Luận văn cao học nuôi trồng thủy sản: Sử dụng chất chiết xuất từ cây hoàng kỳ (astragalus membranaceus) để phòng bệnh mủ gan do vi khuẩn edwardsiella ictaluri trên cá tra (pangasinodon hypophthalmus).

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN HỒNG LOAN

SỬ DỤNG CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ CÂY HOÀNG KỲ (Astragalus membranaceus) ĐỂ PHÒNG BỆNH MỦ GAN DO

VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasinodon hypophthalmus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

2010

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ts. Đặng Thị Hoàng Oanh đã giúp đỡ, động viên và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp.

Đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn.

Xin gửi lời cám ơn đến các thẩy cô của khoa Thủy sản, đặc biệt là các anh chị của

Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản về những lời khuyên quý báu và sự chỉ dẫn tận

tình trong quá trình thực hiện đề tài.

Chân thành cám ơn các bạn lớp cao học K15A và các em Trần Việt Tiên, Lê

Thượng Khởi, Nguyễn Thị Thúy Liễu, Nguyễn Trúc Phương, Nguyễn Hà Giang,

Trần Nguyễn Diễm Tú, Lê Hữu Thôi đã giúp đỡ rất nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã chia sẽ những khó khăn, giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu.

Chân thành cảm ơn !

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của cây Hoàng kỳ (Astragalus radix) trong việc phòng bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus).

Cá tra giống có trọng lượng 25 gram được bố trí các nghiệm thức (nghiệm thức 2, 4

và 6) cho ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất hoàng kỳ (0,5%) và các nghiệm thức (1, 3 và 5) cho ăn thức ăn bình thường trong 5 tuần. Nghiệm thức 3 và 4 được tiêm vắc-

xin ở tuần thứ 3. Sau 5 tuần, cá ở các nghiệm thức 2, 3, 4 và 5 được gây cảm nhiễm

vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp tiêm. Mỗi tuần thu mẫu 1 lần để xác định các

chỉ tiêu huyết học, phân tích hàm lượng lysozyme và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh. Kết quả xác định các chỉ tiêu huyết học ở tất cả các nghiệm thức cho thấy số lượng hồng cầu dao động từ 1,4x106 đến 2,02x106 và khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nghiệm thức có bổ sung hoàng kỳ và nghiệm thức cho ăn thức ăn bình thường. Tổng bạch cầu, tế bào lympho, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân tăng đều qua

5 tuần. Tuy nhiên sau khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri thì số lượng hồng

cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu đều giảm ở các nghiệm thức nhưng bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính lại tăng. Số lượng các chỉ tiêu huyết học của cá

cảm nhiễm có bổ sung hoàng kỳ đều cao hơn cá cho ăn thức ăn bình thường và khác

biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Kết quả phân tích hàm lượng lysozyme trong huyết thanh cá sau 5 tuần dao động từ 26,43 ±1,21 µg/ml đến 29,65 ±1,16 µg/ml và

khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) giữa nghiệm thức 3, 4 so với nghiệm thức 1, 2. Sau

khi gây cảm nhiễm thì hàm lượng lysozyme ở các nghiệm thức đều giảm tuy nhiên chỉ có nghiệm thức 3 là cao nhất và khác biệt so với nghiệm thức 5. Khả năng diệt

khuẩn huyết thanh của cá ở nghiệm thức 2 và 3 cao hơn cá ở nghiệm thức 1 và 5,

phần trăm vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh của cá có ăn hoàng kỳ thấp hơn cá không ăn hoàng kỳ. Tỷ lệ sống của cá sau cảm nhiễm với vi khuẩn

E.ictaluri cao nhất ở nghiệm thức 4 và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với nghiệm

thức 2 và nghiệm thức 3. Kết quả trên cho thấy khi bổ sung hoàng kỳ vào khẩu phần thức ăn làm tăng cường khả năng đề kháng của cá với sự nhiễm vi khuẩn E. ictaluri.

ABSTRACT

iii

The aim of this study is to determine the influence of the extract of Hoang ky (Astragalus membranaceus) in the prevention of white patches in the striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus). Catfish of weighing 25 grams were selected for treatments, in which the treatments 2, 4, 6 applied feeding diets containing 0,5% extract of Hoang ky and the treatments 1, 3, 5 feeding normal feed within 5 weeks. The treatments 3 and 4 were vaccinated (i.p.) against E.ictaluri at the 3rd week. After 5 weeks of feeding, the injection of bacteria E.ictaluri CAF 258 with density of 5,4x104 cfu/ml was done in the treatments 2, 3, 4, 5. Samples were weekly collected to determine haematological indicators and to analyze content of lysozyme and bactericidal capacity of serum. The results of identifying hematological targets in all treatments show that the number of red blood cells (RBC) ranged from 1,4x106 to 2,02x106 and were significantly different among the treatments with diets containing Hoang ky’s extract and those with normal feed. The number of total leukocytes, lymphocyte, neutrophil and monocyte increased over 5 weeks. However, after infection with the bacteria E.ictaluri the number of the RBC, white blood cells, lymphocyte, thrombocyte decreased in the treatments, but the number of monocyte and neutrophil increased. The number of hematological targets in all fish fed with diets containing Hoang ky are higher than that in fish fed normal feed, and this difference is statistically significant (p <0,05). Results from lysozyme analysis in serum of fish after 5 weeks ranged from 26,43 ± 1,21 µg / ml to 29,65 ± 1,16 µg / ml and differed significantly different among the treatments 3,4 and the treatments 1, 2. After causing the susceptibility, content of lysozyme in all the treatments decreased but that in the treatments 3 is highest and different from the treatment 5. Bactericidal ability of serum of fish in the treatments 2 and 3 are higher than that of fish in the treatments 1 and 5. The survival of bacteria after interaction with the serum of fish fed Hoang ky is lower than those fed normal feed. The highest survival of fish after bacterial susceptibility to E.ictaluri was in treatment 4 and significantly higher than treatments of 2 and 3. The results of this study showed that feeding of Hoang ky’s extract stimulated enhance immune response of catfish and protection against E. ictaluri.

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ ......................................................................................................................... i

TÓM TẮT.............................................................................................................................. ii

MỤC LỤC ............................................................................................................................ iv

DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................... vi

DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................................... vii

CHƯƠNG 1 ........................................................................................................................... 1

ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 2 ........................................................................................................................... 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................................... 3

2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu ...................................................................................... 3

2.1.1Tổng quan về nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL...................................................................... 3

2.1.2 Tình hình dịch bệnh trên cá tra nuôi ở ĐBSCL ............................................................ 4

2.2 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi cá tra ................................................... 6

2.2.1 Hiện trạng sử dụng........................................................................................................ 6

2.2.2 Hiện trạng kháng thuốc................................................................................................. 7

2.2.3 Tồn lưu trong môi trường và sản phầm ........................................................................ 8

2.2.4 Ảnh hưởng đến sức khoẻ con người ............................................................................. 9

2.3 Sơ lược các nghiên cứu về thảo dược ............................................................................ 10

2.4 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý cây Hoàng kỳ ............................................... 15

CHƯƠNG 3 ......................................................................................................................... 17

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 17

3.1 Thời gian và địa điểm .................................................................................................... 17

3.2 Vật liệu nghiên cứu........................................................................................................ 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 17

3.3.1 Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn ........................................................................... 17 3.3.2 Thí nghiệm xác định LD50 .......................................................................................... 18 3.3.3 Thí nghiệm cho ăn thảo dược. .................................................................................... 18

3.3.4 Thí nghiệm gây cảm nhiễm sau khi cho ăn thảo dược 5 tuần..................................... 19

3.3.3 Xác định hiệu quả của chiết xuất thảo dược lên sự đề kháng bệnh mủ gan trên cá tra qua các chỉ tiêu. ................................................................................................................... 19

3.4 Quản lý hệ thống thí nghiệm.......................................................................................... 21

3.5 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................................ 22

CHƯƠNG 4 ......................................................................................................................... 23

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................................. 23

4.1 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra........ 23

4.1.1 Hồng cầu ..................................................................................................................... 23

4.1.2 Bạch cầu...................................................................................................................... 24

4.2 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. .................................................................................................. 30

4.2.1 Hồng cầu ..................................................................................................................... 30

4.2.1 Bạch cầu...................................................................................................................... 31

4.3 Lysozyme....................................................................................................................... 33

4.3.1 Hàm lượng lysozyme trước cảm nhiễm...................................................................... 34

4.3.2 Hàm lượng lysozyme sau cảm nhiễm ......................................................................... 35

4.4 Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ............................................................................ 37

4.5 Ảnh hưởng của chiết xuất hoàng kỳ lên sự nhiễm bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri…. ............................................................................................................................. 39

CHƯƠNG 5 ......................................................................................................................... 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................................ 42

5.1 Kết luận.......................................................................................................................... 42

5.2 Đề xuất........................................................................................................................... 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 43

PHỤ LỤC A......................................................................................................................... 52

PHỤ LỤC B......................................................................................................................... 54

PHỤ LỤC C......................................................................................................................... 55

PHỤ LỤC D......................................................................................................................... 56

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.2: Khả năng ảnh hưởng của thuốc và hóa chất dùng trong NTTS đến sức khỏe con người (Kimbrell et al., 2005). .............................................................................................. 10

Bảng 4.2 Số lượng hồng cầu trước và sau cảm nhiễm......................................................... 30

Bảng 4.2 Số lượng các loại bạch cầu sau cảm nhiễm .......................................................... 33 Bảng 4.5 LD50 của vi khuẩn E. ictaluri thí nghiệm ............................................................ 39

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Diễn biến diện tích và sản lượng cá tra ở vùng ĐBSCL giai đoạn 1997-2008 và quy hoạch đến năm 2020 ...................................................................................................... 3

Hình 2.4: Rễ và thân cây Hoàng kỳ. ................................................................................... 15

Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lượng hồng cầu của các nghiệm thức thí nghiệm sau 5 tuần. 23

Hình 4.2 Bạch cầu đơn nhân (A), tiểu cầu (B), bạch cầu trung tính (C), tế bào lympho (D) và tế bào hồng cầu (E) (100X)............................................................................................. 25

Hình 4.3 Biểu đồ số lượng tổng bạch cầu ở cá tra sau 5 tuần.............................................. 27

Hình 4.4 Số lượng tế bào lympho sau 5 tuần....................................................................... 27

Hình 4.5 Số lượng tế bào bạch cầu đơn nhân sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ........................ 28

Hình 4.6 Số lượng tế bào bạch cầu trung tính sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ.. ..................... 28

Hình 4.7 Số lượng tế bào Tiểu cầu sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ.. ...................................... 29

Hình 4.8 Đồ thị nồng độ lysozyme chuẩn ........................................................................... 34

Hình 4.9 Hàm lượng lysozyme trung bình của các nghiệm thức sau 5 tuần cho ăn Hoàng kỳ. .. ..................................................................................................................................... 35

Hình 4.10 Hàm lượng lysozyme trung bình của các nghiệm thức sau cảm nhiễm với vi khuẩn E.ictaluri.. ................................................................................................................. 36

Hình 4.11 Phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá trước cảm nhiễm. ................................................................................................................ 37

Hình 4.12 Phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá sau cảm nhiễm............................................................................................................................ 38

Hình 4.13 Cá tra thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. (mũi tên chỉ đốm trắng trên gan, thận, tỳ tạng) ................................................................................................................ 40

Hình 4.14 Tỷ lệ chết cá chết tích lũy sau khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E.ictaluri.. ............ 41

vii

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu

Trong những năm gần đây phong trào nuôi cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) xuất khẩu ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) gia tăng đáng kể.

Thế nhưng, do phát triển quá nhanh không theo quy hoạch nên dịch bệnh trên cá tra nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều. Theo Phạm Đình Khôi (2009) trong vòng 5

năm qua, môi trường ô nhiễm và dịch bệnh đã làm tỷ lệ sống trung bình của cá nuôi

giảm từ 90% xuống còn 80%. Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan và ctv. (2006) thì tần suất xuất hiện bệnh ở các tỉnh ĐBSCL là đốm trắng trên gan, thận: 52,80%;

xuất huyết: 42,50%; phù đầu, phù mắt: 20,70% và vàng da: 21,60%. Trong đó bệnh

đốm trắng xuất hiện trên nội tạng đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi.

Theo nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv. (2004) thì bệnh đốm trắng trên

gan cá tra là do vi khuẩn Edwardsilla ictaluri gây ra, thường xuất hiện vào mùa lũ,

cao điểm là tháng 7 và tháng 8. Ngoài ra qua kết quả khảo sát của (Nguyễn Chính,

2005) cho rằng bệnh đốm trắng trên gan thân gây tỉ lệ hao hụt cao ở cá hương giống (10-90%) tổng số cá nuôi, mức độ thiệt hại có thể lên đến 60-80%. Khi dich bệnh

xảy ra, để hạn chế thiệt hại người nuôi đã sử dụng thuốc kháng sinh để trị bệnh từ

đó dẫn đến hiện tượng kháng thuốc. Vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra đã kháng với một số loại thuốc kháng sinh như oxytetracyline, oxolinic acid, sulfonamide (Từ

Thanh Dung và ctv, 2004), hầu hết tất cả các chủng E. ictaluri biểu hiện tính đề

kháng và đa kháng với các loại kháng sinh thường sử dụng trong điều trị bệnh (Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007). Kết quả nghiên cứu gần đây nhất của Nguyễn

Thiện Nam (2010) cho thấy đa số các chủng vi khuẩn E. ictaluri đã kháng với nhiều

loại kháng sinh như: streptomycin, chloramphenicol (95%), florfenicol, enrofloxacin (77,5%), doxycyline (67,5%). Bên cạnh đó nghiên cứu cũng xác định 97,5% chủng

vi khuẩn E. ictaluri biểu hiện sự đa kháng thuốc (kháng ít nhất 3 loại kháng sinh) và

khả năng chuyển gen kháng tetracyline của vi khuẩn E. ictaluri cho vi khuẩn E.coli RC 85 với tần số tiếp hợp trung bình là 2,54x106.

Hiện nay, việc phòng trị bệnh cá tra chủ yếu vẫn phụ thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và hóa chất. Điều này khiến cho việc nuôi và xuất khẩu cá tra của Việt Nam gặp nhiều khó khăn do danh mục các loại thuốc và hóa chất cấm sử dụng trong

nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng. Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển các phương

pháp phòng trị bệnh có hiệu quả như sử dụng các loại thảo dược, chất tách chiết từ

thảo dược và Vắc-xin là rất cần thiết nhằm đảm bảo cho sự phát triển bền vững của nghề (Phạm Văn Thư, 2006).

Sử dụng thảo dược và các chất chiết từ thảo dược để phòng trị bệnh trên cá đã

được nghiên cứu ở nhiều loài cá có vẩy và cá trơn như cá rô phi (Yin et al., 2006, Ardó et al., 2008), cá chép (Yin et al., 2008), cá nheo mỹ (Zheng et al., 2009) tuy

nhiên trên cá tra thì chưa có nhiều nghiên cứu đề cập đến. Chính vì sử dụng thảo

dược và các chất chiết từ thảo dược trong phòng bệnh cá là một xu hướng mới có

nhiều triển vọng phát triển trong thời gian tới nên đề tài “ Sử dụng chất chiết xuất

từ cây Hoàng Kỳ (Astragalus membranaceus) để phòng bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được

thực hiện.

Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu của đề tài nhằm tìm hiểu khả năng sử dụng chiết xuất từ cây Hoàng

Kỳ (Astragalus radix) để phòng bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri gây ra ở cho cá

tra nuôi thâm canh nhằm từng bước thay thế kháng sinh trong việc phòng bệnh này.

Nội dung của đề tài

1. Xác định ảnh hưởng của chiết xuất Hoàng kỳ lên các chỉ tiêu huyết học và miễn

dịch của cá tra.

