Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Cảm biến sinh học trên cơ sở composite polypyrrole và ống nanocacbon ứng dụng xác định GOx và ADN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

---------------------- VŨ THỊ HỒNG ÂN CẢM BIẾN SINH HỌC TRÊN CƠ SỞ COMPOSITE

POLYPYRROLE VÀ ỐNG NANOCACBON

ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH GOx VÀ ADN

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA LÝ – HÓA LÝ THUYẾT

HÀ NỘI - 2008

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

---------------------- VŨ THỊ HỒNG ÂN CẢM BIẾN SINH HỌC TRÊN CƠ SỞ COMPOSITE

POLYPYRROLE VÀ ỐNG NANOCACBON

ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH GOx VÀ ADN CHUYÊN NGÀNH: 62443101 LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA LÝ - HÓA LÝ THUYẾT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN ĐẠI LÂM

HÀ NỘI - 2008

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Đại Lâm, người đã trực tiếp

hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Để giúp tôi

hoàn thành tốt nhất nghiên cứu của mình, thầy đã tạo mọi điều kiện và chỉ bảo tôi

tận tình mỗi khi tôi gặp khó khăn trong công việc. Những kiến thức về chuyên môn,

những kinh nghiệm về nghiên cứu khoa học mà tôi học được từ thầy sẽ luôn cùng

tôi trên con đường nghiên cứu tiếp theo

Thành công của luận văn ngày hôm nay cũng là nhờ sự giúp đỡ tận tình của

TS.Trương Thị Ngọc Liên, người đã tạo rất nhiều điều kiện thuận lợi, giúp đỡ về

máy móc, dụng cụ, hoá chất cũng như chỉ bảo, bổ sung kiến thức cho tôi trong suốt

quá trình tiến hành nghiên cứu. Cô và các thành viên khác trong nhóm nghiên cứu

đã cùng tôi từ những thí nghiệm đầu tiên, những buổi semina khoa học nội bộ trong

nhóm đã mang lại những kiến thức thiết thực cho tôi.

Tôi xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp ở Bộ môn Hóa Phân tích đã giúp đỡ tôi

hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình đã động viên, khích lệ, chia

sẻ và luôn ở bên tôi mỗi khi tôi gặp khó khăn.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nôi, ngày tháng 11 năm 2008

Tác giả Vũ Thị Hồng Ân

BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT

GOx

Glucose Oxidaza

ADN

Axit Desoxyribo Nucleic

Py

monomepyrrole

PPy

polypyrrole

CNT

Carbon nanotube: ống nano carbon

QCM

Quartz Crytal Microbalane: Vi cân tinh thể thạch anh

DPV

Diffirential Pulse Voltammetry: Cực phổ xung vi phân

SWV

Square Wave Voltammetry: Cực phổ sóng vuông

CV

Cyclic Voltammetry: Quét thế vòng

EIS

Electrochemical Impedance Spectroscopy: Phổ tổng trở

điện hóa

PPy_CNT_Gox

PPy pha tạp CNT có gắn enzyme glucose

PPy_ADN dò

PPy có gắn ADN dò

PPy_CNT_ADN dò

PPy pha tạp CNT có gắn ADN dò

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1. Cấu trúc hoá học và độ dẫn của một số loại polymer dẫn thông

dụng

Bảng 4.1. Tần số dao động của linh kiện QCM tại giá trị nồng độ DNA đích

xác định.

Bảng 4.2 Giá trị Rct nhận được sau mô phỏng tại các nồng độ DNA đích xác

định.

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1. 1 Mô hình cảm biến sinh học đầu tiên của C Clark

Hình 1. 2 Sơ đồ cấu tạo của cảm biến sinh học thông thường

Hình 1. 3 Một số phần tử được sử dụng làm đầu thu sinh học

Hình 1. 4 Các dạng bắt giữ đầu thu sinh học bằng phương pháp vật lý và gắn kết

hoá học.

Hình 1. 5 Sơ đồ bộ phận chuyển đổi sử dụng tinh thể áp điện

Hình 1. 6 Mô hình cantiler biosensor phát hiện DNA.

Hình 1. 7 Sơ đồ cảm biến Gox

Hình 1. 8 Cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN

Hình 2. 1 Độ dẫn của vật liệu polymer dẫn so với các vật liệu khác.

Hình 2. 2 Polyme dẫn điện tử

Hình 2. 3 Polyme trao đổi ion

Hình 2. 4 Polyme oxy hoá khử.

Hình 2. 5 Công thức cấu tạo của pyrole

Hình 2.6 Công thức cấu tạo phân tử polypyrrole

Hình 2. 7. Polaron, bipolaron và sự hình thành các dải năng lượng tương ứng

Hình 2. 8 Cơ chế phản ứng trùng hợp polypyrrole

Hình 2. 9 Cấu trúc của (a) SWNT và (b) MWNT

Hình 2. 10 CNT nguyên chất và CNT gắn với các cấu tử sinh học.

Hình 3. 1 Chức năng hóa CNT bằng hỗn hợp HNO3: H2SO4 (1:3)

Hình 3. 2 Sơ đồ hệ điện hóa ba điện cực sử dụng tổng hợp màng PPy pha tạp và

không pha tạp ứng dụng xác định chuyển gen trong đậu tương.

Hình 3. 3 Mô tả cấu trúc của tinh thể α-Quartz trong không gian (a) và trong mặt

phẳng (b)

Hình 3. 4 Cơ chế sinh ra hiện tượng áp điện trong tinh thể α-

Hình 3. 5 Mô tả mode dao động trượt theo bề dày của linh kiện QCM.

Hình 3. 6 Mô tả một số mode dao động trượt bề dày, mode trượt bề măt và mode co

giãn.

Hình 3. 7 Cấu trúc của QCM Planar

Hình 3. 8 Biểu diễn vector Fresnel trong mặt phẳng phức.

Hình 3. 9 Tập điểm M vẽ nên một đường phổ tổng trở đặc trưng cho hệ khảo sát.

Hình 3. 10 Mạch điện tương đương Randles

Hình 3. 11 Mạch tương đương cho tổng trở của polymer

Hình 3. 12 Mạch tương đương cho tổng trở của polymer dẫn

Hình 4. 1 Ảnh hiển vi điện tử quét trường phát xạ FESEM của điện cực Gox trên

cơ sở màng composit polypyrrole pha tạp ống nanô cácbon.

Hình 4. 2 Ảnh hiển vi điênh tử quét SEM của màng PPy gắn DNA dò.

Hình 4. 3 Ảnh hiển vi điện tử quét SEM của màng PPy_CNTs gắn DNA dò

Hình 4. 4 Đặc trưng đáp ứng dòng theo thời gian của cảm biến GOx với sự thay đổi

nồng độ glucose trong dung dịch. Cảm biến hoạt động tại điện áp 0,7V so

với điện cực chuẩn Ag/AgCl.

Hình 4. 5 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose của cảm biến GOx làm

việc tại điện áp 0,7V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl.

Hình 4. 6 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose của cảm biến GOx làm

việc tại điện áp 0,75V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl.

Hình 4 .7 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose của cảm biến GOx làm

việc tại điện áp 0,8V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl.

Hình 4. 8 Hệ đo QCM200 đầy đủ gồm thiết bị điều khiển số QCM200, bộ dao động

QCM25, holder tinh thể và các cảm biến tinh thể quartz.

Hình 4. 9 Đặc trưng tần số theo thời gian ở chế độ đo không tải của linh kiện QCM.

Hình 4. 10 Đặc trưng tần số theo thời linh kiện QCM có gắn DNA trong môi trường

không có DNA đích

Hình 4. 11 Sự thay đổi khối lượng hấp thụ Δm trên bề mặt linh kiện QCM có gắn

DNA dò đo trong dung dịch chứa DNA đích với nồng thay đổi từ 0 pM

đến 269pM.

Hình 4. 12 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian của linh kiện QCM có gắn

DNA dò trong dung dịch chứa DNA đích với nồng độ thay đổi từ 0 pM

đến 28 pM.

Hình 4. 13 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian của linh kiện QCM có gắn

DNA dò đo trong dung dịch chứa DNA đích với nồng độ thay đổi từ 32

pM đến 56 pM.

Hình 4. 14 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian của linh kiện QCM có gắn

DNA dò đo trong dung dịch chứa DNA đích với nồng độ thay đổi từ 59

pM đến 269 pM.

Hình 4. 15 Sự thay đổi tần số dao động của linh kiện QCM có gắn DNA dò theo sự

thay đổi nồng độ DNA đích từ 0 pM đến 269 pM.

Hình 4. 46 Thay đổi hình dạng của chuỗi DNA khi chuyển từ trạng thái đơn chuỗi

sang trạng thái ghép cặp.

Hình 4. 57 Mô hình mạch tương đương đơn giản của Randles.

Hình 4. 18 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy/DNA dò tại các nồn độ DNA

đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5 mV, và

Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.

Hình 4. 19 (a) và (b) Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy/DNA dò tại các

nồng độ DNA đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac

= 5 mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.

Hình 4. 20 Quy trình mô phỏng đặc trưng phổ tổng trở xác định Rct sử dụng mô

hình mạch tương đương của Randles trong chế độ Find circle của thiết bị

Autolab

Hình 4. 21 Đường chuẩn sử dụng giá trị 1/Rct như là hàm của nồng độ DNA đích ( từ 25 pM đến 46 pM) với phương trình 1/Rct (Ω-1) = 2,2.10-3+5,5.10- 5*C(pM)

Hình 4. 22 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_CNTs/DNA dò tại các nồn độ

DNA đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5

mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.

Hình 4. 23 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_CNTs/DNA dò tại các nồng độ

DNA đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5

mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.

Hình 4. 64 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_CNTs/DNA dò tại các nồng độ

DNA đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5

mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.

Hình 4. 75 Đường chuẩn sử dụng giá trị 1/Rct như là hàm của nồng độ DNA đích ( từ 25 pM đến 224 pM) với phương trình 1/Rct (Ω-1) = 1,27.10-4 * C – 1,3.10-3 (pM)(nồng độ DNA đích từ 25 pM đến 81 pM).

Hình 4. 26 Mô hình mạch tương đương Randles có tính đến phần đóng góp của

tổng trở Warburg.

- 1 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, cảm biến sinh học thu hút được sự quan tâm của

các nhà khoa học trên thế giới cũng như các nhà khoa học trong nước. Sự phát triển

của cảm biến sinh học giúp giải quyết nhu cầu cấp thiết về phân tích phát hiện cũng

như định lượng các thành phần sinh học bằng các phương pháp phân tích đơn giản

và dễ đưa vào ứng dụng thực tế. Thật vậy, các phương pháp phân tích truyền thống

như sắc ký, điện di, khối phổ...thường đòi hỏi trang thiết bị đi kèm khá phức tạp và

có giá thành cao. Cảm biến sinh học là một thiết bị có nhiều ưu điểm: sử dụng đơn

giản, có khả năng phát hiện nhanh, độ nhạy cao cũng như có tính chọn lọc cao trong

các hệ hóa học và sinh học. Lĩnh vực áp dụng của cảm biến sinh học rất đa dạng, nó

là một công cụ quan trọng trong kiểm tra an toàn thực phẩm, chuẩn đoán y học và

kiểm tra nội khoa, phát hiện các tác nhân ô nhiễm môi trường.

Cảm biến sinh học có thể hiểu là một thiết bị sử dụng các tác nhân sinh học

như enzyme, các kháng thể, ADN… để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hóa chất.

Vì vậy một cảm biến sinh học thông thường gồm có 3 thành phần cơ bản, đó là:

thành phần hóa học, thành phần sinh học và thành phần vật lý.

Cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc biệt là

các ngành công nghệ vật liệu nano và công nghệ thông tin, cảm biến sinh học cũng

đạt được những tiến bộ vượt bậc, hứa hẹn đưa ra những vi thiết bị nhằm xác định

nhanh, chính xác các loại vi khuẩn virut gây bệnh. Các thiết bị này cũng có thể dò

tìm hay phân tích lượng mẫu rất nhỏ (cỡ vài nM) với độ tin cậy cao.

Với những ưu điểm nổi bật như độ nhạy, độ đặc hiệu, tính chọn lọc cao, thiết

bị đơn giản, nhỏ gọn…cảm biến sinh học đã và đang thu hút được sự quan tâm đặc

biệt của các nhà khoa học cũng như các trung tâm nghiên cứu. Tuy nhiên việc chế

tạo cảm biến sinh học vẫn còn gặp nhiều khó khăn như độ ổn định trong chế tạo sản

phẩm, phương pháp đo tín hiệu, thời gian phản ứng, khả năng tái sử dụng, … Do

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 2 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

vậy, những nghiên cứu mới trong tương lai chủ yếu sẽ tập trung vào hai hướng

chính:

(1). Khắc phục những khó khăn sẵn có của thế hệ cảm biến cũ: Nâng cao

độ ổn định để có thể chế tạo hàng loạt, cải thiện khả năng tái sử dụng của các cảm

biến sinh học, tìm giải pháp hạ giá thành sản phẩm.

(2). Tìm kiếm vật liệu mới cũng như khả năng ứng dụng mới của cảm biến,

giảm kích thước cảm biến để tích hợp được nhiều cảm biến trên một thiết bị, cải

tiến thiết bị đo đơn giản và dễ sử dụng, rút ngắn thời gian đáp ứng v.v...

Hướng nghiên cứu của luận án đi theo hướng thứ hai, mục tiêu của luận án

là chế tạo hai cảm biến trên cơ sở vật liệu mới là sử dụng màng polyme dẫn pha tạp

với ống nanocacbon (CNT). Trong đó hai ứng dụng được thử nghiệm là: cảm biến

enzyme sử dụng enzyme glucose để xác định nồng độ glucose và cảm biến ADN để

xác định ADN chuyển gen trong đậu tương.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 3 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

CHƯƠNG I: CẢM BIẾN SINH HỌC

I.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CẢM BIẾN SINH HỌC

Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) thì:

“Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông

tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phần tử nhận biết

sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi ”[1].

Giáo sư C.Clark [2], người được coi là cha đẻ của cảm biến sinh học, đã

công bố bài báo đầu tiên về điện cực oxy hoá vào năm 1956. Những năm tiếp theo

ông tiếp tục mở rộng khả năng hoạt động của cảm biến như phát hiện được thêm

nhiều tác nhân, nâng cao độ chính xác của cảm biến. Vào năm 1962, tại hội nghị

của Viện hàn lâm khoa học New York, ông đã thuyết trình một bài về cảm biến sinh

học: “To make electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or

conductometric) more intelligent by adding enzyme transducers as membrane

enclosed sADN”. Ông đưa ra mô hình đầu tiên về cảm biến sinh học (hình 1).

Hình 1. 1: Mô hình cảm biến sinh học đầu tiên của C. Clark [2].

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 4 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Cảm biến sinh học theo mô hình của C Clark [2] bao gồm điện cực oxy hóa,

trên đó có màng giữ enzyme glucose (glucose oxidase). Khi mật độ glucose trong

môi trường phản ứng giảm thì mật độ chất oxi hóa trên bề mặt điện cực cũng giảm

một cách tương ứng. Dựa trên sự thay đổi đó, Clark đã phát hiện ra sự thay đổi của

nồng độ glucose trong môi trường cần kiểm tra.

Những năm tiếp theo, nhóm của Guilbault và Montalvo [3] lần đầu tiên công

bố chi tiết về chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa trên điện cực chứa enzyme

đo điện thế, một cảm biến đo nồng độ urê dựa trên điện cực cố định enzyme urê

+.

(urease) bằng màng chất lỏng chọn lọc NH4

Năm 1975 Lubber và Opitz đã mô tả một cảm biến sợi quang (fibre-optic

sensor) gắn các chất chỉ thị dùng để đo nồng độ CO2 và O2[4]. Cũng vào năm 1975,

một số vi khuẩn cũng đã được sử dụng như những thành phần sinh học trên các điện

cực vi sinh để đo nồng độ cồn[5]. Năm 1975 công ty Yellow Springs Instrument

(Ohio) lần đầu tiên biến ý tưởng của Clark thành hiện thực thông qua việc thương

mại hóa các cảm biến sinh học. Sản phẩm đầu tiên là thiết bị phân tích glucose dựa

trên hydrogen peroxide và đó cũng là cột mốc đầu tiên đánh dấu sự xuất hiện của

các cảm biến sinh học trong đời sống[5]. Vào năm 1982, Shichiri và các đồng

nghiệp đã báo cáo và mô tả về cảm biến glucose in vivo, là loại cảm biến dạng kim

đầu tiên cho các xét nghiệm dưới da[6].

I.1.1 Cấu tạo cảm biến sinh học

I.1.1.1 Cấu tạo chung

Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học (xem hình 1.1) bao gồm bốn bộ

phận chính: (1) Đầu thu sinh học: có tác dụng bắt cặp và phát hiện sự có mặt của

các tác nhân sinh học cần phân tích; (2) Tác nhân cố định: giúp gắn các đầu thu lên

trên điện cực; (3) Bộ phận chuyển đổi tín hiệu giúp chuyển các biến đổi sinh học

thành các tín hiệu có thể đo đạc được; (4) Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra (bộ phận

này có tác dụng chuyển thành các tín hiệu điện để máy tính và các thiết bị khác có

thể xử lý).

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 5 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Hình 1. 2: Sơ đồ cấu tạo của cảm biến sinh học thông thường.

I.1.1.2. Tác nhân cần phát hiện

Tác nhân cần phát hiện được phân loại theo cấu tạo như sau:

a) Các vi khuẩn: các vi khuẩn thường được phát hiện bởi các cảm biến sinh

học là vi khuẩn Ecoli, vi khuẩn CADNida, vi khuẩn bệnh than …

b) Các phân tử nhỏ: các phân tử nhỏ mà cảm biến sinh học có thể phát hiện

được là CO, CO2, phân tử gluco, phân tử rượu, ure, thuốc trừ sâu, amino axit,

paracetamol, aspirin, penicilin, TNT, các tác nhân thần kinh khác, …

c) Các phân tử sinh học có kích thước lớn: những phân tử này có thể là các

phân tử ADN, RNA, protein, enzyme, các hocmon, …

I.1.1.3. Đầu thu sinh học

Nhiều cảm biến sinh học sử dụng các kết hợp đã được phát triển rất cụ thể

cho các ứng dụng. Có hai loại đầu thu sinh học. Đầu tiên, các cảm biến sinh học sử

dụng các enzyme hoặc kháng thể oligonucleotides, ví dụ các chất có nguồn gốc sinh

học, được thiết kế để thực hiện một chức năng cụ thể trong cơ thể sống. Do vậy,

chúng được sử dụng để phát hiện một chất cụ thể. Ngoài ra còn có những đầu thu

sinh học có thể được mô tả giả như ngược với đầu thu sinh học tự nhiên, thông qua

các phương pháp điện hoá có thể phát hiện một số chất.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 6 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Đầu thu sinh học (Biological Receptor) là những đầu thu phản ứng trực tiếp

với các tác nhân cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học. Dựa vào

các tác nhân sinh học sử dụng người ta chia ra thành một số loại đầu thu như sau:

Đầu thu làm từ enzyme: Đầu thu sinh học làm từ enzyme là dạng đầu thu

phổ biến nhất. Đó là các đầu thu làm từ các enzyme urease, glucose, ...

Đầu thu làm từ các kháng thể/kháng nguyên: Các đầu thu dạng này có

đặc điểm là tính chọn lọc rất cao đồng thời các liên kết được tạo thành khá mạnh.

Đầu thu làm từ protein: Rất nhiều cảm biến có đầu thu sinh học làm từ các

protein như cảm biến phát hiện hocmôn, xác định các chất kích thích thần kinh, ... Các đầu

thu này có đặc điểm là có tính chọn lọc rất cao. Tuy nhiên, chúng có nhược điểm là rất khó

cách ly.

Hình 1. 3 Một số phần tử được sử dụng làm đầu thu sinh học

Đầu thu làm từ các axit nucleic: Các axit nucleic như ADN, ARN có thể sử

dụng làm đầu thu sinh học. Các cảm biến có đầu thu dạng này thường được sử dụng

để phát hiện đột biến và các sai lệch trong cấu trúc di truyền.

Đầu thu kết hợp: Với các đầu thu dạng này, người ta sử dụng đồng thời hai

hay nhiều các phân tử dạng trên (enzyme, kháng thể, protein, ...) trên một đế. Việc

kết hợp này mở rộng khả năng làm việc của các cảm biến sinh học. Một số cảm biến

dạng này là cảm biến xác định thuốc nổ TNT, cảm biến xác định vi khuẩn bệnh than

và cảm biến thử thai.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 7 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Đầu thu làm từ tế bào: Các đầu thu sinh học không chỉ được làm từ các

phân tử, nguyên tử mà nó còn có thể được làm từ các tế bào. Một số tế bào biến đổi

gien của vi khuẩn đã được sử dụng làm đầu thu sinh học. Khi có mặt các phân tử

chất độc, các tế bào này sẽ phát sáng, thông qua đó chúng ta xác định được sự xuất

hiện của các phân tử chất độc.

