TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC HYDROCOLLOID LÊN HIỆU
SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN
ACETOBACTER XYLINUM
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Lê Hoàng Bảo
Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm
Tp.HCM, tháng 12 năm 2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC HYDROCOLLOID LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Lê Hoàng Bảo
Mã số sinh viên : 1511539234
Lớp : 15DTP1A
Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm
Giáo viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Quốc Duy
Tp.HCM, tháng 10 năm 2019
TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM & MÔI TRƯỜNG
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2019
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Nguyễn Lê Hoàng Bảo Mã số sinh viên: 1511539234
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Lớp: 15DTP1A
1. Tên đề tài:
ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC HYDROCOLLOID LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM
2. Nhiệm vụ luận văn
˗ Khảo sát ảnh hưởng của xanthan gum ở những nồng độ khác nhau lên hiệu suất
sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.
˗ Khảo sát ảnh hưởng của microcrystalline cellulose ở những nồng độ khác nhau
lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.
˗ Khảo sát ảnh hưởng của konjac ở những nồng độ khác nhau lên hiệu suất sinh
tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.
3. Ngày giao nhiệm vụ luận văn: 15/6/2019
4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ luận văn: 15/11/2019
5. Người hướng dẫn:
Họ và tên Học hàm, học vị Đơn vị Phần hướng dẫn
Nguyễn Quốc Duy ...... Thạc sĩ ............................ BM CNTP ....................... 100%
Nội dung và yêu cầu của luận văn đã được thông qua bộ môn.
Trưởng Bộ môn Người hướng dẫn
(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)
ThS. Nguyễn Thị Vân Linh ThS. Nguyễn Quốc Duy
LỜI CẢM ƠN
Để có được thành công như ngày hôm nay, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, gia đình và bạn bè. Trước hết, tôi xin cảm ơn giáo viên hướng dẫn
của tôi, thầy Nguyễn Quốc Duy về những hướng dẫn và lời khuyên có giá trị. Tôi cảm
thấy có động lực hơn trong suốt ba tháng làm thí nghiệm. Cô đã truyền cảm hứng cho tôi rất nhiều để hoàn thành dự án này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô
trong Khoa Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường đã cung cấp cho tôi những thông tin,
hướng đi và nền tảng kiến thức cần thiết cho tôi đạt được những mục đích học tập của
mình.
Tôi muốn cảm ơn các anh chị trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ tôi trong khoảng
thời gian qua. Nếu không có sự hiểu biết của anh chị về các thiết bị thì việc hoàn thành
dự án của tôi sẽ rất khó khăn. Cuối cùng, tôi dành một sự cảm ơn đến gia đình, bạn bè
cho một tình yêu thương và giúp đỡ ấy.
Tôi xin kính chúc Quý thầy cô Khoa Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường và thầy
Nguyễn Quốc Duy dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục sứ mệnh trồng người cao đẹp
của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau.
iv
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài “Ảnh hưởng của các hydrocolloid lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum” là công trình nghiên
cứu của cá nhân tôi đã thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Quốc Duy. Các
số liệu và kết quả được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, không sao chép của bất cứ ai, và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học của
nhóm nghiên cứu nào khác cho đến thời điểm hiện tại.
Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của
mình và chấp nhận những hình thức xử lý theo đúng quy định.
Tp.HCM, ngày 25 tháng 11 năm 2019
Tác giả luận văn
(Ký và ghi rõ họ tên)
Nguyễn Lê Hoàng Bảo
v
TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của các hydrocolloid lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum được khảo sát. Hiệu quả của quá trình lên men
cellulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số
lượng vi sinh vật trong canh trường lên men, hiệu suất sinh tổng hợp cellulose và bề dày của lớp cellulose hình thành.
Lượng đường ban đầu 50g/l của môi trường HS giảm mạnh từ ngày 0 (44.862) đến
ngày 7 (8.078) và những ngày sau bắt đầu giảm từ từ cho đến khi môi trường cạn kiệt
cơ chất. Việc không hình thành được cellulose là do vi sinh vật chỉ sử dụng đường để tăng sinh khối.
KJ 0.2% đạt hiệu quả tốt nhất về khối lượng BC (6.97 gDW/L) và độ dày BC
(3.54mm). XG ở các nồng độ 0.1%,0.2% và 0.3% thu được sự ổn định về khối lượng
cellulose (4.96 gDW/L - 6.52gDW/L) và độ dày cellulose (2.54mm-2.67mm) khá
tương đồng nhau MCC ở các nồng độ luôn ở mức hiệu quả thấp nhất.
vi
MỤC LỤC
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ........................................................... iii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ iv
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................v
TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ............................................................. vi
MỤC LỤC ............................................................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... ix
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... xi
Chương 1. MỞ ĐẦU .........................................................................................1
1.1 TÍNH CẤP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI .......................................1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .........................................................................1
1.2.1 Mục tiêu tổng quát ...................................................................................1
1.2.2 Mục tiêu cụ thể.........................................................................................2
1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .........................................................................2
Chương 2. TỔNG QUAN.................................................................................3
2.1 VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM ................................................3
2.1.1 Đặc điểm hình thái ...................................................................................3
2.1.2 Đặc điểm sinh lý ......................................................................................4
2.2 QUÁ TRÌNH LÊN MEN CELLULOSE ....................................................4
2.2.1 Thành phần môi trường lên men ..............................................................4
2.2.2 Phương pháp lên men ..............................................................................4
2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng ..............................................................................5
2.3 CELLULOSE VI KHUẨN ...........................................................................6
Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............7
3.1 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT ......................................................7
3.1.1 Dụng cụ - thiết bị .....................................................................................7
3.1.2 Hóa chất ...................................................................................................7
vii
3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................9
3.2.1 Thời gian nghiên cứu ...............................................................................9
3.2.2 Địa điểm nghiên cứu ................................................................................9
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................9
3.3.1 Quá trình nhân giống vi sinh vật ..............................................................9
3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose ..............................................9
3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .................................................................10
3.4.1 Xác định hàm lượng cellulose sinh tổng hợp ........................................10
3.4.2 Xác định hàm lượng vi sinh vật .............................................................10
3.4.3 Xác định hàm lượng đường khử ............................................................10
3.4.4 Xác định độ acid tổng ............................................................................10
3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ..........................................................11
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................12
4.1 QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP CELLULOSE .................12
4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA HYDROCOLLOID LÊN pH VÀ ĐỘ ACID TỔNG .......................................................................................................................14
4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA HYDROCOLLOID LÊN HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG ....................................................................................... Error! Bookmark not defined.
4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA HYDROCOLLOID LÊN SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT ...........................................................................................................................17
4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA HYDROCOLLOID LÊN TỔNG HỢP CELLULOSE ............................................................... Error! Bookmark not defined.
