Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:227

Thêm vào BST

Báo xấu

70
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của Luận án nhằm xây dựng được quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 500g/mẻ đạt tiêu chuẩn dược dụng. Đánh giá được độc tính cấp và độ ổn định của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MINH NGỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP BERBERIN CLORID LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MINH NGỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP BERBERIN CLORID CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM & BÀO CHẾ MÃ SỐ: 62720402 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Đình Luyện HÀ NỘI – 2020
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là một phần công trình nghiên cứu của một tập thể mà tôi là thành viên. Tôi được toàn bộ các thành viên đồng ý cho phép sử dụng các số liệu trong luận án. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác. NCS. Nguyễn Minh Ngọc
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Đình Luyện người Thầy đã nhiệt tình hướng dẫn, hết lòng giúp đỡ, dìu dắt, chỉ bảo, động viên, khích lệ tôi để tôi có động lực hoàn thành luận án này. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Văn Hải, TS. Nguyễn Văn Giang, TS. Nguyễn Thị Hường, TS. Đào Nguyệt Sương Huyền đã quan tâm đặc biệt, hỗ trợ tôi đa cho tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Đăng Hòa, GS.TS. Nguyễn Hải Nam, PGS.TS. Từ Minh Koóng, PGS.TS. Đàm Thanh Xuân, PGS.TS. Đinh Thị Thanh Hải đã cho tôi những gợi ý quý báu trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn toàn thể các Thầy, Cô giáo tại Bộ Môn công nghiệp Dược, trường Đại Học Dược Hà Nội, Ban giám hiệu trường Cao Đẳng Dược TW Hải Dương, Bộ môn Bào chế, Phòng nghiên cứu khoa học, phòng tài chính kế toán trường Cao Đẳng Dược TW Hải Dương, đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến sự giúp đỡ, cộng tác của các Thầy cô, anh chị của Quý cơ quan: Cục khoa học công nghệ và đào tạo – Bộ Y Tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, Viện Hóa Học - Viện Hàn lâm khoa học và Công Nghệ Việt Nam, Khoa hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý – Đại học Dược Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, Phòng tổ chức Cán bộ, các Phòng chức năng, Bộ môn chuyên ngành công nghệ Dược phẩm và Bào chế thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Song Hà, PGS.TS.Nguyễn Thị Thanh Duyên, TS. Đỗ Hồng Quảng, TS. Nguyễn Trần Linh, TS. Đỗ Huy Hoàng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các học viên cao học, các thế hệ sinh viên dược đã cùng tôi làm việc để hoàn thành được những kết quả trong luận án. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bố mẹ, anh chị người thân và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi suốt những năm qua. NCS. Nguyễn Minh Ngọc
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................... 1 DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................... 3 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ............................................................... 6 ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 2 1.1. Khái quát chung về berberin clorid ........................................................ 2 1.1.1. Đặc điểm cấu trúc hóa học................................................................... 2 1.1.2. Tính chất hóa lý ................................................................................... 3 1.1.3. Ứng dụng trong lâm sàng..................................................................... 4 1.1.4. Tác dụng dược lý ................................................................................. 5 1.2. Phương pháp sản xuất berberin .............................................................. 9 1.2.1. Phương pháp chiết xuất từ dược liệu ................................................... 9 1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học ......................................................... 10 1.3. Phân tích và lựa chọn phương pháp tổng hợp berebrin ..................... 20 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 23 2.1. Nguyên liệu, thiết bị ................................................................................ 23 2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................ 23 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................ 24 2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 26 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 26 2.3.1. Tổng hợp hóa học và tinh chế sản phẩm, khảo sát các thông số tối ưu ...................................................................................................................... 