Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 làm tăng chiều dài sợi gỗ vào bạch đàn lai UP (Eucalyptus urophylla x E. pellita) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Nguyễn Thị Việt Hà

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E. pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Hà Nội - 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Nguyễn Thị Việt Hà

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E. pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hƣớng dẫn 1: TS. Trần Hồ Quang

Hƣớng dẫn 2: TS. Lê Sơn

Hà Nội - 2021

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu của bản thân dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Trần Hồ Quang và TS. Lê Sơn. Mọi kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng của các tác giả khác (nếu có) đều đƣợc trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào cũng nhƣ chƣa đƣợc công bố trên bất kỳ phƣơng tiện nào.

Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Ngƣời cam đoan

Nguyễn Thị Việt Hà

Lời cảm ơn

Tôi xin cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, phòng Đào tạo, các thầy giáo, cô giáo tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trƣờng.

Tôi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, cùng toàn thể các cán bộ Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy hƣớng dẫn, TS. Trần Hồ Quang (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và TS. Lê Sơn (Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Luận văn đƣợc sử dụng một phần số liệu và kết quả từ đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ (giai đoạn 2)” do ThS. Trần Đức Vƣợng làm chủ nhiệm, thuộc Chƣơng trình trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đến 2020 mà Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp là đơn vị thực hiện. Xin chân thành cám ơn.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Học viên

Nguyễn Thị Việt Hà

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

STT Từ viết tắt Viết đầy đủ

AS Acetosyringone 1.

BAP 6-Benzyl Amino Purine 2.

CNSH Công nghệ sinh học 3.

ĐC Đối chứng 4.

ĐHST Điều hòa sinh trƣởng 5.

ADN Acid Deoxyribonucleic 6.

IBA Indole-3-Butyric Acid 7.

IFTIB 8. Institute of Forest Tree Improvement and Biotechnology

Km Kanamycin 9.

LB Môi trƣờng nuôi cấy Luria and Betani 10.

MS Môi trƣờng nuôi cấy Murashige & Skoog 11.

NAA 1-Naphthyl Acetic Acid 12.

OD Mật độ quang học (Optical Density) 13.

PCR 14. Phản ứng trùng hợp chuỗi (Polymerase Chain Reaction)

Danh mục các bảng

Bảng 1.1. Các loài bạch đàn đƣợc nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ................................................................................................. 27

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 40

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 40

Bảng 2.3. Chu trình phản ứng PCR................................................................. 40

Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin .......... 42

Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ Kanamycin đến khả năng ra rễ .. 44

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tuổi vật liệu đến mẫu tạo mô sẹo .......................... 45

Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ................................................................................................ 47

Bảng 3.5. Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn đến tỷ lệ chồi tái sinh ........................ 49

Bảng 3.6. Ảnh hƣởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ tạo mô sẹo ................ 50

Bảng 3.7. Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ........................................................................................................ 52

Bảng 3.8. Khả năng sống sót của chồi chuyển gen sau các lần chọn lọc ....... 56

Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra khả năng ra rễ của chồi chuyển gen sau các lần chọn lọc ........................................................................................................... 59

Bảng 3.10. So sánh hình thái thân giữa cây chuyển gen với cây đối chứng ... 60

Bảng 3.11. So sánh hình thái lá giữa cây chuyển gen và cây đối chứng ........ 61

Bảng 3.12. Đánh giá sinh trƣởng về chiều cao của cây con ngoài vƣờn ƣơm sau 1, 2 và 3 tháng .................................................................................................. 63

Bảng 3.13. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 2 tháng tuổi ........ 64

Bảng 3.14. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 3 tháng tuổi ........ 65

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1. Tỷ lệ cây trồng biến đổi gen/tổng diện tích cây cùng loại của 5 nƣớc trồng cây biến đổi gen lớn nhất trên thế giới .................................................... 7

Hình 1.2. Tổng giá trị (USD) thu đƣợc từ cây trồng biến đổi gen toàn cầu ..... 9

Hình 1.3. Bạch đàn lai UP trồng khảo nghiệm tại Yên Bình – Yên Bái ........ 21

Hình 1.4. Cây con Bạch đàn lai UP bằng phƣơng pháp nhân giống in vitro .. 23

Hình 2.1. Vật liệu Bạch đàn lai UP sử dụng trong chuyển gen ...................... 31

Hình 2.2. Cấu trúc vector pGWB2/35S/EcHB1 ............................................. 32

Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tái sinh thông qua phôi soma cho Bạch đàn lai UP ......................................................................................................................... 34

Hình 2.4. Vị trí các lá đƣợc chọn để đánh giá hình thái ................................. 38

Hình 3.1. Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Km đến chồi chƣa chuyển gen ....................................................................................................... 43

Hình 3.2. Bạch đàn lai UP 15 ngày tuổi tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc .. 45

Hình 3.3. Mẫu bật chồi sau chuyển gen khi tiền nuôi cấy 48 giờ ................... 48

Hình 3.4. Mẫu nhiễm khuẩn với thời gian lần lƣợt sau 10 phút, 15 phút, 20 phút .................................................................................................................. 51

Hình 3.5. Sơ đồ quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UP .............. 54

Hình 3.6. Mẫu chuyển gen tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc ........................ 55

Hình 3.7. Bình nhân chồi dòng Bạch đàn lai UP chuyển gen EcHB1 ............ 55

Hình 3.8. Chồi chuyển gen EcHB1 trên môi trƣờng chọn lọc ........................ 58

Hình 3.9. Hình thái thân và lá của dòng bạch đàn chuyển gen và đối chứng . 62

Hình 3.10. Cây bạch đàn chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 2 tháng tuổi ......................................................................................................................... 63

Hình 3.11. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 2 tháng tuổi ............................................................................................. 64

Hình 3.12. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 3 tháng tuổi ............................................................................................. 66

Hình 3.13. Bạch đàn chuyển gen ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc và cây con tại vƣờn ƣơm ........................................................................................................ 67

Hình 3.14. Cây con chuyển gen EcHB1 trồng tại vƣờn ƣơm ......................... 67

Hình 3.15. Kết quả chạy điện di kiểm tra ADN một số dòng Bạch đàn lai UP ......................................................................................................................... 68

Hình 3.16. Kết quả PCR 40 dòng bạch đàn chuyển gen EcHB1 .................... 69

Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 bằng PCR ................ 70

MỤC LỤC

MỤC LỤC ........................................................................................................ 1

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 6

1.1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ...................................... 6

1.1.1. Hiện trạng và vai trò cây trồng biến đổi gen ........................................... 6

1.1.1.1. Hiện trạng cây trồng biến đổi gen ....................................................... 6

1.1.1.2. Vai trò của cây trồng biến đổi gen ....................................................... 8

1.1.1.3. Tình hình cây trồng biến đổi gen ở nước ta ......................................... 9

1.1.2. Các phƣơng pháp chuyển gen ......................................................... 11

1.1.2.1. Chuyển gen trực tiếp ........................................................................... 11

1.1.2.2. Chuyển gen gián tiếp .......................................................................... 12

1.1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp ............................... 13

1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................... 13

1.1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ................................................................ 15

1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP....................................... 17

1.2.1. Tổng quan về bạch đàn và Bạch đàn lai UP ......................................... 17

1.2.1.1. Tổng quan về bạch đàn ...................................................................... 17

1.2.1.2. Nghiên cứu và phát triển giống Bạch đàn lai UP ở Việt Nam .......... 20

1.2.3. Các hƣớng cải thiện giống bạch đàn bằng ứng dụng Công nghệ sinh học ......................................................................................................................... 22

1.2.3.1. Nhân giống vô tính in vitro cây bạch đàn .......................................... 22

1.2.3.2. Tái sinh in vitro thông qua sự hình thành callus và phôi soma ......... 24

1.2.3.3. Nghiên cứu phát triển và sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo và lai giống ...................................................................................................... 25

1.2.3.4. Chuyển gen cho loài bạch đàn ........................................................... 26

1.2.4. Gen EcHB1 và ứng dụng trong cải thiện chiều dài sợi gỗ .................... 28

1.2.4.1. Vai trò của nhân tố phiên mã trong sinh trưởng của thực vật ........... 28

1.2.4.2. Nhân tố phiên mã gen EcHB1 ............................................................ 30

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................................... 31

2.1. VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT ................................. 31

2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 31

2.1.2. Vật liệu di truyền và chủng vi khuẩn .................................................... 31

2.1.3. Trang thiết bị và hóa chất ...................................................................... 32

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 33

2.2.1. Nghiên cứu tái sinh in vitro ở các dòng Bạch đàn UP .......................... 33

2.2.2. Xác định ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin ........................... 35

2.2.3. Xác định tuổi vật liệu đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ................................... 35

2.2.4. Xác định thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo .................. 36

2.2.5. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens .................................. 36

2.2.6. Xác định thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo .................................................................................................................... 36

2.2.7. Xác định thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ............................................................................................................. 37

2.2.8. Tái sinh cây từ mẫu đã biến nạp gen, nhân các dòng biến nạp gen, ra rễ và trồng chăm sóc bên ngoài vƣờn ƣơm ......................................................... 37

2.2.9. Phƣơng pháp đánh giá hình thái cây chuyển gen .................................. 37

2.2.10. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số................................................. 38

2.2.11. Xác định sự có có mặt của gen trong cây chuyển gen bằng PCR ...... 39

2.2.12. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu .................................. 41

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 42

3.1. QUY TRÌNH CHUYỀN GEN VÀO CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP THÔNG QUA A. TUMEFACIENS ................................................................................ 42

3.1.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin ................. 42

3.1.3. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ........................................................................................................ 46

3.1.4. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens .................................. 48

3.1.5. Ảnh hƣởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ........................................................................................................ 49

3.1.6. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ........................................................................................................ 51

3.1.8. Đánh giá khả năng sống sót của chồi chuyển gen ................................ 56

3.1.9. Đánh giá khả năng ra rễ và kiểm tra chồi chuyển gen .......................... 58

3.2. PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÌNH THÁI CỦA CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI CHUYỂN GEN ................................................................. 60

3.2.1. So sánh hình thái cây Bạch đàn lai UP chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn in vitro ............................................................................................. 60

3.2.2. So sánh hình thái cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn vƣờn ƣơm ......................................................................................................................... 62

3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG MANG GEN CỦA CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN TẠO ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR .................................................. 66

3.3.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 66

3.3.2. Xác định sự có có mặt của gen EcHB1 trong cây bằng PCR ............... 68

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 71

4.1. Kết luận .................................................................................................... 71

4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 72

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, công nghệ gen đƣợc ghi nhận là giải pháp quan trọng và hữu hiệu trong chọn tạo giống mới đặc biệt là kỹ thuật chuyển gen. Thông qua việc sử dụng các kỹ thuật trong chuyển gen cho phép tạo ra những giống cây trồng mới đột phá về năng suất, chất lƣợng cũng nhƣ khả năng chống chịu sâu bệnh hại. Không những thế cây trồng tạo ra từ quy trình chuyển gen có nhiều đặc tính ƣu việt mà ở cây trồng hoang dại ban đầu không có. Chuyển gen ở bạch đàn đã đƣợc thực hiện từ những năm 1990 cho nhiều loài bạch đàn nhƣ: Eucalyptus gunnii, E. globulus, E. camaldulensis, E. nitens,... [1].

Chuyển gen cho cây bạch đàn chủ yếu tập trung vào các tính trạng về tăng sinh khối, thay đổi tính chất gỗ (thay đổi hàm lƣợng lignin, cellulose), chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn hán, lạnh, nhiễm mặn) và chống sâu bệnh hại. Việc chuyển gen trên cây bạch đàn đã đƣợc thực hiện ở trong và ngoài nƣớc. Tetsu Kawazu và cộng sự (2003) đã đƣợc cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen gus vào loài bạch đàn E. camaldulensis, E. globulus, E. grandis, E. grandis x E.urophylla và E. urophylla bằng các mẫu cấy sinh dƣỡng lấy từ cây bạch đàn trƣởng thành; Cheng và cộng sự (2006) cũng đã đƣợc cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen và chọn lọc cây chuyển gen cho loài bạch đàn E. urophylla. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng các loài bạch đàn, dòng bạch đàn khác nhau thì có quy trình chuyển gen khác nhau cũng nhƣ cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [2]. Do vậy để chuyển gen hiệu quả vào từng loài bạch đàn và từng dòng bạch đàn cụ thể cần có một quy trình thích hợp.

Tetsuya Sonoda và cộng sự (2009) phối hợp nghiên cứu với công ty giấy Oji đã thành công trong việc phân lập gen EcHB1 mã hóa nhân tố phiên mã loại II (HD-Zip class II transcription factor) liên quan đến việc hình thành và phát triển sợi gỗ đƣợc phân lập từ các nhóm gen nhân tố phiên mã trên bạch đàn E. camaldulensis. Sử dụng kỹ thuật microarray cho thấy ở bạch đàn E. camaldulensis biến nạp gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1), biểu hiện của

các gen chính liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin nhƣ CCoAOMT, CAD, CCR và C4H đều giảm [3].

Tại Việt Nam, bạch đàn chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) đã đƣợc Trần Hồ Quang và cộng sự thực hiện trong khuôn khổ đề tài ”Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ” giai đoạn 2011- 2015, kết quả đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UU (E. urophylla x E. urophylla) làm tăng chiều dài sợi gỗ và chọn đƣợc dòng bạch đàn lai UU89 có sinh trƣởng nhanh (vƣợt trội về chiều cao hơn 25%, đƣờng kính hơn 10% so với giống đại trà).

Hiện nay, một số dòng Bạch đàn lai UP là giống lai giữa Bạch đàn urophylla và Bạch đàn pellita (E. urophylla x E. pellita) đƣợc đánh giá có ƣu thế lai, sinh trƣởng tốt hơn so với các loài bố mẹ trên nhiều dạng lập địa và đã đƣợc công nhận là giống quốc gia và giống tiến bộ kỹ thuật để phát triển rộng rãi trong sản xuất, đây là nguồn vật liệu tiềm năng cho chuyển gen làm tăng chiều dài sợi gỗ.

Xuất phát từ những cơ sở trên đề tài ”Nghiên cứu chuyển gen EcHB1

làm tăng chiều dài sợi gỗ vào bạch đàn lai UP (Eucalyptus urophylla x E. pellita) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” đã đƣợc tiến hành với mục tiêu xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen cho chiều dài sợi gỗ EcHB1 vào Bạch đàn lai UP từ đó chọn tạo đƣợc các giống bạch đàn biến đổi gen có năng suất, chất lƣợng cao để phục vụ chƣơng trình trồng rừng gỗ lớn.

1. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

1.1.1. Hiện trạng và vai trò cây trồng biến đổi gen

1.1.1.1. Hiện trạng cây trồng biến đổi gen

Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crops – GM Crops) đƣợc thƣơng mại hóa từ năm 1996. Tổ chức Quốc tế về Tiếp thu các Ứng dụng Công nghệ sinh học trong Nông nghiệp (ISAAA) phát hành báo cáo thƣờng niên cập nhật tình hình ứng dụng cây trồng Công nghệ sinh học (CNSH) hay cây trồng biến đổi gen trên toàn cầu năm 2017; cho thấy diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen đã tăng gấp 110 lần sau 21 năm thƣơng mại hoá - phát triển từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên tới 185,1 triệu ha vào năm 2016. Báo cáo cũng tiếp tục cho thấy các lợi ích lâu dài của cây trồng biến đổi gen đối với nông dân, đồng thời nhấn mạnh tiềm năng phát triển và lợi ích của một số giống cây mới đƣợc chấp thuận thƣơng mại hoá trong thời gian gần đây đối với ngƣời tiêu dùng.

Tính đến năm 2017 đã có 67 quốc gia sử dụng cây trồng biến đổi gen (bao gồm 26 quốc gia trồng cây biến đổi gen), cấp phép chính thức nhập khẩu và sử dụng cây trồng biến đổi gen với mục đích làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và chế biến. Cụ thể, tại châu Âu, bốn quốc gia là Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Séc và Slovakia đã trồng hơn 136.000 ha bắp biến đổi gen trong năm 2016, tăng 17% so với năm 2015. Ở châu Phi, Nam Phi và Sudan cũng liên tiếp mở rộng diện tích bắp, đậu nành biến đổi gen và đạt 2,66 triệu ha trong năm 2016, trong khi năm 2015 mới chỉ có 2,29 triệu ha. Còn châu Mỹ, Brazil có diện tích canh tác bắp, đậu nành, bông và hạt cải dầu GM Crops tăng 11%, là nƣớc lớn thứ 2 sau Mỹ về diện tích trồng biến đổi gen. Tại châu Á, Bangladesh là nƣớc thứ 28 trồng cây Cà tím Bt vào tháng 10 năm 2013.

Năm 2018, ở Châu Phi mới có 3 quốc gia ứng dụng cây trồng biến đổi gen là Nam Phi, Sudan, Vƣơng quốc Eswatini. Trong năm 2019, châu lục này đã có thêm 3 quốc gia là Malawi, Nigeria và Ethiopia, quyết định khai thác lợi ích của các cây trồng biến đổi gen. Ngoài ra, Kenya đã công bố việc

thƣơng mại hoá bông biến đổi gen vào cuối năm 2019, và chính thức bắt đầu canh tác vào năm 2020. Với việc bổ sung thêm ba quốc gia ở châu Phi, số quốc gia trồng cây trồng biến đổi gen trong năm 2019 tăng lên thành 29 quốc gia. Trong đó, 5 quốc gia dẫn đầu với diện tích cây trồng biến đổi gen lớn nhất là Hoa Kỳ, Brazil, Argentina, Canada và Ấn Độ (Hình 1.1). Với tỷ lệ ứng dụng cao các cây trồng biến đổi gen chính tại các quốc gia này, có khoảng 1,95 tỷ ngƣời, tƣơng đƣơng với 26% dân số thế giới, đƣợc hƣởng lợi từ CNSH vào năm 2019 [4].

Hình 1.1. Tỷ lệ cây trồng biến đổi gen/tổng diện tích cây cùng loại của 5 nƣớc trồng cây biến đổi gen lớn nhất trên thế giới

(Nguồn: ISAAA)

Tính đến năm 2019, tổng cộng có 190,4 triệu ha cây trồng biến đổi gen đƣợc canh tác tại 29 quốc gia, góp phần quan trọng vào giải quyết các vấn đề về an ninh lƣơng thực, tính bền vững, giảm thiểu biến đổi khí hậu cũng nhƣ nâng cao đời sống của hơn 17 triệu nông dân ứng dụng CNSH cùng gia đình của họ trên toàn cầu. Tốc độ tăng trƣởng diện tích vùng trồng cây biến đổi gen đạt đến hai con số đã đƣợc ghi nhận tại các quốc gia đang phát triển, đặc biệt là ở Việt Nam, Philippines và Colombia [4].

1.1.1.2. Vai trò của cây trồng biến đổi gen

Cây trồng biến đổi gen có những đóng góp về mặt kinh tế, xã hội và

môi trƣờng nhƣ sau:

- Cây trồng biến đổi gen giúp nông dân các nƣớc đang phát triển cải thiện thu nhập, góp phần vào xóa đói giảm nghèo. Trong giai đoạn 1996 – 2016 diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen đã tăng gấp 110 lần sau 21 năm thƣơng mại hóa, phát triển từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên tới 185,1 triệu ha vào năm 2016 đã góp phần làm tăng giá trị sản xuất lên đến 186,1 tỷ đô la cho khoảng 17 triệu nông dân trên toàn cầu [4].

- Cung cấp nguồn lƣơng thực thiết yếu cho tƣơng lai với việc tạo ra các cây trồng biến đổi gen mang những tính trạng quý nhƣ kháng virus, kháng sâu bệnh, chịu mặn, năng suất cao hơn... Ngoài ra còn tăng cƣờng chất lƣợng thực phẩm đƣợc ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới nhƣ các giống lúa giàu carotenoid (tiền vitamin A), khoai tây biến đổi gen với hơn ⅓ lƣợng protein là các chất dinh dƣỡng thiết yếu và có giá trị cao.

- Hoạt động nông nghiệp truyền thống của con ngƣời có tác động rất lớn với môi trƣờng. Cây trồng biến đổi gen với các tính trạng kháng sâu, kháng virus và chống chịu chất diệt cỏ góp phần làm giảm việc sử dụng các hóa chất trong trồng trọt. Giúp tiết kiệm 671 triệu kg thuốc trừ sâu (giai đoạn 1996 - 2016), và 48,5 triệu kg riêng trong năm 2016; làm giảm EIQ (Environmental Impact Quotient) đến 18,4% trong giai đoạn 1996-2016, và riêng năm 2016 đạt 18,3%.

- Cây trồng biến đổi gen có thể giúp giải quyết những lo ngại lớn nhất về môi trƣờng, Giảm thiểu tác hại của biến đổi khí hậu và giảm lƣợng khí gây hiệu ứng nhà kính, giảm thiểu tác động của thay đổi thời tiết. Theo đánh giá trong năm 2016, cây trồng biến đổi gen đã làm giảm khoảng là 27,1 tỷ kg tƣơng đƣơng với khí thải của 16,7 triệu chiếc xe hơi chạy trên đƣờng 1 năm.

- Cây trồng biến đổi gen góp phần giúp xóa đói giảm nghèo và tăng thu nhập cho ngƣời nông dân. Giá trị thu nhập từ cây trồng biến đổi gen tăng lên từ 91 triệu USD (năm 1996 - năm bắt đầu trồng cây trồng biến đổi gen) lên

đến 15,690 triệu USD năm 2014 (Hình 1.2). Tỷ lệ đóng góp của một số loài cây trồng chính vào tổng giá trị cây trồng biến đổi gen trong năm 2014 gồm 8,6 tỷ USD từ ngô biến đổi gen, 5,2 tỷ USD từ đậu tƣơng biến đổi gen, 1,2 tỷ USD từ ngô biến đổi gen, 0,4 tỷ USD từ cây Canola biến đổi gen, 2 tỷ USD từ cây củ cải đƣờng biến đổi gen và phần còn lại từ các loài cây trồng biến đổi gen khác. Đến 2018, giá trị từ cây biến đổi gen trên thế giới đạt 18,15 tỷ USD. Tổng giá trị cây trồng biến đổi gen đạt tới 27,9 tỷ USD vào năm 2020 và đƣợc dự đoán có thể đạt tới 45 tỷ USD vào năm 2027 [4].

