BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
TRẦN THỊ NỮ
NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN GLUCOMANNAN
TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJAC K. KOCH Ở LÂM ĐỒNG
VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT
DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC
Hà Nội, 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------
TRẦN THỊ NỮ
NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN GLUCOMANNAN
TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJAC K. KOCH Ở LÂM ĐỒNG
VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT
DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số:9.44.01.14
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. ĐỖ TRƯỜNG THIỆN
2. TS. TRẦN THỊ Ý NHI
Hà Nội, 2020
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự
hướng dẫn khoa học của PSG.TS. Đỗ Trường Thiện và TS. Trần Thị Ý Nhi. Các số
liệu, kết quả nêu trong tài liệu này là trung thực và chưa từng được công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả
Trần Thị Nữ
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.Đỗ Trường Thiện,
TS. Trần Thị Ý Nhi, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ, động viên em
trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn
Đặc biệt em xin cảm ơn ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, các
phòng ban, các thầy cô tại học viện. Ban lãnh đạo viện Hóa học, tập thể các thầy cô,
anh chị và các bạn tại Viện Hóa học đã tận tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện giúp
đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Nhân dịp này em xin được chân thành cảm ơn đến các anh chị em, bạn bè đồng
nghiệp phòng Polyme Thiên nhiên – Viện Hóa học đã giúp đỡ và động viên tôi
trong quá trình nghiên cứu.
Cảm ơn các bạn đồng nghiệp, bạn bè, gia đình đã động viên, khích lệ và giúp
đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2019
Tác giả
Trần Thị Nữ
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...........................................................................................................
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................
MỤC LỤC......................................................................................................................
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT.............................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ........................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN...........................................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về glucomannan..................................................................... 3
1.1.1.Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan..................................................................3
1.1.2. Tính chất vật lý của glucomannan................................................................. 3
1.1.3. Tính chất hóa học của glucomannan..............................................................5
1.1.4. Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của glucomannan............................ 7
1.2. Cây nưa A.konjac K.Koch và quy trình tách chiết glucomannang................9
1.2.1. Cây Nưa Amorphophallus Konjac K.Koch................................................... 9
1.2.2. Quy trình tách chiết glucomannan từ củ A.konjac...................................... 12
1.3. Phản ứng cắt mạch glucomannan....................................................................15
1.3.1. Cắt mạch bằng các phương pháp lý -hóa học.............................................. 15
1.3.2. Thủy phân với xúc tác enzym...................................................................... 17
1.3.2.1. Đặc điểm của xúc tác enzym................................................................. 17
1.3.2.2.Các hệ enzym thủy phân mannan...........................................................19
1.3.2.3. Nghiên cứu thủy phân glucomannan bằng enzym................................ 26
1.3.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác enzym........................28
1.3.2.5. Phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm xác định điều kiện phản ứng
tối ưu................................................................................................................... 30
1.4. Enzym AMPK và vai trò của nó trong hạ đường huyết............................... 31
1.4.1. Quá trình chuyển hóa glucose trong cơ thể................................................. 31
1.4.1.1. Quá trình hấp thu glucose.....................................................................31
1.4.1.2. Quá trình chuyển hóa glucose.............................................................. 32
1.4.2. Khái quát về enzym Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein kinase
(AMPK).................................................................................................................. 34
1.4.3. Các phương pháp hoạt hóa AMPK.............................................................. 36
1.4.3.1. hoạt hóa AMPK bằng vận động............................................................36
1.4.3.2. hoạt hóa AMPK bằng hoạt chất............................................................38
1.5. Tính hình nghiên cứu glucomannan từ cây nưa A.konjac tại Việt Nam..... 40
Chương 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................. 43
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu................................................. 43
2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất............................................................................... 43
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu.................................................................... 44
2.2. Thực nghiệm.......................................................................................................45
2.2.1. Tách, tinh chế và xác định cấu trúc, tính chất của glucomannan từ cây
A.konjac..................................................................................................................45
2.2.1.1. Tách glucomannan từ cây A.konjac K.Koch........................................ 45
2.2.1.2. Xác định hàm lượng glucomannan trong bột konjac glucomannan.... 47
2.2.1.3. Xác định cấu trúc và đặc trưng của glucomannan...............................49
2.2.2. Thủy phân glucomannan.............................................................................. 52
2.2.2.1. Thủy phân bằng axit..............................................................................52
2.2.2.2. Thủy phân konjac glucomannan bằng enzym.......................................53
2.2.3. Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của LKGM-E trên in vitro..................57
2.2.4. Nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vivo.59
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...................................61
3.1. Nghiên cứu tách, tinh chế và đặc điểm cấu trúc, tính chất của
glucomannan trong củ nưa A.konjac..................................................................... 61
3.1.1. Tách và tinh chế glucomannan từ củ Nưa A.konjac....................................61
3.1.1.1. Hàm lượng glucomannan trong củ Nưa A.konjac................................61
3.1.1.2.Tách glucomannan từ củ Nưa A.konjac.................................................63
3.1.1.3. Tinh chế glucomannan.......................................................................... 65
3.1.2. Đặc trưng cấu trúc, tính chất của glucomannan từ củ A.konjac..................65
3.1.2.1. Phổ IR của glucomannan...................................................................... 65
3.1.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân.................................................................66
3.1.2.3. Tính chất nhiệt của KGM......................................................................72
3.1.2.4. Độ kết tinh............................................................................................. 73
3.1.2.5. Khối lượng phân tử của KGM...............................................................73
3.1.2.6. Hàm lượng tro và kim loại nặng trong bột KGM.................................75
3.2. Thủy phân glucomannan bằng xúc tác axit HCl........................................... 76
3.2.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp của phản ứng thủy phân xúc tác axit....... 76
3.2.2. Cấu trúc và tính chất của sản phẩm thủy phân............................................ 82
3.2.2.1. Độ tan và hiệu suất thu hồi LKGM-1....................................................82
3.2.2.2. Phổ IR của LKGM-1............................................................................. 83
3.2.2.3. Phổ NMR của LKGM-1.........................................................................84
3.2.2.4. Tính chất nhiệt của LKGM-1................................................................ 87
3.2.2.5. Khối lượng trung bình của LKGM-1.................................................... 88
3.3. Thủy phân konjac glucomannan bằng enzym............................................... 89
3.3.1. Định tính khả năng phân huỷ glucomannan của các enzym từ vi khuẩn.... 89
3.3.2. Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng90
3.3.2.1. Kết quả theo mô hình thực nghiệm....................................................... 90
3.3.2.2. Phân tích thống kê.................................................................................92
3.3.2.3. Tìm chế độ thủy phân tối ưu..................................................................96
3.3.3. Đặc điểm cấu trúc và tính chất của LKGM-E............................................. 97
3.3.3.1. Phổ IR của LKGM-E............................................................................. 97
3.3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của LKGM-E..........................................99
3.3.3.3. Tính chất nhiệt của LKGM-E..............................................................102
3.3.3.4. Khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm thủy phân...................103
3.3.3.5. Độ tan và hiệu suất thu hồi LKGM-E................................................. 104
3.4. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E......................................................106
3.4.1. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vitro.................106
3.4.2. Tác dụng ức chế dung nạp glucose huyết của LKGM-E trên mô hình in vivo109
KẾT LUẬN CHUNG............................................................................................. 114
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ.............................................................................................116
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 117
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
A. konjac Amorphophallus konjac K. Koch
ADP Adenosine diphotphat
AMP Adenosine monophotphat
Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein AMPK kinase
ATP Adenosine triphotphat
DA Độ axetyl hóa
DMF Dimetyl Fomamide
DMSO Dimethyl sulfoxit
DMEM Môi trường cơ bản nuôi cấy tế bào
DLS Thiết bị phân tích kích thước hạt
DRS Tổng hàm lượng đường khử
DSC Phân tích nhiệt quét vi sai
E Enzym
EC 3.2.1.21 β- glucosidase
EC 3.2.1.22 α-galactosidase
EC 3.2.1.25 exo-β- mannosidase
EC 3.2.1.78 endo-β-mannanase
FBS Huyết thanh thai bò
GH họ enzym glycosyl hydrolase
GM Glucomannan
HPGPC Sắc kí thẩm thấu gel hiệu năng cao
HRP Enzym Horseradish peroxidase
HS Huyết thanh ngựa
KGM Konjac glucomannan
IR Phổ hồng ngoại
LDK Sản phẩm thủy phân
LKGM-1 Konjac glucomannan thủy phân bằng axit
LKGM-E Konjac glucomannan thủy phân bằng enzym
NAD Nicotinamid adenin dinucleotid
NADH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid
NADP Nicotinamid adenin dinucleotid photphat
NADPH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid photphat
NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
OGTT Xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống
PPAR Peroxisom proliferator
S Cơ chất (Substrate)
SDS Sodium dodecyl sulfat
TCA tricarbocylic acid
TBS-T Tri Buffer saline T Ween 20
TZD Thiazolidinedion
UV Phổ tử ngoại
XRD Quang phổ nhiễu xạ tia X
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Hệ sinh vật phân huỷ mannan....................................................................21
Bảng 1.2. Đặc điểm của β-mannanase sinh ra từ một số vi sinh vật......................... 25
Bảng 1.3. Số thí nghiệm của kế hoạch bậc hai Box – Behnken................................ 30
Bảng 2.1. Các mức của các yếu tố ảnh hưởng........................................................... 55
Bảng 2.2. Ma trận kế hoạch bậc 2 Box – Behnken cho trường hợp k = 4................ 56
Bảng 3.1. Hàm lượng nước trong củ Nưa A.konjac...................................................61
Bảng 3.2. Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn glucose..... 62
Bảng 3.3. Hàm lượng glucomannan trong củ nưa A.konjac khô...............................63
Bảng 3.4. Hàm lượng glucomannan trong củ nưa A. konjac.....................................64
Bảng 3.5. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) của KGM................... 69
Bảng 3.6. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của cacbon (13C) của KGM................. 70
Bảng 3.7. Kết quả phân tích TGA của KGM.............................................................72
Bảng 3.8. Kết quả đo áp suất thẩm thấu của KGM....................................................74
Bảng 3.9. Hàm lượng tro và kim loại nặng trong bột KGM......................................75
Bảng 3.10. Tổng hợp đặc điểm cấu trúc, tính chất của glucomannnan từ củ A.konjac76
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ axit đến hiệu suất và độ nhớt của sản phẩm....76
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tỉ lệ KGM/dd axít đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng và
độ thu hồi sản phẩm....................................................................................................81
Bảng 3.13. Độ tan và hiệu suất thu hồi sản phẩm......................................................82
Bảng 3.14. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) trong LKGM-1....... 85
Bảng 3.15. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của cacbon (13C) trong LKGM-1.......85
Bảng 3.16. Kết quả phân tích TGA của LKGM-1.....................................................87
Bảng 3.17. Áp suất thẩm thấu của các dung dịch sau thủy phân...............................88
Bảng 3.18. Đường kính vòng phân giải glucomannan.............................................. 90
Bảng 3.19. Kết quả thực nghiệm theo kế hoạch Box Behnken................................. 91
Bảng 3.20. Kết quả phân tích ANOVA tối ưu hóa điều kiện phản ứng thủy phân...92
Bảng 3.21. Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm................. 93
Bảng 3.22. Kết quả tính tìm điều kiện tối ưu............................................................. 96
Bảng 3.23. 1H NMR độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của LKGM-E.......................99
Bảng 3.24. Độ dịch chuyển hóa học 13C - NMR (δ ppm) của LKGM-E trong D2O101
Bảng 3.25. Kết quả phân tích TGA của LKGM-E.................................................. 103
Bảng 3.26. Áp suất thẩm thấu của các dung dịch sau thủy phân bằng enzym........103
Bảng 3.27. Độ tan và các tính chất của Konjac glucomannan và sản phẩm thủy phân105
Bảng 3.28. Tỷ lệ biểu hiện p-AMPK/ β-actin.......................................................... 107
Bảng 3.29. Glucose huyết ban đầu và sau khi uống glucose...................................110
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của glucomannan............................................................. 3
Hình 1.2. Hình ảnh cây và củ Nưa A.konjac được trồng thử nghiệm tại Lâm Đồng 12
Hình 1.3. Cấu trúc của một số loại β,1–4 mannan/heteromannan.............................20
Hình 1.4. Cấu trúc phân tử ATP và AMP.................................................................. 35
Hình 3.1. Hình ảnh củ Konjac được gọt vỏ và thái lát.............................................. 61
Hình 3.2. Đường chuẩn glucose................................................................................. 63
Hình 3.3. Hình ảnh bột glucomannan thu được sau khi sấy......................................64
Hình 3.4. Quá trình tách tinh bột và tạp chất trong bột KGM...................................65
Hình 3.5. Phổ IR của KGM........................................................................................ 66
Hình 3.6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR của KGM......................................67
Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của KGM............................................................................ 69
Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của KGM............................................................................ 70
Hình 3.9. phổ HSQC của KGM................................................................................. 71
Hình 3.10. Giản đồ phân tích nhiệt của KGM........................................................... 72
Hình 3.11. Giản đồ nhiễu xạ tia X của KGM............................................................ 73
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ C và Π/C của KGM........... 74
Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ axit đến độ nhớt hỗn hợp phản ứng................. 77
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân glucomannan............ 79
Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng thủy phân glucomannan...........80
Hình 3.16. Phổ IR của LKGM-1................................................................................ 83
Hình 3.17. Phổ 1H -NMR của LKGM-1.....................................................................84
Hình 3.18. Phổ 13C-NMR của LKGM-1.................................................................... 84
Hình 3.19. Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-1..................................................... 87
Hình 3.20. Mối quan hệ giữa nồng độ và áp suất thẩm thấu của LKGM-1.............. 88
Hình 3.21. Vòng phân giải glucomannan của vi khuẩn Bacillus subtilis (A) và mẫu
chứng (B).................................................................................................................... 90
Hình 3.22. Biến đổi độ nhớt của hỗn hợp phản ứng theo thời gian...........................90
Hình 3.23. Đường mức và đáp ứng bề mặt 3D ảnh hưởng của các cặp yếu tố đến độ
nhớt của hỗn hợp phản ứng........................................................................................ 95
Hình 3.24. Phổ IR của LKGM-E................................................................................98
Hình 3.25. Phổ 1H-NMR của LKGM-E ở 80oC trong D2O.......................................99
Hình 3.26. Phổ 13C-NMR của LKGM-E ở 80 oC trong D2O...................................100
Hình 3.27. Phổ 1H-13C-NMR-HSQC của LKGM-E ở 80 oC trong D2O.................101
Hình 3.28. Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-E...................................................102
Hình 3.29. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ (C) và Π/C của LKGM-E 104
Hình 3.30. Số lần tăng mức độ biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ với mẫu thử so
với lô chứng.............................................................................................................. 108
Hình 3.31. Hình ảnh mức độ biểu hiện p-AMPK và actin...................................... 108
Hình 3.32. Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết trước và sau cho uống glucose so với
thời điểm ban đầu..................................................................................................... 110
Hình 3.33. Glucose huyết trước và sau khi cho uống LKGM-E và KGM..............112
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Phản ứng tổng hợp hydrogel trên cơ sở glucomannan ghép với axit
acrylic (AA).................................................................................................................. 7
Sơ đồ 1.2. Quy trình chiết tách bột glucomannan theo phương pháp khô................ 13
Sơ đồ 1.3. Quy trình chiết tách bột glucomannan theo phương pháp khô- ướt........ 14
Sơ đồ 1.4. Quá trình hấp thu glucose trong cơ thể.....................................................32
Sơ đồ 1.5. Cân bằng glucose máu trong cơ thể..........................................................34
Sơ đồ 1.6. Phản ứng chuyển hóa từ ATP tạo AMP................................................... 35
Sơ đồ 1.7. Tác dụng của meformin trong điều trị tiểu đường................................... 38
Sơ đồ 2.1. Quy trình tách glucomannan từ củ A.konjac............................................ 46
Sơ đồ 2.2. Xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống....................................... 59
Sơ đồ 3.1. Cơ chế phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác axit............................78
Sơ đồ: 3.2. Giả thiết cơ chế thủy phân glucomannan bằng endo-1,4-mannanase...105
ĐẶT VẤN ĐỀ
Glucomannan là một polysacarit gồm các mắt xích D-mannose và D-glucose
liên kết với nhau bằng liên kết β-(14) glycosid. Trên một số nguyên tử C6, nhóm
OH được axetyl hóa với độ axetyl hóa khoảng 5÷10%. Tỷ lệ mannose/glucose phụ
thuộc vào nguồn gốc glucomannan và thường dao động từ 1,6/1 ÷ 3,6/1 [1]. Đây là
một chất xơ hòa tan nghèo năng lượng được dùng làm thực phẩm trong khẩu phần
ăn của người ăn kiêng để giảm cân, làm giảm cholesterol trong máu, mỡ máu, giảm
hấp thu glucose. Ngoài ra glucomannan còn có nhiều tính chất quý như có khả năng
hấp thụ nước trương nở tốt tạo dung dịch có độ nhớt cao nên được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực tạo độ ổn định cho thực phẩm, tạo gel, tạo màng [2–5].
Glucomannan có trong nhiều loài nưa, ở mỗi loài cấu trúc và tính chất khác
nhau, trong đó Nưa Konjac (Amorphophalus konjac K.Koch) là loài có hàm lượng
glucomannan cao và là cây trồng chủ lực để phát triển ngành Nưa ở một số nước
Đông Á và Đông Nam Á như: Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan. Việt Nam có
khoảng trên 25 loài Nưa phân bố rải rác khắp các vùng miền trong cả nước. Cây
Nưa Amorphophallus konjac K.Koch mới được tìm thấy vào năm 2012 tại một số
tỉnh miền núi phía Bắc [6].
Do khối lượng phân tử lớn (khối lượng phân tử trung bình của glucomannan
dao động trong khoảng 1,9 106 ÷ 2 106 Da) [7], độ nhớt cao nên khả năng tan
trong nước của glucomannan kém (độ tan khoảng 30%), do đó làm hạn chế một
phần hiệu quả và phạm vi ứng dụng của glucomannan trong một số lĩnh vực. Để
khắc phục hạn chế đó, quá trình thủy phân glucomannan để thu được glucomannan
có khối lượng phân tử nhỏ hơn mà vẫn giữ được những tính chất quý của
glucomannan thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học. Ngoài
tính chất chung của glucomannan (KGM), glucomannan thủy phân (LKGM) còn có
nhiều hoạt tính sinh học như lợi khuẩn, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch…[8–11].
Glucomannan thủy phân còn được sử dụng để vận chuyển thuốc [12].
Với các tiềm năng ứng dụng của LKGM trong lĩnh vực thực phẩm và dược
phẩm, các nghiên cứu về phương pháp điều chế glucomannan khối lượng phân tử
1
thấp gần đây được nhiều tác giả trên thế giới quan tâm, gồm: thủy phân bằng enzym
[13,14,23], [15–22], enzym kết hợp với chiếu xạ [24], thủy phân bằng axit HCl
[14,25], axit HCl kết hợp sử dụng sóng siêu âm [26] hay chiếu xạ tia gamma kết
hợp etanol [27], bằng kiềm kết hợp nhiệt [28]...Tuy nhiên các nghiên cứu trên thế
giới mới chỉ tập trung nhiều vào các phương pháp điều chế glucomannan khối
lượng phân tử thấp mà chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết về tính chất, cấu trúc hóa
học, về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng, đặc biệt khả
năng giảm hấp thu đường huyết và cơ chế tác dụng chưa được nghiên cứu. Những
nghiên cứu như vậy về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam lại càng ít và hầu
như chưa có.
Để đóng góp nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa học cơ bản về glucomannan có
nguồn gốc tại Việt Nam, đồng thời góp phần nâng cao giá trị sử dụng của loại hợp
chất này nhằm đưa ra những sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng có giá trị
thực tiễn cao từ cây Nưa Amorphophalus konjac K.Koch ở Việt Nam chúng tôi đã
lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tách, tinh chế và thủy phân glucomannan từ cây
Amorphophalus konjac K.Koch ở Lâm Đồng và định hướng ứng dụng hạ đường
huyết”. Các mục tiêu cụ thể cho luận án như sau:
1. Tách, xác định tính chất và chứng minh cấu trúc của glucomannan từ củ
(thân củ) cây Amorphophallus konjac K.Koch (A.konjac) thu nhận tại Việt Nam.
2. Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân glucomannan từ cây
A.konjac để chế tạo các loại glucomannan với khối lượng phân tử thấp bằng các
phương pháp khác nhau.
3. Thăm dò hoạt tính hạ đường huyết và cơ chế hạ đường huyết của sản
phẩm thủy phân.
2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về glucomannan
1.1.1. Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan
Glucomannan là một polysacarit mạch thẳng gồm các mắt xích D-mannose
và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid, được tách từ củ
(thân củ) của một số loài Nưa (Amorphophallus sp. - họ Ráy), cây lô hội (Aloe vera)
và trong một số loại rong biển. Các mạch nhánh có thể chiếm khoảng 8% thông qua
liên kết β-1,3-glycosid và β-1,6-glycosid. Trên một số nguyên tử C6, nhóm OH
được axetyl hóa với độ axetyl hóa (degree of acetylation) khoảng 5÷10%. Tỷ lệ
mannose/glucose phụ thuộc vào nguồn gốc glucomannan và thường dao động từ
1,6/1 đến 3,6/1. Glucomannan là một polysacarit với nhiều tính chất quý như khả
năng tương hợp và phân hủy sinh học, có khả năng hình thành gel thuận nghịch và
không thuận nghịch, khối lượng phân tử khoảng 200÷2000 kDa [2-9]
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của glucomannan
1.1.2. Tính chất vật lý của glucomannan
Dạng tồn tại: Ở điều kiện thường, tùy thuộc vào phương pháp tách chiết,
glucomannan tồn tại ở dạng bột màu trắng đến vàng.
Tính tan: Khi tồn tại ở dạng tinh thể, trật tự sắp xếp của polyme không phải
là của ion, nguyên tử, phân tử như ở các nhóm vật liệu khác mà là của mạch phân tử.
Trong polyme tinh thể các mạch sẽ sắp xếp sao cho các nguyên tử ở trong một trật
tự nhất định. Mức độ kết tinh của polyme dao động rất mạnh từ không (0) đến gần
3
như hoàn toàn (95%) phụ thuộc vào tốc độ làm nguội khi đông rắn và hình thái cấu
tạo của mạch. Để có sắp xếp trật tự, polyme phải được làm nguội chậm để các mạch
có thời gian chuyển động và sắp xếp lại theo trật tự.
Đặc điểm chung của các polysacarit là trong mạch phân tử chứa nhóm chức
hydroxyl có khả năng tạo liên kết hydro chặt chẽ. Đây là nguyên nhân chính tạo nên
tính chất kết tinh của polyme. Khi tồn tại ở trạng thái kết tinh, polysacarit khó hòa
tan, khó tham gia phản ứng hóa học nên khả năng ứng dụng bị hạn chế. Khi ở dạng
cấu trúc vô định hình, polyme có diện tích bề mặt riêng lớn, dễ tan trong nước và
trong một số hệ dung môi, dễ tham gia các phản ứng hóa học…[29]
Tùy thuộc vào nguồn gốc cấu trúc khác nhau mà glucomannan có độ tan
khác nhau. Glucomannan tách từ cây A.konjac tan tốt trong nước trong khi
glucomannan tách từ cây A.paeoniifolius không tan trong nước. Yếu tố quyết định
tính tan của glucomannan chính là khối lượng phân tử và độ axetyl hóa.
Glucomannan có độ axetyl hóa thấp, liên kết hydro trong mạch phân tử mạnh sẽ
không tan trong nước, trong khi đó glucomannan có độ axetyl hóa cao, khả năng
hình thành liên kết hydro nội và ngoại phân tử kém nên có khả năng tan trong nước.
Glucomannan có DA≈0 hầu như không tan trong nước lạnh mà chỉ trương trong
nước nóng hình thành dạng hồ hóa [30,31].
Glucomannan từ cây A.konjac có khả năng hấp thụ nước từ 100 - 200 lần, tạo
ra dung dịch dạng dẻo nhớt, độ nhớt của dung dịch glucomannan 1% vào khoảng
5000 - 40000 mpas, cao nhất trong các tác nhân làm đặc có nguồn gốc tự nhiên [30,
31]. Glucomannan có độ axetyl hóa càng cao, khả năng hình thành gel càng giảm.
Glucomannan có độ axetyl hóa thấp, gel có thể hình thành khi được gia nhiệt.
Glucomannan có khả năng tạo gel ổn định trong môi trường kiềm loãng như NaOH,
Ca(OH)2 hay Na2CO3 có pH=9 10. Trong môi trường kiềm, quá trình hình thành
gel xảy ra do sự deaxetyl hóa nhóm axetyl trong mạch đại phân tử. Sự thay đổi cấu
trúc này tạo điều kiện cho việc thiết lập các liên kết hydro, hình thành các tương tác
kỵ nước giữa các phân tử glucomannan. Kết quả của quá trình này là hình thành cấu
trúc mạng lưới không gian hay cấu trúc gel của glucomannan [32–36].
4
Dung dịch konjac glucomannan loãng không tạo gel ở nhiệt độ thường.
Konjac glucomannan còn có khả năng tạo gel tốt khi sử dụng phối hợp với các tác
nhân tạo gel khác như alginat, carrageenan, xanthan…[37,38]
Khối lượng phân tử: Khối lượng phân tử của polyme là một đại lượng quan
trọng ảnh hưởng đến tính chất cơ-lý-hóa của polyme như: độ bền cơ học, tính chất
đàn hồi, độ mềm dẻo, khả năng hòa tan…Khối lượng phân tử trung bình của
polyme là đại lượng mang tính chất thống kê trung bình và được biểu diễn qua 3 giá
trị: Khối lượng phân tử trung bình số Mn, khối lượng phân tử trung bình khối Mw và
khối lượng phân tử trung bình nhớt Mv. Để xác định khối lượng phân tử trung bình
của polyme người ta có thể dùng phương pháp trực tiếp như: đo độ thẩm thấu hoặc
phương pháp gián tiếp như: đo độ nhớt. Theo các nghiên cứu, glucomannan có khối
lượng phân tử trung bình từ 200 2000 kDa tùy thuộc vào nguồn gốc và phương
pháp tách chiết [39–41].
1.1.3. Tính chất hóa học của glucomannan
Trong mạch đại phân tử glucomannan có chứa các nhóm chức có khả năng
tham gia các phản ứng hoá học khác nhau, gồm: phản ứng thủy phân liên kết β-
(14) glycosid, phản ứng ở nhóm hydroxyl (-OH) và nhóm axetyl (CH3CO-).
Phản ứng thủy phân cắt liên kết β-(14) glycosid
Glucomannan bị đề polyme hóa với sự cắt đứt các liên kết β-(14) glycosid
trong phân tử tạo ra các oligoglucomannan và cuối cùng là D-mannose và D-
glucose, tác nhân thủy phân có thể là axit hoặc enzym. Trong số các phương pháp
thủy phân hợp chất cao phân tử thì phương pháp sử dụng tác nhân axit kết hợp tiền
xử lý mẫu bằng rung siêu âm (sonication) cho phép nhận được sản phẩm có sự phân
bố khối lượng phân tử đồng đều hơn so với các phương pháp khác. Sử dụng rung
siêu âm đơn thuần cũng có thể thủy phân mạch glucomannan mà không gây ra bất
kỳ thay đổi nào đến cấu trúc hóa học của nó.
Một số hệ enzym như: β-mananase, β-manosidase, β-glucosidase có thể
phân cắt chọn lọc liên kết β-(1 4) glycosid của glucomannan tạo ra oligome có
5
khối lượng phân tử thấp mà vẫn giữ được các đặc tính và tác dụng sinh học quý của
glucomannan ban đầu [23,25].
Phản ứng deaxetyl hoặc axetyl hóa
Tác giả Chen và các cộng sự đã thực hiện phản ứng đề axetyl hóa glucomannan
bằng các tác nhân khác nhau như NaOH, Na2CO3, Na3PO4, Ca(OH)2 và sử dụng
glucomannan đã đề axetyl hóa làm chất tạo màng. Kết quả cho thấy, độ đề axetyl
hóa có ảnh hưởng đến các tính chất cơ lý của màng glucomannan. Phản ứng này
cũng được Lui và cộng sự đã thực hiện tạo sản phẩm không tan trong nước hấp phụ
tanin [42]. Nhiều tác giả đã sử dụng NaOH để thủy phân nhóm acetyl của
glucomannan ở pH >10. Feng Liu (2010) và cộng sự đã thực hiện phản ứng đề
acetyl hóa bằng NaOH với tỷ lệ NaOH/glucomannan là 0,7/40 trong 240ml dung
dịch etanol (100/140 v/v) ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 12giờ thu được sản phẩm
có DA =0 [43]. Năm 2014, B. Solo-de-Zaldívar và cộng sự đã thủy phân
glucomannan bằng KOH ở pH = 10,7 nhiệt độ 30oC trong thời gian 3 giờ thu được
sản phẩm glucomannan đề acetyl hóa có khả năng tạo màng có khả năng hấp thụ
nước tốt [44].
Phản ứng este hóa
Các nhóm hidroxyl (-OH) của phân tử glucomannan có khả năng phản ứng
với các anhidrit axit hoặc clorua axit tạo ra các este của glucomannan [45].
Phản ứng ete hóa
Nhóm hydroxyl (-OH) của phân tử glucomannan có thể tham gia phản ứng
với các tác nhân như halogen ankyl axit để tạo thành các sản phẩm dạng ete của
glucomannan [46].
Phản ứng đồng trùng hợp ghép
Konjac Glucomannan có khả năng tham gia phản ứng đồng trùng hợp ghép
với một số monome khác nhau như: metylmetacrylat, axit acrylic, acrylamit...dưới
tác dụng của chất khơi mào gốc như hidropeoxit, KMnO4/axit oxalic...Phản ứng xảy
ra theo cơ chế gốc. Tác giả Li-Gui Chen và cộng sự đã tổng hợp hydrogel trên cơ sở
glucomannan ghép với axit acrylic (AA) [47] (Sơ đồ 1.1).
6
Sơ đồ 1.1. Phản ứng tổng hợp hydrogel trên cơ sở glucomannan ghép với axit
acrylic (AA)
1.1.4. Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của glucomannan
Vai trò của các chất xơ hòa tan đối với sức khỏe ngày càng được nhắc đến
nhiều với các bằng chứng khoa học. Chất xơ nghèo năng lượng cho cơ thể, bản thân
nó không cung cấp chất dinh dưỡng cũng như không được tiêu hóa tại ruột nhưng
sự hiện diện của nó đã đem lại nhiều lợi ích đối với sức khỏe, phòng chống nhiều
bệnh chuyển hóa. Chất xơ hòa tan khi vào trong ruột có tác dụng như chiếc chổi
quét các chất béo không có lợi như cholesterol ra khỏi ruột, hạn chế hấp thu chúng
vào máu do đó làm giảm đáng kể các chất béo trong máu, giảm được nguy cơ mắc
bệnh tim mạch. Chất xơ có vai trò điều hòa sự hấp thu đường vào máu, nhờ vậy rất
có lợi đối với bệnh nhân tiểu đường [48,49].
Theo nghiên cứu của Chearskul và cộng sự, glucomannan có tác dụng thỗ trợ
điều trị bệnh tiểu đường tuyp 2 nhờ kìm hãm hormon ghrelin kích thích thèm ăn, và
hormon leptin giúp điều hòa cảm giác đói và cân nặng [50].
Theo nghiên cứu của Chen và cộng sự bổ sung 3,6 g glucomannan/ngày
trong 28 ngày có tác dụng hỗ trợ giảm đường huyết sau ăn, choleserol máu, lipit
máu ở bệnh nhân tiểu đường tuýp 2 [51].
7
Theo một số công bố khác, glucomannan còn có thể hỗ trợ làm tăng độ nhạy
của insulin, kiểm soát hội chứng kháng insulin, giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch ở
bệnh nhân tiểu đường tuyp 2, giảm nồng độ lipit huyết tương và glucose máu, giảm
cân và hỗ trợ điều trị cao huyết áp với liều sử dụng 1 ÷ 13 g/ngày [11,52].
Việc bổ sung KGM làm cải thiện nồng độ lipit máu bởi sự tăng bài tiết qua
phân của các sterol trung tính, axit mật và làm giảm mức glucose tăng cao trong
bệnh tiểu đường. KGM có thể là chất bổ sung cho chữa trị bệnh tiểu đường kèm
tăng lipit máu [51–55].
Do khả năng phân huỷ sinh học và tạo dạng gel, konjac glucomannan được
sử dụng trong sản xuất mỹ phẩm, dược phẩm. Theo Kang Wang và cộng sự, vật liệu
dạng hạt của alginat-KG-chitosan có thể được sử dụng làm chất mang để kiểm soát
sự phân giải của thuốc [38].
KGM có khả năng tan trong nước tạo dung dịch có độ nhớt cao, tăng cường
tính bám dính sinh học (bio-adhesive). Peter và các cộng sự đã phát minh ra một
hợp chất dược học có khả năng tăng cường khả năng bám dính sinh học, được làm
bằng tổ hợp alginate, xanthan gum với glucomannan. Các hợp chất này có thể đáp
ứng được cả hiệu quả bảo vệ và chữa lành tổn thương trên bề mặt màng nhày cho
việc xử lý các rối loạn thực quản [56].