26 2.3.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết................................................... 28 2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học ............................................ 28 2.3.4. Phương pháp đánh giá chất lượng nguyên liệu berberin clorid ......... 28 2.3.5. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định của nguyên liệu tổng hợp được ...................................................................................................................... 29 2.3.6. Phương pháp thử độc tính cấp của nguyên liệu tổng hợp được ........ 30 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ ...................................................... 32
3.1. Xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm .................................................................................................................... 32 3.1.1. Phương pháp tổng hợp berberin clorid thông qua trung gian homopiperonylamin hydroclorid ................................................................. 32 3.1.2. Phương pháp mới tổng hợp berberin clorid từ 2,3- dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim ... 52 3.1.3. So sánh các phương pháp tổng hợp berberin clorid ở quy mô phòng thí nghiệm.......................................................................................................... 56 3.2. Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc hóa học của các chất tổng hợp được ........................................................................................... 56 3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết ......................................................................... 56 3.2.2. Khẳng định cấu trúc sản phẩm tổng hợp được .................................. 58 3.3. Xây dựng quy trình tinh chế berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V ................................................... 65 3.3.1. Quy trình tiến hành ............................................................................ 65 3.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng .......................................................... 65 3.3.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh chế theo tiêu chuẩn DĐVN V ... 66 3.4. Xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid quy mô 100 g/mẻ............................................................................................................ 68 3.4.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal ........... 68 3.4.2. Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4-methylendioxy- β-nitrostyren (61) ......................................................................................... 68 3.4.3. Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3- dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) ........................................................................................... 75 3.4.4. Tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3- dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) ..................................... 76 3.4.5. Tinh chế sản phẩm berberin thô đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V ở quy mô 100 g/mẻ.......................................................................... 77 3.5. Xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid quy mô 500 g/mẻ............................................................................................................ 80
3.5.1. Giai đoạn 1 - tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal ...................................................................................................... 80 3.5.2. Giai đoạn 2 - tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4- methylendioxy-β-nitrostyren (61) với tác nhân khử Fe ............................... 83 3.5.3. Giai đoạn 3 - tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3- dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) ........................................................................................... 86 3.5.5. Giai đoạn 4 - tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N- (2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) .............................. 89 3.5.6. Tinh chế sản phẩm berberin quy mô 500g/mẻ .................................. 92 3.6. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp.. 94 3.7. Kết quả nghiên cứu độ ổn định và thử độc tính cấp của nguyên liệu berberin tổng hợp..................................................................................... 97 3.7.1. Kết quả nghiên cứu độ ổn định .......................................................... 