ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------------------------------------
NGÔ THỊ BẢO OANH
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN
TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL)
LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thái Nguyên, năm 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------------------------------------
NGÔ THỊ BẢO OANH
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN
TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL)
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 8.42.02.01
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG
2. GS.TS. NGÔ XUÂN BÌNH
Thái Nguyên, năm 2020
i
LỜI CẢM ƠN
Trang đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban
chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy
cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên
cứu này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, gửi lời cảm ơn chân thành
tới GS.TS. Ngô Xuân Bình và thầy giáo TS. Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên
khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp
đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện luận văn.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,
người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020
Học viên
Ngô Thị Bảo Oanh
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................... vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... vii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài. .......................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu. ..................................................................................... 3
3. Những đóng góp mới của đề tài. ................................................................... 3
4. Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đè tài luận án. ....................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4
1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tương. ..................................................... 4
1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương ..................................................... 5
1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trong nước và trên thế giới. ........................ 6
1.3.1. Trên thế giới. ........................................................................................... 6
1.3.2. Tại Việt Nam. .......................................................................................... 8
1.4. Đặc điểm của gen CBF1 .......................................................................... 10
1.4.1. Đặc điểm gen CBF1 .............................................................................. 10
1.4.2. Các nghiên cứu về gene CBF1 .............................................................. 10
1.5. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây
trồng ................................................................................................................ 12
1.5.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .................. 12
1.5.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-Plasmid .................................................. 13
1.5.3. Cấu trúc và chức năng T-DNA ............................................................. 13
1.5.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 14
iii
Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 16
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 16
2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 16
2.1.2. Vật liệu di truyền ................................................................................... 16
2.1.3. Hóa chất................................................................................................. 16
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 17
2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 18
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 18
2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 18
2.5. Phân tích, đánh giá cây sau chuyển gen ................................................... 21
2.6. Chọn lọc dòng chuyển gen bằng phun chất diệt cỏ Basta ....................... 24
2.7. Các chỉ tiêu đánh giá ................................................................................ 24
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 25
3.1. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22, cọc chùm, Cúc Hà
Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ......................................................... 25
3.1.1. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22. .................... 25
3.1.2. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm ............... 31
3.1.3. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc ........... 37
3.2. Đánh giá đậu tương chuyển gen dương tính bằng sử dụng phương pháp
PCR. ................................................................................................................ 44
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 47
4.1. Kết luận. ................................................................................................... 47
4.2. Đề nghị. .................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. 1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây ...... 8
Bảng 1. 2 Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam những năm gần đây ..... 9
Bảng 3. 1 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào
cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A.
Tumefaciens………………………27
Bảng 3. 2 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1
vào cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. Tumefaciens. ...................... 28
Bảng 3. 3 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí
nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens ...................................................................................................... 29
Bảng 3. 4 Kết quả chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens ...................................................................................... 30
Bảng 3. 5 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây
đậu tương Cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ............................... 33
Bảng 3. 6 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1
vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ................. 34
Bảng 3. 7 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí
nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens ...................................................................................................... 35
Bảng 3. 8 Kết quả chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens ...................................................................................... 36
Bảng 3. 9 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây
đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ............................ 38
Bảng 3. 10 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1
vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .............. 40
v
Bảng 3. 11 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí
nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens ................................................................................................. 41
Bảng 3. 12 Kết quả chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông
qua vi khuẩn A. tumefaciens............................................................................ 42
Bảng 3. 13 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các cây chuyển gen T0 ...... 44
Bảng 3. 14 Đánh giá biểu hiện gen ở cây chuyển gen T0 bằng PCR ............. 45
vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne ......................................... 13
Hình 2 Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế chuyển
T-DNA ............................................................................................................ 15
Hình 3. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương ..................................... 19
Hình 4. Một số hình ảnh quá trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương
DT22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ...................................................... 26
Hình 5. Hình ảnh cây chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM (A) và ra ... 28
Hình 6. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1
vào giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. .................... 30
Hình 7. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào giống đậu tương
cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ................................................ 32
Hình 8. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi và ra rễ ....................................... 34
Hình 9. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1
vào giống đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. .............. 36
Hình 10. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào giống đậu
tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .................................. 39
Hình 11. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi và ra rễ ..................................... 40
Hình 12. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1
vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. .......... 42
Hình 13. Hình ảnh sàng lọc cây chuyển gen sau 3 ngày bằng Basta ............. 43
Hình 14. Kết quả phân tích PCR cây chuyển gen T0 ..................................... 46
vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CCM Cocultivation medium - Môi trường đồng nuôi cấy
cDNA Complementary DNA
CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide
LB Luria-Bertani
OD600 Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600 nm bằng quang phổ kế
PCR Polymerase Chain Reaction
PCR Polymerase Chain Reaction
RM Rooting medium - Môi trường ra rễ
SEM Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi
SIM Shoot induction medium - Môi trường tạo đa chồi
1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài.
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae) là loại
cây trồng có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao. Các giống đậu tương trồng
ở Việt Nam thuộc giống phụ G. Soja, chi Glycine. Hiện nay, đậu tương trồng ở
Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phương và các giống nhập nội
[1], [2].
Hạt đậu tương có hàm lượng protein từ 32% - 52%, chứa nhiều amino
acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin, leucin...) và các vitamin (B1,
B2, C, D, E, K...) cần thiết cho cơ thể người và động vật. Ngoài giá trị dinh
dưỡng trong hạt, đậu tương còn là cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh
do có khả năng cải tạo đất. Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa
dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu
tương, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu tương...đáp ứng nhu cầu đạm trong
khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc.
Việt Nam đứng thứ 3 thế giới, sau Trung Quốc, Thái Lan về lượng tiêu
thụ sữa đậu tương với khoảng 613 triệu lít/năm và thứ 7 thế giới tính theo bình
quân đầu người với 6,8 lít/người/năm. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn, đậu tương là một trong 4 loại cây trồng chủ lực, nhưng điều bất cập là
diện tích gieo trồng ngày càng giảm. Diện tích đất canh tác nông nghiệp ngày
càng bị thu hẹp do sự phát triển của các ngành công nghiệp và dịch vụ. Bên
cạnh đó, nhu cầu về sản lượng hạt đậu tương để phục vụ cho phát triển chăn
nuôi, công nghiệp chế biến ngày một tăng. Sản lượng đậu tương không đáp ứng
đủ nhu cầu trong nước, do đó phải nhập khẩu từ các nước bên ngoài (Theo Tổng
2
cục Hải quan (GCO), trong 8 tháng đầu vụ Mùa 2016-2017, Việt Nam đã nhập
khẩu 919 nghìn tấn đậu tương trị giá 392 triệu USD).
