Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU

BÙI THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG U THỰC NGHIỆM CỦA RỄ CỦ TAM THẤT (PANAX NOTOGINSENG (BURK.) F.H. CHEN, ARALIACEAE) TRỒNG Ở VIỆT NAM TRƯỚC VÀ SAU CHẾ BIẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU

BÙI THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG U THỰC

NGHIỆM CỦA RỄ CỦ TAM THẤT (PANAX

NOTOGINSENG (BURK.) F.H. CHEN, ARALIACEAE)

TRỒNG Ở VIỆT NAM TRƯỚC VÀ SAU CHẾ BIẾN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 972.02.05 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Vũ Mạnh Hùng

GS. TS. Nguyễn Thanh Hải

HÀ NỘI, NĂM 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan

Luận án “Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất

(Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau

chế biến” là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn khoa học của tập thể

thầy hướng dẫn.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và được công bố trong

các bài báo khoa học của nhóm nghiên cứu. Luận án chưa từng được công bố,

không trùng lặp với luận văn, luận án hoặc bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học

của các tác giả nào khác. Nếu có điều gì sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, ngày 25 tháng 7 năm 2022

Tác giả

Bùi Thị Thu Hà

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện Luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp

đỡ, động viên từ các thầy cô giáo, các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè.

Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn

PGS. TS. Vũ Mạnh Hùng - nguyên Chủ nhiệm Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y

và GS. TS. Nguyễn Thanh Hải - Phó Hiệu trưởng trường Đại học Y Dược, Đại học

Quốc gia Hà Nội, đã hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo, định hướng, giúp đỡ tôi ngay từ

những ngày đầu tiên trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các cán bộ, nhân viên Khoa phân tích-tiêu chuẩn,

Viện Dược liệu; các cán bộ, kỹ thuật viên Bộ môn Dược lý - Học viện Quân y, đã

hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập,

công tác.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Dược liệu, Thủ trưởng Bệnh viện

19-8 và Bệnh viện Y học Cổ truyền - Bộ Công an đã tạo mọi điều kiện thuận lợi

cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án.

Từ đáy lòng mình, xin cảm ơn gia đình, cảm ơn chồng, các con, bố mẹ hai

bên cùng toàn thể gia đình đã luôn tin tưởng, động viên, chia sẻ, ủng hộ và giúp đỡ

trong mọi lúc, mọi nơi.

Xin cảm ơn tất cả những người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã ủng hộ, giúp đỡ

tôi trong quá trình thực hiện luận án này.

Xin trân trọng cảm ơn!

Bùi Thị Thu Hà

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1 ........................................................................................................... 3

TỔNG QUAN ........................................................................................................ 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƯ ........................................................... 3

1.1.1. Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam ........................................... 3

1.1.2. Ung thư với đáp ứng miễn dịch ................................................................. 4

1.2. TỔNG QUAN VỀ TAM THẤT .................................................................. 11

1.2.1. Tổng quan thực vật................................................................................... 11

1.2.2. Hóa thực vật rễ củ Tam thất .................................................................... 14

1.2.3. Các tác dụng dược lý của Tam thất ......................................................... 16

1.2.3.1. Tác dụng chống ung thư ........................................................................ 16

1.2.3.2.Tác dụng tăng cường miễn dịch .............................................................. 18

1.2.3.3. Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan ....................................... 19

1.2.3.4. Các tác dụng khác .................................................................................. 21

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÁC

DỤNG KHÁNG U .............................................................................................. 22

1.3.1. Các mô hình nghiên cứu in vitro .............................................................. 22

1.3.2. Các mô hình nghiên cứu in vivo ............................................................... 26

CHƯƠNG 2 ........................................................................................................ 31

CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 31

2.1. CHẤT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................ 31

2.1.1. Chất liệu nghiên cứu ................................................................................. 31

2.1.2.Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 35

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụngtrong nghiên cứu ............................ 35

2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 35

2.1.3.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .......................................................... 37

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 39

2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến bằng hấp nhiệt đến

hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất............................................................. 39

2.2.1.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có trongcác

mẫu Tam thất hấp và không hấp. ....................................................................... 39

2.2.1.2. Nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng hoạt chất trong Tam thất trước và sau khi

hấp ở các điều kiện khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

............................................................................................................................. 40

2.2.1.3. Định lượng hàm lượng saponin trong 2 mẫu cao NP(O) và NP(H) bằng HPLC

............................................................................................................................. 42

2.2.2. Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng

và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất. ................................................ 42

2.2.2.1. Đánh giá tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng

NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người ....................................... 42

2.2.2.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và khả năng kích thích chết tế bào

theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung

thư mô liên kết chuột sarcoma TG180. ............................................................... 44

2.2.2.3. Nghiên cứu tác dụng ức chế phát triển u của các cao định lượng NP(H)

và NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180. .................. 48

2.2.2.4. Đánh giá tác dụng của các cao định lượng NP(H) và NP(O) lên hệ miễn

dịch của chuột mang khối u rắn sarcoma TG180. .............................................. 50

2.2.2.5. Đánh giá tác dụng chống oxy hoá của các cao định lượng NP(H) và

NP(O) trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG180. ......................................... 52

2.2.2.6. Xác định thời gian sống thêm của chuột mang khối u rắn sarcoma TG180. 53

2.2.3. Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng

NP(H)……………………………………………………………………………...54

2.2.3.1. Đánh giá độc tính cấp của cao định lượng NP(H) trên chuột nhắt trắng

............................................................................................................................. 54

2.2.3.2. Đánh giá độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H) trên chuột

cống trắng. ........................................................................................................... 55

2.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................................... 56

2.4. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU .................................................. 56

CHƯƠNG 3 ......................................................................................................... 59

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................................... 59

3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến đến hàm lượng

saponin của rễ củ Tam thất ............................................................................... 59

3.1.1. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có

trong các mẫu Tam thất hấp và không hấp ...................................................... 59

3.1.1.1. Phân lập các saponin từ rễ củ Tam thất (dược liệu không xử lý hấp) ... 59

3.1.1.2. Phân lập các saponin rễ Tam thất sau khi hấp ở nhiệt độ cao .............. 61

3.1.1.3. Đặc trưng vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất phân lập được ................. 64

3.1.1.4. Biện giải cấu trúc các hợp chất phân lập từ rễ củ Tam thất .................. 72

3.1.2. Kết quả nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng hoạt chất trong Tam thất khi hấp

ở các điều kiện khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

……………………………………………………………………………...78

3.1.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký ...................................................................... 78

3.1.2.2. Xây dựng đường chuẩn .......................................................................... 79

3.1.2.3. Kết quả định lượng các saponin chính từ Tam thất hấp ở các điều kiện khác

nhau ..................................................................................................................... 82

3.1.3. Hiệu suất chiết cao và kết quả định lượnghàm lượng saponin trong 2

mẫu cao định lượng NP(O) và NP(H) bằng HPLC. ......................................... 86

3.1.3.1. Hiệu suất chiết cao từ các mẫu dược liệu .............................................. 86

3.1.3.2. Định lượng các mẫu cao chiết ................................................................ 87

3.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định

lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất. .......................................... 88

3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao

định lượng NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người ................. 88

3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào và khả năng kích thích chết tế

bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào

ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180. ...................................................... 91

3.2.2.1. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào của cao định lượng NP(H) . 91

3.2.2.2. Kết quả đánh giá khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình

(apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết

chuột sarcoma TG180. ........................................................................................ 94

3.2.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u của các cao định lượng NP(H) và

NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180..................... 97

3.2.3.1. Kết quả tạo mô hình khối u sarcoma TG 180 trên chuột ....................... 97

3.2.3.2. Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) và NP(O) đến trọng lượng cơ thể

của chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180. ..................................................... 98

3.2.3.3. Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) và NP(O) đến sự phát triển khối

u rắn sarcoma TG 180. ........................................................................................ 99

3.2.4. Kết quả đánh giá tác dụng của cao định lượng NP(H) và NP(O) lên miễn

dịch trên chuột mang khối u rắn Sarcoma TG180 ......................................... 103

3.2.4.1. Kết quả đánh giá số lượng và công thức bạch cầu trong máu chuột .. 103

3.2.4.2. Kết quả đánh giá nồng độ IL-2 và TNF-α máu. ................................... 104

3.2.4.3. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu huyết học .......................................... 105

3.2.4.4. Kết quả đánh giá cân nặng của lách và tuyến ức . ............................... 107

3.2.5. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa củacao định lượngNP(H) và

NP(O)trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180. ..................................... 108

3.2.5.1. Hàm lượng MDA, GSH, SOD và CAT trong gan chuột mang khối u rắn

sarcoma TG180. ................................................................................................ 108

3.2.5.2. Hoạt độ các enzym ALT, AST trong máu chuột mang khối u rắn

sarcoma TG180. ................................................................................................ 110

3.2.5.3. Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) và NP(O) đối với hình thái đại

thể và vi thể của gan chuột trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180. ...... 111

3.3.6. Kết quả đánh giá tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của cao định

lượng NP(H) và NP(O) trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180. ......... 113

3.4. Kết quả đánh giá độc tính của cao định lượng NP(H) ............................. 116

3.4.1. Kết quả xác định độc tính cấp (LD50) của NP(H) ................................ 116

3.4.2. Kết quả đánh giá độc tính bán trường diễn của NP(H) ........................ 117

CHƯƠNG 4 ....................................................................................................... 126

BÀN LUẬN ....................................................................................................... 126

4.1. Về ảnh hưởng của phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm lượng các

saponin của rễ củ Tam thất ............................................................................. 128

4.1.1. Hàm lượng saponin của Tam thất chưa hấp ......................................... 128

4.1.2. Hàm lượng saponin của Tam thất sau hấp ........................................... 129

4.1.3. Ảnh hưởng của các điều kiện hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ

Tam thất ............................................................................................................ 130

4.2. Về tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số

saponin phân lập từ rễ củ Tam thất. ............................................................... 132

4.2.1. Về tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng

NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người ................................... 132

4.2.2. Về kết quả đánh giá khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình

(apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết

chuột sarcoma TG180. ..................................................................................... 134

4.2.3. Về kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u của các cao định lượng NP(H)

và NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180. ............. 136

4.2.3.1. Về mô hình nghiên cứu ........................................................................ 136

4.2.3.2. Về liều dùng của cao định lượng NP(H) và NP(O).............................. 138

4.2.4. Về tác dụng của cao định lượng NP(H) và NP(O) lên miễn dịch trên

chuột mang khối u rắn Sarcoma TG180 ......................................................... 141

4.2.5. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa trên chuột mang khối u rắn

sarcoma TG 180................................................................................................ 145

4.2.6. Về tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của chuột mang khối u rắn

sarcoma TG 180................................................................................................ 147

4.3. Về kết quả đánh giá độc tính của cao định lượng NP(H). ....................... 153

4.3.1. Về độc tính cấp của cao định lượng NP(H). .......................................... 153

4.3.2. Về độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H). ..................... 154

KẾT LUẬN ........................................................................................................ 159

KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 161

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

STT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng nước ngoài Viết đầy đủ tiếng Việt

1 ALT Alanine aminotransferase

2 AST Aspartate aminotransferase

3 AKP Alkaline Phosphatase

4 CAT Catalase

5 CC Column chromatography Sắc kí cột

6 CHO Cholesterol

7 ĐCSH Đối chứng sinh học

7 ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectrometry Phổ khối lượng phun mù điện tử

8 GC Gas Chromatography Sắc kí khí

9 GSH Glutathione reductase

10 HLD High-density lipoprotein cholesterol Cholesterol trọng lượng phân tử cao

11 HE Haematoxylin and eosin

Performance Liquid 12 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao High Chromatography

13 IL-2 Interleukin-2

14 IR Infra red Phổ hồng ngoại

15 LD50 Lethal dose, 50% Liều gây chết trung bình

16 LDL Low-density lipoprotein cholesterol Cholesterol trọng lượng phân tử thấp

17 LTN Lô uống thuốc tham chiếu

18 MDA Malondialdehyde

Histocompatibility 19 MHC Major Complex Phức hợp kháng nguyên phù hợp tổ chức của người

20 MP Melting point Điểm nóng chảy

21 MS Mass spectrometry Khối phổ

22 NK Natural killer cell Tế bào tiêu diệt tự nhiên

23 NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

24 OA Oleanolic acid

25 OD Optical Density Mật độ quang học

26 OT Otillol

27 PPD Protopanaxadiol

28 ROS Reactive oxygen species

29 SL Lô chứng sinh lý

30 SOD Superoxide dismutase

31 SRB Sulforhodamine B

32 TC Triglycerid

33 TCL Cytotoxic T lymphocyte Tế bào T gây độc

34 TLCT Trọng lượng cơ thể

35 TG Total Cholesterol Cholesterol toàn phần

36 TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

37 TNF α Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u

38 UT Lô gây u không điều trị

39 UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại – Khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 1.1 Thống kê tóm tắt năm 2020 về tình hình ung thư tại Việt Nam 4

Bảng 2.1 Dải nồng độ thử nghiệm của chế phẩm NP(H) 45

Bảng 2.2 46

Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kích thích apoptosis của NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG 180

Bảng 2.3 Thang đánh giá hiệu lực kháng u của H. Itokawa 50

Bảng 3.1 60 Kết quả thu được sau khi tiến hành sắc kí cột thô của cắn n- BuOH

Bảng 3.2 64

Bảng 3.3

Bảng 3.4. Một số tính chất vật lý, dữ kiện phổ khối của các hợp chất PN1-PN6 Dữ kiện phổ 1H và 13C-NMR của các hợp chất PN1, PN2, PN6 64 Dữ kiện phổ 1H và 13C-NMR của các hợp chất PN3, PN4, PN5 68

Bảng 3.5 Kết quả xây dựng đường chuẩn. 80

Bảng 3.6 82

Bảng 3.7 83

Bảng 3.8 84

Bảng 3.9 85 Kết quả định lượng saponin trong mẫu Tam thất khô, hấp ở mức nhiệt 1000C tại các thời điểm hấp khác nhau Kết quả định lượng saponin trong mẫu Tam thất tươi, hấp ở mức nhiệt 100°C tại các thời điểm hấp khác nhau Kết quả định lượng saponin trong mẫu Tam thất khô, hấp ở mức nhiệt 120°C tại các thời điểm hấp khác nhau Kết quả định lượng saponin trong mẫu Tam thất tươi, hấp ở 120°C tại các thời điểm hấp khác nhau

Bảng 3.10 Hiệu suất chiết cao từ các mẫu dược liệu 87

Bảng 3.11 88

Bảng 3.12 89

Bảng 3.13 94 Hàm lượng các saponin trong 2 mẫu cao định lượng NP(O) và NP(H) (Mean ± SD) IC50 của 6 mẫu saponin và 2 cao định lượng NP(O), NP(H) trên 6 dòng tế bào ung thư người đã được thử nghiệm Tỷ số tăng sinh (A%) và giá trị IC50 các mẫu nghiên cứu trên dòng Sarcoma TG 180

Bảng 3.14 Tỷ lệ % tế bào Apoptosis Bảng 3.15 Tỷ lệ tế bào Appotosis sớm 95 96

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.16 Tỷ lệ tế bào Appotosis muộn Trang 97

Bảng 3.17 98

Bảng 3.18 99 Trọng lượng cơ thể chuột và thể tích khối u trong giai đoạn gây u (5 ngày đầu). (Mean ± SD, n =10) Trọng lượng cơ thể chuột trong giai đoạn uống thuốc (Mean ± SD, n =10)

Bảng 3.19 100

Bảng 3.20 102

Thể tích trung bình khối u của chuột trong giai đoạn uống thuốc (từ ngày 7 đến ngày 21) (Mean ± SD, n =10) Hiệu lực kháng u tại ngày 21 sau tiêm gây u ở các lô điều trị (n =10) Số lượng và công thức bạch cầu chuột (Mean ± SD, n =10) Bảng 3.21 104