97 3.7.2. Kết quả thử độc tính cấp của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được .................................................................................................................... 101 Chương 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 111 4.1. Một số bàn luận về quy trình tổng hợp ............................................... 111 4.1.1. Về quy trình tổng hợp quy mô thí nghiệm....................................... 111 4.1.2. Về phương pháp tổng hợp berberin mới .......................................... 116 4.1.3. Về quy trình tổng hợp quy mô 500g/mẻ .......................................... 121 4.2. Bàn luận về quá trình tổng hợp hóa học, tinh chế và độ ổn định của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được ......................................... 127 4.2.1. Về các quá trình tổng hợp chất trung gian và sản phẩm cuối .......... 127 4.2.2. Cấu trúc hóa học của các hợp chất tổng hợp được .......................... 139 4.3. Về độ ổn định của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được ........... 144 4.5. Về tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được .................................................................................................................. 148 4.6. Về độc tính cấp của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được ........ 148 Kết luận Và kiến nghị ...................................................................................... 151
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ac Acetyl ACC Acetyl coenzym-A carboxylase AChE Acetylcholinesterase ADN Acid deoxyribonucleic AR Tiêu chuẩn phân tích (Analytical Reagent) AMPK Protein kinase được hoạt hóa bởi adenosin monophosphat (Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase) BBR Berberin clorid BChE Butyrylcholinesterase Bu n-Butyl COX Cyclooxygenase db Tỷ trọng biểu kiến DCM Dicloromethan DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxid đvC đơn vị Carbon Et Ethyl FBG Đường huyết lúc đói (Fasting Blood Glucose) HbA1c Hemoglobin A1c HPMC Hydroxypropyl methyl cellulose LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) LDLR Thụ thể lipoprotein tỉ trọng thấp LPS Phân tử gồm lipid và polysaccharid (Lipopolysaccharide) m/z Tỉ lệ khối lượng trên điện tích MAO Monoamin-oxidase mARN Acid ribonucleic thông tin (Messenger Ribonucleic Acid) MD Kháng nguyên biệt hóa myeloid (Myeloid Differentiation) Me Methyl MHz Megahertz MMP Proteinkinase kim loại trong chất nền ngoại bào (Matrix Metalloproteinkinase) MS Phổ khối (Mass Spectrometry)
NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) PBG Đường huyết sau bữa ăn (Postprandial blood glucose) Ph Phenyl Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor) SKLM Sắc ký lớp mỏng T2MD Đái tháo đường typ 2 TC Tổng nồng độ cholesterol toàn phần (Total Cholesterol) TFA Acid trifluoroacetic TG Triglycerid THF Tetrahydrofuran Tlag Thời gian tiềm tàng TLR Thụ thể giống Toll (Toll - like receptor) Ts p-Toluensulfonyl (tosyl) OECD Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (Organization for Economic Cooperation and Development;) ICH Hội đồng quốc tế về hài hòa các yêu cầu kỹ thuật về dược phẩm cho con người (International Conference on Harmonization) LD50 Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose 50%)
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh mục dung môi, hóa chất ..................................................................23 Bảng 2.2. Danh mục thiết bị, dụng cụ .......................................................................24 Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp chất 61 theo 2 phương pháp ..........................................35 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol nitromethan/piperonal tới hiệu suất phản ứng ....................................................................................................35 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất phản ứng ............36 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng ...........37 Bảng 3.5 Kết quả tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) theo 5 phương pháp ...........................................................................................................................42 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa NaBH4 và 3,4- methylendioxy-β-nitrostyren (61) đến hiệu suất phản ứng...............................43 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của xúc tác cho phản ứng khử hóa...............44 Bảng 3.8 Kết quả tổng hợp chất 31 theo 2 phương pháp ..........................................46 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa aldehyd và chất 6a..........47 Bảng 3.