I.1.1.4. Tác nhân cố định

Các tác nhân cố định là một phần rất quan trọng trong cảm biến sinh học.

Các tác nhân này có nhiệm vụ gắn kết các đầu thu sinh học lên trên đế. Nói một

cách khác đây là bộ phận trung gian có tác dụng liên kết các thành phần sinh học

(có nguồn gốc từ cơ thể sống) với thành phần vô cơ. Như vậy việc lựa chọn những

tác nhân cố định thích hợp cũng là một công việc quan trọng. Những tác nhân này

vừa phải đảm bảo gắn kết, cố định về mặt cơ học, vừa phải đảm bảo liên kết về mặt

tín hiệu giữa bộ phận sinh học và bộ phận chuyển đổi. Trên hình 1.3 trình bày cách

bắt giữ thành phần sinh học theo phương pháp vật lý và gắn kết hóa học.

Hình 1. 4: Các dạng bắt giữ đầu thu sinh học bằng phương pháp vật lý và gắn kết hoá học.

I.1.1.5. Bộ phận chuyển đổi

Đây là bộ phận quan trọng trong cảm biến sinh học. Có nhiều dạng chuyển

đổi như chuyển đổi điện hoá, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng

tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 8 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

trên điện thế Chuyển đổi điện hoá bao gồm chuyển đổi dựa

(potentiometric), dòng điện (amperometric) và độ dẫn (conductometric).

Chuyển đổi quang là chuyển đổi hoạt động dựa trên các hiệu ứng như: hấp

thụ ánh sáng nhìn thấy và tia UV; phát xạ huỳnh quang và lân quang; bio–

luminiscence; chemi–luminiscence..

Chuyển đổi nhiệt hoạt động dựa trên hiện tượng thay đổi entapy khi hình

thành hoặc phá vỡ các liên kết hóa học trong các phản ứng của enzyme. Bộ chuyển

đổi này có ưu điểm hoạt động tốt với tất cả các phản ứng. Tuy nhiên, dạng chuyển

đổi này có tính chọn lọc thấp.

Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric)

Chuyển đổi hoạt động dựa trên nguyên lý: tinh thể sẽ thay đổi tần số dao

động khi lực tác dụng lên nó thay đổi, sự thay đổi này tuân theo phương trình

Sauerbrey:

∆f = - 2,3.106.f2.∆m/A (1-1)

Trong đó, f là tần số dao động của tinh thể áp điện, ∆m là thay đổi khối

lượng đặt lên tinh thể áp điện và A là hằng số đặc trưng cho tinh thể áp điện.

Chuyển đổi dạng này có ưu điểm là độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian

phản ứng nhanh, khả năng cơ động cao, có thể sử dụng đo đạc trong môi trường

lỏng và khí. Trên hình 1.5 trình bày sơ đồ bộ chuyển đổi sử dụng tinh thể áp điện để

phát hiện kháng nguyên.

Hình 1. 5 Sơ đồ bộ phận chuyển đổi sử dụng tinh thể áp điện

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 9 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Chuyển đổi bằng các hệ vi cơ

Nguyên lý hoạt động của cảm biến sử dụng chuyển đổi này như sau: chiếu

một chùm laser đến bộ phản xạ trên bề mặt một thanh dầm rất mỏng, ánh sáng phản

xạ được thu nhận bởi photodetector. Thanh mỏng này được chế tạo sao cho chỉ với

một lực tác động rất nhỏ cũng làm cho thanh bị uốn cong đi. Như vậy tín hiệu phản

xạ thu nhận được trên photodetector sẽ bị thay đổi so với trường hợp không có lực

tác dụng lên thanh. Căn cứ vào sự thay đổi tín hiệu phản xạ này, người ta có thể xác

định được lực tác dụng lên thanh (hình 1.6)

.

Hình 1. 6 Mô hình sensor sinh học sử dụng vi cơ phát hiện ADN.

I.1.2. Ứng dụng của cảm biến sinh học

Ứng dụng trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khoẻ: Đây là lĩnh vực có

nhiều cải tiến cũng như nhiều ứng dụng nhất. Chúng ta có thể kể ra rất nhiều loại

cảm biến như cảm biến đo nồng độ oxi, lượng glucose trong máu, cảm biến huyết

áp, … Những cảm biến giúp người bệnh có thể thường xuyên theo dõi tình hình

bệnh tật của mình mà không nhất thiết phải đến các trung tâm y tế. Ngày nay, các

cảm biến dạng này không những tăng độ tin cậy, giảm thời gian hồi đáp mà còn

được chế tạo theo hướng càng ngày càng nhỏ gọn, rẻ và dễ sử dụng.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 10 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Ứng dụng trong công nghệ môi trường: Đó là các cảm biến dạng “mũi

điện tử” xác định một hoá chất độc hại nào đó hoặc xác định độ ô nhiễm của môi

trường như cảm biến xác định nồng độ CO2, H2S; xác định dư lượng thuốc trừ sâu,

xác định nồng độ của các kim loại nặng, ...

Ứng dụng trong các tương tác Người – Máy: Đây cũng là một lĩnh vực

mới mẻ có nhiều nghiên cứu, ứng dụng. Có thể kể ra một số cảm biến dạng này như

cảm biến nhận dạng tiếng nói, hình ảnh, nhận dạng các đặc trưng sinh học của con

người. Đây cũng là lĩnh vực hứa hẹn có nhiều nghiên cứu, ứng dụng mới.

Ứng dụng trong việc điều khiển, quản lý các quá trình trong công nghệ

sinh học: Ngày nay, khi công nghệ sinh học phát triển, đồng thời với việc các chế

phẩm sinh học được sản xuất rộng rãi trên qui mô công nghiệp, cũng như tham gia

ngày càng nhiều vào các quá trình sản xuất khác thì một nhu cầu tất yếu nảy sinh,

đó là việc theo dõi, quản lý, điều khiển các quá trình sinh học như điều chỉnh lượng

gluco trong quá trình nuôi vi khuẩn…vv. Các cảm biến sinh học đã tỏ ra có nhiều

ưu điểm so với các phương pháp truyền thống như tính chọn lọc cao, đáp ứng

nhanh, đơn giản và chính xác.

I.1.3 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học

Dưới đây là một số tiêu chí đánh giá, cũng như các yêu cầu đối với cảm biến

sinh học:

1) Độ chính xác: Độ chính xác thể hiện ở khả năng xác định đúng chất quan

tâm, không bị lẫn lộn với các chất khác. Độ chính xác còn được thể hiện ở khả năng

định lượng chính xác chất cần phát hiện.

2) Độ nhạy: Độ nhạy cũng là một tiêu chí khá quan trọng, nó thể hiện lượng

chất nhỏ nhất mà cảm biến có thể phát hiện.

3) Giới hạn đo: Giới hạn đo là giá trị lớn nhất, nhỏ nhất mà cảm biến có thể

đo được.

4) Tốc độ hồi đáp: Tốc độ hồi đáp là khả năng phát hiện, định lượng chất

cần phân tích nhanh hay chậm. Đây là một trong những tính chất của cảm biến mà

người ta đang tập trung cải tiến.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 11 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

5) Khả năng dùng lại: Cho đến bây giờ, hầu hết các cảm biến sinh học chỉ

dùng được một lần do khi các tác nhân bắt cặp với đầu thu sinh học, rất khó để tách

các tác nhân này ra và tạo thành đầu thu ‘sạch’ như lúc ban đầu. Để khắc phục

nhược điểm này người ta đang cố gắng giảm giá thành các sản phẩm dùng một lần

và nghiên cứu chế tạo sản phẩm dùng nhiều lần.

6) Khả năng tự chuẩn hóa và độ thuận tiện, độ an toàn trong sử dụng:

Các cảm biến sinh học sẽ được sử dụng phổ biến ngoài phòng thí nghiệm do đó tiêu

chí dễ sử dụng và an toàn cũng rất quan trọng.

7) Giá thành: hiện nay cảm biến sinh học thường chỉ sử dụng được 1 lần do

đó cần thiết phải giảm giá thành.

I.2 CẢM BIẾN GOx

Từ những nghiên cứu đầu tiên của Clark và Lions vào năm 1962[2], Updike

và Hicks năm 1967 [7], cảm biến glucose trên cơ sở GOx đã đựợc tích cực nghiên

cứu, tiếp tục phát triển và ngày càng mở rộng trong kỹ thuật phân tích hiện đại.

I.2.1 Enzym glucose [8]

Enzym glucose còn có các tên gọi khác như Glucose oxidase; Beta-D-

Glucose: Oxigen 1-oxido-reductase; D-Glucose-1-oxidase; Glucose

aerođehdrogenase; Glucose oxihydrase; GOD

Cấu trúc: là một glycoprotein với 2 phân tử FAD/mol GOD

Được tách, chiết từ nấm, mốc.

Khối lượng phân tử: 160000 (tính theo khối lượng các chuỗi acid amin)

Nhiệt độ tối ưu của enzym tự do: 30oC

pH tối ưu: 5,6

Các chất ức chế: bị ức chế bởi D-arabinoza và 2-deoxy-D-glucose. Ức chế

hoàn toàn bởi p-cloromercuribenzoat, ức chế một phần bởi 8-hydroxycholin,

NaNO3 và semicarbazit. Bị bất hoạt bởi H2O2, Ag+, Hg2+, Cu2+.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 12 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Độ bền:GOD dưới dạng khô không bị giảm hoạt tính trong nhiều năm khi cất

giữ ở nhiệt độ thấp. Dung dịch bảo quản ở +4oC không bị giảm hoạt tính trong vòng

12 tháng.

Đặc tính: enzym là chất đặc hiệu tuyệt đối để phát hiện và định lượng β-

Glucose.

I.2.2 Nguyên tắc của phản ứng điện hoá

Trong mẫu cảm biến đầu tiên của Clark và Lyons[2], phản ứng điện hoá xảy

GOx

+

 →+

Glu

cos

Gluconic

acid

OH 2 2

Oe 2

−

→

+

+ +

H

2

e 2

OH 2 2

O 2

ra như sau:

Khi glucose đehyrogenase (GDH) được hình thành, phản ứng điện hoá tiếp

tục diễn ra như sau:

→ GDH(red) + δ-glucolactone GDH(ox) + D-glucose

Mediator(ox) + GDH(red) → Mediator(red) + GDH(ox)

→ Mediator(ox) + e- Mediator(red)

Hình 1. 7 Sơ đồ cảm biến GOx

Điện thế được đặt giữa hai điện cực làm việc và điện cực so sánh, người ta sẽ

đo dòng chạy qua tế bào. Khi điện thế đạt đến một giá trị nào đó (thường là điện thế

oxi hoá), thì hiện tượng oxi hoá xuất hiện và các electron được sinh ra. Dòng điện

thu được sẽ tỉ lệ với độ tập trung của các phân tử bị oxi hoá.

I.2.3 Cố định enzyme

Kỹ thuật sử dụng để cố định enzyme là một trong những vấn đề quyết định

cho việc chế tạo một cảm biến GOx. Từ trước tới nay đã có nhiều phương pháp

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 13 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

khác nhau để cố định enzyme được sử dụng, bao gồm phương pháp hấp thụ, liên

kết hoá trị, dùng qua một enzyme đặc biệt và sử dụng bẫy trong gel hoặc chất nền

polyme[10-12].

Có nhiều kiểu kỹ thuật lắp ghép cho việc cố định protein như Langmuir-

Blodgett (LB)[13,14], một lớp tự lắp ghép [15], xếp lớp lần lượt trên điện cực

tĩnh[16,17,18].v.v..

Glutaraldehyde là một vật liệu thường được dùng như một loại enzyme đặc

biệt để bắc qua, nhưng một số hoá chất mới, ví dụ như chitosan, đã được sử dụng và

có tác dụng tốt [19]; màng mỏng kim cương ultranano-crystalline dẫn điện cùng

thực hiện với việc cố định enzyme của GOx qua phạm vi nhóm chức aminophenyl

được sử dụng giống như một nền thô cho một lớp mới của bề mặt vô cơ chung và

cảm biến điện hoá [20]. Có hai kiểu sol-gel được pha trộn trước đó là 3-glycidoxy-

propyltrimethoxysilane với methyltrimethoxysilane hoặc tetraetthoxylane [21], ion

liquid-methylimidazolium hexafluophosphate với điều kiện chỉ có một môi trường

nhỏ cho việc cố định GOx [22], silica sáu cạnh, xốp sẽ giữ lại GOx bám trên đó làm

cho cảm biến hoạt động và có độ bền [23].

Những màng LB sử dụng cho việc cố định GOx, từ khi màng mỏng tự nhiên

kích cỡ nano có thể chế tạo thì độ nhạy của sensor được nâng cao, thời gian đáp

ứng nhanh, vì vậy xúc tác cũng cần phải cải tiến cho phù hợp [13]

Vật liệu polyme dẫn đã có những ứng dụng quan trọng và rộng khắp trong

chuẩn đoán lâm sàng và kiểm tra chất lượng môi trường[28-31]. Có rất nhiều thuận

lợi khi chế tạo sensor sử dụng polyme dẫn, sử dụng khả năng di chuyển của điện tử

thay đổi và một khả năng linh hoạt sẵn có trong cấu trúc hoá học của nó. Có nhiều

nghiên cứu chỉ ra rằng quá trình oxy hoá và sự khử enzyme có thể doping với nền

PPy[32], polyaniline[33], polythiophene[34] và được cố định trên bề mặt của điện

cực Pt, Au, GC[35,36].

I.2.4 Vật liệu nano

Vật liệu nano gần đây đã trở thành một chủ đề vô cùng phổ biến trong nghiên

cứu cảm biến điện hoá, vì chúng có tính dẫn điện, cấu trúc duy nhất, thuộc tính xúc

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 14 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

tác, có thể chứa xúc tác sinh học cao, tính ổn định tốt và có khả năng thâm nhập đặc

biệt.

Ống CNT có thể sử dụng như một vật liệu điện cực với thuộc tính hữu ích

của nó có thể ứng dụng làm thiết bị sinh học thu nhỏ. Cảm biến điện hoá sử dụng

CNT được các nhà khoa học nghiên cứu rộng rãi và thu được kết quả ban

đầu[18,33-41]. Các cảm biến này có dòng đáp ứng cao, điện thế làm việc thấpvà ít

bị cản trở. Sợi nano carbon có thể hoà tan trong dung dịch và sử dụng để cải tiến

một cảm biến glucose, hoạt động ở điện thế làm việc thấp, có thể loại bỏ trở ngại và

hạn chế không giải quyết được của các chất nền khác khi sử dụng chúng làm cảm

biến điện hoá [42].

Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng các hạt Au kích cỡ nano tỏ ra có khả

năng xúc tác sinh học đặc biệt, có hoạt tính xúc tác điện hoá rất cao không chỉ trong

sự khử H2O2 và phân tử oxygen mà còn trong quá trình oxi hoá của glucose nhờ có

cấu trúc mạng bằng các cột kích cỡ nano đó [43]. Các hạt phân tử Au được bao bọc

bởi nhóm sulfate làm tăng số lượng điện tử cố định của chất môi giới và bảo đảm

cho tính dẫn tốt của toàn bộ cấu trúc mạng [44]. Một phương pháp đo trực tiếp mới

cho kết quả rất nhanh là mục đích có thể đạt được khi tạo được màng mỏng Au cấu

trúc nano với trạng thái hoạt động của Au [45].

Một cảm biến đo dòng trên cơ sở màng composite gồm ống CNT, PPy gắn

trên điện cực tấm Pt có bề mặt là nhôm xốp kích thước nano đã được thử nghiệm.

Điện cực này cho phép tăng đáng kể diện tích bề mặt giúp cảm biến gắn được nhiều

enzyme hơn [46]. Trên những vi cảm biến khác, sử dụng PPy cấu trúc nano chứa

được nhiều “bẫy” Gox [47]. Đây là những cảm biến điển hình mà xúc tác sinh học

có hoạt tính tốt với glucose.

Trong điều kiện thực hiện đề tài luận văn, chúng tôi nghiên cứu chế tạo cảm

biến GOx trên cơ sở màng composite PPy pha tạp CNT.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 15 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

I.3 CẢM BIẾN ADN

Axit Desoxyribo Nucleic (ADN) là một phân tử sinh học đặc biệt quan trọng

đóng vai trò thiết yếu trong việc xác định đặc trưng di truyền, phân tử này lưu giữ

các thông tin di truyền cần thiết cho sự tái tạo đời sống sinh vật. Trong những năm

gần đây việc sử dụng các cảm biến điện hoá để phân tích ADN trong hoá học lâm

sàng đã có nhiều kết quả tốt.

Khái niệm cảm biến ADN điện hoá (the electrochemical ADN sensor) lần

đầu tiên được Millan và Mikkelsel đề xuất vào năm 1993 [48]. Lĩnh vực này nhanh

chóng gây được sự chú ý của nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới. Cảm biến điện hoá

đến nay đã phát triển mạnh, có thể đọc và phân tích ngay các tín hiệu ghi nhận. Chuỗi

xoắn kép ADN được hình thành trên bề mặt điện cực do quá trình ghép cặp bổ xung giữa

các bazơ của chuỗi dò (probe) và chuỗi đích (target) được gọi là sự lai hoá. Việc chuyển

sự lai hoá thành tín hiệu đọc được thực hiện bởi transducer theo rất nhiều nguyên lý như

điện hoá [49], quang học [50], phân tích khối lượng (QCM) [51], điện [52],v.v...Trong

đó, nguyên lý điện hoá được xem là hướng có nhiều triển vọng, bởi thời gian đáp ứng

nhanh, đơn giản và chi phí thấp. Phương pháp phân tích ADN theo nguyên lý điện hoá

có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp truyền thống (Phương pháp phân tích

đồng vị phóng xạ và phân tích huỳnh quang) như giảm thiểu thời gian phân tích, đơn

giản về mặt kỹ thuật và thao tác phân tích.

I.3.1 Thành phần cấu tạo của ADN[53]:

ADN bao gồm ba thành phần: axit photphoric, phân tử đường (vòng 5

Carbon) và bazơ chứa nitơ. Trong đó, axit photphoric đóng vai trò kết nối giữa các

cụm (bazơ + phân tử đường) với nhau hình thành chuỗi nuclêôtit.

Bazơ: bao gồm bốn loại bazơ khác nhau: Cytosin (C), Guanin (G), Thymin

(T), Adenin (A). Trong đó bazơ C, T thuộc nhóm pyrimidin và bazơ A, G thuộc

nhóm purin. (hình 1.8)

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 16 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Trình tự sắp xếp của các bazơ trong chuỗi ADN được xem như tổ hợp chập

hàng trăm nghìn của bốn phần tử (A, C, T, G) đã tạo nên sự phong phú của gen đặc

trưng ở muôn loài sinh vật

Phân tử đường: Có hai loại phân tử đường trong các axit nucleic, đó là

Ribose và Desoxyribose khi mất một oxi. Trong ADN tồn tại dạng Desoxyribose.

Cấu trúc của ADN:

ADN có cấu trúc đa phân gồm nhiều đơn phân là các nucleôtit, mỗi nuclêôtit

gồm ba thành phần: axit photphoric, phân tử đường 5 cacrbon và bazơ chưa nitơ.

Các nuclêôtit nối với nhau bằng các liên kết hoá trị (phosphodiester) tạo thành chuỗi

polynuclêotit. Một phân tử ADN có số lượng rất lớn các nuclêotit.

Chuỗi ADN (Axid Desoxyribo Nucleic) gồm hai mạch đơn cùng xoắn đều

quanh một trục theo chiều từ trái sáng phải tạo thành hình trụ. Các bazơ trong chuỗi

cách nhau trung bình 3,4A0, Chiều dài của một vòng xoắn là 34A0, đường kính trụ

20A0. Nếu có sự biến đổi liên quan dến một hoặc một số cặp nuclêôtit, xảy ra tại

một điểm nào đó của phân tử ADN thì đó chính là đột biến gen..

Chuỗi xoắn kép ADN được hình thành bởi hai mạch đơn song song ghép cặp

đối diện nhau. Trong đó, mỗi bazơ trong mạch đơn này được liên kết với một bazơ của

mạch kia theo nguyên tắc ghép cặp bổ sung A với T, C với G. Chiều của mỗi mạch đơn

được quy định từ 3’ đến 5’. Do đặc điểm về cấu trúc không gian và sự tương tác ghép cặp

liên kết giữa các bazơ nên hai mạch đơn được ghép song song đối diện phải có chiều

ngược nhau. Nếu chiều của mạch đơn thứ nhất từ 3’ đến 5’ thì chiều của mạch đơn thứ hai

phải từ 5’ đến 3’. Do vậy tạo thành sự xoắn của chuỗi kép (hình 1.7)

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 17 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Liên kết giữa các bazơ nhóm pyrimidin với bazơ nhóm purin: bazơ A liên

kết với bazơ T thông qua 2 liên kết hydro, còn bazơ G liên kết với bazơ C thông

qua 3 liên kết hydro.