Bảng 3.22 105 Kết quả đánh giá nồng độ IL-2 và TNF-α máu (n = 10, Mean ± SD)

106

x

Bảng 3.23 Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu huyết học (n = 10, ± SD)

Bảng 3.24 107 Cân nặng tương đối của lách và tuyến ức chuột các lô chuột nghiên cứu (n = 10, Mean ± SD)

Hàm lượng MDA, GSH, SOD và CAT trong mô gan chuột Bảng 3.25 109 (n = 10, Mean ± SD)

Bảng 3.26 Hoạt độ các enzym ALT, AST trong máu chuột (n = 10) Bảng 3.27 110 113

Bảng 3.28 115

Số chuột sống sót ở các lô nghiên cứu Thời gian sống trung bình (n = 20, Mean ± SD) và thời gian sống kéo dài thêm của chuột (%) Bảng 3.29 Độc tính cấp theo đường uống của NP(H) Bảng 3.30 Trọng lượng cơ thể chuột ở các lô nghiên cứu 116 117

Bảng 3.31 118

Bảng 3.32 119 Ảnh hưởng của cao định lượng NP (H) đối với các chỉ số của hồng cầu Ảnh hưởng của cao định lượng NP (H) đối với số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu

Bảng 3.33 Ảnh hưởng của NP (H) đối với hoạt độ enzym AST và ALT Bảng 3.34 Ảnh hưởng của NP (H) đối với nồng độ albumin máu Bảng 3.35 Ảnh hưởng của NP (H) đối với nồng độ cholesterol máu Bảng 3.36 Ảnh hưởng của NP(H) đối với nồng độ creatinin máu 120 121 121 122

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Một số hình ảnh về Tam thất Lào Cai (tự chụp) 13

Hình 1.2 Sơ đồ sự biến đổi các saponin của Tam thất do hấp nhiệt 15

Hình 1.3 Các đặc điểm phân tích chết tế bào theo chương trình (Apoptosis) 24

Hình 2.1 Mẫu Tam thất khô, hấp ở 100ºC (A) 31

Hình 2.2 Mẫu Tam thất khô, hấp ở 120ºC (B) 32

Hình 2.3 Mẫu Tam thất tươi, hấp ở 100ºC (C) 32

Hình 2.4 Mẫu Tam thất tươi, hấp ở 120ºC (D) 32

Cao định lượng NP(O) và cao định lượng NP (H) Hình 2.5 33

Các saponin phân lập từ Tam thất Hình 2.6 34

Hình 2.7 49 Khối u ở đùi chuột tạo ra sau cấy ghép dòng tế bào ung thư sarcoma TG 180

Hình 3.1 61 Sơ đồ phân lập các hợp chất 1,2,3,4 từ Tam thất không hấp

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất 5,6 từ Tam thất hấp nóng 63

Hình 3.3 74

Các hợp chất phân lập từ thân rễ Tam thất (PN1, PN2, PN6) và phổ HMBC chọn lọc của hợp chất PN1 Các hợp chất phân lập từ thân rễ Tam thất (P. notoginseng) (PN3, Hình 3.4 78 PN4, PN5) và phổ HMBC chọn lọc của hợp chất PN4

Hình 3.5 79 Sắc ký đồ một số mẫu dịch chiết Tam thất

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của các saponin đối chiếu 81

Hình 3.7 86

Đồ thị biểu diễn sự biến đổi hàm lượng Rh1 và Rg3 theo thời gian trong 4 điều kiện khảo sát Sắc ký đồ các cao Tam thất 87

Hình 3.8 Hình 3.9 Hình thái tế bào Sarcoma TG 180 91

Hình 3.10 92 Hình thái tế bào Sarcoma TG 180 dưới tác dụng của cao định lượng NP(H) và thuốc chứng dương Taxol tại thời điểm 48 giờ

Hình 3.11 Hình ảnh mô bệnh học khối u sarcoma TG 180 ở đùi chuột. 103

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Trang

111

112

114

Hình 3.12 Hình ảnh đại thể gan chuột ở các lô nghiên cứu Hình 3.13 Hình ảnh vi thể gan chuột ở các lô nghiên cứu (HE x 400) Hình 3.14 Biểu đồ tỷ lệ chuột sống sót theo thời gian Hình 3.15 Hình ảnh đại thể gan, lách, thận của chuột ở các lô nghiên cứu 123

Hình 3.16 Hình ảnh vi thể gan của chuột ở các lô nghiên cứu 123

Hình 3.17 Hình ảnh vi thể lách của chuột ở các lô nghiên cứu 124

Hình 3.18 Hình ảnh vi thể thận của chuột ở các lô nghiên cứu 124

Hình 4.1 Sơ đồ biến đổi một số saponin trong Tam thất 130

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư và bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế

giới, trong đó ung thư đang dần có xu hướng vượt bệnh tim mạch trở thành nguyên

nhân hàng đầu gây tử vong sớm ở hầu hết các quốc gia [1]. Theo thống kê của Cơ

quan nghiên cứu ung thư quốc tế, năm 2020 ước tính thế giới có 19,3 triệu ca ung

thư mới và gần 10 triệu ca tử vong do ung thư [2]. Tại Việt Nam, trong năm 2020

ước tính số ca ung thư mới là 182563 (0,19 % dân số) và số người chết ước tính là

122690 (0,13% dân số) [3]. Gánh nặng ung thư ở Việt Nam đã tăng gấp ba lần

trong 30 năm qua [4]. Do tính chất ác tính của bệnh, những tác dụng phụ của hóa

trị liệu và xạ trị, giá thành cao của các thuốc điều trị ung thư, việc điều trị ung thư

là một gánh nặng lớn cho bệnh nhân, gia đình và xã hội.

Tam thất (Panax notoginseng) từ lâu được biết đến là một dược liệu quý với

công năng chủ yếu là tán ứ, hoạt huyết, chỉ huyết [5]. Tam thất còn có tên kim bất

hoán, nhân sâm tam thất, sâm tam thất. Tên kim bất hoán (vàng không đổi), ý nói là

vị thuốc Tam thất rất quý, vàng cũng không thể đổi được [6]. Các nghiên cứu dược

lý hiện đại đã chứng minh Tam thất có nhiều tác dụng quý trong điều trị ung thư,

rối loạn tim mạch, huyết ứ, giảm viêm, phù nề và giảm đau...[7]. Tác dụng chống

ung thư của các hoạt chất trong Tam thất gần đây được quan tâm nghiên cứu, cho

thấy tiềm năng tốt trong điều trị ung thư [8], [9]. Đặc biệt, một số tác giả báo cáo

việc hấp hơi rễ Tam thất làm tăng hoạt tính chống ung thư [10], [11], [12].

Ở Việt Nam, cây Tam thất đã được di thực từ những năm 1964 từ Trung

Quốc. Cây được nhập trồng ở tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai nhưng chưa được

quan tâm phát triển nên dược liệu Tam thất ở nước ta vẫn chủ yếu nhập từ Trung

Quốc. Là một trong những cây thuốc quan trọng của vùng Tây Bắc, Tam thất gần

đây đang được quan tâm và khôi phục lại việc trồng trọt và phát triển ở một số vùng

dược liệu trong nước, đặc biệt là ở huyện Si Ma Cai, tỉnh Lào Cai. Việc nghiên cứu

tác dụng định hướng điều trị ung thư của dược liệu quý này góp phần nâng cao giá

trị và tạo đầu ra cho dược liệu Tam thất trồng tại vùng Tây Bắc Việt Nam. Hơn

nữa, thực tế về gánh nặng điều trị bệnh ung thư hiện nay rất cần những sản phẩm từ

dược liệu có hiệu quả tốt trong điều trị ung thư, ít tác dụng phụ, giá thành phù hợp.

Cho đến nay, chưa có nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống về các thông số

trong quá trình hấp hơi nóng tác động đến hàm lượng các saponin và các hoạt tính

định hướng điều trị ung thư của Tam thất trồng tại Việt Nam.

Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tác

dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất (Panax notoginseng, (Burk.)

F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến”, với mục tiêu:

1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm

lượng saponin của rễ củ Tam thất.

2. Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng

và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất.

3. Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng sau

hấp nhiệt.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƯ

1.1.1. Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam

Ung thư được xếp là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu và là rào cản quan

trọng đối với việc tăng tuổi thọ ở mọi quốc gia trên thế giới [1]. Theo thống kê của

Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế [2], trên toàn thế giới ước tính có khoảng

19,3 triệu trường hợp ung thư mới (18,1 triệu trường hợp không bao gồm ung thư

da không tế bào hắc tố) và gần 10 triệu trường hợp tử vong do ung thư (9,9 triệu

trường hợp không bao gồm ung thư da không phải ung thư biểu mô) xảy ra vào

năm 2020. Ung thư vú đã vượt qua ung thư phổi là loại ung thư được chẩn đoán

phổ biến nhất, với ước tính có khoảng 2,3 triệu ca mới (11,7%), tiếp theo là ung thư

phổi (11,4%), đại trực tràng (10,0%), tuyến tiền liệt (7,3%) và dạ dày (5,6%). Ung

thư phổi vẫn là nguyên nhân gây tử vong do ung thư hàng đầu, với ước tính 1,8

triệu ca tử vong (18%), tiếp theo là ung thư đại trực tràng (9,4%), gan (8,3%), dạ

dày (7,7%) và ung thư vú ở nữ (6,9%). Gánh nặng ung thư toàn cầu dự kiến sẽ là

28,4 triệu ca vào năm 2040, tăng 47% so với năm 2020, với sự gia tăng lớn hơn ở

các quốc gia đang phát triển (64% lên 95%) so với các quốc gia phát triển (32% lên

56%). Sự đa dạng bất thường của bệnh ung thư tiếp tục cung cấp bằng chứng cho

những nguyên nhân cơ bản nhưng cũng củng cố nhu cầu về nỗ lực ngày càng leo

thang trên toàn cầu để kiểm soát căn bệnh này [13], [14].

Tại Việt Nam, gánh nặng ung thư đã tăng gấp ba lần trong 30 năm qua và tình

trạng này có thể được giải thích một phần là do sự gia tăng của các yếu tố nguy cơ cũ và

mới [4], [15]. Bên cạnh virus viêm gan B, nhiều yếu tố nguy cơ quan trọng khác như

virus u nhú ở người, sử dụng thuốc lá, lười vận động và chế độ ăn uống không hợp lý

vẫn chưa được kiểm soát ở Việt Nam. Tại Việt Nam, trong năm 2020 ước tính số ca

ung thư mới là 182563 (0,19% dân số), và số người chết ước tính là 122690 (0,13% dân

số) [3]. Những ung thư mắc tỷ lệ cao là ung thư gan, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư

dạ dày, ung thư đại tràng và ung thư tiền liệt tuyến (Bảng 1.1).

Bảng 1.1. Thống kê tóm tắt năm 2020 tình hình ung thư tại Việt Nam

(nguồn Global Cancer Observatory -Vietnam Population fact sheets [3])

Nam Nữ Cả 2 giới

Dân số 48 598 254 48 740 329 97 338 583

Số ca ung thư mới mắc 98 916 83 647 182 563

Tỷ lệ mắc được chuẩn hóa theo độ tuổi (thế giới) 191,5 135,5 159,7

Nguy cơ phát triển ung thư trước 75 tuổi (%) 19,5 13,6 16,3

Số ca chết do ung thư 74481 48209 122690

Tỷ lệ chết được chuẩn hóa theo độ tuổi (thế giới) 144,5 74,8 106,0

Nguy cơ chết ung thư trước 75 tuổi (%) Số ca hiện mắc trong 5 năm 15,0 162 822 8,0 191 004 11,2 353 826

Gan Vú Gan

5 loại ung thư có số ca mắc cao nhất ngoại trừ ung thư da không hắc tố Phổi Phổi Phổi

Dạ dày Đại tràng Vú

Đại tràng Dạ dày Dạ dày

Tiền liệt tuyến Gan Đại tràng

1.1.2. Ung thư với đáp ứng miễn dịch

Hệ miễn dịch là hàng rào bảo vệ cơ thể trước bất kỳ một kẻ lạ mặt nào xuất

hiện trong cơ thể, bao gồm vi khuẩn, virus, nấm, ký sinh trùng, hóa chất, thức ăn,

cũng những tế bào do cơ thể sinh ra như tế bào ung thư [16].

Đáp ứng miễn dịch là một quá trình bảo vệ quan trọng và phức tạp của cơ thể

sinh vật. Ở người, đáp ứng miễn dịch chia hai loại: đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và

đáp ứng miễn dịch thích ứng. Miễn dịch bẩm sinh (innate immunity) là khả năng tự

bảo vệ sẵn có và mang tính di truyền trong các cơ thể cùng một loài. Cơ thể loại trừ

các kháng nguyên (vi khuẩn, virus…) gây bệnh thông qua hàng rào vật lý, hoá học,

tế bào, thể chất. Miễn dịch thích ứng (adaptive immunity) là trạng thái miễn dịch

xuất hiện do kháng thể đặc hiệu tương ứng với từng kháng nguyên được tạo ra sau

khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên (KN). Miễn dịch thích ứng gồm hai phương

thức là đáp ứng miễn dịch dịch thể do các tế bào lympho B đảm nhiệm với các

globulin miễn dịch và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào do tế bào lympho T

đảm nhiệm với các cytokin do chúng tiết ra [16], [17].

Kháng nguyên ung thư cũng như các kháng nguyên khác, khi có mặt trong cơ

thể sẽ chịu sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch. Mặc dù một số ung thư có thể lẩn

tránh sự kiểm soát này nhưng phần lớn ung thư có đáp ứng miễn dịch [18]. Cả đáp

ứng miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch thích ứng đều liên quan tới kiểm soát

miễn dịch ung thư [17]. Với đáp ứng miễn dịch bẩm sinh, các tế bào miễn dịch có khả

năng ly giải các tế bào ung thư một cách tự nhiên mà không cần mẫn cảm trước. Các

tế bào hiệu ứng miễn dịch tự nhiên gồm đại thực bào, tiểu thực bào và tế bào tiêu diệt

tự nhiên NK (nature killer), có thể gây độc tế bào làm cho tế bào ung thư ly giải hoặc

bị kìm hãm, ức chế sự phát triển [17]. Với đáp ứng miễn dịch thích ứng, cả đáp ứng

miễn dịch trung gian tế bào và miễn dịch dịch thể đều có hiệu quả kháng u [18]. Đáp

ứng miễn dịch dịch thể có thể tham gia vào phá hủy các tế bào u thông qua sự hoạt hóa

bổ thể và gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể bởi các tế bào NK. Trong khi đó, tế bào

T gây độc (cytotoxic T lymphocyte - hay gọi tắt là TCL) có vai trò quan trọng trong

đáp ứng miễn dịch tế bào chống ung thư. Ở người, chúng giữ vai trò bảo vệ chống lại

các u gây nên do virus, ví dụ như u lympho Burkitt do Epstein-Barr virus (EBV) và

các u do human papilloma virus (HPV). TCL nhận biết kháng nguyên trên bề mặt tế

bào ung thư nhờ phức hợp kháng nguyên phù hợp tổ chức của người (Major

Histocompatibility Complex - MHC). Các protein MHC hiện diện trên bề mặt tế bào

ung thư là mục tiêu để tế bào lympho T nhận biết kháng nguyên và tiêu diệt tế bào ung

thư. Như vậy TCL và tế bào ung thư phải có cùng MHC. Khả năng đáp ứng miễn dịch

của Tc đối với ung thư đều có đáp ứng lần 2, vì sau một lần mẫn cảm bởi kháng

nguyên ung thư sẽ hình thành TCL trí nhớ. Vì vậy ở những lần sau, khả năng gây độc

của TCL tăng nhanh hơn lần đầu [19].