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các bazơ khác nhau đến hiệu suất phản ứng ngưng tụ .....................................................................................................47 Bảng 3.11 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng .........48 Bảng 3.12 Kết quả tổng hợp berberin clorid (1) theo 2 phương pháp ......................50 Bảng 3.13 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol đến hiệu suất phản ứng .....................50 Bảng 3.14 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng .....................51 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân khử hóa đến hiệu suất phản ứng tổng hợp 63 ................................................................................................54 Bảng 3.16. So sánh các phương pháp tổng hợp berberin clorid từ các nguyên liệu khác nhau ..........................................................................................................56 Bảng 3.17 Đặc điểm sắc ký lớp mỏng của các hợp chất tổng hợp được ..................56 Bảng 3.18 Nhiệt độ nóng chảy của các hợp chất tổng hợp được ..............................57 Bảng 3.19 Kết quả phân tích cấu trúc 61 ..................................................................58 Bảng 3.20 Kết quả phân tích cấu trúc 62 ..................................................................59 Bảng 3.21 Kết quả phân tích cấu trúc 63 ..................................................................60 Bảng 3.22 Kết quả phân tích cấu trúc 25a ................................................................61 Bảng 3.23 Kết quả phân tích cấu trúc 6a ..................................................................62 Bảng 3.24 Kết quả phân tích cấu trúc 31 ..................................................................63 Bảng 3.25 Kết quả phân tích cấu trúc 1 ....................................................................64 Bảng 3.26 Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất kết tinh Berberin clorid .............66
Bảng 3.27 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quy trình tinh chế ........................................66 Bảng 3.28 Kết quả kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V ........................................................................................................................67 Bảng 3.29 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 61 với tác nhân NaOH ở quy mô 100 g/mẻ ................................................................................68 Bảng 3.30 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 6a ....................69 Bảng 3.31 Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng ........................................................71 Bảng 3.32 Kết quả khảo sát tỷ lệ mol chất 61 : sắt ...................................................72 Bảng 3.33 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng .......................................................72 Bảng 3.34 Kết quả khảo sát dung môi ......................................................................73 Bảng 3.35 Kết quả khảo sát tỷ lệ alcol : nước...........................................................73 Bảng 3.36 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình cải tiến tổng hợp chất 6a quy mô 100g/mẻ.............................................................................................................74 Bảng 3.37 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 31 ....................76 Bảng 3.38 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 100 g/mẻ............................................................................................................77 Bảng 3.39 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tinh chế chất 1 .......................77 Bảng 3.40 Kết quả kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V ........................................................................................................................79 Bảng 3.41 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 61 với tác nhân NaOH ở quy mô 500 g/mẻ ................................................................................81 Bảng 3.42 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 6a bằng quy trình cải tiến sử dụng bột sắt ở quy mô 500 g/mẻ .....................................................84 Bảng 3.43 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 31 ở quy mô 500 g/mẻ...................................................................................................................86 Bảng 3.44 