Thêm nữa, tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán kéo dài, lượng
mưa không đều ở các vùng vào các thời điểm trong năm là một khó khăn lớn
cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ… Ngoài
những tác động trực tiếp lên quá trình canh tác, biến đổi khí hậu còn làm thu
hẹp diện tích. Sử dụng giống đậu tương biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng
trong ngành sản xuất đậu tương của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.
Đậu tương được xem là cây trồng nhạy cảm với các biến đổi khí hậu.
Dưới điều kiện bất lợi của môi trường như: hạn, mặn, lạnh…sẽ làm giảm khả
năng điều hòa trao đổi chất, ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển
của cây, làm giảm năng suất cây trồng.
Gen CBF (C-repeat binding factor) là một nhóm gen có mặt trong nhiều
loại thực vật như: Arabidopsis, lúa mì, cà chua, cây cải… Có bốn thành viên
của họ CBF giữ vai trò quan trọng trong cây, giúp cây phản ứng với những
stresses phi sinh học, giúp các hoạt động trao đổi chất tiếp tục diễn ra không bị
ngừng trệ, làm tăng thời gian sinh trưởng và phát triển của cây. Dó đó sẽ góp
phần cải thiện năng suất cũng như chất lượng hạt. Ba gen CBF1, CBF2 và CBF3
nằm trên nhiễm sắc thể số 4 phản ứng với nhiệt lạnh [30] đã chứng minh vai
trò nâng cao tính chịu lạnh ở cây thông qua cơ chế bảo vệ tế bào khi gặp điều
kiện bất lợi [31] trong khi gen CBF4 rất cần thiết cho phản ứng khi khô hạn
xảy ra. Ngoài vai trò tăng cường khả năng chịu lạnh của thực vật gen CBF2 ở
Arabidopsis đã được chứng minh làm chậm quá trình lão hóa của lá và kéo dài
tuổi thọ khoảng thời gian hai tuần [28].
3
Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu
chuyển gen CBF1 và đánh giá biểu hiện trên cây đậu tương (Glycine max
(L.) Merill)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu.
Nghiên cứu biến nạp gen CBF1 vào một số giống đậu tương của Việt Nam.
Đánh giá biểu hiện của gen CBF1 trên cây đậu tương bằng phương pháp
PCR
3. Những đóng góp mới của đề tài.
- Kết quả đạt được của đề tài có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong tiếp
cận nghiên cứu tạo dòng cây chịu stress, thích ứng với biến đổi khí hậu bằng
kỹ thuật chuyển gen ở thực vật.`
- Ứng dụng kĩ thuật PCR đã đánh giá được mức độ biểu hiện của gen
chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được dòng đậu tương chuyển
gen mang gen .
4. Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đề tài luận văn.
Ý nghĩa về mặt khoa học:
Đề tài cho thấy một hướng đi mới trong công tác chọn tạo giống cây trồng
bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens khác xa với
các phương pháp chọn giống truyền thống.
Ý nghĩa thực tiễn:
Các giống đậu tương chuyển gen tạo ra từ kết quả của đề tài có thể sử
dụng làm vật liệu khởi đầu trong công tác chọn tạo giống chống chịu tốt với
điều kiện bất lợi của môi trường mang thương hiệu Việt Nam.
4
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tương.
Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử
dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm
được xác minh. Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công
nhận rằng đậu tương có nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc.
Cây đậu tương được thuần hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều đại và được đưa
vào trồng trọt và khảo sát ở triều đại Shang (năm 1700 – 1100 B.C) trước công
nguyên.
Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill.] là một trong những cây trồng có
vị trí quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Ngoài giá trị dinh dưỡng trong
hạt, đậu tương còn là cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh do có khả
năng cải tạo đất. Diện tích cây đậu tương ở nước ta 5 năm gần đây chỉ trên
170.000 ha, năng suất bình quân xấp xỉ 1,5 tấn/ha, sản lượng hạt trên 210 nghìn
tấn, thấp hơn nhiều so với năng suất bình quân của thế giới [32].
Nguyên nhân chính là do năng suất của giống không cao, tổn thất do sâu
bệnh hại trên đồng ruộng và sau thu hoạch lớn (hàng năm, ước tính thiệt hại về
số lượng sau thu hoạch đối với đậu tương khoảng 6,2 - 14%).
Chi Glycine từng được Carl Linnaeus đưa ra năm 1737 trong ấn bản đầu
tiên của quyển Genera Plantarum. Từ glycine có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp –
Glykys (ngọt) và có thể đề cập đến chất ngọt của củ ăn được sản xuất ở Bắc
Mỹ có dạng cây đậu thân leo, Glycine apios, nay là Apios Americana. Đậu
tương được trồng được xuất hiện đầu tiên trong quyển Species Plantarum của
Linnaeus, với tên gọị Phaseolus max L. Việc kết hợp Glycine max (L.) Merr.,
5
theo đề nghị của Merrill năm 1917, đã trở thành tên gọi chính thức được công
nhận của loài này. [3], [33].
Cũng giống như các loài cây trồng khác có thời gian thuần hóa lâu dài,
mối quan hệ giữa các loài đậu tương hiện đại và các loài mọc hoang có thể
không còn dấu vết ở bất kỳ mức độ chắc chắn nào.
1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương
- Tính chịu lạnh của đậu tương
Nhiệt độ dưới 15oC có ảnh hưởng xấu đến nảy mần của hạt và sự hút
nước. Nhiệt độ dưới 13 - 15oC, giảm ra hoa, đậu quả và ảnh hưởng tới quang
hợp và bộ máy quang hợp. Tổn thương do lạnh thường gây hại màng tế bào, do
màng tế bào không có khả năng giữ cấu trúc của nó ở nhiệt độ thấp. Các mô,
chẳng hạn như hạt phấn đang lớn dễ nhạy cảm với nhiệt độ thấp hơn các mô
khác và dẫn đến sự bất dục ở cây đậu tương.
- Tính chịu hạn của đậu tương
Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu về
nước cao hơn các loại cây khác. Đó chính là do đậu tương có hàm lượng protein
và lipit cao, để tổng hợp 1 kg chất khô cần 500-530 kg nước. Trong quá trình
nảy mầm nhu cầu về nước của đậu tương chiếm 50% khối lượng hạt, trong khi
đó ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26% [3] [4].
Khi nghiên cứu các đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện
sinh lý và di truyền đã cho thấy các đặc tính này liên quan liên quan chặt chẽ
đến đặc điểm hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất.
Khả năng chịu hạn của cây đậu tương mang tính đa gen [4]. Chúng thể hiện ở
nhiều khía cạnh khác nhau như: sự phát triển của bộ rễ [11], [12], thời gian sinh
trưởng [13], cũng như bản chất di truyền của từng giống. Căn cứ vào đặc điểm
này, đậu tương được chia thành hai nhóm:
6
- Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây.
- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của cây.
Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có nhiều thành công khi
nghiên cứu sâu hơn về tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương. Maitra và
Cushman (1994) đã phân lập được cDNA của LEA (late embryogeis abudant
protein) nhóm D-95 từ lá và rễ cây đậu tương khi bị hạn. Các tác giả khác đã
nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương, tiêu biểu là công
trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội của Nguyễn
Huy Hoàng (1992) [4], nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin
tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103; phân lập gen dehydrin liên quan
đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương của Trần Thị Phương Liên (1999) [6],
Nguyễn Thu Hiền và cộng sự (2005) [5]. Nâng cao tính chịu hạn của cây đậu
tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm của Chu Hoàng Mậu (2001) [7].
1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trong nước và trên thế giới.
1.3.1. Trên thế giới.
Công tác tuyển chọn giống đậu tương trên thế giới hiện nay được tổ chức
bởi các tổ chức nghiên cứu quốc tế như INTSOY (Chương trình Nghiên cứu
Đậu tương Quốc tế), Trung Tâm nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia
(ASIAR), Viện Quốc tế Nông nghiệp nhiệt đới (IITA), Mạng lưới Đậu đỗ và
Ngũ cốc Châu Á (CLAN). Với sự phát triển mạnh mẽ của di truyền học và công
nghệ sinh học, các hướng nghiên cứu và thành tựu nổi bật cải biến giống đậu
tương chống chịu các điều kiện bất lợi như: sâu bệnh, ngập úng, hạn hán, tình
trạng chua mặn và đất nghèo dinh dưỡng (FAO - Rapa, 2002).
Năm 2006, trạm Thử nghiệm Nông Nghiệp thuộc Đại học Bắc Dakota
(NDSU) đã phát triển giống đậu tương chuyển gen “G7008RR” kháng thuốc
trừ cỏ Roundup năng suất 6 tấn/ha. Đang nghiên cứu đưa vào sản xuất giống
7
Đậu tương có tính chịu hạn (Hiệp hội Hạt giống Mỹ, 2006), chịu sâu (Mosanto,
2006).
Trong tình hình biến đổi khí hậu toàn cầu như hiện nay, khô hạn gây ảnh
hưởng bất lợi đến sự sinh trưởng và năng suất cây trồng. Trong các điều kiện
hạn, cây trồng thường có những phản ứng sinh lý chung, phức tạp để thích nghi
và tồn tại. Thực vật có cơ chế điều tiết chống chịu sự phân giải nước trong các
cơ quan có chức năng quang hợp. Riêng với các cây đậu đỗ trong đó có cây đậu
tương, một đặc tính bất lợi khi gặp khô hạn là khí khổng không đóng kín hoàn
toàn, làm trầm trọng sự thiếu nước của cây. Để thích ứng, loài cây này dựa vào
một loại protein gọi là Betta được cảm ứng tiết ra khi cây gặp hạn.
Bộ Nông nghiệp Mỹ, tháng 6/2004 đã thiết lập một dự án nghiên cứu làm
tăng vị trí cạnh tranh của đậu tương Mỹ trên thị trường thế giới dựa vào đa dạng
di truyền và tạo giống (Dự án nghiên cứu: Tăng cường vị thế cạnh tranh về đậu
tương trên thị trường toàn cầu thông qua sự đa dạng di truyền và nhân giống
cây trồng. Trong dự án này, chọn tạo các dòng giống đậu tương có khả năng
chịu hạn là một trong những mục tiêu chính. Dự án đã thành lập đội ngũ nghiên
cứu tính chịu hạn gồm 3 lĩnh vực nghiên cứu chính: Sinh lý học – tìm hiểu và
đánh giá khả năng chịu hạn; Chọn giống - thực hiện các phép lai di truyền và
thử nghiệm đồng ruộng; Di truyền phân tử - sử dụng chỉ thị ADN để xác định
vị trí lập bản đồ các gen chịu hạn.
Tại Mỹ, nước sản xuất đậu tương lớn nhất thế giới, các nghiên cứu cơ bản,
các hướng chiến lược chọn tạo, cải thiện giống đậu tương rất được quan tâm.
Ngân hàng dữ liệu đã được thành lập, hộp tra cứu cho các nhà chọn giống đậu
tương, đây là các kết quả nghiên cứu liên kết giữa các nhà nghiên cứu di truyền
và sinh học phân tử đậu tương dùng để tra cứu, cập nhật, liên kết nghiên cứu
cơ bản phục vụ chọn giống đậu tương đang thực hiện. Chương trình Soybean
8
genomics, đồng thời đưa ra Chiến lược chọn giống đậu tương trong những năm
tới, hy vọng sẽ có nhiều kết quả nghiên cứu ứng dụng có tính chất đột phá về
cây đậu tương như được cải thiện rõ rệt về năng suất, tính chống chịu và chất
lượng.
Bảng 1. 1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần
đây
Diện tích Năng suất Sản lượng Năm (triệu ha) (tạ/ha) (triệu tấn)
2014 117,74 26,02 306,34
2015 120.90 26,74 323.30
2016 121,64 27,59 335,61
2017 123,89 28,49 353,02
2018 124,92 27,91 348,71
(Nguồn: FAOSTART,2020)
Qua số liệu bảng 1.1 cho thấy:
Về diện tích từ năm 2014- 2018 có tăng lên nhưng dao động trong khoảng
117,74 – 124,92 (triệu ha). Cao nhất năm 2018 tăng 7,18 (triệu ha).
Về năng suất và sản lượng không ngừng tăng trưởng cao nhất vào năm
2017 đạt 353,02 (triệu tấn). Trong vòng 5 năm từ 2014 – 2018 sản lượng tăng
42,40 (triệu tấn). Sản lượng tăng như vậy là do diện tích trồng trong những năm
gần đây tăng lên và đã được sử dụng các tiến bộ khoa học tiên tiến vào sản xuất. 1.3.2. Tại Việt Nam.
Công tác chọn tạo giống đậu tương ở Việt Nam hiện do 8 cơ quan
nghiên cứu tham gia: Viện Di truyền Nông nghiệp, Trung tâm Nghiên cứu
Đậu đỗ- Viện Cây lương thực và Cây Thực phẩm, Viện Khoa học Kỹ thuật
9
Nông nghiệp Miền Nam, Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Viện
Nghiên cứu Ngô, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Đại học Cần Thơ, Viện
nghiên cứu dầu và cây có dầu. Thành tựu về việc Chọn tạo giống đậu
tương chuyển gen có khả năng chống chịu cao, thích ứng rộng.
