo cung cấp H+

(>100℃ ), tuy nhiên thời gian

xúc tác phản ứng ngưng tụ xảy ra. Ngoài ra,

thường kéo dài và quá trình loại

khoảng pH trên còn giúp quá trình loại nước

nước thường không triệt để do

tạo 1a dễ dàng, đồng thời ít ảnh hưởng tới

nước có thể bị hấp phụ trong

cặp điện tử của N trong hợp chất 31.

lòng khối phản ứng.

✓ Để phá vỡ liên kết này sử dụng amoniac

➢ Để loại đồng sử dụng phương

nhằm cạnh tranh tạo phức với đồng,

pháp chuyển qua lại giữa dạng

berberin được tách ra dưới dạng hydroxyd

muối và dạng bazơ của berberin

và được thêm HCl tạo sản phẩm berberin

➢ Hiệu suất 49,2 – 61,5 %

clorid (1).

✓ Hiệu suất 65,2 %.

Giai đoạn kết tinh sản phẩm berberin clorid

➢ Dung môi kết tinh MeOH có thể

✓ Sử dụng hai dung môi không có sự khác biệt

gây độc hại đến môi trường.

đáng kể về hiệu suất tinh chế. Tuy nhiên, sử

➢ Kết tinh ở nhiệt độ thường tinh

dụng dung môi là ethanol ít độc hại hơn, giá

thể hình thành chậm và hiệu

thành rẻ hơn nên ethanol được lựa chọn làm

suất thấp hơn (85 %)

dung môi kết tinh.

✓ Dịch lọc được làm lạnh giúp quá trình kết

tinh nhanh chóng hình thành. Kết tinh ở

nhiệt độ thấp nhiệt độ 0-5 ℃ trong 5h giúp

rút ngắn thời gian hình thành các tinh thể

kết tinh mà hiệu suất đạt được lại nhỉnh hơn

✓ Hiệu suất 96%

124

Trong khi nâng câp lên quy mô lớn còn quan tâm đến những biện pháp phù

hợp để xử lý môi trường qua mỗi giai đoạn

Giai đoạn 1 (i) : Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (3) từ piperonal (2)

Sản phẩm phụ chủ yếu của phản ứng này là natri clorid, tương đối an toàn với

môi trường. Dịch xử lý có thể thải theo hệ thống thải chung của cơ sở, không cần xử

lý đặc biệt. Khi tinh chế 2 có sử dụng hỗn hợp dung môi ethanol : aceton ; trong đó

aceton độc và dễ bay hơi nên cần tiến hành trong tủ hood. Khi nâng cấp ở quy mô

lớn, có thể tái sử dụng nước cái cho các mẻ sau để giảm thải ra môi trường.

Giai đoạn 2 (ii): Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (4) từ 3,4-

methylendioxy-β-nitrostyren (3)

Phản ứng có sử dụng NaBH4 làm tác nhân khử với lượng dư. Phụ phẩm sinh

ra khi phản ứng và khi xử lý (bằng dung dịch HCl) gồm: khí hydro, diboran (B2H6),

natri hydroxid, natri clorid, oxid sắt. Khí hydro và diboran được thải trực tiếp ra không

khí. Natri clorid được thải qua hệ thống chung của cơ sở. Oxid sắt được thu gom

riêng. Isopropanol và ethyl acetat được xếp loại vào dung môi xanh trong công

nghiệp, an toàn với môi trường. Lượng dùng ether không đáng kể ở quy mô đã trình

bày, song với quy mô lớn hơn, có thể tính toán đến việc thay thế (chẳng hạn Me-

THF). Các dung môi này cũng được thu hồi và tái sử dụng cho các mẻ tiếp theo.

Giai đoạn 3 (iii): Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-

dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (5) từ homopiperonylamin hydroclorid

(4)

Các phụ phẩm là muối natri clorid, natri sulfat và kali hydroxid có thể được

thải theo hệ thống chung. Dung môi dicloromethan được tái sử dụng để chiết cho các

mẻ sau.

Giai đoạn 4 (iv): Tổng hợp berberin clorid (1) thô từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-

N-(2,3-dimethoxybenzyl) ethan-1-amin hydrochlorid (5)

Các phụ phẩm acid acetic, đồng clorid và amoni clorid tương đối an toàn với

môi trường nên được thải theo hệ thống chung của cơ sở.

Giai đoạn 5 (v): Tinh chế berberin clorid đạt tiêu chuẩn dược dụng từ berberin clorid

125

thô.

Quy trình sử dụng ethanol là dung môi thân thiện với môi trường. Dịch kết

tinh được cất để thu hồi và tái sử dụng các dung môi này. Tinh chế berberin clorid

bằng phương pháp kết tinh lại trong dung môi ethanol 95%. Quá trình tinh chế

berberin clorid dựa trên nguyên tắc: Kết tinh nhờ thay đổi nhiệt độ. Hòa tan berberin

clorid trong ethanol nóng, thêm than hoạt tẩy màu, lọc lấy dịch giúp loại bỏ tạp không

tan, tạp màu. Dịch lọc được bốc hơi một phần giúp tạo dung dịch quá bão hòa và làm

lạnh giúp quá trình kết tinh nhanh chóng hình thành.

Hiệu suất toàn quy trình 5 giai đoạn (4 giai đoạn tổng hợp và 1 giai đoạn tinh

chế) tính từ piperonal đạt 40,7%. Đây là phương pháp có triển vọng áp dụng quy mô

công nghiệp và hiệu suất tổng hợp toàn phần cao hơn hầu hết các phương pháp tổng

hợp cũng tổng hợp qua trung gian homopiperonylamin(6) và có số bước thấp nhất

tính đến thời điểm hiện tại đi từ piperonal.

Bảng 4.2 Các phương pháp tổng hợp berberin clorid thông qua hợp chất trung

gian 6

Nguyên liệu ban đầu Nhược điểm STT Hiệu suất (%) Tên phương pháp hoặc tác giả

Kametami Homopiperonylamin (6) Số bước tổng hợp 7 3 Hiệu suất quá thấp

Phenol 17 1 [49] 2 [121] 5 Hiệu suất thấp benzen,

Viện Y học cổ truyền Trung Quốc

W. Liu Hợp chất 23 và dimethyl sulfoxid độc, ô nhiễm 26 Ô nhiễm môi 7

trường

và Catechol 6 3 [119] 4 [67] Chen Lin (cải tiến)

126

[58] Z. X. Chen 2,3- 6 dimethoxylphenylmethanol >20 giảm chi phí liệu nguyên nhưng hợp chất cyanid độc hại độc 67 cyanid hại (NaCN), tác nhân nhạy

cảm với nước (PCl5) Sử dụng 5 homopiperonylamin (6) 6

X.Bian [14] Và P. Yang [106]

từ hợp chất trung gian 6 và có NaCN độc 13,6 9 Pyrocatechol 6 [24]

5 1,2-methylenedioxybenzen 33 CH3CN độc 7 [23] C. Chen, Z. Luo, H. Yang C. Chen, M. Xu, Q. Zhao hại

So với 2 con đường tổng hợp không đi qua hợp chất trung gian kinh điển 6, Alice

E. Gatland, Ben S. Pilgrim [35] đã đưa phương pháp sử dụng hai chất ban đầu là 6-

bromo-2-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd (49) và acid 2-(1,3- benzodioxol-5-

yl)acetic với hiệu suất cao hơn 68%, nhưg với xúc tác đắt tiền như Pd, thực sự khó

áp dụng trong quy mô công nghiệp.

Phương pháp R. Virshinha [83] đưa ra phương pháp tổng hợp berberin qua quá

trình đóng vòng isoquinolin sử dụng xúc tác AgNO3. Phương pháp đã rút ngắn con

đường tổng hợp berberin còn 4 giai đoạn với hiệu suất toàn quy trình đạt 32%. Tuy

nhiên cũng giống như phương pháp trên xúc tác cũng như nguyên liệu đầu vào đắt

tiền, khó có thể áp dụng lên quy mô công nghiệp.

4.2. Bàn luận về quá trình tổng hợp hóa học, tinh chế và độ ổn định của nguyên

liệu berberin clorid tổng hợp được

4.2.1. Về các quá trình tổng hợp chất trung gian và sản phẩm cuối

4.2.1.1. Tổng hợp piperonal từ vanilin

127

a. Tổng hợp 3,4-dihydroxybenzaldehyd từ vanilin

Trong đó: py = pyridin

Hình 4.4 Cơ chế phản ứng demethyl vanilin bằng AlCl3/pyridin

Cơ chế phản ứng demethyl vanilin sử dụng tác nhân AlCl3, pyridin được biểu diễn

trên sơ đồ hình 4.4 [12], [67]. Ở giai đoạn đầu, cặp electron tự do trên nguyên tử O

tấn công vào nguyên tử Al và tách loại một ion Cl-. Tuy nhiên, do tham gia liên hợp

vào nhân thơm, mật độ electron trên O giảm nên quá trình tấn công khó khăn, phản

ứng diễn ra chậm. Giai đoạn tiếp theo là quá trình tách loại H+ (và ) dưới tác dụng

của pyridin để tạo thành phức hợp trung gian 25b. Có thể thay thế pyridin bằng các

tác nhân nucleophil khác như triethylamin (TEA), quinolin... Tuy nhiên, hiệu suất

phản ứng chỉ đạt giá trị cao nhất khi sử dụng pyridin [67]. Ở giai đoạn cuối cùng, 25b

thủy phân bởi HCl thu được aldehyd 25a.

Trong quá trình phản ứng cần lưu ý AlCl3 dễ dàng phản ứng với hơi nước trong

không khí, sinh ra HCl theo phương trình:

AlCl3 + 3H2O Al(OH)3 + 3HCl

Do vậy, phản ứng cần tiến hành trong điều kiện khan để tránh thủy phân làm mất

hoạt tính xúc tác AlCl3. Phản ứng demethyl hóa cho hiệu suất phản ứng ổn định 87%.

128

b. Tổng hợp piperonal

Hình 4.5. Cơ chế phản ứng đóng vòng methylenoxyd của 25a

Phản ứng của 25a với CH2Cl2 diễn ra theo cơ chế như hình 4.2 [19]. Ở giai đoạn

đầu, dưới tác dụng của K2CO3, nhóm OH ở vị trí C4 do có tính acid mạnh hơn (hiệu

ứng -M của -CHO) nên tách H+ chuyển thành ion phenolat rồi tham gia phản ứng thế

SN2 với một phân tử CH2Cl2. Tiếp theo, nhóm OH còn lại của 25a cũng tách H+ thu

được chất trung gian 25c. Chất này tham gia phản ứng đóng vòng nội phân tử tạo

piperonal (25a). Trong quá trình phản ứng còn có thể tạo thành các sản phẩm phụ

dimer 25d và polymer 25e.

Để giảm sự hình thành 25d và 25e cần giảm nồng độ dianion catecholat bằng cách

cho từ từ 25a vào hỗn hợp phản ứng. Tuy nhiên khi đó nồng độ 25a trong dung dịch

luôn ở mức thấp khiến phản ứng diễn ra với tốc độ chậm. Để giảm sự hình thành sản

phẩm phụ mà vẫn đảm bảo tốc độ phản ứng, CH2Cl2 được sử dụng dư từ ban đầu với

tỉ lệ mol 25a: CH2Cl2 = 1: 9.

Trong quá trình tinh chế, piperonal thô được kết tinh lại trong dung môi n -hexan

- ethyl acetat, thu được piperonal với hiệu suất 68%[99]. Tuy nhiên, trên thực tế khi

tiến hành, piperonal thu được theo phương pháp trên không tinh khiết. Do đó, ethanol

129

70% được lựa chọn là dung môi thay thế. Ưu điểm của dung môi này là thu được

piperonal tinh khiết, loại được tạp, thao tác tiến hành đơn giản so với phương pháp

cất kéo theo hơi nước hoặc cất ở áp suất giảm [19], [68], [23]. Quá trình tổng hợp

piperonal từ vanilin qua 2 giai đoạn như đã trình bày ở trên cho hiệu suất 57,6%. Với

ưu điểm vanilin là một nguyên liệu rẻ tiền, có sẵn, quá trình tổng hợp piperonal từ

nguyên liệu này có khả năng ứng dụng để nâng cấp quy mô tổng hợp. Tuy nhiên, hiện

nay piperonal là nguyên liệu có sẵn trên thị trường, do đó để rút ngắn các qua trình

tổng hợp, chúng tôi lựa chọn quá trình nâng cấp quy mô tổng hợp berberin từ nguyên

liệu piperonal.