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 1 ở quy mô 500 g/mẻ...................................................................................................................89 Bảng 3.45 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tinh chế chất 1 .......................92 Bảng 3.46 Tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp ...................95 Bảng 3.47 Kết quả kiểm nghiệm nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được ở quy mô 500g/mẻ.............................................................................................................96 Bảng 3.48 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1A ở điều kiện lão hóa cấp tốc ..................................................................................................98 Bảng 3.49 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1B ở điều kiện lão hóa cấp tốc ..................................................................................................98
Bảng 3.50 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1C ở điều kiện lão hóa cấp tốc ..................................................................................................99 Bảng 3.51 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1A ở điều kiện dài hạn .............................................................................................................100 Bảng 3.52 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1B ở điều kiện dài hạn .............................................................................................................100 Bảng 3.53 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của berberin clorid, số lô 1C ở điều kiện dài hạn .............................................................................................................100 Bảng 3.54 Mô tả tình trạng chuột ở các lô sau dùng mẫu thử nguyên liệu berberin clorid - mẫu 1 ..................................................................................................102 Bảng 3.55 Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ sau khi uống nguyên liệu berberin chlorid .............................................................................................................108 Bảng 3.56 Tỉ lệ chết chuột nhắt trắng và giá trị LD50 của mẫu thử nguyên liệu berberin chlorid .............................................................................................................109 Bảng 4.1. Những cải tiến trong nâng cấp quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 500g.................................................................................................................121 Bảng 4.2 Các phương pháp tổng hợp berberin clorid thông qua hợp chất trung gian 6 .........................................................................................................................126 Bảng 4.3 Kết quả so sánh phổ 1H-NMR berberin tổng hợp được và phổ chuẩn của berberin clorid .................................................................................................143 Bảng 4.4 Kết quả so sánh phổ 13C-NMR berberin tổng hợp được và phổ chuẩn của berberin clorid .................................................................................................143 Bảng 4.5 Tổng hợp giá trị LD50 của nguyên liệu berberin......................................150
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp berberin .............................................................2 Hình 1.2. Phản ứng khử berberin ................................................................................4 Hình 1.3. Phản ứng thủy phân berberin trong môi trường kiềm .................................4 Hình 1.4. Sơ đồ tổng hợp berberin của Amé Pictet và Alfons Gams .......................10 Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp berberin của T. Kametani và cộng sự ..............................11 Hình 1.6. Sơ đồ tổng hợp berberin của Viện Y học cổ truyền Trung Quốc .............12 Hình 1.7. Sơ đồ tổng hợp berberin của W. Liu .........................................................13 Hình 1.8. Sơ đồ tổng hợp berberin của Z. X. Chen ..................................................14 Hình 1.9. Sơ đồ tổng hợp berberin của Xiaolin Bian (2006) và Peng Yang (2008) .15 Hình 1.10. Sơ đồ tổng hợp berberin của Alice Gatland ............................................16 Hình 1.11. Sơ đồ tổng hợp berberin của Virshinha Reddy .......................................17 Hình 1.12. Sơ đồ tổng hợp berberin của Chen Cheng ..............................................18 Hình 1.13. Sơ đồ tổng hợp berberin của Chen Cheng ..............................................19 Hình 1.14. Sơ đồ tổng hợp