Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của alphitonin, maesopsin và một số dẫn xuất của chúng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

DIỆP THỊ LAN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA ALPHITONIN,

MAESOPSIN VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA CHÚNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

HÀ NỘI – 2015

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ……..….***…………

DIỆP THỊ LAN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

ALPHITONIN, MAESOPSIN VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT

CỦA CHÚNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. NGUYỄN QUỐC VƯỢNG

2. PGS. TS. TRỊNH THỊ THỦY

HÀ NỘI - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Quốc Vượng và

PGS.TS. Trịnh Thị Thủy. Các số liệu và kết quả được nêu trong

luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác.

Tác giả luận án

NCS. Diệp Thị Lan Phương

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam. Kinh phí thực hiện từ đề tài thuộc Quỹ Nafosted, Mã

số đề tài 104.01-010.10 (34- Hóa). Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận

được nhiều sự giúp đỡ quý báu của thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng

nghiệp, bạn bè và gia đình.

Trước hết, tôi xin trân trọng cảm ơn nhóm nghiên cứu của GS. Trần Văn Sung

đã phát hiện, mở hướng nghiên cứu cho luận án này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất, sự cảm phục và kính trọng nhất đến

TS. Nguyễn Quốc Vượng và PGS. TS. Trịnh Thị Thủy – những người thầy đã tận tâm

hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi

trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, hội đồng khoa học, phòng Quản lý

tổng hợp Viện Hóa sinh biển; Ban lãnh đạo, phòng Đào tạo và Nghiên cứu khoa

học Học viện Khoa học và công nghệ; tập thể cán bộ, giảng viên Khoa Hóa học,

Phòng Tổ chức Cán bộ và Ban Giám hiệu Trường Đại học Quy Nhơn đã tạo điều

kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng Công nghệ Hóa dược đã nhiệt

tình giúp đỡ, động viên tôi trong học tập cũng như trong quá trình thực nghiệm để

hoàn thiện luận án.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến toàn thể gia

đình, bạn bè và những người thân, đặc biệt là chồng và hai con gái yêu quý đã luôn

quan tâm, khích lệ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và

hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả luận án

Diệp Thị Lan Phương

iii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii

MỤC LỤC ................................................................................................................. iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN ........................ vii

DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... x

DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... xi

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3

1.1. Các hợp chất flavonoid .................................................................................... 3

1.1.1. Hợp chất flavonoid ...................................................................................... 3

1.1.2. Flavonoid glycoside .................................................................................... 5

1.2. Hoạt tính sinh học của aurone và auronol ........................................................ 6

1.2.1. Aurone trong hóa học trị liệu ung thư ......................................................... 6

1.2.1.1. Aurone như là chất điều chỉnh sự kháng đa thuốc qua protein Pgp .. 6

1.2.1.2. Sự ức chế của Cyclin-Dependent Kinases (CDK) ............................. 8

1.2.1.3. Tương tác của các aurone với thụ thể adenosine ............................... 9

1.2.1.4. Aurone chống ung thư thông qua sự phân chia DNA ...................... 10

1.2.1.5. Aurone ức chế hình thành mạch máu khối u ................................... 11

1.2.1.6. Aurone như những tác nhân chống oxi hóa ..................................... 12

1.2.2. Aurone và auronol kháng kí sinh trùng ..................................................... 13

1.2.3. Aurone và auronol như tác nhân kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm . 14

1.2.4. Aurone như tác nhân chống virus ............................................................. 16

1.2.5. Aurone trong điều trị bệnh về da .............................................................. 17

1.2.6. Aurone trong điều trị bệnh tiểu đường ...................................................... 18

1.2.7. Hệ miễn dịch và ảnh hưởng của thực vật đối với hệ miễn dịch ................ 18

1.3. Tổng hợp aurone ............................................................................................ 19

1.3.1. Giới thiệu aurone ....................................................................................... 19

1.3.2. Cơ sở phương pháp tổng hợp aurone ........................................................ 20

1.3.2.1. Phản ứng Houben - Hoesch ............................................................. 20

1.3.2.2. Phản ứng theo Friedel - Crafts ......................................................... 21

1.3.2.3. Phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt ............................................. 21

1.3.3. Tổng hợp aurone từ benzofuranone .......................................................... 22

1.3.3.1. Tổng hợp tiền chất benzofuranone .................................................. 22

1.3.3.2. Các phương pháp tổng hợp aurone từ benzofuranone ..................... 25

1.3.4. Tổng hợp aurone từ chalcone .................................................................... 30

1.3.4.1. Tổng hợp tiền chất chalcone ............................................................ 30

1.3.4.2. Các phương pháp tổng hợp aurone từ chalcone .............................. 32

1.4. Tổng hợp auronol ........................................................................................... 33

1.4.1. Phương pháp tổng hợp auronol theo I.G. Sweeny .................................... 33

1.4.2. Phương pháp tổng hợp auronol theo Kiehlmann and Li ........................... 34

1.4.3. Phương pháp tổng hợp auronol theo Reik Löser ...................................... 34

1.4.4. Phương pháp tổng hợp auronol theo Srikrishna và Mathews ................... 35

1.4.5. Phương pháp bán tổng hợp auronol theo GS. Trần Văn Sung ................. 35

1.5. Các phương pháp tổng hợp glycoside ............................................................ 36

1.5.1. Giới thiệu chung về glycoside .................................................................. 36

1.5.2. Một số phương pháp tổng hợp O-glucoside ............................................. 37

1.5.2.1. Phản ứng Michael ............................................................................ 37

1.5.2.2. Phản ứng Fischer .............................................................................. 37

1.5.2.3. Phản ứng Koenigs-Knorr ................................................................. 38

1.6. Hợp chất chứa nitrile trong hóa dược và phương pháp tổng hợp dẫn xuất

nitrile ..................................................................................................................... 39

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 41

2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 41

2.2. Mục tiêu ......................................................................................................... 41

2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 41

2.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất.......................................................... 41

2.3.2. Phương pháp tổng hợp và tinh chế sản phẩm ........................................... 42

2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học ................................................... 43

2.3.4. Khảo sát hoạt tính ức chế miễn dịch và hoạt tính độc tế bào của các chất

tổng hợp được ..................................................................................................... 43

2.3.4.1. Hoạt tính kích thích tế bào lympo .................................................... 43

2.3.4.2. Hoạt tính độc tế bào ......................................................................... 44

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ................................................................................ 46

3.1. Phân lập và tổng hợp các auronol và auronol glucoside ................................ 46

3.1.1. Phân lập các auronol glucoside từ lá cây Chay Bắc Bộ (A. tonkinensis) và

điều chế maesopsin ............................................................................................. 46

3.1.1.1. Phân lập maesopsin 4-O-β-D-glucopyranoside (TAT2); alphitonin-

4-O-β-D-glucopyranoside (TAT6) ............................................................... 46

3.1.1.2. Điều chế maesopsin ......................................................................... 48

3.1.2. Bán tổng hợp alphitonin ............................................................................ 49

3.1.2.1. Phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall ex Roxb.)

....................................................................................................................... 50

3.1.2.2. Thủy phân astilbin điều chế taxifolin .............................................. 52

3.1.2.3. Phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin ................... 53

3.1.3. Tổng hợp toàn phần các auronol alphitonin và maesopsin ....................... 54

3.1.3.1. Tổng hợp các aurone ........................................................................ 56

3.1.3.2. Tổng hợp auronol từ aurone............................................................. 61

3.1.4. Tổng hợp auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) 65

3.1.5. Tổng hợp các dẫn xuất nitrile của auronol maesopsin, alphitonin và

maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside ................................................................. 67

3.1.5.1. Tổng hợp các auronol mang một nhóm thế nitrile (chất 126 và 127)

....................................................................................................................... 68

3.1.5.2. Tổng hợp các auronol mang hai nhóm thế nitrile (chất 128 và 129)

....................................................................................................................... 69

3.1.5.3. Tổng hợp auronol glucoside mang 1 nhóm thế nitrile (chất 130) ... 71

3.2. Khảo sát hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được ............................... 71

3.2.1. Hoạt tính kích thích lympho bào ............................................................... 71

3.2.2. Hoạt tính độc tế bào .................................................................................. 73

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 75

4.1. Phân lập và tổng hợp các auronol và auronol glucoside ................................ 75

4.1.1. Hai hợp chất auronol glucoside maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside

(116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) ......................................... 75

4.1.1.1. Điều chế auronol maesopsin (98) .................................................... 83

4.1.2. Bán tổng hợp auronol alphitonin (82) ....................................................... 86

4.1.2.1. Kết quả khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ thổ phục linh ............ 86

4.1.2.2. Quy trình phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh ............................... 87

4.1.2.3. Điều chế taxifolin từ astilbin............................................................ 89

4.1.2.4. Phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin ................... 91

4.1.3. Nghiên cứu phương pháp tổng hợp toàn phần của các auronol ................ 97

4.1.3.1. Nghiên cứu phương pháp tổng hợp các aurone ............................... 97

4.1.3.2. Nghiên cứu tổng hợp các auronol từ aurone .................................. 112

4.1.4. Tổng hợp auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside ....... 126

4.1.5. Tổng hợp một số dẫn xuất nitrile của auronol 82 và 98 ......................... 131

4.1.6. Tổng hợp dẫn xuất nitrile của auronol glucoside 116 ............................. 144

4.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tổng hợp được .................................... 148

4.2.1. Hoạt tính kích thích tế bào lympho ......................................................... 150

4.2.2. Hoạt tính độc tế bào ................................................................................ 151

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 154

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................. 156

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 157

vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN

Viết tắt Viết đầy đủ

ABCG2 ATP binding cassette sub-family G member 2

Ac Nhóm acetyl

Acquired immunodeficiency syndrome

AIDS

Ag-TAT2 Maesopsin

Ag-TAT6 Alphitonin

Adenosin triphosphat ATP

Nhóm benzyl Bn

Nhóm n-butyl n-Bu

Nhóm tert-butyl t-Bu

Column chromatography (Sắc ký cột) CC

Cyclin-dependent kinases CDK

Cutaneous leishmaniasis CL

COSY Correlated Spectroscopy

m-CPBA m-Chloroperbenzoic acid

Diclometan DCM

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (phổ DEPT)

Dimethoxyethane DME

N,N-Dimethylformamit DMF

Deoxyribonucleic acid DNA

DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl

Effective concentration 50% (nồng độ có hiệu quả 50%) EC50

ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectrometry

(Phổ khối lượng phun mù điện tử )

Nhóm ethyl Et

FDA Food and Drug Administration

(Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ)

viii

HCV Hepatitis C virus (virus viêm gan C)

Hep G2 Human hepatocellular carcinoma cell line (dòng tế bào ung thư gan)

HIV Human immunodeficiency virus

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

IC50

Imhibitory Concentration 50% (nồng độ ức chế 50%)

IR Infrared spectroscopy (phổ hồng ngoại)

K562 Chronic myelogenous leukemic cell line (dòng tế bào ung thư máu

cấp)

KB Human epidemoid carcinoma cell line (dòng tế bào ung thư biểu mô)

LDA Lithium diisopropylamide

LPS Lipopolysaccharide

LU Lung carcinoma cell lines (dòng tế bào ung thư phổi)

MCF-7 Human breast adenocarcinoma cell line (dòng tế bào ung thư vú)

MDR Multiple drug resistance

Me Nhóm methyl

MEM methoxyethoxymethyl

MIC Minimal inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối thiểu)

MOMCl Methylchloromethyl ether

Nucleotide binding domain 2

NBD2

NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

Pgp P-glycoprotein

PGE2 Prostaglandin E2

Nhóm phenyl Ph

Polyphosphoric axit PPA

PTT Tribromide trimethylphenylammonium

RNA Ribonucleic acid

Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside TAT2

Alphitonin-4-O- β-D- glucopyranoside TAT6

TBAF Tetra n-butylammonium fluoride

TBATB n-tetrabutylammonium tribromide

TBDMS tert-butyldimethylsilyl

Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) TLC

Tetrahydrofuran THF

Trimethylsilan TMS

Thổ phục linh TPL

Thallium (III)nitrate TTN

Visceral leishmaniasis VL

s Singlet br Broad

d Doublet dd Doublet of doublets

t Triplet dm Doublet of multiplets

q Quartet ppm Parts per million

m Multiplet

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Ái lực liên kết với NBD2 của Pgp của dẫn xuất aurone ............................. 8

Bảng 1.2. Sự ức chế Cyclin-dependent kinases CDK1, CDK2 và CDK4 bởi aurone

mimic và flavopiridol .................................................................................................. 9

Bảng 1.3. Ái lực của các aurone trong liên kết với thụ thể adenosine (Ki, µM) ....... 10

Bảng 1.4. Sự phân cắt DNA và độc tế bào của các hợp chất .................................... 10

Bảng 1.5. Khả năng ức chế thình thành mạch của một số dẫn xuất aurone ............. 12

Bảng 1.6. Khả năng ức chế virus cúm của một số aurone ........................................ 16

Bảng 1.7. Khả năng ức chế virus viêm gan C của các aurone .................................. 17

Bảng 4.1. Số liệu phổ 1H-NMR của maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) và

alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) .............................................................. 81

Bảng 4.2. Số liệu phổ 13C-NMR của maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) và

alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) .............................................................. 82

Bảng 4.3. Kết quả khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ Thổ phục linh tại 8 tỉnh

miền Bắc .................................................................................................................... 87

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................ 93

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của dung môi ......................................................................... 93

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian .......................................................................... 93

Bảng 4.7. Khảo sát độ ổn định của phản ứng............................................................ 94

Bảng 4.8. Khảo sát các xúc tác dùng cho phản ứng glucosylation alphitonin ........ 127

Bảng 4.9. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng tổng hợp

dẫn xuất nitrile một nhóm thế của hai auronol 82 và 98 ......................................... 133

Bảng 4.10. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng tổng hợp

dẫn xuất nitrile hai nhóm thế của hai auronol 82 và 98 .......................................... 139

Bảng 4.11. Danh sách ký hiệu, tên và cấu tạo hóa học của các mẫu thử ................ 149

Bảng 4.12. Hoạt tính kích thích tế bào lympho của các mẫu thử ........................... 151

Bảng 4.13. Hoạt tính độc tế bào của các mẫu thử trên tế bào thường NIH/3T3 và 4

dòng tế bào ung thư MCF7, LU-1, KB, HepG2 .................................................... 152

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Khung cơ bản của flavonoid ....................................................................... 3

Hình 1.2. Khung cơ bản của chalcone ........................................................................ 3

Hình 1.3. Cấu trúc chung của flavonoid ..................................................................... 3

Hình 1.4. Khung của Aurone ...................................................................................... 4

Hình 1.5. Công thức chung của các phân nhóm trong lớp major flavonoid ............... 4

Hình 1.6. Công thức chung của các phân nhóm trong lớp isoflavonoid .................... 4

Hình 1.7. Công thức chung của các phân nhóm trong lớp neoflavonoid ................... 4

Hình 1.8. Công thức chung của các phân nhóm trong lớp minor flavonoid ............... 5

Hình 1.9. Các loại đường phổ biến và khung chung của flavonoid glycoside ........... 6

Hình 1.10. Ái lực liên kết của các flavonoid với P-glycoprotein (Pgp) ..................... 7

Hình 1.11. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của các aurone và acid ascorbic ............. 13

Hình 1.12. Một số aurone và auronol tác dụng ức chế kí sinh trùng ........................ 14

Hình 1.13. Các aurone có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm ................................. 15

Hình 1.14. Các aurone và auronol có khả năng chống viêm .................................... 16

Hình 1.15. Hai đồng phân cấu hình (Z), (E) của aurone ........................................... 20

Hình 1.16. Sơ đồ chung tổng hợp aurone ................................................................. 20

Hình 1.17. Sơ đồ tổng hợp benzofuran-3(2H)-one theo Houben - Hoesch .............. 21

Hình 1.18. Sơ đồ tổng hợp benzofuran-3(2H)-one theo Friedel - Crafts .................. 21

Hình 1.19. Sơ đồ tổng hợp chalcone theo phương pháp Claisen - Schmidt ............. 22

Hình 1.20. Sơ đồ tổng hợp 5b theo Min Zhang ........................................................ 22

Hình 1.21. Sơ đồ tổng hợp các hợp chất 17a và 17b ................................................ 22

Hình 1.22. Sơ đồ tổng hợp các hợp chất 18, 19, 20 là sản phẩm O-alkyl hóa 5b..... 23

Hình 1.23. Sơ đồ tổng hợp hợp chất 23 theo Hamid Nadri ...................................... 23

Hình 1.24. Sơ đồ tổng hợp hợp chất 28 theo Walter M.B. ....................................... 24

Hình 1.25. Sơ đồ tổng hợp hợp chất 31 và 34 .......................................................... 24

Hình 1.26. Các con đường tổng hợp aurone qua ngưng tụ giữa benzofuranone và

benzaldehyde ............................................................................................................. 25

xii

Hình 1.27. Sơ đồ tổng hợp một số hydroxyaurone theo Sabrina Okombi ................ 26

Hình 1.28. Sơ đồ tổng hợp 6,7-dihydroxyaurone theo S. Venkateswarlu ................ 26

Hình 1.29. Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dimethoxyaurone theo C. Beney ..................... 27

Hình 1.30. Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất trimethoxyaurone theo Nicholas J. Lawrence 28

Hình 1.31. Sơ đồ tổng hợp aureusidin theo David Bolek ......................................... 28

Hình 1.32. Sơ đồ tổng hợp aureusidin theo Zhao X. ................................................ 29

Hình 1.33. Sơ đồ tổng hợp aureusidin theo Jun Nishida........................................... 29

Hình 1.34. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất aurone theo Hai Chen ............................... 30

Hình 1.35. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất aurone theo Suresh Kumar ....................... 30

Hình 1.36. Cơ chế tổng hợp chalcone theo phương pháp thông thường .................. 30

Hình 1.37. Dạng anion delocalized của hợp phần benzaldehyde ............................. 31

Hình 1.38. Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất chalcone thế 4-hydroxy theo M.R.Jayapal ..... 31

Hình 1.39. Sơ đồ tổng hợp chalcone 71 theo Xiaoming Zeng .................................. 31

Hình 1.40. Sơ đồ tổng hợp aureusidin theo Anastasia Detsi .................................... 32

Hình 1.41. Sơ đồ tổng hợp aurone từ chalcone sử dụng TTN/ MeOH ..................... 32

Hình 1.42. Sơ đồ tổng hợp aurone theo Gopal Bose................................................. 33

Hình 1.43. Sơ đồ tổng hợp auronol của I. G. Sweeny .............................................. 34

Hình 1.44. Sơ đồ tổng hợp auronol của Kiehlmann and Li ...................................... 34

Hình 1.45. Sơ đồ tổng hợp auronol của Reik Löser .................................................. 35

Hình 1.46. Sơ đồ tổng hợp auronol theo Srikrishna và Mathews ............................. 35

Hình 1.47. Sơ đồ bán tổng hợp auronol theo GS. Trần Văn sung ............................ 36

Hình 1.48. α-D-glucopyranose (C1) và α-L-glucopyranose (1C) ............................. 37

Hình 1.49. Khung của glycoside ............................................................................... 37

Hình 1.50. Sơ đồ phản ứng tổng hợp O-glycoside theo Michael.............................. 37

Hình 1.51. Sơ đồ phản ứng tổng hợp O-glycoside theo Fischer ............................... 38

Hình 1.52. Sơ đồ phản ứng tổng hợp O-glycoside theo Koenigs - Knorr ................ 38

Hình 1.53. Cơ chế đề xuất tổng hợp 1,2-trans glycoside theo Koenigs - Knorr ....... 39

Hình 1.54. Cơ chế tổng hợp 1,2-cis glycoside theo Jin - Hwan Kim ....................... 39

Hình 1.55. Khả năng tạo liên kết hydro của nitrile ................................................... 40

xiii

Hình 1.56. Phản ứng tổng hợp nitrile theo Kolbe ..................................................... 40

Hình 1.57. Phản ứng tổng hợp nitrile theo Van Leusen ............................................ 40

Hình 1.58. Phản ứng tổng hợp nitrile theo Williamson ether ................................... 41

Hình 3.1. Sơ đồ phân lập TAT2, TAT6 quy mô 10 kg/mẻ từ lá cây Chay Bắc bộ .. 46

Hình 3.2. Sơ đồ điều chế maesopsin (98) ................................................................ 48

Hình 3.3. Sơ đồ tổng quát bán tổng hợp alphitonin (82) .......................................... 50

Hình 3.4. Sơ đồ phân lập astilbin quy mô 10 kg TPL/mẻ ......................................... 51

Hình 3.5. Phản ứng thủy phân astilbin (94) điều chế taxifolin (81) ......................... 52

Hình 3.6. Sơ đồ bán tổng hợp alphitonin (82) từ taxifolin (81) ................................ 53

Hình 3.7. Sơ đồ tổng hợp toàn phần auronol ............................................................ 55

Hình 3.8. Sơ đồ tổng hợp alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) .................... 66

Hình 3.9. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất nitrile của chất 82 và 98 ............................. 68

Hình 3.10. Tổng hợp dẫn xuất nitrile của chất 116 ................................................... 68

Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của chất 116 (DMSO- d6) ................................................... 77

Hình 4.2. Phổ 13C-NMR của chất 116 (DMSO- d6) .................................................. 78

Hình 4.3. Phổ 1H-NMR của chất 125 (CD3OD) ....................................................... 79

Hình 4.4. Phổ 13C-NMR của chất 125 (CD3OD) ...................................................... 80

Hình 4.5. Sắc ký đồ HPLC của hỗn hợp 2 chất 116/125 ...................................... 83

Hình 4.6. Sắc ký đồ HPLC của chất 125.................................................................. 83

Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của chất 98 (CD3OD) ......................................................... 85

Hình 4.8. Phổ 13C-NMR của chất 98 (CD3OD) ....................................................... 85

Hình 4.9. Sơ đồ tổng quát bán tổng hợp alphitonin .................................................. 86

Hình 4.10. Phổ 1H-NMR giãn của chất 81 (CD3OD) ............................................... 90

Hình 4.11. Phổ 13C-NMR của chất 81 (CD3OD) ..................................................... 91

Hình 4.12. Sơ đồ phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin ................ 91

Hình 4.13. Sơ đồ cơ chế phản ứng đồng phân hóa taxifolin ..................................... 92

Hình 4.14. Phổ ESI-MS của chất 82 ......................................................................... 95

Hình 4.15. Phổ 1H-NMR của chất 82 (acetone- d6) .................................................. 95

Hình 4.16. Phổ 13C-NMR của chất 82 (acetone- d6) ................................................. 96

xiv

Hình 4.17. Phổ HMBC của chất 82 (acetone- d6) ..................................................... 97

Hình 4.18. Sơ đồ tổng hợp của các aurone ............................................................... 98

Hình 4.19. Sơ đồ cơ chế hình thành muối 3 .............................................................. 99

Hình 4.20. Sơ đồ phản ứng thủy phân muối 3 và đóng vòng benzofuranone ......... 100

Hình 4.21. Phổ 1H-NMR của chất 5b (DMSO- d6) ................................................ 101

Hình 4.22. Phổ 13C-NMR của chất 5b (DMSO- d6) ............................................... 101

Hình 4.23. Phổ 1H-NMR của chất 18 (DMSO- d6) ................................................. 103

Hình 4.24. Cơ chế phản ứng ngưng tụ tạo aurone với xúc tác base ....................... 104

Hình 4.25. Cơ chế phản ứng ngưng tụ tạo aurone với xúc tác acid ........................ 104

Hình 4.26. Phổ 1H-NMR của chất 56 (DMSO- d6) ................................................. 106

Hình 4.27. Phổ 13C-NMR của chất 56 (DMSO- d6) ................................................ 107

Hình 4.28. Phổ 13C-NMR của chất 117 (DMSO- d6) .............................................. 108

Hình 4.29. Phổ 1H-NMR của chất 55 (DMSO- d6) ................................................. 110

Hình 4.30. Phổ 1H-NMR của chất 90 (CDCl3) ....................................................... 111

Hình 4.31. Phổ 1H-NMR giãn của chất 118 (DMSO- d6) ....................................... 113

Hình 4.32. Phổ 13C-NMR của chất 119 (DMSO- d6) .............................................. 114

Hình 4.33. Phổ 13C-NMR của chất 120 (DMSO- d6) .............................................. 116

Hình 4.34. Phổ 13C-NMR của chất 91 (CDCl3) ...................................................... 117

Hình 4.35. Sơ đồ tổng hợp auronol từ dihydroaurone ............................................ 118

Hình 4.36. Sơ đồ cơ chế hình thành chất 121 và 92 ............................................... 118

Hình 4.37. Phổ 1H-NMR của chất 121 (CDCl3) ..................................................... 119

Hình 4.38. Phổ DEPT của chất 121 (CDCl3) .......................................................... 120

Hình 4.39. Phổ 13C-NMR của chất 92 (CDCl3) ...................................................... 122

Hình 4.40. Sơ đồ cơ chế phản ứng oxi hóa trimethylsilyl enol ether...................... 122

Hình 4.41. Phổ 13C-NMR của chất 122 (CDCl3) .................................................... 124

Hình 4.42. Phổ 13C-NMR của chất 93 (CDCl3) ...................................................... 125

Hình 4.43. Sơ đồ cơ chế phản ứng glucosyl hóa alphitonin ................................... 126

Hình 4.44. Phổ 1H-NMR của chất 124 (CD3OD) ................................................... 128

Hình 4.45. Phổ HMBC của chất 124 (CD3OD) ...................................................... 129

Hình 4.46. Sơ đồ cơ chế phản ứng deacetyl hóa ..................................................... 130

Hình 4.47. Sơ đồ chung điều chế dẫn xuất nitrile của hai auronol 82 và 98 .......... 131

Hình 4.48. Phổ ESI-MS của chất 126 ..................................................................... 134

Hình 4.49. Phổ 1H-NMR của chất 126 (DMSO- d6) ............................................... 135

Hình 4.50. Phổ 13C-NMR của chất 126 (DMSO- d6) .............................................. 136

Hình 4.51. Phổ HMBC của chất 126 (DMSO- d6) .................................................. 136

Hình 4.52. Phổ 13C-NMR của chất 127 (DMSO- d6) .............................................. 138

Hình 4.53. Phổ HMBC của chất 127 (DMSO- d6) .................................................. 138

Hình 4.54. Phổ ESI-MS của chất 128 ..................................................................... 141

Hình 4.55. Phổ 1H-NMR của chất 128 (CD3OD) ................................................... 141

Hình 4.56. Phổ HMBC của chất 128 (CD3OD) ...................................................... 142

Hình 4.57. Phổ 13C-NMR của chất 129 (CD3OD) .................................................. 144

Hình 4.58. Phổ HMBC của chất 129 (CD3OD) ...................................................... 144

Hình 4.59. Phổ 1H-NMR giãn của chất 130 (CD3OD) ........................................... 146

Hình 4.60. Phổ HMBC của chất 130 (CD3OD) ...................................................... 147

MỞ ĐẦU

Các thuốc tác động đến hệ miễn dịch là các thuốc rất có giá trị cả khi kích

thích hệ miễn dịch hay ức chế hệ miễn dịch hoặc cả điều hòa miễn dịch. Với hoạt

tính kích thích hệ miễn dịch, chúng tăng sức đề kháng của cơ thể và với hoạt tính ức

chế miễn dịch chúng làm cơ thể thích nghi dần với môi trường sống. Các thuốc kích

thích miễn dịch được sử dụng trong phòng và điều trị nhiễm virus như HIV, viêm

gan B, viêm phổi, lao, cúm gà…(Ví dụ các interferon alpha, beta và gamma….).

Các thuốc ức chế miễn dịch được sử dụng sau phẫu thuật để tránh sự đào thải cơ

quan ghép như: gan, thận, da, xương…, và được dùng để điều trị các bệnh do sự

quá mẫn của hệ miễn dịch như bệnh nhược cơ, luput ban đỏ, thấp khớp thể nhẹ, tiểu

đường…(ví dụ cyclosporine, prednisone, azathioprin …). Những loại thuốc này có

thể được tổng hợp, sinh tổng hợp hoặc có nguồn gốc từ thiên nhiên, trong đó, loại

thuốc sau được ưa chuộng sử dụng do ít tác dụng phụ hơn. [1, 2, 3, 4, 5]. Ở nước ta,

hiện nay, phần lớn các loại thuốc này phải nhập khẩu với giá thành rất cao là gánh

nặng khó vượt qua đối với bệnh nhân. Vì vậy việc nghiên cứu, phát hiện và tổng

hợp các loại thuốc tác động đến hệ miễn dịch mới hiệu quả từ tự nhiên hay bán tổng

hợp và tổng hợp toàn phần đều là những đóng góp lớn lao cho sự phát triển của

ngành y học.

Hai hợp chất auronol glycosides là alphitonin-4-O-β-D-glucoside (TAT6) và

maesopsin 4-O-β-D-glucoside (TAT2) được phân lập theo định hướng ức chế miễn

dịch từ dịch chiết butanol của lá cây Chay Bắc bộ (Artocarpus tonkinensis A.

Chev.) bởi nhóm nghiên cứu của GS. Trần Văn Sung [6]. Các kết quả nghiên cứu

ban đầu cho thấy hai hợp chất này có hoạt tính ức chế miễn dịch tuy yếu hơn

cyclosporin A nhưng không gây tác dụng phụ. Cyclosporin A là một loại thuốc ức

chế miễn dịch đang được sử dụng phổ biến mặc dù giá thành rất cao và có rất nhiều

tác dụng phụ như có thể gây độc cho các cơ quan nội tạng, gan, thận, tiêu hóa, thần

kinh…. Các hợp chất auronol và cả auronol glycoside là nhóm chất hiếm gặp và có

hàm lượng thấp trong tự nhiên, đây là lần đầu tiên trên thế giới hoạt tính sinh học

của 2 hợp chất auronol glucoside này được công bố. Hoạt tính ức chế miễn dịch của

hai auronol glucoside TAT6 và TAT2 được giả thiết do phần đường trong phân tử

có khả năng thấm vào màng tế bào phát huy tác dụng của các aglycone. Tương tự,

các hoạt chất dược chứa nhóm nitrile (-CN), được đưa vào sử dụng lâm sàng ngày

càng nhiều, do là nhóm phân tử nhỏ và có khả năng tạo liên kết hydro với các

amino acid, các protein và H2O nên nó cũng có khả năng thấm qua màng tế bào;

trong một số trường hợp, nhóm nitrile cũng có tác dụng thay thế phần đường trong

các phân tử glucoside [7, 8, 9, 10]

Nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính đối với hệ miễn dịch, từ phát hiện

mở đường của 2 auronol glucoside và tính chất của các hợp chất mang nhóm nitrile

chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của

alphitonin, maesopsin và một số dẫn xuất của chúng”.

Các nhiệm vụ của luận án:

- Phân lập 2 hợp chất alphitonin-4-O-β-D-glucoside (TAT6) và maesopsin-4-

O-β-D-glucoside (TAT2) từ lá cây Chay Bắc bộ (Artocapus tonkinensis A. Chev.).

- Nghiên cứu tổng hợp các auronol là alphitonin và maesopsin và một số dẫn

xuất nitrile của chúng.

- Nghiên cứu phản ứng glucoside hóa tổng hợp alphitonin-4-O-β-D-

glucoside.

- Khảo sát hoạt tính kích thích tế bào lympho và hoạt tính độc tế bào của các

sản phẩm tổng hợp được.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Các hợp chất flavonoid

1.1.1. Hợp chất flavonoid

Flavonoid (hoặc bioflavonoid) (bắt nguồn từ Latin flavus nghĩa là màu vàng,

màu của flavonoid trong tự nhiên) là nhóm hợp chất phenolic đa vòng, được tìm

thấy rộng rãi trong thực vật, chúng là loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật.

Các flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phong phú và đa dạng vào

bậc nhất trong tự nhiên. Cho đến nay, có hơn 15 000 [11] hợp chất flavonoid đã

được biết về cấu trúc, chúng có mặt không những chỉ trong thực vật bậc cao mà còn

trong một số thực vật bậc thấp, thậm chí còn có cả trong loài tảo [12, 13].

Về cấu trúc hoá học [14, 15, 16, 17], flavonoid có khung cơ bản 15 nguyên tử

carbon gồm 2 vòng phenyl A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon theo kiểu

C6-C3-C6 (Hình 1.1).

Hình 1.1. Khung cơ bản của flavonoid

Trong đa số trường hợp ở một đầu mạch 3 carbon có một nhóm chức carbonyl,

chúng được xem là dẫn xuất 1,3-diphenylpropan-1-one, hợp chất này được gọi là

dihydrochalcone (Hình 1.2). Hay 3 carbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị

vòng có oxi (vòng C). Như vậy, flavonoid có cấu trúc chung cơ bản C6-C3-C6

phenyl-benzopyran với vòng aryl (vòng B) có thể ở các vị trí 2,3 hoặc 4 của vòng

benzopyran (Hình 1.3).

Hình 1.2. Khung cơ bản của chalcone Hình 1.3. Cấu trúc chung của flavonoid

Trong một số trường hợp, dị vòng C (6 cạnh) còn được thay thế bằng dị vòng

5 cạnh (furran) (Hình 1.4):

Hình 1.4. Khung của Aurone

Dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxi hóa của mạch 3C,

flavonoid được chia thành 4 loại chính [18]. Hình 1.5, Hình 1.6, Hình 1.7 và Hình

1.8 chỉ ra công thức chung của từng phân nhóm trong mỗi lớp flavonoid: major

flavonoid, isoflavonois, neoflavonoid, minor flavonoid [18, 19, 20, 21, 22, 23].

Hình 1.5. Công thức chung của các phân nhóm trong lớp major flavonoid

Hình 1.6. Công thức chung của các phân nhóm trong lớp isoflavonoid

Hình 1.7. Công thức chung của các phân nhóm trong lớp neoflavonoid

Hình 1.8. Công thức chung của các phân nhóm trong lớp minor flavonoid

1.1.2. Flavonoid glycoside

Các flavonoid glycoside bao gồm cả O- và C-glycosylflavonoid, trong đó

chiếm phần lớn là các O-glycoside của flavone, flavonol với hơn 2000 cấu trúc

được biết đến và các C-glycoside flavone. Chúng được phân bố rộng rãi trong thực

vật: trong ngành hạt trần được đặc trưng bởi sự hiện diện của flavonol O-glycoside,

flavone C-glycoside, trong ngành hạt kín ở lớp một lá mầm chiếm phần lớn là các

flavone C-glycoside, ở lớp hai lá mầm chủ yếu tích lũy flavone O-glycoside. Ngoài

ra, các O- và C-glycosylflavonoid còn xuất hiện ở rêu, tảo và dương xỉ. Mặt khác,

các glycoside của chalcone, dihydrochalcone, aurone, flavanone và dihydroflavonol

hầu hết xuất hiện ở dạng O-glycoside với số lượng ít. Các glycoside ngoài phần

đường còn có các nhóm chức khác như dẫn xuất acylate và sulfate. Như vậy số

lượng các khả năng kết hợp là rất lớn do sự biến đổi của cấu trúc. Sự biến đổi đó có

thể là do: [13, 15, 24, 25, 26, 27, 28, 29].

- Sự hydroxyl hóa và methoxyl hóa của phần aglycone.

- Số lượng, bản chất của đường và vị trí gắn với aglycone bởi các nhóm

hydroxyl.

- Bản chất mối liên kết của đường với aglycone, mối liên kết glycosidic khác

nhau giữa các dạng đường hoặc là pyranose hoặc là furanose.

- Bản chất, số lượng và vị trí gắn của các nhóm acyl béo hay thơm với một

hoặc nhiều đường hoặc gắn trực tiếp vào aglycone thông qua nhóm hydroxyl.

- Sự hiện diện và vị trí gắn của một hoặc nhiều nhóm sulfate thông qua nhóm

hydroxyl của aglycone hoặc của đường.

Các flavonoid glycoside có thể phân ra các loại như mono-, di-, tri-, tetra-

glycosylflavonoid, sulfate-glycosylflavonoid, acyl-glycosylflavonoid và C-

glycosyl-O-glycosylflavonoid. Trong đó, các tri-, tetra-glycosylflavonoid là rất

phức tạp do các trisaccharide, tetrasaccharide có thể ở dạng thẳng hoặc phân nhánh

và sulfate- glycosylflavonoid là ít gặp. Các loại đường được tìm thấy nhiều nhất là

D-glucose, L-rhamnose và các D-galactose, L-arabinose, D-xylose (Hình 1.9).

Hình 1.9. Các loại đường phổ biến và khung chung của flavonoid glycoside

Các loại đường thường ở dạng pyranose với liên kết thích hợp: β cho glucose,

galactose, xylose và α cho rhamnose; đối với arabinose có thể ở một trong hai dạng

pyranose hoặc furanose với liên kết α hoặc β [13]. Vị trí mà các glycoside gắn với

flavonoid được tìm thấy chủ yếu là C-3 hoặc C-7 đối với O-glycoside [11, 13] và

C-6 hoặc C-8 đối với C-glycoside [30], ngoài ra vị trí C-5, C-8, C-4′ ở O-glycoside

cũng được tìm thấy. Các flavonol và flavone phổ biến trong flavonoide glycoside là

kaempferol, quercetin, galangin, luteolin, apigenin. Còn các dẫn xuất acylate trong

sự kết hợp với flavone và flavonol là các acid như β-coumaric, caffeic, ferulic,

sinapic, gallic, benzoic, acetic, malonic...

1.2. Hoạt tính sinh học của aurone và auronol

Các hợp chất aurone và auronol thuộc nhóm flavonoid, trong đó auronol là

chất hiếm gặp trong tự nhiên và ít được nghiên cứu. Tuy nhiên cũng tìm thấy được

hoạt tính sinh học đa dạng của chúng như chống ung thư, chống virus, chống viêm,

chống oxy hóa, trị bệnh tiểu đường, các bệnh về da, kháng nấm, kháng khuẩn... Sau

đây, chúng ta xem xét một số hoạt tính sinh học của chúng:

1.2.1. Aurone trong hóa học trị liệu ung thư

1.2.1.1. Aurone như là chất điều chỉnh sự kháng đa thuốc qua protein Pgp

Trong chương trình với mục đích phát hiện ra những flavonoid có khả năng

điều chỉnh sự kháng đa thuốc của các tế bào ung thư, Boumendjel A. và cộng sự đã

lựa chọn một số đại diện như aurone, chalcone, flavone, flavonols, isoflavones để

nghiên cứu về khả năng liên kết với nucleotide-binding domain (NBD2) của P-

glycoprotein (Pgp) và cho thấy aurone ức chế Pgp hiệu quả hơn cả, được thể hiện

qua các giá trị hằng số phân ly KD ở Hình 1.10 [31, 32, 33, 34, 35, 36, 37].

Hình 1.10. Ái lực liên kết của các flavonoid với P-glycoprotein (Pgp) (KD là hằng số phân ly)

Nghiên cứu về ái lực liên kết của một số dẫn xuất của aurone: 4,6-

dimethoxyaurone và 4-hydroxy-6-methoxyaurone với NBD của Pgp, Boumendjel

A. và cộng sự cho kết quả ở Bảng 1.1.

Ở Bảng 1.1 cho thấy 4,6-dimethoxyaurone (KD = 7,0 ± 1,1 µM) ít hoạt động

hơn 4-hydroxy-6-methoxyaurone (KD = 1,32 ± 0,33 µM). Đặc biệt, các dẫn xuất

halogene aurone (4′-halogene) là hoạt động mạnh nhất. Các ái lực liên kết tăng cùng

với việc tăng kích thước của các halogen (I > Br > Cl > F). Sự thay thế hydrogen

của 4-hydroxy-6-methoxyaurone ở vị trí 4′ bởi nguyên tử brome làm tăng ái lực liên

kết lên 8,8 lần (KD = 1,32: 4′-H và 0,15: 4′-Br). Sự hiện diện của các nguyên tử

khác với halogen (-CN, -N(CH3)2, 3′,4′,6′-OMe) là không thuận lợi cho khả năng

liên kết với NBD2 của Pgp như thể hiện qua các hằng số KD [32, 36, 38, 39]. Ngoài

ra, trong nghiên cứu in vitro về khả năng điều chỉnh Pgp qua trung gian kháng đa

thuốc (MDR), Boumendjel và cộng sự phát hiện ra rằng 4,6-dimethoxyaurone có

khả năng gây độc tế bào trên các tế bào K562 và có khả năng gây độc tốt như

cyclosporine A- một loại thuốc đang được sử dụng để điều trị những trường hợp

kháng đa thuốc (MDR) [35].

Bảng 1.1. Ái lực liên kết với NBD2 của Pgp của dẫn xuất aurone

4-hydroxy-6-methoxyaurone 4,6-dimethoxyaurone

R R KD (µM) KD (µM)

1,32 ± 0,33 7,0 ± 1,1 H H

2,7 ± 0,8 0,46 ± 0,08 2,9 ± 0,7 0,99 ± 0,2 F Cl F Cl

0,15 ± 0,07 0,82 ± 0,08 Br Br

0,26 ± 0,03 0,54 ± 0,04 I I

2,9 ± 1 CN

20 ± 4,6 2,6 ± 0,4

92 ± 43 CN -N(CH3)2 3′,4′,6′-OMe

1.2.1.2. Sự ức chế của Cyclin-Dependent Kinases (CDK)

Cyclin-dependent kinases (CDK) là enzyme cần thiết trong việc điều tiết sự

phân chia chu kỳ tế bào. Hoạt động của chúng bị thay đổi trong các tế bào ung thư,

gây ra sự tăng sinh không kiểm soát tế bào, cũng như sự bất ổn định của bộ gen và

nhiễm sắc thể. Sự ức chế CDK đã nổi lên như là một chủ đề quan trọng trong

nghiên cứu chất chống ung thư. Trong số các chất ức chế CDK phải kể đến

flavopiridol một chất ức chế CDK tiên tiến nhất có tác dụng chống khối u đang

trong giai đoạn II phát triển lâm sàng [40, 41, 42]. Mặc dù flavopiridol có tiềm năng

lớn nhưng cũng cần cải thiện tính chọn lọc giữa các CDK1, CDK2 và CDK4. Vì

vậy, các chất tương tự đã được tổng hợp và nghiên cứu, trong đó có cả aurone. Các

aurone mimic này được nghiên cứu thử nghiệm khả năng ức chế CDK1, CDK2 và

CDK4 thể hiện ở Bảng 1.2 [43].

Bảng 1.2. Sự ức chế Cyclin-dependent kinases CDK1, CDK2 và CDK4 bởi aurone

mimic và flavopiridol

Hợp chất IC50 (µM) STT R1 R2 CDK1 CDK2 CDK4

1 H H 0,11 1,28 4,41

2 H Cl 0,60 3,97 25,25

3 H 0,06 0,31 2,21 NO2

4 H 0,009 0,03 1,87 SO2NH2

5 Flavopiridol 0,10 0,22 0,40

Ở aurone mimic không chứa nhóm thế (chất 1) có khả năng ức chế CDK1

tương tự flavopiridol (IC50= 0,11 và 0,10 µM) nhưng khả năng ức chế CDK2 và

CDK4 là yếu hơn. Mặc khác, khi gắn các nhóm thế -NO2 (chất 3) hoặc –SO2NH2

(chất 4) đã làm tăng mạnh hoạt động ức chế CDK1, CDK2 trong khi đó không ảnh

hưởng đáng kể đến hoạt động ức chế đối với CDK4. Đặc biệt, nếu thay thế nhóm –

NO2 (chất 3) bởi nhóm –SO2NH2 (chất 4) càng gia tăng tiềm năng hoạt động ức chế.

Ngược lại, nếu nhóm thay thế chloro (chất 2) đã không dẫn đến một tác dụng có lợi

mà còn làm mất khả năng ức chế 3 enzym CDKs. Như vậy, các hợp chất aurone

mimic có cấu trúc chung 2-benzylidene-4,6-dihydroxy-7-(1-methylpiperidin-4-yl)-

benzofuran-3-one được thiết kế như cấu trúc của flavopiridol, cho thấy sự ức chế

đáng kể CDK 1, 2 và 4, trong đó hoạt động ức chế CDK4 là kém hơn cả.

1.2.1.3. Tương tác của các aurone với thụ thể adenosine

K A. Jacobson và cộng sự đã khám phá ra thụ thể adenosine khi nghiên cứu cơ

chế chống ung thư, chống viêm và ức chế sự tập hợp các tiểu cầu [44]. Trong các

hợp chất nghiên cứu flavone, isoflavone và aurone, chúng đều cho các tương tác với

cả ba loại thụ thể adenosine A1, A2A và A3. Trong đó, aurone cho thấy mối quan hệ

đáng kể trong liên kết với thụ thể adenosine, chủ yếu nhất là với thụ thể A1.

Hispidol đã được tìm thấy là một chất đối kháng thụ thể A1 chọn lọc, với giá trị Ki

= 0,352 ± 0,080 μM [45] (Bảng 1.3)

Bảng 1.3. Ái lực của các aurone trong liên kết với thụ thể adenosine (Ki, µM)

Dẫn xuất aurone R1 R2 R3 A1 A2A

Sulfuretin H H OH 4,44 ± 1,22 28.1 ± 10.1

Aureusidin Hispidol OH H H H OH H 13,2 ± 4,8 0,352 ± 0,080 >100 52,7 ± 9,1

Maritimetin H OH OH 3.47 ± 0,47 9,35 ± 2,51

1.2.1.4. Aurone chống ung thư thông qua sự phân chia DNA

Trong quá trình nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên có tiềm năng trong điều trị

ung thư, Huang [46] đã phân lập được từ lá và thân của Uvaria hamiltonii gồm: 2

flavanone: hamiltone A (6-hydroxy-5,7,4′-trimethoxyflavanone) và hamiltone B

(3′,4′-dihydroxy-5,6,7-trimethoxyflavanone); 1 aurone: hamiltrone (3′,4′-dihydroxy-

4,5,6-trimethoxyaurone); 1 chalcone: hamilcone (3,4-dihydroxy-2′,3′,4′-

trimethoxychalcone) và 1 nonflavonoid: hamilxanthene (tetrahydroxanthene). Kết

quả thử nghiệm trên sự phân cắt sợi DNA và độc tế bào cho thấy aurone hamiltrone

có hoạt tính mạnh nhất gấp 10 lần so với hamiltone A và hamiltone B, còn

hamilcone hoạt động yếu và hamixanthene không hoạt động (Bảng 1.4) [47].