4.2.1.2. Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal

Phản ứng ngưng tụ giữa piperonal và nitromethan có cơ chế tương tự phản ứng

kiểu aldol kèm theo quá trình tách loại một phân tử nước. Sử dụng tác nhân amoni

acetat có ưu điểm là ít tạo sản phẩm phụ, nhưng phản ứng cần tiến hành ở nhiệt độ

sôi của acid acetic (khoảng 120℃ ) và hiệu suất thu được không cao (70% theo tài

liệu [27]). Nhiệt độ cao hơn 120℃ sẽ làm cho khối phản ứng trở nên keo nhầy dẫn

đến rất khó xử lý. Qua khảo sát thực tế, chúng tôi chỉ thu được hiệu suất 60,6% theo

phương pháp này. Khi thay amoni acetat bằng bazơ mạnh (NaOH), chúng tôi đã nâng

được hiệu suất lên 86%. Cơ chế phản ứng kiểu aldol như sau [36], [87]:

Hình 4.6. Cơ chế phản ứng ngưng tụ piperonal và nitromethan

Phản ứng ngưng tụ gồm 2 giai đoạn: giai đoạn cộng hợp aldol thu được 61a, và

giai đoạn loại nước tạo sản phẩm nitrostyren 61. Sự tạo thành muối 61a thể hiện ở

việc dung dịch chuyển sang màu trắng đục và thời gian đảm bảo quá trình này diễn

130

ra hoàn toàn là khoảng 40 phút dưới sự khuấy trộn mạnh. Khi phá hủy muối 61a bằng

dung dịch HCl 4% cần phải pha loãng muối này bằng nước lạnh, đảm bảo nhiệt độ

dung dịch không quá 10℃ và phải cho nhanh vào acid, kết hợp với khuấy trộn mạnh

để tránh hình thành sản phẩm phụ 61b (dạng dầu màu vàng). Nếu tiến hành theo thứ

tự ngược (cho acid vào dung dịch 61a) thì không xảy ra quá trình loại nước tạo alken

mà hầu như chỉ tạo alcol 61b [28]. Điều này có thể giải thích do quá trình tạo sản

phẩm 61b từ 61a là quá trình thuận nghịch, 61b trong môi trường kiềm sẽ chuyển lại

thành 61a còn trong môi trường acid sẽ loại nước tạo sản phẩm 61. Do đó, ta phải

cho nhanh dung dịch chứa 61a vào dung dịch acid mà không làm ngược lại để tăng

tạo sản phẩm 61, tránh hình thành sản phẩm phụ 61b. Khi nâng cấp quy trình tổng

hợp ở quy mô 100 g/mẻ và 500 g/mẻ, chúng tôi thu được sản phẩm 61 với hiệu suất

ổn định (86%) và thời gian tiến hành ngắn. Do đó, phương pháp này thích hợp để

nâng cấp ở quy mô lớn hơn.

4.2.1.3. Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ nitrostyren 61

a. Sử dụng hệ khử NaBH4/CuCl2

- Quá trình khử hóa nitrostyren 61 thu được 6a trải qua 3 giai đoạn (Hình 4.4):

Giai đoạn (1): Quá trình cộng H- vào liên kết đôi tạo 61c;

Giai đoạn (2): Quá trình khử hóa nhóm nitro của 61c bằng NaBH4 có mặt xúc tác;

Giai đoạn (3): Quá trình tạo muối 6a từ 6.

Hình 4.7. Quá trình khử hóa nitrostyren 61 thành muối amin 6a sử dụng hệ

khử NaBH4/CuCl2

Để khử hóa các nitrostyren thành amin, thông thường sử dụng tác nhân LiAlH4

trong THF hoặc ether khan. Nhược điểm của tác nhân này là đắt tiền, dễ bị phân hủy

bởi ẩm (cần tiến hành trong điều kiện khan) và dễ gây cháy nổ khi nâng cấp. Các

nitrostyren cũng có thể được khử hóa bằng các kim loại như Fe, Zn, Sn trong môi

trường acid (HCl, AcOH), tuy nhiên phản ứng thường khó kiểm soát khi tiến hành,

cho hiệu suất thấp và khó loại bỏ cation kim loại. Khi sử dụng NaBH4 để khử hóa các

131

nitrostyren cần tiến hành với sự có mặt của các xúc tác acid Lewis như BF3.OEt2,

trimethylsilyl clorid (TMSCl), AlCl3 khan, NiCl2.6H2O, CuSO4.5H2O, CuCl2... [65].

Ưu điểm của tác nhân khử này: sẵn có, rẻ tiền, ít bị phân hủy bởi nước và alcol. Trong

nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 2 hệ là NaBH4/NiCl2 [74] và NaBH4/CuCl2 [113]

để khử hóa nitrostyren 61 thành amin 6 trải qua 2 giai đoạn:

Giai đoạn (1): Quá trình khử liên kết đôi bằng NaBH4 dựa trên cơ chế vận chuyển

ion H-. Cơ chế chi tiết được thể hiện trên sơ đồ hình 4.8 [22]

Hình 4.8. Cơ chế phản ứng khử nối đôi trong phân tử 61 bằng NaBH4

Quá trình hình thành sản phẩm 61c có thể nhận thấy khi màu vàng của nguyên liệu

61 mất dần và kết thúc khi khối phản ứng chuyển hoàn toàn từ màu vàng sang trắng.

Giai đoạn (2): Quá trình khử hóa nitro 61c bằng NaBH4 có mặt xúc tác

Nhận thấy khi sử dụng đơn độc NaBH4 phản ứng chỉ dừng ở giai đoạn 1, do đó để

khử hóa được nhóm nitro 61c cần phải sử dụng thêm xúc tác. Kết quả cho thấy, khi

khử hóa 61 bằng tác nhân NaBH4/NiCl2 thì lượng muối NiCl2 sử dụng nhiều (2,0 eq.)

đồng thời phản ứng tỏa nhiệt mạnh dẫn đến khó kiểm soát lượng khí H2 sinh ra. Ngoài

ra, quá trình tinh chế sản phẩm khá phức tạp do sử dụng quá trình chiết tách với dung

môi chứa clor, hiệu suất chưa cao (75%). Chính vì vậy, chúng tôi không lựa chọn tác

nhân này để tiếp tục nâng cấp. Sử dụng tác nhân NaBH4/CuCl2 thay cho NaBH4/NiCl2

cho thấy nhiều ưu điểm: lượng muối đồng sử dụng ít hơn (0,1 eq.), phản ứng dễ kiểm

soát nhiệt độ, môi trường tiến hành có nước, hạn chế được khả năng cháy nổ của khí

H2 sinh ra. Khi chúng tôi thay thế CuCl2 bằng NiCl2 ở cùng tỉ lệ (0,1 eq.) thì phản

ứng khử tạo amin 6 cho hiệu suất không cao (40%). Do đó, chúng tôi lựa chọn hệ

NaBH4/CuCl2 để nâng cấp quy mô tổng hợp chất 6a. Khi nâng cấp ở quy mô lớn cần

chú ý chia NaBH4 thành 2 phần: ban đầu sử dụng 5,0 eq. NaBH4 để tạo 61c, sau đó

bổ sung tiếp 3,5 eq. NaBH4 và thêm dung dịch CuCl2 2M để tránh lượng NaBH4 bị

phân hủy, gây mất tác nhân. Đồng thời cần sục khí trơ để đảm bảo tránh tiếp xúc với

132

oxy và hơi nước trong không khí làm mất hoạt tính xúc tác [15],[16]. Quá trình khử

nhóm NO2 thành amin của hệ tác nhân NaBH4/Cu2+ [113] được nhiều nhóm tác giả

nghiên cứu thành công, tuy nhiên cơ chế phản ứng chưa rõ ràng. Do sản phẩm

homopiperonyl amin (6) rất dễ bị oxy hóa nên chúng tôi đã chuyển về dạng muối

clorid (6a) nhằm tăng độ ổn định, thuận lợi hơn trong bảo quản và đánh giá các thông

số vật lý. Ngoài ra, việc tinh chế muối amin 6a được chúng tôi thực hiện với dung

dịch nước HCl 36,5% (thay vì sử dụng HCl khí trong alcol). Những cải tiến này thu

được sản phẩm 6a với hiệu suất ổn định 91,1% khi nâng cấp quy trình ở quy mô lớn.

b. Sử dụng quy trình khử cải tiến qua hai giai đoạn với tác nhân khử Fe

Sử dụng hệ khử khử NaBH4/CuCl2 để tổng hợp amin 6a có ưu điểm rất lớn là cho

hiệu suất cao và sản phẩm dễ dàng được tinh chế. Tuy nhiên, khi nâng cấp quy trình

tổng hợp ở quy mô lớn với hệ này thì xuất hiện nhiều nhược điểm: 1) khó kiểm soát

phản ứng phụ (sinh H2 có thể gây trào khối phản ứng), 2) nhiệt độ phản ứng khó

khống chế, 3) Sử dụng nhiều NaBH4, đây là tác nhân đắt tiền và khó bảo quản. Từ

những vấn đề này chúng tôi đã tiến hành khử hóa để tạo hợp chất nitro 61c (hình 4.5)

từ nitrostyren 61 sử dụng 2 đương lượng NaBH4. Sau đó tiến hành khử hóa chất 61c

bằng bột Fe với sự có mặt của NH4Cl.

Giai đoạn 1: tạo hợp chất 61c từ hợp chất 61 sử dụng NaBH4: Phản ứng này có

thể tiến hành trong nhiều dung môi khác nhau: MeOH, THF, EtOH, IPA…trong phản

ứng này chúng tôi lựa chọn EtOH do dung môi này thân thiện với môi trường và cho

hiệu suất tốt. Ngoài ra trong quá trình này cần chú ý phải thêm từ từ NaBH4 vào hỗn

hợp của chất 61/EtOH và khống chế nhiệt độ để giảm sự hình thành sản phẩm cộng

Michael (sản phẩm cộng của nitro 61c với nitrostyren 61 tạo hợp chất 1,3-dinitroketon

và các hợp chất polynitro khác.)

Giai đoạn 2: Quá trình khử hóa 61c tạo amin 6a: Sau khi thu được hợp chất 61c,

ban đầu chúng tôi cũng tiến hành tách lấy hợp chất này bằng cách chiết với dung môi

EtOAc. Sau đó chúng tôi tiến hành khử hóa với một số tác nhân khác nhau nhứ

Sn/HCl, Zn/AcOH, Fe/NH4Cl thì chúng tôi nhận thấy rằng khi sử dụng các hệ khử

Sn/HCl, Zn/AcOH đều thu được sản phẩm và phản ứng triệt để (khi theo dõi bằng

SKLM), tuy nhiên nhược điểm của các tác nhân này là quá trình trung hòa về pH 9-

133

10 để chiết tách thu amin tự do thì khối phản ứng thường rất khó chiết kiệt do hình

thành các hydroxyd kim loại gây cản trở quá trình tách chất. Khi sử dụng tác nhân

Fe/NH4Cl thì một điều lý thú là kim loại Fe tham gia phản ứng tạo sản phẩm chủ yếu

là các oxid sắt, phản ứng xảy ra hoàn toàn. Chính vì vậy giai đoạn chiết tách được

tiến hành đơn giản và cho hiệu suất tốt.

Phân tích một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng khử bằng tác

nhân Fe/NH4Cl

- Bề mặt tiểu phân bột sắt: quá trình khử xảy ra trên bề mặt sắt, nên bề mặt sắt phải

sạch để đảm bảo tiếp xúc tốt với hợp chất nitro. Sắt dễ bị oxy hóa tạo oxyd sắt trên

bề mặt làm giảm sự tiếp xúc của sắt với hợp chất 61, nên nguyên liệu bột sắt phải

đảm bảo không bị oxy hóa, có thể rửa sắt trước khi phản ứng bằng dung dịch acid

hydrocloric để làm sạch bề mặt.

