Luận án Tiến sỹ Hóa học: Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển Acanthaster planci

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

ĐINH THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CHUYỂN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ

TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA STEROID TỪ LOÀI SAO BIỂN

ACANTHASTER PLANCI

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội-2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

ĐINH THỊ HÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CHUYỂN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ

TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA STEROID TỪ LOÀI SAO BIỂN

ACANTHASTER PLANCI

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên

Mã số: 9 44 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Trần Thị Thu Thủy

2. PGS. TS. Ngô Đại Quang

Hà Nội-2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn của PGS. TS. Trần Thị Thu Thủy và PGS. TS. Ngô Đại Quang. Các số

liệu và kết quả được nêu trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được công

bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Đinh Thị Hà

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện hóa học các Hợp chất thiên nhiên,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới hai người thầy hướng dẫn

là PGS. TS. Trần Thị Thu Thủy – Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên (INPC),

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, và PGS. TS. Ngô Đại Quang –

Tập đoàn hóa chất Việt Nam, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, định hướng

nghiên cứu một cách khoa học cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Lãnh đạo Học Viện Khoa học và Công nghệ,

Ban Lãnh đạo Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam đã luôn tạo điều kiện cho tôi được học tập và sử dụng các thiết

bị tiên tiến của Viện để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra của luận án. Tôi cũng xin

trân trọng cảm ơn Hội đồng Khoa học Viện hóa học các Hợp chất thiên nhiên, GS. TS.

Phạm Quốc Long, GS. TS. Lê Mai Hương, PGS. TS. Nguyễn Mạnh Cường về những

lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc hoàn thiện luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn Viện sĩ Valentin A. Stonik, TSKH Alla A. Kicha –

Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), Viện Hàn lâm Khoa học liên

bang Nga đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập, học hỏi và tiếp cận các phương

pháp nghiên cứu cũng như các trang thiết bị tiên tiến của Viện trong quá trình làm

thực nghiệm và hoàn thiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Lee Jae Wook - Viện Khoa học và Công nghệ

Hàn Quốc (KIST) tại Gangneung, Hàn Quốc và TS. Đỗ Hữu Nghị (INPC) đã tận

tình giúp đỡ tôi trong quá trình thử nghiệm các nghiên cứu về hoạt tính sinh học.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Đoàn Lan Phương và tập thể cán bộ

Phòng Hóa sinh hữu cơ (INPC), bạn bè đồng nghiệp và gia đình đã nhiệt tình giúp đỡ,

động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này.

Tác giả luận án

Đinh Thị Hà

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................v

DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................... vii

DANH MỤC BẢNG....................................................................................................viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................................x

MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3

1.1. Giới thiệu chung về sao biển (Asteroidea) ............................................................... 3

1.2. Các nghiên cứu về lớp chất steroid phân cực từ các loài sao biển ........................... 4

1.2.1. Polyhydroxysteroid ........................................................................................ 4

1.2.2. Steroid sulfate ................................................................................................ 6

1.2.3. Steroid glycoside ........................................................................................... 7

1.2.3.1. Polyhydroxysteroid glycoside .................................................................. 8

1.2.3.2. Asterosaponin ......................................................................................... 12

1.2.3.3. Cyclic steroid glycoside ......................................................................... 13

1.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực từ sao biển ......................... 14

1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư ..................................................... 15

1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus .................................... 16

1.3.3. Hoạt tính điều hòa miễn dịch ....................................................................... 16

1.4. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 17

1.4.1. Đặc điểm sinh học và phân bố của loài sao biển Acanthaster planci.......... 17

1.4.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học loài sao biển Acanthaster planci trên thế giới ............................................................................................................. 18

1.4.2.1. Steroid tự do (sterol và polyhydroxysteroid) ......................................... 19

1.4.2.2. Polyhydroxysteroid glycoside ................................................................ 20

1.4.2.3. Asterosaponin ......................................................................................... 20

1.4.2.4. Glycosphingolipid .................................................................................. 21

1.4.2.5. Các hợp chất khác .................................................................................. 24

1.4.3. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài sao biển Acanthaster planci 25

1.4.3.1. Hoạt tính tán huyết ................................................................................. 25

1.4.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ........................................................................ 25

1.4.4. Tình hình nghiên cứu loài sao biển Acanthaster planci tại Việt Nam ........ 26

1.5. Tình hình cứu tổng hợp các hợp chất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên trên thế giới ......................................................................................... 27

1.5.1. Tổng hợp các hợp chất polyhydroxysteroid từ steroid tự nhiên .................. 28

1.5.2. Tổng hợp các hợp chất hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên.................. 31

1.6. Tình hình nghiên cứu tổng hợp các hợp chất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên tại Việt Nam ................................................... 35

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................37

2.1.Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................. 37

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 37

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất ............................................................. 37

2.2.2.Phương pháp xác định cấu trúc ..................................................................... 38

2.2.3. Các phương pháp đánh giá hoạt tính ........................................................... 39

2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào .................................... 39

2.2.3.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế hình thành khối u trên thạch mềm 41

2.2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú bằng xét nghiệm chữa lành vết thương (wound-healing assay) ...................... 41

CHƯƠNG III - THỰC NGHIỆM ..............................................................................42

3.1. Phân lập các hợp chất từ loài sao biển Acanthaster planci .................................... 42

3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được ............................. 47

3.2.1. Hợp chất Planciside A (AP1)(Hợp chất mới). ............................................. 47

3.2.2. Hợp chất Planciside B (AP2) (Hợp chất mới) .............................................. 48

3.2.3. Hợp chất Planciside C (AP3) (Hợp chất mới) .............................................. 48

3.2.4. Hợp chất Planciside D (AP4) ....................................................................... 49

3.2.5. Hợp chất AP11: Acanthaglycoside G (Hợp chất mới) ................................. 49

3.2.6. Hợp chất AP12: Pentareguloside G .............................................................. 50

3.2.7. Hợp chất AP13: Acanthaglycoside A .......................................................... 50

3.2.8. Hợp chất AP14: Maculatoside ..................................................................... 50

3.2.9. Hợp chất AP5: 3-O-sulfothornasterol A ...................................................... 51

3.2.10. Hợp chất AP6: 5-ergost-7-en-3-ol ......................................................... 51

3.2.11. Hợp chất AP7: Cholesterol ......................................................................... 51

3.2.12. Hợp chất AP8: Astaxanthin ........................................................................ 51

3.2.13. Hợp chất AP9: Thymine ............................................................................. 51

3.2.14. Hợp chất AP10: Uracil ............................................................................... 51

3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của cholesterol .................................................................. 51

iii

3.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất polyhydroxysteroid từ cholesterol .......................... 51

3.3.1.1. Tổng hợp chất cholest-3β,6α-diol (15c) và cholest-3β,6β-diol (16c) .... 51

3.3.1.2. Tổng hợp chất cholestan-5-ene-3β,4β-diol (17c), cholestan-5-ene-3β,7β- diol (18c) và cholestan-5-ene-3β,4β,7β-triol (19c) .............................................. 52

3.3.1.3. Tổng hợp chất cholestane-3β,5α,6α-triol (20c) ..................................... 54

3.3.1.4. Tổng hợp chất cholestane-3β,5α,6β-triol (21c) ...................................... 54

3.3.2. Tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid từ cholesterol ......................... 55

3.3.2.1. Tổng hợp chất cholest-4-ene-3,6-dione (22c) và cholestane-3,6-dione (24c) ......... 55

3.3.2.2. Tổng hợp chất cholest-4-ene-3β,6α-diol (26c) ...................................... 56

3.3.2.3. Tổng hợp chất 6α-hydroxy-4α,5α-epoxycholeatane-3-one (27c) và 4α,5α-epoxycholeatane-3,6-dione (28c) .............................................................. 56

3.3.2.4. Tổng hợp các hydroximinosteroid (23c, 25c,29c,31c) và chất 30c ....... 57

3.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và các dẫn xuất tổng hợp được ...... 59

3.4.1. Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực phân lập từ sao biển Acanthaster planci .................................................................................................. 59

3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất tổng hợp được từ cholesterol .... 60

CHƯƠNG IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................61

4.1. Nghiên cứu thành phần hóa học loài sao biển Acanthaster planci ........................ 61

4.1.1. Hợp chất AP1: Planciside A (Hợp chất mới) ............................................... 61

4.1.2. Hợp chất AP2: Planciside B (Hợp chất mới) ............................................... 67

4.1.3. Hợp chất AP3: Planciside C (Hợp chất mới) ............................................... 72

4.1.4. Hợp chất AP4: Planciside D ......................................................................... 76

4.1.5. Hợp chất AP11: Acanthaglycoside G (Hợp chất mới) ................................. 81

4.1.6. Hợp chất AP12: Pentareguloside G .............................................................. 88

4.1.7. Hợp chất AP13: Acanthaglycoside A .......................................................... 93

4.1.8. Hợp chất AP14: Maculatoside ..................................................................... 97

4.1.9. Hợp chất AP5: 3-O-sulfothornasterol A .................................................... 100

4.1.10. Hợp chất AP6: 5-ergost-7-ene-3-ol ..................................................... 102

4.1.11. Hợp chất AP7: Cholesterol ....................................................................... 104

4.1.12. Hợp chất AP8: Astaxanthin ...................................................................... 106

4.1.13. Hợp chất AP9: Thymine ........................................................................... 109

4.1.14. Hợp chất AP10: Uracil ............................................................................. 109

4.2. Chuyển hóa hóa học của cholesterol .................................................................... 112

4.2.1. Chuyển hóa các dẫn xuất polyhydroxysteroid ........................................... 113

4.2.1.1 Hợp chất cholestane-3β,6α-diol (15c) và cholestane-3β,6β-diol (16c) . 113

4.2.1.2. Hợp chất cholestan-5-ene-3β,4β-diol (17c), cholestan-5-ene-3β,7β-diol (18c) và cholestan-5-ene-3β,4β,7β-triol (19c) ................................................... 115

4.2.1.3. Hợp chất cholestane-3β,5α,6α-triol (20c) ............................................. 117

4.2.1.4. Hợp chất cholestane-3β,5α,6β-triol (21c) ............................................. 119

4.2.2. Chuyển hóa các dẫn xuất hydroxyminosteroid .......................................... 120

4.1.2.1. Hợp chất cholest-4-ene-3,6-dione (22c) và cholestane-3,6-dione (24c)…………………………………………………………………………...121

4.1.2.2. Hợp chất cholest-4-ene-3β,6α-diol (26c) .............................................. 123

4.1.2.3. Hợp chất 6α-hydroxy-4α,5α-epoxycholestane-3-one (27c) và 4α,5α- epoxycholestane-3,6-dione (28c) ....................................................................... 124

4.1.2.4. Các hợp chất hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) và hợp chất 30c……………………………………………………………………………..125

4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học ................................................................. 129

4.3.1. Hoạt tính của các hợp chất steroid glycoside phân lập từ sao biển Acanthaster planci. ............................................................................................... 129

4.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất cholesterol .............................. 134

CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 137

5.1. Kết luận ................................................................................................................ 137

5.2. Kiến nghị .............................................................................................................. 139

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN………………………......................145 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN .................. 141

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 143

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc đại diện của glycosphingolipid ..................................................... 211

Hình 3.1: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ sao biển Acanthaster planci...................... 422

Hình 4.1: Phổ (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP1 ............................................... 611

Hình 4.2: Phổ (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP1 ................................................ 611 Hình 4.3: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP1 ................................................................. 622 Hình 4.4: Phổ 13C-NMR của hợp chất AP1 ................................................................ 633

Hình 4.5: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP1 .............................................................. 65 Hình 4.6: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP1 ............................ 65 Hình 4.7: Phổ (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP2 ................................................. 68 Hình 4.8: Phổ (–) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP2 ................................................. 68 Hình 4.9: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP2 ................................................................... 68

Hình 4.10: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 ............................................................ 70

Hình 4.11: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP2 .......................... 70 Hình 4.12: Phổ (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP3 ............................................. 733

Hình 4.13: Phổ (–) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP3 ............................................. 733

Hình 4.14: Cấu trúc hóa học của chất AP3 ................................................................... 74 Hình 4.15: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP3 .......................... 74 Hình 4.16: Phổ 1H NMR của hợp chất AP4 ................................................................. 77 Hình 4.17: Phổ 13C NMR của hợp chất AP4 ................................................................ 77

Hình 4.18: Cấu trúc của hợp chất AP4 ......................................................................... 79 Hình 4.19: Tương tác COSY, HMBC của hợp chất AP4 ............................................. 79 Hình 4.20: Tương tác ROESY của hợp chất AP4 ........................................................ 79 Hình 4.21: Phổ (+) HR-ESI-MS/MS của hợp chất AP11 ........................................... 822

Hình 4.22: Phổ (-) HR-ESI-MS/MS của hợp chất AP11 ............................................ 822 Hình 4.23: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP11 ............................................................. 822

Hình 4.24: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP11 ......................................................... 844

Hình 4.25: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP11 .......................................................... 85 Hình 4.26: Các tương tác chính trong phổ HMBC và ROESY của hợp chất AP11 .... 85 Hình 4.27: Phổ khối lượng (+) HR ESI-MS của hợp chất AP12 ................................. 88

Hình 4.28: Phổ khối lượng (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP12 ........................... 88

Hình 4.29: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP12 .......................................................... 90 Hình 4.30: Phổ (-) HR ESI-MS/MS của chất AP13 ................................................... 933

Hình 4.31: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP13 .......................................................... 94

Hình 4.32: Phổ (-)-HR ESI-MS/MS của chất AP14 ..................................................... 97

Hình 4.33: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP14 .......................................................... 98 Hình 4.34: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP5 ........................................................ 1011

Hình 4.35: Cấu trúc hóa học của chất AP6 .................................................................. 103 Hình 4.36: Tương tác HMBC của chất AP6 ................................................................ 103 Hình 4.37: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP7 ........................................................... 105 Hình 4.38: Phổ 1H NMR của hợp chất AP8 ............................................................. 1066

Hình 4.39: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP8 ........................................................... 108 Hình 4.40: Cấu trúc hóa học của chất AP9 .................................................................. 109 Hình 4.41: Cấu trúc hóa học của chất AP10 ................................................................ 109 Hình 4.42: Phổ 13C NMR của hợp chất 15c .............................................................. 1144 Hình 4.43: Phổ 13C NMR của hợp chất 16c .............................................................. 1144

Hình 4.44: Tương tác HMBC của hợp chất 18c ....................................................... 1166

Hình 4.45: Phổ tương tác HMBC của chất 19c ...................................................... 11717 Hình 4.46: Phổ 1H NMR giãn rộng của hợp chất 20c ............................................... 1188 Hình 4.47: Phổ 13C NMR giãn rộng của hợp chất 20c .............................................. 1188 Hình 4.48: Phổ 1H NMR giãn rộng của hợp chất 21c ............................................. 11919 Hình 4.49: Phổ 13C NMR giãn rộng của hợp chất 21c ............................................ 11919

Hình 4.50: Phổ (+) ESI-MS của hợp chất 24c .......................................................... 1222 Hình 4.51: Phổ 13C NMR của hợp chất 26c .............................................................. 1233 Hình 4.52: Phổ 13C NMR của hợp chất 27c .............................................................. 1244 Hình 4.53: Phổ 13C NMR của hợp chất 28c .............................................................. 1255

Hình 4.54: Ảnh hưởng của hợp chất AP1 đến sự tăng sinh của các dòng tế bào HCT- 116, T-47D và RPMI-7951 .......................................................................................... 130 Hình 4.55: Ảnh hưởng của các asterosaponin AP11-AP14 đến sự di chuyển của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 ở người ...................................................... 133

vii

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1. Tổng hợp chất 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol (201) từ stigmasterol ....... 29 Sơ đồ 1.2. Tổng hợp chất 24-methylenecholest-4-en-3β,6α-diol (202) từstigmasterol ......... 29

Sơ đồ 1.3. Tổng hợp chất 24-methylene-cholesta-3β,5α,6β,19-tetraol (203) từ stigmasterol ................................................................................................................... 29 Sơ đồ 1.4. Tổng hợp (25R)-26-hydroxycholesterol (204) từ diosgenin ..................... 300 Sơ đồ 1.5. Các giai đoạn tổng hợp certonardosterol D2 (14) từ diosgenin ................. 300

Sơ đồ 1.6. Tổng hợp cholestan-3β,5α,6β-triol (205) từ cholesterol ........................... 311

Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất polyhydroxysteroid từ cholesterol ............... 113 Sơ đồ 4.2. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid từ cholesterol ............... 121

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số đơn vị đường thường gặp trong các loài sao biển .............................. 8 Bảng 1.2: Kết quả thử nghiệm in vitro các chất phân lập từ sao biển C.semiregularis........ .15 Bảng 1.3: Hoạt tính gây độc tế bào T-47D và RPMI-7951 của các hợp chất 95-100 155

Bảng 1.4: Hoạt tính gây độc tế bào làm ức chế sự tinh của trứng cầu gai của các hợp chất asterosaponin từ sao biển Acanthaster planci ....................................................... 26 Bảng 1.5: Kết quả đánh giá hoạt tính chống ung thư của 4 cặn chiết sao biển A. planci.............................................................................................................................26 6 Bảng 1.6: Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 206, 207, 209-220 ................... 333 Bảng 1.7: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất 207, 208 và 221-234 .. 344 Bảng 1.8: Hoạt tính sinh học của 17 hợp chất hydroximinosteroid (206-208, 235- 248)................................................................................................................................35 5 Bảng 4.1: Dữ liệu phổ NMR phần aglycon của hợp chất AP1 ................................... 666 Bảng 4.2: Dữ liệu phổ NMR chuỗi đường của hợp chất AP1 ...................................... 67 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP2 ......................................................... 711 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP3 ......................................................... 745 Bảng 4.5: Bảng so sánh dữ liệu chuỗi đường của AP3 với TLTK ............................. 766 Bảng 4.6: Dữ liệu NMR phần aglycon của hợp chất AP4 và TLTK .......................... 800 Bảng 4.7: Dữ liệu NMR chuỗi đường của hợp chất AP4 và TLTK ........................... 811 Bảng 4.8: Dữ liệu phổ phần aglycon của hợp chất AP11 ............................................. 86 Bảng 4.9: Dữ liệu phổ NMR của chuỗi đường của hợp chất AP11 ............................. 87 Bảng 4.10: Dữ liệu phổ phần aglycon của AP12 và pentareguloside G ..................... 911 Bảng 4.11: Kết quả phổ NMR chuỗi đường của AP12 và pentareguloside G ........... 922 Bảng 4.12: Dữ liệu phổ NMR phần aglycon của AP13 và chất tham khảo ............... 955 Bảng 4.13: Dữ liệu phổ NMR chuỗi đường của AP13 và chất tham khảo................... 96 Bảng 4.14: Dữ liệu phổ NMR phần aglycon của AP14 và chất tham khảo ................. 99 Bảng 4.15: Dữ liệu phổ NMR chuỗi đường của AP14 và chất tham khảo................... 99 Bảng 4.16: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP5 và chất tham khảo ....................... 1022 Bảng 4.17: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP6 ..................................................... 1044 Bảng 4.18: Dữ liệu phổ của AP7 và chất tham khảo ................................................ 1055 Bảng 4.19: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP8 và chất tham khảo ..................... 10808

Bảng 4.20: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP9 và AP10 ................. 1100

Bảng 4.21: Bảng tổng hợp các chất phân lập được từ sao biển Acanthaster planci . 1100

Bảng 4.22: Bảng tổng hợp các dẫn xuất tổng hợp được từ cholesterol.......................128 Bảng 4.23: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của hợp chất AP1 .............................. 1300 Bảng 4.24: Hoạt tính gây độc tế bào và ảnh hưởng tới sự hình thành khối u trên thạch mềm của các hợp chất asterosaponin AP11-AP14 ................................................... 1311 Bảng 4.25: Hoạt tính gây độc tế bào Hep G2 và T98G của các hợp chất 15c-21c... 1344 Bảng 4.26: Hoạt tính gây độc tế bào Hep G2, HeLa, T98G của các chất 22c-31c ... 1355

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng Việt Ký hiệu

Tiếng Anh Các phương pháp sắc ký

Column Chromatography Sắc ký cột thường CC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

High Performance Liquid Chromatography Thin Layer Chromatography Silica gel Sắc ký bản mỏng TLC SiO2

1H-NMR

Các phương pháp phổ

13C-NMR

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Correlated Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carnon 13 Phổ tương tác proton COSY

Phổ DEPT DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Electron Spray Ionization Mass Spectrometry ESI-MS

Gas Chromatography-Mass Spectrometry Heteronuclear Multiple Bond Correlation GC-MS HMBC

H2BC Heteronuclear Two Bond Correlation

HR-ESI-MS High Resolution – Electron Spray Ionization

– Mass Spectrometry Heteronuclear Single Quantum Coherence HSQC Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Sắc ký khí ghép nối khối phổ Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân qua hai liên kết Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại IR

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Total Correlation Spectroscopy Phổ NOESY Phổ TOCSY NOESY TOCSY

frame Overhauser effect Phổ ROESY ROESY Rotating Spectroscopy

J (Hz) Hằng số tương tác tính bằng Hz

δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu

Các dòng tế bào

HeLa Human cervical adenocarcinoma cell line Dòng tế bào ung thư cổ tử cung ở người

Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma cell line Dòng tế bào ung thư gan ở

HT-29 Human colorectal carcinoma cell line

HCT-116 Human colon cancer cell line người Dòng tế bào ung thư đại trực tràng ở người Dòng tế bào ung thư ruột kết ở người

Human breast adenocarcinoma cell line

MDA-MB- 231 RPMI-7951 Human malignant melanoma cell line Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú người Dòng tế bào u sắc tố ác tính ở người

T-47D Human breast cancer cell line Dòng tế bào ung thư vú ở người

Dòng tế bào ung thư não T98G Glioblastoma cell line

Các hóa chất

BH3 Trihydridoborane CeCl3.7H2O Cerium (III) chloride heptahydrate

Chloroform Dichloromethane Cloroform Diclometan

CHCl3 CH2Cl2 (DCM) DMAP 4-Dimethylaminopyridine 4-dimethylaminopyridin

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM

DMSO EtOH EtOAc Dimethyl sulfoxide Ethanol Ethyl acetate Cồn Etyl acetat

Formic acid Acid formic

HCOOH H2O2 m-CPBA Hydrogen peroxide meta-Chloroperoxybenzoic acid

Methanol

Sodium borohydride MeOH NaBH4

Osmium tetroxide NH2OH.HCl hydroxylamine hydrochloride NMO 4-Methylmorpholine N-oxide OsO4

xii

Pyridinium chlorochromate PCC

Tetrahydrofuran Tetramethylsilane

Selenium dioxide THF TMS SeO2

Các ký hiệu viết tắt khác

ED50 IC50 Effective dose 50% Inhibitory concentration 50% cell viability of cancer cells Liều hiệu dụng 50% Nồng độ ức chế 50% khả năng sống của tế bào ung thư

IF50

MIC M.p. Nồng độ gây giảm 50% sự hình thành khối u Nồng độ ức chế tối thiểu Điểm chảy

MTT

MTS

Inhibitory concentration 50% reduction in colonies formation of cancer cells Minimum inhibitory concentration Melting point 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazoli bromide 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-car- boxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophen-yl)- 2H-tetrazolium Độ quay cực riêng

[(cid:2)]D CTPT cs Công thức phân tử Cộng sự

MỞ ĐẦU

Bề mặt trái đất có đến 70% diện tích là biển và các Đại dương, nơi chứa đựng

nguồn tài nguyên sinh vật biển vô cùng đa dạng và phong phú với hàng trăm ngàn loài

thực vật, động vật và vi sinh vật khác nhau. Với sự đa dạng này, nguồn lợi mang lại từ

biển là vô cùng dồi dào và quý báu, cung cấp nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp

chủ lực, như chế biến hải sản, hóa mỹ phẩm, dược phẩm và rất nhiều nhóm ngành

khác...Tuy nhiên, trước đây, giá trị mang lại từ nguồn lợi biển chủ yếu cho các ngành

chế biến thực phẩm, trong khi đó, các giá trị cung cấp về nguồn dược liệu ứng dụng

cho y học và dược học vẫn còn rất hạn chế.

Ngày nay, các giá trị về dược, y học của tài nguyên biển đang ngày càng được

quan tâm nghiên cứu, và ưu tiên phát triển. Đã có nhiều hợp chất từ sinh vật biển được

phân lập, xác định cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học. Trong đó, đã có các hợp

chất thể hiện hoạt tính sinh học phong phú, có thể cung cấp hình mẫu cho các thế hệ

thuốc mới. Đồng thời, khi tìm ra các hoạt chất từ sinh vật biển còn có đóng góp vô

cùng quan trọng trong lĩnh vực tổng hợp và bán tổng hợp hữu cơ. Trên mô hình hoạt

chất phân lập được có thể nghiên cứu tổng hợp ra lượng lớn các hoạt chất đi từ nguyên

liệu đầu phổ biến hoặc chuyển hóa các dẫn xuất của chúng để có thể đánh giá chi tiết,

và tối ưu hơn đối với một thế hệ thuốc có các cấu trúc tương tự nhau (analogous) [1-4].

Việt Nam có dải bờ biển trên 3.260 km, diện tích trên 1 triệu km2, với khí hậu

nhiệt đới gió mùa là điều kiện lý tưởng cho hệ sinh thái biển đa dạng về chủng loại và

giàu về trữ lượng. Cho đến nay, đã xác định được danh mục gần 12.000 loài sinh vật

biển ở Việt Nam bao gồm cả động vật và thực vật [5]. Từ những năm 1970, đã có một

vài công trình nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển. Những năm gần

đây, với mục tiêu nghiên cứu và thăm dò nguồn dược liệu quý từ sinh vật biển, các

nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật biển đã

được tiến hành nghiên cứu. Tuy nhiên, so với nguồn tiềm năng sinh vật biển ở nước ta

thì đến nay những công trình nghiên cứu này vẫn chưa đánh giá một cách đầy đủ, và

toàn diện về nguồn tài nguyên này, đặc biệt là các sinh vật thuộc ngành Da gai.

Ngành Da gai (Echinodermata), là một ngành động vật biển bao gồm năm lớp:

Sao Biển (Asteroidea), Đuôi Rắn (Ophiuroidea), Cầu Gai (Echinoidea), Hải Sâm

(Holothuria) và Huệ Biển (Crinoidea), là một trong những nguồn cung cấp dồi dào các

steroid phân cực. Lớp chất này có cấu trúc rất đa dạng và có phổ sinh học rộng, chúng

thể hiện nhiều hoạt tính như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống ung thư,

chống virus... Steroid phân cực từ sao biển đã và đang thu hút sự quan tâm của nhiều

nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về lớp

chất này, tuy nhiên các nghiên cứu còn hạn chế ở việc phân lập và đánh giá hoạt tính

các hợp chất. Chưa có công trình nghiên cứu tổng thể nào đi vào nghiên cứu phân lập,

chuyển hóa hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của steroid phân lập từ sao biển.

Với mục đích tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển thuộc

ngành Da gai, và chuyển hóa thành các dẫn xuất polyhydroxysteroid và

hydroxyminosteroid từ steroid phổ biến trong sinh vật biển nhằm đóng góp cơ sở

nghiên cứu cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực phát triển dược phẩm, luận

án này tập trung nghiên cứu phân lập, chuyển hóa hóa học và đánh giá hoạt tính sinh

học của steroid từ một loài sao biển phổ biến ở vùng biển Việt Nam. Đối tượng được

tập trung nghiên cứu là loài sao biển Acanthaster planci, một loài sao biển đe dọa đến

sự tồn tại của các rạn san hô do chúng ăn các mầm san hô sống. Chính vì vậy luận án:

“Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ

loài sao biển Acanthaster planci” được thực hiện với những nội dung chính như sau:

 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài sao biển

Acanthaster planci, đặc biệt là các steroid

 Chuyển hóa các dẫn xuất theo định hướng hydroxyl hóa và oxime hóa từ 1

steroid có hàm lượng lớn trong sao biển Acanthaster planci.

 Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và tổng

hợp được.

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về sao biển (Asteroidea)

Sao biển là loài động vật không xương sống, thuộc ngành Da gai

(Echinodermata), lớp Asteroidea. Sao biển phân bố rộng trên khắp các Đại dương,

nhưng tập trung nhiều nhất ở khu vực Bắc Thái Bình Dương. Chúng sống ở đáy biển,

thích nghi với những khu vực đáy có cát, bùn cát, đá nhỏ và các khu vực có rạn san hô.

Cơ thể sao biển dẹp theo chiều lưng bụng và có đối xứng tỏa tròn bậc năm, gồm

một đĩa trung tâm ở giữa và có 5 hay nhiều cánh (có thể lên tới 45 cánh) xếp xung quanh.

Cánh sao biển ở mỗi loài có độ dài ngắn tương đối khác nhau. Lỗ miệng có màu sặc sỡ,

khi bò trên bề mặt giá thì miệng hướng về phía dưới, hậu môn ở về phía đối diện. Bên

trong quanh miệng là vòng ống nước, từ đó phát ra các ống nước nhánh hình nan quạt tỏa

ra đến tận đỉnh của mỗi cánh. Bao bên ngoài mỗi ống nước nhánh có hai dãy chân ống.

Sao biển không có đầu và việc di chuyển được thực hiện nhờ hoạt động nhịp nhàng của

hai hàng chân ống nằm phía dưới mỗi cánh. Tốc độ di chuyển của sao biển rất chậm từ 5

đến 10 cm trong 1 phút, chúng nhạy cảm với ánh sáng và độ mặn nước biển [6].

Theo Blacke (1987), lớp Asteroidea được chia thành 7 bộ (order) bao gồm:

Brisingida, Forcipulatida, Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida và Velatida.

Đến nay người ta đã thống kê có khoảng 1900 loài sao biển, được nhóm vào 370 chi phân

bố ở tất cả các Đại dương trên thế giới [7]. Những nơi có nhiều sao biển phải kể đến các

vùng biển Australia, Đông Thái Bình Dương và Bắc Mỹ, đặc biệt vùng biển nhiệt đới Ấn

Độ - Thái Bình Dương là nơi tập trung đại đa số các loài sao biển [6, 8]. Ở Việt Nam có

khoảng 78 loài sao biển khác nhau, phân bố dọc bờ biển từ Bắc đến Nam.

Loài sao biển Acanthaster planci thuộc chi Acanthaster, họ Acanthasteridae trong bộ

Valvatida. Theo Mah và Hansson (2013), bộ này có 17 họ (Acanthasteridae, Archasteridae,

Asterinidae, Asterodiscididae, Asteropseidae, Chaetasteridae, Ganeriidae, Goniasteridae,

Leilasteridae, Mithrodiidae, Odontasteridae, Ophidiasteridae, Oreasteridae, Podosphaerasteridae,

Poraniidae, Solasteridae, Sphaerasteridae), 165 chi với khoảng 695 loài. Theo Đăng ký thế giới về

các loài sinh vật biển (World Register of Marine Species), chi Acanthaster chỉ có 2 loài là

Acanthaster planci (Linnaeus, 1758) và Acanthaster brevispinus (Fisher, 1917).

Cho đến nay, theo thống kê của tác giả Guang Dong và cs [9] trong giai đoạn từ

năm 1977-2007 đã có khoảng 98 loài sao biển được nghiên cứu về thành phần hóa học.

Các hợp chất phân lập được từ các loài sao biển chủ yếu là các hợp chất thuộc lớp chất

steroid và các hợp chất ceramide. Ngoài ra, sao biển còn chứa một số lớp chất khác như:

carotenoid, nucleoside, alkaloid, acid béo, peptide... Trong đó, các hợp chất steroid là các

hợp chất chuyển hóa thứ cấp chính của sao biển. Hiện nay, đã có hơn 800 hợp chất steroid

phân cực được phân lập từ các loài sao biển khác nhau, và sự đa dạng về cấu trúc của các

hợp chất này dường như là vô tận [10]. Trong số các loài sao biển được nghiên cứu, có

một số loài được quan tâm nghiên cứu khá chi tiết như các loài Asterina pectinifera,

Culcita novaeguineae, Certonardoa semiregularis và Linckia laevigata.

1.2. Các nghiên cứu về lớp chất steroid phân cực từ các loài sao biển

Lớp chất steroid từ sao biển, đặc biệt là các steroid phân cực, thu hút được nhiều

sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới bởi các hoạt tính thú vị của

chúng như: hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư, chống virus, kháng viêm, giảm

đau, tán huyết… Dựa vào cấu trúc hóa học của các steroid đã phân lập được từ tự nhiên

có thể chia chúng thành các nhóm chất chính như sau: polyhydroxysteroid, steroid

sulfate, steroid glycoside [11]. 1.2.1. Polyhydroxysteroid

Các polydydroxysteroid từ sao biển là các hợp chất có chứa từ 4 đến 9 nhóm

hydroxyl (-OH) trong phần nhân tetracyclic steroid của chúng và cả trong phần mạch

nhánh liên kết với nhân steroid ở vị trí C-17. Điều đặc biệt, các nhóm –OH này thường

chỉ được tìm thấy ở một số vị trí xác định. Chúng thường có mặt ở các vị trí như 3β,

6(α hoặc β), 8β, 15(α hoặc β) và 16β trong nhân steroid. Đôi khi các nhóm –OH cũng

được tìm thấy ở các vị trí 4β, 5α, 7(α hoặc β), và hiếm khi được tìm thấy ở vị trí 14α.

Phần mạch nhánh của các hợp chất này khá đa dạng, tuy nhiên trong phần lớn các hợp

chất polyhydroxysteroid có phần mạch nhánh như của cholestane với các nhóm –OH

thường được tìm thấy ở các vị trí C-24 và C-26 (C-28 hoặc C-29 trong loại mạch nhánh

giống của ergostane hoặc stigmastane) [11]. Các penta- và hexaol thường chiếm ưu thế

hơn trong các polyhydroxysteroid.

Điển hình cho nhóm chất này, từ loài sao biển Certonardoa semiregularis thu

thập được gần đảo Komun, Hàn Quốc, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phân lập được

36 hợp chất polyhydroxysteroid (1-36) với sự đa dạng về cấu trúc mạch nhánh và vị trí

các nhóm hydroxyl [12-17].

Từ loài sao biển Asterina pectinifera, năm 2010, nhóm các nhà khoa học Trung

Quốc đã phân lập được 4 hợp chất polyhydroxysteroid (37-40), trong đó có hợp chất

polyhydroxysteroid ester lần đầu được phân lập trong tự nhiên là (25S)-5α-cholestane-

3β,6α,7α,8,15α,16β-hexahydroxyl-26-O-14’Z-eicosenoate (37) [18].

Từ loài sao biển Archaster typicus thu thập được ở vùng biển Việt Nam, nhóm

nghiên cứu của Ivanchina và cs đã phân lập được 2 hợp chất polyhydroxysteroid mới

(41, 42) đều có nhóm -OH ở vị trí hiếm gặp là 14α [19].

Một loạt các dẫn xuất polyhydroxysteroid được phân lập từ các loài sao biển

khác nhau cho thấy một lượng lớn các hợp chất tự nhiên có cấu trúc đa dạng có mặt

trong lớp sao biển Asteroidea cũng như chỉ ra tầm quan trọng của các hợp chất này đối

với sự tồn tại của sao biển. 1.2.2. Steroid sulfate

Các hợp chất tự nhiên có nhóm sulfate được phân bố rộng rãi trong động vật biển,

đặc biệt trong các sinh vật ngành Da gai. Trong cả năm lớp của ngành Da gai, người ta đều

tìm được các hợp chất monosulfate, và chứng minh đây là những hợp chất thứ cấp rất phổ

biến trong sao biển. Các hợp chất steroid sulfate không chỉ được tìm thấy dưới dạng các

hợp chất steroid tự do mà còn được tìm thấy ở dạng sulfate hóa của các hợp chất steroid

glycoside. Nhóm sulfate có thể được tìm thấy ở các vị trí C-3 và C-15 trong hệ đa vòng

của nhân steroid; ở phần mạch nhánh hoặc trong các đơn vị monosaccharide.

Từ loài sao biển Asterina pectinifera, Yan Peng và cs đã phân lập được chất 43

và một polyhydroxysteroid glycoside (44) có mặt nhóm sulfate trong đơn vị đường

[18]. Từ loài sao biển Lethasterias fusca, Ivanchina và cs đã phân lập được một steroid

glycoside sulfate, fuscaside A (45), có nhóm sulfate ở vị trí 15α và hai đơn vị

monosaccharide liên kết ở hai phần khác nhau của nhân steroid; và hợp chất natri

24,25-dihydromarthasterone-3-sulfate (46) [20].

Từ loài sao biển Mithrodia clavigera, Levina và cs phân lập được ba hợp chất

steroid sulfate (47-49). Hợp chất 47, 48 có nhóm sulfate ở vị trí C-3 và nhóm α-OH ở

vị trí C-6. Trước đây, các hợp chất này được cho rằng là sản phẩm thu được sau khi

thủy phân các asterosaponin chứ không tồn tại ở dạng tự do. Tuy nhiên sau đó chúng

đã được chứng minh tồn tại ở dạng tự do trong thành phần hóa học của sao biển. Hợp

chất 49 có nhóm sulfate ở vị trí 15α [21].

Gần đây, năm 2015, từ loài sao biển Leptasterias ochotensis, Timofey và cs đã

phân lập được 4 hợp chất steroid sulfate phân cực mới [22]. Trong đó bao gồm 3

monoglycoside steroid sulfate (50-52) và 1 polyhydroxysteroid sulfate (53).

Từ các kết quả nghiên cứu này cho thấy, sulfate hóa là một định hướng đặc

trưng của biến đổi sinh hóa trong sao biển. Các hợp chất steroid có thể bị sulfate hóa ở

một số vị trí khác nhau trong hệ thống đa vòng và/hoặc trên mạnh nhánh hay thậm chí

trong chuỗi saccharide. 1.2.3. Steroid glycoside

Các hợp chất steroid glycoside là sản phẩm chuyển hóa nổi bật của sao biển,

chúng chịu trách nhiệm trong chức năng gây độc tính của chúng [7]. Dựa trên cấu trúc

hóa học của chúng, có thể chia ra thành ba nhóm chất: polyhydroxysteroid glycoside,

asterosaponin, cyclic steroid glycoside [23]. Thông thường, các đơn vị đường của

chuỗi carbohydrate có dạng pentose (arabinose, xylose, hoặc các dẫn xuất methyl của

chúng); hoặc hexose (glucose, galactose); và có thể có các nhóm sulfate [10]. Cấu trúc

của các đơn vị đường thường gặp trong các loài sao biển được thống kê ở bảng 1.1.

β-D-Quinovose (Qui)

β-D-Glucose (Glc)

β-D-Galactose (Gal)

β-D-Xylopyranose (Xyl)

β-D-Fucose (Fuc)

α-L-Arabinopyranose (Ara)

6-Deoxy-xylo-hex-4-ulose (DXHU)

D-Glucuronic acid (Glucur)

β-D-Galactofuranose (Galf)

β-D-Xylofuranose (Xylf)

α-L-Arabinofuranose (Araf)

β-D-Fucofuranose (Fucf)

Bảng 1.1. Một số đơn vị đường thường gặp trong các loài sao biển

1.2.3.1. Polyhydroxysteroid glycoside

Các polyhydroxysteroid glycoside là các chất chuyển hóa thứ cấp đặc trưng

trong thành phần chính của sao biển. Cấu trúc của các glycoside này gồm hai phần:

phần aglycon là các polyhydroxysteroid; và phần chuỗi carbohydrate thường là 1, 2

hoặc 3 đơn vị đường (hiếm gặp 3 đơn vị đường) gắn vào hệ đa vòng hoặc phần mạch

nhánh của nhân steroid, hay thậm chí cả vào hệ đa vòng và phần mạch nhánh. Các đơn

vị monosaccharide có thể ở dạng pentose, hexose hoặc dạng sulfate của chúng [10].

Những năm gần đây, có khá nhiều các hợp chất polyhydroxysteroid glycoside

mới được phân lập. Đa phần trong số đó là các mono-, diglycoside của

polyhydroxysteroid. Tuy nhiên các hợp chất hiếm gặp như steroid triglycoside cũng

được công bố phân lập được từ một số loài sao biển, nhưng với số lượng không nhiều.

Từ năm 2008 đến nay, ba loài sao biển thuộc chi Anthenea đã được nghiên cứu

về thành phần hóa học lớp chất steroid phân cực, và có 32 hợp chất polyhydroxysteroid

glycoside mới đã được phân lập. Các hợp chất này có phần glycoside chủ yếu là các

mono-, hoặc diglycoside; và các đơn vị glycoside này đều liên kết với khung steroid ở

vị trí C-16 hoặc cả ở vị trí C-7 và C-16.

Đầu tiên là nghiên cứu của Ning Ma và cs, năm 2009-2010, đã phân lập từ loài

Anthenea chinensis 11 hợp chất polyhydroxysteroid glycoside mới là anthenoside A-K

(54-64). Đơn vị monosaccharide của anthenoside A (54) ở vị trí C-2 bị thế bởi một

nhóm acetamid [24, 25]. Đặc biệt, trong tất cả các hợp chất 55-62 đều có mặt chuỗi

carbohydrate có dạng 6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl-(1→3)-(6-O-methyl-β-D-

galactofuranose) gắn ở vị trí C-16. Hợp chất với chuỗi hai đơn vị đường này chưa từng

được bắt gặp trước đó, lần đầu tiên các hợp chất này được phân lập từ loài Anthenea

chinensis [25]. Tất cả các hợp chất này đều có một liên kết đôi ở vị trí C8/C14.

Từ loài sao biển Anthenea aspera, Timofey và cs đã phân lập được 17 hợp chất

polyhydroxysteroid glycoside mới là anthenoside L-U (65-74) [26], anthenoside V-X

(75-77) và anthenoside A1, A2 (78, 79) [27, 28]. Chất 75 có cấu trúc nhân steroid hiếm

dạng 5α-cholest-8(14)-ene-3α,7β,16α-hydroxysteroid. Phân tử đường có dạng 2-

acetamido-2-deoxy-4-O-methyl-β-D-glucopyranosyl của chất 78 và 79 lần đầu tiên

được tìm thấy trong các steroid glycoside của sao biển [28].

Từ loài sao biển Anthenea sibogae được thu tập tại vùng biển Việt Nam,

Timofey đã phân lập được 6 hợp chất polyhydroxysteroid glycoside mới là anthenoside

S1-S6 (80-85). Tất cả các hợp chất này đều có nhân steroid dạng 5α-cholest-8(14)-ene-

3α,6β,7β,16α-tetrahydroxysteroid; và đều gắn với chuỗi carbohydrate ở vị trí C-7 và C-

16 (80-83, 85) hoặc chỉ ở vị trí C-16 (84). Đơn vị đường dạng 4-O-methyl-β-D- glucopyranose (81) và dạng mạch nhánh Δ24-cholestane (82) chưa từng được tìm thấy

trước đó trong các steroid glycoside của sao biển [29].

Các hợp chất polyhydroxysteroid glycoside mà trong cấu trúc phân tử có chứa 3

đơn vị đường thường rất hiếm gặp. Từ loài sao biển Hippasteria kurilensis, Kicha và cs

đã phân lập được các polyhydroxysteroid glycoside loại này là kurilensoside A, B, C

(86-88). Đồng thời một hợp chất diglycoside polyhydroxysteroid cũng được phân lập

và được đặt tên là kurilensoside D (89) [30]. Sau đó, 5 hợp chất monoglycoside mới

bao gồm kurilensoside E-H (90-93) và hợp chất 15-O-sulfate của echinasteroside C

(94) cũng được phân lập từ loài sao biển này [31].

Như vậy có thể thấy các hợp chất polyhydroxysteroid glycoside dường như có sự

đa dạng vô tận về cấu trúc. Rất nhiều các hợp chất mới đã được phân lập từ một số loài sao

biển kể trên từ những năm gần đây. Do đó, đây là lớp chất có nhiều tiềm năng trong việc

phân lập và xác định các cấu trúc mới cho cơ sở dữ liệu các hợp chất mới từ thiên nhiên.

1.2.3.2. Asterosaponin

Asterosaponin là các hợp chất steroid phân cực đặc trưng của sao biển. Đã có

khoảng 150 asterosaponin được phân lập từ các loài sao biển. Cấu trúc của chúng gồm

hai phần chính là phần aglycon và chuỗi oligosaccharide. Phần aglycon thường có dạng Δ9(11)-3β,6α-dihydroxysteroid với một nhóm sulfate ở vị trí C-3 và phần mạch nhánh

nói chung thường có dạng 20β-OH và 23-oxo. Hầu hết phần aglycon của asterosaponin

đều có dạng mạch nhánh của cholestane, tuy nhiên dạng mạch nhánh của ergostane

(24-methyl-cholestane), stigmastane (24-ethyl-cholestane), và aglycon với mạch nhánh

ngắn cũng đã được phân lập [9, 32-34]. Phần chuỗi oligosaccharide thông thường có 5

hoặc 6 đơn vị đường liên kết với nhau gắn với phần aglycon ở ở vị trí C-6.

Năm 2014, từ loài sao biển Leptasterias ochothensis thu thập ở vùng Viễn Đông

của Nga, Kicha và cs phân lập được 6 asterosaponin mới có cấu trúc mạch nhánh khác

nhau, leptasterioside A-F (95-100). Hai hợp chất leptasterioside A (95) và B (96) có

cùng cấu trúc chuỗi pentasaccharide. Bốn hợp chất leptasterioside C-F (97-100) cũng

có cấu trúc chuỗi pentasaccharide giống nhau [32].

Năm 2017, nhóm nghiên cứu này phân lập được 7 hợp chất asterosaponin mới

và 4 hợp chất asterosaponin đã biết từ loài sao biển Pentaceraster regulus thu thập ở

khu vực đảo Chàm của Việt Nam. Các asterosaponin mới này là pentareguloside A-G

(101-107). Chất 101 có cấu trúc phần aglycon dạng (20R,22R,23S,24S)-22,23-epoxy-

24-methyl-5α-cholest-9(11)-en-3β,6α,16β,20-tetraol, và chất 103 có cấu trúc của phần

aglycon dạng (20R,22S,23S)-16β,22-epoxy-24-methyl-27-nor-5α-cholest-9(11)-en-

3β,6α,20,23-tetraol. Đây là những cấu trúc của phần aglycon chưa từng được phân lập

trước đó trong các hợp chất steroid oligoglycoside từ sao biển. Khung steroid của chất

102 và 103 được chứng minh là dạng khung 5α-furostane, đây là lần đầu tiên hợp chất

asterosaponin có dạng khung này được phân lập [33].

Từ loài sao biển Astropecten monacanthus được thu thập ở vùng biển Cát Bà,

Hải Phòng, Việt Nam, nhóm nghiên cứu của GS. Châu Văn Minh và cs đã phân lập

được 4 asterosaponin mới là astrosterioside A-D (108-111) và hai asterosaponin đã biết

psilasteroside và marthasteroside B [34].

Từ các nghiên cứu nói trên có thể thấy, các hợp chất asterosaponin cũng rất đa

dạng về cấu trúc, không chỉ ở chuỗi oligosaccharide mà còn đa dạng cả về cấu trúc

mạch nhánh của phần aglycon. Như vậy, các hợp chất asterosaponin dường như vẫn

còn rất nhiều tiềm năng trong việc tìm ra các cấu trúc mới. 1.2.3.3. Cyclic steroid glycoside

Các cyclic steroid glycoside là các hợp chất có cấu trúc hoàn toàn khác biệt,

được phân lập lần đầu tiên bởi các nhà khoa học Ý từ hai loài sao biển thuộc chi

Echinaster [35-37]. Các hợp chất này có cấu trúc độc đáo với một chuỗi cyclic trisaccharide liên kết hai đầu ở vị trí C-3 và C-6 của phần aglycon có dạng Δ7-3β,6β-

dihydroxysteroid; và sự xuất hiện của đơn vị glucuronic axit trong chuỗi carbohydrate.

Hợp chất sepositoside A (112) phân lập từ loài sao biển Echinaster sepositus có

chứa một đơn vị glucuronic acid, một glucose và một galactose trong chuỗi

carbohydrate, là hợp chất cyclic steroid glycoside đầu tiên được phân lập [35]. Sau đó,

từ loài sao biển này, ba hợp chất cyclic steroid glycoside khác cũng được phân lập

(113-115), các hợp chất này có vòng epoxy ở vị trí C-22 và C-23 của mạch nhánh [36].

Chất thứ năm được biết đến thuộc dãy chất này là luzonicoside A (116) được phân lập

từ loài sao biển Echinaster luzonicus [37].

Đến năm 2015, Kicha và cs đã nghiên cứu phân lập được 5 hợp chất mới từ loài

sao biển Echinaster luzonicus được thu thập ở vùng biển Việt Nam. Trong đó có 4 hợp

chất mới thuộc dạng cyclic steroid glycoside là luzonicoside B-E (117-120) và 1 hợp

chất bị mở vòng của chuỗi carbohydrate ở vị trí C-6 là luzonicoside F (121) [38].

Các kết quả nghiên cứu cho thấy, các hợp chất cyclic steroid glycoside mới chỉ

được phân lập từ hai loài sao biển thuộc chi Echinaster mà chưa từng được tìm thấy ở

các loài sao biển thuộc các chi khác. Vì vậy, có thể coi nhóm chất này như là các chất

nhận diện của chi Echinaster.

1.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực từ sao biển

Ngày nay, ung thư là căn bệnh phổ biến trên toàn thế giới với tốc độ gia tăng

nhanh chóng, tuy nhiên các loại thuốc dùng cho điều trị vẫn còn khá hạn chế. Do đó,

việc tìm ra các loại thuốc cho điều trị các bệnh ung thư rất được quan tâm nghiên cứu.

Trong đó, các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên được quan tâm hơn cả do chúng

thể hiện ưu thế vượt trội hơn so với các thuốc tổng hợp, như: độc tính thấp, khả năng

dung nạp vào cơ thể cao, ít tác dụng phụ. Vì vậy, các nghiên cứu về hoạt tính gây độc

tế bào, chống ung thư của các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là các chất phân lập từ sinh

vật biển gần như chiếm ưu thế. Bên cạnh đó, các nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh

vật, kháng virus hay khả năng điều hòa miễn dịch của các chất có nguồn gốc biển tự

nhiên cũng được quan tâm nghiên cứu do chúng thể hiện phổ sinh học rộng. 1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư

Từ loài sao biển Certonardoa semiregularis, 36 hợp chất polyhydroxysteroid 1-36

được phân lập [12-17]. Các hợp chất này được thử hoạt tính gây độc tế bào trên mô hình in

vitro với các dòng tế bào ung thư ở người, như: ung thư phổi (A549), ung thư buồng trứng

(SK-OV-3), ung thư da (KS-MEL-2), ung thư não (XF498) và ung thư đại tràng (HCT15).

Bảng 1.2: Kết quả thử nghiệm in vitro các chất phân lập từ sao biển C.semiregularis

Hợp chất ED50 (µg/ml)

SK-OV-3 KS-MEL-2

A549 0,15 0,82 0,48 0,54 1,75 0,15 0,43 0,04 0,08 0,90 0,83 0,69 1,51 0,16 0,22 0,12 0,09 0,40 0,28 0,40 0,48 <0,10 0,17 0,05 XF498 0,07 0,43 0,40 0,33 1,22 0,08 0,12 0,12 HCT15 0,01 1,25 1,26 0,73 1,25 0,25 0,48 0,18 14 16 19 20 21 22 30 Doxorubicin

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất 14, 16, 19-22, và 30 thể hiện có hoạt

tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào được thử nghiệm. Trong đó, hợp chất tetraol

14 thể hiện hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào ung thư mạnh hơn so với chất đối

chứng là doxorubicin, với giá trị ED50= 0,01-0,15 µg/ml [13, 15].

Khi nghiên cứu loài sao biển Leptasterias ochotensis sáu hợp chất asterosaponin

leptasterioside A-F (95-100) phân lập từ sao biển này được tiến hành đánh giá hoạt tính

gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung thư ở người: ung thư sắc tố ác tính (RPMI-

7951) và ung thư vú (T-47D). Kết quả cho thấy 6 asterosaponin, leptasterioside A-F

(95-100), thể hiện hoạt tính gây độc trên cả hai dòng tế bào RPMI-7951 và T-47D.