Bảng 1.4. Sự phân cắt DNA và độc tế bào của các hợp chất

Các hợp chất IC50 (µg/mL)

Hamiltone A Hamiltone B Hamiltrone Hamilcone Đơn vị bleomycin* 1,1 1,0 10,0 0,6 >20 >20 >20 8,0

(* kháng sinh glycopeptide, thuộc Danh sách Tổ chức Y tế Thế giới của các thuốc thiết yếu)

Hamixanthene - 10,0

1.2.1.5. Aurone ức chế hình thành mạch máu khối u

Các tế bào ung thư trong một khối u không hoạt động được cung cấp bằng

cách khuếch tán một lượng hạn chế của oxy và chất dinh dưỡng, khi đó, kích thước

của khối u được bắt giữ lớn nhất với đường kính khoảng 1 – 2 mm3 [48, 49]. Sau

khi khối u hình thành mạch máu, các tế bào ung thư có khả năng tiếp nhận đủ oxy

và chất dinh dưỡng cho sự tăng trưởng nhanh chóng của chúng [50]. Tăng trưởng

không kiểm soát của các tế bào ung thư là những đặc điểm cơ bản của một khối u và

kích hoạt quá mức sự hình thành mạch máu là bệnh lý cơ bản cho sự phát triển của

khối u và di căn [51]; Như vậy, ngăn chặn việc hình thành mạch máu và quá trình

tăng trưởng của các mạch máu mới từ các mạch máu hiện có là một trong hai chiến

lược chính được sử dụng trong hóa trị liệu. Trong những năm gần đây, các tác nhân

chống ung thư và một số thuốc ức chế sự hình thành mạch được sử dụng trong lâm

sàng đã được chứng minh là có lợi khi sử dụng kết hợp [52, 53,54]. Ngoài liệu pháp

kết hợp, còn có tác nhân có hoạt tính chống ung thư bằng cách ức chế sự tăng

trưởng của tế bào nội mô. Aurone tự nhiên hay tổng hợp đều có hoạt tính sinh học

mạnh, chống lại các tế bào ung thư như liên kết với P-glycoprotein, ức chế CDK,

điều chỉnh ABCG2 (ATP-binding cassette sub-family G member 2, protein kháng

ung thư vú) qua trung gian kháng đa thuốc, hoạt động chống oxy hóa, phân chia

DNA ... [55, 56]. Theo Huimin Cheng và cộng sự [49], các aurone được phát hiện

gần đây như các chất ức chế tiềm năng của sự gia tăng của HUVEC (Human

Umbilical Vein Endothelial Cells). Trong số các dẫn xuất của aurone, 5-hydroxy, 5-

methoxy và 5-acetoxyaurone đã được thử nghiệm trên các nhóm khác nhau ở vị trí

4′ (Bảng 1.5) cho thấy, các hợp chất 4′-methoxy và 4′-hydroxy-5-hydroxyaurone

giữ ở mức hoạt động tương ứng nhau (IC50 = 9,63 và 9,86 µM) và cả 4′-amino-5-

hydroxyaurone (7,33 µM), chúng có hoạt động ức chế yếu chống lại HUVEC.

Trong khi đó, việc N-methyl hóa và N-ethyl hóa ở vị trí 4′ nhóm amino của các hợp

chất 5-hydroxy và 5-acetoxyaurone sẽ làm tăng đáng kể khả năng hoạt động, đặc

biệt là N-ethyl hóa gấp 5 lần so với N-methyl hóa đối với hợp chất 5-hydroxy và

gấp hơn 10 lần đối với 5-acetoxyaurone. Mặt khác, N-ethyl hóa của 5-hydroxy và 5-

acetoxyaurone ngoài khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào nội mô chúng còn

là tiềm năng chống lại sự tấn công của tế bào ung thư gây di căn.

Bảng 1.5. Khả năng ức chế thình thành mạch của một số dẫn xuất aurone

R′ R R R′ IC50 (µM) IC50 (µM)

Me - H OH 9,63

Me Ac - 3,18 H H 9,86 7,33

Ac 0,23 H 1,35 NMe2 NEt2 NMe2 NEt2

H 0,25 OMe NH2 NMe2 NEt2

1.2.1.6. Aurone như những tác nhân chống oxi hóa

Gốc tự do là các sản phẩm sinh lý tự nhiên, có thể sản sinh trong quá trình sinh

học (nội sinh). Nhưng khi các gốc tự do dư thừa quá mức do quá trình nội sinh hay

ngoại sinh đều có thể gây ra thiệt hại DNA và có tương quan trực tiếp với những rủi

ro gia tăng bệnh ung thư. Để tiêu hủy gốc tự do, các chất chống oxy hóa bắt các gốc

˙־ ), gốc hydroxyl

oxy, bao gồm cả oxy singlet, gốc peroxy, anion superoxide (O2

(HO˙) và làm sạch gốc 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) [57, 58]. Theo

Kinghorn [57] cho thấy rằng các hợp chất aurone (sulfuretin), aurone glucoside

(sulfurein) và biaurone (disulfuretin = 2,2′-[1,2-bis(3,4-dihydroxyphenyl)-1,2-

ethanedylidene]-bis[6-hydroxy-3(2H)-benzofuranone]) có hoạt tính oxy hóa mạnh,

hơn cả acid ascorbic một hợp chất có thuộc tính chống oxy hóa trong tự nhiên được

biết đến và là một dạng (“vitamer”) của vitamin C, trong đó hoạt tính oxy hóa mạnh

nhất là biaurone (IC50 = 9,7 µg/mL) (Hình 1.11) . Theo Somepalli Venkateswarlu

[59], khi nghiên cứu hoạt động bắt gốc tự do DPPH và superoxide của các aurone

thì 3′,4′,6,7-tetrahydroxyaurone (IC50 = 8,3 µM; 6,5 µM) và 3′.4′,5′,6,7-

pentahydroxyaurone (IC50 = 7,9 µM; 4,3 µM) là hoạt động mạnh nhất, mạnh hơn cả

acid ascorbic, vitamin C, vitamin E. Đặc biệt, việc bắt gốc tự do superoxide, cả hai

aurone này mạnh hơn gấp 100 - 150 lần so với vitamin C (IC50 = 670,5 µM).

Hình 1.11. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của các aurone và acid ascorbic

1.2.2. Aurone và auronol kháng kí sinh trùng

Tổ chức y tế thế giới ước tính có khoảng 350 triệu người sống có nguy cơ bị

nhiễm ký sinh trùng Leishmania. Tỷ lệ hàng năm của bệnh nhiễm trùng mới là 1,5 -

2 triệu cho Leishmaniasis da (CL) và hơn 500.000 bệnh Leishmaniasis nội tạng

(VL). Gần đây có sự gia tăng rõ rệt trong sự trùng hợp giữa Leishmaniasis nội tạng

(VL) và nhiễm HIV do lây lan của đại dịch AIDS. Đồng nhiễm Leishmania / HIV

được coi là một bệnh nổi cộm. Trong các nghiên cứu trước đây về loại thuốc mới

antiprotozoal (thuốc điều trị bệnh nhiễm trùng đơn bào) đã tìm thấy các sản phẩm

có nguồn gốc tự nhiên có khả năng ức chế Leishmania [60, 61]. Hoạt động của một

số aurone và auronol như là thuốc mới antiprotozoal có nguồn gốc thực vật. Hầu

hết các aurone và auronol cho thấy ức chế hoạt động của ti thể Leishmania major

fumarate reductase (FRD) ở nồng độ 25 µM hoặc cao hơn. Các aurone có hoạt động

mạnh hơn các auronol. Cụ thể 6-methoxyaurone; 4,6-dihydroxy aurone và 4,6,4′-

trihydroxy-3′-methoxyaurone ức chế ti thể FRD ở nồng độ 25 µM tương ứng là

97,4, 95.4 và 96.3%, còn auronol 6-Benzoyl-2-[phenylhydroxymethylene]-3(2H)-

benzofuran-3-ol là 83,6% và 4,6-Dihydroxy-2-[phenylhydroxymethylene]-3(2H)-

benzofuran-3-ol là 79,8% [61] (Hình 1.12)

Oliver Kayser và cộng sự lần đầu tiên báo cáo về aurone như thuốc tiềm năng

cho các bệnh nhiễm trùng Leishmania và đã được xác định in vitro cho cả khả năng

gây độc trực tiếp chống lại promastigotes ngoại bào của Leishmania donovani, L.

infantum, L. enriettii, và L. major, và amastigote nội bào của L. donovani cư trú

trong các đại thực bào chuột. Aurone hoạt động nhất 6-hydroxyaurone (Hình 1.12)

có EC50 ở ngoại bào 0,45 µg/mL và EC50 1,40 µg/mL ở nội bào [60, 62].

Hình 1.12. Một số aurone và auronol tác dụng ức chế kí sinh trùng

Ngoài ra, một loạt các aurone trong tự nhiên đã được tổng hợp và thử nghiệm

in vitro về khả năng ức chế giai đoạn hồng cầu của các chủng Plasmodium

falciparum, đây là chủng gây bệnh sốt rét. Hợp chất hoạt động nhất là 4,6,4′-

triacetyl-3′,5′-dimetoxyaurone với giá trị IC50 = 0,007 µM (Hình 1.12) [63, 64]

Liên quan đến hoạt tính chống kí sinh trùng, Souard và cộng sự cũng đã tổng

hợp và phân tích 35 aurone cho khả năng của chúng như là thuốc chống sốt rét. Tất

cả các sản phẩm không gây độc tế bào trong dòng tế bào của người. Hầu hết các

hợp chất được thử nghiệm in vitro trên chuột và không độc hại đối với chính các

chuột. Phân tích mối quan hệ hoạt tính - cấu trúc cho thấy dimethyl hóa ở vị trí 4,6

(IC50 = 60,3 µM) là có lợi hơn 4,6-hydroxyaurone (IC50 = 94,5 µM). Mặt khác, qua

điều tra nghiên cứu việc thay thế nguyên tử oxi vòng C bởi một nhóm N-H

(azaurone) làm tăng hoạt tính của sản phẩm, đặc biệt là nhóm thế ethyl ở vị trí 4′

của dimethylazaurone là hoạt động tốt nhất (IC50 = 1,0 µM) [65]

1.2.3. Aurone và auronol như tác nhân kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm

Việc tìm kiếm các thuốc kháng nấm mới đã đạt được đà phát triển trong thập

kỷ qua, đáng chú ý là các sản phẩm bắt nguồn từ tự nhiên hoặc tổng hợp.

Aurone có trong tự nhiên (Hình 1.13 a,b) có tác dụng ức chế các nấm Candida

albicans, C. krusei, và Torulopsis (Candida) glabrata với các giá trị in vitro MIC

(là nồng độ ức chế tối thiểu cần thiết để thực hiện một ức chế sự tăng trưởng của vi

sinh vật sau khi ủ qua đêm) tương ứng là 12,5, 6,25, và 6,25 μg/mL (đối với aurone

A) và 25; 7,48; và 1,74 μg/mL (đối với aurone B) [66]. Mặc khác, theo báo cáo của

Babasaheb P. Bandgar, việc sửa đổi aurone tại vòng B bao gồm việc thay thế cả

nhóm benzylidene bởi nhóm 2,2- bisaminomethylated (Hình 1.13 c) cho thấy hoạt

tính kháng nấm, kháng khuẩn (E. coli, B. subtilis, P. vulgaris, S. aureus và K.

pneumoniae) và kháng viêm của chúng [67].

Hình 1.13. Các aurone có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm

Nói về tiềm năng chống viêm, một số dẫn xuất aurone và auronol đã được

nghiên cứu về khả năng này [67, 68, 69]. Các aurone mimic (Hình 1.14 b) được

tổng hợp tương tự như sulfuretin (3′,4′,6-trihydroxyaurone) (Hình 1.14 a) - một chất

được tìm thấy có khả năng làm giảm việc sản xuất các chất trung gian gây viêm:

nitric oxide (NO) và prostaglandin E2 (PGE2) do các vi sinh vật như

lipopolysaccharide (LPS) kích thích đại thực bào tiết ra. Qua phân tích mối quan hệ

hoạt tính - cấu trúc cho thấy các aurone mimic có một nhóm hydroxyl tại C6 ở vòng

A và nhóm methoxy tại các vị trí trên vòng B ức chế việc sản xuất NO và PGE2

mạnh hơn sulfuretin [68]. Cụ thể, sulfuretin (ức chế NO và PGE2 với giá trị IC50 lần

lượt là 28,97; 5,90 µM), 6-hydroxy-3′-methoxyaurone (23,38; 3,79 µM), 6-

hydroxy-4′-methoxyaurone (23,51; 2,00 µM), 6-hydroxy-3′,4′-dimethoxyaurone

(23,92; 2,90 µM), 6-hydroxy-3′,5′-dimethoxyaurone (22,64; 1,67 µM).

Đối với auronol, lần đầu tiên Chwan - Fwu Lin và cộng sự đã tách được

auronol mới cudrauronol (2,6-dihydroxy-4-methoxy-2-[(2′,4′-dihydroxyphenyl)

methyl]benzofuran-3(2H)-one) (Hình 1.14 c) từ Cudrania cochinchinensis có khả

năng chống viêm trên cơ sở ức chế sản xuất NO [69].

Hình 1.14. Các aurone và auronol có khả năng chống viêm

1.2.4. Aurone như tác nhân chống virus

Một loạt các flavonoid khác nhau được phân tích khả năng ức chế

neuraminidaza (NA)- một glycoprotein tham gia vào quá trình lây nhiễm của virus

cúm. 25 hợp chất flavonoid đã được nghiên cứu mối quan hệ hoạt tính - cấu trúc ức

chế ba loại virus cúm điển hình A/PR/8/34 (H1N1); A/Jinan/15/90 (H3N2) và

B/Jiangshu/10/2003. Thứ tự của các hiệu lực ức chế NA là: aurone> flavone>

isoflavone> flavonol> flavanol và flavanones. Như vậy, các aurone là có khả năng

ức chế virus cúm mạnh nhất, đặc biệt là (E)-2-(4′-hydroxyphenylidene)-6-

hydroxybenzofuran-3(2H)-one (hay 4′,6-dihydroxyaurone) [70] (Bảng 1.6).

Bảng 1.6. Khả năng ức chế virus cúm của một số aurone

Khả năng ức chế NA (IC50 µM)

A/PR/8/34 A/Jinan/15/90 B/Jiangshu/10/

(H1N1) (H3N2) 2003

29,6 ± 0,5 27,7 ± 0,8 51,2 ± 5,7 R1=H, R2=R3=R4=OH

22,0 ± 0,7 22,1 ± 0,3 22,9 ± 0,5 R1=R3=H; R2=R4=OH

72,0 ± 3,5 73,3 ± 7,9 86,6 ± 6,1 R1=R3=R4=H; R2=OH

R1=R2=R4=OH; R3=H 25,6 ± 1,1 22,3 ± 0,6 25,4 ± 1,0

Ngoài khả năng ức chế các virus cúm, Romain Haudecoeur và cộng sự đã

nghiên cứu khả năng ngăn ngừa virus viêm gan C (HCV) RNA-dependent RNA

polymerase (RdRp) (RdRp là enzyme xúc tác việc tái tạo RNA từ một mẫu RNA)

của các aurone và đã xác định aureusidin có hiệu lực ức chế hoạt động của enzyme

này [71]. Tuy nhiên, việc thay thế các nhóm thế ở các vị trí là rất quan trọng cho

hoạt động ức chế của các aurone đối với RdRp. Kết quả cho thấy, ở vòng A một

nhóm hydroxy ở C4 hoặc hai nhóm hydroxy ở C4 và C6; ở vòng B, nhóm hydroxy

ở vị trí C2′,C4′ hoặc C3′,C4′- hay là nhóm kị nước, nhóm cồng kềnh đều có khả

năng tối ưu hóa hoạt động chống HCV của các aurone. Đặc biệt, nếu thay thế vòng

B bởi nhóm Indole (*) thì khả năng ức chế của chúng là hiệu quả hơn cả (Bảng 1.7)

Bảng 1.7. Khả năng ức chế virus viêm gan C của các aurone

Các aurone IC50 (µM) R3′ R4 R6 R2′ R4′

H OH OH OH OH 5,8 ± 0,3

H OH OH H H 15,1 ± 0,7

H OH H H H 14,6 ± 0,6

H OH H OH OH 2,6 ± 0,1

H OH OH H Et 3,6 ± 0,2

H OH OH H i-Pr 3,1 ± 0,1

H OH OH H n-Bu 2,5 ± 0,1

Aureusidin 5,4 ± 0,3

* 2,2 ± 0,2

1.2.5. Aurone trong điều trị bệnh về da

Tyrosinase là một enzyme đóng một vai trò trong quá trình chuyển đổi L-

tyrosine thành dopaquinone, đây là sản phẩm quan trọng trong quá trình tổng hợp

sắc tố melanin. Melanin là sắc tố tự nhiên của da người, các rối loạn liên quan đến

melanin là nguyên nhân gây ra các tổn thương cho da, bệnh bạch tạng, bệnh

Parkinson và u ác tính [72]. Trong chương trình nhằm mục đích tìm kiếm các sản

phẩm tự nhiên có hoạt tính như là chất bảo vệ cho da, Sabrina Okombi đã cho thấy

khả năng ức chế tyrosinase của aurone. Qua phân tích mối quan hệ hoạt tính - cấu

trúc, sự hiện diện của các nhóm hydroxy ở 4,4′; 6,4′ hoặc 4,4′,6 là các vị trí quan

trọng cho hiệu lực ức chế tyrosinase. Tuy nhiên, nếu loại bỏ nhóm hydroxy trên

vòng B sẽ làm mất hoàn toàn hoạt động, hoặc vẫn giữ nhóm hydroxy ở 4′ nhưng

loại bỏ các nhóm hydroxy trên vòng A sẽ làm giảm đáng kể khả năng hoạt động của

chúng (chỉ còn 39% ức chế tại 0,1 μM). Mặt khác, nếu O-methyl hóa ở 4′ hoặc giữ

nguyên nhóm hydroxy ở 4,4′ nhưng methoxy ở vị trí 6 thì sẽ mất khả năng hoạt

động của chúng. Kết quả nghiên cứu cho hợp chất 4,6,4′-trihydroxyaurone là có khả

năng ức chế tyrosinase mạnh nhất (chiếm hơn 75% với giá trị IC50 = 38,0 µM) [73].

1.2.6. Aurone trong điều trị bệnh tiểu đường

Tiểu đường là một căn bệnh chuyển hóa và đã trở thành một vấn đề nghiêm

trọng của xã hội hiện đại do các biến chứng ảnh hưởng đến sức khỏe lâu dài. Đặc

biệt, bệnh tiểu đường type 2 (T2DM) là dạng hay gặp nhất của bệnh tiểu đường,

chiếm khoảng 90-95% tổng số các trường hợp mắc bệnh tiểu đường [74]. Rối loạn

chuyển hóa glucose là những yếu tố chính dẫn đến bệnh tiểu đường. Insulin được

tiết ra từ tế bào-β tuyến tụy là hormone chịu trách nhiệm cho nội cân bằng glucose.

Insulin kích thích tế bào gan, tế bào cơ, tế bào mỡ và để hấp thu glucose từ các hệ

thống tuần hoàn. Tùy thuộc vào nhu cầu, glucose hoặc có thể được sử dụng như một

nguồn năng lượng của glycolysis, hoặc cách khác, lưu trữ dưới dạng glycogen trong

cơ bắp hoặc gan tế bào. Việc sử dụng không phù hợp insulin dẫn đến việc kháng

insulin, thể hiện mất khả năng phản ứng của tế bào với mức bình thường của insulin

do đó dẫn đến sự xuất hiện của bệnh [75]

Các hợp chất tự nhiên có thể được lựa chọn thay thế khả thi cho việc điều trị

bệnh tiểu đường hoặc hỗ trợ để điều trị đang được sử dụng. Một số lượng lớn có thể

được tiêu thụ trong chế độ ăn uống hằng ngày, một số được nghiên cứu để làm sáng

tỏ các cơ chế hoạt động của chúng. Gần đây, một thử nghiệm lâm sàn trên chuột,

Mi-Young Song và cộng sự đã cho thấy aurone có khả năng ức chế chống lại bệnh

tiểu đường, đặc biệt là sulfuretin (3′,4′,6-trihydroxyaurone) [76].

1.2.7. Hệ miễn dịch và ảnh hưởng của thực vật đối với hệ miễn dịch

Hệ miễn dịch là mạng lưới vô cùng phức tạp của các tế bào, mô và các cơ

quan, hoạt động cùng nhau giúp bảo vệ cơ thể chống lại sự tấn công của các sinh

vật lạ. Các tác nhân xâm nhập như virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm cũng như các

rối loạn của tế bào. Hệ miễn dịch tạo ra các kháng thể và các tế bào đặc biệt để tấn

công và giết chết các vi sinh vật lạ, các tế bào bất thường đó.

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất có hoạt tính miễn dịch rất cao. Như

đã trình bày ở mục 1.2.2 và 1.2.3, hoạt tính miễn dịch của một số aurone và auronol

có khả năng kháng kí sinh trùng: 6-Benzoyl-2-[phenylhydroxymethylene]-3(2H)-

benzofuran-3-ol và 4,6-Dihydroxy-2-[phenylhydroxymethylene]-3(2H)-benzofuran-

3-ol (Hình 1.12) ở nồng độ 50 µM tương ứng là 93,2% và 91,5% hoặc ở nồng độ

thấp hơn [61]; auronol có khả năng kháng viêm như cudrauronol (2,6-dihydroxy-4-

methoxy-2-[(2′,4′-dihydroxyphenyl) methyl]-3(2H)-benzofuranone) (Hình 1.14 c).

Đặc biệt, theo nhóm nghiên cứu của GS. Trần Văn Sung, hai auronol maesopsin 4-

O-β-D-glucoside (TAT2) và alphitonin 4-O- β-D-glucoside (TAT6) có khả năng ức

chế miễn dịch mạnh hơn cả cyclosporin A - một chất ức chế miễn dịch được sử

dụng rộng rãi trong lâm sàng hiện nay để ngăn ngừa thải ghép hoặc trong điều trị

các bệnh tự miễn dịch khác nhau. Nồng độ ức chế miễn dịch của chúng từ 0,156

mg/mL hoặc cao hơn, chẳng hạn ở nồng độ 1,25 mg/mL khả năng ức chế hoạt động

của chúng lần lượt là 99,6% và 99,3% [6, 77].

1.3. Tổng hợp aurone

1.3.1. Giới thiệu aurone

Aurone (=2-Benzylidenebenzofuran-3(2H)-one) thuộc nhóm flavonoid có màu

vàng (auro theo tiếng Latinh có nghĩa là vàng kim loại). Khung của chúng có 15

nguyên tử carbon như các flavonoid khác nhưng ở dị vòng (C) chỉ có 5 cạnh. Các

phân tử aurone có chứa một cấu tử benzofuranone kết hợp với cấu tử benzylidene ở

vị trí số 2.

Trong tự nhiên, các aurone được tìm thấy ở thực vật, chúng đóng vai trò quan

trọng trong việc hình thành sắc tố của hoa và rau quả. Aurone có 2 đồng phân cấu

hình (Z) và (E), hầu hết các aurone ở dạng cấu hình (Z), là cấu hình ổn định hơn cấu

hình (E) [12] (Hình 1.15). Số lượng cũng như sự phân bố trong cây của các aurone

cũng bị hạn chế. So với các flavone thì aurone là hợp chất ít gặp trong tự nhiên, có

khoảng trên 100 aurone (năm 2009) [58] đã được tìm thấy từ các nguồn tự nhiên,

chủ yếu là thực vật có hoa, một vài loài dương xỉ, rêu và tảo nâu biển.

Hình 1.15. Hai đồng phân cấu hình (Z), (E) của aurone

Như vậy, việc khai thác aurone trong tự nhiên là khó khăn nên giải pháp khả

thi là nghiên cứu tổng hợp chúng. Có nhiều phương pháp để tổng hợp aurone: (a)

Tổng hợp thông qua sự ngưng tụ của một benzaldehyde với một benzofuran-3(2H)-

one; (b) thông qua phản ứng oxi hóa đóng vòng 2′-hydroxychalcone; (c) đóng vòng

các dẫn xuất 1,3-diphenylprop-2-yn-1-ol với xúc tác Au(I) [78] hoặc Ag+ [79] hoặc

PBu3 [80]; (d) ngưng tụ đóng vòng salicyloyl chloride và phenylacetylene với xúc

tác palladium [81]; (e) thông qua phản ứng giữa phenylboronic acid và dẫn xuất 2-

(bromomethylene)-benzofuran-3(2H)-one [82]... Các phương pháp (c, d, e) diễn ra

rất phức tạp, đòi hỏi xúc tác tốn nhiều chi phí mà hiệu quả không cao. Vì vậy mà 2

phương pháp (a,b) được nghiên cứu nhiều nhất (Hình 1.16) [42, 43, 73, 83, 84].

Hình 1.16. Sơ đồ chung tổng hợp aurone

1.3.2. Cơ sở phương pháp tổng hợp aurone

Tổng hợp tiền chất benzofuran-3(2H)-one và chalcone là cơ sở chính để tổng

hợp nên các aurone. Một số phương pháp tiếp cận để tổng hợp chúng bao gồm:

1.3.2.1. Phản ứng Houben - Hoesch

Phương pháp tổng hợp benzofuran-3(2H)-one được sử dụng phản ứng Houben

- Hoesch theo sơ đồ (Hình 1.17) [42, 85, 86, 87, 88, 89]. Phản ứng diễn ra qua hai

bước chính: hình thành dẫn xuất acetophenone và đóng vòng tạo sản phẩm

benzofuran-3(2H)-one.

Hình 1.17. Sơ đồ tổng hợp benzofuran-3(2H)-one theo Houben - Hoesch

Đầu tiên, các hợp chất polyphenol: resorcinol (1a) hay phloroglucinol (1b)

được ngưng tụ với chloroacetonitrile (2) với sự có mặt của xúc tác acid Lewis

(ZnCl2), acid HCl / Et2O, hình thành nên muối iminium (3). Iminium này được thủy

phân trong acid HCl đồng thời loại phân tử NH4Cl tạo acetophenone tương ứng (4a,

4b). Các acetophenone này sẽ đóng vòng nội phân tử trong MeONa/MeOH, hình

thành nên sản phẩm benzofuran-3(2H)-one tương ứng (5a, 5b).

1.3.2.2. Phản ứng theo Friedel - Crafts

Sử dụng phản ứng Friedel-Crafts để tổng hợp benzofuran-3(2H)-one theo sơ

đồ Hình 1.18 [42, 85, 89, 90].

Hợp chất phenoxyacetic acid (8) được tổng hợp bắt đầu từ dẫn xuất phenol (6)

với chloroacetic acid (7), trong sự hiện diện của NaOH. Các acyl chloride (9) được

hình thành do sự tác dụng của thionyl chlorua với 8. Sau đó 9 sẽ được đóng vòng

nội phân tử theo Friedel - Crafts với sự có mặt của AlCl3 tạo benzofuran-3(2H)-one

tương ứng 10.

Hình 1.18. Sơ đồ tổng hợp benzofuran-3(2H)-one theo Friedel - Crafts

1.3.2.3. Phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt

Phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt được sử dụng làm cơ sở để tổng hợp

chalcone theo sơ đồ Hình 1.19 [89, 91, 92].

Hình 1.19. Sơ đồ tổng hợp chalcone theo phương pháp Claisen - Schmidt

Tổng hợp chalcone từ phản ứng ngưng tụ giữa một benzaldehyde (11) với một

acetophenone (12) có mặt của xúc tác base hoặc acid sẽ tạo sản phẩm chalcone (13).

1.3.3. Tổng hợp aurone từ benzofuranone

1.3.3.1. Tổng hợp tiền chất benzofuranone

1.3.3.1.1. Tổng hợp các hydroxybenzofuranone

Tổng hợp 6-hydroxybenzofuran-3(2H)-one (5a) và 4,6-dihydroxybenzofuran-

3(2H)-one (5b) [42, 71, 84, 87, 93, 94] bằng phương pháp chung sử dụng phản ứng

Houben - Hoesch như đã trình bày ở Hình 1.17 với hiệu suất là 80% (5a) và 82%

(5b). Ngoài ra, theo Min Zhang hợp chất 5b còn thu được bằng cách xử lý trực tiếp

iminium (3) đun hồi lưu 5 giờ trong nước mà không cần bổ sung acid hay base.

Phương pháp này giúp đơn giản hóa quá trình tổng hợp và cho hiệu suất cao hơn

(77%) [95] (Hình 1.20)

Hình 1.20. Sơ đồ tổng hợp 5b theo Min Zhang

Phản ứng Houben - Hoesch không thuận lợi để tổng hợp 4-

hydroxybenzofuran-3(2H)-one (17a) và 5-hydroxybenzofuran-3(2H)-one (17b). Vì

vậy, một phương pháp tổng hợp thay thế được chú ý [49, 71, 87, 93]. Trong trường

hợp này nhóm hydroxyl được bảo vệ bởi nhóm acetyl (Hình 1.21).

Hình 1.21. Sơ đồ tổng hợp các hợp chất 17a và 17b

ˉ , một thuốc thử

Sau khi acyl hóa 15a, 15b được tiếp tục brom hóa chọn lọc tại Cα bằng cách

dùng tribromide trimethylphenylammonium (PTT= PhMe3N+Br3

được biết để chọn lọc brom tại vị trí α của acetophenone mà không tấn công các

vòng thơm). Các bromoacetophenone (16a, 16b) sau đó được đóng vòng ở điều

kiện cơ bản (KOH/ MeOH) để thu được sản phẩm mong muốn (17a, 17b).

1.3.3.1.2. Tổng hợp các methoxybenzofuran-3(2H)-one; benzyloxybenzofuran-

3(2H)-one và methoxyethoxymethylbenzofuran-3(2H)-one

Ngưng tụ trực tiếp 5b với benzaldehyde trong điều kiện cơ bản rất khó thành

công, ngay cả trong điều kiện piperidine/EtOH [93]. Để khắc phục vấn đề này, một

bước được bổ sung đó là bảo vệ nhóm hydroxyl. Các nhóm hydroxyl thường được

bảo vệ bởi các nhóm methoxy, benzyloxy hay methoxyethoxymethyl (MEM) [39,

42, 87, 84, 71, 94, 96, 97] (Hình 1.22)

Hình 1.22. Sơ đồ tổng hợp các hợp chất 18, 19, 20 là sản phẩm O-alkyl hóa 5b

Trong khi đó theo Hamid Nadri [98], để tổng hợp 5,6-dimethoxybenzofuran-

3(2H)-one (23) đi từ dẫn xuất 3,4-dimethoxybenzaldehyde (21), thực hiện phản ứng

oxy hóa Baeyer - Villiger, thủy phân để chuyển một andehyde thành một phenol

bằng cách dùng m-chloroperoxybenzoic acid (m-CPBA) [99]. Phenol 22 được tiến

hành theo phản ứng của Houben - Hoesch tạo sản phẩm 23. (Hình 1.23).

Hình 1.23. Sơ đồ tổng hợp hợp chất 23 theo Hamid Nadri

Theo nghiên cứu của Walter M. Bryant III và George F. Huhn [100]. Tổng

hợp 7-methoxybenzofuran-3(2H)-one (28), không theo phản ứng Houben - Hoesch

mà đi từ 2-hydroxy-3-methoxybenzoic acid (24) qua các phản ứng để tạo một

diester (25), thủy phân diester tạo diacide (26). Phản ứng sau đó được đóng vòng

hình thành sản phẩm 27. Thủy phân 27 bởi acid HCl tạo sản phẩm 7-

methoxybenzofuran-3(2H)-one (28) với hiệu suất 65% (Hình 1.24).

Hình 1.24. Sơ đồ tổng hợp hợp chất 28 theo Walter M.B.

1.3.3.1.3. Tổng hợp dẫn xuất fluorobenzofuran-3(2H)-one

Các dẫn xuất 5,7-difluorobenzofuran-3(2H)-one (31) và 4-fluorobenzofuran-

3(2H)-one (34) được tổng hợp theo sơ đồ Hình 1.25 [42, 71, 90].

Hình 1.25. Sơ đồ tổng hợp hợp chất 31 và 34

Để tổng hợp 31 được thực hiện theo phản ứng Friedel - Crafts với sự hiện diện

của nhôm clorua. Trong khi đó, để tổng hợp 34 đi từ 6′-fluoro-2′-

hydroxyacetophenone (32), sử dụng đồng (II) bromua để thế chọn lọc brom sau đó

đóng vòng trong môi trường cơ bản hình thành hợp chất mong muốn 34 (Hình

1.25).

1.3.3.2. Các phương pháp tổng hợp aurone từ benzofuranone

Tổng hợp aurone từ tiền chất benzofuranone bằng cách cho ngưng tụ với

benzaldehyde [49, 71, 97, 101, 102, 103, 104], đây là phương pháp phổ biến và hiệu

quả hơn cả.

Hình 1.26. Các con đường tổng hợp aurone qua ngưng tụ giữa benzofuranone và

benzaldehyde

Thực ra, con đường tổng hợp aurone theo phương pháp này đã được nghiên

cứu từ những năm 1950. Phản ứng được thực hiện trong môi trường acid, base,

trong sự hỗ trợ của alumina hay ở các điều kiện khác nhau. Cụ thể, năm 1955,

Geissman và Harborne đã sử dụng phản ứng này trong hỗn hợp acid acetide và acid

HCl ở nhiệt độ phòng [105]. Phản ứng này được tiếp tục sử dụng sau đó, mặc dù

hiệu suất phản ứng không cao (37%). Đến năm 1992, Varma và cộng sự [101] đã

thực hiện trên aluminum oxide trong dung môi dichloromethane và đã cải thiện

đáng kể thông qua hiệu suất của phản ứng (86- 93% cho các nhóm thay thế khác

nhau). Tuy nhiên, giới hạn của phương pháp là chỉ dùng cho các chất kém phân cực

(hòa tan trong CH2Cl2). Về sau, phương pháp ngưng tụ giữa benzofuranone và hợp

chất thơm benzaldehyde đã có những thay đổi đáng kể. Didier Villemin và cộng sự

[106] đã tiến hành ngưng tụ hiệu quả, nhanh chóng bằng cách sử dụng vi sóng với

sự hiện diện của Al2O3-KF, kết quả chỉ xảy ra sau 5 phút sản phẩm là các dẫn xuất

methoxyaurone hoặc dị vòng (ở vòng B), hiệu suất 57 - 96%. Sau này, phương pháp

hoàn thiện và được sử dụng rộng rãi với điều kiện ngưng tụ cơ bản là KOH/ MeOH

cũng cho hiệu suất cao (62 - 95%). Tất cả các phương pháp ngưng tụ giữa

benzofuranone với benzaldehyde được tổng hợp qua sơ đồ Hình 1.26.

* Theo Sabrina Okombi [73], các aurone 4-hydroxy, 6-hydroxy, hay 4,6-

dihydroxy aurone được tổng hợp từ các benzofuranone 5a, 5b, 17a [94, 107] tương

ứng. Trong đó để tổng hợp 4-hydroxybenzofuran-3(2H)-one (17a) còn có thể đi từ

chất đầu là 2′,6′-diacetyloxyacetophenone (35). Chất này được brom hóa chọn lọc

với xúc tác trimethylphenylammonium tribromide [108] tạo hợp chất 36 và thủy

phân đóng vòng tạo 17a. Đối với 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one, trước khi

thực hiện phản ứng ngưng tụ tạo aurone, cần bảo vệ các nhóm hydroxyl bởi nhóm

MEMCl 37. Như vậy, các aurone 38, 39 và 40 được tạo thành từ sự ngưng tụ của

các hydroxybenzofuran-3(2H)-one 5a, 37, và 17a với dẫn xuất benzaldehyde, trong

đó aurone 40 để tạo hydroxyaurone 41 cần được loại nhóm bảo vệ MEM bằng acid

HCl trong diethyl ether Hình 1.27.

Hình 1.27. Sơ đồ tổng hợp một số hydroxyaurone theo Sabrina Okombi

* Con đường tổng hợp 6,7-dihydroaurone 45 theo Somepalli Venkateswarlu

[102] và Michael G. Thomas [109] là tương tự nhau như ở sơ đồ Hình 1.28 nhưng

điều kiện phản ứng khác nhau.

85%; (iii): benzaldehyde, Ac2O, 90°C, 2 h, 21–48%.

Hình 1.28. Sơ đồ tổng hợp 6,7-dihydroxyaurone theo S. Venkateswarlu (i): chloroacetic acid, BF3.O(C2H5)2, 65°C, 3h, 55%; (ii): NaOAc, ethanol, reflux, 6h,

Đối với Somepalli Venkateswarlu, để tạo ra chloroacetophenone (43) được

thực hiện theo phản ứng ngưng tụ theo Friedal - Crafts với sự hiện diện của Boron

trifluoride diethyl etherate (BF3.O(C2H5)2), t = 65°C, phản ứng tiếp tục đóng vòng

nội phân tử trong NaOAc/ethanol thu được 44 (85%). Ngưng tụ 44 với dẫn xuất của

benzaldehyde trong Ac2O, 90°C thu được sản phẩm 45 (hiệu suất 21 - 48%). Trong

khi đó, theo Michael G. Thomas, phản ứng tạo chloroacetophenone (43) cũng đi từ

pyrogallol và chloroacetic acid nhưng với sự có mặt của phosphorus oxychloride

(POCl3) và đóng vòng trong NaOAc/ethanol thu được sản phẩm 44 (28%). Sản

phẩm 45 thu được từ sự ngưng tụ 44 với dẫn xuất của benzaldehyde trong điều kiện:

hoặc là có mặt acid HCl/EtOH (50 - 95%) hoặc là trong base NaOH/EtOH (50-

75%). Như vậy, theo phương pháp Michael G. Thomas là khả quan hơn.

* Trong các phản ứng tổng hợp dẫn xuất methoxyaurrone (Hình 1.29)

Hình 1.29. Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dimethoxyaurone theo C. Beney

C. Beney và cộng sự [94] đã tổng hợp 4,6-dimethoxyaurrone từ phloroglucinol

khá thông dụng, sản phẩm 5b tạo ra theo phản ứng Houben - Hoesch và O-methyl

hóa trực tiếp 5b bởi MeI, K2CO3/DMF, sau đó ngưng tụ với dẫn xuất benzaldehyde

tương ứng để tổng hợp nên aurone 46.

* Theo Nicholas J. Lawrence [110], để tổng hợp dẫn xuất 4,5,6-trimethoxy-

3′,4′-dihydroxyaurone (53) đi từ 3,4,5-trimethoxyphenol (47), theo phản ứng Friedal

- Crafts có mặt PPA tạo hợp phần benzofuranone (49). Đối với hợp phần

benzaldehyde (50) được bảo vệ nhóm hydroxyl bởi tert-butyldimethylsilyl chloride

trong imidazole tạo hợp chất 51. Ngưng tụ hai hợp phần benzofuranone (49) và hợp

phần benzaldehyde (51) trong điều kiện có mặt của Al2O3 trong DCM tạo aurone

52. Sau đó loại bỏ nhóm bảo vệ bằng cách dùng TBAF = tetra n-butylammonium

fluoride [(n-C4H9)4 N+Fˉ ] thu được sản phẩm 53 (Hình 1.30)

Hình 1.30. Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất trimethoxyaurone theo Nicholas J. Lawrence * Theo David Bolek and Michael Gütschow [97], tổng hợp (Z)-2-(3,4-

dihydroxybenzylidene)-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (aureusidin) qua 3

bước từ 4,6-dihydrobenzofuranone được O-methyl hóa và ngưng tụ với 3,4-

dimethoxybenzaldehyde (54 a) tiếp đến loại bỏ nhóm bảo vệ bởi BBr3 thu được

aureusidin (56), đạt hiệu suất 12% qua ba bước (Hình 1.31)

Hình 1.31. Sơ đồ tổng hợp aureusidin theo David Bolek

Trong một quy trình khác tổng hợp aureusidin, Zhao X. và cộng sự [111] đã

tiến hành qua ba bước như Hình 1.32 sau:

Hình 1.32. Sơ đồ tổng hợp aureusidin theo Zhao X.

Đầu tiên các tác nhân 2,4,6-trihydroxyacetophenone (57) và 3,4-dihydroxy

benzaldehyde được bảo vệ nhóm hydroxyl bởi methyl chloromethyl ether

(MOMCl), tạo hai hợp chất tương ứng là 58 (78%) và 59 (66%). Ngưng tụ chúng

với nhau để tạo aurone 60, loại bỏ nhóm bảo vệ bằng cách thủy phân trong acid HCl

10% thu được aureusidin 80%. Như vậy, với phương pháp này aureusidin đã cho

hiệu suất 41% qua ba bước.

Trong một phương pháp khác, Nishida J. và cộng sự [83] đã tiến hành ngưng

tụ trực tiếp 4,6-dihydrobenzofuran-3(2H)-one và 3,4-dihydrobenzaldehyde với sự

hiện diện của AcOH/HCl mà không qua bước bảo vệ nào, kết quả thu được

aureusidin với hiệu suất 7% (Hình 1.33)

Hình 1.33. Sơ đồ tổng hợp aureusidin theo Jun Nishida

Như vậy, các phương pháp tổng hợp đã được công bố, đặc biệt là tổng hợp các

aurone có chứa nhóm hydroxyl đều phải qua bước bảo vệ nhóm này nhằm đem lại

năng suất hiệu quả.

Nghiên cứu mới đây (2014) của 2 nhóm nghiên cứu Hai Chen [112] và

Suresh Kumar [113] đã tổng hợp aurone bằng các phương pháp khác nhau. Đối với

Hai Chen, ngưng tụ giữa benzofuranone và benzaldehyde với sự có mặt của chất

xúc tác là nhựa amberlite IR-120. Kết quả cho thấy hầu hết các phản ứng hoàn tất

trong vòng 15-60 phút và sản phẩm aurone thu được với hiệu suất rất cao (90-

97%). Vì vậy, nhựa amberlite IR-120 là xúc tác được tìm thấy là có lợi thế trong

tổng hợp hiện đại của aurone (Hình 1.34). Trong khi đó, đối với Suresh Kumar tổng

hợp aurone ở pha rắn one-pot giữa 2-hydroxyphenacylchloride với benzaldehyde,

có sự kích hoạt của Ba(OH)2. Phản ứng trực tiếp qua một bước trong thời gian vài

phút và tránh được sự đóng vòng tạo benzofuranone, không sử dụng dung môi và

cũng tránh được việc cần phải bảo vệ và khử bảo vệ của nhóm hydroxyl. Như vậy,

đây là một phản ứng tổng hợp rất đơn giản, thân thiện với môi trường ở nhiệt độ

phòng và rất hiệu quả (88-95%) (Hình 1.35).

Hình 1.34. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất aurone theo Hai Chen

Hình 1.35. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất aurone theo Suresh Kumar

1.3.4. Tổng hợp aurone từ chalcone

1.3.4.1. Tổng hợp tiền chất chalcone

Phản ứng tổng hợp chalcone dựa trên cơ sở của phản ứng ngưng tụ Claisen -

Schmidt [114, 115, 116]. Tuy nhiên, việc sử dụng xúc tác cho phản ứng là rất đa

dạng. Ngày nay, nhiều nghiên cứu tổng hợp chalcone đã chú ý đến những xúc tác có

thể tái sử dụng nhằm làm giảm ô nhiễm môi trường và giảm chi phí xử lý [117].

Phương pháp tổng hợp chalcone theo phương pháp thông thường:

Hình 1.36. Cơ chế tổng hợp chalcone theo phương pháp thông thường

Dựa trên sơ đồ phản ứng ta thấy, nếu trong phân tử acetophenone (61) có chứa

nhóm thế 4-hydroxyl với xúc tác base càng làm tăng tính nucleophile của

acetophenone (62) tạo điều kiện thuận lợi tấn công vào nhóm carbonyl của

benzaldehyde (63) để tạo chalcone (64). Trái lại, nếu trong phân tử của

benzaldehyde chứa nhóm 4-hydroxyl, dưới xúc tác base làm giảm hoạt động của

hợp phần benzaldehyde (65) do tạo anion delocalized (66) Hình 1.37.

Hình 1.37. Dạng anion delocalized của hợp phần benzaldehyde

Vì vậy, để tổng hợp hydroxychalcone (67) thì việc bảo vệ nhóm hydroxyl là

cần thiết khi dùng xúc tác base. Ngoài ra, phản ứng còn thực hiện với xúc tác acid.

Theo M.R.Jayapal [118], sử dụng SOCl2 thay thế khí HCl trong quá trình ngưng tụ

(HCl tạo ra trực tiếp bằng phản ứng của SOCl2 với ethanol tuyệt đối) (Hình 1.38).

Hình 1.38. Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất chalcone thế 4-hydroxy theo M.R.Jayapal

Tổng hợp chalcone theo phương pháp thông thường cũng thu được kết quả

tương đối ổn định tuy nhiên phản ứng đòi hỏi nhiều thời gian (12- 18h) và phức tap.