Kích thước nguyên liệu sắt: kích thước tiểu phân sắt càng nhỏ thì bề mặt tiếp -

xúc càng lớn, tăng hiệu quả phản ứng.

 Từ đây có thể giải thích tại sao tăng lượng sắt hiệu suất phản ứng tăng, lượng

sắt tăng sẽ làm tăng bề mặt tiếp xúc giúp thúc đẩy quá trình khử.

Điều kiện khuấy trộn: Phản ứng phải đảm bảo được khuấy trộn liên tục để tăng -

tiếp xúc giữa sắt và hợp chất 61.

pH: Sau khi khử nối đôi bằng NaBH4, môi trường phản ứng là đang ở pH kiềm, -

việc trung hòa bằng HCl về acid nhẹ vừa tạo môi trường cho phản ứng khử nitro sau

đó vừa giúp amin tạo ra tồn tại dưới dạng muối tăng độ ổn định của sản phẩm.

Thời gian phản ứng: phản kéo dài quá lâu sẽ thì sản phẩm trung gian và sản -

phẩm chính sẽ hấp phụ nhiều trên bề mặt bột sắt, gây khó khăn khi xử lý, phải rửa kỹ

bã sắt.

Tỷ lệ nước trong hỗn hợp phản ứng: Nước có hai vai trò trong phản ứng, hòa -

tan NH4Cl giải phóng ion H+ tạo môi trường cho phản ứng khử hóa, phân ly ion OH-

tạo hydroxyd sắt. Lượng nước cũng ảnh hưởng đến việc giải hấp phụ sản phẩm chính

vào pha lỏng, tỷ lệ nước nhiều tăng độ phân cực pha lỏng giảm hòa tan các sản phẩm

134

vào pha lỏng để giải phóng bề mặt phản ứng, giảm hiệu suất.

Khi tiến hành nâng cấp quy trình tổng hợp ở quy mô lớn hơn 100g/mẻ, chúng

tôi tiếp tục cải tiến quá trình khử này bằng phương án one-pot để dễ dàng nâng cấp

quy trình tổng hợp.

Có thể thấy rằng về mặt hiệu suất quy trình này thấp hơn so với sử dụng tác

nhân NaBH4/CuCl2 , tuy nhiên nhìn chung vẫn còn tương đối cao > 80%, đặc biệt

qua trình này đã giúp giảm đáng kể lượng NaBH4 từ 8,5 lần còn 2 lần so với số mol

chất 61. Đây là ưu điểm lớn về chi phí sản xuất khi giá NaBH4 là 350-800 USD/kg

(Trung Quốc) tương đương với 7.700.000 – 17.600.000 VND/kg so với bột sắt có thể

sản xuất trong nước với giá rẻ khoảng 300.000 VND/kg. Điều kiện phản ứng khử nhẹ

nhàng với môi trường acid nhẹ do NH4Cl tạo ra, dễ kiểm soát. Qua đó có thể thấy

việc tổng hợp amin 6a với quy trình được đề xuất trong luận án có khả năng ứng dụng

ở quy mô lớn. Và quá trình này khi tiến hành ở quy mô 500 g/mẻ cho hiệu suất ổn

định (85,6%) và đã giảm đáng kể lượng tác nhân NaBH4 sử dụng.

4.2.1.4. Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-

amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a)

Phản ứng tổng hợp 31 từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) trải qua các

giai đoạn ngưng tụ tạo imin sau đó khử imin thành amin và tạo muối. Sơ đồ tóm tắt

135

và chi tiết cơ chế phản ứng được thể hiện trên sau:

Hình 4.9. Cơ chế phản ứng hình thành 31 từ (6a)

Giai đoạn 1: Ngưng tụ tạo imin

Đây là giai đoạn quan trọng nhất quyết định hiệu suất của phản ứng. Phản ứng trải

qua giai đoạn hình thành trung gian carbinolamin (6b) là một alcol. Như vậy, để phản

ứng diễn ra với hiệu suất cao cần tăng cường quá trình tách nước khỏi 6b giúp hình

thành imin 6c. Do dạng amin bazơ của 6a là dạng lỏng nên nhiều tài liệu [100], [101],

[106], [120], [121] đều sử dụng phương pháp loại nước bằng cách đun nóng trực tiếp

2 chất phản ứng đến nhiệt độ 100-105℃ ở áp suất thường hoặc 70-80℃ ở áp suất

giảm mà không sử dụng dung môi. Tuy nhiên, thực tế chúng tôi tiến hành theo cách

trên hiệu suất thu được rất thấp (khoảng 40 - 55%). Vì dạng muối amin 6a là thể rắn

nên chúng tôi sử dụng kiềm để chuyển 6a về dạng amin bazơ (6). Để loại nước khỏi

6b theo tài liệu [36] ta có thể dùng xúc tác acid, bazơ hoặc điều kiện nhiệt độ. Tuy

136

nhiên, do amin 6 khá nhạy cảm với acid, chỉ một số ít xúc tác bazơ mới có khả năng

loại được nước nên chúng tôi lựa chọn tách nước khỏi 6b bằng cách sử dụng nhiệt

độ. Trong phản ứng này chúng tôi lựa chọn dung môi là hỗn hợp toluen và ethanol

(9:1) đun hồi lưu, kết hợp với dụng cụ Dean-stark để loại nước khỏi khối phản ứng.

Quá trình hình thành imin cũng chịu ảnh hưởng rất lớn của pH môi trường. Nếu

pH quá thấp (pH<1) imin sẽ không hình thành, pH acid (pH<3) cũng sẽ ảnh hưởng

tới mật độ electron trên nguyên tử N của amin 6 [21], [41]. Do đó, để đảm bảo phản

ứng thuận lợi, môi trường phản ứng được giữ ở pH = 9-10 bằng cách bổ sung thêm

KOH.

Giai đoạn 2: Khử imin

Cơ chế phản ứng khử imin bằng NaBH4 là cơ chế vận chuyển ion H- tương tự phản

ứng khử hợp chất 61 thành 61c. Hợp chất imin được cộng hợp H- vào nối đôi tạo sản

phẩm là amin bậc hai. Do khả năng khử của NaBH4 trong dung môi toluen kém nên

hỗn hợp phản ứng chứa imin cần cất loại toluen, bổ sung methanol sau đó mới cho

thêm NaBH4 để khử hóa.

Giai đoạn 3: Tạo muối

Do sản phẩm thu được là amin bậc hai rất dễ bị oxy hóa nên để thuận lợi trong quá

trình bảo quản amin được đưa về dạng muối clorid tương tự như phản ứng tạo hợp

chất 6a, sử dụng dung dịch HCl trong methanol hoặc ethanol rồi để kết tinh thu được

sản phẩm 31 [106],[120],[121].

Những cải tiến này thu được sản phẩm 31 với hiệu suất ổn định 88% khi nâng cấp

quy trình ở quy mô 100,0 g/mẻ và 500 g/mẻ.

4.1.1.5. Tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-

137

dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31)

Cơ chế phản ứng tổng hợp berberin từ 31 được đề xuất gồm các giai đoạn ngưng

tụ, đóng vòng, oxy hóa, tạo muối. Cơ chế phản ứng như sau

Hình 4.10. Cơ chế phản ứng hình thành berberin clorid (1) từ 31

Giai đoạn 1: Giai đoạn ngưng tụ và đóng vòng

Giai đoạn này trải qua nhiều bước trung gian, kết thúc khi hình thành sản phẩm

1a. Quá trình ngưng tụ có cơ chế tương tự phản ứng ngưng tụ tạo imin như hình 4.6.

Giai đoạn đóng vòng bản chất là phản ứng thế electrophil SE vào nhân thơm. Để hiệu

suất hình thành 1a là tốt nhất phụ thuộc vào pH của môi trường và quá trình loại nước

giúp tăng tạo 1a. Nước có thể được loại bằng cách làm bốc hơi ở nhiệt độ cao (>100℃

), tuy nhiên thời gian thường kéo dài và quá trình loại nước thường không triệt để do

138

nước có thể bị hấp phụ trong lòng khối phản ứng như phương pháp 1 mục 3.1.3.

Theo phương pháp nhóm nghiên cứu tiến hành, pH của môi trường nên duy trì

trong khoảng (pH = 3-4), điều này đảm bảo cung cấp H+ xúc tác phản ứng ngưng tụ

xảy ra. Ngoài ra, khoảng pH trên còn giúp quá trình loại nước tạo 1a dễ dàng, đồng

thời ít ảnh hưởng tới cặp điện tử của N trong hợp chất 31 [41].

Giai đoạn 2: Oxy hóa, tạo muối

Giai đoạn oxy hóa có thể diễn ra theo một chuỗi quá trình trong đó có tạo sản phẩm

trung gian là một cation gốc [57] Sản phẩm thu được sau quá trình là dạng muối phức

của đồng và berberin. Để tinh chế thu được berberin cần loại đồng ra khỏi phức này.

Để loại đồng tài liệu [100],[106],[121] sử dụng phương pháp chuyển qua lại giữa

dạng muối và dạng bazơ của berberin. Để phá vỡ liên kết này nhóm nghiên cứu sử

dụng amoniac nhằm cạnh tranh tạo phức với đồng, berberin được tách ra dưới dạng

hydroxyd và được thêm HCl tạo sản phẩm berberin clorid (1).

4.2.2. Cấu trúc hóa học của các hợp chất tổng hợp được

4.2.2.1. Hợp chất 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61)

Phổ IR cho các đỉnh hấp thụ đặc trưng của (C-H anken = 3116 cm-1), (C-H no = 2920

cm-1), (-NO2 = 1485 và 1327 cm-1). [Phụ lục 14]

Trên phổ MS, xuất hiện tín hiệu lớn nhất có giá trị m/z = 194,15 tương ứng với pic

[M+H]+. Ngoài ra xuất hiện 2 tín hiệu nhỏ: tín hiệu có giá trị m/z = 195,20 tương ứng

với pic [M+H]+ và tín hiệu có giá trị m/z = 235,20 tương ứng với pic

[M+H+acetonitril]+. [Phụ lục 11]

Trên phổ 1H-NMR, ngoài tín hiệu của H nhân thơm, H nhóm -CH2 xuất hiện 2 tín

hiệu có độ dịch chuyển 8,14 ppm và 8,07 ppm tương ứng với H của 2 nhóm CH liên

kết đôi. Qua đó chứng tỏ phản ứng đã xảy ra. Hai tín hiệu này đều là một doublet với

hằng số tương tác J = 13,5 Hz. Từ đó cho thấy sản phẩm có cấu hình trans. [Phụ lục

12]

Phổ 13C-NMR của 61 có 9 tín hiệu, tương ứng 9 C trong phân tử. [Phụ lục 13]

Như vậy, kết quả các phổ đều xác nhận cấu trúc của 61 là phù hợp với công thức

dự kiến.