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ .............................................20
5.1 KẾT LUẬN ..................................................................................................20
5.2 KHUYẾN NGHỊ .........................................................................................20
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................21
viii
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi ..................................4
Hình 3.1 Máy quang phổ UV-1800 (Shimadzu Schweiz GmbH) ...................................7
Hình 3.2 Máy ly tâm 80-2 (Wincom Company Ltd.) ......................................................7
Hình 3.3 Cân phân tích PA (OHAUS Instruments Co.,Ltd.) ..........................................8
Hình 3.4 Tủ sấy UN55 (Memmert GmbH + Co.KG) .....................................................8
Hình 4.1 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng
hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. .........................................................................................12
Hình 4.2 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi
vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. ...............................................................................................................................13
Hình 4.3 Sự thay đổi hàm lượng glucose của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi
vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. ...............................................................................................................................14
Hình 4.4 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên pH của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose
bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. .........................................................................................................................15
Hình 4.5 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên độ acid tổng của dịch lên men sinh tổng hợp
cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. .............................................................................................................15
Hình 4.6 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên hàm lượng đường của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. .........................................................................................16
Hình 4.7 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên hàm lượng đường của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. .........................................................................................17
Hình 4.8 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên khối lượng cellulose sinh tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. ..18
ix
Hình 4.9 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên khối lượng cellulose sinh tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L. ..18
x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Thuật ngữ tiếng Anh
Thuật ngữ tiếng Việt
BC
Bacterial cellulose
Cellulose vi khuẩn
BC_W
Width of bacterial cellulose layer
Chiều dày lớp cellulose
Hestrin-Schramm medium
Môi trường Hestrin-Schramm
HS
Total acidity
Độ acid tổng
TA
On a dry weight
Theo chất khô
DW
Xanthan gum
Xanthan gum
XG
MCC
Microcrystalline cellulose
Cellulose vi tinh thể
Konjac
Konjac
KJ
xi
Chương 1. MỞ ĐẦU
1.1 TÍNH CẤP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Cellulose là đại phân tử phong phú nhất trên trái đất và hầu hết cellulose được sản
xuất bởi thực vật. Cellulose bao gồm các homopolymer của -1,4-glucose. Mức độ
trùng hợp của cellulose thay đổi từ 100–15000 đơn vị glucose với sự kết tinh của các chuỗi tuyến tính dài để tạo thành các vi sợi của một thực thể tinh thể duy nhất [1]. Khi
cellulose được xử lý bằng acid đậm đặc ở nhiệt độ cao thì cấu trúc của nó sẽ bị phân
hủy thành các đơn vị glucose [2]. Cellulose là thành phần cấu trúc chính tạo nên thành
tế bào của hầu hết các loại thực vật và nó chủ yếu được lấy từ các nguồn thực vật từ
sợi lông, gỗ có chứa khoảng 40-90% là cellulose. Cellulose có giá trị thương mại trong sản xuất giấy, sợi nano cellulose [3], [4].
Ngoài thực vật, cellulose cũng được tìm thấy trong nhiều vi sinh vật như nấm, vi
khuẩn và tảo. Báo cáo đầu tiên về cellulose được sản xuất từ vi khuẩn (bacterial
cellulose – BC), đặc biệt từ A. xylinum, được công bố vào năm 1996 [5]. Các nghiên
cứu gần đây đã tiết lộ rằng BC có thể được sản xuất bởi các vi khuẩn, bao gồm cả các
loại vi khuẩn Gram âm như Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas, Salmonella, Alcaligenes, cũng như vi khuẩn Gram dương như Sarcina ventriculi.
Mặc dù quá trình hình thành cellulose của A. xylinum đã được nghiên cứu khá
nhiều trong các nghiên cứu trước đó, hầu hết các nghiên cứu đã giải quyết việc làm
sáng tỏ quá trình sinh tổng hợp cellulose, và hầu hết các chủng được nghiên cứu cho
đến nay chỉ tạo ra một lượng cellulose nhỏ [6]–[8]. Hơn nữa, một môi trường tiêu
chuẩn được sử dụng để canh tác các sinh vật sản xuất vi khuẩn như môi trường
Hestrin-Schramm rất tốn kém và đòi hỏi nhiều nguồn bổ sung dinh dưỡng trong quá
trình nuôi cấy [9]. Để tăng hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A. xylinum,
nhiều nghiên cứu được thực hiện bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy các phụ gia tạo cấu trúc như xanthan, alginate, carboxymethyl cellulose. Nghiên cứu này được thực hiện để đánh giá hiệu quả của một số hydrocolloid lên việc hỗ trợ sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1.2.1 Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu nguồn sinh tổng hợp cellulose từ vi sinh vật với nhiều ưu điểm so với
cellulose từ thực vật ứng dụng trong công nghiệp vật liệu và y học.
1
1.2.2 Mục tiêu cụ thể
Khảo sát ảnh hưởng của các loại hydrocolloid khác nhau lên hiệu suất sinh tổng
hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.
1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Khảo sát ảnh hưởng của xanthan gum ở những nồng độ khác nhau lên hiệu suất
sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Khảo sát ảnh hưởng của microcrystalline cellulose ở những nồng độ khác nhau lên
hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Khảo sát ảnh hưởng của konjac ở những nồng độ khác nhau lên hiệu suất sinh
tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.
2
Chương 2. TỔNG QUAN
2.1 VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM
Giới : Bacteria
Ngành : Proteobacteria
Lớp : Alpharoteobacteria
Bộ : Rhodospirillales
Họ : Acetobacteraceae
Chi : Acetobacter
Loài : Acetobacter xylinum
2.1.1 Đặc điểm hình thái
Acetobacter xylinum là một loại vi sinh vât Gram âm, hiếu khí được biết đến như
Gluconacetobacter xylinum, có đặc tính sinh tổng hợp cellulose. Độ dài của A. xylinum
nằm trong khoảng 2–10 µm, với chiều rộng nằm trong phạm vi 0.5–1 µm [6]. A.
xylinum thường phát triển ở độ pH từ 5.4-6.3 và nhiệt độ khoảng 28–31C và có thể
tích lũy 4.5% acid acetic. Một tế bào A. xylinum có khả năng polymer hóa 200000
phân tử glucose/giây tạo thành β-1,4-glucan và sau ñó được bài tiết vào môi trường xung quanh tạo thành dạng sợi. A. xylinum được tìm thấy trên trái cây, ngũ cốc, trà
thảo dược, rau hư, đất, nước, hoa, trái cây và mật ong, nơi xảy ra quá trình lên men
đường [10]. Sự tăng trưởng của chúng có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố vật lý và
sinh hóa. Các yếu tố vật lý bao gồm pH, nhiệt độ, oxy nồng độ, độ ẩm, áp suất (thủy
tĩnh và thẩm thấu) và bức xạ. Mặt khác, các yếu tố sinh hóa bao gồm sự sẵn có của
carbon, nitrogen, lưu huỳnh, phosphor, và vitamin [11].