Hiện nay, liệu pháp miễn dịch ung thư (Cancer imunotherapy, CI), là kỹ

thuật kích thích hệ miễn dịch của cơ thể chống lại các tế bào ác tính, đang là một

trong những biện pháp điều trị mở ra nhiều triển vọng. Liệu pháp miễn dịch ung

thư có thể được thực hiện thông qua thuốc chủng ngừa vaccine ung thư, điều trị

bằng kháng thể hoặc sử dụng các cytokine kích hoạt các tế bào miễn dịch như tế

bào tiêu diệt tự nhiên (tế bào NK), tế bào T gây độc, tế bào tua (DC)...để giúp hệ

thống miễn dịch tiêu diệt được tế bào ung thư. Thay vì nhắm trực tiếp để tiêu diệt tế

bào ung thư, liệu pháp CI có thể tạo ra khả năng cho tế bào miễn dịch của cơ thể

tấn công chống lại tế bào ung thư [19].

Bên cạnh đó, nhiều dược liệu có tác dụng điều hòa miễn dịch và khả năng

kích hoạt hệ thống miễn dịch, giúp cơ thể chống lại các bệnh đa yếu tố như ung thư

đang ngày càng được quan tâm nghiên cứu [20], [21]. Nhiều dược liệu được chứng

minh có tác dụng tăng cường đáp ứng miễn dịch chống ung thư, cả đối với miễn

dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng. Đối với miễn dịch bẩm sinh, dược liệu được

chứng minh có tác dụng làm tăng cường đại thực bào (macrophages), tế bào tua

(dendritic cells), tế bào giết tự nhiên (natural killer) và tế bào ức chế có nguồn gốc

từ tuỷ bào (myeloid-derived suppressor cells – MDSCs), giúp cơ thể chống lại các

mầm bệnh và tế bào khối u bên ngoài, ngăn chặn sự phát triển và di căn của tế bào

ung thư. Đối với miễn dịch thích ứng, dược liệu được chứng minh có tác dụng tăng

cường các tế bào lympho T CD4+/CD8+, tế bào T điều hòa và tế bào B. Đáp ứng

miễn dịch thích ứng là một phản ứng miễn dịch đặc hiệu cao đối với một kháng

nguyên cụ thể, có liên quan đến việc loại bỏ vi khuẩn gây bệnh và tế bào khối u,

giúp cơ thể chống khối u bằng cách điều chỉnh sự biệt hóa của tập hợp con tế bào T

và bài tiết cytokine [22].

1.1.3. Ung thư với stress oxy hóa và chống oxy hóa

Stress oxy hóa được biết đến như một trạng thái sinh lý trong đó mức độ cao

của các loại oxy hoạt động (reactive oxygen species – ROS) và các gốc tự do được

tạo ra do quá trình trao đổi chất chống oxy hóa [23]. Sự trao đổi chất bình thường

của tế bào tạo ra ROS và các gốc tự do và đóng một vai trò quan trọng trong các con

đường tín hiệu tế bào. Ty thể, bộ máy lớn nhất của tế bào, tạo ra ROS khi tạo ra

adenosine triphosphate (ATP), theo đó các điện tử phản ứng với oxy (O2) và sau đó

hình thành anion superoxide (O2−) [24]. Stress oxy hóa có vai trò cốt lõi trong cơ chế

bệnh sinh của nhiều bệnh lý ở người [25]. Ung thư là bệnh mà một nhóm tế bào phân

chia quá mức kiểm soát, dẫn đến xâm lấn, phá hủy các mô lân cận và có thể di căn

thông qua hệ thống hạch lympho hoặc dòng máu. Sự tăng sinh không kiểm soát này

thường bắt đầu từ sự kiện bất thường trên con đường tín hiệu điều hòa và kiểm soát

tăng trưởng tế bào, gây kích hoạt gene tiền ung thư (pro-oncogene) hoặc bất hoạt

gene ức chế ung thư (anti –oncogene) dẫn đến việc kéo dài tín hiệu tăng sinh, phá vỡ

cơ chế kìm hãm sinh trưởng, cũng như mất kiểm soát chu kỳ tế bào [26]. Tác nhân

gây ung thư có nhiều bản chất khác nhau nhưng hậu quả chung là chúng đều làm

tăng các dạng oxy hoạt động, gây stress oxy hóa [27]. Stress oxy hóa được xem là

nguyên nhân chính gây tổn thương các phân tử DNA, thay đổi đường truyền tín hiệu

và sự tiến triển của nhiều bệnh ung thư khác nhau [28], [29]. Hơn nữa, có báo cáo

rằng toàn bộ phân tử DNA có thể liên kết với các gốc hydroxyl, và do đó, làm hỏng

cấu trúc deoxyribose, bao gồm các gốc purine và pyrimidine. Trong quá trình gây hại

này, 8-OH deoxyguanosine (8-OHdG) có thể được tạo ra, có thể làm tăng đáng kể

nguy cơ đột biến [30]. Các phân tử 8-OHdG cũng được sử dụng làm chất chỉ thị để

phát hiện các gốc tự do trong quá trình gây đột biến DNA và được coi là một công

cụ phát hiện sớm sự tiến triển của ung thư [30], [31]. Điều quan trọng là 8-OHdG có

thể biến đổi cặp GC thành cặp TA khi sao chép DNA, có thể gây đột biến nếu tồn tại

các tổn thương oxy hóa, sau đó gây ra ung thư [32].

Tế bào ung thư thể hiện sự cân bằng nội môi oxy hóa khử không bình

thường, nhưng trong khi ROS là yếu tố gây ung thư, thì mức ROS cao lại gây độc

tế bào [33]. Sự tăng sinh quá mức của các tế bào khối u đi kèm với việc sản xuất

ROS cao, nhưng chúng thích nghi để phát triển mạnh trong các điều kiện mà gánh

nặng oxy hóa này đẩy cân bằng oxy hóa khử ra khỏi trạng thái giảm; các tế bào

khối u đạt được điều này bằng cách tăng tình trạng chống oxy hóa để tối ưu hóa sự

tăng sinh ROS, đồng thời tránh các ngưỡng ROS có thể gây ra lão hóa, apoptosis

hoặc ferroptosis [34], [35]. Nhiều bằng chứng cho thấy ROS có thể thúc đẩy cũng

như ngăn chặn sự tồn tại của các tế bào ung thư. Đầu tiên, ROS được biết đến để

điều chỉnh từng bước phát triển của khối u bao gồm biến đổi, tồn tại, tăng sinh,

xâm lấn, di căn và hình thành mạch. Thứ hai, viêm mạn tính, một trong những tác

nhân chính gây ung thư, được điều chỉnh bởi ROS. Thứ ba, ROS được biết là điều

chỉnh các phân tử tín hiệu cần thiết cho sự tiến triển của chu kỳ tế bào. Thứ tư, sự

biểu hiện của các gen ức chế khối u khác nhau nằm trong tầm kiểm soát của ROS.

Thứ năm, mức ROS cao có thể ngăn chặn sự phát triển của khối u thông qua việc

kích hoạt bền vững các chất ức chế chu kỳ tế bào. Thứ sáu, hầu hết các chất hóa trị

liệu và xạ trị liệu hiện có đều tiêu diệt tế bào ung thư bằng cách làm tăng căng

thẳng ROS. Do đó, cả hai chiến lược làm tăng ROS và loại bỏ ROS đã được phát

triển để ứng dụng trong điều trị ung thư [36].

Trong số các phương pháp điều trị ung thư thông thường, hóa trị liệu thường

được thực hiện để điều trị ung thư. Tuy nhiên, thuốc chống ung thư có liên quan đến

rất nhiều tác dụng phụ. Mỗi loại thuốc, trong mỗi nhóm, đều có những phản ứng phụ

riêng có thể khiến bệnh nhân không tuân thủ và giảm chất lượng cuộc sống. Một

trong những nguyên nhân chính gây ra các phản ứng có hại, đặc biệt là đối với các

loại thuốc nhắm vào DNA, là việc sản xuất quá mức các loại oxy phản ứng (ROS) và

sau đó hình thành stress oxy hóa. Để hạn chế những tác dụng phụ không mong muốn

này, một số chất bổ sung trong chế độ ăn uống đã được thử nghiệm, trong đó chất

chống oxy hóa ngày càng phổ biến như một chất bổ trợ trong hóa trị. Chất chống oxy

hóa là những phân tử ổn định đủ để nhận hoặc nhường electron cho các gốc tự do và

trung hòa chúng, do đó làm giảm hoặc mất khả năng gây hại tới tế bào của ROS. Hệ

thống gồm các chất chống oxy hóa có bản chất enzym (SOD, CAT, Peroxidase,

Glutathion peroxidase – GPx, …) và có bản chất phi enzym (nhóm các polyphenol,

Vitamin E- α-tocoferol, các flavonoid, β-caroten, Vitamin C, …) [37]. Liệu pháp

chống oxy hóa giúp làm giảm các tác hại gây ra do stress oxy hóa, hỗ trợ quá trình

điều trị bệnh và cải thiện sức khỏe con người. Có những lo ngại cho rằng việc sử

dụng các chất chống oxy hóa có thể gây trở ngại cho các phương thức tiêu diệt ung

thư bằng cách tạo ra các gốc tự do. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu tổng quan từ 174

bài báo trong đó có 93 thử nghiệm lâm sàng với số lượng tích lũy 18208 bệnh nhân

cho thấy chất chống oxy hóa có tiềm năng vượt trội trong việc cải thiện độc tính gây

ra trong liệu pháp hóa trị [38]. Việc bổ sung chất chống oxy hóa trong quá trình hóa

trị liệu cũng hứa hẹn hiệu quả điều trị cao hơn và tăng thời gian sống cho bệnh nhân.

Việc bổ sung chất chống oxy hóa trong quá trình điều trị bệnh có thể làm giảm bớt

các độc tính từ những phương pháp điều trị ung thư, chẳng hạn như hóa trị, xạ trị

hoặc phẫu thuật. Ngoài ra, nó cũng giúp ngăn ngừa quá trình oxy hóa trong cơ thể, từ

đó ngăn chặn các gốc tự do tiếp tục làm tổn thương tới những tế bào khỏe mạnh khác

trong cơ thể và giúp kìm hãm sự phát triển ồ ạt của khối u.

Gan là một cơ quan quan trọng trong cơ thể, tuy nhiên rất dễ bị tổn thương

trong stress oxy hóa. Sự sản xuất các gốc tự do quá mức gây stress oxy hóa trong gan

có thể dẫn đến tổn thương gan [39]. Sự tiến triển của các bệnh gan khác nhau chủ yếu

liên quan đến quá trình peroxy hóa lipid, tổn thương axit deoxyribonucleic (DNA), tín

hiệu của các chất trung gian gây viêm và cuối cùng là tạo ra các gốc tự do. Vai trò

không thể phủ nhận của các yếu tố độc hại trong bệnh gan có thể được chứng minh

bằng sự gia tăng mức độ của các dấu ấn sinh học của stress oxy hóa, như là

malondialdehyde (MDA) và 4-hydroxynonenal (4-HNE). Bên cạnh đó, việc sử dụng

các cơ chế chống oxy hóa nội sinh để chống đỡ tình trạng stress oxy hóa làm giảm

mức độ của superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), catalase

(CAT) và glutathione (GSH) [40]. Bệnh lý ung thư với sự gia tăng stress oxy hóa làm

tăng nguy cơ tổn thương gan. Không chỉ vậy, việc điều trị bằng hóa chất, xạ trị càng

làm tăng tổn thương gan trong điều trị ung thư. Một số dược liệu cũng như hoạt chất

tổng hợp có tác dụng chống oxy hóa được nghiên cứu về tác dụng hỗ trợ điều trị ung

thư thông qua việc triển khai đánh giá về tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan trên

chuột mang khối u, chuột được xạ trị hoặc hóa trị [41], [42], [43].

1.1.4. Vai trò của dược liệu trong điều trị ung thư

Các dược liệu và các hoạt chất chiết xuất của chúng ngày càng được công nhận là

phương pháp điều trị bổ sung hữu ích cho bệnh ung thư. Các nhà khoa học trên thế giới

đã tìm kiếm, phát hiện ra và đưa vào điều trị nhiều thuốc chống ung thư có nguồn gốc tự

nhiên như Paclitaxel (Taxol), Vinblastin và Vincristin, Camptothecin, Compretastatin…

và các dẫn chất của chúng. Isoflavone được tìm thấy rất nhiều trong hạt đậu nành được

chứng minh có tác dụng giảm nguy cơ ung thư vú và ung thư nội mạc tử cung [44].

Flavonoid từ trà xanh đã được báo cáo có tác dụng ức chế sự hình thành, phát triển và di

căn trong một số bệnh ung thư [45], [46]. β-glucan chiết xuất từ nấm có tác dụng kích

thích miễn dịch, chống khối u, chống oxy hóa... được cấp phép sử dụng trong điều trị

ung thư ở Trung Quốc và Nhật Bản [47], [48], [49]. Ngoài ra còn rất nhiều các hợp chất

khác có nguồn gốc từ thảo dược như curcumin, epigallocatechin gallate, berberine,

artemisinin, ginsenosidRg3, ursolic axit, silibinin, emodin, triptolide, cucurbitacin B,

tanshinone I, oridonin, shikonin, axit gambogic, artesunate, wogonin, β-elemene và

cepharanthine... đã được báo cáo về hiệu quả chống ung thư [50]. Wei Liu và cộng sự

(2019) đã tổng kết kết quả nghiên cứu về mười loại dược liệu được sử dụng phổ biến

của Trung Quốc trong nhiều thế kỷ dùng điều trị ung thư [51]. Các dược liệu bao gồm

bạch hoa xà thiệt thảo (Oldenlandia diffusa), nghệ (Curcuma longa), hoàng kỳ

(Astragalus membranaceus), nhân sâm (Panax ginseng), nấm linh chi (Ganoderma

lucidum), đương quy (Angelica sinensis), tam thất (Panax notoginseng), bán chi liên

(Scutellaria barbata D. Don), cam thảo (Licorice), đan sâm (Radix Salvia miltiorrhiza).

Kết quả cho thấy các dược liệu có khả năng thúc đẩy quá trình tự chết của tế bào ung

thư, ức chế sự di căn của chúng, kích hoạt khả năng miễn dịch chống ung thư của bệnh

nhân và đồng thời tăng hiệu quả của liệu pháp hóa trị và xạ trị thông thường khi được sử

dụng kết hợp. Những dược liệu này và các hoạt chất sinh học của chúng có hiệu quả

chống lại nhiều loại ung thư thông qua nhiều cơ chế khác nhau, cải thiện hiệu quả chất

lượng cuộc sống của bệnh nhân mà không có tác dụng phụ đáng kể [51]. Việt Nam có

nguồn tài nguyên thực vật đa dạng, có tiềm năng tốt cho việc nghiên cứu phát triển các

thuốc từ dược liệu dùng trong điều trị ung thư [52]. Nhiều dược liệu đã được chứng

minh có hiệu quả trong ức chế tế bào ung thư, tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa...

được sử dụng phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư như cây xạ đen, cây sói rừng, lá cây

na rừng,...[53], [54], [55].

1.2. TỔNG QUAN VỀ TAM THẤT

1.2.1. Tổng quan thực vật

* Vị trí phân loại cây Tam thất:

Cây Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen là một loài thuộc chi

Panax. Chi Panax L. là một chi nhỏ trong họ Nhân sâm Araliaceae. Vị trí của chi

Panax L trong hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt như sau [56].

Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta

Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida

Phân lớp Hoa hồng: Rosidae

Bộ hoa tán: Aplales

Họ Nhân Sâm: Araliaceae

Chi Panax. L

* Đặc điểm thực vật:

Cây thảo sống nhiều năm, cao khoảng 0,5m. Thân đơn, lá mọc vòng từ 3 – 4

lá, lá kép hình chân vịt, cuống dài 3 – 6 cm mang từ 3 – 7 lá chét, mép lá có khía

răng cưa nhỏ, cuống lá chét dài 0,6 – 1,2 cm, trên gân chính rải rác có gân cứng

thành gai.