Đã có nhiều nghiên cứu cho việc thay thế tác nhân phản ứng cũng như xúc tác nhằm

mang lại hiệu quả tổng hợp, chẳng hạn như Xiaoming Zeng và cộng sự [119] đã

thay hợp phần benzaldehyde bởi Benzylamines (69) với xúc tác là muối ammonium

persulfate (70) trong dung môi tert-Amyl alcohol mang lại một chalcone (71) hiệu

suất 94 - 95% (Hình 1.39). Ngoài ra, đã có nhiều công bố cho việc tổng hợp

chalcone bằng cách sử dụng xúc tác nano [117], đặc biệt là dùng sóng siêu âm [120,

121], phản ứng diễn ra nhanh chóng (10 phút), đơn giản, thiết thực và hiệu quả cao.

Hình 1.39. Sơ đồ tổng hợp chalcone 71 theo Xiaoming Zeng

1.3.4.2. Các phương pháp tổng hợp aurone từ chalcone

Tổng hợp aurone từ việc đóng vòng chalcone được thực hiện trong các điều

kiện khác nhau. Haruo Sekizaki đã thực hiện phản ứng với xúc tác thủy ngân (II)

acetate trong acid acetic thu được các aurone tương ứng với hiệu suất từ 28- 62%

[122]. Đã có những cải tiến mang lại hiệu suất cao hơn 77 - 87% bằng cách thay đổi

bởi dung môi pyridine [58, 123, 124, 125, 126].

Anastasia Detsi và cộng sự đã tổng hợp aureusidin từ chalcone qua hai bước

đã mang lại hiệu suất 46,5% theo sơ đồ Hình 1.40.

Hình 1.40. Sơ đồ tổng hợp aureusidin theo Anastasia Detsi

Mặc dù việc tổng hợp aurone từ chalcone sử dụng Hg(OAc)2 trong pyridine có

nâng cao hiệu suất, tuy nhiên sử dụng thủy ngân (II) acetate gây ra các vấn đề ngộ

độc, đặc biệt là đối với môi trường. Một phương pháp tổng hợp khác bằng cách sử

dụng hợp chất Thallium(III)nitrate (TTN) trong môi trường acid và dung môi là

MeOH. Phương pháp này cho hiệu suất trung bình 43 - 79%. Tuy nhiên, sự cần

thiết phải có sự hiện diện của một nhóm đẩy electron ở vị trí 5′ của chalcone (vị trí

para với nhóm 2′-hydroxyl) và trong thời gian phản ứng, một nhóm methoxy từ

dung môi lại gắn vào vị trí 4 của sản phẩm aurone thu được, điều này góp phần hạn

chế đáng kể khả năng tổng hợp liên quan đến phương pháp này [127, 128, 129]

(Hình 1.41)

Hình 1.41. Sơ đồ tổng hợp aurone từ chalcone sử dụng TTN/ MeOH

Để cải thiện điều này, Bose G. và cộng sự [130] đã thay bằng n-

tetrabutylammonium tribromide (TBATB). Quá trình diễn ra như sau (Hình 1.42)

Hình 1.42. Sơ đồ tổng hợp aurone theo Gopal Bose

Hợp chất 2′-acetoxychalcone (73) được brom hóa chọn lọc tại vị trí α của

nhóm carboxyl nhờ xúc tác TBATB với sự có mặt của CaCO3 trong CH2Cl2/MeOH

(5/2) kèm theo là sự tấn công của methoxy từ dung môi tại vị trí β sinh ra sản phẩm

74. Xử lý hợp chất này bởi KOH trong EtOH/H2O (4/1), nhóm 2′-acetoxy sẽ bị thủy

phân tạo phenolate, thuận lợi cho việc đóng vòng, đồng thời tách loại phân tử

methanol tạo liên kết đôi ở vị trí 2-aurone, hình thành aurone 75 tương ứng.

1.4. Tổng hợp auronol

Auronol là các aurone đã được hydrate. So với aurone thì các auronol và cả

auronol glycoside là hiếm gặp hơn trong thiên nhiên. Auronol đầu tiên được phân

lập trong thiên nhiên là chất * từ cây Schinopsis balansae và S. lorentzii. Còn

R1=R2=H; R3=R4=R5=OH

* R1=R2=H; R3= OH; R4= OCH3; R5=OH

R1=R5=H; R2=R3=R4= OH Maesopsin

R1=H; R2=R3=R4=R5= OH Alphitonin

alphitonin được phân lập từ cây Alphitonia excelsa và Maesopsis eminii [131, 132]

Các công trình công bố về tổng hợp các auronol và auronol glycoside rất ít ỏi,

các phương pháp công bố được mô tả vắn tắt và khó thực hiện lặp lại. Một số

phương pháp tổng hợp auronol đã được báo cáo:

1.4.1. Phương pháp tổng hợp auronol theo I.G. Sweeny

Theo I. G. Sweeny [133], tổng hợp auronol được thực hiện bằng phương pháp

khử hóa flavonol (Hình 1.43)

Hình 1.43. Sơ đồ tổng hợp auronol của I. G. Sweeny

Đầu tiên Na/NH3 khử hợp chất flavonol 76 tạo hợp chất 77, tại đây xuất hiện

sự liên hợp và được khử tiếp tục hình thành α-hydroxychalcone 78, hợp chất này

được tautomer tạo thành trung gian 1,2-diketone 79 và thuận lợi đóng vòng (do có

nhóm carbonyl dương điện) tạo sản phẩm auronol 80.

1.4.2. Phương pháp tổng hợp auronol theo Kiehlmann and Li

Hình 1.44. Sơ đồ tổng hợp auronol của Kiehlmann and Li

Kiehlmann [134] đã thực hiện phản ứng đồng phân hóa trực tiếp với taxifolin

trong H2O ở nhiệt độ cao thu được alphitonin với hiệu suất khá cao 78%. Như vậy,

phương pháp này hiệu quả hơn và có thể triển khai với lượng tác nhân lớn.

1.4.3. Phương pháp tổng hợp auronol theo Reik Löser

Từ phản ứng ngưng tụ của benzofuranone với benzandehit tạo aurone. Sau đó

aurone được tiến hành qua các bước oxi hóa và khử hóa cho sản phẩm có chứa 2-

Benzyl-2-hydroxybenzofuran-3(2H)-one [135], thể hiện qua sơ đồ Hình 1.45.

Phương pháp này cho nhiều sản phẩm phụ. Do đó, bước chuyển hóa từ aurone

thành auronol vẫn là bài toán chưa được giải quyết.

Hình 1.45. Sơ đồ tổng hợp auronol của Reik Löser

1.4.4. Phương pháp tổng hợp auronol theo Srikrishna và Mathews

Năm 2009, Srikrishna và Mathews [136] đã công bố phương pháp tổng hợp

toàn phần của auronol dimethylethermaesopsin (93). Tác giả cũng đi từ hợp chất

ban đầu là phloroglucinol tổng hợp nên dẫn xuất methoxy benzofuranone, sau đó

ngưng tụ với dẫn xuất của benzaldehyde (89) tạo nên aurone. Từ dẫn xuất aurone

này, tác giả không tiến hành oxy hóa trực tiếp mà đi theo con đường vòng để

chuyển hóa aurone 90 thành auronol (

Hình 1.46).

Hình 1.46. Sơ đồ tổng hợp auronol theo Srikrishna và Mathews

1.4.5. Phương pháp bán tổng hợp auronol theo GS. Trần Văn Sung

Năm 2004, nhóm nghiên cứu của GS. Trần Văn Sung đã công bố trên tạp chí

Phamazie về việc tách hai auronol glucoside có hoạt tính ức chế miễn dịch từ dịch

chiết butanol của lá cây Chay Bắc bộ: maesopsin 4-O-glucopyranoside (TAT2) và

chất mới alphitonin-4-O-glucopyranoside (TAT6). Ngay sau khi phát hiện hoạt tính

ức chế miễn dịch của hai auronol glucoside TAT2 và TAT6 [6, 137], nhóm của GS.

Trần Văn Sung đã nghiên cứu bán tổng hợp hai auronol aglycone: alphitonin (Ag-

TAT6) và maesopsin (Ag-TAT2) [138]. Những chất đầu sử dụng được tách từ rễ

của cây Thổ phục linh là dihydrokaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside và

astilbin, theo sơ đồ Hình 1.47.

Hình 1.47. Sơ đồ bán tổng hợp auronol theo GS. Trần Văn sung

Tác giả đã tiến hành phản ứng trong DMF sử dụng các tác nhân BnCl và

K2CO3 ở nhiệt độ cao thu được các auronol Ag-TAT2 và Ag-TAT6 với hiệu suất

toàn phần thấp và chỉ dừng lại ở lượng nghiên cứu.

1.5. Các phương pháp tổng hợp glycoside

1.5.1. Giới thiệu chung về glycoside

Monosaccharide tồn tại cân bằng giữa dạng mở và dạng vòng. Trong dung

dịch nước, các phân tử của chúng chủ yếu ở dạng vòng 5 cạnh (furanose) hoặc

vòng 6 cạnh (pyranose), trong đó vòng pyranose chiếm tỷ lệ lớn hơn. Theo cấu trúc

Haworth, các pyranose tồn tại chủ yếu ở cấu dạng ghế C1 và 1C. Cấu dạng C1

thường sử dụng cho cấu hình D và 1C cho cấu hình L. Đối với D-glucopyranose,

cấu dạng bền là C1, khi đó nhóm hydroxyl của đồng phân anome α được đặt ở vị trí

trục axial (a) và của β ở vị trí equatorial (e) (Hình 1.48) [139, 140].

Glycoside là hợp chất mà trong phân tử có nhóm glycone (đường) liên kết với

nhóm aglycone (không đường hoặc một phần genin) thông qua liên kết glycosidic.

Các glycoside có thể liên kết bởi O-; S-; N- hoặc C-glycosidic, trong đó liên kết O-

glycosidic là phong phú và quan trọng hơn cả [139] và cũng là phần chúng tôi

nghiên cứu trong luận án với glycone là glucose (Hình 1.49).

Hình 1.49. Khung của glycoside Hình 1.48. α-D-glucopyranose (C1) và

α-L-glucopyranose (1C)

1.5.2. Một số phương pháp tổng hợp O-glucoside

Khi một monosaccharide được ngưng tụ với alcohol béo hoặc thơm hoặc một

phần đường khác thông qua nguyên tử oxy hình thành một liên kết O-glycosidic.

Các phương pháp phản ứng ghép nối phổ biến nhất được sử dụng để tổng hợp

chúng [140, 141].

1.5.2.1. Phản ứng Michael

Hình 1.50. Sơ đồ phản ứng tổng hợp O-glycoside theo Michael

Phương pháp tổng hợp O-glucoside được Michael thực hiện đầu tiên từ phản

ứng giữa 2,3,4,6-Tetraacetyl-α-D-glucopyranosyl clorua (99) và kali phenoxide để

tạo ra dẫn xuất acetyl (100), sau đó chúng được thủy phân trong base tạo phenyl-β-

D-glucopyranoside (101) (Hình 1.50).

1.5.2.2. Phản ứng Fischer

Phản ứng Fischer không sử dụng nhóm bảo vệ và chỉ đơn giản bằng cách kết hợp

giữa đường với alcohol khan trong điều kiện axit (Hình 1.51).

So với phương pháp Michael, phương pháp Fischer không có tính chọn lọc lập

thể, cho nên sản phẩm tạo ra là một hỗn hợp anome. Qua sơ đồ phản ứng cho thấy,

nếu tăng nồng độ acid HCl và tăng nhiệt độ, phản ứng có sự chuyển đổi từ dạng ít

ổn định hơn methyl furanoside (102, 103) sang dạng ổn định hơn methyl α- và β-D-

glucoside (104, 105), điều này cho thấy đây là sản phẩm nhiệt động lực học.

Hình 1.51. Sơ đồ phản ứng tổng hợp O-glycoside theo Fischer

1.5.2.3. Phản ứng Koenigs-Knorr

Phản ứng Koenigs-Knorr là một trong những phản ứng hữu ích và được sử

dụng rộng rãi nhất trong tổng hợp các O-glycoside. Phản ứng từ một

glycopyranosyl halogenua (X = Cl, Br, I) đã được acetyl hóa (106) với một alcohol

hoặc nhóm hydroxyl của đường khác trong sự có mặt của xúc tác muối bạc: oxide,

carbonate, nitrate, triflate hoặc cadmium carbonate (CdCO3)... [140, 141, 142], qua

quá trình glycosyl hóa hình thành một anome 107, thủy phân hợp chất này tạo sản

phẩm 108

Hình 1.52. Sơ đồ phản ứng tổng hợp O-glycoside theo Koenigs - Knorr Trong hầu hết các trường hợp, lập thể quan sát được như là một hệ quả, các

sản phẩm thu được ở dạng 1,2-trans với nhóm bên cạnh (C2) [140]. Như vậy, nếu

glycopyranosyl halogenua có nhóm acyloxy (C2) ở dạng cis với 1-halide, thường

trong quá trình phản ứng tạo cấu hình anome nghịch đảo (tức sản phẩm ở dạng 1,2-

trans glycoside), trong khi đó, nếu nhóm acyloxy (C2) ở dạng trans với 1-halide,

phản ứng vẫn duy trì cấu hình anome thể hiện qua cơ chế ở Hình 1.53. Tuy nhiên,

theo Jin-Hwan Kim và cộng sự [143] đã báo cáo tổng hợp 1,2-cis glycoside khi tại

vị trí C2 là (1S)-phenyl-2-(phenylsulfanyl)ethyl, trong sự có mặt của BF3/Et2O.

Hình 1.53. Cơ chế đề xuất tổng hợp 1,2-trans glycoside theo Koenigs - Knorr

Trong cơ chế này, dưới tác dụng của xúc tác, halogen sẽ bị tách hình thành ion

oxocarbenium (109). Tiếp đến, với sự tham gia của nhóm bảo vệ acetyl tại C2 hình

thành một ion acetoxonium (110) ổn định hơn. Ion này tạo điều kiện thuận lợi cho

tác nhân nucleophine của alcohol tấn công vào anome trung tâm C1 từ một mặt tạo

nên sản phẩm 1,2-trans glycoside (111).

Hình 1.54. Cơ chế tổng hợp 1,2-cis glycoside theo Jin - Hwan Kim

Sau khi hình thành ion oxocarbenium (113), các nucleophine phenylsulfanyl

tại C-2 sẽ tham gia hình thành ion sulfonium trung gian dạng vòng trans-decalin

(114). Sự chuyển vị của ion sulfonium tại equatorial anomic bởi alcohol dẫn đến

việc hình thành sản phẩm dạng 1,2-cis glycoside (115).

1.6. Hợp chất chứa nitrile trong hóa dược và phương pháp tổng hợp dẫn

xuất nitrile

Hiện nay có hơn 30 hợp chất chứa nitrile được sử dụng trong các thuốc chỉ

định với thêm hơn 20 sản phẩm chứa nitrile được phát triển lâm sàng. Vai trò của

các tác nhân nitrile trong y học đã nổi lên và ngày một được chú trọng. Các cuộc

điều tra cho thấy tác dụng hữu ích của các hợp chất chứa nitrile trong y học tập

trung chủ yếu vào nhóm −CN [10]. Nhóm chức năng nitrile (–C≡N) là nhóm phân

tử nhỏ có vai trò như một nhóm hydroxyl hay nhóm carboxyl, có khả năng tạo liên

kết hydro với các amino acid, các khung protein, enzyme hay với các phân tử nước

trong phân tử [Hình 1.55]. Khi thay thế hoặc kết hợp nhóm nitrile trong phân tử đã

tăng hiệu quả tác dụng một cách đáng kể so với phân tử ban đầu [7, 8, 9, 10]. Chẳng

hạn như, etoposide một loại thuốc chống ung thư, nếu thay thế các glycoside bởi

nitrile sẽ làm tăng khả năng ức chế tế bào KB lên gấp đôi hoặc đối với cysteinyl

proteases một enzym làm suy giảm protein, khi kết hợp với nitrile sẽ làm tăng khả

năng liên kết với protein...

Hình 1.55. Khả năng tạo liên kết hydro của nitrile

 Một số phương pháp tổng hợp dẫn xuất nitrile cơ bản

- Phản ứng Kolbe: là phản ứng SN2 giữa một alkyl halogenua (X= Br, Cl) béo

với cyanua kim loại kiềm trong dung môi DMSO hoặc acetone.

Hình 1.56. Phản ứng tổng hợp nitrile theo Kolbe

- Phản ứng Van Leusen: phản ứng chuyển đổi một ketone thành một nitrile

trong một bước duy nhất sử dụng tosylmethyl isocyanide (TosMIC).

Hình 1.57. Phản ứng tổng hợp nitrile theo Van Leusen

- Phản ứng theo Williamson ether: được sử dụng để tổng hợp O-acetonitrile,

phản ứng SN2 giữa alkoxides (hoặc phenoxide) với dẫn xuất halogenua hình thành

sản phầm ether.

Hình 1.58. Phản ứng tổng hợp nitrile theo Williamson ether

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside

2,6-dihydroxy-2-[(3′,4′-dihydroxyphenyl) 2,6-dihydroxy-2-[(4′-hydroxyphenyl)

methyl]-3(2H)-benzofuranone-4-yl--D- methyl]-3(2H)-benzofuranone-4-yl--

glucopyranoside (TAT6) D-glucopyranoside (TAT2)

Alphitonin Maesopsin

2-(3,4-dihydroxybenzyl)-2,4,6-trihydroxy 2-(4-hydroxybenzyl)-2,4,6-trihydroxy

benzofuran-3(2H)-one (Ag-TAT6) benzofuran-3(2H)-one (Ag-TAT2)

2.2. Mục tiêu

Nghiên cứu tổng hợp các auronol alphitonin, maesopsin, các auronol glucoside

alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (TAT6) và maesopsin-4-O-β-D-

glucopyranoside (TAT2) và một số các dẫn xuất nitrile của chúng. Thăm dò hoạt

tính sinh học của các chất tổng hợp được.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất

 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện với bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai

bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch ceri sulfat trong

acid H2SO4, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.

 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G

F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đè tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm

và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ

nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất; sau đó

cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung

môi thích hợp.

 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha

đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel

pha đảo YMC RP-18 (30- 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion

Diaion HP-20 ((Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).

 Sắc lý lỏng cao áp (HPLC)

Sắc ký lỏng cao áp Agilent technologies 1200 Series của Viện Hóa sinh biển,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.2. Phương pháp tổng hợp và tinh chế sản phẩm

- Các phản ứng được thực hiện bằng các phương pháp tổng hợp hữu cơ cơ bản

như phương pháp khử, phương pháp oxi hóa, phương pháp ankyl hóa, phương pháp

glucosyl hóa ... Ngoài ra còn sử dụng một số phương pháp tổng hợp hữu cơ đặc thù

như: phản ứng Houben - Hoesch, phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt...

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để giám sát tiến trình xảy ra của

các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng.

- Các hợp chất sau phản ứng được phân lập và tinh chế bằng các phương pháp

chiết, phương pháp sắc ký cột, phương pháp kết tinh,...

- Tất cả các hóa chất dùng trong quá trình tổng hợp được mua từ các hãng:

Sigma Aldrich, Merck và sử dụng mà không cần tinh chế lại.

- Các dung môi sử dụng được cất lại hoặc làm khan theo điều kiện phản ứng.

2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết

hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:

 Phổ hồng ngoại (FT-IR) được đo bằng máy NICOLET IMPACT-410 FTIR của

hãng Carl Zeiss Jena (Đức) tại Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

 Phổ khối lượng (ESI-MS) được ghi trên máy Agilent 6310 ion trap tại Viện

Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều và 2 chiều sử dụng chất nội

chuẩn là TMS (δ = 0ppm), dung môi CDCl3 hoặc DMSO-d6 được ghi trên máy

Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

13C-NMR. Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương

Việt Nam ở tần số 500,13 MHz cho phổ 1H-NMR và ở tần số 125,76 MHz cho phổ

pháp phổ và so sánh tài liệu.

2.3.4. Khảo sát hoạt tính ức chế miễn dịch và hoạt tính độc tế bào của các chất

tổng hợp được

Khảo sát hoạt tính kích thích tế bào lympo và hoạt tính độc tế bào trên dòng tế

bào thường NIH/3T3 và 4 dòng tế bào ung thư: ung thư vú MCF7, ung thư phổi

LU-1, ung thư biểu mô KB và ung thư gan HepG2 được thực hiện tại phòng thử

nghiệm sinh học- Viện Công nghệ sinh học - Viện hàn lâm khoa học và công nghệ

Việt Nam.

2.3.4.1. Hoạt tính kích thích tế bào lympo

 Vật liệu nghiên cứu

- Tế bào lympho tổng số thu nhận trực tiếp từ máu ngoại vi thỏ.

- Thỏ dòng Newzeland White do Trung tâm dê thỏ Ba Vì cung cấp, có khối

lượng từ 2,0 đến 2,5 kg. Thỏ được nuôi ổn định một tuần trước khi thí nghiệm tại

khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học.

- Môi trường nuôi cấy tế bào là RPMI-1640 (Roswell Park Memorial

Institute medium) và các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco,

Invitrogen v.v.

 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp phân lập tế bào lympho tổng số:

Được thực hiện theo thường quy phân lập tế bào lympho từ máu ngoại vi sử

dụng Ficol paque của GE LIFE SCIENCE

https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/13

14729545976/litdoc71716700AG_20110830221438.pdf) và theo Bøyum A (1974).

Phương pháp xác dịnh khả năng kích thích miễn dịch thông qua tăng sinh

tế bào lympho:

Được thực hiện theo phương pháp xác định khả năng tăng sinh tế bào nhờ

MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) của

Mosmann và cs (1983) và Scudiero AD và cs (1988). Về nguyên lí, tế bào lympho

phân lập trực tiếp là những tế bào thường, không có khả năng tăng sinh và bất tử

nên sẽ chết sau 1-2 ngày nuôi cấy in vitro. Ngoài ra, MTT dưới tác động của hệ

enzyme của ti thể trong các tế bào sống và tăng sinh sẽ bị chuyển hóa thành dạng

formazan có màu xanh tím. Do vậy, tế bào sống càng nhiều thì MTT được chuyển

hóa thành formazan nhiều, giá trị OD thu được càng lớn. Từ đó xác định được khả

năng cảm ứng tăng sinh tế bào lympho của mẫu cần nghiên cứu.

2.3.4.2. Hoạt tính độc tế bào

 Vật liệu nghiên cứu

Dòng tế bào ung thư: MCF7 (ung thư vú ở người); HepG2 (ung thư gan ở

người) và SK-LU-1 (ung thư phổi ở người).

Dòng tế bào thường: NIH/3T3 (Nguyên bào sợi của phôi chuột là tế bào lành)

Môi trường nuôi cấy tế bào là DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s medium)

và các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco, Invitrogen v.v

 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro: Được thực hiện theo thường quy nuôi

cấy của Ngân hàng tế bào Mỹ - American Type Cell Collection (ATCC - Manassas,

VA 20110 USA).

Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào tế bào in vitro: Được thực

hiện theo phương pháp của Monks và cs. (1991). Phương pháp này được Viện Ung

thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc

tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển

hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein

tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành

phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD

máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein. Do đó lượng tế bào

càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Phân lập và tổng hợp các auronol và auronol glucoside

3.1.1. Phân lập các auronol glucoside từ lá cây Chay Bắc Bộ (A. tonkinensis) và

điều chế maesopsin

3.1.1.1. Phân lập maesopsin 4-O-β-D-glucopyranoside (TAT2); alphitonin-4-O-β-

D-glucopyranoside (TAT6)

Mẫu lá cây Chay Bắc bộ (Artocarpus tonkinensis A. Chev.) thu hái ở chùa

Nam Dư Hạ, Mai Động được phơi khô nghiền nhỏ và được phân lập TAT2 và

TAT6 với quy mô 10 kg lá khô/mẻ theo sơ đồ dưới đây:

Hình 3.1. Sơ đồ phân lập TAT2, TAT6 quy mô 10 kg/mẻ từ lá cây Chay Bắc bộ

Mẫu lá cây Chay Bắc bộ khô (10 kg) được nghiền nhỏ và ngâm, chiết trong

EtOH 85% ( 1 × 22 L + 3 × 12 L) ở nhiệt độ phòng. Quá trình chiết mẫu được lặp

lại 4 lần để đảm bảo mẫu được chiết hết (kiểm tra bằng SKLM). Gộp các dịch chiết

lại rồi quay cất dưới áp suất thấp loại dung môi thu được cao ethanol (1,84 kg). Cặn

này được hòa vào H2O (2 L), chiết với n-hexan. Dịch nước được chạy qua sắc ký

cột diaion HP-20 với dung môi rửa giải MeOH/H2O ở các tỉ lệ 0/100; 50/50 và

100/0 (v/v) thu được 3 phân đoạn PA1, PA2 và PA3. Phân đoạn PA2 được chạy cột

diaion tiếp tục với dung môi rửa giải MeOH/H2O (50/50, v/v) thu được 100 g và

được phân lập bằng SKC trên silica gel với hệ dung môi rửa giải EA/MeOH/H2O

(13/7/1, v/v/v) thu được 4 phân đoạn PB1, PB2, PB3, PB4. Phân đoạn PB2 được

phân lập tiếp bằng SKC trên silica gel với hệ dung môi rửa giải EA/MeOH/H2O

(13/7/1, v/v/v) thu được PC1 (10 g), PC1 được phân lập tiếp bằng SKC pha đảo với

hệ dung môi MeOH/H2O ở các tỉ lệ (1/4, 1/7, 1/9) thu được 7 g TAT2 sạch. Phân

đoạn PB3 được phân lập bằng SKC trên sephadex 2 lần với dung môi MeOH thu

được PC2 (0,5 g), sau đó PC2 được phân lập tiếp bằng SKC pha đảo với hệ dung

môi MeOH/H2O ở các tỉ lệ (1/4, 1/7, 1/9), quá trình được lặp lại 3 lần thu được

TAT6 sạch (0,03 g).

Alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (TAT6)

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm)

ESI-MS (negative): m/z = 465 [M-H]ˉ .

6,66/6,67 (1H, 2 × d, J = 2,5 Hz, H-2′),

6,57/6,55 (1H, 2 × d, J = 8,5 Hz, H- 5′),

6,52/6,51 (1H, 2 × dd, J = 2,5, 8,5 Hz, H-6′),

6,00/5,98 (1H, 2 × d, J =1,2 Hz, H-5),

5,88/5,87 (1H, 2 × d, J = 1,2 Hz, H-7), 4,88 (1H, tín hiệu chồng chập, H-1′′), 3,88

(1H, br d, J = 12,5 Hz, Hb-6′′), 3,70 (1H, m, Ha-6′′), 3,53 (1H, dd, J = 8,0, 9,0 Hz,

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,0/195,8 (C=O), 174,9/174,7 (C-

H-2′′), 3,48 (1H, m, H-3′′), 3,43 (2H, m, H-4′′ và H-5′′), 3,04 (2H, m, CH2-10).

8), 174,8/174,6 (C-6), 158,4/158,3 (C-4), 145,6/145,5 (C-3′), 145,1 (C-4′),

126,5/126,4 (C-1′), 123,1/123,0 (C-6′), 118,7/118,6 (C-2′), 115,9/115,8 (C-5′),

107,6/107,5 (C-2), 102,4/102,3 (C-1′′), 101,7/101,5 (C-9), 99,0/98,3 (C-5),

94,0/93,8 (C-7), 78,3/78,2 (C-5′′), 77,3 (C-3′′), 74,1/74,0 (C-2′′), 71,1 (C-4′′), 62,2

(C-6′′), 42,3/42,2 (C-10).

Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (TAT2)

ESI-MS (m/z): 449[M-H]ˉ . 1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ (ppm) 9,14

(OH), 7,56, 7,52 (1 × OH), 6,93/6,91 (2H, d, J =

8,5 Hz, H-2′,6′), 6,56/6,54 (2H, d, J = 8,5 Hz,

H-3′,5′), 6,00 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 5,93

(1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 5,20, 5,13, 5,06, 5,01 (4 × OH), 4,97/4,90 (1H, d, J = 7,5

Hz, H-1′′), 4,59/4,50 (1 × OH), 3,64/3,63 (1H, br m, Ha-6′′), 3,48 (1H, m, Hb-6′′),

3,29 - 3,20 (m, H-3′′, H-5′′, H-2′′, H-4′′), 2,96 và 2,90 (2H, 2 × d, J = 13,5 Hz, CH2-

13C-NMR (125 MHz, DMSO): δ (ppm) 192,8/192,4 (C=O), 171,9 (C-8),

10)

168,5 (C-6), 156,8/156,7 (C-4), 155,9 (C-4′), 131,3 (C-2′), 124,2/124,17(C-1′),

114,7/114,6 (C-3′), 105,6/105,5 (C-2), 102,0/101,8 (C-9), 99,5/99,3 (C-1′′),

95,8/95,3 (C-5), 91,7/91,5 (C-7), 77,2/77,1 (C-5′′), 76,8/76,7 (C-3′′), 73,0/72,9 (C-

2′′), 69,3/69,2 (C-4′′), 60,4/60,3 (C-6′′), 40,5 (C-10).

3.1.1.2. Điều chế maesopsin

Maesopsin được điều chế từ sự thủy phân của glucoside maesopsin-4-O-β-D-

glucopyranoside (116) là hợp chất được phân lập từ lá cây Chay Bắc bộ. Phản ứng

thủy phân được trình bày theo sơ đồ Hình 3.2.

Hình 3.2. Sơ đồ điều chế maesopsin (98)

Quy trình thủy phân

Trong một bình cầu đã được lắp sinh hàn và máy khuấy từ, gia nhiệt, hỗn hợp

dung dịch của chất 116 (0,45 g; 1 mmol) và MeOH (15 mL) được nhỏ từ từ HCl

10% (15 mL) vào trong thời gian 15 phút. Sau đó hỗn hợp phản ứng được đun hồi

lưu trong 5h, kiểm tra SKLM thấy glucoside đã bị thủy phân hết, cất loại dung môi,

phần dịch nước còn lại cho vào chiết với EA (5 × 5 mL). Dịch chiết được kết hợp

lại, rửa với nước muối bão hòa (2 × 5 mL), làm khan bằng Na2SO4 và được cô quay

dưới chân không thấp thu được 0,43 g chất rắn. Chất rắn được phân lập bằng SKC

cột trên silica gel sử dụng hệ dung môi rửa giải n-hexan/EA (1/1) thu được 0,216 g

sản phẩm maesopsin với hiệu suất 75%.

Maesopsin (98): là chất rắn màu vàng nhạt

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,02 (2H,

ESI-MS (m/z): 286,9 [M-H]ˉ .

d, J = 9,0 Hz, H-2′, H-6′), 6,59 (2H, d, J = 8,5

Hz, H-3′, H-5′), 5,78 (1H, br s, H-7), 5,74 (1H,

13C-NMR

br s, H-5), 3,08 (2H, brs, CH2-10).

(ppm) (125 MHz, CD3OD): δ

196,8(C=O), 173,7 (C-8), 171,0 (C-6), 159,7 (C- 4), 157,2 (C- 4′), 132,5 (C-2′, C-

6′), 125,9 (C-1′), 115,7 (C-3′, C-5′), 107,4 (C-2), 103,1 (C-9), 96,8 (C-5), 91,1 (C-

7), 42,1 (C-10).

3.1.2. Bán tổng hợp alphitonin

Alphitonin đã được tổng hợp theo phương pháp của Kiehlmann bằng phản

ứng đồng phân hóa taxifolin. Taxifolin đã được điều chế từ sự thủy phân astilbin

một hợp chất có hàm lượng rất cao (~ 1%) trong rễ cây Thổ phục linh (Smilax

glabra Wall ex Roxb.) ở Việt Nam. Các bước phân lập astilbin, điều chế taxifolin

và phản ứng đồng phân hóa taxifolin được trình bày trong sơ đồ sau:

Hình 3.3. Sơ đồ tổng quát bán tổng hợp alphitonin (82)

3.1.2.1. Phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall ex Roxb.)

Nguồn mẫu thực vật Thổ phục linh (S. glabra) đã được khảo sát sơ bộ về hàm

lượng và trữ lượng của chúng tại 8 tỉnh miền Bắc và Thổ phục linh Trung Quốc

được mua tại hiệu thuốc phố Lãn Ông [144]. Kết qủa khảo sát cho thấy Thổ phục

linh ở nước ta có hàm lượng cao hơn hẳn Thổ phục linh Trung Quốc bán tại các

hiệu thuốc tại Hà Nội. Vì vậy nguồn nguyên liệu rễ Thổ phục linh đã được thu mua

tại hai tỉnh Bắc Giang và Tuyên Quang là 2 vùng có trữ lượng khá phong phú.

Mẫu rễ Thổ phục linh sau khi thu mua được rửa sạch, thái mỏng, phơi, sấy khô

và bảo quản trong bao kín, khô ráo và nghiền nhỏ trước khi chiết.

Mẫu Thổ phục linh khô (10 kg) được nghiền nhỏ và ngâm, chiết trong EtOH

85% ( 1 × 40 L + 3 × 20 L) ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày mỗi lần, quá trình chiết

mẫu được lặp lại 4 lần đảm bảo astilbin trong mẫu được chiết hầu hết (kiểm tra

bằng SKLM). Gộp các dịch chiết lại rồi quay cất dưới áp suất thấp loại dung môi

thu được dịch cô ethanol (2 L). Dịch cô ethanol được pha loãng 2 lần về thể tích với

H2O (2 L) thu được hỗn hợp dạng huyền phù (4 L). Hỗn hợp huyền phù (4 L) được

lần lượt chiết với n-hexan (1 × 2 L + 3 × 1 L) rồi với ethyl acetate (1 × 2 L + 3 × 1 L)

đảm bảo thu hồi hết astilbin (kiểm tra bằng SKLM). Dịch chiết n-hexan và ethyl

acetate được làm khan qua Na2SO4 rồi quay cô loại dung môi thu được cao n-hexan

(41 g) và cao ethyl acetate (EA, 465 g). Cao EA được phân lập sơ bộ qua sắc ký cột

nhanh trên silica gel thu được astilbin thô (254 g) và các phân đoạn của các hợp

chất giải hấp trước astilbin (92 g) và giải hấp sau astilbin (43 g). Astilbin thô được

kết tinh lại từ hỗn hợp dung môi MeOH/H2O (1/1; v/v) 3 lần thu được 100 g astilbin

với hàm lượng 95,5% theo HPLC với hiệu suất tách 1,0 % so với trọng lượng mẫu

khô.

Hình 3.4. Sơ đồ phân lập astilbin quy mô 10 kg TPL/mẻ

Astilbin (94) là chất rắn màu trắng

FT-IR max (cm-1): 3427, 3263, 2912, 1640, 1603, 1519,

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 6,98 (1H, d, J =

1476, 1363, 1301, 1177, 1070, 977.

2,0 Hz, H-2′), 6,86 (1H, dd, J = 8,0 , 2,0 Hz, H-6′), 6,83

(1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′), 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6),

5,92 (1H, d , J = 2,0 Hz, H-8), 5,10 (1H, d, J = 10,5 Hz,

H-2), 4,60 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 4,28 (1H, dq, J = 6,0, 9,6 Hz, H-5′′), 4,07 (1H,

d, J = 1,5 Hz, H-1′′), 3,68 (1H, dd, J = 3,0 , 9,6 Hz, H-3′′), 3,56 (1H, dd, J = 1,5 ,

3,0 Hz, H-2′′), 3,3 (1H, m, H-4′′), 1,21 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6′′).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,0 (C=O); 168,5 (C-7); 165,5 (C-

5); 164,1 (C-9); 147,4 (C-4′); 146,5 (C-3′), 129,2 (C-1′), 120,5 (C-6′); 116,3 (C-5′),

115,5 (C-2′); 102,5 (C-10); 102,1 (C-1′′); 97,4 (C-6); 96,2 (C-8); 83,9 (C-2); 78,5

(C-3); 73,8 (C-4′′); 72,2 (C-3′′); 71,8 (C-2′′); 70,5 (C-5′′); 17,8 (C-6′′).

3.1.2.2. Thủy phân astilbin điều chế taxifolin

Sơ đồ phản ứng:

Hình 3.5. Phản ứng thủy phân astilbin (94) điều chế taxifolin (81)

Quy trình thủy phân astilbin:

Astilbin (0,459 g;1mmol) và MeOH (8 mL) được lần lượt cho vào bình cầu 3

cổ có lắp sinh hàn hồi lưu có phễu nhỏ giọt và đặt trên bếp gia nhiệt có khuấy từ.

Hỗn hợp được khuấy cho tan hết astilbin sau đó dung dịch HCl 10% (3,23 mL; 10 mmol) được nhỏ giọt từ từ vào trong khoảng 10 phút. Sau khi nhỏ hết HCl, hỗn hợp

phản ứng được hồi lưu trong khoảng 4 – 5 giờ, kiểm tra SKLM khi astilbin bị thủy phân hoàn toàn thì dừng phản ứng. Cất loại bớt dung môi rồi thêm H2O (2 – 5mL) vào và chiết hỗn hợp phản ứng bằng ethyl acetate (4 × 10 mL). Kết hợp dịch chiết,

rửa bằng nước đến pH = 4 rồi làm khan và quay cất loại dung môi thu được sản phẩm thô màu vàng nhạt (0,32 g). Sản phẩm thô được tách sắc ký cột nhanh trên

silica gel với hệ n-hexan/EA (1/2; v/v) thu được 0,29 g. Sau đó được kết tinh lại từ hỗn hợp dung dịch MeOH/H2O (1/1; v/v) thu được 0,258 g taxifolin màu vàng nhạt, hiệu suất phản ứng đạt 85 %. T° n/c: 222-224º C.

Taxifolin (81): FT-IR: νKBr (cm-1): 3416, 3195, 2854, 1644, 1614, 1479, 1267, 1169. ESI-MS (m/z ): 303 [M-H]ˉ .

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 6,98 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′); 6,87 (1H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz; H-6′);

6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′); 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 5,90 (1H, d, J = 2,0 Hz; H-8); 4,93 (1H, d,

J = 11,5 Hz, H-2); 4,52 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-3). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 198,4 (C=O); 168,7 (C-5), 165,3 (C-7), 164,5 (C-9); 147,2 (C-3′), 146,3 (C-4′), 129,9 (C-1′), 120,9 (C-6′); 116,1(C-5′), 115,9 (C-2′), 101,9 (C-10);

97,3 (C-6); 96,3 (C-8), 85,1 (C-2); 73,7 (C-3).

3.1.2.3. Phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin

Phản ứng đồng phân hóa taxifolin xảy ra theo quy trình được trình bày trong

sơ đồ Hình 3.6.

Hình 3.6. Sơ đồ bán tổng hợp alphitonin (82) từ taxifolin (81)

 Qui trình chung

Hỗn hợp dung dịch của taxifolin (n mmol), nước DI (VH2O mL) trong một bình

kín một cổ được làm lạnh rồi hút chân không và nạp khí nitơ vào. Sau đó, bình phản

ứng được đun trên bếp cách dầu với nhiệt độ trong dầu truyền nhiệt lên đến T°C và

thời gian phù hợp t giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được để

nguội, lọc loại bỏ kết tủa màu vàng được xác định là quercetin. Dịch nước được

chiết bằng ethyl acetate khoảng 5 lần đến hết sản phẩm auronol (kiểm tra bằng

SKLM). Dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 , rồi quay cất loại dung môi. Phần

cặn thô được phân tách trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EA (2/1) cho

alphitonin với hiệu suất phụ thuộc vào điều kiện phản ứng.

Alphitonin (82):

ESI-MS (negative): m/z = 303 [M-H]ˉ .

1H-NMR (500 MHz, Acetone-d6): δ (ppm) 9,65

(1H, brs, OH), 7,70 (1H, br s, OH), 7,66 (1H, br

s, OH), 6,72 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′), 6,61 (1H,

d, J = 8,0 Hz, H-5′), 6,54 (1H, d, J = 2,0 , 8,0 Hz,

H-6′), 6,43 (1H, br s, OH), 5,86 (1H, d, J = 1,5

Hz, H-5), 5,82 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 3,05

13C-NMR (125 MHz, Acetone-d6): δ (ppm) 195,4 (C=O), 172,5 (C-8), 169,6

(1H, d, J = 13,5 Hz, Hb-10), 3,02 (1H, d, J = 13,5 Hz, Ha-10).

(C-6), 158,8 (C-4), 145,3 (C-3′), 144,7 (C-4′), 126,3 (C-1′), 122,9 (C-6′), 118,5 (C-

2′), 115,5 (C-5′), 107,0 (C-2), 102,7 (C-9), 96,7 (C-5), 91,4 (C-7), 41,8 (C-10).

 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nhiệt độ, dung môi và thời gian

đến phản ứng đồng phân hóa taxifolin.

Phản ứng được tiến hành theo quy trình chung trong bình kín chịu áp với các

điều kiện thay đổi ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng về nhiệt độ (Bảng 4.4), về

dung môi (Bảng 4.5) và về thời gian (Bảng 4.6). Lượng mol của taxifolin trong các

phản ứng khảo sát là 1 mmol (0,304 g). Do phản ứng tiến hành trong bình kín nên

nhiệt độ phản ứng được khảo sát trên cơ sở tương quan với nhiệt độ dầu dẫn nhiệt.

 Nghiên cứu độ ổn định của quy trình

Phản ứng đồng phân hóa taxifolin được tiến hành theo quy trình trên, sau khi

đã xác định được các điều kiện ảnh hưởng với lượng mol tác nhân tăng dần từ 1

mmol đến 15 mmol (Bảng 4.7)

3.1.3. Tổng hợp toàn phần các auronol alphitonin và maesopsin

Các auronol alphitonin và maesopsin đã được nghiên cứu tổng hợp toàn phần

qua bước tổng hợp các aurone sau đó oxy hóa các aurone thu được các auronol.

Như vậy, tổng hợp toàn phần các auronol gồm 2 giai đoạn chính là tổng hợp các

aurone và oxy hóa aurone thành các auronol được trình bày theo sơ đồ Hình 3.7

Sơ đồ phản ứng:

a. ClCH2CN, Et2O, ZnCl2, HCl 0°C, 24 h; b. 1) HCl, hồi lưu; 2) MeONa/MeOH, hồi

lưu (Hiệu suất a, b: 46%); c. H2O, hồi lưu (Hiệu suất a, c: 41%); d. MeI/K2CO3 (69,5% -

77%); e. 3,4-dihydrobenzaldehyde hoặc 4-hydroxybenzaldehyde, HCl/MeOH (52-65%); f.

(80%

- 90%); g. 3,4-dimethoxybenzaldehyde hoặc 4-

H2, Pd/C, EtOAc

methoxybenzaldehyde, HCl/MeOH hoặc NaOH/MeOH, (89% - 93%); h. LDA, THF,

TMSCl, -70°C đến RT; i. 1) m-CPBA, CH2Cl2, NaHCO3, 0°C, 2) TBAF, CH2Cl2 t° phòng

(21- 25% qua 2 bước).

Hình 3.7. Sơ đồ tổng hợp toàn phần auronol

3.1.3.1. Tổng hợp các aurone

Các aurone được tổng hợp theo phương pháp phổ biến nhất là ngưng tụ giữa

các benzofuranone với các benzaldehyde. Chất trung gian chìa khóa 3,4-

dihydroxybenzofuranone (5b) không sẵn có trên thương mại vì vậy đã được nghiên

cứu tổng hợp theo 2 phương pháp từ phloroglucinol một hợp chất sẵn có trong

thương mại.

 Tổng hợp 4,6-dihyroxybenzofuran-3(2H)-one (5b)

Phương pháp 1

Trong bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, bơm hút chân không và nạp đầy khí

N2 cho hỗn hợp của phloroglucinol (25,2 g; 0,2 mol) trong diethyl ether khan (500

mL) được làm lạnh đến 0°C. Hỗn hợp chloroacetonitrile (15,1 g; 0,2 mol) và ZnCl2

(2,7 g; 0,02 mol) được nạp thêm vào bình phản ứng. Sục khí HCl vào hỗn hợp phản

ứng trong 2 h ở 0°C. Hỗn hợp phản ứng được tiếp tục khuấy qua đêm. Sau đó lọc,

rửa kết tủa với diethyl ether và sấy khô trong chân không, thu được chất rắn (3).

Hợp chất 3 được hòa tan trong nước nóng (500 mL) và đun hồi lưu trong 7 h. Sau

đó, hỗn hợp này được làm lạnh xuống nhiệt độ phòng. Các kết tủa trắng được thu

thập bằng cách lọc, rửa sạch bằng nước và sấy khô trong chân không thu được 5b

(21,2 g, 65%).

Chất 3

T°n/c: 239-232°C

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 12,60 , 11,02 ,

9,86 (3H, br s, 2 × s, 3 × OH), 6,33 , 6,08 (2H, 2 × d, J = 1,5

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 175,9, 173,6, 173,0, 160,6 (Ph C-2, C-4,

Hz, H-3, H-5), 5,44 (2H, s, CH2).

+), 99,41 (Ph C-1), 97,13 , 90,14, (Ph C-3, C-5), 75,35 (CH2).

C-6, C=NH2

Chất 5b

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 10,54 (2H, br s, OH),

T°n/c: 252-254°C;

5,91(2H, s, H-5, H-7), 4,55 (2H, s, C-2).

13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 194,0 (C=O), 175,6 , 167,6 , 157,5

(C-4, C-6, C-8), 102,7 , 96,2 , 90,1(C-5, C-7, C-9), 74,8 (C-2).

Phương pháp 2

Trong bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, bơm hút chân không và nạp đầy khí

N2 cho hỗn hợp của phloroglucinol (25,2 g; 0,2 mol) trong diethyl ether khan (500

mL ) được làm lạnh đến 0°C. Hỗn hợp chloroacetonitrile (15,1 g; 0,2 mol) và

ZnCl2 (2,7 g; 0,02 mol) được nạp thêm vào bình phản ứng. Sục khí HCl vào hỗn

hợp phản ứng trong 2 h ở 0°C. Hỗn hợp phản ứng được tiếp tục khuấy qua đêm.

