Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chọn chủng Bacillus Thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ------ Nguyễn Thiện Phú NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ------

Nguyễn Thiện Phú

NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU

Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN THANH THỦY

Thành Phố Hồ Chí Minh - 2013

LỜI CẢM ƠN

 Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy, người đã tận tình

hướng dẫn, luôn quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi tiến hành đề tài.

 Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm

TP. Hồ Chí Minh đã hết lòng dạy dỗ tôi.

 Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Hữu Phúc, TS. Võ Thị Hạnh (Viện Sinh học Nhiệt đới),

cô Tâm, chị Trang, anh Nghĩa (Công ty Vipesco) đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi

hoàn thành đề tài.

 Tôi xin cảm ơn chị Trần Thị Minh Định, chị Phùng Ngọc Thùy Linh, chị Hồ Thị

Mỹ Linh, bạn Phạm Thị Lịch đã nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi.

 Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên

cạnh, động viên và ủng hộ tôi.

Nguyễn Thiện Phú

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong

luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Các tài liệu

tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thiện Phú

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... 1

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. 2

MỤC LỤC ......................................................................................................................... 3

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. 6

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................ 7

1. Lí do chọn đề tài .................................................................................................................. 7

2. Mục tiêu ............................................................................................................................... 7

3. Nhiệm vụ .............................................................................................................................. 8

4. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................................... 8

5. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................................... 8

6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 9

1.1. Sơ lược về RNM Cần Giờ ............................................................................................... 9

1.2. Tổng quan về Bt ............................................................................................................. 12

1.2.1. Lịch sử phát hiện ra Bt ............................................................................................... 12

1.2.2. Đặc điểm phân loại .................................................................................................... 13

1.2.3. Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của Bt .............................................................. 16

1.2.4. Độc tố và cơ chế gây độc ........................................................................................... 17

1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, hình thành bào tử, tinh thể độc.... 21

1.2.6. Đối tượng tác động của Bt ......................................................................................... 22

1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng Bt ......................................................................... 24

1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước ....................................................................................... 24

1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ........................................................................................ 26

1.3.3. Các hướng phát triển của thuốc trừ sâu Bt ................................................................ 27

1.4. Phương pháp sản xuất chế phẩm Bt ............................................................................ 28

1.4.1. Tuyển chọn chủng ...................................................................................................... 28

1.4.2. Lên men chìm ............................................................................................................ 29

1.4.3. Thu hồi sản phẩm ....................................................................................................... 30

1.4.4. Tạo chế phẩm ............................................................................................................. 30

1.4.5. Kiểm tra chất lượng sản phẩm ................................................................................... 30

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 32

2.1. Vật liệu ............................................................................................................................ 32

2.1.1. Đối tượng ................................................................................................................... 32

2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................................... 32

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................... 32

2.1.4. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng ..................................................................... 32

2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................................. 33

2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bt ............................................................................ 33

2.2.2. Phương pháp bảo quản giống bằng dầu khoáng ........................................................ 34

2.2.3. Định danh đến loài các chủng Bacillus bằng sinh học phân tử ................................. 34

2.2.4. Phương pháp nhân giống ........................................................................................... 35

2.2.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, BT, tinh thể Bt ........................ 36

2.2.6. Phương pháp xác định số lượng BT, tinh thể độc ..................................................... 37

2.2.7. Định lượng mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang .................................... 37

2.2.8. Phương pháp nuôi và nhân giống sâu tơ .................................................................... 38

2.2.9. Phương pháp thử hoạt tính diệt sâu ........................................................................... 39 2.2.10. Khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ và Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành tinh thể độc .................................................................................................................................. 40

2.2.11. Phương pháp kiểm tra sự hiện diện của gen sinh nội độc tố của Bt ........................ 41

2.2.12. Phương pháp tạo chế phẩm Bt ................................................................................. 43

2.2.13. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm .................................................................. 43

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .................................................................. 44

3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng VK Bacillus từ đất RNM Cần Giờ ........................... 44

3.2. Khảo sát hoạt tính diệt sâu của các chủng VK có tinh thể độc ................................. 49

3.2.1. Kết quả xác định số lượng BT, tinh thể ..................................................................... 50

3.2.2. Kết quả hoạt lực diệt sâu ............................................................................................ 51

3.3. Định danh bằng sinh học phân tử chủng P14 ............................................................. 54

3.4. Đặc điểm sinh học của chủng đã tuyển chọn .............................................................. 54 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ và Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử, tinh thể độc ............................................................................................................... 56 3.5.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử, tinh thể độc ..................................................................................................................... 56

3.5.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành BT, tinh thể độc ........................................................................................................................... 58

3.6. Bước đầu khảo sát so sánh khả năng sinh trưởng và sinh tinh thể độc của chủng Btk14 phân lập từ RNM Cần Giờ và từ chế phẩm trừ sâu của Đài Loan ...................... 60

3.6.1. So sánh khả năng sinh trưởng, sinh tinh thể độc ....................................................... 60

3.6.2. So sánh hoạt tính diệt sâu .......................................................................................... 62

3.7. Kết quả kiểm tra sự hiện diện gen sinh nội độc tố của Btk14 ................................... 64

3.8. Tạo chế phẩm và thử nghiệm hoạt tính chế phẩm ..................................................... 66

3.9. Kiểm tra khả năng sống sót của chủng Btk14 trong chế phẩm ................................ 68

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 70

4.1. Kết luận........................................................................................................................... 70

4.2. Kiến nghị......................................................................................................................... 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 72

PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 78

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Bào tử BT

Bacillus thuringiensis Bt

Bacillus thuringiensis var. kurstaki Btk

Colony forming unit CFU

(Số đơn vị khuẩn lạc)

kDa kiloDalton

KHV Kính hiển vi

KL Khuẩn lạc

NXB Nhà xuất bản

OD Mật độ quang

PBS Dung dịch đệm

RNM Rừng ngập mặn

TB Tế bào

VK Vi khuẩn

VSV Vi sinh vật

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Sinh vật hại cây trồng là một trong những nguyên nhân lớn nhất làm giảm năng suất,

gây thiệt hại nặng nề cho ngành nông nghiệp. Trung bình mỗi năm lượng nông sản bị mất mát

do sinh vật hại khoảng 22% (Khan, 2008). Vì vậy, việc tiêu diệt chúng trở nên vô cùng cấp

thiết.

Trong giai đoạn đầu, thuốc hóa học bảo vệ thực vật được sử dụng rộng rãi vì có nhiều

ưu điểm nổi trội. Tuy nhiên, thuốc hóa học cũng có nhiều nhược điểm như gây ra những tác

dụng không nhỏ với môi trường và sức khỏe con người, gây mất cân bằng sinh thái và tạo nên

hiện tượng kháng thuốc ở sinh vật hại. Vì vậy, việc tạo ra thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học

(từ VSV), sẽ khắc phục các nhược điểm của thuốc hóa học, và tạo nên một bước tiến mới trong

công tác bảo vệ thực vật. Các sinh vật như: virus, VK, nấm, tuyến trùng… được ứng dụng rộng

rãi để hạn chế tác hại của các sinh vật hại cây trồng.

Trong số hàng loạt những VK có khả năng tiêu diệt sâu hại, Bt là tác nhân sinh học đầu

tiên được nghiên cứu sản xuất thành thuốc trừ sâu vi sinh trên thế giới, đồng thời là sản phẩm

thuốc trừ sâu sinh học nổi tiếng nhất hiện nay.

RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú, độ đa dạng sinh học được đánh giá

cao trong khu vực Đông Nam Á. Ngoài hệ động thực vật, rừng ngập mặn Cần Giờ còn chứa

đựng một tài nguyên sinh vật khác – đó là thành phần khu hệ VSV nơi này. Các chủng VSV

phân lập từ RNM được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nông nghiệp, nhờ khả năng

sinh ra các chất có hoạt tính sinh học cao. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học thuộc

Trung tâm Nghiên cứu hệ sinh thái RNM đã phát hiện trong đất nơi này có Bt có khả năng diệt

sâu.

Từ những lí do trên, tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu chọn chủng Bacillus

thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu”.

2. Mục tiêu

- Thu nhận các chủng Bt có hoạt lực mạnh trong diệt sâu hại cây trồng làm cơ sở khoa học

trong việc tạo chế phẩm.

3. Nhiệm vụ

1. Phân lập các chủng Bacillus từ RNM Cần Giờ.

2. Tuyển chọn các chủng VK có hoạt tính diệt sâu tơ hại bắp cải.

3. Phân loại chủng VK tuyển chọn đến loài bằng sinh học phân tử.

4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng Bt được tuyển chọn.

5. Khảo sát khả năng sinh trưởng, sinh tinh thể độc của chủng Bt nghiên cứu và so sánh

với chủng phân lập từ chế phẩm nước ngoài.

6. Kiểm tra sự hiện diện của gen sinh độc tố của chủng Bt nghiên cứu.

7. Bước đầu tạo chế phẩm diệt sâu và thử nghiệm hoạt tính của chế phẩm.

4. Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng Bt phân lập từ RNM Cần Giờ.

- Chủng Bt phân lập từ chế phẩm trừ sâu của Đài Loan.

- Sâu tơ hại bắp cải nhận từ Công ty thuốc sát trùng Việt Nam - Vipesco.

5. Ý nghĩa của đề tài

5.1. Ý nghĩa khoa học

Góp phần tìm hiểu khả năng diệt sâu tơ gây hại bắp cải của Bt ở RNM Cần Giờ.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn

Dựa vào kết quả thu được của đề tài có thể ứng dụng tạo chế phẩm để phòng trừ sâu tơ

hại bắp cải.

6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 12/2012 đến tháng 09/2013.

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ

Chí Minh.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lược về RNM Cần Giờ

Theo Phan Nguyên Hồng (1999) RNM Việt Nam chia thành 4 khu vực với 12 tiểu khu.

Khu vực I: Ven biển Đông Bắc, từ Mũi Ngọc đến mũi Đồ Sơn.

Khu vực II: Ven biển đồng bằng Bắc Bộ, từ mũi Đồ Sơn đến mũi Lạch Trường.

Khu vực III: Ven biển Trung Bộ, từ mũi Lạch Trường đến mũi Vùng Tàu.

Khu vực IV: Ven biển Nam Bộ, từ mũi Vùng Tàu đến mũi Nai - Hà Tiên.[12]

Địa điểm thu mẫu

Hình 1.1. Bản đồ RNM Cần Giờ

( http://www.diaoconline.vn/tin-tuc/ban-do-thanh-pho-c20)

Trong số các RNM ở Việt Nam, RNM Cần Giờ có độ đa dạng sinh học được đánh giá

cao ở khu vực Đông Nam Á. RNM Cần Giờ được phát triển dựa trên sự lắng đọng và bồi tụ

phù sa từ sông Sài Gòn, hạ lưu là sông Lòng Tàu, Ngã Bảy, sông Đồng Tranh và Soài Rạp,

nằm ở cửa ngõ Đông Nam của thành phố Hồ Chí Minh.

RNM Cần Giờ có diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha với đặc điểm tự nhiên như sau:

• Khí hậu: có hai mùa, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau. Nhiệt độ trung bình là 25,8oC. Lượng mưa thấp từ 1,300 – 1,400mm/năm.

• Địa hình: tương đối bằng phẳng, cao trung bình 1,5m.

• Thổ nhưỡng: gồm các loại đất mặn, đất mặn ít phèn, đất mặn phèn nhiều, đất cát mịn có

pha ít bùn ven biển.

• Chế độ thủy triều: có chế độ bán nhật triều không đều, mực triều trung bình là 2m, khi

triều cao có thể dâng đến 4m.

• Độ mặn: độ mặn lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém. Vào khoảng tháng

4, nước mặn chiếm ưu thế hơn trong mối tương tác sông – biển, nước mặn xâm nhập sâu

hơn vào trong vùng đất liền. [56]

RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú. Tuy nhiên, những nghiên cứu về

RNM Cần Giờ chủ yếu tập trung vào hệ động, thực vật. VSV là đối tượng phân bố rộng rãi và

được xem là “kho báu” của hệ sinh thái RNM Cần Giờ nhưng chỉ mới được quan tâm gần đây.

Những nghiên cứu về vi sinh vật RNM cho thấy chúng có tính thích nghi cao với điều kiện khí

hậu khắc nghiệt ở đây và chúng có khả năng tạo ra các sản phẩm trao đổi chất đặc biệt hơn so

với điều kiện môi trường khác.

Nhiều công trình nghiên cứu ở trong và ngoài nước cho thấy RNM là nơi lưu giữ và

phân huỷ các chất thải từ nội địa chuyển ra. Nhờ các VSV mà các chất này trở thành chất dinh

dưỡng cho nhiều sinh vật khác và môi trường được trong sạch [60]. VSV trong đất RNM bao

gồm VK, nấm sợi, nấm men và xạ khuẩn đều có khả năng khả năng sinh các enzym ngoại bào

mạnh như cellulase, amylase, protease, chitinase giúp phân huỷ các hợp chất ở lớp đất mặt như tinh

bột, cenlulose, pectin, gelatin, casein, chitin có trong xác động vật và thực vật và một số hợp chất

phức tạp hơn như carboxyl methyl cellulose (CMC), các chất lignocellulose ở các mức độ khác

nhau. Một số nấm sợi phân giải được các hợp chất phospho khó tan. Chúng phân huỷ các mùn

bã cây ngập mặn tại chỗ, cung cấp nguồn thức ăn cho khu hệ động thực vật RNM rất phong

phú ở các kênh rạch và vùng biển nông. [59]

Theo Aksornkoae (1993), VK cùng với nấm là những sinh vật quan trọng nhất tham gia

vào quá trình phân hủy thực vật rụng của cây ngập mặn. Trong thời gian phân hủy lá, sinh khối

của nấm giảm trong khi sinh khối VK ổn định hoặc tăng trong suốt giai đoạn phân hủy. Hieber

& Gessner (2002) cho rằng thời gian tạo ra thế hệ mới của VK ngắn hơn so với nấm nên sinh

khối VK tạo ra là rất lớn, vì vậy VK có vai trò vô cùng quan trọng khi tham gia vào quá trình

phân hủy xác thực vật. VK dị dưỡng là nhóm có số lượng nhiều nhất trong các nhóm vi sinh

vật có vai trò chủ chốt trong quá trình phân hủy vật chất hữu cơ, khép kín chu trình sinh địa hóa

hệ sinh thái RNM. Chúng tham gia phân hủy xác động thực vật và chất rơi rụng trong RNM tạo

nguồn thức ăn phế liệu phong phú cung cấp cho các loài động vật ăn phế liệu. Chúng cũng

tham gia phân hủy các hợp chất hữu cơ tạo nguồn thức ăn khoáng cho cây ngập mặn trong hệ

sinh thái. Bản thân VK cũng là nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài động vật nhỏ và ấu

trùng của một số loài. Khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ thường gặp trong hệ sinh thái

RNM của các chủng VK dị dưỡng phân lập từ đất RNM mới phục hồi cũng như RNM tự nhiên

là tương đối cao. [60]

Trong số VK dị dưỡng phân lập từ đất RNM, có rất nhiều chủng là VK hiếu khí không

bắt buộc, chúng có thể sinh trưởng và phát triển tốt trong cả điều kiện môi trường có oxy và

thiếu oxy. Chúng có vai trò không nhỏ trong quá trình phân hủy xác động thực vật RNM, bên

cạnh nấm và các sinh vật phân hủy khác, khi những sinh vật này chỉ có thể phát triển tốt trong

điều kiện môi trường có sẵn oxy tự do. Đại đa số VK dị dưỡng ở đất RNM và trong lá đang

phân hủy có hình que, có khả năng di động và số VK Gram âm (-) chiếm tỷ lệ tương đối lớn. Phần lớn chúng là VK chịu mặn và ưa ấm. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 22-37oC, khi độ mặn

trong môi trường nuôi cấy lên đến 5% thì đa số các chủng bị ức chế sinh trưởng. [60]

Sự phân bố về số lượng cũng như thành phần loài của VSV trong các thủy vực khác

nhau là rất khác nhau, trong đó các yếu tố có tính chất quyết định là hàm lượng muối, chất hữu

cơ, pH, độ đục, nhiệt độ. Trong các vùng ven biển nước lợ với nồng độ muối thường dưới 3%

ngoài các VK biển thật sự và các VK nước ngọt chịu mặn, còn tìm thấy các VK nước lợ ưa

mặn. Nồng độ muối tối ưu của chúng thường nằm trong khoảng 0,5% đến 2%. Các VK nước lợ

thường phát triển rất yếu hoặc hoàn toàn không phát triển được trong các môi trường nước ngọt

và rất hay bị ức chế sinh trưởng ở các nồng độ muối trên 3%. [56]

Khả năng sinh kháng sinh của nhiều loài VK, nấm men, đặc biệt là nấm sợi. Các chủng

VSV có hoạt tính kháng sinh mạnh thuộc các chi Trichoderma, Penicillium, Cephaloporium,

Paecilomyces. Các VSV sinh kháng sinh này còn có tác dụng ức chế các VSV gây bệnh cho

động, thực vật, làm sạch môi trường bị ô nhiễm ven biển.[59]

Các nghiên cứu VSV trong RNM vùng ven biển cho thấy có tới 83/199 chủng nấm sợi

có khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau như các loài nấm sợi thuộc một số chi

Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Canninghamela (Trang và cs, 2003)

làm cho môi trường nước biển trong sạch, tạo điều kiện thuận lợi cho các tảo phù du quang

hợp, cung cấp O2 cho nhiều loài hải sản. Sự phát triển của chúng cũng làm tăng nguồn thức ăn

cho các động vật ở vùng biển. [59]

Qua phân tích các mẫu đất ở RNM Cần Giờ (TP.HCM), các nhà khoa học đã phát hiện

những chủng Bt sinh nhiều tinh thể có khả năng diệt trừ đặc hiệu một số loài côn trùng gây hại

cho người và động, thực vật như các loài sâu róm, sâu tơ, bọ nẹt, ấu trùng muỗi… Nhiều

nghiên cứu đã chứng minh độc lực của chủng Bt phân lập từ RNM Cần Giờ là rất cao với ấu

trùng sâu và muỗi. [59]

Như vậy, việc nghiên cứu các chủng VSV trong đó có VK từ RNM là một hướng đi

đúng đắn.

