Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ----------------------------------------

i liệu trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

LỜI CAM ĐOAN BÙI THỊ THU HUYỀN

Tác giả luận án

NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ

CHỌN TẠO GIỐNG ĐẬU XANH KHÁNG BỆNH Bùi Thị Thu Huyền

KHẢM VÀNG

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ----------------------------------------

BÙI THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG ĐẬU XANH KHÁNG BỆNH KHẢM VÀNG

Chuyên ngành

: Di truyền và chọn giống cây trồng

Mã số

: 62.62 01 11

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

NGƯỜ I HƯỚ NG DẪ N KHOA HỌC

1. PGS.TS. Hà Viết Cường

2. TS. Trần Danh Sửu

HÀ NỘI – 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận

án là do tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả nghiên cứu đã nêu trong

luận án là trung thực và chưa được ai công bố trên bất kỳ một công trình

nghiên cứu nào khác. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ đã được cám ơn,

các tài liệu trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận án

Bùi Thị Thu Huyền

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận án này, nghiên cứu sinh đã nhận được sự tận

tình giúp đỡ của nhiều tập thể và cá nhân.

Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Hà Viết Cường, TS. Trần Danh Sửu, những người thầy đã tận tình dẫn dắt, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận án.

Nghiên cứu sinh biết ơn những ý kiến đóng góp quý báu của các Thầy Cô công tác tại Ban Đào tạo sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam trong suốt quá trình học tập tại đây.

Nghiên cứu sinh xin chân thành cảm ơn các cán bộ, bạn bè đồng nghiệp công tác tại Bộ môn Nhân giống và đánh giá nguồn gen, Bộ môn Đa dạng sinh học Nông nghiệp – Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Phòng Virus học và Phòng chỉ thị Phân tử - Trung tâm Rau Thế giới đã chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ động viên trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Nghiên cứu sinh xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban Lãnh Đạo Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Chủ nhiê ̣m tiểu dự á n GIZ tại Viê ̣t Nam, TS. Nguyễn Thi ̣ Lan Hoa, Chủ nhiê ̣m Dự á n GIZ tại AVRDC, TS. Lawrence Kenyon, HTX Nam An Nghiệp, huyện Tuy An, Phú Yên đã tạo điều kiện học tập và giúp đỡ tận tình trong quá trình thực hiện nghiên cứu này.

Cuối cùng, nghiên cứu sinh xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên

khích lệ trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Bùi Thị Thu Huyền

iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục ii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

5 Danh mục hình MỞ ĐẦ U CHƯƠNG I: TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU, CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1. Cây đậu xanh 5

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại của cây đậu xanh 5

1.1.2. Đặc điểm nông sinh học và yêu cầu sinh thái của cây đậu xanh 6

1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu xanh 7

1.1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất đậu xanh trên thế giới và Việt Nam 8

1.2. Đa dạng di truyền cây đậu xanh 13

1.2.1. Kích thước bộ gen cây đậu xanh 13

1.2.2. Các chỉ thị ADN dùng cho đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh 14

1.2.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đậu xanh bằng chỉ thị phân tử 14

1.2.4. Đa dạng nguồn gen cây đậu xanh 17

1.3. Những nghiên cứu về bệnh khảm vàng đậu xanh 18

1.3.1. Bệnh khảm vàng hại đậu xanh và lịch sử phát hiện 18

1.3.2. Triệu chứng và tác hại do bệnh khảm vàng gây ra 19

1.3.3. Virus gây bệnh khảm vàng và đặc điểm cấu trúc bộ gen. 21

1.3.4. Con đường lây truyền bệnh 23

1.3.5. Điều kiện sinh thái của vectơ và virus 24

1.3.6. Phổ ký chủ của virus 24

1.3.7. Nghiên cứu nguồn kháng virus và vectơ 25

1.3.8. Đánh giá nguồn gen và chọn giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng 26

1.4. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền và ứng dụng trong cải tiến giống

ở cây đậu xanh. 29

1.4.1. Nghiên cứu lập bản đồ di tuyền ở cây đậu xanh 29

1.4.2. Lập bản đồ so sánh bộ gen 34

1.4.3. Nghiên cứu lập bản đồ các gen chính và QTL ở đậu xanh 35

1.4.4. Lập bản đồ vật lý trên cây đậu xanh 37

1.4.5. Tiềm năng ứng dụng những thành tựu nghiên cứu hệ gen đậu xanh

trong cải tiến di truyền cây trồng kháng bệnh nhờ MAS 41

1.5. Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử và lập bản đồ phân tử ở Việt Nam 43

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁ P NGHIÊN CỨ U 44

2.1. Vật liệu nghiên cứu 44

2.2. Nội dung nghiên cứu 45

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 45

2.4. Phương pháp nghiên cứu 46

2.4.1. Phương pháp xác định virus gây bệnh khảm vàng đậu xanh 46

2.4.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền sử dụng DArT 49

2.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh 50

2.4.4. Phương pháp đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự (GBS) 53

2.4.5. Phân tích QTLs (Quantitative Trait Loci) 57

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 58

3.1. Phân lập và xác định virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh 58

3.1.1. Kết quả thu mẫu bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh, các cây họ đậu

khác tại Việt Nam 58

3.1.2. Thiết kế mồi phát hiện các virus gây hại trên cây đậu xanh và các cây

họ đậu khác bằng kỹ thuật PCR 60

3.1.3. Kết quả chuẩn đoán bệnh virus trên đậu xanh và các cây họ đậu khác

bằng kỹ thuật PCR 64

3.1.4. Kết quả giải và phân tích trình tự ADN-A của begomovirus 66

3.1.5. Kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài của MYMV từ các trình tự

ADN-A và ADN-B hoàn chỉnh của Việt Nam 68

3.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đồng ruộng và đặc điểm

nông sinh học của các mẫu giống đậu xanh 72

3.2.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng 72

3.2.2. Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống đậu xanh 79

3.3. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen đậu xanh 86

3.3.1. Thống kê các chỉ tiêu đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị DArT 87

3.3.2. Phân tích khoảng cách di truyền của các giống đậu xanh 90

3.3.3. Kết quả chọn tổ hợp lai để xây dựng quần thể lập bản đồ 95

3.4. Nghiên cứu lập bản đồ gen ở cây đậu xanh 97

3.4.1. Đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng 97

3.4.2. Đánh giá kiểu gen kháng bệnh khảm vàng bằng giải trình tự 106

3.4.3. Lập bản đồ liên kết di truyền, bản đồ vật lý của quần thể

đậu xanh nghiên cứu 109

3.4.4. Lập bản đồ QTL cho tính kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh 111

Kết luận và đề nghị 120

Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 122

Tài liệu tham khảo 122

Phụ lục 143

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN AFLP

ARN A,C,G,T

Axít Deoxyribonucleic Đa hình chiều dài đoạn phân cắt được nhân bội Axít Ribonucleic

bp BSA CAPS

cM CRM

Cặp bazơ Phân tích phân ly nhóm Đa hình các phân đọan nhân bản được cắt giới hạn Đơn vị khoảng cách bản đồ di truyền Bản đồ tham khảo

CTAB

DArT EST

Acid Deoxyribo Nucleic Amplified Fragment Length Polymorphism Acid Ribonucleic Adenine, Cytosine, Guanine, Thyamine Base pair Bulked Segregant Analysis Cleaved Amplified Polymorphic Sequences Centimorgan Comprehensive reference map Cetyltrimethylammonium bromide Diversity Array Technology Công nghệ phân tích đa dạng Expressed Sequence Tag

Hê ̣ số di ̣ hơ ̣p Trình tự xen giữa các SSR

Đoa ̣n trình tự biểu hiê ̣n (là một đoạn trình tự ngắn của một chuỗi cDNA) Genotyping by Sequencing Đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự GBS Observerd Heterogeneity H Inter-Simple Sequence ISSR Repeat Linkage group LG Marker Assisted Selection MAS NBS-LRR Nucleotide binding site –

Nhóm liên kết Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử Vị trí liên kết nucleotide tại những Vùng lặp lại giàu leucine Hệ số đa dạng gen

PIC

PCR QTLs RAPD

RFLP

RGAs RIL SFR SSRs SNP

Phản ứng chuỗi trù ng hơ ̣p Những locut tính trạng số lượng Đa hình ADN được nhân bô ̣i ngẫu nhiên Đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn Những yếu tố tương tự gen kháng Dòng thuần tái hơ ̣p Đô ̣ phân giải cao Những trình tự lặp lại đơn giản Đa hình một nucleotid

leucine rich repeat Polymorphism Information Content Polymerase chain reaction Quantitative trait loci Randomly amplified polymorphic DNA Restriction fragment length polymorphisms Resistance gene analog Recombinant inbred lines Super Fine Resolution Simple sequence repeats Single nucleotide polymorphisms

vii

DANH MỤC BẢNG

Trang

Tên bảng

TT bảng 1.1 Một số loài hoang dại và loài trồng thuộc chi Vigna với tên

thường gọi và nguồn gốc phát sinh

Diện tích và năng suất đậu xanh ở Việt Nam 1.2 13

Nguồn gốc các nguồn gen đậu xanh được đánh giá khả năng 2.1 44

kháng bệnh khảm vàng tại Phú Yên

Các mồi chung phát hiện ADN-A và ADN-β 2.2 47

Thang điểm (1-6) đánh giá bệnh khảm vàng (MYMD) 2.3 51

Tổng hợp kết quả điều tra, thu thập mẫu bệnh Begomovirus 3.1 58

Kết quả thiết kế mồi cho ADN-A của begomovirus 3.2 63

Tổng hợp kết quả thu thập theo nhóm cây trồng 3.3 64

Trình tự của các cặp mồi chống lưng được thiết kế để khuếch đại 3.4 67

toàn bộ ADN-A và ADN-B của MYMV thu thập từ Việt Nam

Các mẫu bệnh được giải trình tự đoạn ADN-A và ADN-B có 3.5 71

chiều dài hoàn chỉnh (full length)

Thống kê mức độ nhiễm bệnh khảm vàng của tập đoàn đậu xanh 3.6 74

tại Phú Yên vụ Hè 2012 và 2013

Danh sách các nguồn gen đậu xanh có khả năng kháng bệnh 3.7 75

khảm vàng được đánh giá tại Phú Yên qua 2 năm 2012 và 2013

Kết quả phân tích ANOVA về ổn định tính kháng của các nguồn 3.8 77

gen đậu xanh nghiên cứu qua các năm

Thời gian sinh trưởng và chiều cao cây của các nguồn gen đậu 3.9 82

xanh trong tập đoàn

3.10 Tham số thống kê và phân bố các yếu tố cấu thành năng suất và 84

năng suất của các nguồn gen trong tập đoàn đậu xanh

viii

3.11 Danh sách các mẫu giống đậu xanh triển vọng trong tập đoàn 86

đậu xanh vụ Hè 2013

3.12 Các giá trị nội dung thông tin đa hình (PIC) cho 560 chỉ thị DarT 87

3.13 Mối quan hệ giữa chất lượng và các thành phần khác của các 88

chỉ thị DArT với 92 nguồn gen đậu xanh

3.14 Các giá trị PIC cho các chỉ thị DArT đa hình với 54 nguồn gen 89

đậu xanh

3.15 Mối quan hệ giữa chất lượng và các thành phần khác của các 89

chỉ thị DArT với 54 nguồn gen đậu xanh

3.16 Bảng tổng hợp các chỉ tiêu chọn các cặp bố mẹ 96

3.17 Phân ly kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng của quần thể 100

đậu xanh 200 dòng F2:3 và 71 dòng F2:3 rút gọn

3.18 Phân tích quy luật di truyền tính kháng bệnh khảm vàng của 101

quần thể đậu xanh F2:3 trên đồng ruộng

3.19 Một số đặc điểm nông sinh học chính của hai dòng đậu xanh F5 105

triển vọng: dòng 148 và dòng 178

3.20 Kết quả gọi ra chỉ thị SNP từ phân tích GBS 108

3.21 Tổng hợp lập bản đồ di truyền đậu xanh dựa trên chỉ thị SNP 110

3.22 Các QTL quy định tính trạng kháng MYMV của quần thể 113

đậu xanh F2:3 lập bản đồ

3.23 Trình tự ADN chứa chỉ thị SNP liên kết với các vùng QTL chính 114

3.24 Các vùng QTL xác định được bằng phương pháp SMR 116

3.25 Các vùng QTL xác định được bằng phương pháp CIM 118

3.26 Danh sách các chỉ thị được lựa chọn cho việc đánh giá chỉ thị 119

DANH MỤC HÌNH

Tên hình

Trang

TT hình 1.1 Quan hệ di truyền giữa các loài thuộc chi Vinga

11 1.2 Diện tích đậu xanh của một số nước trên thế giới

11 1.3 Sản lượng đậu xanh của một số nước trên thế giới

12 1.4 Năng suất TB của một số nước trên thế giới

19 1.5 Phân bố bệnh khảm vàng ở Châu Á

20 1.6 Triệu chứng bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh

22 1.7 Cấu trúc hệ gen của Begomovirus bộ gen kép

23 1.8 Vectơ truyền bệnh – Bọ phấn (Bemisa tabaci)

25 1.9 Các loài thuộc chi Vigna bị bệnh khảm vàng gây ra bởi MYMV

52 2.1 Tạo cây nguồn để lây nhiễm nhân tạo

54 2.2 Các adapter cho GBS, các mồi giải trình tự và PCR

55 2.3 Các bước xây dựng thư viện cho GBS

56 2.4 Quy trình phân tích số liệu GBS

59 3.1 Các triệu chứng khảm vàng ở đậu xanh tại Phú Yên

59 3.2 Định vị các vùng thu thập mẫu bệnh khảm vàng chính tại Việt

Nam, năm 2011-2013

66 3.3 Minh họa phản ứng PCR phát hiện begomovirus trên cây đậu xanh

70 3.4 Cây phát sinh loài của begomovirus gây hại cây họ đậu xây dựng

dựa trên trình tự nucleotide đầy đủ ADN-A

3.5 Cây phát sinh loài của begomovirus gây hại cây họ đậu xây dựng 70

dựa trên trình tự nucleotide đầy đủ ADN-B

3.6 Tỉ lệ phản ứng của các nguồn gen đậu xanh với bệnh khảm vàng 74

vụ Hè năm 2012 và 2013 tại Phú Yên

3.7 Biểu đồ nhiệt độ, lượng mưa tại Phú Yên 2010-2012 76

3.8 Độ ổn định tính kháng của các nguồn gen đậu xanh kháng bệnh 77

qua các năm

3.9 Động thái tăng triệu chứng bệnh của các nguồn gen đậu xanh 77

kháng bệnh so với đối chứng nhiễm bệnh

3.10 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các nguồn gen kháng NM92, 78

NM94, VC3960-88 sử dụng cặp mồi MY-AF1/R1

3.11 Các giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng được chọn lọc 79

tại Tùy Hòa, Phú Yên năm 2012-2013

3.12 Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ của 94 nguồn gen đậu xanh 93

nghiên cứu

3.13 Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ của 54 nguồn gen đậu xanh 94

nghiên cứu

98 3.14 Phân bố kiểu hình kháng bệnh khảm vàng của quần thể F2:3 đậu xanh

3.15 Đánh giá kiểu hình kháng bệnh ở 35 và 55 ngày sau trồng 99

3.16 Phân lớp kiểu hình kháng bệnh MYMV của 200 dòng và 71 dòng 100

quần thể đậu xanh F2:3

103 3.17 Lây nhiễm 71 dòng của quần thể đậu xanh F2:3 bằng bọ phấn

3.18 Triệu chứng của bệnh MYMV sau lây nhiễm 103

3.19 Phân ly kiểu hình tính kháng của quần thể đậu xanh tuân theo 104

quy luật phân phối chuẩn

3.20 Hình ảnh hạt và quả của dòng đậu xanh triển vọng 178 và 148 106

3.21 Kiểu hình kháng bệnh của dòng 148 106

3.22 Biểu đồ biểu diễn số lượng đoạn đọc ngắn trên mỗi mẫu thu được 107

từ giải trình tự

3.23 Bản đồ liên kết di truyền của quần thể đậu xanh nghiên cứu 110

3.24 Bản đồ vật lý gồm 11 nhiễm sắc thể của quần thể đậu xanh 111

NM94xKPS2 (được lập bằng GBS)

3.25 Các vùng QTL chính của tính trạng kháng MYMV của quần thể 114

đậu xanh trên các nhiễm sắc thể và giá trí LOD của nó

3.26 Vị trí các vùng QTL trên bản đồ vật lý của đậu xanh bằng SMR 116

3.27 Vị trí các vùng QTL trên bản đồ vật lý của đậu xanh bằng CIM 118

MỞ ĐẦ U

1. Tính cấp thiết của đề tài

Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek.) là một trong những cây thực

phẩm họ đậu quan trọng ở Châu Á nói chung, khu vực Nam Á và Đông Nam

Á nói riêng trong đó có Việt Nam. Đậu xanh rất giàu và cân đối protein, thời

gian sinh trưởng ngắn, có khả năng chịu hạn, thích ứng rộng với môi trường.

Tuy nhiên, năng suất đậu xanh hiện nay còn thấp và biến động lớn giữa các

quốc gia. Nguyên nhân chính làm cho năng suất đậu xanh thấp là do sâu bệnh

hại và thiếu giống kháng sâu bệnh.

Một trong những bệnh hại nghiêm trọng nhất đến canh tác đậu xanh là

bệnh khảm vàng hay còn gọi là bệnh hoa lá đậu xanh (Mungbean yellow

mosaic virus – MYMV). Đây là bệnh phổ biến trên cây đậu xanh ở các nước

như Ấn Độ, Bangladesh, Sri Lanka và Thái Lan... Bệnh không chỉ gây hại

trên đậu xanh mà còn gây hại trên một số loài cây họ đậu khác như đậu xanh

đen, đậu tương, đậu cowpea …. Nguyên nhân gây bệnh là do một hoặc nhiều

virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus) gây ra và được lan truyền bởi

vectơ truyền bệnh là bọ phấn (Bemisia tabaci Genn.). Bệnh khảm vàng đã

từng gây hại rất nghiêm trọng, làm mất 100% năng suất tại Ấn Độ và Thái

Lan, gây thiệt hại kinh tế trên 300 triệu USD (Varma, 1992).

Bệnh khảm vàng do có phổ ký chủ rộng và được truyền bởi bọ phấn theo

cơ chế không bền vững nên việc kiểm soát bằng hóa học không khả thi và gây

nguy hại đến môi trường. Sử dụng các giống kháng bệnh được đánh giá mang

lại hiệu quả tối ưu, là cách ổn định và an toàn để quản lý dịch bệnh. Do vậy,

nghiên cứu xác định nguồn gen kháng là công việc được quan tâm không chỉ

ở Việt Nam mà ở nhiều quốc gia khác trên thế giới và một số nguồn gen

kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh đã được phát hiê ̣n.

Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ chỉ thị phân tử, nhiều locut

gen kháng sâu bệnh chính đã được định vị trên bản đồ bộ gen của cây đậu

xanh. Chỉ thị phân tử liên kết vớ i tính kháng bê ̣nh khảm vàng trên đâ ̣u xanh cũng đã đươ ̣c báo cáo nhưng các chỉ thị này đều liên kết xa với tính trạng.

Trong số các chỉ thị phân tử, SNP là chỉ thị thế hệ mới, có số lượng cao trong

bộ gen do vậy được ứng dụng tốt cho tăng mật độ chỉ thị, lập bản đồ QTL và

chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử với nhiều thông tin. Sự phát triển nhanh chóng

của các công nghệ giải trình tự thế hệ mới đã giúp dễ dàng phát hiện các SNP

trên toàn bộ hệ gen. Điều này gợi mở cho việc ứng dụng chỉ thị SNP trong

chọn tạo giống cây trồng nhờ chỉ thị phân tử.

Tại Việt Nam, đậu xanh là cây đậu đỗ đứng thứ ba sau lạc và đậu tương.

Đậu xanh được trồng từ Bắc vào Nam. Diện tích trồng đậu xanh của Việt

Nam năm 2015 là 90.950 ha trong đó các tỉnh Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ

và Tây Nguyên là vùng trồng chính với 67,8% diện tích trồng cả nước (2015).

Bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh đã được quan sát ở Việt Nam với các triệu

chứng điển hình từ những năm 1980 (Phan Hữu Trinh và cs., 1986). Bệnh gây

mất năng suất từ 20-70% trên các diện tích trồng. Tuy nhiên, cho đến nay

chưa có nghiên cứu nào xác định virus gây bệnh khảm vàng cũng như xác

định gen kháng bệnh. Vì thế, công tác đánh giá khả năng kháng bệnh khảm

vàng của tập đoàn đậu xanh để tìm ra nguồn gen kháng bệnh, nghiên cứu xác

định cơ sở di truyền tính kháng, lập bản đồ định vị gen kháng sẽ góp phần

thúc đẩy công tác khai thác, sử dụng các nguồn gen kháng làm nguồn vật liệu

cho chương trình chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh ở nước ta.

Xuất phát từ yêu cầu thực tế sản xuất đậu xanh, nhằm cung cấp thêm cơ

sở khoa học và vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh,

chúng tôi đã tiến hành đề tài: "Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo

giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng".

2. Mục tiêu của đề tài

Tìm hiểu, xác định bản chất di truyền tính kháng bệnh khảm vàng trên

cây đậu xanh ở mức phân tử, giới thiệu nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo

giống đậu xanh kháng bệnh.

Mục tiêu cụ thể của đề tài:

- Xác định được virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh tại Việt Nam.

- Xác định được di truyền tính kháng bệnh khảm vàng ở cây đậu xanh.

- Xác định được các QTL kháng bệnh khảm vàng.

- Giới thiệu được một số nguồn gen đậu xanh triển vọng làm vật liệu

khởi đầu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng và

năng suất cao tại Việt Nam.

3. Ý nghi ̃a khoa ho ̣c và thư ̣c tiễn củ a đề tài

Việc xác định được nguyên nhân gây bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh

tại Việt Nam là MYMV, xác định nguồn gen kháng bệnh, đánh giá đa dạng di

truyền, thiết lập bản đồ gen kháng ở giống đậu xanh làm cơ sở khoa ho ̣c cho

công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh.

Xác định di truyền tính kháng bệnh và các chỉ thị SNP liên kết với gen

kháng bệnh khảm vàng ở giống đậu xanh nhập nội NM94 không chỉ nhằm

xác định nguồn gen kháng mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao trong việc khai

thác hiệu quả các nguồ n gen kháng bê ̣nh phục vụ công tác cho ̣n ta ̣o giố ng đâ ̣u

xanh kháng bê ̣nh.

4. Những đóng góp mới của luận án

Đây là đề tài đầu tiên ở Việt Nam đã xác định được virus gây bệnh khảm

vàng trên cây đậu xanh là MYMV.

Đã thiết lập được bản đồ di truyền gồm 11 liên kết tương ứng với 11

nhiễm sắc thể trên bộ gen của cây đậu xanh dựa trên chỉ thị SNP bằng phương

pháp GBS.

Đã xác định được vị trí các QTL kháng bệnh khảm vàng trên bản đồ di

truyền và bản đồ vật lý ở nguồ n gen đâ ̣u xanh nhâ ̣p nô ̣i NM94.

5. Đố i tươ ̣ng và pha ̣m vi nghiên cứ u

5.1. Đối tượng nghiên cứu

Bệnh khảm vàng hại đậu xanh do côn trùng môi giới truyền bệnh là bọ

phấn và các đặc điểm nông sinh học của các nguồ n gen đậu xanh được thu thập

ở Việt Nam và nhập nội có nguồn gốc địa lý khác nhau.

5.2. Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu bản chất di truyền tính kháng bệnh virus trên cây đậu xanh ở

mức phân tử và đặc điểm hình thái nông học của cây đậu xanh bản địa và

nhập nội. Giới thiệu nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh

kháng bệnh và năng suất tại Việt Nam.

Các thí nghiệm của đề tài được thực hiện ta ̣i phò ng thí nghiê ̣m, hê ̣ thố ng nhà lướ i, nhà kính củ a Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Rau Thế giới (AVRDC, Đài Loan), HTX Nam An Nghiệp, huyện Tuy An, Phú Yên trong

giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2015

CHƯƠNG I TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1. CÂY ĐẬU XANH

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại của cây đậu xanh

Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ và được thuần hóa từ 1500 năm trước

công nguyên. Các loài đậu xanh trồng sau đó được du nhập đến Đông Nam Á,

Châu Phi, Châu Úc, Châu Mỹ và Tây Ấn. Một số lượng lớn đậu xanh, cả dạng

hoang dại và dạng trồng, có mặt rộng khắp trên các vùng đồng bằng của tiểu

lục địa Ấn Độ. Đậu xanh cũng được phát hiện ở vùng Tây Bắc dãy

Himalayas, trên độ cao 1850 m so với mặt nước biển và phân bố khắp vùng

nhiệt đới (Mogotsi, 2006).

Đậu xanh đã từng được phân loại là Phaseolus aureus Roxb. trước khi

được chuyển sang chi Vigna (Lambrides và Godwin, 2006). Chi Vigna có liên

quan chặt chẽ với chi Phaseolus tạo thành một nhóm phân loại phức tạp, vì

vậy được gọi là phức hệ Phaseolus-Vigna.

Verdcourt (1970) đã đề xuất chi Phaseolus chỉ dành riêng cho những

loài thuộc Châu Mỹ. Theo đề xuất của ông, đậu xanh và họ hàng thân thuộc

của nó đã được chuyển sang chi Vigna.

Gần đây, đậu xanh được xếp vào họ Fabaceae. Có hai loài đậu xanh

được thuần hóa là Vigna radiata (đậu xanh) và Vigna mungo (đậu xanh đen).

Verdcourt (1970) đã tách V. radiata được chia thành ba nhóm phụ: V.

radiata var. radiata (đậu xanh trồng hiện nay), V. radiata var. sublobata

(dạng hoang dại) và V. radiata var. glabra (có thân, lá và quả nhẵn).

Một số đậu thuộc chi Vigna gần gũi với đậu xanh (Bảng 1.1 và Hình 1.1)

Bảng 1.1. Một số loài hoang dại và loài trồng thuộc chi Vigna

Tên khoa học

V. aconitifolia (Jacq.) V. angularis (Wild) V. glabrescens (Marechal, Mascharpa Stainier) V. mungo (L.) Hepper V. radiata (L.) Wilczek V. trilobata (L.) Verdc. V. umbellata (Thunb.) Tên thường gọi Nguồn gốc Nam Á Đậu ngài Bắc Á Azukibean Đậu xanh vỏ xám Nam Á Ấn Độ Đậu xanh đen Ấn Độ Đậu xanh Nam Á Đậu Jungli Nam Á Đậu nho nhe

Hình 1.1. Quan hệ di truyền giữa các loài thuộc chi Vinga (Gupta et al, 2014)

1.1.2. Đặc điểm nông sinh học và yêu cầu sinh thái của cây đậu xanh

Đậu xanh là cây họ đậu lấy hạt làm thực phẩm quan trọng ở Châu Á

trong đó có Việt Nam. Đậu xanh là cây trồng hàng năm, thân thẳng đứng,

chiều cao cây đạt từ 0,15 - 1,25m (Lambrides và Godwin, 2006). Lá dạng lá

kép ba, các lá chét có hình elip hoặc oval. Hoa mọc thành chùm từ 3 - 40 hoa,

tràng hoa có màu vàng hoặc hơi xanh. Quả dài, hình trụ, trên bề mặt quả có

nhiều lông. Mỗi quả có từ 7 - 20 hạt nhỏ, hình elip hoặc hình khối. Màu sắc

hạt rất đa dạng: thường có màu xanh nhưng cũng có thể có màu vàng, màu ô

liu, màu nâu, màu nâu tím hoặc đen, đốm.

Đậu xanh là cây sinh trưởng, phát triển nhanh, ưa ấm, có thể chín rất

nhanh trong các điều kiện ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nơi nhiệt độ tối

ưu vào khoảng từ 28 - 30°C và luôn cao hơn 15°C.

Đậu xanh không yêu cầu lượng nước lớn (lượng mưa từ 600 – 1000

mm/năm) và có khả năng chịu hạn tốt, ngược lại mẫm cảm với úng (Mogotsi,

2006).

Đậu xanh dễ tính, có thể trồng ở nhiều chân đất khác nhau nhưng thích

hợp nhất ở chân đất cát pha hoặc đất thịt nhẹ thoát nước tốt với pH từ 5 - 8 và

cũng chịu được mặn (Mogotsi, 2006).

1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu xanh

Đậu xanh là cây trồng có giá trị kinh tế cao. Hạt đậu xanh giàu đạm và

được trồng phổ biến cho mục đích sử dụng hạt khô. Trong hạt đậu xanh, hàm

lượng protein cao (22 - 28%), tinh bột (60 - 65%), hàm lượng chất sắt và a-xít

folic cao hơn so với các cây họ đậu khác (Keatinge et al, 2011). Đậu xanh là

nguồn cung cấp protein chính cho người Châu Á để giúp cân bằng dinh

dưỡng cho chế độ ăn chay.

Hạt đậu xanh là mặt hàng xuất khẩu có giá trị, được dùng để chế biến ra

nhiều loại thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại

bánh, chè, nấu xôi đỗ và một số loại đồ uống giải khát... Lá non và ngọn của

cây đậu xanh có thể được dùng làm rau hoặc muối dưa (Nguyễn Mạnh Chính

và cs., 2008). Giá đỗ làm từ đậu xanh được tiêu thụ trong bữa ăn hàng ngày ở

nhiều quốc gia Châu Á kể cả Việt Nam.

Đậu xanh còn có giá trị trong y học. Theo y học cổ truyền Việt Nam, hạt

đậu xanh có vị ngọt, mùi tanh, tính mát, để cả vỏ tính hàn, có công dụng giải

nhiệt, giải độc rất tốt.

Một số bộ phận từ cây đậu xanh cũng hữu dụng để làm thức ăn chăn

nuôi. Ở Việt Nam, người dân sử dụng thân cây đậu xanh già để làm thức ăn

rất giàu dinh dưỡng cho gia súc (Nguyễn Mạnh Chính và cs., 2008).

Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất. Nhờ hệ rễ

đậu xanh có các nốt sần, chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium

nên có khả năng cố định đạm cung cấp cho cây và để lại lượng đạm đáng kể

trong đất sau khi thu hoạch từ 36-70kg N/ha/năm. Vì vậy, đất sau khi trồng

đậu xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn (Pha ̣m Văn Thiều, 2009).

Ngoài ra, cây đậu xanh là cây trồng có thời gian sinh trưởng ngắn nên có thể

tham gia vào nhều công thức canh tác (luân canh, xen canh, gối vụ), góp phần

nâng cao giá trị sử dụng đất.

1.1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất đậu xanh trên thế giới và Việt Nam

1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh

Công tác chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới được tiến hành theo một

số hướng chính sau: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống nâng cao chất

lượng, tạo giống có khả năng chống chịu tốt, tạo giống có khả năng kháng sâu

bệnh.

AVRDC là trung tâm dẫn đầu trên thế giới về nghiên cứu đậu xanh và đã

đạt được những tiến bộ đáng kể trong việc phát triển các dòng đậu xanh mới.

Các dòng đậu xanh tốt nhất ở đây đã được chuyển giao cho các nhà chọn

giống trên khắp thế giới. Con đường tạo giống đậu xanh chủ yếu là lai hữu

tính và đột biến. Một số giống đậu xanh siêu trội đã được phát triển cho vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới. Các giống này đều chín sớm và chín đồng bộ (55-

65 ngày), năng suất và khả năng chống chịu bệnh cao. Các giống này bao

gồm: Chainat 60 (Thái Lan), BPI Mg7 (Philippines) và Merpati (Indonesia)

(Somta et al., 2009).

Tại Ấn Độ, một chương trình chọn tạo giống đậu xanh đáng chú ý được

thiết lập tại Trường đại học Nông nghiệp Punjab, Ludhiana. Chương trình này

đã cho ra đời rất nhiều giống đậu xanh với các mục tiêu khác nhau như: có

loại hình sinh trưởng trung bình, cây khỏe mập, phát triển nhanh, chống chịu

tốt với điều kiện khó khan như: chống đổ, chịu hạn… và có tiềm năng năng

suất cao, ổn định, hàm lượng protein cao, ngắn ngày phục vụ sản xuất (Nair et

al., 2014)

Thái Lan cũng là quốc gia gặp hái được nhiều thành công trong công tác

chọn tạo giống đậu xanh. Các dòng đậu xanh triển vọng từ AVRDC tiếp tục

được nghiên cứu đánh giá tại Thái Lan. Các giống đậu xanh có nguồn gốc từ

AVRDC cho năng suất cao hơn giống địa phương 37% và kháng bệnh được

đưa vào sản xuất như KPS2, Chainat 60… và đang phủ kín hầu hết diện tích

trồng đậu xanh tại Thái Lan (Shanmugasundaram et al., 2010)

Tại Việt Nam, từ những năm 1980 đến nay, nước ta có thêm nhiều cơ sở

nghiên cứu về đậu xanh như: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Học

Viện Nông nghiệp Việt Nam cùng nhiều cơ sở nghiên cứu khác.

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam trong giai đoạn 2001-2005 đã

tiến hành đánh giá 2.024 lượt mẫu giống đậu xanh trong đó có 150 mẫu giống

địa phương. Kết quả đã xác định được 9 mẫu giống đạt năng suất cao từ 1,8-

2,2 tấn/ha, thời gian sinh trưởng 70-75 ngày như: đậu xanh Quảng Bạ, mỡ Hải

Dương, Chianat 36, Chianat 56, Chianat 72… trong đó giống Chianat 36 và

Chianat 72 có nguồn gốc từ Thái Lan có thể sử dụng trực tiếp để nghiên cứu

các biện pháp kỹ thuật và mở rộng sản xuất (Trần Đình Long và cs., 2005).

Trung tâm Tài nguyên Thực vật là Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia

nơi lưu giữ rất nhiều nguồn gen đậu xanh được thu thập trong cả nước và

nhập nội. Từ năm 2003-2005, Trung tâm đã tiến hành mô tả đánh giá 172

mẫu giống đậu xanh và chọn lọc được 3 mẫu giống có tiềm năng phục hồi có

SĐK 4461, 6492 và 6694 có thể tiến hành thí nghiệm so sánh giống và khảo

nghiệm và giới thiệu ra sản xuất (Bùi Phương Mỹ Dung và cs., 2006).

Năm 2009, Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và PTNT đã công bố 17

giống đậu xanh được công nhận từ năm 1988-2007. Trong đó có 6 giống được

lai tạo và chọn lọc trong nước là V123, T135, VN99-1, VN99-3, HL33-6,

HL42-8, còn lại là các giống nhập nội và đánh giá chọn lọc (Cục Trồng trọt,

2009). Giống đậu xanh mới được giới thiệu vào sản xuất gần đây nhất là

ĐX11 được nhập nội từ Thái Lan (Nguyễn Văn Bộ và cs., 2009).

Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương, đậu xanh và biện pháp kỹ thuật

trong hệ thống canh tác với cây ngô giai đoạn 2006-2008 đã chọn tạo được

hai giống đậu xanh ĐXVN4 và ĐXVN5 có nhiều ưu điểm như tiềm năng

năng suất cao, chống chịu sâu bệnh khá (Nguyễn Thị Thanh, 2009).

Tác giả Nguyễn Ngọc Quất và cs., (2014) đã tuyển chọn và khảo nghiệm

giống đậu xanh ĐX14 ở các tỉnh phía Bắc. Trong vụ Hè, giống ĐX14 có thời

gian sinh trưởng 73-75 ngày, năng suất trung bình đạt 1.883-1960kg/ha và

chin tập trung thuận lợi cho thu hoạch.

Tạ Minh Sơn và cs., (2006) đã nghiên cứu chọn lọc thành công giống

đậu xanh NTB01. Đây là giống có hạt xanh mỡ thích hợp với thị hiếu tiêu

dùng trong nước cũng như xuất khẩu. Sau đó, từ dòng phân ly NTB01 đã

chọn lọc ra giống đậu xanh NTB02, có thời gian sinh trưởng 85-90 ngày,

nhiễm nhẹ với các bệnh héo rũ, phấn trắng, đốm nâu, giống chịu hạn và chống

đổ tốt. Năng suất thực thu đạt 2.200-2.500kg/ha cao hơn giống NTB01 từ 350

– 390 kg/ha (Nguyễn Trung Bình và cs., 2014).

Kết quả khảo nghiệm 12 giống đậu xanh vụ hè 2012 tại Gia Lai cho

thấy: Các giống đậu xanh có thời gian sinh trưởng trung bình từ 60-64 ngày.

Năng suất thực thu biến động từ 820 – 1.280 kg/ha, giống đậu xanh HL251

đạt năng suất thực thu cao nhất 2.280 kg/ha vượt đối chứng (cao sản) 20,4%

năng suất (Nguyễn Thị Thanh Duyên và cs., 2012).

Giống đậu xanh HLĐX10 thích hợp với điều kiện sinh thái vùng Đồng

bằng sông Cửu Long có thời gian sinh trưởng 62-65 ngày. Giống chín tập

trung, tỷ lệ chín lần 1 đạt 75-85% năng suất, nhiễm nhẹ bệnh đốm nâu. Năng

suất đạt từ 1.820 – 2.200 kg/ha vượt so với đối chứng từ 23-34% (Nguyễn

Văn Chương và cs., 2014).

1.1.4.2. Tình hình sản xuất đậu xanh

Đậu xanh được trồng rộng khắp thế giới với hơn 6 triệu ha mỗi năm

trong đó tập trung chủ yếu ở Châu Á (chiếm 90%). Ấn Độ là nước có diện

tích trồng lớn nhất thế giới với 3 triệu ha chiếm 50% diện tích trồng trên toàn

thế giới, tiếp theo là Trung Quốc và Myanmar (Hình 1.2).

Hình 1.2. Diện tích đậu xanh của một

Hình 1.3. Sản lượng đậu xanh của một

số nước trên thế giới (Nair et al, 2012)

Sản lượng đậu xanh trung bình hàng năm trên thế giới từ 3,0 - 4,0 triệu tấn

(Weinberger, 2003). Ấn Độ cũng là nước có sản lượng đậu xanh lớn nhất thế

giới, theo sau là Trung Quốc (chiếm 19%) (Hình 1.3). Tuy nhiên, Ấn Độ lại là

nước có năng suất đậu xanh thấp nhất thế giới (dưới 400kg/ha; Hình 1.4) so

với các quốc gia khác. Thái Lan là nước xuất khẩu chính và sản lượng tăng

22% mỗi năm kể từ năm 1980-2000 (Lambrides và Godwin, 2006). Mặc dù

được trồng ở rất nhiều nước ở Châu Phi, nhưng đậu xanh không phải là cây

trồng chính ở đây (Mogotsi, 2006).

Hình 1.4. Năng suất TB của một số nước trên thế giới (Nair et al, 2012)

Ở Việt Nam, cây đậu xanh được trồng rải rác khắp nơi trong cả nước.

Diện tích trồng đậu xanh từ năm 2012-2015 biến động từ 88.180 – 98.200 ha

với năng suất từ 1.026 – 1.098kg/ha. Trong đó diện tích đậu xanh năm 2012

đạt cao nhất và sau đó có xu hướng giảm trong khi năng suất bình quân cả

nước có xu hướng tăng dần và đạt năng suất cao nhất năm 2015.

Đậu xanh được phát triển trên 7 vùng sinh thái trong cả nước. Diện tích

sản xuất đậu xanh giữa các vùng sinh thái trong năm 2015 đạt từ 4.880 –

25.120 ha trong đó có 3 vùng có diện tích sản xuất đậu xanh lớn nhất là Tây

Nguyên (25.120 ha), Bắc Trung Bộ (18.470 ha), Nam Trung Bộ (18.090 ha)

(Bảng 1.2).

Năng suất đậu xanh bình quân cả nước đạt khá cao nhưng có sự chệnh

lệch lớn giữa các vùng sinh thái. Năm 2015, năng suất đậu xanh biến động từ

861 – 1.719 kg/ha. Trong đó, Đồng bằng song Cửu Long đạt năng suất cao

nhất cả nước (1.719 kg/ha), tiếp đó là Đồng bằng song Hồng (1511 kg/ha).

Mặc dù vùng Tây Nguyên, Bắc Trung Bộ, Duyên hải Nam Trung Bộ có diện

tích trồng đậu xanh lớn nhất cả nước nhưng lại là vùng đạt năng suất thấp.

Năng suất đậu xanh tại Tây Nguyên thấp nhất cả nước (861 kg/ha), Bắc Trung

Bộ (938 kg/ha), Duyên hải Nam Trung Bộ (1.169 kg/ha) (Bảng 1.2)

Bảng 1.2. Diện tích và năng suất đậu xanh ở Việt Nam

Diện tích (1.000ha)

Năng suất (kg/ha)

Vùng

2012

2013

2014

2015

2012

2013

2014

2015

ĐB sông Hồng

4,10

4,80

4,51

4,88 1.463 1.458 1.452 1.511

9,50

8,30

7,62

7,03 1.095 1.060 1.004 1.016

Trung du và MN phía Bắc

Bắc Trung Bộ

20,70 20,50 18,65 18,47

865

815

965

938

19,00 18,80 17,55 18,09 1.132 1.160 1.172 1.169

Duyên hải Nam Trung Bộ

Tây Nguyên

27,00 26,20 24,57 25,12

837

847

861

Đông Nam Bộ

9,60

8,60

8,00

9,61 1.083 1.081 1.190 1.237

8,30

6,60

7,28

7,76 1.506 1.576 1.591 1.719

ĐB sông Cửu Long

98,20 93,80 88,18 90,95 1.032 1.026 1.078 1.098 Nguồn: Viện Quy hoạch Thiết kế Nông nghiệp, 2016

Cả nước

1.2. ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐẬU XANH

1.2.1. Kích thước bộ gen cây đậu xanh

Đậu xanh là cây trồng tự thụ, có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n=2x=22

và có kích thước bộ gen nhỏ, ước tính khoảng 579 Mbp. Kích thước này

tương tự như kích thước của các loài khác trong chi Vigna (Somta và

Srinives, 2007). Ngoài ra, đậu xanh còn có kích thước ADN lạp thể là 151

kbp (Tangphatsornruang et al, 2010) và kích thước ADN ti thể là 401 kbp

(Alverson et al, 2011). Mới đây nhất, Kang et al (2014) đã có bước đột phá trong

nghiên cứu trình tự bộ gen đậu xanh và những dấu hiệu tiến hóa trong các loài

thuộc chi Vigna bằng phương pháp de novo assembly sử dụng kỹ thuật đánh giá

kiểu gen bằng giải trình tự (GBS). Tuy nhiên, nghiên cứu về bộ gen của cây đậu

xanh còn rất ít và đi sau các cây họ đậu khác.

1.2.2. Các chỉ thị ADN dùng cho đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh

Đánh giá đa dạng di truyền là vấn đề quan trọng đối với tài nguyên di

truyền thực vật. Các chỉ thị phân tử ADN cung cấp những công cụ hữu ích

cho việc nghiên cứu đa dạng di truyền và các kỹ thuật xây dựng quần thể cho

việc phân tích các chỉ thị phân tử được dùng để đánh giá đa dạng di truyền

trong chi Vigna như chỉ thi ̣ RAPD (Datta et al, 2012), chỉ thi ̣ AFLP (Tatikonda et al, 2009), chỉ thi ̣ SSR (Gupta et al, 2012), chỉ EST-SSR (Gupta et al, 2014), chỉ thi ̣ SNP (Moe et al, 2011; Van et al, 2013), chỉ thi ̣ DArT (Diversity Arrays Technology) (Yang et al, 2006; Vu et al, 2012) …

Trong các loại chỉ thị ADN trên, chỉ thị SSR, do là chỉ thị đồng trội và có

mức độ đa hình cao nên rất được ưa chuộng sử dụng trong nghiên cứu cấu

trúc di truyền và mối quan hệ giữa các loài (Sangiri et al, 2008; Gupta et al,

2013). Chỉ thị DArT được coi là hữu ích ứng dụng trong chọn lọc nhờ chỉ thị

phân tử (Marker Assisted Selection - MAS) do chi phí thấp, hàm lượng thông

tin cao và bao phủ toàn bộ bộ gen (Gupta et al, 2010, Vu et al, 2012).