Sau đó lọc, rửa kết tủa với diethyl ether và sấy khô trong chân không, thu được 30,6

g muối iminium (3). Muối iminium 3 được hòa tan trong dung dịch HCl 1N (643

mL), khuấy ở nhiệt độ phòng trong 3 h (xuất hiện kết tủa trắng) và sau đó đun hồi

lưu trong 2 h. Hỗn hợp này được làm lạnh xuống 6°C qua đêm. Các kết tủa thu

được bằng cách lọc, rửa sạch với nước lạnh, sấy khô trong chân không và hòa tan

trong dung dịch MeONa/MeOH 1,8 M (195 mL). Dung dịch thu được được đun hồi

lưu trong 2 h, sau đó làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và trung hòa với dung dịch

HCl 1N (22 mL). Cất loại methanol, phần còn lại được chiết với ethyl acetate (40

mL). Dịch chiết được rửa lại bằng nước và làm khan bằng Na2SO4. Cất loại dung

môi thu được 5b (15,5 g) trong 46,5% sản lượng qua 2 bước.

 Tổng hợp 4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (18)

Trong bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, bơm hút chân không và nạp đầy khí N2

cho hỗn hợp 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b, 10 mmol) trong DMF (30

mL) và K2CO3 (20 mmol), cho tiếp từ từ methyl iodide (30 mmol) vào hỗn hợp và

được đun ở 80°C trong 1 giờ. Nước đá đã được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Dung

dịch được chiết với EtOAc. Dịch chiết EtOAc được làm khan bởi Na2SO4 sau đó cất

dưới áp suất giảm loại dung môi. Cặn chiết được kết tinh trong hỗn hợp của n-

hexane / EtOAc thu được dimethoxybenzofuranone 18 với hiệu suất 77%, sản phẩm

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 6,35 và 6,16 (2H, 2 × d, J = 1,8 Hz,

là một chất rắn màu trắng, T°n/c: 132-134°C.

H-5 và H-7), 4,64 (2H, s, H-2), 3,85 (3H, s, OCH3), 3,82 (3H, s, OCH3).

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 193,9 (C=O),

176,2 , 169,1 , 158,2 (C-8, C-6, C-4), 104,0 (C-9), 92,8 , 89,3

(C-5, C-7), 75,2 (C-2), 56,2 và 55,8 (2 × OCH3).

 Tổng hợp (Z)-2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methylene]-4,6-

dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (56) và (Z)-2-[(4-hydroxyphenyl)methylene]-

4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (117)

Trong bình cầu 3 cổ 50 mL đã nạp đầy khí nitơ cho hỗn hợp 4,6-

dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b, 1,0 mmol) và 3,4-dihydroxybenzaldehyde

(1,0 mmol) hoặc 4-dihydroxybenzaldehyde (1,0 mmol) trong methanol (14 mL),

HCl 36,0% (2,4 eq) được thêm vào ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp phản ứng được

khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24 h cho đến khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng

SKLM). Sau đó cất loại bỏ methanol, phần còn lại được chiết với EtOAc (3 × 10

mL). Dịch chiết được rửa sạch bằng 10% dung dịch NaCl và làm khan bằng

Na2SO4. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được sản phẩm thô. Tinh chế sản

phẩm bằng cách chạy qua cột trên silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexane / EtOAc

(1/1) thu được 56 và 117 tương ứng.

Hợp chất 56 là một chất rắn màu vàng, hiệu suất 52%.

T°n/c: 282-283°C

FT-IR: νKBr (cm-1): 3469, 3357, 3120, 3039, 2896, 2852, 1654, 1562, 1527,

1449, 1340, 1293, 1245, 1155, 1063, 846, 805, 675, 548, 505, 460.

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 10,81 ,

ESI-MS (negative): m/z = 285 [M-H]ˉ .

9,53 , 9,19 (4H, 3 × brs, 4 × OH); 7,38 (1H, d, J =

2,0 Hz, H-2′), 7,17 (1H, dd, J = 2,0 , 8,5 Hz, H-6′),

6,81 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5′), 6,44 (1H, s, H-10),

6,17 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 6,06 (1H, d, J = 1,5

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 179,0 (C=O), 167,5 (C-8), 166,9

Hz, H-5).

(C-6), 158,1 (C-4), 147,4 (C-4′), 145,9 (C-2), 145,4 (C-3′), 123,9 (C-6′), 123,6

(C-1′), 117,6 (C-2′), 115,9 (C-5′), 109,6 (C-10), 102,9 (C-9), 97,6 (C-5),

90,3(C-7).

Hợp chất 117 là một chất rắn màu vàng, hiệu suất 65 %.

T°n/c: 292-294°C

FT-IR: νKBr (cm-1): 3349, 2922, 1682, 1610, 1462, 1358, 1251, 1154, 1071,

819, 704, 618, 565.

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 7,74

ESI-MS (negative): m/z = 269 [M-H]ˉ .

(2H, d, J = 8,7 Hz, H-2′, H-6′), 6,85 (2H, d, J = 8,7

Hz, H-3′, H-5′), 6,54 (1H, s, H-10), 6,20 (1H, d, J

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 179,2 (C=O), 167,6 , 167,2 , 158,8 ,

= 1,2 Hz, H-5), 6,06 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-7).

158,3 (C-8, C-6, C-4, C-4′), 146,1 (C-2), 132,8 ( C-2′, C-6′), 123,4 (C-1′), 116,0 (C-

3′, C-5′), 109,2 (C-10), 102,9 , 97,7 , 90,5 (C-5, 7, 9).

 Tổng hợp các aurone (Z)-2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methylene]-4,6-

dimethoxy-benzofuran-3(2H)-one (55) và (Z)-2-[(4-methoxyphenyl)methylene]-

4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (90)

Phản ứng ngưng tụ giữa 4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (18) với 3,4-

dimethoxylbenzandehyde và 4-methoxylbenzaldehyde để hình thành các

methoxyaurone 55 và 90 được tiến hành theo 2 phương pháp: ngưng tụ với xúc tác

acid và ngưng tụ với xúc tác base.

Phương pháp 1: Ngưng tụ trong môi trường kiềm

Trong bình cầu 3 cổ 50 mL, hỗn hợp dung dịch của 4,6-dimethoxybenzofuran-

3(2H)-one (18, 10 mmol) và 3,4-dimethoxybenzandehyde (10 mmol) trong MeOH

(10 mL), được cho thêm dung dịch của KOH/MeOH (7,5 mg/15 mL). Hỗn hợp

phản ứng được khuấy ở 60°C trong 30 phút, sau đó giảm xuống nhiệt độ phòng và

trung hòa bằng HCl 10% cho đến pH = 3. Kết tủa màu vàng hình thành được lọc,

rửa bằng hỗn hợp MeOH / H2O (1/1) và kết tinh trong MeOH / H2O (10/1) thu được

tinh thể hình kim màu vàng 55 (89%).

Phương pháp 2: ngưng tụ trong môi trường acid

Trong bình cầu 3 cổ 50 mL đã nạp đầy khí nitơ cho 4,6-dimethoxybenzofuran-

3(2H)-one 18 (10 mmol) trong methanol (140 mL), 3,4-dimetoxylbenzandehyde

(10 mmol) và HCl (24 mmol). Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng 24

h cho đến khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM). Sau đó cất loại bỏ

methanol, phần còn lại đã được chiết với EtOAc (3 × 10 mL). Dịch chiết được rửa

sạch bằng 10% dung dịch NaCl và làm khan bằng Na2SO4. Cất loại dung môi dưới

áp suất giảm, thu được sản phẩm thô. Tinh chế sản phẩm bằng cách chạy qua cột

ngắn trên silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexane / EtOAc (1/1) thu được chất rắn

màu vàng (91%)

Chất 55, tinh thể hình kim màu vàng , T°n/c= 169-17°C

FT-IR: νKBr (cm-1): 3010, 2946, 2840, 1690, 1603,

1514, 1421, 1250, 1099, 813, 469.

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 7,54 (1H,

ESI-MS: m/z = 343 [M + H]+.

d, J = 1,5 Hz, H-2′), 7,51 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz, H-6′), 7,05 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-

5′), 6,68 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5), 6,67 (1H, s, H-10), 6,31 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7),

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 178,8 (C=O), 168,7, 168,0 , 158,8

3,90, 3,88, 3,83 và 3,82 (12H, s, 4 × OCH3), .

(C-8, C-6, C-4), 150,2 , 148,7, 146,1(C-2, C-3′, C-4′), 124,9 (C-1′), 124,8 (C-6′),

114,0 , 111,9, 110,2 (C-10, C-2′, C-5′),104,2 (C-9), 94,3 , 89,8 (C-5, C-7), 56,5 ,

56,1 và 55,6 (4 × OCH3).

Tiến hành tương tự phản ứng ngưng tụ chất 18 với 4-methoxylbenzaldehyde

thu được aurone 90 với hiệu suất 90-93%

Chất 90 là chất lỏng dạng dầu màu vàng.

FT-IR: νKBr (cm-1): 2933, 2833, 1690, 1604, 1500,

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,80 (2H, d, J

1453, 1343, 1251, 1083, 1012, 822, 641, 550, 431.

= 9,0 Hz, H-2′, H-6′), 6,93 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3′,

H-5′), 6,72(1H, s, H-10), 6,34 và 6,08 (2H, 2 × d, J = 1,7 Hz, H-5 và H-7), 3,93,

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 180,5 (C=O), 168,7, 168,6 (C-8, 6),

3,88, 3,84 (9H, 3 × s, 3 × OCH3).

160,5 , 159,3 (C-4, 4′), 146,7 (C-2), 132,8 (C-2′, 6′), 125,3 (C-1′), 114,3 (C-3′, 5′),

110,9 (C-10), 105,4 (C-9), 93,9 , 89,1 (C -5, C-7), 56,1 , 56,0 và 55,2 (3 × OCH3).

3.1.3.2. Tổng hợp auronol từ aurone

Các auronol đã được tổng hợp từ các aurone qua 3 bước: bước 1, khử hóa các

aurone tạo thành các dihydroaurone (120, 91); bước 2 tạo trimethylsilane (TMS)

enol ether (121, 92); bước 3 oxy hóa các TMS enol ether sử dụng m-CPBA thực

hiện phản ứng Rubottom cung cấp các auronol (122, 93)

 Tổng hợp các dihydroaurone 2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methyl]-4,6-

dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (118); 2-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-4,6-

dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (119); 2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4,6-

dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (120); 2-[(4-methoxyphenyl)methyl]-4,6-

dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (91)

Các hợp chất dihydroaurone 118, 119 và 120, 91 được điều chế từ các aurone

tương ứng 56, 117, 55, 90, bằng phản ứng hydro hóa với xúc tác Pd/C

Khí H2 được điều chế từ Zn và HCl loãng được sục vào hỗn hợp dung dịch của

55 (1,71 g, 5 mmol) [hoặc 90 (1,56 g, 5 mmol) hoặc 56 (1,43 g, 5 mmol) hoặc 117

(1,35 g, 5 mmol)], Pd/C (1 mmol) trong ethanol (20 mL) trong 5 giờ. Kiểm tra

SKLM, phản ứng kết thúc, lọc rửa loại bỏ xúc tác, phần dịch ethanol được quay cất

loại hết dung môi rồi hòa tan trong ethyl acetate, dịch ethyl acetate được rửa bằng

H2O, làm khô quay cất loại dung môi thu được sản phẩm thô. Sản phẩm thô được

làm sạch bằng SKC trên silica gel với hệ dung môi rửa giải n-hexane / EA (4/1) thu

được chất rắn màu trắng 120 (1,55 g, hiệu suất 90%); hoặc 91 (1,37 g, 87%); hoặc

118 (0,59 g, 41%); hoặc 119 (0,55 g, 40%).

Hợp chất 120, 91 còn được tổng hợp từ 118 và 119 tương ứng bằng phản ứng

methyl hóa (MeI/K2CO3) tương tự phương pháp tổng hợp hợp chất 18.

Chất 118

FT-IR: νKBr (cm-1): 3478, 3287, 1676, 1610,

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 8,7

1448, 1338, 1222, 1071, 835, 683, 557.

(2H, br s, OH), 6,63 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-2′),

6,60 (1H, d, J = 8,0, H-5′), 6,48 (1H, dd, J =

1,9, 8,0 Hz, H-6′), 5,86 , 5,84 (2H, 2 × d, J = 1,6 Hz, H-5, H-7), 4,69 (1H, dd, J =

3,5, 8,2 Hz, H-2), 2,98 (1H, dd, J = 3,5 , 14,8 Hz, Ha-10), 2,65 (1H, dd, J = 8,2 ,

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 194,7 (C=O), 173,4 , 167,7 , 157,6

14,8 Hz, Hb-10).

(C-8, C-6, C-4), 144,8 , 143,8 (C-4′, C-3′), 127,3 (C-1′), 120,0 (C-6′), 116,8 , 115,3

(C-5′, C-2′), 102,4 (C-9), 96,9 , 89,9 , 85,7 (C-7, C-5, C-2), 36,2 (C-10).

Chất 119

FT-IR: νKBr (cm-1): 3346, 3135, 2948, 2594, 1665, 1607, 1513, 1475, 1342,

1236, 1192, 1076, 1030, 825, 678, 528.

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 7,02

(2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′), 6,65 (2H, d, J = 8,5

Hz, H-3′, 5′), 5,85 (2H, dd, J = 2,0 , 6,5 Hz, H-5,

H-7), 4,73 (1H, dd, J = 3,5, 8,0 Hz, H-2), 3,05

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 194,8 (C=O), 174,2 (C-8), 167,7 (C-

(1H, dd, J = 3,5 , 14,5 Hz, Ha-10), 2,74 ( 1H, dd, J = 8,0 , 14,5 Hz, Hb-10).

6), 157,6 và 158,5 (C-4, 4′), 130,3 (C-2′, C-6′), 126,5 (C-1′), 115,1 và 115,0 (C-3′,

C-5′), 102,5 (C-9), 96,1 và 89,9 (C-5, C-7), 85,6 (C-2), 36,0 (C-10).

Chất 120

FT-IR: νKBr (cm-1): 2943, 2843, 1699, 1614, 1504, 1425, 1213, 1149, 1030,

809, 646, 547.

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 6,87

(1H, br s, H-2′), 6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′),

6,75 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6′), 6,32 và 6,11 (2H,

2 × br s, H-5, 7), 4,91 (1H, dd, J = 3,5 , 8,0 Hz, H-2), 3,82 , 3,79 , 3,70 , 3,69 (12H,

4 × s, 3- OCH3), 3,14 (1H, dd, J = 3,5 , 14,5 Hz, Ha-10), 2,81 (1H, dd, J = 8,0 , 14,5

Hz, Hb-10).

C -NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 194,78 (C=O), 174,9 , 169,4 ,

158,4 (C-8, C-6, C-4), 148,4 , 147,5, (C-3′, C-4′), 128,7 (C-1′), 121,4 (C-6′), 113,0 ,

111,7 (C-2′, C-5′), 103,9 (C-9), 92,8 , 89,2 , 85,9 (C-5, C-7, C-2), 56,2 , 55,8, 55,5 ,

55,4 (4 × OCH3), 36,3 (C-10).

Chất 91

FT-IR: νKBr (cm-1): 3189, 3006, 2950, 2837, 1690, 1610, 1502, 1425, 1338,

1253, 1210, 1105, 1028, 811, 618, 521, 406.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7,22

(2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′), 6,81 (2H, d, J =

8,5 Hz, H-3′, 5′), 6,12 và 5,96 (2H, 2 × d, J =

1,5 Hz, H-5, 7), 4,71 (1H, dd, J = 3,5 , 8,5 Hz,

H-2), 3,88 , 3,83 và 3,71 (9H, 3 × s, 3-OCH3), 3,28 (1H, dd, J = 3,5, 15,0 Hz, Ha-

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 196,1 (C=O), 175,7 (C-8), 169,9 (C-

10, và 2,90 (1H, dd, J = 8,5 , 15,0 Hz, Hb-10).

6), 158,9 (C-4), 158,5 (C-4′), 130,4 (C-2′, C-6′), 128,4 (C-1′), 113,8 (C-3′, C-5′),

104,7 (C-9), 92,9, 88,9 (C-5, C-7), 87,0 (C-2), 36,8 (C-10).

 Tổng hợp các TMS enol ether 121, 92

Trong bình cầu 3 cổ có lắp nhiệt kế, phễu nhỏ giọt, được nạp đầy khí N2, dung

môi THF khan (10 mL) được làm lạnh bằng đá muối, sau đó LDA (1,1 mmol) được

nhỏ giọt từ từ vào (1,2 giọt trong khoảng 5- 10 phút) theo dõi nhiệt độ không được

quá 5°C. Sau khi nhỏ xong hỗn hợp phản ứng được khuấy tiếp 10 phút rồi được làm

lạnh xuống -70°C bằng đá khô/acetone, sau đó chất 120 (0,344 g, 1 mmol trong 1

mL THF) [hoặc chất 91 (0,314 g, 1 mmol)] được thêm vào từ từ trong khoảng 15

phút. Hỗn hợp phản ứng được khuấy 30 phút rồi TMSCl (1,1 mmol, 0,12 g, 0,14

mL) được nhỏ giọt vào từ từ trong khoảng 15 phút. Sau khi nhỏ hết, hỗn hợp được

khuấy tiếp 15 phút rồi đưa dần đến nhiệt độ phòng (30 phút) và khuấy ở nhiệt độ

phòng 30 phút. Hỗn hợp được quay cất đến kiệt rồi chiết bằng n-hexan khan (3 × 10

mL), dịch chiết được cất loại dưới áp suất giảm thu được sản phẩm 121 hoặc 92 thô

là chất rắn được đem phản ứng tiếp ngay mà không cần tinh chế.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 6,78 và 6,77

Chất 121

(3H, tín hiệu chồng chập, H- 2′, H-6′, H-5′), 6,47

và 6,25 (2H, 2 × d, J = 1,7 Hz, H-5 và H-7), 3,95

(2H, brs, CH2-10), 3,77 , 3,83 , 3,84 và 3,86 (12H,

4 × s, 3 × OCH3), 0,25 (9H, s, 3 × Si-CH3).

C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 158,5 , 154,2 , 153,2 (C- 6, 8, 2),

148,9 , 147,6 ( C- 3′, 4′), 140,0 (C-4), 133,3 (C-1′), 131 (C-3), 120,4 (C-6′), 111,7

và 111,2 (C-2′, 5′), 108,1 (C-9), 93,8 và 88,5 ( C-5, 7), 55,1 , 55,6 , 55,8 và 55,9 (4

× OCH3), 30,7 (C-10), 0,13 (Si-(CH3)3

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,15 (2H,

Chất 92

d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′), 6,81 (2H, d, J = 8,5 Hz,

H-3′, 5′), 6,46 và 6,24 (2H, 2 × d, J = 2,0 Hz, H-

5, H-7), 3,94 (2H, s, CH2-10), 3,85 , 3,76 và 3,75

(9H, 3 × s, 3 × OCH3), 0,235 (9H, s, Si-(CH3)3).

C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 158,4, 158,1 , 154,2 , 153,2 (C-8, 6, 4, 4′),

140,3 (C-2), 133,2 (C-3), 130,5 (C-1′), 130,4 (C-2′, 6′), 113,8 (C-3′, 5′), 108,1 (C-

9), 93,7 và 88,5 (C-5, 7), 30,1 (C-10), 0,13 (Si-(CH3)3.

 Oxy hóa TMS enol ether (121, 92) tổng hợp auronol (122, 93)

Trong một bình cầu đáy tròn 3 cổ được nạp đày khí N2, huyền phù của m-

CPBA (1,1 mmol, 0,19 g) trong CH2Cl2 (10 mL) được làm lạnh xuống dưới 0°C và

dung dịch của chất 121 (0,416 g, 1mmol) [hoặc 92 (0,386 g, 1 mmol)] được cho

dần vào. Hỗn hợp phản ứng được khuấy tiếp ở 0°C trong 30 phút rồi được cho thêm

dần TBAF (2 eq) trong khoảng 30 phút sau đó đưa dần đến nhiệt độ phòng. Sau khi

phản ứng kết thúc (kiểm tra SKLM), hỗn hợp đã được chiết với EA, dịch chiết được

rửa với NaHCO3 5% rồi với nước, sau đó được làm khô với Na2SO4 , được quay cất

loại dung môi và tinh chế qua SKC thu được 0,076 g chất 122 (hiệu suất 21%) hoặc

0,083 g chất 93 (hiệu suất 25%).

1H-NMR (500MHz, CDCl3): δ (ppm) 6,63 (1H, d,

Chất 122 là chất rắn trắng.

J = 2,0 Hz, H-2′); 6,53 (1H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz,

H-6′); 6,37 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′); 6,23 (1H, d,

J = 2,0 Hz, H-5) và 6,05 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7);

3,93, 3,77, 3,74, 3,65 (12H, 4 × s, 4 × OCH3), 3,11 (1H, d, J = 13,0 Hz, Ha-10) và

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 194,6 (C=O), 174,6 (C-8), 171,1 (C-6),

3,04 (1H, d, J = 13,0 Hz, Hb-10).

157,6 (C-4), 148,4 và 148,0 ( C-3′, 4′), 126,1 (C-1′), 122,0 (C-6′), 112,6 (C-2′),

110,9 (C-5′), 106,1 (C-2), 104,6 (C-9), 94,6 và 89,4 (C-5, 7), 55,7 , 55,67 , 55,61 ,

55,5 (4 × OCH3), 42,1 ( C-10).

1H-NMR (500MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,16 (2H,

Chất 93

d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,73 (2H, d, J = 8,5

Hz, H-3′, H-5′), 6,07 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5) và

5,90 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 3,86 , 3,85 và

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 193,4 (C=O), 173,6 và 170,7 (C-8, 6),

3,74 (9H, 3 × s, 3-OCH3), 3,16 và 3,06 ( 2H, d, J = 14,5 Hz, Ha-10, Hb-10)

158,9 và 158,5 (C-4, 4′), 131,7 (C-2′, 6′), 125,5 ( C-1′), 113,4 (C-3′, 5′), 109,5 (C-

2), 104,6 (C-9), 92,8 và 88,5 (C-5, 7), 56,1 , 56,0, 55,1 (3 × OCH3), 40,5 (C-10).

3.1.4. Tổng hợp auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)

Phản ứng glucosyl hóa alphitonin (82) dựa trên nguyên tắc của phản ứng

Koenigs-Knorr sử dụng glucopyranosyl halogenua với thử nghiệm ở các điều kiện

xúc tác khác nhau như ZnCl2, CdCO3, HgI2 hoặc Ag2CO3 với K2CO3 (Bảng 4.8).

Các kết quả phản ứng cho thấy sản phẩm trung gian alphitonin-4-O-β-D-tetraacetyl

glucopyranoside (124) thu được khi có mặt hỗn hợp chất xúc tác và chất xúc tiến

K2CO3/Cs2CO3. Sau khi loại bỏ các nhóm bảo vệ của sản phẩm đã thu được

alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) theo sơ đồ Hình 3.8

Hình 3.8. Sơ đồ tổng hợp alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)

 Tổng hợp alphitonin-4-O-β-D-tetraacetyl glucopyranoside (124)

Trong một bình kín hai cổ đã được bơm hút chân không và nạp đầy khí N2,

dung dịch của alphitonin (82, 912 mg; 3 mmol) trong dimethylformamid (15 mL)

được làm lạnh xuống nhiệt độ 0°C, các hợp chất 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-

glucopyranosyl bromide (123, 1,36 g; 3,3 mmol), K2CO3 (912 mg; 6,6 mmol) và

Cs2CO3 (1,08 g; 3,3 mmol) được lần lượt cho vào. Hỗn hợp phản ứng được khuấy

130 phút ở 0°C, sau đó đưa về nhiệt độ phòng và khuấy thêm 4 h cho phản ứng hết

(kiểm tra bằng SKLM). Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được trung

hòa bằng HCl 0,1N đến pH 6-7 và được chiết với EtOAc (2 × 30 mL). Dịch chiết

EtOAc được kết hợp lại và làm khan qua Na2SO4, quay cất chân không loại dung

môi. Phần cặn được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo (H2O / MeOH gradient) thu

được 741 mg hợp chất 124, hiệu suất 39%.

Alphitonin-4-O-β-D-tetraacetyl glucopyranoside (124):

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm)

6,66/6,64 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2′), 6,57/6,53

(1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′), 6,52/6,48 (1H, dd,

J = 1,5, 8,0 Hz, H-6′), 6,02/6,01 (1H, d, J =

1,5 Hz, H-5), 5,96/5,93 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 5,35 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-3′′),

5,32/5,22 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′), 5,23 (1H, dd, J = 8,0 , 9,0 Hz, H-2′′), 5,11 (1H,

m, H-4′′), 4,33/4,31 (1H, dd, J = 5,0, 12,0 Hz, Hb-6′′), 4,18/4,11 (1H, dd, J = 1,7,

12,0 Hz, Ha-6′′), 4,09/4,02 (1H, m, H-5′′), 3,02 (2H, m, H-10), 2,00 - 2,10 (12H, 4 ×

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 194,9 (C=O), 174,3 (C-8), 173,5 (C-

OAc).

6), 172,4, 71,6, 171,4 và 171,3 (4 × OAc), 157,7/157,5 (C-4), 145,6 (C-3′), 145,1

(C-4′), 126,5 (C-1′), 123,1/122,9 (C-6′), 118,8/118,7 (C-2′), 115,9/115,7 (C-5′),

107,4/107,1 (C-2), 103,0/102,9 (C-9), 100,1/99,4 (C-5), 99,8 (C-1′′), 94,6/94,5 (C-

7), 74,1 (C-3′′), 73,2/73,1 (C-5′′), 72,4/72,3 (C-2′′), 69,7/69,6 (C-4′′), 63,0/62,9 (C-

6′′), 42,3/42,2 (C-10), 20,8 , 20,7 , 20,6 và 20,5 (4 × OAc).

 Tổng hợp alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)

Trong một bình cầu 3 cổ có lắp phễu nhỏ giọt và nhiệt kế được nạp đầy khí

N2, hỗn hợp dung dịch của 124 (634 mg; 1 mmol) trong methanol (20 mL) được

làm lạnh xuống 0°C, dung dịch của NaOH/MeOH/H2O (176,0 mg, 4,4 mmol)/5

mL/5 mL được nhỏ dần vào. Hỗn hợp phản ứng được khuấy trong 30 phút ở 0°C,

sau đó được trung hòa với HCl 0,1N đến pH 6-7 rồi được chiết với EtOAc (3 × 30

mL). Dịch chiết EtOAc được kết hợp lại và làm khan qua Na2SO4, quay cất chân

không loại dung môi. Phần cặn được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung

môi rửa giải (H2O/MeOH gradient) thu được 210 mg hợp chất 125 ở hiệu suất 45%.

Alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) có số liệu phổ trùng với số liệu

phổ của chất TAT6 phân lập từ lá cây chay Bắc Bộ (Bảng 4.1 và Bảng 4.2).

3.1.5. Tổng hợp các dẫn xuất nitrile của auronol maesopsin, alphitonin và

maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside

Các dẫn xuất nitrile của auronol maesopsin (98), alphitonin (82) và

maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) được tổng hợp theo sơ đồ Hình 3.9 và

Hình 3.10.

Hình 3.9. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất nitrile của chất 82 và 98

Hình 3.10. Tổng hợp dẫn xuất nitrile của chất 116

3.1.5.1. Tổng hợp các auronol mang một nhóm thế nitrile (chất 126 và 127)

Trong một bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, nhiệt kế và được nạp đầy khí N2,

hỗn hợp dung dịch của chất 82 (hoặc chất 98) (1,0 mmol) và cloroacetonitrile

(0,069 mL; 1,1 mmol) trong dimethylacetamide (10 mL) được cho dần NaOH (44

mg; 1,1 mmol) vào. Sau đó, hỗn hợp được khuấy trong 10 phút tại 0°C và 24 giờ ở

nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), hỗn hợp được

làm lạnh đến 0°C và được trung hòa bằng axit HCl 1N đến pH = 6 rồi chiết với

EtOAc (3 × 20 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, được làm khan bằng Na2SO4,

được cô quay dưới chân không thấp loại dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn

thô được tách trên cột silica gel pha đảo (H2O/MeOH gradient) thu được dẫn xuất

nitrile 1 nhóm thế: chất 126 (hiệu suất 37,5%) hoặc chất 127 (39,8%).

Chất 126 Alphitonin-4-O-acetonitrile

ESI-MS (negative): m/z = 342 [M-H]ˉ

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 8,65

(2H, br s, OH), 7,51 (1H, br s, OH), 6,54 (1H, d,

J = 2,0 Hz, H-2′), 6,49 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′),

6,36 (1H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz, H-6′), 5,98 (1H, br

s, H-5), 5,96 (1H, br s, H-7), 5,19 và 5,13 (2H, 2

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 192,4 (C=O), 172,3 (C-8), 169,4

× d, J = 16,0 Hz, OCH2-CN), 2,90 và 2,82 (2H, 2 × d, J = 14,0 Hz, CH2-10).

(C-6), 155,5 (C-4), 144,4 (C-3′), 143,8 (C-4′), 124,6 (C-1′), 121,2 (C-6′), 117,8 (C-

2′), 116,0 (CN), 115,0 (C-5′), 105,9 (C-2), 101,3 (C-9), 94,4 (C-5), 92,3 (C-7), 53,5

(O-CH2-CN), 40,7 (C-10).

Chất 127: Maesopsin-4-O-acetonitrile

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm)

ESI-MS (negative): m/z = 326 [M-H]-.

9,12 (1H, br s, OH), 7,49 (1H, br s, OH), 6,91

(2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,53 (2H, d, J =

8,5 Hz, H-3′, H-5′), 5,91 (1H, br s, H-5), 5,87

(1H, br s, H-7), 5,17 và 5,12 (2H, 2 × d, J = 16,5,

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 191,8 (C=O), 172,2 (C-8), 170,5

O-CH2-CN), 2,93 và 2,87 (2H, 2 × d, J = 13,5 Hz, CH2-10).

(C-6), 155,8 (C-4′), 155,5 (C-4), 131,2 (C-2′, C-6′), 124,1 (C-1′), 116,1 (CN), 114,6

(C-3′, C-5′), 105,8 (C-2), 100,6 (C-9), 94,9 (C-5), 92,4 (C-7), 53,4 (O-CH2-CN),

40,5 (C-10).

3.1.5.2. Tổng hợp các auronol mang hai nhóm thế nitrile (chất 128 và 129)

Trong một bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, nhiệt kế và được nạp đầy khí N2,

hỗn hợp dung dịch của chất 82 (hoặc chất 98) (1,0 mmol) và cloroacetonitrile

(0,138 mL; 2,2 mmol) trong dimethylacetamide (20 mL) được cho dần NaOH (88

mg; 2,2 mmol) vào. Sau đó, hỗn hợp được khuấy trong 10 phút tại 0°C và 24 giờ ở

nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), hỗn hợp được

làm lạnh đến 0°C và được trung hòa bằng acid HCl 1N đến pH = 6 rồi chiết với

EtOAc (3 × 20 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, được làm khan bằng Na2SO4,

được cô quay dưới chân không thấp loại dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn

thô được tách trên cột silica gel pha đảo (H2O/MeOH gradient) thu được dẫn xuất

nitrile 2 nhóm thế: chất 128 (hiệu suất 37%) hoặc chất 129 ( 39%).

Chất 128: Alphitonin-4,6-di-(O-acetonitrile)

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm)

ESI-MS (negative): m/z = 417 [M+2H2O-H]ˉ , 381 [M-H]ˉ .

6,64 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′), 6,55 (1H, d, J

= 8,0 Hz, H-5′), 6,51 (1H, dd, J = 2,0 , 8,0

Hz, H-6′), 6,38 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 6,24

(1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 5,00 – 5,12 (4H, m,

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,6 (C=O), 174,7 (C-8), 168,4 (C-

2 × O-CH2-CN), 3,10 và 3,06 (2H, d, J = 13,5, CH2-10).

6), 157,0 (C-4), 145,6 (C-3′), 145,2 (C-4′), 125,9 (C-1′), 123,1 (C-6′), 118,7 (C-2′),

116,0, (CN), 115,9 (C-5′, CN), 108,1 (C-2), 106,1 (C-9), 95,9 (C-5), 92,7 (C-7),

55,0 (O-CH2-CN), 54,8 (O-CH2-CN), 42,2 (C-10).

Chất 129: Maesopsin-4,6-di-(O-acetonitrile)

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm)

ESI-MS (negative): m/z = 365 [M-H]ˉ .

7,01 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,58 (2H,

d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,39 (1H, d, J = 1,8

Hz, H-7), 6,24 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-5), 5,00 –

5,10 (4H, m, 2 × O-CH2-CN), 3,16 và 3,11 (2H,

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,5 (C=O), 174,6 (C-8), 168,4 (C-

d, J = 14,0 Hz, CH2-10).

6), 157,3 (C-4′), 157,0 (C-4), 132,5 (C-2′, C-6′), 125,2 (C-1′), 115,9 (CN), 115,8 (C-

3′, C-5′, CN), 108,1 (C-2), 106,1 (C-9), 96,01 (C-5), 92,7 (C-7), 55,0 (O-CH2-CN),

54,8 (O-CH2-CN), 41,9 (C-10).

3.1.5.3. Tổng hợp auronol glucoside mang 1 nhóm thế nitrile (chất 130)

Trong bình cầu 2 cổ đã được lắp sinh hàn và nạp khí N2 cho hỗn hợp

maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (1,0 mmol) và cloroacetonitrile (0,069 mL;

1,1 mmol) được hòa trong dimethylacetamide (10 mL), khuấy đều hỗn hợp và cho

thêm NaOH (44 mg; 1,1 mmol) vào. Hỗn hợp được khuấy tiếp trong 10 phút ở nhiệt

độ phòng. Sau đó, phản ứng được đun cách thủy ở 40°C trong 5h. Kết thúc phản

ứng hỗn hợp được làm lạnh đến 0°C và trung hòa bằng acid HCl 1N cho đến khi pH

=6. Tiến hành chiết với EtOAc (3 × 20 mL). Dịch chiết được làm khan bằng

Na2SO4, cô cạn hết dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn thô được tách trên

cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2 / MeOH = 15/1 và cột silica gel pha đảo với

hệ MeOH / H2O = 4/1 cho dẫn xuất nitrile 1 nhóm thế với hiệu suất là 22%.

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,00

Chất 130: Maesopsin-6-O-cyanomethyllene-4-O-β-D-glucopyranoside

(2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,57 (2H, dd, J

= 3,5 , 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,31 (1H, br s, H-

5), 6,29 (1H, br s, H-7), 5,04 (2H, s, O-CH2-

CN), 4,97 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1′′), 3,90 (1H,

br d, J = 12 Hz, Ha-6′′), 3,66 (1H, m, Hb-6′′), 3,59 – 3,42 (4H, m, H-2′′, 5′′, 3′′, 4′′),

13C-NMR (125 MHz, , CD3OD): δ (ppm) 197,7 (C=O), 174,3 (C-8), 168,8 (C-

3,15 và 3,11 (2H, 2 × d, J = 15,5 Hz, CH2-10).

6), 158,1/158,0 (C-4), 157,3 (C-4′), 132,5 (C-2′, C-6′), 125,2 (C-1′), 116,1 (CN),

115,8 (C-3′, C-4′), 108,0 (C-2), 106,0/105,8 (C-9), 101,8 (C-1′′), 97,1/96,8 (C-5),

92,7 (C-7), 78,6/78,5 (C-5′′), 77,5/77,4 (C-3′′), 74,1 (C-2′′), 71,3 (C-4′′), 62,4/62,3

(C-6′′), 54,7 (O-CH2-CN), 42,1/41,9 (C-10).

3.2. Khảo sát hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

3.2.1. Hoạt tính kích thích lympho bào

Phân lập tế bào lympho tổng số:

5mL máu được lấy từ tĩnh mạch thỏ khỏe mạnh, chống đông bằng heparin và

phủ lên thể tích ficoll paque tương đương. Sau đó ly tâm ở tốc độ 3000 vòng / phút

trong 30 phút. Tách, thu lấy lớp giữa, loại bỏ hồng cầu còn lại bằng NH4Cl. Sau khi

ly tâm, cặn tế bào được hòa lại trong HBSS. Số tế bào được đếm bằng buồng đếm

neubaurer. Tế bào lympho sau khi thu nhận được hòa lại trong môi trường nuôi cấy

RPMI có bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) với nồng độ tế bào 2 ×

106 tế bào/mL.

Xác định khả năng kích thích miễn dịch thông qua tăng sinh tế bào lympho

Phép thử được thực hiện như sau:

Tế bào lympho (180 L ) được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng với nồng

độ 2 × 106 tế bào/mL.

Các chất thử 82, 98, 116, 125 (phân lập và tổng hợp), 126, 127, 128, 129, 130

(20 L) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có

nồng độ là 100 g/mL; 20 g/mL; 4 g/mL; 0,8 g/mL. Concavalin A được sử

dụng làm đối chứng với nồng độ là 5 g/mL, 2,5 g/mL, 1,25 g/mL và 0,625

g/mL. Mẫu được ủ trong 48h ở 37 °C, 5% CO2.

3 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào (180 L) sẽ được sử dụng làm

đối chứng âm.

Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, thêm vào mỗi giếng 50 L MTT 1

mg/mL. Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37° C trong 4h, loại bỏ môi trường và thêm vào mỗi

giếng 100 L DMSO. Đĩa tế bào được đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và

sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu qua

phổ hấp phụ ở bước sóng 490nm. Chỉ số kích thích (SI – stimulate index) được tính

theo công thức:

Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.

DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Chất thử nào có SI > 1,2 sẽ

được xem là có khả năng kích thích miễn dịch. Nồng độ kích thích 50% sự phát

triển của tế bào (SD50 – Stimulate Dose at SI= 1,5) sẽ được xác định nhờ vào phần

mềm máy tính TableCurve 2Dv4

3.2.2. Hoạt tính độc tế bào

Nuôi cấy tế bào in vitro

Các dòng tế bào được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy

DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0

mM sodium pyruvate, 1% PSF (Penicilline-Streptomycine-Fungizone), ngoài ra bổ

sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).

Tế bào được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỉ lệ (1/3) và nuôi trong tủ ấm CO2

ở điều kiện 37°C, 5% CO2.

Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)

Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

Chất thử 82, 98, 116, 125 (phân lập và tổng hợp), 126, 127, 128, 129, 130 (20

L) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng

độ 100 g/mL; 20 g/mL; 4 g/mL; 0.8 g/mL.

Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để

điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 180 L môi

trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.

Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180 L) sẽ được

sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế

bào bằng Trichloracetic acid – TCA.

Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng

bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 °C. Đổ bỏ SRB

và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không

khí ở nhiệt độ phòng.

Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã

bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử

dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của

chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế

bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

% ức chế = 100% - % sống sót

Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma)

luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ

10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL.

DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức

chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve

2DV4. Chất thử nào có IC50 < 20 g/mL (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa

học) hoặc IC50  4 g/mL (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây

độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT.

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phân lập và tổng hợp các auronol và auronol glucoside

4.1.1. Hai hợp chất auronol glucoside maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside

(116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)

Alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside

125 116

Hai hợp chất maesopsin 4-O-β-D-glucopyranoside (116) và alphitonin-4-O-β-

D-glucopyranoside (125) đã được phân lập từ lá cây Chay Bắc bộ bằng các phương

pháp thường quy sử dụng SKC trên diaion, silica gel pha thường, pha đảo và

sephadex. Theo phương pháp đã được công bố quy trình phân lập hai auronol

glucoside (chất 116 và 125) sử dụng dung môi chiết là butanol [6]. Khi tiến hành

phân lập 2 hợp chất 116 và 125, từ lượng lớn mẫu lá Chay (10 kg), quy trình phân

lập đã được thay đổi để không phải sử dụng butanol là một hóa chất độc hại (có mùi

rất sốc và khi tiếp xúc nhiều gây đau đầu). Cao chiết ethanol thu được từ dịch chiết

ethanol của lá Chay được pha loãng với nước rồi được chiết với n-hexan để loại các

chất kém phân cực. Dịch nước còn lại được phân lập qua sắc ký cột trên diaion HP-

20 với hệ dung môi MeOH/H2O ở các tỉ lệ 0/100 50/50 và 100/0 (v/v) thu được 3

phân đoạn PA1, PA2, PA3. Trong đó, phân đoạn PA1 là các hợp chất tan trong

nước bao gồm đường và các muối vô cơ, phân đoạn PA2 là hỗn hợp gồm các chất

chính là chất 116 và chất 125 ngoài ra còn các chất khác là đường và một số chất

kém phân cực hơn chất 116, phân đoạn PA3 là gồm các chất có độ phân cực kém

hơn chất 116. Phân đoạn PA2 được phân lập bằng SKC trên silica gel với hệ dung

môi rửa giải EA/MeOH/H2O (13/7/1, v/v/v) thu được 4 phân đoạn PB1, PB2, PB3,

PB4. Phân đoạn PB2 giàu chất 116 được phân lập tiếp bằng SKC trên silica gel với

hệ dung môi rửa giải EA/MeOH/H2O (13/7/1, v/v/v) thu được PC1 (10 g), PC1

được phân lập tiếp bằng SKC pha đảo với hệ dung môi MeOH/H2O ở các tỉ lệ (1/4,

1/7, 1/9) thu được 7 g TAT2 sạch (hiệu suất tách > 0,07% so với trọng lượng mẫu

khô). Phân đoạn PB3 giàu chất 125, được phân lập bằng SKC trên sephadex 2 lần

với dung môi MeOH thu được PC2 (0,5 g), sau đó PC2 được phân lập tiếp bằng

SKC pha đảo với hệ dung môi MeOH/H2O ở các tỉ lệ (1/4, 1/7, 1/9), quá trình được

lặp lại 3 lần thu được TAT6 sạch (0,03 g, hiệu suất tách 0,0003% so với trọng lượng

mẫu khô).

Các số liệu phổ của chất 116 và 125 cho các tín hiệu phù hợp với cấu trúc

phân tử và các dữ liệu phổ đã được công bố Bảng 4.1 và Bảng 4.2.

Phổ khối ESI-MS của chất 116 và 125 cho các pic ion âm giả phân tử m/z =

449 [M-H]ˉ và 465 [M-H]ˉ phù hợp với công thức phân tử của mỗi chất C21H22O11

và C21H22O12 tương ứng. Các số liệu phổ NMR của chất 116 thể hiện chất này là

một auronol glucoside, phân tử gồm có phần aglycone maesopsin gắn với phần

đường glucopyranoside. Trên phổ NMR của chất 116 ta thấy có rất nhiều cặp tín

hiệu rất gần nhau về độ chuyển dịch hóa học (tín hiệu kép), điều này có thể có 2 giả

thiết: 1, hoặc do trong phân tử có phần aglycone có trung tâm bất đối C*-2 kết hợp

với 4 trung tâm bất đối của phần đường tạo nên các diasteromer tách được trong từ

trường đo; 2, hoặc do phân tử đường cồng kềnh bị cản trở bởi nhóm ketone (3-

C=O) không quay tự do được mà chỉ có khả năng quay về 2 phía của mặt phẳng

benzofuranone (A và C) cũng tạo nên các tín hiệu kép trong phổ NMR. Phổ 1H-

NMR của chất 116 (Hình 4.1) cho các tín hiệu tù rộng của các proton OH ở vùng

trường thấp với δH 9,1 và δH 7,6/7,5. Ở vùng trường thơm là các cặp tín hiệu doublet

của các proton methine thơm vòng B hệ AA′XX′ ở H 6,93 (2H, H-2′, H-6′) và 6,56

(2H, H-3′, H-5′) với hằng số tương tác Jortho = 8,5 Hz, như vậy, nhóm OH thế ở vị

trí C-4′. Cũng ở vùng trường thơm nhưng ở trường cao hơn là các cặp tín hiệu

doublet của các proton thơm meta vòng A ở δH 6,00/6,04 và δH 5,93/5,92 (H-5, H-7)

với hằng số tương tác Jmeta = 1,5 Hz, Ở vùng trường cao hơn là các tín hiệu proton

OH ở δH 5,20/5,13, 5,06/ 5,01, tiếp theo là cặp tín hiệu doublet của proton methine

anomeric H-1′′ của phân tử đường ở H 4,97/4,90 với hằng số tương tác J = 7,5 Hz

cho thấy đây là đường -D-glucopyranoside, ở trường cao hơn là cặp tín hiệu

proton OH ở H 4,59/4,50 và H 3,38. Phần đường còn cho các tín hiệu của các

proton methylene ở H 3,64/3,63 (br m, Ha-6′′) và ở H 3,48 (m, Hb-6′′), các tín hiệu

multiplet ở vùng từ 3,29 - 3,20 ppm là tín hiệu của 4 proton methine H-3′′, H-5′′, H-

2′′ và H-4′′.

Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của chất 116 (DMSO- d6)

Phổ 13C-NMR (Hình 4.2) của chất 116 cũng cho các tín hiệu kép của 21

carbon bao gồm 15 tín hiệu carbon của phần aglycone thuộc khung auronol và 6 tín

hiệu carbon thuộc phần đường glucopyranoside. Ở vùng trường thấp là tín hiệu của

carbon carbonyl (3-C=O) ở C 192,8/192,4, tiếp theo là các tín hiệu của 4 carbon

thơm liên kết với oxy ở C 171,9 (C-8), C 168,5 (C-6), C 156,8/156,7 (C-4), và C

155,9 (C-4′); sáu carbon methine thơm bao gồm 4 carbon của vòng B ở C 131,3

(C-2′, C-6′) và C 114,7, 114,6 (C-3′, C-5′) và 2 carbon methine thơm của vòng A ở

C 95,8/95,3 và C 91,7/91,6 (C-5 và C-7). Ở vòng A, B còn có hai carbon thơm bậc

4 của C-1′ ở C 124,2/124,17 và của C-9 ở C 102,0/101,8 và cụm tín hiệu của các

carbon thuộc phần đường gồm có tín hiệu của carbon hemiacetal C-1′′ ở C

99,4/99,3, tiếp theo là các cặp tín hiệu của 4 carbon methine liên kết với oxy ở C

77,19/77,15 (C-5′′); 76,84/76,74 (C-3′′); 72,95/72,91 (C-2′′); 69,32/69,23 (C-4′′) và

cặp tín hiệu của carbon methylene liên kết với oxy ở C 60,45/60,32/59,8 (C-6′′).

Cuối cùng là tín hiệu của carbon methylene ở C 40,5/40,1 (CH2-10). Kết hợp với

phổ HSQC (phụ lục 14), phổ HMBC (phụ lục 14) cho các tương tác xa của proton

methylene nhóm CH2-10 (2,9 ppm) với C-1′ (124,20/124,17 ppm)/C-2′, C-6′ (131,3

ppm)/3-CO (192,7/192/4). Proton H-1′′ (4,90/4,97 ppm) cho tương tác xa với C-4

(156,8/156,7 ppm) chứng tỏ phần đường gắn vào C-4 của aglycone (maesopsine)

cùng với độ chuyển dịch thấp bất thường của carbon C-8 (173,9 ppm) do sức căng

của vòng C chứng minh cấu trúc khung auronol của chất 116.

Hình 4.2. Phổ 13C-NMR của chất 116 (DMSO- d6)

Các số liệu phổ của chất 125 cũng khẳng định hợp chất này là một auronol

glucoside, phân tử gồm có phần aglycone alphitonin gắn với phần đường

glucopyranoside. Pic ion âm giả phân tử của chất 125 lớn hơn chất 116 một nhóm

OH, điều này cũng thể hiện trên phổ NMR của chúng. Cũng giống chất 116, các tín

hiệu trên phổ NMR (Hình 4.3; Hình 4.4) của chất 125 cũng xuất hiện các cặp tín

hiệu kép. Ở vùng trường thơm, phổ 1H-NMR cho tín hiệu kép của 5 proton methine

thơm gồm 3 proton thơm hệ ABX vòng B ở H 6,66/6,67 (d, J = 2,5 Hz, H-2′), H

6,57/6,55 (d, J = 8,5 Hz, H-5′) và H 6,52/6,51 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, H-6′); và 2

proton thơm meta vòng A ở H 6,00/5,98 (d, J = 1,2 H, H-5) và ở H 5,88/5,87 (d, J=

1,2 Hz, H-7); Ở trường cao cho tín hiệu của nhóm methylene ở H 3,04 (m, CH2-

10).

Hình 4.3. Phổ 1H-NMR của chất 125 (CD3OD)

Phổ 13C-NMR cho 15 tín hiệu của 15 carbon khung auronol: gồm 12 carbon

thơm 2 vòng A và B, trong đó 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với oxy ở C

174,9/174,7 (C-8), ở C 174,8/174,6 (C-6), ở C 158,4/158,3 (C-4), ở C 145,6/145,5

(C-3′) và ở C 145,1 (C-4′); 5 tín hiệu của 5 carbon methine thơm ở C

123,1/123,0/(C-6′), ở C 118,7/118,6 (C-2′), ở C 115,9/115,8 (C-5′); 2 carbon thơm

bậc 4 ở C 126,5/126,4 (C-1′) và ở C 101,7/101,5 (C-9); Vòng C cho tín hiệu của

carbon carbonyl ở C 196,0/195,8 (3-C=O) và carbon hemicetal ở C 107,6/107,5

(C-2). Các tín hiệu của phần đường cũng tương tự như phần đường của chất 116.

Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu của proton hemiacetal ở H 4,88 ppm bị che phủ bởi tín

hiệu rộng của nước. Ở trường cao là các tín hiệu 2 proton của nhóm methylene liên

kết với oxy ở 3,88 ( br d, J =12,5 Hz, Hb-6′′) và ở 3,70 (m, Hb-6′′); ở 3,53 (dd, J =

8,0 , 9,0 Hz, H-2′′); từ 3,48-3,43 ppm là các multiplet của H-3′′, H-4′′ và H-5′′. Phổ

HSQC (phụ lục 22) cho các tương tác C-H trực tiếp và HMBC (phụ lục 22) cho các

tương tác xa phù hợp với cấu trúc phân tử được trình bày trên Bảng 4.1 và Bảng

4.2.

Hình 4.4. Phổ 13C-NMR của chất 125 (CD3OD)

Bảng 4.1. Số liệu phổ 1H-NMR của maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)

[500MHz, CD3OD, giá trị  (ppm), J (Hz)]

Chất 125 (TAT6) Chất 116 (TAT2) H (Phân lập)

(Tài liệu)# 6,07 d (1,7) [6,09 d 6,0/5,98 d (1.2) (Tài liệu)# 6,00 br s (8 Hz) (Phân lập)*** 6,00 d (1,7 5

Hz) (1,7)]*

7 5,96 d (1,7) [5,98 d 5.88/5.87 d (1.2) 5,88 br s (≈5 Hz) 5,93 d (1,7

Hz) (1,7)]

10 3,04 m 2,96 và 2,90 2

3,05 s [3,04 d (13,9)/3,06d (14,1)] × d (13,5 Hz)

2′ 6,65 d (2,0) [6,66 d 6,66/6,67 d (2,5) 3,10 s [3,09 d (14,1)/3,11 d (14)]* 7.01 d (8,4) 6,93/6,91 d

(8,5) (2,0)]

6,59 d (8,3) [6,58 6,56/6,54 d 3′

d (8,30)] (8,5)

5′ 6,57 d (8,1) [6,55 d 6,57/6,55 d (8,5) 6,59 d (8,3) [6,58 6,56/6,54 d

d (8,30)] (8,5) (8,0)]

6′ 6,51 dd (8,1;2,1) 6,52/6,51 dd (2,5; 7,01 d (8,4) 6,93/6,91 d

[6,5dd (8,1;2,0)] 8,5) (8,5)

1" 4,89 d (7,6) [4,87 d 4,89, tín hiệu 4,85 d (7,6) 4,97/4,90 d

chồng chập (7,5) (7,4)]

3,53 dd (8,0; 9,0) 3,54 m 3,53m 2"

3,29-3,20 3,48 m 3,48 m 3,49 m 3"

m 3,43 m 3,42 m 3,42 m 4"

3,43 m 3,43 m 3,41 m 5"

6" 3,88 d (12,0)/3,68 3,88 brd (12,5) 3,88 brd (12,3) 3,64/3,63 brm

dd (12,1;5,5) /3,70 m /3,70 m 3,48 m

* Tương tác HMBC (s: mạnh; m: vừa; w: yếu);

** Tín hiệu trong ngoặc [] hoặc sau dấu / là tín hiệu của đồng phân; *** Các phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất 116 đo trong DMSO. # Tài liệu [6]

[3,89 d (12,1)/3,70 dd (12,0;5,0)]

Bảng 4.2. Số liệu phổ 13C-NMR của maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)

[125MHz, CD3OD, giá trị  (ppm), J (Hz)]

Chất 125 Chất 116 C Tài liệu# Phân lập Tài liệu# Phân lập***

2 107,66 [107,57]** 107,6/107,5 107,56 [107,60]** 105,6/105,5

3 197,01 [196,88] 196,0/195,8 196,15 [196,03] 192,76/192,4

4 158,37 [158,29] 158,4/158,3 158,49 [158,37] 156,8/156,7

5 97,19 [97,75] 99,0/98,3 98,20 [98,57] 95,8/95,3

6 171,49 174,8/174,6 174,22 168,5

7 93,20 [93,37] 94,0/93,8 93,96 [93,77] 91,7/91,5

8 174,64 [174,59] 174.9/174.7 174,62 171,9

9 103,42 [103,65] 101,7/101,5 102,68 [102,51] 102,0/101,8

10 42,17 42,3/41,2 41,97 40,5

1′ 126,17 [126,23] 126,5/126,4 125,72 [125,74] 124,2

2′ 118,62 [118,73] 118,7/118,6 132,51 131,3

3′ 145,62 145,6/145,5 115,77 [115,73] 114,7/114,6

4′ 145,16 [145,16] 145,12 157,2 155,9

5′ 115,90 [115,85] 115,9/115,8 115,77 [115,73] 114,7/114,6

6′ 123,08 [122,99] 123,1/123,0 132,51 131,3

1" 101,56 [101,67] 102,4/102,3 101,63 99,5/99,3

2" 73,97 [74,08] 74,1/74,0 74,02 [104,09] 73,0/72,9

3" 77,32 77,3 77,37 [77,34] 76,8/76,7

4" 71,16 71,1 71,14 69,3/69,2

5" 78,37 [78,30] 78,3/78,2 78,35 [78,29] 77,2/77,1

* Tương tác HMBC (s: mạnh; m: vừa; w: yếu); ** Tín hiệu trong ngoặc [] hoặc sau dấu / là tín hiệu của đồng phân; *** Các phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất 116 đo trong DMSO. # Tài liệu [6]

6" 62,30 62,2 62,30 60,4/60,3

Hình 4.5 là sắc ký đồ HPLC của hỗn hợp chất 116 và chất 125 ở tỉ lệ 116/125

~ 50/50, g/g) và Hình 4.6 là sắc ký đồ HPLC của chất 125. Kết quả trên sắc ký đồ

cho thấy chất 125 được phân lập là chất sạch có thời gian lưu tại 6,223 phút và chất

116 có thời gian lưu là 8,094 phút ở điều kiện tiến hành sắc ký.

Hình 4.5. Sắc ký đồ HPLC của hỗn hợp 2 chất 116/125

Hình 4.6. Sắc ký đồ HPLC của chất 125

4.1.1.1. Điều chế auronol maesopsin (98)

Kết quả phân lập hai hợp chất auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-

glucopyranoside (125) và maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) từ lá cây

Chay Bắc bộ (A. tonkinensis) cho thấy hợp chất auronol glucoside maesopsin-4-O-

β-D-Glc (116) có hàm lượng khá lớn trong lá cây Chay Bắc bộ (> 0,07 %). Vì vậy

hợp chất maesopsin-4-O-β-D-Glc (116) đã được sử dụng là nguồn cung cấp auronol

maesopsin (98). Theo sơ đồ phân lập (Hình 3.1), từ lá cây Chay Bắc Bộ (10 kg lá

khô) đã phân lập được 7 g chất 116 sạch.

Thủy phân 116 sạch (5 g) bằng HCl loãng ở điều kiện đun hồi lưu nhẹ trong

methanol thu được 3,75 g maesopsin với hiệu suất 75%.

Phổ NMR của auronol 98 cho các tín hiệu của các proton và carbon khung

auronol và không còn các tín hiệu của phần đường và ta cũng không thấy xuất hiện

các tín hiệu kép trong phổ NMR của nó. Ở vùng trường thơm, phổ 1H-NMR (Hình

4.7) cho 2 cặp doublet của 4 proton thơm hệ AA′XX′ vòng B ở H 7,01 (H-2′, H-6′)

và 6,59 (H-3′, H-5′) với hằng số tương tác Jortho = 8,5 Hz, ở trường cao hơn là 2 tín

hiệu singlet tù của 2 proton thơm meta vòng A ở H 5,78 (1H, H-5) và H 5,74 (1H,

H-7). Phổ 13C-NMR (Hình 4.8) cho 15 tín hiệu của 15 carbon khung auronol: gồm

12 carbon thơm 2 vòng A và B, trong đó 4 tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với

oxy ở C 173,7 (C-8), 171,0 (C-6), 159,7 (C-4), 157,2 (C-4′); 6 tín hiệu của 6 carbon

methine thơm ở C 132,5 (C-2′, C-6′), 115,7 (C-3′, C-5′) và ở C 96,8 , 91,1 (C-5, C-

7), 2 tín hiệu của carbon thơm bậc 4 ở C 125,9 (C-1′) và ở C 103,1 (C-9); Vòng C

cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 196,8 (3-C=O) và một carbon hemicetal ở C

107,4 (C-2); ngoài ra ở trường cao là tín hiệu của carbon methylene C-10 ở C 42,1.

Phổ HSQC (phụ lục 13) cho các tương tác C-H trực tiếp và HMBC (phụ lục 13) cho

các tương tác xa của proton CH2-10 (3,08 ppm)/C-2 (107,0 ppm)/C-1′(125,9

ppm)/C-2′, 6′ (132,5 ppm)/C-3 (196,8 ppm), cùng với độ chuyển dịch thấp bất

thường của carbon C-8 (173,9 ppm) do ảnh hưởng sức căng vòng 5 (vòng C) đã

chứng minh cấu trúc khung auronol của chất 98. Phổ khối ESI-MS (phụ lục 13) của

chất 98 cho pic ion âm giả phân tử m/z = 287 [M-H]ˉ phù hợp với số khối công thức

phân tử C15H12O6.

Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của chất 98 (CD3OD)

Hình 4.8. Phổ 13C-NMR của chất 98 (CD3OD)

4.1.2. Bán tổng hợp auronol alphitonin (82)

Hình 4.9. Sơ đồ tổng quát bán tổng hợp alphitonin

Alphitonin (82) đã được chúng tôi nghiên cứu tổng hợp theo phương pháp của

Kielhmann bằng phản ứng đồng phân hóa taxifolin dưới tác dụng của nhiệt. Phương

pháp này thể hiện nhiều ưu điểm là nguyên liệu từ nguồn thực vật trong nước, phản

ứng chỉ có 1 bước và sử dụng dung môi nước rất thân thiện với môi trường. Hợp

chất đầu taxifolin được điều chế từ astilbin có hàm lượng rất cao (~ 1%) trong rễ

Thổ phục linh (S. glabra). Với mục tiêu tìm nguồn nguyên liệu cho việc xây dựng

quy trình tổng hợp các hợp chất auronol chúng tôi đã khảo sát một số tỉnh, thành

phố ở miền Bắc và Thổ phục linh của Trung Quốc bán tại phố Lãn Ông Hà Nội.

4.1.2.1. Kết quả khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ thổ phục linh

Kết quả khảo sát các vùng nguyên liệu Thổ phục linh tại 8 tỉnh miền Bắc và

Thổ phục linh Trung Quốc bán tại phố Lãn Ông Hà Nội được trình bày trong Bảng

4.3.

Kết quả khảo sát hàm lượng tách được của astilbin trong các mẫu (1-9) cho

thấy hàm lượng astilbin trong rễ Thổ phục linh Việt Nam tại các tỉnh là khá cao từ

0,8-1,1% so với trọng lượng mẫu củ khô (trừ vùng Sơn La 0,74%) và cao hơn hẳn

so với hàm lượng astilbin trong rễ Thổ phục linh Trung Quốc đang bán tại Hà Nội

(0,3%). Chúng tôi cũng sơ bộ khảo sát trữ lượng tại các vùng lấy mẫu cho thấy

Tuyên Quang và Hà giang là 2 tỉnh vẫn còn khả năng thu mua với lượng lớn Thổ

phục linh. Kết quả thu được là cơ sở cho việc khai thác và sử dụng nguồn dược liệu

quý này ở nước ta.

Bảng 4.3. Kết quả khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ Thổ phục linh tại 8 tỉnh

miền Bắc

Nguồn dược Địa điểm thu, mua mẫu Hiệu suất tách STT liệu ( Tỉnh và Thành phố) Astilbin (% )

Trung Quốc Mua tại phố Lãn Ông Hà Nội 1 0,31

2 Tuyên Quang 0,89

3 Thái Nguyên 0,92

4 Bắc Giang 0,82

5 Hòa Bình 1,18 Việt Nam 6 Sơn La 0,74

7 Sa Pa 0,81

8 Quảng Ninh 1,17

9 Vĩnh Phúc 0,87

4.1.2.2. Quy trình phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh

Astilbin đã được nghiên cứu phân lập từ rễ Thổ phục linh theo một số phương

pháp như:

- Phương pháp 1 sử dụng tính chất acid của hợp chất phenolic, từ cặn dịch

chiết ethanol của rễ TPL sử dụng base để chuyển các hợp chất phenolic và acid về

dạng muối rồi chiết loại hết các chất không tạo muối bằng butanol, sau đó acid hóa

lại và chiết các hợp chất phenolic trong đó thành phần chính là astilbin.

- Phương pháp 2 dựa vào tính tan của astilbin trong các dung môi sử dụng

phương pháp kết tủa phân đoạn kết hợp với SKC nhanh và kết tinh thu được astilbin

sạch với hàm lượng > 95%.

Sau khi khảo sát các phương pháp phân lập chúng tôi đã lựa chọn quy trình sử

dụng ethyl acetate làm dung môi chiết, kết hợp các phương pháp SKC, kết tủa và

kết tinh để phân lập astilbin với quy mô 10 kg TPL/mẻ. Nguồn nguyên liệu được

chúng tôi thu mua tại Tuyên Quang là mẫu có hàm lượng astilbin cao và là vùng

còn có thể thu mua với lượng lớn Thổ phục linh.

Mẫu Thổ phục linh khô (10 kg) sau khi ngâm chiết theo quy trình thu được dịch

cô ethanol, pha loãng với H2O và chiết lần lượt với n-hexan (1 × 2 L + 3 × 1 L) rồi với

ethyl acetate (1 × 2 L + 3 × 1 L) đảm bảo thu hồi hết astilbin (kiểm tra bằng SKLM).

Dịch chiết n-hexan và ethyl acetate được làm khan qua Na2SO4 rồi được quay cô

loại dung môi thu được cao n-hexan (41 g) và cao ethyl acetate (EA, 465 g). Cao

EA được phân lập sơ bộ qua sắc ký cột nhanh trên silica gel thu được astilbin thô

(254 g) sau đó astilbin thô được kết tinh lại từ hỗn hợp dung môi MeOH/H2O (1/1;

v/v) 3 lần thu được 100 g astilbin với hàm lượng 95,5% theo HPLC với hiệu suất

tách 1,0 % so với trọng lượng mẫu khô.

Các dữ liệu phổ của sản phẩm astilbin phân lập phù hợp với cấu trúc phân tử

và các dữ liệu phổ của hợp chất này trong các tài liệu đã được công bố. Trên phổ

proton 1H-NMR (phụ lục 12) của sản phẩm astilbin tại vùng trường thấp xuất hiện

cụm tín hiệu của 3 proton methine thơm hệ ABX vòng thơm B ở δH 6,98 (d, H-2′)

với Jmeta= 2,0 Hz, ở δH 6,86 (dd, H-6′) với 2 hằng số tương tác Jortho = 8,0 Hz, Jmeta=

2,0 Hz và ở δH 6,82 (d, H-5′) với Jortho = 8,0 Hz, cho thấy vòng B đã bị thế vào 2 vị

trí C-3′ và C-4′. Ở trường cao hơn, 2 cặp doublet ở δH 5,94 (1H, d, H-6) và ở δH

5,92 (1H, d, H-8) với Jmeta = 2,0 Hz chứng tỏ vòng thơm A đã bị thế ở vị trí C-5, C-

7. Tín hiệu của các proton H-2, H-3 là các doublet ở δH 5,10 (d, H-2) và δH 4,60 (d,

H-3) với hằng số tương tác lớn J = 10,5 Hz chứng tỏ là 2 proton- trans nằm ở 2

phía mặt phẳng phân tử. Các tín hiệu của đường Rhamnose gắn vào phân tử thể hiện

rõ trên các tín hiệu double quartet (dq) của proton H-5′′ ở δH 4,28 (dq, J = 6,0 Hz và

9,6 Hz) do tương tác với các proton của nhóm methyl 6-CH3 và proton H-4′′. Đặc

biệt tín hiệu của proton anome H-1′′ ở δH 4,07 (d, J = 1,5 Hz), hằng số tương tác

nhỏ chứng tỏ H-1′′ và H-2′′ là các liên kết equatorial còn OH-1′′ và OH-2′′ là các

liên kết axial và astilbin phân lập là taxifolin-α-L-rhamnoside. Các tín hiệu double

doublet (dd) ở δH 3,68 (dd, J = 3,0 và 9,6 Hz, H-3′′) và δH 3,56 (dd, J = 1,5 và 3,0

Hz, H-2′′). Tín hiệu proton của H-4′′ bị che phủ bởi tín hiệu của proton methanol

OCH3 ở 3,36 ppm. Cuối cùng là tín hiệu doublet nhóm -CH3 của H-6′′ ở δH 1,21 (J

= 6,0 Hz).

Phổ 13C-NMR của chất 94 (phụ lục 12) cho 21 tín hiệu của 21 carbon của một

flavonol glucoside bao gồm các tín hiệu của khung aglycone flavonol (taxifolin, 15

carbon) và phần đường rhamnoside (6 carbon). Các tín hiệu của các carbon khung

flavonol bao gồm các carbon thơm của 2 vòng A và B nằm trong vùng trường thơm

gồm 5 tín hiệu của carbon thơm liên kết với oxy ở δC 168,5 (C-7), 165,5 (C-5),

164,1 (C-9), 147,4 (C-4′) và 146,5 (C-3′) và 5 carbon methine thơm ở δC 120,5 (C-

6′); 116,3 (C-5′), 115,5 (C-2′); 97,4 (C-6); 96,2 (C-8) và 2 carbon thơm bậc 4 ở δC

129,2 (C-1′), 102,5 (C-10). Vòng C cho 3 tín hiệu: 1 carbon carbonyl ở δC 196,0 (C-

4); 2 carbon methine ở δC 83,9 (C-2) và δC 78,5 (C-3). Phần đường cho 6 tín hiệu

của 6 carbon bao gồm 1 tín hiệu của carbon anome hemiacetal ở δC 102,1 (C-1′′); 4

carbon methine liên kết với oxy ở δC 70,5 (C-5′′); 73,8 (C-4′′); 72,2 (C-3′′); 71,8 (C-

2′′) và 1 carbon methyl ở δC 17,8 (C-6′′).

4.1.2.3. Điều chế taxifolin từ astilbin

Taxifolin (C15H22O7, 81) thu được từ sự thủy phân của astilbin là nguồn

nguyên liệu cho việc nghiên cứu bán tổng hợp alphitonin. Từ astilbin tương đối

sạch đạt trên 95% đã được thủy phân bằng HCl/MeOH theo phương pháp thông

thường. Sản phẩm thủy phân đã được phân lập kết hợp SKC và kết tinh thu được

taxifolin sạch. Cấu trúc của sản phẩm đã được xác định bằng các phương pháp phổ

phù hợp với cấu trúc phân tử và các dữ liệu phổ của taxifolin đã được công bố.

Phổ khối ion hóa phun mù điện tử cho pic ion âm giả phân tử [M-H]ˉ với m/z=

303 phù hợp với trọng lượng phân tử taxifolin. Trên phổ proton 1H-NMR của sản

phẩm thủy phân, taxifolin, không còn các tín hiệu của đường Rhamnose, chỉ còn

các tín hiệu của các proton của 3 vòng A, B, C. Ở vùng trường thơm là tín hiệu của

5 proton methine thơm của 2 vòng A và B, vòng B cho các tín hiệu của các proton

thơm hệ ABX ở δC 6,98 ppm (d, H-2′) với Jmeta = 2,0 Hz, ở δC 6,87 (dd, H-6′) với

Jmeta = 2,0 Hz và Jortho = 8,0 Hz, ở δC 6,82 (d, H-5′) với J = 8,0 Hz; vòng A cho các

tín hiệu doublet của 2 proton thơm meta ở δC 5,94(d, H-5); 5,90 (d, H-7) với Jmeta =

2,0 Hz. Ở trường cao hơn là 2 cặp doublet của vòng C ở δC 4,92 (d, H-2) và δC 4,52

(d, H-3) với J = 11,5 Hz là tương tác của các Haxial vicinal ở vị trí trans.

Phổ 13C-NMR của hợp chất 81 (Hình 4.11) cho tín hiệu của 15 carbon của

khung flavonol ít thay đổi so với trong phân tử glucoside (astilbin). Hai vòng A và

B cho các tín hiệu của 12 carbon ở vùng trường thơm gồm 5 tín hiệu của 5 carbon

thơm liên kết với oxy của ở δC 168,71 (C-7), 165,32 (C-5), 164,52 (C-9); 147,15 (C-

4′), 146,32 (C-3′) và 5 carbon methine thơm ở δC 120,90 (C-6′); 116,10(C-5′),

115,89 (C-2′), 97,31 (C-6); 96,28 (C-8) và 2 carbon thơm bậc 4 ở δC 129,88 (C-1′),

101,85 (C-10). Vòng C cho 3 tín hiệu ở δC 198,41 (CO); 85,13 (C-2); 73,68 (C-3).

Các tín hiệu này khẳng định khung chắc chắn của flavonol taxifolin.

Hình 4.10. Phổ 1H-NMR giãn của chất 81 (CD3OD)

Hình 4.11. Phổ 13C-NMR của chất 81 (CD3OD)

4.1.2.4. Phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin

Hình 4.12. Sơ đồ phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin

Trong tài liệu đã công bố [138], alphitonin và maesospin được tổng hợp từ

taxifolin và dihydrokaempferol tương ứng. Theo tài liệu này, con đường tổng hợp đi

qua các bước bảo vệ các nhóm OH-phenolic với benzyl bromide tạo thành các hợp

chất phenyl-O-benzyl. Bước tiếp theo là phản ứng đồng phân hóa hợp chất đã được

bảo vệ trong DMF ở nhiệt độ cao. Sau đó, đề các nhóm bảo vệ thu được alphitonin

và maesopsin tương ứng (Hình 1.47). Chúng tôi cũng đã nghiên cứu tổng hợp lặp

lại, kết quả cho thấy rất khó triển khai phản ứng với lượng gam theo phương pháp

này. Vì vậy, phương pháp đồng phân hóa taxifolin thành alphitonin theo của

Kielhmann [134] đã được lựa chọn nghiên cứu. Theo phương pháp này dưới tác

dụng của nhiệt trong điều kiện trơ, taxifolin bị đồng phân hóa thành alphitonin.

Phản ứng đồng phân hóa taxifolin được giả thiết xảy ra theo cơ chế trình bày trong

Hình 4.13.

Hình 4.13. Sơ đồ cơ chế phản ứng đồng phân hóa taxifolin

Theo Kielhmann [134], Paul [132], ở nhiệt độ cao hay có mặt của xúc tác

acid/base, liên kết 1-2 (C-O) trong vòng dị tố C mở ra tạo thành quinone methine

81a. Hợp chất quinone methine 81a hoặc có thể đóng vòng lại cho hỗn hợp sản

phẩm 81d gồm 4 đồng phân (±)-taxifolin và (±)-epimertaxifolin; hoặc tautomer hóa

hình thành chalcone 81b rồi diketone 81c và đóng vòng với sự cấu trúc lại thành

vòng 5 bền hơn cho sản phẩm (±)-alphitonin (82). Paul đã chứng minh sự có mặt

của 4 đồng phân (±)-taxifolin và (±)-epimertaxifolin trong giai đoạn đầu của hỗn

hợp phản ứng dựa trên phổ CD và đã phân lập được cả 4 đồng phân này. Quá trình

cấu trúc lại thành vòng 5 hình thành (±)-alphitonin đã được cả Kielhmann và Paul

đề nghị qua hợp chất trung gian diketone 81c. Để giải thích cho sự hình thành sản

phẩm racemate Paul đã đưa ra trạng thái chuyển tiếp của diketone 81c kết hợp với 2

phân tử nước với các mức năng lượng nhỏ có thể dễ dàng vượt qua ở nhiệt độ

phòng. Do sự racemate nhanh của alphitonin nên không thu được sản phẩm chọn

lọc lập thể của phản ứng.

 Nghiên cứu các điều kiện nhiệt độ, dung môi và thời gian ảnh hưởng đến

hiệu suất phản ứng đồng phân hóa taxifolin

Kết quả ở Bảng 4.4, Bảng 4.5, Bảng 4.6 cho thấy các điều kiện về nhiệt độ,

dung môi và thời gian ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng đồng phân hóa

taxifolin.

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ

STT* 1 2 3 4

Nhiệt độ (°C) 145 150 155 160

* Phản ứng được tiến hành với tỉ lệ taxifolin/H2O (1 mmol/7 mL) trong 95 giờ.

Hiệu suất (%) 42,4 57,9 65 54,5

Bảng 4.4 cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất phản ứng, ở nhiệt

độ thấp do sự hình thành của sản phẩm phụ dihydroquercetin làm giảm hiệu suất

phản ứng. Ở nhiệt độ quá cao dẫn đến phân hủy sản phẩm làm giảm hiệu suất phản

ứng, hiệu suất phản ứng cao nhất ở nhiệt độ dầu cấp là 155°C.

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của dung môi

STT* 1 2 3 4 5

6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 H2O (V, mL)

43,0 33,8 65 26,0

44,0 Hiệu suất (%) * Phản ứng được tiến hành với 1 mmol taxifolin ở 155°C trong 95 giờ.

Bảng 4.5 cho thấy tỉ lệ chất phản ứng và dung môi thích hợp nhất là 1 mmol

taxifolin/7 mL H2O, hiệu suất phản ứng thấp hơn khi tỉ lệ này thay đổi

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian

STT* 1 2 3 4 5

Thời gian (h) 80 85 90 95 100

* Phản ứng được tiến hành với tỉ lệ taxifolin/H2O (1 mmol/7 mL) ở 155°C.

Hiệu suất (%) 56,0 58,8 64,0 65,0 54,9

Bảng 4.6 cho thấy tốc độ quá trình đồng phân hóa diễn ra khá chậm, kéo dài

đến 95 giờ. Thời gian ít hơn hay nhiều hơn đều làm giảm hiệu suất phản ứng.

Sau khi đã khảo sát và chọn lựa các điều kiện phản ứng, chúng tôi đã khảo sát

độ ổn định của phản ứng. Các kết quả thu được được trình bày trong Bảng 4.7.

Bảng 4.7. Khảo sát độ ổn định của phản ứng

Thời gian Nhiệt độ dầu Hiệu suất SSố Taxifolin

(h) TT (g/ mmol) V H2O (mL) (°C) (%)

95 1 0,304/ 1 7 155 65,0

95 2 1,52/ 5 35 155 65,1

95 3 3,03/ 10 70 155 64,7

95 4 4,56/ 15 105 155 64,8

Bảng 4.7 cho thấy ở các điều kiện đã chọn lọc phản ứng đồng phân hóa cho

hiệu suất khá ổn định với lượng mol của taxifolin từ 1mmol, 5mmol, 10 mmol và

15 mmol.

Như vậy, các kết quả khảo sát đã chỉ ra phản ứng đồng phân hóa taxifolin cho

hiệu suất cao ổn định ở điều kiện dung môi là 1 mmol taxifolin/7 mL H2O với thời

gian phản ứng là 95 giờ ở nhiệt độ dầu cấp nhiệt là 155°C, hiệu suất alphitonin đạt

tới 65%. Kết quả này rất hữu ích cho việc nghiên cứu bán tổng hợp alphitonin từ

taxifolin ở lượng cân lớn đáp ứng các nhu cầu nghiên cứu chuyển hóa và thử hoạt

tính tiếp theo của alphitonin.

Tương tự như maesopsin (98), phổ NMR của hợp chất 82 cho các tín hiệu của

các proton và carbon khung auronol, các số liệu phổ phù hợp với cấu trúc phân tử

và với các số liệu đã được công bố [132, 134]. Phổ khối ion hóa phun mù điện tử

cho pic ion âm phân tử đề proton hóa [M-H]ˉ với m/z = 303 phù hợp với công thức

phân tử C15H12O7.

Hình 4.14. Phổ ESI-MS của chất 82

Hình 4.15. Phổ 1H-NMR của chất 82 (acetone- d6)

Ở vùng trường thấp phổ proton 1H-NMR (Hình 4.15) cho các tín hiệu singlet

tù của các proton OH ở δH 9,65, 7,70, 7,76. Ở vùng trường thơm cho 5 tín hiệu của

5 proton thơm của 2 vòng A và B. Vòng B cho 3 tín hiệu của 3 proton dạng ABX ở

δH 6,72 (d, J = 2 Hz, H-2′); ở δH 6,61 (d, J = 8,0 Hz, H-5′) và ở δH 6,54 (dd, J = 2,0

và 8,0 Hz, H-6′). Vòng A cho 2 cặp doublet của các proton meta ở δH 5,86 (d, H-5)

và ở δH 5,82 (d, H-7) với hằng số tương tác Jmeta = 1,5 Hz. Hai proton metylene

CH2-10 cho 2 doublet ở δH 3,05 và ở δH 3,02 với hằng số tương tác Jgem = 13,5 Hz.

Hình 4.16. Phổ 13C-NMR của chất 82 (acetone- d6)

Phổ carbon 13C-NMR (Hình 4.16) cho tín hiệu của 15 carbon khung auronol

bao gồm 12 carbon thơm 2 vòng A và B, 2 carbon thuộc vòng C và một carbon

methylene. Hai vòng thơm A, B cho 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với oxy ở

C 172,5(C-8), 169,6 (C-6), 158,8 (C-4), 145,3 (C-3′) và 144,7 (C-4′); 6 tín hiệu của

6 carbon methine thơm ở C 122,9 (C-2′), 118,5 (C-6′), 115,5 (C-5′), ở C 96,7 và

91,4 (C-5 và C- 7), 2 tín hiệu của 2 carbon thơm bậc 4 ở C 126,3 (C-1′) và 102,7

(C-9). Vòng C cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 195,4 (3-C=O) và tín hiệu của

carbon hemicetal ở C 107,0 (C-2). Ở trường cao là tín hiệu của carbon methylene

C-10 ở C 41,8. Như vậy các tín hiệu phổ NMR khung auronol của aglycone

alphitonin (chất 82) ít thay đổi so với trong phân tử glucoside của nó (chất 125).

Phổ HSQC (phụ lục 7) cho các tương tác C-H trực tiếp và HMBC (Hình 4.17) cho

các tương tác xa của 2 proton CH2-10 (3,05, 3,02 ppm)/C-2 (107,0 ppm)/C-1′(126,3

ppm)/C-6′ (122,9 ppm)/C-2′ (118,5 ppm)/C-3 (195,4 ppm), cùng với độ chuyển

dịch thấp bất thường của carbon C-8 (172,5 ppm) và C-6 (169,6 ppm) do ảnh hưởng

sức căng vòng 5 (vòng C), đã chứng minh cấu trúc khung auronol của chất 82.

Hình 4.17. Phổ HMBC của chất 82 (acetone- d6)

4.1.3. Nghiên cứu phương pháp tổng hợp toàn phần của các auronol

Qua việc đánh giá phân tích các phương pháp tổng hợp toàn phần của auronol

đã công bố chúng tôi đã lựa chọn tổng hợp auronol qua 2 giai đoạn: Giai đoạn 1 là

tổng hợp các aurone; Giai đoạn 2 là khử nối đôi của aurone rồi tiến hành oxy hóa để

thu được sản phẩm aurone đã được hydrate hóa là các auronol.

4.1.3.1. Nghiên cứu phương pháp tổng hợp các aurone

Các aurone có thể được tổng hợp theo nhiều phương pháp như ngưng tụ các

benzofuranone với các benzaldehyde hoặc từ đóng vòng các chalcone hoặc sử dụng

xúc tác cho sự đóng vòng ketone... Trong đó, phương pháp ngưng tụ giữa các

benzofuranone với các benzaldehyde là phương pháp phổ biến, vì vậy chúng tôi đã

nghiên cứu tổng hợp các aurone theo phương pháp này đi từ các nguyên liệu sẵn có

thương mại (Hình 4.18).

hồi lưu (Hiệu suất a, b: 46%); c. H2O, hồi lưu (Hiệu suất a, c: 41%); d. MeI/K2CO3 (69,5 -

77%); e. 3,4-dihydrobenzaldehyde hoặc 4-hydroxybenzaldehyde, HCl/MeOH (52 - 65%);

g. 3,4-dimethoxybenzaldehyde hoặc 4-methoxybenzaldehyde, HCl/MeOH hoặc

NOH/MeOH, (89% - 93%).

Hình 4.18. Sơ đồ tổng hợp của các aurone a. ClCH2CN, Et2O, ZnCl2, HCl 0°C, 24 h; b. 1) HCl, hồi lưu; 2) MeONa/MeOH,

Sơ đồ Hình 4.18 cho thấy bước đầu tiên trong tổng hợp các aurone là tổng hợp

hợp chất trung gian chìa khóa benzofuranone 5b

 Phản ứng điều chế chất trung gian chìa khóa benzofuranone

Hợp chất benzofuranone 5b, là chất chìa khóa trung gian quan trọng trong

tổng hợp aurone, được tổng hợp qua 2 giai đoạn. Giai đoạn đầu tiên là phản ứng

ngưng tụ giữa phloroglucinol và chloroacetonitrile trong sự có mặt của ZnCl2, sau

đó hỗn hợp phản ứng được sục khí HCl tạo nên muối iminium (3) (42%). Muối 3

sau đó được thủy phân đóng vòng để tạo 5b.

Phản ứng thủy phân đóng vòng muối iminium (3) đã được nghiên cứu tiến

hành theo 2 phương pháp. Phương pháp 1 (điều kiện phản ứng b) là thủy phân trong

môi trường acid HCl sau đó đóng vòng bởi MeONa cho 5b với hiệu suất 46% toàn

phần. Phương pháp 2 (điều kiện phản ứng c) chỉ đơn giản là đun hồi lưu trong nước

cho sản phẩm 5b ở hiệu suất 41% sản lượng từ 3. Như vậy, cả hai phương pháp đều

cho kết quả tương ứng nhau. Tuy nhiên, phương pháp thủy phân trong nước

(phương pháp 2, điều kiện phản ứng c) sử dụng H2O đơn giản, kinh tế và không độc

hại môi trường được sử dụng để tổng hợp chất trung gian benzofuranone 5b.

Phản ứng ngưng tụ của phloroglucinol với chloroacetonitrile là phản ứng acyl

hóa Fridel-Crafts các hợp chất phenol nói chung với các hợp chất nitrile, được phát

hiện ra một cách độc lập bởi 2 nhà khoa học Hoesch (1927) và Houben (1926). Vì

vậy, nó còn được gọi là phản ứng Hoesch hay phản ứng Houben - Hoesch. Phản

ứng được thực hiện giữa hợp chất phenol hay dẫn xuất của nó với nitrile và HCl

trong sự có mặt của xúc tác axit Lewis trong ether khan. Cơ chế phản ứng xảy ra

như Hình 4.19

Hình 4.19. Sơ đồ cơ chế hình thành muối 3

Xúc tác Lewis ZnCl2 hoạt hóa tác nhân nitrile hình thành carbocation ái

electrophile, tạo điều kiện thuận lợi cho các electrone thơm của nhân phenol tấn

công hình thành hợp chất imine đồng thời giải phóng ZnCl2. Trong môi trường acid

hợp chất imine tạo muối iminium kết tủa.

* Hợp chất 2-(2-chloro-1-iminoethyl)-1,3,5-benzenetriol hydrochloride (3)

Cấu trúc phân tử của hợp chất muối imine này đã được khẳng định bởi phổ

cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C-NMR (phục lục 1). Trên phổ 1H-NMR ta thấy xuất

hiện các tín hiệu singlet của nhóm methylene (CH2) ở δH 5,44. Ở vùng trường thơm

xuất hiện 2 doublet của 2 proton tương tác meta với J = 1,5 Hz ở δH 6,33 và δH 6,08.

13C-NMR của hợp chất này cũng cho 8 tín hiệu của 8 carbon phù hợp với số carbon

Ở trường thấp hơn là 3 tín hiệu singlet của 3 nhóm OH ở δH 12,06, 11,02, 9,86. Phổ

100

và cấu trúc phân tử gồm tín hiệu carbon của nhóm methylene ở δC 75,35; 3 tín hiệu

của 3 carbon hệ thơm ở δC 99,41 (Ph C-1), δC 97,13 và 90,14 (Ph C-3, 5); Ở trường

thấp hơn là 3 tín hiệu carbon thơm liên kết với oxy (Ph C-2, 4, 6) và 1 tín hiệu của

C=NH+ ở δC 175,9 , 173,63 , 173,00 và 160,56.

Phản ứng thủy phân muối (3) đóng vòng bezofuranone xảy ra theo cơ chế sau:

Hình 4.20. Sơ đồ phản ứng thủy phân muối 3 và đóng vòng benzofuranone

Trong phân tử muối 3, carbon imine dương điện (C=NH+) thuận lợi cho cặp

điện tử tự do của oxy trong phân tử nước tấn công, sau đó tách loại phân tử NH4Cl

hình thành nhóm ketone cung cấp dẫn xuất chloroacetophenone. Nhóm methylene

trong hợp chất này liên kết trực tiếp với nguyên tử Cl và với nhóm carbonyl nên rất

dương điện, thuận lợi cho việc đóng vòng với nguyên tử oxy của nhóm ortho-OH

do có cặp điện tử tự do hình thành lactone vòng 5 bền vững cung cấp sản phẩm 4,6–

dihydroxybenzofuran–3(2H)–one (5b).

Theo phương pháp 2, sự có mặt của acid HCl trong hỗn hợp phản ứng làm

tăng tốc độ phản ứng thủy phân và sự có mặt của nhóm methylate CH3Oˉ

(MeONa/MeOH) làm cho OH-phenol ở dạng phenolate Ph-Oˉ có tính nucleophile

mạnh nên rất thuận lợi phản ứng đóng vòng. Vì vậy mà phản ứng đóng vòng

benzofuranone trong môi trường kiềm (MeONa) chỉ đun hồi lưu trong 2 giờ trong

khi phương pháp thủy phân và đóng vòng được tiến hành trong H2O đun hồi lưu

kéo dài 7 giờ.

* 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b)

Cấu trúc phân tử của hợp chất 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b) đã

được xác định bởi phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C-NMR. Trên phổ 1H-NMR

(Hình 4.21) thấy xuất hiện các tín hiệu singlet của 2 proton nhóm methylen (CH2) ở

101

δH 4,55 và singlet của 2 proton thơm ở δH 5,91. Ở trường thấp hơn là singlet tù của

2 proton OH ở δH 10,67.

Hình 4.21. Phổ 1H-NMR của chất 5b (DMSO- d6)

Hình 4.22. Phổ 13C-NMR của chất 5b (DMSO- d6)

102

Phổ 13C-NMR (Hình 4.22) của hợp chất này cũng cho 8 tín hiệu của 8 carbon

phù hợp với số carbon và cấu trúc phân tử, gồm tín hiệu carbon của nhóm

methylene ở δC 74,8, 2 tín hiệu của 2 carbon methine thơm ở δC 90,1 (C-7), 96,2 (C-

5) và một tín hiệu của carbon thơm bậc 4 ở δC 102,7 (C-9). Ở vùng trường thấp hơn

là 3 tín hiệu của carbon thơm liên kết với oxy ở δC 157,5 (C-4), 167,7 (C-6), 175,6

(C-8) trong đó tín hiệu của C-8 và C-6 dịch chuyển xuống trường thấp hơn do ảnh

hưởng sức căng của vòng 5 furanone. Tín hiệu của nhóm keton 3-C=O ở δC 194,0.

Qua phân tích các dữ liệu phổ cho thấy chất 5b là 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-

one.

 Phản ứng methyl hóa tổng hợp methoxybenzofuranone (18)

Hợp chất dihydroxybenzofuranone 5b đã được methyl hóa bằng methyl iodide

trong DMF với xúc tác K2CO3 thu được methoxybenzofuranone (18) ở hiệu suất

77%.

* 4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (18).

Sự xuất hiện thêm các tín hiệu của 2 nhóm methoxy trên phổ NMR cho thấy

dihydroxybenzofuranone 5b đã được methyl hóa. Trên phổ 1H- NMR (Hình 4.23)

xuất hiện 2 singlet ở δH 3,82 và 3,85 (6H, 2 × s) của 2 nhóm OCH3 gắn vào C-6 và

C-4. Ở trường thấp hơn là singlet của proton methylene vòng furanone ở δH 4,64. Ở

vùng trường thơm có 2 tín hiệu doublet của hai proton thơm meta H-5 và H-6 ở δH

6,16 và δH 6,35 với Jmeta = 1,5 Hz. Phổ 13C-NMR (phụ lục 3) cho 10 tín hiệu carbon

phù hợp với số carbon của phân tử. Tín hiệu của 2 carbon methyl liên kết với oxy

(OCH3) ở δC 55,9 và δC 56,2, tiếp theo là tín hiệu của carbon methylene ở δC 75,3

(C-2). Ở vùng trường thơm là tín hiệu của 6 carbon thơm gồm 3 carbon thơm liên

kết với oxy ở δC 176,3 (C-8), 169,2 (C-6), 158,2 (C-4), 2 carbon methine ở δC 91,9

(C-5), 89,4 (C-7) và 1 carbon thơm bậc 4 ở δC 104,1 (C-9). Tín hiệu của nhóm

103

keton 3-C=O ở δC 194,0. Qua phân tích các dữ liệu phổ cho thấy chất 18 là 4,6-

dimethoxybenzofuran-3(2H)-one.

Hình 4.23. Phổ 1H-NMR của chất 18 (DMSO- d6)

 Phản ứng ngưng tụ benzofuranone với các benzaldehyde

Phản ứng ngưng tụ của các hợp chất benzofuran-3-one với các dẫn xuất

benzaldehyde có thể được tiến hành trong môi trường acid hoặc base. Cơ chế của

phản ứng ngưng tụ phụ thuộc vào sự có mặt của xúc tác acid hay base.

Trong môi trường base cơ chế của phản ứng ngưng tụ xảy ra qua các bước sau

(Hình 4.24):

1, Đề proton hóa nguyên tử hydrogene hoạt động bên cạnh nhóm keton để

hình thành một enolate cộng hưởng bền.

2, Enolate hình thành đóng vai trò tác nhân nucleophile tấn công vào carbon

dương điện trong nhóm aldehyde tạo thành hợp chất ngưng tụ trung gian.

3, Dưới tác dụng của base hợp chất trung gian này loại đi một phân tử nước

cung cấp aurone tương ứng.