2. Xác định ảnh hưởng của chiết xuất Hoàng kỳ lên sự nhiễm mầm bệnh vi khuẩn

E. ictaluri ở cá tra.

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu

2.1.1Tổng quan về nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL ĐBSCL có một mạng lưới kênh rạch chằng chịt bao gồm các hệ thống sông rạch tự

nhiên và các kênh mương nhân tạo với tổng chiều dài trên 5.000 km với nhiều kích thước khác biệt nhau (Lê Anh Tuấn, 2009). ĐBSCL có hai mặt giáp biển Đông và vịnh Thái Lan dài hơn 600 km, mỗi năm vùng đất này nhận hơn 450 tỷ m3 tổng lượng nước từ sông Mêkông. Cùng với hệ thống sông Tiền và sông Hậu là điều kiện thuận lợi để phát triển nuôi trong thủy sản nước ngọt (Lê Anh Tuấn, 2008), trong đó cá tra là đối tượng nuôi phổ biến mang tính truyền thống từ các hình thức nuôi như

tận dụng ao hầm, mương vườn và nguồn thức ăn sẵn có, đến cuối thập niên 90, khi

nghề nuôi cá tra đã có những bước tiến vượt bậc sau sự thành công trong việc sản xuất nhân tạo loài cá này (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Kết hợp với điều kiện tự

nhiên thuận lợi, áp dụng những kỹ thuật nuôi thích hợp và sự phát triển của thị

trường quốc tế đã thúc đẩy cho việc mở rộng diện tích nuôi cá tra ở ĐBSCL. Năm 2003 diện tích nuôi cá tra của ĐBSCL là 2.792 ha đến 2007 lên tới 5.429 ha; tốc độ

tăng trưởng bình quân là 18,1%/năm. Năm 2008 Cần Thơ là địa phương có diện tích

nuôi cá tra cao nhất trong vùng (1.569 ha, chiếm 29%); kế đến là An Giang (1.393 ha, chiếm 25,7%); Đồng Tháp (1.272 ha, chiếm 23,4%) (Hình 2.1) (Dương Công

Hình 2.1 Diễn biến diện tích và sản lượng cá tra ở vùng ĐBSCL giai đoạn 1997-2008 và quy hoạch đến năm 2020 (Nguồn: Dương Công Chinh và Đồng An Thụy. 2009)

Chinh và Đồng An Thụy. 2009)

Hiện nay, khi nghề nuôi cá tra và ba sa phát triển đã kéo theo sự gia tăng về diện

tích và sản lượng, do đó mật độ nuôi cũng được nâng lên với thời gian nuôi là 6

tháng thì năng suất trung bình đạt 300-400 tấn/ha/vụ, có hộ đạt đến 700 tấn/ha/vụ. Theo báo cáo của Bộ NN & PTNT (2010) thì diện tích nuôi trồng thủy sản 10 tháng

đầu năm 2010 đạt 1,1 triệu ha bằng 103% cùng kỳ năm 2009; sản lượng nuôi ước

đạt 2,15 triệu tấn, tăng 8% so cùng kỳ năm 2009.

2.1.2 Tình hình dịch bệnh trên cá tra nuôi ở ĐBSCL Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá tra phát triển rất mạnh ở ĐBSCL, phổ biến

ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ ...từ hình thức nuôi bè nay đã chuyển

sang nuôi thâm canh trong ao đất (Trần Thị Minh Tâm và ctv. 2003), đồng thời qui mô nuôi cũng thay đổi theo hướng tập trung hơn (Nguyễn Phú Son, 2007). Việc

thâm canh hóa nghề nuôi cá tra nhằm đáp ứng nhu cầu xuất khẩu đã dẫn đến tình

trạng phát triển một cách tự phát không theo qui hoạch làm môi trường nước ngày càng ô nhiễm, là điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh phát triển, không những gây ảnh

hưởng đến nghề nuôi mà còn gây thiệt hại lớn về kinh tế - xã hội.

2.1.2.1 Bệnh do vi khuẩn và ký sinh trùng Tình hình dịch bệnh trên cá tra nuôi diễn biến khá phức tạp và có chiều hướng gia

tăng, trong đó bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại rất lớn cho nghề nuôi. Qua khảo sát

của Châu Hồng Thúy (2008) các bệnh thường gặp do vi khuẩn trên cá tra nuôi ở Trà Vinh là: mủ gan, xuất huyết, trắng gan trắng mang, phù đầu lồi mắt, khảo sát này

phù hợp với các nghiên cứu của Nguyễn Chính (2005) và Trần Anh Dũng (2005)

trên cá tra nuôi thâm canh ở An Giang.

Dịch bệnh trên cá tra nuôi xảy ra quanh năm, thời điểm bệnh bùng phát nhiều

nhất là lúc giao mùa do sự thay đổi đột ngột của thời tiết, nhiệt độ, đặc biệt là giai

đoạn nước rút, ngoài ra bệnh còn xuất hiện theo loại hình nuôi với tác nhân là ký sinh trùng (trùng bánh xe, sán lá mang, Myxobolus) và nấm (Bùi Quang Tề, 2001;

Trần Thị Minh Tâm và ctv, 2003; Trần Anh Dũng, 2005). Vào mùa khô (từ tháng 11

đến tháng 4 năm sau) thì 68,3% hộ nuôi ghi nhận là do sán lá gan, trong khi mùa mưa (từ tháng 4 đến tháng 11) 73% hộ nuôi ghi nhận là do trùng bánh xe và sán lá

mang, nhưng khi lũ rút thì đa số là do trùng bánh xe có 85,4% hộ nuôi ghi nhận.

Ngoài ra bệnh trên cá tra nuôi còn tùy thuộc vào giai đoạn nuôi. Qua khảo sát

các tác nhân gây bệnh trên cá tra nuôi thâm canh ở An Giang cho thấy cá tra giống rất mẫn cảm với ký sinh trùng, đặc biệt là trùng bánh xe và chủ yếu gây hại ở giai

đoạn này. Tuy nhiên đến giai đoạn cá thịt thì tỉ lệ tác nhân gây bệnh do sán lá mang

là 68,3% hộ nuôi ghi nhận được đối với loại hình nuôi ao, loại hình nuôi bè là

73,9% và cao nhất là 88% đối với loại hình nuôi đăng quầng. Từ đó cho thấy cá tra nuôi thâm canh rất mẫn cảm với bệnh do sán lá mang và thuộc nhóm khó trị (Trần

Anh Dũng, 2005).

2.1.2.2 Tinh hình bệnh mủ gan ở ĐBSCL. Có thể nói nghiên cứu công bố sớm nhất về bệnh mủ gan (đốm trắng) trên cá tra ở

Việt Nam thuộc về Trần Thị Minh Tâm và ctv. (2003) nhưng xác định tác nhân là

do 2 loài vi khuẩn Hafnia avlei và Plesiomonas shigelloides gây ra, ngoài ra từ các

nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv. (2004) và Nguyễn Quốc Thịnh và ctv. (2004) đã xác định bệnh mủ gan trên cá tra là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.

Tuy nhiên trong giới khoa học về bệnh thủy sản vẫn còn nhiều tranh cải về tác nhân

gây bệnh mủ gan trên cá. Theo kết quả nghiên cứu của Lý Thị Thanh Loan và ctv. (2006) thì vi khuẩn gây bệnh mủ gan là do vi khuẩn Clostridium sp. Đến năm 2008,

tại Hội thảo cá da trơn Châu Á tổ chức tại Cần Thơ, các tác giả (Truong Thi Ho et

al., 2008; Crumlish et al., 2008; Khoi et al., 2008, Tu Thanh Dung et al. 2008) đều khẳng định tác nhân gây bệnh mủ gan ở ĐBSCL, Việt Nam là do E. ictaluri. Nồng độ gây chết (LD50) của vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh mủ gan trên các trang trại nuôi cá tra thâm canh được xác định là 105,17 CFU/ml (Đang Thi Hoang Oanh and Nguyen Thanh Phuong, 2008) và có thể sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện vi

khuẩn E. ictaluri trên cá tra (Đang Thi Hoang Oanh and Nguyen Truc Phuong,

2008).

Theo Từ Thanh Dung (2004) thì bệnh mủ gan trên cá tra xuất hiện từ cuối năm

1998 và trở nên trầm trọng vào năm 1999 ở ĐBSCL, bệnh thường xuất hiện vào

mùa mưa lũ và bộc phát cao nhất vào tháng 7 và 8. Bệnh mủ gan xuất hiện và gây thiệt hại chủ yếu ở giai đoạn cá con (cá giống và cá thịt), tỉ lệ hao hụt lên đến 90%

(Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003). Ngoài ra qua kết quả điều tra của Trần Anh

Dũng (2005) tại các hộ nuôi cá tra ao ở An Giang thì bệnh mủ gan xuất hiện nhiều vào thời gian lũ về với tỉ lệ 87,8%, còn thời điểm lũ rút thì bệnh xuất huyết lại xuất

hiện cao nhất với tỉ lệ 85,4% và bệnh vàng da là 78,1%. Đối với loại hình nuôi bè

thì bệnh mủ gan xuất hiện cao nhất vào mùa mưa với tỉ lệ hộ nuôi ghi nhận là

86,9%.

Tình hình bệnh trên cá tra khá phức tạp, qua khảo sát ở các hộ nuôi cá tra bè

tại Đồng Tháp, có 16 loại bệnh xuất hiện, trong đó bệnh phù đầu có tần suất xuất

hiện nhiều nhất chiếm (60%), kế đến là bệnh gan thận có mủ chiếm tỷ lệ (40,7%) vào thời điểm 2004. Đến năm 2006 tình hình bệnh có một số thay đổi so với 2004,

cụ thể bệnh ký sinh trùng và bệnh vàng da xuất hiện ở hầu hết các hộ nuôi nhưng

bệnh phù đầu, mủ gan lại xuất hiện với tỉ lệ rất thấp (21,4% và 3,6%) (Nguyễn Quốc Thịnh, 2006).

2.2 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi cá tra

2.2.1 Hiện trạng sử dụng Nuôi trồng thủy sản hiện nay đang phát triển mạnh trên nhiều khía cạnh cả về diện

tích, mức độ thâm canh, loại hình nuôi đến đầu tư cơ sở hạ tầng và chế biến sau thu hoạch. Vì thế việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản có một đóng

góp không nhỏ trong sự phát triển của ngành. Từ đó việc sản xuất, kinh doanh thuốc

kháng sinh ngày càng thu hút nhiều công ty ra đời và thường xuyên tung ra các sản phẩm mới nhằm đáp ứng nhu cầu của người nuôi về giá thành, tính đa dạng của sản

phẩm (Nguyễn Hữu Đức, 2007). Qua kết quả điều tra tình hình sử dụng thuốc, hóa

chất và chế phẩm sinh học (CPSH) trong NTTS của Mai Văn Tài và ctv (2004) cho thấy có ít nhất 373 loại hóa chất và CPSH được sử dụng trong NTTS, trong đó có 14

loại hóa chất xử lý đất và nước, 6 chất gây màu nước, 86 hóa chất khử trùng và diệt tạp, 138 kháng sinh, 47 loại CPSH, 13 loại vitamin, 57 loại thức ăn bổ sung, 10 loại hoocmon, 5 loại không xác định. Đối với nuôi cá ao nước ngọt có 67 loại (trong đó

31 loại là kháng sinh), sản xuất cá giống nước ngọt có 85 loại (trong đó 37 loại là

kháng sinh).

Kháng sinh là nhóm có số lượng sản phẩm kinh doanh đứng thứ nhì với mục

đích chủ yếu là trị bệnh, ngoài ra còn sử dụng để phòng bệnh bằng cách trộn vào

thức ăn (Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003) đồng thời kích thích tăng trưởng (Nguyễn Chính 2005). Chi phí cho sử dụng thuốc trong nuôi cá tra công nghiệp

tương đối cao và đứng hàng thứ ba sau chi phí thức ăn và con giống. Thị trường các

loại thuốc trị bệnh cho cá hiện nay rất phong phú và đa dạng về số lượng và chủng loại (Nguyễn Quốc Thịnh, 2006).

Tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra ở An Giang và Cần Thơ

cho thấy nhóm quinolone và sulfonamide có nhiều hoạt chất được sử dụng, cao nhất

là 6 chất, kế đến là nhóm aminoside 4 chất, tetra 3 chất. Về tần suất xuất hiện trong

113 sản phẩm khảo sát thì nhóm quinolone chiếm nhiều nhất là 43 sản phẩm, kế đến

là nhóm colistin 32 sản phẩm (thường dùng kết hợp với các nhóm khác), oxytetracylin 17 sản phẩm, ampiciline 15 sản phẩm, flumequine và trimethoprim 12

sản phẩm (Nguyễn Chính, 2005).

Tại Sóc Trăng và Bạc Liêu cho thấy có 74 loại thuốc và hóa chất trong đó có 19 loại kháng sinh, có 20 loại thuốc và hóa chất dùng diệt tạp và tẩy trùng, 10 loại

hóa chất dùng xử lý đất và nước; 10 loại men vi sinh; và một số loại thuốc và hóa

chất khác như phân bón, sản phẩm dùng tăng cường hệ miễn dịch bổ sung vào thức

ăn. Kháng sinh trên thị trường thường ở dạng kháng sinh đơn lẻ chủ yếu là nhóm fluoroquinolones. Trong đó 42,9% số hộ điều tra sử dụng enrofloxacin và 25% số

hộ điều tra sử dụng norfloxacin. Ngoài ra, sulfamethoxazol, cortrimoxazol,

aminosid, colistin và trimethoprim cũng được sử dụng nhưng chiếm tỉ lệ thấp (Huỳnh Thị Tú và ctv, 2006).

2.2.2 Hiện trạng kháng thuốc Mặc dù thuốc kháng sinh đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại nhiều bệnh tật cho con người và các loài động vật thuỷ sinh, nhưng do việc sử dụng

không đúng cách và sử dụng quá nhiều các loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra hiện

tượng vi khuẩn kháng thuốc và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong thịt thủy sản. Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh là khả năng mà một sinh vật có thể chịu

được tác động của các loại kháng sinh. Các gen kháng thuốc thường có sẵn trong

các loài vi sinh vật tạo ra kháng sinh nhằm bảo vệ chúng khỏi tác động của thuốc kháng sinh này. Những gen này có thể được hình thành trong các loài vi khuẩn khác

thông qua sự trao đổi gen với một vi khuẩn tạo ra kháng sinh, do vậy chúng có khả

năng tạo ra cơ chế làm trung hoà hoặc phá huỷ các loại thuốc kháng sinh (Bùi Quang Tề và ctv., 2006).

Qua nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Nam Kha và ctv (2005) cho thấy

trimethorime/sulfamethoxazole, chloramphenicol,

sulfamidea, oxytetracyline, ampiciline và streptomycine là những kháng sinh thường dùng trong cá nuôi ở trang

trại của Việt Nam với tỷ lệ vi khuẩn kháng lên đến 90% và thể hiện tính đa kháng là

34% (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2005). Đặc biệt với kháng sinh cấm chloramphenicol

(Bộ thủy sản, 2002) tỷ lệ kháng rất cao (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2004), bên

cạnh đó còn thể hiện tính đa kháng. Trong 101 vi khuẩn phân lập đều thể hiện tính

đa kháng với ít nhất 4 loại kháng sinh, đa số (80%) là kháng với 6 loại kháng sinh.

Qua phân lập và khảo sát đặc điểm kháng kháng sinh của vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra nuôi thâm canh ở một số tỉnh ĐBSCL cho thấy tỷ lệ

chủng kháng florfenicol tại Vĩnh Long cao nhất là 45%, kế đến là An Giang 30%,

thấp nhất là Cần Thơ 5% trong tổng số 20 chủng kháng florfenicol được khảo sát tại 4 tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long, An Giang, Bến Tre.

Theo Crumlish et al. (2008) vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bị bệnh từ

các trại nuôi từ 2002 đến 2008, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về loài vi

khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên sự kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng phát hiện nhiều. Theo Stock and Bernd (2001) cho rằng tất cả các chủng E.ictaluri thì nhạy cảm với

các kháng sinh: tetracyclines, aminoglycosides, ß-lactam, quinolones, antifolates,

chloramphenicol, nitrofurantoin and fosfomycin, ngoài ra chúng còn thể hiện tính đề kháng với macrolides, lincosamides, streptogramins, glycopeptides, rifampin and

fusidic acid.

2.2.3 Tồn lưu trong môi trường và sản phầm Xu hướng hiện nay trong việc phát triển nghề nuôi cá tra là thâm canh hóa để gia

tăng năng suất và sản lượng. Tuy nhiên, thâm canh đã gây ảnh hưởng xấu đến môi

trường nước và làm giảm chất lượng sản phẩm mà tác nhân chính là do hậu quả của việc sử dụng hóa chất, kháng sinh không đúng cách, đồng thời tạo hệ vi sinh vật

gây bệnh cho người và vật nuôi. Ngoài ra dư lượng hóa chất kháng sinh không đáp

ứng được yêu cầu bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng trong nước cũng như qui định của các nước nhập khẩu. Do đó nhiều lô thủy sản xuất khẩu đã bị từ chối hoặc tiêu

hủy do phát hiện nhiễm dư lượng hóa chất kháng sinh cấm như: chloramphenicol,

nitrofuran, malachite green,...thiệt hại ước tính hàng triệu USD (Lê Thị Huệ, 2006). Vấn đề tồn lưu kháng sinh, hóa chất trong cá thương phẩm trong các trại nuôi cá tra

thâm canh ở An Giang và Cần Thơ năm 2005 cho thấy các chỉ tiêu như:

chloramphenicol, nitrofuran và nhóm tetracycline đều không phát hiện, nhưng nhóm sulfonamid thì có 8 mẫu (12,5%), nhóm quinolone có 3 mẫu (4,67%) dưới mức giới

hạn cho phép theo quyết định 07/2005 của Bộ Thủy sản. Tuy nhiên, malachite green

là chất bị cấm sử dụng nhưng lại hiện diện với tỉ lệ 10/64 mẫu (chiếm 15,6%).