Hình 1. 8 Cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN

I.3.2 Nguyên lý hoạt động của cảm biến ADN:

Dựa trên khả năng nhận dạng chọn lọc các ADN đích (target) của ADN dò

(probe), khi các ADN mẫu dò và đích kết hợp với nhau tạo thành chuỗi kép (double

helix) nhờ sự ghép cặp bổ sung giữa các bazơ A - T, C - G trong quá trình lai hoá

phân tử. Sự ghép cặp chọn lọc được đảm bảo rằng liên kết hydro và sự tối ưu hoá

trong tương tác không gian giữa các bazơ . Do vậy rất dễ dàng suy luận trình tự của

bất kỳ phân tử ADN đích nếu biết được trình tự của ADN dò.

I.3.3 Các phương pháp phát hiện ADN

Các phương pháp nhận biết điện hoá

Cơ sở chung của nhóm phương pháp này là sử dụng các kỹ thuật điện hoá có

độ nhạy cao như DPV (Diffirential Pulse Voltammetry), SWV (Square Wave

Voltammetry), EIS (Electrochemical Impedance Spectroscopy), để phát hiện sự

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 18 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

thay đổi tín hiệu khi có mặt ADN đích. Các phương pháp này yêu cầu phải có hoạt

động điện hoá. Phương pháp CV (Cyclic Voltammetry) là phương pháp phổ biến

nhất, tuy nhiên độ nhạy của phương pháp không cao do không loại bỏ được dòng tụ

điện. Phương pháp DPV, SWV cho độ nhạy cao hơn do loại bỏ được dòng tụ điện

bằng cách áp xung. Tuy nhiên khi thực hiện các phương pháp này đều phải đưa hệ

ra xa khỏi trạng thái cân bằng vì dựa trên nguyên tắc quét thế hoặc áp xung do đó

vẫn có ảnh hưởng nhất định. Phổ tổng trở điện hóa EIS (Electrochemical Impedance

Spectroscopy) cho các tín hiệu trong cảm biến ADN trên cơ sở phản ứng bắt cặp

ADN. Sau khi target ADN bắt cặp, phổ trở kháng của điện cực thay đổi, điện trở

thay đổi điện tích (Rct) sẽ thay đổi đều đặn trong suốt quá trình đó. Ưu điểm của

phương pháp phổ tổng trở EIS là do chỉ đưa một tín hiệu nhỏ hình sin vào hệ do vậy

vẫn giữ hệ ở trạng thái cân bằng, vì thế phương pháp EIS có độ ổn định cao, cho

phép phân tích không chỉ toàn bộ quá trình mà cả các giai đoạn riêng rẽ, xảy ra

đồng thời hoặc song song trong hệ nghiên cứu [54,55].

Xác định ADN bằng Vi cân tinh thể thạch anh (QCM)

Cảm biến có bộ chuyển đổi làm việc dựa trên nguyên lý cơ học khi có sự

tương tác giữa các thành phần tham gia phản ứng trên bề mặt của cảm biến (khi

ADN đích bắt cặp với ADN dò) làm cho khối lượng trên bề mặt tinh thể thay đổi

dẫn đến tần số dao động của tinh thể bị thay đổi. Cảm biến dạng này có ưu điểm là

độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian phản ứng nhanh, khả năng cơ động cao, có thể

sử dụng đo đạc trong các môi trường khác nhau[56].

Mục tiêu của luận văn là:

- Nghiên cứu chế tạo cảm biến enzyme sử dụng sử dụng màng PPy composite có

gắn các enzyme glucose để xác định nồng độ glucose bằng phương pháp đo dòng.

- Nghiên cứu chế tạo cảm biến ADN sử dụng màng PPy composite có gắn các ADN

dò để phát hiện ADN chuyển gen trong đậu tương bằng kỹ thuật điện hoá là phương

pháp phổ tổng trở và bằng phương pháp khối lượng là sử dụng linh kiện vi cân tinh

thể thạch anh (QCM)

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 19 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

CHƯƠNG II: POLYME DẪN, POLYPYRROLE VÀ CACBONNANOTUBE

II.1 POLYME DẪN

Vật liệu polyme ra đời từ cuối thế kỷ 19. Nhờ các đặc tính như bền, dẻo, giá

thành thấp và dễ dàng tổng hợp ... nên nó có rất nhiều ứng dụng. Polyme được ứng

dụng trong rất nhiều lĩnh vực như công nghiệp gia dụng, công nghiệp nặng, trong

điện tử, y tế ... Riêng trong lĩnh vực điện tử, polyme được ứng dụng làm chất cách

điện do chúng có trở kháng cao. Nói chung vật liệu polyme tổng hợp được trong

giai đoạn này hầu như không có tính dẫn điện. Tuy nhiên, vào năm 1958 đánh dấu

sự xuất hiện đầu tiên của vật liệu polyme có tính dẫn điện. Đó là vật liệu

polyacetylene. Vật liệu này được tổng hợp ở dạng bột đen có độ dẫn từ 7.10-11 đến

7.10-3 Sm-1. Năm 1967, Hideki Shirakawa tại trường Đại Học Công Nghệ Tokyo

tiến hành tổng hợp polyacetylene với xúc tác Ti(O-n-Bu)4 – Et3Al với độ dẫn cao

hơn mẫu vật liệu cũ khoảng 1000 lần. Nhóm của ông tiếp tục oxi hóa polyacetylene

bằng I2 và chúng chuyển sang màu vàng với độ dẫn khoảng 104 Sm-1 (tương đương với

độ dẫn của kim loại). Trên hình 2.1 trình bày độ dẫn của vật liệu polyme dẫn so với

các vật liệu khác như vật liệu kim loại, chất bán dẫn...

Hình 2. 1 Độ dẫn của vật liệu polyme dẫn so với các vật liệu khác

Trong những năm 80 của thế kỉ 20, các nhóm nghiên cứu đã tiến hành tổng

hợp polyheterocycle (polyme của các hợp chất dị vòng). Các polyheterocycle có độ

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 20 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

dẫn thấp hơn mẫu polyacetylene của giáo sư Shirakawa (103 Sm-1) nhưng lại có độ

ổn định cao hơn. Năm 2000, hội đồng khoa học giải thưởng Nobel đã trao giải

Nobel hóa học cho ba giáo sư Alan.J.Heeger, Alan.G.MacDiarmid và Hideki

Shirakawa vì đã có những đóng góp đột phá trong việc nghiên cứu và phát triển vật

liệu polyme dẫn [57].

Hiện nay, polyme dẫn trở thành một trong số những vật liệu mới đầy triển

vọng và ứng dụng mạnh mẽ trong nhiều rất nhiều lĩnh vực.Thông thường, polyme

dẫn được chia thành ba loại chính:

a) Polyme dẫn điện tử : là polyme có mạch chứa các liên kết đôi liên hợp

(nghĩa là các liên kết đôi xem kẽ với liên kết đơn), không có sự tích tụ điện tích một

cách đáng kể. Các polyme loại này bao gồm các polyme liên hợp mạch thẳng

(polyacetylene, ...), các polyme liên hợp vòng thơm (polyaniline, ...) và các polyme

dị vòng (PPy, ...).

Poly acetylene

Polyanilin

Hình 2. 2 Polyme dẫn điện tử

b) Polyme dẫn ion: là loại polyme có các cấu tử hoạt tính oxi hóa khử liên

kết tĩnh điện với mạng polyme dẫn ion. Các cấu tử oxi hóa khử là các ion trái dấu

với chuỗi polyme tĩnh điện. Khi đó, sự vận chuyển electron có thể do sự nhảy cách

điện tử giữa các vị trí oxi hóa khử cố định hoặc do sự khuyếch tán vật lý một phần

các dạng oxi hóa khử kèm theo sự chuyển electron.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 21 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Hình 2. 3 Polyme trao đổi ion

Polyme dẫn ion được điều chế bằng cách đưa các nhóm ion vào mạch

polyme bằng cách đồng trùng hợp hoặc bằng phương pháp cải biến hóa học. Ngoài

ra chúng ta cũng có thể điều chế các polyme loại này bằng cách đặt điện cực tính có

màng polyme dẫn ion vào trong dung dịch chứa các ion hoạt tính oxi hóa khử. Khi

đó, các polyme trao đổi ion có thể tách các ion từ dung dịch và liên kết với chúng

nhờ tương tác tĩnh điện

c) Polyme oxy hoá khử : là các polyme có chứa nhóm hoạt tính oxy hoá khử

liên kết với mạch polyme không hoạt động điện hoá. Trong các polyme loại này, sự

vận chuyển điện tử xảy ra thông qua quá trình tự trao đổi electron liên tiếp giữa các

nhóm oxy hoá khử gần kề nhau. Quá trình này gọi là chuyển electron theo bước

nhảy.

CH

CH2

N

poly(2-methyl-5-vinylpyridine)

Hình 2. 4 Polyme oxy hoá khử.

Ứng dụng của polyme dẫn :

Trong cấu tạo của vật liệu polyme dẫn có rất nhiều liên kết π. Chính hệ

thống các liên kết π này khiến cho polyme nhạy cảm với các phản ứng oxi hóa khử

trong phương pháp hóa học hay điện hóa. Đặc điểm của các phản ứng oxi hóa khử

trong các polyme dẫn là tính thuận nghịch cho nên chúng ta có thể điều khiển các

phản ứng này với độ chính xác khá cao. Nhờ những đặc điểm đó, vật liệu polyme

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 22 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

dẫn ngày càng được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt trong các lĩnh vực công nghệ cao.

Polyme dẫn điện được sử dụng trong vật liệu chống tĩnh điện, vật liệu phủ hấp thụ

sóng điện từ, keo dẫn điện, các dây thần kinh nhân tạo, các linh kiện điện tử, chế tạo

các cảm biến, màn hình hiển thị, chất điện ly rắn, các màng trao đổi ion, pin, ...[57]

Trên bảng 2.1 trình bày cấu trúc hóa học và độ dẫn của một số loại vật liệu

polyme dẫn thông dụng.

Bảng 2.1. Cấu trúc hoá học và độ dẫn của một số loại polyme dẫn thông dụng

Polyme Cấu trúc hoá học Vật liệu pha tạp Độ dẫn (S.m-1)

-

Polyacetylene (CH)n I2, Br2, Li, Na, AsF5 10000

-, ClO4

PPy 500-7500 BF4

-, ClO4

-

BF4 Polythiophene 1000

Polyphenulenesulfide 500 AsF5

Polyphenulenevinylen AsF5 2700

Polyphenylene 1000 AsF5, Li, Na

HCl 200 Polyanailine

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 23 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

II.2. PPy

II.2.1 Monome Pyrrole (Py)

Phân tử Py (hình 2.5) có cấu tạo phẳng với 4 nguyên tử cacbon ở trạng thái

lai hóa sp2 và có một dị tố N.

Hình 2. 5 Công thức cấu tạo của pyrole

Py là chất lỏng không màu, phảng phất mùi clorophom. Khi để trong không

4 là 0.948, n20

D là 1.5035. Khối lượng phân tử của pyrrole là

khí, Py bị sẫm màu nhanh. Nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ sôi lần lượt là – 18.50C

và 130.50C. d20

67.09đvC. Py tan vừa phải trong nước, có khả năng trộn lẫn với amoniac, ete, rượu

etylic và đa số dung môi hữu cơ khác.

Py là hợp chất dị vòng năm cạnh một dị tố (Nitơ). Điểm nổi bật nhất là hợp

chất dị vòng năm cạnh một dị tố này có tính thơm. Đặc biệt tính thơm này, cũng

như các tính chất khác phụ thuộc vào cặp electron không chia sẻ mà dị tố đóng góp

vào hệ electron π của vòng.

II.2.2 Polyme PPy (PPy)

PPy được tổng hợp từ các monome là các phân tử Py. Trong phân tử PPy,

các monome Py thường liên kết với nhau theo dạng phẳng ở các vị trí α′ và α .

Hình 2.6 Công thức cấu tạo phân tử PPy

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 24 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Bằng các phương pháp NMR và IR người ta còn phát hiện ra sự có mặt của

các liên kết dạng khác trong phân tử PPy, tuy nhiên liên kết dạng trên vẫn chiếm đa

số.

PPy được xem như một vật liệu bán dẫn loại p. Do nguyên tử Nitơ trong

phân tử PPy còn dư 2 điện tử chưa tham gia liên kết, do đó dễ dàng di chuyển tự do

trong toàn chuỗi polyme. Phân tử PPy có thể bị oxi hóa tạo thành dạng dẫn điện là

polaron và bipolaron.

Khối lượng riêng: khối lượng riêng của PPy thuần cỡ 1.47 g/cm3.

Hình thái học bề mặt: Nghiên cứu bằng phương pháp SEM cho thấy các

PPy được xây dựng bằng phương pháp điện hóa có xu hướng có dạng hình cầu.

Độ dẫn: độ dẫn của PPy thuần cỡ 100 Scm-1 tuy nhiên khi tiến hành định

hướng màng PPy bằng các phương pháp cơ học, chúng ta có thể tăng độ dẫn của nó

lên cỡ 1000 Scm-1.

Tính chất quang học: màng PPy mọc trên điện cực có thể thay đổi màu sắc

tùy thuộc vào trạng thái oxi hóa và trạng thái khử của nó.

Cơ chế dẫn của PPy:

Theo lý thuyết vùng năng lượng, một nửa vùng hóa trị của polyme dẫn được

điền đầy nhờ sự dịch chuyển của hệ thống liên kết π. Đó chính là điều kiện để

polyme có thể dẫn điện. Bề rộng vùng cấm trong polyme dẫn cỡ khoảng 1.5eV, nên

có thể coi polyme dẫn tương đương với chất bán dẫn. Khi pha tạp các tâm cho e

(donor) hay các tâm nhận e (acceptor) và đặt trong điều kiện thích hợp thì các

polyme có thể trở thành chất dẫn điện. Quá trình pha tạp sẽ tạo ra các mức năng

lượng mới có vị trí phụ thuộc vào quá trình oxy hóa khử của polyme.

Quá trình pha tạp trong Ppy được tiến hành như sau. Đầu tiên, một electron

được tách ra từ chuỗi polyme tạo ra một gốc tự do và một hạt tải dương. Gốc tự do

và cation liên kết với phần còn lại của chuỗi nhờ điều kiện cộng hưởng địa phương

của điện tích và gốc. Liên kết giữa một cation được định xứ trong chuỗi và một gốc

được gọi là polaron. Trạng thái polaron của PPy nằm chính giữa hai bờ vùng năng

lượng (cách mỗi bờ vùng 0.5 eV). Trong quá trình oxy hóa tiếp theo gốc tự do của

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 25 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

polaron tách ra khỏi liên kết tạo ra một trạng thái mới là bipolaron. Trong PPy,

bipolaron được định vị đối xứng trong khe năng lượng ở khoảng cách 0.75eV. Cuối

cùng, với việc pha tạp, dạng vùng năng lượng chuyển thành vùng bipolaron. Sơ đồ

vùng năng lượng của PPy trước và sau khi oxy hóa được trình bày trên hình 2.6

Hình 2. 7. Polaron, bipolaron và sự hình thành các dải năng lượng tương ứng

II.2.3. Phương pháp tổng hợp PPy

Có nhiều phương pháp để tổng hợp polyme dẫn nói chung cũng như PPy nói

riêng cụ thể là: trùng hợp plasma, trùng hợp tự xúc tác, trùng hợp thể nhũ tương,

trùng hợp hóa học và trùng hợp điện hóa. Trong số đó, phương pháp hóa học và

phương pháp điện hóa là hai phương pháp được sử dụng phổ biến nhất. Phương

pháp điện hóa có ưu điểm là tạo màng đồng đều và có độ dẫn tốt hơn so với phương

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 26 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

pháp hóa học. Tuy nhiên nó lại có nhược điểm là không thể chế tạo một lượng lớn

trong thời gian ngắn với giá thành rẻ như phương pháp hóa học.

Đối với phương pháp hóa học, có thể gặp phải một số khó khăn trong việc

lựa chọn dung môi phù hợp để hòa tan các monomer và các chất oxi hóa; việc lựa

chọn các ion đối để liên kết với chất oxi hóa hoặc điều khiển tốc độ phản ứng

polyme hóa. Còn phương pháp điện hóa có ưu điểm sản phẩm tạo ra thường đạt

được độ sạch cao (không cần phải chiết tách từ dung dịch chứa các monomer và

chất oxi hóa), điều khiển được quá trình pha tạp, tốc độ mọc cũng như bề dầy màng.

Chính vì những ưu điểm trên nên trong các hoạt động nghiên cứu, chế tạo thử,

người ta thường sử dụng phương pháp điện hóa.

II.2.3.1 Tổng họp PPy bằng phương pháp hóa học

Những polyme dẫn thuần có cấu trúc nối đôi liên hợp được tổng hợp bằng

phương pháp trùng hợp hóa học ở dạng dung dịch và dạng khí. Phản ứng trùng hợp

này có thể thực hiện theo hai cách: trùng hợp gián tiếp và trùng hợp trực tiếp.

Phương pháp trùng hợp trực tiếp: là phản ứng trùng hợp hoặc trùng ngưng,

phản ứng mở vòng, oxi hóa trực tiếp từ những monomer để hình thành polyme có

cấu trúc liên hợp. Một số polyme dẫn được tổng hợp từ phương pháp này là: PPy,

polyaxetylene, ...

Phương pháp trùng hợp gián tiếp: là phương pháp tổng hợp từ các

monomer thành phần như vinyl monomer, nhận được các polyme trung gian

(precursor), sau đó xử lý tiếp bằng các phương pháp vật lý để hình thành cấu trúc

liên hợp. Ưu điểm của phương pháp này là nhận được những polyme tan tốt trong

dung môi, chảy mềm khi gia nhiệt do đó có thể gia công thành những màng mỏng.

II.2.3.2 Tổng hợp PPy bằng phương pháp điện hóa

Quá trình tổng hợp điện hóa có bản chất điện với những điểm đặc biệt như:

bước khơi mào có thể xảy ra trực tiếp hoặc gián tiếp; phản ứng có thể xảy ra trên bề

mặt điện cực hoặc trong lòng dung dịch; sản phẩm sau phản ứng là màng polyme

dẫn kết tủa trên bề mặt điện cực làm việc (WE – Working Electrode). Trong thực tế,

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 27 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

có thể sử dụng hệ điện hóa với 2 hoặc 3 điện cực. Hệ điện hóa 2 điện cực bao gồm

điện cực làm việc (WE) và điện cực đối (CE – Counter Electrode). Vật liệu dùng

làm điện cực có thể là các kim loại (Au, Pt, ...), bán dẫn hoặc phi kim (ví dụ Si). Hệ

điện hóa hai điện cực thường được sử dụng để tổng hợp vật liệu. Trong hệ điện hóa

3 điện cực, người ta sử dụng điện cực làm việc (WE), điện cực đối (CE), và điện

cực so sánh (RE – Reference Electrode). Điện cực Calomen và điện cực Ag/AgCl

thường được sử dụng làm điện cực so sánh. Hệ điện hóa ba điện cực thường được

sử dụng để nghiên cứu quá trình phản ứng điện hóa.

Về mặt phương pháp, người ta thường sử dụng ba phương pháp sau để tổng

hợp polyme dẫn: phương pháp phân cực vòng, phân cực dòng tĩnh và phân cực thế

tĩnh.

Phương pháp phân cực vòng (CV – Cyclic Voltammetry): Điện thế phân

cực được quét tuyến tính một cách tuần hoàn từ điện thế E1 đến điện thế E2 và quay

lại theo thời gian với vận tốc quét không đổi. Dòng điện phản hồi I được ghi lại. Từ

dòng I và thế quét thu được, người ta xây dựng đồ thị I – E. Khi quan sát các đường

phân cực ta thấy: trong một số chu kỳ đầu, dòng tăng nhanh tương ứng với việc bắt

đầu có polyme kết tủa trên bề mặt anot. Khi tăng chu kỳ phân cực, dòng thụ động

giảm dần. Sau một số chu kỳ, các đường phân cực vòng trùng khít lên nhau. Khi đó

màng polyme bám trên bề mặt điện cực.

Phương pháp phân cực dòng tĩnh (GS - Galvanostatic): Tiến hành áp dòng

điện không đổi lên mẫu và đo hiệu điện thế phân cực E theo thời gian và thiết lập

đường E – t. Khi điều chỉnh mật độ dòng ta thấy: trong trường hợp mật độ dòng

thấp, tốc độ polyme hóa sẽ chậm còn mật độ dòng cao thì hầu hết polyme bị oxi

hóa.