1.2. Tổng quan về Bt

1.2.1. Lịch sử phát hiện ra Bt

Việc nghiên cứu và ứng dụng Bt ra đời và phát triển cùng với sự phát triển khoa học kỹ

thuật của nhân loại. Bt đã được nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau. [7],

[53]

Năm 1870, Louis Pasteur, khi nghiên cứu về bệnh trên dâu tằm, đã phát hiện ra một loại

VK gây bệnh cho tằm và đặt tên là Bacillus bombycos.

Năm 1901, Ishiwatari Shigetane - nhà sinh vật học người Nhật, khi đang thực hiện một

cuộc điều tra nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh Sotto làm chết đột ngột nhiều quần thể tằm, đã

phân lập được một loại VK đặt tên là Bacillus sotto.

Đến năm 1911, Ernst Berliner - nhà sinh vật học người Đức, đã phân lập được VK giết

hại mối Mediterranean flour. Ông phát hiện ra đây chính là loài VK mà Ishiwatari Shigetane đã

công bố, và đặt tên lại cho loài VK này là Bacillus thuringiensis. Tên gọi này được xuất phát

từ địa danh Thuringia, là một thị trấn nhỏ ở Đức, nơi đã phát hiện ra con mối đó.

Năm 1915, Matter khi phân lập từ ấu trùng bướm – mọt bột (Anagasta keuehmella) đã

tái phát hiện ra VK gây bệnh này và chính thức được đặt tên là Bacillus thuringiensis. Cũng

trong thời gian này, Ernst Berliner tiếp tục đưa ra báo cáo về một loại độc tố có bản chất là

protein được Bt sản sinh ra trong cơ thể, và theo ông đó chính là nguyên nhân khiến các con

mối bị giết hại. Tuy nhiên, tác dụng và cơ chế hoạt động của loại protein này vẫn chưa được

khám phá.

Năm 1920, những người nông dân ở các trang trại lớn tại các nước phát triển bắt đầu sử

dụng sinh khối Bt phun cho cây trồng như một loại thuốc phòng trừ sâu bệnh. Pháp là nước sử

dụng Bt sớm nhất (1938), đồng thời đã chế tạo các loại thuốc có nguồn gốc từ bào tử và xác

sâu nhiễm Bt, gọi là Sporine dùng để diệt mọt bột.

Năm 1956, Hannay, Fitz - James và Angus đã nghiên cứu và phát hiện ra tác nhân chính

quyết định khả năng tiêu diệt mối và sâu bọ của Bt là các phân tử protein, được sản sinh trong

cơ thể Bt. Những kết quả nghiên cứu trên đã mở ra cho các nhà khoa học hướng nghiên cứu

mới về tác nhân, cơ chế diệt sâu và di truyền của Bt.

Từ năm 1958, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt bắt đầu được sử dụng

rộng rãi ở Mỹ, Anh, Đức… Đến năm 1961, Bt được đánh giá là một loại thuốc trừ sâu thân

thiện với con người và môi trường trong chiến lược phát triển nông nghiệp của tổ chức bảo vệ

môi trường EPA (Environmental Protection Agency) ở Mỹ. Năm 1977, đã có 13 loài Bt được

phát hiện và công bố. Các nghiên cứu về phổ kháng cho thấy Bt không chỉ gây độc với một giai

đoạn nhất định trên ấu trùng của bộ cánh vảy, mà còn gây độc cả với ấu trùng của bộ cánh

cứng.

Từ năm 1980 trở đi, khả năng kháng độc của sâu bệnh với các loại thuốc hoá học kể cả

các loại cực độc như DDT và 666,… ngày càng gia tăng. Để giải quyết những vấn đề đó, các

chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt ngày càng được sử dụng rộng rãi bởi tinh thể độc

do Bt tiết ra có bản chất là một loại protein, dễ dàng bị phân huỷ nhanh chóng trong môi

trường, không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, vật nuôi. [8], [18], [23], [27].

1.2.2. Đặc điểm phân loại

Vị trí phân loại của Bt

- Lớp Shyzomycetes

- Bộ Eubacteriales

- Họ Bacillaceae

- Giống Bacillus

- Loài Bacillus thuringiensis [5]

Bt được chia làm nhiều loài phụ dựa trên các đặc điểm sau:

- Khả năng hình thành enzyme leucitinase.

- Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng.

- Đặc tính huyết thanh học.

- Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các huyết thanh tương ứng. [6]

Đến nay, phương pháp phân loại Bt được sử dụng phổ biến là dựa trên các đặc tính

huyết thanh học. Đặc tính huyết thanh học của chủng Bt được xác định chủ yếu dựa trên kháng

nguyên tiên mao H và được tiến hành bằng phản ứng ngưng kết các tế bào sinh dưỡng với các

kháng huyết thanh tương ứng. Tuy nhiên, việc phân loại chỉ dựa trên type huyết thanh chưa

phản ánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng. Việc phân lập và tuyển

chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn. Vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị

đưa ra phương pháp phân loại mới. Phương pháp này dựa trên kết quả xác định type huyết

thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể. [3]

Bảng 1.1. Một số type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng

Chủng đại diện Viết tắt Người nghiên cứu Type huyết thanh

1 THU Bt. var. thuringiensis Bliner (1915), Heimpel & Angus (1958)

3a, 3b Bt var. kurstki KUR De Barjac & Lemill (1970)

Ishiwata (1905), Heimpel & Angus 4a, 4b Bt var. sotto SOT (1958)

5a, 5b Bt var. candensis CAN De Barjac & Bonnefoi (1972)

8b, 8d Bt var. nigeriensis NIG Weiser & Prasertphon (1954)

14 Bt var. israelensis ISR De Barjac & cộng sự (1992)

30 Bt var. medellin MED Orduz & cộng sự (1992)

33 Bt var. leesis LEE Lee &cộng sự (1944)

46 Bt var. chanpansis CHA Chainpaisang (1994)

48 Bt var. balearica BAL Iriate Garcia (1995)

49 Bt var. muju MUJ Park (1995)

50 Bt var. navarrersis NAV Iriate Garcia

1.2.3. Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của Bt

Bt là trực khuẩn Gram (+) sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, kích thước 1 - 1,2 x 3 - 5

µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, chứa tinh thể

độc có khả năng diệt sâu. Tinh thể protein được hình thành trong giai đoạn tạo bào tử, kích thước 0,6 – 2 µm. Bt phát triển trong điều kiện nhiệt độ 15 - 450C nhưng thích hợp nhất 290C – 300C. Bào tử dạng hình oval, hình trứng dài 1,6 – 2 µm.

Hình 1.2. Hình thái tế bào của Bt

( http://www.komunich.de/vincent-sanchis/france/bacillus-thuringiensis.html)

Phản ứng sinh lý, sinh hóa của Bt bao gồm:

 Làm ngưng kết sữa, làm trong đường glucose, fructose, glycerol, tinh bột, maltose…,

hình thành acid.

 Không hình thành indol, có phản ứng dương tính với methyl đỏ, phản ứng VP dương

(ethiryl methyl methanol)

 Có tác dụng hòa tan môi trường huyết thanh ngựa agar, có thể mọc trên môi trường

cianate, khử muối nitrate thành nitrite, không khử muối sulphate, sản sinh enzyme

phospholipase.[1], [26], [27].

Hình 1.3. Tinh thể protein của Bt

(http://www.learner.org/courses/biology/archive/images/1006.html)

1.2.4. Độc tố và cơ chế gây độc

1.2.4.1. Các độc tố của Bt

Bt có khả năng tạo 4 loại độc tố:

 Ngoại độc tố α (α - exotoxin): được phát hiện giữa những năm 1950 từ VK Bacillus

thuringiensis vanenlesti bởi C.Toumaroff. Ngoại độc tố α còn gọi là enzyme leucintinase, có

hoạt tính phospholipase, tác động chủ yếu lên gốc phospholipid của màng tế bào sâu, giúp cho

VK gây bệnh dễ xâm nhập vào các xoang trong cơ thể côn trùng. Do vậy, enzyme leucintinase

đã trực tiếp tham gia vào việc tấn công, gây tổn thương tế bào ở thành ruột của sâu. [5], [28]

 Ngoại độc tố β (β - exotoxin): do Hall và Arkavc phát hiện vào năm 1959 khi nuôi ấu

trùng muỗi bằng thức ăn chứa Bt. Đây là một độc tố bền nhiệt có bản chất là nucleotide. Khi độc tố này được xử lý ở 120oC trong 15 phút vẫn giữ được hoạt tính. Cơ chế tác động của ngoại

độc tố β là cạnh tranh ATP với các enzyme RNA polymerase, dẫn đến kìm hãm hoạt động của

enzyme, ngừng tổng hợp RNA, gây rối loạn sinh tổng hợp protein. Mặt khác, khi ngoại độc tố

β cộng hưởng tác động với nội độc tố δ có thể khiến côn trùng chết nhanh chóng. Ngoại độc tố

δ làm dập vỡ, phá huỷ vùng biểu mô ruột giữa côn trùng, còn ngoại độc tố β xâm nhập vào

huyết tương và máu gây ra biến đổi sinh lý của ấu trùng. Ngoại độc tố β gây độc cho nhiều loại

côn trùng thuộc bộ cánh cứng, hai cánh, đặc biệt khi côn trùng ở giai đoạn ấu trùng, sâu non.

Ngoại độc tố β gây cản trở sự lột xác của côn trùng. Nếu được sử dụng ở nồng độ cao, độc tố β

còn tiêu diệt cả trứng côn trùng. [28]

 Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin): là một phospholipase, có bản chất là mạch peptide ngắn

và một số amino acid tự do. Độc tố này tan tốt trong nước, mẫn cảm với không khí, ánh sáng,

nhiệt độ và oxy nên ít hữu dụng trong thực tế đồng ruộng. Cơ chế tác dụng của ngoại độc tố γ

cũng tương tự như ngoại độc tố α. [30], [39]

 Nội độc tố δ (δ - endotoxin) còn được gọi là tinh thể Cry hay ICPs. So với 3 nhóm ngoại

độc tố trên, tinh thể độc Cry được tạo ra với lượng lớn hơn nhiều và có hiệu quả gây độc cho

côn trùng hơn.

Tinh thể Cry được tạo thành trong giai đoạn tạo BT, tác dụng độc đặc hiệu với các loài

côn trùng. Lượng tinh thể độc cũng như phổ tác dụng thay đổi theo chủng. Tinh thể có thể ổn

định trong các dung dịch có phạm vi pH rộng (4 – 12), có thể bị biến tính trong acid

trichloacetic, chlorua thủy ngân. Tuy nhạy cảm với nhiệt độ cao song có tính chịu nhiệt nhất định (ở 65oC có thể giữ được 1 h, 80oC có thể giữ được 20 phút). Những nghiên cứu gần đây về

cấu trúc nội độc tố δ cho thấy protein này có 3 vùng chức năng:

 Vùng I là một bó gồm 7 chuỗi xoắn α. Một vài chuỗi hoặc tất cả các chuỗi có thể

cài vào màng tế bào ruột, tạo ra các lỗ, từ đó các ion có thể qua lại tự do.

 Vùng II chứa 3 dải β không song song tương tự như vùng gắn kháng nguyên của

globulin miễn dịch. Vùng này có vai trò gắn với thụ thể trên bề mặt tế bào biểu

mô ruột.

 Vùng III có nhiệm vụ bảo vệ độc tố đã được hoạt hóa không bị phân hủy bởi

protease ở ruột.

Với cấu trúc phúc tạp như vậy, nội độc tố δ liên kết đặc hiệu với các thụ thể trên màng tế

bào biểu mô ruột của sâu, gây ra tác động dây chuyền. Chính điều này làm nên tính đặc hiệu rất

cao trong hiệu quả tác động của Bt lên sâu hại. Đã có hơn 50 gen mã hóa cho protein tinh thể

độc đã được giải mã cho phép phân loại các chất độc này thành 15 nhóm dựa trên sự giống

nhau trong trình tự gen. [26], [31], [34]

Hình 1.4. Nội độc tố δ của Bt

( http://creationwiki.org/Bacillus_thuringiensis)

 Trong 4 loại độc tố, nội độc tố δ có tác dụng mạnh nhất đến nhiều loại côn trùng và

được ứng dụng rộng rãi trong bảo vệ thực vật như một loại thuốc trừ sâu không độc hại với môi

trường, con người và động vật. [3], [4]

1.2.4.2. Cơ chế gây độc

Theo Angus (1907), protein tinh thể độc của Bt hoạt động trên tế bào biểu mô ruột giữa

của côn trùng ở pH kiềm. Tinh thể tan vào môi trường kiềm của ruột giải phóng ra protein tinh

thể, chất này sau đó bị phân cắt bởi protease. Kết quả là từ một protein 135 kDa bị mất đi một

nửa để còn lại phần lõi xấp xỉ 60 kDa bền với protease. Những thí nghiệm chỉ ra rằng protein

135 kDa chưa bị cắt bởi protease không có khả năng gây độc với côn trùng gọi là “protoxin",

còn lõi 60 kDa gây độc với côn trùng gọi là “toxin”. Quá trình biến đổi từ tinh thể độc protoxin

thành toxin được gọi là quá trình hoạt hoá tinh thể độc. Tuy nhiên, quá trình hoạt hoá tinh thể

độc phụ thuộc rất nhiều vào pH ruột và hệ enzyme. Nếu pH < 8 thì hầu hết các tinh thể độc

không giải phóng ra protoxin. Mặt khác khi pH phù hợp (pH > 8) nhưng hệ enzyme không phù

hợp thì toxin cũng không được tạo ra. Một điều nữa, khi tinh thể độc đã được hoạt hoá thành

toxin nhưng những toxin này không bám được lên màng tế bào biểu mô ruột, độc tố vô tác

dụng.

Những nghiên cứu về hình thái của côn trùng sau khi bị chết bởi Bt cho thấy ruột của

côn trùng bị tổn thương. Nguyên nhân chủ yếu là do hình thành các lỗ hổng trên các tế bào biểu

mô, dẫn đến gây rối loạn hoạt động hấp thụ dinh dưỡng của ruột. Có ba mô hình giải thích cơ

chế hoạt động của toxin như sau:

 Mô hình 1 thường được gọi là mô hình “dung giải hoà tan thẩm thấu keo” bao gồm sự

tổng hợp các lỗ không đặc trưng bởi phân tử độc tố. Khi độc tố liên kết với các receptor

trên màng sẽ hình thành một phức hệ. Phức hệ này tạo nên một lỗ xuyên qua màng tế

bào biểu mô cho phép sự qua lại tự do của nhiều phân tử với kích thước khác nhau dẫn

đến gây rối loạn chức năng của ruột [30], [35].

 Mô hình 2 cho rằng lỗ hổng được hình thành bởi độc tố Bt là đặc trưng rất cao đối với ion K+. Thuyết này được đưa ra từ bằng chứng là sự vận chuyển amino acid phụ thuộc K+ bị ức chế bởi độc tố tinh thể. Cụ thể, những lỗ này dễ cho K+ đi vào, sau đó làm giảm

gradient điện thế màng làm rối loạn sự vận chuyển amino acid trong cơ thể sâu. [35],

[42]

 Mô hình 3 cho rằng độc tố Bt hoạt động trên nhiều kênh hiện có của tế bào biểu mô ruột. Sự có mặt của các độc tố dẫn đến các kênh cho phép K+ tràn vào không giới hạn từ đó

làm ức chế sự hấp thụ amino acid. [46]

Sở dĩ độc tố do Bt tiết ra có tác động chọn lọc lên côn trùng bởi tinh thể độc sau khi xâm

nhập vào ruột côn trùng, để có thể gây chết cho vật chủ thì phải được hoạt hoá thành toxin và

toxin phải gắn được lên tế bào biểu mô ruột.

Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của tinh thể độc tố diệt côn trùng

( http://www.odec.ca/projects/2005/erla5m0/public_html/how.html)

1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, hình thành bào tử, tinh thể

độc

1.2.5.1. Các yếu tố vật lý, hóa học

Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của Bt bao gồm: nhiệt độ, nguồn C, N, các ion kim loại... Điều kiện tối ưu cho Bt sinh trưởng là 28 – 30oC. Nếu nhiệt độ là 15oC thì

bào tử không hình thành và số lượng tinh thể độc cũng giảm đi đáng kể. Ngoài các thành phần

là protein chiếm phần lớn, trong tinh thể còn có mặt các nguyên tố kim loại như Mn, Mg, Ni,

Zn, Al, Ca, Fe…. Trong đó, Mn và Mg ảnh hưởng mạnh đến quá trình hình thành tinh thể độc.