Qua đánh giá ảnh hưởng của malachite green (MG) lên sinh lý, sinh hóa và tồn lưu trên cá tra cho thấy sau 6 giờ cá bị gây nhiễm MG ở các nồng độ (0,1 ppm; 0,15

ppm và 0,2 ppm) thì hàm lượng MG và Leucomalachite green (LMG) tồn tại trong

cơ và da cá rất cao (trung bình từ 39,8 đến 73,5 ppb) chiếm 40% so với nồng độ gây

nhiễm ban đầu, nhưng sau 72 giờ gây nhiễm thì hàm lượng MG và (LMG) trong cơ và da cá giảm nhanh đạt giá trị khoảng 10-25% hàm lượng tồn lưu ở lần thu mẫu 6

giờ. Tuy nhiên, khả năng chuyển hóa và đào thải của MG thì khác nhau tùy theo

từng loài cá và môi trường sống. Ở cá, hơn 80% MG bị hấp thu và chuyển hóa thành LMG, ngoài ra MG có thể tồn tại trong môi trường nước khoảng 80 ngày, nó

còn ảnh hưởng đến các sinh vật trong nước như: tảo, nguyên sinh động vật (Lương

Thị Diễm Trang, 2009).

2.2.4 Ảnh hưởng đến sức khoẻ con người Việc sử dụng thuốc và hóa chất trong NTTS công nghiệp như là thuốc kháng sinh,

thuốc diệt nấm, chất gây màu nước và hormone với tỉ lệ ngày càng tăng trong các

trại đã ảnh hưởng đến sức khỏe con người, tính an toàn của thực phẩm (Lương Đức Phẩm, 2001) và lưu tồn với số lượng lớn. Kết quả điều tra nghiên cứu của Kimbrell

and Letterman (2005) cho thấy khả năng ảnh hưởng của thuốc và hóa chất dùng

trong NTTS đến sức khỏe con người được trình bày ở bảng (2.2).

Theo Bùi Quang Tề và ctv. (2006a) cho thấy một vài hậu quả cụ thể gây ra từ

kháng sinh như: Chloramphenicol gây chứng máu chậm đông, thiếu máu do làm

giảm sự hấp thu và vận chuyển sắt (Lương Đức Phẩm, 2001). Neomyxin kìm hãm sự hoạt hóa disaccharidaza của ruột, tao nên tác động phụ làm rối loạn hô hấp,

Streptomyxin và các aminoglycosid đã làm liệt hô hấp và làm liệt các cơ khác do nó

làm giảm sự dẫn truyền kích thích thần kinh, các aminoglycosid lại làm kéo dài thời gian tái hóa vôi, do đó gây độc cho gan, ngoài ra một số kháng sinh còn gây dị ứng

cho cơ thể. Chính vì những hạn chế trên mà các nhà khoa học đã đưa ra một bản dự

thảo về một số kháng sinh, hóa dược, chế phẩm sinh học dự định được thay thế kháng sinh cấm sử dụng trong NTTS nhằm làm giảm những tác hại không mong

muốn gây ra cho con người.

Đối với các kháng sinh như erythromycin, rifampin được dùng để thay thế cho kháng sinh chloramphenicol, nitrofuran, furazon. Kháng sinh bactrim và

doxycycline thì thay cho chloramphenicol, nitrofuran, furazon và metrodidazole.

Kháng sinh chlortetracyclin dùng thay cho kháng sinh cấm hiện nay là

chloramphenicol và nitrofuran. Bên cạnh đó còn có một số hóa dược như MS-222 thay thế cho kháng sinh chloroform và chlorpromazine trong điều trị. Ngoài ra còn

có nhóm thuốc sát khuẩn như tricloisocyanuric acid (TCCA), BKC, chlorine, dung

dịch anolyte, iodine, formalin và KMnO4 thì dùng để thay thế các chất khử trùng có

độc lực cao. Quan trọng hơn là việc dùng chế phẩm sinh học như các vi sinh vật hữu ích, men vi sinh, chiết xuất của thực vật (trừ Aristolochia spp), β Glucan, Vắc-xin

vô hoạt, Bacterin giải độc tố, kháng thể và vitamin các loại để thay thế các loại

kháng sinh cấm. Bảng 2.2: Khả năng ảnh hưởng của thuốc và hóa chất dùng trong NTTS đến sức khỏe con người (Kimbrell and Letterman, 2005).

STT

Ví dụ

Loài bị nhiễm

Khả năng nguy hiểm

Thuốc và hóa chất

Kháng sinh

Oxytetracycline,

Chloramphenicol, Sulfadimethoxine-

Tôm, Cá da trơn, Cá Hồi

Phát triển vi khuẩn kháng thuốc và tồn lưu trong máu

ormethoprim, Amoxicillin

trihydrate, Nitrofurans

Cá Hồi

Astaxanthin, Canthaxanthin

Có vấn đề đến tính hiếu động của trẻ em và mắt.

Cá Hồi

Chất gây ung thư

PCBs, PBDEs Dioxins

Malachite green

Chất gây ung thư

Growth hormones,

Gây dị ứng, gây độc, gây ảnh hưởng ngoài dự kiến.

antifreeze protein Bovine growth

Thuốc gây màu Chất gây ô nhiễm môi trường Thuốc diệt nấm Biến đổi gen ở cá Hormone

Có liên quan đến ung thư

hormone (rBGH)

Cá Hồi và cá da trơn Cá Hồi, Hàu, 2 mảnh vỏ Hai mảnh vỏ (sò, nghêu)

2.3 Sơ lược các nghiên cứu về thảo dược

Trong lịch sử y học cổ truyền Việt Nam vấn đề nghiên cứu về cây thuốc để trị bệnh

cho người và động vật đã có từ thế kỷ 17 do Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh với hai tác

phẩm “ Nam dược thần hiệu” mô tả 580 vị thuốc trong 3.873 bài thuốc dân gian và

“Hồng nghĩa gia thủ thư” tóm tắt về 680 vị thuốc. Sau đó lương y Lê Hữu Trác tức

Hải Thượng Lãn Ông (1720-1791) là tác giả của 30 tập sách về y học cổ truyền Việt

Nam. Sau cách mạng Tháng Tám năm 1945. Đỗ Tất Lợi, đã nghiên cứu và biên soạn cuốn sách “Medicinal Plants and Drugs from Vietnam” dày hơn 1.200 trang về

cây thuốc, động vật và khoáng vật làm thuốc ở Việt Nam (Đỗ Tất Lợi Và Nguyễn

Xuân Dũng, 1991). Từ đó cho thấy tầm quan trọng của thảo dược trong phòng trị bệnh ở người và động vật và đã được nghiên cứu từ rất lâu.

Đối với NTTS việc sử dụng các hoạt chất có nguồn gốc thực vật trong việc

phòng bệnh đã được người dân áp dụng từ rất lâu theo kinh nghiệm. Một số thảo

mộc có hoạt chất sinh học có thể sử dụng trong NTTS như: Hành (Allium fistulosum), tỏi (Allium sativum L.) có chất alixin có tác dụng kháng khuẩn mạnh

(Đỗ Tất Lợi, 2004; Bùi Quang Tề và ctv. 2006a), hẹ (Allium odorum L.) có chất

odorin có tác dụng ức chế vi trùng Staphyllo coccus aureus và Bacillus coli và một số cây dùng trong diệt tạp như dây thuốc cá (Derris elliptica) có chất rotenone, có

nhiều trong rễ cây, cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia Burm) trong toàn bộ cây có

chứa cosmosilin, taraxerol, tirucallol và myrixylacohol có tác dụng ức chế sinh sản của nhiều loài vi trùng (Đỗ Tất Lợi, 2004; Phan Xuân Thanh và ctv, 2003).

Ngày nay trong NTTS đã có những nghiên cứu bàn về tiềm năng sử dụng

kháng sinh thảo mộc trong việc phòng và chữa trị bệnh nhiễm khuẩn mà tác giả Nguyễn Thị Vân Thái và ctv. (2006) đã đề cập. Trong đó các chất như: alixin trong

tỏi (Bùi Quang Tề, 2006a), odorin trong hẹ, brazilin và sappanin trong tô mộc... đã

được sử dụng để trị các bệnh về viêm nhiễm. Bên cạnh đó các chất chiết từ nấm linh chi, hoàng kỳ, sài đất, nhọ nồi, tỏi, kim ngân, lá ổi, gừng và cỏ mực... đã được

nghiên cứu sử dụng trong phòng trị bệnh trên động vật thủy sản (Bùi Quang Tề và

ctv. 2006a; Ardó et al., 2008; Yin et al., 2006). Ngoài ra còn nêu những nguyên tắc và phương pháp sưu tầm chất kháng khuẩn dùng trong NTTS như: Chọn những thực

vật có tính đối kháng với vi khuẩn dựa vào kinh nghiệm dân gian. Thử hoạt tính

kháng khuẩn một cách hệ thống theo từng họ thực vật, thông qua đó mà chọn ra những cây có tác dụng tốt nhất. Dügenci et al. (2003) cho rằng một vài cây thuốc

như: gừng (Zingiber officinale), cây tầm ma (Viscum album), cây tầm gửi (Urtica

dioica) khi bổ sung vào trong thức ăn tạo chất kích thích miễn dịch cho cá giúp ngăn

ngừa một số bệnh như virus, vi khuẩn và nấm.

Theo Yin et al. 2008 khi nuôi cá chép kết hợp tiêm vắc-xin và cho ăn 2 loại

thảo dược là Hoàng kỳ (Astragalus radix) và Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

làm kích thích hoạt động hô hấp, sự thực bào của bạch cầu trong máu. Cá chép được gây cảm nhiễm với vi khuẩn A. hydrophila có tỷ lệ sống cao. Tỷ lệ sống cao nhất

(60%) là nhóm cá có tiêm vắc-xin và được nuôi bằng cả 2 loại thảo dược, trong khi

đó hầu như 90% cá đối chứng (kiểm soát âm tính) và 60% cá chỉ được tiêm vắc-xin (kiểm soát dương tính) đã chết.

Trên tôm sú (8 g) bị nhiễm đốm trắng, Citarasu et al. (2006) cho rằng chiết

chất Methanolic từ Cỏ gà (Cyanodon dactylon), Aegle marmelos, Dây ký ninh

(Tinospora cordifolia), Picrorhiza kurooa và Cỏ mực (Eclipta alba) có tác dụng nâng cao tỷ lệ sống. Methanolic được trộn vào thức ăn với hàm lượng 100, 200, 400

và 800 mg/kg thức ăn và được theo dõi trong 25 ngày. Kết quả đến ngày thứ 7

nghiệm thức không cho ăn Methanolic có tỷ lệ sống thấp hơn so với các nghiệm thức có cho ăn Methanolic. Nghiệm thức cho ăn 800 mg Methanolic/kg thức ăn có

tỷ lệ sống 74% khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức cho ăn Methanolic còn

lại (p<0,0001). Với tôm sú bị bệnh mềm vỏ do Vibrio spp, theo Bùi Quang Tề và ctv. (2006a) phối hợp chất chiết từ tỏi (Alltium sativum) và sài đất (Weledia

calendualacea) có thể phòng trị được bệnh này. Immanuel et al. (2004) báo cáo

rằng giàu hóa Artemia bằng butanolic chiết từ thực vật (cây Thầu dầu (Ricinus communis), Diệp hạ châu (Phyllanthus niruri), Húng cay đất (Leucus aspera),

Khoai mì (Manihot esculenta)) và rong biển (Rong mơ (Ulva lactuca và Rong nâu

(Sargassum wightii)) làm tăng tỷ lệ sống của tôm he Ấn Độ (Penaeus indicus) giai đoạn giống từ 24,4 lên 43,3-58,9%, tốc độ tăng trưởng từ 1,1%/ngày lên 1,46-2,15

%/ngày và giảm nồng độ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong cơ và gan tụy từ 3,71 x105 và 3,86 x105 CFU/g xuống 1,36-2,03 x105 và 1,47-2,16x105 CFU/g.

Tại Trung Quốc, Zheng et al. (2009) chứng minh tinh dầu cây lá thơm

orengano (Origanum heracleoticum) thêm vào khẩu phần thức ăn cá Nheo bị nhiễm

Aeromonas hydrophila thì cá vẫn tăng trưởng khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (P<0,005) và chức năng gan và các cơ quan nội tạng được cải thiện (P<0,005). Hoạt

động chống oxy hóa của cá cũng tăng lên. Kết quả của Jeney et al. (2008) cho thấy

trộn thảo dược Hoàng kỳ (Astragalus radix) và Kim ngân (Lonicera japonica) vào

thức ăn có thể tăng cường hệ miễn dịch cá chép và rô phi chống lại vi khuẩn A.hydrophila. Theo Yin et al. (2006) bổ sung Hoàng kỳ (Astragalus radix) 0,1-0,5%

vào thức ăn cho cá Rô phi làm tăng lysozyme sau 1 tuần và sau 3 tuần hoạt động

thực bào của tế bào thực bào tăng nhưng không tăng hoạt động hô hấp của tế bào

thực bào. Còn Hoàng cầm (Scutellaria radix) thì không có tác dụng. Kết quả tương tự trên cá Đỏ dạ (Pseudosciaena crocea), hệ miễn dịch cá được tăng cường và tỷ lệ

sống được cải thiện khi cho cá ăn 1-1,5% hỗn hợp Hoàng kỳ (Radix astragali seu

Hedysari) và Đương quy (Radix angelicae sinensis) với tỷ lệ 5:1 (Jian and Wu, 2003). Kết quả tương tự khi Jian và Wu (2004) sử dụng 1% hỗn hợp Hoàng kỳ và

Đương quy tỷ lệ 5:1 trên cá chép.

Tại Bangladesh, Muniruzzaman và Chowdhury (2004) nghiên cứu tác dụng

của chất chiết từ 26 loài thảo dược với 3 vi khuẩn Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda và Pseudomonas fluoescens gây bệnh trên cá. Kết quả có 21 loài

thảo dược (80,76%) có tác dụng với A.hydrophila, 24 loài thảo dược (92,3%) có tác

dụng với P.fluoescens và 12 loài thảo dược (46,15%) có tác dụng với E.tarda. Trong các loài thảo dược thì tỏi (Allium satium) có tác dụng chống A.hydrophila và

P.fluoescens tốt nhất và lá cây Bồng bồng (Calotropis gigantea) diệt vi khuẩn

E.tarda tốt nhất.

Tại Thổ Nhĩ Kỳ, Dügenci et al. (2003) sử dụng chất chiết từ cây Tầm gửi

(Viscum album), cây Tầm ma (Urtica dioica), và cây Gừng (Zingiber ofﬁcinale) cho

cá Hồi (Oncorhynchus mykiss) ăn với khẩu phần 0,1%, 1% và 5% trọng lượng thân/ngày liên tục trong 3 tuần. Kết quả cá ăn thảo dược thì hoạt động hô hấp tăng

đáng kể (P<0,0001) so với đối chứng. Đặc biệt khẩu phần cá ăn 1% chất chiết từ cây

gừng cho kết quả tăng cường miễn dịch về hoạt động thực bào, tăng cường hô hấp của tế bào bạch cầu và tăng mức protein trong huyết tương. Trong tất cả các nồng

độ thảo dược, nồng độ 0,1% của cây gừng là không có tác dụng tăng mức protein

trong huyết tương.

Tại miền Nam Ấn Độ, Crasta et al. (1997) đã chiết Acetone và Ethanol từ 5

loài rong biển Rong nho (Caulerpa taxifolia), Rong sợi (Chaetomorpha antennina),

Cladophora fascicularis, Rong mơ (Ulva lactuca) và Rong câu (Gracilaria corticata). Kết quả C.taxifolia, C.antennina và G. corticata có khả năng chống lại vi

khuẩn Bacillus subtilis. Gracilaria corticata còn có tác dụng chống lại nấm

Candida albicans. Nhưng không có chất chiết nào có thể ức chế vi khuẩn

Pseudomonas aeurginosa, nấm Aspergillus flavus và Fusarium oxysporum.

Thí nghiệm cho cá Rô phi (Oreochromis niloticus) ăn 2 loại thảo dược Hoàng

kỳ (Astragalus membranaceus) và Kim ngân (Lonicera japonica) 0,1% trong 4

tuần. Kết quả cho thấy hệ miễn dịch của cá được tăng cường. Hoạt động đại thực bào, hô hấp của tế bào máu được tăng cường, tỷ lệ sống tăng lên (Ardó et al., 2008).

Cũng trên cá Rô phi, Pachanawan et al. (2008) chứng minh có thể sử dụng lá ổi

(Psidium guajava) để kiểm soát bệnh do Aeromonas hydrophila gây ra. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá Trê trắng (Clarias batrachus) cũng sẽ được

kiểm soát chất chiết từ Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) (Balasundaram

and Harikrishnan, 2009). Theo Bùi Quang Tề và ctv. (2006a) phối hợp chất chiết từ

tỏi và sài đất cũng có tác dụng tốt để tăng cường hệ miễn dịch cá Tra với mầm bệnh xuất huyết (do A.hydrophila) và mủ gan (do Edwardsiella tarda và Hafnia alvei)

gây ra. Theo Harikrishnan et al. (2003) ngâm cá chép đã gây cảm nhiễm A. hydrophila nồng độ 108 cfu/ml bằng lá Sầu đâu (Azadirachta indica) 1g/l trong 10 phút suốt 30 ngày để kiểm tra sự thay đổi thành phần sinh hóa. Kết quả tế bào bạch

cầu, tế bào hồng cầu, mức protein huyết thanh tăng có ý nghĩa thống kê so với cá

đối chứng. Tuy nhiên mức glucose, cholesterol và calcium trong huyết thanh giảm dần theo các lần thu mẫu. Trên cá vàng (Carassius auratus) và cá chép gây cảm

nhiễm nhân tạo bằng A.hydrophila được ăn kết hợp Probiotics (Lactobacillus sp. và

Sporolac sp.) và 3 loại thảo. Kết quả cho thấy cả probiotics và thảo dược điều có tác dụng giúp cá hồi phục tốt sau 24 ngày (Harikrishnan. R and C. Balasundaram,

2009).