1.2.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đậu xanh bằng chỉ thị phân tử

Một trong những ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây

trồng là đánh giá đa dạng di truyền. Trong phân loại học, chỉ thị phân tử phản

ánh được các biến dị di truyền về trình tự ở cả vùng mã hóa và không mã hóa.

Sử dụng chỉ thị phân tử trong xác định khoảng cách di truyền giữa các nguồn

gen đậu xanh là một trong những ứng dụng hiệu quả cho chọn giống nhờ chỉ

thị phân tử. Vì vậy đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử

để đánh giá đa dạng di truyền cây đậu xanh.

Nghiên cứu sử dụng 19 mồi SSR của đậu azuki trên cây đậu xanh gồm

415 nguồn gen đậu xanh trồng (V. radiata var. radiata), 189 nguồn gen đậu

xanh hoang dại (V. radiata var. sublobata) và 11 nguồn gen đậu xanh bán

hoang dại từ các vùng địa lý khác nhau đã chỉ ra rằng đậu xanh có sự đa dạng

cao nhất ở Nam Á. Kết quả này đã củng cố quan điểm cho rằng tiểu lục địa

Ấn Độ là trung tâm thuần hóa đậu xanh (Somta và Srinives, 2007). Kết quả

cũng chỉ ra Úc và Pupua New Guinea là trung tâm đa dạng của loài đậu xanh

hoang dại.

Một tập đoàn hạt nhân gồm 106 nguồn gen thể hiện sự đa dạng di truyền

cao nhất của đậu xanh cũng đã được thiết lập (Sangiri et al, 2008).

Đánh giá đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị RAPD cho thấy có sự tương

đồng gần trong các giống đậu xanh trồng (Lakhanpaul et al, 2000). Nghiên

cứu cho thấy đậu xanh có một nền di truyền hẹp như đã được khẳng định

thêm trong các nghiên cứu khác sử dụng chỉ thị RAPD và ISSR (Betal et al,

2004; Datta et al, 2012) và cả các nghiên cứu sử dụng các chỉ thị SSR và

EST-SSR (Gupta et al, 2013).

Somta et al (2009) đã sử dụng 241 mồi SSR từ đậu xanh, azukibean, đậu

cowpea và đậu trạch để xác định khoảng cách di truyền của 39 nguồn gen đậu

xanh bố mẹ ưu tú. Kết quả đã có 48 chỉ thị SSR đa hình được phát hiện. Các

nguồn gen bố mẹ được đánh giá có mức độ đa dạng di truyền cao. Tổng cộng

175 allen được dò với ngưỡng từ 2-19 allen/1 chỉ thị với chỉ số PIC từ 0,049

đến 0,883. Các chỉ thị SSR đa hình này có thể được sử dụng để đánh giá đa

dạng di truyền của tập đoàn đậu xanh với số lượng lớn hơn.

Wang et al (2012) cũng đã đánh giá đa dạng di truyền của 65 nguồn gen

đậu xanh có nguồn gốc từ Đông và Nam Á, Mỹ và Guatemala sử dụng 15 chỉ

thị SSR. Kết quả đã dò được 47 allen với số allen mỗi locut ở ngưỡng từ 2-6,

trung bình là 3,13 và PIC là 0,28. Các nguồn gen tác giả nghiên cứu chia

thành hai nhóm chính. Một nhóm gồm các nguồn gen có nguồn gốc Đông và

Nam Á, nhóm còn lại có nguồn gốc Mỹ và Guatemala.

Các chỉ thị SNP cũng được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng để đánh giá đa

dạng di truyền trên các đối tượng cây trồng khác nhau. Tuy nhiên, dữ liệu

SNP cho đậu xanh hiện nay còn rất ít.

Chỉ thị DArT có rất nhiều ưu điểm so với các chỉ thị phân tử khác như

RFLP, RAPD, AFLP, SSR và SNP (những chỉ thị thường dùng để lập bản đồ

QTL và bản đồ so sánh). Trong khi hầu hết các chỉ thị phụ thuộc vào trình tự

ADN và số liệu hóa dựa trên phân tích điện di gel hoặc polyacrylamide với

thông tin thấp, chi phí cao thì kỹ thuật DArT thu được thông tin cao với các

máy móc thiết bị ngày càng đạt chuẩn. Kỹ thuật này cho phép tạo ra một

nhiều chỉ thị nhanh chóng, phân bố trên toàn bộ bộ gen với chi phí thấp

(Kilian et al, 2005).

Kỹ thuật DArT được phát triển ban đầu trên lúa (Jaccoud et al, 2001) và

sau đó được nghiên cứu ứng dụng cho các loài có có kích thước bộ gen lớn

hơn và phức tạp hơn như lúa mạch (5.000 Mbp) (Castillo et al, 2013), yến

mạch lục bội (11.000 Mbp) (Tinker et al, 2009). Gần đây DArT đã được ứng

dụng thành công trên các đối tượng cây trồng khác như cây sắn (Xia et al,

2005), chuối (Risterucci et al, 2009), và cây cao lương (Mace et al, 2008).

Ứng dụng thành công DArT trên cây đậu triều (Yang et al, 2006) là tiền đề

cho việc ứng dụng kỹ thuật này để đánh giá đa dạng di truyền trên các cây họ

đậu. Vu et al (2012) đã phát triển các thư viện chỉ thị DArT cho đậu xanh và

đậu tương. Tác giả đã sử dụng 2 phương pháp làm giảm độ phức tạp của bộ

gen đậu xanh và đậu tương là phức hợp enzyme cắt hạn chế PstI/TaqI và

PstI/BstNI. Kết quả thu được từ hai phương pháp này trong khi đối với đậu

xanh không có sự khác biệt trong việc tạo ra các dòng đa hình thì đậu tương

có sự khác biệt đáng kể.

Tại Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền cây trồng bằng các chỉ thị

phân tử đã được tiến hành trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau tuy nhiên

đánh giá đa dạng di truyền trên cây đậu xanh còn rất ít. Hiện nay mới có 2

công trình công bố đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh sử dụng mồi RAPD

và SSR của Điêu Thị Mai Hoa và cs. (2005) và Nguyễn Vũ Thanh Thanh và

cs. (2006).

1.2.4. Đa dạng nguồn gen cây đậu xanh

Phát triển nguồn gen đậu xanh sẽ tạo điều kiện cho công tác đánh giá và

sử dụng tốt hơn các tập đoàn nguồn gen đậu xanh ở nhiều nước trên thế giới.

Trung tâm Rau màu Châu Á (AVRDC) được thành lập năm 1971, là trung

tâm chính trên thế giới lưu giữ, nghiên cứu cải tiến nguồn gen đậu xanh. Hiện

nay, AVRDC đang lưu giữ 6742 nguồn gen của 10 tập đoàn lớn nhất của

nguồn gen đậu xanh trên thế giới (AVGRIS, 2014). Phần lớn nguồn gen đậu

xanh lưu giữ tại đây có nguồn gốc từ Ấn Độ (2788 nguồn gen), tiếp theo là

Iran (583 nguồn gen). Thái Lan cũng là nước đóng góp số lượng nguồn gen

đậu xanh vào ngân hàng gen hạt ở AVRDC với 442 nguồn gen. Nguồn gen

đậu xanh có nguồn gốc từ Việt Nam đang được AVRDC lưu giữ là 122 nguồn

(AVGRIS, 2014).

Ngoài ra, nhiều tập đoàn đậu xanh hoang dại được các nhà khoa học Úc

và Nhật Bản thu thập đã làm tăng nguồn gen đậu xanh hoang dại trên thế giới

(Lawn và Rebetzke, 2006; Tomooka et al, 2006). Để sử dụng các nguồn tài

nguyên đa dạng thu được từ các nguồn gen hoang dại và nguồn gen canh tác

một cách hiệu quả cho nghiên cứu và tạo giống, phương pháp tạo dựng tập đoàn

hạt nhân đã được ứng dụng rộng rãi (Kojima et al, 2005).

Tại Trung Quốc, công tác thu thập và đánh giá nguồn gen cây họ đậu đã

được tiến hành từ cuối những năm 1970 (Cheng và Tian, 2011). Đến cuối năm

2005, đã có hơn 30.000 nguồn gen được thu thập và bảo tồn tại ngân hàng gen cây

trồng quốc gia Trung Quốc trong đó có 5.211 nguồn gen đậu xanh.

Tại Việt Nam, công tác thu thập, bảo tồn và đánh giá, khai thác nguồn

gen cây họ đậu nói chung và cây đậu xanh nói riêng khá được chú trọng. Hiện

nay, Trung tâm tài nguyên thực vật đang lưu giữ 2756 nguồn gen cây họ đậu

với 23 loài khác nhau, chiếm 17,5% số nguồn gen được lưu giữ (Nguyen Nien

Chau et al, 2012). Trong số nguồn gen cây họ đậu đang được lưu giữ tại đây,

cây đậu tương chiếm nhiều nhất với hơn 600 nguồn gen, đậu xanh đứng thứ 2

với hơn 500 nguồn gen. Ngoài ra, đậu xanh cũng như các cây họ đậu khác

cũng được lưu giữ là tập đoàn công tác tại các cơ quan nghiên cứu, các viện,

trung tâm và các trường đại học có nội dung nghiên cứu về cây họ đậu trong cả

nước, thiết lập thành một mạng lưới lưu giữ và nghiên cứu về nhóm cây này.

Như vậy, mặc dù cây đậu xanh có xuất xứ đa dạng, nguồn gen hoang dại

phong phú nhưng các giống đang trồng đại trà trong sản xuất trên thế giới lại có

nền di truyền hẹp, đã trở thành thách thức cho công tác chọn tạo và cải tiến giống

đậu xanh hiện nay. Vì thế nghiên cứu đa dạng di truyền cây đậu xanh sẽ giúp tìm

kiếm những cặp lai bố mẹ có khoảng cách di truyền xa để cải tiến những đặc tính

về chất lượng, chống chịu... mong muốn thu được ở cây đậu xanh.

1.3. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH KHẢM VÀNG ĐẬU XANH 1.3.1. Bệnh khảm vàng hại đậu xanh và lịch sử phát hiện

Bệnh khảm vàng là một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng trên cây

đậu xanh. Bệnh được quan sát thấy lần đầu tiên vào năm 1955 tại ruộng thí

nghiệm của Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ (IARI), New Delhi, Ấn Độ

(Nariani, 1960).

Không chỉ xuất hiện và gây hại ở Ấn Độ, bệnh cũng được phát hiện gây

hại trên cây họ đậu tại một số quốc gia khác thuộc khu vực Nam Á và Đông

Nam Á như Philippines (Benigno và Favali-Hedayat, 1977), SriLanka

(Shivanathan, 1983), Thái Lan (Thongmeearkom et al, 1981), Papua New

Guinea (Pearson, 1981), Bangladesh (Akanda et al, 1992), Pakistan (Saleem

et al, 1998), Myammar (Han et al, 2001) cho thấy đây là bệnh quan trọng gây

hại trên đậu xanh.

Hình 1.5: Phân bố bệnh khảm vàng ở Châu Á (Karthikeyan et al, 2014)

Bệnh khảm vàng xuất hiện trên đậu xanh với các triệu chứng điển hình

tại Việt Nam được báo cáo từ năm 1986 (Phan Hữu Trinh và cs., 1986). Tính

đến thời điểm trước nghiên cứu của đề tài, bệnh khảm vàng được quan sát

thấy trên những cánh đồng trồng đậu xanh ở Việt Nam chỉ dựa vào triệu

chứng bệnh, chưa có các nghiên cứu chuyên sâu về virus gây bệnh.

1.3.2. Triệu chứng và tác hại do bệnh khảm vàng gây ra

Nariani (1960) là người đầu tiên báo cáo về bệnh khảm vàng hại đậu

xanh và mô tả các triệu chứng một cách tỉ mỉ và đầy đủ nhất (Hình 1.6).

Trên cây đậu xanh, triệu chứng đầu tiên của bệnh xuất hiện trên các lá

non ở dạng các chấm hoặc đốm màu vàng mịn nằm rải rác trên bề mặt lá. Lá

kép kế tiếp được sinh ra trên ngọn xuất hiện các mảng màu xanh và màu vàng

xen kẽ nhau không theo quy tắc. Kích thước lá không bị ảnh hưởng nhiều

nhưng thỉnh thoảng cũng thấy các vùng diện tích lá màu xanh hơi nhô lên và

các lá xuất hiện các nếp nhăn nhẹ và giảm kích thước. Diện tích lá vùng màu

vàng sẽ tăng lên ở các lá mới ra và cuối cùng một số lá ở trên ngọn cây sẽ

biến vàng hoàn toàn. Những cây bị bệnh thường chín muộn và ra ít hoa, ít

quả. Kích thước của quả bị giảm và kích thước hạt thu được từ những quả của

cây bị bệnh thường nhỏ.

Hình 1.6. Triệu chứng bệnh khảm vàng trên đậu xanh

Bệnh khảm vàng làm giảm năng suất đáng kể trên nhiều loài cây họ đậu.

Mức độ giảm năng suất trên cây họ đậu bị bệnh phụ thuộc vào thời điểm

nhiễm bệnh và mức độ nghiêm trọng của triệu chứng (Varma, 1992). Giảm số

quả/cây, số hạt/quả và trọng lượng hạt là các yếu tố chính gây mất năng suất.

Vào năm 1977, tại miềm Bắc Thái Lan đã xảy ra một đại dịch khảm

vàng đậu xanh. Bệnh đã gây thiệt hại gần như toàn bộ năng suất trên các cánh

đồng trồng đậu xanh bị bệnh (Thongmeearkom et al, 1981).

Việc ước tính thiệt hại một cách chính xác do bệnh khảm vàng gây ra

trên đồng ruộng của nông dân là rất khó khăn khi mức độ thiêt hại biến động

từ năm này sang năm khác và khác nhau từ giống này sang giống khác. Tuy

nhiên ước tính thiệt hại trên đậu tương, đậu xanh và đậu xanh đen là vượt qua

300 triệu USD (Varma, 1992). Bệnh khảm vàng hại đậu xanh tại Ấn Độ xuất

hiện và gây hại trên diện rộng, có thể gây mất 100% năng suất cho thấy mức

độ nguy hiểm của bệnh (Manjunath et al, 2013).

Tại Việt Nam, mặc dù chưa có một nghiên cứu chính thức nào về thiệt

hại do MYMV gây ra đối với đậu xanh nhưng đã có những ước đoán về thiệt

hại của bệnh gây mất năng suất từ 20-70% (Phạm Văn Thiều, 2009).

1.3.3. Virus gây bệnh khảm vàng và đặc điểm cấu trúc bộ gen.

Virus chính gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh đã được xác định là

Mungbean Yellow Mosaic Virus (MYMV). Virus này thuộc chi Begomovirus,

họ Geminiviridae. Các begomovirus được chia thành hai dạng với bộ gen

khác nhau là dạng có bộ gen đơn và dạng có bộ gen kép (Brown et al, 2012).

MYMV là một begomovirus có bộ gen kép bao gồm hai phân tử ADN-A và

ADN-B. MYMV đã được giải trình tự bộ gen hoàn chỉnh lần đầu tiên tại Ấn

Độ.

Cấu trúc hệ gen và các chức năng gen của begomovirus hệ gen kép

Bộ gen của MYMV, cũng như các begomovirus có bộ gen kép, gồm hai

phân tử ADN-A và ADN-B hoàn toàn khác biệt nhau. Hai phân tử bộ gen

chia sẻ một trình tự ngắn khoảng 200 nucleotite gần như đồng nhất, được gọi

là vùng bảo thủ hay vùng chung (common region – CR). Tổ chức bộ gen của

các begomovirus có bộ gen kép được trình bày tại Hình 1.7.

Phân tử ADN-A điển hình có kích thước khoảng 2,8 kb và có các gen

được sắp xếp theo cả hai chiều. Trên phân tử ADN-A có một vùng liên gen

không mã hóa (intergenic region – IR). Vùng IR chứa các yếu tố khởi động

(promoter) và trình tự bảo thủ TAATATTAC nằm trong vòng nút của cấu

trúc kẹp tóc và các chuỗi lặp đảo gọi là “iteron”.

Phân tử ADN-A của begomovirus gồm 6 khung đọc mở (ORF) được

định hướng theo cả hai chiều kim đồng hồ và mã hóa 6 protein. Các protein

này chịu trách nhiệm nhân bản virus, quy định tính đặc hiệu ký chủ, lắp ghép

virus và khả năng lan truyền qua vector. Mặc dù các gen được đặt tên dựa trên

các chức năng chúng đảm nhiệm, nhưng các chức năng có thể khác nhau

trong chi Begomovirus (Vanitharani et al, 2005).

Hình 1.7. Cấu trúc hệ gen của Begomovirus bộ gen kép (Ha, 2008)

Theo chiều kim đồng hồ có hai gen AV1 và AV2 như sau:

Gen AV1 mã hóa cho protein vỏ (CP, coat protein) của virus, quy định

chức năng truyền qua vectơ, vận chuyển bộ gen virus vào và ra khỏi nhân tế

bào ký chủ và vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào.

Gen AV2 mã hóa cho protein AV, quy định khả năng gây bệnh, có liên

quan đến sự vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào và tham gia vào sự tích

tụ và phân bố ADN của virus trong tế bào ký chủ (Sharma et al, 2011).

Ngược chiều kim đồng hồ có 4 gen AC1, AC2, AC3, AC4 như sau:

Gen AC1 mã hóa protein Rep, chịu trách nhiệm nhân bản bộ gen virus

(Nash et al, 2011).

Gen AC2 mã hóa protein TrAP, kích hoạt quá trình phiên mã của virus

và ức chế hệ thống phòng thủ của cây (Mubin et al, 2010).

Gen AC3 mã hóa protein tăng cường tái sinh. Nó cũng kích thích sự

nhân bản ADN của virus (Pasumarthy et al, 2011)

Gen AC4 mã hóa protein AC4 có chức năng chưa được rõ ràng. Đối với

một số virus, nó là yếu tố quyết định khả năng gây bệnh và ức chế quá trình

bất hoạt gen hậu phiên mã của tế bào ký chủ (Sunitha et al, 2013).

Trong phân tử ADN-B của begomovirus bộ gen kép chứa hai khung đọc

mở sắp xếp theo chiều ngược nhau gọi là BV1 và BC1. Đây là hai gen mã hóa

cho 2 protein đều liên quan đến việc di chuyển virus.

Trên chiều kim đồng hồ có ORF BV1 mã hóa protein con thoi (NSP,

nuclear shuttle protein) có chức năng chính là vận chuyển bộ gen virus vào và

ra khỏi nhân tế bào. Trên chiều ngược kim đồng hồ có ORF BC1 mã hóa

protein vận chuyển (MP, movement protein) có chức năng vận chuyển bộ gen

virus giữa các tế bào ký chủ (Malik et al, 2005).

1.3.4. Con đường lây truyền bệnh

MYMV được lây truyền ngoài tự nhiên duy nhất qua vectơ truyền bệnh

bọ phấn Bemisia tabaci (Genn.) theo cách tuần hoàn (Nariani, 1960).

Bỏ đói bọ phấn trước lây nhiễm không phải yếu tố quyết định nhưng

cũng làm tăng hiệu quả truyền bệnh. Sau khi tiếp nhận virus, cần thời gian

khoảng 3 giờ sống trong vectơ để sự lây nhiễm có thể xảy ra. Để hiệu quả lây

truyền bệnh đạt 100%, mật độ bọ phấn cần từ 4-10 con/cây. Bọ phấn cái là

vectơ truyền virus tốt hơn và cũng giữ virus được lâu hơn (10 ngày) so với bọ

phấn đực (3 ngày) (Rathi và Nene, 1974).

Hình 1.8. Vectơ truyền bệnh – Bọ phấn (Bemisa tabaci)

MYMV, cũng như các begomovirus khác, không truyền qua tiếp xúc cơ

học. Tuy nhiên chủng virus MYMV thu được từ Thái Lan lại có thể lây truyền

qua tiếp xúc cơ giới (Honda et al, 1983) và có thể truyền qua ghép (Akhtar và

Haq, 2003).

1.3.5. Điều kiện sinh thái của vectơ và virus

Trong tự nhiên, bệnh được lây truyền qua bọ phấn nên môi trường sống

ảnh hưởng đến quần thể vectơ và sự lan truyền MYMV là rất quan trọng.

Bọ phấn sinh trưởng tốt nhất dưới điều kiện nóng và ẩm. Tại các vùng

cận nhiệt đới với các mùa khác biệt, bọ phấn cư trú trên các đám cây bụi với

mật độ thấp trong mùa đông và những tháng mùa hè khô. Ở vùng nhiệt đới,

bọ phấn xuất hiện hầu như quanh năm với mật độ quần thể phụ thuộc vào

điều kiện thời tiết (Varma, 1992).

Các yếu tố môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát tán MYMV. Trong

điều kiện nóng ẩm, virus phát tán nhanh hơn (Srivastava và Prajapati, 2012;

Rashid et al, 2013).

1.3.6. Phổ ký chủ của virus

Phổ ký chủ của hầu hết các chủng MYMV chỉ hạn chế trong các loài

thuộc nhóm cây họ đậu như đậu xanh, đậu xanh đen, đậu cowpea, đậu lima,

đậu Hà Lan, đậu triều, đậu tương, đậu ngài, ngoại trừ chủng có thể gây bệnh

trên các loại cỏ thông thường không thuộc nhóm cây họ đậu (Varma, 1992).

Sehrawat và Yadav (2014) đã tiến hành đánh giá đồng ruộng các loài

thuộc chi Vigna và kết quả cho thấy rằng các loại đậu xanh, đậu xanh đen, đậu

cowpea, đậu lima, đậu Hà Lan, đậu triều, đậu tương, đậu ngài đều bị nhiễm

bệnh MYMV ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng muộn hoặc nhiễm MYMV

ở giai đoạn sinh trưởng sinh thực làm quả bị lép. Tuy nhiên đậu nho nhe

(Vigna umbellata) không biểu hiện triệu chứng của bệnh khảm vàng trong

suốt quá trình sinh trưởng phát triển. Như vậy loài này có thể được coi là

Lá biểu hiện các triệu chứng bệnh

Thiệt hại 100% năng suất nếu bị bệnh từ giai đoạn cây con

kháng bệnh khảm vàng.

Hình 1.9. Các loài thuộc chi Vigna bị bệnh khảm vàng gây ra bởi MYMV

1.3.7. Nghiên cứu nguồn kháng virus và vectơ

Đánh giá tính kháng thường được tiến hành sàng lọc trên điều kiện đồng

ruộng ở những vùng có áp lực bệnh lớn xen kẽ với các hàng giống nhiễm

bệnh cao. Sàng lọc trong điều kiện đồng ruộng được hỗ trợ bằng sử dụng bọ

phấn mang virus. Nguồn gen kháng là các nguồn gen không biểu hiện triệu

chứng, hoặc có các vòng chết hoại tử, hoặc có ít hơn 10% thiệt hại của khảm

vàng, hoặc bị ảnh hưởng ở giai đoạn muộn.

Nguồn kháng có thể là kháng virus MYMV, kháng vectơ của nó hoặc

kháng cả hai (Varma, 1992). Tính kháng MYMV cũng được xác định trên

nguồn đậu xanh hoang dại Vigna radiata var. sublobata là tổ tiên của đậu

xanh trồng và có các gen kháng có thể được chuyển sang cho các dạng đậu

xanh thương mại hay nguồn kháng ở các loài khác thuộc chi Vigna như nho

nhe (V. umbrelata) (Sehrawat và Yadav, 2014).

1.3.8. Đánh giá nguồn gen và chọn giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng

Để chọn tạo giống kháng bệnh, nghiên cứu di truyền gen kháng và tìm

kiếm nguồn kháng là công việc rất quan trọng. Đã có nhiều báo cáo về di

truyền tính kháng bệnh khảm vàng trên các loài cây trồng khác nhau. Cả tính

nhiễm bệnh và kháng bệnh đều có thể là tính trội. Tính kháng của đậu xanh

với MYMV đã được đánh giá và báo cáo. Một số công trình nghiên cứu đã

chỉ ra rằng di truyền tính kháng của MYMV được kiểm soát bằng đa gen.

Tính kháng được quy định bằng đơn gen lặn (Reddy, 2009; Sudha et al,

2013a), một gen trội (Gupta et al, 2005), hai gen lặn (Ammavasai et al, 2004;

Singh et al, 2013) và các gen lặn bổ sung (Dhole và Reddy, 2012).

Cho đến nay, biện pháp sử dụng giống kháng là hướng hạn chế thiệt hại

an toàn nhất đối với bệnh khảm vàng trên đậu xanh. Biện pháp này đã được

áp dụng và ghi nhận kết quả tốt và là biện pháp kinh tế nhất. Tuy nhiên, khó

khăn là nguồn gen kháng trên đồng ruộng còn rất hạn chế. Chọn giống kháng

bệnh khảm vàng đã được các nhà virus học và các nhà chọn tạo giống cây

trồng tiến hành từ những năm 1970. Công tác chọn tạo giống kháng bệnh là

sự phối kết hợp của nhiều phương pháp chọn lọc, lai tạo với giống đậu xanh

kháng bệnh, lai trong loài và lai khác loài với nguồn kháng MYMV cao, gây

đột biến nhân tạo trên đậu xanh.

Chọn lọc

Công tác đánh giá, sàng lọc nguồn gen đậu xanh kháng MYMV đã được

tiến hành và tạo ra nhiều giống đậu xanh mới nhờ phương pháp chọn lọc.

Trong số đó có những giống kháng bệnh MYMV. Từ năm 1977 đến 2003,

hơn 8000 nguồn gen và các dòng lai cải tiến của đậu xanh đã được sàng lọc

tính kháng các bệnh MYMV dưới các điều kiện tự nhiên và nhân tạo (Singh

et al, 2006b). Một số nguồn kháng đã được xác định và được sử dụng cho

chương trình chọn tạo giống quốc gia và quốc tế. Trong số các nguồn kháng

này, có cả những nguồn kháng được với nhiều bệnh như MYMV, BLS, CLS.

Những năm sau đó, công việc này vẫn được tiến hành và công bố các giống

kháng đã được đưa ra sản xuất.

Trong điều kiện tự nhiên, Shad et al (2006) đã tiến hành đánh giá 254

dòng về tính kháng MYMV. Kết quả chỉ ra được một số dòng mặc dù áp lực

bệnh cao nhưng vẫn chống chịu và cho năng suất tốt.

Trong điều kiện lây nhiễn nhân tạo, Akhtar et al (2011) tiến hành đánh

giá khả năng kháng bệnh của 162 nguồn gen đậu xanh từ 8 vùng địa lý khác

nhau bằng phương pháp ghép. Kết quả đánh giá thu được 100% nguồn gen có

triệu chứng bệnh và phản ứng với bệnh biến động đáng kể.

Thí nghiệm đánh giá bệnh khảm vàng trong điều kiện nhân tạo sử dụng

phương pháp lây nhiễm nhờ vi khuẩn (agroinnoculation) cũng được Sudha et

al (2013b) tiến hành trên 79 nguồn gen đậu xanh sử dụng 2 chủng MYMV

khác nhau có tên là VA 221 và VA 239. Kết quả thu được 3 nguồn gen ML

1108, KMG 189 và SP 84 biểu hiện kháng chủng VA 221, 77 nguồn gen

nhiễm chủng VA 239. Chỉ có 1 nguồn gen ML 818 kháng chủng VA 239

nhưng lại nhiễm chủng VA 221.

Lai tạo

Từ các dòng đậu xanh kháng MYMV có thể tiến hành lai với các giống

đậu xanh nhiễm MYMV nhưng có năng suất cao, chất lượng tốt để tạo ra các

giống mới vừa cho năng suất và kháng bệnh. Các dòng nhiễm bệnh cao có thể

được trồng xen kẽ với các dòng kiểm tra theo từ 2-3 hàng 1 hàng nhiễm cao

để làm đối chứng (F2-F4). Các dòng kháng từ trung bình đến kháng MYMV

cao với các đặc điểm tính trạng quan tâm khác tốt như năng suất cao, cây

thẳng đứng, ra hoa, ra quả tập trung... có thể được chọn lọc cá thể từ F2/F3.

Theo phương pháp này, nhiều giống đậu xanh vừa kháng bệnh, vừa có năng

suất cao đã được tạo ra như Pant Moong-1 (LM 294-1xT44), Pant Moong-3

(LM 294-1xL80) và trở thành giống thương mại (Singh, 1987).

Các phép lai được tạo ra giữa các giống đậu NM 36, 52, 54 và một số

dòng đậu xanh ưu tú của AVRDC như VC 2768A và B, 3726, 2754A, 2771A,

2778A, 1973A và 1560D, đã tạo ra một số lượng lớn con lai với tiềm năng

năng suất cao, phổ thích ứng rộng, kháng bệnh. Bốn dòng lai thu được là NM

92, 93, 96 và 90 có năng suất cao và các đặc điểm nông sinh học khác tốt

(Sadiq et al, 1999). Gần đây, AVRDC đã đưa ra sản xuất hai giống NM92 và

NM94 có khả năng kháng cao với MYMV. NM94 thể hiện khả năng kháng

bệnh ở vụ Hè nhưng lại bị nhiễm bệnh trong vụ Hè Thu (Nair et al, 2012)

Lai khác loài cũng được sử dụng để cải tiến đậu xanh. Nguồn kháng

MYMV được tìm thấy trên đậu xanh đen được lai với đậu xanh để chuyển các

gen kháng MYMV sang đậu xanh. Phép lai giữa giống đậu xanh nhiễm bệnh

MYMV và đậu xanh hoang dại V. radiata var sublobata cũng đã được tiến

hành (Chen et al, 2013).

Đột biến

Đột biến cũng là một phương pháp phổ biến để tạo ra giống mới với các

mục tiêu mong muốn. Reddy (2009) đã tiến hành gây đột biến trên giống đậu

xanh SML-668 sử dụng tia Gamma 600Gy. Giống SML-668 là giống chín

sớm, năng suất cao, hạt to nhưng nhiễm bệnh khảm vàng. Để tạo ra tính

kháng ở giống SML-668, tác giả đã tiến hành đột biến kép ở M3. Dòng đột

biến này được trồng đến M3 M6. Tất cả các cây đột biến này đều biểu hiện

triệu chứng bệnh rất nhỏ trên lá, không có triệu chứng trên quả. Quả và hạt

bình thường và thu được năng suất bình thường khi so sánh với giống đối

chứng kháng bệnh cao do 2 gen lặn kiểm soát.

Tuy nhiên không có giống thuộc nhóm cây họ đậu nào kháng hoàn toàn

với MYMV. Nhiều giống có các đặc điểm nông sinh học tốt đã được đưa ra

sản xuất với mức độ kháng bệnh khảm vàng rất biến động. Tuy nhiên, do các

nhà chọn tạo giống sử dụng các hệ thống đánh giá bệnh khác nhau nên thuật

ngữ “kháng” vẫn được sử dụng nếu không có triệu chứng bệnh, mức độ thiệt

hại do bệnh gây ra thấp hoặc làm trì hoãn sự lây nhiễm bệnh.

Rất khó thu được tính kháng bệnh kéo dài đối với MYMV, để tính kháng

bệnh được bền vững đòi hỏi phải quy tụ nhiều gen kháng vào cùng một giống.

1.4. NGHIÊN CỨU LẬP BẢN ĐỒ DI TRUYỀN VÀ ỨNG DỤNG TRONG CẢI TIẾN GIỐNG Ở CÂY ĐẬU XANH. 1.4.1. Nghiên cứu lập bản đồ di tuyền ở cây đậu xanh 1.4.1.1. Quần thể lập bản đồ di truyền

Trong di truyền và chọn giống, quần thể lập bản đồ là công cụ để giúp

xác định những locut di truyền điều khiển những tính trạng kiểu hình có thể

quan sát hay đo đếm được. Các quần thể lập bản đồ bao gồm nhiều cá thể của

một loài hay là các con lai của cặp lai khác loài mà bố mẹ có tính trạng đối

lập nhau. Kiểu quần thể di truyền được sử dụng để lập bản đồ phụ thuộc vào

hình thức sinh sản của loại cây trồng được phân tích: tự thụ hay giao phấn.

Đối với các loài tự thụ, quần thể F2:3 và quần thể dòng thuần tái tổ hợp

(RILs-recombinant inbred lines) thường được sử dụng để lập bản đồ di

truyền; đối với quần thể tự bất hợp (self-incompatible) và ở các loài có độ dị

hợp tử cao, quần thể F1 đa phần được lựa chọn. Quần thể lai trở lại và các

dòng lưỡng bội có thể được sử dụng để lập bản đồ cho cả hai loại cây trồng có

hình thức sinh sản tự thụ và giao phấn (Schneider, 2005). Mỗi loại quần thể

có thể cho thông tin về di truyền khác nhau, tùy vào mục đích và đối tượng

cây trồng mà các quần thể khác nhau có thể được lựa chọn.

- Quần thể lai trở lại: được thiết lập bằng cách lai trở lại F1 với cây

bố/mẹ và có sự phân ly các alen được xuất phát từ cây bố/mẹ cho gen (donor

– non recurrent). Quần thể lai trở lại thường được sử dụng khi có nhiều phép

lai khác loài tạo ra cây con lai trở lại hữu thụ, nhưng thế hệ con lai tự thụ lại

bất dục và ít có khả năng ứng dụng trong nghiên cứu di truyền.

- Quần thể F2: Bằng cách tự thụ phấn F1 hay lai chéo F1 với thế hệ chị

em của nó, quần thể F2 được tạo thành. Vì quần thể F2 cho nhiều thông tin

hơn và có khả năng cho nhiều tổ hợp các alen từ bố mẹ hơn (ví dụ: AA, Aa,

aa), nên quần thể F2 được sử dụng nhiều hơn trong lập bản đồ di truyền ở thực

vật. Thông thường để thiết lập bản đồ di truyền cơ bản, quần thể với kích

thước khoảng 50-100 cá thể đã cho phép phát hiện tái tổ hợp giữa các chỉ thị

là 1-3cM (Paterson, 1996).

- Quần thể đơn bội ké p (doubled haploids-DH): thường được sử dụng

trong một số loài thực vật có thể nuôi cấy hạt phấn. DH được tạo thành bằng

cách tái sinh cây từ hạt phấn đơn bội, vì thế nó có nhiễm sắc thể được lưỡng

bội hóa. Các cá thể DH hoàn toàn đồng hợp và có thể tự thụ để tạo ra số

lượng lớn cây con có thông tin di truyền giống hệt nhau ở thế hệ sau. Điều

này cho phép đánh giá kiểu hình lặp lại.

- Quần thể đồng hợp tử (Homozygous populations) có thể thiết lập bằng

cách tự thụ phấn liên tục, được gọi là các thế hệ từ một hạt (single seed

descent). Tự thụ là một dạng đặc biệt hơn của nội phối (RI). Nói chung, các

cá thể RI cung cấp lượng thông tin tương đương với cá thể F2 trong công tác

xây dựng bản đồ di truyền (Paterson, 1996).

Để mô tả sự phức tạp của tổ chức hệ gen, bản đồ di truyền là không đủ

bởi vì chúng chỉ dựa trên sự tái tổ hợp, điều này xảy ra phần lớn là khác nhau

ở các hệ gen khác nhau. Mặc dù vậy, bản đồ di truyền cùng với dữ liệu tế bào

học là cơ sở để xây dựng bản đồ vật lý. Bản đồ tích hợp (intergrated map) sẽ

cung cấp đánh giá chi tiết trong cấu trúc hệ gen và hỗ trợ cho tách dòng gen

để đi đến đích cuối cùng là giải trình tự toàn bộ hệ gen.

1.4.1.2. Chỉ thị phân tử và lập bản đồ liên kết ở cây đậu xanh

Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là lập bản đồ

di truyền. Bản đồ di truyền hiện đại được thiết lập dựa trên cơ sở các loại chỉ

thị phân tử ADN (các loại chỉ thị RFLP, ALFP, RAPD, STS, SSR, SNP ...).

Như hầu hết các loại cây trồng khác, ứng dụng đầu tiên của chỉ thị ADN

trong nghiên cứu hệ gen đậu xanh là chỉ thị RFLP. Chính vì vậy, những bản

đồ di truyền đầu tiên được xây dựng sử dụng các chỉ thị RFLP và quần thể lập

bản đồ là quần thể F2.

Young et al (1992) là người đầu tiên công bố các chỉ thị RFLP dùng để

lập bản đồ liên kết di truyền sử dụng quần thể gồm 58 cá thể F2 được tạo ra từ

tổ hợp lai TC1966 và giống đậu xanh nhiễm bệnh và được phân tích bằng 153

chỉ thị RFLP. Tính kháng được lập bản đồ trên locut đơn của nhóm liên kết 8,

cách khoảng 3,6 cM từ chỉ thị RFLP. Chỉ thị RFLP cũng được Menancio-

Hautea et al (1993) sử dụng để lập bản đồ liên kết trên đậu xanh. 171 locut

RFLP bao phủ 1570 cM của bộ gen của đậu xanh đã được phân tích trong

quần thể F2 gồm 58 cá thể. Quần thể này thu được từ phép lai giữa giống đậu

xanh kháng bệnh phấn trắng (VC3980A) và giống đậu xanh nhiễm (TC1966).

Do chỉ thị RFLPs đòi hỏi kỹ thuật cao và yêu cầu số lượng ADN tinh

sạch lớn, kỹ thuật lai phân tử và phương pháp hiện X quang phức tạp, nên sau

này, phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử dựa trên PCR đã trở nên phổ biến

và được thịnh hành hơn.

Humphry et al (2002) đã xây dựng bản đồ liên kết di truyền với các chỉ

thị RFLP sử dụng quần thể RIL thu được từ phép lai giữa nguồn gen đậu xanh

trồng “Berken” và nguồn gen đậu xanh hoang dại “ACC41” (V. radiata var.

sublobata). Quần thể RIL sử dụng để lập bản đồ gồm 80 dòng bao gồm tổng

số 255 chỉ thị RFLP phân bố trong 13 nhóm liên kết và bao phủ 737,9 cM với

khoảng cách trung bình giữa các chỉ thị là 3,0 cM và khoảng cách xa nhất

giữa các chỉ thị liên kết là 15,4 cM. Zhao et al (2010) cũng sử dụng quần thể

tương tự với 202 dòng để xây dựng bản đồ liên kết di truyền dựa trên tổng số

179 chỉ thị SSR, RFLP, RAPD và STS phân bố trên 12 nhóm liên kết với tổng

chiều dài 1831,8 cM và khoảng cách trung bình giữa các chỉ thị là khoảng 10

cM. Tuy nhiên, tất cả các bản đồ này là các bản đồ liên kết có mật độ thấp và

không có bản đồ nào tạo thành 11 nhóm liên kết là số lượng nhiễm sắc thể

đơn bội của đậu xanh. Để xây dựng được bản đồ 11 nhóm liên kết và phủ kín

bản đồ, cần số lượng chỉ thị nhiều hơn nữa.

Sự ra đời của chỉ thị SSR hoặc microsatellite đã mang lại một thế hệ chỉ

thị mới. Các chỉ thị này thân thiện với người sử dụng hơn các chỉ thị phân tử

khác vì chúng được tạo ra dễ dàng, có mức độ đa hình cao và là chỉ thị đồng

trội. Ngoài ra nó có số lượng phong phú và phân bố cố định trong nhân cũng

như bộ gen của các cơ quan tử. Loa ̣i chỉ thi ̣ này rất hữu ích trong nghiên cứ u hệ gen vì chú ng đươ ̣c thiết kế dựa trên những vù ng mã hó a có tính bảo thủ cao trong hê ̣ gen (Varshney et al, 2005). Tuy nhiên việc nghiên cứu bộ gen

của đậu xanh còn đi sau các loài cây trồng khác vì thiếu các chỉ thị ADN đa

hình (Tangphatsornruang et al, 2009). Số lượng chỉ thị SSR đa hình được

công bố còn rất hạn chế cho đậu xanh. Do đó phát triển và xác định các chỉ thị

SSR đa hình của đậu xanh là yêu cầu rất quan trọng cho sự phát triển của cây

trồng này. Chính vì thế, Tangphatsornruang et al (2009) đã phát triển các chỉ

thị SSR đa hình và sử dụng để đánh giá kiểu gen đậu xanh. Bên cạnh đó thay

vì sử dụng chỉ thị SSR trực tiếp từ đậu xanh, các chỉ thị SSR được sinh ra từ

các cây họ đậu khác thuộc chi Vigna như đậu trạch, đậu cowpea, azukibean

v.v. cũng được sử dụng cho các nghiên cứu so sánh bộ gen (Lambrides và

Godwin, 2007; Somta và Srinives, 2007).

Isemura et al (2012) đã lập bản đồ liên kết gen của đậu xanh sử dụng

quần thể gồm 250 cá thể BC1F1 thu được từ cặp lai JP21874xJP229096 và

430 chỉ thị SSR và EST-SSR từ đậu xanh và các loài có quan hệ họ hàng với

nó và tất cả các chỉ thị được lập bản đồ thành 11 nhóm liên kết bao phủ 727,6

cM với mật độ chỉ thị trung bình là 1,78 cM. Bản đồ đậu xanh này là bản đồ

đầu tiên mà số lượng nhóm liên kết bằng với số lượng nhiễm sắc thể đơn bội

của đậu xanh.

Mặc dù chỉ thị SSR được phát triển và sử dụng rộng rãi cho việc lập bản

đồ di truyền trên nhiều đối tượng cây trồng trong đó có nhiều loài cây họ đậu

thuộc chi Vigna tuy nhiên trên đối tượng cây đậu xanh, chỉ thị này còn hạn

chế vì số lượng chỉ thị SSR đa hình thu được rất thấp, có nghiên cứu lập bản

đồ liên kết di truyền sử dụng 430 chỉ thị SSR được phát triển nhưng chỉ có 30 chỉ

thị SSR từ đậu xanh được định vị trên bản đồ (Chavan và Gacche, 2014).

Chỉ thị SNP (Single nucleotide polymorphism) ra đời được mong đợi là

sẽ thay thế các kỹ thuật chỉ thị phân tử khác đã được phát triển vào cuối thế

kỷ 20. Các chỉ thị SNP bao gồm cả các indel (insertion/deletion) ứng dụng rất

khả thi cho tăng mật độ chỉ thị, lập bản đồ QTL và chọn lọc nhờ chỉ thị phân

tử với lượng thông tin cao (Choudhary et al, 2012). Các SNP là những chỉ thị

có giá trị để lập bản đồ di truyền thông tin cao, phân tích đa dạng di truyền và

các nghiên cứu bản đồ liên kết trên cây trồng (Deleu et al, 2009). Sự ổn định

của các SNP và mức độ chính xác về mặt quan hệ di truyền của chúng cao

hơn của các hệ thống chỉ thị khác.

Sự phát triển nhanh chóng của các công cụ giải trình tự thế hệ mới (next-

generation sequencing - NGS) sẽ giúp dễ dàng phát hiện các SNP và SSR

toàn bộ bộ gen. Điều này gợi mở rằng các SNP và SSR của đậu xanh có thể

được xác định bằng các công nghệ NGS và ứng dụng cho cải tiến cây trồng và

chương trình chọn tạo giống. Tangphatsornruang et al (2009) đã đánh giá

470.024 trình tự shotgun của bộ gen đậu xanh bao phủ 100,5 Mb và xác định

1493 mô típ SSR. Tương tự vậy, thông qua giải trình tự phiên mã các thư viện

cADN ở hai nguồn gen đậu xanh, Moe et al (2011) đã phát hiện số lượng lớn

mô típ SSR và SNP. Khoảng cách trung bình giữa các SNP là 860 bp.