Một số amino acid như leucine, isoleucine gây ức chế quá trình sinh trưởng của vi khuẩn

nên giảm lượng tinh thể độc. Các yếu tố cản trở sự trao đổi acid acetic cũng làm ức chế sự hình

thành BT, tinh thể độc. Các chủng đột biến mất khả năng sinh protease ngoại bào thì không có

khả năng sinh tinh thể độc và bào tử.[33]

1.2.5.2. Bacteriophage

Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm

nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào

chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế

bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Bt cũng là một đối tượng rất dễ bị xâm

nhiễm bởi thực thể. Một số nghiên cứu cho thấy, trong quá trình lên men, Bt bị thực khuẩn thể

xâm nhiễm làm hỏng mẻ cấy, phá hủy tế bào, dẫn đến chế phẩm Bt có hiệu quả thấp. [51]

Hình 1.6. Các loại bacteriophage xâm nhiễm trên Bt

(http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0037557)

1.2.6. Đối tượng tác động của Bt

Các tinh thể độc của Bt có thể diệt được côn trùng thuộc bộ Hai cánh (Diptera), bộ Cánh

cứng (Coleoptera), bộ Cánh vảy (Lepidoptera) và một số côn trùng khác. Trong đó, sâu tơ

(Plutella xylostella) được quan tâm nhiều hơn cả. [52]

1.2.6.1. Phân loại sâu tơ

Sâu tơ (còn gọi là sâu dù) hại rau cải. Sâu có tên khoa học là Plutella xylostella Curtis,

còn có tên khác là Plutella maculipennis Curtis, thuộc họ Yponomeutidae, bộ Lepidoptera

(cánh vảy). [52]

1.2.6.2. Phân bố và ký chủ của sâu tơ

Sâu tơ đầu tiên được ghi nhận có nguồn gốc từ Thổ Nhĩ Kỳ; sau đó phát triển ở hầu hết

các quốc gia trồng rau cải trên thế giới. Sâu tơ có thể sống được ở hầu hết các quốc gia trồng

rau cải, ôn đới lẫn nhiệt đới và là mối lo ngại lớn nhất cho các nhà trồng rau cải hiện nay.

Sâu được ghi nhận là phá hại trên rất nhiều loại rau cải khác nhau như cải bắp, cải bẹ

xanh, cải bẹ trắng, cải ngọt, cải bông, cải rổ; nhưng trầm trọng nhất là trên cải bắp, cải bông.

Ngoài ra, sâu tơ còn gây hại trên một số loại cây họ Cà như khoai tây, cà chua... [52]

1.2.6.3. Đặc điểm hình thái và sinh học của sâu tơ

Sâu có 4 tuổi, phát triển từ 7 - 15 ngày tùy điều kiện thức ăn và thời tiết. Mình sâu nở to

chính giữa, hai đầu nhọn, thân chia đốt rõ ràng, mỗi đốt có nhiều lông mọc thẳng đứng. Sâu có

ba cặp chân giả từ đốt bụng thứ năm, mình sâu dài từ 8 - 11 mm. Chi tiết ở từng giai đoạn tuổi

• Tuổi 1: thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm. Đến cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ 1,2

như sau:

• Tuổi 2: mình sâu bắt đầu chuyển sang màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục. Sâu dài từ 1,5 -

- 1,5 mm. Tuổi 1 phát triển từ 2 - 4 ngày.

• Tuổi 3: mình sâu màu xanh lục tươi, dài từ 3,5 - 5,5 mm và phát triển từ 1 - 3 ngày.

• Tuổi 4: sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể từ 5,5 - 9 mm, phát triển từ 1 -

3,5 mm. Ở tuổi 2 sâu phát triển trong thời gian từ 1 - 3 ngày.

4 ngày. Ấu trùng tuổi 4 sau khi đạt kích thước tối đa, bắt đầu nhả tơ làm nhộng. Đầu

tiên, sâu quay đầu về phía sau đuôi nhả tơ bao phủ phần đuôi trước, dần dần tới phía trên

đầu. Sau khi nhả tơ xong sâu lột xác lần cuối cùng để thành nhộng.

Khi mới hình thành, nhộng có màu xanh nhạt, khoảng 2 ngày sau thành màu vàng nhạt,

chiều dài nhộng từ 5 - 7 mm, chung quanh nhộng có kén bằng tơ bao phủ. Thời gian của giai

đoạn nhộng từ 4 - 7 ngày. [52]

Bướm dài từ 6 - 10 mm. Sải cánh rộng từ 10 - 15 mm. Cánh trước màu nâu xám, trên có

nhiều chấm nhỏ màu nâu; từ chân cánh ra đến cạnh ngoài của cánh trước có một dải hình răng

cưa màu trắng trên bướm đực và màu vàng trên bướm cái, dải này gợn sóng, nhìn có cảm giác

óng ánh và lấp lánh. Hai cạnh của cánh sau có rìa lông rất dài. Khi đậu cánh xếp xuôi theo thân

và dựng đứng phía trên thân mình, đuôi cánh hơi nhô lên cao. Râu dầu dài từ 3 - 3,5 mm và

luôn đưa tới trước rất linh hoạt. Thời gian sống của bướm từ 4 đến khoảng 17 ngày tùy giống

cái hay đực và tùy điều kiện sống. Một bướm cái có thể đẻ đến 200 trứng, trung bình 90 trứng

và đẻ cao điểm vào đêm thứ nhất và thứ nhì.

Trứng hình bầu dục, dẹp, màu vàng nhạt, đường kính từ 0,3 - 0,5 mm. Thời gian ủ trứng

từ 3-8 ngày.

1.2.6.4. Tập tính sinh sống và cách gây hại của sâu tơ

Sâu tuổi 1 đục một lổ nhỏ ở mặt dưới lá, chui đầu vào ăn nhu mô lá, chỉ chừa lại biểu bì.

Sâu tuổi 2 gặm ăn mặt dưới lá để lại lớp biểu bì mặt trên lá tạo thành những đốm trong mờ.

Cuối tuổi 2 trở đi sâu gặm lủng lá. Trên một cây cải bắp bị hại nặng có thể có từ 100 - 300 sâu.

Khi bị động đến sâu thường nhả tơ buông mình xuống đất nên loài sâu này còn có tên gọi là

"sâu dù". [52]

Bướm thuộc loại bướm đêm nhưng ít bị quyến rũ bởi ánh sáng đèn. Ban ngày bướm

thường ẩn ở mặt dưới lá rau cải, khi bị động mới bay lên một quãng ngắn, chiều tối bướm bay

ra bắt cặp và đẻ trứng. Bướm hoạt động nhiều nhất khi trời bắt đầu tối đến nửa đêm. Bướm có

thể giao phối ngay sau khi vũ hóa và một đến hai ngày sau thì đẻ trứng. Trứng được đẻ phân

tán hay thành từng khóm từ 3 - 5 cái ở mặt dưới lá, gần gân hay chỗ lõm trên lá. [52]

Hình 1.7. Vòng đời của sâu tơ

( http://www.bvtvhcm.gov.vn/document.php?id=49&cid=6)

1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng Bt

1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước

Các nghiên cứu về Bt và sản xuất chế phẩm Bt đã có lịch sử hơn 100 năm ra đời và phát

triển theo cùng sự phát triển của khoa học kỹ thuật .

Bt được sử dụng làm thuốc trừ sâu đầu tiên tại Pháp năm 1938 và đến 1950 thì đã được

sử dụng rộng rãi tại Mỹ. Năm 1961, Bt được đăng ký như 1 loại thuốc trừ sâu an toàn với tổ

chức EPA. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học vẫn không ngừng nghiên cứu về lĩnh

vực lên men để đạt được năng suất cao nhất và nâng cao hiệu quả diệt sâu của chế phẩm

Bt.[47]

Chủng Bt 234 được chứng minh là tiêu diệt ấu trùng sâu đục thân mía Eldana

saccharina Walker hiệu quả hơn chủng Btk có trong chế phẩm Thuricide. Black và cộng sự

(1991) đã tiến hành lên men trong 6 loại môi trường khác nhau nhằm xác định môi trường thích

hợp nhất cho việc thu sinh khối và đánh giá hoạt tính diệt sâu của chủng này. Kết quả cho thấy

thời gian lên men tùy thuộc vào thành phần môi trường. Môi trường chứa nguồn C đơn giản

như glucose thì thời gian lên men ngắn, còn môi trường chứa nguồn C phức tạp như sucrose thì

thời gian lên men lâu hơn. [29]

Keshavarzi và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng carbohydrate, protein, tỉ lệ

C/N, pH ban đầu và tốc độ cánh khuấy đến việc lên men thu nhận sinh khối Btk. Thành phần

môi trường bao gồm các sản phẩm và phụ phẩm nông nghiệp như bột cá, bột bắp, bột đậu nành,

cao nấm men, lúa miến (sorghum), peptone là nguồn protein và glucose, mật rỉ đường là nguồn

carbohydrate. Kết quả cho thấy cơ sự tương quan sinh khối và tỷ lệ C/N, hàm lượng glutamic

acid trong môi trường. Sinh khối cao nhất khi bổ sung 13,9% glutamic acid, tỉ lệ C/N là 0.4 –

0.5, pH 7.0 – 8.0, thể tích môi trường chiếm khoảng 1/5 thể tích bình chứa và tốc độ lắc là 250

rpm. [37]

Để giảm chi phí sản xuất và góp phần giả quyết vấn nạn ô nhiễm môi trường, các nhà

khoa học đã nghiên cứu việc sử dụng bùn thải các nhà máy làm cơ chất lên men thu sinh khối

Bt. Lachhaba (2001) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bùn thải và tỉ lệ giống bổ sung ban

đầu đến việc sản xuất chế phẩm Bt. [38]

Từ các mẫu đất ở khu vực nuôi tằm, Xavier và cộng sự (2007) đã phân lập được 30

chủng Bt mang gen Cry1 có khả năng diệt sâu xanh Heliothis armigera. Đặc biệt là 2 chủng

BTRX 24 (RathinamXavier 24) và BTRX28 (RathinamXavier 28) có độc tính mạnh hơn các

chủng còn lại, có sự hiện diện của nhiều gen Cry và có khả năng diệt sâu tơ Plutella xylostella.

[48]

Kati và cộng sự (2007) đã phân lập được 1 chủng VK từ loài bọ Melolontha melolontha.

Sau khi quan sát dưới KHV, SDS - PAGE và phát hiện sự tồn tại của gen cry, thấy có nhiều sự

tương đồng với Bt subsp tenebrionis. Kết quả PCR chứng tỏ chủng này mang gen cry 3.

Zhang và cộng sự (2009) đã thử nghiệm tạo chủng Btk có độc tính cao đối với sâu xanh

da láng Spodoptera exigua và sâu xanh Heliothis armigera thông qua biện pháp gây đột biến

bằng tia UV và diethyl sulfate. Kết quả hoạt tính của chủng đột biến tăng 25.9%. [49]

Shahram và cộng sự (2010) đã tiến hành phân lập và tìm hiểu đặc điểm của chủng Bt ở

những điều kiện môi trường khác nhau ở Ấn Độ. [45]

Năm 2010, Hassan và cộng sự đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu và tìm hiểu đặc điểm của

chủng Bt phân lập từ đất ở Syria và thử nghiệm hoạt tính trên một số côn trùng gây hại”.

P. Kannan, R. Xavier và cộng sự (2012) đã tìm hiểu về sự xuất hiện của Bt trên vùng

trồng lúa thâm canh tại Malaysia. [49]

1.3.2. Các nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam Bt đã được nghiên cứu từ những năm 70, chủ yếu là ở lĩnh vực tạo chế

phẩm sinh học. Nghiên cứu đầu tiên được khởi xướng ở Viện bảo vệ thực vật với việc thử các

chế phẩm Bt sản xuất ở nước ngoài trên sâu phá hoại rau. Sau đó là nghiên cứu sản xuất trên

thiết bị lên men ở nhà máy bột ngọt Việt Trì do GS. Nguyễn Lân Dũng và các cộng tác viên

thực hiện.[5] Tiếp đến là nghiên cứu sản xuất Bt trên môi trường bề mặt của Nguyễn Công

Bình và cộng tác viên ở Viện khoa học Việt Nam Hà Nội. Tại TP.Hồ Chí Minh cũng bắt đầu

nghiên cứu Bt tại phân viện khoa học Việt Nam do Nguyễn Hữu Phúc và các cộng sự thực

hiện.[20]

Năm 1980, phân viện Khoa học Việt Nam đã hợp tác với Liên hiệp khoa học sản xuất

hóa chất để nghiên cứu sản xuất Bt theo phương pháp công nghiệp, xây dựng xưởng sản xuất

thử tại Thủ Đức trên hệ thống thiết bị lên men dung tích 1500 lít. [21] Năm 1984, đề tài này

được nhà nước nghiệm thu và đánh giá là một tiến bộ khoa học kỹ thuật. Ngoài ra còn có

những nghiên cứu về điều kiện sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh Bt, những nghiên cứu về phổ tác

động của thuốc được tiến hành trong nhiều năm ở nhiều vùng khác nhau trong cả nước nhằm

khuyến khích người nông dân sử dụng thước trừ sâu vi sinh thay thế dần các loại thuốc hóa

học. [22]

Năm 2003, Nguyễn Thị Hoài Hà và Ngô Giang Liên đã tiến hành tuyển chọn các chủng

Bt có khả năng diệt sâu tơ và sâu xanh.[8]

Năm 2004, Nguyễn Thanh Cảnh và cộng sự đã nghiên cứu sự đa dạng sinh học của

chủng Bt tại Việt Nam. [2]

Năm 2005, Bùi Thị Hương và cộng sự đã tiến hành phân lập các chủng Btk ở Việt Nam

tại Viện công nghệ sinh học. Kết quả đã phân lập được 36 chủng Bt, trong đó có 11 chủng có

tinh thể hình quả trám, 6 chủng có tinh thể hình vuông và hình chữ nhật, 10 chủng có khối lập

phương, 4 chủng có tinh thể không đều đặn, 2 chủng có tinh thể hình cầu, 3 chủng có dạng thể

vùi nhỏ. Tất cả 10 chủng Btk đều mang gen cry1Ab. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu thì cả 10

chủng có hiệu quả diệt 100% đối với sâu ngài gạo.[13], [14], [15]

Mai Thị Hằng và Trần Thị Mỹ Hạnh (2004) đã phát hiện 6 chủng VK trong đật RNM có

khả năng diệt ấu trùng các loại muỗi thí nghiệm từ 60-100% sau 36 h; có chủng diệt được

100% ấu trùng muỗi sốt rét Anopheles minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti và

Culex quinquefasciatus.[10]

Năm 2007, Lã Thành Nam thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất thuốc trừ sâu

sinh học Bt từ nguồn nước thải chế biến thủy sản” vì nước thải thủy sản chứa nguồn dinh

dưỡng cần thiết cho sự phát triển của VSV.[17]

Năm 2008, Nguyễn Thị Thanh Hạnh đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu sự phân bố và một

số đặc điểm sinh học của Bt phân lập tại vườn quốc gia Cát Bà”. Kết quả đã thu được 11 chủng

Bt, trong đó tinh thể có hình lưỡng tháp chiếm ưu thế, đồng thời đã tiến hành thử hoạt tính diệt

sâu tơ Plutella xytostella.[9]

Năm 2010, Võ Minh Phát đã thực hiện đề tài “Sản xuất thuốc trừ sâu Bt bằng bùn thải”,

nhằm tận dụng được nguồn bùn thải từ các nhà máy, giảm ô nhiễm môi trường. [19]

1.3.3. Các hướng phát triển của thuốc trừ sâu Bt

Một trong các biện pháp hiện nay được sử dụng để phát triển thuốc trừ sâu, đó là cải

biến các chủng Bt thông qua kỹ thuật gen. Từ năm 1980, các nhà khoa học đã khám phá ra

rằng, tinh thể độc được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid của Bacillus thurigiensis. Mỗi

VK có thể có 5 hay 6 plasmid khác nhau mang gen mã hóa cho nhiều chất độc. Giữa các chủng

Bt có sự trao đổi plasmid  tạo ra nhiều chủng với tổ hợp các chất độc khác nhau. Ngoài ra, Bt

còn có các transposon có khả năng mang các gen độc tố đi khắp hệ gen và sang các plasmid

khác nhau  tăng sự đa dạng về độc tố tự nhiên, tạo điều kiện nghiên cứu cải biến về mặt di

truyền. Sản phẩm đầu tiên là Raven có tác động lên bọ cánh cứng tấn công khoai tây, sâu bướm

tấn công nhóm cây thuộc họ Cà. Chủng Bt này mang 2 protein hoạt động Cry III khác nhau và

hai protein Cry I (có ái lực bám khác nhau lên màng tế bào thành ruột giữa của côn trùng).

Phương pháp này một mặt mang lại tiềm năng cho các nhà khoa học phát triển các chủng mới

có độc lực cao, đồng thời trở thành công cụ chống lại khả năng kháng thuốc của côn trùng.[24]

Một hướng phát triển đầy triển vọng khác để tăng cường khả năng chống sâu hại của cây

trồng dựa trên cơ sở thuốc trừ sâu Bt, đó là chuyển gen trực tiếp mã hóa độc tố vào thực vật. Sử

dụng công cụ chuyển gen Cry vào các đối tượng đích ở các mô thích hợp cho phép lựa chọn

mục tiêu biểu hiện độc tính ở trên cây trồng. Khi côn trùng ăn phải thực vật được chuyển gen

có biểu hiện nội độc tố ở các mô, chúng sẽ bị nhiễm độc và chết. Một số loại cây được chuyển

gen Bt và trồng phổ biến như ngô, bông, khoai tây… Vì vậy thuật ngữ “cây trồng Bt” trở nên

rất phổ biến ở Mỹ.[24]

1.4. Phương pháp sản xuất chế phẩm Bt

Theo quy mô công nghiệp, chế phẩm Bt được sản xuất chủ yếu theo 2 phương pháp:

+ Lên men bề mặt: trong công nghiệp lên men thường dùng những hạt cơ chất rắn.