Tại Việt Nam, Phan Xuân Thanh và ctv. (2003) đã đánh giá 25 loài cây (tỏi, sài đất, nghệ, bạc hà…) có hoạt chất có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm có thể

sử dụng trong phòng trị bệnh thủy sản. Kết quả nghiên cứu còn chiết được chất

kháng khuẩn 2-hydroxy 6-pentadeca-trienylbenzoat từ các loài thảo dược trên và thí nghiệm trên tôm sú nuôi, ở nồng độ chất chiết 1-3 ppm có hiệu lực trị bệnh phát

sáng, đen mang, vàng mang, đóng rong, hoại tử phụ bộ… và nồng độ 0,5-1 ppm thì

có tác dụng phòng bệnh do vi khuẩn, nấm và nguyên sinh động vật gây ra. Bùi Quang Tề (2003) đã nghiên cứu thực nghiệm khả năng chống khuẩn của các thảo

dược như tỏi, sài đất, nhọ nồi. Chất tách chiết trên với hoạt chất 10% trộn vào thức

ăn phòng được bệnh xuất huyết, đốm trắng cho cá Tra (Bùi Quang Tề, 2006a). Tỏi

có tác dụng phòng trị bệnh đường ruột cho tôm sú (Bùi Quang Tề, 2006b). Theo

Nguyễn Mạnh Hùng (2008) dịch chiết từ cây Nemm (Azdirachta indica) có thể thay

thế 50% kháng sinh trong sản xuất giống cua biển (Scylla paramamosain).

Gần đây nhất là nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu (2010). Đã sử dụng 30 loại thảo dược thường dùng trong dân gian như: Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens),

Bàng (Terminalia catappa), Ổi (Psidium guajava), Từ bi (Pluchea indica)…để thử

hoạt tính kháng khuẩn trên 3 loại vi khuẩn E.ictaluri, E.tarda và Aeromonas hydrophila cho thấy các cây thuốc này đều có khả năng kháng khuẩn (MIC=16-

2048 µg/ml). Hoạt phổ mạnh trên cả 3 loại vi khuẩn là Bàng, Ổi, Trầu không, Tràm

(MIC=64-512 µg/ml). Tác động mạnh nhất trên E.ictaluri là Sâm đại hành (MIC=16

µg/ml), E.tarda là Rau mương (MIC=32 µg/ml), Aeromonas hydrophila là Bàng (MIC=128 µg/ml).

Hình 2.4: Rễ và thân cây Hoàng kỳ. (Nguồn http://www.yhoccotruyen.htmedsoft.com/)

2.4 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý cây Hoàng kỳ

Thành phần hóa học của cây hoàng kỳ Theo Y học cổ truyền Việt Nam trong Hoàng kỳ có Cholin, Betain, nhiều loại Acid Amin và Sacarosa, Glucosa, tinh bột, chất nhầy, gôm, hơi có phản ứng Alcaloid.

Ngoài ra còn có nhiều loại Acid Amin, Protid (6,16- 9,9%), Cholin, Betain, Acid

Folic, Vitamin P, Amylase, Palmatic acid, Linoleic acid, Linolenic acid, Coriolic acid.

Theo Đỗ Tất Lợi (2004) cho rằng Hoàng kỳ (Astragalus membranaceus (Fish)

Bunge) là một cây sống lâu năm, cao 50-80 cm, rễ cái dài và mọc sâu, rất khó bẻ,

đường kính 1-3 cm, vỏ ngoài màu vàng đỏ hay nâu và là bộ phận chính dùng làm thuốc. Trong hoàng kỳ có cholin betain, nhiều axit amin và sacaroza. Cho đến nay

chúng ta vẫn phải nhập hoàng kỳ của Trung Quốc, mặc dù đã được trồng thử

nghiệm trong nước cho kết quả tốt nhưng chưa đưa vào trồng phổ biến.

Tác dụng dược lý của cây Hoàng kỳ Theo Y học cổ truyền Việt Nam cho rằng Hoàng kỳ có tác dụng làm tăng cường hệ

miễn dịch của cơ thể bằng cách làm tăng chức năng thực bào của hệ thống tế bào lưới, ngoài ra còn có khả năng làm cho tế bào tương của lách súc vật tăng sinh, thức

đẩy sự hình thành kháng thể và nâng cao tính miễn dịch thể dịch. Bên cạnh đó còn

thúc đẩy quá trình chuyển hóa trong cơ thể như chuyển hóa sinh lý tế bào bằng cách điều chỉnh cAMP và cGMP trong tế bào, thúc đẩy sự chuyển hóa protid của huyết

thanh và gan.

Theo Đỗ Tất Lợi (2004). Một số tác dụng dược lý của hoàng kỳ đã được ghi nhận: kéo dài chu kỳ động kinh của chuột bạch, tăng sự co bóp của tim, lợi tiểu, có

tác dụng như kháng sinh (đối với vi trùng lị Shiga) trong ống nghiệm.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

- Thời gian: 10/2009 – 12/2010 - Địa điểm: Khoa Thủy Sản – Đại học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu

- Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm: Kính hiển vi, cân điện tử, lame, lamelle, ống đong, ống nhỏ giọt nhựa, pipet, ống chích, khẩu trang, găng tay, bình tam giác, chai chịu nhiệt, que cấy, đèn cồn, viết lông dầu, bình xịt cồn, bộ tiểu phẩu, đĩa

petri, ống nghiệm, khay nhôm.

- Bếp khuấy gia nhiệt, tủ cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, tủ lạnh, tủ cấy, tủ ấm, nồi thanh trùng, máy chuẩn độ pH. Các chỉ tiêu pH, Nhiệt độ, Oxy được đo bằng

nhiệt kế và test kit.

- Bể thí nghiệm: nhựa 250 lít, bể composit 2 m3 - Hóa chất: NaCl, Na2SO4, Na2HPO4.2H2O, NaH2PO4.2H2O, KH2PO4, Formaline (37%), Methyl violet, nước cất, Methanol, Glycerol, dung dịch Wright&Giemsa, Acid nitric, môi trường TSA, NB, cồn đốt, cồn 700C.

- Nguồn cá tra thí nghiệm được mua từ trại cá giống ở Thành phố Cần Thơ. - Chiết xuất hoàng kỳ (40% polysaccharide) do hãng Xuancheng Baicao, Trung

Quốc sản xuất.

- Nguồn vi khuẩn E. ictaluri CAF 258 từ bộ sưu tập vi khuẩn của Bộ môn Sinh

học và Bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn Chủng vi khuẩn thí nghiệm được phục hồi trên môi trường TSA. Sau 48 giờ quan

sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc và nhuộm gram kiểm tra tính thuần của chủng vi

khuẩn được phân lập. Sau đó nuôi tăng sinh trong môi trường BHI để chuẩn bị cho thí nghiệm xác định LD50 và thí nghiệm cảm nhiễm.

3.3.2 Thí nghiệm xác định LD50

Chuẩn bị thí nghiệm

Cá tra thí nghiệm có trọng lượng 20-25g sau khi mua về được nuôi dưỡng trong bể có thể tích 1m3, có sục khí và cho ăn hằng ngày đến khi nào thấy cá ăn đều thì tiến hành thí nghiệm. Trước khi bố trí thí nghiệm cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi khuẩn nhằm lựa chọn được cá khỏe.

Chuẩn bị vi khuẩn gây cảm nhiễm Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong 200ml môi trường BHI và ủ qua đêm ở 28-300C trên máy lắc 180 vòng/phút. Sau đó vi khuẩn được cho vào ống falcon tiệt trùng (50ml) và ly tâm 5.000 r.p.m trong 10 phút ở 4 0C để thu vi khuẩn. Vi khuẩn được rửa qua nước muối sinh lý (0,9% NaCl) 3 lần và đếm mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610nm (OD=1±0,1≈109 CFU/ml) sau đó dung dịch vi khuẩn được pha loãng 10 lần để được các mật độ cần thí nghiệm là 103, 104, 105, 106. Mật độ vi khuẩn cũng được xác định bằng cách nhỏ 20 µl (lặp lại 6 lần) dung dịch vi khuẩn đã điều chỉnh mật độ lên đĩa TSA và ủ 28-30 0C rồi đếm số khuẩn lạc trung bình sau 24-48 giờ.

Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức ở nồng độ 103, 104, 105, 106 và nghiệm thức đối chứng không tiêm vi khuẩn, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 10 con cá/bể. Cá được tiêm (0,1ml vi khuẩn/cá) tại gốc vi ngực. Mật độ vi khuẩn E. ictaluri tiêm cho thí nghiệm là: 2,8x103, 5,4x104, 5x105, 0,8x106. Sau khi tiêm, các biểu hiện của cá được theo dõi và ghi nhận số cá chết liên tục trong 14 ngày. LD50 được xác định theo phương pháp của Reed và Muench (1938).

LD50= mức gây tỷ lệ nhiễm bệnh trên cá 50% thấp nhất- số nội suy (p.d) p.d = (L%-50)(L%-H%)

Trong đó:

L%: tỷ lệ cá nhiễm bệnh thấp nhất trên 50%

H%: tỷ lệ cá nhiễm bệnh cao nhất dưới 50%

3.3.3 Thí nghiệm cho ăn thảo dược. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại

được thực hiện trong 5 tuần. Trong đó nghiệm thức 1 (NT1) cho ăn thức ăn (TĂ) không bổ sung hoàng kỳ (HK), nghiệm thức 2 (NT2) cho ăn thức ăn có bổ sung

hoàng kỳ, nghiệm thức 3 (NT3) cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ nhưng

được tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3, nghiệm thức 4 (NT4) cho ăn thức ăn có bổ sung

hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3, nghiệm thức 5 (NT5) cho ăn thức ăn không

bổ sung, nghiệm thức 6 (NT6) cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ.

3.3.4 Thí nghiệm gây cảm nhiễm sau khi cho ăn thảo dược 5 tuần. Sau 5 tuần cho ăn thảo dược tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri cho cá ở

các nghiệm thức 2, 3, 4 và 5, riêng nghiệm thức 6 thì tiêm NaCl.

Vắc-xin được điều chế từ chủng E. ictaluri độc lực cao bằng cách làm vở tế

bào vi khuẩn bằng formaline 4% trong 24 giờ. Vắc-xin được tiêm với liều lượng 0,1ml/con, nồng độ 105.17 cfu/ml. Thời gian hiệu ứng của Vắc-xin là 3 tuần. Sau đó gây cảm nhiễm cho cá bằng các chủng vi khuẩn E. ictaluri có khả năng gây bệnh thông qua kết quả thí nghiệm LD50. Sau khi tiêm các chủng vi khuẩn trên vào các bể thí nghiệm trừ bể đối chứng tiêm nước muối sinh lý thì theo dõi liên tục trong 1

tuần. Để đánh giá chính xác khả năng bảo hộ của vắc-xin, trước khi thí nghiệm kết thúc thì tiến hành tái phân lập các cá còn sống nhằm xác định sự tấn công của các

chủng vi khuẩn đã công cường độc (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2002). Các chỉ

tiêu ghi nhận bao gồm: (1) dấu hiệu bệnh mủ gan của cá; (2) số cá chết và thời gian chết.

3.3.3 Xác định hiệu quả của chiết xuất thảo dược lên sự đề kháng bệnh mủ gan

trên cá tra qua các chỉ tiêu. Cá từ các nghiệm thức thí nghiệm được thu và lấy máu để nghiên cứu các chỉ tiêu

đánh giá khả năng miễn dịch của cá.

3.3.3.1 Xác định các chỉ tiêu huyết học Phương pháp đếm hồng cầu Số lượng hồng cầu được xác định lượng theo phưong pháp của Supranee et al.

(1991)

Cho 10 µl máu vào ống nhựa có chứa 1990 µl dung dịch Natt&Herrick. Lắc nhẹ, đều, nhanh ống nghiệm để tránh máu bị đông. Mật độ hồng cầu sẽ được xác định

bằng buồng đếm hồng cầu thông qua sự quan sát dưới kính hiển vi quang học

(40X). Đầu tiên xem ở vật kính 10X, định vị vùng đếm, đưa vào giữa thị trường, chuyển sang vật kính 40X. Đếm lặp lại 2 lần.

Phương pháp nhuộm mẫu máu Dùng ống tiêm 1ml lấy máu ở mạch máu phần đuôi cá. Cho 1 giọt máu lên lame và

trãi điều mẫu, để khô tự nhiên trong không khí. Cố định mẫu bằng methanol. Tiến

hành nhuộm mẫu theo phương pháp của Humason (1979) trích dẫn bởi Rowley

(1993). Cho lame mẫu vào dung dịch Wright trong 3-5 phút. Chuyển mẫu sang dung

dịch pH 6.2-6.8 từ 5-6 phút. Sau đó cho vào dung dịch Giemsa trong 20-30 phút. Tiếp tục cho mẫu vào dung dịch pH 6.2 trong 15-30 phút. Rửa sạch lại bằng nước

cất, để khô tự nhiên và đọc kết quả dưới kính hiển vi.

Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu (Hrubec et al, 2000) Quan sát lame mẫu dưới kính hiển vi ở vật kính 100x có giọt dầu.Sau khi nhuộm

bạch cầu ta tiến hành đếm. trên mỗi lam đếm 1500 tế bào theo hình zichzac.

Tổng tế bào bạch cầu (TBC) được xác định bằng cách đếm tổng số 1500 tế bào

hồng cầu và bạch cầu trên lame mẫu. (Số bạch cầu x mật độ tế bào hồng cầu) TBC (tb/mm3) = Số hồng cầu trên lame mẫu Đếm 200 tế bào bạch cầu nhằm xác định mật độ từng loại bạch cầu.

Số lượng mỗi loại bạch cầu x TBC Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm3) = 200

Dung dịch Micrococcus lysodeikticus được chuẩn bị bằng cách cho 75 mg vi

Các nồng độ lysozyme chuẩn được chuẩn bị bằng cách cho 20 mg lysozyme

3.3.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng lysozyme trong huyết thanh Hàm lượng lysozyme trong huyết thanh được xác định theo phương pháp của Ellis (1990) trích dẫn bởi Doan Nhat Phuong (2007) như sau: - khuẩn Micrococcus lysodeikticus (R3770, sigma) vào 100ml phosphate buffer saline (PBS). - vào 10 ml phosphate buffer saline (PBS) để được dung dịch lysozyme có nồng độ 20 µg/ml. Sau đó lấy 0,5 ml dung dịch lysozyme nồng độ 20 µg/ml vào 0,5 ml PBS

thì được dung dịch lysozyme nồng độ 10 µg/ml . Tiếp theo lấy 0,5 ml dung dịch

lysozyme nồng độ 10 µg/ml vào 0,5 ml PBS thì được dung dịch lysozyme nồng độ 5 µg/ml. Kế đến lấy 0,5 ml dung dịch lysozyme nồng độ 5 µg/ml vào 0,5 ml PBS

được dung dịch lysozyme nồng độ 2,5µg/ml. Tiếp tục lấy 100µl dung dịch

lysozyme nồng độ 10µg/ml vào 0.9ml PBS được dung dịch lysozyme nồng độ

1µg/ml. Tiếp tục lấy 0,5ml dung dịch lysozyme nồng độ 1µg/ml vào 0,5ml PBS

được dung dịch lysozyme nồng độ 0,5µg/ml. Từ đó xây dựng đường cong chuẩn về

các nồng độ khác nhau của lysozyme.

Các phân tích được tiến hành trên đĩa 96 giếng với ba lần lặp lại. Cho 20 µl dung dịch lysozyme chuẩn ở mỗi nồng độ, 20 µl dung dịch huyết thanh cá và 20 µl

dung dịch PBS (mẫu trắng) cho vào 3 giếng khác nhau và lập lại 3 lần. Sau đó tiếp

tục cho 250 µl dung dịch PBS (mẫu trắng) vào 3 giếng đầu và 250 µl dung dịch Micrococcus lysodeikticus vào 3 giếng còn lại. Sau khi cho mẫu vào đĩa 96 giếng

thì lắc đều, đọc nhanh ở bước sóng 530 nm bằng máy microplate reader. Sau khi đo

xong để 5 phút, lắc đều lại và đo lập lại 1 lần nữa. Hoạt tính của của lysozyme trong

mẫu huyết thanh được xác định từ đường cong chuẩn trên.

3.3.3.3 Xác định khả năng diệt khuẩn của huyết thanh Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh được xác định theo phương pháp của

Secombes (1990). Phương pháp: Sau khi đĩa vi khuẩn đã được thuần, chọn 1 khuẩn lạc nuôi tăng sinh trong môi trường NB trong 48h ở 280C. Tiến hành pha loãng vi khuẩn đến mật độ 104 cfu/ml. Sau đó pha loãng huyết thanh 10 lần trong nước muối sinh lý. Lần lược cho 100 µl dung dịch NB vào tất cả các giếng, tiếp theo cho 100 µl dung dịch huyết

thanh vào các giếng trừ giếng control và blank thì cho NB (TSB), tiếp tục cho 30 µl vi khuẩn vào các giếng trừ giếng blank thì cho NB (TSB) và ủ qua đêm ở 280C. Sau đó cho 10 µl MTT (5 mg/ml nước cất) vào các giếng, lắc trong 15 giây thì đo ở

bước sóng 600 nm.

Đọc kết quả: Phần trăm vi khuẩn sống sót được tính bằng công thức sau PSA = ((ODSample - ODblank)/(ODcontrol - ODblank))x100 OD là kết quả đọc ở bước sóng 600 nm.

3.4 Quản lý hệ thống thí nghiệm

- Thí nghiệm được bố trí trong xô nhựa 250 lít, mỗi xô nhựa thả 30 con. Hàng

ngày kiểm tra hệ thống, ghi nhận dấu hiệu bệnh lý, số cá chết.

- Thức ăn sử dụng cho cá là thức ăn công nghiệp chứa 28% đạm chuyên dùng cho

cá Tra giống của công ty Proconco Cần Thơ .

- Cá được cho ăn theo nhu cầu (khoảng 3 lần/ngày) bằng thức ăn dạng viên với chế độ dinh dưỡng có chứa Hoàng kỳ (0,5%) trong 5 tuần. Đối với cá đối chứng

âm (NT1) và đối chứng dương (NT5) thì cho ăn chế độ dinh dưỡng cơ bản mà

không cần bổ sung thảo dược.

- Cách phối trộn: Hòa tan Hoàng Kỳ vào nước rồi phun đều vào thức ăn, đợi cho

viên thức ăn hơi khô thì dùng dầu gan mực áo bên ngoài rồi cho cá ăn.

- Mẫu máu (3 con/nghiệm thức) được lấy ở động mạch chủ ở cột sống đuôi (Houston, 1990) sau 1, 2, 3, 4 và 5 tuần sau khi cho ăn. Dùng chất chống đông máu Heparin.

- Mỗi con cá được lấy máu 1 lần để tránh ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm do

chảy nhiều máu và ảnh hưởng bởi stress.

3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả được trình bày như sau: trung bình của 5 con cá (± sai số tiêu chuẩn), và được so sánh ở mỗi thời điểm bằng cách sử dụng bảng ANOVA một chiều và kiểm

định Duncan của nhiều chiều (SPSS 13). Có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các

thí nghiệm ở mức ý nghĩa 95%. Tỷ lệ chết (thu được ở phần cuối của thí nghiệm) trong mỗi nhóm điều trị đã được thống kê so với nhóm kiểm soát bằng cách sử dụng

kiểm định Chi-square (SPSS 13). Sự khác biệt giữa nhóm kiểm soát và nhóm điều

trị ở một mức độ đáng kể P <0,001 và P <0,05.

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra.

4.1.1 Hồng cầu

Kết quả (Hình 4.1) cho thấy sau 5 tuần thí nghiệm số lượng hồng cầu trung bình giữa các nghiệm thức dao động từ 1,40 x 106 tế bào/ml đến 2,02 x 106 tế bào/ml và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P< 0,05) giữa các nghiệm thức thí nghiệm.

Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lượng hồng cầu của các nghiệm thức thí nghiệm sau 5 tuần. NT1: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ. NT2: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ. NT3: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. NT4: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Kết quả phân tích cho thấy sau hai tuần đầu của thí nghiệm số lượng hồng cầu của cá ở NT2 và NT4 cao hơn ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với NT1 và NT3. Kết quả

này tương tự với nghiên cứu của Trần Thị Yến Nhi và Đặng Thị Hoàng Oanh

(2010) khi so sánh số lượng hồng cầu giữa cá tra cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng 23

kỳ và cá cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ cho thấy số lượng hồng cầu ở cá

có bổ sung hoàng kỳ cao hơn cá không bổ sung hoàng kỳ và khác biệt có ý nghĩa

thống kê (p<0,05).

Sau khi tiêm vắc-xin cho NT3 và NT4 ở tuần thứ 3 thì số lượng hồng cầu của

cá ở các nghiệm thức này đều tăng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với tuần 1 và 2.

Sau 5 tuần cho ăn thì số lựơng hồng cầu ở NT4 là cao nhất, kế đến là NT2, NT3 và thấp nhất là NT1. Sự khác biệt giữa NT2 và NT1 là có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên

giữa NT2 và NT3 là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Còn sự khác biệt

giữa NT4 đối với NT2 và NT3 là có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Điều này cho thấy

khi bổ sung hoàng kỳ vào khẩu phần thức ăn đã làm tăng số lượng hồng cầu, giúp vận chuyển và phân phối oxy đến các mô tốt hơn. Tóm lại số lượng hồng cầu tăng

đều qua các tuần và khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nghiệm thức có bổ sung

hoàng kỳ và không bổ sung hoàng kỳ.

Theo Jeney et al. (2002) khi bổ sung vitamin U với hàm lượng 100 ppm vào

thức ăn cho cá tầm lai trong 4 tuần làm gia tăng hoạt động thực bào và gia tăng tuần

hoàn của bạch cầu so với nhóm cá không bổ sung vitamin U, tuy nhiên khi bổ sung vitamin C vào thức ăn cho cá tầm lai thì số lượng hồng cầu và bạch cầu lại thấp hơn

nhóm đối chứng và khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Theo nghiên cứu của Yin et al. (2008) khi nuôi cá chép kết hợp tiêm vắc-xin và cho ăn hoàng kỳ và nấm linh chi (Astragalus và Ganoderma) làm kích thích hoạt

động hô hấp, sự thực bào của bạch cầu trong máu. Ngoài ra trên cá Rô phi

(Oreochromis niloticus) khi cho ăn hai loại thảo dược là Hoàng kỳ (Astragalus membranaceus) và Kim ngân (Lonicera japonica) với hàm lượng 0,1% trong 4 tuần.

Kết quả cho thấy hệ miễn dịch của cá được tăng cường. Hoạt động của đại thực bào,

hô hấp của tế bào máu được tăng cường và tỷ lệ sống tăng lên (Ardó et al., 2008).

Qua đó cho thấy mặc dù loài cá có khác nhau nhưng khi bổ sung hoàng kỳ vào

khẩu phần thức ăn đều làm tăng cường hoạt động của các tế bào máu dẫn đến số

lượng hồng cầu tăng và khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức (p<0,05).

4.1.2 Bạch cầu

Kết quả định lượng và định loại bạch cầu cho thấy có 4 loại bạch cầu gồm: Tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu (Hình 4.2). Số lượng

tổng bạch cầu, tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu

đều tăng có ý nghĩa thống kê ở các nghiệm thức có bổ sung Hoàng kỳ và nghiệm

Hình 4.2 Bạch cầu đơn nhân (A), tiểu cầu (B), bạch cầu trung tính (C), tế bào lympho (D) và tế bào hồng cầu (E) (100X).

thức tiêm vắc-xin so với các nghiệm thức không bổ sung Hoàng Kỳ.

Tổng bạch cầu Sau 2 tuần cho ăn hoàng kỳ, số lượng tổng bạch cầu (TBC) ở NT2 và NT4 cao hơn

có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức NT1 và NT3. Sau khi tiêm vắc-xin

ở tuần thứ 3 thì số lượng TBC ở NT3 tăng và khác biệt so với nghiệm thức 1. Sau 5 tuần cho ăn thì số lượng TBC ở NT4 là cao nhất, kế đến là NT3 và NT2, thấp nhất ở

NT1. Sự khác biệt giữa NT2 và NT3 là không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Còn sự

khác biệt giữa NT4 đối với NT2 và NT3 là có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (Hình 4.3). Điều này chứng tỏ khi bổ sung hoàng kỳ kết hợp tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3 đã có tác

dụng tốt nhất trong việc kích thích và làm gia tăng hoạt động của bạch cầu. Kết quả

trên cũng phù hợp với nghiên cứu của Trần Thị Yến Nhi và Đặng Thị Hoàng Oanh (2010) là số lượng TBC của cá ở NT cho ăn thức ăn bổ sung hoàng kỳ tăng dần qua

các tuần và cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với cá ở NT không cho ăn thức

ăn bổ sung hoàng kỳ.

Tương tự, khi bổ sung sản phẩm Nutribull 0,1% vào khẩu phần thức ăn cho cá tra đã có tác dụng tốt nhất trong việc kích thích và làm gia tăng hoạt động của bạch

cầu, từ đó nâng cao đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở cá do thành phần nucleotide và β-1,3-1,6 glucan có trong sản phẩm Nutribull (Lê Thị Nga và ctv.,

2009).

Tế bào lympho

Số lượng tế bào lympho ở nghiệm thức cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3 (NT4) là cao nhất, kế đến là NT2 và khác biệt có ý nghĩa thống

kê đối với NT1 và NT3. Ngoài ra số lượng tế bào lympho ở NT3 tăng ở tuần thứ 3

và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với NT1. Sau 5 tuần thí nghiệm thì số lượng tế bào lympho ở NT2, NT3 và NT4 đều tăng và khác biệt so với NT1 (p<0,05) (Hình

4.4). Qua đó cho thấy khi bổ sung hoàng kỳ vào khẩu phần thức ăn đã kích thích sự

gia tăng số lượng tế bào lympho, từ đó kích thích hoạt động của bạch cầu và nâng

cao đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở cá.

Theo Engstad và Robertsen (1994), β-1,3-1,6 glucan kết hợp đặc biệt với một receptor trên bề mặt bạch cầu. Khi receptor được gắn bởi β-1,3-1,6 glucan, tế bào

trở nên hoạt động hơn, tiêu diệt và dung giải tế bào vi khuẩn với cường độ cao hơn. Và cùng lúc đó chúng tiết ra những phân tử báo hiệu kích thích sự hình thành bạch

cầu mới. Các nghiên cứu trên một số loài cá cho thấy có sự gia tăng hoạt động thực

bào của đại thực bào và bạch cầu trung tính khi các hợp chất này được bổ sung vào thức ăn (Trích Lê Thị Nga và ctv., 2009).

Bạch cầu đơn nhân Số lượng tế bào bạch cầu đơn nhân tăng ở NT4, NT2 và NT3 sau 5 tuần cho ăn

thức ăn có bổ sung hoàng kỳ, nhưng không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05).

Tuy nhiên các nghiệm thức này lại khác biệt với NT1 (p<0,05) (Hình 4.5).

Bạch cầu trung tính Số lượng tế bào bạch cầu trung tính của NT1 là thấp nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê đối với NT2, NT3 và NT4 ở tuần 3 và tuần 4, tuy nhiên không khác biệt

so với tuần 5 (p>0,05) (Hình 4.6).

Tiểu cầu Số lượng tiểu cầu ở NT4 là cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các

nghiệm thức còn lại, ở các NT có bổ sung hoàng kỳ số lượng tiểu cầu tăng đều qua

5 tuần và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức không bổ sung hoàng kỳ

Hình 4.3 Biểu đồ số lượng tổng bạch cầu ở cá tra sau 5 tuần. NT1: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ. NT2: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ. NT3: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. NT4: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Hình 4.4 Số lượng tế bào lympho sau 5 tuần. NT1: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ. NT2: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ. NT3: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng

(Hình 4.7).

kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. NT4: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Hình 4.5 Số lượng tế bào bạch cầu đơn nhân sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ. NT1: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ. NT2: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ. NT3: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. NT4: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Hình 4.6 Số lượng tế bào bạch cầu trung tính sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ. NT1: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ. NT2: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ. NT3: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. NT4: Cho ăn thức ăn có bổ

sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Hình 4.7 Số lượng tế bào Tiểu cầu sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ. NT1: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ. NT2: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ. NT3: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. NT4: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Kết quả nghiên cứu của Trần Thị Yến Nhi và Đặng Thị Hoàng Oanh (2010) cho thấy các loại bạch cầu đều tăng có ý nghĩa thống kê sau 5 tuần đối với các NT cho

ăn hoàng kỳ so với NT không cho ăn hoàng kỳ, nhưng sự tăng này không ổn định qua các tuần và chỉ có ý nghĩa thống kê sau 5 tuần cho ăn. Yin et al. (2004) cho rằng hoàng kỳ có ảnh hưởng tích cực đến hệ thống miễn dịch của cá chép do nó tác động

như là một yếu tố làm tăng cường hoạt động hô hấp của các tế bào bạch cầu. Ngoài

ra khi phân tích cho thấy hoàng kỳ có chứa polysacharides, monosacharides, flavonoid và alkaloid cùng với choline, betanine, axit falic…và các chất khoáng vi

lượng như selen, kẽm, sắt đó là vi chất dinh dưỡng cần thiết cho con người và động

vật nhằm kích thích hệ thống miễn dịch không đặc hiệu. Ngoài ra qua kết quả của Jeney et al. (2008) cho thấy trộn thảo dược Hoàng kỳ (Astragalus radix) và Kim

ngân (Lonicera japonica) vào thức ăn có thể tăng cường hệ miễn dịch ở cá chép và

cá rô phi chống lại vi khuẩn A. hydrophila. Như vậy có thể kết luận rằng hoàng kỳ

giúp tăng cường hệ thống miễn dịch không đặc hiệu trên cá thông qua nhiều con

đường như tăng cường hoạt động hô hấp của tế bào thực bào (Yin et al., 2006), tăng

cường chống lại vi khuẩn (Jeney et al., 2008), tăng cường số lượng tế bào bạch cầu, tế bào hồng cầu (Trần Thị Yến Nhi và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010).

4.2 Ảnh hưởng của chất chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri.

4.2.1 Hồng cầu

Các nghiệm thức gây cảm nhiễm sau 5 tuần cho ăn là NT2, NT3, NT4 và NT5. Kết

quả so sánh số lượng hồng cầu của cá trước và sau cảm nhiễm cho thấy ở NT5 có số lượng hồng cầu sau cảm nhiễm giảm nhiều nhất (0,87x106 tế bào/ml, giảm 42%) so với trước cảm nhiễm (1,51x106 tế bào/ml) và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Số lượng hồng cầu ở NT4 sau cảm nhiễm giảm thấp nhất và khác biệt có

ý nghĩa thống kê so với NT2 và NT3, tuy nhiên số lượng hồng cầu giữa NT2 và

NT3 có giảm nhưng không khác biệt nhau (p>0,05) mà khác biệt với NT5 (p<0,05) (Bảng 4.2). Từ đó cho thấy số lượng hồng cầu của cá có bổ sung hoàng kỳ kết hợp

tiêm vắc-xin là cao nhất, kế đến là nhóm chỉ bổ sung hoàng kỳ hoặc chỉ tiêm vắc-

xin. Bảng 4.2 Số lượng hồng cầu trước và sau cảm nhiễm

NT1

NT2

NT3

NT4

NT5

NT6

106 tế bào/ml

Trước cảm nhiễm

Sau cảm nhiễm

1,52±0,05b 1,50±0,04b

1,71±0,16c 1,24±0,05a

1,65±0,17c 1,27±0,04a

1,82±0,15d 1,62±0,05c

1,51±0,06b 0,87±0,09a

1,67±0,11c 1,65±0,06c

Tỷ lệ giảm (%)

Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). NT1 (Cho

ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ). NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-

xin ở tuần thứ 3). NT5 (Cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin). NT6 (Cho ăn thức

ăn có bổ sung hoàng kỳ, tiêm Nacl, không tiêm vắc-xin).

Trần Thị Yến Nhi và Đặng Thị Hoàng Oanh (2010) cũng ghi nhận có sự giảm đáng kể số lượng hồng cầu sau cảm nhiễm ở nghiệm thức không cho ăn hoàng kỳ là 1,45 x 106 tế bào/ml so với nghiệm thức cho ăn hoàng kỳ là 1,65x106 tế bào/ml.

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Liễu và ctv. (2009) thì số lượng hồng cầu trên cá khỏe có số lượng hồng cầu 2,05x106 tế bào/ml nhưng ở cá bệnh chỉ còn 0,75x106 tế bào/ml, giảm 2,73 lần (63,4%) so với cá khỏe, ngoài ra cũng giống với nghiên cứu của Phạm Thanh Hương và ctv. (2009) trên cá bệnh vàng da. Đối với cá

tra bị trắng gan trắng mang (TGTM) Từ Thanh Dung (2010) cho rằng mật độ hồng cầu giảm dần từ cá không có biểu hiện TGTM (giảm khoảng 30%) đến cá nhiễm

TGTM nhẹ (giảm còn 18,7%) và thấp nhất ở cá nhiễm nặng (4,57%).

Theo Hibiya (1982) khi mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể cá sẽ làm tổn thương đến tế bào máu, tuy nhiên vấn đề này còn tùy thuộc theo loài cá. Ngoài ra mầm bệnh

còn tấn công các cơ quan như: thận, tỳ tạng. Khi mầm bệnh tấn công vào thận làm

cho thận bị hoại tử làm giảm chức năng bài tiết chất thải trong quá trình trao đổi chất. Khi cơ thể bị viêm nhiễm thì quá trình trao đổi chất đặc biệt tăng mạnh, đồng

thời tăng cường sản sinh các loại bạch cầu và đại thực bào. Ngoài ra do mô tạo máu

nằm xen kẽ với các tế bào kẽ và các tế bào nội tiết của thận cũng bị hủy hoại làm cho máu trong cơ thể giảm sút. Tỳ tạng bị hoại tử dẫn đến mất khả năng tạo hồng

cầu và phá hủy hồng cầu già cũng như không thể sản xuất các tế bào lympho, và bạch cầu (Nguyễn Quốc Thịnh, 2002). Do đó đây cũng chính là nguyên nhân làm cho số lượng hồng cầu của cá sau cảm nhiễm giảm so với trước cảm nhiễm. Nhưng

mức độ giảm của cá có bổ sung hoàng kỳ thấp hơn cá không bổ sung hoàng kỳ.

4.2.1 Bạch cầu

Tổng bạch cầu, lympho ở NT ĐC dương thấp hơn so với các NT ĐC âm, NT2 ,

NT3, NT4 và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính ở NT4 cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với NT3, NT2 và NT6. Ngoài

ra số lượng tiểu cầu ở các NT gây cảm nhiễm khác biệt không có ý nghĩa thống kê

(p>0,05) (Bảng 4.3). Qua kết quả ở bảng 4.3 cho thấy các loại bạch cầu ở NT gây cảm nhiễm có bổ sung hoàng kỳ đều cao hơn NT gây cảm nhiễm không bổ sung hoàng kỳ.

Bảng 4.2 Số lượng các loại bạch cầu sau cảm nhiễm

NT1

NT2

NT3

NT4

NT5

NT6

Loại tế bào (x 103 tế bào/ml

TBC Lympho

Đơn nhân

134,90±6,2b 112,83±6,6b 8,20±0,9b 7,54±0,8b 6,34±0,6c

137,52±5,3b 112,79±5,1b 10,17±0,5cd 8,64±0,9bc 5,93±0,9bc

138,34±7,2b 115,26±7,5b 8,56±1,7b 9,27±2,5bc 5,39±0,9abc

153,52±7,8c 127,65±8,5c 10,58±1,6d 10,49±2,1c 4,80±1,2ab

93,11±6,9a 77,89±6,6a 5,44±0,8a 5,12±0,9a 4,67±0,6a

151,81±4,8c 130,10±4,3c 8,80±0,9bc 7,14±1,0ab 5,77±0,7abc

Trung tính Tiểu cầu

Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). NT1 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ). NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-

xin ở tuần thứ 3). NT5 (Cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin). NT6 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ, tiêm Nacl, không tiêm vắc-xin).

Kết quả này tương tự với kết quả của Trần Thị Yến Nhi và Đặng Thị Hoàng Oanh

(2010) và Nguyễn Thị Thúy Liễu (2009) số lượng TBC, tế bào lympho, tiểu cầu ở các NT cá bệnh điều giảm so với các NT cá khỏe trong khi đó số lượng bạch cầu

đơn nhân, bạch cầu trung tính lại tăng tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa

thống kê (Phạm Thanh Liêm và ctv., 2008; Đặng Thụy Mai Thy, 2010). Qua đó cho

ta thấy rằng bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính là thành phần đóng vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá vì vậy khi cá bị nhiễm vi khuẩn thì

hoạt động của hệ bạch huyết gia tăng nhằm tiêu diệt vi khuẩn.

Toida et al. (2003) cho rằng do sự tập trung nhanh chóng tế bào lympho ở những vùng bị viêm làm cho quá trình cung cấp bổ sung tế bào này ở vùng ngoại vi của máu bị giảm. Bạch cầu đơn nhân gia tăng số lượng trong 24 giờ và đại thực bào

trong vòng 3 ngày và có vai trò quan trọng trong việc hình thành hàng rào bảo vệ chống lại các tác nhân cơ hội gây bệnh (trích dẫn bởi Đặng Thụy Mai Thy, 2010).

4.3 Lysozyme

Phương trình đường chuẩn của lysozyme được trình bày ở hình 4.8 ở đó trong cùng

một khoảng thời gian ở nồng độ lysozyme càng cao thì khả năng phân giải vi khuẩn Micrococcus lysodeikticus càng nhanh. Từ phương trình đường chuẩn suy ra nồng

độ lysozyme cho mẫu cần phân tích.

Hình 4.8 Đồ thị nồng độ lysozyme chuẩn

4.3.1 Hàm lượng lysozyme trước cảm nhiễm

Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng lysozyme trung bình trong máu cá sau khi cho ăn hoàng kỳ 5 tuần tương đối cao và dao động từ 26,43 ± 1,21 µg/ml đến 29,65

± 1,16 µg/ml, trong đó hàm lượng lysozyme ở nghiệm thức 1 và 2 thấp hơn nghiệm

thức 3, 4 và khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (Hình 4.9). Theo Jeney et al. (2002) khi bổ sung 100 mg và 1.000 mg vitamin C vào thức ăn cho cá tầm lai

sau 20 tuần thì có sự gia tăng đáng kể hàm lượng lysozyme và khác biệt ý nghĩa so

với nhóm đối chứng và nhóm chỉ bổ sung 10 mg vitamin C. Tuy nhiên nghiên cứu của Doan Nhat Phuong (2007) lại cho rằng đối với cá trê lai khi bổ sung 70,9 mg

Vitamin C vào khẩu phần thức ăn sau 10 tuần sẽ làm gia tăng hàm lượng lysozyme

so với nhóm chỉ bổ sung 33,3 mg vitamin C và khác biệt có ý nghĩa thống kê. Ngoài ra qua nghiên cứu của Ardó et al. (2008) cho rằng có sự gia tăng hàm lượng

lysozyme ở tuần đầu đối với cá rô phi cho ăn thức ăn có trôn hoàng kỳ kết hợp với

kim ngân hoặc hoàng kỳ kết hợp với Bo và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chỉ cho ăn với một loại thảo dược. Qua đó cho thấy rằng sự biến đổi về hàm

lượng lysozyme của các nhóm cá ở các nghiệm thức khác nhau thì khác nhau.

Hình 4.9 Hàm lượng lysozyme trung bình của các nghiệm thức sau 5 tuần cho ăn Hoàng kỳ. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). NT1 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ). NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3).

4.3.2 Hàm lượng lysozyme sau cảm nhiễm

Sau khi cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri thì hàm lượng lysozyme ở các nghiệm

thức đều giảm so với trước cảm nhiễm, nghiệm thức 3 có hàm lượng lysozyme cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức 5. Nghiệm thức 2 và 4 thì thấp hơn

NT5 nhưng không khác biệt (p>0,05) (Hình 4.10). Tuy nhiên theo nghiên cứu của

Choi et al. (2000) lại cho rằng khi tiêm sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn Mycobacterium spp trên cá hồi thì nồng độ lysozyme trong huyết thanh tăng cao ở

tuần thứ 2 nhưng sang tuần thứ 8 thì giảm xuống. Theo Caruso et al. (2002) khi gây

cảm nhiễm với E. tarda thì hàm lượng lysozyme của cá đều tăng lên sau ngày thứ 3 và 6. Bên cạnh đó, đối với cá trê lai khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn Aeromonas

hydrophila thì hàm lượng lysozyme của cá tăng lên so với trước khi gây cảm nhiễm

(Doan Nhat Phuong 2007). Gần đây nhất là nghiên cứu của Harikrishman et al. (2010) khi trộn hỗn hợp gồm cây neem (Azadirach indica), cây é tía (Osimum sanctum) và cây nghệ (curcuma longa) với liều lượng 100, 200 và 400 mg/kg hỗn

hợp trên cho cá vàng ăn. Sau đó gây cảm nhiễm với vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Hình 4.10 Hàm lượng lysozyme trung bình của các nghiệm thức sau cảm nhiễm với vi khuẩn E.ictaluri. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3). NT5 (Cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin) So với kết quả nghiên cứu trên cho thấy sau khi gây cảm nhiễm thì hàm lượng

thì hàm lượng lysozyme gia tăng đáng kể ở tuần thứ 2 và thứ 4.

lysozyme có giảm (0,96 %) nhưng giảm rất ít và khác biệt không ý nghĩa (P>0,05).

Theo kết quả nghiên cứu của Sahoo et al (2007) khi gây cảm nhiễm cho cá chép Ấn Độ với vi khuẩn E.tarda thì hàm lượng lysozyme trong huyết thanh của cá giảm hơn

so với trước cảm nhiễm. Từ đó cho thấy chủng vi khuẩn khác nhau, hàm lượng vi

khuẩn khác nhau thì sự biến đổi về hàm lượng lysozyme cũng khác nhau. Nhìn chung hàm lượng lysozyme trong huyết thanh có thể tăng lên hay giảm xuống còn

phụ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể cá, yếu tố stress, ở tùng thời

điểm khác nhau thì khả năng đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau (Stosik et al., 2001).

4.4 Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh

Khả năng diệt khuẩn huyết thanh trước và sau cảm nhiễm sẽ được đánh giá thông

qua chất chỉ thị màu MTT và cách bố trí các mẫu vào đĩa 96 giếng được trình bày trong phụ lục C. Kết quả tính toán phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi

Hình 4.11 Phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá trước cảm nhiễm. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). NT1 (Cho ăn thức ăn bình thường, không tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin). NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3). NT5 (Cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin)

tương tác với huyết thanh được trình bày qua đồ thị ở hình 4.11.

Qua đồ thị cho thấy phần trăm vi khuẩn còn sống ở các nghiệm thức trước cảm

nhiễm dao động từ 72,9 ±29,5 đến 102,5 ± 92,5 và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Thông qua phần trăm vi khuẩn còn sống sau khi tiếp xúc với huyết

thanh cho thấy khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ở nghiệm thức 4 là cao nhất

27,1 % vi khuẩn chết, so với nghiệm thức 1 thì 100% vi khuẩn còn sống. Tuy nhiên

không có sự khác biệt giữa nghiệm thức 1 và 4 (p>0,05). Từ đó cho thấy khi bổ sung hoàng kỳ vào thức ăn làm tăng hoạt động của hệ thống miễn dịch không đặc

hiệu thông qua việc làm tăng hoạt động thực bào của bạch cầu (Yin et al., 2006;

Ardó et al., 2008; Jeney et al., 2008).

Hình 4.12 Phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá sau cảm nhiễm. NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3). NT5 (Cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin). (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Đối với cá được gây cảm nhiễm với vi khuẩn E .ictaluri thì phần trăm trung bình vi

khuẩn còn sống sau khi tương tác với huyết thanh tương đối thấp. Nghiệm thức 2,3,4 chỉ có 22-26% vi khuẩn còn sống, tuy nhiên ở nghiệm thức 5 trên 100% vi

khuẩn còn sống và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Thông qua phần trăm

sống sót của vi khuẩn sau khi tiếp xúc với huyết thanh cho thấy khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở cá cho ăn hoàng kỳ cao hơn cá không bổ sung hoàng

kỳ. Đối với cá được tiêm vắc-xin thì khả năng diệt khuẩn cũng cao hơn nghiệm thức

không bổ sung vắc-xin. Tuy nhiên giữa hai nhóm cá bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc- xin thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

Theo nghiên cứu của Doan Nhat Phuong (2007) cho rằng khả năng diệt khuẩn

của huyết thanh ở cá trê lai có tiêm vi khuẩn Aeromonas hydrophila cao hơn so với huyết thanh của cá trê ở nghiệm thức không tiêm vi khuẩn, tương tự với kết quả của

Nguyễn Thị Thúy Liễu (2010) khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E.ictaluri cho cá tra.

Tuy nhiên cũng có những trường hợp vi khuẩn phát triển hơn 100% sau khi tiếp xúc với huyết thanh, nguyên nhân có thể do mẫu huyết thanh đã mất hoạt tính do phải

trữ lâu trong tủ âm và cũng có thể do cá bị nhiễm nặng nên không còn khả năng

miễn dịch.

So sánh với kết quả của đề tài cho thấy ở nghiệm thức 5 (nghiệm thức đối chứng

dương) vi khuẩn phát triển quá mức sau khi tương tác với huyết thanh có thể do môi trường nuôi vi khuẩn giàu dinh dưỡng (NB) và nhiệt độ ủ thích hợp (28,50C) trong quá trình phân tích đã tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển tốt. Bên cạnh đó có thể

do độc lực của vi khuẩn mạnh nên vẫn có khả năng phát triển được trong môi

trường huyết thanh của cá.

Ngoài ra qua kết quả nghiên cứu của Trần Thị Yến Nhi và Đặng Thị Hoàng

Oanh (2010) cho thấy khả năng diệt khuẩn của huyết thanh trên cá tra bệnh cho ăn

thức ăn có bổ sung hoàng kỳ cao hơn cá bệnh nhưng không bổ sung hoàng kỳ. Từ

đó cho thấy hoàng kỳ có thể làm tăng hoạt động của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu ở cá tra.

Như vậy, khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ở cá bệnh có ăn hoàng kỳ và cá

bệnh có tiêm vắc-xin kết hợp cho ăn hoàng kỳ cao hơn cá bệnh không ăn hoàng kỳ và không tiêm vắc-xin. Điều này cho thấy khi bổ sung hoàng kỳ cho cá tra làm tăng

hoạt động của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu trong việc đề kháng với vi khuẩn

E. ictaluri được thể hiện qua khả năng diệt khuẩn của huyết thanh.

4.5 Ảnh hưởng của chiết xuất hoàng kỳ lên sự nhiễm bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri

Bảng 4.5 LD50 của vi khuẩn E. ictaluri thí nghiệm

Kết quả thí nghiệm xác định nồng độ vi khuẩn gây chết 50% (LD50) cá thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.5). Từ kết quả trên ta xác định được mật độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm là 5,4x104.

Mật độ vi khuẩn Nghiệm thức % cá chết LD50 (CFU/ml)

0 37

5,4x104 45

1 2 3 4 5 Đối chứng 103 104 105 106 95 100

Sau 5 tuần cho ăn hoàng kỳ cá được gây cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri. Dấu

hiệu sau 3 ngày cảm nhiễm cá có biểu hiện nổi đầu, bơi lờ đờ và chết. Biểu hiện bên

ngoài thấy da nhạt màu, hậu môn sưng đỏ, mắt lồi, một số cá bị xuất huyết ở da và vây. Giải phẩu bên trong nội tạng có dịch trong xoang, trên gan, thận và tỳ tạng xuất

hiện nhiều đốm trắng (Hình 4.13). Một số cá nhiễm nặng có hiện tượng thận sưng to

và bị nhũng. Dấu hiệu bệnh lý của cá tra trong thí nghiệm này sau khi cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri giống như mô tả của Từ Thanh Dung và ctv. (2004) và Đặng Thụy

tra

Mai Thy (2010).

thí Hình 4.13 Cá nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. (mũi tên chỉ đốm trắng trên gan, thận, tỳ tạng)

Qua biểu đồ ở hình 4.14 cho thấy tỷ lệ cá chết tích lũy cao nhất ở NT5 đạt

53%, kế đến ở NT2 là 36%, NT3 là 33% và thấp nhất là NT4 24%. Thời gian cá bắt đầu chết sau khi tiêm vi khuẩn ở các nghiệm thức thì khác nhau, trong đó NT5 cá

bắt đầu chết từ ngày 3 đến ngày 11, NT4 và NT3 cá bắt đầu chết từ ngày 4 đến ngày

9, NT2 cá bắt đầu chết từ ngày 4 đến ngày 10. Cá chết liên tục trong vòng 7 ngày và sau đó không chết đến khi kết thúc thí nghiệm. Cá ở NT1 không chết chứng tỏ cá thí

nghiệm là cá khỏe. Dựa vào kết quả của biểu đồ trên cho thấy tỷ lệ sống sau 15 ngày

cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri giữa các nghiệm thức có khác nhau, NT4 có tỷ lệ sống cao nhất là 76%. Tỷ lệ sống thấp nhất ở NT5 là 47%. Ở NT2 và NT3 có tỷ lệ

sống tương đương nhau lần lượt là 64% và 67%. Tỷ lệ sống giữa NT2 và NT3 là

không khác biệt về mặt thống kê (p>0,05). Tuy nhiên sự khác biệt về tỷ lệ sống giữa

NT4 so với NT2 và NT3 là có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05). Điều này chứng tỏ rằng thức ăn có bổ sung 0,5% hoàng kỳ kết hợp tiêm vắc-xin giúp cá đề kháng lại sự

cảm nhiễm bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra tốt hơn là chỉ cho ăn hoàng kỳ hoặc

chỉ tiêm vắc-xin. Kết quả trên cũng phù hợp với nghiên cứu trên cá tra, sau khi gây

cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri, cá được cho ăn thức ăn có bổ sung 0,2%

Nutribull có khả năng giúp cá đề kháng lại bệnh do vi khuẩn này gây ra nhờ thành

phần beta glucan và nucleotide có trong sản phẩm từ đó nâng cao tỷ lệ sống của cá (Lê Thị Nga và ctv., 2009). Ngoài ra qua nghiên cứu của Yin et al. (2008) khi nuôi

cá chép kết hợp tiêm vắc-xin và cho ăn 2 loại thảo dược, gây cảm nhiễm với vi

khuẩn A. hydrophila có tỷ lệ sống cao. Tỷ lệ sống cao nhất (60%) là nhóm cá có tiêm vắc-xin và được cho ăn bằng cả 2 loại thảo dược, trong khi đó hầu như 90% cá

đối chứng (kiểm soát âm tính) và 60% cá chỉ được tiêm vắc-xin (kiểm soát dương

Hình 4.14 Tỷ lệ chết cá chết tích lũy sau khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E.ictaluri. NT1 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ, không tiêm vắc-xin, không tiêm vi khuẩn), NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ, tiêm vi khuẩn). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3, tiêm vi khuẩn). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3, tiêm vi khuẩn). NT5 (Cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin).

tính) đã chết.

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1 Kết luận

1. Sau 5 tuần thí nghiệm số lượng hồng cầu ở cá tra cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ cao hơn có ý nghĩa thống kê số lượng hồng cầu ở cá tra cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ. Số lượng tổng bạch cầu, tế bào lympho, bạch cầu trung

tính, bạch cầu đơn nhân đều tăng dần qua các tuần thí nghiệm, cao nhất ở các

nghiệm thức có bổ sung hoàng kỳ và kết hợp tiêm vắc-cin.

2. Sau khi gây cảm nhiễm số lượng tế bào hồng cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu ở cá thí nghiệm đều giảm nhưng số lượng bạch cầu trung tính, bạch cầu

đơn nhân tăng có ý nghĩa thống kê. Ở các nghiệm thức cho ăn thức ăn có hoàng

kỳ thì các chỉ tiêu huyết học này đều cao hơn các nghiệm thức cá không ăn hoàng kỳ (p<0,05).

3. Hàm lượng lysozyme trong huyết thanh cá sau 5 tuần thí nghiệm cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ đều cao hơn cá chỉ cho ăn thức ăn không có bổ sung hoàng kỳ. Huyết thanh cá sau khi gây cảm nhiễm có hàm lượng lysozyme giảm so với

trước cảm nhiễm nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).

4. Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh của cá có bổ sung hoàng kỳ cao hơn cá không bổ sung hoàng kỳ, cá cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin

thì khả năng diệt khuẩn của huyết thanh không khác biệt so với cá chỉ bổ sung

hoàng kỳ, nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê đối với cá cho ăn thức ăn bình thường (p<0,05).

5. Tỉ lệ cá chết do nhiễm vi khuẩn E .ictaluri thấp nhất ở nghiệm thức cho ăn hoàng

kỳ và tiêm vắc-xin.

5.2 Đề xuất

- Cần nghiên cứu thêm về việc đánh giá ảnh hưởng của hoàng kỳ qua một số chỉ

tiêu miễn dịch như: xác định hàm lượng bổ thể, khả năng sinh O2

- Tiếp tục nghiên cứu khả năng sử dụng hoàng kỳ trong phòng bệnh xuất huyết, trắng gan trắng mang trên cá tra. Nghiên cứu kết hợp hoàng kỳ với nấm linh chi

hay hoàng kỳ với cây nghệ trong việc phòng bệnh trên cá tra.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Ardó.L., G.Yin, Pao Xu, L.Váradi, G.Szigeti, Z.Jeney and G.Jeney, 2008. Chinese

herbs (Astragalus membranaceus and Lonicera japonica) and boron enhance the non-specific immune response of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and

resistance against Aeromonas hydrophila. Aquaculture 275 (2008) 26–33

Balasundaram.C.and Harikrishnan.R, 2009. Immunomodulatory

effect of Andrographis paniculata on Asian Catﬁsh, Clarias batrachus against Aeromonas hydrophila. Experimental and Toxicologic Pathology 61 (2009): 293-294

Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2010. Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch

tháng 9 và 9 tháng đầu năm 2010 ngành nông nghiệp và phát triển nôngthôn. http://www.agroviet.gov.vn/Lists/appsp01_statistic/Attachments/32/baocao_9_2

010_final.pdf.

Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành, Ngô Đại Quang và Lưu Hoàng Ngọc, 2006a. Kết quả nghiên cứu chế phẩm (VTS1-C và VTS1-T) tách chiết từ thảo dược phòng

trị bệnh cho tôm sú và cá tra. Viện NTTS 1.

Bùi Quang Tề, 2001. Kí sinh trùng của một số lòai cá nước ngọt ở Đồng Bằng Sông

Cửu Long và các giải pháp phòng trị chúng. Luận văn tiến sĩ.

Bùi Quang Tề, 2003. Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị. NXB Nông

Nghiệp, Hà Nội. Trang 70-71

Bùi Quang Tề, 2006. Công nghệ nuôi cá tra và cá ba sa an bảo đảm toàn vệ sinh

thực phẩm. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 72 trang

Bùi Quang Tề, 2006a. Công nghệ nuôi cá tra và ba sa đảm bảo toàn vệ sinh an toàn

thực phẩm. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 72 trang

Bùi Quang Tề, 2006b. Công nghệ nuôi tôm sú đảm bảo toàn vệ sinh an toàn thực

phẩm. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 90 trang

Caruso.D, O.Schlumberger, C.Dalm and J.D.Proteau, 2002. Plasma lysozyme levels

in sheatsish Silurus glanis subjected to stress and experimental infection with

Edwardsiella tarda. Aquaculture Research, 33:999-1008.

Citarasu.T, V.Sivaram, G.Immanuel, N.Rout and V.Murugan, 2006. Inﬂuence of

selected Indian immunostimulant herbs against white spot syndrome virus

(WSSV) infection in black tiger shrimp, Penaeus monodon with reference to

haematological, biochemical and immunological changes. Fish & Shellﬁsh

Immunology 21 (2006) 372-384

Crasta.P.J., N.S.Raviraja and K.R.Sridhar, 1997. Antimicirobial activity of some marine algae of the Southwest coast of Indian. Indian Journal Marine Sciences,

26 (2) 201-205

Crumlish.M, Tung.V.T., Thanh.P.C., Koesling.J. and Gravningen.K, 2008. Characterisation of Vietnamese Edwardsiella ictaluri islates recovered from

farmed Striped Catfish (Pangasinodon hypophthalmus). Handbook and

Abstracts Catfish Aquaculture in Asia: Present status and challenges for

sustainable development at Can Tho University Can Tho city, Viet Nam December 5-7, 2008

Châu Hồng Thúy, 2008. Khảo sát tình hình xuất hiện bệnh mủ gan do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri trên cá tra nuôi thâm canh ở tỉnh Trà Vinh. Luận văn tốt nghiệp Cao học ngành Nuôi trồng Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ. 75 trang

Dang Thi Hoang Oanh and Nguyen Truc Phuong, 2008. Development and

application of polymerase chain reaction technique for detection of Edwardsiella ictaluri in striped catfish (Pangasianodon hypopthamus). Handbook and

Abstracts Catfish Aquaculture in Asia: Present status and challenges for

sustainable development at Can Tho University Can Tho city, Viet Nam December 5-7, 2008

Dang Thi Hoang Oanh and Nguyen Thanh Phuong, 2008. Emergence of bacterial

diseases caused by Edwardsiella ictaluri in striped catfish (Pangasianodon hyphthalmus) farming in The Mekong river delta, Viet Nam. Handbook and

Abstracts Catfish Aquaculture in Asia: Present status and challenges for

sustainable development at Can Tho University Can Tho city, Viet Nam December 5-7, 2008

Doan Nhat Phuong, 2007. Non-specific immune responses towards ascorbic acid

supplementation in hydrid catfish (clarias gariepinus x c. macrocephalus) feed. Luận văn thạc sỹ trường Đại học Terengganu Malaysia, 142 pp.

Dügenci, S.K; Arda, N; Candan, A. 2003, Some medicinal plants as

immunostimulant for fish. Journal of Ethnopharmacology 88 (2003) 99-106.

Dương Công Chinh và Đồng An Thụy, 2009. Phát triển nuôi cá tra ở ĐBSCL và các vấn đề môi trường cần giải quyết. Trung tâm nghiên cứu Môi trường và Xử lý

nước. Viện Khoa học Thủy lợi miền Nam.

http://www.vncold.vn/Web/Content.aspx?distid=1952. Cập nhật ngày

24/07/2009

Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương và Nguyễn Thanh Phương. 2002. Xác

định LD50 và thử nghiệm Vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas

hydrophila) trên cá chép (Cyprinus carpio). Đề tài cấp trường Đại Học Cần Thơ Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Minh Hậu và Nguyễn Thanh

Phương, 2004. Thiết lập bộ sưu tập vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh

Chloramphenicol tại khoa thùy sản, Đại học Cần Thơ. Tạp chí nghiên cứu Khoa

học 2004: 2 76-81. Trường Đại học Cần Thơ

Đặng Thị Hoàng Oanh, 2005. Xác định tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn

phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở ĐBSCL, Việt Nam. Tạp chí nghiên cứu

Khoa học 2005: 4 x-y. Trường Đại học Cần Thơ.

Đặng Thụy Mai Thy, 2010. Nghiên cứu đặc tính gây bệnh của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Luận văn Cao

học. Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ. 83 trang

Đỗ Tất Lợi và Nguyễn Xuân Dũng, 1991. Native drugs of Vietnam: which

raditional and scientific approaches. Journal of Ethnopharmacology. Volume 32,

Issues 1-3, April 1991, Pages 51-56

Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, tr

831-833, tr 887-889.

Harikrishman. R et al, 2010. Herbal supplementation diets on hematology and innate immunity in goldfish against Aeromonas hydrophila. Fish & Shellfish

Immunology 28 (2010) 354-361.

Harikrishnan.R. and C.Balasundaram, 2009. Protective effect of probiotics enriched diet and tri-herbal dip treatment on haematological and biochemical proﬁles of

goldﬁsh, Carassius auratus and common carp, Cyprinus carpio artiﬁcially

infected with Aeromonas hydrophila. Experimental and Toxicologic Pathology 61 (2009): 293

Harikrishnan.R., M.N.Rani and C.Balasundaram, 2003. Hematological and

biochemical parameters in common carp, Cyprinus carpio, following herbal

treatment for Aeromonas hydrophila infection. Aquaculture 221 (2003) 41–50

Huỳnh Kim Diệu, 2010. Hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh trên cá tra của một số

cây thuốc nam ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ

, số 15b/2010, trang 222-229.

Huỳnh Thị Tú, Nguyễn Thanh Phương, Frédéric Silvestre, Caroline Douny, Châu

Tài Tảo, Guy Maghuin-Rogister,và Patrick Kestemont, 2006. Khảo sát tình

hình sử dụng thuốc – hóa chất trong nuôi tôm và sự tồn lưu của Enrofloxacin và Furazolidone trong tôm sú (Penaeus monodon). Tạp chí Nghiên cứu Khoa học

2006: 70-78. Trường Đại học Cần Thơ.

Immanuel.G., V.C.Vincybai, V.Sivaram, A.Palavesam and M.P.Marian. 2004.

Effect of butanolic extracts from terrestrial herbs and seaweeds on the survival, growth and pathogen (Vibrio parahaemolyticus) load on shrimp Penaeus indicus

juveniles. Aquaculture 236 (2004): 53-65

Jeney, G and Jeney. Zs, 2002. Application of immunostimulants for modulation of the non-specific defense mechanisms in sturgeon hybrid: Acipenser ruthenus x

A. baerii. J.Appl. Ichthyol 18 (2002), 416-419

Jian.J and Z.Wu, 2003. Effects of traditional Chinese medicine on nonspecific immunity and disease resistance of large yellow croaker, Pseudosciaena crocea

(Richardson). Aquaculture 218 (2003):1 –9

Jian.J and Z.Wu, 2004. Effects of traditional Chinese medicine on nonspecific immunity of Jian Carp (Cyprinus carpio var. Jian). Fish & Shellﬁsh

Immunology 16 (2004) 185–191

Kimbrell. A, T. Letterman, 2005. The catch with seafood – Human health impacts of drugs and chemicals used by the aquaculture industry. Center for Food safety.

Pages 37

Khoi.D.P., Hao.V.N., Sang.V.N., Vu.T.N., Tam.Q.N., Ngan.H.N., Thu.D.N., Hien.T.N. and Nga.T.N.H, 2008. The initial study on disease resistance of

Mekong river Catfish (Pangasinodon hypophthalmus) to the enteric septicaemia

of Catfish (ESC) disease. Handbook and Abstracts Catfish Aquaculture in Asia: Present status and challenges for sustainable development at Can Tho University

Can Tho city, Viet Nam December 5-7, 2008

Lê Anh Tuấn, 2007. Xử lý nước thải ao nuôi cá nước ngọt bằng đất ngập nước kiến

tạo. Kỷ yếu của Hội thảo Quản lý và xử lý ao nuôi thủy sản. Sở Tài nguyên và Môi trường An Giang, Long Xuyên. Tháng 6/2007.

Lê Anh Tuấn, 2008. Nước cho nuôi trồng thủy sản trong chiến lược quy hoạch thủy

lợi đa mục tiêu ở ĐBSCL. Tạp chí khoa học 2008 (2): 205-209. Đại học Cần

Thơ.

Lê Anh Tuấn, 2009. Đặc điểm chế độ khí tượng-thủy văn vùng ĐBSCL.

http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/the-loai-khac/dac-diem-che-do-khi-tuong-thuy-van-

vung-dong-bang-song-cuu-long.6953.html. Cập nhật: 17/032009

Lê Thị Huệ, 2006. Sử dụng hóa chất, kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản.

http://www.ria1.org/modules/pddownloads/singlefile.php?cid=30&lid=252.

Ngày cập nhật: 22/12/2006

Lê Thị Nga, Nguyễn Hữu Thịnh, Lê Thanh Hùng, 2009. Đánh giá tác dụng của sản phẩm Nutribull lên tăng trưởng và cải thiện tình trạng sức khỏe của cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus). Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản tòan quốc

19/11/2009. 139-149

Lương Đức Phẩm, 2001. Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm. NXB Nông

nghiệp, Hà Nội. 423 trang (291-296)

Lương Thị Diễm Trang, 2009. Ảnh hưởng của malachite green lên sinh lý, sinh hóa và tồn lưu trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn cao học. Khoa Thủy

sản, Đại học Cần Thơ. 76 trang.

Lý Thị Thanh Loan và ctv, 2006. Bước đầu phát hiện Clostridium sp cảm nhiễm trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi ở ĐBSCL Việt Nam. Trung tâm

quốc gia quan trắc, cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu

vực Nam bộ Viện nghiên cứu NTTS II.

Mai Văn Tài, Tống Hoài Nam, Nguyễn Hữu Nghĩa, Chu Duy Thịnh, Đoàn Thanh

Loan, Đỗ Thị Dịu, Lê Văn Khôi, Nguyễn Văn Khánh, Võ Văn Bình, Lý Thị

Thanh Loan, Mã Tú Lan, Phạm Văn Tình, Nguyễn Quỳnh Vân, Nguyễn Thanh Bình, Lê Thị Huệ và Bùi Thị Hằng, 2004. Điều tra đánh giá hiện trạng các loại

thuốc, hóa chất và chế phẩm sinh học dùng trong nuôi trồng thủy sản nhằm đề

xuất các giải pháp quản lý. Đề tài cấp Bộ, Bộ Thủy Sản

Muniruzzaman.M. and M.B.R.Chowdhury, 2004. Sensitivity of fish pathogenic

Bacteria to various medicinal herbs. Bangladesh Society for Veterinary

Medicine (2004) 2 (1): 75-82

NACA, 2008. Better management practices for catfish aquaculture in the Mekong

Delta, Viet Nam. Aquaculture Asia Magazine, Volume XIII No. 1, January-

March 2008. ISSN 0859-600X.

Nguyễn Chính, 2005. Đánh giá tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra

(Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở An Giang và Cần Thơ. Luận văn Thạc

sĩ Khoa học chuyên ngành Nuôi trồng Thủy Sản, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Hoàng Nam Kha, Samira Sarter, Thierry Legavre và Didier Montet, 2005.

Nghiên cứu đặc điểm hệ vi khuẩn cộng sinh trên cá nuôi trang trại Việt Nam và

tính kháng kháng sinh. Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Nông Lâm nghiệp,

2005(2&3): 115-123

Nguyễn Hữu Đức, 2007. Điều tra tình hình sử dụng hóa chất và chế phẩm vi sinh

trong quản lý môi trường ao nuôi tôm sú thâm canh ở Bến Tre, Sóc Trăng và

Bạc Liêu. Luận văn cao học ngành nuôi trồng thủy sản. 2007. Trường Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan, 2007. Phân lập và khảo sát đặc điểm

kháng kháng sinh của Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra, Pangasinodon hypophthalmus, nuôi thâm canh. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật

Nông Lâm Nghiệp Trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh số 1 và 2/2007.

Trang 175-179

Nguyễn Thị Thúy Liễu, Bùi Thị Bích Hằng, Đặng Thị Hoàng Oanh, 2009. Tìm hiểu

sự biến động của các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá tra (Pangasinodon

hypophthalmus) nuôi nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản tòan quốc 19/11/2009, trang 202-211.

Nguyễn Mạnh Hùng, 2008. Ứng dụng của dịch chiết từ cây Neem và khoáng vi

trồng trong thủy nuôi

lượng http://www.vienthuysan2.com/index.php?do=news&act=detail&id=129. sản Cập

nhật: 10/10/2008

Nguyễn Phú Son, 2007. Nghiên cứu thị trường cá tra và basa ở ĐBSCL. Tạp chí

khoa học Đại học Cần Thơ, số 08, 2007, trang 28-37

Nguyễn Quốc Thịnh, Từ Thanh Dung và Ferguson H.W, 2004. Nghiên cứu mô bệnh

học cá Tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh trắng gan. Tạp chí Khoa học Đại

học Cần Thơ Chuyên ngành Thủy Sản 2004: 120-125.

Nguyễn Quốc Thịnh, 2006. Điều tra đánh giá ảnh hưởng việc sử dụng thuốc và hoá

chất trong quá trình nuôi đến tình hình bệnh trên cá tra (Pangasius

hypophthalmus) nuôi bè. Đề tài cấp Trường Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Thị Hiền, 2009. Ứng dụng kỹ thuật Knock-Out Gen trong nghiên cứu tạo

Vắc-xin phòng bệnh gan thận mủ cá Tra.Viện Nuôi trồng thủy sản 2. Cập nhật:

10/02/2009

Nguyễn Thị Vân Thái, Nguyễn Minh Phúc, Ngô Thị Kim, Nguyễn Kim Độ và Lưu

Thị Dung, 2006. Bàn về tiềm năng phòng và chữa trị bệnh nhiễm khuẩn bằng

kháng sinh thảo mộc trong nuôi trồng thủy sản.

http://www.ria1.org/modules/PDdownloads/orderby=dateD&start=20. Cập nhật: 27/06/2006

Nguyễn Thiện Nam, 2010. Nghiên cứu sự đa kháng thuốc của vi khuẩn E.ictaluri

gây bệnh trên cá tra (Pangasinodon hypophthalmus). Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ Volume: 14b-2010. 200-210.

Pachanawan.A., P.Phumkhachorn, and P.Rattanachaikunsopon, 2008. Potential of

Psidium guajava Supplemented Fish Diets in Controlling Aeromonas hydrophila Infection in Tilapia (Oreochromis niloticus). Journal of Bioscience and

Bioengineering Vol. 106, No. 5, 419–424. 2008

Phạm Đình Khôi, 2009. Đánh giá tính khả thi của việc chọn giống cá tra trên tính trạng kháng bệnh gan thận mủ. http://www.vienthuysàn.com/index.php. Cập

nhật 10/02/2009.

Phạm Thanh Liêm, A. B Abol-Munafi, M. A Ambak, S. S. Siraj và Đoàn Nhật Phương, 2008. Khả năng kháng bệnh của cá Trê lai (Clarias macrocephalus x

C.gariepinus) thế hệ F1 và con lai sau F1 với vi khuẩn Aeromonas hydrophila.

Tạp Chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2008 (2): 196-204

Phạm Văn Thư, 2006. Sử Dụng Vắc-xin Trong Nuôi Trồng Thủy Sản.

http://www.ria1.org/modules/pddownloads/singlefile.php?cid=30&lid=251. Cập

nhật 22/12/2006.

Phan Xuân Thanh, Nguyễn Đức Mạnh, Bùi Lai, Nguyễn Việt Tú, Nguyễn Thị Mỹ

Thanh, 2003. Khả năng sử dụng các hoạt chất sinh học thay thế các hóa chất độc

và kháng sinh trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Tuyển tập nghề cá sông Cửu

Long (số đặc biệt). Báo cáo khoa học hội thảo quốc gia nghiên cứu khoa học

phục vụ nghề nuôi trồng thủy sản ở các tỉnh phía Nam, Tp.Hồ Chí Minh ngày

20-21/12/2002. NXB Nông Nghiệp TP.Hồ Chí Minh. Trang 286-293

Sahoo, P.K et al, 2007. Innate immune responses in families of Indian major carp, labeo rohita, differeng in their resistance to Edwardsiella tarda infection.

Current Science, 9:1270-1275.

Stock and Bernd Wiedemann, 2001. Natural Antibiotic Susceptibilities of Edwardsiella tarda, E. ictaluri, and E. hoshinae. Antimicrobial agents and

Chemotherapy. Aug. 2001, p. 2245–2255. Vol. 45, No. 8.

Stosik, M., W. Deptula and M. Travncek, 2001. Resistance in crap (Cyprinus carpio

L) affected by natural bacterial infection. Vet. Med. Czech, 1:6-11.

Tu Thanh Dung, K. Chiers, Nguyen Anh Tuan, P. Sorgeloos, F. Van Immerseel,

2008. Study of the in vivo and in vitro interactions of Edwardsiella ictaluri, the

aetiological agent of bacillary necrosis in striped catfish (Pangasinodon hypophthalmus). Handbook and Abstracts Catfish Aquaculture in Asia: Present

status and challenges for sustainable development at Can Tho University Can

Tho city, Viet Nam December 5-7, 2008. 72 trang.

Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng

Thụy Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá Tra

(Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Thủy Sản 2004. Trang 137-142

Trần Anh Dũng, 2005. Khảo sát các tác nhân gây bệnh trong nuôi cá tra

(Pangasinodon hypophthalmus) thâm canh ở tỉnh An Giang. Luận văn Cao học. Khoa thủy sản, Đại học Cần Thơ.

Trần Thị Minh Tâm, Nguyễn Văn Hảo, Lý Thị Thanh Loan, Lưu Hồng Phước,

N.N.Du, L.H.Tài, N.T.M.Hoàng, N.T.H.Vân, T.H.Việt, N.T.M.Thanh, N.K.Giao, 2002. Nghiên cứu tác nhân gây bệnh hoại tử trên cơ quan nội tạng cá

tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tuyển tập nghề cá sông Cửu Long (số đặc

biệt). Báo cáo khoa học hội thảo quốc gia nghiên cứu khoa học phục vụ nghề nuôi trồng thủy sản ở các tỉnh phía Nam, Tp.Hồ Chí Minh ngày 20-21/12/2002.

NXB Nông Nghiệp TP.Hồ Chí Minh. Trang 315-323

Trần Thị Yến Nhi và Đặng Thị Hoàng Oanh (2010). Ảnh hưởng của chiết xuất từ

cây hoàng kỳ lên một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu của cá tra (Pangasianodon hypopthalmus). Tạp chí khoa học, Đại học Cần thơ.

Truong Thi Ho, Nontawith Areechon, Prapansak Srisapoome, Songsri

Mahasawasde, Mashashi Maita and Makoto Endo, 2008. Bacterial infection of

Striped Catfish (Pangasinodon hypophthalmus Sauvage, 1878) in Viet Nam. Handbook and Abstracts Catfish Aquaculture in Asia: Present status and

challenges for sustainable development at Can Tho University Can Tho city,

Viet Nam December 5-7, 2008. 72 trang.

Yin.G, G.Jeney, T.Racz, Pao Xu, Xie Jun and Z.Jeney, 2006. Effect of two Chinese

herbs (Astragalus radix and Scutellaria radix) on non-specific immune response

of tilapia, Oreochromis niloticus. Aquaculture 253 (2006) 39– 47

Yin.G., L. Ardób, K.D.Thompsonc, A.Adams, Z.Jeney and G.Jeney, 2008. Chinese herbs (Astragalus radix and Ganoderma lucidum) enhance immune response of

carp, Cyprinus carpio, and protection against Aeromonas hydrophila. Fish &

Shellfish Immunology (2008): 1-6

Zheng.Z.L., J.Y.W.Tan, H.Y.Liu, X.H.Zhou, X.Xiang and K.Y.Wang. 2009.

Evaluation of oregano essential oil (Origanum heracleoticum L.) on growth,

antioxidant effect and resistance against Aeromonas hydrophila in channel catﬁsh (Ictalurus punctatus). Aquaculture 292 (2009): 214–218

PHỤ LỤC A

Phương pháp pha hóa chất - Dung dịch Giemsa

Hóa chất Số lượng

Giemsa 3,8 g

Methyl alcohol Glycerine 75 ml 25 ml

Trộn Giemsa trong Glycerine, đặt trong tủ sấy 600C khoảng 2 giờ, sau đó thêm Methyl alcohol. - Dung dịch Wright

Số lượng

1 g

Hóa chất Wright’s Methyl alcohol 600 ml

Hòa tan Wright’s trong Methyl alcohol. Khấy qua đêm rồi lọc và trữ trong chai nâu.

Dung dịch đếm hồng cầu

Hóa chất Số lượng

3,88 g

2,5 g 1,09 g

0,25 g

7,5 ml 0,1 g

1000 ml NaCL Na2SO4 Na2HPO4.2H2O KH2PO4 Formaline (37%) Methyl violet H2O

Trộn tất cả các chất rồi thêm nước cất và khuấy qua đêm. Lọc và chuẩn độ đến khi pH=7,3 - Dung dịch pH 6,2-6,8

o Hòa tan 27,6 g NaH2PO4 trong 1000 ml nước cất (1). o Hòa tan 53,6 g Na2HPO4.7H2O trong 1000 ml nước cất (2).

Trộn (1) và (2) theo tỷ lệ theo bảng sau để có dung dịch pH cần pha

pH Dung dịch NaH2PO4 (ml) Dung dịch Na2HPO4 (ml) 5,9 6,1 90 85 10 15

6,3 77 23

6,5 6,7 68 57 32 43

6,9 45 55

7,1 7,3 33 23 67 77

7,4 19 81

7,5 7,7 16 10 54 90

- Dung dịch đệm pH 6,2

o Hòa tan 19,212 g acid citric 0,1M trong 1000 ml nước cất (1). o Hòa tan 28,396 g Na2HPO4 trong 1000 ml nước cất (2).

Trộn 6,78 ml dung dịch (1) và 13,22 dung dịch (2). Chuẩn độ cho đến khi được dung dịch pH 6,2.

Dung dịch nhuộm hồng cầu Natt-Herrick (Natt and Herrick, 1952) Cho tất cả các hóa chất sau vào 1000 ml nước cất, khuấy hỗn hợp trên bếp từ trường (không sử dụng nhiêt độ) để qua đêm, sau đó lọc qua giấy lọc, hiệu chỉnh pH dung

dịch về 7,3.

Hóa chất Lượng

3,88 g

2,5 g

2,91 g 0,25 g

7,5 ml

0,1 g NaCl Na2SO4 Na2HPO4 . 12 H2O KH2PO4 Formalin (37%) Methyl violet

PHỤ LỤC B

Sơ đồ thiết kế mẫu vào đĩa 96 giếng phân tích lysozyme

(cid:1) Trước cảm nhiễm

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

NT1:1 NT1:2 NT1:3 NT1:4 NT1:5 NT3:1 NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

(1)

A

NT1:1 NT1:2 NT1:3 NT1:4 NT1:5 NT3:1 NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

(2)

B

NT1:1 NT1:2 NT1:3 NT1:4 NT1:5 NT3:1 NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

(3)

C

NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4 NT2:5 NT4:1 NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

(4)

D

NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4 NT2:5 NT4:1 NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

(5)

E

NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4 NT2:5 NT4:1 NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

(6)

F

G

PBS

Blank Blank Blank

H

NT1: nghiệm thức 1 (cho ăn thức ăn bình thường, không tiêm vắc-xin, không tiêm vi khuẩn). NT3: nghiệm thức 3 (cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vắc-xin, tiêm vi khuẩn). NT2: nghiệm thức 2 (cho ăn hoàng kỳ, không tiêm vắc-xin, tiêm vi khuẩn). NT4: nghiệm thức 4 (cho ăn hoàng kỳ, tiêm vắc- xin, tiêm vi khuẩn). (1)-(6): đường chuẩn của lysozyme

(cid:1) Sau cảm nhiễm

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

(1)

A NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4 NT2:5 NT3:1 NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

(2)

B NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4 NT2:5 NT3:1 NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

(3)

C NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4 NT2:5 NT3:1 NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

(4)

D NT5:1 NT5:2 NT5:3 NT5:4 NT5:5 NT4:1 NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

(5)

E NT5:1 NT5:2 NT5:3 NT5:4 NT5:5 NT4:1 NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

(6)

F NT5:1 NT5:2 NT5:3 NT5:4 NT5:5 NT4:1 NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

G

PBS

Blank Blank Blank

H PBS

NT2: nghiệm thức 2 (cho ăn hoàng kỳ, không tiêm vắc-xin, tiêm vi khuẩn). NT3: nghiệm thức 3 (cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vắc-xin, tiêm vi khuẩn). NT4: nghiệm thức 4 (cho ăn hoàng kỳ, tiêm vắc-xin, tiêm vi khuẩn). NT5: nghiệm thức 5 (cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vi khuẩn). (1)-(6): đường chuẩn của lysozyme

PHỤ LỤC C

Sơ đồ thiết kế mẫu vào đĩa 96 giếng phân tích khả năng diệt khuẩn huyết thanh

(cid:1) Trước cảm nhiễm

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

NT1:5

NT3:1

NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

A NT1:1 NT1:2 NT1:3 NT1:4

NT1:5

NT3:1

NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

B NT1:1 NT1:2 NT1:3 NT1:4

NT1:5

NT3:1

NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

C NT1:1 NT1:2 NT1:3 NT1:4

NT2:5

NT4:1

NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

D NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4

NT2:5

NT4:1

NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

E NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4

NT2:5

NT4:1

NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

F NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4

G

H Blank Blank Blank Control Control Control

(cid:1) Sau cảm nhiễm

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

NT2:5

NT3:1

NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

A NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4

NT2:5

NT3:1

NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

B NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4

NT2:5

NT3:1

NT3:2 NT3:3 NT3:4 NT3:5

C NT2:1 NT2:2 NT2:3 NT2:4

NT5:5

NT4:1

NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

D NT5:1 NT5:2 NT5:3 NT5:4

NT5:5

NT4:1

NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

E NT5:1 NT5:2 NT5:3 NT5:4

NT5:5

NT4:1

NT4:2 NT4:3 NT4:4 NT4:5

F NT5:1 NT5:2 NT5:3 NT5:4

G

H Blank Blank Blank Control Control Control

PHỤ LỤC D

Bảng giá trị OD đọc ở bước sóng 530 nm (nồng độ lysozyme)

1 0.935 1.004

2 0.982 0.922

3 0.906 0.893

4 0.866 0.878

5 0.943 0.924

6 0.905 0.932

7 1.007 1.011

8 1.002 0.986

9 1.082 1.188

10 1.108 0.982

A B

0.935 0.901 0.920

0.950 1.018 0.970

0.941 1.007 1.019

0.874 0.947 0.960

0.961 0.945 0.978

0.991 1.133 1.128

0.978 0.887 0.869

1.222 1.077 1.014

1.115 0.990 1.076

0.976 1.086 1.031

C D E

0.911

0.990

0.922

0.943

0.963

1.119

0.920

1.056

0.958

1.061

F G

0.894

0.872

0.887

0.038

Trước cảm nhiễm

10 0.934 0.947 0.972 0.895 0.975 0.931 0.892 0.996 0.957 0.903 0.939 0.937 0.958 0.951 0.953 0.982 0.949 0.946 1.011 0.903 0.937 0.937 0.950 0.944 0.984 0.982 0.927 0.969 0.989 0.905 0.981 0.961 0.988 0.981 0.999 1.000 0.937 0.946 0.985 0.891 0.981 0.958 0.959 0.992 0.962 1.006 0.951 0.896 0.979 0.927 0.945 0.967 0.919 0.994 1.011 1.034 0.957 0.951 1.002 0.916 0.041 0.944 0.967 0.939

A B C D E F H

Sau cảm nhiễm

7 0.654 0.129 0.164 0.126 0.816 0.164 0.253 0.612 0.117 0.146 0.123 0.618 0.129 0.169 0.492 0.126 0.173 0.144 0.654 0.125 0.188 0.495 0.150 0.306 0.144 0.562 0.188 0.194 0.433 0.136 0.223 0.120 0.142 0.182 0.235 0.652 0.442 0.268 0.150 0.168 0.341 0.172

10 0.388 0.387 0.297 0.322 0.458 0.323 0.466 0.291 0.218 0.215 0.325 0.398 0.285 0.139 0.385 0.169 0.308 0.294

A B C D E F

Giá trị OD đọc ở bước sóng 600 nm (khả năng diệt khuản của huyết thanh)

1 7 0.246 0.14 0.177 0.243 0.235 0.183 0.156 0.353 0.145 0.169 0.15 0.185 0.237 0.201 0.12 0.768 0.174 0.119 0.15 0.123 0.272 3.252 2.886 1.026 1.278 1.213 0.114 0.161 3.682 2.241 1.061 1.257 1.271 0.488 0.35 4.104 2.711 1.793 1.586 1.440 0.133 0.494

10 0.158 0.374 0.366 0.153 0.199 0.338 0.161 0.173 0.159 0.082 0.194 0.26 0.105 0.138 0.167 0.355 0.161 0.283

A B C D E F

Sau cảm nhiễm