Những vi khuẩn này còn được gọi là vi khuẩn acid acetic có khả năng tạo thành acid từ glucose, rượu ethyl, rượu propyl chứ không phải oxy hóa acid thành carbon dioxide và nước với sự có mặt của oxy. Đặc điểm nổi bật của vi khuẩn này là khả năng trùng hợp glucose thành cellulose chỉ qua quá trình tổng hợp, những vi khuẩn này được hình thành khi có sự kết hợp của 6 đến 8 tế bào và không tạo thành sắc tố nội bào.
A. xylinum có khả năng chống lại những thay đổi đột ngột như khi giảm lượng nước hoặc khi có sự hiện diện của các chất độc hại và những sinh vật gây bệnh. Mặc dù thời tiết không thuận lợi nhưng A. xylinum có thế phát triển và sản xuất cellulose
trong màng bao. Có 23% tế bào vi khuẩn được bao bọc cellulose tồn tại sau khi được
3
xử lý bằng bức xạ UV, loại bỏ các polysaccharide để có thể bảo vệ cellulose khỏi tế
Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi
bào vi khuẩn dẫn đến việc giảm mạnh tỷ lệ sống của vi khuẩn là 3% [12].
2.1.2 Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ từ 28–32C. Ở nhiệt độ 37C, hầu hết
các tế bào đều bị suy thoái hoàn toàn ngay cả ở môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn
nhiều khảo sát khác nhau về các yếu tố như nhiệt độ và pH tối ưu cho vi khuẩn A. xylinum sinh trưởng và tạo màng. Vi khuẩn A. xylinum có thể chịu được pH thấp, do
đó có thể bổ sung acid acetic vào môi trường để nuôi cấy sẽ hạn chế được sự nhiễm
khuẩn lạ.
2.2 QUÁ TRÌNH LÊN MEN CELLULOSE
2.2.1 Thành phần môi trường lên men
Nước dừa được sử dụng tốt nhất trong sản xuất biocellulose, vì chứa nhiều amino
acid giúp tăng trưởng, phát triển hoạt động của A. xylinum. Để tăng trưởng và hoạt
động, A. xylinum đòi hỏi các yếu tố đa lượng và vi lượng. Các yếu tố đa lượng được làm từ carbon và nitrogen. Ngoài carbohydrate và protein, trong nước dừa còn chứa nhiều khoáng chất cần thiết cho A. xylinum như: K, Na, Mg, Ca, P. Loại nước dừa tốt nhất có thể được lấy từ trái dừa già. Mặt khác trong nước dừa non hầu như không chứa khoáng chất cần thiết [13].
2.2.2 Phương pháp lên men
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A. xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn, rìa
mép khuẩn lạc thường gợn sóng có màu trắng, khuẩn lạc lồi lên thuận tiện cho việc dễ
tách ra khỏi môi trường. Do vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường lỏng ở điều kiện
4
tĩnh nên chúng hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose. Trong điều kiện nuôi
lắc, cellulose hình thành những hạt nhỏ có kích thước không bằng nhau và phân tán trong môi trường tạo thành những đặc tính hình thái khác với cellulose được nuôi cấy
ở điều kiện tĩnh [14].
2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng
2.2.3.1 Nguồn carbon
Trong số các nguồn carbon, sucrose, glucose và mannitol là những nguồn carbon tối ưu cho sự hình thành cellulose. Sucrose 60 g/L là hàm lượng cơ chất tối ưu cho
sinh tổng hợp cellulose trong khi 70 g/L là giá trị tối ưu cho glucose và mannitol với hiệu suất sinh tổng hợp cellulose là 5.0 g/L. Ngoài ra, lactose, galactose, acid citric ,
tinh bột và maltose cũng cho hiệu suất sinh tổng hợp celllulose là 2.0 g/L [15].
2.2.3.2 Nguồn nitrogen
Nguồn nitrogen có thể được sử dụng trong hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ. Chiết xuất
men và casein là những sản phẩm tốt được sử dụng cho sự tăng trưởng và hình thành
biocellulose. Những nguồn nitrogen có thể được sử dụng bao gồm casein hydrolysate,
peptone, glutamate và ammonium sulfate [15]. Tuy nhiên, ammonium sulfate và
ammonium phosphate là những vật liệu phù hợp hơn được sử dụng về mặt kinh tế và
năng suất chất lượng của biocellulose [16].
Trong môi trường lên men chứa sucrose, việc bổ sung bột đậu nành hoặc
ammonium sulfate thu được ít cellulose hơn khi sử dụng peptone hay casein
hydrolysate. Điều này cho thấy rằng nguồn nitrogen cũng đóng góp vào việc cải thiện
sự sinh tổng hợp cellulose [15].
2.2.3.3 pH
A. xylinum là một loại vi khuẩn ưa acid có thể phát triển trong môi trường pH thấp.
Nó có thể sống ở pH thấp tới 3.5 [17]. Độ pH tối ưu nằm trong khoảng từ 5.4–6.3 [18]. Các giá trị pH thuận lợi nhất cho sự hình thành cellulose của vi khuẩn ở pH 4.0 và 5.0 [10]. Những giá trị pH thúc đẩy tăng trưởng tối ưu và ảnh hưởng đến oxy hấp thu trong quá trình lên men. Hầu hết các nhà nghiên cứu đã sử dụng pH 5.0 [17], [19].
2.2.3.4 Nhiệt độ
Nhiệt độ để A. xylinum phát triển tối ưu từ 28–31C. Ở nhiệt độ dưới 28C vi
khuẩn phát triển chậm trong khi ở nhiệt độ trên 31C bắt đầu gây ra thiệt hại cho A.
xylinum và có thể dẫn đến tử vong [16].
5
2.2.3.5 Oxy
Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí do đó chúng rất cần oxy trong quá trình sinh trưởng, phát triển. Khi thiếu oxy vi khuẩn này sẽ bị gián đoạn tăng trưởng có thế
dẫn đến tử vong. Do đó những thùng chứa được sử dụng cho quá trình lên men cần
phải được mở thoáng [16].
2.3 CELLULOSE VI KHUẨN
Cellulose tương đối tinh khiết được sản xuất bởi vi khuẩn A. xylinum. Vi sinh vật này đã được nghiên cứu trong hơn 100 năm. Không giống như cellulose từ bột gỗ,
cellulose vi khuẩn không có các polysaccharide tạp khác như lignin và hemicellulose. Ngoài ra, sự phân lập và tinh chế của nó tương đối đơn giản, không cần các quá trình
sử dụng nhiều năng lượng hoặc hóa học [20]. Vi khuẩn này đã được sử dụng làm hệ
thống mô hình trong việc khám phá các quá trình sinh học [21], [22]. Các vi sinh vật
sản xuất polysacchride rất đơn giản và có khả năng tạo nên một polymer từ các nguyên
liệu đơn giản có sẵn và các nguồn nguyên liệu thứ cấp. Các sản phẩm từ củ cải đường
(mật đường, syrup đường và sucrose), ngô (tinh bột, tinh bột thủy phân, syrup glucose
và glucose), và khoai tây (tinh bột thủy phân và tinh bột) có thể được sử dụng để sản
xuất các polymer như vậy. Các chất không ăn được như gỗ, chất thải sản xuất dextran,
chất thải hóa dầu và các sản phẩm, ethanol, methanol, glycerin và ethylene glycol
thường phù hợp [23].