Cụm hoa hình tán mọc ở đầu cành mang hoa. Có hoa đơn tính, hoa lưỡng

tính cùng tồn tại. Lá đài 5, màu xanh. Cánh hoa 5 màu xanh nhạt. Nhị 5, bao phấn

dạng thuân, dài 1,3 – 1,5 mm, rộng 0,6 – 0,8 mm, đĩa rộng, phẳng hay lõm. Bầu

dưới 2 ngăn. Mùa hoa: tháng 5 – 7.

Quả mang hình thận, khi chín màu đỏ, trong có 2 hạt hình cầu. Mùa quả

tháng 8-10 [56], [57].

* Trồng cây Tam thất tại Việt Nam:

Tam thất là cây thuốc đã được trồng từ lâu đời ở Trung Quốc, chủ yếu ở vùng

núi cao 1200 – 2000 m ở tỉnh Vân Nam từ 23,5˚ Bắc tới 104˚ Tây. Từ trước năm

1964, cộng đồng người Hoa sống ở dọc biên giới thuộc huyện Đồng Văn và Mèo

Vạc (Hà Giang) đã lấy giống Tam thất từ Trung Quốc về trồng ở vườn gia đình.

Năm 1964-1973, Viện Dược Liệu và một số địa phương ở tỉnh Hà Giang và Cao

Bằng mới chính thức nhập hạt giống “Tam thất” về trồng tại các huyện Sa Pa, Si Ma

Cai (Lào Cai); Phó bảng (Hà Giang); Hà Quảng và Thông Nông (Cao Bằng) [56],

[57].

Vào mùa thu, trước khi cây ra hoa, đào về rửa sạch, cắt rễ nhánh và thân rễ để riêng

rồi phơi sấy cho đến khô (độ ẩm khoảng 12%) rồi phân loại.

Một số hình ảnh về cây Tam thất:

Tiêu bản cây Tam thất

Vườn cây Tam thất trồng ở Simacai, Lào Cai.

Lá Cành mang hoa

Hoa Củ Tam thất tươi

Củ Tam thất đã sơ chế

13

Hình 1.1. Một số hình ảnh về Tam thất Lào Cai (tự chụp)

1.2.2. Hóa thực vật rễ củ Tam thất

Các thành phần hóa học trong cây Tam thất khá đa dạng. Trong các bộ phận của

cây như rễ, hoa, lá đều chứa các hợp chất saponin, flavonoid, acid amin, polysaccharid,

acid béo…. Trong số các thành phần hóa học của cây Tam thất thì saponin triterpen

tetracyclic nhóm dammaran là thành phần chính có tác dụng sinh học.

Thành phần chính của Tam thất là saponin thuộc nhóm dammaran mà phần

aglycon là các khung 20(S)-protopanaxadiol hoặc 20(S)-proropanaxatriol.Tổng hàm

lượng saponin trong Tam thất là 10%. Các saponin này được xếp thành các khung cơ

bản như ginenosid, notoginsenosid và gypenosid. Một số saponin chính trong Tam

thất như: notoginsenosid R1 (7 - 10%), ginsenosid Rb1 (30 - 36%), Rg1 (20 - 40%), Rd

(5 - 8.4%) và Re (3.9 - 6%) [58]– chiếm 90% tổng saponin được sử dụng để đánh giá

các hoạt tính. Các saponin khác nhau phân bố các các bộ phận khác nhau của Tam

thất, như Rb1 có ở tất cả các bộ phận rễ, thân rễ, nụ hoa, Rg1 tập trung chủ yếu ở rễ và

thân rễ, tuy nhiên Rb3 là thành phần chính của nụ hoa [59], [60].

Trong rễ Tam thất, saponin toàn phần chiếm từ 9,7-14,9% khối lượng khô.

Ginsenosid Rg1, Rb1, Rd và notoginsenosid R1 là những saponin có hàm lượng

cao nhất. Bốn saponin này có tổng hàm lượng lên đến 80% lượng saponin toàn

phần. Ginsenosid Rb1 chiếm 32,32%, Ginsenosid Rg1 chiếm 25,38%, tiếp đó là

ginsenosid Rd 11,17% [61], [62].

Các yếu tố nhiệt độ và độ ẩm có thể dẫn đến sự thủy phân các liên kết

glycosyl và mất nước ở C-6 và C-20. Trong điều kiện hấp nhiệt, quá trình thủy

phân liên kết xylosyl tại C-6 của notoginsenoside R1 và thủy phân liên kết

rhamnosyl tại C-6 của ginsenoside Re tạo thành ginsenoside Rg1. Ginsenoside Rb1

bị thủy phân liên kết glucosyl tại C-20 tạo ra ginsenoside Rd. Như vậy Rg1 và Rd

có thể là hợp chất ban đầu của saponin mới hình thành. Rg1 tiếp tục bị thủy phân

liên kết glucosyl tại C-20 tạo ra Rh1, sau đó tạo thành Rh4 và Rk3 sau khi khử

nước tại C-20. Tương tự, quá trình thủy phân liên kết glucosyl ở C-20 của Rd tạo ra

Rg3, và Rg3 tiếp tục khử nước ở C-20 tạo ra Rg5 và Rk1 [63].

Do tính chất bất đối xứng của C-20, các saponin mới được tạo ra sau quá

trình hấp nhiệt là các đồng phân quang học. Liên kết glucosyl tại C-20 bị thủy phân

tạo thành các đồng phân quang học như 20 (S) - / 20 (R) -ginsenoside Rg3 và 20

(S) - / 20 (R) -ginsenoside Rh2, hoặc bị mất nước ở C-20 thành đồng phân hình

học, tức là đồng phân cis-trans như ginsenoside Rk3 và Rh4, Rk1 và Rg5, Rk2 và

Rb1

Thủy phân liên kết glucosyl tại C-6

Thủy phân liên kết rhamnosyl tại C-6

Rh3, v.v…[63].

Rg1

Thủy phân liên kết glucosyl tại C-20

Rg3

Rh1

Khử nước tại C- 20

Rh4

Rk3

Rh4

Rk3

Thủy phân liên kết xylosyl tại C-6

Hình 1.2. Sơ đồ sự biến đổi các saponin của Tam thất do hấp nhiệt

Như vậy sau khi hấp nhiệt, các saponin cũ giảm dần (ginsenosid Rg1, Rb1,

Rd, Revà notoginsenosid R1), một số saponin mới được hình thành là 20 (S) -Rh₁,

20 (R) -Rh₁, Rk₃, Rh₄, 20 (S) -Rg₃, 20 (R) -Rg₃, Rk₁ và Rg₅…Đây là những

saponin duy nhất chỉ tồn tại trong Tam thất đã hấp, không tồn tại trong saponin

chưa hấp [63], [64], [65].

1.2.3. Các tác dụng dược lý của Tam thất

1.2.3.1. Tác dụng chống ung thư

Tam thất là một vị thuốc có nhiều tác dụng quý nên còn có tên gọi là “kim

bất hoán” tức là vàng không đổi được [6]. Trong số các tác dụng rất đa dạng của

Tam thất, tác dụng tiêu u, hóa ứ đã được sử dụng trong y học cổ truyền từ lâu,

nhiều phần tương ứng với tác dụng chống ung thư trong dược lý hiện đại được

quan tâm nghiên cứu nhiều hiện nay. Tam thất là một trong số 10 dược liệu được

sử dụng phòng chống u phổ biến trong y học cổ truyền Trung Quốc từ nhiều thế kỷ,

với nhiều tác dụng nổi bật [51]. Y học hiện đại cũng có nhiều nghiên cứu về tác

dụng phòng chống ung thư của Tam thất [8].

Các saponin chiết xuất từ Tam thất được báo cáo có các tác dụng ức chế

sự gia tăng và chống di căn của các tế bào ung thư. Wang J.-R. và cộng sự

(2014) nuôi cấy tế bào 4T1 (dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú của chuột)

với saponin chiết xuất từ Tam thất ở các nồng độ khác nhau, từ 50 đến 400

µg/ml, được ủ trong 48 giờ cùng với đối chứng [66]. Kết quả cho thấy ở nồng

độ 50 μg/ml không có sự thay đổi đáng kể về khả năng sống sót của tế bào 4T1,

trong khi giảm khoảng 75, 60, 30 và 10% khả năng sống sót của tế bào 4T1 ở

các nồng độ 400, 300, 200 và 100 μg/ml, tương ứng. Các tác giả cũng đã quan

sát thấy giảm đáng kể sự di chuyển của tế bào 4T1 ở nồng độ 50μg/ml, và mức

giảm lớn nhất được báo cáo ở nồng độ 200 μg/ml [66]. Nghiên cứu của Lee và

cộng sự (2017) cho thấy khả năng sống sót của các tế bào ung thư đại trực

tràng của người HCT-116 sau khi xử lý với notoginsenosid R1 ở nồng độ 75,

150 hoặc 300µmol/l là tương đương với khả năng sống sót của đối chứng trong

48 giờ ủ [67]. Tuy nhiên, ở nồng độ 500µmol/l, notoginsenosid R1 gây ra mức

giảm đáng kể khả năng sống sót của tế bào HCT-116 (58 ± 7,26%) so với đối

chứng (100%) trong thời gian ủ 48h. Ngoài ra, khi ủ với notoginsenosid R1

nồng độ 150 hoặc 300µmol/l trong 24h đã giảm đáng kể lần lượt là 35 và 68%

biểu hiện MMP-9 trong các dòng tế bào HCT-116 so với nhóm đối chứng

(100%) (p <0,01). Kết quả nói trên chỉ ra rằng notoginsenosid R1 ức chế sự di

chuyển và xâm nhập của tế bào ung thư đại trực tràng người HCT-116 bằng

cách điều chỉnh sự biểu hiện MMP-9 trong các dòng tế bào này [67]. Nghiên

cứu tổng quan của Ming-Ming Tan và cộng sự (2021) cho thấy các ginsenosid

chiết xuất từ Tam thất có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau

như ung thư gan, ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư tử cung, ung thư

buồng trứng, ung thư thần kinh đệm [8]. Sáu saponin chính chiết xuất từ Tam

thất bao gồm ginsenosid Rb1, Rd, Rg3, Rh2, Rh4 và notoginsenosid R1 được

chứng minh làm thay đổi đáng kể các dấu hiệu chết tế bào theo chương trình

(apoptotic) bao gồm caspase-3, Bax, p53, p21, ROS và TEER, ngăn ngừa sự

hình thành khối u [8].

Tác dụng chống ung thư của rễ Tam thất đã được chứng minh là tăng

cường đáng kể sau khi hấp hơi nóng. Sun và cộng sự (2010) báo cáo cao chiết

của rễ Tam thất ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư đại trực tràng ở

người SW-480, trong khi cao chiết Tam thất không hấp ức chế không đáng kể.

IC50 của dịch chiết rễ Tam thất hấp trong 1, 2, 4 và 6 giờ ở 120°C lần lượt là

259,2, 131,4, 123,7 và 127,1μg/ ml. Phân tích sự di chuyển của tế bào đã chứng

minh rằng tỷ lệ cảm ứng tế bào apoptotic của tế bào SW-480 là 56,3% và

64,4% với nồng độ lần lượt 150,0 và 200,0 μg/ml cao chiết Tam thất hấp trong

6 giờ [10]. Nghiên cứu của Toh và cộng sự (2011) cũng cho thấy Tam thất hấp

có tác dụng chống tăng sinh tế bào ung thư gan (SNU449, SNU182 và HepG2)

nhiều hơn so với dạng chưa hấp [11]. Tác dụng chống ung thư của rễ Tam thất

được tăng cường có liên quan mật thiết đến sự biến đổi thành phần hóa học khi

hấp. Hấp làm giảm hàm lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Re, Rb1,

Rc, R2, Rb3 và Rd, nhưng làm tăng hàm lượng Rh1, Rg2, 20R-Rg2, Rg3 và

Rh2. Đặc biệt hấp có ảnh hưởng đáng kể đến sự biến đổi của Rg3, một hợp

chất chống ung thư, trong rễ Tam thất [10], [11]. Saponin chiết xuất từ Tam thất

trồng ở Việt Nam được chứng minh có tác dụng chống ung thư vú gây ra do 7,12-

dimethylbenz(a) anthracene ở chuột với bằng chứng là giảm thể tích khối u [68].

1.2.3.2.Tác dụng tăng cường miễn dịch

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các polysaccharid và saponin chiết xuất từ Tam

thất thể hiện tác dụng tăng cường miễn dịch. Sanchinan A, một polysaccharid được

phân lập từ rễ của Tam thất có tác dụng kích hoạt hệ thống lưới nội mô [69].

Polysaccharid của Tam thất kích thích sự tăng trưởng của tế bào lympho T in vivo và

in vitro. Ngoài ra, nó thúc đẩy sự hình thành kháng thể và sự sản xuất interleukin

[70]. Bốn polysaccharid (PF3111, PF3112, PBGA11 và PBGA12) có trọng lượng

phân tử 27 đến 760 kDa được cấu trúc bởi các phân tử đường như glucose, galactose,

arabinose, mannose và xylose với các tỷ lệ mol khác nhau; ngoại trừ PBGA11, các

polysaccharid này đều có tác dụng trong việc sản xuất interferon-γ khi có

concanavalin A.Notoginsenosid-D, -G, -H và –K làm tăng nồng độ IgG huyết thanh

trong ovalbumin gà gây miễn dịch ở chuột. Saponin từ Tam thất kích thích sự tăng

sinh của bạch cầu nội biểu bì khi có concanavalin A và bổ trợ hoạt động miễn dịch

của cơ thể [71]. Sun HX và cộng sự (2003) đánh giá tác dụng của saponin chiết xuất

từ Tam thất (PNS) trên các đáp ứng miễn dịch đối với chuột được tiêm dưới da

ovalbumin (OVA). Kết quả cho thấy nhóm chuột được tiêm OVA và PNS (liều 50,

100, 200 µg/kg thể trọng) có nồng độ kháng thể IgG cao hơn đáng kể (p<0,01) so với

nhóm chuột chỉ nhận được chủng ngừa OVA [72]. Dịch chiết nước từ rễ Tam thất

được chứng minh có tác dụng chống lại sự lây nhiễm của virus Cúm A bằng cách

tăng cường các phản ứng miễn dịch qua trung gian kháng virus và hoạt động của tế

bào giết tự nhiên [73]. Tác dụng tăng cường miễn dịch của Tam thất cũng được xem

là một trong những cơ chế tác dụng trong điều trị ung thư. Nghiên cứu của Bosung

Kim và cộng sự (2018) cho thấy Panax notoginseng ức chế sự phát triển của khối u

thông qua việc kích hoạt đại thực bào thành phân cực M1 [74]. Các Ginsenosid được

chứng minh có tác dụng điều hòa chức năng các tế bào ức chế miễn dịch dòng tủy

trong vi môi trường khối u [75].

Tác dụng tăng cường miễn dịch của Tam thất được thể hiện tốt hơn khi được

chế biến hấp. Zejun Zhang và cộng sự (2020) đã báo cáo kết quả nghiên cứu cho

thấy Tam thất hấp làm giảm tình trạng thiếu máu ở chuột mắc hội chứng thiếu máu

thông qua việc điều chỉnh các yếu tố tạo máu và con đường JAK-STAT [76]. Các

Ginsenosid Rg3 có tác dụng nổi trội trong việc thúc đẩy miễn dịch tế bào ở chuột

mang u gan H22 [77]. Ginsenosid Rk3 và ginsenosid Rh4 có tác dụng rõ rệt chống

thiếu máu trên chuột bị thiếu máu do ribavirin [78]. Các Ginsenosid Rg3, Rk3 và

Rh4 là các saponin mới được tạo ra trong Tam thất sau quá trình hấp [64], [65].