Những hạt này có thể có hoặc không có vai trò hấp thụ chất dinh dưỡng trên bề mặt là nguồn

dinh dưỡng như cám, lúa mì, bột ngô…hoặc chỉ đóng vai trò như chất mang vô cơ.

+ Lên men chìm có sục khí là phương pháp nuôi VK trong môi trường dinh dưỡng dạng

lỏng được thực hiện trong nồi lên men. Phương pháp này cho sản lượng cao, tận dụng được

nguyên liệu, dễ cơ giới hóa và tự động hóa. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao,

tốn nhiều năng lượng và tuyệt đối vô trùng.

Công nghệ lên men bề mặt đạt hiệu quả không cao nên hiện nay ở nước ta và trên thế

giới chủ yếu dùng phương pháp lên men chìm. [24], [30].

1.4.1. Tuyển chọn chủng

Tùy thuộc vào đối tượng sâu hại phòng trừ mà nhà sản xuất sử dụng các chủng khác

nhau để lên men. Có 2 cách để tuyển chọn chủng:

 Nhà sản xuất có thể chọn chủng tự nhiên có độc lực cao phân lập từ đất bởi vì

trong tự nhiên Bt phân bố rất rộng rãi. Tuy nhiên, Bt thường có xu hướng tồn tại trong môi

trường có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dưỡng nên đây là nguồn cơ chất thích hợp để

phân lập và tuyển chọn Bt có hoạt lực cao. Ở Việt Nam hiện nay có khoảng 10 chủng Bt được

phân lập để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Mỗi chủng VSV chỉ chứa 1 hoặc 1 vài gen tổng

hợp protein gây độc với 1 loại sâu nhất định.

 Tạo giống bằng gây đột biến và công nghệ gen:

Để sản xuất được chế phẩm diệt được nhiều loại sâu, người ta tiến hành xác định (có

chọn lọc) những đoạn gen rồi dùng kĩ thuật chuyển gen để đưa vào 1 chủng Bt. Chủng Bt này sau đó được cấy vào bình lên men, trong điều kiện nhiệt độ thích hợp (28oC - 30oC). Sau

khoảng 52 h - 54 h, dịch thể chứa các tinh thể protein độc đối với sâu hại sẽ được thu hoạch.[2],

[3]

1.4.2. Lên men chìm

Bước 1: Nhân giống

+ Mục đích: tạo lượng giống đủ hoạt hoá nhằm giúp giai đoạn pha lag phát triển nhanh.

Nếu lag kéo dài tốn thời gian, môi trường. Thời gian pha lag phụ thuộc lượng giống, trạng thái

sinh lý của giống:

+ Tỷ lệ giống được chọn: 3 – 10%.

+ Giống VK được tiếp vào khi VK đang ở giai đoạn phát triển log, tế bào chuyển hoá

mạnh. Cuối pha log bắt đầu xảy ra tạo bào tử, kéo dài pha log.[37]

Bước 2: Chọn môi trường lên men trên cơ sở môi trường với các thành phần dinh dưỡng

sẵn có. Tùy thuộc vào chủng Bt cần lên men mà chọn môi trường phù hợp. [37]

Bước 3: Lên men

Với phương pháp lên men chìm, tiến hành trong nồi lên men 500 lít, 1000 lít , 2000 lít,

ngoài môi trường dinh dưỡng ra, người ta phải chú ý tới các thông số khác như: chế độ thổi khí,

chế độ nhiệt, chế độ nhân chuyển giống … để làm sao hạn chế được các thực khuẩn thể làm

phá hủy các BT và tinh thể độc tố Bt

+ Chế độ thổi khí: đây là chỉ tiêu quan trọng cho quá trình hình thành BT và tinh thể độc. Ngưỡng thổi khí tốt nhất trong quá trình lên men là 0,5 – 0,6 m3 môi trường/m3 không khí.

Nếu độ thông khí ở mức thấp thì BT phát triển yếu, mật độ thưa. Nếu chế độ khí ở mức cao BT

phát triển nhanh, thời gian lên men ngắn, tinh thể độc tố nhỏ, hiệu quả diệt sâu không cao.

+ Nhiệt độ: có ảnh hưởng đến quá trình hình thành BT. Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá

thấp hoặc quá cao sẽ kéo dài hoặc rút ngắn quá trình lên men.

+ Các chế độ luân chuyển giống: đây là chỉ tiêu làm ảnh hưởng đến dự hình thành BT và

tinh thể độc. Nếu sử dụng giống liên tục, sẽ xảy ra hiện tượng nhiễm thực khuẩn thể. Bình

thường chỉ lên men khoảng 10 – 15 lần giống cũ thì cần phải thay giống mới.

Tính ổn định của quá trình lên men được thể hiện ở kết quả lên men thông qua một số

chỉ tiêu cơ bản sau: số lượng BT nhiều, độc tố endotoxin cao, kích thước tinh thể độc lớn, khối

lượng sinh khối thu hồi trong quá trình lên men cao.[24]

1.4.3. Thu hồi sản phẩm

Đây là giai đoạn quyết định sản lượng chế phẩm. Người ta li tâm dịch lên men sau đó bổ

sung chất bảo quản, giá đỡ để tạo chế phẩm.

+ Điều chỉnh pH dịch lên men về 4,1 bằng H2SO4 5M

+ Li tâm liên tục dịch lên men ở ≥ 8000g và < 35ºC, vẫn khuấy trộn liên tục trong thùng

lên men

+ Bổ sung từ từ chất phân tán với tỷ lệ 2% và 1% gam arabic hoặc 5% lactoza trong khi

vẫn đảo trộn trong 5 phút để đảm bảo không vón cục.

+ Sấy phun đến hàm lượng nước 6 - 7%

+ Sàng qua lỗ < 50μm, nghiền các viên có kích thước lớn ở nhiệt độ < 35ºC

+ Thử hoạt tính của sản phẩm. [3]

1.4.4. Tạo chế phẩm

Chế phẩm dạng hỗn dịch: yêu cầu của chế phẩm dạng hỗn dịch là chế phẩm phải bền

vững trong một thời gian dài mà không có sự phân tách các hạt hay sự lắng tủa khi bảo quản và

sử dụng. Chế phẩm dạng hỗn dịch thường giữ được hoạt tính trong vòng 6 tháng.

Chế phẩm dạng bột: hỗn dịch BT, tinh thể sau khi lên men được li tâm loại nước đến thể

tích bằng 1/10 thể tích ban đầu và hỗn dịch BT tinh thể sau li tâm được bổ sung các chất phụ

gia. Chế phẩm dạng bột có thể bảo quản trong thời gian dài hơn so với chế phẩm hỗn dịch (1

năm). [2]

1.4.5. Kiểm tra chất lượng sản phẩm

Sản phẩm sẽ được kiểm tra các chỉ tiêu như: hiệu lực diệt sâu, kích thước hạt, độ ẩm,

pH, độ thấm ướt, độ phân tán, độ tạo huyền phù, độ nhớt…

Để kiểm tra hiệu lực sinh học cần xác định:

 Số lượng tế bào: đếm trên kính hiển vi quang học.

 Số lượng BT tự do: đếm số KL trên môi trường thạch.

 Hiệu lực diệt sâu: liều lượng gây chết ấu trùng côn trùng.

 Liều thử 25 - 50 ấu trùng, thời gian 24 h, số lần lặp lại 4-6 lần.

 Trọng lượng phân tử protein tinh thể: xác định bằng phương pháp điện di trên gel

polyacrylamid (PAGE). [24]

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Đối tượng

 Mẫu đất từ RNM Cần Giờ làm nguồn phân lập.

 Chủng Bt phân lập từ chế phẩm của Đài Loan.

 Sâu tơ (Plutella xylostella) gây hại bắp cải, nhận từ Công ty thuốc sát trùng Việt

Nam(Vipesco).

2.1.2. Hóa chất

Tryptone, dịch chiết nấm men, tryptose, MnCl2, NaH2PO4, NaHPO4, KH2PO4, NaOH,

peptone, glucose, MgSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, MnSO4.4H2O, FeSO4.7H2O, H2SO4 đậm đặc,

CaCl2.

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ

Nồi hấp vô trùng (ALP, Nhật), Tủ sấy (Memmert, Đức), Máy lắc (Gerhardt, Đức), Tủ cấy

vô trùng (Việt Nam), Máy li tâm (Hettich, Đức), Tủ giữ giống (SANYO, Nhật), Tủ lạnh

(National, Nhật), Kính hiển vi (Olympus, Nhật), Máy chụp ảnh kỹ thuật số (Olympus, Nhật),

Cân phân tích điện tử (Sartorius, Đức), Tủ ấm (Sanyo, Nhật), Máy dập mẫu (Seward, Anh),

Máy quang phổ (Amersham Biosciences, Thụy Điển), Máy PCR (Eppendorf, Đức)

2.1.4. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng

Môi trường T3 đặc (môi trường phân lập): tryptone 3 g/l, dịch chiết nấm men 1,5 g/l, tryptose

2 g/l, MnCl2 0,005 g/l, NaH2PO4 6,9 g/l, Na2HPO4 8,9 g/l, agar 15 g/l.

Môi trường T3 lỏng: thành phần tương tự môi trường T3 đặc nhưng không có agar.

Môi trường H de Barjac (môi trường nhân giống): KH2PO4 6,8g/l, NaOH 2,4g/l, peptone 7,5

g/l, glucose 10 g/l, dung dịch A 10ml/l, dung dịch B 10 ml/l, dung dịch C 10 ml/l, nước cất 1

lít.

Thành phần của các dung dịch như sau

- Dung dịch A:

Thành phần Trọng lượng

12,3g/l MgSO4.7H2O

0,223g/l MnSO4.4H2O

1,4g/l ZnSO4.7H2O

Nước cất 1 lít

- Dung dịch B:

Thành phần Trọng lượng

2g/l FeSO4.7H2O

3 ml/l H2SO4 đậm đặc

Nước cất 1 lít

Hòa 2g FeSO4.7H2O vào 100 ml nước cất, sau đó cho 3 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào. Sau

khi tan hết bổ sung nước cất cho đủ 1 lít.

- Dung dịch C: Hòa 20g CaCl2 vào 1 lít nước.[19]

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bt

2.2.1.1. Phương pháp thu thập mẫu đất

Thu thập mẫu đất từ các địa điểm khác nhau ở RNM Cần Giờ. Mỗi vị trí lấy 3 mẫu.

Cách thu thập mẫu đất như sau:

 Gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 5 cm, dùng dụng cụ sạch thu lấy 100 gam đất.

 Lấy đất cho vào túi vô trùng , dán kín, bảo quản trong thùng lạnh. Trên mẫu đất có nhãn

ghi rõ địa điểm thu mẫu, thảm thực vật, ngày lấy mẫu.

 Đất được đem về phòng thí nghiệm phân lập ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh 4oC

không quá 24 h.

2.2.1.2. Phương pháp phân lập (Traves, 1987)

 Nguyên tắc

 Tách rời các tế bào VSV.

 Nuôi cấy các VSV trong MT dinh dưỡng đặc trưng để mọc thành các KL riêng rẽ, tách

biệt nhau. [24]

 Cách tiến hành

 Cân 0,5g đất trộn với 5ml môi trường T3 lỏng chứa 0,25M đệm natri acetate (pH = 6,8).  Cho vào bình tam giác, nuôi lắc 150vòng/ phút, 30oC/ 4 h.  Mẫu được xử lý ở nhiệt độ 80oC trong 30 phút nhằm tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng .  Lấy 0,2 ml dịch nổi trải đều trên đĩa petri có môi trường T3 nuôi ở 30oC trong 3 ngày.  Quan sát hình dạng tinh thể của các chủng VK phân lập được bằng kính hiển vi (x100).

 Yêu cầu: Chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và có kí hiệu riêng biệt để nhận

biết. [13], [14]

2.2.2. Phương pháp bảo quản giống bằng dầu khoáng

 Nguyên tắc: bảo quản để không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống bằng cách

tạo môi trường yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng của VK.

 Cách tiến hành

 Cho một ít dầu khoáng vào ống Eppendoft, khử trùng ở 1210C trong 30 phút, để nguội.  Chủng VK cần bảo quản được nuôi cấy trong ống nghiệm khoảng 24 h, dùng que cấy vô

trùng lấy 1 ít vi khuẩn cho vào ống Eppendoft, đậy nắp và dùng keo paraffin quấn quanh miệng ống, bảo quản ở điều kiện lạnh - 200C. [16]

2.2.3. Định danh đến loài các chủng Bacillus bằng sinh học phân tử

∗ Thu nhận DNA

- Phá màng tế bào và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải phóng các

DNA, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.

- Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và

chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA.

- Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu được các acid

nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản.

∗ Chạy PCR (polymerase chain reaction)

Nguyên tắc: Khuyếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng

PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước:

- Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường khoảng là 94oC-95oC trong vòng 30 giây -

1 phút.

- Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao

động khoảng từ 40oC – 70oC và kéo dài trong vòng 30 giây - 1 phút.

- Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được tăng lên đến 72oC để DNA polymerase hoạt động tốt

nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30

giây đến vài phút.

∗ Giải trình tự DNA

Nguyên tắc hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải

hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh

lệch nhau một nucleotide.

Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự

tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm

các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là

sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau một nucleotide.

Ở cả hai phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel

polyacrylamide. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định

sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di.

Sau khi giải trình tự gen 16S rRNA, so sánh với ngân hàng gen NCBI để định danh đến

loài chủng VK nghiên cứu.

2.2.4. Phương pháp nhân giống

Sử dụng que cấy vòng lấy sinh khối từ môi trường thạch nghiêng cho vào bình tam giác 250 ml có chứa 50 ml môi trường H de Barjac. Nuôi lắc ở nhiệt độ từ 28oC – 30oC, lắc 220

vòng/phút, trong 24 h.

2.2.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, BT, tinh thể Bt

2.2.5.1. Phương pháp nhuộm Gram

 Nguyên tắc

 Dựa trên khả năng bắt màu của TB chất và màng TB với thuốc nhuộm tím kết tinh và

iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.

 Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu thuốc nhuộm do không bị rửa trôi khi xử lí

bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc Gram dương.

 Loại phức chất thứ hai không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lí bằng

cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. VSV này thuộc Gram âm.

 Cách tiến hành

 Làm vết bôi với VK nuôi cấy từ 16 – 24 h trên ống thạch nghiêng.

 Để vết bôi khô tự nhiên hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn.

 Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi.

 Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian qua giấy lọc trong 1 phút.

 Nhuộm lugol trong 1 phút.

 Rửa bằng nước cất.

 Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ giọt cồn đến khi tan hết màu.

 Rửa bằng nước cất.

 Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 10 – 30 giây.

 Rửa nước, làm khô và quan sát trên KHV với vật kính x100.

 Đọc kết quả: VK Gram âm sẽ bắt màu hồng, VK Gram dương sẽ bắt màu tím. [24]

2.2.5.2. Nghiên cứu đặc điểm bào tử và tinh thể

 Nguyên tắc:

 Coomassie brilliant blue có khả năng tạo phức chất với protein.

 Tế bào và tinh thể đều có thành phần cấu tạo từ protein. Vì vậy, có thể nhận

biết TB, BT và tinh thể thông qua độ bắt màu với thuốc nhuộm này.

 Cách tiến hành

 Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên phiến kính sạch.

 Dùng que cấy vô trùng lấy một phần KL mọc riêng rẽ trên ống thạch nghiêng hòa vào

giọt nước.

 Dàn đều, để khô tự nhiên. Hơ phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết bôi.

 Nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue trong 3 phút để khô tự nhiên.

 Quan sát hình thái tế bào, BT, tinh thể dưới vật kính dầu.

 Đọc kết quả: BT không bắt màu, trong suốt; tinh thể bắt màu xanh; TB bắt màu xanh.

[43]

2.2.6. Phương pháp xác định số lượng BT, tinh thể độc

 Nguyên tắc: Mỗi tế bào của các chủng Bt khi bị phá vỡ giải phóng ra một BT và một

tinh thể độc. Do đó đếm số lượng BT ta có thể ước tính số lượng BT, tinh thể độc, cũng như

đánh giá được tốc độ sinh trưởng của chủng Bt trong môi trường lên men.

 Cách tiến hành Để đếm số lượng BT ta tiến hành xử lý mẫu ở 70oC trong 10 phút rồi pha loãng mẫu. Lấy 0,1ml ở nồng độ pha loãng cuối (10-5) cấy gạt vào các đĩa thạch vô trùng chứa môi trường đếm số lượng BT (3 đĩa). Để vào tủ ấm ở 28oC trong 24h rồi đếm số lượng KL mọc trên mỗi

đĩa.