Phương pháp phân cực thế tĩnh (PS – Potentiostatic): là phương pháp áp

điện thế phân cực không đổi và đo dòng phản hồi I theo thời gian. Từ những dữ

kiện thu được ta xây dựng đồ thị I – t. Trong phương pháp này, thế phân cực phải

đồng thời thực hiện hai nhiệm vụ: thứ nhất là tạo nền, thứ hai là oxi hóa monomer.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 28 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Vì vậy trong phương pháp này, việc lựa chọn điện thế phù hợp là một điều rất quan

trọng.

II.2.3.3 Tổng hợp màng PPy

PPy có thể nhận được từ phản ứng trùng hợp oxy hóa, phản ứng trùng hợp

điện hóa cũng như phản ứng quang điện hóa. Cơ chế của phản ứng trùng hợp PPy

như trên hình 2.8

Hình 2. 8 Cơ chế phản ứng trùng hợp PPy

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 29 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Cơ chế phản ứng được thực hiện theo các giai đoạn sau: một monomer Py bị

oxi hóa tạo thành một cation gốc, sao đó cation gốc này kết hợp với monomer trung

tính tạo ra một dimer. Như vậy, phản ứng tiếp tục xảy ra và tạo thành chuỗi

ologomer. Nếu sử dụng phương pháp điện phân để tổng hợp PPy thì trong dung

dịch điện phân các chuỗi polyme sẽ lớn dần lên. Khi độ tan của oligomer PPy giảm,

nó sẽ kết tủa trên bề mặt điện cực tạo nên vị trí các hạt, các hạt này lớn dần lên do

sự kết hợp của các cation gốc. Các oligomer kết tủa và các monomer có sẵn trong

dung dịch sẽ khuyếch tán đến bề mặt điện cực. Theo thời gian phản ứng, màng tạo

thành lớn dần lên theo hướng đồng dạng với oligomer ban đầu.

Trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi đã sử dụng phương pháp điện hóa để

tiến hành tổng hợp màng PPy trên linh kiện vi điện cực để ứng dụng làm cảm biến

GOx xác định glucose và cảm biến ADN phát hiện sự chuyển gen trong đậu tương.

II.3. Ống nano cacbon

II.3.1. Giới thiệu chung về CNT ( CNT)

CNT bao gồm có ống nanocacbon đơn vách (SWCNT) và ống nanocacbon

đa vách (MWCNT) (hình 2.8 )

Hình 2. 9 Cấu trúc của (a) SWNT và (b) MWNT

Cấu trúc SWCNT đơn vách có thể xem như là một lớp mạng tnh thể graphit

cuộn tròn lại (hình 2.8) Tỷ số giữa chiều dài và kích thước ngang của ống cỡ

khoảng 1000 nên ống này có thể xem như cấu trúc 1 chiều. Cụ thể hơn SWCNT cấu

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 30 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

tạo bởi 2 phần có tính chất hoá lí khác nhau. Phần thứ nhất là thành ống còn phần

thứ 2 là đầu ống.

- Hai đầu ống là các nguyên tử cacbon được sắp xếp tạo thành các vòng lục

giác hoặc ngũ giác.

- Phần thành của SWCNT có cấu trúc hình trụ. Nó được tạo thành khi 1 giải

lớp mạng graphit có bề rộng xác định cuộn lại theo một hướng xác định. Các hướng

được chọn là không liên tục để đảm bảo tạo thành 1 hình trụ khép kín.

MWCNT có thể xem như 1 cấu trúc bao gồm nhiều SWCNT đồng trục có

kích thước khác nhau bao bọc lấy nhau. Chiều dài và kích thước ngang khác nhau

do đó tính chất của chúng khác so với ống đơn vách.

II.3.2. Các tính chất đặc biệt của CNT

Các tính chất điện, phân tử, cấu trúc của CNT có được là do cấu trúc gần 1

chiều của nó. Các tính chất gần 1 chiều của CNT bao gồm:

– Khả năng phản ứng hoá học: Ống nano cacbon khác với mạng graphit ở

cấu trúc cong bề mặt của nó. Các phản ứng xảy ra thường liên quan đến tính chất

không đối xứng của orbitan π gây bởi độ cong tăng lên. Do đó chắc chắn có sự khác

biệt giữa đoạn đầu ống và đoạn thành ống. Cũng từ nguyên nhân trên CNT có kích

thước nhỏ hơn sẽ tham gia phản ứng hoá học mạnh hơn. Sự thay đổi tính liên kết

hoá trị ở cả đầu ống và thành ống đều có thể xảy ra.

– Tính dẫn điện: phụ thuộc vào vectơ cuốn, ống nano cácbon có thể là kim

loại hoặc bán dẫn. Nguyên nhân sự thay đổi của tính dẫn điện là do sự khác nhau về

cấu trúc phân tử đã dẫn tới sự khác nhau về cấu trúc vùng năng lượng và do đó độ

rộng khe năng lượng cũng khác nhau. Sự khác nhau về tính dân điện có thể dễ dàng

suy ra từ tính chất của mạng graphit. Theo đó CNT (n, m) có tính kim loại với n=m

hoặc n – m= 3i ( I là số nguyên). Trở kháng của ống được xác định bởi đặc tính cơ

lượng tử và được chứng minh là độc lập với chiều dài ống.

– Tính chất quang: Các nghiên cứu lí thuyết đã chứng tỏ rằng các tính chất

quang của CNT sẽ biến mất khi kích thước ống tăng lên.. Và do đó nó được cho

rằng nó được cho rằng các tính chất khác cũng được quyết định bởi các hiệu ứng

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 31 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

kích thước. Sử dụng các tính chất quang của CNT có thể tạo ra được vai trò lớn của

CNT trong các dụng cụ quang học.

– Độ bền cơ học: CNT có ứng suất Young rất lớn dọc theo trục của nó. Nói

chung CNT rất mềm mại bởi chiều dài rất dài của nó. Do đó các hợp chất này có

nhiều ứng dụng phù hợp trong các vật liệu coposite mà cần dến tính chất không

đẳng hướng.

Trên hình 2.9 là minh họa cho khả năng gắn kết với phần tử sinh học của

SCNT, Dựa trên khả năng này chúng tôi sử dụng CNT pha tạp vào màng polypyrole

để chế tạo các cảm biến sinh học ứng dụng trong phân tích.

Hình 2. 10. CNT nguyên chất và CNT gắn với các cấu tử sinh học. (1) SWCNT và (2) MWCNT (http://dvworld.northwestern.edu/). (3) Ống nano carbon gắn với các cấu tử khác nhau: a) gắn nucleotide; b) gắn đường; c) gắn chất hoạt động bề mặt; d) gắn peptide; e) gắn C60

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 32 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

CHƯƠNG III: TỔNG HỢP ĐIỆN CỰC VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

III.1 TỔNG HỢP ĐIỆN CỰC

III.1.1 Thiết bị

- Hệ đo điện hoá đa năng AUTOLAB - ECOCHEMIE PGSTAT 12.

- Hệ vi cân tinh thể thạch anh QCM200

- Máy gia nhiệt và khuấy từ VELP F2052162

- Đồng hồ vạn năng model DT9205A

- Máy rung siêu âm Bransonic 12

- Micropipette 0,5- 50 μl

- Cân điện tử

- Điện cực làm việc là vi điện cực Pt dạng răng lược, điện cực đối là điện cực

thanh Pt, còn điện cực so sánh là điện cực Calomen

- Các dụng cụ thí nghiêm cần thiết khác

III.1.2 Hóa chất

- Monome pyrrole: 99%, Aldrich Chemical Co

- Ống nano carbontube (CNT), Trung Quốc, có đường kính ống φ = 40 ÷

60nm với chiều dài cỡ vài µm.

- NaCl PA, Merck

- Enzym glucose (GOx)

- β-D glucose, Merck

- ADN dò (probe) có một đầu được gắn với monomer pyrrole có trình tự:

5’ GGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCC 3’

- ADN đích (target): 5’ GGCAGAGGCATCTTCAACGATGGCC 3’

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 33 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

III.1.3. Quy trình thực nghiệm

III.1.3.1 Quy tình tổng hợp - cố định ADN dò lên màng PPy pha tạp và không pha tạp ống nanô cácbon CNT

Chuẩn bị dung dịch

Tất cả các hóa chất được dùng trong thực nghiệm đều có độ sạch cao nên

được sử dụng ngay không qua quá trình xử lý nào. Tuy nhiên, ống nano cacbon

(CNT–Trung Quốc) có đường kính ống φ=40-60 nm với chiều dài vài µm, để phân

tán được chúng trong dung dịch chúng tôi phải tiến hành chức năng hóa trong môi

trường axít trước khi sử dụng [66].

Hình 3. 1 Chức năng hóa CNT bằng hỗn hợp HNO3: H2SO4 (1:3)

Quá trình này được thực hiện như sau: CNT đa lớp (MWCNTs) được rung

siêu âm trong hỗn hợp dung dịch axit đậm đặc HNO3:H2SO4 (1:3) để tiến hành chức

năng hóa đồng thời loại bỏ các ion kim loại nặng trong nhiều giờ. Hỗn hợp dung

dịch được rửa bằng nước cất vài lần, sau đó rửa trong dung dịch NaOH 0,1M để đạt

độ pH=7. Dung dịch màu đen sau khi chắt lọc được sấy khô qua đêm, thu được dưới

dạng bột đen. Bột này chính là ống nano đã chức năng hoá (CNT). Sau khi được

chức năng hóa, các mạch liên kết cacbon bị phá vỡ ở hai đầu ống, ống

carbonnanotube trở thành cấu trúc hai đầu hở, thành ống trở thành cấu trúc

MWCNT-COOH. Cấu trúc này ngoài việc giúp chúng phân tán tốt trong nước còn

giúp cho các thành phần sinh học như các enzyme, các phân tử ADN... xâm nhập cố

định trong ruột ống, hoặc đính trên bề mặt của ống [67].

ADN dò phát hiện chuyển gen trong đậu tương, chúng tôi sử dụng loại ADN

dò có một đầu được gắn với monomer pyrrole (giúp cho quá trình cố định lên màng

PPy được dễ dàng hơn).

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 34 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Màng PPy cố định ADN dò được tổng hợp trong dung dịch đệm bao gồm Py

(nồng độ 0,3M), nồng độ ADN dò 1μl/1ml dung môi. Còn đối với màng Py pha tạp

MWCNT cố định ADN thì ta cho thêm lượng MWCNT là 2mg/ml dung môi. Do Py

khó tan trong nước nên chúng tôi tiến hành khuấy hỗn hợp chứa pyrrole khoảng 10h

bằng máy khuấy từ. Sau đó cho ADN dò (với màng PPy không pha tạp) hoặc hỗn

hợp ADN dò và MCNT (với màng PPy pha tạp) và rung hỗn hợp này trong khoảng

5 phút để giúp chúng phân tán tốt trong dung môi chứa pyrrole.

Chuẩn bị hệ điện hoá

Trên hình 4.1 trình bày sơ đồ hệ điện hóa ba điện cực sử dụng tổng hợp

màng PPy pha tạp và không pha tạp sử dụng phát hiện chuyển gen trong đậu tương.

Các điện cực sử dụng trong hệ điện hóa này bao gồm: (1) Điện cực làm việc là linh

kiện QCM và vi điện cực răng lược; (2) Điện cực so sánh Ag/AgCl; (3) Điện cực

đối là lưới Pt.

Hình 3. 2 Sơ đồ hệ điện hóa ba điện cực sử dụng tổng hợp màng PPy pha tạp và không pha tạp ứng dụng xác định chuyển gen trong đậu tương.

Hệ điện hóa, được ghép nối với thiết bị AUTOLAB - ECOCHEMIE

PGSTAT 12 với chế độ phân cực thế tĩnh. Điện áp đặt trên điện cực làm việc trong

khoảng 0,65 V đến 0,75 V so với điện cực Ag/AgCl. Thời gian tổng hợp 5000s.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 35 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

III.1.3.2 Quy tình tổng hợp - cố định enzyme glucose lên màng PPy pha tạp MWCNT

Chuẩn bị dung dịch

Quá trình chức năng hoá MWCNT được tiến hành tương tự như trên. Dung

dịch điện ly sử dụng tổng hợp điện cực GOx bao gồm: monome Py (0,3M) được

hòa tan trước trong nước đề iôn bằng máy khuấy từ khoảng 10 giờ. Sau đó cho CNT

vào dung dịch này với tỷ lệ 3 mg CNT/ml dung dịch và đưa vào máy rung siêu âm

trong 15 phút. Cuối cùng cho enzyme glucose GOx (glucose oxidase) với tỷ lệ 0,5

mg/ml vào trong hỗn hợp để tiến hành tổng hợp.

III.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

III.2.1 Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (Quartz Crystal Microbalance- QCM)

Năm 1880, Pierre và Jacques Curie đã phát hiện ra hiện tượng: khi đặt một

áp lực lên tinh thể muối Rochell (NaKC4H4O6.4H2O) sẽ phát sinh ra điện áp và

ngược lại khi đặt điện áp lên tinh thể thì sẽ gây biến dạng cơ học. Phát hiện này là

tiền đề của hiệu ứng áp điện. Bộ dao động điều khiển tần số dựa trên tinh thể Quartz

loại X-cut được sử dụng lần đầu vào năm 1921. Tuy nhiên loại tinh thể này có

nhược điểm là khá nhạy cảm với nhiệt độ vì thế hiện nay không còn được sử dụng

nhiều. Đến năm 1934 người ta phát hiện ra rằng tinh thể Quartz loại AT-cut ổn định

với nhiệt độ. Nhờ đặc điểm này mà nó hầu như là lựa chọn hàng đầu để làm QCM.

Khi đặt điện áp xoay chiều vào tinh thể AT-cut, hai bên điện cực sẽ sinh ra dao

động trượt dọc theo bề mặt tinh thể. Dao động này sẽ cộng hưởng khi tần số dòng

điện bằng tần số dao động riêng của tinh thể Quartz. Tất cả các ứng dụng của cảm

biến sử dụng linh kiện QCM đều xoay quanh tần số dao động cộng hưởng của nó.

Linh kiện QCM được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực như: chế tạo các cảm

biến khí, cảm biến mùi và bộ chỉ thị cho quá trình điện hóa, đo chiều dày của màng

mỏng tạo thành trong quá trình chế tạo màng. Đặc biệt, linh kiện QCM được ứng

dụng mạnh mẽ trong việc chế tạo cảm biến sinh học như: sử dụng để phát hiện virus

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 36 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

gây bệnh, phát hiện chuyển gen ADN…vv. Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi

sử dụng linh kiện QCM để phát hiện chuyển gen trong đậu tương.

III.2.1.1 Tinh thể thạch anh

Cấu trúc

Trong điều kiện nhiệt độ phòng, tinh thể Quartz (SiO2) có cấu trúc trigonal

(α- Quartz) và có hiệu ứng áp điện rất mạnh. Các ô đơn vị lặp lại tuần hoàn trong

không gian. Tinh thể Quartz có nhiệt độ chuyển pha là 573 oC. Khi nhiệt độ lớn hơn

573 oC, tinh thể chuyển sang cấu trúc hexagonal (β-Quartz) và mất đi tính áp điện.

Mạng tinh thể có các ion Si+ và O- , chúng được sắp xếp như trình bày trên hình 3.1.

Hình 3. 3 Mô tả cấu trúc của tinh thể α-Quartz trong không gian (a) và trong mặt phẳng (b)

Tính chất áp điện

Nguồn gốc của hiện tượng áp điện xảy ra trong tinh thể α-Quartz là do sự

dịch chuyển của các ion Si+ và O- trong mạng tinh thể khi có biến dạng. Khi chưa

có ứng suất bên ngoài thì trọng tâm điện tích âm và điện tích dương trùng nhau nên

tinh thể có tính trung hòa về điện. Khi có ứng suất bên ngoài, ứng suất này sẽ làm

cho trọng tâm các điện tích dương và điện tích âm lệch nhau dẫn đến hình thành

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 37 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

một momen phân cực điện. Sự xuất hiện của moment phân cực điện này sẽ tạo ra

điện tích trái dấu giữa 2 mặt tinh thể.

Hình 3. 4 Cơ chế sinh ra hiện tượng áp điện trong tinh thể α-

Khi đặt điện áp xoay chiều có tần số thích hợp lên hai mặt tinh thể, tinh thể

sẽ dao động với tần số của điện áp và sinh ra một tín hiệu điều hòa, gọi là mode dao

động của tinh thể Quartz. Mode dao động này phụ thuộc vào cách cắt tinh thể. Đối

với tinh thể loại AT-cut, dao động tinh thể theo mode trượt (hình 3.6), tinh thể X-

Cut có mode dao động co dãn tinh thể dọc theo hướng đặt điện áp (hình 3.7).

Hình 3. 5 Mô tả mode dao động trượt theo bề dày của linh kiện QCM.

Hình 3. 6 Mô tả một số mode dao động trượt bề dày, mode trượt bề măt và mode co giãn.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 38 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

III.2.1.2. Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (QCM)

Năm 1959, Sauerbrey đã phát hiện ra mối liên hệ giữa sự dịch chuyển tần số

cộng hưởng của tinh thể Quartz với sự thay đổi khối lượng trên một đơn vị diện tích

bể mặt của nó. Công trình này đã đặt nền móng cho việc chế tạo và sử dụng thể

Quartz như một vi cân. Phương trình biểu diễn mối liên hệ giữa độ dịch tần số cộng

Δƒ0 = -cƒΔm (3-1)

hưởng và biến thiên khối lượng trên bề mặt được gọi là phương trình Sauerbrey :

Trong đó, cƒ là hệ số tỉ lệ; Δm biểu diễn sự biến thiên khối lượng trên một

đơn vị bề mặt diện tích của tinh thể; Δƒ0 là độ dịch tần số tương ứng với biến thiên

khối lượng. Như vậy, dựa vào phương trình này chúng ta có thể xác định được độ

tăng khối lượng hấp thụ trên bề mặt tinh thể.

Ngoài ra, trong chất lỏng, độ dịch tần số tỉ lệ với căn bậc 2 của tích mật độ

f

f

∆ = − 0

3/ 2 0

và độ nhớt dung dịch theo phương trình:

ηρ l l πηµ q q

(3-2)

lη ρ lần lượt là độ nhớt và mật độ chất lỏng;

,l

qη µ lần lượt là độ

,q

Trong đó,

nhớt và modun trượt của tinh thể Quartz. Đây chính là cơ sở cho các ứng dụng của

QCM trong việc xác định mật độ cũng như độ nhớt của môi trường. Trong thời gian

gần đây, các nghiên cứu tập trung vào chế tạo các bề mặt điện cực chính xác và đặc

biệt để làm detector đo nồng độ khí môi trường, làm sensor sinh học và dùng để

nghiên cứu tương tác giữa các phân tử bề mặt. Ngoài ra, tinh thể Quartz còn nhạy

đối với một số thay đổi khác trên bề mặt tinh thể như áp suất, nhiệt độ và độ nhám

bề mặt. Lấy gần đúng bậc nhất coi độ dịch tần số bằng tổng độ dịch thành phần do

f

+ ∆ f

+ ∆ f

+ ∆ f

+ ∆ f

các tác nhân khác nhau, ta có:

∆ = ∆ f 0

m

ass

d

ensity/viscosity

compres on

si

roughness

temprature

(3-3)

Ảnh hưởng của các thành phần khối lượng, độ nhớt của dung môi, nhiệt độ

cũng như độ nhám bề mặt của tinh thể Quartz lên độ dịch tần số cộng hưởng được

đánh giá như sau:

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 39 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Ảnh hưởng của khối lượng chất hấp phụ

Khi một lượng chất hấp phụ lên bề mặt tinh thể Quartz thì lượng chất đó có

thể coi như khối lượng cộng thêm vào tinh thể Quartz đồng thời làm tăng chiều dày

tinh thể lên Δd, dẫn tới làm thay đổi tần số cộng hưởng của QCM một khoảng Δƒ0

theo phương trình (3-1)

Ảnh hưởng của độ nhớt dung môi

Khi tiếp xúc với chất lỏng, tần số của hộp cộng hưởng giảm do độ nhớt và

nồng độ môi trường cao gây ra sự tiêu tán năng lượng. Tần số cộng hưởng của

3 2

2

f

f

∆ = − 0

0

QCM tỷ lệ nghịch với tích độ nhớt và mật độ chất lỏng tiếp xúc với điện cực:

ηρ l l πρµ q q

(3-4)

trong đó:

ηl , ρl : độ nhớt và mật độ chất lỏng tiếp xúc

ρq , μq : Mật độ và modun trượt tinh thể Quartz

ρq = 2,648 g.cm-3, μq = 2,947. 1011 g.cm-1.s-2

Ảnh hưởng của nhiệt độ Tần số dao động của tinh thể Quartz cũng phụ thuộc nhiệt độ như trình bày trên

hình 3.5. Tuy nhiên, sự phụ thuộc này đối với tinh thể Quart loại AT-cut là tương

đối nhỏ. Trong thực tế, tinh thể loại AT-cut thường có hệ số nhiệt gần như bằng

không ở nhiệt độ phòng. Trong khoảng nhiệt độ từ 0÷ 60 oC, sự phụ thuộc ƒ(Τ) là

rất nhỏ, cỡ 1-3Hz/ oC và có thể coi như tuyến tính:

Δƒtemprature = -cTƒ0 ΔT (3-5)

Ảnh hưởng của độ nhám bề mặt

Độ nhám bề mặt điện cực gây ra sự mất chính xác của phương trình

Sauerbrey bởi khi đó sự phân bố khối lượng không còn đồng đều nữa. Hay nói cách

khác là bề mặt điện cực không còn là một lớp màng với độ dày đồng đều. Khi độ

nhám nhỏ hơn bước sóng âm hoặc độ nhám phân bố ngẫu nhiên thì mối liên hệ giữa

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 40 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

độ dịch tần số cộng hưởng và khối lượng hấp thụ trên bề mặt tinh thể Quartz vẫn

tuân thêo phương trình Sauerbrey (phương trình 3-1). Độ dịch tần số được tính theo

3 2

1 2

)

(

0

∆ f

a L h a ,

)

roughn

ess

ρη l l 1 2

công thức:

nf ( πρη q q

(3-6)

)

  = −   

  ( ψ δ a ,   

0

=

Trong đó: h là độ cao trung bình, L là khoảng cách trung bình giữa 2 mô nhám. δ η πρ l f l & Ψ là một hàm của các tỉ số giữa các thông số a, L, h, δ

2

=

c

/

Ảnh hưởng của ứng suất

f

f 02

ρµ q q

có thể suy ra tần số của QCM tăng tuyến Từ biểu thức

tính với áp suất do ảnh hưởng của áp suất tới modun đàn hồi của tinh thể.Độ dịch

tần do áp suất được tính bằng công thức:

∆

=

− 9 1.4.10 .

cf

f P . 0

ompression Trong đó P là áp suất tinh thể tính bằng đơn vị torr.