Hình 1.2. Tổng giá trị (USD) thu đƣợc từ cây trồng biến đổi gen toàn cầu

1.1.1.3. Tình hình cây trồng biến đổi gen ở nước ta

Ở nƣớc ta, việc đầu tƣ và khuyến khích các nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen chính thức đƣợc thực hiện từ năm 2006, sau khi chƣơng trình trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ Sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đến năm 2020 đƣợc chính phủ phê duyệt (theo Quyết định số 11/2006/QĐ-TTg của Thủ tƣớng Chính phủ). Các đề tài nghiên cứu về chuyển gen thực vật chủ yếu đƣợc tiến hành ở các cơ sở nghiên cứu khoa học lớn có đội ngũ cán bộ có trình độ chuyên môn cao và có trang thiết bị hiện đại.

Việt Nam đã phê chuẩn cây trồng công nghệ sinh học và thƣơng mại hóa vào tháng 9 năm 2014 cho 4 loại ngô lai là MON 89034 (kháng sâu),

NK603 (chống chịu chất diệt cỏ), Bt11 và MIR162 (kháng côn trùng). Năm 2017, có trên 45.000 ha trồng ngô biến đổi gen ở các tỉnh thành khắp cả nƣớc, tăng 13 lần so với năm 2015. Ƣớc tính có khoảng 37.500 hộ nông dân tham gia trồng loại cây này. Đến thời điểm hiện tại, Việt Nam có 22 giống cây trồng biến đổi gen đƣợc thƣơng mại hóa gồm 14 giống ngô và 8 giống đậu nành [4].

Đối với cây nông nghiệp, trong giai đoạn 2006 - 2011 các nhà khoa học của Việt Nam đã tạo đƣợc một số dòng bông, ngô, đậu tƣơng biến đổi gen mang gen kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ, một số dòng cà chua chuyển gen kháng bệnh vi rút xoắn vàng lá, thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá và xoắn đọt. Các dòng cây chuyển gen nay đang đƣợc đánh giá trong phạm vi nhà lƣới về khả năng biểu hiện của gen chuyển và hình thành các dòng cây biến đổi gen tiến tới khảo nghiệm và ứng dụng vào sản xuất. Tuy nhiên, để đƣa các giống cây trồng biến đổi gen này vào sản xuất diện rộng đang gặp rất nhiều khó khăn [5], [6], [7], [8], [9].

Đối với cây lâm nghiệp, việc nghiên cứu và phát triển giống biến đổi gen có nhiều thuận lợi hơn so với cây nông nghiệp do các sản phẩm từ cây lâm nghiệp nghiệp biến đổi gen không sử dụng trực tiếp làm thức ăn cho ngƣời và động vật nên ít bị cản trở hay kiểm soát bởi các quy định về quản lý an toàn sinh vật biến đổi gen. Vì vậy, nhiều nƣớc trên thế giới đã khuyến khích các nhà khoa học nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen. Đến nay, Bộ Nông nghiệp & PTNT đã phê duyệt 04 nhiệm vụ nghiên cứu khoa học cấp nhà nƣớc về tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen, trên 3 đối tƣợng cây lâm nghiệp là: Xoan ta, thông và bạch đàn. Trong đó, Viện CNSH Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã triển khai 02 nhiệm vụ cấp nhà nƣớc về tạo giống cây Xoan ta và Bạch đàn urô biến đổi gen. Đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta biến đổi gen” với mục tiêu tạo giống cây trồng mới có năng suất cao, chất lƣợng tốt. Kết quả đã xây dựng thành công quy trình biến nạp gen vào đối tƣợng Xoan ta đạt hiệu quả cao, tạo đƣợc 5 dòng Xoan ta chuyển gen sinh trƣởng nhanh và 3 dòng Xoan ta chuyển gen tăng chất lƣợng gỗ. Đề tài “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) sinh

trƣởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen” triển khai trong 5 năm (2012 - 2016). Nhóm nghiên cứu đã xây dựng đƣợc hệ thống tái sinh bạch đàn urô thông qua phôi soma với hiệu suất cao phục vụ biến nạp gen và tạo ra một số dòng bạch đàn chuyển gen trong phạm vi phòng thí nghiệm.

Sự thành công của đề tài cho thấy các nhà khoa học của Việt Nam hoàn toàn có khả năng tiếp cận và làm chủ loại công nghệ mới này. Kết quả của các đề tài cũng đã khẳng định một hƣớng nghiên cứu mới trong lĩnh vực chọn tạo giống cây trồng lâm nghiệp mới và công nghệ này có thể áp dụng đƣợc ở Việt Nam. Trong tƣơng lai, các nhà khoa học hy vọng hƣớng nghiên cứu tạo giống cây trồng đặc biệt là đối tƣợng cây lâm nghiệp bằng công nghệ chuyển gen sẽ tiếp tục đƣợc quan tâm phát triển. Tuy nhiên, nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen cần có nhiều thời gian. Trƣớc tiên, cần xác định những loài cây chủ lực để tập trung nghiên cứu phát triển, sau đó xây dựng chƣơng trình nghiên cứu tổng thể dài hạn cho từng loài cây cụ thể với mức đầu tƣ kinh phí và thời gian nghiên cứu phù hợp (10 - 15 năm), giao nhiệm vụ cho cơ sở nghiên cứu và nhóm nhà khoa học đủ mạnh tập trung nghiên cứu để tạo ra đƣợc sản phẩm cuối (giống mới) đáp ứng mục tiêu của con ngƣời.

1.1.2. Các phƣơng pháp chuyển gen

Hiện nay có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để chuyển gen ở thực vật. Căn cứ vào cách thức đƣa gen vào tế bào thực vật mà ngƣời ta chia thành hai phƣơng pháp là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp.

1.1.2.1. Chuyển gen trực tiếp

Chuyển gen trực tiếp là việc sử dụng các biện pháp cơ học, vật lý hoặc hóa học để chuyển trực tiếp các gen vào tế bào thực vật. Một số phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp bao gồm:

- Phương pháp bắn gen:

Là phƣơng pháp sử dụng các hạt kim loại nặng (vàng, vonfram) có kích thƣớc cực nhỏ, đƣợc bọc bên ngoài bằng ADN rồi bắn trực tiếp vào tế bào thực vật. Bằng phƣơng pháp này có thể biến nạp tất cả các loại tế bào. Tuy

nhiên, cho đến nay tần số biến nạp bằng phƣơng pháp bắn gen còn thấp và thƣờng xuyên nhận đƣợc cây biến nạp khảm [10].

- Phương pháp xung điện:

Là phƣơng pháp dùng hiện tƣợng phóng điện để tạo lỗ trên màng tế bào, làm cho việc đƣa ADN vào tế bào dễ hơn, nhất là khi ADN đã tiếp giáp với màng tế bào. Phƣơng pháp này có thể dễ dàng thực hiện trên đối tƣợng cây một lá mầm [11].

- Phương pháp vi tiêm:

Là phƣơng pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi đƣa ADN vào những tế bào nhất định. Phƣơng pháp này đã tạo ra những dòng biến nạp từ proplast và cây biến nạp khảm từ các tế bào tiền phôi có nguồn gốc từ hạt phấn [10].

Hạn chế của phƣơng pháp này là cần dùng các thiết bị có độ chính xác

cao và kỹ năng phức tạp từ ngƣời sử dụng [12].

- Phương pháp chuyển gen qua ống phấn:

Đây là phƣơng pháp chuyển gen thông qua nuôi cấy in vitro, dựa trên nguyên tắc là ADN ngoại lai chuyển vào cây theo đƣờng ống phấn rồi chui vào bầu nhụy cái.

- Phương pháp siêu âm:

Dùng chuyển gen vào tế bào trần protoplast.

- Phương pháp hóa học:

Chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học nhƣ

polyethylen-glycol.

1.1.2.2. Chuyển gen gián tiếp

- Phương pháp chuyển gen nhờ virus:

Virus là đối tƣợng đƣợc sử dụng chuyển gen vào thực vật vì có một số ƣu điểm: virus có khả năng xâm nhiễm và chuyển genome của mình sang tế bào thực vật. Nhƣng sự lây nhiễm virus thƣờng làm yếu tế bào thực vật, vì vậy đây là phƣơng pháp ít đƣợc sử dụng đến.

- Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium đƣợc nghiên cứu từ những năm 1960 - 1970. Việc phát hiện ra A. tumefaciens có khả năng chuyển gen vào thực vật đã trở thành công cụ quan trọng của CNSH thực vật. Việc sử dụng A. tumefaciens có ƣu điểm hơn so với các phƣơng pháp khác, số bản sao khi sử dụng phƣơng pháp này khi chuyển vào thực vật thƣờng thấp (1 – 2 bản copy) trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn. Do vậy có thể giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen đƣợc chuyển, tăng khả năng chuyển gen, tránh đƣợc cây chuyển gen thể khảm. Ngoài ra, chuyển gen A. tumefaciens có kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền.

Phƣơng pháp này đã khắc phục đƣợc những hạn chế chủ yếu của các phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp nhƣ thƣờng thu nhận cây chuyển gen có nhiều bản sao của gen dẫn tới sự nhiễu gen và không bền vững của gen trong thực vật. Chuyển gen bằng A. tumefaciens đƣợc thực hiện hiệu quả trên nhiều loại cây hai lá mầm: thuốc lá, cà chua, khoai tây… và cây một lá mầm nhƣ lúa.

1.1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp

1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chuyển gen vào cây rừng đƣợc tiến hành từ những năm 1980 bắt đầu bằng việc chuyển các gen chỉ thị để xác định khả năng tiếp nhận và mức độ biểu hiện của gen lạ trong hệ gen của cây chủ và làm cơ sở cho chuyển các gen mục tiêu có giá trị kinh tế.

- Chuyển gen làm thay đổi tính chất gỗ

Các nghiên cứu chuyển gen làm thay đổi tính chất gỗ chủ yếu tập trung cho việc tăng khối lƣợng riêng của gỗ (wood density), giảm hàm lƣợng lignin, cải thiện tính chất sợi gỗ. Hu và cộng sự đã tạo ra đƣợc cây Dƣơng (Populus tremuloides) chuyển gen giảm hàm lƣợng lignin bằng cách làm giảm mức độ biểu hiện của gen 4CL (gen chính trong chu trình sinh tổng hợp lignin). Sau 10 tháng trồng tại nhà kính, cây Dƣơng chuyển gen có hàm lƣợng lignin giảm

45%, hơn nữa, hàm lƣợng cellulose tăng 15% và sinh trƣởng của cây cũng tăng cao hơn [13].

Cũng trên đối tƣợng cây Dƣơng, Coleman và cộng sự (2008) tạo ra đƣợc cây Dƣơng chuyển gen với việc làm giảm mức độ biểu hiện của gen C3H (cũng là gen chính trong chu trình sinh tổng hợp monolignon của lignin). Sau 4 tháng trồng tại nhà kính, các cây Dƣơng này có hàm lƣợng lignin giảm 55%. Tuy nhiên, những nghiên cứu theo hƣớng làm giảm hàm lƣợng lignin trong cây cho thấy hầu hết đều có tác động không tốt tới hình thái và sinh trƣởng của cây, cây sinh trƣởng chậm lại (cây có thân nhỏ), hệ rễ và hình thái lá cũng bị thay đổi. Trong giai đoạn vƣờn ƣơm, các cây chuyển gen không thấy có thay đổi khác biệt so với cây đối chứng, còn trong giai đoạn rừng trồng khảo nghiệm, mức độ khác biệt này lại đáng kể.

- Chuyển gen làm tăng khả năng thích ứng với môi trường

Các nghiên cứu chuyển gen tăng khả năng thích ứng với môi trƣờng đƣợc quan tâm gồm chuyển gen tăng khả năng chống chịu hạn, chống chịu với sâu bệnh, chống chịu lạnh và chịu mặn. Chuyển gen kháng sâu (gen Bt) đã đƣợc Lachance và cộng sự (2007) thực hiện trên cây Vân sam (Picea glauca) [15]. Trong đó 23 dòng chuyển gen đã đƣợc trồng trong 5 năm tại khảo nghiệm ở Valcartier (Canada). Kết quả theo dõi khảo nghiệm cho thấy tính kháng sâu hại ngọn (Choristoneura fumiferana) của các dòng Vân sam trắng chuyển gen ổn định trong suốt thời gian theo dõi. Tƣơng tự nhƣ vậy, khảo nghiệm trong 3 năm đối với 2,256 cây Dƣơng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ (gen BAR) cho thấy các cây này đều biểu hiện tính kháng ổn định, ngoại trừ một số dòng không ổn định.

Một số kết quả nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, các gen đƣợc chuyển thành công vào cây có ảnh hƣởng rõ rệt đến hình thái và quá trình trao đổi chất ở cây chuyển gen: nhƣ gen PtGT1 làm tăng hàm lƣợng lignin và ảnh hƣởng đến khả năng ra hoa sớm ở cây thuốc lá chuyển gen, hay gen PtNDPK2 làm tăng sinh trƣởng và khả năng chống chịu với một số điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt ở cây Dƣơng P. trichocarpa chuyển gen [15], [16]. Cây A. thaliana chuyển gen codA, COX, GSMT/SDMT tăng cƣờng khả năng

chịu lạnh, nhiệt độ cao, chịu mặn và băng giá, cây cải be (Brassica juncea) chuyển gen codA có khả năng chịu mặn tốt hơn cây đối chứng [17]. Vì vậy, việc triển khai các nghiên cứu nhằm tạo ra đƣợc các giống cây trồng nông - lâm nghiệp có khả năng chống chịu đƣợc các điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣng vẫn đảm bảo đƣợc năng suất và chất lƣợng tốt đang là vấn đề cấp bách và cần thiết hiện nay. Trên thế giới, các nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi chủ yếu tập trung vào nhóm cây nông nghiệp, còn nhóm cây lâm nghiệp mới chỉ có một vài công trình công bố [18].

- Chuyển gen làm tăng khả năng sinh trưởng

Cùng với việc chuyển gen là tăng tính chống chịu, các nghiên cứu chuyển gen nhằm cải thiện tính chất gỗ, chuyển gen làm tăng khả năng sinh trƣởng cũng đã đƣợc thực hiện trên cây Dƣơng. Một số gen liên quan đến sinh trƣởng nhƣ gen horseradish peroxidase (gen prxC1a), gen glutamine synthase (gen GS1) và gen aspergillus xylogluconase (gen AaXEG2) đã đƣợc biến nạp vào cây Dƣơng. Kết quả khảo nghiệm sau 3 năm trồng tại tỉnh Granda, Tây Ban Nha cho thấy cây Dƣơng chuyển gen GS1 có sinh trƣởng cao hơn 21%, 36% và 41% so với cây đối chứng ở các năm thứ 1, thứ 2 và thứ 3 (theo thứ tự tƣơng ứng) [19], [20], [21].

1.1.3.2. Các nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, cây biến đổi gen trong lĩnh vực lâm nghiệp cũng đƣợc quan tâm nghiên cứu. Một số loài cây nhƣ dƣơng, vân sam, keo, bạch đàn, xoan… đƣợc chuyển một số gen chống chịu sâu bệnh, gen kháng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, gen tăng cƣờng sinh khối, cải thiện tính chất gỗ [22]. Nghiên cứu chuyển gen cho cây lâm nghiệp ở nƣớc ta mới bắt đầu đƣợc tiến hành từ những năm 2000 và tập trung cho các hƣớng chính sau:

- Chuyển gen làm tăng khả năng thích ứng với môi trường

Chuyển gen kháng sâu (gen Bt Cry 1Ab) cho cây Thông nhựa (Pinus merkusii) đã đƣợc thực hiện trong giai đoạn 2006 – 2010 [23]. Kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc các thông số cần thiết cho chuyển gen chỉ thị (gen gus)

và gen mục tiêu (Bt Cry 1Ab) vào phôi soma cây Thông nhựa. Tuy nhiên, do khả năng tái sinh của phôi soma còn chƣa ổn định nên các nghiên cứu chuyển gen cho cây Thông nhựa vẫn chỉ ở giai đoạn thăm dò ban đầu.

Chuyển gen P5CsM/codA có khả năng tăng cƣờng tính chịu hạn và chịu mặn ở các dòng cây chuyển gen vào cây thuốc lá và cây Xoan ta. Kết quả đã tạo đƣợc 2 dòng Xoan ta mang gen chịu hạn (gen P5CsM) và 5 dòng Xoan ta mang gen chịu mặn (gen TP-codA) chịu đƣợc mặn với nồng độ muối 500 mM, cây chuyển gen sinh tổng hợp và tích lũy hàm lƣợng glycine betaine cao hơn rất nhiều lần so với các công trình công bố trƣớc đây [24].

- Chuyển gen tăng khả năng sinh trưởng

Gen tăng khả năng sinh trƣởng (gen GA20) phân lập từ cây Arabidopsis thaliana và gen tăng chất lƣợng gỗ (gen 4CL1) phân lập từ cây Thông đuôi ngựa (Pinus masoniana) đƣợc gắn vào cấu trúc vector pBI121-GA20 và pPTN289-4CL1 và pBI121-4CL1. Hoạt động của 2 gen này đƣợc điều khiển bởi promotor CaMV 35S. Các cấu trúc gen này đã biến nạp thành công vào cây Xoan ta (Melia azedarach L.). Tuy nhiên, do sử dụng promotor CAMV 35S là loại promotor mạnh nên 2 gen mục tiêu này hoạt động quá mạnh dẫn đến làm thay đổi quá mức các tính trạng của cây. Cụ thể, các dòng chuyển gen tăng khả năng sinh trƣởng (gen GA20) có sinh trƣởng chiều cao quá nhanh, lóng cây quá dài và đƣờng kính thân cây nhỏ, còn các dòng chuyển gen tăng chất lƣợng gỗ (gen 4CL1) thì cây lại có thân to và giòn; lá to dày và có màu xanh đậm.

Dựa trên các kết quả nghiên cứu của đề tài, Hà Văn Huân và cộng sự (2015) đã hoàn thiện quy trình chuyển gen vào Xoan ta (Melia azedarach L.) thông qua vi khuẩn A. tumefaciens với hiệu suất chuyển gen GA20 và gen 4CL1 đạt 3 - 5%. Nhóm tác giả chuyển thành công gen GA20 và gen 4CL1 vào Xoan ta, tạo đƣợc 5 dòng mang gen GA20 và 3 dòng mang gen 4CL1. Các dòng Xoan ta chuyển gen đều có sự khác biệt rõ rệt so với các dòng không chuyển gen [25]. Cũng trên đối tƣợng này, Nguyễn Văn Phong và cộng sự thiết kế cấu trúc vector cải tiến mang gen GA20ox và vector mang gen GS1 để tạo và chọn lọc thành công 2 dòng xoan ta chuyển gen GA20ox và 1 dòng

xoan ta chuyển gen GS1. Cả 3 dòng mang gen có sức tăng trƣởng vƣợt trội so với cây đối chứng không chuyển gen nhất là về thể tích sinh khối thân cây lấy gỗ đạt tỉ lệ tăng trƣởng từ 81 - 102% ở cả 2 mô hình trồng thử nghiệm tại Xuân Mai và Sơn Tây – Hà Nội [26].

Gen GS1 làm tăng khả năng sinh trƣởng đã đƣợc Bùi Văn Thắng và cộng sự thực hiện chuyển thành công vào Bạch đàn uro thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đạt hiệu suất khoảng 3,7% [27].

- Chuyển gen làm tăng chiều dài sợi gỗ

Bạch đàn chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) đã đƣợc Trần Hồ Quang và cộng sự thực hiện trong khuôn khổ của đề tài ”Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn lai UU biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ” ở trong giai đoạn 2011 - 2015. Đề tài đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen EcHB1 làm tăng chiều dài sợi gỗ và đã chọn đƣợc dòng bạch đàn lai UU89 sinh trƣởng nhanh (vƣợt trội về chiều cao hơn 25%, đƣờng kính hơn 10% so với giống đại trà), có khả năng tái sinh cao làm vật liệu biến nạp gen [28].

1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP

1.2.1. Tổng quan về bạch đàn và Bạch đàn lai UP

1.2.1.1. Tổng quan về bạch đàn

Bạch đàn (Eucalyptus) là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), bộ Sim (Myrtaces), phân lớp hoa hồng (Rosidae), lớp hai lá mầm (Dicotyledone). Tên bạch đàn Eucalyptus lần đầu tiên đƣợc nhà thực vật học ngƣời Pháp Charles Louis L’Heritier de Brutelle đặt cho vào năm 1788. Từ đó đến nay đã có tới 600 loài và biến chủng đƣợc mô tả và đặt tên, gần đây 500 loài đã đƣợc chấp nhận chính thức.

Bạch đàn có xuất xứ từ Australia đƣợc dẫn giống bằng hạt đem về trồng ở đất nƣớc ta vào khoảng thập niên 1950. Cho đến nay, bạch đàn đã đƣợc trồng phổ biến ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là các quốc gia ôn đới nhƣ: Brazil, Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam… Chi Bạch đàn bao gồm 700 (E. loài và các giống lai, một số loài có giá trị kinh tế quan trọng camaldulensis, E. tereticornis, E. grandis, E. globulus, E. urophylla và giống

bạch đàn lai) đƣợc trồng để lấy gỗ, làm nguyên liệu bột giấy và các loại tinh

dầu [29].