Bảng 1. 2 Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam những năm gần
đây
Diện tích Sản lượng Năng suất Năm (nghìn ha) (ngàn tấn) (tấn/ha)
2014 109,4 156,5 1,43
2015 100,8 146,4 1,45
2016 99,6 160,7 1,61
2017 68,4 101,7 1,49
2018 53,3 80,8 1,52
(Nguồn: Tổng cục Thống kê (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn, 2020)
Về diện tích: Diện tích gieo trồng đậu tương của nước ta chiếm tỉ lệ nhỏ
trong tổng diện tích gieo trồng và ngày càng có xu hướng giảm xuống. Nếu tính
từ năm 2014 thì đến năm 2018 diện tích đã giảm xuống 56,1 nghìn ha
Về mặt năng suất: tuy số lượng chưa đáp ứng đủ so với nhu cầu ngày một
tăng của nhu cầu trong nước, nhưng nhờ áp dụng những tiến bộ khoa học trong
việc chọn tạo giống và các biện pháp canh tác, năng suất đậu tương trong năm
năm gần đây đã tăng từ 1,43 tấn/ha (2014) lên 1,52 tấn/ha (2018) trong khi diện
tích gieo trồng giảm hơn nửa.
Hiện nay Bộ Tài nguyên và Môi trường đang ban hành qui định khung
(regulatory framework) đánh giá và xét duyệt các giống cây trồng chuyển gen
10
và sử dụng chúng trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Bộ cũng đang xây
dựng qui trình (Circular on the Procedure) chứng nhận an toàn sinh học cho các
sản phẩm chuyển gen, đây cũng là khung pháp lý cơ bản để khảo nghiệm đánh
giá và hợp thức hóa các cây trồng chuyển gen như: bông vải, đậu tương, bắp…
Bộ Nông nghiệp và PTNT cũng xây dựng các thông tư hướng dẫn xét duyệt
các sản phẩm chuyển gen (Circulars on the approval of GMO) được phép sử
dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
1.4. Đặc điểm của gen CBF1
1.4.1. Đặc điểm gen CBF1
Hoạt chất phiên mã liên kết với yếu tố điều hòa DRE / CRT và gây ra sự
biểu hiện gen COR (lạnh được điều hòa) làm tăng khả năng chịu lạnh của cây
trồng. Nó mã hóa một thành viên của họ DREB A-1 của họ hệ số phiên mã
ERF/AP2 (CBF1). Protein chứa một tên miền AP2. Có bốn thành viên của họ
CBF đáp ứng với stress phi sinh học của cây. Ba gen đầu tiên là CBF1, CBF2
và CBF3 rất cần thiết cho phản ứng với nhiệt độ lạnh, trong khi gen CBF4 rất
cần thiết cho phản ứng khi có khô hạn xảy ra. Gen CBF1 này liên quan đến
phản ứng với nhiệt độ thấp và axit abscisic [36].
Ngoài vai trò trong việc tăng cường khả năng chịu lạnh của thực vật, sự
biểu hiện quá mức của gen CBF trong cây Arabidopsis đã góp phần làm chậm
quá trình khởi phát của lá lão hóa và kéo dài tuổi thọ của cây. Sự biểu hiện của
gen CBF cũng có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen yếu tố phiên mã và
gen liên quan đến chuyển hóa protein, suy thoái và biến đổi sau dịch mã [28].
1.4.2. Các nghiên cứu về gen CBF1
Để khai thác tốt chức năng khác nhau giữa CBF1 (StCBF1) của khoai tây
trồng và CBF1 (ScCBF1) của khoai tây hoang dại Commerson, nhóm nghiên
cứu của Jian Li thuộc Đại học Nông nghiệp Sơn Đông đã cho biểu hiện thành
11
công hai gen này trong cây Arabidopsis với hai dòng khác nhau. Tất cả cây
chuyển gen ấy đều biểu hiện kiểu hình lùn, trổ bông muộn, lá dầy hơn và điểm
những chấm hồng. Tuy nhiên, dòng chuyển gen ScCBF1 biểu hiện sự chống
chịu đáng kể đối với lạnh giá và khô hạn hơn dòng chuyển gen StCBF1. Mức
độ thể hiện của nhiều gen liên quan đến chịu lạnh và phát triển, bao gồm các
gen ức chế cây tăng trưởng và trổ bông muộn, cũng cao hơn trong tất cả các
cây chuyển gen.
Kết quả cho thấy hai gen CBF1 có vai trò quan trọng trong phản ứng của
cây đối với stress phi sinh học, tăng trưởng và phát triển. Tuy nhiên, ScCBF1
có chức năng rõ hơn StCBF1 [37].
+ Nhóm tác giả: Li Y, Song Y, Xu B, Xie J, Zhang D, Cooke J thuộc
trường đại học khoa học và công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp Bắc Kinh,
Bắc Kinh, Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu “Hoạt động đặc biệt của gen
CBF1 cây dương trong một mạng lưới điều hòa lạnh tích hợp”. Các yếu tố liên
kết C-repeat (CBFs), cũng được gọi là thành viên nhóm protein yếu tố phản
ứng mất nước (DREB1), đóng vai trò quan trọng trong việc thu nhận khả năng
chịu stress, nhưng trong cây, các cơ chế cơ bản của khả năng chịu stress vẫn
còn khó nắm bắt. Để hiểu rõ hơn về các cơ chế này, nhóm nghiên cứu đã phân
lập năm orthologs CBF1 từ bốn phần cây dương (Populus spp). Và đánh giá biểu
hiện của chúng trong điều kiện hạn hán, lạnh, nhiệt và muối.
Biểu hiện trên toàn phần gây ra trong phản ứng với lạnh gợi ý một mối
tương quan giữa biểu hiện CBF1 dương tính và việc thu nhận khả năng chịu
lạnh. Các phản hồi thay đổi giữa các phần có thể phản ánh các cơ chế chịu ứng
suất theo từng phần cụ thể, cho thấy ảnh hưởng của bối cảnh sinh thái đối với
sự phát triển khả năng chịu ứng suất trung gian CBF1 trong cây dương. Sau đó,
nhóm nghiên cứu đã sử dụng chiến lược tìm kiếm toàn bộ bộ gen trong Populus
12
trichocarpa để dự đoán 2263 gen mục tiêu CBF giả định; các gen được xác
định tham gia vào nhiều quá trình và con đường sinh học. Hầu như tất cả các
gen mục tiêu giả định có chứa nhiều yếu tố tác động cis mà trung gian phản
ứng với các tín hiệu môi trường và nội sinh khác nhau, phù hợp với vai trò quan
trọng của CBF1 trong một mạng lưới điều hòa lạnh tích hợp. Cuối cùng, phân
tích 528 cá thể của Populus simonii đã xác định sáu đa hình đơn nucleotide (tỷ
lệ phát hiện sai Q<0,10) đáng kể (P<0,005) kết hợp với sản xuất
malondialdehyde và rò điện phân, cho thấy tầm quan trọng tiềm năng của
PsCBF1 trong quy định một số chức năng liên quan đến màng tế bào. Phát hiện
của nhóm nghiên cứu cung cấp những hiểu biết mới về chức năng của PsCBF1
và làm sáng tỏ mạng lưới quy định trung gian CBF trong cây dương [38].
