Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus Monodon)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN HOÀNG THỊ THU YẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC MỘT SỐ GEN THUỘC HỆ MIỄN DỊCH TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan tấ t cả các kết quả nghiên cứ u trong luận án là trung thực và

chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nế u sai tôi xin chị u trá ch

nhiệ m hoà n toà n.

Thái Nguyên, ngày … tháng … năm 2012

Tác giả luận án

Hoàng Thị Thu Yến

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i

LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... ii

MỤC LỤC ................................................................................................................. iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ ix

MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2

3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3

1.1. Tôm sú và các bệnh thường gặp ở tôm sú ......................................................... 3

1.1.1. Giới thiệu về tôm sú .................................................................................... 3

1.1.2. Tình hình nuôi và dị ch bệ nh tôm sú ở Việ t Nam ........................................ 5

1.1.3. Các bệnh thường gặp ở tôm sú ................................................................... 7

1.1.4. Phương phá p phòng và trị bệnh ở tôm sú ................................................. 12

1.2. Hệ miễn dịch tôm sú ........................................................................................ 14

1.2.1. Đáp ứng miễn dịch tế bào ......................................................................... 15

1.2.2. Đáp ứng miễn dịch dịch thể ...................................................................... 21

1.3. Nghiên cứ u gen và tiề m năng ứ ng dụ ng trong phò ng trị bệ nh cho tôm sú ......... 23

1.3.1. Tình hình nghiên cứu genome tôm sú trên thế giới .................................. 23

1.3.2. Nghiên cứu gen liên quan đế n khả năng miễ n dị ch ở tôm sú ................... 24

1.3.3. Tiề m năng ứng dụ ng củ a gen liên quan đế n miễ n dị ch trong phò ng

trị bệnh ở tôm sú ...................................................................................... 28

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 32

2.1. Vật liệu ............................................................................................................ 32

2.1.1. Thu thập mẫu ............................................................................................ 32

2.1.2. Hóa chất .................................................................................................... 32

2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................... 34

2.1.4. Các vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu ....................................... 34

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 35

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số ............................................................................ 36

2.2.2. Tinh sạch mRNA ...................................................................................... 37

2.2.3. Tổng hợp cDNA........................................................................................ 38

2.2.4. Thiết kế mồi phân lập một số gen (cDNA) lựa chọn ................................ 41

2.2.5. Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR ........................................................ 48

2.2.6. Tinh sạch sản phẩm PCR .......................................................................... 49

2.2.7. Tạo dòng phân tử sản phẩm PCR ............................................................. 49

2.2.8. Xác định trình tự gen (cDNA) ................................................................. 50

2.2.9. Biểu hiện gen ALFPm3 ............................................................................. 50

2.2.10. Phân tích dữ liệu trình tự và xử lý số liệu ............................................... 55

2.3. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 55

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 56

3.1. Rab7 - protein liên quan đế n cơ chế xâm nhiễ m củ a virus ............................. 56

3.1.1. Tạo dòng gen Rab7 từ mẫu tôm sú Việt Nam .......................................... 56

3.1.2. Xác định và phân tích trình tự gen Rab7 .................................................. 58

3.2. Syntenin - protein liên quan đến con đườ ng dẫ n truyề n tí n hiệ u .................... 61

3.2.1. Phân lậ p đoạn 5‟-syntenin từ mẫu tôm sú Việt Nam ................................ 62

3.2.2. Tạo dòng gen syntenin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam ................... 64

3.2.3. Xác định và phân tích trình tự gen syntenin ............................................. 65

3.3. Hemocyanin - protein có hoạt tính phenoloxidase .......................................... 68

3.3.1. Phân lập đoạn 5‟-hemocyanin từ mẫu tôm sú Việt Nam .......................... 69

3.3.2. Tạo dòng gen hemocyanin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam ............. 72

3.3.3. Phân tích trình tự gen hemoccyanin .......................................................... 74

3.4. Ran - protein điề u khiể n thự c bà o ................................................................... 76

3.4.1. Tạo dòng một phần đoạn gen Ran từ mẫu tôm sú Việt Nam ................... 77

3.4.2. Phân lập đoạn gen 3‟ và 5‟-Ran ................................................................ 78

3.4.3. Tạo dòng gen Ran hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam .......................... 82

3.4.4. Xác định và phân tích trình tự gen Ran .................................................... 83

3.5. Caspase - protein tham gia và o cơ chế apoptosis ............................................ 84

3.5.1. Tạo dòng gen caspase từ mẫu tôm sú Việt Nam ...................................... 85

3.5.2. Xác định và phân tích trình tự gen caspase .............................................. 86

3.6. Hệ thống các protein kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus ...................... 90

3.6.1. Protein khá ng virus PmAV ....................................................................... 90

3.6.2. Peptide khá ng khuẩ n t ương tự crustin (crustin - like antimicrobial

peptide) .................................................................................................... 94

3.6.3. Yế u tố khá ng khuẩ n (ALF - antiliposaccharide factor) ............................ 99

3.7. Biể u hiệ n yế u tố khá ng khuẩ n tái tổ hợp (rALFPm3) ................................... 105

3.7.1. Tạo cấu trúc vector biểu hiện gen ........................................................... 105

3.7.2. Xác định cấu trúc gen ALFPm3 được chuyển vào genome nấm men........ 108

3.7.3. Xác định đoạn peptide ALFPm3 được biểu hiện.................................... 109

3.7.4. Phân tích hoạt tính của rALFPm3 ........................................................... 111

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 113

1. Kết luận ............................................................................................................ 113

2. Kiến nghị .......................................................................................................... 114

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .............. 115

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................

PHỤ LỤC .....................................................................................................................

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh

Vùng 5‟ không dịch mã 5‟ Untranslated region 5‟UTR

Vùng 3‟ không dịch mã 3‟ Untranslated region 3‟UTR

Mồi neo Abridged anchor primer AAP

AFLP Đa hình chiều dài DNA được Amplified fragment length

khuếch đại polymorphism

ALF Yếu tố kháng khuẩn Anti-lipopolisaccharide factor

ALFPm ALF dạng 1 ở tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus

monodon isorform 1

ALFPm3 ALF dạng 3 ở tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus

monodon isorform 3

AMP Peptide kháng khuẩn Antimicrobial peptide

apoptosis Tế bào chết theo chương trình Programmed cell death

bp Cặp base Base pair

B.megaterium Bacillus megaterium Bacillus megaterium

cDNA DNA bổ sung Complement DNA

DP Mồi suy diễn Degenerate primer

DNA Axit deoxyribonucelic Deoxyribonucleic acid

dNTPs Hỗn hợp các nucleotide (dATP, Deoxyribonucleoside triphosphate

dCTP, dGTP, dTTP)

ddNTPs Hỗn hợp các deoxynicleotide Dideoxyribonucleoside triphosphate

(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)

dsRNA RNA sợi kép Double stranded RNA

DEPC Chất khử Rnase Diethyl pyrocarbonate

E. aerogenes Vi khuẩn Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes

Vi khuẩn Escherichia coli Escherichia coli E. coli

Axit ethylenediaminetetraacetic Ethylenediaminetetraacetic acid EDTA

Đoạn trình tự gen biểu hiện Expressed sequence tag EST

Mồi đặc hiệu gen Gene specific primer GSP

vii

kb Kb Kilo base

LB Môi trường LB Luria Bertani

mtDNA DNA ty thể Mitochondrial DNA

mRNA RNA thông tin Messenger RNA

OD Mật độ quang Optical density

ORF Khung đọc mở Open reading frame

PCR Phản ứng chuỗi polymerase Polymerase chain reaction

PmAV Gen khá ng virus ở tôm sú Penaeus monodon antivrus

PmRab7 Rab7 ở tôm sú Penaeus monodon Rab7

P. pastoris Nấm men Pichia pastoris Pichia pastoris

3‟RACE Khuếch đại nhanh đầu 3‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 3' ends

5‟RACE Khuếch đại nhanh đầu 5‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 5' ends

rALFPm3 ALF tái tổ hợp ở tôm sú dạng 3 từ Recombinant anti-lipopolisaccharide

tôm sú factor Penaeus monodon 3

Axit ribonucleic Ribonucleic acid RNA

RNA can thiệp RNA interference RNAi

Enzyme phân hủy RNA Ribonuclease RNase

Enzyme phiên mã ngược Reverse transcriptase RT

RT-PCR PCR bằng enzyme phiên mã ngược Reverse transcriptase-PCR

siRNA RNA can thiệp nhỏ Small interfering RNA

Đa hình các nucleotide đơn Single-nucleotide polymorphism SNP

Dung dị ch Natri citrate Solution sodium citrate SSC

Virus gây hội chứng taura Taura syndrome virus TSV

Mồi khuếch đại chung Universal amplication primer UAP

Hỗn hợp mồi chung Universal primer mix UPM

vòng/phút rotor/minute v/p

WSSV Virus gây bệnh đốm trắng White spot syndrome virus

Virus gây bệnh đầu vàng Yellow head virus YHV

Môi trường YP Yeast peptone YP

Môi trường YPD Yeast peptone dextrose YPD

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thố ng kê cá c gen liên quan đế n hệ miễ n dị ch ở tôm ............................... 26

Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 34

Bảng 2.2. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh tôm sú ......................................................................................... 3

Hình 1.2. Tôm sú nhiễm WSSV ............................................................................... 10

Hình 1.3. Tôm sú nhiễm YHV .................................................................................. 12

Hình 1.4. Tế bà o má u tôm sú .................................................................................... 17

Hình 1.5. Hệ thống hoạt hóa proPO và tổng hợp melanin ........................................ 19

Hình 1.6. Cơ chế đông máu ở tôm ............................................................................ 21

Hình 2.1. Sơ đồ phân lập gen .................................................................................... 35

Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết trình tự .................................................. 42

Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết một phần trình tự đầu 3‟ (Invitrogen) ....... 42

Hình 2.4. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết một phần trình tự đầu 3‟ (Clontech) ......... 43

Hình 2.5. Sơ đồ thiết kế mồi khi biết một phần trình tự đầu 5‟ của gen ................... 43

Hình 2.6. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen syntenin ................................................. 44

Hình 2.7. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen hemocyanin ........................................... 44

Hình 2.8. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen Ran ........................................................ 45

Hình 2.9. Sơ đồ thiết kế mồi để phân lập gen hoàn toàn mới ở tôm sú .................... 46

Hình 2.10. Sơ đồ thiết mồi khuếch đại đoạn gen mã hóa peptide ALFPm3

trưởng thành ............................................................................................. 46

Hình 2.11. Sơ đồ biểu hiện ALFPm3 ........................................................................ 51

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen Rab7 .................. 57

Hình 3.2. Trình tự gen và amino acid suy diễn của Rab7 ......................................... 58

Hình 3.3. So sánh trình tự nucleotide ở gen Rab7 của tôm sú Việt Nam với

trình tự đã công bố ................................................................................... 59

Hình 3.4. Mô phỏng cấu trúc bậc hai và phân tích các motif chức năng của

protein Rab7 ............................................................................................. 60

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn 5‟-syntenin ...... 62

Hình 3.6. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn 5‟-syntenin ........... 63

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen syntenin ............. 64

Hình 3.8. Trình tự gen và amino acid suy diễn của syntenin .................................... 66

Hình 3.9. So sánh trình tự amino acid của protein syntenin giữa các loài khác nhau ....... 67

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn 5‟-hemocyanin ...... 70

Hình 3.11. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn 5‟-hemocyanin ........ 71

Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen hemocyanin ......... 72

Hình 3.13. Trình tự gen và amino acid suy diễn của hemocyanin ............................ 73

Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid của protein hemocyanin giữa các loài ........ 75

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng một phần đoạn

gen Ran .................................................................................................... 77

Hình 3.16. Trình tự nucleotide và amino acid đoạn gen Ran ................................... 78

Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn gen 3‟-Ran ........ 79

Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn gen 5‟-Ran ........ 80

Hình 3.19. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của gen Ran ....................... 81

Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen Ran .................. 82

Hình 3.21. So sánh trình tự amino acid của protein Ran giữa các loài khác nhau ........ 83

Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen caspase ........... 86

Hình 3.23. Trình tự nucleotide và amino acid của caspase ....................................... 87

Hình 3.24. So sánh trình tự nucleotide của gen caspase của tôm sú Việt Nam

với trình tự đã công bố ............................................................................. 88

Hình 3.25. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein caspase tôm sú

với các loài tôm khác nhau ...................................................................... 90

Hình 3.26. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen PmAV .............. 92

Hình 3.27. Trình tự gen và amino acid suy diễn của protein PmAV ........................ 93

Hình 3.28. So sánh trình tự amino acid của protein PmAV ...................................... 94

Hình 3.29. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen mã hóa

peptide khá ng khuẩ n tương tự crustin ..................................................... 96

Hình 3.30. Trình tự gen và amino acid suy diễn của gen mã hóa peptide

kháng khuẩn tương tự crustin .................................................................. 96

Hình 3.31. So sánh trình tự amino acid của peptide khá ng khuẩ n t ương tự

crustin ở tôm ............................................................................................ 98

Hình 3.32. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen ALF ............... 100

Hình 3.33. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của ALFPm ..................... 101

Hình 3.34. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của ALFPm3 ................... 102

Hình 3.35. So sánh trình tự nucleotide của gen ALFPm ở tôm sú Việt Nam

với trình tự đã công bố ........................................................................... 102

Hình 3.36. So sánh trình tự nucleotide của gen ALFPm3 ở tôm sú Việt Nam

với trình tự đã công bố ........................................................................... 103

Hình 3.37. So sánh amino acid suy diễn ALF nhóm I ............................................ 104

Hình 3.38. Mô hình cấu trúc biểu hiện cDNA của ALFPm3 ................................. 106

Hình 3.39. Hình ảnh điện di tạo cấu trúc biểu hiện gen ALFPm3 .......................... 107

Hình 3.40. Xác định gen ALFPm3 trong genome nấm men ở các dòng nấm men ...... 108

Hình 3.41. OD600nm tế bào nấm men P. pastoris biến đổi qua các ngày cảm

ứng biểu hiện ......................................................................................... 109

Hình 3.42. Hình ảnh điện di phân đoạn protein dịch nuôi các dòng nấm men

tái tổ hợp sau 1 ngày cảm ứng biểu hiện ............................................... 110

Hình 3.43. Hình ảnh điện di phân đoạn protein dịch nuôi các dòng nấm men

tái tổ hợp sau 2 ngày cảm ứng biểu hiện ............................................... 110

Hình 3.44. Hoạt tính của rALFPm3 đối với chủng B. megaterium ........................ 111

Hình 3.45. Hoạt tính của rALFPm3 đối với chủng E. aerogenes ........................... 112

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Tôm sú là động vật thủy sản dùng làm thực phẩm mang lại lợi nhuận lớn nhờ

xuất khẩu tại nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Những năm đầu thập

niên 90 của thế kỷ XX, cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm công nghiệp, “dịch

bệnh” ở tôm cũng bắt đầu xuất hiện và lan rộng khắp thế giới. Tác nhân gây bệnh

chính phải kể đến là vi khuẩn và virus. Hiện nay, các nghiên cứu cho thấy việc giảm

sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do các vi khuẩn

thuộc chi Vibrio spp. Trong đó, loài gây bệnh phổ biến nhất là vi khuẩn phát sáng

V. harvey. Các tác nhân gây bệnh do virus bao gồm virus gây bệnh đầu vàng

(Yellow head virus - YHV), virus gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus -

WSSV)… được xem là các tác nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất và làm thiệt hại

đáng kể đến nghề nuôi tôm.

Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sự điều khiển sinh trưởng, sinh sản và

đặc biệt là hệ thống miễn dịch ở tôm sú còn rất hạn chế do thiếu những thông tin về

genome và sự biểu hiện gen của chúng. Kích thước genome tôm sú là rất lớn (khoảng

trên 2 tỉ cặp base = 2/3 bộ gen người), nên việc giải mã toàn bộ genome tôm sú đòi

hỏi nhiều thời gian và chi phí lớn, ước tính hàng chục triệu đô la. Vì vậy, một trong

những hướng nghiên cứu đượ c lự a chọ n là lập bản đồ di truyền liên kết genome tôm

sú, lập bản đồ di truyền từ DNA vệ tinh, phân tích trình tự đầy đủ genome ty thể

(mtDNA), lập bản đồ gen tôm sú bằng giải mã EST/cDNA, nghiên cứu và phân tích

các đoạn trình tự gen biểu hiện (Express sequence tag - EST), lựa chọn các chỉ thị

phân tử phục vụ công tác chọn giống, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các gen

liên quan.

Tôm sú không có hệ thống đáp ứng miễn dịch thích ứng thực sự (adaptive

immune system), thay vào đó chúng phát triển hệ thống bảo vệ cơ thể khác được gọi

là miễn dịch tự nhiên (innate immunity). Những nghiên cứu về phản ứng tế bào và

dịch thể ở tôm khi bị nhiễm vi khuẩn, virus đã được các nhà khoa học rất quan tâm,

đặc biệt là xác định và phân tích đặc điểm của các gen tham gia vào quá trình đáp

ứng miễn dịch. Việc phát triển và ứng dụng rộng rãi Công nghệ sinh học trong lĩnh

vực thủy sản đã đóng vai trò quan trọng trong giải thích các quá trình phát sinh

mầm bệnh, phát triển các phương thức chẩn đoán và phòng ngừa, nhằm duy trì sự

ổn định của nghề nuôi tôm, kiểm soát hậu quả dịch bệnh, hạn chế thiệt hại do dịch

bệnh ở tôm nuôi. Hiện nay, để xử lý tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, thuốc kháng

sinh và hóa chất là phương pháp chính được sử dụng. Tuy nhiên, hạn chế của

phương pháp này là chi phí mua thuốc lớn, tồn dư kháng sinh có thể đe dọa đến sức

khỏe cộng đồng, ảnh hưởng đến môi trường, đồng thời xuất hiện các mầm bệnh

kháng thuốc và chúng có thể lây nhiễm cho con người. Mặt khác, đối với các dịch

bệnh do virus khi đã xảy ra thì chưa có biện pháp nào trị bệnh. Đến nay, những đáp

ứng miễn dịch của tôm đối với nguồn bệnh virus vẫn chưa được sáng tỏ. Do đó,

việc nghiên cứu cơ chế miễn dịch của tôm ở mức độ phân tử là cần thiết để đưa ra

các giải pháp đúng đắn trong phòng trị bệnh cho tôm.

Trong những năm gần đây, ở Việt Nam đã bước đầu có các nghiên cứu nhằm

nâng cao chất lượng giống và kiểm soát dịch bệnh ở tôm. Các nghiên cứu tập trung

phát hiện bệnh tôm và đưa ra giải pháp phòng bệnh cho tôm. Ngoài ra, một vài cấu

trúc protein tái tổ hợp của WSSV đã được tạo ra trong phò ng thí nghiệ m nhằm mục

đích nghiên cứu phòng trị bệnh cho tôm. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về các

gen liên quan đến hệ miễn dịch tôm sú còn ít được biết đến. Do đó, để góp phần làm

sáng tỏ cơ chế phân tử đáp ứng miễn dịch và tạo nguyên liệu cho nghiên cứu phòng

trị bệnh ở tôm sú, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm cấu

trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus monodon)”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập và xác định được trình tự một số gen lựa chọn liên quan đến hệ

miễn dịch tôm sú, tạo vật liệu nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ cơ chế đáp ứng

miễn dịch và giải pháp trong phòng trị bệnh cho tôm sú;

- Bước đầu nghiên cứu tạo peptide kháng khuẩn rALFPm3.

3. Nội dung nghiên cứu

- Phân lập một số gen lựa chọn liên quan đến hệ miễn dịch tôm sú được tiến

hành theo 3 hướng: các gen đã có thông tin trình tự được công bố; các gen chỉ có

một phần thông tin trình tự; gen chưa có thông tin về trình tự.

- Thiết kế vector mang gen mã hóa peptide kháng khuẩn, biểu hiện trong

nấm men và bước đầu phân tích hoạt tính của peptide tái tổ hợp.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TÔM SÚ VÀ CÁC BỆNH THƢỜNG GẶP Ở TÔM SÚ

1.1.1. Giới thiệu về tôm sú

Tôm sú có tên khoa học là Penaeus monodon do Fabricius mô tả và đặt tên

năm 1798. Ngoài ra, loài tôm này còn được gọi với tên địa phương là tôm rong [11].

Tôm sú là một trong số các loài tôm nuôi quan trọng thuộc họ Penaeidae và được

phân loại như sau [38].

Giới: Animalia

Ngành: Arthropoda

Ngành phụ: Crustatacea

Lớp: Malacostraca

Bộ: Decapoda

Bộ phụ: Natantia

Siêu họ: Penaeoidea

Họ: Penaeidae

Chi: Penaeus

Loài: monodon

Cơ thể tôm sú có màu xanh đậm, có những vân sắc tố trắng đen ở các đốt

bụng. Phần còn lại của thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh hoặc đỏ (Hình 1.1).

Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thước lớn (có thể lên đến 330 mm

hoặc lớn hơn về chiều dài cơ thể) và là loài tôm thương mại quan trọng [209].

Hình 1.1. Hình ảnh tôm sú [14]

Tôm sú có nguồn gốc từ Ấn Độ Dương, phía Tây Nam Thái Bình Dương và

được nuôi chủ yếu ở các nước châu Á [174]. Loài tôm này sống ở nơi chất đáy bùn pha cát với độ sâu từ ven bờ đến 40m nước và độ mặn từ 5 - 34 0/00. Tôm sú có khả năng sinh trưởng nhanh, trong 3 - 4 tháng có thể đạt cỡ trung bình 40 - 50 g. Tôm sú

trưởng thành tối đa đối với con cái có chiều dài từ 220 - 250 mm, trọng lượng đạt từ

100 - 300 g, con đực dài từ 160 - 200 mm, trọng lượng đạt từ 80 - 200 g. Tôm sú có

tính ăn tạp, thức ăn ưa thích là thịt các loài nhuyễn thể, giun nhiều tơ và giáp xác.

Về mặt phân bố, ở nước ta tôm sú phân bố từ Bắc vào Nam, từ ven bờ đến vùng có

độ sâu 40 m, vùng phân bố chính là vùng biển các tỉnh Trung bộ [11].

Tôm sú là loài giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể nên sự phát

triển của chúng mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng đột ngột về kích

thước và khối lượng. Sau mỗi lần lột xác, cơ thể tôm sú tăng nhanh về kích thước.

Quá trình này tùy thuộc vào môi trường nước, điều kiện dinh dưỡng và giai đoạn

phát triển của cá thể. Tôm sú thuộc loài dị hình phái tính, con cái có kích thước lớn

hơn con đực ở cùng độ tuổi. Có thể phân biệt con đực và cái thông qua hình dạng cơ

quan sinh dục bên ngoài. Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái trong tự

nhiên là từ tháng thứ tám trở đi [11].

Trong tự nhiên, tôm sú sống trong môi trường nước mặn, sinh trưởng tới

mùa sinh sản chúng tiến vào gần bờ đẻ trứng. Tôm cái đẻ trứng nhiều hay ít là phụ

thuộc vào chất lượng của buồng trứng và trọng lượng của cơ thể. Sau khi trứng được đẻ 14 - 15 giờ, ở nhiệt độ 27 - 280C sẽ nở thành ấu trùng. Ấu trùng theo các

làn sóng biển dạt vào các vùng nước lợ. Trong môi trường này, ấu trùng (larvae)

tiến sang thời kỳ hậu ấu trùng (postlarvae) rồi tôm giố ng (juvenile) và bơi ra biển,

tiếp tục chu trình sinh trưở ng , phát triển và sinh sản của chúng. Ở mỗi giai đoạn

trong chu kỳ sinh trưởng, tôm phân bố ở những thủy vực khác nhau như vùng cửa

sông, vùng biển ven bờ hay vùng biển khơi và có tính sống trôi nổi hay sống đáy

[11], [145], [174].

Thịt tôm sú là một loại thực phẩm thủy sản rất có lợi cho sức khỏe con người

và được ưa thích trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Thực phẩm từ tôm rất tốt cho

sức khỏe do chứa các protein năng lượng thấp, ít chất béo, có hàm lượng selenium,

amino acid cao, ngoài ra còn là nguồn cung cấp các vitamin cho con người. Nhiều

vitamin ở tôm rất cần thiết cho làn da khỏe mạnh, xương và răng như B6, E, A, D

và B12.... Hàm lượng vitamin B12, axit béo omega-3 cao ở tôm rất có lợi cho tim

mạch, ngăn chặn sự tắc nghẽn mạch máu và bảo vệ chống lại bệnh Alzheimer. Các

nghiên cứu trước đây cho rằng: thực phẩm từ tôm có chứa cholesterol do đó ảnh

hưởng đến tim mạch. Tuy nhiên, khi so sánh với các thực phẩm khác như trứng thì

tôm có hàm lượng cholesterol thấp hơn. Do đó, ăn tôm có thể chống lại bệnh rối

loạn nhịp tim và huyết áp cao. Hàm lượng các muối khoáng cao, đặc biệt là

selenium ở tôm có vai trò cảm ứng tổng hợp và sửa chữa DNA, loại bỏ các tế bào

bất thường, ức chế sự sinh sản tế bào ung thư và gây nên sự chết theo chương trình

(apoptosis) của tế bào. Ngoài ra, selenium còn tham gia vào các vị trí hoạt động của

nhiều protein quan trọng, bao gồm cả các enzyme chống oxy hóa [143], [231].

Tôm sú là loài động vật thủy sản được khai thác tự nhiên cũng như nuôi,

mang lại lợi nhuận rất lớn nhờ xuất khẩu tại nhiều nước trên thế giới, trong đó có

các nước châu Á như Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia,

Indonesia, Ấn Độ...[174]. Nghề nuôi tôm sú có ưu thế rất lớn đối với các nước này

vì đây là nguồn tài nguyên bản địa có thể nuôi và khai thác lâu dài, có đóng góp hết

sức quan trọng vào vấn đề an toàn lương thực, xoá đói giảm nghèo và phát triển

kinh tế xã hội của mỗi nước. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt

Nam (VASEP), năm 2010, diện tích nuôi tôm sú cả nước đạt 613.718 ha, giá trị

xuất khẩu tôm sú đạt 1,45 tỷ USD [16].

1.1.2. Tình hình nuôi và dị ch bệ nh tôm sú ở Việt Nam

Nước ta có diện tích mặt nước ngọt, lợ và biển khá lớn, bao gồm các sông,

suối, ao hồ và gần 3200 km bờ biển với thành phần giống loài thủy sản phong phú

là tiềm năng to lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản. Tôm sú là đối tượng nuôi phổ

biến ở các vùng nước lợ, mặn trên toàn quốc. Nghề nuôi tôm ở nước ta là một thế

mạnh của thuỷ sản, Việt Nam đã trở thành một trong 5 quốc gia xuất khẩu tôm lớn

nhất thế giới. Tôm sú Việt Nam đã được xuất khẩu sang hơn 80 nước và vùng lãnh

thổ [201]. Duy trì sự ổn định của nghề nuôi tôm phụ thuộc rất nhiều vào nguồn tôm

khỏe mạnh và sự kiểm soát dịch bệnh hiệu quả. Một trong những vấn đề mà nghề

nuôi tôm sú ở Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới đang phải đối mặt là

nguồn tôm sú bố mẹ. Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhưng gia

hóa tôm sú vẫn còn nhiều khó khăn, nguồn tôm sú bố mẹ đã đượ c gia hó a thà nh

công, tuy nhiên tôm bố mẹ gia hó a cấ p cho cá c trạ i sả n xuấ t tôm giố ng chưa đượ c

nhiề u. Hàng năm, ước tính có khoảng hơn 10 tỷ con tôm sú giống giai đoạn PL15

(postlarva 15 - tôm giống 15 ngày tuổi) được sản xuất từ hàng nghìn trại sản xuất

tôm giống [3]. Sử dụng nguồn tôm bố mẹ còn mang tính thụ động, tự nhiên, cộng

với những yếu tố khác do chính điều kiện sản xuất kinh doanh tại các trại sản xuất

tôm giống chi phối thường dẫn đến chất lượng tôm sú giống không được đảm bảo,

có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng, mang mầm bệnh và tiềm ẩn nhiều rủi ro lớn cho

người nuôi tôm.

Theo thống kê của Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 dịch bệnh tôm

sú đã làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng. Trong năm 1994, tổng diện tích nuôi tôm sú

có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn, trị giá

khoảng 294 tỷ đồng. Đến nay, dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càng rộng gây

tổn thất nghiêm trọng. Đồng bằng sông Cửu Long bị thiệt hại lớn nhất do tập trung

khoảng 87% diện tích nuôi tôm sú của cả nước. Hiện tượng tôm chết hàng loạt ở

các tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 - 1994 đượ c xác định ở tôm sú có các loại

bệnh chính là bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng… [8], [10], [11].

Nước ta đã bước đầu chú ý đến các nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng

giống và kiểm soát dịch bệnh. Các nghiên cứu bước đầu tập trung nghiên cứu đa

dạng genome tôm sú [9], phát hiện bệnh tôm sú [3], [4], [13], đưa ra giải pháp

phòng bệnh cho tôm sú [2], nghiên cứu một vài protein cấu trúc tái tổ hợp của

WSSV trong phòng thí nghiệm nhằm mục đích phòng trị bệnh cho tôm sú [1], [12],

[15]. Đây là những hướng nghiên cứu phù hợp và có triển vọng, đặt cơ sở khoa học,

kỹ thuật cho phép thực hiện các nghiên cứu nâng cao chất lượng của giống thủy sản

có giá trị kinh tế cao này.

1.1.3. Các bệnh thƣờng gặp ở tôm sú

1.1.3.1. Bệnh do vi khuẩn

Các vi khuẩn liên quan đến bệnh ở tôm có thể là nguồn bệnh trực tiếp hoặc

gây bệnh cơ hội. Bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn ở tôm có thể gây chết, tổn thương

kitin, hoại tử, sự đổi màu của mang, tăng trưởng chậm, lớp biểu bì lỏng lẻo, ruột

trắng, trạng thái hôn mê và hấp thụ thức ăn giảm… Các vi khuẩn gây bệnh chủ yếu

ở tôm nuôi là Vibrio, vi khuẩn dạng sợi, vi khuẩn màng nhày, vi khuẩn phân hủy

chitin và vi khuẩn ký sinh [103].

Các loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio spp là nguồn gây bệnh chính ở tôm, chúng

phân bố rộng rãi trong môi trường nước ngọt, nước lợ và biển. Hơn 20 loài thuộc chi

này đã được biết đến, một số trong chúng là nguồn bệnh ở người (V. cholerae, V.

parahaemolyticus và V. vulnificus) trong khi một số loài là nguồn bệnh của các động

vật ở nước bao gồm tôm (V .harveyi, V. spendidus, V. penaecida, V. anguillarum, V.

parahaemolyticus, V. vulnificus). Phần lớn các loài trong chi Vibrio spp được cho là

nguồn bệnh cơ hội, một số trong chúng có thể là nguồn bệnh chính như V. harveyi. V.

harvey là vi khuẩn phát sáng được tìm thấy trên bề mặt cơ thể và ruột của các sinh vật

sống ở nước biển, nước lợ và cũng tìm thấy trong các ao nuôi tôm và đáy ao [95],

[189]. Tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy là do Proteobacterium alpha. Các vi khuẩn

sợi như Leucothrix mucor, Thiothrix sp, Flexibacter sp, Flavobacterium, Cytophaga

sp có thể gây bệnh cho tôm ở giai đoạn ấu trùng. Dấu hiệu của bệnh là màu mang

thay đổi, tiêu thụ thức ăn thấ p, sinh trưởng kém và tỷ lệ chết cao. Bệnh này xuất hiện

khi chất lượng nước kém và ở mật độ nhiễm cao có thể dẫn đến sự hoại tử mô mang.

Các vi khuẩn gây bệnh phân hủy vỏ kitin bao gồm: Benekea, Pseudomonas,

Aeromonas, chi vi khuẩ n xoắn và vi khuẩn ký sinh [103].

1.1.3.2. Bệnh do nấm và ký sinh trùng

Đến nay đã có khoảng 50 loài nấm được phân lậ p từ môi trường nước lợ và

nước biển, một số chúng là nguồn gây bệnh cơ hội cho tôm. Hầu như tất cả các giai

đoạn ấu trùng tôm bị nhiễm nấm và tác nhân phổ biến là Lagenidium callinectes và

Sero spp. Giai đoạn protozoae và mysis thường bị nhiễm với các triệu trứng bệnh

như hôn mê và gây chết do bào tử nấm và hệ sợi nhiễm vào các mô như phần phụ

và mang. Bệnh nấm ở ấu trùng phổ biến ở nơi ươm giống tôm. Gopalan và đtg

(1980) cho rằng, Lagenidium marina và Siro para là tác nhân nhiễm ở tôm sú [76],

chúng gây chết ở ấu trùng tôm sú giai đoạn nauplii, zoea và mysis [163]. Bệnh

mang đen và Fusariosis gây ra bởi Fusarium spp có thể gây ảnh hưởng tất cả các

giai đoạn phát triển của tôm penaeid. Fusarium spp (F. solani, F. moniliformae) là

các nguồn bệnh cơ hội có thể dẫn đến tỷ lệ chết cao (90%). Bệnh được cho là do các

ao nuôi có chất lượng nước kém. Sợi nấm được phát hiện ở mô động vật bị nhiễm

bằng sử dụng kính hiển vi quang học [103].

Một số sinh vật ký sinh, đặc biệt là động vật nguyên sinh có thể nhiễm vào

tôm ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Các động vật nguyên sinh cùng hội sinh

có thể phát hiện được ở mang, chân bơi (periopod), các phần phụ khác và các cơ

quan bên trong cơ thể. Ở mức độ nhiễm cao, các động vật nguyên sinh có thể gây

tắc nghẽn ở mang (mang trở nên màu nâu) dẫn đến chứng biếng ăn, giảm sinh

trưởng, vận động và tăng khả năng nhiễm các nguồn bệnh cơ hội khác. Động vật

nguyên sinh như Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Anophrys, Acineta sp,

Agenophrys và Ephelota có thể là các ký sinh trùng tác động từ bên ngoài. Các ký

sinh trùng như Paranophrys spp và Parauronema sp có thể gây chết cho tôm ở giai

đoạn ấu trùng và ấu niên. Các ký sinh trùng này đi vào cơ thể tôm qua vết thương

và xâm nhiễm vào máu, mang làm tăng tỷ lệ chết, đặc biệt trong trường hợp có sự

xâm nhiễm kết hợp với các ký sinh trùng khác như Leptonmonas spp. Tôm bị nhiễm

các ký sinh trùng này có thể chẩn đoán bằng kiểm tra độ đục của máu, máu không

đông, lượng tế bào máu giảm và số lượng ký sinh trùng tăng rất lớn. Các động vật

nguyên sinh kí sinh bên trong tôm thường tồn tại dưới dạng nhóm, chúng có 2 loại

vật chủ là động vật thân mềm (giun đốt) và giáp xác. Các nhóm động vật nguyên

sinh được phát hiện ở tôm bao gồm: Nematopsis litopenaeus, Paraphioidina

scolecoide, Caphalobolus litopenaeus, Caphalobolus petiti và Caphalobolus stenai.

Các bào tử trưởng thành và giao tử được tìm thấy ở thành ruột và các khoang của cơ

thể. Các bệnh do ký sinh trùng gây giảm hấp thụ thức ăn nhưng dường như ít ảnh

hưởng đến nuôi trồng thủy sản. Một số ký sinh trùng khác như Agmasoma spp,

Microsporidium spp có thể xâm nhiễm vào cơ, tim, tuyến sinh dục, mang và gan

tụy. Tôm bị nhiễm dẫn đến các mô bị mờ đục và uốn cong cơ thể nhưng không gây

chết tôm, tôm bị bệnh ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Có thể chẩn đoán bệnh

này nhờ quan sát các bào tử ở mô cơ bị nhiễm [103].

1.1.3.3. Bệnh do virus

Virus là nguồn bệnh phổ biến nhất ở biển, chúng hiện diện đến 10 tỷ trong 1

lít nước biển và một số trong chúng có thể nhiễm vào nhiều sinh vật [74]. Đến nay,

các nhà khoa học đã phát hiện hơn 20 loại virus nhiễm ở tôm [126]. Trong số các

virus này, virus được nghiên cứu nhiều nhất ở tôm nuôi là WSSV, YHV và TSV,

chúng được cho là các virus gây bệnh nghiêm trọng nhất ở tôm [59]. Tuy nhiên, có

rất ít hiểu biết về các virus này ở giáp xác hoang dã [34]. Trong đó , tôm sú n hiễm

WSSV và YHV gây nên bệnh nghiêm trọng cho tôm nuôi, kết quả dẫn đến sự thiệt

hại lớn về kinh tế.

Bệnh đốm trắng gây ra bởi virus gây hội chứng đốm trắng (White spot

syndrome virus - WSSV) được phát hiện lần đầu tiên ở Đài Loan năm 1992, tiếp

đến là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc vào năm 1993. Do nuôi tôm thâm canh,

môi trường nuôi tôm không an toàn và sự thương mại sản phẩm đông lạnh trên toàn

thế giới, WSSV nhanh chóng lan ra các vùng nuôi tôm ở khu vực châu Á, châu Âu

và cả châu Mỹ [64], [117]. Trong số các virus gây bệnh ở tôm sú, WSSV gây thiệt

hại lớn nhất và là một vấn đề lớn mà ngành thủy sản phải đối mặt cho đến hiện nay

[174]. Ở tôm nuôi, nhiễm WSSV có thể dẫn đến tỷ lệ chết lên đến 100% trong vòng

3-10 ngày [97]. Ngoài họ tôm penaeid, WSSV lây nhiễm một loạt các động vật giáp

xác khác như cá, tôm hùm, cua và thậm chí được phát hiện ở cả côn trùng [64]. Tuy

nhiên, sự lây nhiễm thường không gây chết cho các loài này và do đó chúng là động

vật mang virus [124], [123], [221].

Hình 1.2. Tôm sú nhiễm WSSV [119]

Các động vật nhiễm bệnh có dấu hiệu kém ăn, chuyển động chậm, màu cơ

thể chuyển từ hồng sang đỏ, thường có khuynh hướng cặp mé bờ, sau đó chết và

chìm xuống đáy. Gan, tụy thường có màu trắng hoặc hơi vàng. Đặc trưng của tôm

bị nhiễm WSSV là các đốm trắng trên vỏ kitin (Hình 1.2). Những đốm trắng này là

kết quả của sự vôi hóa, có kích thước từ vài mm đến 1 cm hoặc có thể hơn, vỏ mỏng

lỏng lẻo có thể bóc ra khỏi lớp biểu bì một cách dễ dàng [2], [51].

Genome của WSSV là DNA sợi đôi, vòng, siêu xoắn có kích thước khoảng

300 kb. Trong đó, chủng phân lập từ Thái Lan có kích thước nhỏ nhất 292967 bp,

genome của WSSV ở Đài Loan có kích thước lớn nhất là 307287 bp, genome của

WSSV phân lập từ tôm sú ở Trung Quốc là 307107 bp. Genome WSSV phân lập từ

Trung Quốc, Đài Loan và Thái Lan đã được phân tích, những biến đổi về trình tự

nucleotide giữa các virus đã được công bố [140]. Phân tích trình tự của DNA

genome tôm sú và so sánh với dữ liệu trình tự đã chỉ ra rằng WSSV không có sự

tương đồng với bất kỳ virus nào đã được biết đến. WSSV được xếp vào một họ

virus mới (Nimarividae) và một chi virus mới: Whispovirus [213].

WSSV có thể được truyền nhiễm theo cả chiều ngang và chiều dọc [66]. Sự

lây truyền này có thể qua nước và thức ăn, các loại giáp xác hoang dã trong ao và do

tôm khoẻ ăn con bị nhiễm bệnh đốm trắng [50], [100]. Các mô đông lạnh cũng có thể

là nguyên nhân lây truyền bệnh [63]. Sau đó sự xâm nhiễm được cho là chủ yếu

thông qua mang, nhưng có thể xảy ra thông qua bề mặt khác của cơ thể [42], [50],

[51]. WSSV cũng lây truyền theo chiều dọc trực tiếp từ mẹ sang con cái, duy trì qua

giai đoạn ấu trùng, tôm giống và đã được chứng minh bằng thực nghiệm mặc dù sự

xuất hiện của WSSV ở trứng của tôm vẫn chưa được rõ ràng [122], [158]. Kết quả

theo dõi tôm sú nuôi tại Việt Nam của Bùi Quang Tề cho thấy WSSV lan truyền theo

chiều ngang là chính [8]. Cho đến nay, không có loài tôm nào thuộc họ tôm he được

biết là có khả năng kháng WSSV [117], [127]. Có nhiều phương pháp để chẩn đoán

WSSV bao gồm phương pháp mô học và kính hiển vi được thực hiện bằng cách kiểm

tra phần mô nhuộm màu [117]; các phương pháp miễn dịch dựa trên việc tạo ra

kháng thể đơn dòng và đa dòng để chống lại các kháng nguyên virus. Các kháng thể

đơn dòng và đa dòng [135], [242], phân tích miễn dịch [147]. Bên cạnh đó, các

phương pháp sinh học phân tử được sử dụng phổ biến như phương pháp Dot blot

[62], [182], kỹ thuật lai phân tử [42], [230], phương pháp PCR [117], [121].

Bệ nh đầ u và ng gây ra do virus gây hộ i chứ ng đầ u và ng (Yellow head virus –

YHV) được phát hiện lầ n đầu tiên ở tôm sú tại Thái Lan năm 1990. Tôm nhiễm

YHV thường được mô tả với màu vàng sáng ở vùng đầu ngực và cơ thể thường

nhợt nhạt (Hình 1.3). Màu vàng của vùng đầu ngực là do triệu trứng bệnh ở gan tụy

màu vàng [44]. YHV lan rộng và nhanh trong các vùng nuôi tôm sú ở Thái Lan.

Tôm bị nhiễm YHV chết trong vòng vài giờ và toàn bộ tôm nuôi có thể bị thiệt hại

trong vòng 3-5 ngày sau khi xuất hiện tôm nhiễm [72] với sự hoại tử ở cơ quan bạch

huyết, mang, mô liên kết, tế bào máu và cơ quan tạo máu [216]. Cơ quan bạch huyết

có thể là đích đầu tiên của YHV dựa trên cơ sở nghiên cứu mô bệnh và nghiên cứu

thụ thể YHV [24], [130]. Ngoài tôm sú, YHV gây bệnh ở tôm thẻ chân trắng

(Litopenaeus vannamei) và tôm xanh Thái Bình Dương (Penaeus stylirostris) [128],

tôm trắng Thái Bình dương (Penaeus sytiferus) và Acete spp [67]. YHV có kích

thước rộng 40-60nm, dài 150-200nm, ở đầu tròn có chứa RNA sợi đơn (+) khoảng

26 kb. Virus này thuộc chi Okavirus, Roniviridae, Nidovirales [44], [228]. YHV tồn

tại ít nhất 3 biến thể di truyền khác nhau [215], biến thể đầu tiên được công bố là

YHV phân lập ở Thái Lan khác biệt với biến thể virus kết hợp với mang (Gill

associated virus - GAV) ở Úc khoảng 15% trình tự nucleotide [53]. Kiểu trung gian

thứ 3 của YHV được phát hiện ở Thái Lan và Việt Nam [103].

Hình 1.3. Tôm sú nhiễm YHV [8]

Tôm nhiễm YHV có thể được chẩn đoán bằng mô bệnh học nhờ quan sát sự

xuất hiện khối hoại tử lớn và thể vùi tế bào chất ở các mô ngoại bì và trung bì [35],

[44]. Để phát hiện nhanh YHV, đã có một số quy trình chẩn đoán được thực hiện

như nhuộm [70], [71], dot blot [129], [148], kỹ thuật Western blot [147], kỹ thuật

RT - PCR [229] và mẫu dò gen [200]. Các kỹ thuật miễn dịch cũng được sử dụng để

phát hiện sự lây nhiễm, kháng thể kháng YHV được sản xuất ở Thái Lan [183],

[184] để ứng dụng cho chẩn đoán mô bệnh của YHV và phát triển các test để chẩn

đoán nhanh bệnh này.