Van et al (2013) cũng đã phát triển các chỉ thị SNP của đậu xanh ở toàn

bộ bộ gen. Kết quả phát hiện được 305.504 SNP, trong đó có 40.503 SNP

được coi là đa hình. Trong số 265.001 SNP còn lại, 65,9% (174.579 trường

hợp) là sự chuyển tiếp và 34,1% (90.422 trường hợp) là chuyển đảo và đã

chọn được 42 SNP có giá trị.

Kang et al (2014) đã dò được 1.993 SNP đa hình trong đó có 1.321 SNP

(bao phủ 11 nhóm liên kết) đã được sử dụng để xây dựng bản đồ di truyền. 11

nhóm liên kết thể hiện là các nhiễm sắc thể giả định có chiều dài N50 là 35,4

Mb và bao phủ 314 Mb, tương ứng với 73% tổng số trình tự được đánh giá.

Ngoài ra các tác giả cũng phát triển được 200.808 chỉ thị SSR từ 1.544

scaffold. Số lượng các chỉ thị SSR mô típ lặp 3 Nu có giá trị sử dụng cho

đánh giá kiểu gen là 17.898 chỉ thị.

1.4.2. Lập bản đồ so sánh bộ gen

Các bản đồ liên kết của đậu xanh được phát triển trước đây đều sử dụng

các mẫu dò khác loại từ đậu trạch, đậu cowpea, đậu ván, đậu tương và các hệ

gen so sánh được nghiên cứu giữa đậu xanh với các cây họ đậu khác và các

loài thuộc chi Vigna. Đậu xanh và đậu cowpea có mức độ tương đồng cao về

bộ gen. Các yêu cầu chỉ thị và các nhóm liên kết tương tự nhau ở tổ chức gen

xuất hiện trên 10 vùng bộ gen mặc dù có tồn tại sự trùng lặp hoặc sắp xếp lại

(Menancio-Hautea et al, 1993). Các bản đồ liên kết của đậu xanh và

azukibean chia sẻ một số phân đoạn bộ gen bảo thủ. Isemura et al (2007) đã

chỉ ra rằng các nhóm liên kết 1,2,3,4,8 và 11 của bản đồ đậu xanh tương đồng

với các nhóm liên kết 1,4,10,8,2 và 9 ở bản đồ azukibean.

Hệ gen có tính bảo thủ cao giữa đậu xanh và đậu trạch xuất hiện cao hơn

giữa giữa đậu xanh vào đậu cowpea hoặc azukibean (Somta và Srinives,

2007). So sánh các bản đồ của đậu xanh và đậu trạch hoặc đậu tương chỉ ra

rằng bộ gen của đậu xanh có tính bảo thủ cao với đậu trạch hơn với đậu

tương. Các bản đồ liên kết giữa đậu xanh và đậu trạch chỉ ra đoạn gen có tính

bảo thủ rộng (trung bình 37cM với mức cao nhất là 100cM). Khi so sánh giữa

đậu xanh và đậu tương chỉ ra rằng các khối liên kết ngắn (chiều dài trung bình

12-13cM) và phân tán được đoạn bảo thủ và được coi là những sự sắp xếp lại

hệ gen giữa hai loài.

Lập bản đồ so sánh ở đậu xanh và khoảng cách quan hệ với cây đậu ván

cho kết quả ngạc nhiên là hai loài này chia sẻ một vài đoạn gen bảo thủ như

được chỉ ra bằng các yêu cầu chỉ thị và các nhóm liên kết tương tự (Humphry

et al, 2002).

1.4.3. Nghiên cứu lập bản đồ các gen chính và QTL ở đậu xanh

Sản xuất cây trồng thiệt hại đáng kể bởi nhiều yếu tố sinh lý và sinh hóa.

Một trong những ứng dụng quan trọng của lập bản đồ di truyền là xác định

các chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng nông sinh học quan trọng để tính

di truyền các tính trạng mong muốn có thể được đánh dấu ở các quần thể phân

ly. Ở đậu xanh, nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng đã được lập bản đồ

để sử sụng cho chọn lọc nhờ chỉ thị (MAS).

Tính trạng kháng mọt

Mọt là loài côn trùng gây hại nghiêm trọng đến đậu xanh. Gen kháng

mọt đã được phát hiện trên hai nguồn gen đậu xanh hoang dại là TC1966 và

ACC41 và được lập bản đồ. Gen này quy định tính kháng đối với loài mọt

Callosobruchus chinenis (Br) trong TC1966 được định vị trên nhóm liên kết 8

bằng chỉ thị AFLP sgA882 và mgM151 với khoảng cách tương ứng là 3,6 và

6,5cM (Young et al, 1992). Nhóm liên kết 8 này sau đó được đảo thành nhóm

liên kết 9 (Menancio-Hautea et al, 1993). Khoảng cách từ chỉ thị đến gen

được thu hẹp xuống còn 0,7cM giữa chỉ thị Bng143 và Bng110 (Kaga và

Ishimoto, 1998). Br chỉ cách chỉ thị Bng143 có 0,2cM. Chỉ thị này cùng vị trí

với gen Va là gen kiểm soát tạo ra axit Vignatic là độc tố với mọt. Chen et al

(2007) đã lập bản đồ gen kháng mọt từ nguồn kháng TC1966 sử dụng các chỉ thị

CAPs, RAPD và SCAR.

Tính kháng bệnh phấn trắng

Bệnh phấn trắng là bệnh do nấm Erysiphe polygoni DC. gây ra và là

bệnh phổ biến trên đậu xanh. Bệnh này gây thiệt hại năng suất lên đến 40%.

Zhang et al (2008) sử dụng chỉ thị RFLP (VrCS65) liên kết gần với tính

kháng bệnh phấn trắng định vị để sàng lọc thư viện BAC của đậu xanh và

phát triển 4 chỉ thị dựa trên PCR (hai chỉ thị SSR và hai chỉ thị STS) cùng bắt

nguồn từ chỉ thị RFLP gốc VrCS65. Nghiên cứu này giúp cho việc phát triển

các giống đậu xanh kháng bệnh nhờ MAS.

Tính kháng bệnh khảm vàng (MYMV)

Xác định vị trí và lập bản đồ gen và các QTL kháng với MYMV sử dụng

các chỉ thị thu được từ các loài họ đậu khác như azukibean, đậu trạch, cowpea

và đậu tương. Tuy nhiên tất cả các nghiên cứu này, chỉ thị xác định được

không liên kết gần với tính trạng (>5cM), các nghiên cứu xác định liên kết

chặt hoặc đánh giá các chỉ thị vẫn chưa được tiến hành. Do đó việc nghiên

cứu phát hiện và đánh giá các chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng

MYMV cần được tập trung nghiên cứu hơn nữa. Điều này sẽ giúp cho việc

chuyển các gen kháng sang các giống đậu xanh nhiễm bệnh một cách nhanh

chóng nhờ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS). Một số nghiên cứu xác

định chỉ thị phân tử liên kết gen kháng bệnh MYMV đã được tiến hành.

Selvi et al (2006) đã định vị được gen kháng bệnh khảm vàng ở giống

đậu xanh ML267 và chỉ thị sinh ra từ mồi OPS7900 liên kết gần với gen kháng

này. Dhole và Reddy (2013) cũng đã xác định các chỉ thị liên kết với gen

kháng MYMV sử dụng quần thể RIL được phát triển từ phép lai TM-99-37

(R) x Mulmarada (S), sử dụng phương pháp BSA. Trong số 140 mồi RAPD,

có 45 mồi đa hình ở bố mẹ được sàng lọc sử dụng BSA. Ba mồi được khuếch

đại đoạn đa hình đặc hiệu: OPB-07600, OPC-061750 và OPB-12820. Chỉ thị

OPB-07600 liên kết gần hơn với gen kháng MYMV (6,8cM) sau đó đoạn đặc

hiệu kháng OPB-07600 được tách dòng, giải trình tự và chuyển đổi thành chỉ

thị SCAR. Tuy nhiên tất cả các nghiên cứu lập bản đồ này không có chỉ thị

nào liên kết gần với tính trạng (đều lớn hơn 5cM).

Kitsanachandee et al (2013) đã nghiên cứu lập bản đồ QTL kháng bệnh

khảm vàng virus chủng MYMIV trên đậu xanh. Tác giả đã sử dụng quần thể

lập bản đồ là quần thể RIL được tạo ra ở Thái Lan từ phép lai giữa giống

NM10-12-1 (kháng MYMIV) và giống KPS2 (nhiễm MYMIV). Quần thể

RIL này gồm 122 dòng cùng với bố mẹ được đánh giá khả năng kháng

MYMIV trong điều kiện lây nhiễm bệnh tự nhiên trên đồng ruộng tại Ấn Độ

và Pakistan. Bản đồ liên kết gen đã được lập cho quần thể RIL sử dụng các

chỉ thị SSR. Lập bản đồ CIM đã xác định được 5 QTL đối với tính kháng

MYMIV trong đó có 3 QTL cho Ấn Độ và 2 QTL cho Pakistan. Các QTL này

được ký hiệu từ qYMIV1 đến qYMIV5 kiểm soát hơn 50% sự biến động trong

các phản ứng bệnh. Trong đó, 2 QTL qYMIV1 và qYMIV4 là 2 QTL chính đối

với tính kháng MYMIVvà nằm trên cùng một locus.

Ngoài ra các tính trạng khác trên đậu xanh cũng được lập bản đồ QTL như

tính trạng trọng lượng hạt, độ cứng hạt (Humphry et al, 2005). Một số tính trạng

liên quan đến sự thuần hóa của đậu xanh cũng được lập bản đồ QTL.

1.4.4. Lập bản đồ vật lý trên cây đậu xanh 1.4.4.1. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS)

Công nghệ giải trình tự dideoxy Sanger (Sanger et al, 1977) và những cải

tiến của nó nổi trội trong lĩnh vực giải trình tự ADN trong gần 30 năm qua và

trong 10 năm cuối, chiều dài của các đoạn đọc trình tự Sanger đã được tăng từ

450 base lên hơn 1 kb.

Điểm hạn chế của công nghệ này là: 1) nhất thiết phải tách các sản phẩm

kéo dài theo kích thước trước khi quét, yêu cầu mỗi mẫu phải có một mao

mạch hoặc một làn gel; 2) cần thiết phải tạo ra các quần thể tách dòng của

ADN sử dụng vi khuẩn E. coli để hoạt động trên quy mô lớn. Yêu cầu thứ hai

này có thể được giảm bằng cách sử dụng các phương pháp dựa trên PCR (mặc

dù gần đây tách dòng nhờ E. coli vẫn được sử dụng cho các dự án giải trình tự

toàn bộ bộ gen). Chi phí phản ứng cho giải trình tự có thể giảm xuống nếu sử

dụng thể tích phản ứng giảm nhưng hạn chế cơ bản của việc giảm chi phí giải

trình tự Sanger là ở những giới hạn công nghệ của chúng.

Với những tiến bộ được tạo ra trong các lĩnh vực kênh dẫn vi lưu

(microfuidics), công nghệ nano và công nghệ thông tin, các công nghệ thay

thế để tăng nhanh chóng việc giải trình tự ADN đã được tạo ra. Thuật ngữ

công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) được sử dụng cho các công nghệ

giải trình tự khác công nghệ Sanger. Các công nghệ NGS có tên thương mại

là Roche/454, Solexa/Illumina và AB SOLiD được xây dựng mô hình tiềm

năng để khắc phục những hạn chế của công nghệ Sanger như việc giải trình tự

có thể được ghép ở mức độ lớn hơn nhiều bởi tiến hành nhiều phản ứng song song

ở mức chi phí giảm đáng kể (Hudson, 2008).

Gần đây công nghệ Roche/454, Solexa/Illumina và AB SOLiD là những

công nghệ chiếm ưu thế được sử dụng trong các ứng dụng chọn tạo giống và

di truyền cây trồng. Mặc dù công nghệ Roche/454 có ưu điểm hơn hai công

nghệ còn lại vì cho ra các đoạn đọc trình tự dài hơn, đầu ra số liệu tối đa cao

hơn nhưng chi phí đắt hơn (Gupta, 2008).

Các ứng dụng của công nghệ NGS

Các công nghệ NGS đang được sử dụng cho đa dạng các ứng dụng như

phát triển chỉ thị SNP ở cả những loài cây trồng có bộ gen tham khảo hay

không có bộ gen tham khảo. Khi các trình tự bộ gen tham khảo không có, các

công nghệ NSG có thể được sử dụng để giải trình tự nháp qua các phương

pháp khác nhau gồm góp chung các dòng nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn

(BAC) mà nhờ đó có thể tạo điều kiện cho việc đánh giá bộ gen một cách

nhanh chóng (Wicker et al, 2006). Điểm tiến bộ nữa của công nghệ NGS là

hữu ích để phát triển nhanh chóng và hiệu quả các bộ gen cho các loài cây

trồng thứ yếu hay còn được gọi là “orphan crop” (Varshney et al, 2009a). Các

công nghệ này cũng nhanh chóng trở thành phương pháp được lựa chọn cho

phân tích biểu hiện gen, cụ thể cho các loài mà trình tự bộ gen tham khảo đã

có. Công nghệ NGS cũng được ứng dụng cho lập bản đồ liên kết, lai xa và

chuyển gen, các cải biến biểu sinh và sinh học quần thể. Công nghệ NGS gần

đây được sử dụng cho các dự án giải trình tự toàn bộ bộ gen và giải trình tự

lại các bộ gen của một số loài đã được giải trình tự để tìm kiếm thêm số lượng

lớn hơn các SNP cho việc phát hiện đa dạng giữa các loài, xây dựng bản đồ

dạng đơn bội và tiến hành nghiên cứu liên kết rộng của bộ gen (genome-wide

association studies – GWAS) (Metzker, 2009). Các ứng dụng của công nghệ

NGS liên quan đến di truyền và chọn giống cây trồng đã được Varshney et al

(2009b) mô tả chi tiết.

Các ứng dụng của công nghệ NGS cũng đã được áp dụng trên cây đậu

xanh. Để nghiên cứu trình tự bộ gen và cấu trúc lạp thể của đậu xanh

(Tangphatsornruang et al, 2010), tạo ra và đánh giá các trình tự bộ gen ngắn

bao phủ 100,5 Mb của đậu xanh và xác định các chỉ thị SSR

(Tangphatsornruang et al, 2009), phát triển các chỉ thị SSR và SNP thông qua

phân tích phiên mã (Moe et al, 2011) sử dụng công nghệ giải trình tự 454.

Phát hiện các SNP trên diện rộng của bộ gen (Van et al, 2013), ghép để xây

dựng trình tự bộ gen đầy đủ, phát hiện các SNP và các SSR của đậu xanh

(Kang et al, 2014) sử dụng công nghệ giải trình tự Ilumina.

1.4.4.2. Đánh giá kiểu gen thông qua giải trình tự (GBS)

Sự ra đời của các công nghệ NGS và các ứng dụng rộng rãi của nó đã

dẫn đến chi phí cho việc giải trình tự ADN giảm xuống đến mức mà có thể

đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự (GBS) và có thể thực hiện cho các loài có

bộ gen lớn, mức độ đa dạng cao. Phương pháp GBS phù hợp cho các nghiên

cứu quần thể, đánh giá nguồn gen, chọn giống và lập bản đồ tính trạng trong

đa dạng các loài sinh vật. Quy trình này có thể được khái quát cho tất cả các

loài ở mức chi phí thấp, được dựa trên thông tin cao, giải trình tự thế hệ mới

của các tập phụ bộ gen mục tiêu bằng các enzyme cắt hạn chế.

Mặc dù GBS được tiến hành khá đơn giản cho bộ gen nhỏ, làm giàu mục

tiêu hay giảm sự phức tạp của hệ gen phải được sử dụng để đảm bảo đủ sự

chồng chéo trong phạm vi trình tự của loài có bộ gen lớn. Chiến lược làm giàu

bao gồm khuếch đại bằng PCR phạm vi dài của các vùng bộ gen cụ thể, sử

dụng các mẫu dò phân tử đảo ngược, và các phương pháp bắt cặp trình tự/ lai

ADN khác nhau (Mamanova et al, 2010) tốn thời gian, thách thức về mặt

công nghệ và có thể nâng chi phí để phân tích số lượng lớn mẫu. Giảm sự

phức tạp của bộ gen bằng các enzyme hạn chế (RE) rất dễ dàng, nhanh chóng,

rất cụ thể, khả năng sản sinh cao, và có thể chạm tới các khu vực quan trọng

của bộ gen mà không thể tiếp cận với các phương pháp bắt cặp trình tự. Bằng

cách lựa chọn các RE thích hợp, vùng lặp cao của bộ gen có thể tránh được và

vùng lặp thấp hơn có thể được nhắm mục tiêu với hiệu quả cao hơn gấp hai

đến ba lần (Gore et al, 2009), mà rất đơn giản hoá thách thức về mặt tính toán

vấn đề liên kết trong loài có mức độ đa dạng di truyền cao.

Tăng hiệu quả và giảm chi phí bằng cách kết hợp chiến lược giải trình tự

phức hợp sử dụng hệ thống mã vạch không tốn kém. Vì mã vạch là một trong

các trình tự tiếp hợp (tức là, chúng không được thêm vào các mẫu ADN đơn

lẻ bằng PCR), chi phí hóa chất cho xây dựng thư viện giải trình tự được giảm

thiểu. Các đoạn hạn chế được sinh ra với bộ tiếp hợp thích hợp đơn giản hơn,

tiêu hủy giếng đơn của ADN genome và kết quả gắn bộ tiếp hợp dẫn đến

giảm xử lý mẫu, có rất ít các bước làm tinh sạch ADN và các đoạn ADN

không phải chọn lọc kích thước (Elshire et al, 2011).

Phương pháp GBS đã được áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng

nhưng trên đậu xanh, phương pháp này mới lần đầu tiên được áp dụng để xây

dựng bản đồ di truyền từ quần thể RIL gồm 190 dòng F6 (Kang et al, 2014).

Mặc dù phương pháp GBS có nhiều ưu điểm, nhiều ứng dụng và chi phí

cho đánh giá kiểu gen giảm, công nghệ giải trình tự vẫn đang tiếp tục phát

triển nhanh chóng, các phương pháp phân tích số liệu cũng đang phát triển

nhưng hầu như tất cả đều sử dụng hệ điều hành Linux. Đây là một rào cản rất

lớn cho các nhà sinh vật học. Các kỹ năng phân tích số liệu trên máy tính là

chìa khóa để tiến hành các thí nghiệm GBS thành công.

1.4.5. Tiềm năng ứng dụng những thành tựu nghiên cứu hệ gen đậu xanh

trong cải tiến di truyền cây trồng kháng bệnh nhờ MAS

Yếu tố quan trọng quyết định trong chọn giống là chọn lọc cá thể dựa

trên những đặc tính mong muốn và việc tập hợp các đặc tính quan tâm này

vào một cá thể được chọn lọc. Ứng dụng MAS có thể cung cấp một hệ thống

chọn lọc gián tiếp có thể thay thế cho chọn lọc truyền thống dựa trên kiểu

hình thông qua các thế hệ bằng cách dựa trên chỉ thị phân tử ADN liên kết với

các tính trạng quan tâm trong phòng thí nghiệm. Hầu hết các tính trạng kinh tế

quan trọng đều được điều khiển bởi nhiều QTL bao gồm nhiều gen chi phối

đến kiểu hình. Những chỉ thị ADN đã được định vị trên bộ gen có liên kết rất gần với QTL của tính trạng quan tâm có thể được dù ng thay chọn lọc kiểu hình đó. Ứng dụng MAS có thể giúp nâng cao hiệu quả của chọn lọc ở mức

chọn được ADN liên kết với gen quan tâm ở ngay trong những thế hệ đầu của

chu trình chọn lọc, giúp giảm thế hệ cần chọn lọc, tiết kiệm thời gian trong

chọn giống (Hospital, 2009). Cách tiếp cận này có một lợi thế đặc biệt trong

các lĩnh vực thuộc các chương trình chọn giống ở đậu xanh như: quy tụ nhiều

gen, lai trở lại, nghiên cứu ưu thế lai, đánh giá đa dạng di truyền và chọn lọc

bố mẹ, xác định giống và đánh giá độ thuần hạt giống và đánh giá vật liệu

chọn giống.

Chọn giống nhờ MAS đã trở thành công cụ hữu ích để cải tiến giống cây

trồng. Một số các chỉ thị phân tử được phát triển cho các tính trạng nông sinh

học quan trọng của đậu xanh, bao gồm chỉ thị liên kết tính kháng mọt (Chen

et al, 2007; Sarkar et al, 2011), kháng bệnh phấn trắng (Kasettranan et al,

2010), kháng bệnh khảm vàng (Selvi et al, 2006; Dhole và Reddy, 2013) và

các chỉ thị này có thể giúp ích cho chọn lọc bằng chỉ thị phân tử (MAS).

Các bản đồ liên kết dựa vào các chỉ thị phân tử như RFLP, RAPD,

AFLP, SSR hiện có cho lai khác loài của đậu xanh và quyết định 11 nhóm

liên kết (Humphry et al, 2002; Zhao et al, 2010; Isemura et al, 2012). Tuy

nhiên, tỉ tệ đa hình của các hệ thống chỉ thị hiện tại cho đậu xanh không đủ

cho chọn giống phân tử do nền di truyền hẹp của cây trồng này. Các chỉ thị

SNP có độ phong phú cao trong bộ gen và cung cấp nguồn chỉ thị thích hợp

cho chọn giống phân tử. Kích thước bộ gen nhỏ của đậu xanh sẽ làm cho loài

cây trồng này có thể khả năng giải trình tự bộ gen đầy đủ cao hơn và giảm độ

khó trong giải trình tự thư viện biểu hiện, có hướng để tạo ra số lượng lớn chị

thị SNP (Moe et al, 2011; Van et al, 2013; Kang et al, 2014). Nguồn chỉ thị

này bao phủ dày đặc lện hệ gen của đậu xanh sẽ thuận lợi cho chọn lọc nhờ

phân tử đối với các tính trạng đơn giản và phức tạp trên đậu xanh. Các chỉ thị

SNP liên kết với các tính trạng nông sinh học quan trọng sẽ được lai trở lại

nhờ phân tử và các phương pháp chọn lọc hồi quy và do đó cung cấp các

phương tiện cho tiến trình nhanh chóng phát triển các dòng đậu xanh cải tiến.

1.5. NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ LẬP BẢN ĐỒ PHÂN TỬ Ở VIỆT NAM

Ở nước ta, cho tới nay đã có một số công trình nghiên cứu đa dạng di

truyền và lập bản đồ gen, QTL ở một số loại cây trồng như: lúa, ngô, sử dụng

chỉ thị RAPD, RGA, SSR, AFLP, RFLP… Tuy số lượng các nghiên cứu này

chưa nhiều, nhưng đã cho thấy nước ta hoàn toàn có khả năng thực hiện

những nghiên cứu sinh học sử dụng các phương pháp công nghệ hiện đại

nhằm đẩy mạnh công tác chọn tạo giống cây trồng trong nước.

Trên cây lạc, bản đồ liên kết định vị 8 QTL quy định tính kháng bệnh

đốm lá muộn đã được thiết lập với các chỉ thị SSR có khoảng cách từ 5,8cM

đến 14,8cM. Các chỉ thị này đã được ứng dụng để chọn lọc rút ngắn thời gian

chọn giống lạc kháng bệnh (Lưu Minh Cúc, 2009).

Trên cây bông cỏ, Nguyễn Thị Lan Hoa (2013) đã lập bản đồ liên kết

định vị QTL quy định tính kháng bệnh xanh lùn nằm trên nhiễm sắc thể số 10.

Bản đồ này được lập dựa vào 99 chỉ thị SSR sử dụng quần thể phân ly F2

(B10xKXL002). Kết quả phân tích đã cho thấy có gen trong vùng xung quanh

chỉ thị BNL2960 trên nhiễm sắc thể số 10 có ảnh hưởng đến tính kháng bệnh xanh lùn. Ta ̣i giá tri ̣ P này, mứ c đô ̣ ảnh hưở ng củ a vù ng gen chi phố i đến biểu hiê ̣n tính tra ̣ng là 25,5% và 2 chỉ thị SSR liên kết hai phía gen kháng bệnh xanh lùn (Kxl) là NAU1169 và BNL3646 với khoảng cách giữa hai chỉ thị là

14,6cM.

Nói chung, chỉ thị phân tử có vai trò quan trọng trong các nghiên cứu cơ

bản và ứng dụng hỗ trợ cho phương pháp chọn giống truyền thống. Tuy

nhiên, tại Việt Nam, nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử còn ít trong khi

nước ta là một nước nông nghiệp, nhu cầu về cải tiến giống cây trồng rất lớn.

Xuất phát từ những đòi hỏi thực tiễn nghiên cứu và sản xuất, chúng tôi tiến

hành đề tài với hy vọng góp một phần vào việc ứng dụng công nghệ chỉ thị

phân tử trong việc tìm hiểu hệ gen cây đậu xanh, từng bước đưa những tiến bộ

của công nghệ sinh học áp dụng vào các chương trình chọn giống đậu xanh

kháng bệnh trong tương lai.

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁ P NGHIÊN CỨ U

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Giống đậu xanh

+ Thí nghiệm sàng lọc nguồn gen đậu xanh kháng bệnh khảm vàng:

- 96 nguồn gen đậu xanh địa phương và nhập nội đang được lưu giữ tại ngân

hàng gen cây trồng Quốc gia được đánh giá trong ba năm 2012, 2013 và 2014

bao gồm cả giống đối chứng nhiễm bệnh chuẩn là KPS2 (Akhtar et al, 2011)

có nguồn gốc từ AVRDC (Bảng 2.1 và Phụ lục 1)

Bảng 2.1. Nguồn gốc các nguồn gen đậu xanh được đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng tại Phú Yên

Nguồn gốc Số lượng nguồn gen

Giống địa phương (Việt Nam) 84

AVRDC 9

Nước khác 03

Tổng cộng 96

+ Thí nghiệm đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh:

- 94 nguồn gen được đóng góp từ các quốc gia và tổ chức khác nhau gồm Việt

Nam (50 nguồn gen), AVRDC (13 nguồn gen) và Úc (31 nguồn gen) (chi tiết

ở Phụ lục 2)

+ Quần thể lập bản đồ: 200 dòng quần thể đậu xanh F3 do AVRDC khu vực

Nam Á đóng tại ICRISAT, Hyderabad, Ấn Độ tạo ra từ tổ hợp lai NM94

(kháng MYMV) và KPS2 (nhiễm MYMV)

- Nguồn bệnh

Nguồn bệnh là những cây đậu xanh bị bệnh khảm vàng thu thập tại Phú

Yên với triệu chứng điển hình.

- Các vật liệu hóa chất dùng trong sinh học phân tử 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Phân lập và xác định virus gây bệnh khảm vàng ở Việt Nam

+ Thu mẫu bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh và các cây họ đậu khác;

+ Xác định virus gây bệnh khảm vàng bằng ELISA và PCR.

Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng kháng bệnh khảm vàng và đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống trong tập đoàn đậu xanh Nội dung 3: Nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đậu xanh + Đánh giá đa dạng di truyền cây đậu xanh bằng chỉ thị phân tử DArT + Chọn tổ hợp lai để xây dựng quần thể lập bản đồ Nội dung 4: Nghiên cứu lập bản đồ gen của cây đậu xanh + Đánh giá kiểu hình và kiểu gen tính kháng bệnh khảm vàng của quần thể

đậu xanh lập bản đồ.

+ Xây dựng bản đồ di truyền và xác định QTL kháng bệnh, chỉ thị phân tử

liên kết với tính kháng bệnh khảm vàng ở đâ ̣u xanh.

2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.3.1. Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2011 đến năm 2015.

2.3.2. Địa điểm nghiên cứu

- Các nghiên cứu đánh giá tính kháng bệnh trên đồng ruộng được thực hiện tại

Nam An Nghiệp, Tuy An, Phú Yên

- Các thí nghiệm đánh giá bệnh trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo thực hiện

tại hệ thống nhà lưới chống côn trùng của Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, Học

viện Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Tài nguyên Thực vật.

- Các thí nghiệm nghiên cứu về sinh học phân tử được thực hiện tại Bộ môn

Đa dạng Sinh học Nông nghiệp - Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Trung tâm

Bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Phòng virus học và

Phòng chỉ thị phân tử - Trung tâm Rau thế giới (AVRDC, Đài Loan).

2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1. Phương pháp xác định virus gây bệnh khảm vàng đậu xanh

Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu bệnh

Thu thập và bảo quản mẫu bệnh được tiến hành theo AVRDC như sau:

- Mẫu bệnh được thu thập ngẫu nhiên trên đồng ruộng tại các vùng trồng đậu

xanh chính và ghi chép các thông tin liên quan theo biểu mẫu củ a DSMZ

(Ngân hàng vi sinh vâ ̣t và nuôi cấy mô Đứ c).

- Mẫu bệnh được thu là mẫu lá hoă ̣c quả non và được cất giữ trong bao giấy,

quản lý mẫu theo số thu thâ ̣p kèm theo thông tin chi tiết củ a mẫu cù ng hình ảnh mẫu bê ̣nh.

- Làm khô mẫu bằng silicagel tự chỉ thị. Mẫu khô được bảo quản trong lọ hoặc

ống falcon kín chứa silicagel và bảo quản ở điều kiê ̣n thườ ng.

Tách chiết ADN tổng số

Tách chiết ADN tổng số bằng dung dịch đệm CTAB (Doyle và Doyle, 1987): 1. Mẫu lá non được nghiền mịn trong nitơ lỏng trong ống eppendorf 2ml

sau đó thêm 1 ml dung dịch đệm CTAB (ở 65oC [(0,2M TrisHCl, 0,05M

EDTA pH 8,0, 2M NaCl, 2% CTAB), 5% (w/v) PVP-40 (Sigma)].

2. Ủ mẫu ở 65oC từ 30-1 giờ, lắc ống 20 phút một lần trong bồn ủ lắc,

3. Làm mát xuống trong 5 phút và bổ sung 1 ml hỗn hợp chloroform:

isoamyl alcohol (24:1), trộn đều trong 30 phút.

4. Các mẫu sau đó được ly tâm trong 20 phút ở tốc độ 1000 vòng/phút ở

nhiệt độ phòng.

5. Chuyển phần dịch chiết sang ống 1,5ml sạch, bổ sung thêm cùng thể

tích isopropanol lạnh và lắc ống nhẹ nhàng 10 lần. Ly tâm để thu kết tủa trong

20 phút ở tốc độ 1000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.

6. Rửa kết tủa bằng 2ml EtOH 70%, loại bỏ EtOH, làm khô kết tủa ở 45oC

và hòa tan trong 250ul 1xTE (10mM TrisHCl pH 8,0, 1mM EDTA pH 8,0)

7. Kiểm tra chất lượng và số lượng ADN trên gel agarose 0,8%. Tinh

sạch ADN sử dụng Kit (ZR-96 DNA clean and concentratorTM-5 (Zymo

Research). Nồng độ chính xác được đo trên máy quang phổ nanodrop.

Các mồi phát hiện begomovirus và ADN vệ tinh (Bảng 2.2)

Mồi

Trình tự (5’-3’)

Mục tiêu

Tham khảo

Sản phẩm (kb)

BegoA-Rev1

1.2

Ha et al, 2006

ADN-A của begomovirus

BegoA-For1

PALv1978B

1.5

Tsai et al, 2011

ADN-A của begomovirus

PAR1c715H

Beta1

1.35

ADN-beta

Briddon et al, 2002

Beta2

ATHCCMDCHATCKTBCT iTGCAATCC TGYGARGGiCCiTGYAAR GTYCARTC GCATCTGCAGGCCCACA TBGTYTTHCCNGT GATTTCTGCAGTTDATR TTHTCRTCCATCCA GGTACCACTACGCTACG CAGCAGCC GGTACCTACCCTCCCAG GGGTACAC

Ghi chú: Y: C/T, R: G/A, H: A/C/T, M: A/C, B: C/G/T, D: A/G/T, K: G/T; i=inosine.

Bảng 2.2. Các mồi chung phát hiện ADN-A và ADN-β

Chu trình phản ứng PCR

Thành phần phản ứng PCR H2O Buffer phản ứng PCR (Invitrogen) dNTPs 10mM (2,5mM mỗi loại) Mồi F (10 µM) Mồi R (10 µM) MgCl2 50mM (Invitrogen) Taq (5U/ µl, Invitrogen) AND Tổng thể tích 26,3 µl 5,0 µl 4,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 2,5 µl 0,2 µl 10 µl 50 µl

Chương trình phản ứ ng PCR chạy 30 chu kỳ (biến tính ở 94oC trong 1 phút, gắn mồi ở 55oC trong 2 phút, kéo dài ở 72oC trong 2 phút). Sau đó ủ ở 72oC trong 10 phút

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2 % trong TBE 0,5X

Phương pháp tách dòng và giải trình tự ADN của begomovirus

Các chủng virus thu thập được lựa chọn theo cây trồng, vị trí thu thập và

trình tự của sản phẩm PCR ADN-A 1,5kb để giải trình tự hoàn chỉnh. Dựa

vào việc căn trình tự của các sản phẩm PCR 1,5kb và trình tự nucleotide thu

được trên GenBank, thiết kế mồi khuếch đại các đoạn ADN-A và ADN-B

hoàn chỉnh của các chủng MYMV từ Việt Nam. Các đoạn ADN-A và ADN-B

hoàn chỉnh này sau đó được tách dòng và giải trình tự.

Để phân tích trình tự, các sản phẩm PCR ADN-A 1,5bk được khuếch đại

bằng cặp mồi PAL1v1978B/PAR1c715H và nhân dòng bằng vectơ pGEM-T

Easy theo chỉ dẫn của nhà sản xuất (Promega, WI, USA). Sản phẩm nhân

dòng được nhuộm bằng BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit và

giải trình tự bằng thiết bị ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied

Biosystems, San Francisco, CA, USA) tại công ty Yourgene (Đài Loan).

Phân tích trình tự của các ADN begomovirus

Sử dụng BLASTn trên NCBI (National Centre for Biotechnology

Information) để tìm kiếm các trình tự của geminivirus trên cơ sở dữ liệu của

GenBank tương đồng nhất với trình tự ADN hoàn chỉnh thu được. Phần mềm

ClustalX2 2.0 (Larkin et al, 2007) được sử dụng để căn trình tự và so sánh

trình tự. Cây đa dạng di truyền (Phylogenetic tree) của các ADN-A và ADN-

B của virus được tạo ra bằng phần mềm MEGA6 (Tamura et al, 2013) sử

dụng phương pháp Neighbour-Joining với độ lặp bootstrap là 1000. Khoảng

cách tiến hóa được kiểm tra bằng mô hình p-distance. Chi tiết các trình tự từ

GenBank để so sánh và phân tích được ghi chú trong Phụ lục 3.

Kỹ thuật ELISA

Kỹ thuật ELISA là TAS-ELISA (Triple antibody sandwich –ELISA)

được sử dụng để chẩn đoán một virus rất phổ biến trên cây đậu đỗ tại Việt

Nam là Bean common mosaic virus. Kit ELISA do Viện DSMZ (Đức) cung

cấp và qui trình được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.4.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền sử dụng DArT

Nguyên lý chung của phương pháp:

DArT (Diversity Array Technology) dựa trên cơ sở các phép lai

microarray để phát hiện sự có mặt hay không của các mảnh ADN cá thể trong

đại diện của bộ gen (Jaccoud et al, 2001). Trong kỹ thuật ADN microarray,

người ta cố định các đoạn ADN có trình tự xác định (mẫu dò) trên giá thể

(mảng) thích hợp theo thứ tự. ADN cần nghiên cứu (đích) được đánh dấu sau

đó lai với mẫu dò trên mảng. Ở những điều kiện lý tưởng, các ADN có trình

tự bổ sung bắt cặp chính xác với nhau.

Tách chiết ADN

Các nguồn gen nghiên cứu được gieo trồng, thu lá non từ 5 cây/nguồn

gen để tách chiết ADN tại Phòng chỉ thị phân tử, AVRDC - Đài Loan. Tách

chiết ADN theo phương pháp chiết ADN tổng số bằng dung dịch đệm CTAB

(Doyle và Doyle, 1987) như được mô tả ở trên.

Sau khi tách chiết ADN của đậu xanh, các mẫu ADN này được gửi đến

công ty Diversity Arrays Technology, Bldg 3, Lv D, University of Canberra,

Kirinari st., Bruce, ACT 2617, Australia để thực hiện các bước tiếp theo của

quy trình DArT và nhận lại số liệu thô cho phân tích đa dạng di truyền.

Phân tích số liệu DarT

Các dòng DArT đa hình với P lớn hơn hoặc bằng 80 được lựa chọn để

phân tích đa dạng di truyền của đậu xanh sử dụng phần mềm DARwin 6. Sơ

đồ hình cây được xây dựng dựa trên khoảng cách di truyền của Nei (1978)

theo phương pháp UPGMA bằng phần mềm DARwin 6.

2.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh

2.4.3.1. Đánh giá trong điều kiện áp lực bệnh tự nhiên

Thí nghiệm đồng ruộng đánh giá tính kháng bệnh khảm vàng đậu xanh

được đặt dưới điều kiện áp lực bệnh tự nhiên tại Tuy An, Phú Yên trong vụ

Hè (từ tháng 4 đến tháng 7). Đây là vùng trồng đậu xanh đã được ghi nhận

xuất hiện triệu chứng bệnh trong nhiều năm liên tục tại Nam Trung Bộ.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm sàng lọc nguồn gen kháng bệnh của tập đoàn đậu xanh được

bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) với 3 lần lặp, khoảng cách

hàng x hàng: 40cm, cây x cây: 10cm, 15 cây/hàng/lần lặp.

Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của các dòng

trong quần thể F2:3 được bố trí tuần tự không nhắc lại, khoảng cách hàng x

hàng: 40 cm, cây x cây: 10 cm, 30 cây/dòng. Các cây này được đeo thẻ từ 35

ngày sau trồng để phục vụ cho quá trình đánh giá.

Giống nhiễm chuẩn KPS2 được trồng kẹp giữa mỗi 2 dòng/giống nghiên

cứu ở tất cả các lần lặp để đảm bảo áp lực bệnh đồng đều giữa các dòng đậu

xanh. Thí nghiệm được bao quanh bởi 3 hàng nhiễm chuẩn KPS2 được trồng

xung quanh khu thí nghiệm. Các hàng bao quanh được trồng trước đến khi

xuất hiện triệu chứng bệnh mới tiến hành bố trí thí nghiệm để đảm bảo đủ áp

lực bệnh tự nhiên. Thí nghiệm được cách ly với các ruộng xung quanh bởi 3

hàng giống ĐX208 – là giống được trồng phổ biến ở Phú Yên.

Quy trình kỹ thuật chăm sóc chung đối với cây đậu xanh được áp dụng

cho thí nghiệm, nhưng không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để không ảnh

hưởng đến quần thể bọ phấn - vector truyền bệnh. Cấp bệnh được đánh giá

trên từng cây theo thang điểm 6 cấp (được cung cấp bởi AVRDC) tại thời

điểm cây được 35 và 55 ngày sau trồng.

Bảng 2.3. Thang điểm (1-6) đánh giá bệnh khảm vàng (MYMD) (theo AVRDC)

Cấp Triệu chứng trên từng cây

Mức độ

1 Không biểu hiện triệu chứng

Kháng cao (HR)

2 Xuất hiện đốm khảm vàng nhỏ (5% diện tích lá)

Kháng (R)

3 Khảm vàng trên lá từ 5.1 -15% diện tích lá

Kháng TB (MR)

4 Khảm vàng lớn hơn chiếm 15.1 -30% diện tích lá

Nhiễm TB (MS)

Triệu chứng rõ rệt, lá bị khảm từ 30.1 -75%, lá và

Nhiễm (S)

quả đổi màu rõ rệt, cây còi cọc

Nhiễm nặng (HS)

Triệu chứng khảm vàng rõ rệt, lá bị khảm trên 75%, kích thước của quả bị giảm, cây còi cọc

2.4.3.2. Đánh giá trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo nhờ bọ phấn

Chuẩn bị cây nguồn nhiễm bệnh để lây nhiễm

Cấu trúc xâm nhiễm của MYMV được phát triển và biến nạp thành công

vào vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens (Nguyễn Đức Anh, 2013), kỹ thuật

lây nhiễm nhân tạo nhờ vi khuẩn (Agroinoculation) đã được áp dụng để tạo ra

cây nguồn cho lây nhiễm nhờ bọ phấn. Kỹ thuật lây nhiễm nhân tạo là kĩ thuật

đưa cấu trúc xâm nhiễm mang bộ gen của virus vào tế bào thực vật bằng vi

khuẩn A. tumefeciens.

Lây nhiễm nhân tạo dòng vi khuẩn A.tumefaciens chứa cấu trúc xâm

nhiễm MYMV bằng phương pháp ủ hạt qua đêm (Mandal et al, 1997)

Bước 1: Nuôi riêng rẽ dòng A.tumefaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm của

(ATMY 17-6-1) và (ATMY 6-1-1) trong 100-200 ml môi trường LB lỏng

chứa Kanamycin (50µg/ml), Rifampicin (100µg/ml) và Streptomycin (50

µg/ml), lắc ở 220rpm, 28oC, khoảng 20 giờ.

Bước 2: Ly tâm dịch vi khuẩn trong điều kiện 5000rpm trong 10phút ở

20oC (không cần điều chỉnh pH) và OD ≈ 1. Hòa dịch vi khuẩn trong 10ml

dung dịch chứa MgCl2 10mM và Acetosingone 150µM

Bước 3: Hạt được ngâm trong nước cất vô trùng qua đêm và bỏ vỏ hạt.

Hình 2.1. Tạo cây nguồn để lây nhiễm nhân tạo

(những cây có triệu chứng được kiểm tra lại bằng PCR) Bước 4: Tạo vết thương bằng cách dung kim châm hạt vùng (xung

quanh) trụ mầm. Ngâm hạt trong dịch vi khuẩn đã chuẩn bị ở bước 3

Bước 5: Đặt hạt đã bị châm trong điều kiện nhiệt độ <30oC (25-28oC)

trong vòng 12 giờ, rửa hạt bằng nước cất vô trùng và gieo trong chậu nhựa, để

cây ở điều kiện dưới 30oC. Cây biểu hiện triệu chứng bệnh sau 2-4 tuần sau

lây nhiễm. Cây có triệu chứng điển hình và có biểu hiện dương tính với

MYMV (PCR test) sẽ được sử dụng làm cây nguồn cho bọ phấn chích hút để

truyền bệnh.

Lây nhiễm nhân tạo sử dụng bọ phấn

Các dòng đánh giá được gieo trong khay xốp, mỗi dòng trồng 30 cây,

gieo 1 hạt/hốc, đặt trong nhà lưới. Khi cây mọc và được 10 ngày sau gieo tiến

hành cho lây nhiễm nhờ bọ phấn (Bemisia tabaci) là môi giới trung gian

truyền bệnh.

Cách tiến hành

Chuyển cây bị bệnh vào lồng kín, thả bọ phấn khỏe với mật độ 4-6

con/cây. Sau thời gian 2 ngày, tiếp tục chuyển cây không bị bệnh vào lồng

chứa bọ phấn đã mang bệnh ngay sau khi mang cây bị bệnh ra ngoài. Trong

quá trình này, thường xuyên xua bọ phấn trong lồng để bọ phấn phát tán đều

khắp các dòng đậu xanh F2:3 và tránh tình trạng cây bị hại quá mức do mật độ

bọ phấn cao tập trung chích hút không đồng đều trong quần thể. Sau 2 ngày

lây nhiễm, phun thuốc để diệt bọ phấn bằng thuốc Trichlofon 90SP và chuyển

cây ra nhà lưới để chăm sóc và theo dõi. Chăm sóc hàng ngày và theo dõi kết

quả sau 2 tuần lây nhiễm khi 100% cây của dòng mẫn cảm KPS2 đã biểu hiện

triệu chứng điển hình của bệnh và có kết quả dương tính với MYMV (PRC

test). Mỗi cây được đeo thẻ đánh số để đánh giá bệnh theo thang điểm của

AVRDC ở giai đoạn 35 ngày và 55 ngày sau trồng.