139

4.2.2.2. Hợp chất 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62)

Phổ IR cho các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho từng nhóm (O-H = 3178 cm-1 và 2991

cm-1), (C-H no = 2947 cm-1 và 2827 cm-1), (C=N = 1627 cm-1 và 1600 cm-1), (C=C

thơm = 1575 cm-1 và 1473 cm-1), (C-O = 1269 cm-1 và 1219 cm-1). [Phụ lục 37]

Trên phổ khối lượng (MS): xuất hiện pic ion với cường độ mạnh nhất có giá trị

m/z = 181,9, tương ứng với pic [M+H]+. [Phụ lục 31]

Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR): xuất hiện tín hiệu phổ đồ

tương ứng phù hợp với số lượng cũng như độ chuyển dịch hóa học của các nguyên

tử hydro. Trên phổ ngoài xuất hiện proton của nhân thơm còn có 6 proton của 2 nhóm

-CH3 có độ dịch chuyển 3,81 ppm (-OCH3 gắn với C-2’) và 3,74 ppm (-OCH3 gắn

với C-3’). Bên cạnh đó, xuất hiện 1 proton của nhóm -OH có độ dịch chuyển 11,29

ppm. Đồng thời, xuất hiện tín hiệu của 1 proton trong nhóm -CH liên kết đôi với N

có độ dịch chuyển 8,24 ppm. Qua đó cho thấy phản ứng ngưng tụ đã xảy ra. [Phụ lục

32, 33, 34]

Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân Carbon-13 (13C-NMR): xuất hiện tín hiệu

phổ đồ tương ứng phù hợp với số lượng cũng như độ chuyển dịch hóa học của các

nguyên tử carbon. Trên phổ xuất hiện 6 tín hiệu của 6C vùng thơm. Đồng thời, xuất

hiện 2 tín hiệu của 2 nhóm -CH3 có độ dịch chuyển 60,90 ppm (-OCH3 gắn với C-2’)

và 55,69 ppm (-OCH3 gắn với C-3’). Ngoài ra còn xuất hiện 1 tín hiệu của C liên kết

đôi với N. Các tín hiệu C trên đều phù hợp với công thức dự kiến. [Phụ lục 35, 36]

Như vậy, kết quả các phổ đều xác nhận cấu trúc của 62 là phù hợp với công thức

dự kiến.

+ = 2966 cm-1 và 2621

4.2.2.3. Hợp chất 2,3-dimethoxyphenyl)methanamin (63)

Phổ IR cho các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho từng nhóm (NH3

cm-1 ), (C-H no = 2819 cm-1), (C=C thơm = 1620 cm-1; 1585 cm-1 và 1508 cm-1), (C-

O = 1278cm-1; 1224 cm-1 và 1078 cm-1). [Phụ lục 41]

Trên phổ khối lượng (MS): xuất hiện pic ion với cường độ mạnh nhất có giá trị

m/z = 168,20, tương ứng với pic [M-Cl]+. [Phụ lục 38]

Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR): xuất hiện tín hiệu phổ đồ

tương ứng phù hợp với số lượng cũng như độ chuyển dịch hóa học của các nguyên

140

tử hydro. Trên phổ ngoài các tín hiệu proton của nhân thơm, của nhóm -CH3 còn có

+, không còn tín hiệu proton của nhóm -OH. Qua đó

2 proton của nhóm -CH2 với độ dịch chuyển 4,00 ppm. Đồng thời, xuất hiện tín hiệu

của 3 proton trong nhóm -NH3

cho thấy phản ứng khử hóa đã xảy ra. [Phụ lục 39]

Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân Carbon-13 (13C-NMR): xuất hiện tín hiệu

+ với độ dịch

phổ đồ tương ứng phù hợp với số lượng cũng như độ chuyển dịch hóa học của các

nguyên tử carbon. Trên phổ xuất hiện 1 tín hiệu của C gắn với NH3

chuyển 37,44 ppm bị trùng với tín hiệu của dung môi DMSO nên không biểu hiện

trên phổ. Đồng thời, 8 tín hiệu C khác đều phù hợp với công thức dự kiến. [Phụ lục

40]

Như vậy, kết quả các phổ đều xác nhận cấu trúc của 63 là phù hợp với công thức

dự kiến.

4.2.2.3. Hợp chất homopiperonylamin hydroclorid (6a)

+ = 2042 cm-1). [Phụ lục 18]

Phổ IR xuất hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho (C-H thơm = 3053 cm-1), (C-H no =

2972 và 2885 cm-1), (NH3

Trên phổ MS xuất hiện tín hiệu có giá trị m/z = 166,20 tương ứng pic [M-Cl]+, xuất

. [Phụ lục 15]

hiện tín hiệu có giá trị m/z = 207,25 tương ứng pic [M-Cl+acetonitril]+

Trên phổ 1H-NMR, xuất hiện các pic tương ứng với 3H thơm, 4H alkyl H, không

+ (8,21 ppm). [Phụ lục 16]

còn tín hiệu của 2 nhóm CH liên kết đôi trong phân tử 6a, đồng thời xuất hiện tín hiệu

+ với độ dịch chuyển 39,1 ppm bị trùng

3H của NH3

Phổ 13C-NMR có 1 tín hiệu C gắn với NH3

vào tín hiệu của dung môi DMSO nên không hiển thị trên phổ, đồng thời 8 tín hiệu C

khác đều phù hợp với công thức dự đoán. [Phụ lục 17]

141

Do vậy, khẳng định được sản phẩm 6a là homopiperonylamin clorid.

4.2.2.4. Hợp chất 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-

amin hydrochlorid (31)

Trên phổ IR, xuất hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho (C-O = 1043, 1190 và 1240

cm-1), (C = C thơm = 1440, 1492 và 1631 cm-1), (C-H no = 2937 cm-1), (N+-H = 2773

cm-1), (N-H = 3450 cm-1). [Phụ lục 25]

Phổ MS xuất hiện pic với giá trị m/z = 316,3 tương ứng với pic [M-Cl]+. [Phụ lục

19]

+ (8,94 - 9,01 ppm). [Phụ lục 20, 21,

Phổ 1H-NMR, xuất hiện các pic tương ứng với 2H thơm, 3H nhóm thế trong phân

tử 31, đồng thời xuất hiện tín hiệu 2H của NH2

22]

Trên phổ 13C-NMR cũng xuất hiện 18 tín hiệu tương ứng 18 C. [Phụ lục 23, 24]

Như vậy, dựa vào các kết quả phổ cho phép khẳng định cấu trúc 31 phù hợp đúng

như dự kiến.

4.2.2.5. Hợp chất berberin clorid (1)

Kết quả sắc ký lớp mỏng 1 trùng với berberin chuẩn.

1), (C = C thơm = 1459 và 1631 cm-1), (C-H no = 2913 cm-1), (O-H = 3440 cm-1). [Phụ

Trên phổ IR, xuất hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho (C-O = 1105 và 1276 cm-

lục 30]

. [Phụ lục 26]

Trên phổ MS xuất hiện tín hiệu m/z = 336,25 tương ứng pic [M-Cl]+

Số liệu phổ NMR của sản phẩm cuối cùng 1 xuất hiện các tín hiệu tương ứng với

cấu trúc của berberin. [Phụ lục 27, 28, 29] So sánh với phổ NMR chuẩn của berberin

142

clorid trên cơ sở dữ liệu phổ SDBS [87] thu được kết quả như bảng 4.3, bảng 4.4.

Bảng 4.3 Kết quả so sánh phổ 1H-NMR berberin tổng hợp được và phổ chuẩn

của berberin clorid

Phổ

1H-NMR

Phổ

1H-NMR

thực nghiệm Vị Công thức chuẩn (DMSO-d6, 500 trí H (DMSO-d6, 400 MHz) (ppm) MHz) (ppm)

9,82 9,88 H-8

8,88 8,95 H-13

8,12 8,18 H-12

7,93 8,02 H-11

7,71 7,79 H-14

7,00 7,07 H-4

6,09 6,16 H-2

4,87 4,96 H-6

4,01 4,12 H-1’

3,99 4,07 H-2’

3,13 3,22 H-5

Bảng 4.4 Kết quả so sánh phổ 13C-NMR berberin tổng hợp được và phổ chuẩn

của berberin clorid

Phổ 13C-NMR thực Phổ

13C-NMR

Vị trí Công thức chuẩn nghiệm (DMSO-d6, (DMSO-d6, C 125 MHz) (ppm) 22,5 MHz) (ppm)

150,87 150,33 C9

150,29 149,87 C3a

148,21 147,72 C14a

145,95 145,34 C8

144,15 143,97 C10

143

137,42 137,55 C13a

133,47 133,24 C12a

131,16 130,61 C4a

127,23 127,13 C12

124,01 123,42 C11

121,88 121,46 C13b

120,93 120,40 C8a

120,69 120,21 C13

108,91 108,34 C4

105,92 105,46 C14

102,56 102,00 C2

62,41 61,92 C1’

57,54 57,26 C2’

55,65 55,29 C6

26,81 26,44 C5

Từ kết quả trên cho thấy, các tín hiệu của hợp chất 1 trên phổ NMR thực nghiệm

có sự tương đồng với các tín hiệu trên phổ chuẩn của berberin clorid. Mặt khác, các

số liệu phổ 1H-NMR của 1 cũng phù hợp với số liệu phổ của berberin công bố bởi tác

giả Keiko Hasada [40]. Từ đó cho phép kết luận sản phẩm cuối cùng của quy trình

tổng hợp là berberin.

4.3. Về độ ổn định của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được

Nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid được thực hiện trên 3 mẻ, bảo quản

ở điều kiện dài hạn trong thời gian 12 tháng và điều kiện lão hóa cấp tốc trong thời

gian 6 tháng. Các chỉ tiêu theo dõi theo tiêu chuẩn của DĐVN V, phương pháp định

lượng berberin clorid được tiến hành theo phương pháp HPLC nhằm đánh giá chính

xác hơn các tạp chất sinh ra trong quá trình bảo quản. Kết quả nghiên cứu cho thấy

berberin clorid ổn định trong điều kiện thử với thời gian như trên. Tuổi thọ dự đoán

144

của berberin clorid là 24 tháng.

Trên hình ảnh sắc kí đồ HPLC của berberin clorid không có pic lạ xuất hiện.

Đồng thời trong quá trình đánh giá độ ổn định cho thấy, lượng tạp xuất hiện trong

quá trình bảo quản không đáng kể (<0,2%).

Hình 4.11. Sắc ký đồ HPLC sản phẩm berberin clorid

Berberin clorid tồn tại ở dạng khan và các dạng ngậm nước khác nhau, 1 phân

tử nước (nomohydrat), 2 phân tử nước (dihydrat) và 4 phân tử nước (tetrahydrat). Do

vậy, trong bào chế phải đối mặt với vấn đề thay đổi pha rắn của berberin clorid phụ

thuộc vào độ ẩm và đặc biệt khi độ ẩm môi trường thay đổi như trong quá trình bào

chế sản xuất và hay bảo quản nguyên liệu cũng như bảo quản thành phẩm dạng viên

nén berberin, dạng viên nang … hay các dạng bào chế rắn khác.

Dạng khan và monohydrat biến đổi thành dạng dihydrat ở độ ẩm tương đối

trên 12%. Dihydrat chuyển thành tetrahydrat khi độ ẩm trên 70%. Vì các phân tử

nước bên trong tetrahydrat nằm tập chung về một phía hình thành kênh, nên

tetrahydrat rất không ổn định, và sẽ dễ dàng chuyển hóa thành dihydrat khi được đun

nóng ở nhiệt độ 40°C và thành anhydrat ở khi được đun nóng 80°C. Do vậy, berberin

clorid sẽ bị chuyển dạng qua lại giữa tetrahydrat và dihydrat khi bào chế ở nhiệt độ

30 – 49°C và chuyển dạng qua lại giữa dihydrat và dạng khan ở nhiệt độ 70 – 87°C.

Berberin clorid quy định ở các Dược điển chủ yếu ở dạng dihydrat vì tính ổn định

của nó trong điều kiện môi trường bình thường. Sự thay đổi dạng kết tinh của berberin

có thể xảy ra trong quá trình bào chế viên nén như giai đoạn tạo hạt ướt [93]. Hàm

145

lượng nước quy định trong các Dược điển thường là “không vượt quá 12%”. Vì hàm

lượng nước ở dạng dihydrat và tetrahydrat lần lượt là 8,84% và 16,22%, đáp ứng các

yêu cầu của dược điển nên không loại trừ khả năng các dạng berberin là hỗn hợp các

dạng ngậm nước. Những thay đổi như vậy trong thành phần pha ở trạng thái rắn của

berberin thô được cho là sẽ góp phần làm thay đổi quy trình sản xuất và chất lượng

của viên nén berberin. Kết quả DSC của 2 mẫu nguyên liệu berberin clorid dihydrat

trên thị trường và sản phẩm berberin clorid chúng tôi tổng hợp được

146

Hình 4.12. DSC mẫu berberin clorid bán trên thị trường

Hình 4.13. DSC mẫu berberin clorid tổng hợp được

Nhận thấy rằng, trong cùng điều kiện phân tích cả 2 mẫu đều có 4 đỉnh thu

nhiệt tương ứng với nhiệt độ 86,6oC; 131,9 oC; 199,9 oC; 285,9 oC (ở mẫu thị trường)

và 103,3 oC; 138,9 oC 202,0 oC; 268,7 oC (ở mẫu berberin tổng hợp được) với tính

toán khối lượng mất đi tương ứng 2%; 4%; 2%; 4% (mẫu thị trường) và 6%; 5%; 3%;

6% (mẫu tổng hợp được). Và mẫu thị trường ổn định nhiệt độ từ 0oC cho đến 61,1oC,

và đỉnh thu nhiệt cuối cùng là 285,9 oC, trong khi đó khoảng thu nhiệt của mẫu tổng

hợp hẹp hơn ổn định từ 0 oC đến 69,3 oC đến 268,7 oC. Qua tra cứu tài liệu tham khảo

nhận thấy rằng khi đo DSC của berberin clorid dihydrat [97] cũng có 4 điểm thu nhiệt

lần lượt với khối lượng mất đi tương ứng là 4%, 7%; 7%; và 4%. Được tác giả cho

rằng 4% là hàm lượng nước mất đi và 7% là nhóm C=O bị phân hủy. Điều này cũng

tương đồng với sản phẩm berberin clorid tổng hợp của chúng tôi. Đồng thời kết quả

kiểm nghiệm theo dược điển Việt Nam V thì hàm lượng nước cũng đạt khoảng 11%.

Nhiệt độ kết tinh trong phương pháp kết tinh lại luận án sử dụng cũng <70oC. Đó

cũng là một yếu tố thuận lợi để giúp cho sản phẩm berberin clorid tổng hợp được ở

147

dạng dihydrat là một dạng ổn định phù hợp để ứng dụng trong bào chế.

4.5. Về tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được

Dược điển Việt Nam V và Dược điển Nhật Bản 17 hiện nay cũng không có

những quy định nào phân biệt berberin clorid có nguồn gốc khác nhau thì có chuyên

luận kiểm nghiệm khác nhau. Tuy nhiên căn cứ vào phương pháp tổng hợp hóa học

về quy trình mà luận án đã xây dựng. Thì những tạp dự kiến sẽ là các sản phẩm dư

2-), bazơ

của quá trình tổng hợp. Ví dụ như các chất hữu cơ chưa phản ứng hết, dung môi

(ethanol, toluene, aceton, CH2Cl2), acid tồn dư (HCl, anhydrid acetic, SO4

hữu cơ (IPA) và các tạp vô cơ là các kim loại tham gia xúc tác cho phản ứng tổng

hợp (Cu++. Fe, K+, Na+).

Trong khi berberin clorid có nguồn gốc thực vật có tạp là các thành phần có

đặc tính lý hóa tương tự dễ bị lẫn vào trong quá trình chiết và kết tinh của sản phẩm

chính. Tạp chủ yếu của quá trình chiết berberin clorid thường gặp là palmatin clorid.

Do vậy, theo quy định của DĐVN V thì lượng tạp không quá 0,2% và hàm lượng

berberin clorid đạt từ 95-102%.

Sản phẩm tổng hợp của đề tài xác định được tạp liên quan là 0% là khả năng

xảy ra phù hợp với dự đoán vì lượng tạp liên quan như theo quy định trên là không

có thể có được. Và kết quả định lượng hàm lượng berberin clorid dihydrat theo HPLC

đạt được kết quả sau mỗi quy mô lần lượt là 95,3% ở quy mô phòng thí nghiệm,

97,6% ở quy mô 100g/mẻ và đặc biệt ở quy mô 500g/mẻ thì hàm lượng đạt cao nhất

100% và tất cả các tạp khác có liên quan đều không có hoặc ở mức giới hạn cho phép,

rất thấp. Chứng tỏ sản phẩm tổng hợp hóa học là hoàn toàn, tinh khiết, không còn sản

phẩm phụ của quá trình tổng hợp. Do đó, khi đề xuất tiêu chuẩn chất lượng cho sản

phẩm theo con đường tổng hợp luận án đã đề xuất chỉ tiêu về hàm lượng hẹp hơn so

với dược điển từ 98 – 101%..

4.6. Về độc tính cấp của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được

Mặc dù berberin clorid là dược chất được sử dụng an toàn từ nhiều năm nay,

nhưng trong nước chủ yếu là nguyên liệu chiết từ thực vật. Do vậy, berberin clorid là

một sản phẩm mới của con đường tổng hợp nên cần phải thử độc tính cấp theo

“Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu”

148

của Bộ y tế ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27 tháng 10 năm 2015)

sử dụng phương pháp tính liều LD50 thông qua xác định tỷ lệ động vật chết trong

vòng 72 giờ. Luận án đã tiến hành thử thăm dò trên chuột uống với liều berberin

clorid tăng dần từ 1,56g/kg chuột đến liều 11,25g/kg chuột sau khi xác định được liều

thấp nhất gây chết 50% động vật là 3,12g/kg. Từ kết quả này, tiến hành thử nghiệm

chính thức với các lô chuột được uống berberin clorid tổng hợp được ở mức liều tăng

dần 1,56g/kg đến liều 11,25g/kg chuột theo mô hình liều cố định (OECD – Guideline

420) và sử dụng phân tích hồi quy trên phần mềm SPSS xác định được LD50 cho sản

phẩm berberin clorid tổng hợp được là 4g/kg.

Theo các tài liệu tham khảo sản phẩm berberin clorid tổng hợp được có mức liều

LD50 lớn hơn hầu hết các dạng berberin chiết được từ các loài thực vật có cùng dạng

dùng là đường uống. Berberin dạng đường dùng tiêm tĩnh mạch là dạng gây độc tính

cao hơn là các dạng dùng uống và dùng trong màng bụng. Có thể giải thích là do

berberin có sinh khả dụng đường uống tương đối thấp nhỏ hơn 1% [63]. Khả năng

hấp thụ đường ruột thấp bởi vì có tương tác với P-glycoprotein (P-gp19) trong ruột,

được chuyển hóa ở gan và sự bài tiết ở gan mật và thải trừ theo phân, nồng độ thuốc

trong huyết tương thấp [64]. Do vậy độc tính ở dạng đường uống cũng thấp hơn. Đối

với các dạng muối khác nhau của berberin sulfat và berberin clorid thì nhận thấy rằng

dạng muối sulfat nhìn chung có LD50 thấp hơn dạng muối clorid do độ tan tốt hơn.

Berberin bisulfat tan trong khoảng 100 phần nước, trong khi berberin clorid tan trong

400 phần nước. Do đặc tính đó mà berberin sulfat có những tác dụng riêng như chỉ

định trong điều trị: bệnh giảm tiểu cầu với liều 5 mg x 3 lần/ngày, trong 15 ngày,

uống trước ăn 20 phút; viên nén 5mg berberin bisulfat (Catherine Ulbricht (2010),

Davis's Pocket Guide to Herbs and Supplements) trong chỉ định điều trị các bệnh mãn

tính của gan, túi mật, đường mật và cơ vòng của Oddi. liều lượng và cách dùng: uống

5-10 mg 3 lần một ngày, trước bữa ăn. Quá trình điều trị là 2-4 tuần [123]. Chứng tỏ

cho thấy mức liều LD50 329g/kg vẫn có những bằng chứng an toàn thực tế khi sử

149

dụng điều trị các bệnh mạn tính trên người với liều 5 – 10 mg/ngày.

Bảng 4.5 Tổng hợp giá trị LD50 của nguyên liệu berberin

Đường dùng TLTK Liều LD50 (mg/kg)

2.600 [80] Động vật thí nghiệm Chuột nhắt Uống

Uống [69] Chuột cống Chuột nhắt 1.290 520

Chế phẩm thử độc tính cấp Bột berberin chiết từ rễ cây Hoàng Liên gai (B. Vulgaris) Cắn dich chiết rễ cây Hoàng Liên gai (B. Vulgaris) Berberin tinh khiết Chuột nhắt 23 329 [69]

(rhizoma Chuột nhắt Dùng trong màng bụng Uống Uống 713,58 [114]

sulphat >1.000 [69] 205 [48] Berberin coptidis) Berberin sulphat Berberin (Berberis aristata) Chuột cống Chuột cống

Berberin sulphat Uống Dùng trong màng bụng Uống [37]

Chuột cống Chuột nhắt Chuột nhắt [47] 1.000 329 9,0368 57,6103 Berberin hydrochlorid

>7.000 [70] Chuột nhắt Rhizoma coptidis

Tiêm tĩnh mạch Dùng trong màng bụng Uống Như vậy, có thể thấy rằng với mức liều LD50 4g/kg hay 4000mg/kg đã chỉ ra

rằng sản phẩm berberin clorid tổng hợp của đề tài theo bảng phân loại độc tính của

GHS (Globally Hamonised Classification System for Chemical Substances and

Mixture) ở mức độc tính thấp (2 - 5 g/kg). Với các chế phẩm berbrin clorid trên thị

150

trường đang được sử dụng để điều trị với mức liều 100 – 500mg/ ngày là phù hợp.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Đã xây dựng được quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 500g/mẻ đạt tiêu

chuẩn Dược điển Việt Nam V.

✓ Đã nghiên cứu cải tiến tổng hợp berberin clorid theo phương pháp truyền thống

từ piperonal qua trung gian homopiperonylamin quy mô phòng thí nghiệm

thông qua 4 giai đoạn:

o Giai đoạn 1: đã tổng hợp khảo sát theo 2 phương pháp, lựa chọn được

3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal, hiệu suất 86%.

tác nhân NaOH khảo sát các thông số và cải tiến cho phản ứng tổng hợp

nhân NaBH4/CuCl2 khảo sát các thông số và cải tiến cho phản ứng tổng

hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ hợp chất 61, hiệu suất 77%.

o Giai đoạn 2: đã tổng hợp khảo sát theo 9 phương pháp, lựa chọn được tác

môi hỗn hợp toluen và ethanol (9:1) để tách loại nước, lựa chọn tác nhân kiềm

triethylamin khảo sát các thông số và cải tiến cho phản ứng tổng hợp 2-

(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin

hydrochlorid (31) từ hợp chất 6a, hiệu suất 52,63%.

o Giai đoạn 3: đã tổng hợp khảo sát theo 2 phương pháp, lựa chọn được dung

phương pháp cất loại nước ở nhiệt độ hồi lưu của dung môi acid acetic (112

- 114℃ ), sử dụng amoniac nhằm cạnh tranh tạo phức với đồng để loại đồng,

o Giai đoạn 4: đã tổng hợp khảo sát theo 2 phương pháp, lựa chọn được

từ hợp chất 6a, hiệu suất 54,87%.

khảo sát các thông số và cải tiến cho phản ứng tổng hợp berberin clorid (1)

o Đã tổng hợp được nguyên liệu piperonal từ vanillin qua 2 phản ứng.

o Giai đoạn tinh chế: đã khảo sát các thông số và tinh chế được berberin

clorid trong Ethanol 96o và kết tinh ở nhiệt độ 0-5oC đạt tiêu chuẩn

Dược điển Việt Nam IV.

✓ Đã tổng hợp berberin clorid theo phương pháp mới từ 2,3-

151

dimethoxybenzaldehyd và homopiperonal bằng việc sử dụng chất trung gian

2,3-dimethoxybenzaldoxim ở quy mô phòng thí nghiệm thông qua 4 giai đoạn,

hiệu suất 36,23%:

o Giai đoạn 1: Hợp chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) được

tổng hợp từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd bằng phản ứng ngưng tụ oxim,

hiệu suất 89,50%

o Giai đoạn 2: Tổng hợp (2,3-dimethoxyphenyl)methanamin (63) bằng tác

nhân khử hóa NaBH4 với sự có mặt của xúc tác NiCl2. 6H20 trong dung

môi methanol và Zn trong môi trường acid clohydrid và acid acetic, hiệu

suất 85,63%.

o Giai đoạn 3: Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-

dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) được tổng hợp bằng

phương pháp ngưng tụ imin hợp chất trung gian 63 và aldehyd

homopiperonal, hiệu suất 79,52%.

o Giai đoạn 4: Tổng hợp berberin clorid.