1.1.4. Phƣơng phá p phòng và trị bệnh ở tôm sú

Bệnh truyền nhiễm là một trở ngại chính cho sự thành công, phát triển và là

nguyên nhân gây ra thiệt hại kinh tế rất lớn trong nghề nuôi trồng thủy sản. Để

phòng bệnh do vi khuẩn ở tôm trước khi nuôi thả cần làm kỹ công tác cải tạo ao,

phải có bể chứa lắng để xử lý nước trước khi cấp sang ao nuôi. Tôm giống thả nuôi

phải được kiểm dịch, có chất lượng tốt và nuôi ở mật độ thích hợp, không nên nuôi

với mật độ qúa cao dẫn đến tôm dễ nhiễm bệnh. Việc quản lý môi trường tốt, không

cho thức ăn dư thừa để tránh hiện tượng tảo chiếm ưu thế trong ao gây ra ô nhiễm

nền đáy tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển gây bệnh. Trong quá trình nuôi cần cải

thiện môi trường nuôi bằng cách thường xuyên sử dụng các loại vôi một cách hợp

lý, sử dụng máy quạt nước để gom tụ các chất thải vào giữa ao. Việc tăng cường sử

dụng các loại chế phẩm sinh học, bổ sung đường carbon xuống ao tạo điều kiện cho

vi khuẩn có lợi phát triển mạnh át chế vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra, cần tăng cường

sức khoẻ của tôm bằng cách bổ sung vitamin C vào thành phần thức ăn. Các vi

khuẩn có lợi cũng được các nhà khoa học nghiên cứu chế biến trong thức ăn tôm có

tên gọi là probiotics. Khi tôm bị nhiễm bệnh có thể sử dụng các loại thuốc kháng

sinh như Furacin, Oxytetracycin… trộn vào thức ăn cho ăn liên tục 7-10 ngày [8].

Phương pháp này có hạn chế là chi phí mua thuốc lớn, dư lượng kháng sinh lớn ở

cơ thể tôm ảnh hưởng đến môi trường, sức khỏe con người và xuất hiện các mầm

bệnh kháng thuốc có thể là nguồn bệnh lây nhiễm cho con người. Vì vậy, cần phải

tìm ra một chất mới có thể thay thế cho thuốc kháng sinh đồng thời chống lại mầm

bệnh trên thủy sản [238].

Đối với các bệnh do nấm và ký sinh trùng cần phải sử dụng giải pháp phòng

và trị bệnh tổng hợp. Trong các ao trại ươm giống, nuôi tôm, thức ăn tươi sống có

nguy cơ nhiễm nguồn bệnh do vậy cần phải được khử trùng. Đáy ao phải thường

xuyên được xử lý bằng các hóa chất để diệt nguồn bệnh trong phân trước khi nuôi.

Một số hóa chất đã được sử dụng như formalin, xanh malachite và trelafan [8].

Hiện nay, chưa có phương pháp hiệu quả để xử lý các bệnh do virus gây ra.

Do vậy, chiến lược chính để giảm bệnh ở tôm là phòng tránh. Để phòng bệnh tôm

sú trước tiên phải kiểm nghiệm và chọn con giống sạch bệnh trước khi thả nuôi

bằng các phương pháp khác nhau, trong đó PCR là phương pháp tương đối hiệu

quả. Thêm vào đó ao nuôi tôm cần được tháo cạn nước và xử lý bằng hóa chất,

nước được đưa vào ao nuôi cũng phải được xử lý bởi các hóa chất cho phép để loại

bỏ các tác nhân có thể gây bệnh. Tiếp theo, người nuôi tôm phải chọn mùa vụ thích

hợp để thả tôm, tránh thả tôm vào giữa và cuối mùa mưa do nhiệt độ không khí và

lượng nước thấp. Mưa lớn có thể là một nguyên nhân đưa nước chưa được xử lý vào

ao nuôi. Hạn chế không cho nước chưa được xử lý vào ao nuôi đồng nghĩa với việc

hạn chế được tác nhân mang mầm bệnh cho tôm như các loài giáp xác hoang dã.

Đồng thời trong quá trình nuôi, ao nuôi tôm cũng phải xử lý formol định kỳ nhằm

loại bỏ những cá thể bị nhiễm virus đốm trắng ra khỏi quần đàn một cách kịp thời.

Việc nuôi tôm cần có các ao chứa để xử lý việc lan tràn nguồn bệnh khi dịch bệnh

bắt đầu xảy ra. Ngoài ra, trong quá trình nuôi tôm việc sử dụng một chế độ ăn thích

hợp cũng góp phần tạo môi trường an toàn [2], [117].

Có nhiều bằng chứng cho rằng tôm không có khả năng bảo vệ cơ thể khi tiếp

xúc lần đầu tiên với các tác nhân gây bệnh mới xuất hiện. Điều này chỉ ra tôm

không có hệ miễn dịch thích ứng. Tuy nhiên, một số tôm vẫn có khả năng tồn tại và

phát triển tương đối khi tiếp xúc với tác nhân gây bệnh [68]. Mặt khác, tôm khỏe

mạnh thường bị nhiễm virus ở mức độ thấp [90], [215] và tôm tiếp xúc với tác nhân

gây bệnh virus đã được chứng minh có khả năng kháng khi tiếp xúc virus ở lần tiếp

theo [212]. Do vậy, một trong cá c giải pháp đã được nghiên cứu sử dụng để tăng

cường khả năng miễn dịch cho tôm là các chất chiết xuất từ các loài sinh vật và các

chất kích thích miễn dịch. Nhiều chất chiết xuất từ các loài sinh vật khác nhau được

kết hợp trong chế độ ăn của tôm trước và sau khi nhiễm WSSV, đã chứng minh cải

thiện khả năng miễn dịch và làm giảm tỷ lệ tử vong của tôm bị nhiễm WSSV. Các

chất đó là Fucoidan chiết xuất từ tảo biển Sargassum polycystumwas [49], 2-

methylheptyl chiết xuất từ lá Pongamia pinnata [164] và một số chất khác chiết xuất

khác [29], [52]. Ngoài ra, chế độ ăn có các các chất kích thích miễn dịch như β-1, 3-

glucan [40], [41], lipopolysaccharide [199], peptidoglycan [110] có khả năng kích

thích miễn dịch bẩm sinh giúp tôm có khả năng sống sót cao hơn khi nhiễm WSSV.

1.2. HỆ MIỄN DỊCH TÔM SÚ

Động vật không xương sống, trong đó có tôm chỉ phát triển hệ miễn dịch tự

nhiên (innate immunity) [88], [91]. Hệ miễn dịch tự nhiên chia ra làm hai hệ thống

bảo vệ chính: miễn dịch tế bào (cellular barriers) và miễn dịch dịch thể (Humoral

barriers). Miễn dịch tế bào bao gồm hệ thống thực bào (phagocytocis), tạo thể bao

(encapsulation), thể hạch (nodulation) bao vây vật thể lạ xâm nhập và sau đó phá

hủy thông qua hệ thống hoạt hóa Pro-phenoloxidase (proPO activating system).

Ngoài ra, trong đáp ứng miễn dịch kháng virus còn có cơ chế apoptosis. Miễn dịch

dịch thể bao gồm các hệ thống: bổ thể (complement system), đông máu

(hemolymph coagulation system), yếu tố dính kết tế bào (agglutinin - lectin system)

và quá trình tổng hợp các loại peptide kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus [98],

[119], [202], [235]. Các hệ thống bảo vệ cơ thể của động vật không xương sống

được thể hiện ở bảng 1.1. Ngoài ra,vỏ kitin ở tôm là rào cản vật lý có vai trò trong

các quá trình sinh lý khác nhau liên quan đến các phản ứng miễn dịch [146].

1.2.1. Đáp ứng miễn dịch tế bào

1.2.1.1. Thành phần tế bào

Động vật giáp xác có hệ thống tuần hoàn mở với máu màu xanh lá cây, tuần

hoàn qua mạch máu và đưa đến các mô. Các tế bào máu (hemocytes) và thành phần

dịch thể được vận chuyển trong máu giúp chúng tiếp xúc dễ dàng với các phân tử từ

bên ngoài. Sự tạo máu hình thành nên các tế bào trưởng thành của hệ thống miễn

dịch tự nhiên, số lượng tế bào máu thể hiện vai trò bảo vệ vật chủ và sự cân bằng.

Sự hình thành tế bào máu được điều khiển bởi các tín hiệu bên trong và ngoài tế

bào, kết quả dẫn đến sự hoạt hóa của hàng loạt tín hiệu đặc trưng. Mô tạo máu

(hematopoietic tissue - HPT) ở động vật giáp xác là một mạng lưới của tiểu thùy

nằm ở hai bên lưng và mặt trên của dạ dày, gần động mạch dâu và ở gốc hàm. Các

tế bào máu được tạo ra trong thành của các ống này và giải phóng vào trong các

khoang mạch. HPT của tôm sú và tôm penaeid khác nằm trong các vùng khác nhau

của dạ dày, hàm và tuyến râu [80].

Các tế bào máu ở họ tôm Penaeid nói chung và ở tôm sú nói riêng có đặc

tính sinh học và chức năng tương tự với các đại thực bào, bạch cầu hạt và tế bào

giết tự nhiên của động vật có xương sống [208]. Những tế bào này thực hiện các

quá trình thực bào, hình thành thể hạch, thể bao, melanin, hoạt hóa proPO và

apoptosis. Chúng cũng tạo ra các yếu tố dính kết tế bào (agglutinin-lectin system),

hệ thống đông máu (hemolymph coagulation system), hệ thống bổ thể (complement

system), và peptide kháng khuẩn (AMP) [98], [119], [202], [235]. Các tế bào máu

giải phóng các enzyme ức chế cần thiết để điều khiển phân giải nhiều protein, ngăn

chặn sự biểu hiện quá nhiều protein và các mô bị phá hủy [99], [209].

Có ba loại tế bào máu (hemocytes) ở tôm: bạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạt

và bạch cầu bán hạt [7], [80] (Hình 1.4). Các bạch cầu đơn nhân chiếm 5 - 15% tế

bào máu lưu thông, là những tế bào nhỏ không khúc xạ, có nhân nhỏ, trong tế bào

chất có ít hoặc không có hạt tế bào chất. Bạch cầu đơn nhân không có hoạt động

thực bào và dễ dàng bám vào các bề mặt kính, giống như các đại thực bào ở cá và

động vật có vú. Vai trò chính của các tế bào này có liên quan đến quá trình đông

máu và thực bào [247]. Bạch cầu hạt chiếm 10-20% tế bào máu lưu thông, nhân nhỏ

nhất trong số các tế bào máu. Loại tế bào này có thể bị kích thích bởi β-1,3-glucans,

peptidoglycans (PG) và lipopolysaccharides (LPS) để gây nên sự xuất bào

(exocytosis) và giải phóng enzyme. Ngoài ra, trong tế bào chứa lượng lớn hạt tế bào

chất (hạt có chiều rộng 0,8M), các hạt sẽ giải phóng ra các protein bám β-glucan;

lipopolysaccharide; peptidoglican, các yếu tố đông máu (transglutaminase), các yếu

tố liên quan đến enzyme prophenoloxidase (proPO; ppA; peroxinectin), các chất ức

chế proteinase (-macroglobulin; karazl; serpin; pacifastin) và các chất kháng

khuẩn (penaeidin; lectin). Chức năng của chúng là hình thành thể bao, khởi động hệ

thống proPO và thực bào. Các bạch cầu bán hạt chiếm 75% tế bào máu lưu thông,

có một số lượng lớn các hạt nhỏ (hạt có chiều rộng 0,4 micromet) giống như bạch

cầu hạt ở động vật có xương sống. Các tế bào này chứa các thụ thể cho β-1,3-

glucans và hoạt động chức năng chủ yếu của chúng liên quan đến thực bào, tạo thể

bao để bao bọc các vật thể lạ và đông máu [142], [247].

Hình 1.4. Tế bà o má u tôm sú

A. Tế bào máu tôm sú chụp dƣới kính hiển vi: H (Hyaline cell - Bạch cầu đơn nhân; S

(Semigranular cell - bạch cầu bán hạt); L (Large granular cell - Bạch cầu hạt), B. Mô phỏng các

loại tế bào máu ở giáp xác [194]

1.2.2.2. Các quá trình đáp ứng miễn dịch tế bào

Thực bào là cơ chế miễn dịch tế bào chính ở tôm liên quan đến sự thu nhận

các vật thể lạ từ bên ngoài. Cơ chế này được thực hiện bởi bạch cầu bán hạt và bạch

cầu hạt. Quá trình thực bào bao gồm các bước: hướng hóa, bám chặt, tiêu hóa, phá

hủy tác nhân gây bệnh và xuất bào [106], [210]. Nhìn chung, quá trình thực bào ở

động vật không xương sống nói chung và tôm nói riêng tương tự như ở động vật có

xương sống. Tuy nhiên, sự tiếp xúc miễn dịch luôn được thực hiện có tính ngẫu

nhiên, rất hiếm chủ động theo kiểu hóa hướng động ở động vật có xương sống [5].

Ngoài ra, bạch cầu bán hạt có khả năng nhận biết các tác nhân xâm nhập và hoạt

động như là một sự opsonins hóa kết hợp với hệ thống hoạt hóa proPO [166]. Các thể

hạch phân giải tế bào máu phát hiện trong gan tụy và mang, được hình thành bởi

nhiều tế bào máu cùng hoạt động hỗ trợ để bẫy các vi sinh vật hoặc các kháng nguyên

lớn mà không thể loại bỏ bởi cơ chế thực bào. Sau đó, các thể hạch này trải qua sự

hoạt hóa của hệ thống proPO, sự melanin hóa và phá hủy vi khuẩn [208], [219].

Các yếu tố chống oxy hóa bảo vệ tôm khỏi những tác động gây độc tế bào

gây ra bởi trao đổi chất tế bào và stress oxy hóa tạo ra bởi sự mất cân bằng của các

chất phản ứng ôxy trung gian (reactive oxygen intermediates - ROIs) và chất phản

ứng nitơ trung gian (reactive nitrogen intermediates - RNIs). Để ngăn chặn sự phá

hủy này, chiến lược bảo vệ chất chống oxy hóa đã được phát triển bao gồm các

enzyme (catalase, glutathione peroxidase (GPX), SOD) và các thành phần khác

(ascorbate, β-carotene, flavonoid, α-tocopherol và vitamin E) có thể trung hòa ROIs

hoặc sửa chữa sự phá hủy ở mức độ phân tử cho tế bào [151]. Bằng thực nghiệm

Down và đtg (2001) đã đưa ra kế t luậ n các enzyme chống oxy hóa đóng vai trò như

các chất điều khiển đáp ứng miễn dịch [61]. Hoạt động của enzyme superoxide

dismutase (SODs) là một trong những cơ chế bảo vệ chính chống lại stress oxy hóa

gây ra bởi ô nhiễm, lây nhiễm bệnh, tình trạng thiếu oxy (hypoxia), quá nhiều oxy

(hyperoxia), nhiệt độ và các chất kích thích miễn dịch [153]. Một phân tử SOD

ngoại bào (EC-SOD) đã được công bố ở tôm hùm (Homarinus capensis), nó kết

hợp với sự thực bào, sự hình thành thể bao, sự opsonin hóa và tạo ra các hợp chất

diệt khuẩn [89]. Tuy nhiên, việc tạo ra các hợp chất oxy hóa có tác dụng kháng

khuẩn đã được nghiên cứu trong các tế bào máu ở động vật không xương sống. Sự

đáp ứng tế bào của các chất oxy hóa là rất nhanh và được tạo ra trong suốt quá trình -), gốc tự do

thực bào vi khuẩn. Những hợp chất này bao gồm anion superoxide (O2 hydroxyl (OH-), H2O2, ROIs và RNIs [80].

Bạch cầu hạt tổng hợp, lưu trữ và bài tiết hệ thống prophenoloxydase

(proPO) được hoạt hóa bởi β-glucans nấm, PG và LPS. Các phân tử này cảm ứng

bạch cầu hạt tiết proPO không hoạt động và chuyển đổi chúng thành proPO

enzyme. Enzyme này oxy hóa phenol thành quinon, có thể giúp tiêu diệt mầm bệnh

và được sử dụng để tạo ra melanin [85], [110]. Ngoài ra, các protein tương tác với

các thành phần trong quá trình proPO có liên quan với sự nhận biết và sự trao đổi

của các tế bào máu (Hình 1.5).

Hình 1.5. Hệ thống hoạt hóa proPO và tổng hợp melanin [98]

Melanin hóa là một quá trình hóa sinh phức tạp, ít được biết đến, có liên quan

tới các protease khác nhau (trypsine như serine, serine protease) có sự tham gia của

hệ thống phenoloxidase [157], [170]. Sự melanin hóa đóng một vai trò quan trọng

trong các cơ chế bảo vệ động vật không xương sống [169], trong đó một bao dày của

hắc tố melanin được tạo ra xung quanh tác nhân từ bên ngoài [32]. Melanin, một sản

phẩm của hệ thống proPO, là một sắc tố màu nâu tối với đặc tính kháng khuẩn [89]. -, các gốc hydroxyl Đặc tính diệt khuẩn của melanin và các tác nhân khác như O2

được tạo ra trong quá trình hình thành quinon [85], [210].

Lectin là một họ glycoprotein hoặc protein có một hoặc nhiều vùng chức

năng, nhưng có chung 1 vùng bám carbonhydrat. Lectin được sắp xếp thành nhiều

loại khác nhau [92]. Chức năng của lectin có thể tham gia vào hàng rào đầu tiên

chống lại nguồn bệnh, điều khiển miễn dịch và ngăn chặn sự tự miễn [105].

Kuhlman và đtg (1989) cho rằng lectin có vai trò như là một protein bổ thể làm tăng

quá trình thực bào [108]. Ở tôm sú, lectin đã được tạo dòng và xác định trình tự

[132], [134].

Apoptosis là một quá trình tế bà o chế t theo chương trì nh xả y ra ở cá c cơ thể

sinh vật đa bào và được bảo thủ qua tiến hóa. Nó đóng vai trò quan trọng trong duy trì

hoạt động bình thường của nhiều mô và cơ quan ở cơ thể sinh vật đa bào bằng cách

loại bỏ các tế bào đã bị phá hủy, đặt không đúng chỗ hoặc trở nên không cần thiết.

Apoptosis đóng vai trò quan trọng trong các quá trình kháng virus ở nhiều sinh vật

bằng cách loại bỏ những tế bào nhiễm virus [155]. Do đó, apoptosis như là một cơ

chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên để hạn chế sự sinh sản virus và có thể làm giảm hoặc

loại bỏ sự lây lan của virus trong cơ thể vật chủ. Tuy nhiên, nhiều virus đã có các gen

mã hóa protein có khả năng ngăn chặn hiệu quả hoặc trì hoãn quá trình apoptosis để

sinh sản với số lượng lớn. Một số virus có gen mã hóa protein có thể ức chế vào các

caspase - protein trung tâm trong hoạt động của apoptosis. Mặt khác, số lượng virus

tăng dẫn đến apoptosis hoạt động mạnh. Quá trình apoptosis có thể hoạt động như là

một bước cuối cùng và quan trọng trong sự lây truyền virus đến tế bào lân cận. Số

lượng các phân tử DNA của virus tăng trong tế bào máu dẫn đến hiện tượng

apoptosis ở tôm nhiễm WSSV hoặc YHV. Các caspase là protein trung tâm trong quá

trình apoptosis. Ở tôm thẻ Nhật Bản (Marsupenaeus japonicus) nhiễm WSSV gen

caspase bị „im lặng‟, apoptosis bị ức chế đáng kể dẫn đến sự gia tăng các bản sao của

WSSV, điều này chỉ ra rằng có thể apoptosis đóng vai trò trong cơ chế kháng virus ở

tôm nuôi. Tỷ lệ các tế bào máu thực hiện apoptosis trong tôm nhiễm WSSV là rất

thấp, nhưng cao hơn đáng kể hơn so với tôm càng tiêm WSSV vào ngày 3 hoặc 5 sau

nhiễm. Apoptosis cũng được cho là có vai trò loại bỏ TSV ở tôm trong tự nhiên [119].

Ở tôm sú, gen mã hóa caspase cũng đã được tạo dòng và xác định trình tự [227].

1.2.3. Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Ngoài chức năng tham gia hoạt động trong sự opsonin hóa, thực bào, ngưng

kết và đóng gói tác nhân gây bệnh, các lectin ở động vật không xương sống còn

được coi là phân tử nhận biết nguyên thủy có khả năng phát hiện carbohydrate, thúc

đẩy hệ thống hoạt hóa proPO. Các protein nhận biết mô hình (PRP) là lectins đã

phát hiện các phân tử như LPS, PG, lipoteichoic acid của vi khuẩn, β-1,3-glucans ở

nấm và RNA virus giúp hoạt hóa các cơ chế bảo vệ vật chủ. Các chức năng sinh học

của PRPs là khởi đầu của sự hình thành một loạt các protein hoặc dấu hiệu của cơ

chế bảo vệ và loại bỏ những tác nhân xâm nhiễm hệ thống máu. Khi PRPs phát hiện

kháng nguyên, các tế bào máu di chuyển đến vị trí của chúng bằng hướng hóa, tạo

ra một phản ứng viêm. Kết quả là một cơ chế bảo vệ nhanh và hiệu quả chống lại

tác nhân gây bệnh [80]. Thụ thể Toll receptor (TLRs) cũng là một họ PRRs cổ xưa

có ở các động vật khác nhau có thể phát hiện tất cả các loại tác nhân gây bệnh [93],

[171]. TLRs được hoạt hóa bởi sự lây nhiễm vi khuẩn và virus và đã được công bố

ở tôm thẻ Trung Quốc và tôm thẻ chân trắng [43], [115]. Ở tôm sú, một số protein

được cho rằng có thể đóng vài trò là thụ thể nhận biết mô hình: Rab7, Cyclic AMP-

regulated protein, kazal-type proteinase [192].

Hình 1.6. Cơ chế đông máu ở tôm [98]

Quá trình đông máu được sử dụng để ngăn chặn sự mất máu do tổn thương ở

vỏ kitin và làm bất động các tác nhân gây bệnh xâm nhập [144]. Ở động vật giáp

xác, quá trình đông máu được điều khiển bởi các protein đông máu (Hình 1.6). Các

protein đông máu trong huyết tương hình thành nên dạng polymer cộng hóa trị nhờ transglutaminase phụ thuộc Ca2+ được tiết bởi các tế bào máu [220]. Các protein

đông máu của tế bào có thể được hoạt hóa bởi LPS hoặc β-1,3-glucan và có liên

quan đến hệ thống hoạt hóa proPO [176]. Đáp ứng miễn dịch dịch thể còn có sự

tham gia của các phân tử như cytokine có khả năng hoạt hóa các đáp ứng kháng

khuẩn [150]; peroxynectin thực hiện chức năng phân tán tế bào máu, thực bào, hình

thành thể bao, thể hạch và ngưng kết mà kết quả là sự hoạt hóa peroxide và tiêu hủy

tác nhân xâm nhiễm [187], [188]; Protein sốc nhiệt (heat shock protein -HSP) hoặc

chaperonins ở động vật không xương sống có khả năng bảo vệ và phục hồi cấu trúc

của protein [73]. Năm 2004, mối liên hệ giữa các protein sốc nhiệt, stress và các đáp

ứng miễn dịch của tôm đã được thực hiện bởi Lo và đtg [125], nhóm nghiên cứu đã

tách dòng và mô tả cDNA của gen HSP70 ở tôm sú. Phân tử HSP70 gồm 652 amino

acid với khối lượng phân tử khoảng 71,4 kDa. Sự biểu hiện mRNA của HSP70 ở tế

bào máu tôm tăng 2 đến 3 lần sau một giờ sốc nhiệt và trở lại trạng thái bình thường

sau 30 phút.

Một yếu tố quan trọng chống tác nhân gây bệnh ở động vật không xương sống

là các peptide kháng khuẩn (Antimicrobial peptides - AMPs). Đây là những protein

có trọng lượng phân tử thấp, cần thiết ở các cơ thể sinh vật thiếu khả năng miễn dịch

thích ứng [141]. AMPs có phổ hoạt tính rộng, sự đặc hiệu thấp và gây độc yếu đối với

tế bào động vật. Những peptide này tác động lên màng tế bào của vi khuẩn, nấm, ký

sinh trùng, màng bao bọc virus và thậm chí cả tế bào ung thư, gây nên sự bất ổn định

của các ion và năng lượng dẫn đến sự hình thành các lỗ trên màng tế bào [36], [83].

Lysosome là một thành phần tham gia vào quá trình thực bào, trong lysosome có

chứa nhiều enzyme gọi chung là lysozyme. Lysozyme có vai trò làm giảm các

polysaccharide ở màng nhày của thành tế bào vi khuẩn Gram (-), thay đổi cấu tạo

phân tử của bề mặt tế bào, cho phép các tế bào thực bào dễ dàng nhận biết chúng.

Hầu hết các lysozyme tham gia vào sự phá hủy các vi sinh vật bên trong và bên ngoài

tế bào máu, một số còn đóng vai trò của sterases và chitinases [55].

1.3. NGHIÊN CƢ́ U GEN VÀ TIỀ M NĂNG Ƣ́ NG DỤ NG TRONG PHÒ NG

TRỊ BỆNH CHO TÔM SÚ

1.3.1. Tình hình nghiên cứu genome tôm sú trên thế giới

Nghiên cứu genome sẽ cung cấp những thông tin chính xác nhất cho việc xác

định các tính trạng quan trọng như: tính kháng bệnh, tính chống chịu đối với điều

kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến năng suất, chất lượng sản phẩm của

tôm. Do kích thước genome tôm sú là rất lớn [107] nên việc giải mã, lập bản đồ gen

tôm sú và các loài tôm kinh tế quan trọng khác, như tôm he/thẻ chân trắng, được

tiến hành bằng việc giải mã từng phần. Năm 2000, Wilson và đtg đã phân tích trình

tự đầy đủ genome ty thể (mtDNA) của tôm sú, với kích thước khoảng 15,9 kb, trong

đó có 13 gen mã hóa cho 13 protein, 22 tRNA, 2 rRNA và vùng điều khiển với kích

thước khoảng 1 kb [223].

Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sinh học tôm, đặc biệt quan tâm đến

sự điều khiển sinh trưởng, sinh sản và hệ thống miễn dịch còn rất hạn chế do thiếu

những thông tin về genome của chúng. Một trong các hướng đi quan trọng của

nghiên cứu genome tôm sú là phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử DNA để lập

bản đồ gene, phục vụ công tác chọn giống và nuôi. Bằng phương pháp AFLP,

Wilson và đtg (2002) đã công bố bản đồ di truyền liên kết genome tôm sú. Tuy

nhiên, bản đồ này có mật độ thấp, chỉ bao gồm 20 nhóm liên kết với tổng khoảng

cách là 1,412 cM [224]. Năm 2005, Wuthisuthimethavee và đtg đã lập bản đồ liên

kết di truyền dựa trên các chỉ thị DNA vệ tinh (microsatellite marker). Bản đồ này

bao gồm 9 nhóm liên kết với tổng khoảng cách là 103,6 cM [234]. Nghiên cứu gần

đây nhất, You và đtg (2010) đã xây dựng bản đồ di truyền dựa trên 256 chỉ thị

microsatellite maker và 85 AFLP marker. Kết quả đã phát hiện ra 43 nhóm liên kết

ở tôm đực và 46 nhóm liên kết ở tôm cái. Bản đồ di truyền của tôm đực gồm 176

microsatellite marker và 49 AFLP marker cách nhau ~11,2 cM với tổng chiều dài

genome là 2033,4 cM. Bản đồ di truyền của tôm cái gồm 171 microsatellite marker

và 36 AFLP marker cách nhau ~13,8 cM với tổng chiều dài genome là 2182 cM

[243]. Các microsattelite marker tiếp tục được nghiên cứu, phát triển để lập bản đồ

di truyền liên kết và ứng dụng trong chọn giống tôm sú.

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của các phương pháp sinh

học phân tử hiện đại, nhiều nghiên cứu về gen và genome tôm, đặc biệt là những

phân tích các đoạn trình tự gen biểu hiện (Express Sequence Tag - EST) đã đạt

được nhiều kết quả góp phần làm sáng tỏ một số cơ chế phân tử liên quan đến sinh

trưởng, sức sinh sản và khả năng kháng bệnh. Một trong những dự án giải mã

genome tôm sú lớn nhất cho đến nay là dự án giải mã EST/cDNA genome tôm sú

của Thái Lan do Trung tâm Công nghệ Sinh học (BIOTEC, Thái Lan) thực hiện

trong 5 năm (từ năm 2003 đến 2008). Cơ sở dữ liệu EST của tôm sú sẽ tạo ra nguồn

thông tin di truyền quan trọng để xác định các marker phân tử như: microsattelite và

SNP, lập bản đồ di truyền liên kết phục vụ cho mục đích chọn tạo giống tôm. Kết

quả của dự án này cho đến nay đã thiết lập được hơn 10.000 dòng EST từ 15 thư

viện cDNA từ các loại mô khác nhau của tôm sú trong các điều kiện bình thường và

bất lợi để xác định các gen đặc hiệu mô và các gen đáp ứng với các điều kiện ngoại

cảnh bất lợi (bị nhiễm bệnh, tác động của các yếu tố nhiệt độ, môi trường...). Trong

đó, nhóm nghiên cứu cũng đã xác định được 997 EST có chứa các microsattelite

marker của tôm sú, 74 locus được xác định nằm trong vùng các gen đã biết chức

năng [203].

1.3.2. Nghiên cƣ́ u gen liên quan đế n khả năng miễ n dịch ở tôm sú

Phương pháp phân lập và phân tích các đoạn trình tự gen biểu hiện

(Expressed sequence tag, EST/ cDNA) là một trong các phương pháp sinh học phân

tử hiện đại nhằm tập chung nghiên cứu các gen chức năng. Trong những năm gần

đây, các nghiên cứu về cDNA/EST của genome tôm sú đã đạt được một số kết quả

góp phần làm sáng tỏ một số cơ chế phân tử liên quan đến sinh trưởng, sức sinh sản

và khả năng kháng bệnh. Từ năm 1999, Lehnert và các tác giả khác đã thiết lập thư

viện EST từ các bộ phận đầu ngực, cuống mắt và chân bơi của tôm sú và xác định

được 60 gen mới [111]. Sau đó, hàng loạt gen liên quan đến miễn dịch của tôm sú

cũng được phân lập và xác định trình tự bằng phương pháp phân tích cDNA/EST

[195], [196]. Dự án giải mã cDNA/EST của các nhóm nghiên cứu ở Thái Lan đã tạo

cơ sở dữ liệ u EST quan trọng từ 15 thư viện cDNA ở các mô khác nhau của tôm sú

thường và tôm sú bị gây nhiễm virus [203].

Những nghiên cứu về phản ứng tế bào và dịch thể ở tôm khi bị nhiễm virus đã

được các nhà khoa học rất quan tâm, đặc biệt là xác định và phân tích đặc điểm của

các nhân tố tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch [26], [27], [172]. Trong

những năm gần đây, cùng với sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử

hiện đại, những nghiên cứu liên quan đến hệ miễn dịch ở tôm cũng đạt được nhiều

kết quả góp phần làm sáng tỏ cơ chế phân tử của quá trình này. Từ các chương trình

giải mã cDNA/ EST của một số loài tôm như tôm thẻ chân trắng (P. vanamei) và

tôm sú (P. monodon) đã xác định được trình tự của hàng loạt gen liên quan đến hệ

miễn dịch [79], [195], [196]. Ở tôm sú, nhiều gen liên quan đến miễn dịch đã được

phân lập và xác định trình tự bằng cách sử dụng kỹ thuật RT-PCR [195], [197],

[227]. Trong đó , mộ t số gen liên quan đế n cơ chế miễ n dị ch đã đượ c quan tâm

nghiên cứ u như : protein Rab7 liên quan đế n cơ chế xâm nhiễ m củ a virus ; syntenin

tham gia và o con đườ ng dẫ n truyề n tí n hiệ u nộ i bà o ; hemocyanin có hoạ t tí nh

phenoloxidase liên quan đế n khả năng khá ng khuẩ n , kháng nấm ; protein Ran có

chứ c năng liên quan đế n cơ chế thự c bà o ; protein caspase đượ c cho là tác nhân

trung tâm điề u khiể n cơ chế apoptosis , nhiề u hệ thố ng prote in kháng virus , kháng

khuẩ n cũ ng đã đượ c phân lậ p như gen mã hó a protein khá ng virus (PmAV), gen mã

hóa các yếu tố kháng khuẩn như anti - lipopoysacharide (ALF), penaeidin,

crustin…Những gen này đã và đang được tiếp tục nghiên cứu nhằm chứng minh

chức năng và vai trò của chúng trong cơ chế bảo vệ cơ thể (Bảng 1.1.)

Bảng 1.1. Thố ng kê cá c gen liên quan đế n hệ miễ n dị ch ở tôm

Protein liên

PmRab7

DQ231062 Sritunyalucksana và đtg

quan đế n cơ

(2006) [192]

chế nhậ n biế t

Toll receptor

EF117252 Arts và đtg (2007) [23]

tác nhân gây

Chitin-binding

protein

Chen và đtg (2009) [45]

bệ nh và hệ

(PmCBP)

thống bổ thể

Lectin type C

DQ078266 Luo và đtg (2006) [132]

Protein bá m beta

-1,3-

Roux và đtg (2002) [176]

glucan và

lipopolysacharide

(Lipopolysaccharide

and

beta-1,3-glucan

binding

protein - LGBP)

Protein tham

Syntenin

AF335106 Bangrak và đtg (2002) [31];

gia con đườ ng

Tonganunt và đtg (2005) [207]

dẫ n truyề n tí n

Signal

transducer

and

AY327491 Chen và đtg (2008) [46]

hiệ u

activator of transcription

(STAT)

Eukaryotic

translation

DQ851145 Phongdara và đtg (2007) [160]

initiation

factor

(eIF5A)

Alpha-2-macroglobulin (α2M) AY826818 Tonganunt và đtg (2005) [207]

Protein

liên

Serine protease

FJ620689

Amparyup và đtg (2008) [20]

quan đến hệ

Hemocyanin

AF431737 Bangrak và đtg (2002) [31];

thố ng pro

Zhang và đtg (2004) [245]

phenoloxidase

Prophenoloxidase

AF099741,

Sritunyalucksana và đtg

AF521948

(1999) [191]

Peoroxinectin

AF188840 Sritunyalucksana và đtg

(2001) [193]

Chƣ́ c năng Tên gen Mã số (*) Nhóm nghiên cứu

Melanization

inhibition

Angthong và đtg (2010) [22]

protein (PmMIP)

Serine protease

FJ620689

Amparyup và đtg (2008) [20]

Protein tham

Protein hoạ t hó a thự c bà o

AY680836 Chotigeat và đtg (2007) [48]

gia cơ chế thự c

(Phagocytosis

activating

bào

protein - PAP)

Ran

Perkel (2009) [159]

Rho

Perkel (2009) [159]

Protein liên

Caspase

DQ846887 Wongprasert và đtg

(2007)

quan đế n cơ

[227]; Leu và đtg (2008) [114]

chế apoptosis

Alix/AIP1

(ALG-2-

DQ787160

Sangsuriya và đtg

(2007)

interacting protein X/ALG-

[179]

2-interacting protein 1)

Translationally controlled

AY186580

Bangrak và đtg (2004) [30];

tumor protein (TCTP )

Tonganunt và đtg (2008) [206]

Inhibitor

apoptosis

EF114675 Leu và đtg (2008) [113]

proteins (IAPs)

Protein liên quan

Antivirus protein (PmAV)

AY302750 Luo và đtg

(2007) [131],

(2003) [133];

đến hoạt

tính

kháng khuẩn ,

Crustin

EF654659,

Tassanakajon và đtg

(2010)

kháng nấm và

FJ686014,

[202]

kháng virus

EU623979

Penaeidin

FJ686016,

Tassanakajon và đtg

(2010)

FJ686018,

[202]

AY326471,

AF475082

Yế u tố khá ng khuẩ n (anti-

EU617325,

Tassanakajon và đtg

(2010)

lipopolysacharide factors)

EF523559,

[202]

EF523560

Chƣ́ c năng Tên gen Mã số (*) Nhóm nghiên cứu

Lysozyme

EF434406 Ye và đtg (2009) [237]

Ferritin

EF523241

Zhang và đtg (2006) [244]

Centaurin alpha 1

Wang và đtg (2009) [217]

Enzyme oxy

Enzyme

superoxide

AAW50395 Nayak và đtg (2010) [152]

hóa

dismutase

(Manganese

Superoxide

dismutases

MnSOD)

Glutathione peroxidase (GPX) GQ996722 Liu và đtg (2010) [120]

Protein số c nhiệ t

(HSP -

AF474375 Lo và đtg (2004) [125]

heat shock protein)

Protein liên

Transglutaminase

AY074924 Yeh và đtg (2006) [240]

quan cơ chế

Protein đông má u

AF089867 Yeh và đtg

(2007) [239];

đông má u

(clottable protein - CP)

Cheng và đtg (2008) [47]

Chấ t ứ c chế serin

Jarasrassamee và đtg

(2005)

proteinase

(Kazal-Type

[94]

Serine proteinase inhibitor)

Chú thích: (*) chỉ mã số trình tự các gen phân lập ở tôm sú

(-) chỉ gen chưa chưa có mã số trì nh tự công bố trên Genbank

(+) chỉ gen đã có trình tự nhưng chưa công bố trên Genbank

Chƣ́ c năng Tên gen Mã số (*) Nhóm nghiên cứu

1.3.3. Tiề m năng ƣ́ ng dụ ng củ a gen liên quan đế n miễ n dị ch trong phò ng trị

bệ nh ở tôm sú

Phương pháp phòng và điề u trị các bệnh ở tôm sú do vi khuẩ n , vi nấ m, ký

sinh trù ng và virus đượ c sử dụ ng phổ biế n là điều khiển môi trường nuôi tôm , sàng

lọc tôm giống , sử dụ ng cá c hóa chất , chấ t khá ng sinh và các chất kích thích miễn

dịch. Hiệ n nay , công nghệ sinh họ c trong thủ y sả n phá t triể n , nhiề u gen liên quan

đến miễn dịch ở tôm sú đã đượ c phân lậ p và nghiên cứ u ứng dụ ng trong điề u trị

bệ nh. Các giải pháp được các nhà khoa học quan tâm đó là việc tạo ra các peptide

kháng khuẩn tái tổ hợp, sử dụng kỹ thuật RNAi và tạo các protein vỏ của WSSV tái

tổ hợp.

Peptide kháng khuẩn (Antimicrobial peptide - AMP) là các phân tử tự nhiên

có phổ hoạt tính rộng chống lại nhiều vi sinh vật, dễ tạo ra và rất ít tạo nên sự kháng.

Một vài AMP đã được dùng trị bệnh và sử dụng trong thương mại [167]. Các AMP

có hoạt tính tiềm năng chống lại nhiều nguồn bệnh của động vật dưới nước, sử dụng

các peptide này để điều khiển và ngăn chặn bệnh. Ở loài giáp xác, một số AMPs đã

được xác định như ở cua biển (Carcinus maenas), peptide kháng khuẩn này có kích

thước khoảng 11,5 kDa và có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram (+). Một số họ

AMPs chính được phát hiện ở tôm sú, tôm thẻ chân trắng, tôm thẻ Đại tây dương

(Litopenaeus setiferus) và tôm thẻ Trung Quốc (Fenneropenaeus chinensis) là

penaeidin, crustin và yế u tố khá ng khuẩ n (anti-lipopoysacharide factor - ALF) có khả

năng kháng nấm, kháng vi khuẩn và virus. Các họ AMP này lại có nhiều lớp,

isoform, khác nhau [202].

Hoạt tính sinh học của ALF ở tôm đã được mô tả theo khía cạnh hoạt động

kháng khuẩn chống lại biên độ rộng của các vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của

ALFPm2 (ALF ở tôm sú isoform 2) tái tổ hợp (recombinant ALFPm2 - rALFPm2)

được kiểm tra là kháng E.coli và B. megaterium [202]. ALFPm3 tái tổ hợp

(recombinant ALFPm3 - rALFPm3), một loại ALF ở tôm sú dạng (isoform) 3 thuộc

nhóm I bộc lộ hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram (-) và (+) cũng như

nấm. Đáng chú ý, rALFPm3 có phổ hoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn và nấm bao

gồm cả V.harvey - một vi khuẩn gây bệnh cho tôm nuôi. rALFPm3 giết chết

V.harvey ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - minimum inhibitory contrentration) là

0,78-1,56M, trong khi đó kháng sinh được tổ chứ c thự c phẩ m và thuố c (FDA -

Food and Drug Administration) chấp nhận sử dụ ng trong nuôi trồng thủy sản là

oxytetracyline, có thể giết chết vi khuẩn ở MIC 72,1-90,3M [162], [168].

Họ crustin có 3 lớp đều có các peptide được nghiên cứu tái tổ hợp.

CrustinPm1 (Crustin ở tôm sú dạng 1) có hoạt động kháng khuẩn chống lại vi khuẩn

Gram (+) bằng sự ức chế mạnh mẽ chống lại Staphylococcus aureus và

Staphylococcus iniae [197]. Crus-likePm (Crustin-like antimicrobial peptide -

peptide kháng khuẩn tương tự crustin ở tôm sú) tái tổ hợp cũng cho thấy hoạt động

kháng khuẩn đối với cả vi khuẩn Gram (+) và (-) bao gồm cả V. harveyi [21].

SWDPm2 (single whey acidic protein domain Penaeus monodon 2) tái tổ hợp biểu

hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram (+) [19]. Chưa có công bố nào

về penaeidin tái tổ hợp từ tôm sú, nhưng pen2 (penaeidin dạ ng 2) và pen3

(penaeidin dạ ng 3) tái tổ hợp tạo ra từ tôm thẻ chân trắng, được chứng minh có một

phổ kháng nấm và kháng khuẩn Gram (+). Pen3 có phạm vi rộng và chống lại hiệu

quả hơn các loài vi khuẩn [54]. Tuy nhiên, pen3 có rất ít hoặc không có hoạt tính

chống lại vi khuẩn Gram (-), pen5 (penaeidin dạ ng 5) ở tôm thẻ Trung Quốc có chứa

hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram (-), vi khuẩn Gram (+) và nấm [102].

Nghiên cứu ALFPm3 tái tổ hợp từ tôm sú chỉ ra rằng ALF có ảnh hưởng đến

khả năng lây nhiễm và ức chế sự tiếp xúc của virus với các tế bào tạo máu. Ở tôm

càng (Macrobrachium rosenbergii), ALF có thể hoạt động trong giai đoạn virus xâm

nhập vào tế bào chủ. Cơ chế ức chế này hiệ n nay vẫn chưa được làm rõ. Hoạt tính

chống sự lây nhiễm WSSV của rALFPm3 được kiểm tra ở cả trong in vitro và in

vivo. Tiêm rALFPm3 và WSSV vào tế bào gan nuôi cấy của tôm đã làm giảm đáng

kể sự sinh sản của virus [204]. Hiện nay, công nghệ sinh học đang phát triển một cách

vượt bậc, các gen mã hóa cho peptide kháng khuẩn ở động vật thủy sản nuôi được

phân lập và ứng dụng vào sản xuất một lượng lớn peptide kháng sinh trong phòng trị

bệnh truyền nhiễm. Nhằm nâng cao giá trị sản phẩm và tăng hiệu quả kinh tế trong

nuôi trồng thủy sản, peptide kháng khuẩn tái tổ hợp là một bước tiến mới trong việc

tìm ra và thay thế hóa chất, kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản. Trong các gen liên

quan đến chức năng miễn dịch được nghiên cứu, nhiều peptide được phân lập và

chứng minh có chức năng kháng nấm và ký sinh trùng [58], [202]. Do đó, các

peptide tái tổ hợp cũng sẽ là một trong các giải pháp mới trong phòng trị bệnh nấm

và ký sinh trùng ở tôm.