Chen và cộng sự đã công bố một phương pháp sử dụng carrageenan và
glucomannan để cố định tế bào. Hỗn hợp bao gồm 4090% carrageenan và 6010%
konjac glucomannan được phủ lên hạt gạo để thu được ngũ cốc dùng cho người ăn
kiêng. Sản phẩm có thể được nấu theo cách thông thường [51].
Hơn nữa, với các đặc tính giá thành thấp, khả năng tạo màng tốt, khả năng
hoà hợp và phân huỷ sinh học cao, cũng như là khả năng tạo dạng gel làm cho
KGM trở thành một loại vật liệu polyme mới có nhiều triển vọng trong nhiều lĩnh
vực bao gói và vật liệu bảo quản, vật liệu nhả chậm...[57]
Sản phẩm konjac glucomannan thủy phân (LKGM) có nhiều hoạt tính sinh
học quý đã được nghiên cứu. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng LKGM có giá
trị như một chất lợi khuẩn (prebiotic) thông qua một số cơ chế: nó có thể kích thích
8
có chọn lọc Lactobacillus và Bifidobacterium trong ruột già bằng cách ngăn chặn sự
bám dính của chúng trên bề mặt niêm mạc ruột của động vật, LKGM có thể ngăn
chặn sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh như Coliforms, Enterococci,
Staphylococcus aureus [10].
Một vài nghiên cứu đã chứng minh rằng LKGM có tiềm năng lớn như một
chất chống oxy hóa tự nhiên. LKGM có thể hoạt động trực tiếp như một chất chống
oxy hóa hoặc hoạt hóa các enzym chống oxy hóa nội bào [80].
Tác giả Yu-Heng Mao và cộng sự đã nghiên cứu khả năng bảo vệ các vết
thương hở khỏi nhiễm trùng của konjac glucomannan thủy phân. Kết quả nghiên
cứu cho thấy KGM (≈8,8.108Da) bị suy giảm một phần với siêu âm cường độ cao
đến KGM-US (≈1,8.106) và sau đó thủy phân bằng axit trifloaxetic (TFA) tạo sản
phẩm thủy phân có khối lượng phân tử trung bình đạt 1369Da. Sản phẩm có tác
dụng với hầu hết các chủng vi khuẩn chống lại penicillin và ức chế streptomycin,
làm tăng nồng độ ức chế và diệt khuẩn tối thiểu (MIC và MBC) một cách đáng kể,
và KGM thủy phân cũng cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc tăng cường MBC của
enrofloxacin, penicillin, tetracyclin và streptomycin. Kết quả cho thấy KGM tự
nhiên và KGM thủy phân có tác dụng bảo vệ đối với vi khuẩn probiotic trong ruột
của người chống lại những tổn thương do thuốc kháng sinh đặc hiệu gây ra [67].
1.2. Cây nưa A.konjac K.Koch và quy trình tách chiết glucomannan
1.2.1. Cây Nưa Amorphophallus Konjac K.Koch
Việt Nam có khoảng 25 loài Nưa phân bố từ Bắc vào Nam. Năm 1942,
Ganepain biên soạn họ Ráy ở Đông Dương trong cuốn “Thực vật chí Đông Dương”
ông đã mô tả 4 loài Nưa có ở Việt Nam là: Nưa chuông – A.paeoniifolius, Nưa Bắc
Bộ - A. tonkinensis, Nưa mekong – A. mekongensis, Nưa đứt đoạn – A. interruptus.
Năm 1994, trong một số bài báo khoa học, Hetterscheid công bố một số các loài
Nưa phát hiện ở Việt Nam như Nưa hoa vòng – A. verticillatus từ mẫu thu ở Cúc
Phương, Nưa lông – A. lanuginosus từ mẫu thu ở Hòn Tre (Nha Trang), Nưa trạm
trổ - A. scaber từ mẫu thu ở Nam Bộ v.v. Sau đó, Nguyễn Văn Dư cùng với
Hetterscheid công bố thêm một số loài Nưa mới như Nưa phong nha – A.
9
tuberculatus từ mẫu ở Phong Nha – Kẻ Bàng, Nưa hoa đực khối – A. synandrifer ở
Ninh Thuận, Nưa Kiên lương – A.kienluongensis. Trong các chuyến khảo sát thực
địa ở Việt Nam năm 2012, Nguyễn Văn Dư đã phát hiện ra một số loài như Nưa vân
nam – A. yunnanensis, Nưa đầu nhăn – A. corrugatus, Nưa krausei – A. krausei,
Nưa konjac – A. Konjac [6].
Định danh khoa học Nưa konjac – A. Konjac [58]
Tên Khoa học: Amorphophallus konjac K. Koch, Wochenschr. Gärtnerei
Pflanzenk. 1: 262. 1858.
Tên đồng nghĩa: Amorphophallus mairei H. Léveillé; A. nanus H. Li & C. L.
Long; A. rivieri Durieu ex Riviere; Brachyspatha konjac (K. Koch) K.
Koch; Hydrosme rivieri (Durieu ex Riviere) Engler; Proteinophallus rivieri (Durieu
ex Riviere) J. D. Hooker.
Tên địa phương: Nưa konjac (Vie.), Hua mo yu (Tr.)
Nưa A.konjac là loại cây thảo thân củ. Củ hình cầu dẹp, đường kính tới
2030 cm, ngoài mầu nâu hay nâu nhạt, hơi bóng, theo mùa mọc ra nhiều thân chồi
thân dạng thân rễ có phần đỉnh mập, kích thước tới 50 3 cm. Lá đơn độc, cuống lá
có màu sắc rất biến đổi, thường màu trắng xỉn hoặc màu kem xỉn, gần như toàn bộ
có các đốm hình vạch hay hình đường mầu xanh đen và các chấm trắng nhỏ hơn
hoặc có nhiều đốm xanh đen nhỏ, kích thước 100 8 cm, nhẵn, hơi có sáp ở gốc;
Phiến lá xẻ thùy nhiều, đường kính tới 200 cm, sống có cánh hẹp; phiến chét hình
bầu dục, xanh đục, kích thước 210 26 cm, có mũi nhọn ở đỉnh. Bông mo có
cuống dài, cuống có màu sắc giống cuống lá, kích thước 110 x 5 cm. Mo hình bầu
dục tới mác, có khi hình trứng tới tam giác rộng, kích thước 1060 1055 cm,
ống mo và phiến mo phân biệt, mép của phiến lượn sóng, đỉnh nhọn; có nhiều mụn
cơm ở mặt trong gốc ống mo, mụn cơm nhỏ, dạng chấm; phiến thẳng, màu nâu đen
đều ở mặt trong, bóng, lượn sóng và cong gập theo chiều dọc, mép ở gốc trải rộng;
mặt ngoài mo nâu nhạt xỉn với các đốm xanh đen, hay xám trắng xỉn có các chấm
xanh đen thưa thớt. Bông nạc có mùi thối trong thời gian thụ phấn, tiết ra nhiều giọt
chất nhầy nhỏ, không cuống, dài 15110 cm; phần cái hình trụ hoặc hình nón hẹp,
10
dài 211 cm, rộng 14 cm ở gốc và tới 6 cm ở đỉnh, các hoa xếp dày đặc hoặc thưa
thớt; bầu trắng hoặc hơi hồng, đỉnh tía, hình cầu dẹp, hình bầu dục hoặc có thiết
diện gần tròn, dài 22,5 mm, rộng 24 mm, 23 ô; vòi nhụy tía, mảnh, dài 15 mm,
rộng 0,71 mm, thường phân nhánh ở đỉnh; núm nhụy màu nâu vàng xỉn, dẹp, lượn
sóng ở mép, thường lõm ở giữa, 23 (4 thùy), mặt cắt hình bầu dục hay hình tam
giác, cao 0,5 mm, rộng 1,52 mm, bề mặt xù xì; giữa phần đực và cái thường có
phần bất thụ; phần đực hình trụ, hơi hình thoi, hoặc hình nón, kích thước 212
16 cm, hoa dày đặc; hoa đực gồm 35 nhị; bao phấn dài 22,5 mm; chỉ nhị màu
vàng cam hoặc hơi trắng, rộng 0,51; bao phấn màu xám trắng hay màu kem, cụt
hoặc gần cụt, kích thước 11,5 0,82 mm; trung đới màu tía, sau thành xám khi
thụ phấn, hơi nhô; mở lỗ ở đỉnh, lỗ hình bầu dục hay hình thận; phần phụ hình nón
hay hình thoi hẹp, thường dẹp ở phía bên và có nhiều rãnh nông không đều, dài
10 85 cm, đường kính 5 6 cm, nhọn, màu nâu tía hay đậm hay nhạt, nếp nhăn
nhiều (Hình 1.2).
Sinh học và sinh thái: Cây mọc dưới tán rừng núi đá vôi ở độ cao 15002000
m. Ra hoa tháng 4, quả tháng 6.
Nưa A. Konjac là loài Nưa được quy hoạch thành cây công nghiệp với quy
mô hàng nghìn ha tại các nước Trung Quốc, Nhật Bản [4],[59],[60]. Hiện nay Trung
Quốc là nước trồng và sản xuất bột konjac glucomannan lớn nhất trên thế giới, kế
đến là Nhật Bản. Diện tích canh tác cây A.konjac của Trung Quốc lên tới gần 200
km2 và có khoảng 400 nhà máy sản xuất bột konjac glucomannan. Có cả một hiệp
hội và nhiều trung tâm mang tên Nưa konjac như Hiệp hội Konjac (Konjac
Association), “Konjac Research Centre” thuộc Đại học Tây Nam Trung Quốc hay
“Globle Wholesale and Distribution Centre”. Hàng năm họ xuất khẩu hàng trăm
ngàn tấn bột konjac glucomannan và nhiều sản phẩm khác từ củ Nưa sang các nước
phát triển [59,61].
11
Hình 1.2. Hình ảnh cây và củ Nưa A.konjac được trồng thử nghiệm tại Lâm Đồng
Ở Nhật Bản, chỉ 2 vùng Jinnejo và Uedama, ngay từ những năm 70 của thập
kỷ trước, hàng năm khoảng hơn 15 ngàn ha Nưa được trồng và sản lượng lên tới
hàng trăm tấn [4, 58, 59].
1.2.2. Quy trình tách chiết glucomannan từ củ A.konjac
Trong những năm qua, công nghệ tách chiết và tinh chế glucomannan luôn
được quan tâm nghiên cứu, cải tiến nhằm nhận được glucomannan có độ sạch cao.
Hàm lượng glucomannan thay đổi trong suốt mùa sinh trưởng và đạt cao nhất ở thời
điểm trước khi rụng lá. Ngoài ra, hàm lượng và chất lượng của glucomannan còn
phụ thuộc rất nhiều yếu tố như phương pháp tách chiết, điều kiện canh tác, thời
điểm thu hoạch…Cho tới nay có 3 phương pháp chủ yếu được áp dụng để tách chiết
glucomannan: phương pháp khô (cơ học), phương pháp ướt (hóa học) và phương
pháp kết hợp ướt –khô [59,62,63].
12
Củ Amophophalus Konjac tươi
Rửa sạch, bỏ vỏ
Thái lát
Lát Amophophalus Konjac tươi
phơi khô Sấy khô
Lát Amophophalus Konjac khô
Nghiền nhỏ
Bột Amophophalus Konjac thô
Sàng lọc
Thổi, tách
Bột KGM
Sơ đồ 1.2. Quy trình chiết tách bột glucomannan theo phương pháp khô
Theo phương pháp khô (sơ đồ 1.2) [63], củ cây Nưa được thái lát, phơi khô
tự nhiên bằng ánh nắng mặt trời hoặc sấy khô bằng khí nóng, sau đó nguyên liệu
được nghiền mịn và tách tạp chất bằng phương pháp thổi khí nóng có bổ sung khí
SO2 để ngăn các quá trình oxi hóa gây ra màu cho sản sản phẩm (khi đó các hạt tinh
bột nhẹ hơn sẽ bị tách ra khỏi glucomannan). Tuy nhiên, nhược điểm của phương
pháp khô là tạp chất và glucomannan có xu hướng bó chặt lại với nhau do đó rất
khó để tách glucomannan ra khỏi tạp chất, một lượng không nhỏ glucomannan có
thể lẫn vào tạp chất bị tách loại, dẫn đến hiệu suất tách thấp. Do vậy, sản phẩm nhận
được bằng phương pháp khô thường có độ sạch không cao, tồn dư hàm lượng nhất
định lưu huỳnh trong sản phẩm và do đó không được ứng dụng trong một số lĩnh
13
vực thực phẩm, dược phẩm và chỉ bán được với giá thành thấp. Theo một số kết quả
nghiên cứu trước đây của các tác giả, sản phẩm tách được theo phương pháp khô
chỉ đạt cấp độ 3, có màu nâu, không đáp ứng Tiêu chuẩn NY/T494-2002 (Bộ Nông
nghiệp Trung Quốc, 2002) [64].
Củ Amophophalus Konjac
Rửa sạch, bỏ vỏ
Thái lát
Lát Amophophalus Konjac
Bổ sung etanol tỉ lệ etanol/H2O1,5/1
Nghiền
Hỗn dich bột Nưa Konjac trong etanol
Ly tâm, thu tủa, sấy
Bột Amophophalus Konjac thô Tái sử dụng
Nghiền
Sàng lọc
Bột KGM
Sơ đồ 1.3. Quy trình chiết tách bột glucomannan theo phương pháp khô- ướt
Theo phương pháp ướt, củ A.konjac được rửa sạch, nghiền thành bột konjac
trong môi trường dung môi etanol có bổ sung tác nhân chống nâu hóa, ly tâm và sấy
khô. Do konjac glucomannan có khả năng tạo gel tạo dung dịch có độ nhớt cao.
Hỗn hợp được ly tâm tách glucomannan ở dạng tủa nổi. Rửa bột konjac
glucomannan thô bằng dung môi hữu cơ, sấy khô sản phẩm [63].
14
Ưu điểm của việc sử dụng etanol là sản phẩm thu được có chất lượng cao đáp
ứng được lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm. Tuy nhiên, nhược điểm của phương
pháp này là chi phí cao do phải dùng lượng dung môi lớn, hiệu suất thu hồi sản
phẩm không cao.
Hiện nay để tăng chất lượng của bột konjac glucomannan, một số tác giả đã
tiến hành nghiên cứu kết hợp hai phương pháp trên. Quá trình sản xuất bột konjac
glucomannan được thực hiện theo sơ đồ 1.3.
Theo phương pháp này vừa giảm chi phí, thời gian sản xuất, mà sản phẩm
thu được có chất lượng cao đáp ứng tiêu chuẩn trong sản xuất dược phẩm, thực
phẩm.
1.3. Phản ứng cắt mạch glucomannan
Do glucomannan khối lượng phân tử thấp (LKGM) có nhiều tiềm năng ứng
dụng trong các lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm, trong thời gian qua, nhiều nhóm
tác giả nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm tìm ra phương pháp cắt mạch
glucomanan hiệu quả. Về cơ bản, phản ứng cắt mạch glucomannan được chia thành
hai nhóm phương pháp chính: bằng phương pháp lý-hóa (physicochemical
degradation) và bằng enzym (biodegradation).
1.3.1. Cắt mạch bằng các phương pháp lý -hóa học
Tương tự như các loại polysacarit, glucomannan có thể bị phân cắt liên kết
glycosid bằng axit vô cơ và hữu cơ như: H3PO4, HCl, axit citric, axit tartaric tạo ra
các oligosacarit và cuối cùng là các monosacarit.
Trong môi trường axit HCl, phản ứng thủy phân xảy ra theo cơ chế thế SN1.
Mặc dù dùng axit HCl cho hiệu quả cắt mạch nhanh, sản phẩm có khối lượng phân
tử giảm, độ acetyl hóa thấp hơn nhưng phản ứng khó kiểm soát, sự phân bố khối
lượng phân tử của sản phẩm không đồng đều.
Hsiao-Ling Chen (2005) nghiên cứu về tác dụng lợi khuẩn của glucomannan
và glucomannan thủy phân bằng axit HCl đến hệ vi sinh vật đại tràng của chuột.
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy glucomanan khối lượng phân tử thấp hơn có tác
15
dụng lợi khuẩn (prebiotic) nhanh và tốt hơn đối với hệ vi sinh vật đại tràng so với
glucomannan chưa thủy phân [25].
Cheng và cộng sự (2010) đã dùng axit HCl kết hợp với sóng siêu âm để thủy
phân glucomannan thu được sản phẩm glucomannan có khối lượng 5,6105 Da [26].
Jiangyun Liu (2011) đã thủy phân glucomannan Bletillla striata (Bletillan)
với mức độ thủy phân và độ axetyl hóa mong muốn. Sản phẩm thủy phân được ứng
dụng để vận chuyển thuốc. Phản ứng được thực hiện ở 90 °C tại các nồng độ HCl
0,10 M. Để tăng tính tan, glucomannan được acetyl hóa bằng phản ứng với acetic
anhydride trong dung môi DMF. Khối lượng phân tử, cấu trúc hóa học của sản
phẩm thủy phân được nghiên cứu bằng các phương pháp hóa lý hiện đại như
HPGPC, IR, NMR. Dược động học của quá trình vận chuyển thuốc được nghiên
cứu bằng cách tiêm vào tĩnh mạch thỏ [12].
Shu-Lan Yeh (2010) và cộng sự nghiên cứu về tác dụng bảo vệ tế bào Caco-2
của glucomannan và glucomannan thủy phân bằng 0,2 N HCl (25 g/l) trong 40 phút,
có độ trùng hợp DP8 và DP4. Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm thủy phân có
tác dụng tốt hơn so với glucomannan chưa thủy phân [65].
Tingtiao Pan và cộng sự (2013) nghiên cứu thủy phân glucomannan bằng tia
gamma kết hợp với H2O2. Nghiên cứu này chỉ ra rằng khi chỉ sử dụng H2O2 cho
hiệu quả cắt mạch không cao (480 kDa) trong khi hiệu quả cắt mạch được cải thiện
rõ rệt khi kết hợp đồng thời với chiếu xạ tia gamma (64,8 kDa). Sản phẩm có độ tan
trong nước lên đến 97,17%. Cấu trúc của các sản phẩm thủy phân và glucomannan
ban đầu được khảo sát bằng quang phổ tử ngoại nhìn thấy (UV), hồng ngoại biến
đổi Fourier (FT-IR) và nhiễu xạ tia X (XRD). Kết quả cho thấy không có sự thay
đổi đáng kể trong cấu trúc của sản phẩm sau khi depolyme hóa, mặc dù độ kết tinh
của KGM giảm [66].
W. Jin và cộng sự (2014) đã chiếu xạ glucomannan bằng 60Co khi có mặt
của etanol nhận được sản phẩm có khối lượng phân tử giảm từ 1.4 106 Da xuống
còn 6105Da với liều chiếu xạ 3.6 kGy, 50% etanol. Với liều chiếu xạ tăng lên 6,0
kGy, độ nhớt của sản phẩm giảm từ 139,8 Pas xuống còn 2,928 Pas. Các tính chất
của sản phẩm thủy phân được khảo sát thông qua phổ IR, DSC, DLS...[27].
16
Yu-Heng Mao và cộng sự (2018) đã thủy phân glucomannan có khối lượng
phân tử ban đầu là ~ 8,8 × 108 Da bằng phương pháp siêu âm cường độ cao (20 kHz,
750W) nhận được glucomannan sản phẩm có khối lượng phân tử giảm xuống còn
~1,8×106Da. Sau đó được thủy phân tiếp bằng axit trifluoroactetic (trifloacetic axid
2M, 70°C, 4 giờ) nhận được sản phẩm thủy phân khối lượng phân tử 1369 Da. Sản
phẩm sau thủy phân (5g/lít) có tác dụng bảo vệ lợi khuẩn đường ruột (ruột kết) của
con người khi sử dụng một số kháng sinh đặc hiệu như penicilin streptomycin [67].
Weiping Jin (2014) nghiên cứu thủy phân glucomannan bằng kiềm kết hợp
nhiệt. pH của phản ứng được điều chỉnh ở 7,2; 8,2;9,2, nhiệt độ thay đổi từ 25 đến
80oC. Độ nhớt của sản phẩm được đánh giá bằng nhớt kế Ubbelodhe. Khối lượng
phân tử của sản phẩm thủy phân được tính toán dựa trên phương trình Mark–
Houwink với k và α lần lượt là 5,96×10−2 và 0,73. Tại pH 5,6, sau 2 giờ, khối lượng
phân tử glucomannan giảm nhẹ từ 8,54×105 xuống còn 5,68×105 ở nhiệt độ 80oC. Ở
pH 9,2, nhiệt độ 80oC sau 2 giờ khối lượng phân tử glucomannan giảm từ 8,54 ×
105 xuống còn 3,06 × 105 [28].
Wanmei Lin (2019) và cộng sự nghiên cứu điều chế konjac glucomannan
khối lượng phân tử thấp bằng bằng phương pháp kết hợp tia laser (10 W) và H2O2
và khảo sát tính chất hóa lý của sản phẩm. Tuy nhiên so với các công trình công bố
trước đó, khối lượng phân tử của sản phẩm thủy phân (LDK) giảm không nhiều, từ
7,6×105 Da xuống còn 5,7×105Da, độ nhớt giảm từ 8,38 Pa·s xuống còn 2,26 Pa·s
(dung dịch nồng độ 1g/100ml), LDK bền nhiệt hơn và số liên kết glycosid giảm
Hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm cũng được cải thiện so với glucomannan ban
đầu [68].
1.3.2. Thủy phân với xúc tác enzym
1.3.2.1. Đặc điểm của xúc tác enzym
Enzym là các hợp chất protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học
nhất là các phản ứng xảy ra trong quá trình trao đổi chất của các cơ thể sống. Chúng
có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định, có tính chọn lọc cao
và cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với các xúc tác thông thường. Sỡ dĩ phản
ứng xúc tác enzym diễn ra nhanh như vậy là do năng lượng hoạt hoá trong phản ứng
17
enzym được hạ xuống rất thấp so với trường hợp không có xúc tác và cũng nhỏ hơn
rất nhiều so với các xúc tác khác. Vì có tính đặc hiệu cao nên phản ứng thủy phân
của enzym ít tạo thành sản phẩm phụ hơn so với các phương pháp hóa học [69–75].
Bản chất của enzym là protein nên các tác nhân gây biến tính protein như
nhiệt độ, axit, kiềm, tác động cơ học…đều có thể làm enzym biến tính thuận nghịch
hoặc không thuận nghịch. Trong cấu tạo của enzym một cấu trúc rất đặc biệt gọi là
trung tâm hoạt động. Không phải tất cả các phần của enzym đều tham gia vào hoạt
động xúc tác mà chỉ có trung tâm hoạt động mang tính đặc hiệu trong phân tử
enzym mới tham gia xúc tác phản ứng [69,70].
Enzym có nhiều ưu điểm so với các chất xúc tác hoá học truyền thống. Nổi
bật nhất là tính hiệu quả, tính đặc hiệu và tính chọn lọc của chúng. Enzym chỉ xúc
tác các phản ứng với một phổ cơ chất rất hẹp, một nhóm chất duy nhất, điều này có
nghĩa là phản ứng đã lựa chọn có thể được xúc tác để loại trừ các phản ứng phụ, loại
bỏ các sản phẩm phụ không mong muốn [69]. Như vậy, có thể đạt được hiệu suất
cao nhờ giảm các chi phí về vật chất. Tính hiệu quả của xúc tác sinh học được thể
hiện là làm tăng tốc độ các phản ứng hóa học. Nhiều phản ứng khi không có enzym
xúc tác, xảy ra rất chậm hoặc hầu như không xảy ra. Các phản ứng trong cơ thể
sống thường xảy ra rất nhanh từ 10 tới 30 giây và hầu như không xảy ra nếu đưa ra
ngoài cơ thể.
Tốc độ phản ứng hóa học được xác định bởi giá trị năng lượng hoạt hóa tức
là mức năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được để cắt đứt liên kết cần
thiết và hình thành các liên kết mới. Năng lượng hoạt hóa càng lớn thì vận tốc phản
ứng càng chậm và ngược lại. Do làm giảm năng lượng hoạt hóa phản ứng, các chất
xúc tác có tác dụng thúc đẩy vận tốc phản ứng hóa học. Trong phản ứng thủy phân
có xúc tác enzym, các enzym có tác dụng làm giảm năng lượng hoạt hóa cho phản
ứng bằng cách tạo sản phẩm trung gian, nghĩa là nó không đóng vai trò là chất tham
gia phản ứng. Sau phản ứng, chất xúc tác lại phục hồi về trạng thái ban đầu. Hầu
như tất cả các biến đổi hóa sinh trong tế bào và cơ thể sống đều được xúc tác bởi
enzym ở pH trung tính, nhiệt độ và áp suất bình thường trong khi đa số các chất xúc
tác hóa học khác lại chỉ xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao. Chính nhờ việc tạo được
môi trường đặc hiệu (bởi trung tâm hoạt động của enzym liên kết với cơ chất) có lợi
18
nhất về mặt năng lượng để thực hiện phản ứng mà enzym có được những khả năng
đặc biệt đã nêu trên [69,70].
Trong phản ứng có sự xúc tác của enzym, nhờ sự tạo thành phức hợp trung
gian enzym - cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa. Cơ chất kết hợp vào enzym, do kết
quả của sự phân cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các
liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như
thế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia
phản ứng dễ dàng. Năng lượng hoạt hóa khi có xúc tác enzym không những nhỏ
hơn rất nhiều so với trường hợp không có xúc tác mà cũng nhỏ hơn so với cả trường
hợp có chất xúc tác thông thường. Nhiều dẫn liệu thực nghiệm đã cho thấy quá trình
tạo thành phức hợp enzym cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản phẩm,
giải phóng enzym tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau.
E + S ES P + E
Trong đó E là enzym, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzym - cơ
chất, P là sản phẩm.
- Giai đoạn thứ nhất: enzym kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành
phức hợp enzym - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi
hỏi năng lượng hoạt hóa thấp.
- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ
các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.
- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzym được giải phóng ra dưới
dạng tự do. Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES
là: tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals. Mỗi loại liên
kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.
1.3.2.2.Các hệ enzym thủy phân mannan
Mannan, một hemicellulose quan trọng, là thành phần chính trong nhiều loài
thực vật. Mannan đa dạng về cấu trúc và được chia thành bốn loại chính dựa trên
thành phần đường ở mạch chính, bao gồm: mannan mạch thẳng, glucomannan,
galactomannan và galactoglucomannan. Nhờ có nhiều đặc tính dược lý, trị liệu, y
19
sinh ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm nên các nghiên cứu về
polysacarit trên cơ sở các mannan hiện nay rất được quan tâm nghiên cứu [76].
Hình 1.3. Cấu trúc của một số loại β,1–4 mannan/heteromannan
Các nhóm enzym chính có khả năng phân hủy mannan bao gồm: 1,4-β-D
mannan mannohydrolase (β-mannanase, EC 3.2.1.78), 1,4-β-D- mannopyranoside
hydrolase (β-mannosidase, EC 3.2.1.25) và 1,4-β-D glucoside glucohydrolase ( β-
glucosidase, EC 3.2.1.21) [72]. Để thủy phân các mạch nhánh cần có các enzym
20
như α-galactosidase và acetyl mannan esterase. Enzym mannanase tham gia phân
huỷ mannan rất phong phú. Chúng có nguồn gốc từ nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn,
thậm chí cả nấm men và động thực vật [71–77].
Bảng 1.1. Hệ sinh vật phân huỷ mannan [76]
Vi khuẩn Nấm Thực vật Động vật TT
Antarctic Bacteria Bacillus Arabidopsis 1 Aspergillus niger BK01 springtail licheniformis DSM13 thaliana (Cryptopygus)
Germinating
Aspergillus niger strain Coffea arabica Bacillus nealsonii BCC4525 Chrysonilia grains 2 PN-11 Bacillus Blue mussel sitophila Neosartorya Germinating subtilis B23 fischeri P1 Lilium
testaceum bulbs
Penicillium Bacillus pumilus chrysogenum QML-2 Common sea 3 GBSW19 Bacillus Lactuca sativa Penicillium occitanis hare subtilis YH12 Pol6
Bacteria Bacillus Ripening fruits 4 Aspergillus niger BK01 licheniformis DSM13 of tomato
Aspergillus niger strain Bacillus nealsonii BCC4525 Chrysonilia 5 PN-11 Bacillus sitophila Neosartorya subtilis B23 fischeri P1
Penicillium Bacillus pumilus chrysogenum QML-2 6 GBSW19 Bacillus Penicillium occitanis subtilis YH12 Pol6
21
β-mannanse (EC 3.2.1.78)
Enzym 1,4-β-D mannan mannohydrolases (còn gọi là β-mannanases EC
3.2.1.78) thuỷ phân các liên kết bên trong mạch glucomannan một cách ngẫu nhiên,
dẫn đến làm giảm nhanh chiều dài mạch và tăng các nhóm khử. Enzym này hoạt
động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của
polysacarit [78,79].
Có hai phương pháp chính để nuôi cấy hệ vi sinh sinh endo-β-mannanase là
lên men chìm và lên men ở trạng thái rắn [76]. Hai nguồn chính để sinh Endo-β-
mannanse: từ các nguồn vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Bacillus
megaterium, Brevibacillus brevis, Pichia pastoris và Kluyveromyces cicerisporus;
từ nguồn nấm chủ yếu từ P. pastoris và Aspergillus sp.
Lượng enzym cao nhất thu được sau khi nuôi cấy và tinh chế endo-β-
mannanase thu được từ Chaetomium sp. CQ3 là 150030 U/ml và Bacillus sp.
CFR1601 là 8406 U/ml.
Trên cơ sở trình tự amino axit, endo-β-mannanases từ các sinh vật khác nhau
đã được phân loại trong họ glycoside hydrolase (GH) 5, 26 và 113. GH 5 endo-β-
mannanase chủ yếu được tạo ra bởi các sinh vật nhân chuẩn như nấm, thực vật và
động vật. Tuy nhiên, một số ít vi khuẩn như Cellulosimicrobium sp, Petrophila
Thermotoga, và Bacillus licheniformis cũng đã sản sinh ra GH5 endo-β-mannanase.
GH 26 endo-β- mannanase được tìm thấy chủ yếu trong vi khuẩn như Bacillus sp.
CFR1601, Bacillus subtilis WL-3, Clostridium cellulovorans, Paenibacillus
polymyxa, Pantoea agglomerans, Pseudomonas fluorescens [71, 72], [76–78].
β-mannosidases ( EC 3.2.1.25)
β-mannosidases (EC 3.2.1.25) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu
không khử của polysacarit. Enzym này tác động yếu lên vùng vô định hình ở phía
bên trong của mạch, nhưng tác động mạnh lên mạch bên ngoài của polysacarit kết
tinh hoặc polysacarit đã bị phân giải một phần. Hai enzym β-mannanases (EC
3.2.1.78) và exo-β- mannosidase có tác dụng hiệp đồng cho hiệu quả rõ rệt.
22
Enzym β-mannosidases có khối lượng phân tử 64.000 Da, pI 5,9 và ổn định
ở pH từ 5,0 ÷ 8,5 và ở nhiệt độ dưới 45oC. Enzym này không tác động lên
mannobiose, p-nitrophenyl-beta-D-mannoside, hoặc galactomannan
Vi khuẩn thường không sản sinh β-mannosidases, enzym này thường được
tổng hợp từ một số loài nấm như Trichodemar, Aspergillus [78,79]….Bên cạnh đó
người ta cũng đã phân lập được Exo-1,4/1,3- manosidase từ rong biển nâu và lúa
mạch. Enzym thu được từ hai nguồn này không ổn định nhiệt và bất hoạt ở nhiệt độ
trên 30oC [71,72].
* β- glucosidases (EC 3.2.1.21)
Enzym 1,4-glucosidase (EC 3.2.1.21) còn gọi là cellobiase. Enzym này thuỷ
phân cellobiose và các cellodextrin hoà tan, chúng có hoạt tính thấp và giảm khi
chiều dài của mạch tăng lên. Tuỳ theo vị trí mà 1-4-glucosidase được coi là nội bào,
ngoại bào hoặc liên kết với thành tế bào.
Một loạt các sinh vật bao gồm trực khuẩn, vi khuẩn, thực vật, nấm và động
vật có thể sản xuất mannosidase. Các enzym này thực hiện các chức năng trao đổi
chất quan trọng trong các sinh vật khác nhau [77].
Ngoài sản xuất mannosidase ngoại bào các vi sinh vật còn sản xuất một số
mannosidase nội bào. Mannosidase nhìn chung được sản xuất bởi vi khuẩn Gram
dương đặc biệt là Bacillus sp. Tuy nhiên, một số vi khuẩn Gram âm
như Arthrobacter sp. và Aeromonas aerophila cũng có thể sản sinh
mannosidase. Trong số các loại nấm, các nguồn mannosidase phổ biến là từ
chi Aspergillus, trong khi Thermoascus aurantiacus, Polyporussulfureus,
Trichosporon cutaneum, Rhizopusniveus cũng sản sinh các enzym mannosidase.