2.4.3.3. Phân tích thống kê

Tính tỷ lệ bệnh (TLB) theo phương pháp của Vũ Đình Ninh (1972) và

chỉ số cấp bệnh trung bình (CBTB) tính theo Fang (2010):

TLB% = ;

Trong đó: A: Tổng số cây bị bệnh a: Số cây bị bệnh ở mỗi cấp

B: Tổng số cây nghiên cứu n: Trị số cấp bệnh ở số cây a

Phản ứng đối với bệnh của từng dòng được phân cấp dựa trên chỉ số

cấp bệnh trung bình của các cây/dòng

Tất cả số liệu được nhập vào máy tính và xử lý thống kê theo chương trình

EXCEL và phần mềm thống kê R 1.9 phù hợp với kiểu bố trí thí nghiệm

2.4.4. Phương pháp đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự (GBS) 2.4.4.1. Thiết lập thư viện cho GBS (Elshire et al, 2011)

Tách ADN

Mẫu lá tươi của hai bố mẹ và quần thể 71 dòng quần thể F2:3

(NM94xKPS2) được đánh giá kiểu hình 2 lần dưới áp lực tự nhiên và bằng

lây nhiễm nhân tạo được thu để tách chiết ADN. Mỗi dòng lấy mẫu lá tối

thiểu 17 cá thể để có được ít nhất 1 cây biểu hiện tính trạng mong muốn ở các

dòng dị hợp tử và để trung bình giá trị đánh giá của các dòng F3 đại diện cho

phân ly kiểu gen của thế hệ F2 (Larter và Ikonen, 1977). ADN được tách và

tinh sạch theo các bước khuyến cáo của Quiagen.

Lựa chọn enzyme cắt hạn chế (RE) và thiết kế adapter, tạo thư viện

Enzyme cắt hạn chế là ApeKI, nhận biết trình tự suy biến 5bp (GCWGC,

trong đó W có thể là A hoặc T), tạo ra đầu treo (3bp), nhạy cảm với sự methyl hóa

Sử dụng 2 loại adapter:

+ Common adapter: common adapter có đầu 5’ là trình tự bổ sung với

đầu treo được tạo ra bởi RE ApeKI

+ Barcode adapter: mang các trình tự barcode ở đầu có trình tự bổ sung

với đầu treo của ApeKI. Barcode là các trình tự ngắn từ 4 đến 8 Nu

Trình tự barcode adapter:

5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTxxxx và

5’-CWGyyyyAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT

trong đó ‘‘xxxx’’ và ‘‘yyyy’’ là các trình tự barcode và bổ sung.

Trình tự common adapter:

5’-CWGAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG và

5’-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT

Hình 2.2. Các adapter cho GBS, các mồi giải trình tự và PCR

(a) Các trình tự của barcode adapter và common adapter chuỗi kép. Các adapter được gắn với ADN bộ gen ở vị trí cắt của RE ApeKI bằng enzyme ligaseT4 (NEB). Các vị trí của trình tự barcode và các đầu treo ApeKI liên quan tới ADN được trèn vào; (b, c) Các trình tự của mồi PCR 1, 2 và mồi đọc trình tự 1,2 (sequence read 1) từ 2 đầu sợi ADN trong thư viện. Mồi PCR 1, 2 có các trình tự đầu 5’tương ứng bổ sung với oligo của flowcell 1, 2 của Illumina HiSeq (Elshire et al, 2011)

Các bước chuẩn bị thư viện mẫu cho GBS

Hình 2.3. Các bước xây dựng thư viện cho GBS (Elshire et al, 2011)

(1) các mẫu ADN và các cặp barcode adapter và common adapter được

cho vào đĩa 10ng/µl, thể tích 10µl và làm khô; (2-3) các mẫu sau đó được cắt

bằng ApeKI ở 75oC trong 3h và các adapter được gắn vào các đầu của các đoạn

ADN genome bằng T4 ligase ở 22oC trong 1h; (4) enzyme gắn T4 được làm

bất hoạt bằng nhiệt độ và một lượng nhỏ ADN mỗi mẫu (5µl/mẫu) được trộn

vào nhau và được tinh sạch bằng kit PCR purification (QIAGEN) để loại bỏ

các adapter không phản ứng; (5) các mồi thích hợp với các vị trí gắn trên các

adapter được gắn được bổ sung và phản ứng PCR được tiến hành để làm giàusố

lượng các đoạn ADN; (6-7) các sản phẩm PCR được tinh sạch và kiểm tra kích

thước các đoạn ADN của thư viện bằng DNAlab-chip (Bio analyzer), kiểm tra

nồng độ thư viện bằng máy đo nồng độ DNA Qubit 4.0; kiểm tra hiệu quả nồng

độ trong giải trình tự bằng hệ thống qPCR Roche. Các thư viện được giải trình

tự ADN bằng hệ thống giải trình tự Hiseq 2500 (Illumina) 150 Pair-end.

2.4.4.2. Xử lý số liệu bằng các phần mềm tin sinh học

Phân tích dữ liệu thô NGS (Next Generation Sequencing) và phát hiện

SNP đa hình giữa bố/mẹ và các dòng quần thể F2 bằng gói công cụ STACKS

1.21 (Catchen et al, 2013) chạy trên máy tính hệ điều hành Linux 32G-RAM.

Các phần mềm trong gói công cụ như sau:

Phần mềm FastQC dùng để kiểm tra chất lượng trình tự thô thu được từ

hệ thống giải trình tự Hiseq 2500 (Illumina)

Phần mềm Bowtie 2 (Langmead và Salzberg, 2012) dùng để căn trình tự

thu được với trình tự của bộ gen đậu xanh tham khảo. Bộ gen đậu xanh tham

khảo được đăng tải trên GenBank/EMBL/DDBJ dưới số đăng ký

JJMO00000000 (Kang et al, 2014) và trên website:

http://plantgenomics.snu.ac.kr/JBrowse/index.html?

Phần mềm Samtool (Li et al, 2009) dùng để chuyển đổi định dạng các

file số liệu.

Bộ công cụ phân tích bộ gen GATK (Genome Analysis Toolkit) chạy

trên máy tính hệ điều hành Linux với môi trường câu lệnh command line để

gọi ra các chỉ thị SNP. Chi tiết hướng dẫn sử dụng GATK có trên website

https://www.broadinstitute.org/gatk/

Hình 2.4. Quy trình phân tích số liệu GBS

2.4.5. Phân tích QTLs (Quantitative Trait Loci)

Phân tích QTL đối với quần thể gồm 71 dòng F3 sử dụng phần mềm sau:

- Phần mềm QTL Icimapping 4.0 (Li et al, 2007) dùng để thiết lập bản

đồ di truyền (nhóm các chỉ thị vào các nhóm liên kết với LOD = 3.0) và phân

tích QTL (theo phương pháp lập bản đồ Inclusive Composite Interval

Mapping cho QTL với tính cộng (additive, dominance) (ICIM-ADD). Các chỉ

thị trong mỗi nhóm được sắp xếp bậc sử dụng RECORD (Van Os et al, 2005)

và vị trí chỉ thị được thử lại sử dụng lệnh RIPPLE với chức năng SARF (sum

of adjacent recombination frequencies – tổng tần số tái tổ hợp liền kề). Phân

tích χ2 được tiến hành đối với mỗi chỉ thị để kiểm tra tỉ lệ phân ly mong đợi

1:2:1 trong quần thể F2:3 ở mức ý nghĩa P <0,05 (Paillard et al, 2003)

- Phần mềm Qgene 4.3 (http://www.qgene.org/qgene/index.php) dùng để

xác định các QTL dựa trên vị trí vật lý của các chỉ thị SNP theo phương pháp

phân tích SMR (single marker regression) và phân tích CIM (composite

interval mapping) với LOD (>=3,0) (Li et al, 2007).

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập và xác định virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh

3.1.1. Kết quả thu mẫu bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh, các cây họ

đậu khác tại Việt Nam

Trong 3 năm, từ 2011 đến 2013, mẫu bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh

và các cây họ đậu khác đã được thu thập tại 17 tỉnh, thành phố trong cả nước.

Kết quả được tổng hợp trong Bảng 3.1 và vị trí thu mẫu được định vị trên bản

đồ địa lý Việt Nam tại Hình 3.2. Tổng cộng đã thu được 68 mẫu bệnh, trong

đó có 57 mẫu bệnh trên đậu xanh, 11 mẫu bệnh trên các cây họ đậu khác.

Bảng 3.1. Tổng hợp kết quả điều tra, thu thập mẫu bệnh Begomovirus

Tính đến ngày 15 tháng 12 năm 2013

theo vùng địa lý

Vùng, địa phương

Vùng, địa phương Thái Bình Thanh Hóa Nghệ An Quảng Trị Đà Nẵng Bình Định Phú Yên Cần Thơ

TT 1 Bắc Giang 2 Bắc Ninh 3 Yên Bái 4 Bắc Cạn Sơn La 5 6 Lào Cai 7 Quảng Ninh 8 Hà Nội 9 Hưng Yên

Đậu Xanh 1 1 2 4 1 9 2

Cây họ đậu khác - - 2 1 3 - 4 1 -

Đậu Xanh 7 2 2 1 4 3 16 2

Cây họ đậu khác - - - - - - - -

TT 10 11 12 13 14 15 16 17

Tổng số

57

11

Tại vùng Nam Trung Bộ (Bình Định, Phú Yên), mẫu bệnh khảm vàng

đậu xanh thu được toàn bộ trên giống ĐX208 trồng phổ biến tại đây. Quan sát

các ruộng thu mẫu bệnh cho thấy bệnh gặp tương đối phổ biến và triệu chứng

bệnh rất điển hình. Ngược lại, tại các địa phương khác thu mẫu bệnh, các giống

đậu xanh đều là các giống địa phương và tần suất bắt gặp cây đậu xanh với các

triệu chứng bệnh khảm vàng rất hiếm. Mười một mẫu bệnh khảm vàng thu được

trên các cây họ đậu khác có 3 mẫu đậu đen, 3 mẫu đậu đũa, 2 mẫu đậu côve, 1

mẫu đậu dừa và 2 mẫu trên cây họ đậu chưa xác định được loài cụ thể.

Trong số 68 mẫu bệnh khảm vàng có 16 mẫu bệnh thu tại Phú Yên trên

cây đậu xanh, 10 mẫu bệnh thu tại Hà Nội (9 mẫu bệnh trên đậu xanh, 1 mẫu

bệnh trên đậu đen), 7 mẫu bệnh thu tại Thái Bình trên đậu xanh, còn lại các

mẫu bệnh khác được thu rải rác trên các tỉnh thành khác.

Triệu chứng của cây bị bệnh khảm vàng thu mẫu bệnh là: lá bệnh bị

khảm vàng, xuất hiện từ lá non trước, những điểm khảm vàng nhỏ xuất hiện

dọc theo gân lá và trải rộng dần ra phiến lá; quả đậu mỏng và có dấu hiệu

cong sừng trâu. Nếu bệnh xuất hiện sớm, cây có thể vàng cả cây, cây chùn lại

và gây chết (Hình 3.1).

Hình 3.1. Các triệu chứng khảm vàng ở

Hình 3.2. Định vị các vùng thu

đậu xanh tại Phú Yên

thập mẫu bệnh khảm vàng chính

tại Việt Nam, năm 2011-2013

3.1.2. Thiết kế mồi phát hiện các virus gây hại trên cây đậu xanh và các

cây họ đậu khác bằng kỹ thuật PCR

Vì các begomovirus trên cây họ đậu chủ yếu là các begomovirus có bộ gen

kép nên 2 loại mồi sẽ được thiết kế là (i) các mồi đặc hiệu MYMV và (ii) các

mồi chung đặc hiệu cho tất cả các begomovirrus gây hại trên cây họ đậu (còn

được gọi là các legumovirus). Các bước thiết kế mồi như sau:

Căn trình tự đa chuỗi bộ gen các mẫu virus (multiple sequence

alignment) ClustalX2 2.0 (Larkin et al, 2007).

Ngay sau khi các chuỗi ADN đã được căn trình tự, vùng phù hợp được

chọn để thiết kế các mồi chung và mồi đặc hiệu.

- Mồi chung (universal/degenerate primers): được thiết kế trên các vùng

bảo thủ cao, có khả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau. Thiết kế mồi

chung cho tất cả các legumovirus từ cựu thế giới

- Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể

phân biệt được loài, thậm chí dưới loài như chủng/nòi/type sinh học. Thiết kế

mồi đặc hiệu cho KuMV và MYMV.

Các bước căn trình tự và thiết kế các mồi chung và mồi đặc hiệu phát

hiện begomovirus được thực hiện như sau:

Thiết kế mồi chung phát hiện legumovirus

Đoạn mồi ngược (reverse) chung cho Legumevirus (2461-2480):

Trình tự gốc: GAAGCAGAACATG(G/C/T)AG(A/G)TGA

Trình tự bổ sung: CTTCGTCTTGTAC(C/G/A)TC(T/C)ACT

Ký hiệu: LegA-repR1: TCAYCTVCATGTTCTGCTTC

Đoạn mồi ngược (reverse) chung cho Legumevirus (2372-2394):

Trình tự gốc: CTGAATGTTCGGATGG(T/A)AAT(A/G)TG

Trình tự bổ sung: GACTTACAAGCCTACC(A/T)TTA(T/C)AC

Ký hiệu: LegA-repR2: CAYATTWCCATCCGAACATTCAG

Đoạn mồi xuôi (forward) chung cho Legumevirus: 1846-1866:

Trình tự gốc:ATAATG(T/G/C)GGATC(A/G)ACGTCATC

Ký hiệu: LegA-repF1: ATAATGBGGATCRACGTCATC

Đoạn thiết kế mồi ngược (reverse (cp)) chung cho legume (1000-1050):

Trình tự gốc: GTATATGGCATGTACTCATGC

Trình tự bổ sung: CATATACCGTACATGAGTACG

Ký hiệu: LegA-cpR1: GCATGAGTACATGCCATATAC

Đoạn thiết kế mồi xuôi (forword (cp)) chung cho legume (770-820):

Trình tự gốc: GGTCAAGT(G/T)TT(C/T)AACATGTATGA

LegA-cpF1: GGTCAAGTKTTYAACATGTATGA

Thiết kế mồi đặc hiệu phát hiện MYMV

Đoạn thiết kế mồi xuôi (forward) cho MYMV (1773 – 1795):

Trình tự gốc: CAATTTGAGTGCTGTGTTATCAG

Ký hiệu: MYA-For1: CAATTTGAGTGCTGTGTTATCAG

Đoạn thiết kế mồi ngược (reverse) cho MYMV (2316-2339):

Trình tự gốc: GTAACTTGGATCCACTATTGAG

Trình tự bổ sung: CATTGAACCTAGGTGATAACTC

Ký hiệu mồi: MYA-Rev1: CTCAATAGTGGATCCAAGTTAC

Kết quả đã thiết kế được 7 mồi có thể phát hiện các begomovirus có bộ

gen kép gây hại trên cây họ đậu và mồi đặc hiệu phát hiện MYNV (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Kết quả thiết kế mồi cho ADN-A của begomovirus

Kích

Số

thước

TT Tên mồi

Trình tự mồi (5’-3’) (*)

Nu Tm

Vị trí

(bp)

LegA-repF1 ATAATGBGGATCRACGTCATC

49-53 1846-1866

F1/R1 = 634

LegA-repR1 TCAYCTVCATGTTCTGCTTC

43-48 2461-2480

F1/R2 = 548

LegA-repR2 CAYATTWCCATCCGAACATTCAG

2372-2394

LegA-cpF1

GGTCAAGTKTTYAACATGTATGA

46-48 770-820

280

LegA-cpR1 GCATGAGTACATGCCATATAC

1000-1050

MYA-For1

CAATTTGAGTGCTGTGTTATCAG

1773 – 1795

566

MYA-Rev1

CTCAATAGTGGATCCAAGTTAC

2316-2339

*: Y: C/T, R: G/A, H: A/C/T, M: A/C, B: C/G/T, D: A/G/T, K: G/T; i=inosine.

Nhiệt độ tách cặp ADN (Tm) được tính theo phương pháp Nearest Neighbour

(SantaLucia, 1998)

3.1.3. Kết quả chuẩn đoán bệnh virus trên đậu xanh và các cây họ đậu

khác bằng kỹ thuật PCR

Mẫu đậu xanh và các cây họ đậu khác có biểu hiện triệu chứng bệnh

khảm vàng như khảm vàng toàn bộ diện tích lá, cuốn lá, biến dạng lá, lùn cây

được thu thập tại các địa phương khác nhau và sau đó các mẫu được chúng tôi

tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi chung chuẩn đoán

legumovirus phát hiện tất cả các begomovirus hại cây hại họ đậu và cặp mồi

đặc hiệu phát hiện KuMV đã được thiết kế. Tổng cộng có 68 mẫu đậu xanh và

các cây họ đậu khác chúng tôi thu thập được trong 3 năm 2011-2013 tại 17

địa phương trong cả nước, một số mẫu với triệu chứng đặc trưng và một số

mẫu khác thuộc cây họ đậu với triệu chứng tương tự cũng được tiến hành

chuẩn đoán. Kết quả tổng hợp được trình bày trong Bảng 3.3 và Phụ lục 4.

Số mẫu dương tính với

Số

Loại cây

Địa phương phát hiện

STT

lượng

trồng

mẫu bệnh

Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả thu thập theo nhóm cây trồng

legumo

Begomo

mẫu

MYMV BCMV*

virus

Bình Định (3), Phú Yên

Đậu

(16), Sơn La (3), Thái

xanh

Bình (3),

Yên Bái (2), Quảng Ninh

Đậu

(4), Sơn La (3), Bắc Cạn

khác

(1), Hà Nội (1)

Tổng

68

36

14

*: Bean common mosaic virus

Kết quả chuẩn đoán bằng PCR 68 mẫu bệnh thu được (Bảng 3.3), tất cả 11

mẫu bệnh của cây họ đậu khác đều biểu hiện dương tính với begomovirus,

legumovirus, MYMV. 25 trên tổng số 57 mẫu bệnh đậu xanh dương tính với

begomovirus, legumovirus, MYMV (minh họa tại Hình 3.3).

Về phân vùng địa lý phát hiện bệnh, trong 17 tỉnh thành thu mẫu bệnh,

kết quả chuẩn đoán PCR cho thấy có 4 địa phương phát hiện mẫu đậu xanh

nhiễm MYMV, 5 địa phương phát hiện MYMV trên các cây họ đậu khác

(Bảng 3.3). Trong đó 100% mẫu bệnh thu được trên đậu xanh tại Bình Định

và Phú Yên dương tính với begomovirus khi chuẩn đoán bằng cặp mồi chung

phát hiện begomovirus và các virus này đều là MYMV khi chuẩn đoán bằng

các cặp mồi đặc hiệu phát hiện MYMV.

Kết quả chuẩn đoán bằng ELISA để phát hiện BCMV với 68 mẫu bệnh

thu được cho thấy: cả 11 mẫu bệnh của cây họ đậu khác đều không nhiễm

BCMV, 14 trên 57 mẫu bệnh đậu xanh thu được dương tính với BCMV, các

mẫu này đều âm tính với begomovirus.

Mười lăm mẫu bệnh được thu thập tại Phú Yên và Bình Định năm 2011

(từ MYMV VN1 đến MYMV VN15) được tiến hành chuẩn đoán PCR sử

dụng cặp mồi chung Beta1/Beta2 (Briddon et al, 2002) để phát hiện ADN vệ

tinh gọi là ADN-beta của begomovirus nhưng tất cả các mẫu này đều âm tính

với cặp mồi này. Kết quả này là phù hợp vì các phân tủ ADN vệ tinh chỉ được

phát hiện thấy cùng với các begomovirus có bộ gen đơn.

Kết quả chuẩn đoán bằng PCR cũng giúp phát hiện virus gây bệnh khảm

vàng trên đậu xanh là MYMV. Đây là phát hiện đầu tiên về virus này tại Việt

Nam. Những mẫu bệnh đầu tiên được thu thập nhiễm MYMV là những mẫu

thu tại Bình Định và Phú Yên. Sau đó đã phát hiện thêm các mẫu bệnh nhiễm

MYMV ở nhiều địa điểm khác và trên những cây họ đậu khác. Trong số

những mẫu nhiễm MYMV, có nhiều mẫu thu được tại miền Bắc. Như vậy,

MYMV là virus quan trọng trên cây đậu xanh, có phổ ký chủ rộng gây hại các

cây họ đậu tại miền Bắc và duyên hải Nam Trung Bộ. Tuy nhiên, tần xuất

phát hiện bệnh trên đậu xanh tại Nam Trung Bộ cao hơn và gây hại nặng hơn

rất nhiều so với các vùng trồng đậu xanh khác.

Hình 3.3. Minh họa phản ứng PCR phát hiện begomovirus trên cây đậu xanh

(4 mẫu thu tại Phú Yên)

Ghi chú: Kiểm tra các mẫu bệnh đậu xanh có số thu thập VNP140, 141, 142 và 143

bằng cặp mồi LegA-CPF1/R1 cho sản phẩm băng có kích thước 280bp, kiểm tra bằng cặp

mồi đặc hiệu MY-AF1/R1 phát hiện MYMV, cho sản phẩm băng có kích thước 600bp. Kết

luận: 4 mẫu này dương tính với begomovirus và virus này là MYMV.

649

3.1.4. Kết quả giải và phân tích trình tự ADN-A của begomovirus

Các đoạn ADN-A của begomovirus dài 1,5kb được khuếch đại bằng

PCR với cặp mồi PAL1v1978B/PAR1c715H từ 15 mẫu đậu xanh được thu

thập tại Bình Định và Phú Yên có ký hiệu từ MYMV VN1 đến MYMV VN15

đã được giải trình tự. Kết quả, tất cả các đoạn ADN-A của begomovirus dài

1,5kb này có độ tương đồng với nhau cao (98,4-99,7%) cho thấy 15 mẫu bệnh

này bị nhiễm bệnh từ cùng 1 chủng virus. Kết quả so sánh các trình tự này với

các trình tự công bố trên GenBank bằng BLASTn chỉ ra rằng các trình tự này

có độ tương đồng cao nhất với chủng MYMV trên đậu xanh thu được từ

Campuchia (trình tự có số đăng ký trên GenBank AY271892).

Dựa vào vị trí thu thập mẫu và sự so sánh trình tự của các đoạn ADN-A

begomovirus dài 1,5kb để tiếp tục giải trình tự các đoạn ADN-A và ADN-B

chiều dài hoàn chỉnh (full-length) của chúng (Bảng 3.5). Hai cặp mồi chống

lưng (back-to-back) đã được thiết kế dựa trên trình tự thu được nhằm nhân hoàn

chỉnh bộ gen ADN-A và ADN-B của các mẫu MYMV Việt Nam (Bảng 3.4).

Bảng 3.4. Trình tự của các cặp mồi chống lưng được thiết kế để khuếch

đại toàn bộ ADN-A và ADN-B của MYMV thu thập từ Việt Nam

Tên mồi

Trình tự (5’ - 3’)

Mục đích

VNMYMV-AFV ACCGGATCCATTGGTGAACGACT

khuếch đại ADN-A

hoàn chỉnh của

VNMYMV-AFC CTAGGATCCCACATGGCTGCCA

MYMV

VNMYMV-BFV TCCGAATTCGATTGAGCTTGAGAAAT

khuếch đại ADN-B

hoàn chỉnh của

VNMYMV-BFC TCAGAATTCAATGAGTCGCAAGGACA

MYMV

Sau khi tiến hành phản ứng PCR, nhân dòng và giải trình tự, đã thu được

trình tự đầy đủ (cả ADN-A và ADN-B) của 5 mẫu MYMV thu trên đậu xanh

tại Phú Yên (Bảng 3.5).

Các phân tử ADN-A và ADN-B của MYMV Việt Nam đều có trình tự

bảo thủ – TATATTAC – trong một vòng lặp của cấu trúc kẹp tóc của vùng

không mã hóa (IR-intergenic region). Sáu khung đọc mở (open reading

frame- ORF) gồm 2 gen theo chiều kim đồng hồ (chiều xuôi) là AV1 và AV2

và 4 gen theo chiều ngược kim đồng hồ (từ AC1 đến AC4) đã được phát hiện

ở tất cả các trình tự ADN-A. Tất cả các trình tự ADN-B đều có một khung

đọc mở chiều xuôi (BV1) và một khung đọc mở theo chiều bổ sung (BC1).

Tất cả các trình tự ADN-A và ADN-B có chiều dài đầy đủ này đã được đăng

ký trên cơ sở dữ liệu của GenBank (Bảng 3.5). Khi so sánh các trình tự có

chiều dài đầy đủ này với nhau, tất cả 5 mẫu có mức đồng nhất trình tự từ

99,5-100% ở ADN-A và từ 97,7-99,9% ở ADN-B. Tất cả các virus này có độ

tương đồng lớn nhất về trình tự ADN-A (98,7-98,9%) với MYMV trên đậu

xanh thu thập từ Campuchia (AY271892) và MYMV thu thập tại Thái Lan

(AB017341 và D14703). Các trình tự ADN-B của chúng có độ tương đồng về

trình tự nucleotide lớn nhất (95,9-96,8%) với MYMV trên đậu xanh được

phân lập tại Thái Lan (D14704).

3.1.5. Kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài của MYMV từ các

trình tự ADN-A và ADN-B hoàn chỉnh của Việt Nam

Từ các trình tự ADN-A và ADN-B của các mẫu đậu xanh bị nhiễm bệnh

khảm vàng MYMV VN1, MYMV VN5, MYMV VN7, MYMV VN10,

MYMV VN15 và các trình tự ADN-A và ADN-B trên GenBank (Phụ lục 3),

căn trình tự và so sánh trình tự đa chuỗi được tiến hành sử dụng phần mềm

ClustalX2 2.0 (Larkin et al, 2007).

Sau khi căn trình tự đa chuỗi, so sánh đặc điểm di truyền của các ADN-

A và ADN-B của MYMV thu được với các chủng tham khảo trên GenBank

bằng phần mềm MEGA6 (Tamura et al, 2013). Công việc xây dựng cây phát

sinh loài được tiến hành bằng phương pháp Neighbour-Joining với trị số

Bootstrap 1000.

Từ kết quả phân tích cây phát sinh loài và so sánh tương đồng trình tự

với nhóm ADN-A và ADN-B (Hình 3.4 và Hình 3.5), đề tài đã xác định được:

Virus gây bệnh khảm vàng ở Việt Nam, cụ thể là các mẫu bệnh trên đậu

xanh thu được tại Nam Trung Bộ là Mungbean Yellow mosaic virus.

Dựa vào mức độ tương đồng cao về trình tự nucleotide của trình tự ADN-

A, đã xác định MYMV trên thế giới được chia thành 3 nhóm: nhóm I gồm các

chủng được phân lập từ Thái Lan, Campuchia và Việt Nam, nhóm II gồm các

chủng được phân lập từ Ấn Độ và nhóm III là các chủng được phân lập từ Ấn

Độ và Parkistan. MYMV thuộc nhóm I và II là cùng một chủng (gọi là chủng

A) và MYMV trong nhóm III thuộc về một chủng khác (gọi là chủng B).

Dựa vào mức độ tương đồng cao về trình tự nucleotide của trình tự

ADN-B, đã xác định MYMV chia thành 2 nhóm: nhóm I gồm các chủng được

phân lập từ Ấn Độ, nhóm II gồm các chủng được phân lập từ Ấn Độ,

Pakistan, Thái Lan, Việt Nam. Trong nhóm II, các virus phân lập từ Thái Lan

và Việt Nam nằm trên cùng một nhánh. Kết quả nghiên cứu của đề tài là

những nghiên cứu chuyên sâu đầu tiên về MYMV ở Việt Nam và nguồn gốc

phát sinh của nó.

ADN-A ADN-B

Hình 3.4. Cây phát sinh loài của begomovirus gây hại cây họ đậu, dựa trên trình tự nucleotide đầy đủ ADN-A

Hình 3.5. Cây phát sinh loài của begomovirus gây hại cây họ đậu, dựa trên trình tự nucleotide đầy đủ ADN-B

Trình tự hoàn chỉnh của ADN begomovirus

Địa

Thiệt

Các khung đọc mở của ADN-A (ORF-ADN-A)

ORFs-ADN-B

Ký

điểm

hại

Số đăng ký GenBank

Vị trí

hiệu

thu

Tổng

thập

virus

ADN-A

ADN-B

IR AV1 AV2 AC1 AC2 AC3 AC4

BV1 BC1

2613-

302-

142-

2612-

1624-

1476-

2461-

2114-

421-

2113-

Bình

1 VN15

Định

40% JX244176 JX244181 2730

142

1075

492

1524

1217

1072

2162

2677

420

1191

1217

7 1

Phú

2613-

302-

142-

2612-

1624-

1476-

2461-

2115-

422-

2114-

2 VN1

Yên

50% JX244172 JX244177 2730

142

1075

492

1524

1217

1072

2162

2678

421

1192

1218

Phú

2613-

302-

142-

2612-

1624-

1476-

2461-

2116-

423-

2115-

3 VN7

Yên

50% JX244174 JX244179 2730

142

1075

492

1524

1217

1072

2162

2678

422

1193

1219

Phú

2613-

302-

142-

2612-

1624-

1476-

2461-

2115-

422-

2114-

4 VN5

Yên

60% JX244173 JX244178 2730

142

1075

492

1524

1217

1072

2162

2678

421

1192

1218

Phú

2613-

302-

142-

2612-

1624-

1476-

2461-

2116-

423-

2115-

5 VN10

Yên

60% JX244175 JX244180 2730

142

1075

492

1524

1217

1072

2162

2678

422

1193

1219

Bảng 3.5. Các mẫu bệnh được giải trình tự đoạn ADN-A và ADN-B có chiều dài hoàn chỉnh (full length)

3.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đồng ruộng và đặc điểm

nông sinh học của các mẫu giống đậu xanh

3.2.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng

3.2.1.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh

Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh

được thực hiện trên đồng ruộng tại điểm nóng của bệnh là Phú Yên qua 3 năm

2012, 2013 và 2014. Tổng số 96 nguồn gen đậu xanh địa phương và nhập nội

(bao gồm cả đối chứng nhiễm chuẩn KPS2) đã được đánh giá.

Triệu chứng đầu tiên của bệnh khảm vàng bắt đầu xuất hiện trên các

dòng đối chứng mẫn cảm KPS2 và các dòng đậu xanh địa phương 12 ngày

sau mọc (vụ Hè 2012) và trước 15 ngày sau mọc (vụ Hè 2013). Sau khi xuất

hiện từ 8-10 ngày, biểu hiện cây vàng lùn, lá biến dạng, chết cây con đã được

quan sát thấy ở một vài cá thể ở các hàng đối chứng. Giai đoạn cây 35 ngày

tuổi, ở cả 2 vụ của 2 năm 2012 và 2013, tỉ lệ cây có triệu chứng bệnh đã đạt

100% trên các dòng đậu xanh đối chứng nhiễm KPS2. Điều này cho thấy áp

lực bệnh tự nhiên trên đồng ruộng đủ cho thí nghiệm đánh giá khả năng kháng

bệnh trên đậu xanh tại Phú Yên. Ở giai đoạn này, đa số các nguồn gen nhiễm

không có khả năng đậu quả hoặc đều có ít quả (3-5 quả/cây) với 3-4 hạt/quả,

quả có màu vàng, dạng cong sừng trâu, hạt lép.

Kết quả thống kê ở Bảng 3.6 và Hình 3.6 và Phụ lục 5 cho thấy: tỷ lệ

bệnh ở hầu hết các nguồn gen đạt 100% với cấp bệnh trung bình nằm trong

mức phản ứng nhiễm vừa cho đến nhiễm cao. Đối chứng nhiễm chuẩn KPS2

bị bệnh ở cấp rất cao với chỉ số bệnh trung bình gần như tuyệt đối 5,93 điểm

(năm 2012) và 5,53 điểm (năm 2013).

Trong số 96 nguồn gen đậu xanh được đánh giá qua 2 năm có 65 nguồn

gen (chiếm 67,7%) biểu hiện nhiễm đến nhiễm nặng bệnh khảm vàng, 24

nguồn gen (chiếm 25%) nhiễm bệnh ở mức trung bình. Đánh giá 96 nguồn

gen đậu xanh nhưng chỉ phát hiện được 3 nguồn gen có nguồn gốc địa

phương và 1 nguồn gen có nguồn gốc nhập nội từ AVRDC có biểu hiện

kháng trung bình với bệnh. Tuy nhiên các nguồn gen này có điểm đánh giá

bệnh gần đến 4 nên cũng không có nhiều ý nghĩa trong chọn giống kháng

bệnh. Kết quả đánh giá không sàng lọc được nguồn gen nào có biểu hiện ở

mức kháng với bệnh nhưng đã phát hiện ra 3 nguồn gen có biểu hiện kháng

cao với bệnh khảm vàng là các nguồn gen từ AVRDC gồm: NM92, NM94,

VC3960-88 có số đăng ký lần lượt là 8493; 8923; 12195 là những nguồn gen

có ý nghĩa cao sử dụng làm nguồn vật liệu trong công tác chọn tạo giống

kháng bệnh.

Năm 2012, các nguồn gen NM92, NM94, VC3960-88 có tỷ lệ bệnh

quan sát được lần lượt là 67%, 33% và 27%. Tuy nhiên, cấp bệnh trung bình

của các nguồn gen này đạt thấp, chỉ ở ngưỡng 2,0; 1,73 và 1,13, nằm trong

cấp kháng cao với độ lệch chuẩn giữa các trung bình của từng lần lặp lần lượt:

0,53; 0,42; 0,12 và thời gian nhiễm bệnh rải rác vào giai đoạn từ 35-45 ngày

tuổi, đây là thời gian cây đậu xanh đã bắt đầu hình thành quả và không ảnh

hưởng lớn đến năng suất của cây đậu xanh. Các nguồn gen kháng này được

đánh giá nhắc lại trong vụ Hè năm 2013 và cũng thu được phản ứng kháng

bệnh cao, mặc dù tỷ lệ % cây được phát hiện có triệu chứng bệnh cao hơn so

với vụ trước (Phụ lục 5). Các nguồn gen kháng này không có biểu hiện mẫn

cảm với côn trùng chích hút cũng như các bệnh khác trong hai vụ nghiên cứu

và có thời gian ra hoa cùng trà với các nguồn gen địa phương thí nghiệm. Như

vậy các nguồn gen NM92, NM94, VC3960-88 giữ ổn định khả năng kháng

cao với bệnh khảm vàng tại Phú Yên. Các nguồn gen đậu xanh địa phương

của Việt Nam đều bị nhiễm bệnh khảm vàng với tỷ lệ nhiễm bệnh 100%.

Danh sách các nguồn gen đậu xanh kháng bệnh khảm vàng được đánh giá qua

2 năm năm 2012 và 2013 được trình bày trong Bảng 3.7

Bảng 3.6. Thống kê mức độ nhiễm bệnh khảm vàng của tập đoàn đậu

xanh tại Phú Yên vụ Hè 2012 và 2013

Số Chỉ số bệnh Mức độ nhiễm bệnh nguồn Tỉ lệ % trung bình gen

<=2,0 Kháng cao HR 3 3,1

>2,0 - <3,0 Kháng R 0 0

3.0 - <4,0 Kháng trung MR 4,2 bình 4

4,0 - <5,0 Nhiễm trung MS 25,0 bình 24

>=5,0 Nhiễm đến S, HS 67,7 nhiễm nặng 65

Tổng 96 100

Hình 3.6. Tỉ lệ phản ứng của các nguồn gen đậu xanh với bệnh khảm vàng vụ

Hè năm 2012 và 2013 tại Phú Yên

Thời gian xuất hiện bệnh khảm vàng trên đồng ruộng được báo cáo nặng

nhất vào vụ Xuân Hè (từ tháng 3,4 đến tháng 6,7) hàng năm tại các xã trồng

đậu xanh của huyện Tuy Hòa, Phú Yên.

Bảng 3.7. Danh sách các nguồn gen đậu xanh có khả năng kháng bệnh

khảm vàng được đánh giá tại Phú Yên qua 2 năm 2012 và 2013

Chỉ số

Khả

Tỷ lệ

bệnh TB

STT SĐK

Tên giống

năng

bệnh

(55 ngày)

kháng*

3227

Xanh Đắc Lắc

3,78

4292

VC 6372 (45-8)

3,93

100

4329

Đậu xanh mỡ

3,72

4332

Đậu xanh mỡ

3,83

100

8493

VC 3960-88

1,13 - 1,64

8923

NM 92

1,22 - 1,89

12195 NM 94

1,53 - 1,73

12200 KPS2 (Đ/c nhiễm chuẩn)

100

5,58 - 5,93

*Ghi chú: MR - Kháng trung bình; HR – Kháng cao; S – Nhiễm

Qua biểu đồ nhiệt đồ và lượng mưa tại Tuy Hòa, Phú Yên trong 3 năm

(2010 đến 2012) (Hình 3.7) cho thấy từ tháng 3 đến tháng 7 là thời gian có

nhiệt độ tăng dần và cao nhất trong năm. Đây cũng là thời gian có lượng mưa

thấp nhất trong năm. Từ cuối tháng 5 đến đầu tháng 6 là thời gian có nhiệt độ

cao nhất trong năm (nhiệt độ trung bình tháng tăng cao xấp xỉ 30oC), lượng

mưa trung bình thấp (từ 26 đến 152mm) cũng trùng với thời kỳ cây đậu xanh

bị nhiễm bệnh nặng. Kết quả phân tích này trùng với kết quả nghiên cứu trước

đó về điều kiện phát sinh, phát triển của quần thể bọ phấn, vectơ truyền bệnh

đó là nóng và khô là điều kiện thích hợp để quần thể bọ phấn phát triển

(Srivastava và Prajapati, 2012). Thời điểm xuất hiện bệnh khảm vàng trên đậu

xanh tại xã Tuy An được xác định vào cuối tháng 3 đến giữa đầu tháng 4. Kết

quả đánh giá tổng hợp cả 2 năm trên cho thấy việc lựa chọn bố trí thời vụ thí

nghiệm ảnh hưởng đến thành công của công tác sàng lọc khả năng kháng

trong điều kiện áp lực bệnh tự nhiên.

Hình 3.7. Biểu đồ nhiệt độ và lượng mưa tại Tuy Hòa, Phú Yên 2010-2012

Để khẳng định sự ổn định tính kháng của các nguồn gen đậu xanh biểu

hiện khả năng kháng bệnh khảm vàng qua hai năm nghiên cứu, chúng tôi tiếp

tục đánh giá biểu hiện kháng bệnh của những nguồn gen đậu xanh này tại vụ

Hè 2014. Kết quả khi phân tích ANOVA và hệ số biến động (CV%) của các

nguồn gen trên Excel (Bảng 3.8) cho thấy các nguồn gen có độ ổn định tính

kháng qua 3 năm liên tiếp ở mức ý nghĩa 0,05 (Ftn=0.08

biến động về chỉ số bệnh của các nguồn gen này cũng rất thấp chỉ từ 0,05 đến

0,2% (Hình 3.8). Những giống kháng này khi được theo dõi đánh giá ở giai

đoạn 35 và 55 ngày sau trồng thể hiện động thái tăng chỉ số bệnh rất thấp,

biểu đồ biểu diễn tăng chỉ số bệnh của chúng là đường nằm ngang trong khi

đối chứng nhiễm chuẩn có biểu đồ tăng chỉ số bệnh là được dốc theo chiều

tăng chỉ số bệnh mạnh (Hình 3.9)

Bảng 3.8. Kết quả phân tích ANOVA về ổn định tính kháng của các

Phân tích ANOVA một nhân tố

nguồn gen đậu xanh nghiên cứu qua các năm

Nguồn biến động

SS

df

MS

Pr

FTN

F LT

Giữa các nhóm

0,582

0,291

0,084*

0,92

3,98

Trong nhóm

38,144

3,468

Tổng

38,727

Hình 3.8. Độ ổn định tính kháng của các nguồn

Hình 3.9. Động thái tăng triệu chứng bệnh

gen đậu xanh kháng bệnh qua các năm

của các nguồn gen đậu xanh kháng bệnh so

với đối chứng nhiễm

3.1.1.2. Chuẩn đoán bệnh bằng chỉ thị ADN

Trong phần này, chỉ thị ADN được sử dụng để xác định sự có mặt của

virus trong các cây đậu xanh đối chứng nhiễm (KPS2) và các cây của các

giống có khả năng kháng bệnh khảm vàng trong 2 năm 2012 và 2013 là

NM92, NM94, VC3960-88. Cặp mồi MY-A F1/R1 khuếch đại vùng bảo thủ

trong gen mã hóa protein Rep của virus MYMV được sử dụng để kiểm tra sự

có mặt của virus trong dịch chiết lá cây. Kết quả cho thấy, tất cả các mẫu

(kháng và nhiễm) đều cho băng dương tính với MYMV (Hình 3.10).

Hình 3.10. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các nguồn gen kháng NM92,

NM94, VC3960-88 sử dụng cặp mồi MY-AF1/R1

Từ kết quả kiểm tra cho thấy: (i) khả năng kháng thu nhận được từ các

dòng đậu xanh của AVRDC ổn định trong các vụ nghiên cứu; (ii) các dòng

kháng tuy vẫn cho virus xâm nhập nhưng biểu hiện kiểu hình gây bệnh trên cây

ở mức độ thấp do vậy các giống kháng là kháng với virus gây bệnh chứ không

phải kháng với bọ phấn là vectơ truyền bệnh.

Cho đến nay, nghiên cứu về đa dạng di truyền của virus gây bệnh khảm

vàng từ Bắc Trung Bộ và Nam Trung Bộ Việt Nam mới phát hiện được 1

chủng virus trên các vùng trồng đậu từ Thanh Hóa trở vào đến Phú Yên (Tsai

và cs, 2013). Vì vậy, đây là những giống kháng hữu hiệu cho sản xuất đậu

xanh của vùng Phú Yên nói riêng và vùng Bắc Trung Bộ, Duyên Hải Trung

và Nam trung Bộ nói chung.

Hình 3.11. Các nguồn gen đậu xanh kháng bệnh khảm vàng được chọn lọc tại

Phú Yên năm 2012-2013

3.2.2. Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống đậu xanh

Các đặc điểm nông sinh học chính và các yếu tố cấu thành năng suất là

những tính trạng cần thiết được đánh giá để từ đó chọn ra các nguồn gen triển

vọng có thể trực tiếp giới thiệu ra sản xuất hoặc sử dụng làm nguồn vật liệu

ban đầu cho chọn tạo giống năng suất, chất lượng. Đồng thời, trong công tác

chọn tạo giống kháng bệnh, các nhà chọn tạo giống phải kết hợp chọn tổ hợp

lai có sự đối lập nhau về khả năng kháng/nhiễm bệnh đồng thời một trong hai

bố mẹ phải có đặc điểm nông sinh học tốt và cho năng suất khá để có thể tạo

ra các dòng vừa kháng bệnh vừa có các đặc điểm nông sinh học tốt, cho năng

suất cao. Chính vì vậy, nội dung đánh giá đặc điểm nông sinh học và các yếu

tố cấu thành năng suất của tập đoàn đậu xanh nghiên cứu được tiến hành.