1.5. Vi khuẩn A. tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng
1.5.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn A. tumefaciens
A. tumefaciens là loài vi khuẩn gram âm, có khả năng gây bệnh khối u cho
140 loài cây trồng [14] A. tumefacien là một trong hai loài vi khuẩn sống trong
đất gây ra bệnh khối u hình chóp (crown gall) ở các vị trí tổn thương của thực
vật hai lá mầm. Việc tạo thành khối u do quá trình tổng hợp amino acid mới và
các dẫn xuất của đường được biết chung là opine [15]; [16]. Loại opine tổng hợp
trong khối u như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine phụ
thuộc vào dòng Agrobacterium khởi đầu sự hình thành khối u. Octopyne và
nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất
trong mô khối u. Do đó nhiều dòng A. tumefaciens phổ biến được thiết kế theo
kiểu octopine hoặc nopaline. Agrobacterium chịu trách nhiệm đối với sự hình
thành khối u dị hóa một cách có chọn lọc opine mà nó tổng hợp được và sử dụng
opine như là một nguồn cacbon và nitơ.
13
1.5.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-Plasmid
Ti-plasmid được phát hiện ở tất cả các chủng A. tumefaciens gây nhiễm và
tồn tại bền vững ở nhiệt độ dưới 30oC. Đây là một phân tử DNA dạng mạch
vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép độc lập, có kích
thước khoảng 200 kb [17].
Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T – DNA được chuyển từ vi khuẩn sang
genome của các cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở trong đó. Tuy nhiên, vùng
này lại không mã hóa những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T –
DNA mà cần có sự trợ giúp đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng gây
độc (Virulence Region – vùng Vir) và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn. Vùng Vir
dài khoảng 40 kb đảm nhiệm chức năng gây nhiễm. Ở Ti-plasmid dạng octopin,
vùng Vir chứa tới 24 gen gây độc. Sản phẩm protein do các gen này mã hóa đã
kích thích sự tách biệt T – DNA, bao bọc che chở và giúp chúng tiếp cận với
genome cây chủ [18].
Hình 1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne
1.5.3. Cấu trúc và chức năng T-DNA
T-DNA là nhân tố chính trong việc chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thực
vật và hợp nhất với hệ gen nhân. Vị trí hợp nhất của T-DNA vào DNA thực vật
là hoàn toàn ngẫu nhiên [19], [21]. Các vùng tương đồng với T-DNA đã được
14
tìm thấy ở các Ti-plasmid khác nhau. Trong các dòng Agrobacterium
tumefaciens kiểu nopaline được sử dụng phổ biến. Vùng T-DNA có kích thước
khoảng 24 kb. T-DNA được giới hạn bởi đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn
toàn khoảng 25 bp gọi là đoạn biên [20].
Ở Ti-plasmid nopaline vị trí tmr mã hóa một enzyme liên quan đến hệ thống
cytokinin và sự đột biến ở đây dẫn đến sự tăng sinh rễ từ các khối u đã gây ra ở
một số loài. Các vị trí tms 1 và tms 2 liên quan đến sự tổng hợp không điều hòa
của auxin và sự đột biến một trong hai vị trí gây nên sự tăng sinh chồi từ các khối
u ở nhiều loại thực vật. Vì vậy, T-DNA mang các gen (tms 1, tms 2 và tmr) mà
sản phẩm của chúng không chịu sự điều hòa bình thường của các con đường
chuyển hóa thực vật liên quan đến sự tổng hợp phytohormone. Do đó các gen
tms 1, tms 2 và tmr được xem là các gen gây khối u [22].
1.5.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens
Các tế bào thực vật bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hóa học dẫn dụ vi
khuẩn như: bám vào thành tế bào chủ và chuyển T – DNA vào tế bào thực vật
[23], [25]. Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen Vir và RB, LB.
Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng Vir
hoạt động và tăng cường biểu hiện.
Hoạt động của các gen Vir sinh ra sợi đơn T – DNA làm xuất hiện bản
copy sợi bên dưới của T – DNA [24]. Chỉ đoạn sợi đơn DNA giữa hai trình tự
biên (LB và RB) của T – DNA mới được chuyển vào tế bào thực vật, và được
gắn vào genome của tế bào. Đó là yếu tố hoạt động cis của hệ thống vận chuyển
T – DNA. Protein Vir D1, D2 đóng vai trò là chìa khóa trong bước này, chúng
nhận ra trình tự biên T – DNA và cắt sợi bên dưới tại mỗi bên. Điểm cắt là điểm
đầu và kết thúc của sợi tái sinh. Sau đó, protein Vir D2 vẫn còn gắn kết với đầu
cuối 5’ của sợi T – DNA và tế bào thực vật [23], [25]. Nếu gây đột biến hay
15
loại bỏ đoạn RB thì hầu như mất hoàn toàn khả năng chuyển T – DNA, còn nếu
đột biến LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển T – DNA [26]. Điều đó chứng tỏ
tổng hợp sợi T – DNA là từ đầu 5’ đến 3’, được bắt đầu từ đoạn RB và kết thúc
ở LB.
Phức hợp sợi đơn T-DNA-vir D2 được bao bọc bởi protein vir E2 có trọng
lượng 96 kDa. Sự phối hợp này giúp ngăn cản sự tấn công của nuclease, hơn
nữa sợi đơn T-DNA duỗi thẳng làm giảm kích thước của phức xuống xấp xỉ
2nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển qua các kênh dẫn truyền
trên màng tế bào. Protein vir E2 chứa đựng hai tín hiệu định vị trong nhân tế
bào thực vật và một protein vir D2 [27].
Protein vir D4 cũng là bắt buộc đối với sự vận chuyển phức ss-T-DNA.
Chức năng của protein vir D4 là liên kết với ATP độc lập với phức protein
cần thiết đối với quá trình di truyền T-DNA [23].
Mô hình mô tả các sự kiện xảy ra ở mức phân tử trong sự tương tác giữa
tế bào thực vật và Agrobacterium để hình thành khối u.
Hình 2 Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế
chuyển T-DNA
16
Chương 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Giống đậu tương: sử dụng giống đậu tương trồng phổ biến ở khu vực miền
núi phía Bắc: DT22, Cọc chùm, Cúc Hà Bắc do Trung tâm Tài nguyên Thực
Vật cung cấp.
2.1.2. Vật liệu di truyền
- Vector chuyển gen pER10-pUBQ14:CBF1
- Chủng vi khuẩn chuyển gen: EHA105
- Mồi đặc hiệu:
Gen bar:
Bar-F: 5’- ATGAGCCCAGAACGACG-3’
Bar-R: 5’-TCAGATCTCGGTGACGG-3’
Gen CBF1:
CBF1-F: 5’- ATCAGCGGCCGCATGAACTCATTTTCAGCTTT-3’
CBF1-R: 5’- ATAACTAGTTTAGTAACTCCAAAGCGACACG-3’
Các vật liệu trên do phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Công nghệ
Sinh học và công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái
Nguyên cung cấp.