berberin qua hợp chất trung gian 6a (dạng muối hydroclorid của amin 6) ....................................................................................20 Hình 1.15. Sơ đồ phân tích tổng hợp ngược berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd ...........................................................................................................................22 Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp berberin clorid từ vanilin .................................................27 Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) .......................................................................27 Hình 3.1. Sơ đồ tổng hợp berberin từ piperonal quy mô phòng thí nghiệm ............52 Hình 3.2. Sơ đồ tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim ..............................................................................52 Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal ...........................................................................................................82 Hình 3.4. Sơ đồ quy trình tổng hợp 6a từ 61 ...........................................................85 Hình 3.5. Sơ đồ quy trình tổng hợp amin 31 từ amin 6a .........................................88 Hình 3.6. Sơ đồ quy trình tổng hợp berberin clorid (1) từ amin 31 ..........................91 Hình 3.7. Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid ..................................................93 Hình 3.8. Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid ...................................................94 Hình 3.9. Đồ thị dự đoán tuổi thọ của nguyên liệu berberin clorid ở điều kiện dài hạn. ..................................................................................................................101 Hình 4.1. Sơ đồ tóm tắt các phương pháp tổng hợp berberin qua chất trung gian amin (6) ....................................................................................................................112
Hình 4.2. Các phương pháp tổng hợp homopiperonylamin ....................................114 Hình 4.3. Cơ chế phản ứng hình thành 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) từ 2,3- dimethoxybenzaldehyd ...................................................................................118 Hình 4.4 Cơ chế phản ứng demethyl vanilin bằng AlCl3/pyridin ...........................128 Hình 4.5. Cơ chế phản ứng đóng vòng methylenoxyd của 25a ..............................129 Hình 4.6. Cơ chế phản ứng ngưng tụ piperonal và nitromethan .............................130 Hình 4.7. Quá trình khử hóa nitrostyren 61 thành muối amin 6a sử dụng hệ khử NaBH4/CuCl2 ..................................................................................................131 Hình 4.8. Cơ chế phản ứng khử nối đôi trong phân tử 61 bằng NaBH4 .................132 Hình 4.9. Cơ chế phản ứng hình thành 31 từ (6a) ...................................................136 Hình 4.10. Cơ chế phản ứng hình thành berberin clorid (1) từ 31 ..........................138 Hình 4.11. Sắc ký đồ HPLC sản phẩm berberin clorid ...........................................145 Hình 4.12. DSC mẫu berberin clorid bán trên thị trường .......................................146 Hình 4.13. DSC mẫu berberin clorid tổng hợp được ..............................................147
ĐẶT VẤN ĐỀ Berberin là một hóa dược phổ biến dùng để sản xuất thuốc cho điều trị các bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn đường ruột và ức chế tình trạng kích thích co thắt nhu động ruột. Berberin được sử dụng rộng rãi tại Việt Nam từ những năm 1960 làm thuốc chữa lỵ và nhiễm khuẩn đường ruột. Ngoài ra, berberin còn có trong thành phần của một số loại thuốc khác như thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do tác nhân kích thích bên ngoài và thuốc điều trị bệnh đau mắt hột. Hiện nay, rất nhiều tác dụng khác của berberin được nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng như giúp ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm và chống lại tác hại của vi khuẩn tả, hạ đường huyết, làm giảm mạnh lượng cholesterol, triglycerid và xơ vữa, nhưng không gây ra tác dụng phụ điển hình như các statin. Berberin ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của các tế bào bình thường [89]. Ngoài ra, berberin còn có tác dụng bảo vệ tim mạch, đồng thời có tác dụng chống trầm cảm [82]. Nhu cầu về berberin ngày càng tăng. Tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng berberin cũng rất lớn. Trên thế giới ngành công nghiệp dược đang phải đối mặt với việc khai thác tràn lan quá mức các loại dược liệu mà chưa có chiến lược bảo tồn hợp lý, nguồn nguyên