Sản lượng enzym ảnh hưởng bởi nguồn dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy
và các yếu tố hóa lý khác. Thời gian nuôi cấy cho năng suất tối ưu sản xuất
mannosidase từ vi khuẩn (Bacillus sp. AM-001) là 24 giờ đến 72 giờ, đối với nấm
từ 3 ngày (Aspergillus niger) đến 22 ngày (Phelinus abietis). Tương tự như các
enzym chuyển hóa khác, sản xuất mannosidase tối ưu trong vi khuẩn nằm trong dải
trung tính và trong phạm vi có tính axit yếu [78,79].
23
Quá trình sản xuất mannosidase có thể thực hiện bằng lên men dung dịch
hoặc lên men ở trạng thái rắn (SSF). Nguyên liệu sản xuất bằng phương pháp lên
men trạng thái rắn có thể dùng các chất thải nông nghiệp cho năng suất tối đa.
Mannosidases từ vi sinh vật có thể hoạt động trong một phạm vi nhiệt độ rộng (37 -
87oC). Hầu hết trong số đó có nhiệt độ từ 45 đến 50oC. Độ pH tối ưu cho hoạt động
của chúng thay đổi từ 2,5 đến 7,0 với mannosidase từ
Cellulomonas sp. và T. neapolitana 5068 có hoạt tính tối ưu trong điều kiện kiềm
nhẹ pH 8,0 và 7,7, tương ứng. Mannosidase từ T. neapolitana 5068 có hoạt tính tối
ưu ở 87○C và độ pH 7,7 rất hữu ích cho các ứng dụng mà các enzym ổn định nhiệt
kiềm được sử dụng trong ngành công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy [78,79].
Đặc tính sinh hóa của β-mannanase [67,68],[72–74].
* pH
GH 5 endo-β-mannanase từ các nguồn nấm hoạt động trong môi trường axit:
A. sulphureus (pH 2.4), A. aculeatus (pH 2.5), Penicillium oxalicum GZ2, và
Trichoderma reesi (pH 3.5). Tuy nhiên, một số endo-β-mannanase thuộc họ GH
mới từ A. nidulans hoạt động tối ưu ở pH gần trung tính. Endo-β-mannanase thu
được từ một số loài nấm giữ được khoảng 80% hoạt tính ở pH axit đến trung tính
(4÷7). Các enzym thu được từ nguồn vi khuẩn lại có hoạt tính tốt nhất ở pH trung
tính đến kiềm. Ví dụ, endo-β-mannanase (GH5) từ Bacillus nealsonii PN11 và
Bacillus N16–5 (GH 26) hoạt động tối ưu ở pH 8 và 9.6, endo-β- mannanase (GH
26) từ Bacillus sp. CFR1601 hoạt động tối ưu ở pH 7. Mannanase vi khuẩn ổn định
bền vững trong khoảng pH 6÷9. Đặc biệt endo-β- mannanase từ Acinetobacter sp.
ST 1–1 lại hoạt động trong phạm vi pH rộng 3÷10
* Nhiệt độ
Hầu hết các endo-β-mannanase hoạt động tối đa trong phạm vi nhiệt độ
40÷65°C. Tuy nhiên, GH 5 endo-β-mannanase từ Cryptopygus antarcticus hoạt
động tối đa ở 30°C, Thermotoga neapolitana 5068 và P. oxalicum GZ2 GH 5 endo-
β-mannanase có hoạt tính tốt nhất ở nhiệt độ 92°C và 80°C.
* Khối phân tử và điểm đẳng điện
lượng
24
Khối lượng phân tử của endo-β-mannanase khác nhau nằm trong phạm vi
30 80 kDa (Bảng 1.2). Tuy nhiên, endo-β- mannanase thuộc họ GH 26 từ C.
thermocellum có khối lượng phân tử thấp: 15 kDa và 18 kDa, tương ứng.
Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum sinh ra -β-mannanase có khối lượng
phân tử cao (120 kDa). Điểm đẳng điện (pI) của hầu hết các β-mannanase trong
khoảng 48. Trong một số trường hợp, nhiều dạng enzym là đồng dạng, được tạo ra
từ cùng một gen nhưng cấu trúc khác nhau.
Bảng 1.2. Đặc điểm của β-mannanase sinh ra từ một số vi sinh vật.
pH Nhiệt độ KLPT Nguồn pI kDa) vi sinh vật Tối ưu Ổn định Tối ưu Ổn định
GH5 Bacteria t1/2 3 giờ 8,8 65 50 NR Bacillus 510 ở 70°C nealsonii PN11
90 phút Clostridium 40 47 NR 5,57,0 5,57,0 37oC cellulovorans
8 giờ Neosartorya 80 39,5 5,93 4 3÷7 37oC fischeri P1
GH 26
Bacteria 55 TM 76oC 39 NR 6 510 Bacillus sp.
CFR1601
Dictyoglomus 16 giờ 5 80 40 NR 47 thermophilum 80oC Rt46B.1
55 oC, Bacillus subtilis 6,5 55 40,14 NR 4,57,5 3 giờ YH12
Ký hiệu: NR-không được báo cáo (Not reported)
25
1.3.2.3. Nghiên cứu thủy phân glucomannan bằng enzym
Các nghiên cứu thủy phân glucomannan ban đầu được thực hiện chủ yếu với
mục đích nghiên cứu cấu trúc hóa học của glucomanan.
Năm 1961, Perila và cộng sự nghiên cứu thủy phân glucomannan từ cây
thông (Jack Pine) bằng hemicellulase thương mại, nhận được các monosaccarit,
đisaccarit và trisaccarit [13].
Năm 1969, nghiên cứu cấu trúc của glucomannan tách từ cây
Amorphophallus konjac bằng cách thủy phân glucomannan bằng enzym cellulase và
nhận được các oligosacharide: (a) ( 1-4)-D-mannopyranosyl-D-mannose (b) (l-4)-
D-mannose-D-glucose (c) (1-4)D-glucose-D-mannose [14].
Năm 2004, Guanji Li và cộng sự [16] nghiên cứu động học phản ứng thủy
phân konjac glucomannan bằng β-mannanase từ Bacillus sp. ở pH9, 30oC.
Năm 2012, Xuegang Luo và cộng sự thủy phân Konjac glucomannan khối
lượng phân tử từ trung bình đến cao sử dụng xúc tác enzym β-mannanase 3290 U/g
và khảo sát tính chất của sản phẩm thủy phân bằng SEC, FTIR, UV, XRD và TGA.
Phản ứng được thực hiện bằng đệm phosphat pH7, 50oC, trong 10 phút. Theo kết
quả nghiên cứu của công trình này, glucomannan thủy phân có khối lượng phân tử
Mw giảm xuống 1,721×104Da, có cấu trúc giống như glucomannan ban đầu. Kết
quả khảo sát bằng IR cho thấy phổ của glucomannan ban đầu và sản phẩm thủy
phân hầu như giống nhau. Liên kết O–H dao động trong khoảng 3600 ÷ 3300 cm−1.
Pic 2923 cm−1 được quy kết cho dao động C–H của –CH3. Pic ở 1734 cm−1đặc
trưng cho dao động của nhóm carbonyl, 1024 cm−1đặc trưng cho dao động C–O
trong KGM. Các mẫu glucomannan thủy phân được nghiên cứu đều có cấu trúc vô
định hình, tuy mức độ kết tinh thay đổi không đáng kể. Kết quả phân tích nhiệt cho
thấy tính chất nhiệt của sản phẩm thủy phân không chỉ phụ thuộc vào khối lượng
phân tử mà còn phụ thuộc vào sự sắp xếp cấu trúc trong mạch đại phân tử. Các kết
quả nghiên cứu này có ý nghĩa tham khảo hữu ích để sản xuất các loại glucomannan
có khối lượng phân tử khác nhau với tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm và phụ
gia thực phẩm [18].
26
Năm 2013, Atte Mikkelson và cộng sự điều chế glucomanno oligosacarit
bằng cách thủy phân glucomannan bởi mannanase từ Trichoderma reesei,
endoglucanases EGI (Tr Cel7b) và EGII (Tr Cel5a). Kết quả cho thấy mỗi loại
enzym tạo ra một loại oligosacarit khác nhau. Trong ba loại enzym này, mannanase
là enzym chọn lọc nhất trong quá trình thủy phân konjac glucomannan, hơn 99%
các oligosaccarit hình thành có mannose là đơn vị pyranosyl cuối cùng trong khi sử
dụng endoglucanase, sản phẩm có cả manose và glucose là đơn vị pyranosyl cuối
cùng [22].
Năm 2013, Junfan Chen và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phản
ứng thủy phân glucomannan bởi β-mannanase bằng phương pháp đáp ứng bề mặt.
Mô hình kế hoạch thực nghiệm bậc 2 của Box- Behnken đã được sử dụng để tối ưu
hoá các điều kiện phản ứng như: độ pH, nhiệt độ, thời gian phản ứng và nồng độ
E/S. Hàm đầu ra được tác giả lựa chọn là tổng hàm lượng đường khử DRS. Sử dụng
phần mềm Disgn expert 7.0 đã đưa ra được phương trình hồi quy biểu diễn mối
quan hệ giữa các biến khảo sát. Theo kết quả nghiên cứu của công trình này, điều
kiện tối ưu cho hàm hiệu suất có giá trị cao nhất 3,709 mg/ml ở điều kiện nhiệt độ
41◦C, pH 7,1, thời gian 4giờ, tỷ lệ enzym/cơ chất là E/S 0,49. Tuy nhiên công trình
này chưa nghiên cứu cấu trúc và tính chất cũng như hoạt tính của sản phẩm nhận
được [20].
Wenjie Jian và cộng sự (2013) nghiên cứu phản ứng thuỷ phân konjac
glucomannan bằng tia γ kết hợp với enzym β-mannanase. Liều chiếu xạ an toàn cho
phép sử dụng trong thực phẩm là 10kGy. Khi chỉ sử dụng tia gamma thu được sản
phẩm có khối lượng giảm không đáng kể, từ khối lượng phân tử ban đầu là
1,68×106 Da xuống 1,27 × 106 và 1,45 × 106 Da với liều chiếu xạ lần lượt là 10 và
20 kGy. Hiệu quả thủy phân cải thiện rõ rệt khi sử dụng kết hợp enzym β-
mannanase và chiếu xạ. Với liều chiếu 10 kGy nhận được glucomannan có khối
lượng phân tử 6200 Da, với liều chiếu xạ 20 kGy khối lượng phân tử giảm xuống
chỉ còn 2100 Da, DP ~14 [24].
Năm 2016, Cheng-Yu Chen và cộng sự nghiên cứu thủy phân glucomannan
từ β-mannanase sinh ra từ xạ khuẩn Thermobifida fusca BCRC19214. Công trình
27
đã công bố phương pháp nuôi cấy vi khuẩn để lên men vi sinh enzym β-mannanas
và phương pháp tinh chế để nhận được enzym sạch. Sau thời gian 24 giờ ủ với 8
U/ml β-mannanase ở nhiệt độ 50oC, độ trùng hợp (DPw) của glucomannan giảm từ
6435,139 xuống còn 3089. Độ nhớt của sản phẩm (đo bằng máy đo độ nhớt
Brookfield DV-III ở 50oC) giảm nhanh trong khoảng 10 phút đầu ủ với enzym (từ
khoảng 2300 cPs xuống còn khoảng 800cPs, sau 1 giờ độ nhớt giảm xuống còn
khoảng 100 cPs. Sự giảm độ nhớt đồng thời với giảm lượng đường khử cũng đã
được công bố trong báo cáo [23].
Konjac glucomannan cũng được Jianhua Liu và cộng sự thực hiện phản ứng
thủy phân bằng mannanase, quá trình thủy phân được theo dõi bằng sự biến đổi độ
nhớt của sản phẩm thủy phân. Kết quả nghiên cứu cho thấy, điều kiện tối ưu để thực
hiện phản ứng thủy phân glucomannan với xúc tác mannanase là: thời gian 2 giờ;
nhiệt độ 50 ◦C; pH 6.0; và nồng độ enzym 150 U/g. Sản phẩm thủy phân có độ
trùng hợp trung bình (DP) xấp xỉ 5,2 [21].
1.3.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác enzym
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của các enzym đều theo một quy
luật như nhau. Vận tốc xúc tác của enzym chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn
xác định mà ở đó phân tử enzym chưa bị biến tính. Thông thường đối với đa số
enzym thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40oC ÷ 50oC. Trong phạm vi nhiệt
độ thích hợp, khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính của enzym cũng tăng theo. Khi tăng đến
nhiệt độ tới hạn thì hoạt tính xúc tác sẽ giảm và nếu nhiệt độ tiếp tục tăng thì enzym
bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác. Thông thường đối với đa số enzym bị biến tính
hoàn toàn ở nhiệt độ lớn hơn hoặc bằng 70oC. Khi nhiệt độ thấp hơn 0oC thì enzym
giảm hoạt tính xúc tác hoặc không thể hiện hoạt tính xúc tác.
Mỗi loại enzym có nhiệt độ tối thích mà tại đó nó thể hiện hoạt tính xúc tác
cao nhất. Nhiệt độ thích hợp này phụ thuộc vào loại enzym, nguồn thu enzym, pH,
chất bảo vệ.
- Ảnh hưởng của pH
28
pH ảnh hưởng tương tự như nhiệt độ. pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của
enzym và cả cơ chất. Mỗi enzym chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH xác định
gọi là pH tối ưu của enzym, pH thích hợp cho enzym hoạt động là giá trị pH mà tại
đó enzym và cơ chất tích điện trái dấu do đó mà kết hợp với nhau dễ dàng.
Đại đa số enzym thích hợp với pH từ 5 đến 9, nhưng cũng có loại hoạt động
ở pH thấp (3,5) hoặc cao (11). pH thích hợp của mỗi loại enzym còn phụ thuộc vào
nguồn thu enzym, bản chất enzym và có thể thay đổi tùy thuộc vào nhiệt độ, cơ chất.
- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất và enzym
Nồng độ cơ chất, enzym ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzym. Enzym và cơ
chất sẽ kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzym – cơ chất (ES). Phức hợp ES sẽ
lại được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzym (E).
Enzym được giải phóng lại thực hiện những phản ứng mới.
Từ phương trình xác định nồng độ cơ chất và enzym thích hợp để đạt được
vận tốc phản ứng cao nhất.
Khi tăng lượng chế phẩm enzym sử dụng thì phản ứng thủy phân xảy ra
nhanh hơn, đồng thời, lượng sản phẩm tạo thành cũng nhiều hơn. Khi cơ chất còn
thừa, nếu nồng độ enzym tăng thì vận tốc phản ứng tăng. Khi hết cơ chất, nếu tăng
nồng độ enzym vận tốc phản ứng vẫn không tăng. Khi nồng độ cơ chất giảm thì
mức độ tiếp xúc giữa enzym và cơ chất giảm nên phản ứng enzym cũng giảm.
- Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và ức chế
Chất hoạt hóa là chất khi thêm vào phản ứng enzym sẽ làm tăng hoạt tính
xúc tác của enzym hoặc chuyển enzym từ dạng không hoạt động sang dạng hoạt
động. Do vậy khi có mặt chất hoạt hóa vận tốc phản ứng enzym tăng.
Chất ức chế khi có mặt trong các phản ứng enzym sẽ làm giảm hoạt tính
hoặc mất hoạt tính xúc tác của enzym. Các chất kìm hãm hoạt động của enzym
thường là các ion kim loại nặng, các phần tử vô cơ, các chất hữu cơ, cũng có thể là
các protein và cả cơ chất hay chính sản phẩm của phản ứng.
- Ảnh hưởng của thời gian
29
Phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác enzym là phản ứng một chiều. Vì
vậy nếu để thời gian phản ứng càng dài thì phản ứng cắt mạch xảy ra càng triệt để,
sản phẩm có khối lượng phân tử quá nhỏ, gây khó khăn cho việc thu hồi sản phẩm.
Nếu thời gian phản ứng quá ngắn thì sản phẩm thu được có khối lượng phân tử lớn,
không thỏa mãn mục tiêu đặt ra. Vì vậy thời gian là một trong những yếu tố ảnh
hưởng đến phản ứng cần được nghiên cứu bằng thực nghiệm [56],[70]–[73].
1.3.2.5. Phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm xác định điều kiện phản ứng tối ưu.
Phần lớn các nhiệm vụ trong hóa học và công nghệ hóa học là tìm điều kiện
tối ưu của quá trình, thành phần tối ưu của hỗn hợp… Thực nghiệm thụ động
(phương pháp thực nghiệm cổ điển) với sự thay đổi lần lượt của từng yếu tố đòi hỏi
nhiều thời gian, sức lực và vật chất. Ngược lại, thực nghiệm chủ động (phương pháp
quy hoạch thực nghiệm) nhờ sự bố trí tối ưu của các điểm trong không gian yếu tố
và phép biến đổi tuyến tính của tọa độ đã khắc phục được các nhược điểm của
phương pháp thực nghiệm cổ điển. Quy hoạch thực nghiệm cho phép đồng thời thay
đổi tất cả các yếu tố và nhận được những ước lượng của các hiệu ứng tuyến tính,
tương tác, bình phương với sai số thấp. Cuối cùng thì bằng việc áp dụng quy hoạch
thực nghiệm có thể tăng đáng kể hiệu quả của quá trình thực nghiệm.
Box – Behnken đưa ra một loại kế hoạch bậc hai có ý nghĩa thực tiễn cao.
Những kế hoạch này là một phần của kế hoạch thực nghiệm 3k. Ở đây mỗi một biến
thay đổi trên ba mức -1, 0, +1 trong khi các loại kế hoạch bậc hai khác như kế
hoạch trực giao bậc 2 Box – Wilson, kế hoạch chu bản bậc 2 Box – Hunter có các
biến thay đổi trên 5 mức –α, -1, 0, +1, +α.
Số thí nghiệm cần thiết N trong kế hoạch bậc 2 Box – Behnken tùy thuộc vào
số yếu tố k được thể hiện trong bảng 1.3.
Bảng 1.3. Số thí nghiệm của kế hoạch bậc hai Box – Behnken
Số yếu tố k 4 5 7 3
Số thí nghiệm N 27 46 62 15
Số thí nghiệm ở tâm n0 3 6 6 3
30
1.4. Enzym AMPK và vai trò của nó trong hạ đường huyết
1.4.1. Quá trình chuyển hóa glucose trong cơ thể
1.4.1.1. Quá trình hấp thu glucose
Khi lượng thức ăn có chứa carbohydrate vào cơ thể, hệ tiêu hóa thực hiện
một loạt các phản ứng thủy phân tạo glucose đi vào máu theo các quá trình lần lượt
như sau:
Quá trình chuyển hóa polysacarit thành monosacarit: Nguồn chất bột đường
chiếm lượng lớn trong thức ăn hàng ngày và cũng là nguồn cung cấp năng lượng
chính của cơ thể người. Trong cơ thể người có các hệ men tiêu hoá các chất đường
gồm: α-amylase trong nước bọt, dịch tụy, lactase, maltase, sucrase, galactase... được
tiết ở tế bào niêm mạc ruột. Khi ăn chất bột đường, các men tiêu hóa này sẽ thủy
phân chuỗi dài thành chuỗi ngắn hơn, chuỗi ngắn thành disacarit và cuối cùng thành
monosacarit. Quá trình này bắt đầu ở miệng. Amylase bắt đầu thủy phân tinh bột
thành polysacarit ngắn hơn và thành maltose.Thức ăn khi xuống đến dạ dày sẽ được
hòa trộn với dịch vị và các men tiêu hóa protein, khi đó, amylase sẽ bị bất hoạt. Quá
trình tiêu hóa tinh bột sẽ tạm ngưng. Chất xơ lưu lại trong dạ dày sẽ kéo dài thời
gian căng của dạ dày và tạo cảm giác no.
Ruột non là nơi tiêu hóa chủ yếu của chất bột đường. Amylase của tụy sẽ tiếp
tục tiêu hóa chất bột đường thành oligosacarit, rồi thành disacarit. Bước cuối cùng,
tế bào niêm mạc ruột non sẽ tiết ra các men tiêu hóa disacarit thành các monosacarit.
Maltose --(Maltase)--> Glucose + Glucose
Sucrose --(Sucrase)--> Fructose + Glucose
Lactose --(Lactase)--> Galactose + Glucose
Tất cả disacarit đều đóng góp ít nhất một phân tử glucose cho cơ thể.
fructose và galactose cuối cùng cũng được chuyển thành glucose sau khi qua gan.
Tại ruột già, trong vòng 1 đến 4 giờ sau bữa ăn, tất cả đường và hầu hết tinh bột đã
được tiêu hóa. Chỉ còn những mảnh tinh bột nhỏ (chiếm khoảng 10% - 20% tinh bột
trong thức ăn) và chất xơ không tiêu hóa được nằm lại trong hệ tiêu hóa. Những tinh
bột thừa phản ánh hiệu quả tiêu hóa tinh bột của cơ thể và thành phần cacbonhydrat
của thức ăn. Một số các thức ăn thô sẽ khó tiêu hóa hơn (đậu còn nguyên vỏ, chuối
31
chưa chín...). Các cacbonhydrat không được tiêu hóa sẽ làm tăng nhu động ruột
giống chất xơ nhưng khác ở chỗ là nó không làm giảm cholesterol máu [81,82].
Sự hấp thu các monosacarit vào máu: glucose là chất duy nhất có thể hấp thu
với một lượng giới hạn qua niêm mạc miệng nhưng quá trình hấp thu glucose chủ
yếu vẫn xảy ra ở ruột non. Glucose và galactose được vận chuyển tích cực vào tế
bào ruột non.
Polisacarit Disacarit Monosacarit
Sơ đồ 1.4: Quá trình hấp thu glucose trong cơ thể
Chuỗi tinh bột không phân nhánh được tiêu hóa chậm và gây tăng đường
máu nhẹ hơn chuỗi tinh bột phân nhánh vì chuỗi tinh bột phân nhánh có nhiều nơi
enzym có thể cắt hơn, nên dễ tiêu hóa và giải phóng glucose nhanh chóng [81,82].
1.4.1.2. Quá trình chuyển hóa glucose
Glucose được cung cấp từ thực phẩm, qua quá trình tiêu hóa hấp thu vào máu.
Ớ đây, dưới tác dụng của enzym hexokinase nó được chuyển thành một chất trung
e
gian là glucose - 6-phosphat.
hexokinas
Glucose Gluco-6-photphat
Gluco-6-photphat được sử dụng theo nhiều con đường khác nhau, chủ yếu là:
32
- Quá trình tạo ra năng lượng cho hoạt động sống của cơ thể.
- Dự trữ năng lượng dưới dạng glycogen.
- Dự trữ năng lượng dưới dạng mỡ.
a. Quá trình tạo năng lượng
Đây là giai đoạn đầu tiên của quá trình chuyển hóa glucose trong tế bào.
Glucose-6-phosphat được đốt cháy để cung cấp năng lượng được gọi là quá trình
phân huỷ glucose (glycolysis). Theo quá trình này, glucose 6-phosphat được chuyển
thành pyruvat và một lượng nhỏ năng lượng được giải phóng cung cấp cho các hoạt
động của cơ thể.
Trong điều kiện hiếu khí (có oxy tham gia), pyruvat đi vào một loạt các phản
ứng được biết dưới tên gọi là chu trình tricarbocylic axit (TCA) gọi là chu trình
Krebs. Việc đốt cháy glucose qua chu trình này đã cung cấp một lượng lớn năng
lượng và tạo nên các sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O [81],[82].
b. Dự trữ dưới dạng glycogen (tân tạo glycogen)
Glucose 6-phosphat cũng có thể được chuyển đổi thành carbohydrat dự trữ
(glycogen). Quá trình này có liên quan với sự nối kết nhau của nhiều phân tử
glucose qua một quá trình (thuận nghịch) được gọi là tân tạo glycogen.
Glycogen là một kho dự trữ năng lượng bị hạn chế một cách tương đối
(300 – 400 gam trong toàn bộ cơ thể), kho này được lưu trữ chủ yếu trong gan và cơ.
Kho dự trữ này có thể bị phá vỡ và được sử dụng vào các thời điểm thiếu glucose
[81],[82].
Khi glucose máu tăng chuyển hóa theo con đường polyol tạo ra fructose và
sorbitol. Bình thường dưới tác động của enzym hexokinase, glucose máu được
chuyển thành glucose- 6-phosphat sau đó thành fructose-6-phosphat. Ở người bình
thường chuyển hóa theo con đường polyol chỉ đóng vai trò thứ yếu nhưng ngược lại
ở những người mắc bệnh đái tháo đường (do tăng glucose máu liên tục) chuyển hóa
theo con đường này lại tăng lên rõ rệt. Dưới tác dụng của các enzym aldoceto-
reductase, đặc biệt là aldoreductase khử glucose thành sorbitol và chuyển thành
fructose dưới tác dụng của enzym sorbitol deshydrogengenase. Việc tăng glucose
máu kéo dài đã gây tình trạng ngộ độc tế bào do đường được chuyển hóa theo con
đường polyol tạo sorbitol.
33
Ở điều kiện bệnh lý, người mắc bệnh đái tháo đường, do tăng quá trình
chuyển hóa theo con đường polyol gây tích tụ một lượng lớn sorbitol. Do sorbitol
không dễ dàng đi qua màng tế bào, gây hậu quả xấu lên tế bào, đó là: tăng áp lực
thẩm thấu trong các tế bào; biến đổi hệ thống coenzym oxy hoá khử về tỉ lệ
NAD/NADH và NADPH/NADP làm giảm nồng độ glutathion, axit ascorbic,
vitamin E là những chất chống lại các gốc tự do gây độc với các tế bào; tăng quá
trình chuyển hóa myoinositol dẫn đến giảm lượng myoinositol. Myoinositol có
trong lớp phospholipit tại màng tế bào giúp điều hoà hoạt động của Na+, K+ ATPase
thông qua vai trò của proteinkinase. Giảm myoinositol sẽ gây rối loạn tính thấm của
màng tế bào. Quá trình chuyển hóa glucose trong cơ thể có thể được tóm tắt theo sơ
đồ 1.5.
Như vậy, để hạ glucose máu sẽ có hai con đường chính: ức chế giảm hấp thu
glucose (giảm nguồn cung), hoặc tăng quá trình chuyển hóa, sử dụng glucose ở các
Thức ăn
Tạo năng lượng
Sinh đường
Tạo glycogen
Tạo lipid, protid
Hủy glycogen
Thải qua thận
quá trình trên [81],[82].
CUNG
TIÊU
GLUCOSE MÁU
Sơ đồ 1.5. Cân bằng glucose máu trong cơ thể
1.4.2. Khái quát về enzym Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein kinase (AMPK)
AMPK thuộc họ enzym quan trọng liên quan đến việc chuyển hóa các chất.
Đây là một threonine kinase hoạt hóa bởi một số kinase thượng nguồn. AMPK là
phức hợp protein dị hợp tử được điều chỉnh bởi Adenosine monophotphat (AMP),
Adenosine diphotphat (ADP) và Adenosine triphotphat (ATP). AMPK có ở khắp
mọi nơi trong các mô khác nhau của hệ thống sống như tim, thận, gan, não và các
cơ xương. Do đó sự cố của AMPK sẽ là nguy cơ dẫn đến nhiều bệnh lý của con
34
người đặc biệt là các bệnh liên quan đến rối loạn chức năng chuyển hóa và ty thể.
Các chất hoạt hóa AMPK bao gồm dẫn xuất tổng hợp và một số sản phẩm tự nhiên
đã được tìm thấy có tiềm năng trong điều trị bệnh tiểu đường và các biến chứng tiểu
đường. Tác động chính của AMPK là điều hòa đảm bảo hoạt động của ty lạp thể và
năng lượng cho cân bằng nội môi. Các nghiên cứu kết cấu về AMP và AICAR (5-
Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide) cho thấy rằng các hợp chất có khả
năng kích thích AMPK đều có nhóm amino tự do[83–87]
Adenosine triphotphat (ATP) Adenosine monophotphat (AMP)
Hình 1.4. Cấu trúc phân tử ATP và AMP
Sơ đồ 1.6. Phản ứng chuyển hóa từ ATP tạo AMP
35
Enzym AMPK khu trú ở cơ xương, mô mỡ, gan và các cơ quan khác có thể
làm tăng tỉ lệ AMP/ATP. Khi hoạt hóa AMPK kích thích quá trình sinh ra năng
lượng như tăng quá trình photphoryl hóa, tăng tạo glycogen và tăng tạo lipit từ
cacbohydrat và oxy hóa axit béo và giảm các quá trình tiêu hao năng lượng như
protein và lipit tổng hợp. Nhiều nghiên cứu cho thấy hoạt hóa AMPK giúp cải thiện
tình trạng trao đổi chất, các rối loạn chuyển hóa của động vật gặm nhấm[83–87].
Protein kinase hoạt hóa AMP (AMPK) được hoạt hóa bởi các stress làm tăng
nồng độ AMP so với ATP (ví dụ như thiếu hụt glucose hoặc thiếu oxy huyết) hoặc
tăng các quá trình tiêu hao năng lượng (ví dụ co bóp cơ). Khi điều này xảy ra,
AMPK sẽ kích thích các quá trình có khả năng làm tăng nồng độ ATP như quá trình
oxy hóa axit béo và vận chuyển glucose, và làm giảm các chất khác tiêu thụ ATP,
như sự tổng hợp lipit và protein. Ngoài ra, nó có thể kích thích sự phân hủy đường
trong cơ tim. Bằng chứng gần đây cho thấy rằng AMPK có thể có nhiều tác động
đến các quá trình trao đổi chất của cơ thể. Nó tham gia vào việc điều chỉnh đa dạng
như sinh học ty thể, sự tạo mạch, phân cực của tế bào và sự kiểm soát năng lượng
của tế bào. Ngoài ra, hoạt hóa AMPK trong các mô ngoại vi có thể giảm các bất
thường tế bào của hội chứng chuyển hóa bao gồm kháng insulin, viêm và sự lắng
đọng lipit. Ngược lại, sự rối loạn của AMPK (giảm hoạt động, hoạt động quá kích
hoăc khiếm khuyết) có thể làm gia tăng bất thường này [52].
AMPK là một enzym dị phân cấu tạo từ một tiểu đơn vị xúc tác và điều hòa
gồm 3 loại đồng phân chính là α và β và γ. Các đơn vị α và β tồn tại trong hai đồng
dạng (α1; α2 và β1; β2).
1.4.3. Các phương pháp hoạt hóa AMPK
1.4.3.1. Hoạt hóa AMPK bằng vận động
Hoạt hóa AMPK xảy ra trong cơ xương khi vận động để đáp ứng với sự gắn
kết mạnh mẽ của AMP và giảm liên kết ATP với tiểu đơn vị γ. Tập thể dục có thể
gia tăng năng lượng cơ bắp lớn (> 100 lần) và làm thay đổi trạng thái nucleotit. Mặc
dù ADP là sản phẩm trực tiếp của sự thủy phân ATP trong quá trình co cơ, nó
nhanh chóng chuyển thành AMP thông qua phản ứng adenylat kinase. Điều này dẫn
đến sự gia tăng nồng độ AMP trong huyết thanh phụ thuộc vào cường độ và thời
gian của bài tập. Ngược lại, nồng độ ATP thay đổi rất ít trong thời gian tập thể dục,
trừ khi tập với các bài tập chuyên biệt. AMP hoạt hóa AMPK và ATP gây trở ngại
36
cho hiệu ứng này. Do đó, tỷ số giữa AMP và ATP có tầm quan trọng đối với hoạt
hóa AMPK. AMP có thể kích thích AMPK, nhưng dường như điều này chỉ có tác
động hoạt hóa vừa phải (<10 lần). Quan trọng hơn, sự ràng buộc AMP dẫn đến tăng
phosphoryl AMPK ở Thr 172 của tiểu đơn vị α, có thể làm tăng hoạt động của
AMPK hơn 100 lần. Tầm quan trọng của việc tăng tỷ lệ AMP / ATP trong việc
phosphoryl AMPK trong quá trình tập thể dục được nhấn mạnh bởi thực tế là nó bị
suy giảm ở chuột thiếu adenylate kinase, trong đó sự sản sinh AMP giảm trong các
cơn co cơ [87-89].
Các cơ chế mà theo đó AMP hoạt hóa AMPK gần đây đã được nghiên cứu.
Khi AMP gắn với tiểu đơn vị γ của AMPK, có khả năng hoạt hóa AMPK.
Các cơ chế được mô tả ở trên để hoạt hóa AMPK trong cơ, quá trình tập thể
dục liên quan trực tiếp đến sự gia tăng nồng độ canxi sarcoplasmic và các rối loạn
chuyển hóa xảy ra sau đó (ví dụ: tăng AMP / ATP. AMPK được hoạt hóa phụ thuộc
vào cường độ tập luyện, các nghiên cứu cho thấy rằng, AMPK được kích thích
mạnh khi tập aerobic với công suất 60%.
Những phát hiện gần đây ở người cho thấy các phức hợp AMPK khác nhau
được hoạt hóa rất khác nhau trong quá trình tập thể dục. Trong cơ thể con người chỉ
có 3 phức hợp AMPK được biểu hiện: α1β2γ1, α2β2γ1 và α2β2γ3 và trong thời
gian tập thể dục cường độ lên đến 20 phút, chỉ có hoạt tính α2β2γ3. Chỉ sau khi tập
luyện cường độ vừa phải từ 60 phút trở lên thì hoạt động của phức hợp α2β2γ1 tăng
lên. Điều thú vị là tăng hoạt động của α2β2γ3 tương quan tốt với tăng phosphoryl
hóa ACCβ cho thấy rằng phức hợp này đóng một vai trò quan trọng trong việc điều
hòa quá trình oxy hóa axit béo. Ngược lại, sự gia tăng của hoạt động của phức hợp
α2β2γ1 đã cho thấy tương quan với sự phosphoryl hóa protein AS160. Nhìn chung,
những phát hiện này cho thấy trong quá trình tập thể dục các phức hợp khác nhau
trong cơ hoạt động rất khác nhau phụ thuộc vào cường độ và thời gian luyện tập.
Ngoài cường độ tập thể dục, cường độ hoạt hóa AMPK trong khi tập thể dục
cũng phụ thuộc vào hàm lượng glycogen trong cơ. Khi glycogen ở cơ thấp, hoạt
động của AMPK tăng lên khi nghỉ ngơi và tăng lên đáng kể trong thời gian vận
động hơn so với khi nồng độ glycogen cao. Sự phụ thuộc vào hàm lượng glycogen
cũng rõ ràng khi AMPK được hoạt hóa bởi AICAR. AMPK có liên kết với
glycogen trên tiểu đơn vị β, vì vậy glycogen - trực tiếp hoặc gián tiếp - ức chế hoạt
động AMPK [87-90]
37
1.4.3.2. Kích hoạt AMPK bằng hoạt chất.
Aicar[96]
AICAR có cấu tạo là 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside,
còn được gọi là Acadesine. Bột Aicar là chất kích hoạt protein kinase hoạt hóa
AMP (AMPK) có thể thấm qua màng tế bào. AMPK là một protein quan trọng
trong điều hòa trao đổi chất. Khi nguồn cung cấp năng lượng không đủ, tỷ lệ AMP /
ATP tăng lên, AMPK sẽ được kích hoạt và ức chế quá trình đồng hóa. AICAR có
thể kích hoạt AMPK mà không ảnh hưởng đến mức ATP, ADP và AMP. Ở cấp độ
tế bào hoặc động vật, AICAR thúc đẩy lượng glucose không phụ thuộc insulin vào
cơ xương bằng cách kích hoạt AMPK. AICAR gây ra sự hấp thu glucose trong cơ
xương không thể bị chặn bởi các chất ức chế PI3K. Aicar kích thích sự hấp thu
glucose, tăng hoạt động của protein kinase α và hoạt hóa của mitogen p38 trong cơ
xương và ức chế apoptosis bằng cách giảm sản xuất các hợp chất oxy phản ứng nội
bào
Aicar có thể chuyển đổi thành ZMP (tương tự AMP không phân hủy). Do đó
có thể hoạt hóa AMPK tương tự như AMP [96].
Mefomin [90]
Sơ đồ 1.7. Tác dụng của meformin trong điều trị tiểu đường
38
Metformin là một dẫn xuất tổng hợp của guanide đã được sử dụng như một loại
thuốc trị đái tháo đường. Cơ chế tác dụng của metformin đến nay vẫn chưa sáng tỏ
hoàn toàn, có thể thông qua ba cơ chế: Giảm sản xuất glucose ở gan (ức chế quá
trình tân tạo glucose và quá trình chuyển glycogen thành glucose, tăng tổng hợp
glycogen nội bào, tăng độ nhạy cảm với tác động của insulin tại gan); tăng độ nhạy
cảm với insulin của cơ (thúc đẩy sự hấp thu và sử dụng glucose ở ngoại vi); làm
chậm hấp thu glucose ở ruột. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng tác dụng của
metformin được giải thích là do sự hoạt hóa adenosin monophosphat kinase hoạt
hóa (AMPK) trong gan và cơ. Kết quả gần đây của Fullerton và cộng sự cũng đã chỉ
ra rằng phosphoryl hóa carboxylase của acetyl-CoA bằng AMPK là cần thiết cho
tác dụng hạ lipit và tác dụng nhạy cảm insulin của metformin [90].
Thiazolidinedion [91]
Thiazolidinedion (TZD), còn được gọi là glitazon, là một loại thuốc kích
thích insulin bao gồm troglitazon, pioglitazon và rosiglitazon. TZD hoạt động chủ
yếu bằng cách hoạt hóa các thụ thể hoạt hóa của kích thích tố peroxisom proliferator
(PPAR), đặc biệt là PPARγ, mà ái lực của chúng là cao nhất. Chúng cũng được biết
là có tác dụng trị đái tháo đường một phần thông qua hoạt hóa AMPK. TZD hoạt
hóa nhanh AMPK trong nhiều mô khác nhau bao gồm cơ xương, gan và mô mỡ.
Các cơ chế có liên quan đến sự tích tụ AMP như là kết quả của việc ức chế
phức tạp chuỗi hô hấp ty thể. Ngoài ra, điều trị TZD gây ra sự biểu hiện và giải
phóng adiponectin từ tế bào mỡ, lần lượt hoạt hóa AMPK trong cơ xương và gan,
tăng quá trình tiêu thụ glucose và quá trình oxy hóa axit béo, và giảm sản xuất
glucose ở gan. Do đó, AMPK có thể được hoạt hóa bởi TZD thông qua ít nhất hai
cơ chế khác nhau.
Polyphenol
Ngoài các tác nhân dược phẩm, nhiều hợp chất tự nhiên đã được chứng minh
có thể hoạt hóa AMPK.Trong số đó có polyphenol, một lớp cấu trúc của các sản
phẩm tự nhiên hoặc tổng hợp được đặc trưng bởi sự có mặt của các bội số của các
đơn vị cấu trúc phenol. Mặc dù có sự khác nhau về cấu trúc, nhiều polyphenol có
khả năng hoạt hóa AMPK, và chúng tạo ra các tác dụng có lợi trên bệnh tiểu đường
39
tuyp 2 và hội chứng chuyển hóa. Chúng bao gồm resveratrol (3,5,4′-trihydroxy-
trans-stilbene) từ nho đỏ, quercetin từ nhiều đơn vị thực vật bao gồm trái cây, rau
và ngũ cốc, genistein được tìm thấy trong một số cây như đậu nành,
epigallocatechin gallate từ trà xanh và curcumim từ củ nghệ. Các cơ chế hoạt hóa
AMPK bởi các hợp chất này là ức chế sản xuất ATP ti thể làm tăng tỷ lệ AMP/ATP.
Cơ chế phân tử hoạt hóa AMPK bởi resveratrol, berberine và quercetin đã được hỗ
trợ thêm bởi quan sát thấy rằng các hợp chất này không hoạt hóa AMPK trong các
tế bào biểu thị AMP5γ2 tiểu đơn vị AMP5γ2 không nhạy cảm AMP.
Ginsenosid
Nhân sâm Panax từ lâu đã được biết là có tác dụng thuận lợi trong bệnh tiểu
đường loại 2 và hội chứng chuyển hóa. Ginsenosid, một loại tetracyclic triterpene
glycosid, là thành phần dược lý chính trong nhân sâm. Cho đến nay, hơn 80 loại
ginsenosid cấu trúc khác nhau đã được phân lập từ các giống cây trồng nhân sâm.
Trong đó có một số ginsenosid có thể hoạt hóa AMPK, dẫn đến tăng sự hấp thu
glucose, giảm triglycerid và cholesterol trong gan, và sự ức chế lipogenesis và sản
xuất glucose của gan. Các cơ chế hoạt hóa AMPK bởi ginsenosid phần lớn là không
rõ; tuy nhiên, có lẽ các hợp chất này có khả năng hoạt hóa AMPK thông qua các cơ
chế phụ thuộc AMP bởi vì ginsenosid, Rb1 có khả năng làm tăng tỷ lệ AMP/ATP
nội bào
Konjac glucomannan đã được chứng minh có khả năng hạ glucose máu hỗ
trợ điều trị bệnh đái tháo đường bằng cách tăng khả năng dung nạp glucose của tế
bào [50]. Tuy nhiên, cơ chế của việc hạ glucose máu của hợp chất này chưa được
công bố. Để xác định cơ chế của việc hạ glucose máu của konjac glucomannan và
glucomannan thủy phân cần nghiên cứu nhiều yếu tố tác động, trong đó có việc hoạt
hóa enzym AMPK.
1.5. Tính hình nghiên cứu glucomannan từ cây nưa A.konjac tại Việt Nam
Cây nưa A.konjac mới được phát hiện tại Việt Nam vào năm 2012 bởi TS.
Nguyễn Văn Dư - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học và
Công nghệ Việt Nam. Những nghiên cứu về glucomannan từ cây nưa A.konjac chưa
có nhiều.
40
Năm 2012, Nguyễn Tiến An đã nghiên cứu phương pháp tách và đặc điểm
glucomannan từ 4 loài nưa: Nưa đầu nhăn (Amophophalus congrugatus), nưa trạm
trổ (Amorphophallus scaber), nưa chuông (Amorphophallus paeoniifolius) và nưa
thái (Amorphophallus panomemsis). Kết quả nghiên cứu cho thấy mỗi loài nưa có
hàm lượng glucomannan khác nhau và đặc biệt cấu trúc và tính chất glucomannan ở
mỗi loài cũng khác nhau. Nưa đầu nhăn Amophophalus congrugatus có hàm lượng
glucomannan đạt 15% , tan trong nước tạo dung dịch có độ nhớt cao. Nưa Thái
Amorphophallus panomemsis, nưa chuông Amorphophallus paeoniifolius có hàm
lượng 4%, không tan trong nước. Cũng trong nghiên cứu này, tác giả đã tổng hợp
được 2 dẫn xuất của glucomannan là O-metyl glucomannan và dẫn xuất O-
cacboxymetyl glucomannan từ glucomannan tách được từ cây nưa chuông
Amorphophallus paeoniifolius [92].
Năm 2013, TS. Trần Thị Ý Nhi và cộng sự đã thu và xác định hàm lượng và
đặc điểm cấu trúc, tính chất của glucomannan từ cây nưa A.konjac mọc tự nhiên tại
Hà Giang. Theo kết quả nghiên cứu này, cây nưa A.konjac có hàm lượng
glucomannan khá cao, chiếm 50% trọng lượng khô. Điều này có ý nghĩa cho việc
phát triển cây nưa A.konjac tại Việt Nam [58].
Trần Thị Ý Nhi và cộng sự cũng đã bước đầu nghiên cứu khả năng hạ
glucose huyết của glucomannan trên chuột nhắt trắng. Kết quả nghiên cứu cho thấy
glucomannan từ cây A.konjac với liều 6g/kg cân nặng, tại thời điểm sau khi uống
glucose 60 phút, có tỷ lệ tăng glucose huyết thấp hơn rõ rệt so với lô chứng. Tuy
nhiên cơ chế của việc hạ glucose huyết của glucomannan chưa được làm rõ.
TS.Lê Ngọc Hùng và cộng sự đã di thực cây nưa A.konjac từ Hà Giang và
trồng thử nghiệm thành công tại Đà Lạt, Lâm Đồng. Cũng trong nghiên cứu này, tác
giả đã xây dựng được quy trình chế biến bột glucomannan tạo ra các thành phẩm
bột nưa tinh chế và bột nưa loại gôm. Kết quả nghiên cứu đóng góp không nhỏ
trong việc trồng Nưa và chế biến bột nưa trên địa bàn các tỉnh Tây Nguyên đem lại
hiệu quả kinh tế cho đồng bào các dân tộc [93].
Như vậy, từ các tài liệu đã công bố cho thấy:
41
- Việc nghiên cứu tách chiết glucomannan từ cây nưa A.konjac tại Việt Nam
đã được nghiên cứu. Tuy nhiên nghiên cứu mới tập trung phân tích glucomannan từ
cây nưa A.konjac trong tự nhiên và di thực, nhân giống trồng trọt mà chưa có
nghiên cứu đầy đủ về tách chiết và nghiên cứu cấu trúc và tính chất của
glucomannan từ cây nưa A.konjac đã di thực và trồng thử tại Tây Nguyên.
- Việc biến tính glucomannan đã có nhiều công bố khá phong phú trên thế
giới, tuy nhiên chưa có công trình nào đề cập đến việc thủy phân glucomannan từ
cây nưa Konjac tại Việt Nam. Và đặc biệt là việc đánh giá khả năng hạ đường huyết
của glucomannan từ cây nưa A.konjac cũng như tìm hiểu cơ chế của việc hạ đường
huyết thông qua hoạt hóa emzym AMPK glucomannan thủy phân chưa được nghiên
cứu.
42
Chương 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu.
2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất
Konjac K.Koch di thực từ tỉnh Hà Giang được trồng tại tỉnh Lâm Đồng trong 3
Nguyên liệu được dùng cho nghiên cứu là củ Nưa (thân củ) Amorphophallus
năm. Củ dùng cho nghiên cứu được thu vào tháng 10 năm 2016, đây là thời điểm củ
của loài Nưa có hàm lượng glucomannan cao nhất. Mẫu được giám định tên khoa
học bởi TS Nguyễn Văn Dư, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, tiêu bản được
lưu giữ tại nhà lưới lưu mẫu ở tỉnh Đắc Nông của Trung tâm phát triển công nghệ
cao - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Vi khuẩn Bacillus substilis và Bacillus lichenifomis
Trong nghiên cứu này đã sử dụng khuẩn lạc của 2 chủng Bacillus substilis và
Bacillus lichenifomis được cung cấp bởi phòng thí nghiệm nuôi giữ chủng vi sinh
vật gốc để sản xuất chế phẩm sinh học AT- BiO của Công ty TNHH Sản xuất &
Dịch vụ An Thái. Cả 2 chủng này đều là những vi khuẩn có lợi, an toàn sinh học và
nguồn gốc xuất xứ rõ ràng và có bản giải trình tự gen của chủng gốc kèm theo phụ
lục của luận án này. Các vi sinh vật hữu ích được mua chủng gốc từ Công ty cổ
phần Công nghệ vi sinh và Môi trường. Hồ sơ chủng gốc đã ghi rõ về hoạt tính của
2 chủng vi khuẩn, cụ thể như sau:
+ Chủng Bacillus subtilis (TB2): Có hoạt tính sản sinh ra enzym thuỷ phân
tinh bột, xenlulose, protein, lipit thành đường và các axit amin, tạo ra kháng sinh ức
chế vi khuẩn gây bệnh.
+ Chủng Bacillus licheniformis (TB3): Có hoạt tính sản sinh ra enzym thuỷ
phân tinh bột, xenlulose, protein, lipit thành đường và các acid amin, ức chế vi
khuẩn gây bệnh trong tự nhiên.
- Enzym endo-1,4 β-Mannanase (Bacillus sp.) EC 3.2.1.78Cazy Family:
GH26CAS: 37288-54-3 của công ty Megazyme.
43
- Tế bào C2C12 (tế bào cơ vân nguyên phát của chuột nhắt, CRL-1772) được
cung cấp bởi hệ thống chủng chuẩn của Mỹ (American Type Culture Collection –
ATCC) được lưu giữ trong nitơ lỏng.
- Môi trường nuôi cấy tế bào Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)
huyết thanh ngựa (HS) huyết thanh thai bò (FBS) của hãng Invitrogen-Đức.
- Các kháng thể: anti-rabbit IgG HRP-linked antibody, anti-mouse IgG HRP-
linked antibody kháng thể kháng AMPK-Thr172, kháng thể kháng AMPK tổng của
hãng Cell Signaling Technologies (USA) kháng thể kháng -Actin của hãng Santa
Cruz Biotechnology (USA).
- Metanol, etanol, n-hexan, HCl, CH3COOH, KI, NaOH, KOH, NaHCO3,
KNaC4H4O6.4H2O, 3,5-dinitro salicylic ... là hóa chất tinh khiết của hãng Merck.
Một số loại hóa chất khác là hóa chất tinh khiết phân tích của Trung Quốc, sử dụng
ngay không qua tinh chế.
- Động vật: chuột nhắt trắng, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng từ 20-
30g, do học viện Quân y cung cấp. Động vật thí nghiệm sau khi mua về được nuôi 5
ngày trước khi thí nghiệm, được ăn viên thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Hà
Nội cung cấp, uống nước tự do. Hàng ngày chuột được nuôi bằng thức ăn tổng hợp.
Chế độ quang kỳ 12 giờ sáng: 12 giờ tối.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ được sử dụng trong quá trình nghiên cứu gồm: cân phân tích, nhiệt
Màng nitrocellulose, cốc thủy tinh, bình tam giác và các dụng cụ khác.
kế, dụng cụ chứa tế bào (chai nuôi cấy đĩa petri đĩa 6 giếng đĩa 96 giếng…),
- Các thiết bị phân tích chính được sử dụng trong quá trình nghiên cứu gồm:
+Tủ ấm lắc, bể ổn nhiệt, máy đo pH, tủ sấy, máy khuấy từ có gia nhiệt, máy
ngược, nồi hấp khử trùng, máy điện di và chuyển màng bio-rad.
ly tâm, tủ mát, tủ lạnh (4oC và -20oC), dụng cụ đếm tế bào, kính hiển vi soi
+ Phổ hồng ngoại: được ghi trên quang phổ kế hồng ngoại biến đổi Fouriern
FTIR IMPACT trong vùng 400 - 4000 cm-1 tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa
44
học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu được sấy khô trong tủ sấy chân không ở 60oC và
ép viên với KBr.
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: được ghi trên máy Bruker ADVANCE-
500MHz ở nhiệt độ 80oC trong dung môi D2O – 1%CF3COOD tại Phòng Cộng
hưởng từ hạt nhân - Viện Hoá Học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam;
+ Máy ly tâm Anke TGL-16G, tốc độ 16.000 vòng/phút, Trung Quốc
+ Thiết bị đông khô ALPHA 1-4LD - Đức, Phòng Polyme Thiên nhiên, Viện
Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
+ Máy đo độ nhớt KU3 Brookfield, Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.
+ Giản đồ nhiễu xạ tia X: được ghi trên máy nhiễu xạ Rơnghen SIEM NS
D5000 tại Viện Khoa học Vật liệu – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, với điều kiện đo: ống đồng: CuKα (α=0,15406nm), U=35KV, I = 35 mA, góc
quét (ω-2θ) từ 5o50o;
+ Giản đồ phân tích nhiệt (ThermoGravimetric Analysis - TGA và
Differential Scanning Calorimetry - DSC): được ghi trên máy Hãng Setaram
(Pháp), Labsys Evo S60/58988 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học và Công
nghệ Việt Nam. Các mẫu đều được tiến hành phân tích trong môi trường khí quyển
nitơ, tốc độ gia nhiệt 10oC/phút từ nhiệt độ phòng đến 700oC.
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Tách, tinh chế và xác định cấu trúc, tính chất của glucomannan từ cây
A.konjac
2.2.1.1. Tách glucomannan từ cây A.konjac K.Koch
- Xác định hàm lượng nước trong củ Nưa A.konjac:
Củ Nưa được rửa sạch đất cát, gọt sạch vỏ. Cân một lượng củ nưa (mtươi),
thái lát dày khoảng 2÷3 mm, sấy ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút, sau đó sấy khô ở
nhiệt độ 50÷60oC đến khối lượng không đổi và xác định khối lượng sau khi sấy khô
(mkhô). Hàm lượng nước trong củ nưa được xác định theo công thức:
45
×
(2.1)
mtươi−m
ô
mtươi
% H2O =
100%
- Quy trình tách glucomannan theo phương pháp cải tiến hai giai đoạn được
thực hiện theo sơ đồ 2.1.
Rửa sạch, bỏ vỏ
Thái lát
Củ Amophophalus Konjac tươi
Nhúng vào dd NaHSO3 0,25‰
Bổ sung etanol tỉ lệ etanol/H2O 1/1,5
Xay nghiền trong 20 phút
Lát Amophophalus Konjac tươi
Ly tâm, thu tủa
Hỗn dich bột glucomannan trong etanol
Sấy khô, nghiền, sàng lọc
Thổi, tách
Bột KGM ướt
Thêm etanol 40%, 65oC
Khuấy đều, ly tâm thu tủa
Bột KGM khô
Bột KGM tinh chế
Sơ đồ 2.1. Quy trình tách glucomannan từ củ A.konjac
Quá trình tách glucomannan được thực hiện như sau:
46
Bước 1: Củ nưa Konjac được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, thái lát nhỏ, nhúng
vào dung dịch NaHSO3 0,25 ‰.
Bước 2: Thêm dung dịch etanol/nước tỷ lệ 1:1,5 với tỷ lệ củ/dung môi là 1:2.
Thời gian xay nghiền 20 phút.
Bước 3: Ly tâm thu tủa (dạng sệt).
Bước 4: Sấy khô hỗn hợp sản phẩm thu được bột konjac glucomannan
(KGM).
Bước 5: Tinh chế sản phẩm bằng cách hòa tan bột KGM vào dung dịch
etanol 40% gia nhiệt, khuấy đều, ly tâm thu tủa, bỏ phần dịch lọc. Lặp lại quá trình
3 lần thu được KGM tinh chế [59].
2.2.1.2. Xác định hàm lượng glucomannan trong bột konjac glucomannan
Hàm lượng glucomannan trong bột Konjac glucomannan được xác định bằng
phương pháp 3,5-đinitrosalicylic axit (DNS).
Nguyên tắc của phương pháp: Khi đun sôi hỗn hợp glucomannan và 3,5-
đinitro salicylic axit, glucomannan sẽ bị thủy phân tạo thành D-mannose và D-
glucose và bị khử thành hợp chất amino có màu nâu đỏ (màu đỏ cam). Hàm lượng
glucomannan có trong mẫu sẽ được xác định thông qua tương quan giữa cường độ
màu đo được bằng phương pháp quang phổ kế.
a. Chuẩn bị dung dịch thuốc thử :
- Dung dịch A: hòa tan 6,9g phenol (1,07 g/cm3) trong 15,2 ml NaOH (10%),
nâng thể tích lên thành 69 ml. Thêm 69 ml NaHSO3 vào dung dịch.
- Dung dịch B: cho vào 300 ml NaOH (10%) 225 g Kali Natri tactrat (KNaC4H4O6.4H2O). Sau đó cho hỗn hợp dung dịch vào 880 ml 3,5-đinitro salicylic axit 1% (w/w).
47
Trộn dung dịch A và B, giữ mẫu trong bình màu nâu ở nhiệt độ thường để sử
dụng trong 7÷10 ngày.
- Pha các dung dịch: axit sulfuric (30 mol/l), NaOH (60 mol/l)
- Dung dịch đệm axit focmic-NaOH (0,1 mol/l): nhỏ 1 ml axit focmic vào bình tam giác 250 ml, thêm tiếp 60 ml nước cất. Cân 0,25g NaOH đã hòa tan vào bình tam giác và pha loãng dung dịch lên thành 250ml.
- Dung dịch chuẩn glucose (1,0 mg/ml): cân chính xác 0,1 g glucose tinh
khiết bằng cân phân tích và hòa tan trong 100 ml nước cất.
b. Xác định hàm lượng glucomannan
- Xây dựng đường chuẩn glucose: lần lượt lấy 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2 ml dung
dịch glucose chuẩn và 2 ml nước cất vào 6 bình tam giác 25 ml. Thêm 1,5ml 3,5-
đinitrossalicylic axit vào dung dịch trên, khuấy và đun cách thủy dung dịch trong 5
phút trước khi làm lạnh. Thêm nước cất đến một thể tích nhất định và lắc dung dịch
đến đồng nhất. Xác định độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm, sử dụng nước cất làm
mẫu trắng. Ghi lại cường độ hấp thụ của dung dịch glucose tại các nồng độ khác
nhau. Vẽ đường cong tiêu chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ glucose (trục
X) vào cường độ hấp phụ (trục Y) hoặc thiết lập phương trình hồi quy với độ hấp
thụ Y và nồng độ glucose X.
- Chiết glucomannan: cân một lượng chính xác khoảng 0,1900÷0,20000g bột
KGM vào bình chứa sẵn 50 ml dung dịch đệm axit focmic-NaOH, khuấy đều. Để
dung dịch khuấy-trương ở nhiệt độ phòng qua đêm. Thêm dung dịch đệm fomiat
đến thể tích 100ml. Khuấy dung dịch đến đồng nhất và ly tâm ở nhiệt độ 4000
vòng/phút trong 20 phút. Phần nổi lên trên là dịch chiết glucomannan.
- Thủy phân konjac glucomannan: lấy 5ml dịch chiết glucomannan cho vào
bình tam giác 25ml, thêm chính xác 2,5ml sulfuaric axit (3mol/lit) vào dung dịch,
khuấy mạnh sau đó đun cách thủy trong 1,5 giờ, thêm 2,5 ml NaOH (6mol/lit),
khuấy đều thu được dịch glucomannan thủy phân.
- Xác định hàm lượng glucomannan: lấy 2 bình tam giác 25ml, cho vào mỗi
bình 1,5ml 3,5-đinitro salicylic axit. Bình 1 thêm 2ml dịch chiết glucomannan; bình
2 thêm 2ml dịch glucomannan thủy phân. Đun cách thủy cả 2 bình trong 5 phút, để
nguội, thêm nước cất đến thể tích 25ml. Đo màu bằng máy quang phổ kế tại bước
48
sóng 550 nm với mẫu trắng là nước cất và đặt về 0. Hàm lượng glucose tương ứng
với cường độ màu có thể tính toán được dựa trên đường chuẩn hoặc được tính toán
5000
5( T
To
)
G
(%)
m
theo phương trình hồi quy sau:
(2.2)
Trong đó:
G% là hàm lượng glucomannan trong mẫu khô
ε là tỷ lệ giữa khối lượng phân tử của glucose và manose chưa thủy phân và
khối lượng phân tử của glucose và manose của gluocomanan thủy phân ε0,9
T là nồng độ (mg/ml) glucose trong mẫu glucomannan thủy phân
To là nồng độ (mg/ml) glucose trong dịch chiết glucomannan
m là khối lượng mẫu ban đầu.
2.2.1.3. Xác định cấu trúc và đặc trưng của glucomannan
Đặc trưng cấu trúc, tính chất của glucomannan tinh chế được xác định thông
qua các phương pháp phổ: IR, NMR, TGA và X-Ray.
- Xác định tỷ lệ mắt xích mannose/glucose:
Tỷ lệ đơn vị cấu trúc manose/glucose được xác định dựa vào giá trị tích
Man
R
phân trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR, theo công thức sau:
Man/Glu
I H1 I
H1
Glu
(2.3)
Trong đó: RMan/Glu là tỷ lệ glucose/mannose
IH1-Glu là giá trị tích phân proton H1 của glucose.
IH1 -Man là giá trị tích phân proton H1 của mannose.
- Xác định độ axetyl hóa
Độ axetyl hóa DA được xác định dựa vào giá trị tích phân trên phổ cộng
hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR, theo công thức sau:
49
CH
3
DA
%100
3
1
I H I
(2.4)
Trong đó: ICH3 là giá trị tích phân của proton của nhóm CH3
IH1 là giá trị tích phân của proton liên kết với C1.
- Xác định độ hòa tan:
Tính tan của KGM được tính toán như tài liệu [34], cụ thể: Phân tán 0,1 gam
sản phẩm trong 24,90 g đá bào trong bồn nước đá, khuấy trong 1 giờ (toàn bộ đá
bào tan hết). Sau đó ly tâm dung dịch 4000 vòng/phút trong 20 phút. Lấy 10 gam
dung dịch phía trên, sấy khô ở 105oC đến khối lượng không đổi nhận được m gam.
5,2
m
S
(%)
100
W
Độ tan (S) của LKGM được tính theo công thức:
(2.5)
Trong đó: S là độ tan (%); m là khối lượng chất tan nhận được sau khi sấy
khô 10 gam dung dịch ở nhiệt độ 105oC, W là tổng khối lượng mẫu. Thí nghiệm
được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình.
- Xác định hàm lượng tro tổng số và hàm lượng một số kim loại nặng:
+ Xác định hàm lượng tro: Rửa sạch cốc nung bằng nước, sấy trong tủ sấy ở
105oC trong 30 phút nung trong lò nung ở 525 ± 25oC trong 30 phút. Làm nguội
trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác đến 0,001g được khối lượng chén sứ (C).
Quá trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lượng không đổi. Cân
chính xác 1,5 ÷ 2g mẫu thực vật đã sấy khô ở 105oC trong 1÷2 giờ, cân xác định
tổng khối lượng mẫu và chén trước nung, đặt chén sứ có mẫu vào lò nung. Tăng dần
nhiệt độ lò nung đến 500÷520oC và giữ trong khoảng 4÷5 giờ (cho đến khi khối
lượng không đổi). Lấy mẫu ra cho vào bình hút ẩm, để nguội. Cân tổng khối lượng
mẫu phân tích và chén sứ sau khi nung. Phần trăm khối lượng tro trong mẫu khô
được tính theo công thức:
B−C A−C 100
(2.6) X % = A là khối lượng mẫu và chén sứ trước khi nung (g)
50
B là khối lượng mẫu và chén sứ sau khi nung
C là khối lượng chén sứ (g)
+ Xác định hàm lượng ion kim loại nặng: Sau khi tro hóa mẫu được chuyển
sang cốc 50 ml. Thêm 10ml HNO3 1 :1. Đưa vào lò phá mẫu vi sóng, định mức 25
ml và đo trên máy AAS.
- Xác định khối lượng phân tử:
Sử dụng phương pháp đo áp suất thẩm thấu để xác định khối lượng phân tử
trung bình của glucomannan. Theo định luật Vant-Hoff, áp suất thẩm thấu của dung
dịch tỷ lệ thuận với nồng độ mol của chất tan và nhiệt độ tuyệt đối của dung dịch
theo phương trình:
Π.V=nRT = (g/M)RT
Π= (g/V)(RT)/M
M = (RTC)/Π
Trong đó:
g: khối lượng của chất hòa tan (g)
R: Hằng số
M: khối lượng phân tử của chất (g/mol)
T: Nhiệt độ tuyệt đối
C: nồng độ của dung dịch
Π: Áp suất thẩm thấu.
Định luật này áp dụng cho các dung dịch vô cùng loãng, khi đó khoảng cách
giữa các chất tan đủ lớn để lực tương tác giữa chúng là không đáng kể.
Cách tiến hành: Hòa tan hoàn toàn glucomannan trong nước để thu được các
dung dịch có nồng độ tương ứng là 0,025; 0,05; 0,1; 0,3; 0,4 và 0,5g/100ml. Tiến
hành đo áp suất thẩm thấu trên thiết bị đo OSMOMAT 090. Khối lượng phân tử của
mẫu phân tích được xác định theo công thức[95]:
51
848
)
M
n
d
( KT C
lim
C
0
(2.7)
Trong đó: Mn : Khối lượng phân tử trung bình số
848: Hằng số
T: Nhiệt độ tuyệt đối (K)
C: Nồng độ của mẫu (g/100ml)
lim CC 0
: giá trị ngoại suy của đồ thị phụ thuộc/C khi C 0
d: Khối lượng riêng của dung dịch.
2.2.2. Thủy phân glucomannan
2.2.2.1. Thủy phân bằng axit
- Lấy vào mỗi cốc một thể tích chính xác dung dịch hỗn hợp axit CH3COOH
và axit HCl. Cân 10g glucomannan, phân tán vào dung dịch hỗn hợp axit, khuấy
dung dịch đến đồng nhất đối với cả 2 phương pháp thủy phân bằng axit và bằng axit
kết hợp sóng siêu âm.
- Tiến hành siêu âm mẫu ở nhiệt độ thường trong khoảng 30 phút sau đó
khuấy từ có gia nhiệt đối với mẫu thủy phân kết hợp sử dụng sóng siêu âm với
cường độ 20Hz và chỉ khuấy từ có gia nhiệt đối với mẫu thủy phân bằng axit. Tiến
hành phản ứng tại các nồng độ xác định ở một nhiệt độ, thời gian nhất định. Đo độ
nhớt của hỗn hợp phản ứng tại các thời điểm nghiên cứu.
- Kết thúc phản ứng, rửa hỗn hợp bằng etanol, sấy khô hỗn hợp phản ứng ở
60oC đến khối lượng không đổi nhận được sản phẩm glucomannan thủy phân.
Phương pháp thủy phân bằng axit kết hợp sóng siêu âm cho sản phẩm LKGM-1.
Phương pháp thủy phân bằng axit thu được sản phẩm LKGM-2.
- Các điều kiện phản ứng được khảo sát, cụ thể:
+ Ảnh hưởng của nồng độ axit: Axit CH3COOH được sử dụng để bảo vệ
nhóm axetyl trong phân tử glucomannan, qua khảo sát sơ bộ chúng tôi sử dụng
nồng độ CH3COOH thích hợp là 10%. Các thí nghiệm khảo sát được thực hiện ở
52
cùng điều kiện: nhiệt độ 50oC, thời gian phản ứng 2 giờ, tỉ lệ glucomannan/dung
dịch axit là 1/10 (g/ml). Nồng độ axit HCl được thay đổi 0,05M; 0,1M; 0,15M,
0,2M, 0,25M.
+ Ảnh hưởng của nhiệt độ: Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản
ứng thủy phân, chúng tôi tiến hành phản ứng ở cùng điều kiện: thời gian phản ứng 2
giờ, tỉ lệ glucomannan/dung dịch axit là 1/10. Nồng độ axit HCl đã xác định, nhiệt
độ phản ứng thay đổi: 50 oC, 60 oC, 70 oC, 80 oC.
+ Ảnh hưởng của thời gian phản ứng: Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời
gian phản ứng đến hiệu quả thủy phân glucomannan. Phản ứng được thực hiện ở
cùng điều kiện: tỉ lệ glucomannan/dung dịch axit là 1/10 (g/ml). Nồng độ axit
CH3COOH 10%, nồng độ axit HCl, nhiệt độ đã xác định. Thời gian phản ứng thay
đổi: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ.
+ Ảnh hưởng của tỷ lệ glucomannan/dd axit: Để xác định tỉ lệ rắn/lỏng thích
hợp, các thí nghiệm được thực hiện ở cùng điều kiện: Nồng độ axit CH3COOH 10%,
nồng độ axit HCl, nhiệt độ, thời gian phản ứng đã xác định. Tỉ lệ rắn/lỏng được thay
đổi: 1/5; 1/10; 1/15; 1/20 (g/ml).
Y
(%)
100
Hiệu suất thu hồi sản phẩm được tính theo công thức:
a b
(2.9)
Trong đó: a là khối lượng sản phẩm nhận được khi kết thúc phản ứng
b là khối lượng glucomannan ban đầu
- Giá trị DA, tỷ lệ M/G, khối lượng phân tử, độ hòa tan của sản phẩm thủy phân
được thực hiện tương tự như mô tả ở mục 2.2.1.3.
2.2.2.2. Thủy phân konjac glucomannan bằng enzym
a. Định tính xác định khả năng thủy phân glucomannan của các enzym từ vi
khuẩn.
Glucomannan là một polysacarit có các liên kết β-(14) glycosid. Liên kết
này bị phân cắt bởi enzym β-mannanase. Vì vậy chúng tôi lựa chọn 2 loại vi khuẩn
53
có sản sinh enzym β-mannanase là Bacillus substilis và Bacillus lichenifomis để
định tính khả năng thủy phân glucomannan.
- Chuẩn bị dịch chiết enzym từ vi khuẩn:
+ Vi khuẩn được cấy ria trên đĩa thạch qua đêm trên môi trường tương ứng
để thu khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ. Lấy một khuẩn lạc vi khuẩn vào 2ml môi trường
nuôi cấy dạng lỏng (LB) đã khử trùng (môi trường Luria Betani broth- LB broth),
nuôi cấy lắc 37oC, 6h 8h.
+ Pha thành dung dịch đạt nồng độ tương đương 108 CFU/ml. Nuôi cấy trong
môi trường nuôi cấy vi khuẩn có pH = 5 (pH tối ưu với từng loại vi khuẩn). Đặt
trong tủ ấm lắc ổn nhiệtở 35oC, trong 24 giờ. Sau đó ly tâm bỏ cặn tế bào, thu dịch
chứa enzym.
- Tiến hành phản ứng thủy phân glucomannan bằng enzym từ các vi khuẩn.
+ Lấy 20ml H2O vào mỗi đĩa petri thủy tinh, đánh số thứ tự tương ứng, thêm
vào mỗi đĩa petri 1g glucomannan, khuấy dung dịch đến đồng nhất, đông đặc lại
trong đĩa.
+ Khoan tạo một lỗ tròn bán kính 0,5 cm ở hỗn hợp phản ứng đã đông đặc tại
vị trí chính giữa đĩa thủy tinh. Nhỏ dịch chiết enzym vào lỗ khoan rồi ủ hỗn hợp
trong tủ ấm ở nhiệt độ 50oC.
+ Sau thời gian 4 giờ, đo kích thước lỗ thạch bị hóa lỏng.
Sau khi định tính xác định được loại enzym có khả năng thủy phân
glucomannan, chúng tôi sử dụng enzym thương mại endo-1,4 β-Mannanase
(Bacillus sp.) EC 3.2.1.78 Cazy Family: GH26CAS: 37288-54-3 của công ty
Megazyme đã được tiêu chuẩn hóa trong các thực nghiệm tiếp theo.
b. Khảo sát điều kiện phản ứng tối ưu bằng phương pháp kế hoạch hóa thực
nghiệm.
Phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác enzym bị chi phối đồng thời bởi
các yếu tố trạng thái như: độ pH, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ enzym/cơ chất. Để tìm
điều kiện tối ưu cho phản ứng nhằm tạo ra sản phẩm có khối lượng phân tử thấp,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu khảo sát đồng thời theo quy hoạch thực nghiệm
54
mô hình toán học Box Behken 4 yếu tố 3 mức độ. Trên cơ sở những thí nghiệm sơ
bộ chúng tôi đã chọn ra được 4 yếu tố ảnh hưởng chính (đầu vào, các biến số) là
nhiệt độ, thời gian, pH và tỉ lệ enzym/ cơ chất như được đưa ra ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các mức của các yếu tố ảnh hưởng
Các mức -1 0 +1 Các yếu tố
Nhiệt độ (X1, oC) 30 40 50
Thời gian (X2, h) 4 6 8
pH (X3) 5 7 9
Tỉ lệ %E/S (w/w), X4 0,1 0,4 0,7
Thiết kế thực nghiệm theo mô hình ma trận bậc hai của Box Behnken (Bảng
2.2) cụ thể như sau:
- Chuẩn bị 27 bình phản ứng 500ml đánh số thứ tự.
- Lần lượt lấy vào mỗi bình 300ml H2O vào mỗi bình, pH của dung dịch
điều chỉnh pH 5÷9 bằng dung dịch HCl hoặc NaOH theo kế hoạch.
- Thêm vào các dung dịch lượng enzym tương ứng (w/w) từ 0,1%÷0,7% theo
đúng kế hoạch.
- Phân tán vào mỗi bình chính xác 10g glucomannan, lắc và khuấy dung dịch
đến đồng nhất.
- Ủ hỗn hợp trong tủ ấm trong các khoảng thời gian 48 giờ. Tiến hành phản
ứng tại nhiệt độ 3050oC theo kế hoạch.
- Đo độ nhớt của hỗn hợp phản ứng tại các thời điểm nghiên cứu.
- Kết thúc phản ứng, thêm dư dung môi etanol tuyệt đối vào hỗn hợp, loại bỏ
dung dịch, sấy khô ở nhiệt độ 50oC đến khối lượng không đổi nhận được sản phẩm
glucomannan thủy phân, ký hiệu là LKGM-E.
55
Bảng 2.2. Ma trận kế hoạch bậc 2 Box – Behnken cho trường hợp k = 4
Stt x1 x2 x3 x4
1 - - 0 0
2 + - 0 0
3 - + 0 0
4 + + 0 0
5 0 0 - -
6 0 0 + -
7 0 0 - +
8 0 0 + +
9 - 0 0 -
10 + 0 0 -
11 - 0 0 +
12 + 0 0 +
13 0 - - 0
14 0 + - 0
15 0 - + 0
16 0 + + 0
- 0 - 0 17
+ 0 - 0 18
- 0 + 0 19
+ 0 + 0 20
0 - 0 - 21
0 + 0 - 22
0 - 0 + 23
0 + 0 + 24
25 0 0 0 0
26 0 0 0 0
27 0 0 0 0
56
Xử lý số liệu bằng phần mềm Design Expert 11 (DX11). Phương trình hồi
2
Y
b
X
b
X
b
b
X
X
4 i 1
4 i 1
3 i 1
4 j
i
1
0
i
i
ii
i
ij
i
j
quy mô tả kết quả thực nghiệm theo kế hoạch bậc 2 Box – Behnken có dạng:
- Giá trị DA, tỷ lệ M/G, khối lượng phân tử, độ hòa tan của sản phẩm thủy
phân LKGM-E được thực hiện tương tự như mô tả ở mục 2.2.1.3.
2.2.3. Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của LKGM-E trên in vitro
* Phương pháp đánh giá
Đánh giá khả năng hoạt hóa AMPK của mẫu thử thông qua đánh giá mức độ
biểu hiện của AMPK đã phosphoryl hóa ở phân tử threonin 172 (kí hiệu là p-
AMPK). Phương pháp được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của các enzym
này dùng kỹ thuật lai Western blot. Thí nghiệm được thực hiện tại bộ môn Dược lực,
Trường Đại học Dược Hà Nội.
* Các bước tiến hành
- Nuôi cấy tế bào và ủ với mẫu thử: Hoạt hoá tế bào C2C12 và nuôi cấy trong
môi trường DMEM đã bổ sung 10% FBS, penicillin 100UI/ml; streptomycin
0,1mg/ml ở 37oC trong môi trường không khí có 5% CO2. Thúc đẩy sự biệt hoá tế
bào bằng môi trường DMEM có chứa 5% huyết thanh ngựa (HS);
- Ủ tế bào đã biệt hóa với mẫu thử, chuẩn bị protein để điện di;
Ủ tế bào đã biệt hóa với mẫu thử (đã được hòa tan trong dung dịch DMSO)
ở nồng độ 100 g/ml môi trường trong 1 giờ. Các giếng tế bào sau khi đã biệt hóa
được chia thành các lô mỗi lô gồm 3 giếng:
+ Lô 1: Ủ với LKGM-E (pha trong DMSO) với nồng độ 6,25 μg/mL.
+ Lô 2: Ủ với LKGM-E (pha trong DMSO) với nồng độ 12,5 μg/mL.
+ Lô 3: Ủ với LKGM-E (pha trong DMSO) với nồng độ 25 μg/mL
+ Lô 4: Ủ với LKGM-E (pha trong DMSO) với nồng độ 50 μg/mL
+ Lô 5: Ủ với LKGM-E (pha trong DMSO) với nồng độ 100 μg/mL.
+ Lô 6(lô chứng dương): Ủ với Aicar (pha trong DMSO)
57
+ Lô 7 (lô chứng): chỉ bổ sung DMSO.
- Điện di protein: Phá vỡ màng tế bào để thu protein tổng số. Biến tính
protein bằng dung dịch tải mẫu SDS ở 100oC trong 5 phút.
Để phát hiện các protein p-AMPK và β-actin (protein đối chứng) trong dung
dịch protein toàn phần, tiến hành điện di để tách rời các protein có trọng lượng khác
nhau trên bản gel acrylamit 8%, và đệm tải mẫu được dùng là đệm sodium dodecyl
sulfat(SDS). Sự phân tách này dựa trên điểm đẳng điện (pI), khối lượng phân tử,
điện tích của các protein khác nhau sẽ dịch chuyển về các hướng khác nhau và tốc
độ khác nhau.
Định lượng protein toàn phần bằng phương pháp Bradford, cân bằng nồng độ
protein bằng dung dịch đệm ly giải để lượng protein toàn phần trong các mẫu là như
nhau.
- Phát hiện protein và phân tích kết quả:
* Nguyên tắc phát hiện protein bằng phương pháp Western blot: Nhận
biết AMPK đã hoạt hóa (p-AMPK) bằng phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng p-
AMPK (phospho-AMPK threonin 172 antibody). Nhận biết kháng thể kháng p-
AMPK bằng kháng thể thứ 2 có gắn có gắn horseradish peroxidase (anti rabbit
HPR). Khi có mặt hydrogen peroxid, HRP xúc tác cho phản ứng oxi hóa luminol
tạo thành chất phát quang. Ánh sáng quang học phát ra được hiện trên film X-
quang. β-actin được sử dụng làm protein đối chứng.
*Các bước tiến hành phát hiện một protein p-AMPK trên màng:
+ Ủ màng với kháng thể đặc hiệu kháng p-AMPK trong 12 giờ ở 4oC÷8oC.
+ Rửa màng bằng dung dịch đệm TBS-T (Tris Buffer Saline T Ween 20).
+ Ủ màng với kháng thể thứ hai có gắn HRP trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.
+ Rửa màng bằng dung dịch đệm TBS-T.
+ Nhỏ lên trên màng lai dung dịch luminol và H2O2.
+ Áp màng lai với phim X-Quang để ghi lại ánh sáng quang học phát ra từ
màng lai.
58
+ Rửa phim (thực hiện trong bóng tối).
Dùng phần mềm Image J để xác định mật độ ánh sáng thu được trên phim.
So sánh tỷ lệ mật độ ánh sáng của các dải protein với β-actin giữa lô chứng và lô ủ
mẫu thử để đánh giá ảnh hưởng của glucomannan trên mức biểu hiện của các
protein này.
Kết quả được trình bày bằng số lần tăng biểu hiện p-AMPK của lô tế
bào ủ mẫu thử so với lô chứng. Số liệu được xử lý thống kê theo phần mềm
* Xử lý thống kê
Microsoft Excel. Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê khi P <0,05.
2.2.4. Nghiên cứu tác dụng ức chế dung nạp glucose của LKGM-E trên mô hình
in vivo
Khả năng kích thích sự dung nạp glucose của sản phẩm thủy phân được xác định
trên mô hình chuột bình thường, khỏe mạnh bằng xét nghiệm dung nạp glucose qua
đường uống (Oral glucose tolerance test - OGTT). Thí nghiệm được thực hiện tại
Bộ môn Dược lực Trường Đại học Dược Hà Nội.
các lô, mỗi lô 10 con. Xác định khả năng dung nạp glucose theo sơ đồ sau:
1 giờ
Chuột sau khi đã nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm được chia thành
Sơ đồ 2.2. Xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống
Chuột sau khi đã nuôi ổn định được chia thành các lô.
Lô chứng: cho uống nước cất;
Lô gliclazid: Lô uống 10mg/kg
59
Lô thuốc thử 1: cho uống LKGM-E với liều 3g/kg cân nặng;
Lô thuốc thử 2: cho uống LKGM-E với liều 6g/kg cân nặng;
Lô thuốc thử 3: cho uống glucomannan với liều 6g/kg cân nặng;
Thí nghiệm dung nạp glucose được tiến hành sau khi cho chuột uống mẫu
thử sau 1 giờ (chuột được để nhịn đói 15 giờ trước đó):
- Ngay sau khi cho chuột uống chế phẩm tiến hành định lượng glucose huyết
thu được kết quả glucose huyết (ban đầu).
- Sau uống chế phẩm 1 giờ cho chuột uống glucose với liều 2g/kg cân nặng
để tăng glucose huyết đường uống.
- Định lượng glucose huyết ở các thời điểm sau khi cho uống glucose 30
phút; 60 phút, 120 phút.
- So sánh giá trị glucose huyết và mức độ tăng glucose huyết ở các thời điểm
nghiên cứu so với thời điểm trước khi uống glucose (ban đầu) của lô uống thuốc thử
so với lô chứng tại cùng thời điểm để đánh gía tác dụng dung nạp glucose của chế
phẩm.
- Chỉ số glucose huyết tại các thời điểm sau uống glucose được so sánh với
thời điểm ban đầu được tính theo công thức sau:
− đ
(2.9)
đ × 100% Trong đó: X mức độ tăng glucosse huyết (%)
=
Cbđ: nồng độ glucosse huyết ngay sau khi uống chế phẩm
Ct: nồng độ glucose huyết ở thời điểm t sau khi uống glucose
60
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu tách, tinh chế và đặc điểm cấu trúc, tính chất của
glucomannan trong củ nưa A.konjac
3.1.1. Tách và tinh chế glucomannan từ củ Nưa A.konjac
3.1.1.1. Hàm lượng glucomannan trong củ Nưa A.konjac
Với mỗi lượt mẫu củ nưa sẽ có hàm lượng nước khác nhau, phụ thuộc vào
điều kiện nuôi trồng, thời điểm thu hoạch và phương thức bảo quản mẫu. Vì vậy
việc xác định được hàm lượng nước trong củ Nưa là cần thiết cho việc lựa chọn tỉ lệ
dung môi cồn/nước trong quá trình chiết tách glucomannan nhằm đạt hiệu suất cao.
Kết quả đánh giá hàm lượng nước trong củ Nưa A.konjac được thể hiện ở bảng 3.1.
Hình 3.1. Hình ảnh củ Konjac được gọt vỏ và thái lát
Bảng 3.1. Hàm lượng nước trong củ Nưa A.konjac
TT Khối lượng củ tươi Khối lượng củ sau khi Hàm lượng nước
(mtươi, gam) sấy khô (mkhô, gam) (%)
1 83,7 79,78 16,9
2 90,3 80,5 17,6
3 97,4 77,36 22,0
TB 90,5 18,9 79,21
Như vậy, trong mẫu củ nưa A.konjac thu được tại vùng Đắc Nông, Lâm
Đồng, hàm lượng nước chiếm khá lớn, đến 79,21%. Hàm lượng glucomannan là
một chỉ số quan trọng quyết định giá trị của loài Nưa. Việc xác định hàm lượng
61
glucomannan trong củ nưa là cơ sở quan trọng trong việc định hướng loài nưa sẽ
được quy hoạch phát triển thành loài cây công nghiệp phục vụ sản xuất thực phẩm
và dược phẩm ở nước ta.
Có nhiều phương pháp định lượng glucomannan như: sắc ký lỏng hiệu năng
cao, phương pháp enzym, phương pháp phenol-sunfuric axit, phương pháp 3,5-
dinitrosalicylic axit (DNS) …Trong các phương pháp xác định, phương pháp DNS
được đánh giá là phương pháp dễ thực hiện, cho kết quả nhanh, chính xác hơn cả.
Đây là phương pháp đã được Bộ Nông nghiệp Trung Quốc, một trong những quốc
gia đi đầu trong lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất Glucomannan, sử dụng [64].Trong
luận án, chúng tôi sử dụng phương pháp DNS để xác định hàm lượng GM trong bột
Konjac glucomannan.
Glucose có khả năng hấp thụ ánh sáng có các bước sóng 495,520, 550 và
560nm. Để tìm bước sóng tối ưu cho việc xây dựng đường chuẩn glucose, giá trị
hấp thụ của các mẫu được đo tại các bước sóng khác nhau: 495,520, 550 và 560 nm.
Phương trình hồi quy và hệ số tương quan tương ứng được thể hiện ở bảng 3.2.
Bước sóng λ/nm
Phương trình hồi quy
Hệ số tương quan
495
Y = 0,2981x + 0,00589
0,9968
520
Y = 0,3121x + 0,00858
0,9970
550
Y = 0,3180x + 0,00926
0,9998
560
Y = 0,3060x + 0,00923
0,9967
Bảng 3.2. Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn glucose
Từ kết quả khảo sát ở bảng trên cho thấy, phương trình đường chuẩn glucose
trình bày ở hình 3.2.
được lựa chọn: y = 0,3180x+0,00926, với r2 =0,999. Đường chuẩn glucose được
62
Hình 3.2. Đường chuẩn glucose
Kết quả xác định hàm lượng glucomannan trong củ nưa trồng ở Lâm Đồng
được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hàm lượng glucomannan trong củ nưa A.konjac khô
Giá trị hấp thụ To Giá trị hấp thụ T Hàm lượng TT (Dịch chiết KGM) (mg/ml) (KGM thủy phân) (mg/ml) KGM
1 0,2786 1,689
2 0,2786 0,0979 0,5463 59% 1,688
3 0,2785 1,689
Theo kết quả phân tích, hàm lượng glucomannan trong củ nưa A. konjac khô là
59%. Hàm lượng nước trong củ A. konjac là 79,21% nên tính được hàm lượng
glucomannan trong củ tươi chiếm 12,26%. So sánh với kết quả nghiên cứu của
Nguyễn Tiến An, hàm lượng glucomannan trong củ nưa A.konjac cao hơn so với
các loài khác thuộc chi Nưa (Amorphophallus) như nưa chuông (A.paeonnifolius)
hàm lượng 1,67% và nưa đầu nhăn (A.congrugatus) 6%. Điều này khẳng định vai
trò của cây A.konjac trong định hướng phát triển các loài Nưa ở Việt Nam.
3.1.1.2.Tách glucomannan từ củ Nưa A.konjac
Áp dụng quy trình tách glucomanann ở phần thực nghiệm, hàm lượng
glucomannan trong củ nưa được thể hiện ở hình 3.3 và bảng 3.4.
63
Bảng 3.4. Hàm lượng glucomannan trong củ nưa A. konjac
Khối lượng củ tươi Khối lượng bột Hàm lượng KGM theo STT KGM (g) trọng lượng tươi (%) (g)
1 800 80,96 10,12
2 1000 105,06 10,51
3 950 99,82 10,51
Trung bình 916,66 95,28 10,39
Hình 3.3. Hình ảnh bột glucomannan thu được sau khi sấy.
Bằng việc sử dụng phương pháp tách hai giai đoạn, quy trình tách với quy
mô phòng thí nghiệm đã thu được glucomannan 10,39% trong củ A.konjac tươi. So
sánh với hàm lượng glucomannan có trong củ nưa A.konjac (12,26%) quy trình tách
đã thu được glucomannan đạt hiệu suất tách 85%.
64
3.1.1.3. Tinh chế glucomannan
Trong củ Nưa gồm hai thành phần chính quan trọng là glucomannan và tinh
bột cùng với các tạp chất khác nằm xen kẽ, liên kết với nhau như protein và các
đường hòa tan. Khi tách glucomannan rất hay bị lẫn tinh bột. Về bản chất tinh bột là
các hạt có kích thước nhỏ (khoảng 0,004mm), mềm và dễ bị bẻ gãy hơn các hạt
glucomannan (kích cỡ hạt glucomannan khoảng 0,15 0,45mm và có độ cứng lớn
hơn tinh bột). Hơn nữa, khi tăng nhiệt độ tinh bột bị hồ hóa hòa tan trong dung dịch
etanol. Vì vậy, sử dụng dung dịch etanol 40%, gia nhiệt đến 65oC trong 2 giờ
glucomannan tủa nổi lên trên, tinh bột bị hồ hóa tan trong dung dịch, protein và các
đường hòa tan cũng tan tốt trong dung dịch etanol 40%. Nhờ tác dụng của nhiệt độ
các phân tử glucomannan có thể tách rời khỏi các phân tử tinh bột và protein cũng
như các đường tan theo hình 3.4 [49]. Áp dụng quy trình này chúng tôi đã tinh chế
etanol 40%
Co68 gia nhiêt
được glucomannan có độ sạch đạt 92 % (quy trình được lặp lại 3 lần).
Hình 3.4. Quá trình tách tinh bột và tạp chất trong bột KGM
Kết quả phân tích cho thấy sử dụng dung môi etanol kết hợp gia nhiệt 65oC
loại bỏ được các tạp chất trong bột KGM, hàm lượng glucomannan trong bột KGM
tăng lên đáng kể. Như vậy với phương pháp tinh chế dùng dung dịch etanol 40% kết
hợp gia nhiệt có thể tinh chế tạo sản phẩm glucomannan có độ tinh khiết cao độ
sạch đạt tới 92%.
3.1.2. Đặc trưng cấu trúc, tính chất của glucomannan từ củ A.konjac
3.1.2.1. Phổ IR của glucomannan
Phổ hồng ngoại FTIR là phương pháp phù hợp, cho phép xác định nhanh sự
có mặt của các nhóm chức hóa học trong phân tử glucomannan. Phổ hồng ngoại của
glucomannan (hình 3.5) được ghi trên thiết bị FTIR IMPAC-410 trong vùng bước
sóng từ 4000400 cm-1,
65
Hình 3.5. Phổ IR của KGM
Kết quả phân tích được trình bày ở hình 3.5. Từ giản đồ phổ cho thấy có các
tín hiệu đặc trưng cụ thể như: dao động hóa trị của nhóm hydroxyl (-OH) tại 3444
cm-1, dao động hóa trị của liên kết CH tại 2931 cm-1, nhóm cacbonyl (-C=O) tại
1720 cm-1, 1639 cm-1 đặc trưng cho sự có mặt của phân tử nước hấp thụ, 1413 và
1316 cm-1 đặc trưng cho dao động biến dạng của liên kết CH, 1071 và 1029 cm-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-O của nhóm OH. Các pic trong vùng
từ 773 đến 884 cm-1 đặc trưng cho vòng pyranose dạng β của glucose và mannose.
Các tín hiệu trên cho thấy Konjac glucomannan có chứa các đơn vị đường glucose
và mannose và phù hợp với dữ liệu về phổ hồng ngoại của KGM được công bố bởi
Katsuraya và cộng sự [1].
3.1.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Để khảo sát cấu trúc glucomannan nhận được chúng tôi tiến hành ghi phổ 1H
và 13C. Kết quả được thể hiện lần lượt ở các hình 3.6, hình 3.7, hình 3.8.
66
Hình 3.6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR của KGM
Từ kết quả thu được ở trên cho thấy, các tín hiệu trên phổ 1H-NMR của
KGM có sự chồng lấp lên nhau, ngoại trừ các pic tín hiệu đặc trưng cho proton ở vị
trí cacbon số 1 tại vùng 5,05÷5,65ppm và nhóm axetyl ở 2,52 ppm. Đây là đặc
trưng chung cho các loại polysacarit. Tuy nhiên trên phổ 13C-NMR, có sự tách tín
hiệu rõ nét tạo thành các nhóm pic đặc trưng cho nguyên tử cacbon trong vòng
pyranose.
Thông thường để xác định tỷ lệ mắt xích của glucose và mannose trong
polysacarit thường được thực hiện bằng cách thủy phân hoàn toàn glucomannan
trong môi trường xúc tác axit hoặc enzym sau đó tiến hành phân tích sắc ký như sắc
ký khí, sắc ký lỏng cao áp HPLC hoặc sắc ký khí – khối phổ… để xác định hàm
lượng của glucose và mannose. Ngoài ra có thể sử dụng một phương pháp khác để
xác định tỷ lệ này là sử dụng giá trị tích phân trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton 1H-NMR (hay phổ định lượng proton). Theo phương pháp này, về mặt lý
67
thuyết, tính toán tỷ lệ mắt xích glucose và mannose có thể dựa vào giá trị tích phân
của bất kỳ một proton nào đó liên kết với nguyên tử cacbon tương ứng trong mắt
xích glucose và mannose. Tuy nhiên, theo kết quả phân tích phổ 1H-NMR, các tín
hiệu đặc trưng cho proton liên kết với nguyên tử cacbon từ C2 đến C6 có sự xen
phủ lẫn nhau nên việc tính toán theo giá trị tích phân sẽ cho kết quả không chính
xác. Ở đây, chỉ có tín hiệu của proton H1 là không có sự chồng lấp nên tỷ lệ
glucomannan/mannose được tính theo giá trị tích phân (I) của proton này. Vì vậy
chúng tôi sử dụng cường độ tích phân của proton anome H1 của đường mannose và
glucose để xác định tỷ lệ mắt xích của hai đường này trong phân tử glucomannan.
Man
R
60,1
M/G
I -H1 I
668,2 651,1 00,1 718,1
Glu-H1
Từ công thức phần thực nghiệm tỷ lệ:
Tỷ lệ manose/glucose của glucomannan tách được từ cây A.konjac là 1,6/1.
Kết quả này phù hợp với các tài liệu công bố về A.konjac [1].
Độ axetyl hóa được tính theo công thức (2.4) phần thực nghiệm:
DA=(ICH3×100%)/3IΣH1
DA = (1,167×100%)/3]/(1,00+2,668+1,651+1,718) ≈ 8%,
Như vậy, với giá trị DA là 8% có thể tính được trung bình cứ khoảng 13 mắt
xích pyranose thì có một mắt xích được axetyl hóa.
So với các loại Nưa khác đã tìm thấy tại Việt Nam, glucomannan thu được từ
cây nưa A.konjac có độ acetyl hóa lớn nhất (nưa chuông; nưa thái có DA =0; nưa
trạm trổ có DA = 7,22; nưa đầu nhăn có DA = 7,57) [92]. Kết quả này chứng minh
KGM có khả năng hòa tan trong nước tốt hơn nhiều loại nưa được tìm thấy tại Việt
Nam. Nhờ có tính chất này, KGM được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực
phẩm, dược phẩm và các lĩnh vực khác.
Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) của KGM được quy kết
như ở bảng 3.5.
68
Bảng 3.5. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) của KGM
Tín hiệu Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm)
H1 5,30; 5,60 5,65;5,04
H2 4,24;4,29 3,94÷3,99
H3 4,32÷4,69 4,20÷4,23
H4 3,80÷3,89 3,79
H5 3,65÷3,65 4,06÷4,08
H6 4,29;4,27 4,18÷4,19
H của CH3CO- 2,52
Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của KGM
69
Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của KGM
Độ dịch chuyển hóa học 13C (δ ppm) của KGM được quy kết như ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của cacbon (13C) của KGM
Tín hiệu Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm)
94,72;94,37 96,68;92,78 C1
C2 71,04 72,27;72,18
C3 71,45 73,12
C4 76,76 76,60; 76,56
C5 74,97 73,82
C6 61,97 61,64; 61,55
C của CH3CO- 20,17; 17,46 và 176,80
70
Hình 3.9: phổ HSQC của KGM
Trên phổ hai chiều 1H-13C-HSQC-NMR, mỗi tương tác C/H được đặc trưng
bằng một tín hiệu, các liên kết trực tiếp C-H trong vòng pyranose được quy kết
chính xác như sau:
Manose: C1/H1 (94,71;94,33/5,30; 5,60), C2/H2 (71,04/4,24;4,29),
C3/H3 (71,45/4,32÷4,69), C4/H4(76,76/3,80÷3,89),
C5/H5(74,976/3,651÷3,658), C6/H6(61,97/4,29;4,27),
Glucose: C1/H1 (96,68;92,78/5,65;5,04), C2/H2 (72,27;72,18/3,94÷3,99),
C3/H3(73,12/4,20÷4,23), C4/H4(76,60; 76,56/3,79),
C5/H5(73,82/4,06÷4,08), C6/H6(61,63; 61,54/4,18÷4,19),
Trên phổ 13C-NMR của glucomannan konjac quan sát thấy 4 píc rõ nét, nằm
giữa tín hiệu của C2 và M6, G6. Dựa vào các tài liệu công bố về glucomannan tách
từ cây A.konjac các pic tại 67,74 và 67,48 được quy kết cho liên kết β- (16) D-
Glc [1].
71
3.1.2.3. Tính chất nhiệt của KGM
Hình 3.10. Giản đồ phân tích nhiệt của KGM
Bảng 3. 7. Kết quả phân tích TGA của KGM
Nhiệt độ bắt Nhiệt độ phân Nhiệt độ phân Tổn hao khối
đầu phân hủy hủy mạnh thứ hủy mạnh thứ lượng đến Mẫu vật liệu
(oC) nhất (oC) hai (oC) 800oC (%)
KGM 150,01 318,10 517,85 96,43
Từ giản đồ phân tích nhiệt (hình 3.10) và bảng 3.7 cho thấy quá trình phân
hủy nhiệt của mẫu xảy ra ở 3 vùng nhiệt độ rõ rệt: vùng 31÷150oC ứng với mất
nước nội và ngoại phân tử, khối lượng mẫu mất 8,88% (tương ứng độ ẩm của mẫu
8,88%). Sự giảm khối lượng mạnh nhất ở vùng từ 150÷ 400 oC là 62,28%, trong
khoảng nhiệt độ này xảy ra sự phân hủy các liên kết glycosid trong mạch đại phân
tử hình thành các hợp chất có khối lượng phân tử thấp hơn. Tổng phần trăm khối
lượng mẫu mất ở nhiệt độ 800oC là 96,43%. Như vậy hàm lượng tro trong mẫu tính
theo giản đồ nhiệt là 3,57%.
72
3.1.2.4. Độ kết tinh
Trên phổ nhiễu xạ tia X (hình 3.11) của glucomannan từ cây A.konjac không
xuất hiện các píc rõ rệt mà chỉ xuất hiện píc tù có cường độ thấp, như vậy có thể kết
luận glucomannan từ cây A.konjac tồn tại ở trạng thái vô định hình. Mức độ kết tinh
của KGM phụ thuộc vào tương tác giữa các phân tử thông qua các lực tương tác
như lực Van der Waals, lực liên kết hydro giữa cácnhóm chức hydroxyl (-OH) trong
mạch đại phân tử. Tuy nhiên khi sự có mặt của nhóm axetyl (CH3CO-) làm giảm
đáng kể các tương tác trên và do đó làm giảm sự sắp xếp trật tự của polyme nên
glucomannan nhận được tồn tại ở trạng thái vô định hình và tan được trong nước
Hình 3.11. Giản đồ nhiễu xạ tia X của KGM
3.1.2.5. Khối lượng phân tử của KGM
Khối lượng phân tử của polysaccarit như glucomannan, chitin/chitosan, tinh
bột…là thông số quan trọng nhưng khó có thể xác định được chính xác do sự đa
dạng về kiểu phân bố các nhóm cấu trúc hóa học và khối lượng phân tử phụ thuộc
vào nguồn gốc phân lập của các polyme thiên nhiên. Trên thực tế, khối lượng phân
tử của glucomannan có thể được xác định bằng một số phương pháp như phương
73
pháp tán xạ ánh sáng, phương pháp đo độ nhớt và phương pháp thẩm thấu gel
(GPC). Một trong những yếu tố quan trọng gây khó khăn trong việc xác định khối
lượng phân tử của glucomannan là khả năng hòa tan và độ trương của polyme này
trong nước cũng như trong các dung môi hữu cơ. Do đó phương pháp đo áp suất
thẩm thấu được lựa chọn để xác định khối lượng phân tử trung bình của
glucomannan.
lim
C
C
0
Giá trị được ngoại suy từ phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa C
và Π/C (hình 3.12). Kết quả đo áp suất thẩm thấu của glucomannan tách từ cây
A.konjac được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả đo áp suất thẩm thấu của KGM
C(g/100ml) Π Π/C
0,025 0,197 7,9
0,05 0,985 19,7
0,1 3,120 31,2
0,2 11,200 56,0
0,3 26,400 88,0
0,4 51,200 128,0
0,5 77,000 154,0
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ C và Π/C của KGM
74
Từ phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa C và Π/C (hình 3.12) tính toán
848
)
M
.1
597
.
910
(
g
/
mol
.1)
598
kDa
n
d
( KT C
lim 0 C
được khối lượng phân tử trung bình của KGM theo công thức 2.7.
Khối lượng phân tử của KGM thu được tương đương với khối lượng phân tử
của glucomannan từ các loài nưa khác đã nghiên cứu tại Việt Nam [58,92,93].
3.1.2.6. Hàm lượng tro và kim loại nặng trong bột KGM
Thực hiện tro hóa mẫu KGM bằng lò nung ở nhiệt độ 525oC, kết quả thu
được ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Hàm lượng tro và kim loại nặng trong bột KGM
Hàm lượng tro Tên mẫu Asen (ppm) Chì (ppm) tổng số (%)
KGM 1 4,12 0,208 0,185
KGM 2 4,10 0,207 0,183
KGM 3 4,14 0,208 0,184
TB 4,12 0,208 0,184
Tiêu chuẩn KGM[64] 4,5 2,0 1,0
Từ kết quả nghiên cứu trên bảng 3.9 cho thấy tổng hàm lượng tro trong mẫu
bột glucomannan là 4,12%. Kết quả tro hóa phù hợp với kết quả thu được từ giản đồ
nhiệt (3,57%). Hàm lượng Asen và chì trong bột KGM lần lượt là 0,208 và 0,184
ppm, đều nhỏ hơn tiêu chuẩn cho phép theo quy định về bột KGM tinh chế của
Trung Quốc [64].
Áp dụng công thức phần thực nghiệm, độ tan của KGM xác định được là 32%.
Một số đặc điểm tính chất, cấu trúc của glucomannan được đưa ra ở bảng 3.10.
75
Bảng 3.10. Tổng hợp đặc điểm cấu trúc, tính chất của glucomannnan từ củ A.konjac
Khối lượng Độ tan DA RM/G Nhiệt độ
phân tử TB bắt đầu phân hủy
1.598 kDa 32% 8 1,6 150oC
Kết luận 1: Hàm lượng glucomannan trong củ A.konjac K.Koch tại Việt
Nam là 12,26% trong củ tươi, rất cao so với nhiều loại Nưa khác đã được phát hiện
ở Việt Nam. Bột KGM đạt độ sạch 92%, hàm lượng tro 4,12%, độ ẩm 9%.
Glucomannan tách từ cây A.konjac có cấu trúc vô định hình, được cấu tạo bởi các
mắt xích D-mannose và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4)
glycosid, phân nhánh tại vị trí C6, tỷ lệ manose/glucose là 1,6/1, độ axetyl hóa ≈8%,
độ tan 32%, khối lượng phân tử 1.598 kDa.
3.2. Thủy phân glucomannan bằng xúc tác axit HCl
3.2.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp của phản ứng thủy phân xúc tác axit
a. Ảnh hưởng của nồng độ axit
Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit đến khối lượng phân tử của
sản phẩm thủy phân xúc tác axit kết hợp sóng siêu âm (LKGM-1) và sản phẩm thủy phân xúc tác axit (LKGM-2). Phản ứng được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 50oC,
thời gian 4 giờ, nồng độ CH3COOH 10%, nồng độ axit HCl thay đổi từ 0,05 đến
0,25M, tỷ lệ rắn/lỏng là 1/10. Hiệu quả cắt mạch được đánh giá thông qua độ nhớt
của sản phẩm phản ứng.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit đến hiệu suất và độ nhớt của
sản phẩm thủy phân được thể hiện ở bảng 3.11 và hình 3.13.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ axit đến hiệu suất và độ nhớt của sản phẩm
Nồng độ axit Có siêu âm Không siêu âm
Hiệu suất Độ nhớt Hiệu suất Độ nhớt
0,05 85,2 95,4 728,3 616,2
0,1 77,6 90,6 520,3 446,2
0,15 72,1 83,5 377,2 257,7
0,2 65,8 77,2 357,4 235,3
0,25 60,6 70,5 300,8 205,1
76
Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ axit đến độ nhớt hỗn hợp phản ứng
Điều kiện: nhiệt độ 50oC, thời gian 4 giờ, tỉ lệ rắn/lỏng là 1/10
Kết quả nghiên cứu cho thấy, độ nhớt của hỗn hợp phản ứng có sử dụng sóng
siêu âm luôn có giá trị thấp hơn so với không sử dụng sóng siêu âm. Điều này là do
dưới tác động của sóng siêu âm (tác động cơ học) đã phá vỡ một số liên kết nhất
định trong mạch đại phân tử polyme, dẫn đến khả năng tiếp xúc giữa polyme với tác
nhân phản ứng tốt hơn, làm tăng hiệu quả cắt mạch, giảm độ nhớt của sản phẩm.
Khi tăng nồng độ axit HCl từ 0,05 đến 0,25M, độ nhớt của hỗn hợp phản ứng
giảm nhanh ở cả 2 trường hợp. Điều này là do khi tăng tác nhân axit HCl làm tăng
lượng H+ tấn công vào mạch glucomannan dẫn tới làm tăng khả năng phân cắt các
liên kết glycosid, làm giảm khối lượng phân tử glucomannan. Khi tăng hàm lượng
axit lên quá cao có thể tạo ra sự phân cắt triệt để các phân tử glucomannan thành,
trimer dimer hoặc monome – là thành phần tan hoàn toàn trong nước, làm giảm
mạnh hiệu suất thu hồi của sản phẩm. Do đó chúng tôi chọn tỷ lệ axit/glucomannan
thích hợp là 0,15M cho các thí nghiệm tiếp theo. Cơ chế thủy phân liên kết glycosid
được đề xuất theo sơ đồ 3.1 [94].
77
Sơ đồ 3.1. Cơ chế phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác axit.
b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân glucoamannan xúc tác axit.
Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả của phản ứng thủy phân
glucomannan xúc tác axít, chúng tôi đã thực hiện phản ứng với hai trường hợp có sử
dụng và không sử dụng sóng siêu âm ở cùng điều kiện: nồng độ axit HCl 0,15M và
thời gian phản ứng 4 giờ, tỉ lệ rắn/lỏng:1/10 (g/ml). Kết quả nghiên cứu được thể
hiện ở hình 3.14.
Từ kết quả nghiên cứu thể hiện trên hình 3.14 cho thấy nhiệt độ là yếu tố ảnh
hưởng đến khối lượng phân tử glucomannan nhận được và có sự khác biệt nhiều khi
thay đổi nhiệt độ từ 30 đến 60oC. Cụ thể, khi tăng nhiệt độ từ 30oC đến 50oC, sau
thời gian 1 giờ, độ nhớt của hỗn hợp sản phẩm giảm từ 573,2 cPs xuống còn
357,8cPs đối với mẫu không siêu âm và giảm từ 457,3 cPs đến 253,5 cPs đối với
mẫu siêu âm bằng sóng siêu âm. Khi tăng nhiệt độ lên đến 60oC độ nhớt của hỗn
hợp sản phẩm giảm không đáng kể đối với cả 2 mẫu.
78
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân glucomannan
Điều kiện: [HCl] 0,15M, thời gian: 4 giờ, rắn/lỏng:1/10 (g/ml)
Điều này có thể giải thích là do khi tăng nhiệt độ làm tăng độ tan của
glucomannan trong nước, sự chuyển động nhiệt của xúc tác H+ và các phân tử
glucomannan tăng dẫn tới việc xúc tác H+ có khả năng khuếch tán trong toàn bộ
dung dịch và thâm nhập sâu hơn vào cấu trúc phân tử polyme. Bên cạnh đó thì nhiệt
độ có ảnh hưởng đến hằng số tốc độ thuỷ phân, khi tăng nhiệt độ phản ứng thì dẫn
tới tăng hằng số tốc độ phản ứng và tăng tốc độ thuỷ phân. Tuy nhiên, glucomannan
không bền ở nhiệt độ cao. Vì vậy chúng tôi lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho phản
ứng thủy phân xúc tác axit trong cả hai trường hợp là 50oC.
c. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ nhớt của hỗn hợp thủy phân
Trong sản xuất việc xác định được thời gian thủy phân hợp lý có ý nghĩa về
mặt kinh tế, kỹ thuật. Phản ứng được khảo sát ở các thời điểm từ 3 giờ đến 7 giờ ở
nhiệt độ 50oC, [HCl] 0,15M. Kết quả được trình bày trên hình 3.15.
79
Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng thủy phân glucomannan
Điều kiện: CH3COOH 10%, [HCl] 0,15M, nhiệt độ 50oC, rắn/lỏng:1/10 (g/ml)
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến khối lượng phân
tử glucomannan (Hình 3.15) cho thấy phản ứng thủy phân glucomannan diễn ra
theo 2 giai đoạn. Giai đoạn thứ nhất khi phân tán vào dung dịch, glucomannan hấp
thụ nước và trương nở tạo hỗn dịch có độ nhớt cao (trong khoảng 5 phút đầu). Giai
đoạn tiếp theo, ion H+ có trong dung dịch xúc tác cho phản ứng thủy phân cắt liên
kết β-(14) glycosid khối lượng phân tử của glucomannan giảm mạnh.
Do ảnh hưởng của sóng siêu âm nên giai đoạn ban đầu phản ứng xảy ra
nhanh hơn do năng lượng của sóng có tác dụng phá vỡ kết cấu trong mạch
glucomannan. Vì vậy ban đầu phản ứng xảy ra nhanh hơn so với mẫu không dùng
sóng siêu âm. Với trường hợp có sử dụng sóng siêu âm chỉ sau 4 giờ độ nhớt của
hỗn hợp giảm mạnh đạt đến 253,2 cPs, với trường hợp không sử dụng sóng siêu âm
sau 6 giờ hỗn hợp phản ứng đạt đến độ nhớt tương đương 242 cPs. Sau đó, tiếp tục
thực hiện phản ứng độ nhớt của hỗn hợp vẫn giảm vì với các polysacarit thủy phân
đến cùng tạo ra các monosacarit. Để thu được sản phẩm có khối lượng phân tử phù
hợp có thể tạo dung dịch có độ nhớt khoảng 200cps dễ dàng ứng dụng trong các
lĩnh vực dược phẩm, mỹ phẩm, thời gian phản ứng thích hợp cho phản ứng thủy
phân xúc tác axit có sử dụng sóng siêu âm là 4 giờ, khi không sử dụng sóng siêu âm
thời gian phản ứng là 6 giờ.
80
d. Ảnh hưởng của tỉ lệ KGM/ dd axít
Để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ rắn/lỏng đến hiệu quả thuỷ phân, chúng tôi
tiến hành phản ứng ở 50oC, với nồng độ axit CH3COOH 10%, axit HCl 0,15M, thời
gian phản ứng là 2 giờ, tỷ lệ rắn/lỏng (g/ml) thay đổi từ 1/5 đến 1/20. Ảnh hưởng
của tỉ lệ rắn/lỏng đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng được trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tỉ lệ KGM/dd axít đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng và
độ thu hồi sản phẩm
Tỉ lệ Có siêu âm Không siêu âm
KGM/ dd axít (g/ml) Hiệu suất Độ nhớt Hiệu suất Độ nhớt
1/5 90,6 446,8 95,4 616,2
1/10 85,7 237,7 90,5 307,1
1/15 80,2 240,3 87,1 309,5
1/20 75,6 242,1 85,4 308,5
Từ kết quả nghiên cứu trên bảng 3.12 cho thấy, phản ứng thủy phân
glucomannan chịu ảnh hưởng nhiều bởi tỷ lệ glucomannan/dd axit (g/ml). Khi tỷ lệ
glucomannan/dd axít cao thì khả năng phân tán trong nước của glucomannan không
đồng nhất do glucomannan có tính trương nở cao và tốc độ trương rất nhanh khi gặp
nước. Đồng thời độ nhớt của hệ cao gây khó khăn cho việc phân tán của xúc tác H+
vào mạch polyme, do đó tốc độ thuỷ phân thấp. Tuy nhiên nếu giảm tỷ lệ KGM/ dd
axít quá thấp sẽ làm giảm nồng độ xúc tác, điều này dẫn tới làm giảm mật độ tiếp
xúc của H+ với mạch polyme và quá trình phân cắt mạch glucomannan giảm đi,
mặt khác khi tỷ lệ glucomannan/dd axít nhỏ, dung dịch quá loãng thì hiệu suất thu
hồi giảm. Từ phân tích trên chúng tôi chọn tỷ lệ glucomannan/dd axít là 1/10 (g/ml).
Khi tỷ lệ glucomannan/dd axít cao glucomannan phân tán không đồng nhất
do đó tốc độ thuỷ phân thấp. Tuy nhiên nếu giảm tử lệ KGM/ dd axít quá thấp sẽ
làm giảm nồng độ xúc tác, giảm mật độ tiếp xúc của H+ với mạch polyme, giảm
hiệu quả cắt mạch. Mặt khác khi tỷ lệ glucomannan/dd axít nhỏ, dung dịch quá
loãng thì hiệu suất thu hồi giảm. Từ phân tích trên chúng tôi chọn tỷ lệ
glucomannan/dd axít là 1/10 (g/ml).
81
Như vậy điều kiện thích hợp cho phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác
axit kết hợp sóng siêu âm là: nồng độ axit CH3COOH 10%, axit HCl 0,15M, nhiệt
độ phản ứng là 50oC, thời gian phản ứng 4 giờ, tỷ lệ KGM/dd axit 1/10(g/ml). Đối
với phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác axit không kết hợp sóng siêu âm thực
hiện ở: nồng độ axit CH3COOH 10%, axit HCl 0,15M, nhiệt độ phản ứng là 50oC,
thời gian phản ứng 6 giờ, tỷ lệ KGM/dd axit 1/10 (g/ml).
3.2.2. Cấu trúc và tính chất của sản phẩm thủy phân
3.2.2.1. Độ tan và hiệu suất thu hồi LKGM-1
Để xác định cấu trúc và tính chất của sản phẩm thủy phân glucomannan xúc
tác axit, chúng tôi đã tiến hành phản ứng trong điều kiện thích hợp vừa xác định.
Kết quả độ tan và hiệu suất thu hồi sản phẩm được thể hiện trên bảng 3.13.
Bảng 3.13. Độ tan và hiệu suất thu hồi sản phẩm
Chỉ tiêu LKGM-1 LKGM-2
[HCl] 0,15M, CH3COOH 10%, [HCl] 0,15M, CH3COOH 10%, Điều kiện kết hợp siêu âm, thời gian phản thời gian phản ứng 6 giờ nhiệt độ phản ứng ứng 4 giờ, nhiệt độ 50oC 50oC
Độ tan 82,6 75,2
Hiệu suất (%) 75,2 78,6
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.13 cho thấy so với khi chỉ thủy phân bằng HCl,
phản ứng thủy phân glucomannan kết hợp rung siêu âm nhận được glucomanan có
độ tan tốt hơn (LKGM-1) so với sản phẩm thủy phân chỉ dùng axit HCl (LKGM-2),
Điều này là do dưới tác động của sóng siêu âm (tác động cơ học) đã phá vỡ một số
liên kết nhất định trong mạch đại phân tử polyme, độ nhớt của dung dịch giảm, dẫn
đến khả năng tiếp xúc giữa glucomannan với tác nhân phản ứng tốt hơn, làm tăng
hiệu quả cắt mạch.
Các tính chât tiếp theo chúng tôi chỉ khảo sát sản phẩm thủy phân bằng axit
kết hợp sóng siêu âm.
82
3.2.2.2. Phổ IR của LKGM-1
Phổ IR của sản phẩm được thể hiện lần lượt trên hình 3.16.
Hình 3.16. Phổ IR của LKGM-1
Các pic phổ đặc trưng trên phổ IR của sản phẩm (hình 3.16) được quy kết
như sau: vùng 3000-3700cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm hydroxyl (-
OH); 2887cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết CH (-C–H); 1726cm-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm cacbonyl (-C=O); 1650cm-1 đặc trưng cho
sự có mặt của phân tử nước hấp thụ; 1413 và 1377cm-1 đặc trưng cho dao động biến
dạng của liên kết CH (-CH); 1150cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết
ete C-O-C giữa các mắt xích trong phân tử polysaccarit; 1079 và 1022cm-1 đặc
trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-O của nhóm C-OH. Các pic trong vùng
808÷900 cm-1 đặc trưng cho vòng pyranose dạng β của glucose và mannose. Như
vậy cấu trúc hóa học glucomannan thủy phân hầu như không thay đổi so với
glucomannan ban đầu. Điều này có thể do phản ứng thủy phân tại điều kiện thí
nghiệm lựa chọn xảy ra chủ yếu ở liên kết β-(14) glycosid.
83
3.2.2.3. Phổ NMR của LKGM-1
Hình 3.17. Phổ 1H -NMR của LKGM-1
Hình 3.18. Phổ 13C-NMR của LKGM-1
84
Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của 1H và (13C) trong phân tử KGM thủy
phân được quy kết như ở bảng 3.14 và bảng 3.15
Mannose
Glucose
Tín hiệu
(δ ppm)
(δ ppm)
H1
5,17
5,54; 5,34
H2
4,88; 4,87
3,96
H3
4,69
4,87
H4
4,49
4,58
H5
4,14
4,43; 4,41
H6
4,28; 4,26
4,35
H của CH3CO-
2,49
Bảng 3.14. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) trong LKGM-1
Tín hiệu phổ 13C của sản phẩm (hình 3.18) được quy kết theo bảng 3.15.
Bảng 3.15. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của cacbon (13C) trong LKGM-1
Tín hiệu Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm)
100,86 C1 101,45
72,49 C2 71,03
73,93 C3 71,18
79,34; 79,16 C4 76,86
75,87 C5 76,09
61,53 C6 64,26; 63,68
69,80; 66,67 β- (16) D-Glc
Trên phổ 13C-NMR, có sự tách tín hiệu tạo thành các nhóm pic đặc trưng
cho nguyên tử cac bon trong vòng pyranose. Đây là đặc trưng chung của phổ các tín
hiệu của polysaccarit. Trong mạch KGM có nhiều loại mắt xích khác nhau là β-
85
glucopyranose; β-mannopyranose và các pyranose được axetyl hóa nên các tín hiệu
của nguyên tử Cacbon trên các mắt xích này có sự tách pic theo số liệu trên bảng
3.15.
Từ kết quả thu được cho thấy (hình 3.17), các tín hiệu trên phổ 1H-NMR của
konjac glucomannan thủy phân bằng axit có sự chồng lấp lên nhau nhưng vẫn xuất
hiện các pic tín hiệu đặc trưng cho proton ở vị trí cacbon số 1 ở 5,54; 5,34 và 5,166
ppm và nhóm axetyl (CH3CO-) ở 2,488ppm
Man
R
515,1
M/G
1
I -H1 I
11,0
55,0
-H1
Glu
Từ công thức (2,1) phần thực nghiệm, tỷ lệ M/G tính được là:
Kết quả này cho thấy tỷ lệ M/G của sản phẩm thủy phân gần tương đương
với GM ban đầu.
0
Độ dacetyl hóa của sản phẩm thủy phân được xác định theo công thức
I
3/
0
CH
3
DA
%03,7
35,0 %100 )66,01(3
1
100 HI
Kết quả này cho thấy DA của sản phẩm thủy phân giảm không đáng kể so
với nguyên liệu ban đầu. Điều này được giải thích là do, trong môi trường axit đồng
thời với phản ứng thủy phân tại liên kết β-(14) glycosid còn xảy ra phản ứng đề
acetyl hóa làm giảm DA của sản phẩm [42][94]. Tuy nhiên, trong dung dịch, axit
CH3COOH phân ly thuận nghịch theo phương trình (3.1).
CH3COOH CH3COO- + H+ p ka = 4,75 (3.1)
Do axit CH3COOH là axit yếu, ka rất nhỏ, hơn nữa môi trường có nồng độ
H+ lớn do axít HCl phân ly tạo ra nên lượng axit CH3COOH bị phân ly không đáng
kể, phần lớn chúng tồn tại ở dạng phân tử trung hòa. Phân tử CH3COOH có mặt
trong dung dịch làm cân bằng phản ứng đề axetyl hóa (3.2) chuyển dịch theo chiều
nghịch
ROCOCH3 + H2O ROH + CH3COOH (3.2)
Chính vì vậy, nhóm axetyl có trong phân tử glucomannan được bảo vệ, độ
DA của sản phẩm thủy phân bằng phương pháp axit giảm không đáng kể so với
glucomannan ban đầu.
86
3.2.2.4. Tính chất nhiệt của LKGM-1
Giản đồ phân tích nhiệt của glucomannan thủy phân LKGM-1 hình 3.19
Hình 3.19. Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-1.
Từ hình 3.19 cho thấy quá trình phân hủy nhiệt của glucomannan thủy phân
bằng axit xảy ra ở 3 vùng nhiệt độ rõ rệt: vùng 33÷150oC ứng với mất nước nội và
ngoại phân tử, khối lượng mẫu mất 5,779%, tương ứng với độ ẩm của mẫu khoảng
5,779%. Nhiệt độ phân hủy mạnh nhất ở 291,5oC, thấp hơn nhiệt độ phân hủy mạnh
nhất của glucomanan 27oC (nhiệt độ phân hủy mạnh nhất của glucomannan là
318oC). Điều này chứng tỏ sản phẩm thủy phân có độ bền nhiệt kém hơn so với
glucomannan ban đầu. Tổn hao khối lượng mẫu ở vùng từ 150÷ 400 oC là 67,681%,
trong khoảng nhiệt độ này xảy ra sự phân hủy các liên kết glycosid trong mạch đại
phân tử hình thành các hợp chất có khối lượng phân tử thấp hơn. Đến 800oC mẫu
phân hủy hoàn toàn.
Bảng 3.16. Kết quả phân tích TGA của LKGM-1
Nhiệt độ bắt Nhiệt độ phân Tổn hao khối
Mẫu vật liệu đầu phân hủy hủy mạnh thứ lượng đến
(oC) nhất (oC) 800oC (%)
LKGM-1 150,02 291,52 95,98
87
3.2.2.5. Khối lượng trung bình của LKGM-1.
Kết quả đo áp suất thẩm thấu của hỗn hợp sản phẩm sau thủy phân được thể
hiện ở bảng 3.17 và hình 3.20.
Bảng 3.17. Áp suất thẩm thấu của các dung dịch sau thủy phân.
0,025 C(g/100ml) 0,4475 Π 17,9 π/C
0,05 2,075 41,5
0,1 6,52 65,2
0,2 23,8 119
0,3 51,15 170,5
0,4 103,2 258
0,5 155,5 311
Hình 3.20. Mối quan hệ giữa nồng độ và áp suất thẩm thấu của LKGM-1
848
)
.88
561
Da
,88
561
kDa
M
n
( KT
d
C
lim 0 C
Khối lượng phân tử trung bình của LKGM-1được tính theo công thức sau.
88
Kết quả thu được chứng tỏ phản ứng thủy phân glucomannan trong môi
trường axit kết hợp sử dụng sóng siêu âm cắt đứt liên kết β-(1 4) glycosid làm
giảm khối lượng phân tử trung bình của glucomannan, thu được oligo-glucomannan
có khối lượng phân tử giảm từ 1.598 kDa xuống còn 88,561kDa.
Kết luận 2: Phản ứng thủy phân glucomannan bằng hỗn hợp axit thực hiện ở
điều kiện thích hợp: tỷ lệ KGM/dd axit:1/10 (g/ml); [HCl] 0,15M; CH3COOH 10%;
nhiệt độ phản ứng 50oC; thời gian phản ứng 6 giờ khi không kết hợp sóng siêu âm
và trong 4 giờ khi có kết hợp sóng siêu âm. LKGM-1 có khối lượng phân trung bình
88,561 kDa, độ tan trong nước 82,6%. LKGM-1 được cấu tạo bởi các mắt xích D-
mannose và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid , tỷ lệ M/G
là 1,51, DA của LKGM-1 là 7,03%.
3.3. Thủy phân konjac glucomannan bằng enzym
3.3.1. Định tính khả năng phân huỷ glucomannan của các enzym từ vi khuẩn
Để xác định nguồn gốc enzym có thể phân hủy glucomannan, chúng tôi đã
lựa chọn một số vi sinh vật có sản sinh enzym β-mannanase để định tính khả năng
Vi khuẩn Bacillus subtilis theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis
phân hủy glucomannan.
thuộc: Bộ: Eubacteriales, Họ: Bacillaceae, Giống: Bacillus, Loài: Bacillus subtilis.
Chúng được phân bố trong tự nhiên, khu trú trong đất. Vi khuẩn Bacillus subtilis
sinh enzym mannanase, amylase và protease [70].
Vi khuẩn Bacillus licheniformis là một loài vi khuẩn thuộc bộ: Bacillales,
họ Bacillaceae, ngành: Firmicutes. Vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh enzym
mannanase, enzym protease và enzym amylase có khả năng chịu nhiệt và bền trong
môi trường kiềm [70].
Kết quả đường kính vòng phân giải glucomannan của các loại vi khuẩn được
trình bày ở bảng 3.18.
89
Đường kính vòng phân giải
TT
Loại vi khuẩn
P
glucomannan (D, mm)
1
Bacillus subtilis
30
< 0,05
2
Bacillus licheniformis
22
< 0,05
3
Đối chứng
0
Bảng 3.18. Đường kính vòng phân giải glucomannan
Kết quả thực nghiệm cho thấy, enzym sinh ra từ 2 loại vi khuẩn Bacillus
subtilis và Bacillus licheniformis đều có khả năng thủy phân glucomannan. Khác
biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Trong đó chủng vi khuẩn Bacillus subtillis
có khả năng phân hủy tốt hơn với P<0,05 so với mẫu Bacillus licheniformis.
Từ kết quả định tính trên chúng tôi lựa chọn enzym endo-1,4 β-Mannanase
(Bacillus sp.) EC 3.2.1.78 Cazy Family: GH26CAS: 37288-54-3 của công ty
Megazyme cho các thí nghiệm tiếp theo trong luận án.
3.3.2. Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng
3.3.2.1. Kết quả theo mô hình thực nghiệm
Mô hình quy hoạch hóa thực nghiệm của Box Behnken đã được áp dụng để
nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố đến phản ứng. Hiệu quả của phản
ứng được đánh giá qua việc thay đổi độ nhớt của hỗn hợp phản ứng. Trong quá
trình phản ứng xảy ra độ nhớt của hỗn hợp sản phẩm giảm dần, chứng tỏ khối lượng
phân tử giảm dần, các liên kết glicosid trong mạch polyme bị phân cắt khi có mặt
enzym β-mananase
Để xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân KGM xúc tác enzym,
theo phương pháp thực nghiệm thụ động (phương pháp thực nghiệm cổ điển) với sự
thay đổi lần lượt của từng yếu tố sẽ mất rất nhiều thời gian để thực hiện số lượng thí
nghiệm vô cùng lớn mới tìm hiểu được sự thay đổi của nhiều yếu tố ở nhiều mức độ
khác nhau.Với phương pháp thực nghiệm chủ động (phương pháp quy hoạch thực
nghiệm) nhờ sự bố trí tối ưu của các điểm trong không gian yếu tố và phép biến đổi
tuyến tính của tọa độ đã khắc phục được các nhược điểm của phương pháp thực
nghiệm cổ điển. Quy hoạch thực nghiệm cho phép đồng thời thay đổi tất cả các yếu
90
tố và nhận được những ước lượng của các hiệu ứng tuyến tính, tương tác, bình
phương với sai số thấp.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng mô hình Box – Behnken. Kết quả
thực nghiệm theo mô hình của Box Behnken thu được theo bảng 3.19
Bảng 3.19. Kết quả thực nghiệm theo kế hoạch Box Behnken
X3 X4 Y(cPs) TT X1 X2
1 -1 -1 0 0 173,3
2 +1 -1 0 0 106,2
3 -1 +1 0 0 125,5
4 +1 +1 0 0 138,5
5 0 0 -1 -1 218,7
6 0 0 +1 -1 201,5
7 0 0 -1 +1 222,1
8 0 0 +1 +1 135,6
9 -1 0 0 -1 165,1
10 +1 0 0 -1 161,3
11 -1 0 0 +1 154,4
12 +1 0 0 +1 110,5
13 0 -1 -1 0 220,18
14 0 +1 -1 0 195,17
15 0 -1 +1 0 165,16
16 0 +1 +1 0 155,25
17 -1 0 -1 0 248,00
18 +1 0 -1 0 208,15
19 -1 0 +1 0 183,25
20 +1 0 +1 0 173,29
21 0 -1 0 -1 153,63
22 0 +1 0 -1 130,3
23 0 -1 0 +1 118,5
24 0 +1 0 +1 110,05
25 0 0 0 0 62,86
26 0 0 0 0 61,15
27 0 0 0 0 62,62
91
Phân tích sự phù hợp và sự có nghĩa của mô hình thực nghiệm được đánh
giá bằng phần mềm phân tích Design Expert. Kết quả được chỉ ra ở bảng
ANOVA (Bảng 3.20) và các chỉ số tương quan (Bảng 3.21).
3.3.2.2. Phân tích thống kê
Yếu tố
Giá trị P
Tổng bình phương
Trung bình bình phương
Giá trị F
Bậc tự do
65344,95
14
4667,50
695,95 < 0,0001 Tin cậy
Bảng 3.20. Kết quả phân tích ANOVA tối ưu hóa điều kiện phản ứng thủy phân
Mô hình
1
1915,47
1915,47
285,61 < 0,0001
A-Nhiệt độ
1
563,07
563,07
83,96 < 0,0001
B-Thời gian
1
7412,76
7412,76 1105,29 < 0,0001
C-pH
1
2681,43
2681,43
399,82 < 0,0001
D-tỷ lệ E/S
1
1604,00
1604,00
239,17 < 0,0001
AB
1
223,35
223,35
33,30 < 0,0001
AC
1
402,00
402,00
59,94 < 0,0001
AD
1
57,00
57,00
8,50
0,0130
BC
1
55,35
55,35
8,25
0,0140
BD
1
1200,62
1200,62
179,02 < 0,0001
CD
1
11662,98
11662,98 1739,02 < 0,0001
A²
1
3973,30
3973,30
592,44 < 0,0001
B²
1
47246,57
47246,57 7044,76 < 0,0001
C²
1
7920,57
7920,57 1181,01 < 0,0001
D²
80,48
12
6,71
Phần dư
78,77
10
7,88
9,19
Lack of fit
0,1021 Không tin cậy
Sai số thuần
1,71
2
0,8571
tương
65425,43
26
Tổng quan
92
Kết quả phân tích phương sai (ANOVA) cho thấy mô hình và các hệ số hồi
qui đều phù hợp và có ý nghĩa thống kê (được đánh giá qua p-value đều nhỏ hơn
0,05). Thêm vào đó sự không tương hợp (Lack of fit) của mô hình là 78,77 có
P=0,1021 > 0,05) cho thấy giá trị này không có ý nghĩa thống kê. Điều đó chứng tỏ
mô hình thực nghiệm là hoàn toàn tin cậy.
Sự phù hợp và có ý nghĩa của mô hình thực nghiệm được chỉ ra ở bảng 3.23
Thông số
Giá trị
Thông số
Giá trị
Độ lệch chuẩn
2,59
0,9988
R2
Giá trị
trung bình tại
adj
154,08
0,9973
R2
tâm
pred
Hệ số biến thiên %
1,68
0,9930
R2
Tổng bình phương phần
Độ chính xác phù
hợp (Adeq
dư dự đoán (PRESS)
457,55
96,2798
Precision)
Bảng 3.21. Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm.
Kết quả phân tích cho thấy giá trị Hệ số xác định R2 phản ánh độ phù hợp
của phương trình hồi quy so với thực tế. Hệ số xác định R2 bằng 0,9988, hệ số xác
adj = 0,9973 đều rất cao xấp xỉ 1. Điều đó chứng tỏ phương trình
định điều chỉnh R2
hồi qui hoàn toàn phù hợp với kết quả thực nghiệm.
Từ những giá trị phân tích ở trên, phương trình hồi quy được phần mềm
Y = 62,21 – 12,63X1 – 6,85X2 – 24,85X3–14,95 X4 + 20,02 X1X2 +
7,47X1X3 – 10,02 X1X4 + 3,78 X2X3 + 3,72 X2X4 – 17,32 X3X4 + 46,76 X1
2 +
2
27,29 X2
2 + 94,12 X3
2+ 38,54 X4
DX11 đưa ra như sau:
93
Từ phương trình hồi quy cho thấy các yếu tố nhiệt độ (X1), thời gian (X2) và
độ pH (X3) và tỷ lệ E/S đều ảnh hưởng rõ rệt đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng.
Các hiệu ứng tuyến tính (hệ số bj) đều âm chứng tỏ việc tăng giá trị của các yếu tố
nhiệt độ (X1), thời gian (X2) và độ pH (X3) và tỷ lệ E/S đều làm cho độ nhớt của
hỗn hợp phản ứng giảm. Trong đó mức độ ảnh hưởng của các yếu tố giảm dần theo
Tất cả các hiệu ứng kép (bij) đều có ý nghĩa thống kê, điều đó chứng tỏ ảnh
hưởng tương tác của từng cặp yếu tố là đáng kể. Đặc biệt với biến thời gian phản
ứng có ảnh hưởng nhiều nhất đến hàm độ nhớt với cả bậc 1, bậc 2, và tương tác
đồng thời với các yếu tố khác và các hệ số trong phương trình hồi quy đều lớn.
Điều này phù hợp với thực tế cơ chế phản ứng thủy phân polysacarit. Thời gian
phản ứng càng tăng thì số liên kết glycosid bị cắt càng nhiều dẫn đến khối lượng
phân tử trung bình của hỗn hợp phản ứng càng giảm, độ nhớt của hỗn hợp phản
ứng giảm mạnh. Điều này được minh họa rõ hơn khi quan sát hình minh họa 3D
thứ tự b3 > b4 > b1 > b2
đáp ứng bề mặt hình 3.21. Tất cả các mặt đáp ứng đều là mặt cong tụ ở giữa tuy
nhiên mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của thời gian có độ cong nhỏ hơn so với các
mặt đáp ứng khác. Điều đó chứng tỏ việc lựa chọn giá trị ở tâm và các giá trị biên là
phù hợp.
94
Design-Expert® Software
Factor Coding: Actual
Design-Expert® Software
Factor Coding: Actual
Y (mpa.s)
Design points above predicted value
Y (mpa.s)
Design points below predicted value
Design points above predicted value
61.15
248
Design points below predicted value
250
61.15
250.15
X1 = A: Temperature
300
X2 = D: E/S
X1 = A: Temperature
200
X2 = C: pH
250
Actual Factors
B: Time = 6
Actual Factors
150
C: pH = 7
200
B: Time = 6
D: E/S = 0.4
150
) s . a p m
100
(
Y
) s . a p m
(
100
Y
50
50
0.7
50
50
9
0.6
45
0.5
8
45
0.4
40
7
40
0.3
35
D: E/S
A: Temperature (oC)
0.2
6
35
C: pH
A: Temperature (oC)
0.1
30
5
30
Design-Expert® Software
Factor Coding: Actual
Design-Expert® Software
b) Tỷ lệ E/S và nhiệt độ
a) Độ pH và nhiệt độ
Factor Coding: Actual
Y (mpa.s)
Design points above predicted value
Y (mpa.s)
Design points below predicted value
Design points above predicted value
61.15
250.15
Design points below predicted value
61.15
250.15
300
300
X1 = A: Temperature
X2 = B: Time
X1 = B: Time
250
X2 = C: pH
250
Actual Factors
200
Actual Factors
C: pH = 7
200
A: Temperature = 40
D: E/S = 0.4
D: E/S = 0.4
150
150
) s . a p m
(
) s . a p m
100
Y
(
100
Y
50
50
50
8
9
8
7
45
8
7
6
40
7
6
5
35
B: Time (h)
A: Temperature (oC)
6
5
C: pH
B: Time (h)
4
30
5
4
c) Thời gian phản ứng và nhiệt độ
d) Thời gian phản ứng và độ pH
Design-Expert® Software
Factor Coding: Actual
Design-Expert® Software
Factor Coding: Actual
Y (mpa.s)
Design points above predicted value
Y (mpa.s)
Design points below predicted value
Design points above predicted value
61.15
248
Design points below predicted value
61.15
248
250
250
X1 = C: pH
X2 = D: E/S
X1 = B: Time
200
X2 = C: pH
200
Actual Factors
A: Temperature = 40
Actual Factors
150
A: Temperature = 40
B: Time = 6
150
D: E/S = 0.4
) s . a p m
100
(
) s . a p m
Y
100
(
Y
50
50
0.7
9
9
8
0.6
8
8
7
0.5
0.4
7
7
6
0.3
6
D: E/S
C: pH
6
5
C: pH
B: Time (h)
0.2
0.1
5
5
4
f) E/S và pH
e) pH và thời gian
Hình 3.21. Đường mức và đáp ứng bề mặt 3D ảnh hưởng của các cặp yếu tố đến độ
nhớt của hỗn hợp phản ứng
95
Sử dụng kế hoạch bậc 2 Box – Behnken ta đã nhận được phương trình hồi
quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố là nhiệt độ, thời gian, pH và tỉ lệ E/S đến
thông số tối ưu hóa là độ nhớt của sản phẩm cho quá trình thủy phân
glucomannan. Độ nhớt càng nhỏ thì sự cắt mạch càng tốt nghĩa là nhận được
oligoglucomannan có khối lượng nhỏ hơn. Bài toán tối ưu hóa ở đây được đặt ra
là tìm các điều kiện của các biến nhiệt độ, thời gian, pH và tỉ lệ E/S sao cho hàm
độ nhớt đạt giá trị cực tiểu.
Bài toán tối ưu hóa được thể hiện như sau:
Min (Y = 62,21 – 12,63X1 – 6,85X2 – 24,85X3–14.95 X4 + 20.02 X1X2 +
7,47X1X3 – 10.02 X1X4 + 3,78 X2X3 + 3,72 X2X4 – 17,32 X3X4 + 46,76 X1
2 +
27,29 X2
2 + 94,12 X3
2+ 38,54 X4
2)
với các điều kiện ràng buộc:
-1 ≤ x1 ≤ +1
-1 ≤ x3 ≤ +1
-1 ≤ x2 ≤ +1
-1 ≤ x4 ≤ +1
Phần mềm Design Expert cũng cho phép tìm điều kiện tối ưu và nhận
được kết quả được trình bày ởquả bảng 3.22.
3.3.2.3. Tìm chế độ thủy phân tối ưu
Số thí nghiệm
(min)
Giá trị ban đầu
Điều kiện tối ưu
ŷ1
theo mô hình
T(opt) = 42,376;
30 ≤ T ≤ 50
t(opt)=5,681
4≤ t ≤ 8
pH(opt) = 7,241
100
57,51
5 ≤ pH ≤ 9
E/S(opt) = 0,536
0,1 ≤ E/S ≤ 0,7
Bảng 3.22. Kết tính tìm điều kiện tối ưu
Giá trị Ymin = 57,51
(opt) = 0,14; X2
(opt) = 0,05; X3
(opt) = 0,15; X4
(opt) = 0,24
Ở điều kiện: X1
96
Với hệ số mong muốn rất cao bằng 0,987 gần xấp xỉ bằng 1.
Để kiểm tra điều kiện tối ưu của phản ứng, chúng tôi đã sử dụng chương
trình tính FLEXI viết bằng ngôn ngữ thuật toán FORTRAN. Đây là chương trình tối
ưu hóa rất hiệu quả của quy hoạch phi tuyến tính thích hợp cho nhiều lớp bài toán
thông dụng. Kết quả nhận được giá trị Ymin = 57,514 ở điều kiện tối ưu:
opt = 0,139; X2
opt = 0,048; X3
opt = 0,148; X4
opt = 0,243.
X1
Như vậy hai kết quả khá trùng hợp
Điều kiện tối ưu của phản ứng với các biến thực là:ŷ(opt) = 57,51 cP, ở nhiệt
độ: T= 42,376oC; thời gian t = 5,681 giờ; pH = 7,241; tỉ lệ E/S = 0,536%
Kết quả thu được cũng phù hợp với tác giả Junfan Chen và cộng sự [20] khi
dùng enzym thương mại để thuỷ phân glucomannan ở nhiệt độ 41oC; độ pH = 7,1;
tỷ lệ E/S = 0,49 và thời gian phản ứng là 3,4 giờ.
Kiểm tra lại bằng thực nghiệm ở các điều kiện nhiệt độ, thời gian, pH và tỉ lệ
m
sp
H
%100
E/S tối ưu trên cho kết quả Y = 60,5 cPs.
m
bđ
Hiệu suất thu hồi sản phẩm = 75,8%
Với msp là khối lượng sản phẩm sau thủy phân thu được
mbđ là khối lượng chất gốc glucomannan ban đầu.
3.3.3. Đặc điểm cấu trúc và tính chất của LKGM-E
3.3.3.1. Phổ IR của LKGM-E.
Sản phẩm LKGM-E sau được tiến hành ghi phổ hồng ngoại trên thiết bị
FTIR IMPAC-410 trong vùng bước sóng từ 4000-400cm-1. Kết quả phân tích được
trình bày ở hình 3.22.
97
Hình 3.22. Phổ IR của LKGM-E.
Từ hình 3.22, các pic phổ đặc trưng có thể quy kết như sau: vùng 3000-
3500cm-1pic có cường độ mạnh, chân rộng đặc trưng cho dao động hóa trị của
nhóm hydroxyl (-OH); liên kết cộng hóa trị (C-H) có dao động hóa trị tại pic
2932cm-1và dao động biến dạng tại pic 1413 cm-1 và 1316 cm-1. Đặc biệt, tại phổ IR
động hóa trị của nhóm cacbonyl (-C=O); 1650cm-1 đặc trưng cho sự có mặt của
của LKGM-E vẫn xuất hiện pic tại 1720 với cường độ khá mạnh đặc trưng cho dao
phân tử nước hấp thụ; 1150 cm-1đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết ete C-
O-C của liên kết glycosid giữa các mắt xích trong phân tử polysaccarit; 1071cm-1
và 1029cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-O trong nhóm C-OH.
Các pic trong vùng 884÷818 cm-1 đặc trưng cho vòng pyranose của glucose và
mannose.
Thông qua phổ FTIR, sản phẩm thủy phân có các đặc điểm cấu trúc tương tự
với glucomannan gốc của nó. Pic ở 1720 cm-1 (nhóm acetyl) không biến mất trong
quang phổ của LKGM-E. Điều này có thể là do β-1,4-mannanase đã cắt chọn lọc
các liên kết glycosid bên trong chuỗi polyme của glucomannan, do đó sản phẩm
thủy phân giữ lại các đặc điểm cấu trúc của các nhóm chức glucomannan ban đầu.
Kết quả nghiên cứu phù hợp với kết quả của Xuegang Luo và cộng sự [18].
98
3.3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của LKGM-E
Kết quả ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; 13C-NMR và 1H-13C-
NMR-HSQC của mẫu LKGM-E thủy phân trong D2O ở 80oC được thể hiện lần lượt
trên các hình 3.23; 3.24 và 3.25 tương ứng dưới đây:
Hình 3.23. Phổ 1H-NMR của LKGM-E ở 80oC trong D2O
Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) trong phân tử glucomannan
thủy phân bằng enzym (LKGM-E) được quy kết như ở bảng 3.23
Bảng 3.23. 1H NMR độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của LKGM-E
Proton Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm)
H1 5,26 5,03;5,02
H2 4,41 3,87
H3 4,30 4,22
H4 4,32 4,16
H5 4,01 4,08
H6 4,28; 4,20 4,49
H của CH3CO- 2,70
99
Tỷ lệ mannose/glucose của LKGM-E có thể được tính bằng cách sử dụng các
tích phân của H1 trong phổ 1H NMR. Theo phương pháp này, tỷ lệ mol
=
= 1 2
1− ܯ 1− ܩ =
6 ⺁ Như thể hiện trong hình 3.27, tín hiệu proton của nhóm acetyl được phân 1
mannose/glucose là:
tách tốt, do đó giá trị của hàm lượng axetyl thu được có thể khá chính xác, sử dụng
DA = (ICH3 × 100%) / 3IΣH1 = (2,70 × 100%) / 3] / (6,48 + 5,41)= 7,56%,
phổ dữ liệu 1HNMR, mức độ axetyl hóa LKGM-E được ước tính từ công thức:
Kết quả một lần nữa khẳng định rằng β-mannanase chỉ có thể tấn công các
liên kết glycosid bên trong của mạch đại phân tử glucomannan, giải phóng-1,4-
glucomanno-oligosacarit và một lượng nhỏ đơn vị manose, do đó tỷ lệ RM/G của
LKGM-E thấp hơn một chút so với glucomannan ban đầu. Giá trị của DA là 7,56
chứng tỏ rằng endo-1,4-mannanase không thủy phân các nhóm axetyl trong mạch
glucomannan. Điều này cho thấy phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác enzym
có độ chọn lọc rất cao. Phản ứng chỉ cắt liên kết β-glycosid mà không cắt liên kết
nhóm axetyl.
Hình 3.24: Phổ 13C-NMR của LKGM-E ở 80 oC trong D2O
100
Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) trên phổ 13C NMR trong phân tử LKGM-E
được quy kết như ở bảng 3.24
Tín hiệu
Mannose (δ ppm)
Glucose (δ ppm)
C1
102,15;101,99
104,45
C2
72,52;72,18
75,35;75,11
C3
73,63; 73,15
76,19
C4
77,79÷78,90
80,86
C5
77,26
76,97;76,83
C6
62,92;62,78
62,57;62,45
C của CH3CO-
22,17; 176,80
71,77
β-Man(14)-β-Glc
71,56
β-Man(14)-β-Man
Bảng 3.24. Độ dịch chuyển hóa học 13C - NMR (δ ppm) của LKGM-E trong D2O
Hình 3.25. Phổ 1H-13C-NMR-HSQC của LKGM-E ở 80 oC trong D2O
Trên phổ 1H-13C-HSQC-NMR, mỗi tương tác C/H được đặc trưng bằng một
tín hiệu: tín hiệu đặc trưng cho tương tác C/H của nhóm axetyl (CH3CO-) xuất hiện
tại 22,38/2,69 ppm; các tương tác đặc trưng cho vòng pyranose các tín hiệu được
quy cho các nguyên tử hydro liên kết với C2 đến C6 của cả hai đơn vị glucose và
101
mannose không được phân tách tốt. Trong khi đó, các tín hiệu được quy cho hydro-
H1 liên kết với carbon-C1 của cả đơn vị glucose (5,03; 5,02 ppm) và đơn vị
mannose (5,30; 5,60 ppm) được phân tách tốt. Đây là đặc trưng chung cho các phổ
polysacarit. Từ phổ hai chiều HSQC các tương tác đặc trưng cho vòng pyranose
được quy kết chính xác như sau:
Mannose: C1/H1 (102,15; 101,99/5,26), C2/H2 (72,52; 72,18/4,41), C3/H3
(73,63; 73,15/4,30), C4/H4 (77,79;78,90/4,32), C5/H5 (77,26/4,01), C6/H6 (62,92;
62,78/4,28; 4,20).
Glucose: C1/H1 (104,45/5,03; 5,02), C2/H2 (75,35; 75,11/3,87), C3/H3
(76,19/4,22), C4/H4 (80,86/4,16), C5/H5 (76,97; 76,83/4,08), C6/H6 (62,57;
62,45/4,49).
Qua các phương pháp phổ cho thấy KGM-E có cấu trúc không thay đổi
nhiều so với glucomannan ban đầu. Phản ứng xảy ra chọn lọc ở liên kết β-glycosid.
3.3.3.3. Tính chất nhiệt của LKGM-E
Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-E được trình bày trên hình 3.26
Hình 3.26. Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-E.
Độ bền nhiệt độ của sản phẩm thủy phân glucomannan LKGM-E được thể
hiện trên Bảng 3.25.
102
Bảng 3.25. Kết quả phân tích TGA của LKGM-E
Nhiệt độ bắt đầu Nhiệt độ phân hủy Tổn hao khối lượng Mẫu vật liệu phân hủy (oC) mạnh thứ nhất (oC) đến 800oC (%)
LKGM-E 150,01 282,70 93,85
Từ hình 3.26 cho thấy, quá trình phân hủy nhiệt của glucomannan thủy phân
bằng enzym xảy ra ở 3 vùng nhiệt độ rõ rệt: vùng 33÷150oC ứng với mất nước nội
và ngoại phân tử, khối lượng mẫu mất 7,527% tương ứng với độ ẩm của mẫu là
7,53%. Nhiệt độ phân hủy mạnh nhất ở 282,7oC, thấp hơn nhiệt độ phân hủy mạnh
nhất của glucomanan 35,3oC (nhiệt độ phân hủy mạnh nhất của glucomannan là
318oC). Điều này chứng tỏ sản phẩm thủy phân có độ bền nhiệt kém hơn so với
glucomannan ban đầu. Sự giảm khối lượng mẫu ở vùng từ 150÷ 400 oC là 62,22%,
trong khoảng nhiệt độ này xảy ra sự phân hủy các liên kết glycosid trong mạch đại
phân tử hình thành các hợp chất có khối lượng phân tử thấp hơn. Đến 800oC mẫu
phân hủy hoàn toàn.
3.3.3.4. Khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm thủy phân
lim CC 0
Xác định khối lượng phân tử trung bình của hỗn hợp sản phẩm sau thủy phân
bằng phương pháp áp suất thẩm thấu. Giá trị được ngoại suy từ phương trình
biểu diễn mối quan hệ giữa C và π/C (hình 3.29).
Kết quả đo áp suất thẩm thấu của LKGM-E được thể hiện ở bảng 3.26
Bảng 3.26. Áp suất thẩm thấu của các dung dịch sau thủy phân bằng enzym
C(g/100ml) Π Π/C
0,025 2,82 112,8
0,05 9,02 180,4
0,1 32,6 326
0,2 103,2 516
0,3 210,5 701,6
0,4 341,2 853
0,5 452,5 905
103
Hình 3.27. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ (C) và Π/C của LKGM-E
848
)
M
2051
28,
Da
Khối lượng phân tử trung bình của LKGM-E được tính theo công thức 2.7.
n
d
( KT C
lim 0 C
c
Kết quả thực nghiệm cho thấy, sản phẩm thủy phân LKGM-E có khối lượng
phân tử thấp hơn nhiều so với glucomannan ban đầu. Khối lượng phân tử của KGM
giảm từ 1.598 kDa xuống còn 2.051,28 Da.
Điều kiện tối ưu cho phản ứng thuỷ phân tương tự như kết quả của Cheng-
YU Chen và cộng sự [23], tuy nhiên hiệu quả của quá trình thuỷ phân theo mô hình
thực nghiệm của chúng tôi thu được sản phẩm oligo-glucomannan có khối lượng
nhỏ hơn.
3.3.3.5. Độ tan và hiệu suất thu hồi LKGM-E
Konjac glucomannan có khả năng hòa tan trong nước (độ tan đạt 30%). Tuy
nhiên khi tan trong nước Konjac glucomannan có độ trương nở lớn tạo hỗn dịch có
độ nhớt cao vì vậy hạn chế nhiều ứng dụng của glucomannan. Độ tan theo quy trình
trong phần thực nghiệm là 92,5%, hiệu suất thu hồi 75,6%.
Độ tan và các tính chất của konjac glucomannan và sản phẩm thủy phân
được thể hiện ở bảng 3.27 .
104
(kDa)
Độ tan (%)
RM / G
DA
Loại mẫu
1.598
32
1,6
8
Konjac glucomannan (KGM)
Konjac glucomannan thủy phân
bằng axit kết hợp siêu âm
88,561
82,6
1,51
7,03
(LKGM-1)
Konjac glucomannan thủy phân
2,051
92,5
1,2
7,56
bằng enzym (LKGM-E)
Bảng 3.27. Độ tan và các tính chất của Konjac glucomannan và sản phẩm thủy phân
Như vậy, với điều kiện phản ứng tối ưu trên, phản ứng thủy phân
glucomannan với xúc tác enzym đã xảy ra, cắt đứt chọn lọc các liên kết glycosid thu
được sản phẩm oligo glucomannan có khối lượng không quá nhỏ (thu hồi được
75,6%). Kết quả thực nghiệm cho thấy sản phẩm thủy phân konjac glucomannan có
độ tan lớn hơn nhiều so với chất gốc ban đầu. Điều này có ý nghĩa trong việc ứng
dụng glucomannan trong các lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm.
Giả thiết cơ chế thủy phân glucomanann được đề xuất như sau:
Sơ đồ: 3.2. Giả thiết cơ chế thủy phân glucomannan bằng endo-1,4-mannanase
105
Kết luận 3: Áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm loại kế hoạch bậc
hai Box-Behnken đã tìm được chế độ thủy phân tối ưu ở: nhiệt độ= 42,376oC, thời
gian = 5,681 giờ, pH = 7,241, tỉ lệ E/S = 0,536
LKGM-E được cấu tạo bởi các mắt xích D-mannose và D-glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid, có khối lượng phân tử trung bình 2051,28
Da với hiệu suất thu hồi 75,6%. Tỷ lệ M/G là 1,2, độ acetyl hóa DA là 7,56 % và độ
tan 92,5%.
3.4. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E
3.4.1. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vitro
Để tìm hiểu về cơ chế làm hạ đường huyết của glucomannan thủy phân
chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng hoạt hóa của glucomannan và glucomannan
thủy phân đối với enzym AMPK. AMPK là một enzym quan trọng điều hòa năng
lượng của tế bào và được coi như một yếu tố chính tham gia điều hòa chuyển hóa
glucose và lipit ở nhiều cơ quan đặc biệt là cơ vân và gan [6]. Cơ vân là nơi tiêu thụ
glucose chủ yếu trong cơ thể.
Trên chuyển hóa glucose, AMPK tác dụng lên sự dung nạp glucose của cơ
vân thông qua cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc insulin (làm tăng biểu hiện của
gen mã hóa chất vận chuyển glucose vào tế bào cơ (GLUT-4) và hexokinase II, kích
thích tổng hợp glycogen trong cơ bằng cách hoạt hóa dị lập thể glucose–6–
phosphatase, hoạt hóa 2 enzym chính của chu trình axit citric là citrat synthase và
succinat dehydrogenase …)
AMPK có liên quan đến rất nhiều yếu tố khác tham gia vào quá trình chuyển
hóa carbohydrat và lipit trong cơ thể. Nhờ vậy, hoạt hóa AMPK làm giảm tổng hợp
axit béo tự do và làm tăng quá trình oxy hóa trong ty thể do đó làm giảm nồng độ
axit béo tự do và cải thiện sự kháng insulin.
Để đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của mẫu thử, các thí nghiệm thường
được thực hiện trên nguyên tắc đánh giá mức độ biểu hiện của pAMPK (AMPK đã
được phosphoryl hóa ở vị trí threonin 172) trên lô tế bào ủ với mẫu thử và so sánh
với lô chứng (không ủ với mẫu thử). Đây là một trong những phương pháp có độ
106
nhạy cao để đánh giá biểu hiện của một protein cụ thể trong tế bào được áp dụng
khá rộng rãi trong các nghiên cứu được công bố.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tác dụng hoạt hóa AMPK của glucomannan
thủy phân được tiến hành đánh giá trên tế bào cơ vân chuột nhắt nguyên phát
(C2C12) sau khi đã được biệt hóa thành tế bào trưởng thành bằng phương pháp
Western blot. Phương pháp Western blot (còn gọi l phương pháp thẩm tách miễn
dịch – immunobloting) là phương pháp định tính, định lượng protein dựa trên
nguyên tắc miễn dịch. Để xác định sự có mặt cũng như định lượng protein cụ thể
trong mẫu trước hết cần tiến hành điện di nhằm phân tách các protein thành các
băng protein trên bản gel. Các băng protein này được chuyển sang màng lai sau đó
xác định các protein dựa trên nguyên tắc miễn dịch. Đây là phương pháp hiện đại có
độ nhạy cao, phát hiện protein bằng phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể
tương ứng nên cho kết quả có độ tin cậy cao. Tỷ lệ tăng biểu hiện p-AMPK so với
beta-actin của lô tế bào ủ glucomannan so với lô chứng được thể hiện ở bảng 3.28.
Bảng 3.28: Tỷ lệ biểu hiện p-AMPK/ β-actin
Số lần tăng biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ
mẫu thử so với lô chứng Lô Mẫu
Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB SD P
Chứng 1 1 1 1 1
AICAR AICAR 1,33 1,33 0,020 <0,01 1,28 1,38
m100 1,57 1,47 1,70 0,043 <0,05 1,37 LKGM 100μg/ml
m50 1,81 1,81 0,043 <0,05 1,64 1,99 LKGM 50μg/ml
m25 1,78 1,78 0,326 >0,05 1,18 2,38 LKGM 25μg/ml
m12,5 1,59 1,59 0,471 >0,05 1,02 2,16 LKGM 12,5μg/ml
p: so sánh với lô chứng tại cùng thời điểm
107
Hình 3.28: Số lần tăng mức độ biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ với mẫu thử so
với lô chứng
(Phần đánh dấu * là mẫu có khác biệt thống kê so với lô chứng)
So sánh tỷ lệ mức độ biểu hiện p-AMPK/ β-actin của lô tế bào có ủ mẫu thử
với lô chứng (tế bào ủ với dung môi đã dùng để pha các mẫu thử: DMSO) để đánh
giá tác dụng hoạt hóa AMPK của mẫu thử.
Số lần tăng biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ mẫu thử so với lô chứng được
tính bằng tỷ số giữa tỷ lệ mức độ biểu hiện p-AMPK/ β-actin của lô tế bào có ủ mẫu
thử và tỷ lệ mức độ biểu hiện p-AMPK/ β-actin của lô chứng. Chất đối chiếu được
sử dụng là Aicar.Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Hình ảnh mức độ biểu hiện p-
AMPK và actin thu được bằng kỹ thuật Western blot.
Hình ảnh mức độ biểu hiện p-AMPK và actin thu được bằng kỹ thuật
chứng Aicar
m100 m50 m25 m12,5 m6,25
actin
p-AMPK
Western blot được thể hiện trên hình 3.29.
Hình 3.29. Hình ảnh mức độ biểu hiện p-AMPK và actin
108
Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở cùng nồng độ mẫu thử 100 g/ml: tỷ lệ mức độ
biểu hiện của p-AMPK so với β-actin của mẫu thử LKGM-E và chất đối chiếu là
AICAR đều tăng cao hơn rõ rệt so với lô chứng (tế bào ủ với dung môi đã dùng để
pha mẫu thử là DMSO). Ở mẫu ủ với LKGM-E nồng độ 100μg/ml và nồng độ
50μg/ml có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P<0,05). Ở các nồng
độ thấp hơn 25μg/ml và nồng độ 12,5μg/ml không có sự khác biệt thống kê so với
lô chứng (P>0,05). Điều đó chứng tỏ LKGM-E nồng độ 100μg/ml và nồng độ
50μg/ml có khả năng hoạt hóa enzym AMPK. Ở các nồng độ thấp hơn sự hoạt hóa
enzym AMPK là không rõ ràng.
Kết luận 4: LKGM-E ở các nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50 μg/ml làm
tăng đáng kể mức độ biểu hiện của p-AMPK (lần lượt là 1,47 lần và 1,81 lần so với
lô chứng, p<0,05). LKGM-E ở nồng độ thấp hơn 25 g/ml, 12,5 g/ml và 6,25
g/ml không làm tăng mức độ biểu hiện của p-AMPK so với lô chứng. Điều đó
chứng tỏ LKGM-E nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50μg/ml có khả năng hoạt hóa
enzym AMPK.
3.4.2. Tác dụng ức chế dung nạp glucose của LKGM-E trên mô hình in vivo
Từ kết quả in vitro cho thấy LKGM-E có khả năng hoạt hóa enzym AMPK.
Để đánh giá khả năng kích thích sự dung nạp và hấp thu glucose ở chuột nhắt trắng
của glucomannan thủy phân, chúng tôi đánh giá quá trình hấp thu và dung nạp
glucose của chuột nhắt trắng bằng nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống. Thử
khả năng dung nạp glucose là một nghiệm pháp thường được dùng trong các nghiên
cứu gần đây ở Việt Nam và trên thế giới. Trong nghiên cứu này tập trung vào khả
năng dung nạp glucose của chuột nhắt trắng, một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tác
dụng của thuốc điều trị tiểu đường.
Tác dụng giảm dung nạp glucose của LKGM-E
Ảnh hưởng của sản phẩm LKGM-E đến khả năng dung nạp glucose được thể
hiện thông qua sự biến đổi nồng độ glucose huyết của chuột ở thời điểm 30 phút, 60
phút, 90 phút sau khi uống glucose liều 2g/kg thể trọng. Glucose huyết trung bình ở
các thời điểm trước và sau cho uống glucose được trình bày trong bảng 3.29.
109
Bảng 3.29. Glucose huyết ban đầu và sau khi uống glucose
Thời điểm sau uống glucose
Tên lô Ban đầu t = 0 t = 30 phút t = 60 phút t = 120 phút
Lô 1 (ĐC) 4,51 ± 0,51 3,98 ± 0,44 5,32 ± 0,14 5,02 ±0.25 4,12 ± 0,25
3,53 ± 0,34 5,58 ± 0,24 Lô2 4,42 ± 0,51 5,17 ± 0,31 p>0,05 4,04 ± 0,41 p>0,05 LKGM-E (3g/kg) P>0,05 P>0,05
3,22 ± 0,43 5,35 ± 0,55 Lô3 4,28 ± 0,59 5,05 ± 0,43 P<0,05 4,18 ± 0,55 P>0,05 LKGM-E (6g/kg) P>0,05 P<0,05
Lô 4 Glucomannan 3,58 ± 1,14 5,55 ± 0,32 4,38 ± 0,28 5,12 ± 0,23 P<0,05 4,10 ± 0,23 p>0,05 (6g/kg) P>0,05 P>0,05
Lô 5 Glyclazid (10 3,17 ± 0,51 4,06 ± 0,11 4,4 ± 0,62 mg/kg) P<0,01 P<0,01 3,74 ± 0,29 P<0,01 3,17 ± 0,66 P<0,01
p: so sánh với lô chứng tại cùng thời điểm
Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết tại thời điểm uống glucose và sau khi
uống glucose 30 phút so với thời điểm ban đầu được trình bày trong hình 3.30
Hình 3.30. Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết trước và sau 30 phút cho uống
glucose so với thời điểm ban đầu
(Phần đánh dấu * là mẫu có khác biệt thống kê so với lô chứng)
110
Từ kết quả bảng 3.29 và đồ thị hình 3.30 cho thấy, tại thời điểm mới cho
uống glucose, do đã được uống chế phẩm trước 2 giờ và để nhịn đói nên tất cả các
lô đều có hàm lượng glucose giảm. Lô uống gliclazide có độ hạ glucose huyết mạnh
hơn rõ rệt so với lô chứng (P<0,01) vì đây là thuốc hạ glucose huyết theo cơ chế:
kích thích tế bào beta đảo tụy tăng tiết insulin thông qua việc làm tăng độ nhạy cảm
của các tế bào này với glucose. Tác dụng hạ glucose của các lô cho uống chế phẩm
glucomannan và glucomannan thủy phân không khác biệt so với lô chứng. Thời
điểm 30 phút sau khi cho uống glucose, vì đã uống glucose được 30 phút (2g/kg thể
trọng) nên tỷ lệ ％ glucose huyết tăng ở tất cả các lô. Điều này là phù hợp với sự
hấp thu glucose của cơ thể. Sau khi uống glucose được hấp thụ qua thành ruột vào
máu rất nhanh nên hàm lượng glucose trong máu tăng dần và đạt nồng độ cao nhất
trong máu sau khi uống 30 phút ở tất cả các mẫu thử nghiệm.
Ở thời điểm này các lô thứ 3 thứ 4 và thứ 5 có tỷ lệ ％ tăng glucose huyết
thấp hơn so với lô 1 (lô đối chứng), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P≤ 0,05).
Điều này có thể thấy các chế phẩm glucomannan thủy phân với liều 6g/kg cân nặng
có khả năng giảm dung nạp glucose ở ruột. Điều này được giải thích do
glucomannan là chất xơ hòa tan có độ nhớt cao, khả năng trương nở lớn làm tăng
cảm giác no và làm giảm hấp thu đường huyết giúp ổn định đường huyết. Kết quả
nghiên cứu cho phép giải thích ứng dụng chủ yếu của glucomannan tại các nước
phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ và các nước Châu Âu đã sử dụng
glucomannan như một loại thực phẩm ăn kiêng cho những người mắc bệnh về
chuyển hóa như tiểu đường, mỡ máu và béo phì.
Ảnh hưởng của LKGM-E trên khả năng dung nạp glucose
Sau khi uống glucose được hấp thụ trực tiếp vào máu qua thành ruột. Hàm
lượng glucose huyết tăng dần sau khi uống. Sau đó glucose được chuyển hóa một
phần dự trữ trong gan dưới dạng glycogen, một phần vận chuyển vào các tế bào để
chuyển hóa glucose tạo năng lượng cho hoạt động của tế bào theo ba con đường:
con đường đường phân biến glucose thành pyruvat, con đường hexose
monophotphat và con đường tạo axit glucuronic và axit ascorbic. Hàm lượng
glucose huyết giảm dần, tốc độ giảm phụ thuộc vào quá trình thoái hóa glucose. Để
111
hạ glucose huyết ngoài việc giảm hấp thu còn một biện pháp khác là tăng khả năng
dung nạp glucose ở tế bào. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của KGM và LKGM-E
đến khả năng dung nạp glucose được trình bày ở và hình 3.31.
Hình 3.31. Glucose huyết trước và sau khi cho uống LKGM-E và KGM
Thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi uống glucose, ở tất cả các lô hàm
lượng glucose máu đều giảm so với ban đầu. Điều này là phù hợp với quá trình
chuyển hoá glucose, sau khi đi vào máu glucose được chuyển hóa một phần thành
glycogen dự trữ ở gan, một phần chuyển đến các tế bào để chuyển hóa thành năng
lượng vì vậy hàm lượng glucose máu đều giảm. Ở lô thứ 5, chuột được cho uống
thuốc glyclazide là thuốc hạ đường huyết nên tỷ lệ % hạ glucose huyết mạnh nhất.
Các lô thứ 3,4, được cho uống chế phẩm glucomannan và glucomannan thủy phân
hàm lượng 6g/kg có tỷ lệ % hạ glucose huyết lớn hơn so với lô 1, khác biệt có ý
nghĩa P<0,05. Điều này chứng tỏ các chế phẩm từ glucomannan với liều 6g/kg
ngoài việc có tác dụng làm giảm sự dung nạp glucose ở ruột còn có khả năng kích
thích sự chuyển hóa tiêu thụ glucose. Tại thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi
uống glucose tỷ lệ % hạ glucose huyết ở lô uống glucomannan thủy phân với liều
3g/kg thể trọng không khác biệt so với lô chứng (P>0,05%), điều đó chứng tỏ khả
năng kích thích sự dung nạp glucose ở liều 3g/kg thể trọng của glucomannan thủy
phân không hiệu quả.
112
Tại thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi uống glucose, tỷ lệ hạ glucose
huyết ở lô uống glucomannan thủy phân cao hơn so với lô uống glucomannan cùng
liều lượng 6g/kg cân nặng. Khác biệt này có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Điều này
chứng tỏ sản phẩm thủy phân có khả năng kích thích sự dung nạp glucose tốt hơn so
với glucomannan ban đầu. Kết quả này phù hợp với kết quả thực nghiệm trên in
vivo. Vì LKGM-E có khả năng hoạt hóa enzym AMPK là enzym hoạt hóa kích
thích các quá trình sinh ra năng lượng như: tăng quá trình photphoryl hóa [84]–[88.
Chính vì vậy lượng glucose khi hấp thu vào máu được vận chuyển nhiều vào tế bào
và chuyển hóa thành Glucose-6-phosphat được đốt cháy tạo năng lượng cung cấp
cho các hoạt động của tế bào.
Bên cạnh đó, các nghiên cứu còn chỉ ra rằng, việc hoạt hóa enzym AMPK có
khả năng thúc đẩy quá trình tạo glycogen ở gan. Vì vậy, glucomannan thủy phân có
khả năng hoạt hóa enzym AMPK nên khi glucose được hấp thu vào máu, hàm
lượng glucose tham gia vào quá trình tạo glycogen dự trữ ở gan tăng lên làm lượng
glucose đi vào máu giảm làm giảm glucose huyết. Ngoài ra glucomannan còn có
tiềm năng trong việc hạ cholesterol máu. Điều này có ý nghĩa trong việc tạo ra các
chế phẩm cho người mắc các bệnh về chuyển hóa.
Kết luận 5: Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của glucomannan và
glucomannan thủy phân đến khả năng hấp thụ và dung nạp glucose trên chuột nhắt
trắng. Glucomannan và glucomannan thủy phân được sử dụng với liều 3g/kg cân
nặng và 6g/kg cân nặng. Kết quả cho thấy ở lô chuột uống glucomannan và
glucomannan thủy phân với liều 3g/kg cân nặng khả năng hấp thụ và dung nạp
glucose đều không có khác biệt so với lô chứng.
Nồng độ glucose ở lô uống Glucomannan thủy phân với liều 6g/kg cân nặng
khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Điều đó cho thấy glucomannan thủy
phân có khả năng làm giảm sự hấp thu glucose ở ruột. Trong đó glucomannan thủy
phân có khả năng kích thích sự dung nạp glucose tốt hơn so với glucomannan, khác
biệt này có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
113
KẾT LUẬN CHUNG
Từ các kết quả thu được, chúng tôi rút ra các kết luận chung sau:
1. Đã tách, tinh chế và xác định được cấu trúc, tính chất của glucomannan từ
củ nưa A.konjac ( Amorphophallus Konjac K.Koch):
- Hàm lượng glucomannan trong củ A.konjac K.Koch tại Lâm Đồng, Việt
Nam là 12,26% trong củ tươi. Bột KGM đạt độ sạch 92%, hàm lượng tro 4,17%, độ
hút ẩm 9%, hàm lượng Asen 0,208 ppm, hàm lượng chì 0,184 ppm.
- Glucomannan tách từ cây A.konjac có cấu trúc vô định hình, được cấu tạo
bởi các mắt xích D-mannose và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4)
glycosid, phân nhánh tại vị trí C6, tỷ lệ manose/glucose là 1,6/1, độ axetyl hóa ≈8%,
độ tan 32%, khối lượng phân tử 1.598 kDa.
2. Đã nghiên cứu phản ứng thủy phân KGM xúc tác axit và xác định được
cấu trúc tính chất của sản phẩm LKGM-1:
- Phản ứng thủy phân glucomannan bằng hỗn hợp axit thực hiện ở điều kiện:
tỷ lệ KGM/dd axit: 1/10 (g/ml); [HCl] 0,15M; CH3COOH 10%; nhiệt độ phản ứng
50oC; thời gian phản ứng 6 giờ khi không kết hợp sóng siêu âm và trong 4 giờ khi
có kết hợp sóng siêu âm.
- LKGM-1 có khối lượng phân trung bình 88,561 kDa, độ tan trong nước
82,6%. LKGM-1 cấu tạo bởi các mắt xích D-mannose và D-glucose liên kết với
nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid , tỷ lệ M/G là 1,51, DA của LKGM-1 là
7,03%.
3. Đã nghiên cứu phản ứng thủy phân KGM xúc tác enzym β-mannanase và
xác định được cấu trúc tính chất của sản phẩm LKGM-E.
- Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm loại kế hoạch bậc hai Box-
Behnken đã tìm được chế độ thủy phân tối ưu ở: nhiệt độ= 42,376oC, thời gian =
5,681 giờ, pH = 7,241, tỉ lệ E/S = 0,536.
114
- LKGM-E được cấu tạo bởi các mắt xích D-mannose và D-glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid, có khối lượng phân tử trung bình 2051,28
Da với hiệu suất thu hồi 75,6%. Tỷ lệ M/G là 1,2, độ acetyl hóa DA là 7,56 % và độ
tan 92,5%.
4. Đã nghiên cứu được khả năng hoạt hóa enzym AMPK của LKGM-E:
LKGM-E ở các nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50μg/ml có khả năng hoạt hóa
enzym AMPK. Mức độ biểu hiện của p-AMPK ở nồng độ 100μg/ml là 1,47 lần và
ở nồng độ 50μg/ml là 1,81 lần so với lô chứng (p<0,05)
5. Đã đánh giá được ảnh hưởng của KGM và LKGM-E đến khả năng dung
nạp glucose của chuột nhắt trắng.
LKGM-E với liều 6g/kg cân nặng có khả năng làm giảm sự hấp thu glucose
ở ruột (p<0,05). Glucomannan thủy phân có khả năng kích thích sự dung nạp
glucose tốt hơn so với glucomannan (p<0,05).
Với các kết quả nhận được của nghiên cứu cho thấy glucomannan từ cây
Amorphophallus konjac K.Koch và sản phẩm thủy phân của nó có nhiều tiềm năng
ứng dụng, đặc biệt là trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe.
115
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN
ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
1. Do Truong Thien, Tran Thi Nu, Nguyen Hong Vinh, “Preparation of Low Molecular Weight Glucomannan from A. Konjac K. Koch in Vietnam by Enzyme Catalyzed Hydrolysis Reaction and its Prospective use to Lower Blood Sugar Levels”, Academic journal of polymer science, Volume 2 - issue 2- January 2019.
2. Tran Thi Nu, Tran Thi Y Nhi, Do Truong Thien, “Chemical structure of Konjac glucomannano oligosaccharides prepared by endo-1-4 β mannanase” Tạp chí Hóa học, Vol 57 (4e3,4), p.291-295, 2019.
3. Tran Thi Y Nhi, Tran Thi Nu, Do Truong Thien, Lai Thi Thuy, Le Thi Thanh Ha, Pham Thi Bich Hanh, Le Quang Tuan, Trinh Duc Cong, “Response surface methodology for hydorolysis parameter optimization of Konjac glucomannan using endo-1,4 β mannanase” Tạp chí Hóa học, Vol 57 (4e3,4), p.296-300, 2019.
4. Trần Thị Nữ, Trần Thị Ý Nhi, Đỗ Trường Thiện, Phạm Thị Bích Hạnh, “Nghiên cứu phản ứng thủy phân glucomannan bằng axit kết hợp sử dụng sóng siêu âm và khảo sát cấu trúc của sản phẩm”, Tạp chí Hóa học, 54 (6e1), trang 61-66, 2016
5. Nguyen Van Minh Khoi, Do Truong Thien, Le Minh Ha, Tran Van Thanh, Le Ngoc Hung, Tran Thi Nu, “New lab-scale process for producing glucomannan flour in Viet Nam and their characterization, part 2”, from Amorphophallus plant proceedings of scientific workshop on progress and trends in science and technology, p.225-232, 2016.
6. Trần Thị Ý Nhi, Trần Thị Nữ, Lại Thị Thúy, Đỗ Trường Thiện, Nguyễn Văn Dư, Phạm Thị Bích Hạnh, “Nghiên cứu cấu trúc hóa học của glucomannan từ củ cây Nưa Amorphophallus konjac K. Koch thu tại Hà Giang Việt Nam”, Tạp chí Hóa học 52(6A), p.228-232, 2014
116
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[[1] K. Katsuraya, K. Okuyama, K. Hatanaka, R. Oshima, T. Sato, and K. Matsuzaki, “Constitution of konjac glucomannan: Chemical analysis and 13C NMR spectroscopy” Carbohydr. Polym., vol. 53, no. 2, pp. 183–189, 2003.
[2]
S. S. Behera and R. C. Ray, “Konjac glucomannan, a promising polysaccharide of Amorphophallus konjac K. Koch in health care” Int. J. Biol. Macromol., vol. 92, pp. 942–956, 2016.
[3] M. Alonso-Sande, D. Teijeiro-Osorio, M. J. Alonso, “Glucomannan, a promising polysaccharide for biopharmaceutical purposes” Eur. J. Pharm. Biopharm., vol. 72, no. 2, pp. 453–462, 2009.
[4] M. Chua, T. C. Baldwin, T. J. Hocking, and K. Chan, “Traditional uses and potential health benefits of Amorphophallus konjac K. Koch ex N.E.Br.” J. Ethnopharmacol., vol. 128, no. 2, pp. 268–278, 2010.
[5] C. Zhang, J. Da Chen, and F. Q. Yang, “Konjac glucomannan, a promising polysaccharide for OCDDS” Carbohydr. Polym., vol. 104, no. 1, pp. 175–181, 2014.
[6] N. V. Dư, “Nghiên cứu trồng và phát triển cây Nưa konjac (Amorphoph-allus) và một số loài khác trong chi Nưa (họ Ráy – Araceae) ở Việt Nam hướng tới việc lấy củ làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng và thuốc điều trị bệnh tiểu đường, mỡ máu và béo phì” Báo cáo tổng kết đề tài cấp Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2012.
[7] V. Dave, M. Sheth, S. P. Mccarthy, J. Ann, and D. L. Kaplan, “Liquid crystalline, rheological and thermal properties of konjac glucomannan” vol. 39, no. 5, pp. 1139–1148, 1998.
[8] J. Liu et al., “Preparation, composition analysis and antioxidant activities of konjac oligo-glucomannan” Carbohydr. Polym., vol. 130, pp. 398–404, 2015.
[9] R. F. Tester and F. H. Al-Ghazzewi, “Beneficial health characteristics of native and hydrolysed konjac (Amorphophallus konjac) glucomannan” J. Sci. Food Agric., vol. 96, no. 10, pp. 3283–3291, 2016.
[10] M. Jiang, H. Li,
J.-S. Shi, and Z.-H. Xu, “Depolymerized konjac glucomannan: preparation and application in health care *” J Zhejiang Univ- Sci B (Biomed Biotechnol), vol. 19, no. 7, pp. 505–514, 2018.
[11] L. John and A. Jeffery, “Beneficial effects of viscous dietary fiber from Konjac-mannan in Subjects With the Insulin Resistance Syndrome” vol. 23, no. 1, pp. 9–14, 2000.
[12]
J. Liu, Y. Zhang, Y. Yin, F. Peng, P. Cai, and S. Yang, “Controlled acid hydrolysis and acetylation of glucomannans as drug carriers with designed pharmacokinetic behaviors” J. Control. Release, vol. 152, no. 2011, pp. e61– e62, 2011.
[13] C. T. Bishop, “Enzymic hydrolysis of a glucomannan from Jack Pine (Pinus banksiana Lamb)’ For personal use only. The constitutions of glucomannans
117
from a variety of softwoods have been studied extensively during the past 10 years and much of this work has been summa” vol. 39, no. 6205, 1961.
[14] K. Kato and K. Matsuda, “Studies on the Chemical Structure of Konjac Mannan: Part I. Isolation and Characterization of Oligosaccharides from the Partial Acid Hydrolyzate of the Mannan” Agric. Biol. Chem., vol. 33, no. 10, pp. 1446–1453, 1969.
[15] P. Cescutti, C. Campa, F. Delben, and R. Rizzo, “Structure of the oligomers obtained by enzymatic hydrolysis of the glucomannan produced by the plant Amorphophallus konjac” Carbohydr. Res., vol. 337, no. 24, pp. 2505–2511, 2002.
[16] G. Li, L. Qi, A. Li, R. Ding, and M. Zong, “Study on the kinetics for enzymatic degradation of a natural polysaccharide, Konjac glucomannan” Macromol. Symp., vol. 216, pp. 165–178, 2004.
[17] S. Albrecht, M. G. C. J. van, J. Xu, H. A. Schols, A. G. J. Voragen, and H. Gruppen, “Enzymatic production and characterization of konjac glucomannan oligosaccharides” J. Agric. Food Chem., vol. 59, no. Copyright (C) 2012 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved., pp. 12658–12666, 2011.
[18] X. Luo, X. Yao, C. Zhang, X. Lin, and B. Han, “Preparation of mid-to-high molecular weight konjac glucomannan (MHKGM) using controllable enzyme-catalyzed degradation and investigation of MHKGM properties” J. Polym. Res., vol. 19, no. 4, 2012.
[19] F. H. Al-Ghazzewi and R. F. Tester, “Efficacy of cellulase and mannanase hydrolysates of konjac glucomannan to promote the growth of lactic acid bacteria” J. Sci. Food Agric., vol. 92, no. 11, pp. 2394–2396, 2012.
[20]
J. Chen, D. Liu, B. Shi, H. Wang, Y. Cheng, and W. Zhang, “Optimization of hydrolysis conditions for the production of glucomanno-oligosaccharides from konjac surface methodology” response by using β-mannanase Carbohydr. Polym., vol. 93, no. 1, pp. 81–88, 2013.
[21]
J. Liu, N. Li, P. Cai, and S. Yang, “Kinetics of the enzymatic hydrolysis of glucomannan from Bletilla striata by β-mannanase” J. Control. Release, vol. 172, no. 1, p. e40, 2013.
[22] A. Mikkelson, H. Maaheimo, and T. K. Hakala, “Hydrolysis of konjac glucomannan by Trichoderma reesei mannanase and endoglucanases Cel7B and Cel5A for the production of glucomannooligosaccharides” Carbohydr. Res., vol. 372, pp. 60–68, 2013.
[23] C. Y. Chen, Y. C. Huang, T. Y. Yang, J. Y. Jian, W. L. Chen, and C. H. Yang, “Degradation of konjac glucomannan by Thermobifida fusca thermostable β- mannanase from yeast transformant” Int. J. Biol. Macromol., vol. 82, pp. 1–6, 2016.
[24] W. Jian et al., “Study on preparation and separation of Konjac oligosaccharides” Carbohydr. Polym., vol. 92, no. 2, pp. 1218–1224, 2013.
118
[25] H. L. Chen, Y. H. Fan, M. E. Chen, and Y. Chan, “Unhydrolyzed and hydrolyzed konjac glucomannans modulated cecal and fecal microflora in Balb/c mice” Nutrition, vol. 21, no. 10, pp. 1059–1064, 2005.
[26] L. H. Cheng, H. Nur Halawiah, B. N. Lai, H. M. Yong, and S. L. Ang, “Ultrasound mediated acid hydrolysis of konjac glucomannan” Int. Food Res. J., vol. 17, no. 4, pp. 1043–1050, 2010.
[27] W. Jin et al., “Degraded konjac glucomannan by ??-ray irradiation assisted with ethanol: Preparation and characterization” Food Hydrocoll., vol. 36, pp. 85–92, 2014.
[28] W. Jin et al., “Synergistic degradation of konjac glucomannan by alkaline and thermal method” Carbohydr. Polym., vol. 99, pp. 270–277, 2014.
[29] R. P. Millane and T. L. Hendrixson, “Crystal structures of mannan and glucomannans” Carbohydr. Polym., vol. 25, no. 4, pp. 245–251, 1994.
[30] L. Huang, R. Takahashi, S. Kobayashi, T. Kawase, and K. Nishinari, and acetylated konjac glucomannan” “Gelation behavior of native Biomacromolecules, vol. 3, no. 6, pp. 1296–1303, 2002.
[31]
J. Y. Liu, H. C. Wang, Y. Yin, N. Li, P. L. Cai, and S. L. Yang, “Controlled acetylation of water-soluble glucomannan from Bletilla striata” Carbohydr. Polym., vol. 89, no. 1, pp. 158–162, 2012.
[32] B. Herranz, A. J. Borderias, B. Solo-de-Zald??var, M. T. Solas, and C. A. Tovar, “Thermostability analyses of glucomannan gels. Concentration influence” Food Hydrocoll., vol. 29, no. 1, pp. 85–92, 2012.
[33] B. Herranz, C. A. Tovar, B. Solo-de-Zaldívar, and A. J. Borderias, “Influence of alkali and temperature on glucomannan gels at high concentration” LWT - Food Sci. Technol., vol. 51, no. 2, pp. 500–506, 2013.
[34] X. Du, J. Li, J. Chen, and B. Li, “Effect of degree of deacetylation on physicochemical and gelation properties of konjac glucomannan” Food Res. Int., vol. 46, no. 1, pp. 270–278, 2012.
[35] C. Wang, M. Xu, W. Lv, P. Qiu, Y. Gong, and D. Li, “Study on Rheological Behavior of Konjac Glucomannan” 2012 Int. Conf. Med. Phys. Biomed. Eng., vol. 33, pp. 25–30, 2012.
[36] B. Herranz, C. A. Tovar, B. Solo-de-Zaldívar, and A. J. Borderias, “Effect of alkalis on konjac glucomannan gels for use as potential gelling agents in restructured seafood products” Food Hydrocoll., vol. 27, no. 1, pp. 145–153, 2012.
[37]
J. Wang, C. Liu, Y. Shuai, X. Cui, and L. Nie, “Controlled release of anticancer drug using graphene oxide as a drug-binding effector in konjac glucomannan/sodium alginate hydrogels” Colloids Surfaces B Biointerfaces, vol. 113, pp. 223–229, 2014.
[38] K. Wang and Z. He, “Alginate-konjac glucomannan-chitosan beads as controlled release matrix” Int. J. Pharm., vol. 244, no. 1–2, pp. 117–126, 2002.
119
[39] S. Gao, J. Guo, and K. Nishinari, “Thermoreversible konjac glucomannan gel crosslinked by borax” Carbohydr. Polym., vol. 72, no. 2, pp. 315–325, 2008.
[40] M. Xu et al., “Comparative study on molecular weight of konjac light scattering- glucomannan by gel permeation chromatography-laser refractive index and laser light-scattering methods” J. Spectrosc., vol. 1, no. 1, pp. 2–6, 2013.
[41] B. Li and B. J. Xie, “Single molecular chain geometry of konjac glucomannan as a high quality dietary fiber in East Asia” Food Res. Int., vol. 39, no. 2, pp. 127–132, 2006.
[42] F. Liu, X. Luo, and X. Lin, “Adsorption of tannin from aqueous solution by deacetylated konjac glucomannan” J. Hazard. Mater., vol. 178, no. 1–3, pp. 844–850, 2010.
[43] F. Liu et al., “Removal of copper(II) using deacetylated konjac glucomannan conjugated soy protein isolate” Int. J. Biol. Macromol., vol. 86, pp. 338–344, 2016.
[44] B. Solo-de-Zaldívar, C. A. Tovar, A. J. Borderías, and B. Herranz, “Effect of deacetylation on the glucomannan gelation process for making restructured seafood products” Food Hydrocoll., vol. 35, pp. 59–68, 2014.
[45] X. Lin, Q. Wu, X. Luo, F. Liu, X. Luo, and P. He, “Effect of degree of acetylation on thermoplastic and melt rheological properties of acetylated konjac glucomannan” Carbohydr. Polym., vol. 82, no. 1, pp. 167–172, 2010.
[46] C. Niu, W. Wu, Z. Wang, S. Li, and J. Wang, “Adsorption of heavy metal konjac by from aqueous crosslinked solution ions carboxymethyl glucomannan” J. Hazard. Mater., vol. 141, no. 1, pp. 209–214, 2007.
[47] L. G. Chen, Z. L. Liu, and R. X. Zhuo, “Synthesis and properties of degradable hydrogels of konjac glucomannan grafted acrylic acid for colon- specific drug delivery” Polymer (Guildf)., vol. 46, no. 16, pp. 6274–6281, 2005.
[48] J. L. Slavin, “Dietary fiber and body weight” Nutrition, vol. 21, no. 3, pp. 411–418, 2005.
[49] C. D. Jensen, W. Haskell, and J. H. Whittam, “Long-term effects of water- soluble dietary fiber in the management of hypercholesterolemia in healthy men and women” Am. J. Cardiol., vol. 79, no. 1, pp. 34–7, 1997.
[50] S. Chearskul et al., “Immediate and long-term effects of glucomannan on total ghrelin and leptin in type 2 diabetes mellitus” Diabetes Res. Clin. Pract., vol. 83, no. 2, pp. 2008–2010, 2009.
[51] H.-L. Chen, W. H.-H. Sheu, T.-S. Tai, Y.-P. Liaw, and Y.-C. Chen, “Konjac supplement alleviated hypercholesterolemia and hyperglycemia in type 2 diabetic subjects--a randomized double-blind trial” J. Am. Coll. Nutr., vol. 22, no. 1, pp. 36–42, 2003.
[52] B. Li et al., “Health benefits of konjac glucomannan with special focus on diabetes” Bioact. Carbohydrates Diet. Fibre, vol. 5, no. 2, pp. 179–187, 2015.
120
[53] B. M. Zalewski, A. Chmielewska, and H. Szajewska, “The effect of glucomannan on body weight in overweight or obese children and adults: A systematic review of randomized controlled trials” Nutrition, vol. 31, no. 3, pp. 437–442, 2015.
[54] M. F. Mccarty, “Glucomannan minimizes the postprandial insulin surge: a potential adjuvant for hepatothermic therapy” Scand. J. Gastroenterol. Suppl., vol. 58, pp. 487–490, 2002.
[55] N. Sood, W. L. Baker, and C. I. Coleman, “Effect of glucomannan on plasma lipid and glucose concentrations, body weight, and blood pressure: systematic review and meta-analysis” Am. J. Clin. Nutr., vol. 88, no. 4, pp. 1167–1175, 2008.
[56]
I. Peter et al., “Compositions containing alginate and gums to improve bioadhesive properties for treatment of disorders of the esophagus” vol. 1, no. 12, 2003.
[57] Y. Q. Zhang, B. J. Xie, and X. Gan, “Advance in the applications of konjac glucomannan and its derivatives” Carbohydrate Polymers. 2005.
[58] Trần Thị Ý Nhi, “Nghiên cứu quy trình tách chiết, cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của glucomannan từ cây Nưa-Amorphophallus sp. (họ ráy - Araceae)”, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2014.
[59] W. Xu et al., “A simple and feasible approach to purify konjac glucomannan from konjac flour - Temperature effect” Food Chem., vol. 158, pp. 171–176, 2014.
[60] W. Fang and P. Wu, “Variations of Konjac glucomannan (KGM) from Amorphophallus konjac and its refined powder in China” Food Hydrocoll., vol. 18, no. 1, pp. 167–170, 2004.
[61] F. Zhu, “Modifications of konjac glucomannan for diverse applications” Food Chem., vol. 256, no. September 2017, pp. 419–426, 2018.
for
[62] M. Chua, K. Chan, T. J. Hocking, P. A. Williams, C. J. Perry, and T. C. Baldwin, “Methodologies the extraction and analysis of konjac glucomannan from corms of Amorphophallus konjac K. Koch” Carbohydr. Polym., vol. 87, no. 3, pp. 2202–2210, 2012.
[63] S. Kanlayanarat,
J. Zhao, D. Zhang, G. and C. Srzednicki, Borompichaichartkul, “Development of a low-cost two-stage technique for production of low-sulphur purified konjac flour” Int. Food Res. J., vol. 17, no. 4, pp. 1113–1124, 2010.
[64] The Ministry of the People’s Republic of China, “Professional standard of the People”, Republic of China for konjac flour, 2002.
[65] S. L. Yeh, M. S. Lin, and H. L. Chen, “Partial hydrolysis enhances the inhibitory effects of konjac glucomannan from Amorphophallus konjac C. Koch on DNA damage induced by fecal water in Caco-2 cells” Food Chem., vol. 119, no. 2, pp. 614–618, 2010.
121
[66] T. Pan et al., “Synergetic degradation of konjac glucomannan by γ-ray irradiation and hydrogen peroxide” Carbohydr. Polym., vol. 93, no. 2, pp. 761–767, 2013.
[67] Y. H. Mao, A. X. Song, Z. P. Yao, and J. Y. Wu, “Protective effects of natural and partially degraded konjac glucomannan on Bifidobacteria against antibiotic damage” Carbohydr. Polym., vol. 181, no. August 2017, pp. 368– 375, 2018.
[68] Y. Ni, D. Liu, J. Pang, W. Lin, C. Wu, and L. Wang, “Physicochemical properties of degraded konjac glucomannan prepared by laser assisted with hydrogen peroxide”, vol. 129. Elsevier B.V, 2019.
[69] Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải, “Động học các quá trình xúc tác sinh học”, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2016, Hà Nội.pdf..
[70] Nguyễn Hữu Chấn, “Enzym và xúc tác sinh học”, Nxb Y học, 1983.
[71] S. Dhawan and J. Kaur, “Microbial mannanases: An overview of production and applications” Crit. Rev. Biotechnol., vol. 27, no. 4, pp. 197–216, 2007.
[72] P. S. Chauhan, N. Puri, P. Sharma, and N. Gupta, “Mannanases: Microbial sources, production, properties and potential biotechnological applications” Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 93, no. 5, pp. 1817–1830, 2012.
[73] S. G. Withers, “Mechanisms of glycosyl transferases and hydrolases” Carbohydr. Polym., vol. 44, no. 4, pp. 325–337, 2001.
[74] P. S. Chauhan and N. Gupta, “Insight into microbial mannosidases: a review” Crit. Rev. Biotechnol., vol. 37, no. 2, pp. 190–201, 2017.
this [75] W. Xia et al., “A novel glycoside hydrolase family 113 endo-β-1,4- mannanase from Alicyclobacillus sp. strain A4 and insight into the substrate recognition and catalytic mechanism of family” Appl. Environ. Microbiol., vol. 82, no. 9, pp. 2718–2727, 2016.
[76] P. K. Srivastava and M. Kapoor, “Production, properties, and applications of endo-beta-mannanases” Biotechnol Adv, vol. 35, no. 1, pp. 1–19, 2016.
[77] W. H. van Zyl, S. H. Rose, K. Trollope, “Fungal β-mannanases: Mannan hydrolysis, heterologous production and biotechnological applications” Process Biochem., vol. 45, no. 8, pp. 1203–1213, 2010.
[78] M. N. Domingues et al., “Structural basis of exo--mannanase activity in the GH2 family” J. Biol. Chem., vol. 293, no. 35, pp. 13636–13649, 2018.
exo-1,3/1,4-β-glucanase from marine activity of
[79] Y. Nakatani, S. M. Cutfield, N. P. Cowieson, and J. F. Cutfield, “Structure and bacterium Pseudoalteromonas sp. BB1 showing a novel C-terminal domain” FEBS J., vol. 279, no. 3, pp. 464–478, 2012.
[80] M. Jiang et al., “Subchronic toxicity and genotoxicity assessment of low molecular mass konjac mannan oligosaccharide in vitro and in vivo” Prog. Biochem. Biophys., vol. 43, no. 3, pp. 271–280, 2016.
[81] Nguyễn Nghiêm Luật, “Hóa sinh- sách đào tạo Bac sỹ đa khoa”, NXB Y Học,
122
2012, Hà Nội.
[82] Tạ Thành Văn, “Hóa sinh lâm sàng- sách đào tạo đại học Y”, NXB Y học, 2013, Hà Nội.
[83] H. M. O’Neill, “AMPK and exercise: Glucose uptake and insulin sensitivity” Diabetes Metab. J., vol. 37, no. 1, pp. 1–21, 2013.
[84] N. Musi, T. Hayashi, N. Fujii, M. F. Hirshman, L. A. Witters, and L. J. Goodyear, “AMP-activated protein kinase activity and glucose uptake in rat skeletal muscle” Am. J. Physiol. Metab., vol. 280, no. 5, pp. E677–E684, 2017.
[85] T. L. Scheffler, “AMP-activated Protein Kinase and Muscle Metabolism” vol. 1, pp. 337–345, 2012.
[86] A. Gruzman, G. Babai, and S. Sasson, “Adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) as a new target for antidiabetic drugs: A review on metabolic, pharmacological and chemical considerations” Rev. Diabet. Stud., vol. 6, no. 1, pp. 13–36, 2009.
[87] E. A. Richter and N. B. Ruderman, “AMPK and the biochemistry of exercise: Implications for human health and disease” Biochem. J., vol. 418, no. 2, pp. 261–275, 2009.
[88] S. B. Jørgensen et al., “Role of AMPKα2 in basal, training-, and AICAR- induced GLUT4, hexokinase II, and mitochondrial protein expression in mouse muscle” Am. J. Physiol. - Endocrinol. Metab., vol. 292, no. 1, pp. 331– 339, 2007.
[89] Trần Thị Thùy Linh, “Thăm dò cơ chế tác dụng hạ đường huyết của phân đoạn n-hexan rễ cây Chóc máu Nam trên mô hình nuôi cấy tế bào cơ vân C2C12”, Luận văn Thạc sỹ Dược học, 2013.
[90] M. Foretz, B. Guigas, L. Bertrand, M. Pollak, and B. Viollet, “Metformin: From mechanisms of action to therapies” Cell Metab., vol. 20, no. 6, pp. 953– 966, 2014.
[91] N. K. LeBrasseur et al., “Thiazolidinediones can rapidly activate AMP- activated protein kinase in mammalian tissues” Am. J. Physiol. - Endocrinol. Metab., vol. 291, no. 1, 2006.
[92] Nguyễn Tiến An, “Nghiên cứu thành phần hóa học, quy trình tách chiết, biến tính hóa học và khả năng ứng dụng của glucomannan từ cử một số loài nưa (Amorphophallus SP Araceae) ở Việt Nam”, Luận án Tiến sĩ, Viện Hóa học, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, 2012.
[93] Lê Ngọc Hùng, “Nghiên cứu kỹ thuật trồng, phát triển một số loài thuộc chi Nưa (Amorphophallus Blume Ex Decne) và quy trình công nghệ chế biến glucomannan tại Tây Nguyên”, Báo cáo tổng hợp kết quả đề tài, Chương trình Tây Nguyên 3, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ, 2016.
[94] A. Einbu, H. Grasdalen, and K. M. Vårum, “Kinetics of hydrolysis of chitin/chitosan oligomers in concentrated hydrochloric acid” Carbohydr. Res., vol. 342, no. 8, pp. 1055–1062, 2007.
123
[95] Gonotec, “OSMOMAT 090 User Guide Version1.0” GSG-Hof Reuchlinstr. 10-11 10553, Berlin Germany pp. 1055–1062, 2007.
[96] Kamesh R Ayasolla, Shailendra Giri, Avtar K Singh and Inderjit Singh*, "5- aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranoside (AICAR) attenuates the expression of LPS- and Aβ peptide-induced inflammatory mediators in astroglia", Journal of Neuroinflammation, 2:21 doi:10.1186/1742-2094-2-21, 2005
124