Kỹ thuật can thiệp RNA (RNAi) cung cấp một cơ chế bảo vệ mà tôm có thể

đáp ứng với tác nhân gây bệnh. Các công bố mới gần đây ở tôm đã chứng minh rằng

dsRNAs và siRNA tham gia vào quá trình chống WSSV ở tôm. Robalino và đtg

(2007) là nhóm nghiên cứu đầu tiên chứng minh rằng dsRNA tạo nên sự bảo vệ

kháng WSSV ở tôm thẻ chân trắng [171]. Các dsRNA tương ứng với các gen mã hóa

cho protein VP28, protein kinase của WSSV cho thấy sự bảo vệ ở tôm sú [180]. Tiêm

RNA can thiệp ngắn (siRNA): VP15-siRNA hoặc VP28-siRNA cũng cho thấy hiệu

quả kháng WSSV ở tôm sú [222]. Mặt khác, khi ức chế biểu hiện của PmRab7 (gen

Rab7 ở tôm sú) bằng cách tiêm dsRNA đặc trưng vào tôm sú nhiễm WSSV và YHV,

người ta thấy mRNA VP28 của WSSV cũng giảm mạnh. Điều này chứng tỏ rằng

PmRab7 đóng vai trò trong sự tái bản của WSSV và YHV [156]. Gần đây nhất,

Attasart và đtg (2009) đã chứng minh sự kết hợp sử dụng dsRNA ribonucleotide

reductase tiểu đơn vị nhỏ của ribosome với Rab7 hoặ c không kết hợp đều giúp tôm sú

có khả năng sống sót đến 95% so với đối chứng. Điều này chứng tỏ rằng, dsRNA cho

ribonucleotide reductase cũng có khả năng ức chế sự tái bản của WSSV [25].

Ngoài ra, nhóm nghiên cứu Yi và đtg (2004) đã chứng minh protein vỏ của

WSSV VP28 liên quan đến quá trình xâm nhiễm vào cơ thể tôm, chịu trách nhiệm

gắn lên các thụ thể bề mặt tế bào chuyên biệt. Bằng cách sử dụng kháng thể đơn

dòng chống VP28 để trung hòa VP28 và ngăn chặn quá trình xâm nhiễm của virus

[241]. Mặt khác, tôm có thể có khả năng miễn dịch „thụ động‟ chống lại WSSV

bằng cách sử dụng các protein cấu trúc VP19 và VP28 tái tổ hợp được cho rằng có

thể bảo vệ tôm sú chống lại WSSV [225], [226]. Những protein này được biểu hiện

nhiều ở vi khuẩn, côn trùng, sau đó được tinh chế và cho „ngâm‟ với tôm [96], tiêm

vào tôm [211], [226], bằng vacine đường miệng ở dạng vi khuẩn biểu hiện protein

tái tổ hợp được phủ bởi thức ăn cho tôm [96] hoặc chiết xuất tạo thức ăn dạng viên

[236]. Đặc biệt, trường hợp sử dụng vacine protein vỏ VP28 của WSSV cho thấy tỷ

lệ sống sót đáng kể chống lại sự lây nhiễm WSSV so với lô đối chứng, điều này có

thể dẫn đến sự phát triển của một loại vacin thương mại [225]. Những kết quả

nghiên cứu này đã chỉ ra tiềm năng chống lại WSSV ở tôm sử dụng các protein cấu

trúc của WSSV. Tuy nhiên, cơ sở phân tử của hiện tượng "miễn dịch" hoặc „cơ chế

kháng‟ ở tôm vẫn chưa được biết đến.

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Thu thập mẫu

Mẫu tôm sú bị bệnh đốm trắng (xuấ t hiệ n đố m trắ ng ở vỏ kitin), có kích thước

khoảng 80 – 200 g được thu thập tại Trạm Nghiên cứu thủy sản nước lợ thuộc Viện

Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, km10 đường cao tốc Hải Phòng - Đồ Sơn và các

đầm nuôi tư nhân vùng lân cận. Ngay sau khi nhận tôm nguyên con, các mô gan-tụy

và tim đã được tách từ 8 mẫ u tôm và chia vào các ống giữ mẫu. Các mẫu được bảo

quản trong dung dịch nitơ lỏng.

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được nhập khẩu từ các hãng

Fermentas, Sigma Aldrich, Promega…

- Hóa chất tách chiết RNA tổng số: TRIzol (Invitrogen), Chloroform, Isopropyl

alcohol, Ethanol.

- Tinh sạch mRNA: PolyAtract mRNA Isolation System III Kit (Promega).

- Tổng hợp cDNA: “SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR”

(Invitrogen).

- PCR: Taq DNA polymerase (Fermentas), các kit “3´ RACE System for Rapid

Amplification of cDNA Ends” và “5´ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0” (Invitrogen), kit SMARTerTM RACE cDNA amplification kit user

manual (Clontech).

- Các hóa chất dùng tinh sạch sản phẩm PCR (Fermentas)

- Hóa chất chạy điện di DNA:

+ Agarose;

+ Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate-EDTA) 1X;

+ Dung dịch đệm tra mẫu: Glycerol 20%; Tris-Cl 0,1M (pH 8,0); EDTA 0,01

M; (pH 8,0); Bromophenol blue 0,25%;

+ Thang DNA chuẩn (Fermentas);

+ Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr).

- Hóa chất điện di protein

+ Thành phần gel tách: Acrylamide/bis 25%; Tris-HCl 0,36 M, pH 8,8; Tris-

HCl 0,5 M, pH 6,8; SDS 0,01%; TEMED 0,04%;

+ Thành phần gel cô: Acrylamide/bis 25%; Tris-HCl 0,36 M, pH 8,8; Tris-

HCl 0,5 M, pH 6,8; SDS 0,01%; TEMED 0,04%;

+ Loading dye: Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8; Glycerol 1%; SDS 10%; 2-

Mercaptoethanol 0,05%; Bromophenol Blue 1%;

+ Đệm chạy điện di: Tris base 0,5 M, Glycine 1%, SDS 0,01%.

- Hóa chất nhuộm bạc

+ Dung dịch cố định: Ethanol 50%; Acetic acid 12%; Formaldehyde 0,05%;

+ Dung dịch rửa gel: Ethanol 50%;

+ Dung dịch tăng độ nhạy: Sodium thiosulfate 0,5%;

+ Dung dịch nhuộm bạc: AgNO3 (silver nitrate) 0,2%; Formaldehyde 0,075%; + Dung dịch hiện màu: Sodium carbonate 6%; Sodium thiosulfate 0,0004%,

Formaldehyde 0,05%;

+ Dung dịch dừng phản ứng: Glycine 1%.

- TA Cloning Kit của hãng Invitrogen dùng để gắn sản phẩm khuếch đại vào vector pCR 2.1. Cloning pJET1.2 Kit của hãng Fermentas dùng để gắn sản phẩm

phẩm khuếch vào vector pJET1.2.

- Môi trường nuôi cấy E.coli

+ Môi trường LB lỏng: Hỗn hợp Lucia Bertani bao gồm Bacto - Tryptone 10

g/l; Yeast extract 5 g/l; NaCl 10 g/l; NaOH 2 mM;

+ Môi trường LB đặc: Bao gồm môi trường LB lỏng bổ sung thêm Bacto -

Agar 15 g/l.

- Môi trường nuôi cấy nấm men P. pastoris X33

+ Môi trường YPD lỏng bao gồm Yeast extract 10 g/l, Peptone 20 g/l,

Dextrose 20 g/l;

+ Môi trường YPD đặc bao gồm YPD lỏng bổ sung thêm Bacto - Agar 20 g/l.

- Kháng sinh: Kanamycine, Ampicillin, Zeocine (Fermentas)

- Các dung dịch tách chiết DNA plasmid

+ Dung dịch I: Glucose 50 mM; Tris-Cl 25 mM, pH 8.0; EDTA 10 mM, pH 8.0;

+ Dung dịch II: NaOH 0,2 N, SDS 1%;

+ Dung dịch III: CH3COOK 3 M pH 5.5;

- Dung dịch tách chiết DNA nấm men: Triton 10x, SDS 1%, NaCl 100 mM, Tris-

HCl 10 mM, EDTA 1 mM.

- Xác định trình tự: BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng

Applied BioSystems (ABI, Mỹ).

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Máy xác định trình tự ABI PRISM 3100

Applied BioSystems

Máy PCR (GeneAmp PCR System 9700)

Applied Biosystems

Máy ly tâm 5415 R (Centrifuge )

Eppendorf

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)

Mettler Toledo

Máy làm khô chân không (Speed Vacuum Sc 110A) Savant

Applied BioSciences

Máy chụp ảnh Gel – Doc Tủ -200 C, -800C

Sanyo

Lò vi song

Samsung

Cân phân tích (Analytic balances)

Mettler Toledo

Cân điện tử (Electronic balances)

Ohaus

Pippetman

Gilson

Máy ly tâm (Table centrifuge 5415 C)

Eppendorf

Vortex

OSI Rotolab

Bể ổn nhiệt

Tempette Junior Techne

Máy lắc (Shaking Incubator)

Gyromax 737R Amerex Instrument

Tên Công ty sản xuất

2.1.4. Các vi sinh vật đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

- Vi khuẩn E.coli DH10b được sử dụng làm tế bào khả biến trong tách dòng phân tử.

- Nấm men P. pastoris X33 được sử dụng làm vật chủ biểu hiện gen ALFPm3.

- Vi khuẩn B. megaterium và E. aerogenes được sử dụng để phân tích hoạt tính

kháng khuẩn của ALFPm3 tái tổ hợp.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để phân lập và xác định được trình tự một số gen lựa chọn liên quan đến hệ

miễn dịch tôm sú. Đề tài được thực hiện theo sơ đồ nghiên cứu như sau:

Hình 2.1. Sơ đồ phân lập gen

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số

RNA tổng số từ các mô gan tụy và tim từ tôm sú được thực hiện theo phương

pháp của Susan và đtg (2008) có cải tiến [198] bao gồm các bước như sau:

- Chuẩn bị: dụng cụ nghiền mẫu (phụ lục 1) được ngâm rửa trong dung dịch nước chứa DEPC 0,1%. Sau đó, dụng cụ được khử trùng 20 phút ở nhiệt độ 120oC

và áp suất cao;

- Mẫu mô tôm sú được giữ trong nitơ lỏng, được chuyển nhanh sang dụng cụ

nghiền mẫu. Bổ sung dung dịch TRIzol (Invitrogen) vào dụng cụ nghiền mẫu với tỷ

lệ 100mg mẫu: 1 ml TRIzol;

- Đặt dụng cụ nghiền lên hộp xốp đựng nước đá và nghiền mẫu cho đến khi

mẫu mô tôm sú nhuyễn mịn;

- Chuyển hỗn hợp từ dụng cụ nghiền mẫu sang các ống eppendorf 1,5 ml với

thể tích khoảng 1 ml/ống (mỗi ống eppendorf tương đương với 1ml TRIzol bổ sung

ban đầu);

- Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng 10 phút;

- Bổ sung 0,2 ml chloroform vào mỗi ống (theo tỉ lệ 0,2 ml chloroform/1 ml

TRIzol bổ sung ban đầu). Lắc mạnh ống bằng tay hoặc vortex trong 15-20 giây, sau đó ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC;

- Hút dịch ở pha trên chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml mới;

- Bổ sung 0,5 ml isopropyl alcohol (2-propanol) vào mỗi ống (theo tỉ lệ

0,5ml isopropyl alcohol/1ml TRIzol bổ sung ban đầu). Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng

trong 30 phút;

- Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch và thu lấy tủa RNA;

- Bổ sung 1ml ethanol 70% vào mỗi ống để rửa tủa RNA. Ly tâm 12000 v/p

trong 15 phút ở 4oC và loại bỏ dịch. Lặp lại bước rửa thêm một lần nữa;

- Làm khô tủa RNA tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 phút;

- Hòa tan RNA tổng số trong 200 µl nước hoặc dung dịch TE đã được xử lý DEPC;

- Kiểm tra RNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và đo

quang phổ ở bước sóng 260nm;

- Bảo quản RNA tổng số ở -80oC.

2.2.2. Tinh sạch mRNA

mRNA (có đuôi PolyA+ ở đầu 3‟) được tinh sạch bằng cách sử dụng bộ kit

“PolyAtract® mRNA Isolation Systems III” (Promega).

+ Chuẩn bị lượng RNA tổng số (khoảng 0,1 - 1 mg) chứa trong ống

Eppendorf 1,5 ml.

- Bổ sung thêm nước cất đã khử bằng RNase tới thể tích 500 µl; - Ủ mẫu ở 65oC trong 10 phút;

- Bổ sung 3 µl mẫu dò (Biotinylated - Oligo(dT) Probe) và 13 µl dung dịch

20X SSC vào mẫu, trộn nhẹ rồi đem ủ ở nhiệt độ phòng đến khi nhiệt độ hỗn hợp hạ

xuống (khoảng 10 phút);

+ Rửa hạt sắt từ

- Búng nhẹ ống hạt sắt từ để các hạt phân tán đều trong dung dịch;

- Chuyển ống hạt sắt từ lên trên cột nam châm. Sau khoảng 5 dùng pipette để

hút loại bỏ toàn bộ dung dịch trong ống;

- Chuyển ống ra khỏi cột trộn, bổ sung 300 µl dung dịch 0,5X SSC, trộn đều

nhẹ nhàng để rửa hạt;

- Chuyển ống chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm rồi hút loại bỏ dịch rửa.

Lặp lại bước rửa này 2 lần nữa;

- Bổ sung 100 µl dung dịch 0,5X SSC và trộn đều nhẹ để các hạt khuếch tán

đều trong dung dịch.

+ Bổ sung 500 µl RNA tổng số vào trong 100 µl dung dịch chứa hạt sắt từ đã

qua xử lý.

+ Ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút búng nhẹ mỗi 1-2

phút/lần.

+ Chuyển ống dung dịch lai lên cột nam châm.

+ Rửa hạt sắt từ đã gắn mRNA bằng dung dịch 0,1X SSC: bổ sung 300µl

dung dịch 0,1X SSC, trộn đều nhẹ nhàng, sau đó chuyển ống chứa các hạt sắt từ lên

cột nam châm rồi hút loại bỏ dịch rửa. Lặp lại bước rửa này 2 lần với các thao tác

tương tự.

+ Bổ sung 100 µl nước cất đã khử RNase, trộn đều nhẹ nhàng.

+ Đưa ống mẫu chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm.

+ Hút toàn bộ phần dung dịch chứa mRNA chuyển sang ống eppendorf 1,5

ml mới, giữ mẫu tạm thời trên đá.

+ Bổ sung 150 µl nước nước cất đã khử RNase vào ống chứa các hạt sắt từ

và lại tiếp tục lặp lại bước trên để thu lấy dung dịch chứa mRNA còn lại rồi chuyển

toàn bộ dịch thu được vào 100 µl dịch trước đó (tổng thể tích 250 µl).

2.2.3. Tổng hợp cDNA

2.2.3.1. Tổng hợp cDNA cho phản ứng RT-PCR

Tổng hợp cDNA được tiến hành bằng cách sử dụng bộ kit “SuperScript

First-Strand Synthesis System for RT-PCR” (Invitrogen).

- cDNA được tổng hợp nhờ sử dụng mồi oligo(dT)12-18 trong hỗn hợp mRNA

và mồi như sau:

8 µl mRNA + H2O:

1 µl Oligo(dT)12-18 (0,5 µg/µl):

dNTPs 10 mM: 1 µl

Tổng thể tích: 10 µl

- Ủ mẫu ở 65 oC trong 5 phút, rồi đặt lên đá ít nhất 1 phút;

- Tiếp tục bổ sung các thành phần sau:

Buffer Reverse transcriptase 10X: 2 µl

4 µl MgCl2 25 mM:

DTT 0,1 M: 2 µl

RNaseOUT Recombinant RNase Inhibitor: 1 µl

- Trộn đều mẫu, ủ ở 42 oC trong 2 phút;

oC trong 50 phút;

- Tiếp tục bổ sung 1 l enzyme SuperScriptTM II RT, trộn đều mẫu, ủ ở 42

- Kết thúc phản ứng tổng hợp cDNA sợi thứ nhất bằng cách ủ ở 70 oC trong

15 phút, rồi đặt lên đá;

- Bổ sung 1 l RNase H. Ủ mẫu ở 37oC trong 20 phút. - cDNA lưu giữ ở -20oC.

2.2.3.2. Tổng hợp cDNA cho phản ứng 5’ và 3’RACE

* Tổng hợp cDNA cho phản ứng 5‟RACE sử dụng bộ kit “5´ RACE System

for Rapid Amplification of cDNA Ends” và “3´ RACE System for Rapid

Amplification of cDNA Ends” (Invitrogen) được tiến hành theo 3 bước chính sau:

Bước 1: Tổng hợp sợi cDNA

- Cho vào ống eppendorf 0,5 ml các thành phần sau:

Thành phần Thể tích (µl)

0,5 GSP1 10 M

mRNA 3,0

12 H2O

Tổng thể tích 15,5

- Trộn đều hỗn hợp và ủ ở 70oC, 10 phút. Làm lạnh trên đá một phút;

- Tiếp tục bổ sung các thành phần sau:

Thành phần Thể tích (µl)

Đệm PCR 10x 2,5

2,5 MgCl2 25mM

DTT 0,1M 2,5

dNTP 10 mM 1,05

Tổng thể tích 8, - Trộn đều hỗn hợp và ủ ở 420C, 1 phút;

- Bổ sung 1 µl Reverse transcriptase II. Trộn đều và ủ ở 420, 50 phút;

- Để ống nghiệm ở 700, 15 phút. Để ống nghiệm lại trên đá;

- Bổ sung 1 µl RNase, trộn đều hỗn hợp và ủ ở 300C. Giữ mẫu trên đá hoặc -200 C

Bước 2: Tinh sạch cDNA;

- Bổ sung 120 µl dung dịch NaI 6M;

- Chuyển hỗn hợp vào cột tinh sạch cDNA. Ly tâm 12000 v/p, 20 giây. Bỏ dịch;

- Bổ sung 0,4 ml dung dịch buffer wash 1x vào cột. Ly tâm 12000 v/p, 20

giây. Loại bỏ dịch, bước này lặp lại 2 lần;

- Rửa cột với 400 µl cồn 70%, bước này lặp lại 2 lần;

- Ly tâm 12000 v/p, 1 phút; - Chuyển cột đặt sang ống eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 50 µl H2O (giữ ở - 650 C). Ly tâm 12000 v/p, 1 phút. Thu dịch và giữ ở -200 C.

Bước 3: Gắn chuỗi polyC (chuỗi nucleotide Cytosine) vào đầu 3‟ của cDNA

- Cho vào ống eppendorf 0,5 ml các thành phần sau:

Thành phần Thể tích (µl)

6,5 H2O

Đệm gắn 5x 5,0

cDNA 10

dCTP 2 mM 2,5

Tổng thể tích 24

- Trộn đều, để hỗn hợp ở 940 C, 3 phút. Làm lạnh trên đá 1 phút;

- Bổ sung 1 µl teminal deoxynuclotidyl transferase (TdT), trộn đều. Ủ mẫu ở

370C, 10 phút;

- Để ống mẫu ở 650 C, 10 phút;

- Giữ mẫu ở -200 C.

* Tổng hợp cDNA cho phản ứng 5‟ và 3‟RACE sử dụng bộ kit

“SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit” (Clontech).

- Bước 1: Cho vào ống eppendorf 0,5 ml các thành phần sau:

Thành phần Thể tích (µl)

Đệm 5x 2,0

DTT 20 mM 1,0

dNTP 10 mM 1,0

Tổng thể tích 4,0

- Bước 2: Ủ ở 70oC, 10 phút. Làm lạnh trên đá một phút, sau đó bổ sung:

+ 1,0 µl mồi 5‟-CDS A; 1,0 - 2,75 µl mRNA cho phản ứng 5‟RACE

+ 1,0 µl mồi 3‟-CDS A, 1,0 - 3,7 5µl cho phản ứng 3‟RACE

- Bước 3: Bổ sung H2O đến thể tích cuối cùng là 3,75 µl cho phản ứng

5‟RACE và 4,75 cho phản ứng 3‟RACE;

- Bước 4: Ủ mẫu ở 72oC, 3 phút. Làm nguội 420C, 2 phút;

- Bước 5: Bổ sung 1 µl SMARTter IIA cho phản ứng 5‟RACE;

- Bước 6: Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng sau:

Thành phần Thể tích (µl)

Hỗn hợp phản ứng từ bước 1 4,0

Chất ức chế RNase 0,25

Reverse transcriptase 1,0

Tổng thể tích 5,25

- Bước 7: Bổ sung hỗn hợp phản ứng ở bước 6 vào hỗn hợp biến tính RNA ở

bước 5 cho phản ứng 5‟RACE và bước 4 cho phản ứng 3‟RACE; - Bước 8: Trộn đều hỗn hợp và ủ ở 420, 1 giờ 30 phút; - Bước 9: Biến tính reverse transcriptase ở 700C, 10 phút; - Bước10: Pha loãng hỗn hợp phản ứng và giữ ở -200C.

2.2.4. Thiết kế mồi phân lập một số gen (cDNA) lựa chọn

Sau khi tổng hợp cDNA, cDNA được dùng làm khuôn để nhân các gen mong

muốn bằng phương pháp PCR. Các cặp mồi đặc hiệu (gene specific primers - GSP)

được thiết kế dựa trên những thông tin về trình tự nucleotite đã có trong ngân hàng

GenBank/EMBL/DDBJ. Những thông tin này có thể là trình tự một phần hoặc toàn

phần ORF của gen nào đó. Đối với những gen lần đầu tiên phân lập ở tôm sú (chưa

có thông tin trong ngân hàng GenBank/EMBL/DDBJ), các cặp mồi suy diễn

(degenerate primers) được thiết kế dựa trên những đoạn trình tự amino acid bảo thủ

giữa các loài.

2.2.4.1. Thiết kế mồi phân lập trình tự gen đã có thông tin trong ngân hàng dữ liệu

Đối với một số gen nghiên cứu như gen Rab7, caspase, peptide kháng khuẩn

tương tự crustin (crustin - like antimicrobial peptide), yếu tố kháng khuẩn (anti -

lipopoysacharide factor) và PmAV (Penaeus monodon antivirus), trình tự đầy đủ đã

được công bố trên GenBank với mã số tương ứng DQ231062, DQ846887,

EF654659, EF523562 và AY302750. Chúng tôi thiết kế mồi đặc hiệu (GSP) ở 2 đầu

của gen và có bổ sung thêm trình tự nhận biết của enzyme giới hạn (Hình 2.2).

Trình tự mồi thiết kế mồi để khuếch đại các gen này được trình bày ở bảng 2.2.

Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết trình tự

2.2.4.2. Thiết kế mồi phân lập trình tự gen đã có một phần thông tin trong ngân

hàng dữ liệu

Đối với các gen đã biết trình tự một phần: có 3 trường hợp

+ Trường hợp 1: Khi biết trình tự đầu 3‟ của gen, chúng tôi tiến hành thiết kế

mồi để thực hiện phản ứng 5‟RACE theo kit của Clontech và Invitrogen.

Theo kit Invitrogen: Dựa trên thông tin trình tự gen đã công bố, hai mồi đặc

hiệu GSP2 và GSP3 được thiết kế để khuếch đại gen, những mồi này kết hợp với

các mồi chung AAP (Abridged Anchor Primer), UAP (Universal Amplification

Primer) cung cấp bởi kit “5‟RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends”

(Invitrogen). Sơ đồ thiết kế mồi như hình 2.3

Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết một phần trình tự đầu 3’ (Invitrogen)

Theo kit Clontech: 1 mồi đặc hiệu gen (GSP) và một mồi chung UPM được

tạo ra ở đầu 5‟ khi tổng hợp cDNA theo kit “5´ RACE System for Rapid

Amplification of cDNA Ends” (Invitrogen). Sơ đồ thiết kế mồi như hình 2.4.

Hình 2.4. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết một phần trình tự đầu 3’ (Clontech)

Sau khi xác định được trình tự đoạn cDNA đầu 5‟ của gen, chúng tôi thiết kế

cặp mồi GSP để nhân gen hoàn chỉnh (như trường hợp đã biết trình tự gen).

+ Trường hợp 2: Khi biết trình tự đầu 5‟ của gen, chúng tôi tiến hành thiết kế

mồi để thực hiện phản ứng 3‟RACE, trong đó: 1 mồi đặc hiệu gen (GSP) và một

mồi chung UPM được tạo ra ở đầu 3‟ khi tổng hợp cDNA theo kit “3´ RACE

System for Rapid Amplification of cDNA Ends” (Invitrogen) (Hình 2.5).

Hình 2.5. Sơ đồ thiết kế mồi khi biết một phần trình tự đầu 5’ của gen

Sau khi xác định được trình tự đoạn cDNA đầu 3‟ của gen, chúng tôi thiết kế

cặp mồi GSP để nhân gen hoàn chỉnh (như trường hợp đã biết trình tự gen).

+ Trường hợp 3: Khi biết một đoạn mã hóa của gen (đoạn giữa), dựa vào

trình tự này chúng tôi tiến hành thiết kế primer để thực hiện cả hai phản ứng 3‟ và

5‟ RACE. Sau đó dựa vào trình tự đầu 5‟ và 3‟ của gen nhận được, chúng tôi thiết

kế primer để nhân gen hoàn chỉnh.

Các mồi thiết kế cho RT-PCR, 5‟RACE, 3‟RACE có đặc điểm là không tự

hình thành cấu trúc kẹp tóc, không bổ sung cho nhau, có thành phần GC > 50%,

nhiệt độ nóng chảy của mồi tương đối giống nhau.

Gen syntenin đã biết thông tin một phần trình tự đầu 3‟ được công bố trên

Genbank mã số AF335106. Để phân lập gen này hoàn chỉnh, mồi được thiết kế theo

sơ đồ hình 2.6. Trình tự các mồi được thống kê trong bảng 2.2.

Hình 2.6. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen syntenin

Gen hemocyanin đã biết thông tin một phần trình tự đầu 3‟ được công bố trên

Genbank mã AF431737. Để phân lập gen heomcyanin hoàn chỉnh, mồi được thiết

kế theo sơ đồ hình 2.7. Trình tự các mồi được thống kê trong bảng 2.2.

Hình 2.7. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen hemocyanin

Khi biết được một phần trình tự (đoạn giữa) của gen Ran, chúng tôi đã thiết

kế mồi để khuếch đại đầu 3‟ và 5‟ của gen. Sơ đồ thiết kế mồi khuếch đại gen Ran

hoàn chỉnh thể hiện trên hình 2.8. Trình tự các mồi được trình bày trong bảng 2.2.

Hình 2.8. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen Ran

2.2.4.3. Thiết kế mồi phân lập trình tự gen hoàn toàn mới

Protein có cùng một chức năng thường có vùng bảo thủ cao giữa các loài. Do

đó, dựa vào trình tự amino acid bảo thủ của protein từ các loài khác nhau chúng tôi

tiến hành thiết kế mồi suy diễn (degenerate primer) để khuếch đại đoạn gen mong

muốn ở tôm sú (Hình 2.9). Mồi suy diễn (DP) được thiết kế theo nguyên tắc sau:

- Mồi dài từ 18-20 nucleotide (suy diễn từ khoảng 6-7 amino acid);

- Không nên chọn amino acid được mã hóa bởi 6 loại codon;

- Nên sử dụng methionine hoặc tryptophan (chỉ mã hóa bởi 1 loại codon) ở

đầu 3‟ của mồi;

- Một mồi (degenerate primer) có tối đa khoảng 250 tập hợp các trình tự

oligo khác nhau.

Khi xác định được trình tự đoạn gen khuếch đại từ cặp mồi DP, chúng tôi

tiếp tục tiến hành thiết kế các mồi đặc hiệu GSP để phân lập đoạn gen đầu 3‟, 5‟ và

phân lập gen hoàn chỉnh.

Hình 2.9. Sơ đồ thiết kế mồi để phân lập gen hoàn toàn mới ở tôm sú

Gen Ran chưa có thông tin trình tự ở tôm sú được công bố trên Genbank. Để

phân lập gen Ran hoàn chỉnh, chúng tôi đã thiết kế mồi để khuếch đại một phần

đoạn gen Ran theo nguyên lí hình 2.9. Sau đó, gen Ran được phân lập theo sơ đồ

thiết kế mồi như đã trình bày ở hình 2.8.

2.2.4.4. Thiết kế mồi biểu hiện gen ALFPm3

Sau khi tạo dòng và xác định trình tự gen ALFPm3 đầy đủ từ khuôn là

cDNA ở tôm sú, để biểu hiện gen ALFPm3, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi để khuếch

đại đoạn gen mã hóa peptide kháng khuẩn trưởng thành (Hình 2.10, bảng 2.2) [190]

dựa trên khuôn là vector pCR2.1 mang gen ALFPm3 đầy đủ. Đầu 5‟ của mỗi mồi

được bổ sung thêm trình tự nhận biết của enzyme giới hạn (trình tự nhận biết EcoRI

thêm vào mồi xuôi và XbaI thêm vào mồi ngược) nhằm mục đích gắn gen này vào

vector biểu hiện pPICZA.

Hình 2.10. Sơ đồ thiết mồi khuếch đại đoạn gen mã hóa peptide ALFPm3 trƣởng thành

(Vị trí của hai mồi được đánh dấu bằng thanh màu xám nhạt phía dưới mỗi trình tự)

Bảng 2.2. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu

Gen đích

Sản phẩm PCR (bp)

Stt

Tên mồi

Antiliposaccharide factor (ALF)

357

Đoạn gen ALFPm3

300

Crustin-like antimicrobial peptide

426

PmAV

513

Rab7

630

Caspase

954

4 7

Syntenin cDNA

Đoạn 5‟-syntenin

>550 > 400 > 200

Syntenin (ORF đầy đủ)

1000

Trình tự mồi (5’-3’) ACTAGTCATATGCGTGTGTCCGTG CTCCAGGGATCCCTATGAGTCGAG TGCGAATTCCAAGGGTGGGAGGC GGTCTAGACCTGAGCTGAGCCAC ACTAGTCATATGCTAAAGTTTGTA CTCGAGGGATCCCTATCCCTGAGA ACTAGTCATATGCGTCATACAATCC CTCGAGGGATCCTTAATGTGTCCTGC GTCGACCATATGGCATCTCGCAAGAAG CTCGAGGCAAGAGCATGCATCCTGTTTG CATATGAGCGACGCCGACGACTCA GGATCCTCAGAAGTAAATTTCACGAAGCAG CAT TCA CCT CCA GCA G CTC CCG AAT GGC CTG TCT CTA ATG G CACTGTCCTTGCAGAGGGTGATCTCTCG CAT ATG AGT CTG TAC CCG TCA TTA GAG G CTC GAG CAG GTC GGG AAT GGA GTG GTC

Đoạn 5‟-hemocyanin

> 400

Hemocyanin (ORF đầy đủ)

2100

Ran

~400

Đoạn 3‟-Ran Đoạn 5‟-Ran

>140 >150

Ran (ORF đầy đủ)

717

ATGGGGACCGTCAACATGAAGGTCTT CTAATCATGTTGGATATATTCGCCATG TAGGAYATGCCNACNTTYAAR TACTCGAGYTTYTCRAARTTRTARTT GGTCCTTCACATCAACCTTGTTTCCAC GCCACCCTTGGTGTGGAGGTCCATCCTC TACATATGGGGCTCGAAGCCTTGACGG GCCTCGAGTTACAAGTCTTCATCATCC

Antlip- F1 Antlip-R357 ALF F ALF R Antmic-F1 Antmic-R426 AntVr-F1 AntVr-R513 RAB7F RAB7R Caspa-F1 Caspa-R954 Syn-GSP1-5 Syn-GSP2-5 Syn-GSP3-5 Syn F Syn R Hemocyn-GSP1 CCATGTGGATCACTCTGTCGAC Hemocyn-F1 Hemocyn-R1 Ran DP F Ran DP R Ran - GSP1-3 Ran - GSP1-5 Ran F1 Ran F717

2.2.5. Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR

2.2.5.1. Phản ứng RT-PCR

Thực hiện kỹ thuật RT-PCR với các thành phần sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (l)

Đệm Dream Taq 2,5

dNTPs (10 mM) 2,5

1 Mồi F (10 M)

1 Mồi R (10 M)

0,5 Dream Taq (5 unit/l)

cDNA khuôn 2

14,5 H2O

Tổng thể tích 25

Chu kỳ phản ứng: 940C - 3 phút; (940C - 1 phút, 550C - 1 phút, 720C - 1

phút) lặp lại 30 chu kỳ; 720C - 8 phút và lưu giữ ở 40C.

2.2.5.2. Phản ứng 5’ và 3’ RACE

Kỹ thuật 5‟RACE được thực hiện với các thành phần như sau:

Thể tích (µl) Thành phần

Đệm Dream Taq 2,5

Dream Taq 0,5

dNTPs 10 mM 0,5

Mồi UPM hoặc UAP (10 µM) 0,5

Mồi GSP (10 µM) 0,5

cDNA khuôn 1

19,5 H2O

Tổng thể tích 25

Kỹ thuật 3‟RACE được thực hiện với các thành phần như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (l)

Đệm Dream Taq 2,5

dNTPs (10 mM) 2,5

1 Mồi GSP (M)

1 Mồi UPM hoặc UAP (10 M)

0,5 Dream Taq Polymerase (5 unit/l)

cDNA khuôn 2

14,5 H2O

Tổng thể tích Chu kỳ phản ứng: 940C - 3 phút; (940C - 45 giây, 580C - 45 giây, 720C - 1

phút) lặp lại 30 chu kỳ; 720C - 8 phút và lưu giữ ở 40C.

2.2.6. Tinh sạch sản phẩm PCR

Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR được tiến hành theo kit của hãng

Promega bao gồm các bước như sau:

- Điện di sản phẩm khuếch đại gen, cắt băng gel cho vào ống eppendorf 1,5 ml;

- Bổ sung dung dịch bám theo tỷ lệ 1:1; - Ủ ở nhiệt độ khoảng 50-600C cho đến khi gel tan hoàn toàn;

- Hút dịch sang cột thôi gel, ly tâm 12 000 v/p, 2 phút, bỏ dịch;

- Bổ sung 700 μl dung dịch rửa vào cột, ly tâm 12000 v/p, 2 phút, bỏ dịch;

- Ly tâm cột tiếp 12000 v/p, 2 phút. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút;

- Cho thể tích H2O thích hợp vào cột, đặt cột sang một ống eppendorf mới;

- Ly tâm 12000 v/p, 3 phút. Thu dịch loại bỏ cột. DNA tinh sạch được giữ ở

40C hoặc - 200C sau khi điện di kiểm tra trên gel agarose.

2.2.7. Tạo dòng phân tử sản phẩm PCR

Sản phẩm nhân gen bằng phản ứng PCR (RT-PCR, 3‟RACE và 5‟RACE)

được tinh sạch và tách dòng trong vector pJET1.2 và pCR2.1 (phụ lục 2 và 3) theo

phương pháp của Sambrook và Russell (2001) [178].

Các vector pJET1.2 và pCR2.1 mang đoạn gen nghiên cứu được kiểm tra

bằng phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn các vị trí nhận biết thuộc vector hoặc

đã được gắn vào trình tự của mồi. Các vector tái tổ hợp được tinh sạch nhằm mục

đích xác định trình tự gen.

2.2.8. Xác định trình tự gen (cDNA)

- Trình tự gen được xác định trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100

Genetic Analyzer kết hợp với sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle

Sequencing;

- Thành phần hỗn hợp sử dụng trong xác định trình tự DNA bao gồm cả dNTPs và

ddNTPs trong đó ddNTPs là 4 loại nucleotide được đánh dấu bằng các chất phát

huỳnh quang khác nhau;

- Cặp mồi đọc trình tự là T7 promoter và pJET1.2 reverse (vị trí trên vector

pJET1.2) hoặc M13 Forward và M13 Reverse (vị trí trên vector pCR2.1). Phản ứng

gắn các nucleotide đánh dấu vào sợi DNA tổng hợp trên sợi khuôn được tiến hành

trên máy PCR;

- Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng phương pháp tủa cồn/EDTA: bổ sung

4 l EDTA 125 mM pH 8,0 và 60 l cồn 100% vào ống chứa sản phẩm PCR. Đảo

nhẹ hỗn hợp và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Loại bỏ cồn. Rửa tủa bằng 60 l cồn 70%, ly tâm 12000 v/p trong 10 phút và làm khô. Bổ sung 10 l Hi-DiTM formamide và biến tính ở 95oC trong 5 phút. Các

mẫu được cho vào các giếng của khay đựng mẫu. Điện di trong ống vi mao quản 80

cm x 50 m chứa POP- 4TM;

- Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3100 Data Collection v2.0,

Seqscape v2.5 và BioEdit v7.0.5.

2.2.9. Biểu hiện gen ALFPm3

Biểu hiện gen ALFPm3 được thực hiện bằng cách sử dụng bộ kit

“EasySelect™ Pichia Expression Kit For Expression of Recombinant Proteins

Using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris” (Invitrogen). Tạo peptide kháng

khuẩn rALFPm3 được tiến hành với sơ đồ như sau:

Hình 2.11. Sơ đồ biểu hiện ALFPm3

2.2.9.1. Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen ALFPm3

* Chuẩn bị đoạn gen ALFPm3 - PCR nhân gen đoạn ALFPm3 từ vector tách dòng sử dụng cặp mồi ALF F/ALF R; - Tinh sạch sản phẩm PCR bằng thôi gel; - Cắt bằng sản phẩm thôi gel gen ALFPm3 bằng EcoRI và XbaI; - Tinh sạch sản phẩm cắt bằng thôi gel.

* Chuẩn bị vector pPICZ A (Phụ lục 4; 5)

- Điện di vector pPICZA;

- Tinh sạch vector pPICZA bằng thôi gel;

- Cắt vector pPICZA bằng EcoRI và XbaI.

* Tạo vector tái tổ hợp pPICZA/ALFPm3

- Chèn sản phẩm PCR gen ALFPm3 vào pPICZA;

- Biến nạp vào E.coli DH10b bằng phương pháp sốc nhiệt;

- Tách dòng thu nhận cấu trúc pPICZA/ALFPm3;

- Xác định trình tự.

2.2.9.2. Biến nạp cấu trúc pPICZ A/ALFPm3 vào Pichia pastoris X33

* Chuẩn bị tế bào nấm men Pichia pastoris X33 khả biến - Cấy chủng nấm men P. pastoris X33 lên môi trường YPD đặc và nuôi qua đêm ở 300C;

- Lấy một khuẩn lạc nuôi trong 2 ml môi trường YPD lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 2 ngày ở 300C;

- Lấy 0,1 ml dung dịch nuôi qua đêm cho vào bình tam giác chứa 50 ml YPD lỏng.

Nuôi qua đêm cho đến khi OD600nm=1,3-1,5; - Ly tâm thu tế bào 4.500 v/p, 5 phút, 40C. Hòa tủa bằng 20 ml nước vô trùng lạnh;

- Ly tâm như bước 3, sau đó hòa tủa trong 20 ml nước vô trùng lạnh;

- Ly tâm như bước 3, sau đó hòa tủa trong 20 ml sorbitol 1M vô trùng lạnh;

- Ly tâm như bước 3, sau đó hòa tủa trong 1ml sorbitol 1M vô trùng lạnh.

* Chuẩn bị pPICZ A/ALFPm3

- Cắt 5-10 g vector tái tổ hợp pPICZA/ALFPm3 bằng enzyme hạn chế SacI;

- Kiểm tra sản phẩm cắt bằng điện di gel.

* Biến nạp bằng phương pháp xung điện

- Hỗn hợp khoảng 80 l tế bào nấm men khả biến và 5-10 g pPICZA/ALFPm3 thẳng

chuyển đến cuvet 0.2 cm để lạnh;

- Để cuvet với tế bào trên đá 5 phút;

- Xung điện ở 400 W, 1.5 kV, 25 F;

- Bổ sung 1ml sorbitol 1 M để lạnh, chuyển dịch từ cuvet đến ống falcol vô trùng 15 ml và ủ 300C, không lắc trong 1 giờ, bổ sung 1ml môi trường YPD đến mỗi ống. Lắc 200 v/p, 300C;

- Trải 400 l trên mỗi đĩa môi trường YPD chứa 100 g/ml Zeocine;

- Ủ đĩa 3-5 ngày cho đến khi khuẩn lạc hình thành.

2.2.9.3. Tách chiết DNA tổng số từ nấm men

- Lấy một khuẩn lạc nuôi trong môi qua đêm trong môi trường YPD có bổ sung Zeocine 100 μg/ml, 300C, lắc 200 v/p; - Thu tế bào bằng ly tâm 8000 v/p, 5 phút, 40C;

- Bổ sung 300 μl dung dịch phân giải tế bào nấm men, vortex; - Ủ 15 phút, -800C. Cho ngay vào 900C 1 phút. Lặp lại 3 lần;

- Bổ sung 250 μl Chloroform:isoamyl (24:1), đảo đều nhẹ nhàng; - Ly tâm 13000 v/p, 20 phút, 40C. Thu dịch trong; - Bổ sung 600 μl isopropanol, ủ ở -840C, 10 phút; - Ly tâm 12000 v/p, 15 phút, 40C. Làm khô;

- Hòa trong 30 μl có bổ sung RNase;

- Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số nấm men;

- PCR nhân gen ALFPm3 từ DNA tổng số của nấm men bằng cặp mồi đặc hiệu và

cặp mồi nhân gen từ vector.

2.2.9.4. Cảm ứng tạo peptide ALFPm3 tái tổ hợp

- Lấy một khuẩn lạc cho vào ống penicillin chứa 2 ml YP có bổ sung glycerol đến nồng độ cuối cùng là 1%. Nuôi lắc tế bào ở 300C khoảng16-18 giờ;

- Thu nhận tế bào bằng ly tâm 4500 v/p, 5 phút ở nhiệt độ phòng và hòa tủa trong

20 ml môi trường YPD. Bổ sung methanol 100% đến thể tích cuối cùng là 0,5%;

Hút 1ml dịch, ly tâm 9000 v/p, 2 phút ở nhiệt độ phòng. Dịch tủa và tủa tế bào được dữ ở -800 C (dịch được chia làm 2 ống);

- Để cảm ứng sự biểu hiện, methanol (100%) được thêm vào thường xuyên sau 24 h

để đến nồng độ thể tích cuối cùng 1%;

- Để kiểm tra sự phát triển tế bào, môi trường nuôi cấy (1 ml) được lựa chọn và ly

tâm ở 9000 v/p, 2 phút ở nhiệt độ phòng ở các thời điểm (0, 1, 2, 3, 4, 5 và 6 ngày). Dịch tủa và tủa tế bào được giữ ở -800 C (dịch được chia làm 2 ống);

- Sự biểu hiện của ALFPm3 được phân tích bằng SDS-PAGE. Dòng biểu hiện

protein tái tổ hợp lớn nhất được lựa chọn để tạo ra sản phẩm trên quy mô lớn.

2.2.9.5. Phát hiện rALFPm3 bằng phương pháp điện di

* Điện di biến tính trên gel polyacrylamide

- Xử lý mẫu protein: Sau khi nuôi cấy ở điều kiện cảm ứng, dịch nuôi cấy được thu

lại sau khi đã ly tâm loại bỏ tế bào. Protein được xử lý biến tính bằng đệm xử lý mẫu (treatment buffer 6X) và ủ ở 100oC trong 10 phút;

- Lắp bản gel, tra mẫu vào giếng và chạy với cường độ dòng điện 10 mA cho mỗi

bản gel cho đến khi mẫu qua hết lớp gel cô. Sau đó, cường độ dòng điện được tăng

lên 20 mA cho mỗi bản gel khi mẫu đến lớp gel tách;

- Gỡ bản gel và nhuộm gel với bạc.

