Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài Vitex limonifolia Wall. Ex C.B.Clark và Vitex trifolia L.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Nguyễn Thị Kim Thoa

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LOÀI

Vitex limonifolia WALL. EX C.B.CLARK VÀ Vitex trifolia L.

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Nguyễn Thị Kim Thoa

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LOÀI

Vitex limonifolia WALL. EX C.B.CLARK VÀ Vitex trifolia L.

Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ

Mã số: 9.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. TS. Nguyễn Xuân Nhiệm

2. PGS. TS. Ninh Khắc Bản

Hà Nội – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự

hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Xuân Nhiệm và PGS. TS. Ninh Khắc Bản.

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất

kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Kim Thoa

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được sự

giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia

đình.

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới TS.

Nguyễn Xuân Nhiệm và PGS. TS. Ninh Khắc Bản - những người Thầy đã tận tâm

hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong

suốt thời gian thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ,

đồng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan

tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và

nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển,

đặc biệt là PGS. TS. Phan Văn Kiệm, ThS. Đan Thị Thúy Hằng, ThS. Đỗ Thị Trang

về sự quan tâm giúp đỡ, với những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong

việc thực hiện và hoàn thiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Dược, Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc đã

giúp đỡ tôi thử hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng virus.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu Trường đại học Mỏ -

Địa chất, Phòng Tổ chức Cán bộ và các đồng nghiệp của tôi tại Bộ môn Hóa học,

khoa Khoa học cơ bản đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời

gian làm nghiên cứu sinh.

Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Việt Nam

(NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí theo mã số đề tài 104.01-2014.02.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình,

bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt

quá trình học tập và nghiên cứu.

Xin trân trọng cảm ơn!

iii

MỤC LỤC

MỤC LỤC ............................................................................................................... III

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................................................... VII

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... IX

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. X

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................................ 3

1.1. Giới thiệu về chi Vitex .................................................................................................. 3

1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Vitex................................................................................................ 3

1.1.2. Công dụng của các loài thuộc chi Vitex ................................................................................... 4

1.1.2.1. Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền các loài thuộc chi Vitex ....................................... 4

1.1.2.2. Công dụng khác của các loài thuộc chi Vitex......................................................................... 5

1.1.3. Giới thiệu về loài V. limonifolia và loài V. trifolia .................................................................. 5

1.1.3.1. Loài V. limonifolia ..................................................................................................................... 5

1.1.3.2. Loài V. trifolia ............................................................................................................................ 6

1.1.4. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Vitex ................................................ 7

1.1.4.1. Các hợp chất triterpennoid ....................................................................................................... 7

1.1.4.2. Các hợp chất ecdysteroid ....................................................................................................... 10

1.1.4.3. Các hợp chất labdane-diterpennoid ...................................................................................... 12

1.1.4.4. Các hợp chất lignan và neolignan ......................................................................................... 16

1.1.4.5. Các hợp chất flavonoid ........................................................................................................... 19

1.1.4.6. Các hợp chất iridoid................................................................................................................ 22

1.1.4.7. Các hợp chất khác ................................................................................................................... 24

1.1.5. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Vitex ............................................................ 27

1.1.5.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư ........................................................................................... 27

1.1.5.2. Hoạt tính kháng viêm, giảm đau ............................................................................................ 29

1.1.5.3. Hoạt tính kháng virus và vi sinh vật ...................................................................................... 31

1.1.5.4. Các hoạt tính khác ................................................................................................................... 32

1.1.6. Tình hình nghiên cứu về chi Vitex ở Việt Nam .................................................................... 33

1.1.7. Tình hình nghiên cứu về loài V. limonifolia và V. trifolia .................................................. 34

1.2. Giới thiệu về viêm ....................................................................................................... 34

1.2.1. Sơ lược về viêm .......................................................................................................................... 34

1.2.1.1. Giới thiệu về quá trình viêm ................................................................................................... 34

1.2.1.2. Các giai đoạn của quá trình viêm .......................................................................................... 35

1.2.1.3. Vai trò của nitric oxide trong bệnh lý viêm ........................................................................... 35

1.2.2. Các thuốc kháng viêm .............................................................................................................. 36

1.3. Giới thiệu về kháng virus ........................................................................................... 37

1.3.1. Sơ lược về virus .......................................................................................................................... 37

1.3.2. Các thuốc kháng virus .............................................................................................................. 39

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .............................................................. 41

2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................. 41

2.1.1. Loài Vitex limonifolia Wall. ex C.B.Clarke .......................................................................... 41

2.1.2. Loài Vitex trifolia L. .................................................................................................................. 41

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 41

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất ..................................................................................... 41

2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ........................................................................................................... 41

2.2.1.2. Sắc ký cột (CC) ........................................................................................................................ 41

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc .............................................................................................. 41

2.2.2.1. Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) ........................................................................ 42

2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) ........................................................................................... 42

2.2.2.3. Phổ lưỡng sắc tròn (CD) ........................................................................................................ 42

2.2.2.4. Phương pháp tính toán phổ CD lý thuyết ............................................................................. 42

2.2.2.5. Độ quay cực ([α]D) .................................................................................................................. 42

2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học ............................................................................. 43

2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro ......................................................... 43

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng virus in vitro ......................................................... 45

2.3. Phân lập các hợp chất ................................................................................................. 46

2.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia ........................................................................ 46

2.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài V. trifolia ............................................................................... 49

2.4. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được ....................... 52

2.4.1. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài V. limonifolia ...................... 52

2.4.1.1. Hợp chất VL1: 7α,12α-Dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide (Vitexlimolide A) (hợp

chất mới)................................................................................................................................................. 52

2.4.1.2. Hợp chất VL2: 7α,12β,16-Trihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide (Vitexlimolide B)

(hợp chất mới) ....................................................................................................................................... 52

2.4.1.3. Hợp chất VL3: 7α,16-Dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide (Vitexlimolide C) (hợp

chất mới)................................................................................................................................................. 52

2.4.1.4. Hợp chất VL4: 5,4′-Dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone ........................................................ 52

2.4.1.5. Hợp chất VL5: Vitecetin ......................................................................................................... 53

2.4.1.6. Hợp chất VL6: 5,4′-Dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone ....................................................... 53

2.4.1.7. Hợp chất VL7: Verrucosin ..................................................................................................... 53

2.4.1.8. Hợp chất VL8: 2α,3α-Dihydroxyurs-12-en-28-oic acid ..................................................... 54

2.4.1.9. Hợp chất VL9: Euscaphic acid .............................................................................................. 54

2.4.1.10. Hợp chất VL10: 2α,3α-Dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid

................................................................................................................................................................. 54

2.4.1.11. Hợp chất VL11: Maslinic acid ............................................................................................ 54

2.4.1.12. Hợp chất VL12: Maltol O-β-D-glucopyranoside .............................................................. 54

2.4.2. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài V. trifolia ............................. 55

2.4.2.1. Hợp chất VT1: 3α-Hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid (hợp chất mới) ................... 55

2.4.2.2. Hợp chất VT2: Matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới) ......................... 55

2.4.2.3. Hợp chất VT3: Ecdysone ....................................................................................................... 55

2.4.2.4. Hợp chất VT4: 20-Hydroxyecdysone .................................................................................... 55

2.4.2.5. Hợp chất VT5: 20-Hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide .................................................. 55

2.4.2.6. Hợp chất VT6: Turkesterone ................................................................................................. 56

2.4.2.7. Hợp chất VT7: Polypodine B ................................................................................................. 56

2.4.2.8. Hợp chất VT8: Rubrosterone ................................................................................................. 56

2.4.2.9. Hợp chất VT9: Luteolin .......................................................................................................... 56

2.4.2.10. Hợp chất VT10: (2S)-7,4'-Dihydroxy-5-methoxyflavanone ............................................. 57

2.4.2.11. Hợp chất VT11: Vitexin ........................................................................................................ 57

2.4.2.12. Hợp chất VT12: Orientin ..................................................................................................... 57

2.4.2.13. Hợp chất VT13: Homoorientin............................................................................................ 57

2.4.2.14. Hợp chất VT14: 2-O-Rhamnosylvitexin ........................................................................... 58

2.4.2.15. Hợp chất VT15: Euscaphic acid ......................................................................................... 58

2.4.2.16. Hợp chất VT16: Tormentic acid .......................................................................................... 58

2.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được ........................... 59

2.5.1. Hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập được từ loài V. limonifolia.. 59

2.5.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất .................................................................. 60

CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ ........................................................................... 62

3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được ................................................. 62

3.1.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài V. limonifolia ....................... 64

3.1.1.1. Hợp chất VL1: Vitexlimolide A (hợp chất mới) ................................................................... 64

3.1.1.2. Hợp chất VL2: Vitexlimolide B (hợp chất mới) ................................................................... 71

3.1.1.3. Hợp chất VL3: Vitexlimolide C (hợp chất mới) ................................................................... 77

3.1.1.4. Hợp chất VL4: 5,4′-Dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone ........................................................ 84

3.1.1.5. Hợp chất VL5: Vitecetin ......................................................................................................... 86

3.1.1.6. Hợp chất VL6: 5,4′-Dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone ....................................................... 87

3.1.1.7. Hợp chất VL7: Verrucosin ..................................................................................................... 88

3.1.1.8. Hợp chất VL8: 2α,3α-Dihydroxyurs-12-en-28-oic acid ..................................................... 89

3.1.1.9. Hợp chất VL9: Euscaphic acid .............................................................................................. 91

3.1.1.10. Hợp chất VL10: 2α,3α-Dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid

................................................................................................................................................................. 93

3.1.1.11. Hợp chất VL11: Maslinic acid ............................................................................................ 95

3.1.1.12. Hợp chất VL12: Maltol O-β-D-glucopyranoside .............................................................. 97

3.1.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài V. trifolia .............................. 98

3.1.2.1. Hợp chất VT1: 3α-Hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid (hợp chất mới) ................... 98

3.1.2.2. Hợp chất VT2: Matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới) ....................... 104

3.1.2.3. Hợp chất VT3: Ecdysone ..................................................................................................... 111

3.1.2.4. Hợp chất VT4: 20-Hydroxyecdysone .................................................................................. 113

3.1.2.5. Hợp chất VT5: 20-Hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide ................................................ 115

3.1.2.6. Hợp chất VT6: Turkesterone ............................................................................................... 117

3.1.2.7. Hợp chất VT7: Polypodine B ............................................................................................... 117

3.1.2.8. Hợp chất VT8: Rubrosterone ............................................................................................... 119

3.1.2.9. Hợp chất VT9: Luteolin ........................................................................................................ 121

3.1.2.10. Hợp chất VT10: (2S)-7,4'-Dihydroxy-5-methoxyflavanone ........................................... 121

3.1.2.11. Hợp chất VT11: Vitexin ...................................................................................................... 123

3.1.2.12. Hợp chất VT12: Orientin ................................................................................................... 123

3.1.2.13. Hợp chất VT13: Homoorientin.......................................................................................... 124

3.1.2.14. Hợp chất VT14: 2-O-rhamnosylvitexin .......................................................................... 125

3.1.2.15. Hợp chất VT15: Eucaphic acid ......................................................................................... 126

3.1.2.16. Hợp chất VT16: Tormentic acid ........................................................................................ 126

3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được .............................................. 128

3.2.1. Hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia .......... 128

3.2.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất ................................................................ 130

3.2.2.1. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất từ loài V. limonifolia............................ 131

3.2.2.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất từ loài V. trifolia .................................. 132

KẾT LUẬN ............................................................................................................ 134

KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 136

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ........................................... 137

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 138

vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Proton

Kí hiệu Tiếng Anh 13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy nuclear magnetic Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

resonance spectroscopy Renal carcinoma cell Lung carcinoma cell Acetonide

Mouse microglial cell Pancreatic cancer cell Cytotoxicity concentration 50% 786-O A549 ACN BEL-7402 Hepatocyte carcinoma cell BV2 BXPC-3 CC50

Circular dichroism spectroscopy

CD Colo-320 Human colon cancer cell COSY COX CVB3 DEPT Tế bào ung thư biểu mô thận Tế bào ung thư phổi Acetonide Tế bào ung thư gan Tế bào tiểu thần kinh đệm của chuột Tế bào ung thư tuyến tụy Nồng độ gây độc 50% đối tượng thử nghiệm Phổ lưỡng sắc tròn Tế bào ung thư đại tràng Phổ 1H-1H COSY Enzyme cyclo-oxygenase Virus coxsackievirus B3 Phổ DEPT

1H-1H- correlation spectroscopy Cyclo-oxygenase Coxsackievirus B3 Distortionless enhancement by polarization transfer Dimethylsulfoxide DMSO DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Eca-109 Human esophageal cancer cells Enterovirus 71 EV71 Fetal bovine serum FBS Glucose Glc Hepatitic B Virus HBV HCMV Human cytomegalovirus HCT-116 Human colon cancer cell HCV HeLa HepG2 HIV HL-60

Dimethylsulfoxide 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Tế bào ung thư thực quản người Virus enterovirus 71 Huyết thanh bò Đường glucose Virus viêm gan B Cytomegalovirus người Tế bào ung thư đại tràng Virus viêm gan C Tế bào ung thư cổ tử cung Tế bào ung thư gan

Tế bào ung thư máu người

bond HMBC Hepatitic C Virus Human cervicalcancer cell Hepatocyte carcinoma cell Human Immunodecificiency Virus Virus HIV Human promyelocytic leukemia cell Heteronuclear mutiple correlation

electrospray Human Papilloma Virus resolution High ionization mass spectrum

HO-8910 Human ovarian cell HPV HR-ESI- MS HRV1B Human rhinovirus B3 HSQC singlequantum

Heteronuclear correlation Herpe Simplex Virus Human colon cancer cell HSV HT-29 Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Tế bào ung thư buồng trứng người Virus papilloma ở người Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử Virus human rhinovirus B3 Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết Virus herpe simplex Tế bào ung thư đại tràng

viii

Inhibitory concentration at 50% IC50

iNOS Inducible nitric oxide synthase

K562 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Enzym tạo ra oxit nitơ từ amino L- arginine acid Tế bào ung thư máu người

Human promyelocytic leukemia cell Human epidemoid carcinoma KB KH L-NMMA N(omega)-Monomethyl-L-

Arginine Acetate Lipopolysaccharide Pancreatic cancer cell Human breast carcinomacell Human melanoma cell Tế bào ung thư biểu mô người Kí hiệu N(omega)-Monomethyl-L- Arginine Acetate Lipopolysaccharide Tế bào ung thư tuyến tụy Tế bào ung thư vú người Tế bào ung thư vú người

Tế bào ung thư phổi người LPS LS180 MCF-7 MDA- MB-435 MIC MRC-5 MTT

Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu Human lung carcinoma cell 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide Nitric oxide NO NOESY Nuclear overhauser enhancement Oxit nitric Phổ NOESY spectroscopy NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory Thuốc chống viêm không steroid

Pancreatic cancer cell Prostate adenocarcinoma cell Mật độ quang Tế bào ung thư buồng trứng Tế bào ung thư tuyến tụy Tế bào ung thư tuyến tiền liệt Đại thực bào

Respiratory Syncytial Virus

Human hepatocarcinoma cell Virus hợp bào hô hấp Tế bào ung thư dạ dày người Tế bào ung thư buồng trứng người Tế bào ung thư gan người

drugs Optical density OD OVCAR-3 Human ovarian cancer cell PANC-1 PC-3 RAW 264.7 RSV SGC-7901 Human gastric cancer cell SKOV-3 Human ovarian cancer cell SMMC- 7721 SR Tế bào ung thư máu người

Human promyelocytic leukemia cell Sulforhodamine B Thin layer chromatography Tumor necrosis factor

SRB TLC TLTK TNF tsFT210 Mouse cancer cells TT V. Vero VZV Vitex Kidney epithelial cells Varicella-zoster Virus Sulforhodamine B Sắc ký lớp mỏng Tài liệu tham khảo Yếu tố hoại tử khối u Tế bào ung thư ở chuột Thứ tự Chi Đẻn Tế bào biểu mô thận Virus thủy đậu-zona

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Vitex ở Việt Nam ............................................................... 4 Bảng 1.2. Các hợp chất khung ursane từ chi Vitex ........................................................................... 7

Bảng 1.3. Các hợp chất khung oleanane và friedelane từ chi Vitex ............................................... 9

Bảng 1.4. Các hợp chất khung lupane từ chi Vitex ........................................................................... 9

Bảng 1.5. Các hợp chất ecdysteroid từ chi Vitex ............................................................................. 10 Bảng 1.6. Các hợp chất khung labdane từ chi Vitex ....................................................................... 12

Bảng 1.7. Các hợp chất lignan và neoligan từ chi Vitex................................................................. 17

Bảng 1.8. Các hợp chất flavonoid từ chi Vitex ................................................................................. 20

Bảng 1.9. Các hợp chất iridoid từ chi Vitex...................................................................................... 22 Bảng 1.10. Các hợp chất khác từ chi Vitex ....................................................................................... 24

Bảng 2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh NO của các hợp chất VL1-VL12 trên

tế bào BV2 ............................................................................................................................................. 59

Bảng 2.2. Hoạt tính kháng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B và enterovirus 71 của một số hợp chất từ loài V. limonifolia. ............................................................................................... 60

Bảng 2.3. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng một số chủng virus của các hợp chất từ loài V.

trifolia ..................................................................................................................................................... 61

Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL1 và hợp chất tham khảo ...................................... 66

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL2 và hợp chất tham khảo ...................................... 73

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL3 và hợp chất tham khảo ...................................... 79

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL4 và hợp chất tham khảo ...................................... 84

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL5 và hợp chất tham khảo ...................................... 87

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL8 và hợp chất tham khảo ...................................... 90

Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL9 và hợp chất tham khảo ...................................... 92

Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL10 và hợp chất tham khảo .................................... 94

Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL11 và hợp chất tham khảo .................................... 96

Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL12 và hợp chất tham khảo .................................. 97

Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT1 và hợp chất tham khảo .................................. 100 Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT2 và hợp chất tham khảo .................................. 105 Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT3 và hợp chất tham khảo .................................. 112 Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT4 và hợp chất tham khảo .................................. 114

Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT5 và hợp chất tham khảo .................................. 116 Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT7 và hợp chất tham khảo .................................. 118 Bảng 3.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT8 và hợp chất tham khảo .................................. 120 Bảng 3.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT10 và hợp chất tham khảo ................................ 122 Bảng 3.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT16 và hợp chất tham khảo ................................ 127

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Vitex ................................................................................ 3

Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất khung ursane từ chi Vitex ............................................................ 8

Hình 1.3. Cấu trúc các hợp chất khung oleanane và friedelane từ chi Vitex ................................ 9

Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất khung lupane từ chi Vitex .......................................................... 10

Hình 1.5. Cấu trúc của các hợp chất ecdysteroid từ chi Vitex ....................................................... 12

Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất khung labdane từ chi Vitex ........................................................ 16

Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất lignan và neolignan từ chi Vitex ............................................... 19

Hình 1.8. Cấu trúc các hợp chất flavonoid từ chi Vitex .................................................................. 22

Hình 1.9. Cấu trúc các hợp chất iridoid từ chi Vitex ....................................................................... 23

Hình 1.10. Cấu trúc các hợp chất khác từ chi Vitex ........................................................................ 26

Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. limonifolia ........................................................ 48

Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. trifolia ............................................................... 51

Hình 3.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài V. limonifolia ......................... 62

Hình 3.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài V. trifolia ................................. 63

Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất VL1 và hợp chất tham khảo ....................................... 64

Hình 3.4. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất VL1 ........................... 65

Hình 3.5. Phổ CD thực nghiệm của hợp chất VL1 và tính toán CD theo lý thuyết của

hai epimer 1a và 1b. ......................................................................................................................... 67

Hình 3.6. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VL1 ................................................................................. 67 Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất VL1 ...................................................................................... 68 Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của hợp chất VL1 ..................................................................................... 68

Hình 3.9. Phổ DEPT của hợp chất VL1 ........................................................................................... 69

Hình 3.10. Phổ HSQC của hợp chất VL1 ........................................................................................ 69

Hình 3.11. Phổ HMBC của hợp chất VL1 ....................................................................................... 70

Hình 3.12. Phổ COSY của hợp chất VL1 ......................................................................................... 70

Hình 3.13. Phổ NOESY của hợp chất VL1 ...................................................................................... 71

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học VL2 và hợp chất tham khảo (VL1) ................................................ 71

Hình 3.15. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất VL2 ......................... 72

Hình 3.16. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VL2 ............................................................................... 74 Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của hợp chất VL2 .................................................................................... 74 Hình 3.18. Phổ 13C-NMR của hợp chất VL2 ................................................................................... 75

Hình 3.19. Phổ HSQC của hợp chất VL2 ........................................................................................ 75

Hình 3.20. Phổ HMBC của hợp chất VL2 ....................................................................................... 76

Hình 3.21. Phổ COSY của hợp chất VL2 ......................................................................................... 76

Hình 3.22. Phổ NOESY của hợp chất VL2 ...................................................................................... 77

Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của VL3 và hợp chất tham khảo (VL2) ......................................... 77

Hình 3.24. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất VL3 ......................................... 78

Hình 3.25. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VL3 ............................................................................... 80 Hình 3.26. Phổ 1H-NMR của hợp chất VL3 .................................................................................... 80 Hình 3.27. Phổ 13C-NMR của hợp chất VL3 ................................................................................... 81

Hình 3.28. Phổ DEPT của hợp chất VL3 ......................................................................................... 81

Hình 3.29. Phổ HSQC của hợp chất VL3 ........................................................................................ 82

Hình 3.30. Phổ HMBC của hợp chất VL3 ....................................................................................... 82

Hình 3.31. Phổ COSY của hợp chất VL3 ......................................................................................... 83

Hình 3.32. Phổ ROESY của hợp chất VL3 ...................................................................................... 83

Hình 3.33. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL4 ....................... 84

Hình 3.34. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VL4 ............................................................................... 85

Hình 3.35. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL5 ....................... 86

Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của hợp chất VL6 .............................................................................. 87

Hình 3.37. Cấu trúc hóa học của hợp chất VL7 .............................................................................. 88

Hình 3.38. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL8 ....................... 89

Hình 3.39. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL9 ....................... 91

Hình 3.40. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL10 .................... 93

Hình 3.41. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL11 .................... 95

Hình 3.42. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL12 .................... 97

Hình 3.43. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT1 và hợp chất tham khảo .................................... 98

Hình 3.44. Các tương tác HMBC chính của hợp chất VT1 .......................................................... 99

Hình 3.45. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VT1 ............................................................................. 101 Hình 3.46. Phổ 1H-NMR của hợp chất VT1 .................................................................................. 101 Hình 3.47. Phổ 13C-NMR của hợp chất VT1 ................................................................................. 102

Hình 3.48. Phổ DEPT của hợp chất VT1 ....................................................................................... 102

Hình 3.49. Phổ HSQC của hợp chất VT1 ...................................................................................... 103

Hình 3.50. Phổ HMBC của hợp chất VT1 ..................................................................................... 103

Hình 3.51. Cấu trúc hóa học của VT2 và hợp chất tham khảo ................................................... 104

Hình 3.52. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất VT2 ....................... 106

Hình 3.53. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VT2 ............................................................................. 107 Hình 3.54. Phổ 1H-NMR của hợp chất VT2 .................................................................................. 107 Hình 3.55. Phổ 13C-NMR của hợp chất VT2 ................................................................................. 108

Hình 3.56. Phổ HSQC của hợp chất VT2 ...................................................................................... 108

xii

Hình 3.57. Phổ HMBC của hợp chất VT2 ..................................................................................... 109

Hình 3.58. Phổ COSY của hợp chất VT2 ....................................................................................... 109

Hình 3.59. Phổ ROESY của hợp chất VT2 .................................................................................... 110

Hình 3.60. Phổ CD của hợp chất VT2 trong MeOH .................................................................... 110

Hình 3.61. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT3 ..................... 111

Hình 3.62. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT4 ..................... 113

Hình 3.63. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT5 ..................... 115

Hình 3.64. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT6 ............................................................................ 117

Hình 3.65. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT7 ..................... 117

Hình 3.66. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT8 ..................... 119

Hình 3.67. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT9 ............................................................................ 121

Hình 3.68. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT10 .................. 121

Hình 3.69. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT11 ......................................................................... 123

Hình 3.70. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT12 ......................................................................... 123

Hình 3.71. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT13 ......................................................................... 124

Hình 3.72. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT14 .................. 125

Hình 3.73. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT16 .................. 126

Hình 3.74. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm của các hợp chất VL1-VL12 .................... 129

Hình 3.75. Tác dụng kháng virus CVB3 của các hợp chất VT1-VT16 ..................................... 132

Hình 3.76. Tác dụng kháng virus HRV1B của các hợp chất VT1-VT16 .................................. 132

Hình 3.77. Tác dụng kháng virus EV71 của các hợp chất VT1-VT16 ...................................... 133

MỞ ĐẦU

Việt Nam có vị trí địa lý nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, địa hình

nhiều đồi núi chia cắt nên điều kiện khí hậu rất đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu

khá đặc trưng. Những yếu tố trên đã tạo nên những hệ sinh thái, thảm thực vật nhiệt

đới phong phú và phát triển với khoảng 12 000 loài, trong đó có khoảng 1/3 trên tổng

số loài được nhân dân ta dùng làm thuốc. Nhiều loài từ xa xưa được sử dụng trong y

học cổ truyền và các mục đích khác phục vụ đời sống của con người đã trở nên quen

thuộc như: mật nhân (Eurycoma longifolia), khổ qua (Momordica charantia), đương

quy (Angelica sinensis), ba kích (Morinda oficinalis), bông mã đề (Plantago major),

sâm (Panax vietnamensis), tam thất (Panax pseudoginseng), nghệ (Curcuma

longa),…. Cho đến nay, hàng trăm cây thuốc đã được khoa học y - dược hiện đại

chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng.

Trong vài thập kỉ trở lại đây, xu hướng đi sâu nghiên cứu các cây thuốc và

động vật làm thuốc để tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao nhằm

sản xuất các loại thuốc có giá trị cao phục vụ cuộc sống ngày càng được các nhà khoa

học trên thế giới quan tâm. Với sự trợ giúp của các phương pháp phổ (như phổ cộng

hưởng từ, phổ khối,..) đã xuất hiện nhiều công trình nghiên cứu về các nhóm cây có

ích, trong đó có nhóm cây có hoạt tính sinh học.

Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam, nhiều loài thuộc chi Đẻn (Vitex) có công

dụng chữa các bệnh như: cảm mạo, sốt rét, chóng mặt, nhức đầu, viêm ruột, rối loạn

tiêu hóa, ho, hen suyễn, trị bệnh ngoài da,...[1]. Các nghiên cứu về thành phần hóa

học các loài thuộc chi Vitex cho thấy chi này chứa đa dạng các lớp chất như: terpenoid,

flavonoid, ecdysteroid, lignan,... Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy

dịch chiết và các hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi này có các hoạt tính đáng

quan tâm như: gây độc tế bào ung thư, kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxi hóa, ....

Tuy vậy, những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

các loài thuộc chi Vitex ở Việt Nam còn rất hạn chế. Tính đến nay, ở Việt Nam mới

chỉ có khoảng 5 công trình nghiên cứu về thành phần hóa học một số loài thuộc chi

Vitex [2-6], chưa có công bố nào về hoạt tính sinh học các loài thuộc chi này.

Chính vì vậy, nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học các loài thuộc chi Vitex ở Việt Nam tạo cơ sở khoa học trong việc sử

dụng bền vững tài nguyên cây thuốc này, đồng thời tạo tiền đề cho những nghiên cứu

tiếp theo trong việc tạo ra các chế phẩm có hoạt tính sinh học cao phục vụ công tác

bảo vệ, chăm sóc sức khỏe cộng đồng, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành

phần hóa học và hoạt tính sinh học loài Vitex limonifolia Wall. Ex C.B.Clark và

Vitex trifolia L.”.

Mục tiêu của luận án:

Xác định thành phần hóa học chủ yếu của lá hai loài Vitex limonifolia Wall. Ex

C.B.Clark và Vitex trifolia L. ở Việt Nam.

Đánh giá hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp

chất phân lập được.

Nội dung luận án bao gồm:

1. Phân lập các hợp chất từ lá loài V. limonifolia và V. trifolia ở Việt Nam bằng

các phương pháp sắc ký;

2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương

pháp vật lý, hóa học;

3. Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập được từ loài

V. limonifolia;

4. Đánh giá hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất phân lập được từ loài

V. limonifolia và V. trifolia.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về chi Vitex

1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Vitex

Chi Vitex (Đẻn) thuộc họ Verbenaceae (Cỏ roi ngựa), bộ Lamiales (Hoa môi),

lớp Magnoliapsida (Hai lá mầm), ngành Magnoliophyta (Mộc lan) [1]. Chi Vitex trên

thế giới có khoảng 250 loài phân bố chủ yếu tại các quốc gia thuộc khu vực nhiệt đới

và cận nhiệt đới thuộc hai bán cầu [7]. Các loài trong chi Vitex rất đa dạng, từ cây bụi

tới cây gỗ trung bình, cao khoảng từ 1 m tới 35 m. Lá thường mọc đối, kép chân vịt,

thường có 3 hay 5 lá chét; lá chét có mép nguyên hay xẻ răng cưa. Cuống chung dài

3-5 cm, hơi phình ở gốc, mặt trên lõm, màu xanh, rất nhiều lông mịn. Hoa lưỡng tính,

cụm hoa ở đỉnh cành hay ở nách lá phía đỉnh cành, gồm các xim 2 ngả hay 3 ngả hợp

thành hình chùy, hình tháp hay hình ngù. Quả hạch gần hình cầu hay hình trứng, vỏ

quả trong hóa gỗ cứng, vỏ quả giữa nạc, thường 1-2 hạt [7].

Ở Việt Nam, chi Vitex đã ghi nhận được 20 loài [1, 7] (Bảng 1.1). Chúng được

phân bố khá rộng rãi từ bắc đến nam, tìm thấy ở cả địa hình vùng cao lẫn vùng ven

biển.

Mạn kinh Từ bi biển Ngũ trảo

(V. trifolia) (V. rotundifolia) (V. negundo)

Mẫu kinh năm cánh Bình linh vàng chanh

(V. quinata) (V. limonifolia) Chân chim ba lá (V. tripinnata)

Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Vitex

Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Vitex ở Việt Nam

Tên khoa học

Tên tiếng Việt Đẻn lông, Mẫu kinh lông tro Đẻn nhẵn

TT 1 V. canescens Kurz 2 V. helogiton K. Chum. synonym V.

Ngũ trảo, Hoàng kinh, Chân chim Mẫu kinh, Ngũ trảo lá có răng San trắng, Cây chân vịt

Bình linh cánh, Cây nàng, Suông gia Mẫu kinh núi, Mẫu kinh năm lá, Đẹn năm lá Mẫu kinh núi lông ngắn, Mạn kinh lông

glabrata 3 V. negundo L. 4 V. negundo L. var. cannabifolia 5 V. penduncalaris Wall. Ex Schauer 6 V. pinnata L. synonym V. pubescens Vahl Bình linh lông, Cây năng 7 V. pinnata L. var. ptilota 8 V. quinata (Lour.) F. N. Williams 9 V. quinata (Lour.) Williams var. puberula

Moldenke

10 V. rotundifolia L. synonym V. ovata

Bình linh xoan, Từ bi biển, Quan âm biển, Mạn kinh lá đơn Mạn kinh, Đẹn ba lá, Quan âm Mắt cáo, Chân chim ba lá

Bình linh vàng chanh Đẻn lông nhung Bình linh piere Bình linh vòi dài Bình linh nghệ Đẻn dài, Bình linh đá Đẻn lá như giấy

Thunb. 11 V. trifolia L. 12 V. tripinnata (Lour.) Merr. 13 V. tripinnata var evrardii (P. Dop) Phuong Chân chim evrard 14 V. limonifolia Wall ex C.B.Clark 15 V. vestita Wall ex Schauer 16 V. pierrei Craib 17 V. stylosa P. Dop 18 V. ajugaeflora P. Dop 19 V. pierreana Dop 20 V. pierreana var chartacea Dop

1.1.2. Công dụng của các loài thuộc chi Vitex

1.1.2.1. Tình hình sử dụng trong y học cổ truyền các loài thuộc chi Vitex

Trên thế giới, từ thời cổ đại, con người đã sử dụng nhiều loài thuộc chi Vitex

để chữa nhiều bệnh khác nhau như: đau khớp, co giật, giảm sốt, các bệnh về đường

hô hấp, kháng lao, kháng u hay điều hòa kinh nguyệt [8]. Ở Ấn Độ, lá loài V. trifolia

được sử dụng trong giảm đau, kháng viêm, chống co giật; vỏ loài V. peduncularis

làm thuốc đắp ngoài trị đau ở vùng ngực; nước hãm lá hoặc vỏ rễ, vỏ cành non được

dùng trị sốt rét và bệnh sốt đen Ấn Độ,…. Loài V. angus-catus được người Thổ Nhĩ

Kì sử dụng trong các bài thuốc về tiêu hóa, lợi tiểu và chữa nấm. Ở Trung Quốc, rễ

loài V. canescens được dùng trị ngoại cảm, phong hàn, sốt rét, giun kim; lá loài V.

negundo dùng trị cảm mạo, viêm ruột, trị lỵ; rễ loài V. quinata dùng trị viêm khí quản,

háo suyễn, cam tích, phong thấp,.…[1].

Ở Việt Nam, nhiều loài Vitex cũng được sử dụng trong các bài thuốc dân gian

để chữa trị một số bệnh thông dụng [1]. Chẳng hạn, lá loài V. negundo dùng để trị

nhức mỏi gân cốt, trị sốt; quả, hạt sắc nước tác dụng điều hòa kinh nguyệt, giảm đau

đầu, trị cảm mạo, sốt rét, đau dạ dày. Loài V. quinata dùng để nấu nước thay trà uống

làm ngon miệng; rễ trị viêm thanh quản; lá trị phong thấp, cảm mạo. Lá non loài V.

pinata phối hợp với lá phèn đen, cối xay, hương nhu trắng, giã uống chữa trúng

phong....

1.1.2.2. Công dụng khác của các loài thuộc chi Vitex

Tinh dầu Vitex có mùi cam chanh nên được sử dụng làm nguyên liệu trong

sản xuất xà phòng, nước lau nhà, nước khử mùi, chất giữ ẩm. Ở Ấn Độ, một số loài

thuộc chi Vitex được trồng quanh nhà để chống rắn. Các loài thuộc chi Vitex còn được

dùng để diệt côn trùng, rệp. Ngoài ra, Vitex còn được dùng như gia vị trong nấu ăn,

chuẩn bị thực phẩm.

1.1.3. Giới thiệu về loài V. limonifolia và loài V. trifolia

1.1.3.1. Loài V. limonifolia

Tên khoa học: Vitex limonifolia Wall. ex C.B.Clarke.

Tên thường gọi: Bình linh vàng chanh

Chi: Vitex

Họ: Verbenaceae

Mô tả về thực vật: Cây gỗ nhỏ, cao 8-10 m. Cành non có lông tơ dày màu

nâu nhạt. Lá mọc đối, kép chân vịt, 3-5 lá chét; cuống chung dài 5-7 cm, có lông, có

cánh rộng tới 20-25 mm, mép cánh song song, chóp thót lại, gốc đỉnh tim. Lá chét

hình bầu dục, hình trứng, hình trứng ngược hay hình ngọn giáo; chóp lá nhọn hay có

mũi nhọn dài; gốc nhọn; mép nguyên; mặt trên có lông rải rác và nháp; mặt dưới có

lông mềm màu nâu nhạt; cuống lá chét rất ngắn. Cụm hoa hình chùy ở đỉnh cành,

gồm các bông hoa dài, gián đoạn, có lông màu vàng. Lá bắc dạng lá, hình mũi mác;

lá bắc nhỏ dài 6-7 mm. Đài hình chuông, dài 2,5-3 mm, có lông phía ngoài, 5 thùy

nhỏ, nhọn. Tràng màu trắng ngà, dài 6 mm, nhẵn ở phía ngoài, có lông ở họng, 2 môi:

môi trên 2 thùy tròn, ngắn, cong và hơi lõm; môi dưới 3 thùy với thùy giữa lớn. Nhị

4, thò khỏi ống tràng; chỉ nhị nhẵn, đính ở phía trên ống tràng. Bầu gần hình cầu có

lông ở đỉnh; vòi dài bằng nhị, đỉnh xẻ 2 thùy ngắn. Quả có hình cầu, có lông rải rác,

đường kính 4-6 mm, mang đài bao gần nửa quả [7].

Phân bố: Loài V. limonifolia thường gặp ở vùng rừng hỗn giao, rừng thưa

hoặc ven rừng. Ở Việt Nam, loài này được tìm thấy ở Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh

Thuận. Ngoài ra còn có ở Ấn Độ, Mianma, Lào, Campuchia, Thái Lan [7].

1.1.3.2. Loài V. trifolia

Tên khoa học: Vitex trifolia Linn.

Tên thường gọi: Mạn kinh

Chi: Vitex

Họ: Verbenaceae

Mô tả về thực vật: Loài V. trifolia L. là cây bụi lớn hoặc cây gỗ nhỏ. Cành

non có 4 cạnh, có lông mềm, màu xám nhạt; cành già tròn, nhẵn, màu nâu. Lá kép

mọc đối, 3 lá chét (lá ở gần ngọn có hoa thường đơn), lá chét hình trứng, gốc tròn,

đầu tù hoặc hơi nhọn, mép nguyên, mặt trên nhẵn và đen lại khi khô, mặt dưới phủ

đầy lông trắng, lá chét giữa lớn hơn; lá vò ra có mùi thơm; cuống lá dài 1-3 cm. Cụm

hoa là một chùy tận cùng, đôi khi có lá ở gốc, có lông dày; mang nhiều xim mọc đối,

mỗi xim có 2-3 hoa tím nhạt hoặc lam nhạt; lá bắc nhỏ, hình dài; đài hình chuông, có

lông trắng, 5 răng nhỏ đều; tràng hình trụ có lông ở mặt ngoài trừ phần gốc, môi trên

có 2 thùy ngắn, môi dưới 3 thùy, thùy giữa lớn hơn hai thùy bên; nhị 4, thò ra ngoài,

chỉ nhị có lông ở phía dưới, bao phấn 2 ô dãng ra. Quả hạch, hình cầu đường kính 5-

6 mm, khi chín có màu đen. Mùa hoa quả: tháng 5-7 [7, 9].