3.2.2.1. Đặc điểm sinh trưởng phát triển của các nguồn gen đậu xanh

Thời gian sinh trưởng: Thời gian sinh trưởng (TGST) của cây đậu xanh

được tính từ khi gieo hạt cho đến khi quả chín. Cũng như các cây trồng khác,

cây đậu xanh trải qua hai giai đoạn sinh trưởng: sinh trưởng sinh dưỡng và sinh

trưởng sinh thực. TGST phụ thuộc vào đặc tính của giống và điều kiện ngoại

cảnh. Dựa vào TGST của mỗi giống, người ta có thể xây dựng một hệ thống

luân canh cây trồng hợp lý trên một diện tích canh tác nhằm đem lại hiệu quả

kinh tế cao nhất. Kết quả nghiên cứu TGST của các nguồn gen đậu xanh trong

vụ Hè 2013 được thể hiện qua Bảng 3.9 và Phụ lục 6

Thời gian từ gieo đến bắt đầu ra hoa: Thời gian từ gieo đến bắt đầu ra

hoa của cây đậu xanh dài hay ngắn tùy thuộc vào đặc điểm của giống và điều

kiện ngoại cảnh nhất là ánh sáng. Khi ra hoa trong điều kiện thuận lợi các

giống có xu hướng rút ngắn thời gian nở hoa. Thông thường, những giống

ngắn ngày có thời gian từ gieo đến ra hoa ngắn, hoa nở tập trung, tỉ lệ đậu quả

cao, chín đồng đều, thu hoạch tập trung nhưng năng suất thấp hơn các giống

dài ngày do thời gian tích lũy vật chất ngắn hơn. Qua theo dõi chúng tôi nhận

thấy, thời gian từ gieo đến bắt đầu ra hoa của các nguồn gen trong tập đoàn

biến động từ 35-53 ngày (CV% = 10,1) với thời gian từ gieo đến bắt đầu ra hoa

trung bình là 44,4+4,5 ngày. Có 17 nguồn gen có thời gian từ gieo đến bắt đầu

ra hoa từ 35-40 ngày (chiếm 17,3%) là những nguồn gen được coi là có thời

gian ra hoa ngắn, 71 nguồn gen có thời gian từ gieo đến bắt đầu ra hoa từ 40-50

ngày (72,4 %) là những nguồn gen có thời gian từ gieo đến ra hoa trung bình,

có 12 nguồn gen (12,2%) có thời gian từ gieo đến ra hoa dài trên 50 ngày.

Thời gian từ gieo đến quả chín đầu tiên: thời gian này dài hay ngắn

phụ thuộc vào bản chất di truyền của các giống và thời vụ. Thời kỳ quả chín

nếu gặp điều kiện thời tiết nắng ráo thì thời gian chín của các giống rút ngắn

lại. Qua theo dõi các nguồn gen đậu xanh vụ Hè 2013, kết quả: thời gian từ

gieo đến khi quả chín đầu tiên của các nguồn gen biến động từ 51-71 ngày

(CV% = 6,9). Căn cứ vào thời gian từ gieo đến khi qua chín đầu tiên của các

nguồn gen trong tập đoàn, 98 nguồn gen nghiên cứu được thành 3 nhóm:

+ Nhóm chín sớm có thời gian từ gieo đến khi quả chín đầu tiên dao

động từ 51-60 ngày gồm có 29 nguồn gen (chiếm 29,6%). Nhóm này thích

hợp cho mục tiêu chọn giống chín sớm cho vùng trồng xen canh, gối vụ. Các

nguồn gen đại diện là: ĐX208, ĐX22, 4310, 3210, 3220...

+ Nhóm chín trung bình có thời gian từ gieo đến khi qua chín đầu tiên

dao động từ 60-70 ngày gồm 66 nguồn gen (67,3%). Nhóm này phù hợp cho

mục tiêu chọn tạo giống cho vùng trồng chuyên canh. Các nguồn gen đại diện

là: NM92, NM94, VC3960-88, 3203, 3212, 4310...

+ Nhóm chín muộn có có thời gian từ gieo đến khi quả chín đầu tiên trên

70 ngày có 3 nguồn gen (3,1%) trong đó có những nguồn gen có thời gian từ

gieo đến khi quả chín đầu tiên dài nhất là 71 ngày. Nhóm này phù hợp với

mục tiêu chọn giống có TGST dài ngày cho vùng miền núi và vùng canh tác

nhờ nước trời. Các nguồn gen đại diện như: 3201, 3199, 3229, 4292, 6499...

Chiều cao cây: Chiều cao cây biến động từ 36,4 – 97,4 cm (CV% = 22,8)

trong đó có 22 nguồn gen có chiều cao cây thấp dưới 50 cm chiếm 22,4%, 40

nguồn gen có chiều cao cây từ 50-70 cm chiếm 40,8%, 36 nguồn gen có chiều

cao cây từ trên 70 cm chiếm 36,7%.

Bảng 3.9. Thời gian sinh trưởng và chiều cao cây của các nguồn gen

đậu xanh trong tập đoàn vụ Hè năm 2013

Phân bố biểu hiện

Nguồn gen đại diện

Tham số

Tính trạng

Biểu

Số

Tỉ lệ

(theo số đăng ký)

thống kê

hiện

lượng

(%)

Max = 53

Thời gian từ

17,3

ĐX208, KPS1, KPS2, 4325, 3201, 3213

>40

Min = 35

gieo đến bắt

72,4

NM92, NM94, VC3960-88, 3203, 3212

40-50

TB = 44,4

đầu ra hoa

12,2

3201, 3199, 3229, 4292, 6499

>50

CV% = 10,1

(ngày)

Max = 71

Thời gian từ

<60

29,6

ĐX208, ĐX22, 4310, 3210, 3220

Min = 51

gieo đến bắt

60-70

67,3 KPS2, NM92, NM94, VC3960-88, 4407

TB = 62,0

đầu thu hoạch

>70

3,1

3214, 3219, 4292

CV% = 6,9

(ngày)

Max = 97,4

<50

22,4

VC3960-88, 3219, 3222, 6494, 6495

Min = 36,4

Chiều cao cây

50-70

40,8

NM92, NM94, 3218, 3209, 14030

TB = 63,3

(cm)

>70

36,7

KPS1, KPS2, 3206, 4347, 3199

CV% = 22,8

3.2.2.2. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất

Năng suất là kết quả tổng hợp của nhiều yếu tố cấu thành năng suất tạo

nên như số quả trên cây, số hạt trên quả, khối lượng trăm hạt, năng suất cá

thể... Kết quả đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của các nguồn gen

tham gia thí nghiệm vụ Hè 2013 thể hiện ở Bảng 3.10 và Phụ lục 6

Số quả trên cây: đây là yếu tố quan trọng nhất, quyết định đến năng

suất đậu xanh, có tương quan chặt với năng suất, các giống có số quả trên cây

nhiều thì năng suất cao. Trong điều kiện môi trường thuận lợi, đặc biệt vào

thời kỳ hoa rộ và thời kỳ quả chín thì quá trình thụ phấn thụ tinh thuận lợi, tỉ

lệ đậu quả cao dẫn đến số quả trên cây nhiều cho năng suất cao. Nếu gặp hạn

vào giai đoạn ra hoa và quả chín sẽ làm giảm năng suất đáng kể.

Trong tập đoàn đậu xanh nghiên cứu, các nguồn gen có số quả trên cây

biến động từ 2,0 đến 26,4 quả/cây trung bình là 7 quả/cây (CV% = 43,7),

trong đó có 90 nguồn gen (91,8%) có số quả trên cây thấp dưới 10 quả/cây, 8

nguồn gen (8,2%) có số quả/cây từ trên 10 quả trong đó có nguồn gen SĐK

3199 có số quả trên cây nhiều nhất với 26,4 quả/cây.

Số hạt trên quả: đây cũng là yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng đến năng

suất đậu xanh. Qua theo dõi tập đoàn đậu xanh vụ Hè 2013, chúng tôi nhận

thấy số hạt trên quả của các nguồn gen biến động không nhiều từ 10-14

hạt/quả với trung bình là 11,5 hạt/quả (CV% = 7,3). Nguồn gen có số hạt trên

quả cao nhất là 14 hạt/quả (SĐK 3239, 12762), nguồn gen có số hạt trên quả

thấp nhất là 10 hạt/quả (SĐK 3220).

Chiều dài quả (cm): là chỉ tiêu liên quan mật thiết với số hạt/quả. Đa

phần giống có chiều dài quả lớn sẽ có nhiều hạt. Trong 98 nguồn gen nghiên

cứu, có 8 nguồn gen có chiều dài quả ngắn dưới 8cm (chiếm 8,2%), 55 nguồn

gen có chiều dài quả từ 8-10cm (58,2%) và 7 nguồn gen có chiều dài quả trên

10cm (7%), phạm vi biến động chiều dài quả từ 7,1-12,54cm (CV% = 12,9)

Khối lượng 100 hạt: là yếu tố cấu thành năng suất quan trọng và đây

cũng là chỉ tiêu để đánh giá chất lượng hạt (hình dạng và kích cỡ hạt). Khối

lượng 100 hạt của các nguồn gen được khảo sát trong tập đoàn có sự biến

động lớn từ 2,6 – 7,23 g (CV% = 17,2) trong đó có 8 nguồn gen có khối

lượng 100 hạt nhỏ (dưới 4 g, chiếm 8,2 %), 33 nguồn gen có khối lượng 100

hạt từ 4,0-5,0 g (33,7 %), 38 nguồn gen có khối lượng 100 hạt từ 5,0-6,0g

(38,8 %), có 19 nguồn gen có khối lượng 100 hạt trên 6,0 g (chiếm 19,4 %)

trong đó nguồn gen có P100 hạt nhỏ nhất là SĐK 4248 (2,6 g), nguồn gen có

P100 hạt lớn nhất là SĐK 3224 (7,23 g).

Bảng 3.10. Tham số thống kê và phân bố các nguồn gen đậu xanh theo

yếu tố cấu thành năng suất và năng suất

Phân bố biểu hiện

Tính

Tham số thống kê

Nguồn gen đại diện

Số

Tỉ lệ

Biểu

trạng

lượng

(%)

hiện

Min = 2,0

91,8

3233, 6495, 3255, 3224, 4347

<10

Max= 26,4

10-20

3222, 3247, 6507, 3226, 3213

7,1

Số

quả/cây

1,0

3199

>20

TB = 7,0

CV% = 43,7

34,7

3201, ĐX208, 3219, 3254, 6494

< 11

Max = 14,0

58,2

3233, 3224, 3216, 6493, 3200

11-13

Min = 10,0

Số hạt/quả

7,1

3239, 12762, 14030, 4343, 12172

>13

TB = 11,5

CV% = 7,4%

8,2

3247, 4407, 4247, 9661, 4292

< 8

Max = 12,54

56,1

3233, 6495, 3236, 3219, 4325

8-10

Min = 7,1

Chiều dài

quả (cm)

34,7

3216, 3200, 6493, 3254

>10

TB= 9,57

CV% = 12,9%

8,2

6507, 3247, 4347, 9661, 3256

< 4

Max = 7,23

33,7

4325, 3254, 6493, 3210, 4407

4-5

Min = 2,60

P100 hạt

(g)

38,8

3201, 8493, 3232, ĐX208, 6691

5-6

TB= 5,15

CV% =17,2%

19,4

3233, 3224, 3222, 3219, 3200

> 6

Max = 2.418

<800

35,7

4315, 9665, 3214, 4335, 4321

Năng suất

Min = 335

800-1000

26,5

4486, 3246, 3229, 8285, 6502

thực thu

1000-

TB = 922

35,7

3233, ĐX208, 3232, 3235, 3234

(kg/ha)

CV%=34,5%

1500 >1500

2,0

3222, 3198

Năng suất thực thu: Là năng suất thực tế thu được của các giống trên

diện tích thí nghiệm. Qua kết quả nghiên cứu cho thấy năng suất thực thu biến

động rất lớn từ 335 kg/ha đến 2418 kg/ha, hệ số biến động lớn (CV% = 34,5).

Trong số 98 nguồn gen nghiên cứu, có 35 nguồn gen có năng suất thực

thu thấp, dưới 800 kg/ha (chiếm 35,7%), 26 nguồn gen có năng suất thực thu

từ 800 – 1000 kg/ha chiếm 26,5 %, 22 nguồn gen có năng suất thực thu từ

1000 - 1200 kg/ha chiếm 22,4%, có 13 nguồn gen có năng suất thực thu từ

1200-1500 kg/ha (13,3%) và 2 nguồn gen có năng suất thực thu cao trên 1500

kg/ha là những nguồn gen có đặc điểm sinh trưởng phát triển tốt, có triển

vọng giới thiệu cho sản xuất trong đó nguồn gen có năng suất thực thu cao

nhất là giống đậu xanh 6 tháng Cao Lạng (2418 kg/ha) có SĐK 3198.

Từ kết quả sàng lọc khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đồng ruộng tại

Phú Yên và kết quả đánh giá các đặc điểm nông sinh học của 98 nguồn gen

đậu xanh nghiên cứu, 17 nguồn gen đậu xanh triển vọng đã được chọn lọc dựa

trên tiêu chí năng suất cao hoặc có khả năng kháng bệnh khảm vàng từ mức

trung bình đến kháng cao giới thiệu cho sản xuất góp phần làm phong phú bộ

giống đậu xanh trong sản xuất (Bảng 3.11).

Để chọn ra được tổ hợp lai phù hợp cho chọn tạo giống kháng bệnh và

có năng suất khá thì các nguồn gen kháng nên được chọn làm bố (NM92,

NM94) lai với mẹ là KPS2, nhiễm bệnh nặng nhưng có đặc điểm nông sinh

học tốt, năng suất khá. Tuy nhiên cần kết hợp đánh giá đa dạng di truyền để

xác định khoảng cách di truyền giữa các tổ hợp lai để chọn được tổ hợp lai tốt

nhất cho cả mục đích lập bản đồ di truyền tính kháng bệnh khảm vàng.

Bảng 3.11. Danh sách các mẫu giống đậu xanh triển vọng trong tập

đoàn đậu xanh vụ Hè 2013

Cao

Ngày

Số

P100

NS

Nhiễm

STT SĐK

Tên giống

cây

ra

thu

quả/

(g)

(kg/ha)

MYMV

(cm)

hoa

hoạch

cây

1.255

3210 Mốc Quảng Ngãi

51,40

9,9

4,8

1.349

3211 Sẻ sơn T.Quảng Ngãi

72,20

9,4

5,5

1.225

3217 Xanh Bình Định

56,60

9,5

5,0

1.755

3222 Xanh Buôn Mê Thuật

41,40

10,0

6,9

1.258

3225 Sẻ Kon Tum

51,80

8,5

6,2

1.219

3226 Xanh Lâm Đồng

68,00

10,7

4,5

1.372

3227 Xanh Đắc Lắc

69,60

10,3 MR

5,1

1.310

3232 Mỡ Tân Ba Sông Bé

47,00

8,2

5,7

1.316

3233 Mỡ Biên Hòa

36,40

8,2

6,2

1.359

3234 Mỡ Đồng Nai

50,80

7,9

6,3

1.341

4347 Đậu xanh

71,20

7,9

6,1

1.290

6497 Đậu xanh

67,40

8,3

5,4

975

46,40

7,4

5,3

8493 VC 3960-88

1.105

57,60

9,5

4,6

8923 NM 92

1.151

56,80

9,8

4,6

12195 NM 94

1.274

70,50

9,1

5,0

12199 KPS1

1.381

70,50

9,4

5,3

12200 KPS2

3.3. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen đậu xanh

560 chỉ thị DArT được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền của 94

giống đậu xanh. Các chỉ thị DArT là các chỉ thị hai alen trội. Mỗi chỉ thị được

đánh giá đối với mỗi mẫu là các chỉ số: 0, 1 hoặc – với “-” là số liệu bị trống:

chỉ thị không được đánh giá có độ tin cậy với mẫu đó. Các thông số được sử

dụng trong phân tích DArT gồm P là một phân tích ANOVA dựa trên sự đánh

giá chất lượng chỉ thị phản ánh hai trạng thái tốt như thế nào (Có = 1 so với

Không = 0) của chỉ thị được tách riệng trong dữ liệu. Vì P được dựa trên phân

tích ANOVA, nó không phải là phép đo chất lượng phù hợp cho các chỉ thị có

sự phân bố rất không đồng đều của điểm 0 và 1 (PIC thấp). Đây là lý do tại

sao một số chỉ thị có P rất thấp nhưng tỉ lệ gọi (call rate) cao và giá trị PIC

thấp cũng được báo cáo. Giá trị thông tin đa hình (PIC) trong nghiên cứu sử

dụng chỉ thị DArT có giá trị tối đa là 0,5 khi số liệu đánh giá chỉ thị có 50% 0

và 50% 1 và giá trị PIC từ 0,3 trở lên là lý tưởng.

3.3.1. Thống kê các chỉ tiêu đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị DArT

Kết quả đánh giá được thể hiện ở Bảng 3.12. Giá trị hệ số đa dạng gen

(PIC) phản ánh rất chính xác mức độ đa hình giữa các kiểu gen dùng trong

nghiên cứu, tính riêng rẽ đối với mỗi chỉ thị đa hình. Ở nghiên cứu này giá trị

PIC thấp nhất là 0,021 và giá trị PIC cao nhất là 0,5. Qua bảng 3.12 cho thấy

các chỉ thị cho giá trị PIC nhỏ dưới 0,1 rất lớn với 340 chỉ thị chiếm 60,71%,

các chỉ thị cho các giá trị PIC từ 0,1-0,2; 0,2-0,3; 0,3-0,4 lần lượt là 61, 31, 25

chỉ thị tương đương với 10,89; 5,54; 4,46%. Số lượng các chỉ thị cho giá trị

PIC cao từ 0,4-0,5 là 103 chỉ thị tương đương với 18,39%.

Bảng 3.12. Các giá trị PIC cho 560 chỉ thị DArT

Giá trị PIC Số lượng chỉ thị DArT Tỉ lệ phần trăm

0-0,1 60,71 340

0,1-0,2 10,89 61

0,2-0,3 5,54 31

0,3-0,4 4,46 25

0,4-0,5 18,39 103

Tổng 100 560

Giá trị PIC trung bình 0,157

Do số lượng chỉ thị cho giá trị PIC thấp (nhỏ hơn 0,1) chiếm đa số dẫn

đến giá trị PIC trung bình cũng rất thấp chỉ đạt 0,157, thấp hơn rất nhiều so

với các nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng DArT trước đó trên các đối

tượng cây trồng như lúa mạch (0,38) (Castillo et al, 2013), sắn (0,42) (Xia et

al, 2005), cao lương (0,41) (Mace et al, 2008), đậu triều (0,42) (Yang et al.,

2011).

Giá trị PIC thấp chứng tỏ đậu xanh có nền di truyền hẹp. Kết luận này

cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó về đa dạng di truyền đậu xanh khi

các tác giả cũng kết luận đậu xanh có nền di truyền hẹp (Lakhanpaul et al

2000; Betal et al 2004; Datta et al, 2012; Gupta et al, 2013). Theo Nair et al

(2012), đậu xanh có nền di truyền rất hẹp, các phả hệ của các giống đậu xanh

được trồng phổ biến nhất trên toàn thế giới chỉ được tạo ra từ vài chục nguồn

bố mẹ.

Mối quan hệ giữa chất lượng của các chỉ thị DArT (được đo bằng % của

tổng phương sai tồn tại giữa hai nhóm có và không) và các thành phần khác

của các chỉ thị DArT được xác định thông qua Tỉ lệ gọi (Call rate) và giá trị

PIC được phân tích (Bảng 3.13). Tỉ lệ gọi (Call rate) không phụ thuộc nhiều

vào chất lượng chỉ thị, từ nhóm chất lượng chỉ thị thấp đến nhóm chất lượng

chỉ thị cao đều có tỉ lệ gọi thay đổi không đáng kể và đều ở ngưỡng trên 97%.

Bảng 3.13. Mối quan hệ giữa chất lượng và các thành phần khác của

các chỉ thị DArT với 92 nguồn gen đậu xanh

Chất lượng P<65 65≤P<80 P≥80

Số chỉ thị 72 130 132

Tỉ lệ gọi 97,70±2,83 97,3±2,68 97,24±2,71

PIC 0,074±0,04 0,21±0,15 0,35±0,16

Khi phân tích riêng đa dạng di truyền 50 nguồn gen đậu xanh đóng góp

từ Việt Nam và 4 nguồn gen từ AVRDC (NM92, NM94, KPS1, KPS2) trong

nghiên cứu, kết quả cho thấy có 271 chỉ thị cho đa hình giữa 54 nguồn gen

này (Bảng 3.14) với số lượng chỉ thị cho giá trị PIC cao từ 0,4-0,5 là 77 chỉ

thị chiếm 28,4% và giá trị PIC trung bình đạt 0,248. Đây cũng là giá trị PIC

thấp so với giá trị PIC lý tưởng, cũng chứng tỏ các nguồn gen đậu xanh từ

Việt Nam này cũng có nền di truyền hẹp. Chất lượng của 271 chỉ thị đa hình

này cũng được thể hiện ở Bảng 3.15. Có 119 chỉ thị đa hình có chất lượng cao

trên 80% được sử dụng để xây dựng ma trận dựng cây đa dạng di truyền.

Bảng 3.14. Các giá trị PIC cho các chỉ thị DArT đa hình với 54 nguồn

gen đậu xanh

Giá trị PIC Số lượng chỉ thị DarT Tỉ lệ phần trăm DArT

0-0,1 24,4 66

0,1-0,2 25,1 68

0,2-0,3 9,6 26

0,3-0,4 12,5 34

0,4-0,5 28,4 77

Giá trị TB: 0,248 271

Bảng 3.15. Mối quan hệ giữa chất lượng và các thành phần khác của

các chỉ thị DArT với 54 nguồn gen đậu xanh

P≥80 Chất lượng P<65 65≤P<80

119 Số chỉ thị 44 108

Tỉ lệ gọi 97,8 ± 2,29 97,0 ± 2,74 97,0 ± 2,71

PIC 0,067 ± 0,033 0,21 ± 0,15 0,35 ± 0,15

3.3.2. Phân tích khoảng cách di truyền của các giống đậu xanh

Số liệu DArT được xử lý trên phần mềm DARwin6. Sơ đồ hình cây biểu diễn mố i quan hê ̣ di truyền giữa các giố ng đậu xanh nghiên cứ u đươ ̣c xây dựng bằng phương pháp phân nhó m neighbour-joining UPGMA

(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages) với 132 chỉ thị

DArT có chất lượng chỉ thị cao (P>80) sử dụng hệ số DICE (Nei và Li, 1979)

cho 94 nguồn gen đậu xanh nghiên cứu (Hình 3.12). Từ hình có thể thấy hầu

hết các nguồn gen có cùng nguồn gốc thu thập được phân nhóm cùng nhau

trong các nhóm phụ, tuy nhiên sự phân nhóm này chưa phản ánh rõ ràng

nguồn gốc địa lý của các nguồn gen đậu xanh nghiên cứu. Điều này càng

khẳng định nền di truyền của các giống đậu xanh nghiên cứu thấp.

Phân tích riêng mối quan hệ di truyền của 54 nguồn gen đậu xanh gồm

50 nguồn gen từ Việt Nam đóng góp và 4 nguồn gen đậu xanh từ AVRDC

(NM92, NM94, KPS1 và KPS2). Để xây dựng ma trâ ̣n tương đồ ng di truyền

cho 54 nguồn gen đậu xanh này hê ̣ số khác biệt Dice được sử dụng (Nei và Li,

1979). Kết quả trên ma trận (Phụ lục 7) cho thấy các giống nghiên cứu có độ

khác biệt di truyền từng cặp biến động khá lớn từ 0 đến 0,846 trong đó cặp có

độ khác biệt di truyền lớn nhất là nguồn gen số 37 nhập nội từ Ấn Độ và

nguồn gen số 48 là dòng được chọn lọc từ nguồn gen số 27 được thu thập từ

Lai Châu có đặc điểm toàn bộ cây và quả đều không có lông và có khoảng

cách di truyền là 0,726. Khoảng cách di truyền có hệ số biến động cũng lớn từ

0 đến 0,806.

Sơ đồ hình cây biểu diễn mố i quan hê ̣ di truyền giữa 54 giố ng đậu xanh nghiên cứ u đươ ̣c xây dựng bằng phương pháp phân nhó m neighbour-joining

UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages) với

119 chỉ thị DArT có chất lượng chỉ thị cao (P>80) sử dụng hệ số DICE (Nei

và Li, 1979) (Hình 3.13).

Hình 3.13 cho thấy sự phân nhóm theo vùng địa lý thu thập của các

nguồn gen đậu xanh Việt Nam cũng không rõ ràng thể hiện ở sự xen kẽ các

nguồn gen có nguồn gốc thu thập khác nhau trong cả nước vào cùng nhóm.

Quan sát trên Hình 3.13 có thể thấy 54 nguồn gen này được chia thành 2

nhóm chính được đặt tên là G1 và G2 và nguồn gen đậu xanh số 21 có nguồn

gốc thu thập từ Tuyên Quang tách biệt hẳn khỏi các nhóm còn lại.

Trong nhóm G1, các nguồn gen nghiên cứu được chia nhỏ thành 5 nhóm

phụ lần lượt từ G1.1 đến G1.5. Nhóm phụ G1.1 gồm 10 nguồn gen trong đó

có 8 nguồn gen có nguồn gốc nhập nội từ các nước Ấn Độ, Pakistan,

Philippine, AVRDC và xen vào đó có 2 nguồn gen có nguồn gốc thu thập tại

Việt Nam là nguồn gen đậu xanh số 11 thu thập từ Thái Nguyên có đặc điểm

là nguồn gen đậu xanh xanh lòng, màu sắc hạt rất đẹp, khác biệt với những

nguồn gen đậu xanh nghiên cứu khác và nguồn gen đậu xanh số 32 thu thập

tại Khánh Hòa. Nhóm phụ G1.2 gồm 4 nguồn gen đậu xanh địa phương

nhưng phân bố địa lí từ vùng Tây Bắc đến miền Trung. Nhóm phụ G1.3 gồm

2 nguồn gen có nguồn gốc thu thập Tây Bắc. Nhóm phụ G1.4 gồm 6 nguồn

gen địa phương trong đó 3 nguồn gen thu thập tại miền Bắc, 2 nguồn gen thu

thập tại miền Trung và 1 nguồn gen thu thập tại miền Nam. Nhóm phụ G1.5

gồm 2 nguồn gen thu thập tại Thái Nguyên và Hà Giang.

Nhóm G2 cũng được chia thành 4 nhóm phụ từ G2.1 đến G2.4 trong đó

nhóm phụ G2.1 gồm 11 nguồn gen đậu xanh, có 8 nguồn gen cs nguồn gốc

địa phương phân bố từ miềm Bắc đến miềm Trung, 3 nguồn gen còn lại là

giống KPS1 và KPS2 của AVRDC và 1 nguồn gen từ Nga. Nhóm phụ G2.2

gồm 6 nguồn gen thì có 2 nguồn gen nhập nội từ Thái Lan, 1 nguồn gen nhập

nội từ Nga, 3 nguồn gen còn lại có nguồn gốc địa phương từ Bắc, Trung,

Nam. Nhóm phụ G2.3 gồm 7 nguồn gen tất cả đều có nguồn gốc địa phương

trong đó có 1 nguồn gen được chọn lọc từ nguồn gen số 27 có nguồn gốc thu

thập tại Lai Châu, 6 nguồn gen còn lại có nguồn gốc thu thập tại Nam Trung

Bộ và miền Nam. Nhóm phụ G2.4 gồm 5 nguồn gen thì có 1 nguồn gen có

nguồn gốc nhập nội từ Philippine còn lại có nguồn gốc thu thập từ miền Bắc,

Trung và Nam.

Kết quả phân tích đa da ̣ng di truyền củ a 54 nguồn gen đậu xanh trên chứng tỏ nguồn vật liệu nghiên cứu có nền di truyền hẹp và phân nhóm theo

vùng địa lý không rõ ràng.

Từ các kết quả nghiên cứu trước, 4 nguồn gen đã được chú ý trong đánh

giá khoảng cách di truyền là NM92, NM94, KPS1 và KPS2. Nhìn trên cây đa

hình (Hình 3.13), hai nguồn gen có biểu hiện kháng cao với bệnh khảm vàng

(NM92 và NM94) thuộc cùng một nhóm, hai nguồn gen nhiễm bệnh nặng

(KPS1 và KPS2) thuộc một nhóm khác. Như vậy, hai nhóm kháng và nhiễm

bệnh khảm vàng có khoảng cách di truyền xa lại có đặc tính nông sinh học tốt

cho chọn tổ hợp lai lập bản đồ

NM94

KPS2

Hình 3.12. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ của 94 nguồn gen đậu xanh

nghiên cứu (theo phương pháp neighbour-joining UPGMA dựa trên chỉ số

khác biệt DICE sử dụng 132 chỉ thị có P>80)

Hình 3.13. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ của 54 nguồn gen đậu xanh

nghiên cứu (theo phương pháp neighbour-joining UPGMA dựa trên chỉ số

khác biệt DICE sử dụng 119 chỉ thị có P>80)

3.3.3. Kết quả chọn tổ hợp lai để xây dựng quần thể lập bản đồ

Để lập bản đồ liên kết gen kháng bệnh khảm vàng, chúng tôi phải xác định

quần thể giữa các cặp bố mẹ có đặc điểm kháng/nhiễm đối lập nhau. Vì thế, kết

hợp với đặc điểm kháng/nhiễm bệnh, phân tích đa hình di truyền và một số đặc

điểm sinh học chính, chúng tôi chọn được các cặp lai với mô ̣t số chỉ tiêu chính

để xây dựng quần thể lập bản đồ.

Đặc điểm kháng nhiễm với bệnh và khoảng cách di truyền là chỉ tiêu ưu

tiên để lựa chọn nguồn vật liệu lập bản đồ. Các cặp lai được chọn có các đặc

tính kháng/nhiễm rõ rệt, giống kháng có khả năng kháng bệnh rất cao (HR) và

ổn định, giống nhiễm bệnh nhiễm ở mức rất nặng (HS), chỉ số bệnh trung

bình của các giống nhiễm đều ở mức 5-6. Các giống nhiễm đều có ngày xuất

hiện bệnh rất sớm dưới 16 ngày trong khi các giống kháng có ngày xuất hiện

bệnh rất muộn từ 35-45 ngày và ít ảnh hưởng đến năng suất.

Các giống nhiễm KPS1 và KPS2 có khoảng cách di truyền với các giống

kháng NM92 và NM94 biến thiên từ 0,549 đến 0,657 trong đó hai giống

nhiễm có khoảng cách di truyền với giống kháng NM94 cao hơn giống kháng

NM92 khoảng 0,1. Về sự khác biệt di truyền thì cặp kháng/nhiễm NM94/

KPS2 có sự khác biệt lớn nhất là 0,75, đây chưa phải là giá trị cao nhất trong

các cặp giống trong tập đoàn, nhưng đạt tương đối cao trong số liệu phân tích

(Bảng 3.16).

Kết hợp với số liê ̣u đánh giá tâ ̣p đoàn đậu xanh dùng để sàng lọc khả

năng kháng bệnh khảm vàng tại Phú Yên vụ Hè các năm 2012 và 2013, các

cặp giống này có thời gian sinh trưởng hơn kém nhau từ 4 đến 5 ngày giữa

nguồn vật liệu kháng và nhiễm. Các giống này cũng có năng suất thực thu

tương đối cao trong tập đoàn và cao hơn nhiều so với năng suất thực thu trung

bình của tập đoàn (922 kg/ha), trong đó giống nhiễm KPS2 có năng suất thực

thu cao thứ 3 trong tập đoàn đậu xanh nghiên cứu. Các giống này đều có thời

gian sinh trưởng ngắn, kiểu cây đẹp, năng suất thực thu cao, hạt có kích cỡ to

(P100 hạt lớn).

Bảng 3.16. Bảng tổng hợp các chỉ tiêu chọn các cặp bố mẹ làm vật liệu

lai tạo quần thể

Đặc điểm KPS1 KPS2 NM92 NM94

Tỷ lệ bệnh (%) 100 100 38 56 Khả

năng Chỉ số bệnh trung bình 5,93 5,98 1,22 1,53

kháng Ngày xuất hiện bệnh (ngày) <16 <16 35-45 35-45

bệnh

Sự khác biệt di truyền với NM92 0,500 0,615 - -

Sự khác biệt di truyền với NM94 0,615 0,750 - -

Khoảng cách di truyền với NM92 0,550 0,549 - -

Khoảng cách di truyền với NM94 0,657 0,657 - -

Thời gian từ gieo - ra hoa 39 39 41 42

(ngày)

Thời gian gieo-thu hoạch 60 60 64 65

(ngày) Đặc

điểm Chiều cao cây (cm) 70,5 70,5 57,6 56,8

nông Số quả/cây 9,1 9,4 9,5 9,8

sinh Số hạt/quả 12,0 12,0 10,9 11,3

học Chiều dài quả (cm) 10,23 10,35 8,52 9,56

P100 hạt (g) 5,30 5,00 4,62 4,60

Năng suất thực thu (kg/ha) 1.274 1.381 1.105 1.151

Dựa vào sự đối lập về tính kháng/nhiễm bê ̣nh, khoảng cách di truyền và

các đặc điểm nông sinh học của các nguồn gen đậu xanh trong tập đoàn,

chúng tôi đã chọn được 1 cặp lai: NM94 x KPS2 để tạo quần thể lập bản đồ di

truyền, bản đồ liên kết gen dựa vào chỉ thị phân tử SNP bằng phương pháp

GBS và xác định chỉ thị liên kết gen kháng bệnh khảm vàng.

3.4. Nghiên cứu lập bản đồ gen ở cây đậu xanh

3.4.1. Đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng

3.4.1.1. Đánh giá phân ly kiểu hình kháng bệnh trên đồng ruộng

Thí nghiệm đánh giá sự phân ly kiểu hình kháng bệnh khảm vàng của

quần thể F2-3 dưới các điều kiện tự nhiên được tiến hành tại Nam An Nghiệp,

Tuy An, Phú Yên từ tháng 4 đến tháng 7 năm 2014, đây là thời điểm bệnh

xuất hiện mạnh nhất trong năm.

Các triệu chứng đầu tiên của bệnh khảm vàng bắt đầu xuất hiện trên các

dòng đối chứng mẫn cảm KPS2 15 ngày sau mọc. Sau khi xuất hiện từ 8-10

ngày, biểu hiện cây vàng lùn, lá biến dạng, chết cây con đã được quan sát

thấy. Ở giai đoạn cây con 35 ngày tuổi, tỷ lệ cây có triệu chứng bệnh đã đạt từ

95- 100% trên các dòng đậu xanh đối chứng nhiễm KPS2. Tỷ lệ này đạt 100%

ở giai đoạn cây được 55 ngày tuổi cho thấy áp lực bệnh tự nhiên trên đồng

ruộng đủ cho thí nghiệm đánh giá tính kháng bệnh trên đậu xanh. Ở giai đoạn

này, đa số các dòng nhiễm không có khả năng đậu quả hoặc có ít quả (3-5

quả/cây) và có 3-4 hạt/quả, quả có màu vàng, dạng cong sừng trâu, hạt lép.

Kết quả đánh giá chi tiết được thể hiện trong Phụ lục 8. Kết quả thống kê

kiểu hình tính kháng bệnh của quần thể đậu xanh F3 được thể hiện ở Bảng 3.17

và Hình 3.14.

Từ kết quả đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng của quần thể

đậu xanh ở giai đoạn 55 ngày sau trồng biểu hiện chỉ số bệnh từ 2 đến 5 điểm,

chiếu theo thanh điểm đánh giá của AVRDC thì không có mức kháng cao và

nhiễm nặng trong kiểu hình kháng bệnh của quần thể đánh giá này. Vì vậy

phân bố kiểu hình kháng bệnh của quần thể F2:3 được chia thành 4 nhóm

tương ứng với mức kháng bệnh: kháng, kháng trung bình, nhiễm trung bình

và nhiễm. Chỉ số bệnh trung bình của quần thể là 3,57 (ở ngưỡng nhiễm trung

bình), chỉ số bệnh cao nhất của quần thể là 4,78 (ở ngưỡng nhiễm), chỉ số

bệnh thấp nhất là 2,04 (ở ngưỡng kháng). Chỉ số bệnh của bố mẹ phân bố ở

hai phía của quần thể cho thấy bố mẹ có sự đối lập nhau về kiểu hình tính

kháng bệnh, đạt yêu cầu cho lập bản đồ.

Hình 3.14. Phân bố kiểu hình kháng bệnh khảm vàng của quần thể F2:3

đậu xanh

Hình 3.15. Đánh giá kiểu hình kháng bệnh ở 35 (A) và 55 (B) ngày sau trồng

Dựa vào kết quả phân ly kiểu hình của quần thể F2:3 (Bảng 3.17, Hình

3.16), quần thể được chia làm 4 nhóm tương ứng với 4 cấp bệnh chính được

quan sát bao gồm 37 dòng kháng, 46 dòng kháng trung bình, 60 dòng nhiễm

trung bình và 57 dòng nhiễm. Việc không quan sát thấy hai kiểu hình cấp 1

(kháng cao) và cấp 6 (rất nhiễm) là hoàn toàn phù hợp vì khi quan sát kiểu

hình kháng nhiễm của 2 bố mẹ (NM94 và KPS2) cũng không quan sát thấy

cấp bệnh 1 và 6. Trong tổng số 37 dòng quan sát thấy kiểu hình kháng, chúng

tôi nhận thấy một số dòng có biểu hiện triệu chứng bệnh do rệp gây ra nên

100

triệu chứng của MYMV quan sát thấy không rõ ràng. Điều đó đặt ra yêu cầu

phải có phương pháp kiểm tra lại xem những dòng này có thực sự kháng hay

không bằng áp lực bệnh nhân tạo trong nhà lưới.

Bảng 3.17. Phân ly kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng của quần

thể đậu xanh 200 dòng F2:3 và 71 dòng F2:3 rút gọn

Tham số thống kê các quần

Phân bố biểu hiện

thể

200 71 dòng

200 dòng

71 dòng

dòng

Biểu hiện

Số

Trung

Tỉ lệ

lượng

3,57

3,52

bình

Trung

3,62

2,0-<3,0 (Kháng)

18,5

25,4

vị

3,0-<3,5 (Kháng

4,78

4,67

trung bình)

23,0

16,9

Max

3,5-<4,0 (Nhiễm

2,04

2,10

30,0

33,8

trung bình)

Min

4,93

4,74

28,5

23,9

4,0-5,0 (Nhiễm)

KPS2

2,33

2,58

NM94

Hình 3.16. Phân lớp kiểu hình kháng bệnh MYMV của 200 dòng và 71 dòng

quần thể đậu xanh F2:3

101

Bảng 3.18. Phân tích quy luật di truyền tính kháng bệnh khảm vàng

Số lượng dòng được quan sát ở mỗi lớp

Tỉ lệ

Giá trị

Tổ hợp lai

< 3,0

3,0 – 4,0

> 4,0

mong

χ2

value

TB=2,63

TB=3,52

TB=4,33

đợi

NM94xKPS2

106

1:2:1

5,77 *

0,094

của quần thể đậu xanh F2:3 trên đồng ruộng

Tính đến thời điểm này, một số nghiên cứu cũng đã tiến hành đánh giá

tính kháng, lập bản đồ gen tính kháng bệnh MYMV với các nguồn kháng

khác nhau. Tuy nhiên đối với mỗi nguồn kháng khác nhau, gen quy định tính

kháng lại khác nhau như 1 gen lặn, 2 gen lặn và một gen trội. Điều này chứng

tỏ khi sử dụng những nguồn gen kháng khác nhau dẫn tới những kết quả khác

nhau.

Kết quả phân ly kiểu hình quần thể F2:3 (MN94 x KPS2) thu được từ Tuy

An, Phú Yên, chúng tôi tiến hành xử lý thống kê để xác định tỉ lệ phân ly kiểu

hình có tuân theo quy luật di truyền Mendel không với giả thuyết quần thể

phân ly theo tỉ lệ 1:2:1 (kháng: trung gian: nhiễm). Kết quả tính toán giá trị χ2

đạt 5,77 nhỏ hơn giá trị χ2 lý thuyết (5,99) nên chấp nhận giả thuyết quần thể

này phân ly theo tỉ lệ 1:2:1. Tuy nhiên khi tính giá trị p để xác định ý nghĩa

thống kê của kiểm định thì giá trị p đạt 0,09 (cao hơn 0,05) nên kiểm định này

không có ý nghĩa thống kê. Do chỉ số bệnh trung bình của quần thể và giá trị

trung vị của nó gần nhau nên quần thể được kỳ vọng là có kiểu hình phân bố

theo phân phối chuẩn. Để xác định quần thể phân ly theo quy luật phân phối

chuẩn hay không, phần mềm thống kê R được sử dụng để vẽ đồ thì phân phối

chuẩn và kiểm định quy luật phân chuẩn của quần thể có ý nghĩa thống kê

không (Hình 3.19). Ba phương pháp kiểm định trong thống kê R được áp

dụng cho kiểm định là Anderson-Darling, Shapiro-Wilk và Kolmogorov-

Smirnov. Kết quả cho thấy giá trị p sinh ra từ hai phương pháp kiểm định

102

Anderson-Darling (0,10) và Kolmogorov-Smirnov (0,23) lớn hơn 0,05 có ý

nghĩa thống kê nên kết luận quần thể phân ly tuân theo quy luật phân phối

chuẩn. Tuy nhiên giá trị p sinh ra từ phương pháp kiểm định Shapiro-Wilk

(0,027) nhỏ hơn 0,05 không có ý nghĩa thống kê. Vậy từ kết quả đánh giá kiểu

hình của quần thể lập bản đồ cho chúng ta nghĩ tới tính kháng bệnh khảm

vàng của nguồn kháng (NM94) có thể không phải do 1 gen quy định mà là

tính trạng do nhiều gen quy định (tính trạng QTL).

3.4.1.2. Đánh giá phân ly kiểu hình kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo.

Dựa vào kết quả phân ly kiểu hình 200 dòng của quần thể đậu xanh F2:3

thu được dưới điều kiện tự nhiên tại Tuy Hòa, Phú Yên có thể sử dụng để lập

bản đồ gen kháng bệnh MYMV. Tuy nhiên dưới áp lực bệnh tự nhiên, ngoài

áp lực bệnh MYMV, thí nghiệm còn bị ảnh hưởng bởi những nhân tố khác

như rệp muội, nhện đỏ… khiến cho triệu chứng bệnh MYMV được biểu hiện

không rõ ràng, chính xác đặc biệt là những dòng có biểu hiện kiểu hình kháng

có thật sự kháng hay không. Chính vì vậy việc đánh giá lại trong điều kiện

nhà lưới dưới áp lực bệnh nhân tạo là cần thiết.

Hơn nữa để đánh giá kiểu gen bằng phương pháp GBS đòi hỏi phải rút

bớt số lượng dòng trong quần thể xuống để giảm chi phí tiến hành nhưng vẫn

phải đảm bảo quần thể rút gọn này có đầy đủ 4 nhóm phân lớp như quần thể

ban đầu và đại diện cho cả quần thể ban đầu nên từ kết quả đánh giá kiểu hình

200 dòng F2:3, chúng tôi tiến hành rút gọn quần thể theo nhóm và chọn ra 71

dòng cho quần thể rút gọn (Phụ lục 8). 71 dòng này được đánh giá kiểu hình

kháng bệnh khảm vàng trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo trong nhà lưới sử

dụng môi giới truyền bệnh là bọ phấn.

103

Hình 3.17. Lây nhiễm 71 dòng của quần thể đậu xanh F2:3 bằng bọ phấn

A- Lây nhiễm trong nhà lưới ở giai đoạn 2 lá mầm

B- Sau khi cây có triệu chứng được chuyển ra trồng nhà lưới có cách ly

Hình 3.18. Triệu chứng của bệnh MYMV sau lây nhiễm

A- Sau 2 tuần lây nhiễm

B- Giai đoạn 55 ngày sau lây nhiễm

Quần thể bọ phấn được duy trì trên cây bông tại Trung tâm bệnh cây

nhiệt đới, trước khi lây nhiễm bọ phấn được kiểm tra bằng PCR để chắc chắn

rằng quần thể bọ phấn đang được duy trì là sạch, không mang bất kỳ chủng

begomovirus nào. Cây nguồn thu được tạo ra bằng agroinoculation được sử

104

dụng cho thí nghiệm lây nhiễm bằng bọ phấn. Bố trí thí nghiệm và triệu trứng

bệnh biểu hiện khi tiến hành lây nhiễm nhân tạo được minh họa trong Hình

3.17 và 3.18

Hình 3.19. Phân ly kiểu hình tính kháng của quần thể đậu xanh tuân theo quy

luật phân phối chuẩn

Đánh giá phân ly kiểu hình của 71 dòng quần thể F2:3 bằng lây nhiễm

nhân tạo cho thấy chỉ có 18 dòng biểu hiện kiểu hình kháng thực sự với MYMV

(so với kiểu hình kháng thu được ngoài đồng là 28 dòng), 12 dòng biểu hiện kiểu

hình kháng vừa, 24 dòng biểu hiện kiểu hình kháng vừa và 17 dòng biểu hiện

kiểu hình nhiễm. Quần thể rút gọn này cũng có chỉ số bệnh trung bình và trung

vị gần nhau cũng tuân theo luật phân phối chuẩn khi tiến hành xử lý thống kê

bằng phần mềm R (Hình 3.19). Dựa vào kiểu hình phân ly đối với 71 dòng này

cũng cho thấy gen kháng của NM94 không phải là một gen đơn mà được quy

105

định bởi nhiều gen (QTL). Số liệu kiểu hình chính xác thu được từ 71 dòng này

hoàn toàn có thể sử dụng cho việc xây dựng bản đồ gen.