BC có hình thái, cấu trúc, tính chất và ứng dụng khác nhau tùy thuộc vào loại vi
sinh vật sinh tổng hợp ra chúng. Trong số các vi khuẩn đã nói ở trên, các nguồn hiệu
quả nhất để sản xuất BC là A. xylinum, A. hansenii và A. pasteurianus. Trong số này, A.
xylinum đã được sử dụng để sản xuất BC thương mại do năng suất cao. Mặc dù cả
cellulose thực vật và BC đều được sản xuất trong tự nhiên, nhưng sự thay đổi đáng kể
đã được tìm thấy giữa chúng về độ tinh khiết, tính chất phân tử và đặc tính. So với cellulose thực vật, BC có giá trị module Young cao [24]–[26], khả năng hấp thụ nước cao [27] làm cho nó trở thành vật liệu hữu ích trong nhiều ngành công nghiệp, như thực phẩm, sản xuất giấy và ứng dụng dược phẩm.
6
Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT
3.1.1 Dụng cụ - thiết bị
Cốc thuỷ tinh Giá ống nghiệm
pH kế Pipet
Erlen Bình định mức
Nhiệt kế Ống nghiệm
Bình định mức Ống ly tâm
Cốc thuỷ tinh Phễu
Micropipet Đũa thuỷ tinh
3.1.2 Hóa chất
Chế phẩm enzyme cellulase (Viscozyme®L, Novozymes, Đan Mạch) dạng lỏng
có hoạt tính 100 FBG/g.
Glucose, peptone, chất chiết men, Na2HPO4, citric acid monohydrate, ammonium
Hình 3.1 Máy quang phổ UV-1800
Hình 3.2 Máy ly tâm 80-2 (Wincom
(Shimadzu Schweiz GmbH)
Company Ltd.)
sulfate, acid acetic, sodium acetate, nước cất… đều đạt chuẩn phân tích.
7
Hình 3.3 Cân phân tích PA (OHAUS
Instruments Co.,Ltd.)
Hình 3.4 Tủ sấy UN55 (Memmert GmbH + Co.KG)
8
3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
3.2.1 Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 15 tháng 6 năm 2019 đến ngày 15 tháng 10
năm 2019.
3.2.2 Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa phân tích, trường ĐH
Nguyễn Tất Thành, 331 Quốc lộ 1A, Phường An Phú Đông, Quận 12, Tp.HCM.
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Quá trình nhân giống vi sinh vật
Trong nghiên cứu này, môi trường Hestrin-Schramm (HS) được sử dụng để nuôi
cấy vi khuẩn A. xylinum. Thành phần của môi trường HS bao gồm (g/L): glucose (20.0), peptone (5.0), chất chiết men (5.0), Na2HPO4 (2.7), and citric acid monohydrate (1.15) và pH được hiệu chỉnh về giá trị 5.0 [28]. Môi trường được bổ
sung thêm ammonium sulfate (4 g/L) để kích thích quá trình tăng sinh khối.
Giống vi khuẩn được nhân giống cấp 1 tại cơ sở sản xuất thạch dừa (Sơn Phú,
Giồng Trôm, Bến Tre) trên môi trường nước dừa già có bổ sung ammonium sulfate (4
g/L) và diammonium phosphate (1 g/L) để kích thích tăng trưởng trong khoảng thời
gian 3 ngày ở nhiệt độ 30C.
Giống vi khuẩn hoạt hóa được nhân giống cấp 2 trên môi trường HS sử dụng tỷ lệ
giống cấy 10% ở nhiệt độ 30C trong 5 ngày. Sau 5 ngày nhân giống, giống vi khuẩn
được cấy vào môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp cellulose ở tỷ lệ giống cấy 10% và
tiến hành lên men tĩnh ở nhiệt độ 30C trong 15 ngày. Sau mỗi ngày lên men, màng
cellulose (nếu hình thành) được tách trực tiếp ra khỏi môi trường và được xử lý trước
khi xác định khối lượng. Phần dịch lên men còn lại được sử dụng để phân tích các chỉ tiêu khác bao gồm: pH, độ acid tổng, hàm lượng đường khử, hàm lượng vi khuẩn.
3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose
Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum được thực hiện trên môi trường HS như mô tả trong phần trên với nồng độ cơ chất ban đầu là 50 g/L
với tỷ lệ giống cấy 10%. Ngoài ra, 3 loại hydrocolloid khác nhau được bổ sung vào môi trường bao gồm xanthan gum (XG), microcrytalline cellulose (MCC) và konjac (KJ) với hàm lượng 0.1, 0.2 và 0.3%. Quá trình lên men tĩnh được thực hiện trong 13
9
ngày ở nhiệt độ 30C. Sau khi quá trình lên men kết thúc, dịch lên men và lớp màng
cellulose tạo thành được phân tích xác định các chỉ tiêu hóa lý.
3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
3.4.1 Xác định hàm lượng cellulose sinh tổng hợp
Đầu tiên, màng cellulose được ngâm trong dung dịch NaOH 2% trong 30 phút ở
nhiệt độ 80C để loại bỏ các tạp chất và tế bào bám trên màng. Sau đó, màng được tiếp
tục ngâm trong dung dịch acid acetic 2% trong 30 phút ở nhiệt độ 80C để trung hòa
lượng base và được rửa bằng nước cất để đưa về pH trung tính. Màng cellulose sau khi
rửa sạch được sấy tới khối lượng không đổi ở 105C để xác định khối lượng khô. Hàm
lượng cellulose sinh tổng hợp được biểu diễn theo đơn vị g chất khô cellulose trong 1
L dịch lên men [29].
3.4.2 Xác định hàm lượng vi sinh vật
Canh trường (2 mL) được định mức lên 10 mL sử dụng dung dịch đệm acetate 0.1 M (pH 5.0) có chứa cellulase 1% (v/v) và tiến hành quá trình thủy phân trong 2 h ở
50C. Sau quá trình thủy phân, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Whatman No.2 và hàm
lượng vi sinh vật được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm [30].
3.4.3 Xác định hàm lượng đường khử
Hàm lượng đường khử được xác định bằng phương pháp dinitro salicylic acid
(DNS) [31]. Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo phức có màu vàng giữa đường
khử và thuốc thử DNS có bước sóng hấp thu cực đại ở 540 nm. 2 mL dịch lên men sau
khi pha loãng được bổ sung 1 mL thuốc thử DNS và đun sôi trong 10 phút. Sau khi
làm nguội về nhiệt độ phòng, mẫu được đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm. Hàm
lượng đường khử được tính toán dựa vào đường chuẩn glucose và được biểu diễn bằng
đơn vị g/L .
3.4.4 Xác định độ acid tổng
Độ acid tổng của dịch lên men được xác định bằng phương pháp chuẩn độ acid- base sử dụng dung dịch NaOH 0.05 N làm dung dịch chuẩn độ với chỉ thị màu phenolphthalein. Độ acid tổng được biểu diễn theo đơn vị gam acid acetic trong 1 L
dịch lên men.
10
3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Dữ liệu thực nghiệm được phân tích bằng phần mềm SPSS 15 (SPSS Inc. Chicago, U.S.A) sử dụng những kỹ thuật thống kê cơ bản. Phân tích phương sai một nhân tố
(one-way ANOVA) được áp dụng để xác định sự khác nhau giữa các chế độ xử lý mẫu
và Tukey’s Multiple Range test được áp dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa giữa
các giá trị trung bình ở mức ý nghĩa 5%. Tất cả thí nghiệm và những chỉ tiêu phân tích được lặp lại 3 lần.
11
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1 QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP CELLULOSE
Trong môi trường không bổ sung các hydrocolloid, quá trình lên men sinh tổng
hợp cellulose của A. xylinum được mô tả như sau. Các tiêu chí sử dụng trong quá trình
5
9
4.5
8
4
7
3.5
6
3
5
2.5
H p
4
2
) L / d i c a c i t e c a g (
3
A T
1.5
2
1
1
0.5
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Day
pH
TA
Hình 4.1 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L.
khảo sát là pH, độ acid tổng, hàm lượng đường khử, số lượng vi sinh vật.
Sự thay đổi PH và độ acid tổng của dịch lên men trong môi trường HS được biểu
thị qua Hình 4.1. Kết quả cho thấy rằng sự thay đổi PH và độ acid tổng của dịch lên
men trong môi trường HS cũng có chiều hướng giảm và giảm mạnh từ ngày 0 đến
ngày 7 và do PH giảm nên dẫn tới lượng axit tổng của môi trường tăng.
Những nghiên cứu khác cũng cho rằng khi pH giảm xuống dưới 4.0, quá trình lên men tĩnh tạo ra cellulose bắt đầu xảy ra [10]. Theo tác giả Jagannath et al. (2008), không có sự hình thành cellulose trong giai đoạn đầu của quá trình lên men của vi khuẩn A. xylinum. Cellulose chỉ được hình thành sau ngày thứ 3. Trong suốt thời gian
đầu, canh trường lên men trở nên đục hơn [34].
Vi khuẩn A. xylinum ưa thích môi trường acid nhẹ để tổng hợp cellulose [37]. Do đó, việc tăng giá trị pH môi trường lên men làm giảm đáng kể quá trình tổng hợp
12
cellulose do sự sinh trưởng của vi khuẩn kém trong điều kiện này cũng như việc ức
chế các enzyme tham gia vào quá trình hình thành cellulose [28].
Việc điều chỉnh pH môi trường rất quan trọng để thu được hiệu suất thu hồi
cellulose cao [38], [39]. Sự oxy hóa glucose bởi enzyme glucose dehydrogenase liên
kết màng tế bào tạo nên acid gluconic và làm giảm pH môi trường. Nếu pH môi
0.12
0.1
0.08
0.06
0 0 6 D O
0.04
0.02
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Day
Hình 4.2 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng
glucose ban đầu 50 g/L.
trường giảm xuống dưới 3.0, quá trình tổng hợp cellulose bị ức chế [14].
Sự thay đổi số lượng vi sinh vật của dịch lên men trong môi trường HS được biểu
thị qua Hình 4.2. Kết quả cho thấy rằng số lượng vi sinh vật phát triển liên tục từ ngày
0 đến ngày 7 nhưng từ ngày 8 thì giảm nhẹ và ngày 9 và ngày 10 thì vi sinh vật không
tăng nhiều nhưng từ ngày 11 đến ngày 13 thì vi sinh vật bắt đầu giảm.
Sự thay đổi hàm lượng đường của dịch lên men trong môi trường HS được biểu thị qua hình 4.3. Kết quả cho thấy rằng lượng đường giảm mạnh từ ngày 0 đến ngày 7 và bắt đầu giảm từ từ cho đến hết. Việc không hình thành được cellulose là do vi sinh vật chỉ sử dụng đường để tăng sinh khối.
Trong nghiên cứu này, việc sử dụng môi trường có hàm lượng cơ chất ban đầu trên 10% mới có khả năng thúc đẩy việc cải thiện sinh tổng hợp cellulose. Kết quả này
phù hợp với kết quả của tác giả Jagannath et al. (2008) [34]. Tuy nhiên, tác giả
13
Embuscado et al. (1994) lại kết luận rằng nồng độ chất khô trên 5% không có ảnh
hưởng lên sự sinh tổng hợp cellulose [20].
Tiền chất của cellulose trong quá trình lên men của A. xylinum là uridine
diphosphoglucose nên sự tổng hợp BC có liên quan tới việc sử dụng cơ chất glucose
hoặc fructose là nguồn carbon [12]. Cellulose hình thành có hàm lượng chất khô 1%
60
50
40
30
) L / g ( e s o c u l G
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Day
Hình 4.3 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L.
với khả năng ưa nước và giữ nước tốt [36].
4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA HYDROCOLLOID LÊN QUÁ TRÌNH LÊN MEN
Khi bổ sung hydrocolloid vào môi trường lên men, ảnh hưởng của loại
hydrocolloid và nồng độ của chúng lên quá trình lên men cellulose được mô tả sau đây.
Các hydrocolloid sử dụng bao gồm xanthan gum (XG), microcrystalline cellulose (MCC) và konjac (KJ) với hàm lượng 0.1, 0.2 và 0.3%.
4.2.1 pH và độ acid tổng
14
4.0
3.5
a
e
de
3.0
bd
bd
b
b
bc
bc
c
2.5
2.0
H p
1.5
1.0
0.5
0.0
Hình 4.4 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên pH của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi
khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L.
12
e
10
c
8
b
b
b
ab
ab
ab
a
d
6
) L / d i c a c i t e c a g (
A T
4
2
0
Hình 4.5 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose
ban đầu 50 g/L.
15
PH khi bổ sung các chất phụ được biểu thị qua hình 4.4. Kết quả cho thấy rằng ở
các nồng độ chất phụ gia cho vào không làm thay đổi pH quá nhiều gần như là tương đương nhau.
Độ acid tổng của dịch lên men trong môi trường HS có bổ sung phụ gia được biểu
thị qua Hình 4.5. Kết quả cho thấy độ acid tổng của dịch lên men trong môi trường HS
ở nồng độ KJ 0.3% XG 0.3% thì độ acid đạt mức cao nhất khi so với các nồng độ và phụ gia khác. Các nồng độ còn lại thì độ acid không có sự thay đổi nhiều và khá gần nhau.
6
c
c
5
b
b
b
b
b
e
4
d
3
) L / g ( e s o c u l G
2
a
1
0
Hình 4.6 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên hàm lượng đường (g/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50
g/L.
4.2.2 Hàm lượng đường
Hàm lượng đường của dịch lên men trong môi trường HS được biểu thị qua
Hình 4.6. Kết quả cho thấy rằng hàm lượng đường của dịch lên men trong môi trường
HS đạt mức cao nhất ở nồng độ XG 0.3% và thấp hơn XG 0.3% là KJ 0.2% với lượng đường cũng gần tương đương, thấp nhất ở nồng độ MCC 0.1%.
16
0
a
0
c
0
f
bf
b
b
0
0 0 6 D O
g
0
dg
d
0
e
0
0
Hình 4.7 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng
600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L.
4.2.3 Số lượng vi sinh vật
Hàm lượng vi sinh vật khi bổ sung các chất phụ gia được thể hiện qua Hình 4.7.
Kết quả cho thấy hàm lượng vi sinh vật khi được bổ sung XG 0.2% là tốt nhất và có số
lượng cao hơn so với XG 0.1% và XG 0.3%. KJ 0.1% và KJ 0.3% thì có hàm lượng vi
sinh vật tương đương với XG 0.1% và XG 0.3%. Còn về MCC thì lượng vi sinh vật có
nhưng khá thấp. Nên kết luận XG 0.2% là tốt nhất để vi sinh vật phát triển.
4.2.4 Chiều dày lớp cellulose
Độ dày của BC khi bổ sung các chất phụ gia được thể hiện qua Hình 4.8. Kết quả này cho thấy độ dày của BC khi bổ sung KJ nồng độ (0.1%, 0.2%, 0.3%) cao hơn hẳn so với việc bổ sung XG và MCC có cùng nồng độ. Và với nồng độ 0.2% của KJ thì đồ dày của BC đạt lớn nhất, còn với nồng độ KJ 0.1% thì độ dày tương đương với XG
(0.1%, 0.2%, 0.3%). MCC đạt hiệu quả thấp nhất trong 3 chất phụ gia nhưng cũng góp phần tạo nên độ dày của BC tốt hơn so với việc chỉ sử dụng glucose.
So với nuôi cấy tĩnh, quá trình lên men có khuấy đảo cải thiện sự sinh trưởng của
vi sinh vật. Tuy nhiên, phương pháp lên men này lại hạn chế sự hình thành cellulose
và cellulose hình thành dưới dạng hạt chứ không phải dạng lớp như nuôi cấy tĩnh [35].
17
4.0
g
h
3.5
3.0
c
b
b
b
2.5
)
m m
(
2.0
W _ C B
1.5
f
e
1.0
d
0.5
a
0.0
Hình 4.8 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên chiều dày lớp cellulose (mm) sinh tổng hợp bởi vi
khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L.
8
h
7
c
d
6
i
b
5
/
4
g
) L W D g (
C B
3
f
f
e
2
1
a
0
Hình 4.9 Ảnh hưởng của hydrocolloid lên khối lượng cellulose (g DW/L) sinh tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L.
4.2.5 Khối lượng cellulose
18
Khối lượng BC khi bổ sung các chất phụ gia được thể hiện qua Hình 4.9. Kết quả
cho thấy rằng KJ 0.2% có khối lượng BC cao nhất giống như ở Hình 4.8 cũng cho thấy KJ 0.2% có độ dày BC tốt nhất. Điều này cho thấy rằng khi bổ sung KJ 0.2% thì thạch
sẽ dày và nặng hơn so với việc bổ sung các phụ gia khác. Tuy nhiên khối lượng BC
chỉ tốt nhất khi bổ sung KJ 0.2% còn ở nồng độ 0.1% và 0.3% thì khối lượng thấp hơn
so với XG ở các nồng độ 0.1%, 0.2% và 0.3%. Còn MCC thì hiệu quả khá thấp, khối lượng BC thu được chỉ gần một nửa so với XG và KJ ở cùng nồng độ.
Từ những số liệu thu thập được ở trên, có thể kết luận được rằng việc bổ sung XG
ở các nồng độ 0.1%,0.2% và 0.3% thu được sự ổn định về khối lượng, vi sinh vật và độ dày khá tương đồng nhau. KJ 0.2% đạt hiệu quả tốt nhất về khối lượng BC và độ
dày BC. So với môi trường HS có nồng độ cơ chất 50 g/L, việc chỉ sử dụng glucose
khiến các liên kết cellulose không được hình thành việc bổ sung thêm các chất phụ gia
như KJ [32], XG và MCC [33] giúp cải thiện hơn về liên kết bề mặt BC giúp tạo ra
BC.
Sự cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose khi bổ sung các hydrocolloid được
giải thích là do sự tăng độ hòa tan của BC khi có mặt các hydrocolloid này. Các
hydrocolloid trong quá trình cellulose hình thành sẽ bám vào bề mặt của các sợi
cellulose để cải thiện độ hòa tan cũng như cấu trúc của lớp cellulose. Ngoài ra, quá
trình kết tinh của cellulose cũng làm giảm hiệu suất hình thành cellulose nên sự giảm
độ kết tinh cũng cải thiện lượng cellulose được hình thành [33].
Việc bổ sung các polymer tan trong nước như agar [40], sodium alginate [30],
xanthan [41], polyacrylamide-co-acylic acid [38] và acetan [42] được báo cáo làm
giảm lực trượt, tăng lực ma sát của môi trường lên men; từ đó làm tăng tốc độ truyền
khối và tăng hiệu suất tổng hợp cellulose.
19
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
5.1 KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của các hydrocolloid lên hiệu suất sinh tổng hợp
cellulose của vi khuẩn A. xylinum được khảo sát. Hiệu quả của quá trình lên men
cellulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật trong canh trường lên men, hiệu suất sinh tổng hợp BC và bề dày của
lớp cellulose hình thành.
Lượng đường ban đầu 50g/l của môi trường HS giảm mạnh từ ngày 0 (44.862) đến
ngày 7 (8.078) và những ngày sau bắt đầu giảm từ từ cho đến khi môi trường cạn kiệt cơ chất. Việc không hình thành được cellulose là do vi sinh vật chỉ sử dụng đường để
tăng sinh khối.
KJ 0.2% đạt hiệu quả tốt nhất về khối lượng BC (6.97 gDW/L) và độ dày BC
(3.54mm). XG ở các nồng độ 0.1%,0.2% và 0.3% thu được sự ổn định về khối lượng
cellulose (4.96 gDW/L - 6.52gDW/L) và độ dày cellulose (2.54mm-2.67mm) khá
tương đồng nhau MCC ở các nồng độ luôn ở mức hiệu quả thấp nhất.
5.2 KHUYẾN NGHỊ
Trong quá trình nghiên cứu, do thời gian thí nghiệm và điều kiện trang thiết bị còn
hạn chế nên nghiên cứu vẫn còn nhiều khía cạnh và những khảo sát chưa thực hiện
được. Những vấn đề cần được nghiên cứu kỹ hơn trong những nghiên cứu tiếp theo
bao gồm:
˗ So sánh các loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose khác;
˗ Ảnh hưởng của các hydrocolloid khác lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose;
˗ Khảo sát các chỉ tiêu hiển vi liên quan tới cấu trúc của cellulose thu nhận.
20
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] D. N.-S. Hon, “Cellulose: a random walk along its historical path,” Cellulose, vol. 1, no. 1, pp. 1–25, 1994.
[2] P. Béguin and J.-P. Aubert, “The biological degradation of cellulose,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 13, no. 1, pp. 25–58, 1994.
[3]
J. Bi et al., “Morphology and structure characterization of bacterial celluloses produced by different strains in agitated culture,” J. Appl. Microbiol., vol. 117, no. 5, pp. 1305–1311, 2014.
[4] D. Klemm, B. Heublein, H. Fink, and A. Bohn, “Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material,” Angew. chemie Int. Ed., vol. 44, no. 22, pp. 3358–3393, 2005.
[5] R. M. Brown Jr, “Cellulose structure and biosynthesis: what is in store for the 21st century?,” J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem., vol. 42, no. 3, pp. 487–495, 2004.
[6] P. Ross, R. Mayer, and M. Benziman, “Cellulose biosynthesis and function in bacteria.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 55, no. 1, pp. 35–58, 1991.
[7] L. R. Lynd, P. J. Weimer, W. H. Van Zyl, and I. S. Pretorius, “Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 66, no. 3, pp. 506–577, 2002.
[8] A. Hirai, M. Tsuji, H. Yamamoto, and F. Horii, “In situ crystallization of bacterial cellulose III. Influences of different polymeric additives on the formation of microfibrils as revealed by transmission electron microscopy,” Cellulose, vol. 5, no. 3, pp. 201–213, 1998.
[9] M. Schramm and S. Hestrin, “Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum,” Microbiology, vol. 11, no. 1, pp. 123–129, 1954.
[10] P. G. Verschuren, T. D. Cardona, M. J. R. Nout, K. D. De Gooijer, and J. C. Van den Heuvel, “Location and limitation of cellulose production by Acetobacter xylinum established from oxygen profiles,” J. Biosci. Bioeng., vol. 89, no. 5, pp. 414–419, 2000.
[11] M. Schramm, Z. Gromet, and S. Hestrin, “Synthesis of cellulose by Acetobacter Xylinum. 3. Substrates and inhibitors,” Biochem. J., vol. 67, no. 4, p. 669, 1957.
[12] E. J. Vandamme, S. De Baets, A. Vanbaelen, K. Joris, and P. De Wulf, “Improved production of bacterial cellulose and its application potential,” Polym. Degrad. Stab., vol. 59, no. 1–3, pp. 93–99, 1998.
[13] M. Iguchi, S. Yamanaka, and A. Budhiono, “Bacterial cellulose—a masterpiece of nature’s arts,” J. Mater. Sci., vol. 35, no. 2, pp. 261–270, 2000.
[14] A. Krystynowicz et al., “Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum,” ACTA Biochim. Pol. Ed., vol. 52,
21
no. 3, p. 691, 2005.
[15] K. V Ramana, A. Tomar, and L. Singh, “Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinum,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 16, no. 3, pp. 245–248, 2000.
[16] P. R. Chawla, I. B. Bajaj, S. A. Survase, and R. S. Singhal, “Fermentative production of microbial cellulose,” Food Technol. Biotechnol, vol. 47, no. 2, pp. 107–124, 2009.
[17] E. P. Çoban and H. Biyik, “Evaluation of different pH and temperatures for bacterial cellulose production in HS (Hestrin-Scharmm) medium and beet molasses medium,” Afr. J. Microbiol. Res, vol. 5, no. 9, pp. 1037–1045, 2011.
[18] S. Tantratian, P. Tammarate, W. Krusong, P. Bhattarakosol, and A. Phunsri, “Effect of dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter sp,” J. Sci. Res. Chula Univ, vol. 30, pp. 179–186, 2005.
[19] A. Ishikawa, M. Matsuoka, T. Tsuchida, and F. Yoshinaga, “Increase in cellulose production by sulfaguanidine-resistant mutants derived from Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans,” Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 59, no. 12, pp. 2259–2262, 1995.
[20] M. E. Embuscado, J. S. Marks, and J. N. BeMiller, “Bacterial cellulose. I. Factors affecting the production of cellulose by Acetobacter xylinum,” Topics in Catalysis, vol. 8, no. 5. pp. 407–418, 1994.
[21] D. P. Delmer and Y. Amor, “Cellulose biosynthesis.,” Plant Cell, vol. 7, no. 7, p. 987, 1995.
[22] D. P. Delmer, “Cellulose biosynthesis: exciting times for a difficult field of study,” Annu. Rev. Plant Biol., vol. 50, no. 1, pp. 245–276, 1999.
[23] I. I. Shamolina, “Prospects for use of microbial raw material for fabrication of fibre and film materials. Review,” Fibre Chem., vol. 29, no. 1, pp. 1–8, 1997.
[24] R. M. Brown, J. H. Willison, and C. L. Richardson, “Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum: visualization of the site of synthesis and direct measurement of the in vivo process,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 73, no. 12, pp. 4565–4569, 1976.
[25] Y.-C. Hsieh, H. Yano, M. Nogi, and S. J. Eichhorn, “An estimation of the Young’s modulus of bacterial cellulose filaments,” Cellulose, vol. 15, no. 4, pp. 507–513, 2008.
[26] A. N. Nakagaito, S. Iwamoto, and H. Yano, “Bacterial cellulose: the ultimate the production of high-strength for nano-scalar cellulose morphology composites,” Appl. Phys. A, vol. 80, no. 1, pp. 93–97, 2005.
[27] E. Trovatti et al., “Novel bacterial cellulose–acrylic resin nanocomposites,” Compos. Sci. Technol., vol. 70, no. 7, pp. 1148–1153, 2010.
[28] J. Ye et al., “Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum ATCC 23767 using tobacco waste extract as culture medium,” Bioresour. Technol., vol. 274, pp. 518–524, 2019.
22
[29] Z. Lu, Y. Zhang, Y. Chi, N. Xu, W. Yao, and B. Sun, “Effects of alcohols on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum 186,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 27, no. 10, pp. 2281–2285, 2011.
[30] L. L. Zhou, D. P. Sun, L. Y. Hu, Y. W. Li, and J. Z. Yang, “Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum,” J. Ind. Microbiol. Biotechnol., vol. 34, no. 7, p. 483, 2007.
[31] G. L. Miller, “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar,” Anal. Chem., vol. 31, no. 3, pp. 426–428, 1959.
[32] F. Hong and K. Qiu, “An alternative carbon source from konjac powder for enhancing production of bacterial cellulose in static cultures by a model strain Acetobacter aceti subsp. xylinus ATCC 23770,” Carbohydr. Polym., vol. 72, no. 3, pp. 545–549, 2008.
[33] K.-C. Cheng, J. M. Catchmark, and A. Demirci, “Effect of different additives on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum and analysis of material property,” Cellulose, vol. 16, no. 6, pp. 1033–1045, 2009.
[34] A. Jagannath, A. Kalaiselvan, S. S. Manjunatha, P. S. Raju, and A. S. Bawa, “The effect of pH, sucrose and ammonium sulphate concentrations on the production of bacterial cellulose (Nata-de-coco) by Acetobacter xylinum,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 24, no. 11, p. 2593, 2008.
[35] R. E. Cannon and S. M. Anderson, “Biogenesis of bacterial cellulose,” Crit. Rev. Microbiol., vol. 17, no. 6, pp. 435–447, 1991.
[36] S. Yamanaka et al., “The structure and mechanical properties of sheets prepared from bacterial cellulose,” J. Mater. Sci., vol. 24, no. 9, pp. 3141–3145, 1989.
[37] J. H. Ha, N. Shah, M. Ul-Islam, T. Khan, and J. K. Park, “Bacterial cellulose production from a single sugar α-linked glucuronic acid-based oligosaccharide,” Process Biochem., vol. 46, no. 9, pp. 1717–1723, 2011.
[38] G. Joseph, G. E. Rowe, A. Margaritis, and W. Wan, “Effects of polyacrylamide‐ co‐acrylic acid on cellulose production by Acetobacter xylinum,” J. Chem. Technol. Biotechnol. Int. Res. Process. Environ. Clean Technol., vol. 78, no. 9, pp. 964–970, 2003.
[39] S. T. Park, E. Kim, and Y. M. Kim, “Overproduction of cellulose in Acetobacter xylinum KCCM 10100 defective in GDP-mannosyltransferase,” J. Microbiol. Biotechnol., vol. 16, no. 6, pp. 961–964, 2006.
[40] S. Bae, Y. Sugano, and M. Shoda, “Improvement of bacterial cellulose production by addition of agar in a jar fermentor,” J. Biosci. Bioeng., vol. 97, no. 1, pp. 33–38, 2004.
[41] Y. Chao, M. Mitarai, Y. Sugano, and M. Shoda, “Effect of addition of water‐ soluble polysaccharides on bacterial cellulose production in a 50‐L airlift reactor,” Biotechnol. Prog., vol. 17, no. 4, pp. 781–785, 2001.
[42] T. Ishida, Y. Sugano, T. Nakai, and M. SHODA, “Effects of acetan on production of bacterial cellulose by Acetobacter xylinum,” Biosci. Biotechnol.
23
Biochem., vol. 66, no. 8, pp. 1677–1681, 2002.
24
PHỤ LỤC – KẾT QUẢ XỬ LÝ ANOVA
1. pH
ANOVA
pH
Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Between Groups
1.499
9
109.594
.000
Within Groups
.122
.167 .002
1.621
80 89
Total
pH
Tukey HSDa
Additive
N
Subset for alpha = 0.05
5
2
3
4
9
0.3%XG
1 2.7533 2.7867
9
0.3%KJ
2.8100
0.2%KJ
0.1%MCC
0.2%XG
2.7867 2.8100 2.8133 2.8200 2.8333
0.1%KJ
2.8333
0.1%XG
2.8333 2.8333 2.8833
0.2%MCC
2.8833 2.9133
0.3%MCC
9 9 9 9 9 9 9 9
3.2333
Control
.078
.264
.183
.828
1.000
Sig.
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 9.000.
2. Độ acid tổng
ANOVA
TA
Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Between Groups
49.893
9
77.074
.000
Within Groups
4.172
5.544 .072
Total
54.065
58 67
25
TA
Tukey HSDa,b
Additive
N
Subset for alpha = 0.05
2
3
4
5
1 6.1667
0.3%MCC
0.2%MCC
6.7750 6.8700
Control
6.9500
0.1%XG
7.0750
0.1%KJ
0.2%KJ
0.1%MCC
6.8700 6.9500 7.0750 7.2750 7.3250 7.3500
0.2%XG
8.0167
0.3%XG
9.5250
0.3%KJ
9 6 5 9 6 6 6 6 9 6
1.000
.589
.058
1.000
1.000
Sig.
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 6.522.
b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I
error levels are not guaranteed.
3. Hàm lượng đường khử
ANOVA
Glucose
Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Between Groups
76.035
9
277.509
.000
Within Groups
1.309
8.448 .030
Total
77.344
43 52
Glucose
Tukey HSDa,b
Additive
N
Subset for alpha = 0.05
5
2
3
4
Control
1 1.0116
0.1%MCC
3.0574
0.3%MCC
3.9602
0.1%KJ
0.1%XG
0.2%XG
0.3%KJ
4.4040 4.4542 4.4767 4.5207
6 4 7 5 5 4 5
26
0.2%MCC
4.5970
0.2%KJ
5.0025
0.3%XG
7 6 4
5.2578
Sig.
1.000
1.000
1.000
.754
.391
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.079.
b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I
error levels are not guaranteed.
4. Số lượng vi sinh vật
ANOVA
OD600
Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
.024
9
275.714
.000
Between Groups
.000
Within Groups
.003 .000
.024
21 30
Total
OD600
Tukey HSDa,b
Additive
N
Subset for alpha = 0.05
2
3
4
5
6
7
0.2%MCC
1 .0324
0.3%MCC
0.1%MCC
.0462 .0535
0.2%KJ
.0535 .0559
0.3%KJ
0.1%XG
0.3%XG
.0770 .0799 .0860
0.1%KJ
.0860 .0915
0.2%XG
.1016
Control
4 3 3 2 2 3 4 5 2 3
.1285
Sig.
1.000
.197
.994
.058
.528
1.000
1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.830.
b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not
guaranteed.
5. Khối lượng cellulose
27
ANOVA
BC
Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Between Groups
427.400
9
6032.253
.000
Within Groups
.630
47.489 .008
428.030
80 89
Total
BC
Tukey HSDa
Subset for alpha = 0.05
Additive
N
2
3
4
5
6
7
8
9
1 .0000
Control
1.7750
0.1%MCC
0.2%MCC
2.3983 2.5033
0.3%MCC
3.5950
0.1%KJ
4.9550
0.1%XG
5.5033
0.3%KJ
5.7983
0.3%XG
6.5183
0.2%XG
6.9700
0.2%KJ
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
1.000
1.000
.279
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
Sig.
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 9.000.
6. Chiều dày lớp cellulose
ANOVA
BC_W
Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Between Groups
126.546
9
8046.149
.000
Within Groups
.140
14.061 .002
Total
126.686
80 89
28
BC_W
Tukey HSDa
Additive
N
Subset for alpha = 0.05
2
3
4
5
6
7
8
Control
1 .0000
9 9
.3867
0.1%MCC
0.2%MCC
.9233
0.3%MCC
1.1267
0.1%KJ
0.3%XG
0.1%XG
2.5400 2.5433 2.5833
0.2%XG
2.6733
0.3%KJ
3.3400
0.2%KJ
9 9 9 9 9 9 9 9
3.5400
Sig.
1.000
1.000
1.000
1.000
.466
1.000
1.000
1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 9.000.
29