104

Trong môi trường acid các nhóm carbonyl C=O của cả benzofuranone và hợp

chất benzaldehyde đều được hoạt hóa. Hợp chất benzofuranone được hoạt hóa hình

thành cấu trúc enol. Giống như enolate trong môi trường kiềm, enol đóng vai trò

của 1 tác nhân nucleophile tấn công vào carbon dương điện trong nhóm CHO đã

được hoạt hóa hình thành nên hợp chất ngưng tụ trung gian. Trong môi trường acid

hợp chất ngưng tụ trung gian cũng loại đi một phân tử nước hình thành nên sản

phẩm ngưng tụ aurone tương ứng (Hình 4.25)

Cơ chế phản ứng ngưng tụ trong môi trường kiềm:

Hình 4.24. Cơ chế phản ứng ngưng tụ tạo aurone với xúc tác base

Cơ chế phản ứng ngưng tụ trong môi trường acid

Hình 4.25. Cơ chế phản ứng ngưng tụ tạo aurone với xúc tác acid

105

 Sự ngưng tụ trực tiếp của hydroxybenzofuranone 5b với các

hydroxybenzaldehyde

Thông thường, để thu được các hydroxyaurone, các nhóm hydroxy của các tác

nhân được bảo vệ trước khi tiến hành phản ứng ngưng tụ sau đó loại nhóm bảo vệ

mới thu được hydroxyaurone. Chúng tôi đã nghiên cứu và công bố phương pháp

đơn giản thuận tiện dễ dàng ngưng tụ trực tiếp giữa hydroxybenzofuranone 5b với

các hydroxybenzaldehyde sử dụng xúc tác HCl trong dung môi MeOH ở nhiệt độ

phòng thu được các hydroxyaurone 56, 117 với hiệu suất cao 52% với chất 56 và

65% với chất 117 [145].

Cấu trúc của aurone tổng hợp đã được khẳng định bởi phân tích các phổ FT-

IR, ESI-MS và NMR, phù hợp với các tài liệu đã công bố. Trong các công bố trước

đây [12, 109, 110] đã chứng minh các sản phẩm ngưng tụ hay đóng vòng chalcone

là các đồng phân (Z)-aurone vì ổn định hơn đồng phân (E)- tương ứng. Hai đồng

phân này có thể phân biệt bởi sự khác biệt về độ chuyển dịch hóa học của các

proton olefine trong phổ 1H-NMR ở δH 6,70 ppm cho đồng phân (Z)- và ở δH 7,00

ppm cho đồng phân (E)-. Độ chuyển dịch proton olefine của các aurone tổng hợp

được (56, 117, 55, 90) ở trong khoảng 6,44- 6,72 ppm. Đồng thời phổ hồng ngoại

FT-IR của các (Z)-aurone cũng cho những dải hấp thụ mạnh ở khoảng 1600 cm-1

trong khi những dải hấp thụ này yếu hoặc biến mất đối với (E)-aurone. Như vậy,

các aurone tổng hợp ở dạng đồng phân (Z)-.

* (Z)-2-[(3,4-hydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-

one (56)

106

Các số liệu phổ của hợp chất 56 phù hợp với cấu trúc phân tử và số liệu phổ

của nó đã được công bố trong tài liệu [97]. Phổ NMR cho cấu trúc phân tử khung

aurone với 3 vòng A, B và C. Trên phổ 1H-NMR của chất 56 (Hình 4.26) ở vùng

trường thơm cho 5 tín hiệu của 5 proton methine thơm thuộc 2 vòng thơm A và B

gồm 3 tín hiệu proton thơm hệ ABX của vòng B ở δH 7,38 (d, J = 2,0 Hz, H-2′),

7,17 (dd, J = 2,0 và 8,5 Hz, H-6′), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, H-5′) và 2 cặp doublet của 2

proton thơm meta ở δH 6,17 (H-7), 6,06 (H-5) với hằng số tương tác Jmeta = 1,5 Hz,

ngoài ra còn một singlet của proton methine olefine H-10 ở δH 6,44 cho thấy chất 56

là Z-aurone.

Hình 4.26. Phổ 1H-NMR của chất 56 (DMSO- d6)

Phổ 13C-NMR (Hình 4.27) cho 15 tín hiệu của 15 carbon phù hợp với cấu trúc

khung aurone với 12 carbon thơm của 2 vòng thơm A, B, 2 carbon vòng C và 1

carbon olefine C-10. Hai vòng thơm A, B cho 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết

với oxy ở δC 167,5 (C-8), 166,9 (C-6), 158,1 (C-4), 147,4 (C-4′) và 145,4 (C-3′); 5

tín hiệu của carbon methine thơm ở δC 123,7 (C-6′), 117,6 (C-2′), 115,6 (C-5′), 97,6

(C-5) và δC 90,3 (C-7). Trong vùng trường thơm còn 1 tín hiệu của carbon olefine

107

liên kết với oxy ở δC 145,9 (C-2) của vòng C và 1 tín hiệu của carbon olefine ở δC

109,6 (C-10); hai carbon thơm bậc 4 ở δC 123,9 (C-1′) và δC 102,9 (C-9). Ngoài ra

vòng C còn cho 1 tín hiệu ở vùng trường thấp của carbon carbonyl ở 179,0 (3-C=

O) và 1 carbon olefine bậc 4 liên kết với oxy ở δC 145,9 (C-2). Kết hợp phổ HSQC

(phụ lục 5) cho các tương tác C-H trực tiếp và phổ HMBC (phụ lục 5) cho các

tương tác xa của proton methine olefine H-10 (6,44 ppm)/C-2 (145,9 ppm)/C-

1′(123,9 ppm)/C-6′ (123,7 ppm)/C-2′ (117,6 ppm)/C-3 (179,0 ppm), cùng với độ

chuyển dịch thấp bất thường của carbon C-8 (167,5 ppm) và C-6 (166,9 ppm) do

ảnh hưởng sức căng vòng 5 (vòng C), đã chứng minh cấu trúc khung aurone của

chất 56. Phổ khối ESI-MS (phụ lục 5) cũng cho tín hiệu của pic ion âm giả phân tử

m/z= 285 [M-H]ˉ phù hợp với khối lượng của phân tử.

Hình 4.27. Phổ 13C-NMR của chất 56 (DMSO- d6)

* (Z)-2-[(4-hydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-

one (117)

108

Các số liệu phổ của hợp chất 117 phù hợp với cấu trúc phân. Cũng tương tự

như chất 56, phổ NMR của chất 117 cho cấu trúc phân tử là khung aurone với 3

vòng A, B và C. Trên phổ 1H-NMR (phụ lục 15) ở vùng trường thơm cho 6 tín hiệu

của 6 proton methine thơm thuộc 2 vòng thơm A và B gồm 2 cặp doublet ở δH 7,74

(H-2′, 6′) và ở δH 6,86 (H-3′, 5′) với hằng số tương tác Jortho = 8,5 Hz và 2 cặp

doublet ở δH 6,20 (H-7) và ở δH 6,06 (H-5) với hằng số tương tác Jmeta = 2,0 Hz;

ngoài ra còn một singlet của proton methine olefine H-10 ở δH 6,54 cũng khẳng

định chất 117 là Z-aurone. Phổ 13C-NMR (Hình 4.28) cho 15 tín hiệu của 15 carbon

phù hợp với cấu trúc khung aurone với 12 carbon thơm của 2 vòng thơm A, B, 2

carbon vòng C và 1 carbon olefine C-10. Hai vòng thơm A, B cho 4 tín hiệu của 4

carbon thơm liên kết với oxy ở δC 167,6 (C-8), 167,2 (C-6), 158,8 (C-4), 158,3 (C-

4′); 6 tín hiệu của carbon methine thơm ở δC 132,8(C-2′, 6′), 116,0 (C-3′, 5′), 97,7

(C-5) và δC 90,5 (C-7); 2 carbon thơm bậc 4 ở δC 123,4 (C-1′) và δC 102,9 (C-9).

Trong vùng trường thơm còn 1 tín hiệu của carbon olefine liên kết với oxy ở δC

146,1 (C-2) của vòng C và 1 tín hiệu của carbon methine olefine ở δC 109,2 (C-10).

Ngoài ra vòng C còn cho 1 tín hiệu của carbon carbonyl ở 179,0 (3-C= O). Phổ khối

ESI-MS (phụ lục 15) cũng cho tín hiệu của pic ion giả phân tử m/z = 270 [M]ˉ phù

hợp với khối lượng của phân tử.

Hình 4.28. Phổ 13C-NMR của chất 117 (DMSO- d6)

109

 Sự ngưng tụ của methoxybenzofuranone 18 với các methoxybenzaldehyde

Phản ứng ngưng tụ của methoxybenzofuranone với các methoxybenzaldehyde

đã được tiến hành trong cả 2 điều kiện sử dụng xúc tác acid hoặc xúc tác base cho

hiệu suất cao 89-91% với chất 55 và 90-93% với chất 90.

* (Z)-2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methylene]-4,6-dimethoxybenzofuran-

3(2H)-one (55)

Các số liệu phổ của hợp chất 55 phù hợp với cấu trúc phân tử và số liệu phổ

của nó đã được công bố trong các tài liệu [97]. Tương tự như các hợp chất 56, phổ

NMR của chất 55 cho cấu trúc phân tử khung aurone với 3 vòng A, B và C. Trên

phổ 1H-NMR (Hình 4.29) của chất 56, ở vùng trường thơm cho 5 tín hiệu của 5

proton methine thơm thuộc 2 vòng thơm A và B gồm 3 tín hiệu proton thơm hệ

ABX của vòng B ở δH 7,54 (d, J = 1,5 Hz, H-2′), 7,51 (dd, J = 1,5, 8,5 Hz, H-6′),

7,05 (d, J = 8,5 Hz, H-5′) và 2 cặp doublet của proton thơm meta ở δH 6,68 (H-7),

6,31 (H-5) với hằng số tương tác Jmeta = 1,5 Hz, ngoài ra còn một singlet của proton

methine olefine H-10 ở δH 6,67 cũng cho thấy chất 55 là Z-aurone. Khác với chất

56, ở vùng trường cao còn xuất hiện 4 tín hiệu singlet của 12 proton của 4 nhóm

OCH3 ở δH 3,91, δH 3,88, δH 3,83 và δH 3,82. Phổ 13C-NMR (phụ lục 4) cho 15 tín

hiệu của 15 carbon phù hợp với cấu trúc khung aurone với 12 carbon thơm của 2

vòng thơm A, B, 2 carbon vòng C và 1 carbon olefine C-10. Hai vòng thơm A, B

cho 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với oxy ở δC 168,7 (C-8), 169,0 (C-6),

158,8 (C-4), 150,2 và 148,7 (C-4′, 3′); 5 tín hiệu của carbon methine thơm ở δC

110

124,8 (C-6′), 114,0 (C-2′), 111,9 (C-5′), 94,3 (C-5) và 89,8 (C-7); Hai carbon thơm

bậc 4 ở 124,9 (C-1′) và 104,2 (C-9). Trong vùng trường thơm còn 1 tín hiệu của

carbon olefine liên kết oxy ở δC 146,1 (C-2) của vòng C và 1 tín hiệu của carbon

methine olefine ở δC 110,2 (C-10). Ngoài ra vòng C còn cho 1 tín hiệu ở vùng

trường thấp của carbon carbonyl ở δC 178,8,0 (3-C= O). Phổ ESI-MS (phụ lục 4)

cũng cho tín hiệu của pic ion dương giả phân tử m/z= 343[M+H]+ phù hợp với khối

lượng của phân tử.

Hình 4.29. Phổ 1H-NMR của chất 55 (DMSO- d6) * Z-2-[(4-methoxyphenyl)methyl]-4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (90)

Các số liệu phổ của hợp chất 90 phù hợp với cấu trúc phân tử và số liệu phổ

của nó đã được công bố trong các tài liệu [136]. Cũng tương tự như chất 117, phổ

NMR của chất 90 cho cấu trúc phân tử là khung aurone với 3 vòng A, B và C. Trên

phổ 1H-NMR (Hình 4.30) ở vùng trường thơm cho 6 tín hiệu của 6 proton methine

111

thơm thuộc 2 vòng thơm A và B gồm 2 cặp doublet ở δH 7,80 (H-2′, 6′) và ở δH 6,93

(H-3′, 5′) với hằng số tương tác Jortho = 9,0 Hz và 2 cặp doublet ở δH 6,34 (H-7) và ở

δH 6,08 (H-5) với hằng số tương tác Jmeta = 1,5 Hz; ngoài ra còn một singlet của

proton methine olefine H-10 ở δH 6,72 đã cho thấy chất 90 có cấu hình Z-. Khác với

chất 117, ở vùng trường cao còn xuất hiện 3 tín hiệu singlet của 9 proton của 3

nhóm OCH3 ở δH 3,93, δH 3,88, δH 3,84. Phổ 13C-NMR (phụ lục 8) cho 15 tín hiệu

của 15 carbon phù hợp với cấu trúc khung aurone với 12 carbon thơm của 2 vòng

thơm A, B, 2 carbon vòng C và 1 carbon methine olefine C-10. Hai vòng thơm A, B

cho 4 tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với oxy ở δC 168,73 (C-8), 168,6 (C-6),

160,5 (C-4′), 159,3 (C-4); 6 tín hiệu của carbon methine thơm ở δC 132,8(C-2′, 6′),

114,3 (C-3′, 5′), 93,9 (C-5) và δC 89,1 (C-7); 2 carbon thơm bậc 4 ở δC 125,3 (C-1′)

và δC 105,4 (C-9). Trong vùng trường thơm còn 1 tín hiệu của carbon olefine liên

kết với oxy ở δC 146,7 (C-2) của vòng C và 1 tín hiệu của carbon methine olefine ở

δC 110,9 (C-10). Ngoài ra vòng C còn cho 1 tín hiệu của carbon carbonyl ở δC 180,5

(3-C=O). Qua phân tích các dữ liệu phổ cho thấy chất 90 là Z-2-[(4-

methoxyphenyl)methyl]-4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one.

Hình 4.30. Phổ 1H-NMR của chất 90 (CDCl3)

112

4.1.3.2. Nghiên cứu tổng hợp các auronol từ aurone

 Phản ứng khử hóa các aurone thành dihydroaurone

Các aurone 56, 117, 55, 90 được khử hóa bằng khí H2 với xúc tác Pd/C trong

MeOH ở nhiệt độ phòng cho các dihydroaurrone 118, 119, 120, 91 tương ứng với

hiệu suất cao. Cấu trúc của các dihydroaurone đã được khẳng định bằng các phương

pháp phổ. Các tín hiệu trên phổ của các dihydroaurone có sự thay đổi so với aurone

tương ứng. Do mất nối đôi trong phân tử nên trên phổ NMR của các dihydroaurone

xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm methylene CH2-10 và CH-2 ở vùng trường cao.

Các methoxydihydroaurone 120 và 91 bên cạnh việc ngưng tụ các

methoxybenzofuranone với các methoxy benzaldehyde còn có thể thu được từ phản

ứng methyl hóa các dihydrohydroxyaurone 118 và 119 với MeI với xúc tác K2CO3

* 2-[(3,4-Dihydroxyphenyl)methyl]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one

(118)

Các số liệu phổ của hợp chất 118 phù hợp với cấu trúc phân tử và số liệu phổ

của nó đã được công bố trong các tài liệu [97]. Phổ NMR cho cấu trúc phân tử

khung aurone với 3 vòng A, B và C. Trên phổ 1H-NMR (Hình 4.31) của chất 118, ở

vùng trường thơm cho 5 tín hiệu của 5 proton methine thơm thuộc 2 vòng thơm A

và B gồm 3 tín hiệu proton thơm hệ ABX ở δH 6,63 (d, J = 1,5 Hz, H-2′), 6,60 (d, J

= 8,0 Hz, H-5′), 6,48 (dd, J = 1,9 , 8,0 Hz, H-6′) và 2 cặp doublet của 2 proton

113

thơm meta ở δH 5,84 (H-7), δH 5,86 (H-5) với hằng số tương tác Jmeta = 1,6 Hz, Ở

vùng trường cao xuất hiện thêm các tín hiệu của proton methine liên kết với oxy H-

2 ở δH 4,69 (dd, J = 3,5 và 8,2 Hz) và tín hiệu 2 proton methylene của nhóm CH2-10

13C-NMR (phụ lục 16) cho 15 tín hiệu của 15 carbon phù hợp với cấu trúc khung

ở δH 2,98 (dd, 3,5, 14,8 Hz, Ha-10) và ở 2,65 (dd, J = 8,2, 14,8 Hz, Hb-10). Phổ

aurone với 12 carbon thơm của 2 vòng thơm A, B; 2 carbon vòng C và 1 carbon

methylene. Hai vòng thơm A, B cho 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với oxy ở

δC 174,2 (C-8), 167,7 (C-6), 157,6 (C-4), 144,8 (C-4′) và 143,8 (C-3′); 5 tín hiệu

của carbon methine thơm ở δC 120,0 (C-6′), 1116,8 (C-2′), 115,3 (C-5′), 96,1 (C-5)

và δC 89,9 (C-7); 2 carbon thơm bậc 4 ở δC 127,3 (C-1′) và δC 102,4 (C-9). Vòng C

cho tín hiệu của carbon methine của C-2 ở δC 85,7 và tín hiệu ở vùng trường thấp

của carbon carbonyl ở δC 194,68 (3-C= O). Ở trường cao là tín hiệu của carbon

methylene ở δC 36,2 (C-10). Như vậy tín hiệu của C-2 và C-10 đều chuyển lên

trường cao hơn. Độ chuyển dịch thấp bất thường của carbon C-8 (174,2 ppm) cho

thấy ảnh hưởng sức căng vòng 5 (vòng C), đã chứng minh cấu trúc khung aurone

của chất 118. Phổ khối ESI-MS (phụ lục 16) cũng cho tín hiệu của pic ion dương

giả phân tử m/z = 315[M+H]+ (chất 118) phù hợp với số khối phân tử.

Hình 4.31. Phổ 1H-NMR giãn của chất 118 (DMSO- d6)

114

* 2-[(4-Hydroxyphenyl)methyl]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (119)

Cũng tương tự như chất 117, phổ NMR của chất 119 cho cấu trúc phân tử là

khung aurone với 3 vòng A, B và C. Trên phổ 1H-NMR (phụ lục 17) ở vùng trường

thơm cho 6 tín hiệu của 6 proton methine thơm thuộc 2 vòng thơm A và B gồm 2

cặp doublet của 4 protom hệ AA′XX′ của vòng B ở δH 7,02 (H-2′, 6′) và ở δH 6,65

(H-3′, 5′) với hằng số tương tác Jortho = 8,5 Hz và 2 cặp doublet của 2 proton thơm

meta vòng A ở δH 5,86 (H-7) và ở δH 5,85 (H-5) với hằng số tương tác Jmeta = 2,0

Hz. Ở trường cao là tín hiệu dd của proton methine liên kết với oxy H-2 ở δH 4,73 (J

= 3,5 , 8,0 Hz) và tín hiệu proton methylene ở δH 3,05 (dd, J = 3,5 , 14,5 Hz, Ha-10)

ở δH 2,74 (dd, J = 8,0 , 14,5 Hz, Hb-10).

Hình 4.32. Phổ 13C-NMR của chất 119 (DMSO- d6)

Phổ 13C-NMR (Hình 4.32) cho 15 tín hiệu của 15 carbon phù hợp với cấu trúc

khung aurone với 12 carbon thơm của 2 vòng thơm A, B; 2 carbon vòng C và 1

carbon methylene (C-10). Hai vòng thơm A, B cho 4 tín hiệu của 4 carbon thơm

115

liên kết với oxy ở δC 174,2 (C-8), 167,7 (C-6), 157,5 (C-4′), 155,9 (C-4); 6 tín hiệu

của carbon methine thơm ở δC 130,3 (C-2′, 6′), 115,1 và 115,0 (C-3′, 5′), 96,2 (C-5)

và δC 89,9 (C-7); 2 carbon thơm bậc 4 ở δC 126,5 (C-1′) và δC 102,5 (C-9). Vòng C

cho tín hiệu của carbon methine của C-2 ở δC 85,7 và tín hiệu ở vùng trường thấp

của carbon carbonyl ở δC 194,68 (3-C= O). Ở trường cao là tín hiệu của carbon

methylene ở δC 36,2 (C-10). Như vậy tín hiệu của C-2 và C-10 đều chuyển lên

trường cao hơn. Độ chuyển dịch thấp bất thường của carbon C-8 (174,2 ppm) cho

thấy ảnh hưởng sức căng vòng 5 (vòng C). Phổ khối ESI-MS cũng cho tín hiệu của

pic ion âm giả phân tử m/z= 272[M]ˉ phù hợp với khối lượng của phân tử.

* 2-[(3,4-Dihydromethoxyphenyl)methyl]-4,6-dihydromethoxybenzo

furan-3(2H)-one (120)

Tương tự chất 118, phổ NMR của chất 120 cũng cho cấu trúc phân tử khung

aurone với 3 vòng A, B và C với sự suất hiện thêm các tín hiệu của 4 nhóm OMe ở

vùng trường cao. Trên phổ 1H-NMR của chất 120 (phụ lục 18) ở vùng trường thơm

cho 5 tín hiệu của 5 proton methine thơm thuộc 2 vòng thơm A và B gồm 3 tín hiệu

proton thơm hệ ABX ở δH 6,87 (brs, H-2′), 6,82 (d, J = 8,5 Hz, H-5′), 6,75 (d, J =

8,5 Hz, H-6′) và 2 tín hiệu proton thơm meta ở δH 6,31 (brs, H-7), 5,12 (brs, H-5). Ở

vùng trường cao xuất hiện thêm các tín hiệu của proton methine liên kết với oxy H-

2 ở δH 4,91 (dd, J = 3,5 , 8,5 Hz) và tín hiệu 2 proton methylene ở δH 3,13 (dd, 3,5 ,

14,5 Hz, Ha-10), ở δH 2,81 (dd, J = 8,0, 14,5 Hz, Hb-10). Phổ 13C-NMR (Hình 4.33)

cho 15 tín hiệu của 15 carbon phù hợp với cấu trúc khung aurone với 12 carbon

thơm của 2 vòng thơm A, B; 2 carbon vòng C và 1 carbon methylene. Hai vòng

thơm A, B cho 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với oxy ở δC 174,9 (C-8), 169,4

(C-6), 158,4 (C-4), 148,4(C-4′) và 147,5 (C-3′); 5 tín hiệu của carbon methine thơm

ở δC 121,4 (C-6′), 113,0 (C-2′), 111,7 (C-5′), 92,8 (C-5) và δC 89,2 (C-7); 2 carbon

thơm bậc 4 ở δC 128,7 (C-1′) và 103,9 (C-9). Vòng C cho tín hiệu carbon methine

116

liên kết với oxy của C-2 ở δC 85,9 và tín hiệu ở vùng trường thấp của carbon

carbonyl ở δC 194,8 (3-C= O). Ở trường cao là 4 tín hiệu của 4 nhóm OMe ở δC 56,2

, 55,8 , 55,5 , 55,4 và 1 carbon methylene ở δC 36,3 (C-10). Như vậy tín hiệu của C-

2 và C-10 đều chuyển lên trường cao hơn. Độ chuyển dịch thấp bất thường của

carbon C-8 (174,2 ppm) cho thấy ảnh hưởng sức căng vòng 5 (vòng C). Như vậy,

chất 120 là 2-[(3,4-Dihydromethoxyphenyl)methyl]-4,6-dihydromethoxybenzo

furan-3(2H)-one

Hình 4.33. Phổ 13C-NMR của chất 120 (DMSO- d6)

* 2-[(4-Hydromethoxyphenyl)methyl]-4,6-dihydromethoxybenzofuran-

3(2H)-one (91)

Cũng tương tự như chất 119, phổ NMR của chất 91 cho cấu trúc phân tử là

khung aurone với 3 vòng A, B và C và xuất hiện thêm 3 tín hiệu mới của 3 nhóm

OMe ở trường cao. Trên phổ 1H-NMR (phụ lục 9) ở vùng trường thơm cho 6 tín

hiệu của 6 proton methine thơm thuộc 2 vòng thơm A và B gồm 2 cặp doublet của 4

117

proton thơm hệ AA′XX′ ở δH 7,22 (H-2′, 6′) và ở δH 6,81 (H-3′, 5′) với hằng số

tương tác Jortho = 8,5 Hz và 2 cặp doublet của 2 proton thơm meta vòng A ở δH 6,12

(H-7) và ở δH 5,96 (H-5) với hằng số tương tác Jmeta = 1,5 Hz. Ở trường cao là tín

hiệu dd của proton methine liên kết với oxy H-2 ở δH 4,71 (J = 3,5, 8,5 Hz) và tín

hiệu 2 proton methylene ở δH 3,28 (dd, J = 3,5 , 15,0 Hz, Ha-10), ở δH 2,90 (dd, J =

8,5 , 15,0 Hz, Hb-10).

Hình 4.34. Phổ 13C-NMR của chất 91 (CDCl3)

Phổ 13C-NMR (Hình 4.34) cho 15 tín hiệu của 15 carbon phù hợp với cấu trúc

khung aurone với 12 carbon thơm của 2 vòng thơm A, B, 2 carbon vòng C và 1

carbon methylene. Hai vòng thơm A, B cho 4 tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết

với oxy ở δC 175,7 (C-8), 169,9 (C-6), 159,0 (C-4′), 158,5 (C-4); 6 tín hiệu của

carbon methine thơm ở δC 130,4 (C-2′, 6′), 113,8 (C-3′, 5′), 92,98 (C-5) và δC 88,9

(C-7); 2 tín hiệu của 2 carbon thơm bậc 4 ở δC 128,4 (C-1′) và δC 104,7 (C-9). Vòng

C cho tín hiệu của carbon methine của C-2 ở δC 87,0 và tín hiệu ở vùng trường thấp

của carbon carbonyl ở δC 196,1 (3-C=O). Ở trường cao là 3 tín hiệu của 3 nhóm

OMe ở δC 56,0, 55,9, 55,2 và 1 carbon methylene ở δC 36,8 (C-10). Như vậy tín

hiệu của C-2 và C-10 đều chuyển lên trường cao hơn. Độ chuyển dịch thấp bất

118

thường của carbon C-8 (175,7 ppm) cho thấy ảnh hưởng sức căng vòng 5 (vòng C).

Qua phân tích các dữ liệu phổ cho thấy chất 91 là 2-[(4-

Hydromethoxyphenyl)methyl]-4,6-dihydromethoxybenzofuran-3(2H)-one.

 Tổng hợp các auronol từ dihydroaurone

Phản ứng chuyển hóa aurone trực tiếp về auronol đã được quan tâm nghiên

cứu nhiều nhưng không thành công do khả năng dễ dehydrate auronol trở lại aurone

dưới điều kiện acid. Vì vậy, để hydrate hóa các aurone phải đi theo con đường

vòng qua 2 bước chính: Bước 1 từ dihydroaurone hình thành silyl enol ether, sử

dụng base LDA trong THF; Bước 2 tiến hành oxy hóa silyl enol ether theo

Rubottom sử dụng m-chloroperbenzoic acid (m-CPBA) trong CH2Cl2 ở 0°C sau đó

tách loại nhóm TMS bởi tetrabutylamonium fluoride (TBAF) thu được auronol. Các

bước phản ứng được trình bày trong sơ đồ Hình 4.35.

Hình 4.35. Sơ đồ tổng hợp auronol từ dihydroaurone

Phản ứng hình thành silyl enol ether xảy ra theo cơ chế sau:

Hình 4.36. Sơ đồ cơ chế hình thành chất 121 và 92

119

Dưới tác dụng của base LiN[CH(CH3)2] (LDA) nguyên tử hydrogen linh động

bên cạnh nhóm ketone sẽ bị đề proton hình thành một enolate cộng hưởng bền.

Enolate này đóng vai trò tác nhân nucleophile thuận lợi cho (CH3)3SiCl (TMSCl)

tấn công hình thành trimethylsilyl enol ether (chất 121 và 92).

Các trimethylsilyl enol ether được tổng hợp sử dụng LDA trong THF ở nhiệt

độ thấp -70°C dùng bẫy TMSCl thu được sản phẩm (chất 121 và 92). Các sản phẩm

này dễ chuyển về ketone vì vậy sau khi chiết ra từ hỗn hợp phản ứng được đem sử

dụng ngay cho bước oxi hóa tiếp theo mà không cần tinh chế.

* 2-(3′,4′-dimethoxybenzyl)-4,6-dimethoxybenzofuran-3-yl)oxy) trimethyl

silane (121)

Phổ NMR của chất 121 cho cấu trúc phân tử khung aurone gồm 3 vòng A, B

và C với nhiều thay đổi về độ chuyển dịch các tín hiệu so với phổ NMR của chất

120. Sự thay đổi độ chuyển dịch của các tín hiệu do sự hình thành enolate ở vòng C.

Hình 4.37. Phổ 1H-NMR của chất 121 (CDCl3)

120

Hình 4.38. Phổ DEPT của chất 121 (CDCl3)

Trên phổ NMR tín hiệu của C-3 chuyển lên trường cao hơn còn tín hiệu của

C-2 chuyển xuống trường thấp hơn. Trên phổ 1H-NMR của chất 121 (Hình 4.37) ở

vùng trường thơm cho 5 tín hiệu của 5 proton methine thơm thuộc 2 vòng thơm A

và B gồm 3 tín hiệu proton thơm hệ ABX vòng B là các tín hiệu bị chồng chập ở δH

6,78 và 6,77 (H-2′, 5′, 6′) và 2 proton thơm meta vòng A ở δH 6,47 và δH 6,25 (2 ×

d, J = 1,5 Hz, H-5, 7), Ở vùng trường cao xuất hiện các tín hiệu của proton

methylene nhóm CH2-10 ở δH 3,95 (s) và 4 singlet tín hiệu của 4 nhóm OCH3 ở δH

3,86, 3,84, 3,83 và 3,78. Tín hiệu của 3 nhóm methyl liên kết với silane [-Si(CH3)3]

ở δH 0,25. Phổ 13C-NMR (phụ lục 19) kết hợp với phổ DEPT (Hình 4.38) cho 15 tín

hiệu của 15 carbon phù hợp với cấu trúc khung aurone với 12 carbon thơm của 2

vòng thơm A, B; 2 carbon vòng C và 1 carbon methylene. Hai vòng thơm A, B cho

5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với oxy ở δC 158,5 (C-6), 153,2 ( C-8), 148,9

(C-4′), 147,6 (C-3′), 140,4 (C-4); 5 tín hiệu của carbon methine thơm ở δC 120,4 (C-

6′), 111,7 (C-2′), 111,2 (C-5′), 93,77 (C-5) và 88,52 (C-7); 2 carbon thơm bậc 4 ở

130,9 (C-1′) và 108,1 (C-9). Vòng C cho tín hiệu của 2 carbon olefine liên kết với

oxy ở δC 154,2 (C-3) và ở δC 133,3 (C-2). Ở trường cao là 4 tín hiệu của 4 nhóm

121

OMe ở δC 55,9 , 55,8 , 55,6 , 55,1, 1 carbon methylene ở δC 30,7 (C-10) và 3 carbon

methyl liên kết với silane [Si(CH3)3] ở δC 0,13.

*(4,6-dimethoxy-2-(4-methoxybenzyl)benzofuran-3-yl)oxy)trimethylsilane

(92)

Tương tự hợp chất 121, phổ NMR của chất 92 cũng cho cấu trúc phân tử

khung aurone với 3 vòng A, B và C với nhiều thay đổi về độ chuyển dịch các tín

hiệu do sự hình thành enolate ở vòng C. Trên phổ NMR tín hiệu của C-3 chuyển lên

trường cao hơn còn tín hiệu của C-2 chuyển xuống trường thấp hơn đồng thời sức

căng vòng C cũng giảm đi và các tín hiệu của vòng A đã chuyển lên trường cao

hơn, đặc biệt thay đổi nhiều với C-8. Trên phổ 1H-NMR của chất 92 (phụ lục 10) ở

vùng trường thơm cho 6 tín hiệu của 6 proton methine thơm thuộc 2 vòng thơm A

và B gồm 2 cặp doublet của 4 proton thơm hệ AA′XX′ vòng B ở δH 67,15 (d, J =

8,5 Hz, H-2′, H-6′) và ở δH 6,81(d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′); 2 cặp doublet của 2

proton thơm meta vòng A ở δH 6,46 và 6,24 (2 × d, J = 2,0 Hz, H-5, H-7), Ở vùng

trường cao xuất hiện các tín hiệu của proton methylene nhóm CH2-10 ở δH 3,94 (s)

và 3 singlet tín hiệu của 3 nhóm OCH3 ở δH 3,85, 3,76, 3,75. Tín hiệu của 3 nhóm

methyl liên kết với Silane [Si(CH3)3] ở δH 0,24. Phổ 13C-NMR (Hình 4.39) cho 15

tín hiệu của 15 carbon phù hợp với cấu trúc khung aurone với 12 carbon thơm của 2

vòng thơm A, B; 2 carbon vòng C và 1 carbon methylene. Hai vòng thơm A, B cho

4 tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với oxy ở δC 158,4 (C-6), 158,1 (C-8), 153,2

(C-4′), 140,4 (C-4); 6 tín hiệu của carbon methine thơm ở δC 130,4 (C-2′, 6′), 113,8

và 113,7 (C-3′, 5′), 93,8 (C-5) và 88,5 (C-7); 2 carbon thơm bậc 4 ở 130,5 (C-1′) và

108,1 (C-9). Vòng C cho tín hiệu của 2 carbon olefine liên kết với oxy ở δC 154,2

(C-3) và ở δC 133,2 (C-2). Ở trường cao là 3 tín hiệu của 3 nhóm OMe ở δC 55,5,

55,2, 55,0, tiếp theo là tín hiệu của carbon methylene ở δC 30,2 (C-10) và 3 carbon

methyl liên kết với silane [Si(CH3)3] ở δC 1,3.

122

Trên phổ NMR của các TMS enol ether của chất 92 ta thấy các pic thấp là tín

hiệu của dihydroaurone do sự phân hủy của chất 92 về ketone đầu (do để lâu trước

khi đo). Vì vậy sản phẩm TMS enol ether sau khi xử lý cần đem phản ứng tiếp theo

mà không qua tinh chế.

Hình 4.39. Phổ 13C-NMR của chất 92 (CDCl3)

 Oxy hóa các trimethylsilyl enol ether (121, 92) thành các O-methylauronol

(122, 93)

Phản ứng oxi hóa các TMS enol ether 121, 92 được thực hiện theo phương

pháp oxi hóa Rubottom sử dụng tác nhân oxy hóa m-chloroperbenzoic acid (m-

CPBA) trong CH2Cl2 ở 0°C sau đó dùng tetrabutylamonium fluoride (TBAF) để

loại nhóm TMS thu được auronol. Quá trình oxi hóa TMS enol ether theo cơ chế đề

nghị sau:

Hình 4.40. Sơ đồ cơ chế phản ứng oxi hóa trimethylsilyl enol ether

123

Phản ứng oxi hóa TMS enol ether bởi peroxyacid tạo sản phẩm α-hydroxy

carbonyl. Phản ứng xảy ra theo cơ chế đề nghị trong

Hình 4.40, đầu tiên, dưới tác dụng của peroxyacid tạo sản phẩm siloxy oxirane

trung gian, acid xúc tác mở vòng tạo ion oxocarbanium, sau đó chuyển vị tạo dẫn

xuất α-siloxy carbonyl. Hợp chất này dễ dàng tạo dẫn xuất α-hydroxy carbonyl khi

có mặt của acid, base hay hợp chất của fluoride.

* 4,6-dimethoxy-2-hydroxy-2-(3′,4′-dimethoxyphenyl)methylbezofuran-

3(2H)-one (122)

Phổ NMR của chất 122 cho cấu trúc phân tử khung auronol với 3 vòng A, B

và C, các tín hiệu thay đổi nhiều ở vòng C với độ chuyển dịch của carbon C-2 do

trở thành một carbon hemicetal và carbon C-3 do trở lại về ketone (3-C=O). Trên

phổ 1H-NMR của chất 122 (phụ lục 20) ở vùng trường thơm cho 5 tín hiệu của 5

proton methine thơm thuộc 2 vòng thơm A và B gồm 3 tín hiệu proton thơm hệ

ABX vòng B ở δH 6,63 (d, J = 2 Hz, H-2′), δH 6,53 (dd, J = 2,0 , 8,0 Hz, H-6′), δH

6,37 (d, J = 8,0 Hz, H-5′) và 2 doublet của 2 proton thơm meta vòng A ở δH 6,23 và

δH 6,05 (H-7, H-5) với hằng số tương tác Jmeta = 2,0 Hz. Ở vùng trường cao là 4

singlet của 4 nhóm OMe ở δH 3,93, δH 3,77, δH 3,74, δH 3,65 và 2 doublet của 2

proton methylene ở δH 3,11 (Ha-10) và ở δH 3,04 (Hb-10) với J = 13,0 Hz. Phổ 13C-

NMR (Hình 4.41) cho 15 tín hiệu của 15 carbon phù hợp với cấu trúc khung

auronol với 12 carbon thơm của 2 vòng thơm A, B; 2 carbon vòng C và 1 carbon

methylene. Hai vòng thơm A, B cho 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với oxy ở

δC 174,65 (C-8), 171,08 (C-6), 157,6 (C-4), 148,3 (C-4′) và 148,0 (C-3′); 5 tín hiệu

của carbon methine thơm ở δC 122,0 (C-6′), 112,6 (C-2′), 110,9 (C-5′), 94,6 (C-5)

và δC 89,4 (C-7); 2 carbon thơm bậc 4 ở 126,1 (C-1′) và 104,6 (C-9). Vòng C cho

tín hiệu của carbon hemicetal của C-2 ở δC 110,9 và carbon carbonyl ở δC 194,6 (3-

C=O). Ở trường cao là 4 tín hiệu của 4 nhóm OMe ở 55,7, 55,67, 55,61, 55,5 và 1

124

carbon methylene ở δC 42,1 (C-10). Qua phân tích các dữ liệu phổ cho thấy sản

phẩm oxi hóa chất 121 là 4,6-dimethoxy-2-hydroxy-2-(3′,4′-

dimethoxyphenyl)methylbezofuran-3(2H)-one (122)

Hình 4.41. Phổ 13C-NMR của chất 122 (CDCl3)

* 4,6-dimethoxy-2-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)methylbezofuran-3(2H)-

one (93)

Phổ NMR của chất 93 cho cấu trúc phân tử là khung auronol với 3 vòng A, B

và C, các tín hiệu thay đổi nhiều ở vòng C với độ chuyển dịch của carbon C-2 do

trở thành một carbon hemicetal và carbon C-3 do trở lại về ketone (3-C=O). Trên

phổ 1H-NMR (phụ lục 11) ở vùng trường thơm cho 6 tín hiệu của 6 proton methine

thơm thuộc 2 vòng thơm A và B gồm 2 cặp doublet của 4 proton thơm hệ AA′XX′

vòng B ở δH 7,16 (H-2′, H-6′) và ở δH 6,73 (H-3′, H-5′) với hằng số tương tác Jortho

= 8,5 Hz và 2 cặp doublet của 2 proton thơm meta vòng A ở δH 6,07 (H-7) và ở δH

125

5,90 (H-5) với hằng số tương tác Jmeta = 1,5 Hz. Ở trường cao là 3 singlet của 3

nhóm OMe ở δH 3,86, 3,85, 3,74 và 2 cặp doublet của 2 proton methylene ở δH 3,16

(d, Ha-10), ở 3,06 (d, Hb-10) với hằng số tương tác Jgem = 14,5 Hz. Phổ 13C-NMR

(Hình 4.42) cho 15 tín hiệu của 15 carbon phù hợp với cấu trúc khung auronol với

12 carbon thơm của 2 vòng thơm A, B, 2 carbon vòng C và 1 carbon methylene.

Hai vòng thơm A, B cho 4 tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với oxy ở δC 173,6

(C-8), 170,7 (C-6), 1558,9 (C-4′), 158,5 (C-4); 6 tín hiệu của carbon methine thơm

ở δC 131,7 (C-2′, 6′), 113,4 (C-3′, 5′), 92,8 (C-5) và δC 88,5 (C-7); 2 carbon thơm

bậc 4 ở δC 125,5 (C-1′) và ở δC 104,6 (C-9). Vòng C cho tín hiệu của carbon

methine liên kết với oxy ở δC 104,6 (C-2) và tín hiệu ở vùng trường thấp của carbon

carbonyl ở δC 193,4 (3-C=O). Ở trường cao là 3 tín hiệu của 3 nhóm OMe ở 56,1,

56,0, 55,1 và 1 carbon methylene ở δC 40,5 (C-10). Độ chuyển dịch thấp bất thường

của carbon C-8 (175,7 ppm) cho thấy ảnh hưởng sức căng vòng 5 (vòng C).

Hình 4.42. Phổ 13C-NMR của chất 93 (CDCl3)

126

4.1.4. Tổng hợp auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside

Auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) được tổng hợp

từ auronol gồm 2 bước: Bước 1 là glucoside hóa auronol sử dụng tác nhân 2,3,4,6-

tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl bromide; bước 2 là loại các nhóm bảo vệ acetyl

trong phần đường để thu sản phẩm auronol glucoside Hình 3.8.

 Phản ứng glucoside hóa auronol

Auronol 82 được glucosyl hóa với 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl

bromide (123), cơ chế phản ứng được đề nghị như trình bày trong Hình 4.43.

Hình 4.43. Sơ đồ cơ chế phản ứng glucosyl hóa alphitonin

Phản ứng glucosyl hóa nhóm hydroxyl phenol (Ar-OH) là phản ứng thế

nucleophile (SN1) vào carbon anome (C-1) của phân tử đường glucoside tạo liên kết

O- glycoside, do sự che chắn của vòng 5 acyloxocarbenium các phenol chỉ tấn công

được vào một mặt của chất trung gian, ở phía ngược lại, nên hình thành sản phẩm β

có cấu hình ngược với cấu hình α của α-D-glucopyranosyl bromide 123 [140]. Cơ

chế ở đây cho thấy, khi có mặt các chất hoạt hóa là các chất xúc tiến (promoter,

Cs2CO3) và xúc tác (NaOH) tách ion halogen hình thành ion oxocarbenium, sau đó

do sự chuyển dịch điện tử trong phân tử nhóm acetyl ở C-2 đã đóng vòng với

carbon anome hình thành ion acyloxonium. Tiếp theo, các phenol là các nucleophile

127

tấn công từ một phía vào carbon anome của acyloxocarbenium, đồng thời mở vòng

hình thành sản phẩm O-glucoside (124)

Phản ứng glucosyl hóa alphitonin (82) với acetyl glycopyranosyl bromide đã

được thử nghiệm với các xúc tiến khác nhau như ZnCl2, CdCO3, HgI2 hoặc Ag2CO3

kết hợp với xúc tác base K2CO3. Các kết quả thu được được trình bày trong Bảng

4.8.

Bảng 4.8. Khảo sát các xúc tác dùng cho phản ứng glucosylation alphitonin

Số Alphitonin Xúc tác Hiệu suất K2CO3

TT (g/mmol) (g/mmol) (g/mmol) (%)

1 0,304 g/1 mmol 0,304 g 0%

ZnCl2 0,149 g/1,1 mmol 2,2 mmol

2 0,304 g/1 mmol 0,304 g 0%

CdCO3 0,189 g/1,1 mmol 2,2 mmol

3 0,304 g/1 mmol 0,304 g 0%

HgI2 0,5 g/1,1 mmol 2,2 mmol

4 0,304 g/1 mmol 0,304 g 0%

Ag2CO3 0,303 g/1,1 mmol 2,2 mmol

5 0,304 g/1 mmol 0,304 g 39%

Cs2CO3 0,36 g/1,1 mmol 2,2 mmol

Các kết quả thu được trên cho thấy ở các thí nghiệm 1-4 thì sản phẩm trung

gian alphitonin-4-O-β-D-tetraacetyl glucopyranoside (124) đã không được phát

hiện. Sản phẩm glucoside hóa (chất 124) được hình thành với sự kết hợp của hỗn

hợp K2CO3/Cs2CO3 với hiệu suất 39%.

* Alphitonin-4-O-β-[2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucopyranoside] (124)

Cấu trúc của alphitonin-4-O-β-D-tetraacetyl-glucopyranoside được chứng

minh bằng các phương pháp phổ. Trên phổ NMR của chất 124 ngoài các tín hiệu

aglycone alphitonin ta thấy xuất hiện thêm các tín hiệu của phân tử đường và các tín

128

hiệu của các nhóm acetyl trong phần đường. Tương tự phổ NMR của chất 116, chất

125, trên phổ NMR của chất 124 ta thường thấy các cặp tín hiệu kép. Hiện tượng

này có thể do trung tâm bất đối C*-2 kết hợp với 4 trung tâm bất đối của phần

đường tạo nên các diasteromer tách được trong từ trường đo nên xuất hiện các tín

hiệu kép trong phổ NMR của chúng.