Phân bố: Loài V. trifolia phân bố rải rác ở khắp các tỉnh vùng núi thấp xuống đến

trung du, đôi khi gặp cả ở đồng bằng. Độ cao phân bố thường dưới 100 m [9]. Cụ thể,

thường gặp loài mạn kinh ở Quảng Ninh, Hà Nội, Thanh Hóa, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng,

Quảng Nam vào tới Tiền Giang [1]. Ngoài ra còn có ở Ấn Độ, Trung Quốc, Lào,

Campuchia, Thái Lan, Malayxia và một số nước châu Á khác [7].

Công dụng: Mạn kinh có vị đắng, tính mát. Theo kinh nghiệm dân gian, mạn

kinh được dùng làm thuốc chữa cảm mạo, sốt, đau đầu, nhức thái dương, nhức mắt,

tối tăm mặt mũi. Ở Philippin, người ta dùng dịch chiết từ lá chữa bệnh lao. Ở Ấn Độ,

hoa, lá, rễ được dùng làm thuốc hạ sốt, chống nôn, quả chữa vô kinh. Ở Malaysia,

nhân dân dùng mạn kinh chữa nhiều bệnh. Quả mạn kinh tán nhỏ cho vào kho thóc

gạo hoặc tủ quần áo để trừ côn trùng [9].

1.1.4. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Vitex

Theo thống kê, đến nay mới có khoảng 28 loài thuộc chi Vitex đã được nghiên

cứu về thành phần hóa học, bao gồm: V. agnus-castus, V. altissima, V. canescens, V.

cannabifolia, V. cymosa, V.divaricata, V. doniana, V. fisherii, V. glabrata, V.

leptobotrys, V. leucoxylon, V. limonifolia, V. littoralis (V. lucens), V.madiensis, V.

megapotamica, V. negundo, V. peduncularis, V. pubescence (V. pinnata), V.

polygama, V. pseudo-negundo, V. rehmanni, V. rotundifolia V. rotundiforia, V.

scabra, V. sereti, V. strickeri, V. thyrsiflora và V. trifolia [8, 10]. Kết quả từ các công

trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước cho thấy, thành phần hóa học của các

loài trong chi Vitex khá đa dạng, nhưng chủ yếu là các hợp chất terpenoid, flavonoid,

iridoid, ecdysteroid, lignan,….

1.1.4.1. Các hợp chất triterpennoid

Các hợp chất thuộc loại triterpenoid phân lập từ chi Vitex chủ yếu là các hợp

chất thuộc khung ursane (1-17) (Bảng 1.2, Hình 1.2), oleanane (18-24) (Bảng 1.3,

Hình 1.3) và lupane (25-29) (Bảng 1.4, Hình 1.4).

Các hợp chất khung ursane

3β-hydroxy-11-oxours-12-ene

Bảng 1.2. Các hợp chất khung ursane từ chi Vitex

Bộ phận cây Loài Vitex Lá

TLTK [11]

KH Tên chất 1

Quả

[12]

trifolia var.

2

3β-hydroxy-30-al-urs-12-en-28-oic acid 2α-hydroxyursolic acid

Hạt

[13, 14]

3

tormentic acid ursolic acid acetate negundonorin A negundonorin B 3-epicorosolic acid 2β,3β,19α-hydroxyursolic acid uvaol ursolic acid 3-epiursolic acid

Lá Lá Hạt Hạt Hạt Lá Thân lá Hạt Lá cành

trifolia var.

[14] [15] [16] [16] [16] [17] [18] [19] [20]

4 5 6 7 8 9 10 11 12

vitexnegheteroin H

Hạt

[13]

13

2α,3α-hydroxyursolic acid 2α,3β-hydroxyursolic acid

Lá Lá

V. negundo var. heterophylla V. simplicifolia V. negundo var. heterophylla V. peduncularis V. trifolia V. negundo V. negundo V. negundo V. cymosa V. cauliflora V. negundo V. simplicifolia V. negundo var. heterophylla V. cymosa V. cymosa

[17] [17]

14 15

Bộ phận cây Loài Vitex Lá

TLTK [21]

KH Tên chất 16

V. negundo var. cannabifolia

Lá

V. cymosa

[17]

2α,3α,19α,24-tetrahydroxyurs-12- en-28-oic acid β-D-glucopyranosyl ester 28-O-glucosyl-2α,3α,19α- hydroxyursolic acid ester

17

Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất khung ursane từ chi Vitex

Các hợp chất khung oleanane và friedelane

oleanolic acid 2α,3β-hydroxyoleanolic acid 2α,3α-hydroxyoleanolic acid vulgarsaponin A

Bảng 1.3. Các hợp chất khung oleanane và friedelane từ chi Vitex

TLTK [19] [17] [17] [21]

KH Tên chất 18 19 20 21

Lá

[21]

22 Bộ phận cây Loài Vitex V. negundo Hạt V. cymosa Lá V. cymosa Lá V. negundo var. Lá cannabifolia V. negundo var. cannabifolia

2α,3α,19α,24-tetrahydroxyolea-12- en-28-oic acid β-D-glucopyranosyl ester 3α-friedelinol 3β-friedelinol

Lá Lá

V. peduncularis V. peduncularis

[22] [22]

23 24

Hình 1.3. Cấu trúc các hợp chất khung oleanane và friedelane từ chi Vitex

Các hợp chất khung lupane

lupeol

Bảng 1.4. Các hợp chất khung lupane từ chi Vitex

Bộ phận cây Loài Vitex Lá, cành

TLTK [20]

KH Tên chất 25

betulinic acid

Lá, cành

[19, 20]

26

V. trifolia var. simplicifolia V. trifolia var. simplicifolia V. negundo V. negundo V. trifolia

[19] [19] [15]

obtusalin lup-20(29)-en-3β,30-diol platanic acid

Hạt Hạt Lá

27 28 29

Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất khung lupane từ chi Vitex

1.1.4.2. Các hợp chất ecdysteroid

Theo các tài liệu công bố, từ các loài chi Vitex, có khoảng 29 hợp chất

ecdysteroid (30-58) được phân lập (Bảng 1.5, Hình 1.5).

Bảng 1.5. Các hợp chất ecdysteroid từ chi Vitex

TLTK [23] Vitex schiliebenii [24] Vitex scabra [25] Vitex doniana [25] Vitex doniana [25] Vitex doniana [25] Vitex doniana [25] Vitex doniana [24] Vitex scabra [25] Vitex doniana Vitex doniana [25] Vitex agnus-castus [26] [24] Vitex scabra [24] Vitex scabra [24] Vitex scabra [24] Vitex scabra [27] Vitex cymosa [24] Vitex scabra [24] Vitex scabra [28] Vitex canescens [24] Vitex scabra [28] Vitex canescens

KH Tên chất 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

Vitex canescens Vitex canescens Vitex strickeri

[28] [29] [30]

Rễ Rễ Rễ

-20,22-

51 52 53

Bộ phận cây Loài Vitex Rễ 20-hydroxyecdysone Rễ 20,26-dihydroxyecdysone 21-hydroxyshidasterone Rễ 11β-hydroxy-20-deoxyshidasterone Rễ shidasterone Rễ 2,3-acetonide-24-hydroxyecdysone Rễ Rễ ajugasterone C Rễ scabrasterone Rễ 24-hydroxyecdysone Rễ 11β,24-hydroxyecdysone Lá viticosterone E Rễ pterosterone Rễ 24-epi-makisterone A Rễ polypodine B Rễ pinnatasterone Rễ 26-hydroxypinnatasterone Rễ 11α-hydroxyecdysone Rễ turkesterone Rễ abutasterone Rễ 24-epi-abutasterone Rễ (24R)-11α,20,24- trihydroxyecdysone 11α,20,26-trihydroxyecdysone canescensterone ajugasterone monoacetonide 24(28)-dehydromakisterone A

Thân, lá Thân, lá Thân, lá Vỏ cây

V. lebototrys V. lebototrys V. lebototrys Vitex glabrata

[2] [2] [2] [31]

54 55 makisterone A 56 57

2-deoxy-20-hydroxyecdysone 7,8-dihydro-8α-20- hydroxyecdysone calonysterone

Rễ

Vitex scabra

[24]

58

Hình 1.5. Cấu trúc của các hợp chất ecdysteroid từ chi Vitex

1.1.4.3. Các hợp chất labdane-diterpennoid

Diterpenoid là một lớp chất quan trọng của chi Vitex. Trong đó đại đa số là các

hợp chất diterpenenoid khung labdane, một số ít thuộc khung norlabdane và một vài

hợp chất thuộc khung halimane, abietane, clerodance. Bảng 1.6, Hình 1.6 dưới đây là

tổng hợp 74 hợp chất khung labdane (59-132) được phân lập từ chi Vitex.

Bảng 1.6. Các hợp chất khung labdane từ chi Vitex

Tên chất

negundoin D

Bộ phận cây Loài Vitex Lá

TLTK [11, 32]

KH 59

Quả Quả

V. negundo var. heterophylla V. rotundifolia V. rotundifolia

[33] [34]

60 61

Quả

vitrifolin B 9,13-epoxy-16-norlabda-13E-en-15- al viteagnusin F

62

Quả

viteagnusin G

63

Quả Quả

3S,5S,8R,9R,10S)-3,9-

V. rotundifolia V. agnus-castus V. rotundifolia V. agnus-castus V. rotundifolia V. rotundifolia

[34] [35] [34] [35] [34] [34]

64 65

Quả Quả

5S,6R,8R,9R,10S,13S,16R)-6-

V. rotundifolia V. agnus-castus

[34] [36]

66 67

5S,6R,8R,9R,10S,13S,16S)-6-

Quả

68

V. agnus-castus V. rotundifolia

[36] [37]

5S,6R,8R,9R,10S,13S)-6-

Quả

69

V. agnus-castus V. rotundifolia

[36] [37]

5S,6R,8R,9R,10S,13R,16R)-6-

Quả

V. agnus-castus

[36]

70

5S,6R,8R,9R,10S,13R,16S)-6-

Quả

V. agnus-castus

[36]

71

viterotulin A (rel dihydroxy-13(14)-labden-16,15- olide viterotulin B (rel acetoxy-9,13-epoxy-16-methoxy- labdan-15,16-olide (rel acetoxy-9,13-epoxy-16-methoxy- labdan-15,16-olide (rel acetoxy-9,13-epoxy-15-methoxy- labdan-16,15-olide (rel acetoxy-9,13-epoxy-16-methoxy- labdan-15,16-olide (rel acetoxy-9,13-epoxy-16-methoxy- labdan-15,16-olide

Tên chất

5S,6R,8R,9R,10S,13R)-6-

Bộ phận cây Loài Vitex Quả

KH 72

V. agnus-castus V. rotundifolia

TLTK [36] [37]

5S,6R,8R,9R,10S,13R,15R)-6-

Hạt Hạt Hạt Hạt Quả

V. negundo V. negundo V. negundo V. negundo V. agnus-castus

[32] [32] [32] [32] [35]

73 74 75 76 77

5S,6R,8R,9R,10S,13R,15S)-6-

Quả

V. agnus-castus

[35]

78

5S,6R,8R,9R,10S,13S,15S)-6-

Quả

V. agnus-castus

[35]

79

5S,6R,8R,9R,10S,13S,15R)-6-

Tên chất

viteagnuside A

Bộ phận cây Loài Vitex Lá

TLTK [11]

KH 99

Hạt

[13]

100 vitexilactone C

Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Quả Quả

V. negundo var. heterophylla V. negundo var. heterophylla V. vestita V. vestita V. vestita V. vestita V. vestita V. vestita V. vestita V. rotundifolia V. agnus-castus

[42] [42] [42] [42] [42] [42] [42] [33] [43]

101 vitexolide A 102 12-epivitexolide A 103 vitexolide B 104 vitexolide C 105 vitexolide D 106 vitexolide E 107 acuminolide 108 vitexlactam A 109 9α-hydroxy-13(14)-labden-16,15-

Lá Lá Quả Quả

V. vestita V. vestita V. agnus-castus V. rotundifolia

[42] [42] [43] [34]

amide 110 vitexolin A 111 vitexolin B 112 113

rotundifuran (rel 5S,6R,8R,9R,10S)-6-acetoxy-9- hydroxy-13(14)-labden-16,15-olide

isolophanthin A

Quả Quả Quả Quả Lá

V. rotundifolia V. agnus-castus V. rotundifolia V. rotundifolia V. trifolia

[34] [43] [34] [34] [44]

114 13-epi-2-oxokolavelool 115 epimanoyl oxide 116 117 vitedoin B 118 6α,7α-diacetoxy-13-hydroxy-

8(9),14-labdadien

Lá

V. trifolia

[44]

119 9-hydroxy-13(14)-labden-15,16-

Quả Quả Quả Hạt Thân, lá

V. agnus-castus V. agnus-castus V. agnus-castus V. negundo V. cauliflora

[35] [36] [36] [19] [18]

olide 120 viteagnusin H 121 viteagnusin C 122 8-epi-sclareol 123 vitexilactone B 124 3-oxo,15,17,18-triacetoxy-labda-

limonidilactone

Quả Quả Quả Quả Lá Quả Quả Quả

V. trifolia V. trifolia V. trifolia V. trifolia V. limonifolia V. trifolia V. trifolia V. trifolia

[38] [38] [38] [38] [40] [41] [41] [41]

7,13E-diene 125 vitetrifolin I 126 vitetrifolin D 127 vitetrifolin E 128 vitetrifolin F 129 130 vitextrifolin C 131 vitextrifolin D 132 vitextrifolin E

Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất khung labdane từ chi Vitex

1.1.4.4. Các hợp chất lignan và neolignan

Tổng hợp các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học, cho thấy có 42

hợp chất khung lignan và neolignan (133-174) được phân lập từ chi Vitex. Tên gọi và

cấu trúc của những hợp chất này được liệt kê ở Bảng 1.7, Hình 1.7.

Bảng 1.7. Các hợp chất lignan và neoligan từ chi Vitex

Tên chất

Bộ phận cây Loài Vitex Lá

TLTK [21]

KH 133 cannabilignin

isocannabilignin

Lá

[21]

134

fiscusesquilignan A (+)-sesamin

Lá, cành Lá, cành Quả Hạt Lá

135 vitexkarinol 136 neopaulownin 137 138 139 9R-hydroxy-D-sesamin

[3] [3] [34] [45] [21] [13]

(+)-pinoresinol

140

(+)-diasyringaresinol (+)-paulownin

Hạt Rễ Quả Rễ Hạt Hạt Lá Quả Quả

V. negundo var. cannabifolia V. negundo var. cannabifolia V. leptobotrys V. leptobotrys V. rotundifolia V. negundo V. negundo var. cannabifolia V. negundo var. heterophylla V. negundo V. negundo V. cannabifolia V. negundo V. negundo V. negundo V. altissima V. rotundifolia V. rotundifolia

[45] [46] [47] [46] [45] [45] [48] [34] [34]

141 142 143 vitelignin A 144 altissinone 145 146

Quả Quả Quả Hạt

[34] [34] [34] [13]

(+)-lariciresinol (7S,8R)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 147 viterolignan A 148 viterolignan B ficusal 149 150 vitexnegheteroin E

Hạt

[13]

151 vitexnegheteroin F

152 vitecannaside B

153 6-hydroxy-4-(4-hydroxy-3-

Hạt Quả Hạt Quả

V. rotundifolia V. rotundifolia V. rotundifolia V. negundo var. heterophylla V. negundo var. heterophylla V. negundo var. heterophylla V. cannabifolia V. negundo var. heterophylla V. cannabifolia

[13] [47] [13] [47]

methoxyphenyl)-3-hydroxymethyl- 7-methoxy-3,4-dihydro-2- naphthaldehyde

Hạt

154 vitedoin A

Hạt

[13] [47] [13]

155 vitexdoin A

Quả

[49]

156 6-hydroxy-4-(4-hydroxy-3-

V. negundo var. heterophylla V. cannabifolia V. negundo var. heterophylla V. negundo var. cannabifolia

methoxyphenyl)-3-acetoxymethyl-7- methoxy-3,4-dihydro-2- naphthaldehyde

157 vitexdoin F

Hạt Hạt

V. negundo var. cannabifolia V. negundo

[50] [51]

Tên chất

Bộ phận cây Loài Vitex Quả Hạt

TLTK [47] [13]

KH 158 vitecannaside A 159 vitexnegheteroin G

160 vitexdoin G 161 vitexdoin H 162 vitexdoin I 163 detetrahydroconidendrin

164 vitedoamine A 165 vitrofolal E

166 vitrofolal F

Hạt Hạt Hạt Quả Quả Hạt Hạt Quả Hạt Quả Hạt Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ

V. cannabifolia V. negundo var. heterophylla V. negundo V. negundo V. negundo V. rotundifolia V. cannabifolia V. negundo V. negundo V. cannabifolia V. negundo V. cannabifolia V. negundo V. rotundifolia V. rotundifolia V. negundo V. negundo V. negundo

[51] [51] [51] [52] [47] [53] [53] [47] [53] [47] [53] [54] [54] [46] [46, 55] [46]

167 vitrofolal A 168 vitrofolal B 169 negundin A 170 negundin B 171 6-hydroxy-4-(4-hydroxy-3-

methoxy)-3-hydroxymethyl-7- methoxy-3,4-dihydro-2- naphthaledehyde (+)-lyoniresinol Rễ (+)-lyoniresinol-3α-O-β-D-glucoside Rễ Rễ

V. negundo V. negundo V. rotundifolia

[46, 55] [46] [56]

172 173 174 vitrofolal C

Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất lignan và neolignan từ chi Vitex

1.1.4.5. Các hợp chất flavonoid

Các nhà khoa học cũng đã xác định có 54 hợp chất flavonoid được phân lập

từ các loài thuộc chi Vitex (175-228) (Bảng 1.8, Hình 1.8).

Bảng 1.8. Các hợp chất flavonoid từ chi Vitex

Tên chất

TLTK

Bộ phận cây Loài Vitex Lá Lá Lá

V. peduncularis [14] [14] V. pinnata [57] V. simplicifolia

KH 175 vitecetin luteolin 176 177 2-(5-methoxyphenyl)-3,4,5,7,8- trihydroxychroman-4-one

Lá

V. simplicifolia

[57]

178 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-7- hydroxychromen-4-one

Lá

V. quinata [58] V. agnus-castus [59] [60] V. trifolia V. peduncularis [22]

179 5-hydroxy-7,4-dimethoxyflavanone 180 3-hydroxy-5,6,7,4-tetramethoxy flavone Thân, lá 181 persicogenin 182 4-acetoxy-5-hydroxy-6,7- dimethoxyflavone

Lá Lá Lá cành Lá cành Lá

V. peduncularis [22] V. peduncularis [22] [3] V. leptobotrys [3] V. leptobotrys [61] V. negundo

183 cirsimaritin 184 genkwanin tsugafolin 185 186 alpinetin 187 5-hydroxy-3,4,3,6,7- pentamethoxyflavone

isovitexin

Lá Lá Lá Lá Vỏ rễ

V. agnus-castus [35] V. peduncularis [14] V. peduncularis [14] [61] V. negundo V. negundo [62] V. agnus-castus [63]

188 5-hydroxy-3,4,6,7-tetramethoxyflavone Quả 189 vitexin 190 191 vitegnoside 192 193

6-C-(4-methyl-6-O-

luteolin-7-O-β-D-glucoside luteolin transcaffeoylglucoside) luteolin 6-C-(6-O-transcaffeoyl glucoside) Vỏ rễ luteolin 6-C-(2-O-transcaffeoyl glucoside) Vỏ rễ

isoschaftoside

isocarlinoside luteolin 7-O-(6-p-benzoyl glucoside)

Lá Lá Lá Lá Vỏ rễ Vỏ rễ

V. agnus-castus [63] V. agnus-castus [63] [64] V. polygama [64] V. polygama [64] V. polygama [64] V. polygama V. agnus-castus [63] V. agnus-castus [63]

194 195 196 schaftoside 197 198 carlinoside 199 200 201 4,5-dihydroxy-3,3,6,7-

tetramethoxyflavone isorhamnetin

Vỏ rễ Lá

V. agnus-castus [63] [57] V. simplicifolia

202 203 2-(5-methoxyphenyl)-4,5,7-trihydroxy-

3-methoxychromen-4-one

Lá Lá

V. simplicifolia V. simplicifolia

[57] [57]

3,7-

204 penduletin 205 2-(4-hydroxyphenyl)-5-hydroxy dimethoxy chromen-4-one

Lá

V. simplicifolia

[57]

206 2-(4-hydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy

chromen-4-one

[57] [65] [20]

Lá Quả Lá, cành

207 artemetin 208 5,3-dihydroxy-6,7,4-trimethoxyflavanone 209 casticin

Lá Lá

V. simplicifolia V. rotundifolia V. trifolia var. simplicifolia V. negundo V. negundo

[66] [66]

210 chrysoplenetin 211 chrysosplenol D

Tên chất

iso-orientin

TLTK [60] [17] [17] [17] [17] [17] [17] [17] [17] [67] [67] [67]

Bộ phận cây Loài Vitex KH V. trifolia Lá 212 vitexicarpin V. cymosa Lá 213 kampferol V. cymosa Lá 214 3-O-methylluteolin V. cymosa Lá 215 pachypodol V. cymosa Lá 216 apigenin V. cymosa Lá 217 orientin V. cymosa Lá 218 V. cymosa Lá 219 2-O-p-hydroxybenzoyl orienti V. cymosa Lá 220 2-O-caffeoyl orientin V. negundo Lá 221 3,5,6,7,3,4-hexamethoxyflavone V. negundo 222 5,3-diacetoxy-3,6,7,4-tetramethoxyflavone Lá V. negundo Lá 223 3-benzoyloxy-5-hydroxy-3,6,7,4-

Lá

V. negundo

[67]

Lá

V. negundo

[67]

Lá

V. negundo

[67]

tetramethoxyflavone 224 5,3-dibenzoyloxy-3,6,7,4- tetramethoxyflavone 225 5,3-dipropanoyloxy-3,6,7,4- tetramethoxyflavone 226 5,3-dibutanoyloxy-3,6,7,4- tetramethoxyflavone

Lá

V. negundo

[67]

227 5,3-dipent-4-enoyloxy-3,6,7,4-

Lá

V. negundo

[67]

tetramethoxyflavone 228 5,3-dihexanoyloxy-3,6,7,4- tetramethoxyflavone

Hình 1.8. Cấu trúc các hợp chất flavonoid từ chi Vitex

1.1.4.6. Các hợp chất iridoid

Hợp chất iridoid được tìm thấy trong một số loài thuộc chi Vitex như V. agnus-

catus, V. negundo, V. rotundifolia,... Kết quả từ các công trình nghiên cứu chỉ ra rằng,

có 18 hợp chất iridoid được phân lập từ chi Vitex (229-246) (Bảng 1.9, Hình 1.9).

Bảng 1.9. Các hợp chất iridoid từ chi Vitex

Bộ phận cây Loài Vitex Lá

TLTK [11]

KH Tên chất 229 10-p-hydroxybenzoyl-6β-

V. negundo var. heterophylla

1-O-β-D-(6-O-p-

hydroxyiridoid hydroxybenzoyl)glucopyranoside

230 agnusoside 231 agnuside

Hoa Hoa Vỏ cây Vỏ cây Hoa Lá

V. agnus-castus [68] [68] V. agnus-castus V. peduncularis [73] V. peduncularis [73] V. agnus-castus [68] [62] V. negundo

232 pedunculariside trans-eurostoside 233 234 1,4α,5,7α-tetrahydro-1-β-D-glucosyl-

7-(3,4- dihydroxybenzoyloxymethyl)-5- ketocyclopenta[c]pyran-4-carboxylic acid isonishindaside

Lá

V. cannubifolia [69]

235 TLTK Bộ phận cây Loài Vitex [62] V. negundo Lá V. negundo Lá [62] Quả V. cannabifolia [47] Cành có hoa V. agnus-castus [70] Cành có hoa V. agnus-castus [70] Cành có hoa V. agnus-castus [70] Cành có hoa V. agnus-castus [70]

KH Tên chất 236 nishindaside 237 negundoside 238 geniposide 239 agnucastoside C 240 aucubin 241 mussaenosidic acid 242 6-O-p-

hydroxybenzoylmussaenosidic acid

Cành có hoa V. agnus-castus [70] Cành có hoa V. agnus-castus [70] [71] Quả [17] Lá

V. rotundifolia V. cymosa

243 agnucastoside A 244 agnucastoside B iridolactone 245 246 viteoid II

Hình 1.9. Cấu trúc các hợp chất iridoid từ chi Vitex

1.1.4.7. Các hợp chất khác

Ngoài các chất đã nêu trên, người ta đã phân lập được một số hợp chất khác

(247-283) từ một số loài thuộc chi Vitex còn như: hợp chất phenolic, hợp chất

chalcone,… (Bảng 1.10, Hình 1.10).

Bảng 1.10. Các hợp chất khác từ chi Vitex

Bộ phận cây Loài Vitex Lá

TLTK [11]

KH Tên chất 247 4-hydroxyphenethanol 3-O-β-D-(6-O-

p-hydroxybenzoyl)glucopyranoside salviaplebeiaside

Lá

[11]

248

Hạt

[72]

[72]

255 breynioside A

Hạt

[72]

256 dunnianoside D

Hạt

[72]

257 1,6-di-O-4-hydroxybenzoyl-β-D-

glucopyranoside

Hạt

[72]

258 vitexfolin C

Lá Lá Quả

V. negundo var. heterophylla V. negundo var. heterophylla V. negundo var. heterophylla V. negundo var. heterophylla V. polygama V. polygama V. cannabifolia

[64] [64] [47]

caffeoyl 6-O-β-D-glucopyranoside 259 caffeoyl 6-O-α-D-glucopyranoside 260 261 4-(3,4-dihydroxyphenyl)-butan-2-

one-4-O-β-D-glucoside

Cành Hạt

[70] [72]

262 myzodendrone 263 vitexnegheteroin D

castusic acid chlorogenic acid

Hoa Hoa

γ-tocopherol

Thân, lá Thân, lá

[68] [68] [58] [73] [74]

264 265 266 dimethyl 3,4,3,4-tetrahydroxy--truxinate Lá 267 vitexcarpan 268

Thân, lá

[74]

269 α-tocoquinone

V. agnus-castus V. negundo var. heterophylla V. agnus-castus V. agnus-castus V. quinata V. agnus-castus V. negundo var. cannabifolia V. negundo var. cannabifolia

isochlorogenic acid A

Bộ phận cây Loài Vitex Hoa Lá Rễ Lá Rễ Lá

TLTK [68] [58] [23] [75] [23] [20]

KH Tên chất 270 271 methyl 3,4,5-O-tricaffeoyl quinate stigmasterol 272 stigmasterol glucoside 273 γ-sitosterol 274 275 β-sitosterol

Lá

[20]

276 β-daucosterol

V. agnus-castus V. quinata V. schiliebenii V. negundo V. schiliebenii V. trifolia var. simplicifolia V. trifolia var. simplicifolia V. leptobotrys

Lá

[3]

277 3-(4-hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-

V. leptobotrys V. leptobotrys V. leptobotrys V. leptobotrys V. leptobotrys V. leptobotrys

[2] [2] [2] [2] [2] [2]

trimethoxyphenyl)-2-propen-1-one Thân cardamomin 278 279 helichrysetin Thân 280 2,4-dihydroxy-4,6-dimethoxychalcone Thân 281 4,4-dihydroxy-2,6-dimethoxychalcone Thân 282 4-hydroxy-4,2,6-trimethoxychalcone Thân Thân 283 4,2,4,β-tetrahydroxy-6-methoxy-α,β-

dihydrochalcone

Hình 1.10. Cấu trúc các hợp chất khác từ chi Vitex

Như vậy: Tổng hợp các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy, thành phần

hoá học của các loài trong chi Vitex rất đa dạng và phong phú, góp phần tạo cơ sở

khoa học lý giải cho việc sử dụng các loài thuộc chi này để chữa bệnh trong y học cổ

truyền.

1.1.5. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Vitex

1.1.5.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Kết quả từ các công trình nghiên cứu trên thế giới về các loài thuộc chi Vitex

cho thấy dịch chiết nhiều loài Vitex thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung

thư. Theo Zhelev [76], tinh dầu từ quả của loài V. angus-castus trồng ở Bulgaria có

hoạt tính trên các dòng tế bào ung thư tuyến tụy (LS180), ung thư phổi (A549), ung

thư cổ tử cung (HeLa) với giá trị IC50 trong khoảng 0,12-0,25 g/mL, trong đó tác

dụng ức chế tốt nhất trên tế bào HeLa (IC50 = 0,12 g/mL). Theo một nghiên cứu

khác, tinh dầu từ quả loài V. agnus-catus mọc ở vùng Izmir, Thổ Nhĩ Kì thể hiện hoạt

tính tốt đối với dòng tế bào ung thư vú (MCF-7), ung thư phổi (A549) [77, 78]. Kết

quả nghiên cứu từ loài V. trifolia cũng cho thấy dịch chiết n-butanol tác dụng ức chế

sự phát triển dòng tế bào ung thư gan (HepG2) [79].

Các công trình công bố cũng cho thấy rằng, các hợp chất labdane có thể hiện

hoạt tính gây độc tế bào ung thư với các mức độ khác nhau [42]. Năm 2015, N. Corlay

và các cộng sự nghiên cứu dịch chiết dichloromethane từ lá loài V. vestita đã tách

được 9 hợp chất thuộc khung labdane, trong đó có 6 hợp chất mới 12-epivitexolide

A (102), vitexolide B (103), vitexolide C (104), vitexolin A (110), vitexolin B (111),

vitexolide E (106), và 3 hợp chất đã biết vitexolide A (101), vitexolide D (105),

acuminolide (107), đồng thời đánh giá hoạt tính trên dòng tế bào ung thư đại tràng

(HCT-116) và ung thư phổi (MRC-5). Kết quả cho thấy tất cả các hợp chất đều thể

hiện tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư HTC-116 (1 < IC50 < 10 μM),

trong khi đó, thí nghiệm tương tự trên dòng tế bào ung thư MCR-5 thì chỉ có hợp chất

101, 102, 105, 106 và 107 thể hiện tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư

với giá trị IC50 < 10 μM [42].

Năm 2009, tác giả Wu và cộng sự [38] từ dịch chiết của quả loài V. trifolia đã

phân lập được 2 hợp chất mới thuộc khung labdane là vitetrifolin H (81) và vitetrifolin

I (125) cùng với một số các hợp chất labdane. Các hợp chất này thể hiện tác dụng ức

chế sự phát triển tế bào ung thư cổ tử cung (Hela) với giá trị IC50 trong khoảng 4-28

μM, trong đó hợp chất 125 thể hiện tác dụng gây chết tế bào ung thư theo chương

trình (apoptosis). Một hợp chất diterpene khác khung labdane, rotundifuran (112)

được phân lập từ quả của loài V. rotundifolia đã được chứng minh có khả năng ức

chế tế bào ung thư máu (HL-60) với giá trị IC50 là 22,5 M [80].

Từ quả của loài V. trifolia var. simplicifolia, tác giả Huang [12] đã phân lập

được một hợp chất ursane mới là 3β-hydroxy-30-al-urs-12-en-28-oic acid (2) cùng 7

hợp chất triterpene đã biết khác. Những hợp chất này được đánh giá hoạt tính kháng

u trên các dòng tế bào ung thư HL-60, SGC-7901, PANC-1 và Eca-109, trong đó hợp

chất 2 thể hiện hoạt tính tốt nhất trên 4 dòng ung thư kể trên với các giá trị IC50 lần

lượt là 4,12, 10,46, 9,61 và 7,65 M.

Agnuside (231), một iridoid glycoside khá phổ biến trong nhiều loài Vitex như

V. agnus-catus [81], V. cymosa [17], V. negundo [62]. Hợp chất này thể hiện hoạt

tính gây độc tế bào ung thư với dòng tế bào ung thư đại tràng (Colo-320) với tỷ lệ

phần trăm sống sót sau 24 giờ đạt 76,1% (ở nồng độ 200 g/mL) và giá trị IC50 là

15,99 μg/mL [81].

EVn-50, một lignan có trong thành phần của loài V. negundo, đã được Xin và

cộng sự [82] phân lập và đánh giá hoạt tính cũng như cơ chế ức chế sự phát triển một

số dòng tế bào ung thư. Kết quả thu được EVn-50 thể hiện hoạt tính mạnh với các

dòng tế bào MDA-MB-435, SKOV-3, BXPC-3, SMMC-7721, MCF-7, HO-8910,

SGC-7901, BEL-7402, HCT-116 và 786-O với giá trị IC50 < 10 g/mL. Các tác giả

cũng phát hiện hợp chất này gây chết tế bào ung thư MDA-MB-435 theo cơ chế chết

theo chương trình.

Năm 2013, một flavonoid, castitin (209), được M. Y. Huang và cộng sự phân

lập từ lá, cành của loài V. trifolia var. simplicifolia, thể hiện hoạt tính gây độc tế bào

ung thư đối với tế bào ung thư tuyến tụy (PANC-1) và tế bào ung thư máu (K562)

với giá trị IC50 lần lượt là 4,67 và 0,72 μg/mL [20]. Người ta cũng tìm thấy hợp chất

này trong quả của loài V. rotundifolia [83]. Kết quả nghiên cứu cho thấy casticin gây

chết tế bào ung thư theo chương trình đối với hai dòng tế bào ung thư đại tràng (HT-

29 và HCT-116). Trong một nghiên cứu khác về dịch chiết từ quả của loài V.

rotundifolia [52], casticin thể hiện hoạt tính ức chế mạnh với các dòng tế bào ung thư

máu (K562, với giá trị IC50 = 0,21 μM), tế bào ung thư phổi (NCI H522, IC50 = 0,34

μM). Theo Kim và cộng sự [52], một flavonoid khác là 5,3-dihydroxy-6,7,4-

trimethoxyflavanone (208) đã thể hiện tác dụng gây độc đối với với hai dòng tế bào

ung thư máu K-562 (IC50 = 7,33 μM) và SR (IC50 = 4,82 μM). Ngoài ra, casticin còn

gây ức chế sự phát triển của tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 0,23 μM) [84].

Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Awale đã phát hiện dịch chiết methanol từ

quả của loài V. negundo thể hiện hoạt tính ức chế đối với tế bào ung thư tuyến tụy

(PANC-1) [66]. Từ dịch chiết này, hai flavonoid phân lập được là chrysoplenetin

(210) và chrysosplenol D (211) đã được đánh giá tác dụng ức chế sự phát triển tế bào

ung thư tuyến tụy (PANC-1) và cho kết quả IC50 lần lượt là 3,4 μg/mL và 4,6 μg/mL.

Hợp chất 210 cũng đã được đánh giá hoạt tính ức chế 39 dòng tế bào ung thư người

tại Trung tâm nghiên cứu ung thư Nhật Bản, kết quả cho thấy, hợp chất 210 thể hiện

tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư phổi (NCI-H522), ung thư

buồng trứng (OVCAR‐3) và ung thư tuyến tiền liệt (PC‐3) với giá trị IC50 lần lượt là

0,12, 0,18 và 0,17 μM [66].

Từ loài V. trifolia, Li và các cộng sự đã phân lập được sáu hợp chất flavonoid:

persicogenin (181), artemetin (207), luteolin (176), penduletin (204), chrysosplenol

D (211) và vitexicarpin (212) [60]. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của

những hợp chất này, các hợp chất 176, 204, 211, 212 thể hiện tác dụng ức chế sự phát

triển của tế bào ung thư tsFT210 với các giá trị IC50 lần lượt là 10,7, 19,8, 3,5 và 0,3

μg/mL. Ngoài ra, hợp chất 212 còn có khả năng gây chết tế bào ung thư theo chương

trình đối với tế bào ung thư máu (K562).

Luteolin (176), một flavonoid được J. Kobayakawa và cộng sự phân lập từ quả

của loài V. rotundifolia cũng như tìm thấy ở một số loài Vitex khác, thể hiện hoạt tính

ức chế sự phát triển của tế bào ung thư máu (HL-60) với giá trị IC50 là 15±1,1 μM và

có cơ chết gây chết tế bào ung thư theo chương trình [85].

Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy, các hợp chất phân lập từ các loài thuộc

chi Vitex thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển nhiều dòng tế bào ung thư với các

mức độ khác nhau.

1.1.5.2. Hoạt tính kháng viêm, giảm đau

Các công trình công bố cho thấy, có khá nhiều nghiên cứu về tác dụng hoạt

tính kháng viêm của loài V. negundo. Dịch chiết từ lá loài V. negundo được thử

nghiệm trên chuột có khả năng giảm đau đáng kể và có tác dụng kháng viêm cấp tính

[86]. Theo Zeng và cộng sự cho rằng, dịch chiết từ hạt loài V. negundo thể hiện hoạt

tính giảm phù chân, giảm tỉ lệ viêm khớp, giảm khả năng viêm nhiễm và tăng sản

sinh chất nhầy ở khớp khi thử nghiệm trên chuột. Các kết quả cũng cho thấy việc sử

dụng dịch chiết V. negundo điều trị viêm khớp đã làm giảm nồng độ các chất gây

viêm (TNF-α, IL-1β và IL-6) và tăng nồng độ IL-10 trong huyết thanh. Đây có thể

xem là một liệu pháp hiệu quả để điều trị bệnh viêm khớp [87, 88].

Nghiên cứu dịch chiết từ lá loài V. trifolia của nhóm tác giả Kulkarni [89] cũng

cho kết quả thể hiện hoạt tính kháng viêm.

Dịch chiết từ loài V. cymosa sinh trưởng ở vùng rừng Amazon, Brazil đã được

thử nghiệm hoạt tính và nghiên cứu cơ chế kháng viêm, giảm đau [17]. Kết quả nghiên

cứu đã cho thấy dịch chiết từ lá của loài cây này có tác dụng kích thích hoạt động

giảm đau ngoại vi và trung tâm.

Khi nghiên cứu dịch chiết dichloromethane từ hạt của V. negundo, Zeng và

cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất diterpene khung labdane mới là negundoin A-E

(73, 74, 75, 59, 76) và 4 diterpenoid đã biết. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm

cho thấy, hợp chất 74, 75 ức chế mạnh đối với sự sản sinh nitric oxid (NO) trên các

đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS, với giá trị IC50 tương ứng là 0,12 và

0,23 M. Hai hợp chất này cũng làm giảm đáng kể nồng độ iNOS xuống 0,40% và

41,02% và nồng độ COX-2 xuống tương ứng là 2,06% và 26,40% [32]. Nhóm tác giả

này cũng phân lập được 4 hợp chất lignan mới là vitexdoin F-I (157, 160, 161, 162)

từ hạt loài V. negundo [51]. Khi tiến hành đánh giá hoạt tính kháng viêm của những

hợp chất này thì vitexdoin F (157) có hoạt tính ức chế sự sản sinh NO với giá trị IC50

4,17 μg/mL.

Năm 2002, Suksamrarn đã phân lập được 2 hợp chất iridoid là agnuside (231)

và pedunculariside (232). Cả hai hợp chất này đều thể hiện khả năng ức chế COX-2

với giá trị IC50 là 0,15 ± 0,21 mg/mL và 0,026 ± 0,015 mg/mL, nhưng có hoạt tính

yếu đối với COX-1 và không gây độc trên dòng tế bào thường [90]. Ngoài ra, từ loài

V. grandifolia Om và cộng sự cũng đã phân lập được các iridoid, các iridoid này thể

hiện tác dụng kháng viêm mạnh [91].

Vitexicarpin (212), một flavonoid tìm thấy trong nhiều loài Vitex như V.

rotundifolia [92], V. negundo [67], V. trifolia [60], thể hiện hoạt tính ức chế sự phát

triển của các tiểu bạch cầu, được xem là một tác nhân trị liệu các chứng viêm hay rối

loạn hệ miễn dịch như viêm thấp khớp, ức chế u bạch huyết [92].

Hai hợp chất phenolic là 4-hydroxyphenethanol 3-O-β-D-(6-O-p-

hydroxybenzoyl)glucopyranoside (247) và salviaplebeiaside (248) được phân lập từ

lá loài V. negundo var. heterophylla có khả năng ức chế sự sản sinh NO trên các đại

thực bào RAW 264.7 với giá trị IC50 là 30,76 và 49,89 M [11].

1.1.5.3. Hoạt tính kháng virus và vi sinh vật

Trong một nghiên cứu về khả năng ức chế integrase của virus HIV-1 của một

số cây thuốc đã được dùng cho bệnh nhân nhiễm HIV, cây hoàng kinh (V. negundo)

cũng được nghiên cứu hoạt tính kháng virus HIV-1 [93]. Kết quả cho thấy dịch chiết

ethanol từ lá loài V. negundo có tác động đến quá trình phiên mã ngược của virus

HIV-1. Trong một nghiên cứu khác, W. Pan và cộng sự đã phân lập được chalcone

3-(4-hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trimethoxyphenyl)-2-propen-1-one (277) từ lá loài V.

lepbototrys có khả năng ức chế sự sao chép virus HIV-1 lên tới 77% ở nồng độ 15,9

μM. Các tác giả cũng cho rằng 2 hợp chất flavonoid là tsugafolin (165) và alpinetin

(166) cũng thể hiện hoạt tính kháng virus HIV yếu với các giá trị IC50 lần lượt là 118

và 130 μM [3].

Trong chương trình phát hiện các hợp chất thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của

một số loài cây nhiệt đới, từ dịch chiết dichloromethane của lá loài V. vestita, các nhà

khoa học đã phân lập được vitexolide A (101), 12-epivitexolide A (102), acuminolide

(107) và vitexolin B (111), trong đó hợp chất 101 thể hiện hoạt tính khá mạnh. Ở

nồng độ 48 μM, hợp chất 101 ức chế được 35 trong số 46 chủng vi khuẩn Gram (+),

còn ở nồng độ 96 μM thì hợp chất này có hoạt tính với tất cả các chủng vi khuẩn thử

nghiệm. Một vài kết quả cho hoạt tính cao là: Bacillus sp. (MIC = 6-12 μM),

Staphylococcus sp. (MIC = 6-24 μM, trừ S. sciuri) và Streptococcus agalactiae (MIC

= 12 μM).

Từ hạt của loài V. negundo, Zheng và cộng sự đã phân lập được 9 hợp chất

lignan, trong đó có 1 hợp chất mới là vitelignin A (143). Những hợp chất này được

thử nghiệm hoạt tính kháng nấm Candida albicans, Cryptococcus neoformans,

Trichophyton rubrum và có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm với giá trị MIC

trong khoảng 16-64 g/mL [45].

Theo nghiên cứu của T.J. Ling và cộng sự, dịch chiết từ cây V. negundo có

hoạt tính ức chế các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis, Micrococcus

tetragenus và Pseudomonas fluorescens. Phân tích sâu hơn, nhóm đã phân lập được

hợp chất chrysoplenetin (210) và chrysosplenol D (211) có tác dụng ức chế với cả 4

chủng vi khuẩn trên. So sánh với ampicillin sodium thì 211 có hoạt tính mạnh hơn

khi thử hoạt tính kháng P. fluorescens với nồng độ ức chế tối thiểu là 500 μg/mL,

nhưng yếu hơn trong thử nghiệm kháng E.coli, B. subtilis và M. tetragenus ở nồng

độ tương ứng là 500, 500 và 250 μg/mL [74].

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng nấm của một số hợp chất phân lập được từ

dịch chiết ethanol từ lá loài V. negundo, nhóm tác giả Sathiamoorthy đã xác định hợp

chất vitegnoside (191) và negundoside (237) có hoạt tính ức chế sự phát triển của hai

loại nấm là Trichophyton mentagrophytes và Cryptococcus neoformans với giá trị

MIC 6,25 g/mL [61].

1.1.5.4. Các hoạt tính khác

Bên cạnh hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm, kháng virus, kháng

khuẩn, kháng nấm, các hợp chất và dịch chiết phân lập được từ chi Vitex cũng thể

hiện hoạt tính chống oxi hóa, khả năng chống trầm cảm, điều trị đái tháo đường,….

Năm 2014, từ hạt loài V. negundo var cannabifolia, Lou và cộng sự đã phân lập

được 23 hợp chất khung lignan, tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cho thấy,

trong số những hợp chất này có 16 hợp chất có khả năng thu dọn gốc tự do DPPH

cao.

Trong nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa của những hợp chất từ quả loài V.

cannabifolia [47] và so sánh khả năng thu dọn gốc tự do DPPH với hai chất chống

oxi hóa tiêu chuẩn là α-tocopherol và L-cysteine đã thu được, các hợp chất

vitecannaside B (152), vitecannaside A (158), orientin (217) và iso-orientin (218) thể

hiện hoạt tính mạnh hơn L-cysteine. Đặc biệt 2 hợp chất flavonoid 217, 218 được

phát hiện tác dụng chống oxi hóa mạnh hơn α-tocopherol.

Từ hạt của loài V. negundo, Ono và cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất lignan

6-hydroxy-4-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-hydroxymethyl-7-methoxy-3,4-

dihydro-2-naphthaldehyde (153), vitexdoin A (155), detetrahydroconidendrin (163),

vitedoamine A (164), vitrofolal E (165), vitrofolal F (166). Kết quả đánh giá hoạt tính

chống oxi hóa các hợp chất này có thể hiện hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH mạnh

và mạnh hơn L-cysteine [53].

Dịch chiết của V. agnus-catus, loài thực vật vốn được sử dụng trong y học cổ

truyền để điều trị căng thẳng tiền kinh nguyệt, ngăn ngừa u xơ tử cung và các triệu

chứng tiền mãn kinh, đã được H. Hasan và cộng sự nghiên cứu và chứng minh thấy

sự gia tăng đáng kể chỉ số LH và hoocmon estrogen trong thử nghiệm trên chuột cái,

đồng thời cũng thấy trên nhóm điều trị có thêm nhiều nang trứng và tăng độ dày niêm

mạc tử cung [94].

Từ dịch chiết thân cây loài V. doniana, người ta đã phân lập được 3 hợp chất

mới: 21-hydroxyshidasterone (32), 11β-hydroxy-20-deoxyshidasterone (33) và 2,3-

acetonide-24-hydroxyecdysone (35). Những hợp chất này đã được chứng minh có tác

dụng chống trầm cảm [95].

Một nghiên cứu của nhóm J. Stella về đánh giá hoạt tính hạ đường huyết của

dịch chiết methanol V. agnus-castus [96] cho thấy, dịch chiết ở các nồng độ 50, 100,

200 mg/kg thể trọng trong điều trị Streptozotocin (một tác nhân được sử dụng để gây

ra bệnh đái tháo đường) có tác động tăng insulin và giảm đáng kể lượng đường trong

máu.

Dịch chiết methanol từ lá loài V. negundo trong thử nghiệm trên chuột cũng

đã chứng minh hiệu quả chống lại các cơn co giật do sốc điện, hay do

pentylenetetrazole, strychnine, picrotoxin, từ đó cho thấy tiềm năng của V. negundo

trong điều trị chứng động kinh [97].

Như vậy: Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Vitex cho thấy các loài

trong chi này thể hiện nhiều hoạt tính thú vị như gây độc tế bào ung thư, kháng viêm,

kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa,.... Điều này góp phần định

hướng quan trọng trong việc tiến hành các nghiên cứu tiếp theo về hoạt tính sinh học

các loài Vitex.

1.1.6. Tình hình nghiên cứu về chi Vitex ở Việt Nam

Theo các tài liệu đã công bố thì những nghiên cứu về chi Vitex ở Việt Nam còn

hạn chế. Trong công bố năm 1998, GS. TSKH. Trần Văn Sung và công sự đã phân lập

từ loài V. leptobotrys một số hợp chất chalcone và ecdysteroid, trong đó có 3 hợp chất

mới là 2',4'-dihydroxy-4,6'-dimethoxychalcone (280), 4'-hydroxy-4,2',6'-

trimethoxychalcone (282), 4,2',4',β-tetrahydroxy-6'-methoxy-α,β-dihydrochalcone (283)

[2]. Gần đây, năm 2014, từ lá, cành của loài V. leptobotrys (thu mẫu ở rừng quốc gia Cúc

Phương), Pan và cộng sự đã phân lập được một hợp chất lignan mới vitexkarinol (135),

và một số hợp chất lignan, chalcone, flavonoid đã biết [3].

Năm 2006, PGS. TS. Trần Huy Thái và cộng sự đã công bố kết quả về thành phần

hóa học của tinh dầu từ lá và quả của loài từ bi biển (V. rotundifolia) [5]. Năm 2016, tác

giả Đỗ Ngọc Đại và cộng sự công bố một nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu

của loài V. quinata ở Việt Nam, trong đó thành phần chủ yếu của tinh dầu là β-pinene

(30,1%), β-caryophyllene (26,9%) và β-elemene (7,4%) [4].

Năm 2004, trong một nghiên cứu về thành phần hóa học của V. trifolia (mẫu thu

ở thành phố Hồ Chí Minh), từ quả của loài này, nhóm tác giả đã phân lập được 7 hợp

chất diterpenoid khung labdane [6].

Như vậy: Ở Việt Nam, các nghiên cứu thành phần hóa học cũng như hoạt tính

sinh học về các loài thuộc chi Vitex còn khá hạn chế.

1.1.7. Tình hình nghiên cứu về loài V. limonifolia và V. trifolia

Hiện nay, trên thế giới mới chỉ có 5 công bố về loài V. limonifolia. Theo đó,

các công trình mới chỉ dừng lại ở nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này như:

thành phần tinh dầu từ lá loài V. limonifolia [98] và phân lập được một số hợp chất

labdane-diterpenoid, iridoid [40]. Trong nước chưa có nghiên cứu nào về loài này.

V. trifolia, cây thuốc được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian ở nhiều

nước trên thế giới, là một trong những đối tượng được các nhà khoa học quan tâm

nghiên cứu. Trên thế giới có hơn 40 công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học của loài này. Từ lá hoặc quả của loài V. trifolia, người ta đã phân

lập được các hợp chất thuộc nhiều lớp chất khác nhau như: terpenoid [15, 41], lignan

[99], flavonoid [100]. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài V. trifolia cũng

cho thấy nhiều hoạt tính đáng quan tâm như hoạt tính gây độc tế bào ung thư, hoạt

tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxi hóa [101]. Tuy vậy, như đã trình bày ở trên,

ở Việt Nam mới chỉ có 1 nghiên cứu về quả của loài này [6].

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu trong nước và trên thế giới, chúng tôi đã lựa

chọn 2 loài là V. limonifolia và V. trifolia để nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá

tác dụng sinh học, góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học cũng như kinh nghiệm sử

dụng cây thuốc này trong dân gian, định hướng cho những nghiên cứu y dược tiếp theo.

1.2. Giới thiệu về viêm

1.2.1. Sơ lược về viêm

1.2.1.1. Giới thiệu về quá trình viêm

Viêm là phản ứng tại chỗ của cơ thể do các mô bị kích thích hoặc tổn thương.

Đó là một phản ứng phức tạp của các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau và rối loạn

chức năng của cơ quan bị viêm[102]. Viêm là một quá trình sinh lý quan trọng của

cơ thể. Trong hầu hết các trường hợp, phản ứng viêm xảy ra trong khoảng thời gian

ngắn và dẫn đến phản ứng bảo vệ mong muốn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp,

quá trình viêm kéo dài sẽ có thể trở thành viêm mạn tính, gây ra các bệnh viêm nhiễm,

thậm chí nặng hơn có thể tử vong.

1.2.1.2. Các giai đoạn của quá trình viêm

Mặc dù các nguyên nhân gây viêm khác nhau nhưng cơ thể có chung một kiểu

phản ứng bảo vệ, do đó quá trình viêm diễn biến giống nhau và trải qua 3 giai đoạn:

giai đoạn tổn thương tổ chức, giai đoạn rối loạn mạch máu và thoát dịch rỉ viêm, giai

đoạn tăng sinh tổ chức [103].

Ở giai đoạn I, tác nhân gây viêm gây tổn thương cấu trúc, làm giải phóng ra

các mediator viêm (chất trung gian gây viêm). Các chất trung gian gây viêm bao gồm:

các acid amin (như histamine, serotonin gây ra phản ứng dị ứng); các dẫn xuất của

axit béo (gồm các prostaglandin là các chất trung gian gây viêm quan trọng nhất); các

men lysosom; các lymphokin (yếu tố ức chế di tản đại thực bào); các kinin

(bradykinin, kalidin…có nguồn gốc từ các protein huyết tương).

Ở giai đoạn II, tại ổ viêm người ta thấy có mặt của các bạch cầu trung tính

(tiểu thực bào), các bạch cầu đơn nhân (đại thực bào), các bạch cầu limpho, hồng cầu

và tiểu cầu. Các bạch cầu thực bào các thành phần lạ như vi khuẩn, mảnh tế bào chết

và các tiểu thể lạ khác. Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch hoạt hóa hệ miễn dịch

thể để sản xuất ra các kháng thể có tác dụng loại trừ tác nhân gây viêm.

Ở giai đoạn III, số lượng bạch cầu giảm, còn đại thực bào thì định cư lại và

tăng sinh rất nhanh, sắp xếp trật tự tại ổ viêm cùng các tế bào limpho, tổ chức sợi và

nguyên bào sợi giúp cho quá trình hàn gắn tổn thương. Các tế bào non dần dần trưởng

thành và tạo thành tổ chức nguyên thủy gọi là tổ chức hạt. Tổ chức hạt bao gồm các

tế bào non, nguyên bào sợi và tổ chức sợi, các mạch máu tân tạo. Tổ chức hoại tử ở

giai đoạn trước được thay thế bằng một tổ chức mới được hình thành.

1.2.1.3. Vai trò của nitric oxide trong bệnh lý viêm

Nitric oxide (NO) là một phân tử quan trọng tham gia vào nhiều quá trình bệnh

lý và sinh lý của cơ thể. NO được xem như là một chất trung gian gây viêm (mediator

viêm) được sản sinh quá mức trong những điều kiện bất thường, chẳng hạn như nhiễm

khuẩn,…, gây ra nhiều hoạt động sinh học như: giãn mạch máu, dẫn truyền thần kinh,

ức chế sự kết dính của các tế bào tiểu cầu và liên quan đến đáp ứng miễn dịch bởi các

đại thực bào kích hoạt cytokine, nơi mà giải phóng NO với nồng độ cao.

Quá trình sản sinh NO là một trong các phản ứng tự bảo vệ của cơ thể, tuy

nhiên sự sản sinh quá mức lượng NO lại là nguyên nhân dẫn đến sự tổn thương của

các tế bào và mô, thúc đẩy quá trình viêm và gây ra các bệnh viêm cấp và mạn tính.

Do vậy, mức độ sản sinh NO có thể phản ánh mức độ gây viêm và được coi là một

trong những yếu tố chỉ thị cho quá trình viêm xảy ra. Các hợp chất ức chế sự sản sinh

NO có thể được coi là các tác nhân chống viêm. Nói cách khác, đánh giá khả năng ức

chế sự sản sinh NO được xem là một phương pháp quan trọng để đánh giá sự tiến bộ

trong ngăn chặn và điều trị bệnh viêm [104].

1.2.2. Các thuốc kháng viêm

Thuốc kháng viêm được dùng để trị triệu chứng viêm, được chia ra làm ba loại:

thuốc kháng viêm không steroid, glucocorticoid và thuốc kháng viêm thực vật. Các thuốc

kháng viêm không đảo ngược được quá trình viêm mà làm chậm quá trình viêm bằng

cách ức chế việc sản xuất các chất trung gian gây viêm [105].

Trên thị trường hiện nay chủ yếu là các thuốc kháng viêm không steroid

(NSAIDs-Nonsteroidal anti-inflammatory drugs), bao gồm một số thuốc như: ibuprofen,

aspirin, diclofenac, indomethacin, phenylbutazone, oxicams,.... Đa số NSAIDs là các

thuốc tổng hợp và có tác dụng hầu hết trên các loại viêm không phân biệt nguyên nhân.

NSAIDs giảm đau và viêm bằng cách ngăn chặn enzyme cyclo-oxygenase, gồm hai đồng

enzyme là COX-1 và COX-2, có vai trò tổng hợp các prostaglandin (yếu tố trung gian

quan trọng nhất gây nên phản ứng viêm) [106]. Hầu hết, NSAIDs đều ức chế cả hai

enzyme COX-1 và COX-2. Trong cơ thể, COX-1 có nhiệm vụ duy trì các hoạt động như:

sản xuất bicarbonate, tăng chất nhầy từ niêm mạc dạ dày, ruột, điều chỉnh lưu lượng máu

và tăng sinh biểu mô, tập kết tiểu cầu, tổng hợp prostaglandin trong thận. COX-2 được

phát hiện khi kích thích tế bào monocyte, đại thực bào, bạch cầu trung tính và nội mô.

Sự giải phóng COX-2 được kích hoạt bởi các cytokine, mitogens và endotoxin trong các

tế bào viêm, và chịu trách nhiệm sản xuất prostaglandin trong các mô viêm, gây đau và

viêm. Sự ức chế hoạt động của các enzyme COX của thuốc một mặt là yếu tố quyết định

tác dụng kháng viêm nhưng lại có tác dụng bất lợi ở đường tiêu hoá và thận khi sử dụng

thuốc kéo dài [106]. Chẳng hạn, NSAIDs gây ra chảy máu dạ dày vì chúng ngăn chặn

enzyme COX-1, có tác dụng bảo vệ lớp niêm mạc dạ dày khỏi axit [107]. Các thuốc

NSAIDs khác nhau về tính chọn lọc của của chúng đối với COX-2. Tuy nhiên, không

có thuốc nào hoàn toàn ức chế COX-2 mà không tác động trên COX-1.

Glucocorticoids là thuốc kháng viêm mạnh, ức chế đồng thời hoạt động của

enzyme phospholipase A2 và cyclo-oxygenase (COX-1 và COX-2), làm tăng hiệu quả

chống viêm. Tuy nhiên, thuốc kháng viêm loại này gây ra nhiều tác dụng không mong

muốn nghiêm trọng như: loãng xương, đau cơ, hoại tử mạch máu, gây ra các bệnh tim

mạch (cao huyết áp tăng đường huyết, suy tim, ...), ảnh hưởng đến hệ thần kinh (thay đổi

tâm trạng, giảm trí nhớ, rối loạn giấc ngủ, ...), bệnh tiêu hóa (loét dạ dày, xuất huyết

đường tiêu hóa,...) [108]. Do vậy, glucocorticoids chủ yếu được dùng để điều trị đặc hiệu

cho một số bệnh như: đau đa khớp dạng thấp, viêm tủy xương, phù não hoặc từ chối cấy

ghép nội tạng, mà hiện nay chưa có thuốc nào thay thế được [109].

Do các thuốc kháng viêm tổng hợp luôn đi kèm với những tác dụng phụ không

mong muốn, nên xu hướng tìm kiếm các thuốc kháng viêm có nguồn gốc từ thiên nhiên

đang được đẩy mạnh bởi những tác dụng ưu việt của nó như: an toàn và ít gây ra các

phản ứng phụ. Nhiều loại thảo mộc bổ sung kháng viêm rất tốt như: cây nghệ vàng, gừng,

tảo spirulina, rosemary,.... Cucurmin là thành phần hoạt tính chính trong củ của cây

nghệ vàng (Curcuma longa). Có nhiều nghiên cứu cho thấy Cucurmin là chất chống

viêm mạnh. Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy nó thể hiện hiệu quả trong việc cải

thiện tình trạng viêm của viêm khớp dạng thấp, điều trị viêm loét dạ dày hoặc bệnh

khó tiêu, ức chế viêm loét đại tràng,.. [110]. Ở bệnh nhân viêm xương khớp, gừng

không chỉ có hiệu quả trong việc cải thiện đau giống với diclofenac 100mg mà còn

không có tác dụng phụ (như không thấy biến chứng rối loạn tiêu hóa, không ảnh

hưởng tới niêm mạc dạ dày) [111]. Bột gừng đã có tác dụng cải thiện trong bệnh nhân

cơ xương khớp và thấp khớp thông qua ức chế cyclooxygenase và đường

lipoxygenase trong dịch khớp.

1.3. Giới thiệu về kháng virus

1.3.1. Sơ lược về virus

Virus là một đơn vị sinh học nhỏ bé (kích thước từ 20 – 300 nm) mang những

tính chất cơ bản của sự sống, như: gây nhiễm cho tế bào, duy trì được nòi giống qua

các thế hệ mà vẫn giữ tính ổn định về mọi đặc điểm sinh học của nó trong tế bào cảm

thụ thích hợp.

Cấu trúc cơ bản của virus bao gồm hai thành phần chính [112], đó là:

Thứ nhất, mỗi loại virus đều phải có một trong hai acid nucleic: ARN (acid

ribonucleic) hoặc ADN (acid deoxyribonucleic). Các acid nucleic (AN) của virus chỉ

chiếm từ 1 – 2% trọng lượng phân tử virus nhưng chứa toàn bộ vật liệu và mã thông

tin di truyền, mã hoá cho tổng hợp các thành phần của virus và tổng hợp một số

enzyme cần thiết cho quá trình nhân lên của virus, và quyết định toàn bộ hoạt động

gây bệnh của virus.

Thứ hai, thành phần capsid, là cấu trúc bao quanh acid nucleic. Bản chất hóa

học của capsid là protein. Capsid được tạo bởi nhiều đơn vị, được gọi là capsomer,

có sắp xếp đặc trưng cho từng loại virus. Phần vỏ capsid của virus có thể sắp xếp đối

xứng xoắn, đối xứng khối hoặc đối xứng phức hợp. Vỏ có chức năng bảo vệ virus,

chứa các kháng nguyên đặc hiệu của virus và tạo nên hình thể chung của virus.

Bên cạnh hai thành phần cơ bản thì một số loại virus còn có những cấu trúc

riêng để thực hiện những chức năng đặc trưng cho virus đó, như:

- Một số virus (như virus herpes, HIV, virus cúm,… ) bên ngoài vỏ capsid còn

được bao phủ bởi một lớp bao ngoài, được gọi là envelop. Bản chất hóa học của

envelop là một phức hợp: protein, lipid, carbohydrat, nói chung là lipoprotein hoặc

glycoprotein. Nếu chỉ có màng thì đó là lớp dilipid, nếu có thêm gai nhú (spike) thì

đó là glycoprotein. Những virus không có bao ngoài gọi là virus trần (như

adenovirus). Về mặt chức năng, envelop tham gia vào quá trình bám của virus trên

các vị trí thích hợp của tế bào cảm thụ; tham gia vào giai đoạn lắp ráp và giải phóng

virus ra khỏi tế bào sau chu kỳ nhân lên; tạo nên các kháng nguyên đặc hiệu trên bề

mặt virus. Envelop giữ tính ổn định của kích thước virus.

- Trong thành phần của virus chứa một số protein đặc biệt mang hoạt tính

enzyme, đó là những enzyme cấu trúc. Các enzyme cấu trúc có thể gặp:

neuraminidase, ADN hoặc ARN polymerase, men phiên mã ngược (reverse

transcriptase). Enzyme cấu trúc mang tính kháng nguyên riêng đặc hiệu của mỗi virus

và có những chức năng riêng trong chu kỳ nhân lên của virus.

1.3.2. Các thuốc kháng virus

Để chống lại virus thì biện pháp hàng đầu là sản xuất các loại vaccine phòng

bệnh. Tuy nhiên, trong một số thời điểm, do nhiều yếu tố, ngay cả những người đã

được tiêm vaccine cũng không đảm bảo được hoàn toàn miễn dịch. Trong những

trường hợp này, phương pháp duy nhất là thuốc kháng virus (antiviral drugs). Khác

với thuốc kháng sinh được dùng để diệt vi khuẩn, thuốc kháng virus là loại thuốc

dùng để ức chế sự phát triển của virus. Hiện nay đã có một số thuốc chống virus được

đưa vào điều trị song tác dụng cũng rất hạn chế. Đó là vì virus lại luôn tìm cách chống

đỡ lại thuốc kháng virus bằng cách thay đổi hình dạng của mình và biến đổi cấu trúc

gen. Điều này làm xuất hiện những tuýp virus mới với những kháng nguyên mới.

Chính vì thế, thuốc kháng virus có thể có tác dụng ở một thời điểm nào đó nhưng sẽ

không còn tác dụng khi virus đã thay đổi. Đây là nguyên nhân làm hạn chế tác dụng

của thuốc kháng virus.

Từ khi thuốc kháng virus đầu tiên, idoxuridin, được đưa vào sử dụng năm

1963, cho đến tháng tư năm 2016 đã có 90 loại thuốc kháng virus chính thức được

dùng điều trị 9 nhóm bệnh truyền nhiễm ở người, là: nhiễm HIV (Human

Immunodeficiency Virus), nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B Virus - HBV), viêm

gan C (Hepatitis C Virus - HCV), nhiễm Herpe Simplex Virus (HSV), nhiễm virus

cúm (influenza virus), nhiễm trùng Cytomegalovirus ở người (HCMV), nhiễm virus

thủy đậu-zona (varicella-zoster virus VZV), nhiễm trùng virus hợp bào hô hấp

(respiratory syncytial virus - RSV), mụn cóc do nhiễm trùng papillomavirus (HPVs)

[113]. Các thuốc kháng virus thường được sử dụng phối hợp trong điều trị để tăng

hiệu quả, giảm sự sản sinh kháng nguyên mới kháng thuốc.

Do sự gia tăng số ca nhiễm virus, đặc biệt là các dòng virus kháng thuốc, cần

phải cải tiến các phương thức điều trị sẵn có, bổ sung bằng việc phát hiện ra các thuốc

kháng virus mới. Nguồn dược liệu thiên nhiên có nhiều tiềm năng trong điều trị rối

loạn chuyển hóa và các bệnh truyền nhiễm. Thực tế đã có hàng trăm công bố về hiệu

quả kháng virus của các dịch chiết thực vật (kháng virus cúm, HIV, HSV, viêm gan,

coxackievirus,…) [114].

Cây cơm cháy (Sambucus nigra), thuộc họ Caprifoliaceae cho thấy tiềm năng

kháng virus rất cao. Chiết xuất từ quả của loài này đã được dùng điều trị các bệnh lý

nhiễm trùng đường tiểu, phù, thấp khớp, động kinh, bệnh do nhiễm HSV và HIV. Các

nghiên cứu cho thấy một số hợp chất polysaccharide, polyphenolic và flavonoid phân

lập từ cây cơm cháy có khả năng kháng virus HIV, virus HSV-1và virus cúm [114].

Nhiều loại cây trong thực tế đã được dùng để điều trị các triệu chứng do nhiễm

virus HIV (suy nhược, mất ngủ, trầm cảm, buồn nôn,…) như: sâm Ấn Độ (Withania

somnifera), dây thần thông (Tinospora cordifolia), chùm ngây (Moringa oleifera), cỏ

ban (Hypericum perforatum), cúc gai (Silybum marianum), tỏi (Allium sativum), nhân

sâm (Panax ginseng), nghệ (Curcuma longa),… Cây sâm Ấn Độ đã được các bác sĩ

sử dụng để phục hồi hệ thống miễn dịch cho bệnh nhân HIV, các nghiên cứu thực

hiện trên động vật cho thấy các hoạt động kích thích miễn dịch [114]. Trong một

nghiên cứu khác, dịch chiết methanol và chloroform từ cây mao vĩ lông (Aerva

lanata) đã thể hiện hoạt tính ức chế virus HIV với tỉ lệ lần lượt là 89% và 91% [115].

Trong một nghiên cứu về khả năng ức chế integrase của virus HIV-1 của một số cây

thuốc đã được dùng cho bệnh nhân nhiễm HIV, kết quả thu được rất khả quan: cây

nhọ nồi (Eclipta prostrata), cặn chiết nước và methanol (IC50 lần lượt là 4,8, 21,1

μg/mL); cây kim vàng (Baleria lupulina), cặn chiết nước methanol (IC50 lần lượt là

38,2 và 39,3 μg/mL) [116]. Cây ngũ trảo (Vitex negundo) cũng được nghiên cứu hoạt

tính kháng virus HIV-1. Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol từ lá loài V. negundo có

tác động đến quá trình phiên mã ngược của virus HIV-1 [93].

Cây đại hoàng (Rheum palmatum) thuộc họ Polygonaceae đã được nghiên cứu

hoạt tính kháng virus coxsackievirus B3. Thử nghiệm in vitro cho kết quả dịch chiết

ethanol từ rễ của loài này có hoạt tính kháng virus coxsackievirus B3 trên tế bào Hep-

2 mạnh với giá trị IC50 là 4 μg/mL. Thử nghiệm trên chuột cho thấy tỉ lệ sống sót cao

hơn, giảm các triệu chứng lâm sàng so với nhóm đối chứng [117].

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Loài Vitex limonifolia Wall. ex C.B.Clarke

Mẫu lá loài bình linh vàng chanh (Vitex limonifolia Wall. ex C.B.Clarke) được

thu hái tại Vườn quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế, Việt Nam vào tháng 9/2015.

Tên khoa học được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

và PGS. TS. Ninh Khắc Bản giám định. Mẫu tiêu bản TNSVB-01 được lưu tại Phòng

Nghiên cứu tài nguyên sinh vật, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

2.1.2. Loài Vitex trifolia L.

Mẫu lá loài mạn kinh (Vitex trifolia L.) được thu hái tại Vườn quốc gia Bạch

Mã, Thừa Thiên Huế, Việt Nam vào tháng 9/2015. Tên khoa học được TS. Nguyễn

Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và PGS. TS. Ninh Khắc Bản giám

định. Mẫu tiêu bản TNSVB-02 được lưu tại Phòng Nghiên cứu tài nguyên sinh vật,

Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (0,25 mm, Merck), RP-18 F254s (0,25 mm, Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử

ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch sulfuric

acid 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.

2.2.1.2. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel có cỡ hạt là 0,040 –

0,063 mm (230 - 400 mesh), pha đảo sử dụng loại RP-18 (30 - 50 m, Fuji Silysia

Chemical Ltd.); Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.).

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định trên cơ sở sử dụng các phép

xác định thông số vật lý và các phương pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại đồng

thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo. Các phương pháp đo được

sử dụng gồm có:

2.2.2.1. Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS)

Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy FT-ICR-Mass

spectrometry tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và

máy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS tại Viện Hóa sinh biển và trường

Đại học Yonsei, Hàn Quốc.

2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR)

Phổ NMR được đo trên máy đo trên máy Bruker DRX 500 MHz (Chất chuẩn

nội là TMS) tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và NOESY.

Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO, CD3OD. Việc lựa

chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung môi

phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử.

2.2.2.3. Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

Phổ CD được đo trên máy ChirascanTM CD spectrometer (Applied

Photophysics Ltd., Surrey, UK) tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam.

2.2.2.4. Phương pháp tính toán phổ CD lý thuyết

Tìm kiếm cấu dạng được thực hiện trên chương trình Spartan 14. Các cấu dạng

có thể có sẽ được tối ưu hóa và tính toán lý thuyết dựa trên chương Gaussian 09. Phổ

CD theo tính toán lý thuyết sẽ được thiết lập sau khi hiệu chỉnh dựa trên hệ số phân

bố Boltzmann của các cấu dạng bền sử dụng phần mềm SpecDisv1.64.

2.2.2.5. Độ quay cực ([α]D)

Độ quay cực được đo trên máy JASCO P-2000 polarimeter của Viện Hóa sinh

biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro

Nguyên tắc

Hoạt tính kháng viêm được đánh giá qua tác dụng ức chế của các hợp chất đối

với sự sản sinh NO trên tế bào BV2 được kích thích với LPS.

Nitric oxide (NO) là một phân tử quan trọng tham gia vào nhiều quá trình bệnh

lý và sinh lý của cơ thể. Quá trình sản sinh NO là một trong các phản ứng tự bảo vệ

của cơ thể tuy nhiên sự sản sinh quá mức lượng NO lại là nguyên nhân dẫn đến sự

tổn thương của các tế bào và mô, thúc đẩy quá trình viêm. Mức độ sản sinh NO có

thể phản ánh mức độ gây viêm và được coi là một trong những yếu tố chỉ thị cho quá

trình viêm xảy ra. Các hợp chất ức chế sự sản sinh NO có thể được coi là các tác nhân

chống viêm [104].

BV2 là một dòng tế bào ở hệ thần kinh trung ương, được kích hoạt khi bị kích

thích, sau đó giải phóng iNOS và cuối cùng sản sinh NO. Sự ức chế sản xuất NO

trong các tế bào BV2 được kích thích bởi LPS được coi là một phương pháp điều trị

hiệu quả cho tình trạng viêm trong hệ thần kinh trung ương. Do đó, tế bào BV2 được

sử dụng như một công cụ sàng lọc khi tìm kiếm các tác nhân kháng viêm trong những

sản phẩm thiên nhiên [118].

Hoạt tính kháng viêm được tiến hành sau khi kiểm tra độc tính đối với tế bào

bằng phương pháp so màu MTT. Nồng độ NO trong môi trường thực nghiệm được

xác định thông qua phản ứng Griess [118].

Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro

Hoạt tính kháng viêm in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Yonsei,

Hàn Quốc.

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro thông qua ức chế sản sinh

NO trên tế bào BV2 gồm 4 bước:

Bước 1: Nuôi cấy tế bào [118].

Tế bào BV2 được nuôi cấy trong môi trường DMEM – F12 có bổ sung 10%

huyết thanh (FBS), penicillin 100 IU/mL và streptomycin 100 g/mL ở điều kiện

37oC, 5% CO2.

Bước 2: Kiểm tra độc tính của các chất thử đối với tế bào BV2 theo phương

pháp so màu MTT.

Mỗi giếng của đĩa 96 giếng chứa 100 L tế bào BV2 (3.105 tế bào) môi trường

DMEM – F12 10% FBS, được nuôi cấy ở 37oC, 5% CO2 trong 1 ngày. Sau đó, môi

trường ban đầu được thay thế bằng 100 L môi trường chứa mẫu thử, thí nghiệm

được lặp ít nhất 3 lần. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng không có mẫu thử,

chỉ có dung môi pha mẫu để làm mẫu trắng. Tất cả được ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 48

giờ. Tiếp theo, 10 L MTT 2 mg/mL, hòa tan trong nước muối phosphate (PBS),

được thêm vào mỗi giếng. Sau 4 giờ, loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa

tan bằng 50 µl dimethylsulfoxide (DMSO). Các đĩa sau đó được đo mật độ quang

(OD) ở bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ. DMSO 10% được sử dụng như đối

chứng âm [118].

%sống sót =

× 100

ODmẫu thử − ODmẫu trắng ODDMSO − ODmẫu trắng

- Phần trăm tế bào sống sót sẽ được tính theo công thức:

Bước 3: Đánh giá khả năng ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2.

Các tế bào BV2 nuôi cấy trong môi trường DMEM – F12 10% FBS được đưa

vào 96 giếng, 100 L tế bào (3.105 tế bào)/giếng, ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ.

Loại bỏ môi trường nuôi cấy thay bằng môi trường DMEM – F12 1% FBS. Tế bào

sau đó được ủ mẫu thử ở các nồng độ khác nhau trong 2 giờ, rồi được kích thích

bằng 0,5 g/mL LPS trong 24 giờ để sản sinh yếu tố NO. Một số giếng không được

ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng trắng. Đối chứng

dương được sử dụng là L-NMMA.

Sự hiện diện của nitrit, là sản phẩm oxi hóa của NO, được xác định bằng thuốc

thử Griess (1% sulfanilamide, 0,1% naphtylethylenediamine dihydrochloride trong

axit phosphoric 2%). Cụ thể là, 100 μL dịch nuôi cấy tế bào được trộn với 100 μL

chất thử Griess trong 96 giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, sau đó hàm lượng

nitrit sẽ được đo bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 525 nm. Môi trường chứa 0,5 g

LPS làm chất đối chứng âm [118]. Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được

xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu

chứng âm (LPS).

%ức chế =

× 100

Hàm lượng Nitrit (mẫu thử) − Hàm lượng Nitrit (đối chứng trắng) Hàm lượng Nitrit (đối chứng âm) − Hàm lượng Nitrit (đối chứng trắng)

Phần trăm ức chế sự sản sinh NO của mẫu được tính theo công thức:

Bước 4: Phương pháp xử lý số liệu.

Các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất phân lập được đến sự

sản sinh NO trên tế bào BV2 kích thích bởi LPS được thực hiện ít nhất 3 lần và lấy

giá trị trung bình. Phân tích số liệu, xây dựng đồ thị và tính toán giá trị IC50 (theo

phương pháp hồi qui Sigmoidal dose-response) được thực hiện trên phần mềm

GraphPad Prism 6.0.

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng virus in vitro

Nguyên tắc: Xét nghiệm về hoạt tính kháng virus được thực hiện với phương

pháp SRB [119]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa

vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế

bào được nhuộm bằng Sulforhodamin B (SRB). Giá trị OD của máy đo được tỉ lệ

thuận với lượng SRB gắn trên phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng

protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.

Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng virus in vitro

Các hợp chất phân lập được từ loài V. limonifolia và V. trifolia được đánh giá

hoạt tính kháng virus in vitro với các virus coxsackievirus B3, enterovirus 71 và

human rhinovirus B3. Các thí nghiệm này được thực hiện tại Khoa Dược, Đại học

Yonsei, Hàn Quốc. Quá trình tiến hành gồm các bước cụ thể như sau:

Virus coxsackievirus B3 (được cung cấp từ Trung tâm kiểm soát và phòng

chống dịch bệnh Hàn Quốc, Chungcheongbuk, Hàn Quốc); virus EV71 (được cung

cấp từ Phòng nghiên cứu vắc xin phòng chống dịch bệnh Trung tâm Hàn Quốc,

Cheongwon, Hàn Quốc) được nhân giống ở 37°C trong tế bào Vero (Manassas, VA,

USA), là các tế bào biểu mô thận có nguồn gốc từ loài khỉ xanh châu Phi. Virus

human rhinovirus 1B (được cung cấp từ Manassas, VA, USA) được nuôi cấy vào tế

bào HeLa. Các dòng tế bào HeLa và Vero được bảo quản trong môi trường gồm 5-

10% huyết thanh bò (FBS) và 0,01% antibiotic-antimycotic. Dung dịch antibiotic-

antimycotic, trypsin-EDTA, FBS, và MEM được cung cấp bởi Gibco BRL

(Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Germany). Các đĩa cấy mô được cung cấp

bởi Falcon (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Sulforhodamine B (SRB) được

cung cấp bởi Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Trước tiên các hợp chất được đánh giá độ độc tính đối với tế bào. Những hợp

chất không gây độc tế bào là những chất có giá trị CC50 (nồng độ tối thiểu gây độc

50% tế bào) >50M. Những chất này tiếp tục được đánh giá hoạt tính kháng virus.

Rupuntrivir được sử dụng làm chất đối chứng dương trong thử nghiệm đánh

giá hoạt tính kháng virus CVB3 và EV71. Ribavirin được sử dụng làm chất đối chứng

dương trong thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng virus HRV1B.

Các tế bào HeLa hoặc Vero được đưa vào đĩa 96 giếng (với mật độ 2 x 104 tế

bào/giếng) và nuôi cấy ở điều kiện nêu trên trong 24 giờ. Ngày tiếp theo, loại bỏ toàn

bộ môi trường trong giếng, rửa sạch bằng PBS (photphat buffer saline), sau đó thêm

vào 0,09 mL dung dịch pha loãng chứa virus đảm bảo liều lượng TCID50 (liều gây

nhiễm 50% tế bào nuôi cấy) và 0,01 mL hợp chất thử nghiệm hoạt tính, ủ ở điều kiện

37°C, 5% CO2 trong 2 ngày (mẫu thử). Hoạt tính kháng virus của mỗi hợp chất được

theo dõi ở các nồng độ khác nhau 10 lần từ 0,1, 1,0, 10,0 và 100 μM. Bốn giếng chứa

các tế bào nhiễm virus nhưng không được bơm chất thử nghiệm hoạt tính (mẫu

trắng), bốn giếng được bơm các tế bào không cấy virus để đối chứng (mẫu đối chứng

âm). Sau khi rửa một lần với PBS, thêm vào mỗi giếng 100 ml acetone 70% lạnh (-

20°C) và ủ trong 30 phút ở -20°C. Sau đó, aceton được loại bỏ và tiến hành sấy 96

giếng ở 60°C trong 30 phút. Tiếp tục hút 100 μL SRB 0,4% trong axit acetic 1% thêm

vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ trong phòng trong 30 phút tiếp theo. Rửa sạch các đĩa

5 lần bằng axit acetic 1%, rồi sấy khô. Sau khi sấy trong 1 ngày, SRB còn lại trong

mỗi giếng được hòa tan bởi 100 μL dung dịch đệm Tris-base (10 mM), và để ở nhiệt

độ trong phòng 30 phút.

Độ hấp thụ trong mỗi giếng được đo bằng VERSAmax microplate reader

(Molecular Devices, Palo Alto, CA, USA) ở bước sóng 540 nm. Hoạt tính kháng

virus của mỗi hợp chất thử trong tế bào bị nhiễm CVB3, EV71 hoặc HRV1B được

tính theo tỷ lệ phần trăm so với mẫu đối chứng.

%sống sót =

× 100

ODmẫu thử − ODmẫu trắng ODmẫu đối chứng âm − ODmẫu trắng

Hoạt tính kháng virus được đánh giá bằng phần trăm tế bào sống sót:

Phân tích số liệu, xây dựng đồ thị và tính toán giá trị IC50 (theo phương pháp

hồi qui Sigmoidal dose-response) được thực hiện trên phần mềm GraphPad Prism 6.0.

2.3. Phân lập các hợp chất

2.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia

Lá V. limonifolia sau khi phơi khô, nghiền thành bột mịn (4,2 kg), được làm

ẩm sau đó chiết với methanol (3 lần x 10L) bằng thiết bị siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 1

giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp

suất giảm thu được 350 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hòa tan vào 2 lít

nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với CH2Cl2 và EtOAc thu được cặn

CH2Cl2 (VIL1, 130,0 g), cặn EtOAc (VIL2, 27,0 g) và lớp nước (VIL3) sau khi cất

thu hồi dung môi dưới áp suất giảm.

Phân đoạn VIL1 được phân bố đều trong dichloromethane, tẩm với silica gel,

quay khô loại bỏ dung môi, nghiền mịn đưa lên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi

rửa giải gradient n-hexane:acetone (100:0 → 0:1, v/v) thu được sáu phân đoạn chính,

VIL1A-VIL1F. Phân đoạn VL1B được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung

môi rửa giải MeOH:nước (5:1, v/v) thu được bốn phân đoạn, VIL1B1-VIL1B4.

VIL1B1được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải n-

hexane:EtOAc (1,5:1, v/v) thu được hợp chất VL7 (6,0 mg). Hợp chất VL4 (4,4 mg)

và VL6 (12,5 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn VIL1B3 bằng cột sắc ký silica

gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (1,5:1, v/v).

Phân đoạn VIL1C được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa

giải MeOH:nước (5:1, v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, VIL1C1-VIL1C3.

VIL1C1 tiếp tục được đưa lên đưa lên cột sắc ký LH-20 với hệ dung môi rửa giải

MeOH:nước (1:1, v/v) thu được hợp chất VL5 (2,5 mg). VIL1C2 được tinh chế bằng

cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:MeOH (17:1, v/v) thu được hợp

chất VL3 (14,0 mg). Hợp chất VL8 (10,3 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn

VIL1C3 bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (1,4:1, v/v).

Phân đoạn VIL1D được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa

giải MeOH:nước (4:1, v/v) thu được năm phân đoạn, VIL1D1-VIL1D5. VIL1D2 tiếp

tục được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải acetone:nước

(1,8:1, v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, VIL1D2A-VIL1D2C. Hợp chất VL9

(18,0 mg) và VL10 (4,5 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn VIL1D2A bằng cột

sắc ký silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (1,4:1, v/v). Hợp chất VL11 (7,0

mg) thu được khi tinh chế phân đoạn VIL1D2C bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung

môi n-hexane:EtOAc (1,4:1, v/v). Phân đoạn VIL1D4 được phân tách trên cột sắc ký

RP-18 với hệ dung môi rửa giải acetone:nước (2:1, v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ

hơn, VIL1D4A-VIL1D4C. VIL1D4A được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ

dung môi rửa giải CH2Cl2:acetone (2,5:1, v/v) thu được hợp chất VL2 (8,0 mg).

Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. limonifolia

VIL1D4C được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải n-

hexane:acetone (1,4:1, v/v) thu được hợp chất VL1 (10,5 mg).

Phần nước VIL3 được đưa lên cột diaion HP-20 để loại đường bằng nước, sau

đó được rửa giải bằng methanol trong nước với nồng độ tăng dần (25%, 50%, 75%

và 100%) thu được bốn phân đoạn VIL3A-VIL3D. Phân đoạn VIL3A được tẩm với

silica gel rồi đưa lên cột sắc ký với hệ dung môi rửa giải dichloromethane:MeOH

(100:1 → 0:1, v/v) thu được bảy phân đoạn, VIL3A1-VIL3A7. Phân đoạn VIL3A5

tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký R-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước

(5:1, v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, VIL3A5A-VIL3A5C. Hợp chất VL12 (9,2

mg) thu được khi tinh chế phân đoạn VIL3A5A bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung

môi EtOAc:MeOH:nước (3,5:1:0,15, v/v/v).

2.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài V. trifolia

Lá loài V. trifolia sau khi phơi khô, nghiền thành bột mịn (2,2 kg), được làm

ẩm sau đó chiết với methanol (3 lần x 5L) bằng thiết bị siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 1

giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp

suất giảm thu được 130 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hòa vào 2 lít nước

cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với CH2Cl2 và EtOAc thu được cặn CH2Cl2

(VIT1, 51,0 g), cặn EtOAc (VIT2, 27,0 g) và lớp nước (VIT3) sau khi cất thu hồi

dung môi dưới áp suất giảm.

Phân đoạn VIT2 được phân bố đều trong ethyl acetate, tẩm với silica gel, quay

khô loại bỏ dung môi, nghiền mịn đưa lên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa

giải gradient n-hexane:acetone (100:0 → 0:1, v/v) thu được bốn phân đoạn chính,

VIT2A-VIT2D. Phân đoạn VIT2B tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với

hệ dung môi rửa giải acetone:nước (1,5:1, v/v) thu được hai phân đoạn, VIT2B1 và

VIT2B2. VIT2B2 được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải

n-hexane:EtOAc (1,1:1, v/v) thu được hợp chất VT15 (12,0 mg) và VT16 (10,0 mg).

Hợp chất VT9 (9,0 mg) và VT10 (10,0 mg) thu được khi tinh chế phân đoạn VIT2C

trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1,2:1, v/v). Phân đoạn

VIT2D được đưa lên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:MeOH

(10:1, v/v) thu được ba phân đoạn, VIT2D1-VIT2D3. VIT2D1 được phân tách trên

cột RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1,5, v/v) thu được bốn phân đoạn

nhỏ hơn, VIT2D1A-VIT2D1D. VIT2D1A được đưa lên đưa lên cột sephadex LH-20

với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1, v/v) thu được hợp chất VT1 (5,0 mg) và

VT3 (9,0 mg). VIT2D1C được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi

rửa giải CH2Cl2:acetone:nước (1,5:1:0,05, v/v/v) thu được hợp chất VT4 (10,0 mg)

và VT7 (8,0 mg). VIT2D2 được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa

giải MeOH:nước (1:1,5, v/v) thu được hai phân đoạn, VIT2D2A và VIT2D2B. Hợp

chất VT8 (8,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn VIT2D2A bằng cột sắc ký

silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (12:1, v/v). Hợp chất VT5 (16,0 mg) thu

được sau khi tinh chế phân đoạn VIT2D2B bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2:acetone:nước (1:1:0,05, v/v/v). VIT2D3 được phân tách trên cột sắc ký RP-

18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1,5, v/v) thu được hợp chất VT11 (10,0

mg).

Phần nước VIT3 được đưa lên cột diaion HP-20 để loại đường bằng nước, sau

đó được rửa giải bằng methanol trong nước với nồng độ tăng dần (25%, 50%, 75%

và 100%) thu được bốn phân đoạn VIT3A-VIT3D. VIT3B được phân tách trên cột

sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1,5, v/v) thu được ba phân

đoạn nhỏ hơn, VIT3B1-VIT3B3. Hợp chất VT13 (12,0 mg) thu được sau khi tinh chế

phân đoạn VIT3B1 bằng cột sắc ký sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải

MeOH:nước (1:1, v/v). Hợp chất VT2 (8,0 mg) và VT6 (12,0 mg) thu được sau khi

tinh chế phân đoạn VIT3B2 bằng cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải

acetone:nước (1:3, v/v). Hợp chất VT12 (13,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân

đoạn VIT3B3 bằng cột sắc ký sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước

(1:1, v/v). VIT3C được phân tách trên cột RP-18 với hệ dung môi rửa giải

MeOH:nước (1:1,5, v/v) thu được hợp chất VT14 (15,0 mg).

Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. trifolia

2.4. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được

2.4.1. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài V. limonifolia

2.4.1.1. Hợp chất VL1: 7α,12α-Dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide

(Vitexlimolide A) (hợp chất mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : –24,0 (c 0,1, MeOH).

HR-ESI-MS: m/z 369,1830 [M+Cl]‒.

Tính toán lý thuyết [C20H30O4Cl]‒: 369,1838.

Công thức phân tử C20H30O4, M = 334.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.1.

2.4.1.2. Hợp chất VL2: 7α,12β,16-Trihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide

(Vitexlimolide B) (hợp chất mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : –16,0 (c 0,1, MeOH).

HR-ESI-MS: m/z 385,1772 [M+Cl]‒.

Tính toán lý thuyết [C20H30O5Cl]‒: 385,1787.

Công thức phân tử: C20H30O5, M = 350.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.2

2.4.1.3. Hợp chất VL3: 7α,16-Dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide

(Vitexlimolide C) (hợp chất mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng

Độ quay cực : –24,0 (c 0,1, MeOH)

HR-ESI-MS: m/z 357,2036 [M+Na]+.

Tính toán lý thuyết [C20H30O4Na]+: 357,2036.

Công thức phân tử: C20H30O4, M = 334.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.3.

2.4.1.4. Hợp chất VL4: 5,4′-Dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone

Chất bột màu vàng.

HR-ESI-MS: m/z 313,0711 [M-H]‒.

Tính toán lý thuyết [C17H13O6]‒: 313,0718.

Công thức phân tử: C17H14O6, M = 314.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.4.

2.4.1.5. Hợp chất VL5: Vitecetin

Chất bột màu vàng.

HR-ESI-MS: m/z 359,0752 [M-H]‒.

Tính toán lý thuyết [C18H15O8]‒ : 359,0772.

Công thức phân tử: C18H16O8, M = 360.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.5.

2.4.1.6. Hợp chất VL6: 5,4′-Dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone

Chất bột màu vàng.

HR-ESI-MS: m/z 313,0712 [M-H]‒.

Tính toán lý thuyết [C17H13O6]‒ : 313,0718.

1H-NMR (DMSO-d6): H 6,93 (s, H-2), 6,35 (s, H-6), 6,76 (s, H-8), 7,57 (s, H-2′),

Công thức phân tử: C17H14O6, M = 314.

6,94 (d, J = 7,5 Hz, H-5′), 7,58 (d, J = 7,5 Hz, H-6′), 3,90 (s, 7-OMe), 3,86 (s, 3′-

13C-NMR (DMSO-d6): C 161,1 (C-2), 103,3 (C-3), 181,9 (C-4), 164,0 (C-5), 97,9

OMe).

(C-6), 165,1 (C-7), 92,7 (C-8), 157,2 (C-9),104,7 (C-10), 121,4 (C-1′), 110,2 (C-2′),

148,0 (C-3′), 150,9 (C-4′), 115,8 (C-5′), 120,5 (C-6′), 56,0 (7-OMe), 56,0 (3′-OMe).

2.4.1.7. Hợp chất VL7: Verrucosin

Dạng dầu, không màu.

Độ quay cực : +12,0 (c 0,1, CHCl3).

HR-ESI-MS: m/z 343,1544 [M-H]‒.

Tính toán lý thuyết [C20H23O5]‒: 343,1551.

1H-NMR (CDCl3): H 5,11 (d, J = 8,5 Hz, H-2), 2,24 (m, H-3), 1,77 (m, H-4), 4,39

Công thức phân tử: C20H24O5, M = 344.

(d, J = 9,5 Hz, H-5), 7,04 (d, J = 1,5 Hz, H-2′), 6,92 (d, J = 8,0 Hz, H-5′), 6,99 (dd, J

= 1,5, 8,0 Hz, H-6′), 6,85 (d, J = 1,5 Hz, H-2′′), 6,88 (d, J = 8,0 Hz, H-5′′), 6,82 (dd,

J = 1,5, 8,0 Hz, H-6′′), 3,86 (s, 3′-OMe), 3,91 (s, 3′′-OMe), 1,05 (d, J = 7,0 Hz, 3-

Me), 0,66 (d, J = 7,0 Hz, 4-Me).

13C-NMR (CDCl3): C 87,4 (C-2), 47,8 (C-3), 46,0 (C-4), 83,2 (C-5), 133,2 (C-1′),

109,4 (C-2′), 146,5 (C-3′), 145,2 (C-4′), 114,2 (C-5′), 119,3 (C-6′), 132,8 (C-1′′),

109,8 (C-2′′), 146,2 (C-3′′), 144,6 (C-4′′), 113,9 (C-5′′), 119,9 (C-6′′), 55,9 (3′-OMe),

55,9 (3′′-OMe), 15,0 (3-Me), 15,0 (4-Me).

2.4.1.8. Hợp chất VL8: 2α,3α-Dihydroxyurs-12-en-28-oic acid

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : +30,0 (c 0,1, MeOH).

Công thức phân tử: C30H48O4, M= 472.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.6.

2.4.1.9. Hợp chất VL9: Euscaphic acid

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : +20,0 (c 0,1, MeOH).

Công thức phân tử: C30H48O5, M = 488.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.7.

2.4.1.10. Hợp chất VL10: 2α,3α-Dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-

28-oic acid

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : –40,0 (c 0,1, MeOH).

Công thức phân tử: C30H46O5, M = 486.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.8.

2.4.1.11. Hợp chất VL11: Maslinic acid

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : –64,1 (c 0,1, MeOH).

Công thức phân tử: C30H48O4, M = 472.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.9.

2.4.1.12. Hợp chất VL12: Maltol O-β-D-glucopyranoside

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : –15,0 (c 0,1, MeOH).

Công thức phân tử: C12H16O8, M = 288.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.10.

2.4.2. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài V. trifolia

2.4.2.1. Hợp chất VT1: 3α-Hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid (hợp chất mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : +50,0 (c 0,1, MeOH).

HR-ESI-MS: m/z 455,3540 [M-H]‒.

Tính toán lý thuyết [C30H47O3]‒: 455,3531.

Công thức phân tử: C30H48O3, M = 456.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CDCl3): xem Bảng 3.11.

2.4.2.2. Hợp chất VT2: Matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : –18,0 (c 0,1, MeOH).

CD (c=1,0×10‒3, MeOH): [θ]25 (rel, nm) ‒1,00 (226), ‒0,21 (275)

HR-ESI-MS: m/z 521,2009 [M+H]+.

Tính toán lý thuyết [C26H33O11]+: 521,2017.

Công thức phân tử: C26H32O11, M = 520

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.12.

2.4.2.3. Hợp chất VT3: Ecdysone

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : +70,0 (c 0,1, MeOH).

Công thức phân tử: C27H44O6, M = 464.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.13.

2.4.2.4. Hợp chất VT4: 20-Hydroxyecdysone

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : +52,0 (c 0,1, MeOH).

Công thức phân tử: C27H44O7, M = 480.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.14.

2.4.2.5. Hợp chất VT5: 20-Hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : +50,0 (c 0,1, MeOH).

Công thức phân tử: C30H48O7, M = 520.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.15.

2.4.2.6. Hợp chất VT6: Turkesterone

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : +85,0 (c 0,1, MeOH).

HR-ESI-MS: m/z 495,2950 [M-H]‒.

Tính toán lý thuyết [C27H43O8]‒: 495,2963.

1H-NMR (CD3OD): H 4,03 (ddd, J = 3,0, 4,0, 12,0 Hz, H-2), 3,98 (br d, J = 2,0 Hz,

Công thức phân tử: C27H44O8, M = 496.

H-3), 2,36 (dd, J = 4,0, 13,0 Hz, H-5), 5,82 (d, J = 2,5 Hz, H-7), 3,17 (dd, J = 2,0, 8,5

Hz, H-9), 4,13 (m, H-11), 0,90 (s, H-18), 1,08 (s, H-19), 1,23 (s, H-21), 3,37 (m, H-

13C-NMR (CD3OD): C 39,1 (C-1), 68,9 (C-2), 68,6 (C-3), 33,3 (C-4), 52,8 (C-5),

22), 1,22 (s, H-24), 1,22 (s, H-27).

206,7 (C-6), 122,7 (C-7), 165,7 (C-8), 42,9 (C-9), 39,9 (C-10), 69,5 (C-11), 43,8 (C-

12), 49,0 (C-13), 84,9 (C-14), 31,9 (C-15), 21,5 (C-16), 50,3 (C-17), 18,9 (C-18),

24,6 (C-19), 77,8 (C-20), 21,0 (C-21), 78,4 (C-22), 27,3 (C-23), 42,4 (C-24), 71,3 (C-

25), 29,0 (C-26), 29,7 (C-27).

2.4.2.7. Hợp chất VT7: Polypodine B

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Độ quay cực : +94,2 (c 0,1, MeOH).

Công thức phân tử: C27H44O8, M = 496.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.16.

2.4.2.8. Hợp chất VT8: Rubrosterone

Chất bột màu trắng.

Độ quay cực : +120,0 (c 0,1, MeOH)

Công thức phân tử: C19H26O5, M = 334.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.17.

2.4.2.9. Hợp chất VT9: Luteolin

Chất bột màu vàng.

1H-NMR (CD3OD): H 6,55 (s, H-3), 6,22 (d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,45 (d, J = 2,0 Hz,

Công thức phân tử: C15H10O6, M = 286.

H-8), 7,39* (H-2), 6,92 (d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,39* (H-6). (*Tín hiệu chập).

13C-NMR (CD3OD): C 166,0 (C-2), 103,9 (C-3), 183,9 (C-4), 163,2 (C-5), 100,1

(C-6), 166,4 (C-7), 95,0 (C-8), 159,4 (C-9), 105,3 (C-10), 123,7 (C-1), 114,2 (C-2),

147,0 (C-3), 151,0 (C-4), 116,8 (C-5), 120,3 (C-6).

2.4.2.10. Hợp chất VT10: (2S)-7,4'-Dihydroxy-5-methoxyflavanone

Chất bột màu vàng.

Độ quay cực : -20,5 (c 0,1, MeOH)

Công thức phân tử: C16H14O5, M = 286.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.18.

2.4.2.11. Hợp chất VT11: Vitexin

Chất bột màu vàng.

Độ quay cực : +9,1 (c 0,1, MeOH).

1H-NMR (DMSO-d6): H 6,77 (s, H-3), 6,28 (s, H-6), 8,02 (d, J = 8,5 Hz, H-2′), 6,89

Công thức phân tử: C21H20O10, M = 432.

13C-NMR (DMSO-d6): C 164,0 (C-2), 102,5 (C-3), 182,1 (C-4), 160,4 (C-5), 98,1

(d, J = 8,5 Hz, H-3′), 4,69 (d, J = 10 Hz, H-1′′).

(C-6), 162,5 (C-7), 104,6 (C-8), 156,0 (C-9), 104,1 (C-10), 121,6 (C-1′), 129,0 (C-

2′), 115,8 (C-3′), 161,1 (C-4′), 115,8 (C-5′), 129,0 (C-6′), 73,4 (C-1), 70,9 (C-2),

78,7 (C-3), 70,6 (C-4), 81,8 (C-5), 61,3 (C-6).

2.4.2.12. Hợp chất VT12: Orientin

Chất bột màu vàng.

Độ quay cực : +20,0 (c 0,1, MeOH).

1H-NMR (CD3OD): H 6,63 (s, H-3), 6,26 (s, H-6), 7,48 (s, H-2′), 6,86 (d, J = 8,0 Hz,

Công thức phân tử: C21H20O11, M = 448.

13C-NMR (CD3OD): C 164,1 (C-2), 102,3 (C-3), 182,0 (C-4), 160,4 (C-5), 98,1 (C-

H-5′), 7,53 (d, J = 8,0 Hz, H-6′), 4,68 (d, J = 10 Hz, H-1′′).

6), 162,7 (C-7), 104,5 (C-8), 156,0 (C-9), 104,0 (C-10), 121,9 (C-1′), 114,0 (C-2′),

145,8 (C-3′), 149,7 (C-4′), 115,6 (C-5′), 119,3 (C-6′), 73,4 (C-1), 70,8 (C-2), 78,7

(C-3), 70,7 (C-4), 82,0 (C-5), 61,6 (C-6).

2.4.2.13. Hợp chất VT13: Homoorientin

Chất bột màu vàng.

Độ quay cực : +28,5 (c 0,1, MeOH).

1H-NMR (DMSO-d6): H 6,67 (s, H-3), 6,48 (s, H-8), 7,41 (d, J = 2,0 Hz, H-2′), 6,89

Công thức phân tử: C21H20O11, M = 448.

13C-NMR (DMSO-d6): C 163,3 (C-2), 102,8 (C-3), 181,9 (C-4), 160,7 (C-5), 108,9

(d, J = 8,0 Hz, H-5′), 7,41 (dd, J = 2,0, 10,0 Hz, H-6′), 4,59 (d, J = 10,0 Hz, H-1′′).

(C-6), 163,7 (C-7), 93,5 (C-8), 156,2 (C-9), 103,4 (C-10), 121,4 (C-1′), 113,3 (C-2′),

145,8 (C-3′), 149,7 (C-4′), 116,1 (C-5′), 119,0 (C-6′), 73,1 (C-1), 70,6 (C-2), 79,0

(C-3), 70,2 (C-4), 81,6 (C-5), 61,5 (C-6).

2.4.2.14. Hợp chất VT14: 2-O-Rhamnosylvitexin

Chất bột màu vàng.

Độ quay cực : +30,0 (c 0,1, MeOH).

1H-NMR (CD3OD): H 6,62 (s, H-3), 6,26 (s, H-6), 8,01 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′/H-

Công thức phân tử: C27H30O14, M = 578.

13C-NMR (CD3OD): C 166,7 (C-2), 103,6 (C-3), 184,1 (C-4), 162,7 (C-5), 100,1 (C-

6′), 6,97 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′/H-5′), 5,06 (d, J = 10,0 Hz, H-1′′), 5,11* (H-1′′′).

6), 164,9 (C-7), 105,8 (C-8), 158,0 (C-9), 105,8 (C-10), 123,6 (C-1′), 130,1 (C-2′),

117,0 (C-3′), 162,8 (C-4′), 117,0 (C-5′), 130,1 (C-6′), 73,8 (C-1), 78,2 (C-2), 81,6

(C-3), 72,3 (C-4), 82,9 (C-5), 63,1 (C-6), 102,5 (C-1), 72,5 (C-2), 72,0 (C-

3), 73,6 (C-4), 70,0 (C-5), 18,0 (C-6).(*Tín hiệu chập).

2.4.2.15. Hợp chất VT15: Euscaphic acid

Xem VL9

2.4.2.16. Hợp chất VT16: Tormentic acid

Chất bột vô định hình màu trắng

Độ quay cực :+29,0 (c 0,1, MeOH)

Công thức phân tử: C30H48O5, M = 488.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.19.

2.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

2.5.1. Hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập được từ loài V.

limonifolia

Các hợp chất VL1- VL12 được đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa trên khả

năng ức chế sự sản sinh NO được sinh ra bởi tế bào BV2, kích thích bởi LPS.

Đầu tiên, các hợp chất được kiểm tra độ độc của chúng đối với tế bào ở nồng

độ 20 µM. Những hợp chất không thể hiện độc tính (VL1-VL10, VL12) tiếp tục được

đánh giá sàng lọc ức chế sự sản sinh NO trên dòng tế bào BV2, kích thích bởi LPS ở

50 µM. Những chất thử nghiệm đều có khả năng ức chế mạnh sự sản sinh NO do tế

bào BV2 sinh ra (% ức chế >50%) nên tiếp tục được đánh giá ở các nồng độ khác

nhau: 1,0, 5,0, 10, 20 µM để xác định giá trị IC50. Chất đối chứng dương sử dụng

trong thí nghiệm là L-NMMA, một loại chất ức chế sản sinh NO, với giá trị IC50 là

22,11,20 µM.

Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào BV2, được kích

thích bởi LPS của 12 hợp chất (VL1-VL12) ở nồng độ 20 µM được thể hiện như

bảng dưới đây.

Bảng 2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh NO của các hợp chất

VL1-VL12 trên tế bào BV2

Hợp chất % tế bào sống sót

(-) Không đánh giá hoạt tính kháng viêm ở các nồng độ do tỉ lệ % tế bào sống sót nhỏ (< 80%)

87,062,43 120,757,80 147,828,55 87,1211,28 104,519,50 86,633,23 96,935,10 104,519,50 141,198,73 119,536,65 59,045,83 80,503,25 VL1 VL2 VL3 VL4 VL5 VL6 VL7 VL8 VL9 VL10 VL11 VL12 L-NMMA IC50 (µM) >50 2,500,34 7,130,87 24,701,52 39,673,14 19,161,09 45,315,31 >50 44,232,48 15,881,17 - >50 22,101,20

2.5.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất

Từ loài V. limonifolia

12 hợp chất VL1-VL12 phân lập được từ loài V. limonifolia được tiến hành

đánh giá hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3 (CVB3), human

rhinovirus 1B (HRV1B) và enterovirus 71 (EV71) theo phương pháp thử nghiệm

SRB. Rupuntrivir và ribavirin được sử dụng làm chất đối chứng dương.

Kết quả cho thấy, 2 hợp chất flavonoid VL4 và VL6 thể hiện hoạt tính kháng

virus mạnh (Bảng 2.2). Đồng thời, các hợp chất VL4 và VL6 không thể hiện độc tính

đối với tế bào (dữ liệu không được hiển thị).

Bảng 2.2. Hoạt tính kháng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B và

enterovirus 71 của một số hợp chất từ loài V. limonifolia.

Kí hiệu CC50 (M) IC50 (M)

Coxsackievirus B3 (CVB3)

0,21±0,06 >50 VL4

1,86±0,18 >50 VL6

0,12±0,06 >50 Rupuntrivir

Human rhinovirus 1B (HRV1B)

0,61±0,21 >50 VL4

48,07±1,46 >50 Ribavirin

Enterovirus 71 (EV71)

32,05±0,94 >50 VL4

0,11±0,05 >50 Rupuntrivir

Từ loài V. trifolia

Các hợp chất VT1-VT16 được phân lập từ loài V. trifolia trước tiên được đánh

giá sàng lọc hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus

1B và enterovirus 71.

Kết quả đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng các chủng virus CVB3/ HRV1B/ EV71

của các hợp chất VT1-VT16 ở nồng độ 10 M được trình bày ở bảng dưới đây.

Bảng 2.3. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng một số chủng virus của các hợp chất

từ loài V. trifolia

% tế bào sống sót Hợp chất Coxsackievirus B3 Human rhinovirus 1B Enterovirus 71

2,38 5,41 1,30 VT1

3,52 4,23 5,97 VT2

4,99 -1,51 -4,34 VT3

13,27 0,71 3,37 VT4

1,94 -0,12 2,29 VT5

-2,31 -1,87 -5,16 VT6

4,20 -3,10 6,44 VT7

1,85 -0,68 1,42 VT8

77,14 80,20 43,35 VT9

-5,98 -1,75 -4,99 VT10

3,44 1,03 -4,94 VT11

1,89 -3,34 -1,17 VT12

6,23 -0,95 -1,87 VT13

-0,63 -0,20 1,53 VT14

-0,19 -2,30 -0,19 VT15

1,32 -1,79 -8,83 VT16

Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng virus của các hợp chất phân lập được từ loài

V. trifolia cho thấy, chỉ có hợp chất VT9 thể hiện hiệu quả kháng các chủng virus

virus CVB3/ HRV1B/ EV71.

CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ

3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được

Tổng số 28 hợp chất đã được phân lập và xác định được cấu trúc từ hai loài V.

limonifolia và V. trifolia, trong đó có:

* 12 hợp chất từ loài V. limonifolia (Hình 3.1):

3 hợp chất diterpenoid khung labdane, đều là hợp chất mới được đặt tên là

vitexlimolide A (VL1), vitexlimolide B (VL2) và vitexlimolide C (VL3); 9 hợp chất

đã biết gồm: ba hợp chất flavonoid, 5,4′-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone (VL4),

vitecetin (VL5), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone (VL6); 1 hợp chất lignan,

verrucosin (VL7); 4 hợp chất triterpenoid khung ursane và oleanane, 2α,3α-

dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (VL8), euscaphic acid (VL9), 2α,3α-dihydroxy-19-

oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid (VL10), maslinic acid (VL11); và 1

hợp chất -pyrone glycoside, maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12). Trong đó, các

hợp chất VL4, VL6, VL7, VL10 và VL12 lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex.

Hình 3.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài V. limonifolia

* 16 hợp chất từ loài V. trifolia (Hình 3.2):

Hình 3.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài V. trifolia

Một hợp chất mới triterpene khung lanostane, 3α-hydroxylanosta-8,24E-dien-

26-oic acid (VT1); 1 hợp chất mới khung lignan, matairesinol 4′-O-β-D-

glucopyranoside (VT2); và 14 hợp chất đã biết gồm: 6 hợp chất ecdysteroid, ecdysone

(VT3), 20-hydroxyecdysone (VT4), 20-hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide

(VT5), turkesterone (VT6), polypodine B (VT7), rubrosterone (VT8); 6 hợp chất

flavonoid, luteolin (VT9), (2S)-7,4'-dihydroxy-5-methoxyflavanone (VT10), vitexin

(VT11), orientin (VT12), homoorientin (VT13), 2-O-rhamnosylvitexin (VT14); 2

hợp chất triterpene khung ursane, euscaphic acid (VT15) và tormentic acid (VT16).

Trong đó, hợp chất VT5 lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex, các hợp chất VT3,

VT4, VT6 lần đầu tiên phân lập từ loài V. trifolia.

3.1.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài V. limonifolia

3.1.1.1. Hợp chất VL1: Vitexlimolide A (hợp chất mới)

Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất VL1 và hợp chất tham khảo

Hợp chất VL1 phân lập được dưới dạng chất bột vô định hình, màu trắng.

Công thức phân tử của VL1 được xác định là C20H30O4 dựa vào kết quả phổ khối

lượng phân giải cao HR-ESI-MS với sự xuất hiện pic ion tại m/z 369,1830 [M+Cl]‒

(tính toán lý thuyết cho công thức [C20H30O4Cl]‒, 369,1838).

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VL1 (đo trong CD3OD) xuất hiện tín hiệu của

ba nhóm methyl liên kết trực tiếp với carbon bậc bốn tại δH 0,74 (3H, s), 0,86 (3H, s)

và 0,92 (3H, s), hai proton hydroxymethine tại δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz) và 4,58 (dd, J

= 4,0, 8,0 Hz), ba proton olefin tại δH 4,65 (s), 5,13 (s) và 6,01 (d, J = 2,0 Hz). Trên

phổ 13C-NMR và DEPT của VL1 xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử carbon, trong

đó có ba carbon methyl tại δC 14,3, 22,0 và 33,8, bảy methylene tại δC 20,4, 32,0,

32,5, 39,8, 43,3, 67,2 và 110,0, năm methine tại δC 47,6, 48,8, 67,2, 74,7 và 114,4,

bốn carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 34,1, 40,5, 150,6 và 177,5 và một

carbon carbonyl tại δC 176,5. Tất cả các dữ liệu phổ trên gợi ý cấu trúc của VL1 là

một diterpene khung labdane [42]. Thêm vào đó, số liệu phổ NMR của VL1 tương

tự với hợp chất vitexolide E (VL1a), được phân lập từ V. vestita [42], ngoại trừ việc

xuất hiện thêm nhóm hydroxy tại C-7. Vị trí của nhóm hydroxy tại C-7 và liên kết

đôi tại C-8/C-17 được xác định dựa trên các tương tác HMBC từ H-17 (δH 4,65 và

5,13) đến C-7 (δC 74,7)/C-8 (δC 150,6)/C-9 (δC 47,6); từ H-7 (δH 4,38) đến C-5 (δC

48,8)/C-6 (δC 32,5)/C9 (δC 47,6). Trên phổ 1H-NMR của VL1, hằng số tương tác của

H-6 và H-7 nhỏ, J = 3,0 Hz [H-7: δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz)], gợi ý cấu hình của nhóm

hydroxy tại C-7 là axial (α). Điều này được khẳng định thêm dựa trên sự so sánh với

hằng số tương tác của H-6 và H-7 của hợp chất có nhóm 7β-hydroxy, J = 11,5 Hz

[7β-hydroxyisocupressic acid: δH 3,83 (1H, dd, J = 5,0, 11,5 Hz), H-7, đo trong

CD3OD)] [120] và hợp chất có nhóm 7α-hydroxy, J  0 Hz [7α-hydroxylabd-8(17)-

en-15,18-dioic acid-15-methyl ester: δH 4,38 (br s), H-7, đo trong CDCl3] [121].

Hình 3.4. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất VL1

Các tương tác HMBC giữa H-14 (δH 6,01) và C-12 (δC 67,2)/C-13 (δC

177,5)/C-15 (δC 176,5)/C-16 (δC 73,0); giữa H-16 (δH 5,01) và C-14 (δC 114,4)/C-15

(δC 176,5); giữa H-12 (δH 4,58) và C-9 (δC 47,6)/C-11 (δC 32,0)/C-13 (δC 177,5)/C-

14 (δC 114,4)/C-16 (δC 73,0) khẳng định sự có mặt của vòng γ-lactone chưa bão hòa

tại carbon β (C-13) và vị trí nhóm hydroxy tại C-12. Bằng so sánh độ bội của H-12

(δH 4,58, dd, J = 4,0, 8,0 Hz) của VL1 với các hợp chất có nhóm 12α-hydroxy

[vitexolide A: δH 4,56 (br d, J = 10,6 Hz, H-12), đo trong acetone-d6] [42] và hợp chất

có nhóm 12β-hydroxy [12-epivitexolide A: δH (4,61 br s, H-12), đo trong acetone-d6]

[42], đã gợi ý nhóm hydroxy tại C-12 có cấu hình α.



Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL1 và hợp chất tham khảo

a,c (J = Hz)

C δC

a,b DEPT δH

δC

1,19 (ddd, 3,0, 12,5, 13,0, α)/1,74 (m, β) 39,7 1 39,8 CH2

1,54 (m, α)/1,64 (m, β) 20,1 2 20,4 CH2

1,30 (m, α)/1,45 (brd, 13,0, β) 43,0 3 43,3 CH2

34,1 C - 34,3 4

48,8 CH 1,75 (m) 56,4 5

1,60 (m, α)/1,91 (ddd, 2,5, 3,0, 14,0, β) 25,3 6 32,5 CH2

39,0 74,7 CH 4,38 (t, 3,0) 7

- 149,5 150,6 C 8

52,8 47,6 CH 2,60 (dd, 4,0, 9,0) 9

40,1 - 40,5 C 10

32,1 1,76 (m) 11 32,0 CH2

67,3 67,2 CH 4,58 (dd, 4,0, 8,0) 12

- 176,3 177,5 C 13

114,2 114,4 CH 6,01 (d, 2,0) 14

- 174,1 176,5 C 15

71,8 5,01 (m) 16 73,0 CH2

107,1 4,65 (s)/5,13 (s) 17 110,0 CH2

22,1 0,92 (s) 18 33,8 CH3

34,0 0,86 (s) 19 22,0 CH3

#C của vitexolide E (VL1a, đo trong acetone-d6) [42], ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz.

15,2 0,74 (s) 20 14,3 CH3

Để xác định chính xác cấu hình tuyệt đối của C-12, hợp chất VL1 được tiến

hành đo phổ CD. Phổ CD thực nghiệm của hợp chất này được so sánh với các tính

toán theo lí thuyết (phương pháp TDDFT) [122] của hai epimer 1a (7α,12α-

dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide) và 1b (7α,12β-dihydroxylabda-8(17),13-

dien-15,16-olide)-cấu trúc chỉ khác nhau ở cấu hình của nhóm hydroxy tại C-12. Kết

quả cho thấy, phổ CD của VL1 có hiệu ứng Cotton dương tại max = 218 nm khi đo

ở bước sóng 200-244 nm (nồng độ 10-4 M), và hiệu ứng Cotton âm tại max = 251 nm

67 khi đo ở bước sóng 245-280 nm (nồng độ 10-2 M). So sánh với phổ CD của hợp chất

1a (có hiệu ứng Cotton dương tại max = 221 nm và hiệu ứng Cotton âm tại max =

249 nm) và hợp chất 1b (có hiệu ứng Cotton âm tại max = 221 nm). Như vậy, phổ

CD của hợp chất VL1 có giống với của 1a, do đó có cấu hình của nhóm hydroxy tại

C-12 được chứng minh là α (tức cấu hình R). Từ những phân tích trên, cấu trúc của

hợp chất VL1 được xác định là 7α,12α-dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide.

Đây là một hợp chất mới và được đặt tên là vitexlimolide A.

Hình 3.5. Phổ CD thực nghiệm của hợp chất VL1 và tính toán CD theo lý thuyết

của hai epimer 1a và 1b.

Hình 3.6. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VL1

Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất VL1

Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của hợp chất VL1

Hình 3.9. Phổ DEPT của hợp chất VL1

Hình 3.10. Phổ HSQC của hợp chất VL1

Hình 3.11. Phổ HMBC của hợp chất VL1

Hình 3.12. Phổ COSY của hợp chất VL1

Hình 3.13. Phổ NOESY của hợp chất VL1

3.1.1.2. Hợp chất VL2: Vitexlimolide B (hợp chất mới)

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học VL2 và hợp chất tham khảo (VL1)

Hợp chất VL2 thu được dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng. Công thức

phân tử của VL2 được xác định là C20H30O5 dựa vào kết quả phổ khối lượng phân

giải cao HR-ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 385,1772 [M+Cl] ̶ (tính toán lý thuyết

cho công thức [C20H30O5Cl] ̶ : 385,1787).

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VL2 (đo trong CD3OD) xuất hiện tín hiệu

proton của ba nhóm methyl liên kết với carbon bậc bốn tại δH 0,74 (3H, s), 0,86 (3H,

s) và 0,92 (3H, s), hai proton hydroxymethine tại δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz) và 4,58 (br

s), ba proton olefin tại δH 4,78 (s), 5,13 (s) và 6,04 (s). Trên phổ 13C-NMR và DEPT

của VL2 xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử carbon, trong đó có ba carbon methyl

tại δC 14,2, 22,0 và 33,8, sáu methylene tại δC 20,3, 31,2, 32,4, 39,8, 43,3 và 110,5,

sáu methine tại δC 66,9, 47,6, 49,0, 74,7, 100,2 và 117,1, bốn carbon không liên kết

trực tiếp với hydro tại δC 34,1, 40,5, 150,0 và 173,1 và một carbon carbonyl tại δC

173,1. Số liệu phổ NMR của VL2 khá giống với hợp chất VL1 gợi ý đây cũng là một

hợp chất khung labdane. Tuy nhiên, so sánh số liệu phổ NMR của hai hợp chất trên

có điểm khác biệt lớn, đó là tín hiệu của nhóm oxymethylene (δH 5,01 và δC 73,0) ở

hợp chất VL1 được thay thế bằng nhóm hemiacetal (δH 6,23 và δC 100,2) trong hợp

chất VL2. Tín hiệu cộng hưởng của các proton trong vòng γ-hydroxy-γ-lactone trên

phổ 1H-NMR của VL2 rộng và thấp, cũng như tín hiệu cộng hưởng của C-14 (δC

117,1) và C-16 (δC 100,2) rất khó quan sát trên phổ 13C-NMR gợi ý tồn tại một cân

bằng giữa hai đồng phân epimer tại C-16.

Hình 3.15. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất VL2

Vị trí của nhóm hydroxy tại C-7 và liên kết đôi tại C-8/C-17 được xác định

dựa trên các tương tác HMBC từ H-17 (δH 4,78 và 5,13) đến C-7 (δC 74,7)/C-8 (δC

150,0)/C-9 (δC 47,6); từ H-7 (δH 4,38) đến C-5 (δC 49,0)/C-6 (δC 32,4)/C-9 (δC 47,6).

Vị trí của nhóm hydroxy tại C-12 được xác định dựa trên các tương tác HMBC từ H-

11 (δH 1,65 và 1,73)/H-14 (δH 6,04) đến C-12 (δC 66,9) và tương tác COSY giữa H-9

(δH 2,62)/H-11 (δH 1,65 và 1,73)/H-12 (δH 4,58). Cấu hình của nhóm hydroxy tại C-

12 được xác định là β dựa trên sự so sánh độ bội của H-12 (δH 4,58, br s) của VL2

với các hợp chất có nhóm 12α-hydroxy [vitexolide A: δH 4,56 (br d, J = 10,6 Hz), H-

12, đo trong acetone-d6] [42] và hợp chất có nhóm 12β-hydroxy [12-epivitexolide A:

δH (4,61 br s), H-12, đo trong acetone-d6] [42]. Từ những phân tích trên, cấu trúc của

hợp chất VL2 được xác định là 7α,12β,16-trihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-

olide. Đây là hợp chất mới và được đặt tên là vitexlimolide B.



Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL2 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)

C δC δH δC

39,8 1 39,8 CH2

1,19 (ddd, 3,0, 13,0, 13,0) 1,71 (m)

20,4 1,53 (m) 2 20,3 CH2

1,63 (m)

43,3 1,26 (m) 3 43,3 CH2

1,45 (brd, 13,0)

34,1 C - 34,1 4

49,0 CH 1,75 (m) 48,8 5

1,61 (dd, 3,0, 13,0) 32,5 6 32,4 CH2

1,90 (m)

74,7 74,7 CH 4,38 (t, 3,0) 7

150,6 150,0 C - 8

47,6 CH 2,62 (br d, 12,0) 47,6 9

40,5 40,5 C - 10

32,0 1,65 (m) 11 31,2 CH2

1,73 (m)

67,2 66,9 CH 4,58 (br s) 12

177,5 173,1 C - 13

114,4 117,1 CH 6,04 (s) 14

176,5 173,1 C - 15

73,0 100,2 CH 6,23 (s) 16

110,0 4,78 (s) 17 110,5 CH2

5,13 (s)

33,8 0,92 (s) 18 33,8 CH3

22,0 0,86 (s) 19 22,0 CH3

#C của vitexlimolide A (VL1, đo trong CD3OD), ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz.

14,3 0,74 (s) 20 14,2 CH3

Hình 3.16. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VL2

Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của hợp chất VL2

Hình 3.18. Phổ 13C-NMR của hợp chất VL2

Hình 3.19. Phổ HSQC của hợp chất VL2

Hình 3.20. Phổ HMBC của hợp chất VL2

Hình 3.21. Phổ COSY của hợp chất VL2

Hình 3.22. Phổ NOESY của hợp chất VL2

3.1.1.3. Hợp chất VL3: Vitexlimolide C (hợp chất mới)

Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của VL3 và hợp chất tham khảo (VL2)

Hợp chất VL3 phân lập được dưới dạng chất bột vô định hình, màu trắng.

Công thức phân tử của VL3 được xác định là C20H30O4 dựa vào kết quả phổ khối

lượng phân giải cao HR-ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 357,2036 [M+Na]+ (tính

toán lý thuyết cho công thức [C20H30O4Na]+, 357,2036).

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VL3 (đo trong DMSO-d6) xuất hiện tín hiệu

của ba nhóm methyl đính với nguyên tử carbon bậc bốn tại δH 0,61 (3H, s), 0,75 (3H,

s) và 0,81 (3H, s), một nhóm hydroxymethine tại δH 4,18 (br s), ba proton olefin tại

δH 4,54 (s), 4,96 (s) và 6,03 (s). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của VL3 xuất hiện tín

hiệu của 20 nguyên tử carbon, trong đó có ba carbon methyl tại δC 13,3, 21,4 và 32,7,

bảy methylene tại δC 18,9, 20,2, 26,1, 31,2, 38,3, 41,8 và 107,7, năm methine tại δC

46,8, 49,8, 71,9, 94,0 và 118,7, năm carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC

33,1, 39,0, 150,1, 170,8  2. Số liệu phổ NMR của VL3 tương tự hợp chất VL2, ngoại

trừ việc không có nhóm hydroxy tại C-12. Cấu trúc của đoạn mạch carbon no gắn ở

vị trí C-9 được khẳng định nhờ các tương tác HMBC từ H-11 (δH 2,09 và 2,39) đến

C-8 (δC 150,1)/C-9 (δC 49,8)/C-10 (δC 39,0) và các tương tác COSY giữa H-9 (δH

2,12)/H-11 (δH 2,09 và 2,39)/H-12 (δH 1,52 và 1,70). Tương tự như trên phổ NMR

của VL2, tín hiệu cộng hưởng của C-14 (δC 118,7) và C-16 (δC 94,0) khó quan sát

trên phổ 13C-NMR của VL3 do sự tồn tại cân bằng của hai đồng phân epimer tại C-

16.

Vị trí của nhóm hydroxy tại C-7 và liên kết đôi tại C-8/C-17 được xác định

nhờ các tương tác HMBC từ H-17 (δH 4,54 và 4,96) đến C-7 (δC 71,9)/C-8 (δC

150,1)/C-9 (δC 49,8), từ H-7 (δH 4,18) đến C-5 (δC 46,8)/C-6 (δC 31,2)/C9 (δC 49,8).

Tương tự như VL1 và VL2, trên phổ 1H-NMR của VL3, hằng số tương tác proton

của H-6 và H-7 nhỏ, J  0 Hz [H-7: δH 4,18 (br s)], đã gợi ý nhóm hydroxy tại C-7

có cấu hình axial (α). Từ những phân tích trên, hợp chất VL3 được khẳng định là

7α,16-dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide, và được đặt tên là vitexlimolide C.

Hình 3.24. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất VL3

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL3 và hợp chất tham khảo

a,c (J = Hz)

C δC

a,b DEPT δH

 39,8

δC

1,03 (ddd, 3,0, 12,5, 13,0) 1 38,3 CH2

1,70 (m)

20,3 1,46 (m) 2 18,9 CH2

1,52 (m)

43,3 1,16 (ddd, 4,0, 13,0, 13,0) 3 41,8 CH2

1,37 (m)

34,1 33,1 C - 4

49,0 46,8 CH 1,58 (m) 5

32,4 1,38 (m) 6 31,2 CH2

1,70 (m)

74,7 71,9 CH 4,18 (br s) 7

- 150,0 150,1 C 8

47,6 49,8 CH 2,12 (brd, 10,5) 9

- 40,5 39,0 C 10

31,2 2,09 (m) 11 26,1 CH2

2,39 (m)

1,52 (m) 12 66,9 20,2 CH

1,70 (m)

- 173,1 170,8 C 13

117,1 118,7 CH 6,03 (s) 14

- 173,1 170,8 C 15

6,35 (s) 100,2 94,0 CH 16

4,54 (s) 110,5 17 107,7 CH2

4,96 (s)

33,8 0,81 (s) 18 32,7 CH3

22,0 0,75 (s) 19 21,4 CH3

δC của vitexlimolide (VL2) (đo trong CD3OD), a đo trong DMSO-d6, b125 MHz, c500 MHz

14,2 0,61 (s) 20 13,3 CH3

Hình 3.25. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VL3

Hình 3.26. Phổ 1H-NMR của hợp chất VL3

Hình 3.27. Phổ 13C-NMR của hợp chất VL3

Hình 3.28. Phổ DEPT của hợp chất VL3

Hình 3.29. Phổ HSQC của hợp chất VL3

Hình 3.30. Phổ HMBC của hợp chất VL3

Hình 3.31. Phổ COSY của hợp chất VL3

Hình 3.32. Phổ ROESY của hợp chất VL3

3.1.1.4. Hợp chất VL4: 5,4′-Dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone

Hình 3.33. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL4

Hợp chất VL4 phân lập được dưới dạng bột màu vàng. Công thức phân tử của

VL4 được xác định là C17H14O6 dựa trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS

với sự xuất hiện pic ion tại m/z 313,0711 [M-H]‒ (tính toán lý thuyết cho công thức

[C17H13O6]‒, 313,0718). Trên phổ 1H-NMR của VL4 cho thấy tín hiệu của sáu proton

vòng thơm tại H 6,36 (1H, s), 6,73 (1H, s), 6,95 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 7,97 (2H, d,

J = 8,5 Hz), hai nhóm methoxy tại H 3,86 (3H, s) và 3,80 (3H, s) gợi ý đây là một

hợp chất flavone.

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL4 và hợp chất tham khảo

a,c (J = Hz)

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′, 6′ 3′, 5′ 4′ 3-OMe 7-OMe

 δC 156,0 137,9 178,1 160,9 97,8 165,2 92,4 156,4 105,3 120,6 130,3 115,8 160,3 59,8 56,1

a,b δH δC 155,9 - 137,8 - 178,1 - 160,9 - 98,0 6,36 (s) 165,1 - 92,3 6,73 (s) 156,3 - 105,2 - 120,5 - 130,2 7,97 (d, 8,5) 115,7 6,95 (d, 8,5) 160,3 - 59,7 3,80 (s) 56,1 3,86 (s)

#C của 5,4-dihydroxy-3,7-dimethoxyfavone đo trong CDCl3 [123], ađo trong DMSO-d6, b125MHz,

c500MHz

Trên phổ 13C-NMR và HSQC xuất hiện tín hiệu của 17 nguyên tử carbon, bao

gồm chín carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại C 105,2, 120,5, 137,8, 155,9,

156,3, 160,3, 160,9, 165,1 và 178,1; sáu carbon methine tại C 92,3, 98,0, 115,7 × 2

và 130,2 × 2; hai carbon methoxy tại C 56,1 và 59,1 Những dữ kiện này đã khẳng

định VL4 có cấu trúc khung flavone với hai nhóm thế methoxy.

Các tương tác HMBC giữa H-2′/H-6′ (H 7,97) và C-2 (C 155,9)/C-4′ (C

160,3) cho biết vị trị nhóm hydroxy tại C-4′. Các tương tác HMBC giữa H-6 (H

6,36)/H-8 (H 6,73) và C-7 (C 165,1); giữa proton methoxy (δH 3,80) và (δH 3,86)

lần lượt với C-3 (δC 137,8) và C-7 (C 165,1) đã xác định vị trí của hai nhóm methoxy

tại C-3 và C-7. Từ các phân tích nêu trên, kết hợp với sự giống nhau về số liệu phổ

NMR của VL4 với của hợp chất 5,4′-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone [123], cho

phép khẳng định hợp chất VL4 là 5,4′-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone. Theo tra

cứu trên scienfinder, hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ chi Vitex.

Hình 3.34. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VL4

3.1.1.5. Hợp chất VL5: Vitecetin

Hình 3.35. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL5

Hợp chất VL5 thu được dưới dạng chất bột màu vàng. Công thức phân tử của

hợp chất VL5 được xác định là C18H16O8 dựa trên phổ khối lượng phân giải cao HR-

ESI-MS với sự xuất hiện pic ion tại m/z 359,0752 [M-H]‒ (tính toán lý thuyết cho

công thức [C18H15O8]‒, 359,0718).

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VL5 xuất hiện tín hiệu của bốn proton thơm

tại H 6,37 (s), 6,75 (s), 7,26 (d, J = 2,0 Hz) và 7,32 (d, J = 2,0 Hz), ba nhóm methoxy

tại H 3,81 (3H, s), 3,85 (3H, s) và 3,87 (3H, s). Phổ 13C-NMR và DEPT cho biết sự

có mặt của 18 carbon, bao gồm 11 carbon không liên kết với hydro tại C 105,1,

119,1, 138,0, 138,5, 145,8, 148,1, 156,0, 156,2, 161,0, 165,1 và 177,9; bốn carbon

methine tại C 92,3, 97,8, 104,3 và 109,6; ba carbon methoxy tại C 56,1×2 và 59,6.

Phân tích số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của VL5 cho biết đây là một flavone. Để xác

định cụ thể vị trí của các nhóm chức, phổ HSQC và HMBC đã được đo. Các tương

tác HMBC giữa H-6 (H 6,37)/H-8 (H 6,75) và C-7 (C 165,1); giữa proton methoxy

(δH 3,81) và (δH 3,87) lần lượt với C-3 (δC 138,0) và C-7 (C 165,1) cho biết vị trí của

hai nhóm methoxy tại C-3 và C-7. Vị trí hai nhóm hydroxy tại C-4′ và C-5′, cùng với

nhóm methoxy liên kết với C-3′ của vòng B được xác định nhờ các tương tác HMBC

giữa H-2′ (H 7,26) và C-2 (C 156,0)/C-1′ (C 119,1)/C-3′ (C 148,1)/C-6′ (C 109,6);

giữa H-6′ (H 7,32) và C-2 (C 156,0)/C-1′ (C 119,1)/C-2′ (C 104,3)/C-4′ (C

138,5)/C-5′ (C 145,8); và giữa proton methoxy (H 3,85) và C-3′ (C 148,1). Phân

tích các phổ NMR của hợp chất VL5 cho thấy số liệu phổ của hợp chất này giống với

số liệu phổ của vitecetin ở các vị trí tương ứng [14]. Từ các bằng chứng phân tích nêu

trên, cho phép kết luận hợp chất VL5 là vitecetin.



Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL5 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)

δC 156,0 C 138,0 C 177,9 C 160,9 C 97,8 CH 165,1 C 92,3 CH

#C của vitecetin đo trong DMSO-d6 [14], ađo trong DMSO-d6, b125MHz, c500MHz.

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 3-OMe 7-OMe 3′-OMe δC 155,9 138,2 178,1 161,0 97,9 165,2 92,4 156,3 104,1 119,6 105,2 148,2 137,9 145,6 109,8 59,8 56,2 56,1 δH - - - - 6,37 (s) - 6,75 (s) - - - 7,26 (d, 2,0) - - - 7,32 (d, 2,0) 3,81 (s) 3,87 (s) 3,85 (s) 156,2 C 105,1 C 119,1 C 104,3 CH 148,1 C 138,5 C 145,8 C 109,6 CH 59,6 CH3 56,1 CH3 56,1 CH3

3.1.1.6. Hợp chất VL6: 5,4′-Dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone

Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của hợp chất VL6

Hợp chất VL6 phân lập được dưới dạng chất bột màu vàng. Công thức phân

tử của hợp chất VL6 được xác định là C17H14O6 dựa vào kết quả phổ khối lượng phân

giải cao HR-ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 313,0712 [M-H]‒ (tính toán lý thuyết

cho công thức [C17H13O6]‒, 313,0718). Phổ 1H-NMR của hợp chất VL6 xuất hiện các

tín hiệu proton đặc trưng của một flavone, gồm có: ba proton thơm hệ ABX tại δH

6,94 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,57 (1H, s) và 7,58 (1H, d, J = 7,5 Hz), hai proton thơm ở

vị trí meta với nhau tại 6,35 (1H, s) và 6,93 (1H, s), một proton thơm tại δH 6,76 (1H,

s), cùng với hai nhóm methoxy tại H 3,86 (3H, s) và 3,90 (3H, s). Phổ 13C-NMR và

DEPT của hợp chất VL6 cho biết sự có mặt của 17 nguyên tử carbon, bao gồm chín

carbon không liên kết trực tiếp với hydro, sáu carbon methine và hai nhóm methoxy.

Số liệu phổ NMR của hợp chất VL6 giống với số liệu phổ của 5,4′-dihydroxy-7,3′-

dimethoxyflavone [124] ở các vị trí tương ứng. Từ những phân tích trên cho phép kết

luận hợp chất VL6 là 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone. Hợp chất này lần đầu

tiên được phân lập từ chi Vitex.

3.1.1.7. Hợp chất VL7: Verrucosin

Hình 3.37. Cấu trúc hóa học của hợp chất VL7

Hợp chất VL7 thu được dưới dạng dầu, không màu. Công thức phân tử của

hợp chất VL7 được xác định là C20H24O5 dựa vào kết quả phổ khối lượng phân giải

cao HR-ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 343,1544 [M-H]‒ (tính toán lý thuyết cho

công thức [C20H23O5]‒, 343,1551). Trên phổ 1H-NMR của VL7 xuất hiện tín hiệu của

sáu proton vòng thơm tại δH 6,82 (dd, J = 1,5, 8,0 Hz), 6,85 (d, J = 1,5 Hz), 6,88 (d,

J = 8,0 Hz), 6,92 (d, J = 8,0 Hz), 6,99 (dd, J = 1,5, 8,0 Hz) và 7,04 (d, J = 1,5 Hz);

hai proton methine liên kết trực tiếp với nguyên tử oxi tại δH 4,39 (1H, d, J = 9,5 Hz)

và 5,11 (1H, d, J = 8,5 Hz); hai nhóm methoxy tại δH 3,86 (3H, s) và 3,92 (3H, s).

Phổ 13C-NMR và DEPT của VL7 xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử carbon, bao

gồm sáu carbon không liên kết với hydro tại δC 132,8, 133,2, 144,6, 145,2, 146,2,

146,5, mười carbon methine tại δC 46,0, 47,8, 83,2, 87,4, 109,4, 109,8, 113,9, 114,2,

119,3, 119,9 và bốn carbon methyl tại δC 15,0  2, 55,9  2. Những phân tích trên

cùng với sự tương đồng về số liệu phổ NMR của VL7 với số liệu phổ của verrucosin

[125], cho phép xác định hợp chất VL7 là verrucosin. Hợp chất này lần đầu tiên được

phân lập từ chi Vitex.

3.1.1.8. Hợp chất VL8: 2α,3α-Dihydroxyurs-12-en-28-oic acid

Hình 3.38. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL8

1H-NMR của hợp chất VL8 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại H 5,14 (1H,

Hợp chất VL8 thu được dưới dạng chất bột vô định hình, màu trắng. Trên phổ

t, J = 3,0 Hz), bảy nhóm methyl tại H 0,70 (3H, s), 0,78 (3H, s), 0,82 (3H, d, J = 6,5

Hz), 0,88 (3H, s), 0,89 (3H, s), 0,91 (3H, d, J = 7,0 Hz) và 1,04 (3H, s), hai nhóm

oximethine tại H 3,15 (br s) và 3,77 (br d, J = 11,0 Hz). Phổ 13C-NMR và DEPT của

VL8 xuất hiện tín hiệu của 30 nguyên tử carbon, bao gồm bảy carbon methyl, tám

methylene, tám methine và bảy carbon không liên kết với hydro, trong đó có hai

carbon olefin tại C 124,5 và 138,2. Phân tích số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp

chất VL8 gợi ý hợp chất này có cấu trúc khung urs-12-ene triterpene [126]. Số liệu

phổ NMR của VL8 tương tự với số liệu phổ đã công bố của hợp chất 2α,3α-

dihydroxyurs-12-en-28-oic acid methyl ester [127], ngoại trừ sự vắng mặt của nhóm

methyl ester. Các tương tác HMBC giữa H-23 (δH 0,89)/H-24 (δH 0,78) và C-3 (δC

77,8)/C-4 (δC 38,0)/C-5 (δC 47,6) cho biết vị trí nhóm hydroxy tại C-3. Tương tự, các

tương tác HMBC giữa H-1 (δH 1,13 và 1,41)/H-3 (δH 3,15) và C-2 (δC 64,7) cho biết

sự có mặt của một nhóm hydroxy nữa tại C-2. Ngoài ra, dựa vào giá trị hằng số tách

proton của H-1 và H-2 lớn, J = 11,0 Hz [H-2: δH 3,77 (br d, J = 11,0 Hz)], trong khi

giá trị hằng số tách tương ứng của H-2 và H-3 nhỏ, (J~0 Hz) [H-3: δH 3,15 (br s)] có

thể khẳng định cấu hình của hai nhóm hydroxy tại C-2/C-3 lần lượt là equatorial và

axial. Các tương tác HMBC giữa H-27 (δH 1,04) và C-8 (δC 39,1)/C-13 (δC 138,2)/C-

14 (δC 41,7)/C-15 (δC 28,2); giữa H-12 (δH 5,14) và C-9 (δC 46,8)/C-14 (δC 41,7)/C-

18 (δC 52,4) đã khẳng định vị trí liên kết đôi tại C-12/C-13. Từ những phân tích trên,

cho phép kết luận hợp chất VL8 là 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid.

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL8 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)

C δC δH

# C

42,2 1 41,7 CH2

66,7 79,2 39,3 48,3 18,2 2 3 4 5 6 64,7 CH 77,8 CH 38,0 C 47,6 CH 17,6 CH2

33,0 7 32,6 CH2

40,0 47,6 38,4 23,4 125,8 138,7 42,4 28,2 8 9 10 11 12 13 14 15 39,1 C 46,8 CH 37,8 C 22,9 CH2 124,5 CH 138,2 C 41,7 C 27,4 CH2

24,4 16 23,8 CH2

48,3 53,2 39,1 38,5 30,8 17 18 19 20 21 46,9 C 52,4 CH 38,5 CH 38,4 CH 30,2 CH2

36,8 22 36,3 CH2

#C của methyl 2α,3α-dihydroxy-urs-12-en-28-oate đo trong CDCl3 [127], ađo trong DMSO-d6, b125MHz, c500MHz.

28,6 22,0 16,5 17,1 23,9 178,4 17,1 21,2 23 24 25 26 27 28 29 30 1,13 (m) 1,41 (m) 3,77 (br d, 11,0) 3,15 (br s) - 1,11 (m) 1,27 (m) 1,35 (m) 1,25 (m) 1,42 (m) - 1,54 (m) - 1,85 (m) 5,14 (t, 3,0) - - 0,98 (m) 1,80 (m) 1,52 (m) 1,93 (m) - 2,11 (d, 11,5) 1,31 (m) 0,94 (m) 1,28 (m) 1,43 (m) 1,51 (m) 1,59 (m) 0,89 (s) 0,78 (s) 0,88 (s) 0,70 (s) 1,04 (s) - 0,82 (d, 6,5) 0,91 (d, 7,0) 28,9 CH3 21,9 CH3 16,2 CH3 17,0 CH3 23,2 CH3 178,3 C 16,9 CH3 21,1 CH3

3.1.1.9. Hợp chất VL9: Euscaphic acid

Hình 3.39. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL9

1H-NMR của hợp chất VL9 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại H 5,17 (1H,

Hợp chất VL9 thu được dưới dạng chất bột vô định hình, màu trắng. Trên phổ

br s), bảy nhóm methyl tại H 0,68 (3H, s), 0,78 (3H, s), 0,84 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,88

 2 (3H, s), 1,08 (3H, s) và 1,29 (3H, s), hai nhóm oximethine tại H 3,15 (1H, d, J =

1,0 Hz) và 3,77 (br d, J = 11,0 Hz). Phổ 13C-NMR và DEPT của VL9 xuất hiện tín

hiệu của 30 nguyên tử carbon, bao gồm bảy carbon methyl, tám carbon methylene,

bảy carbon methine và tám carbon không liên kết với hydro, trong đó có hai carbon

olefintại C 126,8 và 138,6. Phân tích số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất VL9

cho thấy hợp chất này có cấu trúc khung urs-12-ene triterpene.

Hợp chất VL9 có cấu trúc tương tự VL8, ngoại trừ điểm khác biệt là sự xuất

hiện thêm một nhóm hydroxy tại C-19. Sự khác biệt này được khẳng định nhờ các

tương tác HMBC giữa H-29 (δH 1,08) và C-18 (δC 53,2)/C-19 (δC 71,6)/C-20 (δC

41,4); giữa H-30 (δH 0,84) và C-19 (δC 71,6)/C-20 (δC 41,4)/C-21 (δC 25,9). Vị trí

nhóm hydroxy tại C-2 được xác định nhờ các tương tác HMBC giữa H-1 (δH 1,15 và

1,39)/H-3 (δH 3,15) và C-2 (δC 64,7). Các tương tác HMBC giữa H-23 (δH 0,88)/H-

24 (δH 0,78 ) và C-3 (δC 77,9)/C-4 (δC 38,0)/C-5 (δC 47,6) cho phép xác định vị trí

nhóm hydroxy tại C-3. Các tương tác HMBC giữa H-27 (δH 1,29) và C-8 (δC 39,5)/C-

13 (δC 138,6)/C-14 (δC 41,2)/C-15 (δC 28,0); giữa H-12 (δH 5,17) và C-9 (δC 46,5)/C-

14 (δC 41,2)/C-18 (δC 53,2) đã chứng minh liên kết đôi tại C-12/C-13. So sánh số liệu

phổ NMR của hợp chất VL9 với số liệu phổ công bố của euscaphic acid thấy có sự

tương đồng ở các vị trí tương ứng [126]. Do đó, có thể khẳng định VL9 là euscaphic

acid.

Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL9 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)



C δC δH δC

42,6 1 41,6 CH2

66,2 79,3 38,9 48,8 18,8 2 3 4 5 6 64,7 CH 77,9 CH 38,0 C 47,6 CH 17,7 CH2

33,7 7 32,6 CH2

40,8 47,8 38,8 24,3 128,7 139,6 42,3 29,1 8 9 10 11 12 13 14 15 39,5 C 46,5 CH 37,8 C 23,1 CH2 126,8 CH 138,6 C 41,2 C 28,0 CH2

26,3 16 25,2 CH2

48,3 54,4 73,2 42,5 27,0 17 18 19 20 21 46,9 C 53,2 CH 71,6 C 41,4 CH 25,9 CH2

38,4 22 37,3 CH2

#C của euscaphic acid đo trong pyridine-d5 [126], ađo trong DMSO-d6, b125MHz, c500MHz.

29,5 22,3 16,7 17,4 24,7 179,4 27,2 16,6 23 24 25 26 27 28 29 30 1,15 (m) 1,39 (m) 3,77 (br d,11,0) 3,15 (d, 1,0) - 1,15 (dd, 4,0, 13,5) 1,28 (m) 1,35 (m) 1,21 (m) 1,43 (m) - 1,66 (m) - 1,89 (m) 5,17 (br s) - - 0,89 (m) 1,69 (m) 1,39 (m) 2,49 (m) - 2,37 (s) - 1,13 (m) 1,12 (m) 1,61 (m) 1,50 (m) 1,59 (m) 0,88 (s) 0,78 (s) 0,88 (s) 0,68 (s) 1,29 (s) - 1,08 (s) 0,84 (d, 6,5) 28,9 CH3 21,8 CH3 16,1 CH3 16,6 CH3 24,1 CH3 179,0 C 26,4 CH3 16,3 CH3

3.1.1.10. Hợp chất VL10: 2α,3α-Dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-

28-oic acid

Hình 3.40. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL10

Hợp chất VL10 thu được dưới dạng chất bột vô định hình, màu trắng. Trên

phổ 1H-NMR của hợp chất VL10 xuất hiện tín hiệu của ba proton olefin tại H 5,41

(s), 5,71 (dd, J = 1,5, 10,5 Hz) và 6,01 (dd, J = 3,0, 10,5 Hz), hai proton

hydroxymethine tại H 3,37 (br s) và 4,00 (dt, J = 4,0, 11,0 Hz), và sáu nhóm methyl

tại H 0,75 (s), 0,88 (s), 0,99 (s), 1,00 (s), 1,01 (s), 1,10 (d, J = 7,0 Hz), và 2,16 (s).

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất VL10 xuất hiện tín hiệu của 30 carbon, trong

đó có bảy carbon methyl tại δC 16,5, 17,1, 19,4, 20,3, 21,8, 28,3, 29,1, bốn carbon

olefin tại δC 128,2, 128,4, 131,3, 144,0 và một carbon carbonyl tại δC 178,5. Phân tích phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất VL10 cho thấy dữ liệu phổ rất tương tự với dữ

liệu phổ đã công bố của hợp chất 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-

dien-28-oic acid [128]. Các tương tác HMBC giữa H-23 (δH 1,01)/H-24 (δH 0,88) và

C-3 (δC 80,1); giữa H-3 (δH 3,37) và C-2 (δC 67,0) cho phép xác định vị trí nhóm

hydroxy tại C-3. Các tương tác HMBC giữa H-3 (δH 3,37) và C-2 (δC 67,0) xác định

vị trí nhóm hydroxy tại C-2. Các tương tác HMBC từ H-27 (δH 1,00) đến C-8 (δC

41,9)/C-13 (δC 144,0)/C-14 (δC 42,4)/C-15 (δC 27,1); từ H-12 (δH 6,01) đến C-9 (δC

55,3)/C-11 (δC 128,2)/C-13 (δC 144,0)/C-18 (δC 128,4); và từ H-18 (δH 5,41) đến C-

12 (δC 131,3)/C-14 (δC 42,4)/C-16 (δC 27,9)/C-17 (δC 48,5)/ C-22 (δC 39,4) đã chứng

minh vị trí của hai liên kết đôi tại C-11/C-12 và C-13/C-18. Các tương tác HMBC

giữa H-29 (δH 2,16) và C-19 (δC 215,1)/C-20 (δC 48,7); giữa H-30 (δH 1,10) và C-19

(δC 215,1)/C-20 (δC 47,8)/C-21 (δC 28,7) đã khẳng định sự có mặt của nhóm oxo tại

C-19. Từ những phân tích trên, hợp chất VL10 được xác định là 2α,3α-dihydroxy-

19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid. Hợp chất này lần đầu tiên được

phân lập từ chi Vitex.

Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL10 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)



C δC δH δC

43,0 1 42,3 CH2

66,3 79,8 39,3 48,7 18,6 2 3 4 5 6 67,0 CH 80,1 CH 39,5 C 49,0 CH 19,0 CH2

32,9 7 33,2 CH2

41,6 55,0 38,8 128,0 130,9 142,9 41,9 26,9 8 9 10 11 12 13 14 15 41,9 C 55,3 CH 39,1 C 128,2 CH 131,3 CH 144,0 C 42,4 C 27,1 CH2

27,8 16 27,9 CH2

48,5 C 128,4 CH 215,1 C

47,9 129,2 211,8 47,8 28,6 17 18 19 20 21 48,7 CH 28,7 CH2

#C của 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-diene-28-oic acid đo trong

pyridine-d5 [128], ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz.

39,4 29,7 22,1 19,6 17,2 20,4 178,3 28,4 16,7 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1,32 (m) 1,85 (m) 4,00 (dt, 4,0, 11,0) 3,37 (br s) - 1,36 (m) 1,45 (m) 1,54 (m) 1,30 (m) 1,42 (m) - 2,19 (br s) - 5,71 (dd, 1,5, 10,5) 6,01 (dd, 3,0, 10,5) - - 1,16 (m) 1,82 (m) 1,48 (m) 2,20 (m) - 5,41 (s) - 2,56 (m) 1,34 (m) 1,70 (m) 1,42 (m)/1,69 (m) 1,01 (s) 0,88 (s) 0,99 (s) 0,75 (s) 1,00 (s) - 2,16 (s) 1,10 (d, 7,0) 39,4 CH2 29,1 CH3 21,8 CH3 20,3 CH3 17,1 CH3 19,4 CH3 178,5 C 28,3 CH3 16,5 CH3

3.1.1.11. Hợp chất VL11: Maslinic acid

Hình 3.41. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL11

Hợp chất VL11 thu được dưới dạng chất bột vô định hình, màu trắng.

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VL11 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin

tại H 5,27 (t, J = 3,5 Hz), bảy nhóm methyl tại H 0,83 (s), 0,84 (s), 0,93 (s), 0,96 (s),

1,03 (s), 1,04 (s) và 1,18 (s), hai nhóm oximethine tại H 2,93 (d, J = 10,0 Hz) và 3,64

(dt, J = 4,5, 10,0 Hz). Phổ 13C-NMR và DEPT của VL11 xuất hiện tín hiệu của 30

nguyên tử carbon, bao gồm bảy carbon methyl tại C 17,1, 17,5, 17,7, 24,0, 26,4, 29,3

và 33,6, chín carbon methylene tại C 19,6, 24,0, 24,6, 28,8, 33,8, 33,9, 34,9, 47,2 và

48,2, sáu carbon methine tại C 42,7, 49,0, 56,7, 69,5, 84,4 và 123,5, và tám nguyên

tử carbon không liên kết trực tiếp với nguyên tử hydro tại C 31,6, 39,3, 40,5, 40,6,

42,9, 47,6, 145,3, 181,8.

Các tương tác HMBC giữa hai nhóm methyl tại H-23 (H 1,04)/H-24 (H 0,84)

và C-3 (δC 84,4); giữa H-3 (H 2,93) và C-2 (C 69,5) xác định vị trí hai nhóm hydroxy

tại C-2 và C-3. Các tương tác HMBC giữa hai nhóm methyl H-29 (H 0,93)/H-30 (H

0,96) và C-19 (δC 47,2)/C-20 (δC 31,6)/C-21 (δC 34,9) xác định vị trí của hai nhóm

methyl này tại C-20. Các tương tác HMBC giữa H-27 (δH 1,18) và C-8 (δC 40,5)/C-

13 (δC 145,3)/C-14 (δC 42,9)/C-15 (δC 28,8) đã chứng minh vị trí của liên kết đôi tại

C-12/C-13. Phân tích phổ NMR của hợp chất VL11 cho thấy số liệu phổ của hợp chất

này tương tự với số liệu phổ đã công bố của maslinic acid [129]. Do đó, hợp chất

VL11 được xác định là maslinic acid.

Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL11 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)



C δC δH δC

46,8 1 48,2 CH2

68,8 83,8 39,1 55,3 18,3 2 3 4 5 6 69,5 CH 84,4 CH 40,6 C 56,7 CH 19,6 CH2

32,6 7 33,8 CH2

39,1 47,5 38,3 23,5 8 9 10 11 40,5 C 49,0 CH 39,3 C 24,6 CH2

122,0 143,6 41,7 27,6 12 13 14 15 123,5 CH 145,3 C 42,9 C 28,8 CH2

23,1 16 24,0 CH2

46,6 41,3 45,8 17 18 19 47,6 C 42,7 CH 47,2 CH2

30,7 33,8 20 21 31,6 C 34,9 CH2

32,3 22 33,9 CH2

#C của maslinic acid [129] đo trong CD3OD, ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz.

28,6 16,8 16,8 16,8 26,0 178,0 33,1 23,5 0,92 (m) 1,95 (m) 3,64 (dt, 4,5, 10,0) 2,93 (d, 10,0) - 0,86 (m) 1,45 (m) 1,58 (m) 1,52 (m) 1,57 (m) - 1,65 (m) - 1,92 (m) 1,96 (m) 5,27 (t, 3,5) - - 1,10 (m) 1,79 (m) 1,62 (m) 2,03 (m) - 2,87 (dd, 4,0, 14,0) 1,16 (m) 1,51 (m) - 1,22 (m) 1,42 (m) 1,36 (m) 1,76 (m) 1,04 (s) 0,84 (s) 0,83 (s) 1,03 (s) 1,18 (s) - 0,93 (s) 0,96 (s) 23 24 25 26 27 28 29 30 29,3 CH3 17,7 CH3 17,5 CH3 17,1 CH3 26,4 CH3 181,8 C 33,6 CH3 24,0 CH3

3.1.1.12. Hợp chất VL12: Maltol O-β-D-glucopyranoside

Hình 3.42. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VL12

Hợp chất VL12 phân lập được dưới dạng chất bột vô định hình, màu trắng.

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VL12 xuất hiện tín hiệu của hai proton olefin tại H

6,47 (1H, d, J = 5,5 Hz) và 8,03 (1H, d, J = 5,5 Hz), một proton anome tại δH 4,85 (d,

J = 8,0 Hz), và một nhóm methyl tại H 2,49 (3H, s). Phổ 13C-NMR của VL12 cho

tín hiệu của 12 nguyên tử carbon, bao gồm một carbon cacbonyl tại δC 177,2, một

carbon methyl tại δC 15,8, một methylene tại δC 62,5, bảy methine tại δC 71,1, 75,4,

78,0, 78,6, 105,5, 117,3 và 157,6, và hai carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại

δC 143,6 và 164,6 đã gợi ý cấu trúc của hợp chất VL12 có một phân tử đường liên

kết với hợp phần vòng -pyrone.

Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL12 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)

δC 164,6 C C 2

 δC 164,7

δH -

3 143,7 143,6 C -

4 177,7 177,2 C -

5 117,4 117,3 CH 6,47 (d, 5,5)

6 157,3 8,03 (d, 5,5)

1′ 15,9 105,5 157,6 CH 15,8 CH3 105,5 CH 2,49 (s) 4,85 (d, 8,0)

2′ 75,4 75,4 CH 3,41 (t, 8,0)

3′ 78,1 78,0 CH 3,42 (m)

4′ 5′ 6′ 71,1 78,0 62,5 71,1 CH 78,6 CH 62,5 CH2

#C của maltol O-β-D-glucopyranoside đo trong CD3OD [130], ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz

3,37 (dd, 8,0, 8,5) 3,27 (m) 3,69 (dd, 5,5, 12,0) 3,85 (dd, 2,0, 12,0)

Các tương tác HMBC giữa H-5 (δH 6,47) và C-3 (δC 143,6)/C-4 (δC 177,2);

giữa H-6 (δH 8,03) và C-4 (δC 177,2)/C-2 (δC 164,6); giữa proton nhóm methyl H-7

(δH 2,49) và C-2 (δC 164,6)/C-3 (δC 143,6)/C-1 (δC 105,5) khẳng định VL12 là một

-pyrone aglycone với một nhóm methyl thế tại vị trí C-2. Các tín hiệu đặc trưng trên

phổ 13C-NMR tại δC 62,5, 71,1, 75,4, 78,0, 78,1 và 105,5 cùng với hằng số tách proton

của H-1′ và H-2′, J = 8,0 Hz, gợi ý sự có mặt của phân tử đường O-β-D-

glucopyranosyl. Thêm vào đó, tương tác HMBC giữa H-1′ (δH 4,85) và C-3 (δC 143,6)

đã xác định vị trí liên kết của glucopyranosyl tại C-3 của -pyrone aglycone. Từ các

bằng chứng phổ phân tích ở trên, cùng với sự phù hợp của về số liệu phổ NMR của

VL12 với tài liệu công bố [130], hợp chất VL12 được xác định là maltol O-β-D-

glucopyranoside. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ chi Vitex.

3.1.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài V. trifolia

3.1.2.1. Hợp chất VT1: 3α-Hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid (hợp chất mới)

Hình 3.43. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT1 và hợp chất tham khảo

Hợp chất VT1 thu được dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng. Dựa trên

phân tích phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của VT1, công thức phân tử của

VT1 được xác định là C30H48O3 với sự xuất hiện pic ion tại m/z 455,3540 [M‒H]‒

(tính toán lý thuyết cho công thức [C30H47O3]‒, 455,3531). Trên phổ 1H-NMR của

VT1 xuất hiện tín hiệu proton của bảy nhóm methyl tại δH 0,69 (s), 0,87 (s), 0,88 (s),

0,94 (d, J = 6,5 Hz), 0,97 (s), 0,99 (s) và 1,84 (s), một proton olefin tại δH 6,89 (1H,

t, J = 7,5 Hz), và một proton oxymethine tại δH 3,43 (br d, J = 3,0 Hz). Phổ 13C-NMR

và DEPT của VT1 xuất hiện tín hiệu của 30 nguyên tử carbon, bao gồm một carbon

carbonyl tại δC 172,7, bảy carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 36,9, 37,6,

44,6, 49,9, 126,6, 134,1 và 134,7, năm methine tại δC 36,4, 44,3, 50,3, 76,1 và 145,7,

mười methylene tại δC 18,2, 21,0, 25,7, 25,9, 26,1, 28,2, 30,1, 30,8, 31,0, 34,8 và bảy

methyl tại δC 12,0, 15,8, 18,5, 19,0, 22,1, 24,3 và 28,0. Phân tích phổ 1H-, 13C-NMR

và DEPT của VT1 cho thấy VT1 là một triterpene khung lanostane và có cấu trúc

tương tự hợp chất VT1a (astrodoric acid D) [131] ngoại trừ sự vắng mặt của nhóm

acetoxy tại vị trí C-22.

Hình 3.44. Các tương tác HMBC chính của hợp chất VT1

Các tương tác HMBC giữa H-28 (δH 0,88)/H-29 (δH 0,97) và C-3 (δC 76,1)/C-4

(δC 37,6)/C-5 (δC 44,3) đã xác định được vị trí của nhóm hydroxy tại C-3. Cấu hình

của nhóm hydroxy này được xác định là α (axial) dựa vào hằng số tương tác giữa H-

2 và H-3 nhỏ, J = 3,0 Hz [H-3: δH 3,43 (br d, J = 3,0 Hz)]. Điều này được khẳng định

thêm dựa trên sự so sánh với hằng số tương tác giữa H-2 và H-3 của hợp chất có

nhóm 3α-hydroxy, J = 1,0 Hz [VL9 (euscaphic acid): δH 3,15 (d, J = 1,0 Hz ), H-3]

và hợp chất có nhóm 3β-hydroxy, J = 10,0 Hz [VL11 (maslinic acid): δH 2,93 (d, J =

10,0 Hz), H-3]. Các tương tác HMBC giữa H-19 (δH 0,99) và C-1 (δC 30,1)/C-5 (δC

44,3)/C-9 (δC 134,7)/C-10 (δC 36,9); giữa H-30 (δH 0,87) và C-8 (δC 134,1)/C-13 (δC

44,6)/C-14 (δC 49,9)/C-15 (δC 30,8) khẳng định vị trí của liên kết đôi tại C-8/C-9. Các

tương tác HMBC giữa H-27 (δH 1,84) và C-24 (δC 145,7)/C-25 (δC 126,6)/C-26 (δC

172,7) xác định vị trí của liên kết đôi tại C-24/C-25 và nhóm carboxylic tại C-25.

Ngoài ra, độ chuyển dịch của carbon methyl Me-27 (δC 12,0) đã chỉ ra nối đôi tại C-

100

24/C-25 có cấu hình E dựa trên sự so sánh với độ chuyển dịch hóa học của Me-27

trên phổ 13C-NMR của hợp chất VT1b (7-oxo-ganoderic acid Z; cấu hình E, Me-27,

δC 12,0) [132] và hợp chất VT1c (schiglauzic acid; cấu hình Z, C-27, δC 22,8) [133].

Từ những phân tích nêu trên, hợp chất VT1 được xác định là 3α-hydroxylanosta-

8,24E-dien-26-oic acid. Theo tra cứu trên Scifinder, đây là hợp chất mới.



Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT1 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

C δC δH

δC 30,1 27,9 76,0 37,6 42,2 18,1 26,0 133,9 134,7 36,9 20,9 25,6 44,4 49,9 31,0 30,7 46,9 15,5 19,0 39,6 12,9 74,8 31,8 139,5 129,1 172,5 12,2 24,2 28,0 22,1

a,c (J = Hz) 1,27 (m)/ 1,48 (m) 1,63 (m)/ 1,95 (m) 3,43 (br d, 3,0) - 1,53 (m) 1,53 (m)/1,60 (m) 2,05 (m) - - - 2,04 (m) 1,60 (m)/ 1,72 (m) - - 1,20 (m)/ 1,61 (m) 1,32 (m)/ 1,93 (m) 1,52 (m) 0,69 (s) 0,99 (s) 1,44 (m) 0,94 (d, 6,5) 1,18 (m)/ 1,58 (m) 2,10 (m)/2,27 (m) 6,89 (t, 7,5) - - 1,84 (s) 0,88 (s) 0,97 (s) 0,87 (s)

#C của astraodoric acid D (đo trong CDCl3) [131], ađo trong CDCl3, b125MHz, c500MHz.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 30,1 CH2 25,7 CH2 76,1 CH 37,6 C 44,3 CH 18,2 CH2 25,9 CH2 134,1 C 134,7 C 36,9 C 21,0 CH2 31,0 CH2 44,6 C 49,9 C 30,8 CH2 28,2 CH2 50,3 CH 15,8 CH3 19,0 CH3 36,4 CH 18,5 CH3 34,8 CH2 26,1 CH2 145,7 CH 126,6 C 172,7 C 12,0 CH3 24,3 CH3 28,0 CH3 22,1 CH3

101

Hình 3.45. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VT1

Hình 3.46. Phổ 1H-NMR của hợp chất VT1

102

Hình 3.47. Phổ 13C-NMR của hợp chất VT1

Hình 3.48. Phổ DEPT của hợp chất VT1

103

Hình 3.49. Phổ HSQC của hợp chất VT1

Hình 3.50. Phổ HMBC của hợp chất VT1

104

3.1.2.2. Hợp chất VT2: Matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới)

Hình 3.51. Cấu trúc hóa học của VT2 và hợp chất tham khảo

Hợp chất VT2 thu được dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng. VT2 có

công thức phân tử là C26H32O11 dựa vào phổ HR-ESI-MS xuất hiện pic ion tại tại m/z

521,2009 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C26H33O11]+, 521,2017).

Trên phổ 1H-NMR của VT2 xuất hiện tín hiệu của các proton thuộc 2 vòng

thơm hệ ABX tại δH 6,49 (dd, J = 1,6, 8,0 Hz), 6,55 (d, J = 1,6 Hz), và 6,66 (d, J = 8,0

Hz); 6,64 (dd, J = 1,6, 8,0 Hz), 6,73 (d, J = 1,6 Hz), và 7,04 (d, J = 8,0 Hz), hai nhóm

13C-NMR của VT2 xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử carbon, trong đó 18 carbon

methoxy tại δH 3,75 (s) và 3,79 (s), một proton anome tại δH 4,84 (d, J = 8,0 Hz). Phổ

1H- và 13C-NMR của VT2 tương tự với số liệu đã công bố của hợp chất VT2a

thuộc khung lignan, hai methoxy và sáu carbon thuộc một đơn vị đường. Dữ liệu phổ

(matairesinol 4-O-β-D-glucopyranoside) [134], ngoại trừ sự thay đổi vị trí của đơn vị

đường glucopyranosyl với khung lignan từ vị trí C-4 chuyển sang vị trí C-4′.

Các tương tác HMBC giữa H-9 (δH 3,91 và 4,16) và C-9′ (δC 181,5); tương tác

COSY giữa H-8′ (δH 2,66)/H-8 (δH 2,47)/H-9 (δH 3,91 và 4,16) đã gợi ý sự có mặt của

vòng butanolide trong cấu trúc phân tử hợp chất VT2. Các tương tác HMBC giữa H-7

2,52) và C-1 (δC 131,3)/C-2 (δC 113,3)/C-6 (δC 122,2)/C-8 (δC 42,6)/C-9 (δC

(δH

72,9)/C-8′ (δC 47,6); giữa proton nhóm methoxy (δH 3,75) và C-3 (δC 149,0); giữa H-

2,85) và C-1′ (δC 134,2)/C-2′ (δC 114,8)/C-6′ (δC 123,0)/C-8′ (δC 47,6)/C-9′ (δC

7′ (δH

181,5)/C-8 (δC 42,6); giữa proton nhóm methoxy (δH 3,79) và C-3′ (δC 150,6) đã khẳng

định vị trí của hai nhóm 3-methoxy-4-hydroxyphenyl tại vị trí C-7 và C-7′.

105



Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT2 và hợp chất tham khảo

a,c (J = Hz)

C δC

a,b δH

δC

131,3 - 132,6 1

113,3 6,55 (d, 1,6) 112,9 2

149,0 - 148,8 3

146,2 - 145,1 4

116,2 6,66 (d, 8,0) 115,3 5

122,2 6,49 (dd, 1,6, 8,0) 120,5 6

38,9 2,52 (m) 36,9 7

42,6 2,47 (m) 40,8 8

70,8 9

72,9 3,91 (dd, 8,0, 8,8, α) 4,16 (dd, 7,2, 8,8, β)

56,4 3,75 (s) 55,6 3-OMe

134,2 - 129,0 1

114,8 6,73 (d, 1,6) 113,5 2

150,6 - 147,5 3

146,8 - 145,1 4

117,8 7,04 (d, 8,0) 115,4 5

123,0 6,64 (dd, 1,6, 8,0) 121,6 6

35,3 2,85 (dd, 6,8, 12,8) 33,8 7

47,6 2,66 (m) 45,7 8

178,6 181,5 - 9

55,6 56,7 3,79 (s) 3-OMe

4-O-glc

100,2 102,9 4,84 (d, 8,0) 1

74,9 3,46 (dd, 8,0, 9,2) 73,3 2

77,8 3,45 (m) 77,1 3

71,3 3,38 (m) 69,7 4

78,1 3,38 (m) 76,9 5

62,5 3,67 (dd, 4,0, 10,8) 60,7 6

#C của matairesinol 4-O-β-D-glucopyranoside (đo trong DMSO-d6) [134], ađo trong CD3OD,

b100MHz, c400MHz.

3,85 (br d, 10,8)

106

Hằng số tương tác proton giữa H-1 và H-2 của hợp phần đường, JH-1″/H-2″ =

8,0 Hz và độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR của các nguyên tử carbon trong phân tử

đường: C-1′′ (δC 102,9), C-2′′ (δC 74,9), C-3′′ (δC 77,8), C-4′′ (δC 71,3), C-5′′ (δC 78,1)

và C-6′′ (δC 62,5) đã gợi ý sự có mặt của phân tử đường β-D-glucopyranosyl. Thêm vào

đó, các tương tác HMBC giữa glc H-1″ (δH 4,84) và C-4′ (δC 146,8) xác định vị trí của

đường tại C-4′.

Cấu hình tuyệt đối của aglycone được xác định nhờ phổ NOESY và phổ CD.

Các tương tác NOE giữa H-8′ (δH 2,66) và Hα-9 (δH 3,91); giữa H-8 (δH 2,48) và Hβ-9

(δH 4,16)/H-7 (δH 2,52); giữa H-7 (δH 2,52) và Hα-9 (δH 3,91), gợi ý cấu hình của H-8

và H-8′ là cấu hình trans. Trên phổ CD, VT2 cho hiệu ứng Cotton âm tại bước sóng

226 và 275 nm xác định cấu hình (8R,8′R) trong hợp phần matairesinol [134]. Từ những

phân tích trên, cấu trúc của VT2 được xác định là matairesinol 4′-O-β-D-

glucopyranoside. Tra cứu cấu trúc của VT2 trên Scifinder cho thấy chưa có công

bố/công trình nào liên quan đến hợp chất này, chứng tỏ đây là hợp chất mới.

Hình 3.52. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất VT2

107

Hình 3.53. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VT2

Hình 3.54. Phổ 1H-NMR của hợp chất VT2

108

Hình 3.55. Phổ 13C-NMR của hợp chất VT2

Hình 3.56. Phổ HSQC của hợp chất VT2

109

Hình 3.57. Phổ HMBC của hợp chất VT2

Hình 3.58. Phổ COSY của hợp chất VT2

110

Hình 3.59. Phổ ROESY của hợp chất VT2

Hình 3.60. Phổ CD của hợp chất VT2 trong MeOH

111

3.1.2.3. Hợp chất VT3: Ecdysone

Hình 3.61. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT3

1H-NMR của VT3 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại H 5,84 (d, J = 2,0 Hz),

Hợp chất VT3 thu được dưới dạng chất bột vô định hình, màu trắng. Trên phổ

ba proton oxymethine tại H 3,97 (br s), 3,86 (ddd, J = 3,0, 3,5, 12,0 Hz) và 3,61 (br

d, J = 9,5 Hz), năm nhóm methyl tại H 1,22 (s), 1,21 (s), 0,99 (s), 0,97 (d, J = 7,0

Hz) và 0,76 (s). Phổ 13C-NMR và DEPT của VT3 xuất hiện tín hiệu của 27 nguyên

tử carbon, trong đó có một carbon carbonyl tại C 206,5, hai carbon olefin tại C 122,0

và 167,6, bốn carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại tại C 39,3, 48,1, 71,4 và

85,1, bảy methine tại C 35,3, 43,4, 48,8, 51,8, 68,5, 68,7 và 75,3; tám methylene tại

C 21,6, 25,4, 27,0, 32,1×2, 32,9, 37,4 và 42,3, năm methyl tại C 13,3, 16,2, 24,5,

29,1 và 29,6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VT3 có sự tương đồng với số liệu đã

công bố của ecdysone [135].

Các tương tác HMBC giữa H-5 (H 2,40) và C-4 (C 32,9)/C-6 (C 206,5)/C-7

(C 122,0); giữa H-7 (H 5,84) và C-5 (C 51,8)/C-9 (C 35,3)/C-14 (C 85,1) xác định

vị trí nhóm oxo tại C-6 và liên kết đôi tại C-7/C-8 (nhóm α,β-carbonyl không no).

Các tương tác giữa H-1 (H 1,43 và 1,80) và C-2 (C 68,7)/C-3 (C 68,5); giữa H-3

(H 3,97) và C-5 (C 51,8) đã gợi ý vị trí của hai nhóm hydroxy tại C-2 và C-3. Thêm

vào đó, hằng số tương tác giữa Hβ-1 và H-2 lớn, J = 12,0 Hz, và hằng số tương tác

giữa H-2 và H-3 nhỏ, J = 3,0 Hz (dựa trên độ bội của H-2 [(3,86 (ddd, 3,0, 3,5, 12,0

Hz)] gợi ý cấu hình của hai nhóm hydroxy tại C-2 và C-3 đều là cấu hình β. Các

tương tác HMBC giữa H-18 (H 0,76) và C-12 (C 32,1)/C-13 (C 48,1)/C-14 ((C

85,1)/C-17 (C 48,8); giữa H-22 (H 3,61) và C-21 (C 13,3)/C-23 (C 25,4)/C-24 (C

42,3); giữa H-26 (H 1,21)/H-27 (H 1,22) và C-24 (C 42,3)/C-25 (C 71,4) xác định

vị trí của ba nhóm hydroxy tại C-14, C-22 và C-25. Từ những phân tích trên, hợp chất

112

VT3 được khẳng định là ecdysone. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ loài

V. trifolia.

Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT3 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)



δC δH δC C

1 37,5 37,4 CH2

68,7 CH 68,5 CH 32,9 CH2 51,8 CH

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 68,7 68,5 32,8 51,8 206,4 122,0 167,5 35,9 39,2 21,6 206,5 C 122,0 CH 167,6 C 35,3 CH 39,3 C 21,6 CH2

12 32,1 32,1 CH2

13 14 15 48,2 85,1 32,1 48,1 C 85,1 C 32,1 CH2

16 27,0 27,0 CH2

17 18 19 20 21 22 23 48,8 16,2 24,4 43,3 13,3 75,3 25,5 48,8 CH 16,2 CH3 24,5 CH3 43,4 CH 13,3 CH3 75,3 CH 25,4 CH2

24 42,2 42,3 CH2

#C của ecdysone [135], ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz.

25 26 27 71,4 29,3 29,5 1,43 (m) 1,80 (m) 3,86 (ddd, 3,0, 3,5, 12,0) 3,97 (br s) 1,73 (m) 2,40 (dd, 4,5, 12,5) - 5,84 (d, 2,0) - 3,17 (t, 8,0) - 1,71 (m) 1,82 (m) 1,60 (m) 2,10 (m) - - 1,79 (m) 1,96 (m) 1,52 (m) 1,98 (m) 2,10 (m) 0,76 (s) 0,99 (s) 1,78 (d, 2,5) 0,97 (d, 7,0) 3,61 (br d, 9,5) 1,34 (m) 1,55 (m) 1,42 (m) 1,80 (m) - 1,21 (s) 1,22 (s) 71,4 C 29,1 CH3 29,6 CH3

113

3.1.2.4. Hợp chất VT4: 20-Hydroxyecdysone

Hình 3.62. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT4

Hợp chất VT4 thu được dưới dạng chất bột vô định hình, màu trắng. Phổ 1H-

NMR của VT4 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại H 5,84 (d, J = 2,5 Hz), ba

proton oxymethine tại H 3,98 (br s), 3,87 (ddd, J = 3,0, 4,0, 12,0 Hz) và 3,36 (tín

hiệu chập), năm nhóm methyl tại H 0,91 (s), 0,99 (s), 1,21 (s), 1,22 (s) và 1,23 (s).

Phổ 13C-NMR và DEPT của VT4 xuất hiện tín hiệu của 27 nguyên tử carbon, bao

gồm một carbonyl, hai carbon olefin, năm carbon không liên kết trực tiếp với hydro,

sáu methine, tám methylen và năm methyl.

So sánh phổ NMR của hợp chất VT4 và VT3 cho thấy hai hợp chất này có cấu

trúc tương tự nhau. Điểm khác biệt giữa hai hợp chất này là sự xuất hiện thêm nhóm

hydroxy tại vị trí C-20 ở hợp chất VT4. Điều này được khẳng định nhờ các tương tác

HMBC giữa H-21 (δH 1,22) và C-17 (δC 50,4)/C-20 (δC 77,9)/C-22 (δC 78,3). Ngoài

ra, các tương tác HMBC giữa H-5 (H 2,40) và C-6 (C 206,5)/C-7 (C 122,1); giữa

H-7 (H 5,84) và C-5 (C 51,7)/C-9 (C 35,0)/C-14 (C 85,2) xác định vị trí nhóm oxo

tại C-6 và liên kết đôi tại C-7/C-8. Các tương tác giữa H-1 (H 1,45 và 1,81) và C-2

(C 68,6)/C-3 (C 68,4); giữa H-3 (H 3,98) và C-5 (C 51,7) xác định vị trị hai nhóm

hydroxy tại C-2 và C-3. Các tương tác HMBC giữa H-18 (H 0,91) và C-12 (C

32,4)/C-13 (C 48,6)/C-14 ((C 85,2)/C-17 (C 50,4); giữa H-22 (H 3,36) và C-21 (C

21,1)/C-23 (C 27,3)/C-24 (C 42,3); giữa H-26 (H 1,21)/H-27 (H 1,23) và C-24 (C

42,3)/C-25 (C 71,3) xác định vị trí của ba nhóm hydroxy tại C-14, C-22 và C-25. Số

liệu phổ NMR của VT4 giống với số liệu đã công bố của hợp chất 20-

hydroxyecdysone [24]. Từ những phân tích trên cho phép kết luận hợp chất VT4 là

20-hydroxyecdysone. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ loài V. trifolia.

114

Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT4 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)

 δC 38,0

C 1 δC 37,3 CH2

68,3 68,2 32,5 51,4 203,5 121,7 166,1 34,6 38,8 21,2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 68,6 CH 68,4 CH 32,7 CH2 51,7 CH 206,5 C 122,1 CH 168,0 C 35,0 CH 39,2 C 21,5 CH2

32,1 12 32,4 CH2

48,2 84,4 31,8 13 14 15 48,6 C 85,2 C 31,7 CH2

21,6 16 21,5 CH2

50,2 17,9 24,5 77,0 21,7 77,7 27,5 17 18 19 20 21 22 23 50,4 CH 18,0 CH3 24,4 CH3 77,9 C 21,1 CH3 78,3 CH 27,3 CH2

42,6 24 42,3 CH2

#C của 20-hydroxyecdysone [24] (đo trong pyridin-d5), ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz.

*Tín hiệu chập

69,8 30,1 30,1 δH 1,45 (m) 1,81 (m) 3,87 (ddd, 3,0, 4,0, 12,0) 3,98 (br s) 1,73 (m) 2,40 (dd, 5,0, 13,0) - 5,84 (d, 2,5) - 3,17 (t, 8,5) - 1,73 (m) 1,82 (m) 1,90 (m) 2,14 (m) - - 1,63 (m) 1,98 (m) 1,75 (m) 2,00 (m) 2,39 (m) 0,91 (s) 0,99 (s) - 1,22 (s) 3,36* 1,31 (m) 1,70 (m) 1,45 (m) 1,81 (m) - 1,21 (s) 1,23 (s) 25 26 27 71,3 C 29,0 CH3 29,7 CH3

115

3.1.2.5. Hợp chất VT5: 20-Hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide

Hình 3.63. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT5

Hợp chất VT5 thu được dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng. Cấu trúc

của VT5 được xác định dựa vào số liệu phổ NMR và so sánh với số liệu phổ NMR

của hợp chất 20-hydroxyecdysone (VT4). Sự có mặt của nhóm acetonide ở vị trí C-

2/C-3 được khẳng định bởi sự xuất hiện thêm tín hiệu của hai nhóm methyl tại δH

1,49 (s) và 1,34 (s) và sự chuyển dịch tín hiệu của H-2 (δH 4,31) và H-3 (δH 4,28) về

phía trường yếu trên phổ 1H-NMR của hợp chất VT5, so với tín hiệu tương ứng trên

phổ 1H-NMR của VT4 [H-2 (δH 3,98) và H-3 (δH 3,87)]. Cùng với đó, trên phổ 13C-

NMR của VT5 xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm acetonide tại C 109,5, 28,8 và 26,6,

và sự chuyển dịch tín hiệu của C-2 (C 73,2) và C-3 (C 73,5) về trường yếu so với

hợp chất VT4 [C-2 (C 68,6) và C-3 (C 68,4)] góp phần chứng minh khẳng định trên.

Ngoài ra, các tương tác HMBC giữa H-2 (δH 4,31)/H-3 (δH 4,28) và C-28 (C 109,5);

giữa nhóm methyl (H 1,49)/(H 1,34) và C-28 (C 109,5) đã xác định vị trí nhóm

acetonide tại C-2/C-3. Từ những phân tích trên, kết hợp so sánh số liệu phổ NMR của

VT5 với số liệu phổ của 20-hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide [136], cho phép

khẳng định cấu trúc của hợp chất VT5 là 20-hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide.

Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ chi Vitex.

116

Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT5 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)

 δC 38,7

C 1 δC 38,8 CH2

73,5 73,2 27,7 2 3 4 73,5 CH 73,2 CH 27,7 CH2

52,5 205,6 121,8 167,2 35,7 38,9 21,6 5 6 7 8 9 10 11 52,5 CH 205,7 C 121,8 CH 167,2 C 35,7 CH 38,9 C 21,6 CH2

32,5 12 32,5 CH2

49,0 85,2 31,7 13 14 15 49,5 C 85,2 C 31,7 CH2

21,5 16 21,5 CH2

50,5 18,0 24,0 77,9 21,0 78,4 27,3 17 18 19 20 21 22 23 50,5 CH 18,0 CH3 23,9 CH3 77,9 C 21,1 CH3 78,4 CH 27,4 CH2

42,9 24 42,4 CH2

#C của 20-hydroxyecdysone-2,3-monoacetonide [136] (đo trong CD3OD), ađo trong CD3OD,

b125MHz, c500MHz. *Tín hiệu chập

71,3 28,9 29,7 109,5 28,8 26,6 25 26 27 28 ACN-Me ACN-Me δH 1,22 (m) 2,00 (m) 4,28 (m) 4,31 (m) 1,30 (m) 2,00 (m) 2,26 (t, 8,5) - 5,81 (d, 2,0) - 2,96 (t, 8,0) - 1,77 (m) 2,01 (m) 1,89 (m) 2,14 (m) - - 1,61 (m) 1,99 (m) 1,72 (m) 2,00 (m) 2,41 (t, 9,0) 0,90 (s) 0,99 (s) - 1,22 (s) 3,33* 1,30 (m) 1,67 (m) 1,46 (m) 1,81 (m) - 1,21 (s) 1,22 (s) - 1,49 (s) 1,34 (s) 71,3 C 29,0 CH3 29,7 CH3 109,5 C 28,8 CH3 26,6 CH3

117

3.1.2.6. Hợp chất VT6: Turkesterone

Hình 3.64. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT6

Hợp chất VT6 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của

VT6 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại H 5,82 (d, J = 2,5 Hz), bốn hydroxyl

methine tại H 3,37 (m), 3,98 (br d, J = 2,0 Hz), 4,03 (ddd, J = 3,0, 4,0, 12,0 Hz) và

13C-NMR và DEPT của VT6 xuất hiện tín hiệu của 27 nguyên tử carbon, bao gồm

4,13 (m), năm nhóm methyl tại H 0,90 (s), 1,08 (s), 1,22 (s), 1,23 (s) và 1,24 (s). Phổ

một nhóm carbonyl tại C 206,7; sáu carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại C

39,9, 49,0, 71,3, 77,8, 84,9 và 165,7; tám carbon methine tại C 42,9, 50,3, 52,8, 68,6,

68,9, 69,5, 78,4 và 122,7; bảy carbon methylene tại C 21,5, 27,3, 31,9, 33,3, 39,1,

1H- và 13C-NMR của VT6 có sự tương đồng với số liệu đã công bố của turkesterone

42,4 và 43,8; năm carbon methyl tại C 18,9, 21,0, 24,6, 29,0 và 29,7. Dữ liệu phổ

[137]. Điều này cho phép khẳng định hợp chất VT6 là turkesterone. Hợp chất này lần

đầu tiên được phân lập từ loài V. trifolia.

3.1.2.7. Hợp chất VT7: Polypodine B

Hình 3.65. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT7

118

Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT7 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)



C δC δH δC

34,9 68,1 69,9 36,1 1 2 3 4 34,2 CH2 68,4 CH 70,2 CH 36,2 CH2

80,3 C 202,4 C 120,6 CH 167,5 C 79,9 201,0 119,9 167,0 5 6 7 8 1,74 (m) 3,97 (m) 4,00 (br d, 3,0) 1,78 (m) 2,10 (m) - - 5,87 (d, 2,5) -

38,4 44,8 22,1 9 10 11 39,0 CH 45,4 C 22,5 CH2

32,2 12 32,6 CH2

48,2 84,1 31,8 13 14 15 48,5 C 84,1 C 31,7 CH2

21,4 16 21,5 CH2

50,1 18,0 17,3 76,9 21,7 77,7 27,6 17 18 19 20 21 22 23 50,4 CH 18,0 CH3 16,9 CH3 77,9 C 21,0 CH3 78,4 CH 27,4 CH2

42,3 24 42,4 CH2

#C của polypodine B [138] (đo trong CD3OD), ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz.

69,7 30,1 30,2 25 26 27 3,20 (t, 8,5) - 1,78 (m) 1,83(m) 1,91(m) 2,16 (m) - - 1,61 (m) 1,98(m) 1,75 (m) 2,00 (m) 2,41 (t, 9,0) 0,92 (s) 0,94 (s) - 1,22 (s) 3,33 (m) 1,31 (m) 1,68 (m) 1,46 (m) 1,82 (m) - 1,21 (s) 1,22 (s) 71,3 C 29,0 CH3 29,7 CH3

119

Hợp chất VT7 thu được dưới dạng bột màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của VT7

xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại H 5,87 (d, J = 2,5 Hz), ba proton

oxymethine tại H 3,33 (m), 3,97 (m) và 4,00 (br d, J = 3,0 Hz), năm nhóm methyl tại

H 0,92 (s), 0,94 (s), 1,21 (s), 1,22 (s)  2. Phổ 13C-NMR của VT7 xuất hiện tín hiệu

của 27 carbon, trong đó có một carbon carbonyl tại C 202,4; hai carbon olefin tại C

120,6 và 167,5; sáu carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại C 45,4, 48,5, 71,3,

77,9, 80,3 và 84,1, năm methine tại C 39,0, 50,4, 68,4, 70,2 và 78,4; tám methylen

tại C 21,5, 22,5, 27,4, 31,7, 32,6, 34,2, 36,2 và 42,4; năm methyl tại C 16,9, 18,0,

21,0, 29,0 và 29,7. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VT7 có sự tương đồng với số liệu

đã công bố của polypodine B [138].

Các tương tác HMBC giữa H-1 (H 1,74) và C-2 (C 68,4)/C-3 (C 70,2)/C-5

(C 80,3)/C-10 (C 45,4); giữa H-19 (H 0,94) và C-1 (C 34,2)/C-5 (C 80,3)/C-9 (C

39,0)/C-10 (C 45,4); giữa H-3 (H 4,0) và C-5 (C 80,3) đã xác định vị trí của ba

nhóm hydroxy tại C-2, C-3 và C-5. Tương tự, dựa vào phổ HMBC cũng xác định

được vị trí nhóm hydroxy tại C-14, C-20 và C-22. Các tương tác HMBC giữa H-7

(H 5,87) và C-5 (C 80,3)/C-9 (C 39,0)/C-14 (C 85,1) đã chứng minh vị trí của liên

kết đôi tại C-7/C-8. Từ những phân tích trên, hợp chất VT7 được khẳng định là

polypodine B.

3.1.2.8. Hợp chất VT8: Rubrosterone

Hình 3.66. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT8

Hợp chất VT8 thu được dưới dạng bột, màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của VT8

xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại H 5,93 (br s), hai proton oxymethine tại

H 3,85 (m) và 3,98 (br s), hai nhóm methyl tại H 0,90 (s) và 1,01 (s). Phổ 13C-NMR

và DEPT của VT8 xuất hiện tín hiệu của 19 nguyên tử carbon, bao gồm hai carbon

carbonyl tại C 206,3, 220,9; hai carbon olefin tại C 122,4 và 164,9; ba carbon không

120

liên kết trực tiếp với hydro tại C 39,3, 54,2, 80,5; bốn methine tại C 35,8, 51,9, 68,4,

68,6; sáu methylene tại C 20,6, 24,9, 29,1, 32,8, 34,1 và 37,2; hai methyl tại C 17,6

và 24,6. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất VT8 với số liệu phổ của rubrosterone

[139] cho thấy phù hợp tại các vị trí tương ứng.

Bảng 3.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT8 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)

C δC δH

 δC 37,8

1 37,2 CH2

1,47 (t, 13,5) 1,82 (dd, 4,0, 13,5)

68,0 68,6 CH 3,85 (m) 2

68,0 32,5 51,6 68,4 CH 32,8 CH2 51,9 CH 3,98 (br s) 1,77 (m) 2,46 (dd, 5,5, 12,0) 3 4 5

203,3 122,0 163,0 206,3 C 122,4 CH 164,9 C - 5,93 (br s) - 6 7 8

35,1 38,8 20,1 9 10 11 35,8 CH 39,3 C 20,6 CH2

3,20 (t, 8,0) - 1,68 (dd, 5,0, 8,0) 1,92 (m)

29,0 12 29,1 CH2

53,3 54,2 C 2,05 (m) 2,31 (m) - 13

79,5 33,6 14 15 80,5 C 34,1 CH2

- 2,40 (m) 2,52 (m)

24,5 16 24,9 CH2

1,60(m) 2,15 (m)

217,2 17,2 - 0,90 (s) 17 18 220,9 C 17,6 CH3

#C của rubrosterone [139] (đo trong CD3OD), ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz.

24,7 1,01 (s) 19 24,6 CH3

Các tương tác HMBC giữa H-2 (H 3,85) và C-1 (C 37,2)/C-3 (C 68,4); giữa

H-3 (H 3,98) và C-2 (C 68,6)/C-5 (C 51,9) xác định vị trí của hai nhóm hydroxy tại

C-2 và C-3. Các tương tác HMBC giữa H-5 (H 2,46) và C-4 (C 32,8)/C-6 (C

206,3)/C-7 (C 122,4); giữa H-7 (H 5,93) và C-5 (C 51,9)/C-9 (C 35,8/C-14 (C

121

80,5) xác định vị trí của nhóm oxo tại C-6 và liên kết đôi tại C-7/C-8. Các tương tác

HMBC giữa H-18 (H 0,90) và C-12 (C 29,1)/C-13 (C 54,2)/C-14 ((C 80,5)/C-17

(C 220,9); giữa H-15 (H 2,39 và 2,52)/H-16 (H 2,15) và C-17 (C 220,9) xác định

vị trí nhóm hydroxy tại C-14 và nhóm oxo tại C-17. Từ những phân tích trên, có thể

khẳng định hợp chất VT8 là rubrosterone. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập

từ chi Vitex.

3.1.2.9. Hợp chất VT9: Luteolin

Hình 3.67. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT9

Hợp chất VT9 thu được dưới dạng bột, màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của VT9

xuất hiện tín hiệu của sáu proton thơm tại H 6,22 (d, J = 2,0 Hz), 6,45 (d, J = 2,0

Hz), 6,55 (s), 6,92 (d, J = 8,5 Hz) và 7,39* (tín hiệu chập)  2. Phổ 13C-NMR và

HSQC của VT9 xuất hiện tín hiệu của 15 nguyên tử carbon, bao gồm chín carbon

không liên kết trực tiếp với hydro tại C 105,3, 123,7, 147,0, 151,0, 159,4, 163,2,

166,0, 166,4 và 183,9; sáu carbon methine tại C 95,0, 100,1, 103,9, 114,2, 116,8 và

120,3. Số liệu phổ NMR của VT9 đã gợi ý đây là một flavone, đồng thời có sự tương

đồng với số liệu phổ đã công bố của luteolin [140]. Do vậy, hợp chất VT9 được xác

định là luteolin.

3.1.2.10. Hợp chất VT10: (2S)-7,4'-Dihydroxy-5-methoxyflavanone

Hình 3.68. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT10

122

Hợp chất VT10 thu được dưới dạng bột, màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của

VT10 xuất hiện tín hiệu hai nhóm proton thơm hệ ABX tại δH 5,95 (1H, d, J = 2,0 Hz),

6,05 (1H, d, J = 2,0 Hz); và 6,78 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,28 (2H, d, J = 8,5 Hz); một

proton oxymethine tại δH 5,32 (dd, J = 2,5, 13,0 Hz) và một nhóm methoxy tại δH 3,73

(s). Phổ 13C-NMR và HSQC của VT10 cho thấy sự có mặt của 16 nguyên tử carbon,

bao gồm có bảy carbon không liên kết hydro tại δC 104,5, 129,4, 157,6, 162,2, 164,2,

164,3 và 187,8, bảy methine tại δC 78,1, 93,2, 95,6, 115,2  2, 128,1 2, một

methylen tại δC 44,8, và một nhóm methoxy tại δC 55,6. Dữ liệu phổ NMR của hợp

chất VT10 có sự tương đồng với số liệu đã công bố của (2S)-7,4'-dihydroxy-5-

methoxyflavanone [141]. Các tương tác HMBC giữa H-6 (δH 6,05)/H-8 (δC 5,95) và

C-7 (δC 164,3) xác định vị trí nhóm hydroxy tại C-7. Tương tác HMBC giữa nhóm

methyl (δH 3,73) và C-5 (δC 162,2) xác định nhóm methoxy tại C-5. Các tương tác

HMBC giữa H-2 (δH 7,28)/H-3 (δH 6,78) và C-4 (δC 157,6) xác định nhóm hydroxy

tại C-4. Ngoài ra, hợp chất VT10 có độ quay cực là = -20,5 (c 0,1, MeOH),

giống với của hợp chất, (2S)-7,4'-dihydroxy-5-methoxyflavanone. Từ những phân

tích trên, hợp chất VT10 được xác định là (2S)-7,4'-dihydroxy-5-methoxyflavanone.

Bảng 3.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT10 và hợp chất tham khảo

a,c (J = Hz)

a,b DEPT δH

 δC 78,0 44,7

C 2 3 δC 78,1 CH 44,8 CH2

187,8 C 162,2 C

93,2 CH

164,2 C

95,6 CH

4 5 6 7 8 9 10

5,32 (dd, 2,5, 13,0) 2,52 (dd, 2,5, 16,5) 2,98 (dd, 13,0, 16,5) - - 6,05 (d, 2,0) - 5,95 (d, 2,0) - - - 187,7 162,1 93,1 164,2 95,5 164,2 104,0 129,3 164,3 C 104,5 C 129,4 C 1

128,1 CH 7,28 (d, 8,5) 128,0 2, 6

115,2 CH 6,78 (d, 8,5) 115,0 3, 5

157,6 C - 157,5

#C của (2S)-7,4'-dihydroxy-5-methoxyflavanone [141], ađo trong DMSO, b125MHz, c500MHz.

3,73 (s) 55,7 4 5-OMe 55,6 CH3

123

3.1.2.11. Hợp chất VT11: Vitexin

Hình 3.69. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT11

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VT11 xuất hiện tín hiệu của sáu proton thơm

tại δH 6,28 (1H, s), 6,77 (1H, s), 6,89 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz)

gợi ý sự có mặt của khung flavone. Bên cạnh đó, phổ 1H-NMR của VT11 cũng ghi

nhận tín hiệu của một proton anome tại δH 4,69 (1H, d, J = 10,0 Hz) gợi ý sự có mặt

của một đơn vị đường liên kết trực tiếp với carbon.

Trên phổ 13C-NMR và DEPT của VT11 xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử

carbon, bao gồm 15 carbon của hệ thơm tại δC 98,1, 102,5, 104,1, 104,6, 115,8  2,

121,6, 129,0  2, 156,0, 160,4, 161,1, 162,5, 164,0, 182,1, và 6 carbon đặc trưng của

một đơn vị đường glucopyranose tại δC 61,3 (CH2), 70,6 (CH), 70,9 (CH), 73,4 (CH),

78,7 (CH), 81,8 (CH). So sánh số liệu phổ NMR của VT11 với của hợp chất vitexin

[142] cho thấy sự tương đồng ở các vị trí tương ứng. Điều này cho phép xác định hợp

chất VT11 là vitexin.

3.1.2.12. Hợp chất VT12: Orientin

Hình 3.70. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT12

124

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VT12 xuất hiện tín hiệu của năm proton thơm

tại δH 6,26 (1H, s), 6,63 (1H, s), 6,86 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,48 (1H, s), 7,53 (1H, d, J

= 8,0 Hz) và một proton anome của một đơn vị đường tại δH 4,68 (1H, d, J = 10,0

Hz). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của VT12 xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử

carbon, bao gồm 15 carbon đặc trưng của hợp chất flavone tại δC 98,1, 102,3, 104,0,

104,5, 114,0, 115,6, 119,3, 121,9, 145,8, 149,7, 156,0, 160,4, 162,7, 164,1 và 182,0

và sáu carbon của một đơn vị đường glucopyranose tại δC 61,6 (CH2), 70,7 (CH), 70,8

(CH), 73,4 (CH), 78,7 (CH), 82,0 (CH). So sánh số liệu phổ NMR của VT12 với của

VT11 cho biết cấu trúc của hợp chất này khác với của VT11 ở vòng B của flavone.

Phân tích chi tiết hơn cho thấy đây là hợp chất orientin (luteolin-8C-β-D-

glucopyranoside) [143]. Điều này cho phép xác định hợp chất VT12 là orientin.

3.1.2.13. Hợp chất VT13: Homoorientin

Hình 3.71. Cấu trúc hóa học của hợp chất VT13

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VT13 xuất hiện tín hiệu của năm proton thơm

tại δH 6,48 (s), 6,67 (s), 6,89 (d, J = 8,0 Hz), 7,41 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 7,41 (d, J =

8,0 Hz) và một proton anome tại δH 4,59 (d, J = 10,0 Hz) gợi ý cấu trúc của hợp chất

VT13 là một flavone có đính một phân tử đường. Trên phổ 13C-NMR và DEPT của

VT13 xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử carbon, bao gồm 15 carbon của hệ thơm

tại δC 93,5, 102,8, 103,4, 108,9, 113,3, 116,1, 119,0, 121,4, 145,8, 149,7, 156,2, 160,7,

163,3, 163,7 và 181,9, sáu carbon đặc trưng của một đơn vị đường glucopyranose tại

δC 61,5 (CH2), 70,2 (CH), 70,6 (CH), 73,1 (CH), 79,0 (CH) và 81,6 (CH). So sánh số

liệu phổ NMR của VT13 với của hợp chất homoorientin (luteolin-6C-β-D-

glucopyranoside) [143] cho thấy số liệu trùng khớp nhau. Điều này cho phép khẳng

định hợp chất VT13 là homoorientin.

125

3.1.2.14. Hợp chất VT14: 2-O-rhamnosylvitexin

Hình 3.72. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT14

Phổ 1H-NMR của hợp chất VT14 xuất hiện tín hiệu của sáu proton thơm tại

δH 6,26 (1H, s), 6,62 (1H, s), 6,97 (2H, d, J = 8,5 Hz), 8,01 (2H, d, J = 8,5 Hz) và hai

proton anome tại δH 5,06 (d, J = 10,0 Hz) và 5,11 (tín hiệu chập) gợi ý hợp chất VT14

có cấu trúc flavone đính hai phân tử đường. Trên phổ 13C-NMR và HSQC của VT14

xuất hiện tín hiệu của 27 nguyên tử carbon, bao gồm 15 carbon của hợp chất flavone

tại δC 100,1, 103,6, 105,8  2, 117,0  2, 123,6, 130,1  2, 158,0, 162,7, 162,8, 164,9,

166,7 và 184,1, sáu carbon của đơn vị đường thứ nhất tại δC 63,1 (CH2), 72,2 (CH),

73,8 (CH), 78,2 (CH), 81,6 (CH) và 82,9 (CH) và sáu carbon đặc trưng cho đơn vị

đường thứ hai tại δC 18,0 (CH2), 70,0 (CH), 72,0 (CH), 72,5 (CH), 73,6 (CH) và 102,5

(CH). So sánh số liệu phổ NMR của VT14 với của hợp chất 2-O-rhamnosylvitexin

[144] cho thấy số liệu trùng khớp nhau.

Trên phổ HMBC xuất hiện tương tác giữa H-3 (δH 6,62) và C-2 (δC 166,7)/C-

4 (δC 184,1)/C-10 (δC 105,8) xác định vị trí nhóm ketone tại C-4. Các tương tác

HMBC giữa H-6 (δH 6,29) và C-5 (δC 162,7)/C-7 (δC 164,9)/C-8 (δC 105,8)/C-10 (δC

105,8) cho phép xác định vị trị hai nhóm hydroxy tại C-5 và C-7. Các tương tác

HMBC giữa H-2 (δH 8,01) và C-2 (δC 166,7)/C-4 (δC 162,8)/C-6 (δC 130,1); giữa H-

3( δH 6,97) và C-1 (δC 123,6)/C-4 (δC 162,8)/C-5 (δC 117,0) xác định nhóm hydroxy

tại C-4. Bên cạnh đó, dựa vào hằng số tương tác của H-1 và H-2, J = 10 Hz và độ

chuyển dịch hóa học 13C-NMR của phân tử đường thứ nhất cho phép xác định đây là

C-β-glucopyranose. Các tương tác HMBC giữa glc H-1 (δH 5,06) và C-7 (δC

126

164,9)/C-8 (δC 105,8)/C-9 (δC 158,0) xác định vị trí liên kết của C-glucopyranose tại

C-8. Các tương tác HMBC giữa proton anome H-1 (δH 5,11) và C-2 (δC 78,1)/C-

2 (δC 72,5)/C-5 (δC 70,0) xác định liên kết của phân tử đường thứ hai với

glucopyranose tại C-2. Từ những phân tích trên, cho phép khẳng định hợp chất

VT14 là 2-O-rhamnosylvitexin.

3.1.2.15. Hợp chất VT15: Eucaphic acid

Xem mục 3.1.1.9

3.1.2.16. Hợp chất VT16: Tormentic acid

Hình 3.73. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VT16

Hợp chất VT16 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Trên phổ 1H-

NMR của VT16 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại H 5,17 (br s), bảy nhóm

methyl tại H 0,69 (s), 0,71 (s), 0,84 (d, J = 6,5 Hz), 0,91 (s), 0,93 (s), 1,08 (s) và 1,29

(s), hai nhóm oximethine tại H 2,75 (dd, J = 4,0, 9,5 Hz) và 3,42 (m). Phổ 13C-NMR

và DEPT của VT16 xuất hiện tín hiệu của 30 nguyên tử carbon, bao gồm bảy carbon

methyl tại δC 16,3  2, 16,6, 17,1, 24,0, 26,4 và 28,8, tám carbon methylene tại δC

18,1, 23,2, 25,2, 25,9, 28,0, 32,6, 37,2 và 46,9, bảy carbon methine tại δC 41,4, 46,7,

53,2, 54,8, 67,2, 82,3 và 126,7, tám carbon không liên kết với hydro tại δC 37,6, 39,0,

39,2, 41,1, 47,0, 71,6, 138,6 và 178,9. Phân tích số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp

chất VT16 cho thấy hợp chất này có cấu trúc khung urs-12-ene triterpene và có số

liệu phổ tương tự với số liệu phổ của tormentic acid [145]. Các tương tác HMBC giữa

H-23 (δH 0,93)/H-24 (δH 0,71) và C-3 (δC 82,3)/C-4 (δC 39,0)/C-5 (δC 54,8) cho phép

xác định vị trí nhóm hydroxy tại C-3.

127

Bảng 3.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT16 và hợp chất tham khảo

a,b DEPT

a,c (J = Hz)



C δC δH δC

47,9 1 46,9 CH2

68,7 83,9 39,8 56,0 19,0 2 3 4 5 6 67,2 CH 82,3 CH 39,0 C 54,8 CH 18,1 CH2

33,5 7 32,6 CH2

40,4 47,8 38,5 24,1 127,9 139,9 42,1 29,3 8 9 10 11 12 13 14 15 39,2 C 46,7 CH 37,6 C 23,2 CH2 126,7 CH 138,6 C 41,1 C 28,0 CH2

26,4 16 25,2 CH2

48,3 54,6 72,7 42,4 26,9 17 18 19 20 21 47,0 C 53,2 CH 71,6 C 41,4 CH 25,9 CH2

38,5 22 37,2 CH2

#C

29,3 17,6 16,8 17,2 24,7 180,6 27,1 16,3 23 24 25 26 27 28 29 30 0,78 (br s) 1,78 (dd, 4,0, 12,5) 3,42 (m) 2,75 (dd, 4,0, 9,5) - 0,77 (m) 1,33 (m) 1,47 (m) 1,23 (m) 1,45 (m) - 1,62 (m) - 1,90 (m) 5,17 (br s) - - 0,89 (m) 1,68 (m) 1,38 (m) 2,49 (m) - 2,37 (s) - 1,24 (m) 1,13 (m) 1,62 (m) 1,50 (m) 1,60 (m) 0,93 (s) 0,71 (s) 0,91 (s) 0,69 (s) 1,29 (s) - 1,08 (s) 0,84 (d, 6,5) 28,8 CH3 17,1 CH3 16,3 CH3 16,6 CH3 24,0 CH3 178,9 C 26,4 CH3 16,3 CH3

của tormentic acid đo trong pyridine-d5 [145], ađo trong DMSO-d6, b125MHz, c500MHz.

128

Các tương tác HMBC giữa H-1 (δH 0,78 và 1,78)/H-3 (δH 2,75) và C-2 (δC

67,2) đã gợi ý vị trí nhóm hydroxy tại C-2. Các tương tác HMBC giữa H-29 (δH 1,08)

và C-18 (δC 53,2)/C-19 (δC 71,6)/C-20 (δC 41,4); giữa H-30 (δH 0,84) và C-19 (δC

71,6)/C-20 (δC 41,4)/C-21 (δC 25,9) xác định vị trí nhóm hydroxy còn lại tại C-19.

Các tương tác HMBC giữa H-27 (δH 1,29) và C-8 (δC 39,2)/C-13 (δC 138,6)/C-14 (δC

41,1)/C-15 (δC 28,0); giữa H-12 (δH 5,17) và C-9 (δC 46,7)/C-14 (δC 41,1)/C-18 (δC

53,2) đã chứng minh vị trí của liên kết đôi tại C-12/C-13. Từ những phân tích trên,

hợp chất VT16 được khẳng định là tormentic acid.

3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

3.2.1. Hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia

Các sản phẩm nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính chống viêm từ lâu đã được sử

dụng như là một phương thuốc dân gian để điều trị sốt, đau và viêm khớp. Theo các

báo cáo đã công bố, có khá nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm của các loài

thuộc chi Vitex [17, 86, 89],…. Những hợp chất phân lập được từ chi Vitex thể hiện

hoạt tính kháng viêm thường là những hợp chất labdane, flavonid, phenolic,… [11].

Viêm là hiện tượng bệnh lý bao gồm một loạt những thay đổi tại chỗ và toàn

thân, bắt đầu ngay khi tác nhân gây viêm xâm nhập vào cơ thể. Viêm nhiễm là căn

bệnh rất phổ biến ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Viêm là một đáp ứng của hệ

miễn dịch bảo vệ cơ thể trước sự tấn công của tác nhân bên ngoài (vi sinh vật, tác

nhân hóa, lý, cơ) hoặc của tác nhân bên trong (hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh tự

miễn). Quá trình viêm kéo dài sẽ có thể trở thành viêm mạn tính, gây ra các bệnh

viêm nhiễm. Trong phản ứng viêm, các tế bào như bạch cầu đa nhân trung tính, đại

thực bào, bạch cầu ưa acid, bạch cầu ưa bazơ, tế bào nội mô sản xuất ra các chất trung

gian hoá học như prostaglandin, histamin, leucotrien,… Các chất trung gian hoá học

vừa giải phóng lại hoạt hoá một số tế bào khác, giải phóng các polypeptid gọi là các

cytokin [146].

Các chất hay thuốc kháng viêm không đảo ngược được quá trình viêm mà chỉ

giới hạn hoặc làm chậm quá trình viêm bằng cách ức chế việc sản xuất các chất trung

gian gây viêm [105].

Để đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro thông qua sự sản sinh NO trên dòng

tế bào BV2, kích thích bởi LPS của 12 hợp chất (VL1-VL12) từ loài V. limonifolia,

129

đầu tiên các hợp chất này được đánh giá độ độc trên dòng tế bào BV2 ở nồng độ 20

M. Các hợp chất có độc tính mạnh (% tế bào sống sót < 80%) không được lựa chọn

để đánh giá hoạt tính kháng viêm. Kết quả sàng lọc cho thấy hợp chất VL11 có độc

tính mạnh (tỉ lệ sống sót 59,04% < 80%), không được lựa chọn đánh giá hoạt tính

kháng viêm. Các hợp chất còn lại không gây độc dòng tế bào BV2 (tỉ lệ sống sót >

80%) (Xem hình dưới).

Hình 3.74. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm của các hợp chất VL1-VL12

Tiếp đó, các hợp chất VL1-VL10, VL12 được đánh giá sàng lọc ức chế sự sản

sinh NO trên dòng tế bào BV2, kích thích bởi LPS ở 50 µM. Kết quả sàng lọc cho

thấy tất cả các hợp chất được đánh giá đều thể hiện tác dụng ức chế sự sản sinh NO

mạnh (% ức chế >50%) vì thế được đánh giá ở các nồng độ nhỏ hơn: 1,0, 5,0, 10, 20

mạnh nhất với giá trị IC50 lần lượt là 2,500,34 và 7,130,87 M. Các hợp chất VL6

µM để xác định giá trị IC50. Các hợp chất VL2 và VL3 gây ức chế mạnh sự sản sinh NO

và VL10 thể hiện khả năng ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2 với giá trị IC50

lần lượt là 19,161,09, 15,881,17 M, mạnh hơn chất đối chứng dương L-NMMA

(IC50 22,101,20 M). Bốn hợp chất VL4, VL5, VL7 và VL9 cũng gây ức chế đáng

kể sự sản sinh NO với các giá trị IC50 nằm trong khoảng 24,70 đến 45,31 M (Thấp

hơn chất đối chứng dương, L-NMMA).

Từ các kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2

của các hợp chất từ loài V. limonifolia đã gợi ý một số nhận định ban đầu về mối liên

hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính kháng viêm của các hợp chất này như sau:

130

- Trong số các hợp chất labdane phân lập được (VL1-VL3), hợp chất VL2,

VL3 thể hiện hoạt tính ức chế mạnh sự sản sinh NO trên tế bào BV2 (giá trị IC50 lần

lượt là 2,500,34, 7,130,87 M) trong cấu trúc phân tử có nhóm hydroxy tại C-16,

trong khi hợp chất VL1 (hoạt tính yếu) không có nhóm hydroxy ở vị trí trên; đặc biệt

hợp chất VL2 có thêm nhóm hydroxy tại C-12 so với hợp chất VL3 thì thể hiện hoạt

tính ức chế NO mạnh hơn.

- Các hợp chất flavonoid phân lập được (VL4, VL5 và VL6) thể hiện hoạt tính

ức sự sản sinh NO ở mức độ trung bình (giá trị IC50 từ 19,16 đến 39,67 M).

3.2.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất

Enterovirus là tên gọi chung của nhóm siêu vi thuộc họ Picornaviridae, có đặc

điểm bộ gen là ARN, sợi đơn, cấu trúc virus không có lớp vỏ bao ngoài envelope.

Các entrovirus gây nhiễm ở vùng họng và đường tiêu hóa. Có hơn 70 loại enterovirus,

được xem vào các nhóm sau: echovirus, coxsackievirus A, coxsackievirus B,

enterovirus 68–71 và poliovirus [147]. Đặc điểm chung của các siêu vi trong nhóm

này là sinh sản và lây lan từ người mang mầm bệnh sang người lành qua đường tiêu

hóa hoặc hô hấp. Con người là vật chủ duy nhất của enterovirus. Dịch bệnh này

thường xảy ra vào mùa hè và mùa thu. Trẻ em thường dễ bị nhiễm enterovirus hơn

người lớn, đặc biệt là trẻ từ 1 đến 4 tuổi [147].

Enterovirus gây ra rất nhiều chứng bệnh khác nhau. Đa số các trường hợp

nhiễm có biểu hiện nhẹ và tự hồi phục mà không cần phải điều trị. Một số ít các

trường hợp có biến chứng thần kinh như viêm não, viêm màng não hoặc bại liệt. Các

trường hợp có biểu hiện nhẹ, thì triệu chứng có thể gặp của bệnh là sốt, phát ban, tiêu

chảy, viêm họng và nổi mụn nước ở trong miệng, lòng bàn tay, chân và vùng mông.

Trường hợp có biến chứng thần kinh thì có thể gặp những triệu chứng như mê sảng,

lơ mơ, co giật, hôn mê, yếu liệt chân tay, khó thở [148]. Mỗi năm, entrovirrus lây

nhiễm hàng triệu người trên thế giới với nhiều triệu chứng khác nhau. Tại Mỹ,

entrovirus gây ra 30 000 đến 50 000 trường hợp viêm màng não mỗi năm trên khoảng

30 đến 50 triệu ca nhiễm bệnh do Entrovirrus gây ra [148]. Các ca nhiễm enterovirus

có triệu chứng lâm sàng không đặc trưng nên thường có thể bị chẩn đoán sai thành

nhiễm bệnh do vi khuẩn hoặc siêu vi khác, dẫn đến điều trị, thủ thuật không cần thiết.

Gần đây, với sự tiến bộ của công nghệ chẩn đoán chính xác virus trong cơ thể và sự

131

phát triển của các liệu pháp kháng virus mới, các trường hợp nhiễm enterovirus nặng

đã được chẩn đoán và điều trị sớm hơn [147]. Tuy nhiên, cho đến nay, trên thế giới

vẫn chưa có loại vắc xin nào phòng ngừa nhiễm các loại entrovirus, cũng như chưa

có thuốc điều trị đặc hiệu được FDA công nhận dùng cho các bệnh do nhiễm

entrovirus [149].

Kết quả nghiên cứu về hoạt tính kháng virus in vitro đối với một số chủng

virus entrovirus của các hợp chất phân lập được từ loài V.limonifolia và V. trifolia

như sau:

3.2.2.1. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất từ loài V. limonifolia

Các hợp chất VL1-VL12 phân lập được từ loài V. limonifolia được tiến hành

đánh giá hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3 (CVB3), human

rhinovirus 1B (HRV1B) và enterovirus 71 (EV71). Kết quả cho thấy, hai hợp chất

flavonoid VL4 và VL6 thể hiện hoạt tính kháng virus mạnh đối với tế bào nhiễm

virus CVB3 với các giá trị IC50 lần lượt là 0,21 ± 0,06, 1,86 ± 0,18 μM và đều có giá

trị CC50 >50 µM (chất đối chứng dương rupintrivir có IC50 là 0,12 ± 0,06 μM). Đồng

thời, hợp chất VL4 còn thể hiện tác dụng ức chế virus HVR1B (với giá trị IC50 là

0,61±0,21 μM và CC50 >50 µM) mạnh hơn so với chất đối chứng dương ribavirin

(IC50 là 48,07±1,46 μM). Hợp chất này cũng thể hiện hoạt tính kháng virus EV71 ở

mức độ trung bình (với giá trị IC50 là 32,05±0,94 μM). Kết quả này cho thấy phạm vi

kháng virus của hợp chất VL4 đối với các chủng entrovirus khá rộng.

Các kết quả về hoạt tính kháng virus enterovirus của các hợp chất từ loài V.

limonifolia cho thấy 2 hợp chất khung flavonoid (VL4 và VL6) thể hiện hoạt tính

kháng virus mạnh. Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố cũng cho thấy khả năng

kháng một số chủng enterovirus của các hợp chất flavonoid. Nyo Min và cộng sự đã

tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng virus enterovirus A71 của các hợp chất flavonoid

và cho thấy 2 hợp chất ST077124 (6-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-

3,5,7-trimethoxychromen-4-one) và ST024734 (peracetate pulicarine) thể hiện hoạt

tính kháng virus mạnh, hứa hẹn sẽ là tác nhân điều trị EVA71[150]. Trong một công

bố khác, từ loài S. baicalensis Georgi, Choi và cộng sự đã phân lập được 3 flavonoid

là norwogonin, oroxylin A, mosloflavone và đánh giá hoạt tính kháng virus EV71.

Kết quả cho thấy những hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng virus EV71 mạnh, có

132

tác dụng ức chế sự tổng hợp lớp vỏ capsid của virus [119]. Một flavonoid được phân

lập từ loài Larix sibirica, dihydroquercetin, trong thử nghiệm trên chuột để điều trị

bệnh viêm tụy gây ra bởi virus coxsackievirus B4 đã cho thấy tác dụng kháng virus

mạnh của dihydroquercetin. Điều này gợi mở khả năng ứng dụng của hợp chất này

trong điều trị viêm tụy do virus [151]. Như vậy kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng

virus in vitro từ các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia đã góp phần gợi mở mối

liên hệ về khả năng kháng các chủng enterovirus của hợp chất flavonoid.

3.2.2.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất từ loài V. trifolia

Các hợp chất VT1-VT16 đã được phân lập từ loài V. trifolia đã được đánh giá

khả năng ức chế đối với ba chủng entrovirus là CVB3, HRV1B và EV71 ở nồng độ

10 M. Kết quả được thể hiện như hình dưới đây:

Hình 3.75. Tác dụng kháng virus CVB3 của các hợp chất VT1-VT16

Hình 3.76. Tác dụng kháng virus HRV1B của các hợp chất VT1-VT16

133

Hình 3.77. Tác dụng kháng virus EV71 của các hợp chất VT1-VT16

Qua đánh giá sơ bộ về hoạt tính kháng một số chủng entrovirus, hợp chất VT9

cho thấy hiệu quả tác dụng chống lại các chủng virus CVB3/ HRV1B/ EV71 ở nồng

độ 10 M với giá trị tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót lần lượt là 77,14%, 80,20%, 43,35%.

Các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính kháng các chủng virus thử nghiệm.

Liên hệ giữa kết quả đánh giá hoạt tính kháng virus của các hợp chất phân lập

được từ loài V. trifolia và cấu trúc của các hợp chất này cho một số nhận xét như sau:

Hợp chất VT9 thể hiện tiềm năng kháng virus có cấu trúc khung flavonoid, điều này

phù hợp với mối liên hệ giữa khả năng kháng các chủng enterovirus với cấu trúc

khung flavonoid như đã nêu ở mục 3.2.2.1. Trong khi đó, hợp chất VT10 cũng là một

flavonoid, có cấu trúc gần giống VT9 nhưng không thể hiện hoạt tính kháng các chủng

virus thử nghiệm. So sánh cấu trúc của hai hợp chất này, cho thấy hợp chất VT10

không có hai nhóm thế hydroxy tại vị trí C-5 và C-5. Các hợp chất flavonoid khác

phân lập được từ loài V. trifolia (VT11, VT12, VT13, VT14) không thể hiện hoạt tính

kháng các chủng virus thử nghiệm trong cấu trúc cũng không có nhóm hydroxy tại vị

trí C-5.

134

KẾT LUẬN

Từ lá của 2 loài Vitex limonifolia và Vitex trifolia thu hái tại vườn quốc gia Bạch

Mã, Thừa Thiên Huế sau khi xử lý ngâm, chiết và tiến hành phân lập bằng các phương

pháp sắc ký và các phương pháp phổ hiện đại, có sự so sánh các số liệu phổ với các

hợp chất tương tự trong tài liệu tham khảo, chúng tôi đã phân lập và xác định cấu trúc

28 hợp chất và nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất này.

1. Từ loài Vitex limonifolia đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp chất.

Trong đó, có 3 hợp chất mới là vitexlimolide A (VL1), vitexlimolide B (VL2) và

vitexlimolide C (VL3); 5 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Vitex là 5,4′-

dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone (VL4), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone

(VL6), verrucosin (VL7), 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-

28-oic acid (VL10) và maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12); và 4 hợp chất đã biết

khác là vitecetin (VL5), 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (VL8), euscaphic

acid (VL9) và maslinic acid (VL11).

2. Từ loài Vitex trifolia đã phân lập và xác định cấu trúc 16 hợp chất. Trong

đó, có 2 hợp chất mới là 3α-hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid (VT1) và

matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (VT2); 1 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ

chi Vitex là 20-hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide (VT5); 3 hợp chất lần đầu tiên

phân lập từ loài V. trifolia là ecdysone (VT3), 20-hydroxyecdysone (VT4) và

turkesterone (VT6); và 10 hợp chất đã biết là polypodine B (VT7), rubrosterone

(VT8), luteolin (VT9), (2S)-7,4'-dihydroxy-5-methoxyflavanone (VT10), vitexin

(VT11), orientin (VT12), homoorientin (VT13), 2-O-rhamnosylvitexin (VT14),

euscaphic acid (VT15) và tormentic acid (VT16).

3. Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vitro thông qua ức chế sự sản sinh

NO trên tế bào BV2 của 12 hợp chất (VL1 - VL12) phân lập được từ loài Vitex

limonifolia. Kết quả cho thấy, các hợp chất VL2, VL3 thể hiện hoạt tính kháng viêm

mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 2,500,34, 7,130,87 M; hợp chất VL6, VL10 thể

hiện hoạt tính kháng viêm với giá trị IC50 lần lượt là 19,161,09, 15,881,17 M, giá

trị này nhỏ hơn so với chất đối chứng dương được sử dụng là L-NMMA (IC50 là

22,101,20 M). Các hợp chất VL4, VL5, VL7 và VL9 thể hiện hoạt tính kháng

viêm trung bình với các giá trị IC50 từ 15,88 đến 72,50 M.

135

4. Đã nghiên cứu hoạt tính kháng virus in vitro đối với ba chủng virus

coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B và enterovirus 71 của 12 hợp chất (VL1-

VL12) phân lập từ loài Vitex limonifolia và 16 hợp chất (VT1-VT16) phân lập được

từ loài Vitex trifolia. Kết quả cho thấy, hợp chất VL4 và VL6 thể hiện hoạt tính kháng

virus mạnh đối với tế bào nhiễm virus coxsackievirus B3 với các giá trị IC50 lần lượt

là 0,21 ± 0,06 và 1,86 ± 0,18 μM. Hợp chất VL4 còn thể hiện hoạt tính kháng virus

trong thử nghiệm kháng virus human rhinovirus 1B (với giá trị IC50 là 0,61±0,21 μM)

và kháng virus enterovirus 71 (với giá trị IC50 là 32,05±0,94 μM). Các hợp chất VT1-

VT16 trong sàng lọc về hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3, human

rhinovirus 1B và enterovirus 71, chỉ có hợp chất VT9 cho kết quả khả quan, ở nồng

độ 10 μM, với giá trị tỷ lệ phần trăm tế bào sống sót lần lượt là 77,14%, 80,20%,

43,35%.

136

KIẾN NGHỊ

Các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài

Vitex limonifolia và Vitex trifolia đã bổ sung thêm những hợp chất mới vào thành phần

hóa học của 2 loài này. Đặc biệt thử nghiệm hoạt tính sinh học của hợp chất labdane VL2

và VL3 thể hiện hoạt tính ức chế NO trên tế bào BV2, kích thích bởi LPS rất mạnh.

Vì thế, có thể tiến hành các thử nghiệm hoạt tính kháng viêm in vivo, từ đó định hướng

về khả năng ứng dụng của các hợp chất VL2, VL3.

Hợp chất VL4 và VT9 thể hiện phạm vi hoạt tính kháng virus đối với các chủng

entrovirus trong phạm vi khá rộng (bao gồm các chủng CVB3, HRV1B và EV71). Vì

thế cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn nữa hoạt tính của hơp chất VL4 và VT9.

137

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Ninh Khac Ban, Nguyen Thi Kim Thoa, Tran My Linh, Do Thi Trang, Phan Van

Kiem, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Chau Van Minh, Jae-Hyoung Song,

Hyun-Jeong Ko, Seung Hyun Kim. Labdane-type diterpenoids from Vitex

limonifolia and their antivirus activities. Journal Natural Medicine, 2018, 72, 290-

297.

2. Ninh Khac Ban, Nguyen Thi Kim Thoa, Tran My Linh, Vu Huong Giang, Do Thi

Trang, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Tran Hong Quang, Pham Hai Yen,

Chau Van Minh, Phan Van Kiem. Chemical constituents of Vitex trifolia leaves.

Natural Product Communications. 2018, 13 (2), 129-130.

3. Nguyen Thi Kim Thoa, Ninh Khac Ban, Do Thi Trang, Tran My Linh, Vu Huong

Giang, Nguyen Xuan Nhiem, Phan Van Kiem. Triterpenes from Vitex limonifolia.

Vietnam Journal of Chemistry, 2017, 55(6), 715 -719.

4. Nguyen Thi Kim Thoa, Ninh Khac Ban, Do Thi Trang, Tran My Linh, Vu Huong

Giang, Nguyen Xuan Nhiem, Phan Van Kiem. Flavonoid and other compounds

from Vitex limonifolia. Vietnam Journal of Chemistry, 2018, 56(6),679-683.

5. Nguyen Thi Kim Thoa, Ninh Khac Ban, Do Thi Trang, Tran My Linh, Vu Huong

Giang, Nguyen Xuan Nhiem, Phan Van Kiem. Ecdysteroids from leaves of Vitex

trifolia. Vietnam Journal of Chemistry, 2018, 56(2), 127-261.

6. Nguyễn Thị Kim Thoa, Vũ Kim Thư, Ninh Khắc Bản, Đỗ Thị Trang, Phan Văn

Kiệm. Các hợp chất triterpenoid và ecdysteroid từ lá loài mạn kinh. Tạp chí

Nghiên cứu Khoa học và công nghệ quân sự, 2018, Số đặc san CBES2, 83-87.

7. Nguyễn Thị Kim Thoa, Nguyễn Thị Thu Hiền, Ninh Khắc Bản, Nguyễn Xuân

Nhiệm, Đỗ Thị Trang. Các hợp chất triterpene và lignan phân lập từ lá loài Vitex

limonifolia. Kỷ yếu Hội nghị Gắn kết khoa học cơ bản với khoa học trái đất lần

thứ hai (CBES2), 2018, 17-22.

138

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. V.V. Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 2002.

2. T.T. Thuy, A. Porzel, H. Ripperger, T. Van Sung, G. Adam, Chalcones and

ecdysteroids from Vitex leptobotrys, Phytochemistry, 1998, 49, 2603-2605.

3. W. Pan, K. Liu, Y. Guan, G.T. Tan, V.H. Nguyen, M.C. Nguyen, D.D. Soejarto, J.M. Pezzuto, H.H.S. Fong, H. Zhang, Bioactive compounds from Vitex

leptobotrys, Journal of Natural Products, 2014, 77, 663-667.

4. D.N. Dai, T.D. Thang, I.A. Ogunwande, O.A. Lawal, Study on essential oils

from the leaves of two Vietnamese plants: Jasminum subtriplinerve C.L. Blume

and Vitex quinata (Lour) F.N. Williams, Natural Product Research, 2016, 30,

860-864.

5. T.H. Thái, P.T. Hồng, Đ.T. Minh, Thành phần hóa học của tinh dầu từ bi biển

(Vitex rotundifolia L.) ở Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 2006, 28, 93-95.

6. F. Kiuchi, K. Matsuo, M. Ito, T.K. Qui, G. Honda, New norditerpenoids with

trypanocidal activity from Vitex trifolia, Chemical and Pharmaceutical Bulletin,

2004, 52, 1492-1494.

7. V.X. Phương, Thực vật chí Việt Nam, Tập 6, Họ Cỏ roi ngựa, Nhà xuất bản

khoa học và kỹ thuật, 2007.

8. S. Ganapaty, K.N. Vidyadhar, Phytoconstituents and biological activities of

Vitex-a review, Journal of Natural Remedies, 2005, 5, 75-95.

9. D.H. Bich, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản khoa

học và kỹ thuật, Tập 1.

10. J.L. Yao, S.M. Fang, R. Liu, M.B. Oppong, E.W. Liu, G.W. Fan, H. Zhang, A

review on the terpenes from genus Vitex, Molecules, 2016, 21, 1179.1171-

1179.1120.

11. C. Qiu, L. Tong, T. Yuan, F. Wang, F. Zhao, L. Chen, Constituents from Vitex negundo var. heterophylla and their inhibition of nitric oxide production, Journal of Natural Medicines, 2017, 71, 292-298.

12. M. Huang, L. Zhang, F. Zhou, X. Ma, Z. Li, T. Zhong, Y. Zhang, A new ursane triterpenoid possessing cytotoxicity from the fruits of Vitex trifolia var. simplicifolia, Chemistry of Natural Compounds, 2016, 52, 660-663.

13. P. Hu, D.H. Li, X. Hu, S.G. Li, C.M. Sai, X.C. Sun, T. Su, J. Bai, Z.H. Wang, Z.L. Li, H.M. Hua, Lignans and triterpenoids from Vitex negundo var.

heterophylla and their biological evaluation, Fitoterapia, 2016, 111, 147-153.

139

14. P. Rudrapaul, I.S. Sarma, N. Das, U.C. De, S. Bhattacharjee, B. Dinda, New flavonol methyl ether from the leaves of Vitex peduncularis exhibits potential

inhibitory activity against Leishmania donovani through activation of iNOS

expression, European Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 87, 328-335.

15. J.S. Jangwan, R.P. Aquino, T. Mencherini, P. Picerno, R. Singh, Chemical

constituents of ethanol extract of leaves and molluscicidal activity of crude extracts from Vitex trifolia Linn, Herba Polonica, 2013, 59, 19-32.

16. C.J. Zheng, J. Pu, H. Zhang, T. Han, K. Rahman, L.P. Qin, Sesquiterpenoids

and norterpenoids from Vitex negundo, Fitoterapia, 2012, 83, 49-54.

17. S.G. Leitao, T.C. dos Santos, F. Delle Monache, M.E. Matheus, P.D. Fernandes, B.G. Marinho, Phytochemical profile and analgesic evaluation of Vitex cymosa

leaf extracts, Revista Brasileira de Farmacognosia, 2011, 21, 874-883.

18. V.E. Rasamison, L. Ranaivo-Harimanana, S. Cao, E. Pan, F. Ratovoson, F.

Randriantafika, R. Rakotondrajaona, S. Rakotonandrasana, R.

Andriantsiferana, D.G.I. Kingston, A new labdane diterpene from Vitex

cauliflora Moldenke from the Madagascar rainforest, Fitoterapia, 2010, 81, 55-

58.

19. C.J. Zheng, B.K. Huang, Y.B. Wu, T. Han, Q.Y. Zhang, H. Zhang, L.P. Qin,

Terpenoids from Vitex negundo seeds, Biochemical Systematics and Ecology, 2010, 38, 247-249.

20. M.Y. Huang, L.J. Zhong, J.M. Xie, F. Wang, Y.H. Zhang, A new taraxastane-

type triterpene from Vitex trifolia var. simplicifolia, Helvetica Chimica Acta,

2013, 96, 2040-2045.

21. Y.T. Li, M.M. Li, J. Sun, Z.X. Zhu, Y.L. Song, D.R. Pang, J. Zheng, Y.F. Zhao,

P.F. Tu, J. Li, Furofuran lignan glucosides from the leaves of Vitex negundo

var. cannabifolia, Natural Product Research, 2017, 31, 918-924.

22. P. Rudrapaul, M. Gruner, H.J. Knolker, B. Dinda, Flavones and triterpenes from the leaves of Vitex peduncularis, Indian journal of chemistry. Section B, Organic chemistry, including medicinal chemistry, 2015, 54B, 279-282.

23. M.G. Nyamoita, I. Ester, M.H. Zakaria, L. Wilber, B.J. Ochola, H. Ahmed, Larvicidal and brine shrimp activities of Vitex schiliebenii extracts and isolated phytoecdysteroids on Anopheles gambiae Giles s.s. larvae, Journal of Applied

Pharmaceutical Science, 2013, 3, 091-095.

24. A. Suksamrarn, S. Kumpun, B. Yingyongnarongkul, Ecdysteroids of Vitex

scabra stem bark, Journal of Natural Products, 2002, 65, 1690-1692.

140

25. C.O. Ochieng, I.O. Ishola, S.A. Opiyo, L.A.O. Manguro, P.O. Owuor, K.C. Wong, Phytoecdysteroids from the stem bark of Vitex doniana and their anti-

inflammatory effects, Planta Medica, 2013, 79, 52-59.

26. N.S. Ramazanov, Ecdysteroids and iridoidal glycosides from Vitex agnus-

castus, Chemistry of Natural Compounds, 2004, 40, 299-300.

27. T.C. Dos Santos, F. Delle Monache, S.G. Leitao, Ecdysteroids from two

Brazilian Vitex species, Fitoterapia, 2001, 72, 215-220.

28. A. Suksamrarn, N. Promrangsan, A. Jintasirikul, Highly oxygenated

ecdysteroids from Vitex canescens root bark, Phytochemistry, 2000, 53, 921-

924.

29. A. Suksamrarn, C. Sommechai, P. Charulpong, B. Chitkul, Ecdysteroids from

Vitex canescens, Phytochemistry, 1995, 38, 473-476.

30. M. Zhang, M.J. Stout, I. Kubo, Isolation of ecdysteroids from Vitex strickeri

using RLCC and recycling HPLC, Phytochemistry, 1991, 31, 247-250.

31. W. Sonjaroon, L. Kaveeta, W. Chai-arree, S. Klinsakorn, A. Suksamrarn, K.

Jutamanee, Exogenous 7,8-dihydro-8α-20-hydroxyecdysone application

improves antioxidative enzyme system, photosynthesis, and yield in rice under

high-temperature condition, Acta Physiologiae Plantarum, 2016, 38, 1-11.

32. C.J. Zheng, B.K. Huang, Y. Wang, Q. Ye, T. Han, Q.Y. Zhang, H. Zhang, L.P. Qin, Anti-inflammatory diterpenes from the seeds of Vitex negundo, Bioorganic

& Medicinal Chemistry Letters, 2010, 18, 175-181.

33. X.Q. Wang, T. Zhang, B. Zheng, W.D. Xie, T. Shen, Labdane-type diterpenoids

from the fruits of Vitex rotundifolia, Bulletin of the Korean Chemical Society,

2014, 35, 672-674.

34. C. Lee, J.W. Lee, Q. Jin, H.J. Lee, S.J. Lee, D. Lee, M.K. Lee, C.K. Lee, J.T.

Hong, M.K. Lee, B.Y. Hwang, Anti-inflammatory constituents from the fruits

of Vitex rotundifolia, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2013, 23, 6010-6014.

35. M. Ono, Y. Nagasawa, T. Ikeda, R. Tsuchihashi, M. Okawa, J. Kinjo, H.

Yoshimitsu, T. Nohara, Three new diterpenoids from the fruit of Vitex agnus- castus, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2009, 57, 1132-1135.

36. M. Ono, K. Eguchi, M. Konoshita, C. Furusawa, J. Sakamoto, S. Yasuda, T.

Ikeda, M. Okawa, J. Kinjo, H. Yoshimitsu, T. Nohara, A new diterpenoid glucoside and two new diterpenoids from the fruit of Vitex agnus-castus,

Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2011, 59, 392-396.

141

37. M. Ono, M. Yamamoto, T. Yanaka, Y. Ito, T. Nohara, Ten new labdane-type diterpenes from the fruit of Vitex rotundifolia, Chemical and Pharmaceutical

Bulletin, 2001, 49, 82-86.

38. J. Wu, T. Zhou, S.W. Zhang, X.H. Zhang, L.J. Xuan, Cytotoxic terpenoids from

the fruits of Vitex trifolia L, Planta Medica, 2009, 75, 367-370.

39. M. Ono, H. Sawamura, Y. Ito, K. Mizuki, T. Nohara, Diterpenoids from the

fruits of Vitex trifolia, Phytochemistry, 2000, 55, 873-877.

40. S. Aphaijitt, K. Nimgirawath, A. Suksamrarn, U. Tooptakong, Isolation and

crystal structure of limonidilactone-a labdane diterpene from Vitex limonifolia,

Australian Journal of Chemistry, 1995, 48, 133-137.

41. C.J. Zheng, J.Y. Zhu, W. Yu, X.Q. Ma, K. Rahman, L.P. Qin, Labdane-type

diterpenoids from the fruits of Vitex trifolia, Journal of Natural Products, 2013,

76, 287-291.

42. N. Corlay, M. Lecso Bornet, E. Leborgne, F. Blanchard, X. Cachet, J. Bignon,

F. Roussi, M.J. Butel, K. Awang, M. Litaudon, Antibacterial labdane

diterpenoids from Vitex vestita, Journal of Natural Products, 2015, 78, 1348–

1356.

43. M. Pal, S.H. Li, S.K. Tewari, H.D. Sun, Diterpenoid compounds from Vitex

agnus-castus, Chemistry of Natural Compounds, 2013, 49, 635-638.

44. N. Tiwari, J. Thakur, D. Saikia, M.M. Gupta, Antitubercular diterpenoids from

Vitex trifolia, Phytomedicine, 2013, 20, 605-610.

45. C.J. Zheng, X.P. Lan, R.B. Cheng, B.K. Huang, T. Han, Q.Y. Zhang, H. Zhang,

K. Rahman, L.P. Qin, Furanofuran lignans from Vitex negundo seeds,

Phytochemistry Letters, 2011, 4, 298-300.

46. H. Azhar ul, A. Malik, M.T.H. Khan, H. Anwar ul, S.B. Khan, A. Ahmad, M.I.

Choudhary, Tyrosinase inhibitory lignans from the methanol extract of the roots

of Vitex negundo Linn. and their structure-activity relationship, Phytomedicine, 2006, 13, 255-260.

47. T. Yamasaki, T. Kawabata, C. Masuoka, J. Kinjo, T. Ikeda, T. Nohara, M. Ono,

Two new lignan glucosides from the fruit of Vitex cannabifolia, Journal of Natural Medicines, 2008, 62, 47-51.

48. C. Sridhar, K.V. Rao, G.V. Subbaraju, Flavonoids, triterpenoids and a lignan

from Vitex altissima, Phytochemistry, 2005, 66, 1707-1712.

142

49. S.T. Fang, N.N. Kong, B.F. Yan, C.Y. Yang, J.H. Wang, S.J. Liu, H.Z. Jin, C.H. Xia, Chemical constituents and their bioactivities from the fruits of Vitex

negundo var. cannabifolia, Natural Product Research, 2016, 30, 2856-2860.

50. Z.H. Lou, H.M. Li, L.H. Gao, R.T. Li, Antioxidant lignans from the seeds of

Vitex negundo var. cannabifolia, Journal of Asian Natural Products Research,

2014, 16, 963-969.

51. C.J. Zheng, X.W. Zhang, T. Han, Y.P. Jiang, J.Y. Tang, D. Bromme, L.P. Qin,

Anti-inflammatory and anti-osteoporotic lignans from Vitex negundo seeds,

Fitoterapia, 2014, 93, 31-38.

52. H. Kim, J.M. Yi, N.S. Kim, Y.J. Lee, J. Kim, D.S. Oh, S.M. Oh, O.S. Bang, J. Lee, Cytotoxic compounds from the fruit of Vitex rotundifolia against human

cancer cell lines, Journal of the Korean Society for Applied Biological

Chemistry, 2012, 55, 433-437.

53. M. Ono, Y. Nishida, C. Masuoka, J.C. Li, M. Okawa, T. Ikeda, T. Nohara,

Lignan derivatives and a norditerpene from the seeds of Vitex negundo, Journal

of Natural Products, 2004, 67, 2073-2075.

54. K. Kawazoe, A. Yutani, K. Tamemoto, S. Yuasa, H. Shibata, T. Higuti, Y.

Takaishi, Phenylnaphthalene compounds from the subterranean part of Vitex

rotundifolia and their antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Journal of Natural Products, 2001, 64, 588-591.

55. H. Azhar Ul, A. Malik, I. Anis, S.B. Khan, E. Ahmed, Z. Ahmed, S.A. Nawaz,

M.I. Choudhary, Enzymes inhibiting lignans from Vitex negundo, Chemical and

Pharmaceutical Bulletin, 2004, 52, 1269-1272.

56. K. Kawazoe, A. Yutani, Y. Takaishi, Arylnaphthalene norlignans from Vitex

rotundifolia, Phytochemistry, 1999, 52, 1657-1659.

57. N. Nwodo, F. Okoye, D. Lai, A. Debbab, M. Kaiser, R. Brun, P. Proksch,

Evaluation of the in vitro trypanocidal activity of methylated flavonoid constituents of Vitex simplicifolia leaves, BMC Complementary and Alternative Medicine, 2015, 15, 1-10.

58. Y. Deng, Y.W. Chin, H.B. Chai, E. Carcache de Blanco, L.B.S. Kardono, S. Riswan, D.D. Soejarto, N.R. Farnsworth, A.D. Kinghorn, Phytochemical and bioactivity studies on constituents of the leaves of Vitex quinata, Phytochemistry

Letters, 2011, 4, 213-217.

59. Azizuddin, T. Makhmoor, M.I. Choudhary, Radical scavenging potential of compounds isolated from Vitex agnus-castus, Turkish Journal of Chemistry, 2010, 34, 119-126.

143

60. W.X. Li, C.B. Cui, B. Cai, H.Y. Wang, X.S. Yao, Flavonoids from Vitex trifolia L. inhibit cell cycle progression at G2/M phase and induce apoptosis in

mammalian cancer cells, Journal of Asian Natural Products Research, 2005, 7,

615-626.

61. B. Sathiamoorthy, P. Gupta, M. Kumar, A.K. Chaturvedi, P.K. Shukla, R.

Maurya, New antifungal flavonoid glycoside from Vitex negundo, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2007, 17, 239-242.

62. R.L. Sharma, A. Prabhakar, K.L. Dhar, A. Sachar, A new iridoid glycoside from

Vitex negundo Linn (Verbenacea), Natural Product Research, 2009, 23, 1201-

1209.

63. C. Hirobe, Z.S. Qiao, K. Takeya, H. Itokawa, Cytotoxic flavonoids from Vitex

agnus-castus, Phytochemistry, 1997, 46, 521-524.

64. M.B.C. Gallo, P.C. Vieira, J.B. Fernandes, M.F.d.G.F. da Silva, F.R. Salimena

Pires, Compounds from Vitex polygama active against kidney diseases, Journal

of Ethnopharmacology, 2008, 115, 320-322.

65. K.M. Kim, D.R. Heo, J. Lee, J.S. Park, M.G. Baek, J.M. Yi, H. Kim, O.S. Bang,

5,3'-Dihydroxy-6,7,4'-trimethoxyflavanone exerts its anticancer and

antiangiogenesis effects through regulation of the Akt/mTOR signaling pathway

in human lung cancer cells, Chemico-Biological Interactions, 2015, 225, 32-39.

66. S. Awale, T.Z. Linn, F. Li, Y. Tezuka, A. Myint, A. Tomida, T. Yamori, H.

Esumi, S. Kadota, Identification of chrysoplenetin from Vitex negundo as a

potential cytotoxic agent against PANC-1 and a panel of 39 Human Cancer Cell

Lines (JFCR-39), Phytotherapy Research, 2011, 25, 1770-1775.

67. F. Diaz, D. Chavez, D. Lee, Q. Mi, H.B. Chai, G.T. Tan, L.B.S. Kardono, S.

Riswan, C.R. Fairchild, R. Wild, N.R. Farnsworth, G.A. Cordell, J.M. Pezzuto,

A.D. Kinghorn, Cytotoxic flavone analogues of vitexicarpin, a constituent of the

leaves of Vitex negundo, Journal of Natural Products, 2003, 66, 865-867.

68. H. Kirmizibekmez, D. Demir, Iridoid glycosides and phenolic compounds from the flowers of Vitex agnus-castus, Helvetica Chimica Acta, 2016, 99, 518-522.

69. T. Iwagawa, A. Nakahara, M. Nakatani, Iridoids from Vitex cannabifolia,

Phytochemistry, 1993, 32, 453-454.

70. A. Kuruuzum Uz, K. Stroch, L.O. Demirezer, A. Zeeck, Glucosides from Vitex

agnus-castus, Phytochemistry, 2003, 63, 959-964.

71. M. Ono, Y. Ito, S. Kubo, T. Nohara, Two new iridoids from Viticis trifoliae

Fructus (fruit of Vitex rotundifolia L.), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1997, 45, 1094-1096.

144

72. P. Hu, D. Li, K. Wang, H. Wang, Z. Wang, Z. Li, H. Hua, New phenolic compounds from Vitex negundo var. heterophylla and their antioxidant and NO

inhibitory activities, Journal of Functional Foods, 2015, 19, 174-181.

73. B. Ahmad, S. Azam, S. Bashir, A. Adhikari, M.I. Choudhary, Biological

activities of a new compound isolated from the aerial parts of Vitex agnus castus

L, African Journal of Biotechnology, 2010, 9, 9063-9069.

74. T.J. Ling, W.W. Ling, Y.J. Chen, X.C. Wan, T. Xia, X.F. Du, Z.Z. Zhang,

Antiseptic activity and phenolic constituents of the aerial parts of Vitex negundo

var. cannabifolia, Molecules, 2010, 15, 8469-8477.

75. D.D. Singh, G. Chitra, I.P. Singh, K.K. Bhutani, Immunostimulatory compounds from Vitex negundo, Indian journal of chemistry. Section B, Organic

chemistry, including medicinal chemistry, 2005, 44B, 1288-1290.

76. I. Zhelev, T. Batsalova, L. Georgieva, B. Dzhambazov, A. Stoyanova, I.

Dimitrova-Dyulgerova, Chemical composition, cytotoxicity and antioxidant

activity of essential oil from Vitex agnus-castus fruits, growing in Bulgaria,

Oxidation Communications, 2016, 39, 145-156.

77. H.G. Duymus, G.A. Ciftci, S.U. Yildirim, B. Demirci, N. Kirimer, The cytotoxic

activity of Vitex agnus castus L. essential oils and their biochemical

mechanisms, Industrial Crops and Products, 2014, 55, 33-42.

78. W. Wuttke, D. Seidlova-Wuttke, Extracts of Vitex agnus-castus for the

treatment and diagnosis of breast cancer. 2019, Bionorica SE, Germany . p.

17pp.; Chemical Indexing Equivalent to 171:90036 (EP).

79. M.A. Mohamed, A.M. Abdou, M.M. Hamed, A.M. Saad, Characterization of

bioactive phytochemical from the leaves of Vitex trifolia, International Journal

of Pharmaceutical Applications, 2012, 3, 419-428.

80. W.G. Ko, T.H. Kang, S.J. Lee, Y.C. Kim, B.H. Lee, Rotundifuran, a labdane

type diterpene from Vitex rotundifolia, induces apoptosis in human myeloid leukaemia cells, Phytotherapy Research, 2001, 15, 535-537.

81. S. Arokiyaraj, K. Perinbam, P. Vivek, P.N.K. Udaya, Free radical scavenging

and in vitro cytotoxicity activity of agnuside from Vitex agnus castus (Verbenacae), Journal of Pharmaceutical Research, 2012, 5, 2548-2552.

82. H. Xin, Y. Kong, Y. Wang, Y. Zhou, Y. Zhu, D. Li, W. Tan, Lignans extracted

from Vitex negundo possess cytotoxic activity by G2/M phase cell cycle arrest

and apoptosis induction, Phytomedicine, 2013, 20, 640-647.

83. L. Qu, F.X. Liu, X.C. Cao, Q. Xiao, X. Yang, K.Q. Ren, Activation of the apoptosis signal-regulating kinase 1/c-Jun N-terminal kinase pathway is

145

involved in the casticin-induced apoptosis of colon cancer cells, Experimental and Therapeutic Medicine, 2014, 8, 1494-1500.

84. J. Kobayakawa, F. Sato Nishimori, M. Moriyasu, Y. Matsukawa, G2-M arrest

and antimitotic activity mediated by casticin, a flavonoid isolated from Viticis

Fructus (Vitex rotundifolia Linne fil.), Cancer Letters, 2004, 208, 59-64.

85. W.G. Ko, T.H. Kang, S.J. Lee, Y.C. Kim, B.H. Lee, Effects of luteolin on the inhibition of proliferation and induction of apoptosis in human myeloid

leukaemia cells, Phytotherapy Research, 2002, 16, 295-298.

86. P.S. Mishra, S. Vyas, R.P. Agrawal, P. Phadnis, A. Tiwari, Analgesic and anti-

inflammatory activities of Vitex negundo (Leaves) extract, International Journal of Pharmacognosy, 2014, 1, 301-306.

87. C.J. Zheng, X.X. Zhao, H.W. Ai, B. Lin, T. Han, Y.P. Jiang, X. Xing, L.P. Qin,

Therapeutic effects of standardized Vitex negundo seeds extract on complete

Freund's adjuvant induced arthritis in rats, Phytomedicine, 2014, 21, 838-846.

88. A. Khan, S. Naz, U. Farooq, M. Shahid, I. Ullah, I. Ali, A. Rauf, Y.N. Mabkhot,

Bioactive chromone constituents from Vitex negundo alleviate pain and

inflammation, Journal of Pain Research, 2018, 11, 95-102.

89. L.A. Kulkarni, Anti-inflammatory activity of Vitex trifolia Linn. (Verbaneaceae)

leaves extracts, International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 2011, 2, 2037-2040.

90. A. Suksamrarn, S. Kumpun, K. Kirtikara, B. Yingyongnarongkul, S.

Suksamrarn, Iridoids with anti-inflammatory activity from Vitex peduncularis,

Planta Medica, 2002, 68, 72-73.

91. O. Bello, A. Ogbesejana, M. Osibemhe, Iridoid glucosides from Vitex

grandifolia displayed anti-inflammatory and antileishmania effects and

structure activity relationship, Journal of Applied Sciences and Environmental

Management, 2018, 22, 373-378.

92. K.M. You, K.H. Son, H.W. Chang, S.S. Kang, H.P. Kim, Vitexicarpin, a flavonoid from the fruits of Vitex rotundifolia, inhibits mouse lymphocyte

proliferation and growth of cell lines in vitro, Planta Medica, 1998, 64, 546- 550.

93. M. Kannan, P. Rajendran, V. Vedha, G. Ashok, S. Anushka, P. Chandran, R.

Nair, HIV-1 reverse transcriptase inhibition by Vitex negundo L. leaf extract

and quantification of flavonoids in relation to anti-HIV activity, Journal of Cell and Molecular Biology, 2012, 10, 53-59.

146

94. H.F. Hasan, Z.M.F. Qaragholi, O.K. Luaibi, N.A. Abdull Wahed, Effect of alcoholic extract of Vitex agnus seeds on some function of female reproductive

system, International Journal of Science and Nature, 2014, 5, 254-257.

95. I.O. Ishola, C.O. Ochieng, S.O. Olayemi, M.O. Jimoh, S.M. Lawal, Potential of

novel phytoecdysteroids isolated from Vitex doniana in the treatment

Involvement of monoaminergic systems, Pharmacology

depression: Biochemistry and Behavior, 2014, 127, 90-100.

96. J. Stella, P. Krishnamoorthy, A.J. Mohamed, Hypoglycemic effect Of Vitex

agnus castus in streptozotocin induced diabetic rats, Asian Journal of

Biochemical and Pharmaceutical Research, 2011, 1, 206-212.

97. K. Pavan Kumar, G. Vidyasagar, D. Ramakrishna, I. Madhusudhana Reddy,

V.S.S.S. Gupta Atyam, Antiepileptic activity for methanolic extract of Vitex

negundo leaf against different animal models, Journal of Chemical and

Pharmaceutical Research, 2011, 3, 159-165.

98. A. Suksamrarn, S. Aphaijitt, J.J. Brophy, The volatile leaf oil of Vitex

limonifolia Wall, Flavour and Fragrance Journal, 1990, 5, 53-55.

99. Q. Gu, X.M. Zhang, J. Zhou, S.X. Qiu, J.J. Chen, One new dihydrobenzofuran

lignan from Vitex trifolia, Journal of Asian Natural Products Research, 2008,

10, 499-502.

100. P. Ramesh, A.G.R. Nair, S.S. Subramanian, Flavone glycosides of Vitex trifolia,

Fitoterapia, 1986, 57, 282-283.

101. L. Kulkarni, Vitex trifolia Linn. (Verbaneaceae): a review on pharmacological

and biological effects, isolated and known potential phytoconstituents of

therapeutic importance, International Journal of Research in Pharmaceutical

Sciences, 2012, 3, 441-445.

102. Từ điển Bách khoa Dược học, NXB Từ điển bách khoa, 2007, Hà Nội.

103. H.H. Kiệm, Vật lý trị liệu và phục hồi chức năng, Nhà xuất bản quân đội nhân

dân, 2014.

104. J.N. Sharma, A. Al-Omran, S.S. Parvathy, Role of nitric oxide in inflammatory

diseases, Inflammopharmacology, 2007, 15, 252-259.

105. Đ.V. Phan, Các thuốc giảm đau, kháng viêm, Bộ môn Dược lý, NXB Đại học

Y Hà Nội, 2004.

106. N. Schellack, G. Schellack, J. Fourie, A review of non-steroidal anti- inflammatory drugs, South African pharmaceutical journal, 2015, 82, 8-18.

147

107. K. Peterson, M. McDonagh, S. Thakurta, Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs), Oregon Health & Science University,

2010.

108. S. Moghadam-Kia, V.P. Werth, Prevention and treatment of systemic

glucocorticoid side effects, International Journal of Dermatology, 2010, 49,

239–248.

109. M.W. Whitehouse, Anti-inflammatory glucocorticoid drugs: reflections after 60

years, Inflammopharmacology, 2011, 19, 1-19.

110. M. Ghasemian, S. Owlia, M.B. Owlia, Review of anti-inflammatory herbal

medicines, Advances in Pharmacological Sciences, 2016, 2016, 9130979.

111. V.N.Drozdov, V.A. Kim, E.V.Tkachenko, G.G. Varvanina, Influence of a

specific ginger combination on gastropathy conditions in patients with

osteoarthritis of the knee or hip, The Journal of Alternative and Complementary

Medicine, 2012, 18, 583-588.

112. S. Baron., Medical Microbiology, 4th edition, 1996.

113. E.D. Clercq, G. Li, Approved Antiviral Drugs over the Past 50 Years, Clinical

Microbiology Review, 2016, 29, 695-747.

114. M. Akram, I.M. Tahir, S.M.A. Shah, Z. Mahmood, A. Altaf, K. Ahmad, N.

Munir, M. Daniyal, S. Nasir, H. Mehboob, Antiviral potential of medicinal plants against HIV, HSV, influenza, hepatitis, and coxsackievirus: A systematic

review, Phytotherapy Research, 2018, 32, 1-12811-12822.

115. P. Rajendra, N. Sainath, M. Estari, HIV‐1 reverse transcriptase inhibitory

activity of Aerva lanata plant extracts, BMC Infectious Disease, 2014, 14, 12-

16.

116. S. Tewtrakul, S. Subhadhirasakul, S. Kummee, Anti‐HIV‐1 integrase activity of

medicinal plants used as self medication by AIDS patients, Journal of Science

and Technology, 2006, 28, 785-790.

117. R. Xiong, Y. Shen, L. Lu, The inhibitory effect of Rheum palmatum against coxsackievirus B3 in vitro and in vivo, The American Journal of Chinese

Medicine, 2012, 40, 801–812.

118. N. Cho, E.H. Moon, H.W. Kim, J. Hong, J.A. Beutler, S.H. Sung, Inhibition of nitric oxide production in BV2 microglial cells by triterpenes from Tetrapanax

papyriferus, Molecules, 2016, 21, 459, 451-459.

148

119. H.J. Choi, H.H. Song, J.S. Lee, H.J. Ko, J.H. Song, Inhibitory effects of norwogonin, oroxylin A, and mosloflavone on enterovirus 71, Biomolecules &

Therapeutics, 2016, 24, 552–558.

120. S.J. Lin, J.P.N. Rosazza, Microbial transformations of isocupressic acid,

Journal of Natural Products, 1998, 61, 922–926.

121. F. Faini, C. Labbé, R. Torres, G.D. Monache, F.D. Monache, Labdane diterpenes from Haplopappus Illinitus, Natural Product Letters, 2002, 16, 223–

228.

122. N. Tanaka, Y. Yano, Y. Tatano, Y. Kashiwada, Hypatulins A and B,

meroterpenes from Hypericum patulum, Organic Letters, 2016, 18, 5360–5363.

123. H. Dong, Y.L. Gou, S.G. Cao, S.X. Chen, K.Y. Sim, S.H. Goh, R.M. Kini,

Eicosenones and methylated flavonols from Amomum koenigii, Phytochemistry,

1999, 50, 899–902.

124. A. Ahond, J. Guilhem, J. Hamon, J. Hurtado, C. Poupat, J. Pusset, M. Pusset,

T. Sévenet, P. Potier, Bubbialine et bubbialidine, alcaloïdes nouveaux extraits

de Zygogynum pauciflorum, Journal of Natural Products, 1990, 53, 875-881.

125. M. Hattori, S. Hada, Y. Kawata, Y. Tezuka, T. Kikuchi, T. Namba, New 2,5-

bis-aryl-3,4-dimethyltetrahydrofuran lignans from the aril of Myristica

fragrans, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1987, 35, 3315-3322.

126. J.J. Cheng, L.J. Zhang, H.L. Cheng, C.T. Chiou, I.J. Lee, Y.H. Kuo, Cytotoxic

hexacyclic triterpene acids from Euscaphis japonica, Journal of Natural

Products, 2010, 73, 1655–1658.

127. Hisashi Kojima, H. Ogura, Triterpenenoids from Prunella vulgaris,

Phytochemistry, 1986, 25, 729-733

128. H. Ping, K. Gloria, W. Shanxin, W. Peter, Triterpene acids from Toddalia

asiatica, Natural Product Research and Development, 2005, 17, 404–408.

129. S. Taniguchi, Y. Imayoshi, E. Kobayashi, Y. Takamatsu, H. Ito, T. Hatano, H. Sakagami, H. Tokuda, H. Nishino, D. Sugita, S. Shimura, T. Yoshida, japonica calli, Production of bioactive triterpenes by Eriobotrya

Phytochemistry, 2002, 59, 315–323.

130. Y. Shikishima, Y. Takaishi, G. Honda, M. Ito, Y. Takeda, O.K. Kodzhimatov,

O. Ashurmetov, Terpenoids and -pyrone derivatives from Prangos

tschimgania, Phytochemistry, 2011, 57, 135-141.

131. K. Arpha, C. Phosri, N. Suwannasai, W. Mongkolthanaruk, S. Sodngam,

Astraodoric Acids A–D: New lanostane triterpenes from edible mushroom

149

Astraeus odoratus and their anti-Mycobacterium tuberculosis H37Ra and cytotoxic activity, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60, 9834-

9841.

132. C. Li, Y. Li, H.H. Sun, New ganoderic acids, bioactive triterpenoid metabolites

from the mushroom Ganoderma lucidum, Natural Product Research, 2006, 20,

985-991.

133. F.Y. Meng, J.X. Sun, X. Li, H.F. Pi, P. Zhang, H.L. Ruan, Triterpenoids from

the stems of Schisandra glaucescens, Helvetica Chimica Acta, 2011, 94, 1778-

1785.

134. X.T. Liu, Z.X. Wang, Y. Yang, L. Wang, R.F. Sun, Y.M. Zhao, N.J. Yu, Active components with inhibitory activities on IFN-γ/STAT1 and IL-6/STAT3

signaling pathways from Caulis trachelospermi, Molecules, 2014, 19, 11560.

135. P.G. Roussel, V. Sik, N.J. Turner, L.N. Dinan, Synthesis and biological activity

of side-chain analogues of ecdysone and 20-hydroxyecdysone, Journal of the

Chemical Society, Perkin Transactions 1, 1997, 1999, 2237-2246.

136. J. Pis, M. Budksinsky, K. Vokac, V. Laudova, J. Harmatha, Ecdysteroids from

the roots of Leuzea carthamoides, Phytochemistry, 1994, 37, 707-711.

137. K. Vokac, M. Budesinsky, J. Hamatha, J. Kohoutova, Ecdysteroid constituents

of the mushroom Tapinella Panuoides, Phytochemistry, 1998, 49, 2109-2114.

138. N. Nishimoto, Y. Shiobara, M. Fujino, S.S. Inoue, T. Takemoto, F.D. Olweira,

G. Akisue, M.K. Akisue, G. Hashimoto, O. Tanaka, R. Kasai, H. Matsuura, Ecdysteroids from Pfaffia iresinoides and reassignment of some 13C NMR chemical shifts, Phytochemistry, 1987, 26, 2505-2507.

139. C.Y. Tana, J.H. Wang, X. Li, Phytoecdysteroid constituents from Cyanotis

arachnoidea, Journal of Asian Natural Products Research, 2003, 5, 237-240.

140. G. Flamini, E. Antognoli, I. Morelli, Two flavonoids and other compounds from

the aerial parts of Centaurea bracteata from Italy, Phytochemistry, 2001, 57, 559-564.

141. U.J. Youn, Y.S. Lee, H. Jeong, J.W. Nam, Y.J. Lee, Y.M. Son, E.S. Hwang,

E.K. Seo, Minor phenolic constituents of the Anemarrhenae rhizoma, Natural Product Sciences, 2009, 15, 203-207.

142. J.H. Kim, B.C. Lee, J.H. Kim, G.S. Sim, D.H. Lee, K.E. Lee, Y.P. Jun, H.B.

Pyo, The isolation and antioxidative effects of vitexin from Acer Palmatum, Archives of Pharmacal Research, 2005, 28, 195-202.

150 143. D.C. Burns, D.A. Ellis, R.E. March, A predictive tool for assessing 13C-NMR chemical shifts of flavonoids, Magnetic Resonance in Chemistry, 2007, 45, 835-

845.

144. O. Bjoroy, S. Rayyan, T. Fossen, K. Kalberg, O.M. Andersen, C-

glycosylanthocyanidins synthesized from C-glycosylflavones, Phytochemistry,

2009, 70, 278–287.

145. J.L. Jin, Y.Y. Lee, J.E. Heo, S. Lee, J.M. Kim, H.S.Y. Choi, Anti-platelet

pentacyclic triterpenoids from leaves of Campsis grandiflora, Archives of

Pharmacal Research, 2004, 27, 376-380.

146. H.P. Kim, K.H. Son, H.W. Chang, S.S. Kang, Anti-inflammatory plant flavonoids and cellular action mechanisms, Journal of Pharmacological

Sciences, 2004, 96, 229-245.

147. J.R. Stalkup, S. Chilukuri, Enterovirus infections: a review of clinical

presentation, diagnosis, and treatment, Dermatologic Clinics, 2002, 20, 217-

223.

148. M.S. Oberste, K. Maher, D.R. Kilpatrick, M.A. Pallansch, Molecular Evolution

of the Human Enteroviruses: Correlation of Serotype with VP1 Sequence and

Application to Picornavirus Classification, Journal of Virology, 1999, 73,

1941-1948.

149. T.C. Chen, K.F. Weng, S.C. Chang, J.Y. Lin, P.N. Huang, S.R. Shih,

Development of antiviral agents for enteroviruses, Journal of Antimicrobial

Chemotherapy, 2008, 62, 1169–1173.

150. N. Min, P.T. Leong, R.C.H. Lee, J.S.E. Khuan, J.J.H. Chu, A flavonoid

compound library screen revealed potent antiviral activity of plant-derived

flavonoids on human enterovirus A71 replication, Antiviral Research, 2018,

150, 62-68.

151. A.V. Galochkina, V.B. Anikin, V.A. Babkin, L.A. Ostrouhova, V.V. Zarubaev, Virus-inhibiting activity of dihydroquercetin, a flavonoid from Larix sibirica, against coxsackievirus B4 in a model of viral pancreatitis, Archives of Virology, 2016, 161, 929–938.