1.2.3.3. Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan

Dịch chiết toàn phần của Tam thất thể hiện hoạt động chelat ion sắt mạnh và

các hoạt động quét các gốc tự do chống lại hydro peroxit, các gốc hydroxyl, đồng

thời cũng thể hiện hoạt động chống lại anion superoxid và các gốc tự do DPPH

[79]. Saponin chiết xuất từ Tam thất được chứng minh có tác dụng tốt dọn dẹp gốc

tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl và gốc hydroxyl trong thử nghiệm chống oxy

hóa in vitro [80]. Tác dụng chống oxy hóa của Tam thất hấp tốt hơn so với Tam thất

chưa hấp [81], [82], [83].

Tác dụng chống oxy hóa của Tam thất có vai trò quan trọng trong dự phòng

và điều trị nhiều bệnh lý. Saponin chiết xuất từ rễ Tam thất có tác dụng chống oxy

hóa mạnh đối với quá trình lão hóa ở tế bào thần kinh, giúp cải thiện triệu chứng

bệnh lý trên mô hình gây bệnh Alzheimer ở chuột [84]. Các saponin trong Tam thất

giúp bảo vệ thận khỏi bệnh tiểu đường thông qua kích hoạt các protein chống oxy

hóa ở chuột [85]. Trilinolein là một triacylglycerol tự nhiên được phân lập từ Tam

thất, có tác dụng chống thiếu máu cục bộ, chống loạn nhịp tim và chống oxy hóa,

được sử dụng trong điều trị các bệnh lý tim mạch [86]. Saponin chiết xuất từ Tam

thất có tác dụng bảo vệ tế bào nội mô vi mạch não chống lại sự suy giảm chức năng

rào cản do oxy-glucose/tái tưới máu thông qua việc kích hoạt đường dẫn tín hiệu

chống oxy hóa PI3K/Akt/Nrf2 [87]. Trên mô hình gây ung thư vú thực nghiệm,

saponin chiết xuất từ Tam thất trồng ở Việt Nam làm giảm thể tích khối u kèm theo

giảm mức độ peroxy hóa lipid và tăng trọng lượng cơ thể, và tăng hoạt động chống

oxy hóa của enzym superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase trong

mô vú chuột [68]. Tác dụng bảo vệ của saponin chiết xuất từ Tam thất trên tổn

thương gan cấp tính do etanol có liên quan đến cải thiện sự tích tụ lipid ở gan và

giảm stress oxy hóa qua trung gian etanol [88].

Gan là cơ quan chính bị các loại oxy phản ứng (ROS) tấn công [89]. Các tế bào

nhu mô là các tế bào nguyên sinh bị tổn thương do stress oxy hóa trong gan. Ti thể,

microsome và peroxisome trong tế bào nhu mô có thể tạo ra ROS, điều hòa PPARα,

liên quan chủ yếu đến biểu hiện gen oxy hóa axit béo ở gan. Hơn nữa, tế bào Kupffer,

tế bào sao gan và tế bào nội mô có khả năng tiếp xúc hoặc nhạy cảm hơn với các phân

tử liên quan đến stress oxy hóa. Một loạt các cytokine như TNF-α có thể được tạo ra

trong tế bào Kupffer do stress oxy hóa gây ra, có thể làm tăng chứng viêm và quá trình

apoptosis. Đối với tế bào gan hình sao, sự tăng sinh và tổng hợp collagen của tế bào

hình sao gan được kích hoạt bởi quá trình peroxy hóa lipid gây ra bởi stress oxy hóa

[90],[91],[92]. Khi ROS tăng quá mức, cân bằng nội môi sẽ bị rối loạn, dẫn đến stress

oxy hóa, đóng vai trò quan trọng trong các bệnh gan và các rối loạn thoái hóa và mạn

tính khác [91]. Stress oxy hóa không chỉ gây ra tổn thương gan bằng cách gây ra sự

thay đổi không thể phục hồi của lipid, protein và nội dung DNA và quan trọng hơn,

điều chỉnh các con đường kiểm soát các chức năng sinh học bình thường [89]. Vì vậy,

những chất có tác dụng chống oxy hóa như GSH, vitamin E, silymarin...được sử dụng

làm thuốc bảo vệ gan. Tam thất cũng thể hiện tác dụng bảo vệ gan thông qua tác dụng

chống oxy hóa. Dịch chiết nước nóng của Tam thất được chứng minh có tác dụng bảo

vệ tế bào gan chuột bị gây nhiễm độc gan mạn tính bằng ethanol, thông qua việc ức

chế sản xuất các gốc oxy tự do gây ra quá trình peroxy hóa lipid [93]. Các chuột được

điều trị bằng saponin chiết xuất từ Tam thất (100 hoặc 300 mg/kg) một lần mỗi ngày

trong 7 ngày liên tục trước khi uống ethanol làm giảm đáng kể tổn thương gan do

nhiễm độc ethanol cấp gây ra, thông qua chỉ tiêu làm giảm các enzym AST và ALT

trong máu chuột. Đồng thời, saponin chiết xuất từ Tam thất ngăn chặn sự gia tăng sản

xuất các loại oxy phản ứng (ROS) và hàm lượng malondialdehyde (MDA), giảm mức

TNF-α và IL-6, khôi phục mức glutathione (GSH), tăng cường hoạt động của

superoxide dismutase (SOD) trong gan, và loại bỏ cảm ứng cytochrome P450 2E1

(CYP2E1) [88]. Các chiết xuất từ methanol và nước của Tam thất cho thấy có tác

dụng bảo vệ tế bào gan rõ rệt trên chuột bị tổn thương gan bằng carbon tetrachloride

[94], [95]. Nhiều hoạt chất chiết xuất từ Tam thất như acidic polysaccharid,

ginsenosid-Re và ginsenosid Rk3 được chứng minh có tác dụng tốt trong bảo vệ tế bào

gan trên các mô hình gây tổn thương gan khác nhau cũng như theo nhiều cơ chế khác

nhau nhưng đều có liên quan đến tác dụng chống oxy hóa [95], [96], [97]. Các saponin

trong Tam thất còn được chứng minh có tác dụng thúc đẩy quá trình tái tạo gan thông

qua việc kích hoạt con đường tăng sinh tế bào PI3K/AKT/mTOR và điều chỉnh con

đường sống sót của tế bào AKT/Bat ở chuột [98].

1.2.3.4. Các tác dụng khác

Tam thất có một số tác dụng sinh học khác như: chống huyết khối [99], ngăn

ngưng kết tiểu cầu [100], chống viêm [101], hạ đường huyết [102], hạ lipid máu

[103], chống béo phì [104]...

Các tác dụng của Tam thất liên quan chặt chẽ với sự biến đổi hoạt chất sau

hấp. Tam thất ở dạng thô chưa hấp có tác dụng cầm máu, chống đông máu và

chống viêm tốt hơn, trong khi Tam thất hấp thể hiện các tác dụng kháng u, tăng

sinh tế bào máu, tăng miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan tốt hơn [10],

[83], [84]. Đối với bệnh nhân bị ung thư, ngoài tác dụng kháng u thì các tác dụng

tăng sinh tế bào máu, tăng miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan đều có

vai trò quan trọng và hỗ trợ điều trị. Vì vậy, Tam thất hấp được xem là một đối

tượng tiềm năng giúp hỗ trợ điều trị ung thư cần được nghiên cứu đánh giá.

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÁC

DỤNG KHÁNG U

Để nghiên cứu tác dụng kháng u trên thực nghiệm của các chế phẩm nghiên

cứu, các nghiên cứu thường tiến hành trên mô hình nuôi cấy tế bào in vitro và trên

mô hình động vật thực nghiệm in vivo.

1.3.1. Các mô hình nghiên cứu in vitro

In vitro là phương pháp nghiên cứu đối với các vi sinh vật, tế bào, hoặc các

phân tử sinh học trong điều kiện trái ngược với bối cảnh sinh học bình thường của

chúng, được gọi là "thí nghiệm trong ống nghiệm". Các nghiên cứu in vitro cho

phép sàng lọc nhanh các hoạt chất có tác dụng chống ung thư, phân tích chi tiết cụ

thể, đơn giản hơn, thuận tiện hơn so với việc thực hiện với toàn bộ cơ thể [105].

Tuy nhiên, các kết quả thu được từ các thí nghiệm trong ống nghiệm có thể không

dự đoán đầy đủ hoặc chính xác tác động trên toàn bộ cơ thể.

Trong mô hình in vitro, các chế phẩm được thử bằng cách ủ trực tiếp với các

dòng tế bào ung thư có nguồn gốc từ người hay động vật. Các tế bào ung thư này

được nuôi cấy ở điều kiện đặc biệt và môi trường thích hợp để tạo dạng đơn lớp

(2D) hay dạng khối cầu (3D). Phương pháp nuôi cấy 2D là phương pháp cơ bản

nhất nhưng có nhiều hạn chế vì không mô phỏng được điều kiện in vivo của cơ thể.

Các tế bào trong mô hình nuôi cấy 3D phát triển trong không gian ba chiều, mô

phỏng lại cấu trúc tự nhiên của các mô, cơ quan trong cơ thể do đó việc thử nghiệm

phản ánh đầy đủ các mối quan hệ giữa tế bào với tế bào, tế bào với chất nền ngoại

bào và tế bào với môi trường dinh dưỡng như trong cơ thể bình thường. Nghiên

cứu bước đầu có thể tiến hành sàng lọc trên mô hình 2D, thu được kết quả khả quan

bước đầu tạo tiền đề để tiếp tục thử nghiệm trên mô hình 3D. Nghiên cứu sử dụng

mô hình 3D để đánh giá sàng lọc, tuyển chọn các chất tự nhiên có khả năng kháng

u [106]. Trong mô hình này, các chỉ số như tỷ lệ tế bào sống/chết, chỉ số IC50, tỷ số

tăng/giảm kích thước khối cầu các tế bào ung thư và các ảnh hưởng của chế phẩm

lên hình thái tế bào sẽ được đánh giá.

Trong phương pháp đánh giá in vitro, các bước tiến hành như sau:

- Hoạt hóa và nhân nuôi dòng tế bào ung thư: dòng tế bào ung thư thường

được lưu trữ ở trạng thái đông lạnh. Khi triển khai thử nghiệm, tế bào được rã đông

ở 37oC sau đó đem ly tâm để thu cặn tế bào, hoạt hóa và đưa và nhân nuôi ở các

môi trường nuôi cấy phù hợp.

- Đánh giá khả năng gây độc tế bào của mẫu thử nghiệm trên dòng tế bào

ung thưnuôi cấy. Các mẫu thử nghiệm được chuẩn bị ở nồng độ gốc, sau đó được

pha loãng trong điều kiện vô trùng để có dải nồng độ ở các đĩa pha mẫu. Tại các

giếng thử, tế bào ung thư được ủ với mẫu thử ở các nồng độ khác nhau. Giếng

không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180 µl) được sử dụng làm đối chứng.

Sau một thời gian ủ nhất định, tế bào được cố định, nhuộm và đo quang để đánh giá

các chỉ số như tỷ lệ tế bào sống/chết, chỉ số IC50...

Để đánh giá sâu hơn về khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình

(apoptosis), các kỹ thuật Flow cytometry hoặc nhuộm hóa mô miễn dịch được áp

dụng. Apoptosis là một quá trình diễn ra tự nhiên trong cơ thể, bao gồm một chuỗi

các bước được kiểm soát để cuối cùng tế bào tự hủy diệt (tự sát) một cách có chủ

đích. Cơ thể dùng apoptosis để giám sát và cân bằng tự nhiên quá trình phân chia tế

bào (nguyên phân) hoặc tiếp tục phát triển và tái tạo tế bào. Quá trình apoptosis

được đặc trưng bởi các đặc điểm hình thái nhất định, bao gồm: những thay đổi

trong màng sinh như mất đối xứng màng và mất sự gắn kết màng, sự cô đặc của tế

bào chất và nhân và sự phân cắt DNA. Trong giai đoạn cuối, các phân mảnh tế bào,

được loại bỏ nhanh chóng bởi tế bào thực bào mà không tạo ra đáng kể tổn thương

viêm cho các tế bào xung quanh. Suy giảm apoptosis làm tăng tỷ lệ sống sót của tế

bào, dẫn đến ung thư phát triển. Do đó mục tiêu apoptosis là một tiêu chuẩn mới

trong phát triển thuốc điều trị ung thư. Các thuốc thử và công nghệ phát hiện

apoptosis, đo lường các chỉ số về apoptosis tại các giai đoạn khác nhau đã được

phát triển dựa trên các đặc điểm đặc biệt của quá trình apoptosis, gồm: thay đổi

Hoạt hoá Caspases

Thay đổi màng Plasma

Tế bào còn hoạt động sống (Live Cells)

Thay đổi ty thể

Chết tế bào theo chương trình

(Apoptosis)

Hoạt hoá Caspases

Tế bào dừng hoạt động sống (Fixed Cells)

Phân mảnh ADN

màng Plasma, thay đổi ty thể, hoạt hoá Caspases, sự phân mảnh AND [107].

Hình 1.3. Các đặc điểm phân tích chết tế bào theo chương trình (Apoptosis)

Thay đổi màng Plasma

Những thay đổi trong màng sinh chất là một trong những đặc điểm sớm nhất

của quá trình apoptosis. Trong tế bào apoptotic, màng phospholipid,

phosphatidylserine (PS), được chuyển vị trí từ trong ra ngoài của màng sinh chất, do

đó bộc lộ PS với môi trường tế bào bên ngoài. Annexin V là một protein liên kết

phospholipid phụ thuộc Ca2+, có ái lực cao với PS và liên kết với các tế bào có PS bộc

lộ ra ngoài. Annexin V có thể được liên hợp với các fluorochromes như FITC và PE,

hoặc với biotin hoặc được gắn với EGFP (protein huỳnh quang xanh tăng cường).

Việc liên hợp này vừa giữ lại ái lực cao của chúng với PS, vừa cung cấp tín hiệu để

phân tích các tế bào đang trải qua quá trình apoptosis. Sự hình thành bên ngoài PS xảy

ra trong giai đoạn sớm hơn của quá trình apoptosis, phương pháp nhuộm Annexin V

có thể xác định được quá trình apoptosis ở giai đoạn sớm hơn so với các thử nghiệm

dựa trên những thay đổi ở nhân như phân mảnh DNA. Do đó, nhuộm Annexin V kết

hợp với thuốc nhuộm propidium iodide (PI) hoặc 7-amino-actinomycin D (7-AAD)

cho phép xác định các tế bào apoptosis sớm (Annexin V dương tính, PI hoặc 7-AAD

âm tính), và những tế bào trong giai đoạn sau của quá trình apoptosis hoặc đã chết

(Annexin V dương tính, PI hoặc 7-AAD dương tính) [108].

Thay đổi ty thể: Thay đổi điện thế màng ty thể

Ty thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis bằng cách giải

phóng cytochrome C và các protein khác cần thiết để kích hoạt pro-caspase-9 và

thực hiện quá trình apoptosis. Một trong những dấu hiệu sớm nhất của quá trình

apoptosis qua trung gian ty thể là sự thay đổi điện thế màng ty thể. Sự khử cực này

được theo sau bởi sự gia tăng tính thấm màng ty thể và sau đó giải phóng các

protein liên màng hòa tan khác nhau vào tế bào chất, như cytochrome C, AIF,

Smac/DIABLO và nhiều pro-caspases khác nhau [109]. Bộ BD™ MitoScreen Kit

(chứa JC-1) dựa trên huỳnh quang để phát hiện và đo lường các tế bào trong giai

đoạn đầu của quá trình apoptosis. Thuốc nhuộm cation ưa béo thấm qua màng JC-1

được sử dụng làm đầu dò điện thế màng Dym. Thuốc nhuộm này có thể tồn tại ở

hai trạng thái khác nhau: tập hợp hoặc đơn phân, và mỗi trạng thái được đặc trưng

với một phổ phát xạ khác nhau. Các ty thể bình thường, khỏe mạnh hấp thụ thuốc

nhuộm, dẫn đến hình thành các tập hợp dẫn đến phát huỳnh quang màu đỏ cao

được đo bằng FL2. Sự chuyển đổi của ty thể từ phân cực sang khử cực (do quá

trình apoptosis hoặc các sự kiện sinh lý khác) dẫn đến rò rỉ chất nhuộm màu ra khỏi

ty thể vào tế bào chất, dẫn đến giảm huỳnh quang màu đỏ. JC-1 không tích lũy

trong ty thể với khử cực Dym và tồn tại trong tế bào chất dưới dạng đơn phân dẫn

đến phát huỳnh quang màu đỏ thấp.