✓ Đã khẳng định được cấu trúc của các chất trung gian và berberin clorid bằng

phân tích phổ IR, MS, NMR.

✓ Đã cải tiến quy trình công nghệ và nâng cấp quy trình tổng hợp berberin đi từ

piperonal ở quy mô 100g/mẻ sản phẩm đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V.

o Cải tiến, nâng cấp, đánh giá độ lặp lại của quy trình qua 4 giai đoạn

hợp chất 61 bằng quá trình khử one-pot qua xúc tác sử dụng 2 đương lượng

NaBH4 và tiếp tục khử bằng bột Fe với sự có mặt của NH4Cl, hiệu suất đạt

91,1%.

o Cải tiến giai đoạn số 2 tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ

✓ Đã đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu berberin clorid với hàm

lượng berberin clorid đạt 98 – 101%

✓ Đã xây dựng được quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid ở quy mô

500 g/mẻ từ nguyên liệu piperonal với hiệu suất toàn phần đạt được là 42%

152

đạt tiêu chuẩn dược dụng.

Đã đánh giá được độc tính cấp và độ ổn định cho sản phẩm berberin clorid.

✓ Đã nghiên cứu độ ổn định của nguyên liệu berberin clorid ở hai điều kiện:

lão hóa cấp tốc và điều kiện dài hạn. Kết quả dự đoán tuổi thọ của nguyên

liệu berberin clorid tổng hợp là 24 tháng ở điều kiện bảo quản dài hạn.

✓ Đã đánh giá được độc tính cấp của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp

được. Kết quả thu được mức liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50)

của nguyên liệu berberin chlorid là 4,0 (2,3 - 5,6) g/kg.

Kiến nghị

Để tiếp tục nghiên cứu ứng dụng được quy trình tổng hợp berberin phục vụ nhu

cầu lớn về dược chất này, chúng tôi đưa ra một số kiến nghị sau:

- Phát triển thành quy trình tổng hợp berberin clorid ở quy mô pilot.

- Ứng dụng dược chất berberin clorid tổng hợp được để bào chế nhằm tăng độ

153

tan, tính thấm cũng như cải thiện sinh khả dụng cho bererin.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

1. Nguyễn Minh Ngọc, Trần Thị Kim Ngân, Nuyễn Văn Phương, Nguyễn Thị Hường, Nguyễn Văn Hải, Nguyễn Đình Luyện (2018), ‘Nghiên cứu tổng hợp berberin từ piperonal”, Tạp chí hóa học, Số 4E2355, tháng 7/2018, tr.240 - 243.

2. Nguyễn Minh Ngọc, Phạm Trung Kiên, Nguyễn Thị Hường, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Văn Hải, Nguyễn Đình Luyện (2019) “Nghiên cứu quy trình tổng hợp, tinh chế berberin clorid dược dụng”, Tạp chí Hóa học, Tập 57, Số 6E1,2, Tháng 12/2019, tr. 441 - 446 .

154

3. Nguyễn Đình Luyện, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Minh Ngọc, Lê Thị Hương, Phạm Trung Kiên, Nguyễn Văn Hải, (2019), “Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid làm nguyên liệu quan trọng điều chế berberin”, Nghiên cứu Dược và Thông tin thuốc, Số 1, năm 2019, tr. 21 - 26.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

1. Nguyễn Tiến Bân, Trần Đình Lý, Nguyễn Tập, Vũ Văn Dũng, Nguyễn Nghĩa

Thìn, Nguyễn Văn Tiến, Nguyễn Khắc Khôi (2007), Sách đỏ Việt Nam Phần II. Thực

Vật, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ. tr. 7–10.

2. Bộ môn Công nghiệp Dược (2012), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, nhà xuất bản

Y học.

3. Bộ Y Tế (2014), “Thông tư 44/2014/TT-BYT”, Thông tư quy định việc đăng ký

thuốc.

4. Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, của Bộ y tế ban hành theo quyết định

5258/QĐ-BYT ngày 28 tháng 11 năm 2017, tr. 143 – 145.

5. Bộ y tế (2015), “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông

y, thuốc từ dược liệu” của Bộ y tế ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày

27 tháng 10 năm 2015.

6. Nguyễn Văn Đàn, Ngô Ngọc Khuyến (1999), Hợp chất thiên nhiên dùng làm

thuốc, nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

7. Nguyễn Văn Hân, Nguyễn Văn Hải (2017), "Chiết xuất berberin từ vàng đắng

bằng nước vôi", Tạp chí Dược học, tập 1 (số 489), tr. 57-61.

8. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, tr.189-195, nhà xuất

bản Y học, Hà Nội.

9. Lại Đức Lưu và cộng sự (2014), ‘‘Sản xuất sinh khối rễ cây Hoàng liên gai làm

nguồn dược liệu cho sản xuất berberin bằng công nghệ khí canh’’, Tạp chí Khoa học

và Phát triển, tập 12(số 8), tr. 1266-1273.

Tiếng Anh

10. Association of South East Asian Nations (2013), Asean Guideline on Stability

Study of Drug Product, 25 th ACCSQ-PPWG.

11. Amritpal S. et al. (2010), “Berberine: alkaloid with wide spectrum of

155

pharmacological activities”, J. Nat. Prod., vol. 3, pp. 64-75.

12. Battu S. K. et al.(2010), “Physicochemical Characterization of Berberine

Chloride: A Perspective in the Development of a Solution Dosage Form for Oral

Delivery”, AAPS Pharm.Sci.Tech, vol. 11, no. 3, pp. 1466-1475.

13. Bentley K. W. (2005),“β-Phenylethylamines and the isoquinoline alkaloids

Kenneth”, Nat. Prod. Rep, vol. 22, no. 2, pp. 249-268.

14. Bian X., He L. and Yang G. (2006), “Synthesis and antihyperglycemic

evaluation of various protoberberine derivatives”, Bioorganic Med. Chem. Lett., vol.

16, no. 5, pp. 1380-1383.

15. Brown C. A. (1970), “Catalytic hydrogenation. V. Reaction of sodium

borohydride with aqueous nickel salts. P-1 nickel boride, a convenient, highly active

nickel hydrogenation catalyst”, J. Org. Chem., vol. 35, no. 6, pp. 1900-1904.

16. Brown C. A. and Ahuja V. K. (1973), “Catalytic hydrogenation. VI. Reaction

of sodium borohydride with nickel salts in ethanol solution. P-2 Nickel, a highly

convenient, new, selective hydrogenation catalyst with great sensitivity to substrate

structure,” J. Org. Chem., vol. 38, no. 12, pp. 2226-2230.

17. Brusq J.M. et al.(2006), “Inhibition of lipid synthesis through activation of

AMP kinase: an additional mechanism for the hypolipidemic effects of berberine”, J.

Lipid Res., vol. 47, no. 6, pp. 1281-1288.

18. Chu M, Xiao R, Yin Y, Wang X, Chu Z.et al.(2014), "Berberine: A Medicinal

Compound for the Treatment of Bacterial Infections", Clin Microbial, 3, pp. 150.

19. Chueh W. H., Lin J. Y. (2012), “Protective effect of isoquinoline alkaloid

berberine on spontaneous inflammation in the spleen, liver and kidney of non-obese

diabetic mice through down-regulating gene expression ratios of pro-/anti-

inflammatory and Th1/Th2 cytokines”, Food Chemistry, 131, pp. 1263-1271.

20. Chun Y. T. et al.(1979), “A biochemical study on the hypotensive effect of

berberine in rats”, Gen. Pharmacol. Vasc. Syst., vol. 10, no. 3, pp. 177-182.

21. Ciacciaa M. and Di Stefano S. (2015), "Mechanisms of Imine Exchange

Reactions in Organic Solvents", Organic & Biomolecular Chemistry, 13(3), pp. 646-

156

654.

22. Clayden J., Greeves. N and Warren. S (2012), Organic chemistry. Oxford

University Press.

23. Cheng C.et al.(2017) "A Concisely Convergent Synthesis of Berberine Chloride",

Chin. J. Org. Chem, 37, pp. 503-507.

24. Cheng C.et al.(2016) "A Novel Synthetic Route for Berberine Chloride", Chin. J.

Org. Chem, 36, pp. 1426-1430.

25. Chen C., Luo Z. , Yang H. et al. (2016), "A Novel Synthetic Route for Berberine

Chloride", Chinese Journal of Organic Chemistry, 36(6), pp.1426-1430.

26. Chen C., Luo Z. , Yang H. et al. (2016), "A Novel Synthetic Route for Berberine

Chloride", Chinese Journal of Organic Chemistry, 36(6), pp.1426-1430.

27. Darosa F. A. et al., (2003), “Synthesis of new indolecarboxylic acids related to

the plant hormone indoleacetic acid IAA”, J. Braz. Chem. Soc., 14(1), pp. 11-15.

28. David E. W. (1929), "Nitrostyrene (styrenne, β-nitro-)", Organic. Syntheses, 9, p.

66.

29. Desai AB, Shah KM, Shah DM (1971), “Berberine in treatment of diarrhoea”,

Indian Pedi04atr, 8(9), pp. 462-465.

30. Diogo C.V.et al.(2011), “Berberine as a promising safe anti-cancer agent - is there

a role for mitochondria?”, Curr Drug Targets, 12(6), Pp. 850-859.

31. Dong H. et al. (2012), “Berberine in the treatment of type 2 diabetes mellitus: a

systemic review and meta-analysis”, Evidence-Based Complement. Altern. Med., vol.

2012, Article ID 591654.

32. Frick S, Kutcham T.M (1999), "Molecular cloning and functional expression of

O-methyltransferases common to isoquinoline alkaloid and phenylpropanoid

biosynthesis", Plant J. . 17, pp. 329 – 339.

33. Freile M. L. et al.(2003), “Antimicrobial activity of aqueous extracts and of

berberine isolated from Berberis heterophylla”, Fitoterapia, vol. 74, no. 7, pp. 702-

705.

34. Gao CR, Zhang JQ, Huang QL. (1997), "Experimental study on the insulin

sensitivity increating effect of berberin in insulin resistance rat models", Chinese

157

Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 3(4), pp. 282-285.

35. Gatland A. E. et al. (2014),“Short and efficient syntheses of protoberberine

alkaloids using palladium-catalyzed enolate arylation”, Angew. Chemie - Int. Ed., vol.

53, no. 52, pp. 14555-14558.

36. Guy M. et al.(2008), "The Henry Reaction: Spectroscopic Studies of Nitrile

and Hydroxylamine By-products Formed During Synthesis of Psychoactive

Phenylalkylamines", Central European Journal of Chemistry, 6(4), pp. 526-534.

37. Gardner Z, McGuffin M. (2013), American Herbal Products Association’s

Botanical Safety Handbook, 2nd ed., New York: CRC Press;. pp. 130–132.

38. Han A. M., Heo H., & Kwon Y. K. (2012),“Berberine Promotes Axonal

Regeneration in Injured Nerves of the Peripheral Nervous System”, J Med Food,

15(4), Pp. 413-417.

39. Han Y.G and Lee J.H. (2005), “Berberine synergy with amphotericin B against

disseminated candidiasis in mice”, Biol. Pharm. Bull., vol. 28, no. 3, pp. 541-544.

40. Hasada K. et al. (2011), “Application of 1H-NMR spectroscopy to validation

of berberine alkaloid reagents and to chemical evaluation of Coptidis Rhizoma”, J.

Nat. Med., vol. 65, no. 2, pp. 262-267.

41. Hansen M. et al.(2015), "Synthesis and pharmacological evaluation of N-

benzyl substituted 4-bromo-2,5-dimethoxyphenethylamines as 5-HT2A/2C partial

agonists", Bioorganic & Medicinal Chemistry, 23, pp. 3933-3937.

41. Hossain M. S. et al. (2018), "Selected Schiff bazơ coordination complexes and

their microbial application: A review", International Journal of Chemical Studies,

6(1), pp. 19-31.

42. Huang L.et.al.(2010), “Berberin derivatives, with substituted amino groups

linked at the 9-position, as inhibitors of acetylcholinesterase/butyrylcholinesterase”,

Bioorg. Med. Chem. Lett, 20,pp. 6649-6652.