Số lượng BT trong 1ml dịch lên men sẽ được tính theo công thức:

X = n.10/a (BT/ml)

X: số lượng BT/ 1ml dịch lên men.

n: số KL trung bình trong 1 đĩa

a: nồng độ pha loãng mẫu. [2]

2.2.7. Định lượng mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang

 Nguyên tắc:

Tế bào VSV là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cản ánh sáng, làm phân

tán chùm ánh sáng tới cũng làm môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật

độ TB. Do vậy có thể định lượng mật độ TB một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy

so màu ở bước sóng 660 nm.

 Cách tiến hành:

Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ TB bằng cách:

 Pha loãng một huyền phù VK cần kiểm nghiệm có mật độ TB bất kỳ thành các huyền

phù khác nhau có độ đục đo ở OD 660 nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.

 Đo OD ở bước sóng 660 nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận các số đo thực

tế. Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi (dùng buồng đếm hồng cầu) xác định

mật độ TB (N/ml) của các huyền phù này. Tính giá trị log(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml

tương ứng với độ đục.

 Vẽ đường tương quan tuyến tính giữa mật độ TB log(N/ml) và giá trị mật độ quang OD

660 nm, với trục tung là mật độ TB, trục hoành là giá trị mật độ quang.

Xác định mật độ TB theo độ đục:

 Đo độ đục của một huyền phù TB cần xác định mật độ.

 Từ giá trị OD660 nm đo được, suy ra số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml từ đường

chuẩn. [16]

2.2.8. Phương pháp nuôi và nhân giống sâu tơ

 Đối tượng: Sâu tơ (Plutella xylostella) gây hại bắp cải, nhận từ Công ty thuốc sát

trùng Việt Nam (Vipesco).

 Cách tiến hành

Thức ăn của sâu là lá rau cải tươi, sẽ được thay mỗi ngày. Sâu tơ tuổi 4 sẽ được nuôi trong tủ ấm, nhiệt độ 220C – 250C, độ ẩm 75% - 80%. Sau 1 –

2 ngày tiến hành thu nhộng, cho vào đĩa Petri.

Nhộng sau 2 ngày sẽ được cho vào hộp (trong đó có 1 lọ đựng dung dịch đường 10%),

phía trên miệng hộp được bịt kín bằng giấy sạch. Lá cải tươi được vò cho dập và đặt lên phía

trên miếng giấy để thu hút bướm đẻ trứng. Nhộng sau khoảng 3 – 4 ngày sẽ nở thành bướm.

Bướm sẽ hút mật (dung dịch đường 10%) và sẽ đẻ trứng trên miếng giấy.

Thu lấy trứng, sau 2 ngày trứng sẽ nở thành sâu non. Tiếp tục nuôi cho đến khi thành

sâu trưởng thành.

 Kết quả: Sâu tuổi 3 có màu xanh đậm, di chuyển linh hoạt, chuyển sang ăn cả phần

biểu bì của lá.

Hình 2.1. Sâu tơ Hình 2.2. Nhộng Hình 2.3. Bướm

(Plutella xylostella)

2.2.9. Phương pháp thử hoạt tính diệt sâu

 Nguyên tắc:

Xác định hoạt tính diệt sâu của chủng Bt dựa trên khả năng tạo ra tinh thể độc, tiêu diệt

nhiều loại sâu hại cây trồng

 Cách tiến hành:

Tiêu chuẩn sâu thí nghiệm: đồng đều về tuổi (đang ở giai đoạn tuổi 3).

Thức ăn cho sâu: lá rau cải tươi

Thí nghiệm được bố trí gồm 2 lô:

 Lô đối chứng: thức ăn của sâu được nhúng vào môi trường lên men vô trùng đã

chuẩn bị sẵn (không có VK Bt).

 Lô thí nghiệm: thức ăn của sâu được nhúng vào dịch lên men VK Bt.

Các lô thí nghiệm bố trí trong các đĩa petri vô trùng (mỗi lô 3 đĩa) với số lượng sâu như

nhau (10 sâu/đĩa).

Các đĩa petri bằng vải màn thưa để đảm bảo môi trường trong đĩa luôn được thoáng khí.

Đặt các đĩa thí nghiệm trong phòng có nhiệt độ 250C.

Theo dõi và thống kê số lượng sâu sống/chết; tình trạng sâu sau 24 h, 48 h, 72 h ở tất cả

các lô thí nghiệm.

𝐶−𝑇 𝐶 𝑥 100

Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức Abbott:

Trong đó: 𝐴 =

A: % sâu chết

C: Số sâu sống sót ở lô đối chứng.

T: Số sâu sống sót ở lô thí nghiệm.

 Yêu cầu kết quả: Sâu bị nhiễm Bt lúc đầu bị tê liệt toàn thân sau đó sâu có hiện tượng

ngừng ăn, di chuyển chậm chạp, cuối cùng không hoạt động, cơ thể biến màu, sâu chết có màu

đen, toàn thân khô cứng. [13], [14], [46]

2.2.10. Khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ và Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình

thành tinh thể độc

2.2.10.1. Ảnh hưởng của Mg2+

 Nguyên tắc: Mg2+ là nguyên tố có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp

protein của vi khuẩn Bt.

 Cách tiến hành

Nuôi hai chủng Bt trong bình tam giác chứa 50 ml môi trường H de Barjac có bổ sung

MgSO4 với nồng độ từ 0 đến 0.15 mM, mỗi bước nhảy 0.005. Sau 40 h nuôi cấy, ở nhiệt độ 30oC, tiến hành thu dịch lên men.

Kiểm tra sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục OD660nm. Kiểm tra số lượng BT, tinh

thể theo 2.2.6.

 Yêu cầu: xác định nồng độ Mg2+ cho khả năng sinh trưởng và hoạt tính diệt sâu cao

nhất. [10]

2.2.10.2. Ảnh hưởng của Mn2+

 Nguyên tắc: Mn2+ là nguyên tố quan trọng có tác dụng làm ổn định cấu trúc của

protein tinh thể và kích thích tạo BT của Bt.

 Cách tiến hành

Nuôi hai chủng vi khuẩn Bt trong bình tam giác chứa 50 ml môi trường H de Barjac có

bổ sung MnSO4 với nồng độ từ 0 đến 2 mM, mỗi bước nhảy 0.5. Sau 40 h nuôi cấy, ở nhiệt độ 30oC, tiến hành thu dịch lên men.

Kiểm tra sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục OD660nm. Kiểm tra số lượng BT, tinh

thể theo 2.2.6.

 Yêu cầu: xác định nồng độ Mn2+ cho khả năng sinh trưởng và hoạt tính diệt sâu cao

nhất. [10]

2.2.11. Phương pháp kiểm tra sự hiện diện của gen sinh nội độc tố của Bt

 Nguyên tắc: các tinh thể diệt côn trùng được mã hóa bởi rất nhiều gen Cry khác nhau. Các

gen này được phát hiện dựa vào khả năng bắt cặp với mồi đặc hiệu.

 Cách tiến hành:

 Bước 1: Tách chiết DNA của chủng Bt nghiên cứu:

 Nuôi chủng Bt trên môi trường thạch T3 ở 370C.  Lấy một KL thuần vào ống Eppendorf, sau đó bổ sung vào 1000µl PBS 1X.

 Vortex dịch trong 5 phút đến khi sinh khối VK được trộn đều.

 Sau đó, tiến hành ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút.  Sốc nhiệt 1000C trong 15 phút, để tủ lạnh 40C trong 15 phút.  Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.

 Hút lấy dịch nổi chuyển sang Eppendorf khác.

 Bước 2: Chạy PCR

 Nguyên tắc: Khuyếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản

ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước:

1 phút.

- Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao

động khoảng từ 40oC – 70oC và kéo dài trong vòng 30 giây - 1 phút.

- Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được tăng lên đến 72oC để DNA polymerase hoạt động tốt

nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30

giây đến vài phút.

 Cách tiến hành:

Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25µl đựng trong ống Eppendorf bao

gồm các thành phần: nước khử ion 13,6µl, dNTP 2,5µl, buffer 2,5µl, primer 2µl, enzim Tag-

polymeraza 0,4µl, MgCl2: µl, DNA 2µl ( nồng độ 50ng/µl).

Bảng 2.1. Các cặp mồi được sử dụng [9], [13], [14], [48]

Cặp Chuỗi nucleotide Gen Kích

mồi thước

(bp)

TY6 5’-GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’ Cry1Ab 238 TY14 5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’

TYIC 5’-CAACCTCTATTTGGTGCAGGTTC-3’ Cry1c 288 TYIUNI 5’-TCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCT-3’

 Bước 3: Điện di sản phẩm PCR

 Nguyên tắc: acid nucleic là một phân tử tích điện âm, vì vậy, chúng có thể dịch

chuyển qua bảng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) dưới tác dụng của điện

trường. Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những phân tử DNA khác nhau về trọng

lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãng đường khác nhau sau một thời

gian như nhau.

 Cách tiến hành:

 Cân khoảng 1g agarose cho vào 100ml đệm TBE (Tris-borate-EDTA) hoặc TAE (Tris-

acetate-EDTA) ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên 1 phút, cho vào lò viba (làm

nóng chảy gel và không tạo bọt).

 Làm nguội gel xuống 50°C - 55°C, thêm 1µl thuốc nhuộm DNA, đổ gel vào khuôn gel

và lắp lược.

 Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm chạy vào khay gel

sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 - 5 mm.

 Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng, đậy nắp và cắm điện cực.

 Điện di trong khoảng 30 phút với điện thế 100V - 120V.

 Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả.

 Bước 4: Đọc kết quả

Bản gel được đặt quan sát trên bàn đèn UV. Chất nhuộm sẽ gắn xen các base của phân

tử DNA nên sẽ phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại. Đối chiếu vạch sáng với thang DNA

chuẩn và đọc kết quả.

2.2.12. Phương pháp tạo chế phẩm Bt

- Hoạt hóa giống: từ giống được bảo quản trong ống Eppendoft ở tủ lạnh 40C, VK được cấy chuyền sang ống thạch nghiêng, đặt trong tủ ấm 300C trong 24 h.

- Nhân giống: giống phát triển tốt sẽ được cấy sang bình tam giác chứa 50 ml môi trường H de Barjac, nuôi lắc 220 vòng/ phút, ở nhiệt độ 300C trong 24 h.

- Lên men thu sinh khối TB:

+ Tiến hành lên men trong bình tam giác (dung tích 250ml) có chứa 50ml môi trường H de Barjac, nuôi lắc 220 vòng/ phút, ở nhiệt độ 300C trong 40 h. + Sau thời gian thích hợp, ly tâm thu sinh khối TB với tốc độ 10000 vòng/20 phút/40C.

+ Rửa TB bằng nước cất.

- Tạo chế phẩm: Dịch sinh khối sau khi ly tâm (có dạng paste) được trộn với chất mang. Chất

mang giúp VK có thể tồn tại lâu, nó nhờ chất bảo quản chế phẩm. Chất mang thường là khô

đậu tương, khô lạc, cám gạo, bột gạo, đường lactose, sucrose,…. Cụ thể như sau:

+ Bổ sung 1 ml Tween 80/1g cặn BT tinh thể. + Trộn sinh khối TB với 50% bột diatomite đã thanh trùng ở 70oC.

+ Trộn thêm với 10% đường sucrose. + Sấy khô hỗn hợp trên bằng tủ sấy có quạt gió, ở nhiệt độ 40 – 45oC với thời gian thích

hợp để đạt độ ẩm 8-12%.

+ Kiểm tra chất lượng chế phẩm sau khi sấy khô: kiểm tra mật độ TB bằng phương pháp

đếm số KL và kiểm tra hoạt tính diệt sâu.

+ Đóng gói chế phẩm: 50g/gói.

+ Bảo quản: chế phẩm được bảo quản trong bao nhôm (hàn kín) và được giữ ở nhiệt độ

phòng.

+ Trong thời gian bảo quản thường xuyên kiểm tra mật độ TB của chế phẩm. [2], [3], [4]

2.2.13. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm

Các thí nghiệm trong luận văn được lặp lại ít nhất 3 lần. Kết quả trình bày trong luận văn

là số liệu trung bình ± sai số, được tính bằng phần mềm Microsoft Excel 2007. Số liệu được xử

lý thống kê bằng phần mềm Stagraphic 3.0.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng VK Bacillus từ đất RNM Cần Giờ

Từ các mẫu đất được lấy ở những khu vực khác nhau trong RNM Cần Giờ, chúng tôi

tiến hành phân lập theo phương pháp của Traves (1987), sử dụng tác nhân chọn lọc là natri acetate. Trước khi phân lập, các mẫu được gia nhiệt ở 800C trong 30 phút để diệt các tế bào

sinh dưỡng và các tế bào không sinh BT. Kết quả thu được 28 dạng khuẩn lạc (KL) khác nhau,

tạm gọi là 28 chủng và được kí hiệu là P1, P2,…,P28.

Sau đó, tiến hành nuôi cấy các chủng trên môi trường T3 ở 300C. Sau 48 h, tiến hành

quan sát hình thái khuẩn lạc, làm tiêu bản nhuộm với thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue

trong 3 phút để quan sát hình dạng tế bào, tinh thể và bào tử. Kết quả được trình bày ở bảng

3.1.

Bảng 3.1. Một số đặc điểm sinh học của các chủng VK phân lập được

Ký Tinh hiệu Hình thái KL Hình thái TB BT thể chủng độc

KL nhỏ, màu trắng trong, bề mặt Hình que, BT hình

nhẵn, viền mờ, đường kính ovan, hơi lệch tâm. + - P1 khoảng 2mm.

KL có màu vàng nhạt, có nhầy Hình sợi dài, xếp

nhớt, đường kính khoảng 3mm. chồng lên nhau. - - P2

KL có màu trắng kem, viền nhăn, Hình que, hai đầu

có núm nhỏ ở tâm, nhìn nghiêng hơi tù, xếp riêng rẽ, + + P3 BT hình trứng, bề mặt hơi sần sùi, đường kính

chính tâm. khoảng 5mm.

Bảng 3.1. Một số đặc điểm sinh học của các chủng VK phân lập được

Ký Hình thái KL Hình thái TB BT Tinh

hiệu thể

chủng độc

KL to, có màu trắng kem, hình tán Hình que, xếp

xạ như bông hoa, có khả năng di riêng rẽ, BT lệch + - P4 động, đường kính khoảng 6mm. tâm.

KL nhỏ, có màu đỏ hồng, khả Hình cầu, có kích

năng di động nhanh, đường kính thước lớn. - - P5 khoảng 2mm.

KL to, màu trắng sữa, mọc tỏa ra Hình que, xếp

như lông chim, viền hơi mờ, riêng rẽ, BT hình + - P6 đường kính khoảng 6mm. trứng.

KL có màu kem, bề mặt sần sùi, Hình que, xếp đơn

bám chặt vào mặt thạch, có hình hay xếp chuỗi, BT

thành vòng mờ xung quanh KL, lệch tâm. + - P7

đường kính khoảng 4mm.

KL màu vàng nhạt, phẳng, trơn, Hình bầu dục,

có nhầy nhớt, đường kính khoảng không hình thành - - P8 3mm. BT.

KL có hình trứng, trắng sữa, có Hình que, xếp

nhiều vòng tròn đồng tâm, đường thành chuỗi, BT + - P9 kính khoảng 3 mm. lệch tâm.

Bảng 3.1. Một số đặc điểm sinh học của các chủng VK phân lập được

Ký Tinh Hình thái KL Hình thái TB BT hiệu thể

chủng độc

KL tròn, trắng sữa, viền có gờ nổi Hình que, ngắn,

lên, ở giữa KL lõm xuống, đường nhỏ, BT chính tâm. + - P10

kính 3 – 4 mm.

KL có hình dạng bất định, không Hình thoi, đứng

đều màu, xung quanh KL có vòng riêng rẽ. - - P11 mờ, đường kính khoảng 2 mm.

KL màu trắng trong, dạng sợi li ti, Hình que, xếp

có nhiều thùy nhỏ, bám chặt vào thành chuỗi, BT + - P12

bề mặt thạch, đường kính 4mm. lệch tâm.

KL tròn, viền nhăn, màu trắng Hình que, xếp

sữa, có tâm, bề mặt gồ ghề, đường riêng rẽ, BT lệch + - P13 kính 8 – 10 mm. tâm.

Tương tự KL chủng P3 nhưng Hình que, đầu hơi

viền lan ra xung quanh, đường tù, BT chính tâm. + + P14 kính 5 – 6 mm.

Tương tự KL chủng P13 nhưng Hình que, xếp

viền tròn, bề mặt nhẵn, có khả riêng rẽ, BT lệch + - P15 năng di động, đường kính 5mm. tâm.

KL có màu trắng kem, viền nhăn, Hình que, BT

bề mặt nhẵn, đường kính khoảng chính tâm. + - P16

4mm.

Bảng 3.1. Một số đặc điểm sinh học của các chủng VK phân lập được

Ký Tinh

hiệu Hình thái KL Hình thái TB BT thể

chủng độc

KL có hình sao, trắng trong, bề Que, BT hình

mặt gồ ghề, đường kính 4 – 6 mm. trứng, lệch tâm. + - P17

KL có màu xám trắng, bề mặt hơi Hình bầu dục, xếp

nhầy nhớt, ở giữa có núm nhỏ, thành chuỗi. - - P18

đường kính khoảng 5 mm.

Tương tự KL chủng P3 nhưng Hình que, đầu hơi

viền ngoài mờ, lan tỏa nhiều, tù, xếp riêng rẽ, BT + + P19 đường kính 5 – 6 mm. chính tâm.