(3-7)

III.2.1.3. Một số cấu trúc QCM

Tùy theo mục đích sử dụng hiện nay người ta đã chế tạo ra nhiều kiểu cấu

trúc QCM như planar, bi mesa, plano-convex. Cấu trúc QCM thường gặp là cấu trúc

phẳng – planar (hình 3.9).

Hình 3. 7 Cấu trúc của QCM Planar

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 41 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

III.2.1.4. Cảm biến ADN trên cơ sở linh kiện QCM

Cảm biến sinh học trên cơ sở linh kiện QCM là một trong những ứng dụng

triển vọng trong nghiên cứu sinh học.

Hiện nay, cảm biến sinh học QCM đã được nghiên cứu rộng rãi với rất nhiều

ứng dụng cũng như chủng loại khác nhau: cảm biến ADN, cảm biến phát hiện tế

bào, cảm biến điện hóa, cảm biến phát hiện các axit amin,… vv. Tuy nhiên, chúng

đều có nguyên tắc chung là: khi lớp màng đặc biệt phủ trên tinh thể Quartz hấp phụ,

cố định các phần tử sinh học sẽ làm thay đổi khối lượng và do đó là thay đổi tần số

cộng hưởng của linh kiện QCM. Cảm biến sinh học ADN trên cơ sở linh kiện QCM

được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực của cuộc sống như: chuẩn đoán di truyền

học, phát hiện các tổ chức thay đổi gen, phát hiện vi khuẩn và các độc tố... Hơn nữa,

chúng còn được sử dụng thành công trong các nghiên cứu về cơ chế sinh học phân

tử như: động học lai hóa bề mặt ADN, phản ứng trùng hợp chuỗi ADN, phản ứng

tách ADN, liên kết của protein với ADN, tương tác ADN thuốc, …vv.

III.2.2 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (Electrochemical impedance spectroscopy – EIS)

Trong những năm gần đây, phương pháp phổ tổng trở điện hóa đã trở thành

một phương pháp hết sức thông dụng và hiệu quả trong việc phân tích các tính chất

của vật liệu. Từ các giá trị trở kháng đo được có thể khảo sát sự vận chuyển khối,

tốc độ phản ứng hóa học, các tính chất của điện môi, độ dẫn của vật liệu…

III.2.2.1. Bản chất của phương pháp

Bản chất của phương pháp là dựa trên việc nhận dạng các đường cong trở

Z = ReZ + j ImZ (3-8)

kháng đo được khi biểu diễn chúng dưới dạng phức:

Đặt một điện áp hình sin U(ω) =Uoeiωt đặt lên hệ điện và dòng xoay chiều

I(ω) = Ioei(ωt+θ) với θ là góc lệch pha giữa điện áp và dòng điện. Trở kháng

thu được

của vật liệu sẽ được biểu diễn như sau:

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 42 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Z(ω) =U(ω)/I(ω) = Uo/Ioe-iθ = Z e-iθ (3-9)

Z(ω) là một số phức có thể được biểu diễn trong hệ toạ độ cực bởi biên độ Z và góc

) ) Z Z ( ( m m

I I - -

M M

|Z| |Z|

θ θ n n i i s s | | Z Z

| |

|Z|cosθ |Z|cosθ

Re(Z) Re(Z)

pha θ hoặc trong hệ toạ độ Đêcac (hình 3.9):

Hình 3. 8 Biểu diễn vector Fresnel trong mặt phẳng phức.

Trong đó ReZ và ImZ là phần thực và phần ảo của trở kháng Z(ω). Sự liên hệ của

Z 2 =(ReZ) 2 +(ImZ) 2 θ = Arctang(

) (3-10)

ZI m ZR e

Re.Z = Z cosθ Im.Z = Z sinθ

các đại lượng này được biểu diễn:

Nếu tần số góc ω (hay θ)thay đổi, tập hợp các điểm M của vectơ tổng trở

Z’’ Z’’

miêu tả trên mặt phẳng phức là đường cong đặc trưng cho hệ khảo sát(hình 3.12).

ωo ωo

R/2 R/2

r + R r + R

r r

Z’ Z’

Hình 3. 9 Tập điểm M vẽ nên một đường phổ tổng trở đặc trưng cho hệ khảo sát.

Ngoài việc đo trở kháng tổng cộng của cả hệ rồi biểu diễn trên mặt phẳng

phức

Z’ = f (Z’’) (mặt phẳng Nyquist), ta có thể đo độ dẫn:

Y (ω) = 1/Z(ω) (3-11)

Mối quan hệ giữa Z(ω) và Y(ω) có thể biểu diễn:

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 43 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

2

2

=

=

+

=

Z

Z

(Re

)

(Im

)

2

2

1 +

Z Y

Z Y

Re Re

Im Im

Y

Y

(Re

)

(Im

)

(3-12)

III.2.2.2. Nội dung phương pháp

Bất kì một hệ điện hoá nào cũng có thể biểu diễn được bằng một sơ đồ mạch

ic ic

tương đương gồm có các điện trở và

RΩ RΩ

các điện dung.

ic + if ic + if

Zf Zf

Mạch tương đương này

if if

(a) (a)

thường chứa các phần tử sau:

≡ ≡

≡ ≡

RΩRΩ RΩ

ZfZf Zf

Rct Rct Rct

Zw Zw Zw

– Điện dung lớp kép: Cd

(b) (b)

– Tổng trở Pharaday: Zf

– Điện trở dung dịch:RΩhay Rs

Hình 3. 10 Mạch điện tương đương Randles – Điện trở chuyển điện tích:Rct

Các thành phần này được biểu diễn trên một mạch điện như hình 3.13:

Mạch tương đương nối song song có ý nghĩa vật lí là một mạch rẽ gồm quá

trình Faraday if và quá trình nạp lớp kép ic

Trong đó: i = if + ic (3-13)

Các phần tử R, C trong mạch tương đương đều là hàm của thời gian.

Bằng cách quét tần số một cách liên tục từ giá trị cao đến thấp trong một

khoảng rộng với thế một chiều là cố định, đường phổ trở kháng phức Z’’ vs Z’ thực

nghiệm sẽ được xử lý và mô phỏng bằng một mạch điện tương đương mà mỗi phần

tử của mạch đại diện cho một tính chất điện của hệ điện phân. Kết quả trở kháng đo

được sẽ được phần mềm xử lý và tính toán để vẽ lên đường phổ tương ứng, đồng

thời cho phép xác định được giá trị của các phần tử mô phỏng.

III.2.2.3. Tổng trở của polyme dẫn

Với điện cực polyme dẫn thì có một thành phần rất quan trọng trong cấu tạo

ZCPE = k.(jω)–p 0 ≤ p ≤ 1 (3-14)

mạch tương đương đó là phân tử hằng số pha CPE:

k – hằng số độc lập với tấn số ; k = Rct.(Cd/Rct)–p

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 44 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Khi đó mạch tương đương cho quá trình điện cực được thể hiện trên hình:

CPE CPE

RΩ RΩ

Rct Rct

Zf Zf

3.14

Hình 3. 11 Mạch tương đương cho tổng trở của polymer

CL = -1/(ω.Z’’) CL = -1/(ω.Z’’)

-Z’’ -Z’’

Phổ tổng trở biểu diễn mạch tương

của điện cực phủ polyme dẫn được thể

hiện trên hình

Cd = 1/(ω.Rct) Cd = 1/(ω.Rct)

(Pm)+x + xe– ↔ Pmo

-Z’ -Z’

α α

Ở vùng tần số cao ω → ∞ đường

RΩ + Rct RΩ + Rct

RΩ RΩ

biểu diễn là nửa vòng tròn bị nén với góc

nén α đặc trưng cho quá trình chuyển điện

tích vào màng polyme (hình 3.15).

Hình 3. 12 Mạch tương đương cho tổng trở của polymer dẫn Ở vùng tần số trung bình đường

biểu diễn nối với đoạn thẳng nghiêng 45o đặc trưng cho quá trình khuếch tán ion

vào màng polyme.Còn ở vùng tần số thấp ω → 0 ứng với đường thẳng đứng tương

ứng với quá trình cài ion vào mạng polyme.

III.2.2.4. Mạch điện tương đương:

Mô hình Randles là mạch thông dụng để mô phỏng hệ điện cực trong dung

dịch điện ly lỏng.

Trong đó các giá trị Rs, Rct, Cdl, W giải thích cho bản chất vật lý của hệ điện

cực được mô tả giới thiệu theo sau:

a) Điện trở dung dịch Rs

Điện trở dung dịch giữa điện cực làm việc và điện cực chuẩn đóng vai trò

quan trọng trong mạch điện mô phỏng phổ trở kháng phức. Điện trở của một dung

dịch ion phụ thuộc nồng độ ion, loại ion, nhiệt độ và cấu trúc hình học của diện tích

mà các ion này chảy qua.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 45 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

b) Điện dung lớp kép

Điện dung lớp kép tồn tại ở bề mặt giao nhau của điện cực và dung dịch điện

ly bao quanh nó. Lớp điện ly này được tạo ra do sự bám dính của các ion từ dung

dịch lên bề mặt điện cực, các ion này gây ra sự phân cực điện tích và làm xuất hiện

một lớp các ion trái dấu trên bề mặt điện cực.

c) Trở kháng Warburg(W)

Trong phép đo trở kháng thực tế, người ta còn thấy sự xuất hiện của các

đường đặc trưng trở kháng trong mặt phẳng phức là những đường thẳng tuyến tính

nghiêng 45o. Để mô phỏng đặc trưng này người ta thường đưa thêm vào hệ tương

đương mọt thành phần trở kháng khác nữa để mô tả hệ vật liệu, đó là trở kháng

Warburg (W). Trở kháng W đặc trưng cho hiện tượng khuếch tán của các hạt mang

điện vào cấu trúc màng điện cực. Phụ thuộc độ sâu của lớp khuếch tán người ta

phân biệt hai trường hợp khác nhau: lớp khuếch tán có chiều dài hữu hạn và lớp

khuếch tán có chiều dài bán vô hạn tương ứng với các biểu thức khác nhau cho trở

kháng Warburg.

d) Điện trở trao đổi điện tích

Xem xét một điện cực được nhúng vào dung dịch điện ly. Khi phản ứng điện

cực xảy ra, các phân tử trên bề mặt điện cực bị oxy hóa theo phản ứng tổng quát

Chất khử ↔ chất Oxi hóa + ne-

Điện trở trao điện tích đặc trưng cho quá trình oxi hóa khử trên và có thể

Rct = RT* (n2F2 A kct[S])-1 (*) [3-15]

được mô tả bởi công thức:

Trong đó: T: Nhiệt độ tuyệt đối

F: Hằng số Faraday

n: Số electron trao đổi trên mỗi phân tử chất trao đổi điện tích

kct: Hằng số tốc độ trao đổi điện tích (phụ thuộc điện thế)

A: Diện tích bề mặt điện cực

[S]: Nồng độ chất tham gia phản ứng oxy hóa khử

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 46 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Khi trạng thái cân bằng ổn định xảy ra ở một tín hiệu nhỏ, điện trở này có thể

Rct = RT/(nFIo) [13]

viết dưới dạng đơn giản hơn:

Với Io là mật độ dòng trao đổi và các thông số khác như trên

Điện trở Rct là một thành phần quan trọng của hệ điện cực. Nó thể hiện độ

dẫn của màng và tốc độ chuyển đổi tín hiệu của một cảm biến sinh học. Các quá

trình nhận biết nồng độ ADN được thực hiện thông qua sự thay đổi giá trị của Rct.

Vì thế chúng tôi tập trung các kết quả thực nghiệm trong việc phân tích đại lượng

này. Tuy nhiên trong quá trình mô phỏng cần thực hiện một số hiệu chỉnh bởi tính

chất không đồng nhất của màng điện cực, người ta hay dùng phần tử pha CPE để

thay thế cho một số các phần tử mạch điện.

Z = 1/[T(i*w)^P]; w: tần số góc

e) Hằng số pha CPE

Tham số: CPE-T(giá trị T), CPE-P(giá trị P)

Thực chất, tất cả các phần tử trở kháng là các phần tử pha CPE với các góc

lệch pha khác nhau ví dụ như tham số CPE-P bằng 1 (góc lệch pha 90o) tương

đương với một phần tử điện dung và bằng 0 (góc lệch pha bằng 0o) tương đương với

một điện trở.

Thông thường do bán kính cung thu được có tâm nằm dưới trục thực (bán

cung bị nén) nên để thực hiện quá trình hiệu chỉnh người ta thường sử dụng phần tử

pha CPE để thay thế cho giá trị điện dung (hiệu chỉnh này do Cole tìm ra và CPE

trường hợp này được gọi là một phần tử Cole). Lúc này hệ số CPE-P có giá trị trong

khoảng từ 0 đến 1. Về bản chất vật lý, CPE thể hiện tính không đồng nhất của hệ

trong trường hợp màng thu được có độ rỗng và xốp.

CPE còn được sử dụng để thay thế cho phần tử trở kháng trong trường hợp

tần số quét không đủ nhỏ ở vùng tần thấp cho việc khuếch tán sâu hơn của các hạt

dẫn vào trong vật liệu màng hoặc màng vật liệu là đủ dày để tần số thấp nhất không

đủ cho hạt dẫn đi sâu vào hoàn toàn trong vật liệu. CPE sẽ sinh ra một phổ trở

kháng giống như của một phần tử Warburg ở vùng “tần cao”.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 47 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Sau quá trình fit các giá trị Rct được ghi lại để thiết lập nên đường chuẩn thể

hiện quan hệ giữa 1/Rct và nồng độ ADN cho cảm biến ADN.

III.2.3 Phương pháp đo dòng (Amperometric)

Phương pháp đo dòng (Amperometric) là một phương pháp của phân tích

điện hoá, trong đó tín hiệu phân tích nhận được ở đầu ra là dòng hiện thời. Dòng

hiện thời này phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ nhất định của chất cần phân tích.

Trong quá trình hoạt động của cảm biến các phản ứng oxi hoá khử sẽ xảy ra trên

điện cực trơ, các điện tử đi chuyển từ dung dịch tới điện cực làm việc hoặc ngược

lại. Hướng di chuyển của các điện tử phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích và

được kiểm soát bởi điện thế áp đặt vào hệ. Phương pháp đo dòng được thực hiện

trên hệ điện hoá được thiết lập gồm hai hay ba điện cực. Điện cực đối thường là

điện cực Au hay Pt, điện cực chuẩn có thế cố định thông thường là Ag/AgCl và điện

cực làm việc. Điện thế được đặt giữa hai điện cực làm việc và điện cực so sánh,

người ta sẽ đo dòng chạy qua tế bào. Khi điện thế đạt đến một giá trị nào đó

(thường là điện thế oxi hoá), thì hiện tượng oxi hoá xuất hiện và các electron được

sinh ra. Dòng điện thu được sẽ tỉ lệ với độ tập trung của các phân tử bị oxi hoá. Tiến

hành đo đặc trưng đáp ứng dòng với sự thay đổi nồng độ glucose trong dung dịch

tại các giá trị điện áp đặt vào điện cực Gox. Xây dựng đường chuẩn của cảm biến

GOx tại các giá trị điện áp.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 48 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

IV.1 TỔNG HỢP MÀNG PPy_CNT_Gox; PPy_ADN dò; PPy_CNT_ADN dò

Trên hình 4.1 trình bày hình thái bề mặt màng composit cố định enzyme

glucose bằng phương pháp chụp ảnh hiển vi điện tử quét trường phát xạ (FESEM).

Kết quả cho thấy đã có sự pha tạp CNT vào trong màng PPy. Hơn nữa, chúng tôi

cũng nhận thấy có những điểm trắng sáng bám trên các CNT. Điều này chứng tỏ đã

có sự bám dính của thành phần sinh học Gox vào màng composit. Ngoài ra, dựa vào

đặc trưng dòng oxy hóa theo thời gian trong trường hợp có mặt và không có mặt

của thành phần sinh học trong quá trình tổng hợp màng cũng đã khẳng định điều

này.

Hình 4. 1: Ảnh hiển vi điện tử quét trường phát xạ FESEM của màng PPy_CN_GOx

Chúng tôi đã sử dụng phương pháp chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) để

quan sát hình thái bề mặt của màng PPy pha tạp và không pha tạp CNT sử dụng

trong cảm biến phát hiện sự chuyển gen trong đậu tương.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 49 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Trên hình 4.2 và 4.3 lần lượt trình bày ảnh SEM màng PPy_ADN dò và

PPy_CNT_ADN dò.

Hình 4. 2 Ảnh hiển vi điện tử quét SEM của màng PPy_ ADN dò

Hình 4. 3 Ảnh hiển vi điện tử quét SEM của màng PPy_CNT_ADN dò

Quan sát hình trên hình 4.2 và 4.3 ta thấy có các khối hình cầu đều xuất hiện

trên bề điện cực. Đây là dạng cấu trúc đặc trưng của PPy, điều đó chứng tỏ rằng đã

có sự hình thành màng PPy trên bề mặt vi điện cực. Tuy nhiên, đối với màng PPy

pha tạp CNT (PPy_CNT), chúng tôi quan sát thấy có các sợi bám trên bề mặt màng.

Như vậy CNT đã được pha tạp vào màng PPy trong quá trình tổng hợp. Hơn nữa,

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 50 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

trên bề mặt của hai dạng màng này chúng tôi đều quan sát thấy các đốm sáng (khác

so với màng PPy không có đính ADN trong các nghiên cứu trước).

Từ những kết quả trên có thể rút ra kết luận rằng chúng tôi đã thành công

trong việc tổng hợp màng PPy pha tạp và không pha tạp CNT bằng phương pháp

điện hoá cũng như gắn được chuỗi ADN lên bề mặt của màng.

IV.2 CẢM BIẾN GOx SỬ DỤNG VI ĐIỆN CỰC

IV.2.1 Cơ sở lý thuyết xác định nồng độ glucose trong dung dịch bằng phương pháp đo dòng (amperometric)

Khi điện cực GOx tiếp xúc với dung dịch có chứa glucose thì các enzyme

trên bề mặt điện cực hoạt động như một chất xúc tác trong phản ứng oxi hóa

GOx

 →+

+

Glu

cos

Gluconic

acid

Oe 2

OH 2 2

−

→

+

+ +

2

H

2 e

OH 2 2

O 2

glucose tạo ra hydrogen peroxide theo phản ứng sau:

Điện thế được đặt giữa hai điện cực làm việc và điện cực so sánh, người ta sẽ

đo dòng chạy qua tế bào. Khi điện thế đạt đến một giá trị nào đó (thường là điện thế

oxi hoá), thì hiện tượng oxi hoá xuất hiện và các electron được sinh ra. Dòng điện

thu được sẽ tỉ lệ với độ tập trung của các phân tử bị oxi hoá.

Như vậy đáp ứng dòng của điện cực sẽ tăng dần theo sự tăng dần nồng độ của glucose trong dung dịch. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát hoạt động của cảm biến tại các giá trị điện áp đặt vào điện cực khác nhau: 0,7 V; 0,75 V và 0,8 V (so với điện cực Ag/AgCl).

IV.2.2 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose trong dung dịch

Đầu tiên chúng tôi đo đáp ứng dòng của điện cực GOx trong dung dịch

không có glucose (nước đề iôn). Chúng tôi nhận thấy đáp ứng dòng I của điện cực

đạt giá trị ổn định 1,4 µA sau vài trăm giây. Chúng tôi tiếp tục quan sát ở vài trăm

giây tiếp theo và nhận thấy đáp ứng dòng I không hề thay đổi. Tiếp theo chúng tôi

tiến hành thay đổi nồng độ của glucose trong dung dịch. Khi trong dung dịch bắt

đầu có sự xuất hiện của glucose thì sự ổn định về đáp ứng dòng của cảm biến bị phá

vỡ. Ở nồng độ glucose thấp hơn 15 mM ( 5 và 10 mM) chúng tôi nhận thấy I tăng

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 51 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

dần theo thời gian và không có xu hướng ổn định. Khi nồng độ glucose trong dung

dịch đạt 15 mM, chúng tôi bắt đầu quan sát thấy hiện tượng đáp ứng dòng I ổn định

ở 1,3 µA trong thời gian dài. Kết quả này chứng tỏ sự hoạt động của điện cực GOx.

Chúng tôi tiếp tục tăng nồng độ glucose trong dung dịch lên và nhận thấy đáp ứng

dòng tăng dần theo thời gian và ổn định tại từng nồng độ glucose xác định. Trên

hình 4.4 trình bày đáp ứng dòng của điện cực GOx theo thời gian khi tiếp xúc với

5.5

Py_CNT_GOx

5.0

4.5

)

4.0

110 mM

90 mM

3.5

80 mM

65 mM

3.0

50 mM

2.5

30 mM

A µ ( g n ß d g n ø p ¸ §

2.0

15 mM

H2O

1.5

0.7V

1.0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Thêi gian (phót)

dung dịch chứa glucose với nồng độ xác định.

Hình 4. 4 Đặc trưng đáp ứng dòng theo thời gian của cảm biến GOx với sự thay đổi nồng độ glucose trong dung dịch

Căn cứ vào kết quả này chúng tôi tiến hành xây dựng đường đặc trưng chuẩn của

cảm biến tức là giá trị của đáp ứng dòng tại các nồng độ glucose xác định trong

dung dịch. Trên hình 4.5 trình bày đường chuẩn của cảm biến GOx hoạt động tại

điện áp 0,7V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl trong dải nồng độ từ 0mM đến

220mM. Kết quả cho thấy đường chuẩn của cảm biến GOx chia làm hai phần rõ rệt.

Trong dải nồng độ từ 0 mM đến 100mM thì mối quan hệ giữa đáp ứng dòng và

nồng độ là một đường tuyến tính với phương trình: I (µA) = 1,03 + 0,025 * C

(mM), trong đó C là nồng độ glucose trong dung dịch. Trong dải nồng độ từ 110

mM đến 220 mM thì quan hệ giữa đáp ứng dòng và nồng độ không còn tuyến tính

nữa mà chúng có xu hướng đạt trạng thái bão hòa. Tức là, đáp ứng dòng thay đổi rất

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 52 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

ít hoặc không thay đổi khi nồng độ glucose trong dung dịch tăng. Chúng tôi cho

rằng chính sự giới hạn về số lượng enzyme glucoscố định trên bề mặt điện cực gây

3.75

Py_CNT_GOx

3.50

3.25

)

3.00

2.75

I(µA)=1,03+0,025*C (mM) C = 5 - 100 (mM)

2.50

2.25

2.00

A µ ( g n ß d g n ø p ¸ §

1.75

1.50

§iÖn ¸p

1.25

0.7V

1.00

0

25

50

175

200

225

100

125

150 75 Nång ®é glucose (mM)

ra hiện tượng này.

Hình 4. 5 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose của cảm biến GOx làm việc tại điện áp 0,7V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl.

. Chúng tôi tiếp tục tiến hành đo đặc trưng đáp ứng dòng với sự thay đổi

nồng độ glucose trong dung dịch tại các giá trị điện áp đặt vào điện cực GOx là

0,75V và 0,8V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl. Đường chuẩn của cảm biến GOx tại

Py_CNT_GOx

3.25

3.00

2.75

)

2.50

I(µA)=1,01+0,029*C (mM) C = 5 - 65 (mM)

2.25

2.00

1.75

A µ ( g n ß d g n ø p ¸ §

1.50

§iÖn ¸p

1.25

0.75 V

1.00

0

50

100

150

200

250

300

Nång ®é Glucose (mM)

các giá trị điện áp này được trình bày trên hình 4.6 và 4.7

Hình 4. 6 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose của cảm biến GOx làm việc tại điện áp 0,75V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 53 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Py_CNT_GOx

2.2

2.1

)

2.0

I(µA) = 1,75 + 0,013*C (mM) C = 5 - 30 (mM)

1.9

A µ ( g n ß d g n ø p ¸ §

1.8

§iÖn ¸p

0.8 V

1.7

0

20

40

60

80

120

140

100 Nång ®é Glucose (mM)

Hình 4 .7 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose của cảm biến GOx làm việc tại điện áp 0,8V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl.

Kết quả cho thấy, cảm biến làm việc tại giá trị điện áp 0,75 V và 0,8 V so với

điện cực chuẩn Ag/AgCl cũng cho kết quả tương tự như khi làm việc tại điện áp

0,7V. Tức là đường chuẩn của cảm biến cũng chia thành hai phần: tuyến tính và bão

hòa. Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy khi cảm biến làm việc tại các giá trị điện áp

này thì dải làm việc tuyến tính của cảm biến bị thu hẹp lại so với khi làm việc tại

điện áp 0,7V. Dải làm việc tuyến tính nằm trong khoảng nồng độ glucose từ 0 ÷ 65

mM tại 0,75V và từ 0 ÷ 30 mM tại 0,8V.

Như vậy, có thể thấy rằng trong các phép đo mà chúng tôi thực hiện thì phép

đo ở điện áp 0,7V so với điện cực Ag/AgCl cho độ nhạy cao nhất (0,167mA cm-2

/M-1), dải tuyến tính rộng nhất (15-95mM). Ở các điện thế cao hơn (0,75V và 0,8 V)

thì độ nhạy giảm đi, và dải tuyến tính cũng hẹp hơn. Chúng tôi cho rằng nguyên

nhân là điện thế 0,7V gần với thế oxi hóa của H2O2 (0,68V) nhất do đó đáp ứng

dòng với cùng một nồng độ glucose là lớn nhất, ở các điện thế xa thế oxi hóa của

H2O2 hơn thì đáp ứng dòng giảm và độ nhạy cũng giảm xuống. Ngoài ra nếu đặt

điện thế một chiều lớn trên điện cực làm việc thì cũng có thể gây ra sự oxi hóa các

chất không mong muốn, làm giảm tính chọn lọc và tính chính xác của phép đo.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 54 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

IV.2.3 Nhận xét

So với một số kết quả nghiên cứu trước[58,60-63], cảm biến của chúng tôi đã

thể hiện được ưu điểm là có dải đo tuyến tính rộng hơn (15-95mM). Kết quả này

mở ra khả năng chế tạo cảm biến đo glucose ở dải nồng độ cao.

Bằng phương pháp điện hóa chúng tôi đã chế tạo thành công điện cực GOx

trong cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose trong dung dịch. Hoạt động của

cảm biến này đã được khảo sát tại ba giá trị điện áp: 0,7 V; 0,75 V và 0,8 V.

IV.3 CẢM BIẾN ADN PHÁT HIỆN CHUYỂN GEN TRONG ĐẬU TƯƠNG

IV.3.1 Cảm biến ADN sử dụng linh kiện vi cân tinh thể (QCM)

IV.3.1.1 Hệ đo QCM 200

Linh kiện QCM chúng tôi sử dụng chế tạo cảm biến ADN có tần số cộng

hưởng f0 = 5 MHz, đường của linh kiện Φ = 1 inch và nó có cấu trúc plano-plano.

Quá trình đo đạc phát hiện sự lai hóa giữa ADN dò và ADN đích được thực hiện

trên máy đo QCM200 trong điều kiện tải lỏng và theo phương pháp đo step by step.

Trên hình 4.8 trình bày hệ đo QCM200. Hệ đo này bao gồm thiết bị điều khiển số

QCM200, bộ điều khiển dao động tinh thể QCM25 và hệ gá mẫu ( hay còn gọi là

holder, được sử dụng để gắn linh kiện QCM sử dụng đo trong môi trường không khí

và môi trường chất lỏng).

Hình 4. 8 Hệ đo QCM200 đầy đủ gồm thiết bị điều khiển số QCM200, bộ dao động QCM25, giá đỡ tinh thể và các cảm biến tinh thể thạch anh

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 55 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

IV.3.1.2. Sự thay đổi tần số dao động của linh kiện QCM theo nồng độ ADN đích

Trước khi tiến hành chế tạo màng PPy gắn ADN dò trên điện cực làm việc

của linh kiện QCM, chúng tôi đã tiến hành đo thử nghiệm linh kiện này trên hệ đo

QCM200 ở chế độ không tải trong môi trường nước (tức là chưa tổng hợp màng

PPy gắn ADN dò lên trên phần điện cực làm việc của linh kiện). Kết quả đo được

trình bày trên hình 4.9. Đầu tiên, chúng tôi tiến hành nhỏ 50 μl H2O lên trên bề mặt

điện cực tiếp xúc môi trường đo (gọi tắt là điện cực làm việc). Chúng tôi quan sát

thấy tần số cộng hưởng của linh kiện lúc này là 5,008 MHz (ổn định trong suốt qua

trình đo, khoảng 350 giây).

Hình 4.9 Đặc trưng tần số theo thời gian ở chế độ đo không tải của linh kiện QCM.

Sau đó chúng tôi tiếp tục nhỏ thêm 100 μl H2O thì tần số cộng hưởng của

linh kiện lập tức giảm xuống 5,007 MHz và giữ ổn định trong suốt quá trình đo

(khoảng 550 giây). Lúc này lượng nước vừa đủ để che phủ toàn bộ bề mặt của điện

cực làm việc. Chúng tôi tiếp tục nhỏ tiếp 100 μl H2O và chúng tôi nhận thấy tần số

hầu như không thay đổi so với trước, tiếp tục nhỏ thêm 200 μl H2O cũng thu được

kết quả tương tự (tức là tần số cộng hưởng của linh kiện giữ không đổi, f0 = 5,007

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 56 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

MHz). Kết quả này cho thấy rằng chỉ có một lớp nước mỏng trên bề mặt điện cực

làm việc mới gây ra sự thay đổi tần số cộng hưởng.

Sau khi tổng hợp thành công màng PPy pha tạp CNT có gắn ADN dò trên

điện cực làm việc của linh kiện QCM, chúng tôi sử dụng để phát hiện cũng như xác

định nồng độ của ADN đích trong dung dịch. Đầu tiên chúng tôi tiến hành đo tần số

cộng hưởng của linh kiện này trong môi trường không có ADN đích (nước đề iôn).

Chúng tôi bơm thật chậm 400 μl H2O sao cho lượng nước này được láng đều trên

toàn bộ bề mặt của linh kiện. Trên hình 4.10 trình bày đặc trưng tần số cộng hưởng

của linh kiện theo thời gian. Kết quả cho thấy tần số hầu như không thay đổi trong

suốt quá trình bơm nước lên bề mặt và f0 = 2,550 MHz.

Hình 4. 10 Đặc trưng tần số theo thời gian của linh kiện QCM có gắn ADN trong môi trường không có ADN đích

Tiếp theo chúng tôi bắt đầu đo đặc trưng của tần số cộng hưởng cũng như sự

thay đổi về khối lượng hấp thụ trên bề mặt điện cực của linh kiện này. ADN đích

được pha với các nồng độ khác nhau trong dung môi nước. Dải nồng độ của ADN

đích nằm trong dải nồng độ từ 0 pM (nước) đến 269 pM. Trên Hình 4.11 trình bày

sự thay đổi khối lượng hấp thụ trên bề mặt điện cực làm việc của linh kiện theo

nồng độ của ADN đích trong dung dịch đo.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 57 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Hình 4. 11 Sự thay đổi khối lượng hấp thụ Δm trên bề mặt linh kiện QCM có gắn ADN dò đo trong dung dịch chứa ADN đích với nồng thay đổi từ 0 pM đến 269pM.

Chúng ta nhận thấy rằng khi trong dung dịch đo có chứa ADN đích với nồng

độ 4 pM thì khối lượng trên bề mặt điện cực của linh kiện tăng lên so với trường

hợp đo trong nước (0 pM). Điều này chứng tỏ đã xảy ra hiện tượng lai hóa ADN

trên bề mặt điện cực của linh kiện. Sự thay đổi khối lượng được đánh giá vào

khoảng Δm = 100 μg/cm2. Chúng tôi cũng quan sát được hiện tượng tương tự khi

thay đổi nồng độ ADN đích trong dung dịch đo đến nồng độ 269 pM tức là Δm thay

đổi theo nồng độ ADN đích trong dung dịch đo. Tuy nhiên, có một điểm không hợp

lý trong kết quả đo này. Đó là sự thay đổi về khối lượng là quá lớn, cỡ 500 μg/cm2

khi nồng độ ADN đích thay đổi từ 0 pM đến 28 pM. Qua nghiên cứu tài liệu của

thiết bị, chúng tôi thấy rằng phần mềm tính toán của thiết bị đã sử dụng công thức

của Sauerbrey (xem công thức 3-1) với hệ số nhạy Cf = 56,6 Hz.cm2/ μg với tinh

thể AT-cut tần số cộng hưởng 5MHz ở nhiệt độ phòng. Tuy nhiên, công thức này

chỉ đúng trong trường hợp màng gắn trên điện cực của linh kiện QCM là một màng

cứng, bám chắc, đồng đều và được đo trong điều kiện chân không hoặc không khí.

Trong trường hợp này có rất nhiều yếu tố (độ cứng, độ xốp, sự không đồng đều của

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 58 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

màng, đo trong tải lỏng,…) làm cho công thức trên không còn chính xác. Như vậy,

để xác định chính xác lượng ADN đích có mặt trong dung dịch ta không thể dựa

vào kết quả về sự thay đổi khối lượng hấp thụ trên bề mặt linh kiện. Do vậy, chúng

tôi đã tập trung vào việc phân tích sự thay đổi tần số dao động của vi cân tinh thể

Quartz theo sự thay đổi của nồng độ của ADN đích trong dung dịch đo.

Trên hình 4.12 trình bày sự thay đổi tần số dao động của linh kiện đo trong

môi trường dung dịch chứa ADN đích với nồng độ thay đổi từ 0 pM đến 28 pM.

Kết quả cho thấy, sự có mặt của ADN đích trong dung dịch đo (nồng độ 4 pM) đã

làm cho tần số dao động của linh kiện ngay lập tức giảm xuống khoảng 4kHz so với

trường hợp không có ADN đích trong dung dịch đo. Điều này chứng tỏ đã có sự lai

hóa ADN xảy ra trên bề mặt linh kiện. Chúng tôi cũng quan sát được hiện tượng

tương tự nồng độ ADN đích trong dung dịch đo tăng dần đến 21 pM. Ứng với mỗi

lần tăng nồng độ ADN đích, tần số dao động của tinh thể giảm xuống khá đều đặn

(khoảng 4 kHz cho mỗi lần). Những thay đổi rõ ràng và ổn định về tần số này đã thể

hiện rõ sự có mặt của ADN đích trong dung dịch ngay từ nồng độ rất thấp 4 pM.

Hình 4. 12 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian của linh kiện QCM có gắn ADN dò trong dung dịch chứa ADN đích với nồng độ thay đổi từ 0 pM đến 28 pM.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 59 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Chúng tôi tiếp tục đo đặc trưng tần số dao động của linh kiện với sự thay đổi

nồng độ ADN đích (từ 32pM đến 56 pM). Kết quả cũng cho thấy có sự suy giảm

tần số dao động của linh kiện theo nồng độ ADN đích (xem hình 4.13).

Hình 4. 13 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian của linh kiện QCM có gắn ADN dò đo trong dung dịch chứa ADN đích với nồng độ thay đổi từ 32 pM đến 56 pM.

Tuy nhiên, sự thay đổi về tần số dao động của linh kiện trong dải nồng độ

này có những khác biệt so với dải nồng độ trước ( từ 0 pM đến 21 pM). Trong dải

nồng độ này, sự suy giảm tần số dao động được đánh giá vào khoảng 27 kHz sau

lần thay đổi nồng độ ADN đích đầu tiên (từ 32 pM lên 36pM). Trong những lần

tăng nồng độ đều đặn tiếp theo (từ 36 pM đến 56 pM) sự thay đổi của tần số ngày

càng ít dần.Để giải thích hiện tượng này, chúng tôi cho rằng khi tăng nồng độ ADN

đích trong một khoảng giá trị xác định nào đó thì quá trình hấp thụ của ADN đích

lên trên bề mặt màng diễn ra mạnh mẽ nhất. Ngoài khoảng giá trị đó thì lượng ADN

dò trên bề mặt màng dần tới trạng thái hấp thụ bão hòa và khó hấp thụ thêm cho dù

tăng thêm nồng độ ADN đích. Ngoài ra, trong dải nồng độ ADN đích từ 32 pM đến

56 pM chúng tôi nhận thấy tín hiệu tần số dao động không còn trơn như khi đo ở dải

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 60 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

nồng độ thấp. Chúng tôi cho rằng có thể đã xảy ra hiện tượng một số ADN đích đi

ra khỏi màng thay vì hấp thụ vào màng .

Chúng tôi tiếp tục đo sự thay đổi tần số dao động của linh kiện trong dải

nồng độ ADN đích từ 59 pM đến 269 pM và cũng thu được kết quả tương tự như

trong hai dải nồng độ trước (xem hình 4.14).

Hình 4. 14 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian của linh kiện QCM có gắn ADN dò đo trong dung dịch chứa ADN đích với nồng độ thay đổi từ 59 pM đến 269 pM.

Tuy nhiên, trong dải nồng độ này, chúng tôi nhận thấy tần số dao động tiếp

tục giảm khi tăng nồng độ của ADN đích nhưng sự suy giảm tần số xảy ra rất chậm.

Tại những nồng độ ADN đích lớn (từ 224 pM đến 269 pM) thì tín hiệu tần số rất

khó đạt trạng thái ổn định. Tín hiệu tần số dao động bị nhiễu nhiều (bị nhăn nhiều).

Điều này chứng tỏ hiện tượng ADN đích đi ra khỏi màng diễn ra mạnh hơn hiện

tượng ADN đích hấp thụ vào màng. Sự hấp thụ bão hoà ADN đích của các ADN dò

trên bề mặt điện cực linh kiện QCM được thể hiện rõ hơn trên đồ thị 4.15. Trên đồ thị

này thể hiện mối quan hệ giữa tần số dao động của linh kiện QCM với nồng độ ADN

đích có trong dung dịch đo. Giá trị tần số dao động của linh kiện gần như không thay

đổi so với sự thay đổi của nồng độ ADN đích trong dung dịch đo (thể hiện ở đường tần

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 61 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

số đã gần như song song với trục nồng độ ADN đích). Do vậy, chúng tôi không tiếp tục

tiến hành đo tần số dao động của linh kiện ở nồng độ ADN đích cao hơn nồng độ

2820

269pM.

Linh kiÖn QCM: PPy_CNTs_DNA dß

2800

2780

2760

2740

2720

2700

) z H k ( è s n Ç T

2680

2660

2640

2620

0

50

200

250

300

150 100 Nång ®é DNA ®Ých (pM)

Hình 4. 15 Sự thay đổi tần số dao động của linh kiện QCM có gắn ADN dò theo sự thay đổi nồng độ ADN đích từ 0 pM đến 269 pM.

Bảng 4.1. Tần số dao động của linh kiện QCM tại giá trị nồng độ ADN đích xác định.