Bên cạnh đó, thí nghiệm lây nhiễm bằng áp lực bệnh nhân tạo đã kiểm

tra chính xác tính kháng đối với một số dòng kháng bệnh và có những đặc

điểm nông học tốt để tiếp tục đánh giá và giới thiệu ra sản xuất mà điển hình

là dòng 148 (VR2011-2-189) và dòng 178 (VR2011-2-223). Hai dòng này

được chúng tôi đánh giá tại F5 và cho các kết quả khả quan so sánh với hai bố

mẹ được thể hiện trong Bảng 3.19. Hình ảnh hạt và quả cùng kiểu cây của hai

dòng này được minh họa trong Hình 3.20 và 3.21

Bảng 3.19. Một số đặc điểm nông sinh học chính của hai dòng đậu

xanh F5 triển vọng: dòng 148 và dòng 178 vụ Xuân 2015 tại Hà Nội

Dòng 148 Dòng 178

Tính trạng NM94 KPS2

(VN2011-2- 189)

(VN2011-2- 223)

Chiều cao cây (cm) 62,8 70,5 67,2 70,3

Ngày ra hoa 43 39 42 40

Ngày thu đầu tiên 65 60 62 63

Số hạt/quả 11,0 12,0 11,6 12,2

Số quả/cây 13,8 15,4 18,3 26,8

P100 hạt (g) 5,4 5,8 6,1 5,61

Năng suất thực thu 1.551 1.781 2.437 2.910

(kg/ha)

Mức độ kháng 1,73 5,93 1,92 2,03

nhiễm MYMV (HR) (HS) (HR) (R)

106

Hình 3.20. Hình ảnh hạt và quả của dòng đậu xanh triển vọng 178 và 148

Hình 3.21. Kiểu hình kháng bệnh của dòng 148

A- 55 ngày sau lây nhiễm dưới áp lực bệnh tự nhiên

B- 55 ngày sau lây nhiễm dưới áp lực bệnh nhân tạo

3.4.2. Đánh giá kiểu gen kháng bệnh khảm vàng bằng giải trình tự

Tổng số 50 Gb số liệu thô đã được tạo ra từ công nghệ giải trình tự

Illumina và thư viện ADN gồm 2 bố mẹ và 71 dòng F2:3 trong đó chứa

98.297.247 đoạn đọc ngắn có chất lượng base, vị trí đầu treo và barcode tốt.

Trung bình cứ mỗi mẫu cho ra 1.346.537 đoạn đọc ngắn với chiều dài đoạn

107

đọc là 101bp và số lượng đoạn đọc ngắn cụ thể trên mỗi mẫu được thể hiện

trên Hình 3.22

Hình 3.22. Biểu đồ biểu diễn số lượng đoạn đọc ngắn trên mỗi mẫu thu được

từ giải trình tự

Trong quá trình phân tích số liệu GBS, bộ công cụ STACKS cùng công

cụ GATK được kết hợp dung để gọi ra các chỉ thị SNP và đánh giá kiểu gen.

Kết quả (Bảng 3.20) đã gọi ra được 110.574 chỉ thị, trong đó có 28.429 chỉ thị

nằm trên scaffold còn lại phân bố trên 11 nhiễm sắc thể (số chỉ thị trên nhiễm

sắc thể số 1 là nhiều nhất với 14.438 chỉ thị, số chỉ thị trên nhiễm sắc thể số 3

là ít nhất với 3.127 chỉ thị), và trung bình có 9214,5 chỉ thị SNP/NST).

Trong tổng số 110.574 chỉ thị SNP được, chỉ có 8500 chỉ thị cho đa hình

giữa bố và mẹ (chiếm 7,69%). Tuy nhiên số chỉ thị cho đa hình này không

được sử dụng hết để lập bản đồ liên kết di truyền mà phải tiếp tục lọc để lấy

các chỉ thị tốt có tỉ lệ missing thấp từ 15% trở xuống và có xuất hiện dị hợp

tử. Kết quả lọc còn lại 4530 chỉ thị chiếm 4,1% số chỉ thị gọi ra ban đầu

(trung bình 377,5 SNP/NST).

108

Bảng 3.20. Kết quả gọi ra chỉ thị SNP từ phân tích GBS

Số chỉ thị có tỉ Số chỉ thị Số chỉ thị có ý

lệ phân li 1:2:1 Nhiễm cho đa hình nghĩa lập bản Số chỉ thị ở mức ý nghĩa sắc thể giữa bố và đồ (tỉ lệ missing

p<0,05 mẹ <= 15%)

Vr1 Vr2 Vr3 Vr4 Vr5 Vr6 Vr7 Vr8 Vr9 Vr10 Vr11 Scaffold Tổng số 14.438 7.164 3.127 5.077 6.614 9.830 12.207 8.250 7.097 3.545 4.796 28.429 110.574 981 332 246 380 634 1.226 946 648 636 598 657 1.216 8.500 517 134 182 206 408 658 366 362 366 369 404 558 4.530 316 51 46 51 170 308 126 159 99 170 201 319 2016

9214,5 708,3 377,5 182,3 Trung chỉ thị bình

Tiếp theo tiến hành phân tích χ2 trên phần mềm QTLicmapping để kiểm

tra tỉ lệ phân ly mong đợi 1:2:1 của quần thể F2:3 đậu xanh ở mức ý nghĩa

P<0,05, kết quả số chỉ thị đạt yêu cầu rút xuống còn 2016 chỉ thị, chỉ chiếm

1,82% số chỉ thị ban đầu và trung bình đạt 182,3 chỉ thị trên một nhiễm sắc

thể. Đây là số lượng chỉ thị SNP đa hình được sử dụng nhiều nhất cho lập bản

đồ so với các nghiên cứu lập bản đồ trên cây đậu xanh trước đó như 153 chỉ

thị RFLP (Young et al, 1992), 255 chỉ thị RFLP (Humphry et al, 2002), 430

chỉ thị SSR (Isemura et al, 2012), hay mới đây nhất cũng chỉ có 1.321 chỉ thị

SNP được sử dụng (Kang et al, 2014).

109

3.4.3. Lập bản đồ liên kết di truyền, bản đồ vật lý của quần thể đậu

xanh nghiên cứu

Từ kết quả gọi chỉ thị và đánh giá kiểu gen, 2016 chỉ thị SNP đa hình đã

được sử dụng để lập bản đồ liên kết di truyền của quần thể đậu xanh bằng

phần mềm QTLicmapping 4.0. Các chỉ thị được nhóm thành các nhóm với giá

trị LOD lớn hơn hoặc bằng 3,0. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.21 và

Hình 3.23. Cụ thể, 2016 chỉ thị đã được nhóm vào 11 nhiễm sắc thể, trong đó

nhiễm sắc thể số 1 và số 6 có số chỉ thị nhiều nhất với 333 và 332 chỉ thị.

Nhiễm sắc thể số 3 ít chỉ thị nhất với 46 chỉ thị. Trung bình có 183,27 chỉ thị

trên một nhiễm sắc thể. Tổng chiều dài bản đồ lập được là 19.114,14 cM.

NST số 6 dài nhất (2801,44 cM), tiếp theo là nhiễm sắc thể số 1 (2261,49 cM)

và nhiễm sắc thể số 8 (2209,98 cM). NST số 3 là NST ngắn nhất (657,10 cM).

Khoảng cách trung bình giữa các chỉ thị ngắn nhất ở nhiễm sắc thể số 1 (6,79

cM), dài nhất ở nhiễm sắc thể số 4 (15,04 cM) và khoảng cách trung bình

giữa các chỉ thị của cả bản đồ đạt 9,48 cM.

Về mặt vật lý, trong số 2016 chỉ thị dùng để lập bản đồ có 319 chỉ thị

nằm trên scaffold ở trên bộ gen tham khảo. Tuy nhiên trên bản đồ này tất cả

319 chỉ thị trên scaffold này đều bán được vào các nhiễm sắc thể, trong đó số

chỉ thị trên scaffold được bám nhiều nhất trên nhiễm sắc thể 11 (77 chỉ thị),

tiếp theo là nhiễm sắc thể số 10 (74 chỉ thị), nhiễm sắc thể số 3 không có chỉ

thị trên scaffold nào bám vào.

Công nghệ GBS được dung để lập bản đồ vật lý quần thể đậu xanh

nghiên cứu. 2016 chỉ thị SNP có ý nghĩa đã bao phủ được 326,49 Mb bản đồ

bộ gen đậu xanh, 579 Mb (Somta và Srinves, 2007) chiếm 62,6% (Bảng 3.21,

Hình 3.24). Trong đó NST số 7 có chiều dài vật lý lớn nhất (55,37 Mb), NST

có chiều dài vật lý ngắn nhất là NST số 3 (12,92 Mb). Khoảng cách trung

bình giữa các chỉ thị SNP trên bản đồ vật lý này là 0,162 Mb.

110

Bảng 3.21. Tổng hợp lập bản đồ di truyền đậu xanh dựa trên chỉ thị SNP

Khoảng

Số chỉ thị

Số

NST

Khoảng

Chiều

Chiều dài

cách TB

Nhiễm

SNP

trên

cách

dài vật

bản

đồ

(vị

trí

sắc thể

đượclập

Scaffold

TB

lý

(cM)

vật lý)

bản đồ

được nhóm

(cM)

(Mb)

333

2261,49

6,79

36,49

0,109

1083,62

13,38

23,31

0,288

657,10

14,28

12,92

0,281

1022,47

15,04

20,58

0,303

180

1848,57

10,27

36,08

0,200

332

2801,44

8,44

37,37

0,113

132

1736,40

13,15

55,37

0,419

202

2209,98

10,94

43,17

0,213

120

1463,23

12,19

20,97

0,175

244

1947,24

7,98

20,87

0,086

278

2082,60

7,49

19,36

0,069

Tổng

2016

319 19114,14

9,48

326,49

0,162

Hình 3.23. Bản đồ liên kết di truyền của quần thể đậu xanh nghiên cứu

111

Hình 3.24. Bản đồ vật lý gồm 11 nhiễm sắc thể của quần thể đậu xanh

NM94xKPS2 (được lập bằng GBS)

3.4.4. Lập bản đồ QTL cho tính kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh

Cơ sở cho việc lập bản đồ tính trạng số lượng (QTL) được biết đến từ

những năm 70 của thế kỷ trước. Tuy nhiên, do thiếu chỉ thị đã hạn chế việc sử

dụng rộng loại bản đồ này. Đến những năm 80, khi việc giải trình tự ADN đã

làm tăng số lượng và mật độ chỉ thị cũng như các phương pháp lập bản đồ

tinh vi về mặt thống kê hơn được phát triển, bản đồ QTL mới được ứng dụng

rộng rãi.

Số liệu đánh giá kiểu hình trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo quần thể

đậu xanh lập bản đồ 71 dòng F2:3 cùng với số liệu đánh giá kiểu gen sử dụng

2016 chỉ thị SNP được dùng để xác định QTL cho tính trạng kháng bệnh

khảm vàng trên hai phần mềm QTLicmapping 4.0 cho vị trí di truyền và

Qgene 4.3 cho vị trí vật lý của các chỉ thị SNP.

112

3.4.4.1. Kết quả lập bản đồ QTL dựa vào vị trí di truyền

Trên phần mềm QTLicmapping 4.0, vị trí của các chỉ thị được sử dụng là

vị trí di truyền được lấy từ bản đồ di truyền ở trên. Phương pháp xác định

QTL là ICIM-ADD. Phương pháp này là cải tiến của phương pháp CIM để

hạn chế tác động của sự chọn lọc chỉ thị ngẫu nhiên đồng thời trên CIM (Li et

al, 2007). Hơn nữa, các phương pháp mô hình đa vị trí khác nhau dựa trên các

thuật toán thống kê Bayesian cũng được phát triển cho việc dựng mô hình

đồng thời các QTL hệ gen lớn (Cai et al, 2011). Mặc dù các phương pháp

Bayesian có nhiều tiến bộ trong lập bản đồ QTL nhưng đòi hỏi chuyên sâu về

máy vi tính và khó sử dụng. Nhờ có các phần mềm máy tính chạy trên hệ điều

hành Windown thân thiện với người sử dụng mà việc phân tích các thuật toán

phức tạp trong lập bản đồ QTL đã trở nên dễ dàng hơn.

Các thông số đầu vào cho phương pháp ICIM được dùng như mặc định

ban đầu với chỉ số LOD là 2,5. Kết quả, đã xác định được 12 vùng QTL

(Bảng 3.22, Hình 3.25). Trong đó có 3 QTL nằm trên nhiễm sắc thể số 8, 4

QTL nằm trên nhiễm sắc thể số 10, còn lại mỗi nhiễm sắc thể số 1, 5, 7, 9 mỗi

NST có 1 QTL. 12 QTL này chỉ có 4 QTL chính là QTL nằm trên các nhiễm

sắc thể 1, 5, 7, 9 là các QTL có chỉ số LOD cao trên 4,5. LOD cao nhất là

QTL nằm trên nhiễm sắc thể số 5 với giá trị LOD là 16,04 và mứ c đô ̣ ảnh

hưở ng củ a vù ng gen chi phố i đến biểu hiê ̣n tính tra ̣ng đươ ̣c tính bằng PVE(%)

đạt cao nhất với 38,91%, tiếp theo là vùng QTL nằm trên nhiễm sắc thể số 9

với giá trị LOD 10,92 và mứ c đô ̣ ảnh hưở ng củ a vù ng gen chi phố i đến biểu

hiê ̣n tính tra ̣ng (PVE%) bằng 21,24%. Vùng QTL được xác định trên nhiễm

sắc thể số 1 cũng có giá trị LOD cao (6,5) và mức độ ảnh hưởng của vùng gen

này chi phối biểu hiện tính trạng kháng MYMV đạt 11,52% và vùng QTL

113

nằm trên nhiễm sắc thể số 7 có giá trị LOD thấp nhất (4,58) với mức độ ảnh

hưởng của vùng gen lên tính trạng kháng MYMV chỉ đạt 8,79%. Các QTL

còn lại có giá trị LOD rất thấp và mức độ ảnh hưởng của vùng gen lên tính

trạng cũng rất nhỏ nên không được xét đến. Tổng số 4 vùng QTL chính được

xác định có mức độ ảnh hưởng chi phối 80,46% tính trạng kháng MYMV.

Bảng 3.22. Các QTL quy định tính trạng kháng MYMV của quần thể

Tên vùng

Vị trí

Mức độ ảnh

Nhiễm

QTL chính

trên

Giá trị

hưởng đến

sắc

Chỉ thị bên trái

Chỉ thị bên phải

bản đồ

LOD

kiểu hình

thể

(cM)

(PVE%)

mymv1-1

42 Vr01:36171544

Vr01:35678505

6,50

11,52

mymv1-2

1214 Vr05:5694513

Vr05:5179489

16,04

38,91

mymv1-3

561 Vr07:6674722

Vr07:11673121

4,58

8,79

567 Vr08:28759842

Vr08:28052284

2,73

3,64

794 Vr08:28019682

Vr08:27690768

2,63

3,58

1286 scaffold_2045:703

scaffold_251:31242

2,73

7,19

mymv1-4

1248 Vr09:20592377

Vr09:20592336

10,92

21,23

530 scaffold_374:126512 Vr10:15509740

2,68

4,71

661 Vr10:15597273

Vr10:16185682

2,99

4,28

700 Vr10:15597646

Vr10:16191195

2,69

3,73

777 Vr10:14474055

Vr10:14819052

2,59

3,43

1352 Vr10:7954034

Vr10:7954058

2,92

4,18

đậu xanh F2:3 lập bản đồ

Các chỉ thị hai đầu của các vùng QTL xác định bằng phương pháp

ICIM sử dụng phần mềm QTLicmapping với kiểu SNP và vị trí vật lý của

SNP được trình bày ở Bảng 3.23, đoạn trình tự có chứa SNP được trình bày

trong Phụ lục 9.

114

Bảng 3.23. Trình tự ADN chứa chỉ thị SNP liên kết với các vùng QTL chính

Tên vùng QTL

Ký hiệu chỉ thị

Kiểu SNP

Vị trí vật lý (bp)

Vr01:36171544

A/G

36171544

mymv1-1

Vr01:35678505

A/G

35678505

Vr05:5694513

A/T

5694513

mymv1-2

Vr05:5179489

T/C

5179489

Vr07:6674722

C/A

6674722

mymv1-3

Vr07:11673121

G/A

11673121

Vr09:20592377

T/C

20592377

mymv1-4

Vr09:20592336

G/T

20592336

Hình 3.25. Các vùng QTL chính của tính trạng kháng MYMV của quần thể

đậu xanh trên các nhiễm sắc thể và giá trí LOD của nó

115

3.4.4.2. Kết quả lập bản đồ QTL dựa vào vị trí vật lý

Do đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự (GBS) cho vị trí vật lý của từng

chỉ thị phân tử trên bản đồ nên để sử dụng vị trí vật lý này trên nhiễm sắc thể

cho việc xác định QTL của tính kháng bệnh khảm vàng, chúng tôi phân tích

và lập bản đồ QTL bằng phần mềm Qgen 4.3 trong đó những scaffold đã

được leo bán trên các nhiễm sắc thể bằng phần mềm QTLicmapping vẫn được

giữ nguyên vị trí trên các nhiễm sắc thể đó.

Phân tích xác định QTL kháng bệnh khảm vàng của quần thể đậu xanh bằng

phương pháp phân tích hồi quy chỉ thị đơn (Single Marker Regression – SMR).

Phương pháp này dựa vào từng chỉ thị đơn và về mặt bản chất là phương

pháp phân tích phương sai một chiều. Sự có mặt của một QTL được kiểm tra

chỉ duy nhất tại các vị trí chỉ thị, có thể là 20cM hoặc lớn hơn trên bản đồ

nhiễm sắc thể. Phương pháp SMR xác định được các QTL ở các vị trí chỉ thị

do đó yêu cầu mật độ chỉ thị cao để thu được những ước lượng chính xác các

vị trí QTL (Doerge et al, 1997). Các số liệu thống kê khác nhau có thể được

lựa chọn. Ở nghiên cứu này với phân tích SMR sử dụng 2016 chỉ thị SNP, các

số liệu thống kê được lựa chọn cho mỗi chỉ thị gồm giá trị LOD, R2 và ảnh

hưởng tương tác (Add effect). Trong phương pháp lập bản đồ QTL bằng

SMR, phép thống kê được sử dụng là dựa vào giá trị LOD của từng chỉ thị và

số lượng lặp lại phân tích là 1000 lần từ đó xác định được giá trị LOD có ý

nghĩa thống kê ở mức alpha 0,05 là 4,579 và alpha 0,01 là 5,25.

Phân tích thu được từ phương pháp SMR đã xác định được 9 vùng QTL

có LOD có ý nghĩa thống kê ở mức alpha 0,05 như được trình bày ở Bảng

3.24 và Hình 3.26. Trong đó có 3 vùng QTL rất nhỏ chỉ có 1 chỉ thị SNP liên

kết trong vùng QTL này là QTL nằm trên NST số 3 và 2 QTL nằm trên NST

số 9. Trên NST số 4 xác định được 1 vùng QTL mymv2-2 có 5 chỉ thị SNP

116

liên kết, nằm từ vị trí 15,34 Mb đến 15,45 Mb có giá trị LOD cao nhất là

10,49 và ảnh hưởng đến tính trạng kháng bệnh MYMV là 49%.

Bảng 3.24. Các vùng QTL xác định được bằng phương pháp SMR

Số chỉ thị

LOD

R2

Tên vùng

Vị trí bắt

Vị trí kết

NST

SNP trong

QTL

đầu (Mb)

thúc

Min Max Min Max

mymv2-1

10,57

6,19

6,19 0,33

0,33

vùng QTL 1

3 mymv2-2

15,34

15,45

9,57

10,49 0,46

0,49

4 mymv2-3

5,69

8,27

11,01 0,42

0,51

5,06

5 mymv2-4

9,67

5,21

10,66 0,29

0,50

8,24

5 mymv2-5

13,33

13,72

5,06

6,78 0,28

0,36

5 mymv2-6

0,18

5,00

5,00 0,28

0,28

9 mymv2-7

12,64

5,37

5,37 0,29

0,29

9 mymv2-8

0,47

5,46

5,72 0,31

0,45

0,23

10 mymv2-9

3,9

5,39

9,54 0,30

0,46

2,76

10 Hình 3.26. Vị trí các vùng QTL trên bản đồ vật lý của đậu xanh bằng SMR

117

Trên NST số 5 xác định được 3 vùng QTL là mymv2-3, mymv2-4 và

mymv2-5 có số chỉ thị SNP nằm trong các vùng QTL này tương ứng là 5, 3, 5

chỉ thị, có giá trị LOD cao nhất tương ứng là 11,01, 10,66 và 6,78, các vùng

QTL nằm trên NST số 5 ảnh hưởng đến tính trạng kháng bệnh khảm vàng cao

nhất lần lượt là 51%, 50% và 36%. Trên NST số 10 xác định được 2 vùng

QTL mymv2-8 và mymv2-9 có các chỉ thị nằm trong vùng QTL lần lượt là 11

và 15 chỉ thị, có giá trị LOD cao nhất lần lượt là 5,72 và 9,54 và có ảnh hưởng

lớn nhất đến tính trạng kháng bệnh MYMV tương ứng là 45 và 46%

Phân tích xác định QTL kháng bệnh khảm vàng của quần thể đậu xanh bằng

phương pháp lập bản đồ đoạn phức hợp (Composite Interval Mapping –CIM).

Lập bản đồ đoạn (Interval mapping – IM) được đề xuất để lập bản đồ

QTL có hệ gen lớn dựa trên các nảm đồ liên kết (Lander và Botstein, 1989).

Phương pháp IM dựa trên kiểm định thống kê cho một QTL ở mỗi vị trí bộ

gen giữa một cặp chỉ thị trên các kiểu gen của hai chỉ thị đầu đoạn. Tuy nhiên,

hai hoặc nhiều QTL liên kết có thể ảnh hưởng đến việc lập bản đồ bằng IM,

dẫn đến sự ước tính vị trí và ảnh hưởng của các QTL. Chính vì thế không lâu

sau khi được công bố, phương pháp IM đã xuất hiện những vấn đề hạn chế

trong phân tích thống kê. Dựa trên IM, phương pháp lập bản đồ đoạn kết hợp

(composite interval mapping – CIM) đã được đề xuất để giảm tác động của

liên kết trên QTL bằng sự kiểm định và cải tiến độ chính xác của bản đồ QTL

(Zeng, 1994).

Áp dụng phương pháp này trong phân tích lập bản đồ QTL tính kháng

bệnh khảm vàng trên quần thể F2 đậu xanh nghiên cứu, sử dụng thống kê

LOD với vị trí nền được lựa chọn theo hệ thống là [Vr03:5887802 3 58.8,

Vr04:15359002 4 153.5, Vr05:415168 5 4.1, scaffold_275:184948 9 1.8,

Vr11:8933162 11 89.3], số lượng lặp lại phân tích là 200 lần từ đó xác định

118

được giá trị LOD có ý nghĩa thống kê ở mức alpha 0,1 là 5,958, alpha 0,05 là

6,643 và alpha 0,01 là 9,22.

Với giá trị LOD có ý nghĩa thống kê ở mức 0,1 (5,958) đã xác định được 3 vị

trí QTL nằm trên 3 NST khác nhau là mymv3-1 trên NST số 4, mymv3-2 trên

NST số 5, mymv3-3 trên NST số 10 (Bảng 3.25, Hình 3.27)

Bảng 3.25. Các vùng QTL xác định được bằng phương pháp CIM

Vị trí

LOD

R^2

Tên vùng

Vị trí

NST

bắt

QTL

kết thúc

đầu

Min Max Min Max

mymv3-1

15,03

15,63

6,73

10,49

0,35

0,49

4 mymv3-2

2,21

13,41

5,92

9,22

0,32

0,45

5 mymv3-3

3.4

6,84

8,54

0,36

0,43

10 Hình 3.27. Vị trí các vùng QTL trên bản đồ vật lý của đậu xanh bằng CIM

119

Từ kết quả xác định các vị trí QTL, 7 chỉ thị được lọc là các chỉ thể đơn

trong phân tích SMR (Bảng 3.26) là các chỉ thị này nằm trong vùng QTL có

giá trị LOD cao nhất, cùng với 8 chỉ thị chặn hai đầu của 4 vùng QTL chính

(Bảng 3.23) được xác định bằng QTL icmapping được đề xuất đánh giá để có

thể ứng dụng chọn giống kháng bệnh nhờ chỉ chị trong các nghiên cứu kế

thừa của đề tài.

Bảng 3.26. Danh sách các chỉ thị được lựa chọn cho việc đánh giá chỉ thị

Vị trí Giá

Tên chỉ thị NST vật lý trị R2 Kiểu SNP

(Mb) LOD

scaffold_183:419936 0,42 8,00 10 0,41 G/A

scaffold_184:377097 0,37 9,24 10 0,45 C/T

Vr03:10571694

10,57 6,19 3 0,33 A/T

Vr04:15430209 15,43 10,49 4 0,49 A/G

Vr05:5694513 5,69 11,01 5 0,51 A/T

Vr05:8244523 8,24 10,66 5 0,50 C/A

0,41 Vr10: 3385439 10 3,22 8,01 T/G

120

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Kết luận

1. Đã xác định được chủng virus thuộc chi begomovirus gây bệnh khảm vàng

trên đậu xanh tại Nam Trung Bộ là các virus MYMV. Tất cả các virus này có

độ tương đồng về trình tự ADN-A lớn nhất (98,7-98,9%) so với MYMV trên

đậu xanh thu thập từ Campuchia (AY271892) và MYMV thu thập tại Thái

Lan (AB017341, D14703). Các trình tự ADN-B có độ tương đồng về trình tự

nucleotide lớn nhất (95,9-96,8%) với MYMV trên đậu xanh được phân lập tại

Thái Lan (D14704).

2. Đề tài đã xác định được ba nguồn gen đậu xanh (NM92, NM94, VC3960-

88), nhập nội từ AVRDC và 5 dòng VR 2011-2-19, VR 2011-2-104, VR

2011-2-189, VR 2011-2-223 và VR 2011-2-245 từ tổ hợp lai NM94xKPS2

kháng cao với virus bệnh khảm vàng tại Phú Yên. Hai nguồn gen NM92 và

NM94 có năng suất thực thu cao lần lượt là 1.105 và 1.151 kg/ha, các nguồn

đậu xanh này là vật liệu khởi đầu có giá trị cho chọn tạo giống đậu xanh vừa

kháng bệnh vừa cho năng suất cao.

3. Từ tổ hợp lai NM94xKPS2, đề tài đã chọn lọc được hai dòng đậu xanh

triển vọng 148 (VN2011-2-189) và 178 (VN2011-2-223) có năng suất cao lần

lượt là 2.437 và 2.910 kg/ha, kháng bệnh khảm vàng có thể giới thiệu trực

tiếp cho sản xuất hoặc sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo

giống đậu xanh kháng bệnh.

4. Kết quả nghiên cứu khoảng cách di truyền và các tính trạng hình thái nông

học cho thấy các nguồn gen đậu xanh có nền di truyền hẹp và phân nhóm

không rõ ràng theo vùng địa lý.

5. Lập được bản đồ di truyền với tổng chiều dài được xác định là 19.114,14

cM trên 11 nhóm liên kết tương ứng 11 NST và bản đồ vật lý với tổng chiều

dài 326,49Mb (chiếm 62,6% toàn bộ bộ gen đậu xanh).

121

6. Dựa vào vị trí di truyền của chỉ thị, xác định được 4 vùng QTL chính

mymv1-1 đến mymv1-4 nằm lần lượt trên các NST 1,5,7,9 có mức độ ảnh

hưởng đến 80,46% kiểu hình tính kháng. Dựa vào vị trí vật lý của chỉ thị và

bằng phương pháp phân tích SMR đã xác định được 9 vùng QTL ký hiệu từ

mymv2-1 đến mymv2-9 nằm trên các NST 3, 4, 5, 9, 10, bằng phương pháp

phân tích CIM đã xác định được 3 vùng QTL từ mymv3-1 đến mymv3-3 nằm

trên các NST 4, 5, 10.

Đề nghị

1. Tiếp tục các nghiên cứu, đánh giá các chỉ thị SNP để sử dụng cho việc chọn

lọc cá thể cho chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng ở Việt Nam.

2. Đề nghị sử dụng các giống đậu xanh NM92, NM94, VC3960-88 từ AVRDC

làm vật liệu trong các chương trình chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm

vàng và các dòng đậu xanh 148 (VN2011-2-189), 178 (VN2011-2-223) chọn lọc

từ quần thể lập bản đồ cho các chương trình chọn tạo giống đậu xanh vừa kháng

bệnh vừa cho năng suất cao.

122

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Bùi Thị Thu Huyền, Nguyễn Thị Lan Hoa, Nguyễn Thị Thu Trang, Trần

Danh Sửu, Hà Viết Cường, Vũ Xuân Trường (2013), “Đánh giá tình hình bệnh

khảm vàng của tập đoàn đậu xanh”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông

nghiệp Việt Nam, Số 5(44), 2013, P.93-96.

2. Wen-Shi Tsai, Su-Ling Shih, Aunu Rauf, Ramadhani Safitri, Nurul

Hidayati, Bui Thi Thu Huyen and Lawrence Kenyon (2013), “Genetic

diversity of legume yellow mosaic begomoviruses in Indonesia and Vietnam”,

Annals of Applied Biology, No.163 (2013), P.367-377.

3. Nguyễn Thị Lan Hoa, Bùi Thị Thu Huyền, Nguyễn Đức Anh, Nguyễn Thị

Thanh Thủy, Hà Viết Cường (2014), “Đánh giá tính kháng bệnh khảm hoa lá

(MYMD) của tập đoàn đậu xanh địa phương và nhập nội tại Phú Yên”, Tạp

chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Số 7, 2014, P.19-26.

4. Bùi Thị Thu Huyền, Nguyễn Thị Lan Hoa, Nguyễn Đức Anh, Trần Danh

Sửu, Hà Viết Cường (2015), “Xác định chủng virus gây bệnh khảm vàng trên

cây đậu xanh ở Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Số

5, 2015, P.10-18.

123

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Đức Anh (2013), Nghiên cứu Mungbean yellow mosaic virus (MYMV) trên đậu xanh và begomovirus trên ớt tại miền Trung Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

2. Nguyễn Trung Bình, Đặng Thị Thu Trang, Nguyễn Ngọc Quất, Nguyễn Văn Hiền, Trương Thị Thuận (2014), “Kết quả chọn khảo nghiệm giống đậu xanh NTB02 cho vùng Duyên hải Nam Trung Bộ”, Báo cáo công nhận giống đậu xanh của Viện KHKT Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung Bộ.

3. Nguyên Văn Bộ, Nguyễn Văn Tuất, Vũ Mạnh Hải, Phạm Xuân Liêm (2009), Giới thiệu giống cây trồng và quy trình kỹ thuật mới, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

4. Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cường (2008), Trồng đậu xanh,

NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr:3-9.

5. Lưu Minh Cúc (2009), Sử dụng chỉ thị vi vệ tinh trong lập bản đồ gen kháng bệnh đốm lá muộn ở lạc (Arachis hypogaea L.) phục vụ công tác chọn tạo giống, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.

6. Cục Trồng trọt (2009), 966 giống cây trồng nông nghiệp mới, NXB

Nông nghiệp, Hà Nội.

7. Nguyễn Văn Chương, Nguyễn Ngọc Quất, Nguyễn Văn Long, Vũ Văn Quang (2014), “Kết quả nghiên cứu chọn tạo khảo nghiệm giống đậu xanh HLĐX10”, Báo cáo công nhận giống đậu xanh của Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Hưng Lộc, Viện KHKT Nông nghiệp Miền Nam.

8. Bùi Phương Mỹ Dung, Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Lưu Ngọc Trình, Đinh Thế Vu (2006), “Đánh giá đa dạng nguồn gen đậu xanh (Vigna radiata)

124

đang bảo tồn tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 2(9), tr. 25-28.

9. Nguyễn Thị Thanh Duyên, Lê Thị Hồng, Hồ Tấn Quốc (2012), “So sánh sinh trưởng và năng suất của 12 giống đậu xanh (Vigna radiata L.) vụ xuân hè 2012 tại xã LơKu, Kbang, Gia Lai”, Tạp chí Khoa học công nghệ và Môi trường 5, tr. 25-30.

10. Nguyễn Thị Lan Hoa (2013), Xá c đi ̣nh chỉ thi ̣ phân tử liên kết gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ, Luận án tiến sỹ Nông Nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

11. Điêu Thị Mai Hoa và Lê Trần Bình (2005). Nghiên cứu tính đa hình di truyền của 57 giống đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng kỹ thuật RAPD. Tạp chí Công nghệ Sinh học 3(1): 57-66.

12. Trần Đình Long, Nguyễn Thị Chinh (2005), Kết quả chọn tạo và phát triển giống đậu đỗ giai đoạn 1985-2005 và định hướng phát triển 2006 – 2010, Khoa học công nghệ nông nghiệp và phat triển nông thôn 20 năm đổi mới - Trồng trọt và Bảo vệ thực vật, tập 1, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr.102-103.

13. Vũ Đình Ninh (1972), Sổ tay phát hiện và dự tính, dự báo sâu bệnh hại

cây trồng, NXB Nông thôn, Hà Nội, 192 trang.

14. Nguyễn Ngọc Quất, Nguyễn Văn Thắng, Hoàng Minh Tâm, Trần Thị Trường, Nguyễn Thị Thúy Lương, Nguyễn Thị Thủy (2014), “Kết quả tuyển chọn và khảo nghiệm giống đậu xanh ĐX14 ở các tỉnh phía Bắc”, Báo cáo công nhận giống đậu xanh của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm.

15. Tạ Minh Sơn, Hoàng Minh Tâm, Hồ Huy Cường, Nguyễn Ngọc Thành, Đặng Thị Thu Trang và cộng sự (2006), Kết quả nghiên cứu chọn lọc giống đậu xanh NTB01, Kỷ yếu hội nghị tổng kết khoa học va công nghệ nông nghiệp 2001-2005, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

125

16. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu và Lê Trần Bình (2006), “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh chịu hạn bằng chỉ thị SSR và RAPD”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(1): 99-106.

17. Nguyễn Thị Thanh (2009), “Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương, đậu xanh và biện pháp kỹ thuật trong hệ thống canh tác với cây ngô”, Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài của Viện Nghiên cứu Ngô, Hà Nội.

18. Phạm Văn Thiều (2009), Cây đậu xanh: Kỹ thuật trồng và chế biến sản

phẩm", Tái bản lần thứ 6, Nxb Nông nghiệp: 119 trang.

19. Phan Hữu Trinh, Vũ Đình Thắng và Trần Thị Mai (1986), Cây hoa màu

xuất khẩu, Nhà xuất bản Nông nghiệp.

20. Viện Quy hoạch Thiết kế Nông nghiệp (2016), Thống kế Nông lâm - Thủy sản, Báo cáo thống kê, Trung tâm Phát triển bền vững Nông nghiệp Nông thôn.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

21. Akanda, A. M., K. Tsuno and S. Wakimoto (1992). Serodiagnosis of viruses infecting some crops of Bangladesh. Journal of the Faculty of Agriculture, Kyushu University 3(4): 121-129.

22. Akhtar, K. P. and M. A. Haq (2003). Standardization of a graft inoculation method for the screening of mungbean germplasm against Mungbean yellow mosaic virus (MYMV). Plant Pathology Journal 19(5): 257-259.

23. Akhtar, K. P., G. Sarwar, G. Abbas, M. J. Asghar, N. Sarwar and T. M. Shah (2011), “Screening of mungbean germplasm against Mungbean yellow mosaic India virus and its vector (Bemisia tabaci)”, Crop Protection 30(9): 1202-1209.

24. Alverson, A. J., S. Zhuo, D. W. Rice, D. B. Sloan and J. D. Palmer (2011). The mitochondrial genome of the legume Vigna radiata and the analysis of recombination across short mitochondrial repeats. PLoS one 6(1): e16404.

126

25. Ammavasai, S., D. Phogat and I. Solanki (2004), “Inheritance of resistance to mungbean yellow mosaic virus (MYMV) in green gram [Vigna radiata (L.) Wilczek]”, The Indian Journal of Genetics and Plant Breeding 64(2): 146-146.

26. AVGRIS (2014). AVRDC vegetable genetic resources information

system. Available at: http://203.64.245.173/search_result.asp?VINO= &ACCNO=&TEMPNO=&SPECIE=VIGNARADIATA&PEDCUL=&S UBTAX=&COUNTR=&NOTES= (accessed on 07 December 2014).

27. Benigno, D. A. and M. A. Favali-Hedayat (1977). Investigations on previously unreported or noteworthy plant viruses and virus diseases in the Philippines. FAO Plant Protection Bulletin 2: 78-84.

28. Betal, S., P. R. Chowdhury, S. Kundu and S. S. Raychaudhuri (2004). Estimation of genetic variability of Vigna radiata cultivars by RAPD analysis. Biologia plantarum 48(2): 205-209.

29. Briddon R.W., Bull S.E., Mansoor S., Amin I., Markham P.G. (2002), “Universal primers for the PCR-mediated amplification of DNA beta: a molecule associated with some monopartite begomoviruses”, Molecular Biotechnolology 20: 315-318.

30. Brown, J. K., C. M. Fauquet, R. W. Briddon, M. Zerbini, E. Moriones and J. Navas-Castillo (2012). Family Geminiviridae. Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses - Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier Academic Press, USA.

31. Cai X, Huang A, Xu S. (2011), “Fast empirical Bayesian LASSO for multiple quantitative trait locus mapping”, BMC Bioinformatics 12:211. doi: 10.1186/1471-2105-12-211.

32. Castillo, A., Maria C Ramirez, Azahara C Martin, Andrzej Kilian, Antonio Martin and Sergio G Atienza (2013). High-throughput genotyping of wheat-barley amphiploids utilising diversity array technology (DArT). BMC Plant Biology 13: 87.

127

33. Catchen, J., Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Amores, A. and Cresko, W. A. (2013), “Stacks: an analysis tool set for population genomics”, Mol Ecol, 22: 3124–3140. doi:10.1111/mec.12354

34. Chavan, S.P. and Gacche, R. (2014), “Identification and Characterization of EST-SSRs in Mungbean”, WebmedCentral BIOTECHNOLOGY 5(3):WMC004598.

35. Chen, H.-M., C.-A. Liu, C. G. Kuo, C.-M. Chien, H.-C. Sun, C.-C. Huang, Y.-C. Lin and H.-M. Ku (2007), “Development of a molecular marker for a bruchid (Callosobruchus chinensis L.) resistance gene in mungbean”, Euphytica 157 (1-2): 113-122.

36. Chen, H.M., H.M. Ku, R. Schafleitner, T. S. Bains, C. G. Kuo, C.A. Liu and R. M. Nair (2013), “The major quantitative trait locus for mungbean yellow mosaic Indian virus resistance is tightly linked in repulsion phase to the major bruchid resistance locus in a cross between mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek] and its wild relative Vigna radiata ssp. Sublobata”, Euphytica 192(2): 205-216.

37. Cheng, Z. and J. Tian (2011). Status and future perspectives of Vigna (mungbean and azuki bean) production and research in China. The 14th NIAS international workshop on genetic resources–Genetic resources and comparative genomics of legumes (Glycine and Vigna). Tsukuba: National Institute of Agrobiological Science.

38. Choudhary, S., R. Gaur, S. Gupta and S. Bhatia (2012), “EST-derived genic molecular markers: development and utilization for generating an advanced transcript map of chickpea”, Theoretical and Applied Genetics 124(8): 1449-1462.

39. Datta, S., S. Gangwar, S. Kumar, S. Gupta, R. Rai, M. Kaashyap, P. Singh, S. K. Chaturvedi, B. B. Singh and N. Nadarajan (2012). Genetic Diversity in Selected Indian Mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek] Cultivars Using RAPD Markers. American Journal of Plant Sciences 3(8): 1085-1091.

128

40. Deleu, W., C. Esteras, C. Roig, M. Gonzalez-To, I. Fernandez-Silva, D. Gonzalez-Ibeas, J. Blanca, M. A. Aranda, P. Arus and F. Nuez (2009), “A set of EST-SNPs for map saturation and cultivar identification in melon”, BMC Plant Biology 9(1): 90.

41. Dhole, V. J. and K. S. Reddy (2012), “Genetic analysis of resistance to mungbean yellow mosaic virus in mungbean (Vigna radiata)”, Plant Breeding 131(3): 414-417.

42. Dhole, V. J. and K. S. Reddy (2013), “Development of a SCAR marker linked with a MYMV resistance gene in mungbean (Vigna radiata L. Wilczek)”, Plant Breeding 132(1): 127-132.

43. Doerge RW, Zeng ZB, Weir BS. (1997), “Statistical issues in the search for genes affecting quantitative traits in experimental populations”, Statistical Science 12(3):195–219.

44. Doyle, J.J. and J.L. Doyle (1987), “A rapid DNA isolation proceducer for small quantities of fresh leaf tissue”, Phytochemical Bulletin 19:11- 15

45. Elshire, R. J., J. C. Glaubitz, Q. Sun, J. A. Poland, K. Kawamoto, E. S. Buckler and S. E. Mitchell (2011), “A robust, simple genotyping-by- sequencing (GBS) approach for high diversity species”, PloS one 6(5): e19379.

46. Fang D.D., Jinhua X., Canci P.C. and Cantrell R.G. (2010), A new SNP haplotype associated with blue disease resistance gene in cotton (Gossypium hirsutum L.). Theoretical and applied genetics TAG 120(5): 943-953.

47. Gore, M. A., J.-M. Chia, R. J. Elshire, Q. Sun, E. S. Ersoz, B. L. Hurwitz, J. A. Peiffer, M. D. McMullen, G. S. Grills and J. Ross-Ibarra (2009), “A first-generation haplotype map of maize”, Science 326(5956): 1115-1117.

129

48. Gupta PK, Kumar J, Mir RR and Kumar A. (2010). Marker-assisted selection as a component of conventional plant breeding. Plant Breeding Reviews 33: 145-217.

49. Gupta, P. (2008), “Ultrafast and low-cost DNA sequencing methods for applied genomics research”, Proceedings of the Indian National Science Academy-Part B: Biological Sciences 78: 91-102.

50. Gupta, S., S. Kumar, R. Singh and S. Chandra (2005), “Identification of a single dominant gene for resistance to Mungbean Yellow Mosaic Virus in blackgram (Vigna mungo (L.) Hepper)”, SABRAO Journal of Breeding and Genetics 37(2): 85-89.

51. Gupta, S., R. Bansal, U. Vaidya and T. Gopalakrishna (2012). Development of EST-derived microsatellite markers in mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek] and their transferability to other Vigna species." Indian Journal of Genetics and Plant Breeding 72(4): 468-471.

52. Gupta, S., R. Bansal, U. Vaidya and T. Gopalakrishna (2013). Assessment of genetic diversity at molecular level in mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek). Journal of Food Legumes 26(3-4): 19-24.