Bạch đàn là loài cây đƣợc trồng rừng với diện tích lớn và phổ biến nhất trên thế giới, ƣớc tính khoảng 20 triệu ha [30]. Là loài cây thân gỗ lâu năm, mọc nhanh, cây trồng 5 - 6 năm tuổi thƣờng có chiều cao trên 7m và đƣờng kính thân khoảng 9 - 10cm. Cây bạch đàn có khả năng thích nghi cao với nhiều loại lập địa và khí hậu khác nhau. Gỗ bạch đàn đƣợc coi là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp sản xuất giấy (hiệu suất bột giấy 49,5 %) vì gỗ bạch đàn có thành phần hóa học và cấu tạo sợi rất thích hợp cho sản xuất bột giấy. Mỗi năm trên thế giới có hàng triệu tấn bột giấy đƣợc sản xuất từ gỗ bạch đàn. Bên cạnh đó, gỗ bạch đàn còn đƣợc sử dụng làm đồ mộc, sản xuất thủ công mỹ nghệ, sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, gỗ xây dựng, cột chống…

Ngoài tác dụng cung cấp gỗ, ván dăm và sản xuất giấy, trong lá của bạch đàn còn chứa một lƣợng lớn tinh dầu có mùi thơm rất dễ chịu đƣợc gọi là tinh dầu khuynh diệp. Mỗi loài có hàm lƣợng và thành phần tinh dầu khác nhau nhƣ bạch đàn trắng có 60 - 70% và bạch đàn liễu có 30 - 50% hàm lƣợng cineol trong tinh dầu còn bạch đàn chanh có hơn 70% hàm lƣợng citronela trong tinh dầu (cineol và citronela là 2 loại tinh dầu đang đƣợc quan tâm). Chúng có công dụng trong chữa ho, kiểm soát và phòng chống bệnh tiểu đƣờng, chữa viêm tai, hen suyễn, cảm lạnh và đau đầu…

Ở Việt Nam, bạch đàn chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng, có mặt tại 6/9 vùng sinh thái chính trong cả nƣớc, trong đó bạch đàn đƣợc trồng rộng rãi tại các tỉnh thuộc vùng Tây Bắc, Đông Bắc, đồng bằng sông Hồng, Bắc Trung bộ và Tây nguyên. Tính đến năm 2014 đã có khoảng 200.000 ha bạch đàn đƣợc trồng tại Việt Nam. Ở nƣớc ta, gỗ bạch đàn (trong đó có Bạch đàn lai UP) nằm trong 10 loại gỗ nhập khẩu nhiều nhất vào Việt Nam trong những năm qua. Riêng năm 2018, nƣớc ta nhập khẩu đến 239.600 m3 gỗ tròn và 101.800 m3 ván xẻ bạch đàn, gỗ bạch đàn nhập khẩu đƣợc sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho chế biến đồ mộc cao cấp [31]. Trong đó, bạch đàn lai (trong loài và khác loài) đƣợc đánh giá có ƣu thế lai và sinh trƣởng tốt hơn

bố mẹ của chúng. Cho đến nay, nhiều tổ hợp và dòng bạch đàn lai có sinh trƣởng vƣợt trội hơn bố mẹ cũng nhƣ các giống sản xuất đại trà, đã đƣợc công nhận giống tiến bộ khoa học kỹ thuật và đƣợc khuyến khích gây trồng rộng rãi.

Đƣợc biết, hiện các cơ sở sản xuất ván bóc ở các tỉnh Phú Thọ, Yên Bái và Bắc Giang đang tiến hành thu mua với giá từ 1,5 - 2 triệu đồng/m3, cao hơn 1,5 - 2 lần giá thu mua làm gỗ dăm xuất khẩu. Ở các tỉnh này nhiều hộ nông dân đã bắt đầu chuyển hƣớng sang trồng rừng bạch đàn kinh doanh gỗ lớn với luân kỳ từ 10 - 12 năm. Một số cơ sở chế biến gỗ lớn đã tiến hành nhập dây chuyền chế biến gỗ bạch đàn để sản xuất các sản phẩm đồ mộc xuất khẩu và đang tiến hành thu mua gỗ bạch đàn làm gỗ xẻ với giá từ 2 - 2,5 triệu đồng/m3 từ đó sẽ làm gia tăng lợi nhuận cho ngƣời trồng rừng.

Bạch đàn ở Việt Nam có nhiều loài, thích nghi với các vùng sinh thái riêng. Dựa vào chỉ tiêu kinh tế để chọn giống, nên khi trồng bạch đàn cần chú ý chọn loài và xuất xứ cho năng suất cao, thích hợp với điều kiện sinh thái từng vùng và khả năng chống chịu với sâu bệnh tốt. Theo kết quả nghiên cứu của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, một số loài đã và đang đƣợc trồng phổ biến ở nƣớc ta nhƣ: E. camaldunensis, E. tereticorni, E. urophyla. Một số loài đƣợc khảo nghiệm và xác định là có hiệu quả đối với các vùng nhƣ sau: các loài E. camaldunensis, E. tereticornis, E. brassina và E. pellita thích hợp với các vùng đồi thấp và đồng bằng miền Nam, các loài E. grandis, E. saligna, E. microcorys thích hợp với vùng đất phèn nặng.

Ở Việt Nam, có khoảng 10 loại bạch đàn đƣợc du nhập, cụ thể gồm các

loài sau:

- Bạch đàn caman (E. camaldulensis) thích hợp vùng đồng bằng.

- Bạch đàn alba (E. alba) thích hợp vùng gần biển.

- Bạch đàn lá nhỏ (E. tereticornis) thích hợp vùng đồi Thừa Thiên

Huế.

- Bạch đàn lá liễu (E. exserta) thích hợp vùng cao miền Bắc.

- Bạch đàn chanh (E. titriodora) thích hợp vùng đồi thấp, lá có chứa

tinh dầu mùi sả.

- Bạch đàn lá bầu (E. globulus) thích hợp vùng cao nguyên.

- Bạch đàn (E. grandis) thích hợp vùng đất phù sa.

- Bạch đàn ƣớt (E. saligna) thích hợp vùng cao nguyên Ðà Lạt.

- Bạch đàn Mai đen (E. maidenii) thích hợp vùng cao nhƣ Lâm Đồng.

- Bạch đàn uro (E. urophyla) thích hợp khu vực đồi núi thấp phía

Bắc.

- Bạch đàn pellita (E. pellita) thích hợp vùng đồi thấp và đồng bằng

miền Nam.

1.2.1.2. Nghiên cứu và phát triển giống Bạch đàn lai UP ở Việt Nam

Bạch đàn đƣợc nhập vào Việt Nam từ những năm 1930, tuy nhiên đến đầu những năm 1960 mới đƣợc phát triển mở rộng và sau đó đƣợc xem là một trong những loài cây chủ lực để phủ xanh đất trống đồi trọc và trồng rừng phân tán. Trong những năm gần đây, việc tạo ra các giống mới bằng cách lai giống trong và khác loài là một hƣớng đi mới có nhiều triển vọng trong nghiên cứu cải thiện giống cây rừng và đã góp phần nâng cao năng suất rừng trồng. Thông qua các chƣơng trình lai giống và chọn giống, đã có nhiều tổ hợp lai trong và khác loài giữa Bạch đàn uro với các loài bạch đàn khác đƣợc đánh giá là những dòng bạch đàn lai có sinh trƣởng tốt, vƣợt trội so với giống đối chứng và giống sản xuất đại trà [32].

Bạch đàn lai UP là giống lai giữa Bạch đàn uro và Bạch đàn pellita (E. urophylla x E. pellita) đang ngày càng đƣợc ƣa chuộng trong sản xuất. Một số dòng bạch đàn lai UP (UP54, UP72, UP97, UP99…) do Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp chọn tạo có thể cho năng suất đạt tới 25 - 35 m3/ha/năm trên nhiều dạng lập địa [33]. Sau 5 năm trồng ở vùng đất đồi Yên Thế, Bắc Giang và vùng khô hạn trên đất cát ở Hàm Thuận Nam, Bình Thuận, rừng trồng bạch đàn lai UP đƣợc công nhận đạt năng suất từ 140 - 150m3/ha, vƣợt trội so với các giống bạch đàn cũ trƣớc đây. Nhiều hộ nông dân ở Bắc Giang và Yên Bái cho biết trồng rừng bằng giống bạch đàn lai mới

có thể thu 150 - 200m3/ha sau 7 tuổi và đem lại thu nhập đến 200 triệu đồng/ha, tính ra lợi nhuận đạt đến 170 triệu đồng/ha sau 7 năm.

Hình 1.3. Bạch đàn lai UP trồng khảo nghiệm tại Yên Bình – Yên Bái

(Nguồn: IFTIB)

Hiện nay, Bộ Nông nghiệp và PTNT đã công nhận 5 giống bạch đàn lai UP để phát triển vào sản xuất, đó là UP35, UP54, UP72, UP97 và UP99. Các giống bạch đàn lai mới có đặc tính thân thẳng, cành nhánh nhỏ, ít bị mấu mắt, màu sắc đều đẹp, chịu lực tốt, ít bị cong vênh nên rất đƣợc các cơ sở sản xuất ƣa chuộng để sản xuất ván bóc và đóng đồ mộc. Các dòng bạch đàn lai UP này đƣợc chọn làm vật liệu ban đầu cho công tác chuyển gen với mục tiêu là vừa tận dụng đƣợc ƣu thế lai về sinh trƣởng và vừa có thể nâng cao chất lƣợng gỗ qua chuyển gen. Đến nay, ngoài các phƣơng pháp chọn và nhân giống thông thƣờng (lai giống, khảo nghiệm giống, nuôi cấy in vitro tế bào) thì vẫn chƣa có một kết quả công bố nào về việc chuyển gen vào bạch đàn lai UP để nâng cao chất lƣợng của nguồn giống này.

Theo TS. Hà Huy Thịnh, để tạo ra đƣợc một giống bạch đàn lai mới cần ít nhất 8 - 10 năm nghiên cứu, từ tạo giống, khảo nghiệm giống và nhân giống. Trong số hàng trăm giống lai, sau 8 - 10 năm nghiên cứu có thể chỉ chọn đƣợc một vài giống thực sự tốt để phát triển vào sản xuất. Ngoài ra, có những giống có thể trồng trên diện rộng nhƣng cũng có những giống chỉ phù hợp với một số vùng nhất định, vì vậy cần phải khảo nghiệm trên nhiều vùng thì mới chọn đƣợc giống tốt nhất cho từng vùng [33]. Giống bạch đàn lai phải đƣợc nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào hoặc giâm hom nhằm giữ nguyên đặc tính ƣu việt của giống. Các quy trình nhân giống mô hom ở quy mô công nghiệp đã đƣợc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam nghiên cứu thành công và chuyển giao cho nhiều cơ sở sản xuất, từ đó đã thúc đẩy công tác trồng rừng phát triển mạnh mẽ.

1.2.3. Các hƣớng cải thiện giống bạch đàn bằng ứng dụng Công

nghệ sinh học

Bạch đàn là nhóm loài cây thân gỗ đƣợc trồng rộng rãi thứ hai trên thế giới. Nó là cây gỗ cứng thƣơng mại quan trọng đối với ngành công nghiệp giấy và gỗ. Do vậy nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống bạch đàn hiện nay đang rất đƣợc quan tâm.

1.2.3.1. Nhân giống vô tính in vitro cây bạch đàn

Tái sinh in vitro cây bạch đàn đã đƣợc nghiên cứu từ những năm 1980 xuất phát từ nhu cầu thực tế là cần nhiều cây giống cho sản xuất. Nguồn nguyên liệu cho nhân giống in vitro chủ yếu đƣợc lấy từ chồi ngọn và chồi nách (nuôi cấy mô tế bào thực vật), đã có hàng triệu cây con đƣợc tạo ra theo cách này [34], [35]. Năm 1987, đã có trên 20 loài bạch đàn đƣợc nhân giống thành công bằng nuôi cấy mô. Đến năm 1991 nhân giống thành công 31 loài và đến nay thì hầu hết các loài bạch đàn có thể nhân giống thành công in vitro [36], [37]. Diện tích rừng trồng bạch đàn bằng cây nuôi cấy mô tế bào đã tăng lên nhanh chóng ở nhiều nƣớc nhƣ Ấn Độ, Australia, Trung Quốc, Việt Nam…

Ở nƣớc ta, các dòng Bạch đàn lai UP đã đƣợc bộ môn Công nghệ tế bào thực vật – Viện NC Giống và CNSH Lâm nghiệp nghiên cứu và xây dựng quy trình nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Quy trình này và giống gốc đã đƣợc chuyển giao cho nhiều đơn vị nghiên cứu và sản xuất lâm nghiệp trong nƣớc, các cơ sở này đã nhân giống in vitro cho các dòng Bạch đàn lai UP có năng suất cao với quy mô hàng triệu cây/năm.

Hình 1.4. Cây con Bạch đàn lai UP bằng phƣơng pháp nhân giống in vitro

(Nguồn: IFTIB)

Tuy nhiên, hệ thống tái sinh này là phƣơng pháp nhân giống thông qua sự phát triển của các chồi nách và các mắt ngủ, nếu chuyển gen vào hệ thống tái sinh này sẽ tạo ra cây bạch đàn chuyển gen thể khảm, tính trạng sẽ biểu hiện không nhƣ mong muốn và gen chuyển không duy trì đƣợc sang thế hệ sau. Vì vậy, để phục vụ mục đích cải thiện giống cây bằng phƣơng pháp chuyển gen thì cần thiết phải có một hệ thống tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn tạo mô sẹo, từ mô sẹo mới tái sinh chồi trực tiếp hoặc qua phôi soma. Nhiều loài bạch đàn có giá trị nhƣ E. nitens, E. globulus, E. grandis, E. grandis x E. urophylla đã đƣợc tái sinh thành công qua mô sẹo phát sinh chồi trực tiếp [38], [39].

1.2.3.2. Tái sinh in vitro thông qua sự hình thành callus và phôi soma

Về nguyên lý, callus (mô sẹo) có thể đƣợc tạo ra từ bất kỳ bộ phận nào của cây (organogenesis) nhƣ trụ dƣới lá mầm, đoạn thân (không có chồi nách), lá... Các vật liệu này sau khi đƣợc khử trùng và tạo mẫu sạch sẽ đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo và kích thích thành phôi soma, những phôi soma này sau đó phát sinh tạo chồi. Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng thông dụng nhất trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật.

Cho đến nay, có hai phƣơng thức tạo phôi soma đƣợc thực hiện cho bạch đàn là tạo phôi soma trực tiếp (direct somatic embryogenesis) và tạo phôi soma gián tiếp (indirect somatic embryogenesis).

- Tạo phôi soma trực tiếp: là phôi soma đƣợc phát triển ngay tại vết cắt của vật liệu sau một thời gian nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, NAA… Phƣơng pháp này có ƣu điểm rút ngắn đƣợc thời gian, bỏ qua giai đoạn tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo. Tuy nhiên phƣơng pháp này có hệ số tạo phôi soma thấp. Pinto và cộng sự (2002) đã quan sát thấy sự hình thành phôi soma trực tiếp trên bề mặt của trụ dƣới lá mầm của Bạch đàn globulus (E. globulus) sau 25 ngày nuôi cấy ở điều kiện tối trên môi trƣờng MS có bổ sung NAA ở các nồng độ 3, 5, 15 mg/l [21].

- Tạo phôi soma gián tiếp: là các mô thực vật khác nhau đƣợc biệt hóa thành mô sẹo và sau đó biệt hóa thành phôi. Hiệu suất tạo phôi soma gián tiếp phụ thuộc vào tuổi của mẫu vật và sự phối hợp nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng. Đối với bạch đàn trắng, hiệu suất tạo phôi soma cao nhất là 61% đƣợc quan sát trên mô sẹo tạo ra từ trụ dƣới lá mầm 10 ngày tuổi với nồng độ BAP là 1 mg/l và NAA là 0,1 mg/l. Còn đối với mẫu 15 ngày tuổi, hiệu suất tạo phôi soma giảm xuống còn 45% và 19% cho mẫu 25 ngày tuổi. Mẫu 30 ngày tuổi cho hiệu suất tạo phôi soma thấp nhất (10%) [40].

Nghiên cứu về khả năng tái sinh in vitro từ các nguồn vật liệu khác nhau ở bạch đàn đƣợc thực hiện đầu tiên vào năm 1964 bởi Jacquiot cho các loài bạch đàn E. caladocalyx, E. gomphocephala, E. gunnii, E. tereticornis và E. camaldulensis. Tác giả đã tạo mô sẹo từ cây hạt và mô tƣợng tầng (cambial

tissue). Sau đó một năm, Sussex đã sử dụng trụ dƣới lá mầm (hypocotyl) để tạo mô sẹo và nuôi cấy lỏng tế bào cho Bạch đàn caman (E. camaldulensis) [41].

Xác định khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ các loại vật liệu khác nhau (cụm hoa non, các phần của hoa, phôi hạt, trụ dƣới lá mầm, đoạn chồi) của cây trội Bạch đàn lai grandis (E. grandis hybrid) 5 tuổi đã đƣợc Warrag và cộng sự thực hiện [42]. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự hình thành mô sẹo (callus) phụ thuộc vào loại mẫu vật, trong đó cụm hoa non có khả năng tạo mô sẹo ở nồng độ đến 10 mg/l 2,4D nhƣng khả năng tái sinh cây từ cụm mô sẹo này không quan sát thấy.

Đối với bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla khả năng tạo mô sẹo từ chồi, đoạn thân và lá của cây trội 3 năm tuổi đƣợc nhân giống in vitro là nhƣ nhau, trong đó mẫu lá cho kết quả trội hơn. Trong các chất điều hòa sinh trƣởng thƣờng đƣợc sử dụng thì IBA và NAA khi ở nồng độ 10 mg/l đều cho khả năng tạo mô sẹo, tuy nhiên khi đƣợc bổ sung 2,4D ở nồng độ 1 mg/l thì khả năng tạo mô sẹo là tốt nhất [43].

Bùi Văn Thắng và cộng sự (2014) khi nghiên cứu tái sinh cây Bạch đàn uro (E. urophylla) thông qua phôi soma làm cơ sở phục vụ chuyển gen GS1 đã sử dụng thân mần và lá mầm làm vật liệu chuyển gen trong môi trƣờng bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng 0,5 mg/l BAP và 0,2 mg/l NAA cho tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 100% [44].

Bạch đàn lai UU (E. urophylla x E. urophylla) thích hợp tạo mô sẹo ở nồng độ cao 4 mg/l 2,4D kết hợp với BAP nồng độ 3 mg/l cho hiệu quả mô sẹo cao 87,9% ở thân và 90,5% ở lá; môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BAP, 0,1 mg/l Kinetin, 0,5 mg/l NAA, 0,1 mg/l IBA cho tỷ lệ cảm ứng phôi soma đạt 62,2% [45].

1.2.3.3. Nghiên cứu phát triển và sử dụng các chỉ thị phân tử trong

chọn tạo và lai giống

Khác với phƣơng pháp lai giống, sử dụng chỉ thị phân tử sẽ giúp cho việc lựa chọn các cặp lai thích hợp với các tính trạng lai có định hƣớng và

nhanh chóng chọn đƣợc con lai có tính trạng mong muốn [46], [47]. Vì vậy trong những năm gần đây các nghiên cứu về phát hiện các chỉ thị phân tử liên kết chặt với một số tính trạng quý của bạch đàn đã phát triển nhanh chóng. Marques và cộng sự (1998) đã nghiên cứu tìm thấy 1 QTLs về hiệu suất bột giấy và 21 QTLs về khả năng nhân giống sinh dƣỡng của các giống bạch đàn lai (E. tereticornis x E. globulus). Các nghiên cứu về bạch đàn E. globulus tại Australia đã tìm thấy 5 gen dự tuyển (candidate gene) liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin [48], 5 QLTs liên quan đến mật độ gỗ, 3 QLTs về hiệu suất bột giấy, 3 QLTs về chiều dài sợi gỗ [49]. Thumman và cộng sự (2005) đã xác định đƣợc mối tƣơng quan giữa mức độ đa hình của gen mã hóa cho enzyme Cinnamoyl CoA redutase (CCR) - một trong những gen chính liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin của bạch đàn E. nitens x E. globulus AFLP [50], [51]. Việc phát hiện ra các chỉ thị phân tử này giúp chọn lọc giống bạch đàn mới với những tính trạng mong muốn.

Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bạch đàn urophylla [52], bạch đàn lai [53], bạch đàn trắng [54] cho kết quả tốt. Qua nghiên cứu, các tác giả đã chọn lọc đƣợc 20 chỉ thị SSR liên quan đến các tính trạng sinh trƣởng ở Bạch đàn lai và 2 chỉ thị tƣơng quan đến tính kháng bệnh trên lá của Bạch đàn caman. Các đề tài đã chọn lọc đƣợc 10 dòng bạch đàn lai sinh trƣởng nhanh, 3 dòng bạch đàn trắng kháng bệnh đốm lá, trong đó dòng bạch đàn lai CU98 và CU82 đã đƣợc công nhận là giống cây trồng lâm nghiệp mới cho phép phổ biến ra sản xuất.

1.2.3.4. Chuyển gen cho loài bạch đàn

Trên thế giới, phƣơng pháp chuyển gen vào bạch đàn phổ biến nhất đƣợc sử dụng là chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens [55]. Các phƣơng pháp khác nhƣ chuyển qua xung điện [56], súng bắn gen, siêu âm [57] đƣợc sử dụng nhƣng còn hạn chế.