Nồng độ (pM) Tần số (kHz) Nồng độ (pM) Tần số (kHz) Nồng độ (pM) Tần số (kHz)

0 2803.62 39 2728.606 81 2671.772

4 2798.995 43 2711.519 96 2668.262

9 2794.660 46 2706.566 117 2663.669

13 2790.531 49 2699.414 134 2659.030

17 2787.518 52 2693.783 164 2654.393

21 2784.145 56 2687.886 195 2646.078

25 2780.431 59 2683.734 224 2640.364

28 2776.974 62 2681.768 251 2636.650

32 2771.526 65 2678.836 296 2634.700

36 2746.94 70 2676.459

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 62 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

IV.4 CẢM BIẾN ADN SỬ DỤNG VI ĐIỆN CỰC

IV.4.1 Cơ sở lý thuyết xác định ADN đích trong dung dịch bằng phương pháp phổ tổng trở

Có rất nhiều lý thuyết và mô hình đã được đưa ra để giải thích cho khả năng

sử dụng phương pháp đo phổ tổng trở của hệ điện cực có gắn ADN dò trong dung

dịch chứa ADN đích nhằm phát hiện cũng như xác định nồng độ của chúng trong

dung dịch. Ở đây chúng tôi xin trình bày một cơ sở lý thuyết đơn giản nhất được sử

dụng để giải thích như sau: Ban đầu khi chưa có ADN đích trong dung dịch, các

ADN dò trên bề mặt điện cực bị cuộn lại một cách ngẫu nhiên và gây ra hiện tượng

blocking cục bộ trên bề mặt. Khi cho điện cực này tiếp xúc với dung dịch có chứa

ADN đích thì hai nửa chuỗi ADN này sẽ bắt cặp với nhau tạo thành một chuỗi xoắn

kép. Về cơ bản chuỗi xoắn kép không bị cuộn lại một cách ngẫu nhiên mà sẽ có tính

định hướng hơn và góc giữa chuỗi kép với bề mặt điện cực cũng tăng lên (xem trên

hình 4.16). Lúc này bề mặt tiếp xúc của điện cực được giải phóng dẫn đến tạo điều

kiện cho các hạt mang điện trao đổi cũng như khuếch tán dễ dàng hơn. Đặc trưng

này được thể hiện thông qua giá trị độ dốc của phần tuyến tính trong đặc trưng phổ

tổng trở.

Probe strand Probe strand

(single strand) (single strand)

Hybrid Hybrid

(double strand) (double strand)

20 Ao 20 Ao 20 Ao

Hình 4. 16 Thay đổi hình dạng của chuỗi ADN khi chuyển từ trạng thái đơn chuỗi sang trạng thái ghép cặp.

IV.4.2 Xây dựng hệ đo và thiết lập mạch mô phỏng

Chúng tôi tiến hành đo đặc trưng phổ tổng trở của hệ điện cực sử dụng màng

PPy không pha tạp và pha tạp CNT có gắn ADN dò trong dung dịch có chứa ADN

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 63 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

đích với nồng độ tăng dần. Quá trình đo đặc trưng phổ tổng trở của hệ điện cực này

được thực hiện bằng phần mềm Frequency Response Analysis (FRA) của thiết bị

Autolab. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz với điện áp xoay chiều Eac=5mV tại

điện áp một chiều Edc = 0,32V so với điện cực Ag/AgCl. Hệ đo được thiết lập như

hệ điện hóa ba điện cực tuy nhiên điện cực làm việc là điện cực đã phủ màng PPy

có gắn ADN dò và dung dịch điện ly được thay thế bằng dung dịch chứa ADN đích

với nồng độ xác định. Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi đã tiến hành đo được đặc

trưng phổ tổng trở của hai hệ điện cực: (1) PPy pha tạp CNT gắn ADN dò và (2)

PPy gắn ADN dò. Sau khi có đặc trưng phổ tổng trở của hệ điện cực tại các nồng

độ ADN đích xác định chúng tôi tiến hành mô phỏng theo mạch mô phỏng tương

đương của Randles để xác định thành phần điện trở liên quan đến quá trình trao đổi

điện tích Rct. Mô hình Randles là mạch thông dụng để mô phỏng hệ điện cực trong

dung dịch điện ly lỏng. Trên hình 4.17 trình bày sơ đồ mạch Randles đơn giản được

CPE CPE »» »

Rs Rs

Rct Rct

chúng tôi sử dụng để mô phỏng xác định Rct.

Hình 4. 17 Mô hình mạch tương đương đơn giản của Randles.

IV.4.3 Đặc trưng phổ tổng trở

a)Điện cực sử dụng màng PPy không pha tạp CNT gắn ADN dò (PPy/ADN dò)

Chúng tôi tiến hành đo đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy/ADN dò trong

dung dịch chứa ADN đích với nồng độ từ 0 pM đến 96 pM.

Trên hình 4.18 trình bày đặc trưng phổ tổng trở trong dải tần số từ 200 kHz

đến 100 mHz trong dung dịch chứa ADN đích với nồng độ thay đổi từ 0 pM đến 21

pM. Kết quả cho thấy đặc trưng phổ tổng trở chỉ có một bán cung trong suốt dải tần

số quét đối với dung dịch không chứa ADN đích và có thêm một số điểm đo không

tuân theo quy luật tại vùng tần số thấp với dung dịch chứa ADN đích với nồng độ

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 64 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

thấp (từ 4 pM đến 21 pM). Chúng tôi cho rằng có thể do nồng độ ADN đích trong

5000

dung dịch đo quá thấp cho nên sự lai hóa ADN trên bề mặt xảy ra chưa rõ ràng.

Vi ®iÖn cùc: PPy_DNA dß

4500

4000

3500

4.5 kHz

3000

0 pM 4 pM 9 pM 13 pM 17 pM 21 pM

)

Ω

2500

' '

( Z -

33.7 kHz

2000

1500

1000

100 mHz

500

0

0

2000

4000

6000

10000 12000 14000

8000 Z'(Ω)

Hình 4. 18 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_ADN dò tại các nồng độ ADN đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5 mV, và Edc = 0,32V vs Ag/AgCl.

Chúng tôi tiếp tục tăng nồng độ ADN đích lên và đo đặc trưng phổ tổng trở

của điện cực này. Trên hình 4.19a và 4.19b trình bày đặc trưng phổ tổng trở đo

trong dải nồng độ ADN đích từ 25 pM đến 96 pM (trong dải nồng độ từ 25 pM đến

46 pM chúng tôi đã cắt bớt đoạn bán cung ở tần số cao để bán cung ở vùng tần số

trung bình và vùng tần số thấp được thể hiện rõ hơn). Chúng tôi nhận thấy rằng trên

đặc trưng phổ tổng trở xuất hiện hai bán cung. Bán cung ở vùng tần số cao không

đầy đủ và mất dần khi nồng độ ADN đích tăng lên. Còn bán cung ở vùng tần số

trung bình xuất hiện ngày càng rõ ràng và có độ cao giảm dần khi nồng độ ADN

đích tăng lên. Đặc biệt hơn nữa, chúng tôi quan sát thấy tại vùng tần thấp của đặc

trưng phổ tổng trở bắt đầu xuất hiện vùng tuyến tính tại nồng nồng độ ADN đích là

28 pM và ngày càng rõ nét ở các nồng độ cao hơn nồng độ này. Khi nồng độ ADN

đích càng tăng thì độ dốc của vùng tuyến tính này càng tăng. Như vậy, chúng ta có

thể nói rằng tại nồng độ 28 pM bắt đầu xảy ra hiện tượng lai hóa ADN rõ ràng và

ngày càng mạnh mẽ tại các nồng độ cao hơn.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 65 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

a)

300

Vi ®iÖn cùc: PPy_DNA dß

250

200

)

25 pM 28 pM 32 pM 36 pM 39 pM 43 pM 46 pM

150

Ω

'

( Z' -

210 Hz

100

2165 Hz

50

100 mHz

4 Hz

0

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

Z'(Ω)

b)

Vi ®iÖn cùc: PPy_DNA dß

100 mHz

200

160

)

Ω

120

' '

49 pM 52 pM 56 pM 59 pM 62 pM 65 pM 70 pM 81 pM 96 pM

( Z -

80

41.6 Hz

2.2 Hz

5.5 kHz

40

0

250

300

350

450

500

550

400 Z'(Ω)

Hình 4. 19 (a) và (b) Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_ADN dò tại các nồng độ ADN đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5 mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 66 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Chúng tôi đã sử dụng mô hình mạch tương đương của Randles để mô phỏng

phổ đặc trưng xác định thành phần Rct từ nồng độ ADN đích là 25 pM. Quá trình mô

phỏng được thực hiện trong chế độ Find circle của thiết bị Autolab (xem hình 4.20).

Sau đó chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn nồng độ ADN đích theo giá trị 1/Rct

mô phỏng được. Trên hình 4.21 trình bày đường chuẩn sử dụng giá trị 1/Rct như là hàm

của nồng độ ADN đích trong dung dịch với nồng độ nằm trong khoảng từ 25 pM đến

46 pM. Kết quả cho thấy giá trị 1/Rct thay đổi rất tuyến tính với sự thay đổi của nồng

độ ADN đích trong dung dịch. Tuy nhiên, khi chúng tôi sử dụng mô hình mạch điện tương

đương của Randles để xây dựng đường chuẩn ở nồng độ cao (từ 49 pM đến 96 pM) thì giá

trị 1/Rct thay đổi không theo quy luật tuyến tính với sự thay đổi của nồng độ. Chúng tôi cho

rằng, mô hình Randles không còn phù hợp để mô phỏng xác định giá trị Rct. Chúng ta dễ

dàng nhận thấy rằng trên mô hình đơn giản của Randles không có thành phần tổng trở

Warburg. Độ dốc của vùng tuyến tính tại tần số thấp của đặc trưng phổ tổng trở liên quan

hay nói cách khác nó được phản ánh qua tổng trở Warburg. Như vậy, để xây dựng đường

chuẩn tại các nồng độ cao chúng tôi cần phải sử dụng mô hình mạch tương đương khác. Tuy

CPE CPE CPE CPE

»» » » »»

Rs Rs Rs Rs

Rct Rct Rct Rct

nhiên do thời gian có hạn nên chúng tôi chưa thực hiện được quá trình mô phỏng này.

Hình 4. 20 Quy trình mô phỏng đặc trưng phổ tổng trở xác định Rct sử dụng mô hình mạch tương đương của Randles trong chế độ Find circle của thiết bị

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 67 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Vi ®iÖn cùc: PPy_DNA dß

0.0048

0.0046

nång ®é DNA ®Ých tõ 21 pM ®Õn 46 pM 1/Rct(Ω-1)=2,2.10-3+ 5,5.10-5*C(pM)

0.0044

)

0.0042

1

Ω-

(

t c

0.0040

R / 1

0.0038

0.0036

0.0034

®iÓm ®o fitting

0.0032

45

50

25

30

40

35 Nång ®é DNA ®Ých (pM)

Hình 4. 21 Đường chuẩn sử dụng giá trị 1/Rct như là hàm của nồng độ ADN đích ( từ 25 pM đến 46 pM) với phương trình 1/Rct (Ω-1) = 2,2.10-3+5,5.10-5*C(pM)

b) Điện cực sử dụng màng PPy pha tạp CNT gắn ADN dò (PPy_CNT_ADN dò)

Cùng với sự phát triển của công nghệ nanô, ống nanô cácbon (CNT) là vật liệu

được nghiên cứu nhiều nhất trong những năm vừa qua. Từ khi được phát hiện ra vào

năm 1991, CNT đã thu hút được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học do những tính

chất đặc biệt và khả năng ứng dụng to lớn của chúng. Thực nghiệm và lý thuyết đã cho

thấy khả năng tương thích và mặt sinh học giữa CNT và các thành phần sinh học như

enzyme hay ADN…Không những thế, CNT góp phần tăng cường diện tích hiệu dụng

của bề mặt vật liệu giúp gắn được nhiều thành phần sinh học. Vì thế chúng tôi tiến

hành pha tạp CNT vào màng PPy sử dụng làm cảm biến ADN (phát hiện chuyển gen

trong đậu tương) có độ nhạy cao và tính ổn định tốt hơn. CNT phải được biến tính

trong môi trường axít (như đã trình bày ở trên) để ống CNT trở thành cấu trúc hai đầu

hở (CNT).

Đặc trưng phổ tổng trở của hệ điện cực PPy_CNT_ADN dò được tiến hành

đo tương tự như điện cực PPy_ADN dò trong dung dịch chứa ADN đích theo

phương pháp stepwise. Kết quả đo đặc trưng phổ tổng trở của điện cực này trong

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 68 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

dung dịch chứa ADN đích với nồng độ thấp (từ 0 pM đến 21 pM) được trình bày

trên hình 4.22. Kết quả cho thấy cũng tương tự như điện cực PPy_ADN dò, với

nồng độ ADN đích thấp hầu như không phát hiện thấy có hiện tượng lai hoá ADN.

Chúng tôi tiếp tục tăng nồng độ ADN đích trong quá trình đo đặc trưng phổ tổng trở

8000

của loại điện cực pha tạp CNT này.

Vi ®iÖn cùc: PPy_CNT_DNA dß

7000

6000

5000

)

Ω

0 nM 4 pM 9 pM 13 pM 17 pM 21 pM

' '

4000

( Z -

3000

2000

1000

0

0

3000

6000

9000

12000

15000

18000

Z'(Ω)

Hình 4. 22 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_CNT_ADN dò tại các nồn độ ADN đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5 mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.

Trong dải nồng độ ADN đích từ 25 pM đến 96 pM đặc trưng phổ tổng trở

được trình bày trên hình 4.23a và 4.23b. Kết quả cho thấy các bán cung ở vùng tần

số trung bình có độ cao giảm dần khi nồng độ ADN đích trong dung dịch tăng lên.

Cơ chế đáp ứng này là hoàn toàn tương tự như trên điện cực sử dụng màng PPy

không pha tạp CNT. Tuy nhiên, các bán cung này có kích thước nhỏ hơn so với các

bán cung trên đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_ADN dò.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 69 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

100 mHz

140

1250 a)

Vi ®iÖn cùc: PPy_CNT_DNA dß

120

DNA dß: 25 pM f = 1810 Hz - 100 mHz

1000

)

Ω

100

' '

9.6 Hz

2.2 Hz

( Z -

)

180.6 Hz

750

25 pM 28 pM 32 pM 36 pM 39 pM 43 pM 46 pM

80

Ω

' '

100 mHz

( Z -

60

1800

1850

1900

1950

2000

2050

500

Z'(Ω)

1780 Hz

250

0 300

600

900

1200

1500

1800

2100

Z'(Ω)

100 mHz

Vi ®iÖn cùc: PPy_CNT_DNA dß

b)

150

120

)

Ω

' '

90

( Z -

49 pM 52 pM 56 pM 59 pM 62 pM 65 pM 70 pM 81 pM 96 pM

60

30

6 Hz

35 Hz

290 Hz

0

700

600

300

400

500 Z'(Ω)

Hình 4. 23 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_CNT_ADN dò tại các nồng độ ADN đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5 mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 70 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

Trên hình 4.24 trình bày đặc trưng phổ tổng trở của điện cực

PPy_CNT_ADN dò đo tại các nồng độ ADN đích khá cao (từ 117 pM đến 224

pM). Trong dải nồng độ này, chúng tôi thấy phần bán cung ngày càng thu nhỏ và

phần tuyến tính ngày càng rõ nét. Độ dốc của phần tuyến tính này tăng mạnh theo

nồng độ ADN đích có mặt trong dung dịch đo.Tương tự như đối với điện cực

PPy/ADN dò, chúng tôi cũng tiến hành mô phỏng đặc trưng phổ tổng trở đo tại các

nồng độ ADN đích khác nhau để xác định giá trị Rct. Giá trị Rct tại các nồng ADN

đích được trình bày trên bảng 4.2.

Vi ®iÖn cùc: PPy_CNT_DNA dß

120

100 mHz

100

117 pM 134 pM 164 pM 224 pM

80

)

Ω

' '

60

3 Hz

( Z -

35 Hz

40

1503 Hz

20

0

150

200

250

350

400

450

300 Z'(Ω)

Hình 4. 24: Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực PPy_CNT_ADN dò tại các nồng độ ADN đích khác nhau. Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = 5 mV, và Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl.

Bảng 4.2: Giá trị Rct nhận được sau mô phỏng tại các nồng độ ADN đích xác định.

Nồng độ ADN đích (pM)

Rct (Ω)

Nồng độ ADN đích (pM)

Rct (Ω)

25

417

62

143

28

397

65

134

32

350

70

128

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 71 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

81

113

36

318

96

109

39

294

117

105

42

245

134

117

46

212

164

112

49

191

195

111

52

178

224

107

56

167

59

153

Từ các giá trị Rct này chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn của giá trị này theo

nồng độ trình bày trên hình 4.25.

0.011

Vi ®iÖn cùc: PPy_CNT_DNA dß

0.010

0.009

)

0.008

1

Ω-

0.007

0.006

( t c R / 1

0.005

0.004

0.003

0.011 0.010 0.009 0.008 0.007 0.006 0.005 0.004 0.003 0.002 0.001

10 20

60 70 80

90

0.002

30 40 50

0

50

100

150

200

250

Nång ®é DNA ®Ých (pM)

Hình 4. 25 Đường chuẩn sử dụng giá trị 1/Rct như là hàm của nồng độ ADN đích ( từ 25 pM đến 224 pM) với phương trình 1/Rct (Ω-1) = 1,27.10-4 * C – 1,3.10-3 (pM)(nồng độ ADN đích từ 25 pM đến 81 pM).

Chúng tôi nhận thấy trong khoảng nồng độ của ADN đích trong dung dịch

đo từ 25 pM đến 81 pM, giá trị 1/Rct thay đổi tuyến tính theo giá trị của nồng độ

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 72 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

theo hàm: 1/Rct (Ω-1) = 1,27.10-4 * C – 1,3.10-3 (pM). Ở dải nồng độ cao (từ 96 pM

đến 224 pM) giá trị 1/Rct thay đổi không theo quy luật tuyến tính với nồng độ ADN

đích. Chúng tôi cho rằng vấn đề này xảy ra tương tự như đối với điện cực PPy/ADN

dò. Từ nồng độ 96 pM ADN đích trở đi, phần tuyến tính ở vùng tần thấp(có liên

quan tới tổng trở Warburg) lớn tới mức chúng ta không thể bỏ qua được. Tức là mô

hình Randles mô phỏng đặc trưng phổ tổng trở xác định Rct không còn phù hợp.

Trên hình 4.26 trình bày mô hình mạch tương đương mô phỏng đặc trưng phổ tổng

trở cho hệ điện cực PPy_ADN dò và PPy_CNT_ADN dò có tính đến ảnh hưởng của

tổng trở Warburg (đặc trưng cho phần tuyến tính tại vùng tần số thấp trên phổ tổng

CPE CPE CPE

»» » »

Rs Rs

trở).

W W W

Rct Rct Rct

Hình 4. 26 Mô hình mạch tương đương Randles có tính đến phần đóng góp của tổng trở Warburg.

IV.4.4 Nhận xét

Tuy giá trị của điện trở trao đổi điện tích Rct nhận được thông qua mô phỏng

đặc trưng phổ tổng trở với mô hình mạch tương đương đơn giản của Randles,

nhưng cũng cho thấy quan hệ khá tuyến tính giữa 1/Rct theo nồng độ. Điều này khá

phù hợp với lý thuyết và khẳng định tính đúng đắn trong việc lựa chọn mô hình

mạch tương đương gần đúng. Hơn nữa, bằng việc pha tạp CNT vào trong màng PPy

chúng tôi đã mở rộng giới hạn xác định nồng độ ADN đích so với màng PPy không

pha tạp. Việc pha tạp CNT vào trong màng còn làm cho đáp ứng đặc trưng phổ tổng

trở của màng ở dải nồng độ cao (từ 49 pM trở lên) rõ ràng hơn hẳn so với khi không

pha tạp CNT. Việc mô phỏng giá trị Rct để xác định nồng độ ADN đích có lẽ không

chỉ dừng lại ở 81 pM, nếu ta mô phỏng đặc trưng phổ tổng trở của các nồng độ

ADN đích khác nhau bằng mạch điện tương hình 4.26. Điều này đồng nghĩa là dải

nồng độ ADN đích xác định bằng giá trị Rct còn có thể mở rộng thêm nữa.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 73 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

KẾT LUẬN

• Cố định được enzyme glucose lên màng composite PPy_CNT và chế tạo

thành công điện cực GOx.

• Cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose trong dung dịch có dải nồng

độ tuyến tính rộng hơn (15-95mM) so với một số nghiên cứu trước.

• Đã chế tạo thành công màng polyme dẫn (PPy) ứng dụng chế tạo cảm biến

ADN phát hiện chuyển gen trong đậu tương.

• Nghiên cứu và ứng dụng thành công linh kiện vi cân tinh thể QCM trong chế

tạo cảm biến ADN.

• Xây dựng và ứng dụng thành công quy trình xác định nồng độ ADN đích

trong dung dịch bằng phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) và Vi cân

tinh thể thạch anh (QCM)

ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

• Đối với cảm biến GOx hướng nghiên cứu của chúng tôi sắp tới là sẽ nâng

cao độ nhạy của cảm biến, cải thiện tính chọn lọc bằng cách giảm điện thế

một chiều trên điện cực làm việc khi đo.