Hình 4.44. Phổ 1H-NMR của chất 124 (CD3OD)

Phổ 1H-NMR của chất 124 (Hình 4.44) cho các các tín hiệu của phần aglycone

alphitonin gồm các tín hiệu của 3 proton dạng ABX của hệ vòng thơm B ở δH

6,66/6,64δ (d, J = 1,5 Hz); 6,57/6,53 (d, J = 8,0 Hz) và 6,52/6,48 (dd, J = 1,5 , 8,0

Hz). Hai proton ở vị trí meta của vòng A cho tín hiệu là các doublet ở δH 6,02/6,01

(d, J = 1,5 Hz) và 5,96/5,93 (d, J = 1,5 Hz). Tín hiệu 2 proton của nhóm metylene

CH2-10 là multiplet ở δH 3,02. Như vậy, độ chuyển dịch của các tín hiệu proton của

phần aglycone ít thay đổi. Trên phổ 1H-NMR của chất 124 còn cho các tín hiệu mới

của phần đường với các nhóm hydroxyl đã được acetyl hóa. Đó là 5 tín hiệu proton

methine của phần đường ở δH 5,35 (t, J = 9,0 Hz), 5,32/5,22 (d, J = 8,0 Hz), 5,23

(dd, J = 8,0 , 9,0 Hz), 5,11 (m), và 4,09/4,02 (m); 2 tín hiệu proton methylene của

129

CH2-6” ở 4,33/4,31(dd, J = 5,0 , 12,0 Hz) và 4,18/4,11 (dd, J = 1,7 , 12,0 Hz). Cuối

cùng ở trường cao là 4 tín hiệu singlet của các proton methyl của các nhóm acetyl ở

2,00- 2,10 ppm (4 × OAc). Tương tự, phổ 13C-NMR (phụ lục 21) cho các tín hiệu

carbon của phần aglycone auronol và các tín hiệu carbon mới của phần đường

glucopyranoside. Hai vòng thơm A, B cho 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với

oxy ở δC 174,28 (C-8), 173,5 (C-6), 157,7/157,5 (C-4) và 145,6/145,1 (C-4′, 3′); 5

tín hiệu của carbon methine thơm ở δC 123,1/122,9 (C-6′), 118,8/118,7 (C-2′),

115,9/115,8 (C-5′),100,1/99,4 (C-5) và δC 94,6/94,5 (C-7); 2 carbon thơm bậc 4 ở δC

126,5 (C-1′) và 103,0/102,9 (C-9). Vòng C cho tín hiệu của carbon hemicetal ở δC

107,4/107,1(C-2) và carbon carbonyl ở δC 194,9 (3-C=O). Phần đường cho 4 tín

hiệu của 4 nhóm C=O của 4 nhóm bảo vệ OAc ở trường thấp với δC 172,4 , 171,6 ,

171,4 và 171,3; 1 carbon hemiacetal của phần đường ở δC 99,8 (C-1”); 4 tín hiệu

của 4 carbon oxymethine của phần đường ở δC 74,1 (C-3′′), 73,2/73,1 (C-5′′),

72,4/72,3 (C-2′′), 69,7/69,6 (C-4′′); 1 tín hiệu oxymethylene ở δC 63,0/62,9 (C-6′′)

và 4 nhóm metyl của 4 nhóm bảo vệ OAc ở trường cao với δC 20,8, 20,7, 20,6 và

20,5.

Hình 4.45. Phổ HMBC của chất 124 (CD3OD)

130

Phản ứng glucosyl hóa chọn lọc tại C-4 được xác định rõ qua phân tích phổ

NMR của hợp chất 124, đặc biệt là bằng phổ HSQC (phụ lục 21) kết hợp với

HMBC (Hình 4.45) cho thấy các tương tác xa giữa CH2-10 (3,02 ppm)/C-2′

(118,8/118,7 ppm), C-6′ (123,1/122,9 ppm)/C-2 (107,4/107,1 ppm)/C-1′ (126,5

ppm)/C-3 (194,9 ppm). Ngoài ra, phổ HSQC, phổ HMBC cho ta thấy tương tác xa

mạnh của proton anome H-1” (5,32/5,22 ppm)/C-4 (157,7/157,5) đã khẳng định

phần đường gắn ở vị trí C-4 của khung auronol.

 Phản ứng deacetyl hóa hợp chất 124

Phản ứng tiếp theo là phản ứng thủy phân các nhóm acetyl của phần đường

trong phân tử auronol glucoside. Hợp chất 124 đã được xử lý bằng dung dịch NaOH

trong MeOH / H2O ở 0°C đề acetyl tạo alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125).

Cơ chế phản ứng deacetyl hóa có thể mô tả ngắn gọn theo sơ đồ trong Hình 4.46.

Hình 4.46. Sơ đồ cơ chế phản ứng deacetyl hóa

Phản ứng thủy phân các nhóm acetyl của phần đường trong phân tử auronol

glucoside 124 bao gồm các bước tấn công của OHˉ vào carbon dương điện của

nhóm carboxyl hình thành một chất trung gian tứ diện. Chất trung gian tứ diện này

không bền nhanh chóng phản ứng với phân tử H2O hình thành acid acetic (trong

môi trường base ở dạng ion acetate) và anchol.

Alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside {125; 2,4,6-trihydroxy-2-[3,4-

dihydroxyphenyl)methyl]-3(2H)-benzofuranone-4-yl-β-D-glucopyranoside}

131

Các dữ liệu phổ NMR của alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside tổng hợp

được là phù hợp với các tài liệu đã báo cáo (Bảng 4.1 và Bảng 4.2).

Như vậy, alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside đã được tổng hợp từ taxifolin

(81) với hiệu suất toàn phần 13,0%. Như đã biết, alphitonin-4-O-β-D-

glucopyranoside chiếm hàm lượng rất nhỏ trong cây Chay Bắc bộ (A. tonkinensis),

vì vậy kết quả tổng hợp này rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn nó cho phép cung

cấp hợp chất auronol glucoside 125 lượng gam cho các nghiên cứu hoạt tính sinh

học của nó.

4.1.5. Tổng hợp một số dẫn xuất nitrile của auronol 82 và 98

Các dẫn xuất nitrile của hai auronol alphitonin (82) và maesopsin (98) được

trình bày trong Hình 4.47

Hình 4.47. Sơ đồ chung điều chế dẫn xuất nitrile của hai auronol 82 và 98

Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất nitrile của các auronol được tiến hành

trong môi trường kiềm ở nhiệt độ 0°C cho các sản phẩm thế 1 lần và 2 lần phụ

thuộc vào tỉ lệ mol của chất nền và các tác nhân. Ở tỉ lệ mol của các tác nhân là

auronol /chloroacetonitrile/NaOH (1/1,1/1,1; mol/mol/mol) ta thu được sản phẩm 1

lần thế vào vị trí C-4 là chất 126 và chất 127. Khi tăng tỉ lệ mol của xúc tác base và

chloroacetonitrile lên gấp hơn 2 lần lượng mol của chất phản ứng (82 hoặc 98) ta

thu được các sản phẩm thế 2 lần vào 2 vị trí C-4 và C-6 là chất 128 và 129. Nếu ta

tiếp tục tăng tỉ lệ mol của xúc tác base và chloroacetonitrile lên gấp hơn 3 hay 4 lần

lượng mol của các auronol ta cũng chỉ thu được sản phẩm thế 2 lần vào 2 vị trí C-4

và C-6. Sự ưu tiên thế vào vị trí 4-OH và 6-OH có thể được giả thiết là do ảnh

hưởng của nhóm C=O vòng C đã hoạt hóa các nhóm 4-OH và 6-OH qua các nối đôi

132

liên hợp vì thế khi lượng tác nhân phản ứng dư ta sẽ thu được các sản phẩm thế ở

các vị trí này. Ở tỉ lệ mol của các tác nhân là auronol/chloroacetonitrile/NaOH

(1/1,1/1,1; mol/mol/mol) ta thu được sản phẩm 1 lần thế vào vị trí C-4 có thể do sự

kết hợp của 2 hiệu ứng –C và –I của nhóm 3-C=O. Ngoài hiệu ứng –C, nhóm 3-

C=O còn có hiệu ứng –I làm bền ion phenolate ở 4-C-Oˉ nên khả năng phản ứng

nucleophine của nhóm này tạo sản phẩm ở C-4 thuận lợi hơn so với ở C-6 và cho ta

sản phẩm ở C-4 trước. Kết quả thực nghiệm đã cho thấy phản ứng thế ưu tiên hơn

vào vị trí C-4 một lần nữa chứng tỏ không có liên kết cầu hydro giữa nhóm 4-OH

(vòng A) với nhóm 3-C=O (vòng C) như đã được khẳng định bởi tín hiệu rộng và

thấp của các nhóm OH hai vòng A, B ở dưới 10 ppm trên phổ 1H-NMR của

alphitonin. Kết quả thu được sản phẩm ưu tiên thế vào nhóm 4-OH của khung

auronol rất thú vị nó đã chứng minh sự bắt gặp 2 auronol glucoside (chất 116, 125)

với nhóm đường gắn vào vị trí C-4 trong tự nhiên.

Phản ứng tổng hợp các hợp chất auronol-O-acetonitrile (126, 127, 128, 129),

là phản ứng tổng hợp Williamson ether, xảy ra theo cơ chế như sau:

Với sự có mặt của xúc tác base, phenol hình thành phenolate đóng vai trò

như là tác nhân ái nhân tấn công vào carbon dương điện trong phân tử

chloroacetonitrile hình thành do sự hút điện tử của nguyên tử clo thay thế clo và

hình thành liên kết C-O mới cho sản phẩm ether ArOCH2CN.

 Khảo sát các điều kiện phản ứng tổng hợp nitrile một nhóm thế của

alphitonin (82) và maesopsin (98)

Hợp chất 126 và 127 được tổng hợp theo quy trình chung mục 3.1.5.1 , các

yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng đã được khảo sát về:

Tỉ lệ mol tác nhân maesopsin hoặc alphitonin / chloroacetonitrile / NaOH

Dung môi phản ứng.

Các kết quả thu được được trình bày trên Bảng 4.9.

133

Bảng 4.9. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng tổng hợp

dẫn xuất nitrile một nhóm thế của hai auronol 82 và 98

Stt Hiệu suất (%)

82/98 (mmol) ClCH2CN (mmol/ mL) NaOH (mmol/ mg) Dung môi (mL) (126/127)

1 1 0,9/0,056 0,9/36 DMF (10 mL) 30,5/30

2 1 0,9/0,056 0,9/36 DMAc (10 mL) 31/31

3 1 1,0/0,063 1,0/40 DMF (10 mL) 31/31

4 1 1,0/0,063 1,0/40 DMAc (10 mL) 32,5/32

5 1 1,1/0,069 1,1/44 DMF (11 mL) 37/35

6 1 1,1/0,069 1,1/44 DMAc (11 mL) 37,5/39,8

7 1 1,3/0,082 1,3/52 DMF (11 mL) 33,5/34

8 1 1,3/0,082 1,3/52 DMAc (11 mL) 34/34,8

9 1 1,5/0,094 1,5/60 DMF (15 mL) 33/36

10 1 1,5/0,094 1,5/60 DMAc (15 mL) 33,5/36,5

Từ các kết quả thu được trong bảng trên chúng tôi lựa chọn tỉ lệ mol của các

tác nhân alphitonin(maesopsin)/chloroacetonitrile/NaOH là 1/1,1/1,1 trong dung

môi dimethylacetamide cho hiệu suất cao nhất là 37,5% với 126 và 39,8% với 127.

Cấu trúc của các sản phẩm đã được chứng minh bằng các phương pháp phổ cho

thấy trong điều kiện phản ứng không ảnh hường đến cấu trúc khung auronol, các

sản phẩm mang một nhóm thế acetonitrile cho các tín hiệu của chất đầu alphitonin

hoặc maesopsine với các tín hiệu mới của một nhóm thế acetonitrile (-CH2CN).

* Alphitonin-4-O-acetonitrile (126)

Tương tự như alphitonin, phổ NMR của hợp chất 126 cho các tín hiệu của

các proton và carbon khung auronol với một nhóm thế acetonitrile, các số liệu phổ

phù hợp với cấu trúc phân tử. Phổ khối ion hóa phun mù điện tử cho pic ion âm

phân tử đề proton hóa [M-H]ˉ với m/z= 342 [M-H]ˉ phù hợp với công thức phân tử

C17H13NO7 dự đoán phân tử sản phẩm có thêm 1 nhóm (-CH2CN) (Hình 4.48).

134

Hình 4.48. Phổ ESI-MS của chất 126

Phổ proton 1H-NMR của chất 126 (Hình 4.49) cho các tín hiệu singlet tù ở

vùng trường thấp của các proton OH ở δH 9,65, 7,51, Ở vùng trường thơm cho 5 tín

hiệu của 5 proton thơm của 2 vòng A và B gồm 3 tín hiệu của 3 proton methine

thơm dạng ABX của vòng B ở δH 6,54 (d, J = 2,0 Hz, H-2′); ở δH 6,49(d, J = 8,0 Hz,

H-5′) và ở δH 6,36 (dd, J = 2,0 , 8,0 Hz, H-6′); 2 singlet tù của 2 proton meta vòng A

ở δH 5,98 (H-5) và ở δH 5,96 (H-7). Tiếp theo là 2 doublet mới của 2 proton

metylene liên kết với oxy của nhóm thế acetonitrile (-CH2CN) ở δH 5,19 và δH 5,13

với hằng số tương tác Jgem = 16,0 Hz. Ở vùng trường cao là tín hiệu của nhóm

methylene CH2-10 ở δH 2,90 và ở δH 2,82 với hằng số tương tác Jgem = 10,0 Hz.

Phổ carbon 13C-NMR của chất 126 (Hình 4.50) cho tín hiệu của 17 carbon

bao gồm 15 carbon khung auronol và 2 carbon mới của nhóm acetonitrile. Khung

auronol bao gồm 12 carbon thơm 2 vòng A và B, 2 carbon thuộc vòng C và một

carbon methylene. Hai vòng thơm A, B cho 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết

với oxy ở C 172,3 (C-8), 169,4 (C-6), 155,4 (C-4), 144,4 (C-3′) và 143,8 (C-4′); 5

tín hiệu của 5 carbon methine thơm ở C 121,2 (C-6′), 117,8 (C-2′), 115,5 (C-5′),

94,4 (C-5) và C 92,3 (C- 7); 2 tín hiệu của carbon thơm bậc 4 ở C 124,6 (C-1′) và

C 101,3 (C-9). Vòng C cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 192,4 (3-C=O) và

135

carbon hemicetal ở C 105,9 (C-2); tín hiệu carbon methylene của CH2-10 ở C 40,7.

Nhóm acetonitrile cho các tín hiệu mới của 1 carbon ankinyl liên kết với nitơ ở C

116,0 (-CN) và 1 carbon methylene liên kết với oxy ở C 53,5 (-CH2CN). Phổ

HSQC (phụ lục 23) cho các tương tác C-H trực tiếp và HMBC (Hình 4.51) cho các

tương tác xa của 2 proton CH2-10 (2,90 và 2,82 ppm)/C-2 (105,9 ppm)/C-1′(124,6

ppm)/C-6′ (121,2 ppm)/C-2′ (117,8 ppm)/C-3 (192,4 ppm), cùng với độ chuyển

dịch thấp bất thường của carbon C-8 (172,3 ppm) và C-6 (169,4 ppm) do ảnh hưởng

sức căng vòng 5 (vòng C), đã chứng minh cấu trúc khung auronol của chất 126. Đặc

biệt, phổ HMBC đã bộc lộ cấu trúc của alphitonin-4-O-acetonitrile với tín hiệu

tương tác xa của proton metylene của nhóm thế acetonitrile với C-4 ở -OCH2CN (

5,19-5,13 ppm) / C-4 (155,5 ppm) đã khẳng định nhóm acetonitrile (-OCH2CN) đã

được gắn vào vị trí số 4 của khung auronol (Hình 4.51)

Hình 4.49. Phổ 1H-NMR của chất 126 (DMSO- d6)

136

Hình 4.50. Phổ 13C-NMR của chất 126 (DMSO- d6)

Hình 4.51. Phổ HMBC của chất 126 (DMSO- d6)

137

* Maesopsin-4-O-acetonitrile (127)

Tương tự chất 126, chất 127 cho các số liệu phổ phù hợp với cấu trúc phân tử

bao gồm cấu trúc khung auronol maesopsin và nhóm thế acetonitrile. Phổ khối ion

hóa phun mù điện tử cho pic ion âm phân tử đề proton hóa [M-H]ˉ với m/z = 326

[M-H]ˉ phù hợp với công thức phân tử C17H13NO6 dự đoán phân tử sản phẩm có

thêm 1 nhóm (-CH2CN) (phụ lục 24). Phổ 1H-NMR của chất 127 cho các tín hiệu

singlet tù của các proton nhóm hydroxy phenolic (Ph-OH) ở δH 9,12 và 7,49. Vòng

thơm B cho 2 cặp doublet của 4 proton dạng AA′XX′ ở δH 6,91 (H-2′, 6′) và ở δH

6,53 (H-3′, 5′) với J = 8,5 Hz. Vòng A cho 2 tín hiệu singlet tù của hai proton meta

ở δH 5,91 (H-5) và δH 5,87(H-7). Các tín hiệu doublet mới của 2 proton methylene

liên kết với oxy của nhóm acetonitrile (-OCH2CN) ở δH 5,17 và δH 5,12 với Jgem =

16,5 Hz. Ở trường cao là 2 doublet của 2 proton geminal của CH2-10 ở δH 2,93 và

δH 2,87 với hằng số tương tác lớn Jgem = 13,5 Hz. Phổ 13C-NMR của chất 127 (Hình

4.52) cho tín hiệu của 17 carbon bao gồm 15 tín hiệu của khung maesopsin và 2 tín

hiệu của 2 carbon của nhóm thế acetonitrile (-OCH2CN). Khung auronol maesopsin

bao gồm 12 carbon thơm 2 vòng A và B, 2 carbon thuộc vòng C và một carbon

methylen. Hai vòng thơm A, B cho 4 tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với oxy ở

C 172,2 (C-8), 170,5 (C-6), 155,8 (C-4′), 155,5 (C-4); 6 tín hiệu của 6 carbon

methine thơm ở C 131,2 (C-2′, 6′), 114,6 (C-3′, 5′), 94,9 (C-5) và 92,4 (C- 7); 2 tín

hiệu của carbon thơm bậc 4 ở C 124,1 (C-1′) và 100,6 (C-9). Vòng C cho tín hiệu

của carbon carbonyl ở C 191,8 (3-C=O) và carbon hemicetal ở C 105,8 (C-2). Ở

vùng trường cao cho tín hiệu carbon methylene ở C 40,5 (CH2-10). Nhóm

acetonitrile cho các tín hiệu mới của 1 carbon ankinyl liên kết với nitơ ở C 116,1 (-

CN) và 1 carbon methylene liên kết với oxy ở C 53,4 (-CH2CN). Phổ HSQC (phụ

lục 24) cho các tương tác C-H trực tiếp và HMBC (Hình 4.53) cho các tương tác xa

của 2 proton methylene nhóm CH2-10 (2,93 và 2,87 ppm)/C-2 (105,8 ppm)/C-

138

1′(124,1 ppm)/C-2′, 6′ (131,2 ppm)/C-3 (191,8 ppm). Đặc biệt, phổ HMBC đã bộc

lộ cấu trúc của maesopsin-4-O-acetonitrile 127 với tín hiệu tương tác xa của proton

metylene liên kết với oxy của nhóm thế O-acetonitrile với C-4 ở -OCH2CN (5,17-

5,12 ppm) / C-4 (155,5 ppm) đã khẳng định nhóm acetonitrile (-OCH2CN) đã được

gắn vào vị trí số 4 của khung auronol (Hình 4.53)

Hình 4.52. Phổ 13C-NMR của chất 127 (DMSO- d6)

Hình 4.53. Phổ HMBC của chất 127 (DMSO- d6)

139

 Khảo sát các điều kiện tổng hợp nitrile hai nhóm thế của alphitonin và

maesopsin

Hợp chất 128 và 129 được tổng hợp theo 3.1.5.2. Chúng tôi đã khảo sát các

yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng như:

Tỉ lệ mol tác nhân alphitonin (maesopsin ) / chloroacetonitrile / NaOH.

Lượng dung môi phản ứng.

Các kết quả thu được được trình bày trên Bảng 4.10.

Bảng 4.10. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng tổng hợp

dẫn xuất nitrile hai nhóm thế của hai auronol 82 và 98

Stt Alphitonin hoặc

ClCH2CN (mmol/mL NaOH (mmol/mg) Dung môi (mL)

maesopsin (mmol) Hiệu suất (128/129) (%) )

1 1 1,8/0,113 1,8/72 DMF (20mL) 28,9/32

2 1 1,8/0,113 1,8/72 DMAc (20mL) 29,1/32,5

3 1 2,0/0,125 2,0/80 DMF (20mL) 29/33

4 1 2,0/0,125 2,0/80 DMAc (20mL) 31,5/34

5 1 2,2/0,138 2,2/88 DMF (20mL) 37/35

6 1 2,2/0,138 2,2/88 DMAc (20mL) 37/39

7 1 33/36 2,5/0,156 2,5/100 DMF (20mL)

8 1 2,5/0,156 2,5/100 DMAc (20mL) 33,5/36,5

9 1 4,0/0,25 4,0/160 DMF (20mL) 25/28

10 1 4,0/0,25 4,0/160 DMAc (20mL) 25,5/29,5

Từ các kết quả thu được trong Bảng 4.10 chúng tôi lựa chọn tỉ lệ mol của các

tác nhân alphitonin(maesopsin)/chloroacetonitrile/NaOH là 1/2,2/2,2 trong dung

môi dimethylacetamide cho hiệu suất cao nhất là 37% (chất 128) và 39% (chất 129).

Cấu trúc của các sản phẩm đã được chứng minh bằng các phương pháp phổ

cho thấy trong điều kiện phản ứng không ảnh hưởng đến cấu trúc khung auronol.

Các sản phẩm mang 2 nhóm thế acetonitrile cho các tín hiệu tương tự của chất đầu

alphitonin (hoặc maesopsine) và các tín hiệu mới của 2 nhóm thế O-acetonitrile (-

OCH2CN).

140

* Alphitonin-4,6-di-(O-acetonitrile) (128)

Tương tự như trong trường hợp dẫn xuất alphitonin mang một nhóm thế (126),

phổ NMR của hợp chất 128 cho các tín hiệu của các proton và carbon khung

auronol alphitonin với 2 nhóm thế acetonitrile, các số liệu phổ phù hợp với cấu trúc

phân tử. Phổ khối ion hóa phun mù điện tử cho pic ion âm phân tử đề proton hóa

[M-H]ˉ với m/z = 381 [M-H]ˉ phù hợp với công thức phân tử C19H14N2O7, dự đoán

phân tử sản phẩm có thêm 2 nhóm acetonitrile (-CH2CN) (Hình 4.54). Trên phổ

proton 1H-NMR của chất 128 (Hình 4.55), ở vùng trường thơm, 2 vòng A và B cho

5 tín hiệu của 5 proton methine thơm gồm 3 tín hiệu của 3 proton dạng ABX của

vòng B ở δH 6,64 (d, J = 2,0 Hz, H-2′); ở δH 6,55 (d, J = 8,0 Hz, H-5′) và ở δH 6,51

(dd, J = 2,0 , 8,0 Hz, H-6′); 2 singlet tù của 2 proton meta vòng A ở δH 6,38 (H-7)

và ở δH 6,24 (H-5) với Jmeta = 2,0 Hz, như vậy do ảnh hưởng của nhóm acetonitrile

độ chuyển dịch của 2 proton vòng A đã thay đổi, H-7 đã dịch chuyển xuống trường

thấp hơn H-5. Tiếp theo là cụm multiplet mới của 4 proton của 2 nhóm metylene

liên kết với oxy của 2 nhóm thế acetonitrile ở δH 5,00 - 5,12 (OCH2CN). Ở vùng

trường cao là tín hiệu proton methylene ở δH 3,10 và 3,06 (CH2-10) với hằng số

tương tác Jgem = 13,5 Hz. Phổ carbon 13C-NMR của chất 128 (phụ lục 25) cho tín

hiệu của 19 carbon bao gồm 15 carbon khung auronol và 4 carbon mới của 2 nhóm

acetonitrile. Khung auronol bao gồm 12 carbon thơm 2 vòng A và B, 2 carbon

thuộc vòng C và một carbon methylene. Hai vòng thơm A, B cho 5 tín hiệu của 5

carbon thơm liên kết với oxy ở C 174,7 (C-8), 168,4 (C-6), 157,0 (C-4), 145,6 (C-

3′) và 145,2 (C-4′); 5 tín hiệu của 5 carbon methine thơm ở C 123,1 (C-6′), 118,7

(C-2′), 115,9 (C-5′), 95,9 (C-5) và 92,7 (C- 7); 2 tín hiệu của carbon thơm bậc 4 ở

C 125,9 (C-1′) và 106,1 (C-9). Vòng C cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 196,6

(3-C=O) và carbon hemicetal ở C 108,1 (C-2). Hai nhóm acetonitrile cho các tín

hiệu mới của 2 carbon ankinyl liên kết với nitơ ở C 116,0 và C 115,9 (2 × CN) và

141

2 carbon methylene liên kết với oxy ở C 55,0 và C 54,4 (2 × OCH2CN). Ở trường

cao cho tín hiệu carbon methylene ở C 42,2 (CH2-10).

Hình 4.54. Phổ ESI-MS của chất 128

Hình 4.55. Phổ 1H-NMR của chất 128 (CD3OD)

142

Hình 4.56. Phổ HMBC của chất 128 (CD3OD)

Phổ HSQC (phụ lục 25) cho các tương tác C-H trực tiếp và HMBC (Hình

4.56) cho các tương tác xa của 2 proton CH2-10 (3,10 và 3,06 ppm)/C-2 (108,1

ppm)/C-1′(125,9 ppm)/C-6′ (123,1 ppm)/C-2′ (118,7 ppm)/C-3 (196,6 ppm), cùng

với độ chuyển dịch thấp bất thường của carbon C-8 (174,7 ppm) và C-6 (168,4

ppm) do ảnh hưởng sức căng vòng 5 (vòng C), đã chứng minh cấu trúc khung

auronol của chất 128. Đặc biệt, phổ HMBC đã bộc lộ cấu trúc của hợp chất

alphitonin-4,6-diacetonitrile 128 với tín hiệu tương tác xa của 4 proton của 2 nhóm

methylene liên kết với oxy của 2 nhóm thế O-acetonitrile (2 × OCH2CN) với C-4 và

C-6 ở [5,19- 5,12 ppm (2 × OCH2CN)/157,0 ppm (C-4)/168,4 ppm (C-6)] đã khẳng

định 2 nhóm acetonitrile (2 × OCH2CN) đã được gắn vào vị trí số 4 và 6 ở vòng A

của khung alphitonin (Hình 4.56)

* Maesopsin-4,6-di-O-acetonitrile (129)

143

Tương tự chất 127, chất 129 cho các số liệu phổ phù hợp với cấu trúc phân tử

bao gồm cấu trúc khung auronol maesopssin và 2 nhóm thế acetonitrile. Phổ khối

ion hóa phun mù điện tử cho pic ion âm phân tử đề proton hóa [M-H]ˉ với m/z =

365 [M-H]ˉ phù hợp với công thức phân tử C19H14N2O6 dự đoán phân tử sản phẩm

có thêm 2 nhóm acetonitrile (-CH2CN) (phụ lục 26). Phổ 1H-NMR của chất 129 cho

2 cặp doublet của 4 proton dạng AA′XX′ ở δH 7,01 (H-2′, 6′) và ở δH 6,58 (H-3′, 5′)

với Jortho = 8,5 Hz.Vòng A cho 2 cặp doublet của hai proton meta ở δH 6,39 (H-7)

và δH 6,24 (H-5) với Jmeta = 1,8 Hz. Các tín hiệu multiplet mới của 4 proton

methylene liên kết với oxy của 2 nhóm O-acetonitrile ở δH 5,00 - 5,10 (2 × O-

CH2CN). Ở trường cao là 2 doublet của 2 proton geminal ở δH 3,16 và δH 3,11

(CH2-10) với hằng số tương tác lớn Jgem = 14,0 Hz.

Phổ 13C-NMR của chất 129 (Hình 4.57) cho tín hiệu của 19 carbon bao gồm

15 tín hiệu của khung maesopsin và 4 tín hiệu của 2 nhóm thế acetonitrile (2 ×

CH2CN). Khung auronol maesopsin bao gồm 12 carbon thơm của 2 vòng A và B, 2

carbon thuộc vòng C và 1 carbon methylene. Hai vòng thơm A, B cho 4 tín hiệu của

4 carbon thơm liên kết với oxy ở C 174,6 (C-8), 168,4 (C-6), 157,3 (C-4′), 157,0

(C-4); 6 tín hiệu của 6 carbon methine thơm ở C131,5 (C-2′, 6′), 115,8 (C-3′, 5′),

96,0 (C-5) và 92,7 (C- 7); 2 tín hiệu của 2 carbon thơm bậc 4 ở C 125,2 (C-1′) và

106,1 (C-9). Vòng C cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 196,5 (3-C=O) và

carbon hemicetal ở C 108,1 (C-2). Ở trường cao cho tín hiệu carbon methylene ở C

41,9 (CH2-10). Hai nhóm acetonitrile cho các tín hiệu mới của 2 carbon ankinyl liên

kết với nitơ ở C 115,9 và C 115,8 (2 × CN) và 2 carbon methylene liên kết với oxy

ở C 55,0 và C 54,8 (2 × OCH2CN). Phổ HSQC (Phụ lục 26) cho các tương tác C-

H trực tiếp và HMBC (Hình 4.58) cho các tương tác xa của 2 proton methylene

nhóm CH2-10 (3,16 và 3,11 ppm)/C-2 (108,1 ppm)/C-1′(125,2 ppm)/C-2′ và C-6′

(132,5 ppm)/C-3 (196,5 ppm). Đặc biệt, phổ HMBC đã bộc lộ cấu trúc của hợp chất

maesopsin-4,6-diacetonitrile 129 với tín hiệu tương tác xa của 4 proton metylene

của 2 nhóm thế O-acetonitrile với C-4 ở 2 × OCH2CN (5,00 - 5,10 ppm) / C-4

(157,0 ppm) / (C-6) 168,4 ppm đã khẳng định 2 nhóm acetonitrile (-OCH2CN) đã

được gắn vào vị trí số 4 và số 6 của khung maesopsin (Hình 4.58).

144

Hình 4.57. Phổ 13C-NMR của chất 129 (CD3OD)

Hình 4.58. Phổ HMBC của chất 129 (CD3OD)

4.1.6. Tổng hợp dẫn xuất nitrile của auronol glucoside 116

Hợp chất auronol glucoside mang một nhóm 130 đã được tổng hợp tương tự

như đối với các auronol, phản ứng cho hiệu suất thấp hơn.

145

* Maesopsin- 6-O-cyanomethylene-4-O-β-D-glucopyranoside (130)

Tương tự các auronol mang nhóm thế nitrile (126, 127, 128, 129), chất 130

cho các tín hiệu phổ của khung auronol với tín hiệu của nhóm thế acetonotrile,

ngoài ra chúng còn có các tín hiệu của phần đường glucopyranoside, các số liệu

phổ phù hợp với cấu trúc phân tử. Phổ khối ESI-MS của chất 130 cho pic ion dương

giả phân tử m/z = 512 [M+Na]+ phù hợp với công thức phân tử C23H23NO11. Trên

phổ 1H-NMR của chất 130 ta cũng thấy những cặp tín hiệu kép. Ở vùng trường

thơm cho các cặp tín hiệu doublet của các proton thơm vòng B hệ AA′XX′ ở H

7,00/6,99 (H-2′, 6′) và 6,58/6,57 (2H, H-3′, 5′) với hằng số tương tác Jortho = 8,5 Hz.

Cũng ở vùng trường thơm nhưng ở trường cao hơn là 2 tín hiệu singlet tù của 2

proton thơm meta vòng A ở δH 6,31 (H-5, H-7); ở trường cao hơn nữa là 2 cặp

douplet của 2 proton methylene ở δH 3,15 (Ha) và 3,11 (Hb-10) với J = 15,5 Hz.

Phần đường cho cặp doublet của proton methine anomer ở H 4,98/4,96 (H-1′′) với

hằng số tương tác J = 7,5 Hz cho thấy đây là đường -D-glucopyranoside; 2 proton

oxymethylene (-CH2-6′′) cho cặp doublet tù ở H 3,90 (Ha-6′′) và multiplet ở H

3,66 (Hb-6′′) với Jgem = 12,0 Hz. Các tín hiệu multiplet ở vùng từ 3,59 - 3,38 ppm là

tín hiệu của 4 proton methine (H-3′′, H-2′′, H-4′′ và H-5′′). Nhóm thế acetonitrile

cho tín hiệu của 2 proton methylene liên kết với oxy ở H 5,04 (OCH2CN).

Phổ 13C-NMR của chất 130 (Hình 4.60) cũng cho các cặp tín hiệu kép của 23

carbon bao gồm 15 tín hiệu carbon của phần aglycone thuộc khung auronol

maesopsin, 6 tín hiệu carbon thuộc phần đường glucopyranoside và 2 tín hiệu của

nhóm thế acetonitrile. Khung auronol cho các tín hiệu của 2 vòng thơm A, B gồm 4

tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với oxy ở C 174,3 (C-8), 168,8 (C-6),

158,1/158,0 (C-4) và C 157,3 (C-4′); 6 carbon methine thơm ở C 132,5 (C-2′, 6′),

115,9/115,8 (C-3′, 5′)và ở C 97,1/96,8 (C-5), 92,6 (C-7); 2 carbon thơm bậc 4 ở C

146

125,2 (C-1′) và ở C 106,0/105,8 (C-9). Vòng C cho tín hiệu của carbon carbonyl ở

C 197,7 (3-C=O) và carbon hemicetal ở C 108,0 (C-2). Ở trường cao hơn là tín

hiệu của carbon methylene ở C 42,1/41,9 (C-10). Nhóm thế acetonitrile cho tín

hiệu của carbon ankinyl liên kết với nitơ ở C 116,1 (CN) và tín hiệu của carbon

methylene liên kết với oxy ở C 54,7 (OCH2CN).

Hình 4.59. Phổ 1H-NMR giãn của chất 130 (CD3OD)

Kết hợp với phổ HSQC (Phụ lục 27), phổ HMBC (Hình 4.60) cho các tương

tác xa của proton CH2-10 (3,15 và 3,11 ppm) /C-1′(125,2 ppm)/C-2′, 6′ (132,5

ppm)/3-CO (197,7) cùng với độ chuyển dịch thấp bất thường của carbon C-8 (174,3

ppm) và C-6 (168,8) do sức căng của vòng C chứng minh cấu trúc khung auronol

của chất 116. Phổ HMBC cho các tương tác xa của proton anome H-1′′

(4,98/4,96ppm)/C-4 (158,1/158,0 ppm) chứng tỏ phần đường gắn vào C-4 của

aglycone (maesopsine) và tương tác xa của các proton của nhóm methylene liên kết

với oxy của nhóm acetonitrile ở -OCH2CN (5,04 ppm)/ C-6 (168,8 ppm) chứng

minh nhóm acetonitrile đã gắn vào vị trí C-6 của vòng A.

147

Hình 4.60. Phổ HMBC của chất 130 (CD3OD)

Kết luận:

1, Hai auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (chất 125) và

maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (chất 116) đã được phân lập từ lá cây Chay

Bắc bộ (Artocapus tonkinensis), trong đó chất 116 có hàm lượng khá lớn trong lá

cây Chay (> 0,7%) đã được sử dụng như nguồn nguyên liệu cho việc điều chế

auronol maesopsin (chất 98).

2, Hợp chất auronol alphitonin (chất 82) đã được nghiên cứu bán tổng hợp từ

taxifolin (chất 81) một flavonoid được điều chế từ astilbin là hợp chất có hàm lượng

lớn ( ~ 1%) trong rễ cây Thổ phục linh (Smilax glabra). Như đã biết Thổ phục linh

là một cây thuốc rất phổ biến ở nước ta vì vậy được xem là nguồn nguyên liệu

phong phú cung cấp chất đầu cho việc bán tổng hợp alphitonin.

3, Đã nghiên cứu thành công tổng hợp toàn phần hai dẫn xuất methoxy của

alphitonin và maesopsin (chất 122 và chất 93). Các phương pháp tổng hợp các

aurone cũng đã được nghiên cứu với hiệu suất cao nhằm cung cấp chất đầu cho tổng

hợp toàn phần của các dẫn xuất auronol.

4, Đã nghiên cứu thành công phản ứng glucoside hóa auronol tổng hợp

auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (chất 125), đã chứng minh

148

được sự hình thành sản phẩm thế vào vị trí C-4 không thuận lợi trong tự nhiên của

auronol glucoside (Chất 116, chất 125).

5, Đã nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mang nhóm thế nitrile của các auronol

và auronol glucoside, đã nghiên cứu các điều kiện thích hợp để thu được các dẫn

xuất mang một nhóm thế nitrile (chất 126, chất 127, chất 130) và mang 2 nhóm thế

nitrile (chất 128, chất 129).

6, Cấu trúc của các sản phẩm phân lập và tổng hợp đã được khẳng định bằng

các phương pháp phổ IR, NMR và ESI-MS và so sánh với các tài liệu đã công bố.

Đã chứng minh các tín hiệu kép trong phổ NMR của các hợp chất auronol gắn

nhóm đường tại C-4 (chất 125, 116, 130) do đóng góp của phần đường trong phân

tử với giả thiết hình thành các diasteromer trong phân tử hoặc do hạn chế góc quay

của phần đường .

7. Đây là lần đầu tiên các hợp chất auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-

glucopyranoside (125), methoxyauronol 122, các auronol O-acetonitrile (126, 127,

128, 129, 130) được nghiên cứu tổng hợp.

4.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tổng hợp được

Hoạt tính của các auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside và

maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside được lý giải là do các phân tử glucoside như

là các dẫn chất có khả năng thấm sâu vào màng tế bào phát huy được hoạt tính của

các aglycone. Trong những năm gần đây các hoạt chất dược chứa nhóm nitrile (-

C≡N) đã được quan tâm nghiên cứu và ngày càng có nhiều thuốc được đưa vào sử

dụng lâm sàng trong việc điều trị các bệnh ung thư, những bệnh phụ thuộc estrogen

hay hệ hormone. Nhóm chức năng nitrile (–C≡N) là nhóm phân tử nhỏ có vai trò

như một nhóm hydroxyl hay nhóm carboxyl, có khả năng tạo liên kết hydro với các

amino acid, các khung protein enzyme hay với các phân tử nước trong phân tử. Như

vậy, các nhóm nitrile có thể thay thế mạch đường glucoside trong phân tử và trong

một số trường hợp, sự thay thế này đã tăng hiệu quả tác dụng một cách đáng kể so

với phân tử ban đầu. Vì vậy cùng với mục tiêu chính nghiên cứu tổng hợp auronol

glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) chúng tôi đã nghiên cứu tổng

hợp một số dẫn xuất nitrile của 2 auronol alphitonin (82) và maesopsin (98). Để

149

khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất tổng hợp được, các auronol glucoside

phân lập, các auronol và các dẫn xuất nitrile của chúng (Bảng 4.11) đã được chúng

tôi đánh giá hoạt tính qua 2 phép thử: 1 là phép thử độc tế bào với tế bào thường

NIH/3T3 và 4 dòng tế bào ung thư MCF7, LU-1, KB, HepG2; 2 là phép thử hoạt

tính kích thích sự phát triển của tế bào lympho.

Bảng 4.11. Danh sách ký hiệu, tên và cấu tạo hóa học của các mẫu thử

Công thức cấu tạo Nguồn gốc TT

Tên viết tắt, ký hiệu mẫu và tên CTPT, trọng lượng phân

đầy đủ tử

TAT2 (116) Từ lá cây Chay 1 Maesopsin -4-O-β- C21H22O11 450 (A.Tonkinensis) D-glucopyranoside

TAT6 (125); Từ lá cây Chay 2 Alphitonin-4-O-β- C21H22O12 466 (A.Tonkinensis) D-glucopyranoside

TAT6 (125);

3 Alphitonin-4-O-β- C21H22O12 466 Chất tổng hợp

D-glucopyranoside

Ag-TAT6 (82) C15H12O7 4 Chất tổng hợp Alphitonin 304

Ag-TAT2 (98) 5 Chất tổng hợp Maesopsin C15H12O6 288

150

T6DX1 (128)

6 Alphitonin-4,6-O- Chất tổng hợp C19H14N2O7 382 diacetonitrile

T6DX2 (126)

7 Alphitonin-4-O- Chất tổng hợp C17H13NO7 343 acetonitrile

DX3 (129)

Maesopsin- 8 Chất tổng hợp

C19H14N2O6 366 4,6-O- diacetonitrile

DX1NT (127)

9 Maesopsin-4-O- Chất tổng hợp C17H13NO6 343 acetonitrile

10 NT-TAT2 (130) Chất tổng hợp C23H23O11 489

4.2.1. Hoạt tính kích thích tế bào lympho

Các hợp chất auronol, auronol glucoside và các dẫn xuất nitrile của 2 auronol

đã được đánh giá hoạt tính kích thích tế bào lympho trong phần thực nghiệm. Các

thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và của các

dữ liệu. Kết quả thu được được trình bày trong Bảng 4.12.

Các kết quả Bảng 4.12 cho thấy ở các nồng độ nghiên cứu từ 100 – 0,8

(µg/mL) các hợp chất tổng hợp được có hoạt tính kích thích tế bào lympho yếu hoặc

không xác định, riêng hợp chất 126 là alphitonin-4-O-acetonitrile có hoạt tính kích

thích tế bào lympho rất mạnh với SC50 = 11,07 µg/mL. So sánh hoạt tính giữa 126

(nhóm acetonitrile tại OH-4) và 125 (nhóm glucopyranose tại OH-4) cho thấy việc

thay thế glucopyranose bởi nhóm acetonitrile tăng đáng kể hiệu quả kích thích tế

bào lympho. Tuy nhiên các kết quả này chỉ là những phép thử sơ bộ, để có các kết

luận chính xác cần có những nghiên cứu sâu hơn nữa trên các cytokine.

151

Bảng 4.12. Hoạt tính kích thích tế bào lympho của các mẫu thử

Conc. 100 20 4 0.8 SC50

g/mL (g/mL)

Non 0.86 1.14 1.06 0.96 Sample TAT2a (116)

determ.

>100 TAT6b (125) 1.36 1.30 1.05 1.02

>100 TAT6 TH 1.35 1.31 1.15 1.05

(125)

>100 Alphit. (82) 1,353 1,18 0,997 0,917

>100 Maesops. (98) 1.32 1.15 1.05 0.97 % Non T6DX1 (128) 0.81 1.31 1.20 1.13 inhib determ. ition 11.07 T6DX2 (126) 1.91 1.62 1.10 1.06

Non DX3 (129)

0.76 1.01 1.11 1.07 determ.

Non DX1N1 (127) 0.96 0.97 1.05 1.3 determ.

Non NT-TAT2 0.84 0.99 1.15 0.90

determ. (130)

* Concavalin là đối chứng dương được thử nghiệm ở các nồng độ 1 g/mL, 0,5 g/mL,

0,25 g/mL và 0,125 g/mL; a b là các hợp chất được phân lập từ lá cây Chay Bắc Bộ

(Artocarpus tonkinenesis A. Chev.)

*Concavalin A 1,20 1,13 1,09 1,06 3,5

4.2.2. Hoạt tính độc tế bào

Các hợp chất auronol, auronol glucoside và các dân xuất nitrile của 2 auronol

đã được đánh giá hoạt tính độc tế bào trong phần thực nghiệm. Các thí nghiệm được

lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và của các dữ liệu. Kết quả

thu được được trình bày trong Bảng 4.13.

152

Bảng 4.13. Hoạt tính độc tế bào của các mẫu thử trên tế bào thường NIH/3T3 và 4

dòng tế bào ung thư MCF7, LU-1, KB, HepG2

% Inhibitions

Conc. (g/ mL)

Ellipt. *

TAT2 (116)

TAT6 (125)

Alphit. (82)

Maeso. (98)

T6DX1 (128)

T6DX2 (126)

DX3 (129)

DX1N1 (127)

TAT6 TH (125)

NT- TAT2 (130)

NIH/3T3

100 -7.58

46.69 57.20 100.67 21.68

50.60

42.82 56.98 16.67

12.17

96.06

-1.05

5.37

6.15

23.52 1.51

18.24

13.12 15.44 3.79

4.94

75.63

-7.80

0.90

0.86

10.60

-5.31

10.49

-3.63

2.12

-2.30

2.25

52.14

0.8

-3.03

-3.50

-3.45

-8.5

-9.10

6.03

-6.56

1.31

-5.98

-3.89

3.25

IC50 >100 >100 >100

50.9 >100

98.56 > 100 83.73 >100 >100

0.31 MCF7

100 29.61 21.4

21.3

95.86 44.92

63.72

29.19 56.03 40.64

21.4

96.06

7.39

-1.4

24.42 15.82

17.97

1.02 20.77 18.14

-1.5

-1.7

75.63

3.48

-8.8

7.17 10.37

2.62

-0.42

4.68

2.6

-8.8

-1.7

52.14

0.8

1.57

-7.3

0.25

5.97

-2.31

5.40

0.54

6.69

-7.4

-8.7

3.25

72.16

>100 77.97 >100 >100

IC50 >100 >100 >100

51.41 >100

0.31 LU-1

100

36.01 9.05

9.10

92.29 28.23

63.36

42.47 48.75 35.27

10.65

96.06

13.70 0.48

0.47

25.80 10.79

39.04

27.33 29.58 19.70

5.67

75.63

7.27

-1.29

-1.25

5.77

7.7

12.99

20.16 10.31 11.77

3.23

52.14

0.8

4.40

-9.50

-9.52

-1.68

5.84

5.21

13.41 2.69 10.68

-3.97

3.25

35.66

>100 >100 >100 >100

IC50 >100 >100 >100

44.90 >100

0.31 KB

100 33.04 21.30 21.15 96.44 37.28

58.87 30.25 64.56 41.93

33.71

96.06

-4.54

5.59 5.60

21.94 10.03

7.88

-0.81

0.61 20.00

12.45

75.63

-5.78

-2.86 -2.76

8.52

3.19

-5.80

-9.33 -10.77 8.19

6.20

52.14

0.8

-10.22

1.20

3.25

>100

IC50 >100

0.31

-1.16 -1.21 >100 >100

2.14 -2.10 55.60 >100

-6.20 -12.35 -12.28 -12.19 85.51 >100 82.60 >100

HepG2

100

18.12 17.34 17.51 87.58

23.93

65.34 39.12

63.97 39.46 19.38

96.06

2.09

5.83

5.82 32.66

30.18 26.18

28.27 1.91

12.32

75.63

5.16

-4.12

-2.64

-2.67

4.20

5.28 12.12

12.25 0.89

5.76

52.14

0.95

0.8

-8.03

-5.36

-5.35

1.55

-3.11

0.18

-2.15

4.32

-10.23 -3.26

3.25

>100

49.10 >100

61.32 >100 >100

IC50 >100 >100 >100 30.77

0.31

153

*Nồng độ của Ellipticine là 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL,

(Ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm).