Đối với bạch đàn, một số gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin, cellulose, tính chất gỗ đã đƣợc xác định cho các loài Bạch đàn globulus (E. globulus); Bạch đàn gunnii (E. gunnii); Bạch đàn caman (E. camaldulensis); Bạch đàn grandis (E. grandis) [58], [59], [60], [61]. Các gen

liên quan đến tăng khả năng hấp thụ lân cũng đã đƣợc phân lập từ Bạch đàn caman, trong số 5 gen đƣợc phân lập thì chỉ có 2 gen có khả năng làm tăng độ hấp thụ lân trên cả điều kiện nghèo và giàu lân [62]. Bảy gen mã hóa cho quá trình tổng hợp cellulose (cellulose synthase CesA gen) đã đƣợc phân lập từ Bạch đàn grandis và các gen này đƣợc cho là đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất cellulose về chất lƣợng cũng nhƣ chiều dài sợi gỗ [63].

Chuyển gen bạch đàn đã đƣợc thực hiện từ những năm 1990 cho nhiều loài bạch đàn nhƣ Bạch đàn gunnii, Bạch đàn globulus, Bạch đàn caman, Bạch đàn nitens... và chủ yếu tập trung cho các tính trạng về tăng sinh khối, thay đổi tính chất gỗ (thay đổi hàm lƣợng lignin, cellulose), chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn hán, lạnh và nhiễm mặn) và sâu bệnh hại (Bảng 1.1).

Bảng 1.1. Các loài bạch đàn đƣợc nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

Loài Gen mục tiêu Tính trạng

E. camaldulensis uidA, nptII Biểu hiện β-glucuronidase

Cry3A, bar Chống chịu sâu ăn lá

C4H, nptII, uidA

Giảm hàm lƣợng lignin và cải thiện chất lƣợng gỗ

Tăng hàm lƣợng cellulose

Antisense Ntlim1 (transcription factor), uidA, nptII, hpt

CodA Chống chịu mặn (tới 30%)

E. globulus uidA, nptII

Biểu hiện β-glucuronidase trong mô

E. grandis × E. Nos, Ti & Ri plasmid

urophylla Giảm hàm lƣợng lignin

Antisense E. gunni cad, nptII, uidA

Mt CS

Tăng khả năng hấp thụ Phosphate vô cơ trong đất acid

E. urophylla Ceceropin D

Tăng tính chống chịu với bệnh Pseudomonas solanacearum lên đến 35%

Tăng khả năng sinh trƣởng GS1

Tăng khả năng sinh trƣởng GA20

EcHB1 Tăng chiều dài sợi gỗ

E. urophylla x E. urophylla

E. saligna Chống chịu lạnh

P5CSF129A, uidA, nptII

1.2.4. Gen EcHB1 và ứng dụng trong cải thiện chiều dài sợi gỗ

1.2.4.1. Vai trò của nhân tố phiên mã trong sinh trưởng của thực vật

Quá trình trao đổi chất và sinh tổng hợp các chất trong thực vật là một quá trình phức tạp, có sự tham gia của nhiều phản ứng, sự xúc tác của hàng loạt các enzyme khác nhau và đƣợc điểu kiển bằng nhiều yếu tố phiên mã. Vì thế việc tác động đến các các yếu tố phiên mã có chức năng điểu khiển các bƣớc sinh tổng hợp của quá trình tổng hợp các chất là một hƣớng đi có hiệu quả hơn trong việc điều khiển sự có mặt của một chất về cả số lƣợng và chất lƣợng.

Nhân tố phiên mã (transcription factors) là những protein đƣợc gắn vào điểm đặc biệt của trình tự ADN và kiểm soát sự phiên mã của gen. Nhân tố phiên mã thực hiện chức năng của mình bằng cách tăng cƣờng hoạt hóa hoặc kìm hãm tốc độ phiên mã của ARN tại vùng bắt đầu phiên mã của gen [64].

Một yếu tố phiên mã thƣờng điều kiển sự biểu hiện của nhiều gen tham gia vào con đƣờng sinh tổng hợp của chất.

Nhân tố phiên mã có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của sinh vật vì nó đảm bảo các gen đƣợc biểu hiện trong tế bào vào đúng thời điểm và đúng số lƣợng trong cơ thể sinh vật. Nó có vai trò trong việc bật/tắt sự phiên mã của các gen thích hợp để làm thay đổi quá trình trao đổi chất trong sinh vật, quá trình biệt hóa tế bào... Đã có 53,319 nhân tố phiên mã thuộc 58 nhóm đƣợc tìm thấy ở 49 loài thực vật, trong đó gồm 9 loài tảo, 1 loài rêu, 3 loài cây hạt trần và 35 loài cây hạt kín [65].

Protein HD-Zip là nhân tố phiên mã đặc thù có trong các loài thực vật. HD-Zip có cấu tạo gồm miền ADN có chức năng liên kết chặt chẽ với motif khóa kéo leucine (leucine zipper motif) trong việc hình thành dimmer. Hai chuỗi polypeptide ở khóa kéo leucine đƣợc giữ với nhau bởi tƣơng tác kỵ nƣớc giữa acid amin leucine và sự lồng vào của 2 vòng xoắn α. Đây là loại homeodomain (miền đồng hình) chỉ có mặt trong thực vật và đƣợc coi là gen HD-Zip có nguồn gốc từ thực vật bằng cách trao đổi giữa một gen exon của miền đồng hình với một chuỗi khóa kéo leucine. Protein HD-Zip bao gồm 4 phân nhóm (từ I đến IV) dựa trên 4 đặc điểm: (1) sự bảo thủ của domain HD- Zip xác định vị trí ADN gắn kết, (2) cấu trúc gen, (3) các motif bảo thủ phụ thêm (additional conserved motif) và (4) chức năng [66].

Mỗi một nhân tố phiên mã kiểm soát sự hoạt động và phát triển của một vùng thực vật đặc biệt. Nhân tố phiên mã ATHB5 thuộc HD-Zip phân nhóm I có chức năng kiểm soát sự hình thành trụ dƣới lá mầm và kéo dài rễ sơ cấp [67], ATHB2 thuộc HD-Zip phân nhóm II có chức năng kiểm soát việc kéo dài tế bào liên quan đến chất lƣợng ánh sáng [68], ATHB8 thuộc phân nhóm III có chức năng kiểm soát sự phát triển của tƣợng tầng trong quá trình biệt hóa tế bào), ATHB10/GLABRA 2 thuộc phân nhóm IV có chức năng kiểm soát sự biệt hóa các dạng khác nhau của tế bào trichomes trên lá và thân, và tế bào lông rễ [70]. Nhiều nhân tố phiên mã chỉ hoạt động khi có sự thay đổi của điều kiện sống. Nghiên cứu trên cây Arabidopsis cho thấy nhóm nhân tố phiên mã CBF/DREB1 chỉ hoạt động trong điều kiện lạnh, nhân tố phiên mã

CBF4 hoạt động trong điều kiện hạn và các nhân tố phiên mã này hoạt động để thúc đẩy sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính chống chịu với các stress này [66].

1.2.4.2. Nhân tố phiên mã gen EcHB1

Sonoda và cộng sự khi phân tích biểu hiện của các gen nhân tố phiên mã trong mô gỗ Bạch đàn caman (E. camaldulensis) bằng kỹ thuật microarray và đã phân lập đƣợc 21 gen nhân tố phiên mã liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin và cellulose và các gen này thuộc nhóm HD-Zip phân nhóm II [3].

Gen EcHB1, gen mã hóa nhân tố phiên mã loại II (HD-Zip class II transcription factor), liên quan đến việc hình thành và phát triển sợi gỗ đã đƣợc phân lập từ các nhóm gen nhân tố phiên mã trên bạch đàn caman. Vai trò của gen này đã đƣợc đánh giá thông qua việc phân tích biểu hiện của gen. Bằng phƣơng pháp phân tích RT-PCR cho thấy gen này biểu hiện ở thân thành thục 5 tuổi (mature stem) và mô rễ (1 tuổi) của Bạch đàn caman. Sử dụng kỹ thuật microarray cho thấy ở Bạch đàn caman biến nạp gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1), biểu hiện của các gen chính liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin nhƣ CCoAOMT, CAD, CCR và C4H đều giảm [3]. Điều này cho thấy việc tăng cƣờng hoạt động của gen EcHB1 có ảnh hƣởng đến quá trình hình thành xylem trong cây. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy sau khi biến nạp thành công gen EcHB1 vào cây thuốc lá, sau 6 tuần sinh trƣởng tại nhà kính cho thấy chiều dài sợi gỗ của các dòng thuốc lá đƣợc chuyển gen EcHB1 dài hơn 20% và có sinh trƣởng về chiều cao hơn 50% so với đối chứng [3].

2. CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

2.1.1. Vật liệu thực vật

Vật liệu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là lá non hoặc đoạn thân non không chứa chồi nách (Hình 2.1) của các dòng Bạch đàn lai UP (UP72, UP99) in vitro đƣợc cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.

Hình 2.1. Vật liệu Bạch đàn lai UP sử dụng trong chuyển gen

Chú thích: a. vị trí lá và đoạn thân đƣợc sử dụng làm vật liệu; b. đoạn thân và c.

mảnh lá trên môi trƣờng tạo vật liệu nhận gen

2.1.2. Vật liệu di truyền và chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58 mang vector pGWB2 bao gồm promoter CamV-35S, gen EcHB1 và gen kháng kháng sinh Kanamycin, đƣợc cung cấp bởi Viện nghiên cứu RIKEN (Nhật Bản). Sơ đồ mô phỏng cấu trúc vector pGWB2/35S/EcHB1 chứa gen EcHB1 đƣợc thể hiện ở Hình 2.2.

Hình 2.2. Cấu trúc vector pGWB2/35S/EcHB1

Chú thích: RB: trình tự bờ phải của đoạn T-DNA, LB: trình tự bờ trái của

T-DNA, NPT II: gen mã hóa cho neomycin phosphatransferase kháng kanamycin;

NOSP: promoter của gen nopaline synthase, NOST: trình tự kết thúc phiên mã của

gen nopaline synthase; 35S: promoter của gen CaMV 35S, EcHB1: gen mã hóa tăng

chiều dài sợi gỗ, HPT: gen mã hóa cho hygromycin phosphatransferase kháng

hygromycin

Cấu trúc vector này đã đƣợc sử dụng để chuyển gen vào bạch đàn lai UU thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và tạo đƣợc một số dòng bạch đàn lai UU chuyển gen đƣợc chứng minh sự có mặt của gen bằng phƣơng pháp lai southern blot và phân tích các chỉ tiêu về chất lƣợng gỗ, từ kết quả của đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ (giai đoạn 1: 2011-2014)” đã đƣợc Hội đồng khoa học và công nghệ các cấp đánh giá nghiệm thu vào năm 2015 [70].

Chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang gen EcHB1 đƣợc giữ bằng cách nuôi dịch khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng bổ sung 50 mg/l Kanamycin, 50 mg/l Rifamycin, nuôi ở 28oC trong 24 giờ và cất giữ trong Glycerol ở -80oC.

2.1.3. Trang thiết bị và hóa chất

Thiết bị: nồi hấp, tủ an toàn sinh học cấp 2, giàn đèn nuôi cấy, tủ định ôn, máy đo pH, cân kỹ thuật, cân phân tích, máy PCR, máy ly tâm, máy điện di, máy chụp ảnh gel, máy nuôi cấy khuẩn, máy lắc của các hãng Applied Biosystem, Nuaire, Wealtec, Amerex, AB, Horiba, Hettech, Sartorius, Olympus… Ngoài ra còn có các thiết bị phụ trợ cho nghiên cứu tế bào, sinh học phân tử gồm pipetman, giàn đèn nuôi cây….

Hóa chất:

+ Môi trƣờng sử dụng để nuôi cấy mô, tế bào cây bạch đàn là môi trƣờng MS cơ bản (Murashige và Skoog 1962) và môi trƣờng MS* có thay đổi hàm lƣợng một số chất (Bảng 1 và Bảng 2, Phụ lục 1); các chất điều hòa sinh trƣởng: 6-Benzyl Amino Purine (BAP), Indol-3-Butyric Acid (IBA) và 1-Naphthyl Acetic Acid (NAA); các chất kháng sinh nhƣ: Cefotaxim, Kanamycin... đƣợc cung cấp bởi các hãng Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan), Biobasic (Canada)…

+ Môi trƣờng sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm là môi

trƣờng nuôi cấy LB (Luria and Betani) (Bảng 3, Phụ lục1).

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Nghiên cứu tái sinh in vitro ở các dòng Bạch đàn UP

Trong bài luận văn này chúng tôi kế thừa và sử dụng quy trình tái sinh thông qua phôi soma cho bạch đàn lai UP (Hình 2.3) của nhóm tác giả đã đƣợc công bố trƣớc đó cụ thể nhƣ sau: Chồi bạch đàn in vitro đƣợc cắt thành các mảnh lá/đoạn thân (không chứa mắt ngủ) đặt trên bề mặt đĩa petri chứa môi trƣờng kích thích tạo mô sẹo, cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đạt 88,3% đối với đoạn thân và 81,7% đối với mảnh lá. Các mô sẹo sau khi hình thành đƣợc gắp chuyển sang môi trƣờng nhân sinh khối mô sẹo và kích thích phát triển phôi soma. Cấy chuyển các khối phôi soma này sang môi trƣờng kích thích phát triển chồi cho tỷ lệ cụm phôi soma bật chồi đạt 69,3%, số chồi trung bình đạt 6,1 chồi/cụm phôi. Sau đó tiến hành nhân nhanh, cho ra rễ các chồi tái sinh và chăm sóc huấn huyện cây con ngoài vƣờn ƣơm [71].

Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tái sinh thông qua phôi soma cho Bạch đàn lai UP

(Theo Nguyễn Thị Việt Hà và cộng sự, 2019)

2.2.2. Xác định ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin

Trong quá trình chuyển gen, việc chọn lọc và xác định đƣợc các cá thể mang gen chuyển là một khâu hết sức quan trọng. Để công tác chọn lọc hiệu quả cần thiết lập đƣợc một môi trƣờng chọn lọc với ngƣỡng phù hợp để có thể loại bỏ phần lớn các cá thể không mang gen chuyển đồng thời giữ lại đƣợc toàn bộ các cá thể đã đƣợc chuyển gen. Gen làm tăng chiều dài sợi gỗ EcHB1 nằm trong vector pGWB2, ngoài gen đích vector này còn mang gen nptII kháng Kanamycin (Km), đƣợc biểu hiện cùng với gen đích nên cá thể biểu hiện gen này thƣờng đƣợc đánh giá sơ bộ là mang gen đích. Do đó, gen kháng Km đƣợc coi là yếu tố chọn lọc cá thể mang gen đƣợc chuyển. Tuy nhiên, trong quá trình chọn lọc kháng sinh không nên sử dụng ở nồng thấp, có thể dẫn đến việc chọn lọc không chính xác. Nhƣng nếu chọn lọc ở nồng độ quá cao có thể dẫn tới mất mát các mô thực vật do quá trình oxy hóa hoặc mô bị hoại tử. Hơn nữa, nếu sử dụng nồng độ Km quá cao trong thời gian đầu sẽ dẫn đến mẫu bị chết sớm, do giai đoạn đầu lây nhiễm, tế bào sản xuất đƣợc lƣợng enzyme kanamycin phosphotransferase còn ít.

Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành xác định ngƣỡng nồng độ của Km để chọn lọc hiệu quả cây Bạch đàn lai UP chuyển gen bằng việc thử nghiệm các nồng độ Km từ 0 mg/l đến 150 mg/l tiến hành thu thập số liệu tỷ lệ mẫu sống sau 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần trong giai đoạn tái sinh và biến nạp gen; và ngƣỡng nồng độ Km từ 0 mg/l đến 50 mg/l thu thập số liệu tỷ lệ chồi ra rễ sau 1 tuần, 2 tuần và 3 tuần trong giai đoạn ra rễ trên đối tƣợng các chồi chƣa chuyển gen.

2.2.3. Xác định tuổi vật liệu đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo

Tuổi của vật liệu có ảnh hƣởng đến tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh cây in vitro. Vật liệu ở các giai đoạn tuổi khác nhau sẽ có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây khác nhau.

Trong luận văn này, vật liệu sau 10, 15, 20, 25 ngày nuôi cấy in vitro của các dòng bạch đàn lai UP đƣợc sử dụng để xác định tuổi vật liệu thích hợp biến nạp gen. Sau 3 tuần chuyển gen, mẫu đƣợc đặt trên môi trƣờng tạo

mô sẹo, tiến hành thu thập tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở các tuổi vật liệu khác nhau.

2.2.4. Xác định thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo

Đoạn thân đƣợc cắt thành những đoạn dài 3 - 5 mm. Mảnh lá có giữ lại cuống đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tiền nuôi cấy: MS* + 20 g/l sucrose + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 100 ml/l nƣớc dừa + 2,6 g/l Phytagel + 100 µM AS với các công thức thời gian tiền nuôi cấy là 0, 24, 48, 72 giờ trƣớc khi chuyển gen [71].

Sau đấy thu thập và xử lý số liệu sau 2 tuần chuyển gen để xác định ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy và thời gian phù hợp nhất đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo trƣớc khi biến nạp gen.

Chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector pGWB2/EcHB1 sau khi đƣợc cất giữ trong Glycerol ở -80oC cấy trải trên lên đĩa môi trƣờng LB đặc bổ sung 50 mg/l Kanamycin, 50 mg/l Rifamycin, nuôi ở 28oC trong 2 ngày. Chọn một khuẩn lạc cho vào 2 ml môi trƣờng LB lỏng bổ sung 50 mg/l Kanamycin và 50 mg/l Rifamycin. Nuôi lắc 200 vòng/phút, ở 28oC, trong 14 - 16 giờ. Sau đó hút 1 ml dịch vi khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng bổ sung 50 mg/l Kanamycin và 50 mg/l Rifamycin, nuôi trong 4 - 5 giờ. Dịch vi khuẩn đƣợc ly tâm lạnh ở tốc độ 5.000 vòng/phút, trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn vi khuẩn trong môi trƣờng ½ MS lỏng (Phụ lục 1, Bảng 3).

2.2.5. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens

Pha loãng cho tới khi dịch có OD600 tại các ngƣỡng 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 khi đo bằng máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 600nm để tiến hành nghiên cứu sự ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn và xác định mật độ tế bào vi khuẩn tốt nhất biến nạp gen đến tỷ lệ chồi phát sinh trên môi trƣờng chọn lọc sau 3 tuần tiến hành chuyển gen.

2.2.6. Xác định thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ

mẫu tạo mô sẹo

Mẫu sau xử lý, chuẩn bị cho biến nạp đƣợc ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn với các khoảng thời gian: 0, 5, 10, 15, 20 phút. Sau đó

thấm khô mẫu bằng giấy thấm vô trùng. Chuyển mẫu sang môi trƣờng đồng nuôi cấy. Môi trƣờng đồng nuôi cấy đƣợc bổ sung thêm Acetosyringone (AS) với nồng độ 100 µM. Theo dõi khả năng nhiễm khuẩn và tỷ lệ sống của các mẫu nuôi cấy sau 2 tuần biến nạp gen.

2.2.7. Xác định thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ

mẫu tạo mô sẹo

Mẫu đƣợc biến nạp với A. tumefaciens, sau đó đồng nuôi cấy trong các khoảng thời gian 24, 48, 72, 96, 120 giờ. Tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đƣợc đánh giá sau 2 tuần chuyển gen trên môi trƣờng chọn lọc tạo mô sẹo.

2.2.8. Tái sinh cây từ mẫu đã biến nạp gen, nhân các dòng biến nạp

gen, ra rễ và trồng chăm sóc bên ngoài vƣờn ƣơm

Các khâu tiếp theo của quá trình chuyển gen từ khâu: Tái sinh cây từ mẫu đã biến nạp gen, nhân các dòng biến nạp gen, ra rễ và trồng chăm sóc bên ngoài vƣờn ƣơm đƣợc kế thừa và sử dụng phƣơng pháp tái sinh thông qua mô phân sinh và phôi soma của nhóm tác giả đã đƣợc công bố trƣớc đó [71].

2.2.9. Phƣơng pháp đánh giá hình thái cây chuyển gen

Để đánh giá sự hoạt động ổn định và vai trò của gen EcHB1, cây Bạch đàn lai UP đƣợc chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ EcHB1 đã đƣợc kiểm tra thông qua phƣơng pháp phân tích hình thái giữa hình thái của cây bạch đàn không chuyển gen (đặc điểm thân, chồi, lá) các dòng UP72 và UP99 (gọi là cây đối chứng) với hình thái của các cây chuyển gen từ chính các dòng này (các dòng chuyển gen UP72CG và UP99CG – gọi là cây chuyển gen) ở cả 2 giai đoạn là in vitro và cây con vƣờn ƣơm.

2.2.9.1. Đánh giá các chỉ tiêu hình thái ở điều kiện in vitro

Các dòng Bạch đàn lai UP đã đƣợc chuyển gen và dòng đối chứng sau cấy nhân chồi đƣợc nuôi trong cùng một điều kiện môi trƣờng MS + 0,5 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA + 30 g/l sucrose + 15 mg/l Riboflavin + 6,5 g/l agar, sau 3 tuần nuôi cấy đƣợc sử dụng làm vật liệu so sánh về hình thái.

Các chỉ tiêu đo đếm nhƣ sau: Màu sắc thân, màu sắc lá, số lóng/chồi, chiều dài các lóng (đơn vị đo cm), tổng số mẫu đo đếm số liệu về chồi: 90 mẫu chồi/dòng, số mẫu đo kích thƣớc lá: 2 lá/chồi x 90 chồi = 180 lá/dòng, chiều dài và chiều rộng các lá thứ 3 - 4 tính từ phần đỉnh chồi (Mũi tên - Hình 2.4) (Đơn vị đo - mm).

Hình 2.4. Vị trí các lá đƣợc chọn để đánh giá hình thái

2.2.9.2. So sánh khả năng sinh trưởng và hình thái của cây chuyển gen

giai đoạn vườn ươm

Tiến hành thu thập số liệu và đánh giá sự sai khác giữa cây chuyển gen và cây đối chứng cây thông qua các chỉ tiêu về chiều cao cây và hình thái lá (hình dạng, màu sắc và kích thƣớc lá) ở các thời điểm 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng sau khi cấy vào bầu.

Lá đƣợc chọn để đo kích thƣớc vẫn là các lá ở vị trí thứ 3 - 4 tính từ ngọn của cây ở giai đoạn 3 tháng tuổi. Tổng số lá đo đếm là 180 mẫu lá/ dòng (2 lá/cây), đơn vị đo giai đoạn vƣờn ƣơm là cm.

2.2.10. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số

Các mẫu bạch đàn chuyển gen (mẫu lá đƣợc thu sau khi đƣa ra vƣờn ƣơm từ 1-2 tháng tuổi) đƣợc tách chiết ADN tổng số theo phƣơng pháp CTAB [72] có cải tiến một số bƣớc cụ thể nhƣ sau:

Cân 100 mg mẫu lá sau khi nghiền mịn bằng nitơ lỏng đƣợc đựng trong ống eppendorf 2 ml, bổ sung 700µl đệm chiết (EDTA 0,5M pH8, 100mM Tris HCl pH8, 500mM NaCl, 2% CTAB, 1% PVP và 0,1% β- mecaptoethanol). Ủ hỗn hợp dịch chiết và mẫu ở 55oC trong vòng 60 phút. Ly tâm 20.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, dùng pipet hút phần dịch sang ống eppendorf 2ml mới và bổ sung 30µl Rnase rồi ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 37oC. Tiếp tục bổ sung 700µl Chlorofom: Isoamyalcohol (tỷ lệ thể tích 24:1), lắc đều và ly tâm 20.000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng pipet hút phần dịch nổi phía trên chuyển sang ống eppendorf 1.5 ml rồi bổ sung thêm Isopropanol (tỷ lệ 1:1,5) và ủ ở -20oC trong 30 phút. Sau đó đem ly tâm 20.000 vòng/phút trong 10 phút rồi thu tủa ADN. Rửa tủa bằng Ethanol 70o lạnh kết hợp với ly tâm. Để ADN ở nhiệt độ phòng trong 5 phút rồi hòa tan bằng 100µl đệm 1x TE và bảo quản trong tủ lạnh -20oC.

Kiểm tra độ sạch trên gel Agarose 0,8% bổ sung 5µl/100ml RedsafeTM của iNtRON (ww.intronbio.com) và đo nồng độ, độ tinh sạch ADN tổng số trên máy quang phổ hấp phụ nanodrop.

2.2.11. Xác định sự có có mặt của gen trong cây chuyển gen bằng

PCR

Để xác định sự có mặt của gen EcHB1 trong các dòng cây bạch đàn chuyển gen mục tiêu EcHB1, kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để nhân gen mục tiêu từ genome của cây chuyển gen bằng cặp mồi đặc hiệu CaMV 35S-F và EcHB1-R theo phƣơng pháp của Trần Hồ Quang và cộng sự (2015) [70]. Trình tự mồi, thành phần phản ứng PCR và chu trình thực hiện đƣợc trình bày ở Bảng 2.1, Bảng 2.2 và Bảng 2.3.

Các cặp mồi phân lập đƣợc thiết kế dựa trên tham khảo các trình tự trên GenBank. Các cặp mồi phục vụ cho thí nghiệm tạo vector biểu hiện đƣợc thiết kế có thêm các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn thích hợp (Bảng 2.1)

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Tên Trình tự Nhiệt độ gắn mồi (Tm)

CaMV 35S-F 5’ CTTCGCAAGACCCTTCCTC 3’ 55,5 oC

EcHB1_R 5’ TTAACAAGCGGCTGATGGATGAGC 3’ 54,6 oC

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR

Thành phần phản ứng Nồng độ sử dụng Thể tích phản ứng

(µl)

12,5 PCR master mix 2X

1,0 CaMV 35S - F 10 µM

1,0 EcHB1-R 10 µM

7,2 dH2O

3,2 ADN 25 ng

25 Tổng thể tích

Bảng 2.3. Chu trình phản ứng PCR

Bƣớc Phản ứng Thời gian Chu kỳ

Nhiệt độ (oC)

1 Biến tính 4 phút 1 94

2 Biến tính 40 giây 94

3 Gắn mồi 30 giây 35 52

4 Kéo dài chuỗi 45 giây 72

5 Hoàn tất kéo dài 7 phút 1 72

6 Kết thúc phản ứng ∞ 12

Sản phẩm PCR sau đó đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose

0,8% bổ sung 5 µl/100ml RedsafeTM của iNtRON (ww.intronbio.com).

2.2.12. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu

Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 - 5 lần lặp. Quá trình tiến hành thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Bộ môn Sinh học phân tử - Viện NC Giống và CNSH Lâm nghiệp.

Số liệu thu đƣợc từ các thí nghiệm trên phƣơng pháp phân tích thống kê

toán học đƣợc xử lý bằng ứng dụng Data Analysis trên Excel.

- Trung bình mẫu:

- Phƣơng sai: S2= )2

Dùng hàm thống kê ANOVA để phân tích phƣơng sai một nhân tố với các lần lặp, trong đó giá trị P-value đƣợc sử dụng để kiểm định giả thuyết H0 (giữa các dòng bạch đàn chuyển gen và đối chứng là không có sự sai khác ở giá trị trung bình của các chỉ tiêu theo dõi). Nếu P-value < 0,001 thì giả thuyết H0 bị bác bỏ (với mức độ sai khác 99,9%), ngƣợc lại giả thuyết đƣợc chấp nhận nếu P-value > 0,001.

Các công thức tính toán:

- Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo =

- Tỷ lệ chồi phát sinh trên môi trƣờng chọn lọc =

- Tỷ lệ mẫu sống trên môi trƣờng chọn lọc =

- Chỉ số kích thƣớc lá (I) đƣợc xác định theo công thức:

3. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. QUY TRÌNH CHUYỀN GEN VÀO CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP THÔNG QUA A. TUMEFACIENS

3.1.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin

Thí nghiệm xác định ngƣỡng nồng độ của Km để chọn lọc hiệu quả cây bạch đàn lai UP chuyển gen đƣợc tiến hành bằng việc thử nghiệm các nồng độ Kanamycin từ 0 mg/l đến 150 mg/l cho các đoạn thân đƣợc cắt từ Bạch đàn lai UP chƣa chuyển gen. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 3.1 và Hình 3.1 sau đây.

Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin

Tỷ lệ mẫu sống Km (mg/l) Tỷ lệ mẫu sống sau 3 tuần (%) Tỷ lệ mẫu sống sau 4 tuần (%) Công thức sau 2 tuần (%)

100,0 100,0 100,0 ĐC 0

1 10 97,8 86,7 75,6

2 50 86,7 64,4 44,4

3 75 72,2 27,8 13,3

4 100 53,3 16,7 8,9

5 150 18,3 0 0

P-value < 0,001 < 0,001 < 0,001

Kết quả thí nghiệm cho thấy sau 4 tuần nuôi cấy Km có ảnh hƣởng trực tiếp tới tỷ lệ sống của đoạn thân. Ở công thức đối chứng các mẫu trên môi trƣờng không bổ sung Km nên mô thực vật vẫn phát triển tốt, sau 4 tuần nuôi cấy các mẫu có tỷ lệ sống đạt 100%. Còn trên môi trƣờng có bổ sung Km các mô, tế bào bị hoá nâu hoặc bạch tạng, không phát triển rồi chết do các mô tế bào bình thƣờng bị kháng sinh này ức chế làm mất sức sống và khả năng phát

triển. Tỷ lệ sống sót của đoạn thân giảm mạnh từ 75,6% (10 mg/l Km) xuống còn 8,9% (100 mg/l Km). Khi tiếp tục tăng nồng độ Km lên 150 mg/l, không còn mẫu nào sống đƣợc trên môi trƣờng này (tất cả các mẫu đều chết từ tuần thứ 3 theo dõi). Căn cứ vào các kết quả trên nồng độ Km là 150 mg/l đƣợc lựa chọn làm cơ sở để chọn lọc các mẫu bạch đàn lai chuyển gen ở các thí nghiệm tiếp theo (Hình 3.1).

Hình 3.1. Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Km đến chồi chƣa chuyển gen

Chú thích: a,c. Chồi chƣa chuyển gen trên môi trƣờng không bổ sung Km;

b,d. Chồi chƣa chuyển gen trên môi trƣờng bổ sung Km

Ngoài ra việc thử nghiệm đánh giá khả năng ra rễ của chồi bạch đàn lai UP không chuyển gen ở những mức nồng độ Km khác nhau cũng đƣợc tiến hành nhằm tìm đƣợc nồng độ chọn lọc Km thích hợp cho chọn lọc cây chuyển gen ở giai đoạn ra rễ. Đối với các dòng bạch đàn lai UP trong giai đoạn tái sinh mô sẹo và phôi soma cũng nhƣ giai đoạn nhân nhanh, chọn lọc chồi thƣờng đƣợc tiến hành ở nồng độ chất chọn lọc Km cao còn giai đoạn ra rễ lại thƣờng ở ngƣỡng nồng độ thấp. Các nồng độ Km khác nhau từ 0 mg/l đến 50 mg/l đƣợc bổ sung vào môi trƣờng ra rễ Bạch đàn lai UP (½ MS + 15 g/l Sucrose + 2 mg/l IBA + 1 mg/l NAA + 7 g/l Agar), thông qua tỷ lệ chồi ra rễ sau 1 tuần, 2 tuần và 3 tuần từ đó tìm ra đƣợc ngƣỡng nồng độ Kanamycin thích hợp dùng trong giai đoạn chọn lọc ra rễ. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 3.2 sau đây.

Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ Kanamycin đến khả năng ra rễ

Công thức Tỷ lệ ra rễ sau 1 tuần (%) Tỷ lệ ra rễ sau 2 tuần (%) Tỷ lệ ra rễ sau 3 tuần (%) (mg/l)

ĐC 11,3 70,0 0 95,3

10 1 0 18,7 0

25 2 0 4,7 0

50 3 0 0 0

P-value < 0,001 < 0,001 < 0,001

Kết quả cho thấy, việc bổ sung Km vào môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng ra rễ của các chồi bạch đàn không chuyển gen (Pvalue <0,001). Khi nồng độ Kanamycin bổ sung vào môi trƣờng lên đến 50 mg/l thì chồi in vitro không chuyển gen bị ức chế hoàn toàn khả năng ra rễ, trong khi ở công thức ĐC (không bổ sung Km) thì tỷ lệ ra rễ đạt 95,3%. Ở khoảng nồng độ 10 - 25 mg/l Km bổ sung vào môi trƣờng, khả năng ra rễ của Bạch đàn lai UP bị ức chế rõ rệt, tuy nhiên mức độ ức chế ra rễ ở mỗi nồng độ là khác nhau. Điều dễ nhận thấy đó là sự sụt giảm đáng kể tỷ lệ mẫu cấy ra rễ: ở công thức bổ sung 10 mg/l Km thì tỷ lệ ra rễ sau 3 tuần chỉ đạt 18,7%. Trên môi trƣờng bổ sung 25 mg/l Km thì tỷ lệ ra rễ sụt giảm chỉ còn 4,7% sau 3 tuần. Ở môi trƣờng bổ sung 50 mg/l Km thì hầu nhƣ các chồi đều bị ức chế ra rễ, sau 3 tuần không có chồi nào có thể ra rễ, mẫu chồi nuôi cấy bị thâm đen và chết. Kết quả này cũng tƣơng tự với các nghiên cứu của Cheng và cộng sự; Tounier và cộng sự [43]. Do vậy, việc sử dụng Kanamycin với nồng độ 50 mg/l để chọn lọc chồi cây Bạch đàn lai UP chuyển gen ở giai đoạn ra rễ là thích hợp.

3.1.2. Ảnh hƣởng của tuổi vật liệu đến tỷ lệ tạo mô sẹo

Nghiên cứu xác định tuổi vật liệu thích hợp làm thể nhận gen đƣợc tiến hành với 2 loại vật liệu là đoạn thân và mảnh lá của chồi in vitro ở các độ tuổi

khác nhau tính sau mỗi lần cấy chuyển: 10, 15, 20, 25 ngày tuổi. Các thông số khác đƣợc cố định bởi mật độ vi khuẩn là OD600 = 0,5 với thời gian nhiễm khuẩn là 10 phút và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ. Sau 3 tuần chuyển gen, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc ở mỗi tuổi chồi khác nhau đƣợc thể hiện trong Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tuổi vật liệu đến mẫu tạo mô sẹo

Tuổi chồi Số lƣợng mẫu Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở đoạn thân Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở mảnh lá in vitro (mẫu) (%) (%) (ngày)

46,4 41,2 10 250

67,2 62,4 15 250

57,2 52,0 20 250

40,4 37,6 25 250

P-value < 0,001 < 0,001

Hình 3.2. Bạch đàn lai UP 15 ngày tuổi tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc

Kết quả thu đƣợc cho thấy, đoạn thân của chồi in vitro có tuổi khác nhau đều cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cao hơn so với mảnh lá, tƣơng ứng với mỗi độ tuổi khác nhau thì cho tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc sau chuyển gen là khác nhau. Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở đoạn thân và mảnh lá đều tăng dần từ chồi in vitro 10 ngày tuổi lên 15 ngày tuổi rồi lại giảm dần xuống.

Kết quả phân tích cho thấy tuổi vật liệu có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng tạo mô sẹo (Pvalue<0,001). Đối với vật liệu là mảnh lá tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc dao động trong khoảng 40,4% - 67,2% đối với đoạn thân, từ 37,6% đến 62,4% đối với mảnh lá và đạt giá trị cao nhất với vật liệu ở 15 ngày tuổi (67,2% và 62,4% tƣơng ứng cho đoạn thân và mảnh lá) (Bảng 3.3, Hình 3.2). Sau 20 ngày tuổi, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo giảm chỉ còn 40,4% cho đoạn thân và 37,6% cho mảnh lá (Bảng 3.3). Nhƣ vậy vật liệu nuôi cấu mô ở 15 ngày tuổi là tốt nhất để làm vật liệu nhận gen.

Kết quả sử dụng trụ dƣới lá mầm với các ngày tuổi khác nhau để tạo phôi soma ở Bạch đàn caman cho thấy tuổi vật liệu càng cao thì tỷ lệ tạo mô sẹo càng thấp. Cụ thể, trụ dƣới lá mầm 10 ngày tuổi cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất 66,33%, sau đó tỷ lệ này giảm dần xuống còn 44,36%, 27,67% và 11,67% cho mẫu có độ tuổi là 15, 25 và 30 ngày (theo thứ tự tƣơng ứng) [40].

3.1.3. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và

tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo

Thời gian tiền nuôi cấy là khoảng thời gian mà mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng tái sinh trƣớc khi tiến hành quá trình lây nhiễm vi khuẩn. Trong thời gian này, nhờ vết cắt ở mẫu mà các tế bào và mô của chúng tiến hành quá trình phân chia mạnh mẽ. Sau thời gian tiền nuôi cấy thực hiện chuyển gen sẽ giúp vi khuẩn A. tumefaciens dễ dàng xâm nhập thông qua các tế bào, mô đang phân chia.

Đoạn thân và mảnh lá đƣợc cắt từ chồi in vitro từ 3-5 mm đƣợc đặt trên đĩa petri chứa môi trƣờng tiền nuôi cấy [71]. Chúng đƣợc nuôi cấy cảm ứng trong các thời gian: 0, 24, 48, 72 giờ trƣớc khi thực hiện biến nạp gen. Kết

quả ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng tiếp nhận gen đƣợc thống kê sau 3 tuần chuyển gen thông qua tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo trình bày trong Bảng 3.4.

Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo

Đoạn thân Mảnh lá

Số lƣợng mẫu Thời gian tiền nuôi cấy Công thức Tỷ lệ mẫu sống (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống (giờ) (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) (%)

47,3 ĐC 0 150 41,3 46,0 36,7

57,3 1 24 150 52,7 52,7 40,0

68,7 2 48 150 64,7 64,7 43,3

50,0 3 72 150 44,7 47,3 33,3

P-value < 0,001 < 0,001

Thời gian tiền nuôi cấy có ảnh hƣởng trực tiếp tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn thông qua tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (Pvalue<0,001) (Bảng 3.3). Ở công thức đối chứng (ĐC - không thông qua tiền nuôi cấy) cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo thấp nhất trong các công thức thí nghiệm, chỉ đạt 41,5 % với đoạn thân và 36,7% đối với mảnh lá. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo tăng dần khi tăng thời gian tiền nuôi cấy từ 24 lên đến 48 giờ, cụ thể tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở đoạn thân dao động từ 41,5% - 64,7% và 36,7% - 43,3% ở mảnh lá. Khi thời gian tiền nuôi cấy đạt 48 giờ rồi cho tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất (64,7% ở đoạn thân và 43,3% ở mảnh lá). Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian tiền nuôi cấy lên 72 giờ thì tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ở cả 2 nguồn vật liệu đều giảm xuống (chỉ còn 44,7% ở thân và 33,3% ở lá). Bởi lẽ, khi tăng thời gian tiền nuôi cấy lên qua cao khiến mẫu

biến nạp sẽ có xu hƣớng phát sinh mô sẹo tại vị trí có vết cắt dẫn đến giảm hiệu quả chuyển gen do vi khuẩn A. tumefaciens khó xâm nhập qua vết thƣơng của mẫu.

Vì vậy, qua Bảng 3.4 ta có thể thấy rằng thời gian tiền nuôi cấy có ảnh hƣởng đến khả năng tiếp nhận gen, thời gian tiền nuôi cấy tốt nhất là 48 giờ trƣớc khi mẫu đƣợc đem biến nạp gen EcHB1. Kết quả này cũng tƣơng tự đối với loài bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla [73], và bạch đàn E. urophylla với tỷ lệ mẫu thân mầm biểu hiện tạm thời gen gus là 41,6%, tỷ lệ mẫu lá mầm biểu hiện tạm thời gen gus là 47,4% [74].

Hình 3.3. Mẫu bật chồi sau chuyển gen khi tiền nuôi cấy 48 giờ

3.1.4. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens

Mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc xác định bởi giá trị quang phổ OD ở bƣớc sóng 600nm của dịch lỏng vi khuẩn, có liên quan tới sinh khối tế bào của chúng hay số lƣợng tế bào trong một thể tích nhất định. Giai đoạn vi khuẩn sinh trƣởng tốt, phát triển mạnh có ý nghĩa quan trọng để hiệu quả chuyển gen đƣợc cao nhất. Thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen đƣợc thử nghiệm ở các mức đo mật độ vi khuẩn OD600 ngƣỡng 0,1; 0,3; 0,5 và 0,7. Các thông số khác vẫn đƣợc giữ nguyên (thời gian nhiễm khuẩn là 10 phút và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ).

Bảng 3.5. Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn đến tỷ lệ chồi tái sinh

Số chồi tái

Số mẫu biến nạp Mật độ khuẩn (OD600) Tỷ lệ chồi tái sinh trên MT chọn lọc (%) sinh trên MT chọn lọc

6 0,1 150 4,0

8 0,3 150 5,3

10 0,5 150 6,7

7 0,7 150 4,7

P-value < 0,001 < 0,001

Kết quả thu đƣợc cho thấy ở công thức thí nghiệm với nồng độ vi khuẩn khác nhau cho tỷ lệ chồi tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc là khác nhau (Pvalue<0,001), chứng tỏ mật độ vi khuẩn có ảnh hƣởng đến tỷ lệ tái sinh chồi Bạch đàn lai UP. Cụ thể, khi thay đổi nồng độ khuẩn từ 0,1 đến 0,5 cho tỷ lệ chồi tái sinh tăng dần, mật độ vi khuẩn ở giai đoạn OD600 = 0,5 cho tỷ lệ chồi tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc cao nhất 6,7% (Bảng 3.5). Khi tăng nồng độ OD600 = 0,7 tỷ lệ chồi tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc giảm xuống còn 4,7% (Bảng 3.5). Kết quả này có sự tƣơng đồng với kết quả chuyển gen GA20 vào Bạch đàn uro (E. urophylla) với vật liệu là thân mầm và mảnh lá mầm cho tỷ lệ tái sinh chồi là cao nhất [75]. Từ kết quả trên chúng tôi lựa chọn OD600 = 0,5 cho quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UP.

3.1.5. Ảnh hƣởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và

tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo

Thời gian nhiễm khuẩn không chỉ quyết định tới khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào mẫu biến nạp mà còn ảnh hƣởng trực tiếp tới khả năng sống sót của mẫu trên môi trƣờng chọn lọc. Thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của thời gian nhiễm khuẩn tới khả năng tiếp nhận gen đƣợc bố trí với 5 công thức ở các khoảng thời gian lây nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens trong thời gian

0 (không nhiễm khuẩn), 5, 10, 15 và 20 phút. Các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo sau chuyển gen đƣợc đánh giá sau 2 tuần trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung 150 mg/l Km, kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hƣởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ tạo mô sẹo

Đoạn thân Mảnh lá

Thời gian nhiễm khuẩn Công thức (phút) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)

ĐC 0,0 0,0 0,0 0,0 không nhiễm khuẩn

1 5 43,3 33,3 41,1 23,3

2 10 61,1 44,4 60,0 42,2

3 15 52,2 38,9 44,4 32,2

4 20 35,6 27,8 34,4 26,7

P-value < 0,001 < 0,001

Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với công thức không nhiễm khuẩn cho tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là 0,0%. Các mẫu này không đƣợc chuyển gen mà trực tiếp đặt lên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung 150 mg/l Kanamycin, nên chúng không có khả năng mang gen nptII mã hóa cho kanamycin phosphotransferase khiến mẫu bị thâm đen và chết. Khi nhiễm khuẩn trong 5 phút, do chƣa đủ thời gian để vi khuẩn xâm nhiễm vào vật liệu nên tỷ lệ mẫu đạt mô sẹo thấp đạt 33,3% và 23,3% (tƣơng ứng với đoạn thân và mảnh lá). Ở thời gian nhiễm khuẩn 10 phút cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo sau 2 tuần chuyển gen cao nhất đạt 44,4% đối với đoạn thân và 42,2% đối với mảnh lá. Thời gian nhiễm khuẩn càng lâu thì tỷ lệ sống của mẫu càng giảm do mẫu bị ngâm lâu trong dung dịch khuẩn dễ bị úng và nhiễm lại dẫn đến tỷ lệ mẫu

tạo mô sẹo cũng giảm dần. Đối với đoạn thân, tỷ lệ tạo mô sẹo của mẫu giảm còn 27,8% sau 20 phút biến nạp. Đối với mẫu lá, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo giảm còn 26,7% sau 20 phút biến nạp. Do vậy thời gian nhiễm khuẩn phải đảm bảo làm sao đủ thời gian cho vi khuẩn xâm nhiễm hiệu quả mà mẫu cấy vẫn có sức sống tốt để thuận lợi cho việc tái sinh ở giai đoạn sau và thời gian thích hợp để nhiễm khuẩn là 10 phút.

Hình 3.4. Mẫu nhiễm khuẩn với thời gian lần lƣợt sau 10 phút, 15 phút,

20 phút

3.1.6. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và

tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo

Thời gian đồng nuôi cấy mẫu là khoảng thời gian mà mẫu cấy sau khi đã lây nhiễm với A. tumefaciens đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đồng nuôi cấy, môi trƣờng này vừa chứa các chất cần thiết cho mô, tế bào thực vật sinh trƣởng và phát triển, lại vừa chứa các yếu tố hoạt hóa quá trình chuyển gen của vi khuẩn vào tế bào thực vật. Do vậy, thời gian đồng nuôi cấy thích hợp sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhiễm và tiến hành quá trình chuyển gen vào mô thực vật, đồng thời sẽ giúp cho bƣớc diệt khuẩn, phục hồi cũng nhƣ chọn lọc về sau đƣợc dễ dàng.

Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đƣợc tiến hành nhằm tìm ra thời gian đồng nuôi cấy phù hợp đảm bảo cho hiệu quả chuyển gen tốt nhất và không ảnh hƣởng đến sức sống và khả năng tái sinh của mẫu cấy sau này. Mẫu qua tiền nuôi cấy trong 48 giờ và đƣợc biến nạp với A. tumefaciens trong 10 phút, sau đó đặt trên môi trƣờng đồng nuôi cấy

(MS* + 3 mg/l BAP+ 0,5 mg/l NAA + 100 µM AS) trong các khoảng thời gian 24, 48, 72, 96, 120 giờ. Tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đƣợc đánh giá sau 2 tuần tiến hành lây nhiễm với A. tumefaciens trên môi trƣờng chọn lọc tạo mô sẹo. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo

Đoạn thân Mảnh lá

Thời gian đồng nuôi cấy Công thức Tỷ lệ mẫu sống (giờ) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) (%)

1 24 58,9 25,6 51,1 23,3

2 48 77,8 47,8 67,8 45,5

3 72 87,8 51,1 85,5 48,9

4 96 74,4 36,7 62,2 35,6

5 120 61,1 33,3 60,0 33,3

P-value < 0,001 < 0,001

Kết quả thí nghiệm cho thấy: thời gian đồng nuôi cấy từ 24 - 72 giờ cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo sau diệt khuẩn tăng dần, đạt kết quả cao nhất khi đồng nuôi cấy 72 giờ; nhƣng khi kéo dài thời gian đồng nuôi cấy lên 120 giờ thì kết quả mẫu tạo mô sẹo sau diệt khuẩn giảm xuống còn 33,3% ở cả 2 vật liệu chuyển gen này. Kết quả này có thể lý giải là do thời gian đồng nuôi cấy dài đã tạo điều kiện thuận lợi cho A. tumefaciens phát triển nhanh và bao trùm kín toàn bộ mẫu cấy, khiến mẫu cấy bị nhiễm khuẩn nặng, thâm dần và chết. Nhƣ vậy, có thể nhận định rằng, thời gian đồng nuôi cấy thích hợp nhất cho việc chuyển gen vào Bạch đàn lai UP là 72 giờ, với tỷ lệ mẫu sống sau đồng nuôi cấy là 87,8% ở đoạn thân và 87,5% ở lá, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo sau 2 tuần

chuyển gen là 48,5% và 49,6% tƣơng ứng ở đoạn thân và mảnh lá. Kết quả này phù hợp với nhận định của Cheng và cộng sự (2006) khi tiến hành chuyển gen trên đối tƣợng bạch đàn E. grandis x E. urophylla cũng nhƣ E. camaldulensis [43].

3.1.7. Hoàn thiện quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai

Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã hoàn thiện quy trình

chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UP với các thông số sau:

- Từ vật liệu ban đầu là đoạn thân và mảnh lá sau 15 ngày nuôi cấy in vitro đƣợc tiền nuôi cấy 48 giờ. Mẫu sau nuôi cấy 48 giờ ở môi trƣờng tiền nuôi cấy đƣợc lắc trong dung dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 = 0,5 khi pha loãng bằng ½ MS bổ sung 100µM AS với thời gian 10 phút. Sau đó thấm khô mẫu bằng giấy thấm vô trùng đƣợc chuyển sang môi trƣờng đồng nuôi cấy ở 28oC, trong buồng tối với thời gian là 72 giờ.

- Các mẫu sau khi đồng nuôi cấy, đƣợc rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3-4 lần có bổ sung 500 mg/l Cefotaxim trong 10 phút. Thấm khô mẫu rồi đặt lên môi trƣờng diệt khuẩn và tái sinh chồi có bổ sung 400 mg/l Cefotaxim. Nuôi trong 5 ngày.

- Mẫu sau 5 ngày trên môi trƣờng diệt khuẩn đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng tái sinh có bổ sung kháng sinh chọn lọc 400 mg/l Cefotaxim và 150 mg/l Kanamycin. Sau 2-3 tuần, các khối mô sẹo đƣợc hình thành. Sau khoảng 8 tuần, các khối mô sẹo cảm ứng tạo chồi trên môi trƣờng chọn lọc. Chu kỳ cấy chuyển khối mô sẹo/các chồi đã phát sinh sang môi trƣờng tƣơng tự là 3 tuần/lần.

- Các chồi phát sinh trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc tách thành từng chồi đơn lẻ, nhân nhanh trên môi trƣờng nhân nhanh bạch đàn bổ sung 150mg/l Km.

Dựa vào quy trình chuyển gen, các thí nghiệm đƣợc tiến hành thực hiện với số lƣợng mẫu lớn nhằm thu đƣợc các chồi sau chuyển gen. Các chồi này

sau đấy đƣợc sàng lọc trên môi trƣờng chọn lọc và đƣợc đánh thành từng dòng riêng rẽ.

Hình 3.5. Sơ đồ quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UP

Hình 3.6. Mẫu chuyển gen tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc

Chú thích: a, b. Mẫu tạo callus; c, d. Mẫu phát sinh phôi soma;

e, f. Phôi soma bật chồi trên môi trƣờng chọn lọc

Hình 3.7. Bình nhân chồi dòng Bạch đàn lai UP chuyển gen EcHB1

3.1.8. Đánh giá khả năng sống sót của chồi chuyển gen

Các chồi phát sinh trên môi trƣờng chọn lọc sau chuyển gen tiếp tục đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng có bổ sung 150mg/l Km. Các chồi này đƣợc chọn lọc 3 lần, mỗi lần chọn lọc cách nhau 3 tuần. Kết quả chồi sống sót và tỷ lệ chồi sống sau mỗi lần chọn lọc so với tổng số chồi ban đầu đƣợc thể hiện trong Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Khả năng sống sót của chồi chuyển gen sau các lần chọn lọc

Vật liệu Số mẫu

Số lần chọn lọc Số chồi sống (chồi) (chồi)

Tỷ lệ chồi sống sau mỗi lần chọn lọc (%)

Chọn lọc ĐC 200 65 32,5 lần 1

Chọn lọc 65 0 0 lần 2

Chọn lọc 0 0 0 lần 3

Chọn lọc 275 202 73,5 Đoạn thân lần 1

Chọn lọc 202 110 40,0 lần 2

Chọn lọc 110 66 24,0 lần 3

Mảnh lá Chọn lọc 244 167 68,4 lần 1

Chọn lọc 167 98 40,2 lần 2

Chọn lọc 98 60 24,5 lần 3

Trên môi trƣờng tái sinh có chứa Km 150 mg/l, đoạn thân cho tỷ lệ chồi sống sau lần chọn lọc đầu tiên đạt 73,5%, sau lần chọn lọc thứ hai tỷ lệ chồi sống còn 40,0%, sau lần chọn lọc thứ ba chỉ còn 66 chồi sống sót, đạt tỷ lệ 24,0% trên tổng số mẫu thí nghiệm. Với vật liệu là mảnh lá, tổng số mẫu ban đầu đem chọn lọc là 244 chồi, sau lần chọn lọc thứ nhất có 167 chồi sống (tƣơng ứng với 68,4%), sau lần chọn lọc thứ hai, số chồi giảm xuống còn 98 chồi (tƣơng ứng 40,2%), 98 chồi này đƣợc chọn lọc tiếp 3 lần và kết quả thu đƣợc là 60 chồi chiếm tỷ lệ 24,5% trên tổng số mẫu. Trong khi ở công thức đối chứng (công thức sử dụng vật liệu chƣa đƣợc chuyển gen) sau lần chọn lọc đầu tiên có 85 chồi còn sống sót, sau lần chọn lọc thứ 2 không có mẫu chồi nào trên môi trƣờng có kháng sinh Km 150 mg/l.

Nhƣ vậy, hiệu quả chọn lọc của kháng sinh Km 150 mg/l đối với bạch đàn lai UP là thích hợp cho việc sàng lọc mẫu giai đoạn đầu. Với tổng số mẫu ban đầu là 719 chồi (200 chồi đối chứng, 275 chồi tái sinh từ đoạn thân, 244 chồi từ mảnh lá) số chồi sống sót tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung 150 mg/l Km ở 3 lần chọn lọc thu đƣợc tổng cộng 126 chồi (66 chồi tái sinh từ đoạn thân và 60 chồi tái sinh từ mảnh lá). Các chồi này là những chồi sống sót, hình thái bình thƣờng (sau 3 lần đƣợc cấy chuyển trên môi trƣờng chọn lọc). Những chồi này tiếp tục đƣợc đánh giá khả năng ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc.

Hình 3.8. Chồi chuyển gen EcHB1 trên môi trƣờng chọn lọc

Chú thích: A. Mẫu thân trên môi trƣờng chọn lọc lần 1; B. Mẫu thân trên môi

trƣờng chọn lọc lần 2; C. Mẫu lá trên môi trƣờng chọn lọc; D. Chồi chuyển gen trên

môi trƣờng nhân nhanh chọn lọc

3.1.9. Đánh giá khả năng ra rễ và kiểm tra chồi chuyển gen

Các chồi sau biến nạp gen, phát triển đƣợc trên môi trƣờng tái sinh chồi có chứa chất chọn lọc Kanamycin 150 mg/l và có chiều cao chồi thu đƣợc đạt từ 2 - 2,5 cm đƣợc tách thành từng chồi đơn lẻ và cấy chuyển sang môi trƣờng ra rễ (½ MS + 2 mg/l IBA + 1 mg/l NAA + 15 g/l Sucrose + 7 g/l Agar) có bổ sung 50 mg/l Km. Với mẫu đối chứng (ĐC) là những chồi chƣa đƣợc chuyển gen), sau 2 lần cấy chuyển trên môi trƣờng ra rễ (mỗi lần chọn lọc cách nhau 3 tuần), các chồi ra rễ và sinh trƣởng tốt sẽ đƣợc nhân lên, quả thí nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 3.9 sau đây.

Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra khả năng ra rễ của chồi chuyển gen sau các lần chọn lọc

Vật liệu Số lƣợng Số chồi ra rễ

Tỷ lệ chồi ra rễ sau mỗi lần chọn lọc Số lần chọn lọc (chồi) (chồi)

(%)

0 60 0 ĐC

Chọn lọc lần 1

0 0 0

Chọn lọc lần 2

39 66 59,1 Đoạn thân Chọn lọc

lần 1

23 39 34,8

Chọn lọc lần 2

35 60 58,3 Mảnh lá Chọn lọc

lần 1

17 35 28,3

Chọn lọc lần 2

Số chồi tái sinh thành cây hoàn chỉnh và sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng ra rễ chọn lọc lần 1 chứa Km 50 mg/l thu đƣợc 74 chồi ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc trên tổng số 186 chồi (60 chồi đối chứng, 66 chồi tái sinh từ đoạn thân và 60 chồi tái sinh từ mảnh lá), tƣơng ứng với 59,1% ở đoạn thân 58,3% từ mảnh lá. Trên môi trƣờng ra rễ chọn lọc lần 2 (Km 50 mg/l) thu đƣợc 39 chồi ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc, tỷ lệ chồi ra rễ của đoạn thân là 34,8% và 17 chồi (chiếm 28,3%) ở vật liệu mảnh lá. Phần còn lại không ra rễ, sinh trƣởng chậm hoặc ngừng sinh trƣởng, trong khi đối chứng (chồi không chuyển gen) 100% chồi không ra rễ, héo dần và chết.

3.2. PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÌNH THÁI CỦA CÁC DÒNG BẠCH ĐÀN LAI CHUYỂN GEN

3.2.1. So sánh hình thái cây Bạch đàn lai UP chuyển gen và cây đối

chứng giai đoạn in vitro

Trong giai đoạn nuôi cấy in vitro, quá trình đánh giá các chỉ tiêu màu sắc thân, lá giữa cây chuyển gen và cây đối chứng là không có sự khác biệt. Nhƣng các chỉ tiêu về hình thái và chất lƣợng chồi (số lóng trung bình, chiều dài lóng và chiều cao chồi) ở cây chuyển gen có sự khác biệt rõ rệt so với cây đối chứng ở cả 2 dòng nghiên cứu (Bảng 3.10, Hình 3.9). Tuy nhiên, giữa các dòng chuyển gen lại không có sự sai khác về các chỉ số đánh giá này (P - value > 0,001).

Do sự khác biệt về cả chỉ tiêu số lóng trung bình và chiều dài lóng trung bình nên có thể dễ dàng thấy rằng chiều cao chồi của cây chuyển gen và cây đối chứng có sự khác biệt rõ rệt. Chiều cao chồi trung bình ở cây chuyển gen đạt từ 31,2 đến 31,8 cm cao hơn so với cây đối chứng (chỉ đạt từ 28,4 đến 29,2 cm). Kết quả này cũng tƣơng tự với cây Dƣơng P. nigra khi các chồi ở cây chuyển gen PnEXPA3 có chiều dài hơn so với cây đối chứng [76].

Bảng 3.10. So sánh hình thái thân giữa cây chuyển gen với cây đối chứng

Các chỉ tiêu hình thái thân

Dòng Tổng số mẫu Số lóng trung bình Chiều cao chồi (mm) Chiều dài lóng trung bình (mm) (số lóng/thân)

90 3,4 ± 0,1 9 ± 0,1 28 ± 0,1 UP72

90 3,7 ± 0,1 11 ± 0,1 32 ± 0,1 UP72CG

90 3,2 ± 0,1 8,5 ± 0,1 29,2 ± 0,1 UP99

90 3,65 ± 0,1 10,3 ± 0,1 31,2 ± 0,1 UP99CG

< 0,001 < 0,001 < 0,001 P-value

Tuy nhiên, ở một nghiên cứu khác, gen PtrEXPA3 và PnEXPA3 lại không làm thay đổi về chiều cao chồi ở cây Dƣơng P. tremular chuyển gen khi đƣợc nuôi cấy ở một điều kiện lạnh (100C) [77]. Nhƣ vây, hình thái và chiều dài chồi trong nuôi cấy in vitro không những phụ thuộc vào bản chất di truyền mà còn phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng nuôi cấy.

Không những khác biệt rõ rệt về các chỉ tiêu hình thái và chất lƣợng chồi, cây chuyển gen và cây đối chứng cũng có sự sai khác về kích thƣớc của lá: chiều dài và chiều rộng (P-value < 0,001) (Bảng 3.11, Hình 3.9). Kết quả phân tích cho thấy, lá ở cây chuyển gen có kích thƣớc lớn hơn cả về chiều rộng và chiều dài so với lá ở cây đối chứng. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây trên một số loài cây Dƣơng và thuốc lá khi các tác giả khẳng định các gen đƣợc chuyển vào cây có ảnh hƣởng rõ rệt đến kích thƣớc của lá ngoại trừ một số trƣờng hợp đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đặc biệt [16], [77]. Tuy nhiên, giữa cây chuyển gen và cây đối chứng lại không có sự sai khác về chỉ số lá khi mà cả 2 đối tƣợng trên đều có giá trị chỉ số lá xấp xỉ 0,51.

Bảng 3.11. So sánh hình thái lá giữa cây chuyển gen và cây đối chứng

Các chỉ tiêu hình thái lá

Dòng Chiều rộng lá Chỉ số lá Tổng số mẫu

Chiều dài lá (mm) (mm)

UP72 180 6,3 ± 0,6 3,2 ± 0,1 0,51

UP72CG 180 9,9 ± 0,2 5,1 ± 0,1 0,52

UP99 180 6,8 ± 0,1 3,5 ± 0,1 0,51

UP99CG 180 9,7 ± 0,2 4,9 ± 0,2 0,51

P-value <0,001 <0,001 >0,001

Giữa các dòng giả định chuyển gen UP72CG và UP99CG không có sự sai khác rõ rệt về các chỉ tiêu hình thái và kích thƣớc lá nghiên cứu (P-value > 0,001). Nhƣ vậy, có thể nhận định gen EcHB1 không chỉ có tác dụng trong việc tác động đến chỉ tiêu chiều dài thân mà ảnh hƣởng đến chiều dài và rộng của lá của cây bạch đàn lai chuyển gen trong giai đoạn in vitro.

Hình 3.9. Hình thái thân và lá của dòng bạch đàn chuyển gen và đối chứng

3.2.2. So sánh hình thái cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn

vƣờn ƣơm

Chồi bạch đàn sau khi ra rễ, đƣợc huấn luyện cho quen với điều kiện tự nhiên rồi đƣợc cấy vào bầu đất và đƣợc theo dõi, đánh giá các chỉ tiêu về chiều cao cây và hình thái lá sau 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng tuổi. Kết quả về đánh giá sinh trƣởng chiều cao đƣợc trình bày ở Bảng 3.12 và Hình 3.10.

Kết quả phân tích cho thấy, ở giai đoạn 1 tháng tuổi, chiều cao của cây chuyển gen và cây đối chứng hầu nhƣ không có sự khác biệt đáng kể do giai đoạn đầu các cây chủ yếu tập trung thích nghi với điều kiện tự nhiên ngoài vƣờn ƣơm (P-value > 0,001). Sau 2 tháng tuổi, các dòng cây chuyển gen có sự phát triển mạnh về chiều cao và vƣợt hơn hẳn so với các cây đối chứng (P- value < 0,001). Lúc này chiều cao cây chuyển gen đạt trung bình 6,4 cm gấp 1,3 lần so với chiều cao của cây đối chứng (xấp xỉ 5 cm). Đến giai đoạn 3 tháng tuổi các dòng bạch đàn chuyển gen vẫn có sinh trƣởng về chiều cao hơn hẳn so với cây đối chứng trong cùng 1 điều kiện môi trƣờng.

Bảng 3.12. Đánh giá sinh trƣởng về chiều cao của cây con ngoài vƣờn ƣơm sau 1, 2 và 3 tháng

Chiều cao (cm)

Mẫu Tổng số cây

1 tháng 2 tháng 3 tháng

UP72 90 3,0 ± 0,1 5,1 ± 0,3 16,9 ± 0,9

UP72CG 90 3,1 ± 0,2 6,3 ± 0,5 20,8 ± 0,7

UP99 90 3,1 ± 0,7 4,9 ± 0,6 16,4 ± 1,3

UP99 CG 90 3,2 ± 0,1 6,5 ±0,4 20,7 ± 0,8

P-value > 0,001 < 0,001 < 0,001

Ở cả 3 giai đoạn đo đếm, hầu nhƣ không có sự khác biệt giữa các dòng chuyển gen là UP72CG và UP99CG về chiều cao cây (P-value > 0,001). Điều này chứng tỏ, các dòng chuyển gen là khá tƣơng đồng về sinh trƣởng cũng nhƣ các chỉ tiêu hình thái.

Hình 3.10. Cây bạch đàn chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 2 tháng tuổi

Đối với hình thái lá, dòng bạch đàn lai chuyển gen có dạng bản lá tròn và có kích thƣớc lớn hơn rõ rệt so với lá của cây đối chứng ở giai đoạn 2 tháng tuổi (P-value < 0,001) (Bảng 3.13, Hình 3.11). Tuy nhiên giữa chúng lại không có sự khác biệt về chỉ số lá (P-value > 0,001).

Bảng 3.13. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 2 tháng tuổi

Chiều dài lá Chiều rộng lá Mẫu Tổng số lá Chỉ số lá (cm) (cm)

3,2 ± 0,1 1,5 ± 0,2 0,47 180 UP72

5,0 ± 0,1 2,4 ± 0,3 0,48 180 UP72CG

3,1 ± 0,3 1,5 ± 0,1 0,48 180 UP99

4,8 ± 0,1 2,3 ± 0,1 0,48 180 UP99CG

P-value < 0,001 < 0,001 > 0,001

ĐC CG

Hình 3.11. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 2 tháng tuổi

Đến giai đoạn 3 tháng tuổi, kết quả phân tích thống kê cho thấy các chỉ tiêu chiều dài, chiều rộng lá của các dòng chuyển gen có sự khác biệt so với dòng đối chứng (P-value > 0,001) (Bảng 3.14, Hình 3.12) cụ thể nhƣ sau:

- Về chiều dài lá: giá trị trung bình của các dòng chuyển gen đạt từ 7,5 -

7,6 cm, trong khi các dòng đối chứng có giá trị trung bình từ 4,7 - 4,9 cm.

- Về chiều rộng lá: giá trị trung bình của các dòng chuyển gen đạt trong

khoảng 3,7 - 3,8 cm trong khi ở các dòng đối chứng chỉ đạt 2,3 – 2,4 cm.

Tuy nhiên, khi phân tích chỉ tiêu chỉ số lá cho thấy tƣơng tự nhƣ trong điều kiện nuôi cấy in vitro và giai đoạn 2 tháng tuổi, ở giai đoạn 3 tháng tuổi, cây chuyển gen và cây đối chứng không có sự sai khác về mặt thống kê ở chỉ tiêu này (P-value > 0,001) (Bảng 3.14). Kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ đối với một số nghiên cứu về đánh giá sai khác về hình thái lá giữa cây chuyển gen và cây không chuyển gen ở một loài cây mô hình nhƣ Arabidopsis thaliana cũng nhƣ trên một số loài cây rừng nhƣ Dƣơng [77], bạch đàn và thông P. sylvestris [78].

Bảng 3.14. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 3 tháng tuổi

Chiều dài lá Chiều rộng lá

Mẫu Tổng số lá Chỉ số lá

(cm) (cm)

UP72 180 4,9 ± 0,2 2,4 ± 0,3 0,49

UP72CG 180 7,6 ± 0,1 3,8 ± 0,1 0,50

UP99 180 4,7 ± 0,2 2,3 ± 0,1 0,49

UP99CG 180 7,5 ± 0,2 3,7 ± 0,1 0,49

P-value < 0,001 < 0,001 > 0,001

Tuy vậy, do hình thái lá là một tính trạng có tính biến dị lớn cá thể, thay đổi theo từng cá thể trong quần thể, nên chỉ số này cũng không ổn định.

Do đó, rất khó đánh giá cây nào thuộc nhóm nào, vì vậy cần sử dụng thêm các chỉ tiêu khác để đƣa ra kết luận chính xác là cây thuộc nhóm chuyển gen hay không chuyển gen. Sự khác biệt về hình thái và kích thƣớc lá giữa cây chuyển gen và cây đối chứng ở bạch đàn lai có thể do ảnh hƣởng của gen EcHB1 là gen liên quan đến phát triển chiều dài sợi gỗ. Tuy nhiên đây mới chỉ là những quan sát và đánh giá bƣớc đầu với số lƣợng các dòng chuyển gen còn hạn chế. Do đó, để đƣa ra đƣợc các kết luận chính xác hơn, cần tiếp tục theo dõi và đánh giá cây chuyển gen và đối chứng khi đƣợc trồng trong điều kiện tự nhiên cũng nhƣ tăng số lƣợng các dòng chuyển gen trong các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.12. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 3 tháng tuổi

3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG MANG GEN CỦA CÁC DÒNG BẠCH

ĐÀN TẠO ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR

3.3.1. Tách chiết DNA tổng số

Cây con bạch đàn lai chuyển gen và cây đối chứng sau khi cấy vào bầu đất đƣợc chăm sóc trong điều kiện vƣờn ƣơm (Hình 3.13 và 3.14) để bƣớc đầu đánh giá khả năng mang gen EcHB1 bằng Phƣơng pháp PCR. Sau 2-3 tháng, tiến hành thu mẫu lá của cây bạch đàn chuyển gen để tách ADN tổng số theo phƣơng pháp CTAB [73] có cải tiến một số bƣớc, nhằm phục vụ cho

việc xác định sự có mặt của gen EcHB1 trong cây chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR.

Hình 3.13. Bạch đàn chuyển gen ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc và cây con tại vƣờn ƣơm

Hình 3.14. Cây con chuyển gen EcHB1 trồng tại vƣờn ƣơm

Kết quả tách ADN đƣợc chạy điện di trên gel Agarose 0,8% với đối chứng dƣơng là λADN, các băng ADN hiện sáng, gọn, có nồng độ và độ tinh sạch đạt tiêu chuẩn khi đo bằng máy nanodrop (Hình 3.15).

Hình 3.15. Kết quả chạy điện di kiểm tra ADN một số dòng Bạch đàn lai UP

3.3.2. Xác định sự có có mặt của gen EcHB1 trong cây bằng

phƣơng pháp PCR

Tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel Agarose 0,8% với đối chứng dƣơng là plasmid tách từ vi khuẩn A. tumefaciens có mang vector chứa gen EcHB1, đối chứng âm là cây đối chứng chƣa chuyển gen trồng ngoài vƣờn ƣơm. Kết quả cho thấy trong số 40 dòng bạch đàn lai UP giả định chuyển gen có 11 dòng (CG5, CG11, CG14, CG18, CG24, CG28, CG29, CG32, CG34, CG35, CG38) xuất hiện một băng duy nhất với kích thƣớc khoảng 759bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc của đoạn gen EcHB1 và promoter CaMV 35S xuất hiện trên đối chứng dƣơng (Hình 3.16), đối chứng âm không chuyển gen thì không hiện băng.

Theo nhƣ kết quả phân tích cho thấy từ 40 dòng bạch đàn lai UP chuyển gen EcHB1 đƣợc kiểm tra thì có 11 dòng cho kết quả PCR dƣơng tính với gen EcHB1 chiếm tỷ lệ 28,9%. Tỷ lệ này tƣơng đƣơng hoặc cao hơn so với các nghiên cứu chuyển gen cho cây lâm nghiệp trƣớc đây nhƣ ở bạch đàn lai UU khi chuyển gen EcHB1 (có 6/19 dòng kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR và có 1 dòng đƣợc khẳng định bằng phƣơng pháp lai Southern Blot) [79]. Hoặc với Xoan ta khi kiểm tra 70 dòng Xoan ta chuyển gen GA20 chỉ có 5 dòng PCR dƣơng tính với gen GA20 chiếm tỷ lệ 7,14%, từ 50 dòng Xoan ta chuyển gen 4CL1 đƣợc kiểm tra chỉ có 3 dòng cho kết quả PCR dƣơng tính với gen 4CL1

chiếm tỷ lệ 6,0% [25]. Tuy nhiên trong nghiên cứu chuyển gen GS1 vào cây Xoan ta của Nguyễn Văn Phong và cộng sự (2019), khi tác giả kiểm tra 55 dòng Xoan ta chuyển gen GS1 dƣơng tính với PCR có 21 dòng dƣơng tính với Southern Blot [80].

Các dòng xuất hiện băng trên gel điện di tiếp tục đƣợc kiểm tra lại lần 2 sau đó 1 tháng. Kết quả cho thấy, 11 dòng này vẫn thể hiện kết quả dƣơng tính với gen EcHB1. Nhƣ vậy, bƣớc đầu đề tài đã tạo ra đƣợc 11 dòng bạch đàn lai UP chuyển gen EcHB1 (Hình 3.17).

Hình 3.16. Kết quả PCR 40 dòng bạch đàn chuyển gen EcHB1

Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 bằng PCR

Chú thích: (+): Plasmid mang gen EcHB1; (-): dòng bạch đàn lai UP không chuyển gen; mk: DNA marker 1 kb; giếng số 1-13: (CG5, CG11, CG14, CG18, CG24, CG28, CG29, CG30, CG31, CG32, CG34, CG35, CG38)

4. CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

- Đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen EcHB1 tăng chiều dài sợi gỗ

cho Bạch đàn lai UP với các thông số chính sau:

+ Ngƣỡng nồng độ kháng sinh chọn Kanamycin trong môi trƣờng nuôi cấy cho các giai đoạn chuyển gen kích thích tái sinh chồi và nhân nhanh là 150 mg/l, và cho giai đoạn chọn lọc chồi ra rễ là 50 mg/l.

+ Vật liệu chuyển gen phù hợp là đoạn thân và mảnh lá cây in vitro sau

15 ngày tuổi không chứa chồi và mắt ngủ đƣợc tiền nuôi cấy 48 giờ.

+ Mật độ vi khuẩn OD600=0,5 với thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens

là 10 phút là thích hợp nhất cho quá trình biến nạp gen.

+ Thời gian đồng nuôi cấy thích hợp là 72 giờ.

- Từ quy trình trên đã chọn tạo đƣợc 40 dòng bạch đàn lai UP giả định chuyển gen EcHB1 qua các môi trƣờng chọn lọc, trong đó 11 dòng cho kết quả dƣơng tính với gen EcHB1 bằng phƣơng pháp PCR (CG5, CG11, CG14, CG18, CG24, CG28, CG29, CG32, CG34, CG35, CG38) ở giai đoạn vƣờn ƣơm.

4.2. Kiến nghị

Để khẳng định sự có mặt của gen và kiểm tra số lƣợng copy của gen, xác định khả năng biểu hiện của gen đích EcHB1 cần tiến hành thêm các phƣơng pháp chỉ thị phân tử nhƣ lai Southern blot và RT-PCR.

Ngoài ra, bạch đàn có nhịp điệu sinh trƣởng ổn định từ sau 3 tuổi. Từ giai đoạn đó trở đi, các chỉ tiêu về sinh trƣởng, tính chất gỗ mới phản ánh đúng đặc điểm di truyền của cây. Do vậy, cần tiếp tục theo dõi, đánh giá các dòng bạch đàn chuyển gen và tiến hành phân tích chiều dài sợi gỗ ở độ tuổi cây.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Girijashankar V., 2011, Genetic transformation of eucalyptus.

Physiology and Molecular Biology of Plants, 17, pp. 9-23.

2. Kawasu T., Susuki Y., Wada T., Kondo K., Koyama H., 2003, Over expression of a plant mitochondrial citrate synthase in eucalyptus trees improved growth when cultured by alphosphate as a sole phosphate source, Plant Cell Physiol, 44, pp. 91.

3. Sonoda T., Koita H., Nakamoto Ohta S., Kondo K., Suezaki T., Kato T., Ishizaki Y., Nagai K., Lida N., Sato S., Umezawa T., Hibino T., 2009, Increasing fiber length and growth in transgenic tobacco plants overexpressing a gene encoding the Eucalyptus camaldulensis HD-Zip class II transcription factor, Plant Biotechnology, 26, pp. 115-120.

4. James C., 2019, Global status of commercialized Biotech/GM crops:

2019, ISAAA Briefs 55.

5. Nguyễn Văn Đồng, 2012, Tạo dòng ngô biến đổi gen kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ, Kỷ yếu hội thảo Khoa học Quốc gia – Kết quả nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học trong lĩnh vực trồng trọt bảo, vệ thực vật và bảo vệ môi trường, Viện Di truyền Nông nghiệp 2012.

6. Trần Thị Cúc Hòa, Nguyễn Trần Hải Bằng, Trần Đức Cƣơng, 2013, Nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tƣơng chuyển gen kháng ruồi đục thân và sâu đục quả, Hội thảo Quốc gia về Khoa học cây trồng lần thứ nhất, tr. 441-449.

7. Đặng Thị Vân, 2012, Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong tạo giống kháng bệnh virus xoắn vàng lá cà chua của Việt Nam, Kỷ yếu hội thảo Khoa học Quốc gia – Kết quả nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học trong lĩnh vực trồng trọt bảo, vệ thực vật và bảo vệ môi trường, Viện Di truyền Nông nghiệp 2012.

8. Lê Văn Sơn, 2012, Nghiên cứu tạo giống thuốc lá kháng bệnh khảm lá và xoăn đọt bằng kỹ thuật chuyển gen, Kỷ yếu hội thảo Khoa học Quốc gia – Kết quả nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học trong lĩnh vực

trồng trọt bảo, vệ thực vật và bảo vệ môi trường, Viện Di truyền Nông nghiệp 2012.

9. Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2012, Chƣơng trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020 – Tình hình thực hiện giai đoạn 2007-2012 và định hƣớng giai đoạn tiếp theo, Kỷ yếu hội thảo Khoa học Quốc gia – Kết quả nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học trong lĩnh vực trồng trọt bảo, vệ thực vật và bảo vệ môi trường, Viện Di truyền Nông nghiệp 2012.

10. Trịnh Đình Đạt, 2009, Công nghệ di truyền, tập 4, NXB Giáo dục, Hà

Nội.

11. Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và

ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

12. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2006, Công nghệ sinh

học, tập 2, NXB Giáo dục, Hà Nội.

transgenic in

13. Hu W.J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai C.J., Chiang V.L., 1999, Repression of lignin biosynthesis promotes trees. Nature cellulose accumulation and growth Biotechnology, 17, pp. 808-812.

14. Li J., Brunner A.M., Meilan R., Strauss S.H., 2009, Stability of transgenes in trees: expression of two reporter genes in poplar over three field seasons, Tree Physiology, 29, pp. 299-312.

15. Wang Y., 2012, Coiled-coil networking shapes cell molecular

machinery, Mol Biol Cell, 23(19), pp. 3911-3922

16. Zhang J., Ali Movahedi, Ming Sang, Zhiheng Wei, Junjie Xu, Xiaoli Wang, Xiaolong Wu, Menyang Wang, Tongming Yin, Qiang Zhuge, 2017, Functional analyses of NDPK2 in Populus trichocarpa and overexpression of PtNDPK2 enhances growth and tolerance to abiotic stresses in transgenic poplar, Plant Physiology and Biochemistry, 117(4), pp. 61-74

17. Waditee R., Nazmul H. Bhuiyan, Vandna Rai, Kenji Aoki, Yoshito Tanaka, Takashi Hibino, Shigetoshi Suzuki, Jun Takano, Andres T. Jagendorf, Tetsuko Takabe, and Teruhiro Takabe, 2005, Genes for direct methylation of glycine provide high levels of glycinebetaine and abiotic- stress tolerance in Synechococcus and Arabidopsis, PNAS February 1, 102 (5), pp. 1318-1323.

18. Yu H.C., Kenichi K., Haga M., 2010, Perilla: The Genus Perilla, Taylor

& Francis, pp. 206.

19. Kawaoka A., Matsunaga E., Endo S., Kondo S., Yoshida K., Shinmyo A., Ebinuma H., 2003, Ectopic expression of a horseradish peroxidase enhances growth rate and increases oxidative stress resistance in hybrid aspen, Plant Physiology, 132, pp. 1177-1185.

20. Jing Z. P., Gallardo F., Pascual M. B., Sampalo R., Romero J., Torres de Navarra A., Canovas D. M., 2004, Improved growth in a field trial of transgenic hybrid poplar overexpressing glutamine synthetase, New Phytologist, 164, pp. 137-145.

21. Pinto G. P., Santos C. S., Neves L. N., Araujo C. A., 2002, Somatic embryogenesis and plant regeneration in Eucalyptus globulus Labill, Plant Cell Reports, 21, pp. 208-213.

22. Trần Hồ Quang, 2020, Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ ở Việt Nam, Kỷ yếu hội thảo đánh giá kết quả thực hiện chương trình Công nghệ sinh học trong lĩnh vực lâm nghiệp, tr. 87- 99.

23. Vƣơng Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cƣờng, Lê Thị Huyền Thanh, Phan Thị Mỵ Lan, Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, 2011, Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để tạo cây thông có khả năng chống chịu cao với sâu róm, Báo cáo tổng kết đề tài 150 trang.

24. Bùi Văn Thắng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, 2013, Nghiên cứu tạo cây Xoan ta (Melia azedarach L.) chuyển gen P5CSm tăng cƣờng khă năng chống chịu khô hạn, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 1, tr. 203- 208.

25. Hà Văn Huân, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Chu Hoàng Hà, 2015,

Nghiên cứu chuyển gien dinh trƣởng nhanh (GA20) và tăng chất lƣợng gỗ (4CL1) vào cây Xoan ta (Melia Azedarach L.). Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, tháng 6/2015, tr. 53-61.

26. Nguyễn Văn Phong, 2020, Nghiên cứu chọn tạo và đánh giá các dòng xoan ta chuyển gen sinh trƣởng nhanh có triển vọng, Kỷ yếu hội thảo đánh giá kết quả thực hiện chương trình Công nghệ sinh học trong lĩnh vực lâm nghiệp, tr. 100-106.

27. Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Thị Huyền, Chu Hoàng Hà, 2017, Tạo cây Bạch đàn Urô chuyển gen GS1 mã hóa glutamine synthetase tăng cƣờng hiệu quả sử dụng nitrogen, Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, số tháng 9/2017.

28. Trần Hồ Quang, 2015, Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến dổi gen cho chiều dài sợi gỗ ở Việt Nam (giai đoạn 1). Báo cáo tổng kết đề tài thuộc chƣơng trình CNSH trong nông nghiệp và phát triển nông thôn. 29. Eldridge K., Davidson C., Harwood C., Van Wyk G., 1994, Eucalyptus

domestication and breeding, New York: Oxford University Press.

30. GIT Forestry, 2008, Cultivated Eucalyptus global map. 31. Tạp chí Gỗ Việt, 2019, Một năm nhìn lại xu hƣớng năm 2019, http://goviet.org.vn/bai-viet/mot-nam-nhin-lai-va-xu-huong-nam-2019- 8943.

32. Hà Huy Thịnh, Phí Hồng Hải, Nguyễn Đức Kiên, 2011, Chọn tạo giống và nhân giống cho một số loài cây trồng rừng chủ yếu, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

33. Lê Đình Khả, Hà Huy Thịnh, Nguyễn Việt Cƣờng, 2005, Cải thiện giống Bạch đàn cho các chƣơng trình trồng rừng ở Việt Nam Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 20 năm đổi mới, 5, tr. 167-178.

34. Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và

ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

35. Đoàn Thị Mai, Lê Sơn, Lƣơng Thị Hoan, Lê Trần Bình, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, 2003, Nhân giống một số loại cây trồng rừng có

năng suất, chất lƣợng cao bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003, tr. 910 – 914.

36. Nguyễn Văn Uyển, 1992, Công nghệ sinh học trong cải thiện giống cây

trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

37. Nguyễn Văn Uyển, 1993, Nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ công tác

giống cây rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

- mediated tumefaciens

38. Ho C.K., Chang S.H., Tsay J.Y., Tsai C.J., Chiang V.L., Chen Z.Z, , 1998, Agrobacterium transformation of Eucalyptus camal dulensis and production of transgenic plant, Plant Cell, 17, pp. 675 – 680.

39. Harcourt R., Kyozuka J., Floyd R., Bateman K., Tanaka H., Decroocq V., Llewellyn D., Zhu X., Peacock W., Dennis E., 2000, Insect-and herbicide-resistant transgenic eucalypts, Molecular Breeding, 6, pp. 307- 315.

40. Prakash M. G., Gurumurthi K., 2010, Effects of type of explant and age, plant growth regulators and medium strength on somatic embryogenesis and plant regeneration in Eucalyptus camaldulensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 100, pp. 13-20.

41. Sussex I. M., 1965, The origin and morphogenesis of Eucalyptus cell populations, Proceedings of the International Conference on Plant Tissue Culture, pp. 383-391.

42. Warrag E., Lesley M.S., Rockwood D.J, 1991, Nodule culture and regeneration of Eucalyptus grandis hybrids, Plant Cell Reports, pp. 586- 589.

and preliminary

43. Cheng Z., Tsay J., Chung J., 1996, Callus culture of Eucalyptus grandis x urophylla studies on organogenesis and Agrobacterium mediated transformation, Taiwan Journal of Forest Sciences, 11(1), pp. 43-52.

44. Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Ngô Văn Thanh, Chu Hoàng Hà, 2014, Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây Bạch đàn uro (Eucalyptus

urophylla) thông qua phôi soma phục vụ chuyển gen, Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, số tháng 11/2014.

45. Ngô Thị Minh Duyên, Đỗ Thị Thu, Trần Hồ Quang, 2014, Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây bạch đàn lai uro (Eucalyptus urophylla) thông qua phôi soma từ cây trội đƣợc tuyển chọn phục vụ chuyển gen, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, số 4/2014, tr. 3516-3523.

46. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997, Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình cao học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp quốc gia, Hà Nội.

47. Lê Trần Bình, Lê Thị Muôi, 1999, Phân lập gen và chọn dòng chống

chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại học quốc gia, Hà Nội.

48. Thamarus K.A., Groom K., Murrell J., Byrne M., Moran G.F., 2002, A genetic linkage map for Eucalyptus globulus with candidate loci for wood, fibre, and floral traits, Theor Appl Genet, 104(3), pp. 379-387. 49. Moran G.F., Karen A., Thamarus, Raymond A. A., Qiu D., Uren T., Southerton S. G., 2002, Genomics of Eucalyptus wood traits, 59, pp. 645-650.

50. Thumma B.R., Nolan M.F., Evans R., Moran G.F., 2005, Polymorphisms in Cinnamoyl CoA Reductase (CCR) are associated with variation in microfibril angle in Eucalyptus spp, Genetics 171(3), pp. 1257-1265.

51. Eugenia B., Staden C., Lezar S., 2009, A microarray based method for the parallel analysis of genotypes and expression profiles of wood forming tissues in Eucalyptus grandis, BMC Biotechnol 9, pp. 51.

52. Trần Hồ Quang, Trần Thanh Trăng, 2010, Kết quả nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bạch đàn, Kỷ yếu Hội nghị Khoa học và Công nghệ Lâm nghiệp với phát triển rừng bền vững và biến đổi khí hậu, tr: 31 – 37.

53. Nguyễn Việt Cƣờng, Nguyễn Việt Tùng, Nguyễn Thị Kim Liên, 2013, Nghiên cứu khả năng ứng dụng chỉ thị SSR trong đánh giá sinh trƣởng các dòng bạch đàn lai, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, 2, tr. 2695-2702.

54. Trần Thanh Trăng, 2020, Chọn tạo giống bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) kháng bệnh đốm lá (cryptosporiopsis eucaluptus) bằng chỉ thị phân tử, Kỷ yếu hội thảo đánh giá kết quả thực hiện chương trình Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Lâm nghiệp, tr. 40-48.

55. Mullins K.V., Llewellyn D.J., Hartney V.J., Strauss., Dennis E.S., 1997, Regeneration and transformation of Eucaluptus camaldulensis, Plant Cell Report, 16, pp. 787-791.

56. Teulieres C., Marque C., Boude A.M., 1994, Genetic transformation of forestry V, plant

Eucaluptus, Biotechnology in agriculture and protoplasts and genetic engineering, 29, pp. 289-307

57. Tournier V., Grat S., Marque C., Kayyal W., Penchel R., Andrade D.G., Boudet A.M., Teulieres C., 2003, An efficient procedure to stably introduce genes into an economically important pulp tree (Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla), Trans Res, 12, pp. 403-411.

58. Vƣơng Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cƣờng, Lê Thị Huyền Thanh, Phan Thị Mỵ Lan, Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, 2011, Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để tạo cây thông có khả năng chống chịu cao với sâu róm, Báo cáo tổng kết đề tài 150 trang.

59. Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos Thevenot P., Grima Pettenati J., 2002, The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous plant species, Plant Molecular Biology, 50, pp. 497-509.

60. Ho C.K., Chen Y.C., Chen Z.Z., 2002, cDNA cloning and sequence from analysis of 5-hydroxyconiferaldehyde O-methyltransferase Eucalyptus camaldulensis, Taiwan Journal of Forest Science, 17, pp. 429-438.

61. Ranik M., Myburg A.A., 2006, Six new cellulose synthase genes from Eucalyptus are associated with primary and secondary cell wall biosynthesis, Tree Physiology, 26, pp. 545-556.

62. Koyama T., Kato N., Hibino T., Kawazu T., Kimura T., Sakka K., 2006, Isolation and expression analysis of phosphate transporter genes from Eucalyptus camaldulensis, Plant Biotechnology, 23, pp. 215-218.

63. Myburg A., Bradfield J., Cowley E., Creux N., Castro M., Hatherell T. L., Mphahlele M., O'Neill M., Ranik M., Solomon L., Victor M., Zhou H., Galloway G., Horsley T., Jones N., Stanger T., Bayley A., Edwards N., Janse B., 2008, Forest and fibre genomics: biotechnology tools for applied tree improvement, Southern Forests: a Journal of Forest Science, 71(10), pp. 59-68

64. Ruan J., Dubitzky W., Wolkenhauer O., Cho K.H., Yokota H., 2013, Encyclopedia of Systems Biology, Springer New York, pp. 2224-2224. 65. Zhang H., Jin J., Tang L., Zhao Y., Gu X., Gao G., Luo J., 2011, Plant TFDB 2.0: update and improvement of the comprehensive plant transcription factor database, Nucleic Acids Research, 39, pp. 1114-1117. 66. Haake V., Cook D., Riechmann J., Pineda O., Thomashow M.F., Zhang J.Z., 2002, Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis, Plant Physiology, 130, pp. 639-648.

67. Johannesson H., Wang Y., Engstrom P., 2001, DNA-binding and dimerization preferences of Arabidopsis homeodomain-leucine zipper transcription factors in vitro, Plant Molecular Biology, 45, pp. 63-73.

68. Carabelli M., Morelli G., Whitelam G., Ruberti I., 1996, Twilight- zone and canopy shade induction of the Athb-2 homeobox gene in green plants, Proceedings of the National Academy of Sciences, 93, pp. 3530- 3535.

69. Di Cristina M., Sessa G., Dolan L., Linstead P., Baima S., Ruberti I., Morelli G., 1996, The Arabidopsis Athb-10 (GLABRA2) is an HD-Zip protein required for regulation of root hair development, The Plant Journal, 10, pp. 393-402.

70. Trần Hồ Quang, 2015, Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến dổi gen cho chiều dài sợi gỗ ở Việt Nam (giai đoạn 1), Báo cáo tổng kết đề tài

thuộc chƣơng trình CNSH trong nông nghiệp và phát triển nông thôn.

71. Nguyễn Thị Việt Hà, Nguyễn Thị Huyền, Lê Thị Thủy, Trần Thị Thu Hà, Lê Sơn, Trần Đức Vƣợng, Nguyễn Hữu Sỹ, Nguyễn Đức Kiên, Đào Thị Thùy Trang, Phùng Thị Kim Huệ, 2019, Nghiên cứu tái sinh cây bạch đàn lai UP (E. urophylla x E. pellita) thông qua phôi soma phục vụ cho chuyển gen. Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, (1), tr. 27-36.

72. Doyle J.J., Doyle, 1987, Rapid DNA isolation procedure for small

quantities of fresh leaf tissue, Phytochemistry Bull, 19, pp. 11-15.

73. Alcantara G.B, Jaoo C.B.F, Maguerite Q., 2011, Organogesis and transient genetic transformation of the hybrid Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, Sci Agric Piracicaba Braz, 68(2), pp. 246-251

74. Lê Thị Mận, 2013, Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh và chuyển gen sử dụng Agrobacterium tumefaciens cho đối tượng cây bạch đàn Uro (Eucalyptus urophylla), Luận văn thạc sĩ sinh học.

75. Bùi Văn Thắng, 2020, Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla) sinh trƣởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen, Kỷ yếu hội thảo đánh giá kết quả thực hiện chương trình Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Lâm nghiệp, tr. 107-120.

76. Kulue B.R., Safiullina M.G., Kniazev A.V., Chemeris A.V., 2013, Morphological analysis of transgenic tobacco plants experessing the PnEXPA3 gene of black poplar (Populus nigra), Ontogenez 44(3), pp. 166-173.

77. Kulue B.R., Knyazev A.V., Mikhaylova E.V., Chemeris A.V., 2017, The role of expansin genes PtrEXPA3 and PnEXPA3 in the regulation of leaf growth in Polar, Russian Journal of Genetics, 53(6), pp. 651-660.

78. Dubouzet D.J., Strabala J.T., Wagner A., 2013, Potential transgenic

routes to increase tree biomass, Plant Sciences, 212, pp. 72-101.

79. Trần Đức Vƣợng, 2020, Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ (giai đoạn 2), Kỷ yếu hội thảo đánh giá kết quả thực

hiện chương trình Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Lâm nghiệp, tr. 121-131.

80. Nguyễn Văn Phong, 2020, Nghiên cứu chọn tạo và đánh giá các dòng xoan ta chuyển gen sinh trƣởng nhanh có triển vọng, Kỷ yếu hội thảo đánh giá kết quả thực hiện chương trình Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Lâm nghiệp, tr. 100-106.

PHỤ LỤC 1. CÁC THÔNG TIN CHUNG

Bảng 1. Môi trƣờng MS cơ bản (Murashige & Skoog, 1962)

Thành phần Hàm lƣợng (mg/l)

1900 KNO3

1650 NH4NO3

370 MgSO4.7H2O

170 KH2PO4

332 CaCl2

6,2 H3BO3

22,3 MnSO4.H2O

8,6 ZnSO4

0,25 Na2MO4

0,025 CuSO4.7H2O

0,025 CoCl2

37,3 Na2EDTA

27,8 FeSO4.7H2O

Glycin 2

Myo-inositol 100

Nicotinic acid 0,5

Thiamin HCl 0,1

Prydoxin HCl 0,5

Bảng 2. Môi trƣờng MS* (là môi trƣờng MS giảm ½ Nitơ tổng số)

Thành phần Hàm lƣợng (mg/l)

950 KNO3

825 NH4NO3

370 MgSO4.7H2O

170 KH2PO4

332 CaCl2

6,2 H3BO3

22,3 MnSO4.H2O

8,6 ZnSO4

0,25 Na2MO4

0,025 CuSO4.7H2O

0,025 CoCl2

37,3 Na2EDTA

27,8 FeSO4.7H2O

Glycin 2

Myo-inositol 100

Nicotinic acid 0,5

Thiamin HCl 0,1

Prydoxin HCl 0,5

Bảng 3. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn LB (Bertani, 1951)

Môi trƣờng Thành phần Hàm lƣợng (g/l)

Môi trƣờng LB lỏng Tryptone 10

Yeast Extract 5

NaCl 10

Môi trƣờng LB đặc Tryptone 10

Yeast Extract 5

NaCl 10

Agar 7

Dịch lỏng tạo dịch Môi trƣờng cơ bản ½ MS huyền phù vi khuẩn

Bảng 4. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy

Thành phần Loại môi trƣờng

Tạo chồi in vitro MS + 30g/l sucrose + 7g/l Agar

MS + 30g/l sucrose + 15mg/l Riboflavin Nhân nhanh & tạo đa chồi + 0,5mg/l BAP + 0,2mg/l NAA+ 6,5g/l Agar

MS* + 20g/l Sucrose + 100ml Nƣớc dừa + 3mg/l

Tạo vật liệu nhận gen BAP + 0,5mg/l NAA +100 µM AS + 2,4g/l

Gelrite

10g/l Tryptone + 5g/l Yeast Extract + 10g/l NaCl Nuôi cấy vi khuẩn A. + 7g/l Bactor Agar + 50 mg/l Kanamycin + 50 tumefaciens tạo khuẩn lạc mg/l Rifamycin

10g/l Tryptone + 5g/l Yeast Extract + 10g/l NaCl Tạo dịch huyền phù vi

+ 50 mg/l Kanamycin + 50 mg/l Rifamycin khuẩn

MS* + 20g/l Sucrose + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l Đồng nuôi cấy NAA + 100 µM AS + 2,4g/l Gelrite

MS* + 20g/l Sucrose + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l Diệt khuẩn và tái sinh chồi NAA + 400 mg/l Cefotaxim + 2,4g/l Gelrite

MS* + 20g/l Sucrose + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l Tái sinh chọn lọc và phát NAA + 15 mg/l Riboflavin + 400 mg/l Cefotaxim sinh chồi + 150 mg/l Kanamycin + 2,4g/l Gelrite

½ MS + 15 g/l Sucrose + 2 mg/l IBA + 1 mg/l Ra rễ chọn lọc NAA + 7 g/l Agar + 50 mg/l Kanamycin

Bảng 5. Danh mục trang thiết bị cần thiết

TT Máy móc, trang thiết bị, vật tƣ TT Máy móc, trang thiết bị, vật tƣ

1 Máy lọc nƣớc 17 Đèn tia cực tím treo tƣờng

2 Máy sản xuất nƣớc cất 1 lần 18 Máy điều hòa nhiệt độ

3 Nồi hấp vô trùng 19 Máy hút ẩm

4 Tủ sấy vô trùng 20 Máy lắc gia nhiệt

5 Cân phân tích 21 Quạt thông gió gắn tƣờng

Bình tam giác 250 ml, 350 ml và

6 Cân kỹ thuật 22 500 ml; bình trụ thủy tinh ra rễ;

đĩa petri vô trùng

7 Máy khuấy từ gia nhiệt 23 Tủ đựng hóa chất dự trữ bảo quản

Bếp gas, nồi đun, các loại cốc

đong, ống đong, bình định mức, 8 Máy đo pH để bàn 24 pipet, bình chứa, thìa đong, ống

hút, …

Tủ lạnh sâu -80 oC, Tủ lạnh sâu - 20 oC; Tủ mát 4 oC, Tủ ổn nhiệt 9 25 Máy nghiền mẫu lá

có gắn máy lắc

10 Tủ an toàn sinh học cấp 2 26 Máy đo nồng độ quang phổ

Bộ panh, kéo, dao cấy, que cấy 11 27 Bộ chạy điện di khuẩn, đèn cồn

12 Ghế ngồi + Xe đẩy 28 Máy ảnh

13 Giàn nuôi cây trong phòng nuôi 29 Máy ly tâm

14 Giá xếp môi trƣờng 30 Tủ hút khí độc

15 Giá úp chai lọ sạch 31 Máy bơm, hệ thống tƣới, che sáng

16 Thiết bị kiểm tra nhiệt độ, độ ẩm 32 Các loại vật tƣ mau hỏng khác

PHỤ LỤC 2. XỬ LÝ SỐ LIỆU

1. Ảnh hƣởng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin

Trong chọn lọc chồi

Sau 2 tuần:

Anova: Single Factor (Số mẫu sống sau 2 tuần)

SUMMARY

Count 5 5 5 5 5 5

Sum 1250 1222 1084 903 667 229

Average 250 244.4 216.8 180.6 133.4 45.8

Groups 0 10 50 75 100 150

Variance 0 5.3 17.2 60.3 38.8 14.2

SS

df

MS

F

F crit

P-value 1.40366E- 28

152848.3

5 30569.66

1350.647717

2.620654148

ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups

543.2

24 22.63333333

Total

153391.5

29 Sau 3 tuần

Anova: Single Factor (Số mẫu sống sau 3 tuần)

Count 5 5 5 5 5 5

Sum 1250 1084 806 348 209 0

Average 250 216.8 161.2 69.6 41.8 0

Variance 0 29.7 72.7 127.3 15.7 0

SS

df

MS

F crit

F

P-value 3.68069E- 28

254801.77

5 50960.35333 1245.974409

2.620654148

SUMMARY Groups 0 10 50 75 100 150 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups

981.6

24

40.9 Total

255783.37

29 Sau 4 tuần

Anova: Single Factor (Số mẫu sống sau 4 tuần

SUMMARY

Groups 0 10 50 75 100 150

Count 5 5 5 5 5 5

Sum 1250 945 555 166 111 0

Average 250 189 111 33.2 22.2 0

Variance 0 87.5 37.5 3.7 7.7 0

SS

df

MS

F

F crit

P-value 3.2045E- 31

255261.1

5 51052.22

2245.698827

2.620654148

ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups

545.6

24 22.73333333

Total

255806.7

29 Trong chọn lọc cây ra rễ

Anova: Single Factor (Số chồi ra rễ sau 2 tuần)

SUMMARY Groups 0 10 50 75

Count 5 5 5 5

Sum Average 141 0 0 0

28.2 0 0 0

Variance 14.7 0 0 0

ANOVA Source of

SS

df

MS

F crit

F

P-value 6.46736E-

Variation Between Groups

2982.15

3

994.05 270.4897959

14 3.238871517

Within

Groups

58.8

16

3.675 Total

3040.95

19 Anova: Single Factor (Số chồi ra rễ sau 3 tuần)

Count 5 5 5 5

Sum Average 876 0 0 0

175.2 0 0 0

Variance 41.7 0 0 0

SUMMARY Groups 0 10 50 75

ANOVA

Source of

df

SS

MS

F

F crit

P-value 6.41224E-

3 115106.4

38368.8

3680.460432

23 3.238871517

Variation Between Groups

16

166.8

10.425 Within Groups

19 Total

115273.2

Anova: Single Factor (Số chồi ra rễ sau 4 tuần)

SUMMARY Groups 0 10 50 75

Count 5 5 5 5

Sum Average Variance 1191 0 0 0

238.2 0 0 0

31.7 0 0 0

ANOVA Source of

SS

df

MS

F

P-value

F crit

Variation Between Groups

212772.15

3 70924.05 8949.40694 5.28E-26

3.238872

Within

Groups

126.8

16

7.925 Total

212898.95

19

2. Ảnh hƣởng của tuổi vật liệu đến khả năng biến nạp gen

Đoạn thân

Anova: Single Factor

Average Variance

46 67.2 57.2 40.4

34 51.2 99.2 6.8

SUMMARY Groups 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày

Count 5 5 5 5

Sum 230 336 286 202

MS

F

F crit

SS

df

P-value 6.87E- 05

711.1333 14.87727

9.005937

47.8 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups

2133.4 764.8

3 16

Total

2898.2

19

Mảnh lá

Anova: Single Factor

Average Variance

39.2 62.4 52 37.6

9.2 20.8 34 4.8

SUMMARY Groups 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày

Count 5 5 5 5

Sum 196 312 260 188

MS

F

F crit

SS

df

P-value 1.24E- 07

681.3333 39.6124

9.005937

17.2 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups

2044 275.2

3 16

Total

2319.2

19

3. Ảnh hƣởng thời gian tiền nuôi cấy

Đoạn thân

Anova: Single Factor

SUMMARY Groups 0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ

Count 5 5 5 5

Sum Average Variance 207.3 263.3 323.3 223.3

9.503 63.268 48.023 25.578

41.46 52.66 64.66 44.66

SS

df

MS

F

F crit

P-value 7.66E- 05

14.5966

9.005937

ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups

3 16

1602.4 585.488

534.1333 36.593

Total

2187.888

19

Mảnh lá

Anova: Single Factor

Average Variance

SUMMARY Groups 0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ

Count 5 5 5 5

Sum 183.3 233.3 293.3 186.6

36.66 46.66 58.66 37.32

27.723 16.668 19.868 18.912

SS

df

MS

P-value

F crit

F

3 1588.834

529.6112 25.47095 2.48E-06 9.005937

ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups

16

332.684 20.79275

Total

1921.518

19

4. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens

Anova: Single Factor

SUMMARY Groups 0,1 0,3 0,5 0,7

Count 5 5 5 5

Average 10 13.2 20.2 10

Sum 50 66 101 50

Variance 2.5 0.7 1.7 6

ANOVA Source of

SS

MS

df

F

P-value

F crit

Variation Between Groups

346.95

3 115.65 42.44036697 7.64E-08 3.238872

Within

Groups

43.6

2.725

16 Total

390.55

19

5. Ảnh hƣởng của thời gian nhiễm khuẩn

Đoạn thân

Anova: Single Factor (Số mẫu tạo mô sẹo)

SUMMARY

Sum Average Variance

0 Count 3 3 3 3 3

0 250 83.33333 25.33333 400 133.3333 20.33333 350 116.6667 20.33333 300

100

4 Groups 0 5 10 15 20

ANOVA Source of

SS

df

MS

F

P-value

F crit

32333.33

4 8083.333 577.381

8.9E-12

3.47805

Variation Between Groups

Within

Groups

140

10

14 Total

32473.33

14

Mảnh lá

Anova: Single Factor (Số mẫu tạo mô sẹo)

Sum Average Variance

0 70 140

0 43 73

0 210 420 290 96.66667 32.33333 260 86.66667 49.33333

Count 3 3 3 3 3

SUMMARY Groups 0 5 10 15 20 ANOVA Source of

SS

df

MS

F

P-value

F crit

Variation Between Groups

4 31240

7810

197.5548 1.81E-09 3.47805

Within

Groups

395.3333

10 39.53333

Total

31635.33

14

6. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy

Đoạn thân

Anova: Single Factor (Số mẫu tạo mô sẹo)

SUMMARY

3

71 Count 3 3 3 3 3

Sum Average Variance 213 415 138.3333 24.33333 437 145.6667 20.33333 411 303

137 101

28 16

Groups 24 48 72 96 120

ANOVA

Source of

SS

df

MS

F

P- val ue F crit

4.37E-

12108.27

4 3027.067 165.1127

09 3.47805

Variation Between Groups

Within

Groups

183.3333

10 18.33333

Total

12291.6

14

Mảnh lá

Anova: Single Factor (Số mẫu tạo mô sẹo)

Count 3 3 3 3 3

Sum Average 228 427 446 417 306

76 142.3333 148.6667 139 102

Variance 1 16.33333 26.33333 21 9

SUMMARY Groups 24 48 72 96 120

ANOVA

Source of

SS

df

MS

F

F crit

P- val ue 1.7E-

11786.27

4 2946.567

199.9932

09 3.47805

Variation Between Groups

Within

14.73333

147.3333 11933.6

10 14

Groups Total

7. Hình thái thân giai đoạn in vitro

Số lóng trung bình

Anova: Single Factor

SUMMARY

Average Variance 3.376667 0.004633

3.71 0.0012

Count 3 3 3 3

Groups Row 1 Row 2 Row 3 Row 4

Sum 10.13 11.13 9.7 10.94

3.233333 0.004233 3.646667 0.004633

SS

F crit

df

F

MS

4.066181

P-value 3.26E- 05

0.454967 0.0294

0.151656 41.26682 0.003675

ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups

3 8

Total

0.484367

11 Chiều dài lóng trung bình

Anova: Single Factor

SUMMARY

Count 3 3 3

Groups Row 1 Row 2 Row 3

Sum 2.67 3.18 2.55

Varianc e 0.0039 0.0028 0.0052

3 Row 4

3.1 0.019733

Average 0.89 1.06 0.85 1.03333 3

SS

df

F

ANOVA Source of Variation Between Groups

P-value 0.04926 4

F crit 4.06618 1

3 4.092729

Within Groups

8 MS 0.03236 7 0.00790 8

0.0971 0.06326 7 0.16036 7

Total

11

Chiều cao chồi

Anova: Single Factor

SUMMARY

2.92 Sum Average Variance 8.53 2.843333 0.000933 9.55 3.183333 0.002633 8.76 0.0063 9.35 3.116667 0.001033

Count 3 3 3 3

Groups Row 1 Row 2 Row 3 Row 4

F crit

P-value

df

MS

F

SS

3 0.231492

0.077164 28.31702 0.00013

4.066181

8 0.0218

0.002725

ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups

Total

0.253292

11

Chiều dài lá trung bình

Anova: Single Factor

Average

Variance

Sum 15.86 5.286666667 0.487033333 23.57 7.856666667 0.046433333 20.54 6.846666667 0.021033333 29.28

0.1429

9.76 Count 3 3 3 3

F crit

P-value

MS

df

F

SS

31.634625

10.544875

60.48107256

4.066181

3 7.6927E- 06

8 1.3948

0.17435

33.029425

11 SUMMARY Groups Row 1 Row 2 Row 3 Row 4 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total

Chiều rộng lá