liệu chiết xuất berberin đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt [1]. Việc canh tác truyền thống tại các vùng trồng dược liệu chứa berberin hiện nay cũng không đáp ứng được nhu cầu của thị trường thuốc hiện tại [6], [8]. Trên thế giới, các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc đã tổng hợp và thương mại hóa chế phẩm berberin tổng hợp từ rất lâu. Các nghiên cứu tổng hợp berberin đã được các nhà khoa học trên thế giới phát triển trong nhiều thập kỉ nay. Chúng tôi thấy rằng sản xuất berberin bằng con đường tổng hợp hóa học nhằm đảm bảo sự ổn định, bền vững nguồn nguyên liệu là rất triển vọng và thiết thực. Vì vậy, chúng tôi thực hiện luận án “Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid” với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng được quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 500g/mẻ đạt tiêu chuẩn dược dụng. 2. Đánh giá được độc tính cấp và độ ổn định của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Khái quát chung về berberin clorid 1.1.1. Đặc điểm cấu trúc hóa học - Công thức phân tử: [C20H18NO4]+Cl- (M = 371,86 đvC) - Công thức cấu tạo [92]: - Tên khoa học: 9,10-dimethoxy-5,6-dihydro[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquino[3,2-a] isoquinolin-7-ium clorid. - Dạng dược dụng của berberin được quy định trong Dược điển Việt Nam V [4], Dược điển Nhật bản XVII [92] là muối berberin clorid dihydrat. Ngoài ra, nó còn có dạng dược dụng là muối berberin tannat, berberin sulfat [92]. Trong thực vật, berberin được sinh tổng hợp từ L-tyrosin, một trong 20 acid amin cơ sở trong các quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào. Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp berberin 2
Trong quá trình sinh tổng hợp berberin [32] hai phân tử tyrosin tham gia vào hai quá trình phản ứng khác nhau để tạo ra hai sản phẩm trung gian là L-3,4- dihydroxyphenylalanine (L -DOPA) và acid 4-hydroxypyruvic. Các sản phẩm trung gian trên đều tham gia vào quá decarboxyl hóa để tạo thành dopamin và 4 hydroxyphenylacetaldehyd tương ứng. Hợp chất dopamin và 4-hydroxy-phenylacetaldehyd tham gia phản ứng ankyl hóa amino để tạo thành (S) -norcolaurin tương tự như phản ứng Mannich. Sản phẩm được metyl hóa nhóm amin và ether hóa đồng thời bằng S-Adenosylmethionin (SAM) tạo thành (S) - reticulin. Sản phẩm của quá trình sinh tổng hợp này tham gia vào quá trình oxi hóa amin bậc 3 tạo thành ion iminium, sau đó nhóm iminium tham gia phản ứng đóng vòng nội phân tử (phản ứng Mannich) vị trí ortho tạo thành X . Sau đó, hợp chất X tham gia phản ứng chuyển vị xeto – enol để tạo thành (S)-scoulerin, và tiếp tục bị metyl hóa bởi SAM để tạo thành (S)–tetrahydrocolumbamin. Hợp chất này bị oxy hóa để tạo thành hợp chất metylenedioxy vòng. Từ ortho -methoxyphenol, O2, enzym NADPH và cytochrom P-450, tạo thành (S)-canadin. Cuối cùng, (S)-canadin bị oxy hóa thành berberin. 1.1.2. Tính chất hóa lý a. Tính chất vật lý - Berberin clorid là tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi, vị rất đắng [4]. - Berberin clorid tan trong nước theo tỷ lệ 1/400, tan tốt trong nước nóng, ethanol, không tan trong cloroform và ether. Berberin không có carbon bất đối nên không có đồng phân quang học [11], [52]. - Dạng bazơ [C20H18O4N]+OH- có nhiệt độ nóng chảy là 145℃ [52]. - Berberin clorid dạng dihydrat có nhiệt độ nóng chảy là 191-192℃ [54], dạng khan nước là 204-206℃ (phân hủy). b. Tính chất hóa học - Dạng bazơ có khả năng tạo muối với các acid khác nhau, việc tạo muối berberin không giống như các alcaloid khác mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại, nghĩa là có loại phân tử nước [6]. [C20H18O4N]+OH- + HCl [C20H18O4N]+Cl- + H2O 3
- Berberin clorid tham gia phản ứng trao đổi [55]: [C20H18O4N]+Cl- + NaOH [C20H18O4N]+OH- + NaCl - Phản ứng cộng nucleophil vào liên kết đôi C = N+ [3], [55]: [C20H18O4N]+Cl- + NaCN [C20H18O4N]+CN- + NaCl - Nhân thơm có chứa N của berberin clorid có thể bị khử bởi các tác nhân khác nhau tạo thành hydro alcaloid không màu theo hình 1.2. Hình 1.2. Phản ứng khử berberin - Berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh, vòng chứa nguyên tử N không vững bền, trong môi trường kiềm mạnh dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd gọi là berberinal theo hình 1.3. Hình 1.3. Phản ứng thủy phân berberin trong môi trường kiềm 1.1.3. Ứng dụng trong lâm sàng - Berberin có hoạt tính kháng khuẩn, chống viêm được chỉ định trong lâm sàng để điều trị nhiễm trùng đường ruột, tiêu chảy, lỵ, viêm ống mật [19], [29], [107], giúp ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm [33], [39]. - Berberin có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) bao gồm Staphylococcus aureus, Shigella antidysenteria, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Escherichia coli [52], [102], [115]. - Tác dụng điều trị nhiễm khuẩn của berberin là do khả năng liên kết với các protein amyloid trong màng sinh học, làm gián đoạn sự ổn định của nó và tăng cường hoạt 4