* Nhuộm bạc

- Ngâm bản gel trong dung dịch cố định, lắc nhẹ trong 1 giờ;

- Rửa bản gel 2 lần bằng ethanol 50%, mỗi lần 20 phút;

- Chuyển bản gel vào dung dịch tăng độ nhạy trong 1 phút;

- Rửa bản gel 3 lần bằng nước khử ion, mỗi lần 20 giây;

- Chuyển bản gel vào dung dịch nhuộm bạc, lắc nhẹ trong 20 đến 30 phút;

- Rửa bản gel 3 lần bằng nước khử ion, mỗi lần 20 giây;

- Chuyển bản gel vào dung dịch hiện màu cho đến khi băng protein xuất hiện;

- Rửa bản gel 3 lần bằng nước khử ion, mỗi lần 2 phút;

- Đặt bản gel vào dung dịch dừng phản ứng trong 10 phút.

2.2.9.6. Phân tích hoạt tính của rALFPm3 (recombinant ALFPm3)

- Lấy một khuẩn lạc cho vào ống penicilin chứa 2 ml YP có bổ sung glycerol

đến nồng độ cuối cùng là 1%. Nuôi lắc tế bào ở 300C khoảng16-18 giờ;

- Thu nhận tế bào bằng ly tâm 4500 v/p, 3 phút ở nhiệt độ phòng và hòa tủa

trong 20 ml môi trường YPD có bổ sung methanol 100% đến thể tích cuối cùng là 1% và biotin 0,002%. Nuôi lắc 200 v/p, 300C. Thu dịch và giữ ở -800 C;

- Nuôi khuẩn trong môi trường LB có bổ sung dịch chứa rALFPm3 với các

tỷ lệ khác nhau (ống đối chứng bổ sung dịch nấm men P. pastoris X33);

- Phân tích hoạt tính rALFPm3 bằng đo nồng độ tế bào OD600nm.

2.2.10. Phân tích dữ liệu trình tự và xử lý số liệu

Các vector tái tổ hợp mang các đoạn sản phẩm PCR được chọn để phân tích

trình tự. Kết thúc quá trình đọc trình tự trên máy xác định trình tự tự động ABI

PRISM 3100 Genetic Analyzer, chương trình phần mềm ABI PRISM 3100

Data Collection v2.0 sẽ giúp xử lý phổ trình tự (dạng hình ảnh đồ thị) thành trình tự

DNA dưới dạng text file. Trong đó :

- Gen PmAV, yế u tố khá ng khuẩ n tương tự crustin : trình tự được xác định từ một

dòng plasmid tái tổ hợp và đọc một chiều.

- Gen ALFPm, ALFPm3: trình tự được xác định từ hai dòng plasmid tái tổ hợp và

đọ c mộ t chiề u

- Gen Rab7, caspase, syntenin, Ran: trình tự được xác định từ hai dòng plasmi d tá i

tổ hợ p và đọ c lặ p lạ i 2 lầ n xuôi ngượ c.

- Gen Hemcyanin: trình tự được đọc ở 2 dòng plasmid tái tổ hợp, ở mỗi dòng đọc

lặp lại 2 lần xuôi ngược và 2 mồi nằm trong gen.

Tiế p theo, trình tự DNA được tiếp tục xử lý loại bỏ những phần có tín hiệu

phổ yếu không đáng tin cậy và loại bỏ thành phần trình tự của vector sử dụng phần

mềm Bioedit, sequence scanner. Sau đó , trình tự đoạn gen được đem so sánh tìm

trình tự tương đồng bằng chương trình BLAST [18].

Các số liệu đo OD tế bào và phân tích hoạt tính peptide tái tổ hợp của

ALFPm3 được xử lý bằng chương trình Excel [6].

2.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học

- Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. RAB7 - PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾ N CƠ CHẾ XÂM NHIỄ M CỦ A VIRUS

Các protein Rab thuộc siêu họ Ras tồn tại 2 dạng cấu trúc, dạng hoạt động

bám GTP và dạng không hoạt động bám GDP. Có hơn 60 loại protein Rab được xác

định ở động vật có vú, chúng hoạt động như là các chất điều khiển quan trọng trong

các con đường lưu thông nội bào như sự vận chuyển các chất, sự hình thành bóng

(vesicle), sự vận động và dung hợp [181]. Rab7 là một loại protein Rab GTPase

[33]. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh Rab7 liên quan đến lưu thông nội bào

và đóng vai trò quan trọng trong sự dung hợp và vận chuyển các chất ở endosome

đến lysosome. Rab7 ở tôm sú (PmRab7) được phân lập, cDNA có chiều dài 1370 bp

bao gồm 5‟UTR, 618 bp mã hóa cho 205 amino acid và trình tự 3‟UTR

(DQ231062). Một số nghiên cứu về Rab7 ở tôm sú cho thấy: đây là một trong các

protein tồn tại trên màng tế bào máu tôm sú và liên quan đến cơ chế xâm nhiễm của

virus vào tôm [156], [192]. Protein PmRab7 tái tổ hợp đã được chứng minh làm

tăng tỷ lệ sống sót của tôm sú nhiễm WSSV khi nghiên cứu chức năng bám protein

vỏ đặc trưng VP28 của WSSV [192]. Ngoài ra, khi ức chế biểu hiện của gen

PmRab7 bằng cách tiêm dsRNA vào tôm sú nhiễm WSSV và YHV cho thấy VP28

mRNA của WSSV cũng giảm mạnh. Điều này chứng tỏ rằng protein PmRab7 đóng

vai trò trong sự tái bản của WSSV và YHV [156]. Cho đến nay, cơ chế nhiễm virus

vào tế bào vật chủ động vật không xương sống vẫn chưa được làm sáng tỏ. Để góp

phần nghiên cứu vai trò của các protein Rab nói chung và của PmRab7 nói riêng

trong đáp ứng sự xâm nhiễm của WSSV, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tạo dòng,

phân tích trình tự nucleotide gen Rab7 từ tôm sú Việt Nam.

3.1.1. Tạo dòng gen Rab7 từ mẫu tôm sú Việt Nam

Dựa trên cơ sở trình tự gen PmRab7 đã công bố trên GenBank với mã số

DQ231062, chúng tôi thiết kế mồi để khuếch đại các gen này hoàn chỉnh (Hình 2.2;

Bảng 2.2). Đầu tiên, mẫu mRNA được tách chiết và tinh sạch từ mô tim của tôm sú

bị bệnh đốm trắng được dùng làm khuôn tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bằng cách sử

dụng mồi Oligo(dT). Sau đó, phản ứng RT-PCR được tiến hành với cDNA thu

được. Sản phẩm RT-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.1A).

A

B

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen Rab7

A. Sản phẩm nhân gen Rab7 bằng kỹ thuật RT-PCR (M: Marker 1kb; 1: Sản phẩm

RT-PCR nhân gen Rab7 từ mô tim), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT-PCR

trong vector tái tổ hợp (M: Marker 1kb, 1-5: Plasmid pCR2.1 mang gen Rab7)

Kết quả ở hình 3.1A cho thấy sản phẩm RT-PCR nhân gen Rab7 có kích

thước khoảng 0,6 kb đúng với tính toán lý thuyết (Bảng 2.2). Sản phẩm này được

tinh sạch từ gel agarose và tách dòng trong vector pCR2.1 (Invitrogen). Enzyme

giới hạn EcoRI đượ c sử dụ ng để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp, enzyme nà y cho

phép cắt gen Rab7 (nếu có) ra khỏi vector. Sau khi phân tích các dòng plasmid tái tổ

hợp bằng enzyme EcoRI, kết quả điện di cho thấy mỗi plasmid bị cắt thành hai

đoạn: một đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pCR2.1 (~ 4 kb) và một

đoạn nhỏ hơn có kích thước 0,6 kb tương ứng với sản phẩm RT-PCR gen Rab7 và

một phần vector (Hình 3.1B). Như vậy, bước đầu chúng tôi cho rằ ng các dòng

plasmid này có thể gắn đượ c gen Rab7.

3.1.2. Xác định và phân tích trình tự gen Rab7

Tiếp theo kết quả tách dòng, chúng tôi tiến hành xác định trình tự các dòng

plasmid thu được. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi thấy đoạn cDNA phân lập

được là trình tự ORF hoàn chỉnh mã hóa Rab7. Gen Rab7 phân lập từ mẫu tôm sú

Việt Nam có kích thước 618 bp, mã hóa 205 amino acid và mã kết thúc là TAA. Kết

quả trình tự thu được phù hợp với tính toán lí thuyết. Trình tự nucleotide và amino

acid suy diễn của gen Rab7 được trình bày trên hình 3.2.

ATGGCATCTCGCAAGAAGATTCTCCTGAAGGTGATCATCCTGGGAGACTCTGGTGTAGGCAAAACATCCCTTATGAACCA 80 M A S R K K I L L K V I I L G D S G V G K T S L M N Q GTTTGTTAACAAGAAATTCAGCAACCAGTACAAGGCAACCATTGGGGCAGACTTCCTCACAAAGGAGGTTATGGTTGATG 160 F V N K K F S N Q Y K A T I G A D F L T K E V M V D ACAGATTGGTCACAATGCAGATCTGGGATACAGCTGGTCAAGAGAGATTCCAGTCGTTAGGTGTTGCATTCTATCGAGGA 240 D R L V T M Q I W D T A G Q E R F Q S L G V A F Y R G GCTGATTGTTGTGTTCTTGTCTATGATGTTACATCTCCCAACACCTTCAAGTCTCTTGATTCGTGGCGTGACGAGTTCCT 320 A D C C V L V Y D V T S P N T F K S L D S W R D E F L AATTCAAGCCTCACCAAGGGACCCTGATCACTTCCCATTTGTTGTCCTGGGTAACAAGATTGATCTGGAGAATAGGGCGG 400 I Q A S P R D P D H F P F V V L G N K I D L E N R A TATCAACGAAGCGAGCACAACAGTGGTGTCATAGTAAAAATGAAGTTCCCTACTTTGAAACTAGTGCAAAGGAAGCCATT 480 V S T K R A Q Q W C H S K N E V P Y F E T S A K E A I AATGTGGAGCTAGCCTTCCAGACCATTGCTCGCAATGCTCTTGCTCAGGAGTCTGAGGTGGAACTCTACAATGAGTTTCC 560 N V E L A F Q T I A R N A L A Q E S E V E L Y N E F P AGACCAGATCAAATTGACCAATGACAACAAGGCTAAACAGGATGCATGCTCTTGCTAA 618 D Q I K L T N D N K A K Q D A C S C *

Hình 3.2. Trình tự gen và amino acid suy diễn của Rab7

So sánh trình tự nucleotide gen Rab7 phân lập từ tôm sú Việt Nam với trình tự

phân lập từ tôm sú Thái Lan (mã số GenBank: DQ231062), chúng tôi thấy có sự sai

khác ở 4 vị trí nucleotide: 318 T  C, 423 A  G, 490 T  C, 537 A  G (Hình

3.3). Tuy nhiên, sự sai khác ở các nucleotide này không dẫn đến sự khác nhau trong

trình tự amino acid. Trình tự gen mã hóa protein Rab7 được đăng ký trên GenBank

với mã số HQ128578.

10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| DQ231062 ATGGCATCTCGCAAGAAGATTCTCCTGAAGGTGATCATCCTGGGAGACTCTGGTGTAGGCAAAACATCCCTTATGAACCA Rab7VN ................................................................................

90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| DQ231062 GTTTGTTAACAAGAAATTCAGCAACCAGTACAAGGCAACCATTGGGGCAGACTTCCTCACAAAGGAGGTTATGGTTGATG Rab7VN ................................................................................

170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| DQ231062 ACAGATTGGTCACAATGCAGATCTGGGATACAGCTGGTCAAGAGAGATTCCAGTCGTTAGGTGTTGCATTCTATCGAGGA Rab7VN ................................................................................

250 260 270 280 290 300 310 320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| DQ231062 GCTGATTGTTGTGTTCTTGTCTATGATGTTACATCTCCCAACACCTTCAAGTCTCTTGATTCGTGGCGTGACGAGTTTCT Rab7VN .............................................................................C.. 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| DQ231062 AATTCAAGCCTCACCAAGGGACCCTGATCACTTCCCATTTGTTGTCCTGGGTAACAAGATTGATCTGGAGAATAGGGCGG Rab7VN ................................................................................

410 420 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| DQ231062 TATCAACGAAGCGAGCACAACAATGGTGTCATAGTAAAAATGAAGTTCCCTACTTTGAAACTAGTGCAAAGGAAGCCATT Rab7VN ......................G.........................................................

490 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| DQ231062 AATGTGGAGTTAGCCTTCCAGACCATTGCTCGCAATGCTCTTGCTCAGGAGTCTGAAGTGGAACTCTACAATGAGTTTCC Rab7VN .........C..............................................G.......................

570 580 590 600 610 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|... DQ231062 AGACCAGATCAAATTGACCAATGACAACAAGGCTAAACAGGATGCATGCTCTTGCTAA Rab7VN ..........................................................

Hình 3.3. So sánh trình tự nucleotide ở gen Rab7 của tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố

Rab7VN: Trình tự nucleotide gen Rab7 từ tôm sú nhiễm bệnh đốm trắng,

DQ231062: Rab7 tôm sú được công bố trên Genbank.

Gen mã hóa Rab7 ở tôm sú được phân lập đầu tiên trong các loài giáp xác.

Nhóm tác giả Sritunyalucksana và đtg (2006) đã so sánh trình tự amino acid của

Rab7 ở tôm sú với các loài khác như chuột, người, ngựa, chó và thỏ và cho rằng

Rab7 là một protein bảo thủ cao [192]. Gần đây, trình tự gen mã hóa Rab7 cũng đã

được phân lập ở một số loài tôm khác như tôm thẻ chân trắng (mã số FJ811529)

và tôm thẻ Nhật Bản (mã số AB379643). So sánh trình tự amino acid của protein

Rab7 ở tôm sú và các loài tôm trên cũng cho thấy sự tương đồng rất cao. Protein

Rab7 ở tôm sú và tôm thẻ chân trắng có độ tương đồng là 100%, trong khi Rab7 ở

tôm thẻ Nhật Bản có sự sai khác duy nhất một trình tự amino acid ở vị trí 22 TA

so với Rab7 ở các loài tôm còn lại.

Cấu trúc bậc hai của PmRab7 phân lập từ tôm sú Việt Nam được dự đoán

bằng cách sử dụng chương trình PSIPRED [39]. Kết quả dự đoán ở hình 3.4 cho

thấy cấu trúc PmRab7 có 4 chuỗi xoắn kép (helix) gồm 8 sợi (strand). Chúng tôi

sử dụng chương trình Prosite [28], [175] để dự đoán các motif chức năng của

protein Rab7. Kết quả cho thấy: vùng chức năng GTPase quan trọng của Rab7 là

đoạn vòng nút (loop) giữa strand và helix thứ nhất (đầu N của protein), vị trí

bám của GTP là từ vị trí amino acid 15 đến vị trí amino acid 22. Ngoài ra, còn có

rất nhiều vị trí phosphoryl hóa chứng tỏ chức năng điều khiển các quá trình sinh

học của protein mang hoạt tính enzyme GTPase này. Đoạn cDNA mã hóa Rab7

mà chúng tôi phân lập được từ tôm sú là nguyên liệu tốt phục vụ cho những

nghiên cứu tiếp theo nhằm làm sáng tỏ chức năng của protein này.

Hình 3.4. Mô phỏng cấu trúc bậc hai và phân tích các motif chức năng của protein Rab7

Vùng nền đen chữ trắng (vị trí amino acid từ 15-22) là ATP/GTP-binding site motif

A (P-loop); Vùng nền xám (vị trí amino acid từ 31-34) là cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site; Các vùng được đóng khung (vị trí amino acid từ 101- 104, 111-114, 145-148, 155-158 và 178-181) là Casein kinase II phosphorylation sites.

3.2. SYNTENIN - PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƢỜNG D ẪN

TRUYỀ N TÍ N HIỆ U

Syntenin của tôm sú là một trong những protein được quan tâm nghiên cứu.

Đây là một loại protein trung gian trong quá trình dẫn truyền tín hiệu nội bào.

Syntenin tương tác với vùng hướng tế bào chất (cytoplasmic domain) của một loại

protein xuyên màng syndecan [78]. Năm 2002, một đoạn gen syntenin đã được

phân lập từ thư viện cDNA mô máu của tôm sú nhiễm virus gây bệnh đốm trắng

[31]. Đoạn gen syntenin đã phân lập này có chiều dài 719 bp (mã số

GenBank AF335106), độ dài protein suy diễn là 233 amino acid với mã kết thúc

TAA. Brangrak và đtg (2002) đã chứng minh syntenin biểu hiện mạnh khi tôm bị

nhiễm virus gây bệnh đốm trắng. Phân tích so sánh trình tự protein cho thấy,

syntenin chứa hai vùng PDZ (postsynaptic density protein). Vùng PDZ là vị trí

diễn ra các phản ứng tương tác giữa syntenin với các protein khác [65]. Để nghiên

cứu sâu hơn mối liên kết giữa syntenin và sự xâm nhiễm virus ở tôm sú, người ta

đã tiến hành các thí nghiệm nhằm xác định các protein tương tác trực tiếp với

syntenin [207]. Ở nghiên cứu này, trình tự đầy đủ của syntenin (kích thước là 969

bp) đã được phân lập và biểu hiện. Tuy nhiên, trình tự này không được đăng ký

trên GenBank. Kết quả nghiên cứu của Tonganunt và đtg (2005) cho thấy,

syntenin tương tác với alpha-2-macroglobulin (2M), một loại protein có trong

huyết tương [207]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, 2M có vai trò ức chế hoạt

động của proteinase và là protein quan trọng trong hệ thống miễn dịch của tôm

[75], [166]. Cả syntenin và 2M cùng được điều khiển tăng biểu hiện khi tôm

nhiễm virus gây bệnh đốm trắng. Ngoài ra, syntenin còn tương tác với nhân tố

khởi đầu dịch mã eIF5A và cân bằng sự điều khiển tín hiệu của eIF5A tới p53 cần

thiết cho quá trình apoptosis [116]. Để góp phần nghiên cứu vai trò các gen liên

quan đến khả năng miễn dịch của tôm sú đối với virus gây bệnh đốm trắng, chúng

tôi mở rộng nghiên cứu gen syntenin trên đối tượng tôm sú Việt Nam. Chúng tôi

tiến hành phân lập gen syntenin hoàn chỉnh dựa trên thông tin một đoạn gen đã công bố trên GenBank nhằm phục vụ cho nghiên cứu biểu hiện và chức năng.

3.2.1. Phân lậ p đoạn 5’-syntenin từ mẫu tôm sú Việt Nam

Để phân lậ p đượ c đoạn 5‟-syntenin hoàn chỉnh , mẫu mRNA tách chiết và

tinh sạch từ mô gan của tôm sú bị bệnh đốm trắng được dùng làm khuôn tổng hợp

sợi cDNA thứ nhất bằng cách sử dụng mồi đặc hiệu GSP1-5. Sau đó, sợi cDNA thứ

nhất được tinh sạch, gắn thêm đuôi polyC đầu 3‟ và dùng làm khuôn để nhân đoạn

5‟-syntenin bằng cách sử dụng các mồi chung AAP, UAP được thiết kế bởi nhà sản

xuất và các mồi đặc hiệu GSP2-5, GSP3-5 được thiết kế dựa trên đoạn gen mã số

AF335106 (Hình 2.6; Bảng 2.2). Phản ứng 5‟RACE bước đầu được tiến hành với

cặp mồi GSP2-5/AAP. Sau đó, để tăng tính đặc hiệu, phản ứng 5‟RACE tiếp tục

được thực hiện với mồi đặc hiệu lồng trong (nested) GSP3-5 và UAP. Sản phẩm

5‟RACE được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.5A).

B

A

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn 5’-syntenin

A. Sản phẩm nhân đoạn 5’-syntenin bằng kỹ thuật RT-PCR (M: Marker 1kb; 1:

Sản phẩm RT-PCR nhân đoạ n 5‟-syntenin từ mô gan), B. Kiểm tra sự có mặt của sản

phẩm RT-PCR trong vector tái tổ hợp (M: Marker 1kb, 1-4: Plasmid pCR2.1 mang gen

đoạn 5‟-syntenin).

Kết quả ở hình 3.5A cho thấy sản phẩm 5‟RACE khuyếch đại đoạn 5‟-

syntenin có kích thước khoảng 600 bp phù hợp với tính toán lý thuyết (Bảng 2.2).

Như vậy, từ vị trí mồi GSP3-5 (Hình 2.6), chúng tôi đã kéo dài thêm vào trình tự đã

biết khoảng hơn 400 bp về phía đầu 5‟. Sản phẩm 5‟RACE này được tinh sạch từ

gel agarose và tách dòng phân tử trong vector pCR2.1 (Invitrogen). Để kiểm tra các

plasmid tái tổ hợp, chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn EcoRI, cho phép cắt đoạn 5‟-

syntenin (nếu có) ra khỏi vector.

Sau khi phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI, kết quả

điện di cho thấy mỗi plasmid bị cắt thành hai đoạn: một đoạn lớn có kích thước

tương ứng với vector pCR2.1 (~ 4 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước khoảng

0,6 kb tương ứng với sản phẩm 5‟RACE (Hình 3.5B). Như vậy, bước đầu chúng tôi

khẳng định các dòng plasmid này đã có gắn đoạn 5‟-syntenin. Sau đó, các dòng

plasmid mang đoạn 5‟-syntenin được tinh sạch và làm khuôn cho chuỗi phản ứng

10 20 30 40 50 60 70 80 CTACTACTACTAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGTGATTGAAGTGTGTGGCGCCGCTGAGGAAAGAGT 90 100 110 120 130 140 150 160 GTATAGACGCCACAGAAAGCAGAGACCGGGAGATATTTCGCTGATTAGCAAGTGATTTTAAGAAATAGATCAGCAACATG M 170 180 190 200 210 220 230 240 AGTCTGTACCCGTCATTAGAGGATATGAAGGTGGACCAAATGGGCCGAGCACAGGCCCAGATGGTGAGCGAGATGATGTC S L Y P S L E D M K V D Q M G R A Q A Q M V S E M M S 250 260 270 280 290 300 310 320 GGCACAGGTGGAAAATAACCCAACAGCGCCACCTGCGATTGCTGGATATGCTGCACCTCCCTATCCACTGCACCCACCAG A Q V E N N P T A P P A I A G Y A A P P Y P L H P P 330 340 350 360 370 380 390 400 AAACTGCGAAGCAGCAGAATAGCTTGGCCCATCTGTATCCTTCACTGGGAGATTACATGGGCCTAGAGTTCACTGATGAA E T A K Q Q N S L A H L Y P S L G D Y M G L E F T D E 410 420 430 440 450 460 470 480 GTTATTGCTGCGAACATGCCAGAATATTTGGCCGTCTCACAAGTGCAGCCTGGAACAGTGGCTGTGGCCCCAACCTCAGG V I A A N M P E Y L A V S Q V Q P G T V A V A P T S G 490 500 510 520 530 540 550 560 ACCAGTCTCAGTGGTGCCCTCAGGGATGGTGGCTCCCATCTCTGGTGCGTCTCCTGGACTTTACCGAGCTCAGGTCACTA P V S V V P S G M V A P I S G A S P G L Y R A Q V T 570 580 590 ATTCCATCCGAGAGATCACCCTCTGCAAGGACAGTG N S I R E I T L C K D S

nhằm đọc trình tự. Kết quả xác định trình tự được trình bày ở hình 3.6.

Phần gạch chân là trình tự của hai mồi UAP và GSP3-5. Phần in đậm là trình tự 5‟-

UTR. Phần có màu nền xám là trình tự mã hóa syntenin mới được xác định thêm.

Hình 3.6. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn 5’-syntenin

Kết quả đọc trình tự cho thấy: đoạn 5‟-syntenin mà chúng tôi phân lập được

với cặp mồi UAP/GSP3-5 có chiều dài 596 bp, trong đó đoạn từ vị trí 425-596 trùng

khớp với đoạn đầu của trình tự đã biết (AF335106). Chúng tôi đã xác định được

thêm 337 bp về phía đầu 5‟ bao gồm 110 bp thuộc đoạn 5‟-UTR và 267 bp thuộc

ORF của gen syntenin. Như vậy, kết hợp với 702 bp đã biết (AF335106) ta có thể

suy ra trình tự gen syntenin đầy đủ là 969 bp. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu

của Tonganunt và đtg (2005), những người đã biểu hiện gen syntenin trong E. coli

[207]. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu chỉ nhận lại ORF của gen syntenin có sẵn trong

plasmid nhận từ tác giả khác [31] và không công bố trình tự này trên ngân hàng dữ

liệu GenBank. Trình tự nucleotide đoạn 5‟-syntenin bao gồm cả đoạn 5‟-UTR mà

chúng tôi đã phân lập được là mới và chưa được công bố trên GenBank.

3.2.2. Tạo dòng gen syntenin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam

Dựa trên cơ sở trình tự đoạn gen syntenin đã công bố trên GenBank

(AF335106) và đoạn 5‟-syntenin đã phân lập được (Hình 3.6), chúng tôi thiết kế

mồi để nhân gen syntenin hoàn chỉnh (Hình 2.6; Bảng 2.2). Từ mẫu mô gan của tôm

sú bị bệnh đốm trắng, mRNA được tách chiết và tinh sạch dùng làm khuôn tổng hợp

sợi cDNA thứ nhất bằng cách sử dụng mồi Oligo(dT). Sau đó, phản ứng RT-PCR

được tiến hành dựa trên khuôn là cDNA thu được. Sản phẩm RT-PCR được điện di

kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.7).

A

B

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen syntenin

A. Sản phẩm nhân gen syntenin bằng kỹ thuật RT-PCR (M: Marker 1kb; 1: Sản

phẩm RT-PCR), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT-PCR trong vector tái tổ hợp

(M: Marker 1kb, 1-5: Plasmid pCR2.1 mang gen syntenin).

Kết quả ở hình 3.7A cho thấy sản phẩm RT-PCR nhân gen syntenin có kích

thước khoảng 1,0 kb đúng với tính toán lý thuyết. Sản phẩm này được tinh sạch từ

gel agarose và tách dòng phân tử trong vector pJET1.2. Để kiểm tra các plasmid tái

tổ hợp, chúng tôi sử dụng hai enzyme giới hạn XhoI và XbaI, cho phép cắt gen

syntenin (nếu có) ra khỏi vector. Kết quả phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp

được thể hiện ở hình 3.7B. Sau khi phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp bằng

enzyme XhoI và XbaI, kết quả điện di cho thấy mỗi plasmid bị cắt thành hai đoạn:

một đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pJET1.2 (~ 3 kb) và một đoạn nhỏ

hơn có kích thước 1,0 kb tương ứng với sản phẩm RT-PCR (Hình 3.7A). Như vậy,

bước đầu chúng tôi khẳng định các dòng plasmid này đã có gắn gen syntenin.

3.2.3. Xác định và phân tích trình tự gen syntenin

Từ kết quả tách dòng, chúng tôi đã xác định trình tự của gen syntenin đầy đủ

đã được gắn với vector pJET1.2. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi đã khẳng định

được rằng đoạn cDNA phân lập được là trình tự ORF hoàn chỉnh mã hóa syntenin.

Trình tự gen syntenin đầy đủ có kích thước 969 bp, mã hóa 322 amino acid và mã

kết thúc là TAA (hình 3.8). Đoạn gen đã công bố trên GenBank mã số AF335106

tương ứng với vị trí 268 - 969.

Khi so sánh trình tự gen syntenin đầy đủ phân lập từ tôm sú Việt Nam với

trình tự đã công bố trên ngân hàng gen (AF335106) phân lập từ tôm sú Thái Lan,

chúng tôi thấy có sự sai khác 3 vị trí nucleotide: 268 T → G, 554 A → T và 662 A

→ G. Sự sai khác trình tự nucleotide này dẫn đến sự sai khác trình tự amino acid ở

3 vị trí 90 Y → D, 185 Q → L và 221 E → G. Điểm đáng chú ý là những amino

acid này đều ở vị trí tương đối bảo thủ (Hình 3.9). Ở vị trí 90 (số thứ tự theo trình tự

của tôm sú Việt Nam của nghiên cứu này), đa phần động vật không xương sống

(tôm sú Việt Nam, muỗi, tằm và rận) là Y, ở động vật có xương sống (người, bò,

chuột và cá) là V. Ở vị trí 185, tôm sú Việt Nam và đa số các loài (80%) đều là Q. Ở

vị trí 221, ngoài tôm sú Thái Lan thì tất cả các loài còn lại đều là E. Trong khi đó ở

tôm sú Thái Lan, cả 3 vị trí trên đều là các loại amino acid khác biệt hẳn với các

trình tự khác (tương ứng là D, L và G). Như vậy, trình tự gen syntenin đầy đủ mà

chúng tôi đã phân lập và xác định trình tự có 3 điểm sai khác so với trình tự đã công

bố trước (AF335106), nhưng amino acid ở những vị trí này không khác biệt so với

syntenin ởcác loài khác.

ATGAGTCTGTACCCGTCATTAGAGGATATGAAGGTGGACCAAATGGGCCGAGCACAGGCCCAGATGGTGAGCGAGATGAT 80 M S L Y P S L E D M K V D Q M G R A Q A Q M V S E M M GTCGGCACAGGTGGAAAATAACCCAACAGCGCCACCTGCGATTGCTGGATATGCTGCACCTCCCTATCCACTGCACCCAC 160 S A Q V E N N P T A P P A I A G Y A A P P Y P L H P CAGAAACTGCGAAGCAGCAGAATAGCTTGGCCCATCTGTATCCTTCACTGGGAGATTACATGGGCCTAGAGTTCACTGAT 240 P E T A K Q Q N S L A H L Y P S L G D Y M G L E F T D GAAGTTATTGCTGCGAACATGCCAGAATATTTGGCCGTCTCACAAGTGCAGCCTGGAACAGTGGCTGTGGCCCCAACCTC 320 E V I A A N M P E Y L A V S Q V Q P G T V A V A P T S AGGACCAGTCTCAGTGGTGCCCTCAGGGATGGTGGCTCCCATCTCTGGTGCGTCTCCTGGACTTTACCGAGCTCAGGTCA 400 G P V S V V P S G M V A P I S G A S P G L Y R A Q V CTAATTCCATCCGAGAGATCACCCTCTGCAAGGACAGTGAGGGTAAGGTAGGCATGCGTGTCAAGGCGATCAACAAGGGA 480 T N S I R E I T L C K D S E G K V G M R V K A I N K G GTGTTCGTGTGCCTGGTGAAGAAGAACTCGCCAGCAGCTCTTGCAGGACTGCGTTTCGGAGACCAGATCTTGCAGATCAA 560 V F V C L V K K N S P A A L A G L R F G D Q I L Q I N CAGTGAAAATGTGGCAGGGTATTCCATGGAAAAAGTACATGACATGCTGAAGAAGAGTCCTACAAATGGAATTTCCCTTG 640 S E N V A G Y S M E K V H D M L K K S P T N G I S L CCATTAGAGACAGGCCATTCGAGAGAACTGTTACCTTACACAAGGACAGCACAGGTCACATTGGATTCCAGTTCCGTGAT 720 A I R D R P F E R T V T L H K D S T G H I G F Q F R D GGAGAGATCACTGCCCTTGTCAAGGATTCCTCAGCTGCGCGAAATGGGCTTCTCACAGACCACCATCTGCTGGAGGTGAA 800 G E I T A L V K D S S A A R N G L L T D H H L L E V N TGGGCAGAATGTGGTGGGGCTGAAGGACAAGGAAGTCTCAGCCATAATCAATGAGTGTGGGCAGGTGGTCACGGTGACAA 880 G Q N V V G L K D K E V S A I I N E C G Q V V T V T TCATGCCGTCCTTTGTCTACAAGCACATGATGAAGCACATGGCCTCCTCGCTGAAGAAGTTCATGGACCACTCCATTCCC 960 I M P S F V Y K H M M K H M A S S L K K F M D H S I P GACCTGTAA 969 D L *

Hình 3.8. Trình tự gen và amino acid suy diễn của syntenin

Syntenin tương tác với syndecan (syndecan binding protein ), tương tác này

được thực hiện thông qua 2 vùng PDZ của syntenin [78]. PDZ là cấu trúc khá bảo

thủ gồm khoảng 80-90 amino acid cấu thành 5 hoặc 6 sợi  và 2 chuỗi xoắn  [77],

[101]. Dựa trên cấu trúc syntenin đã biết , chúng ta có thể dự đoán được cấu trúc của

syntenin tôm sú . Syntenin tôm sú cũng có 2 vùng PDZ [31]: PDZ-1 ở vị trí amino

acid 135-218 và PDZ-2 ở vị trí amino acid từ 220-300. Hình 3.21 cho thấy trong 3

vị trí sai khác giữa trình tự syntenin mà chúng tôi đã xác định và trình tự đã công bố

trước AF335106, có 2 vị trí nằm ở vùng PDZ-1 và PDZ-2. Do PDZ là vùng chức

năng quan trọng của syntenin nên sự sai khác này có thể ảnh hưởng đến hoạt động

của protein này. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đặt ra một vấn đề mới cần nghiên

cứu sâu hơn về các SNPs trong gen syntenin của tôm sú.

Hình 3.9. So sánh trình tự amino acid của protein syntenin giữa các loài khác nhau

Shrimp-TL - tôm sú Thái Lan (AF335106) và Shrimp-VN (tôm sú Việt Nam được

xác định qua nghiên cứu này). Mosquito - muỗi (Anopheles gambiae; XP_318581),

silkworm - bướm (Bombyx mori; NP_001040345), Louse - rận biển (Lepeophtheirus

salmonis; ADD37957), Human - người (Homo sapiens; AAB97144), cattle - bò (Bos

taurus; ABQ12975), mouse - chuột (Mus musculus; AAC27646), salmon – cá hồ i (Salmo

salar; BT045138). Phần trình tự có nền màu đen là phần amino acid giống nhau hoàn toàn

giữa các loài. Phần trình tự có nền màu xám là phần đa số các loài (60-80%) có amino acid

giống nhau. Mũi tên chỉ vị trí khác nhau giữa trình tự syntenin mới được xác định và trình

tự đã biết AF335106. Vị trí của hai vù ng PDZ-1 và PDZ-2 được đánh dấu bằng thanh màu

xám nhạt và đậm phía dưới mỗi đoạn.

3.3. HEMOCYANIN - PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH PHENOLOXIDASE

Hemocyanin là một loại protein lớn chứa ion Cu 2+, có ở máu của động vật

chân khớp và thân mềm [214]. Hemocyanin được xác định ở trong máu của tất

cả đơn vị phân loại của động vật chân khớp [81], [109], [161]. Trong phân lớp

này, các hemocyanin được phân thành 3 loại khác biệt bằng phương pháp miễn

dịch là alpha, beta và gama [137], [139]. Đầu tiên hemocyanin được biết đến là

một protein vận chuyển oxy phân tử. Sau đó, nó được chứng minh là một loại

protein đa chức năng liên quan đến các phản ứng miễn dịch và các quá trình sinh

lí như dự trữ protein, điều khiển thẩm thấu, chu kỳ lột xác và sự hóa cứng lớp vỏ

kitin [17]. Trong ngành phụ giáp xác (Crustacean ), hemocyanin ở một số lớp chỉ

có vai trò vận chuyển oxy , riêng ở lớ p giá p xá c (Malacostraca) các hemocyanin

được nghiên cứu nhiều về cấu trúc và chức năng [136], [138]. Gần đây,

hemocyanin và một số peptide có trình tự tương đồng với trình tự amino acid

đầu C của hemocyanin (95-100%) đã được chứng minh có chức năng kháng

khuẩn và kháng nấm [57], [58], [149]. Theo Iwanaga và đtg (2005), hemocyanin

có hoạt tính phenoloxidase đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo nên

melanin - một chất có khả năng diệt khuẩn mạnh [85], [91].

Nghiên cứu hemocyanin ở loài tôm thẻ Nhật Bản đã phát hiện hai gen mã

hóa hai tiểu phần (subunit) của phức hợp phân tử hemocyanin là PjHcL và

PjHcY. Hai gen PjHcL và PjHcY có sự biểu hiện khác nhau ở mức độ phiên mã

khi tôm nhiễm WSSV, cụ thể là gen PjHcL có biểu hiện mạnh hơn [112]. Năm

2006, Zhang và đtg chỉ ra hemocyanin của tôm thẻ chân trắng có thể kết hợp trực

tiếp với 8 loài nguồn bệnh vi khuẩn ở tôm [246]. Hemocyanin được tách chiết ở

tôm sú và cho thấy khả năng kháng nhiều loại virus bao gồm cả virus RNA và

DNA [245]. Tuy nhiên, cơ chế kháng virus của hemocyanin vẫn chưa được sáng

tỏ. Năm 2002, một đoạn gen hemocyanin đã được phân lập từ thư viện cDNA mô

máu của tôm sú [31]. Đoạn gen hemocyanin này có chiều dài 1470 bp, 1350 bp

mã hóa trình tự protein suy diễn gồm 449 amino acid với mã kết thúc TAG và

120 bp trình tự 3‟UTR (mã số GenBank AF431737). Để góp phần nghiên cứu

hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và virus của hemocyanin ở tôm nói chung và

tôm sú nói riêng, chúng tôi tiến hành tạo dòng và xác định trình tự gen

hemocyanin trên đối tượng tôm sú Việt Nam. Gen syntenin được phân lập hoàn

chỉnh dựa trên thông tin một đoạn gen đã công bố trên GenBank.

3.3.1. Phân lập đoạn 5’-hemocyanin từ mẫu tôm sú Việt Nam

Dựa trên thông tin một đoạn gen hemocyanin đã công bố trên GenBank

(AF431737 ), chúng tôi thiết kế mồi (Bảng 2.2) và tiến hành tạo dòng để xác định

trình tự gen hemocyanin hoàn chỉnh theo sơ đồ 2.7. Trướ c tiên , mẫu mRNA đượ c

tách chiết và tinh sạch từ mô gan của tôm sú bị bệnh đốm trắng được dùng làm

khuôn tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bằng cách sử dụng mồi 5‟RACE CDS A như

đã trì nh bà y ở mụ c . Mồi đặc hiệu GSP1 kết hợp với mồi UPM (Universal Primer

A Mix), cung cấp bởi kit “SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit”

(Clontech) để nhân đoạn gen hemocyanin kéo dài về phía đầu 5‟ (gọi tắt là: đoạn

5‟-hemocyanin) bằ ng p hản ứng 5‟RACE. Sản phẩm 5‟RACE được điện di kiểm

tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.10A).

A

B

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn 5’-hemocyanin

A. Sản phẩm nhân đoạn 5’-hemocyanin bằng kỹ thuật 5’RACE (M: Marker

1kb; 1: Sản phẩm 5‟RACE nhân đoạn 5‟-hemocyanin), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm 5’RACE trong vector tái tổ hợp (M: Marker 1kb, 1-5: Plasmid pCR2.1 mang đoạn

5‟-hemocyanin)

Kết quả ở hình 3.10A cho thấy, sản phẩm 5‟RACE khuyếch đại đoạn 5‟-

hemocyanin có kích thước khoảng 1200 bp phù hợp với tính toán lý thuyết (Bảng

2.2). Như vậy, từ vị trí mồi GSP1 chúng tôi đã kéo dài thêm vào trình tự đã biết

khoảng 800 bp về phía đầu 5‟. Sản phẩm 5‟RACE này được tinh sạch từ gel agarose

và tách dòng phân tử trong vector pCR2.1 (Invitrogen). Để kiểm tra các dòng plasmid

tái tổ hợp mang gen hemocyanin chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn HindIII và XhoI,

hai enzyme này sẽ cắt đoạn 5‟-hemocyanin (nếu có) ra khỏi vector tái tổ hợp.

Sau khi phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp bằng enzyme HindIII và XhoI,

kết quả điện di cho thấy mỗi plasmid bị cắt thành hai đoạn: một đoạn lớn có kích

thước tương ứng với vector pCR2.1 (~ 4 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước

khoảng 1,3 kb tương ứng với sản phẩm 5‟RACE và một phần của vector pCR2.1

(Hình 3.10B). Như vậy, chúng tôi khẳng định các dòng plasmid này đã có gắn đoạn

5‟-hemocyanin.

10 20 30 40 50 60 70 80 CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGATCCACATGGGGACCGTCAACATGAAGGTCTTGT M G T V N M K V L 90 100 110 120 130 140 150 160 TGTTGTTCGCTCTCGTTGCGGCTGCTGCCGCCTGGCCGAACTTTGGCTTCCAGTCGGACGCGGGGGGTGCGGCTGATGCT L L F A L V A A A A A W P N F G F Q S D A G G A A D A 170 180 190 200 210 220 230 240 CAGAAGCAACATGACGTAAACTTCCTGCTTCATAAGATCTACGGGGATATCCGTGACTCTAATCTAAAAGGCAAAGCTGA Q K Q H D V N F L L H K I Y G D I R D S N L K G K A D 250 260 270 280 290 300 310 320 TTCCTTTGACCCGGAAGCCAATTTATCCCATTACAGTGACGGAGGTAAAGCAGTACAGAAACTTATGAGAGACCTGAAGG S F D P E A N L S H Y S D G G K A V Q K L M R D L K 330 340 350 360 370 380 390 400 ATAACAGGCTTCTTCAACAAAGGCATTGGTTCTCTCTCTTCAATCCTAGGCAACGCGAAGAAGCACTTATGCTTTTTGAT D N R L L Q Q R H W F S L F N P R Q R E E A L M L F D 410 420 430 440 450 460 470 480 GTTCTCATTCACTGCAAGGATTGGGATACATTTGTCAGCAATGCTGCCTACTTCCGCCAAATTATGAATGAGGGAGAATT V L I H C K D W D T F V S N A A Y F R Q I M N E G E F 490 500 510 520 530 540 550 560 TGTTTATGCCTTGTATGTTGCGGTCATCCACTCACCTCTGTCTGAACACGTTGTACTTCCTCCACTCTATGAAGTCACGC V Y A L Y V A V I H S P L S E H V V L P P L Y E V T 570 580 590 600 610 620 630 640 CACATCTCTTCACCAACAGCGAAGTCATTGAAGCAGCTTATCGTGCCAAGCAAACACAAAAACCTGGTAAATTTAAGTCT P H L F T N S E V I E A A Y R A K Q T Q K P G K F K S 650 660 670 680 690 700 710 720 AGCTTCACTGGAACTAAGAAGAATCCTGAACAAAGAGTAGCCTATTTCGGAGAGGACATTGGAATGAACACTCATCACGT S F T G T K K N P E Q R V A Y F G E D I G M N T H H V 730 740 750 760 770 780 790 800 CACCTGGCATATGGAATTCCCATTCTGGTGGGACGACAAATACAGCCATCATCTGGATCGCAAAGGAGAGAATTTCTTCT T W H M E F P F W W D D K Y S H H L D R K G E N F F 810 820 830 840 850 860 870 880 GGGTACATCATCAACTTACCGTTCGTTTTGATGCTGAACGTCTCTCCAATTATTTGGATCCCGTCGACGAACTTCACTGG W V H H Q L T V R F D A E R L S N Y L D P V D E L H W 890 900 910 920 930 940 950 960 GAGAAGCCAATCGTACAAGGTTTTGCTCCCCACACCACTTACAAGTATGGAGGTCAGTTCCCCTCTCGTCCAGATAATGT E K P I V Q G F A P H T T Y K Y G G Q F P S R P D N V 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 AGACTTCGAGGATGTGGATGGTGTTGCTCGTATTCGAGACTTGCTTATTGTAGAGAGCCGAATCCGCGATGCTATTGCAC D F E D V D G V A R I R D L L I V E S R I R D A I A 1050 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 ATGGTTATATCGTCGACAGGGCTGGTAATCATATTGATATCATGAATGAGCGTGGAATTGACGTTCTTGGAGATGTTATT H G Y I V D R A G N H I D I M N E R G I D V L G D V I 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 GAATCATCTTTGTACAGCCCTAATGTGCAGTACTATGGAGCCTTGCACAATACTGCTCACATTGTACTTGGTCGACAGAG E S S L Y S P N V Q Y Y G A L H N T A H I V L G R Q S 1210 TGATCCACATGG D P H

Hình 3.11. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn 5’-hemocyanin

Phần gạch chân là trình tự của hai mồi UPM và GSP1. Phần in đậm là trình tự 5‟-

UTR. Phần có màu nền xám là trình tự mã hóa hemocyanin mới được xác định thêm.