53. Gupta, S., R. Bansal and T. Gopalakrishna (2014), “Development and characterization of genic SSR markers for mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”, Euphytica 195(2): 245-258.

54. Ha Viet Cuong, Coombs, S., Revill P., Harding R., Vu M. and Dale J. (2006), “Corchorus yellow vein virus, a New World geminivirus from the Old World”, Journal of General Virology 87: 997-1003. (bỏ tài liệu này vì không trích dẫn trong bài)

55. Ha, C., S. Coombs, P. Revill, R. Harding, M. Vu and J. Dale (2008). Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation. Journal of General Virology 89(1): 312-326.

130

56. Han, T., M. K. Win, A. Shwe, T. Soe, T. Aye, N. Nyi, K. K. Thet and A. Ramakrishna (2001). Legumes in rice-based cropping systems in Myanmar: constraints and opportunities. Legumes in rice-based cropping systems in tropical Asia: constraints and opportunities: 42-61.

57. Honda, Y., M. Iwaki, Y. Saito, P. Thongmeearkom, K. Kittisak and N. transmission, purification, and some Deema (1983). Mechanical properties of whitefly-borne mung bean yellow mosaic virus in Thailand. Plant disease 67(7): 801-804.

58. Hospital, F. (2009), Marker-assited breeding, In: Plant molecular

breeding, (Ed. Newbury, H John), John Wiley & Sons. p: 30-56.

59. Hudson, M.E. (2008), “Sequencing breakthroughs for genomic ecology and evolutionary biology”, Molecular ecology resources 8(1): 3-17.

60. Humphry, M., C. Lambrides, S. Chapman, E. Aitken, B. Imrie, R. Lawn,

C. McIntyre and C. Liu (2005), “Relationships between hard‐seededness and seed weight in mungbean (Vigna radiata) assessed by QTL analysis”, Plant Breeding 124(3): 292-298.

61. Humphry, M., V. Konduri, C. Lambrides, T. Magner, C. McIntyre, E. Aitken and C. Liu (2002), “Development of a mungbean (Vigna radiata) RFLP linkage map and its comparison with lablab (Lablab purpureus) reveals a high level of colinearity between the two genomes”, Theoretical and Applied Genetics 105(1): 160-166.

62. Isemura, T., A. Kaga, S. Konishi, T. Ando, N. Tomooka, O. K. Han and D. A. Vaughan (2007), “Genome dissection of traits related to domestication in azuki bean (Vigna angularis) and comparison with other warm-season legumes”, Annals of botany 100(5): 1053-1071.

63. Isemura, T., A. Kaga, S. Tabata, P. Somta, P. Srinives, T. Shimizu, U. Jo, D. A. Vaughan and N. Tomooka (2012), “Construction of a genetic linkage map and genetic analysis of domestication related traits in mungbean (Vigna radiata), PloS one 7(8): e41304.

131

64. Jaccoud D, P. K., Feinstein D, Kilian A, (2001). Diversity arrays: a solid state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Research 29: 7ps.

65. Kaga, A. and M. Ishimoto (1998), “Genetic localization of a bruchid resistance gene and its relationship to insecticidal cyclopeptide alkaloids, the vignatic acids, in mungbean (Vigna radiata L. Wilczek)”, Molecular and General Genetics MGG 258(4): 378-384.

66. Kang, Y. J., Sue K. Kim, Moon Young Kim, Puji Lestari, Kil Hyun Kim, Bo-Keun Ha, Tae Hwan Jun, Won Joo Hwang, Taeyoung Lee, Jayern Lee, Shim, Young Yoon, Young Eun Jang, Kwang Soo Han, Puntaree Taeprayoon, Na Yoon, Prakit Somta, Patcharin Tanya, Kwang Soo Kim, J.-G. Gwag and e. al. (2014). "Genome sequence of mungbean and insights into evolution within Vigna species." Nature Communications 5: 5443. doi: 5410.1038/ncomms6443.

67. Karthikeyan, A., V.G. Shobhana, M. Sudha, M. Raveendran, N. Senthil, M. Pandiyan & P. Nagarajan (2014), “Mungbean yellow mosaic virus (MYMV): a threat to green gram (Vigna radiata) production in Asia”, International Journal of Pest Management, 60:4, 314-324, DOI: 10.1080/09670874.2014.982230).

loci controlling powdery mildew resistance trait

68. Kasettranan, W., P. Somta and P. Srinives (2010), “Mapping of quantitative in mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”, Journal of Crop Science and Biotechnology 13(3): 155-161.

69. Keatinge J, Easdown W, Y. Chadha and Shanmugasundaram S. (2011), “Overcoming chronicmalnutrition in a future warming world: the key importance of mungbean and vegetable soybean”, Euphytica 80: 129- 141.

70. Kilian, A., E. Huttner, P. Wenzl, D. Jaccoud, J. Carling, V. Caig, M. Evers, K. Heller-Uszynska, C. Cayla and S. Patarapuwadol (2005). The fast and the cheap: SNP and DArT-based whole genome profiling for

132

crop improvement. Proceedings of the international congress in the wake of the double helix: from the green revolution to the gene revolution, Italy.

71. Kitsanachandee, R., P. Somta, O. Chatchawankanphanich, K. P. Akhtar and et al. (2013), “Detaction of quantitative trait loci for mungbean yellow mosaic India virus (MYMIV) resistance in mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek) in India and Pakistan”, Breeding Sicience 63: 367- 373.

72. Kojima, Y., K. Ebana, S. Fukuoka, T. Nagamine and M. Kawase (2005). Development of an RFLP-based rice diversity research set of germplasm. Breeding Science 55(4): 431-440.

73. Lakhanpaul, S., S. Chadha and K. Bhat (2000), “Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis in Indian mung bean (Vigna radiata (L.) Wilczek) cultivars”, Genetica 109(3): 227-234.

74. Lambrides, C. J. and I. D. Godwin (2006), Mungbean, In: Chittarajan,

K., Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants 3: 69-90.

75. Lambrides, C.J. and I.D. Godwin (2007), School of Land and Food Sciences, Plant mprovement Group, The University of Queensland, St Lucia, QLD 4072, Australia (chapter mungbeans).

76. Lander ES and Botstein D. (1989), “Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps”, Genetics 121(1):185–199.

77. Langmead, B. and Salzberg, S.L. (2012), “Fast gapped-read alignment

with Bowtie 2”, Nat.Methods 9: 357–359.

78. Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. (2007), “Clustal W and Clustal X version 2.0”, Bioinformatics 23: 2947-2948.

79. Larter E.N., Ikonen H. (1977), “Number of plants necessary to recover a

trait”, Crop Science 17, 667–668.

133

80. Lawn, R. and G. Rebetzke (2006), “Variation among Australian accessions of the wild mungbean (Vigna radiata ssp. sublobata) for traits of agronomic, adaptive, or taxonomic interest”, Crop and Pasture Science 57(1): 119-132.

81. Li, H. et al. (2009), “The sequence alignment/map format and

SAMtools”, Bioinformatics 25, 2078–2079.

82. Li, H., G. Ye and J. Wang (2007), “A modified algorithm for the improvement of composite interval mapping”, Genetics 175:361-374.

83. Mace ES, Xia L, Jordan DR, Halloran K, Parh DK, Huttner E, Wenzel P and Kilian A (2008), “DArT markers: diversity analyses and mapping in Sorghum bicolor”, BMC Genetics 9: 26-36.

84. Malik, P. S., V. Kumar, B. Bagewadi and S. K. Mukherjee (2005), “Interaction between coat protein and replication initiation protein of Mung bean yellow mosaic India virus might lead to control of viral DNA replication”, Virology 337(2): 273-283.

85. Mamanova, L., A. J. Coffey, C. E. Scott, I. Kozarewa, E. H. Turner, A. Kumar, E. Howard, J. Shendure and D. J. Turner (2010), “Target- enrichment strategies for next-generation sequencing”, Nature methods 7(2): 111-118.

86. Mandal, B., A. Varma and V. G. Malathi (1997), “Systemic Infection of Vigna mungo Using the Cloned DNAs of the Blackgram Isolate of Munghean Yellow Mosaic Geminivirus through Agroinoculation and Transmission of the Progeny Virus hy Whiteflies”, Jounral of Phytopathology 145: 505-510.

87. Manjunath, B., Neetha Jayamm, V. Muniyappa and H.A. Prameela (2013), “Status of Yellow Mosaic Virus and Whitefly Bemisia Tabaci Biotypes on Mungbean in Southern Karnataka”, Legume Research - An International Journal 36(1): 62-66.

88. Menancio-Hautea, D., C. Fatokun, L. Kumar, D. Danesh and N. Young (1993), “Comparative genome analysis of mungbean (Vigna radiata L.

134

Wilczek) and cowpea (V. unguiculata L. Walpers) using RFLP mapping data”, Theoretical and Applied Genetics 86(7): 797-810.

89. Metzker, M.L. (2009), “Sequencing technologies-the next generation”,

Nature Reviews Genetics 11(1): 31- 46.

90. Moe, K. T., J. W. Chung, Y. I. Cho, J. K. Moon, J. H. Ku, J. K. Jung, J. Lee and Y. J. Park (2011), “Sequence information on simple sequence repeats and single nucleotide polymorphisms through transcriptome analysis of mungbean”, Journal of integrative plant biology 53(1): 63- 73.

91. Mogotsi, K.K. (2006), Vigna radiata (L.) R. Wilczek, In: Brink, M. & Belay, G. (Editors). PROTA 1: Cereals and pulses/Céréales et légumes secs. [CD-Rom]. PROTA, Wageningen, Netherlands.

92. Mubin, M., Amin, I., Amrao, L., Briddon, R.W. and Mansoor, S. (2010), “The hypersensitive response induced by the V2 protein of a monopartite begomovirus is countered by the C2 protein”, Molecular Plant Pathology 11(2): 245-254.

93. Nair RM, Schafleitner R, Kenyon L, Srinivasan R, Easdown W, Ebert AW and Hanson P. (2012), “Genetic improvement of mungbean”, SABRAO Jounral of Breeding and Genetics 44: 177-190.

94. Nair R.M., R.Y. Yang, W.J. Easdown, D. Thavarajah, J. A. Hughes and J.D. Keatinge (2014), “Biofortification of mungbean (Vigna radiate L.) as a whole food to enhance human health”, Journal of the Science of Food and Agriculture.93, 1805-1815.

95. Nariani, T. (1960), “Yellow mosaic of Mung (Phaseolus aureus L.)”,

Indian Phytopathology 13(1): 24-29.

96. Nash, T. E., Dallas, M.B., Reyes, M.I., Buhrman, G.K., Ascencio- Ibanez, J.T. and Hanley-Bowdoin, L. (2011), “Functional Analysis of a Novel Motif Conserved across Geminivirus Rep Proteins”, Journal of Virology 85(3): 1182-1192.

135

97. Nei M. and Li W.H. (1979), Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction and nucleases, Proceedings of the National Academy of Sciences 76: 5269-5273.

98. Nei, M. (1978), “Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals”, Genetic 89(3): 583-590.

99. Nguyen Nien Chau, Michael Böhme and Ina Pinker (2012), Plant Genetic Resources in Vietnam: Current Situation of Conservation and Utilization. Conference on International Research on Food Security, Natural Resource, Tropentag 2012, Göttingen, Germany.

100. Paillard S, Schnurbusch T, Winzeler M, Messmer M, Sourdille P, Abderhalden O, Keller B, Schachermayr G. (2003), “An integrative genetic linkage map of winter wheat (Triticum aestivum L.), Theoretical and Applied Genetics 107:1235–1242.

101. Pasumarthy, K. K., S. K. Mukherjee and N. R. Choudhury (2011), “The presence of tomato leaf curl Kerala virus AC3 protein enhances viral DNA replication and modulates virus induced gene-silencing mechanism in tomato plants”, Virology journal 8(1): 1-14

102. Paterson A.H. (1996), Chapter 3: Making genetic mapping, In: GenomeMapping in Plants, Academic Press ; Austin, TX : R.G. Landes Co.,c1996, San Diego, Calif, pp. 23-39.

103. Pearson, M. N. (1981), “A mosaic disease of mung bean in Papua New

Guinea”, Australasian Plant Pathology 2: 31.

104. Rashid, M. H., M. Sazzadul Aktar, Ismail Hossain, M. Mahbubur Rahmam, M. Rashed Hasnat and R. Nair (2013), “Effect of dates of sowing on incidence and severity of Mungbean Yellow Mosaic Virus and Cercospora Leaf spot of mungbean”, International Journal of Advancements in Research and Technology 2(9): 96-105.

105. Rathi, Y. P. S. and Y.L. Nene (1974), “The additional host of mungbean

yellow mosaic virus”, Indian Phytopathol 27: 429-430.

136

106. Reddy, K. (2009), A New Mutant for Yellow Mosaic Virus Resistance in Mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek) Variety SML-668 by Recurrent Gamma-ray Irradiation, Induced Plant Mutation in the Genomics Era, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome: 361- 362.

107. Risterucci A-M, Hippolyte I, Perrier X, Xia L, Caig V, Evers M, Huttner E, Kilian A and Glaszmann J-C (2009), “Development and assessment of diversity arrays technology for high throughput DNA analyses in Musa”, Theoretical and Applied Genetics 119: 1093–1103.

108. Sadiq, M. S., G. Khattak, M. Saleem and G. Sarwar (1999), “Exotic mungbean (Vigna radiata L. Wilczek) germplasm: Its utilization through conventional breeding approach”, Tropical Agricultural Research and Extension 2(1): 4-6.

109. Saleem, M., W. A. A. Haris and I. A. Malik (1998), “Inheritance of yellow mosaic virus in mungbean (Vigna radiata L. Wilczek)”, Pakistan Journal of Phytopathology 1: 30-32.

110. Sanger, F., S. Nicklen and A. R. Coulson (1977), DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proceedings of the National Academy of Sciences 74(12): 5463-5467.

111. Sangiri, C., A. Kaga, N. Tomooka, D. Vaughan and P. Srinives (2008), “Genetic diversity of the mungbean (Vigna radiata, Leguminosae) genepool on the basis of microsatellite analysis”, Australian Journal of Botany 55(8): 837-847.

112. SantaLucia, J. (1998), “A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics”, Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 94(4): 1460-1465. http://www.pnas.org/content/95/4/1460.full

113. Sarkar, S., S. Ghosh, M. Chatterjee, P. Das, T. Lahari, A. Maji, N. Mondal, K. K. Pradhan and S. Bhattacharyya (2011), “Molecular markers linked with bruchid resistance in Vigna radiata var. sublobata

137

and their validation”, Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 20(2): 155-160.

114. Schneider, K. (2005), Mapping populations and principles of genetic

mapping, Wiley VCH, Weinheim.

115. Sehrawat, N. and M. Yadav (2014), “Screening and cross compatibility of various Vigna species for yellow mosaic virus resistance”, Journal of Innovative Biology 1(1): 31-34.

116. Selvi, R., A. Muthiah, N. Manivannan, T. Raveendran, A. Manickam and R. Samiyappan (2006), “Tagging of RAPD marker for MYMV resistance in mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”, Asian Jounral of Plant Science 5: 277-280.

117. Shad, N., S. M. Mughal, K. Farooq and M. Bashir (2006), “Evaluation of mungbean germplasm for resistance against mungbean yellow mosaic begomovirus”, Pakistan Journal of Botany 38(2): 449-457.

118. Shanmugasundaram, S., J.D.H Keatinge and Jacquelin d’Arros Hughes (2010), The Mungbean Transformation: Diversifying Crops, Defeating in Agricultural Development: A Malnutrition, Proven Successes

technical compendium to millions fed, Washington, USA.

119. Sharma, P., R. K. Gaur and M. Ikegami (2011), “Subcellular localization of V2 protein of Tomato leaf curl Java virus by using green fluorescent protein and yeast hybrid system”, Protoplasma 248(2): 281-288.

120. Shivanathan, P. (1983), The epidemiology of three diseases caused by whitefly-borne pathogens, Plant virus epidemiology, The spread and control of insect-borne viruses: 323-330.

121. Singh, D. (1987), Current status of mungbean yellow mosaic virus resistance breeding: Mungbean, Proceedings of the Second International Symposium, Bangkok, Thailand.

122. Singh, G., S. Singh and O. Sheoran (2013), “Inheritance of mungbean yellow mosaic virus (MYMV) resistance in mungbean [Vigna radiata

138

(L.) Wilczek]”, Legume Research-An International Journal 36(2): 131- 137.

123. Singh, G., Y. Sharma, S. Shanmugasundaram, S. Shih and S. Green, (2006b), Status of mungbean yellow mosaic virus resistance breeding, Improving Income and Nutrition by Incorporating Mungbean in Cereal Fallows in the Indo-Gangetic Plains of South Asia DFID Mungbean Project for 2002–2004: 204.

124. Somta, P. and P. Srinives (2007), “Genome research in mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek) and blackgram (V. mungo (L.) Hepper)”, Science Asia 33(1): 69-74.

125. Somta, P., W. Sommanas and P. Srinives (2009), “Molecular diversity assessment of AVRDC-The World Vegetable Center elite-parental mungbeans”, Breeding science 59(2): 149-157.

126. Srivastava, A. and Prajapati, R. (2012), “Influence of Weather Parameters on Outbreak of Mungbean Yellow Mosaic Virus in Black Gram (Vigna mungo L.) of Bundelkhand Zone of Central India, Journal of Agricultural Physics, 12(2), 143-151.

127. Srivastava, A. K. and R.K. Prajapati (2012), “Influence of Weather Parameters on Outbreak of Mungbean Yellow Mosaic Virus in Black Gram (Vigna mungo L.) of Bundelkhand Zone of Central India”, Journal of Agricultural Physics 12(2): 43-51.

128. Sudha, M., A. Karthikeyan, P. Anusuya, N. Ganesh, M. Pandiyan, N. Senthil, M. Raveendran, P. Nagarajan and K. Angappan (2013a), “Inheritance of Resistance to Mungbean Yellow Mosaic Virus (MYMV) in Inter and Intra Specific Crosses of Mungbean (Vigna radiata)”, American Journal of Plant Sciences 4: 19-24.

129. Sudha, M., A. Karthikeyan, P. Nagarajan, M. Raveendran, N. Senthil, M. Pandiyan, K. Angappan, J. Ramalingam, M. Bharathi and R. Rabindran (2013b), “Screening of mungbean (Vigna radiata) germplasm for

139

resistance to Mungbean yellow mosaic virus using agroinoculation”, Canadian Journal of Plant Pathology 35(3): 424-430.

130. Sunitha, S., G. Shanmugapriya, V. Balamani and K. Veluthambi (2013), “Mungbean yellow mosaic virus (MYMV) AC4 suppresses post- transcriptional gene silencing and an AC4 hairpin RNA gene reduces MYMV DNA accumulation in transgenic tobacco”, Virus genes 46(3): 496-504.

131. Tamura, K., G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski and S. Kumar (2013), “MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0”, Molecular biology and evolution 30(12): 2725-2729.

132. Tangphatsornruang, S., D. Sangsrakru,

J. Chanprasert, P. Uthaipaisanwong, T. Yoocha, N. Jomchai and S. Tragoonrung (2010), “The chloroplast genome sequence of mungbean (Vigna radiata) determined by high-throughput pyrosequencing: structural organization and phylogenetic relationships”, DNA research 17: 11-22.

133. Tangphatsornruang, S., P. Somta, P. Uthaipaisanwong, J. Chanprasert, D. Sangsrakru, W. Seehalak, W. Sommanas, S. Tragoonrung and P. Srinives (2009), “Characterization of microsatellites and gene contents from genome shotgun sequences of mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”, BMC Plant Biology 9(1): 137.

134. Tatikonda, L., S. P. Wani, S. Kannan, N. Beerelli, T. K. Sreedevi, D. A. Hoisington, P. Devi and R. K. Varshney (2009), “AFLP-based molecular characterization of an elite germplasm collection of Jatropha curcas L., a biofuel plant”, Plant Science 176(4): 505-513.

135. Thongmeearkom, P., K. Kittipakorn and P. Surin (1981), “Outbreak of mungbean yellow mosaic disease in Thailand” Thai Journal of Agricultural Science 14(2): 201-206.

136. Tinker N, Kilian A, Wight C, Heller-Uszynska K, Wenzl P, Rines H, Bjornstad A, Howarth C, Jannink J-L, Anderson J, Rossnagel B and et

140

al. (2009), “New DArT markers for oat provide enhanced map coverage and global germplasm characterization”, BMC Genomics 10: 39-60.

137. Tomooka, N., A. Kaga and D. Vaughan (2006), “The Asian Vigna (Vigna subgenus Ceratotropis) biodiversity and evolution”, Plant genome: biodiversity and evolution 1(Part C): 87-126.

138. Tsai W. S., Shih S. L., Rauf A., Safitri R., Hidayati N., Huyen B. T. T., Kenyon L. (2013), “Genetic diversity of legume yellow mosaic begomoviruses in Indonesia and Vietnam”, Annals of Applied Biology 163: 367-377.

139. Tsai W.S., Shih S.L., Venkatesan S.G., Aquino M.U., Green S.K., Kenyon L., Jan, F.J. (2011), “Distribution and genetic diversity of begomoviruses infecting tomato and pepper plants in the Philippines”, Annals of Applied Biology 158: 275-287.

140. Van Os H, Stam P, Visser R, Van Eck H. (2005), “RECORD: a novel method for ordering loci on a genetic linkage map”, Theoretical and Applied Genetics 112:30–40

141. Van, K., Y. J. Kang, K.-S. Han, Y.-H. Lee, J.-G. Gwag, J.-K. Moon and S.-H. Lee (2013), “Genome-wide SNP discovery in mungbean by Illumina HiSeq”, Theoretical and Applied Genetics 126(8): 2017-2027.

142. Vanitharani, R., Chellappan, P. and Fauquet, C.M.

(2005), Geminiviruses and RNA silencing, Trends in Plant Science 10: 144-151.

143. Varma, A. (1992), MYMV transmission and its control in India, Mungbean yellow mosaic disease: proceedings of an international workshop, Bangkok 1991, AVRDC.

144. Varshney R.K., Graner A. and Sorrells M.E. (2005), “Genic microsatellite markers in plants: features and applications”, Trends Biotechnology 23: 48-55.

145. Varshney, R. K., S. N. Nayak, G. D. May and S. A. Jackson (2009b), “Next-generation sequencing technologies and their implications for crop genetics and breeding”, Trends in biotechnology 27(9): 522-530.

141

146. Varshney, R. K., T. J. Close, N. K. Singh, D. A. Hoisington and D. R. Cook (2009a), “Orphan legume crops enter the genomics era”, Current opinion in plant biology 12(2): 202-210.

147. Verdcourt, B. (1970), Studies in the Leguminosae-Papilionoideae, In:

Flora of Tropical East Africa IV. Kew Bull. 24: 507-576.

148. Vu, T. T. H., R. J. Lawn, L. M. Bielig, S. J. Molnar, L. Xia and A. Kilian initial evaluation of diversity array

(2012), “Development and technology for soybean and mungbean”, Euphytica 186: 741-754.

149. Wang, X. Q., Kwon, X.W., Park, Y.J. (2012), “Comparison of Population Genetic Structures between Asian and American Mungbean Accessions Using SSR Markers”, Journal of Agricultural Science 4(9): 150-158.

150. Weinberger K. (2003), “Impact analysis on mungbean research in south and southeast Asia”, AVRDC Processing No 9991175. Shanhua, Taiwan

151. Wicker, T., E. Schlagenhauf, A. Graner, T. J. Close, B. Keller and N. Stein (2006), “454 sequencing put to the test using the complex genome of barley”, BMC genomics 7(1): 275.

152. Xia L, Peng K, Yang S, Wenzl P, Carmen de Vicente M, Fregene M and Kilian A (2005), “DArT for high-throughput genotyping of cassava (Manihot esculenta) and its wild relatives”, Theoretical and Applied Genetics 110: 1092–1098.

153. Yang S, Pang W, Ash G, Harper J, Carling J, Wensl P, Hutter E, Zong X and Kilian A (2006), “Low level of genetic diversity in cultivated pigeonpea compared to its wild relatives is revealed by diversity array technology”, Theoretical Applied Genetics 113: 585-595.

154. Yang, S.Y., Saxena, R.K., Kulwal, P.L., Ash, G.J., Dubey, A., Harper, J.D., Upadhyaya, H.D., Gothalwal, R., Kilian, A. and Varshney, R.K., (2011), “The first genetic map of pigeon pea based on diversity arrays technology (DArT) markers”, Journal of genetics, 90(1), pp.103-109.

142

155. Young, N., L. Kumar, D. Menancio-Hautea, D. Danesh, N. Talekar, S. Shanmugasundarum and D. Kim (1992), “RFLP mapping of a major bruchid resistance gene in mungbean (Vigna radiata, L. Wilczek)”, Theoretical and Applied Genetics 84(7-8): 839-844.

156. Zeng ZB. (1994), “Precision mapping of quantitative trait loci”, Genetics

136(4):1457–1468.

157. Zhang, M., D. Wang, Z. Zheng, M. Humphry and C. Liu (2008),

“Development of PCR‐based markers for a major locus conferring powdery mildew resistance in mungbean (Vigna radiata)”, Plant breeding 127(4): 429-432.

158. Zhao D., Cheng X. Z., Wang L. X., Wang S. H. and Ma Y. L. (2010), “Construction of mungbean genetic linkage map”, Acta Agronomica Sinica 36: 932-939.

143

PHỤ LỤC

144

Phụ lục 1:

Dánh sách đậu xanh đánh giá bệnh khảm vàng tại Phú Yên

Phụ lục 2:

Danh sách đậu xanh đánh giá đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị DArT

Phụ lục 3:

Bảng chi tiết trình tự và số đăng ký trên Genbank của ADN-A và

AND-B của begomovirus gây hại trên cây họ đậu được sử dụng để

thiết kế mồi chung, mồi đặc hiệu và xây dựng cây phát sinh loài

Phụ lục 4:

Kết quả kiểm tra một số mẫu đậu đỗ bằng PCR và ELISA

Phụ lục 5:

Kết quả đánh giá khả năng bệnh khảm vàng của các giống đậu xanh vụ

Hè năm 2012 và 2013

Phụ lục 6: Một số đặc điểm NSH của 98 nguồn gen đậu xanh đánh giá khả năng

kháng bệnh khảm vàng trên đồng ruộng

Phụ lục 7: Ma trận khác biệt di truyền của 54 nguồn gen đậu xanh sử dụng hệ số

DICE

Phụ lục 8:

Kết quả đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng trên quần thể

đậu xanh nghiên cứu

Phụ lục 9:

Các đoạn trình tự chứa các SNP đề xuất đánh giá

Phụ lục 10: Các vùng QTL xác định được bằng phần mền QIL icmapping

Phụ lục 11: Các vùng QTL xác định trên Qgen bằng phân tích SMR

Phụ lục 12: Các vùng QTL xác định trên Qgen bằng phân tích CIM

Phụ lục 13: Hình ảnh phân tích kiểu gen của quần thể lập bản đồ (11 NST) trên

Qgen sử dụng phân tích SMR và CIM

MỤC LỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Dánh sách đậu xanh đánh giá bệnh khảm vàng tại Phú Yên

TT SĐK/ĐKT

Tên giống

Nguồn gốc

Buôn Ma Thuột, Đắc Lắc Kon Tum Tân Ba, Sông Bé Biên Hòa, Đồng Nai Đồng Nai Ninh Hải, Ninh Thuận Ninh Sơn, Ninh Thuận

Xanh Buôn Mê Thuật Sẻ Kon Tum Mỡ Tân Ba Sông Bé Mỡ Biên Hòa Mỡ Đồng Nai Mỡ Ninh Hải Ninh Thuận Mỡ Ninh Sơn Ninh Thuận Xanh Nho Quan Ninh Bình Nho Quan Ninh Bình Mốc Hà Tây Tằm Nghĩa Đàn VC 3541A VC 3890B VC 6372 (45-8) VO 2253 Đậu xanh lòng xanh Đậu xanh Mường La Đậu xanh Đậu xanh mỡ Đậu xanh Đậu xanh mỡ Đậu xanh vỏ mốc Đậu xanh Đậu xanh mỡ Đậu xanh Đậu xanh Đậu xanh Đậu xanh Đậu xanh Đậu xanh địa phương Đậu tằm Đậu xanh Đậu xanh mỡ Đậu xanh

Hà Tây Nghĩa Đàn, Nghệ An AVRDC AVRDC AVRDC AVRDC Định Hóa, Thái Nguyên TX Sơn la, Sơn La Tuyên hoá, Quảng Bình Đông Hà, Quảng Trị Phú Lộc, Thừa Thiên Huế Quảng Xương, Thanh Hoá Gia Lộc, Hải Dương Tây Ninh Lộc Thủy, Phú Lộc, Thừa Thiên Huế Chiêm Hóa, Tuyên Quang Vị Xuyên, Hà Giang Vị Xuyên, Hà Giang Na Rì, Bắc Cạn Sơn Động, Bắc Giang Noong Luong, Điện Biên, Lai Châu Thanh Hóa Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hòa Khánh Đông, Khánh Vĩnh, K.Hòa Hàm Thuận Bắc, Bình Thuận

3222 3225 3232 3233 3234 3235 3236 3247 3253 3254 4247 4248 4292 4310 4335 4407 4450 4461 4486 4503 5613 6493 6494 6495 6497 6499 6502 6507 6691 7490 8285 8286 8292

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

Vụ Xuân 2012

Tên giống

Nguồn gốc

VC 3960-88 Đỗ xanh quả dài NM 92 1791 CM-23 NM 94 03004746 Thúa kheo

TT SĐK/ĐKT 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

AVRDC Bắc Giang AVRDC Ấn Độ Thái Lan AVRDC Philippine Khau Tinh, Nà Hang, Tuyên Quang Bắc Mạ, Quỳnh Nhai, Sơn La Hoài Đức, Hà Nội Hợp Thành, Cao Lộc, Lạng Sơn Hợp Thành, Cao Lộc, Lạng Sơn Xan Viên, ĐÌnh Lập, Lạng Sơn Phú Yên Phú Yên Phú Yên AVRDC AVRDC

8493 8499 8923 9661 9665 12195 12762 12772 14030 Má thúa kheo T6586 T8568 T8569 T8571 12200

Đậu xanh da tre Đỗ xanh hạt nhỏ Thúa dìn Thúa xanh ĐX 208 Đậu sẻ ĐX22 ML267 KPS2 (Đ/c nhiễm chuẩn)

3199

Hòa An, Cao Bằng

3200

Xanh Quảng Hòa Cao Bằng Quảng Hòa, Cao Bằng Thua kheo Hòa An Cao Bằng Chi Lăng, Lạng Sơn Tằm Chi Lăng Lạng Sơn Hữu Lũng, Lạng Sơn Mốc Hữu Lũng Lạng Sơn Đại Kim, Phù Yên, Bắc Thái Mốc Bắc Thái Bắc Thái Mỡ Bắc Thái Xanh Bạch Thông Bắc Thái Bắc Thái Hà Bắc Tằm Hà Bắc Đà Nẵng Xanh Đà Nẵng Quảng Ngãi Mỡ Quảng Ngãi Quảng Ngãi Mốc Quảng Ngãi Quảng Ngãi Sẻ sơn Tỉnh Quảng Ngãi Khánh Hòa Mốc Khánh Hòa Khánh Hòa Mỡ Khánh Hòa Cam Ranh, Khánh Hòa Mỡ Cam Ranh Khánh Hòa Xanh Vạn Linh khánh Hòa Vạn Ninh, Khánh Hòa

3201 3202 3203 3204 3205 3206 3208 3209 3210 3211 3212 3213 3214 3215

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Vụ Xuân 2013

Tên giống

Nguồn gốc

Bình Định Bình Định Phú Yên Phú Yên Gia Lai Gia Lai Kon Tum Lâm Đồng Đắc Lắc Đắc Lắc Đắc Lắc Sông Bé Tân Uyên, Sông Bé Hòa Bình Hà Tây Hà Nội Nghệ An Hà Bắc

TT SĐK/ĐKT 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 39 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49

Chí Linh, Hải Dương TX Tuyên Quang, Tuyên Quang Hàm Yên, Tuyên Quang Phú Lương, Thái Nguyên Định Hóa, Thái Nguyên Định Hóa, Thái Nguyên Định Hóa, Thái Nguyên Định Hóa, Thái Nguyên Định Hóa, Thái Nguyên Định Hoá, Thái Nguyên AVRDC AVRDC AVRDC AVRDC

3216 3217 3218 3219 3220 3221 3224 3226 3227 3228 3229 3230 3231 3237 3238 3239 3246 3252 3255 3256 4315 4321 4325 4328 4329 4332 4342 4343 4347 8493 8923 12195 12200

Sẻ Bình Định Xanh Bình Định Mốc Phú Yên Mỡ Phú Yên Mỡ Gia Lai Datre Gia Lai Mỡ Kon Tum Xanh Lâm Đồng Xanh Đắc Lắc Mốc Đắc Lắc Xanh Sông Bé Mốc Sông Bé Mốc Tân Uyên Sông Bé Vỏ bạc Hòa Bình Trung Châu Hà Tây Tiêu Hà Nội Xanh Nghệ An Mốc Lục Nam Xanh hạt nhỏ Tuyên Quang Tân Hồng, Yên Sơn, Tuyên Quang Xanh ruột vàng Chí Linh Đậu mốc vỏ bạc TQ Đậu xanh hạt tiêu Tẩu gio Khua kheo Đậu xanh mỡ Đậu xanh mỡ Đỗ xanh hạt mốc Đậu xanh mốc Đậu xanh VC 3960-88 NM 92 NM 94 KPS2 (Đ/c nhiễm chuẩn)

Phụ lục 2: Danh sách đậu xanh đánh giá đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị DArT

TT SĐK

Tên giống

Nguồn gốc thu thập

TT

SĐK

3222

Xanh Buôn Mê Thuật

Đak Lak, Việt Nam

6691

Kon Tum, Đak Lack, VN Sông Bé, Bình Dương Biên Hòa, Đồng Nai, VN Đồng Nai, VN Ninh Thuận, VN Ninh Thuận, VN

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

3225 Sẻ Kon Tum 3232 Mỡ Tân Ba, Sông Bé 3233 Mỡ Biên Hòa 3234 Mỡ Đồng Nai 3235 Mỡ Ninh Hải, Ninh Thuận 3236 Mỡ Ninh Sơn, Ninh Thuận 3247 4248 4291 4335 4342

Xanh Nho Quan, Ninh Bình Ninh Bình, VN VC 3890B VC 6372A Đậu xanh xanh lòng Đỗ xanh hạt mốc

AVRDC AVRDC Thái Nguyên, VN Thái Nguyên, VN

49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59

12199 V02343 A-G V02546 B-G V02709 B-G V02802 B-G V03549 A-G V04718 A-G VI059229 VI060037 VC2778A

Nguồn gốc thu thập Lai Châu , VN (lọc từ số 27) Phú Yên AVRDC AVRDC AVRDC AVRDC AVRDC AVRDC AVRDC AVRDC AVRDC AVRDC

4407

Đậu xanh Mường La

Sơn La, VN

VI032156

AVRDC

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

4450 4461 4473 4503 5619 6493 6494 6495 6497 6499 6502 6507 6688

Đậu xanh Đậu xanh mỡ Đậu xanh mốc Đậu xanh mỡ Đậu xanh Đậu xanh Đậu xanh mỡ Đậu xanh Đậu xanh Đậu xanh Đậu xanh Đậu xanh Đậu hạt tiêu

Quảng Bình, VN Quảng Trị, VN Quảng Trị, VN Thanh Hóa Hải Dương Tây Ninh Huế Tuyên Quang Hà Giang Hà Giang Bắc Cạn Bắc Giang Sơn La

61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

VC6370-92 VC6371-94 AusTRC324270 AusTRC324348 AusTRC324383 AusTRC321818 M 773 OAEM 58-62 98/27-9 VC2768A VC2778A 3511-9 Berken

Tên giống Đậu xanh không lông ĐX22 KPS1 (S) KPS2 V. radiata var. sublobata NM 92 NM 94

AVRDC AVRDC Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia

Phụ lục 2: Danh sách đậu xanh đánh giá đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị DArT

Nguồn gốc thu thập Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia Australia

Tên giống TT SĐK Đậu xanh địa phương 6691 27 Đậu xanh địa phương 6694 28 Thúa xẻng 7254 29 Đậu tằm 7490 30 Đậu xanh 8285 31 Đậu xanh mỡ 8286 32 Đậu xanh 8292 33 U443-1 8487 34 U755 8489 35 Đỗ xanh quả dài 8499 36 1791 9661 37 CO-1 9662 38 9665 39 CM-23 12197 CM-19 40 12203 Son đét khiêu 41 12433 Má thúa kheo 42 12434 Đậu xanh 43 3019879 12757 44 12762 45 3004746 12772 Thúa kheo 46 12763 47

3004754

Nguồn gốc thu thập Lai Châu Lai Châu Bắc Giang Thanh Hóa Khánh Hòa Khánh Hòa Bình Thuận Nga Nga Bắc Giang Ấn Độ Ấn Độ Thái Lan Thái Lan An Giang Điện Biên Nghệ An Pakistan Philippine Tuyên Quang Philippine

TT 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94

SĐK Celera Crystal Delta Emerald Green Diamond Satin II White Gold Yellow Sun M07167 M07213 M08019 M08154 M09245 M09350 M10237 M10242 M10285 M10290 M10293 M10440 3254

Tên giống V. mungo Tằm Nghĩa Đàn Nghệ An, Việt Nam

Phụ lục 3: Bảng chi tiết trình tự và số đăng ký trên Genbamk của ADN-a của Begomovirus gây hại trên cây họ đậu được sử dụng để thiết kế mồi chung, mồi đặc hiệu và xây dựng cây phát sinh loài