43. IngkaninanK. et al. (2006), “Acetylcholinesterase inhibitors from Stephania

venosa tuber”, J. Pharm. Pharmacol, 58, pp. 695-700.

44. Jademyr S. (2018), "Synthesis of Conformationally Restrained Serotonin 2A

Agonists Probing for Functional Selectivity", Department of Chemistry and

158

Molecular Biology University of Gothenburg, pp. 30.

45. JiH. F. and Shen L. (2011), “Berberin: A Potential Multipotent Natural Product

to Combat Alzheimer’s Disease”, Molecules, 16, pp. 6732-6740.

46. Jung H.A.et.al.(2009), “Anti-Alzheimer and antioxidant activities of Coptidis

Rhizoma alkaloids”, Biol. Pharm. Bull., 32, pp. 1433-1438.

47. Kheir MM, Wang Y, Hua L, Hu J, Li L, Lei F, Du L (2010), Acute toxicity of

berberine and its correlation with the blood concentration in mice, Food Chem

Toxicol, 48(4):1105-10.

48. Kulkarni SK, Dandiya PC, Varandani NL (1972), “Pharmacological

investigations of berberine sulphate””, Jpn J Pharmacol, 22(1):11-6.

49. Kametani T. et. al. (1969), “Studies on the Syntheses of Heterocyclic

Compounds. Part CCCII.l Alternative Total Syntheses of (Nandinine, Canadine, and

Berberine Iodide)”, J. Chem. Soc. C Org., vol. 15, pp. 2036-2038.

49. Kim W. S. et. al. (2009) "Berberine improves lipid dysregulation in obesity by

controlling central and peripheral AMPK activity", Am J Physiol Endocrinol Metab,

296, pp. 812-819.

50. Ko B. S., Choi S. B., Park S. K., et al.(2005), "Insulin sensitizing and

insulinotropic action of berberine from Cortidis rhizoma", Biol Pharm Bull, 28, pp.

1431-1437.

51. Kong W.J. et al.(2008), “Combination of simvastatin with berberine improves

the lipid-lowering efficacy”,Metabolism, vol. 57, no. 8, pp. 1029-1037.

52. Kong W. J.et. al(2012), “Effect of berberine on Escherichia coli, Bacillus

subtilis, and their mixtures as determined by isothermal microcalorimetry”, Appl

Microbiol Biotechnol, 96, pp. 503-510.

53. Koppen L. M. et al. (2017), “Efficacy of Berberine Alone and in Combination

for the Treatment of Hyperlipidemia: A Systematic Review”, J Evid Based

Complementary Altern Med, 22(4), Pp. 956-968.

54. Koseki Y. et al. (2003), “Total synthesis of lennoxamine and chilenine via ring-

expansion of isoindoloisoquinoline to isoindolobenzazepine”, Heterocycles, vol. 59,

159

no. 2, pp. 527-540.

55. Kulkarni P. M. et al.(2016), “Novel Electrophilic and Photoaffinity Covalent

Probes for Mapping the Cannabinoid 1 Receptor Allosteric Site(s)”, J. Med. Chem.,

vol. 59, no. 1, pp. 44-60.

56. Lee Y. S., Kim W. S., Kim K. H., et al. (2006), "Berberine, a natural plant

product, activates AMP-activated protein kinase with beneficial metabolic effects in

diabetic and insulin-resistant states", Diabetes, 55, pp. 2256-2264.

57. Li J. et al. (2012), “A fluorescence ‘turn-on’ chemodosimeter for Cu2+ in

aqueous solution based on the ion promoted oxidation”, Dalt. Trans., vol. 41, no. 13,

p. 3623.

58. Liu D. and Zhang W. (2010), “Some Progress in Organic Synthesis of

Pharmaceuticals in China”, Pharmaceutical Process Chemistry, 2010, pp. 273-302.

59. Liu X. and Ji Q. (2015) “Berberine Inhibits Invasion and Metastasis of

Colorectal Cancer Cells via COX-2/PGE2 Mediated JAK2/STAT3 Signaling

Pathway”, PLoS One, 10(5).

60. Liu Y. et al. (2008),“Protective effects of berberine on radiation-induced lung

injury via intercellular adhesion molecular-1 and transforming growth factor-beta-1

in patients with lung cancer”, European Journal of Cancer, 44(16), Pp. 2425-2432.

61. Lu B. et al. (2010),“Cytotoxicity of berberine on human cervical carcinoma

HeLa cells through mitochondria, death receptor and MAPK pathways, and in-silico

drug-target prediction”, Toxicology in Vitro, 24(6), Pp. 1482-1490.

62. Liu Y., Lu Y., Prashad M. et al. (2005), "A practical and chemoselective

reduction of nitroarenes to anilines using activated iron", Advanced synthesis &

catalysis, 347(2‐3), pp.217-219.

63. Liu, Y. T., H. P. Hao, H. G. Xie, L. Lai, Q. Wang, C. X. Liu, et G. J. Wang.

2010. "Extensive intestinal first-pass elimination and predominant hepatic

distribution of berberine explain its low plasma levels in rats." Drug Metab Dispos

38 (10):1779-84. doi: 10.1124/dmd.110.033936.

64. Liu, C. S., Y. R. Zheng, Y. F. Zhang, et X. Y. Long. 2016. "Research progress

on berberine with a special focus on its oral bioavailability." Fitoterapia 109:274-82.

160

doi: 10.1016/j.fitote.2016.02.001.

65. Maresh J. J.et al. (2014), “Chemoselective Zinc/HCl reduction of halogenated

β-nitrostyrenes: synthesis of halogenated dopamine analogues”, Synlett., 25(20), pp.

2891-2894.

66. Marin-NetoJ. A. et al.(1988), “Cardiovascular effects of berberine in patients

with severe congestive heart failure”, Clin. Cardiol., vol. 11, no. 4, pp. 253-260.

67. Merck & Co. Rahway (1983), The Merck Index (10th Ed).

68. Ming M. et al. (2014),“Dose-Dependent AMPK-Dependent and Independent

Mechanisms of Berberine and Metformin Inhibition of mTORC1, ERK, DNA

Synthesis and Proliferation in Pancreatic Cancer Cells”, PLoS One, 9(12).

69. Morgan M, Bone K, Mills S, McMillan J. (2005), Safety monographs. In:

Mills, The Essential Guide to Herbal Safety. USA: Elsevier Health Sciences; pp. 255–

261.

70. Ning N, Wang YZ, Zou ZY, Zhang DZ, Wang DZ, Li XG (2015),

Pharmacological and safety evaluation of fibrous root of Rhizoma Coptidis, Environ

Toxicol Pharmacol, 39(1):53-69.

71. Nakagawa K. et al. (1984), “Release and crystallization of berberine in the

liquid medium of Thalictrum minus cell suspension cultures”, Plant Cell Rep., vol.

3, no. 6, pp. 254-257.

72. Nechepurenko I. V., Salakhutdinov N. F and Tolstikov G. A.(2010),

“Berberine: Chemistry and Biological Activity”, Chemistry for Sustainable

Development, 18, Pp. 1-23.

73. Nagaraja D., Pasha M. (1999), "Reduction of aryl nitro compounds with

aluminium/NH4Cl: effect of ultrasound on the rate of the reaction", Tetrahedron

letters, 40(44), pp.7855-7856.

74. Osby J. O. et al. (1985), “Reduction Of Nitroalkanes to Amines Using Sodium

Borohydride - Nickel(II)Chloride - Ultrasound”, Tetrahedron Lett., 26(52), pp. 6413-

6416.

75. Osby J. O. and Ganem B. (1985), "Rapid and eficent reduction of alphatic nitro

161

compounds to amines", Tetrahedron Letters, 26(S2), pp. 6413-6416.

76. Pan G. Y., Wang G.J.,Sun J. G.et al. (2003), "Inhibitory action of berberine on

glucose absorption", Yao Xue Xue Bao, 38, pp. 911-914.

77. Pan G. Y.et al. (2003), "The antihyperglycaemic activity of berberine arises

from a decrease of glucose absorption", Planta Med, 69, pp. 632-636.

78. Pirillo A, Catapano A. L. (2015),"Berberine, a plant alkaloid with lipid- and

glucoselowering properties: From in vitro evidence to clinical studies",

Atherosclerosis, 243(2), pp. 449-461.

79. PictetA. and Gams A. (1911), “Synthese des Berberins”, Eur. J. Inorg. Chem.,

vol. 44, no. 3, pp. 2480-2485.

80. Peychev L. (2005), Pharmacological investigation on the cardiovascular

effects of Berberis vulgaris on tested animals, Pharmacia, 52:118–121.

81. Phillips B. (2016), Catalytic Transfer Hydrogenation of Nitroalkenes to

Primary Amines, Ursinus College, p. 21.

82. Qing Y. et al.(2018), “Berberine promoted myocardial protection of

postoperative patients through regulating myocardial autophagy”, Biomedicine &

Pharmacotherapy, 105, pp. 1050-1053.

83. Reddy V., Jadhav A. S. and Anand R. V. (2015), “A room-temperature

protocol to access isoquinolines through Ag(I) catalysed annulation of o-(1-

alkynyl)arylaldehydes and ketones with NH4OAc: elaboration to berberine and

palmatine”, Org. Biomol. Chem., vol. 13, no. 12, pp. 3732-3741.

84. Ramadas K., Srinivasan N. (1992), "Iron-ammonium chloride-a convenient and

inexpensive reductant", Synthetic communications, 22(22), pp.3189-3195.

85. Reeve W. and Eareckson III. W. M. (1950), “Preparation of

Homopiperonylamine by Hydrogenation of 3, 4-Methylenedioxybenzyl Cyanide

over Raney Cobalt Catalyst”, J. Am. Cthem. Soc., vol. 72, no. 7, pp. 3299-3300.

86. Roselli M. et al. (2016), "Synthesis and evaluation of berberine derivatives and

analogs as potential antiacetylcholinesterase and antioxidant agents", Phytochemistry

Letters, 18, pp. 150-156.

87. Rosini. G. (1991), "The Henry (Nitroaldol) Reaction", Comprehensive

162

Organic Synthesis, Volume 2, Pp. 321-340.

88. Schor J., (2012), "Clinical Applications for Berberine", Natural medicine

journal, Vol. 4. Issue 12.

89. Sun Y. et. al. (2018), “Oncosis-like cell death is induced by berberine through

ERK1/2-mediated impairment of mitochondrial aerobic respiration in gliomas”,

Biomedicine & Pharmacotherapy,102, Pp 699-710.

90. Singh N and Sharma B (2018) Toxicological Effects of Berberine and

Sanguinarine, Front. Mol. Biosci., 5:21

91. Seyede Zohre Kamrani Rad, Maryam Rameshrad, Hossein Hosseinzadeh

(2017), “”Toxicology effects of Berberis vulgaris (barberry) and its active

constituent, berberine: a review”, Basic Med Sci, 20:516-529.74.

92. The Japanese pharmacopoeia seventeenth edition (2016).

93. Henry Tong et al., (2010), “Process‐Induced Phase Transformation of

Berberine Chloride Hydrates”, Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 99,

Issue 4, April 2010, Pages 1942-1954

94. Tsukinoki T., Tsuzuki H. (2001), "Organic reaction in water. Part 5. Novel

synthesis of anilines by zinc metal-mediated chemoselective reduction of

nitroarenes", Green Chemistry, 3(1), pp.37-38.

95. Vinogradova V. I. et al.(1990), “Syntheses based onβ-phenylethylamines. I.

Preparation of substitutedβ-phenylethylamines”, Chem. Nat. Compd., vol. 26, no. 1,

pp. 54-59.

96. Vogel. A. I. et al. (1989), Vogel’s textbook of Practical Organic Chemistry 5th

Edition, Longman Scientific and Technical Wiley, pp. 1035-1036.

97. X.X. Cheng, Xiao et al (2013), “Thermal behavior and thermodynamic

properties of berberine hydrochloride”, J Therm Anal Calorim, 114:1401–1407

98. Wallace G. C. et al.(2013),“Targeting Oncogenic ALK and MET: A Promising

Therapeutic Strategy for Glioblastoma”, Metab Brain Dis, 28(3), Pp. 355-366.