Các dòng plasmid mang đoạn 5‟-hemocyanin được tinh sạch và làm khuôn

cho chuỗi phản ứng đọc trình tự. Kết quả xác định trình tự được trình bày ở hình

3.11. Kết quả đọc trình tự cho thấy đoạn 5‟-hemocyanin phân lập được với cặp mồi

UPM/GSP1 có chiều dài 1212 bp, trong đó đoạn từ vị trí 755 - 1212 trùng khớp với

đoạn đầu của trình tự đã biết (AF431737). Chúng tôi đã xác định được thêm 709 bp

về phía đầu 5‟ bao gồm 7 bp thuộc đoạn 5‟-UTR và 702 bp thuộc ORF của gen

hemocyanin. Như vậy, kết hợp với 1350 bp đã biết (AF431737) ta có thể suy ra

trình tự gen hemocyanin đầy đủ là 2052 bp. Trình tự nucleotide đoạn 5‟-hemocyanin

bao gồm cả đoạn 5‟-UTR mà chúng tôi đã phân lập được là mới và chưa được công

bố trên GenBank.

3.3.2. Tạo dòng gen hemocyanin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam

Dựa trên cơ sở trình tự đoạn gen hemocyanin đã công bố trên GenBank

(AF431737) và đoạn 5‟-hemocyanin đã phân lập được, chúng tôi thiết kế mồi để

nhân gen hemocyanin hoàn chỉnh (Hình 2.7; Bảng 2.2). Tương tự như trường hợp

phân lập các gen dựa trên thông tin trình đã biết hòa toàn, sợi cDNA thứ nhất được

tổng hợp dựa trên khuôn là mRNA tách chiết và tinh sạch từ mô gan của tôm sú bị

bệnh đốm trắng bằng cách sử dụng mồi Oligo(dT). Phản ứng RT-PCR sau đó được

tiến hành với cDNA thu được. Sản phẩm RT-PCR được điện di kiểm tra trên gel

agarose 0,8% (Hình 3.12A).

A

B

Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen hemocyanin

A. Sản phẩm nhân gen hemocyanin bằng kỹ thuật RT-PCR (M: Marker 1kb; 1:

Sản phẩm RT-PCR nhân gen hemocyanin), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT- PCR trong vector tái tổ hợp (M: Marker 1kb, 1-4: Plasmid pJET1.2 mang gen hemocyanin)

Sản phẩm RT-PCR nhân gen hemocyanin có kích thước khoảng 2,0 kb đúng

với tính toán lý thuyết (Bảng 2.2), sản phẩm này được tinh sạch từ gel agarose và tách

dòng vào vector pJET1.2 (Fermentas). Plasmid tái tổ hợp được phân tích bằng hai

enzyme giới hạn: XbaIvà XhoI, cho phép cắt gen hemocyanin (nếu có) ra khỏi vector,

kết quả điện di cho thấy mỗi plasmid bị cắt thành hai đoạn: một đoạn lớn có kích thước

tương ứng với vector pJET 1.2 (~ 3 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước 2,0 kb tương

ứng với sản phẩm RT-PCR gen hemocyanin (Hình 3.12B). Như vậy, bước đầu chúng

tôi khẳng định các dòng plasmid này đã có gắn gen hemocyanin.

ATGGGGACCGTCAACATGAAGGTCTTGTTGTTGTTCGCTCTCGTTGCGGC 50 M G T V N M K V L L L F A L V A A TGCTGCCGCCTGGCCGAACTTTGGCTTCCAGTCGGACGCGGGGGGTGCGG 100 A A A W P N F G F Q S D A G G A CTGATGCTCAGAAGCAACATGACGTAAACTTCCTGCTTCATAAGATCTAC 150 A D A Q K Q H D V N F L L H K I Y GGGGATATCCGTGACTCTAATCTAAAAGGCAAAGCTGATTCCTTTGACCC 200 G D I R D S N L K G K A D S F D P GGAAGCCAATTTATCCCATTACAGTGACGGAGGTAAAGCAGTACAGAAAC 250 E A N L S H Y S D G G K A V Q K TTATGAGAGACCTGAAGGATAACAGGCTTCTTCAACAAAGGCATTGGTTC 300 L M R D L K D N R L L Q Q R H W F TCTCTCTTCAATCCTAGGCAACGCGAAGAAGCACTTATGCTTTTTGATGT 350 S L F N P R Q R E E A L M L F D V TCTCATTCACTGCAAGGATTGGGATACATTTGTCAGCAATGCTGCCTACT 400 L I H C K D W D T F V S N A A Y TCCGCCAAATTATGAATGAGGGAGAATTTGTTTATGCCTTGTATGTTGCG 450 F R Q I M N E G E F V Y A L Y V A GTCATCCACTCACCTCTGTCTGAACACGTTGTACTTCCTCCACTCTATGA 500 V I H S P L S E H V V L P P L Y E AGTCACGCCACATCTCTTCACCAACAGCGAAGTCATTGAAGCAGCTTATC 550 V T P H L F T N S E V I E A A Y GTGCCAAGCAAACACAAAAACCTGGTAAATTTAAGTCTAGCTTCACTGGA 600 R A K Q T Q K P G K F K S S F T G ACTAAGAAGAATCCTGAACAAAGAGTAGCCTATTTCGGAGAGGACATTGG 650 T K K N P E Q R V A Y F G E D I G AATGAACACTCATCACGTCACCTGGCATATGGAATTCCCATTCTGGTGGG 700 M N T H H V T W H M E F P F W W ACGACAAATACAGCCATCATCTGGATCGCAAAGGAGAGAATTTCTTCTGG 750 D D K Y S H H L D R K G E N F F W GTACATCATCAACTTACCGTTCGTTTTGATGCTGAACGTCTCTCCAATTA 800 V H H Q L T V R F D A E R L S N Y TTTGGATCCCGTCGACGAACTTCACTGGGAGAAGCCAATCGTACAAGGTT 850 L D P V D E L H W E K P I V Q G TTGCTCCCCACACCACTTACAAGTATGGAGGTCAGTTCCCCTCTCGTCCA 900 F A P H T T Y K Y G G Q F P S R P GATAATGTAGACTTCGAGGATGTGGATGGTGTTGCTCGTATTCGAGACTT 950 D N V D F E D V D G V A R I R D L GCTTATTGTAGAGAGCCGAATCCGCGATGCTATTGCACATGGTTATATCG 1000 L I V E S R I R D A I A H G Y I TCGACAGGGCTGGTAATCATATTGATATCATGAATGAGCGTGGAATTGAC 1050 V D R A G N H I D I M N E R G I D

GTTCTTGGAGATGTTATTGAATCATCTTTGTACAGCCCTAATGTGCAGTA 1100 V L G D V I E S S L Y S P N V Q Y CTATGGAGCCTTGCACAATACTGCTCACATTGTACTTGGTCGACAGAGTG 1150 Y G A L H N T A H I V L G R Q S ATCCACATGGAAAATATGATTTACCCCCTGGTGTGCTGGAACACTTTGAA 1200 D P H G K Y D L P P G V L E H F E ACTGCCACCCGTGATCCTAGCTTCTTTAGGCTGCATAAATACATGGATAA 1250 T A T R D P S F F R L H K Y M D N CATCTTCAAGGAACACAAGGACAGTCTCCCTCCATACACCGTGGAAGAAC 1300 I F K E H K D S L P P Y T V E E TAACATTTGCCGGTGTAAGTGTAGACAATGTAGCAATTGAAGGAGAACTA 1350 L T F A G V S V D N V A I E G E L GAGACCTTCTTCGAGGATTTCGAATACAATCTCATTAACGCTGTTGATGA 1400 E T F F E D F E Y N L I N A V D D CACTGAACAAATTCCAGATGTAGAAATTTCTACTTACGTGCCTCGTCTGA 1450 T E Q I P D V E I S T Y V P R L ACCATAAGGACTTTAAAATTAAGATTGATGTTAGCAATAACAAGGGCCAG 1500 N H K D F K I K I D V S N N K G Q GAAGTTCTAGCTACCGTTCGCATTTTCGCCTGGCCTCACCTAGACAATAA 1550 E V L A T V R I F A W P H L D N N TGGTATTGAATTCACCTTCGACGAAGGCCGTTGGAATGCTATTGAACTGG 1600 G I E F T F D E G R W N A I E L ATAAGTTCTGGGTCAAGTTGCCTGCTGGAACACACCATTTCGAACGTAAA 1650 D K F W V K L P A G T H H F E R K TCCTCGGAATCTGCTGTCACTGTGCCTGATGTGCCTAGTTTCGCAACTCT 1700 S S E S A V T V P D V P S F A T L CTTCGAGAAGACCAAAGAAGCCTTAGCTGGTGCAGACTCCGGACTTACAG 1750 F E K T K E A L A G A D S G L T ATTTCGAGAGTGCAACTGGTATTCCTAATCGATTCCTTCTCCCTAAGGGT 1800 D F E S A T G I P N R F L L P K G AATGAACAGGGTCTGGAATTCGATCTTGTTGTAGCGGTGACTGATGGCGC 1850 N E Q G L E F D L V V A V T D G A AGCCGATGCAGCAGTGGATGGCCTCCACGAAAATACCGAATTCAATCACT 1900 A D A A V D G L H E N T E F N H ACGGTTCCCATGGAAAGTACCCTGACAATCGCCCACATGGCTACCCTCTG 1950 Y G S H G K Y P D N R P H G Y P L GATCGCAAGGTTCCCGATGAACGTGTATTCGAAGATCTGCCCAACTTCGG 2000 D R K V P D E R V F E D L P N F G TCACATCCAAGTTAAGGTCTTCAATCATGGCGAATATATCCAACATGAT 2050 H I Q V K V F N H G E Y I Q H D TAG 2052 *

Hình 3.13. Trình tự gen và amino acid suy diễn của hemocyanin

Tiếp theo, chúng tôi xác định trình tự của gen hemocyanin đầy đủ gắn trong

vector pJET 1.2 và tách dòng. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi đã khẳng định được

chắc chắn rằng đoạn cDNA phân lập được là trình tự ORF hoàn chỉnh mã hóa

hemocyanin. Trình tự gen hemocyanin đầy đủ có kích thước 2052 bp, mã hóa 683

amino acid và một mã kết thúc là TAG (Hình 3.13). Đoạn gen đã công bố trên

GenBank mã số AF431737 tương ứng với vị trí 703 - 2052 của gen tách dòng.

3.3.3. Phân tích trình tự gen hemoccyanin

Khi so sánh trình tự gen hemocyanin đầy đủ phân lập từ tôm sú Việt Nam

với trình tự đoạn gen hemocyanin (GenBank, AF431737) phân lập từ tôm sú Ấn

Độ, chúng tôi thấy có sự sai khác 33 vị trí nucleotide. Sự sai khác trình tự

nucleotide này dẫn đến sự sai khác trình tự amino acid ở 7 vị trí 242 H → D, 304 N

→ D, 360 V → L, 443 K → L, 453 Y→ F, 472 A → P và 576 G → A. Điểm đáng

chú ý là hemocyanin ở tôm sú Việt Nam có thêm 5 amino acid ở trình tự đầu N.

Ngoài ra, ở vị trí 242 (số thứ tự theo trình tự hemocyanin phân lập từ tôm sú Việt

Nam của nghiên cứu này), đa phần các loài tôm (tôm sú Việt Nam, tôm sú Ấn Độ,

tôm thẻ chân trắng, tôm thẻ Trung Quốc) đều là D, trong khi đó ở tôm sú Ấn Độ là

N; ở vị trí 360 của hầu hết các protein nghiên cứu đều là L thì ở tôm sú Ấn Độ là V;

ở vị trí 547, 679 và 681 tương ứng hemocyanin tôm sú là F, Y và Q thì các protein

còn lại là I và H; còn ở vị trí 576 hemocyanin tôm sú Ấn Độ và các hemocyanin còn

lại là G riêng ở tôm sú Việt Nam là A. Kết quả nghiên cứu này đặt ra một vấn đề

mới cần nghiên cứu sâu hơn về các SNPs trong gen hemocyanin của tôm sú. Mặt

khác, khi phân tích 6 amino acid histidin thực hiện chức năng liên kết với Cu - Vị trí

bám cho phân tử oxy, chúng tôi thấy rằng các histidin này mang tính bảo thủ rất cao

ở protein hemocyanin của các loài tôm (Hình 3.14).

Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid của protein hemocyanin giữa các loài

PmHc (hemocyanin tôm sú Ấn Độ mã số AF431737), PmHc VN (tôm sú Việt Nam

được xác định qua nghiên cứu này), PvaHc và PvaHc1 - hemocyanin tôm thẻ chân trắng

(X82502, AJ250830), FchHC - hemocyanin tôm thẻ Tung Quốc (FJ594414), MjaHcL và

MjaHcY - hemocyanin tôm thẻ Nhật Bản (EF375711 và EF375712). Phần trình tự có nền

màu đen là phần amino acid giống nhau hoàn toàn giữa các loài. Phần trình tự có nền

màu xám là phần đa số các loài (60-80%) có amino acid giống nhau. Mũi tên chỉ vị trí

khác nhau giữa trình tự hemocyanin mới được xác định với trình tự đã biết AF431737 và

vị trí sai khác của hemocyanin tôm với các loài tôm khác. Dấu () chỉ gốc amino acid

histidine bảo thủ.

Phân tử hemocyanin thường gồm 630 - 660 amino acid, với khối lượng phân tử

dao động khoảng 75 kDa. Mỗi phân tử thường có chứa 3 vùng. Vùng thứ nhất đầu N (~

150 - 180 amino acid) cần thiết cho sự hình thành xoắn α. Vùng thứ 2 (~ 220 amino

acid) bao gồm các vị trí bám của đồng (Cu) là CuA và CuB. Sự vận chuyển 1 phân tử

oxy được trợ giúp bởi 2 ion Cu, mỗi phân tử Cu liên kết với 3 amino acid histidin

tương ứng trong các vị trí ở vùng 2. Vùng thứ 3 có chứa nếp gấp beta (~260 amino

acid) quy định sự hình thành nên cấu trúc bậc 2 [138]. Các vùng này sẽ quy định nên

chức năng của hemocyanin. Gen mã hóa hemocyanin lần đầu tiên được phân lập hoàn

chỉnh từ mẫu tôm sú. Sự sai khác trình tự amino acid của hemocyanin phân lập từ tôm

sú Việt Nam với hemocyanin ở các loài khác có ảnh hưởng đến chức năng của

hemocyanin như thế nào cần có những nghiên cứu sâu hơn về chức năng.

3.4. RAN - PROTEIN ĐIỀ U KHIỂ N THƢ̣ C BÀ O

Ran là một thành viên của siêu họ Ras (Ras superfamily) có bản chất là

GTPase kích thước nhỏ. Protein này có mức độ bảo thủ cao ở sinh vật nhân chuẩn

từ nấm men đến con người [86]. Ran GTPase là chìa khóa điều khiển sự vận chuyển

chất giữa nhân và tế bào chất trong suốt kỳ trung gian của quá trình phân bào. Hầu

hết sự vận chuyển này được điều khiển bởi chu kỳ của Ran giữa trạng thái Ran-GTP

và Ran-GDP [154]. Hơn nữa, nghiên cứu gần đây cho thấy Ran GTPase còn liên

quan đến cơ chế bảo vệ của tôm đối với virus WSSV [82]. Protein Ran của loài tôm

thẻ Nhật Bản được kiểm tra hoạt tính bám GTP và phân tích chức năng. Kết quả

RT-PCR và Western blot đã chỉ ra rằng các bản phiên mã và protein Ran được phát

hiện ở các mô bao gồm: gan tụy, huyết thanh, mang, ruột, tim và cơ. Ở tôm nhiễm

WSSV sau 4 giờ, mRNA của gen Ran được tổng hợp tăng đáng kể, điều đó chứng

tỏ protein Ran đóng vai trò trong miễn dịch của tôm chống lại sự lây nhiễm virus

[82]. Theo Perkel (2009), Ran GTPase của tôm thẻ Nhật Bản liên kết với chuỗi nhẹ

của myosin, tham gia vào cơ chế điề u khiể n thực bào [159]. Đến nay, gen Ran từ

tôm sú vẫn chưa được phân lập. Do đó, để góp phần nghiên cứu vai trò các gen liên

quan đến cơ chế thực bào, một cơ chế miễn dịch tế bào chính ở tôm, chúng tôi tiến

hành phân lập gen Ran hoàn chỉnh trên đối tượng tôm sú Việt Nam.

3.4.1. Tạo dòng một phần đoạn gen Ran từ mẫu tôm sú Việt Nam

Trên cơ sở so sánh trình tự amino acid của protein Ran ở một số loài đã công

bố trên GenBank: chuột (Rattus norvegicus-AAH59123; M. musculus-NP033417),

người (H. sapiens-AAH16654), cá (S. salar-CAA10039, D. rerio-AAH50517), tôm

thẻ Nhật Bản (AAY96645), hoa hướng dương (H. annuus-AF495716), chúng tôi đã

thiết kế cặp mồi suy diễn (Ran DP F và Ran DP R) để nhân đoạn gen Ran (Hình 2.8;

Bảng 2.2). Để phân lậ p một phân đoạn gen Ran từ nguồ n vậ t liệ u là mRNA tá ch chiế t

và tinh sạ ch từ mẫ u mô gan tụ y tôm sú Việt Nam. Phản ứng RT-PCR được tiến hành

với khuôn cDNA có nguồn gốc từ mRNA được tách chiết và tinh sạch từ mô gan tụy

của tôm sú bị bệnh đốm trắng bằng cách sử dụng mồi Oligo(dT). Sản phẩm khuếch

đại gen được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.15A).

A

B

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng một phần đoạn gen Ran

A. Sản phẩm nhân đoạn gen Ran bằng kỹ thuật RT-PCR (M: Marker 1kb; 1:

Sản phẩm RT-PCR), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT-PCR trong vector tái tổ

hợp (M: Marker 1kb, 1-2: Plasmid pJET1.2 mang đoạn gen Ran)

Kết quả ở hình 3.15A cho thấy sản phẩm PCR đoạn gen Ran có kích thước

khoảng 0,4 kb đúng với tính toán lý thuyết (Bảng 2.2). Sản phẩm này được tinh

sạch từ gel agarose và tách dòng phân tử trong vector pJET1.2 (Fermentas). Để

kiểm tra các plasmid tái tổ hợp chúng tôi sử dụng hai enzyme giới hạn XhoI và

XbaI, cho phép cắt gen Ran (nếu có) ra khỏi vector. Kết quả phân tích các dòng

plasmid tái tổ hợp được thể hiện ở hình 3.13B cho thấy mỗi plasmid bị cắt thành hai

đoạn: một đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pJET1.2 (~3,0 kb) và một

đoạn nhỏ hơn có kích thước 0,4 kb tương ứng với sản phẩm RT-PCR (Hình 3.15B).

Tiếp theo, chúng tôi đã xác định trình tự của đoạn gen Ran đã được gắn với vector

pJET1.2. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi đã khẳng định đoạn DNA phân lập

được là trình tự CDS mã hóa đoạn gen Ran, đoạn gen có kích thước 470 bp, mã hóa

153 amino acid (Hình 3.16). Đoạn trình tự này được đăng ký trên GenBank với mã

số JN617868.

TAGGACATGCCCACCTTTAAATTGGTGTTGGTTGGTGATGGTGGTACTGGTAAAACTACCTTTGTTAAGCGTCACTTGAC 80 D M P T F K L V L V G D G G T G K T T F V K R H L T AGGAGAGTTTGAGAAGAAATATGTAGCCACCCTTGGTGTGGAGGTCCATCCTCTCGTTTTCCATACAAATAGAGGACCCA 160 G E F E K K Y V A T L G V E V H P L V F H T N R G P TCAAATTCAATGTCTGGGATACTGCTGGCCAAGAGAAGTTGGGAGGTCTTCGTGATGGTTACTACATCCAGGCTCACTGT 240 I K F N V W D T A G Q E K L G G L R D G Y Y I Q A H C GCCATTATTATGTTTGATGTTACATCTAGAGTCACGTACAAGAATGTTCCCAACTGGCACAGAGATCTTGTGAGAGTGTG 320 A I I M F D V T S R V T Y K N V P N W H R D L V R V C TGAAAATATCCCAATTGTACTCTGTGGAAACAAGGTTGATGTGAAGGACCGCAAAGTCAAGGCGAAATCCATCATCTTCC 400 E N I P I V L C G N K V D V K D R K V K A K S I I F ACAGGAAGAAGAATCTTCAATACTATGACATCTCAGCCAAGTCTAATTACAATTTTGAAAAACTCGAGTA 470 H R K K N L Q Y Y D I S A K S N Y N F E K

Hình 3.16. Trình tự nucleotide và amino acid đoạn gen Ran

3.4.2. Phân lập đoạn gen 3’ và 5’-Ran

Mẫu mRNA tách chiết và tinh sạch từ mô gan tụy của tôm sú bị bệnh đốm

trắng được dùng làm khuôn tổng hợp sợi cDNA sử dụng mồi 3‟-RACE CDS A, 5‟-

RACE CDS A, SMARTer II A Oligonucleotide và enzyme Reverse Transcriptase

theo kit “SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit” để nhân đoạn gen Ran kéo

dài về phía 3‟ (đoạn 3‟-Ran) và phía 5‟ (đoạn 5‟-Ran). Dựa trên trình tự mộ t p hầ n

đoạn gen Ran thu được, chúng tôi thiết kế mồi đặc hiệu Ran-GSP1 và Ran-GSP2

(Hình 2.8; Bảng 2.2). Hai mồi đặc hiệu này tương ứng kết hợp với mồi UPM

(Universal Primer A Mix), cung cấp bởi kit “SMARTer™ RACE cDNA

Amplification Kit” để nhân đoạn gen 3‟-Ran và 5‟-Ran.

Phản ứng 3‟RACE và 5‟RACE được tiến hành với cặp mồi tương ứng Ran-

GSP1/UPM và Ran-GSP2/UPM. Sản phẩm khuếch đại được điện di kiểm tra trên

gel agarose 0,8% (Hình 3.17A, 3.18A). Kết quả ở hình 3.17A cho thấy sản phẩm

3‟RACE có kích thước khoảng 1000 bp và đoạn trình tự này đã kéo dài thêm vào

trình tự đã biết khoảng 600 bp về phía đầu 3‟. Kết quả ở hình 3.18A cho thấy sản

phẩm 5‟RACE khuyếch đại đoạn 5‟-Ran có kích thước khoảng 500 bp. Như vậy, từ

vị trí mồi Ran-GSP2 chúng tôi đã kéo dài thêm vào trình tự đã biết khoảng 350 bp

về phía đầu 5‟. Cả đoạn 3‟-Ran và 5‟-Ran đượ c khuế ch đạ i đề u có kí ch thướ c phù

hợp với tính toán lý thuyết (Bảng 2.2).

A

B

Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn gen 3’-Ran

A. Sản phẩm nhân đoạn gen 3’-Ran bằng kỹ thuật 3’RACE (M: Marker 1kb; 1:

Sản phẩm 3‟RACE nhân đoạn 3‟-Ran), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm 3’RACE

trong vector tái tổ hợp (M: Marker 1kb, 1-5: Plasmid pCR2.1 mang đoạn gen 3‟RACE)

A

B

Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn gen 5’-Ran

A. Sản phẩm nhân đoạn gen 5’-Ran bằng kỹ thuật 5’RACE (M: Marker 1kb; 1: Sản phẩm 5‟RACE nhân đoạn 5‟-Ran), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm 5’RACE

trong vector tái tổ hợp (M: Marker 1kb, 1-3: Plasmid pCR2.1 mang đoạn gen 5‟RACE)

Sản phẩm 5‟RACE và 3‟RACE gen Ran được tinh sạch từ gel agarose và

tách dòng phân tử trong vector pCR2.1. Để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp chúng

tôi sử dụng enzyme giới hạn HindIII và XhoI, cho phép cắt đoạn 5‟và 3‟-Ran (nếu

có) ra khỏi vector (Hình 17B, 18B). Kết quả điện di cho thấy mỗi plasmid bị cắt

thành hai đoạn: một đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pCR2.1 (~ 4 kb)

và một đoạn nhỏ hơn có kích thước 1,0 kb (đoạn 3‟-Ran) và 0,5 kb (đoạn 5‟-Ran)

tương ứng với sản phẩm 3‟RACE và 5‟RACE. Như vậy, chúng tôi có thể khẳng

định đã thu nhận được các dòng plasmid đã gắn đoạn gen 3‟ và 5‟-Ran.

Tiế p theo, các dòng plasmid mang đoạn 5‟ và 3‟-Ran được tinh sạch và làm

khuôn cho chuỗi phản ứng đọc trình tự. Để phân tích trình tự, chúng tôi ghép nối

đoạn trình tự 3‟, 5‟-Ran. Kết quả ghép nối trình tự được trình bày ở hình 3.19. Kết

quả trình tự trên hình cho thấy đoạn trình tự gen Ran ghép nối có kích thước 1196

bp. Trong đó, 92 bp ở 2 đầu là trình tự mồi UPM, trình tự được phiên mã của gen

Ran có kích thước 1104 bp chứa 2 bp 5‟UTR, 717 bp trình tự mã hóa và 385 bp

3‟UTR. Trình tự gen Ran chúng tôi phân lập được ở tôm sú là hoàn toàn mới chưa

được công bố.

10 20 30 40 50 60 70 80 CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGGCTCGAAGCCTTGACGGGAATCTGGTCC M G L E A L T G I W S

90 100 110 120 130 140 150 160 GTACAGCTCATCCGTAACCAAGTCCAAATCTCCACCATGGCAGCAGAACAGGACATGCCCACCTTTAAATTGGTGTTGGT V Q L I R N Q V Q I S T M A A E Q D M P T F K L V L V 170 180 190 200 210 220 230 240 TGGTGATGGTGGTACTGGTAAAACTACCTTTGTTAAGCGTCACTTGACAGGAGAGTTTGAGAAGAAATATGTAGCCACCC G D G G T G K T T F V K R H L T G E F E K K Y V A T 250 260 270 280 290 300 310 320 TTGGTGTGGAGGTCCATCCTCTCGTTTTCCATACAAATAGAGGACCCATCAAATTCAATGTCTGGGATACTGCTGGCCAA L G V E V H P L V F H T N R G P I K F N V W D T A G Q 330 340 350 360 370 380 390 400 GAGAAGTTGGGAGGTCTTCGTGATGGTTACTACATCCAGGCTCACTGTGCCATTATTATGTTTGATGTTACATCTAGAGT E K L G G L R D G Y Y I Q A H C A I I M F D V T S R V 410 420 430 440 450 460 470 480 CACGTACAAGAATGTTCCCAACTGGCACAGAGATCTTGTGAGAGTGTGTGAAAATATCCCAATTGTACTCTGTGGAAACA T Y K N V P N W H R D L V R V C E N I P I V L C G N 490 500 510 520 530 540 550 560 AGGTTGATGTGAAGGACCGCAAAGTCAAGGCGAAATCCATCATCTTCCACAGGAAGAAGAATCTTCAATACTATGACATC K V D V K D R K V K A K S I I F H R K K N L Q Y Y D I 570 580 590 600 610 620 630 640 TCAGCCAAGTCAAATTACAACTTTGAGAAGCCCTTCCTGTGGCTGGCCCGTAAGCTGATTGGTGACCCCAACCTGGAATT S A K S N Y N F E K P F L W L A R K L I G D P N L E F 650 660 670 680 690 700 710 720 TGTTGCCATGCCTGCCTTGCTCCCACCCGAGGTGCAGATGGACCCACAATGGCAACGACAGATCGAGAACGACCTCCAGG V A M P A L L P P E V Q M D P Q W Q R Q I E N D L Q 730 740 750 760 770 780 790 800 AAGCTTCCCAGACCGCCCTCCCAGAGGATGATGAAGACTTGTAAATCTAGAGTGATAATGATAGTCAAATACAGACTAAA

E A S Q T A L P E D D E D L *

810 820 830 840 850 860 870 880 ACTATATTTGTTGATTGGTTGCATATAATCGGAATTATTGTTGATACAACAAATGCCTTGCCTCAGCAGCTCACTTATTT 890 900 910 920 930 940 950 960 GGTATAAGAAGTAATCCTTTATTTTTTACATTGCTCTTTATTATTTTCATCAAAAATGAAGTGGCTTGCTTGGAGCTTAC 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 ACATCCGTGCAAGATAAAACGTGACTCAAACAAAAACATTCCTTTTTTTCCTTGCTGCATGAGGTTGCTAATAGAAGCCT 1050 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 GGAATAACTAATTTCCAATTGACTAGTGGTACTATGTCAATTATATACCAAACTTTTTTTTAATAAACTATATAAATAAA 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAG

Hình 3.19. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của gen Ran

Phần gạch chân là trình tự của UPM, gạch chân và in nghiêng là mồi của Ran-

GSP1và Ran-GSP2. Phần in đậm là trình tự 3‟ và 5‟-UTR. Phần có màu nền xám là trình

tự mã hóa protein Ran.

3.4.3. Tạo dòng gen Ran hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam

Dựa trên cơ sở trình tự đoạn 3‟ và 5‟-Ran thu được, chúng tôi thiết kế mồi để

nhân gen Ran hoàn chỉnh (Hình 2.8; Bảng 2.2). Mẫu mRNA tách chiết và tinh sạch

từ mô gan tụy của tôm sú bị bệnh đốm trắng được dùng làm khuôn tổng hợp sợi

cDNA bằng cách sử dụng mồi Oligo(dT). Phản ứng RT-PCR sau đó được tiến hành

với khuôn cDNA. Sản phẩm RT-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%

(Hình 3.20A).

B

A

Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen Ran

A. Sản phẩm nhân gen Ran bằng kỹ thuật RT-PCR (M: Marker 1kb; 1: Sản

phẩm RT-PCR nhân gen Ran), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT-PCR trong

vector tái tổ hợp (M: Marker 1kb, 1-5: Plasmid pCR2.1 mang gen Ran)

Kết quả ở hình 3.20A cho thấy sản phẩm RT-PCR nhân gen Ran có kích

thước khoảng 0,7 kb đúng với tính toán lý thuyết (Bảng 2.2). Sản phẩm này được

tinh sạch từ gel agarose và tách dòng trong vector pCR2.1 (Invitrogen). Để kiểm tra

các plasmid tái tổ hợp chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn EcoRI, cho phép cắt gen

Ran (nếu có) ra khỏi vector. Sau khi phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp bằng

enzyme EcoRI, kết quả điện di cho thấy mỗi plasmid bị cắt thành hai đoạn: một

đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pCR2.1 (~4 kb) và một đoạn nhỏ hơn

có kích thước 0,75 kb tương ứng với sản phẩm RT-PCR gen Ran và một phần

vector (Hình 3.20B). Như vậy, bước đầu chúng tôi khẳng định các dòng plasmid

này đã có gắn gen Ran.

3.4.4. Xác định và phân tích trình tự gen Ran

Chúng tôi đã xác định trình tự của gen Ran đầy đủ gắn với vector pJET 1.2.

Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi đã khẳng định được chắc chắn rằng đoạn

cDNA phân lập được là trình tự ORF hoàn chỉnh mã hóa protein Ran. Trình tự gen

Ran đầy đủ có kích thước 717 bp, mã hóa 238 amino acid và mã kết thúc là TAA.

Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phân tích so sánh trình tự gen Ran thu được với trình

tự ở các loài khác (Hình 3.21).

Hình 3.21. So sánh trình tự amino acid của protein Ran giữa các loài khác nhau

Mũi tên chỉ vị trí khác nhau giữa trình tự protein Ran trong họ tôm he so với trình

tự từ các loài khác, phần gạch dưới chỉ trình tự amino acid chỉ có ở protein Ran tôm sú

Việt Nam (trình tự amino acid của protein Ran tôm sú Việt Nam được thực hiện trong

nghiên cứu này), M.japonicus - tôm he Nhật Bản (AAY96645), Drosophila - ruồi

(Drosophila yakuba; XP_002100902), honey bee - ong (Apis mellifera; XP_393761),

silkworm - bướm (B. mori; NP_001040274), Fish - cá (S. salar; CAA10039), Chicken - gà

(Gallus gallus; NP_990589), Frog - ếch (Xenopus laevis; NP_001128547), Rat - chuột (R.

norvegicus; AAH59123), Human - người (H. sapiens; AAH16654), Tomato - cà chua

(Solanum lycopersicum - NP_001234016), Sunflower - hoa hướng dương (H. annuus- AF495716).

Khi so sánh trình tự amino acid đầy đủ của protein Ran phân lập từ tôm sú

Việt Nam với trình tự amino acid protein này ở các loài khác, điểm đáng chú ý là

protein Ran ở tôm sú Việt Nam có thêm 21 amino acid ở trình tự đầu N. Ngoài ra,

trình tự amino acid có tính bảo thủ đặc trưng ở họ tôm so với các loài khác thể hiện

ở các vị trí 94 F  L, 106 Q  H, 205 A  L, 233 D  E và 236 D  E (số thứ

tự theo trình tự protein Ran của tôm sú Việt Nam của nghiên cứu này). Gen Ran

được phân lập là nguyên liệu mới để nghiên cứu chức năng của gen liên quan đến

cơ chế thực bào ở tôm sú. Trình tự gen Ran phân lập từ tôm sú Việt Nam được đăng

ký trên GenBank với mã số JN596104.

3.5. CASPASE - PROTEIN THAM GIA VÀ O CƠ CHẾ APOPTOSIS

Apoptosis đóng vai trò quan trọng trong các quá trình kháng virus ở nhiều

sinh vật bằng cách loại bỏ những tế bào nhiễm virus [155]. Hầu hết những thay đổi

về mặt hình thái do apoptosis đều được gây ra bởi sự hoạt hóa các enzyme trong họ

caspase, một họ protease cystenine liên quan với nhau về cấu trúc. Đến nay đã có 14

caspase của động vật có vú được phát hiện [60]. Dựa theo vai trò của chúng trong

apoptosis, các caspase được chia thành 2 nhóm nhỏ khác: các caspase khởi động và

các caspase phản ứng lại kích thích [177]. Trong các caspase, caspase-3 là tác nhân

trung tâm trong điều khiển apoptosis, lượng caspase-3 trong các tế bào xác định các

ảnh hưởng của kích thích đến apoptosis. Caspase-3 được phát hiện đóng vai trò chìa

khóa của apoptosis gây ra do virus [233]. Khanobdee và đtg (2002) cho rằ ng sự tiế n

triển và lan rộng hiện tượng apoptosis ở tôm sú khi nhiễm virus gây bệnh đầu vàng

là nguyên nhân chính gây nên sự rối loạn chức năng và cái chết của vật chủ [104].

Năm 2004, Wu và Muroga phát hiện tỷ lệ chết ở tôm thẻ Nhậ t Bả n nhiễ m WSSV

luôn tỷ lệ thuậ n vớ i hiệ n tượ ng apoptosis [232]. Nhữ ng kế t quả nà y cũ ng đã chứ ng

minh quan điể m củ a Flegel và Pasharawipas (1998) trướ c đó cho rằ ng tỷ lệ chế t củ a

tôm nhiễ m virus liên quan đế n cơ chế apoptosis [69]. Gen caspase từ tôm thẻ Nhật

Bản biể u hiệ n tăng và làm tăng khả năng sống sót ở tôm sau khi nhiễm WSSV , điều

này cũng cho thấy caspase có thể liên quan đến miễn dịch kháng virus của tôm. Thí

nghiệm làm bất hoạt gen caspase bằng kỹ thuật siRNA cho thấy hiện tượng

apoptosis ở tôm do nhiễm WSSV bị ức chế đáng kể. Hơn nữa, dựa trên cơ sở phát

hiện PCR định lượng phát hiện sự bất hoạt gen caspase ở tôm thẻ Nhật Bản dẫn đến

sự tăng các bản sao của virus, điều này chỉ ra rằng apoptosis đóng vai trò chìa khóa

trong các quá trình kháng virus của tôm [218]. Ở tôm sú, gen caspase đã được phân

lập và bước đầu nghiên cứu biểu hiện. cDNA caspase có chiều dài 954 bp, mã hóa

317 amino acid (DQ846887). Bằ ng thự c nghiệ m in vitro cho thấ y caspase ở tôm sú

có hoạt tính của caspase - 3. Sử dụ ng kỹ thuậ t RT -PCR đị nh lượ ng phát hiện gen

caspase biểu hiện tăng sau 48 giờ tôm nhiễm virus WSSV và duy trì ở mức cao cho

đến khi tôm ở trạng thái gần chết . Protein caspase cũ ng đượ c chứ ng minh biể u hiệ n

ở mức cao khi phân tí ch bằ ng kỹ thuậ t western blot so sá nh giữ a tôm nhiễ m WSSV

và tôm khỏe [227]. Hiện nay, cơ chế phân tử của các gen tham gia vào apoptosis

vẫn chưa được làm sáng tỏ. Do vậy, chúng tôi tiến hành phân lập gen caspase tạo

nguyên liệu để nghiên cứu cấu trúc và chức năng.

3.5.1. Tạo dòng gen caspase từ mẫu tôm sú Việt Nam

Dựa trên cơ sở trình tự gen caspase đã công bố trên GenBank với mã số

DQ846887, chúng tôi thiết kế mồi để khuếch đại gen này hoàn chỉnh (Hình 2.2;

Bảng 2.2). Gen caspase đượ c khuế ch đạ i bằ ng cá ch sử kỹ thuậ t RT -PCR vớ i khuôn

là cDNA bắt nguồn từ mRNA của mẫu mô gan tụ y tôm sú bị bệnh đốm trắng.

Phương phá p tổ ng hợ p cDNA tương tự như đã trì nh bà y trong trườ ng hợ p phân lậ p

gen Rab7 và ở mục 2.2.3.1. Sau đó, sản phẩm RT-PCR được điện di kiểm tra trên

gel agarose 0,8% (Hình 3.22A).

B A

Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen caspase

A. Sản phẩm nhân gen caspase bằng kỹ thuật RT-PCR (M: Marker 1kb; 1: Sản phẩm

RT-PCR nhân gen caspase), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT-PCR trong

vector tái tổ hợp (M: Marker 1kb, 1-5: Plasmid pCR2.1 mang gen caspase)

Trên hình 3.22A cho thấ y , sản phẩm RT -PCR khuế ch đạ i gen caspase thu

đượ c mộ t băng DNA đ ặc hiệ u có kí ch thướ c khoả ng 1,0 kb, kế t quả nà y đú ng vớ i

tính toán lý thuyết đã đưa ra (Bảng 2.2). Tiế p theo, sản phẩm RT -PCR gen casapse

đượ c tinh sạ ch và gắ n và o vector pCR 2.1. Kế t quả phân tí ch cá c dò ng vector

plasmid pCR 2.1 mang gen caspase bằ ng cá ch sử dụ ng enzyme EcoRI đượ c thể

hiệ n trên hì nh 3.22B, mỗi plasmid bị cắt thành hai đoạn: một đoạn lớn có kích

thước tương ứng với vector pCR2.1 (~4 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước 1,0

kb tương ứng với sản phẩm RT-PCR gen caspase và một phần vector. Như vậ y, gen

caspase có thể đã được tạo dòng trong vector pCR 2.1.

3.5.2. Xác định và phân tích trình tự gen caspase

Chúng tôi tiế n hà nh xác định trình tự của gen caspase từ vector đã tạ o dò ng

pCR2.1. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi đã khẳng định được chắc chắn đoạn

cDNA phân lập được là trình tự ORF hoàn chỉnh mã hóa caspase. Gen caspase có

kích thước 954 bp, mã hóa 317 amino acid và mã kết thúc là TGA (Hình 3.23).

ATGAGCGACGCCGACGACTCAGCGAGAGCCGAAGCCCAGCCGAGGGACGGGCGCGATGGCGAGAACGAAGGCTTGGCCAA 80 M S D A D D S A R A E A Q P R D G R D G E N E G L A N CACGACGGAGAACAGGGGCGCGGAGGCGGAGGAACCTGCGAAGAACGTTCCTTGGGGGCGTCCTACCGCATACACGGCCG 160 T T E N R G A E A E E P A K N V P W G R P T A Y T A TGGACGGACTCAGCGAATGTTACCCAATGAACCGTCGGCCGCGGGGCGCTGCTCTCATCTTCGCTCACTCCAAGTTCGAT 240 V D G L S E C Y P M N R R P R G A A L I F A H S K F D AATAAAGATCTCAAACCGCGACCCAGTGCCGCCCACGACGCCGAGCTCGCGAGAGGCGCCTTCGAGGCCCTCGAGTTCCA 320 N K D L K P R P S A A H D A E L A R G A F E A L E F Q GCCTGAGGTGTTCTTGGACCTCACGAGGAACGAGCTCGAGGGGAAACTGAGCGAAGTCGCTAAGCGCGACCACAGCGGCT 400 P E V F L D L T R N E L E G K L S E V A K R D H S G GCGACGCCCTTGCCATAGTGTTCATGAGCCATGGCGAGGTAAAACCCAGGAATAACATGGAATTCGTGTGGGCCAAAGAC 480 C D A L A I V F M S H G E V K P R N N M E F V W A K D GACAAGATTCCTACCAAGGAACTGTGGATAAACTTCACGGCTGAACGGTGCGCAGGTCTAGCCGGCAAACCTAAGCTGTA 560 D K I P T K E L W I N F T A E R C A G L A G K P K L Y CTTCATTCAGGCATGCAGGGGCCCCGACGTGGATAAGGGCGTGAACATGACTCGGGCAGTGCGTGGCATGGCGGTTCAGA 640 F I Q A C R G P D V D K G V N M T R A V R G M A V Q CGGACAGCATTGAGGAGTACGTGATTCCCATCCATGCTGACCAGCTTGTTATGTGGGCTTCCTACCCAGGATTCCCGGCC 720 T D S I E E Y V I P I H A D Q L V M W A S Y P G F P A TTCACGAGTCAACGCGAGGGAATCCAAGGAAGTGTCTTCATCCACTTCCTGGCCGAGAACCTCAGGAATTATGCCTTATC 800 F T S Q R E G I Q G S V F I H F L A E N L R N Y A L S TTCTCCACGACCAAGTCTATCTTCCATTCTTCTCAAAGTCAGCAGGGAAGTGGCAGTCCTCTACGAATCCGACATTGATT 880 S P R P S L S S I L L K V S R E V A V L Y E S D I D CTCAAAACCAATATCACAAAAATAAACAAGTTCCTTACATCCACTCGACGCTGCTTCGTGAAATTTACTTCTGA 954 S Q N Q Y H K N K Q V P Y I H S T L L R E I Y F *

Hình 3.23. Trình tự nucleotide và amino acid của caspase

Khi so sánh trình tự nucleotide của gen caspase phân lập từ tôm sú Việt

Nam với trình tự đã đăng ký trên ngân hàng GenBank bao gồm gen caspase phân

lậ p từ tôm sú ở Ấn độ (mã số : HM034317), tôm sú ở Thái Lan (mã số:

DQ846887), chúng tôi thấy gen caspase phân lậ p từ tôm sú ở Ấ n Độ và Thá i Lan

có sự tương đồng 100%. Gen caspase phân lậ p từ tôm sú Việ t Nam có sự sai

khác ở 5 vị trí nucleotide so với trình tự đã công bố: 100 T G, 150 G  A, 159

T  C, 290 T  C, 354 C  G (Hình 3.24). Sự sai khác trình tự nucleotide này

dẫn đến sự sai khác trình tự amino acid ở 3 vị trí 34 S  A, 103 V  A và 124

D  E. Trình tự gen caspase phân lập từ tôm sú Việt Nam được đăng ký trên

GenBank với mã số JQ241180.