Chủng/loài virus

Ký chủ

Vị trí thu thập

Ký hiệu

ADN-A

ADN-B

Tài liệu tham khảo

African cassava mosaic virus

Glycine max

Nigeria

ACMV-Ng

EU685325

Alabi và cs., 2008

Bean calico mosaic virus

Phaseolus vulgaris

Mexico / Sonora

BCaMV-Mx

AF110189

AF110190

Brown và cs., 1999

Bean dwarf mosaic virus

Bean

Colombia

BDMV-Co

M88179

M88180

Gilbertson và cs., 1991

Bean golden mosaic virus

G. max

Brazil / Goias state

BGMV-Br

FJ665283

Fernandes và cs., 2009

Bean golden mosaic virus

P. vulgaris

Brazil / Goias state

BGMV-Br:Fb

M88686

M88687

Gilbertson và cs., 1993

Bean golden yellow mosaic virus

Bean

USA / Florida

BGYMV-USA

DQ119824

DQ119825

Blair và cs., 1995

Bean golden yellow mosaic virus

Bean

Guatemala

BGYMV-Gu

M91604

M91605

Gilbertson và cs., 1991

Cowpea golden mosaic virus

Unknown

Nigeria / Nsukka

CoGMV-Ng

AF029217

Dolichos yellow mosaic virus

Lablab purpureus

Bangladesh / Gazipur

DoYMV-Bg

AY271891

Horsegram yellow mosaic virus

M. uniflorum

India / Coimbatore

HgYMV-Id:Co

AJ627904

AJ627905

Barnabas và cs.,2010

Kudzu mosaic virus

Pueraria montana

Vietnam / Hoabinh

KuMV-Vn

DQ641690

DQ641691

Ha và cs., 2008

Kudzu mosaic virus

P. montana

China

KuMV-Cn

FJ539014

Wu,Z. and Zhang,J, 2008

Legume yellow mosaic India virus

V. radiata

Pakistan

LeYMV-Pk

AJ512498

Hameed và Robinson, 2004

Mungbean yellow mosaic India virus

V. mungo

India / New Delhi

MYMIV-Id:Bg

AF126406

AF142440

Pant và cs., 2001

Mungbean yellow mosaic India virus

V. radiata

Bangladesh

MYMIV-Bl:Mg

AF314145

Mungbean yellow mosaic India virus

V. radiata

India / Sriganganagar

MYMIV-Id:Sri:Mg

AF416742

AF416741

Mungbean yellow mosaic India virus

V. unguiculata

India / New Delhi

MYMIV-Id:Cp

AF481865

AF503580

Mungbean yellow mosaic India virus

G. max

India / Jabalpur

MYMIV-Id:Ja:Sb

AJ416349

AJ420331

Girish và Usha, 2005

Mungbean yellow mosaic India virus

G. max

Pakistan/NawabShah

MYMIV-Pk:Sb

AM992618

FM161881

Ilyas và cs., 2010

Mungbean yellow mosaic India virus

V. radiata

India/Akola

MYMIV-Id:Ako

AY271893

AY271894

Chủng/loài virus

Ký chủ

Vị trí thu thập

Ký hiệu

ADN-A

ADN-B

Tài liệu tham khảo

Mungbean yellow mosaic India virus

L. purpureus

India / Varanasi

MYMIV-Id:Var:Do

AY547317

DQ061273

Singh và cs., 2006

Mungbean yellow mosaic India virus

V. unguiculata

India/Varanasi

MYMV-Id:Var:Cp

AY618902

Mungbean yellow mosaic India virus

V. unguiculata

India / Gujarat

MYMIV-Id:Gu:Cp

AY937195

AY937196

John và cs., 2008

Mungbean yellow mosaic India virus

V. radiata

Pakistan / Faisalabad

MYMIV-Pk:Fai-Mg

FM208837

FM202439

Ilyas và cs., 2010

Mungbean yellow mosaic India virus

V. radiata

Pakistan/Muzaf

MYMIV-Pk:Muz-Mg

FM208839

FM958506

Ilyas và cs., 2010

Mungbean yellow mosaic India virus

V. unguiculata

Pakistan / Faisalabad

MYMIV-Pk:Fai-Cp

FM208840

FM202446

Ilyas và cs., 2010

Mungbean yellow mosaic India virus

V. radiata

Pakistan / Multan

MYMIV-Pk:Mul:Mg

FM955600

FM955603

Ilyas và cs., 2010

Mungbean yellow mosaic India virus

P. vulgaris

India / Palampur

MYMIV-Id:Pal:Fb

FN794200

FR714861

Mungbean yellow mosaic virus

V. radiata

Thái Lan

MYMV-Thai1

AB017341

Ikegami, 1998

Mungbean yellow mosaic virus

G. Max

India / Maharashtra

MYMV-Id:Sb

AF314530

Tsai và cs., 2000

Mungbean yellow mosaic virus

V. radiata

India/Tamil Nadu

MYMV-Id:Tm1

AJ132575

Karthikeyan và cs., 2004

Mungbean yellow mosaic virus

G. Max

India / Madurai

MYMV-Id:Mad-Sb

AJ421642

AJ582267

Girish và Usha, 2005

Mungbean yellow mosaic virus

G. Max

Pakistan/Islamabad

MYMV-Pk:Is-Sb

AY269991

Tsai và cs., 2003

Mungbean yellow mosaic virus

V. radiata

Cambodia/Ph-Penh

MYMV-Cam

AY271892

Tsai và Green, 2003

Mungbean yellow mosaic virus

V. radiata

India/Haryana

MYMV-Id:Har

AY271896

Tsai và Green, 2003

Mungbean yellow mosaic virus

Vigna radiata

Thái Lan

MYMV-Thai2

D14703

D14704

Morinaga và cs., 1993

Mungbean yellow mosaic virus

V. mungo

India / Tamil Nadu

MYMV-Id:Tm3

DQ400848

DQ400849

Rouhibakhsh và cs., 2008

Mungbean yellow mosaic virus

V. aconitifolia

India / Tamil Nadu

MYMV-Id-Tm2

DQ865201

DQ865202

Rajeswaran và Veluthambi, 2006

Mungbean yellow mosaic virus

Pakistan/Kundian

MYMV-Pk:Kun

FM242701

FM242702

Ilyas,M. và cs., 2010

Rhynchosia capitata

Mungbean yellow mosaic virus

Vigna mungo

India/New Delhi

MYMV-Id-Dl

JQ398669

JQ398670

Roy và cs., 2012

Mungbean yellow mosaic virus

V. aconitifolia

India / Tamil Nadu

MYMV-Id:Tm3

DQ865203

Mungbean yellow mosaic virus

V. mungo

India / Tamil Nadu

MYMV-Id:Tm4:Bg

AJ439059

Karthikeyan và cs., 2004

Chủng/loài virus

Ký chủ

Vị trí thu thập

Ký hiệu

ADN-A

ADN-B

Tài liệu tham khảo

Mungbean yellow mosaic virus

V. mungo

India / Tamil Nadu

MYMV-Id:Tm5:Bg

AJ132574

Karthikeyan và cs., 2004

Mungbean yellow mosaic virus

V. mungo

India / Tamil Nadu

MYMV-Id:Tm6:Bg

AF262064

Karthikeyan và cs. 2004

Mungbean yellow mosaic virus

V. mungo

India / Tamil Nadu

MYMV-Id:Tm7:Bg

AJ439058

Karthikeyan và cs., 2004

Mungbean yellow mosaic virus

V. mungo

India / Tamil Nadu

MYMV-Id:Tm8:Bg

AJ439057

Karthikeyan và cs., 2004

Mungbean yellow mosaic virus

Pakistan / Mianwali

MYMV-Pk:Mia:Rc

FM955607

Ilyas và cs., 2010

Rhynchosia capitata

Okra mottle virus

Brazil / Goias state

OMoV-Br

FJ686695

FJ686696

Fernandes và cs., 2009

G. max

Papaya leaf curl virus

R. capitata

Pakistan / Mianwali

PaLCV-Pk

FM955601

Ilyas và cs., 2010

Rhynchosia yellow mosaic virus

R. minima

Pakistan / Lahore

RhYMV-Pk

AM999981

AM999982

Ilyas và cs., 2009

Sida golden mosaic virus

P. vulgaris

USA / Florida

SiGMV-USA

GQ357649

Durham và cs., 2010

Sida micrantha mosaic virus

G. max

Brazil / Goias state

SiMMV-Br

FJ686693

FJ686694

Fernandes và cs., 2009

Soybean blistering mosaic virus

G. max

Argentina

SbBMV-Ar

EF016486

Rodriguez và cs., 2011

Soybean chlorotic blotch virus

G. max

Nigeria

SbCBV-Ng

GQ472985

GQ472986

Alabi và cs., 2010

Soybean crinkle leaf virus

Nhật Bản

SbCLV-Jp

AB050781

Samretwanich và cs., 2001

G. max

Soybean mild mottle virus

Nigeria / Oyo State

SbMMV-Ng

GQ472984

Alabi và cs., 2010

G. max

Tomato leaf curl Pakistan virus

G. max

Pakistan/NawabShah

ToLCPKV-Pk:Sb

AM948961

Ilyas và cs., 2010

Tomato yellow leaf curl China virus

P. vulgaris

China / Yunnan

TYLCCNV-Cn

DQ256460

Dong và cs., 2007

Tomato yellow leaf curl virus

Bean

Tunisia / Sahel region

ToYLCV-Tn

EF101929

Chouchane và cs., 2007

Tomato yellow leaf curl virus

V. unguiculata

China / Shanghai

ToYLCV-Cn

GU434143

Dai và cs., 2011

Tomato yellow spot virus

Bean

Argentina

ToYSV-Ar

FJ538207

Rodriguez và cs., 2011

Velvet bean severe mosaic virus

Mucuna pruriens

India / Lucknow

VeBSMV-Id:Luck

FN543425

FN543426

Zaim,M., và cs., 2011

Phụ lục 4: Kết quả kiểm tra một số mẫu đậu đỗ bằng PCR và ELISA

PCR

ELISA

STT

Cây

Triệu chứng

Địa điểm

Leg CP

MY-A

BCMV

PAL1v1978B/P AR1c715H +

Rep F1/R2

MYMV VN1

Đậu xanh

Khảm vàng

An Định, Phú Yên

MYMV VN2

Đậu xanh

Khảm vàng

Cầu Cây Cam, Tuy Yên, Phú Yên

MYMV VN3

Đậu xanh

Khảm vàng

Cầu Cây Cam, Tuy Yên, Phú Yên

MYMV VN4

Đậu xanh

Khảm vàng

Cầu Cây Cam, Tuy Yên, Phú Yên

MYMV VN5

Đậu xanh

Khảm vàng

Cầu Cây Cam, Tuy Yên, Phú Yên

MYMV VN6

Đậu xanh

Khảm vàng

Cầu Cây Cam, Tuy Yên, Phú Yên

MYMV VN7

Đậu xanh

Khảm vàng

An Nhơn, Phú Yên

MYMV VN8

Đậu xanh

Khảm vàng

Cầu Cây Cam, Tuy Yên, Phú Yên

MYMV VN9

Đậu xanh

Khảm vàng

Cầu Cây Cam, Tuy Yên, Phú Yên

MYMV VN10

Đậu xanh

Khảm vàng

Cầu Cây Cam, Tuy Yên, Phú Yên

MYMV VN11

Đậu xanh

Khảm vàng

Cầu Cây Cam, Tuy Yên, Phú Yên

MYMV VN12

Đậu xanh

Khảm vàng

Cầu Cây Cam, Tuy Yên, Phú Yên

MYMV VN13

Đậu xanh

Khảm vàng

Đập Đá, Bình Định

MYMV VN14

Đậu xanh

Khảm vàng

Đập Đá, Bình Định

MYMV VN15

Đậu xanh

Khảm vàng

Đập Đá, Bình Định

VN01

Đậu xanh

Khảm vàng

An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội

VN02

Đậu xanh

Khảm vàng

An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội

VN03

Đậu xanh đen

Khảm vàng

An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội

VN04

KPS2

Khảm vàng

An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội

VN05

Đậu xanh

Khảm vàng

Bắc Ninh

VNP9

Đậu đen

Khảm

Viện Nghiên cứu Rau quả, Hà Nôi

VNP38

Đậu xanh

Khảm vàng

Hưng Hà-Thái Bình

PCR

ELISA

STT

Cây

Triệu chứng

Địa điểm

Leg CP

MY-A

BCMV

PAL1v1978B/P AR1c715H

Rep F1/R2 +

VNP45

Đậu đũa

Khảm vàng

Lục Yên-Yên Bái

VNP69

Đậu đen

Khảm vàng

Lục Yên-Yên Bái

VNP82

Đậu cove

Cuốn lá

Hà Cối - Quảng Ninh

VNP83

Đậu cove

Khảm vàng

Hà Cối - Quảng Ninh

VNP85

Đậu đũa

Khảm vàng

Hà Cối - Quảng Ninh

VNP86

Đậu đũa

Khảm vàng

Hà Cối - Quảng Ninh

VNP140

Đậu xanh

Lá biến vàng

Phú Yên

VNP141

Đậu xanh

Lá biến vàng

Phú Yên

VNP142

Đậu xanh

Lá biến vàng

Phú Yên

VNP143

Đậu xanh

Lá biến vàng

Phú Yên

VNP206

Đậu đen

Khảm vàng

Mai Sơn-Sơn La

VNP208

Đậu xanh

Khảm vàng

Mai Sơn-Sơn La

VNP209

Đậu xanh

Khảm vàng

Mai Sơn-Sơn La

VNP222

Cây họ Đậu

Khảm nhăn

Yên Châu-Sơn La

VNP224

Cây họ Đậu

Khảm

Yên Châu-Sơn La

VNP551

Đậu dừa

Khảm vàng

Chợ Mới, Bắc Cạn

VNP6

Đậu xanh

khảm

Viện Nghiên cứu Rau quả, Hà Nôi

-

VNP7

Đậu xanh

khảm

Viện Nghiên cứu Rau quả, Hà Nôi

Địa điểm

Leg CP

MY-A

BCMV

PAL1v1978B/P AR1c715H

Rep F1/R2 -

VNP35

Đậu xanh

Khảm vàng

Đông Hưng-Thái Bình

khảm

VNP111

Đậu xanh

Nghi Kim-Nghi Lộc-Nghệ An

nhăn

VNP125

Đậu xanh

Nghi Kim-Nghi Lộc-Nghệ An

VNP225

Đậu xanh

khảm

Yên Châu-Sơn La

Phụ lục 5: Kết quả đánh giá khả năng bệnh khảm vàng của các giống đậu xanh Vụ Hè năm 2012 và 2013

No

ĐKT

SĐK

Tên giống

STDEV

Tỷ lệ bệnh

Phản ứng với bệnh

Chỉ số bệnh trung bình (55 ngày)

Ngày xuất hiện bệnh

Vụ Hè 2012

3222 Xanh Buôn Mê Thuật

14-18

100

4,73

1,55

3225 Sẻ Kon Tum

<14

100

6,00

3232 Mỡ Tân Ba Sông Bé

14-18

100

4,93

1,51

3233 Mỡ Biên Hòa

<14

100

6,00

3234 Mỡ Đồng Nai

<14

100

6,00

3235 Mỡ Ninh Hải Ninh Thuận

14-18

100

4,87

1,03

3236 Mỡ Ninh Sơn Ninh Thuận

100

6,00

<14 14-18

3247 Xanh Nho Quan Ninh Bình

100

6,00

14-18

3253 Mốc Hà Tây

100

6,00

<14

3254 Tằm Nghĩa Đàn

100

6,00

4247 VC 3541A

<14

100

6,00

4248 VC 3890B

100

5,33

0,42

4292 VC 6372 (45-8)

14-18

100 3,93

0,31

MR

4310 VO 2253

<14

100

5,93

0,12

4335 Đậu xanh lòng xanh

14-18

100

5,80

0,20

4407 Đậu xanh Mường La

<14

100

6,00

Phụ lục 5: Kết quả đánh giá khả năng bệnh khảm vàng của các giống đậu xanh Vụ Hè năm 2012 và 2013

No

ĐKT

SĐK

Tên giống

STDEV

Tỷ lệ bệnh

Phản ứng với bệnh

Chỉ số bệnh trung bình (55 ngày)

Ngày xuất hiện bệnh

4450 Đậu xanh

<14

100

6,00

4461 Đậu xanh mỡ

14-18

100

5,87

0,23

4486 Đậu xanh

100

5,93

0,12

<14 <14

4503 Đậu xanh mỡ

100

5,93

0,12

5613 Đậu xanh vỏ mốc

14-18

100

5,87

0,23

6493 Đậu xanh

14-18

100

5,33

0,12

6494 Đậu xanh mỡ

<14

100

5,93

0,12

6495 Đậu xanh

14-18

100

6,00

6497 Đậu xanh

<14

100

6,00

6499 Đậu xanh

14-18

100

6,00

6502 Đậu xanh

<14

100

6,00

6507 Đậu xanh

14-18

100

5,80

0,35

6691 Đậu xanh địa phương

14-18

100

5,80

0,35

7490 Đậu tằm

14-18

100

5,93

0,12

8285 Đậu xanh

<14

100

5,33

0,83

8286 Đậu xanh mỡ

14-18

100

5,33

0,83

8292 Đậu xanh

14-18

100

5,07

1,01

Phụ lục 5: Kết quả đánh giá khả năng bệnh khảm vàng của các giống đậu xanh Vụ Hè năm 2012 và 2013

No

ĐKT

SĐK

Tên giống

STDEV

Tỷ lệ bệnh

Phản ứng với bệnh

Chỉ số bệnh trung bình (55 ngày)

Ngày xuất hiện bệnh

8493 VC 3960-88

35-45

27 1,13

0,12

HR

8499 Đỗ xanh quả dài

14-18

100

6,00

8923 NM 92

35-45

67 1,89

0,53

HR

9661

1791

14-18

100

5,53

0,64

9665 CM-23

14-18

100

6,00

12195 NM 94

35-45

33 1,73

0,42

HR

12762 03004746

14-18

100

6,00

14-18

100

6,00

T3870

14-18

100

6,00

T6586

12772 Thúa kheo 14030 Má thúa kheo

Đậu xanh da tre

14-18

100

5,93

0,12

T8568

Đỗ xanh hạt nhỏ

14-18

100

5,80

0,20

T8569

Thúa dìn

14-18

100

5,93

0,12

T8571

Thúa xanh

14-18

100

4,67

0,31

ĐX 208

14-18

100

5,33

0,23

Đậu sẻ

14-18

100

5,14

0,29

ĐX22

14-18

100

6,00

ML267

19-23

100

5,87

0,23

Phụ lục 5: Kết quả đánh giá khả năng bệnh khảm vàng của các giống đậu xanh Vụ Hè năm 2012 và 2013

No

ĐKT

SĐK

Tên giống

STDEV

Tỷ lệ bệnh

Phản ứng với bệnh

Chỉ số bệnh trung bình (55 ngày)

Ngày xuất hiện bệnh

12200 KPS2 (Đ/c nhiễm chuẩn)

100

5,93

0,12

<14

Vụ Hè 2013

100

3199

Xanh Quảng Hòa Cao Bằng

<16

5,14

0,41

100

3200 Thua kheo Hòa An Cao Bằng

17-22

4,72

0,46

17-22

100

3201

Tằm Chi Lăng Lạng Sơn

5,00

0,08

17-22

100

3202

Mốc Hữu Lũng Lạng Sơn

5,00

0,25

17-22

3203

Mốc Bắc Thái

4,25

0,46

17-22

100

3204

Mỡ Bắc Thái

5,01

0,23

17-22

100

3205

Xanh Bạch Thông Bắc Thái

5,08

0,25

17-22

100

3206

Tằm Hà Bắc

5,06

0,05

17-22

100

3208

Xanh Đà Nẵng

4,39

0,50

<16

100

3209

Mỡ Quảng Ngãi

5,17

0,22

17-22

100

3210

Mốc Quảng Ngãi

4,61

0,21

17-22

100

3211

Sẻ sơn Tỉnh Quảng Ngãi

5,03

0,10

17-22

100

3212

Mốc Khánh Hòa

4,14

0,27

17-22

100

3213

Mỡ Khánh Hòa

4,87

0,30

17-22

100

3214 Mỡ Cam Ranh Khánh Hòa

4,78

0,21

Phụ lục 5: Kết quả đánh giá khả năng bệnh khảm vàng của các giống đậu xanh Vụ Hè năm 2012 và 2013

No

ĐKT

SĐK

Tên giống

STDEV

Tỷ lệ bệnh

Phản ứng với bệnh

Chỉ số bệnh trung bình (55 ngày)

Ngày xuất hiện bệnh

3215

Xanh Vạn Linh khánh Hòa

17-22

100

5,08

0,25

3216

Sẻ Bình Định

17-22

100

4,60

0,27

3217

Xanh Bình Định

<16

100

5,34

0,14

3218

Mốc Phú Yên

17-22

100

5,03

0,25

3219

Mỡ Phú Yên

17-22

100

5,00

0,33

3220

Mỡ Gia Lai

17-22

100

5,17

0,29

3221

Datre Gia Lai

17-22

100

5,22

0,17

3224

Mỡ Kon Tum

17-22

100

4,11

0,21

3226

Xanh Lâm Đồng

17-22

100

4,73

0,50

3227

Xanh Đắc Lắc

17-22

93 3,78

0,77

MR

3228

Mốc Đắc Lắc

17-22

100

4,58

0,37

3229

Xanh Sông Bé

17-22

100

5,00

3230

Mốc Sông Bé

17-22

4,18

1,50

3231

Mốc Tân Uyên Sông Bé

17-22

4,04

0,28

3237

Vỏ bạc Hòa Bình

17-22

100

4,58

0,51

3238

Trung Châu Hà Tây

<16

100

5,14

0,29

3239

Tiêu Hà Nội

17-22

100

4,42

0,14

Phụ lục 5: Kết quả đánh giá khả năng bệnh khảm vàng của các giống đậu xanh Vụ Hè năm 2012 và 2013

No

ĐKT

SĐK

Tên giống

STDEV

Tỷ lệ bệnh

Phản ứng với bệnh

Chỉ số bệnh trung bình (55 ngày)

Ngày xuất hiện bệnh

3246

Xanh Nghệ An

17-22

100

5,02

0,30

3252

Mốc Lục Nam

17-22

100

4,29

0,13

3255

Xanh hạt nhỏ Tuyên Quang

17-22

100

5,00

0,29

3256

Xanh ruột vàng Chí Linh

17-22

100

5,03

0,10

4315

Đậu mốc vỏ bạc TQ

17-22

100

5,03

0,05

4321

Đậu xanh hạt tiêu

17-22

100

5,00

0,14

4325

Tẩu gio

<16

100

5,11

0,35

4328

Khua kheo

17-22

100

4,81

0,29

4329

Đậu xanh mỡ

17-22

82 3,72

0,59

MR

4332

Đậu xanh mỡ

17-22

100 3,83

0,60

MR

4342

Đỗ xanh hạt mốc

17-22

100

4,06

0,60

4343

Đậu xanh mốc

17-22

100

4,03

0,05

4347

Đậu xanh

17-22

100

4,15

0,49

8493

VC 3960-88

35-45

53 1,64

0,38

HR

8923

NM 92

35-45

38 1,22

0,19

HR

12195

NM 94

35-45

56 1,53

0,24

HR

<16

100

5,58

0,14

12200

KPS2 (Đ/c nhiễm chuẩn)

Phụ lục 6. Một số đặc điểm NSH của 98 nguồn gen đậu xanh đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đồng ruộng

STT ĐKT

SĐK

Tên giống

P100 (g)

NS (kg/ha)

Cao cây (cm)

Ngày ra hoa

Ngày thu hoạch

Dài quả (cm)

Số hạt/ quả

Số quả/ cây

Nhiễm MYM V

3233 Mỡ Biên Hòa

8.2

36.4

9.20

11.2

6.18

6495 Đậu xanh

6.8

37.6

8.80

11.4

4.83

3255 Xanh hạt nhỏ Tuyên Quang

7.3

37.8

9.72

11.2

4.95

3224 Mỡ Kon Tum

2.8

38.0

9.94

12.2

7.23

4328 Khua kheo

5.2

38.5

8.80

11.0

5.27

3201 Tằm Chi Lăng Lạng Sơn

3.7

41.4

9.34

10.8

5.35

ĐX 208

8.5

41.4

9.34

10.8

5.35

3222 Xanh Buôn Mê Thuật

10.0

41.4

9.96

11.0

6.87

3236 Mỡ Ninh Sơn Ninh Thuận

3.1

41.8

8.34

11.0

5.70

3219 Mỡ Phú Yên

5.0

43.0

8.24

10.0

6.09

8499 Đỗ xanh quả dài

3.9

44.2

9.88

10.8

6.28

3216

Sẻ Bình Định

4.5

44.8

11.10

12.0

5.40

7.4

8493 VC 3960-88

46.4

9.68

10.8

5.26

1,316 868 938 572 699 494 1,144 1,755 455 705 608 683 975 1,310

8.2

47.0

10.00

12.2

5.65

14 15

3232 Mỡ Tân Ba Sông Bé 4325 Tẩu gio

9.0

48.2

8.80

10.8

4.05 STT ĐKT

SĐK

Tên giống

P100 (g)

NS (kg/ha)

Cao cây (cm)

Ngày ra hoa

Ngày thu hoạch

Dài quả (cm)

Số hạt/ quả

Số quả/ cây

Nhiễm MYM V

910

3254 Tằm Nghĩa Đàn

7.7

48.2

10.30

10.8

4.95

6493 Đậu xanh

5.1

48.2

11.16

12.0

4.85

3200 Thua kheo Hòa An Cao Bằng

4.9

48.8

12.54

11.6

6.45

T8571

Thúa xanh

4.9

48.8

12.54

11.6

6.45

6494 Đậu xanh mỡ

5.5

49.6

9.04

10.8

6.05

3235 Mỡ Ninh Hải Ninh Thuận

9.1

49.6

9.26

10.8

5.20

3221 Datre Gia Lai

5.0

49.8

9.82

10.2

7.06

6691 Đậu xanh địa phương

6.5

50.4

9.34

11.4

5.69

3234 Mỡ Đồng Nai

7.9

50.8

8.90

11.8

6.29

3210 Mốc Quảng Ngãi

9.9

51.4

8.92

11.4

4.80

3247 Xanh Nho Quan Ninh Bình

13.4

51.6

7.36

10.8

3.49

3225

Sẻ Kon Tum

8.5

51.8

8.82

10.2

6.23

3237 Vỏ bạc Hòa Bình

3.5

52.0

9.68

10.6

5.15

4407 Đậu xanh Mường La

7.1

52.6

7.34

10.2

4.67

3203 Mốc Bắc Thái

957 692 845 845 839 1,190 832 978 1,359 1,255 1,177 1,258 439 783 722

4.7

53.6

10.64

11.2

5.90 STT ĐKT

SĐK

Tên giống

P100 (g)

NS (kg/ha)

Cao cây (cm)

Ngày ra hoa

Đậu xanh da tre

4.5

56.8

10.58

11.8

5.50

9.8

12195 NM 94

56.8

9.56

11.0

4.60

8292 Đậu xanh

2.9

56.8

11.76

10.6

5.40

4329 Đậu xanh mỡ

6.7

57.2

9.78

11.2

5.25

9.5

8923 NM 92

57.6

8.52

10.8

4.62

3253 Mốc Hà Tây

5.8

59.0

10.06

10.6

5.45

3220 Mỡ Gia Lai

9.5

59.2

9.24

10.0

4.55

4461 Đậu xanh mỡ

4.9

61.0

10.26

11.4

6.40

3205 Xanh Bạch Thông Bắc Thái

7.1

61.6

8.18

11.4

4.25

T8568

Đỗ xanh hạt nhỏ

6.9

61.6

8.18

11.6

4.25

3218 Mốc Phú Yên

1,047 858 1,138 1,225 677 677 1,151 384 920 1,105 775 1,001 822 793 793 1,011

7.7

64.6

9.90

12.4

4.55 STT ĐKT

SĐK

Tên giống

P100 (g)

NS (kg/ha)

Cao cây (cm)

Ngày ra hoa

Ngày thu hoạch

Dài quả (cm)

Số hạt/ quả

Số quả/ cây

Nhiễm MYM V

3209 Mỡ Quảng Ngãi

6.4

65.4

9.60

11.2

5.50

4342 Đỗ xanh hạt mốc

3.3

65.4

10.34

12.4

5.75

3239 Tiêu Hà Nội

6.3

67.4

11.60

14.0

5.15

12762 3004746

6.3

67.4

68.6

7.26

10.6

3.20

9661

1791

6.5

68.6

7.26

10.6

3.20

3204 Mỡ Bắc Thái

9.9

69.0

8.54

12.0

4.25

ML267

9.9

69.0

8.54

12.0

4.25

3213 Mỡ Khánh Hòa

11.3

69.6

8.46

10.4

4.40

4503 Đậu xanh mỡ

11.3

69.6

8.46

10.4

4.40

3227 Xanh Đắc Lắc

920 546 1,053 1,053 1,014 1,290 790 790 1,219 512 512 1,170 1,170 1,196 1,196 1,372

10.3

69.6

8.94

11.4

5.05 STT ĐKT

SĐK

Tên giống

P100 (g)

NS (kg/ha)

Cao cây (cm)

Ngày ra hoa

Sẻ sơn Tỉnh Quảng Ngãi

Thúa dìn

7.6

72.2

8.94

11.4

4.60

3212 Mốc Khánh Hòa

6.2

72.4

9.36

11.0

4.60

3228 Mốc Đắc Lắc

6.4

72.8

8.44

11.6

4.40

3208 Xanh Đà Nẵng

6.2

73.2

9.54

12.4

5.30

4486 Đậu xanh

6.1

73.2

9.60

12.4

5.50

3246 Xanh Nghệ An

7.2

73.4

11.10

13.2

4.95

12772 Thúa kheo

7.2

73.4

11.10

13.2

4.95

4343 Đậu xanh mốc

1,130 1,381 1,274 1,027 1,341 1,349 926 926 926 725 754 952 959 1,092 1,092 335

2.0

73.8

11.22

13.6

5.25 STT ĐKT

SĐK

Tên giống

P100 (g)

NS (kg/ha)

Cao cây (cm)

Ngày ra hoa

Ngày thu hoạch

Dài quả (cm)

Số hạt/ quả

Số quả/ cây

Nhiễm MYM V

4321 Đậu xanh hạt tiêu

5.3

74.6

7.54

12.2

3.60

4335 Đậu xanh lòng xanh

3.1

75.6

9.46

10.6

6.75

3256 Xanh ruột vàng Chí Linh

8.0

76.2

8.04

11.4

3.45

4315 Đậu mốc vỏ bạc TQ

3.7

77.2

10.90

12.3

5.10

9665 CM-23

3.7

10.90

12.3

5.10

77.2

4310 VO 2253

3.3

77.6

8.56

11.4

4.15

3229 Xanh Sông Bé

5.0

79.0

11.06

12.2

6.00

8285 Đậu xanh

5.0

79.0

11.06

12.0

6.00

6499 Đậu xanh

3.8

81.2

10.04

12.2

6.30

3198 Xanh 6 tháng Cao Lạng

26.4

81.6

8.18

11.6

4.25

4292 VC 6372 (45-8)

6.7

82.2

7.10

10.6

2.75

6502 Đậu xanh

6.5

83.4

10.20

11.8

5.45

3214 Mỡ Cam Ranh Khánh Hòa

4.1

83.4

10.74

13.2

5.65

3215 Xanh Vạn Linh khánh Hòa

7.5

83.8

8.52

11.6

5.35

5613 Đậu xanh vỏ mốc

7.5

83.8

8.52

11.6

5.35

3230 Mốc Sông Bé

541 510 735 546 546 367 842 842 676 2,418 452 975 709 1,079 1,079 968

5.7

84.0

10.88

12.8

5.75 STT ĐKT

SĐK

Tên giống

P100 (g)

NS (kg/ha)

Cao cây (cm)

Ngày ra hoa

Ngày thu hoạch

Dài quả (cm)

Số hạt/ quả

Số quả/ cây

Nhiễm MYM V

8286 Đậu xanh mỡ

5.9

84.0

10.88

12.2

5.75

3202 Mốc Hữu Lũng Lạng Sơn

6.8

94.6

8.92

12.0

4.75

Đậu sẻ

6.8

94.6

8.92

12.0

4.75

4248 VC 3890B

5.8

97.4

7.22

11.2

2.60 Max

97.4

53.0

71.0

12.54

14.00

7.23

26.4 Min

36.4

35.0

51.0

7.10

10.00

2.60

2.0 TB

63.3

44.4

62.0

9.57

11.50

5.15

7.0 968 894 894 395 2,418 335 922 318

STDEV CV%

14.0 22.1

4.5 10.2

4.2 6.8

1.23 12.9

173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200

Đánh giá trong nhà lưới cách ly trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo Chỉ số bệnh TB (55 ngày sau - trồng) - 3.62 3.58 3.71 2.11 - - 2.77 - - 3.92 - - - - - - - - - - - 3.00 4.38 - - - 4.76 2.57

Phản ứng bệnh MS MS MS R MR MS R S S R

Đánh giá trên đồng ruộng trong đk tự nhiên Phản ứng Chỉ số bệnh bệnh TB (55 ngày MS 3.85 sau trồng) MR 3.48 MR 3.42 S 4.08 S 4.39 R 2.04 MR 3.08 S 4.00 R 2.86 S 4.29 MR 3.11 S 4.39 MS 3.52 MS 3.68 S 4.22 MR 3.09 MS 3.75 MR 3.19 S 4.38 R 2.96 S 4.39 S 4.65 MS 3.68 R 2.61 S 4.74 MR 3.48 R 2.89 MR 3.09 S 4.93 R 2.33

VR2011-2-216 VR2011-2-217 VR2011-2-219 VR2011-2-220 VR2011-2-222 VR2011-2-223 VR2011-2-224 VR2011-2-225 VR2011-2-226 VR2011-2-227 VR2011-2-228 VR2011-2-231 VR2011-2-232 VR2011-2-234 VR2011-2-235 VR2011-2-236 VR2011-2-237 VR2011-2-238 VR2011-2-239 VR2011-2-240 VR2011-2-241 VR2011-2-243 VR2011-2-244 VR2011-2-245 VR2011-2-247 VR2011-2-248 VR2011-2-249 VR2011-2-250 KPS2 NM94

P1 P2

Phụ lục 9. Các đoạn trình tự chứa các SNP đề xuất đánh giá

Các vùng QTL xác định được bằng QTL icmapping và chỉ thị SNP chặn 2 đầu của vùng QTL mymv1-1 Đoạn trình tự chứa chỉ thị bên trái: >Vr01 Vr01:36171500..36171600 (36171544) (101 bp) CCAAAGAAAGATACGCTGCTGCGTCTGCACCACCCAGGTCCTGG[A/G]GACGTCAAATCTGAACC GTTGGATTGCCAAAACCAGCTCGAGAATCAGGAAGCACC Đoạn trình tự chứa chỉ thị bên phải: >Vr01 Vr01:35678450..35678570 (35678505) (121 bp) GGCTATGCCAATTCACACTTTTTCCCATCAAATCAGTATTCAGTATTTCATTTTG[A/G]GCCAAGTC TTTATTTTTCAAAGATAAACCGGGTTGTCTCAGTTGCTCTAATTTTGGGGGAGCTTT mymv1-2 Đoạn trình tự chứa chỉ thị bên trái: >Vr05 Vr05:5694470..5694600 (5694513) (131 bp) TGCGGTTTCTTTCGATGGTTTTGCGATCAAGTTTAGTGGAATC[A/T]TCGATGGTGCTTGCTGCTA ATCTCTTCTTCATCTTGATCGATTGCGAGGTTATTTCATAAGTTTGTGTGAAAGAGAAGTGATTAG GG Đoạn trình tự chứa chỉ thị bên phải: >Vr05 Vr05:5179450..5179570 (5179489) (121 b) AGGGCTTGGTCTTGACTTAAACCAAGTGGATGATGCTTC[T/C]GACATGGGCATTTGCTTGAACA GTAATCATAAAATTGATGTGCCAATTATGCAGGGGAAATCATCATTGGGTGGTCCACCA mymv1-3 Đoạn trình tự chứa chỉ thị bên trái: >Vr07 Vr07:6674651..6674750 (6674722) (100 bp) TCAAGTGAAATGAAAAAATACCCCAACAAAAACCAAAAATGGCATGTGAACAGCATACCAGAAG AATCTTT[C/A]GCAGACTGAGCTTGCACCTGAGCTGCAT Đoạn trình tự chứa chỉ thị bên phải: >Vr07 Vr07:11673095..11673155 (11673121) (61 bp) ATTTAGTATTAAGTCATGGCTGCCAC[G/A]TTTGTCAATTAGGATGCATGGTGATTGATTTCTT mymv1-4 Đoạn trình tự chứa chỉ thị bên trái: >Vr09 Vr09:20592321..20592402 (20592377) (82 bp) TTGGTAATTTAATCTGTAGGGAGTTTCCAGCACATCACGAGCAACATCCAAATTGC[T/C]TCTTCAT CCAGCAGCAGCCCACAAT Đoạn trình tự chứa chỉ thị bên phải: >Vr09 Vr09:20592280..20592380 (20592336) (101 bp)

GATATTGACTTTAGAAGTGATAAATGGTGCAGCGGGGCCCATTGGTAATTTAATCT[G/T]AGGGA GTTTCCAGCACATCACGAGCAACATCCAAATTGCTTCT Các chỉ thị được phát hiện bằng phân tích SMR Đoạn trình tự chứa chỉ thị: >Scaffold_183 Scaffold:419900..419992 (419936) (93 bp) ATTTGTTGCAAATCAAAATAAGCCCCCTGAAGTTGTGAGCATCCTT[G/A]TCACAAACAAACACAA GCTTTTGCAATTTTTGGAAAACTTCAATTG >scaffold_184 scaffold_184:377032..377123 (377097) (92 bp) TTTTTAGGGTTATTATAATAATTTTTAGGGTTATTATAATAACTTGTAGGGTTATAGAAAACTCT [C/T]AACTTTGTAAATCATGGCACAGCAAC >Vr03 Vr03:10571650..10571750 (10571694) (101 bp) CGAAATTTAGGGGGTGAAGTGTTTTGTATGCTTGTGAAATTATA[A/T]AAGTAAAATGTTAAACA AATAACTCATTTCTCAGGTCAACTTTTTAAAATGTCATG >Vr04 Vr04:15430120..15430279 (15430209) (159 bp) TTGCTAATGTAACTACTTAAATAAGCAAACTGCATGGATCCTGTTTGAGCTCATTGCATGAAATTT TCTAGCTGATGCTAAATCTTTGG[A/G]CTTTTCATACGTACAAACCTTGGGTCTGGCTGCATTGCTT CAAAGCTGGAAACACGTCTTAGGTTAGCTG >Vr05 Vr05:5694475..5694583 (5694513) (109 bp) TTTCTTTCGATGGTTTTGCGATCAAGTTTAGTGGAATC[A/T]TCGATGGTGCTTGCTGCTAATCTCT TCTTCATCTTGATCGATTGCGAGGTTATTTCATAAGTTTGTGTGA >Vr05 Vr05:8244483..8244583 (8244523) (101 bp) CATTGCGGCTGACTACTGATTTTGGAGTACATTATTTGTG[C/A]AGTTCTGCAAAGCAAAGGAGA ATCTTTACGTGGCCAACCAAAACCGAGAAAGGAAATTGA >>Vr10 Vr10:3385389..3385500 (3215234) (112 bp) AATAAAAAATATTTCATCTCTTTTCAAGCATATGATCCGAGTCTG[T/G]TTAAAACACACTAATATT TCCCCATTCCGAAGCCTTTCATTAGCCAGGCAGCGAGCATTTTATTGA

Phụ lục 10. Các vùng QTL xác định được bằng phần mền QIL icmapping

Vị trí

Chỉ thị trái

Chỉ thị Phải

LOD

PVE(%)

Nhiễm sắc thể

Vùng QTL1 mymv1-1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

18 Vr01:15808491 19 Vr01:15808491 20 Vr01:15808491 21 Vr01:15808491 22 Vr01:15808491 23 Vr01:15808491 24 Vr01:15808491 25 Vr01:15808491 26 Vr01:15808491 27 Vr01:15808491 28 Vr01:15808491 29 Vr01:15808491 30 Vr01:15808491 31 Vr01:15808491 32 Vr01:15808491 33 Vr01:15808491 34 Vr01:15808491 35 Vr01:15808491 36 Vr01:15808491 37 Vr01:15808491 38 Vr01:15808491 39 Vr01:15808491 40 Vr01:15808491 41 Vr01:15808491 42 Vr01:36171544 43 Vr01:36171544 44 Vr01:36171544 45 Vr01:36171544 46 Vr01:36171544 47 Vr01:36171544 48 Vr01:36171544 49 Vr01:36171544 50 Vr01:36171544 51 Vr01:36171544 52 Vr01:36171544 53 Vr01:36171544

Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:36171544 Vr01:35678505 Vr01:35678505 Vr01:35678505 Vr01:35678505 Vr01:35678505 Vr01:35678505 Vr01:35678505 Vr01:35678505 Vr01:35678505 Vr01:35678505 Vr01:35678505 Vr01:35678505

2.6378 2.809 2.9796 3.1503 3.3215 3.4937 3.6672 3.8423 4.019 4.1972 4.3766 4.5568 4.7372 4.9173 5.0962 5.2729 5.4465 5.616 5.7801 5.9378 6.0881 6.2299 6.3624 6.4853 6.5035 6.3665 6.2019 6.0126 5.801 5.568 5.3128 5.0329 4.7258 4.3925 4.0427 3.6969

13.0056 13.2957 13.5265 13.7261 13.8933 14.0348 14.1437 14.2277 14.2936 14.335 14.3564 14.3516 14.325 14.2704 14.1915 14.0866 13.9414 13.763 13.5425 13.2803 12.9659 12.5999 12.1759 11.695 11.5218 11.7436 11.8566 11.8758 11.8089 11.6564 11.4011 11.0178 10.4592 9.6731 8.6412 7.4747

Vùng QTL1 mymv1-2

5 5 5 5 5 5 5

1192 Vr05:2128629 1193 Vr05:2128629 1194 Vr05:2128629 1195 Vr05:2128629 1196 Vr05:2128629 1197 Vr05:2128629 1198 Vr05:2128629

Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513

5.4105 7.3941 8.673 9.6394 10.4516 11.1623 11.7925

20.2773 31.3428 33.8131 35.646 37.1163 38.2288 39.0314

Vị trí

Chỉ thị trái

Chỉ thị Phải

LOD

PVE(%)

Nhiễm sắc thể

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

1199 Vr05:2128629 1200 Vr05:2128629 1201 Vr05:2128629 1202 Vr05:2128629 1203 Vr05:2128629 1204 Vr05:2128629 1205 Vr05:2128629 1206 Vr05:2128629 1207 Vr05:2128629 1208 Vr05:2128629 1209 Vr05:2128629 1210 Vr05:2128629 1211 Vr05:2128629 1212 Vr05:5694513 1213 Vr05:5694513 1214 Vr05:5694513 1215 Vr05:5694513 1216 Vr05:5694513 1217 Vr05:5694513 1218 Vr05:5694513 1219 Vr05:5694513 1220 Vr05:5694513 1221 Vr05:5694513

Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5694513 Vr05:5179489 Vr05:5179489 Vr05:5179489 Vr05:5179489 Vr05:5179489 Vr05:5179489 Vr05:5179489 Vr05:5179489 Vr05:5179489 Vr05:5179489

12.3538 12.8545 13.3014 13.7003 14.0562 14.3738 14.657 14.9091 15.1321 15.3267 15.4905 15.6166 15.6895 15.7149 16.0083 16.0433 15.9515 15.7674 15.5 15.1455 14.6861 14.0736 13.1516

39.6018 39.9906 40.235 40.3576 40.3815 40.3202 40.186 39.9945 39.7547 39.4758 39.15 38.7426 38.1407 37.2787 38.5357 38.9134 39.0571 39.0595 38.9392 38.6871 38.2707 37.6007 36.1766

Vùng QTL1 mymv1-3

7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7

540 Vr07:6340513 541 Vr07:6340513 542 Vr07:6340513 543 Vr07:6340513 544 Vr07:6340513 545 Vr07:6340513 546 Vr07:6340513 547 Vr07:6340513 548 Vr07:6340513 549 Vr07:6340513 550 Vr07:6340513 551 Vr07:6340513 552 Vr07:6674722 553 Vr07:6674722 554 Vr07:6674722 555 Vr07:6674722 556 Vr07:6674722 557 Vr07:6674722 558 Vr07:6674722 559 Vr07:6674722 560 Vr07:6674722 561 Vr07:6674722

Vr07:6674722 Vr07:6674722 Vr07:6674722 Vr07:6674722 Vr07:6674722 Vr07:6674722 Vr07:6674722 Vr07:6674722 Vr07:6674722 Vr07:6674722 Vr07:6674722 Vr07:6674722 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121

2.7048 2.9327 3.1418 3.3297 3.496 3.6411 3.7653 3.8691 3.9529 4.0172 4.0627 4.0901 4.1295 4.21 4.2867 4.3579 4.4219 4.4771 4.5223 4.556 4.5769 4.5837

5.8083 6.3262 6.7112 6.9965 7.1998 7.3331 7.4023 7.4125 7.3659 7.2645 7.1068 6.8941 6.8745 7.2268 7.5535 7.8495 8.1087 8.3297 8.5101 8.6484 8.7428 8.7901

Vị trí

Chỉ thị trái

Chỉ thị Phải

LOD

PVE(%)

Nhiễm sắc thể

7 7 7 7 7 7 7 7 7

562 Vr07:6674722 563 Vr07:6674722 564 Vr07:6674722 565 Vr07:6674722 566 Vr07:6674722 567 Vr07:6674722 568 Vr07:6674722 569 Vr07:6674722 570 Vr07:6674722

Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121 Vr07:11673121

4.5752 4.5503 4.5078 4.447 4.3675 4.2692 4.1533 4.0219 3.8789

8.7886 8.7349 8.6246 8.4531 8.2146 7.904 7.5171 7.062 6.5535

Vùng QTL1 mymv1-4

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

1234 Vr09:20592571 1235 Vr09:20592571 1236 Vr09:20592571 1237 Vr09:20592571 1238 Vr09:20592571 1239 Vr09:20592571 1240 Vr09:20592571 1241 Vr09:20592571 1242 Vr09:20592571 1243 Vr09:20592571 1244 Vr09:20592571 1245 Vr09:20592571 1246 Vr09:20592377 1247 Vr09:20592377 1248 Vr09:20592377

Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592377 Vr09:20592336 Vr09:20592336 Vr09:20592336

6.2999 7.0059 7.58 8.0435 8.4257 8.7443 9.0103 9.2305 9.4087 9.5468 9.6457 9.706 10.1352 10.6688 10.916

15.0816 17.6534 18.8622 19.5805 20.051 20.3589 20.5429 20.6185 20.5872 20.4401 20.158 19.7156 20.3827 21.1631 21.2378

Permutation analysis. QTL mapping method: Composite IM (LS) Statistic: LOD Selected chromosomes: [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11] Selected trait: [MYMV] Selected background loci: [Vr04:15430209 4 154.3, Vr06:35603909 6 356.0,

QTL_6_580 6 58.0, QTL_6_2880 6 288.0, QTL_9_2060 9 206.0]

Phụ lục 11. Các vùng QTL xác định trên Qgen bằng phân tích CIM

Number of iterations: 200 alpha 0.10 = 5.885 alpha 0.05 = 8.176 alpha 0.01 = 10.982

Nhiễm sắc thể

Vị trí vật lý (Mb)

Vị trí

MYMV CIM (LOD)

Locus name 10 scaffold_183:3173 10 scaffold_184:401589 10 scaffold_183:608490 10 10

MYMV CIM (Add effect) 0.497 0.498 0.528 0.541 0.451

MYMV CIM (R^2) 0.373 0.366 0.402 0.425 0.358

0 4 6 32 34

0 0.4 0.6 3.2 3.4

7.189 7.026 7.919 8.542 6.836

4 4 4 Vr04:15430209 4

150.3 152.3 154.3 156.3

15.03 15.23 15.43 15.63

6.731 7.819 10.485 7.048

0.354 0.398 0.493 0.367

0.53 0.521 0.585 0.554

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

22.1 36.1 38.1 40.1 42.1 44.1 46.1 48.1 50.1 52.1 54.1 56.1 58.1 78.1 80.1 82.1 88.1 90.1 92.1 94.1 96.1 98.1

2.21 3.61 3.81 4.01 4.21 4.41 4.61 4.81 5.01 5.21 5.41 5.61 5.81 7.81 8.01 8.21 8.81 9.01 9.21 9.41 9.61 9.81

7.793 5.971 6.476 6.977 7.466 7.932 8.366 8.764 9.175 9.194 8.927 8.507 8.41 6.779 8.137 9.221 5.916 6.244 6.534 6.78 7.051 8.946

0.397 0.321 0.343 0.364 0.384 0.402 0.419 0.434 0.448 0.449 0.44 0.424 0.42 0.356 0.41 0.45 0.319 0.333 0.345 0.356 0.367 0.44

0.485 0.495 0.517 0.534 0.547 0.554 0.557 0.554 0.55 0.538 0.533 0.528 0.552 0.594 0.584 0.555 0.448 0.464 0.475 0.481 0.484 0.578

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

100.1 102.1 116.1 118.1 120.1 122.1 124.1 126.1 128.1 130.1 132.1 134.1

10.01 10.21 11.61 11.81 12.01 12.21 12.41 12.61 12.81 13.01 13.21 13.41

0.644 0.672 0.883 0.85 0.801 0.744 0.685 0.625 0.568 0.516 0.467 0.47

8.388 7.028 6.016 6.403 6.609 6.672 6.632 6.526 6.382 6.222 6.066 6.499

0.42 0.366 0.323 0.34 0.349 0.351 0.35 0.345 0.339 0.332 0.325 0.344

QTL_6_580 6 58.0, QTL_6_2880 6 288.0, QTL_9_2060 9 206.0]

Phụ lục 12. Các vùng QTL xác định trên Qgen bằng phân tích CIM