Hoạt hoá capases

Một trong những đặc điểm sớm của quá trình apoptosis là sự kích hoạt một

loạt các protease tế bào, các caspase, phân cắt nhiều cơ chất protein, dẫn đến mất

cấu trúc và chức năng tế bào, và cuối cùng dẫn đến chết tế bào. Đặc biệt, các

caspase -3, -8 và -9 có liên quan đến quá trình apoptosis: caspase-9 trong con

đường ty thể, caspase-8 trong con đường Fas/CD95, và caspase-3. Hoạt hoá

Caspase-3 là dấu hiệu các tế bào đang trải qua quá trình apoptosis, caspase-3 là một

protease quan trọng được kích hoạt trong giai đoạn đầu của quá trình apoptosis

[110]. BD Bioscineces cung cấp kháng thể phát hiện Caspase-3 hoạt hoá hoặc sử

dụng BD™ CBA’s (cytometric bead arraya) để phân tích đa thông số trong con

đường apoptosis (Human Apoptosis Kit (Cleaved PARP, Bcl-2, Active Caspase-3),

Cat.No. 557816).

Phân mảnh DNA

Một trong những bước sau của quá trình apoptosis là phân mảnh DNA, là kết

quả của việc kích hoạt các endonuclease trong apoptosis. Những nuclease này làm

suy giảm cấu trúc nhiễm sắc bậc cao thành các đoạn có kích thước ~ 300 kb và sau

đó thành các đoạn DNA nhỏ hơn khoảng 50 bp. Một phương pháp thường được sử

dụng để phát hiện DNA phân mảnh sử dụng phản ứng được xúc tác bởi exogenous

terminal transferase, TdT, thường được gọi là “End-labeling” hoặc “TUNEL”

(terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling). APO-BrdU và

Apo-Direct kit phát hiện sự phân mảnh DNA trong các tế bào bám dính và trong

các tế bào phát triển ở trạng thái huyền phù bằng cách sử dụng phép đo dòng chảy

kết hợp với phân tích chu kỳ tế bào [111].

1.3.2. Các mô hình nghiên cứu in vivo

Thực tế cho thấy có những hợp chất có tác dụng, biểu hiện hoạt tính khi

thửnghiệm in vitro nhưng chưa chắc đã có kết quả mong muốn khi áp dụng lên cơ

thể động vật thí nghiệm. Vì vậy, thử nghiệm in vivo vẫn được coi là bước thử

nghiệm cần thiết để đánh giá tác dụng của chế phẩm nghiên cứu sau khi đã tiến

hành thử nghiệm in vitro cho các kết quả khả quan. Trong lĩnh vực nghiên cứu ung

thư thực nghiệm, mô hình nghiên cứu in vivo là mô hình nghiên cứu bắt buộc để có

thể đưa ra các số liệu khoa học tin cậy về một chất có thực sự tác động và biểu hiện

hoạt tính chống lại ung thư hay không, trước khi tiến hành thử nghiệm trên người

[112], [113]. Các mô hình nghiên cứu gây khối u trên động vật (in vivo) cho được

chia ra làm các nhóm như sau:

* Nhóm 1: Khối u phát triển tự nhiên trên một số loài động vật (cả loài gặm

nhấm và không gặm nhấm); do tỷ lệ bắt gặp thấp (khoảng 1%), khối u phát triển tự

nhiên trên động vật rất khó ứng dụng trong việc đánh giá hiệu quả của các tác nhân

điều trị/dự phòng.

* Nhóm 2: Khối u phát triển do các tác nhân ngoại sinh: hai tác nhân ngoại

sinh quan trọng gây ra khối u là chế độ ăn và hóa chất. Chẳng hạn “Chế độ ăn

phương Tây” (“Western diet”) với đặc điểm là tăng chất béo, giảm calci và vitamin

D, cho chuột ăn trong thời gian trên 12 tuần làm tăng sinh các tuyến nhú đại tràng

(colonic crypts) ở chuột cống và chuột nhắt. Hóa chất gây khối u được tiến hành

trên nhiều mô hình. Hợp chất 1,2-dimethylhydrazine (DMH) và chất chuyển hóa

của nó, azoxymethane (AOM), là hai chất gây ung thư được sử dụng phổ biến nhất

để gây ung thư đại trực tràng ở chuột cống và chuột nhắt. N-methyl-N-nitro-N-

nitrosoguanidine và N-methyl-N-nitrosourea: (viết tắt là MNU và NMU) là những

chất gây ung thư tác động trực tiếp được dùng cho cả chuột cống và chuột nhắt để

gây ra các khối u ở nhiều cơ quan. Khi dùng đường uống, ung thư phát triển ở dạ

dày, ruột non, đại tràng, thận, da, phổi và tuyến ức. Khi tiêm MNU gây ung thư

tuyến tiền liệt và ung thư vú. Ở thời điểm 14 ngày tuổi, các chuột nhắt trắng đực

được gây ung thư biểu mô gan bằng cách tiêm phúc mạc một liều

diethylnitrosamine (DEN) 35mg/kg, pha trong dung dịch đệmnước muối sinh lý

phosphat vô khuẩn (sterile phosphate buffered saline - PBS). Mặc dù các phương

pháp gây u bằng hóa chất có những ưu điểm nhất định, nhưng thực tế nghiên cứu

cho thấy mô hình này vẫn còn bộc lộ một số nhược điểm. Phương pháp gây u sử

dụng hóa chất thường phải tiêu tốn nhiều thời gian, công sức vì phải sau một thời

gian dài từ lúc cho chuột uống hóa chất (có thể lên tới 8-12 tháng) mới tạo thành

khối u, hóa chất thường không tạo ra một khối u đơn thuần mà lại có thể gây ra

nhiều khối u ở phổi và ở nhiều cơ quan khác nên rất khó đánh giá khi chỉ muốn

nghiên cứu về một loại u cụ thể, tỷ lệ chuột chết cao nhất là khi sử dụng liều cao vì

các hóa chất gây u đều rất độc… Quá trình cho động vật sử dụng các chất gây ung

thư kéo theo sự nguy hại cho người tiến hành thí nghiệm, chất thải độc hại ra môi

trường hoặc xử lý rác thải rất tốn kém.

* Nhóm 3: Các mô hình gây khối u do sự biến đổi gen ở chuột theo các cách

khác nhau.

- Mô hình gây đột biến dòng tế bào mầm gây ra bởi các chất gây đột biến,

các đột biến trong tế bào được truyền sang con cái. Ví dụ chuột nhắt ApcMin được

tạo ra từ đột biến ở chuột C57Bl/6J do ethylnitrosurea (ENU). Vì sự giống nhau về

mặt bệnh học và phân tử của mô hình ApcMin với bệnh lý đa polyp tuyến gia đình

(familial adenomatous polyposis –FAP), một bệnh lý mà nếu không điều trị sẽ

100% tiến triển thành ung thư đại trực tràng.

- Chuột nhắt biến đổi di truyền cung cấp khả năng tổng hợp lại chính xác các

phân tử liên quan đến căn nguyên bệnh ở người, giúp các nhà nghiên cứu lựa chọn

các chuột biến đổi gen kiểm soát được loại hình, thời gian, vị trí biến đổi gen phù

hợp tạo ra mô hình ung thư theo mục đích nghiên cứu.

Các chuột ung thư do biến đổi gen mặc dù có nhiều ưu điểm, nhưng việc tạo

ra khối u trên chuột biến đổi gen là một kỹ thuật khó, chi phí cao và đòi hỏi sự quản

lý nghiêm ngặt. Chính vì vậy, các mô hình gây khối u do sự biến đổi gen ở chuột

hiện nay vẫn chưa được thực hiện tại Việt Nam.

* Nhóm 4: Các mô hình gây khối u theo cách cấy ghép khối tế bào ung thư

vào chuột. Có các hình thức cấy ghép u sau:

- Mô hình ghép dị loài: Mô hình này sử dụng chuột thiếu hụt miễn dịch để

cấy ghép tế bào ung thư người trên cơ thể động vật. Đây được xem là một bước đột

phá trong nghiên cứu ung thư. Trên các mô hình này, các khối ung thư tạo ra trên

chuột mang các đặc tính cơ bản giống khối ung thư trên người, nên nó tiệm cận gần

hơn trong việc đánh giá tác dụng điều trị của các thuốc mới dự định áp dụng điều

trị ung thư trên người. Về cơ bản, hầu hết các loại ung thư người đều có thể được

ghép tạo khối u trên chuột thiếu hụt miễn dịch [112], [113].

Bắt đầu được tạo ra từ năm 1966 bởi Flanagan, chuột Balb/c nude có biểu

hiện bên ngoài khác biệt là không có lông, suy giảm hoặc mất chức năng tuyến ức

dẫn đến sự suy giảm hệ miễn dịch nghiêm trọng, các tế bào lympho T nguồn gốc

tuyến ức thiếu hụt còn gây ảnh hưởng tới khả năng hoạt động của các tế bào

lympho B và tế bào gốc tủy xương [114]. Chính vì vậy, các đáp ứng liên quan đến

đáp ứng của hệ miễn dịch bị ảnh hưởng bao gồm:

+ Hình thành kháng thể liên quan đến tế bào lympho T: CD4+ helper.

+ Đáp ứng qua miễn dịch trung gian tế bào cần sự có mặt của lympho T: CD4+

và/hoặc CD8+ (đáp ứng quá mẫn muộn, tiêu diệt virus hoặc phản ứng thải ghép).

Như vậy, với mô hình ghép dị loài, đánh giá tác dụng của các chế phẩm

nghiên cứu thông qua tác động tới hệ miễn dịch bị hạn chế. Nhiều dược liệu, bài

thuốc cũng như các chế phẩm sinh học có tác dụng trên hệ thống miễn dịch, cần

được đánh giá tác dụng kháng u của chế phẩm thông qua hàng loạt các cơ chế

miễn dịch. Để đánh giá tác dụng của các chế phẩm như vậy, cần tiến hành

nghiên cứu trên mô hình động vật mang u có hệ thống miễn dịch đầy đủ.

Cấy chuyển các dòng tế bào ung thư động vật (mô hình ghép đồng loài): Các

dòng tế bào ung thư thực nghiệm đã có từ khá lâu. Các nhà khoa học nhận thấy tế

bào ung thư dù ở trong cơ thể động vật hay nuôi cấy trong ống nghiệm vẫn giữ

được đặc tính mô bệnh học của nó và khi cấy chuyển những tế bào này vào cá

thểcùng loài thì tạo nên khối u mới có đặc tính của khối u nguyên phát [112]. Hiện

nay, hai dòng tế bào sarcoma TG180 và Lewis Lung Carcinoma được sử dụng

nhiều trong các mô hình ung thư thực nghiệm. Với mô hình này, tế bào ung thư

được cấy chuyển lên chuột bình thường không bị các tác nhân biến đổi gen hay hóa

chất làm suy giảm hệ thống miễn dịch. Cũng do hệ thống miễn dịch của chuột còn

tốt, vấn đề nuôi dưỡng, chăm sóc chuột cũng thuận tiện hơn nhiều so với các chuột

suy giảm miễn dịch. Tế bào ung thư cấy ghép là tế bào đồng loài nên hầu như tránh

được việc thải loại ghép, tỷ lệ cấy ghép thành công đạt mức cao. Chuột sau khi phát

triển khối u, yếu tố chính ảnh hưởng đến miễn dịch ở chuột là khối u chứ không

phải các yếu tố khác. Chính vì thế khi nghiên cứu chế phẩm trên mô hình này cho

phép đánh giá tác dụng của chế phẩm trên hệ miễn dịch của chuột mang u và mối

liên hệ giữa tác dụng trên hệ miễn dịch với tác dụng kháng u của chế phẩm.

Nhìn chung, có rất nhiều mô hình giúp nhà nghiên cứu có được những hiểu

biết có giá trị về ung thư ở người và đánh giá tác dụng kháng ung thư của các chế

phẩm nghiên cứu. Tuy nhiên, không có một mô hình đơn lẻ nào có được đầy đủ các

khía cạnh của bệnh lý trên người, do đó các nhà nghiên cứu phải lựa chọn cẩn thận

mô hình phù hợp nhất cho mục tiêu nghiên cứu của mình.

Trong các mô hình nghiên cứu in vivo, các chỉ tiêu như tỷ số phát triển u

(GR%), tỷ số thoái lui u (IR%), thời gian sống thêm (ILS) cũng như sự ảnh hưởng

của chế phẩm tới tình trạng sức khỏe chung của động vật thí nghiệm (sự tăng trọng,

chỉ tiêu sinh lý máu, sự biến đổi các cơ quan nội tạng, miễn dịch…) sẽ được khảo

sát. Mô hình in vivo có ưu điểm nổi bật là đánh giá được chính xác tác động của

thuốc lên khối u cũng như lên cơ thể do sự tương tác của cả 3 yếu tố: khối u, thuốc

và hệ miễn dịch của động vật thí nghiệm, đồng thời có thể đánh giá được tác động

chống oxy hóa của thuốc nghiên cứu trên cơ thể động vật mang u...

CHƯƠNG 2

CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. CHẤT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Chất liệu nghiên cứu

* Mẫu dược liệu nghiên cứu

Mẫu dược liệu nghiên cứu là rễ củ 4 năm của cây Tam thất (Panax

notoginseng (Burk.) F.H.) được trồng tại Simacai, Lào Cai. Mẫu nghiên cứu đã

được PGS. TS. Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu

thẩm định tên khoa học. Mẫu tiêu bản số HTV2-072015 được lưu tại Khoa Hóa

thực vật - Viện Dược liệu (Phụ lục 2).

Các mẫu Tam thất hấp được chuẩn bị như sau:

Mẫu tươi: rễ củ Tam thất tươi được thái lát, chia thành các phần nhỏ được

bọc bằng gạc, mỗi phần khoảng 150g. Tiến hành hấp ở nhiệt độ 100°C (hoặc

120°C) trong nồi hấp. Sau mỗi 4 giờ, lấy 01 phần đựng dược liệu ra, sấy khô ở

nhiệt độ 45°C, bảo quản trong túi nilon kín, phục vụ quá trình nghiên cứu.

Mẫu khô: rễ củ Tam thất tươi được thái lát, sấy khô ở 45°C đến độ ẩm 

10%, thu được mẫu Tam thất khô. Mẫu khô được xay thành bột, chia thành các

phần nhỏ, mỗi phần khoảng 30g. Tiến hành hấp ở nhiệt độ 100°C (hoặc 120°C)

trong nồi hấp. Sau mỗi 4 giờ, lấy 01 phần đựng dược liệu ra, sấy khô ở nhiệt độ

45°C, bảo quản trong túi nilon kín, phục vụ quá trình nghiên cứu.

Hình 2.1: Mẫu Tam thất khô, hấp ở 100ºC

Hình 2.2: Mẫu Tam thất khô, hấp ở 120ºC

Hình 2.3: Mẫu Tam thất tươi, hấp ở 100ºC

Hình 2.4: Mẫu Tam thất tươi, hấp ở 120ºC

* Cao định lượng NP(O) và NP(H)

Cân khoảng 1 kg bột Tam thất, chiết hồi lưu với dung môi ethanol 70%, tỷ lệ

dung môi/dược liệu: 10/1 (thể tích/khối lượng), 3 lần, mỗi lần 3 giờ. Gộp các dịch

chiết, cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc.