Trong đó, chất 97 thể hiện hoạt tính rất mạnh trên dòng tế bào T-47D [32].

Bảng 1.3: Hoạt tính gây độc tế bào T-47D và RPMI-7951 của các hợp chất 95-100

Dòng TB IC50 (µM)

T-47D RPMI-7951 95 10 17 96 23 30 97 2 27 98 68 151 99 143 151 100 111 91

1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus

Ngoài hoạt tính gây độc tế bào, các hợp chất 1-13 phân lập từ loài sao biển

Certonardoa semiregularis cũng được tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn chống lại

20 chủng vi khuẩn khác nhau. Hầu hết các hợp chất này đều thể hiện hoạt tính kháng

khuẩn yếu trên các chủng Streptococcus pyogenes 308A, Pseudomonas aeruginosa

1771 và Pseudomonas aeruginosa 1771M [9].

Các hợp chất 37-40, 43, 44 phân lập từ loài sao biển Asterina pectinifera được

tiến hành thử hoạt tính chống virus Herpes type1 (HSV-1) gây rộp da. Kết quả cho thấy

các hợp chất 39, 40, 43, 44 thể hiện hoạt tính chống lại dòng virus HSV-1 này với nồng

độ ức chế thấp nhất (MIC) là 0,2; 0,05; 0,2 và 0,07 µM. Điều này gợi ý rằng, nhóm –

OH ở vị trí C-4, nhóm sulfate ở vị trí C-3 có thể là yếu tố cần thiết cho hoạt tính kháng

virut HSV-1. Hơn nữa, khi cấu hình nhóm –OH của C-15 chuyển từ dạng α (39) sang β

(40), hoạt tính kháng virus HSV-1 của chất 40 tăng mạnh hơn [18]. 1.3.3. Hoạt tính điều hòa miễn dịch

Khi nghiên cứu các hợp chất cyclic steroid glycoside phân lập được từ loài sao

biển Echinaster luzonicus, Kicha và cs đã đánh giá hoạt tính điều hòa hệ miễn dịch,

bao gồm các hoạt tính: kích thích lysosome, mức độ của ROS (reactive oxygen

species) nội bào và sự sản sinh oxit nitric (NO) của chất luzonicoside A (116) và

luzonicoside D (119) trên tế bào đại thực bào RAW 264.7. Hai chất này chỉ có sự khác

biệt nhau trong cấu trúc của đơn vị đường thứ ba trong vòng carbohydrate, đơn vị

galactose của chất 116 và đơn vị glucose của chất 119. Cả hai chất này đều không gây

độc tế bào RAW 264.7 trong khoảng nồng độ 0,001-50 µM [38]. Ở liều không gây độc

tế bào, chất 116 điều chỉnh hoạt động lysosome của tế bào RAW 264.7 theo sự lệ thuộc

vào liều và biểu đồ đường cong hình chuông. Khi tế bào được xử lý với hợp chất 116 ở

nồng độ 10 µM thì làm giảm nhẹ hoạt động lysosome. Ở trong khoảng nồng độ 0,001-

1,0 µM, chất 116 gây kích thích đáng kể hoạt động lysosome, và nồng độ đạt được cực

đại ở 0,1 µM, gây kích thích lên đến 50% so với đối chứng. Trong khi đó, chất 119

kém ảnh hưởng trên các phép thử này. Hoạt tính kích thích của 119 trên lysosome đại

thực bào là 20−40% so với các tế bào không được điều trị ở cùng khoảng nồng độ, với

hiệu quả tối đa ở nồng độ 0,001 và 0,1 μM.

Chất 116 tạo ra sự hình thành ROS trong khoảng nồng độ 0,01−10,0 µM và tăng tối

đa mức độ ROS khoảng hai lần với liều 0,01 μM. Trong khi đó, chất 119 không cho thấy bất

kỳ sự kích thích đáng kể nào về sự hình thành ROS trong khoảng nồng độ 0,001−10 µM.

Khi đánh giá sự sản xuất NO, chất 116 gây ra sự gia tăng sản xuất NO trong các

đại thực bào theo sự phụ thuộc vào liều và cách thức tương tự như hoạt động của

lysosome. Nồng độ hiệu quả nhất để tăng cường điều chỉnh sự sản sinh NO trong tế

bào RAW 264.7 lên đến 15−30% khi so sánh với nồng độ kiểm chứng lần lượt là 0,01

và 0,1 μM. Trong khi chất 119 kém hiệu quả và hàm lượng NO tăng lên không đáng kể

trong các tế bào mà không có mối quan hệ phụ thuộc liều rõ rệt.

Lipopolysaccharide (LPS) từ E. coli, một chất điều hòa miễn dịch, được sử dụng là

chứng dương trong nghiên cứu này. Hợp chất 116 ở nồng độ 0,1 μM có hiệu quả hơn

trong việc kích thích hoạt động lysosome so với LPS ở liều 1 μg/mL và có tác dụng tương

tự LPS trong việc kích thích tổng hợp NO trong các tế bào đại thực bào RAW 264.7. Kích

thích sản xuất NO trong các tế bào là một hiện tượng tương đối hiếm đối với các hợp chất

thiên nhiên từ biển có trọng lượng phân tử thấp. Trên cơ sở những thử nghiệm này,

luzonicoside A (116) hứa hẹn là một tác nhân điều hòa miễn dịch tiềm năng [38].

1.4. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1.4.1. Đặc điểm sinh học và phân bố của loài sao biển Acanthaster planci

a. Đặc điểm sinh học

Sao biển Acanthaster planci (A. planci) là loài sao biển có kích thước cơ thể lớn

với đường kính có thể đạt tới 0,5 m. Cơ thể chúng có hình dạng đối xứng, nhiều cánh

(từ 16 đến 21 cánh) và toàn bộ cơ thể được bao phủ bởi các gai nhọn, dài và có độc

tính. Chiều dài của gai nhọn xấp xỉ 5 cm nhằm bảo vệ, và chống lại sự đe dọa từ kẻ

địch. Màu sắc của chúng có thể khác nhau tùy theo khu vực sinh sống, từ màu nâu nhạt

đến xám-xanh. Vòng đời của loài sao biển gai từ 5-7,5 năm [39]. Da của chúng là một

màng rất nhạy cảm, được sử dụng để lấy oxy hòa tan trong nước biển. Sao biển gai nên

được xử lý cẩn thận vì các gai nhọn dài của chúng có thể gây đau đớn và làm vết

thương chậm lành [39, 40].

Khẩu phần ưa thích của sao biển gai là các mầm (polyp) san hô sống.Vì vậy, chúng

là mối đe dọa lớn đối với hệ sinh thái của các rạn san hô. Chúng được coi là một trong 100

loài xâm lấn tồi tệ nhất thế giới. Để hạn chế sự gia tăng của chúng, người ta đã mở các chiến

dịch săn bắt sao biển gai, hoặc tiêm natri bisulfate vào cơ thể chúng (hợp chất này là chất

độc gây chết sao biển gai mà không gây ảnh hưởng tới hệ sinh thái san hô).

Sao biển A. planci là loài gây nguy hại đối với hệ sinh thái của các rạn san hô.

Tuy nhiên, các nghiên cứu hóa học của chúng cho thấy thành phần hóa học chính là

các steroid, ceramide và các asterosaponin. Đây là những lớp chất có hoạt tính sinh học

quý báu đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Bên cạnh

việc cần tiêu diệt và hạn chế sự sinh trưởng bùng phát của loài sao biển này để bảo vệ

các rạn san hô thì đây cũng là nguồn cung cấp nguyên liệu rất lớn để phục vụ cho các

nghiên cứu hóa học cũng như hoạt tính của các hợp chất có trong loài sao biển này.

Điều này không chỉ góp phần vào bảo vệ hệ sinh thái của các rạn san hô mà còn bổ

sung cho các nghiên cứu sâu hơn về hóa học của loài sao biển này cũng như góp phần

lý giải các độc tính mà chúng gây ra.

b. Sự phân bố

Sao biển A. planci phân bố rộng khắp Ấn Độ Dương-Thái Bình Dương. Chúng

xuất hiện ở các vĩ độ nhiệt đới và cận nhiệt đới từ Biển Đỏ và đông bờ biển châu Phi

qua Thái Bình Dương, qua Ấn Độ Dương đến bờ tây Trung Phi.

Ở Việt Nam, loài sao biển này có mặt ở hầu hết các vùng biển, nhưng đặc biệt

chúng sinh trưởng và phát triển khá mạnh ở dải biển miền Trung – Nam, nơi có nhiều

rạn san hô như các tỉnh: Nha Trang, Quảng Nam, Cù Lao Chàm…

1.4.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học loài sao biển Acanthaster planci

trên thế giới

Theo phân loại, chi Acanthaster chỉ có 2 loài là Acanthaster planci (Linnaeus,

1758) và Acanthaster brevispinus (Fisher, 1917). Trong đó chỉ có loài Acanthaster

planci được nghiên cứu về thành phần hóa học từ rất sớm, đầu những năm 70 của thế

kỷ trước. Theo thống kê, đến nay có khoảng 80 hợp chất đã được xác định có mặt trong

thành phần hóa học của loài sao biển này. Tuy nhiên, các hợp chất glycosphingolipid

(cerebroside và ganglioside) và các asterosaponin chiếm ưu thế hơn cả trong số này.

Các hợp chất steroid tự do (sterol và polyhydroxysteroid), và polyhydroxysteroid

glycoside cũng đã được phân lập, nhưng số lượng các hợp chất này không nhiều. Ngoài

ra còn có một số hợp chất khác như: carotenoid, nucleoside...

1.4.2.1. Steroid tự do (sterol và polyhydroxysteroid)

Từ năm 1972, Y. M. Sheikh và cs đã phân lập được hai sapogenin 5α-pregn-

9(11)-ene-3β,6α-diol-20-one (122) và 5α-cholesta-9(11),20(22)-diene-3β,6α-diol-23-

one (123) từ loài sao biển này [41].

Năm 1975, Isao Kitagawa và cs đã phân lập thêm được 8 hợp chất khác, trong

đó có 7 hợp chất steroid (124-130) và 1 hợp chất ở dạng glycoside steroid [42].

Thornasterol A (126) và thornasterol B (127) mang phần cấu trúc của mạch nhánh là

20-hydroxy-23-ketone được coi là 2 sapogenol chính của sao biển A.planci.

Tiếp đó, Kitagawa đã phân lập được 3 hợp chất acetylsteroid (131-133) [43]. Ba

hợp chất này có nhân steroid giống nhau với nhóm acetyl ở vị trí C-3, nhóm keton ở C- 6 và liên kết đôi Δ9,11, chúng khác nhau ở cấu trúc mạch nhánh gắn với C-17.

Đến năm 1980, nghiên cứu của Susumu Sato đã đưa ra kết quả phân tích sự có

mặt của 11 sterol (134-144) trong sao biển A.planci bằng phương pháp GC-MS [44].

Các sterol này có cấu trúc phần mạch nhánh khá đa dạng.

(135) Cholesterol

(134) 5α-cholestan-3β-ol

(136) 5α-cholestan-7-en- 3β-ol

(138) Ergost-5-en-3β-ol

(139) 5α-ergost-7-en-3β-ol

(137) (22E)-5α-ergost-7,22- dien-3β-ol

(141) 23,24-dimethyl-5α- cholesta-7,22-dien-3β-ol

(140) 5α-ergost-7,24(28)- dien-3β-ol

(142) 23- demethylacanthasterol

(144) Gorgostanol

(143) Gorgosterol

1.4.2.2. Polyhydroxysteroid glycoside

Trước đây, không có nhiều các hợp chất polyhydroxysteroid và dạng glycoside

của chúng được phân lập từ sao biển A. planci. Năm 1973, nhóm nghiên cứu của

Sheikh đã phân lập được hai monoglycoside steroid (145 và 146) từ sao biển A. planci

[45]. Sau đó, hợp chất nodososide (147) được công bố phân lập từ sao biển gai bởi

nhóm nghiên cứu của Minale [46].

Cho đến những năm trở lại đây mới tiếp tục có các công bố về sự phân lập các

polyhydroxysteroid glycoside từ sao biển gai. Nhóm các nhà khoa học Nga, Kicha và

cs đã phân lập được một triglycoside polyhydroxysteroid mới (148). Hợp chất này có 2

chuỗi phân tử đường khác nhau liên kết với khung aglycon qua 2 liên kết glycoside.

Trong đó, một đơn vị đường 2-OMe-Xyl liên kết ở C-3 của nhân steroid và chuỗi hai

phân tử đường Fuc-Xyl gắn với C-28 ở mạch nhánh [47]. 1.4.2.3. Asterosaponin

Asterosaponin là lớp chất phổ biến trong sao biển. Thành phần các asterosaponin

trong sao biển A. planci được quan tâm nghiên cứu rất sớm từ những năm 1970. Thống kê

các công bố cho thấy, đến nay đã có khoảng 10 asterosaponin đã được phân lập từ loài sao

biển này. Đi đầu trong các nghiên cứu về thành phần asterosaponin của loài sao biển này

là nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản. Từ 1978-1986, đã có 8 asterosaponin được

phân lập bao gồm thornasteroside A (149) được phân lập bởi Isao Kitagawa [49],

asterosaponin 150, acanthaglycoside A-D, F (151-155) và hợp chất đã biết marthasteroside

NaO3SO

Xyl

OHOH

NaO3SO

O OH

HO OO

Gal OO

Qui

Xyl

HO OO

Qui OO

Qui

HOHO

Fuc

Qui

HOHO

A1 (156) được phân lập bởi Tetsuya Komori [48-50].

149 Thornasteroside A R=

Fuc

151 Acanthaglycoside A

150 R=

NaO3SO

Xyl

HO OO

Glc OO

Qui

Xyl

HO OO

152-154

Glc OO

Qui

155, 156

Qui

Fuc

HOHO

Qui

HOHO

Fuc

152 Acanthaglycoside B R=

155 Acanthaglycoside F R

156 Marthasteroside A1 R

153 Acanthaglycoside C R=

154 Acanthaglycoside D R=

1.4.2.4. Glycosphingolipid

Các glycosphingolipid là một loại phụ của glycolipid có chứa chuỗi mạch dài amino

acohol sphingosine (sphingoid base). Sự liên kết của một chuỗi acid béo với sphingoid bằng liên

kết amin sẽ tạo thành ceramide. Phần chuỗi carbohydrate liên kết ở phía đầu của sphingolipid

được nối vào mạch ceramide thông qua liên kết glycoside tạo thành glycosphingolipid.

Hình 1.1: Cấu trúc đại diện của glycosphingolipid

(R = H hoặc OH/ R' =H hoặc OH)

Glycosphingolipid được chia thành hai nhóm bao gồm cerebroside và

ganglioside. Các sphingolipid thường được phát hiện từ các mô của các loài động vật

bậc cao, đây là một phần cấu tạo lên thành tế bào. Do chúng nằm ở màng tế bào với

đầu phân tử đường hướng ra ngoài tế bào nên chúng thường có liên quan đến các hoạt

động miễn dịch. Trong số các glycosphingolipid phân lập từ Da gai thì cerebroside là

thành phần được quan tâm nghiên cứu hơn cả. Các hợp chất glycosphingolipid của sao

biển A. planci cũng được quan tâm nghiên cứu khá chi tiết từ những năm 1980 bởi các

nhà khoa học thuộc ĐH Kyushu, Nhật Bản. Đã có khoảng 25 glycosphingolipid đã

được phân lập và được chứng minh cấu trúc.

Từ năm 1980-1988, nhóm nghiên cứu Tetsuya Komori và cs đã phân lập được

10 cerebroside (156-165) [51, 52] và 2 ceramide lactoside là acanthalactoside A và B

(166 và 167) [53]. Ba hợp chất 160-162 được xác định thuộc dạng ceramide

phytosphingosine có liên kết glycoside với một phân tử đường dạng 1-O-β-D-

glucopyranoside. Hợp chất 160 và 161 có chứa một mạch acid béo bão hòa 2-hydroxy

cùng với chuỗi mạch dài bão hòa. Chất 162 có chứa một mạch acid béo bão hòa 2-

hydroxy và một chuỗi mạch dài với 1 vị trí liên kết chưa bão hòa. Các hợp chất 163-

165 được xác định thuộc dạng ceramide sphingosine có liên kết glycoside với một

phân tử đường dạng 1-O-β-D-glucopyranoside; một mạch acid béo bão hòa 2-hydroxy

và một chuỗi mạch dài có 2 vị trí liên kết chưa bão hòa. Hai ceramide lactoside 166 và

167 được xác định có dạng ceramide lactoside phytosphingosine có chứa mạch acid

béo 2-hydroxy và chuỗi đường được xác định là liên kết của hai phân tử đường có dạng

β-galactopyranosyl-(1→4)-β-glucopyranose.

Năm 1990, nhóm nghiên cứu của Kawano phân lập được 5 hợp chất ganglioside

từ cặn chiết lipid phân cực của loài sao biển này là acanthaganglioside A-E (168-172).

Cấu trúc của chúng cùng chứa một chuỗi mạch dài giống nhau, chuỗi oligosaccharide

có 5 đến 6 phân tử đường và chuỗi acid béo khác nhau [54, 55].

Ba hợp chất acanthaganglioside F-H (173-175) sau đó cũng được phân lập và

được chứng minh là các dẫn xuất của acanthaganglioside C (170) chỉ có sự khác biệt ở

chuỗi mạch dài ankyl trong phần nhân cấu trúc của ceramide (gồm chuỗi acid béo và

chuỗi sphingoid). Acanthaganglioside F (173) và G (174) có cấu trúc của chuỗi

sphingoid giống nhau với 16 đơn vị cacbon và chỉ khác là hơn kém nhau 2 đơn vị

carbon trong chuỗi acid béo với số đơn vị carbon tương ứng là 21 và 23 carbon. Trong

khi đó thì acanthaganglioside H (175) được xác định có chuỗi sphingoid là 17 đơn vị

carbon và chuỗi acid béo là 24 đơn vị carbon [56, 57].

Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Inagaki đã công bố phân lập được 3 ceramide

dạng phytosphingosine từ phân đoạn ít phân cực của cặn chiết lipid sao biển gai và ký

hiệu là AC-1-6 (176); AC-1-10 (177) và AC-1-11 (178) [58].

Năm 2000, Miyamoto và cs đã phân lập thêm được 2 ganglioside mới cũng là

dẫn xuất của acanthaganglioside C, có chuỗi phân tử đường và chuỗi sphingoid có cấu

trúc giống với acanthaganglioside C, chỉ khác nhau ở chuỗi acid béo. Hai ganglioside

này là acanthaganglioside I, J (179, 180) [59].

1.4.2.5. Các hợp chất khác

Hai nucleoside là thymine deoxyribonucleoside (181) và uracil

deoxyribonucleoside (182) đã được phân lập từ sao biển gai vào năm 1980 [51].

Hợp chất carotenoid đầu tiên được phân lập từ sao biển gai là 7,8-didehydroastaxanthin

(183) vào năm 1976 [60]. Đến năm 2010, thành phần chi tiết các carotenoid có trong loài sao

biển này mới được công bố bởi Maoka [61]. Theo công trình này, các carotenoid chính là 7,8-

didehydroastaxanthin (183), astaxanthin (184), peridiniol (185). Một số carotenoid khác có hàm

lượng nhỏ cũng được phân lập: 7,8,7’,8’-tetrahedroastaxanthin (186), diadinoxanthin (187),

diatoxanthin (188), alloxanthin (189) và 4 carotenoid mới (190-193). Năm 2011, Luo và cs

nghiên cứu phân tích thành phần hóa học và độc tính của sao biển gai khi sử dụng làm thức ăn

cho chuột. Khi phân tích thành phần astaxanthin (184), Luo đã chỉ ra hàm lượng của carotenoid

này trong sao biển gai (65.4-97.4 g/g mẫu khô) cao hơn trong vỏ tôm, và nhận định đây là

nguồn cung cấp astaxanthin tiềm năng. Khi sử dụng sao biển A. planci làm thức ăn cho chuột,

kết quả cho thấy loài sao biển này không làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và sức khỏe của

chuột. Dựa trên kết quả nghiên cứu này, Luo đề xuất sử dụng sao biển A. planci là thành phần

cho thức ăn chăn nuôi để làm giảm việc sử dụng bột cá, dầu cá và các carotenoid. Đây cũng là

một phương pháp góp phần vào kiểm soát tài nguyên giúp bảo vệ hệ sinh thái của các rạn san hô

tránh khỏi sự tàn phá của loài sao biển này [62].

1.4.3. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài sao biển Acanthaster planci

Cho đến nay các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất tinh khiết phân

lập từ sao biển gai không nhiều. Các nghiên cứu chủ yếu trên các cặn chiết thô của các

gai nhọn hoặc các cặn chiết thô của toàn thân loài sao biển này. 1.4.3.1. Hoạt tính tán huyết

Nguyên nhân gây ra sự chậm lành và máu khó đông trên các vết thương gây ra

bởi gai nhọn của loài sao biển A. planci đã được các nhà khoa học nghiên cứu và đánh

giá trên hoạt tính tán huyết để lý giải.

Năm 1996, Karasudani đã tinh chế plancinin (một peptide dimer có liên kết

disulfit trong phân tử, phân tử lượng được xác định khoảng 7500 Da) từ gai nhọn của

sao biển A. planci và tiến hành thử nghiệm hoạt tính tán huyết của plancinin và cặn

chiết thô của các gai nhọn so sánh với heparin. Kết quả sau khi tinh chế plancinin đã

làm tăng hoạt tính tán huyết lên 6,5 lần so với cặn chiết thô, và yếu hơn so với đối

chứng. Khi làm giảm liên kết disulfit với 2-mercaptethanol của plancinin thì hoạt tính

tán huyết không còn. Điều này chứng tỏ chính liên kết disulfit của plancinin là yếu tố

gây ra hoạt tính tán huyết [63].

Nghiên cứu của Koyama và cs năm 1998 cũng chỉ ra rằng plancinin có khả năng

kéo dài thời gian kích hoạt yếu tố tổ chức thromboplastin (chất tạo thành trong các giai

đoạn đông máu đầu tiên) và prothrombin (quá trình đông máu) nhưng không kéo dài

thời gian đông máu thrombin. Plancinin không ảnh hưởng đến sự thoái hóa của

thrombin bởi tác nhân chống thrombin III hoặc thụ thể giống heparin II [64].

Năm 2013, Chi-Chiu Lee và cs đã chứng minh rằng hoạt tính tán huyết gây ra

bởi gai của sao biển A. planci bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như pH, nhiệt độ, ion kim loại, EDTA, cholesterin, protease, và sự thủy phân của glycoside. Các yếu tố ion Cu2+,

cholesterin, α-chymotrypsin và enzym cellulase gây ức chế tác dụng tán huyết gây ra

bởi gai của loài sao biển này [65]. 1.4.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào

Năm 1996, Komori và cs đã nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào phôi thai làm

ức chế sự thụ tinh trên trứng cầu gai và sao biển của 7 hợp chất asterosaponin phân lập

từ sao biển A. planci bao gồm: thornasteroside A (149), acanthaglycoside A-F (151-

155), marthasteroside A1 (156). Kết quả cho thấy cả 7 hợp chất này đều thể hiện có

hoạt tính gây ức chế 50% sự thụ tinh trong lần phân cắt đầu tiên sau khi thụ tinh 1,5 giờ

(ED50) và gây chết 99% trước giai đoạn phôi nang (LD99). Chất 149 và 155 biểu hiện

sự ức chế tốt nhất [66, 67].

Bảng 1.4: Hoạt tính gây độc tế bào làm ức chế sự tinh của trứng cầu gai của các hợp

chất asterosaponin từ sao biển A. planci

Tên chất Cầu gai

Thornasteroside A (149) Acanthaglycoside A (151) Acanthaglycoside B (152) Acanthaglycoside C (153) Acanthaglycoside D (154) Acanthaglycoside F (155) Marthasteroside A1 (156) ED50 (µg/ml) 10 50 - 15 15 5 15 LD99 (µg/ml) 5 50 - 2 5 2 5 Sao biển ED50 (µg/ml) 100 200 - 200 200 100 200

Năm 2014, Chi-Chiu Lee và cs đã đánh giá hoạt tính chống ung thư của bốn cặn

chiết phân đoạn của sao biển A.planci, bao gồm các cặn chiết: cặn ether dầu hỏa, cặn

EtOAc, cặn EtOH và cặn BuOH trên 4 dòng tế bào ung thư ở người là ung thư phổi

(A549), ung thư da ác tính (A375.S2), ung thư tuyến tiền liệt (PC3) và ung thư gan

(Hep G2). Kết quả thử nghiệm cho thấy cặn BuOH cho hoạt tính cao nhất trong số 4

cặn chiết được thử nghiệm. Trong khi đó, các cặn chiết ít phân cực (ether dầu hỏa và

EtOAc) gần như không thể hiện có hoạt tính hoặc yếu. Điều này cho thấy thành phần

saponin trong cặn chiết BuOH có những hoạt tính gây độc tế bào rất tiềm năng [68].

Bảng 1.5: Kết quả đánh giá hoạt tính chống ung thư của 4 cặn chiết sao biển A.planci

Cặn chiết IC50 (µg/ml)

Ether dầu hỏa EtOAc EtOH A549 >1000 >1000 298,45±2,42 A375.S2 >1000 697,74±5,21 325,85±3,39 PC3 >1000 >1000 435,75±3,12 Hep G2 >1000 >1000 437,10±4,71

BuOH 140,48±3,77 112,65±2,98 152,34±2,32 216,62±3,19

1.4.4. Tình hình nghiên cứu loài sao biển Acanthaster planci tại Việt Nam

Loài sao biển A. planci mặc dù được quan tâm nghiên cứu rất sớm từ những

năm 1970, tuy nhiên tại Việt Nam dù được coi là vùng biển có sự phân bố rộng rãi của

loài sao biển này nhưng các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài sao biển này

còn rất hạn chế.

Năm 2013, nhóm nghiên cứu của GS. Châu Văn Minh - Viện Hóa sinh biển đã

công bố phân lập được hai hợp chất pyrrole oligoglycoside mới từ cặn chiết MeOH của

loài sao biển này là plancipyrroside A (194) và B (195) [69]. Hai hợp chất này gây ức

chế sự sản sinh NO trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7. Plancipyrroside B gây

ức chế mạnh với giá trị IC50 = 5,94±0,34 µM trong khi giá trị IC50 của plancipyrroside

A là 16,61±1,85 µM, chất đối chứng dương được sử dụng là cardamonin với IC50 =

2,20±0,27 µM. Khi nồng độ NO cao là dấu hiệu trong điều trị rối loạn viêm. Theo chức

năng và đặc điểm cụ thể, ức chế sản xuất NO bởi các tế bào miễn dịch, điển hình là đại

thực bào được đề xuất là một trong những chiến lược phát triển chất chống viêm. Kết

quả này cho thấy plancipyrroside B là một chất tiềm năng để đánh giá sâu hơn về cơ

chế hoạt động của phân tử trên mục tiêu viêm cụ thể [69].

Năm 2016, nhóm nghiên cứu này phân lập được thêm 5 hợp chất

polyhydroxylsteroid glycoside từ sao biển A.planci, trong đó có 2 hợp chất mới 199,

200 và 3 hợp chất đã biết 196-198 [70].

1.5. Tình hình cứu tổng hợp các hợp chất polyhydroxysteroid và

hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên trên thế giới

Từ steroid tự nhiên có rất nhiều hướng để chuyển hóa như hydroxyl hóa, oxime

hóa, sulfate hóa, epoxy hóa, ketone hóa, amide hóa hay dimer hóa. Tuy nhiên tùy theo

đối tượng và hướng nghiên cứu cụ thể mà có các định hướng nghiên cứu khác nhau.

Do các hợp chất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid từ sinh vật biển có rất

nhiều chất thể hiện hoạt tính tốt chống lại nhiều dòng tế bào ung thư. Vì vậy, hai hướng

nghiên cứu tổng hợp các hợp chất này đi từ steroid tự nhiên đã được nhiều nhà khoa

học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Trong nội dung nghiên cứu này, hai hướng

nghiên cứu hydroxyl hóa và oxime hóa steroid tự nhiên sẽ được phân tích cụ thể.

1.5.1. Tổng hợp các hợp chất polyhydroxysteroid từ steroid tự nhiên

Hydroxysteroid là các steroid có một hoặc nhiều nhóm hydroxyl (-OH) trong

phân tử, là lớp chất được biết đến có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý, như: chống

virut, gây độc tế bào, kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, và hoạt tính trên hệ

thần kinh [9, 71-75]. Đã có rất nhiều các hợp chất polyhydroxysteroid được nghiên cứu

phân lập, trong số đó có nhiều hợp chất thể hiện hoạt tính tốt [13, 15, 19]. Tuy nhiên,

việc phân lập các hợp chất này từ tự nhiên là rất khó khăn và hàm lượng thu được

không nhiều. Do đó, hướng nghiên cứu tổng hợp ra các polyhydroxysteroid này đi từ

nguồn steroid phổ biến trong tự nhiên, dễ thu thập và được thương mại hóa với giá

thành thấp đã được quan tâm nghiên cứu. Các steroid được lựa chọn làm nguyên liệu

đầu thường là các steroid từ thực vật như diosgenin, stigmasterol, sitosterol; hay steroid

từ động vật như cholesterol, cholestanol, ergosterol. Các dẫn xuất chuyển hóa từ

steroid tự nhiên cũng cho những kết quả khả quan trong đánh giá các tác dụng sinh

học, có thể ứng dụng nghiên cứu ở quy mô lớn. Đây là hướng nghiên cứu được các nhà

khoa học quan tâm nghiên cứu từ sớm.

Từ stigmasterol, Cui và cs đã tổng hợp hai dẫn xuất hydroxyl chỉ khác nhau ở

cấu hình nhóm –OH ở vị trí C-6 là 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol (201, sơ

đồ1.1) và 24-methylenecholest-4-en-3β,6α-diol (202, sơ đồ 1.2). Chất 201 được tổng

hợp qua 10 bước phản ứng, hiệu suất đạt 20%. Trong khi đó, chất 202 được tổng hợp

qua 8 bước phản ứng, nhưng hiệu suất chỉ đạt 9% [75, 76]. So sánh hoạt tính gây độc tế

bào của hai chất này trên dòng tế bào ung thư dạ dày (MGC) và dòng tế bào ung thư cổ

tử cung (HeLa), kết quả chất 201 thể hiện độc tính trên hai dòng tế bào này với giá trị

ED50 tương ứng là 10,0 và 12,0 µg/ml. Trong khi đó chất 202 thể hiện độc tính yếu trên

hai dòng này với ED50 tương ứng là 110,0 và 130,0 µg/ml. Chất 201 đã được báo cáo

phân lập từ loài san hô Alcyonium patagonicum thể hiện hoạt tính gây độc mạnh trên

dòng tế bào gây bệnh bạch cầu ở chuột với giá trị IC50 = 1µg/ml [75].

Sơ đồ 1.1. Tổng hợp chất 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol (201) từ stigmasterol

Sơ đồ 1.2. Tổng hợp chất 24-methylenecholest-4-en-3β,6α-diol (202) từ stigmasterol

Cũng từ stigmasterol, Weigang Lu và cs đã tổng hợp thành công chất 24-

methylene-cholesta-3β,5α,6β,19-tetraol (203, sơ đồ1.3) qua 10 bước phản ứng, hiệu

suất quá trình đạt 9%. Hợp chất này đã được phân lập từ hai loài san hô mềm Nephthea

albida và N. tiexieral verseveldt, có khả năng gây độc tế bào với nhiều dòng tế bào ung

thư ở người như tế bào ung thư phổi A549, tế bào ung thư ruột kết HT-29, tế bào ung

thư biểu bì KB, và bệnh bạch cầu ở chuột P-388 với các giá trị ED50 lần lượt là 0,81;

Sơ đồ 1.3. Tổng hợp chất 24-methylene-cholesta-3β,5α,6β,19-tetraol (203) từ stigmasterol

0,93; 0,39 và 0,34 µg/mL [77].

Từ diosgenin, John R. Williams và cs đã tổng hợp thành công hợp chất (25R)-26-

hydroxycholesterol (204), một chất trung gian trong quá trình chuyển hóa cholesterol

thành acid mật, qua 4 bước phản ứng, với hiệu suất tương đối cao (58%). Chất 204 ức

chế mạnh quá trình sinh tổng hợp cholesterol vì nó là chất ức chế hiệu quả enzym

HMG-CoA. Hợp chất này còn được chứng minh có khả năng gây ức chế quá trình tổng

hợp của DNA trên cơ thể người. Trước tiên, diosgenin được khử hóa bằng phản ứng

Clemmensen để mở vòng genin. Sau đó hai nhóm hydroxyl ở C-3 và C-26 được bảo vệ

bởi tác nhân TBDMSCl. Nhóm hydroxyl ở vị trí C-16 sau khi được loại bỏ, các nhóm

bảo vệ được tách ra thu được sản phẩm cuối là chất 204 (sơ đồ 1.4) [78].

Sơ đồ 1.4. Tổng hợp (25R)-26-hydroxycholesterol (204) từ diosgenin

Hợp chất certonardosterol D2 (14) được phân lập từ loài sao biển Certonardoa

semiregularis có khả năng gây độc tế bào tốt với nhiều dòng tế bào ung thư ở người như

A549, Sk-OV-3, Sk-MEL-2, XF498, HCT15 với giá trị ED50= 0.01-0.15 µg/mL [16].

Sơ đồ 1.5. Các giai đoạn tổng hợp certonardosterol D2 (14) từ diosgenin

Jiang và cs đã nghiên cứu tổng hợp thành công hợp chất này từ nguồn nguyên

liệu phổ biến trong tự nhiên là diosgenin qua bốn giai đoạn chính bao gồm: giai đoạn 1

tổng hợp bisnorcholanic lactone, giai đoạn 2 tổng hợp 15β C-22 steroid aldehyde, giai

đoạn 3 tổng hợp cấu trúc mạch nhánh, giai đoạn 4 gắn kết phần nhân steroid với mạch

nhánh sau đó tách loại nhóm bảo vệ thu được chất 14 (sơ đồ 1.5) [79].

Năm 2014, Maud Voisin và cs đã chỉ ra vai trò quan trọng của các hợp chất

dạng 3β,5α,6β-triol steroid có dạng mạch nhánh giống cholesterol trong chức năng sinh

học của chúng đối với nhiều dòng tế bào ung thư [80]. Từ cholesterol, Maud Voisin đã

tổng hợp chất cholestan-3β,5α,6β-triol (205) chỉ qua một bước phản ứng sử dụng HIO4

như một tác nhân oxy hóa với các tỷ lệ đương lượng khác nhau. Khi 3 đương lượng

HIO4 được sử dụng chất 205 thu được với hiệu suất 12% trong thời gian 24 giờ. Khi

tăng HIO4 lên 10 đương lượng, hiệu suất thu được tăng lên là 85%. Tuy nhiên, khi tăng

HIO4 lên 20 đương lượng, hiệu suất thu được chất 205 chỉ còn 6%. Như vậy, hiệu suất

sản phẩm bị ảnh hưởng rất lớn khi thay đổi tỷ lệ HIO4 [81].

Sơ đồ 1.6. Tổng hợp cholestan-3β,5α,6β-triol (205) từ cholesterol

Chất 205 được chứng minh thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng

tế bào ung thư ở người như: tế bào ung thư phổi A549, tế bào ung thư xương MG63

với giá trị IC50 tương ứng là 12,2±3,9 và 7,7±2,1 µM, so với đối chứng dương

adriamycin có IC50 tương ứng là 2,8±1,5 và 3,5±1,2 µM [81].

1.5.2. Tổng hợp các hợp chất hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên

Các hợp chất hydroximinosteroid là các hợp chất steroid có chứa một hoặc

nhiều nhóm hydroxime (>C=N-OH) trong phân tử. Các hợp chất này được biết đến với

sự có mặt trong một số loài sinh vật biển, đặc biệt trong một số loài hải miên. Những

hợp chất steroid có chứa nhóm oxime phân lập từ nguồn sinh vật biển là những hợp

chất hiếm. Hai hợp chất 6E-hydroximino-24-ethylcholest-4-en-3-one (206) và 6E-

hydroximinocholest-4-en-3-one (207) là những hợp chất steroid có một nhóm oxime

trong phân tử đầu tiên được phân lập từ hai loài hải miên Cinachirella alloclada và

Cinachirella apion bởi Rodriguez và cs năm 1997 [82]. Năm 2005, một hợp chất khác

là 3E-hydroximinocholest-4-en-6-one (208) được phân lập từ loài hải miên

Cinachirella australiensis [83]. Các hợp chất oximesteroid này gây ra các hoạt tính

sinh học rất lý thú. Ví dụ, chất 207 có hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư

như: tế bào ung thư bạch cầu ở chuột P-388, tế bào ung thư phổi ở người A549, tế bào

ung thư đại trực tràng ở người HT-29 với cùng giá trị IC50 = 1,25 µg/ml; và tế bào khối

u tủy ở người MEL-28 với giá trị IC50 = 2,5 µg/ml [84]. Hay chất 208 thể hiện hoạt tính

in vitro chống virus viêm gan Hep G2 [83]. Ba hợp chất này được coi như hình mẫu để

tổng hợp ra các dẫn xuất oxime khác nhau có cấu trúc tương tự với chúng.

Từ những năm 2000 trở lại đây, đã có một số nghiên cứu tổng hợp các hợp chất

hydroximinosteroid theo hình mẫu của 3 hợp chất trên đi từ các steroid phổ biến trong

tự nhiên như cholesterol, stigmasterol và β-sitosterol. Các kết quả đánh giá hoạt tính

sinh học cho thấy các hợp chất hydroximinosteroid tổng hợp được thể hiện phổ hoạt

tính rộng. Có độc tính gây độc nhiều dòng tế bào ung thư ở người như: A549, HCT-

116, T98G, PSN1, Sk-Hep-1, H-292, PC-3 và Hey-1B [84-86].

Trước tiên là nghiên cứu của Noé Deivevà cs, năm 2001, đã tổng hợp thành

công hai hợp chất 206, 207 cùng với 12 hợp chất 6-hydroximinosteroid mới khác (209-

220) đi từ cholesterol, sitosterol, gorgosterol và sản phẩm khử của (+)-dehydroiso-

androsterone (steroid hormon). Các sản phẩm 6-hydroximinosteroid được tổng hợp đi

qua nhiều giai đoạn trung gian khác nhau. Sản phẩm oxime cuối cùng thu được từ phản

ứng giữa một hợp chất steroid có nhóm C=O ở vị trí C-6 với tác nhân hydroxylamine

hydrochloride (NH2OH.HCl) trong pyridine tạo thành các sản phẩm oximesteroid có

nhóm oxime ở vị trí C-6.

Các chất này được đánh giá hoạt tính sinh học in vitro trên 4 dòng tế bào: ung thư bạch cầu

chuột P-388, ung thư phổi ở người A549, ung thư đại trực tràng HT-29 và ung thư xương ở

người MEL-28 (xem bảng 1.6). Kết quả cho thấy các hợp chất 6-hydroximinosteroid có

phần mạch nhánh ở vị trí C-17 giống cholesterol (207, 215-219) thể hiện hoạt tính mạnh hơn

so với các 6-hydroximinosteroid có phần mạch nhánh giống sitosterol (206), gorgosterol

(210) và các hợp chất không có mạch nhánh ở C-17 (212-214) [84].

Chất Chất Bảng 1.6: Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 206, 207, 209-220 IC50 (μg/mL) P388 A549 HT29 MEL28

IC50 (μg/mL) P388 A549 HT29 MEL28 1,25 10 10 10 5 5 5 5 1,25 1,25 0,125 0,125 0,125 5 1,25 10 10 10 5 5 5 1,25 10 10 10 5 5 5 5 1,25 1,25 0,25 0,25 0,5 5 5 1,25 1,25 0,25 0,25 0,25 5 1,25 10 10 10 5 5 5 206 207 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220

5 1,25 1,25 0,125 0,125 0,125 5 Tiếp đó, nhóm nghiên cứu này đã tổng hợp một dãy 14 hợp chất 6-

hydroximinosteroid mới (221-234) đi từ nguyên liệu đầu là cholesterol. Phản ứng oxy

hóa là phản ứng chính sử dụng các tác nhân oxy hóa khác nhau để tổng hợp các dẫn

xuất có nhóm C=O ở vị trí C-6 và các nhóm chức thay đổi vị trí xung quanh vòng A, B

và D của khung steroid. Sau đó được hydroxime hóa bằng NH2OH.HCl để thu được

sản phẩm có nhóm oxime ở vị trí C-6 [85]. 14 hợp chất này (221-234) cùng với 2 hợp

chất 207 và 208 được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư ở

người bao gồm ung thư phổi A549, ung thư đại tràng HCT-116, ung thư tuyến tụy

PSN1 và ung thư não T98G (xem bảng 1.7). Kết quả cho thấy tất cả các hợp chất được

đánh giá đều thể hiện hoạt tính trên 4 dòng tế bào ung thư ở các nồng độ khác nhau.

Nghiên cứu này cũng chỉ ra tầm quan trọng của các vị trí được thế bởi nguyên tử oxy

trên vòng A đối với sự gia tăng hoạt tính gây độc tế bào của chúng (ví dụ hợp chất 4,5-

epoxy (223) cho giá trị IC50 trên dòng tế bào HCT116 dưới mức µM) [85].

Bảng 1.7: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất 207, 208 và 221-234

Chất Chất IC50 (μM)

A549 HCT116 PSN1 12,10 12,10 12,10 1,17 0,23 2,34 2,32 2,32 11,60 >25 >25 >25 1,06 0,21 1,06 11,54 1,15 11,54 23,09 1,15 11,54 >23,31 2,33 11,65 T98G 24,21 2,34 23,2 25 1,06 >23,09 23,09 23,31 IC50 (μM) A549 HCT116 PSN1 T98G >25 >25 >25 >25 19,41 19,41 >25 21,14 >25 22,98 11,54 11,54 2,22 2,22 >25 >25 >25 >25 1,94 21,14 22,98 11,54 2,22 >25 >25 >25 19,41 21,14 22,98 11,54 2,22 >25 207 208 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234

Năm 2009, Cui và cs đã đưa ra nhiều bằng chứng hơn cho việc chứng minh mối

quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất hydroximinosteroid. 14 hợp chất

hydroximinosteroid (235-248) đã được tổng hợp đi từ 3 steroid tự nhiên là cholesterol,

stigmasterol và β-sitosterol. Các hydroximinosteroid tổng hợp được có nhóm oxime ở

C-6 và nhóm C=O ở C-3; hoặc ngược lại nhóm oxime ở vị trí C-3 và nhóm C=O ở C-

6; hoặc cả hai vị trí C-3 và C-6 đều là các nhóm oxime.

Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của 14 hợp chất này cùng với 3 hợp chất

206-208 trên 4 dòng tế bào Sk-Hep-1, H-292, PC-3 và Hey-1B (xem bảng 1.8) đã chỉ ra

rằng hoạt tính gây độc tế bào của các hydroximinosteroid không chỉ phụ thuộc vào vị trí của

nhóm oxime, mà còn phụ thuộc vào dạng mạch nhánh gắn ở vị trí C-17 của khung steroid

[86]. Nghiên cứu này một lần nữa khẳng định rằng, các hydroximinosteroid có dạng mạch

nhánh giống cholesterol (207, 238, 243, 245) có hoạt tính mạnh hơn các hợp chất có mạch

nhánh giống stigmasterol; và các hợp chất có mạch nhánh giống stigmasterol có hoạt tính

mạnh hơn các hợp chất có mạch nhánh giống sitosterol [86].

Bảng 1.8: Hoạt tính sinh học của 17 hợp chất hydroximinosteroid (206-208, 235-248)

Chất

IC50 (µM) IC50 (µM) Sk-Hep-1 H-292 PC-3 Hey-1B

Sk-Hep-1 H-292 >100 32,6 >100 >100 >100 59,5 26,2 37 62,5

>100 33 >100 >100 >100 43 20,1 37 45

PC-3 Hey-1B >100 35 >100 >100 >100 44 32,5 40,5 41,5

>100 54 >100 >100 >100 49 26,3 45 53

>100 >100 25 76,8 24 57 >100 34,5

>100 >100 46 70 33 76 >100 53

>100 >100 76 >90 36 66 >100 52

>100 >100 38 78 37 51 >100 45

206 207 208 235 236 237 238 239 240

241 242 243 244 245 246 247 248

Như vậy, từ các dẫn chứng ở trên có thể thấy các hợp chất hydroximinosteroid

thể hiện phổ sinh học rất rộng, có tiềm năng chống lại nhiều dòng tế bào ung thư. Việc

nghiên cứu mối quan hệ giữa hoạt tính cấu trúc cũng cho thấy các hợp chất

hydroximinosteroid có phần mạch nhánh giống của cholesterol thể hiện hoạt tính tốt

nhất so với những loại mạch nhánh khác. Điều này cung cấp rất nhiều thông tin hữu ích

cho việc thiết kế các loại thuốc hóa liệu, cũng như định hướng nghiên cứu tổng hợp các

hydroximinosteroid. Vì vậy, cholesterol là steroid được ưu tiên hàng đầu cho hướng

tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid này.

1.6. Tình hình nghiên cứu tổng hợp các hợp chất polyhydroxysteroid và

hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên tại Việt Nam

Ở Việt Nam, đã có một số các công trình nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất đi từ

steroid tự nhiên. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu chuyển hóa trên các steroid từ

thực vật hoặc các steroid hormone. Không nhiều nghiên cứu định hướng tổng hợp các

hợp chất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên, đặc biệt từ các

steroid động vật.

Điển hình là các nghiên cứu của nhóm nghiên cứu của Lưu Đức Huy và cs, từ

những năm 1990 đến nay nhóm nghiên cứu này đã định hướng nghiên cứu nhằm hoàn

thiện một số phương pháp mới chuyển hóa từ sterol đến corticoid thông qua 17-

ketosteroid trung gian. Mục đích cuối cùng là đưa ra một sơ đồ mới hiệu quả để tổng

hợp corticoid từ sterol để thay thế cho các sơ đồ tổng hợp trước đây đi từ các nguyên

liệu cũ như diosgenin hay solasodine. Gần đây, nhóm nghiên cứu này đã nghiên cứu và

hoàn thiện một số phương pháp tổng hợp pregnane và một số dẫn xuất của chúng từ

9α-hydroxyandrostenedione (9α-OH AD) [87].

Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Thu Thủy và cs đã nghiên cứu tổng

hợp thành công 8 dẫn xuất polyhydroxysteroid đi từ diosgenin sử dụng các tác nhân

oxy hóa để thu được các diol như SeO2, OsO4 hay acid formic [88].

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng nghiên cứu

Thông tin về mẫu Hình ảnh

- Tên Việt Nam: Sao biển gai

- Tên khoa học: Acanthaster planci

Linnaeus, 1758

 Hệ thống phân loại

- Giới: Động vật (Animalia)

- Ngành: Da Gai (Echinodermata)

- Lớp Sao biển (Asteroidea)

- Bộ Valvatida Mặt phía trên - Họ Acanthasteridae

- Chi Acanthaster

 Thông tin mẫu

- Thời gian thu mẫu: 05/2012

- Địa điểm thu mẫu: Vịnh Vân Phong, gần

Nha Trang, Khánh Hòa, ở độ sâu 5 – 10 m

- Giám định loài: PGS TS. Đỗ Công Thung,

Viện tài nguyên và môi trường biển

- Mẫu tiêu bản số SBG 05-2012 lưu tại Viện

hóa học các hợp chất thiên nhiên Mặt phía dưới

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất

 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn 60 F254 (20 x 20 cm,

Merck). Vệt chất được phát hiện dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm

hoặc dùng thuốc thử là dung dịch acid H2SO4 10% trong EtOH phun đều trên bản

mỏng, sấy khô và đốt nóng trên bếp điện đến khi hiện màu vệt chất.

 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột thường (CC): sử dụng các loại chất hấp phụ Silica gel 60 cỡ hạt 0,04

÷ 0,063 mm (230 ÷ 400 mesh) và 0,063 ÷ 0,200 mm (70 ÷ 230 mesh) của Merck,

Polychrome 1 (Teflon, Biolar, Latvia), Silica gel KSK (50 ÷ 160 µm, Sorbpolimer,

Krasnodar, Russia) và chất hấp phụ Florisil (200 ÷ 300 mesh, Aldrich Chemical Co.).

 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100, cột pha đảo Diasfer-110-

C18 (10 µm, 250 x 15 mm), cột Discovery C18 (5 µm, 250 x 15 mm) và cột Ascentis

RP-Amide (5 µm, 250 x 4,6 mm) của Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương

(PIBOC), Vladivostok, Nga.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là sử dụng

kết hợp giữa các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm:

 Phổ khối (ESI –MS) và phổi khối phân giải cao (HR ESI-MS)

Phổ khối lượng ESI-MS được đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS.

Phổ khối phân giải cao HR ESI-MS được đo trên máy Bruker Impact II Q-TOF

của Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), Vladivostok, Nga. Mẫu đo được

hòa tan trong MeOH ở nồng độ 0,001 mg/mL.

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D, 2D NMR được đo trên máy Bruker 500

MHz của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; hoặc máy

Bruker DRX 500 MHz và Bruker Avance III 700 MHz của Viện Hóa sinh hữu cơ Thái

Bình Dương (PIBOC), Vladivostok, liên bang Nga. Tất cả các phép đo đều sử dụng

tetramethylsilane (TMS) làm chất chuẩn nội. Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân

được sử dụng bao gồm:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D): 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1D-

TOCSY.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D): HSQC, HMBC, COSY, NOESY,

ROESY

- Dung môi được sử dụng: CDCl3, CD3OD, Pyridin-d5, DMSO-d6

 Sắc ký khí (GC)

Sắc ký khí được tiến hành trên máy Agilent 6580, khí mang He (1,7 ml/ph), chương trình nhiệt độ trong giải 100 – 270oC ở 5oC/phút, cột mao quản HP-1 MS capilla (30 m x 0,32 mm), tinl. 150oC, tdet. 280oC.

 Độ quay cực [α]D

Độ quay cực được đo trên máy Perkin-Elmer 141 polarimeter của Viện Hóa sinh

hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), Vladivostok, liên bang Nga.

 Thủy phân, xác định cấu hình tuyệt đối của mạch nhánh khung steroid và

các gốc đường

a. Thủy phân steroid glycoside thành aglycon

Hợp chất glycoside (2 mg) trong 1 mL dung dịch acid 2M trifluoroacetic (TFA) được gia nhiệt ở100oC trong 2 giờ, sau đó, lớp nước được chiết bằng CHCl3 (3 x 0,5

mL/lần), tách lấy pha hữu cơ, làm khan, rồi đem cất loại dung môi dưới áp suất giảm

thu được hỗn hợp cặn cô.

Hỗn hợp thu được được tinh chế bằng phương pháp HPLC sử dụng cột Ascentis

RP-Amide (5 µm, 250 x 4.6 mm), tốc độ dòng 1 mL/phút với hệ dung môi rửa giải là

MeOH-H2O (9:1) thu được phần aglycon sạch [71].

b. Xác định cấu hình tuyệt đối của các gốc đường

Hợp chất glycoside (1,2 mg) trong 0,5 mL dung dịch acid 2M trifluoroacetic (TFA) được gia nhiệt ở 100oC trong 2 giờ, sau đó, lớp nước được rửa bằng CHCl3 (3 x 0,5 mL/lần),

loại bỏ pha hữu cơ. Lớp nước được quay cất dưới áp suất giảm thu được cặn cô.

Cặn cô thu được được tiếp tục cho phản ứng với 0,5 mL (R)-(-)-2-octanol (Aldrich) và 1 giọt acid TFA đặc ở 130oC trong 6 giờ. Dung dịch sau phản ứng đem cất

loại dung môi, bổ sung thêm 0,6 mL hỗn hợp pyridine/acetic anhydride (1:1) để ở nhiệt

độ phòng trong 7 giờ thu được hỗn hợp đường được acetyl hóa. Hỗn hợp này được

phân tích bằng phương pháp sắc ký khí (GC) so sánh với các đường chuẩn cũng được

acetyl hóa theo cách tương tự [89].