99. Wang K. et al.(2016), “Synergistic chemopreventive effects of curcumin and

berberine on human breast cancer cells through induction of apoptosis and autophagic

163

cell death”, Scientific Reports, 6, Article number: 26064.

100. Wang Y. X. et al.(2012), “Synthesis and structure-activity relationship of

berberine analogues in LDLR up-regulation and AMPK activation”, Bioorganic Med.

Chem., vol. 20, no. 22, pp. 6552-6558.

101. Wang Y. X. et al.(2009), “Synthesis and biological evaluation of berberine

analogues as novel up-regulators for both low-density-lipoprotein receptor and

insulin receptor”, Bioorganic Med. Chem. Lett., vol. 19, no. 21, pp. 6004-6008.

102. Wojtyczka R. et. al. (2014), "Berberine Enhances the Antibacterial Activity

of Selected Antibiotics against Coagulase-Negative Staphylococcus Strains in Vitro",

Molecules, 19, pp. 6583-6596.

103. Wu M.,Wang J, and Liu L. (2010), “Advance of studies on anti-

atherosclerosis mechanism of berberine”, Chin. J. Integr. Med., vol. 16, no. 2, pp.

188-192.

104. Wu Y. et. al. (2011), "In vivo and in vitro antiviral effects of berberine on

influenza virus", Chin J Integr Med, 17(6), pp. 444-452.

105.Yamaji T. et al. (2018), “Spectral Database for Organic Compounds SDBS.

National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Japan”.

106. Yang P. et al. (2008), “Synthesis and structure-activity relationships of

berberine analogues as a novel class of low-density-lipoprotein receptor up-

regulators”, Bioorg. Med. Chem. Lett., vol. 18, no. 16, pp. 4675-4677.

107.Yeşilada E. and Küpeli E. (2002), “Berberis crataegina DC. root exhibits

potent anti-inflammatory, analgesic and febrifuge effects in mice and rats”, J.

Ethnopharmacol., vol. 79, no. 2, pp. 237-248.

108. Yin J, Hu R, Chen M, et al. (2002) "Effects of berberine on glucose

metabolism in vitro", Metabolism., 51, pp. 1439-1443.

109. Yin J, Chen M, Tang J, et al. (2004), "Effects of berberine on glucose and

lipid metabolism in animal experiment", Chinese Journal of Diabetes, 12, pp. 215-

218.

110. Yin J, Gao Z, Liu D, et al.(2008), "Berberine improves glucose metabolism

through induction of glycolysis", Am J Physiol Endocrinol Metab. in press, 294(1),

164

pp. 148-156.

111. Yin J., Xing H. (2008), “Efficacy of Berberine in Patients with Type 2

Diabetes”, Metabolism, vol. 57, no. 5, pp. 712-717.

112. Yang P., Song D.Q., Li Y.H. et al, (2008), "Synthesis and structure–activity

relationships of berberine analogues as a novel class of low-density-lipoprotein

receptor up-regulators", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 18(16), pp.4675-

4677.

113.Yoo S. E. et al. (1990), “Reduction of Organic Compounds with Sodium

Borohydride-Copper(II) Sulfate System”, Synlett, 7, pp. 419-420.

114. Yi J, Ye X, Wang D, He K, Yang Y, Liu X, Li X (2013) Safety evaluation of

main alkaloids from Rhizoma Coptidis,J Ethnopharmacol, 145(1):303-10.

115 .Zhang D., Li A., Xie J.,Ji C. (2010), “In vitro antibacterial effect of berberine

hydrochloride and enrofloxacin to fish pathogenic bacteria”, Aquaculture Research,

41,pp. 1095-1100.

116. Zhang R. X. et al. (1990),“Laboratory studies of berberine used alone

and in combination with 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea to treat malignant brain

tumors”, Chin Med J (Engl), 103(8), pp.658-665.

117. Zhuangyu Z. et al. (1990), “A facile approach to 2-arylethylamines via

polymeric palladium catalyst”, Synth. Commun., vol. 20, no. 22, pp. 3563-3574.

118. Zhou L, Yang Y, Wang X, et al. (2007), "Berberine stimulates glucose

transport through a mechanism distinct from insulin", Metabolism, 56, pp. 405-412.

Tài liệu tiếng Trung

119. 夏正君, 陈再新, 陶锋马绍明 (2012), “盐酸小檗碱的制备方法”.

(Zhengjun X. et al. (2012), “Preparation method of berberine hydrochloride”)

120. 潘俊芳, 余琛, 朱大元, 张慧任建英 (2005), “六种异喹啉生物碱”.

(Junfang P. et al.(2005), “Six isoquinoline alkaloids”)

121. 陈绍全, 林维凤, 臧家惠, 刘久知, 齐淑华, 张丽秋宋桂丽 (2004), “黄

连素及其盐类的制备方法”.

165

(Shaoquan C.,Weifeng L.et al (2004), “Preparation of berberine and its salts”)

Website

122. http://mims.com/vietnam/drug/search?q=berberin truy cập ngày 20/12/2020

166

123. VIFITEH, " https://vifiteh.ru/", truy cập ngày 20/12/2020.

PHỤ LỤC

Tên phụ lục TT

Phụ lục 1. Phổ MS hợp chất 3,4-dihydroxybenzaldehyd 1

Phụ lục 2. Phổ 1H-NMR hợp chất 3,4-dihydroxybenzaldehyd 2

lục 3. Phổ

1H-NMR

giãn rộng hợp chất 3,4- 3 Phụ dihydroxybenzaldehyd

Phụ lục 4. Phổ 13C-NMR hợp chất 3,4-dihydroxybenzaldehyd 4

Phụ lục 5. Phổ MS hợp chất piperonal 5

Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR hợp chất piperonal 6

7 Phụ lục 7. Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất piperonal (Vùng 6,0 - 10,0 ppm)

8 Phụ lục 8. Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất piperonal (Vùng 6,90 - 7,50 ppm)

Phụ lục 9. Phổ 13C-NMR hợp chất piperonal 9

Phụ lục 10. Phổ 13C-NMR hợp chất piperonal 10

Phụ lục 11. Phổ MS hợp chất 61 11

Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR hợp chất 61 12

Phụ lục 13. Phổ 13C-NMR hợp chất 61 13

Phụ lục 14. Phổ IR hợp chất 61 14

Phụ lục 15. Phổ MS hợp chất 6a 15

Phụ lục 16. Phổ 1H-NMR hợp chất 6a 16

Phụ lục 17. Phổ 13C-NMR hợp chất 6a 17

Phụ lục 18. Phổ IR hợp chất 6a 18

Phụ lục 19. Phổ MS hợp chất 31 19

Phụ lục 20. Phổ 1H-NMR hợp chất 31 20

Phụ lục 21. Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất 31 (vùng 2.0 - 4,5 ppm) 21

Phụ lục 22. Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất 31 (vùng 5,0 - 7,5 ppm) 22

Phụ lục 23. Phổ 13C-NMR hợp chất 31 23

Phụ lục 24. Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất 31 (Vùng 100 - 160 ppm) 24

Phụ lục 25. Phổ IR hợp chất 31 25

Phụ lục 26. Phổ MS hợp chất 1 26

Phụ lục 27. Phổ 1H-NMR hợp chất 1 27

Phụ lục 28. Phổ 13C-NMR hợp chất 1 28

Phụ lục 29. Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất 1 (vùng 95 - 155 ppm) 29

Phụ lục 30. Phổ IR hợp chất berberin clorid 30

Phụ lục 31. Phổ MS hợp chất 62 31

Phụ lục 22. Phổ 1H – NMR hợp chất 62 32

33 Phụ lục 33. Phổ 1H – NMR giãn rộng hợp chất 62 (Vùng 3,5 – 11,5 ppm)

Phụ lục 34. Phổ 1H – NMR giãn rộng hợp chất 62 (Vùng 7,0 – 7,4 ppm) 34

Phụ lục 35. Phổ 13C – NMR hợp chất 62 35

Phụ lục 36. Phổ 13C – NMR giãn rộng hợp chất 62 (Vùng 50 - 160 ppm) 36

Phụ lục 37. Phổ IR hợp chất 62 37

Phụ lục 38. Phổ MS hợp chất 63 38

Phụ lục 39. Phổ 1H – NMR hợp chất 63 39

Phụ lục 40. Phổ 13C – NMR hợp chất 63 40

Phụ lục 41. Phổ IR hợp chất 63 41

42 Phụ lục 42: Phiếu kiểm nghiệm berberin clorid ở quy mô 100 g/mẻ theo tiêu chuẩn DĐVN V

43 Phụ lục 43: Phiếu kiểm nghiệm berberin clorid ở quy mô 500 g/mẻ theo tiêu chuẩn cơ sở đề xuất

Phụ lục 1. Phổ MS hợp chất 3,4-dihydroxybenzaldehyd

Phụ lục 2. Phổ 1H-NMR hợp chất 3,4-dihydroxybenzaldehyd

Phụ lục 3. Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất 3,4-dihydroxybenzaldehyd

Phụ lục 4. Phổ 13C-NMR hợp chất 3,4-dihydroxybenzaldehyd

Phụ lục 5. Phổ MS hợp chất piperonal

Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR hợp chất piperonal

Phụ lục 7. Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất piperonal (Vùng 6,0 - 10,0 ppm)

Phụ lục 8. Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất piperonal (Vùng 6,90 - 7,50 ppm)

Phụ lục 9. Phổ 13C-NMR hợp chất piperonal

Phụ lục 10. Phổ 13C-NMR hợp chất piperonal

Phụ lục 11. Phổ MS hợp chất 61

Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR hợp chất 61

Phụ lục 13. Phổ 13C-NMR hợp chất 61

Phụ lục 14. Phổ IR hợp chất 61

Phụ lục 15. Phổ MS hợp chất 6a

Phụ lục 16. Phổ 1H-NMR hợp chất 6a

Phụ lục 17. Phổ 13C-NMR hợp chất 6a

Phụ lục 18. Phổ IR hợp chất 6a

Phụ lục 19. Phổ MS hợp chất 31

Phụ lục 20. Phổ 1H-NMR hợp chất 31

Phụ lục 21. Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất 31 (vùng 2.0 - 4,5 ppm)

Phụ lục 22. Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất 31 (vùng 5,0 - 7,5 ppm)

Phụ lục 23. Phổ 13C-NMR hợp chất 31

Phụ lục 24. Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất 31 (Vùng 100 - 160 ppm)

Phụ lục 25. Phổ IR hợp chất 31

Phụ lục 26. Phổ MS hợp chất 1

Phụ lục 27. Phổ 1H-NMR hợp chất 1

Phụ lục 28. Phổ 13C-NMR hợp chất 1

Phụ lục 29. Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất 1 (vùng 95 - 155 ppm)

Phụ lục 30. Phổ IR hợp chất berberin clorid

Phụ lục 31. Phổ MS hợp chất 62

Phụ lục 32. Phổ 1H – NMR hợp chất 62

Phụ lục 33. Phổ 1H – NMR giãn rộng hợp chất 62 (Vùng 3,5 – 11,5 ppm)

Phụ lục 34. Phổ 1H – NMR giãn rộng hợp chất 62 (Vùng 7,0 – 7,4 ppm)

Phụ lục 35. Phổ 13C – NMR hợp chất 62

Phụ lục 36. Phổ 13C – NMR giãn rộng hợp chất 62 (Vùng 50 - 160 ppm)

Phụ lục 37. Phổ IR hợp chất 62

Phụ lục 38. Phổ MS hợp chất 63

Phụ lục 39. Phổ 1H – NMR hợp chất 63

Phụ lục 40. Phổ 13C – NMR hợp chất 63

Phụ lục 41. Phổ IR hợp chất 63

Phụ lục 42. Phiếu kiểm nghiệm berberin clori quy mô 100 g/mẻ theo tiêu chuẩn

dược điển Việt Nam V

Phụ lục 43. Phiếu kiểm nghiệm berberin clorid quy mô 500 g/mẻ theo tiêu chuẩn

cơ sở đề xuất