2.1.3. Hóa chất
Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần nền khoáng B5, MS.
Chất dẫn dụ Acetosyringone (AS), chất bổ sung: Yeast extract, L-Cysteine,
trypton, sucrose, agarose… và các thành phần hóa chất trong phân tích sinh học
phân tử được liệt kê theo các hãng sản xuất sau đây:
- Merk: Na2EDTA, NaCL, Tris-HCL, CTAB, Acetosyringone.
- Wako: β-mercaptoethanol, Phenol: Cloroform: Izoamyl alcohol
(25: 24: 1), Cloroform: Izoamyl alcohol (24:1), Izopropanol, Ethanol.
17
- Fermentas: dNTP, MgCl2, Taq, mồi, PCR buffer.
- Sigma: Agarose, Ethidium bromide (EtBr), Hygromycin.
Hóa chất được sử dụng để tách chiết DNA như sau :
1) Đệm CTAB 100 ml gồm:
- CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 2,25 gam
– Mercapto ethanol : 250 l
- EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : 4,5 ml
- NaCl 5M : 30 ml
- Tris HCl 8,0 : 15 ml
: 55 ml - H2O
2) Đệm TE EDTA pH 8,0 gồm:
- Tris HCl 8,0 : 10 mM
- EDTA 8,0 : 1 mM
3) Enzyme RNase : 10 g/ml
4) Cồn tuyệt đối lạnh
5) NaCl 5 M
6) Dung dịch (24:1) gồm Chloroform/Isoamylalcohol pha theo tỷ lệ 24/1.
7) Dung dịch (25:24:1) gồm Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol pha
theo tỷ lệ 25/24/1.
8) Dung dịch rửa là cồn 75%.
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm
Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu được bao gồm:
- Cân điện tử (Sartonicus / CP224S)
- Tủ ổn nhiệt 28oC/37oC (Innova 4230),
- Tủ cấy vô trùng cấp II (ESCO – EQR/GL 05),
- Máy li tâm lạnh (Eppendorf - 5810R),
18
- Máy hút chân không (Eppendorf Concentrator – 5310),
- By hút chân không (Eppendorf Concentrator –Máy nhân gen (Gene
Amp PCR system 9700/ Applied Biolosystems),
- By nhân gen (Gene Amp PCR syst
- Máy khử trùng (ASV – 2402),
- Báy khử trùng (ASV – 2402), m
Máy soi gel (B-2300 TVRN Hout),
-
- Bình Schoff (250 ml, 500ml, 1000 ml),
- Bình tam giác (100 ml, 250 ml),
- Đĩa petri...
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ
thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm –Đại học Thái Nguyên.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1. Chuyển gen CBF1 vào giống đậu tương DT22, cọc chùm, Cúc
Hà Bắc.
- Nội dung 2. Chọn lọc, phân tích các dòng đậu tương chuyển gen sau biến
nạp bằng phương pháp PCR.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp biến nạp gen vào đậu tương
Gen CBF1 được chuyển vào giống DT22, cọc chùm, Cúc Hà Bắc thông qua
vi khuẩn A. tumefacience. Quy trình thực hiện sử dụng phương pháp nửa hạt có
cải tiến (half- seed) của Magie M. Paz và cộng sự (2006) [39].
Số mẫu biến nạp 100 mẫu/lần biến nạp. Mẫu biến nạp được nuôi cấy trên
đĩa petri, 5-7 mẫu/đĩa trong điều kiện 25OC, 16/8 giờ sáng/tối. Thành phần môi
trường nuôi cấy được trình bày chi tiết ở phần phụ lục. Biến nạp gen bằng
phương pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefacience được thực hiện theo
sơ đồ hình 3 dưới đây:
19
Hạt đậu tương Chủng vi khuẩn A. tumefacience
Khử trùng bề mặt Nuôi lỏng tạo dịch huyền phù
Gây tổn thương nách lá mầm, sau đó lây nhiễm 30 phút trong dịch khuẩn
Đồng nuôi cấy trên CCM trong 5 ngày
Cảm ứng tạo chồi trên SIM (4 tuần)
Cắt bỏ lá mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM
Ra rễ trên RM
Ra cây
Hình 3. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương
2.4.2. Phương pháp chuẩn bị mẫu đậu tương.
Hạt đậu tương trưởng thành không có bất kỳ khuyết tật nào được lau
sạch bằng vải bông (được làm ướt bằng cồn 75%), sau đó khử trùng bề mặt
trong 16 giờ bằng khí clo (100 ml NaClO + 10 ml HCl hoặc 100 ml NaClO + 3,5
ml HCl) trong một buồng kín. Để có được mẫu cấy một lá mầm nửa hạt, các
hạt đã khử trùng được ngâm trong nước vô trùng ở 23°C dưới bóng tối trong
16 -18 giờ.
2.4.3. Biến nạp gen thông qua Agrobacterium tumefaciens
20
(A). Tạo dịch huyền phù Agrobacterium tumefaciens
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid quan tâm được
cất giữ trong glycerol ở -200C. Nuôi lắc vi khuẩn trong môi trường LB lỏng có
bổ sung kháng sinh tương ứng, nuôi ở 280C trong 20 giờ (lắc 200 vòng/phút).
Mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy quang phổ ở bước sóng 600nm
(OD600). Ly tâm dịch khuẩn ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn tế
bào. Cặn tế bào được làm loãng trong 50 ml môi trường lỏng lây nhiễm CCM
(phục lục thành phần môi trường) nuôi lắc 200 vòng/phút ở 280C khoảng 40-
60 phút trước khi biến nạp.
(B). Lây nhiễm vi khuẩn
Các hạt có vỏ bọc được dùng dao cắt theo chiều dọc của hilum, và các lớp
vỏ hạt được loại bỏ. Các lá mầm được tạo tổn thương. Chuyển các mẫu cấy nửa
hạt vào đĩa petri có chứa dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium đã chuẩn bị
sẵn lây nhiễm trong 30 phút. Có lắc nhẹ nhàng (50 -70 vòng/phút). Sau đó đặt
mẫu vừa lây nhiễm vào đĩa petri chứa môi trường lây nhiễm bán rắn CCM. Mẫu
đồng nuôi cấy ở điều kiện 230C và thời gian chiếu sáng 18/6h sáng/tối trong 5
ngày.
(C). Tạo chồi
Sau quá trình đồng nuôi cấy, các mẫu đậu tương được rửa nhanh bằng môi
trường tạo chồi lỏng SIM (phục lục thành phần môi trường) có bổ sung kháng
sinh Cefotaxime để ức chế sự phát triển của vi khuẩn (kết hợp lắc nhẹ). Sau đó
mẫu được cấy trên môi trường rắn tạo chồi (SIM) lần thứ nhất có bổ sung kháng
sinh diệt khuẩn trong khoảng 14 ngày. Cắt bỏ phần lớn lá mầm, thu các cụm chồi
tạo thành chuyển sang môi trường tạo chồi lần thứ hai có bổ sung chất chọn lọc
và kháng sinh diệt khuẩn, duy trì 14 ngày ở chế độ 230C và thời gian chiếu sáng
18/6h sáng/tối để chọn lọc chồi chuyển nạp gen.
21
(D). Kéo dài chồi
Tách riêng biệt các chồi từ cụm chồi thu được chuyển sang môi trường
kéo dài SEM (phụ lục thành phần môi trường).) có bổ sung chất chọn lọc thích
hợp để tái sinh chồi. Nuôi 4 tuần ở chế độ 250C, với 18/6h sáng/tối. Trong thời
gian này chia làm hai lần cấy chuyển.
(E). Tái sinh cây biến nạp gen hoàn chỉnh
Khi chồi phát triển có chiều dài khoảng trên 4 cm được chuyển sang môi
trường tạo rễ RM (phụ lục thành phần môi trường) nuôi sáng ở 250C, thời gian
từ 2-3 tuần.
(F). Chuyển cây ra đất
Cây tái sinh trên môi trường RM có 3-4 rễ, cao 3-4 cm được chuyển ra đất
trồng.
2.5. Phân tích, đánh giá cây sau chuyển gen
Đánh giá đậu tương chuyển gen bằng chất diệt cỏ Basta.
Các cây con được trồng trong bầu đất, sau 2 – 3 tuần khi cây đủ ba lá tiến
hành phun Basta 2 lần liên tiếp, mỗi lần cách nhau 3 ngày với nồng độ
glufosinate 10 mg/L. Sau 2 lần phun, quan sát sự biểu hiện của cây, thu mẫu
lá của cây con còn sống để tách chiết DNA.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ lá đậu tương
Khi cây có lá thứ 5 thì tiến hành thu mẫu lá để tách chiết DNA. DNA được
tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp CTAB của Saghai Maroof (1984) có
cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Tách chiết DNA từ lá đậu tương
- Bước 1: Nghiền 0,3-0,5 gam lá đậu tương trong nitơ lỏng thành bột mịn.
- Bước 2: Chuyển bột lá vào ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 0,8 ml đệm CTAB
đã ủ ở 650C trong 10 phút.
22
- Bước 3: Ủ các ống ly tâm ở 650C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt
khoát 20 phút một lần để việc tách có hiệu quả.
- Bước 4: Ly tâm 12.000 vòng/phút, hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ
sung 0,7 ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ nhàng trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm
trong 10 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại 2 lần).
- Bước 5: Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung (25:24:1) tỷ lệ (1:1) lắc
nhẹ trong 20 phút. Rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Bước 6: Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol vào tỷ lệ 1:1
với mẫu, bổ sung thêm 3-5 l NaCl 5M. Lắc nhẹ trong 10 phút. Để trong tủ -
200C qua đêm.
- Bước 7: Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.
- Bước 8: Rửa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20
phút (thực hiện 2 lần).
- Bước 9: Loại bỏ dịch lỏng làm khô bằng máy ly tâm hút chân không
(20 phút).
- Bước 10: Bổ sung 30 l H2O + 1 l RNase sau đó ủ ở 370C trong 30
phút. Đem cất giữ ở -200C.
Phương pháp phân tích PCR các cây biến nạp gen
Chúng tôi sử dụng hai cặp mồi gen bar và CBF1 xác định sự có mặt của
gen CBF1. Trình tự cặp mồi được trình bày ở mục 2.1.2:
Hỗn hợp phản ứng bao gồm:
12l - H2O
- Dung dịch đệm PCR 10X 2,0 l
1,0 l - MgCl2 (50 mM)
- dNTP (1 mM) 2,5 l
- Mồi xuôi (50 ng/l ) 0,5 l
23
- Mồi ngược (50 ng/l ) 0,5 l
- Tag-polymerase (5UI/l ) 0,5 l
- DNA (25 ng/l ) 1 l
Tổng thể tích phản ứng 20 l
Chương trình chạy như sau:
- 940C trong 2 phút
- 940C trong 1 phút
- 550C trong 45 giây 35 chu kỳ
- 720C trong 1 phút
- 720C trong 10 phút
- 40C
Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose nồng độ 1%
Chuẩn bị bản gel:
- Chuẩn bị khay điện di, lau khô, cài lược, chỉnh cho cân bằng.
Chuẩn bị gel agarose 1%, đưa vào lò vi sóng khoảng 2 phút cho agarose
tan hoàn toàn trong dung dịch 1xTBE. Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn
50-600C, bổ sung ethidium bromide rồi đổ vào khay điện di.
Sau khoảng 45-60 phút gel đông lại, rút lược khỏi bản gel. Đặt khay vào bể
điện di, bổ sung thêm dung dịch 1xTBE cho ngập mặt gel.
Tra mẫu DNA:
Lấy 2l đệm tra mẫu, thêm vào 8l DNA sản phẩm, trộn đều rồi tra vào
các giếng. Tra thêm DNA marker 1 kb vào giếng đầu tiên để xác định độ dài
của các băng DNA.
Lắp nguồn điện vào bể điện di, chỉnh điện thế từ 85-100V trong khoảng 45
phút đến 1 giờ. DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường.
Dựa vào vị trí của các vạch màu để dừng quá trình điện di
24
Nhuộm bản gel và chụp ảnh: Gel được soi dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng
245-260 nm của máy soi và chụp ảnh bản gel bằng máy CLS-Microdoc (Clever
Scientific Ltd)
2.6. Các chỉ tiêu đánh giá
Tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp phản ánh các yếu tố làm ảnh hưởng tới quá
trình biến nạp. Tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp được tính như sau:
Số mẫu kéo dài chồi Tỷ lệ mẫu sống sót sau chọn lọc (%) = ×100 % Tổng số mẫu đa chồi
Số mẫu sống sót sau chọn lọc Tỷ lệ mẫu đa chồi đậu tương (%) = ×100 % Số mẫu đưa vào chọn lọc
- Hiệu quả chuyển nạp gen thông qua chất chọn lọc thực vật:
Số cây sống
Hiệu suất chuyển gen = x 100 (%)
Tổng số chồi chọn lọc
Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê
toán học và phần mềm Microsolf Excel.
25
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22, cọc chùm, Cúc
Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Nghiên cứu biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22, cọc chùm,
Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được tiến hành với tổng số 1000
mẫu trong 10 lần thí nghiệm. Hạt đậu tương trưởng thành không bị sâu bệnh
được khử trùng bề mặt trong 16 giờ bằng khí clo trong một buồng kín (Hình
4A).