10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HM034317 ATGAGCGACGCCGACGACTCAGCGAGAGCCGAAGCCCAGCCGAGGGACGGGCGCGATGGCGAGAACGAAGGCTTGGCCAACACGACGGAG DQ846887 .......................................................................................... CaspaseVN .......................................................................................... 100 110 120 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HM034317 AACAGGGGCTCGGAGGCGGAGGAACCTGCGAAGAACGTTCCTTGGGGGCGTCCTACCGCGTACACGGCTGTGGACGGACTCAGCGAATGT DQ846887 .......................................................................................... CaspaseVN .........G.................................................A........C..................... 190 200 210 220 230 240 250 260 270 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HM034317 TACCCAATGAACCGTCGGCCGCGGGGCGCTGCTCTCATCTTCGCTCACTCCAAGTTCGATAATAAAGATCTCAAACCGCGACCCAGTGCC DQ846887 .......................................................................................... CaspaseVN .......................................................................................... 280 290 300 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HM034317 GCCCACGACGCCGAGCTCGTGAGAGGCGCCTTCGAGGCCCTCGAGTTCCAGCCTGAGGTGTTCTTGGACCTCACGAGGAACGACCTCGAG DQ846887 .......................................................................................... CaspaseVN ...................C...............................................................G...... 370 380 390 400 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HM034317 GGGAAACTGAGCGAAGTCGCTAAGCGCGACCACAGCGGCTGCGACGCCCTTGCCATAGTGTTCATGAGCCATGGCGAGGTAAAACCCAGG DQ846887 .......................................................................................... CaspaseVN .......................................................................................... 460 470 480 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HM034317 AATAACATGGAATTCGTGTGGGCCAAAGACGACAAGATTCCTACCAAGGAACTGTGGATAAACTTCACGGCTGAACGGTGCGCAGGTCTA DQ846887 .......................................................................................... CaspaseVN .......................................................................................... 550 560 570 580 590 600 610 620 630 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HM034317 GCCGGCAAACCTAAGCTGTACTTCATTCAGGCATGCAGGGGCCCCGACGTGGATAAGGGCGTGAACATGACTCGGGCAGTGCGTGGCATG DQ846887 .......................................................................................... CaspaseVN .......................................................................................... 640 650 660 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HM034317 GCGGTTCAGACGGACAGCATTGAGGAGTACGTGATTCCCATCCATGCTGACCAGCTTGTTATGTGGGCTTCCTACCCAGGATTCCCGGCC DQ846887 .......................................................................................... CaspaseVN .......................................................................................... 730 740 750 760 770 780 790 800 810 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HM034317 TTCACGAGTCAACGCGAGGGAATCCAAGGAAGTGTCTTCATCCACTTCCTGGCCGAGAACCTCAGGAATTATGCCTTATCTTCTCCACGA DQ846887 .......................................................................................... CaspaseVN .......................................................................................... 820 830 840 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| HM034317 CCAAGTCTATCTTCCATTCTTCTCAAAGTCAGCAGGGAAGTGGCAGTCCTCTACGAATCCGACATTGATTCTCAAAACCAATATCACAAA DQ846887 .......................................................................................... CaspaseVN .......................................................................................... 910 920 930 940 950 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... HM034317 AATAAACAAGTTCCTTACATCCACTCGACGCTGCTTCGTGAAATTTACTTCTGA DQ846887 ...................................................... CaspaseVN ......................................................

Hình 3.24. So sánh trình tự nucleotide của gen caspase của tôm sú Việt Nam

với trình tự đã công bố

CaspaseVN: Trình tự nucleotide của gen caspase phân lập từ tôm sú Việt Nam

nhiễm bệnh đốm trắng; DQ846887: gen caspase đượ c phân lậ p từ tôm sú ở Thái Lan; HM034317: gen caspase đượ c phân lậ p từ tôm sú ở Ấn Độ

Gen caspase đã đượ c tạ o dò ng và và xá c đị nh từ nhiề u loà i tôm khá c như

tôm thẻ (Fenneropenaeus merguiensis - mã số AY839873), tôm thẻ Trung Quốc phân

lập từ Trung Quốc (Fenneropenaeus Chinensis - mã số GU597089), Fccasp TL -

tôm thẻ Trung Quốc ở Thái Lan (AY839873), tôm thẻ chân trắng ở Thái Lan

(Litopenaeus vannamei - mã số DQ 988351), Lvcasp CN - tôm thẻ chân trắng ở

Trung Quốc (EU421939), tôm thẻ Nhậ t Bả n (Marsupenaeus japonicus - mã số

EF079670; GU645568; GU645547; GU645549). Để phân tích trình tự amino acid ở

chuỗi polypeptide của gen caspase, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự amino acid

ở tôm sú và các loài tôm khác trong họ tôm . Kết quả so sánh trì nh tự cho thấ y , gen

caspase phân lậ p từ tôm thẻ Nhậ t Bả n mã hó a chuỗ i polypeptide có trì nh tự amino

acid khá c biệ t so vớ i protein caspase cá c loài tôm còn lại. Do đó , chúng tôi chỉ phân

tích trình tự amino acid suy diễn của gen caspase phân lậ p từ tôm sú Việ t Nam vớ i

tôm sú , tôm thẻ , tôm thẻ chân trắ ng và tôm thẻ Trung Quố c đã công bố trên

Genbank. Kế t quả so sá nh được thể hiện trên hình 3.25.

Trên hì nh 3.25 cho thấy, trình tự amino acid trong chuỗi polypeptide của

gen caspase phân lập từ tôm sú Việt Nam có 3 vị trí amino acid sai khác với trình

tự ở tôm sú Trung Quốc và Thái Lan 34 S  A, 103 V  A và 124 D  E. Phân

tích sự sai khác trình tự amino acid caspase ở tôm sú so với các loài tôm khác ,

phát hiện thấy ở tôm sú có các trình tự đặc trưng : 3 S  D, 21 G  E, 66 R  C,

102 I  L, 255 K E và 271 K  R. Tuy nhiên , protein caspase ở cá c loà i tôm

đượ c phân tí ch đề u có chứa vị trí hoạt động tiềm năng (QACRG), bảo thủ ở hầu

hết các loà i . Các vị trí phân cắt chuỗi polypetide caspase ở tôm sú thành các tiểu

đơn vị lớ n nhỏ khá c nhau đã đượ c dự đoá n là vị trí 60D và 221D (vị trí theo

nghiên cứ u nà y ) [227]. Kế t quả so sá nh trên hì nh 3.26 chỉ ra rằ ng 2 vị trí amino

acid nà y đượ c bả o thủ ở cá c loà i trong họ tôm . Tiế p theo sau vị trí 221D củ a

caspase ở tôm sú là Serin (S) không giố ng vớ i cá c loà i tôm cò n lạ i . Để xác định

được sự sai khác này có ảnh hưởng đến hoạt tính của protein caspase ở tôm hay

không thì cần phải có những nghiên cứu sâu hơn.

10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Pmcasp VN MSDADDSARAEAQPRDGRDGENEGLANTTENRGAEAEEPAKNVP------WGRPTAYTAVDGLSECYPMNRRPRGAALIFAHSKFDNKDL Pmcasp AD .................................S..........------........................................ Pmcasp TL .................................S..........------........................................ Fmcasp ..S.V.......H.K..C..G.QS.................D..------...T....V......R....N............E.K.ES. Fccasp CN ..SG..A.......N.....G.Q...D....TS........AEEVAKNGFR.......E......R....H....S............S. Fccasp TL ..S.V.......H.K..C..G.QS.................D..------...T....V......R....N............E.K.ES. Lvcasp TL ..S.G.A......RA.....G.K.T.S......KR...Y.Q.AI------C.....H.V......R...S.............E.ED.A. Lvcasp CN ..S.G.A......RA.....G.K.T.S......KR...Y.Q.AI------C.....H.V......R...S.............E.ED.A. 100 110 120 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Pmcasp VN KPRPSAAHDAELARGAFEALEFQPEVFLDLTRNELEGKLSEVAKRDHSGCDALAIVFMSHGEVKPRNNMEFVWAKDDKIPTKELWINFTA Pmcasp AD ............V....................D........................................................ Pmcasp TL ............V....................D........................................................ Fmcasp R..........I.SD..K..G.L....SN..KD...KT.H..S......S...V.................................... Fccasp CN N...C......I..A..K..D.K....F.......LRE.QA.S......S..F...........T......................... Fccasp TL R..........I.SD..K..G.L....SN..KD...KT.H..S......S...V.................................... Lvcasp TL ...........I..A.....D......F...KD..VR..R..SQ..........V.........A.....L.C....RL........... Lvcasp CN ...........I..A.....D......F...KD..VR..R..SQ..........V.........A.....L.C....RL........... 190 200 210 220 230 240 250 260 270 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Pmcasp VN ERCAGLAGKPKLYFIQACRGPDVDKGVNMTRAVRGMAVQTD---SIEEYVIPIHADQLVMWASYPGFPAFTSQREGIQGSVFIHFLAENL Pmcasp AD .........................................---.............................................. Pmcasp TL .........................................---.............................................. Fmcasp ....S...............L........S...........NIG.T......V...................N.K.........Y..... Fccasp CN .............................S...........---............................K.K.........Y..... Fccasp TL ....S...............L........S...........NIG.T......V...................N.K.........Y..... Lvcasp TL ...P.................E.....R...PAF.IP....S--IQ.D....L...................E.K............... Lvcasp CN ...P.................E.....S...PAF.IP....S--IQ.D....L.....D.............E.K............... 280 290 300 310 320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|. Pmcasp VN RNYALSSPRPSLSSILLKVSREVAVLYESDIDSQNQYHKNKQVPYIHSTLLREIYF Pmcasp AD ........................................................ Pmcasp TL ........................................................ Fmcasp K.S.NI.........................G.R.K..E................. Fccasp CN KD..NT......................T..G.D....E................. Fccasp TL K.S.NI.........................G.R.K..E................. Lvcasp TL K.C.ST...--........T.........E.....P.................... Lvcasp CN K.C.ST...--........T.........E.....P....................

Hình 3.25. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein caspase tôm sú với các

loài tôm khác nhau

Pmcasp VN - gen caspase từ tôm sú ở Việt Nam được xác định qua nghiên cứu này,

PmCasp AD - gen caspase tôm sú ở Ấn độ, Pmcasp TL - gen caspase tôm sú ở Thái Lan,

Pmecasp - gen caspase ở tôm thẻ, Fccasp CV - gen caspase tôm thẻ Trung Quốc phân

lập từ Trung Quốc, Fccasp TL - gen caspase tôm thẻ Trung Quốc ở Thái Lan, Lvcasp TL

- gen caspase tôm thẻ chân trắng ở Thái Lan, Lvcasp CN - gen caspase tôm thẻ chân

trắng ở Trung Quốc

3.6. HỆ THỐ NG CÁ C PROTEIN KHÁNG KHUẨN , KHÁNG NẤM VÀ

KHÁNG VIRUS

3.6.1. Protein khá ng virus PmAV

Virus là một trong những tác nhân gây bệnh ở tôm, cơ chế phân tử của các

phản ứng miễn dịch đối với virus vẫn chưa được sáng tỏ. Gần đây đã có một số

nghiên cứu về các protein/gen có liên quan đến các phản ứng của vật chủ đối với

một số loại virus phổ biến như: virus gây bệnh đốm trắng (WSSV), virus gây bệnh

đầu vàng (YHV) và virus gây hội chứng taura (TSV) [119]. Năm 2003, gen mã hóa

protein kháng virus đầu tiên được phân lập từ tôm sú nhiễm virus WSSV (kí hiệu

PmAV). Quá trình phiên mã của gen PmAV được điều khiển tăng đáng kể khi đáp

ứng lại sự kích thích của virus. cDNA của gen này có chiều dài 513 bp, mã hóa cho

170 amino acid (AY302750), có một vùng giống lectin type C - là một protein bổ

thể tham gia vào sự opsonin hóa làm tăng quá trình thực bào [108]. Protein PmAV

tái tổ hợp được tạo ra ở E. coli và được chứng minh có chức năng kháng virus.

Nhóm nghiên cứu cũng cho rằng, protein PmAV tồn tại chủ yếu trong tế bào chất và

không có khả năng bám vào WSSV. Điều này chứng tỏ cơ chế kháng virus của

protein PmAV không ức chế sự tiếp xúc giữa virus và tế bào vật chủ [133]. Sau đó,

cấu trúc genome, hoạt tính promoter của gen PmAV và sơ lược sự biểu hiện của gen

này ở cả tôm thường và tôm nhiễm virus đã được nghiên cứu. Sử dụng kỹ thuật real

time PCR, Luo và đtg (2007) đã phát hiện gen PmAV biểu hiện cao ở mô gan tụy và

được điều khiển tăng lên từ ngày thứ 2 sau khi tôm nhiễm WSSV [131]. Đế n nay,

chứ c năng củ a protein nà y tham gia và o cơ chế phân tử trong đá p ứ ng miễ n dị ch ở

tôm sú vẫ n chưa đượ c sá ng tỏ . Do đó , để góp phần nghiên cứu cấu trúc chức năng

của các protein liên quan đến kh ả năng kháng virus , gen PmAV đượ c lự a chọ n để

tạo dòng để phân tích cấu trúc trình tự gen.

3.6.1.1. Tạo dòng gen PmAV từ mẫu tôm sú Việt Nam

Gen PmAV đượ c khuế ch đạ i dự a trên cơ sở trình tự gen mã hóa protein

kháng virus PmAV (antivirus) đã công bố trên GenBank với mã số AY302750,

chúng tôi đã thiết kế cặ p mồi đặ c hiệ u để khuếch đại gen PmAV hoàn chỉnh (Hình

2.2; Bảng 2.2). Kỹ thuật RT-PCR thự c hiệ n để khuế ch đạ i gen PmAV sử dụ ng

khuôn là cDNA đượ c tổ ng hợ p từ nguồ n mRNA được tách chiết, tinh sạch của mô

tôm sú bị bệnh đốm trắng. Sau đó, sản phẩm khuế ch đạ i gen được điện di kiểm tra

trên gel agarose 0,8% (Hình 3.26A).

Kết quả ở hình 3.26A cho thấy, sản phẩm RT-PCR nhân gen ALF PmAV có

mộ t băng đặ c hiệ u vớ i kích thước khoả ng 0,5 kb đúng với tính toán lý thuyết (Bảng

2.2). Sản phẩm này được tinh sạch từ gel agarose và tách dòng phân tử trong vector

pCR2.1. Để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp, chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn

EcoRI, cho phép cắt các gen (nếu có) ra khỏi vector. Kết quả phân tích các dòng

plasmid tái tổ hợp được thể hiện ở hình 3.26B.

A

B

Hình 3.26. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen PmAV

A. Sản phẩm nhân gen PmAV bằng kỹ thuật RT-PCR (M: Marker 1kb; 1: Sản phẩm

RT-PCR), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT-PCR trong vector tái tổ hợp (M:

Marker 1kb, 1-4: Plasmid pCR2.1 mang gen PmAV)

3.6.1.2. Xác định và phân tích trình tự gen PmAV

Từ kết quả tách dòng, chúng tôi đã xác định trình tự của gen PmAV đầy đủ

đã được gắn với vector pCR2.1. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi đã khẳng định

được chắc chắn đoạn cDNA phân lập được là trình tự ORF hoàn chỉnh mã hóa

PmAV. Gen PmAV có kích thước 513 bp, mã hóa 170 amino acid và mã kết thúc là

TAA (Hình 3.27).

ATGCGTCATACAATCCTAGTTTTCCTTTCCCTCGGTGTTGTTGGGTCGGCTGTGGCAACATCATACGAGAAAAGTGCCAA 80 M R H T I L V F L S L G V V G S A V A T S Y E K S A N TGATTCCAAGGCTGTCTGCTATAGCCCCTATACTGCCATTGCGGATCGCTGTTTGTTTGTCGATCACCAGACAGATGGAA 160 D S K A V C Y S P Y T A I A D R C L F V D H Q T D G GCTGGTATGACATGCGAGAGTACTGTAACCTTATAAATGGAGACTTTCTCAAGCTGGATGACGCTAATCTCCTTACTGAT 240 S W Y D M R E Y C N L I N G D F L K L D D A N L L T D ATCGTTGAGTACATTACTTACCAAGTGGGTGTGAACAGAGACTACTGGATCGGGGGGAGTGACGAGAACCACGAGGGTCT 320 I V E Y I T Y Q V G V N R D Y W I G G S D E N H E G L TTGGCTGTGGACGGACGGAACTCTCATGCGGACAGGTGTTCCCTTGTGGTACCATTGCACCTCCATCTCTCAACAACCAG 400 W L W T D G T L M R T G V P L W Y H C T S I S Q Q P ATGGTGGCTCCTCAGAGAACTGTGCCGTCATGCGCTGGGACTCATTTTACCATATCCATGATGTGTCTTGCTACACTTCT 480 D G G S S E N C A V M R W D S F Y H I H D V S C Y T S CGGTCTGTCATTTGTGAAAGCAGGACACATTAA 513 R S V I C E S R T H *

Hình 3.27. Trình tự gen và amino acid suy diễn của protein PmAV

So sánh trình tự nucleotide gen PmAV phân lập từ tôm sú Việt Nam với trình tự

gen PmAV phân lập từ tôm sú Trung Quốc và Ấn Độ (mã số GenBank tương ứng:

AY302750, DQ641258 và HM034318). Trong đó , mã số AY302750 và HM034318 là

trình tự cDNA mã hóa protein kháng virus, con DQ641258 là trình tự gen PmAV được

phân lậ p từ DNA genome [131]. Khi so sánh trình tự nucleotide củ a gen PmAV phân

lậ p từ tôm sú Việ t Nam vớ i cá c trì nh tự đã công bố , chúng tôi không thấy có sự sai

khác về trình tự nucleotide. Như vậy, trình tự gen PmAV có tính bảo thủ cao trong loài.

Tuy nhiên, khi chúng tôi sử dụng phần mềm BLAST để phân tích trình tự gen PmAV,

kết quả cho thấy gen PmAV có sự tương đồng cao với gen mã hóa protein kháng virus

tương tự lectin type C (lectin type C like antivirus) đượ c công bố vớ i mã số HM034320.

Lectin là một họ gen mã hóa cho nhiều loại protein có thể có các chức năng

quan trọng trong đáp ứng miễn dịch [105]. Theo Kuhlman và đtg (1989), lectin là

một protein bổ thể tham gia vào sự opsonin hóa làm tăng quá trình thực bào [108].

Ở tôm sú, có 2 trình tự gen mã hóa lectin (lectin type C) đã được tạo dòng và xác

định trình tự có chiều dài 709 và 1249 bp với khung đọc mở tương ứng 603 bp và

1002 bp [132], [134]. Lectin type C cũng được phân lập từ tôm thẻ ở Trung Quốc và

công bố trên GenBank với mã số DQ078166 và DQ871244. Tuy nhiên, trình tự gen

lectin type C không có sự tương đồng với PmAV ở tôm sú. Gen mã hóa cho protein

kháng virus tương tự lectin type C đượ c phân lập ở tôm thẻ Ấn Độ

(Fenneropenaeus indicus) đượ c so sá nh vớ i trình tự amino acid với trình tự protein

PmAV từ tôm sú. Kết quả so sánh được thể hiện trên hình 3.28.

Hình 3.28. So sánh trình tự amino acid của protein PmAV

Antivirus VN- PmAV được phân lập từ tôm sú Việt Nam, HM034320 - protein

kháng virus tương tự lectin type C từ tôm thẻ Ấn Độ.

Kế t quả trên hình 3.28 cho thấy, trình tự amino acid của protein khá ng virus

tương tự lectin type C có thêm 2 amino acid M và H ở đầu N. Còn đầu C của PmAV

từ tôm sú có một đoạn trình tự amino acid từ vị trí 152-172 mà protein kháng virus

tương tự lectin type c không có. Đoạn amino acid từ vị trí 146-151 sai khác nhau

hoàn toàn giữa 2 trình tự được phân tích. Từ kết quả so sá nh này, chúng tôi cho rằng

gen mã hóa cho PmAV có thể tồn tại dưới dạng họ gen. Như vậy, đoạn cDNA mã hóa

PmAV mà chúng tôi phân lập được là nguyên liệu có thể phục vụ cho những nghiên

cứu tiếp theo nhằm làm sáng tỏ chức năng của protein này. Trình tự gen mã hóa

protein PmAV của chúng tôi được đăng ký trên GenBank với mã số HQ662599.

3.6.2. Peptide khá ng khuẩn tƣơng tƣ̣ crustin (crustin - like antimicrobial peptide)

Peptide kháng khuẩn (AMPs) là một đoạn peptide hoặc protein nhỏ có độ dài

phân tử thấp khoảng 15-100 amino acid, chúng khác nhau về trình tự và cấu trúc.

Các AMP được tìm thấy ở hầu hết các sinh vật sống, có vai trò quan trọng trong hệ

miễn dịch tự nhiên và thực hiện chức năng như là hàng rào đầu tiên chống lại các vi

sinh vật xâm nhiễm [37], [84]. Các AMP tôm đã được tổng hợp đầu tiên ở tế bào

máu và được giải phóng để đáp ứng lại sự lây nhiễm. Mô hình biểu hiện khác nhau

của các AMP đã được đánh giá kết hợp với sự kích thích của nhiều nguồn bệ nh.

AMP có 3 họ peptide đại diện chính là: Penaeidin, crustin và yế u tố khá ng khuẩ n

(ALF - anti-lipopolisaccharide factor). Phân tích trình tự nucleotide và amino acid

đã phát hiện mỗi họ AMP của tôm có sự đa dạng về trình tự và có nhiều loại

isoform, nhóm nhỏ. Hoạt tính sinh học của các AMP ở mỗi họ của tôm cũng được

mô tả trong in vitro và in vivo sử dụng các protein và peptide tái tổ hợp của chúng

[202]. AMP khác được tìm thấy ở tôm có nguồn gốc từ hemocyanin, đoạn trình tự

đầu C có hoạt tính kháng nấm. Tuy nhiên, cơ chế mà hemocyanin được phân tách

và hoạt hóa vẫn chưa rõ ràng [58].

Ở họ tôm penaeid, các crustin cũng được phát hiện ở nhiều loài tôm. Smith

và đtg (2008) đã xếp họ crustin thành 3 loại: I, II và III trên cơ sở sự khác biệt trong

tổ chức vù ng gi ữa trình tự tín hiệu và vù ng WAP (Whey acidic protein). Theo sự

phân loại này, hầu hết các crustin thuộc loại II và một số ít thuộc loại III. So sánh

trình tự amino acid loại II phát hiện hai nhóm nhỏ là: crustin II và peptide khá ng

khuẩ n tương tự crustin (crustin-like antimicrobial peptide). Ở tôm sú, crustin loại II

và III đã được tạo dòng và xác định trình tự [186]. Trong đó, gen mã hóa peptide

kháng khuẩn tương tự crustin có chi ều dài 716 bp, chứa 2 exon và 1 intron. Exon 1

có kích thước 38 bp gồm cả 5‟UTR đến intron có kích thước 191 bp, sau đó đến

exon 2 có kích thước 487 bp bao gồm cả vùng mã hóa và 3‟UTR [21]. cDNA mã

hóa peptide khá ng khuẩ n tương tự crustin có chi ều dài 426 bp, mã hóa 141 amino

acid (EF654659). Để gó p phầ n tạ o nguyên liệ n nghiên cứ u sự đa dạ ng trong trì nh tự

gen mã hó a peptide khá ng khuẩ n tương tự crustin và nghiên cứ u chứ c năng , chúng

tôi tiến hành tạo dòng gen từ mẫu tôm sú Việt Nam.

3.6.2.1. Tạo dòng gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin từ mẫu tôm

sú Việt Nam

Dựa trên cơ sở trình tự gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin đã

công bố trên GenBank với mã số EF654659, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu

để nhân gen (Hình 2.1; Bảng 2.2). Gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự

crustin được khuếch đại bằ ng cá ch sử dụ ng kỹ thuậ t RT -PCR, khuôn cDNA đượ c

tổ ng hợ p như đã trì nh bà y ở 2.3.1. Sản phẩm RT -PCR sau đó đượ c gắ n và o vector

tách dòng pCR 2.1. Kiể m tra sự có mặ t củ a gen mã hó a peptide khá ng khuẩ n trong

vector bằ ng cá ch sử dụ ng enzyme EcoRI. Kết quả khuế ch đạ i và tá ch dò ng gen

đượ c thể hiệ n trên Hì nh 3.29.

A

B

Hình 3.29. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen mã hóa peptide

kháng khuẩn tƣơng tự crustin

A. Sản phẩm nhân gen mã hóa peptide khá ng khuẩ n tƣơng tƣ̣ crustin bằng kỹ thuật RT-PCR (M: Marker 1kb; 1: Sản phẩm RT-PCR), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT-PCR trong vector tái tổ hợp (M: Marker 1kb, 1-5: Plasmid pCR2.1 mang gen

mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin)

3.6.2.2. Xác định và phân tích trình tự gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin

Chúng tôi đã xác định trình tự của gen mã hóa peptide khá ng khuẩ n tương tự

crustin đầy đủ được gắn với vector pCR2.1. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi đã

khẳng định được chắc chắn đoạn cDNA phân lập được là trình tự ORF hoàn chỉnh

mã hóa peptide khá ng khuẩ n tương tự crustin . Gen mã hóa pe ptide khá ng khuẩ n

tương tự crustin có kích thước 426 bp, mã hóa 141 amino acid và mã kết thúc là

TAG (Hình 3.30).

ATGCTAAAGTTTGTAGTATTATCCGTTGTCGCTGTGGCTGTGGTACACGCGCAGGATAAAGGCAATGCCGATACTCGCTT 80 M L K F V V L S V V A V A V V H A Q D K G N A D T R F CCTAGGTGGAGTTGGAGTTCCTGGAGGTGGAGTTCCTGGAGTTGGAGTTCCTGGAGTTGGAGGTGGATTCCTGCCGGGGG 160 L G G V G V P G G G V P G V G V P G V G G G F L P G TTCCTGGGCATGGTGGCGTTGTTCCTGGAGGCGGTGGCCTTCTCCCTGGAGGTCAATTCGAGTGCAATTACTGCAGAACG 240 V P G H G G V V P G G G G L L P G G Q F E C N Y C R T AGGTACGGATACGTATGCTGCAAGCCCGGCAGGTGTCCACAGATTCGCGATACCTGCCCAGGCCTCAGAAAGGGTGTCCC 320 R Y G Y V C C K P G R C P Q I R D T C P G L R K G V P GATCTGCCGTCAGGACACTGACTGCTTCGGCTCCGACAAATGCTGCTTCGACACCTGCTTGAACGACACCGTCTGCAAAC 400 I C R Q D T D C F G S D K C C F D T C L N D T V C K CCATCGTGGCAGGTTCTCAGGGATAG 426 P I V A G S Q G *

Hình 3.30. Trình tự gen và amino acid suy diễn của gen mã hóa peptide kháng khuẩn tƣơng tƣ̣ crustin

Khi so sánh trình tự nucleotide của gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương

tự crustin phân lập từ tôm sú Việt Nam với trình tự đã đăng ký ở GenBank với mã

số EF654659, chúng tôi thấy không có sự sai khác trình tự nucleotide. Trình tự gen

mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin phân lập từ tôm sú Việt Nam được

đăng ký trên GenBank với mã số HQ662560.

Crustin là các peptide kháng khuẩn giàu cysteine chứa một vùng WAP (whey

acidic protein) ở đầu C [185], vùng WAP có chứa 50 gốc amino acid với 8 gốc

cysteine ở các vị trí xác định, chúng hình thành 4 liên kết disulfide [165]. Hiện có

khoảng hơn 50 trình tự crustin đã được phân lập từ các loài giáp xác như tôm, cua…

Crustin có hoạt tính kháng các loại vi khuẩn Gram (-) [185], [202]. Các crustin

được sắp xếp thành 3 loại: I, II và III trên cơ sở sự khác biệt giữa trình tự tín hiệu và

vùng WAP. Theo sự phân loại này, hầu hết các crustin thuộc loại II và một số ít

thuộc loại III. Crustin loại II có chứa peptide tín hiệu, kế sau là một vùng dài giàu

glycine, một vùng giàu cysteine (4 cysteine) và một vùng WAP (8 cysteine) ở đầu

C. So sánh trình tự amino acid loại II phát hiện hai nhóm nhỏ là: crustin và peptide

kháng khuẩn tương tự crustin (crustin-like antimicrobial peptide), 2 loại này khác

nhau ở amino acid suy diễn của peptide tín hiệu và đoạn cysteine ở giữa vùng giàu

cysteine và vùng WAP [165]. Crustin loại III được gọi là protein vùng WAP đơn

(single WAP domain - SWDs) không chứa vùng giàu cysteine và glycine nhưng có

vùng giàu proline-arginine giữa trình tự tín hiệu và vùng WAP [185]. Ở tôm sú, có

5 isoform của crustin loại III với chiều dài rất khác nhau đã được phân lập và đây là

peptide đa dạng nhất trong họ AMP ở loài này [202].

Gen mã hóa peptide kháng khuẩ n tương tự crustin đến nay được phân lập với

số lượng ít, chỉ được phát hiện ở tôm sú, tôm thẻ chân trắng và tôm thẻ Trung Quốc.

Để phân tích sâu hơn trình tự gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin thu

được, chúng tôi đã so sánh trình tự amino acid của peptide này với các trình tự đã

công bố ở họ tôm. Kết quả so sánh được thể hiện trên hình 3.31.

Hình 3.31. So sánh trình tự amino acid của peptide khá ng khuẩ n tƣơng tƣ̣ crustin ở tôm

crus - likePmVN - gen được phân lập từ Việt Nam, crus-likePm - phân lập từ tôm

sú Thái Lan (EF654658), crus-likeLv - phân lập từ tôm thẻ chân trắng (FE049920), crus-

likeFc - phân lập từ tôm thẻ Trung Quốc (DQ097703)

Kế t củ a củ a hì nh 3.31 cho thấy, trình tự peptide khá ng khuẩ n tương tự

crustin từ tôm sú ở 2 vùng địa lý khác nhau không có sự sai khác trình tự amino

acid. Phân tích trình tự amino acid ở các vùng chức năng, chúng tôi thấy trình tự

amino acid ở peptide tín hiệu của peptide khá ng khuẩ n tương tự crustin có sự tương

đồng hoàn toàn với trình tự ở tôm thẻ Trung Quốc và có sự sai khác ở 2 vị trí amino

acid 8 A  S và 15 A  V so với tôm thẻ chân trắng. Các peptide khá ng khuẩ n mã

hóa tương tự crustin ở các loài tôm khác nhau có sự sai khác nhiều nhất ở vùng giàu

glycine, trình tự amino acid GVF (37 - 40), GGV (57 - 59) có ở tôm thẻ chân trắng

mà không phát hiện thấy ở tôm sú, đoạn trình tự 65G - 71G chỉ có ở tôm Trung

Quốc, ngược lại đoạn trình tự 30 G - 44 G có ở tôm sú và tôm thẻ chân trắng. Ngoài

ra, một số trình tự amino acid đặc trưng của tôm sú thuộc về vùng này: 21 G, 22 N,

31 V, 36 G, 41 - 43 (VPGV). Còn vùng giàu cystenin và WAP cũng chỉ ra các vị trí

amino acid sai khác của tôm sú so với các loài tôm khác, đó là 81 I  L, 85 G  Q,

107 P  Q, 108 V  I, 111 V  T, 136 Y  F và 138 V  T. Mặt khác, peptide

kháng khuẩn tương tự crustin ở tôm sú và tôm Trung Quốc ở vùng này có chung các

vị trí amino acid sai khác so với tôm thẻ chân trắng: 87 N  E, 94 P  R, 95 V 

Y, 114 S  G, 115 T  L, 119 P  V, 121 V  I, 126 L  T, 129 S  F và 141

E  N. Như vậy, gen mã hó a peptide khá ng khuẩ n tương tự crustin có sự đa dạng

về trình tự nucleotide và amino acid. Để biết được các vị trí sai khác đóng vai trò

như thế nào cần có những nghiên cứu sâu hơn.

3.6.3. Yế u tố khá ng khuẩ n (ALF - antiliposaccharide factor)

Các ALF là một trong 3 họ peptide kháng khuẩn chính ở tôm và được đánh

giá là một trong những peptide kháng khuẩn quan trọng và gần đây đang được tập

trung nghiên cứu [27]. Theo thố ng kê củ a Liu và đtg (2009), ALF biểu hiện mạnh

khi tôm nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở tôm đồng (Pacifastacus leniusculus) và

khi gen ALF bị bất hoạt bằng RNAi thì virus được nhân lên với tỷ lệ rất cao [118].

Một nghiên cứu khác cũng phát hiện , khi tôm thẻ chân trắng bị nhiễm virus gây

bệnh đốm trắng, gen ALF cũng biểu hiện mạnh hơn [170]. Ở loài tôm này, hai gen

ALF đã phân lập được (LvALF1 và LvALF2). Khi gen LvALF1 bị bất hoạt, tỷ lệ chết

của tôm bị nhiễm vi khuẩn Vibrio penaeicida và nấm Fusarium oxysporum tăng

một cách đáng kể [56]. Ở tôm sú, một vài isoform của ALF đã được xác định từ cơ

sở dữ liệu EST [203]. So sánh trình tự DNA genomic, các ALF tôm sú được phân

thành 2 nhóm: nhóm A và nhóm B. Nhóm A có 3 exon được xen bởi 2 intron, trong

khi đó nhóm B có chứa 4 exon xen với 3 intron. Các loại peptide ALF khác nhau ở

mỗi nhóm được tạo ra bởi cơ chế ghép nối lựa chọn RNA (alternative RNA

splicing) [205]. Các cDNA mã hóa ALF được xác định từ nhiều loài khác nhau và

được sắp xếp thành 3 nhóm: I, II và III. Ở tôm sú, các gen ALF được phân lập thuộc

nhóm II và III. Các cDNA mã hóa ALF được xác định từ nhiều loài khác nhau.

Phân tích trình tự amino acid của ALF ở tôm cho thấy: chúng có cấu tạo gồm một

vùng kỵ nước cao ở đầu N và chứa các gốc tích điện dương với vòng disulfite bảo

thủ ở đầu C. Trình tự đầu C là vùng bám vào lipopolysaccharide (LPS) - thành phần

của tế bào vi khuẩn [87]. Nhìn chung, các peptide ALF của tôm có chiều dài khoảng

98-123 amino acid, có chứa một trình tự peptide tín hiệu ngắn khoảng 25 amino

acid. Hầu hết các peptide ALF trưởng thành đều có khoảng 97-98 amino acid với

khối lượng phân tử theo tính toán lý thuyết khoảng 11kDa. Phân tích trình tự amino

acid các peptide ALF từ tôm cho thấy, ALF được chia thành 3 nhóm: I, II và II.

100

Phân tích hệ thống phát sinh của ALF ở tôm cho thấy ALF của tôm sú được xếp vào

2 nhóm: I và II. Các ALF nhóm I tồn tại 2 dạng isoform (ALFPm và ALFPm3).

cDNA của ALFPm và ALPm3 có chiều dài 357 và 372 bp mã hóa cho số amino

acid tương ứng là 118 và 123 (EU617325, EF523559) [190], [196]. Cấu trúc

genome ALFPm3 cũng được công bố (EF523562) [205]. Các ALF nhóm II của tôm

sú có sự đa hình trình tự amino acid cao so với các loài tôm khác [202]. Do đó , để

tạo nguyên liệu nghiên ứng dụng trong công nghệ sinh học thủy sản, chúng tôi tiến

hành phân lập gen mã hó a yế u tố khá ng khuẩ n .

3.6.3.1. Tạo dòng gen mã hóa yếu tố kháng khuẩn từ mẫu tôm sú Việt Nam

Cặ p mồi đượ c thiết kế để khuếch đại gen này hoàn chỉnh dự a trên thông tin

đã đượ c công bố trên GenBank với mã số EU617325 (Hình 2.2; Bảng 2.2). Để tạo

dòng gen nà y, mẫu mRNA được tách chiết và tinh sạch từ mô của tôm sú bị bệnh

đốm trắng được dùng làm khuôn tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bằng cách sử dụng

mồi Oligo(dT). Sau đó, phản ứng RT-PCR được tiến hành với khuôn cDNA và

được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.32A).

A

B

Hình 3.32. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen ALF

A. Sản phẩm nhân gen ALF bằng kỹ thuật RT-PCR (M: Marker 1kb; 1: Sản

phẩm RT-PCR), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT-PCR trong vector tái tổ hợp

(M: Marker 1kb, 1-4: Plasmid pCR2.1 mang gen ALF).

101

Kết quả ở hình 3.33A cho thấy, sản phẩm RT-PCR nhân gen ALF và có kích

thước đúng với tính toán lý thuyết (Bảng 2.2). Sản phẩm này được tinh sạch từ gel

agarose và tách dòng phân tử trong vector pCR2.1. Để kiểm tra các plasmid tái tổ

hợp, chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn EcoRI, cho phép cắt các gen (nếu có) ra

khỏi vector. Kết quả phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp được thể hiện ở hình

3.30B. Sau khi phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI, kết quả

điện di cho thấy mỗi plasmid bị cắt thành hai đoạn: một đoạn lớn có kích thước

tương ứng với vector pCR2.1 (~ 4 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước tương

ứng với sản phẩm RT-PCR của các gen (Hình 3.32A). Như vậy, bước đầu có thể

cho rằng các dòng plasmid thu được có thể đã gắn gen.

3.6.3.2. Xác định và phân tích trình tự gen mã hó a yế u tố kháng khuẩn

Từ các dòng plasmid mang đoạn gen ALF, chúng tôi đã xác định trình tự của

gen ALF đầy đủ đã được gắn với vector pCR2.1. Sau khi phân tích trình tự, chúng

tôi đã khẳng định đoạn cDNA phân lập được là trình tự ORF hoàn chỉnh mã hóa

ALF. Trình tự gen ALF phân lập được có 2 isoform. Isoform thứ nhất có kích thước

357 bp, mã hóa 118 amino acid, isoform thứ 2 có kích thước 372 bp, mã hóa 123

amino acid và đều có mã kết thúc là TAG (Hình 3.33; Hình 3.34).

ATGCGTGTGTCCGTGCTGGTGGTGTCCCTGGTGGCAGTCTTCGCCCCACAGTGCCAGGCTCAAGGGTGGGAGGCTGTGGC 80 M R V S V L V V S L V A V F A P Q C Q A Q G W E A V A AGCGGCCGTCGCCAGCAAGATCGTAGGGTTGTGGAGGAACGAAAAAACTGAACTTCTCGGCCACGAGTGCAAGTTCACCG 160 A A V A S K I V G L W R N E K T E L L G H E C K F T TCAAGCCTTATTTGAAGAGATTCCAGGTGTACTACAAGGGGAGGATGTGGTGCCCAGGCTGGACGGCCATCAGAGGAGAA 240 V K P Y L K R F Q V Y Y K G R M W C P G W T A I R G E GCCAGCACACGCAGTCAGTCCGGGGTAGCTGGAAAGACAGCCAAAGACTTCGTTCGGAAAGCTTTCCAGAAAGGTCTCAT 320 A S T R S Q S G V A G K T A K D F V R K A F Q K G L I CTCTCAACAGGAGGCCAACCAGTGGCTCAGCTCATAG 357 S Q Q E A N Q W L S S *

Hình 3.33. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của ALFPm

102

ATGCGTGTGTCCGTGCTGGTGAGCCCGGTGCTGGTGGTGTCCCTGGTGGCAGTCTTCGCCCCACAGTGCCAGGCTCAAGG 80 M R V S V L V S P V L V V S L V A V F A P Q C Q A Q G GTGGGAGGCTGTGGCAGCGGCCGTCGCCAGCAAGATCGTGGGGTTGTGGAGGAACGAAAAAACTGAACTTCTCGGCCACG 160 W E A V A A A V A S K I V G L W R N E K T E L L G H AGTGCAAGTTCACCGTCAAGCCTTATTTGAAGAGATTCCAGGTGTACTACAAGGGGAGGATGTGGTGCCCAGGCTGGACG 240 E C K F T V K P Y L K R F Q V Y Y K G R M W C P G W T GCCATCAGAGGAGAAGCCAGCACACGCAGTCAGTCCGGGGTAGCTGGAAAGACAGCCAAAGACTTCGTTCGGAAAGCTTT 320 A I R G E A S T R S Q S G V A G K T A K D F V R K A F CCAGAAAGGTCTCATCTCTCAACAGGAGGCCAACCAGTGGCTCAGCTCATAG 372 Q K G L I S Q Q E A N Q W L S S *

Hình 3.34. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của ALFPm3

Hiện nay, các cDNA ALF được phân lập từ nhiều loài khác nhau. Khi so

sánh trình tự nucleotide gen ALF phân lập từ tôm sú Việt Nam với trình tự công bố

trên GenBank, chúng tôi thấy 2 isoform có sự tương đồng tương ứng với 2 loại ALF

là ALFPm (EU617325) và ALFPm3 (EF523559). Kết quả so sánh trình tự ALFPm

và ALFPm 3 phân lậ p từ cDNA tôm sú Việ t Nam vớ i trì nh tự đã công bố trên

Genbank được trình bày trên hình 3.35 và 3.36.

10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EU617325 ATGCGTGTGTCCGTGCTGGTGGTGTCCTTGGTGGCACTCTTCGCCCCACAGTGCCAGGCTCAAGGGTGGGAGGCTGTGGC ALFPmVN ...........................C........G........................................... 90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EU617325 AGCGGCCGTCGCCAGCAAGATCGTGGGGTTGTGGAGGAACGAAAAAACTGAACTTCTCGGCCACGAGTGCAAGTTCACCG ALFPmVN ........................A....................................................... 170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EU617325 TCAAGCCTTATTTGAAGAGATTCCAGGTGTACTACAAGGGGAGGATGTGGTGCCCAGGCTGGACGGCCATCAGAGGAGAA ALFPmVN ................................................................................ 250 260 270 280 290 300 310 320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EU617325 GCCAGCACACGCAGTCAGTCCGGGGTAGCTGGAAAGACAGCCAAAGACTTCGTTCGGAAAGCTTTCCAGAAAGGTCTCAT ALFPmVN ................................................................................ 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|.. EU617325 CTCTCAACAGGAGGCCAACCAGTGGCTCAGCTCATAG ALFPmVN .....................................

Hình 3.35. So sánh trình tự nucleotide của gen ALFPm ở tôm sú Việt Nam với trình

tự đã công bố

ALFPmVN: trình tự nucleotide gen ALFPm từ mô tôm sú Việt Nam nhiễm bệnh

đốm trắng; EU617325 - trình tự nucleotide của gen ALFPm tôm sú Ấn Độ

103

10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EF523559 ATGCGTGTGTCCGTGCTGGTAAGCCTGGTGCTGGTGGTGTCCCTGGTGGCACTCTTCGCCCCACAGTGCCAGGCTCAAGG ALFPm3 VN ....................G....C.........................G............................ 90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EF523559 GTGGGAGGCTGTGGCAGCGGCCGTCGCCAGCAAGATCGTAGGGTTGTGGAGGAACGAAAAAACTGAACTTCTCGGCCACG ALFPm3 VN .......................................G........................................ 170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EF523559 AGTGCAAGTTCACCGTCAAGCCTTATTTGAAGAGATTCCAGGTGTACTACAAGGGGAGGATGTGGTGCCCAGGCTGGACG ALFPm3 VN ................................................................................ 250 260 270 280 290 300 310 320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| EF523559 GCCATCAGAGGAGAAGCCAGCACACGCAGTCAGTCCGGGGTAGCTGGAAAGACAGCCAAAGACTTCGTTCGGAAAGCTTT ALFPm3 VN ................................................................................ 330 340 350 360 370 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.. EF523559 CCAGAAAGGTCTCATCTCTCAACAGGAGGCCAACCAGTGGCTCAGCTCATAG ALFPm3 VN ....................................................