Kết quả trên Bảng 4.13 cho thấy ở các nồng độ nghiên cứu từ 100 – 0,8

(µg/mL), hầu hết các mẫu nghiên cứu đều không gây độc tế bào (IC50 > 100 µg/mL)

hoặc gây độc tế bào yếu (128, 129) với 2 nhóm thế nitrile trong phân tử. Mẫu

alphitonin (82) có hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình yếu với tất cả các dòng

tế bào ung thư và tế bào thường. Các mẫu còn lại không thể hiện hoạt tính ở nồng

độ nghiên cứu. Đặc biệt, hợp chất 126, kích thích tế bào lympho mạnh nhưng không

có sự ức chế ngay cả ở nồng độ 100 microgam / mL. Đây là một phát hiện tuyệt vời

để có thể nghiên cứu sâu hơn về hợp chất 126.

154

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận: Luận án đã hoàn thành các mục tiêu đề ra.

1. Đã nghiên cứu điều chế các auronol maesopsin và alphitonin từ nguồn nguyên

liệu thực vật trong nước.

- Từ kết quả phân lập 2 auronol glucoside là alphitonin-4-O-β-D-

glucopyranoside (116) maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116), trong dịch

chiết lá cây Chay Bắc Bộ (Artocapus tonkinensis A. Chev.), đã lựa chọn chất

116 có hàm lượng cao (> 0,07 % trọng lượng lá khô) điều chế auronol

maesopsin (98).

- Từ hàm lượng cao của astilbin trong rễ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall ex

Roxb.) một cây thuốc phổ biến ở nước ta, đã nghiên cứu quy trình phân lập

astilbin, điều chế taxifolin và tiến hành phản ứng đồng phân hóa taxifolin bán

tổng hợp alphitonin (82), quy trình tổng hợp được tối ưu hóa ngắn gọn với

hiệu suất cao.

2. Đã nghiên cứu tổng hợp toàn phần các methoxyauronol (chất 122, chất 93). Quy

trình được cải tiến ở bước tổng hợp các hợp chất aurone làm chất trung gian chìa

khóa. Bước tiếp theo là quá trình hydrate hóa aurone bao gồm khử hóa và oxy

hóa để thu được các hợp chất auronol 122 và 93.

3. Lần đầu tiên đã nghiên cứu tổng hợp thành công auronol glucoside là alphitonin-

4-O-β-D-glucopyranoside (125) một hợp chất được đánh giá có hoạt tính ức chế

miễn dịch cao nhưng có hàm lượng rất thấp trong lá cây Chay Bắc Bộ (Artocapus

tonkinensis A. Chev.) qua phản ứng glucosyl hóa alphitonin.

4. Cũng lần đầu tiên nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất O-acetonitrile của các

auronol alphitonin và maesopsin ở 1 vị trí C-4 (chất 126 , chất 127) hoặc ở cả 2

vị trí C-4 và C-6 (chất 128, chất 129) của vòng A; và đã tổng hợp các dẫn xuất

nitrile của auronol glucoside 116 là maesopsin-6-O-acetonitrile-glucopyranoside

(chất 130).

5. Hoạt tính kích thích tế bào lympho và hoạt tính độc tế bào trên các dòng tế bào

thường NIH/3T3 và 4 dòng tế bào ung thư MCF7, LU-1, KB và HepG2 của các

sản phẩm tổng hợp lần đầu tiên được khảo sát, kết quả khảo sát cho thấy:

155

- Hợp chất alphitonin-4-O-acetonitrile (chất 126) có hoạt tính kích thích tế bào

lympho mạnh nhất với SC50 = 11,07 µg/mL, các hợp chất còn lại là không xác

định.

- Hợp chất alphitonin-4-O-acetonitrile (chất 126) và hầu hết các hợp chất thu

được đều có hoạt tính ức chế yếu với tế bào thường và cả 4 dòng tế bào ung

thư với IC50 > 100 µg/mL. Các dẫn xuất thế 2 nhóm nitrile 128 và 129 có hoạt

tính độc tế bào mạnh hơn một chút với IC50 < 100 µg/mL. Alphitonin có hoạt

tính độc tế bào trung bình với IC50 là 50,90 µg/mL (NIH/3T3), 51,41 µg/mL

(MCF7), 44,90 µg/mL (LU-1), 55,60 µg/mL (KB) và 30,77 µg/mL (HepG2).

Kiến nghị:

Các hợp chất auronol alphitonin, maesopsin, các auronol glucoside và dẫn

xuất O-acetonitrile của chúng là những chất có tiềm năng hoạt tính sinh học cao còn

ít được nghiên cứu. Đề nghị được tiếp tục nghiên cứu tổng hợp chúng với quy mô

lượng lớn cho việc đánh giá hoạt tính sinh học sâu hơn của chúng.

156

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyễn Quốc Vượng, Vũ Văn Chiến, Nguyễn Thị Thu, Diệp Thị Lan Phương,

Phạm Văn Cường, Châu Văn Minh, “Khảo sát hàm lượng Astilbin trong rễ cây Thổ

phục linh (SMILAX GLABRA ROXB.) và bán tổng hợp alphitonin bằng phương

pháp đồng phân hóa taxifolin”, Tạp chí hóa học, (4/2013), T.51 (2AB), 208-212.

2. Diệp Thị Lan Phương, Pham Thi Hang, Vu Van Chien, Chau Van Minh, Pham

Van Cuong, Nguyen Quoc Vuong, “SYNTHESIS OF 4,6,3′,4′-

TETRAHYDROXYAURONES”, proceedings of the 2 nd VAST-KAST workshop

biodiversity and bio-active compounds, (2013), 152-158.

3. Quoc Vuong Nguyen, Phuong Diep Thi Lan, Hang Pham Thi, Van Chien Vu,

Tuan Nguyen Le, Van Minh Chau and Van Cuong Pham, “Facile, Protection-Free,

One-Pot Synthesis of Aureusidin”, Natural Product Communications, Vol. 9 (11)

2014, 1563-1566.

4. Diệp Thị Lan Phương, Phạm Thị Hằng, Vũ Văn Chiến, Nguyễn Quốc Vượng,

Phạm Văn Cường, "Synthesis of aurones from phloroglucinol" Tạp chí hóa học,

2015, 2E (53), 167.

5. Phuong Diep Thi Lan, Quoc Vuong Nguyen, Van Chien Vu, Tuan Nguyen

Le, Thi Hue Nguyen, Thi Hang Pham, Van Minh Chau and Van Cuong Pham,

"Synthesis of Auronol Derivatives and Their Immunostimulating Activity", Natural

Product Communication, 2015, 10(4), 591.

157

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Permender Rathee, Hema Chaudhary, Sushila Rathee, Dharmender Rathee and

Vikash Kumar, “Immunosuppressants: A Review”, The Pharma Innovation-

Journal, 2012, 1 (12), 90-101.

2. Lui Sing-Leung, “An Update on Immunosuppressive Medications in

Transplantation”, Special Feature, 2001, 6 (4), 1-6.

3. Trần Thị Mộng Hiệp, “Khuynh hướng điều trị thuốc ức chế miễn dịch trong ghép

thận và ghép gan ở trẻ em (2009)”, Hội nghị khoa học kỹ thuật công nghệ Đại

học y Phạm Ngọc Thạch, 2010, 14 (2), 5-7.

4. Barbara Kern and Robert Sucher, “Chapter 20: Clinical Immunosuppression in

Solid Organ and Composite Tissue Allotransplantation, Immunosuppression -

Role in Health and Diseases”, Dr. Suman Kapur (Ed.), ISBN: 978-953-51-0152-

9, InTech, 2012, 423-432.

5. Jan F. Gummert, Tuija Ikonen and Randall E. Morris, “Newer

Immunosuppressants drugs: A review”, Journal of the American Society of

Nephrology, 1999, 10, 1366-1380.

6. T. T. Thuy, C. Kamperdick, P.T. Ninh, T. P. Lien, T. T. P. Thao, T. V. Sung,

“Immunosuppressive auronol glycosides from Artocarpus tonkinensis”,

Pharmazie, 2004, 59 (4), 297-300.

7. Oballa, R. M.; Truchon, J. F.; Bayly, C. I.; Chauret, N.; Day, S.; Crane, S.;

Berthelette, C. , “A generally applicable method for assessing the electrophilicity

and reactivity of diverse nitrilecontaining compounds”, Bioorg.Med.Chem.Lett.

2007, 17, 998–1002.

8. Murphy, S. T.; Case, H. L.; Ellsworth, E.; Hagen, S.; Huband, M.; Joannides, T.;

Limberakis, C.; Marotti, K. R.; Ottolini, A.M.; Rauckhorst, M.; Starr, J.; Stier,

M.; Taylor, C.; Zhu, T.; Blaser, A.; Denny, W. A.; Lu, G. L.; Smaill, J. B.; Rivault,

F. “The synthesis and biological evaluation of novel series of nitrilecontaining

fluoroquinolones as antibacterial agents”, Bioorg. Med. Chem.Lett., 2007, 17,

2150–2155.

158

9. MacFaul, P. A.; Morley, A. D.; Crawford, J. J. “A simple in vitro assay for

assessing the reactivity of nitrile containing compounds”, Bioorg. Med. Chem.

Lett. 2009, 19, 1136–1138.

10. Fraser F. Fleming, Lihua Yao, P. C. Ravikumar, Lee Funk, and Brian C. Shook,

“Nitrile-Containing Pharmaceuticals: Efficacious Roles of the Nitrile

Pharmacophore”, J. Med. Chem., 2010, 53, 7902–7917.

11. Jianbo Xiao, Tingting Chen, Hui Cao, “Flavonoid glycosylation and biological

benefits”, Biotechnology Advances, 2014.

12. Attaur Rahman, Muhammad Iqbal Choudhary, Safdar Hayat, Abdul Majeed

Khan, and Aftab Ahmed, “Two New Aurones from Marine Brown Alga

Spatoglossum variabile”, Chem. Pharm. Bull., 2001, 49(1) 105-107.

13. Qyvind M. Andersen and Kenneth R. Markhan, “Flavonoids, chemistry,

biochemistry and application”, CRC Press, 2006.

14. Bruce A.Bohn, “Introduction to flavonoids”, Chemistry and biochemistry of

organic natural products, CRC Press, 1999.

15. Tsukasa lwashina, “The Structure and Distribution of the Flavonoids in plants”,

Journal of Plant Research, 2000, 113, 287-299

16. Jingjun Tan, “Dietary Isoflavones: Aglycones and Glycosides, Chapter 1.

General Introduction”, School of Food Science and Nutrition, 2011, 1-24.

17. Pedro F. Pinheiro and Gonçalo C. Justino, “Structural Analysis of Flavonoids

and Related Compounds – A Review of Spectroscopic Applications”,

Phytochemicals, 2012, p. 33-56 (538 pages).

18. Filippos Ververidis, Emmanouil Trantas, Carl Douglas, Guenter Vollmer, Georg

Kretzschmar, and Nickolas Panopoulos, “Biotechnology of flavonoids and other

phenylpropanoid-derived natural products. Part I: Chemical diversity, impacts on

plant biology and human health”, Biotechnology Jounal, 2007, 2, 1214–1234.

19. Pier-Giorgio Pietta, “Flavonoids as Antioxidants”, Journal Natural Products,

2000, 63,1035-1042.

159

20. Kelly E. Heim, Anthony R. Tagliaferro, Dennis J. Bobilya, “Flavonoid

antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships”, Journal

of Nutritional Biochemistry, 2002, 13, 572-584.

21. Alan Crozier, Indu B. Jaganath and Michael N. Clifford, “Plant Secondary

Metabolites, Chapter 1 Phenols, Polyphenols and Tannins: An Overview”,

Blackwell, 2006, 1-24.

22. Jin-Yi Han, Jin-Tae Hong, Sang-Yoon Nam, Ki-Wan Oh, “Flavonoids and their

free radical reactions”, Journal of Biomedical Research, 2009, 10 (2), 45-52.

23. Shashank Kumar and Abhay K. Pandey, “Chemistry and Biological Activities of

Flavonoids: An Overview”, The Scientific World Journal, 2013, Article ID

162750, 16 pages.

24. J. B. Harborne and C. A. Williams, “Anthocyanins and Other Flavonoids”,

Natural Product Reports, 1995, 12, 639- 657.

25. J. B. Harborne and C. A. Williams, “Anthocyanins and Other Flavonoids”,

Natural Product Reports, 1998, 15, 631- 652.

26. J. B. Harborne and C. A. Williams, “Anthocyanins and Other Flavonoids”,

Natural Product Reports, 2001, 18, 310- 333.

27. Christine A. Williams and Renée J. Grayer, “Anthocyanins and other

flavonoids”, Natural Product Reports, 2004, 21, 539- 573.

28. Nigel C. Veitch and Rene´e J. Grayer, “Flavonoids and their glycosides,

including anthocyanins”, Natural Product Reports, 2008, 25, 555–611.

29. Nigel C. Veitch and Rene´e J. Grayer, “Flavonoids and their glycosides,

including anthocyanins”, Natural Product Reports, 2011, 28, 1626–1695.

30. Amélia P. Rauter, Rui G. Lopes and Alice Martins, “C-Glycosylflavonoids:

Identification, Bioactivity and Synthesis”, Natural Product Communications,

2007, 2 (11), 1175-1196.

31. Ahcène Boumendjel, Frédéric Bois, Anne-Marie Mariotte, Gwenaëlle Conseil,

and Attilio Di Petro, “Synthesis and Biological Activity of 4-Alkoxy Chalcones:

160

Potential Hydrophobic Modulators of P-Glycoprotein-Mediated Multidrug

Resistance”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1999, 7, 2691-2695.

32. Ahcène Boumendjel, Frédéric Bois, Chantal Beney, Anne-Marie Mariotte,a

Gwenaëlle Conseil and Attilio Di Pietro,“B-ring Substituted 5,7-

Dihydroxyflavonols with High-Affinity Binding to P-Glycoprotein Responsible

for Cell Multidrug Resistance”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,

2001, 11, 75-77.

33. Ahcène Boumendjel, Attilio Di Pietro, Charles Dumontet, Denis Barron,

“Recent advances in the discovery of flavonoids and analogs with high-affinity

binding to P-glycoprotein responsible for cancer cell multidrug resistance”,

Medicinal Research Reviews, 2002, 22, 512–529.

34. Ahcène Boumendjel, “Aurones: a subclass of ﬂavones with promising biological

potential, Curr Med Chem, 2003, 10, 2621-30.

35. Ahcène Boumendjel, Mohamed Hadjeri, Magali Barbier, Xavier Ronot, Anne-

Marie Mariotte and Jean Boutonnat, “Modulation of P-Glycoprotein-Mediated

Multidrug Resistance by Flavonoid Derivatives and Analogues”, J. Med. Chem.,

2003, 46, 2125-213.

36. Radka Václavíková, Ahcene Boumendjel, Marie Ehrlichová, Jan Ková and Ivan

Gut, “Modulation of paclitaxel transport by flavonoid derivatives in human

breast cancer cells. Is there a correlation between binding affinity to NBD of P-

gp and modulation of transport?”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2006, 14,

4519–4525.

37. Gilles Comte, Jean-Baptiste Daskiewicz, Christine Bayet, Gwenae¨lle Conseil,

Armelle Viornery- Vanier, Charles Dumontet, Attilio Di Pietro, and Denis

Barron, “C-Isoprenylation of Flavonoids Enhances Binding Affinity toward P-

Glycoprotein and Modulation of Cancer Cell Chemoresistance”, J . Med. Chem.,

2001, 44, 763-768.

38. Frédéric Bois, Chantal Beney, Ahcène Boumendjel, Anne-Marie Mariotte,

Gwenaëlle Conseil, and Attilio Di Pietro, “Halogenated Chalcones with High-

161

affinity Binding to P-Glycoprotein: Potential Modulators of Multidrug

Resistance”, J. Med. Chem., 1998, 41, 4161-4164.

39. Ahcène Boumendjel, Chantal Beney, Nabajyoti Deka, Anne- Marie Mariotte,

Martin Ata Lawson, Doriane Trompier, Hélène Baubichoncortay, and Attilio Di

Pietro, “4-Hydroxy-6-methoxyaurones with High-Affinity Binding to Cytosolic

Domain of P-Glycoprotein”, Chem. Pharm. Bull., 2002, 50 (6), 854—856.

40. Sridhar Mani, Chenguang Wang, Kongming Wu, Richard Francis and Richard

Pestell, “Cyclin- dependent kinase inhibitors: novel anticancer agents”, Exp.

Opin. Invest. Drugs, 2000, 9 (8), 1849- 1870.

41. Marcos Malumbres and Mariano Barbacid, “Cell cycle, CDKs and cancer:

a changing paradigm”, Nature Reviews Cancer, 2009, 9, 153-166.

42. Romain Haudecoeur, “Pharmacochimie des aurones pour la modulation

d′enzymes ”, Thèse cotutelle internationale, Université de Genève , 2011, 293

papes.

43. Joseph Schoepfer, Heinz Fretz, Bhabatosh Chaudhuri, Lionel Muller, Egge

Seeber, Laurent Meijer, Olivier Lozach, Eric Vangrevelinghe, and Pascal Furet,

“Structure-Based Design and Synthesis of 2-Benzylidene-benzofuran-3-ones as

Flavopiridol Mimics”, J. Med. Chem., 2002, 45, 1741-1747.

44. Kenneth A. Jacobson and Zhan-Guo Gao, “ Adenosine receptors as therapeutic

targets”, Nature reviews, 2006, 5, 247- 264.

45. Kenneth A. Jacobson, Stefano Moro, John A. Manthey, Patrick L.

West and Xiao-duo Ji, “Interaction of flavones and other phytochemiscals with

adenosine receptors”, Adv Exp Med Biol., 2002, 505, 163–171.

46. Li Huang, Monroe E. Wall, Mansukh C. Wani, Hernán Navarro, Thawatchai

Santisuk, Vichai Reutrakul, Eun-Kyoung Seo, Norman R. Farnsworth, and A.

Douglas Kinghorn, “New Compounds with DNA Strand-Scission Activity from

the Combined Leaf and Stem of Uvaria hamiltonii”, J. Nat. Prod., 1998, 61, 446-

450.

162

47. A. Douglas Kinghorn, Norman R. Farnsworth, D. Doel Soejarto Geoffrey A.

Cordell1, John M. Pezzuto1, George O. Udeani, Mansukh C. Wani, Monroe E.

Wall, Hernán A. Navarro, Rob A. Kramer, Ana T. Menendez, Craig R. Fairchild,

Kate E. Lane, Salvatore Forenza, Dolotrai M. Vyas, Kin S. Lam and Yue-Zhong

Shu, “Novel strategies for the discovery of plantderived anticancer agents”, Pure

Appl. Chem., 1999, 71, 1611-1618.

48. Robert S. Kerbel, “Tumor angiogenesis: past, present and near future”,

Carcinogenesis, 2000, 21 (3), 505- 515.

49. Cheng H, Zhang L, Liu Y, Chen S, Cheng H, Lu X, Zheng Z, Zhou GC,

“Design, synthesis and discovery of 5-hydroxyaurone derivatives

as growth inhibitors against HUVEC and some cancer cell lines”. European

Journal of Medicinal Chemistry, 2010, 45, 5950-5957.

50. Douglas Hanahan and Judah Folkman, “ Patterns and Emerging Mechanisms of

the Angiogenic Switch during Tumorigenesis”, Cell, 1996, 86, , 353–364.

51. Judah Folkman, “Angiogenesis”, Annu. Rev. Med., 2006, 57,1–18.

52. T. Browder, C.E. Butterfield, B.M. Kräling, B. Shi, B. Marshall, M.S. O′Reilly,

J. Folkman, “Antiangiogenic Scheduling of Chemotherapy Improves Efficacy

against Experimental Drug-resistant Cancer”, Cancer Res.. 2000, 60, 1878-1886.

53. Judah Folkman, “ Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery?”,

Nat. Rev. Drug Discov., 2007, 6,273-286.

54. Martin E. Eichhorn, Sebastian Strieth, Marc Dellian, “Anti-vascular tumor

therapy: recent advances, pitfalls and clinical perspectives”, Drug Resistance

Updates, 2004, 7, 125–138.

55. Hong-May Sim, Chong-Yew Lee, Pui Lai Rachel Ee, Mei-Lin Go,

“Dimethoxyaurones: Potent inhibitors of ABCG2 (breast cancer resistance

protein)”, European journal of pharmaceutical sciences, 2008, 35, 293- 306.

56. Hong May Sim, Ker Yun Loh, Wee Kiang Yeo, Chong Yew Lee, and Mei Lin

Go, “Aurones as Modulators of ABCG2 and ABCB1: Synthesis, and Structure–

Activity Relationships”, Chem.Med.Chem., 2011, 6, 713 – 724.

163

57. Hans E. Westenburg, Kon-Joo Lee, Sang Kook Lee, Harry H. S. Fong, Richard

B. van Breemen, John M. Pezzuto, and A. Douglas Kinghorn, “Activity-Guided

Isolation of Antioxidative Constituents of Cotinus coggygria”, J. Nat. Prod.,

2000, 63, 1696-1698.

58. Anastasia Detsi, Maya Majdalani, Christos A. Kontogiorgis, Dimitra

Hadjipavlou-Litina, Panagiotis Kefalas, “Natural and synthetic 2′-hydroxy-

chalcones and aurones: Synthesis, characterization and evaluation of the

antioxidant and soybean lipoxygenase inhibitory activity”, Bioorg. Med. Chem.,

2009, 17, 8073–8085.

59. Somepalli Venkteswarlu, Gopala K. Panchagnula & Gottumukkala V.

Subbaraju, “Synthesis and Antioxidative Activity of 3′,4′,6,7-

Tetrahydroxyaurone, a Metabolite of Bidens frondosa”, Bioscience,

Biotechnology, and Biochemistry, 2004, 68(10), 2183-2185.

60. Oliver Kayser and Albrecht F. Kiderlen, “ Leishmanicidal Activity of Aurones”,

Tokai J Exp Clin Med., 1999, 23 (6), 423-426.

61. Oliver Kaysera, Ming Chenb, Arsalan Kharazmib and Albrecht F. Kiderlen,

“Aurones Interfere with Leishmania major Mitochondrial Fumarate Reductase”,

Z. Naturforsch., 2002, 57c, 717- 720.

62. Oliver Kayser, Albrecht F. Kiderlen, Folkens U. and Kolodziej H. “In vitro

leishmanicidal activity of aurones”, Planta Med., 1999, 65, 316 -319.

63. Oliver Kayser, Albrecht F. Kiderlen, Brun R., “In vitro activity of aurones

against Plasmodium falciparum strains K1 and NF54”, Planta Med., 2001, 67(8),

718-721.

64. Oliver Kayser, Albrecht F. Kiderlen, S.L. Croft, “Natural products as

antiparasitic drugs”, Parasitol Res, 2003, 90, S55–S62.

65. Florence Souard, Sabrina Okombi, Chantal Beney, Séverine Chevalley, Alexis

Valentin, Ahcène Boumendjel, “1-Azaaurones derived from the naturally

ccurring aurones as potential antimalarial drugs”, Bioorg. Med. Chem., 2010, 18,

5724–5731.

164

66. Patent Evaluation, “Antifungal - antimicrobial aurone derivatives”, Exp. Opin.

Ther. Patents, 1998, 8(2), 191- 193.

67. Babasaheb P. Bandgar, Sachin A. Patil, Balaji L. Korbad, Satish C. Biradar,

Shivraj N. Nile, Chandrahasya N. Khobragade, “Synthesis and biological

evaluation of a novel series of 2,2-bisaminom ethylated aurone analogu es as

anti-inflammatory and antimicrobial agents”, European Journal of Medicinal

Chemistry, 2010, 45, 3223- 3227.

68. Seo Young Shin, Min Cheol Shin, Ji-Sun Shin, Kyung-Tae Lee, Yong Sup Lee,

“Synthesis of aurones and their inhibitory effects on nitric oxide and PGE2

productions in LPS-induced RAW 264.7 cells”, Bioorg. Med. Chem. Lett. , 2011,

21, 4520–4523.

69. Chwan -Fwu Lin, Yi-Ju Chen, Yu-Ling Huang, Wen-Fei Chiou, Jen-Hwey Chiu

and Chien-Chih Chen, “A new auronol from Cudrania cochinchinensis”, Journal

of Asian Natural Products Research, 2012, 14(7), 704–707.

70. Ai-Lin Liu, Hai-Di Wang, Simon MingYuen Lee, Yi-Tao Wang, Guan-Hua Du,

“Structure–activity relationship of flavonoids as influenza virus neuraminidase

inhibitors and their in vitro anti-viral activities”, Bioorg. Med. Chem., 2008, 16,

7141–7147.

71. Romain Haudecoeur, Abdelhakim Ahmed-Belkacem, Wei Yi, Antoine Fortune,

Rozenn Brillet, Catherine Belle, Edwige Nicolle, Coralie Pallier, Jean-Michel

Pawlotsky, and Ahcene Boumendjel, “Discovery of Naturally Occur ring

Aurones That Are Potent Allosteric Inhibitors of Hepatitis C Virus RNA-Depe

ndent RNA Polymerase”, J. Med. Chem., 2011, 54, 5395–5402.

72. Carole Dubois, Romain Haudecoeur, Maylis Orio, Catherine Belle, Constance

Bochot, Ahcène Boumendjel, Renaud Hardré, Hélène Jamet, Marius Réglier,

“Versatile effects of aurone structure on mushroom tyrosinase activity”,

Chem.Bio.Chem., 2012, 13, 559 – 565.

73. Sabrina Okombi, Delphine Rival,Se´bastien Bonnet, Anne-Marie Mariotte, Eric

Perrier, and Ahcène Boumendjel, “Discovery of Benzylidenebenzofuran-3(2H)-

165

one (Aurones) as Inhibitors of Tyrosinase Derived from Human Melanocytes”, J.

Med. Chem., 2006, 49, 329-333.

74. Barbara MLinar, Janja Marc, Andrej Janež, Marija Pfeifer, “Molecular

mechanisms of insulin resistance and associated diseases”, Clinica Chimica Acta,

2007, 375, 20 – 35.

75. Cristina Coman, Olivia Dumitriţa Rugină, Carmen Socaciu, “Plants and Natural

Compounds with Antidiabetic Action”, Not Bot Horti Agrobo, 2012, 40(1), 314-

325.

76. Mi-Young Song, Gil-Saeng Jeong, Kang-Beom Kwon, Sun-O Ka, Hyun-Young

Jang, Jin-Woo Park, Youn-Chul Kim, and Byung-Hyun Park, “Sulfuretin protects

against cytokine-induced β-cell damage and prevents streptozotocin-induced

diabetes”, Exp Mol Med., 2010, 42(9), 628–638.

77. L. K. Dung, T. T. Thuy, T. V. Sung, P. T. Ninh, “Phenol glycosides from

Vietnamese Artocarpus tonkinensis”, Tạp chí dược liệu, 2004, 9 (1), 2-6.

78. Harkat H, Blanc A, Weibel JM, Pale P., “Versatile and expeditious synthesis of

aurones via AuI-catalyzed cyclization”, Journal of Organic Chemistry, 2008, 73,

1620-1623.

79. Jong TT, Leu SJ. “Intramolecular cyclisation catalysed by silver(I) ion; a

convenient synthesis of aurones”. Journal of the Chemical Society, 1990, 1, 423-

424.

80. Changqing Liu, Zhannan Zhang, Jitan Zhang, Xing Liu, and Meihua Xie,

“Regioselective Synthesis of Aurone Derivatives via PBu3-Catalyzed Cyclization

of 2-Alkynoylphenols”, Chin. J. Chem., 2014, 32, 1233-1237.

81. Zhong-Wei An, Catellani M, Chiusoli GP. “Palladium-catalyzed synthesis of

aurone from salicyloyl chloride and phenylacetylene”, Journal of Organometallic

Chemistry, 1990, 397, 371-373.

82. G. A. Kraus, V. Gupta., “Divergent approach to flavones and aurones via

dihaloacrylic acids. Unexpected dependence on the halogen atom”, Org. Lett.

2010, 12, 5278-5280.

166

83. Nishida J, Kawataba J., “DPPH radical scavenging reaction of hydroxy- and

methoxychalcones”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2006, 70,

193-202.

84. Chong-Yew Lee, Eng-Hui Chew, Mei-Lin Go, “Functionalized aurones as

inducers of NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 that activate AhR/XRE and

Nrf2/ARE signaling pathways: Synthesis, evaluation and SAR”, European

Journal of Medicinal Chemistry, 2010, 45, 2957-2971.

85. Ahmed Mustafa, “The Chemistry of heterocyclic compounds. Chapter V.

Benzofuranone”, John Wiley & Sons. Inc., 1974, 210- 296.

86. Laszlo Kurti, Barbara Czako, “Strategic Applications of Named Reactions in

Organic Synthesis: Background and Detailed Mechanisms”, Academic Press,

2005, 758 papes.

87. Eric Perrier, Okombi Sabrina, Rival Delphine, Ahcène Boumendjel, Mariotte

Anne-Marie, “A method of cosmetic depigmentation care by applying at least

one aurone”, European Patent Application, EP 1 709 964 A2, 2006.

88. Zerong Wang, “Comprehensive Organic Name Reactions and Reagents. 334,

Houben-Hoesch Reaction”, John Wiley & Sons. Inc., 2010, 1496- 1500.

89. Jie Jack Li, “Name Reactions: A Collection of Detailed Mechanisms and

Synthetic Appilication, Fifth Edition”, Springer International Publishing

Switzerland, 2014, 325-326.

90. C. Brehm, P. J. Zimmermann, S. Zemolka, A. Palmer, W. Buhr, S. Postius, W.-

A. Simon, M. Herrmann, “Pharmaceutically active dihydrobenzofurane-

substituted benzimidazole derivatives”, PCT Int. Appl. WO 2008/084067, 2008.

91. Bradford P. Mundy, Michael G. Ellerd, Frank G. Favaloro, “Name reactions and

reagents in organic synthesis”, A John Wiley & Sons, Inc., 2005.

92. Alka N Choudhary, Vijay Juyal, “Synthesis of chalcone and their derivetives as

antimicrobial agents”, Int J Pharm Pharm Sci, 2011, 3 (3), 125-128.

167

93. Sabrina Okombi, “Recherche et etude de molécules à activité antityrosinase et

leur utilisation comme agents d´epigmentants en dermo cosmétique”. Organic

chemistry. Thèse de Doctorat, Université Joseph Fourier - Grenoble , 2005.

94. Beney C, Mariotte AM and Boumendjel A, “An efficient synthesis of 4,6-

dimethoxyaurones”, Heterocycles, 2001, 55, 967–972.

95. Min Zhang, Xiao-Hua Xu, Yan Cui, Long-Guan Xiea and Chui-Hua Kong, "

Synthesis and herbicidal potential of substituted a urones”, Pest Manag Sci,

2012, 68(11), 1512-22.

96. G. Büchi, M. Weinreb, “Total syntheses of aflatoxins M1 and G1 and an

improved synthesis of aflatoxin B1”, J. Am. Chem. Soc. 1971, 93, 746-752.

97. Bolek D, Gütschow M. “Preparation of 4,6,3′,4′-tetrasubstituted aurones via

aluminium oxide-catalyzed condensation”, Journal of Heterocyclic Chemistry,

2005, 42, 1399-1403.

98. Nadri H, Pirali-Hamedani M, Moradi A, Sakhteman A, Vahidi A, Sheibani

V, Asadipour A, Hosseinzadeh N, Abdollahi M, Shafiee A, Foroumadi A., “5,6-

Dimethoxybenzofuran-3-one derivatives: a novel series of dual

Acetylcholinesterase/Butyrylcholinesterase inhibitors bearing benzyl pyridinium

moiety”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 21(1), 15

99. Chuang Chuang Li, Zhi Xiang Xie, Yan Dong Zhang, Jia Hua Chen, and Zhen

Yang, “Total synthesis of wedelolactone”. J. Org Chem, 2003, 68, 8500–8504.

100. Walter M. Bryant 111, George F. Huhn, “A Practical Preparation of 7-

Methoxy-3(2H)-benzofuranone”, Synthetic communications, 1995, 25(6), 915-

920.

101. Varma RS, Varma M., “Alumina-mediated condensation. A simple synthesis of

aurones”, Tetrahedron Letters, 1992, 33, 5937-5940.

102. Venkateswarlu S, Panchagnula GK, Subbaraju GV., “Synthesis and

antioxidative activity of 3′,4′,6,7-tetrahydroxyaurone, a metabolite of Bidens

frondasa”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2004, 68, 2183-2185.

168

103. Morimoto M, Fukumoto H, Nozoe T, Hagiwara A, Komai K., “Synthesis and

insect antifeedant activity of aurones against Spodoptera litura larvae”, Journal

of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55, 700-705.

104. Manjulatha, K.; Srinivas, S.; Mulakayala, N.; Rambabu, D.; Prabhakar, M.;

Arunasree, K.M.; Alvala, M.; Rao, M.V.B.; Pal, M., “Ethylenediamine diacetate

(EDDA) mediated synthesis of aurones under ultrasound: Their evaluation as

inhibitors of SIRT1”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22,

6160–6165.

105. T. A. Geissman, J. B. Harborne, “Anthochlor pigments. X. Aureusin and

cernuoside”. J. Am. Chem. Soc., 1955, 77, 4622-4624.

106. Didier Villemin, Benoit Martin and Nathalie Bar, “Application of Microwave

in Organic Synthesis. Dry Synthesis of 2-Arylmethylene-3(2)-

naphthofuranones”, Molecules, 1998, 3, 88–93.

107. Wen-Sen Li, Zhenrong Guo, John Thornton, Kishta Katipally, Richard

Polniaszek, John Thottathil, Truc Vu and Michael Wong, “Synthesis of

substituted 2,3-dihydrobenzofuran in a process involving a facile acyl

migration”, Tetrahedron Letters, 2002, 43, 1923–1925.

108. Andre´ Fougerousse, Emmanuel Gonzalez, and Raymond Brouillard, “A

Convenient Method for Synthesizing 2-Aryl-3-hydroxy-4-oxo-4H-1-benzopyrans

or Flavonols”, J. Org. Chem., 2000, 65, 583-586.

109. Michael G. Thomas, Chris Lawson, Nigel M. Allanson, Bruce W. Leslie,

Joanna R. BottomLey, Andrew McBride and Oyinkan A. Olusanya, “A Series of

2(Z)-2-Benzylidene-6,7-dihydroxybenzofuran-3(2H)-ones as Inhibitors of

Chorismate Synthase”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 423–426.

110. Nicholas J. Lawrence, David Rennison, Alan T. McGown and John A.

Hadfield, “The Total Synthesis of an Aurone Isolated from Uvaria hamiltonii:

Aurones and Flavones as Anticancer Agents”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003,

13, 3759–3763.

169

111. Zhao X, Liu J, Xie Z, Li Y., “A one-pot synthesis of aurones from substituted

acetophenones and benzaldehydes: A concise synthesis of aureusidin”, Synthesis,

2012, 44, 2217–2224.

112. Hai Chen, Xiao-Dong Qi and Ping Qiu, “A novel synthesis of aurones: Their in

vitro anticancer activity against breast cancer cell lines and effect on cell cycle,

apoptosis and mitochondrial membrane potential”, Bangladesh J Pharmacol,

2014, 9, 501-510.

113. Suresh Kumar, “An improved one-pot and eco-friendly synthesis of aurones

under solvent-free conditions”, Green Chemistry Letters and Reviews, 2014, 7

(1), 95-99.

114. Fang Dong a,b, Cheng Jian, Fei Zhenghao, Gong Kai, Liu Zuliang, “Synthesis

of chalcones via Claisen–Schmidt condensation reaction catalyzed by acyclic

acidic ionic liquids”, Catalysis Communications, 2008, 9, 1924–1927.

115. Hua Qian and Dabin Liu, “Synthesis of Chalcones via Claisen-Schmidt

Reaction Catalyzed by Sulfonic Acid-Functional Ionic Liquids”, Ind. Eng. Chem.

Res., 2011, 50, 1146–1149.

116. Suvitha Syam, Siddig Ibrahim Abdelwahab, Mohammed Ali Al-Mamary and

Syam Mohan. “Synthesis of Chalcones with Anticancer Activities”, Molecules

2012, 17, 6179-6195.

117. Ezzat Rafiee, Farzaneh Rahimi, “A green approach to the synthesis of

chalcones via Claisen-Schmidt condensation reaction using cesium salts of 12-

tungstophosphoric acid as a reusable nanocatalyst”, Monatsh Chem, 2013, 144,

361–367.

118. M.R.Jayapal and N.Y. Sreedhar, “Synthesis and characterization of 4-

hydroxybchalcone by aldol condensation using SOCl2/EtOH”, Int J Curr Pharm

Res, 2010, 2 (4), 60-62.

119. Yu Wei, Jinghua Tang, Xuefeng Cong and Xiaoming Zeng, “ Practical Metal-

free Synthesis of Chalcone Derivatives via a Tandem Cross-Dehydrogenative-

Coupling/Elimination Reaction”, Greeen chemistry, 2013, S1-S51

170

120. K.J. Jarag, D.V. Pinjari, A.B. Pandit, G.S. Shankarling, “Synthesis of chalcone

(3-(4-fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one): advantage of

sonochemical method over conventional method”, Ultrasonics Sonochemistry,

2011, 18, 617–623.

121. K.L. Ameta , Nitu S. Rathore and Biresh Kumar, “ Synthesis of some novel

chalcones and their facile one - pot conversion to 2-aminobenzene-1,3-

dicarbonitriles using malononitrile”, Analele Universităţii din Bucureşti – Chimie

(serie nouă), India, 2011, 20 (1),15 – 24.

122. Haruo Sekizaki, “Synthesis of 2-benzylidene-3(2H)-benzofuran-3-ones

(aurones) by oxidation of 2′-hydroxychalcones with mercury(II) acetate”. Bull.

Chem. Soc. Jpn. 1988, 61, 1407-1409.

123. N. N. Agrawal, P. A. Soni., “A new process for the synthesis of aurones by

using mercury (II) acetate in pyridine and cupric bromide in dimethyl sulfoxide”,

Indian J. Chem., 2006, 45B, 1301-1303.

124. Clemens Zwergela, François Gaaschta,b, Sergio Valentea, Marc Diederichb,

Denyse Bagrela and Gilbert Kirsch, “Aurones: Interesting Natural and Synthetic

Compounds with Emerging Biological Potential”, Natural Product

Communications, 2012, 7 (3), 389- 394.

125. Céu M. Sousa, Jérôme Berthet, Stephanie Delbaere, Paulo J. Coelho, “ One pot

synthesis of aryl s ubstituted aurones”, Dyes and Pigments., 2011, 92, 537-541.

126. Marina Roussaki, Sofia Costa Lima, Anna-Maria Kypreou, Panagiotis Kefalas,

Anabela Cordeiro da Silva and Anastasia Detsi, “Aurones: A Promising

Heterocyclic Scaffold for the Development of Potent Antileishmanial Agents”,

International Journal of Medicinal Chemistry, 2012, 1-8.

127. Lévai A, Tókés AL., “Synthesis of aurones by the oxidative rearrangement of

2′-hydroxychalcones with thallium (III) nitrate”, Synthetic Communication, 1982,

12, 701-707.

171

128. K. Thakkar, M. Cushman., “A novel oxidative cyclization of 2′-

hydroxychalcones to 4-methoxyaurones by thallium(III)nitrate”, Tetrahedron

Lett. 1994, 35, 6441-6444.

129. K. Thakkar, M. Cushman., “A novel oxidative cyclization of 2′-

hydroxychalcones to 4,5-dialkoxyaurones by thallium(III) nitrate”, J. Org. Chem.

1995, 60, 6499-6510.

130. G. Bose, E. Mondal, A. T. Khan, M. J. Bordoloi, “An environmentally benign

synthesis of aurones and flavones from 2′-acetoxychalcones using n-

tetrabutylammonium tribromide”, Tetrahedron Lett., 2001, 42, 8907-8909.

131. Birch, A. J.; Ritchie, E.; Speake, R. N., “The Structure of Alphitonin”, J.

Chem. Soc, 1960, 3593 −3599.

132. Paul W. Elsinghorst, Taner Cavlar, Anna Muller, Annett Braune, Michael

Blaut, and Michael Gutschow, "The Thermal and Enzymatic

Taxifolin−Alphitonin Rearrangement", J. Nat. Prod., 2011, 74, 2243−2249.

133. J. G. Sweeny et al., “Sodium - ammonia reduction of flavonols,” J. Org.

Chem., 1979, 44 (9), 1494 - 1496.

134. E. Kiehlmann et al., “Isomerization of dihydroquercetin”, J. Nat. Prod., 1995,

58 (3), 450-455.

135. Reik Loeser, Marta Chlupacova, Ales Marecek, Veronika Opletalova, Michael

Guetschov, “Synthetic studies towards the preparation of 2-benzyl-2-

hydroxybenzofuran-3(2H)-one, the Prototype of Natural Occuring Hydrated

Auronols”, Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 2597 - 2601.

136. A Srikrishna & M Mathews, “Synthesis of dimethyl ether of marsupsin”,

Indian Journal of Chemistry , 2009, 48B, 383-385.

137. Nicola Pozzesi, Sara Pierangeli, Carmine Vacca, Lorenzo Falchi, Valentina

Pettorossi, Maria Paola Martelli, Trinh Thi Thuy, Pham Thi Ninh, Anna Marina

Liberati, Carlo Riccardi, Tran Van Sung, Domenico V Delfino, “Maesopsin-4-O-

β-D-glucoside, a natural compound isolated from the leaves of Artocarpus

172

tonkinensis, inhibits proliferation and up-regulates HMOX1, SRXN1 and BCAS3

in acute myeloid leukemia”. Journal of Chemotherapy, 2011, 23 (3), 150-157

138. Tran Van Loc, Tran Van Chien, Tran Duc Quan, Pham Van Ly, Trinh thi Thuy,

Tran Van Sung, “Isolation of dihydrokaempferol 3-O-α-l-rhamnopyranoside and

astibin from the Similax glabra roots and their transformation into auronols”,

Vietnamese Academy of Science and Technology, 2007, 45(3A), 138-141.

139. Caroline Emilie Paul, “Protecting Group-Free Synthesis of Glycosides”,

Master of Sciences, Graduate Department of Chemistry, University of Toronto,

2010.

140. Marco Brito-Arias, “Synthesis and Characterization of Glycosides”, Springer

Science & Business Media, 2007, 351 papes.

141. Momcilo Miljkovic´, “Carbohydrates, Synthesis, Mechanisms, and

Stereoelectronic Effects”, Springer Science & Business Media, 2009, 543 papes.

142. Zdeněk Wimmer, Lucie Pechová and David Šaman, “Koenigs-Knorr Synthesis

of Cycloalkyl Glycosides”, Molecules, 2004, 9, 902-912.

143. Jin-Hwan Kim, Hai Yang, Jin Park, and Geert-Jan Boons, “A General Strategy

for Stereoselective Glycosylations”, J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 12090-12097.

144. Nguyễn Quốc Vượng, Vũ Văn Chiến, Nguyễn Thị Thu, Diệp Thị Lan Phương,

Phạm Văn Cường, Châu Văn Minh, “Khảo sát hàm lượng Astilbin trong rễ cây

Thổ phục linh (Smilax Glabra Roxb.) và bán tổng hợp Alphitonin bằng phương

pháp đồng phân hóa Taxifolin”, Tạp chí hóa học, 2013, T 51, 208-212.

145. Quoc Vuong Nguyen, Phuong Diep Thi Lan, Hang Pham Thi, Van Chien Vu,

Tuan Nguyen Le, Van Minh Chau and Van Cuong Pham, “Facile, Protection-

Free, One-Pot Synthesis of Aureusidin”, Natural Product Communications, 2014,

9 (11), 1563-1566.

Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của alphitonin, maesopsin và một số dẫn xuất của chúng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

DIỆP THỊ LAN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA ALPHITONIN,

MAESOPSIN VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA CHÚNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ……..….***…………

DIỆP THỊ LAN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

ALPHITONIN, MAESOPSIN VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT

CỦA CHÚNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. NGUYỄN QUỐC VƯỢNG

2. PGS. TS. TRỊNH THỊ THỦY

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Quốc Vượng và

PGS.TS. Trịnh Thị Thủy. Các số liệu và kết quả được nêu trong

luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác.

Tác giả luận án

LỜI CẢM ƠN

Diệp Thị Lan Phương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN

Imhibitory Concentration 50% (nồng độ ức chế 50%)

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Các hợp chất flavonoid

1.2. Hoạt tính sinh học của aurone và auronol

˙־ ), gốc hydroxyl

1.3. Tổng hợp aurone

1.4. Tổng hợp auronol

1.5. Các phương pháp tổng hợp glycoside

1.6. Hợp chất chứa nitrile trong hóa dược và phương pháp tổng hợp dẫn

xuất nitrile

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.2. Mục tiêu

2.3. Phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Phân lập và tổng hợp các auronol và auronol glucoside

3.2. Khảo sát hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phân lập và tổng hợp các auronol và auronol glucoside

4.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tổng hợp được

% Inhibitions

Ellipt. *

T6DX1 (128)

T6DX2 (126)

NIH/3T3

50.9 >100

98.56 > 100 83.73 >100 >100

0.31

MCF7

51.41 >100

0.31

LU-1

44.90 >100

0.31

KB

0.31

2.14 -2.10 55.60 >100

HepG2

0.31

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng