BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
PHAN THỊ VIỆT HÀ
NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA
LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG
ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT
ĐÀ NẴNG 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
PHAN THỊ VIỆT HÀ
NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA
LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG
ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm
Mã số : 62.54.01.01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. ĐẶNG MINH NHẬT
PGS.TS. TRẦN THỊ XÔ
ĐÀ NẴNG 2021
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi
nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định.
Người cam đoan
Phan Thị Việt Hà
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài .....................................................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................................3 3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................................3 4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................................4
4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết .............................................................. 4
4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm ........................................................ 4 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...............................................................................5 6. Bố cục của luận án ...................................................................................................................5
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 6 1.1. Tổng quan về lipase ..............................................................................................................6
1.1.1. Nguồn thu nhận lipase .............................................................................. 7
1.1.2. Cấu trúc và cơ chế xúc tác của lipase ....................................................... 8
1.1.3. Tính đặc hiệu của lipase ......................................................................... 10
1.1.4. Các hệ phản ứng cho lipase xúc tác ........................................................ 11 1.2. Lipase thực vật .................................................................................................................. 12
1.2.1. Khả năng xúc tác của lipase thực vật ..................................................... 12
1.2.2. Một số nguồn lipase từ thực vật ............................................................. 13
1.2.3. Phƣơng pháp chiết tách lipase từ thực vật ..................................................... 17
1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ của lipase thực vật .......................... 19
1.2.5. Ứng dụng của lipase thực vật ................................................................. 21
1.2.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm ........................................................ 21
1.2.5.2. Trong công nghiệp dƣợc ................................................................. 22
1.2.5.3. Trong các lĩnh vực khác .................................................................. 23
1.3. Dầu cá và ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá ........................... 24
1.3.1. Dầu cá ..................................................................................................... 24
1.3.2. Ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá ..................... 26 1.4. Lƣợc sử vấn đề nghiên cứu .............................................................................................. 28
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 28
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ........................................................... 34
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 38 2.1. Nguyên liệu ........................................................................................................................ 38
2.1.1. Nguyên liệu hạt ....................................................................................... 38
2.1.2. Nguyên liệu phụ phẩm nông nghiệp (cám gạo, phôi lúa mì) ................. 38
2.1.3. Nguyên liệu mủ từ các loại quả .............................................................. 39 2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ........................................................................................ 40
2.2.1. Hóa chất .................................................................................................. 40
2.2.2. Thiết bị .................................................................................................... 40 2.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................................... 41 2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................................ 42
2.4.1. Phần 1: Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật: đậu
nành, đậu phộng nảy mầm, cám gạo, phôi mì, mủ sung, mủ vả, mủ đu đủ ..... 42
2.4.2. Phần 2: Nghiên cứu thu nhận lipase thô từ mủ đu đủ ............................ 49
2.4.3. Phần 3: Chiết tách và tinh sạch lipase từ lipase thô mủ đu đủ ............... 51
2.4.4. Phần 4: Nghiên cứu tính chất của lipase tinh sạch ................................. 52
2.4.5. Phần 5: Phƣơng pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô .......................... 53 2.5. Phƣơng pháp phân tích ..................................................................................................... 61
2.5.1. Phƣơng pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu ........................ 61
2.5.2. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp chuẩn độ ...... 61
2.5.3. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp đo quang ...... 62
2.5.4. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp khuếch tán đĩa
thạch.................................................................................................................. 62
2.5.5. Phƣơng pháp xác định điểm đẳng điện của lipase ................................. 62
2.5.6. Phƣơng pháp kết tủa phân đoạn lipase với muối amoni sunfat .............. 63
2.5.7. Phƣơng pháp tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion .......................... 63
2.5.8. Phƣơng pháp điện di ............................................................................... 64
2.5.9. Phƣơng pháp xác định đặc tính hóa lý của dầu cá ................................. 64
2.5.10. Phƣơng pháp xác định thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi .. 65
2.5.11. Phƣơng pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác bởi
CPL ................................................................................................................... 65
2.5.12. Phƣơng pháp xác định các thông số động học Km và Vmax của phản
ứng thủy phân dầu cá hồi bằng CPL ................................................................ 65
2.5.13. Phƣơng pháp xác định năng lƣợng hoạt hóa ........................................ 66
2.5.14. Phƣơng pháp phân tích số liệu thực nghiệm ........................................ 67
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 68 3.1. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn thực vật ..................................... 68
3.1.1. Hoạt tính lipase từ các loại hạt có dầu nảy mầm .................................... 68
3.1.2. Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nông nghiệp: cám gạo và phôi lúa mì ..... 74
3.1.3. Hoạt tính lipase từ mủ của các loại quả .................................................. 79
3.1.4. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật khác nhau .... 86 3.2. Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ ....................................................................... 87
3.2.1. Các phƣơng pháp bảo quản mủ đu đủ .................................................... 87
3.2.2. Thu nhận enzyme thô ............................................................................. 90
3.2.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân của lipase thô từ mủ đu đủ trên
các cơ chất khác nhau ....................................................................................... 96 3.3. Tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ ............................................................................. 99
3.3.1. Chiết tách lipase mủ đu đủ bằng muối sodium lauroyl sarcosinate
(SLS) ................................................................................................................. 99
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ SLS lên hoạt độ lipase .................................. 101
3.3.3. Tủa lipase bằng dung dịch amoni sunfat (AS) ..................................... 102
3.3.4. Kết quả xác định điểm đẳng điện của protein enzyme ......................... 103
3.3.5. Kết quả tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ bằng sắc ký trao đổi ion ... 104
3.4. Tính chất của lipase tinh sạch ......................................................................................... 104
3.4.1. Kết quả xác định khối lƣợng phân tử lipase ......................................... 104
3.4.2. Xác định Km và Vmax ............................................................................ 105
3.5. Đánh giá khả năng ứng dụng lipase mủ đu đủ trong quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA và EPA .......................................................................................................................... 106
3.5.1. Một số đặc điểm của dầu cá hồi thô ..................................................... 106
3.5.2. Xác định thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi ........................ 107
3.5.3. Ứng dụng lipase từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi ........................ 109
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 127
A. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 127
B. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ................................................... 128
C. KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .................................. 128
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ ........................ 129
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 130
DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt
CPL Carica papaya lipase Lipase từ mủ đu đủ
DHA Docosahexaenoic acid
EPA Eicosapentaenoic acid
PUFAs Polyunsaturated fatty acids Acid béo không bão hòa nhiều nối đôi
Para-nitrophenyl palmitate p-NPP
Para-nitrophenol p-NP
Optical density OD Mật độ quang
AS Amoni sunfat Ammonium sulfate
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
Degree of hydrolysis DH Hiệu suất thủy phân
Triacylglycerol TAG
Sodium Lauroyl Saccosine SLS
CHAPS
3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate
EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid Acid etylenediaminetetraacetic
DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu Tên bảng Trang
Bảng 1.1. Tính chất của một số lipase có nguồn gốc từ hạt [72] 14
Bảng 1.2. Tính chất của lipase từ một số loại hạt chứa dầu 30
Bảng 1.3. Tính chất của lipase từ một số loại hạt ngũ cốc 31
Bảng 1.4. Tính chất của lipase từ một số loại mủ 32
Bảng 2.1. Một số hóa chất chính d ng trong nghiên cứu 40
Bảng 2.2. 48 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố nhiệt độ, pH và các ion kim loại đến hoạt độ lipase
Bảng 2.3. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 55
Bảng 2.4. Ma trận quy hoạch thực nghiệm 55
Bảng 2.5. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 56
Bảng 2.6. Ma trận quy hoạch thực nghiệm 57
Bảng 2.7. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 60
Bảng 2.8. Ma trận quy hoạch thực nghiệm 60
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của hạt đậu nành, đậu phộng 68
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của cám gạo và phôi lúa mì 75
Bảng 3.3. Thành phần hóa học của mủ đu đủ 79
Bảng 3.4. Hiệu quả thu nhận lipase từ các nguồn thực vật 86
Bảng 3.5. 88 Ảnh hƣởng của các phƣơng pháp sấy khác nhau lên hoạt độ lipase
Bảng 3.6. 89 Sự thay đổi hoạt độ lipase của mủ đu đủ theo thời gian trữ đông
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc đến hiệu quả thu nhận lipase thô 90
Bảng 3.8. 92 Ảnh hƣởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hiệu quả thu nhận lipase thô
Bảng 3.9. 93 Hoạt độ của chế phẩm lipase thô thu bằng 2 phƣơng pháp sấy khác nhau
Bảng 3.10. Hoạt độ của CPL sau khi loại lipid và chiết tách với SLS 100
Bảng 3.11. Hoạt tính của CPL sau hòa tan mà không loại lipid 100
Bảng 3.12. Hoạt tính lipase thu đƣợc ở các phân đoạn tủa khác nhau 102
Bảng 3.13. Các chỉ số chất lƣợng của dầu cá hồi thô 107
Bảng 3.14. Thành phần và hàm lƣợng acid béo trong dầu cá hồi 108
Bảng 3.15. Phần trăm acid béo có trong dầu cá hồi trƣớc và sau khi 110 thủy phân
Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 111
Bảng 3.17. Giá trị các hệ số b trong phƣơng trình hồi quy và xác suất p 112
Bảng 3.18. Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 114
Bảng 3.19. Giá trị các hệ số b trong phƣơng trình hồi quy và xác suất p 114
Bảng 3.20. Hiệu suất thủy phân dầu cá trong các hệ phản ứng khác 116 nhau
Bảng 3.21. Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 120
Bảng 3.22. Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 121
Bảng 3.23. Tốc độ ban đầu phản ứng thu đƣợc ở các nồng độ cơ chất 123
khác nhau trong thủy phân dầu cá hồi bằng CPL trong thời gian 60 phút
125
Bảng 3.24. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hằng số tốc độ (k)
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Số hiệu Tên hình Trang
Hình 1.1. Mô hình cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase 9
Hình 1.2. Cơ chế phản ứng thủy phân liên kết ester xúc tác bởi esterase 9
và lipase
Hình 1.3. Phản ứng xúc tác bởi lipase không đặc hiệu và đặc hiệu vị trí 11
sn 1, sn 3
Hình 1.4. Cấu trúc phân tử DHA, EPA 25
Hình 1.5. Quy trình tổng hợp glyceride giàu DHA, EPA [37] 27
Hình 2.1. Hạt đậu nành (a) và hạt đậu phộng (b) 38
Hình 2.2. Phôi lúa mì (a) và cám gạo (b) 38
Hình 2.3. Vƣờn thu nhận mủ đu đủ 39
Hình 2.4. Quả vả (a) và quả sung (b) 39
Hình 2.5. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 41
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình thu lipase từ hạt đậu phộng, đậu nành nảy 43
mầm
Hình 2.7. Sơ đồ quy trình thu lipase thô từ cám gạo, phôi lúa mì 44
46
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ Lipase thô thu đƣợc từ mủ đu đủ đƣợc dùng trong các thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase.
Hình 2.9. Thu nhận mủ vả 47
Hình 2.10. Sơ đồ khảo sát quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme 58
lipase thô từ mủ đu đủ
Hình 3.1. Hình thái hạt đậu nành nảy mầm theo thời gian theo thứ tự từ 69
1 - 6 ngày
Hình 3.2. Hình thái hạt đậu phộng nảy mầm theo thời gian 69
Hình 3.3. Hoạt độ lipase trong thời gian nảy mầm của hạt đậu nành, 70
đậu phộng
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành 71
nảy mầm
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ hạt đậu nành 72
nảy mầm
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase từ hạt đậu 73
nành nảy mầm
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ cám gạo và 76
phôi lúa mì
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ cám gạo và 77
phôi lúa mì
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ của lipase từ cám 78
gạo
Hình 3.10. Lipase thô từ mủ đu đủ 80
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ 80
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ 81
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ của lipase từ mủ đu 82
đủ
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ sung và mủ vả 83
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt độ lipase từ mủ sung và mủ vả 84
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ sung, 85
mủ vả
Hình 3.17. Mủ đu đủ thu đƣợc sau khi phơi nắng, sấy đối lƣu, sấy thăng 89
hoa
Hình 3.18. Ảnh hƣởng của tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc đến hoạt độ riêng và 91
hoạt độ tổng của CPL
Hình 3.19. Ảnh hƣởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hoạt độ riêng và 92
hoạt độ tổng của CPL.
Hình 3.20. Mẫu lipase từ mủ đu đủ sau khi sấy đối lƣu (a) và sấy thăng 94
hoa (b)
Hình 3.21. Quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ 95
Hình 3.22. Hoạt độ của chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ đối 96
với các cơ chất khác nhau
Hình 3.23. Khả năng thủy phân của lipase trên cơ chất dầu cá hồi 98
Hình 3.24. Khả năng thủy phân của lipase trên cơ chất dầu cọ 98
Hình 3.25. Ảnh hƣởng của nồng độ SLS đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ 101
Hình 3.26. Đồ thị độ đục của dung dịch enzyme lipase ở pH khác nhau 103
Hình 3.27. Sắc ký đồ của phân đoạn lipase tủa ở 50-60% AS 104
Hình 3.28. Hình ảnh điện di SDS 105
106 Hình 3.29. Đồ thị Lineweaver-Burk xác định Km (mM) và Vmax (mM/min/mL) của lipase từ mủ đu đủ
Hình 3.30. Điều kiện tối ƣu nhiệt độ, pH của phản ứng thủy phân dầu cá 113
trong hệ nhũ tƣơng dầu – nƣớc.
Hình 3.31. Điều kiện tối ƣu tỷ lệ nƣớc/cơ chất và nồng độ enzyme của 115
phản ứng thủy phân dầu cá trong hệ nhũ tƣơng dầu – nƣớc.
Hình 3.32. Ảnh hƣởng của nồng enzyme đến hiệu suất thủy phân 117
Hình 3.33. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy 118
phân
Hình 3.34. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 119
Hình 3.35. Điều kiện tối ƣu của phản ứng thủy phân dầu cá trong hệ 2 122
pha iso - octan/nƣớc
Hình 3.36. Biểu đồ thể hiện sự thay đổi tốc độ phản ứng theo thời gian 123
trong thủy phân dầu cá hồi bằng CPL.
Hình 3.37. Biểu đồ Lineweaver-Burk thủy phân dầu cá bằng CPL 124
Hình 3.38. Đồ thị Arrhenius thủy phân dầu cá bằng CPL 125
Hình 3.39. Biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất của quá trình 126
thủy phân
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Lipase hay Triacylglycerol acylhydrolase (E.C. 3.1.1.3) là loại enzyme có
khả năng xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol mạch dài tạo thành
diacylglycerol, monoacylglycerol, glycerol và các acid béo tự do tại các bề mặt liên
pha giữa nƣớc và dung môi hữu cơ. Khác với esterase ở cơ chất thủy phân, lipase
đƣợc định nghĩa là carboxylesterase có khả năng xúc tác thủy phân acylglycerol với
gốc acyl có mạch dài trên 10 nguyên tử carbon. Ngoài ra, lipase còn tham gia xúc
tác các phản ứng chuyển vị ester và cả phản ứng tổng hợp ester trong môi trƣờng ít
nƣớc [105].
Năm 2010, thị phần enzyme toàn cầu trong công nghiệp đƣợc ƣớc tính
khoảng 3,3 tỷ đô la. Lipase đứng thứ ba trong số các enzyme đang đƣợc thƣơng mại
hóa chỉ sau protease và carboxylase [35]. Đến năm 2016, thị phần enzyme trên thế
giới đƣợc sản xuất và ứng dụng trong công nghiệp ƣớc tính đạt 5 đến 5,5 tỷ đô la.
Trong đó, lipase chiếm gần 10% thị phần enzyme toàn cầu, với một loạt các ứng
dụng trong các ngành công nghiệp nhƣ sản xuất chất tẩy rửa, chế biến dầu, chế biến
thực phẩm và dƣợc phẩm [56]. Điều này cho thấy ngành công nghệ enzyme, trong
đó có lipase đang phát triển đầy triển vọng.
Lipase đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ: vi khuẩn (45%), nấm
(21%), động vật (18%), thực vật (11%) và vi tảo (3%) [91]. Lipase trong công
nghiệp chủ yếu đƣợc phân lập từ vi sinh vật và một phần từ thực vật. So với lipase
từ vi sinh vật, lipase từ thực vật có những ƣu điểm quan trọng nhƣ:
- Dễ đƣợc ngƣời tiêu dùng chấp nhận trong thực phẩm, dƣợc phẩm hơn, ngay
cả ở dạng enzyme thô [75];
- Nguồn nguyên liệu để thu nhận có sẵn trong tự nhiên, không độc hại và
không cần công nghệ di truyền phân tử để sản xuất ra [75].
Lipase thực vật đƣợc cho là có tiềm năng ứng dụng tốt trong công nghệ thực
phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp các chất hữu cơ, dƣợc phẩm và cả trong sản xuất nhiên
1
liệu sinh học nhƣ biodiesel [108].
Do đó, lipase thực vật thu hút sự quan tâm ngày càng nhiều của các nhà
nghiên cứu.
Lipase thực vật thƣờng đƣợc tìm thấy trong các loại hạt chứa dầu, ngũ cốc
(hạt cải, đậu phộng, đậu nành, yến mạch, v.v…) cũng nhƣ các thực vật có chứa
nhiều mủ nhƣ Asclepiadaceae, Sapotaceae, Euphorbiaceae, Moraceae,
Papaveraceae và Asteraceae.
Nhiều nghiên cứu về đặc tính và ứng dụng lipase thực vật thu đƣợc từ mủ
cho thấy chúng có thể thay thế cho các lipase vi sinh vật. Lipase đã đƣợc tìm thấy
trong mủ xƣơng rồng, mủ sung và đã đƣợc tinh sạch và xác định đƣợc khối lƣợng
phân tử [52], [53]. Lipase từ mủ đu đủ đƣợc xác định là enzyme cố định trong mủ
[18], đƣợc sử dụng trong điều chỉnh cấu trúc của glycerolipid [50], tổng hợp ester
terpene [127], tổng hợp bơ ca cao nhân tạo [94].
Trong hạt có dầu, lipase có chức năng thủy phân triglyceride để tạo glycerol
và acid béo, cung cấp năng lƣợng cần thiết cho sự nảy mầm hạt và phát triển
cây con [25]
Trên thế giới, mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu về lipase thực vật từ
chiết tách, khảo sát đặc tính, tinh sạch lipase đến ứng dụng. Nhƣng cho đến nay chỉ
mới 29 loại lipase từ thực vật đã đƣợc xác định khối lƣợng phân tử cũng nhƣ trình
tự acid amin trong chuỗi protein [108]. Việc nghiên cứu chiết tách và tinh sạch
lipase từ thực vật còn gặp nhiều thách thức do hàm lƣợng lipid và phenolic trong
mẫu cao dẫn đến lipase kém bền và dễ bị biến tính trong quá trình chiết tách. Trong
quy trình thu lipase từ hạt nảy mầm, thời gian nảy mầm kéo dài có thể cho hoạt độ
lipase cao, nhƣng cũng có thể chịu ảnh hƣởng của sự nhiễm vi sinh vật [108]. Ngoài
ra, quá trình sấy khô hạt cũng làm lipase mất hoạt tính.
Tƣơng tự, các nghiên cứu về cấu trúc của lipase thực vật cũng gặp những
khó khăn vì khó thu đƣợc cấu trúc tinh thể và mẫu có độ đồng đều không cao [108].
Điển hình là trƣờng hợp lipase từ mủ đu đủ. Một số tác giả ngoài nƣớc đã nghiên
cứu chiết tách, tinh sạch để xác định cấu trúc phân tử của lipase từ mủ đu đủ, nhƣng
2
gặp phải những khó khăn do lipase này có bản chất cố định tự nhiên trong mủ đu
đủ, rất khó giải phóng ra. Tất cả các nỗ lực để chiết tách lipase này ra khỏi mủ đu
đủ đều không thành công [17].
Trong khi đó, những công trình nghiên cứu ở trong nƣớc về lipase còn ít, chủ
yếu là nghiên cứu về phân lập lipase từ vi sinh vật và thu lipase từ nội tạng các loài
cá, nghiên cứu về lipase từ thực vật là lĩnh vực hầu nhƣ không đƣợc quan tâm.
Với những ƣu điểm nổi bật đƣợc trình bày ở trên, việc nghiên cứu khai thác
nguồn enzyme lipase từ thực vật đƣợc đánh giá có tiềm năng mang lại những lợi ích
lớn về mặt kinh tế cho ngành công nghệ enzyme.
Việt Nam có nguồn thực vật đa dạng và phong phú và lƣợng lớn phế phẩm từ
thực vật có tiềm năng thu đƣợc lipase chất lƣợng tốt, tuy nhiên chúng chƣa đƣợc
quan tâm nghiên cứu. Do đó, đề tài đƣợc chọn cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận,
đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp
thực phẩm" thực sự có ý nghĩa khoa học và thực tiễn.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của luận án là đánh giá khả năng khai thác lipase từ các nguồn thực
vật sẵn có ở Việt Nam và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, thông qua đó có thể
tạo ra sản phẩm có giá trị cao từ nguồn thực vật phổ biến ở Việt Nam.
Mục tiêu cụ thể nhƣ sau:
1 - Đánh giá hoạt tính lipase thu nhận từ một số nguồn thực vật:
+ Hạt có dầu
+ Phụ phẩm nông nghiệp
+ Mủ các loại quả
2 - Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận lipase thô từ nguồn thực vật;
3 - Xác định các đặc tính hoá sinh của lipase thô và lipase tinh sạch;
4 - Đánh giá khả năng ứng dụng lipase thô trong công nghiệp thực phẩm.
3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc những mục tiêu nghiên cứu nhƣ trên, đề tài xác định các nội
3
dung cần thực hiện nhƣ sau:
- Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu thực vật thích hợp để thu nhận
lipase;
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase thu đƣợc;
- Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase thô có hoạt độ cao từ nguyên
liệu đã lựa chọn;
- Nghiên cứu khảo sát các đặc tính hoá sinh của lipase thô;
- Nghiên cứu tinh sạch lipase thô và xác định đặc tính hoá sinh của lipase tinh
sạch;
- Nghiên cứu ứng dụng lipase thô trong quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA
và EPA.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tƣ liệu, sách báo, các công trình đã nghiên
cứu về enzyme lipase.
4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Các phƣơng pháp xác định thành phần nguyên liệu thực vật gồm: phƣơng
pháp xác định độ ẩm, hàm lƣợng tro tổng, hàm lƣợng protein, hàm lƣợng chất béo.
- Các phƣơng pháp thu nhận lipase từ đậu phộng nảy mầm, đậu nành nảy
mầm, cám gạo, phôi lúa mì, mủ đu đủ, mủ vả và mủ sung.
- Các phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase: phƣơng pháp chuẩn độ, phƣơng
pháp đo quang, phƣơng pháp đĩa thạch.
- Các phƣơng pháp tinh sạch lipase: xác định điểm đẳng điện, phƣơng pháp
tủa bằng amoni sunfat, phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion, phƣơng pháp điện di.
- Các phƣơng pháp hóa lý xác định chỉ tiêu chất lƣợng dầu cá hồi: chỉ số
acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số ester.
- Các phƣơng pháp toán học: phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm, phƣơng
4
pháp tối ƣu hoá.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Từ những nội dung nghiên cứu đƣợc định ra trong luận án sẽ toát lên ý nghĩa
khoa học và ý nghĩa thực tiễn nhƣ sau:
* Ý nghĩa khoa học
- Đánh giá đƣợc khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn nguyên liệu thực
vật, ảnh hƣởng của các yếu tố đến hoạt độ của chế phẩm, từ đó xác định đƣợc
nguồn nguyên liệu thực vật có tiềm năng để khai thác enzyme lipase.
- Đề xuất đƣợc quy trình thu lipase thô từ nguồn thực vật có hiệu quả cao.
- Xác định đƣợc tính đặc hiệu đối với cơ chất lipid của lipase thô thu nhận
đƣợc từ nguồn thực vật.
- Đề xuất phƣơng pháp tinh sạch lipase thô từ mủ đu đủ và xác định khối
lƣợng phân tử của lipase.
* Ý nghĩa thực tiễn
- Tận dụng phế phẩm của quá trình thu papain từ mủ đu đủ để sản xuất
lipase thô.
- Ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi nhằm thu acid
béo tạo tiền đề cho quá trình làm giàu DHA, EPA ứng dụng trong công nghiệp
thực phẩm.
6. Bố cục của luận án
MỞ ĐẦU
Chƣơng 1: TỔNG QUAN
Chƣơng 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về lipase
Lipase (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) thuộc lớp hydrolase, là
enzyme hoạt động tốt tại bề mặt liên pha dầu – nƣớc. Tiềm năng xúc tác của lipase
đƣợc biết đến từ năm 1930 theo công trình công bố của JBS Haldane và cộng sự
[38].
Lipase có thể tham gia xúc tác cho rất nhiều phản ứng khác nhau nhƣ thủy
phân, chuyển ester, tổng hợp ester. Lipase xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride
tạo glycerol và acid béo, đây là phản ứng đặc trƣng của lipase. Ngoài ra, trong điều
kiện ít nƣớc, lipase còn có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp ester, chuyển ester.
Các phản ứng xúc tác bởi lipase [106] đƣợc thể hiện nhƣ sau:
(1) Phản ứng thủy phân
(2) Phản ứng tổng hợp
Phản ứng ester hóa
Phản ứng amid hóa
6
Phản ứng tổng hợp thioester
(3) Phản ứng chuyển ester
Phản ứng thế gốc acid
Phản ứng thế gốc amin
Phản ứng thế gốc ancol
Phản ứng chuyển vị ester
1.1.1. Nguồn thu nhận lipase
Lipase đƣợc phân bố rộng rãi ở vi sinh vật, động vật và thực vật. Lipase vi
sinh vật đã đƣợc một số tác giả thu nhận từ Pseudomonas [128], Bacillus sp. LBN 4.
[27], Staphylococcus epidermidis [63], Acinetobacter sp. CR9 [68]. Lipase chịu
nhiệt từ nấm Rhizopus homothallicus cũng đã đƣợc chiết tách bởi Diaza và cộng sự
năm 2006 [41].
Ở động vật, lipase đƣợc thu nhận chủ yếu từ tụy tạng của trâu, bò, cừu, lợn,
và một số loại cá. Lipase ở động vật đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa
lipid. Một số tác giả đã thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc, cá tra [11], [12]. Trong
các loại côn tr ng, lipase đƣợc tìm thấy trong cơ, huyết tƣơng, ống tiêu hóa và các
tuyến nƣớc bọt.
Thực vật có thể là nguồn cung cấp lipase quan trọng khi xét đến những ƣu
điểm nhƣ giá thành thấp, tính đặc hiệu, dễ dàng đƣợc chấp nhận và có thể ứng dụng
7
trực tiếp nhƣ là chất xúc tác sinh học sau quá trình tinh sạch sơ bộ [33], [75].
Nguồn lipase từ thực vật rất đa dạng và phong phú, có thể thu nhận từ các
nguồn thực vật có sẵn trong tự nhiên mà không cần quy trình nuôi cấy nghiêm ngặt
nhƣ lipase từ vi sinh vật. Lipase chủ yếu hiện diện ở dạng dự trữ trong các mô của
các hạt đang phát triển hoặc đặc biệt ở những nơi chứa lƣợng lớn triacylglycerol.
Hoạt động lipase của hạt tăng lên trong suốt quá trình nảy mầm vì triacylglycerol
cần đƣợc chuyển hoá thành glycerol và các acid béo bằng phản ứng thủy phân bởi
lipase, sau đó các chất này đƣợc chuyển hoá tiếp thành các phân tử đƣờng hòa tan,
vận chuyển đến các mô đang phát triển để cung cấp nguồn carbon và năng lƣợng hỗ
trợ cho sự phát triển của cây non [91]. Lipase từ một số loại hạt cũng đã đƣợc các
tác giả nghiên cứu chiết tách nhƣ phôi dừa (Cocos nucifera linn) [43], hạt của hoa
hƣớng dƣơng [103], hạt lupin vàng nảy mầm [28], hạt nguyệt quế [59], hạt hạnh
nhân [126]. Lipase cũng đƣợc nghiên cứu ở một số loại ngũ cốc nhƣ các loại đậu
nành [73], yến mạch [64], cám gạo [62]. Ngoài ra lipase từ thực vật cũng có ở phần
mủ của một số loại quả nhƣ mủ đu đủ [17], mủ sung [53], mủ xƣơng rồng [52].
1.1.2. Cấu trúc và cơ chế xúc tác của lipase
Ngày nay, hàng trăm loại lipase đã đƣợc xác định cấu trúc không gian 3
chiều trong cơ sở dữ liệu protein.
Lipase từ các nguồn gốc khác nhau, thƣờng khác nhau về kích thƣớc phân tử
và có rất ít các trình tự tƣơng đồng. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu các lipase đã
đƣợc kết tinh cho thấy hầu hết chúng là những protein có cấu trúc α/β với một trung
tâm là các cấu trúc gấp nếp β đƣợc bao quanh bởi một số dải xoắn α [106].
Theo Abdelmonaem và cộng sự (2011), mô hình enzyme Arabidopsis
thaliana lipase đã đƣợc xác định có dạng monomer dạng α/β bao gồm 8 chuỗi gấp β
xen lẫn với 22 chuỗi xoắn α. Lipase này cũng có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc
lipase từ động vật và vi khuẩn, nhƣng chỉ khác nhau về số lƣợng của chuỗi xoắn α
và gấp nếp β. Hình 1.1 thể hiện cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase [76].
Trung tâm hoạt động của lipase đƣợc hình thành bởi bộ ba xúc tác bao gồm
8
các acid amin: serine, histidine và acid aspartic/acid glutamic [72]. Trung tâm hoạt
động của cả lipase và protease tƣơng tự nhau về mặt hóa học nhƣng có cấu trúc
khác nhau.
Hình 1.1. Mô hình cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase [76]
Hình 1.2. Cơ chế phản ứng thủy phân liên kết ester xúc tác bởi esterase và
lipase [101]
9
Chú thích: (a) Tấn công nucleophin của nhóm –OH serine vào carbon của liên kết
ester; (b) tứ diện trung gian; (c) acyl-enzyme trung gian và tấn công nucleophilic
bằng nƣớc; (d) tứ diện trung gian; (e) enzyme tự do
Do sự giống nhau của bộ ba xúc tác đƣợc tìm thấy trong lipase so với những
gì đƣợc quan sát trong serine protease, nên cơ chế xúc tác lipase đƣợc cho là tƣơng
tự nhƣ xúc tác của serine protease [60].
Cơ chế phản ứng xúc tác thủy phân bởi lipase đƣợc thể hiện ở Hình 1.2. Phản
ứng bắt đầu do nhóm -OH của serine thuộc trung tâm hoạt động enzyme tấn công
nucleophin vào carbon của liên kết ester trong cơ chất tạo thành phức acyl - enzyme
và giải phóng ancol từ lipid. Sau đó, phức acyl - enzyme bị thủy phân và lipase tự
do đƣợc giải phóng trở lại.
1.1.3. Tính đặc hiệu của lipase
Mỗi loại lipase xúc tác chuyển hóa một loại cơ chất nhất định hay một kiểu
phản ứng hóa học nhất định, đó chính là tính đặc hiệu của lipase.
Theo Villeneuve (2003) và cộng sự, tính đặc hiệu của lipase có thể chia
thành 3 nhóm chính nhƣ sau:
- Đặc hiệu cơ chất: cơ chất tự nhiên của lipase là glycerol ester. Lipase
không những xúc tác thủy phân triacylglycerol (TAG), mà còn thủy phân di- và
monoacylglycerol và thậm chí là phospholipid [25]. Điều này thể hiện lipase xúc tác
trên các cơ chất glycerol ester có các chuỗi acid béo dài hoặc ngắn khác nhau. Tính
đặc hiệu cơ chất đƣợc xác định bằng cách ủ enzyme với cơ chất và xác định hoạt độ
enzyme. Cơ chất đƣợc sử dụng là các ester của p–nitrophenyl có chiều dài chuỗi
carbon khác nhau. Trong một số nghiên cứu, cơ chất triglyceride với các chuỗi acid
béo bão hòa, chƣa bão hòa khác nhau cũng đƣợc sử dụng để xác định tính đặc hiệu
cơ chất của lipase. Theo nghiên cứu của S. Abdekafi và cộng sự cho thấy enzyme
chiết tách từ mủ đu đủ có tính đặc hiệu cơ chất trên tributyrin với hoạt độ cao nhất
(168 ± 9,8 U/mg) so với cơ chất trioctanoin (14 ± 3,0 U/mg) và dầu oliu (8 ± 1,3
U/mg) [17].
- Đặc hiệu vị trí (Regioselective): lipase chỉ thủy phân triacylglycerol ở vị trí
10
liên kết C1 và C3 của glycerol, tạo ra acid béo, 2-monoacylglycerol và 1,2 hoặc 2,3 -
diacylglycerol, hai chất này không bền, chuyển nhóm acyl tạo sản phẩm 1,3 -
diacylglycerol và 1- hoặc 3–monoacylglycerol. Đối với lipase không có tính đặc
hiệu vị trí, chúng xúc tác thủy phân hoàn toàn triacylglycerol thành các acid béo và
glycerol một cách ngẫu nhiên, tạo mono- và diacylglycerol là sản phẩm trung gian
(Hình 1.3) [25].
Hình 1.3. Phản ứng xúc tác bởi lipase không đặc hiệu và đặc hiệu vị trí sn 1,
sn 3 [25]
- Đặc hiệu quang học: lipase thể hiện khả năng phân biệt các dạng đồng phân
trong hỗn hợp đồng phân quang học [25].
1.1.4. Các hệ phản ứng cho lipase xúc tác
Lipase là enzyme xúc tác thủy phân dầu/chất béo trong hệ dị thể và phản ứng
diễn ra tại bề mặt liên pha dầu và nƣớc, do đó tốc độ phản ứng phụ thuộc phần lớn
vào bề mặt liên pha [101]. Để tạo đƣợc bề mặt liên pha lớn, các hệ phản ứng khác
nhau đã đƣợc nghiên cứu trong quá trình thủy phân dầu cá sử dụng lipase để xúc tác
nhƣ hệ nhũ tƣơng và hệ 2 pha.
- Hệ nhũ tƣơng: là hỗn hợp của hai chất lỏng không tan lẫn nhau. Một chất
(pha phân tán) đƣợc phân tán trong chất kia. Chất nhũ hóa thƣờng là chất ổn định
làm bền hệ nhũ tƣơng, thƣờng là chất hoạt động bề mặt. Hạn chế chính của hệ này
đối với quá trình thủy phân lipid là cần năng lƣợng lớn cho quá trình đồng hóa để
11
tạo hệ phân tán mịn với sự có mặt của chất hoạt động bề mặt thích hợp và cho quá
trình ly tâm tách sản phẩm, cơ chất sau phản ứng [58]. Hai loại chất lỏng khác nhau
có thể tạo nên hai loại hệ nhũ tƣơng, ví dụ nhƣ nƣớc và dầu có thể tạo thành các nhũ
tƣơng nhƣ nƣớc trong dầu và dầu trong nƣớc [71].
- Hệ 2 pha: là hệ trong đó tồn tại hai pha lỏng riêng biệt và các pha không
trộn lẫn với nhau, chỉ các chất phản ứng hoặc sản phẩm có thể di chuyển từ pha này
sang pha khác. Quá trình thủy phân dầu đƣợc tiến hành trong hệ 2 pha iso -
octan/nƣớc để khắc phục một số hạn chế của hệ nhũ tƣơng. Trong hệ này, các
enzyme thủy phân dễ dàng hơn và cần ít chi phí hơn. Vì cơ chất dầu đƣợc hòa tan
trong iso - octan và trộn với enzyme trong pha nƣớc bằng cách khuấy trộn mà
không cần năng lƣợng lớn để tạo hệ nhũ tƣơng. Ƣu điểm của hệ này là dễ dàng phân
tách chất xúc tác và sản phẩm, giảm sự ức chế của cơ chất hoặc sản phẩm. Tuy
nhiên, dung môi hữu cơ có thể làm biến tính enzyme khi xúc tác [29].
1.2. Lipase thực vật
1.2.1. Khả năng xúc tác của lipase thực vật
Lipase thực vật đƣợc tìm thấy ở hầu hết các hạt có dầu. Lipase có khả năng
xúc tác cho các phản ứng thủy phân hoặc tổng hợp nhiều loại cơ chất khác nhau.
Lipase từ thực vật có một số ƣu điểm vƣợt trội hơn so với lipase từ động vật, vi sinh
vật bao gồm: có tính đặc hiệu cao, giá thành thấp và đƣợc thu nhận từ những nguồn
thực vật có sẵn trong tự nhiên mà không cần đến công nghệ biến đổi gen để tạo ra
[25]. Lipase thực vật đƣợc chiết tách thô từ các nguồn sẵn có nhƣ các loại hạt, mủ
các loại quả, phụ phẩm nông nghiệp có thể đƣợc ứng dụng trực tiếp ngay trong thực
phẩm mà không độc hại đối với con ngƣời. Do đó, việc khai thác nguồn enzyme
lipase từ thực vật đƣợc đánh giá có tiềm năng đem lại những lợi ích lớn về mặt kinh
tế cho ngành công nghệ enzyme.
Lipase thực vật bao gồm các lipid acylhydrolase không đặc hiệu,
phospholipase A1, A2, B, C, D, monoacylglycerol và triacylglycerol lipase.
Triacylglycerol acylhydrolase (TAG) lipase đƣợc tìm thấy chủ yếu trong các loại
12
hạt có nhiều năng lƣợng nhƣ hạt có chứa nhiều chất béo. Enzyme bền trong khoảng pH từ 4 đến 9; nhiệt độ từ 25 oC đến 60 oC và có khối lƣợng phân tử khoảng 19 -
270 kDa. Lipase chiết tách từ các nguồn thực vật khác nhau có đặc tính khác nhau.
Đặc tính của một vài loại lipase đã đƣợc xác định sau nhiều bƣớc tinh sạch. Cho đến
gần đây chỉ có 29 loại lipase thực vật có khối lƣợng phân tử và trình tự acid amin
trong chuỗi protein đƣợc công bố [108].
Điều này chứng tỏ nghiên cứu về lipase thực vật cho đến nay vẫn chƣa
nhiều, chúng chỉ đƣợc khảo sát ứng dụng trong một vài lĩnh vực cụ thể [108].
1.2.2. Một số nguồn lipase từ thực vật
1.2.2.1. Lipase từ hạt có dầu
Ngoài các đặc điểm chung của nhóm lipase, lipase từ hạt còn có một số đặc
điểm riêng biệt. Một số đặc tính của lipase thu nhận từ các loại hạt có dầu đã đƣợc
một số tác giả ngoài nƣớc nghiên cứu thu nhận thể hiện ở Bảng 1.1.
Từ Bảng 1.1. cho thấy đa số lipase thực vật có nhiều ở các hạt có dầu, chứa
nhiều triacylglycerol. Nhìn chung lipase thu nhận từ các loại đậu hoạt động tốt ở pH gần trung tính, nhiệt độ tối ƣu 30 oC và đặc hiệu với các acid béo chuỗi ngắn và
chuỗi trung bình. Lipase từ hạt đậu Africa hoạt động tốt trên cơ chất dầu dừa. Hầu
13
hết, lipase từ các loại đậu đều tăng hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân dầu oliu khi có mặt của Ca2+. Đối với các hạt hạnh nhân, hạt nguyệt quế thì lipase hoạt động tốt ở pH kiềm và nhiệt độ cao khoảng 50 oC – 65 oC [128], [59].
Bảng 1.1. Tính chất của một số lipase có nguồn gốc từ hạt [72]
To
Chất hoạt hóa
Chất ức chế
Cơ chất
Đặc hiệu vị trí Ứng dụng
opt
pHopt
Nguồn Hạt đậu Africa
30 oC
Ca2+
7,0
EDTA
Dầu dừa
Thủy phân
(Pentaclethra macrophylla Benth)
35 oC
7,0
Tween 20
Ca2+
Thủy phân
30 oC
4,5
Ca2+
p- Chloromercuribenzoic
Ester hóa
Dầu oliu, triacetine, dầu hạt đậu French p - nitrophenyl butyrate
sn – 1, sn – 2
Hạt đậu French (Phaseolus vulgaris) Hạt đậu Castor (Phaseolus vulgaris)
7,0
37 oC
Dầu oliu
Bi3+, Ca2+
Ester hóa Chuyển ester
Hạt cải (Brassica napus L.)
Fe3+, Fe2+, Zn2+, Hg2+, Cu2+,
37 oC
7,5
Fe2+
Dầu oliu
Ca2+, Mg2+
Thủy phân
Hạt dầu mè (Jatropa curcas L.)
45 oC
5,0
Ca2+, Mg2+, K+
Dầu lupin
Thủy phân
sn – 1, sn – 2
Hạt đậu Lupin (Lupinus luteus L.)
aquatic
40 oC
8,0
Ca2+, Mg2+
Hg2+, Mn2+, Zn2+, Al3+
Thủy phân
p-nitrophenyl acetate
65 oC
8,5
Mg2+ Cu2+ Ni2+
Dầu đậu nành
Thủy phân
Hạt đậu French (Panchira Bombacaceae) Hạt hạnh nhân (Amygdalus comunis L.)
50 oC
8,0
Dầu nguyệt quế
Thủy phân
Hạt nguyệt quế (Laurus nobilis L.)
Ca2+, Mn2+ Co2+ Ba2+ Fe2+ Ca2+, Mg2+, Co2+, Cu2+, Fe2+
45 oC
6,0
Dầu oliu
Hạt thì là (Nigerlla sativa)
Thủy phân Ester hóa Chuyển ester
80 oC
11
Dầu oliu
sn – 2
Thủy phân
Hạt gạo
14
To
Chất hoạt hóa
Chất ức chế
Cơ chất
Đặc hiệu vị trí Ứng dụng
opt
pHopt
Nguồn (Oryza sativa)
37 oC
8,0
Triolein
Thủy phân. Ester hóa.
Hạt lúa mì (Triticum aestivum L.)
65 – 75 oC
9,0
Thủy phân
p-nitrophenyl palmitate
Ba2+ Ca2+ Mn2+ Zn2+
Hạt yến mạch (Avena fatua)
30 – 40 oC
8,5
Dầu oliu
Thủy phân
sn – 1, sn – 3
Phôi dừa (Cocos nucifera linn)
15
Hoạt tính thủy phân của lipase từ mủ babaco (Vasconcellea x Heilbornii cv.)
và Plumeria trên cơ chất dầu hƣớng dƣơng đƣợc nghiên cứu bởi Cambon và cộng
sự vào năm 2006 [31]. Nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng thủy phân trên cơ chất dầu
hƣớng dƣơng của babaco và Plumeria là 50 °C đến 55 °C. Giá trị pH tối ƣu của
lipase từ mủ babaco là 7, trong khi lipase từ Plumeria có hai giá trị pH tối ƣu 4 và 7
[31]. Theo nghiên cứu của S. Abdefafi và cộng sự, hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ
khi thủy phân tributyrin, dầu oliu, trioctanoin đã đƣợc xác định tƣơng ứng là 2000 ±
185 U/g, 256 ± 8 U/g và 983 ± 29 U/g ở nhiệt độ tối ƣu 37 °C và pH 9 [17]. Kết quả
cho thấy với cơ chất tributyrin thì hoạt tính enzyme cao chứng tỏ enzyme từ mủ đu
đủ là esterase hơn là lipase. Hoạt tính lipase đƣợc thể hiện trên cơ chất có chuỗi acid
béo mạch dài trên 10 carbon nhƣ dầu oliu [106]. Tuy nhiên, đặc điểm thuận lợi nhất
của CPL là khả năng hoạt động hiệu quả trong phạm vi rộng của pH và nhiệt độ.
Lipase từ mủ đu đủ có khả năng chịu nhiệt tốt bởi nó là enzyme cố định trong mủ. CPL hoạt động tối ƣu ở pH 9, nhiệt độ 370C trên cơ chất dầu oliu. Với cơ chất
tributyrin và trioctanoin, hoạt tính của CPL đạt cực đại tƣơng ứng ở pH 8 và 9 [17].
Giá trị pH tối ƣu cho hoạt động của CPL tƣơng tự nhƣ các lipase thực vật khác nhƣ
lipase từ quả cọ [82] và babaco [31].
Mặc dù, mủ đu đủ chứa lipase có hoạt tính mạnh, những nỗ lực nghiên cứu
để tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ đến nay cũng chƣa thành công vì chƣa hòa
tan đƣợc enzyme. Lƣợng protein của phân đoạn không tan của mủ đã đƣợc phân
tích bằng phƣơng pháp điện di, kết hợp với khối phổ và đã xác định đƣợc 28 loại
protein [40]. CPL sẽ bị mất hoạt tính trong môi trƣờng có Triton X100, Sodium
Dodecyl Sulfate (SDS) và Tetradecyl Trimethylammonium Bromide (TTAB) và nó
vẫn có hoạt tính cao khi có mặt của Sodium Taurodeoxycholate (NaTCD) và chất
tẩy rửa ion lƣỡng cực Chaps. Ảnh hƣởng của nhiều loại protease lên hoạt tính thủy
phân của lipase cũng đã đƣợc nghiên cứu và CPL có khả năng chống lại nhiều loại
enzyme, ngoại trừ trypsin. Tất cả những đặc tính này đã dự đoán rằng CPL có tiềm
năng ứng dụng tốt trong nhiều lĩnh vực [17].
16
Lipase từ mủ sung và mủ xƣơng rồng cũng đã đƣợc thu nhận và xác định đặc
tính bởi bởi Houda Lazreg và cộng sự. Lipase mủ sung có nhiệt độ tối ƣu 45 oC, pH
tối ƣu 5,5 trên cơ chất dầu oliu [52]. Lipase mủ xƣơng rồng hoạt động tối ƣu ở 40oC, pH 8 trên cơ chất tributyrin và dầu oliu và có khối lƣợng phân tử 40kDa .
1.2.3. Phương pháp chiết tách lipase từ thực vật
Lipase thực vật thƣờng đƣợc ứng dụng dƣới dạng chiết xuất thô hoặc tinh
sạch một phần, hoặc ở dạng lipase tinh khiết thu đƣợc bằng các phƣơng pháp chiết
tách.
Một số phƣơng pháp chiết tách lipase từ thực vật đƣợc mô tả dƣới đây. Mỗi
phƣơng pháp thƣờng liên quan đến nhiều bƣớc khác nhau tùy thuộc vào bộ phận
của thực vật đƣợc sử dụng hoặc mức độ tinh sạch mong muốn. Các bƣớc xử lý sinh
khối thƣờng đƣợc sử dụng để chiết xuất lipase bao gồm: chuẩn bị thực vật chiết thô
1.2.3.1. Chuẩn bị thực vật chiết thô
và tinh sạch lipase.
Quá trình chuẩn bị thực vật chiết thô thƣờng bao gồm 2 bƣớc là nghiền sinh
khối và tách loại lipid sinh khối nghiền.
Ngoại trừ mủ, quá trình chiết enzyme thực vật thƣờng bắt đầu bằng cách
nghiền các phần khác nhau của nguyên liệu. Quá trình nghiền giúp phá vỡ sinh khối
thực vật thành các hạt nhỏ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc với môi trƣờng bên
ngoài, dẫn đến tăng khả năng để enzyme tiếp xúc với dung môi chiết [73].
Tách loại bỏ lipid có trong thực vật chiết thô bằng dung môi hữu cơ là công
đoạn cần thiết. Lipid hiện diện trong sinh khối chủ yếu là acid béo và
triacylglycerol, có thể tác động đến quá trình chiết và ảnh hƣởng đến hoạt độ của
lipase. Quá trình tách loại lipid tạo điều kiện thuận lợi để chiết lipase trong pha
nƣớc, làm tăng năng suất chiết và tăng hoạt độ của lipase. Nghiên cứu của
Kapranchikov và cộng sự cho rằng loại bỏ lipid trƣớc khi chiết enzyme giúp cải
thiện hoạt động của lipase từ mầm lúa mì (Triticum aestivum L.) gấp 1,8 lần. Kazim
Kose cũng d ng acetone để loại lipid trong cám gạo trƣớc khi chiết lipase [92].
Các dung môi hiệu quả nhất để loại lipid từ thực vật là diethyl ether, acetone
17
và n-hexane. Việc lựa chọn dung môi sử dụng trong bƣớc này là rất quan trọng vì
một số dung môi hữu cơ có thể ức chế hoạt động xúc tác của enzyme. Trong nhiều
trƣờng hợp, n-hexane thƣờng cho kết quả tốt nhất, với lƣợng lipase tổn thất không đáng kể và n-hexan có tính dễ bay hơi. Theo Hassanien, acetone lạnh (20 oC) cũng
có thể là một dung môi tốt d ng để loại lipid. Vì acetone có thể bảo tồn đƣợc hoạt
1.2.3.2. Tinh sạch lipase thực vật
tính của lipase [92].
Quá trình tinh sạch lipase thực vật nhằm thu đƣợc lipase tinh khiết, tạo điều
kiện thuận lợi cho nghiên cứu về đặc tính và cấu trúc của chúng. Thông thƣờng, kỹ
thuật tinh sạch lipase gồm các quá trình: chiết enzyme với dung dịch đệm, kết tủa,
sắc ký cột. Quá trình này áp dụng đối với các loại lipase tan đƣợc trong nƣớc. Còn
đối với lipase không tan trong nƣớc nhƣ lipase từ mủ đu đủ thì cần có bƣớc tiền
chiết tách ban đầu là sử dụng dung dịch chứa các chất hoạt động bề mặt để lôi kéo
lipase ra khỏi cấu trúc mủ đu đủ. Một vài nổ lực nghiên cứu tách lipase ra khỏi mủ
đu đủ nhƣng chƣa thành công. Điều này có thể đƣợc giải thích là do lipase có liên
kết cộng hóa trị với các polymer isopren có trong mủ. Do đó Abdelkafi và cộng sự
đã sử dụng dung dịch đệm Tris – HCl pH 8 chứa chất hoạt động bề mặt CHAPS
20mM để hòa tan mủ đu đủ tách một phần enzyme. Tuy nhiên, kết quả xác định đặc
tính cho thấy enzyme này thể hiện hoạt tính esterase hơn là hoạt tính lipase [17].
CHAPS có tên hóa học là 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-
propanesulfonate hydrate, là chất hoạt động bề mặt lƣỡng cực d ng để hòa tan
protein. SLS có tên gọi là Sodium N–Lauroyl Methyl Glycinate đƣợc cấu tạo bởi
muối natri của acid béo và amino acid là Sarcosine (Methyl Glycinate), là chất hoạt
động bề mặt anion. Chất hoạt động bề mặt này có thể lôi kéo protein ra khỏi cấu
trúc polymer của mủ đu đủ.
Dựa trên cơ sở này, dung dịch Tris – HCl pH 8 chứa chất hoạt động bề mặt
SLS đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu này để tách lipase ra khỏi cấu trúc mủ đu đủ.
Bƣớc tiếp theo của quá trình chiết lipase là kết tủa. Kỹ thuật phổ biến nhất
đƣợc áp dụng để kết tủa protein lipase là phƣơng pháp kết tủa phân đoạn bằng
18
amoni sunfat (AS). Lipase từ hạt và vỏ quả đu đủ cũng đã đƣợc chiết tách và tủa
bằng AS [90], lipase từ hạt yến mạch tủa bằng AS bão hòa 50% có hoạt độ cao gấp
1,97 lần so với lipase thô ban đầu [64].
Qua nghiên cứu của một số tác giả cho thấy hoạt độ lipase cao nhất thƣờng
đạt đƣợc ở các phân đoạn tủa với dung dịch AS bão hòa nồng độ dao động từ 60%
đến 90%. Để quá trình thu hồi lipase hiệu quả sau bƣớc kết tủa, cần có bƣớc loại bỏ
muối AS bằng phƣơng pháp thẩm tách.
Ngoài kết tủa bằng AS, còn có thể kết tủa acetone theo tỷ lệ thích hợp. Dung
môi hữu cơ thƣờng ít đƣợc sử dụng hơn vì dễ gây biến tính không thuận nghịch đối
với các protein lipase [80].
Sắc ký là phƣơng pháp đƣợc áp dụng phần lớn trong quá trình tinh sạch các
lipase thực vật sau bƣớc kết tủa (tiền tinh sạch). Sắc ký tách các protein khác nhau
chứa trong kết tủa dựa trên ái lực của chúng với pha tĩnh. Các kỹ thuật đƣợc áp
dụng nhiều nhất là sắc ký trao đổi ion và sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc. Lipase từ đậu
castor đã đƣợc tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion với pha tĩnh là Diethylaminoethyl
(DEAE) [115]. Lipase (EpLL) từ mủ xƣơng rồng cũng đƣợc tinh sạch bằng sắc ký
trao đổi anion trên cột DEAE-Cellulose có độ tinh sạch gấp 12,57 lần [52].
Trong nghiên cứu này, sắc ký trao đổi anion trên cột Hi Trap Q Sepharose
Fast flow (5,0ml, 1,6cm×2,5cm) đƣợc dùng để tinh sạch lipase từ mủ đu đủ.
Ngoài ra kỹ thuật lọc bằng màng lọc dựa theo trọng lƣợng phân tử, kỹ thuật
chiết tách 2 pha cũng đƣợc sử dụng để tinh sạch lipase.
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của lipase thực vật
Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ và cấu trúc ổn định của lipase trong
quá trình thủy phân nhƣ nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, chất hoạt
hóa, chất kìm hãm.
- Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính của lipase thực vật
Nhiệt độ có tác động rõ rệt đến hoạt động xúc tác của lipase thực vật. Nhiệt
độ tối ƣu đƣợc xác định cho các loại lipase thực vật khác nhau trong khoảng từ 30 oC đến 55 oC. Khi nhiệt độ phản ứng cao hơn nhiệt độ hoạt động tối ƣu của lipase
19
thì tốc độ phản ứng xúc tác bởi lipase sẽ giảm. Điều này đƣợc giải thích do enzyme
lipase bị bất hoạt ở nhiệt độ cao [81]. Lipase giảm hoạt tính liên quan đến sự cắt đứt
các liên kết hydro trong cấu trúc phân tử protein, dẫn đến các cấu trúc bậc 2, 3 và 4
của lipase bị biến đổi. Việc duy trì nhiệt độ trong quá trình phản ứng có ảnh hƣởng
mạnh đến hoạt động xúc tác của enzyme. Nhiệt độ tối ƣu của một số lipase thực vật đã đƣợc xác định cụ thể nhƣ sau: lipase từ hạt đậu Africa hoạt động tối ƣu ở 30 oC [45], lipase hạt dừa hoạt động tối ƣu ở 40 oC [63], lipase từ mủ sung hoạt động tối ƣu ở 45 oC [53], lipase từ mủ xƣơng rồng hoạt động tối ƣu ở 40 oC [52]. Bên cạnh
đó, lipase từ một số loại hạt có nhiệt độ tối ƣu cao nhƣ lipase từ hạt hạnh nhân hoạt động tối ƣu ở 65 oC [126], hay lipase hạt óc chó hoạt động tối ƣu ở 70 oC [125].
- Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính của lipase thực vật
pH là một yếu tố có tác động rõ rệt đến hoạt động của lipase trong dung dịch
nƣớc hoặc hữu cơ. Giá trị pH của môi trƣờng tác động đến trạng thái ion hóa của
lipase, sự tích điện của các nhóm phân cực trong phân tử lipase ảnh hƣởng đến
trung tâm hoạt động của lipase [81]. Khi thay đổi pH sẽ làm thay đổi liên kết hydro,
do đó hình dạng trung tâm hoạt động của enzyme thay đổi, ảnh hƣởng đến sự liên
kết của cơ chất và trung tâm hoạt động. Giá trị pH mà tại đó lipase có hoạt động tốt
nhất gọi là pH tối ƣu. Trong khoảng pH tối ƣu, lipase có hoạt độ cao nhất, ở giá trị
pH cao hay thấp hơn giá trị pH tối ƣu thì hoạt độ của lipase giảm. Điều này là vì
chuỗi bên acid amin trong trung tâm hoạt động của enzyme có thể hoạt động nhƣ
acid và bazơ yếu với các chức năng quan trọng phụ thuộc vào trạng thái ion hóa
nhất định của chúng. Sự ion hóa của hầu hết các lipase phụ thuộc vào pH, để lipase
ở trạng thái hoạt động thì nhất định các nhóm chức tại trung tâm hoạt động của
lipase phải đƣợc ion hóa. Do đó, pH tối ƣu cho phản ứng sẽ là pH mà tại đó trạng
thái ion hóa của cơ chất và lipase là thuận lợi nhất cho các phản ứng. Nhìn chung,
khoảng pH tối ƣu của lipase từ một số loại hạt nằm trong khoảng 7 đến 9 [25].
Lipase thu đƣợc từ các nguồn thực vật khác nhau thì có pH tối thích khác nhau.
- Ảnh hƣởng của một số ion kim loại lên hoạt tính của lipase thực vật
Một số ion kim loại nặng nhƣ: Cu2+, Hg2+, Zn2+, Pb2+, Fe2+ là những chất ức
20
chế hoạt động thủy phân của lipase [25]. Ngoài ra EDTA cũng ức chế hoạt động
+ và Ba2+ ở nồng độ thấp
xúc tác của lipase. Vài ion kim loại nhƣ Na+, Ca2+, K+, NH4
0,01M cũng làm tăng hoạt tính lipase. Vƣợt quá nồng độ này, chúng sẽ gây ức chế
hoạt động của enzyme [6].
Mức độ nhũ tƣơng hóa của cơ chất cũng là yếu tố quan trọng làm tăng hoạt
tính lipase. Nhũ tƣơng hóa làm cho cơ chất có kích thƣớc micell, tạo hệ dầu/ nƣớc
giúp cho lipase dễ dàng hoạt động hơn. Một số chất nhũ hóa dầu nhƣ: muối mật,
acid cholic, acid deoxycholic, gum arabic, Triton – X100 [72].
1.2.5. Ứng dụng của lipase thực vật
Lipase là loại enzyme ngày càng đƣợc ứng dụng phổ biến bởi chúng có khả
năng xúc tác nhiều loại phản ứng khác nhau nhƣ thủy phân, tổng hợp chất béo cũng
nhƣ phản ứng chuyển ester [25]. Lipase có vai trò quan trọng trong các ngành công
nghiệp do nó ổn định trong các dung môi hữu cơ, hoạt động trên các cơ chất khác
nhau, có tính đặc hiệu cao. Do đó, lipase đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các quá trình
có liên quan đến chất béo và dầu, nhƣ chất tẩy rửa, công nghệ thực phẩm, tổng hợp
các chất hóa học, trong công nghiệp dƣợc phẩm, sản xuất biodiesel, sản xuất nƣớc
1.2.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm
hoa, v.v...
Trong các sản phẩm thực phẩm, lipase đƣợc ứng dụng để tạo ra các acid béo
bằng cách thủy phân chọn lọc chất béo và dầu có trong nhiều loại thực phẩm [25].
Phụ thuộc vào độ dài của chuỗi carbon và độ bất bão hòa, các acid béo thu đƣợc tạo
cho thực phẩm có hƣơng thơm, màu sắc và mùi vị đặc trƣng với những tính chất lý
hóa và thành phần dinh dƣỡng của nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau [51], [53],
[113].
Ƣu điểm của việc sử dụng lipase thực vật trong các ngành công nghiệp thực
phẩm so với các nguồn lipase khác là lipase thực vật dễ dàng đƣợc chấp nhận so với
lipase vi sinh vật. Lipase thực vật bền hơn trong các phản ứng xúc tác có dung môi
hữu cơ nhƣ phản ứng chuyển ester. Hơn nữa, lipase thực vật còn có chi phí sản xuất
thấp [75]. Mangos và cộng sự đã ứng dụng CPL trong quá trình tổng hợp các
21
triacylglycerol chuỗi ngắn và chuỗi dài (TAG) để dùng trong sữa công thức cho trẻ
sơ sinh [74]. CPL cũng đƣợc sử dụng để tổng hợp triacylglycerol cấu trúc bằng
phản ứng chuyển ester của ethyl ester với tripalmitin [84]. Chất thay thế chất béo
sữa ngƣời đã đƣợc tổng hợp bằng cách sử dụng CPL cố định trong mủ đu đủ nhƣ
một chất sinh học và đƣợc sử dụng thay thế cho lipase thƣơng mại với chi phí thấp
[32]. CPL đƣợc dùng xúc tác cho phản ứng chuyển ester của dầu cọ, tạo ra chất béo
có giá thành thấp dùng cho tổng hợp bơ ca cao nhân tạo, sản xuất chocolate có giá
thành thấp hơn. Việc sản xuất này tạo ra ít sản phẩm phụ hơn so với tổng hợp bằng
phƣơng pháp hóa học [95]. Từ những ứng dụng trên cho thấy lipase từ mủ đu đủ có
tiềm năng ứng dụng thƣơng mại lớn trong ngành công nghệ thực phẩm.
Lipase từ lúa mì, đại mạch, bắp và hạt cải đã đƣợc d ng để sản xuất ester có
khối lƣợng phân tử nhỏ trong môi trƣờng hữu cơ [25]. Những ester này có vai trò
tạo hƣơng cho các sản phẩm thực phẩm.
Ngoài ra lipase đƣợc sử dụng để cải biến triacylglycerol, tạo ra những sản
phẩm dầu có chứa hàm lƣợng các acid béo không no cao nhằm đáp ứng nhu cầu dinh
dƣỡng và tăng giá trị cảm quan. Trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, lipase đƣợc
d ng để thủy phân chất béo trong sữa để tạo những sản phẩm, chất béo đặc biệt với
hƣơng thơm mong muốn nhƣ việc tạo ra các acid béo có các chuỗi carbon khác nhau.
Bên cạnh đó, lipase còn thủy phân các chất béo từ sữa, tạo hƣơng thơm cho
1.2.5.2. Trong công nghiệp dƣợc
các sản phẩm pho mát.
Lipase thực vật đƣợc ứng dụng trong dƣợc phẩm thuận lợi hơn so với lipase
vi sinh vật vì chúng an toàn thậm chí đối với cả lipase chỉ đƣợc tinh sạch một
phần. Lipase thực vật ổn định trong môi trƣờng acid nên không bị phá vỡ bởi acid
dạ dày. Tursi và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng lipase từ lúa mạch, ổn định
trong acid để điều trị bệnh bị thiếu dịch tụy do u xơ [119]. Villeneuve và cộng sự
cũng đã nghiên cứu ứng dụng lipase từ mủ đu đủ trong quá trình tổng hợp ester
canol phytosterol oleate, chất này hoạt động nhƣ các chất làm giảm cholesterol,
làm giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành. Lipase này cũng đã đƣợc sử dụng để ức
22
chế sự phát triển khối u [121].
Hơn nữa, do có tính đặc hiệu cao nên lipase có thể đƣợc d ng để tạo nên các
hợp chất có tính chất dƣợc lý. Lipase là một trong những enzyme đƣợc sử dụng
nhiều nhất trong quá trình tổng hợp đồng phân quang học trung gian tinh khiết.
Việc sử dụng lipase chủ yếu là do các đặc tính chọn lọc vị trí, nhóm chức và đồng
phân quang học trong quá trình phân giải các hỗn hợp đồng phân quang học. Hơn
nữa, lipase nhìn chung ổn định tốt trong dung môi hữu cơ, tạo điều kiện cho sự hòa
tan các cơ chất hữu cơ. Một số cải tiến và các ứng dụng mới cũng đã đạt đƣợc trong
quá trình tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc xúc tác bởi lipase [34].
Nhìn chung, các enzyme này bền trong dung môi hữu cơ, nơi mà cơ chất đƣợc hòa
1.2.5.3. Trong các lĩnh vực khác
tan [49], [61].
Ngoài các ứng dụng trên, lipase còn đƣợc ứng dụng trong công nghiệp chất
tẩy rửa, sản xuất biodiesel sinh học, sản xuất vật liệu sinh học, tổng hợp hữu cơ,
công nghiệp giấy và bột giấy, tổng hợp chất hoạt động bề mặt và triglyceride cấu
trúc, công nghiệp hóa dầu, sản xuất hóa chất nông nghiệp, công nghiệp thuốc trừ
sâu và quản lý môi trƣờng.
Lipase đƣợc sử dụng nhƣ chất phụ gia trong chất giặt rửa và chất tẩy. Các
tính chất chính của lipase đƣợc khai thác trong chất tẩy rửa là do chúng ổn định trong điều kiện pH từ 10 đến 11 và nhiệt độ từ 30 oC đến 60 oC, khả năng chống lại
các thành phần khác nhƣ protease và tính đặc hiệu cơ chất thấp. Lipase từ gạo
(Oryza sativa) và yến mạch (Avena fatua) có các tính năng ph hợp để sử dụng trong bột giặt vì chúng ổn định ở pH kiềm và nhiệt độ khoảng 60 oC [25].
Lipase đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghiệp mỹ phẩm để sản xuất các
chất hoạt động bề mặt nhƣ monoacylglycerol và diacylglycerol thông qua phản ứng
ester hóa của glycerol [56].
Ngoài ra, ứng dụng lipase thực vật trong sản xuất biodiesel đã cho thấy kết
quả đầy hứa hẹn trong những năm gần đây. Khi sử dụng enzyme xúc tác, sản phẩm
phụ glycerol có thể dễ dàng đƣợc loại bỏ mà không cần một quá trình tách phức tạp.
23
Ngoài ra, các acid béo tự do trong dầu, đƣợc sử dụng làm nguyên liệu thô cũng
đƣợc chuyển hóa hoàn toàn thành các alkyl ester [52]. Lipase từ thực vật đƣợc dùng
trong sản xuất acid béo từ triacylglycerol thu đƣợc từ nhiều nguồn khác nhau, các
chất béo có thể đƣợc ester hóa bằng methanol hoặc ethanol để sản xuất biodiesel
[25]. Sản xuất biodiesel thông qua ester hóa nhờ lipase thực vật thuận lợi hơn các
phản ứng hóa học vì nó giảm độ nhớt của dầu bằng cách thay thế glycerol với
methyl hoặc ethyl ancol trong phản ứng ester hóa.
Mounguengui và cộng sự cho rằng lipase từ thực vật có thể dễ dàng đƣợc
chiết tách từ các loại hạt, cám gạo và nhựa cây để ứng dụng trong sản xuất biodiesel
có giá trị không đắt hơn so với lipase từ vi sinh vật. Hơn nữa, chế phẩm lipase thực
vật có thể d ng đƣợc ở dạng chế phẩm thô sau quá trình tinh sạch sơ bộ [80].
Donato và cộng sự (2008) đã đề xuất việc sản xuất methyl và ethyl ester sử
dụng một số các quá trình ester hóa sau khi thủy phân của các loại dầu khác nhau
bằng lipase thực vật. Theo các nhà nghiên cứu, các acid béo có thể thu đƣợc từ quá
trình thủy phân dầu cọ, dầu hạt cây thông bằng lipase hạt thầu dầu; thủy phân dầu
cọ bằng lipase có trong chính nó và ester hóa với methanol hoặc ethanol để sản xuất
biodiesel [42].
1.3. Dầu cá và ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá
1.3.1. Dầu cá
Dầu cá theo IFFO (International fishmeal and fish oil organisation) đƣợc xác
định là một chất lỏng có màu vàng hoặc nâu đƣợc ép từ thịt cá và sau đó thƣờng
đƣợc tinh chế. Dầu cá đƣợc sản xuất từ phần phụ phẩm của các loại cá sau quá trình
chế biến. Phụ phẩm của cá đƣợc lựa chọn chủ yếu là phần thịt vụn, xƣơng, lƣờn và
phần đầu của các loài cá giàu chất béo nhƣ cá hồi, cá trích, cá mòi, cá ngừ. Các phụ
phẩm này cũng đƣợc dùng để chế biến dầu cá/bột cá, chiếm 10-15% thị phần trên
toàn cầu [30].
Dầu cá nhƣ cá ngừ, cá hồi, cá trích, cá mòi, …là nguồn chứa nhiều acid béo
bất bão hoà đa (PUFA) ω-3, trong đó DHA (Docosahexaenoic acid) và EPA
(Eicosapentaenoic acid) có vai trò rất quan trọng đối với cơ thể ngƣời [37]. Cả hai
24
loại acid béo DHA (C22:6, ω-3) và EPA (C20:5, ω-3) đều thuộc nhóm ω-3, rất cần
cho cơ thể và cơ thể ngƣời không tự tổng hợp đƣợc [44]. Cấu trúc phân tử DHA,
EPA đƣợc thể hiện ở Hình 1.4.
DHA là một trong những PUFA hữu ích nhất đối với ngành dƣợc vì nó có
vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn và kiểm soát một số loại bệnh nhƣ bệnh tim
mạch, viêm, dị ứng, ung thƣ, đáp ứng miễn dịch, tiểu đƣờng, tăng huyết áp và rối
loạn thận. DHA còn đƣợc gọi là thức ăn tốt cho não ngƣời vì nó tập trung nhiều ở
màng tế bào não và tế bào võng mạc của mắt [37].
Bên cạnh đó, EPA (C20:5, ω -3) cũng đƣợc xem là acid béo thiết yếu sẽ
chuyển hoá thành các chất sinh học quan trọng nhƣ prostaglandin, leucotrien…
Prostaglandin có tác dụng ức chế sự đông vón tiểu cầu, giảm và phòng ngừa hình
thành huyết khối, đồng thời có thể giảm bớt lƣợng cholesterol, giảm bớt triglyceride
trong máu làm giảm độ nhớt dính của máu. EPA còn tác dụng làm giảm tình trạng
xơ vữa động mạch. Vì vậy EPA có tác dụng tốt đối với việc phòng ngừa và chữa trị
các bệnh tim mạch do xơ vữa động mạch.
Hình 1.4. Cấu trúc phân tử DHA, EPA
Cá hồi là tên gọi chung cho nhiều loại cá thuộc họ Salmonidae, là nguồn lợi
thủy sản quý chứa nhiều chất có lợi cho sức khỏe nhƣ vitamin, DHA, EPA, các
nguyên tố vi chất và nhiều acid amin. Cá hồi sống dọc các bờ biển tại cả Bắc Đại
Tây Dƣơng và Thái Bình Dƣơng. Ở Việt Nam, cá hồi đƣợc ƣơm, nuôi ở Sa Pa, Đà
Lạt, Lạng Sơn, Bắc Giang và một số địa phƣơng khác…Dầu cá hồi chứa hàm lƣợng
cao các acid béo không no đa nối đôi ω -3 PUFA (khoảng 11% EPA, 12,9% DHA)
[32], cao hơn các dầu cá khác. Tuy nhiên, hàm lƣợng DHA, EPA khi chiết tách từ
dầu cá hồi thì chỉ thu đƣợc với hàm lƣợng nhỏ, chƣa đến 30%. Đối với sản phẩm
25
thực phẩm chức năng đòi hỏi lƣợng DHA, EPA trong sản phẩm phải đạt trên 30%.
Do đó, việc nghiên cứu sản xuất triglyceride giàu DHA, EPA từ dầu cá hồi là cần
thiết.
1.3.2. Ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá
DHA có thể đƣợc chiết tách từ dầu cá và các sản phẩm triglyceride có hàm
lƣợng DHA, EPA cao đƣợc tạo ra bằng các phƣơng pháp hóa học hay phƣơng pháp
enzyme. Phƣơng pháp enzyme chiếm ƣu thế hơn phƣơng pháp hóa học vì giảm chi
phí dung môi, phản ứng trong điều kiện êm dịu của pH, nhiệt độ, tính đặc hiệu
enzyme cao, dễ dàng phản ứng [37].
Lipase (EC 3.1.1.3) có thể xúc tác cả phản ứng thủy phân dầu và phản ứng
ester hóa với tốc độ ph hợp, t y vào các loại lipase khác nhau. T y thuộc vào các
điều kiện cụ thể của phản ứng sẽ quyết định phản ứng nào xảy ra. Phản ứng thủy
phân là thuận nghịch và có thể thay đổi chiều phản ứng khi một yếu tố thay đổi, ví
dụ nhƣ hàm lƣợng nƣớc trong phản ứng:
C3H5(OOCR)3 + 3H2O ↔ C3H5(OH)3 + 3RCOOH
Quá trình tổng hợp triglyceride giàu DHA và EPA hay còn gọi là quá trình
làm giàu DHA, EPA dựa vào tính đặc hiệu xúc tác của lipase. Tính đặc hiệu thể hiện
mỗi enzyme chỉ ƣu tiên xúc tác thủy phân một kiểu acid béo nhất định trong phân tử
glyceride. Dựa trên đặc tính này, những acid béo không mong muốn có thể bị loại bỏ,
làm biến đổi cấu trúc phân tử chất béo thông qua các phản ứng đặc trƣng của enzyme,
nhờ đó thu đƣợc các sản phẩm có hàm lƣợng DHA, EPA cao hơn ban đầu.
Một trong những phƣơng pháp enzyme sử dụng để tổng hợp triglyceride
giàu DHA đó là thủy phân và ester hóa chọn lọc. Phƣơng pháp này đƣợc thể hiện
ở sơ đồ Hình 1.5.
Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng lipase từ vi sinh
vật để làm giàu DHA, EPA trong dầu cá nhƣng lipase từ thực vật thì chƣa có công
bố nào. Một số lipase cố định nhƣ Candida cilyndracea lipase, Candida rugosa
lipase, Rhizomucor miehei lipase (RML) đƣợc d ng để thủy phân dầu cá nhằm thu
acid béo omega 3 [110], [79]. Hơn nữa nếu lipase sử dụng là lipase cố định thì sẽ có
26
nhiều ƣu điểm hơn so với lipase tự do. Theo lý thuyết, lipase cố định sẽ bền hơn
trong khoảng pH và nhiệt độ rộng, có tính đặc hiệu hơn, có hoạt tính cao và đặc biệt
là có thể tái sử dụng. Hơn nữa lipase cố định dễ dàng đƣợc thu hồi và do đó giảm
đƣợc giá thành của enzyme [37].
Do đó hƣớng ứng dụng của đề tài là sử dụng lipase để thủy phân dầu cá hồi
Dầu cá, iso-octan/nƣớc
Thủy phân bởi lipase không đặc hiệu
Chiết với hexan và KOH trong cồn
Pha hữu cơ chứa glyceride
Chiết FFA trong pha nƣớc
Ester hóa với butanol bởi lipase
không đặc hiệu với DHA, EPA
Ester của các acid béo khác DHA, EPA
Tách phân đoạn acid béo giàu DHA, EPA
Ester hóa với glycerol bởi lipase đặc
hiệu với DHA, EPA
Glyceride giàu DHA, EPA
làm tiền đề cho quá trình làm giàu DHA, EPA trong dầu cá.
27
Hình 1.5. Quy trình tổng hợp glyceride giàu DHA, EPA [37]
1.4. Lƣợc sử vấn đề nghiên cứu
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trƣớc đây, việc nghiên cứu lipase chỉ xuất phát từ việc thu nhận chế phẩm
enzyme bằng nuôi cấy vi sinh vật, động vật. Tuy nhiên, hiện nay lipase thu nhận từ
các nguồn thực vật hiện đang đƣợc các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên
1.4.1.1. Tình hình nghiên cứu đặc tính lipase từ thực vật
cứu nhiều.
Tóm tắt một số đặc tính của lipase từ các nguồn thực vật khác nhau đƣợc các
tác giả trên thế giới nghiên cứu thể hiện ở các Bảng 1.2, Bảng 1.3 và Bảng 1.4.
Bảng 1.2 cho thấy lipase từ một số nguồn hạt chứa dầu đã đƣợc một số tác
giả nghiên cứu chủ yếu là thu nhận, xác định nhiệt độ, pH tối thích, chất hoạt hóa,
chất kìm hãm cũng nhƣ tính đặc hiệu của lipase trên những cơ chất khác nhau. Lipase từ hạt có dầu có nhiệt độ tối thích tƣơng đối cao khoảng 37 - 70 oC. Các lipase này hoạt động tốt trong môi trƣờng kiềm. Ion Ca2+ thƣờng làm tăng hoạt độ của lipase từ hạt có dầu; ion Cu2+, Ni2+ làm giảm hoạt độ của lipase từ hạt có dầu.
Tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng về loại lipase này vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều.
Tính chất của một số loại hạt ngũ cốc đã đƣợc một số tác giả nghiên cứu thể
hiện ở Bảng 1.3. Lipase từ các loại đậu, hạt hƣớng dƣơng đƣợc d ng để thủy phân
dầu sản xuất acid béo. Lipase từ cám gạo đƣợc ứng dụng bổ sung trong chất tẩy rửa.
Bên cạnh đó một số nghiên cứu về lipase cũng chỉ tập trung chủ yếu về khả năng
thủy phân chất béo trong quá trình bảo quản hạt giống.
Lipase từ các loại mủ (latex) nhƣ mủ xƣơng rồng, mủ sung, mủ đu đủ, đã
đƣợc các tác giả ngoài nƣớc nghiên cứu chiết tách và xác định đặc tính. Từ Bảng
1.4 cho thấy lipase thô từ mủ quả Babaco và Plumeria rubra đƣợc dùng xúc tác
phản ứng thủy phân dầu hƣớng dƣơng và phản ứng chuyển nhóm acyl. Lipase từ vỏ
và hạt quả đu đủ cũng đƣợc thu nhận, tinh sạch và ứng dụng trong phản ứng thủy
phân và tổng hợp ester. Trong những năm gần đây, lipase từ mủ đu đủ đƣợc quan
tâm nghiên cứu nhiều về đặc tính cũng nhƣ ứng dụng. Tuy nhiên, lipase thu nhận
28
đƣợc chỉ dừng lại ở dạng chế phẩm thô. Năm 2011, Slim Abdelkafi cũng đã chiết
tách enzyme thủy phân từ mủ đu đủ, xác định đặc tính hóa sinh và khẳng định
enzyme chiết đƣợc thể hiện hoạt tính esterase hơn là lipase [17]. Lipase thô đƣợc
xem là loại lipase “cố định” trong mủ, mặc d đã đƣợc nghiên cứu nhƣng các nhà
khoa học chƣa thể tách đƣợc lipase ra khỏi mủ đu đủ, đó là khó khăn đang cần đƣợc
29
nghiên cứu khảo sát.
Bảng 1.2. Tính chất của lipase từ một số loại hạt chứa dầu
Chất hoạt hóa
Chất ức chế
Cơ chất
Tài liệu tham khảo
Nguồn nguyên liệu thu lipase pHopt
To opt (oC)
Hạt hạnh nhân (Amygdalus
65
8,5
Mg2+, Cu2+ và Ni2+
Dầu đậu nành Tributyrin
Ca2+, Fe2+, Mn2+, Co2+, và Ba2+
Yeşiloğlu Y, Başkurt L. (2008) [126]
communis L.)
50
8,0
Dầu bay laurel
Isbilir và cộng sự (2008) [59]
Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Mg2+
Hạt nguyệt quế (Laurus nobilis L.)
5
Ca2+
Cu2+
Dầu oliu
Panzanaro S, (2010) [89]
Quả ô liu (europaea Olea)
9,0
70
Dầu oliu
Cu2+, Ca2+, Hg2+, Mn2+, Ni2 +
Yes¸im Yes¸ilog˘lu và cộng sự (2010) [125]
Hạt óc chó (Juglans regia L.)
acid stearic, oleic
9,0
38
Ezema và cộng sự (2012) [48]
và palmitic.
Hạt cacao nảy mầm (Theobroma cacao L.)
CaCl2 1mM, MgCl2 10mM và PMSF 1- 10 mM
CuCl2, HgCl2, FeCl3, AlCl3, EDTA và DMSO
37
Ca2+
Pb2+
Dầu oliu
5,9 - 7,5
Ezema và cộng sự (2012) [47]
Hạt dƣa hấu trắng (Cucumeropsis manni.) Lipase acid và lipase kiềm
5,4
40
Avramiuc, M. và cộng sự (2016) [24]
Hạt đậu phộng, quả óc chó, hạt hạnh nhân, vừng
Dầu hƣớng dƣơng, bí ngô, đậu nành, bắp, đậu phộng, quả óc chó, hạnh nhân và vừng
30
Cơ chất
Ứng dụng
Tài liệu tham khảo
Bảng 1.3. Tính chất của lipase từ một số loại hạt ngũ cốc pHopt To
Chất hoạt hóa
opt (oC) 50
8
- Dầu oliu
Chất ức chế
Eze Sabinus Onyebuchi và cộng sự (2007) [120]
24
8
- Dầu oliu
Nguồn nguyên liệu thu lipase Bốn loại ngô (Zea mays): Local yellow (LY), Western yellow (WY), Western white (WW), Popcorn (POP) Hạt đậu nành
Thủy phân dầu đậu phộng, dầu cọ, dầu đậu nành (hoạt độ cao nhất).
5,5
32-37
Ca2+, Mg2+
Hg2+ EDTA
Gadge, P.P và cộng sự (2011) [73] Morgana Karin Pierozan và cộng sự, (2011) [93]
Hạt lúa mì (Triticum aestivum)
4,5
- Dầu oliu - Dầu dừa - Tributyrin - Dầu cọ - Dầu đậu nành
Thủy phân đặc hiệu cơ chất chuỗi dài và chuỗi trung bình. Thủy phân các loại dầu khác nhau để sản xuất acid béo
Kádima C. Santos và cộng sự (2013) [107]
7,0
p - NPP.
Hyuk Jung (2013) [64]
Đậu castor (Ricinus communis), Ngô (Zea mays), hạt hƣớng dƣơng (Helianthus annuus), Hạt chanh dây (Passiflora edulis) Hạt yến mạch (oat seeds)
7,0
Đặc hiệu cao với monoacylglycerol có acid béo mạch ngắn -
5,4
40
Cám gạo (rice bran) Hạt giống (Pachira Aquatica)
p-nitrophenyl acetate - Dầu đậu tƣơng - Nƣớc thải
7,0
- Chất tẩy rửa - Xử lý nƣớc thải gia cầm - Thủy phân chất béo - Bổ sung vào chất tẩy rửa
Cám gạo
Mukesh Kumar Sharma (2013) [112] Patrícia Peres Polizell và cộng sự (2013) [97] P. Kanmani và cộng sự (2015) [66]
7,0
40
Ca2+
Hạt cọ
T.Okunwaye (2015) [84]
- Dầu Castor - Dầu oliu - Dầu cọ - dầu dừa - dầu oliu - dầu cọ
31
Bảng 1.4. Tính chất của lipase từ một số loại mủ
Chất hoạt hóa
Chất ức chế
Cơ chất
Ứng dụng
Tài liệu tham khảo
opt
pHopt
To (oC)
Emmanuelle Cambon, (2006) [31]
50 55
- Thủy phân - Tổng hợp
30-60
7,0 4,0 - 7,0 8,5 - 10,0
Nguồn nguyên liệu - Babaco - Plumeria rubra Vỏ và hạt quả đu đủ
Fernanda Wiermann Paques (2008) [90]
- Ester hóa với acid sterid
protease phenylmethanosulfony l fluorate (PMSF)
9
37
Slim Abdelkafi & cộng sự, (2011), [17]
- Dầu hƣớng dƣơng - Dầu hạt cải - Dầu oliu - Tributyrin
Mủ quả đu đủ Lipase cố định trong mủ.
sodium taurodeoxycholate (NaTCD) và chất tẩy rửa ion lƣỡng cực Chaps
5,5
45
Ca2+ và Cu2+
- Dầu oliu
Houda Lazreg-Aref (2012) [53]
Mủ quả sung (Ficus carica L.) (Moracea)
Triton X100, sodium dodecyl sulfate (SDS) tetradecyl trimethylammonium bromide (TTAB) Fe2+, Mg2+, và Zn2+ Triton X100 và EDTA
Toshifumi Miyazawa và cộng sự (2013) [78]
Mủ quả đu đủ (Carica papaya)
- chuyển ester của 2-propanoic acid ester
40
Houda Lazreg Aref và cộng sự (2014) [52]
Sodium dodecyl sulfate
-Tributyrin - Dầu oliu
8
Mủ xƣơng rồng (Tunisian Euphorbia peplus latex) KLPT 40kDa
Fe2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+ , Triton X100 và Tween80
8,5
60
- Dầu hạt bông
Paula Di Santo Meztler và cộng sự [77]
Lipase cố định từ mủ Araujia sericifera Brot. (Apocynaceae)
32
1.4.1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng lipase thực vật
Mangos và cộng sự đã ứng dụng thành công CPL trong việc tổng hợp
triacylglycerol chuỗi ngắn có năng lƣợng thấp và chuỗi dài dùng trong sữa công
thức cho trẻ sơ sinh. CPL cũng đƣợc dùng để sản xuất triacylglycerol cấu trúc bằng
phản ứng chuyển ester của ethyl ester với tripalmitin vào năm 2001 [54].
Năm 2009, Porntippa Pinyaphong và Suree Phutrakul ở đại học Thái Lan đã
nghiên cứu tổng hợp bơ ca cao nhân tạo từ dầu cọ xúc tác bởi CPL. Kết quả nghiên
cứu cho thấy các sản phẩm bơ ca cao nhân tạo chịu ảnh hƣởng bởi các chất cho
nhóm acyl, tỷ lệ cơ chất, hàm lƣợng nƣớc ban đầu của enzyme, thời gian phản ứng,
nhiệt độ phản ứng và lƣợng enzyme. Trong số ba chất cho nhóm acyl là methyl
stearate, ethyl stearate và acid stearic, trong đó methyl stearate là chất cho nhóm
acyl tốt nhất cho sự tổng hợp bơ ca cao nhân tạo. Điều kiện phản ứng đạt tối ƣu ở 45 oC trong 4 giờ, tỷ lệ cơ chất (dầu cọ: methyl stearate, mol/mol) 1:4, lƣợng
enzyme là 18%, hoạt độ nƣớc ban đầu 0,11. Hiệu suất thu hồi bơ ca cao nhân tạo ở
điều kiện tối ƣu đạt 55% so với lƣợng dầu cọ đã sử dụng [94].
Năm 2012, Weerasooriya và cộng sự đã chiết tách lipase kiềm từ hạt cao
su, lipase này đƣợc tinh sạch một phần, khảo sát đặc tính và tiềm năng ứng dụng
nhƣ phụ gia bổ sung vào chất tẩy rửa. Enzyme đƣợc tìm thấy tƣơng thích với chất
hoạt động bề mặt ion và không có tính ion, chất oxy hóa và chất tẩy rửa thƣơng mại. Enzyme vẫn thể hiện hoạt độ khi có mặt Triton X100 và Ca2+, hoạt độ giảm
đáng kể khi có mặt của Tween 80, Tween 20 và SDS. Lipase này hoạt động tốt ở pH 8 và 40 oC. Enzyme này ổn định đáng kể ở pH 8 đến 10, nhiệt độ thấp 30 oC – 50 oC [123].
Năm 2012, Carla Tecelão và cộng sự đã ứng dụng lipase mủ đu đủ làm chất
xúc tác trong tổng hợp chất béo thay thế sữa mẹ (HMFS). Mục đích nghiên cứu
nhằm đánh giá tiềm năng của CPL tự cố định trong mủ đu đủ nhƣ một chất xúc tác
sinh học cho sự tổng hợp HMFS, đƣợc sử dụng nhƣ là một nguồn thay thế với giá
thành thấp thay cho lipase thƣơng mại. Hai chế phẩm CPL khác nhau chiết xuất từ
33
quả đu đủ (CPL I) và từ cuống lá (CPL II) của cây đu đủ, đã đƣợc thử nghiệm nhƣ
là chất xúc tác cho các phản ứng thế gốc acid giữa tripalmitin và (i) acid oleic hoặc (ii) omega - 3 PUFA, ở 60 oC, trong môi trƣờng không có dung môi. Sau 24 giờ, tỷ
lệ mol acid oleic phản ứng cao hơn (22,1% mol) khi sử dụng CPL I xúc tác [116].
Năm 2013, Matheus H.M. Avelar và cộng sự đã nghiên cứu chiết lipase từ
bột đậu castor (Ricinus communis L.), ứng dụng để thủy phân các loại dầu thực vật
khác nhau cho hiệu suất thu acid béo cao. Dịch chiết enzyme cho thấy có hoạt độ
cao hơn trên các loại dầu giàu acid linoleic (C18: 2) và acid linolenic (C18: 3)
chẳng hạn nhƣ dầu đậu tƣơng (86,1 ± 2,3 UI/g) và dầu hạt cải (81,3 ± 2,4 UI/g) so
với dầu giàu acid oleic nhƣ dầu oliu (61,1 ± 4,5 UI/g). Quá trình thủy phân nhờ
enzyme xúc tác thực hiện trong lò phản ứng có cánh khuấy cho thấy có hiệu suất
thủy phân dầu hạt cải đạt 88,2 ± 6,80% sau 3 giờ phản ứng. Nghiên cứu đã xác định
đƣợc điều kiện tối ƣu của quá trình thủy phân dầu hạt cải sau thời gian 2 giờ là không bổ sung thêm CaCl2, ở 37,5 oC và tỷ lệ khối lƣợng dầu : dung dịch đệm là 30
wt%. Theo kết quả nghiên cứu cho thấy, dùng lipase thu nhận từ hạt đậu castor với
giá thành thấp để thủy phân dầu thực vật là có tính khả quan. Chiến lƣợc này có ý
nghĩa kinh tế trong việc sản xuất các acid béo tự do từ triglycerides, một loại hợp
chất trung gian quan trọng dành cho ngành công nghiệp hóa dầu [23].
Nhận xét: Lipase thô từ thực vật cũng đã đƣợc một số tác giả trên thế giới
nghiên cứu ứng dụng nhƣ lipase mủ đu đủ ứng dụng trong sản xuất bơ cacao nhân
tạo, sản xuất chất béo thay thế sữa mẹ, lipase từ hạt cao su d ng để bổ sung vào chất
tẩy rửa, lipase bột đậu ứng dụng thủy phân chất béo để sản xuất acid béo. Điều này
cho thấy lipase thực vật cũng có tiềm năng ứng dụng cao nếu đƣợc khai thác triệt
để, đặc biệt là lipase từ mủ đu đủ. Đến nay, ứng dụng lipase thực vật để thủy phân
dầu cá vẫn chƣa có công trình nghiên cứu nào đƣợc công bố. Đây cũng là định
hƣớng nghiên cứu ứng dụng của đề tài.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu và ứng dụng về lipase còn chƣa
nhiều. Nghiên cứu về lipase mới chỉ tập trung vào thu nhận enzyme từ nguồn vi
34
sinh vật, động vật. Tuy nhiên, nghiên cứu lipase từ nguồn thực vật hầu nhƣ chƣa
đƣợc quan tâm.
- Nghiên cứu về đặc tính của lipase
Năm 2008, tác giả Đinh Thị Vĩnh Hà đã nghiên cứu sự biến đổi hoạt độ
lipase, protease và amylase của hạt đậu tƣơng nảy mầm trong điều kiện thiếu nƣớc.
Kết quả cho thấy, trong điều kiện đủ nƣớc, hoạt độ lipase tăng dần từ ngày thứ 1,
đạt đỉnh ở ngày thứ 3, ổn định và giảm đến ngày thứ 7 sau khi gieo. Trong điều kiện
thiếu nƣớc, hoạt độ lipase cũng tăng từ ngày thứ 1 nhƣng tăng chậm và đạt đỉnh ở
ngày thứ 5 và sau đó hoạt độ giảm khi đến ngày thứ 7 [1].
Năm 2011, tác giả Trần Đăng Khoa và cộng sự đã sàng lọc, thu nhận và khảo
sát hoạt tính lipase từ Bacillus. Kết quả cho thấy chủng Bacillus subtilis OII (BS7)
sinh lipase cao nhất ở pH 7; nồng độ cơ chất dầu oliu 1,2% (w/w) sau 3 ngày nuôi
cấy. Chế phẩm lipase thu đƣợc có khả năng chịu kiềm (pHopt 10), chịu nhiệt opt 60 oC). Mg2+, Ca2+ là hai ion giữ hoạt tính lipase; Zn2+, Cu2+, SDS 0,2% làm (to
giảm 95% hoạt tính lipase. Khối lƣợng phân tử của lipase từ Bacillus đƣợc xác định
khoảng 23,8 kDa [2].
- Nghiên cứu ứng dụng lipase
Năm 2004, tác giả Đặng Thị Thu cùng các cộng sự thuộc Đại học Bách Khoa
Hà Nội đã nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase từ nấm men Candida rusgosa và
chủng Bacillus trong công nghệ sản xuất dầu béo [10]. Kết quả ứng dụng lipase
trong công nghiệp sản xuất dầu béo nhằm làm tăng chỉ số acid của dầu và ứng dụng
trong sản xuất pho mát.
Năm 2012, tác giả Trần Thị Bé Lan và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng
enzyme lipase từ Candida rusgosa (LCR) và Porcine pancreases (LPP) thƣơng mại
đƣợc tinh chế ở dạng tự do xúc tác phản ứng transester hóa dầu dừa. Các thông số
ảnh hƣởng đến hoạt động và tính bền của lipase đƣợc đánh giá dựa vào chỉ số ester
và hiệu suất thu hồi. Phản ứng chuyển ester xúc tác bởi LCR và LPP có chỉ số ester, hiệu suất thu hồi lần lƣợt là 7,03 (mg KOH/g), 0,81% ở 35 oC; đệm phosphate pH 7; tốc độ khuấy 250 (vòng/phút); 6 giờ và 6,01 (mg KOH/g); 0,73% ở 35 oC, đệm
35
borat pH 9; tốc độ khuấy 200 (vòng/phút); 5 giờ. Độ chuyển hóa thực hiện ở điều
kiện tốt nhất của phản ứng đƣợc xác định dựa vào phân tích GC/FID. Kết quả cho
thấy LCR có độ chuyển hóa là 0,77%, cao hơn LPP (0,43%) [3].
Năm 2013, tác giả Vƣơng Bảo Thy, Trần Bích Lam và Lƣu Duẩn đã nghiên
cứu tính chất động học và đặc điểm thủy phân của lipase tinh sạch từ gan tụy cá
tra (Pangasius). Lipase từ tụy cá tra đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp kết tủa
phân đoạn với muối amoni sulfate, sắc ký trao đổi ion DEAE Cellulose, sắc ký lọc
gel Sephadex G - 75. Thông số động học của lipase từ gan tụy cá tra (Pangasius)
đƣợc xác định Km = 1,381 mM và Vmax = 0,063 mM/min với cơ chất triolein. Lipase tinh sạch có hoạt tính ổn định ở khoảng pH 7 đến 9, 35 - 50 oC. Ở 50 oC,
enzyme mất khoảng 44,7% hoạt độ sau thời gian 120 phút. Lipase tinh sạch thủy
phân cơ chất đặc hiệu vị trí α - 1,3 của triglyceride. Ở nồng độ muối mật NaTC
0,015M, hoạt độ của enzyme lipase tăng gấp 3,08 lần so với mẫu không bổ sung
muối mật NaTC [11].
Năm 2016, Hoàng Thị Bích và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hƣởng của một số
yếu tố đến quá trình thủy phân dầu từ đầu cá ngừ vây vàng thành các acid béo tự do
bởi enzyme lipase từ Candida Rugosa trong hệ hai pha dung môi: nƣớc. Kết quả cho thấy ở điều kiện tối ƣu pH 7,5, 40 oC, tỷ lệ enzyme cơ chất 0,8%, thời gian thủy
phân 12 giờ đã giải phóng lƣợng acid béo tự do lớn nhất với chỉ số acid đạt
149,8mg KOH/g và hiệu suất thủy phân dầu là 77,42% [2].
Năm 2019, Đào Thị Mỹ Linh và cộng sự đã nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình
nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger nhằm thu nhận enzyme lipase và ứng dụng
trong tiền xử lý nƣớc thải [5].
Tình hình nghiên cứu lipase ở Việt Nam chủ yếu thu nhận từ vi sinh vật và
nội tạng động vật, khảo sát đặc tính, tinh sạch và ứng dụng. Cho đến nay lipase từ
thực vật ở Việt Nam vẫn chƣa đƣợc tác giả nào nghiên cứu khảo sát về đặc tính
cũng nhƣ ứng dụng.
Tóm lại, qua tham khảo các kết quả nghiên cứu đã đƣợc công bố ở Việt Nam
và trên thế giới liên quan đến quá trình thu nhận, khảo sát đặc tính của lipase, có thể
36
nhận thấy ra một số vấn đề còn tồn đọng cần giải quyết nhƣ sau:
- Mặc dù trên thế giới cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu lipase thu
nhận từ các nguồn thực vật khác nhau nhƣng chƣa có công trình nào đƣợc thực hiện
trên các nguyên liệu phổ biến ở Việt Nam.
- Mủ đu đủ đƣợc xác định có chứa nhiều loại enzyme nhƣng đến nay lipase
với đặc tính “cố định” trong mủ đã gây nhiều khó khăn cho việc hòa tan, đây vẫn
đang là enzyme chƣa đƣợc tinh sạch hoàn toàn.
- Nghiên cứu xây dựng quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ vẫn chƣa hoàn
thiện.
- Tính đặc hiệu của lipase trên các cơ chất khác nhau vẫn chƣa đƣợc nghiên
cứu đầy đủ.
- Nghiên cứu ứng dụng lipase từ nguồn thực vật cho ngành công nghệ thực
phẩm vẫn còn hạn chế.
- Đặc biệt, nghiên cứu lipase thu từ nguồn thực vật ở Việt Nam là chƣa có.
Hƣớng nghiên cứu của đề tài đƣợc chọn: “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát
đặc tính của lipase từ thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực
37
phẩm” nhằm góp phần giải quyết các tồn đọng rút ra ở trên.
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Nguyên liệu hạt
- Đậu nành (Glycine max): giống ĐTDH.02 do Viện Khoa học Kỹ thuật
Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung Bộ cung cấp. Hạt đậu nành có màu vàng sáng,
rốn hạt màu nâu, kích thƣớc hạt lớn và biến động từ 175 - 185 g/ nghìn hạt.
- Đậu phộng (Arachis hypogaea L.): ở Đắk Lắk thu hoạch sau khi trồng
khoảng 95 – 100 ngày. Đậu phộng sau khi thu hoạch sẽ đƣợc phơi để đảm bảo khả
năng nảy mầm và tăng thời gian bảo quản. Tiến hành bóc vỏ và lựa chọn các hạt đậu
phộng có kích thƣớc đồng đều, màu hồng nhạt, căng bóng để tiến hành nghiên cứu.
(a) (b)
Hình 2.1. Hạt đậu nành (a) và hạt đậu phộng (b)
2.1.2. Nguyên liệu phụ phẩm nông nghiệp (cám gạo, phôi lúa mì)
- Cám gạo: thu nhận từ nhà máy xay xát lúa ở Quảng Ngãi.
- Phôi lúa mì (Triticum aestivum): thu nhận từ nhà máy bột mì Việt Ý, Đà Nẵng.
(a) (b)
38
Hình 2.2. Phôi lúa mì (a) và cám gạo (b)
2.1.3. Nguyên liệu mủ từ các loại quả
- Mủ đu đủ: thu từ một số vƣờn đu đủ (Carica papaya) trồng tại xã Đại An,
huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam. Giống đu đủ: Sinta (F1) của Thái Lan.
Hình 2.3. Vƣờn thu nhận mủ đu đủ
- Mủ quả vả (Ficus auriculata) và mủ quả sung (Ficus racemosa) đƣợc thu
nhận từ vƣờn của các hộ nông dân ở Phú Lộc, Thừa Thiên Huế.
(a) (b)
39
Hình 2.4. Quả vả (a) và quả sung (b)
2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
Một số hóa chất chính d ng trong nghiên cứu đƣợc tóm tắt ở Bảng 2.1
Bảng 2.1. Một số h a chất ch nh d ng trong nghiên cứu
TT TÊN HÓA CHẤT XUẤT XỨ QUY CÁCH Đ C T NH
Sigma 1g/lọ >98% 1 para-Nitrophenyl palmitate
Bio- Rad 500 g/lọ 99,9% 2 Tris - Base
Canada 500ml/lọ 3 Triton X-100
Merck 1000ml/lọ >99,8% 4 2-Propanol
Sigma–Aldrich 5 n – Hexan
Merck 250g/lọ >99,5% 6 NaCl
Sigma 50g/lọ >99% 7 p-Nitrophenol
Sigma 50g/lọ >97% 8 N-Lauroyl sarcosine sodium
Trung Quốc 9
Đạt tiêu chuẩn phân tích
KCl, MgCl2, CaCl2, NaHCO3, Na2CO3, CH3COOH, Gum Arabic, CH3COONa, NaH2PO4.7H2O, NaH2PO4.7H2O, acetone
2.2.2. Thiết bị
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ
thực phẩm, Khoa Hóa, Trƣờng Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng, Trung tâm
Hóa học Tiên tiến, Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ cao – Đại học Duy Tân.
Ngoài ra, một số chỉ tiêu còn đƣợc phân tích tại Trung tâm Phân tích Quatest 2, Đà
40
Nẵng. Danh mục một số thiết bị và hình ảnh của chúng đƣợc trình bày ở Phụ lục 1.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Đậu nành, - Đậu phộng - Thành phần nguyên liệu - Cám gạo, - Phôi lúa mỳ - Mủ đu đủ, - Mủ sung, mủ vả
Nảy mầm
Thu lipase thô
Khảo sát hoạt t nh của lipase thô - Nhiệt độ tối ƣu - pH tối ƣu - Ion kim loại
Chọn nguồn nguyên liệu tiềm năng - Hoạt độ lipase - Hiệu suất thu lipase
- PP bảo quản nguyên liệu - Thông số tối ƣu quy trình - Thử khả năng thủy phân trên các cơ chất khác nhau
Xây dựng quy trình thu lipase thô
Tinh sạch lipase
- Chiết lipase - Tủa bằng AS - Sắc ký .
Ứng dụng lipase thô trong quy trình làm giàu DHA, EPA trong dầu cá hồi
- Điện di và V - K
m
max
- Đặc tính thủy phân. - Tối ƣu hóa quá trình thủy phân. Xác định đặc t nh lipase tinh sạch
41
Hình 2.5. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
2.4. Bố trí thí nghiệm
2.4.1. Phần 1: Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật:
đậu nành, đậu phộng nảy mầm, cám gạo, phôi mì, mủ sung, mủ vả, mủ đu
đủ
Mục đích: khảo sát thu lipase thô từ các nguồn thực vật và đánh giá chọn
2.4.1.1. Phần 1.1. Xác định một số thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu
hạt đậu nành, hạt đậu phộng, cám gạo, phôi lúa mì, mủ đu đủ
nguồn thực vật có tiềm năng thu lipase tốt nhất để nghiên cứu tiếp theo.
Các thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu: độ ẩm, hàm lƣợng tro tổng,
hàm lƣợng lipid tổng, hàm lƣợng protein tổng đƣợc xác định theo các phƣơng pháp
2.4.1.2. Phần 1.2. Thu nhận lipase từ các nguồn thực vật
mô tả ở mục 2.5.1.
a. Thu nhận lipase từ hạt đậu phộng, hạt đậu nành nảy mầm
- Phương pháp xác định thời gian nảy mầm
Để xác định thời gian nảy mầm cho hoạt độ lipase cao nhất, hạt đƣợc ngâm,
ủ và đo hoạt độ lipase sau mỗi 24 giờ. Cách tiến hành nhƣ sau:
Hạt đậu phộng sau khi lựa chọn đƣợc ngâm trong nƣớc theo tỷ lệ 1:1 ở nhiệt
độ phòng trong 3 giờ, sau đó đem ủ trong bóng tối để hạt nảy mầm.
Hạt đậu nành đƣợc gieo trong m n cƣa có độ ẩm 70%, ủ trong bóng tối ở
nhiệt độ phòng để hạt nảy mầm.
Mẫu đậu phộng, đậu nành đƣợc quan sát hình thái hạt sau mỗi 24 giờ trong
khoảng 6 ngày và tiến hành thu dịch chiết lipase thô theo quy trình mô tả ở Hình
2.6. Phƣơng pháp thu dịch chiết lipase từ đậu phộng, đậu nành nảy mầm đƣợc thực
hiện theo quy trình Hình 2.6, tƣơng tự nhƣ quy trình thu lipase từ đậu nành nảy
mầm của Gadge và cộng sự [73].
Cụ thể nhƣ sau:
42
- Các mẫu hạt nảy mầm sau mỗi 24 giờ đƣợc nghiền với nƣớc cất lạnh (tỷ lệ 1:1); Ly tâm các mẫu với tốc độ 7500 vòng/phút trong 10 phút ở 4 oC và thu phần dịch; Tủa 20 ml dịch thu đƣợc bằng acetone lạnh (4 oC) theo tỷ lệ 1:2 (v/v); Ly tâm
với tốc độ 7500 vòng/phút trong 10 phút ở 4 oC, thu phần tủa. Hòa tan phần tủa thu đƣợc trong 50 ml nƣớc cất và ly tâm 7500 vòng/phút trong 10 phút ở 4 oC để thu
dịch chứa lipase thô.
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình thu lipase từ hạt đậu phộng, đậu nành nảy mầm
Các dịch lipase thô thu đƣợc đem phân tích xác định hoạt độ lipase bằng
phƣơng pháp chuẩn độ theo mục 2.5.2. và so sánh để chọn thời gian nảy mầm tốt
nhất.
- Phương pháp thu chế phẩm lipase thô từ hạt đậu nành nảy mầm
43
Cân 20 g hạt đậu nành nảy mầm tại thời điểm cho hoạt độ lipase cao nhất, nghiền với 20 ml nƣớc cất. Sau đó lọc thu lấy dịch chiết, tủa với actone lạnh ở 4 oC
theo tỷ lệ 1:2. Thể huyền ph thu đƣợc đem ly tâm ở 7500 vòng/phút trong 10 phút; Thu phần tủa đem cấp đông trong 24 giờ ở nhiệt độ -20 oC. Sau đó đem sấy thăng hoa ở -40 oC trong 5 giờ. Nghiền mịn kết tủa sau khi sấy thu đƣợc chế phẩm lipase
thô ở dạng khô [73].
Chế phẩm này đƣợc dùng trong các thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh
hƣởng đến hoạt độ lipase của hạt đậu nành nảy mầm.
b. Thu nhận lipase từ cám gạo, phôi lúa mì
Cám gạo và phôi lúa mì đƣợc lấy từ các nhà máy, đóng gói trong bao ni lông
kín và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh (4 oC).
Phƣơng pháp thu dịch lipase thô từ cám gạo và phôi mì đƣợc thực hiện theo
quy trình ở Hình 2.7, tƣơng tự nhƣ quy trình thu lipase từ cám gạo của Kanmani và
cộng sự [66].
Hình 2.7. Sơ đồ quy trình thu lipase thô từ cám gạo, phôi lúa mì
44
Theo quy trình Hình 2.7, lƣợng cám gạo (hoặc phôi lúa mì) d ng để thu
lipase là 40 gam, cho vào cốc 500ml, thêm n-hexan vào với tỷ lệ 3/1 (v/w), khuấy trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (25 oC) nhằm loại lipid trong nguyên liệu. Đem hỗn
hợp lọc qua vải lọc tách lấy phần bã, sấy khô bã nhằm loại hết n-hexan. Thêm dung
dịch đệm phosphate 50 mM, pH 7 với tỷ lệ: 5/1 (v/w) vào phần bã thu đƣợc, ngâm ở 4 oC, trong 30 phút. Hỗn hợp đƣợc đem ly tâm 7500 vòng/phút trong 15 phút ở 4 oC
thu đƣợc dịch chiết lipase thô từ cám gạo (hoặc phôi lúa mì) [66].
Dịch chiết lipase thô từ cám gạo (hoặc phôi lúa mì) đƣợc dùng trong các thí
nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase.
c. Thu nhận lipase từ mủ các loại quả
c.1. Mủ quả đu đủ
* Điều kiện lấy mủ
Mủ đƣợc lấy ở những quả đang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lƣợng từ 0,3-
0,5 kg. Quả non quá hoặc quả già quá cho lƣợng mủ ít vừa không sánh sệt, hoạt độ
enzyme không cao. Để thu chế phẩm enzyme có hoạt tính cao nhất, nên lấy mủ ở
quả đang độ 10 tuần tuổi [9].
Thời gian lấy mủ: bắt đầu thu nhận từ 6 đến 8 giờ sáng, lúc độ ẩm không khí
cao. Mủ đu đủ đƣợc thu nhận vào đầu tháng 9 dƣơng lịch.
* Tiến hành thu nhận mủ đu đủ
- Dùng dao lam rạch vài đƣờng dọc theo quả ở chỗ đƣờng kính lớn nhất, các
vết khía cách nhau 3-5 cm (không rạch sâu quá 2 mm, nếu không dịch nƣớc và tinh
bột từ quả sẽ trộn lẫn vào mủ và làm giảm chất lƣợng dịch mủ thu đƣợc).
- Hứng mủ chảy ra bằng lọ nhựa trong 4-6 phút, sau khi lấy mủ xong đậy nắp
kín và bảo quản lạnh ngay, sau đó đƣa về phòng thí nghiệm bảo quản ở -20 °C để sử
dụng cho các nghiên cứu [9].
* Cách tiến hành thu lipase thô từ mủ đu đủ
Mủ đu đủ sau khi thu nhận tại vƣờn đƣợc cấp đông, sấy thăng hoa ở -40 oC
trong 16 giờ thu đƣợc mủ đu đủ khô.
45
Sơ đồ thu nhận lipase thô từ mủ đu đủ thể hiện ở Hình 2.8
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ
Bƣớc 1: Thêm 55 ml nƣớc cất lạnh vào 1,63g mủ khô, khuấy 5 phút. Bƣớc 2: Ly tâm mẫu 6000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC loại bỏ phần
dịch nổi
Bƣớc 3: Lặp lại bƣớc 1 và bƣớc 2 thêm 3 lần. Bƣớc 4: Tủa thu đƣợc đem sấy thăng hoa ở -40 oC trong 16 giờ. Nghiền mịn
mẫu, thu đƣợc chế phẩm lipase dạng thô, bảo quản trong bình thủy tinh đậy nắp kín
[102], [116].
Lipase thô thu đƣợc từ mủ đu đủ đƣợc dùng trong các thí nghiệm khảo sát
các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase.
c.2. Mủ quả vả, quả sung
Quả vả, quả sung thuộc họ Ficus. Mủ của các loại quả này đƣợc biết đến
chứa nhiều loại enzyme protease (ficin), ngoài ra còn có enzyme lipase.
Mủ vả, sung đƣợc lấy từ những quả còn xanh, non. Mủ đƣợc lấy vào lúc 6
46
đến 8 giờ sáng.
Hình 2.9. Thu nhận mủ vả
* Tiến hành thu nhận mủ vả, mủ sung
Dùng dao cắt cuống quả, hứng lấy mủ chảy ra bằng lọ thủy tinh, đậy nắp kín lọ để sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -20 oC để sử dụng sau này. Quá trình thu nhận
mủ thể hiện trên Hình 2.9.
* Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ vả, mủ sung
Mủ vả, mủ sung sau khi lấy ra từ tủ đông đƣợc đƣa đi rã đông ở nhiệt độ
thƣờng. Mẫu sau khi bảo quản lạnh đông sẽ tách làm hai phần: phần dịch lỏng và phần gum. Mẫu đƣợc đem ly tâm ở 6000 vòng/phút ở 4 oC trong vòng 15 phút, loại
bỏ phần gum, thu lấy phần dịch lỏng chính là chế phẩm enzyme lipase thô [53]. Lipase thô thu đƣợc từ mủ vả, mủ sung bảo quản ở 4 oC và đƣợc dùng trong các thí
2.4.1.3. Phần 1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố nhiệt độ, pH, ion kim
loại đến hoạt độ lipase
nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase.
Mục đích của nghiên cứu là tìm điều kiện để lipase hoạt động tốt nhất.
Trong phần nghiên cứu này thực hiện khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố
nhiệt độ, pH, sự có mặt của các ion kim loại đến hoạt độ của lipase thô thu đƣợc từ
các nguồn thực vật khác nhau đậu nành nảy mầm, cám gạo, phôi lúa mì, mủ đu đủ,
47
mủ sung và mủ vả.
Hoạt độ lipase đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp UV-VIS với thuốc thử p –
NPP theo mô tả ở mục 2.5.3.
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố nhiệt độ, pH và
các ion kim loại đến hoạt độ lipase
TN 1 Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định
1.1 Nhiệt độ môi trƣờng (oC) - pH môi trƣờng 8
25 – 30 – 35 – 40 – 45 – 50 – 55 – 60 - Lƣợng enzyme
- Thời gian phản ứng
1.2 pH môi trƣờng - Nhiệt độ môi trƣờng: đƣợc
4 – 4,5 – 5 – 5,5 – 6 – 6,5 – 7 – 7,5 – 8 chọn từ kết quả TN 1.1
– 8,5 – 9 – 9,5 - 10 - Lƣợng enzyme
- Thời gian phản ứng
1.3 Các ion kim loại (dạng muối clorua - Nhiệt độ môi trƣờng: đƣợc
chọn từ kết quả TN 1.1
0,1M) và EDTA Ca2+ - Mg2+ - Na+ - K+ - pH môi trƣờng: đƣợc chọn
từ kết quả TN 1.2
- Lƣợng enzyme
- Thời gian phản ứng
Các thông số khảo sát nhƣ nhiệt độ, pH, ion kim loại đƣợc lựa chọn dựa trên
nghiên cứu của các tác giả Abdelkafi, S., Kanmani, P. và Madhikar, S. [17], [66],
[73]. Nhiệt độ khảo sát thay đổi bằng cách sử dụng bể ổn nhiệt. pH khảo sát thay
đổi nhờ các dung dịch đệm natri actetate 0,1M (pH 3,0 – 4,5), natri phosphate 0,1M
(pH 5,0 – 7,0); Tris – HCl 0,1M (pH 7,5 – 10,0). Các ion kim loại đƣợc khảo sát bao gồm Ca2+, Mg2+, Na+, K+ ở dạng muối clorua với nồng độ 0,1M. Lƣợng enzyme
sử dụng là 0,01g đối với lipase dạng bột và 1ml đối với lipase dạng lỏng. Thời gian
2.4.1.4. Phần 1.4. So sánh tiềm năng khai thác lipase từ các nguồn thực vật
khảo sát từ đó chọn nguồn nguyên liệu có tiềm năng thu lipase tốt nhất
48
enzyme xúc tác phản ứng thủy phân là 15 phút.
Khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật khác nhau là khác nhau.
Trong phần này, nguồn thực vật đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo đƣợc đánh
giá thông qua việc so sánh hiệu suất thu nhận lipase từ các nguồn nguyên liệu.
Hiệu suất thu nhận lipase (mU/g) đƣợc xác định bằng tổng hoạt độ lipase
(mU) thu nhận đƣợc từ 1 gam nguyên liệu ban đầu.
Tổng hoạt độ lipase = hoạt độ lipase thô × khối lƣợng lipase thô thu đƣợc (2.1)
(2.2)
2.4.2. Phần 2: Nghiên cứu thu nhận lipase thô từ mủ đu đủ
Mục đích: đề xuất quy trình công nghệ sản xuất lipase thô từ mủ đu đủ có
2.4.2.1. Phần 2.1. Nghiên cứu các phƣơng pháp bảo quản mủ đu đủ
hoạt độ cao, hiệu suất cao và xác định đặc tính của lipase thô thu đƣợc.
a. Nghiên cứu phương pháp sấy mủ đu đủ để bảo quản
Mủ đu đủ sau khi thu nhận tại vƣờn có độ ẩm cao nên cần đƣợc sấy khô để
tránh hƣ hỏng và bảo tồn hoạt tính lipase.
Tiến hành: mủ đu đủ sau khi thu nhận từ quả đu đủ đƣợc làm khô đến khối
lƣợng không đổi theo 3 cách sau:
- Phơi nắng: 30 – 40 oC, thời gian 36 giờ - Sấy đối lƣu: 55 oC, thời gian 36 giờ trong tủ sấy UN160 - Memmert - Đức - Sấy thăng hoa: -40 oC, thời gian 16 giờ trong máy sấy thăng hoa Alpha 1-2
LD plus – Đức.
Kết quả thu đƣợc mủ đu đủ khô. Tiến hành thu lipase thô theo sơ đồ Hình 2.8
với lƣợng mủ khô ban đầu là 3 gam. Xác định hoạt độ lipase thô thu đƣợc bằng
phƣơng pháp đo quang trên cơ chất p – NPP.
b. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trữ đông mủ đu đủ đến hoạt độ lipase
Cấp đông là một trong những phƣơng pháp phổ biến để bảo quản nguyên
liệu. Thời gian trữ đông mủ đu đủ có ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase nên cần đƣợc
khảo sát.
49
Tiến hành: Mủ đu đủ sau khi thu nhận từ vƣờn đƣợc cho vào các lọ nhựa và
cấp đông ở nhiệt độ -18 ± 2oC. Cứ sau thời gian mỗi tuần, mẫu mủ đu đủ đƣợc lấy
ra rã đông và tiến hành thu lipase thô. Cân mỗi mẫu 15g mủ đu đủ tƣơi hòa tan vào
100 ml nƣớc cất, sau đó tiến hành thu lipase tƣơng tự nhƣ các bƣớc theo sơ đồ Hình
2.8. Xác định hoạt độ lipase thô thu đƣợc bằng phƣơng pháp đo quang trên cơ chất
2.4.2.2. Phần 2.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase thô từ mủ
đu đủ
p – NPP. Mẫu đối chứng là mẫu không trữ đông.
Mục tiêu của nghiên cứu là xác định đƣợc các thông số thích hợp cho quá
trình rửa mủ đu đủ để xây dựng quy trình thu lipase có hoạt độ cao. Các thông số
thích hợp bao gồm tỷ lệ mủ đu đủ/ nƣớc, số lần lặp rửa – ly tâm và phƣơng pháp sấy
mủ thu lipase thô.
a. Nghiên cứu chọn tỷ lệ mủ đu đủ/nước
Mục đích: xác định hàm lƣợng nƣớc thích hợp để rửa tối đa lƣợng tạp chất
(không phải lipase) tan trong nƣớc.
Tiến hành: ứng với mỗi mẫu thí nghiệm cân chính xác 20 gam mủ đu đủ sau
rã đông. Bổ sung lƣợng nƣớc với tỷ lệ mủ đu đủ/ nƣớc biến thiên tƣơng ứng là 1:4,
1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, tiếp tục thực hiện chiết lipase thô theo quy trình Hình 2.8 với
1 lần rửa - ly tâm. Các mẫu thu đƣợc đem đi xác định khối lƣợng, độ ẩm và hoạt độ
lipase trên cơ chất p - NPP.
b. Nghiên cứu xác định số lần lặp quy trình rửa-ly tâm
Mục đích: xác định số lần lặp thích hợp nhất nhằm thu lipase thô ít tạp chất
và hoạt độ lipase cao.
Tiến hành: ứng với mỗi mẫu thí nghiệm cân chính xác 20 gam mủ đu đủ. Bổ
sung lƣợng nƣớc với tỷ lệ mủ đu đủ/ nƣớc tối ƣu vừa tìm đƣợc ở thí nghiệm
2.4.2.2.a. Khảo sát biến thiên số lần lặp rửa – ly tâm tƣơng ứng là 1, 2, 3, 4, 5 lần.
Tiếp tục thực hiện chiết lipase thô theo quy trình Hình 2.8. Các mẫu thu đƣợc đem
đi xác định khối lƣợng, độ ẩm và hoạt độ lipase trên cơ chất p - NPP.
c. Nghiên cứu xác định phương pháp sấy để thu lipase thô
50
Mục đích: xác định phƣơng pháp sấy tối ƣu để bảo tồn hoạt tính lipase
Tiến hành: ứng với mỗi mẫu thí nghiệm cân chính xác 20 gam mủ đu đủ. Bổ
sung lƣợng nƣớc và thực hiện số lần lặp rửa - ly tâm theo các điều kiện tối ƣu ở
trên. Mủ đu đủ sau khi loại bỏ các tạp chất đƣợc sấy theo 2 phƣơng pháp: sấy đối
lƣu và sấy thăng hoa. Các mẫu thu đƣợc đem đi xác định độ ẩm và hoạt độ lipase
trên cơ chất p - NPP.
2.4.2.3. Phần 2.3. Khảo sát khả năng thủy phân của lipase thô từ mủ đu đủ
trên các cơ chất khác nhau
Từ kết quả nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất lipase thô từ mủ đu đủ.
Mục đích: xác định tính đặc hiệu của lipase thô trên các cơ chất khác nhau.
Tiến hành: thực hiện quá trình thủy phân các cơ chất khác nhau: dầu cá hồi,
dầu đậu nành, triolein và tristearin bởi lipase thô từ mủ đu đủ. Xác định hoạt độ
lipase thô bằng phƣơng pháp chuẩn độ theo mục 2.5.2.
Ngoài ra, tính đặc hiệu của lipase thô đối với cơ chất dầu cá hồi, dầu cọ còn
đƣợc định tính bằng phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch đƣợc mô tả theo mục 2.5.4.
2.4.3. Phần 3: Chiết tách và tinh sạch lipase từ lipase thô mủ đu đủ
Lipase trong mủ đu đủ đƣợc xem nhƣ là lipase cố định tự nhiên, việc tách
lipase này ra khỏi cấu trúc mủ cũng gặp nhiều trở ngại. Nhiều nhà khoa học đã
nghiên cứu tìm cách chiết lipase ra khỏi mủ đu đủ nhƣng đến nay vẫn chƣa thành
công. Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng chất hoạt động bề mặt SLS để chiết
tách lipase ra khỏi cấu trúc mủ đu đủ và sử dụng các kỹ thuật kết tủa phân đoạn với
amoni sunfat, sắc ký trao đổi ion và điện di để phân lập đƣợc các lipase có trong chế
2.4.3.1. Phần 3.1. Nghiên cứu chiết tách lipase bằng dung dịch đệm chứa SLS
phẩm thô.
a. Phương pháp hòa tan lipase có loại lipid
Cân 1g enzyme thô từ mủ đu đủ cho vào 50 ml dung dịch gồm n – hexan: 2 – propanol (1:1:v/v) lắc 30 phút ở 4 oC để loại lipid trong phần mủ. Sau đó đem ly tâm 7500 vòng ở 4 oC, 20 phút. Thu lấy phần không tan đem cô quay chân không để
tách dung môi. Phần rắn này tiếp tục hòa tan vào 50 ml dung dịch gồm Tris-HCl
51
0,1M pH 8, chứa muối SLS 0,5% (w/v). Dung dịch đƣợc lắc 30 phút và sau đó ly
tâm 7500 vòng ở 4 oC, 20 phút thu đƣợc phần lỏng và phần rắn. Xác định hoạt độ
lipase ở cả 2 phần theo mục 2.5.3.
b. Phương pháp hòa tan lipase không loại lipid
Cân 1g enzyme lipase thô từ mủ đu đủ hòa vào 100ml dung dịch gồm Tris-
HCl 0,1M có pH 8, chứa muối SLS 0,5%. Lắc hỗn hợp trong 30 phút, ly tâm tốc độ 7500 vòng/phút, 4 oC, trong 20 phút. Thu phần rắn và phần lỏng đem đi xác định
2.4.3.2. Phần 3.2. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ SLS đến
hoạt độ lipase
hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp đo quang theo mục 2.5.3.
Nhằm mục đích xác định nồng độ SLS tối ƣu để chiết tách triệt để lipase ra
Tiến hành cân 1g enzyme lipase thô từ mủ đu đủ hòa vào 100 ml dung dịch gồm Tris-HCl 0,1M có pH 8, muối SLS 0,25% ở 4 oC lắc 30 phút. Mẫu đƣợc đem ly tâm 7500 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC. Thu dịch và đo hoạt độ của dịch lipase
khỏi cấu trúc mủ đu đủ, các nồng độ SLS khác nhau đƣợc khảo sát.
thu đƣợc.
Thực hiện tƣơng tự nhƣ trên nhƣng thay nồng độ muối SLS lần lƣợt là 0,5%,
2.4.3.3. Phần 3.3. Tủa lipase bằng dung dịch amoni sunfat
0,75%, 1%.
Dịch lipase thô thu đƣợc ở thí nghiệm Phần 3.2 với nồng độ muối SLS có
hoạt độ lipase cao nhất đƣợc tủa bằng dung dịch Amoni sunfat ở các nồng độ khác
2.4.3.4. Phần 3.4. Tinh sạch lipase bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion
nhau.
Phân đoạn tủa với amoni sunfat cho khối lƣợng lipase lớn và hoạt độ cao
nhất đƣợc lựa chọn để thực hiện quá trình tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion.
2.4.4. Phần 4: Nghiên cứu tính chất của lipase tinh sạch
Mục đích: đánh giá độ tinh sạch của lipase và xác định các thông số động
2.4.4.1. Phần 4.1. Xác định khối lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp điện di
học của lipase thu đƣợc.
52
Tiến hành điện di dung dịch lipase sau khi tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi
ion nhằm xác định khối lƣợng phân tử của enzyme thu đƣợc và đánh giá độ tinh
2.4.4.2. Phần 4.2. Xác định các thông số động học của lipase tinh sạch
sạch của lipase.
Dịch lipase thu đƣợc sau tinh sạch đƣợc xác định hằng số Michaelis–Menten
(Km) và tốc độ cực đại của phản ứng (Vmax) trên cơ chất p – NPP ở pH 8, 40 °C
bằng phƣơng pháp đo quang dựa trên phƣơng trình Lineweaver–Burk.
(2.3)
Trong đó [S] là nồng độ cơ chất.
V là tốc độ phản ứng.
Tiến hành pha cơ chất p – NPP ở các nồng độ khác nhau tăng dần từ 0,7946
mM đến 7,946 mM, dùng dung dịch lipase thu đƣợc sau sắc ký để thủy phân cơ chất
p – NPP ở các nồng độ khác nhau. Đo lƣợng p – NP tạo thành để tính tốc độ phản
ứng (V), từ đó vẽ đồ thị liên hệ 1/V và 1/[S]. Dựa vào phƣơng trình của đồ thị tính
đƣợc Km và Vmax [36].
2.4.5. Phần 5: Phương pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô
Mục đích: xác định điều kiện tối ƣu để thủy phân dầu cá hồi bằng xúc tác của
2.4.5.1. Phần 5.1. Phƣơng pháp thu nhận dầu cá hồi
CPL thu acid béo giàu DHA, EPA.
Quá trình thu nhận dầu cá hồi đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Lƣờn cá hồi sau khi đƣợc cắt nhỏ (3cm – 5cm), đem hấp cách thủy 20 phút.
Thu phần dầu tự chảy ra từ lƣờn cá trong quá trình hấp ở đáy nồi. Phần lƣờn cá sau
khi hấp đƣợc đem đi ép bằng máy ép thủy lực để thu triệt để phần dầu còn lại. Sau
đó, để lắng hỗn hợp và gạn lấy phần dầu ở phía trên.
Dùng Na2SO4 khan để loại bỏ nƣớc trong dầu thu đƣợc, sau đó bổ sung chất
chống oxy hóa butylated hydroxytoluene (BHT), bảo quản trong bình kín ở -4 oC.
Sản phẩm dầu cá hồi thu đƣợc đƣợc đánh giá chất lƣợng thông qua xác định
các chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số ester, chỉ số iod và chỉ số peroxide.
Thành phần của các acid béo trong dầu cá đƣợc xác định bằng phƣơng pháp
53
sắc ký khí GC [19] tại trung tâm đo lƣờng chất lƣợng Quatest 2.
2.4.5.2. Phần 5.2. Khảo sát khả năng thủy phân dầu cá hồi bằng lipase thô từ
mủ đu đủ (CPL)
Mục đích của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng lipase thô từ mủ đu đủ
(CPL) là thu đƣợc hỗn hợp các acid béo trong đó có chứa các acid béo bất bão hòa
đa nhƣ DHA, EPA. Đây là bƣớc đầu tiên của quy trình làm giàu DHA, EPA từ dầu
cá hồi.
Cho vào bình nón hỗn hợp gồm 5g dầu cá và nƣớc cất với tỷ lệ 5:1 (v/v),
thêm 4ml đệm phosphate (pH = 7; 0,08M). Sau đó thêm vào hỗn hợp 4% lƣợng
CPL so với cơ chất dầu cá. Không khí trong bình nón đƣợc thay bằng khí nitơ, và dịch huyền phù tạo thành đƣợc lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở 30 oC
trong 24 giờ. Mẫu đối chứng tiến hành tƣơng tự nhƣ trên nhƣng không có enzyme.
Kết thúc quá trình thủy phân, sản phẩm thu đƣợc sau phản ứng đƣợc lọc để
loại enzyme. Sau đó hòa tan trong 50 ml n-hexane và đƣợc chiết với 15 ml dung
dịch KOH 1N pha trong ethanol. Thu phân đoạn không phân cực (tan trong n-
hexane) chứa acylglycerol không thủy phân và phân đoạn phân cực chứa acid béo
tự do ở dạng muối kali. Phân đoạn không phân cực đƣợc đem đi phân tích sắc ký
2.4.5.3. Phần 5.3. Tối ƣu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL
khí tại trung tâm Quatest 2 để xác định thành phần acid béo trong mẫu.
Mục đích của quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL nhằm thu các acid béo
với hiệu suất thủy phân cao nhất. Vấn đề cần giải quyết là xác định đƣợc các thông
số tối ƣu của quá trình thủy phân dầu cá hồi để đạt hiệu suất thủy phân cao nhất.
Quá trình tối ƣu hóa các thông số ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi
CPL đƣợc thực hiện thông qua các thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm và tối ƣu hoá
bằng công cụ của phần mềm Minitab 18.0.
Phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay cấp II theo Box và Hunter
đƣợc chọn để xây dựng phƣơng trình hồi quy ảnh hƣởng của một số yếu tố đến quá
trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL.
a. Tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá trong hệ nhũ tương dầu – nước
* Tối ƣu hóa yếu tố nhiệt độ và pH của quá trình thủy phân dầu cá hồi
Thí nghiệm đƣợc khảo sát theo quy hoạch thực nghiệm Box-Hunter với 2
54
yếu tố ảnh hƣởng là nhiệt độ (x1) và pH (x2). Hàm mục tiêu (Y) là hiệu suất thủy
phân. Tìm điều kiện tối ƣu cho hàm mục tiêu để hiệu suất của phản ứng thủy phân
đạt cực đại.
Chuẩn bị mẫu: mỗi mẫu chứa 2g dầu cá hồi, với 4ml đệm theo từng pH khảo
sát, 10ml nƣớc; 0,32g gum Arabic; 0,08g enzyme. Bỏ mẫu vào máy lắc, lắc với tốc
độ 200 v/phút, ở từng nhiệt độ khảo sát, thời gian 24 giờ. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại
3 lần. Mẫu sau khi thủy phân đƣợc xác định chỉ số acid để tính hiệu suất thủy phân.
Các mức và khoảng biến thiên của 2 yếu tố đƣợc lập ở Bảng 2.2
Bảng 2.3. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm
Yếu tố x1 (oC) x2 Mức TN
Mức trên (+1) 9 40
Mức cơ sở (0) 8 35
Mức dƣới (-1) 7 30
Khoảng biến thiên 1 5
Với 2 yếu tố tối ƣu (k = 2), số thí nghiệm cần thực hiện là 2k + 2k + no = 10,
trong đó số thí nghiệm tại tâm phƣơng án no = 2 , với cánh tay đòn α = ± 1,414.
Từ cách chọn phƣơng án và điều kiện thí nghiệm, tiến hành thiết lập ma trận
quy hoạch thực nghiệm ở Bảng 2.4 và tiến hành thí nghiệm theo ma trận.
Bảng 2.4. Ma trận quy hoạch thực nghiệm
Biến thực Biến mã hóa
Số thí nghiệm
55
x1 (oC) 40 30 40 30 42 28 35 35 35 35 X1 +1 -1 +1 -1 +α -α 0 0 0 0 X2 +1 +1 -1 -1 0 0 +α -α 0 0 x2 9 9 7 7 8 8 9,4 6,6 8 8 1 2 3 4 5 6 7 8 T1 T2
Trong đó :T1, T2 là 2 thí nghiệm tại tâm phƣơng án.
2
- Chọn dạng phƣơng trình hồi quy
2+ b22x2
Y = b0 + b1x1+ b2x2 + b12x1x2 + b11x1
Trong đó: b0, b1, …,b22 là các hệ số trong phƣơng trình hồi quy đƣợc xác định bằng
số liệu thực nghiệm; x1, x2 là các yếu tố ảnh hƣởng.
Hàm mục tiêu (Y) là hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL.
Từ kết quả thí nghiệm thu đƣợc, sử dụng phần mềm Minitab 18 để xác định
đƣợc phƣơng trình hồi quy. Kiểm tra tính có nghĩa của các hệ số b trong phƣơng
trình hồi quy và xác định đƣợc các giá trị tối ƣu nhiệt độ và pH.
* Tối ƣu hóa yếu tố tỷ lệ nƣớc/cơ chất và nồng độ enzyme của quá trình thủy phân
dầu cá hồi
Thí nghiệm đƣợc khảo sát theo quy hoạch thực nghiệm Box-Hunter với 2
yếu tố ảnh hƣởng là tỷ lệ nƣớc/cơ chất (x3) và nồng độ enzyme (x4)
Chuẩn bị mẫu: mỗi mẫu chứa 2g dầu cá hồi, với 4ml đệm photphate có pH
tối ƣu tìm đƣợc ở trên, lƣợng nƣớc theo khảo sát, 0,32g gum Arabic cùng với nồng
độ enzyme theo từng mẫu thí nghiệm khảo sát. Bỏ mẫu vào máy lắc, lắc với tốc độ
200 vòng/phút, ở nhiệt độ tối ƣu tìm đƣợc ở trên. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
Mẫu sau khi thủy phân đƣợc xác định chỉ số acid để tính đƣợc hiệu suất thủy
phân. Các mức và khoảng biến thiên của 2 yếu tố đƣợc cho ở Bảng 2.5
Bảng 2.5. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm
Yếu tố x3 (v/w) x4 (%) Mức TN
Mức trên (+1) 1,5 5
Mức cơ sở (0) 1 4
Mức dƣới (-1) 0,5 3
Khoảng biến thiên 0,5 1
Từ cách chọn phƣơng án và điều kiện thí nghiệm, tiến hành thiết lập ma trận
56
quy hoạch thực nghiệm ở Bảng 2.6 và tiến hành thí nghiệm theo ma trận.
Bảng 2.6. Ma trận quy hoạch thực nghiệm
Biến thực Biến mã hóa
Số thí nghiệm
x3 (v/w) x4 (%) X3 X4
1 5 +1 +1 1,5
2 3 -1 +1 1,5
3 5 +1 -1 0,5
4 3 -1 -1 0,5
5 5,4 +α 0 1
6 2,6 -α 0 1
7 4 0 +α 1,7
8 4 0 -α 0,3
4 0 0 1 T1
4 0 0 1 T2
Trong đó :T1, T2 là 2 thí nghiệm tại tâm phƣơng án.
2
- Chọn dạng phƣơng trình hồi quy
2+ b44x4
Y = b0 + b3x3+ b4x4 + b34x3x4 + b33x3
Trong đó: b0, b3, …,b44 là các hệ số trong phƣơng trình hồi quy đƣợc xác định bằng
số liệu thực nghiệm; x3, x4 là các yếu tố ảnh hƣởng.
Hàm mục tiêu (Y) là hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL.
Từ kết quả thí nghiệm thu đƣợc, sử dụng phần mềm Minitab 18 để xác định đƣợc
phƣơng trình hồi quy. Kiểm tra tính có nghĩa của các hệ số b trong phƣơng trình hồi
quy và xác định đƣợc các giá trị tối ƣu tỷ lệ nƣớc/cơ chất và nồng độ enzyme của
quá trình thủy phân dầu cá hồi.
b. Khảo sát đơn biến các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi
CPL trong hệ 2 pha iso-octan/ nước
Quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ nƣớc/iso-octan chịu ảnh
57
hƣởng của các yếu tố: nồng độ nồng độ enzyme (%), tỷ lệ dung môi/cơ chất (w/w), nhiệt độ thủy phân (oC). Quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL đƣợc thực hiện
theo sơ đồ Hình 2.10.
Hình 2.10. Sơ đồ khảo sát quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme lipase
thô từ mủ đu đủ
b.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ enzyme (%) đến hiệu suất thủy phân
Tiến hành bố trí 4 mẫu thí nghiệm với nồng độ enzyme sử dụng ở các mẫu
khác nhau lần lƣợt là 1,2%; 1,4%; 1,6%; 1,8%. Thực hiện thủy phân các mẫu ở điều
kiện cố định: lƣợng dầu cá 1gam, tỷ lệ dung môi iso-octan/cơ chất dầu cá hồi: 1/1 (w/w) ở 35 oC theo sơ đồ Hình 2.10 trong thời gian 1 giờ [114].
Xác định chỉ số acid của dịch thủy phân sau phản ứng từ đó tính hiệu suất thủy
phân. Chọn giá trị nồng độ enzyme cho hiệu suất thủy phân lớn nhất làm yếu tố cố
định cho nghiên cứu tiếp theo.
b.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân
Thực hiện thí nghiệm tƣơng tự nhƣ ở mục 2.3.6.1.b1 với tỷ lệ dung môi iso-
octan/cơ chất dầu cá hồi (w/w) biến thiên lần lƣợt là 0,5; 1; 1,5; 2. Thực hiện quá
trình thủy phân các mẫu ở điều kiện cố định: lƣợng dầu cá 1gam, nồng độ enzyme
58
đƣợc chọn tối ƣu ở thí nghiệm trên. Thực hiện thí nghiệm thủy phân theo sơ đồ
Hình 2.10 ở 35 oC trong thời gian 1 giờ [114].
Dịch thủy phân thu đƣợc đem xác định chỉ số acid của hỗn hợp sản phẩm sau
phản ứng từ đó tính hiệu suất thủy phân. Chọn giá trị tỷ lệ dung môi iso-octan/cơ
chất dầu cá hồi cho hiệu suất thủy phân lớn nhất làm yếu tố cố định cho nghiên cứu
tiếp theo.
b.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân
Việc lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp là rất quan trọng bởi vì nhiệt độ cao (lớn hơn 40 oC) có thể gây biến tính lipase trong khi nhiệt độ thấp (nhỏ hơn
20 °C) có thể làm chậm tốc độ phản ứng [36].
Thực hiện tƣơng tự nhƣ thí nghiệm ở mục 2.3.6.1.b2 với nhiệt độ thủy phân đƣợc khảo sát lần lƣợt là 30 oC, 35 oC, 40 oC, 45 oC. Thực hiện thủy phân các mẫu ở
điều kiện cố định: lƣợng dầu cá 1gam, nồng độ enzyme và tỷ lệ dung môi iso-
octan/cơ chất dầu cá hồi đƣợc chọn theo thí nghiệm trên. Thực hiện thí nghiệm thủy
phân theo sơ đồ Hình 2.10 trong thời gian 1 giờ [114].
Dịch thủy phân thu đƣợc đem xác định chỉ số acid của hỗn hợp sản phẩm sau
phản ứng từ đó tính hiệu suất thủy phân. Mỗi thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp.
Dựa vào các thông số tối ƣu tìm đƣợc trong quá trình khảo sát đơn biến ảnh
hƣởng của các yếu tố nồng độ enzyme, tỷ lệ dung môi/cơ chất, nhiệt độ đến hiệu
suất thủy phân dầu cá hồi bởi CPL ở phần trên, tiến hành nghiên cứu tối ƣu hóa các
yếu tố.
c. Tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL trong hệ 2 pha iso-octan/
nước
Tiến trình thí nghiệm tối ƣu hóa các yếu tố nồng độ enzyme, tỷ lệ dung
môi/cơ chất, nhiệt độ đƣợc thực hiện theo sơ đồ Hình 2.10.
Các yếu tố cố định gồm lƣợng dầu cá hồi 1g, lƣợng nƣớc cất 3ml, 1 ml đệm
phosphate pH 7, thời gian thủy phân 1 giờ.
Thí nghiệm đƣợc khảo sát theo quy hoạch thực nghiệm tâm xoay Box-
Hunter với 3 yếu tố ảnh hƣởng nồng độ enzyme (x1), tỷ lệ dung môi/cơ chất (x2),
59
nhiệt độ thủy phân (x3).
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy hoạch thực nghiệm, mức và khoảng
biến thiên của các yếu tố thực nghiệm đƣợc lập và thể hiện ở Bảng 2.7
Bảng 2.7. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm
Yếu tố
Mức TN
Mức trên Mức dƣới Khoảng biến thiên Mức cơ sở x1 (%) 1,8 1,4 0,2 1,6 x2 (w/w) 1,5 0,5 0,5 1 x3 (oC) 40 30 5 35
Với 3 yếu tố tối ƣu (k = 3), số thí nghiệm phải thực hiện là N = 23+2×3+3= 17
thí nghiệm (TN) và 3 thí nghiệm tại tâm phƣơng án. Ma trận quy hoạch thực
nghiệm đƣợc thể hiện ở Bảng 2.8.
Bảng 2.8. Ma trận quy hoạch thực nghiệm
Biến mã hoá
Số th nghiệm X1 X2 X3
Biến thực x2 (w/w) 1,5 x1 (%) 1,8 1 x3 (oC) 30 +1 +1 -1
1,84 1,6 2 35 0 +α 0
1,4 1,5 3 30 -1 +1 -1
1,6 1 4 26,6 0 0 -α
1,4 1,5 5 40 -1 +1 +1
1,94 1 6 35 +α 0 0
1,8 0,5 7 40 +1 -1 +1
1,4 0,5 8 30 -1 -1 -1
1,4 1,26 1,6 0,5 1 1 9 10 11 40 35 43,4 -1 -α 0 -1 0 0 +1 0 +α
1,8 1,8 1,5 0,5 12 13 40 30 +1 +1 +1 -1 +1 -1
1,6 1,6 0,16 1 35 35 0 0 -α 0 0 0
1,6 1 35 0 0 0
60
1,6 1 35 0 0 0 14 T1 T2 T3
Trong đó: T1, T2, T3 là 3 thí nghiệm tại tâm phƣơng án.
Hàm mục tiêu (Y) là hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL.
Hiệu suất của quá trình thủy phân (DH) đƣợc tính theo công thức ở mục 2.5.11.
Từ kết quả thí nghiệm thu đƣợc, sử dụng phần mềm Minitab 18 để xác định
đƣợc phƣơng trình hồi quy. Kiểm tra tính có nghĩa của các hệ số b trong phƣơng
trình hồi quy và xác định đƣợc các giá trị tối ƣu về nồng độ enzyme, tỷ lệ dung
môi/cơ chất, nhiệt độ thủy phân của quá trình thủy phân cho hiệu suất thủy phân cao
nhất.
d. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá
hồi bởi CPL hệ 2 pha iso-octan/ nước
Tiến hành thủy phân dầu cá hồi bởi CPL theo quy trình Hình 2.10 với các
thông số tối ƣu tìm đƣợc ở mục 2.4.5.3.c. Các mẫu thí nghiệm thủy phân dầu cá hồi
đƣợc thực hiện ở các khoảng thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ. Tính hiệu suất
của quá trình thủy phân thông qua đo chỉ số acid của các mẫu. Từ đó xác định thời
gian cho hiệu suất thủy phân cao nhất.
2.5. Phƣơng pháp phân t ch
2.5.1. Phương pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu
Thành phần hóa học của một số nguyên liệu (đậu nành, đậu phộng, mủ đu
đủ, cám gạo, phôi lúa mì) đƣợc xác định theo các phƣơng pháp sau:
- Xác định độ ẩm và hàm lƣợng tro theo phƣơng pháp của AOAC 952.08 và
AOAC 938.08 (1990) [20].
- Xác định hàm lƣợng protein tổng bằng phƣơng pháp Kjeldahl [7].
- Xác định hàm lƣợng chất béo bằng phƣơng pháp chiết Soxhlet [7].
2.5.2. Phương pháp xác định hoạt độ lipase bằng phương pháp chuẩn độ
Hoạt độ enzyme lipase đƣợc xác định theo phƣơng pháp chuẩn độ của
Maliks và cộng sự (2000). Đơn vị hoạt độ lipase (U/g hoặc U/ml) đƣợc xác định là
lƣợng enzyme cần thiết để xúc tác giải phóng ra 1μmol acid béo tự do trong thời
gian 1 phút ở điều kiện xác định [73].
61
Cách tiến hành thực hiện theo phụ lục 2.5
Cơ chất sử dụng trong phƣơng pháp chuẩn độ gồm: dầu oliu, dầu cá hồi,
triolein, tristearin.
2.5.3. Phương pháp xác định hoạt độ lipase bằng phương pháp đo quang
Nguyên tắc: Lipase xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl
palmitate (p-NPP) tạo ra p-nitrophenol (p-NP) biểu hiện màu vàng đặc trƣng. Hoạt
độ của lipase đƣợc xác định bằng cách đo cƣờng độ màu của dung dịch chứa p-NP
trên máy UV-VIS ở bƣớc sóng λ = 410 nm.
Cách tiến hành thực hiện theo phụ lục 2.6
Đơn vị hoạt độ đƣợc tính là lƣợng enzyme cần thiết để xúc tác giải phóng ra
1 µmol p-NP trong một phút [44].
- Độ ẩm lipase thô đƣợc xác định bằng máy đo độ ẩm MX50 – Nhật Bản.
2.5.4. Phương pháp xác định hoạt độ lipase bằng phương pháp khuếch tán
đĩa thạch
- Hoạt độ lipase định tính bằng phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch, thông qua
xác định đƣờng kính vòng thủy phân xuất hiện quanh các giếng có hoặc không có
chế phẩm lipase. Sản phẩm tạo thành sau quá trình thủy phân cơ chất của dầu là
acid béo. Cơ chế của hiện tƣợng đƣợc cho là có sự tƣơng tác giữa các acid béo tạo
thành với thuốc nhuộm Rhodamine B. Vòng thủy phân màu da cam hiển thị khi
chiếu đèn UV ở bƣớc sóng 350 nm [69], [86].
Cách tiến hành thực hiện theo phụ lục 2.7.
2.5.5. Phương pháp xác định điểm đẳng điện của lipase
Nguyên tắc: Các phân tử protein là các polymer có tính điện ly lƣỡng tính.
Trong dung dịch, khi pH thay đổi nó phân ly tạo thành các nhóm tích điện dƣơng và
các nhóm tích điện âm khác nhau. Đối với mỗi protein sẽ có một giá trị pH xác định
mà tại đó tổng số điện tích âm bằng tổng số điện tích dƣơng, khi đó phân tử protein
trung hòa về điện, pH đó gọi là điểm đẳng điện của protein. Tại điểm đẳng điện, dung
dịch protein không bền, dễ bị kết tủa. Khi đo quang cho thấy độ đục lớn nhất [4].
62
Cách tiến hành thực hiện theo phụ lục 2.8.
2.5.6. Phương pháp kết tủa phân đoạn lipase với muối amoni sunfat
Nguyên tắc: Khi thêm muối vào dung dịch protein, các phân tử muối
(NH4)2SO4 phân ly thành các các ion, các ion này liên kết với các phân tử nƣớc làm
cho protein mất lớp áo nƣớc, liên kết lại với nhau và hình thành kết tủa. Tác dụng
kết tủa của các ion muối tỷ lệ thuận với lực ion của chúng. Do đó, mỗi loại protein
(enzyme) trong hỗn hợp kết tủa tối đa ở một nồng độ xác định của muối nào đó.
Cách tiến hành:
Dung dịch protein thu đƣợc sau khi hòa tan lipase thô đƣợc d ng để tủa với
muối AS.
Bƣớc 1: Dùng ống đong để xác định thể tích của dung dịch protein.
Bƣớc 2: Thêm lƣợng AS vào dung dịch protein để đạt dung dịch bão hòa
40%, ở 40C, để yên trong 30 phút.
Bƣớc 3: Ly tâm thu tủa và dịch.
Bƣớc 4: Dịch thu đƣợc tiếp tục thực hiện theo bƣớc 1 và bƣớc 2 để đạt dung
dịch bão hòa 50% và thực hiện bƣớc 3.
Bƣớc 5: Thực hiện tƣơng tự nhƣ bƣớc 4 để đạt dung dịch bão hòa 60%, 70%,
80% và 90%.
Bƣớc 6: Kết tủa thu đƣợc ở các phân đoạn muối bão hòa khác nhau sẽ đƣợc
hòa tan trở lại trong 1ml đệm tris-HCl 0,1M pH =8. Dịch hòa tan sẽ đem đi thẩm
tích trong nƣớc cất loại muối bằng màng cellophane trong vòng 48 giờ.
Sau cùng, ứng với từng phân đoạn muối bão hòa xác định hoạt độ lipase của
dịch thẩm tích bằng phƣơng pháp đo quang [99].
2.5.7. Phương pháp tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trao đổi ion của protein tích điện với ion của
nhựa trao đổi ion. Trong đó nhóm tích điện (+) là chất mang trao đổi với các ion (-)
và do đó chúng đƣợc gọi là các chất trao đổi anion và ngƣợc lại chúng đƣợc gọi là
chất trao đổi cation.
Tiến hành: Mẫu ở phân đoạn tủa 50 - 60% AS đƣợc thẩm tách muối qua
63
màng cellophan trong 48 giờ, sau đó đƣợc nạp vào cột sắc ký trao đổi ion. Sử dụng
cột sắc ký HiTrap Q Sepharose Fast flow (5,0 ml, 1,6 cm×2,5 cm) trong máy sắc ký
nhanh protein (GE Akta Purifier 100, Sweden). Trƣớc tiên cột đƣợc cân bằng bởi
dung dịch đệm Tris-HCl 0,01M có pH 9. Mẫu đƣợc rửa giải bằng dung dịch NaCl
có nồng độ tăng dần từ 0 đến 1M với tốc độ 0,1M NaCl/phút. Tốc độ dòng đƣợc
thiết lập 1ml/phút. Dung dịch thu đƣợc sau sắc ký đƣợc thu thập trong các ống có
thể tích 1mL và đo mật độ quang ở bƣớc sóng 280nm. Sau đó xác định hoạt độ của
lipase tinh sạch ở mỗi phân đoạn thu đƣợc bằng phƣơng pháp đo quang.
2.5.8. Phương pháp điện di
Nguyên tắc: kỹ thuật điện di protein dựa trên sự dịch chuyển của các protein
tích điện dƣới tác dụng của điện trƣờng, chúng sẽ dịch chuyển về cực (+) hoặc cực
(-) t y theo điện tích của chúng.
Mẫu protein sau khi đã xử lý đƣợc nạp vào các giếng trong khuôn gel
polyacryamide trong dung dịch đệm thích hợp. Dòng điện chạy từ đầu này đến đầu
kia của gel làm cho protein tích điện dịch chuyển trong khuôn gel. T y thuộc vào
kích thƣớc mà mỗi protein sẽ dịch chuyển với tốc độ khác nhau, sau quá trình chạy
điện di, các phân tử protein sẽ phân bố ở các vị trí khác nhau trên khuôn gel, chúng
đƣợc phân tách theo kích thƣớc và theo khối lƣợng. Quá trình điện di mẫu đƣợc
chạy c ng với mẫu protein marker với khối lƣợng phân tử đã biết [70].
Cách tiến hành thực hiện theo phụ lục 2.9.
2.5.9. Phương pháp xác định đặc tính hóa lý của dầu cá
Tính chất hóa lý của dầu cá đƣợc xác định thông qua các chỉ số acid, chỉ số
xà phòng, chỉ số ester, chỉ số iod, chỉ số peroxit
- Chỉ số acid: là số mg KOH cần thiết để trung hòa hết lƣợng acid béo tự do có
trong 1 gam chất béo.
Chỉ số acid đƣợc xác định theo TCVN 6127:2010 [13].
- Chỉ số xà phòng hóa: là số mg KOH cần thiết để trung hòa acid béo dạng tự do và
acid béo dạng kết hợp khi tiến hành xà phòng hóa hoàn toàn 1 gam chất béo.
Chỉ số xà phòng hóa đƣợc xác định theo TCVN 6126:2015 [14].
64
- Chỉ số iod: là số mg iod cần thiết để phản ứng hết với 1 gam chất béo
Chỉ số iod d ng để đánh giá độ bất bão hòa của acid béo có trong dầu.
Chỉ số iod đƣợc xác định theo TCVN 6122:2010 [15]
2.5.10. Phương pháp xác định thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi
Thành phần của các acid béo trong dầu cá hồi đƣợc xác định bằng sắc ký khí
(GC) theo phƣơng pháp AOAC 996.06 tại Trung Tâm Quatest 2.
Nguyên tắc: Các acid béo tự do sau khi thủy phân đƣợc chiết bằng n-hexane,
sau đó cô quay và đƣợc methyl ester hóa (FAMEs) bằng hỗn hợp BF3 trong
methanol. Các FAMEs đƣợc phân tích bằng hệ sắc ký khí đầu dò FID, cột mao quản
SP-2560. Kết quả đƣợc tính từ phần trăm diện tích của từng FAME trên tổng diện
tích các peak FAMEs.
2.5.11. Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác bởi
CPL
Mẫu dầu cá hồi sau khi kết thúc quá trình thủy phân đƣợc bất hoạt enzyme
bằng 15 ml hỗn hợp aceton và etanol (tỷ lệ 1:1). Mẫu sau thủy phân đƣợc xác định
chỉ số acid và tính hiệu suất thủy phân DH % nhƣ sau [83]:
(2.4)
2.5.12. Phương pháp xác định các thông số động học Km và Vmax của phản
ứng thủy phân dầu cá hồi bằng CPL
Mục đích của việc xác định các thông số động học của phản ứng là để biết
đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất và enzyme đến phản ứng thủy phân cũng nhƣ
ái lực của enzyme đối với cơ chất.
Các tham số nồng độ enzyme, tỷ lệ dung môi/cơ chất, nhiệt độ đã đƣợc xác
định theo mục 2.4.5.3.c. đƣợc chọn để nghiên cứu động học của quá trình thủy phân
dầu cá hồi bởi CPL.
Dầu cá đƣợc hòa tan vào dung môi iso – octan trong bình nón 125ml, thêm
enzyme CPL và nƣớc cất vào để tạo hỗn hợp phản ứng. Khuấy từ hỗn hợp ở 400
vòng/ phút trong 1 giờ.
65
Xác định giá trị Km và Vmax của quá trình thủy phân dầu cá bởi CPL dựa trên
đồ thị phƣơng trình Linewear – Burk tƣơng tự nhƣ trình bày ở mục 2.4.4.2. nhƣng
thay cơ chất p – NPP bằng cơ chất dầu cá hồi.
Xác định tốc độ ban đầu của phản ứng (V) trong các khoảng thời gian của
phản ứng lên đến 1 giờ ở 4 giá trị nồng độ cơ chất dầu cá hồi [S] ban đầu khác nhau
540,25; 921,94; 1207,3; 1428,36 (µmol acid béo liên kết/ml) [40].
Nồng độ cơ chất dầu cá hồi [S] ban đầu đƣợc xác định là số mol acid béo
liên kết có trong 1ml thể tích hỗn hợp. Số mol acid béo liên kết đƣợc xác định
thông qua chỉ số ester chính là chỉ số xà phòng trừ chỉ số acid. Cách tính cụ thể
đƣợc trình bày ở phần phụ lục 3.38.
Tốc độ ban đầu của phản ứng đƣợc tính bằng biến thiên nồng độ của acid
béo tạo thành chia cho thời gian phản ứng.
Tốc độ ban đầu của phản ứng thủy phân dầu cá (V) đƣợc xác định bằng cách
vẽ đồ thị giữa lƣợng acid béo tự do tạo thành và thời gian trong các khoảng thời
gian ngắn của phản ứng lên đến 1 giờ.
2.5.13. Phương pháp xác định năng lượng hoạt hóa
Năng lƣợng hoạt hóa (EA) cho phản ứng thủy phân của dầu cá với enzyme
lipase mủ đu đủ đƣợc xác định dựa trên đồ thị phƣơng trình Arrhenius [112].
(2.5)
Trong đó, k là hằng số tốc độ; A0 là yếu tố tiền hàm mũ; EA là năng lƣợng hoạt
hóa (KJ/mol); R là hằng số khí và T là nhiệt độ (K). Dạng tuyến tính của phƣơng
trình Arrhenius nhƣ sau:
(2.6)
Ảnh hƣởng của sự thay đổi nhiệt độ đối với quá trình thủy phân dầu cá hồi với
enzyme lipase đƣợc nghiên cứu ở ba mức nhiệt độ khác nhau: 30 ºC, 35 ºC và 40 ºC
để xác định hằng số tốc độ (k) tƣơng ứng. Từ đó vẽ đồ thị Arrhenius liên hệ giữa
lnk và 1/T theo phƣơng trình (2.6) để tính năng lƣợng hoạt hóa. Hệ số góc của
66
phƣơng trình đƣờng thẳng Arrhenius tƣơng ứng với giá trị của -EA/R . Từ giá trị
-EA/R trên đồ thị suy ra năng lƣợng hoạt hóa của phản ứng thủy phân dầu cá hồi xúc
tác bởi CPL [114].
2.5.14. Phương pháp phân tích số liệu thực nghiệm
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp để lấy giá trị trung bình và xác
định độ lệch chuẩn bằng Microsoft Excel. Sự khác biệt có nghĩa giữa các kết quả
thí nghiệm đƣợc đánh giá bằng kiểm định Fisher (p ≤ 0,05) bằng phần mềm
Minitab 18.
Các chữ số a, b, c, ... trên các đồ thị và các bảng thể hiện sự khác biệt có nghĩa
67
của các kết quả nghiên cứu.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn thực vật
Việt Nam có nguồn thực vật phong phú, có tiềm năng cung cấp lipase để ứng
dụng trong công nghiệp. Trong phạm vi luận án, các đối tƣợng đƣợc chọn nghiên
cứu bao gồm hạt có dầu (đậu nành, đậu phộng), phụ phẩm nông nghiệp (cám gạo,
phôi lúa mì) và mủ của các loại quả (đu đủ, vả, sung). Trong số này, một số đã đƣợc
quan tâm trong một số nghiên cứu về lipase ở nƣớc ngoài (mủ đu đủ), một số ít
đƣợc quan tâm hơn (cám gạo, phôi lúa mì, mủ sung, đậu phộng nảy mầm) hoặc
chƣa từng đề cập trong một nghiên cứu nào (mủ quả vả, đậu nành nảy mầm).
3.1.1. Hoạt tính lipase từ các loại hạt có dầu nảy mầm
3.1.1.1. Đánh giá một số thành phần hóa học cơ bản của đậu nành, đậu phộng
Thành phần hoá học của nguyên liệu phụ thuộc vào nhiều yếu tố và có thể
ảnh hƣởng đến hoạt tính lipase của nguyên liệu. Một số thành phần hóa học cơ bản
của hạt đậu nành, đậu phộng đã đƣợc xác định theo các phƣơng pháp mô tả ở mục
2.5.1. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của hạt đậu nành, đậu phộng
STT Đậu phộng Đậu nành
Nguyên liệu Thành phần (%) Độ ẩm Tro tổng Lipid tổng Protein tổng 1 2 3 4 6,99±0,15 2,49±0,1 47,22±1,31 29,6±0,94 10,57±0,31 4,65±0,14 20,93±0,86 33,98±1,16
Kết quả từ Bảng 3.1 cho thấy thành phần lipid và protein của hai loại nguyên
liệu này đều cao, trong đó hàm lƣợng protein trong đậu nành (33,98%) cao hơn so
với hàm lƣợng protein trong đậu phộng (29,6%). So sánh với hàm lƣợng protein
trong đậu nành (35,5%) theo công bố của Ramadan thì có kết quả thấp hơn [99].
Điều này có thể là do có sự khác nhau về giống đậu nành. Ngoài ra, hàm lƣợng lipid
trong đậu phộng (47,22%) cao hơn nhiều so với hàm lƣợng lipid trong đậu nành
68
(20,93%).
3.1.1.2. Ảnh hƣởng của thời gian nảy mầm đến hoạt tính lipase của hạt đậu
nành và đậu phộng nảy mầm
Lipase từ hạt chứa dầu đƣợc tìm thấy có hoạt độ cao trong giai đoạn nảy mầm
[73]. Nhằm xác định thời điểm thu lipase hiệu quả nhất, hoạt độ lipase của hạt đậu
nành, hạt đậu phộng nảy mầm đƣợc khảo sát trong suốt thời gian ủ 6 ngày. Kết quả
hình thái của hạt đậu nành, đậu phộng nảy mầm thể hiện trên Hình 3.1. và Hình 3.2.
Hình 3.1. Hình thái hạt đậu nành nảy mầm theo thời gian theo thứ tự
(b)
(c)
(a)
(f)
(d)
(e)
từ 1 - 6 ngày
(a) 1 ngày b) 2 ngày c) 3 ngày d) 4 ngày e) 5 ngày f) 6 ngày
Hình 3.2. Hình thái hạt đậu phộng nảy mầm theo thời gian
69
Kết quả cho thấy hạt bắt đầu nhú rễ mầm sau thời gian 1 ngày ủ. Đến ngày ủ
thứ 3, kích thƣớc rễ mầm tăng lên và sau 6 ngày ủ thì rễ phụ mọc dài ra và hạt phát
triển thành cây con.
Hoạt độ lipase đƣợc xác định sau mỗi 24 giờ trong 6 ngày bằng phƣơng pháp
chuẩn độ theo mục 2.4.1.2.a. và so sánh với mẫu hạt đậu trƣớc khi ngâm (ngày 0).
Kết quả đƣợc thể hiện tại Hình 3.3.
) l
0.9
0.82
/
m U
0.8
0.72
Đậu nành
0.67
0.7
( e s a p
Đậu phộng
0.61
i l
0.57
0.6
0.51
0.5
0.43
ộ đ t ạ o H
0.41
0.4
0.33
0.31
0.3
0.2
0.21
0.19
0.2
0.15
0.1
0
0
1
2
4
5
6
3 Thời gian nảy mầm (ngày)
Hình 3.3. Hoạt độ lipase trong thời gian nảy mầm của hạt đậu nành,
đậu phộng
Kết quả cho thấy hoạt độ lipase tăng dần từ ngày nảy mầm thứ 1 đến ngày
thứ 3 và đạt đỉnh với hoạt độ là 0,82 U/ml đối với đậu nành và 0,72 U/ml đối với
đậu phộng. Trong giai đoạn này, lipase đã hoạt động tích cực để phân giải lipid dự
trữ trong hạt, cung cấp dinh dƣỡng và năng lƣợng cho sự nảy mầm của hạt.
Từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 6 hoạt độ lipase giảm dần, có thể là do lúc này
các hợp chất dự trữ trong hạt hầu nhƣ đã đƣợc phân giải và cạn kiệt. Mặt khác cũng
có thể do sự hình thành các sản phẩm trao đổi khác, cùng với hoạt động mạnh của
enzyme protease làm ảnh hƣởng hoặc phân giải lipase.
Hoạt độ lipase tối đa từ đậu nành nảy mầm thu đƣợc sau 3 ngày (0,82U/ml)
cao hơn so với hoạt độ lipase tối đa từ hạt đậu phộng nảy mầm (0,72 U/ml). Do đó
lipase từ hạt đậu nành nảy mầm đƣợc lựa chọn để nghiên cứu các đặc tính tiếp theo.
70
Hoạt độ lipase tối đa đạt đƣợc trong nghiên cứu này cao hơn đáng kể so với
kết quả của Gadge và cộng sự, theo đó hạt đậu nành sau 24 giờ nảy mầm chỉ đạt
0,02U/ml khi quy đổi về cùng một lƣợng nguyên liệu chiết [73]. Nguyên nhân có
thể do khác biệt về thời gian nảy mầm, điều kiện canh tác, thổ nhƣỡng và giống.
Kết quả cho thấy thời điểm để thu lipase hiệu quả nhất là hạt đậu nảy mầm
3.1.1.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy
mầm
sau 3 ngày.
Để khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy
mầm, bƣớc đầu tiến hành thu chế phẩm lipase thô. Chế phẩm enzyme lipase thô
dạng bột đƣợc thu nhận theo phƣơng pháp mô tả ở mục 2.4.1.2.a. sau khi để hạt nảy
mầm 3 ngày. Từ 20 gam đậu nành nảy mầm thu đƣợc 2,08 gam lipase thô, hiệu suất
thu lipase thô đạt 10,4%. Các yếu tố ảnh hƣởng đƣợc nghiên cứu bao gồm pH, nhiệt
độ và các ion kim loại nhằm xác định điều kiện hoạt động tốt nhất cho enzyme.
a. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Hoạt độ lipase thô từ đậu nành nảy mầm đƣợc xác định ở các mức nhiệt độ môi trƣờng thay đổi từ 25 oC đến 60 oC nhƣ trình bày ở mục 2.4.1.3. Phƣơng pháp
đo quang với cơ chất p-NPP đƣợc sử dụng để đánh giá hoạt độ với kết quả đƣợc thể
8
6.980a
6.484b
hiện trên đồ thị Hình 3.4.
) g / U m
7
6.181c
5.913d
6
5.328e
( e s a p
i l
5
4.545f
3.996g
4
3.209h
ộ đ t ạ o H
3
2
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Nhiệt độ (oC)
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy mầm
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
71
Từ đồ thị Hình 3.4 có thể thấy, khi nhiệt độ tăng từ 25÷30 oC hoạt độ
enzyme lipase cũng tăng từ 6,18÷6,98 (mU/g). Từ 30÷60 oC, hoạt độ lipase giảm từ 6,98÷3,209 (mU/g). Tại 30 oC thì hoạt độ enzyme lipase cao nhất (6,98 mU/g), cao hơn gấp 2 lần so với giá trị ở 60 oC (3,209 mU/g). Điều này cho thấy ở nhiệt độ cao,
lipase dễ bị biến tính làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động nên làm giảm hoạt
độ lipase.
Theo nghiên cứu của Gadge và cộng sự [73] về lipase từ đậu nành nảy mầm, nhiệt độ tối ƣu là 24 oC trên cơ chất dầu oliu, trong khi ở nghiên cứu này, nhiệt độ tối ƣu của lipase đậu nành nảy mầm xác định đƣợc là 30 oC. Nhiệt độ tối ƣu khác
nhau có thể là do sự khác nhau về giống đậu nành và cơ chất thủy phân.
b. Ảnh hưởng của pH
Chọn nhiệt độ tối ƣu vừa tìm đƣợc 30 oC và thay đổi giá trị pH của môi
trƣờng từ 4 đến 10, hoạt độ lipase từ đậu nành nảy mầm đƣợc đo và kết quả đƣợc
12
11.170a
thể hiện trên đồ thị Hình 3.5.
) g / U m
10
( e s a p
i l
8
6.98b
6.757c
6
ộ đ t ạ o H
3.504f 3.833e 4.176d
4
3.068g
2
0
3
4
5
6
8
9
10
11
7 pH
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ hạt đậu nành nảy mầm
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Từ Hình 3.5 cho thấy hoạt độ lipase tăng dần từ pH 4 đến pH 9 và đạt đỉnh
tại pH 9 (11,17 mU/g enzyme). Nhƣ vậy, lipase này hoạt động tối ƣu ở pH 9 trên cơ
chất p-NPP.
pH tối ƣu của lipase thô từ đậu nành nảy mầm của nghiên cứu này cao hơn
72
so với pH tối ƣu 8 của lipase đậu nành theo công bố của Gadge và cộng sự [73].
Điều này là do lipase xúc tác trên cơ chất khác nhau nên có pH tối ƣu cũng có thể
khác nhau [53].
c. Ảnh hưởng của ion kim loại
Sự có mặt của các ion kim loại trong môi trƣờng phản ứng cũng ảnh hƣởng
đáng kể đến hoạt độ lipase. Tùy vào nồng độ và loại ion mà sẽ làm tăng, giảm hay
ổn định hoạt độ enzyme.
Trong nghiên cứu này hoạt độ lipase đƣợc xác định với sự có mặt của các ion Ca2+, Mg2+, Na+, K+ (ở dạng muối clorua 0,1M) và so sánh với mẫu đối chứng. Các
thí nghiệm đƣợc thực hiện theo mô tả ở mục 2.4.1.3. Tất cả các mẫu đƣợc đo ở điều
kiện nhiệt độ và pH tối ƣu đƣợc xác định từ các thí nghiệm trên. Kết quả thu đƣợc
20
17.456a
18
thể hiện ở Hình 3.6.
) g / U m
(
16
13.372b
14
ộ đ t ạ o H
11.170c
12
10
8.405d
8
6.721e
6
4
2
0
K+
Na+
Ca2+
Mg2+
Đối chứng
Ion kim loại
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành
nảy mầm
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Hình 3.6 cho thấy Ca2+, Mg2+ làm tăng hoạt độ lipase từ đậu nành nảy mầm.
73
Kết quả này tƣơng tự nhƣ kết quả của Ezema và cộng sự [48] trong một nghiên cứu cũng cho thấy Ca2+ làm tăng hoạt độ lipase từ hạt Cucumeropsis manni (White Melon). Trong khi đó K+, Na+ làm giảm hoạt tính của loại enzyme này.
Cụ thể là ion Ca2+, Mg2+ làm tăng hoạt độ lipase tƣơng ứng gấp gần 1,5 và 1,2 lần so với mẫu đối chứng. Ion K+, Na+ đều có tác dụng làm giảm hoạt độ lipase
từ 11,17 xuống 8,405 (mU/g) và 6,721 (mU/g).
Ion Ca2+, Mg2+ ở dạng muối clorua 0,1M có tác dụng làm tăng hoạt độ
enzyme lipase do có khả năng hình thành phức hợp enzyme – ion kim loại - cơ chất. Bên cạnh đó Ca2+, Mg2+ còn có thể làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử
enzyme nhờ tƣơng tác tĩnh điện, làm tăng độ bền của lipase và giúp nó hoạt động tốt hơn trong môi trƣờng phản ứng. Sự gia tăng hoạt độ lipase khi có mặt của Ca2+ có thể là do Ca2+ có vai trò quan trọng trong việc xây dựng cấu trúc ổn định xúc tác của enzyme. Ca2+ liên kết với cấu trúc bên trong của enzyme, dẫn đến làm thay đổi
độ hòa tan và khả năng ion hóa của acid béo tại bề mặt liên pha [100]. Kết quả này tƣơng tự nhƣ nghiên cứu của Gadge và cộng sự với ion Ca2+, Mg2+ đều có tác dụng
làm tăng hoạt độ enzyme lipase [73].
Ion Na+, K+ có tác dụng làm giảm hoạt độ enzyme lipase do các ion có tác
dụng tƣơng hỗ với các nhóm tích điện trái dấu của enzyme, làm trung hòa điện tích
trên bề mặt enzyme, vừa có tác dụng loại bỏ lớp vỏ hydrate của phân tử enzyme.
Khi đó enzyme tập hợp lại với nhau nên ít có khả năng tiếp xúc với cơ chất hơn dẫn
đến làm giảm khả năng xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme.
* Kết luận:
- Lipase từ hạt đậu phộng và đậu nành đều có hoạt độ cao nhất ở thời điểm
hạt nảy mầm sau 3 ngày, tuy nhiên lipase từ đậu nành có hoạt độ cao hơn.
- Chế phẩm enzyme lipase thô từ đậu nành nảy mầm hoạt động tối ƣu ở 30 oC, pH 9. Sự có mặt của các ion Ca2+, Mg2+ ở nồng độ muối clorua 0,1M có tác dụng làm tăng hoạt độ của enzyme lipase này. Trong khi đó, ion Na+, K+ lại có tác
dụng ức chế hoạt động lipase.
3.1.2. Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nông nghiệp: cám gạo và phôi lúa mì
3.1.2.1. Đánh giá một số thành phần hóa học cơ bản của cám gạo và phôi lúa mì
Độ ổn định của nguyên liệu ban đầu có ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình thu
nhận, đánh giá chất lƣợng enzyme thu nhận đƣợc. Một số thành phần hóa học của
74
nguyên liệu đƣợc xác định theo mục 2.5.1. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của cám gạo và phôi lúa mì
STT Cám gạo Phôi mì
Nguyên liệu Hàm lƣợng (%)
Độ ẩm 1 11,70±0,36 12,12±0,42
Tro tổng 2 3,12±0,11 7,30±0,17
Protein tổng 3 10,69±0,23 28,75±1,16
Lipid tổng 4 8,24±0,36 4,11±0,17
Bản chất của enzyme là protein, do đó hàm lƣợng protein nhƣ một chỉ tiêu để
đánh giá chất lƣợng của enzyme. Hàm lƣợng protein trong nguyên liệu cao nên dễ
thu đƣợc lipase. Hàm lƣợng protein trong cám gạo thu đƣợc 10,69 %, kết quả này
tƣơng đồng với kết quả hàm lƣợng protein trong cám gạo (11-17%) của một số tác
3.1.2.2. Kết quả thu nhận chế phẩm lipase thô
giả khác [109].
Cám gạo, phôi lúa mì là những phụ phẩm của quá trình xay xát của nhà máy
sản xuất lƣơng thực, chúng là nguồn thức ăn dồi dào cho chăn nuôi gia súc, gia
cầm. Tuy nhiên phụ phẩm này lại là nguồn chứa lipase cao.
Cám gạo, phôi lúa mì sau khi thu nhận tiến hành loại lipid, thu lipase theo
các bƣớc nêu trong mục 2.4.1.2.b. Kết quả cho thấy từ 40 g cám gạo thu đƣợc
176,6 ml dịch enzyme thô; từ 40 g phôi lúa mì thu đƣợc 182 ml dịch enzyme thô.
Chế phẩm enzyme thô đƣợc cho vào cốc thủy tinh, đậy kín, bảo quản ở 4 oC,
3.1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase từ cám gạo, phôi lúa mì
dùng cho nghiên cứu tiếp theo.
a. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của lipase
Kết quả nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động phân giải lipid của lipase khảo sát
75
đƣợc thể hiện trên đồ thị Hình 3.7.
0.3
) l
/
cám gạo
0.247a
m U m
0.25
phôi lúa mì
( e s a p
0.207a
i l
0.2
0.167b
0.150b
0.141c
ộ đ t ạ o H
0.15
0.140c
0.116c
0.111d
0.095d
0.1
0.079e
0.101e
0.065f 0.079e
0.057g
0.072f
0.05
0.057g
0
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Nhiệt độ (oC)
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ cám gạo và phôi lúa mì
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Từ đồ thị Hình 3.7 cho thấy hoạt độ lipase từ cám gạo và phôi lúa mì tăng
khi nhiệt độ tăng từ 25°C lên đến 45°C. Ở nhiệt độ tăng trên 45°C, cho thấy hoạt độ
lipase từ cám gạo và phôi lúa mì giảm rõ rệt. Điều này có thể giải thích, ở nhiệt độ
cao lipase bị biến tính dẫn đến làm giảm hoạt động xúc tác nên hoạt độ lipase giảm.
Kết quả cho thấy, lipase từ cám gạo và phôi lúa mì có cùng nhiệt độ tối ƣu ở 45 °C
và hoạt độ lipase cám gạo là 0,247mU/ml cao hơn so với hoạt độ lipase phôi lúa mì
là 0,207mU/ml. Nhiệt độ tối ƣu của lipase cám gạo thu đƣợc là 45 °C thấp hơn so
với giá trị nhiệt độ tối ƣu của lipase cám gạo 50 °C theo nghiên cứu của P. Kanmani
và cộng sự [66]. Trong khi đó, giá trị nhiệt độ tối ƣu của lipase từ phôi lúa mì này
45 °C cao hơn so với kết quả nghiên cứu lipase từ phôi mì của Kapranchikov và cộng sự có nhiệt độ tối ƣu là 37 oC [67].
b. Ảnh hưởng của pH
Kết quả pH tối ƣu cho hoạt động phân giải lipid của lipase khảo sát đƣợc thể
76
hiện trong Hình 3.8
0.3
) l
cám gạo
/
phôi lúa mì
0.238a
m U m
0.25
0.220b
( e s a p
0.189b 0.199a
i l
0.2
0.171c 0.183b
0.185b
0.169d
0.153d
0.177c 0.146e
ộ đ t ạ o H
0.15
0.126f
0.133e
0.115g
0.108f
0.1
0.087g
0.05
0.033h
0
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
9
9.5
10
10.5
pH
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ cám gạo và phôi lúa mì
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Từ Hình 3.8 cho thấy hoạt độ lipase cám gạo tăng mạnh khi pH tăng từ 6 đến
8, sau đó hoạt độ lipase giảm khi tiếp tục tăng pH đến 9,5. Kết quả cho thấy pH tối
ƣu của lipase cám gạo là 8 tƣơng ứng với hoạt độ lipase 0,238 mU/ml. Kết quả trên
đồ thị Hình 3.9 cũng cho thấy lipase từ phôi lúa mì hoạt động tốt nhất ở pH 9,5 với
hoạt độ 0,199 mU/ml. Giá trị pH này cao hơn so với pH tối ƣu 8 của lipase từ phôi
lúa mì theo nghiên cứu của Kapranchikov và cộng sự [67]. Lipase từ thực vật đƣợc
một số tác giả báo cáo thƣờng hoạt động tối ƣu ở pH trung tính hoặc pH kiềm. Giá
trị pH tối ƣu của lipase còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất và nguyên liệu thu
nhận nên mỗi loại lipase có pH tối ƣu khác nhau [125].
c. Ảnh hưởng của ion kim loại
Kết quả ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase cám gạo và phôi lúa
77
mì đƣợc thể hiện trên Hình 3.9.
0.3
) l
lipase cám gạo
/
lipase phôi lúa mì
m U m
0.25
0.238a
( e s a p
i l
0.207a
0.199b
0.195b
0.2
0.179b
0.178c
0.176c
0.174b
ộ đ t ạ o H
0.164c
0.153d
0.143e
0.15
0.125f
0.102d
0.1
0.067e
0.05
0
Ca2+
Cu2+
Mg2+
Mn2+
Na+
EDTA Mẫu đối chứng
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ của lipase từ cám gạo
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Từ Hình 3.9 cho thấy sự có mặt của các ion kim loại với nồng độ 0,1M đều
làm giảm hoạt độ của lipase cám gạo. Tuy nhiên, ảnh hƣởng của các ion khác nhau
đến hoạt độ lipase không giống nhau. Lipase cám gạo bị ức chế nhiều nhất bởi sự có mặt của ion Na+, Cu2+, EDTA; ức chế ít nhất bởi ion Mg2+, Ca2+. Kết quả này tƣơng
tự nhƣ nghiên cứu của P. Kanmani và cộng sự thì sự có mặt của các ion kim loại nhƣ Ca2+, Mg2+, Cu2+, Na+ ở nồng độ 3mM cũng làm giảm đáng kể hoạt độ lipase từ
cám gạo. Điều này đƣợc cho rằng sự có mặt của các ion kim loại ở nồng độ cao nó
có thể bao phủ bề mặt lipase làm ngăn chặn lipase kết hợp với cơ chất [66].
Tƣơng tự nhƣ lipase cám gạo, sự có mặt của các ion kim loại nhƣ Mg2+, Cu2+, Na+, Mn2+ và EDTA ở nồng độ 0,1M đều làm giảm hoạt độ lipase phôi lúa mì. Tuy nhiên ion Ca2+ lại làm tăng nhẹ hoạt độ lipase thêm 1,05 lần (2,076 U/ml).
* Kết luận:
78
Lipase từ cám gạo hoạt động tối ƣu ở 45 oC và pH 8; lipase từ phôi lúa mì hoạt động tối ƣu ở 45 oC và pH 9,5. Đây là 2 loại lipase chịu nhiệt, hoạt động tốt
trong môi trƣờng kiềm. Sự có mặt của một số ion Na+, Cu2+, Mn2+ và EDTA ở nồng
độ 0,1M đều có tác dụng làm giảm hoạt độ của lipase từ cám gạo và phôi lúa mì. Tuy nhiên, Ca2+ lại làm tăng nhẹ hoạt độ lipase phôi lúa mì còn đối với lipase cám
gạo thì ngƣợc lại.
3.1.3. Hoạt tính lipase từ mủ của các loại quả
3.1.3.1. Lipase từ mủ quả đu đủ
a . Đánh giá một số thành phần hóa học cơ bản của mủ đu đủ
Một số thành phần hoá học của mủ đu đủ nhƣ: độ ẩm, hàm lƣợng tro, hàm
lƣợng protein và hàm lƣợng chất béo đƣợc xác định theo phƣơng pháp mô tả ở mục
2.5.1. Kết quả một số thành phần hóa học của mủ đu đủ đƣợc trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần hóa học của mủ đu đủ
STT Chỉ tiêu Thành phần (%)
1 Độ ẩm 77,53±1,38
2 Tro tổng 2,07±0,09
3 Protein tổng 6,23±0,25
4 Lipid tổng 1,86±0,07
Độ ẩm trong mủ đu đủ tƣơng đối cao (77,53%), do đó mủ đu đủ sau khi thu
nhận từ vƣờn phải đƣợc bảo quản lạnh ngay để tránh bị hƣ hỏng làm giảm hoạt độ
của enzyme. Hàm lƣợng protein trong mủ đu đủ là chỉ tiêu đánh giá hàm lƣợng
lipase, vì bản chất của enzyme là protein. Trong khi đó hàm lƣợng lipid thấp là điều
kiện thuận lợi cho việc tinh sạch enzyme mà không cần loại chất béo.
b. Kết quả thu nhận chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ
Từ 17,25 g mủ đu đủ tƣơi, sau khi sấy thăng hoa thu đƣợc 3 g mủ khô.
Lƣợng mủ khô này đƣợc sử dụng để thu lipase thô theo quy trình mô tả ở mục
2.4.1.2.c. Kết quả thu đƣợc 0,58g lipase thô. Sản phẩm lipase thô thu từ mủ đu đủ
79
đƣợc thể hiện ở Hình 3.10.
Hình 3.10. Lipase thô từ mủ đu đủ
c. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ
* Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính lipase từ mủ đu đủ
Cố định hàm lƣợng cơ chất và pH môi trƣờng ở giá trị 8, hoạt độ lipase đƣợc
xác định theo mục 2.5.3 ở các điều kiện nhiệt độ môi trƣờng phản ứng thay đổi thay đổi từ 25 oC đến 60 oC nhờ bể ổn nhiệt. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trên đồ thị
140
119.57a
113.04b
120
Hình 3.11.
) g / U m
102.37c
100
( e s a p
88.54d
i l
80
60
51.48e
ộ đ t ạ o H
46.19f
40
25.34g
20
0
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
nhiệt độ (oC)
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
80
Từ Hình 3.11 cho thấy rằng hoạt độ của lipase tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 25 oC đến 45 oC, sau đó giảm dần khi tiếp tục tăng nhiệt độ từ 45 oC đến 60 oC. Hoạt độ lipase đạt giá trị cao nhất là 119,57 mU/g ở 45 oC. Điều này tuân theo quy luật
của phản ứng enzyme, nghĩa là khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng enzyme tăng
và nếu nhiệt độ tăng cao quá thì protein của enzyme bị biến tính làm cho enzyme bị
vô hoạt. Nhiệt độ tối ƣu này thấp hơn công bố trong nghiên cứu của Abdelkafi S và cộng sự, với nhiệt độ hoạt động tối ƣu của lipase từ mủ đu đủ là 50 oC [17].
* Ảnh hƣởng của pH
Cố định nhiệt độ phản ứng ở 45 oC và hàm lƣợng cơ chất, sử dụng các hệ đệm
để thay đổi giá trị pH môi trƣờng phản ứng từ 6 đến 10. Kết quả theo dõi ảnh hƣởng
của pH đến hoạt động phân giải lipid của lipase trên cơ chất p-NPP đƣợc thể hiện
140
116.78b
115.44b 120.43a
trên đồ thị của Hình 3.12.
) g / U m
120
( e s a p
100
i l
79.18c
80
62.91d
ộ đ t ạ o H
58.47e
60
40
12.85f
20
0
5.5
6
6.5
7
7.5
8.5
9
9.5
10
10.5
8 pH
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Kết quả trên Hình 3.12 cho thấy khi pH tăng dần từ 6 đến 8,5 thì hoạt độ
lipase cũng tăng dần, sau đó hoạt độ lipase giảm dần khi pH tăng từ 8,5 đến 10.
Điều này cũng dễ thấy rằng mỗi enzyme hoạt động tốt nhất tại giá trị pH xác định,
nếu thay đổi pH của môi trƣờng sẽ làm thay đổi điện tích của enzyme dẫn đến làm
thay đổi hình dạng trung tâm hoạt động của enzyme vì vậy sẽ làm giảm hoạt động
của enzyme. Trên Hình 3.12 cho thấy lipase từ mủ đu đủ hoạt động tốt trong
81
khoảng pH 8-9 với hoạt độ lớn nhất đạt đƣợc là 120,43 mU/g tại giá trị pH 8,5. Giá
trị pH này thấp hơn so với pH tối ƣu 9 của lipase mủ đu đủ trên cơ chất dầu oliu
theo nghiên cứu của Abdelkafi S và cộng sự [17].
* Khảo sát ảnh hƣởng của ion kim loại
140
120.43a
Kết quả xác định hoạt độ lipase của các mẫu đƣợc thể hiện trên Hình 3.13.
) g / U m
112.04b
114.08b
120
( e s a p
100
i l
80
67.17c
ộ đ t ạ o H
60
43.31d
40
25.69e
20
0
Mg2+
Ca2+
Mn2+
Na+
EDTA
Mẫu đối chứng
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Kết quả trên cho thấy, tất cả các ion đều làm giảm hoạt độ lipase từ mủ đu đủ. Tuy nhiên, Mg2+, Ca2+ ít ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme, trong khi đó, Mn2+ làm giảm gần 2 lần và EDTA, Na+ ảnh hƣởng mạnh nhất đến hoạt độ của loại lipase
này. Kết quả trên tƣơng tự nhƣ nghiên cứu của Kanmani và cộng sự năm 2015 khi
nghiên cứu về ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt độ lipase. Với nồng độ các ion
kim loại trong dung dịch là 0,1M làm giảm hoạt tính của lipase bởi nó có thể bao
phủ về mặt trung tâm hoạt động, ngăn không cho enzyme tiếp xúc với cơ chất [66].
3.1.3.2. Lipase từ mủ quả vả và mủ quả sung
Tóm lại, lipase từ mủ đu đủ là một enzyme chịu kiềm, chịu nhiệt tốt. Hoạt động tối ƣu ở 45 0C và pH 8,5 trên cơ chất p-NPP. Ion Ca2+, Mg2+ ít ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme, trong khi đó Mn2+, Na+, EDTA lại có tác dụng làm giảm hoạt độ lipase.
a. Kết quả thu nhận lipase từ mủ quả sung, quả vả
82
Từ 71,58 g mủ vả tiến hành thu lipase thô theo phƣơng pháp mô tả ở mục
2.4.1.2.c thu đƣợc 49,34 ml dịch lipase thô. Tƣơng tự, từ 60,25 g mủ sung thu đƣợc
41,69 ml dịch lipase thô. Hiệu suất thu dịch lipase thô từ mủ vả đạt 68,93% (v/w) và
mủ sung đạt 69,21% (v/w). Kết quả này tƣơng đồng theo Houda và cộng sự, theo đó
trong mủ sung có 30% gum với hàm lƣợng protein 17 – 18%, phần còn lại 70% là
dịch mủ có chứa lipase [53]. Dịch lipase thu đƣợc có màu vàng nâu, do trong thành
phần của quả sung, vả có chứa các hợp chất polyphenol dễ bị oxy hóa [85]. Dịch lipase thô của mủ quả vả, mủ quả sung đƣợc bảo quản lạnh ở 4 oC để phục vụ quá
trình nghiên cứu tiếp theo.
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả, mủ sung
* Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Để xác định nhiệt độ tối ƣu của lipase, giữ nguyên giá trị pH = 8 và hàm
lƣợng cơ chất, thay đổi giá trị nhiệt độ từ 30 °C đến 55 °C. Sự thay đổi hoạt động
0.1
phân giải lipid của lipase theo nhiệt độ đƣợc thể hiện trên Hình 3.14.
) l
0.090a
/
lipase mủ sung
0.09
m U m
lipase mủ vả
0.08
0.072a
( e s a p
i l
0.07
0.064b
0.056c 0.058b
0.06
0.061b
ộ đ t ạ o H
0.048d
0.05
0.052c
0.04e
0.04
0.029f
0.027d
0.03
0.021e
0.02
0.01
25
30
35
50
55
60
45
40 Nhiệt độ (0C)
Hình 3.14 Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ sung và mủ vả
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
83
Đồ thị Hình 3.14 cho thấy rằng hoạt độ của lipase từ mủ vả và mủ sung đều tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 35 oC đến 45 oC, sau đó giảm dần khi tiếp tục tăng nhiệt độ từ 45 oC đến 55 oC. Hoạt độ lipase từ mủ vả, mủ sung đạt giá trị cao nhất
tƣơng ứng là 0,072 mU/ml và 0,09 mU/ml ở 45 oC. Nhiệt độ tối ƣu này tƣơng tự
nhƣ công bố của Houda Lazreg-Aref và cộng sự khi nghiên cứu về lipase từ mủ quả
sung [53].
* Ảnh hƣởng của pH
Tiến hành thí nghiệm ở điều kiện nhiệt độ tối ƣu vừa tìm đƣợc và hàm lƣợng
cơ chất không đổi, chọn các hệ đệm thích hợp để thay đổi giá trị pH từ 6-10. Kết
quả hoạt độ lipase mủ sung, mủ vả ở các điều kiện pH môi trƣờng khác nhau đƣợc
thể hiện trên Hình 3.15.
) l
0.12
/
lipase mủ sung
m U m
0.096a
lipase mủ vả
0.1
( e s a p
0.081b
0.079a
i l
0.08
0.072c
0.073c
0.064e
0.068d
0.062e
0.054f
0.06
ộ đ t ạ o H
0.067c 0.071b
0.060d
0.054e
0.044g
0.054e
0.04
0.045f
0.040g
0.029h
0.02
0
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
9
9.5
10 10.5 pH
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt độ lipase từ mủ sung và mủ vả
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
pH là một trong những giá trị quan trọng làm thay đổi hoạt độ lipase trong
môi trƣờng phản ứng. Kết quả trên Hình 3.15 cho thấy khi pH tăng dần từ 6 đến 9
thì hoạt độ lipase từ mủ vả cũng tăng dần, trong khi hoạt độ lipase từ mủ sung tăng
dần khi tăng pH từ 6 đến 8,5; sau đó hoạt độ lipase giảm dần khi pH tăng đến 10.
Kết quả cho thấy lipase từ mủ vả đạt hoạt độ cao nhất là 0,079 mU/ml tại pH 9,
lipase từ mủ sung đạt hoạt độ cao nhất là 0,096 mU/ml tại pH 8,5. Ta nhận thấy
hoạt độ của lipase từ mủ sung cao hơn hoạt độ lipase từ mủ vả tại điều kiện nhiệt
độ, pH tối ƣu. Giá trị pH của lipase từ mủ sung thu đƣợc cao hơn kết quả của Houda
84
Lazreg-Aref và cộng sự (pH 5,5) do khác cơ chất thủy phân [22].
* Ảnh hƣởng của ion kim loại
0.12
Lipase mủ sung
Lipase từ mủ vả
0.096a
0.1
Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trên Hình 3.16.
e s a p
i l
0.079a
0.08
0.069b
0.068b
0.067b
0.063c
ộ đ t ạ o H
0.055c
0.06
0.051d
0.045d
0.045e
0.039e
0.038f
0.04
0.02
0
K+
Ca2+
Mg2+
Mn2+
EDTA
Đối chứng
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ sung, mủ vả
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Kết quả Hình 3.16 cho thấy sự có mặt của các ion K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+,
EDTA ở nồng độ 0,1M đều làm giảm hoạt độ của lipase từ mủ sung và mủ vả. Trong đó, ion Na+ và EDTA lại làm giảm đáng kể hoạt độ lipase, EDTA làm ức chế
hoạt động của lipase đáng kể là do nó có khả năng tạo phức. Quá trình hình thành
phức một cách tự nhiên của hệ khi có mặt của EDTA dẫn đến làm gián đoạn quá
trình hình thành phức enzyme - cơ chất. Điều này ảnh hƣởng đến việc hình thành
sản phẩm cuối nên hoạt độ lipase giảm [45]. Kết quả nghiên cứu cũng tƣơng đồng
với kết quả của Houda và cộng sự khi nghiên cứu ảnh hƣởng của các ion kim loại Ca2+, Mg2+, Zn2+ đến hoạt độ lipase mủ sung [22].
Tóm lại, lipase từ mủ vả và mủ sung có cùng nhiệt độ tối ƣu là 45 oC. Tuy
nhiên, ở cùng nhiệt độ này lipase mủ sung có pH tối ƣu 8,5 và mủ vả có pH tối ƣu 9
trên c ng cơ chất thủy phân là p - NPP. Hơn nữa giá trị hoạt độ của lipase mủ sung
cao hơn so với lipase mủ vả ở điều kiện nhiệt độ, pH tối ƣu. Sự có mặt của các ion kim loại nhƣ K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, EDTA ở nồng độ 0,1M đều làm giảm hoạt độ
85
lipase từ mủ sung và mủ vả.
3.1.4. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật khác nhau
Từ các kết quả nghiên cứu thu nhận lipase và khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng
đến hoạt độ lipase từ các nguồn thực vật khác nhau từ các thí nghiệm trên, khả năng
thu nhận lipase thô từ các nguồn thực vật có thể đƣợc tổng kết ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hiệu quả thu nhận lipase từ các nguồn thực vật
Hiệu quả
Nguồn thu nhận lipase STT Hoạt độ riêng của chế phẩm thu nhận Điều kiện hoạt động tối ƣu Dạng chế phẩm lipase thô (mU/g nguyên liệu)
1 Bột 11,170 mU/g 1,160 Đậu nành nảy mầm
2 Mủ đu đủ Bột 120,430 mU/g 4,050
3 Cám gạo Dịch lỏng 0,238 mU/ml 1,050
4 Phôi lúa mì Dịch lỏng 0,199 mU/ml 0,910
5 Mủ vả Dịch lỏng 0,079 mU/ml 0,054
Kết quả tổng hợp thể hiện ở Bảng 3.4 cho thấy ở điều kiện nhiệt độ, pH tối
6 Mủ sung Dịch lỏng 0,096 mU/ml 0,066 30 oC, pH = 9 45 oC, pH = 8,5 45 oC, pH = 8 45 oC, pH = 9,5 45 oC, pH = 9 45 oC, pH = 8,5
ƣu của từng loại lipase thì lipase từ mủ đu đủ có hoạt độ riêng cao nhất (120,430
mU/g). Hiệu quả thu nhận lipase, tức tổng hoạt độ lipase thu đƣợc từ 1 gam nguyên
liệu của mủ đu đủ là 4,050 mU/g cũng cao nhất.
Ngoài mủ đu đủ, hạt đậu nành nảy mầm, cám gạo và phôi lúa mì cũng cho
hiệu quả thu nhận lipase đáng kể lần lƣợt đạt 1,160 mU/g, 1,050 mU/g, 0,910 mU/g.
Trong khi đó, hiệu quả thu lipase từ mủ sung và mủ vả kém hơn nhiều.
Trong số các nguồn thực vật trên, việc khai thác lipase từ mủ đu đủ là nhiều
86
tiềm năng nhất. Vì mủ đu đủ từ lâu đã đƣợc khai thác để thu nhận papain ở quy mô
công nghiệp [9], nên đây là nguồn nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền. Vì lipase có ở phần
rắn không tan của mủ đu đủ, papain có trong phần hoà tan đƣợc trong nƣớc của mủ
đu đủ, điều này cho phép thu nhận đồng thời lipase và papain từ một nguồn nguyên
liệu và trong một quy trình kết hợp.
Cho đến nay, chƣa có một quy trình thu nhận lipase từ mủ đu đủ với đầy đủ
các thông số tối ƣu đƣợc công bố, do đó mủ đu đủ đƣợc chọn là đối tƣợng để
nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất lipase thô và đánh giá khả năng ứng dụng
của nó trong các nghiên cứu tiếp theo của luận án.
Chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ có thể ứng dụng trực tiếp trong công nghệ
thực phẩm mà không gây lo ngại ảnh hƣởng đến sức khỏe của ngƣời tiêu dùng.
Ngoài ra, lipase từ mủ đu đủ có những ƣu điểm trội hơn so với lipase vi
khuẩn và động vật nhƣ: ổn định tốt trong phạm vi rộng của pH, nhiệt độ. Lipase này
đƣợc coi nhƣ một enzyme "cố định một cách tự nhiên" vì lipase liên kết chặt với các
thành phần không tan trong nƣớc của mủ nên nó có thể đƣợc thu hồi và tái sử dụng
[17]. Lipase có thể thu nhận từ chất thải nông nghiệp của các loại quả đu đủ bị bệnh
khi còn xanh và chất thải công nghiệp khi sản xuất papain.
3.2. Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ
Mủ đu đủ có chứa nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó enzyme dễ hòa
tan trong nƣớc gồm papain, chymopapain và peptidase. Ngoài ra mủ đu đủ còn
chứa các enzyme không tan trong nƣớc, đặc biệt là lipase. Mục đích của nghiên
cứu này nhằm tìm các điều kiện thích hợp để thu lipase thô từ phần không tan
trong nƣớc của mủ đu đủ, từ đó đề xuất quy trình sản xuất lipase thô từ mủ đu đủ
đạt hiệu quả cao.
3.2.1. Các phương pháp bảo quản mủ đu đủ
a. Nghiên cứu bảo quản mủ đu đủ bằng phương pháp sấy
Mủ đu đủ có thành phần là các acid béo bão hòa, không bão hòa, tocopherol,
tocotrienol, triterpenic alcol, sterol và sự hiện diện của các chuỗi polyisoprene ngắn
liên kết cộng hóa trị với các phospholipid tạo nên cấu trúc polymer [18].
87
Mủ đu đủ sau khi thu nhận tại vƣờn thƣờng dễ bị đóng rắn trong không khí,
điều này khiến lipase bị “nhốt” trong mủ và ảnh hƣởng đến hoạt tính thủy phân của
lipase. Hàm lƣợng nƣớc cao cũng làm mủ khó bảo quản đƣợc lâu. Mục đích của sấy
khô mủ để bảo quản mủ tránh bị hƣ hỏng. Từ nguồn mủ thô ban đầu thu nhận trực
tiếp từ quả đu đủ vào lúc sáng sớm, mủ đu đủ đƣợc đem đi làm khô đến khối lƣợng không đổi theo 3 phƣơng pháp khác nhau: phơi nắng, sấy đối lƣu (55 oC, 36 giờ), sấy thăng hoa (-40 oC, 16 giờ). Quá trình tiến hành đƣợc thực hiện theo mục
2.4.2.1.a. Kết quả thu đƣợc theo Bảng 3.5. Hình ảnh mủ khô thu đƣợc thể hiện ở
Hình 3.17.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của các phƣơng pháp sấy khác nhau lên hoạt độ lipase
Phƣơng pháp sấy Hoạt độ lipase Độ ẩm (%) (mU/g CK) nguyên liệu ban đầu
Phơi nắng 11,80 27,68 ± 1,02
Sấy đối lƣu 11,30 18,22 ± 0,78
Sấy thăng hoa 9,13 120,35 ± 4,59
Kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy, ở nhiệt độ cao trong thời gian phơi nắng kéo
dài có ảnh hƣởng đáng kể đến hoạt độ lipase. Bên cạnh đó, quá trình phơi nắng còn
phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, khó kiểm soát, sản phẩm thu đƣợc có màu sắc bị
biến đổi sang màu vàng nâu, điều này có thể do các polyphenol trong mủ bị oxy hóa
nên khả năng tái hòa tan mủ đu đủ trong nƣớc kém hơn, dẫn đến làm giảm hoạt độ
lipase.
Đối với sấy đối lƣu, thời gian sấy kéo dài, mủ đu đủ có thể bị polymer hóa,
đóng rắn nên làm giảm hoạt độ lipase.
Mủ đu đủ sau sấy thăng hoa có hoạt độ cao nhất (120,35 mU/g CK), cao gần
gấp 6 lần so với phƣơng pháp sấy đối lƣu và hơn 4 lần so với phơi nắng. Hình 3.17
thể hiện các sản phẩm thu đƣợc bằng các phƣơng pháp làm khô mủ khác nhau. Mủ
khô thu đƣợc sau sấy thăng hoa có độ xốp, khi hòa tan vào nƣớc trƣơng nở trở lại và
có tính chất giống nguyên liệu ban đầu, enzyme trong mủ không bị mất hoạt tính,
88
khả năng hòa tan vào nƣớc tốt hơn so với mủ khô thu nhận từ các phƣơng pháp sấy
đối lƣu hoặc phơi nắng. Kết quả nghiên cứu này tƣơng đồng với Darvishi và cộng
sự cho rằng phƣơng pháp sấy thăng hoa là phƣơng pháp tốt nhất để bảo toàn hoạt
tính lipase từ Yarrowia lipotica [39].
Hình 3.17. Mủ đu đủ thu đƣợc sau khi phơi nắng, sấy đối lƣu, sấy thăng hoa
Vậy sấy thăng hoa là phƣơng pháp sấy tốt nhất để làm khô mủ đu đủ trƣớc
khi bảo quản trong số các phƣơng pháp sấy đã nghiên cứu.
b) Nghiên cứu bảo quản mủ đu đủ bằng phương pháp lạnh đông
Ngoài sấy khô, kỹ thuật lạnh và lạnh đông cũng thƣờng đƣợc sử dụng trong bảo
quản nguyên liệu. Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy mủ đóng rắn nhanh trong bảo quản lạnh (5 oC), làm giảm hoạt độ lipase của mủ. Do đó, trong nghiên cứu này, khả năng
bảo quản mủ bằng phƣơng pháp lạnh đông đƣợc đánh giá thông qua việc theo dõi hoạt
độ lipase của mủ sau các khoảng thời gian trữ đông.
Quá trình thu lipase từ mủ tƣơi sau trữ đông đƣợc xác định theo mô tả ở mục
2.4.2.1.b. Kết quả theo dõi hoạt độ lipase sau các khoảng thời gian trữ đông đƣợc
thể hiện ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Sự thay đổi hoạt độ lipase của mủ đu đủ theo thời gian trữ đông
Thời gian trữ đông (tuần) Hoạt độ lipase (mU/g CK)
Mẫu đối chứng 1 2 3 4 5 6 129,61 ± 7,08a 128,88 ± 7,46ab 127,00 ± 7,35ab 126,08 ± 8,64ab 123,51 ± 5,86ab 117,37 ± 7,30bc 109,74 ± 8,64c
Ghi chú: Các giá trị được đánh dấu bởi những chữ cái khác nhau thể hiện sai khác
89
có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05).
Kết quả ở Bảng 3.6 cho thấy thời gian trữ đông từ 1 đến 4 tuần đầu thì hoạt
độ lipase giảm không đáng kể. Đến tuần thứ 5, 6 thì hoạt độ lipase giảm nhiều hơn.
Do đó mủ đu đủ có thể bảo quản trữ đông đƣợc sau 4 tuần mà vẫn giữ ổn định hoạt
độ lipase.
Kết quả cho thấy hoạt độ lipase thu đƣợc từ mủ đu đủ tƣơi sau cấp đông 5
tuần có hoạt độ tƣơng đƣơng với hoạt độ lipase thu đƣợc từ mủ khô sau khi sấy
thăng hoa.
Do đó nếu thu lipase từ nguyên liệu mủ tƣơi thì mủ đu đủ có thể bảo quản trữ
đông đến 5 tuần, còn nếu mủ cần để thời gian dài thì chọn phƣơng pháp sấy thăng
hoa mủ là tối ƣu.
3.2.2. Thu nhận enzyme thô
3.2.2.1. Chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nƣớc
Lipase thô là enzyme cố định trong mủ đu đủ, là phần rắn còn lại của mủ đu
đủ sau khi loại bỏ các thành phần hoà tan trong nƣớc của mủ nhƣ papain,.... Hiệu
suất loại bỏ các thành phần hoà tan trong nƣớc của mủ đu đủ càng cao, hoạt độ
riêng của lipase trong phần rắn càng lớn. Do đó, mục đích của nghiên cứu này là
xác định tỷ lệ nƣớc thích hợp để rửa, loại bỏ các thành phần tan trong nƣớc của mủ
đu đủ.
Tiến hành thí nghiệm nhƣ mô tả ở mục 2.4.2.2.a, kết quả đƣợc thể hiện ở
Bảng 3.7. và Hình 3.18.
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc đến hiệu quả thu nhận lipase thô
STT Tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc (w/w) Khối lƣợng lipase thô (g) Độ ẩm (%)
1 1:4 1,9861 ± 0,0343 9,54
2 1:5 1,6927 ± 0,0082 9,56
3 1:6 1,3626 ± 0,0376 9,57
4 1:7 1,1382 ± 0,0125 9,54
5 1:8 1,1315 ± 0,0148 9,55
90
6 1:9 1,1250 ± 0,0110 9,54
85
80
80
70
75
)
60
70
U m
) g / U m
65
50
60
( e s a p
40
i l
55
( g n ổ t e s a p
i l
30
50
g n ê i r
45
20
ộ đ t ạ o H
40
ộ đ t ạ o H
10
35
30
0
1:4
1:5
1:6
1:7
1:8
1:9
Tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc
Hoạt độ riêng lipase (mU/g)
Hoạt độ lipase tổng (mU)
Hình 3.18. Ảnh hƣởng của tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc đến hoạt độ riêng và hoạt độ
tổng của CPL
Kết quả Bảng 3.7 cho thấy khi tăng dần lƣợng nƣớc hòa tan mủ đu đủ theo tỷ
lệ từ 1:4 đến 1:7 thì lƣợng lipase thô thu đƣợc giảm dần chứng tỏ lƣợng tạp chất hòa
tan đƣợc nhiều hơn. Tuy nhiên, khi lƣợng nƣớc tăng thêm đến tỷ lệ 1:8 thì khối
lƣợng lipase thô thay đổi không đáng kể.
Trong khi đó, kết quả ở Hình 3.18 cho thấy hoạt độ riêng của lipase thô cũng
tăng dần khi lƣợng nƣớc hòa tan tăng nhƣng hoạt độ tổng vẫn giảm không đáng kể.
Điều này chứng tỏ với tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc là 1:7 là thích hợp cho quá trình hòa tan
3.2.2.2. Chọn số lần lặp rửa-ly tâm
mủ đu đủ thu lipase thô.
Quá trình rửa mủ đu đủ nếu lặp lại nhiều lần có thể làm tăng khả năng hòa
tan các enzyme tan trong nƣớc cũng nhƣ lƣợng tạp chất có trong mủ. Dựa vào kết
quả nghiên cứu trên, chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nƣớc là 1:7 để rửa lipase. Tiến hành thu
lipase theo quy trình nêu ở mục 2.4.2.2.b. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở Bảng 3.8. và
91
Hình 3.19.
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hiệu quả thu nhận
lipase thô
STT Số lần lặp rửa - ly tâm Khối lƣợng lipase thô (g) Độ ẩm (%)
1 1 1,1378 ± 0,0107 9,59
2 2 0,8959 ± 0,0195 9,55
3 3 0,6386 ± 0,0154 9,56
4 4 0,6333 ± 0,0176 9,54
5 5 0,6324 ± 0,0068 9,57
Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy nếu số lần lặp rửa - ly tâm tăng từ 1 đến 3 lần
thì khối lƣợng lipase thô thu đƣợc cũng giảm từ 1,1378g xuống còn 0,6386g. Dễ
dàng nhận thấy số lần lặp tăng thì khả năng hòa tan tạp chất trong nƣớc của mủ đu
đủ cũng tăng. Nếu tăng số lần lặp rửa – ly tâm lên 4 lần thì lƣợng lipase thô thu
140
80
75
120
70
đƣợc thay đổi không đáng kể.
)
100
U m
65
) g / U m
60
80
( e s a p
i l
55
( g n ổ t e s a p
i l
60
g n ê i r
50
45
40
ộ đ t ạ o H
ộ đ t ạ o H
40
20
35
0
30
1
5
4 3 2 Số lần lặp rửa - ly tâm
Hoạt độ riêng lipase (mU/g)
Hoạt độ lipase tổng (mU)
Hình 3.19. Ảnh hƣởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hoạt độ riêng và hoạt độ
92
tổng của CPL.
Từ Hình 3.19. cho thấy hoạt độ riêng của lipase tăng dần khi tăng số lần lặp từ
1 đến 3 lần và hoạt độ ổn định nếu tiếp tục tăng số lần lặp rửa – ly tâm và hoạt độ
tổng thì không thay đổi. Điều này chứng tỏ lƣợng tạp chất hòa tan trong nƣớc đã hết.
Do đó, chọn số lần lặp cho quá trình rửa và ly tâm mủ đu đủ 3 lần là phù hợp
trong quá trình thu lipase, tiết kiệm đƣợc chi phí năng lƣợng khi ly tâm.
Quá trình thu papain từ mủ đu đủ cũng đƣợc thực hiện bằng cách hòa tan mủ
đu đủ với nƣớc cất thu dịch chứa papain [9]. Vậy phần mủ hòa tan trong nƣớc có
3.2.2.3. Phƣơng pháp sấy để thu lipase thô
thể là nguồn thu papain, sau khi thu lipase thô.
Phần rắn thu đƣợc sau ly tâm cần đƣợc sấy khô đến độ ẩm bảo quản để thu
chế phẩm enzyme thô. Mục đích nghiên cứu nhằm đánh giá hoạt độ của chế phẩm
lipase thô từ mủ đu đủ theo 2 phƣơng pháp sấy khô khác nhau. Từ đó đề xuất đƣợc
quy trình thu nhận chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ.
Dựa vào kết quả nghiên cứu trên, chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nƣớc là 1:7 để rửa
lipase và số lần lặp rửa – ly tâm là 3 lần. Tiến hành thu lipase thô theo quy trình nêu
ở mục 2.4.2.2.c. Kết quả hoạt độ lipase thu đƣợc thể hiện ở Bảng 3.9. Sản phẩm
lipase thô thu đƣợc thể hiện trên Hình 3.20.
Bảng 3.9. Hoạt độ của chế phẩm lipase thô thu bằng 2 phƣơng pháp
sấy khác nhau
Phƣơng pháp sấy Độ ẩm Hoạt độ
kết thúc (%) (mU/ g enzyme khô)
Sấy thăng hoa 9,13 120,349 ± 4,612 (-40 oC, 24 giờ)
93
Sấy đối lƣu 9,55 32,069 ± 1,315 (55 oC, 36 giờ)
(a)
(b)
Hình 3.20. Mẫu lipase từ mủ đu đủ sau khi sấy đối lƣu (a) và sấy thăng hoa (b)
Kết quả cho thấy hoạt độ lipase thô thu đƣợc của mẫu sau khi sấy thăng hoa
(120,349 mU/g) cao hơn nhiều so với mẫu lipase thô sau khi sấy đối lƣu (32,069
mU/g). Điều này dễ thấy trong quá trình sấy đối lƣu, dƣới tác dụng nhiệt độ và thời
gian sấy kéo dài, enzyme có thể đã bị biến tính một phần và có thể quá trình đóng
rắn của mủ đã cố định chặt chẽ enzyme hơn, làm giảm khả năng xúc tác. Ngoài ra,
có thể do ảnh hƣởng của các phản ứng oxy hoá polyphenol hoặc phản ứng Maillard,
sản phẩm trở nên sẫm màu hơn. Trong khi đó, mẫu lipase thô sau sấy thăng hoa giữ
đƣợc hoạt tính cao, có màu trắng đục, độ mịn cao, độ tơi xốp hơn so với mẫu sấy
đối lƣu. Hơn nữa, lipase thô có trong phần không tan trong nƣớc của mủ đu đủ,
ngoài ra còn chứa các chất khác nhƣ tocopherol, tocotrienol, triterpenic alcol, sterol,
polyisopren, các phospholipid [18]. Chuỗi polyisopren sẽ liên kết cộng hóa trị với
các phospholipid làm polymer hóa mủ. Nếu sấy đối lƣu ở nhiệt độ cao thì lipase sẽ
cố định trong mủ nên việc tách các enzyme lipase ra khỏi mủ sẽ gặp trở ngại. Do
đó, lipase thu nhận đƣợc bằng phƣơng pháp sấy thăng hoa sẽ bảo toàn đƣợc hoạt
3.2.2.4. Đề xuất quy trình thu lipase thô
tính lipase.
Dựa vào kết quả nghiên cứu trên, quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ có thể
94
đƣợc đề xuất trên Hình 3.21.
Mủ đu đủ
Bảo quản lạnh đông (-18 ± 2 oC)
Nƣớc cất
Lặp lại 3 lần
Rã đông
Ngâm, rửa tạp chất (5 phút)
Tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc (1:7; w/w)
o
Dịch thải
(6000 vòng, 20 phút, 4
C)
Ly tâm
Sấy thăng hoa o C, 16 giờ ) (-40
Lipase thô (CPL) Lipase thô (CPL)
Hình 3.21. Quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ
Thuyết minh quy trình công nghệ:
- Mủ đu đủ đƣợc thu nhận từ quả đu đủ còn xanh tại vƣờn vào lúc 6-8g sang.
Bằng cách dùng dao nhọn rạch theo chiều dọc của quả chỗ có đƣờng kính lớn nhất,
thu mủ vào lọ nhựa đậy kín nắp và bảo quản lạnh trong thùng xốp trong quá trình
vận chuyển.
- Sau đó mủ đƣợc cấp đông ở -18 ± 2 oC để bảo quản, thời gian trữ đông của
mủ có thể kéo dài đến 5 tuần.
- Mủ đu đủ sau khi rã đông đƣợc rửa trong nƣớc cất với tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc cất là 1:7 (w/w), khuấy trong 5 phút. Ly tâm lạnh ở 4 oC, 6000 vòng, 20 phút. Thu tủa, lặp lại quá trình rửa – ly tâm thêm 3 lần.
- Phần rắn thu đƣợc đem sấy thăng hoa -40 oC, 16 giờ thu đƣợc chế phẩm
95
lipase thô.
3.2.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân của lipase thô từ mủ đu đủ trên
các cơ chất khác nhau
Do cấu trúc lý hóa của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạt
động mà enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông thƣờng
khác. Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện ở đặc điểm mỗi enzyme chỉ có khả năng
xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng
nhất định.
Lipase thuộc lớp enzyme serine hydrolase đƣợc định nghĩa nhƣ là
triacylglycerol acyl hydrolase (EC.3.1.1.3) và nó khác với esterase bởi cơ chất xúc
tác của nó. Trong khi lipase có khả năng thủy phân acylglycerol chuỗi dài (>10
nguyên tử carbon) thì esterase chỉ xúc tác thủy phân acylglycerol mạch ngắn (<10
nguyên tử carbon) [97].
Để đánh giá khả năng thủy phân của lipase từ mủ đu đủ trên các cơ chất khác
nhau, hoạt độ lipase đƣợc đo trên cơ chất dầu cá hồi, dầu đậu nành, triolein và
tristearin. Dầu cá hồi chứa các gốc acyl là các acid béo bất bão hòa đa, mạch dài,
không no, nhiều nối đôi. Dầu đậu nành chứa chủ yếu là hỗn hợp acid linolenic, có
chứa gốc acyl là các acid béo không no, 1-2 nối đôi.
Kết quả khảo sát hoạt độ lipase từ mủ đu đủ trên các cơ chất khác nhau đƣợc
300
256.67a
250
223.33b
208.33b
trình bày trong Hình 3.22.
) g / U
200
159.67c
( e s a p
150
i l
100
ộ đ t ạ o H
50
0
Triolein
Tristearin
Dầu cá hồi
Dầu đậu nành
Cơ chất
Hình 3.22. Hoạt độ của chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ đối với các cơ
chất khác nhau
96
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Kết quả trên Hình 3.22. cho thấy hoạt độ lipase cao nhất trên cơ chất dầu cá
hồi (256,67 U/g enzyme) và thấp nhất đối với cơ chất tristearin (159,67 U/g
enzyme). Từ đó, có thể sắp xếp mức độ ƣu tiên thủy phân của enzyme lipase từ mủ
đu đủ đối với gốc acyl của triglycerides nhƣ sau: acid béo bất bão hoà đa > acid béo
đơn bất bão hoà > acid béo no.
Kết quả nghiên cứu này tƣơng tự nhƣ theo nghiên cứu Slim Abdelkafi,
Nathalie Barouth (2011) cho thấy hoạt độ lipase trên cơ chất dầu ô liu (256 ± 8 U/g)
[17]. Sự sai khác có thể do điều kiện thủy phân chƣa đƣợc tối ƣu, enzyme lipase từ
mủ đu đủ thu nhận từ các vùng khác nhau.
Ngoài ra, theo nghiên cứu của P. Villeneuve, M. Pina, A. Skarbek và cộng sự
(1997) cho thấy lipase từ mủ đu đủ ƣu tiên thủy phân đối với các gốc acyl mạch
ngắn hơn các gốc acyl mạch dài [122]. Theo nghiên cứu Slim Abdelkafi, Nathalie
Barouth (2011) cho thấy enzyme lipase từ mủ đu đủ thể hiện mức độ ƣu tiên với các
triacylglycerides mạch ngắn và trung bình hơn là triacylglycerides mạch dài. Hoạt
độ lipase từ mủ đu đủ trên dầu cọ, phosphatidylcholine tƣơng ứng là 250 ± 14 U/g,
65 ± 3 U/g, nhƣng cho thấy không có hoạt độ trên oleate cholesterol [17].
* Hoạt độ lipase từ mủ đu đủ trên cơ chất dầu cọ và dầu cá hồi
Có nhiều phƣơng pháp đo hoạt độ lipase khác nhau nhƣ phƣơng pháp chuẩn
độ, phƣơng pháp đo quang, phƣơng pháp sắc ký, phƣơng pháp đĩa thạch. Mỗi
phƣơng pháp có ƣu nhƣợc điểm riêng. Tuy nhiên để đánh giá hoạt độ lipase bằng
hình ảnh trực quan thì phƣơng pháp đĩa thạch đƣợc ƣu tiên lựa chọn. Do đó. hoạt độ
lipase trên cơ chất dầu cọ và dầu cá hồi đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đĩa thạch
nhƣ mô tả ở mục 2.5.4.
97
Kết quả hoạt độ lipase thể hiện trên Hình 3.23 và Hình 3.24
4
1
3
2
Hình 3.23. Khả năng thủy phân của lipase trên cơ chất dầu cá hồi
1, mẫu đối chứng
2, mẫu lipase thƣơng mại
2
1
3
4
3, 4, mẫu lipase thô từ mủ đu đủ
Hình 3.24. Khả năng thủy phân của lipase trên cơ chất dầu cọ
1 - mẫu đối chứng
2 - mẫu lipase thƣơng mại
3, 4 - mẫu lipase thô từ mủ đu đủ
Kết quả trên Hình 3.23 và 3.24 cho thấy CPL hoạt động tốt trên cơ chất dầu
98
cá hồi hơn so với dầu cọ (chứa nhiều tripalmitin).
3.3. Tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ
Mặc d đã có nhiều thành công lớn trong việc phát hiện ra khả năng ứng
dụng của CPL thô trong công nghiệp, tuy nhiên nghiên cứu về cấu trúc phân tử của
CPL đã bị hạn chế do tính chất “cố định” tự nhiên của enzyme lipase trong mủ, tức
là enzyme đƣợc chứa trong một cấu trúc mủ đu đủ phức tạp, rất khó hòa tan. Có
một vài nghiên cứu để hòa tan enzyme lipase này trong mủ nhƣng không thành
công [17]. Năm 2009, Abdelkafi và cộng sự đã sử dụng chất hoạt động bề mặt
CHAPS và sóng siêu âm để hòa tan một phần mủ và sau đó tách các phân đoạn
protein có hoạt tính thủy phân. Các enzyme thu nhận thể hiện hoạt tính là esterase
chứ không phải lipase và do đó lipase từ mủ đu đủ có thể đã mất hoạt tính trong quá
trình phân tách ở nghiên cứu trên.
Trong nghiên cứu này, chất hoạt động bề mặt là Sodium lauroyl sarcosinate
đƣợc sử dụng để hòa tan lipase ra khỏi cấu trúc mủ đu đủ.
3.3.1. Chiết tách lipase mủ đu đủ bằng muối sodium lauroyl sarcosinate
(SLS)
3.3.1.1. Kết quả chiết tách lipase theo quy trình có bƣớc loại lipid
Lipase thô từ mủ đu đủ (CPL) đƣợc tinh sạch một phần theo quy trình đƣợc
mô tả bởi Abdelkafi và cộng sự năm 2009, trong đó hệ dung môi n-hexan: 2-
propanol (tỷ lệ: 1:1) đƣợc sử dụng để loại lipid trƣớc khi lipase đƣợc chiết tách nhờ
tác dụng hỗ trợ của SLS [45].
Từ 1,012 g enzyme thô ban đầu, có hoạt độ riêng xác định đƣợc là
108,55 mU/g, tiến hành hòa tan trong dung dịch gồm n-hexan: 2-propanol (1:1 v/v)
theo mục 2.4.3.1.a. thu đƣợc 45 ml dịch lỏng và 0,5632 g cặn khô sau công đoạn
tách lipid. Kết quả khảo sát không phát hiện hoạt tính lipase trong dịch lỏng. Kết
quả ở Bảng 3.10 cho thấy hoạt độ lipase của phần rắn trên cơ chất p-NPP là
17,30 mU/g. Hoà tan toàn bộ phần rắn theo quy trình nhƣ mục 2.4.3.1.a. thì thu
đƣợc 45 ml dịch lỏng và 0,2815g cặn khô. Khối lƣợng chất khô trong dung dịch
99
lỏng sau khi sấy là 0,2105g và hoạt độ lipase đo đƣợc là 0,19 mU/ml.
Bảng 3.10. Hoạt độ của CPL sau khi loại lipid và chiết tách với SLS
Mẫu Enzyme thô Phần rắn tách béo Dịch lipase thô
Khối lƣợng/Thể tích 1,0120 g 0,5632 g 45 ml
Hoạt độ riêng 108,55 mU/g 17,30 mU/g 0,19 mU/ml
Hoạt độ tổng 109,85 mU 9,74 mU 8,55 mU
Kết quả trên cho thấy rằng SLS có thể hòa tan khoảng 44,3% lƣợng lipase
thô, cả phần rắn và lỏng đều có hoạt độ lipase, điều đó chứng tỏ một phần enzyme
lipase đu đủ vốn dĩ đƣợc cố định tự nhiên trong “lớp bọc cao su tự nhiên” của nó đã
đƣợc giải phóng ra bên ngoài dung dịch lỏng, đây là một phát hiện có ý nghĩa lớn,
làm cơ sở để thu nhận enzyme lipase đu đủ tinh khiết. Từ đó, tạo điều kiện thuận lợi
cho việc nghiên cứu các đặc tính và cấu trúc của enzyme này. Tuy nhiên, hoạt độ
riêng của enzyme lipase thu đƣợc từ phần lỏng và phần rắn giảm đáng kể, xấp xỉ
80,6% so với hoạt độ enzyme lipase thô ban đầu. Điều này chứng tỏ một phần đáng
kể enzyme lipase đã bị biến tính trong quá trình dùng dung môi n-hexan và
2-propanol để loại lipid, nó có thể làm giảm hoạt độ lipase. Theo Ghori và cộng sự
đã nghiên cứu cho thấy lipase từ Bacillus sp. cũng bị giảm hoạt tính khi có mặt của
dung môi hữu cơ là 2-propanol [55].
Kết quả này cho thấy rằng dung dịch chất hoạt động bề mặt SLS có thể hòa
tan gần một nửa lipase thô và bƣớc loại lipid ban đầu có thể không hiệu quả và
3.3.1.2. Kết quả chiết tách lipase không có bƣớc loại lipid
không cần thiết.
Tiến hành hòa tan lipase theo các bƣớc nhƣ mục 2.4.3.1.b. kết quả thu đƣợc
ở Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Hoạt tính của CPL sau hòa tan mà không loại lipid
Mẫu Lipase thô Phần rắn Phần lỏng
Khối lƣợng/Thể tích 1,016 g 0,498 g 97 ml
Hoạt độ riêng 115,07mU/g 20,83mU/g 50,16mU/ml
Hoạt độ tổng 116,91mU 10,37mU 4865,5mU
Kết quả cho thấy hoạt tính của lipase có cả ở phần rắn và phần lỏng. Hoạt
100
tính còn lại trong phần rắn (10,37 mU) chỉ chiếm 8,87% so với hoạt tính ban đầu
của lipase thô. Tuy nhiên, hoạt độ lipase trong phần dịch lỏng cao gấp 40 lần so với
dịch lỏng có loại lipid ở phƣơng pháp trƣớc. Sự tăng vƣợt trội về hoạt độ lipase cho
thấy rằng một lƣợng lipase đáng kể trong mủ đã đƣợc SLS hòa tan ra khỏi mủ.
Enzyme đƣợc giải phóng ra ở dạng tự do hoạt động mạnh hơn ở dạng cố định trong
mủ và có thể không bị ảnh hƣởng bởi bản chất của chất hoạt động bề mặt SLS ở
nồng độ sử dụng.
Muối SLS là chất hoạt động bề mặt anion, khi nó đƣợc hòa tan trong dung
dịch Tris HCl 0,1M, pH 8 thu đƣợc một dung dịch có tính hoạt động bề mặt, nó
tƣơng tác với lớp mủ nhựa cao su, lôi kéo lipase thoát ra khỏi lớp bọc nhựa cao su,
giải phóng một phần từ phần rắn ra ngoài dung dịch lỏng. Do đó khi khảo sát hoạt
độ ở phần lỏng thì có xuất hiện hoạt độ lipase. Hoạt độ tổng của phần lỏng tăng lên
rất nhiều so với trƣớc khi hòa tan. Vì một phần enzyme lipase đã đƣợc giải phóng ra
khỏi cấu trúc cao su tự nhiên, giúp tăng diện tích tiếp xúc giữa lipase với cơ chất
nhiều hơn từ đó làm tăng hoạt độ của lipase. Từ đây, mở ra một con đƣờng mới cho
việc nghiên cứu tinh sạch lipase từ mủ đu đủ.
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ SLS lên hoạt độ lipase
Nhằm khảo sát tìm nồng độ tối ƣu của dung dịch SLS để hòa tan mủ đu đủ
thu lipase cho hoạt độ cao nhất, quá trình hòa tan đƣợc thực hiện theo mục 2.4.3.2.
với các nồng độ của dung dịch SLS từ 0,25% đến 1% (w/v). Kết quả thu đƣợc ở
70
62.00a
59.43b
57.01c
Hình 3.25
) l
60
/
44.82d
50
m U m
40
( e s a p
30
i l
20
ộ đ t ạ o H
10
0
0.25
0.5
0.75
1
Sodium lauroyl sarcosinate (%)
Hình 3.25. Ảnh hƣởng của nồng độ SLS đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ
101
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Có thể khẳng định rằng nồng độ SLS ảnh hƣởng đáng kể đến hoạt độ lipase
của dịch lỏng sau hòa tan thu đƣợc (p < 0,005). Hoạt độ thủy phân của lipase tăng
khi nồng độ của SLS tăng từ 0,25% đến 0,5%, sau đó giảm dần khi nồng độ SLS
tăng từ 0,5% đến 1%. SLS là chất hoạt động bề mặt có bản chất ion, nó góp phần
hút các gốc phân cực của các acid amin cấu tạo nên protein của lipase, lôi kéo các
phân tử lipase ra khỏi cấu trúc nhựa đu đủ, nồng độ SLS ở 0,5% có thể hòa tan mủ
đu đủ để giải phóng lipase làm tăng hoạt độ của dịch lỏng. Tuy nhiên, nồng độ SLS
tăng cao hơn 0,5% có thể làm lipase bị biến tính, dẫn đến làm giảm hoạt tính lipase.
Hoạt độ lipase cao nhất đạt đƣợc là 62 mU/ml khi nồng độ SLS sử dụng để hòa tan
enzyme là 0,5%.
3.3.3. Tủa lipase bằng dung dịch amoni sunfat (AS)
Để thu lipase từ phần dịch lỏng, sau khi hòa tan lipase thô trong dung dịch
SLS 0,5% và ly tâm, sử dụng AS ở các nồng độ bão hòa khác nhau để tủa enzyme.
Bảng 3.12 thể hiện khối lƣợng và hoạt tính thủy phân p-NPP của lipase ở các nồng
độ tủa khác nhau.
Hàm lƣợng muối AS (%) Khối lƣợng tủa (g)
Hoạt tính lipase
10-40
-
0,000
40-50
-
0,050
50-60
+
0,300
60-70
+
0,102
70-80
+
0,031
80-90
-
0,000
Bảng 3.12. Hoạt t nh lipase thu đƣợc ở các phân đoạn tủa khác nhau
Ghi chú: dấu “+” thể hiện có hoạt tính lipase, dấu “-” thể hiện không có hoạt tính
lipase
Kết quả cho thấy, không có kết tủa lipase xuất hiện khi thêm (NH4)2SO4 đạt
đến dung dịch 40% bão hòa. Tất cả các protein đều tạo tủa với dung dịch (NH4)2SO4
102
ở nồng độ 50% đến 90%. Tuy nhiên, chỉ ở phân đoạn 50-60%, 60-70%, 70-80% cho
thấy có hoạt tính lipase. Kết quả này tƣơng tự nhƣ kết quả của Paques và cộng sự liên
quan đến hàm lƣợng AS sử dụng để tủa lipase từ vỏ và hạt của quả đu đủ [90]. Lipase
cũng thu đƣợc khi tủa với hàm lƣợng muối (NH4)2SO4 là 40 – 80%.
Phân đoạn 50-60% có hoạt tính thủy phân tốt và khối lƣợng lipase tủa lớn
nhất nên phân đoạn này đƣợc chọn để tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion và điện di.
3.3.4. Kết quả xác định điểm đẳng điện của protein enzyme
Để tách đƣợc phân đoạn protein trên cột sắc ký Q Sepharose Fast Flow cần
có sự tƣơng tác giữa protein với các chất trên cột sắc ký này. Vì đây là cột trao đổi
anion cần đƣa pH môi trƣờng lớn hơn điểm đẳng điện của protein (pI). Do đó mục
đích xác định điểm đẳng điện sẽ làm cơ sở cho việc lựa chọn pH cho pha động và
loại cột phù hợp dùng trong sắc ký trao đổi ion để tinh sạch enzyme.
Điểm đẳng điện của dịch protein enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp
mô tả ở mục 2.5.5.
Kết quả đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 620 nm của dung dịch enzyme thu đƣợc
0.12
0.1
0.08
0.06
ở Hình 3.26.
D O
0.04
0.02
0
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
9
9.5 10 10.5
pH
Hình 3.26. Đồ thị độ đục của dung dịch enzyme lipase ở pH khác nhau
Kết quả cho thấy khi pH= 3÷5,5 độ đục của dung dịch chƣa xuất hiện, chỉ có
103
ống nghiệm chứa pH 6,5 thì dung dịch có vẫn đục, khi tăng pH của dung dịch đệm
lên thì độ đục của dung dịch giảm dần và khó quan sát. Kết quả mật độ quang của
các dung dịch ở pH 3,5; 4; 4,5; 5 gần tƣơng đƣơng nhau. Từ pH = 3÷6 thì độ đục
dung dịch tăng dần, độ đục dung dịch giảm dần khi pH tăng từ 7-10. Ống nghiệm
chứa pH 6,5 đo quang đƣợc OD lớn nhất đúng nhƣ quan sát.
Có thể kết luận, điểm đẳng điện của dung dịch lipase là gần 6,5. Điều này có
thể giải thích do pH = 6,5 gần với pI của protein nhất nên có nhiều tủa nhất, còn các
pH còn lại xa dần pI nên lƣợng kết tủa giảm dần.
3.3.5. Kết quả tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ bằng sắc ký trao đổi ion
Mẫu ở phân đoạn tủa 50-60% AS đƣợc thẩm tách muối qua màn Cellophan
trong 48 giờ sau đó đƣợc nạp vào cột sắc ký trao đổi ion. Quá trình thực hiện đƣợc
tiến hành theo mô tả ở mục 2.5.7. Mẫu lipase tinh sạch sau khi ra khỏi cột trao đổi
ion đƣợc thu lại, mỗi phân đoạn thu 0,5 ml/ống. Sau đó xác định hoạt độ của lipase
tinh sạch ở mỗi phân đoạn thu đƣợc bằng phƣơng pháp đo quang.
Hình 3.27. Sắc ký đồ của phân đoạn lipase tủa ở 50-60% AS
Kết quả trên Hình 3.27 cho thấy có xuất hiện 2 peak chứng tỏ có ít nhất 2
loại protein có trong mẫu. Peak đầu tiên đƣợc rửa giải từ 2,58 phút đến 6,87 phút,
tiếp theo peak thứ 2 xuất hiện từ 6,87 phút đến 11,29 phút. Hoạt độ lipase đƣợc xác
định tƣơng ứng với 2 peak là 0,316mU/mL và 0,338mU/mL.
3.4. Tính chất của lipase tinh sạch
3.4.1. Kết quả xác định khối lượng phân tử lipase
Mẫu dung dịch lipase tinh sạch sau khi ra khỏi cột sắc ký đƣợc kiểm tra lại
104
bằng phƣơng pháp điện di SDS - PAGE để xác định khối lƣợng phân tử. Kết quả
điện di đƣợc thể hiện trên Hình 3.28.
Hình 3.28. Hình ảnh điện di SDS
M: standard proteins (10-170 kDa); 1-3: mẫu lặp ở phân đoạn tủa AS 50-60%
Kết quả trên Hình 3.28 thể hiện 2 băng protein trong mẫu, dự đoán có 2
protein trong mẫu. Một protein có kích thƣớc khoảng 35-40 kDa và một loại có kích
thƣớc khoảng 40-55 kDa. Kết quả này phù hợp với kết quả chạy sắc ký. Có thể kết
luận rằng có 2 loại lipase có khối lƣợng phân tử trong khoảng 35-55 kDa trong phân
đoạn tủa với AS 50-60%.
Khối lƣợng phân tử của lipase từ mủ đu đủ tƣơng tự nhƣ khối lƣợng phân tử
của lipase từ vi sinh vật và lipase từ thực vật, nhƣ lipase tinh sạch từ
Microbacterium sp., có khối lƣợng 40 kDa [118] hay lipase từ mủ Tunisian
Euphorbia peplus [7]. Trong khi đó, khối lƣợng phân tử của lipase từ Raphia
mesocarp là 35 kDa [84].
3.4.2. Xác định Km và Vmax
Nhằm nghiên cứu ái lực giữa enzyme và cơ chất, các thông số động học của
lipase trên cơ chất p-NPP đƣợc xác định. Giá trị Km và Vmax của lipase với cơ chất
p-NPP đƣợc tính toán từ việc xây dựng đồ thị phƣơng trình Lineweaver–Burk bằng
cách sử dụng hoạt độ lipase phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Đồ thị phƣơng trình
Lineweaver–Burk có dạng đƣờng thẳng biểu thị mức độ thủy phân của p-NPP bởi
105
lipase theo động học của Michaelis–Menten thể hiện trên Hình 3.29.
Hình 3.29. Đồ thị Lineweaver-Burk xác định Km (mM) và Vmax (mM/min/mL)
của lipase từ mủ đu đủ
Kết quả tính toán Km và Vmax của lipase tinh sạch từ mủ đu đủ trên đồ thị Lineweaver-Burk tƣơng ứng là 1,12mM và 1,2×10-6 mM/min/mL. Giá trị Km phụ
thuộc vào loại cơ chất và điều kiện môi trƣờng nhƣ pH, nhiệt độ, lực ion và độ phân
cực. Km thể hiện ái lực giữa enzyme và cơ chất, nếu Km càng nhỏ thì ái lực giữa
enzyme và cơ chất càng lớn dẫn đến tốc độ phản ứng tăng. Giá trị Km của lipase tinh
sạch từ mủ đu đủ có ái lực cao với p-NPP hơn so với lipase từ Microbacterium sp.
có Km là 3,2 mM đƣợc xác định bởi Ritu R, và cộng sự [118]. Tuy nhiên, khả năng
tạo phức với p – NPP của lipase từ mủ đu đủ không tốt bằng lipase từ quả cọ, lipase
từ thermophilic Bacillus stearothermophilus MC 7, lipase từ Acinetobacter sp. AU
07 có Km lần lƣợt là 0,01mM; 0,33mM và 0,51mM [84], [65], [57].
3.5. Đánh giá khả năng ứng dụng lipase mủ đu đủ trong quy trình sản
xuất dầu cá giàu DHA và EPA
3.5.1. Một số đặc điểm của dầu cá hồi thô
Trong nghiên cứu này, dầu cá hồi đƣợc sản xuất từ lƣờn cá hồi theo quy trình
thu nhận dầu cá nhƣ đã trình bày ở mục 2.3.5.1. Chất lƣợng của dầu cá đƣợc đánh
giá dựa trên các chỉ số hóa lý gồm chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số ester, chỉ
số iod và chỉ số peroxit theo các phƣơng pháp nhƣ đã mô tả ở mục 2.5.9. Kết quả có
106
ở Bảng 3.13.
STT
Chỉ tiêu chất lƣợng
Đơn vị
Kết quả
1
Chỉ số acid
mg KOH/g dầu
9,78
2
Chỉ số xà phòng hóa
mg KOH/g dầu
211,35
3
Chỉ số ester
mg KOH/g dầu
201,57
4
Chỉ số iod
1176
g I2/100 g dầu
5
Chỉ số peroxit
meq/kg
3,89
Bảng 3.13. Các chỉ số chất lƣợng của dầu cá hồi thô
Chỉ số acid của dầu cá hồi (9,78 mg KOH/g dầu) cao hơn dầu cá mòi (1,6 mg
KOH/g dầu), dầu cá hồi (0,1 mg KOH/g dầu) của tác giả Aditi Sharma [111]. Điều
này có thể là do đặc tính vốn có của cá, hoặc do quá trình thu nhận và bảo quản dầu
cá, một số acid béo đã bị thủy phân dƣới tác dụng nhiệt. Hơn nữa dầu cá hồi thu
đƣợc này chƣa qua công đoạn trung hòa acid so với các loại dầu cá đã tinh luyện ở
trên nên có chỉ số acid cao.
Chỉ số xà phòng là số mg KOH cần thiết để trung hòa lƣợng acid béo tự do
cũng nhƣ liên kết có trong 1 g chất béo. So với chỉ số xà phòng hóa của một số dầu
cá khác nhƣ dầu cá mòi (179 mg KOH/g dầu), dầu cá hồi của tác giả Aditi Sharma
[111] thì chỉ số xà phòng của dầu cá hồi trong nghiên cứu này (211,35 mg KOH/g
dầu) cao hơn. Điều này cho phép khẳng định rằng hàm lƣợng acid béo có trong dầu
cá hồi thƣờng cao hơn một số loài cá khác.
3.5.2. Xác định thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi
Dầu cá hồi là một trong những loại dầu cá biển có hàm lƣợng các acid
béo bất bão hòa đa PUFA với hàm lƣợng cao, các acid béo này không những có lợi
cho sức khỏe mà còn phòng ngừa đƣợc một số bệnh. Eicosapentaenoic acid (EPA,
20:5) và docosahexaenoic acid (DHA, 22:6) là hai trong số các omega 3 PUFA có
ảnh hƣởng tốt đến sức khỏe con ngƣời [124]. Hàm lƣợng EPA và DHA trong dầu cá
biển phụ thuộc vào nhiều yếu tố, chẳng hạn nhƣ loài, nguồn gốc, m a đánh bắt và
thức ăn của cá [104]. Thành phần các loại acid béo hiện diện trong dầu cá hồi đƣợc
xác định bằng phƣơng pháp sắc kí khí (GC). Hàm lƣợng của mỗi loại acid béo đƣợc
107
thể hiện trong Bảng 3.14. là hàm lƣợng tổng của cả acid béo ở dạng liên kết và dạng
tự do.
Bảng 3.14. Thành phần và hàm lƣợng acid béo trong dầu cá hồi
Acid béo methyl ester STT % trong mẫu dầu cá Kí hiệu Tên thông thƣờng
1 C14:0 Myristic acid methyl ester 3,23
2 C16:0 Palmitic acid ester 12,17
3 C18:0 Stearic acid methyl ester 2,99
4 C20:0 Arachidic acid methyl ester 0,36
Tổng hàm lượng acid béo no 18,75
5 C16:1 Palmitoleic acid methyl ester 3,22
6 C18:1 Oleic acid methyl ester 40,89
7 C20:1 cis-11-Eicosenoic acid methyl ester 0,99
Tổng hàm lượng acid béo bất bão hòa đơn 45,1
6 C18:2 Linoleic acid methyl ester 16,78
7 C18:3 Linolenic acid methyl ester 6,08
8 C20:2 cis-11,14-Eicosadienoic acid 2,52
9 C20:5 5,1 cis-5,8,11,14,17-Eicosanpentaenoic acid methyl ester (EPA)
12 C22:6 5,66 Cis-4,7,10,13,16,19-Docosanpentaenoic acid methyl ester (DHA)
Tổng hàm lượng acid béo bất bão hòa đa 36,14
Tổng hàm lượng acid béo EPA + DHA 10,76
Kết quả phân tích cho thấy hàm lƣợng acid oleic trong mẫu dầu cá hồi thu
đƣợc có lƣợng acid oleic (C18:1) chiếm cao nhất (40,89%), đây cũng là loại acid
béo chiếm thành phần chủ yếu trong dầu oliu. Các acid béo mạch dài có chủ yếu
trong dầu cá hồi, đặc biệt là hàm lƣợng acid béo bất bão hòa đơn (45,1%) thấp hơn
so với dầu cá hồi theo nghiên cứu của Derya Kahveci (48,2%) [124].
Dầu cá hồi chứa ít acid béo no, phần lớn là các acid béo không no chiếm
81,24%. Thành phần PUFAs trong dầu cá hồi chiếm 36,14%, trong đó 2 acid béo
đặc biệt quan trọng là DHA và EPA lần lƣợt chiếm 5,66% và 5,1%. Giá trị này cao
108
hơn hàm lƣợng DHA (1,46%) và EPA (0,45%) trong dầu cá ba sa theo công bố của
Nguyễn Diên Sanh và cộng sự năm 2006 [8]. Điều này khẳng định dầu cá hồi có
thành phần dinh dƣỡng cao, rất tốt cho sức khỏe.
Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ đã khuyến cáo rằng mỗi ngƣời nên ăn cá ít nhất
hai lần một tuần và những ngƣời mắc bệnh tim mạch đƣợc ghi nhận nên bổ sung
dầu cá 1 g/ngày EPA và DHA [79]. Do đó, việc tìm cách nâng cao hàm lƣợng
DHA, EPA trong dầu cá hồi là cần thiết để sử dụng bổ sung trong các sản phẩm
thực phẩm (sữa, bánh kẹo) và các thực phẩm chức năng khác.
3.5.3. Ứng dụng lipase từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi
3.5.3.1. Khảo sát đặc tính thủy phân của CPL trên cơ chất dầu cá hồi
Tính đặc hiệu cơ chất của lipase liên quan đến việc lipase ƣu tiên chuyển hóa
acid béo chuỗi ngắn, chuỗi trung bình hoặc chuỗi dài và độ bất bão hòa của acid
béo. Lipase chuyển hóa các nhóm acyl có kích thƣớc khác nhau chịu ảnh hƣởng
trực tiếp bởi hình dạng của trung tâm hoạt động của lipase và bản chất của các acid
amin tham gia tạo nên nó [97].
Theo nghiên cứu của Slim Abdelkafi và cộng sự cho biết CPL có khả năng
thủy phân triglyceride chứa acid béo chuỗi dài nhƣ dầu oliu, dầu trioctanoin [17].
Tuy nhiên tính đặc hiệu cơ chất của CPL đối với nhiều loại acid béo khác ít đƣợc
nghiên cứu và công bố.
Để đánh giá xem lipase thô từ mủ đu đủ có tính đặc hiệu nhƣ thế nào đối với
các loại acid béo khác nhau có trong dầu cá hồi, thành phần acid béo của mẫu dầu
cá hồi ban đầu đƣợc so sánh với thành phần acid béo trong phần mẫu dầu cá không
bị thủy phân bởi lipase mủ đu đủ sau khi loại bỏ các acid béo tự do bị thuỷ phân
theo quy trình đƣợc mô tả ở mục 2.4.5.2. Nếu lipase có tính đặc hiệu với acid béo
nào thì hàm lƣợng acid béo đó trong mẫu sau khi thuỷ phân sẽ bị giảm đi so với
mẫu ban đầu.
Kết quả xác định thành phần các acid béo của dầu cá hồi trƣớc khi thủy phân
và phần acylglycerol còn lại sau khi thủy phân bằng sắc ký khí (thực hiện tại Trung
109
tâm Quatest 2) đƣợc thể hiện trên Bảng 3.15.
Bảng 3.15. Phần trăm acid béo c trong dầu cá hồi trƣớc và sau khi thủy phân
Acid béo methyl ester STT % trong phân đoạn dầu không bị thuỷ phân Kí hiệu Tên thông thƣờng % trong mẫu ban đầu
1 C14:0 Myristic acid methyl ester 3,23 2,64
Palmitic acid ester Palmitoleic acid methyl ester Stearic acid methyl ester
2 3 4 5 6 7 8 9 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 Oleic acid methyl ester C18:2 Linoleic acid methyl ester C20:0 Arachidic acid methyl ester C18:3 Linolenic acid methyl ester C20:1 12,17 3,22 2,99 40,89 16,78 0,36 6,08 0,99 10,59 2,96 2,9 40,93 15,96 0 5,83 2,59
10 C20:2 2,52 0,95
11 C20:5 5,1 4,97
12 C22:6 5,66 7,73
13 C20:3 0 0,25
14 C20:3 0 0,83
15 16 cis-11-Eicosenoic acid methyl ester cis-11,14-Eicosadienoic acid methyl ester cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid methyl ester (EPA) Cis-4,7,10,13,16,19- Docosahexaenoic acid methyl ester (DHA) cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid methyl ester cis-11,14,17-Eicosatrienoic acid methyl ester C22:1 Erucic acid methyl ester C20:4 Arachidonic acid methyl ester 0 0 0,32 0,56
Sau khi thủy phân 24 giờ, có sự giảm nhẹ về tỷ lệ các acid béo no nhƣ
myristic, palmitic và stearic trong phần acylglycerol còn lại không thuỷ phân, bên
cạnh đó là sự tăng nhẹ về phần trăm của các acid béo nhƣ eicosatrienoic, erucic và
arachidonic.
Riêng với các acid béo quan trọng nhất trong nghiên cứu là DHA và EPA có
sự thay đổi khác nhau. Trong khi thành phần EPA ít thay đổi, DHA có sự tăng nhẹ.
Tổng phần trăm của 2 acid béo này trong dầu ban đầu là 10,8% và sau khi thuỷ
110
phân là 12,7%. Nhìn chung, tỷ lệ % của các acid béo còn lại trong mẫu triglyceride
không bị thủy phân so với mẫu dầu ban đầu khác nhau không đáng kể. Điều này cho
thấy CPL xúc tác thủy phân không đặc hiệu với các acid béo có trong dầu cá hồi.
Tính chất không đặc hiệu của CPL tƣơng tự nhƣ lipase từ Candida rugosa
khi thủy phân dầu cá ngừ [37]. Với khả năng xúc tác không đặc hiệu với các acid
béo, CPL rất phù hợp để ứng dụng trong quá trình thủy phân thu acid béo, hay bổ
sung trong chất tẩy rửa.
Có nhiều cách khác nhau để làm giàu DHA, EPA từ dầu cá hồi dựa vào
enzyme lipase đặc hiệu hay không đặc hiệu khi thủy phân. Vì CPL không đặc hiệu
đối với DHA, EPA nên sử dụng CPL xúc tác thủy phân dầu cá đƣợc xem nhƣ là
bƣớc đầu của quá trình để giải phóng ra các acid béo từ việc phá vỡ liên kết ester
của các triglyceride trong dầu cá [114]. Vì vậy, việc tối ƣu hóa quá trình thủy phân
dầu cá bởi CPL để tìm các thông số tối ƣu là cần thiết nhằm thu hiệu suất thủy phân
3.5.3.2. Tối ƣu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL
cao nhất.
a. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL
Sử dụng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay Box-Hunter nhƣ mô
tả ở mục 2.4.5.3.a, kết quả thu đƣợc thể hiện ở Bảng 3.16.
Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm
Biến thực Biến mã hoá Hiệu suất (%)
Số thí nghiệm Y X1 X2
111
Nhiệt độ x1 (oC) 40 30 40 30 42 28 35 35 35 35 pH x2 9 9 7 7 8 8 9,4 6,6 8 8 +1 -1 +1 -1 +α -α 0 0 0 0 25,835 35,035 32,860 38,930 32,160 37,675 24,860 36,690 36,895 37,800 +1 +1 -1 -1 0 0 +α -α 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 T1 T2
Kết quả ở Bảng 3.16 cho thấy nhiệt độ tăng thì hiệu suất thủy phân dầu cá bởi CPL tăng, nhƣng nhiệt độ tăng ở 40 oC thì hiệu suất thủy phân thấp nhất
(25,8%) sau 24 giờ. Điều này có thể thấy ở nhiệt độ cao trong thời gian dài có thể
làm biến tính CPL nên làm giảm hiệu suất thủy phân.
Xử lý các số liệu đo đƣợc của hàm Y ở Bảng 3. 16 bằng phần mềm Minitab
18.0 để kiểm tra tính có nghĩa của các hệ số trong phƣơng trình hồi quy theo chuẩn
Student, mức độ tin cậy của từng hệ số trong phƣơng trình hồi qui đƣợc đánh giá
qua giá trị p với mức độ tin cậy 95%, thu đƣợc các kết quả ở Bảng 3.17.
Bảng 3.17. Giá trị các hệ số b trong phƣơng trình hồi quy và xác suất p
Giá trị -221,0 3,86 53,7 -0,16 0,045 -3,225 Xác suất p 0,000* 0,009* 0,005* 0,403 0,233 0,016* Hệ số bo b1 b2 b12 b11 b22
(*) các hệ số có ý nghĩa (p < 0,05)
Bảng 3.17 cho thấy chỉ có các hệ số b0, b1, b2, b22 là có ý nghĩa về mặt thống
kê (p < 0,05). Các hệ số còn lại b11, b12 không tác động đến giá trị của hàm mục tiêu
(p > 0,05). Loại bỏ các hệ số không có nghĩa thu đƣợc phƣơng trình hồi quy thể
2
hiện ảnh hƣởng của các yếu tố nhiệt độ và pH đến hiệu suất thủy phân nhƣ sau:
Y = -221,0 + 3,86x1 + 53,7x2 – 3,225x2
Mức độ phù hợp của phƣơng trình hồi quy đƣợc đánh giá bằng phép kiểm
định “Test of Lack of Fit”. Kết quả thu đƣợc là p = 0,235 lớn hơn nhiều so với mức
ý nghĩa (0,05) cho thấy phƣơng trình hồi quy tƣơng thích với thực tế, khẳng định sự
đúng đắn của mô hình với ý nghĩa thống kê cao.
Hệ số tƣơng quan của mô hình hồi quy R2 = 94,67% cao cũng cho thấy tính
chặt chẽ của mô hình tƣơng quan này. Do đó, phƣơng trình hồi quy này đƣợc sử
112
dụng để tìm điểm tối ƣu.
Hình 3.30. Điều kiện tối ƣu nhiệt độ, pH của phản ứng thủy phân dầu cá
trong hệ nhũ tƣơng dầu – nƣớc.
Thực hiện tối ƣu hóa điều kiện thủy phân dầu cá bởi CPL bằng công cụ tối
ƣu hoá của phần mềm Minitab 18.0, kết quả trên Hình 3.30. cho thấy nhiệt độ tối ƣu là 29 oC và pH tối ƣu là 7,6. Ở điều kiện tối ƣu này CPL thủy phân dầu cá hồi cho
hiệu suất thủy phân cao nhất (39,7%), cao hơn lipase từ R. javanicus, P. solitum
nhƣng thấp hơn so với lipase từ Aspergillus niger với hiệu suất thủy phân dầu cá hồi
đạt 60% [83].
pH tối ƣu khi thủy phân dầu cá hồi của CPL đƣợc xác định là 7,6; giá trị này
cao hơn so pH tối ƣu 7 của lipase từ Babaco (một loại quả thuộc họ đu đủ) theo
công bố của Pierre Villeneuve và cộng sự [31].
b. Xác định tỷ lệ nước/cơ chất và nồng độ enzyme tối ưu cho quá trình thủy phân
dầu cá hồi bằng CPL
Lƣợng nƣớc sử dụng có vai trò rất quan trọng trong phản ứng thủy phân dầu.
Lipase là enzyme có khả năng thủy phân tốt dầu trên bề mặt liên pha dầu – nƣớc. Do đó, ở nhiệt độ tối ƣu là 29 oC và pH tối ƣu là 7,6 vừa tìm đƣợc, tiến hành các thí
nghiệm theo quy hoạch tâm xoay 2 yếu tố với các biến là tỷ lệ nƣớc/cơ chất và nồng
113
độ enzyme. Kết quả xác định hiệu suất thủy phân đƣợc thể hiện trên Bảng 3.18.
Bảng 3.18. Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm
Biến thực Biến mã hoá Hiệu suất (%)
Số thí nghiệm Y X3 X4
Nồng độ enzyme x4 (%) Tỷ lệ nƣớc/ cơ chất x3 (v/w)
1 5 +1 +1 46,4 1,5
2 3 -1 +1 39,0 1,5
3 5 +1 -1 44,0 0,5
4 3 -1 -1 24,8 0,5
5 5,4 +α 0 40,0 1
6 2,6 -α 0 24,0 1
7 4 0 +α 48,0 1,7
8 4 0 -α 24,5 0,3
4 0 0 46,7 1 T1
4 0 0 45,7 1 T2
Xử lý kết quả ở Bảng trên bằng phần mềm Minitab 18.0 thu đƣợc kết quả ở
Bảng 3.19.
Bảng 3.19. Giá trị các hệ số b trong phƣơng trình hồi quy và xác suất p
Giá trị
-125,9
60,0
67,0 -5,9 -5,99 -15,47 Xác suất p 0,000* 0,016* 0,016* 0,248 0,043* 0,131 Hệ số bo b1 b2 b12 b11 b22
(*) các hệ số có ý nghĩa (p < 0,05)
Bảng 3.19 cho thấy chỉ có các hệ số b0, b1, b2, b11 là có ý nghĩa về mặt thống
kê (p < 0,05). Các hệ số còn lại b12, b22 không tác động đến giá trị của hàm mục tiêu
(p > 0,05). Loại bỏ các hệ số không có nghĩa thu đƣợc phƣơng trình hồi quy thể
114
hiện ảnh hƣởng của các yếu tố đến mục tiêu nhƣ sau:
2
Y = -125,9 + 60,0x3 + 67,0x4 – 5,99x3
Đánh giá tính ph hợp của phƣơng trình hồi quy bằng phép kiểm định “Test
of Lack of Fit” cho kết quả p=0,103 lớn hơn nhiều so với mức ý nghĩa (0,05), cho
thấy phƣơng trình hồi quy tƣơng thích với thực tế, khẳng định sự đúng đắn của mô
hình với ý nghĩa thống kê cao.
Hệ số tƣơng quan của mô hình hồi quy R2 = 91,51% cao cũng cho thấy tính
chặt chẽ của mô hình tƣơng quan này. Do đó, phƣơng trình hồi quy này đƣợc sử
dụng để tìm điểm tối ƣu.
Hình 3.31. Điều kiện tối ƣu tỷ lệ nƣớc/cơ chất và nồng độ enzyme của
phản ứng thủy phân dầu cá trong hệ nhũ tƣơng dầu – nƣớc.
Kết quả tối ƣu hóa bằng phần mềm Minitab 18.0 ở Hình 3.31 cho biết ở điều
kiện thủy phân với tỷ lệ nƣớc/cơ chất 4,36 và nồng độ enzyme 1,34% hiệu suất thủy
phân đạt cao nhất 49,4%. Tỷ lệ nƣớc và cơ chất tƣơng ứng là 4,36 giúp enzyme
lipase phân tán tốt vào bề mặt phân pha dầu nƣớc dẫn đến tƣơng tác giữa enzyme và
cơ chất diễn ra tốt hơn nên enzyme hoạt động tốt, do đó hiệu suất thủy phân cao.
c. Thí nghiệm kiểm chứng
Tiến hành thủy phân dầu cá hồi bằng CPL với các điều kiện tối ƣu: nhiệt độ 290C, pH đệm 7,6; tỷ lệ nƣớc/cơ chất 4,36% và nồng độ enzyme 1,34%. Thí nghiệm
đƣợc lặp lại 3 lần cho kết quả hiệu suất thủy phân là 48,2% ± 0,3%.
Kết quả này không khác biệt lớn so với giá trị lý thuyết, nên có thể sử dụng
115
đƣợc các điều kiện tối ƣu tìm đƣợc.
3.5.3.3. Đánh giá hiệu suất thủy phân dầu cá của CPL trong hệ 2 pha iso –
octan/ nƣớc và hệ nhũ tƣơng dầu/nƣớc
Kết quả thủy phân dầu cá ở điều kiện tối ƣu ở trên cho thấy hiệu suất thủy
phân chƣa cao. Nhằm mục đích làm tăng hiệu suất thủy phân, quá trình thủy phân
dầu cá với CPL đƣợc nghiên cứu thực hiện trong hệ 2 pha iso-octan/nƣớc.
Theo nghiên cứu của Aditi Sharma và cộng sự năm 2014, lipase thủy phân
dầu cá tốt nhất khi sử dụng dung môi là iso-octan [114]. Do đó iso-octan đƣợc lựa
chọn làm dung môi sử dụng trong quá trình nghiên cứu này.
Kết quả hiệu suất thủy phân dầu cá bằng CPL trong hệ 2 pha iso-octan/nƣớc
và hệ nhũ tƣơng dầu/nƣớc sau 24 giờ đƣợc thể hiện ở Bảng 3.20.
Bảng 3.20. Hiệu suất thủy phân dầu cá trong các hệ phản ứng khác nhau
Hệ 2 pha Hệ nhũ tƣơng Hệ phản ứng iso-octan/nƣớc dầu/nƣớc
Hiệu suất thủy phân (%) 56,42a 49,84b
Ghi chú: các chữ cái khác nhau trên Bảng 3.20 thể hiện sai khác có ý nghĩa với p
<0,05.
Kết quả cho thấy hiệu suất thủy phân dầu cá trong hệ 2 pha iso-octan/nƣớc
cao hơn so với hệ nhũ tƣơng dầu/nƣớc ở c ng điều kiện thủy phân.
Khi sử dụng iso–octan ở một giới hạn cho phép sẽ làm cho hoạt động của
enzyme diễn ra mạnh mẽ hơn từ đó thúc đẩy phản ứng sinh sản phẩm nhiều hơn.
Iso-octan là dung môi không tan trong nƣớc có vai trò rất quan trọng vì
chúng có thể làm giảm sự ức chế enzyme bởi glycerol và acid béo nhờ khả năng hòa
tan cao các chất không phân cực, lôi kéo các acid béo tự do ra khỏi tâm hoạt động
của enzyme [87]. Theo các nghiên cứu đƣợc báo cáo bởi Puthli và cộng sự; Paez và
cộng sự, cho thấy các dung môi có ích vì nó làm giảm sự ảnh hƣởng độ nhớt của
dầu, gây ra sự cải thiện bề mặt liên pha trong hệ nhũ tƣơng dầu nƣớc [88], [98].
Dung môi có khả năng thâm nhập vào bên trong phức hợp enzyme dầu nƣớc tạo sự
116
ổn định cho hệ. Nếu dung môi có độ phân cực cao sẽ làm giảm hoạt tính enzyme
bằng cách giữ nƣớc dƣ thừa trong vùng lân cận của enzyme.
3.5.3.4. Khảo sát đơn biến các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân dầu cá hồi
bởi CPL trong hệ 2 pha iso-octan/nƣớc
a. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân
Kết quả hiệu suất thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ iso-octan/nƣớc ở
các mẫu có nồng độ enzyme khác nhau đƣợc thể hiện trên Hình 3.32.
)
39
%
37.0a
34.9b
36
33
29.5c
30
( n â h p y ủ h t t ấ u s u ệ i H
26d
27
24
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
Nồng độ enzyme (%)
Hình 3.32. Ảnh hƣởng của nồng enzyme đến hiệu suất thủy phân
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Kết quả khảo sát cho thấy, khi nồng độ enzyme tăng lên từ 1,2 – 1,6% thì
hiệu suất của phản ứng thủy phân đƣợc tăng lên đáng kể và đạt cực đại 37,0% ở
nồng độ enzyme là 1,6%. Điều này cho thấy tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với nồng
độ enzyme. Nhƣng khi tốc độ thủy phân đạt cực đại nếu tăng lƣợng enzyme thì sẽ
có tác dụng ức chế ngƣợc, bởi khi nồng độ enzyme lớn làm cho dung dịch thủy
phân bị đặc lại sẽ gây cản trở enzyme tiếp xúc với cơ chất dẫn đến quá trình thủy
phân diễn ra chậm nên tạo sản phẩm ít hơn.
Do đó để hiệu suất thủy phân lớn nhất, chọn nồng độ enzyme là 1,6%.
b. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân
Bằng cách cố định nồng độ enzyme là 1,6% và các thông số khác, thay đổi tỷ
117
lệ dung môi/cơ chất ở các nồng độ khác nhau. Quá trình thủy phân đƣợc thực hiện
theo phƣơng pháp mô tả ở mục 2.4.5.3.b.2. Kết quả hiệu suất thủy phân đƣợc thể
39
hiện trên đồ thị Hình 3.33.
)
36.6a
%
35.3b
36
32.7c
33
30
27.3d
( n â h p y ủ h t t ấ u s u ệ i H
27
24
0
0.5
1
1.5
2
2.5
Tỷ lệ dung môi/cơ chất (w/w)
Hình 3.33. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Kết quả thu đƣợc trên Hình 3.34 cho thấy với tỷ lệ dung môi iso-octan/cơ
chất là 1 cho hiệu suất thủy phân đạt cao nhất là 36,6%. Điều này cho thấy dung
môi ảnh hƣởng rất lớn đến hoạt động của enzyme do đó ảnh hƣởng đến hiệu suất
của phản ứng thủy phân. Trong giới hạn cho phép, khi tăng lƣợng dung môi iso-
octan sẽ thúc đẩy hoạt động của enzyme diễn ra mạnh hơn do đó hiệu suất thủy
phân tăng. Mặt khác, sản phẩm sau quá trình thủy phân có xu hƣớng hòa tan vào
trong dung môi làm cho sản phẩm ra khỏi enzyme do sự tƣơng tác yếu với enzyme.
Tuy nhiên nếu lƣợng dung môi sử dụng vƣợt mức cần thiết thì có thể gây biến tính
enzyme, từ đó làm giảm hiệu suất của phản ứng.
Bằng cách cố định nồng độ enzyme là 1,6%, tỷ lệ dung môi iso-octan/cơ chất là 1/1, thay đổi nhiệt độ phản ứng từ 30 oC đến 45 oC. Quá trình thủy phân đƣợc
c. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân
thực hiện theo phƣơng pháp mô tả ở mục 2.4.5.3.b.3. Kết quả hiệu suất thủy phân
118
đƣợc thể hiện trên đồ thị Hình 3.34.
39
36.8a
)
%
36
33.8b
32.8c
33
30
26.4d
27
( n â h p y ủ h t t ấ u s u ệ i H
24
25
30
45
50
35 40 Nhiệt độ (oC)
Hình 3.34. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân
(Các chữ cái khác nhau trên đồ thị thể hiện sai khác có ý nghĩa với p<0,05)
Từ kết quả thu đƣợc ta thấy, khi nhiệt độ tăng từ 30 ℃ đến 35 ℃ thì hiệu suất
thủy phân tăng. Điều này cho thấy khi nhiệt độ tăng các phân tử trong hệ dao động
mạnh hơn làm tăng cơ hội va chạm giữa chúng, thúc đẩy sự tiếp xúc giữa enzyme
với cơ chất. Do đó, tốc độ phản ứng thủy phân trong giai đoạn này cũng tăng theo
và đạt giá trị cực đại ở 35 °C. Kết quả này tƣơng đồng với nhiệt độ thủy phân tối ƣu
của enzyme Candida antarctica Lipase B (CAL-B) khi thủy phân dầu cá hồi theo
nghiên cứu của Aditi Sharma và cộng sự [111].
Từ kết quả khảo sát đơn biến các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất của quá
trình thủy phân với các thông số tƣơng ứng: nồng độ enzyme là 1,6%, dung môi
iso-octan/cơ chất là 1, nhiệt độ 35 °C. Các giá trị này đƣợc chọn làm giá trị tại tâm
của quá trình tối ƣu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ hai pha
3.5.3.5. Tối ƣu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ hai pha
iso-octan/nƣớc
iso-octan/nƣớc.
Quá trình tối ƣu hóa 3 yếu tố: nồng độ enzyme, tỷ lệ dung môi/cơ chất, nhiệt độ
đến quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL đƣợc thực hiện theo mô hình phƣơng
119
pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay Box-Hunter nhƣ mô tả ở mục 2.4.5.3.c. Thời
gian thủy phân là 1 giờ, kết quả hiệu suất thủy phân thể hiện ở Bảng 3.21.
Bảng 3.21. Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm
Biến thực Biến mã hoá
Hiệu suất (%)
Số thí nghiệm
Y X3 X1 X2
Tỷ lệ dung môi/cơ chất (x2) Nhiệt độ (x3)
1 Nồng độ enzyme (x1) 1,8 30,8 -1 +1 +1 1,5 30
2 32,4 0 0 +α 1,6 1,84 35
3 27,5 -1 -1 +1 1,4 1,5 30
4 25,9 -α 0 0 1,6 1 26,6
5 31,3 +1 -1 +1 1,4 1,5 40
6 31,9 0 +α 0 1,94 1 35
7 33,4 +1 +1 -1 1,8 0,5 40
8 26,4 -1 -1 -1 1,4 0,5 30
9 31,9 +1 -1 -1 1,4 0,5 40
10 27,1 0 -α 0 1,26 1 35
11 32,0 +α 0 0 1,6 1 43,4
12 33,1 +1 +1 +1 1,8 1,5 40
13 33,9 -1 +1 -1 1,8 0,5 30
14 30,4 0 0 -α 1,6 0,16 35
35,0 0 0 0 1,6 1 35 T1
35,5 0 0 0 1,6 1 35 T2
T3 36,1 0 0 0 1,6 1 35
Xử lý các số liệu đo đƣợc của hàm Y ở Bảng trên bằng phần mềm Minitab
18.0 để kiểm tra tính có nghĩa của các hệ số trong phƣơng trình hồi quy theo chuẩn
Student, mức độ tin cậy của từng hệ số trong phƣơng trình hồi quy đƣợc đánh giá
120
qua giá trị p với mức độ tin cậy 95%, thu đƣợc các kết quả ở Bảng 3.22.
Bảng 3.22. Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm
Giá trị Hệ số
-265,4
189,2
15,2
7,42 Xác suất p 0,000* 0,003* 0,931 0,004*
-4,87 0,352
-0,937 0,097
0,055
-44,8
-4,62 bo b1 b2 b3 b12 b13 b23 b11 b22
-0,081 0,787 0,003* 0,027* 0,002* b33
(*) các nhân tố có ý nghĩa (p < 0,05)
Bảng 3.22 cho thấy chỉ có các hệ số b0, b1, b3, b11, b22, b33 là có ý nghĩa về mặt
thống kê (p < 0,05). Các hệ số còn lại b2, b12, b13, b23 không tác động đến giá trị của
hàm mục tiêu (p > 0,05). Loại bỏ các hệ số không có nghĩa thì thu đƣợc phƣơng
2
trình hồi quy thể hiện ảnh hƣởng của các yếu tố đến hàm mục tiêu nhƣ sau:
2 – 4,62x2
2 -0,081x3
Y = -265,4+ 189,2x1 + 7,42x3 – 44,8x1
Tiếp tục đánh giá tính ph hợp của phƣơng trình hồi quy dựa trên xác suất p
thu đƣợc của mức độ phù hợp với mô hình thí nghiệm bằng phép kiểm định Lack of
Fit. Kết quả thu đƣợc là p = 0,109 lớn hơn nhiều so với mức ý nghĩa (0,05) cho thấy
phƣơng trình hồi quy tƣơng thích với thực tế, khẳng định sự đúng đắn của mô hình
với ý nghĩa thống kê cao.
Hệ số tƣơng quan của mô hình hồi quy R2 = 91,48% cao cũng cho thấy tƣơng
quan chặt chẽ có đƣợc trong mô hình này. Do đó, phƣơng trình hồi quy này đƣợc sử
dụng để tìm điểm tối ƣu.
Điều kiện tối ƣu của phản ứng thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ 2 pha
iso – octan/nƣớc đƣợc xác định bằng phần mềm Minitab 18 và đƣợc biểu diễn ở
121
Hình 3.35.
Hình 3.35. Điều kiện tối ƣu của phản ứng thủy phân dầu cá
trong hệ 2 pha iso - octan/nƣớc
Kết quả Hình 3.35 cho thấy điều kiện thủy phân tối ƣu thu đƣợc ở nồng độ
enzyme là 1,68% tƣơng ứng với 84 mg enzyme cho 1g dầu cá hồi, tỷ lệ dung môi/cơ chất là 0,97 và nhiệt độ là 36,4oC. Hiệu suất thủy phân đạt 35,98% ở điều
kiện tối ƣu sau khoảng thời gian 1 giờ.
Nghiên cứu của một số tác giả cho thấy lipase cố định có hoạt tính tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40 oC. Nhiệt độ tối ƣu của CPL khi thủy phân dầu cá hồi trong hệ 2 pha iso-octan/ nƣớc là 36,4 oC. Kết quả này tƣơng đồng với nhiệt độ tối ƣu 37 oC
của lipase cố định từ Candida theo báo cáo của Pizarro và cộng sự [96].
* Thí nghiệm kiểm chứng điều kiện tối ƣu
Để kiểm tra tính tƣơng thích của kết quả phƣơng trình hồi quy đối với thực
nghiệm, thí nghiệm thủy phân dầu cá hồi với xúc tác CPL trong hệ 2 pha iso -
octan/nƣớc đƣợc thực hiện lại trong 1 giờ với các điều kiện tối ƣu đã xác định đƣợc
ở trên. Kết quả xác định đƣợc hiệu suất thủy phân là 35,6%. Kết quả thực nghiệm
3.5.3.6. Xác định các thông số động học của quá trình thủy phân dầu cá hồi
bởi CPL trong hệ 2 pha iso octan-nƣớc
này phù hợp với hiệu suất tối ƣu thu đƣợc từ mô hình.
a. Xác định Km và Vmax
122
Tốc độ ban đầu của phản ứng thủy phân dầu cá (VM) đƣợc xác định bằng
cách vẽ đồ thị giữa lƣợng acid béo tự do tạo thành phản ứng theo thời gian. Nồng
độ acid béo tạo thành ở các khoảng thời gian khác nhau từ 15 phút, 30 phút, 45
phút và 60 phút ở 4 nồng độ cơ chất [S] khác nhau 540,25; 921,94; 1207,30;
1428,36 (µmol FAs liên kết/ml) tƣơng ứng với lƣợng dầu cá hồi sử dụng là 1g; 2g;
3g; 4g đƣợc thể hiện ở Hình 3.36.
l
[S1]
[S2]
[S3]
[S4]
Linear ([S1])
Linear ([S2])
Linear ([S3])
Linear ([S4])
250
) l
R² = 0.9901
R² = 0.99
200
R² = 0.9958
m / s A F F
150
R² = 0.9831
100
o m µ ( h n à h t o ạ t s A F F ộ đ g n ồ N
50
0
0
15
30
45
60
75
Thời gian (phút)
Hình 3.36. Biểu đồ thể hiện sự thay đổi tốc độ phản ứng theo thời gian trong
thủy phân dầu cá hồi bằng CPL.
Kết quả Hình 3.36 cho thấy nồng độ sản phẩm tạo thành tỷ lệ tuyến tính với
thời gian, từ đây có thể kết luận rằng phản ứng thủy phân dầu cá hồi bởi enzyme CPL
là phản ứng bậc một. Các giá trị tốc độ ban đầu của phản ứng thủy phân tƣơng ứng
với nồng độ cơ chất khác nhau theo thời gian 1 giờ đƣợc thể hiện trên Bảng 3.23.
Bảng 3.23. Tốc độ ban đầu phản ứng thu đƣợc ở các nồng độ cơ chất khác
nhau trong thủy phân dầu cá hồi bằng CPL trong thời gian 60 phút
Tốc độ ban đầu VM (µmol FFAs/phút.ml) 1/VM (µmol FFAs/phút.ml)-1 Nồng độ cơ chất (µmol FAs liên kết/ml)
123
2,86 3,33 3,55 3,74 1/[S] (µmol FAs liên kết/ml)-1 0,0019 0,0011 0,0008 0,0007 0,350 0,300 0,282 0,267 [S1] = 540,25 [S2] = 921,94 [S3] = 1207,30 [S4] = 1428,36
Từ các số liệu ở Bảng 3.23, vẽ đồ thị liên hệ giữa 1/VM và 1/[S]. Kết quả thể
0.37
hiện ở Hình 3. 37.
1 - ) l
m
0.35
y = 66.056x + 0.2254 R² = 0.9897
0.33
. t ú h p
0.31
/ s A F F
0.29
0.27
l o m µ ( M v / 1
0.25
0.0005
0.0009
0.0017
0.0021
0.0013 1/[S] (µmol FFAs/ml)-1
Hình 3.37. Biểu đồ Lineweaver-Burk thủy phân dầu cá bằng CPL
Phƣơng trình tƣơng ứng với y = 66,056x + 0,2254. Xác
định đƣợc các giá trị Vmax là 4,44 µmol FFAs/phút.ml tƣơng ứng với 266,4 µmol
FFAs/giờ.ml và hằng số Michaelis-Menten Km là 293,3 µmol FAs/ml.
So sánh với kết quả của Aditi Sharma khi thủy phân dầu cá hồi bằng chế
phẩm enzyme Candida antarctica Lipase B (CAL-B) từ vi sinh vật có Vmax là
333,3 (µmol FFAs/giờ.ml) và Km là 25,0 (µmol FFAs/ml) cho thấy rằng mặc dù giá
trị Vmax của phản ứng thủy phân dầu cá hồi bằng CPL nhỏ hơn nhƣng đối với một
enzyme thô từ thực vật thì kết quả này đã là rất cao. Km của CPL trong phản ứng
thủy phân dầu cá hồi cao hơn nên ái lực của enzyme này với cơ chất dầu cá hồi thấp
hơn so với CAL-B [111].
b. Xác định năng lượng hoạt hóa EA
Năng lƣợng hoạt hóa (EA) của phản ứng thủy phân dầu cá hồi bằng CPL đã
đƣợc xác định dựa trên phƣơng trình Arrhenius đƣợc mô tả theo mục 2.5.13.
Ảnh hƣởng của sự thay đổi nhiệt độ đối với quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi
CPL đã đƣợc nghiên cứu ở ba giá trị nhiệt độ khác nhau là 30 ºC, 35 ºC, và 40 ºC.
124
Kết quả đƣợc thể hiện trong Bảng 3.24.
Bảng 3.24. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hằng số tốc độ (k)
ln k Nhiệt độ T (K) Hằng số tốc độ k (µmol FFAs/ml) 1/T (K-1)
303 0,232 0,00330 -1,46
308 0,317 0,00325 -1,15
313 0,399 0.00319 -0,92
Tốc độ của phản ứng tăng lên khi nhiệt độ tăng lên đến giới hạn nhất định, tạo
điều kiện cho sự va chạm nhiều hơn giữa các chất phản ứng và enzyme. Dạng tuyến
tính của phƣơng trình Arrhenius đƣợc sử dụng để tính toán giá trị của năng lƣợng
hoạt hóa.
Sử dụng các giá trị ở Bảng 3.24, vẽ đồ thị thể hiện mối liên hệ giữa lnk và 1/T.
Kết quả thể hiện trên Hình 3.38, dựa vào phƣơng trình đồ thị để tính năng lƣợng
-0.8
0.00315
0.0032
0.00325
0.0033
0.00335
-1
hoạt hóa EA.
k n
l
-1.2
y = -4873.6x + 14.646 R² = 0.9811
-1.4
-1.6
1/T (K-1)
Hình 3.38. Đồ thị Arrhenius thủy phân dầu cá bằng CPL
Phƣơng trình tƣơng ứng với y = -4873,6x + 14,646
Từ đây, năng lƣợng hoạt hóa đƣợc xác định EA = 40,5 kJ/mol. Một phản ứng có
năng lƣợng hoạt hóa càng nhỏ thì tốc độ phản ứng càng lớn.
So sánh với kết quả của Aditi Sharma khi thủy phân dầu cá hồi bằng chế phẩm
enzyme Candida antarctica Lipase B (CAL-B) từ vi sinh vật EA = 16,1 kJ/mol thì
125
thấy rằng EA của phản ứng thủy phân xúc tác bởi CPL lớn hơn. Điều này cho thấy
rằng quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL có tốc độ phản ứng chậm hơn so với
xúc tác bằng CAL-B. Nguyên nhân có thể là do chế phẩm CPL ở dạng thô và là
3.5.3.7. Ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá
trong hệ 2 pha iso-octan/nƣớc ở điều kiện tối ƣu
enzyme cố định, trong khi lipase vi sinh vật đƣợc so sánh là lipase tinh sạch.
Hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL trong hệ 2 pha iso-
octan/nƣớc ở điều kiện tối ƣu đƣợc xác định theo thời gian thể hiện trên Hình 3.39.
)
80
%
70
64b
63.9c
63.9a
57d
60
( t ấ u s u ệ i H
50
40
30
20
10
e
0
0
24
96
120
72 48 Thời gian (giờ)
Hình 3.39. Biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất của
quá trình thủy phân
Từ đồ thị cho thấy, hiệu suất phản ứng thủy phân dầu cá hồi xúc tác bởi CPL
ở chế độ thủy phân đã chọn tăng dần theo thời gian.
Hiệu suất thủy phân tăng nhanh trong 24 giờ đầu lên đến 57%, và đạt 63,9%
sau 48 giờ. Sau khoảng thời gian này thì hiệu suất thủy phân tăng rất ít và gần nhƣ
không đổi. Nguyên nhân có thể do hệ phản ứng đã đạt trạng thái cân bằng.
Vì vậy quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ iso –octan không cần
126
kéo dài quá 48 giờ.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
A. KẾT LUẬN
Công trình "Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và
khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm" đã thu đƣợc những kết quả
chính sau:
1/ Đã thu nhận đƣợc lipase thô từ một số nguồn nguyên liệu thực vật ở Việt
Nam, gồm đậu nành nảy mầm, cám gạo, phôi lúa mì, mủ sung, mủ vả và xác định
đƣợc điều kiện hoạt động tối ƣu của chúng trên cơ chất p-NPP, trong đó lipase từ mủ đu đủ có nhiệt độ tối ƣu 45 oC, pH tối ƣu khoảng 8-9. Kết quả so sánh hoạt độ
lipase từ các nguồn nguyên liệu thực vật đƣợc khảo sát ở điều kiện hoạt động tối ƣu
của chúng cho thấy lipase từ mủ đu đủ có hoạt độ cao nhất, có tiềm năng nhất để
khai thác ở quy mô công nghiệp.
2/ Đã xây dựng đƣợc quy trình công nghệ sản xuất lipase thô từ mủ đu đủ
(CPL). Sản phẩm thu đƣợc có độ ẩm 9,13%, hoạt độ riêng 120,349 mU/g, có khả
năng thủy phân dầu cá hồi tốt hơn so với dầu đậu nành, triolein, tristearin.
3/ Lần đầu tiên, lipase từ mủ đu đã đƣợc chiết tách bằng cách sử dụng dung
dịch đệm Tris – HCl chứa SLS 0,5%. Bƣớc đầu phân lập đƣợc một phân đoạn chứa
2 loại lipase có khối lƣợng phân tử khoảng 35 – 55 kDa. Các thông số động học Km
và Vmax của phân đoạn lipase này trên cơ chất p –NPP đƣợc xác định lần lƣợt là 1,22mM và 1,2.10-6 mM.min-1.ml-1
4/ Kết quả phân tích thành phần acid béo của dầu cá hồi trƣớc và sau khi
thuỷ phân bằng sắc ký khí cho thấy CPL thủy phân không đặc hiệu các acid béo có
trong dầu cá hồi.
5/ Điều kiện tối ƣu của quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ nhũ tƣơng dầu/ nƣớc đã đƣợc xác định là 290C, pH 7,6, tỷ lệ lƣợng nƣớc/cơ chất 4,36,
nồng độ enzyme 1,34%, khi đó hiệu suất thủy phân tối ƣu đạt 49,4% sau 24 giờ.
Điều kiện tối ƣu của quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ 2 pha iso- octan/nƣớc đã đƣợc xác định là 36,4 oC, nồng độ enzyme 1,68%, tỷ lệ dung môi/ cơ
127
chất 0,97, khi đó hiệu suất thủy phân tối ƣu đạt 57% sau 24 giờ.
6/ Các thông số động học Km, Vmax và năng lƣợng hoạt hóa của quá trình
thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ 2 pha iso-octan/nƣớc đã đƣợc xác định lần
lƣợt là 15,8mol FFAs/ml, 270,6mol FFAs/h.ml và 40,5 kJ/mol.
B. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Các kết quả nghiên cứu của luận án đã đƣợc xác định có những đóng góp
cho khoa học về mặt học thuật và thực tiễn nhƣ sau:
- Đã chiết đƣợc phần lớn lipase ra khỏi cấu trúc mủ đu đủ nhờ vào 3 điểm cải
tiến so với các quy trình trƣớc đây đƣợc công bố: tiến hành đông khô nhanh mủ đu
đủ, không sử dụng dung môi hữu cơ để loại lipid và sử dụng chất hoạt động bề mặt
SLS 0,5% để chiết tách lipase. Qua đó, đã phân lập đƣợc 2 thành phần lipase từ mủ
đu đủ có khối lƣợng phân tử trong khoảng 35 – 55kDa.
- Đã xác định đƣợc enzyme lipase từ mủ đu đủ không có tính đặc hiệu với
các acid béo có trong dầu cá hồi. Các thông số tối ƣu cho quá trình thuỷ phân dầu cá
hồi trong hệ nhũ tƣơng dầu nƣớc và hệ hai pha với iso-octan đã đƣợc xác định, mở
ra khả năng ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ trong quy trình làm giàu DHA và EPA
từ dầu cá hồi nói riêng và các loại dầu cá khác nói chung.
C. KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1/ Nghiên cứu thu nhận lipase từ các nguồn nguyên liệu thực vật khác có sẵn ở Việt
Nam.
2/ Nghiên cứu ứng dụng lipase từ mủ đu đủ trong các phản ứng ester hóa, phản ứng
128
chuyển ester.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ
1. Phan Thị Việt Hà, Đặng Minh Nhật, Trần Châu Cẩm Hằng (2015), “Nghiên
cứu động thái sinh tổng hợp lipase của hạt đậu nành trong quá trình nảy
mầm và một số đặc tính của loại enzyme này”, Hội thảo khoa học quản lý
chất lƣợng & An toàn thực phẩm, ISBN 987-604-913-415-9, pp. 17 – 23.
2. Phan Thị Việt Hà, Đặng Minh Nhật, Trần Thị Xô, Phan Thị Luyến (2015),
“Nghiên cứu thu nhận và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase
từ mủ đu đủ”, Tạp chí Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt
Nam, 53 (6e1,2), p.291-294.
3. Phan Thị Việt Hà, Đặng Minh Nhật, Trần Thị Bích Hà (2016), “Nghiên cứu
thu nhận và khảo sát đặc tính lipase từ mủ đu đủ (carica papaya latex)”,
Tạp chí khoa học và công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 108 (11), pp. 82-85.
4. Phan Thị Việt Hà, Huỳnh Thị Tuyết Mai, Đặng Minh Nhật, Trần Thị Xô
(2017), “Nghiên cứu chiết tách và khảo sát đặc tính của lipase từ hạt đậu
phộng nảy mầm”, Tạp chí Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ
Việt Nam, (4E23), pp. 118-223.
5. Dang Minh Nhat, Phan Thi Viet Ha (2019), “The isolation and
characterization of lipase from carica papaya latex using zwitterion sodium
lauroyl sarcosinate as agent”, Potravinarstvo Slovak Journal of Food
Sciences, 13 (1), pp. 773-778.
6. Phan Thị Việt Hà, Huỳnh Thị Phƣơng Thu, Đặng Minh Nhật (2020), Tối ưu
hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng lipase từ mủ đu đủ, Tạp chí khoa
129
học và công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 18 (1), pp. 55-59.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
[1] Đinh Thị Vĩnh Hà, Nguyễn Văn Mã (2008), “Sự biến đổi hoạt độ enzim
protease, lipase và amylase của hạt đậu tƣơng nảy mầm trong điệu kiện thiếu
nƣớc”, Tạp chí khoa học và công nghệ, 46 (6), pp. 51-58.
[2] Trần Đăng Khoa, Lê Quang Huy, Ngô Đại Nghiệp (2011), “Sàng lọc, thu nhận
và khảo sát hoạt tính lipase từ Bacillus,” Science Technology Development, 14
(3), pp. 64–72.
[3] Trần Thị Bé Lan, Nguyễn Phƣơng Phi, Phan Ngọc Hòa (2012), “Nghiên cứu
enzyme lipase từ Candida Rugosa và Porcine Pancreas xúc tác phản ứng
Transester hóa dầu dừa,” Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 23b, pp.
105–114.
[4] Trần Thị Bé Lan, Nguyễn Minh Nam, Tạ Thị Thanh Thúy, Phan Ngọc Hòa
(2012), “So sánh một số tính chất của chế phẩm enzyme lipase từ Candida
rugosa và Porcine pancreas,” Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 22b,
pp. 210–220.
[5] Đào Thị Mỹ Linh, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Trần Thị Mỹ Thảo, Lý Thị Diễm
Trang, Lê Thị Mỹ Trinh, Võ Thị Thúy Vân (2019), “Tối ƣu quá trình nuôi cấy
nấm mốc Aspergillus niger thu nhận enzyme lipase và ứng dụng trong tiền xử
lý nƣớc thải sữa tổng hợp”, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 55 (1),
pp. 277–285.
[6] Nguyễn Đức Lƣợng (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia
Thành Phố Hồ Chí Minh.
[7] Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành Hóa sinh học, Nhà xuất bản đại học quốc
gia Hà Nội, 2001.
[8] Nguyễn Diên Sanh (2006), Nghiên cứu làm giàu DHA (Docosahexaenoic acid)
trong dầu, mỡ cá ba sa (Pangasius Bocourti) thô bằng phương pháp enzym và
chưng cất phân đoạn, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học
130
Quốc gia TP. HCM.
[9] Nguyễn Phú Thọ, Dƣơng Thị Hƣơng Giang (2011), “Nghiên cứu quy trình điều
chế bột enzyme papain thô từ nhựa đu đủ”, Tạp chí khoa học Trường Đại học
Cần Thơ, 17b, pp. 158–166.
[10] Đặng Thị Thu (2004), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất một số loại dầu béo
bằng lipaza,” Đề tài cấp nhà nƣớc, Hà Nội.
[11] Vƣơng Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lƣu Duẩn (2013), “Tính chất động học và
đặc điểm thủy phân của lipase tinh sạch từ gan tụy cá tra (Pangasius)”, Tạp chí
phát triển KH & CN, 16 (K4), pp. 85–91.
[12] Trần Thanh Trúc, Nguyễn Văn Mƣời (2019), “Nghiên cứu trích ly lipase (EC
3.1.1.3) từ nội tạng cá lóc nuôi”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ,
55 (2), pp. 174–184.
[13] TCVN 6127 : 2010 (ISO 660:2009), Dầu mỡ động vật và thực vật - Xác định
chỉ số axit và độ axit, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lƣờng - Chất lƣợng đề nghị. Bộ
Khoa học, Công nghệ và Môi trƣờng ban hành, 2010.
[14] TCVN 6126:2015 (ISO 3657:2013), Dầu mỡ động vật và thực vật – xác định
chỉ số xà phòng hóa,. Bộ Khoa học và Công nghệ công bố, 2015.
[15] TCVN 6122:2010 (ISO 3961:2009), “Dầu mỡ động vật và thực vật – xác
định trị số iot, Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật
và thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng thẩm định,
Bộ Khoa học và Công nghệ công bố,” 2010.
Tiếng Anh
[16] Abdelkafi S, Ogata H, Barouh N, Fouquet B, Lebrun R, Pina M,
Scheirlinckx F, Villeneuve P, Carrière F. (2009), “Identification and
biochemical characterization of a GDSL-motif carboxylester hydrolase from
Carica papaya latex,” Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids, 1791
(11), pp. 1048–1056.
[17] Abdelkafi S, Barouh N, Fouquet B, Fendri I, Pina M, Scheirlinckx F,
Villeneuve P, Carrière F. (2011), “Carica papaya Lipase: A Naturally
131
Immobilized Enzyme with Interesting Biochemical Properties,” Plant Foods for
Human Nutrition, 66 (1), pp. 34–40.
[18] Alvarado, G. C, Miranda, R. T (2013), “Recent advances and applications of
B: Enzymatic, 90, pp. 49–60.
the lipolytic activity of Carica papaya latex”, Journal of Molecular Catalysis
[19] AOAC Offical method 996.06 (2001), AOAC fat (Total, Saturated and
unsaturated) in foods, hydrolytic extraction Gas Chromatographic Method, 18
edition.
[20] AOAC Official Methods of Analysis of the Association of Official
Analytical Chemists (AOAC) (1990).
[21] Aref, H. L, Mosbah, H, Fekih, A., Kenani A. (2014), “Purification and
biochemical characterization of lipase from Tunisian Euphorbia peplus latex”,
JAOCS, J. Am. Oil Chem. Soc., 91 (6), pp. 943–951.
[22] Aref, H. L, Mosbah, H, Fekih, A., Said, K. (2012), “Purification and
biochemical characterization of lipase from Ficus carica latex of tunisian east
coast zidi variety”, JAOCS, J. Am. Oil Chem. Soc., 89 (10), pp. 1847–1855,
2012.
[23] Avelar, M. H. M, Cassimiro, D.M.J, Santos, K. C., Domingues, R. C. C.,
Castro, H. F. De, Mendes A. A. (2013), “Hydrolysis of vegetable oils catalyzed
by lipase extract powder from dormant castor bean seeds”, Ind. Crops Prod.,
(44), pp. 452–458.
[24] Avramiuc, M. (2016), “Research Regarding Lipase Activity From Some
Plant Species Under the Influence of Some External Factors”, Sci. Pap. Sci. Ser.
Lucr. Ştiinţifice - Ser. Zooteh., vol. 65, pp. 223–229.
[25] Barros, M., Fleuri, L. F., MacEdo, G. A. (2010), “Seed lipases: Sources,
applications and properties - A review”, Brazilian J. Chem. Eng., 27 (1), pp.
15–29.
[26] Beisson, F., Tiss, A., Rivière, C., Verger, R. (2000), “Methods for lipase
detection and assay: a critical review”, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 102 (2), pp.
132
133–153.
[27] Bora, L., Kalita, M. (2012), “Production and Optimization of Thermostable
lipase from a Thermophilic Bacillus sp LBN 4”, Internet J. Microbiol., 4 (1), pp.
4–9.
[28] Borek, S., Ratajczak, W., Ratajczak, L. (2006), “Ultrastructural and
enzymatic research on the role of sucrose in mobilization of storage lipids in
germinating yellow lupine seeds,” Plant Sci., 170 (3), pp. 441–452.
[29] Boyer, B., Hambardzoumian, A., Roque, J. P., Beylerian, N. (2000),
“Reaction in biphasic water/organic solvent system in the presence of
surfactant: Inverse phase transfer catalysis versus interfacial catalysis”,
Tetrahedron, 56 (2), pp. 303–307.
[30] Breivik, H. (2007), Long-chain omega-3 specialty oils, Neperdo Biomarine,
Porsgrunn, Norway: Woodhead Publishing in Food Science, Technology and
Nutrition.
[31] Cambon E, Gouzou F, Pina M, Barea B, Barouh N, Lago R, Ruales J, Tsai
SW, Villeneuve P (2006), “Comparison of the lipase activity in hydrolysis and
acyl transfer reactions of two latex plant extracts from babaco (Vasconcellea x
Heilbornii Cv.) and Plumeria rubra: Effect of the aqueous microenvironment”,
J. Agric. Food Chem., 54 (7), pp. 2726–2731.
[32] Campos, P. R. B., Fregolente, L. V (2009), “Enzymatic Hydrolysis of
Salmon Oil by Native Lipases: Optimization of Process Parameters”, J. Braz.
Chem. Soc., 20 (1), pp. 117–124.
[33] Caro Y., Villeneuve P., Pina M., Reynes, M., Graille, J. (2000), “Lipase
activity and fatty acid typoselectivities of plant extracts in hydrolysis and
interesterification”, JAOCS, J. Am. Oil Chem. Soc., 77 (4), pp. 349–354.
[34] Carvalho, A. C. L. D. M. et al. (2015), “Recent advances in lipase-mediated
preparation of pharmaceuticals and their intermediates,” Int. J. Mol. Sci., 16
(12), pp. 29682–29716.
[35] Celligoi, M. A. P. C., Baldo, C., Melo, M. R. D, Gasparin, F. G. M.,
133
Marques, T. A., Barros, M. D (2017), “Lipase properties, functions and food
applications,” Microb. Enzym. Technol. Food Appl., 12, pp. 214–240.
[36] Chaurasia, Sharma, A. (2013), Lipase Catalyzed Synthesis of DHA Rich
Triglycerides from Fish Oils by Selective Hydrolysis and Esterification,
Banasthali Univesity.
[37] Chaurasia, S. P., Bhandari, K., Sharma, A., Dalai, A. K. (2016), “A Review
on Lipase Catalysed Synthesis of DHA Rich Glyceride from Fish Oils”, Int. J.
Res. Sci. Innov., 3, pp. 3-19.
[38] Daiha et al (2015), “Are Lipases Still Important Biocatalysts? A Study of
Scientific Publications and Patents for Technological Forecasting”, PloS One,
10(6): e0131624.
[39] Darvishi, I., Destain, F., Nahvi, J. (2012), “Effect of additives on freeze-
drying and storage of Yarrowia lipolytica Lipase,” Appl. Biochem. Biotechnol,
68, pp. 1101–1107.
[40] Dhouib, R. et al. (2011), “Identification of a putative triacylglycerol lipase
from papaya latex by functional proteomics”, FEBS J., 278 (1), pp. 97–110.
[41] Diaz, J. C. M., et al. (2006), “Lipase from the thermotolerant fungus
Rhizopus homothallicus is more thermostable when produced using solid state
fermentation than liquid fermentation procedures”, Enzyme Microb. Technol.,
39 (5), pp. 1042–1050.
[42] Donato, J. S., et al. (2008), “Produção de Ácidos Graxos Catalisada por
Lipases não Purificadas de Sementes ou Frutos Vegetais para Subseqüente
Esterificação por Catálise Ácida,” PI, 7A, p. 603824.
[43] Ejedegba, B. O., Onyeneke, E. C., Oviasogie, P. O. (2007), “Characteristics
of lipase isolated from coconut ( Cocos nucifera linn) seed under different
nutrient treatments”, African Journal of Biotechnology, 6(6), pp. 723–727.
[44] Ellie, W., Rolfes, S.R. (2008), Understanding Nutrition, Thomson Wa.
California.
[45] Enujiugha, V. N., Thani, F. A., Sanni, T. M., Abigor, R. D. (2004), “Lipase
134
activity in dormant seeds of the African oil bean (Pentaclethra macrophylla
Benth)”, Food Chem., 88 (3), pp. 405–410.
[46] Enujiugha, V. N. (2009), “Isolation and preliminary characterization of
conophor nut ( Tetracarpidium conophorum ) lipase,” African J. Biochem. Res.,
3, pp. 9–12.
[47] Eze, S. O. O., Ezema, B. O. (2012), “Purification and characterization of
lipase (EC-3.1.1.3) from the seeds of cucumeropsis manni (white melon)”, Thai
J. Agric. Sci., 45 (2), pp. 115–120.
[48] Ezema, B. O. (2012), Purification and characterization of lipase (
ec.3.1.1.3 ) from the seeds of cucumeropsis mannii (white melon), Department
of Biochemistry, University of Nigeria, Nsukka.
[49] Fernández, V. G, Brieva, R., Gotor, V. (2006), “Lipases: Useful biocatalysts
for the preparation of pharmaceuticals”, J. Mol. Catal. B Enzym., 40 (3), pp.
111–120.
[50] Foglia, T. A. (1997), “Carica papaya latex-catalyzed synthesis of structured
triacylglycerols”, J. Am. Oil Chem. Soc., 74 (11), pp. 1447–1450.
[51] Freire, F. L., Castilho G. D. M. (2008), “Enzimas em biotecnologia:
Produção, Aplicação e Mercado”, Rio Janeiro Interciência.
[52] Fukuda, H., Kondo, A., Noda, H. (2001), “Biodiesel fuel production by
transesterification of oils”, J. Biosci. Bioeng., 92 (5), pp. 405–416.
[53] Gandhi, N. G. (1997), “Applications of lipase”, J. Am. Oil Chem. Soc., 74(6),
pp. 621–634.
[54] Gandhi, N. N., Mukherjee, K. D. (2001), “Reactivity of medium-chain
substrates in the interesterification of tripalmitin catalyzed by papaya lipase”,
JAOCS, J. Am. Oil Chem. Soc., 78 (9), pp. 965–968.
[55] Ghori, M.I., Iqbal, M.J, Hameed, A. (2011), “Characterization of a novel lipase from
bacillus sp. isolated from tannery wastes”, pp. 22–29.
[56] Guerrand, D. (2017), “Lipases industrial applications: Focus on food and
agroindustries”, OCL - Oilseeds fats, Crop. Lipids, 24 (4), pp. 1–7.
135
[57] Gururaj, P., Ramalingam, S., Devi, G. N, Gautam, P. (2016), “Process
optimization for production and purification of a thermostable, organic solvent
tolerant lipase from Acinetobacter sp. AU07”, Brazilian J. Microbiol., 47 (3),
pp. 647–657.
[58] Hunter, T. N., Pugh, R. J., Franks, G. V., Jameson, G. J. (2008), “The role of
particles in stabilising foams and emulsions,” Adv. Colloid Interface Sci., 137
(2) no. 2, pp. 57–81.
[59] Isbilir, S. S., Ozcan, H. M., Yagar, H. (2008), “Some biochemical properties
of lipase from bay laurel (Laurus nobilis L.) seeds,” JAOCS, J. Am. Oil Chem.
Soc., vol. 85, no. 3, pp. 227–233.
[60] Jaeger, K.-E., Dijkstra, B. W., Reetz, M. T. (1999), “Bacterial Biocatalysts:
Molecular Biology, Three-Dimensional Structures, and Biotechnological
Applications of Lipases,” Annu. Rev. Microbiol., 53 (1), pp. 315–351.
[61] Jaeger, K. E., Eggert T. (2002), “Lipases for biotechnology,” Curr. Opin.
Biotechnol., 13 (4), pp. 390–397.
[62] Janani, P., Sudharsana, J., Ravikumar, R. (2013), “Performance of Aqueous
Two Phase System for the Extraction of Lipase from”, Res. J. Pharm. Biol.
Chem. Sci., 4 (3), pp. 754–760.
[63] Joseph, B., Ramteke, P. W., Kumar, P. A. (2006), “Studies on the enhanced
production of extracellular lipase by Staphylococcus epidermidis,” J. Gen.
Appl. Microbiol., 52 (6), pp. 315–320.
[64] Jung, H., Moon, S. (2013), “Purification , Distribution , and Characterization
Activity of Lipase from Oat Seeds ( Avena sativa L .)”, Journal of the Korean
Society for Applied Biological Chemistry, 56, pp. 639–645.
[65] Kambourova, M., Kirilova N., Mandeva R., Derekova, A. (2003),
“Purification and properties of thermostable lipase from a thermophilic Bacillus
stearothermophilus MC 7”, J. Mol. Catal. B Enzym., 22(5), pp. 307–313.
[66] Kanmani, P. et al. (2015), “Rice Bran Lipase : Partial Purification ,
Immobilization in Calcium Alginate Beads , Characterization and Application
136
as a Detergent Additive”, 33 (6), pp. 1052–1058.
[67] Kapranchikov, V. S., Zherebtsov, N. A, Popova, T. N. (2004), “Purification
and Characterization of Lipase from Wheat ( Triticum aestivum L .) Germ,” 40,
(1), pp. 98–103.
[68] Kasana, R. C., Kaur, B. K., Yadav, S. K., “Isolation and identification of a
psychrotrophic Acinetobacter sp. CR9 and characterization of its alkaline
lipase,” J. Basic Microbiol., 48 (3), pp. 207–212.
[69] Kouker, G., Jaeger, K. E. (1987), “Specific and sensitive plate assay for
bacterial lipases,” Appl. Environ. Microbiol., 53 (1), pp. 211–213.
[70] Laemmli, U. K. (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4,” Nature, 227(5259), pp. 680-685.
[71] Leonga, T.S.H., et al (2009) “Minimising oil droplet size using ultrasonic
emulsification”, Ultrason. Sonochem., 16 (6), pp. 721–727.
[72] López, C. C., et al. (2009), “Activation of bacterial thermo alkalophilic
lipases is spurred by dramatic structural rearrangements”, J. Biol. Chem., 284
(7), pp. 4365–4372.
[73] Madhikar, S. D., Yewle, J. N., Jadhav, U. U., Chougale, A. D., Zambare, V.
P., Padul, M. V. (2011), “Biochemical Studies of Lipase from Germinating Oil
Seeds (Glycine max)”, American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 7
(3), pp. 141–145.
[74] Mangos, T. J., Jones, K. C., and Foglia, T. A.(1999), “Lipase-catalyzed
synthesis of structured low-calorie triacylglycerols,” J. Am. Oil Chem. Soc.,
76(10), pp. 1127–1132.
[75] Mardani, F. and Salehi, E. A. (2019), “Lipases : Sources , Characteristics and
application in Food industry,” International Journal of PharmTech Research,
9(12), pp. 305–312.
[76] Messaoudi A., Belguith, H., and Hamida, J. B. (2011), “Three-dimensional
structure of Arabidopsis thaliana lipase predicted by homology modeling
method”, Evol. Bioinforma., 2011(7), pp. 99–105.
137
[77] Meztler, P. D. S., Fait, M. E., Foresti, M. L., and Morcelle, S. R. (2014),
“Biocatalytic characterization of a naturally immobilized lipase found in
Araujia sericifera Brot. (Apocynaceae) latex”, Catal. Sci. Technol., 4(5), pp.
1386–1394.
[78] Miyazawa, T., Iguchi, W. (2013), “Long-chain ethers as solvents can amplify
the enantioselectivity of the Carica papaya lipase-catalyzed transesterification
of 2-(substituted phenoxy)propanoic acid esters”, Biotechnol. Lett., 35(10), pp.
1639–1643.
[79] Mohammadi, M., Habibi, Z., Dezvarei, S., Yousefi, M., and Ashjari, M.
(2015), “Selective enrichment of polyunsaturated fatty acids by hydrolysis of
fish oil using immobilized and stabilized Rhizomucor miehei lipase
preparations,” Food Bioprod. Process., 94(6), pp. 414–421.
[80] Mounguengui, R. W. M (2013), “Are plant lipases a promising alternative to
catalyze transesterification for biodiesel production?”, Prog. Energy Combust.
Sci., 39(5), pp. 441–456.
[81] Mounguengui, R. W. M, Brunschwig, C., Baréa B., Villeneuve, P., and Blin,
J.(2013), “Are plant lipases a promising alternative to catalyze
transesterification for biodiesel production?”, Prog. Energy Combust. Sci.,
39(5), pp. 441–456.
[82] Ngando, G. et al (2006), “Assaying lipase activity from oil palm fruit (Elaeis
guineensis Jacq.) mesocarp”, Plant Physiol. Biochem., 44(10), pp. 611–617.
Fregolente, L. V. (2009), “Enzymatic Hydrolysis of Salmon Oil by Native
[83] Noffs, M.D.O., Carvalho, P.O.., Campo, P. R. B., Fregolente, P. B. L.,
Lipases : Optimization of”, J. Braz. Chem. Soc., 20(1), 117-124.
[84] Okunwaye,T., Obibuzor, J. U., and Okogbenin, E. A. (2015), “Purification
and biochemical properties of lipase from raphia palm fruit mesocarp”, African
J. Biochem. Res., 9(5), pp. 73–80.
[85] Oliveira, A. P.,Valentão P, Pereira JA, Silva BM, Tavares, F. (2009), “Ficus
carica L.: Metabolic and biological screening”, Food Chem Toxicol, 47(11), pp.
138
2841–2846.
[86] Olusesan, A. T., Azura, L. K., Abubakar, F., Hamid, N. S. A., Radu, S., and
Saari, N.(2009), “Phenotypic and molecular identification of a novel
thermophilic Anoxybacillus species: A lipase-producing bacterium isolated
from a Malaysian hotspring”, World J. Microbiol. Biotechnol., 25(11), pp.
1981–1988.
[87] Otto, C. S. R. T., Scheib, H., Bornscheuer, U. T., Pleiss, J. and Schmid, R.
D.(2000), “Substrate specificity of lipase B from Candida antarctica in the
synthesis of arylaliphatic glycolipidsNo Title”, J. Mol. Catal. B Enzym., 8(4),
pp. 201–211.
[88] Paez, G. E., Medina AR, Rubio FC, Moreno PG (2003), “Modeling the effect
of free water on enzyme activity in immobilized lipase-catalyzed reactions in
organic solvents”, Enzyme Microb. Technol., 33(6) ,pp. 845–853.
[89] Panzanaro, S., Nutricati, E., Miceli, A., and De Bellis, L. (2010),
“Biochemical characterization of a lipase from olive fruit (Olea europaea L.),”
Plant Physiol. Biochem., 48(9), pp. 741–745.
[90] Paques, F. W., Pio, T. F., P. et al (2008), “Characterization of the lipase from
Carica papaya residues”, Braz. J. Food Technol, 11(1), pp. 20–27.
[91] Patil, K. J., Chopda, M. Z., Mahajan, R. T.(2011), “Lipase biodiversity,”
Indian J. Sci. Technol., 4(8), pp. 971–982 .
[92] Pierozan, M. K., J. da Costa, R., Antunes, O. A. C., Enrique, D. O. et al
(2009), “Optimization of Extraction of Lipase from Wheat Seeds (Triticum
aestivum) by Response Surface Methodology,” J. Agric. Food Chem., 57(20),
pp. 9716–9721.
[93] Pierozan, M. K., Oestreicher, E. G., Oliveira, J. V., D. , Treichel, H., and
Cansian, R. L. (2011), “Studies on immobilization and partial characterization
of lipases from wheat Seeds (Triticum aestivum)”, Appl. Biochem. Biotechnol.,
165(1), pp. 75–86.
[94] Pinyaphong, P. and Phutrakul, S. (2009), “Synthesis of cocoa butter
139
equivalent from palm oil by Carica papaya lipase-catalyzed interesterification,”
Chiang Mai J. Sci., 36(3), pp. 359–368.
[95] Pinyaphong, P. and Phutrakul, S. (2009), “Modification of Palm Oil
Structure to Cocoa Butter Equivalent by Carica papaya Lipase- Catalyzed
Interesterification”, World Acad. Sci. Eng. Technol., 3(6), pp. 309 - 313.
[96] Pizarro, W. L. C., Brañes M.C., Markovits A., Fernández-Lorente G., Guisán
J.M., Chamy R. (2012), “Influence of different immobilization techniques for
Candida cylindracea lipase on its stability and fish oil hydrolysis”, Mol. Catal.
B Enzym, 78, pp. 111–118.
[97] Polizelli, P. P., Facchini, F. D. A., and Bonilla-Rodriguez, G. O. (2013),
“Stability of a lipase extracted from seeds of pachira aquatica in commercial
detergents and application tests in poultry wastewater pretreatment and fat
particle hydrolysis”, Enzyme Res., 2013.
[98] Pandit, A. P., Puthli, M. S., and Rathod, V. K. (2006), “Enzymatic hydrolysis
of castor oil: Process intensification studiese”, Biochem. Eng. J., 31(1), pp. 31–
41.
[99] Ramadan E. A. (2012), “Effect of Processing and Cooking Methods on the
Chemical Composition, Sugars and Phytic Acid of Soybeans”, Food Public
Heal., 2(1), pp. 11–15.
[100] Ramani, K., Kennedy, L. J., Ramakrishnan, M., and Sekaran, G. (2010),
“Purification, characterization and application of acidic lipase from
Pseudomonas gessardii using beef tallow as a substrate for fats and oil
hydrolysis”, Process Biochem., 45(10), pp. 1683–1691.
[101] Ribeiro, B. D., De Castro, A. M., Coelho, M. A. Z., and Freire, D. M. G.
(2011), “Production and use of lipases in bioenergy: A review from the
feedstocks to biodiesel production,” Enzyme Res., 2011(1).
[102] Rivera, I., Mateos-díaz, J. C. and Sandoval, G. (2012), “Lipases and
Phospholipases,” 861, pp. 115–122.
[103] Sagiroglu, A. and Arabaci, N. (2005), “Sunflower seed lipase: Extraction,
140
purification, and characterization,” Prep. Biochem. Biotechnol., 35(1), pp. 37–
51.
[104] Sahena, F. et al. (2009), “PUFAs in Fish: Extraction, Fractionation,
Importance in Health,” Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. Table, 8, pp. 59–74.
[105] Salleh, M., Rahman, A.B., Basri R.N. (2006), New Lipases and Proteases.
New York Nova Science Publishers, Inc.
[106] Sandova, G. (2012), Lipases and Phospolipases: Methods and Protocols,
Methods in Molecular Biology, Springer Science+Business Media New York.
[107] Santos, K. C. et al. (2013), “Characterization of the catalytic properties of
lipases from plant seeds for the production of concentrated fatty acids from
different vegetable oils”, Ind. Crops Prod., 49, pp. 462–470.
[108] Seth, S., Chakravorty, D., Dubey, V. K., and Patra, S.(2014), “An insight
into plant lipase research - Challenges encountered”, Protein Expr. Purif., 95,
pp. 13–21.
[109] Sharif, M. K., Butt, M. S., Anjum F. M. and S. H. Khan (2014), “Rice Bran:
A Novel Functional Ingredient”, Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 54(6), pp. 807–816.
[110] Sharma, A., Dalai, A., K. and Chaurasia, P (2013), “Enzymatic hydrolysis of
cod liver oil for the fatty acids production,” Catal. Today, 207, pp. 93–100.
[111] Sharma, A., Dalai, A., K. and Chaurasia, P. (2018), “Salmon and Herring
Fish Oil Hydrolysis with Immobilized Candida antarctica Lipase-B,” Int. J.
Gen. Eng. Technol., 7 (4), pp. 7–20.
[112] Sharma, M. K. (2011), “Aqueous two-phase extraction – of Lipase from Rice
Bran,” Adv. Appl. Sci. Res., 2(2), pp. 265–271.
[113] Sharma, R., Chisti, Y. and Banerjee, U. C. (2001), “Production, purification,
characterization, and applications of lipases,” Biotechnol. Adv., 19(8), pp. 627–662.
[114] Sharma, A., Chaurasia, S., P. and Dalai, A., K. (2014), “Non-selective
hydrolysis of tuna fish oil for producing free fatty acids containing
docosahexaenoic acid,” Can. J. Chem. Eng., 92(2), pp. 344–354.
[115] Su.Y, Zhou, Y., You, P. and Wei, D. (2010), “Lipases in the castor bean seed
141
of Chinese varieties: Activity comparison, purification and characterization”, J.
Shanghai Univ., 14, pp. 137–144.
[116] Tecelão, C., Sandova,G., Rivera, I. and Ferreira‐Dias, S.(2012), “Carica
papaya latex: A low-cost biocatalyst for human milk fat substitutes production”,
Eur. J. Lipid Sci. Technol., 114(3), pp. 266–276.
[117] Thakur, S.(2012), “Lipases, its sources, Properties and Applications: A
Review”, Int. J. Sci. Eng. Res. Vol., 3(7), pp. 1–29.
[118] Tripathi, R., Singh, J., Bharti, R. K. and Thakur, I. S. (2014), “Isolation,
purification and characterization of lipase from microbacterium sp. and its
application in biodiesel production”, Energy Procedia, 54, pp. 518–529.
[119] Tursi, J. M., Phair, P. G. and Barnes, G. L.(1994),“Plant sources of acid
stable lipases: Potential therapy for cystic fibrosis”, J. Paediatr. Child Health,
30(6), pp. 539–543.
[120] Uchenna, C., Afulenu, L. (2007), “Properties of Lipase (Ec 3.1.1.3) From
Different Varieties of Maize”, Anim. Res. Int., 4 (2), pp. 2–5.
[121] Villeneuve, P. et al. (2005), “Lipase-catalyzed synthesis of canola
phytosterols oleate esters as cholesterol lowering agents,” Enzyme Microb.
Technol., 37 (1), pp. 150–155.
[122] Villeneuve, P., Pina, M., et al. (1997), “Specificity of Carica papaya latex in
reactions”, Biotechnology Techniques, 11 (2), pp. 91–94.
[123] Weerasooriya, M. K. B., Kumarasinghe, A. A. N. (2012), “Isolation of
alkaline lipase from rubber seed - Partial purification, characterization and its
potential applications as a detergent additive,” Indian J. Chem. Technol., 19 (4),
pp. 244–249.
[124] Yashodhara, B. M. et al. (2009), “Omega-3 fatty acids : a comprehensive
review of their role in health and disease Omega-3 fatty acids : a comprehensive
review of their role in health and disease,” BMJ.
[125] Yeşiloǧlu, Y., Demirkan B. (2010), “Biocatalytic properties of lipase from
walnut seed (juglans regia L.),” JAOCS, J. Am. Oil Chem. Soc., 87 (6), pp. 659–
142
665.
[126] Yeşiloǧlu, Y., et al (2008), “Preparative Biochemistry and Biotechnology
Partial Purification and Characterization of Almond Seed Lipase”, Prep.
Biochem. Biotechnol., 38, pp. 397–410.
[127] You, P., Su, E., et al (2011), “Carica papaya lipase-catalyzed synthesis of
terpene esters”, J. Mol. Catal. B Enzym., 71 (3), pp. 152–158.
[128] Zivkovic, L. T. I., et al (2009), “Enzymatic characterization of 30 kDa lipase
from Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853”, J. Basic Microbiol., 49 (5), pp.
143
452–462.
PHỤ LỤC
PL 1
Phụ lục 1: HÌNH ẢNH CÁC THIẾT BỊ CHÍNH DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
Hình 1.1. Cân phân tích Hình 1.2. Máy li tâm lạnh
Hình 1.3. Máy sấy thăng hoa Hình 1.4. Máy lắc
PL 2
Hình 1.5. Máy đo quang Hình 1.6. Máy khuấy từ
Hình 1.7. Máy đồng hóa Hình 1.8. Máy cô quay chân không
PL 3
Hình 1.9. Máy sấy thƣờng Hình 1.10. Máy sắc ký trao đổi ion
Phụ lục 2 : MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU Phụ lục 2.1. Phƣơng pháp xác định độ ẩm
Sấy mẫu thực phẩm ở áp suất không khí, nhiệt độ sấy theo quy định của từng * Nguyên tắc
loại sản phẩm và cân đến khối lượng không đổi.
* Cách tiến hành
Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
- Lấy mẫu ít nhất 200g mẫu đại diện.
- Chuẩn bị mẫu thử: Đồng hóa mẫu bằng máy xay phù hợp. Chú ý không để nhiệt độ của mẫu tăng quá 250C và thao tác phải nhanh để tránh việc mẫu bị hút ẩm, ảnh hưởng tới kết quả phân tích. Bảo quản mẫu trong bình khô, sạch và có nắp đậy
kín. Phân tích mẫu trong vòng 24h sau khi đồng hóa.
Chuẩn bị cốc cân
- Sấy khô cốc cân, đũa thủy tinh (nếu cần) 30 phút trong tủ sấy ở 1030C . - Để cốc cân, đũa thủy tinh trong bình hút ẩm nguội đến nhiệt độ phòng và
cân chính xác đến 0,001g.
- Lăp lại các quá trình trên cho đến khi chênh lệch giữa 2 lần cân liên tiếp
không quá 0,001g.
Xác định
- Cân m gam (chính xác đến 0,001g) mẫu thử đã được chuẩn bị vào cốc cân
đã biết trước khối lượng.
- Dùng đũa thủy tinh trộn đều mẫu thử và dàn thành lớp mỏng (nếu cần). Đặt
tất cả vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ và thời gian tùy từng loại sản phẩm
- Sau thời gian sấy đậy nắp cốc cân lại, lấy ra khỏi tủ sấy, để nguội đến nhiệt
độ phòng trong bình hút ẩm và cân chính xác đến 0,001g.
- Lặp lại quá trình như trên (nhưng với thời gian sấy theo quy định) cho đến khi chênh lệch kết quả giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,001g (nếu tiêu chuẩn
chưa quy định).
Tính kết quả
- Độ ẩm (Hàm lượng nước) (X) tính bằng % khối lượng theo công thức:
PL 4
( m1 – m2 ) x 100 X (%) = m1 – m0
Trong đó: + m0: Khối lượng của cốc cân, nắp và đũa thủy tinh (nếu có); tính bằng gam. + m1: Khối lượng của cốc cân, nắp, đũa thủy tinh (nếu có) và mẫu thử trước khi sấy; tính bằng gam. + m2: Khối lượng của cốc cân, nắp, đũa thủy tinh (nếu có) và mẫu thử sau khi sấy; tính bằng gam.
Phụ lục 2.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tro * Cách tiến hành: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 550-600 oC đến trong lượng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác đến 0,0001g.
Cho vào chén sứ khoảng 5g mẫu thử. Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác như trên, Cho tất cả vào lò nung và nâng nhiệt độ từ từ cho đến 550 – 600 oC. Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại hết các chất hữu cơ, thường khoảng 6 - 7 giờ. Trường hợp còn tro đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và nung lại đến tro trắng. Để nguội trong bình hút ẩm và cân đến độ chính xác
như trên. Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình
hút ẩm và cân cho đến trong lượng không đổi.
* Tính kết quả: Hàm lượng tro (%) được tính theo công thức: X = ((G2 - G)×100)/(G1 - G) Trong đó: G: trọng lượng chén (g) G1: trong lượng chén và mẫu trước khi nung (g) G2: trong lượng chén và mẫu sau khi nung (g) Phụ lục 2.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein thô bằng phƣơng pháp
Kjeldahl * Nguyên tắc: Vô cơ hóa mẫu bằng acid sunfuric đậm đặc, nitơ có trong mẫu thử
chuyển thành amonisunfat. Dùng kiềm đậm đặc đẩy amoniac ra khỏi amonisunfat
trong máy cất đạm tạo thành amoni hydroxyt rồi định lượng bằng acid.
* Cách tiến hành: Vô cơ hóa mẫu - Cân chính xác đến 0,001g khoảng 1-3g mẫu thử (tùy thuộc vào hàm lượng nước có trong mẫu) chuyển vào ống thủy tinh của máy phá mẫu DK6 sao cho mẫu thử không dính vào cổ bình, cho tiếp khoảng 1g hỗn hợp xúc tác và khoảng 10mL acid H2SO4 đậm đặc. - Đặt 6 ống thủy tinh chứa mẫu vào máy, kết nối với hệ thống bơm hút khí
PL 5
độc. Ban đầu, gia nhiệt ở nhiệt độ thấp sao cho chất lỏng trong bình không sủi
phồng, không bắn lên cổ bình (có thể để qua đêm rồi mới đun) cho đến khi có khói
trắng xuất hiện thì nâng nhiệt cao hơn. Quá trình vô cơ hóa kết thúc khi dung dịch
có màu xanh duơng hoặc trong suốt không màu (không được có màu vàng nhạt) mặt trong bình hoàn toàn sạch. Để dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng.
- Nếu quá trình vô cơ mẫu kéo dài (mẫu không trắng), ngừng đun để nguội,
cho thêm khoảng 0,5g chất xúc tác hoặc vài giọt acid HClO vào rồi tiếp tục đun.
Nếu thấy mẫu còn đen nhưng đã cạn, thì lấy ra để nguội cho thêm khoảng 3mL acid H2SO4 đậm đặc vào và tiếp tục đun cho đến khi dung dịch đạt yêu cầu. Cất mẫu
- Dùng pipet hoặc buret lấy chính xác một lượng H2SO4 0,1N không lớn hơn 25mL (tuỳ theo từng loại mẫu thử) và 5 giọt chỉ thị hỗn hợp vào bình nón dung tích 250mL, đặt bình dưới ống sinh hàn của máy cất đạm sao cho đầu ống sinh hàn ngập
hẳn vào dung dịch.
- Cẩn thận cho thêm nước cất vào ống nghiệm chứa mẫu đã được vô cơ hóa
và thêm vào 6-8 giọt chỉ thị hỗn hợp, gắn nhanh ống vào vị trí cất của máy cất đạm
UDK 132.
- Cài đặt chương trình cất cho máy, máy sẽ tự động bơm dung dịch NaOH
30-40% vào ống nghiệm và tự khuấy trộn mẫu (dung dịch trong ống chứa mẫu phải
chuyển thành màu nâu xám nếu không phải cho tiếp vào một ít dung dịch kiềm
nữa).
- Mở van nước cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn và bắt đầu chưng cất
liên tục trong 4 phút. Khi gần hết thời gian cất, hạ bình hứng để ống sinh hàn lên
khỏi mặt nước, dùng bình tia rửa đầu ống sinh hàn hứng nước ngưng chảy ra ở đầu
ống sinh hàn thử bằng giấy đo pH thấy không có phản ứng kiềm. (Trong quá trình
cất dung dịch trong bình hứng phải còn thừa acid – dung dịch vẫn còn màu tím, nếu
- Dùng NaOH 0,1N chuẩn độ lượng acid dư trong bình hứng cho đến khi
dung dịch chuyển sang màu xanh xám thì phải bổ sung thêm acid). dung dịch trong bình chuyển từ màu tím sang màu xanh. * Chú ý: Đối với những loại thực phẩm giàu đạm: Sau khi vô cơ hóa mẫu có thể pha loãng dịch mẫu vào bình định mức 100mL và lấy chính xác VmL dung dịch cho vào ống cất mẫu của máy cất đạm. Khi tính kết quả phải nhân cho độ pha loãng này.
PL 6
- Xác định mẫu trắng bằng cách dùng dung dịch NaOH 0,1N để chuẩn 25mL dung dịch H2SO4 0,1N.
Tính kết quả
Hàm luợng Nitơ tổng =
Trong đó:
+ B: Số ml NaOH 0,1N dùng cho mẫu trắng. + S: Số ml NaOH 0,1N dùng cho mẫu thử. + m: Khối lượng mẫu dùng để phân tích. + N: Nồng độ NaOH.
+ 1,4007: Đương luợng gam của Nitơ đã nhân với 100%.
+ f: Độ pha loãng (nếu có).
Hàm lƣợng Protein thô = Hàm luợng Nitơ tổng x hệ số qui đổi
+ Hệ số qui đổi:
- Lúa mì, lúa mạch và các sản phẩm: 5,83
- Cám mỳ: 6,3
- Gạo: 5,95
- Đậu nành và các sản phẩm 5,71
- Các loại hạt 5,3
Phụ lục 2.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng chất béo * Nguyên tắc: Mẫu thực phẩm được đun sôi với HCl, lọc và rửa sạch phần lọc, sấy
khô và chiết chất béo bằng ether petroleum. Làm bay hơi dung môi, sấy và cân
lượng chất béo còn lại đến khối lượng không đổi.
* Cách tiến hành Mẫu thử được xay nhỏ bằng máy xay phù hợp. Bảo quản mẫu trong bình
hoặc túi nilon khô, sạch, kín khí. Tiến hành phép thử nghiệm càng nhanh càng tốt.
Chuẩn bị bình thu chất béo - Sấy bình cầu của bộ soxhlet 30 phút trong tủ sấy ở 1030C ± 20C. - Để bình cầu trong bình hút ẩm nguội đến nhiệt độ phòng và cân chính xác
- Lăp lại các quá trình trên cho đến khi chênh lệch giữa 2 lần cân liên tiếp
đến 0,001g. không quá 0,001g
Xác định
PL 7
- Cân 3-5 gam (chính xác đến 0,001g) mẫu thử đã được chuẩn bị vào bình nón 250mL, thêm 50mL dung dịch HCl loãng và một vài viên bi thủy tinh (Nếu
cần), đậy bình với mặt kính đồng hồ. Đun sôi trong 1h, duy trì thể tích bằng cách
cho thêm nước.
- Đem lọc tất cả qua giấy lọc đã thấm ướt bằng nước lạnh và có chứa một ít cát sạch, tráng bình tam giác và mặt kính đồng hồ bằng nước nóng rồi chuyển hết
qua giấy lọc. Tráng rửa giấy lọc nhiều lần bằng nước nóng cho đến dịch lọc không
còn acid. (Thử bằng giấy pH, pH = 7).
- Để giấy lọc và cặn ráo hết nước, làm khô giấy lọc trên mặt kính đồng hồ
trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C. - Dùng kẹp gắp cuộn cặn và giấy lọc cho vào ống giấy lọc, gói kín và đặt vào
ống chiết của máy soxhlet. Rửa bình tam giác, mặt kính đồng hồ kẹp gắp bằng ether
petroleum hoặc dùng bông thấm ether petroleum lau sạch. (Dung môi rửa, bông này sẽ được cho vào ống chiết của máy soxhlet)
- Lắp bình cầu (đã sấy khô và cân trước khối lượng) vào ống chiết của máy
soxhlet. Cho nước làm lạnh chảy qua sinh hàn. Cho dung môi ether petroleum vào
ống chiết và bình cầu khoảng 2/3 thể tích. Bật bếp, điều chỉnh nhiệt độ sao cho
trong 1h khoảng 5-6 lần ete tràn từ ống chiết xuống bình cầu (Tránh đun ở nhiệt độ quá cao >600C làm hao hụt dung môi). Duy trì tốc độ chiết như vậy trong 4 giờ hoặc đến khi hoàn toàn hết lipit. (Kiểm tra bằng cách lấy vài giọt dung môi chiết
trên ống xi phông nhỏ lên tờ giấy lọc trắng, chờ cho dung môi ete bay hơi hết. Quan
sát bề mặt giấy: Nếu trên bề mặt giấy không có vết loang, nghĩa là trong gói mẫu
không còn lipit.).
- Khi hoàn tất việc chiết, chờ cho dung môi ete chảy hết xuống bình cầu thì
ngừng đun. Nhấc ống sinh hàn lên, dùng banh gắp gói mẫu ra khỏi bình chiết và
lắp lại sinh hàn. Bật bếp chưng cất cho dung môi ete bay hơi và ngưng hết lên bình
chiết. Ngừng đun, thu hồi ete và tháo bình cầu ra cho vào tủ sấy, sấy 30-40 phút ở 60 oC. Lấy ra để nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân khối lượng bình và lipit. Lặp lại quá trình sấy như trên cho đến khi khối lượng không đổi hoặc chênh lệch khối lượng giữa 2 lần cân không quá 0,001g.
* Tính kết quả
- Hàm lượng chất béo ( X ) tính bằng % khối lượng theo công thức:
PL 8
X (%) = ( m2 – m1 ) x 100 m
Trong đó:
+ m: Khối lượng của mẫu; tính bằng gam (g) + m1: Khối lượng của bình cầu; tính bằng gam (g) + m2: Khối lượng của bình cầu và lipit; tính bằng gam (g)
Phụ lục 2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp chuẩn độ * Cách tiến hành
Chuẩn bị hệ nhũ tương gồm 180 ml nước cất, 0,4g natri benzoat, 20 ml dầu
oliu (hoặc các cơ chất khác) và 4g gum arabic. Sau đó đánh tan bằng máy đồng hóa siêu âm trong 5 phút, thu được hệ nhũ tương đồng nhất. Mỗi mẫu phân tích bao
gồm 5ml dầu oliu đã được nhũ hóa, 5ml dung dịch đệm Tris - HCl 0,1M (pH=8) và lượng enzyme phù hợp, lắc đều và ủ ở 35 oC trong 30 phút. Dừng phản ứng bằng cách cho thêm 15ml hỗn hợp acetone : etanol (1:1). Mẫu thu được đem chuẩn độ
bằng dung dịch NaOH 0,05N với chỉ thị phenolphthalein 1%. Thể tích dung dịch
NaOH 0,05N dùng để chuẩn độ mẫu phân tích là b, mẫu trắng là a.
Hoạt độ lipase được tính theo công thức:
Hoạt độ lipase = (U/ml hoặc U/mg) (2.2)
trong đó: t là thời gian phản ứng thủy phân xảy ra (phút), m: lượng enzyme tham
gia phản ứng (g hoặc ml); 0,05 là nồng độ đương lượng gam của NaOH (N).
Phụ lục 2.6. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp đo quang
* Cách tiến hành Xây dựng đồ thị đường chuẩn p-NP
Đồ thị chuẩn p-NP được xây dựng dựa trên mối tương quan giữa hàm lượng
p-NP và mật độ quang tại bước sóng 410 nm.
Bước 1: Chuẩn bị 2 dung dịch
Dung dịch A: Cho 0,03g p-NPP vào 10ml 2-propanol, đánh siêu âm 2 phút.
Dung dịch B: Cho 0,18g gum Arabic, 720µl triton-X 100 vào bình tam giác
250ml có chứa 180ml tris-HCl 0,1M, pH = 8, hòa tan trên máy lắc. Bước 2: Pha các dung dịch chuẩn p-NP sao cho có nồng độ p-NP (mmol/l) tăng dần: 0,009; 0,01; 0,012; 0,015; 0,021; 0,03; 0,06. Đem đo giá trị OD và xây dựng đường chuẩn.
PL 9
Từ đồ thị Hình 2.10 có được phương trình đường chuẩn y = 13,649x + 0,012, với x là nồng độ p-NP (mM), y là giá trị OD410 tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,9999 chứng tỏ mối liên hệ giữa y và x là chặt chẽ do đó có thể sử dụng
phương trình trên để tính lượng p-NP giải phóng ra trong phản ứng định lượng
lipase trong các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 2. 1: Kết quả OD 410 nm ở các nồng độ p-NP khác nhau
Nồng độ p-NP OD410nm
(mmol/l)
0,009 0,138
0,01 0,148
0,012 0,173
0,015 0,214
0,021 0,301
0,03 0,423
y = 13.649x + 0.012 R² = 0.9999
0,06 0,830
D O
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
0
0.02
0.06
0.08
0.04 Nồng độ p-NP (mM)
Hình 2.1. Đồ thị chuẩn liên hệ giữa nồng độ p-NP và giá trị OD410 nm
Bước 3: Xác định hoạt độ enzyme
Dung dịch gồm 4860 µl dung dịch B và 540 µl dung dịch A được nâng lên
nhiệt độ cần khảo sát. Cho 0,0015g enzyme vào. Để phản ứng xảy ra trong 5 phút.
Dừng phản ứng bằng cách lọc enzyme qua xilanh có bông không thấm.
Đo độ hấp thụ ở bước sóng 410 nm với mẫu trắng là mẫu chuẩn bị tương tự
như mẫu khảo sát hoạt độ enzyme, chỉ khác là dùng 540 µl 2-propanol thay cho 540 µl dung dịch A.
PL 10
[ ] [ ]
Đơn vị hoạt độ được tính là lượng enzyme cần thiết để xúc tác giải phóng ra
1 µmol p-NP trong một phút.
Hoạt độ lipase
Phụ lục 2.7. Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase bằng phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch
* Cách tiến hành Chuẩn bị hỗn hợp môi trường gồm 1g agar, 3g dầu cá hồi (dầu cọ), thuốc
nhuộm Rhodamine B 0,01mg, 100ml nước cất trộn đều, đồng hóa trên máy đồng
hóa. Đun sôi hỗn hợp, đổ trên đĩa thạch để nguội, khoét các lỗ tròn đường kính 3mm và đổ dung dịch lipase vào, ủ trong 48h ở 37 oC. Sự xuất hiện vòng huỳnh quang màu cam xung quanh phần đục lỗ bằng cách quan sát dưới đèn UV chứng tỏ
lipase có hoạt tính.
Phụ lục 2.8. Phƣơng pháp xác định điểm đẳng điện của lipase
* Cách tiến hành Chuẩn bị 15 ống nghiệm chứa 3ml dung dịch enzyme lipase thu được từ mục
2.4.3.1.b. Thêm vào mỗi ống 2ml các dung dịch có pH thay đổi: 3; 3,5; 4; 4,5 ;5;
5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5; 10. Chờ 10 phút rồi tiến hành đo quang hấp thụ
quang của dung dịch enzyme ở bước sóng 620 nm để xác định điểm đẳng điện của
enzyme lipase.
Phụ lục 2.9. Phƣơng pháp điện di
* Nguyên tắc
Điện di trên gel polyacrylamide được Weintraub và cộng sự sử dụng lần đầu tiên vào năm 1959. Hợp chất cơ bản trong gel là acrylamide (CH2 = CH-CO-NH2), phản ứng polymer hóa hình thành khi có mặt các gốc tự do (có nguồn gốc từ ammonium persulfate-APS) và ổn định bởi TEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl- ethylenediamine). Khi bisacrylamide (N,N’-methylene-bisacrylamide) được bổ sung, các chuỗi sẽ liên kết chéo để tạo thành dạng gel. Độ xốp của gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo.
Điện di SDS (sodium dodecyl sulfate) được sử dụng để phân tách hỗn hợp
PL 11
protein theo khối lượng phân tử của chúng, SDS có tác dụng liên kết với các phân
tử protein theo tỷ lệ 1,4 g SDS trên 1 g protein biến tính và tích tạo ra một tỷ lệ khối
lượng điện tích thống nhất cho mọi phân tử protein. Lúc này, cấu trúc bậc 3 và bậc
4 của phân tử protein bị phá vở do sự đứt gẫy các liên kết hydrogen và sự mở xoắn
của các phân tử. Liên kết disulfite giữa các gốc cysteine bị phá vỡ khi có mặt của
gốc thiol như β-mercaptoethanol hoặc dithiothreitol. Chuỗi polypeptide liên kết với
SDS sẽ duỗi thẳng, tích điện âm nên sự dịch chuyển qua gel chỉ phụ thuộc vào kích
thước của protein. Dưới tác dụng của điện trường, các phân tử chuyển động về cực
dương với tốc độ tỷ lệ nghịch với trọng lượng phân tử của chúng. Các phân tử nhỏ
chuyển động nhanh, các phân tử lớn chuyển động chậm. Từ đó chúng sẽ phân bố ở
các vị trí khác nhau trên bản điện di.
* Cách tiến hành
Chuẩn bị gel polyacrylamide 15%, chuẩn bị dụng cụ, hóa chất. Lau sạch các
tấm kính bằng ethanol, sau đó lau lại thật sạch bằng nước cất. Gắn các tấm kính vào
giá đỡ. Thử độ thấm lắp ghép bằng nước cất, nếu nước chảy ra từ khe ghép nhiều
thì phải làm lại. Quá trình đổ gel được tiến hành ở (bảng 1.1). Tiếp đến, cho gel vào
buồng điện di, đổ ngập bằng đệm chạy (1X Electrophoresis buffer). Chú ý không để
bọt khí ở phía dưới tấm kính, dùng pipette làm sạch gel thừa trong các giếng. Chạy
prerun khoảng 5 phút ở 80 - 100 V cung cấp ion cho điện trường hoạt động. Sau đó,
dùng Hamilton syringe lấy 20 µL (30 µg protein) sản phẩm protein kháng nguyên
mỗi loại, trộn với 5 µl chỉ thị màu (Loading dye 5X) với mẫu và tra riêng biệt vào
từng giếng trong gel. Tuy nhiên, đối với chỉ thị phân tử protein được tra vào trong 1
giếng riêng biệt (khoảng 6 µl). Chỉ thị phân tử protein (Protein marker) được dùng
là chỉ thị protein “SDS-PAGE Molecular Weight Standards của hãng BioBase tạo
thành 9 phân đoạn có độ dài từ 10 – 170 kDa. Nối hệ thống điện di với nguồn điện,
protein kháng nguyên sẽ chuyển dịch từ cực âm đến cực dương. Chạy điện di ở hiệu
thế 60 - 100 V trong 2,5 - 4,5 giờ cho đến khi vạch màu đi hết độ dài tấm kính (thời
gian thay đổi tùy theo mẫu). Lấy gel ra khỏi buồng điện di, cho vào dụng cụ nhuộm
(thường là các hộp nhựa) có chứa dung dịch gel staining (có chứa Coomassie Blue
R250), lắc nhẹ khoảng 25 vòng/phút trong khoảng từ 10 - 15 phút và sau đó rửa gel bằng dung dịch gel destaining trên máy lắc nhẹ, khoảng 10 phút thay dung dịch rửa
PL 12
1 lần cho đến khi hoàn thành và chụp ảnh giữ mẫu kiểm tra.
Bảng 2.1. Thành phần các hóa chất cho quá trình chuẩn bị gel polyacrylamide 15% (kính có kích thƣớc 12 cm x 10 cm)
Tên hóa chất Separating gel 15% Stacking gel 5%
DW 1,25 mL 0,88 mL
Acrylamide 2,5mL 260 L
Separating buffer 1,25 mL -
Stacking buffer - 380 L
TEMED 7,5 L 2 L
APS 10% 45 L 12 L
Vortex khoảng 1 - 2 phút Vortex khoảng 1 phút
Phụ lục 2.10. Phƣơng pháp xác định chỉ số acid
Chỉ số acid của lipid là số mg KOH cần để trung hòa acid béo tự do trong 1g
chất béo.
*Cách tiến hành
Hòa tan phần mẫu thử trong dung môi là hỗn hợp dietyl ete/ etanol 96% (v/v)
(1÷1), sau đó chuẩn độ acid béo tự do với dung dịch kali hydroxit trong etanol cho
đến điểm kết thúc được biết bằng chất chỉ thị (màu hồng của phenolphtalein giữ
vững được ít nhất trong 10 giây).
Phản ứng xảy ra như sau:
RCOOH + KOH → RCOOK + H2O Dựa vào lượng KOH dùng để trung hòa các acid béo để tính chỉ số acid.
Công thức xác định chỉ số acid (AV):
Trong đó : - V là thể tích của dung dịch chuẩn KOH đã sử dụng. (ml). - c là nồng độ chính xác của dung dịch chuẩn KOH đã sử dụng. (mol/l)
- m là khối lượng mẫu thử. (g).
Phụ lục 2.11. Phƣơng pháp xác định chỉ số xà phòng hóa
Chỉ số xà phòng hóa là lượng mg KOH cần để trung hòa acid béo tự do cũng
PL 13
như liên kết có trong 1g chất béo.
*Cách tiến hành
Đun sôi mẫu thử với dung dịch KOH trong etanol, cho hoàn lưu bằng bộ phận
sinh hàn, một lượng xác định chất béo sẽ phản ứng với lượng dư dung dịch KOH trong thời gian 1 giờ để xà phòng hóa hoàn toàn chất béo, sau đó chuẩn độ KOH dư
bằng dung dịch chuẩn HCl 0,5N với chỉ thị phenolphtalein. Điểm tương đương
nhận được khi dung dịch chuyển từ màu hồng sang không màu.
Phản ứng xảy ra như sau:
RCOOH + KOH → RCOOK + H2O
CH2 – O – COR1 CH2 – OH R1COOK CH – O – COR2 + 3KOH → CH – OH + R2 COOK CH2 – O – COR3 CH2 – OH R3 COOK
KOHdư + HCl → KCl + H2O
Lượng kiềm dư được xác định bằng HCl. Dựa vào lượng kiềm phản ứng, tính
được chỉ số xà phòng hóa.
Công thức xác định chỉ số xà phòng (SV):
Trong đó: - Vo là thể tích của dung dịch HCl 0,5N đã sử dụng cho phép thử trắng, (ml) - V1 là thể tích của dung dịch HCl 0,5N đã sử dụng cho phép xác định. (ml) - c là nồng độ chính xác của dung dịch HCl. (mol/lít)
- m là khối lượng của phần mẫu thử. (g)
Phụ lục 2.12. Xác định chỉ số este
Chỉ số este là số mg KOH cần để xà phòng hóa các glycerol có trong 1g chất
béo.
Chỉ số este = Chỉ số xà phòng – Chỉ số acid
Phụ lục 2.13. Phƣơng pháp xác định chỉ số iod
Chỉ số Iod của dầu béo là số gam iod cần thiết để cộng vào các nối đôi có chứa
trong 100g dầu béo.
*Cách tiến hành
PL 14
Là phương pháp dùng thuốc thử có iod clorua (dung dịch Wijs) kết hợp với các nối đôi có trong dầu béo (dầu béo được hòa tan trong CCl4). Lượng ICl phản ứng với KI để giải phóng iod ở dạng tự do và được định phân bằng dung dịch
2-
Na2S2O3 chuẩn, chỉ thị hồ tinh bột. Điểm tương đương được nhận biết khi dung dịch chuyển từ màu tím xanh sang không màu.
Phản ứng xảy ra như sau: R1 R2 R1 – HC = CH – R2 + ICl → CH – CH I Cl ICl + KI → I2 + KCl 2- → 2 I- + S4O6 I2 + 2S2O3 Công thức xác định chỉ sô iod (IV):
Trong đó:
- C là nồng độ của dung dịch chuẩn natri thiosulfat đã dùng, (mol/l) - V1 là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat đã dùng trong phép thử trắng,
(ml)
- V2 là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat đã dùng trong phép xác định,
(ml)
PL 15
- m là khối lượng phần mẫu thử, (g)
Phụ lục 3: SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM Phụ lục 3. 1. Hoạt độ lipase trong thời gian nảy mầm của hạt đậu nành
Thời gian nảy mầm (ngày) ĐC 0 1 2 3 4 5 6 Hoạt độ enzyme (U/ml) 0,13±0,03 0,19±0,00 0,41±0,03 0,61±0,00 0,72±0,00 0,57±0,03 0,33±0,00 0,20±0,03 STT 1 2 3 4 5 6 7 8
Phụ lục 3. 2. Hoạt độ lipase trong thời gian nảy mầm của hạt đậu phụng
Thời gian nảy mầm (ngày) ĐC 0 1 2 3 4 5 6 Hoạt độ enzyme (U/ml) 0,13 ± 0,03 0,19 ± 0,03 0,41± 0,03 0,61± 0,00 0,72± 0,00 0,57± 0,03 0,33± 0,00 0,2± 0,03 STT 1 2 3 4 5 6 7 8
Phụ lục 3. 3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy
mầm
PL 16
Nhiệt độ (0C) 25 30 35 40 45 50 55 60 Lần 1 6,264 6,976 6,502 5,803 5,367 4,563 3,996 3,191 Hoạt độ lipase (mU/g) Lần 3 6,159 7,121 6,383 6,014 5,46 4,616 4,101 3,31 Lần 2 6,119 6,844 6,568 5,921 5,156 4,457 3,89 3,126 Trung bình 6,181 ± 0,075c 6,98 ± 0,139a 6,484 ±0,094b 5,913± 0,106d 5,328±0,156e 4,545±0,081f 3,996±0,106g 3,209±0,093h
Phụ lục 3. 4. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy mầm
pH 4 5 6 7 8 9 10 Lần 1 3,152 3,376 3,679 4,22 6,976 11,315 6,713 Hoạt độ lipase (mU/g) Lần 3 3,099 3,653 3,864 4,299 7,121 10,985 6,673 Lần 2 2,954 3,482 3,956 4,009 6,844 11,21 6,884 Trung bình 3,068 ± 0,103g 3,504 ± 0,14f 3,833 ± 0,141e 4,176 ± 0,15d 6,98 ± 0,139b 11,17 ± 0,169a 6,757 ± 0,112c
Phụ lục 3. 5. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành
nảy mầm
Hoạt độ lipase (mU/g)
Ion kim loại Đối chứng K+ Na+ Ca2+ Mg2+ Lần 1 11,315 8,598 6,858 17,144 13,346 Lần 2 11,21 8,176 6,541 17,527 13,188 Lần 3 10,985 8,44 6,765 17,698 13,583 Trung bình 11,17±0,169c 8,405±0,213d 6,721±0,163e 17,456 ±0,284a 13,372 ±0,199b
Phụ lục 3. 6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ cám gạo bằng
phƣơng pháp đo quang
Hoạt độ lipase cám gạo (mU/ml) Nhiệt độ (0C)
PL 17
25 30 35 40 45 50 55 60 Lần 1 0,061 0,085 0,117 0,145 0,242 0,091 0,082 0,06 Lần 2 0,067 0,076 0,121 0,152 0,249 0,096 0,08 0,059 Lần 3 0,066 0,077 0,11 0,152 0,251 0,099 0,075 0,053 Trung bình 0,065±0,003f 0,079±0,005e 0,116±0,006c 0,15±0,004b 0,247±0,005a 0,095±0,004d 0,079 ±0,004e 0,057±0,004g
Phụ lục 3. 7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ phôi mỳ bằng phƣơng pháp đo quang
Hoạt độ lipase phôi mỳ (mU/ml) Nhiệt độ (0C)
25 30 35 40 45 50 55 60 lần 2 0,062 0,069 0,105 0,139 0,206 0,163 0,142 0,107 lần 3 0,055 0,075 0,098 0,144 0,211 0,168 0,144 0,114 Trung bình 0,057±0,004g 0,072±0,003f 0,101±0,004c 0,14±0,003c 0,207±0,004a 0,167±0,004b 0,141±0,004c 0,111±0,004d lần 1 0,054 0,073 0,1 0,138 0,203 0,17 0,136 0,113
Phụ lục 3. 8. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ lipase từ cám gạo
Hoạt độ lipase cám gạo (mU/ml) pH
6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 Lần 2 0,034 0,115 0,17 0,228 0,24 0,173 0,15 0,126 Lần 3 0,036 0,118 0,172 0,218 0,244 0,177 0,145 0,122 Trung bình 0,033±0,003h 0,115±0,003g 0,169±0,004d 0,221±0,006b 0,239±0,006a 0,177±0,004c 0,146±0,004e 0,126±0,004f Lần 1 0,03 0,113 0,165 0,218 0,233 0,181 0,142 0,129
Phụ lục 3. 9. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ lipase từ phôi mỳ
Hoạt độ lipase phôi mỳ (mU/ml) pH
PL 18
6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 Lần 2 0,084 0,108 0,128 0,156 0,168 0,183 0,188 0,201 0,189 Lần 3 0,091 0,111 0,138 0,146 0,169 0,187 0,193 0,202 0,187 Trung bình 0,087±0,004g 0,108±0,004f 0,133±0,005e 0,153±0,006d 0,171±0,005c 0,183±0,004b 0,189±0,004b 0,199±0,005a 0,185±0,005b Lần 1 0,085 0,104 0,132 0,157 0,177 0,18 0,186 0,193 0,179
Phụ lục 3. 10. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase từ cám gạo
Hoạt độ lipase cám gạo (mU/ml) Ion kim loại
Trung bình 0,174±0,004b 0,143±0,002e 0,179±0,005b 0,164±0,005c 0,125±0,004f 0,153±0,004d 0,238±0,004a lần 2 0,171 0,14 0,184 0,166 0,126 0,155 0,239 lần 3 0,178 0,144 0,175 0,168 0,128 0,155 0,242 lần 1 0,174 0,144 0,178 0,158 0,12 0,148 0,234
Ca2+ Cu2+ Mg2+ Mn2+ Na+ EDTA Mẫu đối chứng Phụ lục 3. 11. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase từ phôi mỳ
ion kim loại
Ca2+ Cu2+ Mg2+ Mn2+ Na+ EDTA Mẫu đối chứng Lần 1 0,206 0,101 0,176 0,194 0,063 0,18 0,19 Hoạt độ lipase phôi mỳ (mU/ml) Lần 3 Lần 2 0,212 0,202 0,105 0,1 0,18 0,173 0,196 0,206 0,069 0,068 0,173 0,181 0,2 0,195 Trung bình 0,207±0,005a 0,102±0,003d 0,176±0,004c 0,199±0,006b 0,067±0,003e 0,178±0,004c 0,195±0,005b
Phụ lục 3. 12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ
Hoạt độ lipase (mU/g) Nhiệt độ (0C)
PL 19
25 30 35 40 45 50 60 Lần 1 51,27 88,73 102,8 113,2 119,11 44,26 24,37 Lần 2 50,64 87,36 101,3 113,89 120,8 47,16 25,69 Lần 3 52,54 89,52 103,1 112,04 118,8 47,16 25,95 Trung bình 51,48 ± 0,968e 88,54 ± 1,093d 102,37 ± 0,96c 113,04 ± 0,935b 119,57 ± 1,076a 46,19 ± 1,674f 25,34 ± 0,847g
Phụ lục 3. 13. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ
pH
6 7 7,5 8 8,5 9 10 Lần 1 13,4 57,66 78,07 115,74 119,16 116,16 62,77 Hoạt độ lipase (mU/g) Lần 2 13,4 58,45 80,66 116,58 120,8 118,22 64,04 Lần 3 11,76 59,29 78,81 114 121,33 115,95 61,93 Trung bình 12,85 ± 0,947f 58,47 ±0,815e 79,18±1,334c 115,44 ±1,316b 120,43±1,131a 116,78 ± 1,254b 62,91 ± 1,062d
Phụ lục 3. 14. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ bằng
phƣơng pháp đo quang
Hoạt độ lipase (mU/g) ion kim loại
Mẫu đối chứng
Mg2+ Ca2+ Mn2+ Na+ EDTA Lần 1 119,2 114,94 110,72 68,05 44,52 23,74 Lần 2 120,8 114,73 112,78 67,68 43,2 26,85 Lần 3 121,3 112,57 112,62 65,78 42,2 26,48 Trung bình 120,43±1,131a 114,08± 1,312b 112,04±1,146b 67,17±1,218c 43,31±1,164d 25,69±1,699e
Phụ lục 3. 15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ sung
Hoạt độ lipase từ mủ sung (mU/ml) Nhiệt độ (0C)
Lần 1 0,04 0,051 0,059 0,093 0,05 0,03 Lần 2 0,038 0,056 0,065 0,088 0,048 0,026 Lần 3 0,042 0,05 0,064 0,091 0,045 0,028 Trung bình 0,04 ±0,002e 0,052±0,003c 0,063±0,003b 0,091±0,003a 0,048±0,003d 0,028±0,002f 30 35 40 45 50 55
Phụ lục 3. 16. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ vả
Nhiệt độ (0C)
PL 20
Lần 1 0,054 0,057 0,061 0,069 0,024 Hoạt độ lipase từ mủ vả (mU/ml) Lần 3 Lần 2 0,057 0,058 0,056 0,062 0,06 0,063 0,073 0,073 0,028 0,028 TB 0,056±0,002c 0,058±0,003b 0,061±0,002b 0,072±0,002a 0,027±0,002d 30 35 40 45 50
55 0,021 0,019 0,022 0,021±0,002e
Phụ lục 3. 17. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ lipase từ mủ sung
pH
Hoạt độ lipase mủ sung (mU/ml) Lần 2 0,046 0,056 0,065 0,072 0,083 0,094 0,072 0,066 0,063 Lần 3 0,045 0,054 0,064 0,074 0,081 0,097 0,071 0,069 0,064 Trung bình 0,044±0,002g 0,054±0,002f 0,064 ±0,002e 0,072±0,003c 0,081±0,002b 0,096±0,002a 0,073±0,002c 0,068±0,002d 0,062±0,002e Lần 1 0,042 0,053 0,062 0,069 0,079 0,096 0,075 0,069 0,06 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10
Phụ lục 3. 18. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ lipase từ mủ vả
Hoạt độ lipase từ mủ vả (mU/ml) pH
Lần 2 0,031 0,047 0,056 0,062 0,067 0,071 0,078 0,057 0,04 Lần 3 0,029 0,046 0,053 0,059 0,065 0,072 0,081 0,053 0,038 Trung bình 0,029±0,002h 0,045±0,003f 0,054±0,002e 0,06±0,002d 0,067±0,002c 0,071±0,001b 0,079±0,002a 0,054±0,003e 0,04±0,002g Lần 1 0,028 0,042 0,054 0,06 0,068 0,07 0,077 0,052 0,042 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10
Phụ lục 3. 19. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase từ mủ sung
Hoạt độ lipase mủ sung (mU/ml) Ion kim loại
PL 21
K+ Ca2+ Mg2+ Mn2+ EDTA Đối chứng Lần 2 0,046 0,065 0,067 0,069 0,039 0,094 Lần 3 0,046 0,064 0,069 0,071 0,038 0,097 Trung bình 0,045±0,002d 0,063±0,003c 0,067±0,002b 0,069±0,003b 0,039±0,002e 0,096±0,002a Lần 1 0,042 0,06 0,066 0,066 0,041 0,096
Phụ lục 3. 20. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase từ mủ sung
Hoạt độ lipase từ mủ vả (mU/ml) Ion kim loại
K+ Ca2+ Mg2+ Mn2+ EDTA Đối chứng Lần 1 0,036 0,051 0,053 0,066 0,047 0,077 Lần 2 0,04 0,049 0,055 0,069 0,045 0,078 Lần 3 0,037 0,052 0,056 0,07 0,043 0,081 Trung bình 0,038±0,002f 0,051±0,002d 0,055±0,002c 0,068±0,002b 0,045±0,002e 0,079±0,002a
Mẫu sấy thăng hoa Mẫu sấy đối lưu
Phụ lục 3. 21. Hoạt độ lipase của mẫu phơi nắng, sấy thƣờng và sấy thăng hoa Mẫu phơi nắng 0,616 0,6649 0,607 0,6293 OD1 OD2 OD3 OD trung bình 0,4657 0,3916 0,4046 0,4206
0,0299 16,158 11,3 88,7 0,0452 24,414 11,8 88,2 0,3805 0,422 0,478 0,427 0,0303*10 (pha loãng 10 lần) 109,361 9,13 90,87
27,6808 18,2175 120,349
Đối chứng 2 tuần 3 tuần 4 tuần 1 tuần 5 tuần 6 tuần
130.64 133.19 120.69 118.87 135.3 128.93 125.81 116.85 127.88 136.51 122.37 129.95 131.48 116.12 130.64 116.76 110.4 124.96 116.71 110.93 101.57
[p-NP] Hoạt độ lipase (mU/g) Độ ẩm (%) % chất khô Hoạt độ lipase tính theo chất khô (mU/g enzyme khô) Phụ lục 3. 22. Sự thay đổi hoạt độ lipase của mủ đu đủ theo gian trữ đông Hoạt độ lipase Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Stdev 129.61 7.08 127 7.35
PL 22
128.88 7.46 128.88 ± 7.46ab 127 ± 7.35ab 126.08 8.64 126.08 ± 8.64ab 123.51 5.86 123.51 ± 5.86ab 117.37 7.3 117.37± 7.3bc 109.74 7.64 109.74± 8.64c 129.61 ± 7.08a
Phụ lục 3. 23. Ảnh hƣởng của tỷ lệ mủ đu đủ/nước đến hoạt độ riêng và hoạt độ tổng của CPL
Tỷ lệ mủ đu đủ/ nước Hoạt độ riêng lipase (mU/g) Hoạt độ lipase tổng (mU)
Stdev 3.19 2.64 3.95 3.48 3.54 3.18 Stdev 0.94 1.73 1.92 2.36 2.29 2.23 77.36 75.79 75.62 74.67 74.53 74.17 38.94 44.78 55.48 65.59 65.85 65.92
Hoạt độ lipase tổng (mU) Hoạt độ riêng lipase (mU/g) Stdev Stdev
1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 Phụ lục 3. 24. Ảnh hƣởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hoạt độ riêng và hoạt độ tổng của CPL. Số lần lặp rửa - ly tâm 1 2 3 4 5 65.26 82.63 115.87 116.02 116.09 74.24 74.05 73.99 73.46 73.42 2.2 1.85 2.53 2.22 2.97 1.84 3.25 2.47 1.49 2.5
Phụ lục 3. 25. Hoạt độ lipase thô của mẫu lipase thô sấy bằng 2 phƣơng pháp sấy thăng hoa và sấy thƣờng
OD1 OD2 OD3 OD trung bình Mẫu sau sấy thường 0,9544 1,0004 1,3811 1,111
Mẫu sau sấy thăng hoa 0,3805 0,422 0,478 0,427 0,0303*10 (pha loãng 10 lần) 109,361 9,13 0,080 29,006 9,55
PL 23
[p-NP] Hoạt độ lipase (mU/g) Độ ẩm mẫu (%) Hoạt độ lipase theo hàm lượng chất khô (mU/g enzyme khô) 120,349 32,069
Phụ lục 3. 26. Hoạt độ của chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ trên các cơ chất khác nhau Hoạt độ lipase (U/g) Dầu cá hồi Dầu đậu nành Triolein Tristearin Trung bình 256,67 ± 3,06a 223,33 ± 11,72b 208,33 ±7,64b 159,67 ± 7,57c Lần 2 256 210 200 163 Lần 1 260 228 210 151 Lần 3 254 232 215 165
% Sodium lauroyl Saccosinate OD [p - NP] TB OD Phụ lục 3. 27. Ảnh hƣởng của nồng độ SLS đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ Hoạt độ lipase mU/ml
0,25% 44,82 0,0830
0,5% 62,00 0,1148
0,75% 0,1100 59,43
1%
1,0567 1,1846 1,1451 1,1941 1,6567 1,6604 1,5792 1,4207 1,5217 1,4874 1,5144 1,5341 1,4542 1,4621 1,453267 0,1055804 57,01 1,4435
Phụ lục 3. 28. Kết quả đo độ đục của dung dịch enzyme lipase ở bước sóng 620 nm.
PL 24
pH 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 OD 0,0270 0,0280 0,0290 0,0280 0,0280 0,0330 0,0642 0,1102 0,0360 0,0348 0,0331 0,0330 0,0321 0,0311 0,0310
Phụ lục 3. 29. Số liệu xác định Km và Vmax Chuẩn bị pha các dung dịch cơ chất p - NPP có nồng độ khác nhau.
Hòa tan 0,015 gam p – NPP vào 5ml dung dịch propanol. Tính nồng độ p – NPP chính là nồng độ cơ chất [S] = 7.946599mM. Tiếp tục pha loãng dung dịch cơ chất gấp đôi từ đó xác định [S] ở các mẫu. Lần lượt cho dịch lipase vào thủy phân cơ chất p – NPP ở 5 nồng độ khác nhau, đo lượng sản phẩm tạo thành bằng phương pháp đo độ hấp thụ xác định OD từ đó xác định được [p-NP] dựa vào phương trình đường chuẩn. Tính được tốc độ phản ứng V. Số liệu thể hiện trong bảng sau
Mẫu Giá trị OD [PNP] mM v (mM/phút) 1/v [S] mM 1/[S]
0.3015 0.021195692 1.0597846 0.94358797 7.946599 0.12584 M1
0.2953 0.020741446 1.037072313 0.96425291 3.973299 0.25168 M2
0.2056 0.014169536 0.708476811 1.4114788 1.98665 0.50336 M3
0.1679 0.011407429 0.570371456 1.75324342 0.993325 1.00672 M4
0.1518 0.010227856 0.511392776 1.95544413 0.79466 1.2584 M5
PL 25
Từ số liệu trên vẽ đồ thị liên hệ giữa 1/v và 1/[S]. Từ đó xác định được Km và Vmax.
PL 26
Phụ lục 3. 30. Kết quả đo sắc ký khí của mẫu dầu cá hồi ban đầu
PL 27
Phụ lục 3. 31. Hình ảnh sắc ký đồ của mẫu dầu cá ban đầu
PL 28
Phụ lục 3. 32. Kết quả đo sắc ký khí của phân đoạn dầu không bị thuỷ phân
PL 29
Phụ lục 3. 33. Hình ảnh sắc ký đồ của phân đoạn dầu không bị thuỷ phân
X1 X2 HS pH (x2)
Phụ lục 3. 34. Số liệu xác định nhiệt độ và pH tối ƣu cho hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL Số thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 nhiệt độ (x1) 35,0000 35,0000 40,0000 40,0000 30,0000 30,0000 42,0711 27,9289 35,0000 35,0000 0,00000 0,00000 1,00000 -1,00000 1,00000 -1,00000 0,00000 0,00000 1,41421 -1,41421 0,00000 0,00000 1,00000 1,00000 -1,00000 -1,00000 1,41421 -1,41421 0,00000 0,00000 8,00000 8,00000 9,00000 7,00000 9,00000 7,00000 8,00000 8,00000 9,41421 6,58579 36,9 37,8 25,8 32,9 35,0 38,9 32,2 37,7 24,8 36,7
1 10 1 2 Replicates: Total runs: 10 Total blocks: 1
DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value 0,011 0,005 0,009 0,005 0,039 0,233 0,016 0,403 0,403 14,56 27,79 22,53 33,05 8,18 1,98 16,23 0,87 0,87
PL 30
Central Composite Design Design Summary Factors: Base runs: Base blocks: α = 1,41421 Two-level factorial: Full factorial Point Types 4 Cube points: 2 Center points in cube: 4 Axial points: 0 Center points in axial: Response Surface Regression: HS versus nhiệt độ, pH Analysis of Variance Source Model Linear nhiệt độ pH Square nhiệt độ*nhiệt độ pH*pH 2-Way Interaction nhiệt độ*pH Error 5 213,283 42,6566 2 162,807 81,4036 66,000 65,9996 1 96,808 96,8076 1 47,916 23,9580 2 5,7857 5,786 1 47,546 47,5457 1 2,5600 2,560 1 2,5600 2,560 1 2,9294 11,718 4
9,31 0,235
11,313 3 0,405 1 9 225,001 3,7709 0,4050
Lack-of-Fit Pure Error Total Model Summary S
R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 63,53% 88,28%
Coef SE Coef T-Value P-Value VIF 37,35 -4,062 -4,920 -2,25 -6,45 -1,60 0,000 0,009 1,00 0,005 1,00 0,233 1,23 0,016 1,23 0,403 1,00 30,86 -4,75 -5,75 -1,41 -4,03 -0,93 1,21 0,856 0,856 1,60 1,60 1,71
1,71156 94,79% Coded Coefficients Term Constant nhiệt độ pH nhiệt độ*nhiệt độ pH*pH nhiệt độ*pH Regression Equation in Uncoded Units HS = -221,0 + 3,86 nhiệt độ + 53,7 pH - 0,0450 nhiệt độ*nhiệt độ - 3,225 pH*pH - 0,160 nhiệt độ*pH
Biểu đồ đƣờng mức và biểu đồ mặt đáp biểu ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH đến hiệu suất thủy phân đƣợc thể hiện trên Hình 3.33 và Hình 3.34.
Hình 3.1. Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH đến hiệu
PL 31
suất thủy phân
Hình 3.2. Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH đến hiệu suất
thủy phân
Phụ lục 3. 35. Số liệu xác định tỷ lệ nƣớc/cơ chất và nồng độ enzyme tối ƣu cho hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL Response Surface Regression: HS versus Nước/cơ chất, độ Enzyme Analysis of Variance
D F Adj SS Adj MS 5 821,784 164,357 2 613,334 306,667 1 302,921 302,921 1 310,413 310,413 2 173,640 86,820 1 164,178 164,178 68,380 1 68,380 F- Value 8,62 16,08 15,88 16,28 4,55 8,61 3,59 P- Value 0,029 0,012 0,016 0,016 0,093 0,043 0,131
1,83 1,83 0,248 0,248
50,52 0,103
34,810 34,810 19,071 25,262 0,500
34,810 1 34,810 1 76,285 4 75,785 3 0,500 1 9 898,069
Source Model Linear Nước/cơ chất Nồng độ Enzyme Square Nước/cơ chất*Nước/cơ chất Nồng độ Enzyme*Nồng độ Enzyme 2-Way Interaction Nước/cơ chất*Nồng độ Enzyme Error Lack-of-Fit Pure Error Total Model Summary S
R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 39,77% 80,89%
PL 32
4,36706 91,51% Coded Coefficients Term Constant Coef SE Coef T-Value P-Value VIF 46,20 14,96 0,000 3,09
8,70 8,81 -11,98 -7,73 -5,90 2,18 2,18 4,08 4,08 4,37 3,99 4,03 -2,93 -1,89 -1,35 0,016 1,00 0,016 1,00 0,043 1,22 0,131 1,22 0,248 1,00
= -125,9 + 60,0 Nước/cơ chất + 67,0 Nồng độ Enzyme - Nước/cơ chất Nồng độ Enzyme Nước/cơ chất*Nước/cơ chất Nồng độ Enzyme*Nồng độ Enzyme Nước/cơ chất*Nồng độ Enzyme Regression Equation in Uncoded Units H S
5,99 Nước/cơ chất*Nước/cơ chất - 15,47 Nồng độ Enzyme*Nồng độ Enzyme - 5,90 Nước/cơ chất*Nồng độ Enzyme
Hình 3.3. Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng của lƣợng nƣớc/cơ chất và
nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân
Hình 3.4. Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc/cơ chất và nồng
PL 33
độ enzyme đến hiệu suất thủy phân
Phụ lục 3.36. Tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá trong hệ 2 pha iso- octan/nước
Xác định nồng độ KOH
Thể tích dung dịch KOH (ml) chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Mẫu lặp 1 Mẫu lặp 2 Trung bình
Nồng độ dung dịch KOH (N) 10,30 10,35 10,33 0,097
Thí nghiệm
Thể tích KOH chuẩn độ ứng với 3 mẫu lặp (ml) Mẫu lặp 2 13,20 13,90 12,10 11,50 13,70 13,65 14,45 11,80 13,80 12,20 13,95 14,40 14,70 13,35 14,80 15,25 15,30 Mẫu lặp 3 13,55 14,30 12,30 11,90 13,30 13,80 14,55 11,85 13,95 11,95 13,85 14,15 14,45 13,25 15,15 15,15 15,60 Mẫu lặp 1 13,45 13,80 12,20 11,40 13,80 13,95 14,05 11,75 13,65 12,00 13,75 14,20 14,50 13,15 14,90 14,95 15,20 Thể tích KOH trung bình (ml) 13,40 14,00 12,20 11,60 13,60 13,80 14,35 11,80 13,80 12,05 13,85 14,25 14,55 13,25 14,95 15,12 15,36 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 T1 T2 T3
Thí nghiệm Nhiệt độ (oC) Chỉ số acid Nồng độ enzyme (%) Hiệu suất thủy phân (%) Thể tích KOH trung bình (ml)
PL 34
Ti lệ dung môi/cơ chất (w/w) 1,5 1,84 1,5 1 1,5 1 0,5 0,5 1,8 1,6 1,4 1,6 1,4 1,94 1,8 1,4 30 35 30 26,6 40 35 40 30 13,40 14,00 12,20 11,60 13,60 13,80 14,35 11,80 72,81 76,07 66,29 63,03 73,89 74,98 77,97 64,11 30,8 32,4 27,5 25,9 31,3 31,9 33,4 26,4 1 2 3 4 5 6 7 8
1,4 1,26 1,6 1,8 1,8 1,6 1,6 1,6 1,6 0,5 1 1 1,5 0,5 0,16 1 1 1 40 35 43,4 40 30 35 35 35 35 13,80 12,05 13,85 14,25 14,55 13,25 14,95 15,12 15,36 74,98 65,47 75,25 77,43 79,06 71,99 81,23 82,15 83,49 9 10 11 12 13 14 T1 T2 T3 31,9 27,1 32,0 33,1 33,9 30,4 35,0 35,5 36,1
Response Surface Regression: Hiệu suất thủy phân (%) nhiệt độ (độ C) Analysis of Variance
Source Model DF Adj SS Adj MS 15,9728 F- Value 8,35
0,016
9 143,75 5 3 69,374 23,1247 1 35,958 35,9585 1 0,0155 1 33,400 33,4001 3 65,298 21,7659 1 37,487 37,4872 1 14,971 14,9707 12,09 18,80 0,01 17,46 11,38 19,60 7,83
1 45,904 45,9041 3,0279 3 1,9012 1 9,084 1,901 24,00 1,58 0,99
1 1 7,031 0,151 7,0312 0,1513 3,68 0,08
8,43
1,9124 2,5560 0,3033
PL 35
Linear Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C) Square Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) 2-Way Interaction Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) Error Lack-of-Fit Pure Error Total 7 13,387 5 12,780 0,607 2 16 157,14 2
P-Value 0,005 0,004 0,003 0,931 0,004 0,004 0,003 0,027 0,002 0,277 0,352 0,097 0,787
0,109
Source Model Linear Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C) Square Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) 2-Way Interaction Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) Error Lack-of-Fit Pure Error Total Model Summary S
R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 35,12% 80,53%
1,38290 91,48% Coded Coefficients
Term Constant SE Coef 0,797 T- Value 44,47 P- Value 0,000
Coef 35,45 2 2,746 0,057 2,628 -5,18 -3,26 0,633 0,629 0,629 1,17 1,17 4,34 0,09 4,18 -4,43 -2,80 0,003 0,931 0,004 0,003 0,027
-5,71 -1,39 1,17 1,40 -4,90 -1,00 0,002 0,352
-2,68 0,39 -1,92 0,28 0,097 0,787
PL 36
Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C) Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) Term 1,40 1,38 VIF
Constant 1,00 Nồng độ enzyme (%) 1,00 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) 1,00 Nhiệt độ (độ C) 1,16 Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) 1,16 1,16 Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) 1,00 Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) 1,00 Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) 1,00 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) Regression Equation in Uncoded Units
= -265,4 + 189,2 Nồng độ enzyme (%)
Hiệu suất thủy phân (%)
+ 15,2 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) + 7,42 Nhiệt độ (độ C) - 44,8 Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) -4,62 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) - 0,0810 Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) - 4,87 Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) - 0,937 Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) + 0,055 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C)
Fits and Diagnostics for Unusual Observations
Hiệu suất thủy phân (%) Std Resid
2,31 R Obs 15 Fit Resid 33,900 32,060 1,840
R Large residual Effects Pareto for Hiệu suất thủy phân (%) Các biểu đồ đường mức và biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố
PL 37
đến hiệu suất thủy phân được thể hiện trên Hình 3.40, Hình 3.41, Hình 3.42, Hình 3.43, Hình 3.44, Hình 3.45.
Hình 3.5. Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng của nồng độ enzyme và nhiệt
độ đến hiệu suất thủy phân
Hình 3.6. Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng của nồng độ enzyme và nhiệt độ
đến hiệu suất thủy phân
PL 38
Từ biểu đồ đường mức biểu thị ảnh hưởng của nồng độ enzyme và nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân cho thấy vùng có hiệu suất thủy phân cao nhất nằm trong khoảng nồng độ enzyme là (1,57 – 1,8%) và nhiệt độ là (34 – 38,7oC).
Hình 3.7. Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng của nồng độ enzyme và tỷ lệ
dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân
Hình 3.8. Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng của nồng độ enzyme và tỷ lệ
dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân
PL 39
Từ biểu đồ đường mức biểu thị ảnh hưởng của nồng độ enzyme và tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân cho thấy vùng có hiệu suất thủy phân cao nhất nằm trong khoảng nồng độ enzyme là (1,6 – 1,8%) và tỷ lệ dung môi/cơ chất là (0,65 – 1,25).
Hình 3.9. Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi/cơ chất và
nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân
Hình 3.10. Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi/cơ chất và
nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân
PL 40
Từ biểu đồ đường mức biểu thị ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/cơ chất và nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân cho thấy vùng có hiệu suất thủy phân cao nhất nằm trong khoảng nhiệt độ là (35,3 – 39oC) và tỷ lệ dung môi/cơ chất là (0,75 – 1,28).
Phụ lục 3.37. Kiểm chứng điều kiện tối ưu bằng thực nghiệm của quá trình thủy phân dầ cá hồi bằng CPL trong hệ 2 pha iso-octan/nước
Xác định nồng độ KOH
Thể tích dung dịch KOH (ml) chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Mẫu lặp 1 Mẫu lặp 2 Trung bình
10,30 10,30 10,30 0,097 Nồng độ dung dịch KOH (N)
Chỉ số acid Thể tích KOH trung bình (ml) Hiệu suất thủy phân (%)
15,15 82,52 35,7
Thể tích KOH chuẩn độ ứng với 3 mẫu lặp (ml) 15,05 15,10 15,30
Phụ lục 3.38. Xác định Km và Vmax Xác định nồng độ KOH
Thể tích dung dịch KOH (ml) chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Mẫu lặp 1 Mẫu lặp 2 Trung bình
11,05 11,00 11,03 0,091 Nồng độ dung dịch KOH (N)
dầu. V hỗn hợp) Nồng độ cơ chất dầu cá hồi [S] ban đầu được xác định là số mol acid béo liên kết có trong 1ml thể tích hỗn hợp. Số mol acid béo liên kết được xác định thông qua chỉ số ester chính là chỉ số xà phòng trừ chỉ số acid. Thể tích (V) V hỗn hợp = V nước cất + V dung dịch đệm + V dầu + V dung môi = 3 + 1 + khối lượng dầu.Khối lượng riêng dầu + khối lượng dung môi.Khối lượng riêng dung môi. = 4 + khối lượng dầu.0,892 + khối lượng dung môi.0,69 (ml). [S] = số mol dầu/V hỗn hợp =khối lượng dầu/(
glycerol + 3
acid béo – 3MH2O
dầu =
acid béo
acid béo =
= 38,5 - 3
PL 41
xi: tỷ lệ % theo khối lượng của từng acid béo thành phần thứ i
: khối lượng phân tử của từng acid béo thành phần thứ i
n: số acid béo có mặt trong dầu KLPT trung bình của các acid béo trong dầu cá hồi xi% , xi
2,87 10,8 2,86 2,65 36,3 14,9 0,32 5,4 0,88 2,24 4,53 5,02 88,77 880,42 228,4 256,4 254,4 284,5 282,5 280,4 312,5 278,4 310,5 308,5 302,5 328,5 655,508 2769,12 727,584 753,925 10254,75 4177,96 100 1503,36 273,24 691,04 1370,325 1649,07 280,79
số Chỉ số acid Nồng độ cơ chất [S] Số mol acid béo liên kết
PL 42
myristic acid methyl ester palmitic acid ester palmitoleic acid methyl ester stearic acid methyl ester oleic acid methyl ester linoleic acid methyl ester arachidic acid methyl ester linolenic acid methyl ester cis-11-eicosenoic acid methyl ester cis-11,14-eicosadienoic acid methyl ester EPA DHA sum KLPT TB của dầu cá hồi Tính nồng độ cơ chất ban đầu [S] Chỉ Khối este lượng dầu (g) 1 2 3 4 Chỉ số xà phòng hóa 210,4 210,4 210,4 210,4 198,75 198,75 198,75 198,75 11,65 11,65 11,65 11,65 3549,462 7098,924 10648,386 14197,848 Thể tích hỗn hợp (ml) 6,57 7,7 8,82 9,94 540,253 921,938 1207,3 1428,355
1/[S] VKOH 1/v Dầu cá số mol FFA số mol KOH Nồng độ cơ chất [S] Thời gian (phút) V hỗn hợp số mol FFA tạo thành (*) Tốc độ phản ứng (v)
15,45 1401,360544 1401,360544 0,35 540,25 0,0019
9,95 902,4943311 902,4943311 487,1645628 13,51 1225,396825 1225,396825 810,0670571 1582,76644 1167,436672 17,45 2000 1584,670232 22,05 1582,76644 2000 0,3 921,94 0,0011
1207,3 0,0008
15,25 1383,219955 1383,219955 552,5604181 9,94
22,3 2022,675737 2022,675737
PL 43
Nồng độ FFAs tạo thành 0 66,4 7,1 643,9909297 643,9909297 436,3260456 6,57 9,17 831,7460317 831,7460317 624,0811476 6,57 95 11,9 1079,365079 1079,365079 871,7001952 6,57 132,7 1193,69566 6,57 181,7 0 63,3 7,7 7,7 105,2 7,7 151,6 7,7 205,8 0 12,17 1103,854875 1103,854875 480,8602229 8,82 54,5 17,29 1568,253968 1568,253968 945,2593158 8,82 107,2 20,95 1900,226757 1900,226757 1277,232105 8,82 144,8 28,35 2571,428571 2571,428571 1948,433919 8,82 220,9 0 55,6 1192,0162 9,94 119,9 26,02 2360,090703 2360,090703 1529,431166 9,94 153,9 34,55 3133,786848 3133,786848 2303,127312 9,94 231,7 2,86 3,33 3,55 0,282 3,74 0,267 0 15 30 45 60 0 15 30 45 60 0 15 30 45 60 0 15 30 45 60 1428,36 0,0007 1gam 2gam 3gam 4gam
Ghi chú: Số mol FFA tạo thành (*) = số mol FFA - số mol FFA ban đầu Số mol FFA ban đầu = 207,6649 Phụ lục 3.39. Xác định năng lượng hoạt hóa E
Xác định nồng độ KOH
Thể tích dung dịch KOH (ml) chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Mẫu lặp 1 Mẫu lặp 2 Trung bình
Nồng độ dung dịch KOH (N) 11,45 11,55 11,50 0,087
Nhiệt độ (K) Thể tích KOH trong 3 lần lặp (ml) Thể tích KOH trung bình (ml) Nồng độ FFAs tạo thành trong 1 giờ đầu (µmol FFAs) Vận tốc phản ứng trong 1 giờ đầu (µmol FFAs/phút,ml)
298 10,65 109,4 1,82
303 13,12 142,0 2,37
308 17,00 193,6 3,23
PL 44
10,70 10,60 10,65 13,05 13,15 13,15 17,00 17,10 16,90