2.2.3. Các phương pháp đánh giá hoạt tính 2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

Các tác nhân

- Phosphate buffered saline (PBS), L-glutamine, dung dịch penicillin-

streptomycin (10.000 U/mL, 10µg/ml) do hãng Sigma-Aldrich cung cấp (St.

Louis, Missouri, Mỹ).

- The Basal Medium Eagle (BME), Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

(DMEM), McCoy’s 5A Modified Medium (McCoy’s 5A), huyết thanh bê (FBS-

fetal bovine serum), thạch mềm (soft agar) được cung cấp bởi hãng

ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Mỹ.

- Tác nhân MTS: 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,

được cung cấp từ công ty Promega, Madison, Wisconsin, Mỹ.

Các dòng tế bào ung thư ở người:

- Tế bào ung thư ruột kết HCT-116 (ATCC® số CCL-247TM) - Tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 (ATCC® số HTB-38TM) - Tế bào khối u sắc tố ác tính RPMI-7951 (ATCC® số HTB-66TM) - Tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 (ATCC® số HTB-26TM) - Tế bào ung thư vú T-47D (ATCC® số HTB-133TM) - Tế bào ung thư gan Hep G2 (ATCC® số HB-8065TM) - Tế bào ung thư cổ tử cung HeLa (ATCC® số CCL-2TM) - Tế bào ung thư não T98G (ATCC® số CRL-1690TM)

Môi trường nuôi cấy tế bào: các tế bào Hep G2, HeLa, T98G, HCT-116, RPMI-7951,

MDA-MB-231, T-47D, HT-29 được nuôi trong môi trường DMEM/10% FBS (Hep

G2, HeLa, T98G, HCT-116, RPMI-7951, MDA-MB-231); McCoy’s 5A/10% FBS

(HT-29); hoặc RPMI-1640/10% FBS (T-47D) tương ứng, được bổ sung thêm 10%

(v/v) huyết thanh bê FBS, 2 mM L-glutamine, và 1% penicilin-streptomycin trong môi

trường có chứa 5% khí CO2.

Phương pháp gây độc tế bào: các tế bào được pha với mật độ 5,0 x 104 tế bào/200 µL

môi trường phù hợp với từng dòng tế bào trong phiến 96 giếng. Sau 24 giờ ủ, các hợp

chất thử nghiệm được đưa vào môi trường nuôi tế bào ở mức nồng độ 10-150 µM,

trong khi đó chất đối chứng được đưa vào môi trường hoàn toàn chỉ có DMEM hoặc McCoy’s 5A. Các tế bào tiếp tục được nuôi ở 37 oC trong 24 giờ trong môi trường phù

hợp có 5% khí CO2. Sau đó, chất nhuộm MTS (20 µL) được thêm vào các giếng thử, và tế bào được ủ thêm 3 giờ ở 37 oC trong môi trường có 5% khí CO2. Độ hấp thụ được

đo ở 490/630 nm trên máy đo microplate (Power Wave XS, Mỹ). Tất cả các mẫu thử

được thực hiện lặp lại 3 lần. Nồng độ của các mẫu thử gây ra ức chế 50% khả năng

sống của các tế bào ung thư được tính toán (IC50) [90, 91].

(cid:4)ẫ(cid:6) (cid:8)(cid:9)ô(cid:11)(cid:12) (cid:13)ó (cid:13)(cid:9)ấ(cid:16) (cid:16)(cid:9)ử

% ức chế của chất thử = (cid:4)ẫ(cid:6) (cid:8)(cid:9)ô(cid:11)(cid:12) (cid:13)ó (cid:13)(cid:9)ấ(cid:16) (cid:16)(cid:9)ử(cid:18)(cid:19)ẫ(cid:6) (cid:13)ó (cid:13)(cid:9)ấ(cid:16) (cid:16)(cid:9)ử (cid:20) 100%

2.2.3.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế hình thành khối u trên thạch mềm

Các tế bào ở mật độ 2,4x104 tế bào/mL được nuôi trong 1 mL của môi trường cơ

bản Eagle’s agar 0,3% có chứa 10% FBS. Các chất thử nghiệm sau đó được thêm vào

môi trường nuôi tế bào ở nồng độ không gây độc là 5, 10, và 15 µM. Môi trường nuôi cấy được duy trì ở 37 oC, có 5% khí CO2 ủ trong 2 đến 4 tuần và các khối u hình thành

được đo bằng kính hiển vi Motic AE20 (Trung Quốc) và phần mềm hình ảnh Image J

theo phương pháp được miêu tả bởi Colburn [92].

2.2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu

mô tuyến vú bằng xét nghiệm chữa lành vết thương (wound-healing assay)

Tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231, ở mật độ 3,0 x 105 tế bào/mL,

được đưa vào nuôi trong phiến 6 giếng. Khi tế bào đã phát triển thành một tổ hợp 80%,

môi trường sau đó được loại bỏ và một vết tổn thương được tạo ra bằng cách cạo bằng

một đầu pipet 200 µL vô trùng. Sau đó, các tế bào được rửa lại 2 lần với PBS và thêm

vào môi trường có chứa các chất thử ở nồng độ 10 µM và để trong 48 giờ. Các thí

nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi nhóm. Vùng tổn thương được kiểm tra ở các khoảng

thời gian khác nhau (0, 24 và 48 giờ) bằng kính hiển vi Motic AE20 và phần mềm hình

ảnh NIH Image (Image J). Độ rộng của vùng tổn thương được đo và sau đó tính phần

trăm khoảng cách di chuyển của tế bào cho khu vực di chuyển của các tế bào ung thư

biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 [93].

CHƯƠNG III - THỰC NGHIỆM

Mẫu tươi A.planci 10 kg

1.Nghiền nhỏ 2. Ngâm EtOH (3x20 L), lọc 3. Quay cất loại dung môi

BÃ

Dịch cô EtOH (100 g)

MeOH (3 x 500 mL)

DCM (3 x 500 mL)

n-Hexan (3 x 500 mL)

Cặn MeOH (50 g)

Cặn DCM (27,5 g)

Cặn Hexan (14,7 g)

CH2Cl2/MeOH: 100:0 – 0:100

Polychrome 1 dm H2O, EtOH

FM (35 g)

FD1 1,8 g

FD2 5,2 g

FD3 4,7 g

Sephadex LH-20 CC-SiO2; HE (7:1)

Sephadex LH-20 CC-SiO2; HE (9:1)

3.1. Phân lập các hợp chất từ loài sao biển Acanthaster planci

FD5 4,5 g RP-C18 MeOH/H2O (7:3)

FD4 3,1 g RP-C18 MeOH/H2O (2:3)

CC-SiO2 DCM/EtOH:gradient

AP7 2,74 g

AP8 70 mg

AP5 7,6 mg

AP6 1,50 g

AP10 6,3 mg

AP9 25,8 mg

FM2 2,1 g

FM7 2,6 g

FM1 1,4 g

FM3 3,2 g

FM4 4,5 g

FM5 3,8 g

FM6 5,5 g

FM9 2,3 g

CC - SiO2, CHCl3-EtOH: 2:1 → 1:2

FM8 3,1 g CC - SiO2, CHCl3-EtOH: 2:1 → 1:2

4.1

…

4.4

4.6

…

4.13

4.5

5.2 20,3 mg

5.1 15,8 mg

EtOH/H2O/NH4OAc: (60:24:1) HPLC (C-18)

CC-Florisil,CHCl3-EtOH (2:1 →1:2) HPLC (C-18), EtOH/H2O/NH4OAc (60:24:1)

EtOH/H2O/NH4OAc: (45:54:1) HPLC (C-18)

AP12 14,4 mg

AP2 1,9 mg

AP1 7,0 mg

AP4 1,4 mg

AP3 0,3 mg

AP11 6,9 mg

AP13 2,5 mg

AP14 8,9 mg

Hình 3.1: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ sao biển Acanthaster planci

Mẫu sao biển tươi (10 kg), được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu, sau khi rã đông

rửa qua bằng nước để loại muối và tạp bẩn, để ráo nước. Mẫu được thái nhỏ rồi ngâm

chiết 3 lần (mỗi lần 1 tuần) với EtOH (20 lít/lần) ở nhiệt độ phòng, lọc lấy dịch chiết.

Gộp các dịch chiết EtOH lại, quay cất chân không để loại bỏ dung môi dưới áp suất

giảm thu được cặn cô EtOH. Cặn cô này được hòa tan lần lượt bằng các dung môi có

độ phân cực tăng dần là n-hexan (3 x 500 mL), dichlomethan (3 x 500 mL), và

methanol (3 x 500 mL). Phần dung dịch sau khi được hòa tan bằng mỗi dung môi được

lọc, quay cất chân không thu được các cặn tương ứng lần lượt là cặn hexan (14,7 g),

cặn DCM (27,5 g), và cặn MeOH (50 g).

Cặn MeOH (50 g) được hòa tan trong 1 lít nước cất. Dịch nước này được chia

thành hai phần và tiến hành loại muối bằng cách cho chạy qua hai cột Polychrome

1(đường kính cột Ф 75 mm, chiều dài cột L = 260 mm), dung môi rửa giải là nước cất.

Sử dụng dung dịch AgNO3 1N để kiểm tra đến khi dịch nước thu được không còn tạo

kết tủa với AgNO3 1N thì dùng ethanol (3 lít) để rửa giải. Gom phần dịch rửa giải bằng

ethanol của hai cột lại với nhau, quay cất chân không thu được 35 g cặn ký hiệu là FM.

Phân đoạn FM (35 g) được tiến hành phân tách trên cột sắc ký (đường kính cột

Ф 60 mm, chiều dài cột L = 160 mm) với chất hấp phụ là silica gel pha thường (silica

gel KSK, Sorbpolimer, Krasnodar, Nga, kích thước 50 – 160 µm) sử dụng các hệ dung

môi rửa giải lần lượt có độ phân cực tăng dần với tỷ lệ về thể tích tương ứng là CH2Cl2

– EtOH (từ 9:1 đến 5:1), CH2Cl2 – EtOH – H2O (từ 5:1:0,1 đến 1:1:0,2), EtOH – H2O

(từ 15: đến 5:1) thu được chín phân đoạn ký hiệu là: FM1 (1,4 g), FM2 (2,1 g), FM3

(3,2 g), FM4 (4,5 g), FM5 (3,8 g), FM6 (5,5 g), FM7 (2,6 g), FM8 (3,1 g), và FM9 (2,3

g).

Phân đoạn FM4 (4,5 g) được tiến hành phân tách bằng sắc ký cột nhanh với

chất hấp phụ là silica gel pha thường (silica gel KSK, kích thước 50 – 160 µm; đường

kính cột Ф 40 mm, chiều dài cột L = 85 mm) với hệ dung môi rửa giải là CHCl3 –

EtOH từ 2:1 đến 1:2 (2:1 (1,5 lít), 1:1 (2,5 lít), 1:2 (1 lít)) thu được 13 phân đoạn được

ký hiệu là 4.1 (351 mg), 4.2 (373,5 mg), 4.3 (146,8 mg), 4.4 (541,0 mg), 4.5 (249,5

mg), 4.6 (127 mg), 4.7 (401,5 mg), 4.8 (312,3 mg), 4.9 (218,1 mg), 4.10 (407, 2 mg),

4.11 (315,6 mg), 4.12 (216,4 mg), 4.13 (138,8 mg).

Phân đoạn 4.4 (541 mg) được tiến hành phân tách bằng sắc ký cột nhanh pha

thường (đường kính cột Ф 40 mm, chiều dài cột L = 50 mm) với chất hấp phụ là

Florisil (SiO2, MgO 15,5%, Na2SO4 0,5%, cỡ hạt 100-200 µm) và hệ dung môi rửa giải

là CHCl3 – EtOH (từ 2:1 đến 1:2) thu được 6 phân đoạn ký hiệu là 441 (20,4 mg), 442

(35,2 mg), 443 (29 mg), 444 (68,7 mg), 445 (40,0 mg), 446 (21,8 mg).

Phân đoạn nhỏ 444 (68,7 mg) hòa tan trong 1 mL ethanol và lọc qua màng lọc

C18 (độ dày màng 0,2 mm), dịch lọc sau đó được tiến hành tinh chế sử dụng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao RP-HPLC sử dụng cột sắc ký Diasfer-110-C18 (cỡ hạt

10 µm, đường kính cột Ф 15 mm, chiều dài cột L = 250 mm, tốc độ dòng 2,5

mL/phút), và sau đó dùng cột Discovery C18 (cỡ hạt 5 µm, đường kính cột Ф 10 mm,

chiều dài cột L = 250 mm, tốc độ dòng 1,2 mL/phút), với dung môi rửa giải là hỗn hợp

dung môi EtOH – H2O – 1M NH4OAc (60:24:1, v/v/v) thu được hai hợp chất sạch là

AP1 (7,0 mg, tR = 24,5 phút, Rf = 0,67 với hệ dung môi BuOH/EtOH/H2O: 4/1/2) ở

dạng rắn, vô định hình; và AP2 (1,9 mg, tR = 25,2 phút, Rf = 0,65 với hệ dung môi

BuOH/EtOH/H2O: 4/1/2) cũng ở dạng rắn, vô định hình.

Phân đoạn 4.5 (249,5 mg) được hòa tan trong 4 mL ethanol và lọc qua màng lọc

C18 (độ dày màng 0,2 mm), dịch lọc sau đó được tiến hành tinh chế sử dụng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao RP-HPLC sử dụng cột sắc ký Diasfer-110-C18 (cỡ hạt

10 µm, đường kính cột Ф 15 mm, chiều dài cột L = 250 mm, tốc độ dòng 2,5

mL/phút), và sau đó dùng cột Discovery C18 (cỡ hạt 5 µm, đường kính cột Ф 10 mm,

chiều dài cột L = 250 mm, tốc độ dòng 1,2 mL/phút), với dung môi rửa giải là hỗn hợp

dung môi EtOH – H2O – 1M NH4OAc (60:24:1, v/v/v) thu được hai hợp chất sạch là

AP3 (0,3 mg, tR = 20,3 phút, Rf = 0,63 với hệ dung môi BuOH/EtOH/H2O: 4/1/2) và

AP4 (1,4 mg, 12,4 phút, Rf = 0,60 với hệ dung môi BuOH/EtOH/H2O: 4/1/2) cùng ở

dạng chất rắn, vô định hình.

Phân đoạn FM5 (3,8 g) được tiến hành phân tách bằng sắc ký cột nhanh với

chất hấp phụ là silica gel pha thường (silica gel KSK, kích thước 50 – 160 µm; đường

kính cột Ф 50 mm, chiều dài cột L = 80 mm) với hệ dung môi rửa giải là CHCl3 –

EtOH từ 2:1 đến 1:2 v/v (2:1 (1,0 lít), 1:1 (1,5 lít), 1:2 (0,5 lít)) thu được hợp chất

AP12 (14,4 mg, Rf = 0,55 với hệ dung môi BuOH/EtOH/H2O: 4/1/2) và hai phân đoạn

hỗn hợp chất được ký hiệu là 5.1 ( 313 mg), 5.2 (524 mg).

Phân đoạn 5.1 (313 mg) được hòa tan trong 2,5 mL ethanol và lọc qua màng lọc

C18 (độ dày màng 0,2 mm), dịch lọc sau đó được tiến hành tinh chế sử dụng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao RP-HPLC sử dụng cột sắc ký Diasfer-110-C18 (cỡ hạt

10 µm, đường kính cột Ф 15 mm, chiều dài cột L = 250 mm, tốc độ dòng 2,5

mL/phút), với dung môi rửa giải là hỗn hợp dung môi EtOH – H2O – 1M NH4OAc

(45:54:1, v/v/v) thu được chất sạch là AP11 (6,9 mg, tR = 13,1 phút, Rf = 0,52 với hệ

dung môi BuOH/EtOH/H2O: 4/1/2) ở dạng rắn, vô định hình.

Phân đoạn 5.2 (524 mg) được hòa tan trong 4,5 mL ethanol, lọc qua màng lọc

C18 (độ dày màng 0,2 mm), dịch lọc sau đó được tiến hành tinh chế sử dụng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao RP-HPLC sử dụng cột sắc ký Diasfer-110-C18 (cỡ hạt

10 µm, đường kính cột Ф 15 mm, chiều dài cột L = 250 mm, tốc độ dòng 2,5

mL/phút), với hệ dung môi rửa giải là EtOH – H2O – 1M NH4OAc (50:49:1, v/v/v) thu

được hai hợp chất sạch là AP13 (2,5 mg, tR = 14,4 phút, Rf = 0,57 với hệ dung môi

BuOH/EtOH/H2O: 4/1/2), và hợp chất AP14 (8,9 mg, tR = 18,5 phút, Rf = 0,57 với hệ

dung môi BuOH/EtOH/H2O: 4/1/2) cùng ở dạng chất rắn, vô định hình.

Cặn DCM (27,5 g) hòa tan trong 5 mL DCM và tẩm khô với silica gel pha

thường (cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm, của hãng Merck, Đức), và được đưa lên phân tách

trên cột sắc ký (đường kính cột Ф 65 mm, chiều dài cột L = 250 mm) với chất hấp phụ

là silica gel pha thường (cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm, của hãng Merck, Đức). Dung môi rửa

giải là hệ dung môi DCM – MeOH với độ phân cực tăng dần (gradient nồng độ) từ

100:0 đến 0:100 (v/v), thu được 5 phân đoạn ký hiệu là FD1 (1,8 g), FD2 (5,2 g), FD3

(4,7 g), FD4 (3,1 g), và FD5 (4,5 g).

Phân đoạn FD2 (5,2 mg) được phân tách trên cột sắc ký Sephadex LH-20

(đường kính cột Ф 20 mm, chiều dài cột L = 500 mm) với hệ dung môi rửa giải là

MeOH – DCM (95:5, v/v) thu được ba phân đoạn ký hiệu là D2.1 (0,75 g), D2.2 (2,93

g), và D2.3 (0,56 g). Ba phân đoạn được phân tích định tính bằng sắc ký bản mỏng

(TLC) với hệ dung môi rửa giải n-hexan – EtOAc (7:1, v/v), và hiện hình bằng thuốc

thử FeCl3 (thuốc thử cho sterol), thấy phân đoạn D2.2 cho một vết màu hồng tím (màu

của sterol với thuốc thử).

Phân đoạn nhỏ D2.2 (2,93 g) tiếp tục được tinh chế lại bằng sắc ký cột silica gel

pha thường (cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm, đường kính cột Ф 30 mm, chiều dài cột L = 150

mm), rửa giải bằng dung môi n-hexan – EtOAc (12:1, v/v) thu được phân đoạn chất chính kết tủa màu trắng. Phân đoạn chất này được kết tinh lại trong MeOH, ở 5oC thu

được hợp chất AP7 (2,74 g) ở dạng tinh thể hình kim, màu trắng (TLC với hệ dung

môi DCM/MeOH: 10/1 (v/v) có Rf = 0,71; hiện màu hồng tím với thước thử FeCl3,

màu hồng với H2SO4).

Phân đoạn nhỏ D2.3 (0,56 g) được phân tách trên cột sắc ký silica gel (đường

kính cột Ф 20 mm, chiều dài cột L = 150 mm) và rửa giải với hệ dung môi n-

hexan/diclometan/aceton (gradient nồng độ) thu được 3 phân đoạn nhỏ là D231 (125

mg), D232 (158 mg) và D233 (131 mg). Phân đoạn nhỏ D232 (58 mg) được tinh chế

lại bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 (đường kính cột Ф 10 mm, chiều dài cột L = 500

mm) với hệ dung môi rửa giải MeOH/DCM (95:5), thu được phân đoạn chất có màu

tím sẫm. Phân đoạn chất này được kết tinh lại trong hệ dung môi 3% DCM trong MeOH và để lạnh ở 5 – 10oC. Tinh thể được rửa lại 3 lần với dung môi MeOH lạnh,

thu được hợp chất AP8 (70 mg) dạng tinh thể hình kim, màu tím sẫm (TLC với hệ

dung môi DCM/aceton: 9/1 có Rf = 0,64; hiện UV mạnh ở bước sóng 254 nm).

Phân đoạn FD3 (4,7 g) được hòa tan hoàn toàn trong 3 mL dung môi 5% DCM

trong MeOH và được phân tách trên cột Sephadex LH-20 (đường kính cột Ф 20 mm,

chiều dài cột L = 500 mm), rửa giải bằng hệ dung môi 5% DCM trong MeOH (200

mL) thu được ba phân đoạn D31 (0,41 g), D32 (2,49 g), D33 (1,02 g).

Phân đoạn D32 (2,49 g) được tinh chế lại bằng sắc ký cột silica gel pha thường

(cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm, đường kính cột Ф 30 mm, chiều dài cột L = 150 mm) rửa giải

bằng dung môi n-hexan/EtOAc (9:1, v/v) thu được phân đoạn chất chính D323 (1,86

g). Phân đoạn D323 này được tinh chế lại trên cột Sephadex LH-20 (đường kính cột Ф

20 mm, chiều dài cột L = 500 mm) cũng với hệ dung môi rửa giải 5% DCM trong

MeOH. Chất thu được sau đó được kết tinh lại 2 lần trong MeOH lạnh, thu được hợp

chất AP6 (1,58 g) dạng tinh thể hình kim, màu trắng (TLC của AP6 hiện màu tím hồng

với thuốc thử H2SO4 , Rf = 0,69 với hệ dung môi DCM – MeOH: (10:1, v/v)).

Phân đoạn FD4 (3,1 g) được phân tách trên cột sắc ký silica gel (cỡ hạt 0,04 –

0,063 mm, Merck, Đức; đường kính cột Ф 30 mm, chiều dài cột L = 150 mm) với hệ

dung môi rửa giải là CH2Cl2 – MeOH (gradient nồng độ) thu được 5 phân đoạn ký hiệu

là D41 – D45. Phân đoạn D44 (113,5 mg) được hòa tan trong 1 mL dung dịch MeOH -

H2O: 2/3 (v/v) và được đưa lên cột sắc ký pha đảo (RP-18, đường kính cột Ф 15 mm,

chiều dài cột L = 250 mm) rửa giải cũng bằng dung môi MeOH - H2O: 2/3 thu được

hợp chất AP9 (25,8 mg) màu trắng, vô định hình, (TLC của AP9 có Rf = 0,35 với hệ

dung DCM/MeOH: 9:1 (v/v), và bắt UV mạnh ở bước sóng 254 nm, không hiện hình

với thuốc thử H2SO4, hiện hình màu đỏ cam với thuốc thử Dragendoff).

Phân đoạn FD5 (4,5 g) được hòa tan trong 2 mL hệ dung môi 5% DCM trong

MeOH và đưa lên cột sắc ký Sephadex LH-20 (đường kính cột Ф 20 mm, chiều dài cột

L = 500 mm), rửa giải bằng hệ dung môi 5% DCM trong MeOH thu được 4 phân đoạn

là D51 – D54.

Phân đoạn D52 (93 mg) được hòa tan trong 1 mL dung dịch MeOH - H2O: 2/3

(v/v) và được đưa lên cột sắc ký pha đảo (RP-18, đường kính cột Ф 15 mm, chiều dài

cột L = 250 mm) rửa giải cũng bằng dung môi MeOH - H2O: 1/1 thu được hợp chất

AP10 (6,3 mg, có Rf = 0,33 với hệ dung DCM/MeOH: 9:1 (v/v), bắt UV mạnh ở bước

sóng 254 nm, không hiện hình với thuốc thử H2SO4, hiện hình màu đỏ cam với thuốc

thử Dragendoff) màu trắng, vô định hình.

Phân đoạn D54 (104,7 mg) được phân tách trên cột sắc ký silica gel (cỡ hạt

0,04 – 0,063 mm, đường kính cột Ф 20 mm, chiều dài cột L = 150 mm), rửa giải bằng

hệ dung môi DCM – MeOH: 9:1 (v/v) thu được 3 phân đoạn ký hiệu là D541 – D543.

Phân đoạn D543 (35,7 mg) được tinh chế lại bằng cột sắc ký pha đảo (RP-18, đường

kính cột Ф 15 mm, chiều dài cột L = 250 mm) rửa giải bằng hệ dung môi MeOH – H2O

(7:3, v/v) thu được hợp chất AP5 (7,6 mg, có Rf = 0,68 với hệ dung môi

BuOH/EtOH/H2O: 4/1/2, v/v/v) ở dạng chất rắn, vô định hình.

3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được

3.2.1. Hợp chất Planciside A (AP1)(Hợp chất mới).

: - 30,7 (c 0,7, MeOH)

(cid:25)(cid:26) Độ quay cực: [(cid:2)](cid:24) (+)-HR ESI-MS m/z [M + Na]+: 815,4279, tính toán lý thuyết cho CTPT là

Chất rắn, vô định hình. Rf = 0,67 (TLC, silica gel, BuOH – EtOH – H2O: 4:1:2)

C39H68O16Na = 815,4405.

(-)-HR ESI-MS m/z [M – H]: 791,4650, tính toán lý thuyết cho CTPT là

C39H67O16 = 791,4429.

(+)-HR ESI-MS/MS của mảnh ion ở m/z 815: m/z 797 [(M + Na) – H2O]+, 653 [(M+Na) – C6H10O5] +, 635 [(M + Na) – C6H10O5 – H2O] +, 521 [(M + Na) – C6H10O5 – C5H8O4] +, 503 [(M + Na) – C6H10O5 – C5H8O4 – H2O] +, 317 [C6H10O5 + C5H8O4 + Na]+.

(-)-HR ESI-MS/MS của mảnh ion ở m/z 791: m/z 629 [(M – H) – C6H10O5],

611 [(M – H) – C6H10O5 – H2O], 497 [(M – H) – C6H10O5 – C5H8O4], 479 [(M – H) –

C6H10O5 – C5H8O4 – H2O].

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.1 và 4.2)

3.2.2. Hợp chất Planciside B (AP2) (Hợp chất mới)

: - 37,9 (c 0,2, MeOH)

(cid:25)(cid:26) Độ quay cực: [(cid:2)](cid:24) (+)-HR ESI-MS m/z [M + Na]+: 813,4476, tính toán lý thuyết cho CTPT là

Chất rắn, vô định hình. Rf = 0,65 (TLC, silica gel, BuOH – EtOH – H2O: 4:1:2)

C40H70O15Na = 813,4612.

(-)-HR ESI-MS m/z [M – H]: 789,4891, tính toán lý thuyết cho CTPT là

C40H69O15 = 789,4642.

(+)-HR ESI-MS/MS của mảnh ion ở m/z 813: m/z 795 [(M + Na) – H2O]+, 667 [(M+Na) – C6H10O4] +, 649 [(M + Na) – C6H10O4 – H2O] +, 521 [(M + Na) – C6H10O4 – C6H10O4] +.

(-)-HR ESI-MS/MS của mảnh ion ở m/z 789: m/z 771 [(M – H) – H2O], 643

[(M – H) – C6H10O4], 625 [(M – H) – C6H10O4 – H2O], 497 [(M – H) – C6H10O4 –

C6H10O4], 479 [(M – H) – C6H10O4 – C6H10O4 – H2O].

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.3)

3.2.3. Hợp chất Planciside C (AP3) (Hợp chất mới)

: + 3,3 (c 0,03, MeOH)

(cid:25)(cid:26) Độ quay cực: [(cid:2)](cid:24) (+)-HR ESI-MS m/z [M + Na]+: 915,3855, tính toán lý thuyết cho CTPT là

Chất rắn, vô định hình. Rf = 0,63 (TLC, silica gel, BuOH – EtOH – H2O: 4:1:2)

C40H69O18SNa2 = 915,4000.

(-)-HR ESI-MS m/z [M – Na]: 869,4461, tính toán lý thuyết cho CTPT là

C40H69O18S = 869,4210.

(+)-HR ESI-MS/MS của mảnh ion ở m/z 915: m/z 795 [(M + Na) – NaHSO4]+, 777 [(M+Na) – NaHSO4 – H2O] +, 635 [(M + Na) – NaHSO4 – C7H12O4] +, 503 [(M + Na) – NaHSO4 – C7H12O4 – C5H8O4] +, 315 [C7H12O4 + C5H8O4 + Na]+.

(-)-HR ESI-MS/MS của mảnh ion ở m/z 869: m/z 851 [(M – Na) – H2O], 709

[(M – Na) – C7H12O4], 691 [(M – Na) – C7H12O4 – H2O], 577 [(M – Na) – C7H12O4 –

C5H8O4], 97 [HSO4].

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.4 và 4.5)

3.2.4. Hợp chất Planciside D (AP4)

: - 21,7 (c 0,06, MeOH)

(cid:25)(cid:27) Độ quay cực: [(cid:2)](cid:24) (+)-HR ESI-MS m/z [M + Na]+: 927,4954, tính toán lý thuyết CTPT là

Chất rắn, vô định hình. Rf = 0,60 (TLC, silica gel, BuOH – EtOH – H2O: 4:1:2)

C45H76O18Na = 927,4924.

(-)-HR ESI-MS m/z [M – H]: 903,4915, tính toán lý thuyết cho CTPT là

C45H75O18 = 903,4959.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.6 và 4.7)

3.2.5. Hợp chất AP11: Acanthaglycoside G (Hợp chất mới)

: + 21,6 (c 0,1, MeOH)

(cid:25)(cid:27) Độ quay cực: [(cid:2)](cid:24) (+)-HR ESI-MS m/z: 1187,4533 [M + Na]+, tính toán lý thuyết cho CTPT là

Chất rắn, vô định hình. Rf = 0,52 (TLC, silica gel, BuOH – EtOH – H2O: 4:1:2)

C51H81Na2O26S = 1187,4532.

(-)-HR ESI-MS m/z: 1141,4735 [M – Na], tính toán lý thuyết cho CTPT là

C51H81O26S = 1141,4737.

(+)-HR ESI-MS/MS của mảnh ion [M + Na]+ ở m/z 1187: 1067 [(M + Na) − NaHSO4]+, 921 [(M + Na) − NaHSO4 − С6H10O4]+, 775 [(M + Na) − NaHSO4 – 2 ×

С6H10O4]+, 771 [С6H12O5 + 4 × С6H10O4 + Na]+, 607 [4  С6H10O4 Na]+, 461 [3 

С6H10O4 Na]+, 315 [2  С6H10O4 Na]+.

(-)-HR ESI-MS/MS của mảnh ion [M – Na] ở m/z1141: 995 [(M – Na) –

С6H10O4], 849 [(M – Na) – 2 × С6H10O4], 703 [(M – Na) – 3 × С6H10O4], 557 [(M –

Na) – 4 × С6H10O4], 411 [(M – Na) – 5 × С6H10O4], 393 [(M – Na) – 4 × С6H10O4 –

С6H12O5], 97 [HSO4].

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.8 và 4.9).

Kết quả GC xác định phân tử đường của hợp chất AP11:

tR các đường của hợp chất AP11: D-quinovose (tR: 20,60; 20,82; 21,16 và 21,45

phút); D-fucose (tR: 20,60; 21,12 và 21,54 phút).

fucose): 20,70; 21,23 và 21,61 phút; tR-(L-quinovose): 20,44; 20,92 và 21,50 phút; tR-(L-fucose):

tR của mẫu đường chuẩn: tR-(D-quinovose): 20,64; 20,86; 21,21 và 21,47 phút; tR-(D-

20,95; 21,03; 21,21 và 21,30 phút.

3.2.6. Hợp chất AP12: Pentareguloside G

: + 7,0 (c 0,5, MeOH)

(cid:25)(cid:27) Độ quay cực: [(cid:2)](cid:24) (+)-HR ESI-MS m/z: 1173,4356 [M + Na]+, tính toán lý thuyết cho CTPT là

Chất rắn, vô định hình. Rf = 0,55 (TLC, silica gel, BuOH – EtOH – H2O: 4:1:2)

C50H79O26SNa2 = 1173,4376

(-)-HR ESI-MS m/z: 1127,4552 [M – Na], tính toán lý thuyết cho CTPT là

C50H79O26S = 1127,4586.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.10; 4.11)

3.2.7. Hợp chất AP13: Acanthaglycoside A

: – 8,7 (c 0,4; H2O)

(cid:25)(cid:28) Độ quay cực: [(cid:2)](cid:24) (+)-HR ESI-MS m/z: 1271,5003 [M+Na]+, tính toán lý thuyết cho CTPT

Chất rắn, vô định hình. Rf = 0,57 (TLC, silica gel, BuOH – EtOH – H2O: 4:1:2)

C56H89O27Na2S = 1271,5107

(-)-HR ESI-MS m/z: 1225,5316 [M – Na], tính toán lý thuyết cho CTPT

C56H89O27S = 1225,5312

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.11 và 4.13)

3.2.8. Hợp chất AP14: Maculatoside

Chất rắn, vô định hình. Rf = 0,57 (TLC, silica gel, BuOH – EtOH – H2O: 4:1:2)

Độ quay cực: [α]D ± 0 (c 0,5; CH3OH)

(+)-HR ESI-MS m/z: 1273,5167 [M+Na]+, tính toán lý thuyết cho CTPT

C56H91O27Na2S = 1273,5264.

(-)-HR ESI-MS m/z: 1227,5450 [M–Na], tính toán lý thuyết cho CTPT

C56H91O27S = 1227,5468.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.14 và 4.15)

3.2.9. Hợp chất AP5: 3-O-sulfothornasterol A

: + 39 (c 0,15, EtOH)

(cid:25)(cid:26) Độ quay cực: [(cid:2)](cid:24) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.16)

Chất rắn, vô định hình. Rf = 0,68 (TLC, silica gel, BuOH – EtOH – H2O: 4:1:2)

3.2.10. Hợp chất AP6: 5-ergost-7-en-3-ol

Tinh thể hình kim, màu trắng

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.17)

3.2.11. Hợp chất AP7: Cholesterol

Tinh thể hình kim, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 148oC

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.18)

3.2.12. Hợp chất AP8: Astaxanthin

Tinh thể hình kim, màu tím, nhiệt độ nóng chảy: 222oC

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.19)

3.2.13. Hợp chất AP9: Thymine

Tinh thể hình kim, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 316-317 oC

1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δH ppm: 1,72 (3H, d, J = 1Hz, H-7); 7,24 (1H, d, J = 1 Hz, H-6). 13C-NMR (DMSO- d6, 125 MHz) δC ppm: 11,8 (C-7); 107,7 (C-5);

137,7 (C-6); 151,5 (C-2); 164,9 (C-4).

3.2.14. Hợp chất AP10: Uracil

Tinh thể hình kim, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 335 oC

1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δH ppm: 5,44 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5); 7,38 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-6); 11,0 (1H, NH). 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δC ppm:

100,2 (C-5); 142,1 (C-6); 151,5 (C-2); 164,3 (C-4).

3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của cholesterol

Hợp chất AP7 được xác định là cholesterol (xem phần 4.1.11) được lựa chọn là

chất đầu để chuyển hóa thành các dẫn xuất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid.

3.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất polyhydroxysteroid từ cholesterol

3.3.1.1. Tổng hợp chất cholest-3β,6α-diol (15c) và cholest-3β,6β-diol (16c)

Cholesterol (540 mg, 1,4 mM) được hòa tan trong 8 mL THF khan ở 0oC trong

môi trường khí trơ. Thêm vào bình phản ứng 7 mL dung dịch 1M BH3 trong THF (7,0

mM), hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ 0oC trong 4 giờ. Dung dịch NaOH 5N

(1,5 mL, 7,5 mM) và 0,75 mL dung dịch 30% H2O2 (6,5 mM) được nhỏ giọt từ từ vào bình phản ứng ở 0oC. Hỗn hợp phản ứng tiếp tục được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1

giờ, sau đó được quay cất chân không dưới áp suất giảm để loại bỏ THF thu được dịch

cô thô. Dịch cô này được chiết với ethyl acetate (3 x 15 mL), pha hữu cơ tiếp tục được

rửa lần lượt với dung dịch 1N HCl, dung dịch NaHCO3 bão hòa, dung dịch muối NaCl

bão hòa, sau đó được làm khan bằng Na2SO4, lọc và quay cất chân không. Cặn thô thu

được được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là DCM-MeOH

100:1 thu được hai hợp chất 15c (402 mg, 71%) và 16c (50 mg, 9%).

Hợp chất 15c: chất rắn màu trắng, m. p.191-193 oC; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH

(ppm): 3,55 (1H, m, H-3); 3,39 (1H, ddd, J = 4,5; 10,5; 11,0 Hz, H-6); 0,90 (3H, d, J =

6,5 Hz, CH3-21); 0,86 (6H, d, J = 6,5 Hz, CH3-26, CH3-27); 0,80 (3H, s, CH3-19); 0,65 (3H, s, CH3-18); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC (ppm): 71,1 (C-3); 69,4 (C-6); 56,2

(C-14); 56,18 (C-5); 53,8 (C-17); 51,6 (C-9); 42,6 (C-13); 41,5 (C-4); 39,8 (C-12);

39,5 (C-24); 37,3 (C-1); 36,3 (C-10); 36,1 (C-22); 35,7 (C-20); 34,3 (C-8); 32,1 (C-7);

30,8 (C-2); 28,1 (C-16); 28,0 (C-25); 24,2 (C-15); 23,8 (C-23); 22,8 (C-26); 22,5 (C-

27); 21,1 (C-11); 18,6 (C-19); 13,4 (C-21); 12,0 (C-18).

Hợp chất 16c: chất rắn màu trắng, m. p. 212-215 oC; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH

(ppm): 4,09 (1H, br, H-6); 3,70 (1H, br, H-3); 0,68 (3H, s, CH3-18); 0,86 (6H, d, J = 6,5 Hz, CH3-26, CH3-27); 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-21); 1,14 (3H, s, CH3-19); 13C

NMR (125 MHz, CDCl3) δC (ppm): 73,3 (C-3); 66,2 (C-6); 56,5 (C-17); 56,4 (C-14);

43,6 (C-9); 42,8 (C-13); 40,2 (C-10); 40,1 (C-12); 39,5 (C-24); 36,2 (C-22); 35,8 (C-

20); 34,8 (C-1); 34,4 (C-7); 33,6 (C-23); 30,6 (C-2); 30,1 (C-5); 28,3 (C-8); 28,0 (C-

25); 27,5 (C-4); 26,1 (C-19); 24,2 (C-15); 23,8 (C-16); 22,8 (C-26); 22,5 (C-27); 20,9

(C-11); 18,7 (C-21); 12,1 (C-18).

3.3.1.2. Tổng hợp chất cholestan-5-ene-3β,4β-diol (17c), cholestan-5-ene-3β,7β-diol

(18c) và cholestan-5-ene-3β,4β,7β-triol (19c)

Cholesterol (1,0 g; 2,58 mM) được hòa tan hoàn toàn trong 20 mL dioxan và

thêm vào 0,1 mL nước cất, khuấy ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm vào hỗn hợp phản ứng 0,516 g SeO2 (4,64 mM) và gia nhiệt lên nhiệt độ 80oC, khuấy trong 80 giờ. Hỗn

hợp phản ứng sau đó được lọc loại bỏ tạp chất rắn, dịch lọc được quay cất chân không

thu được cặn thô. Cặn thô này được hòa tan trong 20 mL DCM và được rửa với nước

(20 mL), chiết lấy pha hữu cơ, làm khan bằng Na2SO4, lọc và quay cất loại bỏ dung

môi thu được sản phẩm thô. Sản phẩm được tinh chế bằng sắc ký cột nhanh silica gel

với dung môi rửa giải là n-hexan/ethyl acetate (9:1, v/v) thu được ba sản phẩm là 17c

(500 mg, 50%), 18c (20 mg, 2%), và 19c (35 mg, 3,5%).

Hợp chất 17c: chất rắn màu trắng, m. p. 175-178 oC; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH

(ppm): 5,68 (1H, m, H-6); 4,13 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-4); 3,56 (1H, dt, J = 4,0, 11,5 Hz,

H-3); 1,18 (3H, s, CH3-19); 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-21); 0,86-0,87 (6H, d, J = 7,0 Hz, CH3-26, CH3-27); 0,68 (3H, s, CH3-18); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC (ppm):

142,8 (C-5); 128,8 (C-6); 77,3 (C-4); 72,3 (C-3); 56,9 (C-17); 56,1 (C-14); 50,2 (C-9);

42,3 (C-13); 39,7 (C-12); 39,5 (C-24); 36,9 (C-1); 36,2 (C-22); 36,0 (C-10); 35,8 (C-

20); 32,1 (C-8); 31,8 (C-7); 28,2 (C-15); 28,0 (C-25); 25,4 (C-16); 24,3 (C-2); 23,8 (C-

23); 22,8 (C-26); 22,6 (C-27); 21,1 (C-11); 20,6 (C-19); 18,7 (C-21); 11,9 (C-18).

Hợp chất 18c: chất rắn, màu trắng, m. p. 178-180 oC; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH

(ppm): 5,60 (1H, dd, J = 2,5; 5,0 Hz, H-6); 3,84 (1H, br s, H-7); 3,58 (1H, m, H-3);

2,36 – 2, 25 (m, 2H, Hα,β-4); 0,99 (3H, s, CH3-19); 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-21); 0,86-0,87 (6H, d, J = 6,5 Hz, CH3-26, CH3-27); 0,68 (3H, s, CH3-18);13C NMR (125

MHz, CDCl3) δC (ppm): 146,3 (C-5); 123,9 (C-6); 71,4 (C-3); 65,4 (C-7); 55,9 (C-17),

49,4 (C-14); 42,3 (C-9); 42,2 (C-13); 42,0 (C-4); 39,5 (C-24); 39,2 (C-12); 37,5 (C-8);

37,4 (C-10); 37,0 (C-1); 36,2 (C-22); 35,8 (C-20); 31,4 (C-2); 28,3 (C-15); 28,0 (C-

25); 24,3 (C-16); 23,7 (C-23); 22,8 (C-26); 22,6 (C-27); 20,7 (C-11); 18,8 (C-21); 18,3

(C-19); 11,6 (C-18).

Hợp chất 19c: chất rắn, màu trắng, m. p. 190-192 oC; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH

(ppm): 5,87 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6); 4,18 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-4); 3,94 (1H, d, J = 3,5

Hz, H-7); 3,60 (1H, m, H-3); 2,01 (1H, dt, J = 3,0; 3,5; 2,5 Hz, H-12); 1,18 (3H, s,

CH3-19); 0,93 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-21); 0,86-0,87 (6H, d, J = 6,5 Hz, CH3-26, CH3- 27); 0,69 (3H, s, CH3-18); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC (ppm): 147,0 (C-5); 129,7

(C-6); 76,9 (C-4); 72,1 (C-3); 65,3 (C-7); 55,8 (C-17); 49,3 (C-14); 42,6 (C-9); 42,1

(C-13); 39,5 (C-24); 39,1 (C-12); 37,6 (C-8); 37,0 (C-10); 36,7 (C-1); 36,2 (C-20);

35,8 (C-22); 28,3 (C-15); 28,0 (C-25); 25,1 (C-2); 24,3 (C-16); 23,7 (C-23); 22,8 (C-

26); 22,6 (C-27); 20,1 (C-11); 19,4 (C-21); 18,7 (C-19); 11,6 (C-18).

3.3.1.3. Tổng hợp chất cholestane-3β,5α,6α-triol (20c)

Cholesterol (100 mg, 0,258 mM) được hòa tan trong 5 mL hỗn hợp dung môi

dioxan:H2O (50:1, v/v), khuấy ở nhiệt độ phòng. Thêm vào 150 mg NMO (1,28 mM)

và dung dịch 4% OsO4 (300 µL, 0,05 mM), gia nhiệt và đun hồi lưu phản ứng trong 48

giờ, sau đó làm mát xuống nhiệt độ phòng, thêm vào 5 mL dung dịch 20% NaHSO3.

Hỗn hợp phản ứng được khuấy thêm 10 phút, sau đó quay cất chân không để loại bỏ

dioxan. Dịch phản ứng sau đó được chiết với ethyl acetate (5 x 10 mL), pha hữu cơ

được tách riêng, làm khan bằng Na2SO4, quay cất chân không thu được cặn sản phẩm

thô. Sản phẩm được tinh chế bằng sắc ký cột nhanh silica gel rửa giải bằng hệ dung

môi DCM – MeOH (99:1, v/v) thu được sản phẩm 20c (80 mg, 74%).

Hợp chất 20c: chất rắn, màu trắng, m. p. 240-241oC. 1HNMR (500 MHz, CDCl3) δH

(ppm): 4,05 (1H, m, H-3); 3,67 (1H, d like, J = 10,0 Hz, H-6); 2,14 (1H, dd, J = 13,0;

3,5 Hz, H-4); 1,98 (brt, J = 12,0 Hz, H-12); 1,69 (m, 1H, H-7); 0,96 (3H, s, CH3-19);

0,90 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-21); 0,86 (6H, d, J = 6,5 Hz, CH3-26, CH3-27); 0,64 (3H, s, CH3-18); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC (ppm): 76,7 (C-5); 70,6 (C-6); 67,5 (C-

3); 56,2 (C-17); 55,9 (C-14); 44,6 (C-9); 42,7 (C-13); 39,8 (C-12); 39,5 (C-24); 39,1

(C-10); 38,3 (C-4); 36,1 (C-20); 35,8 (C-22); 35,2 (C-7); 33,5 (C-8); 31,0 (C-1); 30,6

(C-2); 28,2 (C-16); 28,0 (C-25); 24,1 (C-15); 23,9 (C-23); 22,8 (C26); 22,5 (C-27);

21,2 (C-11); 18,6 (C-21); 15,5 (C-19); 12,1 (C-18).

3.3.1.4. Tổng hợp chất cholestane-3β,5α,6β-triol (21c)

Acid formic 88% (2 mL) được thêm vào hỗn hợp của cholesterol (200 mg, 0,516 mM) trong 4 mL THF khan, khuấy và gia nhiệt đến 40-45oC, thêm vào từ từ 0,6 mL dung dịch 30% H2O2, khuấy ở nhiệt độ 40-45oC trong 10 phút sau đó làm mát

xuống nhiệt độ phòng và khuấy phản ứng trong 12 giờ. Kết thúc phản ứng, thêm vào

hỗn hợp 10 mL nước và 15 mL ethyl acetate, khuấy 10 phút sau đó chiết phân lớp lấy

pha hữu cơ, pha nước được chiết lại với ethyl acetate (3 x 10 mL). Pha hữu cơ được

gom lại sau đó rửa lần lượt với dung dịch 10% NaHCO3, 5% NaOH, muối NaCl bão

hòa, và nước cất, làm khan pha hữu cơ bằng Na2SO4, lọc và quay cất chân không thu

được cặn thô. Cặn thô sau đó được hòa tan trong 15 mL dung dịch 3% KOH trong

MeOH, đun hồi lưu trong 15 phút, sau đó quay cất chân không thu được sản phẩm thô.

Sản phẩm được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải

là DCM –MeOH (19:1, v/v) thu được hợp chất 21c (160 mg, 75%).

Hợp chất 21c: chất rắn, màu trắng, m. p. 231oC; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH

(ppm): 4,05 (1H, m, H-3); 3,49 (1H, br s, H-6); 0,90 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-21); 0,86 (6H, d, J = 6,5 Hz, CH3-26, CH3-27); 0,68 (3H, s, CH3-18). 13C NMR (125 MHz,

CDCl3) δC (ppm): 76,0 (C-5); 75,7 (C-6); 67,5 (C-3); 56,3 (C-17); 56,0 (C-14); 45,8

(C-9); 42,8 (C-13); 40,3 (C-4); 40,0 (C-12); 39,5 (C-24); 38,3 (C-10); 36,2 (C-20);

35,8 (C-22); 34,3 (C-16); 32,4 (C-1); 30,6 (C-8); 30,3 (C-7); 28,3 (C-2); 28,0 (C-25);

24,2 (C-23); 23,9 (C-15); 22,8 (C-26); 22,6 (C-27); 21,2 (C-11); 18,7 (C-21); 16,8 (C-

19); 12,2 (C-18).

3.3.2. Tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid từ cholesterol 3.3.2.1. Tổng hợp chất cholest-4-ene-3,6-dione (22c) và cholestane-3,6-dione (24c)

Pyridinium chlorochromate (PCC, 5eq) được thêm vào hỗn hợp của 1eq

cholesterol (hoặc cholestan-3β,6α-diol (15c)) được hòa tan trong 30 mL CH2Cl2. Hỗn

hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Kiểm tra bảng mỏng TLC

thấy hết chất đầu thì thêm vào 20 mL diethylether, khuấy thêm 5 phút thì dừng phản

ứng. Hỗn hợp dung dịch phản ứng được đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường, và

rửa giải bằng dung môi diethylether. Dung môi rửa giải ra khỏi cột được gom lại và

quay cất chân không loại dung môi thu được cặn sản phẩm màu vàng nâu. Sản phẩm

được tinh chế lại bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi

DCM/diethylether (1:1, v/v) thu được sản phẩm 22c (80%); hoặc sản phẩm 24c (82%).

Hợp chất 22c: chất rắn, màu trắng, m.p. 132-134oC. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH

(ppm): 6,18 (s, 1H, H-4); 2,69 (dd, J = 4,0; 11,0 Hz, H-7); 2,53 (m, 1H, H-2); 1,18 (s, 3H,

H-19); 0,94 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H-21); 0,88 (2d, J = 6,5 Hz, 6H, H-26, H-27); 0,74 (s, 3H, H-18). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC (ppm): 202,3 (C-3); 199,5 (C-6); 161,1 (C-5);

125,4 (C-4); 56,6 (C-14); 56,0 (C-17); 51,0 (C-9); 46,8 (C-2); 42,5 (C-13); 39,8 (C-10);

39,45 (C-24); 39,1 (C-12); 36,0 (C-22); 35,7 (C-8); 35,5 (C-1); 34,2 (C-20); 33,9 (C-7);

28,0 (C-25); 28,0 (C-16); 24,0 (C-15); 23,8 (C-23); 22,8 (C-26); 22,5 (C-27); 20,9 (C-11); 18,6 (C-21), 17,5 (C-19); 11,9 (C-18). (+)-ESI-MS: m/z 398.62 [M+H]+.