tính kháng khuẩn của kháng sinh, đồng thời cạnh tranh với LPS để gắn với TLR4 / MD-2, qua đó ức chế quá trình viêm trong nhiễm trùng [18]. 1.1.4. Tác dụng dược lý Berberin lần đầu tiên được phân lập từ cây Xanthoxylon cava vào năm 1926. Dịch chiết từ các loài thực vật có chứa hoạt chất này đã được mô tả có khả năng điều trị các bệnh lý liên quan đến đường tiêu hóa như bệnh tả và các bệnh tiêu chảy do vi khuẩn trong y học dân gian truyền thống của người Mỹ, Trung Quốc và Nhật Bản trong nhiều thế kỉ. Các nghiên cứu chỉ ra rằng berberin có khả năng ức chế khá nhiều chủng vi khuẩn gram dương như Staphylococcus aureus, Staphylococcus cholermidis, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis và các chủng vi khuẩn gram âm như Aspergdlus fumigatus, Plasmodium falciparum. Berberin có khả năng làm giảm kích thích co thắt nhu động ruột do vi khuẩn cũng như có hoạt tính ức chế tế bào ung thư. Một số nghiên cứu trước đây đã đưa ra kết luận hoạt tính sinh học của hợp chất này dựa trên tương tác giữa các ion iminium trong cấu trúc dị vòng liên hợp của berberin có thể phản ứng với các acid amin trong enzym của các thụ thể trong vi sinh vật. 1.1.4.1. Tác dụng hạ đường huyết Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên 36 người mắc bệnh đái tháo đường loại 2 được phân ngẫu nhiên điều trị bằng berberin hoặc metformin trong một thử nghiệm 3 tháng. Tác dụng hạ đường huyết của berberin tương tự như của metformin. Nhóm điều trị bằng berberin giúp giảm đáng kể hemoglobin A1c (HbA1c từ 9,5% xuống 7,5%), đường huyết lúc đói (FBG từ 10,6 ± 0,9 mmol/L xuống 6,9 ± 0,5 mmol/L), đường huyết sau bữa ăn (PBG từ 19,8 ± 1,7 mmol/L xuống 11,1 ± 0,9 mmol/L) [111]. Tác dụng hạ đường huyết của berberin dựa trên nhiều cơ chế khác nhau như bảo vệ và phục hồi chức năng tế bào đảo tụy, tăng cường biểu hiện mARN insulin receptor, giảm tình trạng kháng insulin [34], [56], [109], [118]. Trong tế bào gan, tế bào mỡ, berberin làm tăng tiêu thụ hoặc hấp thu glucose khi không có insulin có thể là do sự kích thích glycolysis, có liên quan đến sự ức chế quá trình oxy hóa trong ty thể [50], [108], [110]. Berberin cũng có thể hoạt động như một chất ức chế α- 5
glucosidase. Nó ức chế các hoạt động disacaridase và giảm vận chuyển glucose qua biểu mô ruột [76], [77]. 1.1.4.2. Tác dụng cải thiện trí nhớ Alzheimer là chứng mất trí nhớ phổ biến nhất, đặc biệt ở người cao tuổi, hiện đang trở thành vấn đề sức khỏe được quan tâm trên toàn cầu. Đây là bệnh gây tử vong ở người cao tuổi đứng hàng thứ 6 hiện nay và là một trong những bệnh tốn kém nhất cho xã hội ở các nước phát triển. Berberin có thể được xem là một tác nhân đầy hứa hẹn để ứng dụng trong điều trị bệnh Alzheimer do hợp chất này sở hữu các tác dụng sinh học như chống oxy hóa, ức chế AChE và BChE, ức chế monoamin-oxidase (MAO), giảm sự kết tập mảng β-amyloid và hạ cholesterol. Thử nghiệm cho thấy sử dụng berberin đường uống với liều 50 mg/kg thể trọng, một lần mỗi ngày, trong 14 ngày, cải thiện đáng kể tình trạng suy giảm trí nhớ trong mô hình gây bệnh Alzheimer trên chuột [42], [43], [45], [46]. Trong một mô hình chuột bị suy giảm trí nhớ gây ra bởi việc bơm acid ibotenic, sự tồn tại của các tế bào hình chóp và hạt được tăng lên rất nhiều trong vùng hippocampus (vùng liên quan tới khả năng lưu trữ, xử lý thông tin trong não) khi dùng berberin. Trong một mô hình chấn thương của dây thần kinh chuột, bốn tuần sau khi sử dụng berberin (20 mg/kg, một lần mỗi ngày trong 1 tuần), độ dày của các sợi trục được cải thiện khoảng 1,4 lần ở gốc xa của vết thương [38]. 1.1.4.3. Tác dụng hạ lipid máu Trong một nghiên cứu của 32 bệnh nhân điều trị hạ lipid máu bằng cách sử dụng berberin 500 mg, hai lần mỗi ngày trong 3 tháng. Ở những bệnh nhân này, giảm đáng kể LDL, triglycerid, và tổng số cholesterol (giảm 25% LDL, 35% chất béo trung tính và giảm 29% cholesterol toàn phần). Trong một nghiên cứu khác kéo dài 2 tháng với 63 bệnh nhân, sử dụng berberin 500 mg hai lần mỗi ngày, giảm LDL trung bình 23,8%. Kết hợp của simvastatin 20 mg mỗi ngày và berberin, LDL hạ xuống trung bình 31,8% [17], [78]. Nghiên cứu phân tích meta thực hiện bởi Hui Dong và cộng sự đối với 14 thử nghiệm lâm sàng trên 1068 người tình nguyện, cũng chỉ ra rằng nồng độ lipoprotein cholesterol giảm rõ rệt khi được điều trị bằng berberin [31]. So sánh với simvastatin, berberin cũng cho hiệu quả điều trị tương tự: TC, LDL, TG 6