Hình tròn, ướt, vàng nhạt, mép Hình cầu, bắt màu

nhăn, có nhầy nhớt, bám chặt vào đậm, xếp riêng rẽ. - - P20 bề mặt thạch, đường kính 5 mm.

Tương tự KL chủng P8 nhưng Hình bầu dục,

không có vòng đồng tâm, đường không hình thành - - P21 kính 5 – 6 mm. BT.

Tương tự KL chủng P13 nhưng bề Hình que, xếp

mặt nhẵn, đường kính 7 – 8 mm. riêng rẽ, BT lệch + - P22

tâm.

KL khô, ghồ ghề, vàng cam, mép Hình cầu, không

răng cưa, không đều, có nhiều hình thành BT. - - P23 vòng tròn đồng tâm, đường kính 3

– 4 mm.

Bảng 3.1. Một số đặc điểm sinh học của các chủng VK phân lập được

Ký Tinh

hiệu Hình thái KL Hình thái TB BT thể

chủng độc

que, xếp + - P24 KL ở giữa trắng kem, xung quanh Hình

trắng trong, mép gợn sóng, bám thành chuỗi, BT

chặt vào bề mặt thạch, đường kính hình trứng, ngay

3 – 4 mm. tâm.

KL màu trắng kem, hình trứng, Hình que, xếp

mép răng cưa, có vòng mờ xung riêng rẽ hay thành + - P25

quanh KL, đường kính 5mm. chuỗi.

Tương tự KL chủng P16 nhưng Hình que, BT

viền tròn, bề mặt nhẵn, đường chính tâm. + - P26

kính 8 – 10 mm.

KL có bề mặt ướt, màu trắng kem, Hình que, xếp

viền hơi mờ, bám vào mặt thạch, riêng rẽ, BT lệch + - P27

đường kính khoảng 10 mm. tâm.

Tương tự KL chủng P3 nhưng Hình que, hai đầu

viền tròn hơn, màu trắng sữa, hơi tù, BT hình bầu + + P28

đường kính 5 – 6 mm. dục, chính tâm.

Ghi chú: + (kết quả dương tính); - (kết quả âm tính).

Kết quả cho thấy trong số 28 chủng VK phân lập có:

 20/28 chủng TB có dạng que, hình thành bào tử.

 4/28 chủng quan sát thấy có sự hiện diện của tinh thể độc (P3, P14, P19, P28).

Căn cứ vào các đặc điểm hình thái của các chủng nghiên cứu, đối chiếu với các đặc

điểm trong khóa phân loại của Bergey (2004), chúng tôi có thể kết luận, 20 trong số 28 chủng

thuộc chi Bacillus, trong đó có 4 chủng có tinh thể độc.

(a) (b)

Hình 3.1. Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng P3 (x100)

(a) (b)

Hình 3.2. Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng P14 (x100)

(a) (b)

Hình 3.3. Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng P19 (x100)

3.2. Khảo

sát

hoạt

tính

diệt

sâu của

các

chủng

VK

có tinh

thể

(a) (b)

độc

Hình 3.4.Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng P28 (x100)

Để thử hoạt tính diệt sâu của các chủng VK phân lập được, chúng tôi tiến hành nuôi cấy

4 chủng VK có sự hiện diện của tinh thể độc (P3, P14, P19, P28) trên môi trường H de Barjac ở

300C, lắc 220 vòng/phút trong 40 h. Sau đó, tiến hành xác định số lượng BT, tinh thểvà thử

hoạt tính trên sâu tơ (Plutella xylostella).

3.2.1. Kết quả xác định số lượng BT, tinh thể

Để xác định số lượng bào tử chúng tôi tiến hành xử lý mẫu ở 70oC trong 10 phút rồi pha

loãng mẫu. Lấy 0,1ml cấy gạt vào các đĩa thạch vô trùng chứa môi trường thạch T3. Để vào tủ ấm ở 28oC trong 24 h rồi đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa. Kết quả được thể hiện ở

bảng 3.2.

Bảng 3.2. Số lượng BT, tinh thể /ml dịch lên men

Số lượng bào tử (x109) /ml STT Ký hiệu chủng dịch lên men

1 P3

2 P14

3 P19

4 P28 1,98a ± 0,03 2,21b ± 0,03 1,52c ± 0,04 1,70d ± 0,06

(a, b, c, d: chỉ sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê)

Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.5 bên dưới cho thấy, trong 4 chủng VK

nghiên cứu, chủng P14 có tốc độ sinh trưởng nhanh nên cho số lượng BT và tinh thể cao nhất

so với các chủng còn lại. Mỗi tế bào của các chủng VK khi bị phá vỡ sẽ giải phóng ra một BT

và một tinh thể độc. Vì vậy, bằng cách đếm số lượng BT ta có thể ước tính số lượng tinh thể

độc có trong dịch lên men, cũng như theo dõi được tốc độ sinh trưởng của chủng VK đang sử

dụng.

Hình 3.5. Biểu đồ số lượng BT/ml dịch lên men của các chủng VK

có tinh thể độc

3.2.2. Kết quả hoạt lực diệt sâu

Để tiến hành thử nghiệm hoạt lực diệt sâu, chúng tôi tiến hành pha loãng dịch lên men của 4 chủng (P3, P14, P19, P28) đạt đến nồng độ 109 BT/ml. Thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu

được bố trí trong các đĩa Petri, mỗi đĩa 10 con sâu (tương đối đồng đều về kích thước, tuổi).

Kết quả xác định hoạt lực diệt sâu ở các thời điểm sau 24 h, 48 h và 72 h (tính theo công thức

Abbott) được trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Hoạt lực diệt sâu của các chủng VK nghiên cứu

Tỷ lệ sâu chết (%) STT Ký hiệu chủng

1 P3

2 P14

3 P19

4 P28 24 h 36,67a 53,33b 3,33c 26,67a 72 h 95,23a 100,00a 38,69b 77,38c 48 h 74,81a 78,88a 13,33b 57,03c

Hình 3.6. Biểu đồ hoạt lực diệt sâu của các chủng VK nghiên cứu

Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và biểu đồ 3.2 cho thấy, cả 4 chủng VK

nghiên cứu đều có hoạt lực diệt sâu. Trong đó:

Ở mốc thời gian 24 h, chủng P14 có hoạt lực diệt sâu mạnh nhất, tỉ lệ sâu chết khoảng

53,33%. Các chủng còn lại cũng có hoạt lực diệt sâu, nhưng tỉ lệ sâu chết không cao. Trong đó,

chủng P19 có tỉ lệ sâu chết thấp nhất, chỉ đạt 3,33%.

Ở mốc thời gian 48 h, hoạt lực diệt sâu của các chủng VK nghiên cứu tăng lên rõ rệt.

Trong đó, chủng P3 có tỉ lệ sâu chết tăng nhanh nhất (74,81%). Tuy nhiên, chủng P14 vẫn cho

hoạt lực diệt sâu mạnh hơn các chủng còn lại.

Ở mốc thời gian 72 h, tỉ lệ sâu chết ở nghiệm thức của chủng P14 đạt 100%. Các chủng

P3 và P28 có tỉ lệ sâu chết trên 75%. Chủng P19 vẫn là chủng có hoạt lực diệt sâu yếu nhất

(<50%).

Như vậy, sau khi thử nghiệm hoạt lực diệt sâu, có thể kết luận rằng chủng P14 có hoạt

lực diệt sâu mạnh nhất trong 4 chủng. Điều này có thể được giải thích do chủng P14 sinh

trưởng nhanh, tạo số lượng BT, tinh thể nhiều hơn các chủng còn lại.

Sự khác biệt giữa các chủng có ý nghĩa về mặt thống kê. Vì vậy, chúng tôi quyết định

chọn chủng P14 đi sâu nghiên cứu và định danh đến loài bằng sinh học phân tử.

Theo nhóm tác giả Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Lê Thị Minh Thành, Ngô Đình Bính,

Dương Văn Hợp (2008), các chủng VK có tinh thể độc phân lập tại Vườn quốc gia Cát Bà đều

cho hoạt tính diệt sâu cao từ 81% - 100% sau 72 h.

Theo nhóm tác giả Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thùy

Châu, Đinh Duy Kháng (2003), các chủng VK có tinh thể độc phân lập được đều cho hoạt tính

diệt sâu cao từ 90% - 100% sau 72 h.

Hình 3.7. Hoạt lực diệt Hình 3.8. Hoạt lực diệt Hình 3.9. Hoạt lực diệt

sâu của chủng P14 sau sâu của chủng P14 sau sâu của chủng P14 sau

24h 48h 72h

Hình 3.10. Hoạt lực diệt Hình 3.11. Hoạt lực diệt Hình 3.12. Hoạt lực diệt

sâu của chủng P3sau sâu của chủng P3 sau sâu của chủng P3 sau

24h 48h 72h

Hình 3.13. Hoạt lực diệt Hình 3.14. Hoạt lực diệt Hình 3.15. Hoạt lực diệt

sâu của chủng P19 sau sâu của chủng P19 sau sâu của chủng P19 sau

24h 48h 72h

Hình 3.16. Hoạt lực diệt Hình 3.17. Hoạt lực diệt Hình 3.18. Hoạt lực diệt

sâu của chủng P28 sau sâu của chủng P28 sau sâu của chủng P28 sau

24h 48h 72h

3.3. Định danh bằng sinh học phân tử chủng P14

Để định danh, chúng tôi gửi chủng P14 đến công ty xét nghiệm Nam Khoa giải trình tự

gen 16S rRNA, kết quả như sau:

TCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGAC

AGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGTGGGTAAC

CTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTT

TGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACC

CGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAG

CCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA

CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG

CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAA

GTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTA

ACTACGTGCCAGCA

So sánh với ngân hàng gen NCBI, trình tự gen 16S rRNA của chủng P14 có độ tương

đồng 99% với loài Bacillus thuringiensis var. kurstaki. Kết luận chủng P14 thuộc loài Bacillus

thuringiensis var. kurstaki.

Chúng tôi gọi chủng VK phân lập được là Btk14.

3.4. Đặc điểm sinh học của chủng đã tuyển chọn

• Quan sát đại thể

Trên môi trường T3 đặc, sau 24 h nuôi cấy, chủng Btk14 tạo thành những KL hơi tròn,

đường kính khoảng 5mm. Mặt trên KL có màu trắng kem, nhìn nghiêng bề mặt hơi sần sùi, có

núm nhỏ ở tâm. Mép KL màu trắng, lan tỏa ra xung quanh. Mặt dưới của KL phẳng, có màu

trắng kem.

Hình 3.19. Hình thái KL chủng Btk14 Hình 3.20. Hình thái KL chủng Btk14

(mặt trên) (mặt dưới)

• Quan sát vi thể

Sau 1 ngày nuôi cấy trên môi trường T3, tiến hành nhuộm Gram, quan sát hình thái TB

dưới KHV ở độ phóng đại x 1000. Để quan sát hình dạng bào tử, sau 3 ngày nuôi cấy, tiến

hành chụp ảnh dưới KHV điện tử quét tại Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam. Chủng Btk14

có hình thái TB dạng hình que, hai đầu tù, bắt màu với thuốc nhuộm tím gentian. Bào tử

hình trứng, chính tâm của tế bào. Tinh thể có hình quả trám.

Hình 3.21. Hình thái TB của chủng Hình 3.22. Hình dạng tinh thể độc của

Btk14 phân lập chủng Btk14 phân lập. (chụp dưới

kính hiển vị điện tử quét – Viện hàn

lâm Khoa học Việt Nam, Tp.HCM)

3.5. Khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ và Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình

thành bào tử, tinh thể độc

3.5.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành

bào tử, tinh thể độc

Theo Lucas và cộng sự (2001), Yin và cộng sự (2010), Mg2+ là ion kim loại có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protein của sinh vật nhân sơ. Sự có mặt của Mg2+ ở

nồng độ thấp có thể làm tăng hiệu quả dịch mã.

Theo Zhang và cộng sự (2005, 2006), Soberon và cộng sự (2009), Port và cộng sự (2011), Mg2+ liên quan đến hoạt động của nội độc tố, kích hoạt 3 miền của nội độc tố gắn với thụ thể trên tế bào chủ. Vì vậy, chúng tôi bổ sung Mg2+ (dưới dạng muối MgSO4) là yếu tố thử

nghiệm nhằm làm tăng hoạt lực của chủng Bt.

Để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của Mg2+, chúng tôi bổ sung MgSO4 vào môi trường H

de Barjac với nồng độ lần lượt là 0,001 mM; 0,005mM; 0,01mM; 0,015mM; 0,02mM. Tiến hành nuôi cấy chủng VK ở nhiệt độ 30oC/ 40 h. Sau đó, kiểm tra sự sinh trưởng bằng cách đo

OD (660nm), xác định số lượng BT, tinh thể và thử hoạt lực diệt sâu. Kết quả được thể hiện ở

bảng 3.4.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của Mg2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành tinh thể độc

Nồng độ Mg2+ Sinh trưởng

(mM)

Đối chứng

0,005

0,01

0,015 (OD 660nm) 2,238a± 0,05 2,598b± 0,02 2,560c± 0,05 2,577a± 0,02 Số lượng BT, tinh thể (x109) /ml dịch lên men 2,15a± 0,06 2,55b± 0,09 2,55b± 0,07 2,52bc± 0,06

0,02 2,504d± 0,01 2,42c± 0,05

Hình 3.23. Đồ thị ảnh hưởng Mg2+ đến khả năng sinh trưởng của chủng Btk14

Hình 3.24. Đồ thị ảnh hưởng của Mg2+ đến khả năng hình thành bào tử, tinh

thể của chủng Btk14

Kết quả khảo sát cho thấy, khi bổ sung Mg2+ vào môi trường nuôi cấy thì sự sinh trưởng

tăng lên rõ rệt (OD 660= 2,598, ở nồng độ 0,005mM) so với nghiệm thức không bổ sung thêm Mg2+ (OD 660 = 2,238). Có thể nói, Mg2+ là một yếu tố rất cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh BT, tinh thể của chủng Bt nghiên cứu. Từ kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, khi bổ sung Mg2+ ở các

nồng độ từ 0,005mM đến 0,02mM sự sinh trưởng, sinh BT và tinh thể độc tương đối ổn định.

Tuy nhiên, có thể thấy ở nồng độ 0,005 mM chủng nghiên cứu sinh trưởng mạnh và có số

lượng BT, tinh thể nhiều nhất.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Mai Thị Hằng và cộng sự (2005). Khi nhóm tác giả này nghiên cứu về ảnh hưởng của ion Mg2+ đến sự sinh trưởng và hoạt lực diệt muỗi của các chủng Bt phân lập từ RNM, cũng thấy rằng ở nồng độ Mg2+ là 0,005

mM thì sự sinh trưởng và hoạt lực diệt muỗi đạt kết quả tốt nhất.

Như vậy, có thể bổ sung Mg2+ vào môi trường nuôi cấy nhằm nâng cao hoạt tính của Bt

với sâu hại và tốt nhất ở nồng độ 0,005 mM.

3.5.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành

BT, tinh thể độc

Để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của Mn2+, chúng tôi bổ sung MgCl2vào môi trường H

de Barjac với nồng độ lần lượt là 0 mM; 0,5 mM; 1 mM; 1,5 mM; 2 mM . Tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC trong 40 h. Sau đó, chúng tối tiến hành kiểm tra sự sinh trưởng bằng cách đo OD

(660nm), xác định số lượng BT, tinh thể. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành BT, tinh thể độc

Nồng độ Mn2+ Sinhtrưởng

(mM) (OD 660nm) Số lượng BT, tinh thể (x109) /ml dịch lên men

2,163a± 0,02 2,627b± 0,01 2,03a± 0,05 2,60b± 0,02 0,5

1,0

1,5 2,630b± 0,0003 2,468c± 0,02 2,55b± 0,05 2,21c± 0,03

2,0 2,201d± 0,02 2,08a± 0,07

Hình 3.25. Biểu đồ ảnh hưởng của Mn2+ đến khả năng sinh trưởng của chủng

Btk14

Từ kết quả ở bảng 3.5, biểu đồ 3.5 và 3.6 bên dưới cho thấy, trên môi trường nuôi cấy có bổ sung Mn2+ (0,5 mM) thì sự sinh trưởng, khả năng hình thành BT, tinh thể độc là cao nhất.

Các nồng độ còn lại cũng cho tốc độ sinh trưởng và số lượng BT, tinh thể cao hơn so với nghiệm thức không bổ sung thêm ion Mn2+. Điều này có thể giải thích là do Mn2+ đã kích thích

quá trình tạo BT và tham gia ổn định cấu trúc không gian của tinh thể protein, do đó gián tiếp

làm tăng hoạt tính của Bt.

Theo Selgel (1977), Mn2+ là một nguyên tố quan trọng có tác dụng ổn định cấu trúc và đảm bảo tính bền vững của tinh thể protein. Ngoài ra, theo Dulmage và Rhodes, (1973), Mn2+

còn có tác dụng kích thích quá trình tạo BT của sinh vật nhân sơ, đặc biệt là vi khuẩn Bt.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Mai Thị Hằng và cộng sự (2005). Khi nhóm tác giả này nghiên cứu về ảnh hưởng của ion Mn2+ đến sự sinh trưởng và hoạt lực diệt muỗi của các chủng Bt phân lập từ RNM, cũng thấy rằng ở nồng độ Mn2+ là 0,5

mM thì sự sinh trưởng và hoạt lực diệt muỗi đạt kết quả tốt nhất.

Như vậy, có thể bổ sung Mn2+ vào môi trường nuôi cấy nhằm nâng cao hoạt tính của Bt

với sâu hại và tốt nhất ở nồng độ 0,5 mM.

Hình 3.26. Biểu đồ ảnh hưởng của Mn2+ đến khả năng sinh trưởng của chủng

Btk14

3.6. Bước đầu khảo sát so sánh khả năng sinh trưởng và sinh tinh thể độc của

chủng Btk14 phân lập từ RNM Cần Giờ và từ chế phẩm trừ sâu của Đài Loan

Nhằm đánh giá khả năng sinh trưởng và hoạt lực của chủng Btk14 phân lập được, chúng

tôi tiến hành so sánh với chủng VK trong chế phẩm Baolus (Đài Loan) đang sử dụng phổ biến

trên thị trường.

Để khảo sát khả năng sinh trưởng và sinh tinh thể độc của Btk14 phân lập từ RNM Cần

Giờ và từ chế phẩm trừ sâu của Đài Loan, chúng tôi tiến hành nuôi cấy 2 chủng VK này trên môi trường H de Barjac (có bổ sung Mg2+ và Mn2+) với tỷ lệ giống bằng nhau (10%), ở 300C,

lắc 220 vòng/phút trong 40 h. Sau đó, tiến hành xác định số lượng BT, tinh thể và thử hoạt tính

trên sâu tơ (Plutella xylostella).

3.6.1. So sánh khả năng sinh trưởng, sinh tinh thể độc

Để khảo sát khả năng sinh trưởng, sinh BT, sinh tinh thể độc chúng tôi tiến hành đo OD dịch lên men của 2 chủng VK ở bước sóng 660 nm. Sau đó mẫu được tiến hành xử lý ở 70oC

trong 10 phút rồi pha loãng mẫu. Lấy 0,1ml cấy gạt vào các đĩa thạch vô trùng chứa môi trường. Để các đĩa thạch vào tủ ấm ở 28oC trong 40 h rồi đếm số lượng KL mọc trên mỗi đĩa.

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.6.

Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng, sinh tinh thể độc của chủng B. thuringiensis phân lập từ

RNM Cần Giờ và từ chế phẩm trừ sâu của Đài Loan

Ký hiệu chủng OD (660 nm)

2,31a ± 0,08 Số lượng BT, tinh thể (x109) /ml dịch lên men 2,18a ± 0,03 Chủng P14

Chủng Btk phân lập từ 4,8b± 0,03 4,67b ±0,07 chế phẩm

Hình 3.27. Biểu đồ khả năng sinh trưởng, sinh tinh thể độc của chủng Btk14

phân lập từ RNM Cần Giờ và từ chế phẩm trừ sâu của Đài Loan

Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 và biểu đồ 3.7 cho thấy, chủng Btk phân lập từ chế

phẩm Đài Loan sinh trưởng mạnh hơn hẳn (OD660 = 4,8) so với chủng Btk14 phân lập từ RNM

(OD660 = 2,31). Chính vì vậy, số lượng tinh thể và BT do chủng Btk phân lập từ chế phẩm Đài Loan (4,17.109) cũng nhiều hơn hẳn chủng Btk phân lập từ RNM (2,20.109). Điều này có thể

do chủng Btk phân lập từ chế phẩm là chủng công nghiệp, đã được tuyển chọn và cải biến di

truyền nên có nhiều đặc điểm tốt, trong khi đó, chủng Btk từ RNM là chủng được tuyển chọn

từ tự nhiên.

3.6.2. So sánh hoạt tính diệt sâu

Để tiến hành so sánh hoạt lực diệt sâu, chúng tôi tiến hành pha loãng dịch lên men của 2 chủng VK đạt đến nồng độ 109 BT/ml. Thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu được bố trí trong các

đĩa Petri, mỗi đĩa 10 con sâu (tương đối đồng đều về kích thước, tuổi). Kết quả xác định hoạt

lực diệt sâu ở các thời điểm sau 24 h, 48 h và 72 h (tính theo công thức Abbott) được trình bày

ở bảng 3.7

Bảng 3.7. Hoạt lực diệt sâu của chủng Btk14 phân lập từ RNM Cần Giờ và từ chế phẩm

trừ sâu của Đài Loan

Tỷ lệ sâu chết (%)

Ký hiệu chủng 24 h 48 h 72 h

Chủng Btk14 phân 50,00a 78,52a 88,89a lập từ RNM

Chủng Btk phân lập

64,45b 92,59a 100a từ chế phẩm

(a,b: chỉ sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê)

Hình 3.28. Biểu đồ hoạt lực diệt sâu của chủng Btk14 phân lập từ RNM Cần

Giờ và từ chế phẩm trừ sâu của Đài Loan

Kết quả được trình bày ở bảng 3.7 và biểu đồ3.8 cho thấy:

Ở mốc thời gian 24 h, chủng Btk phân lập từ chế phẩm có hoạt lực diệt sâu mạnh, tỉ lệ

sâu chết khoảng 64,45%. Chủng Btk14 phân lập từ RNM có tỉ lệ sâu chết thấp hơn, chỉ đạt

50%.

Ở mốc thời gian 48 h, hoạt lực diệt sâu của chủng Btk phân lập từ chế phẩm tăng lên rõ

rệt, đạt 92,59%. Tỉ lệ sâu chết ở nghiệm thức của chủng Btk14 phân lập từ RNM cũng tăng,

nhưng tăng chậm hơn chủng Btk phân lập từ chế phẩm.

Ở mốc thời gian 72 h, tỉ lệ sâu chết ở nghiệm thức của chủng Btk phân lập từ chế phẩm

đạt 100%. Trong khi đó, tỉ lệ sâu chết ở nghiệm thức của chủng Btk14 phân lập từ RNM chỉ đạt

88,89%.

Như vậy, chủng Btk phân lập từ chế phẩm có hoạt lực diệt sâu cao hơn chủng Btk14

phân lập từ RNM. Điều này có thể được giải thích là do chủng Btk phân lập từ chế phẩm có

khả năng sinh trưởng, sinh tinh thể độc hơn hẳn chủng Btk14 phân lập từ RNM. Tuy nhiên

chủng Btk14 phân lập từ RNM là chủng hoang dại, nhưng có khả năng sinh trưởng khá tốt, số lượng bào tử, tinh thể độc được tạo ra khá cao (>109). Chính vì vậy, hoạt lực diệt sâu có thể sẽ

tăng lên rất nhiều lần nếu áp dụng các phương pháp cải tiến như gây đột biến với chủng này.

Hình 3.29. Hoạt lực diệt Hình 3.30. Hoạt lực diệt Hình 3.31. Hoạt lực diệt

sâu của chủng P14 sau sâu của chủng P14 sau sâu của chủng P14 sau

24h 48h 72h

Hình 3.32. Hoạt lực diệt Hình 3.33. Hoạt lực diệt Hình 3.34. Hoạt lực diệt

sâu của chủng phân lập sâu của chủng phân lập từ sâu của chủng phân lập từ

từ chế phẩm sau 24h chế phẩm sau 48h chế phẩm sau 72h

3.7. Kết quả kiểm tra sự hiện diện gen sinh nội độc tố của Btk14

Theo Hernandez và Ferre (2005), các tinh thể diệt côn trùng được mã hóa bởi rất nhiều

gen Cry khác nhau. Hiện nay, hơn 200 gen Cry đã được mô tả và phân loại thành các nhóm dựa

vào hoạt tính diệt côn trùng và trình tự amino acid.

Do chủng VK chúng tôi phân lập được là Btk, với gen mã hóa thuộc nhóm Cry1Ab và

Cry1C. Vì vậy, để kiểm tra sự hiện diện của gen sinh nội độc tố của chủng VK phân lập được,

chúng tôi đã tách chiết DNA và tiến hành chạy phản ứng PCR. Theo Kalman và cộng sự

(1993), để khuếch đại gen cry1Ab cần phải sử dụng cặp mồi đặc hiệu là TY6 - TY14, gen

cry1C sử dụng cặp mồi đặc hiệu là TYIC – TYIUNI. Kết quả điện di được thể hiện ở hình 3.35.

1 1 1 2 2 2 3 3 4 4 5 5

300 bp 200 bp 200 bp

Hình 3.35. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose

Chú thích: Giếng 1: Thang DNA chuẩn; Giếng 2: DNA của chủng VK với mồi

TYIC – TYIUNI; Giếng 3: Mồi TYIC – TYIUNI; Giếng 4: DNA của chủng VK với

mồi TY6 - TY14; Giếng 5: Mồi TY6 - TY14.

Kết quả ở hình 3.35 cho thấy sản phẩm PCR thu được rất đặc hiệu, không có sản phẩm

phụ. Khi điện di sản phẩm PCR trên gel agarose thấy có vạch DNA có kích thước khoảng giữa

200 bp và 300 bp. Trong nhóm gen Cry1 thì kích thước của gen Cry1Ab khoảng 238 bp. Điều

này có thể kết luận, chủng Btk có chứa gen Cry1Ab sinh nội độc tố.Theo Kalman và cộng sự

thì chủng Bt mang gen cry1Ab có hoạt lực diệt sâu tơ rất đặc hiệu.Gen Cry1Ab tổng hợp

protein có trọng lượng phân tử 130 kDa. Protein này là tiền độc tố, dưới tác dụng của protease

và pH kiềm trong ruột ấu trùng sẽ biến thành protein độc 67 kDa gây độc đối với ấu trùng sâu

xanh và sâu tơ.

Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của các tác giả Bùi Thị Hương, Đỗ

Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thùy Châu, Đinh Duy Kháng (2003) khi tiến hành

phân lập và nghiên cứu các chủng Btk ở Việt Nam. 10 chủng Btk do nhóm tác giả trên phân lập

đều mang gen Cry1Ab, không mang gen Cry1C.

Nhóm tác giả Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Lê Thị Minh Thành, Ngô Đình Bính, Dương

Văn Hợp (2008), cũng tiến hành xác định nhóm gen cho các chủng Bt phân lập tại Vườn quốc

gia Cát Bà. Trong số 8 chủng Bt nghiên cứu có 7 chủng mang gen thuộc nhóm Cry1. Trong đó,

gen Cry1Aa xuất hiện nhiều nhất (41,18%), sau đó đến gen Cry1Ac chiếm 29,41%, Cry1Ab

chiếm 23,53%, còn lại là gen Cry1C chỉ chiếm 5,88%.

Theo nhiều tài liệu đã công bố thì các gen Cry khác nhau có hoạt tính diệt côn trùng

khác nhau. Vì vậy, việc phát hiện các gen này rất có ý nghĩa, để phục vụ cho việc sản xuất

thuốc trừ sâu sinh học, làm nguyên liệu chuyển gen vào cây trồng, cũng như để lưu giữ và bảo

tồn nguồn gen quý này.

3.8. Tạo chế phẩm và thử nghiệm hoạt tính chế phẩm

Chủng Btk14 phân lập từ RNM Cần Giờ có đặc điểm tương đối tốt, mang gen cry1Ab có

hoạt lực diệt sâu tơ rất đặc hiệu. Vì vậy, việc tạo ra chế phẩm từ chủng Btk14 để ứng dụng

trong phòng trừ sâu hại cây trồng là có cơ sở. Để tạo chế phẩm, chúng tôi tiến hành các bước

 Nhân giống và lên men chủng Btk14 trong môi trường H de Barjac ở nhiệt độ 300C, lắc

220 vòng/phút trong khoảng 40 h.

 Sau 40 h nuôi cấy, ly tâm thu sinh khối TB với tốc độ 10000 vòng/phút, nhiệt độ 40C

trong 20 phút.

 Tiếp theo rửa TB (2 lần) bằng nước.

 Dịch sinh khối sau ly tâm (có dạng paste) được phối trộn với bột diatomite theo tỉ lệ

50% thu được chế phẩm dạng bột. Sau đó tiếp tục trộn với các chất mang theo tỉ lệ 10%

đường sucrose.

 Do điều kiện phòng thí nghiệm, nên chúng tôi sử dụng phương pháp sấy khô để làm khô

chế phẩm. Hỗn hợp sau phối trộn được sấy khô bằng tủ sấy có quạt gió, ở nhiệt độ ≤450C đến khi chế phẩm có khối lượng không đổi (độ ẩm đạt 8 - 12%).

 Thời gian sấy khô chế phẩm khoảng 2 – 3 h. Chúng tôi nhận thấy khoảng thời gian này

tương đối ít có thể là do đặc điểm của bột diatomite. Đây là một loại chất trợ lọc sử dụng

làm chất mang, chất hấp phụ rất tốt. Vì chúng có cấu trúc xốp, mịn, khả năng thấm hút,

hấp phụ cao (có thể hấp phụ một lượng chất lỏng gấp 3 lần khối lượng của nó).

 Chế phẩm được bảo quản trong bao nhôm, đóng gói 50g/gói và được giữ ở nhiệt độ

phòng [28]. Chế phẩm trên được chúng tôi đặt tên là BTK14.

 Tiến hành kiểm tra mật độ TB, số lượng bào tử, tinh thể độc của chế phẩm ngay sau khi

sấy khô. Kết quả kiểm tra được trình bày ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Đặc tính của chế phẩm BTK14 sau khi sấy khô

Chế phẩm sau khi sấy khô Chỉ tiêu

2,25.109 Mật độ tế bào (CFU/g chế phẩm)

2,17.109 Số lượng bào tử, tinh thể

44,44 24h

Hoạt lực diệt sâu (%) 66,67 48h

81,48 72h

Qua số liệu ở bảng 3.8, chúng tôi nhận thấy sau sấy khô, số lượng TB của chủng Btk14 đạt 2,25.109, số lượng bào tử tinh thể đạt 2,17.109 . Điều đó chứng tỏ tỉ lệ sống sót sau sấy khô của chủng này là tương đối cao so với mức cho phép (109 CFU/g chế phẩm). Điều này có thể

giải thích là do sinh khối TB được phối trộn với chất mang là diatomite. Nhiều nghiên cứu cho

thấy, do diatomite có khả năng hấp phụ cao nên TB có thể được cố định tốt hơn. Ngoài ra,

đường sucrose có thể rút nước bên trong TB ra ngoài, bảo vệ TB khỏi bị tổn thương bằng cách

ổn định màng TB nên giảm bớt thời gian sấy khô chế phẩm. Đồng thời cũng có thể trong điều

kiện thiếu dinh dưỡng và chứa nhiều sản phẩm trao đổi chất có hại của pha ổn định, nội bào tử

đã hình thành giúp TB có sức đề kháng cao trong suốt quá trình sấy khô. Và cũng có thể do chế

phẩm được bảo quản tốt trong bao nhôm nên ít bị hao hụt.

Riêng hoạt lực diệt sâu của chủng nghiên cứu trong chế phẩm có thay đổi nhưng không

đáng kể so với khảo sát ban đầu, cụ thể 24 h (44,44%); 48 h (66,67%); 72 h (81,48%).

Tóm lại, chế phẩm BTK14 có những đặc điểm sau: - Chứa sinh khối TB của chủng Btk14 đạt 2,25.109 CFU/g chế phẩm, số lượng bào tử

tinh thể đạt 2,17.109/g chế phẩm.

- Có dạng bột, tương đối mịn và xốp.

- Không mùi, có màu trắng của chất mang (diatomite).

- Độ ẩm đạt khoảng 8-10%.

Như vậy, chế phẩm BTK14 của chúng tôi đảm bảo yêu cầu của một chế phẩm trừ sâu.

Do đó việc sử chế phẩm BTK14 để phòng bệnh sâu hại cây trồng là hoàn toàn có cơ sở.

(a) (b)

Hình 3.36. Chế phẩm sau khi đã sấy khô (a) và sau khi đóng gói (b)

3.9. Kiểm tra khả năng sống sót của chủng Btk14 trong chế phẩm

Để khảo sát tính ổn định của chế phẩm BTK14, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng

sống sót của chủng Btk14 trong suốt quá trình bảo quản. Do thời gian có hạn, chúng tôi chỉ

kiểm tra được số lượng TB của chủng nghiên cứu sau 6 tuần bảo quản (so với số lượng TB

ngay sau khi sản xuất chế phẩm). Kết quả được thể hiện qua bảng 3.9 và đồ thị 3.10.

Bảng 3.9. Sự biến động số lượng tế bào của chủng Btk14 trong chế phẩm BTK14 theo thời

gian bảo quản

Thời gian (tuần)

0 1 2 3 4 5 6

2,25 2,16 2,12 2,04 1,98 1,86 1,79 Số lượng x 109 CFU/ 1g

chế phẩm

Tỉ lệ sống sót 100 96 94,22 90,67 88 82,67 79,56 (%)

Hình 3.37. Đồ thị sự biến động số lượng TB của chủng Btk14 trong chế phẩm

BTK14 theo thời gian bảo quản

Từ kết quả ở bảng 3.9 và đồ thị 3.10 bên dưới, chúng tôi nhận thấy sau 3 tuần bảo quản

tỉ lệ sống sót của chủng Btk14 trong chế phẩm BTK14 có xu hướng giảm, mặc dù có thay đổi

nhưng tỉ lệ sống sót vẫn khá cao (>90%). Tuy nhiên, từ tuần thứ 4 trở đi, tỉ lệ sống sót của

chủng nghiên cứu có xu hướng giảm mạnh. Đến cuối tuần thứ 6, tỉ lệ sống sót chỉ còn khoảng

79,56%. Sau 6 tuần bảo quản, số lượng TB của chủng P14 có xu hướng giảm nhưng vẫn đạt 1,79.109 CFU/g chế phẩm (>109 CFU/g chế phẩm). Nhiều nghiên cứu cho rằng, số lượng TB của các chủng VSV trong chế phẩm đạt trên 109CFU/1g chế phẩm là tốt nhất và sẽ mang lại

hiệu quả cao nhất.

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

1. Đã phân lập được 20 chủng VK thuộc chi Bacillus, trong đó có 4 chủng VK có tinh

thể độc (P3, P14, P19, P28).

2. Đã tuyển chọn được chủng P14 có khả năng sinh trưởng, sinh bào tử, tinh thể độc và

hoạt lực diệt sâu cao nhất trong 4 chủng khảo sát.

3. Đã định danh tới loài bằng sinh học phân tử cho thấy chủng P14 là B. thuringiensis

var. kurstaki. Đây là chủng VK rất an toàn với người và động vật.

4. Đã xác định được các đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn là:

- KL hơi tròn, đường kính khoảng 5mm. Mặt trên KL có màu trắng kem, nhìn nghiêng

bề mặt hơi sần sùi, có núm nhỏ ở tâm. Mép KL màu trắng, lan tỏa ra xung quanh.Mặt dưới của

KL phẳng, có màu trắng kem.

- Hình thái TB dạng hình que, hai đầu tù, bắt màu với thuốc nhuộm tím gentian.

- Bào tử hình trứng, chính tâm.

- Tinh thể có hình quả trám 5. Đã xác định nồng độ Mg2+(0,005 mM ) và Mn2+ (0,5mM) là thích hợp nhất cho sự

sinh trưởng, khả năng sinh bào tử, tinh thể độc của chủng nghiên cứu.

- Đã tiến hành so sánh hoạt lực diệt sâu của chủng Btk14 với chủng VK phân lập từ chế

phẩm Baolus của Đài Loan, cho thấy chủng phân lập từ chế phẩm có hoạt lực diệt sâu mạnh

hơn.

6. Đã xác định được gen sinh độc tố của chủng Btk14 là gen Cry1Ab (238 bp).

7.1. Đã tạo được chế phẩm BTK14 đảm bảo yêu cầu của chế phẩm trừ sâu, với các đặc

điểm như sau:

- Chứa sinh khối TB của chủng Btk14 đạt 2,25.109 CFU/g chế phẩm, số lượng bào tử

tinh thể đạt 2,17.109/g chế phẩm.

- Có dạng bột, tương đối mịn, xốp, màu trắng.

- Không mùi.

- Độ ẩm đạt khoảng 8-10%.

7.2. Đã tiến hành thử hoạt lực diệt sâu của chế phẩm BTK14 với tỉ lệ sâu chết cụ thể ở

24 h (44,44%); 48 h (66,67%); 72 h (81,48%).

7.3. Khả năng sống sót của chủng Btk trong chế phẩm BTK14sau 6 tuần bảo quản đạt

79,56% đáp ứng được yêu cầu sử dụng của chế phẩm.

4.2. Kiến nghị

Do thời gian nghiên cứu khá hạn hẹp nên chúng tôi không thể thực hiện tất cả nội dung

nghiên cứu một cách sâu sắc, chặt chẽ. Vì vậy, nếu có điều kiện tiếp tục nghiên cứu vấn đề này,

chúng tôi xin đề nghị nghiên cứu tiếp một số nội dung sau:

- Tiếp tục tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh độc tố bằng

phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm.

- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường sucrose và bột diatomite tới thời gian sấy khô và

bảo quản chế phẩm BTK14.

- Tiếp tục thử nghiệm hoạt lực của chế phẩm BTK14 trong điều kiện in vivo.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Ngô Đình Bính (2005), Thuốc trừ sâu vi sinh, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội,

tr. 10 – 43.

2. Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Phạm Minh Hương, Nguyễn Anh Nguyệt,

Ngô Đình Quang Bính, Nguyễn Văn Tuất (2003), “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng

thuốc trừ sâu Bt ở Việt Nam”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Hà Nội, tr.179 –

183.

3. Nguyễn Thùy Châu, Trương Thanh Bình và cộng sự (2004), Sản xuất thử chế phẩm

Bacillus thuringiensis dạng bột để phòng trừ côn trùng hại kho bộ cánh vảy trên nông

sản bảo quản, Báo cáo khoa học tổng kết dự án, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông

thôn, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, 399 tr.

4. Nguyễn Thị Chính, Nguyễn Đình Quyến (1998), Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu Bt

và ứng dụng trong phòng trừ sâu hại, Báo cáo nghiệm thu nhánh đề tài thuộc dự án hợp

tác Việt Nam – CHLB Đức, VNM 9510-017.

5. Nguyễn Lân Dũng (1981), Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại cây trồng, NXB

Khoa học kỹ thuật.

6. Nguyễn Lân Dũng (1999), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục.

7. Ngô Đình Quang Đính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh

Nguyệt, Nguyễn Hoài Trâm, Trịnh Thế Cường (2000), “Nghiên cứu sự phân bố và đa

dạng sinh học của Bacillus thuringiensis phân lập ở một số tỉnh ở Việt Nam”, Những

vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia

Hà Nội, tr 484 – 488.

8. Nguyễn Thị Hoài Hà, Ngô Giang Liên (2003), “Tuyển chọn các chủng B. thuringiensis

có khả năng diệt sâu tơ và sâu xanh”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, 1(4),

tr.260 – 263.

9. Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Lê Thị Minh Thành, Ngô Đình Bính, Dương Văn Hợp

(2008), “Nghiên cứu sự phân bố và một số đặc điểm sinh học của chủng B.

thuringiensis phân lập tại vườn quốc gia Cát Bà”, Tạp chí Sinh học, 30(2), tr. 129 –

135.

10. Mai Thị Hằng, Trần Thị Mỹ Hạnh, Võ Thị Hường (2005), “Nghiên cứu một số đặc

điểm của chủng Bacillus thuringiensis phân lập từ RNM Việt Nam”, Tạp chí Khoa học

Công nghệ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.

11. Lê Thị Thu Hiền, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình, Nông Văn Hải (1998), “Gen kháng

côn trùng và ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật”, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh

học.

12. Phan Nguyên Hồng (1999), Rừng ngập mặn Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 205

tr.

13. Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thuỳ Châu, Đinh

DuyKháng (2005), “Phân lập các chủng B. thuringiensis var.kurstaki ở Việt Nam”, Tạp

chí Sinh học, Hà Nội.

14. Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thùy Châu, Đinh Duy

Kháng (2003), “Phân lập các chủng Btk ở Việt Nam”, Tạp chí di truyền học và ứng

dụng, số 3.

15. Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thùy Châu, Đinh Duy

Kháng (2003), “Tạo dòng và xác định trình tự DNA đặc điệu của gen cry 1Ab từ các

chủng Btk phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí di truyền học và ứng dụng, số 4.

16. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công

nghệ sinh học – tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB ĐHQG TP. HCM.

17. Lã Thành Nam (2009), Xây dựng quy trình sản xuất thuốc trừ sâu B. thuringiensis từ

nguồn nước thải chế biến thủy sản, Luận văn Thạc sỹ Công nghệ Sinh học, Đại học

Bách Khoa TP.HCM.

18. La Thị Nga, Nguyễn Minh Dương, Trần Duy Minh, Trương Ba Hùng, Võ Thị Thứ

(2003), “Đa dạng phân tử của Bt ở các tỉnh Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ”, Tạp chí di

truyền học và ứng dụng, số 1.

19. Võ Minh Phát (2010), Sản xuất thuốc trừ sâu B. thuringiensis bằng bùn thải, Luận văn

Thạc sỹ Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa TP.HCM.

20. Nguyễn Hữu Phúc, Trần Thị Cẩm Nhung, Nguyễn Thị Ngọc Tú, Lê Thị Khánh Vân,

Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, Lâm Thanh Thúy (1982), “Nghiên cứu sản xuất thuốc

trừ sâu Bt tại phân viện khoa học VN 1976 – 1982”, Báo cáo khoa học phân viện Khoa

học Việt Nam, tr.76 – 82.

21. Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự (1985), Nghiên cứu công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi

sinh Bt, Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài quốc gia ngày 30/6/1986.

22. Nguyễn Hữu Phúc, Ngô Kế Sương (1995), “Hiện trạng và triển vọng của việc nghiên

cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm vi sinh BVTV ở TP. HCM”, Hội thảo Công nghệ

sinh học, tr.16 - 24/04/1995.

23. Phạm Thị Thuỳ (2004), Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, NXB Đại học Quốc

gia Hà Nội, tr 235 - 243.

24. Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật, NXB Giáo dục.

25. Võ Thị Thứ, Nguyễn Kim Thoa (2000), “Đặc điểm phân loại của các chủng B.

thuringiensis var israelensis phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 22(4), tr.53 - 58.

26. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2007), Giáo trình Công nghệ sinh học – tập 5, NXB

Giáo dục.

27. Nguyễn Thị Thanh Vân (1996), Nghiên cứu điều kiện đơn giản nhân giống Bacillus

thuringiensis, lựa chọn phương pháp sản xuất giống để cung cấp cho các vùng trồng

rau sạch, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại học Lâm nghiệp.

Tiếng Anh

28. Amos Navon(1993), “Control of Lepidopteran pets with Bacillus thuringiensis",

Bacillus thuringiensis an environment biopestiside theory and practide,pp. 126 – 146.

29. Black K.G. and Snyman S.J. (1991), “Biomass yield and insecticidal activity of a local

Bt isolate in six fermentermedia”, Proceedings of the Annual Congress – South Africa

Sugar Technologist’Association.

30. Chilcot C.N and P. J Wigley (1994), “Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis

crystal protein", Proceeding of the 2nd Canberra meeting on Bacillus thurigiensis, pp.

43 – 52.

31. Choma C . T . W. K. surewicz, P. R. Carey, M. Pozsgay, T. Raynor and H. Kaplan

(1990),“Unusual proteolysis of the protoxin and toxin Bacillus thuringiensis”, Eur.J.

Biochem, vol. 189, pp. 523 – 527.

32. Deluca A.J, Simonson J.G and larson A. D(1981), “Bacillus thuringiensisdistribution

on soil of the United States”, Microbiol, vol. 27,pp. 865 – 870.

33. Fisher R., Rosner L., 1959, “Toxicology of the Microbial Insecticide, Thuricide”,

Journal of agricultural and food chemistry, vol 7, pp. 686 – 688.

34. Hofte. H and H. R. Whitelog (1989) “Insecticidal crystal protein of Bacillus

thuringiensis", Microbiol, Rev. 53, pp. 242 – 255.

35. Iizuka T,Eds Yuzinin, Sun Ming, Liu Ziduo(1999), “Historical review on Bacillus

thuringiensis", Biotechnology of Bacillus thuringiensis, Vol. 3, tr. 3-5.

36. Imre S. Otvos, Holly Armstrong, Nicolas Conder (2005), Safety of Btk Applications for

Insect Control to Humans and Large Mammals.

37. Keshavarzi M., Salimi H. and Mirzanamadi F. (2005), “Biochemical and physical

requirements of Bt subsp kurstaki for high biomassyeild production”, J Agric Sci

Technol, vol 7, pp. 41 – 47.

38. Lachhaba K., Dtyagia R.,Valéro J.R. (2001), “Production of Bt biopesticides using

wastewater sludge as a raw material: effect of inoculums and sludge solids

concertration”, Process biochemistry, vol 37, pp. 197 – 208.

39. Laurent P. H, Ripauteau H, Dumamoir V.C, Frachon E, Lecadet M-M (1996), “A

micromethod for serotyring Bacillus thuringiensis”, Microbiol, vol. 22, pp. 259-261.

40. Meadows M.P., Entwistle P.F., Cory J.S., Bailey M. J. and Higgs S. ED., (1993),

“Bacillus thuringiensis in the enviroment: Ecology and risk assement”,Bacillus

thuringiensis, an environmental biopesticide: Theory and practice, Wiley and Sons, pp.

193 – 220.

41. Pedersen J.C., Damgaard P. H., Eilenberg E. and Hansen B. M. (1995), “Dispersal of

Bacillus thuringiensis var kurstaki in an experimental cabbage field”,Can J Microbiol,

vol 41,pp. 118 – 125.

42. Powel, C.A. Charlto, T. Yanamoto(1994), “Recent advences in structure and fuction

reseach onBacillus thuringiensiscrystal protein”, Bacillus thuringiensis biotechnology

and environmental benefits, Vol 1, pp. 1-20.

43. Pries F . G(1992), “Biological control of Mosquitoes and other bitting flies by Bacillus

thuringiensis and B. sphaericus”, Journal of Applied Bacteriology, vol. 72, pp. 357-

369

44. Sakhi. V. F. P. Parenti, G.M.Hanazet, B.Giordara, P . Lluthy (1986), “Bacillus thuringiensis toxin inhibits K+ - gradient dependent amino acid transport across the

brush border membrane of pieris brassicae midgut”.

45. Shahram Aramideh, Mohammad Hassan Saferalizadeh, Ali Asghar Pourmirza,

Mahmuod Rezazadeh Bari, Mansureh Keshavarzi, Mahdi Mohseniazar (2010),

“Isolation and identification native Bacillus thuringiensis in different habitat from west

Azerbaijan and evaluate effects on Indian moth plodia interpunctella (hubner)

(Lepidoptera: pyralidae)”, Mun. Ent. Zool,Vol. 5, pp. 1034 – 1039.

46. Thiery, E. Frachon (1997), Indentification, isolation culture and preservation enbromo

pathogenic Biologocal techniques manual of technology in Insect pathology, A

academicpress, pp. 55 – 56.

47. Vimala Devi P.S., Ravinder T. and Jaidev C. (2005), “Barley-based medium for the

cost – effective production of Bt”, World Journal of Microbiology and Biotechnology,

vol. 21, pp. 173 – 178.

48. Xavier R., NagarathinamP., Gopalakrishnan, Murugan V. and JayaramanK. (2007),

“Isolation of Lepidopteran Active Native Bt strains through PCR panning”,Asia Pacific

Journal of molecular Biology and Biotechnology, vol. 15 (2), pp. 61 – 67.

49. Zhang X., Liang., Siddiqui Z. A., Gong Y., Yu Z., Chen S., 2009, “Efficient screening

and breeding of Bt subsp k for high toxicity against Spodoptera exigua and Heliothis

armigera”,J Ind microboil Biotechnol, vol 36, pp. 815 – 820.

50. World Health Organization, Geneva (1999), Microbial Pest Control Agent Bacillus

thuringiensis.

Trang web

51. http://www.vietscience.free.fr

52. http://tusach.thuvienkhoahoc.com/

53. http://www.vietbao.vn/Khoa-hoc/Dung-vi-khuan-lam-thuoc-tru-sau

54. www.slideshare.net/haucsk32/thuoc-tru-sau-bt

55. http://www.wattpad.com/855399-vk-gay-benh

56. http://www.agbiotech.com.vn

57. http://www.ebook.edu.vn

58. http://www.thiennhien.com

59. http://mabvietnam.net/Vn/MERD1-vn.htm

60. www.ctu.edu.vn/guidelines/scientific

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Đường chuẩn tương quan tuyến tính giữa số lượng tế bào và OD 660 nm.

Phụ lục 2: Kết quả định danh

PHÒNG XÉT NGHIỆM NK- BIOTEK

Số: 072/2013/DVVS

793/58 TRẦN XUÂN SOẠN, P. TÂN HƯNG, Q.7, TP.HCM ĐT: (848) 7715818, 8328, 8329 Fax: (848) 7750583, 2250 Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com, namkhoa.biotek@gmail.com GP số: 41G8005341 Theo định hướng ISO 15189

KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

THÔNG TIN VỀ MẪU THỬ

Nơi gởi mẫu:

NGUYỄN THIÊN PHÚ

Mẫu vi khuẩn

Mẫu thử:

Định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S

Yêu cầu:

PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN ⌦ Giải trình tự gen 16S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH

Kết quả

Trực Gram (+)

BA

Kết quả giải trình tự gen 16S TGGAGAGTTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTC GAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACG TGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAA CATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGAC CCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCG ACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTG ATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAA GCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC

Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH

Bacillus thuringiensis serovar kurstaki, complete genome Sequence ID: gb|CP004069.1|Length: 5646799Number of Matches: 12 Related Information Range 1: 82289 to 82811GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match

Alignment statistics for match #1

Score Expect Identities Gaps Strand

961 bits(520) 0.0 523/524(99%) 1/524(0%) Plus/Plus

Features: rRNA-16S ribosomal RNA

Query 1 TGGAGAGTTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTC 60

||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 82289 TGGAGAG-TTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTC 82347

Query 61 GAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 82348 GAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT 82407

Query 121 GGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACA 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 82408 GGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACA 82467

Query 181 TTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCC 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 82468 TTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCC 82527

Query 241 GCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACC 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 82528 GCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACC 82587 81

Query

301

TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC

360

Sbjct

82588

82647

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC

Query

361

AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA

420

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA

Sbjct

82648

82707

Query

421

GGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGG

480

Sbjct

82708

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGG

82767

Query

481

CACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC 524

Sbjct

82768

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC 82811

KẾT LUẬN Bacillus thuringiensis var. kurstaki

TP. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 03 năm 2013

TRƯỞNG PHÒNG

Phụ lục 3: Xử lý thống kê các số liệu thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Xác định số lượng bào tử, tinh thể của các chủng P3, P14, P19,

P28

• Xử lý bằng Excel