Hiệu suất chiết cao đặc từ bột Tam thất được xác định dựa trên công

thức:

Mcao x (100-acao) x 100 H= Mdl x (100-adl)

Trong đó: H: hiệu suất chiết cao (%)

Mcao, Mdl: khối lượng cao, khối lượng dược liệu (g)

acao, adl: độ ẩm cao, độ ẩm dược liệu (%)

- Cao định lượng từ bột rễ củ Tam thất không hấp được ký hiệu là NP(O).

- Cao định lượng từ bột rễ củ Tam thất hấp được ký hiệu là NP(H).

NP(H)

NP(O)

Hình 2.5. Cao định lượng NP(O) và cao định lượng NP(H)

* Các saponin đã phân lập:

- 2 saponin Rg3 và Rh1 thu được từ rễ củ Tam thất đã hấp hơi nóng;

- 4 saponin Rg1, Re, Rd và Rb1 thu được từ rễ củ Tam thất chưa xử lý qua hơi nóng;

Hình 2.6. Các saponin phân lập từ Tam thất

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

- Các dòng tế bào ung thư người: ung thư ruột kết (HT29), ung thư tế bào gan

(HepG2), ung thư vú (MCF-7), ung thư cơ (RD), ung thư biểu mô đáy phế nang

phổi (A549), ung thư biểu mô tuyến phổi (SK-LU-1): (ATCC, Hoa Kỳ), được bảo

quản tại Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam.

- Dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột Sarcoma TG180:(ATCC, Hoa Kỳ),

được bảo quản tại Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, cân nặng từ 20 -

22 gam, do Học viện Quân y cung cấp,dùng trong nghiên cứu độc tính cấp và

nghiên cứu tác dụng kháng u đùi thực nghiệm.

- Chuột cống trắng trưởng thành, dòng Wistar, không phân biệt giống, đạt

tiêu chuẩn thí nghiệm, cân nặng 180 - 220g, do Học viện Quân y cung cấp, dùng

trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn.

Chuột được nuôi 7- 14 ngày để thích nghi với môi trường và điều kiện chăn

nuôi của phòng thí nghiệm trước khi tiến hành nghiên cứu. Nhiệt độ phòng nuôi 25

± 50C. Động vật được ăn thức ăn dạng viên và uống nước sạch, tự do (ad libitum).

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụngtrong nghiên cứu

2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

* Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến hấp

nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất

- Các dụng cụ dùng trong quá trình thực nghiệm như bình gạn, bình nón,

phễu lọc, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet, kim tiêm.

- Cột sắc ký các kích thước.

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI).

- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115.

- Bếp điện, bếp đun cách thủy.

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, cân xác

định độ ẩm Precisa HA60.

- Đèn UV-Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV.

- Máy scan CanoScan LiDe 100 (Trung Quốc).

- Máy siêu âm Power sonic 405 (Hàn Quốc).

- Máy UV-VIS 1800 dải đo 190nm-800nm, hãng Shimadzu-Nhật Bản; Máy

đo điểm chảy Kofler micro-hotstage, Viện Hoá học các hợp chất Thiên nhiên, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VHLKH&CNVN).

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): BRUKER AVANCE AM500

FT – NMR (Công ty Bruker, Billerica, MA, Mỹ), và BRUKER – DRX-300 (Công

ty Bruker, Billerica, MA, Mỹ), của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam, chất nội chuẩn là tetramethyl silan.

- Máy đo phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization

MassSpectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap

(Mỹ) của Viện Hoá các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

- Máy UV-VIS 1800 dải đo 190nm- 800nm, hãng Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích Shimadzu LC10 TVP, detector

diod array SPD-M10Avp (Nhật Bản).

- Nồi hầm hơi nước OCOO OC-8000RV (Hàn Quốc)

* Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm, độc tính

cấp và bán trường diễn của các mẫu thử

- Buồng đếm tế bàoMalassez, Pháp.

- Máy đọc Elisa (SpectraMAX Plus 384 - Mỹ)

- Máy đếm tế bào BDFACS-Lysis của hãng BD - Mỹ

- Đĩa nuôi cấy tế bào 35, 100 mm; Chai nuôi cấy tế bào T25 (Corning, Mỹ).

- Hệ thống phòng thí nghiệm phục vụ nuôi cấy TB: phòng sạch, tủ ấm CO2, kính

hiển vi soi ngược, máy ly tâm, tủ mát 40C, tủ âm -200C, -800C, bình chứa nitơ lỏng…

- Máy xét nghiệm huyết học Vet abcTM Animal Blood Counter của hãng

ABX-Diagnostic (Pháp).

- Máy xét nghiệm sinh hóa 3000 Evolution (Biochemical Systems

International, Ý).

- Kính hiển vi huỳnh quang Nikon Eclipse Ti2 (Nhật Bản).

- Máy nhuộm tiêu bản tự động Leica Autostainer XL- ST5010, Đức.

- Máy đọc đĩa ELISA Chromate 4300, Awareness Technology, Mỹ.

- Máy rửa tự động Stat Fax- 2600®, Awareness Technology, Mỹ.

- Máy ủ và lắc trộn Stat Fax- 2200, Awareness Technology, Mỹ.

- Kính hiển vi phẫu thuật đa năng YSX- 107; Richy- Trung Quốc.

- Máy ly tâm lạnh Universal 320R; Hettich- Đức.

- Máy nghiền mô-tế bào-Homogenizer-D160-DLAB ( Mỹ).

- Tủ ấm Memmert INB 500; Memmert- Đức.

- Cân phân tích Ohaus PA 214C (d = 0,0001 g); Ohaus (Mỹ), Sartorius (Đức).

- Dụng cụ cho động vật uống thuốc (kim cong đầu tù các cỡ).

- Micropipet các cỡ, đầu côn, ống falcon các loại.

- Thước kẹp caliper dùng đo kích thước khối u đùi chuột.

- Dụng cụ phẫu thuật các cỡ, kim tiêm, chỉ, dao, kéo… và một số dụng cụ,

máy móc chuyên dụng khác.

2.1.3.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

* Dung môi, hóa chất dùng trong chiết xuất và phân lập: Methanol (MeOH),

ethanol, n-hexan, aceton, dicloromethan (DCM), chloroform, ethyl acetat (EtOAc),

n-butanol (n-BuOH)…và các thuốc thử.

* Dung môi, hóa chất dùng trong định lượng:

- Acetonitril (Merck), methanol (Merck), acid phosphoric (Merck)

- Silica gel cho sắc ký cột (0,04-0,063 mm, Merck)

- Bản mỏng silica gel tráng sẵn (MERCK): Pha thuận (Silica gel 60 F254) và pha

đảo (Silica gel 60 RP-18 F254 s) hoạt hóa trong tủ sấy ở nhiệt độ 105-110°C trong 60 phút.

* Dung môi hóa chất dùng trong nghiên cứu in vitro, in vivo:

- Trichloracetic acid - TCA (Sigma), Sulforhodamine B - (Sigma).

- Thuốc tham chiếu: Lentinan (Carbosynth Limited., Anh; Batch: FL

333211401), Mã sản phẩm FL33321; CAS No.37339-90-5), sử dụng làm chất tham

chiếu trong nghiên cứu in vivo.

- Chất tham chiếu: Ellipticine (Sigma – Mỹ), sử dụng làm chất tham chiếu

cho thử nghiệm đánh giá tác dụng kháng ung thư của 6 saponin đã phân lập và cao

định lượng NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người.

- Chất tham chiếu: Taxol (Sigma – Mỹ), sử dụng làm chất tham chiếu cho

thử nghiệm đánh giá tác dụng độc tính của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào

ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180.

- Kit định lượng các chỉ số hóa sinh trong máu: ALT, AST, Albumin, Cholesterol,

Bilirubin, Creatinin của hãng Hospitex Diagnosics (Italy) và hãng Dialab GmbH (Áo).

- Dung dịch xét nghiệm huyết học ABX Minidil LMG cho chuột của hãng

ABX – Diagnostics.

- Kít định lượng IL-2 (mã: RAB0287-1KT), TNF-α (mã: REF KMC3011)

cho chuột của hãng Invitrogen (Mỹ).

- Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy RPMI

1640 (Gibco, Mỹ), PBS (Phosphate Buffered Saline) (Gibco, Mỹ), Trypsin –

EDTA (Gibco, Mỹ), FBS (Fetal Bovine Serum) (Invitrogen, Mỹ).

- Blue Trypan (Gibco, Mỹ).

- DMSO (Dimethyl Sulfoxide) (Prolabo, Mỹ).

- CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Mỹ)

- Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến bằng hấp nhiệt đến

hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất.

2.2.1.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có trongcác

mẫu Tam thất hấp và không hấp.

* Phương pháp chiết xuất

Củ Tam thất (khô, đã nghiền bột) được chiết 3 lần với methanol 80% bằng

phương pháp chiết nóng ở nhiệt độ sôi. Tiến hành lọc loại bã dược liệu, gộp dịch lọc và

cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 45-50oC thu được cao đặc. Cao đặc này đem

phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, cất thu

hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn tương ứng dùng cho nghiên

cứu phân lập và tinh chế các chất.

* Phương pháp phân lập các chất

- Phân lập các hợp chất trong củ Tam thất bằng sắc ký cột (CC), theo dõi các

phân đoạn sắc ký bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM).

- Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-

0,063mm, Merck) với các hệ dung môi thích hợp.

- SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254

(Merck, ký hiệu 105715) và RP18 (Merck). Phát hiện chất dùng thuốc thử là dung

dịch H2SO4 10% trong ethanol.

- Kết tinh lại trong hệ dung môi.

- Độ tinh khiết của các chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, nhận

biết bằng đèn tử ngoại, phun dung dịch H2SO4 10% - hơ nóng, đo điểm chảy.

* Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên tính chất cảm quan, các

thông số vật lý (nhiệt độ nóng chảy) và các phương pháp phổ bao gồm: phổ khối

lượng (APCI-MS hoặc ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều

(1H, 13C và DEPT, HMBC, COSY…) và so sánh dữ liệu phổ thu được với các dữ liệu

phổ đã công bố.

- So sánh SKLM với chất đối chiếu trong cùng điều kiện.

2.2.1.2. Nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng hoạt chất trong Tam thất trước và sau khi

hấp ở các điều kiện khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Hàm lượng hoạt chất trong Tam thất trước và sau khi hấp ở các điều kiện

khác nhau được đánh giá bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Các yếu tố được khảo sát là thời gian hấp (0, 4, 8, 12, 16, 20, 24h), nhiệt độ hấp

(1000C, 1200C), mẫu Tam thất tươi hoặc khô [115].

Các chất đối chiếu là các chất tinh khiết đã được chiết xuất và phân lập từ

mẫu nghiên cứu (mục 3.1.1). Phương pháp định lượng được tham khảo tài liệu của

Dong Wang và cộng sự có điều chỉnh cho phù hợp với mẫu nghiên cứu [116].

Chuẩn bị mẫu:

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 15,0 mg mỗi chất đối chiếu, hòa tan riêng

trong 5ml methanol, thu được các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 3mg/ml. Phối hợp

các dung dịch chuẩn gốc thu được dung dịch hỗn hợp chuẩn. Pha loãng dung dịch hỗn

hợp chuẩn với methanol, thu được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ thích hợp.

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 2,0 g bột dược liệu, cho vào bình nón,

thêm 100ml dung môi methanol. Chiết hồi lưu trong 2 giờ. Để nguội, lọc dịch chiết

vào bình định mức 100ml, thêm dung môi đến vạch thu được dung dịch thử.

Các dung dịch chuẩn và dung dịch thử được lọc qua màng lọc kích thước

0,45µm trước khi triển khai sắc ký.

Điều kiện sắc ký:

Hệ thống HPLC của hãng Shimadzu, Nhật Bản

Nhiệt độ buồng cột: 28°C

Tốc độ dòng: 1,0ml/phút

Thể tích tiêm mẫu: 20µl

Bước sóng phát hiện: 205nm

Pha tĩnh: Cột Agilent C18 (250 x 4,6mm; 5µm)

Pha động: acetonitril (A) – Acid phosphoric 0,1% trong nước (B), rửa giải theo chương trình sau:

Thời gian (phút) Acetonitril (%) Acid phosphoric 0,1% trong nước (%)

0-20 20-22 80-78

20-45 22-46 78-54

45-55 46-55 54-45

55 45

55-70 Tiến hành:

Tiêm các dung dịch hỗn hợp chuẩn, ghi nhận sắc ký đồ. Xây dựng đường

chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic của các chất đối chiếu và nồng độ

của chúng trong dung dịch.

Tiêm các dung dịch thử, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ.

Hàm lượng một chất trong mẫu dược liệu Tam thất được xác định dựa trên

công thức:

100 100 Y-b X (%)= x H x k x x m x 1000000 100-a A

Trong đó:

X: hàm lượng chất cần phân tích tính theo dược liệu khô kiệt (%)

Y: diện tích pic của chất cần phân tích trên sắc ký đồ mẫu thử

A,b: các hệ số của phương trình đường chuẩn, xác định bằng thực nghiệm

H: độ tinh khiết của chất đối chiếu (tính theo diện tích pic)

k: hệ số điều chỉnh thực nghiệm

m: khối lượng dược liệu mang chiết (g)

a: độ ẩm của dược liệu (%)

2.2.1.3. Định lượng hàm lượng saponin trong 2 mẫu cao NP(O) và NP(H) bằng HPLC

* Chuẩn bị mẫu

Dung dịch chuẩn:chuẩn bị như ở mục 2.2.1.2.

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 200mg cao chiết, thêm ethanol 70%, siêu

âm cho tan hoàn toàn, chuyển vào bình định mức 25ml, thêm dung môi đến vạch.

Các dung dịch chuẩn và dung dịch thử được lọc qua màng lọc kích thước

0,45µm trước khi triển khai sắc ký.

Điều kiện sắc ký: như ở mục 2.2.1.2.

Tiến hành: như ở mục 2.2.1.2.

Hàm lượng một chất trong mẫu cao Tam thất được xác định dựa trên công thức:

X (%)= x H x k x x Y-b A 25 m x 1000 100 100-a

Trong đó:

- X: hàm lượng chất cần phân tích tính theo khối lượng cao khô kiệt (%)

- Y: diện tích pic của chất cần phân tích trên sắc ký đồ mẫu thử

- A,b: các hệ số của phương trình đường chuẩn, xác định bằng thực nghiệm

- H: độ tinh khiết của chất đối chiếu (tính theo diện tích pic)

- k: hệ số điều chỉnh thực nghiệm

- m: khối lượng cao chiết (mg)

- a: độ ẩm của cao chiết (%)

2.2.2. Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng

và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất.

2.2.2.1. Đánh giá tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng

NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người

Theo phương pháp được mô tả bởi Monks A và cộng sự (1991) [117].

Nguyên lý của phép thử: tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa

vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của

tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ

thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, lượng tế bào càng nhiều (lượng

protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.

* Hoạt hóa và nhân nuôi tế bào ung thư người

Tế bào ở trạng thái đông lạnh được rã đông ở 37oC sau đó đem ly tâm ở vận

tốc 1300rpm trong 5 phút để thu cặn tế bào. Kết tủa tế bào sau đó được đánh tan

trong môi trường nuôi cấy sao cho khả năng phân tán của các tế bào là tốt nhất. Các

dòng tế bào ung thư người: ung thư ruột kết (HT29), ung thư tế bào gan (HepG2),

ung thư vú (MCF-7), ung thư cơ (RD), ung thư biểu mô đáy phế nang phổi (A549),

ung thư biểu mô tuyến phổi (SK-LU-1) sau đó được nuôi cấy trên môi trường thích

hợp. Các dòng tế bào dòng tế bào này đều bám dính vào bề mặt đĩa nuôi, được thay

môi trường 3 ngày 1 lần cho đến khi số lượng tế bào phủ kín trên 80% diện tích đáy

đĩa nuôi cấy tế bào sẽ được tách khỏi chai nuôi bằng Trypsin EDTA 0,04% và cấy

chuyển sang đĩa nuôi cấy mới. Chu trình được lặp lại hoàn toàn tương tự cho đến

khi thu được lượng tế bào đủ để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Một số tế

bào thu được được đem bảo quản trong môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh bổ sung

5% DMSO và được lưu trữ ở trong bình chứa Nitơ lỏng.