• Hoàn thiện quy trình chế tạo cảm biến ADN sử dụng QCM và cảm biến

ADN sử linh kiện vi điện cực.

• Thử nghiệm đo cảm biến ADN sử dụng QCM ở chế độ bơm.

• Kiểm tra tiếp tính ổn định và tính lặp lại trong các phép đo của cảm biến

ADN.

• Sử dụng mô hình mạch điện tương đương mới trong mô phỏng các đặc trưng

phổ tổng trở để xây dựng một đường chuẩn nồng độ ADN đích theo giá trị

Rct hoàn thiện hơn.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 74 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. IUPAC, A definition of biosensor. Biosensors and Bioelectronics, 1996.

[2]. Clark L C.; Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Acad. Sci. 1962, 102, 29-45.

[3]. Guilbault, G.G. and Montalvo, J. JACS 91, 2164-2569 (1969).

[4]. Lubbers, D.W. and Opitz, N. Z. Naturforsch. C: Biosci. 30c, 532-533 (1975).

[5]. Professor Anthony P F Turner, Biosensors: Past, Present and Future, Cranfield University 1996

[6]. Shichiri, M., Kawamori, R., Yamaski, R., Hakai, Y. and Abe, H. Lancet ii, 1129-1131 (1982).

[7]. Updike, S.J.; Hicks, G.P. The Enzyme Electrode. Nature 1967, 214, 986-988.

[8]. Nguyễn văn Mùi, Xác định hoạt độ enzym, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội 2002.

[9]. Sung, W.J.; Bae, Y.H. A glucose oxidase electrode based on PPy with polyanion PEG/enzyme conjugate dopant. Biosens. Bioelectron. 2003, 18, 1231- 1239.

[10]. Yao, T.; Takashima, K. Amperometric biosensor with a composite membrane film and electrochemically generated poly(1,2- of sol-gel derived enzyme diaminobenzene) film. Biosens.Bioelectron. 1998, 13, 67-73.

[11]. Li, G.; Wang, Y.; Xu, H. A hydrogen peroxide sensor prepared by electropolymeization of pyrrole based on screen-printed carbon paste electrodes. Sensors 2007, 7, 239-250.

[12]. Rahman, A.; Kumar, P.; Park, D.-S.; Shim, Y.-B. Electrochemical sensors based on organic conjugated polymes. Sensors 2008, 8, 118-141.

[13]. Ohnuki, H.; Saiki, T.; Kusakari, A.; Endo, H.; Ichihara, M.; Izumi, M. Incorporation of glucose oxidase into langmuir-blodgett films based on prussian blue applied to amperometric glucose biosensor. Langmuir 2007, 23, 4675-4681

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 75 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

[14]. Caseli, L.; dos Santos Jr, D.S.; Foschini, M.; Goncalves, D.; Oliveira Jr, O.N. The effect of the layer structure on the activity of immobilized enzymes in ultrathin films. J. Colloid Interface Sci.2006, 303, 326-331.

[15]. Mashazi, P.N.; Ozoemena, K.I.; Nyokong, T. Tetracarboxylic acid cobalt phthalocyanine SAM on gold: Potential applications as amperometric sensor for H2O2 and fabrication of glucose biosensor. Electrochim. Acta 2006, 52, 177-186.

[16]. Sun, Y.; Yan, F.; Yang, W.; Sun, C. Multilayered construction of glucose oxidase and silica nanoparticles on Au electrodes based on layer-by-layer covalent attachment. Biomaterials 2006, 27, 4042-4049.

[17]. Zhang, S.; Yang, W.; Niu, Y.; Li, Y.; Zhang, M.; Sun, C. Construction of glucose biosensor based on sorption of glucose oxidase onto multilayers of polyelectrolyte/nanoparticles. Anal. Bioanal. Chem. 2006, 384, 736-741.

[18]. Liu, G.; Lin, Y. Amperometric glucose biosensor based on self-assembling glucose oxidase on carbon nanotubes. Electrochem. Commun. 2006, 8, 251-256.

[19]. Chen, P.C.; Hsieh, B.C.; Chen, R.L.C.; Wang, T.Y.; Hsiao, H.Y.; Cheng, T.J. Characterization of natural chitosan membranes from the carapace of the soldier crab Mictyris brevidactylus and its application to immobilize glucose oxidase in amperometric flow-injection biosensing system. Bioelectrochemistry 2006, 68, 72- 80.

[20]. Wang, J.; Carlisle, J.A. Covalent immobilization of glucose oxidase on conducting ultrananocrystalline diamond thin films. Diamond Relat. Mater. 2006, 15, 279-284.

[21]. Florescu, M.; Barsan, M.; Pauliukaite, R.; Brett, C.M.A. Development and application of oxysilane sol-gel electrochemical glucose biosensors based on cobalt hexacyanoferrate modified carbon film electrodes. Electroanalysis 2007, 19, 220- 226.

[22]. . Li, J.; Yu, J.; Zhao, F.; Zeng, B. Direct electrochemistry of glucose oxidase entrapped in nano gold particles-ionic liquid-N,N-dimethylformamide composite film on glassy carbon electrode and glucose sensing. Anal. Chim. Acta 2007, 587, 33-40.

[23]. Dai, Z.H.; Ni, J.; Huang, X.H.; Lu, G.F.; Bao, J.C. Direct electrochemistry of glucose oxidase immobilized on a hexagonal mesoporous silica-MCM-41 matrix. Bioelectrochemistry 2007, 70, 250-256.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 76 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

[24] Kan, J.; Mu, S.; Xue, H.; Chen, H. Effects of conducting polymes on immobilized galactose oxidase. Synth. Met. 1997, 87, 205-209.

[25]. Poet, P.D.T.d.; Miyamoto, S.; Murakami, T.; Kimura, J.; Karube, I. Direct electron transfer with glucose oxidase immobilized in an electropolymeized poly-N- methylpyrrole film on a gold microelectrode. Anal. Chim. Acta 1990, 235, 255-264.

[26]. Gerard, M.; Chaubey, A.; Malhotra, B.D. Application of conducting polymes to biosensors. Biosens. Bioelectron. 2002, 17, 345-359.

[27]. Li, G.; Zheng, J.; Ma, X.; Sun, Y.; Fu, J.; Wu, G. Development of QCM trimethylamine sensor based on water soluble polyaniline. Sensors 2007, 7, 2378- 2388.

[28]. Tsujimoto, M.; Yabutani, T.; Sano, A.; Tani, Y.; Murotani, H.; Mishima, Y.; Maruyama, K.; Yasuzawa, M.; Motonaka, J. Characterization of a glucose sensor prepared by electropolymeization of pyrroles containing a tris-bipyridine osmium complex. Anal. Sci. 2007. 23, 59-63.

[29]. Borole, D.D.; Kapadi, U.R.; Mahulikar, P.P.; Hundiwale, D.G. Glucose oxidase electrodes of polyaniline, poly(o-anisidine) and their co-polyme as a biosensor: A comparative study. J. Mater. Sci. 2007, 42, 4947-4953.

[30]. Deng, C.; Li, M.; Xie, Q.; Liu, M.; Yang, Q.; Xiang, C.; Yao, S. Construction as well as EQCM and SECM characterizations of a novel Nafion/glucose oxidase- glutaraldehyde/poly(thionine) /Au enzyme electrode for glucose sensing. Sens. Actuat. B Chem. 2007, 122, 148-157.

[31]. Pan, X.; Kan, J.; Yuan, L. Polyaniline glucose oxidase biosensor prepared with template process. Sens. Actuat. B Chem. 2004, 102, 325-330.

to electrochemically polymeized [32]. Cosnier, S. Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment films. A review. Biosens. or attachment Bioelectron. 1999, 14, 443-456.

[33]. 43. Huang, J.; Yang, Y.; Shi, H.; Song, Z.; Zhao, Z.; Anzai, J.I.; Osa, T.; Chen, Q. Multi-walled carbon nanotubes-based glucose biosensor prepared by a layer-by-layer technique. Mater. Sci. Eng., B 2006, 26, 113-117.

[34]. Zhou, Q.; Xie, Q.; Fu, Y.; Su, Z.; Jia, X.; Yao, S. Electrodeposition of carbon nanotubes - Chitosan - Glucose oxidase biosensing composite films triggered by reduction of pbenzoquinone or H2O2. J. Phys. Chem. B 2007, 111, 11276-11284.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 77 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

[35]. Sljukic, B.; Banks, C.E.; Salter, C.; Crossley, A.; Compton, R.G. Electrochemically polymeised composites of multi-walled carbon nanotubes and poly(vinylferrocene) and their use as modified electrodes: Application to glucose sensing. Analyst 2006, 131, 670-677.

[36]. Timur, S.; Anik, U.; Odaci, D.; Gorton, L. Development of a microbial biosensor based on carbon nanotube (CNT) modified electrodes. Electrochem. Commun. 2007, 9, 1810-1815.

[37]. Liu, Y.; Wang, M.; Zhao, F.; Xu, Z.; Dong, S. The direct electron transfer of glucose oxidase and glucose biosensor based on carbon nanotubes/chitosan matrix. Biosens. Bioelectron. 2005, 21, 984-988.

[38]. Yogeswaran, U.; Chen, S.-M. A review on the electrochemical sensors and biosensors composed of nanowires as sensing material. Sensors 2008, 8, 290-313.

[39]. Rubianes, M.D.; Rivas, G.A. Dispersion of multi-wall carbon nanotubes in polyethylenimine: A new alternative for preparing electrochemical sensors. Electrochem. Commun. 2007, 9, 480-484.

[40]. Rivas, G.A.; Rubianes, M.D.; Pedano, M.L.; Ferreyra, N.F.; Luque, G.L.; Rodriguez, M.C.; Miscoria, S.A. Carbon nanotubes paste electrodes. A new alternative for the development of electrochemical sensors. Electroanalysis 2007, 19, 823-831.

[41]. Chen, J.; Burrell, A.K.; Collis, G.E.; Officer, D.L.; Swiegers, G.F.; Too, C.O.; Wallace, G.G. Preparation, characterisation and biosensor application of conducting polymes based on ferrocene substituted thiophene and terthiophene. Electrochimica Acta 2002, 47, 2715-2724.

[42]. Wu, L.; Zhang, X.; Ju, H. Amperometric glucose sensor based on catalytic reduction of dissolved oxygen at soluble carbon nanofiber. Biosens. Bioelectron. 2007, 23, 479-484.

[43]. Shin, C.; Shin, W.; Hong, H.G. Electrochemical fabrication and electrocatalytic characteristics studies of gold nanopillar array electrode (AuNPE) for development of a novel electrochemical sensor. Electrochim. Acta 2007, 53, 720-728.

[44]. Sun, Y.; Bai, Y.; Yang, W.; Sun, C. Controlled multilayer films of sulfonate- capped gold nanoparticles/thionine used for construction of a reagentless bienzymatic glucose biosensor. Electrochim. Acta. 2007, 52, 7352-7361.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 78 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

[45]. Zhao, W.; Xu, J.J.; Shi, C.G.; Chen, H.Y. Fabrication, characterization and application of gold nano-structured film. Electrochem. Commun. 2006, 8, 773-778.

[46]. Ekanayake, E.M.I.M.; Preethichandra, D.M.G.; Kaneto, K. PPy nanotube array sensor for enhanced adsorption of glucose oxidase in glucose biosensors. Biosens. Bioelectron. 2007, 23, 107-113.

[47]. Liu, L.; Jia, N.q.; Zhou, Q.; Yan, M.m.; Jiang, Z.y. Electrochemically fabricated nanoelectrode ensembles for glucose biosensors. Mater. Sci. Eng., C 2007, 27, 57-60.

[48]. Millan K M and Mikkelsen S R , Sequence-selective biosensor for ADN based on electroactive hybridization in dicators. Anal. Chem. 1993. 65, 2317-2323

[49]. Millan K M, Saraullo S and Mikkelsen S R, Voltametric ADN biosensor for cystic fibrosis based on a modified carbon paste electrode. Anal. Chem. 1996. 66, 2943-2948.

[50]. Piunno P A E, Krull U J, Hudson R H E, Damha M J and Cohen H, Fiber optic for fluorimetric detection of ADN hibridization. Anal. Chim. 1994. Acta 288, 205-214.

[51]. Minunni M, Tombelli S, Scielzi R, Mannelli I, MasciniMand Gaudiano C, Detection of β-thalassemia by a ADN piezoelectric biosensor coupled with polymease chain reaction. Anal. Chim. 2003. Acta 481, 55-64.

[52]. Kelley S O, Boon E M, Barton J K, Jackson N M and Hill M G, Single-base mismatch detection based on charge transduction through ADN. Nucleic Acids Res. 1999. 27, 4830-4837.

[53]. Watson J D and Crick F H C, Nature. 1953. 171, 737.

[54]. Allen J B, Larry R, Faulkner, Electrochemmistry: Principe, method and application. 2001: John Viley & Sons Inc.

[55]. Tran Dai Lam, Ph.D thesis Univ. Paris VII 2003, Direct Electrochemical ADN biosensor based on novel conducting polymes

[56]. Guedon P, Livache T, Martin F, Lesbre F, Roget A, Bidan G and Levy Y, PPy electrospotting for the condtruction of oligonucleotide arrays compatible with a surface plasmon resonnance hybridization detection. Sythetic metals. 2001. 121(1- 3), 1443-1444.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 79 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

[57]. Ngyễn Đức Nghĩa, Bán dẫn hữu cơ polyme. Công nghệ chế tạo, tính chất, ứng dụng. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà Nội 2007.

[58] Truong T.N. Lien, L. H. Bac, T. D. Lam, P. Q. Pho, Glucose sensor based on multi-wall carbon nanotubes doped PPy,Proceedings of the 10th German- Vietnamese Seminar on Physics and Engineering, Bonn, 04-09,June, 2007

[59] Pablo A. Fiorito, Susana I. Córdoba de Torresi, Glucose Amperometric Biosensor Based on the Co-immobilization of Glucose Oxidase (Gox) and Ferrocene in Poly(pyrrole)Generated from Ethanol/WaterMixtures,CP26077,05513-970.

[60] Yu-Chen Tsai, Shih-Ci Li, Shang-Wei Liao, Electrodeionposition of polypyrole-multiwalled carbon nanotube-glucose oxidase nanobiocomposite film for the detection of glucose, Biosensor and Bioelectronics 22, (2006) 495-500

[61] Kanan Balasubramanian, Marko Burghard, Biosensors based on carbon nanotubes, Anal Bional Chem (2006) 385: 452-468.

[62] Chun Xiang Li, Yun Zeng, Chun Ran Tang, Glucose biosensor based on carbon/PVC-COOH/Ferrocene composite with covalently immobilized enzyme, Chinese Chemical Letters Vol.16, No.10, (2005)1357-1360

[63] Sulak, M.T., Gokdogan, O., Gulce, A. and Gulce, Amperometric glucose biosensors based on gold-deposited polyvinylferrocene film on Pt electrode, Biosensor and Bioelectronics 21, (2006)1719-[8] Uang, Y.M., Chou, T.C., 2003. Biosens. Bioelectron.19, 141-147

[64] Ma, M., Qu, L., Shi, G., 2005. J. Appl. Polym. Sci. 98, 2550-2554

[66] Z.Wang, J.Liu, Q.Liang, Y.Wang, G.Luo, Analyst 127 (2002) 653

[67] Eugenii Katz and Itamar Willner, Bionecule-Functionnalized Carbon Nanotubes: Applications in nanobioelectronics, Chemphischem 2004, 5, 1084- 1140.

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 80 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

MỤC LỤC

POLYPYRROLE

POLYME

DẪN,

II:

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG I: CẢM BIẾN SINH HỌC .............................................................. 3 I.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CẢM BIẾN SINH HỌC .............................. 3 I.1.1 Cấu tạo cảm biến sinh học ................................................................ 4 I.1.1.1 Cấu tạo chung ............................................................................. 4 I.1.1.2. Tác nhân cần phát hiện .............................................................. 5 I.1.1.3. Đầu thu sinh học ........................................................................ 5 I.1.1.4. Tác nhân cố định ....................................................................... 7 I.1.1.5. Bộ phận chuyển đổi ................................................................... 7 I.1.2. Ứng dụng của cảm biến sinh học ...................................................... 9 I.1.3 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học .......................................... 10 I.2 CẢM BIẾN GOx .................................................................................... 11 I.2.1 Enzym glucose ................................................................................ 11 I.2.2 Nguyên tắc của phản ứng điện hoá .................................................. 12 I.2.3 Cố định enzyme ............................................................................... 12 I.2.4 Vật liệu nano .................................................................................... 13 I.3 CẢM BIẾN ADN ................................................................................... 15 I.3.1 Thành phần cấu tạo của ADN[53]: .................................................. 15 I.3.2 Nguyên lý hoạt động của cảm biến ADN: ....................................... 17 I.3.3 Các phương pháp phát hiện ADN .................................................... 17 VÀ CHƯƠNG CACBONNANOTUBE .................................................................................. 19 II.1 POLYME DẪN ..................................................................................... 19 II.2. PPy ....................................................................................................... 23 II.2.1 Monome Pyrrole (Py) ..................................................................... 23 II.2.2 Polyme PPy (PPy) .......................................................................... 23 II.2.3.1 Tổng họp PPy bằng phương pháp hóa học .............................. 26 II.2.3.2 Tổng hợp PPy bằng phương pháp điện hóa ............................. 26 II.2.3.3 Tổng hợp màng PPy ................................................................ 28

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 81 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

II.3. Ống nano cacbon .................................................................................. 29 II.3.1. Giới thiệu chung về CNT ............................................................. 29 II.3.2. Các tính chất đặc biệt của CNT ..................................................... 30 CHƯƠNG III: TỔNG HỢP ĐIỆN CỰC VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................ 32 III.1 TỔNG HỢP ĐIỆN CỰC ..................................................................... 32 III.1.1 Thiết bị .......................................................................................... 32 III.1.2 Hóa chất ......................................................................................... 32 III.1.3. Quy trình thực nghiệm ................................................................. 33 III.1.3.1 Quy tình tổng hợp - cố định ADN dò lên màng PPy pha tạp và không pha tạp ống nanô cácbon CNT ................................................... 33 III.1.3.2 Quy tình tổng hợp - cố định enzyme glucose lên màng PPy pha tạp MWCNT ......................................................................................... 35 III.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 35 III.2.1 Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (Quartz Crystal Microbalance- QCM) ........................................................................................................ 35 III.2.1.1 Tinh thể thạch anh .................................................................. 36 III.2.1.2. Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (QCM) ........................... 38 III.2.1.3. Một số cấu trúc QCM ........................................................... 40 III.2.2 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (Electrochemical impedance spectroscopy – EIS) .................................................................................. 41 III.2.2.1. Bản chất của phương pháp ..................................................... 41 III.2.2.2. Nội dung phương pháp ......................................................... 43 III.2.2.3. Tổng trở của polyme dẫn ....................................................... 43 III.2.2.4. Mạch điện tương đương: ....................................................... 44 III.2.3 Phương pháp đo dòng (Amperometric) ........................................ 47 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 48

PPy_CNT_Gox;

PPy_ADN

dò;

IV.1 TỔNG HỢP MÀNG PPy_CNT_ADN dò ..................................................................................... 48 IV.2 CẢM BIẾN GOx SỬ DỤNG VI ĐIỆN CỰC ................................... 50 IV.2.1 Cơ sở lý thuyết xác định nồng độ glucose trong dung dịch bằng phương pháp đo dòng (amperometric) ..................................................... 50

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008

- 82 - Cảm biến sinh học trên cơ sở composite PPy và ống nanocacbon xác định GOx và ADN

IV.2.2 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose trong dung dịch .. 50 IV.2.3 Nhận xét ....................................................................................... 54 IV.3 CẢM BIẾN ADN PHÁT HIỆN CHUYỂN GEN TRONG ĐẬU TƯƠNG ....................................................................................................... 54 IV.3.1 Cảm biến ADN sử dụng linh kiện vi cân tinh thể (QCM) ........... 54 IV.3.1.1 Hệ đo QCM 200 .................................................................... 54 IV.3.1.2. Sự thay đổi tần số dao động của linh kiện QCM theo nồng độ ADN đích .............................................................................................. 55 IV.4 CẢM BIẾN ADN SỬ DỤNG VI ĐIỆN CỰC ................................... 62 IV.4.1 Cơ sở lý thuyết xác định ADN đích trong dung dịch bằng phương pháp phổ tổng trở ......................................................................................... 62 IV.4.2 Xây dựng hệ đo và thiết lập mạch mô phỏng .............................. 62 IV.4.3 Đặc trưng phổ tổng trở .................................................................. 63 IV.4.4 Nhận xét ....................................................................................... 72 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 73 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ................................................ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 74

Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008