Hình 3.36. So sánh trình tự nucleotide của gen ALFPm3 ở tôm sú Việt Nam với trình

tự đã công bố

ALFPm3 VN: trình tự nucleotide gen ALFPm3 từ mô tôm sú Việt Nam nhiễm bệnh

đốm trắng; EF523559 - trình tự nucleotide của gen ALFPm3 từ tôm sú Thái Lan

So sánh trình tự gen ALF thu được với trình tự đã công bố, kết quả cho thấy:

gen ALFPm có sự sai khác ở 3 vị trí nucleotide: 28 T  C, 37 C  G, 105 G  A

(Hình 3.35), sự sai khác trình tự nucleotide này dẫn đến sự sai khác trình tự amino

acid ở 1 vị trí 13 L  V. Còn ALFPm3 có sự sai khác ở 4 vị trí nucleotide: 21 A 

G, 26  T, 52 C  G, 120 A  G (Hình 3.36), dẫn đến sự sai khác trình tự amino

acid ở 2 vị trí 9 L  P và 18 L  V.

Năm 1993, Hoess và đtg phân tích trình tự amino acid mã hóa ALF của cua

thấy chúng đều có vùng kỵ nước mạnh ở đầu N và chứa các gốc tích điện dương với

vòng disulfite bảo thủ là vùng đầu C bám vào LPS [87]. Nhìn chung, các gen ALF

của tôm có khung đọc mở mã hóa 98 - 123 amino acid, có chứa một trình tự peptide

tín hiệu ngắn của 25 gốc amino acid với vị trí phân hủy sau trình tự CXX từ đầu C

(X là amino acid bất kỳ). Tất cả các peptide ALF trưởng thành có 97 - 98 amino

acid với khối lượng phân tử theo tính toán lý thuyết khoảng 11 kDa, trừ LvALF2.

Phân tích trình tự amino acid các loại ALF của các loài tôm thuộc họ penaeid cho

thấy ALF có thể chia thành 3 nhóm theo độ tương đồng được gọi là nhóm I, II và III

104

[202]. Kết quả so sánh trình tự amino acid ở trên cho thấy rằng 2 isoform của ALF

phân lập từ tôm sú Việt Nam (ALFPm và ALFPm3) thuộc vào ALF nhóm I. Kết

quả phân tích so sánh trình tự amino acid ALF phân lập được với các trình tự amino

acid ALF nhó m I của các loài tôm khác được thể hiện trên hình 3.37.

---------signal peptide----------

Hình 3.37. So sánh amino acid suy diễn ALF nhóm I

ALFPmVN, ALFPm3VN: ALF được phân lập từ tôm sú Việt Nam nhiễm bệnh

đốm trắng; ALFPm3 - từ cDNA tôm sú Thái Lan, ALFPm3-1- từ DNA genome tôm

sú Thái Lan; ALFPm - từ tôm sú Ấn Độ; ALFFc - từ tôm thẻ Trung Quốc.

Hình 3.38 cho thấy, ALF nhóm I có sự bảo thủ cao. Trong đó, sự khác biệt

lớn nhất là trình tự amino acid ALF nhóm I có 2 isoform, isoform 1 có trình tự

SLVLV ở trình tự peptide tín hiệu (signal peptide) và isoform còn lại thì không.

Mặt khác, cả hai isoform ALF nhóm I phân lập từ tôm sú đều có sự sai khác một số

amino acid 63 L  I, 68 V  L, 86 S  K, 91 Q  R, 97 K  R, 109 K  Q,

116 K  Q, 122 S  N, 37 S  V so với trình tự ALF từ tôm thẻ Trung Quốc. So

sánh trình tự ALF ở mỗi isoform phân lập ở tôm sú từ các vùng địa lý khác nhau

cho thấy ở cả hai isoform ALF tôm sú Việt Nam đều có duy nhất 1 vị trí sai khác

nucleotide là 19 L  V (theo thứ kết quả so sánh hình 3.37). Sự khác biệt này có

thể đặt ra một vấn đề mới cần nghiên cứu sâu hơn về các SNPs trong gen ALF của tôm sú.

Để chống lại nhiều vi khuẩn có hại ở môi trường xung quanh, các peptide

kháng khuẩn ở tôm đã có sự tiến hóa đa dạng. Các AMP của tôm là các phân tử

peptide phân cực dương (Cation amphibathic) biểu hiện chủ yếu ở tế bào máu tuần

105

hoàn, là vị trí đáp ứng miễn dịch chính. Từ tế bào máu, AMP đi đến các mô nhiễm

bệnh và thực hiện chức năng chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm [37], [84]. Các

AMP ở tôm penaeid được nghiên cứ u cho đến nay có các hoạt tính kháng khuẩn,

kháng nấm. Một trong số chúng còn có khả năng kháng virus. Peptide kháng khuẩn

cung cấp một lựa chọn tốt trong kiểm soát các bệnh vi khuẩn truyền nhiễm. Chúng

là các phân tử tự nhiên với khả năng hoạt động chống lại một loạt các vi sinh vật.

Hiện nay, các peptide kháng khuẩn ở tôm có thể đượ c sản xuất như một phụ gia

thực phẩm tăng cường miễn dịch của tôm, có tiềm năng sử dụng trong phò ng trị

bệ nh tôm như là một giải pháp thay thế cho thuốc kháng sinh và hóa chất, cung cấp

một chiến lược mới để vượt qua bùng phát dịch bệnh nghiêm trọng.

Các ALF ở tôm đã được chứng minh có hoạt tính kháng được nhiều loại vi

sinh vật. ALFPm3 tái tổ hợp (Recombinant ALFPm3 - rALFPm3) có hoạt tính

kháng vi khuẩn Gram (-) và (+) cũng như nấm [190]. Gen ALF mà chúng tôi đã

phân lập từ tôm sú Việt Nam sẽ là một trong những nguyên liệu quan trọng cho

những nghiên cứu sâu hơn nhằm tăng cường tính kháng bệnh của tôm sú Việt Nam.

Trình tự gen ALFPm và ALFPm3 được đăng ký trên GenBank với mã số tương ứng

JQ241181 và JQ256520.

3.7. BIỂ U HIỆ N YẾ U TỐ KHÁ NG KHUẨ N TÁI TỔ HỢP (rALFPm3)

3.7.1. Tạo cấu trúc vector biểu hiện gen

Vector pPICZA được thiết kế để biểu hiện gen tái tổ hợp ở nấm men Pichia

pastoris, trên vector có cấu trúc gen mã hóa cho enzyme alcohol oxidase (ký hiệu

AOX1). Genome nấm men có 2 gen mã hóa cho enzyme alcohol oxidase (AOX1 và

AOX2), gen AOX1 biểu hiện mạnh còn AOX2 hoạt động yếu. Enzyme alcohol

oxidase có chức năng phân hủy methanol thành formaldehyde tạo ra nguồn C để

nấm mem có thể sống mà không cần bổ sung nguồn C khác, sự biểu hiện của AOX1

và AOX2 cũng được cảm ứng bởi methanol. Cấu trúc vector pPICZA mạch thẳng

được biến nạp vào nấm men khi đó xảy ra sự tái tổ hợp đoạn gen AOX1 của vector

pPICZA với AOX1 của genome nấm men [173]. Theo Somboonwiwa và đtg

106

(2005), gen ALFPm3 có đoạn peptide tín hiệu 25 amino acid đầu N và chỉ biểu hiện

đoạn gen mã hóa cho đoạn peptide trưởng thành [190]. Do đó, chúng tôi tiến hành

thiết kế cặp mồi (Bảng 2.2) để khuếch đại đoạn gen mã hóa cho ALFPm3 trưởng

thành sử dụng khuôn là vector pCR2.1 tách dòng mang gen ALFPm3 hoàn chỉnh,

trình tự nhận biết của enzyme giới hạn EcoRI được thêm vào đầu 5‟ mồi xuôi và

XbaI được thêm vào đầu 5‟mồi ngược (không chứa mã kết thúc). Trình tự nhận biết

của 2 enzyme này được đưa vào nhằm mục đích gắn gen ALFPm3 vào vector biểu

hiện pPICZA. Với mục đích biểu hiện gen ALFPm3 sử dụng vector biểu hiện

pPICZA ở nấm men, cấu trúc biểu hiện gen ALFPm3 được thiế t kế thể hiện trên

hình 3.38.

Hình 3.38. Mô hình cấu trúc biểu hiện cDNA của ALFPm3

Trình tự -factor là trình tín hiệu tiết; Kex2 và Ste 13 là vị trí phân hủy peptide tín

hiệu; vị trí nhật biết EcoRI và XbaI là vị trí mà ALFPm3 chèn vào pPICZA, phần trình tự

gạch dưới là trình tự mồi khuếch đại một phần gen ALFPm3, trình tự in nghiêng và nền

xám là trình tự giúp tinh sạch peptide tái tổ hợp

107

Để tạo cấu trúc biểu hiện ALFPm3, chúng tôi sử dụng cặp mồi (Bảng 2.2)

để khuếch đại một phần gen ALLPm3 từ khuôn là vector tách dòng pPCR2.1

mang gen ALFPm3 hoàn chỉnh. Kết quả khuếch đại gen thể hiện trên hình 3.39.

A

B

Hình 3.39. Hình ảnh điện di tạo cấu trúc biểu hiện gen ALFPm3

A. Sản phẩm nhân đoạn gen ALFPm3 bằng kỹ thuật PCR (M: Marker 1kb; 1:

Sản phẩm PCR nhân gen ALFPm3), B. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm PCR trong

vector pPICZA (M: Marker 1kb, 1-5: pPICZA mang đoạn gen ALFPm3)

Trên hình 3.39A cho thấy sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa

ALFPm3 trưởng thành có kích thước 300 bp. Kết quả này đúng với tính toán lý

thuyết của chúng tôi (Bảng 2.2). Để gắn sản phẩm PCR vào này vector biểu hiện

pPICZA, chúng tôi tiến hành tinh sạch vector pPICZA và sản phẩm PCR thu

được. Tiếp theo, ALFPm3 và pPICZA cùng được xử lý bằng enzyme giới hạn

EcoRI và XbaI. Sau đó, đoạn gen biểu hiện được gắn với vector pPICZA sử dụng

enzyme ligase và biến nạp vào E.coli DH10b. Để kiểm tra cấu trúc biểu hiện gen

ALFPm3 trong vector pPICZA, bước đầu chúng tôi tiến hành xử lý vector thu

được bằng enzyme EcoRI và XbaI. Kết quả trên hình 3.39B cho thấy mỗi vector bị

cắt thành hai đoạn: một đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pPICZA (~

3,6 kb) và một đoạn nhỏ có kích thước ~ 300 bp tương ứng với sản phẩm PCR nhân

108

gen ALFPm3 từ vector tách dòng. Như vậy, bước đầu chúng tôi khẳng định đã tạo

được cấu trúc biểu hiện gen ALFPm3/pPICZA. Để kiểm tra chắc chắn đã thiết kế

thành công cấu trúc biểu hiện gen ALFPm3, một số dòng tái tổ hợp đã được kiểm

tra thêm một bước nữa bằng phương pháp xác định trình tự (Phụ lục 6; 7).

3.7.2. Xác định cấu trúc gen ALFPm3 đƣợc chuyển vào genome nấm men

Để tạo ALFPm3 tái tổ hợp, chúng tôi biến nạp cấu trúc ALFPm3/pPICZA

đã xử lý bằng SacI vào nấm men P. pastoris X33. Theo tính toán lý thuyết, cấu trúc

biểu hiện gen này được biến nạp vào tế bào nấm men và sẽ xảy ra hiện tượng tái tổ

hợp vật chất di truyền giữa cấu trúc gen AOX1 của vector pPICZA với AOX1 ở

genome của nấm men. Để kiểm tra sự tồn tại của cấu trúc biểu hiện gen

ALFPm3/pPICZA, DNA tổng số từ một số dòng nấm men được tách chiết làm

khuôn để nhân gen ALFPm3. Đồng thời để khẳng thêm một lần nữa sự có mặt của

cấu trúc ALFPm3 trong genome nấm men, chúng tôi tiến hành thêm phản ứng PCR

với cặp mồi ALF F/AOX1 R (AOX1 F bám vào trình tự gen AOX1 ở đầu 3‟ nằm

trong trình tự vector pPICZA; ALF R bổ sung trình tự gen ALFPm3). Kết quả

khuếch đại được thể hiện trên hình 3.40.

Hình 3.40. Xác định gen ALFPm3 trong genome nấm men ở các dòng nấm men

M: Marker 1kb; 1, 3, 5: Sản phẩm PCR nhân gen ALFPm3 với cặp mồi ALF

F/ALF R; 2, 4, 6: sản phẩm PCR khuếch đại gen ALFPm3 và một phần gen AOX1 với cặp

mồi AOX1 F/ALF R tương ứng dòng A1, A2 và A3

109

Trên hình cho thấy, giếng 1, 3, 5 là kết quả khuếch đại gen ALFPm3 với cặp

mồi ALF F/ALF R từ 3 dòng nấm men có một băng DNA với kích thước ~ 300 bp,

tương đương với kích thước đoạn gen ALFPm3 cần biểu hiện. Còn giếng 2, 4 và 6

là sản phẩm PCR nhân đoạn gen với cặp mồi AOX1 F/ALF R có một băng duy nhất

với kích thước khoảng 650 bp. Kết quả này phù hợp với tính toán lý, đoạn 294 bp

của gen ALFPm3 và một phần trình tự đầu 5‟ của gen AOX1. Do vậy, chúng tôi

khẳng định đã biến nạp thành công cấu trúc biểu hiện gen ALFPm3/pPICZA.

3.7.3. Xác định đoạn peptide ALFPm3 đƣợc biểu hiện

Để tạo peptide rALFPm3, chúng tôi tiến hành cảm ứng bằng methanol ở ba

dòng tế bào nấm men ký hiệu tương ứng là A1, A2, A3 và dòng đối chứng qua 6

ngày nuôi. Kết quả nồng độ tế bào ở các chủng nghiên cứu và đối chứng được trình

bày trên hình 3.41.

Hình 3.41. OD600nm tế bào nấm men P. pastoris biến đổi qua các ngày cảm ứng biểu hiện

X33. Pichia pastoris X33; A1, A2 và A3 là các dòng nấm men mang gen ALFPm3.

Trong cấu trúc biểu hiện gen ALFPm3 có trình tự peptide tín hiệu -factor,

trình tự này giúp tế bào nấm men tiết rALFPm3 ra ngoài tế bào. Do đó, để phát hiện

sự có mặt của peptide kháng khuẩn rALFPm3, dịch đã loại bỏ tế bào từ 5 ngày cảm

ứng biểu hiện được kiểm tra bằng phương pháp điện di protein. Kết quả điện di

SDS-PAGE cảm ứng ngày 1, 2 phát hiện được băng rALFPm3 rõ nhất và thể hiện

trên hình 3.42 và 3.43.

110

Hình 3.42. Hình ảnh điện di phân đoạn protein dịch nuôi các dòng nấm men tái tổ

hợp sau 1 ngày cảm ứng biểu hiện

M. Marker protein, 1. Đối chứng; 2. A1; 3. A2; 4. A3

Hình 3.43. Hình ảnh điện di phân đoạn protein dịch nuôi các dòng nấm men tái tổ hợp sau 2 ngày cảm ứng biểu hiện

M. Marker protein, 1. Đối chứng; 2. A1; 3. A2; 4. A3

Trên hình 3.42 và 3.43 cho thấy, ở cả ba dòng nghiên cứu đều xuất hiện một

băng protein có kích thước khoảng 13,7 kb mà không xuất hiện ở dòng đối chứng

(P. pastoris X33). Kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết của chúng tôi. Ở

dòng A1, A2 và A3 mang cấu trúc biểu hiện ALFPm3/pPICZA nên xuất hiện

băng protein của ALFPm3 dung hợp (98 amnino acid của ALFPm3 và một đoạn 23

amino acid thuộc vector pPICZA). Kết quả cũng chỉ ra băng protein lạ có kích

111

thước lớn nhất sau 1 ngày cảm ứng biểu hiện, sau 2 ngày cảm ứng biểu hiện thì

lượng băng rALFPm3 giảm đi. Kết quả này cũng phù hợp với sự phát triển của tế

bào được đo OD600nm qua các ngày cảm ứng (Hình 3.41).

3.7.4. Phân tích hoạt tính của rALFPm3

Từ kết quả nghiên cứu sự biểu hiện ALFPm3 qua 5 ngày cảm ứng biểu hiện

cho thấy, ALFPm3 biểu hiện mạnh nhất sau 1 ngày cảm ứng biểu hiện và dòng A3

cho sản phẩm băng protein lớn hơn so với 2 dòng còn lại. Do đó, Chúng tôi tiến

hành thu dịch nuôi tế bào nấm men (đã loại tế bào) để bước đầu phân tích hoạt tính

của peptide tái tổ hợp. Dịch đối chứng là dịch nuôi P. pastoris X33 không mang cấu

trúc ALFPm3/pPICZA.

Somboonwiwat và đtg (2005) đã phân tích hoạt tính rALFPm3 với các vi

khuẩn Gram (+) (Aerococcus viridans, B. megaterium, Micrococcus luteus,

Staphylococcus aureus) cho thấy rALFPm3 có hoạt tính mạnh nhất với Bacillus

megaterium. rALFPm3 cũng có khả năng kháng các vi khuẩn Gram (-) bao gồm cả

vi khuẩn gây bệnh ở tôm (Enterobacter cloacae, E. coli 363, Vibrio alginolyticus,

V. anguillarum, V. harveyi, V. penaeicida…) và một số nấm (Fusarium oxysporum,

Botrytis cinerea, Penicillium crustosum) [190]. Trong nghiên cứu của chúng tôi,

hoạt tính kháng khuẩn của dịch chứa rALFPm3 được nghiên cứu với 2 chủng vi

khuẩn B. megaterium và E. aerogenes. Kết quả phân tích được thể hiện ở hình 3.44, 3.45.

Hình 3.44. Hoạt tính của rALFPm3 đối với chủng B. megaterium

112

Hình 3.45. Hoạt tính của rALFPm3 đối với chủng E. aerogenes

Trong nghiên cứu của chúng tôi, dịch chứa rALFPm3 lần đầu tiên được thử

hoạt tính kháng Enterobacter aerogenes, một loài có quan hệ gần với E. cloacae đã

được nghiên cứu [190]. Kết quả trên hình 3.46 cho thấy: peptide tái tổ hợp có khả

năng kháng loài vi khuẩn này. Dịch chứa rALFPm3 có khả năng kháng B.

megaterium mạnh hơn E. aerogenes (Hình 3.45). Như vậy, bước đầu có thể khẳng

định dịch chứa rALFPm3 có hoạt tính kháng vi khuẩn.

113

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

1) Tạo dòng và phân tích đượ c trình tự gen mã hóa protein liên quan đến cơ

chế xâm nhiễm của virus: Rab7. cDNA gen Rab7 có kích thước 618 bp, mã hóa 205

amino acid, có sự sai khác ở 4 vị trí nucleotide: 318 T  C, 423 A  G, 490 T 

C, 537 A  G so vớ i trì nh tự đã công bố (DQ231062). Sự sai khá c nà y không dẫn

đến sự khác nhau trong trình tự amino acid.

2) Tạo dòng và phân tích đượ c trình tự gen mã hó a protein tham gia và o con

đườ ng dẫ n truyề n tí n hiệ u nộ i bào: Syntenin. Gen syntenin hoàn chỉnh có kích thước

969 bp, mã hóa 322 amino acid , trình tự gen syntenin phân lập được còn có thêm

110 bp thuộc đoạn 5‟-UTR. Gen syntenin đượ c phân lậ p hoà n chỉ nh lầ n đầ u tiên

dự a trên mộ t phầ n trì nh tự đầ u 3‟-syntenin đã biế t.

3) Tạo dòng và phân tí ch đượ c trình tự gen mã hó a protein hemocyanin có

hoạt tính phenoloxidase. cDNA gen hemocyanin có kích thước 2052 bp, mã hóa

683 amino acid , trình tự gen hemocyanin phân lậ p đượ c từ tôm sú Việ t Nam có

thêm 7 bp thuộc đoạn 5‟-UTR. Gen hemocyanin đượ c phân lậ p hoà n chỉ nh lầ n đầ u

tiên dự a trên mộ t phầ n trì nh tự đầ u 3‟-hemocyanin đã công bố .

4) Tạo dòng và phân tích trình tự toàn bộ gen mã hó a protein liên quan đế n

cơ chế điề u khiể n thự c bà o : Ran protein. Gen Ran có chiều dài 1104bp, mã hóa 238

amino acid , mã kết thúc là TAA , 385 bp trình tự 3‟UTR và 2 bp trình tự 5‟UTR.

Trình tự gen Ran lầ n đầ u tiên đượ c phân lậ p ở tôm sú .

5) Tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa cho protein tham gia vào cơ

chế apoptosis ở tôm sú : Caspase. cDNA caspase có kích thước 954 bp, mã hóa cho

317 amino acid, có sự sai khác ở 5 vị trí nucleotide: 100 T G, 150 G  A, 159 T

 C, 290 T  C, 354 C  G so vớ i trì nh tự đã công bố (DQ846887). Sự sai khác

trình tự nucleotide này dẫn đến sự sai khác trình tự amino acid ở 3 vị trí 34 S  A,

103 V  A và 124 D  E.

114

6) Tạo dòng và phân tích trình tự cá c cDNA mã hóa protein liên quan đến

khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus bao gồm:

+ Gen mã hó a protein khá ng virus PmAV có kích thước 513 bp, mã hóa 170

amino acid. Gen không có sự sai khá c trì nh tự nucleotide so vớ i trì nh tự công bố .

+ Gen mã hó a peptide khá ng khuẩ n tương tự crustin có chiề u dà i 426 bp, mã

hóa 141 amino acid . Gen không có sự sai khá c trì nh tự nucleotide so vớ i trì nh tự

công bố .

+ Gen mã hó a yế u tố khá ng khuẩ n có 2 dạng (isoform) tương ứ ng là ALFPm

và ALFPm3. Chiề u dà i cDNA ALFPm là 357 bp, mã hóa 118 amino acid, ALFPm3

có kích thước 372 bp, mã hóa 123 amino acid. Gen ALFPm có sự sai khác ở 3 vị trí

nucleotide: 28 T  C, 37 C  G, 105 G  A dẫn đến sự sai khác trình tự amino

acid ở 1 vị trí 13 L  V. Còn ALFPm3 có sự sai khác ở 4 vị trí nucleotide: 21 A 

G, 26  T, 52 C  G, 120 A  G dẫn đến sự sai khác trình tự amino acid ở 2 vị

trí 9 L  P và 18 L  V.

7) Thiết kế được vector biểu hiện yế u tố khá ng khuẩ n ALFPm 3, biểu hiện

được ở nấm men P. pastoris X33 và bước đầu khẳng định dịch chứa rALFPm3 có

hoạt tính kháng vi khuẩn B. megaterium và E. aerogenes.

2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về chức năng của các gen được phân lập, đồng

thời tiến hành tinh sạch rALFPm3 để phân tích hoạt tính.

115

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Hoàng Thị Thu Yến, Vũ Hải Chi, Kim Thị Phương Oanh, Phạm Anh

Tuấn, Nông Văn Hải (2010), "Phân lập và xác định trình tự hoàn chỉnh cDNA mã

hóa syntenin liên quan đến đáp ứng miễn dịch đối với bệnh đốm trắng ở tôm sú

(Penaeus monodon)", Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(2), tr. 155-163.

2. Hoàng Thị Thu Yến, Kim Thị Phương Oanh, Trần Trung Thành, Phạm

Anh Tuấn, Nông Văn Hải (2010), "Tạo dòng và xác định trình tự cDNA mã hóa

protein Rab7 liên quan đến cơ chế nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở tôm sú

(Penaeus monodon)", Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3A), tr. 481-487.

3. Hoàng Thị Thu Yến, Kim Thị Phương Oanh, Phạm Anh Tuấn, Nông Văn

Hải (2011), "Tạo dòng và xác định trình tự cDNA mã hóa protein PmAV liên quan

đến cơ chế kháng virus ở tôm sú (Penaeus monodon)", Tạp chí Khoa học và Công

nghệ Thái Nguyên 85(9), tr. 161-164

4. Công bố 11 trình tự các gen trên ngân hàng gen quốc tế: GenBank

(1) Yen H. T. T., Oanh K. T. P., Tuan P. A. and Hai N. V. (2010). Penaeus

monodon anti-lipopolysacharide factor (ALFPm3) mRNA, complete cds. GenBank,

Accession JQ256520

(2) Yen H. T. T., Oanh K. T. P., Tuan P. A. and Hai N. V. (2011). Penaeus

monodon anti-lipopolysacharide factor (ALFPm) mRNA, complete cds. GenBank,

Accession JQ241181

(3) Yen H. T. T., Oanh K. T. P., Tuan P. A. and Hai N. V. (2011). Penaeus

monodon crustin-like antimicrobial peptide mRNA, complete cds. GenBank,

Accession HQ662560

(4) Yen H. T. T., Oanh K. T. P., Tuan P. A. and Hai N. V. (2010). Penaeus

monodon Antivirus mRNA, complete cds GenBank, Accession HQ662559.

(5) Yen H. T. T., Oanh K. T. P., Tuan P. A. and Hai N. V. (2010). Penaeus

monodon Rab7 mRNA, complete cds GenBank, Accession HQ128578

(6) Yen H. T. T., Oanh K. T. P., Tuan P. A. and Hai N. V. (2010). Penaeus

monodon Caspase-3 mRNA, complete cds GenBank, Accession JQ241180

(7) Yen H. T. T., Oanh K. T. P., Tuan P. A. and Hai N. V. (2010). Penaeus

monodon Syntenin mRNA, complete cds GenBank, Accession HM210774

(8) Yen H. T. T., Oanh K. T. P., Tuan P. A. and Hai N. V. (2011). Penaeus

monodon 5‟ hemocyanin mRNA, partical cds GenBank, Accession JF342238

(9) Yen H. T. T., Oanh K. T. P., Tuan P. A. and Hai N. V. (2011). Penaeus

monodon hemocyanin mRNA, complete cds GenBank, Accession JF357966

(10) Yen H. T. T., Oanh K. T. P., Tuan P. A. and Hai N. V. (2011). Penaeus

monodon Ran protein mRNA, partical cds GenBank, Accession JN617868

116

(11) Yen H. T. T., Oanh K. T. P., Tuan P. A. and Hai N. V. (2011). Penaeus

monodon Ran protein mRNA, complete cds GenBank, Accession JN596104

117

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Quỳnh Anh, Nguyễn Đức Hoàng, Trần Linh Thước (2005), "Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa cho protein vỏ VP19 của WSSV gây bệnh đốm trắng trên

tôm sú (Penaeus monodon)", Tạp chí di truyền và ứng dụng 4, tr. 210-216.

2. Nguyễn Văn Hảo (2005), "Một số vấn đề về kỹ thuật nuôi tôm sú công nghiệp",

Nxb bản Nông nghiệp

3. Nguyễn Văn Hảo, Trương Hồng Việt, Thới Ngọc Bảo, Vũ Hồng Như Yến, Đào

Thị Hương (2007), "Đánh giá hiện trạng sản xuất giống và các bệnh thường gặp

trên tôm sú bố mẹ và ấu trùng tại các trại giống ở miền Nam", Tuyển tập nghề cá

sông Cửu Long, tr. 319-331.

4. Lê Thị Hội, Đinh Thương Vân, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2001), "Tách

dòng và xác định trình tự đoạn ADN đặc hiệu của virus gây bệnh đốm trắng trên

tôm sú Việt Nam", Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học, tr. 341-347.

5. Đỗ Ngọc Liên (2004), "Miễn dich học cơ sở", Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội.

6. Chu Văn Mẫn (2003), "Ứng dụng tin học trong sinh học", Nxb Đại học Quốc gia

Hà Nội.

7. Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương (2008), "Giáo trình miễn dịch học

động vật thủy sản", Trường Đại học Cần Thơ.

8. Bùi Quang Tề (2003), "Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị", Nxb Nông

nghiệp Hà Nội.

9. Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết, Lê Thị Thu Giang, Phạm

Anh Tuấn (2004), "Đánh giá tính đa hình của 3 quần đàn tôm sú (Penaeus

monodon) nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp Microsattelite", Tạp chí Công nghệ

sinh học 2. tr. 315-324.

10. Nguyễn Việt Thắng (1996), "Xác định nguyên nhân chính gây bệnh cho tôm ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và các biện pháp tổng hợp để phòng trừ bệnh", Báo cáo đề tài khoa học, Bộ Thủy sản, tr. 160 - 162.

11. Nguyễn Văn Thường, Trương Quốc Phú (2009), "Giáo trình ngư loại II (Giáp

xác và nhuyễn thể)", Trường Đại học Cần Thơ.

12. Phan Thị Phượng Trang, Phạm Hồng Ánh, Nguyễn Đức Hoàng, Trần Linh Thước (2003), "Sử dụng vector pQE30 để biểu hiện và tinh chế protein vỏ VP28 của virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú", Tạp chí Công nghệ sinh học 1, tr. 299-307.

118

13. Nguyễn Đức Trọng, Trần Ngọc Tuyền, Nguyễn Thị Pha, Trần Vũ Phương, Trần Nhân Dũng, Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Phước Đường (2006), "Chẩn đoán bệnh

đốm trắng (White Spot Syndrome virus) cho tôm sú bằng kỹ thuật PCR ", Tạp chí

Nghiên cứu Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, tr. 207-219.

14. Hồ Thị Ánh Tuyết (2008), "Giống tôm Sú (tôm he), các giai đoạn sinh trưởng",

www.maivietbio.com.vn:

15. Đinh Thương Vân, Lê Thị Hội, Hà Thị Thu, Đinh Duy Kháng (2003), "Tạo

dòng và biểu hiện ở E.coli gen mã hóa cho protein vỏ (VP26) của virus gây bệnh

đốm trắng trên tôm sú ở Việt Nam", Tạp chí Sinh học 27(1), tr. 53-57.

16. Thông tấn xã Việt nam (2010), "Xuất khẩu tôm vượt 2 tỷ USD",

www.agritrade.com.vn:

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17. Adachi K., Endo H., Watanabe T., Nishioka T., Hirata T. (2005), "Hemocyanin

in the exoskeleton of crustaceans: enzymatic properties and immunolocalization",

Pigment Cell Res 18(2), pp. 136-143.

18. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E. W., Lipman D. J. (1990), "Basic

local alignment search tool", J Mol Biol 215(3), pp. 403-410.

19. Amparyup P., Donpudsa S., Tassanakajon A. (2008), "Shrimp single WAP

domain (SWD)-containing protein exhibits proteinase inhibitory and antimicrobial

activities", Dev Comp Immunol 32(12), pp. 1497-1509.

20. Amparyup P., Jitvaropas R., Pulsook N., Tassanakajon A. (2007), "Molecular

cloning, characterization and expression of a masquerade-like serine proteinase

homologue from black tiger shrimp Penaeus monodon", Fish Shellfish Immunol

22(5), pp. 535-546.

21. Amparyup P., Kondo H., Hirono I., Aoki T., Tassanakajon A. (2008b),

"Molecular cloning, genomic organization and recombinant expression of a crustin-like antimicrobial peptide from black tiger shrimp Penaeus monodon", Mol Immunol 45(4), pp. 1085-1093.

22. Angthong P., Watthanasurorot A., Klinbunga S., Ruangdej U., Soderhall I., Jiravanichpaisal P. (2010), "Cloning and characterization of a melanization inhibition protein (PmMIP) of the black tiger shrimp, Penaeus monodon", Fish Shellfish Immunol 29(3), pp. 464-468.

119

23. Arts J. A., Cornelissen F. H., Cijsouw T., Hermsen T., Savelkoul H. F., Stet R. J. (2007), "Molecular cloning and expression of a Toll receptor in the giant tiger

shrimp, Penaeus monodon", Fish Shellfish Immunol 23(3), pp. 504-513.

24. Assavalapsakul W., Smith D. R., Panyim S. (2006), "Identification and

characterization of a Penaeus monodon lymphoid cell-expressed receptor for the yellow head virus", J Virol 80(1), pp. 262-269.

25. Attasart P., Kaewkhaw R., Chimwai C., Kongphom U., Namramoon O., Panyim

S. (2009), "Inhibition of white spot syndrome virus replication in Penaeus

monodon by combined silencing of viral rr2 and shrimp PmRab7", Virus Res

145(1), pp. 127-133.

26. Bachere E. (2000), "Shrimp immunity and disease control", Aquaculture 191, pp. 3-11. 27. Bachere E., Gueguen Y., Gonzalez M., de Lorgeril J., Garnier J., Romestand B.

(2004), "Insights into the anti-microbial defense of marine invertebrates: the

penaeid shrimps and the oyster Crassostrea gigas", Immunol Rev 198, pp. 149-168.

28. Bairoch A., Bucher P., Hofmann K. (1997), "The PROSITE database, its status

in 1997", Nucleic Acids Research Website: http://www.expasy.ch/prosite 25, pp.

217-221.

29. Balasubramanian G., Sarathi M., Kumar S. R., Sahul Hameed A. S. (2007),

"Screening the antiviral activity of Indian medicinal plants against white spot

syndrome virus in shrimp", Aquaculture 263, pp. 15-19.

30. Bangrak P., Graidist P., Chotigeat W., Phongdara A. (2004), "Molecular cloning

and expression of a mammalian homologue of a translationally controlled tumor

protein (TCTP) gene from Penaeus monodon shrimp", J Biotechnol 108(3), pp.

219-226.

31. Bangrak P., Graidist P., Chotigeat W., Supamattaya K., Phongdara A. (2002),

"A syntenin-like protein with postsynaptic density protein (PDZ) domains

produced by black tiger shrimp Penaeus monodon in response to white spot syndrome virus infection", Dis Aquat Organ 49(1), pp. 19-25.

32. Barillas-Mury C. (2007), "CLIP proteases and Plasmodium melanization in

Anopheles gambiae", Trends Parasitol 23(7), pp. 297-299.

33. Bock J. B., Matern H. T., Peden A. A., Scheller R. H. (2001), "A genomic perspective on membrane compartment organization", Nature 409(6822), pp. 839-841.

34. Bonami J. R., Lightner D. V. (1991), "Unclassified viruses of crustacean", In:

Adams JR, Bonami JR, editors. Boca Raton: CRC Press, pp. 597-622.

120

35. Boonyaratpalin S., Supamataya K., Kasornchnadra J., Direkbusarakom S., Aekpanithanpong U., Chantanachookin C. (1993), "Non-occluded baculo-like

virus, the causative agent of yellow-head disease in the black tiger shrimp

(Penaeus monodon)", Fish Pathol 28, pp. 103-109.

36. Brogden K. A. (2005), "Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic

inhibitors in bacteria?", Nat Rev Microbiol 3(3), pp. 238-250.

37. Brown K. L., Hancock R. E. (2006), "Cationic host defense (antimicrobial)

peptides", Curr Opin Immunol 18(1), pp. 24-30.

38. Brusca R. C., Brusca G. J. (1990), "Invertebrates", Sinauer Associates, Inc.,

Massachusetts: 922pp.

39. Bryson K., McGuffin L. J., Marsden R. L., Ward J. J., Sodhi J. S., Jones D. T. (2005), "Protein structure prediction servers at University College London", Nucl

Acids Res 33(Web Server issue), pp. 36-38.

40. Chang C. F., Su M. S., Chen H. Y., Lo C. F., Kou G. H., Liao I. C. (1999),

"Effect of dietary β-1,3 glucan on resistance to white spot syndrome virus (WSSV)

in postlarval and juvenile Penaeus monodon", Dis Aquat Org 36, pp. 163-168.

41. Chang C. F., Su M. S., Chen H. Y., Liao I. C. (2003), "Dietary beta-1,3-glucan

effectively improves immunity and survival of Penaeus monodon challenged with

white spot syndrome virus", Fish Shellfish Immunol 15(4), pp. 297-310.

42. Chang P. S., Lo C. F., Wang Y. C., Kou G. H. (1996), "Identification of white

spot syndrome associated baculovirus (WSBV) target organs in the shrimp

Penaeus monodon by in situ hybridization", Dis Aquat Org 27, pp. 131-139.

43. Changjian Y., Jiquan Z., Fuhua L., Hongming M., Qingli Z., Jose Priya T. A.,

Xiaojun Z., Jianhai X. (2008), "A Toll receptor from Chinese shrimp

Fenneropenaeus chinensis is responsive to Vibrio anguillarum infection", Fish

Shellfish Immunol 24, pp. 564-574.

44. Chantanachookin C. S., Boonyaratpalin J., Kasornchnadra S., Direkbusarakom U., Ekpanithanpong K., Supamataya S. (1993), "Histology and ultrastructure reveal a new granulosis-like virus in Penaeus monodon affected by yellowhead disease.", Dis Aqua Org 17, pp. 145-157.

45. Chen K. Y., Hsu T. C., Huang P. Y., Kang S. T., Lo C. F., Huang W. P., Chen L. L. (2009), "Penaeus monodon chitin-binding protein (PmCBP) is involved in

white spot syndrome virus (WSSV) infection", Fish Shellfish Immunol 27(3), pp. 460-465.

121

46. Chen W. Y., Ho K. C., Leu J. H., Liu K. F., Wang H. C., Kou G. H., Lo C. F. (2008), "WSSV infection activates STAT in shrimp", Dev Comp Immunol 32(10),

pp. 1142-1150.

47. Cheng W., Chiang P. C., Lai C. Y., Yeh M. S. (2008), "Expression of clottable

protein of tiger shrimp (Penaeus monodon) in gonads and its possible role as nutrient source for the embryo", Dev Comp Immunol 32(12), pp. 1422-1429.

48. Chotigeat U., Deachamag P., Phongdara A. (2007), "Identification of a protein

binding to the phagocytosis activating protein (PAP) in immunized black tiger

shrimp", Aquaculture 271, pp. 112-120.

49. Chotigeat W., Tongsupa S., Supamataya K., Phongdara A. (2004), "Effect of fucoidan on disease resistance of black tiger shrimp", Aquaculture 233, pp. 23-30. 50. Chou H. Y., Huang C. Y., Lo C. F., Kou G. H. (1998), "Studies on transmission

of white spot syndrome associated baculovirus (WSBV) in Penaeus monodon and

Penaeus japonicus via waterborne contact and oral ingestion", Aquaculture 164,

pp. 263-276.

51. Chou H. Y., Huang C. Y., Wang C. H., Chiang H. C., Lo C. F. (1995),

"Pathogenicity of a baculovirus infection causing white spot syndrome in cultured

penaeid shrimp in Taiwan", Dis Aquat Org 23, pp. 165-173.

52. Citarasu T., Sivaram V., Immanuel G., Rout N., Murugan V. (2006), "Influence

of selected Indian immunostimulant herbs against white spot syndrome virus

(WSSV) infection in black tiger shrimp, Penaeus monodon with reference to

haematological, biochemical and immunological changes", Fish Shellfish

Immunol 21(4), pp. 372-384.

53. Cowley J. A., Dimmock C. M., Wongteerasupaya C., Boonsaeng V., Panyim S.,

Walker P. J. (1999), "Yellow head virus from Thailand and gill-associated virus

from Australia are closely related but distinct prawn viruses.", Dis Aquat Org 36,

pp. 153-157.

54. Cuthbertson B. J., Bullesbach E. E., Gross P. S. (2006), "Discovery of synthetic penaeidin activity against antibiotic-resistant fungi", Chem Biol Drug Des 68(2), pp. 120-127.

55. de-la-Re-Vega E., Garcia-Orozco K. D., Calderon-Arredondo S. A., Romo- Figueroa M. A., Islas-Osuna M. A., Yepiz-Plascencia G. M., Sotelo-Mundo R. R.

(2004), "Recombinant expression of marine shrimp lysozyme in Escherichia coli", J. Biotechnol 7, pp. 298-304.

122

56. de la Vega E., O'Leary N. A., Shockey J. E., Robalino J., Payne C., Browdy C. L., Warr G. W., Gross P. S. (2008), "Anti-lipopolysaccharide factor in

Litopenaeus vannamei (LvALF): a broad spectrum antimicrobial peptide essential

for shrimp immunity against bacterial and fungal infection", Mol Immunol 45(7),

pp. 1916-1925.

57. Decker H., Jaenicke E. (2004), "Recent findings on phenoloxidase activity and

antimicrobial activity of hemocyanins", Dev Comp Immunol 28(7-8), pp. 673-687.

58. Destoumieux-Garzon D., Saulnier D., Garnier J., Jouffrey C., Bulet P., Bachere

E. (2001), "Crustacean immunity. Antifungal peptides are generated from the C

terminus of shrimp hemocyanin in response to microbial challenge", J Biol Chem 276(50), pp. 47070-47077.

59. Dhar A. K., Cowley J. A., Hasson K. W., Walker P. J. (2004), "Genomic

organization, biology, and diagnosis of Taura syndrome virus and yellowhead

virus of penaeid shrimp", Adv Virus Res 63, pp. 353-421.

60. Donepudi M., Grutter M. G. (2002), "Structure and zymogen activation of

caspases", Biophys Chem 101-102, pp. 145-153.

61. Downs C. A., Fauth J. E., Woodley C. M. (2001), "Assessing the health of grass

shrimp (Palaeomonetes pugio) exposed to natural and anthropogenic stressors: a

molecular biomarker system", Mar Biotechnol (NY) 3(4), pp. 380-397.

62. Dupuy J. W., Bonami J. R., Roch P. (2004), "A synthetic antibacterial peptide

from Mytilus galloprovincialis reduces mortality due to white spot syndrome virus

in palaemonid shrimp", J Fish Dis 27(1), pp. 57-64.

63. Durand S. V., Tang K. F. J., Lightner D. V. (2000), " Frozen commodity

shrimp: Potential avenue for introduction of white spot syndrome virus and yellow

head virus", J Aquat Anim Health 12, pp. 128-135.

64. Escobedo-Bonilla C. M., Alday-Sanz V., Wille M., Sorgeloos P., Pensaert M.

B., Nauwynck H. J. (2008), "A review on the morphology, molecular characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome virus", J Fish Dis 31(1), pp. 1-18.

65. Fanning A. S., Anderson J. M. (1996), "Protein-protein interactions: PDZ

domain networks", Curr Biol 6(11), pp. 1385-1388.

66. Flegel T. W. (1997), "Major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus

monodon) in Thailand", World J Microbiol Biotechnol 13, pp. 433-442.

123

67. Flegel T. W., Fegan D. F., Sriurairatana S. (1995a), "Environmental control of

infectious shrimp diseases in Thailand", Shariff M, Arthur JR, Subasinghe RP

(eds) Diseases in Asian Aquaculture II. Fish Health Section, Asian Fish. Soc.,

Manila, pp. 65-79.

68. Flegel T. W., Pasharawipas T. (1998), "Active viral accommodation: A new

concept for crustacean response to viral pathogens. In Advances in Shrimp

Biotechnology", National Center for Genetic Engineering and Biotechnology,

Bangkok, pp. 245-250.

69. Flegel T. W., Pasharawipas T. (1998), "Active viral accommodation:a

newconcept for crustacean response to viral pathogens", In: Flegel, T.W. (Ed.),

Advances in Shrimp Biotechnology. National Center for Genetic Engineering and

Biotechnology, Bangkok, pp. 245-250.

70. Flegel T. W., Sriurairatana S. (1993), "Black tiger prawn disease in Thailand".

Tech. Bull., Am. Vol. AQ39/1993/3, Sect. B, pp. 1-30.

71. Flegel T. W., Sriurairatana S. (1994), "Shrimp health management: an

environmental approach", In: Subasinghe RP, Shariff M (eds) Diseases in

Aquaculture: The current issues. Malaysia Fisheries Society publication, Faculty

of Fisheries and Marine Sciences, University pertanian Malaysia, Serdang, pp. 1-48.