Hợp chất 24c: chất rắn, màu trắng, m.p. 172-173oC. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm):

2,59 (brs, 1H, H-4α); 2,40 (1H, dd, J= 13,5; 4,5 Hz, H-7α); 2,37-2,34 (m, 1H, H-7); 2,30-2,32

(m, 2H, H-2); 0,96 (s, 3H, H-19); 0,92 (d, 3H, J = 6,5 Hz, H-21); 0,87 (d, 3H, J = 6,5 Hz, H-26); 0,86 (d, 3H, J = 6,5 Hz, H-27); 0,69 (s, 3H, H-18). (+)-ESI-MS: m/z 401.2 [M+H]+

3.3.2.2. Tổng hợp chất cholest-4-ene-3β,6α-diol (26c)

Hòa tan hoàn toàn cholest-4-en-3,6-dione (22c, 530 mg, 1,38 mM, 1 eq) trong

20 mL hỗn hợp dung môi DCM/MeOH (1:1, v/v) và khuấy ở nhiệt độ phòng. Thêm

vào hỗn hợp phản ứng CeCl3.7H2O (530 mg, 1,38 mM, 1 eq) và NaBH4 (232 mg, 6,07

mmol, 4,4 eq), khuấy phản ứng trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó dung dịch axit 1N

HCl được thêm vào phản ứng cho đến khi đạt môi trường trung tính. Thêm vào 15 mL

DCM, khuấy 5 phút và chiết lấy pha hữu cơ, làm khan pha hữu cơ bằng Na2SO4 sau đó

quay cất loại bỏ dung môi thu được sản phẩm thô. Tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký

cột silica gel n-hexan/EtOAc (5:1, v/v) thu được hợp chất 26c (580 mg, 89%). Hợp chất 26c: chất rắn màu trắng, vô định hình. 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δH

(ppm): 5,65 (H-4); 4,22 (brt, H-3); 4,19 (m, H-6); 1,04 (s, 3H, Me-19); 0,90 (d, J 6,0

Hz, 3H, Me-21); 0,865 (d, J 7,0 Hz, 3H, Me-26); 0,860 (d, J 6,5 Hz, 3H, Me-27); 0,68 (s, 3H, Me-18). 13C NMR (125 MHz, CDCl3), δC (ppm): 149,2 (C-5); 119,8 (C-4);

68,6 (C-3); 67,9 (C-6); 56,2 (C-14); 55,8 (C-17); 54,2 (C-9); 42,5 (C-13); 42,1 (C-2);

39,7 (C-10); 39,5 (C-24); 37,9 (C-12); 36,1 (C-22); 36,0 (C-8); 35,8 (C-1); 34,4 (C-

20); 29,0 (C-7); 28,1 (C-25); 28,0 (C-16); 24,2 (C-15); 23,8 (C-23); 22,8 (C-26); 22,5

(C-27); 21,0 (C-11); 19,7 (C-21); 18,7 (C-19); 12,0 (C-18). 3.3.2.3. Tổng hợp chất 6α-hydroxy-4α,5α-epoxycholeatane-3-one (27c) và 4α,5α-

epoxycholeatane-3,6-dione (28c)

Hợp chất cholest-4-ene-3β,6α-diol (26c, 285 mg, 0,7 mM) được hòa tan trong 20 mL DCM ở 0oC, sau đó thêm vào hỗn hợp dung dịch của m-CPBA (290 mg, 1,48 mmol) trong 10 mL DCM ở 0oC, khuấy phản ứng trong 15 giờ trong điều kiện làm lạnh bằng đá

muối. Dung dịch phản ứng sau đó được rửa lần lượt bằng dung dịch 10% Na2CO3 (3 x 20

mL), nước cất (30 mL). Pha hữu cơ được tách riêng, làm khan bằng Na2SO4, quay cất

chân không để loại bỏ dung môi, thu được hỗn hợp hai sản phẩm 4α,5α-epoxy-choletane-

3β,6α-diol và 4β,5β-epoxy-choletane-3β,6α-diol. Hỗn hợp hai sản phẩm này (210 mg) tiếp tục được hòa tan trong 10 mL DCM, khuấy ở 0oC trong 10 phút, sau đó thêm vào hỗn hợp

phản ứng tác nhân Dess-Martin (420 mg, 0,96 mmol), tiếp tục khuấy phản ứng trong 1

giờ. Pha loãng hỗn hợp phản ứng bằng 10 mL diethylether rồi thêm vào 20 mL dung dịch

NaHCO3 (có chứa 4 g Na2S2O3). Khuấy hỗn hợp này trong 15 phút sau đó chiết lấy pha

hữu cơ, rửa lại bằng 30 mL dung dịch NaHCO3 bão hòa, 30 mL nước cất, làm khan bằng

Na2SO4, quay cất chân không thu được cặn thô. Cặn thô này được tinh chế bằng sắc ký cột

silica gel với hệ dung môi rửa giải là hexan/EtOAc (9:1, v/v) thu được hai sản phẩm là 27c

(36 mg, 12,3%) và 28c (60 mg, 14,5%). Hợp chất 27c: chất rắn, màu trắng, vô định hình. 1H-NMR (CDCl3, 500MHz), δH (ppm):

4,17 (dd, 1H, J 3,0 & 10,0 Hz, H-6); 3,48 (s, 1H, H-4); 1,13 (s, 3H, H-19); 0,90 (d, 3H, J 6.5

Hz, H-21); 0,87 (d, 3H, J 6.0 Hz, H-26); 0,86 (d, 3H, J 6.0 Hz, H-27); 0,69 (s, 3H, H-18). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz), δC (ppm): 206,0 (C=O, C-3); 72,4 (C-5); 64,7 (C-6); 56,7

(C-4); 56,1 (C-14); 55,6 (C-17); 46,3 (C-9); 42,8 (C-13); 39,5 (C-2); 39,4 (C-24); 38,2 (C-

12); 37,5 (C-10); 36,1 (C-22); 35,7 (C-8); 34,1 (C-20); 32,6 (C-1); 28,0 (C-25, C-7); 28,01

(C-16); 26,6 (C-15); 24,2 (C-15); 23,8 (C-23); 22,8 (C-27); 22,6 (C-26); 21,6 (C-11); 19,2 (C-19); 18,6 (C-21); 12,0 (C-18). (+)-ESI-MS: m/z 417,2 [M+H]+. Hợp chất 28c: chất rắn, màu trắng, vô định hình. 1H-NMR (CDCl3, 500MHz), δH

(ppm): 3,13 (s, 1H, H-4); 1,15 (s, 3H, H-19); 0,92 (d, 3H, J 6,5 Hz, H-21); 0,87 (d, 3H, J 6,5 Hz, H-26); 0,86 (d, 3H, J 6,5 Hz, H-27); 0,72 (s, 3H, H-18). 13C-NMR (CDCl3,

125 MHz), δC (ppm): 203,2 (C=O, C-6); 202,8 (C=O, C-3); 71,4 (C-5); 60,1 (C-4);

56,4 (C-17); 56,0 (C-14); 46,15 (C-2); 46,13; 42,9 (C-13); 39,5 (C-24); 39,11 (C-12);

39,07 (C-10); 36,1(C-22); 35,7 (C-8); 35,6 (C-20); 32,5 (C-7); 28,0 (C-25); 27,9 (C-

16); 27,6 (C-1); 24,0 (C-15); 23,8 (C-23); 22,8 (C-27); 22,6 (C-26); 21,7 (C-11); 18,7 (C-19); 18,6 (C-21); 12,0 (C-18). (+)-ESI-MS: m/z 415,2 [M+H]+. 3.3.2.4. Tổng hợp các hydroximinosteroid (23c, 25c,29c,31c) và chất 30c

Các hợp chất ketone (22c, 24c, 27c, 28c, 1 eq) được hòa tan trong 5 mL

pyridine, sau đó thêm vào dung dịch phản ứng hydroxylamine hydrochloride (10 eq).

Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, sau đó quay cất loại bỏ dung

môi. Cặn sau quay cất được hòa tan trong 10 mL ethyl acetate và rửa với nước (3 x 10

mL), chiết lấy pha hữu cơ, làm khan bằng Na2SO4, quay cất chân không thu được sản

phẩm thô. Cặn thô sau đó được tinh chế lại bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hệ

dung môi DCM/MeOH (20:1, v/v) thu được các sản phẩm tương ứng với các hợp chất

ketone ban đầu là 23c (75 mg, 85%), 25c (35 mg, 81%), 29c (5 mg, 19,3%), 30c (3,5

mg, 13,4%), 31c (7,0 mg, 22,5%).

Hợp chất 23c: chất rắn màu trắng, vô định hình. 1H-NMR (CDCl3, 500MHz) H

(ppm): 6,53 (s, 1H, H-4); 3,33 (dd, 1H, J 4,5, 15,5 Hz, H-7α); 3,08 (brd, 1H, J 15,0 Hz,

H-2β); 1,00 (s, 3H, H-19); 0,91 (dd, 3H, J 6,5 Hz, H-21); 0,87 (d, 3H, J 2,0 Hz, H-26);

0,86 (d, 3H, J 2,5 Hz, H-27); 0,69 (s, 3H, H-18). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) C

(ppm): 157,2 (C-6); 156,8 (C-3); 147,8 (C-5); 119,2 (C-4); 56,7 (C-14); 56,1 (C-17);

51,3 (C-9); 42,6 (C-13); 39,5 (C-7, C-24); 38,3 (C-12); 36,1 (C-22); 35,7 (C-20); 33,6

(C-1); 33,0 (C-10); 29,7 (C-8); 28,2 (C-16); 28,0 (C-25); 24,1 (C-23); 23,8 (C-15);

22,8 (C-26); 22,6 (C-27); 21, (C-11); 18,7 (C-21); 18,6 (C-2); 17,6 (C-19); 11,9 (C-18). (+)-ESI-MS: m/z 429,2 [M+H]+. Hợp chất 25c: chất rắn, màu trắng. 1H-NMR (CDCl3, 500MHz) δH (ppm): 3,33 (dd,

1H, J 4,5; 14,0 Hz, H-7); 3,27 (brd, 1H, J 12,5 Hz, H-2); 0,91 (d, 3H, J 6,5 Hz, H-

21); 0,87 (d, 3H, J 6,0 Hz, H-26); 0,86 (d, 3H, J 6,0 Hz, H-27); 0,85 (s, 3H, H-19); 0,67 (s, 3H, H-18). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC (ppm): 160,5 (C-6); 159,6 (C-3);

56,6 (C-14); 56,2 (C-17); 54,0 (C-9); 50,9 (C-5); 42,9 (C-10); 39,7 (C-13); 39,5 (C-24,

C-12); 36,6 (C-22); 36,1 (C-20); 35,7 (C-8); 35,6 (C-16); 29,5 (C-25); 28,3 (C-7); 28,1

(C-2); 28,0 (C-1); 24,1 (C-19); 23,8 (C-15); 22,8 (C-23); 22,5 (C-4); 21,4 (C-27); 19,9 (C-26); 18,6 (C-11); 12,1 (C-21); 11,8 (C-18). (+)-ESI-MS: m/z 431,2 [M+H]+. Hợp chất 29c: chất rắn, màu trắng. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz), δH (ppm): 4,16 (dd,

1H, J 5,0; 11,5 Hz, H-6β); 3,81 (1H, s, H-4); 2,59 (dd, 1H, J 4,0; 19,5 Hz, H-8); 1,06

(s, 3H, H-19); 0,90 (d, 3H, J 6,0 Hz, H-21); 0,86 (2d, 6H, J 1,5; 6,0 Hz, H-26, 27); 0,68 (s, 3H, H-18). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz), δC (ppm): 154,9 (C-3); 89,7 (C-5); 69,5

(C-4); 64,8 (C-6); 56,2 (C-14); 55,6 (C-17); 54,2 (C-9); 45,7 (C-2); 42,8 (C-13); 39,5

(C-10); 39,4 (C-24); 38,0 (C-12); 37,4 (C-22); 36,1 (C-1); 35,8 (C-8); 34,1 (C-7); 28,1

(C-25); 28,0 (C-16); 25,7; 24,2 (C-15); 23,8 (C-23); 22,8 (C-26); 22,6 (C-27); 21,5 (C- 11); 18,6 (C-21); 17,9 (C-19); 12,0 (C-18). (+)-HR ESI-MS: m/z 432,3474[M+H]+. Hợp chất 30c: chất rắn, màu trắng. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz), δH (ppm): 4,05 (m,

1H, H-6); 3,28 (d, 1H, J 3,5 Hz, H-4); 2,60 (dd, 1H, J 3,5 & 15,0 Hz, H-7); 2,08 (d,

1H, J 3,0 Hz, H-12); 2,06 (d, 1H, H-24); 1,96 (t, 1H, J 12,5 Hz, H-7); 1,89 (m, 1H, H-

8); 1,87 (m, 1H, H-25); 1,64 (m, 1H, H-2); 1,56 (m, H-15); 1,53 (m, H-2); 1,52 – 1,50

(m, 2H, H-11); 1,03 (s, 3H, H-19); 0,92 (d, 3H, J 6,5 Hz, H-21); 0,87 (d, 3H, J 6,5 Hz, H-26); 0,86 (d, 3H, J 6,0 Hz, H-27); 0,70 (s, 3H, H-18). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz),

δC (ppm): 205,6 (C=O, C-3); 69,9 (C-5); 64,7 (C-6); 62,6 (C-4); 56,5 (C-14); 56,1 (C-

17); 48,1 (C-9); 46,5 (C-7); 42,7 (C-13); 39,5 (C-12); 39,3 (C-24); 38,1 (C-10); 36,1

(C-22); 35,7 (C-20); 34,8 (C-8); 29,2 (C-1); 28,01 (C-23); 28,0 (C-25); 25,7 (C-2);

24,1 (C-15); 23,8 (C-16); 22,8 (C-26); 22,6 (C-27); 21,5 (C-11); 18,6 (C-21); 18,3 (C-

19); 11,9 (C-18). (+)-HR ESI-MS: m/z 434,3633.

Hợp chất 31c: chất rắn, màu trắng. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz), δH (ppm): 4,44 (s,

1H, H-4); 2,64 (m, 1H, H-7); 2,58 (m, 1H, H-2); 2,40 (dd, 1H, J 5,0; 19,5 Hz, H-2);

2,14 (m, 1H, H-7); 2,10 (m, 1H, H-8); 2,00 (dt, 1H, J 3,5; 6,0 Hz, H-12); 1,86 (m, 1H,

H-9); 0,91 (d, 3H, J 6,5 Hz, H-21); 0,88 (d, 3H, J 6,5 Hz, H-26); 0,87 (s, 3H, H-19); 0,86 (d, 3H, J 6,5 Hz, H-27); 0,69 (s, 3H, H-18). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz), δC

(ppm): 161,3 (C=NOH, C-6); 154,6 (C=NOH, C-3); 91,0 (C-5); 85,7 (C-4); 57,5 (C-

14); 55,9 (C-17); 49,0 (C-9); 42,4 (C-13); 40,7 (C-10); 39,5 (C-12; C-24); 39,3 (C-2);

36,1 (C-22); 35,7 (C-8); 32,1 (C-20); 30,4 (C-23); 28,0 (C-7); 27,97 (C-25); 27,8 (C-

16); 24,2 (C-15); 23,8 (C-23); 22,8 (C-2); 22,54 (C-27); 22,47 (C-26); 19,4 (C-11); 18,7 (C-21); 14,8 (C-19); 11,8 (C-18). (+)-HR ESI-MS: m/z 445,3427[M+H]+.

3.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và các dẫn xuất tổng hợp được

3.4.1. Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực phân lập từ sao biển

Acanthaster planci

Các hợp chất steroid phân cực phân lập được từ loài sao biển A. planci được tiến

hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào. Sau đó, những hợp chất có hoạt tính tiếp tục

được nghiên cứu sâu hơn dựa trên các thử nghiệm về khả năng ức chế hình thành khối

u trên thạch mềm và khả năng ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú

MDA-MB-231.

3.4.1.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Các hợp chất steroid phân cực phân lập được từ sao biển A. planci (bao gồm:

AP1, AP11, AP12, AP13, AP14) được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng

tế bào ung thư ở người như dòng tế bào ung thư ruột kết (HCT-116), ung thư sắc tố ác

tính (RPMI-7951), ung thư đại trực tràng (HT-29), và 2 dòng tế bào ung thư biểu mô

tuyến vú T-47D và MDA-MB-231 theo phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

được nêu trong mục 2.2.3.1. Thử nghiệm được tiến hành tại phòng sinh học thực

nghiệm, viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm khoa học liên bang

Nga, Vladivostok, liên bang Nga.

3.4.1.2. Hoạt tính ức chế sự hình thành khối u trên thạch mềm

Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự hình thành khối u trên thạch mềm của

các hợp chất steroid phân cực phân lập được (AP1, AP11, AP12, AP13, AP14) được

nêu trong mục 2.2.3.2. Thử nghiệm được tiến hành tại phòng sinh học thực nghiệm,

viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm khoa học liên bang Nga,

Vladivostok, liên bang Nga.

3.4.1.3. Hoạt tính in vitro ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú

Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô

tuyến vú MDA-MB-231 của các hợp chất asterosaponin (AP11, AP12, AP13, AP14)

phân lập được từ loài sao biển A. planci được mô tả trong mục 2.2.3.3. Thử nghiệm

được tiến hành tại phòng sinh học thực nghiệm, viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình

Dương, Viện Hàn lâm khoa học liên bang Nga, Vladivostok, liên bang Nga.

3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất tổng hợp được từ cholesterol

Các hợp chất hydroxysteroid (15c-21c), các hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c,

31c) và các chất trung gian (22c, 24c, 26c-28c, 30c) được đánh giá hoạt tính gây độc

tế bào trên các dòng tế bào ung thư gan (Hep G2), ung thư cổ tử cung (HeLa) và ung

thư não (T98G) theo phương pháp mô tả ở phần 2.2.3.1.

Trong đó: - Các thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào Hep G2 và HeLa

được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên

nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Các thử nghiệm trên dòng tế bào T98G được thực hiện tại Trung tâm

nghiên cứu Hợp chất tự nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Hàn Quốc (KIST),

Gangneung, Hàn Quốc.

CHƯƠNG IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Nghiên cứu thành phần hóa học loài sao biển Acanthaster planci

Từ các cặn chiết của sao biển Acanthaster planci phân lập được 14 hợp chất bao

gồm 11 hợp chất steroid, 1 hợp chất carotenoid và 2 hợp chất nucleobase. Trong đó có

4 hợp chất mới là các hợp chất AP1, AP2, AP3 và AP11.

4.1.1. Hợp chất AP1: Planciside A (Hợp chất mới)

Hình 4.1: Phổ (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP1

Hình 4.2: Phổ (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP1

Hợp chất AP1 phân lập được ở dạng chất rắn, vô định hình. Trên phổ khối

lượng phân giải cao (+)-HR ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 815,4279 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho CTPT C39H68O16Na = 815,4405). Phổ (–)-HR ESI-

MS xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 791,4650 [M–H] (tính toán lý thuyết cho

CTPT C39H67O16 = 791,4429). Như vậy, CTPT của AP1 được xác định là C39H68O16 (M = 792). Khi tiếp tục bắn phá mảnh ion [M+Na]+ ở m/z 815 bằng kỹ thuật (+)-HR ESI-

MS/MS thu được các mảnh ion ở m/z: 653 [(M + Na) – C6H10O5]+, 521 [(M + Na) – C6H10O5 – C5H8O4]+, 317 [C6H10O5 + C5H8O4 + Na]+ tương ứng với sự mất lần lượt của

một đơn vị đường hexose, và hai đơn vị đường (một đơn vị hexose và một đơn vị pentose). Ngoài ra còn có các mảnh ion ở m/z: 797 [(M + Na) – H2O]+, 779 [(M + Na) – 2H2O]+, 635 [(M + Na) – C6H10O5 – H2O]+, 617 [(M + Na) – C6H10O5 – 2H2O]+, 503 [(M + Na) – C6H10O5 – C5H8O4 – H2O]+. Phù hợp với điều đó, trong phổ (–)-HR ESI-

MS/MS của pic ion [M–H] ở m/z 791 cũng cho thấy các mảnh ion thu được do sự mất

lần lượt một đơn vị đường hexose ở m/z 629 [(M – H) – C6H10O5]; hai đơn vị đường

hexose và pentose ở m/z 497 [(M – H) – C6H10O5 – C5H8O4]. Ngoài ra, trên phổ này

còn thấy các pic ion ở m/z:611 [(M – H) – C6H10O5 – H2O], 479 [(M – H) – C6H10O5 –

C5H8O4 – H2O], 461 479 [(M – H) – C6H10O5 – C5H8O4 – 2H2O]. Sự mất các phân tử

H2O cùng với sự mất lần lượt các đơn vị monosaccharide là đặc điểm rất đặc trưng của

các hợp chất polyhydroxysteroid glycoside.

Hình 4.3: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP1

Phổ 1H-NMR của AP1 cho thấy tín hiệu của 5 nhóm methyl bao gồm: 2 tín hiệu

singlet của 2 nhóm methyl góc ở δH 1,23 (3H, s, H-18); 1,15 (3H, s, H-19); 3 tín hiệu

doublet của 3 nhóm methyl (-CH3) gắn với nhóm metin (-CH) ở δH 0,95 (3H, d, J = 6,6

Hz, H-21); 0,91 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-26); và 0,89 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-27). Ngoài ra,

ở vùng trường yếu còn quan sát thấy tín hiệu của các nhóm hydroximetin (>CH-OH) ở

δH 3,42 (1H, m); 4,18 (1H, dt, J = 4,5; 11,0 Hz); 4,20 (1H, t, J = 7,0 Hz); 4,26 (1H, br

s); 4,37 (1H, dd, J = 5,6; 7,0 Hz) và hai tín hiệu của hai proton anome lần lượt ở δH

4,82 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-1') và 4,94 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1").

Phổ 13C và phổ DEPT cho thấy sự có mặt của 39 nguyên tử carbon trong phân

tử, bao gồm 5 carbon methyl, 10 carbon methylen, 21 carbon metin, 2 carbon bậc bốn và một carbon bậc ba liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy. Phổ 13C-NMR cho thấy tín

hiệu của 5 nhóm methyl, trong đó có 2 nhóm methyl góc tại δC 17,9 (C18), 17,0 (C19),

1 nhóm methyl liên kết với nhóm –CH tại δC 18,6 (C21), 2 nhóm methyl liên kết với

một carbon metin tại δC 20,0 (C26) và 19,9 ppm (C27); 7 nguyên tử carbon liên kết

trực tiếp với oxy trong phần khung aglycon cũng được khẳng định tại δC 64,8; 69,1;

70,2; 71,2; 72,8; 73,7; 77,1 ppm cùng với tín hiệu của 2 carbon anome ở δC 109,7 và 109,6 ppm. Kết hợp dữ liệu phân tích phổ 1H, 13C NMR cùng với dữ liệu phân tích phổ

khối phân giải cao có thể dự đoán chất AP1có sự tồn tại của hai đơn vị monosaccharide

trong phân tử với một đơn vị hexose, một đơn vị pentose và khung steroid không có

nối đôi có 5 vị trí carbon bậc 3 bị thế bới các nhóm hydroxy.

Hình 4.4: Phổ 13C-NMR của hợp chất AP1

Các tương tác của phổ 1H-1H COSY và phổ HMBC cho phép ghép nối các

mảnh cấu trúc từ C-1 đến C-7, C-9 đến C-12 qua C-11, C-14 đến C-17, C-17 đến C-20,

C-20/C-21/C-22, C-22 đến C-26; C-25/C-27; và của C-24 đến C-28. Các tương tác

chìa khóa trong phổ NOESY của H-3 (δH 3,42)/H-5 (δH 0,94); Hax-7 (δH 1,35)/H-5 (δH

0,94), H-9 (δH 0,82), H-14 (δH 1,01); H3-18 (δH 1,23)/Hax-11 (δH 1,76); và H3-19 (δH

1,15)/Hax-2 (δH 1,82), H-6 (δH 4,18) đã chứng minh hóa lập thể cấu trúc nhân steroid

của AP1 có dạng 5α-cholestane và nhóm –OH ở vị trí C-3 có dạng β, nhóm-OH ở vị trí

C-6 có dạng α. Mặt khác, khi so sánh các dữ liệu phổ phần aglycon của AP1 với hợp

chất đã biết là cariniferoside C (có nhân steroid dạng 5α-cholestane-

3β,4β,6α,8β,15β,16β-heptol) [95], chúng tôi nhận thấy các dữ liệu của phần nhân

steroid của chúng là tương tự nhau, chỉ khác nhau phần mạch nhánh ở vị trí từ C-23

đến C-25, và C-28 do vị trí liên kết glycoside và chuỗi disaccharide của chúng khác

nhau. Khi so sánh độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử carbon từ C-20 đến C-28

của AP1 với hợp chất đã biết culcitoside C2, được phân lập từ sao biển Culcita

novaeguineae [96], chúng tôi nhận thấy các độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử

carbon hầu như tương đương nhau chỉ có sự khác biệt nhỏ ở vị trí C-24 (δC 45,9 ppm)

và C-28 (δC 70,2 ppm) của AP1 chuyển dịch về phía trường yếu hơn một chút so với

culcitoside C2 (δC 44,9 (C-24); 69,3 (C-28) ppm). Điều này chứng tỏ có sự gắn kết của

một chuỗi carbonhydrate với một nhóm –CH2 vào vị trí C-24, và vị trí gắn kết của

chuỗi carbonhydrate là ở vị trí C-28 (–CH2). Từ các phân tích ở trên, có thể khẳng định

phần cấu trúc aglycon của AP1 có dạng 28-O-hydroxy-24-methyl-5α-cholestane-

3β,4β,6α,8β,15β,16β,28-heptol. Toàn bộ cấu trúc phẳng của phần aglycon của hợp chất

AP1 được mô tả như trong hình 4.5.

Phân tích dữ liệu phổ chuỗi disaccharide, phổ 1H có tín hiệu của hai proton anome

ở vùng trường yếu lần lượt ở δH 4,82 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-1') và 4,94 (1H, d, J= 1,5 Hz,

H-1"). Tương ứng với các tín hiệu này, trong phổ HSQC chỉ ra tín hiệu của hai carbon lần

lượt ở độ chuyển dịch hóa học δC 109,7 (H-1') và 109,6 (H-1") ppm. Chiếu xạ proton

anome trong phổ 1D TOCSY thu được tín hiệu độ chuyển dịch hóa học và hằng số tương

tác của H-1 đến H-6 của đường galactose và của H-1 đến H-5 của đường arabinose. Kết

hợp với các dữ liệu phổ COSY, HSQC, HMBC và NOESY dẫn đến quy kết được tất cả

các tín hiệu proton và carbon chuỗi carbohydrate của hợp chất AP1, ngoại trừ hai tín hiệu

carbon ở δC 83,0 và 84,8 ppm của đơn vị galactose cùng có tương tác với một tín hiệu

multiplet ở δH 3,98 ppm của proton H-2" và H-4" trong phổ HSQC. Phương pháp phổ

H2BC đã được sử dụng để xác định độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử carbon

này. Dựa trên sự xuất hiện tín hiệu tương tác của proton anome H-1" ở δH 4,94 với carbon

bên cạnh là C-2" trong phổ H2BC nên giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-2" được xác

định ở δC 83,0 ppm và giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-4" được xác định ở δC 84,8

ppm. Các dữ liệu phổ NMR chuỗi disaccharide của AP1 (xem bảng 4.2) hoàn toàn trùng

khớp với các dữ liệu phổ NMR của đơn vị đường cuối chuỗi là β-D-galactofuranosyl và

đơn vị đường đầu chuỗi là α-L-arabinofuranosyl bị thế ở vị trí C-5' đã được công bố trước

đây trong các hợp chất glycoside đã biết từ sao biển [30, 97, 98]. Sự gắn kết của chuỗi

carbohydrate vào phần aglycon của phân tử và vị trí của liên kết glycoside của hai phân tử

đường được suy ra từ các đỉnh tương tác xa trong phổ NOESY và HMBC do có xuất hiện

tín hiệu tương tác giữa H-1' của đường Araf với H2-28 (C-28) của phần aglycon, và tương

tác giữa H-1" của đường Galf với H-5' (C-5') của đường Araf. Đơn vị đường α-arabinose

được xác định ở cấu hình L và đơn vị β-galactose được xác định ở cấu hình D trong chuỗi

carbohydrate của AP1 bởi có sự trùng khớp về độ chuyển dịch hóa học và hằng số tương

tác với phổ của các steroid glycoside cũng đã được phân lập từ loài sao biển A.planci và

các loài sao biển khác [49, 50, 98]. Kết hợp tất cả các dữ liệu phổ 1D, 2D-NMR cho phép

quy kết tín hiệu của tất cả các vị trí trong cấu trúc của AP1 (xem bảng 4.1, 4.2).

Cấu hình của C-20 được xác định là 20R (20β-H) dựa trên các tương tác trong

phổ NOESY của H3-18/H3-21 và H3-21/Heq-12, cũng như độ chuyển dịch hóa học của

H3-21 ở δH 0,95 ppm, lớn hơn δH 0,90 ppm, đặc trưng cho các steroid đã được chứng

minh có cấu hình 20R hay (20β-H) với mạch nhánh bão hòa (nếu cấu hình 20S thì δH<

0,90 ppm) [99, 100]. Để xác định cấu hình của C-24, hợp chất AP1 được tiến hành

thủy phân chuỗi đường với dung dịch 2 M CF3COOH (xem 2.2.2), phần aglycon được

phân lập bằng HPLC trên cột Ascentis RP-Amide. Phần aglycon (AP1a) được đo phổ 1H NMR để xác định cấu hình C-24. Kết quả cho thấy, các proton H2-28 xuất hiện dưới

dạng hai tín hiệu tách biệt nhau ở δH 3,52 (dd, J = 6,3; 11,0 Hz) và 3,54 (J = 6,1; 11,0

Hz), và các proton H3-27 ở δH 0,870 (J = 6,7 Hz) và H3-26 ở δH 0,874 ((J = 6,7 Hz) có

độ chuyển dịch hóa học gần nhau. Trong khi đó, trong trường hợp của epimer 24R, thì

các proton H2-28 sẽ cộng hưởng như một tín hiệu broad doublet ở δH 3,52 (br d, J = 5,0

Hz) và các tín hiệu của H3-26 và H3-27 sẽ tách biệt nhau hơn [71]. Vì vậy, cấu hình của

C-24 được xác định là S.

Hình 4.5: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP1 Hình 4.6: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP1

Bảng 4.1: Dữ liệu phổ NMR phần aglycon của hợp chất AP1

ac

δC 39,7 HMBC (H→C) C3, C5 NOESY H19 C 1

26,2 H19 2

73,7 69,1 57,2 64,8 50,1 C2, C10 C6, C7, C10, C19 C5, C6, C8, C9 3 4 5 6 7

77,1 58,4 38,1 18,9 H5 H3, H7 H19 H5, H9, H14 H7, H14 H18 8 9 10 11

43,4 C9, C14 12

δH multab(J = Hz) 1,70 m 0,97 m 1,82 m 1,54 m 3,42 m 4,26 br s 0,94 m 4,18 (dt, J = 4,5; 11,0 Hz) 2,46 (dd, J = 4,4; 12,2 Hz) 1,35 (t, J = 11,8 Hz) - 0,82 (dd, J = 3,2; 12,4 Hz) - 1,76 m 1,40 m 1,94 m 1,11 m - 1,01 (d, J = 5,6 Hz) 44,5 61,2 H18 H21 H7, H9 13 14

4,37 (dd, J = 5,6; 7,0 Hz) 4,20 (t, J = 7,0 Hz) 0,96 m 1,23 s 71,2 72,8 62,8 17,9 H11, H12, H21 15 16 17 18

17,0 31,4 18,6 34,8 C8, C9, C12, C13, C15, C17 C13, C16, C17 C14, C15 C12, C13, C14, C17 C1, C5, C9, C10 C17, C20, C22 H1, H2, H6 H18, H12 19 20 21 22

26,0 H27 23

a Đo trong CD3OD, b 700,13 MHz, c 176,04 MHz

45,9 29,5 20,0 19,9 70,2 C26, C27 C24, C26, C27 C24, C25, C27 C24, C25, C26 C23, C24, C25 24 25 26 27 28 1,15 s 1,90 m 0,95 (d, J = 6,6 Hz) 1,75 m 1,11 m 1,47 m 1,20 m 1,40 m 1,83 m 0,91 (d, J = 6,6 Hz) 0,89 (d, J = 6,6 Hz) 3,71 m 3,32 m H27 H23, H24, H28 H1', H27 H1', H27

C Bảng 4.2: Dữ liệu phổ NMR chuỗi đường của hợp chất AP1 ac HMBC (H→C) NOESY δH multab (J = Hz) δC Araf

1' 2' 3' 4' 5' 109,7 83,8 79,1 83,4 68,0 C28, C3', C4' C3' C4', C5' C3', C4' C3', C4' H28 H1" H1"

4,82 (d, J = 1,7 Hz) 3,95 (dd, J = 1,7; 3,9 Hz) 3,89 (dd, J = 3,8; 6,5 Hz) 4,01 m 3,83 (dd, J = 5,1; 11,2 Hz) 3,66 (dd, J = 3,7; 11,2 Hz) Galf

a Đo trong CD3OD, b 700,13 MHz, c 176,04 MHz

1" 2" 3" 4" 5" 6" 109,6 83,0 78,9 84,8 72,5 64,4 C5', C2", C3", C4" C6" C4", C5" H5' 4,94 (d, J = 1,5 Hz) 3,98 m 3,99 m 3,98 m 3,71 m 3,63 (dd, J = 5,8; 11,3 Hz) 3,62 (dd, J = 6,8; 11,1 Hz)

Từ tất cả các phân tích nêu trên, cấu trúc hóa học của hợp chất AP1 được xác

định là [(24S)-28-O-[(β-D-galactofuranosyl-(1→5)-α-L-arabinofuranosyl]-24-methyl-

5α-cholestane-3β,4β,6α,8β,15β,16β,28-heptol. Đơn vị đường β-D-galactofuranose ở

cuối chuỗi đường và liên kết glycoside (1→5) là rất hiếm trong lớp chất

polyhydroxysteroid glycoside của sao biển. Hơn nữa, chuỗi disaccharide β-D-Galf-

(1→5)-α-L-Araf lần đầu tiên được tìm thấy trong nhóm các steroid từ sao biển. AP1

được xác định là chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và đặt tên là

Planciside A.

4.1.2. Hợp chất AP2: Planciside B (Hợp chất mới)

Hợp chất AP2 phân lập được ở dạng chất rắn, vô định hình. Phổ khối phân giải cao (+)-HR ESI-MS của AP2 xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 813,4476 [M+Na]+

(tính toán lý thuyết cho CTPT C40H70O15Na = 813,4612). Phổ (–)-HR ESI-MS xuất

hiện pic ion giả phân tử tại m/z 789,4891 [M–H] (tính toán lý thuyết cho CTPT

C40H69O15 = 789,4642). Như vậy, CTPT của AP2 được xác định là C40H70O15 (M = 790). Mảnh ion giả phân tử ở m/z 813 [M + Na]+ tiếp tục được bắn phá bằng kỹ thuật (+)-HR ESI-MS/MS thu được các pic ion lần lượt ở m/z: 667 [(M + Na) - C6H10O4]+, 521 [(M + Na) – C6H10O4 – C6H10O4]+. Đồng thời, thực hiện bắn phá tiếp mảnh ion ở

m/z 789 [M – H] bằng kỹ thuật (–)-HR ESI-MS/MS cũng thu được các pic ion tương

ứng với sự mất lần lượt của một và hai đơn vị C6H10O4 ở các tín hiệu m/z 643 [(M – H)

– C6H10O4]; 497 [(M – H) – C6H10O4 – C6H10O4]. Điều này phù hợp với sự mất của

một đơn vị đường deoxyhexose và một đơn vị đường O-methyl-pentose.

Hình 4.7: Phổ (+)-HR ESI-MS của hợp chất AP2

Hình 4.8: Phổ (–)-HR ESI-MS/MS của hợp chất AP2

Hình 4.9: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP2

So sánh các dữ liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất AP2 với hợp chất AP1,

nhận thấy các dữ liệu phổ phần aglycon của chúng gần như trùng khớp nhau, chỉ có sự

khác biệt ở phần chuỗi disaccharide (xem bảng 4.1 và bảng 4.3). Như vậy, có thể kết

luận rằng hợp chất AP2 cũng có cấu trúc của phần aglycon là 24-methyl-5α-

cholestane-3β,4β,6α,8β,15β,16β,28-heptol.

Phổ 1H-NMR của AP2 có hai tín hiệu của hai proton anome ở δH 4,31 (J =

7,2Hz) và 5,21 ppm (J = 3,0Hz), tương quan với chúng là tín hiệu của hai carbon

tương ứng ở δC 103,8 và 100,1 ppm. Một đơn vị đường 6-deoxyhexose được gợi ý có

mặt trong chuỗi diasaccharide bởi sự xuất hiện của một tín hiệu doublet đặc trưng cho

một nhóm methyl ở δH 1,17 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-6"). Khi chiếu xạ proton anome bằng

kỹ thuật 1D TOCSY thu được độ chuyển dịch hóa học và hằng số tương tác của H-1'

đến H-5' của một đơn vị đường O-methyl-pentose; và của H-1" đến H-4" của một đơn

vị đường 6-deoxyhexose. Dữ liệu phổ 2D NMR cho phép gán tất cả các tín hiệu trên

phổ NMR của chuỗi disaccharide (xem bảng 4.3). Một tương tác trong phổ HMBC của

H-3' với carbon OMe của đơn vị đường O-methyl-pentose đã chỉ ra rằng nhóm O-

methyl gắn vào phân tử đường ở vị trí C-3'. Các tín hiệu của carbon và proton, cùng

với các hằng số tương tác tương ứng của đơn vị đường O-methyl-pentose giống với dữ

liệu của đơn vị đường không thế 3-O-methyl-β-xylopyranosyl đã được xác định trong

hợp chất milleporoside A, phân lập từ loài sao biển Fromia milleporell [101], ngoại trừ

tín hiệu của C-2' và H-2' đã bị dịch chuyển về vùng trường yếu từ δC 74,5 tới 76,3 ppm

và từ δH 3,23 tới 3,42 ppm là do ảnh hưởng của liên kết glycoside ở vị trí C-2' của phân

tử đường. Giá trị hằng số tương tác nhỏ J = 3,0 Hz giữa H-1" và H-2" của đơn vị

đường 6-deoxyhexose chỉ ra sự định hướng equatorial của proton H-1"; giá trị hằng số

tương tác lớn J = 10,0 Hz giữa H-2" với H-3" chỉ ra sự định hướng axial cho cả hai

proton này; và giá trị nhỏ J = 2,9 Hz giữa H-3" với H-4" biểu thị sự định hướng

equatorial của proton H-4". Các dữ liệu này kết hợp cùng với tín hiệu tương tác trong

phổ NOESY của H-3"/H-5", cho phép khẳng định hai proton này ở dạng cis với nhau.

Như vậy, có thể kết luận rằng phân tử monosaccharide thứ hai có dạng α-fucopyranose. Thêm vào đó, dữ liệu phổ 13C-NMR của đơn vị monosaccharide này trùng khớp với dữ

liệu của một đơn vị đường α-fucopyranose ở cuối mạch của hợp chất stereonsteroid G

phân lập từ loài san hô mềm Stereonephthya crystalliana [102].

Vị trí liên kết glycoside giữa hai phân tử đường và vị trí gắn kết của chuỗi

disaccharide với phần aglycon của phân tử được xác định bằng các tương tác trong phổ

HMBC và NOESY. Cụ thể là có xuất hiện tương tác giữa H-1' của đơn vị đường 3-

OMe-Xylp với H2-28 (C-28) của phần aglycon trên phổ NOESY; và H-1" của đơn vị

đường Fucp với H-2' (C-2') của đơn vị 3-OMe-Xylp trên phổ HMBC. Điều này thể hiện

chuỗi disaccharide gắn kết với phần aglycon ở vị trí C-28, và vị trí liên kết glycoside

của đơn vị Fucp với đơn vị 3-OMe-Xylp là (1→2). Đây là lần đầu tiên đơn vị đường α-

fucose được tìm thấy trong lớp chất steroid glycoside của sao biển. Đơn vị đường β-D-

fucose thường có mặt trong lớp chất chuyển hóa thứ cấp này. Trước đây, đơn vị đường

α-L-fucopyranose đã được tìm thấy trong lớp chất steroid glycoside từ một số nguồn

sinh vật biển khác, như san hô mềm hay bọt biển. Vì vậy, dựa vào sự tương đồng với

các steroid glycoside này, cấu hình L được đề cử cho đơn vị α-fucopyranose. Cấu hình

D của đơn vị 3-O-methyl-β-xylopyranose của AP2 được ưu tiên hơn như là β-D-

xylopyranose, và đơn vị O-methyl hay di-O-methyl-β-D-xylopyranose là thường gặp

nhất trong số các steroid glycoside từ sao biển.

Từ tất cả các phân tích nêu trên, cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 được xác

định là [(24S)-28-O-[α-L-fucopyranosyl-(1→2)-3-O-methyl-β-D-xylopyranosyl]-24-

methyl-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,15β,16β,28-heptol. Cấu trúc của AP2 được mô tả như

hình 4.10. Đây là hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được

đặt tên là Planciside B.

Hình 4.10: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 Hình 4.11: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP2

Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP2

ac

C 1 δC 39,6 HMBC (H→C) NOESY

2 26,2

3 4 5 6 7 73,7 69,1 57,2 64,8 50,0

8 9 10 11 77,1 58,4 38,2 18,9 C10 C5, C6, C8, C9 C5, C6 H5 H3, H7 H19 H5, H9, H14 H7, H14

12 43,4 C9

13 14 44,5 61,2 δH multab (J = Hz) 1,70 m 0,97 m 1,82 m 1,55 m 3,42 m 4,26 br s 0,94 m 4,18 (dt, J = 4,5; 11,0 Hz) 2,46 (dd, J = 4,6; 12,0 Hz) 1,35 (t, J = 12,2 Hz) - 0,82 (dd, J = 3,2; 12,4 Hz) - 1,76 m 1,41 m 1,94 m 1,11 m - 1,01 (d, J = 5,7 Hz) H18, H21 H17 H7, H9

15 16 17 18 19 20 21 22 71,2 72,8 63,0 17,9 17,0 31,5 18,6 35,0 C8, C9, C13, C15, C17, C18 C13, C17 C13, C14 C12, C13, C14, C17 C1, C5, C9, C10 C17, C20, C22 H22 H12 H12, H20 H6 H18 H12 H16

23 25,6 H27

24 25 26 27 28 46,3 28,9 20,1 19,2 71,6 4,38 (dd, J = 5,6; 7,1 Hz) 4,20 (t, J = 7,1 Hz) 0,94 m 1,23 s 1,15 s 1,90 m 0,94 (d, J = 6,5 Hz) 1,73 m 1,08 m 1,46 m 1,10 m 1,37 m 1,86 m 0,89 (d, J = 6,8 Hz) 0,87 (d, J = 6,8 Hz) 3,78 (dd, J = 6,5; 9,5 Hz) 3,42 m C27 C24, C25, C27 C24, C25, C27 C1’, C23, C24, C25 C1’, C23, C24, C25 H27, H28 H28 H23, H24, H28 H1', H24, H26, H27 H24, H26, H27

3-OMe-Xylp

1' 2' 103,8 76,3 4,31 (d, J = 7,2 Hz) 3,42 (dd, J = 7,1; 8,6 Hz) C28, C2', C3', C5' H28, H3', H5'

88,2 71,7 66,7

3' 4' 5' eq 5' ax OMe 60,8 3,27 (t, J = 8,5 Hz) 3,57 m 3,82 (dd, J = 5,7; 11,7 Hz) 3,20 (dd, J = 9,8; 11,5 Hz) 3,61 s OMe, C2', C4' C1', C3', C4' C1', C3', C4' C3' H1' H4’ H1' H3', H1"

Fucp

a Đo trong CD3OD, b 700,13 MHz, c 176,04 MHz

1" 2" 3" 4" 5" 6" 100,1 70,2 71,7 73,8 67,6 16,8 5,21 (d, J = 3,0 Hz) 3,70 (dd, J = 3,3; 10,1 Hz) 3,72 (dd, J = 2,9; 10,0 Hz) 3,65 brs 4,33 (brq, J = 6,7 Hz) 1,17 (d, J = 6,6 Hz) C2', C2", C3", C5" C3" C2" C2", C3" C1", C4", C6" C4", C5" H2', OMe H5" H5", H6" H3", H4" H4"

4.1.3. Hợp chất AP3: Planciside C (Hợp chất mới)

Hợp chất AP3 được phân lập dưới dạng chất rắn, vô định hình. Trên phổ (+)-HR ESI-MS của chất AP3 xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 915,3855 [M + Na]+ (tính

toán lý thuyết cho CTPT C40H69O18SNa2 = 915,4000). Phổ (–)-HR ESI-MS xuất hiện

pic ion giả phân tử ở m/z 869,4461 [M–Na] (tính toán lý thuyết cho CTPT C40H69O18S

= 869,4210). Như vậy, CTPT của AP3 được xác định là C40H69O18SNa (M = 892).

Mảnh ion giả phân tử ở m/z 915 [M + Na]+ tiếp tục được bắn phá bằng kỹ thuật

(+)-HR ESI-MS/MS thu được pic ion ở m/z 795 tương ứng với sự mất của đơn vị NaHSO4 [(M + Na) – NaHSO4]+; mảnh ion giả phân tử ở m/z 869 tiếp tục được bắn

phá bằng kỹ thuật (–)-HR ESI-MS/MS thu được pic ion ở m/z 97 tương ứng với pic ion

của [HSO4] điều này khẳng định chắc chắn rằng AP3 có chứa một nhóm sulfate trong

cấu trúc phân tử. Ngoài ra, trong phổ (+)-HR ESI-MS/MS khi bắn phá mảnh ion ở m/z 915 [M + Na]+ còn xuất hiện các mảnh ion ở m/z: 635 [(M + Na) – NaHSO4 – C7H12O4]+, 503 [(M + Na) – NaHSO4 – C7H12O4 – C5H8O4]+, và 315 [C7H12O4 + C5H8O4 + Na]+. Tương tự, trong phổ (–)-HR ESI-MS/MS khi bắn phá mảnh ion ở m/z

869 cũng thu được các pic ion khác được quy kết như sau: ở m/z 709 [(M – Na) –

C7H12O4], 577 [(M – Na) – C7H12O4 – C5H8O4].

Hình 4.12: Phổ (+)-HR ESI-MS/MS của hợp chất AP3

Hình 4.13: Phổ (–)-HR ESI-MS/MS của hợp chất AP3

Từ các dữ liệu phân tích phổ MS/MS ở trên, có thể xác định các mảnh ion thu

được trong hai phổ này phù hợp với sự mất của đơn vị đường di-O-methyl-pentose và

đơn vị đường pentose. Như vậy trong cấu trúc phân tử AP3 có chứa hai đơn vị đường,

có thể là một chuỗi diasaccharide hoặc hai đơn vị monosaccharide tách biệt nhau.

Khi so sánh dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của AP3 với dữ liệu phổ phần aglycon của

AP1, nhận thấy các tín hiệu phần aglycon của chúng gần như trùng khớp nhau, chỉ có sự

khác biệt duy nhất với phần aglycon của AP1 là có xuất hiện một tín hiệu của một nhóm

sulfate ở vị trí C-6 của AP3 (xem bảng 4.1 và bảng 4.4), bởi vì có sự chuyển dịch hóa học

về phía trường thấp của tín hiệu H-6 từ δH 4,26 (của AP1) tới δH 4,92 ppm (của AP3), và

của C-6 từ δC 69,1 (của AP1) tới δC 74,5 (của AP3) ppm. Vì vậy, có thể khẳng định chất

AP3 có phần khung aglycon giống chất AP1, chỉ khác ở vị trí C-6 của AP3 được thế bởi

một nhóm sulfate (xem phụ lục phổ NMR của AP3). Cấu trúc nhân steroid của AP3 được

xác định có dạng [28-O-glycosylated-24-methyl-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,15β,16β,28-

heptol] 6-O-sulfate. Việc kết hợp tất cả các dữ liệu phổ 1D, 2D NMR của AP3 cho phép

xác định, gán được các tín hiệu H và C của AP3 (xem bảng 4.4).

Khi so sánh các dữ liệu phổ chuỗi disaccharide của AP3 thấy trùng khớp với các

dữ liệu chuỗi disaccharide của hợp chất đã biết Certonardoside B2 được phân lập từ sao

biển Certonardoa semiregularis [12] (xem bảng 4.5). Do vậy, có thể khẳng định chuỗi

disaccharide của AP3 là sự kết hợp của hai đơn vị đường 2,4-di-O-methyl-β-D-

xylopyranosyl và α-L-arabinofuranosyl. Vị trí gắn kết giữa hai đường này và vị trí liên

kết giữa chuỗi đường với phần aglycon được xác định bởi các tương tác trong phổ

ROESY và HMBC của AP3. Do có xuất hiện tương tác giữa H-1' của đường Araf với

H2-28 (C-28) của phần aglycon trong, và tương tác giữa H-1" của đơn vị đường 2,4-di-

O-Me-Xylp với H-2' (C-2') của đường Araf. Như vậy, vị trí liên kết giữa hai phân tử

đường trong chuỗi disaccharide là (1→2) và vị trí gắn với phần aglycon của chuỗi

đường là vị trí C-28. Toàn bộ cấu trúc phẳng của phần aglycon của chất AP3 và chìa

khóa tương tác giữa các vị trí trong phân tử được mô tả như trong hình 4.14 và 4.15.

Hình 4.14: Cấu trúc hóa học của chất AP3 Hình 4.15: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP3

Kết hợp tất cả các dữ liệu phân tích ở trên, cấu trúc hóa học của hợp chất AP3

được xác định là [(24S)-28-O-[2,4-di-O-methyl-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-α-L-

arabinofuranosyl]-24-methyl-5α-cholestane-3β,4β,6α,8,15β,16β,28-heptol] 6-O-sulfate.

Đây là hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được đặt tên là

Planciside C.

Bảng 4.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP3

ac

HMBC (H→C) C 1 δC 39,4

2 26,5 ROESY H9

3 4 5 6 7 72,9 68,9 56,0 74,5 47,9

δH multab (J = Hz) 1,72 m 1,00 m 1,82 m 1,57 m 3,45 m 4,30 br s 1,13 m 4,92 (dt, J = 4,4; 11,1 Hz) 2,72 (dd, J = 4,4; 12,2 Hz) 1,54 (t, J = 12,0 Hz) 0,84 (dd, J = 3,0; 12,5 Hz) C3 C5, C6, C8,C9 C5, C6 8 9 77,2 58,1

10 11 38,7 18,8 H5 H3, H7, H9 H19 H15 H5, H9, H14 H1, H5, H7, H12, H14 H18, H19

12 43,4

13 14 44,6 61,0 1,76 m 1,40 m 1,94 m 1,11 m 1,03 (d, J = 5,6 Hz) H21 H9, H21 H7, H9

15 16 17 18 19 20 21 22 71,1 72,9 62,9 17,9 16,9 31,4 18,6 34,8 C8, C13, C15, C17, C18 C13, C17 C13, C14 C18 C12, C13, C14, C17 C1, C5, C9, C10 C17, C20, C22

23 26,1 H7 H22 H11, H20 H6, H11 H18 H12, H23 H16 H24 H21

a Đo trong CD3OD, b 700,13 MHz, c 176,04 MHz

24 25 26 27 28 45,9 29,5 20,1 19,8 70,2 C24, C25, C27 C24, C25, C26 C23, C25 4,38 (dd, J = 5,6; 6,8 Hz) 4,20 (t, J = 6,8 Hz) 0,94 m 1,23 s 1,23 s 1,91 m 0,95 (d, J = 6,8 Hz) 1,75 m 1,12 m 1,46 m 1,24 m 1,40 m 1,83 m 0,89 (d, J = 7,0 Hz) 0,91 (d, J = 7,0 Hz) 3,72 (dd, J = 5,8; 9,6 Hz) 3,28 m H22, H28 H28 H1', H24, H26 H1'

Bảng 4.5: Bảng so sánh dữ liệu chuỗi đường của AP3 với TLTK

Certonardoside B2[12] C AP3

ab

ac

ae

δH δH δC

1' 2' 3' 4' δC Araf 108,3 91,9 77,6 84,0 4,96 (d, J = 1,5 Hz) 4,05 (dd, J = 1,5; 4,0 Hz) 3,95 (dd, J = 4,0; 7,6 Hz) 3,88 m 108,1 91,6 77,7 84,3

62,7 62,7 3,76 (dd, J = 3,1; 12,1 Hz) 3,62 (dd, J = 5,7; 12,1 Hz) 4,96 (br s) 4,06 (dd, J = 1,3; 3,8 Hz) 3,95 (dd, J = 3,8; 7,8 Hz) 3,88 (ddd, J = 3,0; 5,5; 8,0 Hz) 3,76 (dd, J = 3,3; 12,0 Hz) 3,62 (dd, J = 5,5; 12,0 Hz) 5'eq 5'ax

2,4-di-OMe-Xylp

1" 2" 3" 4" 104,8 84,8 76,5 80,9 104,5 84,9 76,5 80,8

64,4 64,5

4,41 (d, J = 7,6 Hz) 2,86 (dd, J = 7,6; 9,0 Hz) 3,38 (t, J = 9,0 Hz) 3,17 (ddd, J = 5,0; 8,7; 10,0 Hz) 4,01 (dd, J = 5,1; 11,3 Hz) 3,12 (dd, J = 10,0; 11,3 Hz) 3,55 s 3,45 s 4,43 (d, J = 8,0 Hz) 2,85 (dd, J = 7,8; 9,3 Hz) 3,38 (t, J = 8,8 Hz) 3,18 (ddd, J = 4,8; 8,3; 10,0 Hz) 4,01 (dd, J = 4,5; 11,0 Hz) 3,13 (dd, J = 10,0; 11,0 Hz) 3,56 s 3,46 s 61,2 59,1 61,2 59,0

5"eq 5"ax 2"-OMe 4"-OMe a Đo trong CD3OD, b 700,13 MHz, c 176,04 MHz; d500 MHz, e125 MHz

4.1.4. Hợp chất AP4: Planciside D

Hợp chất AP4 được phân lập dưới dạng chất rắn, vô định hình. Phổ khối lượng

phân giải cao phun mù điện tử (+)-HR ESI-MS của AP4 có xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 927,4954 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho CTPT C45H76O18Na = 927,4924).

Phổ (–)-HR ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 903,4951 [M – H] (tính toán

lý thuyết cho CTPT C45H75O18= 903,4959). Dữ liệu phổ MS gợi ý rằng hợp chất AP4

có CTPT là C45H76O18 (M = 904).

Dữ liệu phổ 13C NMR, HSQC cho thấy hợp chất này có chứa 45 nguyên tử cacbon

bao gồm: 6 nhóm methyl (-CH3); 10 nhóm methylen (-CH2); 23 nhóm metin (CH) trong

đó có 1 nhóm CH=; 4 carbon bậc bốn trong đó có 1 carbon liên kết trực tiếp với oxi và 1 carbon sp2; và một nhóm methoxyl. Phổ 1H, 13C NMR và HSQC của phần aglycon cho

thấy tín hiệu của hai nhóm methyl góc dưới dạng singlet của H3C-18 ở δH 1,12 (δC 16,8) và

H3C-19 ở δH 1,36 (δC22,7) ppm; một liên kết đôi dạng broad singlet ở δH 5,64 ppm và δC

126,9 (C4), 148,3 (C5) ppm; 4 nhóm oxymetin HC-3 (δH 4,18 ppm; δC 77,5 ppm), HC-6

(δH 4,30 ppm; δC 76,4 ppm), HC-15 (δH 4,16 ppm, dd, J = 2,6; 10,7 Hz; δC 80,9 ppm), và

HC-16 (δH 3,97 ppm, dd, J = 2,6; 7,4 Hz; δC 83,0 ppm); và một carbon bậc 4 có gắn với

nguyên tử oxy ở δC 76,2 ppm. Dữ liệu phổ cũng cho thấy mạch nhánh của phần aglycon

có ba nhóm methyl H3C-21 (δH 0,93 ppm, d, J = 6,8 Hz; δC 18,7 ppm), H3C-26 (δH 0,90

ppm, d, J = 6,8 Hz; δC 20,4 ppm), và H3C-27 (δH 0,88 ppm, d, J = 6,8 Hz; δC 19,5 ppm);

và nhóm oxymethylen H2C-28 (δH 3,78 ppm, dd, J = 6,5; 9,3 Hz; δH 3,45 ppm, m; δC 71,5

ppm) liên kết với chuỗi carbohydrate bởi liên kết glycoside. Những dữ liệu của AP4 cho

thấy hợp chất này có khung steroid dạng 28-O-24-methylcholestane với chuỗi glycoside ở

vị trí C-28 như của các hợp chất AP1, AP2 và AP3 ở trên.

Hình 4.16: Phổ 1H NMR của hợp chất AP4

Hình 4.17: Phổ 13C NMR của hợp chất AP4

Tất cả các dữ liệu phổ 1H, 13C NMR được quy kết thông qua sự kết hợp với các

phổ 2D NMR. Sự tương quan trong phổ COSY và HSQC của các proton cho thấy sự

ghép nối các chuỗi cấu trúc từ C-1 đến C-4, C-6 đến C-7, C-9 đến C-12 qua C-11, từ

C-14 đến C-17, C-17 đến C-21, C-22 đến C-27, và C-24 đến C-28. Phổ HMBC cho

thấy các tương tác xa của proton với các cacbon xung quanh như của H-4 với C-6 và

C-10; của H3-18 với C-12, C-13, C-14 và C-17; của H-14 với C-13, C15 và C-18; của

H3-19 với C-1, C-5, C-9 và C-10; của H3-21 với C-17, C-20 và C-22; của H3-26 với C-

24, C-25 và C-27; và của H3-27 với C-24, C-25 và C-26, và cho phép xác định cấu trúc

tổng thể của phần aglycon của hợp chất AP4. Tín hiệu cộng hưởng của C-5 ở δC 148,3 ppm và của C-10 ở δC 37,6 ppm không được quan sát thấy trên phổ 13C NMR và

HSQC, chúng được tìm thấy nhờ tương tác của H3-19 với C-5 và của H-4 với C-10

trong phổ HMBC. Tất cả độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon chứng minh

rằng hợp chất AP4 có cấu trúc phần aglycon là 24-methyl-cholest-4-ene-

3β,6β,8,15α,16β,28-hexaol với liên kết glycoside ở vị trí C-3 và C-28.

Trên phổ proton có xuất hiện 3 tín hiệu doublet tại δH 4,30 (d, J =7,6 Hz), 4,41 (d,

J =7,8 Hz), và 5,26 (d, J =2,9 Hz) ppm đặc trưng của các proton anome. Tương ứng với

các tín hiệu proton này trên phổ HSQC là các carbon anome ở δC 101,0; 103,9; và 104,6

ppm. Điều này cho thấy, trong cấu trúc của AP4 có chứa 3 đơn vị monosaccharide.

Đồng thời, hằng số tương tác J của hai proton anome là 7,6 và 7,8 Hz và một proton

anome là 2,9 Hz chứng tỏ có hai monosaccharide dạng β và một monosaccharide dạng α.

Tín hiệu doublet của một nhóm methyl ở δH 1,18 ppm chứng tỏ rằng AP4 có chứa một

đơn vị đường là 6-deoxyhexose. Các phân tích này cũng phù hợp với sự phân tích phổ

khối lượng phân giải cao HR ESI-MS/MS. Phổ (+)-HR ESI-MS/MS của mảnh m/z 927 [M + Na]+ thu được các mảnh ion ở m/z: 781 [(M + Na) – C6H10O4]+ tương ứng với sự

mất của một đơn vị 6-deoxyhexose (hoặc O-methylpentose); 649 [(M + Na) – C6H10O4 – C5H8O4]+ tương ứng với sự mất của hai đơn vị monosaccharide trong đó có một đơn vị pentose; và 503 [(M+Na)–C6H10O4–C6H10O4–C5H8O4]+ tương ứng với sự mất của ba đơn

vị monosaccharide. Như vậy, từ dữ liệu phổ khối cùng với dữ liệu phổ NMR có thể

khẳng định rằng hợp chất AP4 có chứa một đơn vị đường 6-deoxyhexose, một đơn vị O-

methylpentose, và một đơn vị pentose.

Hình 4.18: Cấu trúc của hợp chất AP4 Hình 4.19: Tương tác COSY, HMBC của hợp chất AP4

Hình 4.20: Tương tác ROESY của hợp chất AP4

Độ chuyển dịch hóa học và các hằng số tương tác của H-1 đến H-5 trong đường

pentose và đường O-methylpentose; và tương tác từ H-1 đến H-4 của đường 6-

deoxyhexose đã được chứng minh bởi sự chiếu xạ proton anome bằng phương pháp

phổ 1D TOCSY. Sự chiếu xạ của H3-6 của nhóm deoxy cho thấy độ chuyển dịch hóa

học của H-5 của đường 6-deoxyhexose. Sự cộng hưởng của tất cả các proton và carbon

của các đơn vị monosaccharide đã được quy kết sử dụng các phương pháp phổ COSY,

HSQC, HMBC và ROESY. Vị trí liên kết của chuỗi carbohydrate và sự xuất hiện của

liên kết glycoside (1→2) giữa các đơn vị monosaccharide trong chuỗi disaccharide của

AP4 được xác định bởi các tương tác của proton anome và carbon trong phổ ROESY

và HMBC như H-1' (Xylp)/H2-28, C-28 phần aglycon; H-1" (Fucp)/H-2' (Xylp); và H-

1"' (2-O-Me-Xylp)/H-3, C-3 phần aglycon.

Từ những phân tích ở trên kết hợp với so sánh dữ liệu phổvới hợp chất đã biết

planciside D [47] được phân lập từ sao biển A.planci thì thấy chúng hoàn toàn trùng khớp

với nhau (xem bảng 4.6, 4.7). Như vậy, hợp chất AP4 được xác định là hợp chất đã biết

planciside D: [(24S)-3-O-(2-O-methyl-β-D-xylopyranosyl)-28-O-[α-L-fucopyranosyl-

(1→2)-β-D-xylopyranosyl]-24-methylcholest-4-ene-3β,6β,8,15α,16β,28 -hexaol.

Bảng 4.6: Dữ liệu NMR phần aglycon của hợp chất AP4 và TLTK

ac

AP4 δH (*)[47] δH

1 δC 39,7

ac δC 39,7

2 27,9 27,9

3 4 5 6 7 77,5 126,9 148,3 76,4 44,4 77,5 126,9 148,3 76,4 44,4

8 9 10 11 76,2 57,8 37,6 19,5 76,2 57,8 37,6 19,5

12 43,0 43,0

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 44,9 63,6 80,9 83,0 60,6 16,8 22,7 31,2 18,7 25,0 44,9 63,6 80,9 83,0 60,6 16,8 22,7 31,2 18,7 25,0

23 25,7 25,7

24 25 26 27 28 46,4 29,3 20,4 19,5 71,5 46,4 29,3 20,4 19,5 71,5

ab (J Hz) 1,78 m 1,29 m 1,97 m 1,77 m 4,18 m 5,64 br s - 4,30 m 2,58 (dd, J = 3,2; 15,0 Hz) 1,50 (dd, J = 3,5; 14,8 Hz) - 1,04 (dd, J = 2,9; 12,8 Hz) - 1,86 m 1,47 m 1,97 m 1,17 m - 1,02 (d, J = 10,9 Hz) 4,16 (dd, J = 2,6; 10,7 Hz) 3,97 (dd, J =2,6; 7,4 Hz) 1,20 m 1,12 s 1,36 s 1,82 m 0,93 (d, J = 6,8 Hz) 1,62 m 0,98 m 1,47 m 1,13 m 1,32 m 1,83 m 0,90 (d, J = 6,8 Hz) 0,88 (d, J = 6,8 Hz) 3,78 (dd, J = 6,5; 9,3 Hz) 3,45 m

ab (J Hz) 1,78 m 1,29 m 1,97 m 1,77 m 4,18 m 5,64 br s 4,30 m 2,58 (dd, J = 3,2; 15,0 Hz) 1,50 (dd, J = 3,5; 14,8 Hz) 1,04 (dd, J = 2,9; 12,8 Hz) 1,86 m 1,47 m 1,97 m 1,17 m 1,02 (d, J = 10,9 Hz) 4,16 (dd, J = 2,6; 10,7 Hz) 3,97 (dd, J =2,6; 7,4 Hz) 1,20 m 1,12 s 1,36 s 1,82 m 0,93 (d, J = 6,8 Hz) 1,62 m 0,98 m 1,47 m 1,13 m 1,32 m 1,83 m 0,90 (d, J = 6,8 Hz) 0,88 (d, J = 6,8 Hz) 3,78 (dd, J = 6,5; 9,3 Hz) 3,45 m

a Đo trong CD3OD, b500 MHz, c125 MHz, (*) Planciside D

Bảng 4.7: Dữ liệu NMR chuỗi đường của hợp chất AP4 và TLTK

ac

ab (J Hz)

ac

ab (J Hz)

δC AP4 δH δC (*)[47] δH

Xylp

1' 2' 3' 4' 5' 103,9 79,9 78,4 71,3 66,7 103,9 79,9 78,4 71,3 66,7 4,30 (d, J = 7,6 Hz) 3,36 (t, J = 7,8 Hz) 3,53 (t, J = 8,7 Hz) 3,51 m 3,87 (dd, J = 5,0; 11,5 Hz) 3,19 (dd, J = 9,5; 11,4 Hz)

4,30 (d, J = 7,6 Hz) 3,36 (t, J = 7,8 Hz) 3,53 (t, J = 8,7 Hz) 3,51 m 3,87 (dd, J = 5,0; 11,5 Hz) 3,19 (dd, J = 9,5; 11,4 Hz) Fucp

1" 2" 3" 4" 5" 6" 101,0 70,6 71,7 73,8 67,9 16,9 5,26 (d, J = 2,9 Hz) 3,73 (dd, J = 2,7; 10,0 Hz) 3,74 (dd, J = 1,5; 10,5 Hz) 3,63 (br s) 4,26 (br q, J = 6,5 Hz) 1,18 (d, J = 6,5 Hz) 101,0 70,6 71,7 73,8 67,9 16,9 5,26 (d, J = 2,9 Hz) 3,73 (dd, J = 2,7; 10,0 Hz) 3,74 (dd, J = 1,5; 10,5 Hz) 3,63 (br s) 4,26 (br q, J = 6,5 Hz) 1,18 (d, J = 6,5 Hz)

2-OMe-Xylp

1"' 2"' 3"' 4"' 5"' 104,6 84,9 77,5 71,3 66,8 104,6 84,9 77,5 71,3 66,8

2"'-OMe a Đo trong CD3OD, b500 MHz, c125 MHz, (*) Planciside D

4,41 (d, J = 7,8 Hz) 2,83 (dd, J = 7,8; 9,1 Hz) 3,30 m 3,47 m 3,81 (dd, J = 5,4; 11,3 Hz) 3,16 (dd, J = 10,5; 11,4 Hz) 3,57 s 4,41 (d, J = 7,8 Hz) 2,83 (dd, J = 7,8; 9,1 Hz) 3,30 m 3,47 m 3,81 (dd, J = 5,4; 11,3 Hz) 3,16 (dd, J = 10,5; 11,4 Hz) 3,57 s 61,1 61,1

4.1.5. Hợp chất AP11: Acanthaglycoside G (Hợp chất mới)

Hợp chất AP11 thu được dưới dạng chất rắn, vô định hình. Trên phổ (+) HR-ESI- MS xuất hiện pic ion giả phân tử [M+Na]+ tại m/z 1187,4533 (tính toán lý thuyết cho

CTPT C51H81Na2O26S = 1187,4532). Trên phổ (-) HR-ESI-MS có mặt pic ion giả phân tử

[M–Na] tại m/z 1141,4735 (tính toán lý thuyết cho CTPT C51H81O26S = 1141,4737). Do

đó, CTPT của AP11 được xác định là C51H81O26SNa (M = 1164). Các mảnh pic tại m/z 1067 [(M+Na) – NaHSO4]+ trong phổ (+) HRESI-MS/MS của pic ion [M+Na]+ ở m/z

1187, và pic ion ở m/z 97 [HSO4] trong phổ (–) HRESI-MS/MS của pic ion [M–Na] ở

m/z 1287 chứng tỏ sự có mặt của nhóm sulfate trong phân tử AP11. Ngoài ra, trên phổ (–)

HR-ESI-MS/MS của pic ion [M – Na] ở m/z 1141 xuất hiện tín hiệu của các pic ion tại

m/z 995 [(M – Na) – C6H10O4], 849 [(M – Na) – 2 x C6H10O4], 703 [(M – Na) – 3 x

C6H10O4], 557 [(M – Na) – 4 x C6H10O4], 411 [(M – Na) – 5 x C6H10O4], tương ứng với

các tín hiệu này là sự mất lần lượt của 1, 2, 3, 4, và 5 đơn vị đường 6-deoxyhexose. Như

vậy, từ dữ liệu phân tích phổ khối lượng phân giải cao 1 lần MS và hai lần MS/MS có thể

+MS, 0.8-1.4min #44-83

3+ 1187.4533

Intens. 5 x10 4

1+ 437.1941

2+ 605.2223

1+ 526.3922

1+ 1269.4566

774.6342

1367.4546

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

m/z

dự đoán phân tử AP11 có chứa 5 đơn vị đường 6-deoxyhexose.

-MS, 1.3-1.8min #76-100

1- 1141.4735

Intens. 6 x10 4

2- 570.2335

1163.4545

497.2043

977.4046

1127.4573

424.1754

849.3573

995.4151

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

m/z

Hình 4.21: Phổ (+) HR-ESI-MS của hợp chất AP11

Hình 4.22: Phổ (-) HR-ESI-MS của hợp chất AP11

Hình 4.23: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP11

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP11 có xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm methyl trong đó có

hai tín hiệu singlet của hai nhóm methyl góc CH3-18 và CH3-19 lần lượt ở δH 0,58, 0,94 ppm;

một tín hiệu singlet của nhóm methyl CH3-21 ở vùng trường yếu hơn ở δH 2,08 ppm, có thể do

có liên kết với một nhóm carbonyl (C=O). Ngoài ra, trên phổ này còn có các tín hiệu của một

proton olefin ở δH 5,24 (brt, J = 4,2 Hz) ppm; một nhóm oxymetin liên kết với một nhóm sulfate

ở δH 4,87 (m) ppm; một nhóm oxymetin liên kết trực tiếp với một chuỗi carbohydrate ở vị trí

CH-6 với δH 3,78 (m). Ở vùng trường yếu còn quan sát thấy các tín hiệu doublet của 5 proton

anome của 5 đơn vị monosaccharide ở δH 4,82 (1H, d, J = 7,6 Hz), 4,84 (1H, d, J = 7,9 Hz), 4,97

(1H, d, J = 6,8 Hz), 5,03 (1H, d, J = 7,7 Hz), 5,27 (1H, d, J = 7,7 Hz).

Phổ 13C-NMR của AP11 cho thấy sự có mặt của 51 nguyên tử carbon, trong đó có 8

nhóm CH3, 7 nhóm CH2, 32 nhóm CH và 4 carbon bậc 4. Sự có mặt của nối đôi bị thế ba

lần trong phân tử được xác định tại tín hiệu cộng hưởng δC 116,4/145,8 ppm. 5 tín hiệu

carbon nhóm CH tại δC 102,3; 103,6; 104,9; 104,9; 106,9 ppm được xác định là các carbon

anome của 5 gốc đường. Ngoài ra, cũng trên phổ này, trong vùng từ 60 – 90 ppm có các tín

hiệu cộng hưởng của 23 nguyên tử carbon liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy, bao gồm 22

carbon oximetin trong đó có hai carbon của phần aglycon tại δC 77,4 (C-3) liên kết với nhóm

sulfate; δC 80,1 (C-6) liên kết với chuỗi carbohydrate; và 20 carbon thuộc các phân tử đường

tại δC 73,8; 91,0; 74,4; 71,7; 82,3; 75,1; 85,7; 71,4; 84,3; 77,5; 75,7; 72,8; 73,7; 74,9; 72,3;

71,8; 76,2; 77,5; 75,5; 73,4; và 1 carbon bậc 4 của nhóm carbonyl tại δC 208,0 ppm.

Kết hợp các dữ liệu phổ COSY, HSQC, HMBC và ROESY của AP11 cho phép xác

định tất cả các tín hiệu cộng hưởng của cấu trúc khung steroid trong phân tử AP11. Phân

tích chi tiết các tương tác nhận được trên phổ COSY và HSQC cho phép ghép nối các mảnh

cấu trúc từ C-1 đến C-8, C-11 đến C-12, và C-8 đến C-17 của phần aglycon. Trên cơ sở kết

quả phổ COSY thu được, cùng các tương tác HMBC giữa các proton của H3-18 (δH 0,58)

với C-12 (δC 40,4), C-13 (δC 42,3), C-14 (δC 53,5), C-17 (δC 63,2); của H3-19 (δH 0,94) với

C-1 (δC 35,8), C-5 (δC 49,1), C-9 (δC 145,8), C-10 (δC 35,8); và H3-21 (δH 2,08) với C-17 (δC

63,2), C-20 (δC 208,0) cho phép khẳng định vị trí của các nhóm H-18, H-19, H-21 và một

liên kết đôi ở vị trí 9(11) của phần khung steroid cũng như chứng minh cho toàn bộ cấu trúc

của phần aglycon. Phổ ROESY cũng cho thấy các tương tác chìa khóa giữa H-5 với H-3α,

H-7α; H-14 với H-12α, H-17; H3-18 với H-8, H-15β, H-16β; và H3-19 với H-2β, H-4β, H-

6β, H-8. Điều này chứng minh cấu hình trong khung steroid ở các vị trí được xác định là

5α/8β/10β/13β/14α/17α và cấu hình tương đối của các nhóm thế ở C-3 và C-6 là 3β và 6α.

Như vậy, có thể khẳng định H-3 có cấu hình α, và H-6 có cấu hình β. Trên phổ HMBC có

xuất hiện tương tác của proton anome H-1 của đơn vị đường Qui1 ở δH 4,82 ppm với C-6 ở

δC 80,1 ppm của aglycon và trong phổ ROESY có xuất hiện tương tác của proton anome H-

1 của Qui1 ở δH 4,82 ppm với H-6 ở δH 3,78 ppm của aglycon. Điều này chứng tỏ vị trí liên

kết của chuỗi oligosaccharide với phần aglycon là vị trí C-6.

Từ các dữ liệu phân tích nói trên có thể khẳng định rằng hợp chất AP11 là một hợp

chất asterosaponin với phần aglycon của AP11 có dạng asterone đã biết là 3β,6α-dihydroxy-

5α-pregn-9(11)-en-20-one [48, 103]; chuỗi carbohydrate có chứa 5 đơn vị đường đơn liên

kết với phần aglycon ở vị trí C-6, và một nhóm sulfate ở vị trí C-3.

Dữ liệu phổ proton phân tích ở trên cho thấy 5 tín hiệu cộng hưởng ở vùng trường

yếu của các proton anome ở δH 4,82, 4,97, 4,84, 5,03 và 5,27 ppm, bằng tương tác trực tiếp

trong phổ HSQC xác định được độ chuyển dịch hóa học của các carbon tương ứng ở δC

104,9; 103,6; 102,3; 106,9 và 104,9. Hằng số tương tác của các proton anome trong khoảng

6,8 – 7,9 Hz chứng tỏ tất cả các liên kết glycoside có cấu hình β. Năm tín hiệu của nhóm

methyl dạng doublet ở δH 1,60; 1,73; 1,48; 1,49; và 1,79 trong phổ proton tiết lộ rằng có sự

xuất hiện của 5 đơn vị đường 6-deoxyhexose. Điều này cũng đã được khẳng định bằng các

dữ liệu phân tích phổ (-) ESI MS/MS của pic ion [M – Na] ở m/z 1141 nói trên với sự mất

lần lượt của 1, 2, 3, 4 và 5 đơn vị đường 6-deoxyhexose. Như vậy, có thể khẳng định cấu

trúc của chuỗi carbohydrate là sự liên kết của 5 đơn vị đường 6-deoxyhexose.

Hình 4.24: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP11

Sự có mặt của 4 đơn vị đường Qui, 1 đơn vị đường Fuc được chỉ ra trên phổ 1D TOCSY.

Kết quả cho thấy các tín hiệu cộng hưởng của H-1–H-6 của 4 đơn vị quinovose và của H-1–H-4

của một đơn vị đường fucose, trong khi chiếu xạ cộng hưởng của một nhóm methyl tương ứng

dẫn đến một tín hiệu cho H-5 của đơn vị fucose. Dựa trên dữ liệu của phổ COSY, HSQC,

HMBC, và ROESY có thể xác định chuỗi oligosaccharide của hợp chất AP11 có chứa 2 đơn vị

đường β-fucopyranosyl và β-quinovopyranosyl ở phần cuối mạnh (terminal); và 3 đơn vị đường

phần đầu mạch (internal) bao gồm một β-quinovopyranosyl bị thế ở vị trí C-3 bởi cầu liên kết

glycoside; một β-quinovopyranosyl bị thế ở vị trí C-2 và C-4 bởi hai cầu liên kết glycoside; và một

β-quinovopyranosyl bị thế ở vị trí C-2 bởi một cầu liên kết glycoside. Thứ tự liên kết giữa các

phân tử đường và phần aglycon cũng được khẳng định dựa trên các tín hiệu tương tác trên phổ

HMBC và phổ ROESY. Từ các tương tác chìa khóa giữa H-1 của Quip1 và H-6 (C-6) của

aglycon, H-1 của Quip2 và H-3 (C-3) của Quip1, H-1 của Quip3 và H-4 (C-4) của Quip2, H-1 của

Fucp và H-2 (C-2) của Quip3, H-1 của Quip4 và H-2 (C-2) của Quip2 có thể suy ra vị trí liên kết

giữa các phân tử đường với nhau và giữa phần đường với phần aglycon của hợp chất steroid là

Fuc(1→2)-Qui3(1→4)-[Qui4(1→2)]-Qui2(1→3)-Qui1-Aglycon. Dựa vào các tín hiệu trên phổ

1D-, 2D-NMR xác định được các giá trị carbon và proton của phần đường (xem bảng 4.9).

Hình 4.25: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP11

Hình 4.26: Các tương tác chính trong phổ HMBC và ROESY của hợp chất AP11

Cấu hình D của các phân tử đường có trong AP11 (quinovose, fucose) được

chứng minh bằng cách thủy phân với dung dịch TFA 2M, rồi tiến hành phản ứng ancol

phân với (R)-(-)-2-octanol, sau đó acetyl hóa và xác định tR của dẫn xuất octyl thu được

bằng phương pháp GC theo quy trình của Leontein và cs [89]. Kết quả phổ GC của các

đơn vị đường được trình bày trong phần 3.2.5.

Bảng 4.8: Dữ liệu phổ phần aglycon của hợp chất AP11

ac

H

HMBC (H→C) C 35,8

29,3

77,4 30,6

49,1 80,1 41,3

35,4 146,0 35,8 115,8 40,4 42,3 53,5 25,3

23,0 ROESY (H→H) H-11, H3-19 H-3, H-11 H3-19 H-1, H-5 H3-19 H-3, H-7 H3-19 H-5 H3-18, H3-19 H-1 H-14, H-17 H-12, H-17 H3-18 H3-18

C 1β 1α 2α 2β 3 4α 4β 5 6 7β 7α 8 9 10 11 12 13 14 15α 15β 16β 16α 17 18 63,2 12,9

ab (JHz) 1,63 m 1,38 m 2,81 (brd, J 13,6 Hz) 1,89 (brq, J 12,5 Hz) 4,87 m 3,45 (brd, J 12,6Hz) 1,70 m 1,48 m 3,78 m 2,66 m 1,28 m 2,06 m ‒ ‒ 5,24 (brt, J 4,2 Hz) 2,14 brs ‒ 1,33 m 1,76 m 1,20 m 2,34 (brq, J 10,9 Hz) 1,61 m 2,51 (t, J 8,7 Hz) 0,58 s

H-12, H-14, H3-21 H-8, H-15, H-16

19 19,0 0,94 s

a C5D5N, b 500,13 MHz, c 125,75 MHz

20 21 208,0 30,8 ‒ 2,08 s H-1, H-2, H-4, H-6, H-8 H-17 C-13, C-18 C-12, C-13, C-14, C-17 C-1, C-5, C-9, C- 10 C-17, C-20

Bảng 4.9: Dữ liệu phổ NMR của chuỗi đường của hợp chất AP11

ac

ab (JHz)

ROESY HMBC (H→C) δC δH

C Qui 1 1 104,9 4,82 (d, J 7,6 Hz) C-6 of aglycon

C-1, C-3 Qui1

3,97 (t, J 8,3 Hz) 3,77 (t, J 8,6 Hz) 3,55 (t, J 9,0 Hz) 3,69 m 1,60 (d, J 6,0 Hz) 4,97 (d, J 6,8 Hz) C-3, C-6 Qui1 C-4, C-5 Qui1 C-3 Qui1 2 3 4 5 6 Qui 2 1 73,8d 91,0 74,4 71,7d 18,2 103.6

4,09 (t, J 7,6 Hz) 4,12 (t, J 8,7 Hz) 3,56 (t, J 8,7 Hz) 3,90 m 1,73 (d, J 6,1 Hz) 4,84 (d, J 7,9 Hz) C-4 Qui2 2 3 4 5 6 Qui 3 1 82.3 75.1 85.7 71.4 18,0 102,3

4,00 (t, J 8,3 Hz) 4,13 (t, J 9,3 Hz) 3,62 (t, J 8,9 Hz) 3,71 m 1,48 (d, J 6,0 Hz) 5,03 (d, J 7,7 Hz) C-3 Qui3, C-1 Fuc C-2, C-4 Qui3 C-5, C-6 Qui3 C-3 Qui3 C-4, C-5 Qui3 C-2 Qui3 2 3 4 5 6 Fuc 1 84,3 77,5 75,7 72,8 17,7d 106,9

H-6 of aglycon; H-3, H-5 Qui1 H-1 Qui1, H-1 Qui2 C-1 Qui 2 H-6 Qui1 H-1 Qui1 H-4 Qui1 H-3, H-5 Qui2; H-3 Qui1 H-1 Qui4 H-1 Qui2 C-2 Qui2 H-6 Qui2, H-1 Qui3 C-3 Qui2 H-1 Qui2 H-4 Qui2, H-1 Qui3 C-4, C-5 Qui2 H-3, H-5 Qui3; H-4, H-6 Qui2 H-1 Fuc H-1, H-5 Qui3 H-6 Qui3 H-1, H-3 Qui3 H-4 Qui3 H-3, H-5 Fuc; H-2 Qui3

2 3 4 5 6 Qui 4 1 73,7d 74,9 72,3 71,8d 16,9 104,9 C-1, C-3 Fuc C-3 Fuc C-1, C-4 Fuc C-4, C-5 Fuc C-2 Qui2

4,41 (dd, J 8,6; 9,5 Hz) 4,06 (dd, J 3,6; 9,5 Hz) H-1, H-5 Fuc H-5, H-6 Fuc 3,99 (d, J 4,0 Hz) H-3, H-4 Fuc 3,78 (q, J 6,5 Hz) H-4 Fuc 1,49 (d, J 6,2 Hz) H-3, H-5 Qui4; 5,27 (d, J 7,7 Hz) H-2 Qui2 H-1 Qui4 H-6 Qui4 H-1 Qui4 H-4 Qui4 4,04 (t, J 8,8 Hz) 4,12 (t, J 8,8 Hz) 4,01 (t, J 8,7 Hz) 3,70 m 1,79 (d, J 6,1 Hz) 76,2 77,5 75,5 73,4 17,8d C-4, C-5 Qui 4

2 3 4 5 6 a C5D5N, b 500,13 MHz, c 125,75 MHz, d các vị trí có thể hoán đổi cho nhau

Từ các kết quả phổ khối lượng HR-ESI-MS, phổ 1D-, 2D-NMR nêu trên, hợp

chất AP11 được xác định là: muối natri 6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-β-D-

quinovopyranosyl-(1→4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1→2)]-β-D-quinovopyranosyl-

(1→3)-β-D-quinovopyranosyl}-6α-hydroxy-5α-pregn-9(11)-en-20-one-3β-yl sulfate.

Đây là một asterosaponin hiếm với chuỗi carbohydrate bao gồm duy nhất hai dạng đơn

vị đường β-D-fucopyranosyl và β-D-quinovopyranosyl. Mới chỉ có hai asterosaponin

có cấu trúc chuỗi oligosaccharide tương tự là archasterosides B và C được phân lập

trước đây từ sao biển Archaster typicus [104, 105]. Như vậy, đây là hợp chất mới lần

đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được đặt tên là acanthaglycoside G.

+MS, 1.0-1.6min #59-92

Intens. 5 x10

1+ 437.1929

0.8

0.6

1+ 1173.4356

0.4

1195.4182

0.2

1+ 413.2659

685.4355

587.5483

619.5270

1293.4164

0.0

m/z

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

4.1.6. Hợp chất AP12: Pentareguloside G

-MS2(1127.4552), 110.0eV, 1.8-2.1min #103-122

Intens. 5 x10

1- 96.9603

2.0

1- 981.3975

146.0574

146.0577

1.5

1- 835.3401

1- 557.2407

1- 1127.4552

1.0

18.0105

132.0419

146.0574

1- 393.1727

0.5

146.0575

411.1832

585.2356

1- 689.2827

1- 225.0066

0.0

m/z

200

400

600

800

1000

Hình 4.27: Phổ khối lượng (+) HR ESI-MS của hợp chất AP12

Hình 4.28: Phổ khối lượng (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP12

Hợp chất AP12 thu được dưới dạng chất rắn, vô định hình. Trên phổ (+) HR ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử [M+Na]+ tại m/z 1173,4356 (tính toán lý thuyết cho CTPT

C50H79O26SNa2 = 1173,4376). Trên phổ (-) HR ESI-MS có mặt pic ion giả phân tử [M–Na]

tại m/z 1127,4552 (tính toán lý thuyết cho CTPT C50H79O26S = 1127,4586). Do đó, CTPT

của AP12 được xác định là C50H79O26SNa (M = 1150). Mảnh pic ion tại m/z 97 [HSO4]

trên phổ (–) HRESI-MS/MS của pic ion [M–Na] ở m/z 1127 chứng tỏ sự có mặt của nhóm

sulfate trong phân tử AP12. Ngoài ra, trên phổ (–) HR-ESI-MS/MS của pic ion [M–Na] ở

m/z 1127 còn xuất hiện tín hiệu của pic ion tại m/z 981 [(M – Na) – C6H10O4], 835 [(M –

Na) – 2 x C6H10O4], 689 [(M – Na) – 3 x C6H10O4], 557 [(M – Na) – 3 x C6H10O4 –

C5H8O4], 411 [(M – Na) – 4 x C6H10O4 – C5H8O4], 393 [(M – Na) – 4 x C6H10O4 – C5H8O4

– H2O], tương ứng với các tín hiệu này là sự mất lần lượt của 1, 2, 3, 4 đơn vị đường 6-

deoxyhexose, và một đơn vị đường pentose. Như vậy, từ dữ liệu phân tích phổ khối lượng

phân giải cao có thể dự đoán AP12 là một asterosaponin có chứa 4 đơn vị đường 6-

deoxyhexose và một đơn vị đường pentose trong phân tử.

Phổ 1H-NMR của AP12 cho thấy hợp chất này có dạng cấu trúc của một steroid

glycoside. Trên phổ này thấy xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm methyl khung steroid trong đó có

hai tín hiệu của hai nhóm methyl góc lần lượt ở δH 0,58 (s, CH3-18) và 0,94 (s, CH3-19); một tín

hiệu singlet của nhóm methyl CH3-21 có độ chuyển dịch hóa học về vùng trường yếu hơn ở δH

2,08 ppm có thể do có liên kết với một nhóm carbonyl. Ngoài ra, còn có tín hiệu của một proton

olefin của nối đôi bị thế 3 lần >C=CH ở δH 5,25 (brt, J = 3,6 Hz); một nhóm oxymetin liên kết

trực tiếp với một nhóm sulfate ở vị trí CH-3 với δH 4,85 ppm; một nhóm oxymetin ở vị trí CH-6

với δH 3,77 ppm. Các dữ liệu này gần như trùng khớp với các dữ liệu phân tích trong phần

aglycon của hợp chất AP11. Điều này chứng tỏ hợp chất AP12 có thể có phần aglycon giống

với hợp chất AP11 và có dạng 3β,6α-dihydroxy-5α-pregn-9(11)-en-20-one. Bên cạnh đó, ở

vùng trường yếu còn quan sát thấy các tín hiệu doublet của 5 proton anome của 5 đơn vị đường

ở δH 4,79 (1H, d, J = 7,7 Hz), 4,91 (1H, d, J = 7,7 Hz), 4,95 (1H, d, J = 7,7 Hz), 5,06 (1H, d, J =

7,5 Hz), 5,25 (1H, d, J = 7,7 Hz). Hằng số tương tác trong khoảng 7,5 – 7,7 Hz của các proton

anome chứng tỏ tất cả các liên kết glycoside có cấu hình β.

Phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu 3 nhóm methyl của phần aglycon lần lượt tại δC

12,9 (C-18), 19,0 (C-19), 30,8 (C-21), tín hiệu của một nhóm carbonyl tại δC 207,9 (C-

20). Sự có mặt của nối đôi bị thế ba lần trong phân tử được xác định tại δC 115,9/145,8.

Độ chuyển dịch hóa học của 5 nhóm CH tại δC 102,3; 103,6; 104,9; 104,9; 106,9 được

xác định là các carbon anome của 5 đơn vị đường. Kết hợp so sánh với dữ liệu phổ

phần aglycon của hợp chất AP11 ở trên và hợp chất đã biết pentareguloside G [33],

nhận thấy các tín hiệu của chúng hoàn toàn trùng khớp (xem bảng 4.10). Như vậy, có

thể khẳng định hợp chất AP12 có cấu trúc của phần aglycon là 3β,6α-dihydroxy-5α-

pregn-9(11)-en-20-one có chứa một nhóm sulfate tại vị trí C-3 và một chuỗi

oligisaccharide ở vị trí C-6.

Hình 4.29: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP12

Sự có mặt của 3 đơn vị đường Qui, 1 đơn vị đường Xyl, và 1 đơn vị đường Fuc

được chỉ ra trên phổ 1D TOCSY. Kết quả cho thấy các tín hiệu cộng hưởng của H-1 –

H-6 của 3 đơn vị quinovose, của H-1 – H-5 của một đơn vị xylose, và của H-1 – H-4

của một đơn vị đường fucose. Dựa trên dữ liệu của phổ COSY, HSQC, HMBC, và

ROESY có thể xác định chuỗi oligosaccharide của hợp chất AP12 có chứa 2 đơn vị

đường là β-fucopyranosyl và β-quinovopyranosyl ở cuối mạnh; và 3 đơn vị đường đầu

mạch bao gồm β-quinovopyranosyl bị thế ở vị trí C-3 bởi cầu liên kết glycoside; β-

xylopyranosyl bị thế ở vị trí C-2 và C-4 bởi hai cầu liên kết glycoside; và β-

quinovopyranosyl bị thế ở vị trí C-2 bởi một cầu liên kết glycoside. Thứ tự liên kết

giữa các phân tử đường và phần aglycon cũng được khẳng định dựa trên các tín hiệu

tương tác trên phổ HMBC. Từ các chìa khóa tương tác giữa H-1 của Quip1 và H-6 (C-

6) của aglycon, H-1 của Xylp và H-3 (C-3) của Quip1, H-1 của Quip2 và H-4 (C-4) của

Xylp, H-1 của Fucp và H-2 (C-2) của Quip2, H-1 của Quip3 và H-2 (C-2) của Xylp có

thể suy ra vị trí liên kết giữa các phân tử đường với nhau và giữa cụm đường với phần

aglycon của hợp chất steroid là Fuc(1→2)-Qui2(1→4)-[Qui3(1→2)]-Xyl(1→3)-Qui1-

Aglycon. Dựa vào các tín hiệu trên phổ 1D-, 2D-NMR ta xác định được tất cả các giá

trị carbon và proton của cụm đường. Đồng thời so sánh kết quả dữ liệu thu được từ

phần đường của AP12 với dữ liệu phổ phần đường của hợp chất pentareguloside G

[33] thì thấy các dữ liệu của chúng trùng khớp với nhau (xem bảng 4.11).

Bảng 4.10: Dữ liệu phổ phần aglycon của AP12 và pentareguloside G

ac

AP12 δH δH

1 δC 35,8

# δC 35,7

2 29,2 29,1

3 4 77,5 30,5 78,1 30,5

ab (J = Hz) 1,36 m 1,61 m 1,86 m 2,74 m 4,85 m 1,67 m 3,42 m 1,44 m

pentareguloside G [33] ## (J = Hz) 1,37 m 1,62 m 1,84 m 2,75 m 4,85 m 1,68 m 3,41 m 1,45 m 5 49,0 49,1

6 7 80,0 41,3 80,3 41,5

3,77 m 1,25 m 2,67 (dt, J = 12,7; 4,7 Hz) 3,77 m 1,27 m 2,67 (dt, J = 12,3; 4,7 Hz)

2,07 m 2,07 m 8 35,4 35,4

- - 5,23 brt - - 5,25 (brt J = 3,6 Hz) 9 10 11 146,0 38,2 115,8 145,8 38,2 115,9

12 13 14 15 40,4 42,3 53,5 25,3 40,4 42,3 53,4 25,4

16 23,0 23,0

2,14 m - 1,32 m 1,21 m 1,76 m 1,61 m 2,34 (brq, J = 11,6 Hz) 2,50 (t, J = 9,3 Hz) 2,15 m - 1,32 m 1,21 m 1,76 m 1,62 m 2,34 (brq, J = 10,9 Hz) 2,51 (t, J = 9,4 Hz) 17 63,2 63,2

0,57 (3H, s) 0,58 (3H, s) 18 12,9 12,9

0,92 (3H, s) 0,94 (3H, s) 19 19,0 19,0

- - 20 208,0 207,9

a C5D5N, b 500,13 MHz, c125,75 MHz; # C5D5N, 700,13 MHz, ## C5D5N, 176,04 MHz;

2,08 (3H, s) 2,08 (3H, s) 21 30,8 30,8

Bảng 4.11: Kết quả phổ NMR chuỗi đường của AP12 và pentareguloside G

pentareguloside G[33] AP12

##

ac

ab

δH δH δC

# δC

105,1 73,7 90,0 74,3 71,9 18,3 5,25 (d, J = 8,0 Hz) 4,40 (t, J = 7,8 Hz) 3,83 (t, J = 10,0 Hz) 3,55 (t, J = 9,0 Hz) 3,68 m 1,58 (d, J = 6,0 Hz) 105,0 73,9 90,2 74,4 71,8 18,2 4,79 (d, J = 7,8 Hz) 3,98 (dd, J = 8,8; 8,0 Hz) 3,80 (t, J = 8,9 Hz) 3,55 (t, J = 8,8 Hz) 3,66 m 1,55 (d, J = 5,5 Hz)

104,2 82,2 75,3 78,5 64,2 5,06 (d, J = 7,5 Hz) 4,07 (brt, J = 8,3 Hz) 4,21 (t, J = 8,8 Hz) 4,16 m 3,79 (brt, J = 10,3 Hz) 4,47 (dd, J = 5,1; 12,0 Hz) 104,4 81,6 75,6 78,6 64,3 5,02 (d, J = 7,7 Hz) 4,11 (t, J = 8,2 Hz) 4,19 (t, J = 8,9 Hz) 4,16 m 3,78 (dd, J = 11,9; 9,9 Hz) 4,48 (dd, J = 5,0; 11,8 Hz)

101,3 84,8 77,3 75,8 72,8 18,0 4,91 (d, J = 7,7 Hz) 3,94 (t, J = 8,7 Hz) 4,12 (t, J = 8,9 Hz) 3,62 (t, J = 8,8 Hz) 3,67 m 1,49 (d, J = 6,0 Hz) 101,5 84,9 77,3 75,7 72,8 17,9 4,91 (d, J = 7,8 Hz) 3,94 (t, J = 8,6 Hz) 4,12 (t, J = 9,1 Hz) 3,63 (t, J = 8,8 Hz) 3,66 m 1,49 (d, J = 5,9 Hz)

106,8 73,7 74,8 72,4 71,8 17,0 4,95 (d, J = 7,7 Hz) 4,40 (dd, J = 7,8; 9,5 Hz) 4,03 (dd, J = 3,4; 9,6 Hz) 3,97 m 3,74 (q, J = 6,9 Hz) 1,49 (d, J = 6,0 Hz) 106,9 73,7 74,8 72,4 71,8 17,0 4,95 (d, J = 8,1 Hz) 4,41 (dd, J = 7,2; 9,6 Hz) 4,03 (dd, J = 2,8; 9,4 Hz) 3,97 (d, J = 3,8 Hz) 3,73 (q, J = 6,4 Hz) 1,49 (d, J = 6,7 Hz)

a C5D5N, b 500,13 MHz, c125,75 MHz; # C5D5N, 700,13 MHz, ## C5D5N, 176,04 MHz.

C Qui 1 1 2 3 4 5 6 Xyl 1 2 3 4 5 Qui 2 1 2 3 4 5 6 Fuc 1 2 3 4 5 6 Qui 3 1 2 3 4 5 6 104,8 75,8 76,8 75,5 72,8 17,8 4,79 (d, J = 7,7 Hz) 3,96 3,62 m 1,77 (d, J = 6,2 Hz) 104,7 76,0 76,6 74,8 73,7 17,7 5,31 (d, J = 7,9 Hz) 4,07 (brt, J = 8,1 Hz) 4,11 (brt, J = 10,3 Hz) 4,04 (brt, J = 9,4 Hz) 3,71 m 1,76 (d, J = 6,6 Hz)

Như vậy, từ tất cả các dữ liệu được phân tích ở trên có thể khẳng định hợp chất

AP12 chính là hợp chất pentareguloside G được phân lập từ loài sao biển

Pentaceraster regulus[33]. Hợp chất AP12 được xác định là: muối natri 6-O-{β-D-

fucopyranosyl-(1→2)-β-D-quinovopyranosyl-(1→4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1→2)]-

β-D-xylopyran-osyl-(1→3)-β-D-quinovopyranosyl}-6α-hydroxy-5α-pregn-9(11)-en-

20-one-3β-yl sulfate Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ sao biển

Acanthaster planci.

Intens.

-MS2(1225.5316), 110.0eV, 2.1-2.3min #120-133

1- 981.3965

8000

146.0579

146.0570

6000

1- 1127.4543

1- 835.3394

96.9602

18.0108

4000

132.0422

1- 557.2401

146.0571

146.0568

2000

98.0757

1- 393.1725

1- 689.2823

255.2321

200

400

600

800

1000

1200

m/z

4.1.7. Hợp chất AP13: Acanthaglycoside A

Hình 4.30: Phổ (-)-HR ESI-MS/MS của chất AP13

Hợp chất AP13 thu được dưới dạng chất rắn, vô định hình. Trên phổ (+) HR ESI-MS của AP13 có mặt pic ion giả phân tử [M+Na]+ tại m/z 1271,5003 (tính toán lý

thuyết cho CTPT C56H89O27Na2S = 1271,5107). Trên phổ (-) HR ESI-MS có mặt pic

ion giả phân tử [M–Na] tại m/z 1225,5316 (tính toán lý thuyết cho CTPT C56H89O27S

= 1225,5312). Do đó, CTPT của AP13 được xác định là C56H89O27SNa (M = 1248).

Mảnh pic ion tại m/z 97 [HSO4] trong phổ (–) HR ESI-MS/MS của pic ion [M–Na] ở

m/z 1225 chứng tỏ sự có mặt của nhóm sulfate trong phân tử AP13. Đồng thời, cũng

trên phổ (–) HRESI-MS/MS này xuất hiện tín hiệu của mảnh pic ion ở m/z 1127 là sự

mất của một mảnh C6H10O [(M – Na) –C6H10O]; ở m/z: 981 [(M – Na) – C6H10O4–

C6H10O], 835 [(M – Na) – 2 x C6H10O4–C6H10O], 689 [(M – Na) – 3 x C6H10O4–

C6H10O], 557 [(M – Na) – 3 x C6H10O4 – C5H8O4–C6H10O], 411 [(M – Na) – 4 x

C6H10O4 – C5H8O4–C6H10O], 393 [(M – Na) – 4 x C6H10O4 – C5H8O4–C6H10O– H2O],

tương ứng với các tín hiệu này là sự mất lần lượt của 1, 2, 3, 4 đơn vị đường 6-

deoxyhexose, và một đơn vị đường pentose. Như vậy, từ dữ liệu phân tích phổ khối

lượng phân giải cao có thể dự đoán AP13 là một asterosaponin có chứa 4 đơn vị đường

6-deoxyhexose và một đơn vị đường pentose trong phân tử (giống với chuỗi đường của

AP12), và sự mất của mảnh C6H10O ở m/z 1127 [(M – Na) – C6H10O] cho thấy hợp

chất AP13 chỉ có sự khác biệt với hợp chất AP12 ở cấu trúc phần aglycon, cụ thể là ở cấu trúc mạch nhánh và hơn kém nhau mảnh đơn vị C6H10O-.

Phổ 1H NMR của hợp chất AP13, phần aglycon cho thấy tín hiệu của hai nhóm

methyl góc lần lượt ở δH 0,79 (s, 3H, CH3-18), 0,96 (s, 3H, CH3-19); hai nhóm methyl

chuyển dịch về phía trường yếu do liên kết với carbon olefin ở δH 1,75 (s, 3H, CH3-26),

2,18 (s, 3H, CH3-27); một nhóm methyl gắn với carbon bậc 4 có liên kết trực tiếp với

nguyên tử oxy ở δH 1,50 (s, 3H, CH3-21); một nhóm methylen nằm giữa hai carbon bậc

bốn ở δH 2,80 và 2, 68 (q, 2H, J 16 Hz, CH2-22); và hai proton olefin ở δH 5,30 (m, 1H,

H-11), 6,25 (s, 1H, H-24). Bên cạnh đó còn thấy xuất hiện tín hiệu của 5 proton anome

lần lượt ở δH 5,26 (d, J 7,0 Hz); 5,05 (d, J 7,5 Hz); 4,95 (d, J 8,0 Hz); 4,91 (d, J 8,0

Hz); và 4,79 (d, J 7,5 Hz).

Phổ 13C NMR của AP13 cho thấy tín hiệu của một nhóm carbonyl ở δC 201,7

(C-23); hai carbon olefin ở δC 154,7 (C-25) và 116,5 (C-11). Tín hiệu carbon của 5

nhóm methyl ở δC 13,4 (C-18); 19,1 (C-19); 20,4 (C-27); 27,09 (C-21) và 27,12 (C-

26). Tín hiệu của 5 carbon anome ở độ chuyển dịch hóa học δC 106,9; 105,1; 104,8; 104,3 và 101,4 ppm. Từ dữ liệu phổ 1H và 13C NMR của AP13 có thể dự đoán hợp chất

này có cấu trúc phần aglycon là một steroid khung cholestane với 3 nhóm –OH, trong

đó có 1 nhóm gắn với C-20; 2 nối đôi trong đó 1 nối đôi gắn với hai nhóm methyl ở

mạch nhánh; 1 nhóm carbonyl (C=O).

Hình 4.31: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP13

Bảng 4.12: Dữ liệu phổ NMR phần aglycon của AP13 và chất tham khảo

C AP13

ac

δH

δC 35,8 29,3 78,5 30,6 49,2 80,1 41,34 35,2 145,4 38,15 116,5 42,3 41,5 53,9 23,2 25,0 59,6 13,4 19,1 74,3 27,09 55,7 201,7 125,9 154,7 27,12 20,4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Acanthaglycoside A [49] # δC 36,2 29,7 77,9 30,9 49,6 80,6 41,7 35,5 145,4 38,5 116,7 42,7 41,8 54,1 23,6 25,3 59,8 13,8 19,5 74,3 27,6 56,1 201,7 126,0 154,9 27,5 20,9

ab (J in Hz) 4,85 m 5,23 (brd, 1H, J 6,0 Hz) 0,79 s 0,96 s - 1,50 s 2,80; 2, 68 (q, 2H, J 16 Hz) - 6,25 (1H, s) - 1,75 s 2,18 s a C5D5N, b 500,13 MHz, c125,75 MHz; # C5D5N

Bảng 4.13: Dữ liệu phổ NMR chuỗi đường của AP13 và chất tham khảo

a C5D5N, b 500,13 MHz, c125,75 MHz; # C5D5N;

Qui 1 1 2 3 4 5 6 Xyl 1 2 3 4 5 Qui 2 1 2 3 4 5 6 Fuc 1 2 3 4 5 6 Qui 3 1 2 3 4 5 6 AP13 ac δC 104,3 74,3 90,1 74,8 72,4 17,8 104,8 82,3 75,5 77,4 64,3 105,1 75,8 77,3 76,9 74,0 18,3 106,9 71,8 74,8 73,5 72,9 17,05 101,4 84,9 77,4 76,2 73,7 18,0 Acanthaglycoside A [49] # δC 104,5 74,3 90,2 74,6 72,2 18,2 105,0 82,1 75,6 77,9 64,6 105,1 76,0 77,5 76,9 74,0 18,7 107,0 72,1 75,0 73,1 72,7 17,5 101,5 85,1 77,5 76,1 74,0 18,5

Kết hợp tất cả các dữ liệu phổ đã phân tích và so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất

đã biết là acanthaglycoside A, thì nhận thấy dữ liệu phổ của hai chất này là hoàn toàn trùng

khớp với nhau (xem bảng 4.12 và 4.13) [49]. Như vậy, hợp chất AP13 được xác định là

acanthaglycoside A: muối natri 6-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-β-D-quinovopyranosyl-

(1→4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1→2)]-β-D-xylopyranosyl(1→3) -β-D-quinovopyranosyl}-

6α-hydroxy-5α-cholesta-9(11),24-dien-23-one-20-hydroxy-3β-yl sulfate.

-MS2(1227.5450), 110.0eV, 4.2-4.7min #242-270

Intens. 4 x10

146.0572

1- 981.3950

1- 1127.4523

146.0569

1- 835.3381

132.0419

1- 96.9600

100.0804

1- 557.2393

146.0569

146.0570

1- 393.1719

1- 689.2812

200

400

600

800

1000

1200

m/z

4.1.8. Hợp chất AP14: Maculatoside

Hình 4.32: Phổ (-)-HR ESI-MS/MS của chất AP14

Hợp chất AP14 thu được dưới dạng chất rắn, vô định hình. Phổ (+) HR ESI-MS của AP14 có mặt pic ion giả phân tử [M+Na]+ tại m/z 1273,5167 (tính toán lý thuyết

cho CTPT C56H91O27Na2S = 1273,5264). Trên phổ (-) HR ESI-MS có mặt pic ion giả

phân tử [M–Na] tại m/z 1227,5450 (tính toán lý thuyết cho CTPT C56H91O27S =

1227,5468). Vì vậy, CTPT của AP14 được xác định là C56H91O27SNa (M = 1250).

Mảnh pic ion tại m/z 97 [HSO4] trong phổ (–) HRESI-MS/MS của pic ion [M–Na] ở

m/z 1227 chứng tỏ sự có mặt của nhóm sulfate trong phân tử AP14. Đồng thời, cũng

trên phổ (–) HRESI-MS/MS này xuất hiện tín hiệu của mảnh pic ion tại m/z 1127 là sự

mất của một mảnh ion [C6H12O]- : [(M – Na) – C6H12O]. Phân tích các mảnh ion tiếp

đó ở m/z: 981 [(M – Na) – C6H10O4–C6H12O], 835 [(M – Na) – 2 x C6H10O4–

C6H12O], 689 [(M – Na) – 3 x C6H10O4– C6H12O], 557 [(M – Na) – 3 x C6H10O4 –

C5H8O4– C6H12O], 411 [(M – Na) – 4 x C6H10O4 – C5H8O4– C6H12O], 393 [(M – Na)

– 4 x C6H10O4 – C5H8O4– C6H12O– H2O], tương ứng với các tín hiệu này là sự mất lần

lượt của 1, 2, 3, 4 đơn vị đường 6-deoxyhexose, và một đơn vị đường pentose. Như

vậy, từ dữ liệu phân tích phổ khối lượng phân giải cao có thể thấy chất AP14 là một

asterosaponin có chứa 4 đơn vị đường 6-deoxyhexose và một đơn vị đường pentose

trong phân tử (giống với chuỗi đường của AP12 và AP13). Phân tích các mảnh ion có

thể dự đoán hợp chất AP14 có cấu trúc phần chuỗi đường hoàn toàn giống với AP13.

Như vậy, hai hợp chất này có thể chỉ có sự khác biệt ở cấu trúc phần aglycon, cụ thể là

ở cấu trúc mạch nhánh và hơn kém nhau hai proton trong phân tử vì ở chất AP13 có sự mất mảnh ion [C6H10O]- và chất AP14 có sự mất mảnh [C6H12O]-.

Phổ 1H NMR của hợp chất AP14, phần aglycon cho thấy tín hiệu của hai nhóm

methyl góc lần lượt ở δH 0,94 (s, 3H, CH3-18), 1,00 (s, 3H, CH3-19); hai nhóm methyl

liên kết với một metin ở δH 0,90 (s, 3H, CH3-26), 0,89 (s, 3H, CH3-27); một nhóm

methyl gắn với carbon bậc 4 có liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy ở δH 1,56 (s, 3H,

CH3-21); một nhóm methylen nằm giữa một carbon bậc bốn và một carbon carbonyl ở

δH 2,71 (2H, J 15,0 Hz, CH2-22); và một proton olefin ở δH 5,35 (m, 1H, H-11). Đồng

thời có sự xuất hiện tín hiệu của 5 proton anome lần lượt ở δH 5,22 (d, J 7,5 Hz); 5,07

(d, J 7,5 Hz); 4,96 (d, J 8,0 Hz); 4,92 (d, J 8,0 Hz); và 4,80 (d, J 7,5 Hz).

Phổ 13C NMR của AP14 cho thấy các tín hiệu của một nhóm carbonyl ở δC

211,6 (C-23); 2 carbon olefin ở δC 116,5 (C-11), và δC 145,4 (C-9); tín hiệu carbon của

5 nhóm methyl ở δC 13,4 (C-18); 19,1 (C-19); 22,3 (C-27); 22,5 (C-26) và 26,9 (C-21).

Ngoài ra còn có tín hiệu của 5 carbon anome ở độ chuyển dịch hóa học δC 106,9; 105,6; 104,6; 104,1 và 101,3 ppm. Từ dữ liệu phổ 1H và 13C NMR của AP14, đồng

thời so sánh với dữ liệu phổ của AP13, và dữ liệu phổ phần aglycon của

acanthaglycoside C, có thể dự đoán hợp chất này có cấu trúc phần aglycon giống của

acanthaglycoside C là 3β,6α,20-trihydroxy-5α-cholesta-9(11)-en-23-one.

Hình 4.33: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP14

Bảng 4.14: Dữ liệu phổ NMR phần aglycon của AP14 và chất tham khảo

ac

# (J in Hz)

AP14 δH (#) [50, 106] δH

1 2 3α δC 35,8 29,4 77,4

ab (J in Hz) 4,88 m

δC 35,8 29,2 78,0 4,22 m (W (cid:29) = 22,0) (cid:25)

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 5,37 (br d, J = 5,5 Hz) 5,34 m 0,81 (3H, s) 1,02 (3H, s) - 1,37 (3H, s) 2,61 (2H, q, J = 16,0 Hz) - 2,41 (d, J = 6,8 Hz) 0,94(d, J = 6,6 Hz) 0,95 (d, J = 6,6 Hz) 30,6 49,1 80,6 41,5 35,2 145,4 38,1 116,5 42,2 41,5 53,9 23,1 25,0 59,7 13,5 19,1 73,7 26,9 54,9 211,8 53,9 24,2 22,5 22,4 30,6 49,2 80,0 41,5 35,2 145,4 38,2 116,4 42,3 41,3 53,8 23,1 25,0 59,5 13,4 19,1 73,7 26,9 54,7 211,6 53,9 24,2 22,5 22,3

5,35 m 0,94 (3H, s) 1,00 (3H, s) - 1,56 (3H, s) 2,71 (2H, q, J = 15,0 Hz) - 0,90 (3H, d, J = 6,5 Hz) 0,89 (3H, d, J = 6,5 Hz) a C5D5N, b 500,13 MHz, c125,75 MHz; # C5D5N; (#): Acanthaglycoside C

Bảng 4.15: Dữ liệu phổ NMR chuỗi đường của AP14 và chất tham khảo

AP14 ac δC 105,6 74,1 89,8 74,3 72,4 18,0 Maculatoside [106] # δC 105,0 74,1 90,0 74,5 72,5 17,9 Qui 1 1 2 3 4 5 6 Xyl

100

104,1 82,9 75,4 78,3 64,3 104,6 75,6 76,3 76,3 73,8 18,0 106,9 71,9 74,9 73,6 71,85 17,1 101,3 84,9 75,8 77,1 72,9 18,3 104,1 82,0 75,3 78,5 64,2 105,0 75,5 76,7 76,1 73,8 18,1 106,8 71,9 74,8 73,6 71,9 17,1 101,2 84,7 75,9 77,4 73,0 18,4 1 2 3 4 5 Qui 2 1 2 3 4 5 6 Fuc 1 2 3 4 5 6 Qui 3 1 2 3 4 5 6 a C5D5N, b 500,13 MHz, c125,75 MHz; # C5D5N; 250 MHz; 62,5 MHz

Từ các phân tích dữ liệu phổ MS, 1H và 13C NMR của chất AP14, kết hợp so

sánh với dữ liệu phổ của phần hợp chất đã biết là maculatoside (được phân lập từ sao

biển Luidia maculata), kết quả cho thấy dữ liệu phổ của hai chất này hoàn toàn trùng

khớp với nhau (xem bảng 4.14 và 4.15) [50, 106]. Như vậy, cấu trúc của hợp chất

AP14 được xác định chính là hợp chất maculatoside: muối natri 6-O-{β-D-

fucopyranosyl-(1→2)-β-D-quinovopyranosyl-(1→4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1→2)]-

β-D-xylopyran-osyl-(1→3)-β-D-quinovopyranosyl}-6α-hydroxy-5α-cholesta-9(11)-en-

23-one-20-hydroxy-3β-yl sulfate.

4.1.9. Hợp chất AP5: 3-O-sulfothornasterol A

Hợp chất AP5 thu được dưới dạng chất rắn, vô định hình. Phổ NMR của AP5 cho thấy sự đặc trưng của một hợp chất có khung steroid. Phổ 1H-NMR có sự xuất hiện

của 5 nhóm methyl bao gồm: 2 tín hiệu singlet của 2 nhóm methyl góc tại δH 0,78 (3H,

101

s, H-18); δH 0,97 (3H, s, H-19); một tín hiệu singlet của một nhóm methyl bậc ba ở

vùng trường thấp hơn tại δH 1,33 (3H, s, H-21); 2 tín hiệu doublet của hai nhóm methyl

ở δH 0,89 (3H, d, J 6,5 Hz, H-26) và 0,91 (3H, d, J 6,5 Hz, H-27). Ngoài ra cũng trên

phổ proton, ở vùng trường yếu cũng cho thấy tín hiệu của hai nhóm oximetin tại độ

chuyển dịch hóa học δH 3,50 (1H, td, J = 4,1; 10,9 Hz, H-6) và δH 4,20 (1H, m, H-3).

Hằng số tương tác Jee và Jea tại vị trí H-6 chứng tỏ, cấu hình của H-6 được xác định là

rộng pic w 1 dạng β hay nhóm –OH ở vị trí C-6 có cấu hình α. Tín hiệu của proton ở vị trí C-3 có độ 2(cid:31) = 20 Hz cho phép khẳng định H-3 ở dạng α. Trên phổ 1H-NMR cũng

cho thấy tín hiệu của một proton olefin tại δH 5,33 ppm (1H, d, J = 6,0 Hz, H-11).

Hình 4.34: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP5

Phổ 13C-NMR của AP5 chỉ ra trong phân tử có mặt 27 nguyên tử carbon, trong

đó có 3 tín hiệu carbon dạng oxymetin (>CHO-) tại δC 79,6 (C-3), 69,8 (C-6), 60,4 (C-

20); một liên kết đôi tại C-9/C-11 tại δC 146,7 (C-9)/117,8 (C-11). Ngoài ra, trên phổ

carbon còn thể hiện sự có mặt của một carbon carbonyl tại δC 213,8 ppm (C-23).

Khi so sánh các dữ liệu phổ của hợp chất AP5 với hợp chất đã biết là Δ24-3-O-

sulfothornasterol A, được phân lập từ sao biển Asterias rathbuni [107] nhận thấy các

dữ liệu NMR của chúng hoàn toàn trùng khớp nhau, chỉ có sự khác biệt ở phần mạch nhánh tại vị trí C-25. Ở phần mạch nhánh của hợp chất Δ24-3-O-sulfothornasterol A,

các giá trị δC 126,4 (C-24), 157,4 (C-25) ở vùng trường yếu đã bị dịch chuyển về phía

trường cao hơn ở δC 54,7 (C-24), 25,4 (C-25) trong phổ của AP5. Điều này chứng tỏ

hợp chất AP5 không có liên kết đôi ở vị trí C-24/C-25 phần mạch nhánh (xem bảng

4.16). Do đó, hợp chất AP5 được xác định là 3-O-sulfothorasterol A.

102

Bảng 4.16: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP5 và chất tham khảo

ac

** (J= Hz)

AP5 δH (#) [107] δH

1 2 3 4 5 6 δC 37,0 29,6 79,6 31,1 51,3 69,8

ab (J= Hz) 4,20 (1H, m, H-3) 3,50 (1H, td, J= 10,9; 4,1 Hz)

* δC 36,9 29,6 79,7 31,1 51,1 69,8

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 43,4 36,7 146,7 39,2 117,8 43,2 42,5 55,1 25,9 23,8 65,3 13,6 19,5 60,4 26,6 75,2 5,33 (1H, d, J = 6,0 Hz) 0,78 (3H, s) 0,97 (3H, s) 1,33 (3H, s) 43,4 36,7 146,7 39,2 117,7 43,2 42,5 55,1 25,3 25,9 56,3 13,6 19,5 60,5 27,7 75,6

a Đo trong CD3OD, b 500 MHz, c125MHz; * 250MHz, CD3OD, **62,9 MHz, CD3OD (#): 3-

O-sulfothornasterol A [107]

23 24 25 26 27 213,8 54,8 25,4 22,8 22,9 2,37 (2H, d, J = 7,0 Hz) 0,89 (3H, d, J = 6,5 Hz) 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz) 203,5 126,4 157,4 20,9 26,9 4,20 (1H, m, H-3) 2,45 (dm, J = 12,5 Hz) 3,50 (1H, td, J = 10,8; 4,4 Hz, H-6) 5,33 (1H, d, J = 5,9 Hz) 0,78 (3H, s, H-18) 0,96 (3H, s, H-19) 1,33 (3H, s, H-21) 2,53 (Ha-22) 2,61 (Hb-22) 6,19 (1H, s) 1,90 (3H, s) 2,11 (3H, s)

4.1.10. Hợp chất AP6: 5-ergost-7-ene-3-ol

Phổ 1H-NMR của AP6 cho thấy sự xuất hiện của 6 nhóm methyl bao gồm: 2

nhóm methyl góc tại δH 0,54 (3H, s, H-18), δH 0,79 (3H, s, H-19); 1 tín hiệu của nhóm

methyl bậc ba tại δH 0,92 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-21); 3 nhóm methyl tại δH 0,79, 0,81

và 0,85 ppm. Tín hiệu của proton ở vị trí C-3 có δH 3,60 ppm (1H, m), và độ rộng pic

103

2(cid:31) = 22,0 cho phép khẳng định H-3 ở dạng α. Trên phổ 1H-NMR cũng cho thấy tín hiệu của proton olefin tại δH 5,17 ppm (1H, m). So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR của AP6

với dữ liệu của hợp chất đã biết 5α-ergost-7-ene-3β-yl acetate [108] nhận thấy độ

chuyển dịch hóa học của chúng gần như giống nhau. Hợp chất 5α-ergost-7-ene-3β-yl

acetate cũng có các tín hiệu như sau: tín hiệu của 1 proton olefin ở δH 5,18 ppm, 6 tín

hiệu của 6 nhóm methyl lần lượt ở δH 0,53 (3H, C-18), 0,77 (3H, C-27), 0,80 (3H, C-

19), 0,77 (3H, C-28), 0,85 (3H, C-26), 0,91 (3H, C-21) ppm, và xuất hiện thêm tín hiệu

ở δH 2,03 (3H, C-3, OAc), tín hiệu của H-3 có sự chuyển dịch về phía trường yếu hơn ở

δH 4,63 ppm (1H, C-3) so với H-3 của AP6. Như vậy, hợp chất AP6 có thể có dạng là

tiền chất của 5α-ergost-7-ene-3β-yl acetate không bị acetyl hóa ở vị trí H-3.

Hình 4.35: Cấu trúc hóa học của chất AP6 Hình 4.36: Tương tác HMBC của chất AP6 Phổ 13C-NMR của AP6 chỉ ra trong phân tử có mặt 28 nguyên tử carbon. Một

tín hiệu của carbon dạng metin (>CHO-) tại vị trí C-3 và một liên kết đôi cũng xuất

hiện lần lượt tại các độ chuyển dịch hóa học δC 71,1 (C-3) và 117,4 (CH=)/139,6 (C=).

Độ chuyển dịch hóa học của 6 carbon trong 6 nhóm methyl tương ứng tại δC 11,9 (C-

18), 13,0 (C-19), 18,8 (C-21), 18,2 (C-26), 20,2 (C-27), 15,4 (C-28) và 10 tín hiệu

carbon của CH2. So sánh dữ liệu phổ của AP6 với chất đã biết 5α-cholest-7-en-3β-ol

[109], nhận thấy các tín hiệu của chúng gần như trùng khớp nhau chỉ có sự khác biệt ở

độ chuyển dịch hóa học của các carbon trong phần mạch nhánh từ C-24 đến C-27, và

hợp chất AP6 nhiều hơn 1 carbon. Sự khác biệt này được giải thích do vị trí C-24 của

AP6 có liên kết với một nhóm methyl (CH3-28) (xem bảng 4.17).

Các phổ COSY, HSQC và HMBC cho phép xác định liên kết đôi ở vị trí C-7/C-

8. Sự phân tích chi tiết về mối tương quan HMBC và COSY của hợp chất AP6 cho kết

quả các tương tác được mô tả như hình 4.36. Như vậy, từ các dữ liệu phổ phân tích ở

trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo có thể khẳng định hợp chất AP6 là hợp

chất 5α-ergost-7-ene-3β-ol đã biết.

104

Bảng 4.17: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP6

C AP6 C

ac

δH

5α-cholest-7-en-3β-ol [109] * δC 37,1 1 δC 37,2 1

2 31,5 2 31,3

3 4 71,1 38,0 3 4 70,7 37,8

5 6 7 8 9 10 11 40,3 29,7 117,4 139,6 49,5 34,2 21,6 5 6 7 8 9 10 11 40,2 29,6 117,2 139,3 49,4 34,1 21,5

12 13 14 15 39,6 43,4 55,0 23,0 12 13 14 15 39,5 43,2 54,9 22,9

16 27,9 16 27,9

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

ab (J= Hz) 1,83 m 1,07 m 1,39 m 1,79 m 3,60 (1H, m) 1,71 m 1,27 m 1,39 m, 1H 1,78 m, 2H 5,17 m, 1H - 1,64 - 1,55 m 1,44 m 2,02 m, 2H - 1,80 1H 1,40 m 1,52 m 1,25 m 1,87 m 1,21 m 0,54 (3H, s) 0,79 (3H, s) 1,27 m 0,92 (3H, d, J = 7,5 Hz) 1,02 m, 2H 1,20 m, 2H 1,33 m 1,52 m 0,85 (d, J = 6,6 Hz) 0,81 (d, J = 6,6 Hz) 0,79 3H

a Đo trong CDCl3, b 500 MHz, c125MHz, * 25 MHz

56,2 11,9 13,0 38,8 18,8 33,7 30,4 36,3 32,4 18,2 20,2 15,4 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 56,1 11,8 12,9 36,1 18,8 36,1 23,9 39,4 27,9 22,5 22,7

4.1.11. Hợp chất AP7: Cholesterol

Hợp chất AP7 thu được dưới dạng chất rắn, màu trắng, tinh thể hình kim. Phổ 1H-NMR cho thấy hợp chất AP7 có cấu trúc của một steroid, với tín hiệu của 5 nhóm

105

methyl bao gồm: 2 nhóm methyl góc ở δH 0,67 (s, 3H, CH3-18) và 1,00 (s, 3H, CH3-

19); 3 tín hiệu doublet của 3 nhóm methyl ở mạch nhánh gồm CH3-21 ở δH 0,91 (d, 3H,

J = 6,5 Hz), CH3-26 ở δH 0,87 (d, 3H, J = 6,0 Hz), CH3-27 ở δH 0,86 (d, 3H, J = 6,5

Hz). Ngoài ra, còn xuất hiện tín hiệu multilet của một proton olefin ở δH 5,34 và tín

hiệu của một proton của nhóm metin liên kết trực tiếp với một nguyên tử oxy (CH-O) ở

2(cid:31) = 22,5 cho phép khẳng định cấu hình α.

δH 3,52 ppm, có độ rộng pic w1

Phổ 13C-NMR, phổ DEPT và phổ HSQC của AP7 cho phép xác định được hợp

chất này có sự xuất hiện của 27 carbon, trong đó bao gồm 5 carbon CH3 với δC 11,8

(C-18), 18,7 (C-21), 19,4 (C-19), 22,5 (C-27) và 22,8 (C-26); 11 carbon CH2 và 6

carbon CH trong vùng chuyển dịch hóa học 23-57 ppm; 1 carbon liên kết trực tiếp với

oxy (C-3) ở δC 71,7 ppm; 2 carbon olefin ở δC 121,7 (CH=), 140,7 (s>C=); và 2 carbon

bậc bốn ở δC 36,5 (C-4) và δC 42,2 (C-13). Như vậy, phổ carbon cho thấy đầy đủ các

tín hiệu của một hợp chất khung steroid có dạng cholestane.

Hình 4.37: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP7

Kết hợp tất cả các dữ liệu phổ 1D- và 2D-NMR của AP7 xác định được tất cả

các độ chuyển dịch hóa học của các carbon và proton trong phân tử AP7. So sánh các

dữ liệu này với các dữ liệu phổ của hợp chất đã biết là cholesterol [109, 110] thì thấy

các dữ liệu của chúng trùng khớp với nhau (xem bảng 4.18). Như vậy, hợp chất AP7

được xác định chính là cholesterol hay 3β-cholest-5-en-3-ol.

Bảng 4.18: Dữ liệu phổ của AP7 và chất tham khảo

C AP7

d

δH

Cholesterol [109, 110] e δC 37,2 1

ac δC 37,2

2 31,6 31,5

3 4 5

ab(J = Hz) 1,83 m 1,10 m 2,09 m 1,53 m 3,52 m, 1H 2,26 -

71,7 42,3 140,7 δH 1,82 m 1,30 m 1,82 m 3,52 m 2,27 m - 71,4 42,2 140,5

106

6 7 121,7 31,87 121,3 31,8

8 9 10 11 12 31,88 50,1 36,5 21,1 39,7 31,8 50,0 36,4 21,0 39,7

13 14 15 42,2 56,7 24,3 42,2 56,6 24,2

16 28,2 28,2

a CDCl3, b 500 MHz, c 125 MHz; d 100 MHz, e 25 MHz

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 5,34 m, 1H 1,85 m 1,52 m 1,44 m 0,94 m - 1,43-1,51 m 2,00 m 1,11 m - 1,00 m 1,54 m 1,51 m 1,85 m 1,23 m 1,12 m 0,67 s, 3H 1,00 s, 3H 1,37 m 0,91 (d, 3H, J = 6,5 Hz) 1,00 m 1,11 m 1,10-1,15 m 1,49 m 0,87 (d, 3H, J = 6,0 Hz) 0,86 (d, 3H, J =6,5 Hz) 56,1 11,8 19,4 35,8 18,7 36,2 23,8 39,5 28,0 22,8 22,5 5,35 m 1,52 m 1,52 m 0,97 m - 1,52 m 1,98 m 1,11 m - 0,97 m 1,52 m 1,51 m 1,82 m 1,30 m 1,30 m 0,68 s 1,01 s 1,30 m 0,91 d 0,97 m 1,11 m 1,11 m 1,52 m 0,87 d 0,85 d 56,1 11,8 19,2 35,7 18,7 36,1 23,8 39,4 27,9 22,5 22,7

4.1.12. Hợp chất AP8: Astaxanthin

Hình 4.38: Phổ 1H NMR của hợp chất AP8

107

Hợp chất AP8 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, màu tím sẫm. Phổ 1H-

NMR của hợp chất AP8 cho thấy 5 tín hiệu singlet của 5 nhóm methyl lần lượt ở các vị trí

δH 1,21 (s, 6H); 1,32 (s, 6H); 1,94 (s, 6H); 1,99 (s, 6H) và 2,00 (s, 3H). Ngoài ra, còn có sự

xuất hiện của các cặp tín hiệu proton khác có độ chuyển dịch hóa học về phía trường yếu

hơn ở δH 2,16 (2H, dd, J = 5,5; 13,0 Hz) của nhóm metylen, ở δH 4,32 (2H, ddd, J = 1,5;

5,5; 13,5 Hz) là proton của nhóm CH-O, và ở δH 6,21 (2H); 6,30 (4H); 6,43 (2H); 6,45

(2H); 6,63 (2H) và 6,68 (2H) là tín hiệu của các cặp proton olefin. Các dữ liệu này cho

phép dự đoán hợp chất AP8 có dạng cấu trúc của một carotenoid.

Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất này cho thấy tín hiệu của 20 carbon bao gồm 1 tín hiệu của carbonyl (C=O) tại δC 200,4 ppm; 1 carbon sp2 tại δC 162,3; và 10 carbon sp2 trong vùng chuyển dịch hóa học 123-142 ppm; 1 carbon liên kết trực tiếp

với nguyên tử oxy của nhóm CH-O ở δC 69,2; 1 carbon của nhóm CH2 tại δC 45,5; 1

carbon bậc bốn tại δC 36,8; và 5 carbon của nhóm CH3 lần lượt tại δC 30,8; 26,2; 14,0;

12,8 và 12,6 ppm. Kết hợp các dữ liệu này với phổ HSQC xác định các tương tác trực

tiếp của các nhóm proton tới carbon mà chúng liên kết có thể xác định mỗi tín hiệu

carbon này là sự nhân đôi của các cặp carbon trong cấu trúc phân tử đối xứng nhau của

hợp chất AP8.

Hằng số tương tác J = 16 Hz của H-7 (với H-8) và J = 15Hz của H-12 (với H-

11) cho thấy AP8 có cấu hình all-trans. Ngoài ra, phổ NOESY của AP8 cũng khẳng

định điều này với các tương tác quan sát được của H-7 với H-16, H-17 và H-19; của H-

8 với H-18, H-10; của H-11 với H-19 và/hoặc H-20; H-12 với H-10 và/hoặc H-14. Phân tích tất cả các dữ liệu phổ 1H, 13C NMR, DEPT và các phổ hai chiều COSY,

HSQC, HMBC và NOESY xác định được tất cả độ chuyển dịch hóa học của các proton

và carbon trong phân tử AP8. Đồng thời so sánh các dữ liệu này với dữ liệu phổ của

một carotenoid phổ biến ở một số loài sinh vật biển là astaxanthin [111], thì thấy các

dữ liệu của chúng hoàn toàn tương đồng với nhau (xem bảng 4.19). Như vậy, hợp

chất AP8 được xác định là hợp chất astaxanthin, có tên IUPAC là: (6S)-6-hydroxy-

3-[18-[(4S)-4-hydroxy-2,6,6-trimethyl-3-oxo-1-cyclohexenyl]-3,7,12,16-tetramethyl-

octadeca-1,3,5,7,9,11,13,15,17-nonaenyl]-2,4,4-trimethyl-cyclohex-2-en-1-one. Hợp

chất này đã được công bố có mặt trong sao biển Acanthaster planci bởi Maoka [61].

108

Hình 4.39: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP8 Bảng 4.19: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP8 và chất tham khảo

C (**) [111]

ac

##

δH

1, 1’ 2, 2’ δC 36,8 45,5 δC 36,84 45,47

3, 3’ 69,2 69,23

# δH - 1,81 dd (13,0; 13,5) Hax 2,16 dd (5,5; 13,0) Heq 3,68 d (1,5) OH 4,32 ddd (1,5; 5,5; 13,5)

4, 4’ 5, 5’ 6, 6’ 7, 7’ 8, 8’ 9, 9’ 10, 10’ 200,4 126,9 162,3 123,3 142,4 136,7 133,8 200,44 126,85 162,26 123,33 142,36 136,74 133,85

11, 11’

AP8 ab(J = Hz) - 1,81 dd (13,0; 13,5) Hβ 2,16 dd (5,5; 13,0) Hα 4,32 ddd (1,5; 5,5; 13,5) - - - 6,21 d (16,0), 2H 6,43 d (16,0) 2H - 6,30 (4H) (trùng với H-14, H-14’) 6,63-6,68 (4H) (trùng với H-15, H-15’) - - - 6,21 d (16,0) 6,43 d (16,0) - 6,30 (trùng với H-14, H-14’) 6,63-6,68 (trùng với H-15, H-15’) 124,6 hoặc 130,7

12, 12’ 13, 13’ 14, 14’ 139,8 134,6 135,2 124,65 hoặc 130,71 (không phân biệt với C-15, C-15’) 139,75 134,60 135,20

15, 15’ 6,45 d (15,0), 2H 6,30 (4H) (trùng với H-10, H-10’) 6,63-6,68 (4H) (trùng với H-11, H-11’) 6,45 d (15,0) 6,30 (trùng với H-10, H-10’) 6,63-6,68 (trùng với H-11, H-11’) 130,71 hoặc 124,6

1,21 s 6H 1,32 s 6H 1,94 s, 6H

30,8 26,2 14,0 12,8 124,65 hoặc 130,71 (không phân biệt với C-11, C-11’) 16, 16’ 17, 17’ 18, 18’ 19, 19’ 1,99 – 2,00 (2x6H, 2s, hoặc H-20, H-20’)

a CDCl3, b 500 MHz, c 125 MHz; # CDCl3, 500 MHz, ## CDCl3, 125 MHz; (**): astaxanthin

20, 20’ 1,99 – 2,00 (2x6H, 2s, 12,8 hoặc H-19, H-19’)

109

4.1.13. Hợp chất AP9: Thymine

Hợp chất AP9 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng. Phổ 1H

NMR của hợp chất AP9 chỉ cho thấy 3 nhóm tín hiệu bao gồm một tính hiệu doublet ở

δH 1,72 (3H, d, J = 1Hz) của một nhóm methyl; một tín hiệu doublet thuộc vùng trường

yếu ở δH 7,24 (1H, d, J = 1Hz) của một proton olefin, độ chuyển dịch của proton olefin

sâu về phía trường yếu này là do ảnh hưởng bởi liên kết với dị tố của carbon olefin và

hằng số tương tác nhỏ J = 1,0 Hz có thể dự đoán carbon olefin này liên kết với một

carbon olefin bậc bốn (>C=) và một dị tố có liên kết với 1 proton; và hai tín hiệu ở δH

10,6 và 11,0 của hai nhóm NH.

Phổ 13C NMR của AP9 cho thấy các tín hiệu phù hợp với cấu trúc của thymin.

Quan sát thấy tín hiệu của 5 carbon trong đó bao gồm: 1 carbon của nhóm CH3 ở δC

11,8; 2 carbon olefin tại δC 107,7 (CH=) và 137,7 (>C=), 2 carbon của nhóm carbonyl

(C=O) tại δC 151,5 và 164,9 ppm (chi tiết xem bảng 4.20).

Từ các dữ liệu phổ proton và carbon thu được kết hợp so sánh với dữ liệu phổ

của chất đã biết là thymin [112, 113], nhận thấy các dữ liệu của chúng trùng khớp với

nhau. Vì vậy, hợp chất AP9 được xác định chính là hợp chất thymin, cấu trúc hóa

học được mô tả trong hình 4.40.

4.1.14. Hợp chất AP10: Uracil

Hợp chất AP10 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng. Phổ 1H

NMR của hợp chất AP10 cho thấy tín hiệu của hai proton olefin bao gồm một tín hiệu

doublet ở δH 5,44 (1H, d, J = 7,5 Hz), và tín hiệu doublet thuộc vùng trường yếu ở δH

7,24 (1H, d, J = 1Hz); và hai tín hiệu multiplet ở δH 10,8 và 11,0 của hai nhóm NH. So

sánh dữ liệu phổ proton của AP10 với AP9 thấy hai hợp chất này chỉ khác nhau bởi sự

xuất hiện của một nhóm methyl ở AP9, trong khi đó hợp chất AP10 không có sự xuất

hiện của nhóm methyl nhưng thay vào đó là sự xuất hiện của một proton olefin (CH=).

Vì vậy, hợp chất AP10 được dự đoán có cấu trúc hóa học giống với AP9 và mất đi một

nhóm methyl trong cấu trúc. Hợp chất AP10 có thể là hợp chất uracil.

Hình 4.40: Cấu trúc hóa học của chất AP9 Hình 4.41: Cấu trúc hóa học của chất AP10

110

Bảng 4.20: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP9 và AP10

δH δH

NH 2 NH 4 5 6 7 AP9 ab (J in Hz) 10,6 m 11,0 m 7,24 (1H, d, J = 1Hz) 1,72 (3H, d, J = 1Hz)

ac δC 151,5 164,9 107,7 137,7 11,8

AP10 ab (J in Hz) 10,7 m 11,0 m 5,44 (1H, d, J = 7,5 Hz) 7,38 (1H, d, J = 7,5 Hz)

ac δC 151,2 164,3 100,2 142,1

a DMSO, b 500 MHz, c 125 MHz

Phù hợp với các dự đoán trong phổ proton của AP10, phổ 13C NMR của hợp

chất này cho thấy các tín hiệu carbon của: 2 carbon olefin ở δC 100,2 và 142,1 ppm; 2

carbon nhóm carbonyl (C=O) ở δC 151,5 và 164,3 ppm và không thấy tín hiệu của

nhóm methyl ở δC 11,8 ppm như của AP9. So sánh tất cả các tín hiệu phổ proton và

carbon của hợp chất AP9 và AP10 (xem bảng 4.20), kết hợp với tài liệu tham khảo về

công bố của uracil [114] có thể khẳng định hợp chất AP10 chính là hợp chất uracil.

Cấu trúc hóa học của uracil được mô tả như hình 4.41.

Bảng 4.21: Bảng tổng hợp các chất phân lập được từ sao biển Acanthaster planci

AP2 Planciside B (Hợp chất mới) AP1 Planciside A (Hợp chất mới)

111

AP4 Planciside D AP3 Planciside C (Hợp chất mới)

AP5 3-O-sulfothorasterol A AP6 5α-ergost-7-ene-3β-ol

AP8 Astaxanthin AP7 Cholesterol

AP10 Uracil AP9 Thymine

AP11 Acanthaglycoside G (Hợp chất mới)

112

AP12 Pentareguloside G

AP13 Acanthaglycoside A

AP14 Maculatoside

4.2. Chuyển hóa hóa học của cholesterol

Như đã phân tích ở trên, các hợp chất polyhydroxysteroid, hydroximinosteroid

có mạch nhánh giống cholesterol được đánh giá là các hợp chất tiềm năng có hoạt tính

gây độc trên nhiều dòng tế bào ung thư. Vì vậy, cholesterol (hợp chất AP7) được lựa

chọn làm nguyên liệu đầu cho các phản ứng chuyển hóa tạo các sản phẩm hydroxyl và

oxime hóa.

113

4.2.1. Chuyển hóa các dẫn xuất polyhydroxysteroid

Bảy hợp chất polyhydroxysteroid (15c-21c) đã được tổng hợp từ cholesterol sử

dụng các tác nhân nhân oxy hóa và có khả năng tạo sản phẩm dạng diol theo sơ đồ 4.1

dưới đây. Các hợp chất này mặc dù không phải là các chất mới, tuy nhiên nội dung

nghiên cứu này nêu ra phương án tổng hợp đơn giản và hiệu quả hơn so với các

phương pháp đã công bố, đồng thời có thể áp dụng trên các hợp chất steroid khác từ

sao biển để tạo ra các dẫn xuất polyhydroxysteroid.

Sơ đồ 4.1.Tổng hợp các dẫn xuất polyhydroxysteroid từ cholesterol Các tác nhân và điều kiện phản ứng:(i): BH3.THF, H2O2, NaOH, 0oC, 1 giờ (15c: 71%, 16c: 9%); (ii): SeO2, dioxane, H2O, 80oC, 80 giờ (17c: 50%, 18c: 2,0%, 19c: 3,5%); (iii): 4% OsO4/H2O, NMO, đun hồi lưu, 48 giờ (20c: 74%); (iv): 1. HCOOH 88%, THF/H2O2, 12 giờ, 2. KOH 3% trong MeOH (21c: 75%).

4.2.1.1 Hợp chất cholestane-3β,6α-diol (15c) và cholestane-3β,6β-diol (16c)

Phản ứng hydroxyl hóa cholesterol sử dụng tác nhân oxy hóa BH3.THF/H2O2

được thực hiện theo phương pháp mô tả bởi Jiang và cs [79]. Theo công bố này, phản

ứng chỉ thu được một sản phẩm dạng 3β,6α-diol khi thực hiện phản ứng trên diosgenin.

Tuy nhiên, khi thực hiện phản ứng này trên cholesterol chúng tôi thu được hai đồng

114

phân isomer cholestane-3β,6α-diol (15c) và cholestane-3β,6β-diol (16c) với tỷ lệ 8:1, tổng hiệu suất phản ứng đạt 80%. Phổ 1H NMR của hai hợp chất không còn thấy xuất

hiện tín hiệu của proton olefin ở δH 5,34 ppm và thay vào đó là sự xuất hiện tín hiệu

của proton nhóm CH-O ở vị trí C-6. Hai hợp chất này chỉ có sự khác biệt cấu hình H-

6β ở δH 3,39 (ddd, J = 4,5; 10,5; 11,0 Hz) ppm trong hợp chất 15c và H-6α ở δH 4,09

(br s) ppm trong hợp chất 16c. Tín hiệu ddd và các hằng số J (10,5; 11,0 Hz) lớn cho

thấy H-6 có cấu hình trans so với H-5α và H-7α. Vì vậy, H-6 của chất 15c được xác

định có cấu hình β. Tín hiệu H-6 có dạng broad singlet có dạng equatorial trong khi hai

proton liền kề H-5 và H-7 và có dạng axial nên khó có sự tương tác.

Hình 4.42: Phổ 13C NMR của hợp chất 15c

Hình 4.43: Phổ 13C NMR của hợp chất 16c

Dữ liệu phổ carbon của hai hợp chất đều cho thấy tín hiệu của 27 carbon và dữ liệu

của chúng gần như tương đồng nhau tuy nhiên có sự khác biệt rõ ràng ở vị trí C-6 của 15c

có δC 69,4 ppm trong khi C-6 của 16c chuyển dịch về phía trường mạnh hơn ở δC 66,2 ppm. Trong phổ 13C NMR của cả hai hợp chất đều không còn xuất hiện tín hiệu của

115

carbon olefin (C-5) ở δC 140,7 ppm như trong phổ của cholesterol (xem bảng 4.18). Như

vậy, cholestrol đã bị hydroxyl hóa ở vị trí nối đôi C5/C6 tạo thành hai hợp chất cholestane-

3β,6α-diol (15c, sản phẩm chính) và cholestane-3β,6β-diol (16c, sản phẩm phụ).

4.2.1.2. Hợp chất cholestan-5-ene-3β,4β-diol (17c), cholestan-5-ene-3β,7β-diol (18c)

và cholestan-5-ene-3β,4β,7β-triol (19c)

Theo nghiên cứu của Eunsook Ma và cs [113], khi thực hiện phản ứng hydroxyl

hóa cholesterol cũng như một số các steroid khác có dạng 5-ene-3β-ol bằng tác nhân oxy hóa allylic selendioxide (SeO2) ở 80oC trong 18 giờ chỉ thu được một sản phẩm

ancol allylic duy nhất có dạng 5-ene-3β,4β-diol (17c). Tuy nhiên, khi chúng tôi thực

hiện phản ứng trên cholesterol và kéo dài thời gian phản ứng lên 80 giờ thì nhận thấy

có sự hình thành thêm hai sản phẩm 18c và 19c, và 17c vẫn là sản phẩm chính của

phản ứng. Hiệu suất phản ứng khi thực hiện trong 18 giờ là 68% sản phẩm 17c, nhưng

khi tăng thời gian phản ứng lên 80 giờ hiệu suất của các sản phẩm 17c, 18c, và 19c thu

được tương ứng là 50,0%, 2,0% và 3,5%.

Hợp chất 17c: phổ 1H NMR của hợp chất 17c trong vùng trường yếu ngoài tín

hiệu của một proton olefin H-6 ở δH 5,68 (d, J = 3,0 Hz) và tín hiệu của một proton H-3

của nhóm HC3-O ở δH 3,56 (dt, J = 4,0; 11,5 Hz) thì còn xuất hiện thêm một tín hiệu của proton nhóm HC-O ở δH 4,13 (d, J = 3,0 Hz) so với phổ 1H của cholesterol. Phổ 13C NMR của 17c cũng cho thấy đầy đủ các tín hiệu của 27 carbon, trong đó tín hiệu

của hai carbon dạng metin liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy (HC-O) ở δC 77,3 (C-4,

do ảnh hưởng của liên kết đôi nên chuyển dịch về phía trường yếu hơn so với C-3) và

72,3 (C-3); tín hiệu của hai carbon olefin ở δC 142,8 (C-5) và 128,8 (C-6). Cấu hình 4β-

OH đã được Eunsook Ma chứng minh khi dùng SeO2 là tác nhân hydroxyl hóa các hợp chất steroid có dạng 5-en-3β-ol. Dữ liệu phổ 1H, 13C NMR của 17c kết hợp với tài liệu

tham khảo [114] cho phép xác định hợp chất 17c là cholestan-5-ene-3β,4β-diol.

Hợp chất 18c thu được với hiệu suất 2,0%. Trong phổ 1H NMR xuất hiện thêm

một tín hiệu của proton nhóm CH-O ở δH 3,85 ppm (1H, br s, H-7) so với phổ của 17c.

Bên cạnh đó, vẫn thấy xuất hiện tín hiệu của proton olefin H-6 ở δH 5,60 (1H, dd, J =

116

1,5; 5,0 Hz), tín hiệu của proton nhóm hydroxyl ở vị trí C-3 ở δH 3,57 (m, 1H), và 2 proton H-4 ở δH 2,25-2,36 ppm. Phổ 13C NMR và HSQC của 18c cho thấy tín hiệu của

27 carbon trong đó hai carbon olefin được xác định ở δC 146,2 (C-5) và δC 123,9 (C-6);

hai carbon có nhóm hydroxy được xác định ở δC 71,3 (C-3) và δC 65,3 (C-7). Kết hợp các dữ liệu phổ 13C NMR, COSY, HSQC và HMBC có thể quy kết và xác định được

toàn bộ các tín hiệu của 27 carbon (xem phần 3.3.1).

Hình 4.44: Tương tác HMBC của hợp chất 18c

Vị trí của nhóm hydroxyl được xác định ở C-7 do quan sát thấy các tương tác

của H-7 với C-6, C-5 và tương tác của H-6 với C-7 trong phổ tương tác HMBC (hình

4.44). Hằng số tương tác J của H-6 có giá trị nhỏ (J = 1,5; 5,0 Hz) chứng tỏ Hα-6 và H-

7 ở dạng cis với nhau. Vì vậy, proton của C-7 được xác định có cấu hình α hay nhóm

OH ở vị trí C-7 được xác định có cấu hình β. Hợp chất 18c được xác định là

cholestan-5-ene-3β,7β-diol.

Hợp chất 19c: Trong phổ 1H NMR của 19c ngoài tín hiệu của một proton olefin

ở δH 5,87 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6) và một proton của nhóm hydroxy vị trí C-3 ở δH 3,60

(1H, m) còn xuất hiện thêm tín hiệu của hai proton nhóm CH-O ở δH 4,18 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-4) và δH 3,94 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-7). Từ phổ 13C NMR và HSQC xác định

được vị trí của các carbon đặc trưng như carbon olefin ở δC 147,0 (C-5), 129,7 (C-6); 3

carbon có liên kết với nhóm hydroxy ở δC 76,9 (C-4), 72,1 (C-3), 65,3 (C-7); và 5

carbon nhóm methyl. Kết hợp các phổ 1D, 2D NMR cho phép quy kết và xác định

được vị trí của 27 carbon trong hợp chất 19c (xem phần 3.3.1).

117

Hình 4.45: Phổ tương tác HMBC của chất 19c

Vị trí của hai nhóm –OH mới được xác định ở vị trí C-4 và C-7 do quan sát thấy

các tương tác trong phổ HMBC của H-4 với C-3, C-6; của H-6 với C-4, C-7. Như đối

với hợp chất 17c nhóm hydroxy đã được Eunsook Ma và cs [114] chứng minh có cấu

hình β. Bên cạnh đó, hằng số tương tác J của H-6, H-4 và H-7 đều có giá trị nhỏ (5,0;

3,0; 3,5 Hz) chứng tỏ các proton này đều ở dạng cis với nhau. Vì vậy, cả hai nhóm

hydroxy ở vị trí C-4 và C-7 đều được xác định có cấu hình β. Hợp chất 19c được xác

định là cholestan-5-ene-3β,4β,7β-diol.

4% OsO4/H2O, NMO

Dioxan, reflux, 48h

4.2.1.3. Hợp chất cholestane-3β,5α,6α-triol (20c)

20c

Phản ứng diol hóa alken sử dụng tác nhân OsO4/H2O thông thường sẽ thu được

hai đồng phân có dạng cis-α,α-diol và cis-β,β-diol [115]. Tuy nhiên, khi thực hiện phản

ứng diol hóa cholestrol bằng tác nhân này chúng tôi chỉ thu được một sản phẩm duy

nhấtdạng cis-α,α-diol (20c).

Phổ 1H NMR cho thấy tín hiệu multiplet đặc trưng của H-3 ở δH 4,05 ppm và

xuất hiện thêm một tín hiệu proton của nhóm CH-O ở δH 3,67 (1H, br d, J 10,0 Hz)

ppm. Trên phổ này không còn thấy tín hiệu proton olefin H-6 ở δH 5,34 ppm của

cholesterol.

118

Hình 4.46: Phổ 1H NMR giãn rộng của hợp chất 20c

Hình 4.47: Phổ 13C NMR giãn rộng của hợp chất 20c

Tương ứng với các tín hiệu của phổ proton, phổ 13C NMR của 20c cho thấy đầy

đủ tín hiệu của 27 carbon. Trong đó, không còn thấy tín hiệu của carbon olefin ở δC

121,7 ppm (C-6) và 140,7 ppm (C-5), thay vào đó là 3 tín hiệu của carbon liên kết trực

tiếp với oxy lần lượt ở δC76,8 (C-5), 70,6 (C-6), 67,5 (C-3). Điều này chứng tỏ liên kết

đôi vị trí C5/C6 của cholesterol đã bị diol hóa. Sản phẩm 20c được xác định là

cholestan-3β,5α,6α-triol. Cholesterol có cấu trúc thuộc dãy 5α, vì vậy sản phẩm diol

hóa sẽ ưu tiên dạng 5α-OH hơn dạng 5β-OH. Khi ở dạng 5β-OH, nhóm OH nằm cùng

trên một mặt phẳng với CH3-19, điều này không có lợi do hiệu ứng cản trở không gian

(steric effect). Do đó, chỉ thu được một sản phẩm duy nhất α,α-diol thay vì hỗn hợp hai

đồng phân α,α-diol và β,β-diol như với các alken khác. Kết quả này cũng giống với kết

quả thu được khi thực hiện phản ứng trên diosgenin, sản phẩm thu được cũng ở dạng

5α,6α-diol, được công bố bởi Trần Thị Thu Thủy và cs [88]. Như vậy, hợp chất 20c

được xác định cấu trúc là cholestane-3β,5α,6α-triol.

119

1. HCOOH 88%, THF/H2O2, 12h

2. 3% KOH in MeOH, ref lux, 15 min

4.2.1.4. Hợp chất cholestane-3β,5α,6β-triol (21c)

21c

Phản ứng diol hóa các steroid có dạng Δ5-sterol với một nhóm thế ở vị trí CH3-

19 bằng tác nhân acid formic có thể thu được một hỗn hợp của hai đồng phân 5α,6β-

diol và 5β,6α-diol, với đồng phân 5α,6β-diol là sản phẩm chính [116]. Tuy nhiên, khi

thực hiện phản ứng này trên cholesterol sử dụng tác nhân oxy hóa là HCOOH/H2O2

chúng tôi chỉ thu được một sản phẩm duy nhất có dạng 5α,6β-diol với hiệu suất phản

ứng là 75%. Không thu được sản phẩm 5β,6α-diol do cholesterol có khung steroid

thuộc dãy 5α (vòng A và vòng B gắn kết theo dạng trans), và đồng thời nhóm methyl

góc CH3-19 ở vị trí β nên nhóm hydroxy ở vị trí C-5α sẽ thuận lợi hơn về mặt hiệu ứng

cản trở không gian. Kết quả này cũng giống với kết quả thu được khi thực hiện phản

ứng trên diosgenin, sản phẩm thu được cũng ở dạng 5α,6β-diol, được công bố bởi Trần

Thị Thu Thủy và cs [88].

Hình 4.48: Phổ 1H NMR giãn rộng của hợp chất 21c

Hình 4.49: Phổ 13C NMR giãn rộng của hợp chất 21c

120

Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR đã cho thấy phản ứng dihydroxy hóa đã xảy ra.

Trong phổ proton không còn thấy xuất hiện tín hiệu của proton olefin H-6 và thay vào

đó là sự xuất hiện một tín hiệu proton của nhóm CH-O ở δH 3,49 ppm (H-6). Đồng thời

phổ carbon cũng cho thấy tín hiệu của 3 carbon liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy lần

lượt ở δC 76,0 (C-5), 75,7 (C-6) và 67,5 (C-3). Phổ NOESY không có tương tác giữa

CH3-19 và H-6, chứng tỏ rằng H-6 có cấu hình α hay OH-6 có cấu hình β. Như vậy,

hợp chất 21c được xác định là cholestan-3β,5α,6β-triol.

Hợp chất 21c đã được phân lập từ loài san hô Muriceosis flavida [80] và được

công bố tổng hợp từ cholesterol qua một bước phản ứng duy nhất sử dụng 10 đương

lượng tác nhân HIO4 trong 24 giờ, hiệu suất 85% [81]. Tuy nhiên, phản ứng này phải

có sự kiểm soát chính xác về tỷ lệ đương lượng HIO4. Bởi vì khi tăng lên 20 đương

lượng HIO4 hiệu suất phản ứng chỉ là 6%, hoặc giảm xuống còn 3 đương lượng thì hiệu

suất chỉ đạt 12%. Như vậy, sử dụng tác nhân acid formic sẽ có lợi thế hơn về mặt thời

gian phản ứng (12 giờ) cũng như tỷ lệ tác nhân không quá ngặt nghèo. Đây là lần đầu

tiên sản phẩm này được tổng hợp từ cholesterol chỉ qua một bước phản ứng sử dụng

tác nhân oxy hóa là acid formic.

4.2.2. Chuyển hóa các dẫn xuất hydroxyminosteroid

Các nghiên cứu gần đây về cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất

hydroximinosteroid cho thấy đây là lớp chất có tiềm năng về hoạt tính sinh học. Các

nghiên cứu về mối quan hệ giữa hoạt tính – cấu trúc cũng chỉ ra rằng vị trí của các

nhóm oxime và loại mạch nhánh ở vị trí C-17 của khung steroid cũng đóng vai trò

quan trọng trong khả năng gây độc tế bào của chúng [84, 86, 118]. Nghiên cứu của Cui

và cs đã chứng minh rằng steroid có cấu trúc mạch nhánh của cholestane có hoạt tính

tốt hơn mạch nhánh của stigmastane, và mạch nhánh giống của stigmastane có hoạt

tính tốt hơn mạch nhánh của sitostane [86]. Sự xuất hiện của nhóm oxime ở vị trí C-3

hoặc/và C-6, hoặc sự xuất hiện của nguyên tố oxy trong vòng A (C-3,4,5) có thể làm

tăng hoạt tính gây độc tế bào [85, 118]. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tổng hợp một số

hydroximinosteroid từ cholesterol. Các sản phẩm có nhóm oxime ở vị trí C-3; hoặc C-3

và C-6; và vòng epoxy ở vị trí C-4,5.

121

Sơ đồ 4.2. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid từ cholesterol Các tác nhân và điều kiện phản ứng: (i): PCC/CH2Cl2, rt, 48 giờ (22c: 80,0%, 24c: 82,0%); (ii): BH3.THF/H2O2, NaOH, 0 oC, 1 giờ (15c: 80,0%); (iii): CeCl3.7H2O/NaBH4, CH2Cl2&MeOH (1:1), rt, 1 giờ (26c: 89,0%); (iv): 1. m-CPBA/CH2Cl2, 2. Dess- Martin/CH2Cl2, 0 oC (27c: 12,3%, 28c: 14,5%); (v):NH2OH.HCl/Pyridine, 24 giờ (23c: 85,0%, 25c: 81,0%, 29c: 19,3%, 30c: 13,4%, 31c: 22,5%).

Bốn hợp chất hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) đã được tổng hợp qua 2 đến 4

bước phản ứng, trong đó có 2 hợp chất hydroximinosteroid mới (29c, 31c) và 2 hợp chất

hydroximinosteroid đã biết (23c, 25c). Bảy sản phẩm trung gian được tổng hợp, trong đó có

1 sản phẩm trung gian được xác định là chất mới (30c) và 6 sản phẩm trung gian đã biết

(15c, 22c, 24c, 26c, 27c, 28c). Các phản ứng được thực hiện theo như sơ đồ 4.2.

4.1.2.1. Hợp chất cholest-4-ene-3,6-dione (22c) và cholestane-3,6-dione (24c)

122

Hai hợp chất diketone được tổng hợp bằng cách chuyển hóa trực tiếp trên

cholesterol và một sản phẩm hydroxy hóa từ cholesterol là cholestane-3β,6α-diol (15c)

bằng tác nhân oxy hóa pyridinium chlorochromate (PCC) theo phương pháp được mô

tả bởi Nagia [119]. Hiệu suất phản ứng thu được khá cao, 80% trên cholesterol và 82%

trên hợp chất 15c. Khi chuyển hóa cholesterol thu được sản phẩm 22c với hai nhóm

ketone ở vị trí C-3 và C-6, và có sự chuyển vị liên kết đôi từ C5/C6 sang C4/C5.

Chuyển hóa hợp chất 3,6-diol (15c) thu được sản phẩm 24c cũng có hai nhóm ketone

tại vị trí C-3 và C-6. Hai sản phẩm này chỉ khác nhau ở liên kết đôi vị trí C4/C5 trong sản phẩm 22c, còn sản phẩm 24c không có liên kết đôi trong phân tử. Dữ liệu phổ 1H, 13C NMR cho thấy phản ứng xảy ra và các nhóm hydroxy đã bị ketone hóa.

Hợp chất 22c: Phổ 1H NMR của 22c không còn xuất hiện tín hiệu của proton

H-3 ở δH 3,52 ppm như trong phổ của cholesterol. Tín hiệu của proton olefin ở δH 5,34

(H-6) ppm có sự thay đổi và chuyển dịch về phía trường yếu hơn ở δH 6,18 (s, 1H) ppm do có liên hợp với nhóm C=O. Phổ 13C NMR của 22c cũng không còn tín hiệu của

carbon C-3 nhóm CH-O ở δC 71,7 ppm, thay vào đó là sự xuất hiện tín hiệu của hai

carbon nhóm C=O ở δC 202,3 (C-3) và 199,5 (C-6) ppm. Kết hợp các dữ liệu phổ 1D

và 2D NMR, hợp chất 22c được xác định bị ketone hóa ở hai vị trí C-3 và C-6. Đồng

thời, có sự chuyển vị của liên kết đôi từ vị trí C5/C6 sang vị trí C4/C5. Sự chuyển vị

này xảy ra là do tạo hệ liên kết đôi liên hợp, đảm bảo sức căng và độ bền liên kết của

vòng A và vòng B. Điều này đã được giải thích bởi Nagia và cs [119]. Dữ liệu phổ

proton và carbon của toàn bộ các vị trí đã được xác định. Các dữ liệu này cũng trùng

khớp với dữ liệu đã được công bố trước đó của sản phẩm này [119]. Như vậy, chất 22c

được xác định là cholest-4-ene-3,6-dione.

Hình 4.50: Phổ (+) ESI-MS của hợp chất 24c

123

Hợp chất 24c: Dữ liệu phổ 1H của 24c không còn xuất hiện tín hiệu của hai

proton nhóm CH-O ở δH 3,55 (H-3) và 3,39 (H-6) như trong phổ proton của chất 15c.

Điều này được dự đoán rằng hai nhóm hydroxyl ở vị trí C-3 và C-6 đã bị ketone hóa. Đồng thời, phổ (+) ESI-MS của 24c cho pic ion giả phân tử ở m/z 401,2 [M+H]+, tương

ứng với CTPT là C27H45O2. Như vậy, CTPT của chất 24c là C27H44O2 (M = 400,3)

hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của 24c được xác định có dạng cholestane-3,6-dione.

Các dữ liệu phổ của hợp chất 24c cũng trùng khớp với dữ liệu đã được công bố của

hợp chất này [119].

CeCl3.7H2O/NaBH4

DCM/MeOH (1:1), 89%

4.1.2.2. Hợp chất cholest-4-ene-3β,6α-diol (26c)

22c

26c

Hợp chất 26c được tổng hợp bằng phản ứng dihydroxyl hóa trên hợp chất

diketone 22c, sử dụng tác nhân khử hóa NaBH4 theo phương pháp được mô tả bởi Cui

và cs [76]. Sản phẩm thu được với hiệu suất 89%.

Hình 4.51: Phổ 13C NMR của hợp chất 26c

Phổ 13C NMR cho thấy không còn tín hiệu của hai nhóm carbonyl (C=O) tại δC

202,3 (C-3) và 199,5 (C-6) như trong phổ carbon của chất 22c. Thay vào đó là sự xuất

hiện 2 tín hiệu carbon nhóm CH có liên kết với nguyên tử oxy ở độ chuyển dịch hóa học δC 68,6 (C-3) và 67,9 (C-6). Đồng thời, trong phổ 1H NMR cũng quan sát thấy sự

xuất hiện của 2 tín hiệu proton nhóm CH-O ở δH 4,22 (brt, H-3) và 4,19 (m, H-6). Tín

hiệu của proton olefin ở vị trí H-4 ở δH 5,65 ppm và tương ứng với nó là độ chuyển

dịch hóa học của hai carbon olefin vị trí C4/C5 ở δC 149,2 (C-5) và 119,8 (C-4) ppm.

Như vậy, chất 26c được xác định là sản phẩm hydroxyl hóa của chất 22c. Chất này

124

cũng đã được Cui và cộng sự xác định có dạng 3β,6α-diol [76]. Như vậy, hợp chất

26c được xác định là cholest-4-ene-3β,6α-diol.

(27c) và 4α,5α-

1. m-CPBA/DCM, 0 oC

2. Dess-Martin/DCM, 0 oC

4.1.2.3. Hợp chất 6α-hydroxy-4α,5α-epoxycholestane-3-one epoxycholestane-3,6-dione (28c)

26c

27c

28c

Hợp chất 26c được oxy hóa bằng m-CPBA tạo vòng epoxy ở vị trí C4/C5, tiếp

đó được ketone hóa bằng tác nhân Dess-Martin theo phương pháp mô tả bởi Javier [85]

thu được hỗn hợp hai sản phẩm 27c và 28c. Trong đó, hợp chất 27c được xác định là

sản phẩm bị oxy hóa không hoàn toàn, chỉ có một nhóm carbonyl ở vị trí C-3 được tạo

thành. Chất 28c là sản phẩm đã bị oxy hóa hoàn toàn hai nhóm hydroxyl tạo thành hai

nhóm ketone ở vị trí C-3 và C-6.

Hình 4.52: Phổ 13C NMR của hợp chất 27c

Hợp chất 27c: thu được với hiệu suất thấp 12,3%. Phổ khối (+) ESI-MS cho pic ion phân tử ở m/z 417,2 [M+H]+ tương ứng với CTPT C27H45O3 (M = 417). Như vậy, CTPT của chất 27c được xác định là C27H44O3 (M = 416). Phổ 1H NMR cho thấy tín

hiệu của hai proton nhóm CH-O ở δH 4,17 (dd, J 3,0; 10,0 Hz, H-6) và 3,48 (s, H-4). Phổ 13C NMR của chất 27c chỉ cho thấy tín hiệu của một nhóm carbonyl ở δC 206,0 (C-

3) ppm. Kết hợp các dữ liệu phổ 1D, 2D NMR cùng với kết quả phổ MS có thể khẳng

định hợp chất 27c là 6α-hydroxy-4,5-epoxycholestane-3-one.

Hợp chất 28c: thu được với hiệu suất 14,5 %. Khác với chất 27c ở trên, chất

28c là sản phẩm đã bị oxy hóa hoàn toàn hai nhóm hydroxyl ở C-3 và C-6 của chất 26c. Phổ (+) ESI-MS của 28c xuất hiện pic ion phân tử ở m/z 415,2 [M+H]+ tương ứng

125

với CTPT là C27H43O3 (M = 415). Như vậy, chất 28c có CTPT là C27H42O3 (M = 414). Phổ 1H NMR của chât 28c không còn xuất hiện tín hiệu của hai proton nhóm CH-O ở

C-3 và C-6 như trong phổ của chất 26c.

Hình 4.53: Phổ 13C NMR của hợp chất 28c

Phù hợp với điều đó trong phổ 13C NMR của 28c có xuất hiện tín hiệu của hai

carbon carbonyl (C=O) ở δC 203,2 (C-6) và 202,8 (C-3). Kết hợp các dữ liệu phổ 1D,

2D NMR có thể xác định được độ chuyển dịch hóa học tất cả các vị trí của chất 28c.

Như vậy, cấu trúc hóa học của chất 28c xác định là 4α,5α-epoxycholestane-3,6-dione.

4.1.2.4. Các hợp chất hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) và hợp chất 30c

Các hợp chất 22c, 24c, 27c và 28c tiếp tục được chuyển hóa tạo các dẫn xuất

oxime bằng tác nhân hydroxylamine hydrochloride (NH2OH.HCl) trong pyridine theo

phương pháp mô tả bởi Javier [85], thu được các dẫn xuất monohydroximino (29c);

dihydroxymino (23c, 25c, 31c) và hợp chất 30c theo sơ đồ 4.2. Các sản phẩm tạo thành

đều có sự chuyển hóa nhóm ketone (C=O) thành nhóm hydroxime (C=N-OH). Dữ liệu

phổ của các chất cho thấy sự thay đổi rõ ràng trong độ chuyển dịch hóa học của các

carbon nhóm carbonyl (δC 195-210 ppm) thành các carbon nhóm oxime (δC 155-165

ppm).

Hợp chất 23c: thu được với hiệu suất phản ứng đạt 85%. Cấu trúc của 23c được chứng minh bằng phương pháp phổ 1H, 13C NMR và phổ MS. Độ chuyển dịch hóa học

của H-4 trong hợp chất 23c có sự thay đổi và chuyển dịch về phía trường yếu hơn ở δH

6,53 (s) ppm so với chất đầu 22c ở δH 6,18 (s) ppm. Đồng thời, các proton H-2 và H-7

126

của 23c cũng có sự chuyển dịch về phía trường yếu hơn ở δH 3,08 (brd, J 15,0 Hz, H- 2α); 3,33 (dd, J 4,5; 15,5 Hz, H-7β) so với chất 22c. Phổ13C NMR chỉ ra độ chuyển

dịch hóa học của hai carbon C-3 và C-6 đã có sự chuyển dịch về phía trường mạnh

hơn, tương ứng ở δC 156,8 và 157,2 ppm thay vì ở 202,3 và 199,5 ppm như trong phổ

của 22c. Cấu hình 3E,6E của 23c đã được chứng minh bởi Cui và cộng sự [86]. Độ chuyển dịch hóa học của 27 carbon đã được quy kết dựa trên các phổ 1H, 13C NMR kết

hợp với so sánh dữ liệu của tài liệu tham khảo [86]. Phổ (+) ESI-MS của 23c cho pic ion giả phân tử ở m/z 429,2 [M+H]+ phù hợp với CTPT C27H45N2O2. Do đó, CTPT của

chất 23c được xác định là C27H44N2O2 (M = 428,3). Như vậy, hợp chất 23c xác định là

hợp chất đã biết (3E,6E)-dihydroximinocholest-4-ene.

Hợp chất 25c: phản ứng thu được với hiệu suất 81%. Cũng giống với chất 23c, phổ 1H NMR của chất 25c cũng cho thấy tín hiệu của hai proton ở δH 3,27 (brd, J 12,5

Hz, H-2α) và 3,33 (dd, J 4,5; 14,0 Hz, H-7β) ppm. Tín hiệu của 2 nhóm carbonyl

(δC>200 ppm) của chất 24c đã bị chuyển dịch về phía trường mạnh hơn ở δC 160,5 (C-

6) và 159,6 (C-5) ppm. Điều này chứng tỏ 2 nhóm C=O đã bị oxime hóa. Dữ liệu NMR

của 25c trùng khớp với kết quả đã công bố của chất này. Tác giả Cui và cs cũng chứng

minh hai nhóm oxime của chất này đều có cấu hình E [118]. Phổ (+) ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 431,2 [M+H]+ phù hợp với CTPT là C27H47N2O2. Do đó, CTPT

của chất 25c được xác định là C27H46N2O2 ( M= 430,3). Như vậy, chất 25c được xác

định là hợp chất đã biết (3E,6E)-dihydroximinocholestane.

Các hợp chất oximesteroid 29c và 31c, với vòng epoxy ở vị trí C-4/C-5, được

chuyển hóa qua 3 bước phản ứng từ hợp chất diketone 22c theo mô tả như trong sơ đồ

4.2. Phản ứng oxime hóa chất 27c thu được 2 sản phẩm bao gồm 1 sản phẩm đã bị

oxime hóa (chất 29c) và một sản phẩm bị oxime hóa không hoàn toàn (chất 30c) với

vòng epoxy ở vị trí 4/5 đã bị mở tạo sản phẩm dihydroxyl hóa và nhóm ketone vị trí C-

3 không bị oxime hóa. Trong khi đó, phản ứng oxime hóa hợp chất 28c chỉ thu được

một sản phẩm dihydroximino là chất 31c. Hiệu suất của các phản ứng này tương đối

thấp (13-22%).

Hợp chất 29c: thu được với hiệu suất 19,3%. Phổ 1H NMR của 29c có sự thay

đổi về độ chuyển dịch hóa học của H-4 ở δH 3,48 (s) trong chất 27c về phía trường yếu

hơn ở δH 3,81 (s) trong phổ của chất 29c. Điều này được lý giải do ảnh hưởng của nhóm oxime được tạo thành ở vị trí C-3. Phổ 13C NMR của 29c chứng minh rõ ràng

127

nhóm carbonyl ở vị trí C-3 trong chất 27c đã bị chuyển hóa thành nhóm oxime trong

chất 29c do có sự chuyển dịch hóa học của C-3 từ δC 206,0 ppm (C=O) về trường

mạnh hơn ở δC 154,9 ppm (C=N-OH). Phổ khối phân giải cao (+)-HR ESI-MS cho thấy pic ion giả phân tử ở m/z 432,3474 [M+H]+ phù hợp với CTPT là C27H46NO3. Do

đó, CTPTcủa chất 29c là C27H45NO3 (M = 431). Kết hợp các dữ liệu phổ 1D và 2D có

thể quy kết tất cả các giá trị của các carbon và proton trong phân tử . Như vậy, hợp chất

29c được xác định cấu trúc là 4α,5α-epoxy-6α-hydroxycholestane-3-oxime. Đây là

hợp chất mới lần đầu tiên được tổng hợp.

Hợp chất 30c: thu được với hiệu suất thấp 13,4%. Chất 30c được xác định là

sản phẩm bị mở vòng epoxy ở vị trí C4/5 đồng thời tạo thành hai nhóm hydroxyl ở hai

vị trí này. Nhóm C=O ở vị trí C-3 cũng không bị oxime hóa như của chất 29c. Phổ khối phân giải cao (+)-HR ESI-MS cho thấy pic ion giả phân tử ở m/z 434,3633 [M]+, tính toán lý thuyết phù hợp với CTPT của chất 30c là C27H46O4 (M = 434). Phổ 1H NMR

cho thấy tín hiệu của hai proton nhóm CH-O ở δH 4,05 (m, H-6) và 3,28 (d, J 3,5 Hz, H-4) ppm. Tương ứng với tín hiệu proton của các nhóm CH-O, phổ 13C NMR của 30c

cũng cho thấy tín hiệu tương ứng của các carbon liên kết với nhóm hydroxyl (CH-O) ở

δC 64,7 (C-6) và 62,6 (C-4). Bên cạnh đó còn có tín hiệu của một carbon bậc bốn liên

kết với nhóm hydroxyl ở δC 69,9 ppm (C-5). Đặc biệt, vẫn quan sát thấy tín hiệu của

nhóm carbonyl ở vị trí C-3 ở δC 205,6 ppm. Điều này chứng tỏ nhóm C=O không bị

oxime hóa tạo thành nhóm >C=N-OH như sản phẩm 29c. Kết hợp các dữ liệu phân tích

ở trên, chất 30c được xác định là hợp chất 4α,5α,6α-trihydroxy-cholestane-3-one.

Hợp chất 31c: thu được với hiệu suất 22,5%. Phổ 13C NMR của 31c cho thấy rõ

ràng hai nhóm carbonyl (C=O) của chất 28c đã bị oxime hóa do có sự chuyển dịch hóa

học của hai nhóm carbonyl này từ δC 203,3 (C=O, C-6) và 202,8 (C=O, C-3) về phía

trường mạnh hơn ở δC 161,3 (C=NOH, C-6) và 154,6 (C=NOH, C-3) ppm. Đồng thời,

phổ khối phân giải cao (+)-HR ESI-MS của 31c cho thấy pic ion giả phân tử ở m/z 445,3427 [M+H]+, tính toán lý thuyết cho CTPT là C27H45N2O3. Điều này phù hợp với

CTPT của chất 31c là C27H44N2O3 (M = 444). Từ các phân tích ở trên chứng tỏ sản

phẩm 31c không bị mở vòng epoxy. Hợp chất 31c được xác định là hợp chất mới

4α,5α-epoxycholestane-3,6-dioxime.

128

Bảng 4.22: Bảng tổng hợp các dẫn xuất tổng hợp được từ cholesterol

17c cholestan-5-ene-3β,4β-diol 15c cholestane-3β,6α-diol 16c cholestane-3β,6β-diol

20c cholestane-3β,5α,6α-triol 18c cholestan-5-ene-3β,7β- diol 19c cholestan-5-ene- 3β,4β,7β-diol

21c cholestan-3β,5α,6β-triol 22c cholest-4-ene-3,6- dione 23c (3E,6E)- dihydroximinocholest-4-ene

26c cholest-4-ene-3β,6α-diol 24c cholestane-3,6-dione

25c (3E,6E)- dihydroximinocholestane

28c 4α,5α-epoxy- cholestane-3,6-dione 27c 6α-hydroxy-4,5-epoxy- cholestane-3-one 29c 4α,5α-epoxy-6α- hydroxycholestane-3-oxime (chất mới)

30c 4α,5α,6α-trihydroxy-cholestane-3-one (chất mới) 31c 4α,5α-epoxycholestane-3,6-dioxime (chất mới)

129

4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học

Ung thư là căn bệnh phổ biến với nhiều dạng bệnh ung thư khác nhau. Trong đó,

bệnh phổ biến ở nam giới như ung thư gan, ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, ung

thư đại trực tràng…, ở nữ giới điển hình như các bệnh ung thư vú, ung thư cổ tử cung,

ung thư buồng trứng…, hay cả ở nam và nữ giới như các bệnh về ung thư máu, ung thư

não…Diễn biến của các bệnh ung thư ngày càng phức tạp, trong khi các loại thuốc

được dùng trong điều trị ung thư không nhiều và gây ra nhiều tác dụng phụ gây ảnh

hưởng hoặc có thể tiêu diệt cả các tế bào lành trong cơ thể. Vì vậy, mục tiêu tìm ra các

loại thuốc mới có tính ưu việt ngày càng trở lên cấp thiết. Do đó, các nghiên cứu về

hoạt tính gây độc tế bào chống ung thư đang là hướng nghiên cứu có ý nghĩa quan

trọng trong việc sàng lọc ban đầu để tìm ra các hoạt chất tiềm năng có thể ứng dụng

trong sản xuất thuốc điều trị ung thư. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu khả năng gây độc tế bào của các hợp chất phân lập và các dẫn xuất tổng hợp được

từ cholesterol trên một số dòng tế bào ung thư phổ biến ở người. Tiếp đó đánh giá ảnh

hưởng sâu hơn của các hợp chất này đến sự hình thành của khối u trên thạch mềm và

khả năng ức chế sự di căn của dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231,

một dòng tế bào ung thư vú có khả năng di căn cao ở phụ nữ.

4.3.1. Hoạt tính của các hợp chất steroid glycoside phân lập từ sao biển Acanthaster planci

a. Hoạt tính sinh học của các hợp chất polyhydroxysteroid glycoside

Trong bốn hợp chất planciside A-D (AP1-AP4) chỉ có planciside A (AP1) được

tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro và đánh giá khả năng ức chế sự

hình thành khối u trên thạch mềm trên 3 dòng tế bào ung thư ở người: ung thư ruột kết

HCT-116, ung thư vú T-47D và ung thư sắc tố ác tính RPMI-7951. Ba hợp chất còn lại

không được thử nghiệm do lượng chất tách được ít (chỉ từ 0,3 đến 1,9 mg).

Các thử nghiệm hoạt tính sinh học gây độc tế bào in vitro theo phương pháp

MTS (mô tả ở phần 2.2.3.1) cho thấy AP1 có hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế

bào được thử nghiệm so với đối chứng dương là cisplatin. Cả AP1 và cisplatin đều

không gây độc ở nồng độ150 µM trên dòng tế bào T-47D. Hợp chất AP1 có khả năng

gây độc trên dòng tế bào HCT-116 và tế bào RPMI-7951 với giá trị IC50 tương ứng là

36 µM và 58 µM. Trong khi đó chất đối chứng dương cisplatin có tác dụng gây độc tế

bào trên dòng tế bào HCT-116 và RPMI-7951 với các giá trị IC50 tương ứng là 75 µM

và 43 µM (xem bảng 4.23). Như vậy, hợp chất AP1 gây độc trên dòng tế bào HCT-116

130

cao hơn so với đối chứng, nhưng gây độc trên dòng tế bào RPMI-7951 yếu hơn so với

đối chứng là cisplatin.

Bảng 4.23: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của hợp chất AP1

Dòng tế bào (IC50 µM)

HCT-116 Cisplatin 75 AP1 36

T-47D RPMI-7951 > 150 43 >150 58

Tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của hợp chất AP1 và cisplatin ở nồng độ không

gây độc tế bào (15 µM) đối với sự tăng sinh của ba dòng tế bào HCT-116, T-47D và

RPMI-7951. Kết quả cho thấy AP1 ức chế nhẹ sự tăng sinh của dòng tế bào HCT-116

so với cisplatin (hình 4.52A). Tuy nhiên, AP1 ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung

thư vú T-47D sau 72 giờ là 35%, dòng tế bào ung thư sắc tố ác tính RPMI-7951 sau 48

giờ là 27% (hình 4.52B, C). Trong khi đó đối chứng dương cisplatin gần như ức chế

hoàn toàn sự phát triển của các dòng tế bào T-47D và RPMI-7951 (hình 4.52B, C).

B C

A Control AP1, 15 μM

Cisplatin, 15 Μm Hình 4.54: Ảnh hưởng của hợp chất AP1 đến sự tăng sinh của các dòng tế bào HCT-

116, T-47D và RPMI-7951

Đánh giá ảnh hưởng của AP1 lên sự hình thành khối u (colony formation) trên

thạch mềm của các dòng tế bào T-47D, HCT-116 và RPMI-7951 (theo phương pháp

mô tả ở mục 2.2.3.2). Các tế bào được xử lí với AP1 ở nồng độ 15 µM trên ma trận thạch mềm (soft agar matrix) trong môi trường có 5% khí CO2 và ủ ở 37oC trong lồng

ấp 4 tuần. Kết quả cho thấy hợp chất AP1 ở nồng độ 15 µM không có ảnh hưởng đến

sự hình thành khối u trên thạch mềm của cả ba dòng tế bào T-47D, HCT-116 và RPMI-

7951. Trong khi đó cisplatin ở nồng độ 4 µM lại ức chế hoàn toàn sự hình thành khối u

trên các dòng tế bào này.

131

Như vậy, dựa trên các kết quả thử nghiệm đã thu được cho thấy hợp chất AP1 có khả

năng ức chế sự tăng sinh của các dòng tế bào HCT-116, T-47D và RPMI-7951 nhưng

không có ảnh hưởng đến sự hình thành khối u trên thạch mềm của các dòng tế bào này.

b. Hoạt tính sinh học của các hợp chất asterosaponin

Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất asterosaponin (AP11-AP14)

trên các dòng tế bào ung thư sắc tố ác tính RPMI-7951, tế bào ung thư đại trực tràng

HT-29 và tế bào ung thư biểu mô tuyến vú ở người MDA-MB-231 cũng được đánh giá

bằng các thử nghiệm theo phương pháp MTS (mô tả ở mục 2.2.3.1). Kết quả thử

nghiệm cho thấy các chất AP11 và AP12 không có tác dụng gây độc tế bào đối với tất

cả các dòng tế bào được thử nghiệm ở nồng độ lên tới 150µM. Chất AP13 và AP14 ở

cùng một liều thử có khả năng gây độc nhẹ với các tế bào ung thư đại trực tràng HT-29

(với giá trị IC50 tương ứng là 109 µM và 90 µM) và tế bào ung thư biểu mô tuyến vú

MDA-MB-231 (với giá trị IC50 tương ứng là 30 µM và 24 µM), nhưng không gây độc

tế bào ung thư sắc tố ác tính RPMI-7951(xem bảng 4.24).

Bảng 4.24: Hoạt tính gây độc tế bào và ảnh hưởng tới sự hình thành khối u trên thạch mềm của các hợp chất asterosaponin AP11-AP14

RPMI-7951 HT-29 MDA-MB-231

IC50, µM >150 >150 >150 >150 IC50, µM >150 >150 109 90 IF50, µM >15 >15 11 7 IC50, µM >150 >150 30 24 IF50, µM >15 >15 13 8 Chất AP11 AP12 AP13 AP14

IF50: Nồng độ gây giảm 50% sự hình thành khối u trên thạch mềm của các tế bào ung thư;

IF50, µM >15 >15 15 14 IC50: Nồng độ gây giảm 50% khả năng sống sót của các tế bào ung thư;

Đánh giá ảnh hưởng của 4 asterosaponin AP11-AP14 đến sự hình thành khối u

của các dòng tế bào RPMI-7951, HT-29 và MDA-MB-231 được nghiên cứu bằng các

xét nghiệm trên thạch mềm (theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.3.2). Kết quả thử

nghiệm cho thấy các chất AP11 và AP12 chỉ làm giảm nhẹ số lượng khối u của các

dòng tế bào được thử nghiệm, với tỷ lệ ức chế thấp hơn 20% so với đối chứng (mẫu

trắng không được xử lý với các hợp chất thử nghiệm). Trong khi đó, chất AP13 và

AP14 ức chế hiệu quả sự hình thành khối u của các dòng tế bào ung thư đại trực tràng

HT-29 và dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231, và ít hiệu quả hơn với

dòng tế bào ung thư sắc tố ác tính RPMI-7951. Nồng độ gây ra sự ức chế 50% số lượng

132

khối u của chất AP13 và AP14 tương ứng là 11 µM và 7 µM trên dòng tế bào HT-29;

13 µM và 8 µM trên dòng tế bào MDA-MB-231; 15 µM và 14 µM trên dòng tế bào

RPMI-7951 (xem bảng 4.22). Như vậy, có thể thấy chất AP13 và AP14 là hai chất có

tín hiệu tích cực đối với dòng tế bào MDA-MB-231.

Sự di chuyển của tế bào là một phần không thể thiếu của sự di căn tế bào, đó là

yêu cầu ở hầu hết mọi bước của sự di căn [92]. Ung thư vú là một trong những bệnh

ung thư nguy hiểm nhất ở phụ nữ. Trong đó, tế bào ung thư vú ba âm tính (TNBC –

Triple Negative Breast Cancer) MDA-MB-231 có khả năng di căn tích cực hơn nhiều

so với các dòng tế bào ung thư vú của các phân nhóm phân tử khác (ví dụ như T-47D,

MCF-7) và được biết đến với tần suất tái phát cao hơn. Kết quả là, tỷ lệ tử vong của

bệnh nhân TNBC cao hơn đáng kể so với những bệnh nhân mắc các loại ung thư vú

khác (thụ thể estrogen và progesterone dương tính) [94]. Phương pháp thử nghiệm hoạt

tính ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 bằng xét

nghiệm chữa lành vết thương (wound-healing assay) là một phương pháp hiệu quả để

đánh giá khả năng ảnh hưởng của chất đó đến sự di căn của tế bào này.

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng của các hợp chất asterosaponin

AP11-AP14 tới khả năng ức chế sự di chuyển của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-

MB-231 ở người để đánh giá tác dụng sinh học của các hợp chất này đối với dòng tế bào

ung thư vú có khả năng di căn cao. Các thí nghiệm đã được thực hiện theo phương pháp

xét nghiệm chữa lành vết thương (wound-healing assay) được mô tả ở mục 2.2.3.3. Kết

quả cho thấy khoảng cách được tạo ra (vùng tổn thương) trong khối tổ hợp tế bào MDA-

MB-231 sau 48 giờ được xử lý với chất AP13 và AP14 ở nồng độ 10 µM không bị đóng

lại hoàn toàn so với giếng được xử lý với chất AP11 và AP12 cũng như so với đối chứng

(mẫu trắng không được xử lý với các chất thử nghiệm) ở cùng một điều kiện. Tính toán tỷ

lệ đóng vùng tổn thương của khối tế bào, kết quả chất AP13 và AP14 có thể ngăn chặn sự

di chuyển của các tế bào MDA-MB-231 với tỷ lệ tương ứng là 26% và 45% (khu vực tế

bào không bị đóng lại) so với đối chứng (hình 4.55). Trong khi đó, với chất AP11 và

AP12 vùng tổn thương đã bị khép lại hoàn toàn sau 48 giờ.

133

Hình 4.55: Ảnh hưởng của các asterosaponin AP11-AP14 đến sự di chuyển của tế bào

ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 ở người

Các thử nghiệm sinh học đã thực hiện cho thấy trong số 4 hợp chất

asterosaponin được thử nghiệm thì chất AP13 và AP14 là hoạt động mạnh nhất trong

khi chất AP11 và AP12 không hoạt động hoặc ít hoạt động hơn. Tất cả 4 hợp chất

asterosaponin đều có phần chuỗi carbohydrate giống hoặc tương tự nhau. Chỉ có sự

khác biệt ở độ dài phần mạch nhánh của aglycon. Ở đây có thể đưa ra giả thuyết rằng

có sự liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính của 4 hợp chất asterosaponin này. Phần cấu trúc

aglycon của AP11-AP14, đặc biệt là phần mạch nhánh khi bị rút ngắn độ dài (hợp chất

AP11 và AP12) dẫn đến làm giảm hoạt tính gây độc tế bào và chống ung thư của

chúng. Những kết quả này cũng tương tự với các kết quả nghiên cứu trước đó trên các

asterosaponin phân lập từ ba loài sao biển khác nhau trong nghiên cứu hoạt tính tán

huyết và hoạt tính gây độc tế bào phôi thai ức chế sự thụ tinh của trứng cầu gai và sao

biển [67]. Nghiên cứu này chỉ ra rằng sự rút ngắn độ dài mạch nhánh trong phần

aglycon của các asterosaponin được thử nghiệm cũng làm giảm hoạt tính tán huyết và

hoạt tính ức chế sự thụ tinh của trứng cầu gai và sao biển. Do đó, giả thuyết khi độ dài

mạch nhánh của các hợp chất asterosaponin giảm dẫn đến làm giảm hoạt tính của

chúng thêm một lần nữa được khẳng định.

Như vậy, chỉ có hai hợp chất AP13 và AP14 trong số bốn hợp chất

asterosaponin cho thấy hoạt tính gây độc tế bào yếu trên các dòng tế bào ung thư ở

người là ung thư sắc tố ác tính RPMI-7951, ung thư trực tràng HT-29 và ung thư biểu

mô tuyến vú MDA-MB-231. Tuy nhiên, hai hợp chất này ức chế hiệu quả sự hình

thành khối u trên thạch mềm của dòng tế bào HT-29 và MDA-MB-231, và thể hiện khả

năng ức chế sự di căn của các tế bào ung thư vú MDA-MB-231. Hiện nay, ung thư vú

đang là một căn bệnh có tỷ lệ di căn và tử vong cao. Vì vậy, điều này rất có ý nghĩa

134

trong việc tìm ra các hợp chất tự nhiên có tiềm năng trong điều trị và ngăn chặn sự di

căn của các tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231.

4.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất cholesterol

a. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất polyhydroxysteroid

Bảy hợp chất polyhydrosteroid (15c-21c) được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

trên hai dòng tế bào ung thư gan Hep G2 và dòng tế bào ung thư não T98G. Có 3 hợp

chất (16c, 18c, 21c) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng Hep G2 với giá trị IC50

tương ứng là 11,59; 11,89 và 6,87 µM. Chỉ có chất 21c thể hiện hoạt tính gây độc tiềm

năng trên dòng tế bào ung thư não T98G với giá trị IC50 = 2,28 (µM) (xem bảng 4.25).

Bảng 4.25: Hoạt tính gây độc tế bào Hep G2 và T98G của các hợp chất 15c-21c

Chất Chất IC50 µM IC50 µM

Hep G2 T98G Hep G2 T98G

a đối chứng dương, Hep G2: dòng tế bào ung thư gan, T98G: dòng tế bào ung thư não

>100 >100 >100 >100 15c 16c 17c 18c >100 11,59 >100 11,89 19c 20c 21c Paclitaxela >100 >100 6,87 0,040 >100 >100 2,28 0,023

So sánh cấu trúc hóa học của các cặp chất 15c và 16c; 20c và 21c. Hai cặp hợp

chất này chỉ khác nhau ở cấu hình nhóm hydroxyl ở vị trí C-6 (6α-OH ở chất 15c và

20c; 6β-OH ở chất 16c và 21c). Chất 16c thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế

bào Hep G2 và chất 21c thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên cả hai dòng tế bào Hep

G2 và T98G được thử nghiệm thì chất 15c và 20c lại không thể hiện hoạt tính trên các

phép thử này. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Cui và cs trên hai

hợp chất 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol (201) và 24-methylenecholest-4-en-

3β,6α-diol (202) được tổng hợp từ stigmasterol đã đề cập ở trên [75, 76]. Như vậy, cấu

hình β của nhóm hydroxyl ở vị trí C-6 của dạng cấu trúc này có thể là một trong những

yếu tố quyết định hoạt tính gây độc tế bào của chúng.

b. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất hydroximinosteroid và các chất

trung gian

Bốn dẫn xuất hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) và sáu dẫn xuất trung

gian (22c, 24c, 26c, 27c, 28c, 30c) được tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào

135

trên ba dòng tế bào ung thư ở người bao gồm: dòng tế bào ung thư gan Hep G2, dòng

tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, và dòng tế bào ung thư não T98G (xem bảng 4.26).

Bảng 4.26: Hoạt tính gây độc tế bào Hep G2, HeLa, T98G của các chất 22c-31c

Chất Chất IC50(µM) IC50 (µM)

27c 28c 29c 30c 31c

Hep G2 HeLa >100 68,6 >100 >100 >100 0,031 >100 42,4 >100 >100 >100 0,040 T98G >100 70,3 >100 69,8 >100 0,023 Paclitaxela Hep G2 HeLa 72,4 74,6 >100 >100 >100 0,031 41,8 >100 >100 >100 >100 0,040 T98G >100 >100 >100 18,5 2,9 0,023

22c 23c 24c 25c 26c Paclitaxela a đối chứng dương

Kết quả cho thấy hợp chất oxime 23c có hoạt tính gây độc tế bào tương đối yếu

trên cả ba dòng tế bào Hep G2, HeLa và T98G với giá trị IC50 tương ứng là 42,4; 68,6

và 70,3µM. Chất 27c có hoạt tính yếu gây độc trên hai dòng tế bào Hep G2 và HeLa

với giá trị IC50 tương ứng là 41,8 và 72,4 µM. Chất 28c chỉ thể hiện hoạt tính gây độc

tế bào trên một dòng tế bào HeLa với giá trị IC50 = 74,6 µM. Ba hợp chất 25c, 30c và

31c chỉ có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư não T98G với giá trị IC50

tương ứng là 69,8; 18,5 và 2,9 µM. Đối chứng dương được sử dụng là paclitaxel với

giá trị IC50 trên các dòng tế bào Hep G2, HeLa và T98G tương ứng là 0,040; 0,031; và

0,023 µM. Các chất còn lại đều không thể hiện hoạt tính trên các phép thử này.

Từ các kết quả thu được có thể thấy trong 04 dẫn xuất hydroximinosteroid (23c,

25c, 29c, 31c) có 03 dẫn xuất 3,6-dihydroximino (23c, 25c, 31c) thể hiện hoạt tính gây

độc tế bào mạnh hơn so với dẫn xuất 3-hydroximino-6α-hydroxy (29c) trên ba dòng tế

bào được thử nghiệm. Hợp chất 3,6-dihydroximino 25c không có liên kết đôi ở vị trí

C4/5 có thể là nguyên nhân gây mất hoạt tính gây độc trên hai dòng tế bào Hep G2 và HeLa so với hợp chất Δ4-3,6-dihydroximino 23c. Trước đây, tác giả Cui và cs cũng

nhận thấy sự giảm hoạt tính gây độc tế bào của chất 25c so với chất 23c khi thử nghiệm

trên 04 dòng tế bào Sk-Hep-1, H-292, PC-3 và Hey-1B [86, 118]. Điều thú vị khác là

trong khi chất 31c có 2 nhóm oxime ở vị trí C-3, C-6 và vòng epoxy ở vị trí C-4,5 có

hoạt tính gây độc tế bào chọn lọc trên dòng tế bào ung thư não T98G (IC50= 2,9 μM)

thì chất 29c chỉ có một nhóm oxime ở vị trí C-3 và vòng epoxy ở vị trí C-4/5 nhưng

không có hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào này.

136

Trong số các dẫn xuất trung gian (22c, 24c, 26c, 27c, 28c, 30c), kết quả thử

nghiệm cho thấy các hợp chất có sự xuất hiện của nguyên tố oxy tại vị trí C-4 hoặc C-5

(27c, 28c, 30c) có hoạt tính gây độc tế bào vừa phải đối với ít nhất một dòng tế bào,

trong khi các hợp chất còn lại không có khả năng gây độc tế bào một cách rõ ràng trên

các dòng tế bào được thử nghiệm.

Như vậy, các hợp chất steroid dạng này có liên kết đôi ở vị trí C4/5 hoặc có liên

kết với nguyên tố oxy ở vị trí C-4, C-5 có thể có tác dụng tích cực đối với hoạt tính gây

độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư được thử nghiệm. Nghiên cứu này đã cung cấp

thêm các thông tin bổ sung cho mối quan hệ giữa cấu trúc-hoạt tính, và cần được đầu

tư nghiên cứu sâu thêm để hiểu rõ hơn về đặc điểm cấu trúc của các hợp chất có tác

dụng sinh học đối với các dòng tế bào gây bệnh ung thư.

137

CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

1. Từ loài sao biển Acanthaster planci thu thập ở vùng biển Việt Nam đã phân lập được

14 hợp chất. Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ

khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và các phương pháp hóa lý khác. Các hợp chất phân

lập được bao gồm: planciside A (AP1); planciside B (AP2); planciside C (AP3); planciside D

(AP4); 3-O-sulfothornasterol A (AP5); 5-ergost-7-en-3-ol (AP6); cholesterol (AP7);

astaxanthin (AP8); thymin (AP9); uracil (AP10); acanthaglycoside G (AP11); pentareguloside

G (AP12); acanthaglycoside A (AP13); maculoside (AP14). Trong đó có 4 hợp chất steroid

glycoside mới lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên bao gồm: 3 hợp chất polyhydroxysteroid là

planciside A (AP1); planciside B (AP2); planciside C (AP3); và 1 hợp chất asterosaponin là

acanthaglycoside G (AP11). Ngoài ra, hợp chất pentareguloside G (AP12) lần đầu tiên được tìm

thấy ở loài sao biển Acanthaster planci của Việt Nam.

2. Từ cholesterol (AP7) phân lập được từ loài sao biển này đã tổng hợp được 17

dẫn xuất, trong đó bao gồm 07 dẫn xuất polyhydroxysteroid (15c-21c), 04 dẫn xuất

hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) và 06 dẫn xuất trung gian (22c, 24c, 26c, 27c,

28c, 30c). Các hợp chất bao gồm: cholestane-3β,6α-diol (15c); cholestane-3β,6β-diol

(16c); cholestan-5-ene-3β,4β-diol (17c); cholestan-5-ene-3β,7β-diol (18c); cholestan-5-

ene-3β,4β,7β-triol (19c); cholestane-3β,5α,6α-triol (20c); cholestane-3β,5α,6β-triol

(21c); cholest-4-ene-3,6-dione (22c); (3E,6E)-dihydroximinocholest-4-ene (23c);

cholestane-3,6-dione (24c); (3E,6E)-dihydroximinocholestane (25c); cholest-4-ene-

3β,6α-diol (26c); 6-hydroxy-4,5-epoxycholestane-3-one (27c); 4α,5α-epoxycholestane-

3,6-dione (28c); 4α,5α-epoxy-6-hydroxycholestane-3-oxime (29c); 4α,5α,6α-

trihydroxy-cholestane-3-one (30c); 4α,5α-epoxycholestane-3,6-dioxime (31c). Trong

đó các chất 4α,5α-epoxy-6-hydroxycholestane-3-oxime (29c); 4α,5α,6α-trihydroxy-

cholestane-3-one (30c); 4α,5α-epoxycholestane-3,6-dioxime (31c) là các chất mới lần

đầu tiên được tổng hợp.

3. Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất

AP1, AP11, AP12, AP13, AP14 đến sự hình thành khối u trên thạch mềm của các

dòng tế bào ung thư ở người. Kết quả cho thấy:

138

- Hợp chất AP1 có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư ruột kết

(HCT-116) và ung thư sắc tố ác tính (RPMI-7951) với giá trị IC50 tương ứng là

36 µM và 58 µM. Hợp chất AP1 có hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào HCT-

116, T-47D và RPMI-7951 nhưng không có ảnh hưởng đến sự hình thành khối

tế bào của các dòng tế bào này.

- Hợp chất AP13 và AP14 có hoạt tính gây độc nhẹ trên dòng tế bào ung thư đại

trực tràng HT-29 với giá trị IC50 tương ứng là 109 µM và 90 µM; và dòng tế bào

ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 với giá trị IC50 tương ứng là 30 µM và

24 µM. Hợp chất AP13 và AP14 ức chế hiệu quả sự hình thành khối u trên

thạch mềm của hai dòng tế bào HT-29 (với giá trị IF50 tương ứng là 11 µM và 7

µM) và MDA-MB-231(với giá trị IF50 tương ứng là 13 µM và 8 µM); ít hiệu

quả hơn trên dòng RPMI-7951 (với giá trị IF50 tương ứng là 15 µM và 14 µM).

4. Đã khảo sát khả năng ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú

MDA-MB-231 bằng phương pháp đánh giá khả năng chữa lành vết thương trong ống

nghiệm của các hợp chất asterosaponin (AP11-AP14). Kết quả cho thấy: hợp chất

AP13 và AP14 ở nồng độ 10 µM có thể ngăn chặn sự di chuyển của các tế bào ung thư

biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 với tỷ lệ tương ứng là 26% và 45% so với đối chứng

sau 48 giờ ủ tế bào.

Các kết quả hoạt tính sinh học liên quan đến các hợp chất asterosaponin đã phân

lập được phù hợp với giả thuyết rằng một mạch nhánh ngắn của khung steroid có thể

ảnh hưởng đến hoạt tính gây độc tế bào của các asterosaponin này.

5. Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của 07 dẫn xuất polyhydroxysteroid

(15c-21c), 04 dẫn xuất hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) và 06 dẫn xuất trung

gian của chúng (22c, 24c, 26c, 27c, 28c, 30c) tổng hợp được từ cholesterol trên các

dòng tế bào ung thư gan (Hep G2), ung thư cổ tử cung (Hela) và ung thư não (T98G).

Kết quả cho thấy:

- Năm hợp chất (16c, 18c, 21c, 23c, 27c) có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế

bào ung thư gan (Hep G2) với các giá trị IC50 tương ứng là 11,59; 11,89; 6,87;

42,40; 41,80 µM.

- Ba hợp chất (23c, 27c, 28c) có hoạt tính yếu gây độc tế bào ung thư cổ tử cung

(HeLa) với các giá trị IC50 tương ứng là 68,6; 72,4 và 74,6 µM.

139

- Năm hợp chất (21c, 23c, 25c, 30c, 31c) có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế

bào ung thư não (T98G) với các giá trị IC50 tương ứng là 2,28; 70,3; 69,8; 18,5

và 2,9 µM. Trong đó chất 21c và 31c thể hiện hoạt tính tốt và chọn lọc trên

dòng tế bào ung thư não.

5.2. Kiến nghị

Từ các kết quả nghiên cứu thu được có thể thấy loài sao biển Acanthaster planci

là loài sao biển có nhiều tiềm năng trong nghiên cứu phân lập các hợp chất mới và các

đánh giá hoạt tính sinh học mới chỉ dừng ở mức độ thăm dò. Vì vậy, cần tiếp tục

nghiên cứu sâu hơn nữa về thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học một cách

toàn diện hơn để từ đó có thể phát triển các sản phẩm nâng cao sức khỏe, phòng ngừa

và hỗ trợ điều trị các căn bệnh như ung thư, viêm nhiễm…

Từ cholesterol và các steroid khác phân lập được có thể tiếp tục mở rộng hướng

nghiên cứu chuyển hóa cũng như thử nghiệm các hoạt tính khác của các dẫn xuất tổng

hợp được.

140

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Từ loài sao biển Acanthaster planci thu thập ở vùng biển Việt Nam đã phân lập

được 14 hợp chất. Bốn hợp chất steroid glycoside là các hợp chất mới lần đầu tiên

được phân lập từ tự nhiên, trong đó có 3 hợp chất polyhydroxysteroid glycoside là

planciside A (AP1); planciside B (AP2); planciside C (AP3) và 1 hợp chất

asterosaponin là acanthaglycoside G (AP11).

2. Từ cholesterol (AP7) phân lập được từ loài sao biển này sử dụng làm nguyên liệu

đầu đã tổng hợp được 17 dẫn xuất, bao gồm 07 dẫn xuất polyhydroxysteroid, 04 dẫn xuất

hydroxyminosteroid và 06 dẫn xuất trung gian. Các hợp chất polyhydroxysteroid được tổng

hợp bằng các phương pháp ngắn gọn và hiệu quả với 1 hoặc 2 bước phản ứng. Bốn dẫn xuất

hydroxyminosteroid có nhóm oxime ở các vị trí C-3, C-6 và có liên kết đôi ở vị trí C4/5

hoặc có liên kết với nguyên tố oxy ở vị trí C-4, C-5 được tổng hợp thông qua 6 dẫn xuất

trung gian. Trong số các dẫn xuất tổng hợp được có 3 dẫn xuất mới là 4α,5α-epoxy-6-

hydroxycholestane-3-oxime (29c); 4α,5α,6α-trihydroxy-cholestane-3-one (30c); 4α,5α-

epoxycholestane-3,6-dioxime (31c) lần đầu tiên được tổng hợp.

3. Hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính ức chế sự hình thành khối u trên thạch mềm chống lại 05 dòng tế bào ung thư (HCT-116, HT-29, RPMI-7951, MDA-MB-231) của các hợp chất steroid glycoside phân lập được đã được đánh giá. Hợp chất AP1 gây độc vừa phải trên hai dòng tế bào HCT-116 và RPMI-7951 với giá trị IC50 tương ứng là 36 và 58 µM. Hợp chất AP13 và AP14 gây độc vừa phải trên 3 dòng tế bào RPMI-7951, HT-29, MDA-MB-231 với giá trị IC50 nằm trong dải từ 24 đến 109 µM. Hai hợp chất AP13 và AP14 còn có khả năng ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 với tỷ lệ 26% và 45%.

Các kết quả liên quan đến các hợp chất asterosaponin đã phân lập được phù hợp

với giả thuyết rằng một chuỗi bên ngắn của các hợp chất steroid có thể có ảnh hưởng đến

hoạt tính gây độc tế bào của các asterosaponin này.

4. Các dẫn xuất tổng hợp được từ cholesterol đã được đánh giá hoạt tính gây độc tế

bào trên 03 dòng tế bào ung thư ở người (HepG2, HeLa, T98G). Các hợp chất 16c, 18c,

21c, 23c, 25c, 27c, 28c, 30c và 31c thể hiện khả năng gây độc tế bào trên ít nhất 1 dòng

tế bào được thử nghiệm. Đặc biệt, hai hợp chất 21c và 31c thể hiện hoạt tính tốt và chọn

lọc trên dòng tế bào ung thư não T98G với giá trị IC50 tương ứng là 2,28 và 2,9 µM.

141

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

1. Asterosaponins from the tropical starfish Acanthaster planci and their cytotoxic and

anticancer activities in vitro. Dinh T. Ha, Alla A. Kicha, Anatony I. Kalinovsky,

Timofey V. Malyarenko, Roman S. Popov, Olesya S. Malyarenko, Svetlana P.

Ermakova, Tran T. T. Thuy, Pham Q. Long, and Natalia V. Ivanchina. Natural

Product Research, 2019, 1-8. DOI: 10.1080/14786419.2019.1585845 (SCI-E).

2. Three new steroid biglycosides, Plancisides A, B, and C, from the starfish

Acanthaster planci. Alla A. Kicha, Thi H. Dinh, Natalia V. Ivanchina, Timofey V.

Malyarenko, Anatony I. Kalinovsky, Roman S. Popov, Svetlana P. Ermakova, Thi

T. T. Tran, and Lan P. Doan. Natural Product Communications, 2014, Vol. 9, No. 9,

1269-1274.(SCI-E)

3. Bằng độc quyền sáng chế: Hợp chất (24S)-28-O-[beta-D-galactofuranosyl-(1→5)-

alpha-L-arabinofuranosyl]-24-methyl-5alpha-cholestane- 3beta, 4beta, 6alpha, 8,

15beta, 16beta, 28-heptol và phương pháp phân lập hợp chất này từ loài sao biển

Acanthaster planci. Đoàn Lan Phương, Trần Thị Thu Thủy, Đinh Thị Hà, Alla A.

Kicha, Natalia V. Ivanchina, Timofey V. Malyarenko, Anatoly I. Kalinovsky,

Roman S. Popov, Svetlana P. Ermakova, Phạm Minh Quân, Số 18377, Quyết định

số 6820/QĐ-SHTT, 05/02/2018.

4. Giải pháp hữu ích: Hợp chất [(24S)-28-O-[alpha-L-fucopyranosyl-(1→2)-3-O-

methyl-beta-D-xylopyranosyl]-24-methyl-5alpha-cholestane-3beta, 4beta, 6alpha, 8,

15beta, 16beta, 28-heptol; [(24S)-28-O-[2,4-di-O-methyl-beta-D-xylopyranosyl-

(1→2)-alpha-L-arabinofyranosyl]-24-methyl-5alpha-cholestane-3beta,4beta, 6alpha,

8, 15beta, 16beta, 28-heptol] 6-O-sulfat và phương pháp phân lập hai hợp chất này

từ loài sao biển Acanthaster planci. Đoàn Lan Phương, Trần Thị Thu Thủy, Đinh

Thị Hà, Alla A. Kicha, Natalia V. Ivanchina, Timofey V. Malyarenko, Anatoly I.

Kalinovsky, Roman S. Popov, Svetlana P. Ermakova, Phạm Minh Quân, Số 1637,

Quyết định số 4539/QĐ-SHTT, 31/01/2018.

5. Thành phần hóa học của loài sao biển gai Acanthaster planci từ biển Việt Nam.

Đoàn Lan Phương, Phạm Quốc Long, Đinh Thị Hà, Đoàn Thị Hương, Nguyễn Tiến

Dũng, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Trần Thị Thu Thủy. Tạp chí hóa học, 2013, T.51,

số 6ABC, 131-134.

142

6. Synthesis and cytotoxicity of polyhydroxylated cholesterol derivatives. Dinh Thi

Ha, Doan Lan Phuong, Pham Quoc Long, Ngo Dai Quang, Tran Thi Thu Thuy.

Vietnam Journal of Science and Technology, 2018, 56 (4), 467-473.

7. Synthesis of two new hydroximinosteroids from cholesterol and their biological

evaluation. Dinh Thi Ha, Baskar Salvaraja, Pham Quoc Long, Ngo Dai Quang, Do

Huu Nghi, Lee Jae Wook, Tran Thi Thu Thuy. Vietnam Journal of Science and

Technology, 2019, 57 (5), 527-538.

8. Các hợp chất steroid glycoside mới từ hai loài sao biển Việt Nam Acanthaster planci

và Echinaster luzonicus. Phạm Quốc Long, Nguyễn Anh Hưng, Alla A. Kicha,

Natalia V. Ivanchina, Đinh Thị Hà, Anatoly I. Kalinovsky, Timofey V.

Malyarenko, Trần Thị Thu Thủy, Đoàn Lan Phương, Trịnh Thị Thu Hương,

Valentin A. Stonik. Kỷ yếu Hội thảo khoa học về Đa dạng sinh học và các hợp chất

có hoạt tính sinh học, 2015, 265-269.

143

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. G. Cheng, X. Zhang, H. F. Tang, Y. Zhang, X. H. Zhang, W. D. Cao, D. K. Gao, X.

L. Wang, B. Q. Jin, Asterosaponin 1, a cytostatic compound from the starfish

Culcita novaeguineae, functions by inducing apoptosis in human glioblastoma

U87MG cells, Journal of Neuro-Oncology, 2006, 79, 235-241.

2. Y. Zhao, Ch. Zhu, X. Li, Zh. Zhang, Y. Yuan, Y. Ni, T. Liu, S. Deng, J. Zhao, Y.

Wang, Asterosaponin 1 induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis

in A549 human lung cancer cells, Oncology reports, 2011, 26, 919-924.

3. G. Xiao, and B. Yu, Total synthesis of starfish saponin Goniopectenoside B, Chem.

Eur. J., 2013, 19, 7708-7712.

4. Y. Dai, and B. Yu, Total synthesis of Astrosterioside A, an anti-inflammatory

asterosaponin, Chem. Commun., 2015, 51, 13826-13829.

5. http://baochinhphu.vn/Bien-Viet-Nam/Da-xac-dinh-danh-muc-gan-12000-loai-sinh-

vat-bien-Viet-Nam/330856.vgp.

6. Trương Kinh Phong và N. N. K., Động vật chí Trung Quốc – Ngành động vật Da

gai, NXB Khoa học, 1963.

7. C. L. Mah, D. B. Blake, Global diversity and phylogeny of the Asteroidea

(Echinodermata), PLos ONE, 2012, 7, e35644.

8. D. B. Blake, A classification and phylogeny of post- Palaeozoic sea stars

(Asteroidea: Echinodermata), Journal of Natural History, 1987, 21, 481-582.

9. G. Dong, T. Xu, B. Yang, X. Lin, X. Zhou, X.Yang, Y. Liu, Chemical constituents

and bioactivities of starfish, Chemistry & Biodiversity, 2011, 8, 740-791.

10. R. S. Popov, V. N. Ivanchina, A. A. Kicha, T. V. Malyarenko, P. S. Dmitrenok,

Structural characterization of polar steroid compounds of the Far Eastern starfish

Lethasterias fusca by Nanoflow liquid chromatography coupled to quadrupole time-

of-flight tandem mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2019, Doi:

10.1007/s13361-019-02136-3.

11. E. V. Levina, A. I. Kalinovsky, V. A. Stonik, P. S. Dmitrenok, P. V.

Andriyaschenko, Steroid compounds from Far Eastern starfishes Henricia aspera

and H. tumida, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2005, 31, 467-474.

144

12. W. Weihong, H. Jongki, L. Chong-ok, S. I. Kwang, S. C. Jae, H. J. Jee, Cytotoxic

sterols and saponins from the starfish Certonardoa semiregularis, Journal of

Natural Products, 2004, 67, 584-591.

13. W. Wang, H. Jang, J. Hong, L. Chong-Ok., S. I. Kwang, S. J. Bae, J. H. Jung,

Additional cytotoxic sterols and saponin from the starfish Certonardoa

semiregularis, Journal of Natural Products, 2004, 67, 1654-1660.

14. W. Wang, H. Jang, J. Hong, L. Chong-Ok, S. J. Bae, S. Shinm, J. H. Jung, New

cytotoxic sulfates saponins from the starfish Certonardoa semiregularis, Archives of

Pharmacal Research, 2005, 28, 285-289.

15. W. Wang, F. Li, N. Alam, Y. Liu, J. Hong, C. K. Lee, K.S. Im, J. H. Jung, New

saponins from the starfish Certonardoa semiregularis, Journal of Natural Products,

2002, 65, 1649-1656.

16. W. Wang, F. Li, Y. Park, J. Hong, L. Chong-Ok., J. Y. Kong, S. Snin, K. S. Im, J.

H. Jung, Bioactive sterols from the starfish Certonardoa semiregularis, Journal of

Natural Products, 2003, 66, 384-391.

17. W. H. Wang, F. M. Li, J. K. Hong, L. Chon- Ok, H. Y. Cho, K. S. Im, J. H. Jung,

Four new saponins from the starfish Certonardoa semiregularis, Chemical &

Pharmaceutical Bulletin, 2003, 51, 435-439.

18. P. Yan, Zh. Jianxian, H. Riming, W. Yifei, X. Tunhai, Z. H. Xuefeng, L. Qiuying,

Z. Fanli, J. Huaiqiang, Y. Xianwen, L. Yonghong, Polyhydroxy steroids and

saponins from China sea starfish Asterina pectinifera and their biological activities,

Chem. Pharm. Bull., 2010, 58 (6), 856-858.

19. V. N. Ivanchina, A. A. Kicha, T. T. T. Huong, A. I. Kalinovsky, P. S. Dmitrenok, I.

G. Agafonova, P. Q. Long, V. A. Stonik, Highly hydroxylated steroids of the starfish

Archaster typicus from the Vietnamese waters, Steroids, 2010, 75, 897-904.

20. N. V. Ivanchina, T. V. Malyarenko, A. A. Kicha, A. I. Kalinovskii, P. S. Dmitrenok,

Polar steroidal compounds from the Far-Eastern starfishLethasterias fusca, Russ.

Chem. Bull., 2008, 57 (1), 204-208.

21. E. V. Levina, A. I. Kalinovsky, S. P. Ermakova, P. S. Dmitrenok , Steroid

compound from Pacific starfish Mithrodia clavigera and their toxicity to human

melanoma cells, Russ. J. Bioorg. Chem., 2012, 38 (5), 520-525.

145

22. T. V. Malyarenko, O. S. Malyarenko, N. V. Ivanchina, A. I. Kalinovsky, R. S.

Popov, A. A. Kicha, Four new sulfated polar steroids from the Far Eastern starfish

Leptasterias ochotensis: Structure and activites, Mar. Drugs, 2015, 13, 4418-4435.

23. H. Tang, Y. Yi, L. Li, P. Sun, Bioactive asterosaponins from the starfishCulcita

novaeguineae, J. Nat. Prod., 2005, 68, 337-341.

24. M. Ning, T. F. Hai, Q. Feng, W. L. Hou, R. T. Xiang, Zh. Wei, A new

polyhydroxysteroidal glycoside from the starfish Anthenea chinensis, Chinese

Chemical Letters, 2009, 20, 1231-1234.

25. M. Ning, T. F. Hai, Q. Feng, W. L. Hou, R. T. Xiang, Zh. Wei, N. Y. Min,

Polyhydroxysteroidal glycosides from the starfishAnthenea chinensis, J. Nat. Prod.,

2010, 73, 590-597.

26. T. V. Malyarenko, S. D. Kharchenko, A. A. Kicha, N. V. Ivanchina, P. S.

Dmitrenok, E. A. Chingizova, E. A. Pislyagin, E. V. Evtushenko, T. I. Antokhina, C.

V. Minh, V. A. Stonik, Anthenosides L-U, steroidal glycosides with unusual

structural features from the starfish Anthenea aspera, Journal of Natural Products,

2016, 79, 12, 3047-3056.

27. T. V. Malyarenko, O. S. Malyarenko, A. A. Kicha, N. V. Ivanchina, A. I.

Kalinovsky, P. S. Dmitrenok, S. P. Ermakova., V. A. Stonik, In vitro anticancer and

proapoptotic activities of steroidal glycosides from the starfishAnthenea aspera,

Mar. Drugs, 2018, 16, 420.

28. T. V. Malyarenko , N. V. Ivanchina, O. S. Malyarenko, A. I. Kalinovsky, P. S.

Dmitrenok, E. V. Evtushenko, C. V. Minh, A. A. Kicha, Two new steroidal

monoglycosides, Anthenosides A1 and A2, and revisison of the structure of known

Anthenoside A with unusual monosaccharide residue from the starfishAnthenea

aspera, Molecules, 2018, 23, 1077.

29. A. A. Kicha, D. T. Ha, N. V. Ivanchina, T. V. Malyarenko, A. I. Kalinovsky, P. S.

Dmitrenok, S. P. Ermakova, O. S. Malyarenko, N. A. Hung, T. T. T. Thuy, P. Q.

Long, Six new polyhydroxysteroidal glycosides, Anthenosides S1-S6, from the

starfishAnthenea sibogae, Chem. Biodiversity, 2018, 15, e1700553.

30. A. A. Kicha, N. V. Ivanchina, A. I. Kalinovsky, P. S. Dmitrenok, I. G. Agafonova ,

V. A. Stonik, Steroidal triglycosides, Kurilensosides A, B, and C, and other polar

146

steroids from the far eastern starfishHippasteria kurilensis, Journal of Natural

Products, 2008, 71, 793-798.

31. A. A. Kicha, N. V. Ivanchina, A. I. Kalinovsky, P. S. Dmitrenok, V. A. Stonik, Steroidal

monoglycosides from the far eastern starfish Hippasteria kurilensis and hypothetic

pathway of polyhydroxysteroid biosynthesis in starfish, Steroids, 2009, 74, 238-244.

32. T. V. Malyarenko, A. A. Kicha, N. V. Ivanchina, A. I. Kalinovsky, R. S. Popov, O.

S. Vishchuk, V. A. Stonik, Asterosaponins from the Far Eastern starfish

Leptasterias ochotensis and their anticancer activity, Steroids, 2014, 87, 119-127.

33. A. A. Kicha, A. I. Kalinovsky, N. V. Ivanchina, T. V. Malyarenko, P. S.

Dmitrenok, A. S. Kuzmich, E. V. Sokolova, V. A. Stonik, Furostane series

asterosaponins and other unusual steroid oligoglycosides from the tropical starfish

Pentaceraster regulus, Journal of Natural Products, 2017, 80 (10), 2761-2770.

34. N. P. Thao, N. X. Cuong, B. T. T. Luyen, N. V. Thanh, N. X. Nhiem, Y. S. Koh, B.

M. Ly, N. H. Nam, P. V. Kiem, C. V. Minh, Y. H., Anti-inflammatory

asterosaponins from the starfish Astropecten monacanthus, Journal of Natural

Products, 2013, 76 (9), 1764-1770.

35. E. De Simone, A. Dini, L. Minale, C. Pizza, F. Senatore, F. Zollo, Starfish saponins

VI- Unique 22,23-epoxysteroidal cyclic glycosides, minor constituents from

Echinaster sepositue, Tetrahedron Letters, 1981, 22 (16), 1557-1560.

36. R. Riccio, A. Dini, L. Minale, C. Pizza, F. Zollo, T. Sevenet, Starfish saponins VII

– Structure of luzonicoside, a futher steroidal cyclic glycoside from the parcific

starfish Echinaster luzonicus, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1981, 1855-1862.

37. R. Riccio, A. Dini, L. Minale, C. Pizza, F. Zollo, T. Sevenet, Experientia, 1982, 38, 68-70.

38. A. A. Kicha, A. I. Kalinovsky, T. V. Malyarenko, N. V. Ivanchina, P. S. Dmitrenok

, E. S. Menchinskaya, E. A. Yurchenko, E. A. Pislyagin, D. L. Aminin, T. T. T.

Huong, P. Q. Long, V. A. Stonik, Cyclic steroid glycosides from the starfish

Echinaster luzonicus: Structures and Immunomodulatory activities, J. Nat. Prod.,

2015, 78, 1397-1405.

39. P. Moran.The Acanthaster phenonmenon, Australian Institute of Marine Science

Monograph Series,1988, 7, 379-480.

40. C. Mah. WoRMS Taxon Details: Acanthaster planci, World Asteroidea database,

Accessed through: World Register of Marine Species, 2011, May 24.

147

41. Y. M. Sheikh, B. M. Tusch, C. Djerassi. 5α-pregn-9(11)-ene-3β,6α -diol-20-one and

5α-cholesta-9(11),20(22)-diene-3β,6α-diol-23-one. Two novel steroids from the

starfish Acanthaster planci, J. Am. Chem. Soc., 1972, 94:9, 3278-3280.

42. I. Kitagawa, M. Kobayashi, T. Sugawara, I. Yosioka. Thornasterol A and B, two genuine

sapogenols from the starfish Acanthaster planci, Tetrahedron Letters, 1975, No.11, 967-970.

43. I. Kitagawa, M. Kobayashi. On the structure of the major saponin from the starfish

Acanthaster planci, Tetrahedron Letters, 1977, No.10, 859-862.

44. S. Susumu, I. Nobuo. Identification of 23-demethylacanthasterol in an asteroid,

Acanthaster planciand its synthesis, Steroids, 1980, Vol. 36, No.1, 65-71.

45. Y. M. Sheikh, C. Djerassi. Characterization of 3β-hydroxy-5α-cholesta-9(11),

20(22)-dien-23-one-6α-YL- β-D-6’-deoxy glucoside from the starfish Acanthaster

planci, Tetrahedron Letters, 1973, No.31, 2927-2930.

46. L. Minale, C. Pizza, R. Riccio, F. Zollo, Starfish saponins, XIII. Occurrence of

Nodososide in the Starfish Acanthaster planciand Linckia laevigata, J. Nat. Prod.,

1983, Vol. 47, No. 3, 558.

47. A. A. Kicha, A. I. Kalinovskii, N. V. Ivanchina, T. V. Malyarenko, R. S. Popov, F. K. Long,

and N. A. Hung,Minor Steroidal Triglycoside Planciside D from the Tropical Starfish

Acanthaster planci, Chemistry of Natural Compounds, 2014, Vol. 50, No. 6, 1032-1036.

48. T. Komori, J. Matsuo, Y. Itakura, K. Sakamoto, Y. Ito, Sh. Taguchi and T. Kawasaki.

Isolation and Structure of the Oligoglycoside Sulfates, Liebigs Ann. Chem., 1983, 24-36.

49. T. Komori, H. Nanri, Y. Itakura, K. Sakamoto, Sh. Taguchi, R. Higuchi, T.

Kawasaki, T. Higuchi. Structures of Two Newly Characterized Genuine Sapogenins

and an Oligoglycoside Sulfate, Liebigs Ann. Chem., 1983, 27-55.

50. Y. Itakura and T. Komori. Structures of Four New Oligoglycoside Sulfates, Liebigs

Ann. Chem., 1986, 499-508.

51. T. Komori, Y. Sanechika, Y. Ito, J. Matsuo, T. Nohara, T. Kawasaki. Biologisch aktive

Glykoside aus Asteroidea, I.-Strukturen eines neuen Cerebrosidgemischs und von Nucleosiden

aus dem Seestern Acanthaster planci, Liebigs Ann. Chem., 1980, No. 5, 653-824.

52. Y. Kawano, R. Higuchi, R. Isobe, T. Komori. Biologically Active Glycoside from

Asteroidea, XIII- Isolation and Structure of Six New Cerebrosides, Liebigs Ann.

Chem., 1988, 19-24.

148

53. Y. Kawano, R. Higuchi, R. Isobe, T. Komori. Biologically Active Glycoside from

Asteroidea,XVII- Glycosphingolipids from the starfish Acanthaster planci- Isolation and

Structure of Two New Ceramide Lactosides, Liebigs Ann. Chem., 1988, 1181-1183.

54. R. Higuchi, T. Natori, T. Komori. Biologically Active Glycoside from Asteroidea,

XX. Glycosphingolipids from the starfish Asterina pectinifera, 1- Isolation and

characterization of Acanthacerebroside B and structure elucidation of related,

nearly homogeneous cerebrosides, Liebigs Ann. Chem., 1990, 51-55.

55. R. Higuchi, J. X. Jhou, K. Inukai, and T. Komori. Glycosphingolipids from the

starfish Asterias amurensis versicolor, 1. Isolation and structure of six new

cerebrosides, Asteriacerebrosides A-F, and two known cerebrosides,

Astrocerebroside A and Acanthacerebroside C. Liebigs Ann. Chem., 1991, 745-752.

56. Y. Kawano, R. Higuchi, T. Komori. Biologically Active Glycoside from

Asteroidea,XIX- Glycosphingolipids from the starfish Acanthaster planci- Isolation

and Structure of Five New Gangliosides. Liebigs Ann. Chem., 1990, 43-50.

57. T. Miyamoto, M. Inagaki, R. Isobe, Y. Tanaka, R. Higuchi, M. Iha and K. Teruya.

Biologically Active Glycoside from Asteroidea,36[1]- Re-examination of the

Structure of Acanthaganglioside C, and the Identification of Three Minor

Acanthaganglioside F, G and H. Liebigs Ann. Chem., 1997, 931-936.

58. M. Inagaki, R. Isobe, Y. Kawano, T. Miyamoto, T. Komori and R. Higuchi.

Isolation and Structure of Three New Ceramides from Starfish Acanthaster planci.

Eur. J. Org. Chem., 1998, 129-131.

59. T. Miyamoto, A. Yamamoto, M. Wakabayashi, Y. Nagaregawa, M. Inagaki, R.

Iha, and K. Teruya. Biologically Active Glycoside

Higuchi, M. from Asteroidea,40[‡]-Two New Gangliosides, Acanthagangliosides I and J from the

Starfish Acanthaster planci. Eur. J. Org. Chem., 2000, 2295-2301.

60. Y. Tanaka, T. Katayana, Bull, Jap. Soc. Sci. Fish., 1976, 42, 807-812.

61. T. Maoka, N. Akimoto,Y. Terada, S. Komemushi, R. Harada, N. Sameshima, Y.

Sakagami. Structure of Minor Carotenoids from the Crown-of-Thorns Starfish,

Acanthaster planci. J. Nat. Prod., 2010, 73, 675-678.

62. P. Luo, C. Hu, J. Xia, C. Ren, X. Jiang.Chemical constituent analysis of the crown-of-

thorns starfish Acanthaster planci and potential utilization value of the starfish as feed

ingredient for animals. African Journal of Biotechnology, 2011, 10 (62), 13610-13616.

149

63. I. Karasudani, T. Koyama, S. Nakandakari and Y. Aniya. Purification of

Anticoagulant factor from the Spine venom of the Crown-of-thorns Starfish,

Acanthaster planci. Toxicon, 1996, Vol. 34, No. 8, 871-879.

64. T. Koyama, K. Noguchi, Y. Aniya and M. Sakanashi. Analysis for Sites of

Anticoagulant Peptide Isolated from the Starfish Acanthaster planci, in the Blood

Coagulation Cascade. Gen. Pharmac., 1998, Vol. 31, No.2, 277-282.

65. C. -C. Lee, W. -S. Tsai, H. J. Hsieh and D. -F. Hwang. Hemolytic activity of venom

from crown-of-thorns starfish Acanthaster planci spines. J. Ven. Ani. And Tox. Inc.

Trop. Dis., 2013, 19, 22.

66. T. Komori. Toxins from the starfish Acanthaster planci and Asterina pectinifera,

Toxicon, 1997, 35 (10), 1537-1548.

67. N. Fusetani, Y. Kato, K. Hashimoto, T. Komori, Y. Itakura and T. Kawasaki.

Biological activities of Asterosaponins with special reference to structure-activity

relationships. J. Nat. Prod., 1984, 47 (6), 997-1002.

68. C. -C. Lee, H. -J. Hsieh, C. -H. Hsieh. Antioxidative and anticancer activities of

various ethanolic extract fractions from crown-of-thorns starfish(Acanthaster

planci). Envi. Tox. and Pharmac., 2014, 38, 761-773.

69. L. T. Vien, T. T. H. Hanh, P. T. T. Huong, N. H. Dang, N. V. Thanh, L. Ekaterina,

N. X. Cuong, N. H. Nam, P. V. Kiem, A. A. Kicha, and C. V. Minh. Pyrrole

Oligoglycosides from the Starfish Acanthaster planci Suppress Lipopolysaccharide-

Induced Nitric Oxide Production in RAW264.7 Macrophages, Chem. Pharm. Bull.,

2016, Vol. 64, No. 11, 1654-1657.

70. L. T. Vien, T. T. H. Hanh, P. T. T. Huong, V. A. Tu, N. V. Thanh, E. G. Lyakhova,

N. X. Cuong, N. H. Nam, P. V. Kiem, C. V. Minh, A. A. Kicha and V. A. Stonik,

New Steroidal Glycosides from the Starfish Acanthaster planci, Chemistry of

Natural Compounds, 2016, Vol. 52, No. 6, 1056-1060.

71. L. Minale, R. Riccio, F. Zollo. Steroidal oligoglycosides and polyhydroxysteroids

from echinoderms, Fortschr. Chem. Org. Naturst., 1993, 62, 75-308.

72. V. A. Stonik, N. V. Ivanchina, A. A. Kicha. New polar steroids from starfish, Nat.

Prod. Commun., 2008, 3, 1587-1610.

73. N. V. Ivanchina, A. A. Kicha, V. A. Stonik. Steroid glycosides from marine

organisms, Steroid, 2011, 76, 425-454.

150

74. J. Cui, H. Wang, Y. M. Huang, Y. Xin, A. M. Zhou. Synthesis and cytotoxic analysis of

some disodium 3β,6β- dihydroxysterol disulfates, Steroids, 2009, 74, 1057-1060.

75. J. G. Cui, L. M. Zeng, J. Y. Su, W. G. Lu.Synthesis of polyhydroxysterols (I):

synthesis of 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol, acytotoxic natural hydroxylated

sterol, Steroids, 2001, 66, 33-38.

76. J. Cui, C. W. Lin, L. M. Zeng, J. Y. Su. Synthesis of polyhydroxysterols (III):

synthesis and structural elucidation of 24-methylenecholest-4-en-3β,6α-diol,

Steroids, 2002, 67, 1015-1019.

77. W. G. Lu, L. M. Zeng, J. Y. Su. Synthesis of polyhydroxysteroid (IV): synthesis of

24-methylene-cholesta-3β,5α,6β,19-tetrol, a cytotoxic natural hydroxylated sterol,

Steroids, 2004, 69, 445-449.

78. J. R. Williams, D. Chai, D. Wright.Synthesis of (25R)-26-hydroxycholesterol,

Steroids, 2002, 67, 1041-1044.

79. B. Jiang, H. P. Shi, W. Sh. Tian, W. Sh. Zhou.The convergent synthesis of novel

cytotoxic certonardosterol D2 from diosgenin, Tetrahedrons, 2008, 64, 469- 476.

80. T. F. Liu, X. Lu, H. Tang, M. M. Zhang, P. Wang, P. Sun. 3β,5α,6β-oxygenated sterols

from the South China sea gorgonian Muriceopsis flavida and their tumor cell growth

inhibitory activity and apoptosis-inducing fuction, Steroids, 2013, 78, 108-114.

81. M. Voisin, S. S. Poirot, M. Poirot.One step synthesis of 6-oxo-cholestan-3β,5α-diol,

Biochemical and Biophysical Communications, 2014, 446, 782-785.

82. J. Rodriguez, L. Nunez, S. Peixinho, C. Jiménez.Isolation and synthesis of the first

natural 6-hydroximino-4-en-3-one steroids from the sponges Cinachyrella spp.,

Tetrahedron Lett., 1997, 38, 1833-1836.

83. D. J. Xiao, X. D. Peng, S. Z. Deng, W. Z. Ma, H. M. Wu. Structure elucation of

(3E)-cholest-4-en-3,6-dione-3-oxime in marine sponge Cinachyrella australiensis

from the south china sea, Chi. J. Org. Chem, 2005, 25 (12), 1606-1609.

84. N. Deive, J. Rodríguez, and C. Jiménez.Synthesis of cytotoxic 6E-Hydroximino-4-

ene steroids: Structure/activity studies, J.Med.Chem., 2001, 44, 2612-2618.

85. P. Javier, R. Miriam, P. Vanessa, A. Beatriz, R. Jaime, S. Nélida, F. Antonio, J.

Carlos.Synthesis and evaluation of new 6-hydroximinosteroid analogs as cytotoxic

agents, Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 4722-4740.

151

86. J. Cui, L. Fan, L. L. Huang, H. L. Liu, A. Zhou. Synthesis and evaluation of some steroidal

oximes as cytotoxic agents: Structure/activity studies (I), Steroids, 2009, 74, 62-72.

87. Nguyễn Thị Diệp, Luận án tiến sỹ hóa học: Nghiên cứu một số phương pháp tổng

hợp pregnan và một số dẫn xuất của chúng từ 9α-hydroxy androstendion, năm 2017,

Học viện Khoa học và công nghệ Việt Nam.

88. D. T. Ha, D. L. Phuong, T. T. K. Trang, P. Q. Long, N. D. Quang, M. Bordoloi, T.

T. T. Thuy.Synthesis of poly-hydroxysteroids from diosgennin, Journal of Science

and Technology, 2016, 54 (2B), 222-229.

89. K. Leontein, B. Lindberg, J. Lönngren. Assignment of absolute configuration of

sugars by g.l.c of their acetylated glycosides formed from chiral alcohols,

Carbohydrat Res., 1978, 62, 359-362.

90. N. V. Ivanchina, A. I. Kalinovsky, A. A. Kicha, T. V. Malyarenko, P. S. Dmitrenok,

S. P. Ermakova, V. A. Stonik. Two new asterosaponins from the Far Eastern

starfishLethasterias fusca, Natural Product Communications, 2012, 7, 853-858.

91. M. V. Berridge, A. S. Tan. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular

localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron

transport in MTT reduction. Arch. Biochem. Biophys., 1993, 303, 474-482.

92. N. H. Colburn, E. J. Wendel, G. Abruzzo. Dissociation of mitogenesis and late-stage

promotion of tumor cell phenotype by phorbol esters: mitogen-resistant variants are

sensitive to promotion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1981, 78, 6912-6916.

93. J. C. Yarrow, Z. E. Perlman, N. J. Westwood, T. J. Mitchison. A high-throughput

cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based

readout methods. BMC Biotechnol., 2004, 4, 21.

94. A. K. Dzik, A. R. Stojko, R. Kubina, Z. J. Stojko, R. Stojko, R. D. Wojtyczka, J.

Stojko. Migration rate inhibition of breast cancer cells treated by caffeic acid and

caffeic acid phenethyl ester: an in vitro comparison study. Nutrients, 2017, 9, 1144.

95. T. V. Malyarenko, A. A. Kicha, N. V. Ivanchina, A. I. Kalinovsky, P. S. Dmitrenok,

S. P. Ermakova, V. A. Stonik. Cariniferosides A-F and other steroidal biglycosides

from the starfish Asteropsis carinifera, Steroids, 2011, 76, 1280-1287.

96. A. A. Kicha, A. I. Kalinovsky, P. V. Andriyashchenko, E. V. Levina. Culcitosides C2 and C3

from the starfish Culcita novaeguineae, Khimiya Prirodnykh Soedinenii, 1986, 592-596.

152

97. K. Bock, H. Thøgersen. Nuclear magnetic resonance spectroscopy in the study of mono-

and oligosaccharides, Annual Reports on NMR Spectroscopy, 1982, 13, 1-57.

98. A. A. Kicha, A. I. Kalinovsky, N. V. Ivanchina, V. A. Stonik. Steroid glycosides from the

starfish Solaster dawsoni (Verrill), Russian Chemical Bulletin, 1993, 42, 943-946.

99. A. A. Kicha, A. I. Kalinovsky, A. S. Antonov, O. S. Radchenko, N. V. Ivanchina, T.

V. Malyarenko, A. M. Savchenko, V. A. Stonik. Determination of C-23 configuration in (20R)-23-hydroxycholestane side chain of steroid compounds by 1H and 13C NMR spectroscopy, Natural Product Communications, 2013, 8, 1219-1222.

100. D. J. Vanderach, C. Djerassi. Marine natural products – synthesis of four naturally

occurring 20-β-H cholanic acid-derivatives, J. Org. Chem., 1978, 43, 1442-1448.

101. E. V. Levina, A. I. Kalinovsky, V. S. Levin. New steroid glycosides from the

starfishFromia milleporella, Rus. J. Bioorg. Chem., 2006, 32, 84-88.

102. S. K. Wang, C. F. Dai, C. Y. Duh. Cytotoxic pregnane steroids from the

Formosan soft coral Stereonephthya crystalliana, J. Nat. Prod., 2006, 69, 103-106.

103. Y. Itakura, T. Komori. Biologically active glycosides from Asteroidea, IX.

Steroid oligoglycosides from the starfish Asterias amurensis [cf.] versicolor Sladen,

2. Structure elucidation of two new oligoglycoside sulfates, versicoside B and

versicoside C, Liebigs Ann. Chem., 1986, 359-373.

104. K. Leontein, B. Lindberg, J. Lönngren. Assignment of absolute configuration of

sugars by g.l.c of their acetylated glycosides formed from chiral alcohols,

Carbohydrat Res., 1978, 62, 359-362.

105. A. A. Kicha, N. V. Ivanchina, T. T. T. Huong, A. I. Kalinovsky, P. S. Dmitrenok, S.

N. Fedorov, S. A. Dyshlovoy, P. Q. Long, V. A. Stonik. Two new asterosaponins,

archasterosides A and B, from the Vietnamese starfish Archaster typicusand their

anticancer properties, Biorg. Med. Chem. Lett., 2010, 20, 3826-3830.

106. A. A. Kicha, N. V. Ivanchina, T. T. T. Huong, A. I. Kalinovsky, P. S.

Dmitrenok, P. Q. Long. Minor asterosaponin archasteroside C from the starfish

Archaster typicus, Russ. Chem. Bull., 2010, 59, 2133-2136.

107. L. Minale, R. Ricco, O. G. Squillace, J. Pusset, J. L. Menou. Starfish saponins

XVI. Composition of the steroidal glycoside sulphates from the starfish Luidia

maculate, Comp. Biochem. Physiol., 1985, 80, 113-118.

153

108. N. V. Ivanchina, A. A. Kicha, A. I. Kalinovsky, P. S. Dmitrenok, N. G.

Prokofeva, V. A. Stonik. New steroid glycosides from theAsterias rathbuni, Journal

of Natural Products, 2001, 64 (7), 945-947.

109. M. Tsuda, Jr. G. J. Schroepfer, Carbon-13 nuclear magnetic resonance studies of

C27 sterol precursors of cholesterol, J. Org. Chem., 1978, Vol. 44, No.8, 1290-1293.

110. http://www.hmdb.ca/spectra/nmr_one_d/1065.

111. http://kirste.userpage.fuberlin.de/chemistry/oc/subst/cholesterol.html.

112. Hoàng Thị Huệ An, Trần Thị Thu Thủy, Nguyễn Quyết Chiến. Phân lập và tinh

chế astaxathin từ vỏ tôm. Tạp chí hóa học, 2007, 45 (6A), 226-230.

https://www.chemicalbook.com/SpectrumEN_65-71-4_1HNMR.htm.

113. 114. R. L. Benoit, M. Frechette. 1H and 13C nuclear magnetic resonance and

ultraviolet studies of the protonnation of cytosine, uracil, thymine, and related

compounds, Can. J. Chem, 1986, 64, 2348-2352.

115. M. Eunsook, C. Taeyoung. An Efficient 4β-Hydroxylation of Steroidal 5-en-3β-

ols and 1,4-Conjugation of Steroidal 4-en-3-ones Using SeO2 Oxidation, Bull.

Korean Chem. Soc., 2009, 30 (1), 245-248.

116. T. T.T. Tran, N. T. Ngo, T. H. Dinh, G. V. Thanh, S. Legoupy. Synthesis of novel

triazolo cyclobutane nucleoside analogs, Bull. Korean Chem. Soc., 2015, 36, 1390-1395.

117. W. Lu, L. Zeng, J. Su. Synthesis of polyhydroxysterols (IV): synthesis of 24-

methylene-cholesta-3β,5α,6β,19-tetrol, a cytotoxic natural hydroxylated sterol,

Steroids, 2004, 69, 445-449.

118. J. Cui, L. Fan, M. Y. Huang, Y. Xin, M. A. Zhou. Synthesis and evaluation of

some steroidal oximes as cytotoxic agents: Structure/activity studies (II), Steroids,

2009, 74, 989-995.

119. A. Nagia, A. Anthony. Facile synthesis of steroidal Δ4-3,6-diones from Δ5-3-ols

using pyridinium chlorochromate, Synth. Commun., 1996, 26, 225-230.

154

MỤC LỤC PHỤ LỤC

Hình PL1: Phổ (+) HR ESI-MS và (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP1 Hình PL2: Phổ (-) HR ESI-MS và (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP1 Hình PL3: Phổ 1H NMR của hợp chất AP1 Hình PL4: Phổ 13C NMR của hợp chất AP1 Hình PL5: Phổ HSQC của hợp chất AP1 Hình PL6: Phổ COSY của hợp chất AP1 Hình PL7: Phổ HMBC của hợp chất AP1 (1) Hình PL8: Phổ HMBC của hợp chất AP1 (2) Hình PL9: Phổ H2BC của hợp chất AP1 Hình PL10: Phổ NOESY của hợp chất AP1 (1) Hình PL11: Phổ NOESY của hợp chất AP1 (2) Hình PL12: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP1 (1) Hình PL13: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP1 (2) Hình PL14: Phổ (+) HR ESI-MS và (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP2 Hình PL15: Phổ (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP2 Hình PL16: Phổ 1H NMR của hợp chất AP2 Hình PL17: Phổ 13C NMR của hợp chất AP2 Hình PL18: Phổ COSY của hợp chất AP2 (1) Hình PL19: Phổ COSY của hợp chất AP2 (2) Hình PL20: Phổ HSQC của hợp chất AP2 (1) Hình PL21: Phổ HSQC của hợp chất AP2 (2) Hình PL22: Phổ HMBC của hợp chất AP2 (1) Hình PL23: Phổ HMBC của hợp chất AP2 (2) Hình PL24: Phổ NOESY của hợp chất AP2 (1) Hình PL25: Phổ NOESY của hợp chất AP2 (2) Hình PL26: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP2 (1) Hình PL27: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP2 (2) Hình PL28: Phổ (+)-HR ESI-MS/MS và (–)-HR ESI-MS/MS của hợp chất AP3 Hình PL29: Phổ 13C NMR của hợp chất AP3 Hình PL30: Phổ COSYcủa hợp chất AP3 Hình PL31: Phổ HMBC của hợp chất AP3 (1) Hình PL32: Phổ HMBC của hợp chất AP3 (2) Hình PL33: Phổ ROESY của hợp chất AP3 (1) Trang 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190

155

Hình PL34: Phổ ROESY của hợp chất AP3 (2) Hình PL35: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP3 (1) Hình PL36: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP3 (2) Hình PL37: Phổ HR ESI-MS của hợp chất AP4 Hình PL38: Phổ 1H NMR của hợp chất AP4 Hình PL39: Phổ 1H NMR của hợp chất AP4 (2) Hình PL40: Phổ 13C NMR của hợp chất AP4 Hình PL41: Phổ 1H NMR của hợp chất AP11 (1) Hình PL42: Phổ 13C NMR của hợp chất AP11 Hình PL43: Phổ COSY của hợp chất AP11 Hình PL44: Phổ HSQC của hợp chất AP11 Hình PL45: Phổ HMBC của hợp chất AP11 Hình PL46: Phổ ROESY của hợp chất AP11 Hình PL47: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP11 Hình PL48: Phổ (±) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP11 Hình PL49: Phổ GC của hợp chất AP11 Hình PL50: Phổ GC của các đường chuẩn Hình PL51: Phổ HR ESI-MS và HR ESI-MS/MS của hợp chất AP12 Hình PL52: Phổ 1H NMR của hợp chất AP12 Hình PL53: Phổ 13C NMR của hợp chất AP12 Hình PL54: Phổ (-) HR ESI-MS và (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP13 Hình PL55: Phổ 1H NMR của hợp chất AP13 Hình PL56: Phổ 13C NMR của hợp chất AP13 Hình PL57: Phổ (-) HR ESI-MS và (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP14 Hình PL58: Phổ (+) HR ESI-MS và (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP14 Hình PL59: Phổ 1H NMR của hợp chất AP14 Hình PL60: Phổ 13C NMR của hợp chất AP14 Hình PL61: Phổ 1H NMR của hợp chất AP5 Hình PL62: Phổ 13C NMR của hợp chất AP5 Hình PL63: Phổ 1H NMR của hợp chất AP6 Hình PL64: Phổ 13C NMR của hợp chất AP6 Hình PL65: Phổ 1H NMR của hợp chất AP7 Hình PL66: Phổ 13C NMR của hợp chất AP7 Hình PL67: Phổ 1H NMR của hợp chất AP8 Hình PL68: Phổ 13C và DEPT của hợp chất AP8 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225

156

Hình PL69: Phổ 1H và 13C NMR của hợp chất AP9 Hình PL70: Phổ 1H và 13C NMR của hợp chất AP10 Hình PL71: Phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 15c Hình PL72: Phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 16c Hình PL73: Phổ HMBC của hợp chất 16c (1) Hình PL74: Phổ HMBC của hợp chất 16c (2) Hình PL75: Phổ 1H NMR của hợp chất 17c Hình PL76: Phổ 13C NMR của hợp chất 17c Hình PL77: Phổ 1H NMR của hợp chất 18c Hình PL78: Phổ 13C NMR của hợp chất 18c Hình PL79: Phổ HMBC của hợp chất 18c Hình PL80: Phổ 1H NMR của hợp chất 19c Hình PL81: Phổ 13C NMR của hợp chất 19c Hình PL82: Phổ HMBC của hợp chất 19c (1) Hình PL83: Phổ HMBC của hợp chất 19c (2) Hình PL84: Phổ 1H NMR của hợp chất 20c Hình PL85: Phổ 13C và HSQC của hợp chất 20c Hình PL86: Phổ HMBC của hợp chất 20c Hình PL87: Phổ 1H NMR của hợp chất 21c Hình PL88: Phổ 13C và HSQC của hợp chất 21c Hình PL89: Phổ HMBC của hợp chất 21c Hình PL90: Phổ 1H NMR giãn rộng của hợp chất 22c Hình PL91: Phổ 13C NMR giãn rộng của hợp chất 22c Hình PL92: Phổ (+) ESI-MS của hợp chất 23c Hình PL93: Phổ 1H NMR của hợp chất 23c Hình PL94: Phổ 13C NMR của hợp chất 23c Hình PL95: Phổ 1H NMR và (+) ESI-MS của hợp chất 24c Hình PL96: Phổ 1H NMRcủa hợp chất 25c Hình PL97: Phổ 13C NMRcủa hợp chất 25c Hình PL98: Phổ (+) ESI-MS của hợp chất 25c Hình PL99: Phổ 1H NMRcủa hợp chất 26c Hình PL100: Phổ 13C NMRcủa hợp chất 26c Hình PL101: Phổ 1H NMRcủa hợp chất 27c Hình PL102: Phổ 13C NMRcủa hợp chất 27c Hình PL103: Phổ HSQC của hợp chất 27c 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260

157

Hình PL104: Phổ (+) ESI-MS của hợp chất 27c Hình PL105: Phổ 1H NMRcủa hợp chất 28c Hình PL106: Phổ 13C NMRcủa hợp chất 28c Hình PL107: Phổ (+) ESI-MS của hợp chất 28c Hình PL108: Phổ 1H NMR của hợp chất 29c Hình PL109: Phổ 13C NMR của hợp chất 29c Hình PL110: Phổ (+) HR ESI-MS của hợp chất 29c Hình PL111: Phổ 1H NMR của hợp chất 30c Hình PL112: Phổ 13C NMR của hợp chất 30c Hình PL113: Phổ (+) HR ESI-MS của hợp chất 30c Hình PL114: Phổ 1H NMR của hợp chất 31c Hình PL115: Phổ 13C NMR của hợp chất 31c Hình PL116: Phổ (+) HR ESI-MS của hợp chất 31c 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273

158

Hình PL1: Phổ (+) HR ESI-MS và (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP1

159

Hình PL2: Phổ (-) HR ESI-MS và (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP1

160

Hình PL3: Phổ 1H NMR của hợp chất AP1

161

Hình PL4: Phổ 13C NMR của hợp chất AP1

162

Hình PL5: Phổ HSQC của hợp chất AP1

163

Hình PL6: Phổ COSY của hợp chất AP1

164

Hình PL7: Phổ HMBC của hợp chất AP1 (1)

165

Hình PL8: Phổ HMBC của hợp chất AP1 (2)

166

Hình PL9: Phổ H2BC của hợp chất AP1

167

Hình PL10: Phổ NOESY của hợp chất AP1 (1)

168

Hình PL11: Phổ NOESY của hợp chất AP1 (2)

169

Hình PL12: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP1 (1)

170

Hình PL13: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP1 (2)

171

Hình PL14: Phổ (+) HR ESI-MS và (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP2

172

Hình PL15: Phổ (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP2

173

Hình PL16: Phổ 1H NMRcủa hợp chất AP2

174

Hình PL17: Phổ 13C NMRcủa hợp chất AP2

175

Hình PL18: Phổ COSYcủa hợp chất AP2 (1)

176

Hình PL19: Phổ COSYcủa hợp chất AP2 (2)

177

Hình PL20: Phổ HSQCcủa hợp chất AP2 (1)

178

Hình PL21: Phổ HSQCcủa hợp chất AP2 (2)

179

Hình PL22: Phổ HMBCcủa hợp chất AP2 (1)

180

Hình PL23: Phổ HMBCcủa hợp chất AP2 (2)

181

Hình PL24: Phổ NOESYcủa hợp chất AP2 (1)

182

Hình PL25: Phổ NOESYcủa hợp chất AP2 (2)

183

Hình PL26: Phổ 1D TOCSYcủa hợp chất AP2 (1)

184

Hình PL27: Phổ 1D TOCSYcủa hợp chất AP2 (2)

185

Hình PL28: Phổ (+)-HR ESI-MS/MS và (–)-HR ESI-MS/MS của hợp chất AP3

186

Hình PL29: Phổ 13C NMR của hợp chất AP3

187

Hình PL30: Phổ COSY của hợp chất AP3

188

Hình PL31: Phổ HMBC của hợp chất AP3 (1)

189

Hình PL32: Phổ HMBC của hợp chất AP3 (2)

190

Hình PL33: Phổ ROESY của hợp chất AP3 (1)

191

Hình PL34: Phổ ROESY của hợp chất AP3 (2)

192

Hình PL35: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP3 (1)

193

Hinhd PL36: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP3 (2)

194

Hình PL37: Phổ HR ESI-MS của hợp chất AP4

195

Hình PL38: Phổ 1H NMR của hợp chất AP4

196

Hình PL39: Phổ 1H NMR của hợp chất AP4 (2)

197

Hình PL40: Phổ 13C NMR của hợp chất AP4

198

Hình PL41: Phổ 1H NMR của hợp chất AP11

199

Hình PL42: Phổ 13C NMR của hợp chất AP11

200

Hình PL43: Phổ COSY của hợp chất AP11

201

Hình PL44: Phổ HSQC của hợp chất AP11

202

Hình PL45: Phổ HMBC của hợp chất AP11

203

Hình PL46: Phổ ROESY của hợp chất AP11

204

Hình PL47: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP11

+MS2(1187.4467), 90.0eV, 3.5-3.6min #199-206

Intens. 5 x10

1+ 1067.4985

0.8

0.6

1+ 921.4415

1+ 461.1613

1+ 607.2185

0.4

771.2859

1+ 315.1037

0.2

625.2288

1+ 775.3843

401.1401 479.1719

753.2758

169.0461

1+ 373.1452

185.0410 1+ 185.0410

0.0

200

400

600

800

1000

m/z

-MS2(1141.4698), 110.0eV, 2.7-3.1min #151-176

Intens. 5 x10

1- 96.9602

1.25

1.00

1- 849.3550

1- 995.4123

0.75

1- 557.2402

0.50

1- 393.1724

1- 703.2977

411.1828

0.25

1- 1141.4698

539.2298

523.2348

1- 225.0065

0.00

200

400

600

800

1000

m/z

205

Hình PL48: Phổ (±) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP11

GC của hợp chất AP11 và D-Fuc GC của hợp chất AP11

206

Hình PL49: Phổ GC của hợp chất AP11

GC D-Fuc GC D-Qui

GC L-Fuc GC L-Qui

207

Hình PL50: Phổ GC của các đường chuẩn

-MS, 1.1-1.3min #65-76

Intens. 6 x10

1- 1127.4586

2- 563.2253

1149.4393

1243.5412

490.1964

963.3895

417.1676

981.4000

835.3422

1227.5464

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

m/z

-MS2(1127.4552), 110.0eV, 1.8-2.1min #103-122

Intens. 5 x10

1- 96.9603

2.0

1- 981.3975

146.0574

146.0577

1.5

1- 835.3401

1- 557.2407

1- 1127.4552

1.0

18.0105

132.0419

146.0574

1- 393.1727

0.5

146.0575

411.1832

585.2356

1- 689.2827

1- 225.0066

0.0

200

400

600

800

1000

m/z

208

Hình PL51: Phổ HR ESI-MS và HR ESI-MS/MS của hợp chất AP12

209

Hình PL52: Phổ 1H NMR của hợp chất AP12

210

Hình PL53: Phổ 13C NMR của hợp chất AP12

-MS, 0.8-1.2min #47-68

Intens. 5 x10

1- 1225.5306

1.25

1- 647.3463

1.00

0.75

0.50

1127.4576

695.3112

447.1339

0.25

563.2256

465.3041

891.5301

0.00

400

500

600

700

800

1000

1100

1200

1300 m/z

900

Intens.

-MS2(1225.5316), 110.0eV, 2.1-2.3min #120-133

1- 981.3965

8000

146.0579

146.0570

6000

1- 1127.4543

1- 835.3394

96.9602

18.0108

4000

132.0422

1- 557.2401

146.0571

146.0568

2000

98.0757

1- 393.1725

1- 689.2823

255.2321

200

400

600

800

1000

1200

m/z

211

Hình PL54: Phổ (-) HR ESI-MS và (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP13

212

Hình PL55: Phổ 1H NMR của hợp chất AP13

213

Hình PL56: Phổ 13C NMR của hợp chất AP13

-MS, 2.7-3.2min #156-182

Intens. 5 x10

1- 1227.5445

1249.5263

1- 1127.4560

1- 563.5507

535.5195

1353.5117

591.5820

457.1858

m/z

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

-MS2(1227.5450), 110.0eV, 4.2-4.7min #242-270

Intens. 4 x10

146.0572

1- 981.3950

1- 1127.4523

146.0569

1- 835.3381

132.0419

1- 96.9600

100.0804

1- 557.2393

146.0569

146.0570

1- 393.1719

1- 689.2812

200

400

600

800

1000

1200

m/z

214

Hình PL57: Phổ (-) HR ESI-MS và (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP14

+MS, 1.4-1.9min #80-112

Intens. 5 x10

1+ 437.1911

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

1295.4988

0.5

1+ 685.4319

1+ 1273.5167

587.5455

1317.4815

559.5144

648.2541

0.0

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

m/z

+MS2(1273.5193), 100.0eV, 3.4-3.8min #196-219

Intens. 4 x10

1+ 1053.4750

146.0555

1.0

0.8

1+ 907.4195

100.0865

0.6

0.4

146.0564

119.9620

146.0554

146.0565

146.0559

0.2

1+ 593.1996

1+ 447.1431

1+ 761.3636

164.9188

301.0867

1153.5615

0.0

200

400

600

800

1000

1200

m/z

215

Hình PL58: Phổ (+) HR ESI-MS và (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP14

216

Hình PL59: Phổ 1H NMR của hợp chất AP14

217

Hình PL60: Phổ 13C NMR của hợp chất AP14

218

Hình PL61: Phổ 1H NMR của hợp chất AP5

219

Hình PL62: Phổ 13C NMR của hợp chất AP5

220

Hình PL63: Phổ 1H NMR của hợp chất AP6

221

Hình PL64: Phổ 13C NMR của hợp chất AP6

222

Hình PL65: Phổ 1H NMR của hợp chất AP7

223

Hình PL66: Phổ 13C NMR của hợp chất AP7

224

Hình PL67: Phổ 1H NMR của hợp chất AP8

225

Hình PL68: Phổ DEPT của hợp chất AP8

226

Hình PL69: Phổ 1H và 13C NMR của hợp chất AP9

227

Hình PL70: Phổ 1H và 13C NMR của hợp chất AP10

228

Hình PL71: Phổ 1H và phổ DEPT của hợp chất 15c

229

Hình PL72: Phổ 1H NMR của hợp chất 16c

230

Hình PL73: Phổ HMBC của hợp chất 16c (1)

231

Hình PL74: Phổ HMBC của hợp chất 16c (2)

232

Hình PL75: Phổ 1H NMR của hợp chất 17c

233

Hình PL76: Phổ 13C NMR của hợp chất 17c

234

Hình PL77: Phổ 1H NMR của hợp chất 18c

235

Hình PL78: Phổ 13C NMR của hợp chất 18c

236

Hình PL79: Phổ HMBC của hợp chất 18c

237

Hình PL80: Phổ 1H NMR của hợp chất 19c

238

Hình PL81: Phổ 13C NMR của hợp chất 19c

239

Hình PL82: Phổ HMBC của hợp chất 19c (1)

240

Hình PL83: Phổ HMBC của hợp chất 19c (2)

241

Hình PL84: Phổ 1H NMR của hợp chất 20c

242

Hình PL85: Phổ 13C và HSQC của hợp chất 20c

243

Hình PL86: Phổ HMBC của hợp chất 20c

244

Hình PL87: Phổ 1H NMR của hợp chất 21c

245

Hình PL88: Phổ 13C và HSQC của hợp chất 21c

246

Hình PL89: Phổ HMBC của hợp chất 21c

247

Hình PL90: Phổ 1H NMRgiãn rộng của hợp chất 22c

248

Hình PL91: Phổ 13C NMRgiãn rộng của hợp chất 22c

249

Hình PL92: Phổ (+) ESI-MS của hợp chất 23c

250

Hình PL93: Phổ 1H NMRcủa hợp chất 23c

251

Hình PL94: Phổ 13C NMRcủa hợp chất 23c

252

Hình PL95: Phổ 1H NMRvà (+) ESI-MS của hợp chất 23c

253

Hình PL96: Phổ 1H NMRcủa hợp chất 25c

254

Hình PL97: Phổ 13C NMRcủa hợp chất 25c

255

Hình PL98: Phổ (+) ESI-MS của hợp chất 25c

256

Hình PL99: Phổ 1H NMRcủa hợp chất 26c

257

Hình PL100: Phổ 13C NMRcủa hợp chất 26c

258

Hình PL101: Phổ 1H NMRcủa hợp chất 27c

259

Hình PL102: Phổ 13C NMRcủa hợp chất 27c

260

Hình PL103: Phổ HSQC của hợp chất 27c

261

Hình PL104: Phổ (+) ESI-MS của hợp chất 27c

262

Hình PL105: Phổ 1H NMRcủa hợp chất 28c

263

Hình PL106: Phổ 13C NMRcủa hợp chất 28c

264

Hình PL107: Phổ (+) ESI-MS của hợp chất 28c

265

Hình PL108: Phổ 1H NMR của hợp chất 29c

266

Hình PL109: Phổ 13C NMR của hợp chất 29c

267

Hình PL110: Phổ (+) HR ESI-MS của hợp chất 29c

268

Hình PL111: Phổ 1H NMR của hợp chất 30c

269

Hình PL112: Phổ 13C NMR của hợp chất 30c

270

Hình PL113: Phổ (+) HR ESI-MS của hợp chất 30c

271

Hình PL114: Phổ 1H NMR của hợp chất 31c

272

Hình PL115: Phổ 13C NMR của hợp chất 31c

273

Hình PL116: Phổ (+) HR ESI-MS của hợp chất 31c