Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tổng hợp, biến tính bề mặt hệ nano dendrimer polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

NGUYỄN THỊ THỊNH

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP, BIẾN TÍNH BỀ MẶT HỆ NANO DENDRIMER POLYAMIDOAMIN MANG THUỐC KHÁNG VIRUS HIV

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP, BIẾN TÍNH BỀ MẶT HỆ NANO DENDRIMER POLYAMIDOAMIN MANG THUỐC KHÁNG VIRUS HIV

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 9 44 01 14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. GS.TS. NGUYỄN CỬU KHOA

2. TS. HỒ VIỆT ANH

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022

LỜI CAM ĐOAN

Công trình được thực hiện tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh và Viện Kiểm nghiệm

thuốc Thành phố Hồ Chí Minh

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và được sự hướng dẫn khoa

học của GS. TS. Nguyễn Cửu Khoa và TS. Hồ Việt Anh. Các nội dung nghiên cứu, kết

quả trong đề tài này là trung thực, được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của

tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào

khác.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thịnh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Cửu Khoa và

TS. Hồ Việt Anh đã định hướng khoa học, sự giúp đỡ tận tình và động viên trong suốt

quá trình thực hiện luận án. Xin gửi đến Thầy và Cô những lời biết ơn chân thành nhất

Tôi xin cảm ơn đến Học Viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện cho tôi

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của các Anh Chị và các Em trong Viện Khoa học Vật liệu

trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này.

ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong quá trình thực hiện

luận án.

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ, hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi của PGS.TS. Trần Việt

Hùng cùng toàn thể các Anh Chị, các Em đồng nghiệp của Viện Kiểm nghiệm thuốc

Sau cùng, tôi xin cảm ơn và thực sự không thể quên được sự giúp đỡ tận tình của

Thành phố Hồ Chí Minh

gia đình, bạn bè, anh em xa gần đã động viên, tạo điều kiện trong suốt quá trình tôi hoàn

thành luận án này.

Tác giả

Nguyễn Thị Thịnh

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................. 3

LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................... i

MỤC LỤC ............................................................................................................................. ii

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... v

DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................................. vii

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ................................................................................... x

DANH MỤC PHỤ LỤC ...................................................................................................... xii

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ........................................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................................... 2

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án ....................................................................... 2

4. Đóng góp mới của luận án .................................................................................................. 3

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ............................................................................... 3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................................. 4

1.1.

Virus HIV/AIDS và thuốc điều trị ........................................................................... 4

1.1.1. Virus HIV/AIDS .................................................................................................... 4

1.1.2. Lịch sử phát triển liệu pháp điều trị HIV/AIDS.................................................... 5

1.1.3. Cơ chế tác động của thuốc điều trị HIV ............................................................... 6

1.1.3.1.

Lamivudin ......................................................................................................... 8

1.1.3.2.

Zidovudin .......................................................................................................... 9

1.1.3.3.

Tenofovir disoproxil fumarat ............................................................................ 9

1.1.3.4. Ritonavir ........................................................................................................... 9

1.1.4. Liệu pháp điều trị ARV kết hợp .......................................................................... 10

1.1.5. Những tồn tại của liệu pháp kháng HIV thông thường ...................................... 12

1.2. Giải pháp thuốc phóng thích kéo dài ......................................................................... 15

1.2.1. Ưu điểm của phóng thích kéo dài ....................................................................... 17

1.2.2. Nhược điểm của phóng thích kéo dài ................................................................. 17

1.3.

Các chiến lược điều trị HIV hướng đến hiện nay .................................................. 17

1.3.1 Thuốc hướng đích .................................................................................................... 17

1.3.2 Thuốc có tác dụng kéo dài ....................................................................................... 20

1.3.3 Vacccin điều trị ........................................................................................................ 24

1.4. Dendrimer PAMAM biến tính và tiềm năng mang thuốc.......................................... 24

1.5. Các tác nhân biến tính ................................................................................................ 26

1.5.1. Poly(ethylen glycol), PEG và dẫn xuất methoxy poly(ethylen glycol), mPEG ... 26

1.5.2. Pluronic .............................................................................................................. 30

MỤC LỤC

iii

1.6. Tình hình nghiên cứu về thuốc ARV sử dụng chất mang nano ................................. 32

1.6.1. Thế giới ............................................................................................................... 32

1.6.2. Trong nước ......................................................................................................... 33

2.1. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 35

2.2. Nguyên liệu - hóa chất, dụng cụ - thiết bị .................................................................. 37

2.1.1. Nguyên liệu - hóa chất ........................................................................................ 37

2.1.2. Dụng cụ - thiết bị ................................................................................................ 38

2.3. Tổng hợp dendrimer PAMAM .................................................................................. 39

2.3.1. Tổng hợp dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 .............................................. 39

2.3.1.1.

Tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5, G0.5, G1.5 và G2.5 ............................. 40

.......................................................................................................................................... 41

2.3.1.2.

Tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0, G1.0, G2.0 và G3.0 .............................. 41

2.3.2. Biến tính PAMAM dendrimer ............................................................................. 43

2.3.2.1. Chuẩn bị tác nhân biến tính ............................................................................ 43

2.3.2.2.

Tổng hợp PAMAM dendrimer biến tính ......................................................... 47

2.4. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định các ARV ......................................... 49

2.4.1. Xây dựng phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF VÀ RTV ............................... 50

2.4.1.1. Xác định AZT, 3TC và xác định đồng thời AZT, 3TC ..................................... 50

2.4.1.2. Xác định TDF, RTV và xác định đồng thời TDF và RTV ............................... 51

2.4.2. Thẩm định phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF và RTV ............................... 52

2.4.2.1.

Tính tương thích hệ thống HPLC .................................................................... 53

2.4.2.2.

Tính đặc hiệu, LOD và LOQ ........................................................................... 53

2.4.2.3.

Tính tuyến tính ................................................................................................ 54

2.4.2.4. Độ đúng ........................................................................................................... 54

2.4.2.5. Độ chính xác ................................................................................................... 54

2.4.2.6. Khoảng xác định ............................................................................................. 55

2.5. Tạo hệ dẫn truyền thuốc nano .................................................................................... 55

2.5.1. Chuẩn bị dung dịch hoạt chất ............................................................................ 56

2.5.2. Chuẩn bị dung dịch hệ G3.0@mPEG và G3.0@F127 ....................................... 56

2.5.3. Dẫn truyền hoạt chất .......................................................................................... 56

2.5.4. Loại hoạt chất tự do............................................................................................ 57

2.5.5. Đông khô ............................................................................................................ 57

2.6. Đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất in vitro và thử hoạt tính sinh học ............... 57

2.6.1. Đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất ........................................................... 57

2.6.2. Thử hoạt tính sinh học ........................................................................................ 58

2.6.2.1.

Thử độc tính tế bào ......................................................................................... 58

2.6.2.2.

Thử hoạt tính ức chế pepsin ............................................................................ 59

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ............................................... 62

3.1. TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM THẾ HỆ G-0.5 - G3.0 .................................. 62

3.1.1. Phổ hồng ngoại FTIR ......................................................................................... 62 3.1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR ................................................................... 63 3.1.3. Phổ khối lượng MS và sắc ký lọc gel GPC ............................................................. 65 3.1.4. Tính toán khối lượng phân tử dendrimer PAMAM bằng phổ 1H-NMR ................. 67 3.1.5. Hiệu suất phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM ................................................. 69

3.2. BIẾN TÍNH PAMAM DENDRIMER G3.0 VỚI mPEG VÀ PLURONIC F127 ..... 69

3.2.1. Hình thái, kích thước .......................................................................................... 69

3.2.2. Phổ hồng ngoại FTIR ......................................................................................... 71 3.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR ............................................................... 72 3.3. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 75

3.3.1. Tính tương thích của hệ thống sắc ký ................................................................. 75

3.3.2. Tính đặc hiệu ...................................................................................................... 75

3.3.3. Tính tuyến tính .................................................................................................... 76

3.3.4. Độ chính xác ....................................................................................................... 77

3.3.4.1. Độ lặp ............................................................................................................. 77

3.3.4.2. Độ chính xác trung gian ................................................................................. 78

3.3.5. Độ đúng .............................................................................................................. 78

3.4. KẾT QUẢ DẪN TRUYỀN HÓA HOẠT CHẤT ..................................................... 80

3.4.1. Kết quả dẫn truyền hóa hoạt chất tạo hệ dẫn truyền thuốc đơn ........................ 80

3.4.1.1. Hình thái, kích thước ...................................................................................... 80

3.4.1.2. Phổ hồng ngoại FTIR .................................................................................... 82

3.4.1.3. Kết quả dẫn truyền hoạt chất đơn ................................................................... 85

3.4.2. Kết quả dẫn truyền hóa hoạt chất kết hợp ......................................................... 88

3.5. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG HOẠT CHẤT ....................... 90

3.5.1. Kết quả giải phóng hoạt chất trên hệ dẫn truyền thuốc đơn .............................. 90

3.5.2. Kết quả giải phóng hoạt chất trên hệ dẫn truyền thuốc kết hợp ........................ 94

3.6. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC .............................................................. 99

3.6.1. Kết quả thử độc tính tế bào ................................................................................ 99

3.6.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế pepsin ................................................................. 102

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 107

KẾT LUẬN ........................................................................................................................ 107

KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................ 108

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .......................................................... 109

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 110

PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 122

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Ý nghĩa

Anti-retroviral therapy, Liệu pháp kháng virus ART

Lamivudin, thuốc điều trị HIV 3TC

Acquired Immuno Deficiency Syndrome, Hội chứng suy giảm miễn AIDS

dịch mắc phải

Antiretroviral, Thuốc kháng HIV ARV

Zidovudin, thuốc điều trị HIV AZT

Chất mang CM

Stavudine, Thuốc điều trị HIV d4T

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium, môi trường DMEM

Dynamic Light Scattering DLS

Ethylene diamin EDA

Entry/fusion inhibitor, Nhóm ức chế hòa màng/xâm nhập EI&FI

Food and Drug Administration, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược FDA

phẩm Mỹ

FTIR Fourier transform infared spectroscopy, Phổ hồng ngoại biến đổi

Fourier

Global Health Observatory, Đài Quan sát sức khỏe toàn cầu GHO

Gel permeation chromatography, Sắc ký lọc gel GPC

Human Immunodeficiency Virus, Virus suy giảm miễn dịch ở người HIV

HIV-1 Human immunodeficiency virus type 1, Virus suy giảm miễn dịch ở

người loại 1

High-performance liquid chromatography, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Half maximal inhibitory concentration, Nồng độ ức chế 50 % IC50

Integrase inhibitor resistance, Nhóm ức chế enzyme tích hợp INSTI

Methylacrylat MA

Methoxy poly(ethylen glycol) mPEG

Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, Phổ cộng hưởng từ hạt NMR

nhân

NNRTI Tenofovir disoproxil fumarat, thuốc điều trị HIV

p-nitrophenyl cloroformat NPC

Nucleotide Reverse Transcriptase Inhibitors, Nhóm ức chế enzym sao NRTI

chép ngược tương tự nucleotid

PAMAM Polyamidoamin

PEG Polyethylen glycol

Protease inhibitor, Nhóm ức chế men protease PI

Protease, Enzyme protease PR

Reverse transcriptase, Men sao chép ngược RT

Ritonavir, thuốc điều trị HIV RTV

Thuốc ban đầu T-BĐ

Tenofovir disoproxil fumarate, thuốc điều trị HIV TDF

Thermal Gravimetry Analysis TGA

Thuốc được dẫn truyền hóa T-NH

Thuốc tự do T-TD

United State Pharmacopeia, Dược điển Mỹ USP

World Health Organization, Tổ chức Y tế Thế giới WHO

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Danh sách các loại thuốc PEG hóa được FDA chấp thuận .......................... 28

Bảng 1.2. Đặc tính của chất đồng trùng hợp khối pluronic ........................................... 31

Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu - hóa chất .................................................................... 37

Bảng 2.2. Danh mục dụng cụ - thiết bị............................................................................. 38

Bảng 2.3. Tổng hợp dendrimer PAMAM thế hệ lẻ (G-0.5, G0.5, G1.5, G2.5) .......... 40

Bảng 2 4. Tổng hợp dendrimer PAMAM thế hệ lẻ (G0.0, G1.0, G2.0, G3.0)............ 41

Bảng 2.5. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng trong tổng hợp

G3.0-PEG ........................................................................................................... 49

Bảng 2.6. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng trong tổng hợp

G3.0@F127 ........................................................................................................ 49

Bảng 2.7. Trình tự thực hiện thử hoạt tính ức chế pepsin .............................................. 61

Bảng 3.1. Tần số hấp thụ phổ FTIR của dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến

G3.0 ..................................................................................................................... 62

Bảng 3. 2. Dữ liệu phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0 . 64

Bảng 3.3. Khối lượng phân tử của PAMAM theo MS ................................................... 66

Bảng 3.4. Khối lượng phân tử của PAMAM theo GPC ................................................ 66

Bảng 3.5. Khối lượng phân tử của PAMAM tính theo 1H-NMR ................................ 67

Bảng 3 6. Khối lượng phân tử của PAMAM tổng hợp so với cấu trúc PAMAM theo

lý thuyết. ............................................................................................................. 68

Bảng 3.7. Hiệu suất phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 ...... 69

Bảng 3.8. Tần số hấp thụ phổ FTIR của dendrimer PAMAM G3.0, mPEG-NPC,

G3.0@mPEG, NPC-F127-OH và G3.0@F127 ............................................. 72

Bảng 3.9. Tính tương thích hệ thống sắc ký xác định AZT, 3TC................................. 75

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính AZT ............................................................ 76

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính tuyến tính 3TC ............................................................. 77

Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ lặp AZT, 3TC ................................................................. 77

Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian AZT, 3TC ................................... 78

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng của AZT ................................................................ 78

viii

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng của 3TC ................................................................. 79

Bảng 3.16. Báo cáo tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp xác định hàm lượng AZT,

3TC ..................................................................................................................... 79

Bảng 3.17. Kết quả xác định kích thước của hệ dẫn truyền thuốc bằng DLS ............... 81

Bảng 3.18. Tần số hấp thụ phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc 3TC@G3.0@mPEG,

AZT@G3.0@mPEG ......................................................................................... 83

Bảng 3.19. Tần số hấp thụ phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc TDF@G3.0@mPEG,

RTV@G3.0@mPEG ........................................................................................ 83

Bảng 3.20. Tần số hấp thụ phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc 3TC@G3.0@F127,

AZT@G3.0@F127 ........................................................................................... 84

Bảng 3.21. Tần số hấp thụ phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc TDF@G3.0@F127,

RTV@G3.0@F127 ........................................................................................... 84

Bảng 3.22. Sự dịch chuyển quang phổ FTIR một số tín hiệu .......................................... 84

Bảng 3.23. Kết quả dẫn truyền hóa AZT ........................................................................... 85

Bảng 3.24. Kết quả dẫn truyền hóa 3TC ............................................................................ 85

Bảng 3.25. Kết quả dẫn truyền hóa TDF ........................................................................... 85

Bảng 3.26. Kết quả dẫn truyền hóa RTV ........................................................................... 85

Bảng 3.27. Kết quả dẫn truyền kết hợp AZT, 3TC ........................................................... 88

Bảng 3.28. Kết quả dẫn truyền kết hợp TDF, RTV .......................................................... 88

Bảng 3.29. Kết quả giải phóng hoạt chất AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền đơn thuốc

ARV@G3.0@mPEG ........................................................................................ 90

Bảng 3.30. Kết quả giải phóng hoạt chất TDF, RTV trong hệ dẫn truyền đơn

ARV@G3.0@mPEG ........................................................................................ 90

Bảng 3.31. Kết quả giải phóng hoạt chất AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền thuốc đơn

ARV@G3.0@F127 ........................................................................................... 91

Bảng 3.32. Kết quả giải phóng hoạt chất TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc đơn

ARV@G3.0@F127 ........................................................................................... 91

Bảng 3.33. Kết quả giải phóng AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT,

3TC@G3.0@mPEG ......................................................................................... 94

Bảng 3.34. Kết quả giải phóng TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF,

RTV@G3.0@mPEG ........................................................................................ 94

Bảng 3.35. Kết quả giải phóng AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT,

3TC@G3.0@F127 ............................................................................................ 95

Bảng 3.36. Kết quả giải phóng TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF,

RTV@G3.0@F127 ........................................................................................... 96

Bảng 3.37. Thời gian phóng thích hệ dẫn truyền đơn và hệ dẫn truyền kết hợp .......... 98

Bảng 3.38. Kết quả tỷ lệ tế bào sống trên hệ G3.0, G3.0@mPEG và G3.0@F127 ..... 99

Bảng 3.39. Kết quả tỷ lệ tế bào sống trên các hệ dẫn truyền thuốc đơn và phối hợp . 100

Bảng 3.40. Kết quả thử hoạt tính ức chế của ARV chuẩn đối với pepsin ................... 102

Bảng 3.41. Kết quả thử hoạt tính ức chế của ARV@G3.0@mPEG đối với pepsin ... 103

Hình 1.1. Chu trình nhân bản HIV ............................................................................................. 4 Hình 1.2. Cơ chế tác động của thuốc ARV lên chu trình nhân bản HIV [8] .............................. 7 Hình 1.3. Đồ thị nồng độ thuốc theo thời gian ở các dạng thuốc khác nhau. ........................... 17 Hình 1.4. Cấu trúc dendrimer điển hình ................................................................................... 25 Hình 1.5. Một số kiểu kết hợp giữa dendrimer và thuốc .......................................................... 26 Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp G3.0 từ lõi là ethylendiamin [4], [70], [87] .................................... 39 Hình 2.2. Cơ chế phản ứng alkyl hóa ....................................................................................... 39 Hình 2.3. Cơ chế phản ứng amid hóa ....................................................................................... 40 Hình 2.6. Phản ứng tổng hợp PEG-NPC [79] .......................................................................... 43 Hình 2.7. Quy trình tổng hợp mPEG-NP ................................................................................. 44 Hình 2.8. Phản ứng tổng hợp NPC-F127-NPC ........................................................................ 45 Hình 2.9. Phản ứng tổng hợp HO-F127-NPC .......................................................................... 46 Hình 2.11. Phản ứng tổng hợp (A) G3.0@mPEG và (B) G3.0@F127 .................................... 48 Hình 2.42. Sơ đồ dẫn truyền hoạt chất ARV vào hệ G3.0@mPEG và G3.0@F127 ............... 57 Hình 3.1. Phổ FTIR của dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0 ................................. 62 Hình 3.2. Phổ 1H-NMR các dendrimer PAMAM G-0.5-G3.0 ................................................. 64 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G-0.5 (bên trái) và G0.0 (bên phải) .................. 65 Hình 3.4. Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G0.5 (bên trái) và GPC G3.0 (bên phải) .......... 66 Hình 3.5. Xác định khối lượng phân tử của PAMAM G 1.0 đến G 2.5 bằng 1H-NMR .......... 67 Hình 3.6. Hình thái, kích thước hạt của G3.0, G3.0@mPEG................................................... 70 Hình 3.7. Hình thái, kích thước hạt của G3.0@F127 ............................................................... 70 Hình 3.8. Phổ FTIR của G3.0; mPEG-NPC và G3.0@mPEG ................................................. 71 Hình 3.9. Phổ FTIR của G3.0; NPC-F127-OH và G3.0@F127 ............................................... 71 Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của G3.0, PEG-NPC và G3.0@mPEG ............................................ 72 .................................................................................................................................................. 73 Hình 3.11. Phổ 1H-NMR của G3.0, NPC-F127-OH và G3.0@F127 ...................................... 73 Hình 3.12. Tính đặc hiệu của phương pháp xác định AZT, 3TC và xác định đồng thời AZT, 3TC ........................................................................................................................................... 76 Hình 3.13. Hình thái, kích thước hạt của RTV@G3.0@mPEG ............................................... 81 Hình 3.14. Hình thái, kích thước hạt của RTV@G3.0@F127 ................................................. 81 Hình 3.15. Phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc 3TC@G3.0@mPEG và AZT@G3.0@mPEG 82 Hình 3.16. Phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc TDF@G3.0@mPEG và RTV@G3.0@mPEG .................................................................................................................................................. 82 Hình 3.17. Phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc 3TC@G3.0@F127 và AZT@G3.0@F127 .... 83 Hình 3.18. Phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc TDF@G3.0@F127 và RTV@G3.0@F127 .... 83 Hình 3.19. Phần trăm hiệu suất dẫn truyền (% DLE) của ARV ............................................... 86 Hình 3.20. Phần trăm khả năng dẫn truyền (% DLC) của ARV .............................................. 86 Hình 3.21. Phần trăm hiệu suất dẫn truyền kết hợp (% DLE) của ARV .................................. 88 Hình 3.22. Phần trăm khả năng dẫn truyền kết hợp (% DLE) của ARV.................................. 89 Hình 3.23. Đồ thị biểu diễn % 3TC (A), % AZT (B), % TDF (C) và % RTV (D) giải phóng trong hệ dẫn truyền thuốc đơn ARV@G3.0@mPEG ............................................................... 91 Hình 3.24. Đồ thị biểu diễn % 3TC (E), % AZT (F), % TDF (G) và % RTV (H) giải phóng trong hệ dẫn truyền thuốc đơn ARV@G3.0@F127 ................................................................. 92 Hình 3.25. Đồ thị biểu diễn % AZT (I), % 3TC (J), % TDF (K) và % RTV (L) giải phóng trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp ARV@G3.0@PEG ............................................................ 95 Hình 3.26. Đồ thị biểu diễn % AZT (M), % 3TC (N), % TDF (O) và % RTV (P) giải phóng trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp ARV@G3.0@F127 ........................................................... 96

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 3.28. Kết quả về cảm ứng chết của tế bào trên hệ dẫn truyền thuốc đơn và kết hợp ARV@G3.0@F127, ARV@G3.0@mPEG ............................................................................ 101 Hình 3.29. Đồ thị biểu diễn hoạt tính ức chế của ARV đối với pepsin .................................. 104

xii

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ cấu trúc sản phẩm dendrimer PAMAM G-0.5, G0.0, G0.5, G1.0, G1.5,

G2.0, G2.5, G3.0

Phụ lục 2. Phổ cấu trúc sản phẩm dendrimer PAMAM biến tính với PEG và Pluronic

Phụ lục 3. Kết quả thẩm định phương pháp xác định TDF, RTV và xác định đồng thời

TDF, RTV

Phụ lục 4. Sắc ký đồ dẫn truyền AZT trên hệ G3.0@mPEG và G3.0@F127

Phụ lục 5. Sắc ký đồ dẫn truyền 3TC trên hệ G3.0@mPEG và G3.0@F127

Phụ lục 6. Sắc ký đồ dẫn truyền TDF trên hệ G3.0@mPEG và G3.0@F127

Phụ lục 7. Sắc ký đồ dẫn truyền RTV trên hê G3.0@mPEG và G3.0@F127

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

HIV là căn bệnh thế kỷ có khả năng tấn công và phá hủy hệ miễn dịch của cơ thể,

xảy ra trên toàn thế giới, để lại nhiều hậu quả nghiêm trọng. Tuy nhiên, vẫn chưa có

phương pháp điều trị dứt điểm cho căn bệnh này trong khi số người mắc bệnh vẫn tăng

lên.

Theo số liệu của của Đài quan sát sức khỏe toàn cầu GHO (Global Health

Observatory), từ khi khởi phát dịch HIV đến năm 2019, số người nhiễm virus HIV đã

lên đến 79,3 triệu người với khoảng 33,6 triệu người tử vong vì HIV/AIDS [1]. Trên

toàn cầu, có khoảng 38 triệu người đang sống với HIV.

Tại Việt Nam, theo Cục Phòng, chống HIV/AIDS, số người nhiễm HIV hiện đang

còn sống được báo cáo đến thời điểm 30/9/2021 là 212.769 trường hợp [2]. Số người

nhiễm HIV tử vong lũy tích tính từ đầu vụ dịch đến nay là 108.849 trường hợp. Hiện

nay, điều trị nhiễm HIV bằng thuốc kháng HIV (ARV- Antiretroviral).

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), mặc dù thuốc ARV giúp cứu sống và cải thiện

cuộc sống cho bệnh nhân HIV/AIDS, nhưng trong quá trình sử dụng vẫn thường xảy ra

các vấn đề liên quan đến an toàn thuốc, đặc biệt là các phản ứng có hại (ADR- Adverse

Drug Reaction) nghiêm trọng xuất hiện trong thời gian ngắn hoặc dài. Các ADR này

làm giảm tuân thủ điều trị của bệnh nhân dẫn tới thất bại điều trị và làm tăng khả năng

xuất hiện virus kháng thuốc.

Bên cạnh đó, các liệu pháp điều trị HIV bằng ARV đều sử dụng kết hợp ít nhất hai

loại thuốc ARV dạng uống do vấn đề kháng thuốc và do hấp thu kém, sinh khả dụng

của thuốc không cao (saquinavir mesilat hấp thu khoảng 30 - 40% và bị chuyển hóa

mạnh ở gan, nên sinh khả dụng chỉ là 4% khi uống) [3]

Nhằm khắc phục các nhược điểm trên, sử dụng hệ phụ trợ chất mang kích thước

nano mang thuốc ARV nhằm mục đích đem lại hiệu quả vượt trội so với dạng bào chế

thông thường như: tác dụng kéo dài, giảm độc tính…dựa trên các dược chất sẵn có.

Dendrimer PAMAM là một loại vật liệu nanopolyme có cấu trúc và trình tự không

gian lặp đi lặp lại nhiều lần ở cấp độ nano. Trái ngược với các polymer tuyến tính,

dendrimer PAMAM có các nhóm chức được kiểm soát chính xác và tinh chỉnh được.

Dendrimer có nhiều hiệu ứng y sinh tích cực trong cơ thể sống như: (1) có cấu trúc phân

tử ở mức độ chính xác cao; (2) có cấu trúc đa dạng và linh hoạt; (3) có tính chất hóa –

sinh đặc biệt và đa hóa trị [4]. Sau khi biến tính với các polyme ưa nước có tính tương

hợp sinh học cao, không độc, không gây miễn dịch là methoxy polyethyleneglycol [5]

và pluronic, dendrimer PAMAM biến tính có khả năng tránh được sự loại bỏ khỏi hệ

tuần hoàn bởi lưới nội chất, đồng thời tăng lượng thuốc dẫn truyền thông qua cơ chế hấp

phụ trên bề mặt hạt, cuốn vào và liên kết với các nhóm chức bên trong hạt. Điều này

không chỉ giúp vận chuyển thuốc thụ động đến đúng mục tiêu, tác dụng hiệp đồng của

các ARV khi mang thuốc phối hợp giúp giảm kháng thuốc, giảm lượng thuốc sử dụng,

giảm độc tính và giảm số lần sử dụng do tác dụng kéo dài. Nhiều nghiên cứu đã chứng

minh rằng ARV có thể được mang bên trong các dendrimer PAMAM biến tính như một

hệ thống phân phối thuốc

Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất luận án: “Nghiên cứu tổng hợp, biến tính bề

mặt hệ nano dendrimer polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Tổng hợp hệ nano dendrimer PAMAM biến tính với methoxy polyethylen glycol

(mPEG) và pluronic F127 (F127) mang thuốc kháng virus HIV tạo hệ dẫn truyền thuốc

HIV đơn và HIV kết hợp có khả năng phóng thích kéo dài.

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

Điều chế dendrimer đến thế hệ G3.0 và các dẫn xuất của G3.0: G3.0@mPEG,

G3.0@ F127. Xác định cấu trúc các dẫn xuất bằng phương pháp FTIR, 1H-NMR, GPC,

MS và MS dựa trên phổ 1H-NMR

Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF và RTV trong hệ

dẫn truyền thuốc đơn và phối hợp bằng phương pháp HPLC-PDA.

Đánh giá hiệu suất dẫn truyền, khả năng dẫn truyền của ARV@G3.0@mPEG và

ARV@G3.0@F127.

Khảo sát giải phóng hoạt chất từ hệ dẫn truyền thuốc ARV@G3.0@mPEG và

ARV@G3.0@F127 trong 4 môi trường pH 1,2; pH 4,5; pH 6,8; và pH7,4.

Thử độc tính tế bào trên dòng tế bào fibroblast và thử hoạt tính sinh học (hoạt tính

ức chế pepsin) của dendrimer PAMAM G3.0, G3.0@mPEG, G3.0@F127 và

ARV@G3.0@mPEG và ARV@G3.0@F127.

4. Đóng góp mới của luận án

Luận án đã dẫn truyền 4 hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV trên chất mang

nano dendrimer PAMAM sau biến tính với các polymer sinh học là G3.0@mPEG

và G3.0@F127, tạo các hệ dẫn truyền thuốc đơn và hệ dẫn truyền thuốc phối hợp

kháng HIV

Luận án đã xây dựng phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF, RTV trong

hệ dẫn truyền thuốc đơn. Đặc biệt xác định đồng thời AZT, 3TC và TDF, RTV

trong các hệ dẫn truyền phối hợp, cung cấp bộ dữ liệu thẩm định phương pháp

chứng minh sự phù hợp của phương pháp HPLC-PDA đã xây dựng trên hệ dẫn

truyền thuốc đơn và thuốc phối hợp

Khả năng tải thuốc của hệ G3.0@F127 tốt hơn hệ G3.0@mPEG do pluronic

F127 trong cấu trúc có 65 nhóm PO có tính kỵ nước nên các tương tác kỵ nước

của thuốc sẽ tương tác với nhóm PO của F127 do vậy lượng thuốc được đóng gói

nhiều hơn. Kết quả khảo sát giải phóng hoạt chất từ ARV@G3.0@mPEG và

ARV@G3.0@F127 trong 4 môi trường pH 1,2; pH 4,5; pH 6,8 và pH 7,4 cho

thấy có khả năng phóng thích kéo dài và có hoạt tính ức chế pepsin trên hệ dẫn

truyền thuốc AZT và RTV

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu mới của nghiên cứu sinh có ý nghĩa khoa học cho sự phát

triển của các hệ chất mang nano dẫn truyền thuốc kháng virus HIV giúp giảm độc tính,

có tác dụng kéo dài và đặc biệt cho phép phát triển các liệu pháp kết hợp trong việc dẫn

truyền kết hợp các ARV

Kết quả đạt được của luận án đóng góp ý nghĩa quan trọng trong việc định hướng

nghiên cứu phát triển hệ dẫn truyền thuốc điều trị HIV/AIDS kết hợp nhằm hỗ trợ việc

tuân thủ điều trị của bệnh nhân trong việc uống thuốc hàng ngày kéo dài suốt đời với

bệnh mãn tính và đe dọa tính mạng như HIV/ AIDS, qua đó cải thiện việc tuân thủ điều

trị giúp giảm chi phí và nguồn lực xã hội trong chiến lược điều trị HIV/ AIDS.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Virus HIV/AIDS và thuốc điều trị

1.1.1. Virus HIV/AIDS

Virus HIV (gồm HIV-1 và HIV-2) thuộc vào họ Retroviridae,

giống Lentivirus. Những virus này có dạng hình cầu, có vỏ, kích thước hạt virus 80 -100

nm về đường kính, genom chứa ARN chuỗi đơn. Quá trình sao chép acid nucleic của

chúng (ARN) tạo ra chuỗi đôi cDNA (ADN bổ sung) qua trung gian của enzyme reverse

transcriptase. Sự hình thành dạng tiền virus ở chromosom của tế bào vật chủ là một bước

bắt buộc trong chu kỳ phát triển của chúng [6]

Genom của HIV có kích thước 9,8 kb

(kilobase), gen mã hoá của các HIV có 3 đoạn

lớn đó là đoạn gen gag mã hoá cho sự tổng hợp

cho các protein cấu trúc của lõi của virus, gen

pol mã hoá cho sự hình thành các protein

enzyme của virus (integrase, reverse

transcriptase/RNase, protease) và đoạn gen env

mã hoá cho sự hình thành các glycoprotein của

vỏ virus (gp 120, gp 41). Nhiều đoạn gen nhỏ

mã hoá cho các protein có vai trò trong quá

trình nhiễm trùng và phát triển của virus trong

tế bào [6].

• Chu kỳ sinh học của HIV trong tế bào:

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, HIV bắt đầu

tấn công một loại tế bào trong máu có tên là tế

bào CD4 (hay lympho bào T4). Chu trình của

HIV trong tế bào vật chủ bao gồm các bước (xem Hình 1:1)

Hình 1.1. Chu trình nhân bản HIV

(1) Xâm nhập vào tế bào

Để xâm nhập vào tế bào, gp120 của HIV gắn vào các receptor của tế bào gồm phân

tử CD4+ và receptor CCR5

(2) Sao chép ngược từ ARN thành AND

Trong nguyên tương của tế bào ARN sợi đơn của virus được sao mã ngược để trở

thành ADN chuổi đôi qua trung gian của enzyme reverse transcriptase

(3) Tích hợp vào bộ gen của tế bào vật chủ

ADN chuỗi đôi tạo thành được chuyển vào nhân tế bào và tích hợp vào nhiễm sắc

thể của tế bào, gọi là tiền virus (provirus), qua trung gian của enzym integrase

(4) Sao chép và dịch mã gen của virus

ADN tiền virus là bản nền (template) cho việc tạo ra ARN của virus mới và ARN

thông tin cho sự tổng hợp protein của virus

(5) Tổ hợp và xâm nhiễm các tế bào khác

Sự tổ hợp và hình thành virus mới xảy ra ở màng tế bào. Ở đây ARN mới tạo

thành của virus được gói trong các protein của lõi capsid. Capsid tiếp đó nhận được vỏ

ngoài khi hạt virus đi qua màng tế bào bằng phương thức đẩy từ từ hạt virus ra ngoài

như sự nảy mầm cây [6].

Ở người lớn khỏe mạnh số lượng CD4 dao động khoảng 500 - 1500 tế bào/mm3

máu. Ở người mắc HIV, nếu CD4 ở mức từ 350 - 500 tế bào/mm3 máu tức là hệ miễn

dịch suy giảm nhẹ. Nếu CD4 ≤ 200 tế bào/mm3 máu đồng nghĩa với việc hệ miễn dịch

bị suy giảm nặng, HIV chuyển sang AIDS và không có khả năng chống đỡ các bệnh

nhiễm trùng thông thường, cơ thể xuất hiện các bệnh nhiễm trùng cơ hội, ung thư và

chính các bệnh này thường là nguyên nhân gây tử vong cho người bệnh [7].

1.1.2. Lịch sử phát triển liệu pháp điều trị HIV/AIDS

Năm 1985, thuốc điều trị HIV đầu tiên được phát triển và đưa vào thử nghiệm lâm

sàng là azidothymidin (AZT, sau này gọi là zidovudin) - một dẫn chất thuộc nhóm ức

chế enzym sao chép ngược tương tự nucleosid (NRTI). Mặc dù vẫn còn những hạn chế

và tác dụng phụ (như giảm bạch cầu, thiếu máu, viêm cơ, buồn nôn và nôn), AZT đã

được phê duyệt vào năm 1987 để điều trị cho những bệnh nhân nhiễm HIV mức độ nặng

[8].

Năm 1995, việc nghiên cứu ra lamivudin (3TC) đã đem đến một bước tiến mới

trong điều trị HIV/AIDS. Trong khi sự kháng thuốc diễn ra nhanh chóng với các liệu

pháp đơn trị liệu, lamivudin đã có tác dụng hiệp đồng với các nucleosid khác và khả

năng dung nạp tương đối tốt. Tuy nhiên, vẫn không có phối hợp kép nào có thể kiểm

soát lây nhiễm HIV được lâu dài [8].

Liệu pháp điều trị HIV tiếp theo là sự phát triển của các thuốc thuộc nhóm ức chế

enzym sao chép ngược không có cấu trúc nucleosid (NNRTI) và nhóm ức chế enzym

protease (PI), cả hai nhóm này đều tác động trực tiếp lên HIV. Nevirapin là thuốc thuộc

nhóm NNRTI đầu tiên được phê duyệt vào năm 1996. Sự kháng thuốc phát triển nhanh

chóng nếu chỉ sử dụng nevirapin đơn trị liệu. Tuy nhiên, khi kết hợp nevirapin với 2

thuốc thuộc nhóm NNRT thành phác đồ phối hợp 3 thuốc đem lại hiệu quả điều trị mong

muốn. Các thử nghiệm đầu tiên chứng minh hiệu quả này được thực hiện tại Ý, Hà Lan,

Canada và Úc. Saquinavir (1995) là thuốc đầu tiên thuộc nhóm PI được phê duyệt, tiếp

đến là indinavir (1996) đã làm thay đổi đáng kể bối cảnh điều trị, mở ra thời kỳ sử dụng

phác đồ kháng retrovirus hiệu lực cao (highly active antiretroviral therapy - HAART)

[8].

Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã ban hành Hướng dẫn điều trị

HIV/AIDS đầu tiên, khuyến cáo sử dụng phác đồ phối hợp 3 thuốc bao gồm 2 thuốc

nhóm NRTI và 1 thuốc nhóm NNRTI (hoặc PI), hoặc 3 thuốc nhóm NRTI. Phác đồ ưu

tiên là phác đồ có chứa AZT hoặc d4T. Tuy nhiên, đến năm 2010, Tổ chức Y tế thế giới

đã khuyến cáo không sử dụng d4T trong phác đồ điều trị HIV/AIDS do gây ra ADR

nghiêm trọng bao gồm nhiễm toan chuyển hóa lactic, rối loạn phân bố mỡ và bệnh lý

thần kinh ngoại vi. Hiện nay, phác đồ điều trị ưu tiên là phác đồ có chứa TDF. Tóm lại,

việc theo dõi, phát hiện, đánh giá và phòng tránh các ADR liên quan tới thuốc ARV có

vai trò quan trọng trong việc tăng cường hiệu quả điều trị, tiết kiệm chi phí, ngăn ngừa

tình trạng kháng thuốc và góp phần cải thiện chất lượng cuộc sống của người bệnh [8].

1.1.3. Cơ chế tác động của thuốc điều trị HIV

Hiện nay trên thế giới có 5 nhóm thuốc ARV được phân chia theo tác động của

chúng lên những bước khác nhau trong chu trình nhân bản của HIV trong tế bào vật chủ

(Hình 2), bao gồm: (1) Nhóm ức chế enzym sao chép ngược tương tự nucleosid (NRTI);

(2) Nhóm ức chế enzym sao chép ngược không có cấu trúc nucleosid (NNRTI); (3)

Nhóm ức chế enzym protease (PI); (4) Nhóm ức chế enzym tích hợp (INSTI); (5) Nhóm

ức chế xâm nhập và ức chế hòa màng (EI&FI) [8-9]

Hình 1.2. Cơ chế tác động của thuốc ARV lên chu trình nhân bản HIV

(1) Các NRTI ức chế enzym sao chép ngược bằng cách gắn các nucleic giả vào

ADN của virus mới được tạo thành làm dây ADN đó không thể kéo dài. Độc tính của

nhóm này gồm suy thận (TDF), thiếu máu (AZT), quá mẫn (ABC).

(2) Các NNRTI ức chế enzym sao chép ngược bằng cách gắn trực tiếp vào enzym

sao chép ngược tại vị trí xúc tác làm virus không thể trưởng thành và không có khả năng

gây nhiễm. Nhóm này gây ra dị ứng, thường gặp nhất là với NVP; độc tính với gan cũng

thường liên quan đến NVP và gặp ít hơn với EFV. EFV có thể gây tác dụng phụ trên hệ

thần kinh trung ương.

(3) Các PI ức chế sự trưởng thành của virus. Do protease tác dụng ở giai đoạn cuối

của chu kỳ phát triển của virus nên PI ức chế sự sao chép của HIV của bất cứ tế bào bị

nhiễm nào và ở bất cứ giai đoạn nào của chu kỳ. PI làm rối loạn tiêu hóa (tiêu chảy,

buồn nôn, nôn), vàng da, viêm gan, các rối loạn chuyển hóa (tăng mỡ máu, rối loạn phân

bố mỡ, tiểu đường).

(4) Các INSTI ức chế enzym integrase - enzym tích hợp ADN của virus vào ADN

của tế bào vật chủ, do đó ngăn cản quá trình sao chép tạo ra virus mới. Độc tính của

nhóm này là ức chế đào thải creatinin tại ống lượn gần của thận, làm tăng nhẹ creatinin

huyết thanh.

(5) Maraviroc - MVC là chất ức chế xâm nhập gắn chọn lọc vào thụ thể CCR5 trên

màng tế bào vật chủ và ngăn cản tương tác giữa glycoprotein 120 của HIV-1 với CCR5,

dẫn đến ngăn cản sự xâm nhập của HIV vào tế bào vật chủ. Enfuvirtid - chất ức chế hòa

màng ngăn cản bước thứ 2 trong con đường hòa màng bằng cách gắn vào vùng HR1 của

glycoprotein 41 (gp41) và ngăn cản tương tác giữa HR1 và HR2, do đó ngăn cản sự thay

đổi về hình dạng của gp41 để hoàn thành bước cuối cùng của quá trình hòa màng. Độc

tính của MVC bao gồm nhiễm trùng đường hô hấp trên, ho, sốt, phát ban và chóng mặt;

độc tính với gan có thể xuất hiện sau phát ban nặng và các biểu hiện dị ứng toàn thân

khác (sốt, tăng bạch cầu ái toan).

Tại Việt Nam, theo quyết định số 5968/QĐ-BYT của Bộ Y tế ngày 31 tháng 12

năm 2021 Về việc ban hành hướng dẫn Điều trị và chăm sóc HIV/AIDS trong đó phác

đồ ARV bậc 1 phối hợp 3 thuốc là AZT + 3TC + RAL (Raltergravir-PI) là phác đồ ưu

tiên sử dụng [10]. Do vậy, trong nghiên cứu này, bốn thuốc được chọn để nghiên cứu

là: zidovudin, lamivudin, tenofovir disoproxil fumarat thuộc nhóm thuốc ức chế enzym

sao chép ngược tương tự nucleosid và nucleotid (NRTI) và ritonavir thuộc nhóm thuốc

ức chế men protease (PI) do là các thuốc nằm trong phác đồ điều trị HIV/AIDS của Bộ

y tế và đại diện cho hai thuộc tính thuốc tan trong nước là AZT, 3TC và kém tan/không

tan trong nước là TDF, RTV.

1.1.3.1. Lamivudin

Danh pháp IPAC: (3TC; 2',3'-dideoxy-3'-

thiacytidine)

Công thức phân tử: C8H11N3O3S

2′,3′-Dideoxy-3′-thiacytidin

Khối lượng phân tử: 229,26 g.mol-1

Lamivudin là chất thứ năm trong số các loại thuốc được cấp phép sử dụng tại Hoa

kỳ. Chúng thuộc nhóm NRTI, lamivudin có hoạt tính kìm virus in vitro đối với HIV-1,

HIV-2 và có hoạt tính kháng virus viêm gan B. Trong tế bào, lamivudin được phosphoryl

hóa và được chuyển đổi nhờ các enzym trong tế bào thành chất chuyển hóa có hoạt tính

5 - triphosphat. Thuốc cạnh tranh với deoxycytidin triphosphat tự nhiên để hợp nhất vào

ADN của virus bởi enzym sao chép ngược, gây kết thúc sớm tổng hợp ADN của virus.

Lamivudin có độc tính thấp đối với tế bào [8].

1.1.3.2. Zidovudin

Danh pháp IPAC: (AZT; 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine)

Công thức phân tử: C10H13N5O4

Khối lượng phân tử: 267,24 g.mol-1

Thông tin qui chế: Thuốc độc bảng A.

Zidovudin là thuốc đầu tiên được phê duyệt để điều trị HIV và là chất tương tự

nucleosid nguyên mẫu. Khi được đưa vào cơ thể, zidovudin bị phosphoryl hoá 3 lần để

tạo thành dạng có hoạt tính là triphosphat. Zidovudin triphosphat ức chế cạnh tranh với

thymidin triphosphat của enzym sao chép ngược, nhưng vì trong cấu trúc của zidovudin

triphosphat thiếu nhóm -OH ở vị trí 3 nên dây nối phosphodiester ở vị trí 3',5' không

được tạo thành. Vì vậy quá trình tổng hợp ADN bị kết thúc sớm [8].

1.1.3.3. Tenofovir disoproxil fumarat

Danh pháp IPAC:

Công thức phân tử: C19H30N5O10P.C4H4O4

Khối lượng phân tử: 635,51 gmol-1

Tenofovir disoproxil fumarat là ester fumarat của tenofovir disoproxil. Tenofovir

disoproxil được hấp thu và chuyển hóa thành dạng có hoạt tính tenofovir monophosphat.

Sau đó, trong tế bào được chuyển thành tenofovir diphosphat. Dạng diphosphat này sẽ

gắn vào ADN, ức chế cạnh tranh enzym sao chép ngược của HIV làm ngừng tổng hợp

ADN của HIV-1. Thuốc cũng ức chế polymerase của virus viêm gan B [8]

1.1.3.4. Ritonavir

Danh pháp IPAC:

Công thức phân tử: C37H48N6O5S2

Khối lượng phân tử: 720,94 gmol-1

Ritonavir là chất ức chế chọn lọc, cạnh tranh thuận nghịch enzym protease của

HIV. Trong quá trình sao chép của HIV, enzym HIV protease chịu trách nhiệm phân cắt

chuỗi polypeptid gag và gag-pol để tạo thành các protein cấu trúc của hạt virus và các

enzym thiết yếu của virus (như enzym sao chép ngược, integrase, protease). Ritonavir

can thiệp vào quá trình hình thành các protein và enzym thiết yếu nên ngăn cản sự hoàn

thiện của virus và tạo ra các mảnh virus rối loạn về chức năng, không trưởng thành và

không gây nhiễm. Ritonavir có phổ kháng virus giới hạn. Thuốc có hoạt tính kháng

retrovirus người in vitro, bao gồm HIV-1 và cũng có một số hoạt tính in vitro đối với

HIV-2 [8].

1.1.4. Liệu pháp điều trị ARV kết hợp

Điều trị ARV kết hợp thường có thể đạt được mục tiêu nếu bệnh nhân dùng

thuốc > 95% thời gian. Tuy nhiên, duy trì mức độ tuân thủ này là khó khăn. Sự ức chế

một phần (giảm nồng độ huyết tương xuống mức không thể phát hiện) có thể lựa chọn

cho một hoặc nhiều đột biến tích lũy của virus HIV làm cho virus kháng một phần

hoặc hoàn toàn đối với một loại thuốc đơn lẻ hoặc toàn bộ các thuốc. Điều trị có thể

sẽ không thành công trừ khi điều trị tiếp theo sử dụng các loại thuốc của các lớp khác

mà vi rút HIV vẫn còn nhạy cảm.

Nếu điều trị không thành công, đánh giá tính nhạy cảm với thuốc (kháng thuốc)

có thể xác định mức độ nhạy cảm của virus HIV đối với tất cả các loại thuốc hiện có.

Các thử nghiệm về kiểu gen và kiểu hình có sẵn và có thể giúp các bác sỹ lâm sàng

lựa chọn một phác đồ mới có chứa ít nhất 2 và tốt hơn là 3 loại thuốc mà chủng HIV

nhạy cảm hơn.

Kháng thuốc đối với HIV ở người là yếu tố chính dẫn đến thất bại trong điều trị.

Mỗi phác đồ điều trị phải có ít nhất 3 thuốc ARV để bảo đảm hiệu lực ức chế virus và

giảm nguy cơ kháng thuốc (Phác đồ kháng retrovirus hiệu lực cao - HAART) [8], [10]

Người nhiễm HIV cần được điều trị ARV sớm nhất có thể, theo tiêu chí điều trị

của quốc gia, để có hiệu quả cao nhất trong việc phục hồi miễn dịch và giảm lây truyền

HIV trong cộng đồng. Người nhiễm HIV cần được điều trị ARV suốt đời, phải tuân thủ

điều trị đầy đủ và được theo dõi trong suốt quá trình điều trị.

Trong quá trình điều trị ARV kết hợp, tương tác giữa các thuốc kháng retrovirus

có thể làm tăng hoặc giảm hiệu quả. Ví dụ, hiệu quả có thể tăng lên bằng cách kết hợp

liều thấp của ritonavir với các PI khác. Ritonavir ức chế men gan để chuyển hóa PI.

Ritonavir làm tăng mức độ các thuốc, duy trì nồng độ tăng lâu hơn, làm giảm khoảng

cách liều và tăng hiệu quả. Một ví dụ khác là lamivudin cộng với zidovudin. Việc sử

dụng một trong hai loại thuốc ở dạng đơn trị liệu sẽ dẫn đến kháng thuốc một cách nhanh

chóng. Tuy nhiên, những đột biến tạo kháng thuốc với lamivudin có tính nhạy cảm hơn

với zidovudin. Do đó, khi được sử dụng cùng nhau, chúng có tính hiệp lực. Ngược lại,

tương tác giữa các thuốc kháng retrovirus có thể làm giảm hiệu quả của mỗi loại thuốc.

Một loại thuốc có thể làm tăng sự loại bỏ một loại thuốc khác (ví dụ, bằng cách thúc đẩy

các enzym cytochrome P-450 trong gan có trách nhiệm loại bỏ). Một tác động chưa rõ

cơ chế của một số kết hợp NRTI (ví dụ zidovudin cộng với stavudin) làm giảm hoạt

động kháng retrovirus mà không làm tăng việc loại bỏ thuốc.

Một trong những sự kết hợp thuốc ARV đầu tiên được Tổ chức Y tế Thế giới

(WHO) khuyến cáo sử dụng là: kết hợp 2 chất ức chế nucleosid phiên mã ngược (NRTI)

với một chất ức chế protease (PI) hoặc chất ức chế men sao chép ngược không nucleosid

(NNRTI) [9]. Trong một số nước, cụ thể là Viện Quốc gia Ngoại khoa ở Mexico, sự kết

hợp zidovudin, lamivudin, lopinavir và ritonavir tiếp tục tạo thành một trong những phác

đồ điều trị chính.

Các phác đồ điều trị bằng thuốc kháng virus hoạt tính cao dựa trên việc sử dụng

các chất ức chế men sao chép ngược nucleoside (NRTI), là loại thuốc chính được sử

dụng bởi những bệnh nhân bị nhiễm virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV). Việc

sử dụng kết hợp NRTI đã mang lại lợi ích lâm sàng rõ ràng cho bệnh nhân điều trị. Tuy

nhiên, sự kết hợp của hai NRTI có thể làm tăng nguy cơ mất ổn định bộ gen so với các

loại thuốc được sử dụng riêng lẻ [11]

Tác giả Tung-Che Hung và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu Liệu pháp kép với

thuốc ức chế protease tăng cường ritonavir (PI) cộng với lamivudin so với liệu pháp ba

thuốc với PI tăng cường ritonavir cộng với hai chất ức chế men sao chép ngược nucleotid

(NRTI) có chứa lamivudine (3TC) (150 mg hai lần mỗi ngày hoặc 300 mg một lần mỗi

ngày) cộng với lopinavir/ritonavir (LPV/r) 250/50 mg hai lần mỗi ngày hoặc

darunavir/ritonavir (DRV/r) 800 /100 mg x 1 lần/ngày. Những bệnh nhân duy trì liệu

pháp bộ ba ức chế với DRV/r hoặc LPV/r cộng với hai NRTI được đưa vào để so sánh.

Tiêu chí đánh giá chính là tỷ lệ bệnh nhân có tải lượng virus <50 bản sao/mL sau 48

tuần theo dõi. Kết quả: Tổng cộng, 364 bệnh nhân được bao gồm trong đó 93 (25,5%)

chuyển sang liệu pháp kép sau 48 tuần theo dõi, tải lượng virus <50 bản sao/mL được

quan sát thấy ở 96,8% và 94,1% ở nhóm trị liệu kép và trị liệu ba lần, 19 bệnh nhân

(3,2%) trong nhóm trị liệu kép và 16 (7,6%) trong nhóm trị liệu bộ ba đã tiến triển thất

bại về mặt virus học. Kết luận: Liệu pháp kép với DRV/r hoặc LPV/r cộng với lamivudin

đã chứng minh hiệu quả tương tự trong việc duy trì sự ức chế virus so với liệu pháp ba

thuốc [12]

1.1.5. Những tồn tại của liệu pháp kháng HIV thông thường

• Kháng thuốc

Quá trình nhân lên của virus HIV diễn ra rất nhanh chóng (10 tỉ virus được tạo ra

hàng ngày) và dễ bị lỗi, đồng thời tạo ra ít nhất một đột biến trên mỗi bộ gen. Các đột

biến này cho phép virus phát triển khả năng chống lại thuốc điều trị HIV [13].

Vào cuối năm 2021, 28,7 triệu người đang được điều trị bằng thuốc kháng virus

trên toàn thế giới. Kháng thuốc HIV có thể làm giảm hiệu quả của thuốc kháng virus

trong việc giảm tỷ lệ nhiễm HIV cũng như tỷ lệ mắc bệnh và tử vong liên quan đến HIV.

Trong 21 trong số 30 cuộc điều tra được báo cáo cho WHO, tỷ lệ kháng thuốc HIV

trước điều trị với nevirapin (NVP) hoặc efavirenz (EFV) trong bệnh nhân bắt đầu điều

trị ARV bậc một đạt mức trên 10 %.

Gần một nửa số trẻ sơ sinh có mẹ nhiễm HIV bị HIV kháng thuốc với một hoặc

nhiều NNRTI.

Tỷ lệ đề kháng toàn cầu đối với nhóm thuốc NNRTI nhấn mạnh sự cần thiết phải

nhanh chóng theo dõi quá trình chuyển đổi sang các phác đồ dựa trên dolutegravir mới

hơn.

Để ngăn chặn HIV kháng thuốc, tất cả các bên liên quan trên toàn cầu nên thúc

đẩy sự sẵn có của các loại thuốc tối ưu để điều trị nhiễm HIV, hỗ trợ duy trì chăm sóc

và tuân thủ điều trị tối ưu, tăng khả năng tiếp cận và sử dụng xét nghiệm tải lượng virus

để biết quá trình điều trị HIV có hiệu quả hay không và nhanh chóng chuyển đổi phác

đồ trong trường hợp thất bại điều trị được xác nhận.

Theo báo cáo của WHO về kháng thuốc HIV năm 2021 cho thấy có tiến bộ đáng

kể trong việc xây dựng các kế hoạch hành động quốc gia nhằm ngăn ngừa, giám sát và

ứng phó với HIV kháng thuốc cũng như triển khai các cuộc điều tra đại diện trên toàn

quốc ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình. Tính đến năm 2021, 64% quốc gia

có gánh nặng HIV cao đã xây dựng kế hoạch hành động quốc gia [14]

• Điều trị bằng thuốc dài hạn

Quá trình điều trị HIV bằng thuốc đòi hỏi bệnh nhân phải tuân thủ trong thời gian

dài, không bị gián đoạn. Tuân thủ điều trị là rất quan trọng bất kể về việc bênh nhân

chưa điều trị hay đã từng điều trị . Bệnh nhân tuân thủ kém thường là yếu tố dẫn đến

thất bại điều trị và sự phục hồi của virus. Sự thiếu kiên trì của bệnh nhân làm phức tạp

phác đồ điều trị của thuốc ARV và chi phí lớn hơn khi điều trị ARV kết hợp [13].

• Độc tính và tương tác thuốc

Độc tính

Điều trị kéo dài bằng thuốc ARV dẫn đến một số tác dụng phụ như: sốt, rối loạn

gan, loạn dưỡng cơ, rối loạn chuyển hóa, bệnh lý thần kinh ngoại biên…

Lamivudin: Viêm tụy (một số trường hợp tử vong) đã xảy ra ở 14 - 18% trẻ dùng

lamivudin đơn thuần hoặc phối hợp với các thuốc kháng retrovirus khác. Nhiễm toan

chuyển hóa lactic và chứng gan to mức độ nặng, thoái hóa mỡ gan (đôi khi gây tử vong)

đã được báo cáo ở bệnh nhân sử dụng thuốc NRTI. Trong dạng viên phối hợp có

zidovudin, lưu ý độc tính với máu (thiếu máu nặng, giảm bạch cầu trung tính) của

zidovudin, bệnh cơ khi dùng zidovudin kéo dài [8].

Zidovudin: Thiếu máu (thường xảy ra sau 6 tuần dùng zidovudin nhưng đôi khi

sớm hơn), giảm bạch cầu trung tính, giảm bạch cầu (thường là thứ phát sau giảm bạch

cầu trung tính) có thể xảy ra khi dùng zidovudin. Rối loạn chuyển hóa lipid, hoại tử

xương đã gặp ở bệnh nhân nhiễm HIV ở giai đoạn bệnh tiến triển hoặc sau khi dùng trị

liệu phối hợp thuốc kháng retrovirus kéo dài.

Tenofovir disoproxil fumarat: Giảm mật độ xương, do đó cần theo dõi các triệu

chứng bất thường về xương, nhất là những người bệnh có tiền sử bị gãy xương hoặc có

nguy cơ loãng xương [8].

Ritonavir: Tác dụng phụ nặng của ritonavir là viêm tụy nặng, có thể gây tử vong.

Hoại tử xương có thể xảy ra ở người bệnh mắc HIV ở giai đoạn muộn hoặc đã được điều

trị lâu ngày bằng trị liệu kết hợp thuốc kháng retrovirus [8].

Tương tác thuốc

Tương tác thuốc có thể xảy ra trong quá trình hấp thụ, chuyển hóa hoặc đào thải

ARV và/hoặc các thuốc tương tác. Một số tương tác sau [15]

Các chất làm giảm acid - chẳng hạn như thuốc ức chế bơm proton, thuốc kháng

H2 hoặc thuốc kháng acid - có thể làm giảm sự hấp thu của thuốc ARV cần acid dạ dày

để hấp thu tối ưu (ví dụ: atazanavir và rilpivirin).

Các sản phẩm có chứa cation đa hóa trị - chẳng hạn như chất bổ sung, sản phẩm

sắt hoặc thuốc kháng acid có chứa nhôm, canxi hoặc magiê - có thể liên kết với các chất

ức chế chuyển chuỗi liên kết (INSTI) và làm giảm sự hấp thụ của các chất ARV này.

Các thuốc gây cảm ứng hoặc ức chế enzym cytochrom P450 (CYP) 3A4 hoặc chất

vận chuyển P-glycoprotein trong ruột có thể làm giảm hoặc thúc đẩy quá trình hấp thu

các thuốc khác.

Hệ thống enzyme CYP450 chịu trách nhiệm chuyển hóa nhiều loại thuốc, bao gồm

các chất ức chế men sao chép ngược không nucleoside, chất ức chế protease, chất đối

kháng CCR5 maraviroc và INSTI elvitegravir. CYP3A4 là enzym phổ biến nhất chịu

trách nhiệm chuyển hóa thuốc, mặc dù nhiều enzym có thể tham gia vào quá trình

chuyển hóa thuốc. Thuốc ARV và thuốc dùng đồng thời có thể là chất gây cảm ứng,

chất ức chế và/hoặc cơ chất của các enzym này.

Ritonavir (RTV) và cobicistat (COBI) đều là chất ức chế mạnh enzym CYP3A4

và do đó, khi dùng đồng thời với thuốc ARV được chuyển hóa theo con đường CYP3A4,

kết quả là sự tiếp xúc toàn thân của thuốc ARV sẽ cao hơn. Điều quan trọng là RTV và

COBI có tác dụng khác nhau đối với các enzym chuyển hóa CYP và các chất vận chuyển

thuốc. Các cơ chế phức tạp hoặc chưa biết của các tương tác dựa trên dược động học

loại trừ khả năng ngoại suy của tương tác thuốc RTV đối với một số tương tác COBI

nhất định, chẳng hạn như tương tác với warfarin, thuốc chống đông đường uống trực

tiếp, phenytoin, voriconazole, thuốc tránh thai.

Các chất vận chuyển thuốc được thể hiện trong các mô khác nhau và chúng đóng

một vai trò quan trọng trong việc xử lý thuốc. Kiến thức về các chất vận chuyển thuốc

đang phát triển, làm sáng tỏ thêm các cơ chế tương tác thuốc. Ví dụ, DTG làm giảm độ

thanh thải thận của metformin bằng cách ức chế chất vận chuyển cation hữu cơ trong tế

bào ống thận. Các chất vận chuyển tương tự hỗ trợ thải trừ thuốc ở gan, thận và mật và

có thể dễ bị tương tác thuốc. ARV và thuốc dùng đồng thời có thể là chất gây cảm ứng,

chất ức chế và/hoặc cơ chất của những chất vận chuyển thuốc này. Ảnh hưởng của các

chất vận chuyển thuốc đối với tương tác thuốc-thuốc rất phức tạp và ý nghĩa lâm sàng

của những tương tác này chưa rõ ràng nhưng đang được nghiên cứu làm sáng tỏ.

• Sinh khả dụng kém

Hầu hết các thuốc ARV được bào chế dưới dạng rắn bằng đường uống, tuy dạng

rắn bằng đường uống cung cấp sự tiện lợi khi sử dụng nhưng liều lượng kết hợp giữa

các hợp chất của ARV trong phác đồ điều trị thường cao để đạt được mục đích điều trị

là ức chế được virus. Việc phân phối thuốc qua đường uống bị tác động bởi quá trình

hấp thu và phân hủy trong đường tiêu hóa do các enzym và pH của dạ dày. Các rào cản

chuyển hóa/đào thải và vận chuyển làm giảm đáng kể lượng thuốc HIV đạt được mục

tiêu. Bên cạnh đó, một số thuốc ARV có thời gian bán thải ngắn do vậy đòi hỏi người

bệnh phải sử dụng thường xuyên liều tăng cường để bù lại sự kháng thuốc [13].

• Thiếu khả năng tiếp cận với các mô và ổ virus

Hầu hết các thuốc kháng virus HIV không thể vượt qua hàng rào máu não do

chúng xâm nhập không hiệu quả vào các tế bào vi mô như tế bào thần kinh đệm hình

sao, tế bào biểu mô nội tủy, tế bào ít nhánh và vi bào đệm. Nguyên nhân là do các tế bào

vi mô này có lượng protein cao nên thuốc kháng HIV không thể liên kết với các trình tự

protein này để tiếp cận với virus HIV tại đây [13].

Theo nghiên cứu của Christa Buckheit Sturdevant và cộng sự, sự nhân lên của virus

HIV-1 trong phân khu hệ thống thần kinh trung ương có khả năng cung cấp nền tảng

cho sự suy giảm nhận thức thần kinh [16]. Với người bị nhiễm HIV có số lượng tế bào

CD4 < 200 có nguy cơ phát triển tình trạng sa sút trí tuệ ảnh hưởng đến tinh thần và thể

chất trong đó người bệnh không thể thực hiện các hoạt động binh thường hàng ngày mà

không có sự trợ giúp.

Ngoài ra, người ta quan sát thấy rằng các loại thuốc ARV không thể tiếp cận hệ

bạch huyết chứa virus HIV. Vì vậy, liệu pháp thông thường không hiệu quả trong việc

tiêu diệt các ổ chứa virus như hạch bạch huyết trong hệ thống tuần hoàn. Các tế bào của

hệ bạch huyết như đại thực bào và tế bào đuôi gai có liên quan đến việc truyền virus đến

tế bào CD4 và không thể nhắm vào mục tiêu là các ổ virus làm tăng nguy cơ tái phát

virus sau điều trị [13].

1.2. Giải pháp thuốc phóng thích kéo dài

Các dạng thuốc phóng thích tức thời không duy trì được nồng độ thuốc ổn định

trong huyết tương. Do đó, các dạng này thường có thời gian tác dụng ngắn, đòi hỏi sử

dụng nhiều lần trong ngày. Trong khi đó, các bệnh mãn tính thường có thời gian điều trị

kéo dài, có thể lên đến vài tháng, thậm chí nhiều năm. Việc dùng thuốc nhiều lần trong

ngày gây khó khăn và bất tiện cho bệnh nhân. Nguy cơ quên liều hoặc bổ sung liều dễ

xảy ra dẫn đến khả năng không tuân thủ điều trị [17]

Vào năm 2013, ExpressScripts tuyên bố rằng việc không tuân thủ đã gây ra chi phí

337 tỷ đô la cho hệ thống chăm sóc sức khỏe, tương đương với gần 10.000 đô la chi tiêu

bổ sung cho mỗi cá nhân. Một nghiên cứu năm 2015 của Healthentic cho biết việc không

tuân thủ dùng thuốc đối với một số bệnh mãn tính phổ biến nhất, chẳng hạn như tiểu

đường, bệnh tim và cholesterol cao, cũng góp phần gây ra hơn 8 triệu đô la mỗi năm chi

phí nhập viện có thể tránh được cho mỗi 100.000 người. Nghiên cứu ExpressScripts chỉ

ra rằng các hành vi của bệnh nhân, chẳng hạn như hay quên, trì hoãn và nhầm lẫn đối

với các thói quen dùng nhiều loại thuốc phức tạp, là nguyên nhân chính dẫn đến tỷ lệ

không tuân thủ điều trị cao [18]. Trong những năm gần đây, các dạng thuốc phóng thích

kéo dài qua đường uống ngày càng trở nên phổ biến và là sự lựa chọn thay thế hiệu quả

cho các dạng uống rắn thông thường. Đây là dạng bào chế có khả năng giải phóng dược

chất trong khoảng thời gian mong muốn để duy trì nồng độ thuốc ở khoảng điều trị. Nói

một cách đơn giản, mục tiêu của các dạng thuốc này là kéo dài quá trình giải phóng và

hấp thu dược chất, giảm thiểu kích ứng tại chỗ ở đường tiêu hóa, nhằm duy trì nồng độ

thuốc trong máu ở khoảng điều trị trong một thời gian cụ thể, nhờ đó kéo dài thời gian

tác động, giảm số lần dùng thuốc do đó cải thiện đáng kể sự tuân thủ của bệnh nhân,

tăng độ an toàn, nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc [19]. Về hình thức dạng thuốc

• Dạng thuốc giải phóng kéo dài: chỉ chung các dạng bào chế có khả năng giải

phóng thích kéo dài có thể là viên nén, viên bao, vi hạt, hỗn dịch, nhũ tương.

phóng dược chất trong khoảng thời gian mong muốn để duy trì nồng độ thuốc ở khoảng

• Dạng thuốc giải phóng nhắc lại: là những dạng bào chế chứa những liều dược

điều trị.

chất được giải phóng ngắt quãng sau những khoảng thời gian nhất định, nồng độ

dược chất duy trì trong khoảng điều trị, nhưng không hằng định (ví dụ viên trong

• Dạng thuốc giải phóng có kiểm soát: cũng là thuốc phóng thích kéo dài nhưng

viên).

ở mức độ cao hơn, “kiểm soát” hàm ý duy trì nồng độ dược chất hằng định trong

• Dạng giải phóng thuốc khác - giải phóng tại đích: là các bào chế phóng thích

máu ở khoảng điều trị.

kéo dài giải phóng phần lớn dược chất tại nơi điều trị, tập trung nồng độ dược

chất cao tại đích, phát huy được tối đa hiệu quả điều trị.

1.2.1. Ưu điểm của phóng thích kéo dài

- Duy trì nồng độ dược chất trong máu ở khoảng điều trị.

- Giảm được dao động nồng độ thuốc trong máu (tránh hiện tượng đỉnh- đáy) do

- Giảm được số lần dùng thuốc cho người bệnh, bảo đảm được sự tuân thủ của

đó giảm được tác động không mong muốn của thuốc, tăng tính an toàn.

người bệnh theo chế độ liều đã được chỉ định, nhất là những người bị bệnh mãn

tính phải điều trị dài ngày (bệnh cao huyết áp, đái tháo dường…).

- Khi có hiện tượng ngộ độc, tác dụng phụ hoặc không dung nạp thuốc thì khó

1.2.2. Nhược điểm của phóng thích kéo dài

- Thuốc phóng thích kéo dài là những dạng bào chế đòi hỏi kỹ thuật cao

- Chỉ một số dược chất điều chế được dưới dạng phóng thích kéo dài.

- Cần phải hướng dẫn sử dụng thuốc để đảm bảo việc dùng thuốc đúng với ý đồ

khăn trong việc xử trí vì thuốc không được thải trừ ngay ra khỏi cơ thể.

- Giá thuốc của dạng bào chế thường cao hơn dạng thông thường.

- Thuốc phóng thích kéo dài có thể chia thành các loại sau (xem hình 1.3)

thiết kế, ví dụ không được nhai, cà nát...

Hình 1.3. Đồ thị nồng độ thuốc theo thời gian ở các dạng thuốc khác nhau.

Ghi chú: MEC nồng độ tối thiểu có tác dụng điều trị; MTC nồng độ tối thiểu gây độc

1.3. Các chiến lược điều trị HIV hướng đến hiện nay

1.3.1 Thuốc hướng đích

Nhiễm virus suy giảm miễn dịch ở người (HIV) vẫn là một nguyên nhân gây tử

vong đáng kể trên toàn cầu. Mặc dù điều trị ARV đã làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc và tử

vong do AIDS, nhưng có một số hạn chế trong liệu pháp hiện tại, bao gồm độc tính,

tương tác thuốc - thuốc, sự phát triển của tình trạng kháng thuốc, sự cần thiết đối với

điều trị bằng thuốc trong thời gian dài, tính khả dụng sinh học kém và thiếu khả năng

tiếp cận với các mô và các ổ chứa rirus. Để phá vỡ những các vấn đề, các nghiên cứu

điều trị kháng HIV gần đây đã tập trung vào việc cải thiện hệ thống phân phối thuốc

thông qua thuốc được nhắm mục tiêu cụ thể đến các tế bào vật chủ bị nhiễm HIV hoặc

có khả năng bị nhiễm HIV [16].

Trong số các cách tiếp cận gần đây của hệ thống phân phối thuốc mới cho các

thuốc kháng HIV, phân phối thuốc nhắm mục tiêu/nội bào chỉ trong các tế bào chủ có

khả năng bị nhiễm HIV hoặc cụ thể hơn là các tế bào nhiễm HIV và các ổ chứa virus.

Mục đích chính của việc nhắm mục tiêu là tối ưu hóa chỉ số điều trị của một loại thuốc

bằng cách xác định vị trí nghiêm ngặt hoạt động dược lý của nó cho vị trí hoặc cơ quan

tác dụng. Kết quả của việc nhắm mục tiêu sẽ làm giảm đáng kể độc tính của thuốc, giảm

thuốc, liều lượng, và tăng hiệu quả điều trị. Trong quá trình nhiễm HIV, virus chỉ lây

nhiễm các tế bào cụ thể của hệ thống miễn dịch bao gồm tế bào lympho TCD4, (hay còn

được gọi là tế bào CD4+), đại thực bào và tế bào đuôi gai. Đó là cơ sở lý luận vững chắc

để nhắm mục tiêu phân phối các loại thuốc chống HIV đặc biệt cho các tế bào này để

tăng hiệu quả của liệu pháp. Phân phối thuốc đến các mô nhiễm HIV/tế bào có tính chọn

lọc có thể đạt được bằng cách nhắm mục tiêu các điểm đánh dấu bề mặt trên tế bào

TCD4, đại thực bào, tế bào đuôi gai và hướng tới thần kinh trung ương.

Nhắm mục tiêu vào các thụ thể này có thể có hai tác dụng: i) bảo vệ dự phòng tế

bào bằng cách chiếm giữ thụ thể cần thiết cho sự tương tác giữa virus và tế bào, và/ hoặc

ii) cải thiện sự hấp thu cụ thể của một vật mang nano được tải các loại thuốc kháng virus.

• Nhắm mục tiêu glycoprotein - 120 (gp 120)

Glycoprotein-120 (gp120) có trong vỏ ngoài của HIV cho phép sự xâm nhập của

các phần tử virus vào tế bào TCD4. Nó chủ yếu liên kết với thụ thể CD4 của tế bào

lympho T và đại thực bào và hỗ trợ sự xâm nhập của virus với sự trợ giúp của protein

dung hợp gp41 [20].

Các tiểu đơn vị bề mặt HIV-1 gp120 vỏ chứa 5 vùng hằng định được bảo tồn (C1-

C5) và 5 các vùng biến đổi (V1-V5) và đóng một vai trò quan trọng trong việc bắt đầu

và kiểm soát lây nhiễm HIV-1 [21], [22], [23], [24] và một số vị trí khác (glycoprotein

N332, vị trí liên kết CD4 (sCD4),…). Thông tin cấu trúc này cung cấp cơ sở để phân

tích sự tương tác giữa các chất ức chế và virus, cũng như giúp tiếp tục thiết kế tối ưu

hóa các chất ức chế.

• Các kháng thể hoặc protein tái tổ hợp nhắm mục tiêu gp120 CD4

VRC01, VRC02 và VRC03 là các kháng thể trung hòa phổ rộng được phân lập

từ các tế bào B của người nhiễm HIV-1, bắt chước một phần sự tương tác của thụ thể

CD4 với gp120 [25].

• Protein nhắm mục tiêu gp120 CD4

Sự gắn kết của gp120 với CD4 đóng một vai trò quan trọng trong bước đầu tiên

của sự xâm nhập của virus. CD4 hòa tan chứa bốn miền tương đồng globulin miễn dịch

ngoại bào (T4), có thể cạnh tranh với thụ thể CD4 cho phối tử và là ứng cử viên sớm

nhất được xem xét để phát triển thành thuốc kháng HIV tiềm năng [26]. Người ta nhận

thấy rằng hai miền ngoại bào đầu tiên (D1D2) cũng có thể mô phỏng sự gắn kết của thụ

thể CD4 với gp120 [27]. Trong một nghiên cứu cho thấy, phân tử CD4 hòa tan tái tổ

hợp cắt ngắn (sCD4) đã được sản xuất dễ dàng vô hiệu hóa sự lây nhiễm của các chủng

HIV-1 trong phòng thí nghiệm trong ống nghiệm [28], [29]. Một nghiên cứu khác cho

thấy các hợp chất bắt chước CD4 và sCD4 ức chế nhiễm HIV-1 bằng cách kích hoạt

sớm trạng thái trung gian hoạt động nhưng thoáng qua của glycoprotein vỏ. Bên cạnh

đó, sCD4 có hoạt tính kháng HIV-1 cao trong ống nghiệm và in vivo [30], [31]. Tuy

nhiên, thời gian bán hủy của sCD4 tương đối ngắn. Ở một số bệnh nhân, virus phục hồi

nhanh chóng và không cho thấy hiệu quả điều trị rõ ràng [28], [29]. Ngoài ra, sCD4, ở

mức nồng độ thấp, có thể làm tăng sự lây nhiễm của một số chủng lâm sàng, có thể do

sự liên kết của sCD4 đến HIV-1 gp120 dẫn đến phơi nhiễm, làm cho virus dễ dàng lây

nhiễm các ô lân cận [32], [33]. Những hạn chế này đã làm giảm đáng kể các ứng dụng

lâm sàng của sCD4. Tương tự, để chặn sự tương tác giữa gp120 và thụ thể CD4 theo

cách hiệu quả hơn, PRO-542, chứa miền liên kết của CD4 và IgG2 không có miền VH

và VL, đã được thiết kế [34], [35]. Đúng như dự đoán, PRO-542 đã ngắt liên kết CD4

với gp120 bằng cách bắt chước thụ thể CD4. Hơn nữa, nó có thể vô hiệu hóa hoạt động

chống lại các chủng HIV-1 tiên phát trong ống nghiệm, và có thể làm giảm tải lượng

virus trong mô hình murin [36], [37]. So với sCD4, PRO-542 liên kết với virion nhiều

hơn và có thời gian bán hủy dài 3 - 4 ngày trong in - vivo. Một nghiên cứu liều đơn Pha

II cho thấy PRO 542 gây ra 80 % tỷ lệ đáp ứng và tải lượng virus đã giảm đáng kể trong

vài tuần sau điều trị. Tuy nhiên, tiêm tĩnh mạch và chi phí thuốc có thể là những trở ngại

cho việc sử dụng lâm sàng [34], [38].

• Nhắm mục tiêu glycoprotein - 41 (gp 41)

Người ta tin rằng các chất béo trong lipopeptid có thể gắn các peptid vào màng tế

bào, dẫn đến nồng độ peptid tăng cao tại vị trí hợp nhất [39], [40], [41], [42]. Các

lipopeptid có thời gian bán hủy in- vivo kéo dài hơn so với các peptid không liên hợp,

có thể vì chúng có thể liên kết thuận nghịch với protein trong huyết thanh [43], [44],

[45]. Klug và cộng sự đã sửa đổi HP23 và 2P23 với các chất béo khác nhau (ví dụ: béo

acid, cholesterol, sphingolipid). HP23 và 2P23 được liên hợp với axit palmitic (C16),

methionin liên kết với MT trong HP23 được thay thế bằng leucine để tạo ra LP-11 và

LP-19, chủ yếu nhắm mục tiêu PFD của gp 41 NHR và ức chế HIV-1 trên lâm sàng với

các chủng được phân lập, bao gồm các chủng kháng T20 và các chủng kháng HP23 hoặc

2P23. Ngoài ra, LP-19 có thể ức chế hiệu quả sự lây nhiễm HIV-2 và SIV [39], [46].

Sau đó, cùng một nhóm đã thiết kế một loạt (ví dụ như lipopeptid, để thiết kế LP40 bằng

cách thay thế vùng giàu tryptophan ở đầu cuối T20 với C16. Điều thú vị là LP40 ức chế

sự dung hợp tế bào và hoạt động xâm nhập của virus pseudovirus bổ sung cho LP-11,

do đó có tác dụng hiệp đồng kháng virus HIV [47].

1.3.2 Thuốc có tác dụng kéo dài

• Thuốc tiêm

Các phác đồ dùng thuốc có tác dụng kéo dài có thể giúp việc điều trị HIV thuận

tiện hơn và giảm gánh nặng chung sống với virus. Một số thuốc tiêm hiện tại tác dụng

kéo dài trong thử nghiệm lâm sàng phase II và phase III sau đây:

Rilpivirin (RPV, TMC278), là một chất ức chế men sao chép ngược không

nucleosid (NNRTI) được FDA chấp thuận cho việc điều trị HIV vào năm 2011 khi được

sử dụng như một phần của phác đồ ART kết hợp đường uống [48-50].

Ngoài việc sử dụng bằng đường uống, dược động học và đặc tính hóa học của

RPV, phần lớn không tan trong nước và dầu, đã cho phép nó phát triển ở kích thước

nano [51]. Một nghiên cứu về các liều khác nhau của kích thước nano RPV nhằm mục

đích đánh giá dược động học và độ an toàn của cơ mông hoặc tiêm bắp delta (IM) hoặc

tiêm dưới da bụng ở 60 tình nguyện viên khỏe mạnh âm tính với HIV cho thấy kết quả

phù hợp với trải nghiệm tiền lâm sàng: RPV được giải phóng từ từ từ vị trí tiêm vào

huyết tương, với nồng độ thuốc trên 10 ng/mL cho 12 - 26 tuần (với các tác dụng phụ

được báo cáo tối thiểu và không có sự kiện bất lợi cấp 4) [52]. Thời gian bán hủy thải

trừ trong huyết tương là 44–61 ngày [52], [53].

Abotegravir (CAB, GSK1265744) là chất ức chế chuyển sợi tích hợp (INSTI),

một đồng loại hóa học của dolutegravir (DTG), có hoạt tính in vitro và hiệu lực tương

therapy - liệu pháp kháng virus tác dụng kéo dài) dưới dạng hỗn dịch tiêm tác dụng kéo

đương [54]. Cabotegravir đang được phát triển LA-ART (Long - acting antiretroviral

dài để điều trị dự phòng trước phơi nhiễm nhằm giảm nguy cơ quan hệ tình dục HIV

mắc phải. Nghiên cứu mù đôi giai đoạn I và IIa có đối chứng với giả dược đánh giá liều

CAB uống hàng ngày và duy nhất trong 10 ngày đã chứng minh sự gia tăng tỷ lệ với

liều lượng thuốc ở những người tham gia không bị nhiễm HIV và người bị nhiễm HIV

(persons with HIV - PWH), một sự gia tăng kéo dài thời gian bán hủy trung bình trong

huyết tương là 31,5 giờ và ở PWH, với mức giảm RNA HIV hơn 11 ngày còn 2,2 - 2,3

log10 bản sao/mL [55]. Cabotegravir thường được dung nạp tốt. Nghiên cứu mở giai

đoạn I đã thử nghiệm hỗn dịch tiêm CAB 200 mg/mL được dùng với liều tăng dần duy

nhất được tiêm bắp hoặc tiêm dưới da ở những người không bị nhiễm HIV và được tìm

thấy nồng độ thời gian trong huyết tương kéo dài với nồng độ CAB có thể đo được lên

đến 52 tuần sau khi dùng thuốc [56].

• Thuốc đường uống sử dụng chất mang nano

Công nghệ nano - tập hợp các nguyên tử hoặc cấu trúc hợp chất thành quy mô

nanomet - đang thu hút sự quan tâm của các ngành khoa học bao gồm hóa học, khoa học

vật liệu và kỹ thuật. Trong khoa học dược phẩm, ý tưởng tạo ra các công thức thuốc

nano không phải là mới. Nó đã được sử dụng để bào chế thuốc thành các tinh thể có

kích thước nano, nhũ tương, chất keo và các công thức liposom ở dạng huyền phù hoặc

ở dạng bào chế rắn. Gần đây, các nền tảng phân phối thuốc dựa trên công nghệ nano đã

thu hút được sự quan tâm mới - đặc biệt là trong nghiên cứu công thức nano kết hợp

thuốc - đặc biệt là kết hợp đa dạng của các loại thuốc đến các tế bào và mô và kéo dài

các mức thuốc này chỉ với một liều duy nhất. Một mục tiêu đầy thách thức như vậy là

cần thiết để giải quyết nhu cầu lâm sàng trong việc tuân thủ điều trị của bệnh nhân và

khắc phục tình trạng thiếu thuốc ở mô xảy ra ở bệnh nhân HIV trong liệu pháp phối hợp

thuốc uống hàng ngày kéo dài suốt đời. Một khi một nền tảng điều trị kết hợp thuốc tác

dụng kéo dài (có thể được nhắm mục tiêu) như vậy được thiết lập, nó có thể được sử

dụng để giải quyết các bệnh mãn tính và đe dọa tính mạng thách thức nhất như HIV/

AIDS, ung thư, rối loạn tim mạch, v.v.

• Sử dụng hạt nano lipid

Thông qua việc khám phá các tương tác giữa lipid - thuốc và lipid - protein, các hệ

thống phân phối thuốc dựa trên lipid (liposom, hạt nano lipid, hạt nano lipid rắn và

ethosom).

Liposom hoặc túi lipid, được chế tạo với các lớp kép lipid đồng tâm (một mô phỏng

sinh học của màng tế bào) để bảo vệ các phân tử thuốc trong màng lipid hoặc lõi nước,

là một nền tảng công thức quan trọng tương thích sinh học và có thể phân hủy sinh học

cho các thuốc chống HIV/AIDS. Liposom mang lại những lợi thế như kết hợp cả thuốc

ưa nước trong lõi nước và thuốc kỵ nước trong lớp kép phospholipid. Tuy nhiên, phần

thuốc hòa tan trong nước được bao bọc trong lõi nước, ngay cả khi ở nồng độ lipid bão

hòa là rất nhỏ, và điển hình đối với các hạt nước hoặc liposom nhỏ ở kích thước 50-100

nm sẽ là khoảng 1% hoặc ít hơn. Chúng cũng cho phép chức năng hóa bề mặt để cung

cấp mục tiêu thuốc và chúng có tính sinh miễn dịch thấp. Bốn loại hệ thống phân phối

dựa trên liposom - cation, anion, ổn định và miễn dịch - đã được nghiên cứu chủ yếu để

phân phối thuốc chống HIV/AIDS [56]. Với thiết kế phức tạp, liposom có thể được sửa

đổi với các phối tử nhắm mục tiêu để tăng cường phân phối thuốc trong tế bào và cải

thiện hiệu quả của thuốc. Các liposom cũng có thể cuốn theo các thuốc ARV dạng hạt

nano khác để giải phóng thuốc bền vững [57].

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử phospholipid Hình 1.4: Mặt cắt ngang của liposom

gồm 2 phần: Đầu ưa nước (màu xanh) và

đuôi kỵ nước (màu vàng)

Hạt nano lipid là phức hợp lipid-thuốc. Chúng cho thấy sự ổn định về thể chất và

khả năng tải thuốc cao của các loại thuốc kỵ nước nói chung, nhưng thách thức hơn

trong việc bao bọc các phân tử ưa nước. Các hạt nano lipid thể hiện các mô hình phân

bố và đào thải khác biệt trong cơ thể so với liposom [58]. Nhóm nghiên cứu đã báo cáo

ban đầu về hạt nano lipid có chứa IDV giúp nâng cao nồng độ thuốc trong tất cả các

hạch bạch huyết được phân tích ở động vật linh trưởng [59]. Sau đó, nhóm nghiên cứu

phát hiện ra tương tác của atazanavir (ATV) và darunavir (DRV) với lipid có thể tạo

điều kiện thuận lợi cho việc phân phối kết hợp 2 loại thuốc trên [60].

Các hạt nano lipid rắn (SLN): chứa một lõi lipid rắn, rắn ở cả nhiệt độ phòng và

nhiệt độ cơ thể người [61]. Chúng đã được sử dụng thay thế cho các hệ thống hạt lipid

hiện có để điều chỉnh cấu hình giải phóng thuốc [62]. SLN có thể được sửa đổi thêm với

các polyme để khắc phục các nhược điểm liên quan đến công thức lipid rắn bao gồm

khả năng tải thuốc hạn chế, khả năng giải phóng thuốc không thể đoán trước và độ hòa

tan hạn chế của thuốc trong nền lipid [63].

Ethosom: chứa phospholipid, rượu ở nồng độ tương đối cao và nước - là những túi

chất dẫn truyền khác với kết quả đầy hứa hẹn cho việc phân phối thuốc chống HIV/AIDS

qua da. Nghiên cứu thấm IDV qua da tử thi người cho thấy thông lượng thẩm thấu qua

da từ các liposom ethanol được tăng cường đáng kể so với từ dung dịch thuốc ethanol,

liposom thông thường, hoặc dung dịch thuốc thông thường [64]. Tuy nhiên, tác dụng

cục bộ của ethanol trên da có thể là một thách thức đối với việc sử dụng lâu dài ở một

số bệnh nhân [65].

Hình 1.5: Cấu trúc Liposom [66]

• Sử dụng hạt nano polyme

Hạt nano dựa trên polyme đã được nghiên cứu rộng rãi để điều trị HIV/AIDS bằng

cách tăng cường khả năng tải thuốc của chúng, kéo dài thời gian lưu thông trong máu,

dễ dàng điều chỉnh hoạt chất, và chức năng hóa bề mặt thuận tiện. Thuốc có thể được

liên hợp cộng hóa trị thành polyme, được nạp vào các mixen cao phân tử bằng các tương

tác kỵ nước, hoặc được bao bọc thành cao phân tử hạt nano. Các liên hợp polyme-thuốc

bao gồm các chất mang polyme tan trong nước, các liên kết phân hủy sinh học. Thuốc

cũng có thể được thiết kế khéo léo để trải qua quá trình giải phóng "kích hoạt" từ polyme

với các liên kết liên hợp cụ thể. Khả năng kích hoạt nội bào giải phóng các tiền chất

polyme này có thể kéo dài hiệu quả thời gian bán hủy tuần hoàn và giảm bớt các tác

dụng phụ gây độc tế bào ngoài mục tiêu.

Thuốc cũng có thể được nạp hoặc đóng gói thành các hạt nano cao phân tử mà

không cần có sự liên hợp của chất mang và thuốc. Nhiều loại polyme, chẳng hạn như

polymethylmethacrylat (PMMA), poly (propylenimin) (PPI) dendrimer, đã được sử

dụng để cung cấp ARV thành công [67].

1.3.3 Vacccin điều trị

Mặc dù thành công của liệu pháp kháng virus (ART) trong việc biến HIV thành

bệnh có thể kiểm soát được, rõ ràng là điều trị ARV lâu dài sẽ không loại bỏ được ổ

chứa HIV và chữa khỏi bệnh nhiễm trùng. Thay thế các chiến lược để loại trừ lây nhiễm

HIV, hoặc ít nhất là tạo ra trạng thái kiểm soát virus và thuyên giảm không dùng thuốc

là cần thiết. Tiêm phòng trị liệu bằng vaccin nhằm mục đích tạo ra hoặc tăng cường khả

năng miễn dịch để thay đổi quá trình của một dịch bệnh [68].

Không giống như vaccin được thiết kế để ngăn ngừa lây nhiễm HIV, vaccin điều

trị HIV có thể được sử dụng cho những người đã có virus, kích thích hệ thống miễn dịch

của họ để ngăn chặn sự tiến triển của HIV và loại bỏ nhu cầu điều trị khác.

Mục tiêu phổ biến hiện nay là theo đuổi sự bảo vệ người bị nhiễm HIV bằng vaccin

qua trung gian kháng thể. Với nhiều bằng chứng về khả năng của tế bào T trong việc

kiểm soát sự nhân lên của HIV-1, tiềm năng bảo vệ của chúng cũng nên được khai thác

bằng cách tiêm chủng. Mục tiêu của chiến lược vaccin điều trị là tạo ra các tế bào T

mạnh và rộng nhắm mục tiêu vào các phần quan trọng về mặt chức năng của các protein

HIV-1 phổ biến cho các biến thể toàn cầu. Các vaccin này đã được thử nghiệm trong

tám thử nghiệm lâm sàng phòng ngừa và điều trị giai đoạn 1/2 ở châu Âu và châu Phi,

và tạo ra tần số cao của tế bào TCD8 đặc hiệu rộng có khả năng ức chế trong ống nghiệm

bốn nhóm HIV-1và kết hợp với tác nhân kích hoạt độ trễ đã tạo ra tín hiệu kiểm soát

virus học không dùng thuốc ở những bệnh nhân được điều trị sớm [69].

1.4. Dendrimer PAMAM biến tính và tiềm năng mang thuốc

Dendrimer polyamidoamin (PAMAM) là một loại nano polymer được đánh giá là

có tiềm năng làm chất mang thuốc do nhà hóa học người Mỹ Donald A.Tomalia và cộng

sự khám phá ra năm 1985, có cấu trúc như nhánh cây tỏa ra xung quanh từ lõi. Bên

ngoài dendrimer chứa các nhóm chức hoạt động, bên trong có nhiều khoang trống có

thể tạo thành các nanocapsul lý tưởng để mang vác các hoạt chất, đặc biệt là thuốc nhằm

tang khả năng tan của thuốc, giảm độ độc của thuốc, tăng thời gian lưu trong máu của

thuốc. Ngoài ra, với các nhóm chức amin trên bề mặt giúp dendrimer có khả năng biến

tính với các tác nhân làm tăng khả năng thâm nhập qua màng tế bào của thuốc, tăng khả

năng sinh khả dụng của thuốc, tăng hiệu quả dử dụng thuốc, tăng khả năng tồn trữ của

thuốc [4]. Phân tử dendrimer điển hình gồm 3 phần: lõi trung tâm, nhánh phát sinh từ

Nhóm bề mặt Nhánh bên trong

lõi và nhóm bề mặt bên ngoài [4].

Hình 1.4. Cấu trúc dendrimer điển hình

Giống như các dendrimers khác, PAMAM có hình dạng giống quả cầu về tổng thể

và được đặc trưng bởi kiến trúc phân tử bên trong phân nhánh giống như cây.

Dendrimer là nền tảng phân tử có triển vọng để phân phối thuốc do các đặc tính

độc đáo của chúng. Các đại phân tử này được biết đến với kích thước, hình dạng và

trọng lượng phân tử xác định, cũng như tính phân tán đơn lẻ, sự hiện diện của khoảng

trống bên trong. Chính những lợi điểm về cấu trúc này cho phép dendrimer đóng vai trò

quan trọng trong các lĩnh vực công nghệ nano, dược phẩm, hóa dược và mỹ phẩm. Các

hoạt chất có thể dễ dàng gói gọn vào bên trong của dendrimer hoặc gắn các tác nhân liên

hợp hoặc hấp phụ vật lý trên bề mặt dendrimer nhằm đạt được các đặc tính mong muốn

của hệ phân phối. Sự tương tác giữa dendrimer với các loại thuốc hữu cơ được phân

thành hai loại là tương tác vật lý và tương tác hóa học như Hình 1.5 được mô tả dưới

đây:

Thuốc hấp thụ Thuốc liên hợp Thuốc đóng gói

Hình 1.5. Một số kiểu kết hợp giữa dendrimer và thuốc

PAMAM được tổng hợp từ các diamin nên nhóm bề mặt là các nhóm amin, các

nhóm này có thể tương tác với màng tế bào gây ra hiện tượng dung giải, đây là nhược

điểm lớn nhất của dendrimer. Do vậy, dendrimer được ghép với methoxy polyethylen

glycol (mPEG), pluronic, nhóm acetyl, carbohydrat và các chất khác không ảnh hưởng

đến khả năng tồn tại của tế bào, và vẫn duy trì các đặc tính có lợi khác [4].

Dendrimer PAMAM G 3.0 với 32 nhóm amin, cấu trúc đủ chặt để tạo các khoảng

trống bên trong phân tử polyme tạo thành nano-capsule lý tưởng tạo thuận lợi cho việc

mang thuốc, …Nhiều nghiên cứu cho thấy việc kết hợp PAMAM với các polymer ưa

nước sẽ cải thiện được nhược điểm của dendrimer. Vì vậy, chúng tôi chọn methoxy

poly(ethylen glycol) có khối lượng phân tử trung bình Mn 5.000 Da và pluronic F127

(Mn 12.600 Da, có tên thương mại poloxamer 407 đã được Cục Quản lý Thực phẩm và

Dược phẩm Mỹ FDA phê duyệt như một tá dược) làm nguyên liệu biến tính dendrimer

PAMAM nhằm mục đích giảm tác dụng không mong muốn và làm tăng tính tương hợp

sinh học [4], [70].

1.5. Các tác nhân biến tính

1.5.1. Poly(ethylen glycol), PEG và dẫn xuất methoxy poly(ethylen glycol), mPEG

Poly (ethylen glycol), PEG, là một polyme tổng hợp được đánh giá cao từ các tiểu

đơn vị ethylen [72]. Không độc hại, không gây miễn dịch, không kháng nguyên và và

ưa nước, PEG đã được FDA chấp thuận cho các ứng dụng dược phẩm uống, tiêm tĩnh

mạch và da ở người [73]. Nhờ những đặc tính thuận lợi này, PEG với tư cách là polyme

biến tính giờ đây đóng một vai trò quan trọng trong việc phân phối thuốc, một chiến

lược được gọi là PEGylation (PEG hóa). Ban đầu, PEG hóa thường được mô tả chúng

là cation của protein, peptid hoặc các phân tử hữu cơ nhỏ bằng cách liên kết cộng hóa

trị với một hoặc nhiều chuỗi poly-ethylen glycol (PEG) có trọng lượng phân tử khác

nhau [74]. PEG hóa được Davies và Abuchowsky báo cáo lần đầu tiên vào những năm

1970, với albumin và catalase [75-78]. Kể từ đó, công nghệ này đã được sử dụng rộng

rãi trong nghiên cứu thuốc, dẫn đến sự thành công vượt bậc trong nghiên cứu và thương

mại. Các liên hợp PEG - thuốc có một số ưu điểm: kéo dài thời gian lưu trú trong cơ thể,

giảm sự phân huỷ bởi các enzym chuyển hoá, giảm hoặc loại bỏ tính sinh miễn dịch của

protein, [77], [78-80].

PEG là một loại polymer sinh học ưa nước, được sử dụng như một thành phần quan

trọng đối với nhiều hệ thống phân phối thuốc khác nhau. Việc gắn PEG lên bề mặt

dendrimer đem lại nhiều lợi ích như tăng tính tương hợp sinh học, tăng khả năng thâm

nhập qua màng tế bào, làm giảm độ độc của dendrimer, giảm tính sinh kháng thể, có

khả năng kéo dài thời gian lưu thông trong máu, đồng thời dễ đào thải khỏi cơ thể [75].

Về cấu trúc, poly(ethylen glycol) là sản phẩm giữa sự tương tác của các monomer

ethylen oxid với nước, với ethylen glycol, hoặc giữa các oligomer ethylen glycol với

nhau. Thông thường các đại phân tử poly(ethylen glycol) tạo ra có cấu trúc thẳng hoặc

nhánh với trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 500 Da – 30 kDa [70].

PEG được tổng hợp từ quá trình polymer hóa mở vòng bởi tương tác nucleophilic

bằng ion OH- lên vòng epoxid. Tuy nhiên, PEG có nhóm OH ở hai đầu mạch nên có độ

đa phân tán và trọng lượng phân tử cao do phản ứng polymer hóa xảy ra ở cả hai đầu

mạch. Để giải quyết vấn đề đó, người ta đã tiến hành thay thế chúng bằng methoxy

poly(ethylen glycol), mPEG.

Hình 1.6. Cấu trúc phân tử poly(ethylen Hình 1.7. Cấu trúc phân tử

methoxy poly(ethylen glycol) glycol)

Thuốc PEG hóa hiện được sử dụng trong điều trị ung thư, bệnh thận mãn tính, viêm

gan, đa xơ cứng, bệnh máu khó đông và rối loạn tiêu hóa. ADAGEN được sản xuất bởi

Enzon Pharmaceuticals, Inc., Hoa Kỳ là protein PEG hóa đầu tiên được Cơ quan Quản

lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê duyệt vào tháng 3 năm 1990 và đưa

vào thị trường. Kể từ khi ADAGEN được giới thiệu, một lượng lớn protein PEG hóa và

các loại thuốc peptid đã theo kịp bước chân và nhiều loại khác đang được thử nghiệm

lâm sàng hoặc đang trong giai đoạn phát triển. Trong số các loại thuốc được FDA chấp

thuận, Pegasys và Neulasta, đã vượt quá 5 tỷ đô la vào năm 2011. Điều đáng nói là tất

cả các loại thuốc được FDA chấp thuận đều chứa methoxypoly (ethylene glycol -

mPEG). Danh sách các loại thuốc PEG hóa được FDA chấp thuận được trình bày trong

Bảng 1.1 dưới đây:

Bảng 1.1. Danh sách các loại thuốc PEG hóa được FDA chấp thuận

Thuốc cao phân tử

Đơn vị SX

Hoạt chất PEG hóa

Chỉ định

KLTB PEG

Tên thương mại

Năm phê duyệt

Fylnetra

G-CSF

Giảm bạch cầu

20 kDa

2022

Amneal Pharmaceuticals LLC

Besremi PharmaEssentia Corp

Interferon

Đa hồng cầu

40 kDa

2021

Skytrofa

Ascendis

4 x 10 kDa

2021

human growth hormone

Thiếu hormon tăng trưởng

Empaveli

Apellis

Pentadecapeptide

40 kDa

2021

Đái huyết sắc tố kịch phát về đêm (PNH)

4 Nyvepria

Pfizer Inc.

G-CSF

20 kDa

2020

Giảm bạch cầu trung tính liên quan đến hóa trị liệu

Esperoct

Novo Nordisk

40 kDa

2019

Bệnh chảy máu di truyền (hemophilia A)

recombinant antihemophilic factor

6 Ziextenzo

Sandoz

G-CSF

20 kDa

2019

Nhiễm trùng trong quá trình hóa trị liệu

7 Udenyca Coherus Biosciences

G-CSF

20 kDa

2018

Nhiễm trùng trong quá trình hóa trị liệu

Palynziq

phenylketonuria

~ 9 X 20 kDa

2018

BioMarin Pharmaceutical

Revcovi Leadiant Bioscience

ADA-SCID

80 kDa

2018

recombinant phenylalanine amm onia lyase recombinant adenosine deaminase

Fulphila

Mylan GmbH

G-CSF

20 kDa

2018

Nhiễm trùng trong quá trình hóa trị liệu

11 Asparlas

Servier Pharma

L-asparaginase

leukemia

31-39 x 5 kDa

2018

Jivi

Bayer Healthcare

2 X 30 kDa

2017

Bệnh chảy máu di truyền (hemophilia A)

13 Rebinyn

Novo Nordisk

40 kDa

2017

h Bệnh chảy máu di truyền (hemophilia B)

14 Adynovate

Baxalta

≥1 X 20 kDa

2015

Bệnh chảy máu di truyền (hemophilia A)

Plegridy

Biogen

Đa xơ cứng

20 kDa

2014

16 Omontys

Takeda

Thiếu máu

2 X 20 kDa

2012

Sylatron

Merck

U ác tính

12 kDa

2011

recombinant antihemophilic factor recombinant coagulation factor lX recombinant antihemophilic factor peginterferon beta- 1a erythropoietin peginterferon-alfa- 2b

18 Krystexxa

Horizon Pharma

Bệnh gout

40 X 10 kDa

2010

recombinant uricase protein

2008

Cimzia

UCB

Viêm khớp dạng thấp

40 kDa

antitumor necrosis factor

2007

20 Mircera

Roche

erythropoietin

Thiếu máu

30 kDa

2004

21 Macugen

Pfizer

aptamer

Thoái hóa điểm vàng

2 X 20 kDa

22 Somavert

Pfizer

To đầu chi

4-6 X 5 kDa

2003

human growth hormone

23 Neulasta

Amgen

G-CSF

20 kDa

2002

Nhiễm trùng trong quá trình hóa trị liệu

2002

Pegasys

Roche

Viêm gan B và C

40 kDa

2001

25 Pegintron

Schering

Viêm gan C, u ác tính

12 kDa

69-82 X 5 kDa

1994

26 Oncaspar

Enzon

11-17 X 5 kDa

1990

27 Adagen

Enzon

Giảm bạch cầu Rối loạn miễn dịch kết hợp (ADA-SCIO)

peginterferon-alfa- 2a peginterferon-alfa- 2b asparaginase Adenosin deaminas Thuốc phân tử thấp naloxone

Táo bón

339 Da

2014

28 Movantik

AstraZeneca

dodecyl alcohol

Suy tĩnh mạch

400 Da

2010

29 Asclera

Chemische Fabrik Kreussler

Thuốc kích thước nano

Doxil

Schering

liposomal

2 kDa

1995

Ung thư buồng trứng, đa u tủy

PEG có thể được sử dụng như một phương tiện mang thuốc. Quá trình phân phối

thuốc chủ yếu dựa vào PEG vì hợp chất này có thể tương tác với các liên hợp thuốc -

kháng thể. Hơn nữa, PEG còn giúp cải thiện hiệu quả phân phối thuốc bằng cách phủ

lên bề mặt các hạt nano có lỗ rỗng hoặc xốp, từ đó làm chậm quá trình giải phóng thuốc

đã dẫn truyền hóa, cũng như ngăn sự thanh thải bởi protein khỏi hệ tuần hoàn.

• Tóm lại, PEG hóa có ba ưu điểm chính

+ Cải thiện dược động học và đặc tính dược lực học: Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng

sau khi PEG hóa, các đặc tính dược động học trong cơ thể sẽ thay đổi đáng kể, bao gồm

kéo dài thời gian bán thải trong huyết tương, tăng giải phóng thuốc trong cơ thể, giảm

tốc độ thanh thải qua thận, v.v.

+ Tăng cường độ ổn định của thuốc: Sau quá trình PEG hóa của protein và peptid,

một lớp màng hydrat hóa dày hơn sẽ được hình thành trên bề mặt để ngăn chặn sự kết

tụ và kết tủa. Chuỗi PEG linh hoạt có thể tạo ra hiệu ứng cản trở, bảo vệ sửa đổi khỏi sự

tấn công của protease và tăng tính ổn định của sửa đổi.

+ Cải thiện sự phân bố của thuốc trong cơ thể: Sau khi được biến đổi bởi PEG,

trọng lượng phân tử của thuốc tăng lên, làm giảm đáng kể tác dụng lọc cầu thận khi

dùng toàn thân, do đó làm giảm bài tiết qua nước tiểu. Ngoài ra, thuốc PEG hóa đã cải

thiện sự ổn định trong tuần hoàn toàn thân và kéo dài thời gian lưu, có lợi để cải thiện

sự phân phối thuốc trong cơ thể. Đặc biệt, nó có lợi cho sự tích tụ của thuốc đại phân tử

trong khối u và vị trí viêm với tác dụng tăng cường lưu giữ, do đó kéo dài thời gian điều

trị của thuốc in - vivo.

1.5.2. Pluronic

Pluronic hay polyethylen-polypropylen glycol copolymer là tên thương mại của

poloxamer. Poloxamer là một chất đồng trùng hợp triblock không ion bao gồm một khối

kỵ nước trung tâm của poly(propylen oxid) (PPO) được bao bọc bởi hai khối

poly(ethylen oxid) ưa nước (PEO) [73] Từ "poloxamer" được đặt ra bởi Irving

Schmolka, người phát minh ra và đã nhận được bằng sáng chế cho các chất này vào năm

1973. Pluronic còn được biết đến với các tên thương mại khác là Synperonic và

Kolliphor.

Hình 1.8. Cấu trúc phân tử pluronic

Các poloxamer thường có tính chất đặc trưng là phản ứng lại với nhiệt độ và được

dùng rộng rãi trong các hệ thống gel nhiệt. Trong môi trường nước, các poloxamer cho

thấy chúng có cấu trúc khá giống micelle. Khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ tới hạn hoặc

nồng độ tới hạn, các nhóm propylen oxid (PO) kỵ nước sẽ kết vào trong, còn các đầu

ethylen oxid (EO) ưa nước sẽ hướng ra ngoài [82].

Tất cả các pluronic đều có cấu tạo hóa học giống nhau, chỉ khác nhau ở số lượng

tương đối của PO và EO nên trọng lượng phân tử cũng như đặc tính hoạt động bề mặt

của mỗi loại là khác nhau. Hầu hết các pluronic là các chất rắn có khả năng tan trong

nước và chúng hòa tan trong nước lạnh nhiều hơn trong nước nóng, đó là kết quả của

việc gia tăng sự solvat hóa và liên kết hydro ở nhiệt độ thấp. Điều này được giải thích

bởi ở nhiệt độ thấp sẽ tồn tại một lớp hydrat hóa bao quanh các phân tử pluronic trong

dung dịch nước, làm phân tán chúng và kết quả là các pluronic được hòa tan vào trong

nước. Khi nhiệt độ nâng lên các chuỗi ưa nước của pluronic không solvat hóa nữa do sự

đứt gãy các liên kết hydro đã được thiết lập giữa dung môi và các chuỗi này, do đó mà

pluronic không tan tốt trong nước có nhiệt độ cao (> 20 oC) [83].

Các poloxamer thường có tính chất đặc trưng là phản ứng lại với nhiệt độ và được dùng rộng rãi trong các hệ thống gel nhiệt. Khi ở nhiệt độ thấp (0 – 4 oC), dung dịch

pluronic với một nồng độ thích hợp sẽ tồn tại ở trạng thái lỏng, nhưng khi tăng nhiệt độ lên nhiệt độ phòng (20 ~ 25 oC) thì lại chuyển sang dạng gel rắn. Tuy nhiên, dạng gel

này sẽ bị thoái biến và chuyển về dạng lỏng ban đầu nếu hạ nhiệt độ xuống [83]. Nguyên nhân của sự biến đổi thể chất này là do sự hình thành các micelle khi tăng

nồng độ dung dịch pluronic và nhiệt độ môi trường xung quanh. Trong môi trường nước

ở nồng độ thấp (dưới 12 – 15 %) chúng tạo thành các micelle đơn phân tử gồm các phân

tử pluronic đơn lẻ, nhưng khi ở nồng độ cao hơn thì nhiều phân tử tập hợp lại thành các

micell hình cầu gồm một lõi trung tâm kỵ nước ở giữa chứa các chuỗi PPO [83].

Đặc tính của chất đồng trùng hợp khối pluronic® EO-PO-EO thường được sử dụng

vảy [70], [81], [82].

trong dược phẩm trong đó pluronic các ký hiệu L, liquid - lỏng; P, paste - sệt; F, flake -

Pluronic

Khối lượng phân tử

Tổng số nhóm PO Tổng số nhóm EO

Giá trị HLB

trung bình - Da

L64

2.900

12 -18

P84

4.200

12 - 18

P105

6.500

12 - 18

F127

12.600

200

18 - 23

F108

14.600

264

>24

Bảng 1.2. Đặc tính của chất đồng trùng hợp khối pluronic

Tương tự như PEG, pluronic cũng là một polymer tan được trong nước, thấm nước,

không miễn dịch, không độc hại, có độ tương hợp sinh học cao và được sử dụng rộng

rãi trong lĩnh vực y sinh.

Pluronic có tiềm năng lớn trong việc mang các thuốc khó tan trong nước, đặc biệt

là thuốc trị ung thư. Ngoài ra pluronic có nhóm -OH đầu mạch nên dễ dàng kết hợp với

một chất khác để tạo ra hệ chất nano mang thuốc hiệu quả hơn. Về mảng ứng dụng,

pluronic làm chất dẫn truyền và phân phối thuốc trong ngành dược. Với cấu trúc vừa ưa

nước, vừa ưa dầu (amphiphilic), những poloxamer có tính chất hoạt động bề mặt tốt nên

chúng có nhiều ứng dụng trong công nghiệp. Poloxamer có thể làm tăng khả năng hòa

tan trong nước của các chất kỵ nước, chất dầu, hoặc tăng khả năng trộn lẫn của hai chất

kỵ nước khác nhau. Do đó, các poloxamer thường được sử dụng trong các ứng dụng

công nghiệp, mỹ phẩm, dược phẩm. Chúng cũng được đánh giá cao trong việc phân phối

thuốc, đặc biệt với các thuốc kháng tế bào ung thư.

1.6. Tình hình nghiên cứu về thuốc ARV sử dụng chất mang nano

1.6.1. Thế giới

Có rất nhiều nghiên cứu của thế giới hướng đến trong liệu pháp điều trị HIV đã

trình bày trong mục 1.3 Các chiến lược điều trị HIV hướng đến hiện nay, sau đây xin

trình bày thêm một số nghiên cứu:

Theo Dinesh Kumar et al. (2013), nhóm nghiên cứu đã dẫn truyền thuốc ARV

Lamivudin trên nền dendrimer PAMAM G4.0, G5.0 và dendrimer PAMAM liên hợp

G4.0-PEG, G5.0-PEG với hiệu suất mang lần lượt là 28 %; 43 % đối với G4.0, G5.0 và

54 %; 74 % đối với G4.0-PEG, G5.0-PEG [84].

Theo Mohammad R. Aghasadeghi et al. (2013) Lamivudin kết nối với hạt nano

chitosan được PEG hóa để tạo ra một phiên bản mới của Lamivudin. Sản phẩm được

kiểm tra bằng các phương pháp hóa lý như 1H-MNR, quang phổ FTIR và phân tích CHN

được thực hiện. Sau đó, thuốc Lamivudin-PEG- Chitosan (LPC) được đánh giá về khả

năng ức chế sản sinh virion HIV và độc tính tế bào ở các liều lượng khác nhau. Các

virion HIV được tạo ra bằng cách truyền plasmid psPAX2, PmzNL4-3 và pMD2.G vào

dòng tế bào HEK293T. Ngoài ra, đánh giá lượng P24 của chất nổi trên tế bào được thực

hiện bằng phương pháp ELISA. Trong số các liều khác nhau của thuốc LPC (0,1, 1, 10

và 100 μM), người ta thấy rằng 0,1 μM là liều hiệu quả nhất và ít độc nhất so với

Lamivudin ở cùng liều. Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng thuốc LPC có khả năng

ức chế sự nhân lên của virus HIV một cách có ý nghĩa [85].

Esmaeel Mohammadi Pargoo et al. (2021), dendrimer G2.0 liên hợp các phân tử

Lamivudin sử dụng 1 ‐ ethyl ‐ 3‐ [3 ‐ dimethylaminopropyl] carbodien liên hợp với imid

(EDC) và N-hydroxysulfosuccinimid/Calciclorid làm chất xúc tác và chất hút ẩm. Tách

Lamivudin-dendrimer bằng màng thẩm tách kích thước 500–1000 KD. Sản phẩm trong

màng thẩm tách được đông khô và được xác định cấu trúc bằng FTIR, MS và H-NMR,

kích thước và thế zeta. Thực hiện quy trình tương tự thu được sản phẩm Efavirenz-

dendrimer. Sản phẩm được đem thử nghiệm khả năng kháng virus trên tế bào T HEK ‐

293 (dòng tế bào để sản xuất các hạt retrovirus.) được nuôi cấy trong 96 đĩa giếng và

được đánh giá bằng cách sử dụng xét nghiệm XTT và tải lượng protein P24 của HIV-1.

Kết quả cho thấy G2 liên hợp Lamivudin làm giảm đáng kể hoạt tính của virus mà không

gây độc tính tế bào [86].

1.6.2. Trong nước

Một trong trong những ứng dụng nổi bật của dendrimer PAMAM là ứng dụng làm

chất dẫn truyền nano và phân phối thuốc nhằm mục đích tăng sinh khả dụng, tác dụng

kéo dài, giảm độc tính và tác dụng hướng đích của thuốc.

Năm 2013-2014, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Cửu Khoa và Trần Ngọc Quyển

cũng đã có một vài công bố trên các tạp chí ISI về các hạt nano dendrimer dẫn truyền

thuốc chống ung thư 5-fluouroacil và cisplatin. Trong đó chất mang pegylated dendrimer

đã dẫn truyền và nhả chậm thuốc 5- fluouroacil tiêu diệt tế bào ung thư vú và khối u trên

chuột. Đối với dẫn truyền và nhả chậm cisplatin, nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương

pháp cải tiến trong đó dạng hydrat cisplatin được tạo phức với dendrimer. Kết quả hiệu

suất mang cisplatin tăng lên 10 % so với các nghiên cứu đã được công bố trước đó, đồng

thời hệ chất dẫn truyền nano dendrimer-cisplatin có hoạt tính cao trong tiêu diệt tế bào

ung thư phổi [83].

Đối với chất dẫn truyền nanogel heparin, Trần Ngọc Quyển, Nguyễn Đại Hải và

nhóm nghiên cứu ở Hàn Quốc đã tổng hợp thành công chất dẫn truyền nanogel âm điện

- nhạy nhiệt trên cơ sở heparin dẫn truyền nhả chậm các protein dương điện tích hoặc

các tác nhân kích thích phát triển sinh học (growth factors) nhằm ứng dụng trong y sinh

[83].

Năm 2016, luận án tiến sĩ Nguyễn Thị Trâm Châu đã biến tính thành công

dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 với PEG có chiều dài mạch khác

nhau (từ PEG4K đến PEG12K) kết quả cho thấy dendrimer PAMAM G3.0 có thể liên

hợp với 11-12 nhóm PEG và mạch PEG càng dài thì càng khó biến tính. Tương tự, đề

tài cũng biến tính với pluronic có cấu trúc mạch khác nhau (F68 – 8.400 Da, F127 -

12.600 Da và F108 – 14.600 Da) kết quả mạch càng dài càng khó biến tính, số lượng

nhánh polyme gắn lên dendrimer PAMAM đều giảm.

Các dendrimer trước và sau khi biến tính với PEG và pluronic được dẫn truyền

thuốc trị ung thư 5-fluorouracil kết quả dendrimer PAMAM-PEG và PAMAM-pluronic

dẫn truyền thuốc 5-fluorouracil cao hơn các dendrimer PAMAM chưa biến tính trong

đó PAMAM - pluronic dẫn truyền được nhiều thuốc hơn (38,05 % - 76,25 %) so với

PAMAM - PEG (31,05 % - 66,35 %).

Các dendrimer PAMAM-PEG và PAMAM-pluronic dẫn truyền thuốc 5-

fluorouracil có mức độ giải phóng thuốc chậm hơn rất nhiều so với thuốc 5-fluorouracil

đối chứng [70]

Năm 2021, luận án tiến sĩ Nguyễn Ngọc Thể (2021), Tổng hợp và đánh giá hiệu

quả mang thuốc và tiêu diệt tế bào ung thư của một số hệ nanogel trên cơ sở

polysaccharid sulfat (Heparin, Fucoidan) ghép các copolymer tương hợp sinh học,

kết quả đề tài, hệ nanogel Hep-P123 và Fud-P123 dẫn truyền cisplatin và cisplatin

hydrat gần bằng nhau, cụ thể: Fud-P123-Cis (8,66 %) và Hep-P123-Cis (8,92 %). Tuy

nhiên, hiệu quả mang CisOH của hệ chất mang Hep-P123 (30,3%) cao hơn nhiều so

với hệ chất mang Fud-P123 (22 %). Kết quả khả năng nhả thuốc của hệ Hep-P123-

CisOH và Fud-P123-CisOH đều phụ thuộc pH, khi giá trị pH của dung dịch đệm tăng

lên, tốc độ giải phóng thuốc giảm, thuốc được giải phóng nhanh trong môi trường

acid. Đồng thời, cả 2 hệ nanogel mang thuốc còn cho thấy sự giải phóng thuốc diễn

ra không hoàn toàn sau 24 giờ. Phần trăm CisOH được giải phóng ra ở pH 5,5 từ

nanogel Hep-P123 là gần 75 %, trong khi đó nanogel Fud-P123 giải phóng thuốc

chậm hơn sau 24 giờ chỉ giải phóng được khoảng 43 % [83].

Qua các tìm hiểu các nghiên cứu và xu hướng hiện nay đối với liệu pháp điều

trị HIV, trong đề tài này chúng tôi thực hiện dẫn truyền đơn 4 thuốc (AZT, 3TC, TDF,

RTV) và dẫn truyền phối hợp AZT, 3TC; TDF, RTV trên 2 hệ chất mang nano

dendrimer PAMAM G3.0@mPEG và PAMAM G3.0@F127 có khả năng phóng

thích kéo dài, sự thành công của nghiên cứu bước đầu góp phần định hướng cho các

nghiên cứu phát triển thuốc phóng thích kéo dài trong điều trị HIV liều phối hợp ở

Việt Nam.

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong luận án bao gồm:

2.1.1 Phương pháp tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G3.0

Tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G3.0 dựa trên phản ứng alkyl hóa và

phản ứng amid hóa.

Cấu trúc các dendrimer PAMAM G0.5 đến G3.0 được xác định bằng phương pháp:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR: đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR,

Bruker Avance 500 MHz, tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam.

- Phương pháp phổ khối MS: đo trên máy LCMS IT-TOF, Shimadzu, tại Viện Kiểm

nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh

- Phương pháp sắc ký lọc gel HPLC-RID, Agilent, Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

- Quang phổ hồng ngoại FTIR, Shimadzu, tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố

Hồ Chí Minh

- Hình thái, kích thước hạt: bằng ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) được chụp

bằng máy JEOL JEM 1400 ở 140 kV - Nhật Bản, tại Trường Đại học Bách Khoa,

Thành phố Hồ Chí Minh và thiết bị Zetasizer nano 3600 Malvern - Anh, tại Viện

Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.2 Phương pháp biến tính dendrimer PAMAM G3.0 bằng mPEG và F127

Phương pháp biến tính dựa trên phản ứng thân hạch.

Cấu trúc G3.0@mPEG và G3.0-@F127 được xác định bằng phương pháp:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR: đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR,

Bruker Avance 500MHz, tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam.

- Quang phổ hồng ngoại FTIR, Shimadzu - Nhật Bản, tại Viện Kiểm nghiệm thuốc

Thành phố Hồ Chí Minh.

- Hình thái, kích thước hạt: bằng ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) được chụp

bằng máy JEOL JEM 1400 ở 140 kV - Nhật Bản, tại Trường Đại học Bách Khoa,

Thành phố Hồ Chí Minh và thiết bị Zetasizer nano 3600 Malvern - Anh, tại Viện

Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.3 Phương pháp dẫn truyền hoạt chất

- Đông khô sản phẩm trên Máy đông khô FDU EYELA - Nhật Bản, tại Viện Hóa

học.

- Loại hoạt chất tự do bằng phương pháp HPLC trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng

cao đầu dò PDA, Shimadzu - Nhật Bản, tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố

Hồ Chí Minh, dựa trên phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất AZT, 3TC,

TDF và RTV đã được xây dựng và thẩm định theo ICH.

2.1.4 Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất in vitro

- Để đánh gía khả năng giải phóng hoạt chất, phương pháp màng thẩm tách được sử

dụng để khảo sát sự nhả chậm hoạt chất từ hệ dẫn truyền thuốc

ARV@G3.0@mPEG và ARV@G3.0@F127, sử dụng màng thẩm tách có khối

lượng phân tử 3,5 kDa của SpectrumTM Spectra/PorTM 3 RC - Fisher Scientific

- Mỹ

- Xác định hàm lượng hoạt chất giải phóng bằng phương pháp HPLC trên thiết bị

sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò PDA, Shimadzu - Nhật Bản, tại Viện Kiểm

nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh, dựa trên phương pháp xác định hàm lượng

hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV trên các hệ dẫn truyền thuốc

ARV@G3.0@mPEG và ARV@G3.0@F127 đã được xây dựng và thẩm định theo

ICH.

2.1.5 Phương pháp khảo sát độc tế bào

- Độc tính tế bào được đánh giá trên tế bào nguyên bào sợi của người, dòng tế bào

BJ thông qua xét nghiệm MTT sử dụng máy đọc ELISA, HumanRead – Mỹ, tại

phòng Vật liệu sinh dược - Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng.

2.1.6 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

- Thử hoạt tính ức chế pepsin theo quy trình của Merck, sử dụng thiết bị Quang phổ

tử ngoại - khả kiến của Shimadzu - Nhật Bản, tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành

phố Hồ Chí Minh.

2.2. Nguyên liệu - hóa chất, dụng cụ - thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu - hóa chất

Tất cả hóa chất và dung môi sử dụng cho luận án đạt tiêu chuẩn Tinh khiết phân tích

hoặc HPLC

STT Nguyên liệu - hóa chất

Nhà sản xuất

Ethylen diamin (EDA)

Sigma Aldrich

2 Methyl acrylate (MA)

2 Methanol (MeOH)

J.T.Baker

Toluen

J.T.Baker

Khí nitơ tinh khiết

Việt Nam

Sigma Aldrich

5 Methoxy poly(ethylen glycol) 5000 Da

Sigma Aldrich

Pluronic F127 12.600 Da

4-nitrophenyl cloroformat

Sigma Aldrich

Tetrahydrofuran

J.T.Baker

Diethyl ether

Merck

10 Acid hydroclorid

Merck

11 Kali dihydrogen phosphat

Merck

12 Kali hydroxyd

Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. HCM

13 Nước siêu tinh khiết

(IDQC)

Sigma Aldrich

14 Hemoglobin từ máu bò

Sigma Aldrich

Pepsin (≥2.500 unit/mg protein)

Merck

16 Acid tricloroacetic (TCA)

17 Màng bán thấm cellulose MWCO 2000 Da

SpectrumTM Spectra/PorTM 3 RC

18 Màng bán thấm cellulose MWCO 3500 Da

SpectrumTM Spectra/PorTM 3 RC

19 Màng bán thấm cellulose MWCO 6000 - 8000 Da SpectrumTM Spectra/PorTM 3 RC

Màng bán thấm cellulose MWCO 12000 - 14000

SpectrumTM Spectra/PorTM 3 RC

Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu - hóa chất

IDQC

Zidovudin

IDQC

Lamivudin

IDQC

Tenofovir disoproxil fumarat

USP

Ritonavir

2.1.2. Dụng cụ - thiết bị

STT

Dụng cụ - thiết bị

Nhà sản xuất

Cân phân tích 5 và 6 số lẻ

Mettler Toledo

Cân kỹ thuật 2 số lẻ

Mettler Toledo

Cột sắc ký (C18 250 x4.6 mm, 5 mcm)

Phenomenex

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò PDA (HPLC -

Shimadzu

PDA)

Máy quang phổ hồng ngoại (FTIR)

Shimadzu

Máy LCMS 8040 nguồn ESI

Shimadzu

Máy LCMS IT-TOF nguồn ESI

Shimadzu

Máy cộng hưởng từ hạt nhân 500 MHz cho 1H-NMR

Brucker

Máy đông khô

Eyela

Thiết bị Zetasizer Nano ZS

Malvern

Máy sắc ký lọc gel (GPC)-HPLC-RID

Agilent

Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Jeol

Máy quang phổ UV-VIS

Shimadzu

Bơm chân không

Becker

Máy lắc ống nghiệm

Talboy

Bể ổn nhiệt

Lauda

Máy cô quay chân không

Yamato

Máy khuấy từ gia nhiệt

Ika C-mag

Máy khuấy từ gia nhiệt 15 vị trí

Ika

Bình cầu 2 cổ nhám 1000 ml

Duran

Bình cầu 2 cổ nhám 500 ml

Duran

Pipet tự động dung tích 10.000 µl

Eppendorf

Pipet tự động dung tích 5.000 µl

Eppendorf

Pipet tự động 1.000 µl

Bảng 2.2. Danh mục dụng cụ - thiết bị

2.3. Tổng hợp dendrimer PAMAM

2.3.1. Tổng hợp dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0

Dendrimer PAMAM được tổng hợp từ lõi ethylendiamin (EDA) và mạch nhánh

là methyl acrylat (MA) thông qua phản ứng alkyl hóa và phản ứng amid hóa theo sơ đồ

[4], [70], [87]:

Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp G3.0 từ lõi là ethylendiamin

• Phản ứng alkyl hóa (Cộng vào nối đôi C=C-C=O)

Phản ứng cộng vào nối đôi C=C tiếp cách là nhóm C=O theo cơ chế ái nhân. Do

hiệu ứng liên hợp nhóm C=O rút điện tử làm cho C=C mang điện tích dương nên các

tác nhân mang điện tích âm rất dễ tấn công vào. Hơn nữa khi có mặt dung môi phân cực

hay xúc tác như axit lewis làm cho liên kết π trên C=C phân cực hơn và tác nhân cộng

hợp cũng phân cực hơn, do đó phản ứng xảy ra dễ dàng hơn [70]. Cơ chế phản ứng cộng

vào nối đôi C=C-C=O được thực hiện theo phương trình:

Hình 2.2. Cơ chế phản ứng alkyl hóa

• Phản ứng amid hóa (cộng hợp vào nối đôi C=O)

Phản ứng thực hiện theo cơ chế ái nhân. Nhóm C=O có khả năng cộng hợp với rất

nhiều nhóm, do nguyên tử oxy có độ âm điện lớn làm cho liên kết π bị phân cực mạnh

làm xuất hiện hai trung tâm: trung tâm điện tích dương trên nguyên tử carbon và trung

tâm điện tích âm trên nguyên tử oxy. Trung tâm dương sẽ tương tác với các tác nhân ái

nhân, trung tâm âm tương tác với các tác nhân ái điện tử [4]. Cơ chế cộng vào nguyên

tử C của nhóm C=O được thực hiện như sau:

Hình 2.3. Cơ chế phản ứng amid hóa

Do ester có khả năng cộng hợp kém hơn aldehyde hay ketone nên quá trình cộng

hợp vào C=O của ester xảy ra khó khăn, vì vậy người ta dùng xúc tác để thúc đẩy quá

trình phản ứng. Gần đây, chất trao đổi ion được sử dụng làm xúc tác thay cho acid. Các

dung môi thường được sử dụng là methanol, benzen và aceton.

2.3.1.1. Tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5, G0.5, G1.5 và G2.5

Tổng hợp dendrimer PAMAM thế hệ lẻ (G-0.5, G0.5, G1.5, G2.5) được trình bày

trong Bảng 2.3.

Thế hệ

Tiến hành

Điều kiện phản

Tinh

chế

ứng

sản phẩm

G-0.5

- 300 ml MA – MeOH (1:1) vào bình cầu 3 cổ 1000 ml,

Thời gian: 2

Cô quay áp

khuấy đều

ngày ở nhiệt độ

suất giảm

- Nhỏ từ từ 40 ml hỗn hợp EDA - MeOH (1:1) vào bình

phòng, khuấy

để làm sạch

cầu phản ứng. Giữ lạnh hỗn hợp phản ứng ở 0 °C 3 giờ.

đều và cấp khí

sản phẩm.

nitơ liên tục

Thêm

G0.5

- 560 ml MA - MeOH (1:1) vào bình cầu 3 cổ 1000 ml,

Thời gian: 3

MeOH

khuấy đều.

ngày ở nhiệt độ

trong

qua

- Nhỏ từ từ hỗn hợp gồm 20 g PAMAM G0.0 và 50 ml

phòng, khuấy

trình

cô

MeOH vào bình phản ứng, khuấy đều. Giữ lạnh hỗn hợp

đều và cấp khí

quay để loại

phản ứng ở 0 °C 3 giờ.

nitơ liên tục

bỏ hết MA

G1.5

- 200 ml MA – MeOH (1:1) vào bình cầu 3 cổ 1000 ml,

còn dư. Lưu

khuấy đều.

trữ

sản

- Nhỏ từ từ hỗn hợp gồm 20 g PAMAM G1.0 và 50 ml

phẩm trong

MeOH vào bình phản ứng, khuấy đều. Giữ lạnh hỗn hợp

MeOH.

phản ứng ở 0 °C 3 giờ.

Bảng 2.3. Tổng hợp dendrimer PAMAM thế hệ lẻ (G-0.5, G0.5, G1.5, G2.5)

G2.5

- 300 ml MA – MeOH (1:1) vào bình cầu 3 cổ 1000 ml,

khuấy đều.

- Nhỏ từ từ hỗn hợp gồm 50g PAMAM G 2.0 và 100 ml

MeOH vào bình phản ứng, khuấy đều. Giữ lạnh hỗn hợp

phản ứng ở 0 °C 3 giờ.

Hình 2.4. Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM thế hệ lẻ (G-0.5, G0.5, G1.5, G2.5)

2.3.1.2. Tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0, G1.0, G2.0 và G3.0

Tổng hợp dendrimer PAMAM thế hệ chẵn (G0.0, G1.0, G2.0, G3.0) được trình

bày trong Bảng 2.4

Thế hệ

Tiến hành

Điều kiện phản

Tinh chế sản

ứng

phẩm

G0.0

- 300 ml EDA – MeOH (1:1) vào bình cầu 3 cổ 1000

Thời gian: 4

Cô quay áp

ml, khuấy đều

ngày ở nhiệt độ

suất

giảm

- Nhỏ từ từ hỗn hợp 20 g PAMAM G-0.5/50 ml MeOH

phòng, khuấy

trong 5 ngày,

vào bình cầu phản ứng. Giữ lạnh hỗn hợp phản ứng ở 0

đều và cấp khí

dùng hỗn hợp

°C 3 giờ.

nitơ liên tục

toluen

Bảng 2 4. Tổng hợp dendrimer PAMAM thế hệ lẻ (G0.0, G1.0, G2.0, G3.0)

G1.0

- 300 ml EDA – MeOH (1:1) vào bình cầu 3 cổ 1000

Thời gian: 5

MeOH (9:1)

ml, khuấy đều

ngày ở nhiệt độ

để loại EDA

- Nhỏ từ từ hỗn hợp 20 g PAMAM G0.5/50 ml MeOH

phòng, khuấy

dư, sau đó

vào bình cầu phản ứng. Giữ lạnh hỗn hợp phản ứng ở 0

đều và cấp khí

dùng MeOH

°C 3 giờ.

nitơ liên tục

để loại toluen

G2.0

- 300 ml EDA – MeOH (1:1) vào bình cầu 3 cổ 1000

Thời gian: 7

ra khỏi hỗn

ml, khuấy đều.

ngày ở nhiệt độ

hợp

sản

- Nhỏ từ từ hỗn hợp gồm 30 g PAMAM G1.5/100 ml

phòng, khuấy

phẩm. Lưu

MeOH vào bình phản ứng, khuấy đều. Giữ lạnh hỗn hợp

đều và cấp khí

trữ sản phẩm

phản ứng ở 0 °C 3 giờ.

nitơ liên tục

trong MeOH.

G3.0

- 300 ml EDA – MeOH (1:1) vào bình cầu 3 cổ 1000

Thời gian: 8

Thẩm

tách

ml, khuấy đều.

ngày ở nhiệt độ

bằng màng

- Nhỏ từ từ hỗn hợp gồm 50g PAMAM G 2.5 và 100 ml

phòng, khuấy

bán

thấm

MeOH vào bình phản ứng, khuấy đều. Giữ lạnh hỗn hợp

đều và cấp khí

cellulose

phản ứng ở 0 °C 3 giờ.

nitơ liên tục

MWCO 3,5

kD sử dụng

MeOH trong

3 ngày

Hình 2.5. Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM thế hệ chẵn (G0.0, G1.0, G2.0, G3.0)

2.3.2. Biến tính PAMAM dendrimer

2.3.2.1. Chuẩn bị tác nhân biến tính

(a) Tổng hợp PEG-NPC

Phản ứng tổng hợp PEG-NPC được thực hiện theo cơ chế thế thân hạch trên nhóm

carbonyl như sau [79]:

Hình 2.6. Phản ứng tổng hợp PEG-NPC

Trong cấu trúc của NPC, liên kết C=O có tính chất không no và bị phân cực mạnh

về phía oxy, làm xuất hiện mật độ điện tích dương trên nguyên tử carbon, tạo ra trung

tâm thiếu điện tử. Trong khi đó trên nguyên tử oxy của nhóm -OH của phân tử mPEG

còn hai đôi điện tử tự do, nên nguyên tử oxy có vai trò như một tác nhân ái nhân. Trung

tâm thiếu điện tử trên nguyên tử carbon của phân tử NPC gặp tác nhân ái nhân của phân

tử PEG sẽ tương tác với nhau tạo sản phẩm mPEG-NPC [87].

- Cho 50,0 g mPEG 5000 Da vào bình phản ứng, hút chân không và thổi khí nitơ

trong 2 giờ, duy trì nhiệt độ bình phản ứng ở 65-70 °C.

- Khi mPEG đã nóng chảy hoàn toàn, bổ sung 2,44 g NPC vào phản ứng (tỷ lệ

mPEG - NPC = 1:1,2 mol/mol), khuấy từ ở tốc độ 300 vòng/phút, duy trì nhiệt độ 65-

70 °C. Phản ứng được thực hiện trong 6 giờ.

- Giảm nhiệt độ xuống 40 °C, thêm 50 ml THF, khuấy cho hỗn hợp tan đều, sau

đó chuyển hỗn hợp về nhiệt độ phòng và giữ phản ứng đến 16 giờ.

- Nhỏ giọt từ từ sản phẩm trong bình phản ứng (thu được ở bước 3) vào cốc 1000

ml chứa sẵn 500 ml diethyl ether lạnh, khuấy trong suốt quá trình kết tủa sản phẩm. Đặt

dung dịch thu được vào tủ đông -5 °C trong vòng 2 giờ.

- Lọc lấy kết tủa ở áp suất thấp (tránh hơi nước), làm khô sản phẩm bằng cô quay

chân không để thu được chất rắn màu trắng. Đây là sản phẩm mPEG đã hoạt hóa.

Hình 2.7. Quy trình tổng hợp mPEG-NPC

(b) Tổng hợp HO-F127-NPC

Quá trình tổng hợp HO-F127-NPC diễn ra thông qua hai phản ứng chính: phản

ứng tổng hợp NPC-F127-NPC, và phản ứng bất hoạt một đầu -NPC bằng 3-

aminopropanol

• Phản ứng tổng hợp NPC-F127-NPC

Ban đầu, một trong hai nhóm hydroxyl trên phân tử pluronic F127 phản ứng ngẫu

nhiên với phân tử p-nitrophenyl cloroformat để hình thành pluronic F127 gắn với một

phân tử NPC. Tuy nhiên, do lượng 4-nitrophenyl cloroformat bổ sung dư nên nhóm

hydroxyl còn lại cũng được hoạt hóa để hình thành NPC-F127-NPC.

Phản ứng tổng hợp NPC-F127-NPC diễn ra theo cơ chế thế thân hạch như sau:

NPC NPC- F127

Hình 2.8. Phản ứng tổng hợp NPC-F127-NPC

• Phản ứng bất hoạt một đầu -NPC bằng 3-aminopropanol

Do tác động của hiệu ứng rút điện tử từ nhóm nitrophenyl lên liên kết ester trong

phân tử NPC-F127-NPC, làm cho liên kết carbonyl bị phân cực mạnh, kết quả là carbon

trên nhóm carbonyl dương điện hơn. Khi có mặt tác nhân thân hạch như nhóm -NH2

trên phân tử 3-aminopropanol, nitơ trên nhóm -NH2 còn dư một cặp electron chưa liên

kết nên có khả năng gắn lên carbon dương điện, đồng thời đẩy nhóm nitrophenolat. Đầu

còn lại trên phân tử 3-aminopropanol là -OH không tham gia phản ứng, kết quả là sau

phản ứng, nhóm -NPC đầu mạch trên phân tử NPC-F127-NPC được thay thế bằng nhóm

-OH đầu mạch.

Hình 2.9. Phản ứng tổng hợp HO-F127-NPC

Phản ứng tiến hành ở tỷ lệ NPC-F127-NPC: 3-aminopropanol = 1:1 nên quá trình

phản ứng chỉ thay thế một nhóm -NPC đầu mạch trên phân tử NPC-F127-NPC để hình

thành phân tử HO-F127-NPC [87]

- Cho 50,0 g pluronic F127 vào bình phản ứng, hút chân không và thổi khí trơ,

khan trong 2 giờ, duy trì nhiệt độ bình phản ứng ở 75-80 °C.

- Khi pluronic F127 đã nóng chảy hoàn toàn, bổ sung 2,02 g NPC vào phản ứng

(tỷ lệ F127 : NPC = 1:2,5 mol/mol), khuấy từ ở tốc độ 300 vòng/phút, duy trì nhiệt độ

75-80 °C trong 6 giờ.

- Giảm nhiệt độ xuống 50 °C, thêm 50 ml THF, khuấy cho hỗn hợp tan đều, sau

đó chuyển hỗn hợp về nhiệt độ phòng và giữ phản ứng đến 24 giờ.

- Bổ sung 100 µl nước, khuấy đều 10 phút.

- Nhỏ từ tử 304 µl 3-aminopropanol đã được pha loãng trong 5 ml THF (tỷ lệ

NPC-F127-NPC: 3-aminopropanol = 1:1 mol/mol), khuấy từ 24 giờ tại nhiệt độ

phòng.

- Nhỏ giọt từ từ dung dịch phản ứng vào cốc 1000 ml chứa sẵn 500 ml diethyl

ether lạnh, khuấy trong suốt quá trình kết tủa sản phẩm. Đặt dung dịch thu được vào

tủ đông -5 °C trong vòng 2 giờ.

- Lọc lấy kết tủa ở áp suất thấp, làm khô sản phẩm bằng cô quay chân không để

thu sản phẩm.

Sơ đồ tổng hợp HO-F127-NPC được thể hiện trong Hình 2.10

Hình 2.10. Sơ đồ tổng hợp HO-F127-NPC

2.3.2.2. Tổng hợp PAMAM dendrimer biến tính

Do tác động của hiệu ứng rút điện tử từ nhóm nitrophenyl lên liên kết ester trong

phân tử mPEG-NPC, làm cho liên kết carbonyl bị phân cực mạnh, kết quả là carbon trên

nhóm carbonyl dương điện hơn [6]. Khi có mặt tác nhân thân hạch như nhóm amin (-

NH2) trên PAMAM dendrimer thế hệ chẳng, nitơ trên nhóm amin còn dư một cặp

electron chưa liên kết nên có khả năng gắn lên carbon dương điện, đồng thời đẩy nhóm

nitrophenolat (đây là một nhóm xuất tốt) để hình thành sản phẩm G3.0@mPEG hoặc

G3.0@F127 và sản phẩm phụ nitrophenol.

Phản ứng tổng hợp G3.0@mPEG và G3.0@F127 được thể hiện trong Hình 2.11

Hình 2.11. Phản ứng tổng hợp (A) G3.0@mPEG và (B) G3.0@F127

Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat pH = 10,0: Hòa tan 3,48 (g) kali dihydro

phosphat vào 80 ml nước cất qua lọc 0,45 µm; Điều chỉnh pH dung dịch về 10,0 bằng

dung dịch KOH 1M; Chuyển dung dịch vào bình định mức 100 ml và định mức tới vạch

bằng nước cất.

Chuẩn bị dung dịch PAMAM 3,0 % trong nước (pH = 4): Cô quay chân không ở

áp suất thấp để loại bỏ tất cả MeOH trong các PAMAM dendrimer, cân chính xác

khoảng 1,00 g PAMAM dendrimer hòa tan vào cốc 100 ml chứa sẵn 20 ml nước cất đã

lọc qua màng lọc 0,45 µm, khuấy đến tan đều; Chỉnh pH dung dịch về 4,0 bằng HCl

1M, tráng đầu máy đo pH bằng nước cất vừa đủ để thu được 33,33 g dung dịch.

• Tổng hợp G3.0@mPEG

- Cho e (g) dung dịch PAMAM G3.0 nồng độ 3,0 % trong nước vào cốc 100 ml.

- Bổ sung thêm 20 – e (8,36 g) nước cất, khấy đều 30 phút ở 200 vòng/phút.

- Tăng tốc độ khuấy lên 300 vòng/phút, nhỏ giọt từ từ dung dịch có chứa f (g)

mPEG-NPC đã được hòa tan trong 20 ml nước cất và 10 ml dung dịch đệm phosphat

pH = 10,0 vào hỗn hợp phản ứng. Cho phép phản ứng diễn ra 48 giờ. Chú ý, hỗn hợp

phản ứng phải được tránh sáng.

- Thẩm tách trong môi trường nước sử dụng màng bán thấm cellulose MWCO 12-

14 kDa đến khi mất màu vàng.

- Đông khô để thu được chất rắn màu trắng, xốp.

Bảng 2.5. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng trong tổng hợp G3.0-

Thành phần tỷ lệ

Khối lượng dung

Khối lượng mPEG-NPC sử

Ký hiệu mẫu

G3.0 : mPEG-NPC

dịch G3.0 - e (g)

dụng - f (g)

(mol/mol)

G3.0@mPEG1.16

1:16

8,36

3,00

PEG

• Tổng hợp G3.0@F127

- Cho g (g) dung dịch PAMAM G3.0 nồng độ 3,0 % trong nước vào cốc 100 ml.

- Bổ sung thêm 20 – g (g) nước cất, khấy đều 30 phút ở 200 vòng/phút.

- Tăng tốc độ khuấy lên 300 vòng/phút, nhỏ giọt từ từ dung dịch có chứa h (g) HO-

F127-NPC đã được hòa tan trong 20 ml nước cất và 10 ml dung dịch đệm phosphat pH

= 10,0 vào hỗn hợp phản ứng. Cho phép phản ứng diễn ra 48 giờ. Chú ý, hỗn hợp phản

ứng phải được tránh sáng.

- Thẩm tách trong môi trường nước sử dụng màng bán thấm cellulose MWCO 12-

14 kDa đến khi mất màu vàng.

- Đông khô để thu được chất rắn màu trắng, xốp.

Bảng 2.6. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng trong tổng hợp

Thành phần tỷ lệ

Khối lượng dung

Khối lượng HO-F127-NPC

Ký hiệu mẫu

G3.0 : HO-F127-NPC

dịch G3.0 - g (g)

sử dụng -h (g)

G3.0@F127.1.16

1:16 (mol/mol)

5,04

4,50

G3.0@F127

2.4. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định các ARV

Phương pháp xác định ARV có thể sử dụng là phương pháp UV-VIS , HPLC, ….

Tuy nhiên, phương pháp UV-VIS có hạn chế là chỉ xác định các ARV khi được mang ở

dạng đơn chất. Trong khi đó, phương pháp HPLC là một lựa chọn tốt để tách và xác

định đồng thời các ARV. Với phương pháp này, kết quả có độ chính xác và tính chọn

lọc cao, đồng thời không tốn nhiều thời gian. Đã có nhiều chuyên luận trong Dược điển

Hoa Kỳ (USP), Dược điển Anh (BP), Dược điển Quốc tế (IP) về xác định các ARV ở

các dạng nguyên liệu và thành phẩm. Tuy nhiên, không có phương pháp nào trong số

này để phân tích đồng thời ARV mang trong dendrimer PAMAM biến tính mPEG và

pluronic F127.

Nhằm đánh giá khả năng cũng như hiệu quả mang thuốc của hệ mang thuốc, nhóm

nghiên cứu đã xây dựng phương pháp xác định đồng thời các ARV được mang trong

chất mang nano dendrimer sau khi đã biến tính với các polymer sinh học bằng kỹ thuật

HPLC-PDA. Phương pháp xây dựng được thẩm định theo hướng dẫn của ICH (Hội nghị

quốc tế về hài hòa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người).

Việc xây dựng phương pháp xác định các ARV đơn và các ARV đồng thời dựa

trên cơ sở tham khảo USP 41, sau khi khảo sát, quy trình được đề nghị như sau:

2.4.1. Xây dựng phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF VÀ RTV

2.4.1.1. Xác định AZT, 3TC và xác định đồng thời AZT, 3TC

• Điều kiện sắc ký:

Cột C18 (150 × 4,6 mm; 5µm)

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

Detector: PDA bước sóng phát hiện 266 nm.

Thể tích tiêm: 10 l.

Pha động: dung dịch đệm phosphat pH 2,5 - methanol (65:35)

Dung dịch đệm phosphat pH 2,5: Cân 0,68 g kali dihydrophosphat hòa tan trong

nước vừa đủ 1000 ml, thêm 1 ml triethylamin (TT) khuấy đều, điều chỉnh pH = 2,5 ±

0,05 bằng acid phosphoric (TT). Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Dung dịch chuẩn gốc: Pha dung dịch chuẩn gốc AZT và 3TC trong nước để có

nồng độ chính xác khoảng 1mg/ml mỗi dung dịch. Từ dung dịch chuẩn gốc, pha các

dung dịch chuẩn hỗn hợp để có dãy chuẩn tối thiểu 5 điểm có nồng độ chính xác trong

khoảng từ 5 µg /ml đến 300 µg /ml.

Dung dịch thử: Cân lượng chế phẩm tương ứng 10 mg AZT cho vào bình định

mức 100, thêm 60 ml nước, siêu âm và lắc để hòa tan rồi thêm nước vừa đủ 100 ml. Lắc

đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

• Cách tiến hành:

Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký dung dịch

chuẩn hỗn hợp AZT và 3TC có nồng độ khoảng 100 µg /ml lặp lại 6 lần. Hệ thống sắc

ký đạt yêu cầu khi độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic của AZT và 3TC không quá

2,0 %. Hệ số đối xứng pic AZT và 3TC không quá 2,0. Hệ số phân giải giữa AZT và

3TC không ít hơn 2,0. Số đĩa lý thuyết không ít hơn 2.000, hệ số phân giải giải giữa 3TC

và AZT không ít hơn 2,0.

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch dãy chuẩn và dung dịch thử.

• Tính kết quả:

Từ diện tích pic của các dung dịch chuẩn, lập đường chuẩn thực nghiệm biểu diễn

sự phụ thuộc của diện tích pic (y) vào nồng độ (x). Từ đường tuyến tính ta nội suy ra

hàm lượng AZT và 3TC trong dung dịch thử.

Hàm lượng AZT (C17H19NO5) và 3TC (C8H11N3O3S) trong chế phẩm được tính

theo công thức sau:

𝑋(%) = 𝑥100 (𝑆 − 𝑏)𝑥𝐷 1000 𝑥 𝑎 𝑥 𝑚

Trong đó:

S: Diện tích pic đáp ứng của hoạt chất

a: Độ dốc của đường chuẩn

b: Hệ số chặn

m: Khối lượng mẫu thử (g)

D: Độ pha loãng của mẫu thử

2.4.1.2. Xác định TDF, RTV và xác định đồng thời TDF và RTV

• Điều kiện sắc ký:

Cột C18 (150 × 4,6 mm; 5µm)

Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

Detector: PDA bước sóng phát hiện 260 nm - TDF, 240 nm -RTV hoặc TDF -

RTV)

Thể tích tiêm: 10 l.

Pha động: dung dịch đệm phosphat pH 2,5 – methanol (25:75)

Dung dịch đệm phosphat pH 2,5: Cân 0,68 g kali dihydrophosphat hòa tan trong

nước vừa đủ 1000 ml, thêm 1 ml triethylamin (TT) khuấy đều, điều chỉnh pH = 2,5 ±

0,05 bằng acid phosphoric (TT). Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Dung dịch chuẩn gốc: Pha dung dịch chuẩn gốc TDF và RTV trong nước để có

nồng độ chính xác khoảng 1mg/ml mỗi dung dịch. Từ dung dịch chuẩn gốc, pha các

dung dịch chuẩn hỗn hợp để có dãy chuẩn tối thiểu 5 điểm có nồng độ chính xác trong

khoảng từ 20 µg /ml đến 200 µg /ml

Dung dịch thử: Cân lượng chế phẩm tương ứng 10 mg TDF cho vào bình định

mức 100, thêm 60 ml nước, siêu âm và lắc để hòa tan rồi thêm nước vừa đủ 100 ml. Lắc

đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

• Cách tiến hành:

Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký dung dịch

chuẩn hỗn hợp TDF và RTV có nồng độ lần lượt là 100 µg /ml lặp lại 6 lần. Hệ thống

sắc ký đạt yêu cầu khi độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic của TDF và RTV không

quá 2,0 %. Hệ số đối xứng pic TDF và RTV không quá 2,0. Hệ số phân giải giữa TDF

và RTV không ít hơn 2,0. Số đĩa lý thuyết không ít hơn 2.000

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch dãy chuẩn và dung dịch thử.

• Tính kết quả:

Từ diện tích pic của các dung dịch chuẩn, lập đường chuẩn thực nghiệm biểu diễn

sự phụ thuộc của diện tích pic (y) vào nồng độ (x). Từ đường tuyến tính ta nội suy ra

hàm lượng TDF và RTV trong dung dịch thử.

Hàm lượng TDF (C19H30N5O10P.C4H4O4 ) và RTV (C37H48N6O5S2) trong bột chế

phẩm được tính theo công thức sau:

𝑋(%) = 𝑥100 (𝑆 − 𝑏)𝑥𝐷 1000 𝑥 𝑎 𝑥 𝑚

Trong đó:

S: Diện tích pic đáp ứng của hoạt chất

a: Độ dốc của đường chuẩn

b: Hệ số chặn

m: Khối lượng mẫu thử (g)

D: Độ pha loãng của mẫu thử

2.4.2. Thẩm định phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF và RTV

Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng

chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra.

Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin

cậy của kết quả phân tích. Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không

thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy [88]

Các phương pháp không tiêu chuẩn hay phương pháp nội bộ: là các phương pháp

do phòng thử nghiệm tự xây dựng. Các quy trình đã xây dựng xác định AZT, 3TC, TDF

và RTV trong hệ dẫn truyền thuốc đơn và thuốc kết hợp được chứng minh sự phù hợp

đối với đối tượng nghiên cứu thông qua việc Thẩm định qui trình phân tích đầy đủ theo

hướng dẫn của ASEAN và ICH (International Conference on Harmonisation - Hội nghị

quốc tế về hài hòa hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người) [89]. Các

chỉ tiêu cần thẩm định:

+ Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống (System Suitability Testing)

+ Tính đặc hiệu (Specificity)

+ Tính tuyến tính (Linearity)

+ Khoảng xác định (Range)

+ Độ đúng (Accuracy)

+ Độ chính xác (Precision)

+ Giới hạn phát hiện (LOD: Limit of detection)

+ Giới hạn định lượng (LOQ: Limit of quantitation)

2.4.2.1. Tính tương thích hệ thống HPLC

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 0,1 mg/ml.

Ghi lại sắc ký đồ, diện tích pic và thời gian lưu

• Yêu cầu:

RSD diện tích pic và thời gian lưu :  2,0 %.

Hệ số đối xứng pic T:  2,0.

Độ phân giải giữa các chất cần xác định trong chuẩn: ≥ 2,0.

Số đĩa lý thuyết N của chất cần xác định: ≥ 2.000.

2.4.2.2. Tính đặc hiệu, LOD và LOQ

• Tính đặc hiệu

Dung dịch chuẩn: sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml.

Dung dịch mẫu thử: chuẩn bị dung dịch thử như quy trình

Dung dịch placebo: Cân chính xác lượng placebo tương ứng với lượng hoạt chất

cần lấy để xác định theo quy trình, thực hiện xử lý mẫu như dung dịch thử .

Tiến hành tiêm dung dịch placebo, dung dịch chuẩn, dung dịch thử.

Ghi lại các sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu độ tinh khiết của pic trong sắc ký đồ

mẫu thử và mẫu chuẩn.

• Yêu cầu:

Sắc ký đồ dung dịch mẫu placebo không xuất hiện pic tương ứng với thời gian lưu

của pic chuẩn trong sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn.

Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu

của pic chính trong sắc ký đồ ký đồ dung dịch mẫu chuẩn

LOD và LOQ

LOD và LOQ là hai thông số quan trọng nhằm đánh giá độ nhạy của phương pháp.

Giá trị LOD và LOQ được xác định thông qua phương trình hồi quy theo công thức sau:

LOD = 3,3*SD/a

LOQ = 10*SD/a

Trong đó, a là độ dốc của đường tuyến tính và SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu.

Hoặc LOD được xác định dựa trên dung dịch có nồng độ Cmin có thể xuất hiện tín hiệu

của chất phân tích, xác định tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N ≥ 3 (S/N = Signal to noise

ratio ) và LOQ = 3*LOD.

Trong đó, S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích và N là nhiễu đường nền.

2.4.2.3. Tính tuyến tính

Dung dịch chuẩn gốc: chuẩn bị như quy trình.

Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp: chuẩn bị dãy chuẩn gồm tối thiểu 5 điểm có nồng

độ từ khoảng 2 % - 300 % nồng độ định lượng. Thực hiện theo quy trình phân tích đã

xây dựng.

Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ (x) và diện tích pic

(y) của chất cần xác định. Xác định hệ số tương quan r.

Yêu cầu: Hệ số tương quan r trong khoảng 0,998 – 1,002

2.4.2.4. Độ đúng

Thực hiện ở 3 mức nồng độ 80 %, 100 %, 120 % so với nồng độ định lượng. Mỗi

nồng độ thực hiện 3 lần

Yêu cầu: Tỷ lệ hồi phục 98 % - 102 %.

2.4.2.5. Độ chính xác

• Độ lặp lại

Tiến hành tiêm 6 dung dịch mẫu thử độc lập chuẩn bị như trong quy trình

Xác định hàm lượng hoạt chất

Xác định giá trị trung bình và % RSD:

Yêu cầu: RSD % ≤ 2,0 % (n = 6)

• Độ chính xác trung gian

Tiến hành như độ lặp nhưng thực hiện khác ngày, khác thiết bị, khác điều kiện môi

trường.

Xác định giá trị trung bình và giá trị % RSD của hoạt chất cần xác định trên 12

mẫu thử:

Yêu cầu: RSD % ≤ 2,0 % (n = 12)

2.4.2.6. Khoảng xác định

Khoảng xác định của phương pháp là khoảng nồng độ thử nghiệm mà ở đó phương

pháp đạt yêu cầu về tuyến tính, độ đúng và độ chính xác.

Khoảng xác định của phương pháp định lượng được khảo sát trong khoảng 80 %

- 120 % so với nồng độ định lượng.

2.5. Tạo hệ dẫn truyền thuốc nano

Các hoạt chất AZT, 3TC, TDF, RTV được dẫn truyền đơn và phối hợp vào các hệ

G3.0@mPEG và G3.0@F127. Xác định khả năng dẫn truyền (DLC %) và hiệu suất dẫn

truyền (DLE %) của các hệ dẫn truyền thuốc nano bằng công thức:

DLC % = x100% mT-NH mT-NH + mCM

DLE % = x100% mT-NH mT-BĐ

mT-NH : Lượng hoạt chất được dẫn truyền (mg)

mCM : Khối lượng hệ dendrimer sử dụng (mg)

mT-TD : Lượng thoạt chất tự do (mg)

mT-BĐ : Tổng lượng hoạt chất ban đầu (mg)

Sử dụng phương pháp HPLC xác định hàm lượng các hoạt chất tự do sau quá

trình dẫn truyền hoạt chất tạo các hệ dẫn truyền thuốc đơn và hệ dẫn truyền thuốc phối

hợp sau đây:

Hệ dẫn truyền thuốc đơn Hệ dẫn truyền thuốc phối hợp

AZT@G3.0@mPEG AZT-3TC@G3.0@mPEG

3TC@G3.0@mPEG TDF-RTV@G3.0@mPEG

TDF@G3.0@mPEG AZT-3TC@G3.0@F127

RTV@G3.0@mPEG TDF-RTV@G3.0@F127

AZT@G3.0@F127

3TC@G3.0@F127

TDF@G3.0@F127

RTV@G3.0@F127

2.5.1. Chuẩn bị dung dịch hoạt chất

Hoạt chất được lựa chọn bao gồm:

AZT, 3TC: đại diện cho nhóm hoạt chất tan trong nước

TDF: đại diện cho nhóm hoạt chất ít tan trong nước

RTV: đại diện cho nhóm hoạt chất không tan trong nước

Đối với AZT, 3TC và TDF: Cân một lượng chính xác khoảng 10,0 – 50,0 mg mỗi

hoạt chất hòa tan trong vừa đủ lượng nước tinh khiết bằng cách siêu âm, khuấy trong

khoảng 30 phút để có nồng độ hoạt chất khoảng 2,0 mg/ml

Đối với RTV: Cân một lượng chính xác khoảng 10,0 – 50,0 mg RTV hòa tan trong

dung dịch ethanol 35 % bằng cách khuấy trong khoảng 1 giờ để có nồng độ dung dịch

RTV khoảng 2,0 mg/ml

2.5.2. Chuẩn bị dung dịch hệ G3.0@mPEG và G3.0@F127

Dung dịch hệ dẫn truyền cho AZT, 3TC và TDF: Cân chính xác lượng

G3.0@mPEG hoặc G3.0@F127 hòa tan trong nước tinh khiết bằng cách khuấy trong

khoảng 30 phút để có nồng độ khoảng 8,0 mg/ml.

Dung dịch hệ dẫn truyền cho RTV: Cân chính xác lượng G3.0 @mPEG hoặc

G3.0@F127 hòa tan trong dung dịch ethanol 35 % bằng cách khuấy trong khoảng 1 giờ

để có nồng độ khoảng 8,0 mg/ml.

2.5.3. Dẫn truyền hoạt chất

Nhỏ từ từ dung dịch hoạt chất đã chuẩn bị vào dung dịch hệ dẫn truyền

G3.0@mPEG và G3.0@F127, khuấy đều trong 24 giờ duy trì nhiệt độ trong khoảng 20

- 25 oC. Sau 24 giờ, nâng nhiệt độ 37 oC trong khoảng 3 - 4 giờ trước khi loại hoạt chất

tự do.

2.5.4. Loại hoạt chất tự do

Cho dung dịch hệ dẫn truyền thuốc vào màng bán thấm cellulose MWCO 3.500

Da, treo trên giá, đặt vào becher dung tích 1000 ml chứa 1000 ml nước tinh khiết, tiến

hành thẩm tách trong 30 phút, thực hiện lặp lại 2 - 3 lần. Xác định hàm lượng hoạt chất

tự do của dung dịch ngoài màng bằng phương pháp HPLC theo quy trình đã xây dựng

và được thẩm định.

2.5.5. Đông khô

Phần dung dịch trong màng sau khi đã loại hoạt chất tự do được đem đông khô thu

được sản phẩm là các hệ dẫn truyền thuốc nano. Sản phẩm là chất rắn khô, màu trắng,

Sơ đồ dẫn truyền hoạt chất vào hệ G3.0@mPEG và G3.0@F127 được thể hiện

trong Hình 2.12.

Hình 2.42. Sơ đồ dẫn truyền hoạt chất ARV vào hệ G3.0@mPEG và G3.0@F127

2.6. Đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất in vitro và thử hoạt tính sinh học

2.6.1. Đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất

Để đánh gía khả năng giải phóng hoạt chất, phương pháp màng thẩm tách được sử

dụng để khảo sát sự nhả chậm hoạt chất từ hệ dendrimer biến tính G3.0@mPEG và

G3.0@F127. Màng thẩm tách có khối lượng phân tử 3,5 kDa được treo lơ lững trong

cốc dung tích 1000 ml chứa 500 ml môi trường hòa tan.

Chuẩn bị các dung dịch đệm cho thử nghiệm

Các dung dịch acid và dung dịch đệm dưới đây được chuẩn bị theo USP 41[90]

• Dung dịch acid hydrocloric (HCl) 0,1 N

Pha loãng 8,5 ml acid hydrocloric (TT) với nước vừa đủ 1000 ml

• Dung dịch đệm acetat pH 4,5

Hòa tan 2,99 g natri acetat trihydrat (CH3COONa.3H2O) trong nước, thêm 1,58

ml acid acetic băng (TT), thêm nước vừa đủ 1000 ml

• Dung dịch đệm citro phosphat pH 6,8 (sử dụng cho RTV)

Trộn 77,3 ml dung dịch dinatri hydrophosphat dodecahydrat (Na2HPO4.12H2O)

với 22,7 ml dung dịch acid citric monohydrat (C6H8O7.H2O) 2,1 %

• Dung dịch đệm phosphat pH 6,8

Hòa tan 6,81 g kali dihydrophosphatt (KH2PO4) trong nước, thêm 0,95 natri

hydroxyd (NaOH), thêm nước vừa đủ 1000 ml

• Dung dịch đệm PBS pH 7,4

Hòa tan 8,0 g natri clorid (NaCl); 0,2 g kali clorid (KCl); 1,44 g dinatri

hydrophosphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O); 0,24 g kali dihydrophosphat (KH2PO4) trong

800 ml nước, chỉnh pH 7,4 bằng acid hydrocloric, thêm nước vừa đủ 1000 ml

Tiến hành thử nghiệm giải phóng hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV từ các hệ dẫn

truyền thuốc

Thể tích môi trường: 500 ml dung dịch môi trường hòa tan.

Tốc độ khuấy: 50 vòng/phút.

Nhiệt độ môi trường: 37 oC ± 0,5 oC

Thời gian lấy mẫu: 0, 1, 3, ...n giờ cho đến khi thuốc phóng thích không ít hơn

85,0 %.

Thể tích hút: 1 ml tại mỗi thời điểm, bổ sung bằng 1 ml môi trường tương ứng.

Lượng mẫu: Cân a (khoảng 0,4 g – 0,5 g) sản phẩm sau đông khô.

2.6.2. Thử hoạt tính sinh học

2.6.2.1. Thử độc tính tế bào

Độc tính tế bào được đánh giá trên tế bào nguyên bào sợi của người, dòng tế bào

BJ thông qua xét nghiệm MTT [81]. Các dung dịch mẫu có nồng độ 200.000 µg/mL

trong DMSO được chuẩn bị trong ống eppendorf bằng máy xoáy trong 1 phút ở tốc độ

2000 vòng/phút và siêu âm ở 37 oC trong 20 phút. Các dung dịch sau đó được pha loãng

đến 1000 µg/mL trước khi tiếp xúc với tế bào BJ.

Tế bào BJ [92] được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng với 104 tế bào/giếng và được ủ ở

37 oC, độ ẩm tương đối 98 % và CO2 là 5 %. Môi trường nuôi cấy tế bào là hỗn hợp

DMEM với 10 % FBS và 0,1 % penicilin-streptomycin, được gọi ngắn gọn là DMEM.

Sau 1 ngày, môi trường tế bào đã được thay thế bằng các dung dịch mẫu với các nồng

độ khác nhau, chẳng hạn như 0, 5, 25, 50, 100, 200, 400 và 800 µg/mL đối với G3.0; và

0, 50, 100, 200, 400 và 800 µg/mL cho G3.0@mPEG và ARV @ G3.0 @ mPEG. Mẫu

đối chứng âm tính là DMSO 0,5 % hòa tan trong DMEM. Mỗi mẫu được lặp lại ba lần

cho ba giếng. Sau 24 giờ ủ ở 37 oC, độ ẩm tương đối 98 % và CO2 là 5 %, thêm 1 µL

MTT vào và các giếng được ủ liên tục trong cùng điều kiện trong 4 giờ. Môi trường sau

đó được thay thế bằng 200 µL DMSO. Sau khi lắc nhẹ trong 5 phút, khả năng sống của

tế bào được xác định bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 570 nm sử dụng máy đọc

ELISA, HumanRead.

Phần mềm Prism được sử dụng để xác định IC50. Trong khi đó, xét nghiệm

sống/chết dựa trên trên nhuộm kép acridin da cam (AO)/propidium iodid (PI) được sử

dụng để đánh giá hình thái của tế bào BJ với sự hỗ trợ của kính hiển vi đồng tiêu kênh

laser kép.

2.6.2.2. Thử hoạt tính ức chế pepsin

Xác định hoạt độ pepsin bằng phương pháp của Anson [93] cải tiến với cơ chất

hemoglobin theo quy trình mô tả của hãng Sigma Aldrich. Pepsin được ủ với dung dịch

hemoglobin 2 % trong HCl 10 mM ở 37 oC, 15 phút. Phản ứng được làm ngừng bằng

cách bổ sung TCA 5 %, sản phẩm phân giải trong dịch nổi thu được sau khi ly tâm được

xác định bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng ở 280 nm (A280). Đối chứng âm là mẫu

pepsin bị bất hoạt bằng TCA 5 % trước khi bổ sung cơ chất. Hoạt độ pepsin được đánh

giá trên cơ sở hiệu số số đọc A280 của mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra/đối chứng [93-

95].

• Hóa chất, thuốc thử:

Quá trình chuẩn bị hóa chất, thuốc thử pha trong nước thì được hiểu là nước siêu

tinh khiết .

1. Nước siêu tinh khiết (điện trở suất ≥18 MΩ-cm, 25 oC)

2. Dung dịch hemoglobin chuẩn gốc 2,5 % (dung dịch cơ chất): Cân chính xác

lượng hemoglobin hòa tan trong nước để có nồng độ 25 mg/ml, khuấy 30 phút, ly tâm

5000 vòng/phút trong 30 phút. Lấy phần dung dịch phía trên

3. Dung dịch acid hydroclorid 5M: Pha lõang 212,5 ml acid hydrocloric với nước

vừa đủ 500 ml

4. Dung dịch acid hydroclorid 10 mM: Hút 1 ml dung dịch acid hydrocloric 5 M

thêm nước vừa đủ 500 ml

5. Dung dịch hemoglobin chuẩn 2,0 %: Lấy 80 ml dung dịch hemoglobin chuẩn

gốc 2,5 %, ủ 37 oC, chỉnh pH 2 ở 37 oC bằng dung dịch acid hydroclorid 5M, thêm nước

vừa đủ 100 ml

6. Dung dịch acid TCA 5 %: Hòa tan 5,0 g acid tricloroacetic trong nước và thêm

nước vừa đủ 100 ml

7. Dung dịch chuẩn enzym (pepsin) gốc nồng độ 1 mg/ml: Cân chính xác lượng

pepsin chuẩn hòa tan trong dung dịch acid hydrocloric 10 mM thích hợp, để 2 – 8 oC

trong khoảng 1 giờ, thỉnh thoảng lắc.

8. Dung dịch chuẩn pepsin 0,05 mg/ml: Hút 5 ml dung dịch chuẩn pepsin gốc 1

mg/ml thêm dung dịch acid hydrocloric 10 mM/2-8 oC đến vừa đủ 100 ml.

Dung dịch chuẩn pepsin được trộn với dung dịch thử tỷ lệ (1:1), ủ ở 37 oC trong 10 phút.

Tiến hành:

Quá trình được thực hiện trong bể ổn nhiệt ở 37 oC, ống nghiệm dung tích 20 ml

có nắp vặn. Mỗi nồng độ thực hiện lặp lại 3 lần.

Bảng 2.7. Trình tự thực hiện thử hoạt tính ức chế pepsin

Thuốc thử

Trắng (ml)

Thử 1 (ml)

Thử 2 (ml)

Thử 3 (ml)

5,0

1.Dung dịch cơ chất

5,0

2.Đặt vào bể ổn nhiệt ở 37 oC/ 10 phút, sau đó thêm

1,0

Dung dịch enzym

1,0

3.Trộn đều, ủ 37 oC chính xác 10 phút, sau đó thêm

10,0

Dung dịch TCA 5 %

10,0

Dung dịch enzym

1,0

4.Trộn đều, ủ ở 37 oC thêm 5 phút

5.Lọc mẫu trắng và mẫu thử qua màng lọc 0,45 µm. Đo dịch lọc ở A280 nm

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1. TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM THẾ HỆ G-0.5 - G3.0

Các sản phẩm dendrimer PAMAM với lõi ethylen diamin từ thế hệ G-0.5 đến G3.0 tổng hợp được có dạng dẻo màu vàng nhạt đậm dần từ G-0.5 đến G3.0. Cấu trúc của các dendrimer PAMAM được xác định bằng quang phổ hồng ngoại biến đổi FTIR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, MS, GPC.

3.1.1. Phổ hồng ngoại FTIR

Phổ FTIR và tần số hấp thụ phổ FTIR của dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến

G3.0 được thể hiện trong Hình 3.1 và số sóng được thống kê trong Bảng 3.1

Hình 3.1. Phổ FTIR của dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

Nhóm

Amin bậc 2 (N-H) và OH

Số sóng Thế hệ lẻ (cm-1) 3385 - 3270

Số sóng Thế hệ chẵn (cm-1) -

Amin bậc 2 (N-H)

3404

Hydrocarbon thẳng (C-H)

2953; 2835

2953 - 2841

Acid carboxylic (C=O)

1732 - 1726

Amid (C=O)

1643 - 1647

1647 - 1641

1558 - 1552

Amin bậc 1 (NH2)

Bảng 3.1. Tần số hấp thụ phổ FTIR của dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

Đối với thế hệ lẻ (G-0.5, G0.5, G1.5, G2.5), phổ FTIR có tín hiệu hấp thụ đặc trưng

của nhóm OH và NH; nhóm C-H; nhóm C=O (acid); nhóm C=O (amid); Đây là những

nhóm chức đặc trưng trong cấu trúc dendrimer PAMAM thế hệ lẻ.

Đối với thế hệ chẵn (G0.0, G1.0, G2.0, G3.0), phổ FTIR có tín hiệu hấp thu đặc

1 - 1726 cm-1 của nhóm C=O (acid) và xuất hiện tín hiệu 1558 cm-1 - 1552 cm-1 của

trưng của nhóm NH; nhóm CH; nhóm C=O (amid); Có sự biến mất tín hiệu ở 1732 cm-

nhóm -NH2.

Kết quả phân tích phổ FTIR phù hợp với các công bố tổng hợp dendrimer PAMAM

trước đây [70], [87], [96].

3.1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR

Phổ 1H-MNR của dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0 được thể hiện

trong Hình 3.2 và và độ dịch chuyển hóa học được thống kê trong Bảng 3.2.

Hình 3.2. Phổ 1H-NMR các dendrimer PAMAM G-0.5-G3.0

Vị trí H

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

H của nhóm

a b c d e g h

Độ dịch chuyển hóa học (, ppm) 2,50 - 2,60 2,73 - 2,82 2,32 - 2,40 2,64 - 2,77 3,16 - 3,28 2,43 - 2,48 3,66 - 3,67

-CH2CH2N< -CH2CH2CO- -CH2CH2CONH- -CH2CH2NH2 -CONHCH2CH2N- -CH2CH2COOCH3 -COOCH3

Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của các dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến

G3.0 (Bảng 3.2), một lần nữa khẳng định sự lặp đi lặp lại các tính hiệu proton trong các

thế hệ dendrimer PAMAM. Các tín hiệu proton ở vị trí a, b, c, e luôn xuất hiện trong

phân tử dendrimer PAMAM. Tín hiệu proton ở vị trí d chỉ xuất hiện ở thế hệ chẵn (G0.0,

G1.0, G2.0, G3.0) và tín hiệu proton ở vị trí g, h chỉ xuất hiện ở thế hệ lẻ (G-0.5, G0.5,

G1.5, G2.5).

Kết quả phân tích phổ 1H-NMR phù hợp với các công bố tổng hợp dendrimer

PAMAM trước đây [70], [87], [96-97].

3.1.3. Phổ khối lượng MS và sắc ký lọc gel GPC

Dựa trên các kết quả nghiên cứu về dendrimer PAMAM đã công bố [70], [87],

[96-97], đối với các hệ dendrimer khối lượng thấp từ G-0.5 đến G2.0 có thể sử dụng

phương pháp MS cho độ chính xác cao, PAMAM dendrimer G2.0 trở lên không xác

định được giá trị m/z. Điều này được công bố trong các kết quả nghiên cứu của Schwartz

và Hood [98], [99]. Nguyên nhân của việc không xác định khối lượng phân tử của các

dendrimer thế hệ cao hơn G2.0 có thể do ảnh hưởng của hiệu ứng lập thể [100]. Với các

thế hệ dendrimer cao hơn, phương pháp 1H-NMR được dùng để thay thế kỹ thuật MS

và GPC trong dự đoán khối lượng phân tử của các dendrimer PAMAM và các dẫn xuất

của chúng với độ chính xác tương đối cao [97].

Phổ MS các dendrimer PAMAM G-0.5; G0.0 và G0.5 sử dụng phương pháp khối

phổ (MS), dendrimer PAMAM G3.0 sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel (GPC), các

PAMAM còn lại sử dụng phương pháp tính tích phân từ phổ 1H-NMR tương ứng. Kết

quả được thể hiện trong Hình 3.3, Hình 3.4 và Bảng 3.3.

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G-0.5 (bên trái) và G0.0 (bên phải)

Hình 3.4. Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G0.5 (bên trái) và GPC G3.0 (bên phải)

Phổ MS PAMAM G-0.5 pic m/z = 405,20 = [M+H]+ tương ứng với công thức

phân tử C18H32O8N2 (M = 404,5).

Phổ MS PAMAM G 0.0 có pic m/z = 517,20 = [M+H]+ tương ứng với công thức

phân tử C22H48N10O4 (M = 516,7).

Phổ MS PAMAM G 0.5 có pic m/z = 1206 = [M+H]+ tương ứng với công thức

phân tử C54H96O20N10 (M = 1205,4).

Thế hệ

CTPT

Độ lệch (%)

MLT

MMS

G -0.5

404,5

404,2

0,07

C18H32O8N2

G 0.0

516,7

516,2

0,10

C22H48 O4N10

G 0.5

1205,4

1205,0

0,03

C54H96O20N10

Đơn vị: (g/mol) C = 12.0011

H = 1.00797

O = 15.9994

N = 14.0067

Bảng 3.3. Khối lượng phân tử của PAMAM theo MS

Thế hệ

CTPT

Độ lệch (%)

MLT

MGPC

G 3.0

6908,84

6962,5

0,78

C302H608O60N122

Đơn vị: (g/mol) C = 12.0011

H = 1.00797

O = 15.9994

N = 14.0067

Bảng 3.4. Khối lượng phân tử của PAMAM theo GPC

Kết quả Bảng 3.1, Bảng 3.2 và Bảng 3.4. cho thấy dendrimer PAMAM G3.0 đã

tổng hợp là đúng, kết quả khối lượng phân tử G3.0 theo GPC là 6.962,5 g/mol so với

khối lượng lý thuyết của G3.0 là 6.908,84 g/mol của sản phẩm thương mại Sigma, với

độ lệch là 0,78 %. Sản phẩm G3.0 sẽ được sử dụng để thực hiện các nghiên cứu tiếp

theo của luận án.

3.1.4. Tính toán khối lượng phân tử dendrimer PAMAM bằng phổ 1H-NMR

Dựa trên kết quả công bố của tác giả Nguyễn Thị Bích Trâm và cộng sự [97], khối

lượng phân tử dendrimer PAMAM được xác định tại peak có độ chuyển dịch hóa học

2,50 - 2,55 ppm (vị trí a) và 3,25 - 3,35 ppm (vị trí e) theo công thức:

Trong đó:

: Diện tích peak ở vị trí (e) và (a)

: Tổng số proton ở vị trí (e) và (a) theo lý thuyết

: Khối lượng phân tử của PAMAM theo lý thuyết

Hình 3.5. Xác định khối lượng phân tử của PAMAM G 1.0 đến G 2.5 bằng 1H-NMR

Độ lệch

Thế hệ

MLT

H-NMR

(%)

G 1.0

2,08

1429,9

1487,1

4,00

Bảng 3.5. Khối lượng phân tử của PAMAM tính theo 1H-NMR

0,85

2807,3

2774,7

1,16

G 1.5

2,10

3256,2

3419,0

5,00

G 2.0

0,95

6011,1

6140,4

2,15

G 2.5

Bảng 3 6. Khối lượng phân tử của PAMAM tổng hợp so với cấu trúc PAMAM theo lý

CTPT

Độ lệch (%)

Thế hệ

MLý thuyết

MThực tế

404,5

404,2 (1)

0,07

G -0.5

C18H32O8N2

516,7

516,2 (1)

0,10

G 0.0

C22H48 O4N10

1205,4

1205,0 (1)

0,03

G 0.5

C54H96O20N10

1429,9

1487,1 (2)

4,00

G 1.0

C62H128O12N26

2807,3

2774,7 (2)

1,16

G 1.5

C126H224O44N26

3256,2

3419,0 (2)

5,00

G 2.0

C142H288O28N58

6011,1

6140,4 (2)

2,15

G 2.5

C270H480O92N58

6908,9

6962,5 (3)

0,78

G 3.0

C302H608O60N122

(3) GPC

Phương pháp:

(1) MS

(2) 1H-NMR

Đơn vị: (g/mol) C = 12.0011

H = 1.00797

O = 15.9994

N = 14.0067

thuyết.

Kết quả phân tích phổ MS (Bảng 3.3) cho thấy sản phẩm dendrimer PAMAM từ

thế hệ G-0.5 đến G0.5 có khối lượng phân tử phù hợp với khối lượng phân tử theo lý

thuyết, phần trăm độ lệch 0,03 % - 0,10 % so với lý thuyết.

Kết quả phân tích phổ GPC (Bảng 3.4) cho thấy sản phẩm dendrimer PAMAM từ

thế hệ G3.0 có khối lượng phân tử phù hợp với khối lượng phân tử theo lý thuyết, độ

lệch 0,78 % so với lý thuyết.

Kết quả Xác định khối lượng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-

NMR trong Bảng 3.5 cho thấy: khối lượng phân tử của dendrimer PAMAM thế hệ G1.0,

G1.5, G2.0 và G2.5 có độ lệch so với lý thuyết trong khoảng 1,16 % - 5,00 %, so với

phương pháp phổ MS có hiệu số sai lệch so với lý thuyết bé hơn (từ 0,03 % - 0,10 %).

Tuy nhiên, ưu điểm vượt trội của phổ 1H-NMR, vừa xác định được cấu trúc phân tử vừa

xác định được khối lượng phân tử dendrimer PAMAM mà không bị giới hạn bởi khối

lượng phân tử lớn so với phương pháp phổ khối lượng chỉ có thể xác định được

dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G2.0. Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng phổ 1H-

NMR để tính khối lượng phân tử cho những dendrimer PAMAM thế hệ G1.0, G1.5,

G2.0 và G2.5 và kết quả này là hoàn toàn phù hợp so với các công bố nghiên cứu trước

đây của dendrimer PAMAM [70], [87], [97].

Qua kết quả phổ FTIR, 1H-NMR, GPC, MS và MS tính toán dựa trên phổ 1H-NMR

cho thấy sản phẩm dendrimer đã tổng hợp từ thế hệ G-0.5 đến thế hệ G3.0 là đúng và

phù hợp với cấu tạo của dendrimer lý thuyết cũng như các công bố tổng hợp dendrimer

trước đây [70], [87], [96], [97].

3.1.5. Hiệu suất phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM

Các số liệu và hiệu suất phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0

được thể hiện trong Bảng 3.7.

Thế hệ

Phân tử lượng

Số mol

KL lý thuyết

KL thực tế

Hiệu suất

g/mol

404,5

0,2935

118,7208

100,3190

84,5

G-0.5

516,7

0,0494

25,5476

21,0512

82,4

G0.0

1205,4

0,0387

46,6576

38,9591

83,5

G0.5

1429,9

0,0166

23,7249

20,3322

85,7

G1.0

2807,3

0,0140

39,2657

34,7894

88,6

G1.5

3256,2

0,0107

34,7971

28,4914

81,9

G2.0

6011,1

0,0154

92,3024

80,5183

87,2

G2.5

6908,9

0,0083

57,4679

49,9740

87,0

G3.0

Bảng 3.7. Hiệu suất phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0

Qua kết quả Bảng 3.7. nhận thấy hiệu suất tổng hợp các dendrimer nhìn chung

khá cao, hiệu suất tổng hợp tất cả các thế hệ của dendrimer PAMAM đều lớn hơn 80 %.

3.2. BIẾN TÍNH PAMAM DENDRIMER G3.0 VỚI mPEG VÀ PLURONIC

F127

3.2.1. Hình thái, kích thước

Hình thái, kích thước của dendrimer PAMAM, dendrimer G3.0 biến tính với

mPEG (G3.0@mPEG) và pluronic F127 (G3.0@F127) được thể hiện trong Hình 3.6.

và Hình 3.7.

Hình 3.6. Hình thái, kích thước hạt của G3.0, G3.0@mPEG

Hình 3.7. Hình thái, kích thước hạt của G3.0@F127

Hình thái và kích thước hạt của dendrimer G3.0 và G3.0@mPEG được thể hiện

trong Hình 3.6 và của G3.0@F127 trong Hình 3.7. Hình ảnh TEM (Hình a và b của

G3.0@mPEG và hình g của G3.0@F127) cho thấy rằng các hạt G3.0, G3.0@mPEG và

G3.0@F127 đều có hình cầu với kích thước hạt lần lượt là 4,3 ± 0,2 nm và 34,5 ± 0,2

nm và 56 ± 10 nm. Trong khi đó, kích thước được đo bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng

động DLS của G3.0, G3.0@mPEG vả G3.0@F127 lần lượt là 5,8 ± 0,4 nm , 127,4 nm

± 1,2 nm và 135,1 ± 1,8 nm. Cả kết quả TEM và DLS của G3.0@mPEG và G3.0@F127

đều lớn hơn kết quả của G3.0 do lớp mPEG và pluronic F127 liên hợp trên bề mặt G3.0.

Lớp này không chỉ giữ được nhiều thuốc hơn mà còn tăng cường thời gian lưu trú trong

máu của các phần tử [101]. Tuy nhiên, kết quả DLS lớn hơn đường kính đo bằng TEM,

điều này được giải thích là do lớp solvat xung quanh hạt trong phép đo DLS do phân tán

sản phẩm trong môi trường nước [102].

3.2.2. Phổ hồng ngoại FTIR

Phổ FTIR và tần số hấp thụ phổ FTIR của dendrimer PAMAM G3.0, mPEG-NPC

và G3.0@mPEG được thể hiện trong Hình 3.8 và Hình 3.9.

Hình 3.8. Phổ FTIR của G3.0; mPEG-NPC và G3.0@mPEG

Hình 3.9. Phổ FTIR của G3.0; NPC-F127-OH và G3.0@F127

Bảng 3.8. Tần số hấp thụ phổ FTIR của dendrimer PAMAM G3.0, mPEG-NPC,

G3.0@mPEG, NPC-F127-OH và G3.0@F127

Nhóm chức

G3.0

mPEG-NPC

G3.0@F127

Số sóng (cm-1) G3.0@mPEG

3415

3421

NPC-F127- OH -

3447

1641 - - - -

- 2888 1768 1115

1641 2887 - 1112

1641 2887 1765 1112 3446

1641 2887 - 1107

Amin bậc 2 (N-H) Amid (C=O) (C-H) (NO2) (C-O) (OH)

Kết quả Bảng 3.8. cho thấy phổ FTIR của PAMAM G3.0@mPEG tổng hợp có tín

hiệu tại 3421 cm-1 và 1641 cm-1 lần lượt tương ứng với dao động của nhóm N-H và C=O

trên phân tử PAMAM G 3.0, mũi hấp thụ tại 2887 cm-1 và 1112 cm-1 đặc trưng cho dao

động của nhóm C-H và C-O trên phân tử PEG. Ngoài ra, trên phổ PAMAM

G3.0@mPEG còn có sự mất đi tín hiệu của nhóm N−⃛ O (số sóng 1768 cm-1), đồng nghĩa

phản ứng loại bỏ nhóm chức -NPC trên PEG-NPC đã xảy ra [102-104].

1, 1641 cm-1 lần lượt tương ứng với dao động của nhóm N-H và C=O trên cả hai phân

Tương tự, phổ FTIR của PAMAM G3.0@F127 tổng hợp có tín hiệu tại 3447 cm-

tử PAMAM G3.0 và F127. Tín hiệu tại 2887 cm-1 và 1107 cm-1 đặc trưng cho dao động

của nhóm C-H và C-O trên phân tử F127. Ngoài ra, trên phổ PAMAM G3.0@F127 còn

có sự mất đi tín hiệu của nhóm -NO2 (số sóng 1765 cm-1), đồng nghĩa phản ứng loại bỏ

nhóm chức -NPC trên HO-F127-NPC đã xảy ra [102-104].

3.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR

Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của G3.0, PEG-NPC và G3.0@mPEG

Hình 3.11. Phổ 1H-NMR của G3.0, NPC-F127-OH và G3.0@F127

Dữ liệu phổ 1H-NMR của G3.0, mPEG-NPC, G3.0@mPEG, NPC-F127-OH và

G3.0@F127 theo Hình 3.10 và Hình 3.11 cho thấy:

Phổ 1H-NMR của G 3.0 có các tín hiệu tại δH = 3,24 ppm (c), δH = 2,77 ppm (a),

δH = 2,38-2,36 ppm (b), δH = 2,21 ppm (e), δH = 2,57-2,56 ppm (d). Đây đều là các tín

hiệu đặc trưng của PAMAM G 3.0.

Phổ 1H-NMR của mPEG-NPC có các tín hiệu tại δH = 3,40 ppm (x), δH = 3,84

-3,34 ppm (y), δH = 4,45 ppm (z), δH = 7,48-7,46 ppm (m), và δH = 8,34-8,32 ppm (k),

các tín hiệu này đều là các tín hiệu đặc trưng của mPEG-NPC.

Phổ 1H-NMR của G 3.0@mPEG có các tín hiệu tại δH = 3,28 ppm (c), δH = 2,81-

2,80 ppm (a), δH = 2,39 ppm (b), δH = 2,61 ppm (d), δH = 2,24 ppm (e), các tín hiệu

này đặc trưng cho PAMAM G 3.0. Khi so sánh với phổ 1H-NMR của mPEG-NPC, ta

thấy tín hiệu ở δH = 7,48-7,46 ppm, và δH = 8,34-8,32 ppm của nhóm p-nitrophenolat

biến mất và có sự thay đổi về độ dịch chuyển hóa học ở vị trí (i) từ δH = 4,45 ppm ở

mPEG-NPC sang δH = 4,19 ppm ở G 3.0@mPEG, độ chuyển dịch này là do có sự

chuyển hóa từ >CH-CH2-OC(O)O- (i) sang >CH-CH2-OC(O)NH- (i’), các tín hiệu còn

lại không có sự khác biệt đáng kể. Điều này chứng tỏ mPEG đã gắn thành công lên

PAMAM G3.0 [87].

Phổ 1H-NMR của HO-F127-NPC có các tín hiệu tại δH = 1,12-1,11 ppm (a), δH =

3,08 ppm (g), δH = 3,83-3,07 ppm (b+c+h), δH = 4,49 ppm (d), δH = 7,51-7,48 ppm

(e) và δH = 8,36-8,34 ppm (f), các tín hiệu này đều là các tín hiệu đặc trưng của HO-

F127-NPC.

Phổ 1H-NMR của G 3.0@F127 có các tín hiệu tại δH = 3,28 ppm (z), δH = 2,81-

2,80 ppm (x), δH = 2,46-2,39 ppm (y), δH = 2,61 ppm (k), các tín hiệu này đặc trưng

cho PAMAM G 3.0. Khi so sánh với phổ 1H-NMR của HO-F127-NPC, ta thấy tín hiệu

ở δH = 7,51-7,48 ppm, và δH = 8,36-8,34 ppm của nhóm p-nitrophenolat biến mất và

có sự thay đổi về độ dịch chuyển hóa học ở vị trí (d) từ δH = 4,49 ppm ở HO-F127-NPC

sang δH = 4,19 ppm ở G 3.0@F127, độ chuyển dịch này là do có sự chuyển hóa từ >CH-

CH2-OC(O)O- (d) sang >CH-CH2-OC(O)NH- (d’), các tín hiệu còn lại không có sự khác

biệt đáng kể. Điều này chứng tỏ F127 đã gắn thành công lên PAMAM G 3.0

• Công thức tính số nhóm mPEG và pluronic F127 liên hợp

Kế thừa các nghiên cứu về dendrimer PAMAM biến tính với PEG và F127 cho

thấy: Biến tính với polymer sinh học mPEG và F127 làm giảm độc tính của chất mang

và tăng khả năng dẫn truyền thuốc. Tuy nhiên, tỉ lệ (1:8) cho thấy khả năng dẫn truyền

thuốc không cao, nhóm -NH2 của dendrimer PAMAM G3.0 vẫn còn nhiều nên có khả

năng gây độc tế bào và tỉ lệ (1:32) bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng không gian [105] nên đề

tài lựa chọn tỉ lệ 1:16

Số lượng nhóm mPEG gắn lên PAMAM G 3.0 có thể dễ dàng được xác định thông

qua tỷ lệ tích phân tín hiệu 3H tại 3,40 ppm của nhóm –OCH3 trên mPEG với tín hiệu

60H tại 2,61 ppm trên dendrimer PAMAM G 3.0 (tín hiệu tại 2,61 ppm được chọn vì

luôn xuất hiện rõ ràng và không trùng lặp với bất kỳ peak khác) theo công thức:

Số nhóm gắn = số proton 2,61 pm x tích phân vị trí 3,40 pm số proton vị trí 3,40 pm x tích phân vị trí 2,61 ppm

Tỉ lệ gắn = x 100 số nhóm PEG gắn số nhóm PEG đưa vào phản ứng

Tương tự, phản ứng giữa nhóm amin (-NH2) trên PAMAM G 3.0 với nhóm -NPC

trên phân tử HO-F127-NPC tạo ra tín hiệu 2H tại 4,18 ppm của liên kết >CH-CH2-

OC(O)NH-. Do đó, số lượng nhóm gắn lên PAMAM G 3.0 có thể dễ dàng được xác

định thông qua tỷ lệ tích phân tín hiệu 2H tại 4,18 ppm với tín hiệu 60H tại 2,61 ppm

trên dendrimer PAMAM G 3.0 (tín hiệu tại 2,61 ppm được chọn vì luôn xuất hiện rõ

ràng và không trùng lặp với bất kỳ peak khác) theo công thức:

Số nhóm gắn = số proton 2,61 pm x tích phân vị trí 4,18 pm số proton vị trí 4,18 pm x tích phân vị trí 2,61 ppm

Tỉ lệ gắn = x 100 số nhóm F127 gắn số nhóm F127 đưa vào phản ứng

Số nhóm mPEG liên hợp hợp với mPEG là 12,74 và F127 là 13,95 tương ứng với tỷ lệ

là 79,63 % và 87,19 %.

3.3. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

Kết quả thẩm định phương pháp được thực hiện trên quy trình xác định hàm lượng

AZT, 3TC và xác định đồng thời AZT và 3TC, thực hiện tương tự cho quy trình xác

định hàm lượng TDF, RTV và xác định đồng thời TDF và RTV.

3.3.1. Tính tương thích của hệ thống sắc ký

Tính tương thích hệ thống được AZT, 3TC thể hiện ở Bảng 3.9.

Độ lặp lại

Hệ số bất

Số đĩa lí

Độ lặp lại

Độ phân

Thời lưu gian tR

Hợp chất

(phút)

T.lưu

đối

thuyết

Spic

giải

3TC

3,523

0,12

1,30

2.706

0,03

AZT

4,387

0,11

1,38

4.037

0,12

4,85

Yêu cầu

≤ 2,0 %

T ≤ 2,0

N ≥ 2.000

≤ 2,0 %

R ≥ 2,0

Bảng 3.9. Tính tương thích hệ thống sắc ký xác định AZT, 3TC

Các thông số thực nghiệm thể hiện sự phù hợp của hệ thống sắc ký đã lựa chọn để

phân tích các hợp chất nghiên cứu.

3.3.2. Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu của phương pháp được thể hiện ở Hình 3.12.

Sắc ký đồ của dung dịch thử AZT (A), 3TC (B), mẫu placebo (C), mẫu trắng (D),

sắc ký đồ và phổ UV từng thành phần của mẫu placebo bổ sung AZT và 3TC (E, F, G)

thể hiện độ tinh khiết của pic AZT và 3TC.

Kết quả Hình 3.12 cho thấy dung dịch chuẩn và dung dịch thử cho pic có thời gian

lưu tương ứng, dung môi pha mẫu và mẫu placebo không cho pic ở thời gian tương ứng

với AZT và 3TC, các dữ liệu về độ tinh khiết pic AZT, 3TC (F, G).

Độ lệch thời gian lưu của 3TC giữa chuẩn và thử là 1,81 % và của AZT giữa chuẩn

và thử 0,21 %.

Kết quả cho thấy phương pháp xây dựng đặc hiệu với chất phân tích AZT và 3TC

Thực hiện tương tự cho phương pháp xác định TDF, RTV và xác định đồng thời

TDF, RTV.

Hình 3.12. Tính đặc hiệu của phương pháp xác định AZT, 3TC và xác định đồng thời

AZT, 3TC

3.3.3. Tính tuyến tính

Kết quả Tính tuyến tính AZT và 3TC được trình bày ở Bảng 3.10 và Bảng 3.11.

Nồng độ C (µg/ml)

2,16

43,27

108,18

162,26

324,53

Diện tích pic S

51908

1038160

2580257

3877184

7739087

(mAu.s)

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính AZT

10000000

8000000

y = 23842.021x + 3612.648 R² = 01.000

Phương trình hồi qui

6000000

ŷ = 23842,0214x + 3612,6482

i

4000000 c p 2000000 h c

Hệ số tương quan r = 1,000

i

200

í t n ệ D

400 Nồng độ (µg/ml)

Nồng độ C (µg/ml)

2,54

20,28

50,70

76,05

152,10

Diện tích pic S

63960

511680

1292198

1930855

3877384

(mAu.s)

5000000

4000000

y = 25501.830x - 3386.501 R² = 01.000

Phương trình hồi qui

3000000

ŷ = 25501,8299x - 3386,5008

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính tuyến tính 3TC

i

2000000

c p h c

Hệ số tương quan r = 1,000

1000000

i

í t n ệ D

100

200

Nồng độ (µg/ml)

Kết quả khảo sát cho thấy hệ số tương quan r = 1,000: có sự tương quan tuyến tính

chặt chẽ giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic đáp ứng trong khoảng nồng độ

khảo sát đối với các hợp chất nghiên cứu. Kết quả này được sử dụng làm cơ sở cho các

nghiên cứu dẫn truyền hóa thuốc và phóng thích thuốc in vitro.

Kết quả tính tuyến tính TDF, RTV được trình bày trong Phụ luc 4.

3.3.4. Độ chính xác

Kết quả Độ chính xác của AZT và 3TC được trình bày ở Bảng 3.12 và Bảng 3.13.

3.3.4.1. Độ lặp

AZT

3TC

Thử

Lượng cân -

Diện tích

Hàm lượng

Diện tích

Hàm lượng

Pic (mAu.s)

0,1020

2569883

10,51

1289368

4,96

0,1010

2572635

10,63

1288950

5,00

Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ lặp AZT, 3TC

0,1013

2572857

10,60

4,99

1289540

0,1017

2572817

10,56

4,97

1289882

0,1015

2575090

10,59

4,99

1292400

0,1018

2572589

10,55

4,97

1289973

Trung bình

10,57

4,98

RSD (%)

0,39

0,36

3.3.4.2. Độ chính xác trung gian

AZT

3TC

Thử

Lượng cân -

Diện tích

Hàm lượng

Diện tích

Hàm lượng

Pic (mAu.s)

0,1018

2571154

10,51

4,91

1287431

0,1025

2572237

10,44

4,89

1290855

0,1018

2573139

10,52

4,91

1287967

0,1015

2573288

10,55

4,93

1287990

0,1020

2575381

10,51

4,91

1290392

0,1022

2575252

10,49

4,90

1290735

Trung bình

10,5

4,91

RSD (%)

0,34

0,25

Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian AZT, 3TC

Kết quả Bảng 3.12 và Bảng 3.13 cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về Độ chính

xác: RSD < 2,0 % (n=12) (AZT có RSD 0,82 % và 3TC có RSD là 0,49 %).

Kết quả Độ chính xác của TDF, RTV được trình bày Phụ luc 4.

3.3.5. Độ đúng

Kết quả khảo sát Độ đúng được thể hiện ở Bảng 3.14 (AZT) và Bảng 3.15 (3TC)

Mức

Lượng

Diện tích

C.chuẩn

Tỷ lệ phục

RSD

chuẩn

C. chuẩn

pic

tìm lại

Tỷ lệ phục

hồi

thêm-mg

µg/ml

(mAu.s)

µg/ml

hồi TB - %

80 %

98,48

0,21

8,80

87,56

2060200

86,41

98,69

8,82

87,76

2060359

86,42

98,47

8,85

88,06

2063359

86,54

98,28

11,00

100 %

109,45

2578249

108,14

98,84

0,12

98,80

11,02

109,65

2581403

108,27

98,74

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng của AZT

109,25

2578137

108,13

98,98

10,98

120 %

131,14

3097635

129,92

99,19

0,27

99,07

13,18

131,34

3100493

130,04

99,01

13,20

130,84

3103858

130,18

99,50

13,15

Mức

Lượng

Diện tích

C.chuẩn

Tỷ lệ phục

RSD

chuẩn

C. chuẩn

pic

tìm lại

Tỷ lệ phục

hồi

thêm-mg

µg/ml

(mAu.s)

µg/ml

hồi TB - %

99,28

40,20

1027958

39,91

99,41

0,52

4,02

80 %

99,98

40,00

1030039

39,99

4,00

98,98

40,50

1032477

40,09

4,05

50,00

1289365

50,06

100,12

99,65

0,51

5,00

100 %

99,74

50,30

1292130

50,17

5,03

99,11

50,50

1289069

50,05

5,05

100,09

60,20

1551898

60,25

100,12

0,28

6,02

120 %

99,86

60,40

1553561

60,32

6,04

100,41

60,10

1554359

60,35

6,01

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng của 3TC

Kết quả khảo sát Độ đúng ở 3 mức nồng độ của AZT và 3TC cho thấy phương

pháp đạt yêu cầu về Độ đúng (Tỷ lệ phục hồi trong khoảng 98,0 % – 102,0 %).

Kết quả Độ đúng của TDF, RTV được trình bày trong Phụ luc 4.

Bảng 3.16. Báo cáo tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp xác định hàm lượng AZT,

STT

Chỉ tiêu

Yêu cầu

Kết quả

Kết luận

Tính tương thích hệ

thống:

-Thời gian lưu

RSD ≤ 2,0 %

Đạt

-Diện tích pic

RSD ≤ 2,0 %

Đạt

-Số đĩa lý thuyết

N ≥ 2.000

Đạt

-Hệ số bất đối

T ≤ 2 ,0

Đạt

-Độ phân giải

R ≥ 2,0

Đạt

3TC: RSD = 0,03 % AZT: RSD = 0,12 % 3TC: RSD = 0,12 % AZT: RSD = 0,11 % 3TC: N = 2.706 AZT: N = 4.037 3TC: T = 1,30 AZT: T = 1,38 R = 4,85

3TC

Tính đặc hiệu

Mẫu trắng, mẫu placebo phải

Mẫu

trắng, mẫu

Đạt

không có pic trùng với pic của

placebo không có pic

3TC, AZT

trùng với pic của

3TC, AZT

Độ lệch thời gian lưu giữa chuẩn

3TC: 1,81 %

Đạt

và thử không quá 2,0 %

AZT: 0,21 %

Đạt

Tính tuyến tính

Hệ số tương quan r ≥ 0,998

Đạt

Độ đúng

98,0 % - 102,0 %

3TC: r = 1,000 AZT: r = 1,000 AZT: 98,84 % 3TC: 99,73 %

Đạt

Độ chính xác

Đạt

5.1 Độ lặp lại

RSD ≤ 2,0 % (n = 6)

3TC: RSD = 0,36 % AZT: RSD = 0,39 %

Đạt

5.2 Độ chính xác

RSD ≤ 2,0 % (n = 12)

3TC: RSD = 0,82 % AZT: RSD = 0,49 %

trung gian

3TC: 40-60 µg/ml

Khoảng xác định

AZT: 87-130 µg/ml

Kết quả Bảng 3.16 cho thấy quy trình xây dựng xác định hàm lượng hoạt chất

AZT, 3TC đáp ứng đầy đủ các chỉ tiêu cần thẩm định theo yêu cầu của ICH [92]. Quy

trình đã xây dựng phù hợp để xác định AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền thuốc đơn và

thuốc kết hợp. Kết quả xác định hàm lượng các hoạt chất AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền

thuốc đơn và thuốc kết hợp là đáng tin cậy.

3.4. KẾT QUẢ DẪN TRUYỀN HÓA HOẠT CHẤT

3.4.1. Kết quả dẫn truyền hóa hoạt chất tạo hệ dẫn truyền thuốc đơn

3.4.1.1. Hình thái, kích thước

Hình thái và kích thước của hệ dẫn truyền thuốc đơn được thực hiện bằng phương

pháp TEM và DLS. Kết quả được thể hiện trong Hình 13, Hình 14 và Bảng 3.17.

Hình 3.13. Hình thái, kích thước hạt của Hình 3.14. Hình thái, kích thước hạt của

RTV@G3.0@mPEG RTV@G3.0@F127

Hình thái (hình ảnh TEM) của hệ dẫn truyền thuốc RTV@G3.0@mPEG và

RTV@G3.0@F127 có dạng hình cầu.

Kích thước hạt trung bình của hệ dẫn truyền thuốc RTV@G3.0@mPEG là 43,0 ±

8,2 nm (TEM); 131,8 nm ± 2,7 (DLS); với hệ RTV@G3.0@F127 có kích thước hạt

trung bình là 57,2 ± 7,6 nm (TEM); 140,5 nm ± 2,5 (DLS)

Kích thước có sự khác nhau giữa 2 phương pháp do DLS phân tán trong môi trường

lỏng nên bị ảnh hưởng bởi lớp solvat [96]

Hệ dẫn truyền thuốc

Đường kính TB

Hệ dẫn truyền thuốc

Đường kính TB

(nm)

G3.0@mPEG

127,4 ± 2,2

G3.0@F127

135,1 ± 2,6

3TC@G3.0@mPEG

131,8 ± 2,7

3TC@G3.0@F127

140,5 ± 2,5

AZT@G3.0@mPEG

131,6 ± 1,9

AZT@G3.0@F127

138,1 ± 3,2

TDF@G3.0@mPEG

129,6 ± 2,0

TDF@G3.0@F127

136,8 ± 2,1

RTV@G3.0@mPEG

129,2 ± 2,4

RTV@G3.0@F127

136,3 ± 1,7

Bảng 3.17. Kết quả xác định kích thước của hệ dẫn truyền thuốc bằng DLS

Kết quả kích thước được đo bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động DLS của hệ dẫn

truyền thuốc ARV@G3.0@mPEG và ARV@G3.0@F127 được trình bày trong Bảng

3.17, Hình 3.13 và Hình 3.14 cho thấy hệ sau dẫn truyền thuốc kích thước tăng so với

trước dẫn truyền thuốc, kích thước hệ dẫn truyền thuốc 3TC là cao nhất trong bốn hệ

(131,8 nm với hệ 3TC@G3.0@mPEG và 140,5 nm với hệ 3TC@G3.0@F127), kích

thước hệ dẫn truyền thuốc RTV là thấp nhất (129,2 nm với hệ RTV@ G3.0@mPEG và

136,3 nm với hệ RTV@G3.0@F127) điều này được giải thích do trong môi trường nước

khả năng solvat hóa giảm dần của các ARV (3TC > AZT > TDF> RTV), kết quả này

cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây [81] khi đo DLS với thuốc kỵ nước sẽ cho đường

phân bố hẹp hơn, độ đa phân tán nhỏ hơn (thể hiện qua chỉ số phân tán DPI nhỏ hơn).

3.4.1.2. Phổ hồng ngoại FTIR

Phổ FTIR và tần số hấp thụ phổ của các hệ dẫn truyền thuốc ARV@G3.0@mPEG

và ARV@G3.0@F127 được trình bày từ Hình 3.15 đến Hình 3.18 và số sóng được

thống kê từ Bảng 3.18 đến Bảng 3.21.

Hình 3.15. Phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc 3TC@G3.0@mPEG và

AZT@G3.0@mPEG

Hình 3.16. Phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc TDF@G3.0@mPEG và

RTV@G3.0@mPEG

Hình 3.17. Phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc 3TC@G3.0@F127 và

AZT@G3.0@F127

Hình 3.18. Phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc TDF@G3.0@F127 và

RTV@G3.0@F127

Bảng 3.18. Tần số hấp thụ phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc 3TC@G3.0@mPEG,

3TC - 3327 2837 1651 1286

AZT 3462 2812 1643 1280 2083

G3.0@mPEG 3421 2887 1641 1112

3TC@G3.0@mPEG 3385 2889 1649 1280-1112

AZT@G3.0@mPEG 3462 2883 1689 1280-1111 2085

Nhóm chức -NH- -OH C-H C=O C-O Azid (N3)

AZT@G3.0@mPEG

Bảng 3.19. Tần số hấp thụ phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc TDF@G3.0@mPEG,

Nhóm chức -NH- -OH C-H C=O (acid) C-O C=O

TDF - 3500 2879 1764 1281 1658

RTV 3500 2879 1674 1280 1658

G3.0@mPEG 3421 2887 1641 1112

TDF@G3.0@mPEG 3421 3500 2887 1763 1280-1112 1653

RTV@G3.0@mPEG 3421 3500 2887 1722 1281-1113 1651

RTV@G3.0@mPEG

Bảng 3.20. Tần số hấp thụ phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc 3TC@G3.0@F127,

G3.0@F127 3447 2875 1641 1107

3TC@G3.0@F127 3412 2874 1639 1105

AZT@G3.0@F127 3447 2876 1691 1107 2110

3TC - 3327 2837 1651 -

AZT 3462 2812 1643 1143 2083

Nhóm chức -NH- -OH C-H C=O C-O Azid (N3)

AZT@G3.0@F127

Bảng 3.21. Tần số hấp thụ phổ FTIR của hệ dẫn truyền thuốc TDF@G3.0@F127,

Nhóm chức -NH- -OH C-H C=O (acid) C-O C=O

TDF - 3500 2879 1764 1281 1658

RTV 3500 2879 1674 1280 1658

G3.0@F127 3447 2875 1641 1107

TDF@G3.0@F127 3500-3420 2879 1659 1280-1111 1659

RTV@G3.0@F127 3500-3421 2876 1641 1252-1107 1641

RTV@G3.0@F127

Qua bảng tổng kết dữ liệu FTIR, có sự lặp đi lặp lại các tín hiệu dao động đặc trưng

của các hoạt chất 3TC, AZT, TDF, RTV, hệ G3.0@mPEG , G3.0@F127 và các tín hiệu

này cũng xuất trong các hệ dẫn truyền thuốc. Bên cạnh đó, có sự dịch chuyển quang phổ

một số tín hiệu được quan sát đối với hệ polyme, hoạt chất và hệ dẫn truyền thuốc tập

trung ở các nhóm -C=O, -NH-, C-O, -OH được trình bày tóm tắt trong Bảng 3.22. Những

thay đổi quang phổ được cho là do tương tác của các nhóm phân cực trong hoạt chất

như -OH, -NH2, -CO, -CN, -N3 với polyme dendrimer PAMAM G-0.5 đến G3.0 và hệ

dẫn truyền G3.0@mPEG, G3.0@F127. Bao gói thuốc bằng hệ dẫn truyền

G3.0@mPEG, G3.0@F127 dẫn đến tương tác như liên kết hydro, van der Waal và tĩnh

điện [97] giữa các nhóm phân cực của hạt chất và hệ dẫn truyền.

Nhóm

Hoạt chất /Hệ

Hệ dẫn truyền thuốc

RTV

Hệ RTV@G3.0@F127

1280 cm-1

1252 cm-1

C-O

1659-1658 cm-1

1641 cm-1

C=O

G3.0@F127

TDF@G3.0@F127

3447 cm-1

3420 cm-1

-NH-

AZT

AZT@G3.0@mPEG

1643 cm-1

1689 cm-1

C=O

Bảng 3.22. Sự dịch chuyển quang phổ FTIR một số tín hiệu

AZT@G3.0@F127

2083 cm-1

2110 cm-1

Azid N3

G3.0@mPEG

AZT@G3.0@mPEG

C=O

1641 cm-1

1689 cm-1

TDF

Hệ TDF@G3.0@F127

C=O

1764 cm-1

1659 cm-1

-OH

Mũi nhọn

Mũi tù

3.4.1.3. Kết quả dẫn truyền hoạt chất đơn

Kết quả dẫn truyền hoạt chất AZT, 3TC, TDF, RTV trên 2 hệ G3.0@mPEG và

G3.0@F127 được trình bày trong Bảng 3.23 đến Bảng 3.26. Đồ thị biểu diễn phần trăm

hiệu suất dẫn truyền và khả năng dẫn truyền trong Hình 3.19 và Hình 3.20.

Hệ

DLE %

DLC %

mT-BD - mg

mT-TD - mg

G3.0@mPEG

83,50

57,01

32,01 ± 0,43

7,18 ± 0,54

G3.0@F127

84,25

55,55

34,37 ± 0,38

7,36 ± 0,44

Bảng 3.23. Kết quả dẫn truyền AZT

Hệ

DLE %

DLC %

mT-BD - mg

mT-TD -mg

G3.0@mPEG

83,07

56,01

32,84 ± 0,26

7,31 ± 0,25

G3.0@F127

83,25

54,07

35,16 ± 0,32

7,74 ± 0,34

Bảng 3.24. Kết quả dẫn truyền 3TC

Hệ

DLE %

DLC %

mT-BD - mg

mT-TD - mg

G3.0@mPEG

68,52

44,58

58,49 ± 1,54

9,53 ± 1,46

G3.0@F127

70,15

24,58

64,44 ± 0,56

12,06 ± 1,38

Bảng 3.25. Kết quả dẫn truyền TDF

Hệ

DLE %

DLC %

mT-BD - mg

mT-TD - mg

G3.0@mPEG

82,36

23,83

72,81 ± 1,73

13,86 ± 1,01

G3.0@F127

80,30

11,80

84,51 ± 0,89

14,78 ± 1,17

Bảng 3.26. Kết quả dẫn truyền RTV

84.51

72.81

64.44

58.49

35.16

34.37

% E L D

32.84

32.01

3TC

AZT

TDF

RTV

G30@mPEG

G3.0@F127

14.78

13.86

12.06

9.53

7.74

7.36

7.31

7.18

% C L D

3TC

AZT

TDF

RTV

G3.0@mPEG

G3.0@F127

Hình 3.19. Phần trăm hiệu suất dẫn truyền (% DLE) của ARV

Hình 3.20. Phần trăm khả năng dẫn truyền (% DLC) của ARV

Từ kết Bảng 3.23 đến Bảng 3.26, Hình 3.19 và Hình 3.20 cho thấy:

Đối với AZT, 3TC: Lượng hoạt chất AZT và 3TC trên hệ dẫn truyền thuốc

ARV@G3.0@mPEG là 7,18 % và 7,31 %; trên hệ dẫn truyền thuốc ARV@G3.0@F127

là 7,36 % và 7,74 %. Có thể thấy rằng khả năng dẫn truyền của 2 hoạt chất AZT và 3TC

không có sự khác biệt đáng kể trên 2 hệ. Khi đóng gói hoạt chất AZT, 3TC với hệ

G3.0@mPEG và G3.0@F127 sẽ có tương tác ưa nước của hoạt chất AZT và 3TC (cả

hai hoạt chất này đều tan tốt trong môi trường nước) với nhóm -NH-, -OH, …của phân

tử polyme [97] của 2 hệ. Lượng hoạt chất AZT và 3TC trong hệ G3.0@F127 cao hơn

hệ G3.0@mPEG khoảng 2 - 3 %.

Đối với TDF: Lượng hoạt chất TDF trên hệ G3.0@F127 là 12,06 % và hệ

G3.0@mPEG là 9,53 % là do TDF thuộc nhóm Hơi tan (Theo Dược điển Việt Nam V

quy định về độ tan), do vậy khả năng solvat hóa của TDF sẽ khó hơn so với AZT, 3TC

và khi đóng gói hoạt chất TDF với hệ G3.0@mPEG và G3.0@F127. Bên cạnh đó, hệ

G3.0@F127 trong cấu trúc của phân tử F127 có 2 nhóm ưa nước bên ngoài và nhóm kỵ

nước bên trong nên khả năng giữ hoạt chất TDF trên hệ G3.0@F127 cao hơn so với

G3.0@mPEG.

Đối với RTV: Lượng hoạt chất của RTV trên hệ G3.0@mPEG là 13,84 % và hệ

G3.0@F127 là 14,78 %: Theo Dược điển Việt Nam V quy định về độ tan thì hoạt chất

RTV thuộc nhóm Thực tế không tan (để hòa tan 1 g RTV cần 200 lít nước). Vì vậy,

trong quá trình dẫn truyền hóa RTV có sử dụng dung môi để trợ tan. Dung môi được

lựa chọn là ethanol, nồng độ bổ sung là 35 %, ethanol được lựa chọn trong dẫn truyền

RTV vào hệ vì RTV không tan trong nước nhưng ethanol tan trong nước, phân tử ethanol

có nhóm ethyl (-C2H5) không phân cực nên có thể hòa tan các chất không phân cực như

RTV và có nhóm hydroxyl (-OH) tạo thành liên kết hydrogen liên phân tử do vậy RTV

tan dễ dàng, với liên kết hydrogen và các tương tác kỵ nước của RTV với hệ G3.0@F127

giúp giữ RTV trong khoang trống của hệ G3.0@F127. Do vậy, lượng RTV hệ dẫn truyền

thuốc RTV@G3.0@F127 cao hơn hệ RTV@G3.0@mPEG.

Như vậy, qua kết dẫn truyền hoạt chất AZT, 3TC, TDF, RTV đơn trên 2 hệ nhận

thấy:

Lượng hoạt chất trong hệ dẫn truyền: RTV trong khoảng 13,84 % - 14,78 % > TDF

trong khoảng 9,53 % - 12,06 % > AZT trong khoảng 7,18 % - 7,31 % = 3TC trong

khoảng 7,36 % - 7,74 %.

Bản chất hệ: hệ dẫn truyền thuốc ARV@G3.0@F127 chứa nhiều thuốc hơn hệ dẫn

truyền thuốc ARV@G3.0@mPEG do hệ G3.0@F127 có liên hợp F127, trong cấu trúc

của phân tử F127 ngoài nhóm thân nước EO có 65 nhóm PO có tính kỵ nước nên các

tương tác kỵ nước của thuốc sẽ tương tác riêng với nhóm PO của F127 do vậy lượng

thuốc được đóng gói nhiều hơn trên hệ G3.0@F127

Tính chất của hoạt chất: hoạt chất có tính tan càng kém thì tỷ lệ hoạt chất được dẫn

truyền càng cao trên hệ G3.0@F127 do có tương tác kỵ nước giữa hoạt chất và hệ dẫn

truyền có chứa nhóm PO kỵ nước trong phân tử F127. Độ tan 3TC ≈ AZT >TDF >RTV

tương ứng với lượng hoạt chất được dẫn truyền trên hệ G3.0@F127 là 7,74 % ≈ 7,31 %

<12,06 % < 14,78 %. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây [106] thuốc

ARV càng kỵ nước càng có ái lực lớn hơn với lõi có thành phần kỵ nước của hệ dẫn

truyền. Do vậy, lượng thuốc được dẫn truyền vào hệ sẽ cao hơn

3.4.2. Kết quả dẫn truyền hóa hoạt chất kết hợp

Kết quả dẫn truyền hoạt chất kết hợp AZT, 3TC và TDF, RTV trên 2 hệ

G3.0@mPEG và G3.0@F127 được trình bày trong Bảng 3.27 đến Bảng 3.28. Đồ thị

biểu diễn phần trăm hiệu suất dẫn truyền và khả năng dẫn truyền trong Hình 3.21 và

Hình 3.22.

Hệ

AZT

3TC

DLE %

DLC %

DLE %

DLC %

G3.0@mPEG

20,04 ± 3,50

4,05 ±0,29

21,11 ± 1,75

4,22 ± 0,25

G3.0@F127

22,13 ± 3,26

4,17 ±0,20

22,19 ± 0,74

4,20 ±0,34

Bảng 3.27. Kết quả dẫn truyền kết hợp AZT, 3TC

Hệ

TDF

RTV

DLE %

DLC %

DLE %

DLC %

G3.0@mPEG

32,34 ±1,16

6,84 ± 0,39

39,81 ± 3,15

8,95 ± 1,61

G3.0@F127

35,96 ± 2,40

7,39 ± 0,49

50,17 ± 2,29

9,96 ± 1,25

53.86

39.81

35.96

32.34

% E L D

22.19

22.13

21.11

20.04

AZT

3TC

TDF

RTV

G3.0@mPEG

G3.0@F127

Bảng 3.28. Kết quả dẫn truyền kết hợp TDF, RTV

Hình 3.21. Phần trăm hiệu suất dẫn truyền kết hợp (% DLE) của ARV

10.69

8.95

7.39

6.84

% C L D

4.22

4.200

4.17

4.05

AZT

3TC

TDF

RTV

G3.0@mPEG

G3.0@F127

Hình 3.22. Phần trăm khả năng dẫn truyền kết hợp (% DLE) của ARV

Từ kết quả Bảng 3.27, Bảng 3.28, Hình 3.21, Hình 3.22 cho thấy:

Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT và 3TC: Lượng hoạt chất AZT và 3TC trên hệ

G3.0@mPEG là 4,05 % và 4,17 %; trên hệ G3.0@F127 là 4,22 % và 4,20 %. Có thể

thấy rằng khả dẫn truyền kết hợp 2 hoạt chất AZT và 3TC không có sự khác biệt đáng

kể trên 2 hệ. So với khả năng dẫn truyền đơn của AZT (7,36 % - 7,74 %) và 3TC (7,18

% - 7,31 %) thì thấp hơn. Tuy nhiên, tổng lượng thuốc AZT và 3TC được dẫn truyền

trên 2 hệ dẫn truyền G3.0@F127 và G3.0@mPEG lại cao hơn so với dẫn truyền đơn

(cao hơn khoảng 1 %).

Hệ dẫn truyền thuốc TDF và RTV: Lượng hoạt chất TDF và RTV trên hệ

G3.0@mPEG là 6,84 % và 8,95 %; trên hệ G3.0@F127 là 7,39 % và 10,69 %. Có thể

thấy rằng khả năng dẫn truyền kết hợp 2 hoạt chất TDF và RTV của hệ G3.0@F127 cao

hơn hệ G3.0@mPEG. So với khả năng dẫn truyền đơn của TDF (9,53 % - 13,86 %) và

RTV (12,06 % - 14,78 %) thì thấp hơn. Tuy nhiên, tổng lượng thuốc TDF và RTV được

dẫn truyền trên 2 hệ G3.0@mPEG (15,79 %) và G3.0@F127 (18,08 %) cao hơn so với

dẫn truyền đơn

Sử dụng hệ G3.0@F127 dẫn truyền hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV hiệu quả

hơn hệ G3.0@mPEG đặc biệt với các chất ít tan như TDF, RTV

Kết quả cho thấy có thể dẫn truyền phối hợp AZT và 3TC, TDF và RTV vào

G3.0@F127

3.5. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG HOẠT CHẤT

3.5.1. Kết quả giải phóng hoạt chất trên hệ dẫn truyền thuốc đơn

Kết quả giải phóng hoạt chất trên hệ dẫn truyền thuốc đơn được trình bày trong

Bảng 3.29 đến Bảng 3.32, đồ thị biểu diễn phần trăm thuốc phóng thích trong Hình 3.23

và Hình 3.24.

Bảng 3.29. Kết quả giải phóng hoạt chất AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền thuốc đơn

Thời gian

pH 1,2 (%)

pH 4,5 (%)

pH 6,8 (%)

pH 7,4 (%)

3TC

AZT

3TC

AZT

–giờ

AZT

3TC

AZT

3TC

21,03

24,81

20,94

22,80

20,01

18,53

17,4

14,7

36,43

36,68

37,51

36,10

40,45

34,70

35,6

28,4

49,46

45,33

51,88

43,51

46,47

43,94

49,0

39,0

57,55

59,76

60,06

57,86

55,94

55,20

58,0

46,6

64,38

71,15

70,70

67,20

64,88

62,26

67,0

55,5

78,86

81,49

82,53

76,02

75,80

75,32

79,5

63,1

89,79

94,54

91,79

92,41

83,80

84,19

84,3

74,9

94,62

90,60

92,0

86,0

ARV@G3.0@mPEG

Bảng 3.30. Kết quả giải phóng hoạt chất TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc đơn

Thời gian

pH 1,2 (%)

pH 4,5 (%)

pH 6,8 (%)

pH 7,4 (%)

RTV

TDF

RTV

TDF

–giờ

TDF

RTV

TDF

RTV

12,51

17,72

20,31

21,82

14,51

14,30

18,3

12,70

19,56

27,40

27,97

30,48

20,03

19,64

29,9

21,27

34,22

34,97

35,79

37,28

28,25

28,57

37,2

30,25

44,66

47,01

44,70

47,52

38,12

38,45

43,2

37,72

59,73

55,29

58,45

68,98

46,53

46,97

53,5

43,73

71,60

60,43

75,60

75,44

50,83

58,3

54,22

78,28

82,60

84,18

84,87

60,53

61,20

69,4

58,85

88,39

90,86

94,89

89,52

74,51

67,21

77,42

63,38

93,40

75,15

85,19

70,09

88,07

74,53

86,37

ARV@G3.0@mPEG

Hình 3.23. Đồ thị biểu diễn % 3TC (A), % AZT (B), % TDF (C) và % RTV (D) giải

phóng trong hệ dẫn truyền thuốc đơn ARV@G3.0@mPEG

Bảng 3.31. Kết quả giải phóng hoạt chất AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền thuốc đơn

Thời gian

pH 1,2 (%)

pH 4,5 (%)

pH 6,8 (%)

pH 7,4 (%)

–giờ

AZT

3TC

AZT

3TC

AZT

3TC

AZT

3TC

21,71

19,31

15,34

18,51

19,58

14,69

17,59

14,17

35,88

35,82

32,63

35,66

36,76

33,31

35,00

27,86

41,66

48,63

41,09

46,10

42,28

42,60

39,63

38,25

55,41

56,41

56,90

55,85

54,93

53,81

47,29

45,87

64,21

67,68

66,77

67,42

63,79

59,73

58,04

54,41

75,82

81,81

76,49

75,30

73,03

71,37

69,39

62,02

86,77

86,85

90,01

87,35

82,02

78,84

78,20

68,77

88,96

88,00

82,29

72,88

89,61

86,26

Bảng 3.32. Kết quả giải phóng hoạt chất TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc đơn

ARV@G3.0@F127

Thời gian

pH 1,2 (%)

pH 4,5 (%)

pH 6,8 (%)

pH 7,4 (%)

–giờ

TDF

RTV

TDF

RTV

TDF

RTV

TDF

RTV

17,05

10,36

14,07

12,38

14,30

10,55

12,70

7,08

ARV@G3.0@F127

27,69

20,14

21,42

19,29

19,64

17,49

21,27

16,26

35,29

27,73

30,64

28,81

28,57

24,40

30,25

21,25

48,27

35,36

37,63

35,65

38,45

32,25

37,72

23,96

55,88

44,21

47,69

41,71

46,97

39,73

43,73

27,17

60,92

57,82

54,43

48,57

50,83

44,08

54,22

31,80

69,96

65,00

63,69

57,48

61,20

50,21

58,85

39,49

83,41

71,88

69,31

63,89

67,21

52,72

63,38

45,05

91,55

81,09

79,59

70,58

75,15

59,25

70,09

52,52

89,89

88,00

78,96

88,07

64,53

74,53

61,40

88,62

78,28

86,37

71,86

86,19

79,78

86,11

Hình 3.24. Đồ thị biểu diễn % 3TC (E), % AZT (F), % TDF (G) và % RTV (H) giải

phóng trong hệ dẫn truyền thuốc đơn ARV@G3.0@F127

Từ kết quả Bảng 3.29 đến Bảng 3.32 và Hình 3.23, Hình 3.24 cho thấy:

Môi trường: thực hiện giải phóng hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV trong 4 môi

trường là dung dịch pH 1,2 (dung dịch HCl 0,1 N); dung dịch đệm acetat pH 4,5; dung

dịch đệm phosphat pH 6,8 và dung dịch đệm PBS pH 7,4. Quá trình giải phóng hoạt

chất được dừng lại khi có ít nhất một điểm đạt trên 85 % lượng hoạt chất được giải

phóng và số điểm lấy mẫu phân bố đều trong thời gian này.

Môi trường pH 1,2 và pH 4,5: Môi trường pH 1,2 có tính acid, có nhiều ion H+,

dendrimer PAMAM G3.0 có 32 nhóm amin bề mặt, sau khi biến tính với mPEG và F127

tỷ lệ 1:16, bề mặt của dendrimer PAMAM G3.0@mPEG và G3.0@F127 vẫn còn nhiều

+, các nhóm NH3

nhóm amin chưa liên hợp nên chúng sẽ lấy ion H+ tạo thành NH3

dương điện này sẽ đẩy nhau làm cho phân tử dendrimer có cấu trúc mở nhất trong 4 môi

trường. Kết quả, lượng hoạt chất được giải phóng nhanh hơn các môi trường còn lại.

Với môi trường pH 4,5 vẫn còn tính acid nên chất mang dendrimer PAMAM

G3.0@mPEG và G3.0@F127 vẫn ở dạng cấu trúc mở, tuy nhiên mức độ mở không bằng

môi trường pH 1,2 nên lượng hoạt chất giải phóng ra có phần chậm hơn so với môi

trường pH 1,2.

Môi trường pH 6,8 và pH 7,4: Môi trường pH 6,8, các nhóm bề mặt của hệ

G3.0@mPEG và G3.0@F127 không còn đẩy nhau do không xuất hiện các nhóm dương

điện mà có sự cân bằng về điện tích do vậy quá trình giải phóng hoạt chất chậm lại và

chậm nhất là môi trường pH 7,4, lúc này do môi trường có tính kiềm làm cho cấu trúc

hệ G3.0@mPEG và G3.0@F127 co lại có dạng túi chặt giữ hoạt chất bên trong nên quá

trình giải phóng hoạt chất kéo dài.

Hoạt chất: AZT và 3TC trong 2 hệ dẫn truyền ARV@G3.0@mPEG và

ARV@G3.0@F127 có tỷ lệ phóng thích hoạt chất là như nhau, phóng thích ≥ 85,0 % ở

pH 1,2 và pH 4,5 sau 13 giờ, ở pH 6,8 và pH 7,4 sau 15 giờ. Với TDF và RTV trong hệ

dẫn truyền thuốc ARV@G3.0@mPEG phóng thích ≥ 85,0 % ở pH 1,2 và pH 4,5 sau 15

giờ. Với hệ dẫn truyền thuốc ARV@G3.0@F127 của TDF và RTV có sự khác khá rõ

với hệ dẫn truyền thuốc ARV@G3.0@mPEG. Cụ thể, TDF phóng thích ≥ 85,0 % ở pH

1,2, pH 4,5, pH 6,8 và pH 7,4 lần lượt là 17, 19, 19 và 21 giờ; với RTV lần lượt là 19,

21, 23, 25 giờ. Có sự khác biệt này là do:

+ Bản chất của môi trường hòa tan: môi trường acid pH 1,2 và pH 4,5 cấu trúc hệ

dẫn truyền có dạng mở nhất, hoạt chất phóng thích dễ dàng hơn. Môi trường pH 6,8 và

pH 7,4, cấu trúc hệ dẫn truyền có dạng túi chặt, hoạt chất phóng thích khó hơn.

+ Bản chất chất mang: mPEG là polyme ưa nước, thành phần cấu trúc có nhóm ưa

nước; F127 trong cấu trúc vừa có nhóm ưa nước, vừa có nhóm kỵ nước nên giữa phân

tử F127 và thuốc có tương tác kỵ nước vì vậy thuốc bị giữ chặt hơn.

+ Phân tử lượng của hoạt chất: Khối lượng phân tử của 3TC là 229,26 gmol-1 <

AZT 267,24 gmol-1 < TDF 635,51 gmol-1 < RTV 720,94 gmol-1. Khối lượng phân tử

càng lớn, cồng kềnh càng khó phóng thích.

+ Sự phân cực của hoạt chất: căn cứ biểu thị Độ tan trong nước của DĐVN V AZT

≈ 3TC:Tan > TDF: Ít tan > RTV: Không tan. Khả năng sovat hóa càng kém càng khó

phóng thích hoạt chất ra bên ngoài.

3.5.2. Kết quả giải phóng hoạt chất trên hệ dẫn truyền thuốc kết hợp

Kết quả giải phóng hoạt chất trên hệ dẫn truyền thuốc kết hợp được trình bày

trong Bảng 3.33 đến Bảng 3.36, đồ thị biểu diễn phần trăm thuốc phóng thích trong Hình

3.25 và Hình 3.26.

Bảng 3.33. Kết quả giải phóng AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT-

Thời gian

pH 1,2 (%)

pH 4,5 (%)

pH 6,8 (%)

pH 7,4 (%)

–giờ

AZT

3TC

AZT

3TC

AZT

3TC

27,45

31,96

26,71

23,82

26,45

23,08

24,68

30,19

38,06

40,39

36,86

34,56

35,26

39,95

42,19

39,46

48,06

49,43

42,05

40,99

44,24

47,44

51,96

51,55

62,79

62,31

56,11

52,68

59,71

56,03

59,59

60,25

75,97

75,55

73,86

62,67

65,90

64,61

68,81

73,59

83,20

84,41

84,66

71,71

76,61

77,68

76,95

84,36

97,37

99,84

90,15

80,84

84,73

82,64

83,58

92,66

88,21

90,82

87,37

89,81

3TC@G3.0@mPEG

Bảng 3.34. Kết quả giải phóng TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF-

Thời gian

pH 1,2 (%)

pH 4,5 (%)

pH 6,8 (%)

pH 7,4 (%)

–giờ

TDF

RTV

TDF

RTV

TDF

RTV

24,56

23,03

20,22

21,39

21,08

19,63

17,38

22,71

34,09

30,70

29,50

29,48

27,73

28,33

26,59

30,12

40,72

39,27

38,05

36,90

34,07

34,53

35,59

37,54

49,13

47,07

46,22

45,83

47,81

40,43

42,25

45,77

59,52

58,09

56,75

55,49

52,36

46,59

50,39

54,23

66,97

69,43

64,83

65,90

65,48

55,07

55,81

67,88

78,07

76,87

77,74

71,47

69,82

68,90

64,51

77,82

RTV@G3.0@mPEG

93,64

87,86

88,06

86,46

82,01

79,65

81,93

72,46

90,54

86,53

85,77

79,92

86,47

Hình 3.25. Đồ thị biểu diễn % AZT (I), % 3TC (J), % TDF (K) và % RTV (L) giải

phóng trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp ARV@G3.0@PEG

Bảng 3.35. Kết quả giải phóng AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT,

Thời gian

pH 1,2 (%)

pH 4,5 (%)

pH 6,8 (%)

pH 7,4 (%)

AZT

3TC

AZT

3TC

AZT

3TC

AZT

3TC

–giờ

23,87

26,06

24,86

25,36

22,24

23,61

22,04

23,61

33,06

35,52

31,98

34,71

31,95

34,67

32,64

34,67

41,67

43,82

43,13

44,78

39,53

41,30

35,72

41,30

54,32

59,03

52,22

55,05

52,35

51,64

51,24

51,64

65,45

69,72

63,70

69,21

62,80

59,66

60,08

59,66

74,63

78,57

72,77

77,85

67,52

68,29

69,92

68,29

90,17

95,66

89,23

91,72

77,90

77,74

76,29

77,74

87,85

89,76

85,34

89,76

3TC@G3.0@F127

Bảng 3.36. Kết quả giải phóng TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF,

Thời gian

pH 1,2 (%)

pH 4,5 (%)

pH 6,8 (%)

pH 7,4 (%)

TDF

RTV

TDF

–giờ

TDF

RTV

TDF

RTV

21,33

19,30

20,71

19,18

17,77

19,55

18,08

18,40

30,01

27,08

26,59

27,36

26,56

25,76

28,34

26,69

37,69

36,09

36,96

32,49

34,27

37,08

36,08

29,56

44,68

43,21

44,87

40,48

41,77

42,64

40,76

37,01

59,20

55,98

54,19

51,38

50,72

52,20

47,15

44,85

68,30

66,44

61,61

61,04

58,56

58,01

53,72

55,44

75,76

72,89

71,72

66,28

64,69

64,44

57,28

64,04

83,08

80,43

76,27

78,00

72,04

73,18

66,88

72,43

89,91

87,36

82,12

84,81

79,64

82,16

72,04

82,35

90,87

92,05

84,07

90,67

80,55

87,27

88,95

86,04

RTV@G3.0@F127

Hình 3.26. Đồ thị biểu diễn % AZT (M), % 3TC (N), % TDF (O) và % RTV (P) giải

phóng trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp ARV@G3.0@F127

Từ kết quả Bảng 3.33 đến Bảng 3.36, Hình 3.25, Hình 3.26 cho thấy:

Môi trường pH 1,2 và pH 4,5:

Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, 3TC@G3.0@mPEG có tốc độ phóng thích hoạt

chất khá đồng đều: môi trường pH 1,2 đạt 97,37 % (AZT) và 99,84 % (3TC) sau 13 giờ;

môi trường pH 4,5 đạt 90,15 % (AZT) và 92,66 % (3TC) sau 13 giờ, điều này được giải

thích có thể do cả hai thuốc đều là thuốc dễ tan trong nước.

Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, 3TC@G3.0@F127 có tốc độ phóng thích hoạt

chất tương tự hệ dẫn truyền thuốc AZT, 3TC@G3.0@mPEG: môi trường pH 1,2 đạt

97,37 % (AZT) và 99,84 % (3TC); môi trường pH 4,5 đạt 90,17 % (AZT) và 95,66 %

(3TC) sau 13 giờ.

Không có sự khác biệt giữa 2 hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT,

3TC@G3.0@mPEG và AZT, 3TC@G3.0@F127 do đều có tương tác ưa nước của hoạt

chất AZT và 3TC (cả hai hoạt chất này đều tan tốt trong môi trường nước) với nhóm -

NH-, -OH, …của phân tử polyme [98] của hệ dẫn truyền.

Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@mPEG có tốc độ phóng thích

hoạt chất chậm thơn so với hệ AZT, 3TC@G3.0@mPEG; cụ thể môi trường pH 1,2 đạt

93,64 % (TDF) và 87,86 % (RTV) sau 15 giờ; môi trường pH 4,5 đạt 88,06 % (TDF) và

86,46 % (RTV) sau 15 giờ điều này được giải thích do thuốc TDF và RTV xếp nhóm ít

tan (TDF) và gần như không tan (RTV).

Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@F127 có tốc độ phóng thích hoạt

chất chậm thơn so với hệ TDF, RTV@G3.0@mPEG; cụ thể môi trường pH 1,2 đạt

89,91 % (TDF) và 87,36 % (RTV) sau 17 giờ; điều này được giải thích do thuốc TDF

và RTV thuộc nhóm ít tan (TDF) và gần như không tan (RTV) nên sẽ có các tương tác

kỵ nước trong cấu trúc của phân tử F127 với thuốc [106], kết quả thuốc được giữ chặt

hơn nên tốc độ phóng thích chậm hơn.

Môi trường pH 6,8 và pH 7,4

Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, 3TC@G3.0@mPEG có tốc độ phóng thích

hoạt chất khá đồng đều: môi trường pH 6,8 đạt 88,21 % (AZT) và 90,82 % (3TC) sau

15 giờ; môi trường pH 7,4 đạt 87,37 % (AZT) và 89,81 % (3TC) sau 15 giờ, so với môi

trường pH 1,2 và pH 4,5 thì tốc độ phóng thích của AZT và 3TC chậm hơn 2 giờ.

Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@mPEG có tốc độ phóng thích

hoạt chất chậm thơn so với hệ AZT, 3TC@G3.0@mPEG; cụ thể môi trường pH 6,8 đạt

90,54 % (TDF) và 86,53 % (RTV) sau 17 giờ.

Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, 3TC@G3.0@F127: môi trường pH 6,8 đạt

87,85 % (AZT) và 89,76 % (3TC) sau 15 giờ; môi trường pH 7,4 đạt 85,34 % (AZT) và

89,76 % (3TC) sau 15 giờ, so với môi trường pH 1,2 và pH 4,5 thì tốc độ phóng thích

của AZT và 3TC chậm hơn 2 giờ.

Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@F127 có tốc độ phóng thích

hoạt chất chậm thơn so với hệ TDF, RTV@ G3.0@mPEG; cụ thể môi trường pH 6,8

đạt 90,05 % (TDF) sau 19 giờ và 88,95 % (RTV) sau 21 giờ; môi trường pH 7,4 đạt

90,67 % (TDF) sau 19 giờ và 86,04 % (RTV) sau 21 giờ.

So với kết quả phóng thích hoạt chất trong hệ dẫn truyền đơn Bảng 3.37. cho

thấy:

Môi trường pH 1,2 và pH 4,5 của hệ dẫn truyền đơn AZT@G3.0@mPEG,

3TC@G3.0@mPEG, AZT@G3.0@F127, 3TC@G3.0@F127 và hệ dẫn truyền kết hợp

AZT, 3TC@G3.0@mPEG là tương đương nhau, phóng thích ≥ 85,0 % hoạt chất sau 13

giờ và ở môi trường pH 6,8 và pH 7,4 là 15 giờ. Tương tự cho hệ TDF@G3.0@mPEG,

RTV@G3.0@mPEG, TDF,RTV@G3.0@mPEG sau 15 giờ phóng thích ≥ 85,0 % ở pH

1,2 và pH 4,5 và 17 giờ TDF, RTV@G3.0@F127 so với hệ dẫn truyền đơn

RTV@G3.0@F127 ở pH 1,2 và pH 4,5 lần lượt là 19 giờ và 21 giờ, kết quả cho thấy

tốc độ phóng thích của TDF ít thay đổi trong hệ đơn và hệ phối hợp. Tuy nhiên, với

RTV phóng thích nhanh hơn trong hệ kết hợp với TDF, do có sự hiện diện của TDF kéo

theo RTV (thuốc kém tan hơn) phóng thích nhanh hơn [107] so với khi chỉ có RTV

trong hệ dẫn truyền đơn.

Kết quả này lặp lại tương tự với hệ kết hợp TDF, RTV@G3.0@F127 so với hệ dẫn

truyền đơn TDF@G3.0@F127 và RTV@G3.0@F127 ở pH 6,8 và pH 7,4. Cụ thể pH

7,4 hệ TDF@G3.0@F127 là 21 giờ; hệ RTV@G3.0@F127 là 25 giờ; hệ TDF,

RTV@G3.0@F127 là 19 giờ (TDF) và 21 giờ (RTV).

Hệ dẫn truyền

Thời gian (giờ) phóng thích ≥ 85,0 % hoạt chất

pH 1,2

pH 4,5

pH 6,8

pH 7,4

AZT@G3.0@mPEG

.13

3TC@G3.0@mPEG

TDF@G3.0@mPEG

RTV@G3.0@mPEG

Bảng 3.37. Thời gian phóng thích ARV hệ dẫn truyền đơn và hệ dẫn truyền kết hợp

AZT@G3.0@F127

3TC@G3.0@F127

TDF@G3.0@F127

RTV@G3.0@F127

AZT, 3TC@G3.0@mPEG

TDF, RTV@G3.0@mPEG

17-TDF

19-RTV

AZT, 3TC@G3.0@F127

TDF, RTV@G3.0@F127

19-TDF

21-RTV

3.6. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

3.6.1. Kết quả thử độc tính tế bào

Nồng độ

Tỷ lệ tế bào sống (%)

ppm

G3.0

G3.0@F127

G3.0@mPEG

101,20 ± 3,24

105,80 ± 2,60

98,00 ± 2,32

94,70 ± 1,64

82,30 ± 1,64

70,60 ± 2,22

101,60 ± 3,37

97,60 ± 0,85

100

48,30 ± 5,5

96,40 ± 2,73

99,30 ± 0,06

200

39,90 ± 2,63

95,80 ± 0,66

97,40 ± 0,93

400

26,10 ± 1,31

86,50 ± 2,05

90,90 ± 0,97

800

6,60 ± 4,66

81,10 ± 1,04

86,50 ± 0,94

Bảng 3.38. Kết quả tỷ lệ tế bào sống trên hệ G3.0, G3.0@mPEG và G3.0@F127

100

G3.0 G3.0@mPEG G3.0@F127

Hình 3.27. Kết quả về cảm ứng chết của tế bào trên dendrimer G3.0, G3.0@mPEG và

G3.0@F127

Tỷ lệ tế bào sống (%)

3TC@G3.0

RTV@G3.0@F

TDF@G3.0@

TDF-

3TC@G3.0@

Nồng độ

@mPEG

127

F127

RTV@G3.0@

mPEG

F127

ppm

99,70 ± 2,38

103,30 ± 3,12

102,9 ± 3,17

98,80 ± 4,73

102,40 ± 2,29

99,70 ± 1,99

102,70 ± 2,88

102,10 ± 2,98

102,60 ± 2,37

102,80 ± 4,47

100

102,40 ± 0,14

101,50 ± 2,75

97,60 ± 1,30

100,20 ± 4,42

101,90 ± 2,50

200

93,80 ± 1,34

85,10 ± 1,41

93,30 ± 0,86

94,00 ± 1,41

95,30 ± 0,82

400

91,10 ± 0,99

76,10 ± 0,63

87,60 ± 0,58

85,90 ± 0,42

91,10 ± 1,15

800

87,40 ± 1,33

70,90 ± 0,86

79,60 ± 0,97

80,40 ± 1,30

84,10 ± 1,17

Bảng 3.39. Kết quả tỷ lệ tế bào sống trên các hệ dẫn truyền thuốc đơn và kết hợp

101

3TC@G3.0@mPEG RTV@G3.0@F127 DF-RTV@G3.0@F127 AZT@G3.0@F127 TDF@G3.0@F127

Hình 3.28. Kết quả về cảm ứng chết của tế bào trên hệ dẫn truyền thuốc đơn và kết

120

100

)

(

g n ố s o à b ế T

100

200

400

800

Nồng độ (ppm)

3TC@G3.0 @mPEG

RTV@G3.0@F127

TDF@G3.0@F127

TDF-RTV@G3.0@F127

3TC@G3.0@mPEG

hợp ARV@G3.0@F127, ARV@G3.0@mPEG

Hình 3.299. Biểu đồ cảm ứng chết của tế bào trên hệ dẫn truyền thuốc đơn và kết hợp

Từ kết quả Tỷ lệ tế bào sống Bảng 3.38, Bảng 3.39 cho thấy:

102

Tỷ lệ sống sót của tế bào giảm từ 101 % xuống 6,6 %, khi nồng độ G3.0 trong môi

trường nuôi cấy tăng từ 0 đến 800 ppm. Sau khi biến tính bề mặt G3.0 với F127 hoặc

PEG, tỷ lệ sống của nguyên bào sợi được cải thiện đáng kể. Ở nồng độ 800 ppm (nồng

độ cao nhất trong thử nghiệm), trên 80 % nguyên bào sợi sống sót so sánh với mẫu

chứng. Theo ISO 10993-5:1999 hay tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam TCVN 7391-5:2005

về tính an toàn của vật liệu trong y tế, có thể kết luận vật liệu G30@F127 và

G3.0@mPEG có tính tương hợp sinh học cao, và vật liệu có tiềm năng ứng dụng trong

lĩnh vực dược phẩm.

Đối với các mẫu được dẫn truyền hóa thuốc, ở nồng độ thử nghiệm dưới 200 ppm,

phần trăm nguyên bào sợi sống sót đều trên 80 %. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ, sức sống

của nguyên bào sợi giảm dần. Đặc biệt với mẫu mang thuốc RTV, tỷ lệ sống của tế bào

giảm còn 70 % ở nồng độ 800 ppm. Dựa trên kết quả khảo sát độc tính chất mang, có

thể kết luận nguyên nhân gây chết tế bào là do thuốc mang trong hệ.

Từ kết quả về cảm ứng chết của tế bào Hình 3.27 và Hình 3.28 nhận thấy:

Dựa trên kết quả về độc tính, để kiểm tra tính an toàn của sản phẩm sau dẫn truyền

hóa thuốc ARV đơn và ARV phối hợp, phương pháp nhuộm kép AO/PI được sử dụng.

Theo kết quả trên hình, nguyên bào sợi sau 24 giờ được ủ G3.0, chất nhuộm PI đi

vào tế bào, cường độ tín hiệu huỳnh quang mạnh, chứng tỏ tế bào đang trong quá trình

chết. Kết quả này phù hợp với kết quả MTT.

Đối với các mẫu biến tính, G3.0@mPEG và G3.0@F127, nguyên bào sợi bắt màu

xanh, cường độ của bước sóng 700 nm không ghi nhận được. Ở trường hợp sử dụng 2

bước sóng đồng thời 525 nm/700 nm, tín hiệu huỳnh quang ở 525 nm (màu xanh) át

hoàn toàn, chứng tỏ tế bào sống và khỏe mạnh trong điều kiện môi trường nuôi cấy có

bổ sung G3.0@mPEG hoặc G3.0@F127. Nói cách khác, độc tính của G3.0 được loại

bỏ sau khi biến tính bề mặt.

Bên cạnh đó, đánh giá về độc tính của hệ chất mang thuốc: Tất cả các mẫu nguyên

bào khi ủ với mẫu mang thuốc, nguyên bào sợi phát triển theo đúng hình thái học của

chúng, không có sự biến đổi về nhân. Thêm vào đó, mật độ tế bào bắt huỳnh quang của

AO trội hơn hẳn so với PI, do đó có thể kết luận, các thuốc được mang trong hệ

G3.0@PEG và G3.0@F127 không gây ảnh hưởng đến tế bào lành.

3.6.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế pepsin

Bảng 3.40. Kết quả thử hoạt tính ức chế của ARV chuẩn đối với pepsin

103

AZT

3TC

TDF

RTV

Nồng độ

% hoạt độ

Nồng độ

% hoạt độ

Nồng độ

% hoạt độ

Nồng độ

% hoạt độ

(mM)

còn lại

(mM)

còn lại

(mM)

còn lại

(mM)

còn lại

0,0000

100,00

0,0000

100,00

0,0000

100,00

0,0000

100,00

0,0377

92,95

0,0439

96,10

0,0159

99,80

0,0141

85,61

± 0,16

± 0,87

± 0,20

± 0,35

0,0754

88,15

0,0878

95,71

0,0318

98,54

0,0282

78,50

± 0,04

± 0,15

± 0,07

± 0,91

0,1130

82,96

0,1318

95,75

0,0477

98,90

0,0423

65,32

± 0,10

± 0,17

± 0,38

± 0,96

0,1507

75,48

0,1757

95,77

0,0636

97,66

0,0564

53,11

± 0,22

± 0,05

± 0,06

± 1,29

0,1884

68,76

0,2196

98,61

0,0795

99,70

0,0705

41,60

± 0,20

± 0,49

± 0,43

± 0,57

0,2261

63,68

0,2635

99,01

0,0954

98,66

0,0845

28,49

± 0,04

± 0,08

± 0,05

± 0,50

0,2638

60,91

±0,20

0,3014

59,55

± 0,29

0,3391

58,74

± 0,18

AZT@G3.0@mPEG

3TC@G3.0@mPEG

TDF@G3.0@mPEG

RTV@G3.0@mPEG

Nồng độ

% hoạt độ

Nồng độ

% hoạt độ

Nồng độ

% hoạt độ

Nồng độ

% hoạt độ

(mM)

còn lại

(mM)

còn lại

(mM)

còn lại

(mM)

còn lại

100,00

0,0000

100,00

0,0000

100,00

0,0000

100,00

0,0379

93,93

0,0447

98,27

0,0157

99,17

0,0139

87,14

± 0,11

± 0,48

± 0,25

± 1,12

0,0758

88,59

0,0893

99,04

0,0313

99,72

0,0277

80,15

± 0,25

± 0,53

± 0,07

± 1,10

0,1137

85,57

0,1340

98,82

0,0470

98,51

0,0416

65,86

± 0,02

± 1,02

± 0,06

± 0,66

0,1516

77,68

0,1787

97,23

0,0627

98,20

0,0555

56,28

± 0,67

± 1,24

± 0,06

± 0,68

0,1895

74,25

0,2233

99,37

0,0783

99,98

0,0694

44,89

Bảng 3.41. Kết quả thử hoạt tính ức chế của ARV@G3.0@mPEG đối với pepsin

104

± 0,34

± 0,37

± 1,48

± 0,71

0,2274

67,23

0,2680

97,22

0,0940

98,36

0,0832

39,29

± 0,12

± 0,31

± 0,75

± 0,22

0,2653

62,65

± 0,11

0,3032

61,23

± 0,08

0,3411

60,42

± 0,08

Hình 3.30. Đồ thị biểu diễn hoạt tính ức chế của ARV đối với pepsin

Từ kết quả thử nghiệm khả năng ức chế pepsin theo phương pháp Anson cải tiến

của các ARV nhận thấy:

- Hoạt tính ức chế pepsin giữa của các hoạt chất khi chưa dẫn truyền và sau khi

dẫn truyền là tương đương nhau, sau dẫn truyền hoạt chất vẫn giữ được hoạt tính

ức chế pepsin được thể hiện thông qua phần trăm hoạt độ còn lại là như nhau.

- AZT: AZT thuộc nhóm thuốc ức chế enzym sao chép ngược tương tự nucleosid

và nucleotid (NRTI) nhưng vẫn có hoạt tính ức chế pepsin. Ở nồng độ 0,038 mM

AZT, phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là 92,62 % (ức chế khoảng 7 % hoạt

105

độ của pepsin) và ở nồng độ 0,226 mM AZT phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin

là 64,06 % (ức chế 36 % hoạt độ của pepsin). Điều này cho thấy, AZT tuy thuộc

nhóm NRTI nhưng vẫn có khả năng ức chế pepsin tuy nhiên khả năng ức chế

pepsin không mạnh do đặc tính này không điển hình của nhóm NRTI

- 3TC và TDF thuộc nhóm thuốc ức chế enzym sao chép ngược tương tự nucleosid

và nucleotid (NRTI). Ở nồng độ 0,264 mM đối với 3TC và 0,233 mM đối với

TDF, phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin lần lượt là 99,01 % và 98,59 %. Do

đó 3TC và TDF hoàn toàn không có hoạt tính ức chế pepsin.

- RTV thuộc nhóm thuốc ức chế men protease (PI). Ở nồng độ 0,014 mM RTV,

phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là 84,95 % (ức chế khoảng 15 % hoạt độ

của pepsin), ở nồng độ 0,056 mM RTV phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là

50,95 % (ức chế khoảng 50 % hoạt độ của pepsin) và ở nồng độ 0,085 mM RTV,

phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là 25,20 %. Điều này cho thấy, RTV có khả

năng ức chế pepsin mạnh hơn AZT. Kết quả nồng độ IC50 của RTV được dẫn

truyền hóa là 0,056 Mm

- Navia và cộng sự từ các phòng thí nghiệm Merck là nhóm đầu tiên có được cấu

trúc tinh thể của PR HIV [48]. Dựa trên sự hiện diện của trình tự acid amin đặc

trưng, Asp-Thr-Gly, nó được đề xuất bởi Toh et al. vào năm 1985 cho rằng

protease của HIV có thể thuộc về họ protease aspartic. Điều này đã được xác

nhận thông qua sự ức chế pepstatin A, một chất ức chế chọn lọc protease aspartic.

Vì trình tự protease của HIV không có nhiều hơn 99 acid amin và chỉ chứa một

của bộ ba bắt buộc Asp-Thr-Gly, người ta cho rằng dạng hoạt động của HIV

protease là một đồng phân tử (dạng dimer) của 198 acid amin. Giả thuyết này sau

đó đã được xác nhận bằng phương pháp xác định tinh thể học tia X [82].

- Protease của HIV-1 là một enzyme không thể thiếu trong chu trình sống của virus

HIV. Nó cắt các chuỗi poly peppeptide gag, gag-pol tại những vị trí đặc hiệu để

tạo thành các protein cấu trúc và enzym cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Nếu

protease HIV bị ức chế, các hạt virus vẫn nảy chồi từ màng tế bào, nhưng các

protein bên trong chúng không ở dạng trưởng thành và hoạt động, do đó virus

không lây nhiễm. Vì vậy, protease HIV-1 được xem như một trong các đích quan

trọng trong phát triển thuốc chống HIV thông qua khả năng ức chế enzym.

Protease HIV-1 thuộc họ protease aspartat, có dạng dimer và mang những đặc

106

điểm tương đồng với pepsin về cấu trúc cũng như cơ chế xúc tác. Các protease

HIV-1 và pepsin đều có trình tự nhận biết Asp-Thr-Gly. Nhìn chung, chúng có

cấu trúc bậc nhất tương tự nhau, đều bị ức chế bởi pepstatin A và bị bất hoạt khi

đột biến xảy ra ở vùng hoạt tính chứa Aso [108]. Do đó, pepsin có thể được dùng

như một enzym đích để sàng lọc các chất ức chế protease HIV-1[109], [110-111].

- Hệ sau dẫn truyền thuốc AZT, 3TC, TDF và RTV có hoạt tính ức chế pepsin

tương đương với hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV tinh khiết khi chưa dẫn

truyền

107

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Qua thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận án, chúng tôi đã đạt được những kết

quả sau:

1. Đã tổng hợp các chất mang dendrimer PAMAM đến thế hệ G3.0 từ lõi

ethylendiamin và mạch nhánh là methyl acrylat có khối lượng phân tử 6.962,5 g/ml bằng

phương pháp GPC so với khối lượng lý thuyết của G3.0 là 6.908,9 g/mol, với độ lệch là

0,78 %. Cấu trúc của sản phẩm được chứng minh bằng phương pháp FTIR, MS, 1H-

NMR, GPC và tính toán khối lượng phân tử trên cơ sở dữ liệu của phổ 1H-NMR, hình

thái và kích thước bằng TEM và DLS

2. Đã biến tính thành công dendrimer G3.0 với PEG 5.000 và pluronic F127 12.600

Da. Cấu trúc sản phẩm được chứng minh bằng FTIR, 1H-NMR, GPC

3. Đã xây dựng và thẩm định phương pháp theo ICH (Hội nghị quốc tế về hài hòa

hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người) xác định các hoạt chất AZT,

3TC, TDF và RTV đơn và xác định đồng thời AZT,3TC; TDF, RTV bằng phương pháp

HPLC - PDA

4. Đã dẫn truyền thành công các hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV lên hệ

G3.0@mPEG tạo các hệ dẫn truyền thuốc đơn ARV@G3.0@mPEG với khả năng dẫn

truyền thấp nhất là AZT (7,18 %), cao nhất RTV (13,86 %). Với hệ ARV@G3.0@F127

với khả năng dẫn truyền thấp nhất là AZT (7,36 %), cao nhất ARV (14,78 %). Sản phẩm

của hệ dẫn truyền đơn được kiểm tra bằng phổ FTIR và kích thước bằng DLS. Với hệ

dẫn truyền thuốc phối hợp, khả năng dẫn truyền của AZT, 3TC, TDF và RTV lần lượt

là 4,17 %, 4,20 %, 7,39 % và 9,96 % thấp hơn dẫn truyền đơn. Tuy nhiên, tổng lượng

thuốc được dẫn truyền cao hơn dẫn truyền đơn.

Sử dụng hệ G3.0@F127 dẫn truyền hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV hiệu quả

hơn hệ G3.0@mPEG đặc biệt với các chất ít tan như TDF, RTV

5. Đã khảo sát khả năng giải phóng các hoạt chất của AZT, 3TC, TDF và RTV khi

được dẫn truyền đơn và dẫn truyền kết hợp. Hệ dẫn truyền đơn ARV@G3.0@mPEG

giải phóng ≥ 85,0 % thấp nhất pH 1,2 (AZT, 13 giờ), cao nhất pH 7,4 (RTV, 21 giờ).

Hệ dẫn truyền đơn ARV@G3.0@F127 giải phóng ≥ 85,0 %, thấp nhất pH 1,2 (AZT, 13

giờ), cao nhất pH 7,4 (RTV, 25 giờ). Hệ dẫn truyền kết hợp AZT, 3TC@G3.0@F127

108

thấp nhất pH 1,2 (13 giờ); cao nhất pH 7,4 (15 giờ). Hệ TDF, RTV@G3.0F127, thấp

nhất pH 1,2 (17 giờ); cao nhất sau pH 7,4 (21 giờ)

6. Đã khảo sát độc tính của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0, G3.0@mPEG và

G3.0@F127 cho thấy: G3.0 gây độc tế bào, G3.0@mPEG và G3.0@F127 độc tính

không còn. Bên cạnh đó, đánh giá về độc tính của hệ chất mang thuốc các thuốc được

mang trong hệ G3.0@PEG và G3.0@F127 không gây ảnh hưởng đến tế bào lành.

7. Đã thử hoạt tính ức chế pepsin hệ sau dẫn truyền thuốc cho thấy: AZT có khả

năng ức chế pepsin tuy nhiên khả năng ức chế pepsin không mạnh do đặc tính này không

điển hình của nhóm NRTI; 3TC hoàn toàn không có hoạt tính ức chế pepsin, RTV có

khả năng ức chế pepsin mạnh hơn AZT. Kết quả nồng độ IC50 của RTV là 0,056 Mm

KIẾN NGHỊ

Trong thời gian tới, chúng tôi đề xuất một số kiến nghị sau:

Tiếp tục nghiên cứu in vivo trên hệ dẫn truyền thuốc ARV@G3.0@mPEG và

ARV@G3.0@F127 và thử độc tính tế bào với dòng tế bào đại thực bào hoặc tế bào miễn

dịch.

Nghiên cứu bào chế hạt nano kết hợp giữa lipid - polymer mang thuốc ARV (có

thể sử dụng polymer polyvinylpyrrolidon – PVP để bao thuốc RTV, bên ngoài là acid

béo stearic và poly ethylen glycol (PEG). Sản phẩm được đánh giá qua sự hấp thụ trên

tế bào thần kinh

Nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học, độ ổn định của hệ dẫn truyền thuốc

ARV@G3.0@mPEG và ARV@G3.0@F127

109

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Vu Minh Thanh, Thi Hiep Nguyen, Tuong Vi Chan, Uyen-Thi Phan Ngoc, Minh

Nhat Ho, Thi Thinh Nguyen, Yen Nguyen Tram Chau, Van Thu Le, Ngoc Quyen

Chan, Cuu Khoa Nguyen, Dai Hai Nguyen, Low systemic toxicity nanocarriers

fabricated from heparin-mPEG and PAMAM dendrimers for controlled drug

release. Materials Science & Engineering C, 82 (2018) 291-298, IF = 5,33

(Q1)

2. Nguyễn Thị Thịnh, Nguyễn Cửu Khoa, Thẩm định quy trình xác định đồng thời

Zidovudin và Lamivudin trên hệ chất mang nano dendrimer G3.0-

F127@AZT/3TC bằng phương pháp HPLC-PDA, Tạp chí Khoa học và Công

nghệ Việt Nam, 63 (5), 5.2021, 29-34

3. Thi Thinh Nguyen, Bao Phu Nguyen, Dinh Tien Dung Nguyen, Ngoc Hoi

Nguyen, Dai Hai Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Retrovirus Drugs-Loaded

PEGylated PAMAM for Prolonging Drug Release and Enhancing Efficiency in

HIV Treatment, Polymers, 2022, 14, 114, IF = 4,329 (Q1)

110

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Global HIV & AIDS statistics. AIDS Statistics - 2019

https://www.unaids.org/en/resources/fact (Truy cập ngày 15/12/2021)

2. Cục phòng, chống HIV/AIDS - Bộ Y tế. Dịch HIV/AIDS có gì thay đổi trong năm

2021. https://vaac.gov.vn/dich-hiv-aids-co-gi-thay-doi-trong-nam-2021.html (Truy

cập ngày 29/07/2022)

3. https://ykhoaphuocan.vn/thuvien/duoc-thu/Saquinavir (Truy cập ngày 29/07/2022)

4. Nguyễn Cửu Khoa (2015), Dendrimer Tổng hợp và ứng dụng trong Y – Dược, trang

54 - 235

5. Ning Li, Hao Cai, Lei Jiang, Jiani Hu, Ashika Bains, Jesse Hu, Qiyong Gong, Kui

Luo, and Zhongwei Gu, Enzyme-sensitive and amphiphilic PEGylated dendrimer-

paclitaxel prodrug-based nanoparticles for enhanced stability and anticancer

efficacy. ACS applied materials & interfaces, 2017. 9(8): p. 6865-6877.

6. https://healthvietnam.vn/thu-vien/tai-lieu-tieng-viet/vi-sinh-vat/virus-hiv-aids

(Truy cập ngày 29/07/2022).

7. Tế bào lympho TCD4 và bệnh HIV/AIDS. https://www.vinmec.com/vi/tin-

tuc/thong-tin-suc-khoe/suc-khoe-tong-quat/te-bao-lympho-tcd4-va-benh-hivaids

(Truy cập ngày 29/07/2022).

8. Cục phòng, chống HIV/AIDS (2016), Cẩm nang Hướng dẫn sử dụng thuốc điều trị

HIV/AIDS, trang 18 - 60.

9. Julie S. Eggleton; Shivaraj Nagalli, Highly active Antiretroviral Therapy (HAART)

(2022).

10. Bộ Y tế (2021), Quyết định 5968/QĐ-BYT ngày 31/12/2021 về việc ban hanh

Hướng dẫn điều trị và chăm sóc HIV/AIDS, Trang 34-47.

11. Allyne cristina Grando, Nilza Nascimento Guimaraes, Ana Paula de Souza,

Mauricio Lehmann, Kenya Silva Cunha, Rafael Rodrigues Dihl, Assessment of

complex genomic alterations induced by AZT, 3TC and the combination AZT+3TC.

Drug and chemical Toxicology (2020); 43(4).

12. Tung-Che Hung, Guan-Jhou Chen, Shu-Hsing Cheng, Jhen-Hong Chen, Jheng-Lun

Eei, Chien-Yu Cheng, Chien-Ching Hung, Dual therapy with ritonavir-boosted

111

protease inhibitor (PI) plus lamivudine versus triple therapy with ritonavir-boosted

PI plus two nucleos(t)ide reverse-transcriptase inhibitor in HIV-infected patients

with viral suppression. Journal of Microbiology, Immunology and Infection (2019)

52.

13. Appakkudal R. Anand, Swaminathan Sethuraman, Uma Maheswari Krishnan,

Targeting strategies for delivery of anti-HIV drugs, Journal of Controlled Release,

2014. 192: p. 271-283.

14. World Health Organization (2022), HIV drug resistance Available online

https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hiv-drug-resistance (Truy cập

ngày 3/12/2022).

15. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV

(2022). Available online https://clinicalinfo.hiv.gov/en/guidelines/hiv-clinical-

guidelines-adult-and-adolescent-arv/overview (Truy cập ngày 03/12/2022).

16. Christa Buckheit Sturdevant, Sarah B. Joseph, Gretja Schnell, Richard W. Price,

Ronald Swanstrom, Serena Spudich, Compartmentalized Replication of R5 T Cell

Tropic HIV-1 in the Central Nervous System Early in the Course of Infection,

Journals PLOS Pathog, 2015, 11(3).

17. Gaurav Agarwal, Shilpi Agarwal, PK Kara and Shagun Goyal, Oral Sustained

Release Tablets: An overview with a special emphasis on Matrix Tablet, American

Journal of Advanced Drug Delivery, 2017. 5(4): p. 064-076.

18. Cost is Primary Driver of Medication non-Adherence rates (2022)

https://healthitanalytics.com/news/cost-is-a-primary-driver-of-medication-non-

adherence-rates (Truy cập ngày 3/12/2022).

19. Nihad Al-Hashimi, Nazish Begg, Raid G. Alany. Hany Hassanin, Amr Elshaer,

Oral Modified Release Multiple - Unit Particulate Systems: Compressed Pellets,

Micropaticles and Nanoparticles. Pharmaceutics (2018). 10 (4), 176.

20. D.G. Myszka, R.W. Sweet, P. Hensley, M. Brigham-Burke, P.D. Kwong, W.A.

Hendrickson, R. Wyatt, J. Sodroski, M.L. Doyle, Energetics of the HIV gp120–CD4

binding reaction, Proc. Natl. Acad. Sci. 97(2000) 9026–9031.

21. Jing Pu, Qian Wang, Wei Xu, Lu Lu and Shibo Jiang, Development of Protein- and

Peptide-Based HIV Targeting gp120 or gp41, Viruses 2019, 11, 705.

112

22. Shaik, M.M.; Peng, H.; Lu, J.; Rits-Volloch, S.; Xu, C.; Liao, M.; Chen, B.

Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature 2019,

565, 318–323.

23. Starcich, B.R.; Hahn, B.H.; Shaw, G.M.; McNeely, P.D.; Modrow, S.; Wolf, H.;

Parks, E.S.; Parks, W.P.; Josephs, S.F.; Gallo, R.C.; et al., Identification and

characterization of conserved and variable regions in the envelope gene of HTLV-

III/LAV, the retrovirus of AIDS. Cell 1986, 45, 637–648.

24. Huang, C.C.; Tang, M.; Zhang, M.Y.; Majeed, S.; Montabana, E.; Stanfield, R.L.;

Dimitrov, D.S.; Korber, B.; Sodroski, J.; Wilson, I.A.; et al., Structure of a V3-

containing HIV-1 gp120 core. Science 2005, 310, 1025–1028.

25. Zhou, T.; Georgiev, I.; Wu, X.; Yang, Z.Y.; Dai, K.; Finzi, A.; Kwon, Y.D.; Scheid,

J.F.; Shi, W.; Xu, L.; et al., Structural basis for broad and potent neutralization of

HIV-1 by antibody VRC01. Science 2010, 329, 811– 817.

26. Sattentau, Q.J.; Moore, J.P. The role of CD4 in HIV binding and entry. Philos.

Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 1993, 342, 59–66.

27. Traunecker, A.; Luke, W.; Karjalainen, K. Soluble CD4 molecules neutralize

human immunodeficiency virus type 1. Nature 1988, 331, 84–86.

28. Daar, E.S.; Li, X.L.; Moudgil, T.; Ho, D.D. High concentrations of recombinant

soluble CD4 are required to neutralize primary human immunodeficiency virus type

1 isolates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 6574– 6578.

29. Schooley, R.T.; Merigan, T.C.; Gaut, P.; Hirsch, M.S.; Holodniy, M.; Flynn, T.;

Liu, S.; Byington, R.E.; Henochowicz, S.; Gubish, E.; et al., Recombinant soluble

CD4 therapy in patients with the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and

AIDS-related complex. A phase I-II escalating dosage trial. Ann. Int. Med. 1990,

112, 247–253.

30. Haim, H.; Si, Z.; Madani, N.; Wang, L.; Courter, J.R.; Princiotto, A.; Kassa, A.;

DeGrace, M.; McGee-Estrada, K.; Mefford, M.; Soluble CD4 and CD4-mimetic

compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a shortlived activated state.

PLoS Pathog. 2009, 5.

31. Orloff, S.L.; Kennedy, M.S.; Belperron, A.A.; Maddon, P.J.; McDougal, J.S. Two

mechanisms of soluble CD4 (sCD4)-mediated inhibition of human

113

immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infectivity and their relation to primary

HIV-1 isolates with reduced sensitivity to sCD4. J. Virol. 1993, 67, 1461–1471.

32. Allan, J.S. Receptor-mediated activation of immunodeficiency viruses in viral

fusion. Science 1991, 252, 1322–1323.

33. Schutten, M.; Andeweg, A.C.; Bosch, M.L.; Osterhaus, A.D. Enhancement of

infectivity of a non-syncytium inducing HIV-1 by sCD4 and by human antibodies

that neutralize syncytium inducing HIV-1. Scand. J. Immunol. 1995, 41, 18–22.

34. Jacobson, J.M.; Lowy, I.; Fletcher, C.V.; O’Neill, T.J.; Tran, D.N.; Ketas, T.J.;

Trkola, A.; Klotman, M.E.; Maddon, P.J.; Olson, W.C.; et al. Single-dose safety,

pharmacology, and antiviral activity of the human immunodeficiency virus (HIV)

type 1 entry inhibitor PRO 542 in HIV-infected adults. J. Infect Dis. 2000, 182,

326–329.

35. Allaway, G.P.; Davis-Bruno, K.L.; Beaudry, G.A.; Garcia, E.B.; Wong, E.L.;

Ryder, A.M.; Hasel, K.W.; Gauduin, M.C.; Koup, R.A.; McDougal, J.S.; et al.,

Expression and characterization of CD4-IgG2, a novel heterotetramer that

neutralizes primary HIV type 1 isolates. AIDS Res. Hum. Retrovir. 1995, 11, 533–

539.

36. Gauduin, M.C.; Allaway, G.P.; Olson, W.C.; Weir, R.; Maddon, P.J.; Koup, R.A.

CD4-immunoglobulin G2 protects Hu-PBL-SCID mice against challenge by

primary human immunodeficiency virus type 1 isolates. J. Virol. 1998, 72, 3475-

3478.

37. Trkola, A.; Pomales, A.B.; Yuan, H.; Korber, B.; Maddon, P.J.; Allaway, G.P.;

Katinger, H.; Barbas, C.F. 3rd; Burton, D.R.; Ho, D.D.; et al. Cross-clade

neutralization of primary isolates of human immunodeficiency virus type 1 by

human monoclonal antibodies and tetrameric CD4-IgG. J. Virol. 1995, 69, 6609–

6617.

38. Jacobson, J.M.; Israel, R.J.; Lowy, I.; Ostrow, N.A.; Vassilatos, L.S.; Barish, M.;

Tran, D.N.; Sullivan, B.M.; Ketas, T.J.; O’Neill, T.J.; Treatment of advanced

human immunodeficiency virus type 1 disease with the viral entry inhibitor PRO

542. Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 48, 423–429

39. Chong, H.; Wu, X.; Su, Y.; He, Y. Development of potent and long-acting HIV-1

fusion inhibitors. AIDS 2016, 30, 1187–1196 (33).

114

40. Ashkenazi, A.; Viard, M.; Unger, L.; Blumenthal, R.; Shai, Y. Sphingopeptides:

Dihydrosphingosine-based fusion inhibitors against wild-type and enfuvirtide-

resistant HIV-1. FASEB J 2012, 26, 4628–4636. (34).

41. Urbanowicz, R.A.; Lacek, K.; Lahm, A.; Bienkowska-Szewczyk, K.; Ball, J.K.;

Nicosia, A.; Cortese, R.; Pessi, A. Cholesterol conjugation potentiates the antiviral

activity of an HIV immunoadhesin. J. Pept. Sci. 2015, 21, 743–749 (35).

42. Wexler-Cohen, Y.; Ashkenazi, A.; Viard, M.; Blumenthal, R.; Shai, Y. Virus-cell

and cell-cell fusion mediated by the HIV-1 envelope glycoprotein is inhibited by

short gp41 N-terminal membrane-anchored peptides lacking the critical pocket

domain. FASEB J. 2010, 24, 4196–4202. 936)

43. Jiang, S.; Lin, K.; Strick, N.; Neurath, A.R. HIV-1 inhibition by a peptide. Nature

1993, 365, 113 (31).

44. Pan, C.; Cai, L.; Lu, H.; Qi, Z.; Jiang, S. Combinations of the first and next

generations of human immunodeficiency virus (HIV) fusion inhibitors exhibit a

highly potent synergistic effect against enfuvirtide-sensitive and-resistant HIV type

1 strains. J. Virol. 2009, 83, 7862–7872 (32)

45. Lim, S.B.; Banerjee, A.; Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of

lipid-based nanocarriers. J. Control. Release. 2012, 163, 34–45

46. Chong, H.; Xue, J.; Xiong, S.; Cong, Z.; Ding, X.; Zhu, Y.; Liu, Z.; Chen, T.; Feng,

Y.; He, L.; et al. A lipopeptide HIV-1/2 fusion inhibitor with highly potent in vitro,

ex vivo and in vivo antiviral activity. J. Virol. 2017, 91.

47. Ding, X.; Zhang, X.; Chong, H.; Zhu, Y.; Wei, H.; Wu, X.; He, J.; Wang, X.; He,

Y. Enfuvirtide (T20)-based lipopeptide is a potent HIV-1 cell fusion inhibitor:

Implications for viral entry and inhibition. J. Virol. 2017, 91.

48. US FDA. Drug approval package: Edurant; 2011.

49. Cohen CJ, Andrade-Villanueva J, Clotet B, et al., Rilpivirine versus efavirenz with

two background nucleoside or nucleotide reverse A. I. Rana et al. transcriptase

inhibitors in treatment-naive adults infected with HIV-1 (THRIVE): a phase 3,

randomised, non-inferiority trial. Lancet. 2011;378(9787):229–37.

50. Molina J-M, Cahn P, Grinsztejn B, et al., Rilpivirine versus efavirenz with tenofovir

and emtricitabine in treatment-naive adults infected with HIV-1 (ECHO): a phase

3 randomised double-blind active-controlled trial. Lancet. 2011;378(9787):238–46

115

51. Hoeben E, Borghys H, Looszova A, Bouche M-P, van Velsen F, Baert L.

Pharmacokinetics and disposition of rilpivirine (TMC278) nanosuspension as a

long-acting injectable antiretroviral formulation. Antimicrob Agents Chemother.

2010;54(5):2042–50.

52. Verloes R, Deleu S, Niemeijer N, Crauwels H, Meyvisch P, Williams P. Safety,

tolerability and pharmacokinetics of rilpivirine following administration of a long-

acting formulation in healthy volunteers. HIV Med. 2015;16(8):477–84.

53. McGowan I, Siegel A, Engstrom J, et al. Persistence of rilpivirine following single

dose of long‐acting injection. J Int Aids Society. 2016;19.

54. Yoshinaga T, Kobayashi M, Seki T, et al. Antiviral characteristics of GSK1265744,

an HIV integrase inhibitor dosed orally or by long-acting injection. Antimicrob

Agents Chemother. 2015;59(1):397–406.

55. Spreen W, Min S, Ford S, et al. Pharmacokinetics, safety, and monotherapy

antiviral activity of GSK1265744, an HIV integrase strand transfer inhibitor. HIV

Clin Trials. 2013;14(5):192–203.

56. Spreen W, Ford SL, Chen S, et al. GSK1265744 pharmacokinetics in plasma and

tissue after single-dose long-acting injectable administration in healthy subjects. J

Acquir Immune Defc Syndr. 2014;67(5):481–6

57. Nayak D, et al., Stavudine loaded gelatin liposomes for HIV therapy: Preparation,

characterization and in vitro cytotoxic evaluation. Mater Sci Eng C Mater Biol

Appl, 2017 73: p. 406–416.

58. Kraft JC, et al., Emerging Research and Clinical Development Trends of Liposome

and Lipid Nanoparticle Drug Delivery Systems. Journal of Pharmaceutical

Sciences, 2014 103(1): p. 29–52.

59. Kinman L, et al., Lipid-drug association enhanced HIV-1 protease inhibitor

indinavir localization in lymphoid tissues and viral load reduction: a proof of

concept study in HIV-2287-infected macaques. J. Acquir Immune Defic Syndr,

2003 34(4): p. 387–97.

60. Duan J, et al., Evaluation of atazanavir and darunavir interactions with lipids for

developing pHresponsive anti-HIV drug combination nanoparticles. J Pharm Sci,

2014 103(8): p. 2520–9.

116

61. Naseri N, Valizadeh H, and Zakeri-Milani P, Solid Lipid Nanoparticles and

Nanostructured Lipid Carriers: Structure, Preparation and Application. Advanced

Pharmaceutical Bulletin, 2015 5(3): p. 305–313.

62. Javan F, et al., Encapsulation of ritonavir in solid lipid nanoparticles: in-vitro anti-

HIV-1 activity using lentiviral particles. Journal of Pharmacy and Pharmacology,

2017 69(8): p. 1002–1009.

63. . K SJ, et al., Gelatin modified lipid nanoparticles for anti-viral drug delivery. Chem

Phys Lipids, 2017 207(Pt A): p. 24–37.

64. Dubey V, et al., Enhanced transdermal delivery of an anti-HIV agent via ethanolic

liposomes. Nanomedicine, 2010 6(4): p. 590–6.

65. Chu GJ and Murad A, A case of ethanol-induced systemic allergic dermatitis.

Contact Dermatitis, 2017 76(3): p. 182–184.

66. Aggarwal R, Sahoo PK, Ethosomes: The Novel Drug Delivery Carriers, Sch. Acad.

J. Pharm., Jun 2018; 7(6): 266-273.

67. Khalil NM, et al., Potential of polymeric nanoparticles in AIDS treatment and

prevention. Expert Opin Drug Deliv, 2011 8(1): p. 95–112.

68. Zhilin Chen , Boris Julg. Therapeutic Vaccines for the Treatment of HIV. Journal

Pre-proy 2020.

69. Tomáš Hanke, Aiming for protective T-cell responses: a focus on the first

generation conserved-region HIV consv vaccines in preventive and therapeutic

clinical trials. Expert Review of Vaccines (2019).

70. Nguyễn Thị Trâm Châu (2015), Nghiên cứu biến tính các dendrimer PAMAM bằng

biopolymer ứng dụng mang thuốc, Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu, Học Viện

Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

71. Li, N., et al., Enzyme-sensitive and amphiphilic PEGylated dendrimer-paclitaxel

prodrug-based nanoparticles for enhanced stability and anticancer efficacy. ACS

applied materials & interfaces, 2017. 9(8): p. 6865-6877.

72. Pasut G, Sergi M, Veronese FM. Anti-cancer PEG-enzymes: 30 years old, but still

a current approach. Advanced Drug Delivery Reviews 2008;60:69–78.

73. Brocchini S, Godwin A, Balan S, Choi J, Zloh M, Shaunak S. Disulfide bridge

based PEGylation of proteins. Advanced Drug Delivery Reviews 2008;60:3–12.

117

74. Eto Y, Yoshioka Y, Mukai Y, Okada N, Nakagawa S. Development of PEGylated

adenovirus vector with targeting ligand. International Journal of Pharmaceutics

2008;354:3–8.

75. Huynh L, Neale C, Pomès R, Allen C. Computational approaches to the rational

design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery.

Nanomedicine 2012;8:20–36.

76. Payne RW, Murphy BM, Manning MC. Product development issues for PEGylated

proteins. Pharmaceutical Development and Technology 2011;16:423–40.

77. Abuchowski A, Van Es T, Palczuk NC, Davis FF. Alteration of immunological

properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol.

Journal of Biological Chemistry 1977;252:3578–81.

78. Abuchowski A, McCoy JR, Palczuk NC, van Es T, Davis FF. Effect of covalent

attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine

liver catalase. Journal of Biological Chemistry;252:3582–6.

79. Li C, Wallace S. Polymer-drug conjugates: recent development in clinical

oncology. Advanced Drug Delivery Reviews 2008;60:886–98.

80. Pasut G, Veronese FM. Polymer–drug conjugation, recent achievements and

general strategies. Progress in Polymer Science 2007;32:933–61.

81. Andrew M. Bodratti and Paschalis Alexandridis. Formulation of Poloxamers for

Drug Delivery. J. Funct. Biomater. 2018, 9, 11.

82. Alexandridis, P.; Hatton, T.A. Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-

poly(ethylene oxide) block copolymer surfactants in aqueous solutions and at

interfaces: Thermodynamics, structure, dynamics, and modeling. Colloids Surf. A

Physicochem. Eng. Asp. 1994, 96, 1–46.

83. Nguyễn Ngọc Thể (2021), Tổng hợp và đánh giá hiệu quả mang thuốc và tiêu diệt

tế bào ung thư của một số hệ nanogel trên cơ sở polysaccharide sulfate (Heparin,

Fucoidan) ghép các copolymer tương hợp sinh học , Luận án Tiến sĩ Hóa hữu cơ,

Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

84. P. Dinesh Kumar, P.Vijayaraj Kumar, T. Panneer Selvam and K.R.S. Sambasiva

Rao. Prolonged Drug Delivery System of PEGylated PAMAM Dendrimers with a

Anti-HIV Drug. Research in Pharmacy 3(2): 08-17, 2013.

118

85. Mohammad R Aghasadeghi , Hossein Heidari, Seyed M Sadat, Shiva Irani, Safieh

Amini, Seyed D Siadat, Mohammad E Fazlhashemy, Rezvan Zabihollahi, Seyed M

Atyabi, Seyed B Momen, Mohammad S Khosraavy, Mehdi Davari, Tahmineh

Darvish Mohammadi, Mohammad Doroudian, Mehdi S Ardestani. Lamivudine –

PEGylated chitosan: a novel effective nanosized antiretroviral agent. Curr HIV

Res.2013 Jun; 11(4):309-20.

86. Esmaeel Mohammadi Pargoo,Mohammad Reza Aghasadeghi,Kazem

Parivar,Mehri Nikbin, Pooneh Rahimi,Mehdi Shafiee Ardestan. Lamivudine-

conjugated and efavirenz – loaded G2 dendrimers: Novel anti-retroviral nano drug

delivery systems. IET Nanobiotechnology Jun 2021.

87. Hồ Minh Nhật (2020), Nghiên cứu tổng hợp hệ nano dendrimer Poly (amidoamine)

mang thuốc chống ung thư (Carboplatin và Oxaliplatin), Luận án Tiến sĩ Khoa học

vật liệu, Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

88. Viện Kiểm nghiệm An toan Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương pháp

trong phân tích hóa học và vi sinh vật.

89. ICH Harmonised Tripartite Guideline validation of Analytical Procedures: Text

and Methodology Q2(R1) (1994)

90. The United States Pharmacopeia 2021 (USP 44)

91. Le Hang Dang, Phuong Doan, Tran Thi Yen Nhi, Dinh Trung Nguyen, Bich Tram

Nguyen, Thi Phuong Nguyen, Ngoc Quyen Tran. Multifunctional injectable

pluronic-cystamine-alginate-based hydrogel as a novel cellular delivery system

towards tissue regeneration. Intternational journal of Biological Macromolecules,

Volume 185, 31August 2021, 592-603

92. ATCC.BJ https://www.atcc.org/products/crl-

2522#:~:text=BJ%20cells%20are%20fibroblasts%20established,Applications%20

include%20toxicology%20research.&text=Discounts%2 (Truy cập ngày 3/12/2022

93. Enzymatic Assay of Pepsin (3.4.23.1)

https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/technical-documents/protocol/protein-

biology/enzyme-activity-assays/enzymatic-assay-of-pepsin (Truy cập ngày

3/12/2020)

119

94. Van-Dung Nguyen, Hong-Loan Thi Nguyen¸ Linh-Chi Do, Vu Van Tuan, Phuong

Thien Thuong and Tuan-Nghia Phan. A New Saponin with Anti-HIV-1 Protease

Activity from Acacia pennata. Natural Product Communication Vol.13 (4) 2018,

411-414

95. Nguyễn Văn Dũng, Lương Thị Kim Châu, Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Thị

Phương, Phương Thiện Thương, Phan Tuấn Nghĩa, Bùi Phương Thuận (2015). Hoạt

tính ức chế pepsin và protease HIV-1 của các cao chiết và hoạt chất Acid maslinic

từ dược liệu. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội: Khoa học Tự nhiên và

Công nghệ, Tập 31, Số 2 (2015) 18-27

96. Ho, M.N.; Bach, L.G.; Nguyen, D.H.; Nguyen, C.H.; Nguyen, C.K.; Tran, N.Q.;

Nguyen, N.V.; Thi, T.T.H. PEGylated PAMAM dendrimers loading oxaliplatin with

prolonged release and high payload without burst effect. Biopolymers 2019, 110.

97. Thi Bich Tram Nguyen, Thi Tram Chau Nguyen, Hoang Chinh Tran, Cuu Khoa

Nguyen, Ngoc Quyen Tran, 1H NMR spectroscopy as an effective method for

predicting molecular weight of polyaminoamine dendrimers and their derivatives.

International Journal of Polymer Analysis and Characterization, 2015. 20(1): p. 57-

68.

98. B. L. Schwartz, A. L. Rockwood, R. D. Smith, D. A. Tomalia, R. Spindler,

Detection of high molecular weight starburst dendrimers by electrospray ionization

mass spectrometry. Rapid communications in mass spectrometry, 1995. 9(15):

1552-1555.

99. R.J., Hood, J.T. Watson, and A.D. Jones. Resolution and mass accuracy of

highmass ions in TOF mass spectrometry: Applications to PAMAM dendrimers.

54th Annual Conference on Mass Spectrometry, Seattle, Washington, 2006.

100. K. Madaan, S. Kumar, N. Poonia, V. Lather, D. Pvaita. Dendrimers in drug

delivery and targeting: drug-dendrimer interactions and toxicity issues. Journal of

Pharmacy and Bioallied Sciences, 2014. 6(3): 139-150.

101. Luong, D.; Kesharwani, P.; Deshmukh, R.; Amin, M.C.I.M.; Gupta, U.; Greish,

K.; Iyer, A.K. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating

toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 2016, 43,

14–29.

120

102. Ho, M.N.; Bach, L.G.; Nguyen, D.H.; Nguyen, C.H.; Nguyen, C.K.; Tran, N.Q.;

Nguyen, N.V.; Thi, T.T.H. PEGylated PAMAM dendrimers loading oxaliplatin

with prolonged release and high payload without burst effect. Biopolymers 2019,

110.

103. Ahmed, R.; Aucamp, M.; Ebrahim, N.; Samsodien, H. Supramolecular assembly

of rifampicin and PEGylated PAMAM dendrimer as a novel conjugate for

tuberculosis. J. Drug Deliv. Sci. Technol. 2021, 66.

104. Lin-Vien, D.; Colthup, N.B.; Fateley, W.G.; Grasselli, J.G. The Handbook of

Infrared and Raman Characteristic Frequencies of Organic Molecules; Academic

Press: London, UK, 1991.

105. Sonam Choudhary, Lokesh Gupta, Santa Rani, Kaushalkuma Dave, Umesh

Gupta. Impact of dendrimers on solubility of hydrophobic Drug. Front Pharmacol,

2017, 8:261

106. M A Navia, P M Fitzgerald, B M McKeever, C T Leu, J C Heimbach, W K

Herber, I S Sigal, P L Darke, J P Springer. Three-dimensional structure of aspartyl

protease from human immunodeficiency virus HIV-1, Nature 1989 Feb

16;337(6208):615-20

107. Bazzo, Giovana Carolina; Mostafa, Dina; França, Maria Terezinha; Pezzini,

Bianca Ramos; Stulzer, Hellen Karine (2019). How tenofovir disoproxil fumarate

can impact on solubility and dissolution rate of efavirenz?. International Journal of

Pharmaceutics, 118597.

108. Anthony D. Richards, Lowri H. Phylip, William G.Farmerie, Paula

E.Scarborough, Alicia Alvarez, Ben M,Dunn, Ph-Herve Hire, Libuse pavlickova,

Vladimir Kostka, and John Kay. Sensitive, Solube Chromogenic Subtrates for HIV-

1 proteinase. The Journal of Biological chemistry Vol.265, No.14, Issue of May 16,

pp.7733-7736, 1990

109. Alterman, M. Design and Synthesis of HIV-1 Protease Inhibitor; Acta

Universitatis Upsaliensis: Uppsala, Sweden, 2001.

110. Gaber, R.; Majerle, A.; Jerala, R.; Benˇcina, M. Noninvasive high-throughput

single-cell analysis of HIV protease activity using ratiometric flow cytometry.

Sensors 2013, 13, 16330–16346.

121

111. Oluwaseun Ogunwuy, Namita Kumari, Kahli A. Smith, Oleg Bolshakov, Simeon

Adesina, Avele Gugssa, Winston A. Anderson, Sergei Nekhai, Emmanuel, O.

Akala, Antiretroviral Druds-Loaded Nanoparticles Fabricated by Dispersion

Polymerization with Potential for HIV/AIDS Treatment. Infect Dis (Auckl), 2016;

9: 21-32

122

PHỤ LỤC

123

PHỤ LỤC 1.

PHỔ CẤU TRÚC SẢN PHẨM DENDRIMER PAMAM G-0.5, G0.0, G0.5, G1.0,

G1.5, G2.0, G2.5, G3.0

Phổ IR dendrimer PAMAM G-0.5

124

Phổ IR dendrimer PAMAM G0.0

125

Phổ IR dendrimer PAMAM G0.5

126

Phổ IR dendrimer PAMAM G1.0

127

Phổ IR dendrimer PAMAM G1.5

128

Phổ IR dendrimer PAMAM G2.0

129

Phổ IR dendrimer PAMAM G3.0

130

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G-0.5

131

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G0.0

132

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G0.5

133

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G1.0

134

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G1.5

135

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G2.0

136

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G2.5

137

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0

138

Phổ GPC của dendrimer PAMAM G3.0

139

PHỤ LỤC 2.

PHỔ CẤU TRÚC SẢN PHẨM DENDRIMER PAMAM

BIẾN TÍNH VỚI mPEG VÀ PLURONIC F127

Phổ 1H-NMR mPEG-NPC

140

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0@mPEG

141

Phổ GPC của dendrimer PAMAM G3.0@mPEG

142

Phổ 1H-NMR của HO-F127-NPC

143

Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0@F127

144

PHỤ LỤC 3

KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TDF, RTV VÀ

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI TDF, RTV

Tính tuyến tính

Nồng độ C (µg/ml)

2,72

67,93

135,87

271,74

407,61

Diện tích pic S

13989

309796

738331

1468549

2167338

(mAu.s)

2500000

Phương trình hồi qui

y = 5385.840x - 14622.204 R² = 00.999

ŷ = 5385,8396x – 14622,2039

2000000 c i p 1500000 h c í 1000000 t n ệ 500000 D

Hệ số tương quan r = 0,9995

100 200 300 400 500 Nồng độ (µg/ml)

Kết quả khảo sát tính tuyến tính của TDF

Nồng độ C (µg/ml)

2,63

65,67

131,34

262,68

394,02

Diện tích pic S

16839

469233

942161

1881293

2827375

(mAu.s)

3000000

Phương trình hồi qui

2500000

y = 7178.038x - 1983.425 R² = 01.000

2000000

ŷ = 7178,0380x - 1983,4253

1500000

Hệ số tương quan r = 1,0000

c 1000000 i p h 500000 c í t n ệ D

100 200 300 400 500 Nồng độ (µg/ml)

Kết quả khảo sát tính tuyến tính của RTV

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng

độ chất phân tích và diện tích pic đáp ứng trong khoảng nồng độ khảo sát đối với

các hợp chất nghiên cứu. Kết quả này được sử dụng làm cơ sở cho các nghiên cứu

dẫn truyền hóa thuốc và phóng thích thuốc in vitro

145

Độ chính xác

TDF

RTV

Thử

Lượng cân

Diện tích

Hàm lượng

Diện tích

Hàm lượng

Pic (mAu.s)

8,04

943024

10,57

0,0621

533105

8,18

977888

10,81

0,0630

549955

8,26

977767

10,89

0,0625

550793

8,21

975882

10,82

0,0628

550419

8,12

976029

10,70

0,0635

550231

8,31

976219

10,96

0,0620

549625

8,19

10,79

Trung bình

1,16

1,29

RSD (%)

Kết quả khảo sát độ lặp của TDF và RTV

TDF

RTV

Thử

Lượng cân

Diện tích

Hàm lượng

Diện tích

Hàm lượng

Pic (mAu.s)

7,99

936398

10,41

0,0627

529766

7,85

938480

10,36

0,0632

529812

8,10

938897

10,70

0,0612

529294

8,06

936405

10,62

0,0615

529180

7,98

938411

10,54

0,0621

528635

7,90

936538

10,40

0,0628

529619

7,98

10,50

Trung bình

1,18

1,30

RSD (%)

Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của TDF và RTV

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp đạt độ chính xác có RSD < 2,0 %

(n=12): TDF có RSD 1,18 % và RTV có RSD là 1,30 %

146

Độ đúng

Diện tích

RSD

Mức

Lượng

Nồng

pic

Nồng độ

Tỷ

Trung

độ

(mAu.s)

chuẩn

lệ

bình

chuẩn

tìm lại

phục hồi

thêm

µg/ml

80 %

107,96

589592

109,47

101,40

10,85

107,46

589229

109,40

101,81

101,35

0,48

10,80

108,55

589562

109,47

100,84

10,91

100 %

135,32

738154

137,05

101,28

13,60

135,12

740101

137,42

101,70

101,41

0,25

13,58

135,42

738387

137,10

101,24

13,61

120 %

162,38

883469

164,04

101,02

100,82

0,17

16,32

162,68

883046

163,96

100,78

16,35

162,88

883208

163,99

100,68

16,37

Kết quả khảo sát độ đúng của TDF

Lượng

Nồng

Diện tích

Nồng độ

Trung

RSD

Tỷ

Mức

độ

pic

chuẩn

bình

lệ

chuẩn

tìm lại

phục hồi

thêm

µg/ml

80 %

105,00

755329

105,23

100,22

10,50

105,50

753794

105,01

99,75

0,41

99,54

10,55

105,70

754826

105,16

99,49

10,57

100 %

132,00

945840

131,77

99,82

13,20

132,20

941420

131,15

99,37

0,40

99,21

13,22

132,50

942419

131,29

99,09

13,25

120 %

160,00

1129909

157,41

98,38

16,00

159,60

1130985

157,56

98,73

0,35

98,72

15,96

159,00

1130813

157,54

99,08

15,90

Kết quả khảo sát độ đúng của RTV

147

PHỤ LỤC 4

SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN AZT TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127

148

149

PHỤ LỤC 5

SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN 3TC TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127

150

151

PHỤ LỤC 6

SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN TDF TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127

152

153

PHỤ LỤC 7

SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN RTV TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127

154

Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tổng hợp, biến tính bề mặt hệ nano dendrimer polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

NGUYỄN THỊ THỊNH

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP, BIẾN TÍNH BỀ MẶT HỆ NANO DENDRIMER POLYAMIDOAMIN MANG THUỐC KHÁNG VIRUS HIV

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP, BIẾN TÍNH BỀ MẶT HỆ NANO DENDRIMER POLYAMIDOAMIN MANG THUỐC KHÁNG VIRUS HIV

Mã số: 9 44 01 14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. GS.TS. NGUYỄN CỬU KHOA

2. TS. HỒ VIỆT ANH

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022

4. Đóng góp mới của luận án

Luận án đã dẫn truyền 4 hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV trên chất mang

nano dendrimer PAMAM sau biến tính với các polymer sinh học là G3.0@mPEG

và G3.0@F127, tạo các hệ dẫn truyền thuốc đơn và hệ dẫn truyền thuốc phối hợp

kháng HIV

Luận án đã xây dựng phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF, RTV trong

hệ dẫn truyền thuốc đơn. Đặc biệt xác định đồng thời AZT, 3TC và TDF, RTV

trong các hệ dẫn truyền phối hợp, cung cấp bộ dữ liệu thẩm định phương pháp

chứng minh sự phù hợp của phương pháp HPLC-PDA đã xây dựng trên hệ dẫn

truyền thuốc đơn và thuốc phối hợp

Khả năng tải thuốc của hệ G3.0@F127 tốt hơn hệ G3.0@mPEG do pluronic

F127 trong cấu trúc có 65 nhóm PO có tính kỵ nước nên các tương tác kỵ nước

của thuốc sẽ tương tác với nhóm PO của F127 do vậy lượng thuốc được đóng gói

nhiều hơn. Kết quả khảo sát giải phóng hoạt chất từ ARV@G3.0@mPEG và

ARV@G3.0@F127 trong 4 môi trường pH 1,2; pH 4,5; pH 6,8 và pH 7,4 cho

thấy có khả năng phóng thích kéo dài và có hoạt tính ức chế pepsin trên hệ dẫn

truyền thuốc AZT và RTV

Tác giả Tung-Che Hung và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu Liệu pháp kép với

1.2.1. Ưu điểm của phóng thích kéo dài

Thuốc cao phân tử

peginterferon-alfa- 2a peginterferon-alfa- 2b asparaginase Adenosin deaminas Thuốc phân tử thấp naloxone

Thuốc kích thước nano

2.2. Nguyên liệu - hóa chất, dụng cụ - thiết bị

2.3. Tổng hợp dendrimer PAMAM

Thuốc thử

Trắng (ml)

Thử 1 (ml)

Thử 2 (ml)

Thử 3 (ml)

H của nhóm

3.1.4. Tính toán khối lượng phân tử dendrimer PAMAM bằng phổ 1H-NMR

i

4000000 c p 2000000 h c

i

í t n ệ D

400 Nồng độ (µg/ml)

i

c p h c

i

í t n ệ D

Nồng độ (µg/ml)

3.5. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG HOẠT CHẤT

PHỤ LỤC

Độ chính xác

Độ đúng

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng