Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

LÊ VĂN NHÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN, CYTOKININ) TRONG RAU XANH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội, 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

LÊ VĂN NHÂN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN, CYTOKININ) TRONG RAU XANH

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 9.44.01.18

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

1. PGS. TS. Nguyễn Quang Trung

2. TS. Vũ Đức Nam

Hà Nội, 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài Luận án “Nghiên cứu xây dựng và phát triển

phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin,

cytokinin) trong rau xanh” là do tôi thực hiện với sự hƣớng dẫn của PGS. TS

Nguyễn Quang Trung và TS. Vũ Đức Nam. Các kết quả nghiên cứu trong luận án là

trung thực, không trùng lặp và sao chép với bất kỳ công trình khoa học nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Nghiên cứu sinh

Lê Văn Nhân

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án, nghiên cứu

sinh đã nhận đƣợc sự hỗ trợ và giúp đỡ từ nhiều cá nhân và tập thể; nghiên cứu sinh

rất trân trọng và biết ơn sự hỗ trợ và giúp đỡ này.

Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến thầy giáo

PGS. TS. Nguyễn Quang Trung, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ,

dành nhiều thời gian trao đổi và định hƣớng cho tôi trong quá trình nghiên cứu và

thực hiện luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Vũ Đức Nam, ngƣời luôn quan tâm,

nhắc nhở, hƣớng dẫn và động viên tôi sớm hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công

nghệ đã tạo điều kiện về mặt thời gian, cơ sở vật chất, trang thiết bị phục vụ cho

việc nghiên cứu và thực hiện luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ đã mời các

giảng viên có nhiều kinh nghiệm và kiến thức chuyên sâu giảng dạy cho các nghiên

cứu sinh cũng nhƣ bố trí thời gian học tập linh hoạt và phổ biến các thông tin kịp

thời tới nghiên cứu sinh.

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em bạn bè, đồng nghiệp đã động viên,

khích lệ, cổ vũ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án.

Con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới cha mẹ, vợ, con, các anh chị em

và ngƣời thân đã luôn động viên, khích lệ và cổ vũ con hoàn thành chƣơng trình đào

tạo nghiên cứu sinh.

Xin chân thành cảm ơn!

Nghiên cứu sinh

Lê Văn Nhân

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN.............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii

MỤC LỤC ...................................................................................................... iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT....................................... vii

DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... ix

DANH MỤC HÌNH.......................................................................................... x

MỞ ĐẦU......................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.............................................................................. 3

1.1. Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng thực vật.......................................... 3

1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật ....... 3

1.2.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin................... 3

1.2.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin ........... 6

1.2.3. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin ............. 7

1.3. Vai trò chức năng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật ................... 9 1.3.1. Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm auxin ............................... 9

1.3.2. Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm gibberellin ..................... 10

1.3.3. Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm cytokinin ....................... 11

1.4. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật ... 11

1.4.1. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm auxin............... 11

1.4.2. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm gibberellin ....... 14

1.4.3. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm cytokinin ......... 15 1.5. Các nghiên cứu về dƣ lƣợng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật .. 17

1.6. Các phƣơng pháp phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật ......... 18

1.6.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu ............................................................. 18

1.6.1.1. Thu thập mẫu.......................................................................... 19

1.6.1.2. Chiết tách ............................................................................... 19

1.6.1.3. Làm sạch và tinh chế mẫu ........................................................ 19

1.6.2. Phƣơng pháp phân tích ................................................................... 20 1.6.2.1. Phương pháp phân tích các hợp chất auxin ............................... 21

1.6.2.2. Phương pháp phân tích các hợp chất gibberellin ....................... 22

1.6.2.3. Phương pháp phân tích các hợp chất cytokinin .......................... 23

CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 25

2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ................................................ 25

2.1.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................ 25

2.1.2. Hóa chất thí nghiệm ....................................................................... 25

2.1.2.1. Hóa chất ................................................................................ 25

2.1.2.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ....................................................... 26

2.2. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................... 26 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................... 26

2.2.2. Đối tƣợng phân tích ....................................................................... 27

2.2.3. Thu thập mẫu ................................................................................ 27

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 28 2.3.1. Phƣơng pháp khảo sát các điều kiện tối ƣu của quy trình phân tích ..... 28

2.3.1.1. Phương pháp khảo sát điều kiện khối phổ.................................. 28

2.3.1.2. Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký lỏng .............................. 28

2.3.2. Phƣơng pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu ...................................... 30 2.3.3. Phƣơng pháp xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích ........................................................................................................ 32

2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau thu thập tại Hà Nội ....................................................... 35

2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến sự phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng ........ 36

2.3.5.1. Bố trí thí nghiệm ..................................................................... 36

2.3.5.2. Phương pháp đánh giá sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh

trưởng thực vật đến sự phát triển của các loại rau ................................. 38

2.3.5.3. Phương pháp đánh giá sự tích lũy của chất kích thích sinh trưởng

thực vật trong các loại rau................................................................... 38

2.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................. 39

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 40

3.1. Khảo sát các điều kiện tối ƣu của quy trình phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong rau ............................................................................. 40

3.1.1. Khảo sát điều kiện phân tích khối phổ ............................................. 40

3.1.1.1. Khảo sát mức năng lượng phân mảnh của các ion...................... 40

3.1.1.2. Khảo sát các hướng phân mảnh của các chất KTST ................... 45

3.1.1.3. Khảo sát các thông số của nguồn ion hóa .................................. 56

3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng ........................................................ 57 3.1.2.1.Khảo sát cột phân tích và dung môi pha động ............................. 57

3.1.2.2. Khảo sát chế độ gradient của pha động..................................... 66

3.2. Tối ƣu hóa điều kiện xử lý mẫu ............................................................. 69

3.3. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích................... 74 3.3.1. Xây dựng quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau ....................................................................... 74

3.3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích............................... 77

3.3.2.1. Đánh giá độ ổn định của chu kỳ đông/rã đông mẫu .................... 77

3.3.2.2. Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng............ 79

3.3.2.3. Ảnh hưởng của nền mẫu .......................................................... 81

3.3.2.4. Hiệu suất thu hồi và độ chính xác của phương pháp phân tích .... 83

3.3.2.5. So sánh với một số phòng thí nghiệm ........................................ 86

3.4. Kết quả đánh giá hiện trạng dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau thu thập tại Hà Nội ..................................................... 89

3.4.1. Số lƣợng mẫu rau phát hiện chứa các chất kích thích sinh trƣởng thực vật ......................................................................................................... 89 3.4.2. Số lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh .................................................................................... 90 3.4.3. Hàm lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh ...................................................................... 91 3.4.4. Sự tồn dƣ nhiều hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong mẫu rau cải xanh ở các khu vực nghiên cứu ........................................................... 93

3.5. Đánh giá ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến sự phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng ................................... 97 3.5.1. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của một số loại rau xanh ......... 97 3.5.1.1. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau cải xanh .............. 97

3.5.1.2. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau mồng tơi ............100

3.5.1.3. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau xà lách ...............102

3.5.2. Sự tích lũy của GA3 trong một số loại rau .......................................105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................................110

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN .........................................................................111

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ..................................................112

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................114

PHỤ LỤC .....................................................................................................128

PHỤ LỤC 1. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CÁC CHẤT KÍCH

THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT TRONG RAU ......................................128

PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHẾ ĐỘ GRADIENT ............................133

PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỐI CHỨNG Ở CÁC PTN....................139

PHỤ LỤC 4. ĐƢỜNG CHUẨN CỦA GA3 TRÊN CÁC NỀN MẪU RAU THÍ

NGHIỆM......................................................................................................144

PHỤ LỤC 5. MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG NGHIÊN CỨU ...........................145

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Axít 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic

2,4,5-T

2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid

2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

Axít 2,4-dichlorophenoxyacetic

4-CI-IAA

4-Chloroindole-3-acetic acid

Axít 4-chloroindole-3-acetic

β-Indolyaxetic acid

Axít β-Indolyaxetic

AIA

Atmospheric Pressure Chemical Ionization

Ion hóa hóa học áp suất khí quyển

APCI

N6-Benzyladenine

Et al.

Cộng tác viên

Ctv

DHZR

Dihydrozeatin Riboside

Electron Ionization

Ion hóa điện tử

ELISA

Enzym Link Immunosorbent Assay

Thử nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với enzyme Ion hóa tia điện

Electrospray Ionization

ESI

Đầu dò huỳnh quang

Flourescence Detector

FLD

Gibberellin A1

GA1

Gibberellin A3

GA3

Gibberellin A4

GA4

Gibberellin A7

GA7

Gibberellin

GAs

Gas Chromatography

Sắc ký khí

HPLC

High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Indole-3-acetic acid

Axít Indole-3-acetic

IAA

Indole-3-butyric acid

Axít Indole-3-butyric

IBA

Indole-3-carboxylic acid

Axít Indole-3-carboxylic

ICA

N6-Isopentenyladenine

6-Isopentenyladenine

Indole-3-propionic acid

Axít Indole-3-propionic

IPA

Isopentenyladenosine

iPR

IT MS

Ion Trap Mass Spectrometry

Khối phổ bẫy ion

Kinetin

KTST

Plant growth substances

Chất kích thích sinh trƣởng thực vật

LFMCE

MRM

Leaf-Ferrocene Modified Carbon Paste Electrode Multiple Reaction Monitoring

Điện cực dán cacbon biến tính lá Ferrocene Giám sát đa phản ứng

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

viii

Mass Spectrometry

Khối phổ

NanoESI Nano-Electrospray Ionization

Ion hóa tia điện nano

PAA

Phenylacetic acid

Axít Phenylacetic

PGR

Plant Growth Regulator

Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật

QQQ MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry

Khối phổ ba tứ cực

RIA

Radioimmunoassay

Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

SIM

Selected Ion Monitoring

Giám sát ion chọn lọc

SRM

Selected Reaction Monitoring

Giám sát phản ứng chọn lọc

TDZ

Diphenylurea, thidiazuron

TOF-MS

Time-of-Flight Mass Spectrometry

Khối phổ thời gian bay

Trans-zeatin

tZR

Trans-zeatin Riboside

UPLC

Ultra Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng siêu cao áp

Zeatin

α-NAA

α-naphthaleneacetic acid

Axít α-naphthaleneacetic

(Chú thích: Tên hóa chất trong luận án đƣợc viết theo tên tiếng Anh)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin..................... 5

Bảng 1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin ............. 7

Bảng 1.3. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin ............... 9

Bảng 1.4. Một số nghiên cứu về tác dụng của auxin đối với các loại cây trồng ..... 13

Bảng 1.5. Một số nghiên cứu về tác dụng của gibberellin đối với các loại cây trồng

..................................................................................................................... 14

Bảng 1.6. Một số nghiên cứu về tác dụng của cytokinin đối với các loại cây trồng 16

Bảng 3.1. Các điều kiện tối ƣu hóa của khối phổ trong phân tích các chất KTST .. 42

Bảng 3.2. Các thông số của nguồn ion đƣợc tối ƣu hóa ...................................... 56

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát gradient của pha động ............................................. 67

Bảng 3.4. Điều kiện gradient tối ƣu sử dụng phân tích các chất KTST trong rau

xanh .............................................................................................................. 68

Bảng 3.5. Diện tích píc của các chất KTST và độ ổn định của chu kỳ đông/ rã đông

..................................................................................................................... 78

Bảng 3.6. Đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp

phân tích ........................................................................................................ 81

Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật .... 84 Bảng 3.8. Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 10 ng.mL-1.. 86 Bảng 3.9. Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 100 ng.mL-1 87 Bảng 3.10. Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 1000 ng.mL-1

..................................................................................................................... 88

Bảng 3.11. Số lƣợng các chất KTST phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh .. 90

Bảng 3.12. Hàm lƣợng của các KTST phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh 92

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm auxin................................... 3

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm gibberellin ........................... 6

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm cytokinin ............................. 8

Hình 2.1. Quy trình tách chiết và phân tích các hoocmon thực vật trong mẫu cây

thuộc Họ Cải theo nghiên cứu của Xiangqing và cộng sự ................................... 30

Hình 2.2. Các khu vực nghiên cứu và thu thập mẫu rau ...................................... 35

Hình 2.3. Thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật Gibber4TB ............................... 37

Hình 2.4. Mô hình thí nghiệm đánh giá sự tích lũy của chất kích thích sinh trƣởng

thực vật trong một số loại rau xanh................................................................... 37

Hình 3.1. Kết quả khảo sát năng lƣợng phân mảnh ion của các chất KTST .......... 41

Hình 3.2. Phân mảnh ion đặc trƣng của các chất KTST ở điều kiện tối ƣu hóa ..... 44

Hình 3.3. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IAA ................... 46

Hình 3.4. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IBA ................... 47

Hình 3.5. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất ICA ................... 47

Hình 3.6. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IPA.................... 48

Hình 3.7. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA3 ................... 49

Hình 3.8. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA4 ................... 49

Hình 3.9. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA7 ................... 50

Hình 3.10. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất BA................... 51

Hình 3.11. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất DHZR .............. 52

Hình 3.12. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất iP..................... 52

Hình 3.13. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất iPR .................. 53

Hình 3.14. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất K ..................... 54

Hình 3.15. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZ .................... 54

Hình 3.16. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZR .................. 55

Hình 3.17. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Hypersil sử dụng

pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 ....................................................................................................... 58

Hình 3.18. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Hypersil sử dụng

pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 ....................................................................................................... 59

Hình 3.19. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

Hình 3.20. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,3 mL.phút-1 ....................................................................................................... 61

Hình 3.21. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

Hình 3.22. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,3 mL.phút-1 ....................................................................................................... 63

Hình 3.23. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,5 mL.phút-1 ....................................................................................................... 64

Hình 3.24. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 1 mL.phút-1 ....................................................................................................... 65

Hình 3.25. Quy trình tách chiết và phân tích các KTST trong các mẫu rau xanh

đƣợc phát triển và tối ƣu hóa ........................................................................... 70

Hình 3.26. Hiệu suất của quá trình chiết mẫu theo quy trình Xiangqing và cộng sự

sử dụng các dung môi 1-propanol và 2-propanol ............................................... 72

Hình 3.27. Hiệu suất của quá trình chiết mẫu theo quy trình mới xây dựng và phát

triển sử dụng các dung môi 1-propanol và 2-propanol ........................................ 73

Hình 3.28. Sơ đồ quy trình chiết và phân tích các chất KTST trong các mẫu rau... 74

Hình 3.29. Sắc ký đồ của các chất KTST ở điều kiện gradient tối ƣu ................... 76

Hình 3.30. Đƣờng chuẩn của các chất KTST trên nền mẫu rau cải xanh .............. 79

Hình 3.31. Ảnh hƣởng của nền mẫu đến tín hiệu của các chất KTST ................... 82

Hình 3.32. Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh ............................. 90

xii

Hình 3.33. Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh ở các huyện nghiên

cứu ................................................................................................................ 90

Hình 3.34. Sự phân bố hàm lƣợng của các chất KTST trong các mẫu rau cải xanh ở

các khu vực nghiên cứu ................................................................................... 94

Hình 3.35. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau cải xanh ...................... 98

Hình 3.36. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau mồng tơi ...................101

Hình 3.37. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau xà lách.......................104

Hình 3.38. Sự tích lũy của GA3 trong các loại rau .............................................108

MỞ ĐẦU

Nhu cầu sử dụng lƣơng thực, thực phẩm và rau xanh ở Việt Nam ngày càng

gia tăng. Do đó, trong sản xuất nông nghiệp, ngƣời ta luôn tìm kiếm, nghiên cứu các

giải pháp để nâng cao hiệu quả sản xuất cây trồng. Sử dụng chất điều hòa sinh

trƣởng thực vật đƣợc xem là một trong những giải pháp tốt trong nông nghiệp để

thúc đẩy nhanh quá trình tăng trƣởng của cây.

Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là những chất có khả năng điều tiết sự

sinh trƣởng và phát triển của thực vật từ khi nảy mầm đến khi lão hóa và chết.

Trong tự nhiên, các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật còn đƣợc gọi là các hoocmon

sinh trƣởng thực vật, là những chất đƣợc sinh ra trong cây. Bằng con đƣờng hóa học

nhân tạo, nhiều hợp chất khác nhau, có hoạt tính tƣơng tự với các chất điều hòa sinh

trƣởng thực vật tự nhiên đƣợc tổng hợp nhân tạo và dùng để điều chỉnh quá trình

sinh trƣởng, phát triển của cây nhằm tăng năng suất và phẩm chất của cây trồng. Có

hai nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thực vật gồm: nhóm chất kích thích sinh trƣởng

thực vật (auxin, gibberellin và cytokinin...), có vai trò thúc đẩy sự sinh trƣởng và

phát triển của thực vật và nhóm chất ức chế sinh trƣởng thực vật (absicic, ethylen và

các hợp chất phenol...), có chức năng kìm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của thực

vật để chuyển sang thời kỳ ra hoa, kết quả, hoặc chín.

Trên thị trƣờng, nhiều loại hóa chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc buôn

bán và sử dụng ở các dạng khác nhau nhƣ: dạng bột, dạng lỏng hoặc dạng phối trộn

cùng với các loại phân bón khác... Trong đó, nhiều hóa chất đƣợc sản xuất ở Việt

Nam, một số loại khác đƣợc nhập khẩu từ các nƣớc trên thế giới và có cả những loại

không nhãn mác, không có nguồn gốc xuất xứ. Nếu không đƣợc quản lý chặt chẽ và

sử dụng đúng cách thì những chất này có thể tiềm ẩn những nguy cơ dẫn tới ô

nhiễm môi trƣờng, ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời sản xuất và tiêu dùng.

Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đã đƣợc các nhà khoa học trên thế

giới quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng từ nhiều năm nay. Việc sử dụng các chất

điều hòa sinh trƣởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp cũng diễn ra khá phổ biến

ở Việt Nam, tuy nhiên, rất ít công trình công bố nghiên cứu về phƣơng pháp phân

tích và đánh giá dƣ lƣợng của các chất này trong các sản phẩm nông nghiệp, đặc

biệt là rau xanh. Mặt khác, có nhiều loại thuốc điều hòa sinh trƣởng thực vật không

có nhãn mác và nguồn gốc xuất xứ vẫn đƣợc nông dân truyền tai nhau sử dụng do

hiệu quả nhanh chóng và vƣợt trội của chúng mang lại cho cây trồng. Đây là một

trong những nguyên nhân tiềm ẩn có thể gây nên tình trạng ngộ độc thực phẩm và ô

nhiễm môi trƣờng liên quan đến dƣ lƣợng của các hóa chất sử dụng trong sản xuất

nông nghiệp.

Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu sinh đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên

cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng

trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh”. Nghiên cứu này thành

công sẽ là tiền đề cho việc phát triển và ứng dụng phƣơng pháp phân tích đánh giá

dƣ lƣợng và thực trạng sử dụng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các

loại rau xanh, các sản phẩm nông nghiệp và trái cây.... sản xuất ở nƣớc ta cũng nhƣ

nhập khẩu từ các nƣớc trên thế giới. Đây cũng chính là cơ sở giúp các cơ quan chức

năng, các nhà quản lý ban hành các chế tài và có phƣơng thức giám sát việc sử dụng

các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong sản xuất nông nghiệp một cách hiệu

quả, đảm bảo sự phát triển sản xuất, an toàn cho ngƣời tiêu dùng và môi trƣờng sinh

thái.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

 Nghiên cứu xây dựng và phát triển phƣơng pháp phân tích đồng thời các hợp

chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong rau xanh bằng phƣơng pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ bẫy ion.

 Áp dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc để phân tích, đánh giá hiện trạng sử

dụng, mức độ tồn dƣ và khả năng tích lũy của một số chất kích thích sinh

trƣởng thực vật sử dụng trong rau tại một số quận/ huyện của Hà Nội.

Nội dung nghiên cứu của luận án:

1) Khảo sát các điều kiện tối ƣu của phƣơng pháp phân tích các chất kích thích

sinh trƣởng thực vật trong rau, gồm: các điều kiện vận hành trên thiết bị sắc ký

lỏng khối phổ và các điều kiện của phƣơng pháp xử lý mẫu.

2) Xây dựng phƣơng pháp phân tích và đánh giá các thông số của phƣơng pháp.

3) Đánh giá hiện trạng dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các

mẫu rau xanh thu thập tại Hà Nội.

4) Đánh giá ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến sự sinh trƣởng

và phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng trong rau xanh.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng thực vật

Chất kích thích sinh truởng thực vật (KTST) là nhóm các hợp chất hữu cơ

nhƣ: auxin, gibberellin, cytokinin, brassinosteroid, jasmonate, salicyclic acid và

strigolactone...; có tác dụng kích thích quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây

[1]. Những chất này tác động lên sự sinh trƣởng của cây trồng theo cơ chế: (1) Kích

thích tăng trƣởng thể tích tế bào ở lá, thân, quả [2-4]; (2) Kích thích hình thành tế

bào mới, làm tăng cƣờng sự nảy chồi, đâm rễ, ra hoa [5-7]; (3) Bổ sung và tăng

cƣờng hoạt động của các men trong quá trình sinh tổng hợp của cây bằng cách cung

cấp thêm các chất vi lƣợng nhƣ Fe, Mn, Cu, Bo, Zn… [1].

1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

α-NAA (C12H10O2)

2,4-D (C8H6Cl2O3)

2,4,5-T (C8H5Cl3O3)

Picloram (C6H3Cl3N2O2)

Dicama (C8H6Cl2O3)

IAA (C10H9NO2)

IBA (C12H13NO2)

IPA (C11H11NO2)

1.2.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin

4-CI-IAA β-IAA

ICA (C9H6NO2) PAA (C8H8O2) (C10H8ClNO2)

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm auxin

Auxin là một hoocmon thực vật có nguồn gốc từ axít amin tryptophan, đƣợc

xác định và phân lập về mặt hóa học vào những năm 1930. Auxin có trong tất cả

các bộ phận của cây với các nồng độ khác nhau, trong đó, nồng độ auxin ở mỗi vị

trí là thông tin quan trọng của sự phát triển, đƣợc điều chỉnh chặt chẽ thông qua cả

quá trình trao đổi chất và vận chuyển trong cây. Auxin hoạt động kết hợp hoặc đối

lập với các hoocmon thực vật khác. Ví dụ, tỷ lệ nhất định của auxin với cytokinin

trong các mô thực vật có ảnh hƣởng đến sự hình thành rễ của các cành giâm [8].

Cấu trúc hóa học của các hợp chất auxin đƣợc trình bày ở Hình 1.1. Ở cấp độ

phân tử, tất cả các auxin đều là hợp chất có một vòng thơm và một nhóm axít

cacboxylic. Trong đó, indole-3-acetic acid (IAA) là một dẫn xuất của indole-3-

acetic acid, là monocacboxylic acid, hợp chất chứa acetic acid đƣợc liên kết với

nguyên tử cacbon C3 của indole. IAA đƣợc xem là hợp chất quan trọng nhất của

nhóm auxin, có vai trò tạo ra phần lớn các hiệu ứng auxin trong thực vật. Là một

auxin tự nhiên nên trạng thái cân bằng của IAA trong cây có thể đƣợc kiểm soát

theo nhiều cách từ tổng hợp cho đến sự phân hủy các phân tử của nó tùy theo điều

kiện môi trƣờng [9].

Có 5 hợp chất auxin trong tự nhiên gồm: IAA, 4-chloroindole-3-acetic acid

(4-CI-IAA), indole-3-butyric acid (IBA), indole-3-propionic acid (IPA) và

phenylacetic acid (PAA) [10, 11]. Bên cạnh đó, nhiều hợp chất tổng hợp có tính

chất tƣơng tự auxin nhƣ: Indole-3-carboxylic acid (ICA); α-naphthaleneacetic acid

(α-NAA); 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D); 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic

acid (2,4,5-T); 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (tordon or picloram); 2-

Methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid (dicamba), β-Indolyaxetic acid (AIA)... [10].

Những auxin tổng hợp nhân tạo này cũng có khả năng kích thích sự phát triển của

thực vật và đã đƣợc ứng dụng nhiều trong nông nghiệp và thƣơng mại.

Các đặc điểm, tính chất hóa lý nhƣ khối lƣợng mol phân tử, mật độ, diện tích

bề mặt, màu sắc, trạng thái, nhiệt độ nóng chảy và độ tan của một số hợp chất auxin

đƣợc trình bày ở Bảng 1.1.

Độ tan

Bảng 1.1. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm auxin (Nguồn: PubChem) Hợp chất KLPT (g.mol-1)

Nóng chảy (oC)

Màu sắc, trạng thái

Mật độ (g.cm-3)

Diện tích bề mặt (Å2)

IAA

53,1

Dạng rắn, màu trắng

tan tan

trong trong

175,187

1,4±0,1

IBA

203,241

53,1

125

nƣớc: ở

1,252

Tinh thể màu trắng hơi vàng

IPA

189,214

151,1

53,09

168-170 Không nƣớc, etanol (50 mg.L-1) 250 Trong 20oC; mg.L-1 trong benzene: > 1000 g.L-1; Trong acetone, etanol, diethyl: 30-100 g.L-1; trong chloroform: 0,01-1 g.L-1 134-135 Trong nƣớc: 0,73 50

etanol:

g.L-1; mg.mL-1

232-234 Trong

nƣớc: 5%;

ICA

208

53,1

161,15

etanol: 95% 179-180 Trong nƣớc: 0,42

4-CI-IAA 209,63 1,5±0,1

53,1

g.L-1 15 g.L-1

76-77

PAA

136,15

1,1

37,3

140,5 Trong

2,4-D

1,42

46,5

221,04

Tinh thể, màu vàng đến cam Tinh thể màu vàng nhạt Dạng bột màu trắng Dạng rắn màu trắng Màu trắng hơi vàng

135

α-NAA

1,2±0,1

37,3

Màu trắng

186,21

Dicamba

1,57

46,5

Màu trắng

221,03

900 nƣớc: mg.L-1; trong aceton: 67,3 g/400 mL; trong benzene 0,94 g/100 mL Trong nƣớc: 0,42 g.L-1 (ở 20oC); tan nhẹ trong dung môi hữu cơ: benzene, aceton, acetic acid, chlorofom 114-116 Trong nƣớc: 4500 mg.L-1 ở 25oC; tan trong dung môi hữu cơ: methanol, aceton, chloroform, dichloromethane

Picloram

76,2

Màu trắng

218,5 Trong

241,45

cơ:

430 nƣớc: mg.L-1 (ở 25oC); tan trong các dung môi hữu aceton, acetonitrile, benzene, etanol, isopropanol

2,4,5-T

1,8

46,5

154-158 Trong

nƣớc:

238

255,48

Màu trắng hơi vàng

mg.kg-1 (ở 30oC)

1.2.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin

Gibberellin (GAs) là nhóm hoocmon thực vật đƣợc phát hiện sau auxin, đƣợc

tổng hợp trong các mô non của chồi, có thể có trong rễ, hạt đang phát triển và lá cây

[12]. Gibberellin chính là các diterpenoid acid đƣợc tổng hợp từ terpenoid trong thể

hạt và sau đó đƣợc biến đổi thành dạng hoạt hóa sinh học trong lƣới nội chất và

cytosol [13]. Các gibberellin đều dẫn xuất từ bộ khung ent-gibberellan và đƣợc tổng

hợp thông qua ent-kauren.

Các gibberellin đƣợc đặt tên theo thứ tự phát hiện của chúng là GA1, GA2,

GA3.... GAn. Trong đó, GA3 là gibberellin đầu tiên đƣợc mô tả cấu trúc và là chất có

tác dụng sinh học lớn nhất. Hiện nay, có 126 gibberellin đƣợc xác định từ thực vật,

nấm và vi khuẩn với công thức phân tử không chứa nitơ [14]. Gibberellin là các

deterpene acid, với sự xuất hiện của cacbon 19 (C-19) hoặc cacbon 20 (C-20). Các

gibberellin C-19, bị mất đi C-20, tại vị trí đó sở hữu một cầu lacton 5 thành viên

liên kết với cacbon 4 và cacbon 10. Gibberellin C-19 đƣợc xem là dạng gibberellin

có hoạt tính sinh học [15].

Các gibberellin có hoạt tính sinh học gồm: GA1, GA3, GA4, GA7 với các đặc

điểm chung là: nhóm hydroxyl gắn ở vị trí C-3β, một nhóm cacboxyl ở vị trí C-6,

và một lacton ở vị trí giữa C-4 và C-10. Nhóm 3β-hydroxyl có thể đƣợc trao đổi cho

các nhóm chức khác ở vị trí C-2 và/ hoặc C-3. GA5 và GA6 là các gibberellin có

hoạt tính sinh học không chứa nhóm hydroxyl ở vị trí C-3β [16]. Công thức cấu tạo

của một số gibberellin đƣợc trình bày ở Hình 1.2.

GA1 (C19H24O6) GA3 (C19H22O6) GA4 (C19H24O5) GA7 (C19H22O5)

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm gibberellin

Gibberellin tan tốt trong dung môi hữu cơ nhƣng tan kém trong nƣớc. Các

đặc điểm hóa lý của một số gibberellin đƣợc trình bày trong Bảng 1.2.

Bảng 1.2. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm gibberellin

Độ tan

Hợp chất KLPT (g.mol-1)

Mật độ (g.cm-3)

Màu sắc, trạng thái

Nóng chảy (oC)

Diện tích bề mặt (Å2)

104

Dạng bột màu trắng

1,34

104

348,4 1,5±0,1 222-230 GA1 Trong nƣớc: 3,93 g.L-1

Dạng bột màu trắng

346,4 233-235 Trong nƣớc: 5 g.L-1 GA3

1,4±0,1

83,8

(ở 20oC); tan tốt trong etanol, methanol, aceton

Dạng bột màu trắng

1,4±0,1

332,4 201-205 GA4 Trong nƣớc: 127 mg.L-1 (ở 20oC)

Dạng bột màu trắng

330,4 169-172 GA7 Trong nƣớc: 127 mg.L-1 (ở 20oC)

(Nguồn: PubChem)

1.2.3. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin

Cytokinin là hoocmon thực vật đƣợc phát hiện sau auxin và gibberellin, có

khả năng thúc đẩy sự phân chia tế bào trong thân và rễ cây. Cytokinin tham gia vào

quá trình phát triển và biệt hóa tế bào, truyền tín hiệu tại chỗ và tới các vị trí khác

nhau trong cơ thể với cơ chế vận chuyển tƣơng tự nhƣ purin và nucleosit; đồng thời

cytokinin ảnh hƣởng đến tính ƣu thế đỉnh, sự phát triển chồi nách và sự già đi của lá

[17].

Cytokinin hoạt động phối hợp với auxin trong điều hòa sự sinh trƣởng và

phát triển của thực vật. Cytokinin là các hợp chất hữu cơ với thành phần cơ bản

gồm các nguyên tố C, N và H. Một số hợp chất thuộc nhóm cytokinin nhƣ: kinetin

(K), zeatin (Z), 6-benzylaminopurine, diphenylurea, thidiazuron (TDZ), trans-

zeatin (tZ), N6-Benzyladenine (BA), N6-Isopentenyladenine (iP),

Isopentenyladenosine (iPR), Dihydrozeatin riboside (DHZR), Trans-zeatin riboside

(tZR)…. [18].

Cytokinin là các dẫn xuất của adenine với chuỗi bên ở vị trí N6. Cấu trúc và

hình dạng của chuỗi bên gắn với vị trí N6 có thể ảnh hƣởng rõ rệt đến hoạt tính sinh

học của cytokinin. Tùy thuộc vào cấu trúc của nhóm thế N6, các cytokinin đƣợc

phân loại thành các cytokinin isoprenoid hoặc thơm. Cấu trúc hóa học của adenine

và một số chất thuộc nhóm cytokinin đƣợc trình bày ở Hình 1.3.

Adenin (C5H5N5) BA (C12H11N5) K (C10H9N5O) Diphenylurea (C13H12N2O)

Z (C10H13N5O) (C10H13N5O) iP (C10H13N5) Thidiazuron (C9H8N4OS)

iPR (C15H21N5O4) DHZR (C15H23N5O5) tZR (C15H21N5O5)

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các chất thuộc nhóm cytokinin

Các hợp chất hữu cơ thuộc nhóm cytokinin thƣờng có màu trắng hoặc không

màu và tan kém trong nƣớc. Đặc điểm, tính chất hóa lý của một số hợp chất

cytokinin đƣợc trình bày trong Bảng 1.3.

Bảng 1.3. Đặc điểm, tính chất hóa lý của các chất thuộc nhóm cytokinin

Độ tan

Hợp chất KLPT (g.mol-1)

Mật độ (g.cm-3)

Màu sắc, trạng thái

Nóng chảy (oC)

Diện tích bề mặt(Å2)

K 215,216 1,5±0,1

79,6 Màu trắng 269-271 Trong nƣớc: 358 mg.L-1 (ở 25oC); trong etanol: < 1 mg.mL-1

86,7 Màu vàng

Z 219,248 1,4±0,1

sáng 208-210 Trong nƣớc: 25 mg.L-1 (ở 25oC)

tZ 219,24 1,4±0,1

81 Màu trắng 207-208 Trong nƣớc: 25 mg.L-1 (ở 25oC) 66,5 Không màu 234-235 Trong nƣớc: 0,44

41,1 Màu trắng 238-240 Trong nƣớc: 0,15

225,255 0,899 BA mg.L-1

Diphenylurea 212,252 1,239 mg.L-1

Thidiazuron 220,25 1,5±0,1 Không màu 210,5- 212,5 Trong nƣớc: 20 mg.L-1

203,24 1,3±0,1 218-220 Trong NaOH: 33,3 iP Tinh thể màu trắng mg.L-1

126 Không màu 143-146

146

335,36 1,7±0,1 - iPR

146

353,37 1,7±0,1 DHZR Tinh thể màu trắng 167-169 Trong nƣớc: 60 mg.L-1 ở 20oC

351,37 1,7±0,1 176-179 Trong acetic acid: tZR Không màu 50 mg.L-1

(Nguồn: PubChem)

1.3. Vai trò chức năng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

1.3.1. Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm auxin

Auxin đóng vai trò quan trọng trong việc điều phối nhiều quá trình sinh lý

cần thiết trong chu kỳ sống của thực vật nhƣ: sự sinh trƣởng, phát triển, sự ra hoa,

hình thành củ, quả, hạt của thực vật.... Auxin có thể ảnh hƣởng đến dòng của tế bào

chất, sự di chuyển của chất lỏng trong tế bào và hoạt tính của các enzym khác nhau

[19].

Nồng độ auxin ảnh hƣởng đến quá trình quang dƣỡng của cây, cho phép cây

hƣớng về phía ánh nắng mặt trời để thu đƣợc nhiều năng lƣợng nhất. Auxin kiểm

soát quá trình này bằng cách tập trung về phía cây xa ánh nắng mặt trời. Điều này

tạo ra những thay đổi trong các tế bào, làm cong cây về phía ánh sáng [19].

Auxin tạo ra tính ƣu thế ngọn ở nhiều loài thực vật, là sự phát triển sớm và

nhanh của một mô phân sinh. Auxin đƣợc giải phóng từ mô này ức chế tất cả các

chồi mới mọc ra bên dƣới nó. Nếu ngọn cây bị cắt bỏ, sự điều hòa nồng độ auxin

trong cây sẽ thay đổi, nhiều chồi mới sẽ mọc ra phía bên dƣới, trong đó, có một chồi

sẽ phát triển mạnh hơn các chồi khác. Sự điều hòa nồng độ auxin trong cây quyết

định tốc độ phát triển và chiều cao của cây. Hơn nữa, auxin kích thích sự ra rễ của

các cành giâm, ngăn cản sự phát triển của chồi, tạo quả không hạt và hạn chế quả

rụng [19, 20].

1.3.2. Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm gibberellin

GAs điều hòa và ảnh hƣởng đến các quá trình phát triển khác nhau của thực

vật nhƣ: kéo dài thân, nảy mầm, ngủ của hạt, ra hoa, phát triển hoa và già đi của lá

và quả [14].

Các hạt giống ngủ đông thƣờng rất ít hoặc không xảy ra hoạt động trao đổi

chất. Khi tiếp xúc với nƣớc, quá trình trao đổi chất đƣợc thúc đẩy, tạo điều kiện cho

phôi phát triển, giải phóng các phân tử gibberellin, sau đó chúng di chuyển đến lớp

aleurone bao quanh nội nhũ, nơi dự trữ tinh bột, chất béo và protein cho phôi đang

phát triển để tiến hành sản xuất các enzyme giúp tiêu hóa nội nhũ và cung cấp chất

dinh dƣỡng cho phôi hạt giống phát triển [14]. Bên cạnh đó, gibberellin ảnh hƣởng

đến sự cân bằng của protein, do đó, kích thích sự phát triển và kéo dài của tế bào

trong thân cây và giữa các lóng. Sự thay đổi nồng độ gibberellin trong cây giúp cây

phản ứng và thích nghi tốt hơn với sự thay đổi của các điều kiện môi trƣờng, đồng

thời điều hòa các quá trình sinh trƣởng phát triển phù hợp [14].

Ngoài ra, các phân tử gibberellin có liên quan và tƣơng tác với các hormone

thực vật khác trong cây. Ví dụ, hàm lƣợng auxin có liên quan trực tiếp đến hàm

lƣợng gibberellin trong cây và chúng thƣờng bổ sung cho nhau, trong khi đó,

ethylene có xu hƣớng làm suy giảm mức độ gibberellin trong cây.

1.3.3. Vai trò chức năng của các chất thuộc nhóm cytokinin

Cytokinin tƣơng tác trực tiếp với các auxin, kích thích sự phân chia tế bào và

các quá trình chuyển hóa khác nhau của tế bào. Sự hoạt hóa mạnh mẽ của cytokinin

với các ADN và protein của thực vật cho phép cây phát triển các mô khác nhau để

thực hiện các mục đích khác nhau [17]. Cytokinin ảnh hƣởng trực tiếp đến sự phân

hóa chồi của thực vật, kích thích sự phát triển của chồi bên và sự giãn nở của lá

bằng cách phân chia và mở rộng tế bào. Bên cạnh đó cytokin còn kích thích tổng

hợp chất diệp lục tạo ra sự chuyển đổi etioplast thành lục lạp và tăng cƣờng mở khí

khổng ở một số loài thực vật [18]. Cytokinin làm chậm quá trình lão hóa các bộ

phận trên cây thông qua việc duy trì hàm lƣợng protein và clorophin, giúp cây giữ

đƣợc màu xanh lâu hơn. Việc xử lý cytokinin giúp phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ và

kích thích sự nảy mầm của hạt và củ. Cytokinin kết hợp với auxin là giảm hiện

tƣợng ƣu thế ngọn và tăng sự phân hóa chồi ở các loài thực vật. Các cytokinin đóng

vai trò quan trọng trong việc giúp cây phát triển tốt ở điều kiện khô hạn, thiếu nƣớc

[21, 22].

1.4. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

1.4.1. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm auxin

Auxin là thành phần cơ bản trong kỹ thuật in vitro để nhân giống cây trồng

từ các tế bào, cơ quan hay toàn bộ cơ thể thực vật đồng thời loại bỏ các mầm bệnh

bẩm sinh và tạo ra các cây không bị nhiễm virus [23]. Nghiên cứu nuôi cấy rễ cây

cà chua in vitro cho thấy, cây phát triển không giới hạn nhờ vào việc sản xuất IAA

và cytokinin trong mô phân sinh ở đỉnh rễ. Hơn nữa, các mẫu nuôi cấy mô thực vật

đầu tiên là các mẫu cấy đƣợc cung cấp auxin hoặc do các khối u, sẹo của chúng sản

xuất auxin hoặc do ứng dụng IAA từ bên ngoài vào môi trƣờng nuôi cấy. Tuy

nhiên, hiện nay, IAA tự nhiên ít đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô hoặc tế bào thực

vật, thay vào đó là các auxin nhƣ: 2,4-D hoặc 1-NAA, đƣợc sử dụng một mình hoặc

kết hợp với nhau. Kỹ thuật này thƣờng đƣợc áp dụng cho các dòng/chủng tế bào

trong nghiên cứu cơ bản với các đối tƣợng cây trồng, ví dụ cây thuốc lá BY-2 và

Nicotiana tabacum L. Ngoài ra, auxin ngoại sinh còn đƣợc ứng dụng trong việc tạo

rễ cho các cành giâm trong sinh sản vô tính [24].

Một số nghiên cứu ảnh hƣởng của các auxin (IAA, α-NAA, 2,4-D...) đến sự

sinh trƣởng, phát triển và sản lƣợng của nhiều đối tƣợng cây trồng nhƣ: cà chua, ớt

cay, cà tím, hành tây, rau cải mầm,... cho thấy, việc xử lý các chất kích thích sinh

trƣởng thực vật thuộc nhóm auxin làm thúc đẩy sự sinh trƣởng và phát triển của cây

về chiều cao, số lƣợng lá; gia tăng sinh khối và số lƣợng quả trên mỗi cây, tăng sản

lƣợng cây trồng trên cùng một đơn vị diện tích và trong cùng một thời gian nghiên

cứu [25-28].

Các auxin đƣợc sử dụng nhƣ thuốc diệt cỏ là các axít hữu cơ có chứa vòng

thơm và nhóm cacboxyl; và đƣợc đặc trƣng bởi trọng lƣợng phân tử thấp. Có 5 loại

thuốc diệt cỏ auxin chính, gồm: phenoxy-cacboxylic acid (ví dụ, 2,4-

dichlorophenoxyacetic acid); benzoic acid (ví dụ, dicamba); pyridineacids (ví dụ,

picloram, clopyralid); quinolinecarboxylic acid (ví dụ, quinclorac); và pyrimidine

cacboxylic acid (ví dụ: aminocyclopyrachlor). Trong đó, 2,4-D đƣợc xem là thuốc

trừ sâu đầu tiên trong các auxin tổng hợp đƣợc sử dụng nhƣ chất diệt cỏ, với khả

năng giết chết thực vật chủ yếu theo 3 cách: (i) làm thay đổi độ dẻo của thành tế

bào, (ii) ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp protein và (iii) tăng sản xuất ethylene.

Hiện nay, 2,4-D đƣợc sử dụng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, với chi phí thấp và

hiệu quả sử dụng cao bởi nó không ảnh hƣởng đến cây trồng, đồng thời giảm thiểu

sự phát triển của những cây cỏ kháng thuốc theo thời gian [29]. Một số nghiên cứu

ứng dụng các hợp chất auxin đến sự sinh trƣởng, phát triển và hiệu quả sản xuất của

các loại cây trồng đƣợc trình bày ở Bảng 1.4.

Bảng 1.4. Một số nghiên cứu về tác dụng của auxin đối với các loại cây trồng

Loại cây trồng Hiệu quả Tài liệu Auxin Nồng độ (mg.L-1)

[26]

12 Cải mầm IAA

[30] 100 Đậu bắp

[31] IBA 25 Đậu bắp

40 Ớt cay

[27] [26]

12 Cải mầm

[32] 20 Cà tím

[33]

140 Súp lơ NAA

[34]

80 Bắp cải

[28]

100 Hành tây

[35] 200 Dƣa chuột

5 Ớt cay [27] [36] 2,4-D 15 Khoai lang ruột vàng Tăng tỷ lệ và tốc độ nảy mầm, giảm thời gian nảy mầm, tăng sản lƣợng và nằng suất rau mầm Tăng chiều cao, số lƣợng nhánh và sản lƣợng Tăng các chỉ số tăng trƣờng và năng suất Tăng năng suất quả 13,61% Tăng tỷ lệ và tốc độ nảy mầm, giảm thời gian nảy mầm, tăng sản lƣợng rau mầm Tăng số lƣợng nhánh, số lƣợng quả và khối lƣợng quả tƣơi Tăng chiều cao, đƣờng kính thân, tán cây rộng, số lá, đƣờng kính, chiều dài, khối lƣợng bông và sản lƣợng Tăng chiều cao cây, số lƣợng lá, độ rộng tán cây, đƣờng kính bắp, khối lƣợng và năng suất bắp Giảm tình trạng mất khối lƣợng và hạn chế hƣ hỏng do các tổn thƣơng Thúc đẩy sự phát triển, tăng năng suất quả và hạt, điều chỉnh tỷ lệ giới tính Tăng năng suất quả 28,75% Tăng chiều dài của thùy lá và diện tích lá, sản lƣợng và chất lƣợng khoai

1.4.2. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm gibberellin

Bảng 1.5. Một số nghiên cứu về tác dụng của gibberellin đối với các loại cây trồng

Loại cây trồng Tài liệu Hiệu quả

Gibberellin Nồng độ (mg.L-1) 10 Ớt cay [27] [10]

8 Rau cải mầm

[45]

125 Cà chua

[32] 10 Cà tím

[46]

50 Súp lơ

[47]

120 Bắp cải GA3

[48]

15 Rau muống

[30] 150 Đậu bắp

[49] 100 Hành ống

[50]

30 Dƣa chuột

[51] 10 Ngô rau

[36]

300 Khoai lang ruột vàng Tăng năng suất quả 2,30 % Tăng tỷ lệ và tốc độ nảy mầm, giảm thời gian nảy mầm, tăng sản lƣợng rau mầm Tăng chiều cao, số lƣợng lá, số cành, số quả, số hoa, số chùm quả, đƣờng kính quả, năng suất Tăng số lƣợng nhánh, số lƣợng quả và khối lƣợng quả tƣơi Tăng đƣờng kính, chiều dài cồi, khối lƣợng bông, sản lƣợng và giảm thời gian sản xuất Tăng chiều cao cây, số lƣợng lá, đƣờng kính bắp và năng suất; giảm thời gian hình thành bắp Tăng tỷ lệ nảy mầm, các chỉ tiêu sinh trƣởng và năng suất, thời gian sản xuất ngắn Rút ngắn thời gian ra hoa và số ngày thu hoạch, tăng tỷ lệ hình thành quả Tăng chiều cao, số lƣợng lá/cây, chiều dài lá và độ rộng lá Tăng lƣợng hoa có nhụy đƣợc thụ phấn, số lƣợng và khối lƣợng quả Tăng năng suất và phẩm chất của cây Tăng chiều dài của thùy lá và diện tích lá, sản lƣợng và chất lƣợng khoai

Trong số các gibberellin có hoạt tính sinh học, GA3 là gibberellin đƣợc

nghiên cứu ứng dụng cho nhiều đối tƣợng cây trồng, cây ăn quả và cây cảnh bởi nó

đóng vai trò quan trọng kích thích sự nảy mầm của hạt [37], phản ứng với các điều

kiện ức chế của môi trƣờng [38], thúc đẩy sự tăng trƣởng quả [39], kéo dài thân

[40], kích thích ra hoa [41], hình thành hạt của lúa mạch và tạo ra các hiệu ứng sinh

lý khác khi tƣơng tác với các phytohormone khác trong cơ thể cây trồng [42]. Bên

cạnh đó, hỗn hợp GA4+7 đƣợc ứng dụng trong việc kiểm soát hình dạng, kích thƣớc

và gia tăng chất lƣợng của trái cây [43]. Việc xử lý GA4+7 có thể giúp kích thích sản

xuất các hoa cái thụ tinh ở một số đối tƣợng cây trồng, góp phần nâng cao hiệu quả

sản xuất, canh tác [44]. Một số nghiên cứu ứng dụng các hợp chất gibberellin đến

sự sinh trƣởng, phát triển và hiệu quả sản xuất của các loại cây trồng đƣợc trình bày

ở Bảng 1.5.

1.4.3. Các nghiên cứu về tác dụng của các chất thuộc nhóm cytokinin

Việc sử dụng trans-zeatin, trans-zeatin riboside, 6-benzyladenine và các

cytokinin khác có thể làm chậm quá trình lão hóa của thực vật [52]. Kết quả ứng

dụng cytokinin trên một số đối tƣợng cây trồng cho thấy, cytokinin ngoại sinh làm

tăng độ mở khí khổng và tốc độ thoát hơi nƣớc ở lá cây [53, 54]. Hơn nữa,

cytokinin giúp tích tụ chất diệp lục và thúc đẩy quá trình chuyển đổi nguyên bào

thành lục lạp [1], đóng vai trò quan trọng trong duy trì diện tích lá xanh hoạt động

quang hợp. Cytokinin nội sinh đƣợc gia tăng thông qua việc cấy vi khuẩn sản xuất

cytokinin vào cây để taọ ra cytokinin với các nồng độ nằm trong giới hạn sinh lý

của cây [55]. Xử lý cây trồng bằng vi khuẩn sản xuất cytokinin dẫn đến tăng hàm

lƣợng cytokinin trong rau diếp và lúa mì giúp cây phát triển nhanh hơn ở cả điều

kiện khô hạn cũng nhƣ đƣợc tƣới đầy đủ [56]. Các phản ứng của khí khổng đối với

cytokinin ngoại sinh là đặc trƣng cho loài và phụ thuộc vào nồng độ cytokinin [57].

Các ứng dụng, nồng độ và tác dụng của các cytokinin ngoại sinh đối với các loại

cây trồng đƣợc trình bày ở Bảng 1.6.

Bảng 1. 6. Một số nghiên cứu về tác dụng của cytokinin đối với các loại cây trồng

Loài cây trồng

Hiệu quả

Tài liệu

Ứng dụng

[58]

Nồng độ (µM) 22

lƣợng

100

Lúa mạch Hordeumvulgare Arabidopsis thaliana

[59]

2,2

[60]

(Malus×

đổi

hàm

tàu Táo domestica Borkh.)

[61]

(Musa

1000 Chuối

lƣợng

[62]

100

(Brassica

chậm quá

[57]

acuminata) Súp lơ oleracea L.) 1 và 100 Dƣa chuột

35,5

Lúa mạch đen

cao năng

[63]

bluegrass

[64]

Kentucky (Poa pratensis L.)

Chồi hoặc lá tách rời ủ với cytokinin

(Acer

1-100 Cây

mía

[65]

saccharum) Arabidopsis thaliana

[66]

lệ nảy

tỷ

[67]

5 và 10 Đậu

(Phaseolus

Tăng hàm diệp lục chậm quá Làm trình già hóa của lá cây Thay lƣợng diệp lục Tăng hàm diệp lục Làm trình già hóa Tăng độ dẫn khí khổng Nâng suất Thúc đẩy sự sinh trƣởng và phục hồi lý của các sinh thực vật ở khu vực khô hạn Tăng độ dẫn của khí khổng Tăng mầm Tăng độ dẫn của khí khổng và tỷ lệ quang hợp

[68]

(Solanum

vulgaris L.) Củ cải đƣờng (Bata vulgaris L.) Cà tím melongena)

[69]

Poa pratensis L.

tỷ

10 Dứa

(Ananas

[70]

comosus L. Merr.)

Tăng hàm lƣợng diệp lục và độ dẫn khí khổng Tăng độ dẫn khí khổng và lệ quang hợp Gia tăng phát triển thân

Bổ sung vào môi trƣờng in vitro

1.5. Các nghiên cứu về dƣ lƣợng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

Hiện nay, các hóa chất nông nghiệp, đặc biệt là các chất kích thích sinh

trƣởng thực vật đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất rau xanh và cây ăn quả ở

Việt Nam cũng nhƣ các nƣớc trên thế giới. Tuy nhiên, bên cạnh hiệu quả và công

dụng của các hợp chất này mang lại, thì việc sử dụng các hợp chất này cũng tiềm ẩn

nhiều nguy cơ ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Dƣới đây là một số nghiên

cứu về dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các sản phẩm trái

cây và rau xanh ở một số nƣớc trên thế giới.

Dƣ lƣợng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật: GA3; α-NAA; 2,4-D

và Ethephon (Eth) trong 154 mẫu trái cây (gồm: đào, nho, lê, mận, mơ, ổi, táo, vả,

chà là và xoài) và 112 mẫu rau xanh (gồm: cà rốt, bắp cải, rau diếp, cà chua, dƣa

chuột, xà lách rocket, rau molekhia và cần tây) đƣợc thu thập tại một số siêu thị

chính ở các quận/huyện: phía Đông, phía Tây, miền Trung, Giza, Eldoki, Embaba,

Bolack EI Dakror, EI Omrania, Mariotia và Kerdasa thuộc Giza Government, Hy

Lạp đã đƣợc nghiên cứu [71]. Kết quả phân tích cho thấy, có 101 mẫu trái cây

(65,6%) phát hiện dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật. Mức độ dƣ

lƣợng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật đƣợc so sánh với Giới hạn dƣ

lƣợng tối đa (MRLs) theo Tiêu chuẩn của Châu Âu [72]. Số lƣợng mẫu trái cây

chứa dƣ lƣợng GA3, α-NAA; 2,4-D và Eth cao hơn MRLs lần lƣợt chiếm 71%,

63%, 69% và 53%. Trong các mẫu rau xanh, phát hiện có 68 mẫu tƣơng đƣơng

60,7% có dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật: GA3; α-NAA; 2,4-D và

Eth. Trong đó, số mẫu rau chứa dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng cao hơn so

với MRLs đƣợc xếp theo thứ tự: 2,4-D (74%) > NAA (66%) > ethephon (45%) >

gibberellin (44%) [71].

Trong một nghiên cứu khác, dƣ lƣợng của 6 hợp chất kích thích sinh trƣởng

thực vật gồm 2,4-D, gibberellins, 4-CPA, thiadiazuron, forchlorfenuron và

paclobutrazol và 8 hợp chất thuốc trừ sâu: carbendazim, pyrimethanil, metalaxyl,

triadimefon. thiophanate, prochloraz, dimethomorph and difenoconazole diệt trừ

nấm trong 96 mẫu trái cây, trong đó có 24 mẫu táo, 16 mẫu nho, 15 mẫu dƣa hấu,

11 mẫu chuối, 10 mẫu đào, 10 mẫu vải và 10 mẫu quả việt quất thu thập tại một số

siêu thị của thành phố Hàng Châu, Trung Quốc. Kết quả nghiên cứu cho thấy, có

29% số mẫu phát hiện các thuốc trừ sâu và chất kích thích sinh trƣởng thực vật,

trong đó, forchlorfenuron là một trong các hợp chất phổ biến đƣợc tìm thấy; và chỉ

có 1% số mẫu có dƣ lƣợng cao hơn so với MRLs theo quy định của Trung Quốc

[73]. Theo Lu và cộng sự [74] đã phát hiện dƣ lƣợng của GA3 (0,05 mg/kg) trong

cây mía đƣờng thí nghiệm ở huyện Hƣng Nghĩa, tỉnh Quý Châu, Trung Quốc. Tuy

nhiên, giá trị này thấp hơn giới hạn dƣ lƣợng tối đa theo tiêu chuẩn của Mỹ quy

định (0,15 mg/kg) [75].

Ở Việt Nam, hiện chƣa có nào công trình công bố về dƣ lƣợng các chất kích

thích sinh trƣởng thực vật trong các sản phẩm rau xanh và trái cây. Tuy nhiên, trên

thị trƣờng, các thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật đƣợc buôn bán và sử dụng với

nhiều tên thƣơng mại khác nhau nhƣ: siêu ra rễ, siêu trái, thuốc kích mầm, thần

dƣợc siêu tăng trƣởng... Bên cạnh đó, một số loại phân bón qua lá cho các loại cây

trồng cũng chứa một hàm lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật nhất định.

Bản chất của các thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật chứa các chất nhƣ: auxin,

gibberellin hoặc cytokinin... có vai trò kích thích sự phân chia tế bào, thúc đẩy sự

sinh trƣởng phát triển, gia tăng sinh khối cho cây trồng...

Việc sử dụng quá liều lƣợng quy định hoặc không đảm bảo thời gian cách ly

khi sử dụng các thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật cho các loại cây trồng, đặc

biệt là rau xanh, có thể ảnh hƣởng đến sức khỏe của ngƣời tiêu dùng nhƣ: ngộ độc

thức ăn, tiêu chảy, ung thƣ, hoặc tử vong...

1.6. Các phƣơng pháp phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

Trong những năm gần đây, có rất nhiều công trình công bố về phƣơng pháp

phân tích các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong các mẫu sinh học. Tuy nhiên,

rất ít bài báo lý giải việc lựa chọn phƣơng pháp này thay vì các phƣơng pháp kia.

Tùy theo phƣơng pháp phân tích đƣợc sử dụng mà lựa chọn các kỹ thuật chuẩn bị

mẫu cho phù hợp.

1.6.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong phƣơng pháp phân tích trong những năm gần

đây, nhƣng việc chuẩn bị mẫu vẫn đƣợc xem là bƣớc chính trong phân tích các chất

kích thích sinh trƣởng thực vật và chiếm tới 80% tổng thời gian phân tích [76]. Tùy

thuộc vào đối tƣợng mẫu và phƣơng pháp đƣợc sử dụng, quy trình chuẩn bị mẫu

hoàn chỉnh có thể bao gồm các quá trình nhƣ: thu thập mẫu, đồng nhất mẫu, chiết

chất phân tích từ nền mẫu và tinh chế dịch chiết để loại bỏ các chất cản trở đồng

chiết xuất [77].

1.6.1.1. Thu thập mẫu

Thu thập mẫu là bƣớc đầu tiên trong quá trình chuẩn bị mẫu trƣớc khi phân

tích, đòi hỏi phải thao tác nhanh chóng và đông cứng mẫu trong nitơ lỏng để tránh

thay đổi nồng độ của chất phân tích trong mẫu [78]. Tiếp đến, thực hiện nghiền các

mẫu đông lạnh trong môi trƣờng nitơ lỏng để ngăn ngừa sự rã đông của mẫu và sự

phân hủy hóa học của các chất phân tích [79]. Có thể đông khô mẫu trƣớc khi

nghiền, giúp loại bỏ các hạn chế về thời gian liên quan đến khả năng rã đông và

giảm thiểu sự phân hủy hóa học của chất phân tích [80].

1.6.1.2. Chiết tách

Các mẫu thực vật có dạng rắn, do đó bƣớc đầu tiên của quy trình phân tích

chính là thực hiện phƣơng pháp chiết tách rắn lỏng để chuyển hóa chất phân tích từ

dạng rắn sang dạng lỏng, sử dụng cho việc tinh chế và làm giàu nồng độ ở các bƣớc

tiếp theo. Hiệu suất chiết phụ thuộc vào việc lựa chọn dung môi chiết, và hỗn hợp

các dung môi thƣờng cho hiệu suất chiết cao hơn so với dung môi đơn lẻ [80]. Một

số dung môi khác nhau đã đƣợc sử dụng trong chiết xuất các chất kích thích sinh

trƣởng thực vật: methanol [81], methanol : nƣớc [82], 1-propanol : H2O : HCl [83],

acetonitrile : nƣớc [84], methanol : đệm KH2PO4 [85], iso-propanol : đệm imidazole

[86]....

1.6.1.3. Làm sạch và tinh chế mẫu

Việc làm sạch và tinh chế mẫu đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ các

chất cản trở và tăng độ nhạy của phƣơng pháp phân tích. Tuy nhiên, tùy thuộc vào

đối tƣợng mẫu và phƣơng pháp phân tích để lựa chọn phƣơng pháp làm sạch và tinh

chế phù hợp. Một số phƣơng pháp làm sạch và tinh chế mẫu sử dụng trong phân

tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật nhƣ: chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn, vi

chiết lỏng-lỏng phân tán, vi chiết pha rắn... [80].

Các kỹ thuật chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn đƣợc xem là các phƣơng pháp

tinh chế mẫu cổ điển, đơn giản và tự động hóa, đƣợc sử dụng phổ biến trong phân

tích các chất PGR. Bên cạnh đó, sắc ký trao đổi ion (IEC) cũng đƣợc kết hợp với

chiết pha rắn và/hoặc chiết lỏng-lỏng trong quá trình làm sạch và tính chế mẫu

nhằm giảm thiểu ảnh hƣởng của nền mẫu và gia tăng khả năng phát hiện chất phân

tích trên thiết bị LC-ESI-MS [87]. Tuy nhiên, các phƣơng pháp này đòi hỏi lƣợng

mẫu phân tích tƣơng đối lớn, thời gian hoạt động dài, và tạo ra nhiều chất thải dung

môi. Để khắc phục những hạn chế này, các kỹ thuật vi chiết đƣợc phát triển nhằm

giảm thiểu việc sử dụng lƣợng mẫu ban đầu và dung môi chiết. Nhƣng, trên thị

trƣờng số lƣợng các lớp phủ sợi trong kỹ thuật vi chiết tƣơng đối hạn chế và yêu

cầu đối với chất phân tích dễ bay hơi hoặc bán bay hơi trong phân tích vi chiết pha

rắn-sắc ký khí [88]. Kỹ thuật vi chiết lỏng-lỏng phân tán đã từng đƣợc sử dụng

trong chiết xuất các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong tảo xanh

Chlorella vulgaris với thời gian chiết xuất duới 1 phút [82]. Tuy nhiên, phƣơng

pháp này không thể áp dụng đƣợc đối với một số loài thực vật trên cạn do độ nhiễu

của nền mẫu quá lớn [80]. Điều này làm thu hẹp phạm vi ứng dụng của kỹ thuật vi

chiết trong phân tích các hợp chất PGR trong các mẫu thực vật.

Một số tác giả đã sử dụng cột miễn dịch để tinh chế các chất chiết xuất từ

thực vật dựa trên sự tƣơng tác kháng nguyên-kháng nguyên có khả năng chọn lọc,

do đó khắc phục đáng kể các vấn đề phổ biến của SPE nhƣ đồng chiết xuất và sự

gây nhiễu của chất nền [89]. Các cột miễn dịch đƣợc đóng gói bằng chất hấp thụ có

chứa kháng thể cố định chống lại chất phân tích cụ thể, hay còn gọi là chất hấp thụ

miễn dịch, cho phép cô đặc mẫu [90]. Kỹ thuật QuEChERS cũng đƣợc ứng dụng

trong quá trình xử lý mẫu phục vụ cho việc phân tích các chất kích thích sinh trƣởng

thực vật với độ thu hồi cao [91]. Tuy nhiên, tùy theo phƣơng pháp phân tích, đối

tƣợng mẫu và điều kiện của cơ sở nghiên cứu mà lựa chọn phƣơng pháp tinh chế

mẫu cho phù hợp để đạt đƣợc những kết quả mong muốn.

1.6.2. Phương pháp phân tích

Phƣơng pháp phân tích phát hiện và định lƣợng các hợp chất kích thích sinh

trƣởng thực vật thuộc các nhóm auxin, gibberellin và cytokinin đã đƣợc báo cáo

trong một số công trình nghiên cứu trƣớc đây.

1.6.2.1. Phương pháp phân tích các hợp chất auxin

GC/MS là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất để phân tích IAA. Hợp

chất này thƣờng đƣợc methyl hóa hoặc trimethylsilyl hóa để tăng tính bay hơi của

nó. Việc tạo dẫn xuất nhƣ vậy làm cải thiện đáng kể tín hiệu sắc ký và độ nhạy của

phép phân tích. Độ nhạy của các máy khối phổ đơn thông thƣờng thƣờng không đủ

cao để phân tích hợp chất IAA với hàm lƣợng nhỏ miligram trong các mô thực vật.

Cần phải tinh chế dịch chiết một cách tốt hơn, tối ƣu hóa việc thu hồi chất phân tích

và điều chỉnh điều kiện phân tích máy khối phổ để đảm bảo độ nhạy chấp nhận

đƣợc [92]. Tuy nhiên, có thể giảm thiểu việc tinh chế mẫu bằng cách sử dụng khối

phổ song song hoặc khối phổ có độ phân giải cao, là các kỹ thuật cung cấp độ chọn

lọc cao đối với các chất phân tích.

Một phƣơng pháp khác đƣợc phát triển cho phép định lƣợng hợp chất IAA ở

nồng độ milligram trong các mẫu thực vật với việc tinh chế tƣơng đối ít bằng cách

sử dụng thiết bị từ tính hội tụ kép với hình học đảo ngƣợc cho phép giám sát các

phản ứng đƣợc lựa chọn (GC-MS-SRM) [93]. Kỹ thuật quét này liên quan đến việc

phát hiện các ion con có nguồn gốc từ các ion mẹ di căn đặc trƣng, cho độ nhạy và

độ chọn lọc cực cao. Phƣơng pháp này đã đƣợc cải tiến hơn nữa kể từ khi nghiên

cứu đƣợc công bố và hiện tại cho phép phân tích định lƣợng hàm lƣợng chất trong

mẫu ở mức 0,05-0,1 mg. Tính hữu ích của phƣơng pháp này đã đƣợc chứng minh

trong việc phân tích sự phân bố IAA theo các mô đặc trƣng ở các cây mầm

Arabidopsis [94] và để xác định hàm lƣợng IAA và sự luân chuyển IAA trong từng

milimét của rễ cây mầm Arabidopsis [95, 96]. Tuy nhiên, trên thực tế, công nghệ

hiện đã đạt đến một giai đoạn mà ở đó sự nhiễm bẩn và chuẩn bị mẫu là ngang nhau

hoặc đôi khi còn hạn chế hơn độ nhạy của máy phân tích khối phổ!

Phép phân tích khối phổ song song có thể đƣợc thực hiện với các loại khối

phổ khác nhau nhƣ: thiết bị bẫy ion MS-MS hoặc ba tứ cực. Ví dụ, phƣơng pháp

phân tích IAA và các hoocmon khác đã đƣợc mô tả bằng cách sử dụng thiết bị bẫy

ion MS-MS [97], với khối lƣợng mẫu yêu cầu cho việc định lƣợng các chất phân

tích dao động trong khoảng 20-200 mg. Các phƣơng pháp sử dụng thiết bị sắc ký

lỏng ghép nối song song với khối phổ theo chế độ phun điện tử để phân tích IAA và

các chất chuyển hóa của IAA cũng đã đƣợc phát triển [98, 99]. Các phƣơng pháp

này có độ nhạy và độ chọn lọc cao, do đó có tiềm năng trong việc định lƣợng.

1.6.2.2. Phương pháp phân tích các hợp chất gibberellin

Gibberellin chủ yếu đƣợc phân tích dƣới dạng dẫn xuất metyl este trimetylsilyl-ete bằng GC/MS2. Vì số lƣợng GA trong mỗi mô thực vật có thể rất

cao, nên điều quan trọng là phải tối ƣu hóa hệ thống GC để tách các đồng phân GA,

ví dụ: GA1 và GA29, và các GA có các phân mảnh khối phổ chung. Điều này đặc

biệt quan trọng khi các GA khác nhau không đƣợc tách biệt trƣớc khi phân tích

GC/MS, vì các GA đồng rửa giải có thể gây ra sự không chính xác. Mặc dù có một

vài ví dụ về GA đƣợc định lƣợng trong một lƣợng mẫu nhỏ mà không cần tinh chế

sâu bằng cách sử dụng phƣơng pháp phát hiện SRM có độ chọn lọc cao [100, 101],

điều quan trọng cần lƣu ý là trong nhiều nguyên liệu thực vật, ví dụ: Lá cây

Arabidopsis có chứa một số hợp chất liên quan đến cấu trúc có thể gây cản trở đến

việc phân tích GA của GC/MS. Do đó, việc tinh chế sâu hơn và phân tích bằng

HPLC đóng vai trò cần thiết trƣớc khi phân tích các chất nghiên cứu trên thiết bị

GC/MS. Với HPLC, có thể tách một số lƣợng lớn GA, nhƣng bằng cách kết hợp các

phần nhỏ để giảm số lƣợng các phần GA cần phân tích. SPE và HPLC là các

phƣơng pháp đƣợc lựa chọn để tinh chế mẫu còn GC/MS đƣợc sử dụng để phân tích

cuối cùng.

LC/MS chủ yếu đƣợc sử dụng để phân tích các liên hợp GA [102]. Mặc dù

có những trƣờng hợp GA đã đƣợc phân tích bằng LC/ESI-MS-MS trên một thiết bị

ba tứ cực [103], trong khi việc phân tích vết GA trong các mô cụ thể là không thể

hoặc chƣa thực hiện đƣợc bằng LC/MS. Thay vào đó, GC/SRM-MS đã đƣợc sử

dụng trong một công trình nghiên cứu công bố phân tích hàm lƣợng GA trong một

lƣợng nhỏ mô thực vật. Theo nghiên cứu này, nồng độ của GA1, GA4 và GA5 đƣợc

theo dõi trong các chóp Lolium trong quá trình cảm ứng ra hoa dài ngày [100].

Phƣơng pháp phân tích này yêu cầu giới hạn phát hiện thấp hơn 0,5 pg và độ thu hồi

cao trong quá trình chiết xuất. Do đó, việc phân tích đƣợc thực hiện mà không cần

tinh chế dịch chiết bằng HPLC, và để xác nhận danh tính của các GA đƣợc phân

tích, một số chiết xuất đã đƣợc bổ sung thêm các GA không nhãn. Phƣơng pháp

luận này rất hữu ích để xác nhận các phƣơng pháp và có thể rất hữu ích để phân biệt

các hợp chất quan tâm với các chất gây nhiễu.

1.6.2.3. Phương pháp phân tích các hợp chất cytokinin

Việc phân tích các cytokinin có liên quan đến một số vấn đề cụ thể liên quan

đến bản chất hóa học của các hợp chất. Ví dụ, để xác định chính xác hàm lƣợng

nucleotide cytokinin có trong mẫu, quá trình chiết cần phải đƣợc thực hiện cẩn thận

vì phosphatase có thể đƣợc kích hoạt trong quá trình chiết xuất. Một phƣơng pháp

phổ biến là chiết mẫu trong đệm Bielesky (60% MeOH, 25% CHCl3, 10% HCOOH

và 5% H2O) ở -20°C [104]. Các chất chiết xuất có thể đƣợc tinh chế thêm bằng cách

sử dụng các cột chiết pha rắn SPE trao đổi ion cation mạnh, ví dụ SPESCX, và sắc

ký anion SPEDEA, SPE-SAX. Sau đó có thể tách nucleotide khỏi base và riboside.

Một báo cáo liên quan đến cột SPE với cả vật liệu C18 và SCX (MCX) đã đƣợc sử

dụng để tách các cytokinin khác nhau [105]. Tinh chế cột ái lực miễn dịch cũng đã

đƣợc sử dụng rộng rãi trong phân tích cytokinin [106]. Mặc dù sắc ký ái lực miễn

dịch chậm, nhƣng ƣu điểm là các chất chiết xuất sạch, do đó đơn giản hóa việc phát

hiện cuối cùng bằng phƣơng pháp khối phổ.

Có một số phƣơng pháp tạo dẫn xuất cytokinin để phân tích trên thiết bị

GC/MS [107], nhƣng gần đây LC/MS là phƣơng pháp đƣợc ƣa thích để phân tích

cytokinin. Một số công trình nghiên cứu đã mô tả phân tích cytokinin bằng frit-FAB

LC/MS, là một kỹ thuật có thể cho độ nhạy cao, tuy nhiên, nó khá phức tạp [108].

Hiện nay, LC-ESI-MS là công cụ phân tích đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu các

cytokinin [109]. Mặc dù, cấu trúc của các hợp chất cytokinin phù hợp với việc phân

tích bằng chế độ ESI, nhƣng hiệu quả của việc phân tích có thể đƣợc cải thiện hơn

nữa bằng cách tạo dẫn xuất, điều này không chỉ làm tăng sự ion hóa ESI tuyệt đối

mà còn cải thiện các đặc tính sắc ký của cytokinin. Với việc tạo dẫn xuất, có thể

tách tất cả các hợp chất cytokinin chính, bao gồm các nucleotide, và đạt đƣợc giới

hạn phát hiện thấp.

* Nhận xét phần nghiên cứu tổng quan:

Từ các thông tin và dữ liệu đƣợc trình bày phần tổng quan, nghiên cứu sinh

nhận thấy:

- Các chất kích thích sinh trƣởng đóng vai trò quan trọng trong thúc đẩy sự

sinh trƣởng và phát triển của cây, rút ngắn thời gian sản xuất, tăng chất lƣợng và sản

lƣợng cây trồng, nâng cao hiệu quả sản xuất, tăng thu nhập cho ngƣời nông dân,

góp phần trong phát triển kinh tế xã hội của đất nƣớc.

- Nghiên cứu về sự tồn dƣ của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong

các mẫu rau xanh và trái cây trên thế giới còn hạn chế, và chƣa có công trình nào

công bố ở Việt Nam.

- Việc nghiên cứu xây dựng và phát triển phƣơng pháp phân tích các chất

điều hòa sinh trƣởng thực vật trên các đối tƣợng rau xanh và trái cây đã đƣợc các

nhà khoa học trên thế giới quan tâm và thực từ nhiều năm nay, nhƣng ở Việt Nam

đây vẫn là một trong những vấn đề mới, chƣa đƣợc công bố.

- Phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ đƣợc xem là phƣơng pháp tốt

nhất trong phân tích các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, bởi phƣơng pháp này

khắc phục các nhƣợc điểm của các phƣơng pháp còn lại, có khả năng định tính,

phân tách tốt, với độ chính xác cao.

- Trong nghiên cứu này, nghiên cứu sinh lựa chọn kỹ thuật sắc ký lỏng ghép

nối với đầu dò khối phổ bẫy ion để xây dựng và phát triển phƣơng pháp phân tích

đồng thời các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh. Phƣơng

pháp này đƣợc xác nhận và đánh giá trƣớc khi áp dụng để đánh giá dƣ lƣợng của

các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh thu thập ở một số

quận huyện của Hà Nội, và đánh giá mức độ tích lũy của chất kích thích sinh trƣởng

thực vật trong một số loại rau xanh. Kết quả của nghiên cứu này chính là cơ sở cho

việc nghiên cứu xác định dƣ lƣợng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

trong các sản phẩm rau xanh cũng nhƣ các loại trái cây và các sản phẩm nông

nghiệp khác.

CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

2.1.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

• Thiết bị sắc ký lỏng Ultimate 3000 HPLC system, cột sắc ký: C18 Hypersil

GOLD aQ (3 µm, 150 x 2.1 mm) (gọi tắt là cột Hypersil), cột Purospher ®

RP-18 endcapped (5 µm, 250 x 4,6 mm) (gọi tắt là cột Purospher) và thiết bị

phân tích khối phổ LCQ Fleet MS (Thermo Fisher Scientific, Germany).

• Thiết bị sản xuất nƣớc siêu sạch (Milli-Q Integral 3 Water Purification

System (Merck Millipore, France).

• Các thiết bị và dụng cụ phụ trợ khác: máy đồng nhất mẫu; máy ly tâm; máy

votex; lò vi sóng; máy siêu âm; bộ cô mẫu bằng khí nitơ; cân phân tích có độ

chính xác 0,0001 g; cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g; kim tiêm mẫu

Hamilton có dung tích 500 µL; tủ đông, tủ lạnh bảo quản mẫu; micropipete

các loại điều chỉnh đƣợc thể tích: 10-1000 µL; pipet Pasteur; ống ly tâm có

nắp kín Teflon 15 mL, 50 mL; lọ đựng mẫu có thể tích 1,8 mL, có màu nâu

dùng cho tiêm mẫu vào hệ thống LC; bình định mức, cốc, ống đong, kéo,

thìa, kẹp, nhíp….

2.1.2. Hóa chất thí nghiệm

2.1.2.1. Hóa chất

Các chất chuẩn có độ tinh khiết ≥ 98% gồm: IAA, IBA, ICA, IPA, GA3,

GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR và DHZR đƣợc mua từ công ty OlChemim Ltd.,

Cộng hòa Czech. Methanol, MeOH và Acetonitrile, ACN dùng cho HPLC có độ

tinh khiết 99,80%, đƣợc mua của Merck, Đức. Foocmic acid, FA và hydrochloric

acid, HCl 65% của Merck, Đức. Dung môi dichloromethane, 1-propanol và 2-

propanol mua của Sigma-Aldrich (Singapore). Thuốc kích thích sinh trƣởng thực

vật Gibber4TB sản xuất bởi Công ty TNHH Á Châu hóa sinh. Nitơ lỏng mua của

Công ty TNHH xuất nhập khẩu TM và DV Đại Dƣơng.

2.1.2.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc 1000 μg.mL-1: cân chính xác 10 mg mỗi

chất chuẩn chất kích thích sinh trƣởng thực vật, sau đó hòa tan trong bình định mức

10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 0,1% FA thêm đầy đến vạch tiêu chuẩn.

Dung dịch MeOH chứa 0,1% FA đƣợc chuẩn bị bằng cách pha 1 mL axít foocmic

trong 1 L MeOH. Các dung dịch chuẩn gốc đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ dƣới 0oC, có thể lƣu giữ và sử dụng trong thời gian 1 năm.

- Chuẩn bị dung dịch trung gian 100 μg.mL-1: Lấy 1 mL dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg.mL-1 của mỗi chất kích thích sinh trƣởng thực vật pha loãng

trong bình định mức 10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 0,1% FA thêm đầy đến vạch tiêu chuẩn. Dung dịch đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ từ 0-4oC, có thể lƣu

giữ và sử dụng trong 6 tháng.

- Chuẩn bị dung dịch trung gian 20 μg.mL-1: Lấy 2 mL dung dịch chuẩn có nồng độ 100 μg.mL-1 của mỗi chất kích thích sinh trƣởng thực vật pha loãng trong

bình định mức 10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 0,1% FA thêm đầy đến vạch tiêu chuẩn. Dung dịch đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ từ 0-4oC, có thể lƣu giữ

và sử dụng trong 6 tháng.

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp với nồng độ mỗi chất 1 μg.mL-1: Lấy 1 mL dung dịch chuẩn có nồng độ 20 μg.mL-1 của mỗi chất kích thích sinh trƣởng

thực vật cho vào cùng một bình định mức có dung tích 20 mL, sau định bổ sung

dung môi MeOH có chứa 0,1% FA đầy đến vạch tiêu chuẩn. Dung dịch đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ từ 0-4oC, có thể lƣu giữ và sử dụng trong 6 tháng.

- Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật làm việc gồm: 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 và 2000 ng.mL-1 đƣợc pha từ dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ mỗi chất 1 μg.mL-1 và 20 μg.mL-1 trong

dung môi MeOH có chứa 0,1% FA. Các dung dịch này chỉ pha khi cần sử dụng.

2.2. Đối tƣợng nghiên cứu

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu

Các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật thuộc ba nhóm: auxin (IAA,

IBA, ICA và IPA ), gibberellin (GA3, GA4 và GA7) và cytokinin (BA, iP, iPR, K,

DHZR, tZ, tZR).

2.2.2. Đối tượng phân tích

 Các mẫu rau cải xanh (Brassica juncea) đƣợc sử dụng để khảo sát, xây dựng

và đánh giá phƣơng pháp phân tích.

Hạt giống của các mẫu rau thí nghiệm đƣợc mua của Viện Nghiên cứu Rau

quả, Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội. Hạt giống rau đƣợc gieo và phát triển thành cây

con sau 7 ngày mới đƣa vào thùng xốp trồng thí nghiệm (kích thƣớc thùng: 40 cm ×

60 cm × 45 cm, đáy thùng đƣợc đục lỗ để thoát nƣớc). Khoảng cách giữa các cây và

các hàng là 12 cm × 15 cm. Đất trồng: sử dụng đất phù sa đƣợc lấy từ bãi bồi ở khu

vực ven sông Hồng thuộc địa phận xã Vĩnh Ngọc, huyện Đông Anh, thành phố Hà

Nội. Đất trồng trƣớc khi sử dụng đƣợc lấy mẫu phân tích đảm bảo không nhiễm

thuốc trừ sâu và các chất kích thích sinh trƣởng thực vật mới đƣa vào thí nghiệm. Phân bón: bón lót bằng phân chuồng hoai mục (1,0 kg.thùng-1) và phân lân (0,1 kg.thùng-1) ngay từ ban đầu. Không sử dụng thuốc điều hòa sinh trƣởng và các hóa

chất bảo vệ thực vật khác. Thời gian chuẩn bị mẫu: 42 ngày (tính từ ngày gieo hạt

đến ngày thu mẫu thí nghiệm). Địa điểm trồng: Thôn Ngọc Giang, xã Vĩnh Ngọc,

Huyện Đông Anh, Thành phố Hà Nội.

 Các mẫu rau xanh thu thập từ các mô hình sản xuất rau quy mô hàng hóa tại

một số quận/huyện thuộc thành phố Hà Nội.

 Các mẫu rau của thí nghiệm ứng dụng quy trình phân tích xác định sự tích

lũy của GA3 trong một số loại rau xanh.

2.2.3. Thu thập mẫu

- Mẫu phân tích đƣợc thu thập theo Tiêu chuẩn ngành 10TCN 386:1999 về

Phƣơng pháp lấy mẫu kiểm định chất lƣợng và dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực

vật [110].

- Các mẫu rau thí nghiệm phục vụ xây dựng và đánh giá phƣơng pháp phân

tích: đƣợc thu thập ở ngày phát triển thứ 35 sau khi chuyển ra trồng trong các

thùng xốp, bằng cách nhổ cả gốc, rửa sạch, cắt bỏ phần gốc, phần còn lại

đƣợc đông cứng bằng nitơ lỏng cho đến khi đƣợc xử lý và phân tích.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp khảo sát các điều kiện tối ưu của quy trình phân tích

2.3.1.1. Phương pháp khảo sát điều kiện khối phổ

Dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ 1 μg.mL-1 của mỗi hợp chất kích

thích sinh trƣởng thực vật đƣợc tiêm trực tiếp vào detector MS thông qua máy bơm tự động kết nối với syringe Hamilton với tốc độ dòng 5 µL.phút-1 để xác định các

ion phân tử và ion sản phẩm của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật theo các

chế độ ion hóa âm (-) và ion hóa dƣơng (+).

Khảo sát điều kiện của nguồn ion hóa phun điện tử với sự có mặt của hệ

dung môi pha động. Tiêm hỗn hợp dung dịch chuẩn của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật với nồng độ mỗi chất 1 μg.mL-1 vào hệ thống LC kết hợp với các

dung môi pha động gồm MeOH (+0,1% FA) và nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA, tốc độ dòng 0,5 mL.phút-1, không dùng cột sắc ký. Sử dụng phần mềm Xcalibur để điều

chỉnh và tối ƣu hóa các thông số trên máy gồm: nhiệt độ nguồn phun, tốc độ dòng

khí mang, tốc độ dòng khí bổ trợ, tốc độ dòng khí quét buồng ion hóa, điện thế

nguồn phun, nhiệt độ ống mao quản, điện thế ống mao quản và điện thế thấu kính

hội tụ của các ion. Khảo sát các điều kiện trong ESI bằng cách thay đổi hoặc tăng

giảm các thông số của máy để thu đƣợc cƣờng độ tín hiệu của các chất phân tích

cao nhất có thể.

2.3.1.2. Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký lỏng

a) Khảo sát cột phân tích và dung môi pha động:

- So sánh hiệu quả phân tách các chất kích thích sinh trƣởng thực vật giữa cột

Hypersil với cột Purospher.

- So sánh hiệu quả rửa giải các chất kích thích sinh trƣởng thực vật giữa hệ

dung môi MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA và hệ dung môi ACN

(+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA. Trong đó:

+ Dung dịch 0,1% axít foocmic đƣợc tạo thành bằng cách pha 1 mL axít

foocmic trong 1 L dung môi MeOH hoặc ACN và nƣớc siêu sạch.

+ Quá trình khảo sát cột phân tích và dung môi pha động đƣợc tiến hành

đồng thời với nhau; mỗi cột phân tích lần lƣợt đƣợc khảo sát khả năng phân tách

các chất kích thích sinh trƣởng thực vật khi sử dụng các tổ hợp pha động MeOH

(+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA và hệ dung môi ACN (+0,1% FA) +

nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA.

+ Chu trình gradient sử dụng các dung môi rửa giải ACN (+0,1% FA) hoặc

MeOH (+0,1% FA) (B) đƣợc khảo sát theo thứ tự: bắt đầu từ 10% B hoặc 20% B

hoặc 30% B, sau đó từ phút thứ 2 đến phút thứ 10 tăng lên 90% ACN, giữ 90%

ACN trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu

trình gradient. Tốc độ dòng dung môi đƣợc khảo sát gồm: 0,1; 0,3; 0,5; và 1 mL.phút-1. Tổng thời gian phân tích là 15 phút.

+ Hỗn hợp chuẩn chứa các chất kích thích sinh trƣởng thực vật có nồng độ mỗi chất 0,5 µg.mL-1 đƣợc bơm vào hệ thống LC-MS, theo dõi và đánh giá các

thông số nhƣ cƣờng độ tín hiệu píc, độ rộng chân píc, độ nhiễu và thời gian rửa

giải...

b) Khảo sát các điều kiện khác:

Sau khi lựa chọn đƣợc cột phân tích và dung môi pha động phù hợp cho việc

phân tách các chất kích thích sinh trƣởng thực vật, nghiên cứu sinh tiếp tục khảo sát

các điều kiện khác nhƣ:

- Tốc độ dòng dung môi gồm: 0,1 mL.phút-1; 0,3 mL.phút-1; 0,5 mL.phút-1...

- Chế độ rửa giải gradient với các tỷ lệ dung môi pha động thay đổi khác

nhau: tăng dần từ 10%, 20%, 30%...

Các thông số sau đƣợc cố định trong quá trình khảo sát các điều kiện trên

gồm:

 Cột sắc ký: C18 Hypersil GOLD aQ (3 µm, 150 × 2.1 mm)

 Nhiệt độ cột phân tích: 40oC  Bộ phận bơm mẫu tự động đƣợc duy trì ở điều kiện nhiệt độ 10oC để đảm

bảo các chất phân tích không bị ảnh hƣởng bởi điều kiện bên ngoài.

 Thể tích bơm mẫu: 10 µL

 Thời gian phân tích mẫu: 15 phút/mẫu

 Điều kiện khối phổ: đƣợc kiểm soát theo các chế độ đƣợc tối ƣu hóa ở

trên.

2.3.2. Phương pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Phƣơng pháp tách chiết các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các

mẫu rau xanh đƣợc phát triển dựa trên cơ sở phƣơng pháp tách chiết các hoocmon

thực vật ở loài cây Arabidopsis thaliana thuộc Họ Cải, ở Columbia theo nghiên cứu

của Xiangqing và cộng sự sử dụng dung môi chiết 1-propanol/H2O/HCl (2 : 1 :

0,002, v/v/v) và Dichloromethane; đƣợc mô tả ở Hình 2.1 [83].

Cho vào ống 2,0 mL và đông cứng bằng nitơ lỏng

Bƣớc 1: Lấy 50 mg mẫu

Thêm 500 µL 1-propanol/H2O/HCl (2:1:0.002)

Trong 30 phút ở 4oC

Bƣớc 3: Lắc mẫu

Thêm 1 mL Dichloromethane

Trong 30 phút ở 4oC

Bƣớc 2: Nghiền mẫu

Bƣớc 4: Lắc mẫu (lần 2)

4000 vòng.phút-1 trong 5 phút

Bƣớc 6: Hút 1 mLdd lớp dƣới

Thổi khô bằng nitơ, hòa tan bằng MeOH

Bƣớc 5: Ly tâm mẫu

Bƣớc 7: Đo trên LC/ESI/MS

Hình 2.1. Quy trình tách chiết và phân tích các hoocmon thực vật trong mẫu cây

thuộc Họ Cải theo nghiên cứu của Xiangqing và cộng sự [83]

Bước 1: Lấy 50 mg mẫu tƣơi cho vào lọ đựng mẫu 2,0 mL, có nắp đậy kín, sau đó

đông cứng mẫu trong nitơ lỏng cho đến khi phân tích.

Bước 2: Nghiền nhỏ mẫu rồi thêm 500 µL 1-propanol/H2O/HCl (2:1:0.002, v/v/v).

Bước 3: Rung lắc trong thời gian 30 phút, ở nhiệt độ 4oC.

Bước 4: Thêm 1 mL dung dịch Dichloromethane và rung lắc mẫu lần 2 trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 4oC.

Bước 5: Ly tâm mẫu với tốc độ 4000 vòng.phút-1 trong thời gian 5 phút.

Bước 6: Sau khi ly tâm, có hai lớp chất lỏng khác nhau đƣợc tạo thành và các mảnh

vụn thực vật phân bố ở giữa hai lớp. Tiến hành hút 1 mL phần dung dịch ở lớp phía

dƣới bằng pipet Pastuer thủy tinh cho vào lọ thủy tinh có dung tích 15 cm, sau đó cô

cạn bằng dòng khí nitơ, rồi hòa tan các chất phân tích trong 1 mL dung môi MeOH.

Bước 7: Bơm mẫu trực tiếp vào thiết bị HPLC-ESI-MS2 để phân tích.

Thay thế dung môi chiết 1-propanol bằng dung môi 2-propanol, sau đó, biến

đổi và bổ sung một số bƣớc cần thiết trong quy trình nghiên cứu của Xiangqing và

cộng sự [83] nhƣ: tăng khối lƣợng mẫu sử dụng, bổ sung các bƣớc chiết siêu âm,

phân tích phần dịch trong suốt và lọc mẫu qua màng PTFE 0,22 µm trƣớc khi phân

tích trên thiết bị khối phổ. Thực hiện so sánh hiệu quả chiết giữa quy trình sử dụng

1-propanol với 2-propanol theo phƣơng pháp đƣọc nghiên cứu bởi Xiangqing và

cộng sự [83], đồng thời so sánh hiệu quả chiết của quy trình đƣợc phát triển và biến

đổi khi sử dụng các dung môi chiết 1-propanol và 2-propanol.

Các mẫu rau thí nghiệm đƣợc xay nhỏ và đồng nhất, sau đó đƣợc sử dụng để

đánh giá phƣơng pháp tách chiết các chất kích thích sinh trƣởng thực vật thông qua

các mẫu "pool" [111] với 3 nhóm thí nghiệm, gồm:

Nhóm 1: các mẫu rau thí nghiệm đƣợc xử lý theo các quy trình nghiên cứu

và xây dựng.

Nhóm 2: thêm chuẩn hỗn hợp các chất kích thích sinh trƣởng thực vật với nồng độ trung bình của mỗi chất là 0,1 µg.mL-1 vào các mẫu rau rồi tiến hành xử lý

theo các quy trình nghiên cứu và xây dựng.

Nhóm 3: tiến hành xử lý các mẫu rau thí nghiệm theo các quy trình nghiên

cứu và xây dựng, sau đó thêm chuẩn hỗn hợp các chất kích thích sinh trƣởng thực vật với nồng độ trung bình của mỗi chất là 0,1 µg.mL-1.

Trong đó: mỗi nhóm thí nghiệm đƣợc bố trí lặp lại 5 lần.

Hiệu suất của mỗi phƣơng pháp tách chiết đƣợc đánh giá theo công thức:

R (%) =

Với: A, B và C lần lƣợt là diện tích píc của các chất phân tích trong các mẫu

rau thuộc nhóm 1, 2 và 3; i - là chất kích thích sinh trƣởng.

2.3.3. Phương pháp xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân

tích

Các kết quả nghiên cứu thu đƣợc từ việc xác định điều kiện tách chiết mẫu

và tối ƣu hóa điều kiện phân tích của thiết bị sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ sẽ

đƣợc xây dựng thành quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trƣởng

thực vật trong các mẫu rau xanh.

Quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trƣởng thực vật đƣợc

xác nhận và thẩm định nhằm khẳng định tính phù hợp của phƣơng pháp phân tích.

Các chỉ tiêu đƣợc đánh giá và thẩm định bao gồm: độ ổn định của mẫu, đƣờng

chuẩn, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng, ảnh hƣởng của nền mẫu, hiệu suất

thu hồi và độ chính xác của phƣơng pháp phân tích.

(1) Độ ổn định của chu kỳ đông/rã đông mẫu: đƣợc đánh giá thông qua việc phân tích các mẫu rau thí nghiệm đƣợc thêm chuẩn ở các nồng độ thấp (10 ng.mL–1) và cao (2000 ng.mL–1) so với đƣờng chuẩn vào trƣớc và sau 3 chu trình đông/rã

đông (bảo quản mẫu). Mỗi nồng độ đƣợc phân tích lặp lại 6 lần. Độ ổn định của

phƣơng pháp chính là tỷ lệ phần trăm diện tích píc của chất phân tích trong mẫu sau

bảo quản so với diện tích píc của mẫu trƣớc bảo quản ở cùng nồng độ thêm chuẩn.

( )

Trong đó: SSBQ và STBQ lần lƣợt là diện tích píc của chất phân tích trong mẫu sau bảo quản và trong mẫu trƣớc bảo quản

(2) Đường chuẩn: Xác định đƣờng chuẩn của các chất kích thích sinh trƣởng

thực vật bằng cách đo các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau, gồm: 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 và 2000 ng.mL-1; trong đó, mỗi nồng độ tiến hành phân tích

lặp lại 6 lần. Khảo sát sự tƣơng quan giữa nồng độ và tín hiệu chất phân tích thu

đƣợc. Tùy theo đối tƣợng mẫu phân tích mà xây dựng đƣờng chuẩn trên chính nền

mẫu đó. Đƣờng chuẩn của mỗi chất kích thích sinh trƣởng thực vật có thể là toàn bộ

hoặc một phần khoảng tuyến tính, đƣợc xây dựng dựa trên việc tính toán diện tích

píc, sử dụng trong quá trình xác minh và định lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng

thực vật có trong các mẫu rau.

Đƣờng chuẩn của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau

xanh có dạng: y = ax + b; trong đó: a là hệ số góc và b là giá trị hệ số chặn; hệ số

tƣơng quan R:

R =

Nếu 0,995 < R ≤ 1: có tƣơng quan tuyến tính rõ rệt

(3) Giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (MQL): Giới hạn phát

hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp phân tích đƣợc tính toán dựa trên tỷ lệ

cƣờng độ tín hiệu của chất phân tích so với đƣờng nền bằng cách thêm chuẩn 10 ppb vào nền mẫu rồi phân tích trên thiết bị LC-ESI-MS2. Trong đó, MDL = 3 × S/N

và MQL = 10 × S/N, hay MQL = 10/3 × S/N [112].

(4) Ảnh hưởng của nền mẫu (ME): nền mẫu có thể làm tăng cƣờng hoặc suy

giảm tín hiệu của chất cần phân tích, đƣợc đánh giá và biểu thị nhƣ là tỷ lệ phần

trăm giữa cƣờng độ tín hiệu của chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn sau

chiết và mẫu chuẩn trong dung môi:

( )

Trong đó: SMT và SMC lần lƣợt là diện tích píc của chất cần phân tích trong

mẫu trắng thêm chuẩn sau chiết và trong mẫu chuẩn dung môi.

(5) Độ thu hồi và độ chính xác của phương pháp:

Độ thu hồi là giá trị dùng để đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp phân

tích, đƣợc tính toán bằng cách so sánh hàm lƣợng mỗi chất kích thích sinh trƣởng

thực vật có trong các mẫu thêm chuẩn/ chiết xuất và mẫu chiết/ thêm chuẩn.

( )

Trong đó: STC và SC lần lƣợt là diện tích píc của chất cần phân tích trong mẫu

trắng thêm chuẩn/ chiết và trong mẫu chiết/ thêm chuẩn.

Độ chính xác của phƣơng pháp đƣợc biểu thị bằng độ lặp lại hay độ lệch

chuẩn tƣơng đối (RSD%) của việc xác định hiệu suất thu hồi ở ba mức nồng độ gồm: 10 ng.mL–1 (mức thấp), 100 ng.mL–1 (mức trung bình) và 1000 ng.mL–1 (mức

cao). Mỗi nồng độ phân tích 6 lần, độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tƣơng đối

RSD đƣợc tính theo các công thức sau:

RSD (%) =

Trong đó: SD: độ lệch chuẩn

n: số thí nghiệm

xi: Giá trị tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ “i” x: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm RSD (%): Độ lệch chuẩn tƣơng đối

(6) So sánh với một số phòng thí nghiệm

Bố trí 3 mẫu thử nghiệm gồm mẫu 1, mẫu 2 và mẫu 3 có hàm lƣợng mỗi chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong mẫu lần lƣợt là 10, 100 và 1000 ng.mL-1.

Thực hiện phân tích 3 mẫu này theo phƣơng pháp đã xây dựng tại Phòng Thí

nghiệm Trọng điểm về An toàn Thực phẩm và Môi trƣờng – Trung tâm Nghiên cứu

và Chuyển giao Công nghệ (viết tắt là PTN ATTP), đồng thời gửi các mẫu này tới

các phòng thí nghiệm khác nhau để phân tích đối chứng nhằm so sánh và đánh giá

kết quả phân tích của phƣơng pháp.

Các phòng thí nghiệm phân tích đối chứng gồm:

(1) Trung tâm Công nghệ Môi trƣờng tại Tp. Hồ Chí Minh. Vilas 450 (TTMT

HCM)

(2) Phòng Hóa sinh môi trƣờng, Viện Hóa học (PTN VHH)

(3) Phòng Phân tích Hóa học - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (PTN

HCTN)

Thực hiện so sánh kết quả phân tích giữa các phòng thí nghiệm thông qua hệ

số z-score [113] đƣợc tính toán theo công thức:

z =

Trong đó: z là độ lệch của phƣơng pháp phân tích

là kết quả phân tích trung bình của PTN

A là giá trị ấn định

SD là độ lệch chuẩn để đánh giá thành thạo

Giá trị z phản ánh mức độ sai lệch của kết quả phân tích theo thứ tự:

ǀzǀ ≤ 2: đạt

2 < ǀzǀ < 3: cần xem xét lại

ǀzǀ ≥ 3: có số lạc

2.3.4. Phương pháp đánh giá dư lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật

trong các mẫu rau thu thập tại Hà Nội

Hình 2.2. Các khu vực nghiên cứu và thu thập mẫu rau

(Địa điểm thu thập mẫu rau được biểu thị bằng màu xám)

Tổng số 111 mẫu rau cải xanh đƣợc thu thập ở các quận/huyện thuộc thành

phố Hà Nội gồm: Huyện Đông Anh, Huyện Gia Lâm, Huyện Mê Linh, Huyện Sóc

Sơn, Quận Hoàng Mai và Huyện Phúc Thọ với số mẫu tƣơng ứng là 19, 27, 30, 14,

11 và 10 (Hình 2.2). Các mẫu rau đƣợc thu thập ở ngày phát triển thứ 35-40, có 5-7

lá thật, với kích thƣớc tƣơng đồng nhau. Mỗi mẫu rau đƣợc lấy ngẫu nhiên theo

hình chữ X với lƣợng khoảng > 1kg/mẫu trên một thửa ruộng, trong khoảng thời

gian từ tháng 1 đến tháng 3 năm 2019 (cách thời điểm thu hoạch khoảng 7-10

ngày). Các mẫu rau đƣợc thu vào buổi sáng, nguyên cả cây và bảo quản mát trong

các thùng nhựa chuyên dụng, sau đó đƣợc vận chuyển về phòng thí nghiệm, rửa

sạch, loại bỏ rễ, phần còn lại đƣợc đông cứng trong nitơ lỏng và bảo quản ở điều kiện dƣới 4oC trong các tủ lạnh cho đến khi đƣợc phân tích.

- Tiến hành xử lý và phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong

các mẫu rau xanh thu thập ở các khu vực nghiên cứu theo phƣơng pháp đƣợc xây

dựng và đánh giá ở các mục 2.3.1, 2.3.2 và 2.3.3.

- So sánh dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu

phân tích với các quy định về giới hạn dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực

vật của Việt Nam, và một số quốc gia trên thế giới nhƣ: Nhật Bản, Mỹ và châu Âu...

2.3.5. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thực

vật đến sự phát triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng

2.3.5.1. Bố trí thí nghiệm

Các loại rau thí nghiệm: rau cải xanh (Brasssica juncea), rau mồng tơi

(Basella alba) và rau xà lách (Lactuca sativa)

Hạt giống, đất trồng, phân bón sử dụng trong thí nghiệm tƣơng tự mục

2.3.1.1.

Hóa chất thí nghiệm: Thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật Gibber4TB, có

chứa hoạt chất kích thích sinh trƣởng GA3 100% (Hình 2.3).

Hình 2.3. Thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật Gibber4TB

Các công thức thí nghiệm xử lý thuốc Gibber4TB gồm các nồng độ thuốc khác nhau: Đối chứng (0 mg.L-1), 10 mg.L-1, 30 mg.L-1, 50 mg.L-1 và 100 mg.L-1.

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo sơ đồ mô tả ở Hình 2.7, trong đó, mỗi công thức đƣợc

bố trí lặp lại 3 lần.

Rau cải xanh Rau mồng tơi Rau xà lách

Hình 2.4. Mô hình thí nghiệm đánh giá sự tích lũy của chất kích thích sinh trƣởng

thực vật trong một số loại rau xanh

Rau thí nghiệm sau khi chuyển ra trồng 7 ngày mới bắt đầu tiến hành xử lý

thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật. Việc xử lý thuốc kích thích sinh trƣởng đƣợc

thực hiện vào cuối buổi chiều các ngày thí nghiệm thứ 7, 14 và 21.

Thí nghiệm đƣợc bố trí ngoài trời, có thiết kế mái che bằng cách kéo căng bạt

tránh bị ảnh hƣởng bởi trời mƣa.

Thời gian thí nghiệm: từ tháng 1 đến tháng 3 năm 2019.

Địa điểm thí nghiệm: Thôn Ngọc Giang, xã Vĩnh Ngọc, huyện Đông Anh,

Thành phố Hà Nội.

2.3.5.2. Phương pháp đánh giá sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thực

vật đến sự phát triển của các loại rau

Các chỉ tiêu đánh giá gồm: chiều cao, số lƣợng lá và sinh khối tƣơi của các

loại rau giữa các nghiệm thức thí nghiệm.

Các chỉ tiêu đánh giá đƣợc xác định vào buổi sáng, ở các thời điểm: ngày thí

nghiệm thứ 1, 7, 14, 21 và 35. Số liệu nghiên cứu là giá trị trung bình của 6 cây rau

ngẫu nhiên của mỗi nghiệm thức thí nghiệm. Trong đó:

- Chiều cao của rau đƣợc tính bằng cách sử dụng thƣớc kéo đo khoảng cách

từ vị trí thân tiếp giáp với mặt đất cho tới đỉnh ngọn của cây rau.

- Số lƣợng lá rau đƣợc tính bằng cách đếm những lá có mặt trên mỗi cây.

- Sinh khối của rau: đƣợc tính bằng cách cắt bỏ phần rễ và rửa sạch rau, để

ráo nƣớc, rồi lấy khăn giấy thấm khô nƣớc trƣớc khi cân trên cân kỹ thuật có độ

chính xác 0,01 g.

2.3.5.3. Phương pháp đánh giá sự tích lũy của chất kích thích sinh trưởng thực vật

trong các loại rau

Mẫu rau của mỗi nghiệm thức thí nghiệm trên từng loại rau đƣợc thu thập từ

6 cây ngẫu nhiên, sau đó rửa sạch, cắt rễ và đông cứng bằng nitơ lỏng vận chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản ở điều kiện -20oC trong tủ đông cho đến khi đƣợc

xử lý và phân tích theo quy trình đƣợc nghiên cứu và xây dựng ở mục 3.3. Trong

đó, tùy theo loại rau mà xây dựng các đƣờng chuẩn của các chất kích thích sinh

trƣởng thực vật tƣơng ứng phục vụ cho việc định lƣợng chúng trong các mẫu rau thí

nghiệm.

2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu

Hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh đƣợc

tính toán trên phần mềm Xcalibur 2.0 sử dụng đƣờng ngoại chuẩn. Kết quả nghiên

cứu đƣợc trình bày dƣới dạng TB ± độ lệch chuẩn (SD). Phân tích thống kê đƣợc

thực hiện bằng cách sử dụng biểu đồ hộp (box and whisher plots) sử dụng phần

Microsoft Excel 2016 (Redmond, WA, USA, Microsoft Corp). Trong đó, giá trị

trung bình đƣợc tính theo các công thức sau:

Trong đó: là trung bình cộng

a1, a2,...., an là các giá trị xác định tƣơng ứng lần thứ 1, 2, ..., n.

n là số các số hạng

Công thức tính giá trị trung vị:

Me =

Trong đó: Me là số trung vị

là lƣợng biến đứng ở vị trí

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát các điều kiện tối ƣu của quy trình phân tích các chất kích thích

sinh trƣởng thực vật trong rau

3.1.1. Khảo sát điều kiện phân tích khối phổ

3.1.1.1. Khảo sát mức năng lượng phân mảnh của các ion

Độ nhạy và độ chính xác cao của các thí nghiệm phân tích LC-ESI-MS, đặc

biệt là khi sử dụng phƣơng pháp quan sát phản ứng chọn lọc, khiến cho hệ thiết bị

phân tích này phù hợp với việc nghiên cứu định lƣợng các loại chất kích thích sinh

trƣởng thực vật. Có hai giai đoạn chính trong việc lựa chọn ion của các hợp chất

nghiên cứu ở các thí nghiệm MS-SRM, đó là: giai đoạn thứ nhất: ion phân tử hay

còn gọi là ion mẹ đƣợc lựa chọn và phân mảnh dƣới điều kiện kiểm soát nhất định,

hình thành nên các mảnh ion đặc trƣng đƣợc lựa chọn cho giai đoạn 2. Độ đặc trƣng

của các thí nghiệm SRM phụ thuộc nhiều vào sự lựa chọn quá trình chuyển đổi từ

ion mẹ thành các ion sản phẩm, trong khi độ nhạy phụ thuộc vào cƣờng độ tín hiệu

và sự ổn định của cả các ion mẹ và các ion sản phẩm. Hơn nữa, việc lựa chọn các

ion mẹ và các ion sản phẩm phân mảnh cũng nhƣ cơ chế phân mảnh có sự khác

nhau giữa các loại thiết bị phổ khối khác nhau, ví dụ: khối phổ bẫy ion, khối phổ ba

tứ cực, khối phổ tứ cực thời gian bay... Trong đó, các thiết bị phổ khối bẫy ion

thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi do có tính linh hoạt, khả năng thực hiện các phân tích

đồng thời nhiều giai đoạn và chi phí đầu tƣ thấp hơn so với khối phổ ba tứ cực và tứ

cực thời gian bay. Những ƣu điểm này làm cho khối phổ bẫy ion thƣờng đƣợc lựa

chọn cho các phân tích định tính, sàng lọc và định lƣợng các hợp chất [114].

Trong nghiên cứu này, tất cả các thông số kỹ thuật áp dụng cho quá trình ion

hóa, phân mảnh và phát hiện chất kích thích sinh trƣởng thực vật đều đƣợc tối ƣu

hóa để đạt đƣợc độ nhạy và độ chọn lọc tốt nhất khi phân tích trên thiết bị khối phổ

bẫy ion. Việc xác nhận và định lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật và

các chất chuyển hóa chính của chúng đƣợc thực hiện trên thiết bị phân tích khối phổ

LCQ Fleet MS có trang bị nguồn ion hóa điện hóa. Dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ 1 μg.mL-1 của mỗi chất kích thích sinh trƣởng thực vật đƣợc tiêm trực tiếp

vào detector MS thông qua máy bơm tự động kết nối với syringe Hamilton với tốc

độ dòng 5 µL.phút-1 để xác định các ion phân tử và ion sản phẩm của các chất kích

thích sinh trƣởng thực vật theo các chế độ ion hóa âm và ion hóa dƣơng. Lựa chọn

ba ion sản phẩm tƣơng ứng với mỗi chất kích thích sinh trƣởng thực vật, trong đó,

ion có tín hiệu lớn nhất và ổn định nhất đƣợc dùng cho mục đích định lƣợng, hai ion

còn lại đƣợc sử dụng làm ion xác nhận chất phân tích.

Hình 3.1. Kết quả khảo sát năng lƣợng phân mảnh ion của các chất KTST

Để tối ƣu hóa mức năng lƣợng phân mảnh các ion của các chất kích thích

sinh trƣởng thực vật trên thiết bị phân tích khối phổ, các thông số độ rộng phân

mảnh và giá trị hoạt hóa lần lƣợt đƣợc cố định ở các giá trị bằng 2,0 Da và 0,25. Cả

hai chế độ ion hóa âm và ion hóa dƣơng đều đƣợc khảo sát nhằm lựa chọn chế độ

ion hóa có cƣờng độ tín hiệu của các chất phân tích cao nhất. Mức năng lƣợng phân

mảnh các ion của mỗi chất phân tích đƣợc thay đổi bằng cách tăng dần cho đến khi

thu đƣợc độ nhạy và tín hiệu của các ion mẹ và ion sản phẩm ổn định với tỷ lệ tín

hiệu của ion mẹ bằng khoảng 20% so với tín hiệu của ion sản phẩm. Kết quả khảo

sát mức năng lƣợng phân mảnh tối ƣu của các ion chất kích thích sinh trƣởng thực

vật đƣợc mô tả ở các Hình 3.1, mỗi hợp chất có 3 phân mảnh ion chính đƣợc lựa

chọn và biểu thị bằng 3 màu khác nhau, trong đó, màu đỏ biểu thị cho mảnh ion

định lƣợng, còn các màu xanh biểu thị cho các mảnh ion xác nhận.

Ion mẹ

Hợp chất

Act Q Năng lƣợng phân mảnh và các ion sản phẩm Ion

Ion

Chế độ ion hóa

ISO width (Da)

174

2,0

0,250

CE (V) 26

định lƣợng 146

IAA

IBA

202

2,0

0,250

158

ICA

160

2,0

0,250

116

IPA

188

2,0

0,250

144

345

2,0

0,250

239

GA3

331

2,0

0,250

313

GA4

329

2,0

0,250

223

GA7

226

2,0

0,250

DHZR

354

2,0

0,250

222

204

2,0

0,250

136

iPR

336

2,0

0,250

204

216

2,0

0,250

148

220

2,0

0,250

202

tZR

352

2,0

0,250

220

CE (V) 28 30 28 20 22 20 30 27 18 20 24 29 18 21 25 18 28 26 21 18 28 35 28 31 30 28 26 32

xác nhận 131 116 116 144 144 133 116 133 301 283 287 269 267 255 148 209 148 136 148 175 148 136 135 81 136 148 202 136

Bảng 3.1. Các điều kiện tối ƣu hóa của khối phổ trong phân tích các chất KTST

Ghi chú: (-) chế độ ion hóa âm, (+) chế độ ion hóa dƣơng

Các chất kích thích sinh trƣởng thực vật đƣợc phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng phổ khối theo chế độ ESI-MS2, trong đó bảy loại chất kích thích sinh trƣởng:

IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, và GA7 đƣợc phân tích theo chế độ ion hóa âm [M-H]−, trong khi bảy loại chất kích thích sinh trƣởng khác gồm BA, iP, iPR, tZ, K, DHZR và tZR đƣợc phân tích theo chế độ ion hóa dƣơng [M+H]+. Các ion phân tử

và ion sản phẩm tạo thành của mỗi hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật đƣợc

xác định thông qua các chất chuẩn, và quá trình chuyển hóa từ ion mẹ sang các ion

sản phẩm tƣơng ứng với hƣớng phân mảnh chính đặc trƣng cho từng chất kích thích

sinh trƣởng thực vật đƣợc lựa chọn trên cơ sở tối ƣu hóa mức năng lƣợng phân

mảnh. Bảng 3.1 biểu thị điều kiện tối ƣu hóa của khối phổ trong phân tích các chất

kích thích sinh trƣởng thực vật.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, mức năng lƣợng phân mảnh tối ƣu của các ion

định lƣợng của các chất thuộc nhóm gibberellin dao động ở mức 22-23 V, nhóm

auxin ở mức 23-26 V, và nhóm cytokinin ở mức 22-28 V. Các hợp chất kích thích

sinh trƣởng thuộc nhóm auxin gồm IAA, IBA, ICA và IPA có thể đƣợc định lƣợng

thông qua các mảnh ion đƣợc lựa chọn lần lƣợt gồm: 146, 158, 116 và 144 m/z; và

các mảnh ion xác nhận tƣơng ứng với IAA là 131 và 116 m/z; IBA là 116 và 144

m/z; ICA là 144 và 133 m/z; IPA là 116 và 134 m/z. Trong khi đó 239, 313 và 223

m/z là những mảnh ion chính cùng với các mảnh ion xác nhận tƣơng ứng gồm 301

và 283; 287 và 269; 267 và 256 của các hợp chất thuộc nhóm gibberellin: GA3, GA4

và GA7. Đặc biệt, các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật thuộc nhóm

cytokinin nhƣ: BA, DHZR, iP, iPR, K, tZ và tZR lần lƣợt đƣợc phát hiện bởi các

mảnh ion có tín hiệu cao nhất lần lƣợt gồm: 91, 222, 136, 204, 148, 202 và 220 m/z;

và các mảnh ion xác nhận tƣơng ứng là 148 và 209; 148 và 136; 148 và 175; 148 và

136; 135 và 81; 136 và 148; 202 và 136 m/z (Bảng 3.1). Các phân mảnh ion đặc

trƣng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh phân tách

ở mức năng lƣợng phân mảnh ion tối ƣu đƣợc biểu thị ở Hình 3.2.

Hình 3.2. Phân mảnh ion đặc trƣng của các chất KTST ở điều kiện tối ƣu hóa

Trong nghiên cứu trƣớc đây, Sheila và cộng sự [114] chọn 223 và 136 m/z là

các mảnh ion chính trong các chuyển hóa của các ion mẹ tƣơng ứng của GA7 và iP.

Năm 2013, Terezie và ctv chỉ ra rằng mảnh ion mẹ 345 m/z của GA3 trong các mô

thực vật đã chuyển hóa thành mảnh con 239 m/z dƣới điều kiện phân tích LC ghép

nối với hệ thống ESI-MS/MS [115]. Theo Xiangqing và cộng sự, các mảnh ion 116

và 158 m/z lần lƣợt đƣợc lựa chọn là các ion định lƣợng của ICA và IBA [83].

Ondrej và ctv [116] đã sử dụng HPLC-ESI-MS/MS để phân tích các hợp chất kích

thích sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinin nhƣ iP và BA trong các mô thực vật, thông

qua các ion sản phẩm tƣơng ứng là 136 và 91 m/z. Trong một nghiên cứu khác,

Izumi và cộng sự [117] đã báo cáo 204 và 220 m/z lần lƣợt là các mảnh ion sản

phẩm chính của iPR và tZR, trong khi 144 m/z đƣợc xác định là ion định lƣợng của

IPA. Đây là một số kết quả nghiên cứu đã đƣợc báo cáo liên quan đến quá trình

chuyển hóa từ ion mẹ thành các ion sản phẩm của các hợp chất kích thích sinh

trƣởng thực vật: GA3, GA7, iP, iPR, tZR, IBA, ICA, BA và IPA. Tuy nhiên, các ion

định lƣợng của các hợp chất IAA, GA4 và tZ, lần lƣợt đƣợc ghi nhận là 130 m/z

[83], 287 m/z [114] và 136 m/z [116], khác với những mảnh ion chính theo nghiên

cứu của chúng tôi là: 142, 313 và 202 m/z. Chƣa có nghiên cứu nào công bố sự

chuyển hóa từ ion mẹ thành các ion sản phẩm của các hợp chất kích thích sinh

trƣởng thực vật K và DHZR.

Những kết quả nghiên cứu trên cho thấy rằng thiết bị phân tích khối phổ bẫy

ion đóng vai trò then chốt trong việc phân tích các hợp chất kích thích sinh trƣởng

thực vật và phƣơng pháp giám sát phản ứng chọn lọc có thể đƣợc sử dụng để phát

hiện quá trình chuyển hóa từ ion mẹ thành các ion sản phẩm một cách tiện lợi và

kinh tế, với độ nhạy và độ chọn lọc cao. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là nghiên

cứu đầu tiên nghiên cứu phân tích đồng thời 14 hợp chất kích thích sinh trƣởng thực

vật: IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, GA7, BA, iP, iPR, tZ, K, DHZR, và tZR trong

các mẫu thực vật.

3.1.1.2. Khảo sát các hướng phân mảnh của các chất KTST

Các hƣớng phân mảnh của các hợp chất auxin: IAA, IBA, ICA, IPA và các

hợp chất gibberellin: GA3, GA4, GA7 đƣợc nghiên cứu theo chế độ ion hóa âm [M- H]-, còn các hợp chất cytokinin nhƣ: BA, DHZR, K, iP, iPR, tZ và tZR đƣợc khảo sát theo chế độ ion hóa dƣơng [M+H]+. Trong đó, mỗi hợp chất đƣợc nghiên cứu

lựa chọn theo 3 hƣớng phân mảnh khác nhau với các ion sản phẩm đặc trƣng tƣơng

ứng cho mỗi hƣớng dựa trên các mức năng lƣợng phân mảnh khác nhau. Công thức

hóa học và công thức phân tử của các sản phẩm chuyển hóa đƣợc dự đoán nhƣ sau:

a. Các ion sản phẩm của hợp chất IAA

Hợp chất IAA có khối lƣợng phân tử là 175 với công thức phân tử là C10H9NO2 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.3. Ở chế độ ion âm [M-H]-,

hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 174 với mảnh phổ nhƣ trong Hình 3.2. Các

ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 174 là mảnh phổ 146 (mất đi 28 khối

lƣợng); mảnh 131 (mất đi 43 khối lƣợng) và mảnh 116 (mất đi 58 khối lƣợng). Theo

đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ IAA

đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.3.

C9H9NO Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 26 V, CO bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 174 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 146, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C9H9NO.

C9H9N Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 28 V, COOH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 174 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 131 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C9H9N. C10H9NO2

C8H7N

Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 30 V, CH2COOH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 174 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 116 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C8H7N.

Hình 3.3. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IAA

b. Các ion sản phẩm của hợp chất IBA

Hợp chất IBA có khối lƣợng phân tử là 203 với công thức phân tử là

C12H13NO2 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.4. Ở chế độ ion âm [M- H]-, hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 202 với mảnh phổ nhƣ trong Hình 3.2.

Các ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 202 là mảnh phổ 158 (mất đi 44 khối

lƣợng); mảnh 116 (mất đi 86 khối lƣợng) và mảnh 144 (mất đi 58 khối lƣợng). Theo

đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ IBA

đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.4.

C11H13N Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 23 V, CH2OH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 202 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 158, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C11H13N.

C8H7N C12H13NO2 Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 28 V, C4H8OH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 202 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 116 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C8H7N

C10H11N Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 20 V, C2H4OH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 202 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 144 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C10H11N.

Hình 3.4. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IBA

c. Các ion sản phẩm của hợp chất ICA

Hợp chất ICA có khối lƣợng phân tử là 161 với công thức phân tử là C9H7NO2 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.5. Ở chế độ ion âm [M-H]-,

hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 160 với mảnh phổ nhƣ trong Hình 3.2. Các

ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 160 là mảnh phổ 116 (mất đi 44 khối

lƣợng); mảnh 144 (mất đi 16 khối lƣợng) và mảnh 133 (mất đi 27 khối lƣợng). Theo

đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ ICA

đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.5.

Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 26 V, COOH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 160 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 116, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C8H7N.

Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 22 V, OH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 160 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 144 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C9H7NO.

C8H7N

C9H7NO C9H7NO2

Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 20 V, O bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 160 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 133 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C8H7NO.

C8H7NO

Hình 3.5. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất ICA

d. Các ion sản phẩm của hợp chất IPA

Hợp chất IPA có khối lƣợng phân tử là 189 với công thức phân tử là

C11H11NO2 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.6. Ở chế độ ion âm [M- H]-, hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 188 với mảnh phổ nhƣ trong Hình 3.2.

Các ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 188 là mảnh phổ 144 (mất đi 44 khối

lƣợng); mảnh 116 (mất đi 72 khối lƣợng) và mảnh 133 (mất đi 55 khối lƣợng). Theo

đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ IPA

đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.6.

C10H11N Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 25 V, COOH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 188 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 144, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C10H11N.

C8H7N

Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 30 V, C4H8COOH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 188 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 116 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C8H7N

C11H11NO2

C8H7NO Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 27 V, C3H4O bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 188 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 133 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C8H7NO.

Hình 3.6. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất IPA

e. Các ion sản phẩm của hợp chất GA3

Hợp chất GA3 có khối lƣợng phân tử là 346 với công thức phân tử là C19H22O6 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.7. Ở chế độ ion âm [M-H]-,

hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 345 với mảnh phổ nhƣ trong Hình 3.2. Các

ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 345 là mảnh phổ 239 (mất đi 106 khối

lƣợng); mảnh 301 (mất đi 44 khối lƣợng) và mảnh 283 (mất đi 62 khối lƣợng). Theo

đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ GA3

đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.7.

C17H21O4 Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 22 V, các gốc 2OH, CH3, CH2, COOH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 345 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 239, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C17H21O4.

C19H22O6 C18H22O4 Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 18 V, COOH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 345 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 301 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C18H22O4.

C18H19O3

Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 20 V, các gốc OH và COOH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M- H]- = 345 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 283 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C18H19O3.

Hình 3.7. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA3

f. Các ion sản phẩm của hợp chất GA4

C19H22O4 Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 22 V, các gốc OH và H- bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 331 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 313, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C19H22O4.

C19H24O5 C17H20O4

Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 24 V, các gốc OH, CH3, H, và CH2 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M- H]- = 331 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 287 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C17H20O4.

C17H20O3 Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 29 V, các gốc OH, O, CH3, H, và CH2 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 331 tạo thành ion sản phẩm [M- H]- = 269 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C8H7NO.

Hình 3.8. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA4

Hợp chất GA4 có khối lƣợng phân tử là 332 với công thức phân tử là C19H24O5 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.8. Ở chế độ ion âm [M-H]-,

hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 331 với mảnh phổ nhƣ trong Hình 3.2. Các

ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 331 là mảnh phổ 313 (mất đi 18 khối

lƣợng); mảnh 287 (mất đi 44 khối lƣợng) và mảnh 269 (mất đi 62 khối lƣợng). Theo

đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ GA4

đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.8.

g. Các ion sản phẩm của hợp chất GA7

Hợp chất GA7 có khối lƣợng phân tử là 330 với công thức phân tử là C19H22O5 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.9. Ở chế độ ion âm [M-H]-,

hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 329 với mảnh phổ nhƣ trong Hình 3.2. Các

ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 329 là mảnh phổ 223 (mất đi 106 khối

lƣợng); mảnh 267 (mất đi 62 khối lƣợng) và mảnh 255 (mất đi 64 khối lƣợng). Theo

đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ GA7

đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.9.

C16H20O

Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 23 V, các gốc OH, COOH và CO2 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M- H]- = 329 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 223, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C16H20O.

C19H22O5 C18H20O2

Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 18 V, các gốc OH, COOH bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M-H]- = 329 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 267 là tƣơng ứng với hợp chất có CTPT C18H22O4.

C17H20O2

Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 20 V, các gốc OH, COOH và CH2 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M- H]- = 329 tạo thành ion sản phẩm [M-H]- = 255 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C18H19O3.

Hình 3.9. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất GA7

h. Các ion sản phẩm của hợp chất BA

Hợp chất BA có khối lƣợng phân tử là 225 với công thức phân tử là

C12H11N5 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.10. Ở chế độ ion dƣơng [M+H]+, hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 226 với mảnh phổ nhƣ trong Hình

3.2. Các ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 226 là mảnh phổ 91 (mất đi 135

khối lƣợng); mảnh 148 (mất đi 78 khối lƣợng) và mảnh 209 (mất đi 17 khối lƣợng).

Theo đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ

BA đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.10.

C7H8 Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 28 V, C5H4N5 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 226 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 91, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C7H8.

C6H7N5 Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 25 V, C6H6 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 226 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 148 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C6H7N5.

C12H11N5

Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 18 V, CH3 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 226 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 209 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C11H9N5.

C11H9N5

Hình 3.10. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất BA

i. Các ion sản phẩm của hợp chất DHZR

Hợp chất DHZR có khối lƣợng phân tử là 353 với công thức phân tử là

C15H23N5O5 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.11. Ở chế độ ion dƣơng [M+H]+, hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 354 với mảnh phổ nhƣ trong Hình

3.2. Các ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 354 là mảnh phổ 222 (mất đi 132

khối lƣợng); mảnh 148 (mất đi 206 khối lƣợng) và mảnh 136 (mất đi 118 khối

lƣợng). Theo đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình

thành từ DHZR đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.11.

Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 22 V, C5H9O4 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 354 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 222, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C10H15N5O.

C10H15N5O

C15H23N5O5 Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 28 V, C5H9O4 và C4H9O bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 354 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 148 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C6H7N5. C6H7N5

C5H5N5 Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 26 V, C5H9O4 và C5H11O bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 354 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 136 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C5H5N5.

Hình 3.11. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất DHZR

j. Các ion sản phẩm của hợp chất iP

C5H5N5 Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 23 V, C5H8 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 204 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 136, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C5H5N5.

C6H7N5 Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 21 V, C4H7 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 204 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 148 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C6H7N5.

C10H13N5

Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 18 V, CH3 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 204 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 175 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C8H9N5. C8H9N5

Hình 3.12. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất iP

Hợp chất iP có khối lƣợng phân tử là 203 với công thức phân tử là C10H13N5 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.12. Ở chế độ ion dƣơng [M+H]+, hợp

chất này có khối lƣợng phân tử là 204 với mảnh phổ nhƣ trong Hình 3.2. Các ion

sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 204 là mảnh phổ 136 (mất đi 68 khối lƣợng);

mảnh 148 (mất đi 56 khối lƣợng) và mảnh 175 (mất đi 29 khối lƣợng). Theo đó, các

mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ iP đƣợc giả thiết

nhƣ Hình 3.12.

k. Các ion sản phẩm của hợp chất iPR

Hợp chất iPR có khối lƣợng phân tử là 335 với công thức phân tử là

C15H21N5O4 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.13. Ở chế độ ion dƣơng [M+H]+, hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 336 với mảnh phổ nhƣ trong Hình

3.2. Các ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 336 là mảnh phổ 204 (mất đi 132

khối lƣợng); mảnh 148 (mất đi 188 khối lƣợng) và mảnh 136 (mất đi 200 khối

lƣợng). Theo đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình

thành từ iPR đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.13.

Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 22 V, C5H9O4 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 336 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 204, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C10H13N5.

C10H13N5

C6H7N5 Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 28 V, C5H9O4 và C4H8 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 336 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 148 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C6H7N5.

C15H21N5O4

C5H5N5 Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 35 V, C5H9O4 và C5H10 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 336 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 136 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C5H5N5.

Hình 3.13. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất iPR

l. Các ion sản phẩm của hợp chất K

Hợp chất K có khối lƣợng phân tử là 215 với công thức phân tử là C10H9N5O và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.14. Ở chế độ ion dƣơng [M+H]+, hợp

chất này có khối lƣợng phân tử là 216 với mảnh phổ nhƣ trong Hình 3.2. Các ion

sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 216 là mảnh phổ 148 (mất đi 68 khối lƣợng);

mảnh 135 (mất đi 81 khối lƣợng) và mảnh 81 (mất đi 135 khối lƣợng). Theo đó, các

mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ K đƣợc giả thiết

nhƣ Hình 3.14.

Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 26 V, C5H6O bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 216 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 148, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C6H7N5. C6H7N5

C5H5N5 Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 28 V, C6H8O bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 216 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 135 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C5H5N5.

C10H9N5O

C5H6O

Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 31 V, C6H6N5 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 216 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 81 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C5H6O.

Hình 3.14. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất K

m. Các ion sản phẩm của hợp chất tZ

Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 24 V, OH- bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 220 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 202, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C10H13N5.

C10H13N5

C10H13N5O C5H5N5

Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 30 V, C5H8O- bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 220 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 136 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C5H5N5. Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 28 V, C4H5O- bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 220 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 148 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C6H7N5. C6H7N5

Hình 3.15. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZ

Hợp chất tZ có khối lƣợng phân tử là 219 với công thức phân tử là

C10H13N5O và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.15. Ở chế độ ion dƣơng [M+H]+, hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 220 với mảnh phổ nhƣ trong Hình

3.2. Các ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 220 là mảnh phổ 202 (mất đi 18

khối lƣợng); mảnh 136 (mất đi 84 khối lƣợng) và mảnh 148 (mất đi 52 khối lƣợng).

Theo đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ tZ

đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.15.

n. Các ion sản phẩm của hợp chất tZR

Hợp chất tZR có khối lƣợng phân tử là 351 với công thức phân tử là

C15H21N5O5 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.16. Ở chế độ ion dƣơng [M+H]+, hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 352 với mảnh phổ nhƣ trong Hình

3.2. Các ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 352 là mảnh phổ 220 (mất đi 31

khối lƣợng); mảnh 202 (mất đi 300 khối lƣợng) và mảnh 136 (mất đi 116 khối

lƣợng). Theo đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình

thành từ tZR đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.16.

Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng - bị tách phân mảnh CE = 22 V, C4H9O4 khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 352 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 220, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C10H13N5O. C10H13N5O

C10H13N5 Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng - và OH- bị phân mảnh CE = 28 V, C4H9O4 tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 352 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 202 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C10H13N5. C15H21N5O5

C5H5N5

Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng - và C5H9O- phân mảnh CE = 31 V, C4H9O4 bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 352 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 136 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C5H5N5.

Hình 3.16. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZR

3.1.1.3. Khảo sát các thông số của nguồn ion hóa

Sau khi xác định đƣợc các điều kiện chuyển hóa ion của hệ thống MS, điều

kiện của nguồn ion hóa phun điện tử tiếp tục đƣợc khảo sát với sự có mặt có hệ

dung môi pha động. Hỗn hợp dung dịch chuẩn của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật có nồng độ 1 µg.mL-1 đƣợc tiêm vào hệ thống LC kết hợp với các dung

môi pha động gồm MeOH (+0,1 FA) và nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA, tốc độ dòng 0,5 mL.phút-1, không dùng cột sắc ký. Phần mềm Xcalibur đƣợc sử dụng để điều

chỉnh các thông số trên máy. Điều kiện phân tích khối phổ sau khi đƣợc tối ƣu hóa đƣợc thiết lập nhƣ sau: nhiệt độ nguồn phun 100oC, tốc độ dòng khí mang 25 L.phút-1, tốc độ dòng khí bổ trợ 5 L.phút-1, tốc độ dòng khí quét buồng ion hóa 0 L.phút-1, điện thế nguồn phun của ion dƣơng và ion âm lần lƣợt là 3,6 kV và -3,0 kV, nhiệt độ ống mao quản 200oC, điện thế ống mao quản của ion âm là -31 V và

ion dƣơng 4 V; và điện thế thấu kính hội tụ: ion âm là -125 V và ion dƣơng là 70 V

(Bảng 3.2). Tất cả các chất rửa giải đƣợc theo dõi theo chế độ giám sát phản ứng

chọn lọc. Để gia tăng độ nhạy của hệ thống, các chƣơng trình phân tách đƣợc thực

hiện dựa trên cơ sở ổn định thời gian lƣu để các ion chỉ rửa giải trong một thời gian

lƣu nhất định.

Bảng 3.2. Các thông số của nguồn ion đƣợc tối ƣu hóa

TT Thông số Đơn vị Giá trị tối ƣu

1 Nhiệt độ nguồn 100

2 Tốc độ dòng khí mang L/phút 25

3 Tốc độ dòng khí bổ trợ L/phút 5

Tốc độ dòng khí quét buồng ion hóa L/phút 4

0 -3,0 3,6

6 Điện thế nguồn phun - Ion âm - Ion dƣơng Nhiệt độ ống mao quản kV kV oC 200

7 Điện thế ống mao quản

- Ion âm - Ion dƣơng V V -31 4

8 Điện thế thấu kính hội tụ:

- Ion âm - Ion dƣơng V V -125 70

Nhƣ vậy với các điều kiện của nguồn ion hóa khối phổ đƣợc tối ƣu cho phép

phân tích các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh, trong

đó, mỗi hợp chất xác định đƣợc 2 ion sản phẩm tƣơng ứng phục vụ cho việc định

lƣợng và xác nhận chúng. Điều này đảm bảo yêu cầu về tính chọn lọc của một

phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng các chất theo yêu cầu của Liên minh Châu Âu

[118].

3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng

3.1.2.1.Khảo sát cột phân tích và dung môi pha động

Pha tĩnh trong sắc ký lỏng đóng vai trò phân tách các chất phân tích với nhau

và các thành phần khác có trong mẫu. Trong nghiên cứu này, các cột pha đảo

Hypersil và Purospher đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng phân tách các chất kích

thích sinh trƣởng thực vật. Đây là các cột sắc ký lỏng phổ biến với nhiều ƣu điểm

nhƣ: phạm vi ứng dụng rộng, khả năng phân tách các chất phân tích ổn định, phù

hợp với việc sử dụng các dung môi phân cực nhƣ methanol, acetonitrile, nƣớc (rẻ

tiền). Bên cạnh đó, ƣu điểm của hệ thống sắc ký lỏng khối phổ là khả năng nhận

biết các chất theo tỷ số khối lƣợng trên điện tích nên đảm bảo cho việc phát hiện tín

hiệu của các chất phân tích. Đây đƣợc xem là một trong những kỹ thuật phổ biến

đang đƣợc sử dụng trong việc nghiên cứu phân tách các chất ở nhiều cơ quan, đơn

vị nghiên cứu và các trƣờng đại học ở Việt Nam.

Pha động sử dụng cho hệ thống sắc ký lỏng là các dung môi có độ phân cực

cao, có ảnh hƣởng đến quá trình phân tách của các chất, quá trình ion hóa và tín

hiệu của các chất phân tích. Các pha động đƣợc bổ sung thêm axít để cải thiện hình dáng của các píc sắc ký và cung cấp proton H+ trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử

bắn phá ở chế độ ion dƣơng. Dung dịch 0,1% FA đƣợc tạo thành bằng cách pha 1

mL axít foocmic trong 1 L dung môi pha động. FA và MeOH là các dung dịch đƣợc

nhiều nhà khoa học sử dụng trong việc phân tích, xác định và định lƣợng các chất

điều hòa sinh trƣởng thực vật trong các mô thực vật sử dụng thiết bị sắc ký lỏng

ghép nối với khổi phổ [119, 120]. Bên cạnh đó, ACN cũng là dung môi đƣợc nhiều

tác giả nghiên cứu sử dụng trong việc phân tách các chất điều hòa sinh trƣởng thực

vật trong các mẫu sinh học [121, 122]. Do đó, trong nghiên cứu này, nghiên cứu

sinh đã khảo sát và đánh giá hiệu quả phân tách, rửa giải các chất kích thích sinh

trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh giữa hệ dung môi pha động khác nhau,

gồm: ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA và MeOH (+0,1% FA) +

nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA. Bên cạnh đó, khả năng phân tách của các cột sắc ký

Hypersil và Purospher đƣợc đánh giá đồng thời cùng với các hệ dung môi pha động

thí nghiệm.

a. Kết quả khảo sát trên cột Hypersil

(Ion hóa âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion hóa dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 3.17. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Hypersil sử dụng

pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1

Kết quả khảo sát khả năng phân tách các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

của cột sắc ký Hypersil cho thấy: khi sử dụng hệ pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc

siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 thì hầu hết các chất phân tích

đƣợc phân tách hoàn toàn với tín hiệu píc rõ ràng. Tuy nhiên, có 2 hợp chất phân

tích theo chế độ ion hóa âm là ICA và IPA rửa giải không hoàn toàn và một hợp chất

phân tích theo chế độ ion hóa dƣơng là tZ có píc sắc ký bị chẻ ngọn, chân píc rộng

khoảng 1,0-1,2 phút (Hình 3.17). Ở điều kiện tƣơng tự khi sử dụng hệ pha động

MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA cho thấy tất cả các chất kích

thích sinh trƣởng thực vật phân tích theo hai chế độ ion hóa âm và ion hóa dƣơng

trên cột Hypersil có píc sắc ký rõ ràng, sắc nét, với chân píc gọn và độ rộng chân

píc khoảng 0,3-0,6 phút (Hình 3.18).

(Ion hóa âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion hóa dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 3.18. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Hypersil sử dụng

pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1

b. Kết quả khảo sát trên cột Purospher

Kết quả khảo sát khả năng phân tách các chất KTST trên cột Purospher sử

dụng hệ dung môi ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA đƣợc biểu thị ở Hình 3.19 và Hình 3.20. Ở điều kiện tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1, hầu hết các chất

phân tích theo chế độ ion hóa âm có tín hiệu không rõ ràng, trong khi đó, các hợp

chất phân tích theo chế độ ion hóa dƣơng có píc sắc ký tù, chân píc choãi, độ rộng của chân píc lên tới 5-6 phút. Khi tăng tốc độ dòng lên 0,3 mL.phút-1 thì nhiều hợp

chất phân tích theo chế độ ion hóa âm không xuất hiện tín hiệu nhƣ: IAA, IBA, IPA

và GA4; và tất cả các hợp chất phân tích theo chế độ ion hóa dƣơng rửa giải không

hoàn toàn với hình dạng píc xấu, chẻ ngọn và chân píc rộng 1-2 phút.

(Ion hóa âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion hóa dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 3.19. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1

(Ion hóa âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion hóa dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 3.20. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,3 mL.phút-1

Khi sử dụng hệ pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 để rửa giải các chất kích thích sinh trƣởng thực

vật trên cột sắc ký Purospher cho thấy tất cả các chất nghiên cứu có tín hiệu píc

không rõ ràng và độ nhiễu cao, một số chất khác không xuất hiện tín hiệu (Hình 3.21). Khi tăng tốc độ dòng dung môi lên 0,3 mL.phút-1, các hợp chất ICA, IPA,

GA4, K, Z, tZ, iPR, tZR và DHZR có píc sắc ký rõ ràng, sắc nét với độ rộng chân

píc khoảng 0,2-0,8 phút; trong khi đó, hai hợp chất iP và BA có tín hiệu nền tƣơng

đối cao, và các hợp chất IAA, IBA, GA3 và GA7 không xuất hiện tín hiệu píc (Hình 3.22). Ở điều kiện tốc độ dòng dung môi pha động 0,5 mL.phút-1, các chất phân tích

IAA, iP, iPR, tZ, tZR và BA có hình dạng píc đẹp, sắc nét, rõ ràng với độ rộng chân

píc khoảng 0,2-0,3 phút; tuy nhiên, các hợp chất còn lại nhƣ: IBA, ICA, IPA, GA3,

GA4, GA7, K và DHZR không xuất hiện tín hiệu píc (Hình 3.23). Kết quả khảo sát ở tốc độ dòng 1 mL.phút-1 cho thấy, chỉ có hai hợp chất IPA và GA3 có tín hiệu píc

rõ ràng; các hợp chất GA4, iP, K, tZ và BA có độ nhiễu tƣơng đối cao; các hợp chất

IAA, IBA, ICA, GA7, iPR, tZR và DHZR không xuất hiện tín hiệu (Hình 3.24).

(Ion hóa âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion hóa dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 3.21. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1

(Ion hóa âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion hóa dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 3.22. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,3 mL.phút-1

(Ion hóa âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion hóa dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 3.23. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,5 mL.phút-1

(Ion hóa âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion hóa dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 3.24. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng

pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 1 mL.phút-1

Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy rằng, có sự khác nhau về hiệu quả phân

tách các chất kích thích sinh trƣởng thực vật khi sử dụng các hệ dung môi pha động

khác nhau trên cùng một cột sắc ký nhƣ nhau; và khi sử dụng cùng một chế độ dung

môi pha động, các cột sắc ký khác nhau có khả năng phân tách các chất kích thích

sinh trƣởng thực vật khác nhau. Trong đó, cột sắc ký Hypersil cho hiệu quả phân

tách các chất nghiên cứu ở cả hai chế độ ion hóa âm và ion hóa dƣơng tốt hơn so

với cột Purospher. Việc sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch

chứa 0,1% FA cho kết quả phân tách các chất kích thích sinh trƣởng thực vật tốt hơn

so với pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA. Sự kết hợp của

cột sắc ký Hypersil và pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA

cho kết quả phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật tốt nhất với tín hiệu

của các chất phân tích rõ ràng, cƣờng độ tín hiệu cao, chân píc hẹp và sắc nét. Do

đó, cột Hypersil và pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA

đƣợc lựa chọn và sử dụng để khảo sát các điều kiện phân tích khác phục vụ cho các

thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu này.

3.1.2.2. Khảo sát chế độ gradient của pha động

Tốc độ dòng dung môi và chế độ rửa giải đƣợc khảo sát và đánh giá để lựa

chọn điều kiện phân tích phù hợp, đảm bảo các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

trong các mẫu phân tích đƣợc phân tách hoàn toàn, với các píc có tín hiệu cao nhất,

rõ ràng và cân đối, nhằm tiết kiệm thời gian phân tích mẫu, hóa chất, dung môi sử

dụng và giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị phân tích.

Nhiệt độ của cột sắc ký là một trong những yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến

khả năng phân tách và thời gian rửa giải các chất phân tích, do đó, để tránh sự biến

đổi của nhiệt độ môi trƣờng đến kết quả nghiên cứu, cột phân tích sắc ký đƣợc kiểm soát ở điều kiện 40oC để đảm bảo cho quá trình tách các chất đƣợc ổn định. Hỗn hợp chuẩn của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật có nồng độ 0,5 µg.mL-1

đƣợc sử dụng để khảo sát chế độ gradient của pha động.

Điều kiện khối phổ: đƣợc kiểm soát theo các chế độ đƣợc tối ƣu hóa ở Bảng

3.1 và 3.2.

Chế độ gradient của pha động sử dụng trong phân tích các chất kích thích

sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh đƣợc khảo sát theo sự gia tăng của tỷ lệ

dung môi rửa giải và tốc độ dòng dung môi tƣơng ứng với các gradient đƣợc mã

hóa từ gradient 1-5. Kết quả khảo sát các chế độ gradient của pha động MeOH

(+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA đƣợc trình bày ở Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát gradient của pha động (A = 0,1% FA; B = MeOH + 0,1% FA)

Điều kiện gradient

Tốc độ dòng

Nhận xét

Gradient 1 đƣợc mã hóa theo % của MeOH là: 0-2p=10%; 2-10p↑90%; 10-13p=90%; 13-13,5p↓10%; 13-15p=10% 0,1 (mL.phút-1)

Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,75-6,96 phút. Tuy nhiên, hợp chất IPA rửa giải chƣa hoàn toàn.

Từ khi bắt đầu đến 2 phút 10% B, sau đó tăng lên 90% B từ 2 đến 10 phút, giữ 90% B trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tổng thời gian 15 phút.

Gradient 2 đƣợc mã hóa theo % của MeOH là: 0-2p=20%; 2-10p↑90%; 10-13p=90%; 13-13,5p↓10%; 13-15p=10%

0,1 (mL.phút-1)

Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,42-6,96 phút. Tuy nhiên, hợp chất IPA vẫn chƣa rửa giải hoàn toàn.

Từ khi bắt đầu đến 2 phút 20% B, sau đó tăng lên 90% B từ 2 đến 10 phút, giữ 90% B trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tổng thời gian 15 phút.

Gradient 3 đƣợc mã hóa theo % của MeOH là: 0-2p=30%; 2-10p↑90%; 10-13p=90%; 13-13,5p↓10%; 13-15p=10%

0,1 (mL.phút-1)

Từ khi bắt đầu đến 2 phút 30% B, sau đó tăng lên 90% B từ 2 đến 10 phút, giữ 90% B trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tổng thời gian 15 phút.

Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,07-6,31 phút. Tất cả các hợp chất phân tích đƣợc rửa giải hoàn toàn và các píc gọn, sắc nét, cân đối, rõ ràng, độ rộng chân píc khoảng 0,2-0,5 phút.

Gradient 4 đƣợc mã hóa theo % của MeOH là: 0-2p=30%; 2-10p↑90%; 10-13p=90%; 13-13,5p↓10%; 13-15p=10%

0,3 (mL.phút-1)

Các chất phân tích theo chế độ ion âm không xuất hiện tín hiệu trên sắc ký đồ. Các chất phân tích theo chế độ ion dƣơng có tín hiệu píc sắc ký đƣợc rửa giải sớm hơn so với tốc độ dòng 0,1 mL/phút với thời gian lƣu khoảng 1,5 phút.

Gradient 5 đƣợc mã hóa theo % của MeOH là: 0-2p=30%; 2-10p↑90%; 10-13p=90%; 13-13,5p↓10%; 13-15p=10%

0,5

Các chất phân tích theo chế độ ion âm không xuất hiện tín hiệu trên sắc ký đồ. Các chất phân tích theo chế độ ion dƣơng đƣợc phát hiện ở thời gian lƣu từ 0,8 đến 1,2 phút; sớm hơn so với các điều kiện gradient ở trên.

Ghi chú: píc sắc ký của các gradient được trình bày ở phần Phụ lục 2.

Kết quả khảo sát điều kiện gradient của pha động trong phân tích các chất

kích thích sinh trƣởng thực vật cho thấy: sự thay đổi của tỷ lệ dung môi MeOH

(+0,1% FA) với nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA và tốc độ dòng dung môi có ảnh

hƣởng rõ rệt đến tín hiệu của chất phân tích, hình dạng píc sắc ký và thời gian rửa

giải của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật. Trong các gradient đƣợc khảo sát,

gradient 3 có điều kiện phân tách tốt nhất, với tín hiệu chất phân tích rõ ràng, sắc

nét, chân píc gọn, và các chất đƣợc rửa giải hoàn toàn, do đó điều kiện của gradient

này đƣợc lựa chọn sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu phân tích đƣợc tách

bằng cột sắc ký C18 Hypersil GOLD aQ (3 µm, 150 x 2.1 mm) và rửa giải bằng

dung môi pha động MeOH (+0,1% FA) và nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng dung môi là 0,1 mL.phút-1, trong tổng thời gian phân tích là 15 phút. Trong đó,

tỷ lệ của các dung môi pha động có sự thay đổi theo thời gian rửa giải, thành phần

dung môi methanol chiếm 30% trong 2 phút đầu tiên, sau đó tăng dần nồng độ đến

90% trong khoảng thời gian từ phút thứ 2 đến phút thứ 10 và duy trì ở tỷ lệ này

trong khoảng 3 phút; tiếp đó tỷ lệ methanol đƣợc giảm xuống điều kiện ban đầu

30% trong thời gian 0,5 phút và duy trì cho đến hết chu trình gradient trƣớc khi

chuyển sang phân tích các mẫu tiếp theo (Bảng 3.4).

Bảng 3.4. Điều kiện gradient tối ƣu sử dụng phân tích các chất KTST trong rau

Thời gian (phút) Kênh A: H2O (với 0,1% FA) Kênh B: MeOH (+0,1% FA)

Tốc độ dòng (mL.phút-1) 0,1 0 70 30

2 0,1 70 30

10 0,1 10 90

13 0,1 10 90

13.5 0,1 70 30

15 0,1 70 30

3.2. Tối ƣu hóa điều kiện xử lý mẫu

Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp tách chiết các chất kích thích sinh

trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh đƣợc xây dựng và phát triển bằng cách biến

đổi và bổ sung một số bƣớc cần thiết trong quy trình tách chiết các hoocmon thực

vật ở loài cây Arabidopsis thaliana thuộc Họ Cải, ở Columbia theo nghiên cứu của

Xiangqing và cộng sự [83]. Đây là phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện và có thể áp

dụng cho nhiều đối tƣợng mẫu khác nhau. Tuy nhiên, lƣợng mẫu ban đầu sử dụng

tƣơng đối ít nên sẽ không đảm bảo việc mang tính đại diện cho một mẫu nghiên

cứu. Bên cạnh đó, dung dịch 1-propanol sử dụng trong phƣơng pháp là chất hữu cơ

có nhóm –OH đính vào vị trí cuối trong cấu trúc phân tử làm cho chất này kém

phản ứng, ít ổn định đồng thời hạn chế phạm vi ứng dụng của nó. Mặt khác, mẫu

nghiên cứu chỉ đƣợc nghiền một cách đơn thuần, sau đó đƣợc chiết theo phƣơng

pháp rắn lỏng thông thƣờng nên có thể một phần nhỏ các chất phân tích trong các

mảnh vụn thực vật lớn sau nghiền không đƣợc chiết hết khỏi mẫu, do đó, có thể làm

giảm hiệu suất chiết của phƣơng pháp. Phần dung dịch trong suốt ở lớp trên có thể

chứa một lƣợng chất phân tích nhất định cần đƣợc phân tích nhƣng tác giả không sử

dụng phần mẫu này. Hơn nữa, việc bơm trực tiếp mẫu không qua màng lọc vào thiết

bị có thể là nguyên nhân ảnh hƣởng đến cƣờng độ tín hiệu của các chất phân tích

cũng nhƣ tiềm ẩn nguy cơ gây tắc ống mao quản của thiết bị phân tích.

Để khắc phục những hạn chế trên, dung dịch 1-propanol đƣợc thay thế bởi

dung dịch 2-propanol, là dung dịch này có nhóm –OH gắn ở vị trí giữa của cấu trúc

phân tử tạo nên các đặc tính đặc trƣng nhƣ: khả năng phản ứng mạnh hơn, ổn định

hơn, và ít axít hơn, do đó, phạm vi ứng dụng của chất này rộng hơn. Bên cạnh đó,

nghiên cứu sinh thực hiện các biến đổi trong quy trình xử lý mẫu và tách chiết các

chất kích thích sinh trƣởng thực vật với các bƣớc cụ thể nhƣ sau:

Bƣớc 2: Nghiền nhỏ và cân 300 mg mẫu vào ống ly tâm Teflon 15 mL

Thêm 3 ml 2-propanol/H2O/HCl

Bƣớc 3: Lắc mẫu và chiết siêu âm

Lắc 30 phút, ở 4oC Siêu âm 5 phút

4000 vòng.phút-1, ở 4oC

Bƣớc 1: Đông cứng mẫu trong nitơ lỏng

Bƣớc 4: Ly tâm mẫu và hút dịch lớp trên

Lắc 30 phút, ở 4oC Siêu âm 5 phút

Bƣớc 6: Ly tâm mẫu

Dịch trong suốt

Thêm 6 mL dichloromethane Bƣớc 5: Lắc mẫu và chiết siêu âm

4000 vòng.phút-1, ở 4oC

Cô cạn bằng nitơ, hòa tan trong MeOH

Bƣớc 7: Hút 1 mL dung dịch lớp dƣới

Bƣớc 8: Phân tích trên HPLC-ESI-MS2

Hình 3.25. Quy trình tách chiết và phân tích các KTST trong các mẫu rau xanh

đƣợc phát triển và tối ƣu hóa

Bước 1: Mẫu rau sau khi thu thập đƣợc đông cứng trong nitơ lỏng chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ dƣới 0oC cho đến khi phân tích.

Bước 2: Tiến hành nghiền nhỏ mẫu với khối lƣợng khoảng 1 kg, sau đó, cân chính

xác một lƣợng 300 mg mẫu cho vào ống teflon 15 mL, có nắp vặn chặt.

Bước 3: Thêm 3 mL 2-propanol/H2O/HCl (2:1:0.002, v/v/v) sau đó rung lắc mẫu với tốc độ 100 vòng.phút-1 trong thời gian 30 phút, ở nhiệt độ 4oC. Tiến hành siêu

âm mẫu trong thời gian 5 phút.

Bước 4: Thực hiện ly tâm mẫu với tốc độ 4000 vòng.phút-1 ở điều kiện nhiệt độ 4oC

trong thời gian 5 phút. Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1mL phần dung dịch trong

suốt ở lớp phía trên của ống teflon thí nghiệm cho vào eppendorf đựng mẫu có thể

tích 2 mL.

Bước 5: Thêm 6 mL dung dịch dichloromethane và rung lắc mẫu trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 4oC, sau đó, tiếp tục chiết siêu âm trong thời gian 5 phút.

Bước 6: Thực hiện ly tâm mẫu với tốc độ 4000 vòng.phút-1 trong thời gian 5 phút,

có hai lớp chất lỏng khác nhau đƣợc hình thành sau ly tâm và các mảnh vụn thực

vật phân bố ở giữa hai lớp. Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1 mL phần dung dịch

trong suốt ở lớp phía trên của ống teflon thí nghiệm, sau đó cho vào eppendorf đựng

phần dung dịch hút ra ở bƣớc 4. Tiến hành xoáy mẫu trên máy Votex trong thời

gian 5 phút để trộn lẫn hai phần dung dịch này với nhau. Sau đó, dùng micropipet hút 1 mL mẫu cho vào lọ đựng mẫu 1,5 mL để phân tích trên máy HPLC-ESI-MS2.

Bước 7: Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1 mL phần dung dịch của lớp phía dƣới

ống teflon thí nghiệm, sau đó cho vào lọ thủy tinh có dung tích 15 mL. Tiến hành cô

cạn bằng dòng khí nitơ, hoà tan các chất sau cô cạn bằng 1 mL dung môi MeOH.

Bước 8: Thực hiện lọc mẫu qua màng lọc PTFE 0,22 µm trƣớc khi phân tích trên thiết bị HPLC-ESI-MS2.

 Hàm lƣợng của các chất phân tích đƣợc xác định bằng tổng hàm lƣợng của

các chất thu đƣợc ở các phân đoạn đƣợc thực hiện ở bƣớc 4, 6 và bƣớc 7.

Kết quả so sánh hiệu quả tách chiết các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

của 1-propanol và 2-propanol theo quy trình nghiên cứu của Xiangqing và cộng sự

[83] đƣợc biểu thị ở Hình 3.26. Quy trình sử dụng 1-propanol thu đƣợc hiệu suất

chiết trung bình 66,93±4,84%. Trong đó, hiệu suất chiết cao nhất đạt 75% đƣợc

phát hiện ở hợp chất ICA, tiếp đến là hợp chất tZ có hiệu suất 74%, sau đó là ba hợp

chất GA4, iP và tZR có hiệu suất chiết 70%. Có 8 hợp chất có hiệu suất chiết trung

bình đạt từ 62-68% gồm: DHZR, IBA, IPA, iPR, IAA, GA3, GA7 và K; đặc biệt,

hiệu suất chiết thấp nhất đƣợc tìm thấy ở hợp chất BA với 57%. Đối với quy trình

chiết sử dụng dung môi 2-propanol thu đƣợc hiệu suất chiết cao nhất đạt 88% ở hợp

chất GA3 và thấp nhất ở hợp chất BA với 68%. Có 5 hợp chất kích thích sinh trƣởng

gồm IAA, tZ, ICA, GA4 và tZR có hiệu suất chiết từ 80-85%; các hợp chất còn lại

có hiệu suất chiết đạt giá trị ≥ 70%, nhƣ: GA7, 70%; IPA, 75%; K, iP và tZR đều

đạt cùng một giá trị 76%; và hợp chất IBA đạt giá 78%. Điều này cho thấy rằng, có

sự khác nhau về hiệu suất chiết giữa các chất kích thích sinh trƣởng thực vật khác

nhau sử dụng cùng một dung môi chiết; và sự khác nhau về hiệu suất chiết giữa các

dung môi chiết khác nhau đối với cùng một hợp chất phân tích; trong đó, việc sử

dụng dung môi chiết 2-propanol cho hiệu quả chiết cao hơn so với dung môi chiết

Quy trình xq 1-propanol

Quy trình xq 2-propanol

)

( i ồ h

u h t t ấ u s u ệ i H

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Chất kích thích sinh trƣởng thực vật

1-propanol ở cùng điều kiện nghiên cứu.

Hình 3.26. Hiệu suất của quá trình chiết mẫu theo quy trình Xiangqing và cộng sự

sử dụng các dung môi 1-propanol và 2-propanol

Kết quả tách chiết các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trên nền rau cải

xanh theo quy trình mới xây dựng và phát triển sử dụng các dung môi chiết 1-

propanol và 2-propanol đƣợc trình bày ở Hình 3.27. Hiệu suất thu hồi trung bình

của quy trình sử dụng 2-propanol đối với các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

đạt 85,93±5,28% cao hơn quy trình sử dụng 1-propanol là 76,00±5,13%. Các giá trị

này cao hơn nhiều so với quy trình tách chiết các chất kích thích sinh trƣởng thực

vật theo nghiên cứu của Xiangqing và cộng sự [83] sử dụng 2-propanol và 1-

propanol lần lƣợt là 78,29±5,78% và 66,93±4,84%. Đặc biệt, có 6 hợp chất kích

thích sinh trƣởng thực vật có hiệu suất chiết cao hơn 90% là: GA3 đạt đến 95%,

IAA đạt đến 94%, ICA đạt đến 92%, tZR đạt đến 92%, IBA đạt 90% và GA4 đạt

90%; 7 hợp chất có hiệu suất chiết đạt từ 80-87% gồm K, IPA, tZ, iP, GA7, iPR và

DHZR; và chỉ có 01 hợp chất là BA có hiệu suất chiết < 80% ở quy trình sử dụng 2-

propanol. Trong khi đó, quy trình sử dụng 1-propanol chỉ thu đƣợc hợp chất ICA có

hiệu suất chiết đạt 83%; các chất phân tích nhƣ IAA, IBA, IPA, GA3, GA4, GA7, K,

iP, iPR, tZ và tZR có hiệu suất ≤ 80%; các hợp chất BA và DHZR có hiệu suất chiết

< 70%. Điều này cho thấy rằng, việc thay thế dung dịch 1-propanol bằng dung dịch

2-propanol, kết hợp với điều chỉnh và bổ sung một số kỹ thuật khác trong quá trình

chuẩn bị mẫu nhƣ: nghiền mẫu, chiết siêu âm, lựa chọn phần mẫu phân tích và lọc

mẫu thông qua màng PTFE 0,22 µm... đã góp phần nâng cao hiệu suất của phƣơng

Quy trình pt 1-propanol

Quy trình pt 2-propanol

100

)

( i ồ h

u h t t ấ u s u ệ i H

Chất kích thích sinh trƣởng thực vật

pháp tách chiết các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau cải xanh.

Hình 3.27. Hiệu suất của quá trình chiết mẫu theo quy trình mới xây dựng và phát

triển sử dụng các dung môi 1-propanol và 2-propanol

Trong đó:

- Quy trình pt 1-propanol: quy trình chiết đƣợc mô tả theo Hình 3.11 sử dụng

dung môi chiết 1-propanol.

- Quy trình pt 2-propanol: quy trình chiết đƣợc mô tả theo Hình 3.11 sử dụng

dung môi chiết 2-propanol.

3.3. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích

3.3.1. Xây dựng quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trưởng

thực vật trong các mẫu rau

Từ các kết quả nghiên cứu thu đƣợc của việc khảo sát các điều kiện phân tích

khối phổ, điều kiện sắc ký lỏng và điều kiện xử lý mẫu, chúng tôi đã xây dựng quy

trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau

Mẫu rau đƣợc rửa sạch và đông cứng trong nitơ lỏng

Nghiền nhỏ mẫu, đồng nhất, cân và chuyển 300 mg mẫu vào ống ly tâm Teflon 15 mL, có nắp vặn chặt

Thêm 3 ml dung môi chiết 2-propanol/H2O/HCl và lắc mẫu với tốc độ 100 vòng.phút-1, trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 4oC; sau đó, thực hiện chiết siêu âm trong 5 phút

Ly tâm mẫu ở điều kiện 4000 vòng.phút-1

ở nhiệt độ 4oC, thời gian 5 phút

Thêm tiếp 6 mL dung dịch dichloromethane vào mỗi ống nghiệm, lắc ở điều kiện 4°C trong 30 phút, sau đó chiết siêu âm 5 phút

Dịch trong suốt

Ly tâm mẫu ở điều kiện 4000 vòng.phút-1; nhiệt độ 4oC, thời gian 5 phút

Sử dụng pipet Pasteur hút 1 mL phần dung dịch phía dƣới ống nghiệm cho vào lọ thủy tinh 15 mL (mới) và cô cạn bằng dòng khí nitơ trong khoảng ~1 giờ, sau đó hòa tan trong 1 mL MeOH, ly tâm và lọc lại bằng màng lọc PTFE 0,22 µm

xanh nhƣ Hình 3.28.

HPLC-ESI-MS2

Hình 3.28. Sơ đồ quy trình chiết và phân tích các chất KTST trong các mẫu rau

Các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh sau khi bơm

vào máy qua bộ phận bơm mẫu tự động đƣợc tách bởi cột sắc ký pha đảo Hypersil

GOLD aQ C18 (3 µm, 150 × 2,1 mm), sau đó đƣợc phân tích trên hệ thiết bị khối phổ ESI-MS2. Các chất phân tích đƣợc theo dõi theo phƣơng pháp giám sát phản ứng chọn lọc. Sắc ký đồ ESI-MS2 của 14 hợp chất kích thích sinh trƣởng đƣợc thể

hiện ở Hình 3.29, trong đó bảy hợp chất kích thích sinh trƣởng gồm IAA, IBA,

ICA, IPA, GA3, GA4, và GA7 đƣợc phân tích theo chế độ ion hóa âm và bảy chất

kích thích sinh trƣởng còn lại là BA, DHZR, K, iP, iPR, tZ, và tZR đƣợc phân tích

theo chế độ ion hóa dƣơng.

Nhìn chung, tất cả 14 hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật đƣợc rửa giải

hoàn toàn theo các điều kiện đã đƣợc tối ƣu hóa và thiết lập ở trên, với pha động là

MeOH (+0,1% FA) và nƣớc deion chứa 0,1% axít foocmic. Trong số các chất kích

thích sinh trƣởng đƣợc phát hiện dƣới dạng ion âm, thì IAA rửa giải đầu tiên tại

3,07 phút, tiếp đó là GA3 tại 4,62 phút. Năm hợp chất kích thích sinh trƣởng còn lại

bao gồm ICA, IPA, IBA, GA7 và GA4 đƣợc xác định lần lƣợt theo thứ tự ở các thời

gian lƣu khác nhau, gồm: 4,96 phút; 5,38 phút; 5,72 phút; 6,13 phút và 6,31 phút

(Hình 3.29).

Đối với nhóm các hợp chất kích thích sinh trƣởng đƣợc phát hiện theo chế độ

quét ion dƣơng, thì tZ rửa giải đầu tiên tại 4,40 phút, tiếp đó là tZR và DHZR lần

lƣợt đƣợc tìm thấy tại 4,44 và 4,45 phút. Bốn chất kích thích sinh trƣởng còn lại,

bao gồm K, iPR, BA và iP đƣợc phát hiện lần lƣợt theo thứ tự tại 5,00 phút; 5,51

phút; 5,60 phút và 5,66 phút (Hình 3.29).

(Ion hóa âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion hóa dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 3.29. Sắc ký đồ của các chất KTST ở điều kiện gradient tối ƣu

Sự khác biệt về quá trình chuyển hóa từ ion tiền chất thành các ion sản phẩm

theo phƣơng pháp SRM cho phép phát hiện từng chất kích thích sinh trƣởng có

trong các hỗn hợp. Để có thể phân tích định tính một cách chính xác các hợp chất

này, thì giá trị thời gian rửa giải trong sắc ký lỏng LC và kết quả phân tích chuyển hóa ion tiền chất thành các ion sản phẩm trong khối phổ ESI-MS2 là hai thông số vô

cùng quan trọng. Đây cũng chính là hai thông số chính trong việc phân tích định

lƣợng các hợp chất kích thích sinh trƣởng có trong mẫu rau và các mẫu sản phẩm

nông nghiệp khác.

3.3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích

Trong nghiên cứu này, quy trình phân tích đồng thời các chất kích thích sinh

trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh đƣợc xác nhận thông qua việc đánh giá các

chỉ tiêu gồm: độ ổn định, đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng, sự

ảnh hƣởng của nền mẫu, hiệu suất thu hồi và độ chính xác của phƣơng pháp phân

tích.

3.3.2.1. Đánh giá độ ổn định của chu kỳ đông/rã đông mẫu

Trƣớc mỗi đợt phân tích mẫu, dung dịch chuẩn Pierce positive/negative ion

calibration solution (Thermo Fisher, CAS 88324) đƣợc bơm vào thiết bị khối phổ

LCQ Fleet MS để hiệu chuẩn độ chính xác khối. Hiện tại, ở Việt Nam chƣa có các

mẫu tham chiếu đƣợc chứng nhận của các mẫu rau, nên độ ổn định của chu kỳ

đông/ rã đông mẫu đƣợc đánh giá thông qua các mẫu thêm chuẩn ở các nồng độ 10 ng mL–1 và 2000 ng mL–1 vào trƣớc và sau chu trình đông và rã đông. Độ ổn định

của chu trình đông/ rã đông chính là tỷ lệ phần trăm diện tích píc của các chất phân

tích trong mẫu sau bảo quản so với diện tích píc của chúng trong mẫu trƣớc bảo

quản ở cùng nồng độ thêm chuẩn. Bảng 3.5 mô tả diện tích píc trung bình và độ ổn

định của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu thêm chuẩn ở các nồng độ 10 và 2000 ng.mL-1 sau chu trình đông/ rã đông. Kết quả nghiên cứu cho

thấy có 6/14 chất kích thích sinh trƣởng có độ ổn định đạt trên 100%, trong đó, cao

nhất là hợp chất IAA đạt 106,28%; tiếp đến GA3 đạt 105,48% và GA4 đạt 104,10%;

sau đó tZ đạt 103,32%, K đạt 101,93% và GA7 đạt 101,48%. Còn 8 hợp chất còn lại

có độ ổn định sau chu trình đông/rã đông từ 91,79 đến 99,98%; gồm: iP đạt 99,98%;

iPR đạt 98,49%; IBA đạt 98,26%; ICA đạt 96,48%; BA đạt 94,73%; IPA đạt

94,62%; DHZR đạt 94,07% và tZR đạt 91,79% (Bảng 3.5). Theo nghiên cứu của

Frank và cộng sự [123], độ ổn định của chu kỳ đông/ rã đông trong xác nhận một

phƣơng pháp phân tích mới dao động trong khoảng từ 90-110%. Điều này cho thấy,

chu kỳ đông/ rã đông của phƣơng pháp phân tích các chất kích thích sinh trƣởng

thực vật trong các mẫu rau xanh thỏa mãn yêu cầu của việc xác nhận phƣơng pháp

phân tích mới, đồng nghĩa với quá trình đông và rã đông mẫu không ảnh hƣởng đến

kết quả phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh.

Bảng 3.5. Diện tích píc của các chất KTST và độ ổn định của chu kỳ đông/ rã đông

Hợp chất

Nồng độ (ng.mL-1)

Diện tích píc trƣớc rã đông (1/2 cps.phút)

Diện tích píc sau rã đông (1/2 cps.phút)

Độ ổn định (%)

3 ± 0,84

3,25 ± 0,61

IAA

106,28

2000

382,33 ± 10,31

398,50 ± 10,41

24,83 ± 2,04

25,17 ± 1,94

IBA

98,26

2000

4822,80 ± 82,49

4590,20 ± 164,84

55,17 ± 3,66

52,67 ± 0,95

ICA

96,48

2000

8916,70 ± 65,39

8692,80 ± 463,28

3,83 ± 1,47

3,50 ± 0,84

IPA

94,62

2000

860,08 ± 52,35

842,25 ± 34,08

18,00 ± 2,61

19,00 ± 1,79

105,48

GA3

2000

2902,80 ± 38,99

3060,00 ± 115,07

128,50 ± 5,32

135,83 ± 8,52

104,10

GA4

2000

8872,70 ± 67,63

9093,50 ± 145,79

32,33 ± 2,42

33,50 ± 1,05

101,48

GA7

2000

4266,50 ± 48,94

4239,00 ± 127,18

5779,00 ± 106,74

5401,50 ± 259,82

94,73

2000

977702,00 ± 1979,00

938536,00 ± 22139,00

577,17 ± 20,09

542,33 ± 17,83

DHZR

94,07

2000

98682,00 ± 710,25

92930,00 ± 2948,20

20520,00 ± 1065,30

18918,00 ± 985,54

99,98

2000

4197832,00 ± 22305,20 4197201,00 ± 192544,20

18,33 ± 1,86

18,17 ± 0,75

iPR

98,49

2000

4112,80 ± 97,87

4025,70 ± 118,09

4007,50 ± 80,93

4196,50 ± 99,62

101,93

2000

824280,00 ± 3655,70

840148,00 ± 11323,00

4956,70 ± 60,08

5269,20 ± 377,92

103,32

2000

1181608,00 ± 108092,40 1199066,00 ± 56517,25

1083,50 ± 69,28

982,50 ± 40,36

tZR

91,79

2000

190974,00 ± 6015,73

177399,50 ± 3731,92

3.3.2.2. Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Phƣơng pháp ngoại chuẩn kết hợp với nền mẫu nghiên cứu đƣợc lựa chọn

cho việc phân tích định lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các

mẫu rau xanh. Đƣờng chuẩn của 14 hợp chất kích thích sinh trƣởng đƣợc xây dựng

trên nền mẫu rau cải xanh với các nồng độ thêm chuẩn gồm: 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 và 2000 (ng.mL-1) (Hình 30); mỗi mẫu đƣợc phân tích lặp lại ba lần

theo quy trình phân tích đƣợc xây dựng ở trên.

Hình 3.30. Đƣờng chuẩn của các chất KTST trên nền mẫu rau cải xanh

Các hợp chất phân tích có cùng khoảng tuyến tính từ 10-2000 (ng.mL-1). Hệ số tƣơng quan (R2) cao nhất thu đƣợc là 0,9999 khi phân tích hai chất kích thích

sinh trƣởng DHZR and tZ, tiếp theo là 0,9997 khi phân tích hai chất kích thích sinh

trƣởng IAA và GA3, và sau đó là 0,9995; 0,9993 và 0,9992 tƣơng ứng với iP; GA4 và IPA. Giá trị R2 của IBA, ICA, BA, iPR và K dao động trong khoảng từ 0,9982

tới 0,9989, và thấp nhất ở GA7 là 0,9961 (Bảng 3.6). Nhìn chung, các hệ số tƣơng

quan của các hợp chất kích thích sinh trƣởng đều cao hơn giá trị 0,995 và do đó

đƣợc coi là chấp nhận đƣợc.

Giá trị MDL là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích trong mẫu ban đầu

trải qua quá trình xử lý và phân tích có tỷ lệ tín hiệu so với đƣờng nền S/N = 3. Các

nhóm hợp chất kích thích sinh trƣởng khác nhau có giá trị MDL khác nhau, với mức

độ thấp nhất đƣợc ghi nhận ở nhóm cytokinin, tiếp đến là nhóm gibbereline và cao

nhất là nhóm auxin. Các chất kích thích sinh trƣởng BA, DHZR, iP, tZ và tZR đƣợc phát hiện dƣới mức 1 ng.g−1 trong khi K, ICA và IBA đƣợc phát hiện lần lƣợt ở mức 1,20; 2,1, và 3,2 ng.g−1. Giá trị MDL của các gibberelines: GA3, GA4, GA7 và iPR dao động trong khoảng từ 4,1 tới 5,16 ng.g–1, trong khi IAA và IPA đƣợc phát hiện lần lƣợt ở 14,3 và 326 ng.g–1 (Bảng 3.6).

MQL là giá trị nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích trong mẫu ban đầu

trải qua quá trình xử lý và phân tích có tỷ lệ tín hiệu so với đƣờng nền S/N = 10.

Kết quả phân tích cho thấy, giá trị MQL của các chất kích thích sinh trƣởng có sự khác nhau rõ rệt. Trong đó, giá trị MQL thấp nhất là tZ ở 0,6 ng.g–1, tiếp theo là tZR với 0,9 ng.g–1 và BA với 1,0 ng.g–1. MQL của các chất iP và DHZR lần lƣợt là 1,54 and 2,0 ng.g–1. Giá trị MQL cao hơn đƣợc ghi nhận lần lƣợt ở các hợp chất K và ICA tƣơng ứng với 4,0 và 6,9 ng.g–1; trong khi đó IBA và GA4 có cùng giá trị MQL là 10,8 ng.g–1. Các gibberellins nhƣ GA4 và GA3 có MQL lần lƣợt là 13,8 và 17,2 ng.g–1, trong khi đó các auxin IPA và IAA có giá trị MQL cao hơn tƣơng ứng là 47,6 và 108,6 ng.g–1 (Bảng 3.6).

Bảng 3.6. Đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng

pháp phân tích

Hợp chất Đƣờng chuẩn R2 MDL (ng.g-1) MQL (ng.g-1)

108,6 IAA y = 0,19x + 1,99 0,9997 32,6

IBA y = 2,46x + 20,60 0,9987 3,2 10,8

ICA y = 4,45x + 127,66 0,9985 2,1 6,9

IPA y = 0,44x – 1,39 0,9992 14,3 47,6

y = 1,46x + 14,33 0,9997 5,2 17,2 GA3

y = 4,44x + 144,25 0,9993 4,1 13,8 GA4

y = 2,12x + 95,66 0,9961 4,3 10,8 GA7

BA y = 7,59x + 11,48 0,9989 0,3 1,0

DHZR y = 49,25x + 145,59 0,9999 0,6 2,0

iP y = 49,32x – 32,74 0,9995 0,5 1,5

iPR y = 2,01x – 12,26 0,9988 4,6 15,2

K y = 30,32x + 7,68 0,9982 1,2 4,0

tZ y = 70,48x – 80,36 0,9999 0,2 0,6

tZR y = 92,742x + 176,7 0,9992 0,3 0,9

Kết quả nghiên cứu này cho thấy giá trị MDL và MQL có sự khác nhau giữa

các nhóm chất kích thích sinh trƣởng, và khác nhau giữa các chất kích thích sinh

trƣởng thuộc cùng một nhóm cho thấy đƣợc tính phù hợp của phƣơng pháp phân

tích này trong việc định tính và định lƣợng các hợp chất kích thích sinh trƣờng

trong mẫu rau và các sản phẩm nông nghiệp khác.

3.3.2.3. Ảnh hưởng của nền mẫu

Hiệu ứng nền mẫu (làm tăng cƣờng hoặc triệt tiêu tín hiệu phân tích) là yếu

tố quan trọng hàng đầu ảnh hƣởng đến độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích sắc ký

lỏng ghép nối với khối phổ. Hiệu ứng nền mẫu đƣợc đánh giá thông qua việc so

sánh diện tích píc của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu trắng

thêm chuẩn sau chiết với diện tích píc của chất phân tích trong dung môi ở cùng

nồng độ nhất định. Một số nghiên cứu trƣớc đây đã chỉ ra rằng, giá trị ME = 100%

có nghĩa là không có sự ảnh hƣởng của nền mẫu đến hệ thống phân tích khối phổ;

còn giá trị ME cao hơn hoặc thấp hơn 100% tƣơng ứng với hiệu ứng tăng cƣờng

hoặc ức chế sự ion hóa. Khoảng giá trị ME dao động từ 80-120% đƣợc xem là

khoảng chấp nhận đƣợc và nền mẫu có ảnh hƣởng không đáng kể đến kết quả phân

tích và ngƣợc lại, các giá trị ME nằm ngoài khoảng giới hạn này biểu thị sự ảnh

hƣởng của hiệu ứng nền mẫu đến kết quả phân tích trên thiết bị phân tích MS [124-

)

Khoảng ME chấp nhận đƣợc

( u ẫ m n ề n a ủ c g n ứ

u ệ i H

130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

126].

Chất kích thích sinh trƣởng thực vật

Hình 3.31. Ảnh hƣởng của nền mẫu đến tín hiệu của các chất KTST

Sự ảnh hƣởng của nền mẫu rau cải xanh đến tín hiệu của các chất kích thích

sinh trƣởng thực vật đƣợc biểu thị ở Hình 3.31. Giá trị ME cao nhất là 118% đƣợc

phát hiện ở hợp chất IAA và thấp nhất là 82% ở hợp chất BA. Đặc biệt, các hợp

chất thuộc nhóm gibberellin có giá trị ME > 100%, trong đó, ME của GA3 là 115%,

GA4 là 107% và GA7 là 102%. Nhiều hợp chất có giá trị ME nằm trong khoảng 90-

100% nhƣ: IBA-97%, K-97%, tZ-93%, iP-92%, IPA-90% và DHZR-90%; trong khi

đó, có 3 hợp chất có giá trị ME nằm trong khoảng 80-90 (%) là iPR-87%, ICA-85%

và tZR-84%. Điều này cho thấy rằng, nền mẫu ảnh hƣởng không đáng kể đến kết

quả phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau cải xanh.

3.3.2.4. Hiệu suất thu hồi và độ chính xác của phương pháp phân tích

Hiệu suất thu hồi đƣợc xác định là tỷ lệ giữa hàm lƣợng của mỗi chất kích

thích sinh trƣởng thực vật có trong các mẫu thêm chuẩn/ chiết xuất và các mẫu

chuẩn dung môi. Các giá trị hiệu suất thu hồi của các chất kích thích sinh trƣởng

thực vật đƣợc đánh giá ở các mức độ khác nhau của đƣờng chuẩn gồm: thấp, trung bình và cao với các nồng độ tƣơng ứng là: 10, 100 và 1000 ng.mL-1. Hiệu suất thu

hồi trung bình khác nhau giữa các nồng độ khác nhau của từng chất kích thích sinh

trƣởng thực vật, cũng nhƣ khác nhau giữa các PGR khác nhau có cùng nồng độ.

Hiệu suất thu hồi dao động từ 68,42% đến 119,47% ở nhóm các chất có nồng độ

thấp, từ 76,81% đến 107,69% ở nhóm các chất có nồng độ trung bình và từ 75,20%

đến 102,56% ở nhóm các chất có nồng độ cao. Do đó, hiệu suất thu hồi trung bình

của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật là khá cao, dao động từ 82,30% đến

104,50%. Đáng chú ý, hiệu suất thu hồi cao nhất đạt 104,50% đƣợc ghi nhận ở hợp

chất GA3, tiếp theo là 103,73% ở IAA. Hiệu suất thu hồi của GA4 và GA7 tƣơng

đồng nhau với các giá trị lần lƣợt là 101,6% và 102,35%, trong khi đó đối với các

chất thuộc nhóm cytokinin nhƣ BA, K, iP, iPR, tZ, tZR, DHZR và các auxin: IBA,

ICA, IPA dao động trong khoảng từ 82,30% đến 93,32% (Bảng 3.7).

Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

IAA

103,73 ± 4,20

IBA

93,32 ± 3,10

ICA

92,49 ± 5,92

IPA

86,09 ± 15,34

104,50 ± 13,42

GA3

101,60 ± 4,31

GA4

102,35 ± 5,80

GA7

83,38 ± 6,87

DHZR

90,26 ± 0,92

90,95 ± 7,29

iPR

84,85 ± 5,78

92,30 ± 3,90

88,40 ± 1,40

tZR

82,30 ± 5,45

Hợp chất Độ thu hồi trung bình (%)*

Nồng độ pha (µg.mL–1) 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 Độ lặp lại (RSD, %) 8,00 10,79 4,60 6,19 10,71 3,74 2,99 0,61 3,13 15,25 3,72 0,48 11,07 5,52 3,68 1,92 1,42 0,63 4,54 0,44 1,13 0,56 0,06 0,02 0,82 1,11 1,11 1,22 0,58 0,22 17,17 2,83 1,66 1,46 1,91 0,28 0,67 1,25 1,60 3,39 9,13 7,45

Độ thu hồi (%)* 104,17 107,69 99,33 92,31 90,86 96,80 85,71 96,68 95,07 68,42 93,84 96,02 119,47 101,87 92,58 105,35 96,90 102,56 108,60 97,14 101,31 92,47 82,48 75,20 90,77 89,21 90,83 97,51 92,23 83,09 86,30 89,76 78,48 90,81 89,36 96,72 87,26 87,97 89,96 82,37 76,81 87,71 (*) Biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n = 6

Độ chính xác của phƣơng pháp đƣợc biểu thị bằng độ lặp lại (hay độ lệch

chuẩn tƣơng đối, RSD) của việc xác định hiệu suất thu hồi ở ba mức nồng độ gồm: 10 ng.mL–1 (mức thấp), 100 ng.mL–1 (mức trung bình) và 1000 ng.mL–1 (mức cao).

Độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích đối với các chất kích thích sinh trƣởng thực

vật ở các mức nồng độ khác nhau lần lƣợt là thấp, trung bình và cao tƣơng ứng với

các giá trị từ 0,56-17,17%; 0,06-10,79% và 0,02-7,45% (Bảng 3.7). Những kết quả

nghiên cứu này tƣơng đồng với nhiều kết quả nghiên cứu trƣớc đây của các nhà

khoa học trên thế giới. Dasharath và cộng sự [127] đã phân tích 12 hợp chất kích

thích sinh trƣởng thực vật gồm: IAA, IBA, NAA, K, Z, 6-benzyladenine, GA3,

abscisic acid, forchlorfenuron, paclobutrazole, isoprothiolane, và 2,4-D trong quả

nho bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối song song khối phổ bẫy ion

với hiệu suất thu hồi đạt 80-120%. Trong một nghiên cứu khác của Fan et al. [128],

có 13 hoocmon thực vật đƣợc phát hiện trong bã nho sau khi ép dầu gồm IAA, α-

NAA, 2-chlorobenzoic acid, 4-chlorobenzoic acid, IBA, GA3, 2,4-D, 2-

naphthoxyacetic acid, abscisic acid, 2,3,5-triiodobenzoic acid, uniconazole,

paclobutrazol và 2,4-epibassinolide. Kết quả nghiên cứu trên thiết bị sắc ký lỏng

hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ bẫy ion thu đƣợc hiệu suất thu hồi từ

77.9% đến 99.9%. Theo Ma và cộng sự [129], 15 chất điều hòa sinh trƣởng thực vật

trong mầm đậu và cà chua gồm: chlormequat chloride, mepiquat chloride, GA3, 6-

benzylaminopurine, IAA, 4-chlorophenoxyacetic acid, forchlorfenuron, thidiazuron,

IBA, abscisic acid, 2,4-D, NAA, brassinolide đƣợc phân tích đồng thời trên thiết bị

sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ ba tứ cực với hiệu suất thu hồi đạt 70-110%.

Theo tài liệu hƣớng dẫn SANTE/11813/2017 [130], giá trị hiệu suất thu hồi trung

bình có thể chấp nhận đƣợc dựa trên các xác nhận ban đầu nằm trong phạm vi 70

đến 120%, với RSD liên quan là ≤ 20%, cho các chất phân tích trong phạm vi của

một phƣơng pháp nhất định. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng phƣơng pháp chiết

xuất phù hợp đảm bảo cho việc phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

trong các mẫu rau cải xanh. Đây cũng chính là cơ sở để phát triển, mở rộng và ứng

dụng phƣơng pháp này trong việc phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

trên các đối tƣợng rau xanh khác cũng nhƣ các loại trái cây và các sản phẩm nông

nghiệp.

3.3.2.5. So sánh với một số phòng thí nghiệm

Để đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích đã đƣợc xây dựng ở trên,

chúng tôi đã tiến hành gửi một số mẫu chuẩn đến một số phòng thí nghiệm uy tín

nhƣ trình bày trong phần 2.3.4 để so sánh các kết quả phân tích. Các kết quả đƣợc

đánh giá thông qua chỉ số z-score. Kết quả so sánh với các phòng thí nghiệm đƣợc

trình bày trong các bảng dƣới đây.

Bảng 3.8. Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 10 ng.mL-1

z-score

SD Hợp chất PTN ATTP PTN HCM PTN VHH PTN HCTN PTN ATTP PTN HCM PTN VHH PTN HCTN

10,4 10,0 9,9 0,24 1,67 0 -0,42 -0,42 9,9 IAA

10,5 10,7 10,2 0,43 1,16 1,63 0,47 -0,70 9,7 IBA

9,6 10,1 10,1 10,0 0,24 -1,67 0,42 0,42 0 ICA

9,8 IPA 10,0 10,0 10,2 0,16 0 0 1,25 -1,25

9,6 9,7 10,0 9,9 0,18 0 -0,56 -1,67 -2,22 GA3

9,9 10,0 10,2 9,6 0,25 0,80 -1,60 0 -0,40 GA4

9,5 0 -1,06 10,3 10,6 10,0 0,47 0,64 1,28 GA7

9,4 BA 9,8 10,0 9,9 0,26 0 -0,38 -0,77 -2,31

9,6 DHZR 9,3 9,9 9,9 0,29 -0,34 -0,34 -2,41 -1,38

iP 9,7 9,7 9,8 10,2 0,24 -1,25 -0,83 -1,25 0,83

iPR 10,0 9,7 10,0 10,5 0,33 -0,91 0 1,52 0

K 10,0 9,8 10,5 10,0 0,30 -0,67 1,67 0 0

tZ 10,4 9,9 10,0 10,0 0,22 1,82 -0,45 0 0

tZR 10,3 10,2 9,9 9,3 0,45 0,67 0,44 -0,22 -1,56

Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu có nồng độ mỗi chất 10 ng.mL-1 cho thấy các hợp chất nghiên cứu có nồng độ trung bình dao động từ 9,3-10,7 ng.mL; giá trị trung vị là 10,0 ng.mL-1 và độ lệch chuẩn của các phƣơng

pháp từ 0,16-0,47 (Bảng 3.8). Hệ số z-score đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ sai

lệch của kết quả phân tích của các phòng thí nghiệm theo thứ tự: ǀzǀ ≤ 2: đạt; 2 < ǀzǀ

< 3: cần xem xét lại; ǀzǀ ≥ 3: có số lạc. Kết quả phân tích cho thấy, tất cả các hợp

chất nghiên cứu theo phƣơng pháp của PTN ATTP có giá trị tƣơng đồng với các

phòng thí nghiệm đối chứng khác: PTN HCM, PTN VHH và PTN HCTN. Hệ số z-

score của phƣơng pháp phân tích có giá trị ǀzǀ ≤ 2, đạt yêu cầu của chƣơng trình thử

nghiệm thành thạo. Điều này cho thấy rằng quy trình phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật đối với mẫu thử nghiệm có nồng độ 10 ng.mL-1 đảm bảo độ tin

cậy của phƣơng pháp nghiên cứu.

Bảng 3.9. Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 100 ng.mL-1

z-score

SD Hợp chất PTN ATTP PTN HCM PTN VHH PTN HCTN PTN ATTP PTN HCM PTN VHH PTN HCTN

106,2 93,9 100,9 97,5 5,23 1,19 -1,17 0,17 -0,48 IAA

101,1 101,6 102,8 106,0 2,20 0,50 0,73 1,27 2,73 IBA

104,2 102,5 94,5 106,1 5,10 0,82 0,49 -1,08 1,20 ICA

103,7 104,2 95,7 98,7 4,09 0,90 1,03 -1,05 -0,32 IPA

104,8 101,3 100,6 99,2 2,41 1,99 0,55 0,25 -0,34 GA3

96,1 97,5 103,8 100,1 3,38 -1,15 -0,74 1,12 0,03 GA4

103,0 98,3 101,1 99,6 2,02 1,49 -0,84 0,54 -0,20 GA7

98,7 101,7 100,8 93,5 3,67 -0,35 0,46 0,22 -1,77 BA

DHZR 101,5 99,5 98,1 98,2 1,58 0,95 -0,32 -1,20 -1,14

102,3 94,2 93,2 96,8 4,08 0,56 -1,42 -1,67 -0,78 iP

97,6 103,6 99,1 105,2 3,61 -0,66 1,00 -0,25 1,44 iPR

99,1 105,5 102,5 100,4 2,79 -0,32 1,97 0,90 0,14 K

99,8 98,1 107,0 101,4 3,86 -0,05 -0,49 1,81 0,36 tZ

tZR 98,2 95,1 96,1 105,3 4,60 -0,39 -1,07 -0,85 1,15

Kết quả nghiên cứu tƣơng tự đối với mẫu có nồng độ 100 ng.mL-1 cho thấy nồng độ trung bình của các hợp chất nghiên cứu dao động từ 93,2-107,0 ng.mL-1; giá trị trung vị là 100,5 ng.mL-1 và độ lệch chuẩn của phƣơng pháp từ 1,58-5,23

(Bảng 3.9). Các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật phân tích theo phƣơng

pháp của PTN ATTP có giá trị tƣơng đồng với các phòng thí nghiệm đối chứng:

PTN HCM, PTN VHH và PTN HCTN, đặc biệt, hệ số z-score của tất cả các chất

nghiên cứu có giá trị ǀzǀ ≤ 2, đạt yêu cầu của chƣơng trình thử nghiệm thành thạo đối

với việc phân tích các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau

xanh. Kết quả này cho thấy độ chính xác và độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích

các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh có nồng độ 100 ng.mL-1 của PTN ATTP.

Bảng 3.10. Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu 1000 ng.mL-1

z-score

SD Hợp chất PTN ATTP PTN HCM PTN VHH PTN HCTN

IAA 1007,0 1056,8 1074,1 1016,1 32,13 PTN ATTP 0,22 PTN HCM 1,77 PTN VHH 2,31 PTN HCTN 0,50

IBA 975,7 961,0 1028,1 1017,1 32,21 -0,75 -1,21 0,87 0,53

ICA 993,9 945,6 985,0 1053,2 44,45 -0,14 -1,22 -0,34 1,20

IPA 995,5 967,8 1067,6 1020,4 42,37 -0,11 -0,76 1,60 0,48

999,3 983,6 989,9 975,6 10,02 -0,07 -1,64 -1,01 -2,44 GA3

1009,8 1015,8 1001,1 954,2 28,01 0,35 0,56 0,04 -1,64 GA4

1074,2 993,7 1044,5 973,4 46,16 1,61 -0,14 0,96 -0,58 GA7

BA 986,7 967,6 1014,7 1029,8 27,87 -0,48 -1,16 0,53 1,07

DHZR 981,6 981,3 992,3 1030,5 23,29 -0,79 -0,80 -0,33 1,31

iP 1024,4 1012,3 980,7 986,8 20,73 1,18 0,59 -0,93 -0,64

iPR 982,7 1061,8 993,0 1002,8 35,45 -0,49 1,74 -0,20 0,08

K 1008,3 950,5 1045,3 979,0 40,58 0,20 -1,21 1,12 -0,52

tZ 1000,7 1014,8 1027,6 1004,7 12,00 0,06 1,23 2,30 0,39

tZR 1034,6 1031,0 1025,3 963,5 33,62 1,03 0,92 0,75 -1,09

Kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm đối với mẫu có nồng độ 1000 ng.mL-1 cho thấy, các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật có giá trị nồng độ trung bình đạt từ 945,6-1074,2 ng.mL-1; trung vị là 1001,95 và độ lệch chuẩn giữa

các phòng thí nghiệm dao động từ 10,02-46,16 (Bảng 3.10). Kết quả phân tích cho

thấy, giá trị nồng độ của các chất thử nghiệm phân tích theo phƣơng pháp của PTN

ATTP tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của các phòng thí nghiệm đối chứng:

PTN HCM, PTN VHH và PTN HCTN. Đặc biệt, tất cả các hợp chất nghiên cứu của

PTN ATTP có hệ số ǀzǀ ≤ 2, đạt yêu cầu của chƣơng trình thử nghiệm thành thạo đối

với việc phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh.

Nhƣ vậy, kết quả so sánh với một số phòng thí nghiệm của 3 mẫu nghiên cứu

ở 3 mức nồng độ của các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật, tƣơng ứng 10, 100 và 1000 ng.mL-1 cho thấy, phƣơng pháp phân tích của Phòng Thí nghiệm Trọng

điểm về An toàn Thực phẩm và Môi trƣờng - Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển

giao Công nghệ thu đƣợc các giá trị tƣơng đồng với các phòng thí nghiệm đối

chứng với hệ số z-score của các chất nghiên cứu đạt ǀzǀ ≤ 2. Điều này có nghĩa các

kết quả phân tích các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau cải

xanh theo quy trình đƣợc xây dựng và đánh giá đảm bảo độ tin cậy, có thể ứng dụng

trong việc phân tích các mẫu thực nhằm khảo sát hiện trạng sử dụng chất kích thích

sinh trƣởng thực vật trong sản xuất rau xanh.

3.4. Kết quả đánh giá hiện trạng dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực

vật trong các mẫu rau thu thập tại Hà Nội

3.4.1. Số lượng mẫu rau phát hiện chứa các chất kích thích sinh trưởng thực vật

Tổng số 111 mẫu rau cải xanh đƣợc thu thập tại các quận/ huyện cung cấp

rau chính cho trung tâm Thành phố Hà Nội, đƣợc phân tích để xác định sự tồn dƣ

của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật. Kết quả phân tích cho thấy, có 83 mẫu

tƣơng đƣơng 74,77% số mẫu phát hiện dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng

thực vật bằng hoặc cao hơn giới hạn định lƣợng trong khi đó chỉ có 11 mẫu tƣơng

ứng với 9,91% số mẫu không phát hiện các chất kích thích sinh trƣởng thực vật. Có

17 mẫu chiếm 15,32%, phân tích có hàm lƣợng chất KTST cao hơn MDL và thấp

hơn MQL (Hình 3.32).

Hình 3.33 biểu thị số lƣợng mẫu chứa các chất kích thích sinh trƣởng thực

vật thu thập ở các huyện khác nhau. Số lƣợng mẫu định lƣợng đƣợc các chất PGRs

khác nhau ở các quận huyện, và đƣợc sắp xếp theo thứ tự: quận Hoàng Mai (100%)

> huyện Đông Anh (89,47%) > huyện Sóc Sơn (71,43%) > huyện Phúc Thọ (70%)

> huyện Gia Lâm (66,67%) và huyện Mê Linh (66,67%). Một tỷ lệ thấp về số lƣợng

các mẫu không phát hiện các chất PGRs đƣợc ghi nhận khoảng 16,67%; 14,81% và

14,29% tƣơng ứng ở các huyện: Mê Linh, Gia Lâm và Sóc Sơn. Điều này cho thấy

một tỷ lệ lớn số mẫu rau cải xanh phát hiện chứa các chất PGRs ở các huyện nghiên

cứu.

Hình 3.32. Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh Hình 3.33. Tỷ lệ phát hiện các chất KTST trong rau cải xanh ở các huyện nghiên cứu

3.4.2. Số lượng chất kích thích sinh trưởng thực vật phát hiện được trong các

mẫu rau cải xanh

Bảng 3.11. Số lƣợng các chất KTST phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh

Quận/ Huyện

Hợp chất

Đông Anh Gia Lâm Mê Linh Sóc Sơn Hoàng Mai Phúc Thọ

tZ +

+ + GA3

IBA + + +

IAA + + + +

ICA + + + +

IPA + + + +

+ + + + GA7

+ + + + + + GA4

5 7 5 3 6 2 Số chất đƣợc phát hiện

Bảng 3.11 biểu thị số lƣợng chất KTST đƣợc tìm thấy trong các mẫu rau cải

xanh. Có sự khác nhau về số lƣợng và chủng loại chất KTST đƣợc ngƣời dân sử

dụng ở các huyện nghiên cứu. Trong đó, số lƣợng chất KTST nhiều nhất đƣợc phát

hiện trong các mẫu rau thu thập ở huyện Gia Lâm, gồm: IAA, ICA, IBA, IPA, GA4,

GA7 và tZ. Ở huyện Đông Anh, nguời nông dân sử dụng các loại thuốc chứa các

chất IBA, IPA, GA3, GA4 và GA7 trong sản xuất rau xanh. Đặc biệt, ở quận Hoàng

Mai và huyện Mê Linh, ngƣời dân lựa chọn các loại thuốc có chứa các chất KTST

nhƣ IAA, ICA, IPA, GA4 và GA7 để thúc đẩy sự phát triển của rau cải xanh. Bên

cạnh đó, các thuốc chứa hợp chất GA3 đƣợc sử dụng nhƣ một trong số các chất

KTST trong sản xuất rau xanh ở quận Hoàng Mai. Một số chất kích thích sinh

trƣởng thực vật nhƣ IAA, ICA, GA4 đƣợc sử dụng ở huyện Sóc Sơn; các chất nhƣ

IBA và GA4 đƣợc sử dụng ở huyện Phúc Thọ. Kết quả nghiên cứu này cho thấy

rằng, GA4 là hợp chất kích thích sinh trƣởng phổ biến nhất đƣợc phát hiện trong các

mẫu rau cải xanh thu thập ở cả 6 quận huyện thuộc thành phố Hà Nội, trong khi đó,

hợp chất tZ đƣợc phát hiện trong mẫu rau thu thập ở 01 huyện (Gia Lâm).

3.4.3. Hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng thực vật phát hiện được trong

các mẫu rau cải xanh

Hàm lƣợng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật phát hiện đƣợc trong

các mẫu rau cải xanh thu thập ở 6 quận/ huyện của Hà Nội nhƣ: Hoàng Mai, Đông

Anh, Sóc Sơn, Phúc Thọ, Gia Lâm và Mê Linh đƣợc trình bày ở Bảng 3.12. Có 8

hợp chất PGRs đƣợc phát hiện trong các mẫu rau gồm: IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, GA7 và tZ với dƣ lƣợng dao động trong khoảng từ 0,01-1,37 mg.kg-1, với giá trị trung bình và trung vị lần lƣợt là: 0.47 ± 0.39 mg.kg-1 và 0.39 mg.kg-1. Dựa trên

những dữ liệu phân tích của chúng tôi, dƣ lƣợng cao nhất đƣợc phát hiện là 0.65 ± 0.54 mg.kg-1 GA3. Tiếp đến là các hợp chất IAA và GA7 có hàm lƣợng tìm thấy tƣơng ứng là 0.56 ± 0.46 mg.kg-1 và 0.52 ± 0.37 mg.kg-1. Sau đó, dƣ lƣợng của GA4 và IPA lần lƣợt đƣợc phát hiện ở mức 0.49 ± 0.38 mg.kg-1 và 0.41 ± 0.38 mg.kg-1;

trong khi đó mức dƣ lƣợng tƣơng đƣơng của các chất IBA và ICA đƣợc xác định lần lƣợt là 0.37 ± 0.38 mg.kg-1 và 0.34 ± 0.40 mg.kg-1. Dƣ lƣợng thấp nhất trong số

các chất kích thích sinh trƣởng thực vật phát hiện đƣợc trong các mẫu rau ở mức 0.04 ± 0.01 mg.kg-1 của hợp chất tZ (Bảng 3.12).

Bảng 3.12. Hàm lƣợng của các KTST phát hiện đƣợc trong các mẫu rau cải xanh

Hợp chất n Hàm lƣợng (mg.kg-1) TB ± SD (mg.kg-1) Tỷ lệ (%)

9.91 0.14-1.18 0.56 ± 0.46 11 IAA

4.50 0.02-0.85 0.37 ± 0.38 5 IBA

0.01-1.08 0.34 ± 0.40 20 18.02 ICA

0.05-0.94 0.41 ± 0.38 13 11.71 IPA

0.03-0.98 0.65 ± 0.54 5 4.50 GA3

0.02-1.37 0.49 ± 0.38 63 56.76 GA4

0.04-1.36 0.52 ± 0.37 34 30.63 GA7

- - - - BA

- - - - iP

- - - - iPR

0.03-0.05 0.04 ± 0.01 4 3.60 tZ

- - - - K

- - - - DHZR

- - - - tZR

(-): Giá trị dƣới MQL; n: Số lƣợng mẫu

Bên cạnh đó, có sự khác nhau về tỷ lệ mẫu có chứa các chất kích thích sinh

trƣởng thực vật khác nhau, đƣợc biểu thị ở Bảng 3.13. Hợp chất GA4 đƣợc phát

hiện trong 63 mẫu phân tích (56,76%), trong khi đó, các hợp chất GA7 và ICA lần

lƣợt đƣợc tìm thấy trong 34 mẫu (30,63%) và 20 mẫu (18,02%). Tỷ lệ mẫu chứa các

hợp chất IPA và IAA lần lƣợt là 13 mẫu (11,71%) và 11 mẫu (9,91%). Các hợp chất

IBA và GA3 đƣợc tìm thấy trong các mẫu rau với tỷ lệ tƣơng đồng nhau 5 mẫu

(chiếm 4,5%), trong khi đó có 4 mẫu (3,6%) phát hiện hợp chất tZ. Tuy nhiên,

nhiều hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật thuộc nhóm cytokinin nhƣ BA, iP,

iPR, K, DHZR và tZR không có trong các mẫu rau cải xanh thu thập tại các quận

huyện cung cấp rau xanh cho khu vực Trung tâm Thành phố Hà Nội (Bảng 3.12).

Điều này cho thấy rằng, các hợp chất KTST thuộc nhóm cytokinin ít đƣợc sử dụng

trong sản xuất rau cải xanh so với các hợp chất KTST thuộc các nhóm khác nhƣ:

auxin và gibberellin. Đặc biệt, hợp chất GA4 đƣợc xem là chất kích thích thích sinh

trƣởng thực vật đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất rau xanh ở nhiều quận

huyện thuộc Hà Nội.

3.4.4. Sự tồn dư nhiều hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật trong mẫu rau

cải xanh ở các khu vực nghiên cứu

Hình 3.34 mô tả sự phân bố và tính chính xác của hàm lƣợng các chất kích

thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau cải xanh thu thập ở các huyện nghiên

cứu thuộc thành phố Hà Nội. Dữ liệu đƣợc biểu thị bằng biểu đồ hình hộp với các

râu trên và râu dƣới (boxs-and-whiskers) thể hiện giá trị tối thiểu, phân vị thứ 25,

giá trị trung vị, phân vị thứ 75 và giá trị tối đa. Kết quả phân tích cho thấy, sự phân

bố của các chất kích thích sinh trƣởng trong các mẫu khác nhau giữa các huyện

nghiên cứu, trong đó, huyện Đông Anh và huyện Gia Lâm xuất hiện nhiều loại chất

kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau cải xanh, cũng nhƣ số lƣợng mẫu

phát hiện các chất kích thích sinh trƣởng thực vật (Hình 3.34). Bên cạnh đó, sự phân

bố của các nồng độ chất kích thích sinh trƣởng có sự khác nhau giữa các huyện nghiên cứu với hàm lƣợng trung bình dao động trong khoảng 0,01 đến 1,37 mg.kg-1.

Đặc biệt, hàm lƣợng tối đa của cùng một loại hoạt chất kích thích sinh trƣởng thực

vật xác định đƣợc trong các mẫu rau khác nhau giữa các huyện nghiên cứu khác

nhau.

Ví dụ, sự khác nhau về nồng độ của GA4 xác định đƣợc trong các mẫu rau

thu thập ở các huyện Đông Anh, Gia Lâm, Mê Linh, Sóc Son, Hoàng Mai và Phúc Thọ. Nồng độ cao nhất phân tích đƣợc là 1,37 mg.kg-1 trong các mẫu rau thuộc huyện Đông Anh, tiếp đến là 1,29 mg kg-1 ở huyện Mê Linh và 1,09 mg.kg-1 ở huyện Gia Lâm, sau đó là 0,95 mg.kg-1 ở huyện Sóc Sơn và 0,61 mg.kg-1 ở huyện Hoàng Mai, và thấp nhất là 0,33 mg.kg-1 ở huyện Phúc Thọ. Đối với GA7, là hoạt

chất không phát hiện ở các huyện Sóc Son và Phúc Thọ; tuy nhiên, nó đƣợc tìm

thấy khá phổ biến trong các mẫu rau thu thập ở huyện Mê Linh, với hàm lƣợng đo đƣợc cao nhất là 1,36 mg.kg-1. Các giá trị 1,07 mg.kg-1, 0,93 mg.kg-1 và 0,78 mg.kg- 1 là các nồng độ GA7 cao nhất phát hiện đƣợc trong các mẫu rau thu thập ở các

huyện tƣơng ứng nhƣ Đông Anh, Gia Lâm và Hoàng Mai.

Hình 3.34. Sự phân bố hàm lƣợng của các chất KTST trong các mẫu rau cải xanh ở

các khu vực nghiên cứu

Trong đó

Giá trị cao nhất Giá trị trung vị Giá trị nhỏ nhất

- Giá trị biểu thị khu vực chỉ phát hiện 1 mẫu chứa chất KTST Hàm lƣợng cao nhất của IAA trong các mẫu rau cải giảm từ 1,18 mg.kg-1 ở huyện Gia Lâm xuống 0,92 mg.kg-1 ở huyện Mê Linh, sau đó là 0,63 mg.kg-1 ở

huyện Hoàng Mai, và thấp nhất là 0,30 mg.kg-1 ở huyện Sóc Sơn. Đặc biệt, các huyện Gia Lâm và Sóc Sơn có hàm lƣợng IAA tƣơng đƣơng nhau với 1,08 mg.kg-1 và 1,06 mg.kg-1. Một vài mẫu xác định đƣợc ICA đƣợc phát hiện ở huyện Mê Linh và huyện Hoàng Mai với các nồng độ tƣơng ứng là 0,17 mg.kg-1 và 0,01 mg.kg-1.

Nồng độ cao nhất của IBA trong các mẫu rau thu thập ở huyện Đông Anh và Gia Lâm lần lƣợt là 0,85 mg.kg-1 và 0,02 mg.kg-1, trong khi đó nồng độ cao nhất của IPA phân tích đƣợc ở mức 0,94 mg.kg-1, 0,77 mg.kg-1, 0,72 mg.kg-1 và 0,07 mg.kg-1 tƣơng ứng ở các huyện Đông Anh, Gia Lâm, Mê Linh và Hoàng Mai. Đặc

biệt, giá trị tối đa của GA3 sử dụng ở các huyện Đông Anh và Hoàng Mai tƣơng đồng nhau với 0,98 mg.kg-1 và 0,94 mg.kg-1. Hoạt chất tZ đƣợc phát hiện trong một số mẫu rau thu thập ở huyện Gia Lâm với hàm lƣợng 0,05 mg.kg-1, trong khi đó, các

huyện khác không phát hiện hoạt chất này.

Một số tác giả cho rằng, rất khó để phân biệt giữa các chất kích thích sinh

trƣởng xảy ra trong tự nhiên với dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng tổng hợp

đƣợc ứng dụng. Trong tự nhiên, hàm lƣợng của các chất kích thích sinh trƣởng trong các mô thực vật rất thấp, dao động trong khoảng 10–9 to 10–6 M [131, 132].

Chu và cộng tác viên [133] cho rằng các hoocmon thực vật trong cây chỉ ở mức độ vết với hàm lƣợng 0,1 - 50 ng.g-1 khối lƣợng tƣơi. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu

trên mẫu rau cải thu thập ở các huyện Đông Anh, Gia Lâm, Mê Linh, Sóc Sơn,

Hoàng Mai và Phúc Thọ phát hiện các chất kích thích sinh trƣởng thực vật có hàm

lƣợng cao hơn. Đây có thể là sự tích lũy các chất kích thích sinh trƣởng nhân tạo từ

việc sử dụng của ngƣời dân trong quá trình sản xuất rau, là tác nhân có thể ảnh

hƣởng đến sức khỏe của ngƣời tiêu dùng.

Sự tích lũy của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau đã

đƣợc báo cáo trong các nghiên cứu trƣớc đây. Theo nghiên cứu của Bauer và cộng

sự [134], tổng số 1888 mẫu rau quả đƣợc phân tích để xác định sự tồn dƣ ethephon.

Dƣ lƣợng của ethephon đƣợc tìm thấy trong táo, lê, nho, dứa, nƣớc ép dứa, sầu

riêng, quả sung, ớt ngọt, bƣởi, hồng, xoài, cam, mận, đào và cà chua. Kết quả có

151 mẫu (chiếm 8%) phát hiện dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng, trong đó

28 mẫu (1,5%) xác định đƣợc hàm lƣợng ethephon cao hơn mức dƣ lƣợng tối đa.

Có sáu mẫu rau, gồm 1 mẫu cam, 1 mẫu dứa, 2 mẫu cà chua và 2 mẫu ớt ngọt đƣợc

xem không an toàn cho ngƣời sử dụng theo Điều 14 Quy định (EC) số 178/2002 của

Hội đồng Nghị viện Châu Âu [135].

Gehan và cộng tác viên [71], đã khảo sát và đánh giá hàm lƣợng của các chất

kích thích sinh trƣởng thực vật tồn dƣ trong các mẫu rau: cà rốt, cải bắp, rau diếp,

cà chua, dƣa chuột, mùi tây ở Giza, Hy Lạp. Bốn loại chất kích thích sinh trƣởng,

gồm GA3, α-NAA, 2,4-D và ethephon đã đƣợc tìm thấy. Kết quả phân tích cho thấy,

60,7% số mẫu phát hiện có dƣ lƣợng của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật

với hàm lƣợng trên giới hạn an toàn đƣợc xếp theo thứ tự: 2,4-D (74%) > NAA

(66%) > Eth (45%) > GA3 (42%). Thêm vào đó, tác giả cũng cho rằng, các

gibberellin tổng hợp thƣờng đƣợc ứng dụng trong việc thúc đẩy sự phát triển của

các loại rau, và sự kết hợp của chúng làm gia tăng năng suất và sản lƣợng sản xuất.

Nhƣng, dƣ lƣợng của gibberellin có nguy cơ gây ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Trong một nghiên cứu khác, 0,05 mg.kg-1dƣ lƣợng gibberellin đƣợc phát

hiện trong cây mía trồng ở tỉnh Quý Châu – Trung Quốc [136]. Kết quả này thấp hơn so với mức hàm lƣợng quy định trên cây mía của Hoa Kỳ là 0,15 mg.kg-1. Mức

dƣ lƣợng của gibberellin đƣợc quy định theo Giới hạn dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong thực phẩm là 0,10 mg.kg-1 [137]. Theo Giới hạn dƣ lƣợng tối đa (MRLs) của EU

[72], giới hạn an toàn của dƣ lƣợng gibberellin trong rau đƣợc quy định là 0,20 mg.kg-1. Đây cũng là mức giới hạn dƣ lƣợng tối đa của gibberellin trong các loại rau

theo quy định của Nhật Bản và Hoa Kỳ [138]. Tuy nhiên theo kết quả phân tích của

chúng tôi, dƣ lƣợng trung bình của các chất kích thích sinh trƣởng, đặc biệt là dƣ lƣợng gibberellin dao động trong khoảng 0,49 đến 0,65 mg.kg-1 (Bảng 3.12), cao

hơn so với các quy định của Châu Âu, Hoa Kỳ và Nhật Bản. Theo Sørensen và

Danielsen [139] và Erin và ctv [140], việc lạm dụng hóa chất nông nghiệp, đặc biệt

là các chất kích thích sinh trƣởng có thể làm ô nhiễm môi trƣờng, ngộ độc thực

phẩm và các vấn đề sức khỏe khác của ngƣời tiêu dùng. Hơn nữa, dƣ lƣợng chất

kích thích sinh trƣởng trong các sản phẩm nông nghiệp và nƣớc uống có nguy cơ

ảnh hƣởng nghiêm trọng đến vật nuôi và sức khỏe con ngƣời [141, 142]. Điều này

cho thấy rằng, sự phát hiện dƣ lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong

các mẫu rau cải xanh thu thập ở các huyện Đông Anh, Gia Lâm, Mê Linh, Sóc Sơn,

Hoàng Mai và Phúc Thọ có thể tiềm ẩn các nguy cơ ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời

tiêu dùng, nên đƣợc quản lý bởi các cơ quan chức năng để giảm thiểu tác động của

chúng đối với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng xung quanh.

3.5. Đánh giá ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến sự phát

triển của một số loại rau và mức độ tích lũy của chúng

3.5.1. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của một số loại rau xanh

3.5.1.1. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau cải xanh

Sự ảnh hƣởng của thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật GA3 đến sự phát

triển của rau cải xanh đƣợc trình bày ở Hình 3.35. Các nồng độ xử lý khác nhau của

GA3 có ảnh hƣởng khác nhau đến sự phát triển chiều cao, số lƣợng lá và sinh khối

của rau cải xanh. Kết quả nghiên cứu cho thấy, từ ngày trồng cây đến ngày thí

nghiệm thứ 7 chƣa xử lý GA3, chiều cao trung bình của rau cải xanh ở các công

thức thí nghiệm tƣơng đối đồng đều, dao động từ 10,1-12,5 cm. Chiều cao của rau

cải xanh có sự gia tăng theo thời gian thí nghiệm và theo nồng độ xử lý của GA3 ở

các công thức thí nghiệm. Việc xử lý GA3 vào ngày thí nghiệm thứ 7, thứ 14 và thứ

21 cho kết quả phân hóa về chiều cao của rau cải xanh giữa các công thức xử lý

GA3 với đối chứng. Đặc biệt, từ ngày thí nghiệm thứ 14 trở đi, có sự khác nhau rõ rệt về chiều cao của cải xanh giữa công thức xử lý GA3 50 mg.L-1 với các công thức xử lý 10; 30; 100 mg.L-1 GA3 và đối chứng. Kết quả thí nghiệm ngày thứ 35 cho

thấy chiều cao trung bình của cải xanh có sự khác biệt giữa các công thức xử lý GA3 với đối chứng và giữa công thức xử lý GA3 50 mg.L-1 với 100 mg.L-1, 30 mg.L-1 và 10 mg.L-1. Tuy nhiên, không có sự khác biệt về chiều cao rau cải xanh giữa hai công thức xử lý GA3 10 mg.L-1 và 30 mg.L-1. Sau 35 ngày thí nghiệm, rau cải xanh đƣợc xử lý GA3 50 mg.L-1 có chiều cao trung bình cao nhất đạt 38 cm và

cao hơn 25% so với các cây không đƣợc xử lý GA3; tiếp đến là công thức xử lý 100 mg.L-1 GA3 có chiều cao đạt 35,5 cm cao hơn đối chứng 19,72%, sau đó là công thức xử lý 30 mg.L-1 GA3 với chiều cao đạt 33,40 cm, cao hơn 14,67% và công thức 10 mg.L-1 GA3 có chiều cao đạt 32,6 cm, cao hơn so với đối chứng 12,58% chiều

cao cây đạt 28,50 cm (Hình 3.35A).

Đối chứng

)

10 mg/L

m c (

30 mg/L

50 mg/L

100 mg/L

h n a x i ả c u a r

o a c

u ề i h C

14 Ngày thí nghiệm

(B)

Đối chứng

10 mg/L

30 mg/L

50 mg/L

) 1 - y â c . á l (

100 mg/L

h n a x i ả c u a r á l

ố S

14 Ngày thí nghiệm

(A)

265.00

270

260

) 1 - y â c . g (

250

238.75

237.00

232.50

240

225.00

230

220

h n a x i ả c u a r i ố h k

210

h n i

200

100

Đối chứng

10 50 30 Nồng độ của GA3 (mg.L-1)

(C)

Hình 3.35. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau cải xanh

Số lƣợng lá rau cải xanh có sự gia tăng theo thời gian thí nghiệm, và nồng độ

xử lý GA3 khác nhau có ảnh hƣởng khác nhau đến sự phát triển số lá của rau cải

xanh. Sự khác biệt về số lƣợng lá giữa các công thức xử lý GA3 với đối chứng xảy

ra từ ngày thí nghiệm thứ 14; tuy nhiên, sự khác nhau về số lƣợng lá giữa các công

thức xử lý GA3 không đáng kể. Đặc biệt, sự khác nhau giữa các công thức thí

nghiệm biểu hiện rõ nhất ở các ngày thí nghiệm thứ 21 và 35. Kết quả nghiên cứu

cho thấy, sau 35 ngày thí nghiệm, số lƣợng lá cải xanh nhiều nhất ở công thức xử lý GA3 50 mg.L-1 với 8,7 lá.cây-1, tiếp đến là công thức xử lý GA3 100 mg.L-1 với 8,2 lá/cây, sau đó là công thức xử lý GA3 30 mg.L-1 với 7,6 lá.cây-1 và GA3 10 mg.L-1 với 7,1 lá.cây-1, và thấp nhất ở đối chứng chỉ có 6,3 lá.cây-1 (Hình 3.35B).

Bên cạnh chiều cao và số lƣợng lá thì sinh khối của cây cũng là một trong

những yếu tố quan trọng đƣợc quan tâm trong việc đánh giá sự ảnh hƣởng của GA3

đối với sự sinh trƣởng và phát triển của các loại rau. Việc xử lý GA3 làm gia tăng

sinh khối trung bình của rau cải xanh ở các công thức thí nghiệm, trong đó khối lƣợng rau cải cao nhất thu đƣợc ở công thức xử lý GA3 50 mg.L-1 đạt 265 g.cây-1, cao hơn 17,78% so với đối chứng; tiếp đến công thức xử lý GA3 30 mg.L-1 đạt 238,75 g.cây-1 và GA3 100 mg.L-1 đạt 237 g.cây-1 lần lƣợt cao hơn 6,11% và 5,33% so với đối chứng; sau đó là công thức xử lý GA3 10 mg.L-1 đạt 232,5 g.cây-1, cao

hơn 3,33% so với công thức không sử dụng chất kích thích sinh trƣởng GA3 đạt 225 g.cây-1 (Hình 3.21C). Tuy nhiên, không ghi nhận sự sai khác về sinh khối của rau cải xanh giữa các công thức xử lý GA3 10 mg.L-1, 30 mg.L-1 và 100 mg.L-1. Điều

này cho thấy rằng, rau cải xanh phát triển tốt nhất về chiều cao, số lƣợng lá và sinh khối ở điều kiện xử lý GA3 với nồng độ 50 mg.L-1 (Hình 3.35C).

Kết quả nghiên cứu này tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu trƣớc đây của

các nhà khoa học thuộc Viện Nông nghiệp Hạt nhân Bangladesh. Tác giả đã nghiên cứu ảnh hƣởng của GA3 ở các nồng độ khác nhau gồm 0, 25, 50 và 75 mg.L-1 lên sự

sinh trƣởng và sản lƣợng của cây cải xanh, và thu đƣợc kết quả, ở điều kiện xử lý 50 mg.L-1 cây cải xanh đạt chiều cao, số lƣợng nhánh, sản lƣợng hạt và sinh khối cao

nhất so với các nghiệm thức khác [143]. Trong một nghiên cứu khác, ảnh hƣởng

của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến sự sinh trƣởng, biến đổi sinh hóa và

sản lƣợng của cây cải xanh đã đƣợc nghiên cứu bởi Nitish và cộng sự [144]. Kết

100

quả nghiên cứu cho rằng, các nghiệm thức xử lý GA3 có tác dụng làm gia tăng hiệu quả sản xuất cải xanh, đặc biệt ở điều kiện xử lý 50 mg.L-1 GA3 cây cải xanh đạt chiều cao cao nhất là 67,88 cm và số lƣợng nhánh nhiều nhất là 22,46 nhánh.cây-1

sau 60 ngày thí nghiệm.

3.5.1.2. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau mồng tơi

Kết quả nghiên cứu tƣơng tự trên rau mồng tơi cho thấy sự khác nhau đáng

kể về chiều cao của rau giữa các công thức xử lý GA3 với đối chứng từ ngày thí

nghiệm thứ 14 trở đi. Kết thúc 35 ngày thí nghiệm thu đƣợc rau mồng tơi có chiều cao cao nhất ở công thức xử lý GA3 30 mg.L-1 đạt 20,13 cm, tiếp đến là công thức xử lý GA3 50 mg.L-1 đạt 19,47 cm, sau đó là công thức xử lý GA3 10 mg.L-1 đạt 18,17 cm, công thức xử lý GA3 100 mg.L-1 đạt 17,33 cm và thấp nhất ở đối chứng

đạt 16,32 cm (Hình 3.36A).

Sự ảnh hƣởng của việc xử lý GA3 đối với sự phát triển số lƣợng lá rau mồng

tơi đƣợc biểu thị ở Hình 3.36B. Không có sự khác biệt về số lƣợng lá rau mồng tơi

giữa các công thức thí nghiệm trong 7 ngày đầu thí nghiệm. Đến ngày thí nghiệm thứ 14, có sự sai khác giữa các công thức xử lý GA3 30 và 50 mg.L-1 với các công thức xử lý GA3 10 mg.L-1, 100 mg.L-1 và đối chứng về số lƣợng lá rau mồng tơi.

Kết quả tƣơng tự thu đƣợc ở ngày thí nghiệm thứ 21, trong đó các công thức xử lý GA3 10, 30 và 50 mg.L-1 có số lƣợng lá tƣơng đồng nhau và nhiều hơn so với các công thức xử lý GA3 100 mg.L-1 và đối chứng. Sau 35 ngày nghiên cứu, số lƣợng lá rau mồng tơi nhiều nhất đƣợc phát hiện ở công thức xử lý GA3 30 mg.L-1 đạt 11,83 lá, tiếp đến là các công thức xử lý GA3 10 mg.L-1 và 50 mg.L-1 có số lá tƣơng ứng là 10,42 lá.cây-1 và 10,33 lá.cây-1, và không có sự khác biệt về số lƣợng lá giữa công thức xử lý GA3 100 mg.L-1 và đối chứng, với 8,83 lá.cây-1 (Hình 3.36B).

101

Đối chứng

(A) A

)

10 mg/L

30 mg/L

m c ( i ơ t

50 mg/L

100 mg/L

g n ồ m u a r

o a c

u ề i h C

22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

14 Ngày thí nghiệm (B)

Đối chứng

10 mg/L

30 mg/L

50 mg/L

100 mg/L

) 1 - y â c . á l ( i ơ t

g n ồ m u a r á l

ố S

14 Ngày thí nghiệm

(C)

46.75

45.87

42.00

40.65

37.50

) 1 - y â c . g ( i ơ t

g n ồ m u a r g n ợ ƣ l i ố h K

100

Đối chứng

50 30 10 Nồng độ của GA3 (mg.L-1)

Hình 3.36. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau mồng tơi

102

Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển sinh khối của rau

mồng tơi đƣợc trình bày ở Hình 3.36C. Sau 35 ngày thí nghiệm, sinh khối trung

bình của rau mồng tơi đƣợc xử lý GA3 cao hơn nhiều so với đối chứng. Ở điều kiện xử lý GA3 30 mg.L-1, rau mồng tơi đạt sinh khối cao nhất với 46,75 g.cây-1, cao hơn 24,67% so với đối chứng; tiếp đến là công thức xử lý GA3 50 mg.L-1, với sinh khối 45,87 g.cây-1, cao hơn 22,32% so với đối chứng; sau đó là các công thức xử lý GA3 100 mg.L-1 và 10 mg.L-1 với sinh khối lần lƣợt là 42 g.cây-1 và 40,65 g.cây-1, tƣơng

ứng cao hơn 12% và 8,4% so với đối chứng. Không có sự khác nhau về sinh khối tƣơi của rau mồng tơi giữa các công thức xử lý GA3 30 mg.L-1 và 50 mg.L-1; và giữa các công thức xử lý GA3 10 mg.L-1 và 100 mg.L-1. Kết quả thí nghiệm cho

thấy, các nồng độ thích hợp đối với sự phát triển về chiều cao, số lƣợng lá và sinh khối của rau mồng tơi là 30 mg.L-1 và 50 mg.L-1. Kết quả này tƣơng đồng với kết luận của Satya và cộng tác viên [145], việc xử lý GA3 50 mg.L-1 làm gia tăng sự

phát triển mầm và chiều cao của thân cây mồng tơi. Bên cạnh đó, Taha và cộng sự

đã ghi nhận vai trò của hợp chất GA3 trong việc kích thích sự sự nảy mầm ở mô sẹo của rau mồng tơi trong điều kiện nhiệt độ 24 ± 1oC với thời gian chiếu sáng ban

ngày 16 giờ và ban đêm 8 giờ [146]. Trong khi đó, Neocleous và cộng sự [147] cho rằng công thức xử lý GA3 20 (mg.L-1) làm gia tăng sinh khối tƣơi và tăng chất

lƣợng của cây mồng tơi thí nghiệm.

3.5.1.3. Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của rau xà lách

Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển chiều cao, số lƣợng lá và sinh khối

tƣơi của rau xà lách đƣợc mô tả ở Hình 3.37. Các nồng độ xử lý GA3 khác nhau ảnh

hƣởng khác nhau đến sự phát triển chiều cao của xà lách. Các công thức xử lý GA3 gồm 10, 30 và 50 mg.L-1 làm gia tăng chiều cao của xà lách, trong khi đó công thức xử lý GA3 100 mg.L-1 làm giảm chiều cao của loài rau này khi so sánh với rau ở

công thức đối chứng. Kết quả sau 35 ngày thí nghiệm, chiều cao trung bình cao nhất của xà lách đƣợc phát hiện ở công thức xử lý GA3 30 mg.L-1 đạt 30,08 cm, thứ hai là công thức xử lý GA3 10 mg.L-1 đạt 29,54 cm, thứ ba là các công thức xử lý GA3 50 mg.L-1 đạt 27,50 cm, thứ tƣ là đối chứng đạt 25,17 cm và thấp nhất ở công thức xử lý GA3 100 mg.L-1 đạt 14,58 cm (Hình 3.37A).

103

Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển số lƣợng lá của cây

xà lách cho thấy, 14 ngày đầu thí nghiệm không có sự sai khác về số lƣợng lá trên

cây xà lách giữa các công thức thí nghiệm xử lý GA3 với đối chứng (Hình 3.37B).

Sự ảnh hƣởng của nồng độ xử lý GA3 đến sự phát triển lá trên cây xà lách đƣợc thể

hiện rõ ở ngày thí nghiệm thứ 21. Số lƣợng lá rau xà lách ở các công thức thí nghiệm GA3 10, 30 và 50 mg.L-1 tƣơng đồng nhau với 7,4 lá.cây-1; cao hơn so với số lƣợng lá ở công thức xử lý GA3 100 mg.L-1 và đối chứng là 6,7 lá.cây-1. Đặc biệt,

theo sự gia tăng thời gian thí nghiệm từ ngày 21 đến ngày 35, số lá xà lách ở công thức xử lý GA3 100 mg.L-1 có xu hƣớng giảm so với đối chứng. Kết quả thí nghiệm

thu đƣợc ở ngày thứ 35 cho thấy, số lƣợng lá xà lách nhiều nhất đƣợc phát hiện ở công thức xử lý GA3 30 mg.L-1 với 9,28 lá.cây-1, tiếp đến là công thức xử lý GA3 10 mg.L-1 với 8,76 lá.cây-1 và GA3 50 mg.L-1 với 8,53 lá.cây-1, sau đó là nghiệm thức đối chứng với 7,67 lá.cây-1 và thấp nhất ở công thức xử lý GA3 100 mg.L-1 với 7,25 lá.cây-1. Những dữ liệu này cho thấy, GA3 xử lý ở nồng độ thấp gồm: 10, 30 và 50 mg.L-1 trên cây xà lách trƣớc 21 ngày tuổi làm gia tăng số lƣợng lá cho cây, trong khi ở nồng độ cao GA3 100 mg.L-1 lại ức chế sự phát triển lá cây (Hình 3.37B).

Sự phát triển sinh khối của cây xà lách bị ảnh hƣởng bởi các nồng độ thí

nghiệm khác nhau của GA3 (Hình 3.37C). Kết quả nghiên cứu cho thấy, sinh khối trung bình của cây xà lách đạt giá trị cao nhất là 12,5 g.cây-1 ở nghiệm thức xử lý GA3 30 mg.L-1, cao hơn 45,32% so với đối chứng; tiếp đến là công thức xử lý GA3 10 mg.L-1, cao hơn 39,95% so với đối chứng; sau đó là công thức xử lý GA3 50 mg.L-1, cao hơn so 17,65% so với đối chứng. Đặc biệt, ở nồng độ xử lý GA3 100 mg.L-1, sinh khối của xà lách thu đƣợc thấp hơn 29,88% so với đối chứng. Bên cạnh đó, sinh khối của rau xà lách ở các công thức xử lý GA3 với nồng độ 10 mg.L-1 và 30 mg.L-1 cao hơn so với các công thức xử lý GA3 50 mg.L-1 và 100 mg.L-1 và đối

chứng (Hình 3.37C).

104

(A)

Đối chứng

)

10 mg/L

30 mg/L

50 mg/L

100 mg/L

m c ( h c á l à x u a r

o a c

u ề i h C

14 Ngày thí nghiệm (B)

Đối chứng

10 mg/L

30 mg/L

50 mg/L

100 mg/L

) 1 - y â c . á l ( h c á l à x u a r á l

ố S

14 Ngày thí nghiệm

(C)

30.08

29.54

21.50

18.75

14.58

) 1 - y â c . g ( h c á l à x u a r g n ợ ƣ l i ố h K

100

Đối chứng

10 50 30 Nồng độ của GA3 (mg.L-1)

Hình 3.37. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển của rau xà lách

105

Theo Harrington và cộng sự [148], việc xử lý GA3 ở các nồng độ từ 3-10 mg.L-1 bằng cách phun qua lá ở giai đoạn xà lách có 4 lá và 8 lá làm gia tăng sự

sinh trƣởng và phát triển, đồng thời giúp thu hoạch xà lách sớm hơn so với chu trình

phát triển của nó khoảng 14 ngày. Geoge và cộng sự [149] đã khảo sát sự ảnh hƣởng của việc xử lý GA3 ở các nồng độ khác nhau gồm: 0, 25 và 50 mg.L-1 đến sự

phát triển chiều cao của cây xà lách. Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc ứng dụng

GA3 làm gia tăng chiều cao của rau xà lách ở các công thức thí nghiệm. Đặc biệt, số lƣợng lá của xà lách nhiều nhất đƣợc tìm thấy ở công thức xử lý GA3 25 mg.L-1.

Tuy nhiên, sản lƣợng sinh khối tƣơi và khô cao nhất của xà lách đƣợc phát hiện ở công thức xử lý GA3 50 mg.L-1 [149]. Taslima Akter [150] nghiên cứu ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng GA3 ở các nồng độ 0, 25 và 50 mg.L-1 lên sự phát

triển và sản lƣợng của cây xà lách cho rằng, sản lƣợng xà lách cao nhất thu đƣợc ở nghiệm thức xử lý GA3 25 mg.L-1 với 29,05 tấn.ha-1 trong khi đó công thức đối chứng, sản lƣợng xà lách chỉ đạt 16,27 tấn.ha-1. Mới đây, Alessandro và cộng sự

[151] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển số lƣợng lá của cây xà lách thông qua việc bổ sung GA3 với các hàm lƣợng thấp: 0, 10-8, 10-6, 10-4 M vào

dung dịch dinh dƣỡng. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tổng số lƣợng lá trung bình trên cây cao nhất thu đƣợc ở nghiệm thức bổ sung GA3 nồng độ 10-6 M vào dung

dịch dinh dƣỡng nuôi cây. Kết quả nghiên cứu cho thấy cây xà lách phát triển về chiều cao, số lƣợng lá và sinh khối tốt nhất ở điều kiện xử lý GA3 10-30 mg.L-1.

Những bằng chứng trên cho thấy rằng, GA3 đóng vai trò quan trọng trong

kích thích sự sinh trƣởng, phát triển và gia tăng sản lƣợng sinh khối của các loại rau

xanh. Tuy nhiên, tùy theo đối tƣợng nghiên cứu, mỗi loại rau thích hợp với một

nồng độ xử lý GA3 nhất định, trong đó, rau cải xanh phát triển tốt nhất ở điều kiện xử lý GA3 50 mg.L-1, trong khi đó, GA3 30 mg.L-1 là nồng độ thích hợp nhất đối với

sự phát triển của rau mồng tơi và xà lách. Đây có thể là cơ sở để lựa chọn nồng độ

thích hợp ứng dụng trong sản xuất từng loại rau nhằm kích thích sự sinh trƣởng phát

triển và gia tăng hiệu quả sản xuất rau xanh.

3.5.2. Sự tích lũy của GA3 trong một số loại rau

Sự tích lũy của chất kích thích sinh trƣởng thực vật GA3 trong các loại rau:

cải xanh, mồng tơi và xà lách sau 35 ngày thí nghiệm đƣợc trình bày trong Hình

106

3.38. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lƣợng GA3 trong mỗi loại rau tƣơng đồng

nhau giữa các công thức thí nghiệm trong 7 ngày đầu, sau đó có sự gia tăng theo

thời gian nghiên cứu từ ngày 14 tới ngày 35.

Trƣớc khi đƣợc xử lý bằng thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật GA3, rau cải xanh 7 ngày tuổi có hàm lƣợng GA3 trung bình khoảng 0,113 ± 0,0024 mg.kg-1. Ở

công thức đối chứng cho thấy, hàm lƣợng GA3 trong rau có sự gia tăng cùng với sự sinh trƣởng và phát triển của cây theo thời gian từ 0,115 mg.kg-1 ở ngày thứ 7 đến 0,125 mg.kg-1 ở ngày thứ 21, sau đó giảm xuống 0,115 mg.kg-1 ở ngày thứ 35. Điều

này cho thấy, bản thân cây rau đã có sự điều hòa hàm lƣợng chất kích thích sinh

trƣởng thực vật GA3 để đáp ứng cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây. Sau 7

ngày xử lý, hàm lƣợng GA3 trong rau cải xanh xác định đƣợc ở ngày thí nghiệm thứ 14 lần lƣợt là 0,130 mg.kg-1; 0,149 mg.kg-1; 0,170 mg.kg-1 và 0,198 mg.kg-1 tƣơng ứng ở các công thức xử lý 10; 30; 50 và 100 mg.L-1 cao hơn so với đối chứng là 0,122 mg.kg-1. Kết quả phân tích mẫu rau cải xanh ở ngày thí nghiệm thứ 21 cho

thấy hàm lƣợng GA3 ở các công thức xử lý với thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật

GA3 cao hơn so với đối chứng, và cao hơn so với giá trị tƣơng ứng xác định đƣợc ở

ngày thí nghiệm thứ 14. Đặc biệt, sau 35 ngày thí nghiệm, hàm lƣợng GA3 trong rau cải xanh ở thí nghiệm xử lý 100 mg.L-1 có giá trị cao nhất đạt 0,302 mg.kg-1, tiếp đến là công thức xử lý 50 mg.L-1 đạt 0,254 mg.kg-1, sau đó là công thức xử lý 30 mg.L-1 197 mg.kg-1 và 10 mg.L-1 0,145 mg.kg-1, và thấp nhất ở công thức đối chứng có 0,115 mg.kg-1. Kết quả nghiên cứu cho thấy, chất kích sinh trƣởng thực vật GA3

sự tích lũy trong rau cải xanh qua các lần xử lý (Hình 3.38A).

Kết quả nghiên cứu tƣơng tự trên cây mồng tơi và xà lách cho thấy, giai đoạn

7 ngày đầu hàm lƣợng GA3 trung bình trong các mẫu rau mồng tơi và xà lách lần lƣợt là: 0,082 ± 0,0005 mg.kg-1 và 0,069 ± 0,0016 mg.kg-1. Hàm lƣợng GA3 trong

rau mồng tơi và xà lách có sự gia tăng theo thời gian thí nghiệm từ ngày thứ 14 đến

ngày thứ 35 (Hình 3.38B và C). Kết quả phân tích mẫu rau mồng tơi ở ngày thí nghiệm thứ 14 cho thấy, hàm lƣợng GA3 ở các công thức xử lý 10 mg.L-1 là 0,087 mg.kg-1, 30 mg.L-1 là 0,102 mg.kg-1, 50 mg.L-1 là 0,105 mg.kg-1 và 100 mg.L-1 là 0,116 mg.kg-1 lần lƣợt cao hơn 2,23%; 16,67%; 19,05% và 26,72% so với đối

chứng. Đến ngày thí nghiệm thứ 21, tỷ lệ tích lũy của GA3 trong các mẫu rau ở các

107

công thức thí nghiệm có xu hƣớng gia tăng ở các nồng độ xử lý GA3 với các giá trị lần lƣợt là 0,095 mg.kg-1; 0,117 mg.kg-1; 0,127 mg.kg-1 và 0,155 mg.kg-1 tƣơng ứng ở các công thức 10; 30; 50 và 100 mg.L-1. Kết quả phân tích mẫu rau mồng tơi ngày

thí nghiệm thứ 35 cho thấy, hàm lƣợng GA3 tích lũy trong rau mồng tơi cao nhất ở nghiệm thức xử lý 100 mg.L-1 với 0,190 mg.kg-1, tiếp đến là công thức xử lý 50 mg.L-1 với 0,152 mg.kg-1, sau đó là công thức xử lý 30 mg.L-1 với 0,130 mg.kg-1 và 10 mg.L-1 với 0,101 mg.kg-1, thấp nhất ở đối chứng là 0,083 mg.kg-1 (Hình 3.38B).

Theo dữ liệu phân tích các mẫu rau xà lách, hàm lƣợng GA3 đƣợc tìm thấy lần lƣợt là 0,079 mg.kg-1; 0,090 mg.kg-1; 0,114 mg.kg-1 và 0,130 mg.kg-1 tƣơng ứng

với các công thức xử lý thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật GA3 10; 30; 50 và 100 mg.L-1, cao hơn so với đối chứng là 0,075 mg.kg-1 ở ngày thí nghiệm thứ 14. Hàm

lƣợng GA3 trong các mẫu rau xà lách ở các công thức tăng lên 21,74%; 38,46%;

55,56% và 63,64% tƣơng ứng ở các công thức xử lý thuốc kích thích sinh trƣởng 10; 30; 50 và 100 mg.L-1 khi so sánh với hàm lƣợng GA3 trong xà lách đối chứng ở

ngày thí nghiệm thứ 21. Sau 35 ngày thí nghiệm, giá trị hàm lƣợng GA3 cao nhất đƣợc tìm thấy ở công thức xử lý GA3 100 mg.L-1 là 0,265 mg.kg-1, tiếp đến là công thức 50 mg.L-1 là 0,210 mg.kg-1, sau đó là công thức 30 mg.L-1 là 0,145 mg.kg-1 và 10 mg.L-1 là 0.100 mg.kg-1; thấp nhất ở đối chứng là 0,065 mg.kg-1 (Hình 3.38C).

108

0.32

Đối chứng

0.28

10 mg/L

0.24

30 mg/L

) 1 - g k g m

50 mg/L

0.2

( 3

100 mg/L

0.16

0.12

A G g n ợ ƣ l

0.08

m à H

0.04

14 Ngày thí nghiệm (ngày)

0.21

(A-Rau cải xanh)

Đối chứng

10 mg/L

0.18

30 mg/L

0.15

) 1 - g k g m

50 mg/L

( 3

0.12

100 mg/L

0.09

A G g n ợ ƣ l

0.06

m à H

0.03

14 Ngày thí nghiệm (ngày)

0.3

(B-Rau mồng tơi)

Đối chứng

10 mg/L

0.25

30 mg/L

0.2

) 1 - g k g m

50 mg/L

( 3

100 mg/L

0.15

0.1

A G g n ợ ƣ l

m à H

0.05

14 Ngày thí nghiệm (ngày)

(C-Rau xà lách)

Hình 3.38. Sự tích lũy của GA3 trong các loại rau

109

Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ xử lý thuốc kích thích sinh trƣởng

thực vật GA3 càng cao thì sự tích lũy của chúng trong các mẫu rau càng nhiều, và

cùng một nồng độ xử lý nhƣng hàm lƣợng GA3 có sự tích lũy khác nhau trong các

loại rau, trong đó giá trị cao nhất đƣợc tìm thấy ở rau cải xanh, tiếp đến là xà lách

và thấp nhất ở rau mồng tơi. Cụ thể, sau 35 ngày thí nghiệm xử lý thuốc kích thích sinh trƣởng 50 mg.L-1 và 100 mg.L-1, hàm lƣợng GA3 phân tích đƣợc trong rau cải xanh lần lƣợt là 0,254 mg.kg-1 và 0,302 mg.kg-1; trong rau xà lách là 0,210 mg.kg-1 và 0,265 mg.kg-1 và trong rau mồng tơi là 0,152 mg.kg-1 và 0,190 mg.kg-1. Theo

Gehan và cộng sự [71], dƣ lƣợng GA3 trong rau quả có thể tiềm ẩn các nguy cơ ảnh

hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời. Theo giới hạn dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong thực phẩm quy định hàm lƣợng của gibberellin trong rau quả là 0.10 mg.kg-1 [137].

Liên minh Châu Âu (EU) đƣa ra giới hạn dƣ lƣợng tối đa của hoạt chất gibberellin trong rau quả là 0,20 mg.kg-1 [72]. Một số quốc gia khác nhƣ Hoa Kỳ và Nhật Bản cũng quy định giới hạn dƣ lƣợng tối đa của gibberellin trong rau quả là 0,20 mg.kg-1

[138]. Mặt khác, việc lạm dụng hóa chất nông nghiệp, đặc biệt là thuốc kích thích

sinh trƣởng, có thể dẫn tới ô nhiễm môi trƣờng, gây ra các vấn đề sức khỏe cho con

ngƣời và vật nuôi... [152, 153]. Điều này cho thấy rằng, việc sử dụng thuốc kích thích sinh trƣởng thực vật GA3 ở nồng độ 50 mg.L-1 và 100 mg.L-1 ở các loại rau

nhƣ cải xanh và xà lách gây nên tình trạng tích lũy hoạt chất kích thích sinh trƣởng

GA3 với hàm lƣợng lớn, vƣợt quá mức quy định của châu Âu, Hoa Kỳ và Nhật Bản;

có nguy cơ ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng và môi trƣờng. Đây có thể là cơ

sở để các cơ quan có thẩm quyền khuyến cáo ngƣời dân nên sử dụng các thuốc kích

thích sinh trƣởng thực vật theo đúng liều lƣợng đƣợc hƣớng dẫn bởi nhà sản xuất,

và không nên lạm dụng quá mức các loại thuốc này. Bên cạnh đó, có thể đề xuất các

biện pháp giám sát chặt chẽ hơn việc sử dụng các hóa chất kích thích sinh trƣờng

thực vật trong sản xuất cây trồng và dƣ lƣợng của chúng trong các sản phẩm nông

nghiệp để giảm thiểu tác động của chúng đối với sức khỏe ngƣời tiêu dùng và môi

trƣờng sinh thái.

110

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Luận án đã hoàn thành mục tiêu đề ra và thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau:

(1) Đã xây dựng và thẩm định đƣợc phƣơng pháp phân tích đồng thời 14 hợp chất

kích thích sinh trƣởng thực vật gồm IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, GA7, BA,

K, iP, iPR, tZ, tZR và DHZR trong các mẫu rau cải xanh sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ bẫy ion HPLC-ESI-MS2. Trong đó, hệ số tƣơng quan R2: 0,9961-0,9999; giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đạt 0,2-32,6 (ng.g-1); giới hạn định lƣợng: 0,6-108,6 (ng.g-1); và hiệu suất

thu hồi đạt 82,30-104,50%.

(2) Ứng dụng quy trình phân tích đánh giá sơ bộ sự tồn dƣ của các chất kích thích

sinh trƣởng thực vật trong 111 mẫu rau cải xanh thu thập ở một số quận huyện

thuộc thành phố Hà Nội cho thấy có 83 mẫu nghiên cứu có chứa chất KTST.

Các hợp chất đƣợc phát hiện gồm: tZ, GA3, GA4, GA7, IAA, IBA, ICA và IPA với hàm lƣợng trung bình 0,04-0,65 mg.kg-1.

(3) Sự tích lũy GA3 trong các loại rau xanh gia tăng cùng với nồng độ hóa chất sử

dụng và có sự khác nhau về mức độ tích lũy của hợp chất này giữa các loại rau

xanh khác nhau khi sử dụng cùng một nồng độ xử lý nhƣ nhau.

KIẾN NGHỊ

• Các cơ quan ban ngành cần có biện pháp nâng cao nhận thức của ngƣời dân

về các chất KTST thực vật và cách sử dụng chúng trong sản xuất rau xanh.

• Cần hoàn thiện và bổ sung các quy định về mức dƣ lƣợng tối đa của các chất

KTST thực vật trong các loại rau xanh, đồng thời ban hành các chế tài quản

lý việc sử dụng các chất KTST và dƣ lƣợng của chúng trong các sản phẩm

rau xanh.

• Tiếp tục nghiên cứu và phát triển phƣơng pháp phân tích các chất kích thích

sinh trƣởng thực vật trong các loại rau xanh khác, các loại trái cây và các sản

phẩm nông nghiệp….

111

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN

1) Là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về xây dựng quy trình phân tích đồng thời

các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật (IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4,

GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR và DHZR) trong các mẫu rau xanh sử dụng thiết

bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ bẫy ion (LC-ESI- MS2).

2) Quy trình đã nghiên cứu 9 hợp chất kích thích sinh trƣởng mới, chƣa có trong

danh mục quy định của Cục Bảo vệ thực vật – Bộ Nông nghiệp và Phát triển

Nông thôn (CV-2376/BVTV-QLT, ngày 02/12/2013) nhƣ: GA4, GA7, BA, K,

3) Là nghiên cứu đầu tiên đánh giá sơ bộ hiện trạng tồn dƣ của các chất kích thích

iP, iPR, tZ, tZR, DHZR.

sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh thu thập ở một số quận huyện

thuộc thành phố Hà Nội, và khảo sát mức độ tích lũy của chất kích thích sinh

trƣởng thực vật trong một số loại rau xanh.

112

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

1. Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Tibor Janda, Gabbriella, Tien Dat Nguyen, Truong Giang Le. Foliage applied Gibberelic acid Influences growth, nutrient contents and quality of Lettuces (Lactuca sativa L.). The Journal of Animal and Plant Sciences, 2021, 31 (6).

2. Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Tien Dat Nguyen, Ngoc Tung Nguyen,

Tibor Janda, Gabbriella Szala, Truong Giang Le. The potential health risks and

environmental pollution associated with the application of plant growth

regulators in vegetable production in several suburban areas of Hanoi, Vietnam.

Biologia Futura, 2020. DOI :10.1007/s42977-020-00041-5.

3. Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Truong Giang Le.

Analysis of Plant Growth Substances (Auxins, Gibberelins and Cytokinins) in

Vegetables Using High-Performance Liquid Chromatography Coupled to

Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. The International Journal

of Science and Technoledge, 2020, 8(7): 38-46.

4. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Hoàng Thị Thoa, Nguyễn Ngọc Tùng,

Quách Thị Sơn. Quy trình phân tích sàng lọc một số chất kích thích tăng

trƣởng thực vật trong rau xanh. Tạp chí Phân tích: Hóa, Lý và Sinh học, 2019,

24 (4B), 45-51.

5. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Phùng Trung Kiên.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của GA3 lên sự sinh trƣởng và phát triển của cải bẹ xanh

[Brassica Juncea (L.) czern. et coss]. Tạp chí Phân tích: Hóa, Lý và Sinh học,

2019, 24 (4B), 97-102.

6. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam, Lê

Trƣờng Giang, Đinh Ngọc Huy. Xây dựng các bƣớc nghiên cứu cơ bản trong

phân tích thuốc kích thích tăng trƣởng trans-zeatin sử dụng thiết bị sắc ký lỏng

hiệu năng cao ghép nối khối phổ. Tạp chí Phân tích: Hóa, Lý và Sinh học, 2018,

23 (4), 41-49.

7. Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Truong Giang Le,

Tibor Janda, Gabbriella Szalai, Yukui Rui. Simultaneous analysis of plant

endogenous hormones in green mustard by liquid chromatography tandem mass

113

spectrometry. (Đã phản biện và đang chờ đăng trên Tạp chí Chinese Journal of

Analytical Chemistry).

8. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam. Phân

tích đồng thời các chất kích thích sinh trƣởng Cytokinin trong rau xanh. (Đã

phản biện và đang chờ đăng trên Tạp chí Hóa học).

9. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam. Ảnh

hƣởng của GA3 đến sự phát triển sinh khối của một số loại rau xanh. (Đã phản

biện và đang chờ đăng trên Tạp chí Hóa học).

114

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. P. J. Davies, The Plant Hormones: Their Nature, Occurrence, and Functions. In Plant Hormones, Springer: Dordrecht, The Netherlands, 2010; 1-15. [2]. L. A. C. J. Voesenek, J. H. G. M. Rijnders, A. J. M. Peeters, H.M. van de Steeg, H. de Kroon, Plant Hormones Regulate Fast Shoot Elongation under Water: From Genes to Communities, Ecology, 2004, 85, 16-27.

[3]. M. Bar, N. Ori, Leaf development and morphogenesis, Development, 2014,

141, 4219-4230.

[4]. J. P. Nitsch, Plant Hormones in the Development of Fruits, The Quarterly

Review of Biology, 1952, 27, 33-57.

[5]. M. Miransari, D. L. Smith, Plant hormones and seed germination,

Environmental and Experimental of Botany, 2014, 99, 110-121.

[6]. E. Tanimoto, Regulation of Root Growth by Plant Hormones - Roles for Auxin and Gibberellin, Critical Review in Plant Sciences, 2005, 24, 249-265.

[7]. J. D. Metzger, Plant Hormones: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. In Hormones and Reproductive Development, Ed. Springer: Dordrecht, The Netherlands, 1995, 617-648.

[8]. J. Friml, Auxin transport - shaping the plant, Current Opinion in Plant

Biology, 2003, 6 (1), 7-12.

[9]. L. Taiz, E. Zeiger, Plant Physiology (2nd ed.), Massachusetts: Sinauer

Associates, 1998.

[10]. S. Simon, P. Petrášek, Why plants need more than one type of auxin, Plant

Science, 2011, 180 (3), 454-460.

[11]. J. Ludwig-Müller, Auxin conjugates: their role for plant development and in the evolution of land plants, Journal of Experimental Botany, 2011, 62 (6), 1757-1773.

[12]. D. L. Jones and I. D. J. Phillips, Organs of Gibberellin Synthesis in Light-

Grown Sunflower Plants Russell, Plant Physiology, 1966, 41, 1381-1386.

[13]. N. Campbell, J. B. Reec, Biology (6th ed.). San Francisco: Benjamin

Cummings, 2006.

[14]. P. Hedden, V. Sponsel, A Century of Gibberellin Research, Journal of Plant

Growth Regulation, 2015, 34 (4), 740-60.

[15]. Gibberellins, AccessScience. doi:10.1036/1097-8542.289000.

[16]. S. Yamaguchi, Gibberellin metabolism and its regulation, Annual Review of

Plant Biology, 2008, 59, 225-51.

[17]. J. J. Kieber, Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding

of Cytokinin Biology, Journal of Plant Growth Regulation, 2002, 21 (1), 1-2.

115

[18]. O. Aina, K. Quesenberry, M. Gallo, Thidiazuron-Induced Tissue Culture Arachis Quartered-Seed

Explants from of

Regeneration paraguariensis, Crop Science, 2012, 52 (3), 555.

[19]. E. Zažímalová, J. Petrášek & E. Benková, Auxin and Its Role in Plant

Development, 2014, doi:10.1007/978-3-7091-1526-8.

[20]. Yunde Zhao, Auxin Biosynthesis and Its Role in Plant Development, Annual

Review of Plant Biology, 2010, 61(1), 49-64.

[21]. M. Reguera, Z. Peleg, Y. M. Abdel-Tawab, E. B. Tumimbang, C. A. increases Delatorre, E. Blumwald, Stress-induced cytokinin synthesis drought tolerance through the coordinated regulation of carbon and nitrogen assimilation in rice, Plant Physiology, 2013, 163, 1609-1622.

[22]. L. Rubia, L. Rangan, R. Choudhury, M. Kaminek, P. Dobrev, J. Malbeck, M. Fowler, A. Slater, N. Scott, J. Bennett, S. Peng, G. Khush, M. Elliott, Changes in the chlorophyll content and cytokinin levels in the top three leaves of new plant type rice during grain filling, Journal of Plant Growth Regulation, 2014, 33, 66-76.

[23]. Preece, A century of progress with vegetative plant propagation, Hort

Science, 2003, 38, 1015-1025.

[24]. P. Salasˇ, H. Saskova´, J. Mokricˇkova´, T. Litschmann, Evaluation of different types of rooting stimulators, Acta Universitatis Agricultural et Silviculturae Mendelianae Brunensis, 2012, 60, 217-228

[25]. Võ Thị Phƣơng Nhung, Đỗ Thị Thúy Hằng, Võ Thị Hải Hiền, Xuất khẩu rau quả Việt Nam – thực trạng và giải pháp. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm Nghiệp tháng 10/2017.

[26]. R. N. Prasad, S. K. Singh, R. B. Yadava, and S. N. S. Chaurasia, Effect of GA3 and NAA on growth and yield of tomato, Vegetable Science, 2013, 40 (2), 195-197.

[27]. B. R. Chaudhary, M. D. Sharma, S. M. Shakya, and D. M. Gautam, Effect of plant growth regulators on growth, yield and quality of Chilli (Capsicum annuum L.) at Rampur, Chitwan, Journal of the Institute of Agriculture and Animal Science, 2006, 27, 65- 68.

[28]. M. J. Patel, H. C. Patel, and J. C. Chavda, Influence of plant growth regulators and their application methods on yield and quality of onion (Allium cepa L.). Asian journal of horticulture, 2010, 5(2), 263-265.

[29]. Pedro Jacob Christoffoleti, Marcelo Rodrigues Alves de Figueiredo, Lázaro Eustáquio Pereira Peres, Scott Nissen, Todd Gaines., Auxinic herbicides, mechanisms of action, and weed resistance: A look into recent plant science advances, Scientia Agricola, 2015, 72 (4), 356-362.

116

[30]. A. A. Dhage, P. K. Nagre, K. K. Bhangre and A. K. Pappu, Effect of plant growth regulators on growth and yield parameters of okra, Asian Journal of Horticulture, 2011, 6 (1), 170-172.

[31]. Utpal Maity, Puspendu Dutta and Bijoy Layek, Effect of Plant Growth Regulators on Growth, Yield and Quality of Okra [Abelmoschus esculentus (L.) Moench]. Journal of Agroecology and Natural Resource Management, 2016, 3 (3), 251-253.

[32]. J. L. Netam and Sharma Richa, Efficacy of plant growth regulators on growth characters and yield attributes in brinjal (Solanum melongena L.) cv, Brinjal 3112. IOSR, Journal of Agriculture and Veterinary Sciences, (IOSR- JAVS), 2014, 7, 27-30.

[33]. R. S. Jadon, R. Lekhi, S. Sharma and R. Sharma, Effect of Gibberelic acid, IBA and NAA as Foliar Spray on the Growth, Yield and Quality of Cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis L.), Agriculture: Towards a New Paradigm of Sustainability, 2009, 230.

for hybrid seed production lines

[34]. J. Chaurasiy, M. L. Meena, H. D. Singh, A. Adarsh and P. K. Mishra, Effect of GA3 and NAA on growth and yield of cabbage (Brassica oleracea var. Capitata L.) cv. Pride of India, The Bioscan, 2014, 9 (3), 1139-1141. [35]. N. Sandra, S. KumarLal, S. K. Chakrabarty, and A. Talukdar, Effect of plant growth regulators on sex expression, fruit setting, seed yield and quality in in bitter gourd the parental (Momordicacharantia), Indian Journal of Agricultural Sciences, 2015, 85 (9), 1185-1191.

[36]. G. Koteswara Rao, P. Ashok, D. V. Swami and K. Sasikala, Influence of Plant Growth Regulators on Growth, Root Tuber Yield and Quality of Orange Flesh Sweet Potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) Varieties G, International Journal of Current Microbiology and Applied Science, 2017, 6 (6), 2017-2025.

[37]. T. Urbanova, G. Leubner-Metzger, Gibberellins and seed germination, In: Hedden P, Thomas SG (eds) The gibberellins, Annual plant reviews, Wiley, Oxford, 2016, 253-284.

[38]. E. H. Colebrook, S. G. Thomas, A. L. Phillips, P. Hedden, The role of gibberellin signalling in plant responses to abiotic stress, Journal of Experimental Biology, 2014, 217, 67-75.

[39]. Y. H. Li, Y. J. Wu, B. Wu et al., Exogenous gibberellic acid increases the fruit weight of ‘Comte de Paris’ pineapple by enlarging flesh cells without negative effects on fruit quality, Acta Physiologiae Plantarum, 2010, 33, 1715-1722. https ://doi.org/10.1007/s11738-010-0708-2.

[40]. J. Dayan, N. Voronin, F. Gong et al. Leaf-induced gibberellin signaling is essential for internode elongation, cambial activity, and fiber differentiation

117

Tobacco stems, Plant Cell, 2012, 24, 66-79. https

in ://doi.org/10.1105/tpc.111.09309 6

[41]. N. Muñoz-Fambuena, C. Mesejo, M. C. González-Mas et al., Gibberellic acid reduces flowering intensity in sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck] by repressing CiFT gene expression. Journal of Plant Growth Regulation, 2012, 31, 529-536. https ://doi.org/10.1007/s0034 4-012-9263-y

[42]. P. Hedden, V. Sponsel, A century of gibberellin research, Journal of Plant Growth Regulation, 2015, 34, 740-760. https ://doi.org/10.1007/s00344-015- 9546-1

[43]. Qingfeng Niu, Tao Wang, Jianzhao Li, Qianqian

Yang, Minjie Qian & Yuanwen Teng, Effects of exogenous application of GA4+7 and N- (2-chloro-4-pyridyl)-N′-phenylurea on induced parthenocarpy and fruit quality in Pyrus pyrifolia ‘Cuiguan’, Plant Growth Regulation, 2015, 76, 251-258.

[44]. M. H. Curt AlmqvAkand, H. K. Mazed, M. A. Islam, M. Pulok, and S. N. C. J. F. Moonmoon, Growth and yield of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) as influenced by different level of gibberellic acid application, International Journal of Applied Research, 2015, 1(3), 71-74.

[45]. M. H. Akand, H. K. Mazed, M. A. Islam, M. Pulok, and S. N. C. J. F. Moonmoon, Growth and yield of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) as influenced by different level of gibberellic acid application, International Journal of Applied Research, 2015, 1(3), 71-74.

[46]. H. H. Sitapara, N. J. Vihol, M. J. Patel and J. S. Patel, Effect of growth regulators and micro nutrient on growth and yield of cauliflower cv., Asian Journal of Horticulture, 2011, 6(2), 348-351.

[47]. M. M. Islam, M. S. I. Khan, and A. Parven, Growth and Yield Potential of Late Planting Cabbage Influenced by Gibberellic Acid, International Journal of Business Social Science Research, 2017, 6(1): 62-67.

[48]. Nguyễn Đình Thi, Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (GA3, IAA và α-NAA) đến sinh trưởng và năng suất của rau cải mầm ở Thừa Thiên Huế, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, 2010, số 57.

[49]. Jagati Yadagiri, Prashant Kumar Gupta, Rajesh Tiwari and V. B. Singh, Improvement of Growth and Yield of Onion (Allium cepaL.) cv.Agrifound Light Red through Different Application Methods of Gibberellic Acid andTrichoderma viride, International Journal of Pure and Applied Bioscience, 2017, 5 (4), 1444-1450.

[50]. M. T. Hidayatullah, M. Farooq, M. A. Khokhar and S. I. Hussain, Plant growth regulators affecting sex expression of Bottle gourd (Lagenaria siceraria Molina) plants, Pakistan Journal of Agricultural Research, 2012, 25.

118

[51]. Lê Xuân Công, Nguyễn Đình Thi, Trần Huy Quát, Lê Thị Quyên, Hiệu quả của việc xử lý axit gibberelllic (GA3) cho hạt trước khi gieo đến sinh trưởng và năng suất rau muốn ở Thừa Thiên Huế, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, 2009, số 52,.

[52]. J. Pospísilová, Participation of phytohormones in the stomatal regulation of

gas exchange during water stress. Biologia Plantarum, 2003, 46, 491-506.

photosynthesis during water to

[53]. J. Pospísilová, I. C. Dodd, Role of plant growth regulators in stomatal limitation stress. M. Pessarakli (Ed.), Handbook of Photosynthesis, Ed 2, Revised and Expanded, Marcel Dekker, New York, 2005, 811-825

[54]. R. Nishiyama, Y. Watanabe, Y. Fujita, D. T. Le, M. Kojima, T. Werner, et al., Analysis of cytokinin mutants and regulation of cytokinin metabolic genes reveals important regulatory roles of cytokinins in drought, salt and abscisic acid responses, and abscisic acid biosynthesis, The Plant Cell, 2011, 23, 2169-2183.

[55]. T. N. Arkhipova, S. U. Veselov, A. I. Melentiev, E. V. Martynenko, G. R. Kudoyarova, Ability of bacterium Bacillus subtilis to produce cytokinins and to influence the growth and endogenous hormone content of lettuce plants, Plant Soil, 2005, 272: 201-209.

[56]. T. N. Arkhipova, S. Yu Veselov, A. I. Melent’ev, E. V. Martinenko, G. R. Kudoyarova, Comparison of effects of bacterial strains differing in their ability to synthesize cytokinins on growth and cytokinin content in wheat plants, Russian Journal of Plant Physiology, 2006, 53, 507-513.

[57]. S. Can, Effects of some external treated plant growth regulators on stomatal aperture of cucumber (Cucumis sativus L.), African journal of agricultural research, 2009, 4, 628-632.

[58]. A. K. Kravtsov, Y. O. Zubo, M. V. Yamburenko, O. N. Kulaeva, V. V. Kusnetsov, Cytokinin and abscisic acid control plastid gene transcription during barley seedling de-etiolation, Plant Growth Regulation, 2011, 64, 173-183.

[59]. I. Sergiev, D. Todorava, M. Somleva, V. Alexieva, E. Karanov, E. Stanoeva, V. Lachkova, A. Smith, M. Hall, Influence of cytokinins and novel cytokinin antagonists on the senescence of detached leaves of Arabidopsis thaliana, Biologia Plantarum, 2007, 51, 377-380.

[60]. J. Dobránszki, D. N. Mendler, Cytokinin-induced changes in the chlorophyll content and fluorescence of in vitro apple leaves, Journal of Plant Physiology, 2014, 171, 1472-1478.

[61]. N. J. Aghofack, A.

J. Manka, Effects of exogenously applied benzylaminopurine and kinetin on the ripening of banana (Musa acuminata

119

Colla var. William) fruits, American Journal of Plant Physiology, 2012, 7, 154-163.

[62]. M. L. Costa, P. M. Civello, A. R. Chaves, G. A. Martinez, Effect of ethephon and 6-benzylaminopurine on chlorophyll degrading enzymes and a peroxidase-linked chlorophyll bleaching during post-harvest senescence of broccoli (Brassica oleracea L.) at 20o C, Postharvest Biology and Technology, 2005, 35, 191-199.

[63]. X. L. Wang, D. Liu, Z. Q. Li, Effects of the coordination mechanism between roots and leaves induced by root-breaking and exogenous cytokinin spraying on the grazing tolerance of ryegrass, Journal of Plant Research, 2012, 125, 407-416.

[64]. L. Hu, Z. Wang, B. Huang, Growth and physiological recovery of kentucky bluegrass from drought stress as affected by a synthetic cytokinin 6- benzylaminopurine, Crop Science, 2012, 52, 2332-2340.

[65]. R. Nishiyama, Y. Watanabe, Y. Fujita, D. T. Le, M. Kojima, T. Werner, L. S. Tran, Analysis of cytokinin mutants and regulation of cytokinin metabolic genes reveals important regulatory roles of cytokinins in drought, salt and abscisic acid responses, and abscisic acid biosynthesis, The Plant Cell, 2011, 23, 2169-2183.

[66]. S. Srivastava, R. J. N. Emery, M. H. Rahman, N. N. V. Kav, A crucial role for cytokinins in pea ABR17-mediated enhanced germination and early seedling growth of Arabidopsis thaliana under saline and low-temperature stresses, Journal of Plant Growth Regulation, 2007, 26, 26-37.

[67]. J. Pospisilova, J. Rulcova, L. Vomacka, Effect of benzyladenine and hydroxybenzyladenosine on gas exchange of bean and sugar beet leaves, Biologia Plantarum, 2001, 44, 523-528.

[68]. X. X. Wu, J. He, J. L. Chen, S. J. Yang, D. S. Zha, Alleviation of exogenous 6- benzyladenine on two genotypes of eggplant (Solanum melongena Mill.) growth under salt stress, Protoplasma, 2014, 251, 169-176.

[69]. L. X. Hu, Z. L. Wang, B. R. Huang, Effects of cytokinin and potassium on stomatal and photosynthetic recovery of Kentucky Bluegrass from drought stress, Crop Science, 2013, 53, 221-231.

[70]. A. M. Al-Saif, A. B. M. S. Hossain, R. M. Taha, Effects of benzylaminopurine and naphthalene acetic acid on proliferation and shoot growth of pineapple (Ananas comosus L. Merr) in vitro. African Journal of Biotechnology, 2011, 10, 5291-5295.

[71]. H. Gehan, S. A. Shreen and E. M. Samira, Evaluation of synthetic plant growth regulators residues in fruits and vegetables and health risk assessment in Giza, Egypt, Journal of Soil Sciences and Agricultural Engineering, Mansoura University, 2015, 6 (9), 1075-1089.

120

[72]. EU Pesticides Database, 2010, http:// ec.europa.eu/sanco pesticides/public/

index cfm?event=substance.selection&ch=1.

[73]. L. Shaoying, H. Xihui, H. Huali, J. Quan, Z. Guonian, Evaluation of selected plant growth regulators and fungicides residues in fruits for dietary risk assessment, Human and Ecological risk assessment: an international journal, 2016, 22 (6), 1386-1395.

[74]. L. Jiaju, L. Chaoyun, Z. Lansong, L. Xiaolang, F. Jing, Z. Wei, A Study on the Application and Residues of Plant Growth Regulators in the Fruit Sugarcane Grown in the Sub-Suitable Region, Journal of Agricultural Science, 2010, 2 (4), 254-256.

[75]. A. D. Xu, Research Advance in the Toxicity and Residue of Plant Growth Regulator in Vegetables in China, Journal of China Vegtables, 2009, 8 (3), 61-66.

28:1431-1439. 2008, https

[76]. Chen S. Y., Kuo S. R., Chien C. T., Roles of gibberellins and abscisic acid in dormancy and germination of red bayberry (Myrica rubra) seeds, Tree Physiology, ://doi.org/10.1093/treep hys/28.9.1431

[77]. F. Du, G. Ruan, H. Liu, Analytical methods for tracing plant hormones,

Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 403, 55-74.

[78]. X. Pan, R. Welti, X. Wang, Quantitative analysis of major plant hormones in crude plant extracts by high-performance liquid chromatography-mass spec- trometry, Nature Protoccol, 2010, 5, 986-992.

[79]. Y. Bai, F. Du, H. Liu, Determination strategies of phytohormones: recent ad-

vances, Analytical Methods, 2010, 2, 1867-1873.

[80]. P. Sara, D. R. Marco, G. D. Silva, P. Augusto, J. C. Maria, A. Parastoo, Current analytical methods for plant auxin quantification – A review, Analytica Chimica Acta, 2016, 902, 8-21.

[81]. I. Nakurte, A. Keisa, N. Rostoks, Development and validation of a reversed- phase liquid chromatography method for the simultaneous determination of indole-3-acetic acid, indole-3-pyruvic acid, and Abscisic acid in Barley (Hordeum vulgare L.), Journal of Analytical Methods Chemistry, 2012, 6, http://dx.doi. org/10.1155/2012/103575.

[82]. Q. Lu, L. Chen, M. Lu, G. Chen, L. Zhang, Extraction and analysis of auxins in plants using dispersive liquid- liquid microextraction followed by high- performance liquid chromatography with fluorescence detection, Journal of Agricultural Food Chemistry, 2010, 58, 2763-2770.

[83]. P. Xiangqing, W. Ruth and W. Xuemin, Simultaneous quantification of major phytohormones and related compounds in crude plant extracts by

121

chromatography electrospray tandem mass spectrometry,

liquid Phytochemistry, 2008, 69, 1773-1781.

in rice by

[84]. F. Matsuda, H. Miyazawa, K. Wakasa, H. Miyagawa, Quantification of liquid spectrometry, ionization-tandem mass

indole-3-acetic acid and amino acid conjugates chromatography-electrospray Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2005, 69, 778-783.

[85]. H. T. Liu, Y. F. Li, T. G. Luan, C. Y. Lan, W. S. Shu, Simultaneous determination of phytohormones in plant extracts using SPME and HPLC, Chromatographia, 2007, 66, 515-520.

[86]. X. Liu, L. Barkawi, G. Gardner, J. D. Cohen, Transport of indole-3-butyric acid and indole-3-acetic acid in Arabidopsis hypocotyls using stable isotope label-ing, Plant Physiology, 2012, 158, 1988-2000.

in environmental water samples,

[87]. P. Herrero, F. Borrull, E. Pocurull, R. Marcé, Eﬃcient tandem solid-phase extraction and liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry method to determine polar benzotriazole, benzothiazole and benzenesulfon- amide contaminants Journal of Chromatography A, 2013, 1309, 22–32.

[88]. R. Meyer, G. F. Rautenbach, I. A. Dubery, Identification and quantification of methyl jasmonate in leaf volatiles of Arabidopsis thaliana using solid- phase microextraction in combination with gas chromatography and mass spec-trometry, Phytochemical Analysis, 2013, 14, 155-159.

[89]. J. Swaczynová, O. Novák, E. Hauserová et al, New techniques for the estimation of naturally occurring brassinosteroids, Journal of Plant Growth Regulation, 2007, 26, 1-14.

[90]. J. Li, Z. Y. Wu, L. T. Xiao, A novel piezoelectric biosensor for the detection of phytohormones-indole acetic acid. Analytical Science, 2002, 18, 1-5. [91]. P. Chieh-Han, L. Shao-Kai, C. Wei-Chen, S. Tsyr-Horng, Modified QuEChERS method for 24 plant growth regulators in grapes using LC- MS/MS, Journal of Food and Drug Analysis, 2018, 26 (2), 637-648.

[92]. D. M. Ribnicky, T. J. Cooke, J. D. Cohen, A microtechnique for the analysis of free and conjugated indole-3-acetic acid in milligram amounts of plant tissue using a benchtop gas chromatograph-mass spectrometer, Planta, 1998, 204, 1-7.

[93]. A. Edlund, S. Eklöf, B. Sundberg, T. Moritz, G. Sandberg, A microscale technique for gas chromatography-mass spectrometry measurements of picogram amounts of indole-3-acetic acid in plant tissues, Plant Physiology, 1995, 108, 1043-1047.

[94]. K. Ljung, R. P. Bhalerao, G. Sandberg, Sites and homeostatic control of

auxin

122

biosynthesis in Arabidopsis during vegetative growth, Plant Journal, 2001, 28, 465-474.

[95]. J. Friml, E. Benková, I. Blilou, J. Wisniewska, T. Hamann, K. Ljung, S. Woody, G. Sandberg, B. Scheres, G. Jürgens, K. Palme, AtPIN4 mediated sink-driven auxin gradients and root patterning in Arabidopsis, Cell, 2002, 108, 661-673.

[96]. R. Swarup, J. Friml, A. Marchant, K. Ljung, G. Sandberg, K. Palme, M. Bennett, Localization of the auxin permease AUX1 suggests two functionally distinct hormone transport pathways operate in the Arabidopsis root apex. Genes & Development, 2001, 15, 2648-2653

[97]. A. Müller, P. Düchting, E. W. Weiler, A multiplex GC/MS/MS technique for the sensitive and quantitative single-run analysis of acidic phytohormones and related compounds, and its applications to Arabidopsis thaliana. Planta, 2002, 216, 44-56.

[98]. M. Kowalczyk, G. Sandberg, Quantitative analysis of indole-3-acetic acid metabolites in Arabidopsis, Plant Physiology, 2001, 127, 1845-1853

[99]. E. Prinsen, W. Van Dongen, E. L. Esmans, H. A. Van Onckelen, Micro and liquid chromatography-tandem mass spectrometry: a new capillary dimension in phytohormone research, Journal of Chromatography A, 1998, 826, 25-37.

[100]. R. W. King, T. Moritz, L. T. Evans, O. Junttila, A. J. Herlt, Long-day induction of flowering in Lolium temulentum involves sequential increases in specific gibberellins at the shoot apex, Plant Physiology, 2001, 127, 624-632. [101]. T. Moritz, J. E. Olsen, Comparison between high-resolution selected ion monitoring, selected reaction monitoring, and four-sector tandem mass spectrometry in quantitative analysis of gibberellins in milligram amounts of plant tissue, Analytical Chemistry, 1995, 67, 1711-1716.

[102]. G. Schneider, J. Schmidt, Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for analysing plant hormone conjugates, Journal of Chromatography A, 1996, 728, 371-375.

[103]. S. D. Chiwocha, S. R. Abrams, S. J. Ambrose, A. J. Cutler, M. Loewen, A. R. Ross, A. R. Kermode, A method for profiling classes of plant hormones and their metabolites using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry: an analysis of hormone regulation of thermodormancy of lettuce (Lactuca sativa L.) seeds, Plant Journal, 2003, 35, 405-417.

[104]. R. L. Bielesky, The problem of halting enzyme action when extracting plant

tissues, Analytical Biochemistry, 1964, 9, 431-442.

123

[105]. P. Dobrev, M. Kaminek, Fast and efficient separation of cytokinins from auxin and abscisic acid and their purification using mixed-mode solid-phase extraction, Journal of Chromatography A, 2002, 950, 21-29.

[106]. M. Faiss, J. Zalibulova, M. Strnad, T. Schmuelling, Conditional transgenic expression of the ipt gene indicates a function for cytokinins in paracrine signalling in whole tobacco plants, Plant Journal, 1997, 12, 401-415.

[107]. T. Moritz, Mass spectrometry of plant hormones, Applications of Modern Mass Spectrometry in Plant Science Research, In RP Newton, TJ Walton, eds, Clarendon Press, Oxford, 1996, 139-158.

[108]. C. Åstot, K. Dolezal, T. Moritz, G. Sandberg, Precolumn derivatisation and capillary liquid chromatographic/frit-fast atom bombardment mass spectrometry analysis of cytokinins in Arabidopsis thaliana, Journal of Mass Spectrometry, 1998, 33, 892-902.

[109]. E. Prinsen, W. Van Dongen, E. L. Esmans, H. A. Van Onckelen, Micro and liquid chromatography-tandem mass spectrometry: a new capillary dimension in phytohormone research, Journal of Chromatography A, 1998, 826, 25-37.

[110]. Tiêu chuẩn ngành 10TCN 386:1999 về Phương pháp lấy mẫu kiểm định chất lượng và dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, Quyết định số 116/1999/QĐ-BNN- KHCN ban hành ngày 04/8/1999.

[111]. W. B. Dunn et al, Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry, Nature Protocol, 2011, 6 (7), 1060-1083.

[112]. EMA, Bioanalytical method validation, European Medicines Agency, 2012 [Online], Available: https://www.ema.europa.eu/en/bioanalytical-method- validation. [Accessed: 08-Dec-2019].

[113]. Báo cáo Tổng kết – Chương trình thử nghiệm thành thạo so sánh Liên phòng

thí nghiệm – Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố HCM, 2014.

[114]. M. Kowalczyk, and G. Sandberg, Quantitative analysis of indole-3- aceticacid metabolites in Arabidopsis, Plant Physiology, 2001, 127, 1845- 1853.

[115]. U. Terezie, T. Danuše, N. Ondřej, H. Peter, S. Miroslav, Analysis of gibberellins as free acids by ultra-performance liquid chromatography– tandem mass spectrometry, Talanta, 2013, 112, 85-94.

[116]. N. Ondrej, H. Eva, A. Petra, S. Miroslav, Cytokinin profiling in plant tissues using ultra-performance liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry, Phytochemistry, 2008, 69, 2214-2224.

[117]. Y. Izumi, A. Okazawa, T. Bamba, et al., Development of a method for comprehensive and quantitative analysis of planthormones by highly

124

sensitive nanoflow liquid chromatography-electrospray ionization-ion trap mass spectrometry, Analytica Chimica Acta, 2009, 648, 215–225.

[118]. European Union (2002), Commission decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results.

[119]. Z. Fengzu, Z. Pengyue, S. Weili, G. Yong, J. Qiu, P. Canping, Development of a Method for the Analysis of Four Plant Growth Regulators (PGRs) Residues in Soybean Sprouts and Mung Bean Sprouts by Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry, Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2012, 89, 674-679.

[120]. J. Šimura, I. Antoniadi, J. Široká, D. Tarkowská, M. Strnad, K. Ljung, and O. Novák, Plant Hormonomics: Multiple Phytohormone Profiling by Targeted Metabolomics, Plant Physiology, 2018, 177, 476-489.

[121]. L. Sijie, W. Yongning, F. Chiguang, C. Yong, J. Nan and W. Hui, Simultaneous Determination of 19 Plant Growth Regulator Residues in Plant-originated Foods by QuEChERS and Stable Isotope Dilution–Ultra Performance Liquid Chromatography–Mass Spectrometry, Analytical Sciences, 2017, 33 (9), 1047-1052.

[122]. H. Bingjun, Q. Bing, H. Yan and P. Lixu, Determination of Plant Growth Regulators in Chinese Herbal Medicine: A Comparison of Liquid (QuEChERS) and Solid (MSPD) Extraction Methods, Journal of Brazilian Chemical Society, 2019, 30 (7), 1406-1414.

[123]. F. M. Frank T. Peters, Olaf H. Drummer, Validation of new methods,

Forensic science international, 2007, 165 (2-3), 216-224.

[124]. A. Kruve, A. K¨unnapas, K. Herodes, and I. Leito, Matrix effects in pesticide multi-residue analysis by liquid chromatography-mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2008, 1187, 58-66.

in aquatic

chromatography

[125]. C. Kong, Y. Wang, Y. Huang, and H. Yu, Multiclass screening of >200 foods by ultrahigh pharmaceutical and other residues performance quadrupole Orbitrap mass liquid spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2018, 410, 5545- 5553.

[126]. T. G. Schwanz, C. K. Carpilovsky, G. C. C. Weis, and I. H. Costabeber, Validation of a multi-residue method and estimation of measurement uncertainty of pesticides in drinking water using gas chromatography–mass spectrometry and liquid chromatography–tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2019, 1585, 10-18.

[127]. P. O. Dasharath, B. Kaushik, S. G. Manoj, D. R. Sahadeo, G. N. Dattatraya, B. P. Shubhangi, R. J. Manjusha, G. A. Pandurang, Multiresidue Analysis of Multiclass Plant Growth Regulators in Grapes by Liquid

125

Spectrometry, Journal of AOAC

Chromatography/Tandem Mass International, 2011, 94 (3), 968-977.

[128]. S. F. Fan, X. P. Wang, P. W. Li, Q. Zhang, W. Zhang, Simultaneous determination of 13 phytohormones in oilseed rape tissues by liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry and the evaluation of the matrix effect, Journal of Separation Science, 2011, 34, 640-650.

[129]. L. Y. Ma, Z. Hongyan, X. Wentao, H. Xiaoyun, Y. Lili, L. Yunbo, H. Kunlun, Simultaneous Determination of 15 Plant Growth Regulators in Bean Sprout and Tomato with Liquid Chromatography–Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry, Food Analytical Methods, 2013, 6, 941-951.

[130]. Analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed, 2017, SupersedesDocument No. SANTE/11945/2015. Implemented by 01/01/2018.

[131]. Y. Izumi, A. Okazawa, T. Bamba et al, Development of a method for comprehensive and quantitative analysis of planthormones by highly sensitive nanoflow liquid chromatography-electrospray ionization-ion trap mass spectrometry, Analytica Chimica Acta, 2009, 648, 215-225.

[132]. M. Maren and M. B. Sergi, Rapid and sensitive hormonal profilling of complex plant samples by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry, Plant Methods, 2011, 7, 1-11.

[133]. J. F. Chu, S. Fang, P. Y. Xin, Z. P. Guo and Y. Chen, Quantitative analysis of plant hormones based on LC-MS/MS, Hormone Metabolism and Signaling in Plants, 2017, 471-537.

[134]. N. Bauer, D. Kolberg, K. Hacker, M. Wieland, A. Barth and M. Anastassiades, Ethephon - a Growth Regulator Detected in a Broad Range of Crops. Chemistres und Chemistry und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, 2010, http://www.crl- pesticides.eu/library/docs/srm/EPRW10_Cvuas_EthephonPM034.pdf.

25.03.2008 1. – -

[135]. Regulation (EC) No 178/2002 of the European parliament and the council, Laying down the general principles and requirements of food law, establishing laying down the European Food Safety Authority and procedures in matters of food safety, The 28 january 2002. 2002R0178 - EN - https://eur- 003.001 lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CONSLEG:2002R0178:2008 0325:EN:PDF.

[136]. S. Y. Liu, Z. T. Zheng, F. L. Wei, Y. P. Ren, W. J. Gui, H. M. Wu and G. N. Zhu, Simultaneous determination of seven neonicotinoid pesticide residues in food by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58, 3271-3278.

126

[137]. CODEX (201۰). Codex alimentarius commission Pesticide residues in food feed.

and http://www.codexalimentarius.net/pestres/data/pesticides/index.html.

[138]. L. Yuan and D. Q. Xu, Stimulatory Effect of Exogenous GA3 on Photosynthesis and the Level of Endogenous GA(l+3) in Soybean Leaf, Acta Photophysiologica Sinica, 2002, 28, 317-320.

[139]. M. T. Sørensen, V. Danielsen, Effects of the plant growth regulator, chlormequat, on mammalian fertility, International Journal of Andrology, 2006, 29 (1), 129-33.

[140]. N. Erin, B. Afacan, Y. Ersoy, F. Ercan, M. K. Balci, Gibberellic acid, a plant growth regulator, increases mast cell recruitment and alters Substance P levels, Toxicology, 2008, 254 (1 and 2), 75-81.

[141]. A. T. Marília, D. D. S. Gezimar, R. F. Edson, B. William and M. Axel, Validate method for phytohormone quantification in plants, Frontiers in Plant Science, 2014, 5, Article 417.

[142]. M. Matías, G. C. Aurelio and Vicent A., Rapid and reproducible determination of active gibberelins in citrus tissues by UPLC/ESI-MS/MS, Plant Physiology and Biochemistry, 2015, 94, 1-9.

[143]. A. Akter, E. Ali, M. M. Z. Isalm, R. Karim, A. H. M. Razzaque, Effect of GA3 on growth and yield of mustard, International Journal of Sustainable Crop Production, 2007, 2 (2),16-20.

[144]. S. Nitish, N. Nikita, S. Monika, S. Prashansha, R. Priyanka, K. P. Anand, A. H. Khan, A. K. Singh and R. K. Yadav, Effect of plant growth regulators on growth, biochemical changed and yield of mustard [Brassica juncea (L.) Czern & Coss.], Plant Archives, 2017, 17 (1), 33-38.

[145]. P. Satya, S. Poonam, A. P. S. Kunwar, S. Vipul, S. Raghvendra, S. C. Vimal1 and K. S. Sagar, Effect of Plant Growth Regulators on Partially Aged Seeds of Spinach (Spinacea oleracea L.) Genotypes, International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 2017, 6 (11), 1327-1334.

[146]. R. S. Taha, S. Vahid, R. Darioush, E. Mahdi, G. Javad and M. C. Roya, The effect of plant growth regulators, explants and cultivars on spinach (Spinacia oleracea L.) tissue culture, African Journal of Biotechnology, 2010, 9 (27), 4179-4185.

[147]. D. Neocleous, I. Papadopoulos and C. Olympios, The effect of growth regulators on the growth and tissue nitrate content of lettuce plant (Lactuca sativa L.), Agricultural Research Institute – Ministry of Agriculture, Natural, Resources and the environment. http://news.ari.gov.cy/publications/tb230- neocleous.pdf

127

[148]. J. F. Harrington, The use of gibberellic acid to induce bolting and increase seed yield of tight-heading lettuce, Journal of the American Society for Horticultural Science, 1960, 75: 476-479.

[149]. T. George, A. P. Spyridon, M. K. Ebrahim, Effect of GA3 and nitrogen on yield and marketability of lettuce (Lactuca sativa L.), Australian Journal of Crop Science, 2014, 8 (1), 127-132.

[150]. T. Akter, Effect of gibberelic acid and spacing on growth and yield of lettuce (Lactuca sativa L.L. ), Master Thesis, Department of Horticulture, Sher-e- bangla agricultural university, Dhaka-1207, 2015.

[151]. M. Alessandro, M. Alessandra, L. Sabatino and F. Vetrano, Effect of Gibberellic Acid on Growth, Yield, and Quality of Leaf Lettuce and Rocket Grown in a Floating System, Agronomy, 2019, 9, 382.

[152]. C. Ismail, T. Yasin and I. Ismail, Evalution of toxicity of abcisic acid and gibberellic acid in rats: 50 days drinking water study, Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2007, 22 (2), 219-226.

[153]. I. Celik and M. Kara, The effects of plant growth regulators on activity of eight serum enzymesin vitro, Journal of Environmental Science and Health - Part A: Environmental Science and Engineering and Toxicology, 1997, 32 (6), 1755-1761.

128

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CÁC CHẤT KÍCH

THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT TRONG RAU

1. Phạm vi áp dụng

Phƣơng pháp này có thể áp dụng đối với các mẫu rau xanh, trái cây và các

sản phẩm nông nghiệp

2. Nguyên tắc

Tùy theo đối tƣợng phân tích mà xây dựng đƣờng chuẩn của các chất nghiên

cứu trên chính các nền mẫu đó.

3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

3.1 . Thiết bị

- Thiết bị sắc ký lỏng Ultimate 30000 HPLC system, cột sắc ký: C18

Hypersil GOLD aQ (3 µm, 150 x 2.1 mm) và thiết bị phân tích khối phổ LCQ Fleet

MS (Thermo Fisher Scientific, Germany).

- Thiết bị sản xuất nƣớc deionized (Milli-Q Integral 3 Water Purification

System (Merck Millipore, France).

- Một số thiết bị khác: máy đồng nhất mẫu; máy ly tâm; máy votex; lò vi

sóng; máy siêu âm; bộ cô mẫu bằng khí nitơ; cân phân tích có độ chính xác 0,0001

g; cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g.

3.2. Dụng cụ

Kim tiêm mẫu Hamilton có dung tích 500 µL; tủ đông, tủ lạnh bảo quản

mẫu; micropipete các loại điều chỉnh đƣợc thể tích: 10-1000 µL; pipet Pasteur; ống

ly tâm có nắp kín Teflon 15 mL, 50 mL; lọ đựng mẫu có thể tích 1,8 mL, có màu

nâu dùng cho tiêm mẫu vào hệ thống LC; bình định mức, cốc, ống đong, kéo, thìa,

kẹp, nhíp….

3.3. Hóa chất

Các chất chuẩn: IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ,

tZR và DHZR (có độ tinh khiết ≥ 98%).

MeOH, Formic acid, Dichloromethane và 2-propanol.

129

Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

- Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc 1000 μg.mL-1: cân chính xác 10 mg mỗi

chất chuẩn chất kích thích sinh trƣởng thực vật, sau đó hòa tan trong bình định mức

10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 1% axít foocmic thêm đầy đến vạch tiêu chuẩn. Các dung dịch chuẩn gốc đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ dƣới 0oC, có

thể lƣu giữ và sử dụng trong thời gian 1 năm.

- Chuẩn bị dung dịch trung gian 100 μg.mL-1: Lấy 1 mL dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg.mL-1 của mỗi chất kích thích sinh trƣởng thực vật pha loãng

trong bình định mức 10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 1% axít foocmic thêm đầy đến vạch tiêu chuẩn. Dung dịch đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ từ 0-4oC,

có thể lƣu giữ và sử dụng trong 6 tháng.

- Chuẩn bị dung dịch trung gian 20 μg.mL-1: Lấy 2 mL dung dịch chuẩn có nồng độ 100 μg.mL-1 của mỗi chất kích thích sinh trƣởng thực vật pha loãng trong

bình định mức 10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 1% axít foocmic thêm đầy đến vạch tiêu chuẩn. Dung dịch đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ từ 0-4oC, có thể

lƣu giữ và sử dụng trong 6 tháng.

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp với nồng độ mỗi chất 1 μg.mL-1: Lấy 1 mL dung dịch chuẩn có nồng độ 20 μg.mL-1 của mỗi chất kích thích sinh trƣởng

thực vật cho vào cùng một bình định mức có dung tích 20 mL, sau định bổ sung

dung môi MeOH có chứa 1% axít foocmic đầy đến vạch tiêu chuẩn. Dung dịch đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ từ 0-4oC, có thể lƣu giữ và sử dụng trong 6

tháng.

MeOH có chứa 1% axít foocmic. Các dung dịch này chỉ pha khi cần sử dụng.

4. Thu thập mẫu

Mẫu rau đƣợc thu thập theo Tiêu chuẩn ngành 10TCN 386:1999 về Phƣơng

pháp lấy mẫu kiểm định chất lƣợng và dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật.

130

5. Cách tiến hành

Bƣớc 1: Đông cứng mẫu trong nitơ lỏng

Thêm 3 ml 2-propanol/H2O/HCl

Bƣớc 2: Nghiền nhỏ và cân 300 mg mẫu vào ống ly tâm Teflon 15 mL

Lắc 30 phút, ở 4oC. Siêu âm 5 phút

4000 vòng.phút-1, ở 4oC

Bƣớc 3: Lắc mẫu và chiết siêu âm

Thêm 6 mL Dichloromethane

Bƣớc 4: Ly tâm mẫu và hút dịch lớp trên

Lắc 30 phút, ở 4oC. Siêu âm 5 phút

Bƣớc 6: Ly tâm mẫu

Dịch trong suốt

4000 vòng.phút-1, ở 4oC

Bƣớc 5: Lắc mẫu và chiết siêu âm

Cô cạn bằng nitơ, hòa tan trong MeOH

Bƣớc 8: Phân tích trên HPLC-ESI-MS2

Bƣớc 7: Hút 1 mL dung dịch lớp dƣới

Hình 1.1. Quy trình tách chiết và phân tích các KTST trong mẫu rau đƣợc phát triển

và tối ƣu hóa

Bƣớc 1: Mẫu rau sau khi thu thập đƣợc đông cứng trong nitơ lỏng chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ dƣới 0oC cho đến khi phân tích.

Bƣớc 2: Tiến hành nghiền nhỏ mẫu với khối lƣợng khoảng 1 kg, sau đó, cân chính

xác một lƣợng 300 mg mẫu cho vào ống teflon 15 mL, có nắp vặn chặt.

Bƣớc 3: Thêm 3 mL 2-propanol/H2O/HCl (2:1:0.002, v/v/v), đồng thời bổ sung 10

ng hỗn hợp chuẩn các chất kích thích sinh trƣởng thực vật, sau đó rung lắc mẫu với

131

tốc độ 100 vòng.phút-1 trong thời gian 30 phút, ở nhiệt độ 4oC. Tiến hành siêu âm

mẫu trong thời gian 5 phút.

Bƣớc 4: Thực hiện ly tâm mẫu với tốc độ 4000 vòng.phút-1 ở điều kiện nhiệt độ 4oC

trong thời gian 5 phút. Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1mL phần dung dịch trong

suốt ở lớp phía trên của ống teflon thí nghiệm cho vào eppendorf đựng mẫu có thể

tích 2 mL.

Bƣớc 5: Thêm 6 mL dung dịch Dichloromethane và rung lắc mẫu trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 4oC, sau đó, tiếp tục chiết siêu âm trong thời gian 5 phút.

Bƣớc 6: Thực hiện ly tâm mẫu với tốc độ 4000 vòng.phút-1 trong thời gian 5 phút,

có hai lớp chất lỏng khác nhau đƣợc hình thành sau ly tâm và các mảnh vụn thực

vật phân bố ở giữa hai lớp. Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1 mL phần dung dịch

trong suốt ở lớp phía trên của ống teflon thí nghiệm, sau đó cho vào eppendorf đựng

phần dung dịch hút ra ở bƣớc 4. Tiến hành xoáy mẫu trên máy Votex trong thời

gian 5 phút để trộn lẫn hai phần dung dịch này với nhau. Sau đó, dùng micropipet hút 1 mL mẫu cho vào lọ đựng mẫu 1,5 mL để phân tích trên máy HPLC-ESI-MS2.

Bƣớc 7: Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1 mL phần dung dịch của lớp phía dƣới

ống teflon thí nghiệm, sau đó cho vào lọ thủy tinh có dung tích 15 mL. Tiến hành cô

cạn bằng dòng khí nitơ, hoà tan các chất sau cô cạn bằng 1 mL dung môi MeOH.

Bƣớc 8: Thực hiện lọc mẫu qua màng lọc PTFE 0,22 µm trƣớc khi phân tích trên thiết bị HPLC-ESI-MS2.

 Hàm lƣợng của các chất phân tích đƣợc xác định bằng tổng hàm lƣợng của

các chất thu đƣợc ở các phân đoạn đƣợc thực hiện ở bƣớc 4, 6 và bƣớc 7.

6. Tính toán kết quả

Hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh đƣợc

tính toán theo đƣờng ngoại chuẩn. Kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày dƣới dạng TB

± độ lệch chuẩn (SD). Trong đó, giá trị trung bình đƣợc tính theo các công thức sau:

Trong đó: là trung bình cộng

a1, a2,...., an là các giá trị xác định tƣơng ứng lần thứ 1, 2, ..., n.

132

n là số các số hạng

Công thức tính giá trị trung vị:

Me =

Trong đó: Me là số trung vị

là lƣợng biến đứng ở vị trí

7. Báo cáo kết quả

Bản báo cáo kết quả gồm có các thông tin sau:

1) Thông tin về đối tƣợng mẫu thu thập

2) Phƣơng pháp phân tích

3) Kết quả phân tích mẫu

133

PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHẾ ĐỘ GRADIENT

Gradient 1: Từ khi bắt đầu đến 2 phút 10% MeOH, sau đó từ 2 đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tốc độ dòng 0,1 dung môi mL/phút. Tổng thời gian 15 phút (Hình 3.1).

Hình 2.1. Chu trình dung môi gradient 1

(Ion âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 2.2. Sắc ký đồ của các chất KTST theo chế độ gradient 1

134

Nhận xét: Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,75-6,96 phút. Tuy nhiên, hợp chất IPA rửa giải chƣa hoàn toàn.

Gradient 2: Từ khi bắt đầu đến 2 phút 20% MeOH, sau đó từ 2 đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tốc độ dòng 0,1 dung môi mL/phút. Tổng thời gian 15 phút. Hình 3.3. Chu trình dung môi gradient 2

(Ion âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 2.4. Sắc ký đồ của các chất KTST theo chế độ gradient 2

135

Nhận xét: Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,42-6,96 phút. Tuy nhiên, hợp chất IPA vẫn chƣa rửa giải hoàn toàn.

Gradient 3: Từ khi bắt đầu đến 2 phút 30% MeOH, sau đó từ 2 đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tốc độ dòng dung môi 0,1 mL/phút. thời gian 15 phút Tổng (Hình 3.5). Hình 2.5. Chu trình dung môi gradient 3

(Ion âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 2.6. Sắc ký đồ của các chất PGR theo chế độ gradient 3

136

Nhận xét: Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,07-6,31 phút. Tất cả các hợp chất phân tích đƣợc rửa giải hoàn toàn và các píc gọn, sắc nét, cân đối, rõ ràng, độ rộng chân píc khoảng 0,2-0,5 phút.

Gradient 4: Từ khi bắt đầu đến 2 phút 30% MeOH, sau đó từ 2 đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tốc độ 0,3 dung môi dòng mL/phút. Tổng thời gian 15 phút (Hình 3.7). Hình 2.7. Chu trình dung môi gradient 4

(Ion âm

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 2.8. Sắc ký đồ của các chất KTST theo chế độ gradient 4

137

Nhận xét: Các chất phân tích theo chế độ ion âm không xuất hiện tín hiệu trên sắc ký đồ. Các chất phân tích theo chế độ ion dƣơng có tín hiệu píc sắc ký đƣợc rửa giải sớm hơn so với tốc độ dòng 0,1 mL/phút với thời gian lƣu khoảng 1,5 phút. Gradient 5: Từ khi bắt đầu đến 2 phút 30% MeOH, sau đó từ 2 đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tốc độ dòng 0,5 dung môi mL/phút. Tổng thời gian 15 phút (Hình 3.9).

Hình 2.9. Chu trình dung môi gradient 5

(Ion âm)

ICA

IAA

IPA

IBA

GA7

GA4

GA3

(Ion dƣơng)

iPR

tZR

DHZR

Hình 2.10. Sắc ký đồ của các chất PGR theo chế độ gradient 5

138

Nhận xét: Các chất phân tích theo chế độ ion âm không xuất hiện tín hiệu trên sắc

ký đồ. Các chất phân tích theo chế độ ion dƣơng đƣợc phát hiện ở thời gian lƣu từ

0,8 đến 1,2 phút; sớm hơn so với các điều kiện gradient ở trên.

139

PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỐI CHỨNG Ở CÁC PTN

144

PHỤ LỤC 4. ĐƢỜNG CHUẨN CỦA GA3 TRÊN CÁC NỀN MẪU RAU THÍ

NGHIỆM

Hình 4.1. Đƣờng chuẩn của GA3 trên các nền mẫu rau thí nghiệm

145

PHỤ LỤC 5. MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG NGHIÊN CỨU

Hệ thống sắc ký lỏng HPLC-ESI-MS Máy ly tâm

Cột Purospher ® RP-18 endcapped (5 µm, 250 x 4,6 mm) Cột C18 Hypersil GOLD aQ (3 µm, 150 x 2.1 mm)

Bộ cô mẫu bằng nitơ Máy lọc nƣớc siêu sạch

Micropipette đơn kênh Cân phân tích

Hình 5.1. Một số thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

146

Hình 5.2. Một số hình ảnh bố trí thí nghiệm

147

Hình 5.3. Một số hình ảnh khảo sát và thu thập mẫu