Thu hoạch tế bào ung thư nuôi cấy trên đĩa nuôi cấy tế bào đường kính 10 cm

bằng Trypsin EDTA, sau đó li tâm để loại bỏ môi trường, thu tế bào và hòa đều vào

trong môi trường tương ứng. Mật độ tế bào trong môi trường được xác định bằng

cách sử dụng buồng đếm Neubauer và kính hiển vi quang học.

* Tiến hành thử nghiệm

Các mẫu thử nghiệm gồm 6 saponin tinh khiết (Mẫu đánh số từ 1 đến 6) và

hai mẫu cao định lượng NP(O) và NP(H) được chuẩn bị ở nồng độ gốc là 10 mg/ml

trong DMSO100%. Sau đó, mẫu được pha loãng trong điều kiện vô trùng bằng môi

trường cơ bản (DMEM) không có FBS (Fetal Bovin Serum) để có dải nồng độ ở đĩa

pha mẫu là 100-20-4-0,8 µg/ml; Cuối cùng, 20 µl mẫu từ đĩa pha mẫu ở trên được

đưa vào các giếng của đĩa thử nghiệm 96 giếng, thêm 180 µl dịch tế bào đã điều

chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ cuối cùng của mẫu

thử trong giếng là 10,0 µg/ml; 2,0 µg/ml; 0,4 µg/ml và 0,08 µg/ml. Giếng không có

chất thử nhưng có tế bào ung thư (180 µl) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0.

Giếng đối chứng ngày 0 này, tế bào được cố định bằng Trichloracetic acid - TCA

20% trong 1h. Ủ trong tủ ấm 72 giờ, sau đó tế bào được cố định bằng TCA trong 1

giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để

khô ở nhiệt độ phòng. Thêm 100µL unbuffered Tris base 10 mM để hòa tan lượng

SRB, lắc nhẹ trong 10 phút.Đọc kết quả mật độ quang học (OD) ở bước sóng 540

nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek).

Tỷ lệ (%) ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử được xác định

bằng công thức: [OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100

(%) ức chế = 100% - OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0)

Các mẫu được thực hiện lặp lại 3 lần và tính giá trị trung bình.

Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định bởi phần

mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

Trong cùng điều kiện thử nghiệm, thuốc chống ung thư Ellipticine ở các

nồng độ 10 µg/ml; 2 µg/ml; 0,4 µg/ml và 0,08 µg/ml được dùng làm chất đối chứng

dương; dung dịch DMSO 10% được dùng làm đối chứng âm.

2.2.2.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và khả năng kích thích chết tế bào

theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung

thư mô liên kết chuột sarcoma TG180.

* Hoạt hóa và nhân nuôi dòng tế bào Sarcoma TG180

Tế bào ở trạng thái đông lạnh được rã đông ở 37oC sau đó đem ly tâm ở vận

tốc 1300 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào. Kết tủa tế bào sau đó được đánh

tan trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640, có bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh 44

sao cho khả năng phân tán của các tế bào là tốt nhất. Huyền phù được chuyển vào

chai nuôi cấy chai nuôi cấy 75cm2 và được giữ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.

Tế bào được thay môi trường nuôi cấy mỗi lần sau hai ngày và cấy chuyển

khi tế bào 60 – 70% trong môi trường nuôi cấy, khi đạt được số lượng đủ, tiến hành

thu và làm thí nghiệm.

** Đánh giá khả năng gây độc tế bào của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào

Sarcoma TG180 nuôi cấy

Để đánh giá khả năng gây độc tế bào của mẫu thử trên dòng tế bào nghiên

cứu, chúng tôi sử dụng bộ kit CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation

Assay của hãng Promega, Mỹ (gọi tắt là phương pháp MTT).

Nồng độ mẫu thử nghiệmđược trình bày ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Dải nồng độ thử nghiệm của các mẫu thử

[Cµg/ml] Dãy nồng độ thử(*) [Cµg/ml]

C1 C2 C3 C4 C5 C6 Chất thử

2000 1000 500 250 125 62,5 NP(H)

2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 Taxol

20 20 20 20 20 20 ĐCSH(RPMI)

0,5% 0,5% 0,5% 0,5% 0,5% 0,5% ĐCDM(DMSO)

[Cµg/ml] – Nồng độ thử nghiệm tính đơn vị µg/1ml.

ĐCSH là viết tắt của đối chứng sinh học,khi tế bào được nuôi cấy bình

thường trong môi trường nuôi cấy RPMI 1460 (Gibco, Mỹ).

ĐCDM là viết tắt của đối chứng dung môi, khi tế bào có ủ với dung môi pha

thuốc DMSO (Prolabo, Mỹ).

 Quy trình thí nghiệm:

 Nạp tế bào: tiến hành nạp tế bào vào trong các giếng của đĩa nuôi cấy 96

giếng với nồng độ 7.000 tế bào/180 µl môi trường nuôi cấy, sau đó ủ trong

37oC, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24h trước khi tiến hành thử thuốc.

 Ủ với thuốc thử: Bổ sung 20µl thuốc thử tương ứng để đạt nồng độ thuốc cần

thiết. Gõ nhẹ vào thành đĩa cho thuốc phân bố đều rồi ủ trong 48h ở trong tủ

ấm 37oC, 5% CO2.

 Sau 48h, bổ sung vào 40μl dung dịch nhuộm MTS. Gõ nhẹ đĩa và ủ trong 2-

4h ở 37oC. Ở bước này, dung dịch cần được bọc kín để tránh sáng.

 Đo mật độ quang học của dung dịch trong giếng bằng máy Microplate

Reader ở bước sóng 490 nm.

 Dựa vào giá trị mật độ quang học, ta xác định được % tỷ số tăng sinh (A) của

tế bào, từ đó đánh giá được độ độc đối với tế bào của mẫu thử. A được tính

theo công thức:

A(%) = x 100 T VH

VH: giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi dùng

pha mẫu thử.

T: giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với mẫu thử.

Nếu A = 50% có nghĩa là mẫu thử có tác dụng gây độc và làm chết 50% tế bào.

Nồng độ mẫu thử mà tại đó giá trị A đạt 50% gọi là liều gây chết 50% tế bào, ký hiệu là

IC50. Giá trị IC50 càng thấp chứng tỏ khả năng gây độc tế bào của mẫu thử càng cao.

*** Đánh giá khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của

cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180

Khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao định

lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180 được

đánh giá bằng kỹ thuật Flow cytometry trên máy BDFACS-Lyric. Tế bào ung thư

mô liên kết chuột Sarcomma 180 được ủ với cao định lượng NP(H) tại nồng độ ½

giá trị IC50 (IC50NP(H)/Sar180= 206,65µg/ml) là 103,3µg/ml, với các khoảng thời

gian ủ là 12h, 24h và 48h. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.

Sơ đồ thí nghiệm được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kích thích apoptosis của NP(H)

trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180

Mẫu thử (nồng độ)thời gian ủvới tế bào Sarcoma TG180

NP(H) NP(H) NP(H)

(103,03µg/ml) (103,03µg/ml) (103,03µg/ml) ĐCSH

12h 24h 48h

NP(H) NP(H) NP(H)

(103,03µg/ml) (103,03µg/ml) (103,03µg/ml) ĐCSH

12h 24h 48h

ĐCSH là viết tắt của đối chứng sinh học, khi tế bào được nuôi cấy bình

thường trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640 (Gibco, Mỹ).

Chỉ số đánh giá:

Để xác định tỉ lệ tế bào chết theo chương trình chúng tôi sử dụng bộ kít anti-

annexin V gắn chất phát huỳnh quang là Fluorescein isothiocyanate (FITC) và chất

nhuộm nhân tế bào phát huỳnh quang là 7-Amino Actinomycin D (7AAD). Quy

trình chạy flow cytometrytheo hướng dẫn của bộ kit Annexin V Apoptosis

Detection (BD) trên máy đếm tế bào BDFACS-Lysis Của hãng BD Mỹ, tại Labo

Sinh học phân tử- Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân Y. Các tế bào apoptosis

sớm (xác định bởi Annexin V dương tính, PI âm tính), và các tế bào apoptosis

muộn (trong giai đoạn sau của quá trình apoptosis hoặc đã chết, xác định bởi

Annexin V dương tính, PI dương tính) được đánh giá tự động bởi máy đo, từ đó

tính toán ra tỷ lệ % tế bào apoptosis sớm, tỷ lệ % tế bào apoptosis muộn và tỷ lệ %

tế bào apoptosis.

2.2.2.3. Nghiên cứu tác dụng ức chế phát triển u của các cao định lượng NP(H)

và NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180.

* Phương pháp tạo khối u rắn sarcoma TG180 trên chuột nhắt trắng

Tế bào ung thư Sarcoma TG180 sau khi được hoạt hóa và nhân nuôi đảm

bảo đủ số lượng sẽ được dùng để gây u trên chuột theo phương pháp của Lapis và

cộng sự [118]. Cụ thể:

- Tế bào ung thư sarcoma TG 180 được bảo quản trong nitơ lỏng ở -198°C.

Đưa tế bào về 37°C cho rã đông. Tế bào ung thư sarcoma TG 180 sau đó được

hoạt hóa, nuôi cấy tăng sinh đạt mật độ và số lượng như mong muốn. Ngay

trước khi tiêm tế bào gây u, tiến hành li tâm bỏ dịch bảo quản, rửa tế bào 2 lần

bằng dung dịch đệm PBS, sau đó pha loãng trong dung dịch PBS. Dùng

micropipet hút một lượng nhỏ, cho vào buồng đếm để xác định mật độ tế bào.

Pha loãng hỗn dịch tế bào sao để có 5×106 tế bào/ml;

- Lắc nhẹ bơm tiêm để các tế bào phân tán đều trong hỗn dịch trước khi tiêm.

Các chuột được tiêm 0,1ml hỗn dịch tế bào vào dưới da đùi sau bên phải của chuột,

tương ứng với lượng 5×105 tế bào sarcoma TG 180 mỗi chuột.

- Theo dõi trong 5 ngày đầu sau tiêm hỗn dịch tế bào sarcoma TG 180. Đánh

giá theo dõi sự hình thành và phát triển khối u tại vị trí tiêm (đùi phải) bằng quan

sát, sờ nắn. Những chuột có sự xuất hiện khối u phát triển tại đùi tại chỗ tiêm

(thường sau 3 ngày bắt đầu phát hiện rõ khối u), và thể tích khối u tăng dần theo

thời gian, được đánh giá là gây u thành công và được đưa vào nghiên cứu.

* Đánh giá tác dụng ức chế phát triển u của các cao định lượng NP(H) và NP(O)

Chuột gây u bằng cách tiêm vào dưới da đùi tế bào sarcoma TG180 như mô

tả trên. Các chuột gây u thành công được chia ngẫu nhiên thành 6 lô, thêm 01 lô

chuột không gây u, tổng cộng có 7 lô chuột nghiên cứu, mỗi lô 10 con.

- Lô 1 - chứng sinh lý (SL): chuột không gây u, uống nước muối sinh lý 0,3 ml/20g.

- Lô 2 - ung thư (UT): chuột gây u, uống nước muối sinh lý 0,3 ml/20g.

- Lô 3 - Letinan (LTN): chuột gây u, uống Lentinan liều 240 mg/kg/ngày.

- Lô 4 - NP(O)-1: chuột gây u, uống NP(O) liều 300 mg/kg/ngày.

- Lô 5 - NP(O)-2: chuột gây u, uống NP(O) liều 900 mg/kg/ngày.

- Lô 6 - NP(H)-1: chuột gây u, uống NP(H) liều 300 mg/kg/ngày.

- Lô 7 - NP(H)-2: chuột gây u, uống NP(H) liều 900 mg/kg/ngày.

Chế phẩm NP(O), NP(H), Lentinan và nước muối sinh lý được cho chuột uống

(theo phân lô) từ ngày thứ 6 kể từ khi tiêm tế bào sarcoma TG180, và cho uống liên

tục trong 16 ngày.

Đánh giá tác dụng ức chế khối u dựa trên các chỉ tiêu:

- Quan sát các biểu hiện, hoạt động, tập tính ăn uống vận động của chuột.

- Cân chuột để đánh giá tình trạng cân nặng của chuột.

- Thể tích khối u: Đo kích thước khối u bằng thước kẹp Caliper, xác định

đường kính lớn nhất và đường kính nhỏ nhất của khối u (Hình 2.7). Tính thể tích

khối u rắn theo công thức của Bagley và cộng sự [119]: V= 0,52.a2.b.

Trong đó: a: đường kính nhỏ nhất của khối u (mm); b: đường kính lớn nhất

của khối u (mm); V: thể tích khối u (mm3).

Hình 2.7. Khối u

ở

đùi chuột tạo ra

sau cấy ghép

dòng tế bào ung thư sarcoma TG180.

(A) Đo kích thước khối u bằng thước kẹp; (B) Khối u ở chuột; và (C) khối u được mổ

ra từ đùi chuột.

- Vào thời điểm kết thúc thí nghiệm, phẫu tích bóc tách lấy khối u khỏi đùi

chuột, cân bằng cân phân tích 10-4 để xác định cân nặng khối u (W). Làm tiêu bản

nhuộm HE ngẫu nhiên 4 khối u bóc tách từ 4 chuột ở mỗi lô để đánh giá. Tiêu bản

mô bệnh học khối u chuột được thực hiện và đọc tại Bộ môn - Khoa Giải phẫu

bệnh – Pháp y, bệnh viện 103.

- Đánh giá hiệu lực kháng u theo tiêu chuẩn của Itokawa và cộng sự [120]:

+ Xác định tỷ số phát triển khối u (GR-Growth Ratio):

GR (%) = V(W) nghiên cứu/V(W) đối chứng x 100 (%)

+ Xác định tỷ số ức chế khối u (IR-Inhibition Ratio):

IR (%) = 100% - GR(%)

Hiệu lực kháng u được đánh giá theo thang đánh giá của H. Itokawa

Bảng 2.3. Thang đánh giá hiệu lực kháng u của H. Itokawa

IR (%) Hiệu lực kháng u

0 – 30 -

31 – 60 +

61 – 90 ++

91 – 100 +++

2.2.2.4. Đánh giá tác dụng của các cao định lượng NP(H) và NP(O) lên hệ miễn

dịch của chuột mang khối u rắn sarcoma TG180.

Tác dụng tăng cường miễn dịch của Tam thất được xem là một trong những

cơ chế tác dụng trong điều trị ung thư [76], [77]. Để đánh giá tác dụng của các cao

định lượng NP(H) và NP(O) lên hệ miễn dịch gắn liền với vai trò trong điều trị ung

thư,nghiên cứu tiến hành đánh giá trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG180, là

mô hình gây ung thư trên chuột còn hệ miễn dịch đầy đủ. Thử nghiệm được thực

hiện theo phương pháp được mô tả bởi Stefanova T.H. [121].

Chuột gây u bằng cách tiêm vào dưới da đùi tế bào sarcoma TG180 như mô tả

ở phần 2.2.2.3. Các chuột gây u thành công được chia ngẫu nhiên thành 6 lô, thêm

01 lô chuột không gây u, tổng cộng có 7 lô chuột nghiên cứu, mỗi lô 10 con.