72. Flegel T. W., Sriurairatana S., Wongteerasupaya C., Boonsaeng V., Panyim S.,

Withyachumnarnkul B. (1995b), "Progress in characterization and control of

yellow-head virus of Penaeus monodon", In: Browdy C, Hopkins S (eds)

Swimming through troubled water. Proceedings of the special session on shrimp

farming, Aquaculture ‟95. World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA, USA,

pp. 76-83.

73. Frankenberg M. M., Jackson S. A., Clegg J. S. (2000), "The heat shock response

of adult Artemia franciscana", J Therm Biol 25(6), pp. 481-490.

74. Fuhrman J. A. (1999), "Marine viruses and their biogeochemical and ecological

effects", Nature 399(6736), pp. 541-548.

75. Gollas-Galvan T., Sotelo-Mundo R. R., Yepiz-Plascencia G., Vargas-Requena

C., Vargas-Albores F. (2003), "Purification and characterization of alpha 2-

macroglobulin from the white shrimp (Penaeus vannamei)", Comp Biochem

Physiol C Toxicol Pharmacol 134(4), pp. 431-438.

124

76. Gopalan U. K., Meenakshikunjamma P. P., Purushan K. S. (1980), "Fungal infection in the tiger prawn (Penaeus monodon) and in other crustaceans from the

Cochin backwaters", Mahasagar Bull Natl Inst Oceanogr 13, pp. 359-365.

77. Grembecka J., Cierpicki T., Devedjiev Y., Derewenda U., Kang B. S.,

Bushweller J. H., Derewenda Z. S. (2006), "The binding of the PDZ tandem of syntenin to target proteins", Biochemistry 45(11), pp. 3674-3683.

78. Grootjans J. J., Zimmermann P., Reekmans G., Smets A., Degeest G., Durr J.,

David G. (1997), "Syntenin, a PDZ protein that binds syndecan cytoplasmic

domains", Proc Natl Acad Sci U S A 94(25), pp. 13683-13688.

79. Gross P. S., Bartlett T. C., Browdy C. L., Chapman R. W., Warr G. W. (2001), "Immune gene discovery by expressed sequence tag analysis of hemocytes and hepatopancreas in the Pacific White Shrimp, Litopenaeus vannamei, and the

Atlantic White Shrimp, L. setiferus", Dev Comp Immunol 25(7), pp. 565-577.

80. Guzman A. G., Sanchez M. J. G., Campa C. A. I., Gonzalez A. L., Ascencio F.

(2009), "Penaeid Shrimp Immune System", Thai J. Vet. Med. 39(3), pp. 205-215.

81. Hagner-Holler S., Schoen A., Erker W., Marden J. H., Rupprecht R., Decker H.,

Burmester (2004), "A respiratory hemocyanin from an insect", Proc Natl Acad Sci

U S A 101(3), pp. 871-874.

82. Han F., Zhang X. (2007), "Characterization of a ras-related nuclear protein (Ran

protein) up-regulated in shrimp antiviral immunity", Fish Shellfish Immunol 23(5),

pp. 937-944.

83. Hancock R. E. (1998), "The therapeutic potential of cationic peptides", Expert

Opin Investig Drugs 7(2), pp. 167-174.

84. Hancock R. E., Brown K. L., Mookherjee N. (2006), "Host defence peptides

from invertebrates--emerging antimicrobial strategies", Immunobiology 211(4),

pp. 315-322.

85. Hellio C., Bado-Nilles A., Gagnaire B., Renault T., Thomas-Guyon H. (2007), "Demonstration of a true phenoloxidase activity and activation of a ProPO cascade in Pacific oyster, Crassostrea gigas (Thunberg) in vitro", Fish Shellfish Immunol 22(4), pp. 433-440.

86. Hetzer M., Gruss O. J., Mattaj I. W. (2002), "The Ran GTPase as a marker of chromosome position in spindle formation and nuclear envelope assembly", Nat

Cell Biol 4(7), pp. 177-184.

125

87. Hoess A., Watson S., Siber G. R., Liddington R. (1993), "Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti-LPS factor,

at 1.5 A resolution", EMBO J 12(9), pp. 3351-3356.

88. Hoffmann J. A., Kafatos F. C., Janeway C. A., Ezekowitz R. A. (1999),

"Phylogenetic perspectives in innate immunity", Science 284(5418), pp. 1313-1318. 89. Holmblad T., Soderhäll K. (1999), "Cell adhesion molecules and antioxidative

enzyme in a crustacean, possible role in immunology", Aquaculture. 172: 111-123.

90. Hsu H. C., Lo C. F., Lin S. C., Liu K. F., Peng S. E., Chang Y. S., Chen L. L.,

Liu W. J., Kou G. H. (1999), "Studies on effective PCR screening strategies for

white spot syndrome virus (WSSV) detection in Penaeus monodon brooders", Dis Aquat Org 39(1), pp. 13-19.

91. Iwanaga S., Lee B. L. (2005), "Recent advances in the innate immunity of

invertebrate animals", J Biochem Mol Biol 38(2), pp. 128-150.

92. Janeway C. A., Medzhitov R. (2002), "Innate immune recognition", Annu Rev

Immunol 20, pp. 197-216.

93. Janeway C. A., Medzhitov R. (2000), "Viral interference with IL-1 and Toll

signaling", Proc Natl Acad Sci USA 97, pp. 10682-10683.

94. Jarasrassamee B., Supungul P., Panyim S., Klinbunga S., Rimphanichayakit V.,

Tassanakajon A. (2005), "Recombinant expression and characterization of five-

domain Kazal-type serine proteinase inhibitor of black tiger shrimp (Penaeus

monodon)", Mar Biotechnol (NY) 7(1), pp. 46-52.

95. Jayasree L., Janakiram P., Madhavi R. ( 2006), "Characterization of Vibrio spp.

associated with diseased shrimp from culture ponds of Andhra Pradesh (India)", J

World Aquac Soc 37, pp. 523-532.

96. Jha R. K., Xu Z. R., Shen J., Bai S. J., Sun J. Y., Li W. F. (2006), "The efficacy

of recombinant vaccines against white spot syndrome virus in Procambarus

clarkii", Immunol Lett 105(1), pp. 68-76.

97. Jiravanichpaisal P., Bangyeekhun E., Soderhall K., Soderhall I. (2001), "Experimental infection of white spot syndrome virus in freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus", Dis Aquat Org 47(2), pp. 151-157.

98. Jiravanichpaisal P., Lee B. L., Soderhall K. (2006), "Cell-mediated immunity in arthropods: hematopoiesis, coagulation, melanization and opsonization",

Immunobiology 211(4), pp. 213-236.

126

99. Johansson M., Keyser P., Sritunyalucksana K., Soderhäll K. (2000),

"Crustacean haemocytes and haematopoiesis", Aquaculture 191, pp. 45-52.

100. Kanchanaphum P., Wongteerasupaya C., Sitidilokratana N., Boonsaeng V.,

Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul B., Flegel T.W. (1998),

"Experimental transmission of white spot syndrome virus (WSSV) from crabs to shrimp Penaeus monodon", Dis Aquat Org 34(1), pp. 1-7.

101. Kang B. S., Cooper D. R., Jelen F., Devedjiev Y., Derewenda U., Dauter Z.,

Otlewski J., Derewenda Z. S. (2003), "PDZ tandem of human syntenin: crystal

structure and functional properties", Structure 11(4), pp. 459-468.

102. Kang C. J., Xue J. F., Liu N., Zhao X. F., Wang J. X. (2007), "Characterization and expression of a new subfamily member of penaeidin antimicrobial peptides (penaeidin 5) from Fenneropenaeus chinensis", Mol Immunol 44(7), pp. 1535-1543.

103. Karunasagar I., Karunasagar I., Umesha R. K. (2004), "Microbial Diseases in

Shrimp Aquaculture", Marine Microbiology: Facets & Opportunities; Ramaiah, N

(Ed.), pp. 121-134.

104. Khanobdee K., Soowannayan C., Flegel T. W., Ubol S., Withyachumnarnkul

B. (2002), "Evidence for apoptosis correlated with mortality in the giant black

tiger shrimp Penaeus monodon infected with yellow head virus", Dis Aquat

Organ 48(2), pp. 79-90.

105. Kilpatrick D. C. (2002), "Animal lectins: a historical introduction and

overview", Biochim Biophys Acta 1572(2-3), pp. 187-197.

106. Kondo M., Itami T., Takahashi Y., Fujii R., Tomonaga S. (1998),

"Ultrastructural and cytochemical characteristics of phagocytes in kuruma prawn",

Fish Pathol 33, pp. 421-427.

107. Koyama T., Asakawa S., Katagiri T., Shimizu A., Fagutao F. F., Mavichak R.,

Santos M. D., Fuji K., Sakamoto T., Kitakado T., Kondo H., Shimizu N., Aoki T.,

Hirono I. (2010), "Hyper-expansion of large DNA segments in the genome of kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus", BMC Genomics 11, pp. 141.

108. Kuhlman M., Joiner K., Ezekowitz R. A. (1989), "The human mannose-

binding protein functions as an opsonin", J Exp Med 169(5), pp. 1733-1745.

109. Kusche K., Ruhberg H., Burmester T. (2002), "A hemocyanin from the Onychophora and the emergence of respiratory proteins", Proc Natl Acad Sci U S

A 99(16), pp. 10545-10548.

127

110. Lee M. H., Osaki T., Lee J. Y., Baek M. J., Zhang R., Park J. W., Kawabata S.,

Soderhall K., Lee B. L. (2004), "Peptidoglycan recognition proteins involved in

1,3-beta-D-glucan-dependent prophenoloxidase activation system of insect", J

Biol Chem 279(5), pp. 3218-3227.

111. Lehnert S. A., Wilson K. J., Byrne K., Moore S. S. (1999), "Tissue-Specific

Expressed Sequence Tags from the Black Tiger Shrimp Penaeus monodon", Mar

Biotechnol (NY) 1(5), pp. 465-0476.

112. Lei K., Li F., Zhang M., Yang H., Luo T., Xu X. (2008), "Difference between

hemocyanin subunits from shrimp Penaeus japonicus in anti-WSSV defense",

Dev Comp Immunol 32(7), pp. 808-813.

113. Leu J. H., Kuo Y. C., Kou G. H., Lo C. F. (2008), "Molecular cloning and

characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp,

Penaeus monodon", Dev Comp Immunol 32(2), pp. 121-133.

114. Leu J. H., Wang H. C., Kou G. H., Lo C. F. (2008), "Penaeus monodon

caspase is targeted by a white spot syndrome virus anti-apoptosis protein", Dev

Comp Immunol 32(5), pp. 476-486.

115. Li S. Y., Zhi X. Y., Ji X. L., Xian D. H., Chang J. G., Shao P. W., Siu M. C.,

Xiao Q. Y., Jian G. H. (2007), "A toll receptor in shrimp", Mol Immunol 44, pp.

1999-2008.

116. Li A. L., Li H. Y., Jin B. F., Ye Q. N., Zhou T., Yu X. D., Pan X., Man J. H.,

He K., Yu M., Hu M. R., Wang J., Yang S. C., Shen B. F., Zhang X. M. (2004),

"A novel eIF5A complex functions as a regulator of p53 and p53-dependent

apoptosis", J Biol Chem 279(47), pp. 49251-49258.

117. Lightner D. V. (1996), "A handbook of pathology and diagnostic procedures

for diseases of penaeid shrimp", In Special publication of the World Aquaculture

Society. LA: Baton Rouge.

118. Liu H., Jiravanichpaisal P., Soderhall I., Cerenius L., Soderhall K. (2006),

"Antilipopolysaccharide factor interferes with white spot syndrome virus

replication in vitro and in vivo in the crayfish Pacifastacus leniusculus", J Virol

80(21), pp. 10365-10371.

119. Liu H., Soderhall K., Jiravanichpaisal P. (2009), "Antiviral immunity in

crustaceans", Fish Shellfish Immunol 27(2), pp. 79-88.

128

120. Liu K. F., Yeh M. S., Kou G. H., Cheng W., Lo C. F. (2010), "Identification and cloning of a selenium-dependent glutathione peroxidase from tiger shrimp,

Penaeus monodon, and its transcription following pathogen infection and related

to the molt stages", Dev Comp Immunol 34(9), pp. 935-944.

121. Lo C. F., Leu J. H., Ho C. H., Chen C. H., Peng S. E., Chen Y. T., Chou C. M., Yeh P. Y., Huang C. J., Chou H. Y., Wang C. H., Kou G. H. (1996b), "Detection

of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps

using polymerase chain reaction", Dis Aquat Org 25, pp. 133-141.

122. Lo C. F., Ho C. H., Chen C. H., Liu K. F., Chiu Y. L., Yeh P. Y., Peng S. E.,

Hsu H. C., Liu H. C., Chang C. F., Su M. S., Wang C. H., Kou G. H. (1997), "Detection and tissue tropism of White spot syndrome baculovirus (WSBV) in captured brooders of Penaeus monodon with a special emphasis on reproductive

organs", Dis Aquat Org 30, pp. 53-72.

123. Lo C. F., Ho C. H., Peng S. E., Chen C. H., Hsu H. C., Chiu Y. L., Chang C.

F., Liu K. F., Su M. S., Wang C. H., Kou G. H. (1996a), "White spot syndrome

baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other

arthropods", Dis Aquat Org 27, pp. 215-225.

124. Lo C. F., Ho C. H., Peng S. E., Chen C. H., Hsu H. C., Chiu Y. L., Chang C.

F., Liu K. F., Su M. S., Wang C. H., Kou G. H. (1996a), "White spot syndrome

baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other

arthropods", Dis Aquat Org 27, pp. 215-225.

125. Lo W. Y., Liu K. F., Liao I. C., Song Y. L. (2004), "Cloning and molecular

characterization of heat shock cognate 70 from tiger shrimp (Penaeus monodon)",

Cell Stress Chaperones 9(4), pp. 332-343.

126. Loh P. C., Tapay L. M., Lu Y., Nadala E. C. (1997), "Viral pathogens of the

penaeid shrimp", Adv Virus Res 48, pp. 263-312.

127. Lotz J. M. (1997), "Viruses, Biosecurity and Specific Pathogen Free Stocks In

Shrimp Aquaculture", World J Microbiol Biotechnol 13, pp. 405-413.

128. Lu Y., Tapay L. M., Brock J. A., Loh P. C. (1994), "Infection of the yellow head baculo-like virus (YBV) in two species of penaeid shrimp, Penaeus stylirostris (Stimpson) and Penaeus vannamei (Boone)", J Fish Dis 17, pp. 649-656. 129. Lu Y., Tapay L. M., Loh P. C. (1996), "Development of nitrocellulose enzyme

immunoassay (NC-EIA) for the detection of yellowhead virus from penaeid shrimp", J Fish Dis 19, pp. 9-13.

129

130. Lu Y., Tapay L. M., Loh P. C., Brock J. A., Gose R. B. (1995), "Distribution of yellow head virus in selected tissue and organs of penaeid shrimp Penaeus

vannamei", Dis Aqua Org 23, pp. 67-70.

131. Luo T., Li F., Lei K., Xu X. (2007), "Genomic organization, promoter

characterization and expression profiles of an antiviral gene PmAV from the shrimp Penaeus monodon", Mol Immunol 44(7), pp. 1516-1523.

132. Luo T., Yang H., Li F., Zhang X., Xu X. (2006), "Purification, characterization

and cDNA cloning of a novel lipopolysaccharide-binding lectin from the shrimp

Penaeus monodon", Dev Comp Immunol 30(7), pp. 607-617.

133. Luo T., Zhang X., Shao Z., Xu X. (2003), "PmAV, a novel gene involved in

virus resistance of shrimp Penaeus monodon", FEBS Lett 551(1-3), pp. 53-57.

134. Ma T. H., Benzie J. A., He J. G., Chan S. M. (2008), "PmLT, a C-type lectin

specific to hepatopancreas is involved in the innate defense of the shrimp Penaeus

monodon", J Invertebr Pathol 99(3), pp. 332-341.

135. Makesh M., Koteeswaran A., Chandaran N. D. J., Manohar B. M., Ramasamy

V. (2006), "Development of monoclonal antibodies against VP28 of WSSV and

its application to detect WSSV using immunocomb", Aquaculture 261, pp. 64-71.

136. Mangum C. P. (1985), "Oxygen transport in invertebrates", Am J Physiol

248(5 Pt 2), pp. 505-514.

137. Markl J. (1986), "Evolution and function of structurally diverse subunits in the

respiratory protein hemocyanin from arthropods", Biol Bull 171: 90-115.

138. Markl J., Decker H. (1992), "Molecular structure of the arthropod

hemocyanins", Adv Comp Environ Physiol 13, pp. 325-376.

139. Markl J., Stocker W., Runzler R., Precht E. (1986), "Immunological

correspondences between the hemocyanin subunits of 86 arthropods: evolution of

a multigene protein family", In: Linzen B (ed) Invertebrate oxygen carriers.

Springer, Heidelberg, pp. 281-292.

140. Marks H. (2005), "Genomics and transcriptomics of White spot syndrome virus", PhD thesis Wageningen University - with references - with summary in Dutch.

141. Marshall S. H., Arenas G. (2003), "Antimicrobial peptides: A natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied biotechnology.", J.

Biotechnol 6, pp. 271-284.

130

142. Martin G. G., Graves B. (2005), "Fine structure and classification of shrimp

haemocytes", J. Morphol 185, pp. 339-348.

143. Mateljan G. (2006), "The World's Healthiest Foods, Essential Guide for the

Healthiest Way of Eating", Published World's Healthiest Foods, 880 pp.

144. Meng-Yi C., Kuang-Yu H. U. B., Chih-Cheng H., Yen-Ling S. (2005), "More type of invertebrates? A second transglutaminase than one type of in

transglutaminase is involved in shrimp coagulation", Dev. Comp. Immunol. 29,

pp. 1003-1016.

145. Motoh H. (1984), "Biology and ecology of Penaeus monodon. Proceedings of

the First International Conference on the Culture of Penaeid Prawns/Shrimp", SEAFDEC Aquaculture Department, Iloilo City, pp. 27-36.

146. Mylonakis E., Aballay A. (2005), "Worms and flies as genetically tractable

animal models to study host-pathogen interactions", Infect Immun 73(7), pp. 3833-3841.

147. Nadala E. C., Tapay L. M., Cao S., Loh P. C. (1997), "Detection of yellowhead

virus and Chinese baculovirus in penaeid shrimp by the Western blot technique", J

Virol Methods 69(1-2), pp. 39-44.

148. Nadala E. C. B. J., Loh P. C. (2000), "Dot-blot nitrocellulose immunoassay for

the detection of white spot virus and yellow head virus of penaeid shrimp", J Virol

Methods 84, pp. 175-179.

149. Nagai T., Osaki T., Kawabata S. (2001), "Functional conversion of

hemocyanin to phenoloxidase by horseshoe crab antimicrobial peptides", J Biol

Chem 276(29), pp. 27166-27170.

150. Nappi A. J., Ottaviani E. (2000), "Cytotoxicity and cytotoxic molecules in

invertebrates", Bioessays 22(5), pp. 469-480.

151. Nathan C., Shiloh M. U. (2000), "Reactive oxygen and nitrogen intermediates

in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens", Proc Natl

Acad Sci U S A 97(16), pp. 8841-8848.

152. Nayak S., Singh S. K., Ramaiah N., Sreepada R. A. (2010), "Identification of in Vibrio harveyi challenged Penaeus immune-related genes

upregulated monodon postlarvae", Fish Shellfish Immunol 29(3), pp. 544-549.

153. Neves C. A., Santos E. A., Bainy A. C. (2000), "Reduced superoxide dismutase activity in Palaemonetes argentinus (Decapoda, Palemonidae) infected

by Probopyrus ringueleti (Isopoda, Bopyridae)", Dis Aquat Organ 39(2), pp. 155-158.

131

154. Nevo R., Stroh C., Kienberger F., Kaftan D., Brumfeld V., Elbaum M., Reich (2003), "A molecular switch between alternative Z., Hinterdorfer P.

conformational states in the complex of Ran and importin beta1", Nat Struct Biol

10(7), pp. 553-557.

155. O'Brien V. (1998), "Viruses and apoptosis", J Gen Virol 79(8), pp. 1833-1845. 156. Ongvarrasopone C., Chanasakulniyom M., Sritunyalucksana K., Panyim S.

(2008), "Suppression of PmRab7 by dsRNA inhibits WSSV or YHV infection in

shrimp", Mar Biotechnol (NY) 10(4), pp. 374-381.

157. Pais R., Khushiramani R., Karunasagar I., Karunasagar I. (2008), "Effect of

immunostimulants on the haemolymph haemagglutinins of tiger shrimp Penaeus monodon", Aquac Res 39, pp. 1339-1345.

158. Peng S. E., Lo C. F., Lin S. C., Chen L. L., Chang Y. S., Liu K. F., Su M. S.,

Ko G. H. (2001), "Performance of WSSV-infected and WSSV-negative Penaeus

monodon postlarvae in culture ponds", Dis Aquat Org 46(3), pp. 165-172.

159. Perkel J. M. (2009), "Shrimp study exposes mechanisms of innate immunity",

J Proteome Res 8(3), pp. 1107.

160. Phongdara A., Laoong-u-thai Y., Wanna W. (2007), "Cloning of eIF5A from

shrimp Penaeus monodon, a highly expressed protein involved in the survival of

WSSV-infected shrimp", Aquaculture 265, pp. 16-26.

161. Pick C., Schneuer M., Burmester T. (2009), "The occurrence of hemocyanin in

Hexapoda", FEBS J 276(7), pp. 1930-1941.

162. Ponprateep S., Somboonwiwat K., Tassanakajon A. (2009), "Recombinant

anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 and the prevention of vibriosis in the

black tiger shrimp, Penaeus monodon", Aquaculture 289, pp. 219-224.

163. Ramasamy P., Rajan P. R., Jayakumar R., Rani S., Brenner G. P. (1996),

"Lagenidium callinectes (Couch, 1942) infection and its control in cultured larval

Indian tiger prawn, Penaeus monodon Fabricus", J Fish Dis 19, pp. 75-82.

164. Rameshthangam P., Ramasamy P. (2007), "Antiviral activity of bis(2- methylheptyl)phthalate isolated from Pongamia pinnata leaves against White Spot Syndrome Virus of Penaeus monodon Fabricius", Virus Res 126(1-2), pp. 38-44. 165. Ranganathan S., Simpson K. J., Shaw D. C., Nicholas K. R. (1999), "The whey acidic protein family: a new signature motif and three-dimensional structure by

comparative modeling", J Mol Graph Model 17(2), pp. 106-113.

132

166. Rattanachai A., Hirono I., Ohira T., Takahashi Y., Aoki T. (2004), "Molecular cloning and expression analysis of alpha 2-macroglobulin in the kuruma shrimp,

Marsupenaeus japonicus", Fish Shellfish Immunol 16(5): 599-611.

167. Reddy K. V. R., Yedery R. D., Aranha C. C. (2004), "Antimicrobial peptide:

Premises and promises", Int J Antimicrob Agents 24, pp. 536-547.

168. Reed L. A., Siewickib T. C., Shah J. C. (2004), "Pharmacokinetics of

oxytetracycline in the white shrimp, Litopenaeus setiferus", Aquaculture 232, pp.

11 -28.

169. Relf J. M., Chisholm J. R., Kemp G. D., Smith V. J. (1999), "Purification and

characterization of a cysteine-rich 11.5-kDa antibacterial protein from the granular haemocytes of the shore crab, Carcinus maenas", Eur J Biochem 264(2), pp. 350-357. 170. Robalino J., Almeida J. S., McKillen D., Colglazier J., Trent H. F., Chen Y. A.,

Peck M. E., Browdy C. L., Chapman R. W., Warr G. W., Gross P. S. (2007),

"Insights into the immune transcriptome of the shrimp Litopenaeus vannamei:

tissue-specific expression profiles and transcriptomic responses to immune

challenge", Physiol Genomics 29(1). pp. 44-56.

171. Robalino J., Browdy C. L., Prior S., Metz A., Parnell P., Gross P., Warr G.

(2004), "Induction of antiviral immunity by double-stranded RNA in a marine

invertebrate", J Virol 78(19), pp. 10442-10448.

172. Roch P. (1999), "Defense mechanisms and disease prevention in farmed

marine invertebrates", Aquaculture 172, pp. 125-145.

173. Romanos M. A., Scorer C. A., Clare J. J. (1992), "Foreign Gene Expression in

Yeast: A Review", Yeast 8, pp. 423-488.

174. Rosenberry B. (2004), "World shrimp farming 2004. In Shrimp News

International", San Diego, California, USA.

175. Rost B., Yachdav G., Liu J. (2007), "The PredictProtein Server", Nucleic Acids

Research32 (Web Server issue, pp. 321-326, Website: http://www.predictprotein.org/: 176. Roux M. M., Pain A., Klimpel K. R., Dhar A. K. (2002), "The lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein gene is upregulated in white spot virus-infected shrimp (Penaeus stylirostris)", J Virol 76(14), pp. 7140-7149. 177. Salvesen G. S., Dixit V. M. (1999), "Caspase activation: the induced-proximity

model", Proc Natl Acad Sci U S A 96(20), pp. 10964-10967.

178. Sambrook J., Russell D.W. (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

133

179. Sangsuriya P., Rojtinnakorn J., Senapin S., Flegel T. W. (2007), "Characterization and tissue expression of apoptosis-related ALG-2 interacting

protein Alix/AIP1 from the black tiger shrimp Penaeus monodon", Fish Shellfish

Immunol 23(2), pp. 485-492.

180. Sarathi M., Simon M. C., Ahmed V. P., Kumar S. R., Hameed A. S. (2008), "Silencing VP28 gene of white spot syndrome virus of shrimp by bacterially

expressed dsRNA", Mar Biotechnol (NY) 10(2), pp. 198-206.

181. Seabra M. C., Mules E. H., Hume A. N. (2002), "Rab GTPases, intracellular

traffic and disease", Trends Mol Med 8(1), pp. 23-30.

182. Shekhar M. S., Azad I. S., Ravichandran P. (2006), "Comparison of dot blot and PCR diagnostic techniques for detection of white spot syndrome virus in different tissues of Penaeus monodon", Aquaculture 261, pp. 1122-1127.

183. Sithigorngul P., Chauychuwong P., Sithigorngul W., Longyant S.,

Chaivisuthangkura P., Menasveta P. (2000), "Development of a monoclonal

antibody specific to yellow head virus (YHV) from Penaeus monodon", Dis Aquat

Org 42, pp. 27-34.

184. Sithigorngul P., Rukpratanporn S., Chauychuwong P., Sithigorngul W.,

Longyant S., Chaivisuthangkura P., Menasveta P. (2002), "Monoclonal antibodies

specific to yellow head virus (YHV) from Penaeus monodon", Dis Aquat Org 49,

pp. 71-76.

185. Smith V. J., Fernandes J. M., Kemp G. D., Hauton C. (2008), "Crustins:

enigmatic WAP domain-containing antibacterial proteins from crustaceans", Dev

Comp Immunol 32(7), pp. 758-772.

186. Smith V. J., Fernandes J. M., Kemp G. D., Hauton C. (2008), "Crustins:

Enigmatic WAP domain-containing antibacterial proteins from crustaceans", Dev

Comp Immunol 32, pp. 758-772.

187. Soderhall I., Bangyeekhun E., Mayo S., Soderhall K. (2003), "Hemocyte production and maturation in an invertebrate animal; proliferation and gene expression in hematopoietic stem cells of Pacifastacus leniusculus", Dev Comp Immunol 27(8), pp. 661-672.

188. Soderhall K., Cerenius L. (1998), "Role of the prophenoloxidase-activating

system in invertebrate immunity", Curr Opin Immunol 10(1), pp. 23-28.

134

189. Somboonwiwat K., Chaikeeratisak V., Wang H. C., Fang Lo C., Tassanakajon A. (2010), "Proteomic analysis of differentially expressed proteins in Penaeus

monodon hemocytes after Vibrio harveyi infection", Proteome Sci 8, pp. 39.

190. Somboonwiwat K., Marcos M., Tassanakajon A., Klinbunga S., Aumelas A.,

Romestand B., Gueguen Y., Boze H., Moulin G., Bachere E. (2005), "Recombinant expression and anti-microbial activity of anti-lipopolysaccharide

factor (ALF) from the black tiger shrimp Penaeus monodon", Dev Comp Immunol

29(10), pp. 841-851.

191. Sritunyalucksana K., Cerenius L., Soderhall K. (1999), "Molecular cloning and

characterization of prophenoloxidase in the black tiger shrimp, Penaeus monodon", Dev Comp Immunol 23(3), pp. 179-186.

192. Sritunyalucksana K., Wannapapho W., Lo C. F., Flegel T. W. (2006),

"PmRab7 is a VP28-binding protein involved in white spot syndrome virus

infection in shrimp", J Virol 80(21), pp. 10734-10742.

193. Sritunyalucksana K., Wongsuebsantati K., Johansson M. W., Soderhall K.

(2001), "Peroxinectin, a cell adhesive protein associated with the proPO system

from the black tiger shrimp, Penaeus monodon", Dev Comp Immunol 25(5-6), pp.

353-363.

194. Supamattaya K., Chittiwan V., Boonyaratpalin M. (2006), "Immunological

factors in Black Tiger shrimp, Penaeus monodon, Fabricius",

www.en.engormix.com:

195. Supungul P., Klinbunga S., Pichyangkura R., Hirono I., Aoki T., Tassanakajon

A. (2004), "Antimicrobial peptides discovered in the black tiger shrimp Penaeus

monodon using the EST approach", Dis Aquat Organ 61(1-2), pp. 123-135.

196. Supungul P., Klinbunga S., Pichyangkura R., Jitrapakdee S., Hirono I., Aoki

T., Tassanakajon A. (2002), "Identification of immune-related genes in hemocytes of

black tiger shrimp (Penaeus monodon)", Mar Biotechnol (NY) 4(5), pp. 487-494.

197. Supungul P., Tang S., Maneeruttanarungroj C., Rimphanitchayakit V., Hirono I., Aoki T., Tassanakajon A. (2008), "Cloning, expression and antimicrobial activity of crustinPm1, a major isoform of crustin, from the black tiger shrimp Penaeus monodon", Dev Comp Immunol 32(1), pp. 61-70.

198. Susan L. G., Saban T., Peter J. H. (2008), "Extraction and purification of total

RNA using TRIzol or trireagent", Dept. of Animal Sciences, University of Florida (SLG is currently at Purdue Pharma Inc.). www.animal.ufl.edu/hansen/protocols/RNA_extraction.htm.

135

199. Takahashi Y., Kondo M., Itami T., Honda T., Inagawa H., Nishizawa T., Soma

G. I., Yokomizo Y. (2000), "Enhancement of disease resistance against penaeid

acute viraemia and induction of virus-inactivating activity in haemolymph of

kuruma shrimp, Penaeus japonicus, by oral administration of Pantoea

agglomerans lipopolysaccharide (LPS)", Fish Shellfish Immunol 10(6), pp. 555-558.

200. Tang K. F. J., Lightner D. V. (1999), "A yellowhead virus gene probe: nucleotide

sequence and application for in situ hybridization", Dis Aquat Org 35, pp. 165-173.

201. Tanticharoen M., Flegel T. W., Meerod W., Grudloyma U., Pisamai N. (2008),

"Aquacultural biotechnology in Thailand: the case of the shrimp industry", J.

Biotechnol, 10 (6), pp. 588-603.

202. Tassanakajon A., Amparyup P., Somboonwiwat K., Supungul P. (2010),

"Cationic antimicrobial peptides in penaeid shrimp", Mar Biotechnol (NY) 12(5),

pp. 487-505.

203. Tassanakajon A., Klinbunga S., Paunglarp N., Rimphanitchayakit V., Udomkit

A., Jitrapakdee S., Sritunyalucksana K., Phongdara A., Pongsomboon S.,

Supungul P., Tang S., Kuphanumart K., Pichyangkura R., Lursinsap C. (2006),

"Penaeus monodon gene discovery project: the generation of an EST collection

and establishment of a database", Gene 384, pp. 104-112.

204. Tharntada S., Ponprateep S., Somboonwiwat K., Liu H., Soderhall I., Soderhall

K., Tassanakajon A. (2009), "Role of anti-lipopolysaccharide factor from the

black tiger shrimp, Penaeus monodon, in protection from white spot syndrome

virus infection", J Gen Virol 90(Pt 6), pp. 1491-1498.

205. Tharntada S., Somboonwiwat K., Rimphanitchayakit V., Tassanakajon A.

(2008), "Anti-lipopolysaccharide factors from the black tiger shrimp, Penaeus

monodon, are encoded by two genomic loci", Fish Shellfish Immunol 24(1), pp. 46-54.

206. Tonganunt M., Nupan B., Saengsakda M., Suklour S., Wanna W., Senapin S.,

Chotigeat W., Phongdara A. (2008), "The role of Pm-fortilin in protecting shrimp

from white spot syndrome virus (WSSV) infection", Fish Shellfish Immunol

25(5), pp. 633-637.

207. Tonganunt M., Phongdara A., Chotigeat W., Fujise K. (2005), "Identification

and characterization of syntenin binding protein in the black tiger shrimp Penaeus

monodon", J Biotechnol 120(2), pp. 135-145.

136

208. van de Braak C. B., Botterblom M. H., Taverne N., van Muiswinkel W. B.,

Rombout J. H., van der Knaap W. P. (2002), "The roles of haemocytes and the

lymphoid organ in the clearance of injected Vibrio bacteria in Penaeus monodon

shrimp", Fish Shellfish Immunol 13(4), pp. 293-309.

209. van de Braak C. B. T. (2002), "Haemocytic defence in black tiger shrimp (Penaeus monodon)", Thesis, Wageningen University - with ref. - with summary

in Dutch.

210. Vargas-Albores F., Yepiz-Plascencia G. (1998.), "Shrimp immunity: A

review", Trends Comp Biochem Physiol 5, pp. 195-210.

211. Vaseeharan B., Prem Anand T., Murugan T., Chen J. C. (2006), "Shrimp vaccination trials with the VP292 protein of white spot syndrome virus", Lett Appl

Microbiol 43(2), pp. 137-142.

212. Venegas C. A., Nonaka L., Mushiake K., Nishizawa T., Murog K. (2000),

"Quasi-immune response of Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA virus

(PRDV)", Dis Aquat Organ 42(2), pp. 83-89.

213. Vlak J. M., Bonami J. R., Flegel T. W., Kou G. H., Lightner D. V., Lo C. F.,

Loh P. C., Walker P. J. (2005), "Nimaviridae", In Virus Taxonomy - Eight Report

of the International Committee on Taxonomy of Viruses: 187-192. Edited by C.

M. Fauquet, M. A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger & L. A. Ball. London:

Elsevier Academic Press.

214. Voit R., Feldmaier-Fuchs G. (1990), "Arthropod hemocyanins. Molecular

cloning and sequencing of cDNAs encoding the tarantula hemocyanin subunits a

and e", J Biol Chem 265(32), pp. 19447-19452.

215. Walker P. J., Cowley J. A., Spann K. M., Hodgson Raj Hall M. R.,

Withyachumnarnkul B. (2001), "Yellow head complex viruses: transmission

cycles and topographical distribution in the Asia- Pacific region", In: Browdy

CL, Jory DE (eds) The new wave. Proc. Spec. Session Sustainable Shrimp Culture, Aquaculture 2001. The World Aquaculture Society Baton Rouge LA, pp. 227-237.

216. Wang C. S., Tang K. J., Kuo G. H., Chen S. N. (1996), "Yellowhead disease- like virus infection in the kuruma shrimp Penaeus japonicus cultured in Taiwan", Fish Pathol 31, pp. 177-182.

137

217. Wang H., Ma J., Ruan L., Xu X. (2009), "Cloning of a centaurin-alpha1 like gene MjCent involved in WSSV infection from shrimp Marsupeneaus japonicus",

Fish Shellfish Immunol 26(2), pp. 279-284.

218. Wang L., Zhi B., Wu W., Zhang X. (2008), "Requirement for shrimp caspase

in apoptosis against virus infection", Dev Comp Immunol 32(6), pp. 706-715.

219. Wang R., Lee S. Y., Cerenius L., Soderhall K. (2001), "Properties of the

prophenoloxidase activating enzyme of the freshwater crayfish, Pacifastacus

leniusculus", Eur J Biochem 268(4), pp. 895-902.

220. Wang R., Liang Z., Hal M., Soderhall K. (2001), "A transglutaminase involved

in the coagulation system of the freshwater crayfish, Pacifastacus leniusculus. Tissue localisation and cDNA cloning", Fish Shellfish Immunol 11(7): 623-637. 221. Wang Y. C., Lo C. F., Chang P. S., Kou G. H. (1998), "Experimental infection

of White spot baculovirus in some cultured and wild decapods in Taiwan",

Aquaculture 164, pp. 221-231.

222. Westenberg M., Heinhuis B., Zuidema D., Vlak J. M. (2005), "siRNA injection

induces sequence-independent protection in Penaeus monodon against white spot

syndrome virus", Virus Res 114(1-2), pp. 133-139.

223. Wilson K., Cahill V., Ballment E., Benzie J. (2000), "The complete sequence

of the mitochondrial genome of the crustacean Penaeus monodon: are

malacostracan crustaceans more closely related to insects than to branchiopods?",

Mol Biol Evol 17(6), pp. 863-874.

224. Wilson K., Li Y. T., Whan V., Lehnert S. A., Byrne K., Moore S. S. (2002),

"Genetic mapping of the black tiger shrimp Penaeus monodon with amplified

fragment length polymorphims", Aquaculture 204, pp. 297-309.

225. Witteveldt J., Cifuentes C. C., Vlak J. M., van Hulten M. C. (2004),

"Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus by oral

vaccination", J Virol 78(4), pp. 2057-2061.

226. Witteveldt J., Vlak J. M., van Hulten M. C. (2004), "Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine", Fish Shellfish Immunol 16(5), pp. 571-579.

227. Wongprasert K., Sangsuriya P., Phongdara A., Senapin S. (2007), "Cloning and characterization of a caspase gene from black tiger shrimp (Penaeus

monodon)-infected with white spot syndrome virus (WSSV)", J Biotechnol 131(1), pp. 9-19.

138

228. Wongteerasupaya C., Sriurairatana S., Vickers J. E., Anutara A., Boonsaeng V., Panyim S. (1995), "Yellowhead virus of Penaeus monodon is an RNA virus",

Dis Aquat Org 22, pp. 45-50.

229. Wongteerasupaya C., Tongcheua W., Boonsaeng V., Panyim S., Tassanakajon

A., Withyachumnarnkul B., Flegel T.W. (1997), "Detection of yellowhead virus (YHV) of Penaeus monodon by RT-PCR amplification", Dis Aquat Org 31, pp. 181-186.

230. Wongteerasupaya C., Wongwisansri S., Boonsaeng V., Panyim S., Pratanpipat

P., Nash G. L., Withyachumnarnkul B., Flegel T. W. (1996), "DNA fragment of

Penaeus monodon baculovirus PmNOBII gives positive in situ hybridization with

white-spot viral infections in six penaeid shrimp species", Aquaculture 143, pp. 23-32. 231. Wouters R., Lavens P., Nueto J., Sorgeloos P. (2001), "Penaeid shrimp broodstock nutrition: an updated review on research and development",

Aquaculture 202, pp. 1-21.

232. Wu J. L., Muroga K. (2004), "Apoptosis does not play an important role in the

resistance of 'immune' Penaeus japonicus against white spot syndrome virus", J

Fish Dis 27(1), pp. 15-21.

233. Wurzer W. J., Planz O., Ehrhardt C., Giner M., Silberzahn T., Pleschka S.,

Ludwig S. (2003), "Caspase 3 activation is essential for efficient influenza virus

propagation", J EMBO 22, pp. 2717-2728.

234. Wuthisuthimethavee S., Lumubol P., Toojinda T., Tragoonrung S., Vanavichit

A. (2005), "SSLP-based linkage map construction in black tiger shrimp (Penaeus

monodon Fabricius)", ScienceAsia 31, pp. 91-97.

235. Xian J. A., Wang A. L., Ye C. X., Chen X. D., Wang W. N. (2010),

"Phagocytic activity, respiratory burst, cytoplasmic free-Ca(2+) concentration and

apoptotic cell ratio of haemocytes from the black tiger shrimp, Penaeus monodon

under acute copper stress", Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 152(2),

pp. 182-188.

236. Xu Z. R., Du H. H., Xu Y. X., Sun J. Y., Shen J. (2006), "Crayfish Procambarus clarkii protected against white spot syndrome virus by oral administration of viral proteins expressed in silkworms", Aquaculture 253, pp. 179-183. 237. Ye X., Gao F. Y., Zheng Q. M., Bai J. J., Wang H., Lao H. H., Jian Q. (2009), "Cloning and characterization of the tiger shrimp lysozyme", Mol Biol Rep 36(6),

pp. 1239-1246.

139

238. Yeaman M. R., Yount N. Y. (2003), "Mechanisms of antimicrobial peptide

action and resistance", Pharmacol Rev 55(1), pp. 27-55.

239. Yeh M. S., Huang C. J., Cheng J. H., Tsai I. H. (2007), "Tissue-specific

expression and regulation of the haemolymph clottable protein of tiger shrimp

(Penaeus monodon)", Fish Shellfish Immunol 23(2), pp. 272-279.

240. Yeh M. S., Kao L. R., Huang C. J., Tsai I. H. (2006), "Biochemical

characterization and cloning of transglutaminases responsible for hemolymph

clotting in Penaeus monodon and Marsupenaeus japonicus", Biochim Biophys

Acta 1764(7), pp. 1167-1178.

241. Yi G., Wang Z., Qi Y., Yao L., Qian J., Hu L. (2004), "Vp28 of shrimp white spot syndrome virus is involved in the attachment and penetration into shrimp cells", J Biochem Mol Biol 37(6), pp. 726-734.

242. Yoganandhan K., Syed Musthaq S., Narayanan R. B., Sahul Hameed A. S.

(2004), "Production of polyclonal antiserum against recombinant VP28 protein

and its application for the detection of white spot syndrome virus in crustaceans",

J Fish Dis 27(9), pp. 517-522.

243. You E. M., Liu K. F., Huang S. W., Chen M., Groumellec M. L., Fann S. J.,

Yu H. T. (2010), "Construction of integrated genetic linkage maps of the tiger

shrimp (Penaeus monodon) using microsatellite and AFLP markers", Anim Genet

41, pp. 365-376.

244. Zhang J., Li F., Wang Z., Zhang X., Zhou Q., Xiang J. (2006), "Cloning,

expression and identification of ferritin from Chinese shrimp, Fenneropenaeus

chinensis", J Biotechnol 125(2), pp. 173-184.

245. Zhang X., Huang C., Qin Q. (2004), "Antiviral properties of hemocyanin

isolated from shrimp Penaeus monodon", Antiviral Res 61(2), pp. 93-99.

246. Zhang Y., Wang S., Xu A., Chen J., Lin B., Peng X. (2006), "Affinity

proteomic approach for identification of an IgA-like protein in Litopenaeus vannamei and study on its agglutination characterization", J Proteome Res 5(4), pp. 815-821.

247. Zhang Z. F., Shao M., Ho Kang K. (2006), "Classification of haematopoietic cells and haemocytes in Chinese prawn Fenneropenaeus chinensis", Fish Shellfish Immunol 21(2), pp. 159-169.

140

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: Dụng cụ nghiền mẫu (Homogenizer)

PHỤ LỤC 2: Vector pJET1.2 (Fermentas)

141

PHỤC LỤC 3: Vector pCR2.1 (Invitrogen)

PHỤ LỤC 4: Vector pPICZA (Invitrogen)

142

PHỤ LỤC 5: Vị trí đa tách dòng của pPICZA

143

PHỤC LỤC 6: Một phần trình tự nucleotide của ALFPm3 đƣợc dung hợp

trong cấu trúc AOX1 của vector biểu hiện pPCICZA

PHỤ LỤC 7: Một phần trình tự nucleotide của ALFPm3 đƣợc dung hợp trong

cấu trúc AOX1 của vector biểu hiện pPCICZA