Để có được mẫu cấy một lá mầm nửa hạt, các hạt đã khử trùng được ngâm
trong nước vô trùng ở 23°C dưới bóng tối trong 16 -18 giờ. Các lá mầm được
tạo tổn thương. Chuyển các mẫu cấy nửa hạt vào đĩa petri có chứa dịch huyền
phù vi khuẩn Agrobacterium đã chuẩn bị sẵn lây nhiễm trong 30 phút (Hình
4B- 4C). Có lắc nhẹ nhàng (50 -70 vòng/phút).
3.1.1. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22.
Mẫu lá mầm sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được đồng nuôi cấy trên môi
trường CCM rắn ở điều kiện 230C và thời gian chiếu sáng 18 / 6h (sáng /tối) trong
5 ngày (Hình 4D).
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, các mẫu cấy có chuyển xanh (Hình 4E) được
đưa sang môi trường cảm ứng tái sinh chồi SIM lần 1trong 14 ngày có bổ sung
kháng sinh diệt khuẩn (Hình 4F). Cắt bỏ phần lớn lá mầm, thu các cụm chồi tạo
thành chuyển sang môi trường tạo chồi lần thứ hai có bổ sung chất chọn lọc và
kháng sinh diệt khuẩn, duy trì 14 ngày ở chế độ 230C và thời gian chiếu sáng 18/6h
sáng/tối để chọn lọc chồi chuyển nạp gen. (Hình 4G). Các chồi chết là các chồi
không chứa gen biến nạp.
26
B
C
A
E
D
G
F
Hình 4. Một số hình ảnh quá trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu
tương DT22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Ghi chú:
(A): khử trùng hạt; (B): dung dịch huyền phù vi khuẩn; (C): lây nhiễm đậu
tương trong dung dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium; (D-E): đồng nuôi
cấy trên môi trường CCM; (F): Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi
trường SIM lần 1; (G): Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường
SIM lần 2.
27
Bả5003. Error! Bookmark not defined. Kết quả tạo đa chồi của các thí
nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn
A. Tumefaciens
Số lượng mẫu Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi Lần thí Số mẫu nghiệm (%) CCM SIM1
Lần 1 100 90 61 67,78
Lần 2 100 91 65 71,42
Lần 3 100 92 62 67,39
Lần 4 100 95 72 75,79
Lần 5 100 97 66 68,04
Lần 6 100 84 58 69,04
Lần 7 100 72 51 70,83
Lần 8 100 88 59 67,05
Lần 9 100 86 54 62,79
Lần 10 100 91 55 60,44
68,05 Tổng cộng 1000 886 603
Qua kết quả bảng 3.1 cho thấy: sau 10 lần chuyển gen tổng số 1000 mẫu
đậu tương DT22 được lây nhiễm với vi khuẩn mang gen CBF1. Sau 5 ngày
đồng nuôi cấy thu được 886 mẫu sống sót. Với số mẫu tạo chồi là 603 sau
14 ngày tái sinh và chọn lọc lần thứ nhất trên môi trường SIM1 có chứa
10mg/l PPT. Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi đạt 68,05%, chứng tỏ bước đầu biến nạp
đã thành công.
Sau 14 ngày chọn lọc trên môi trường SIM1, mẫu cấy tiếp tục được chọn lọc
trên môi trường SIM2 có chứa 5mg/l PPT trong 14 ngày. Mẫu được cấy chuyển
sang môi trường cảm ứng kéo dài chồi SEM. Chồi tái sinh có kích thước khoảng
4 cm (Hình 5A) được chuyển sang môi trường tạo rễ RM để phát triển thành cây
hoàn chỉnh (Hình 5B).
28
B
A
Hình 5. Hình ảnh cây chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM (A)
và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường RM (B)
Bết quả Error! Bookmark not defined. KSEQ Bả mẫu biến nạp kéo dài
chồi và ra rễB)EM (A) và ra và ra khi chồi kéoT22 thông qu thông qua vi
khu n A. Tumefaciens.
Số lượng mẫu Lần thí Tỷ lệ sống sau chọn lọc
nghiệm bằng kháng sinh (%) SIM2 SEM RM
Lần 1 61 11 4 18,03
Lần 2 56 5 3 8,93
Lần 3 62 5 5 8,06
Lần 4 67 6 3 8,96
Lần 5 66 7 4 10,61
Lần 6 58 4 3 6,90
Lần 7 51 7 4 13,73
Lần 8 59 7 3 11,86
Lần 9 54 2 1 3,70
Lần 10 55 1 0 1,82
Tổng cộng 589 55 30 9,34
29
Kết quả chọn lọc từ 589 mẫu trên môi trường SIM2 thu được tổng số 55
chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc SEM (tỷ lệ 9,34%), số chồi đủ tiêu chuẩn
chuyển sang môi trường tạo rễ là 30 chồi (Bảng 3.2, Hình 5).
Cây chuyển gen được chuyển ra chậu đất và trồng trong nhà lưới cho đến
khi trưởng thành (Hình 6A). Kết quả biến nạp của 10 thí nghiệm đã thu được 12
cây đậu tương chuyển gen T0 sống sót sau khi chuyển ra trồng trong điều kiện nhà
lưới (Hình 6B). Cây chuyển T0 tiếp tục được chọn lọc bằng thuốc trừ cỏ basta và
PCR.
Bảng 3. 1 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các
thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens
Lần thí Chồi sống sót sau chọn lọc tạo rễ trên Số cây sống sót
nghiệm môi trường RM sau khi ra đất
Lần 1 4 2
Lần 2 3 1
Lần 3 5 2
Lần 4 3 1
Lần 5 4 1
Lần 6 3 2
Lần 7 4 2
Lần 8 3 1
Lần 9 1 0
Lần 10 0 0
Tổng cộng 30 12
30
A
B
Hình 6. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp
gen CBF1 vào giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Ghi chú: (A): Cây chuyển gen được trồng ra bầu đất cảm ứng trong phòng;
(B): Cây chuy cảm ứng trong phòngông qua vi khuẩn A. tumefaci
Bảng 3. Error! Bookmark not defined. KSEQ Bi chuy Bi Cây đu tương
DT22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. nạp gen CBF
Số cây sống Số cây sống sót Hiệu suất Lần thí Số mẫu biến sót sau khi ra sau khi phun biến nạp nghiệm nạp (mẫu) đất kiểm tra basta (%)
2 90 Lần 1 1 1,11
1 91 Lần 2 0 0
2 92 Lần 3 2 2,17
1 95 Lần 4 1 1,10
1 97 Lần 5 0 0
2 84 Lần 6 0 0
2 72 Lần 7 1 1,39
1 88 Lần 8 0 0
0 86 Lần 9 0 0
0 91 Lần 10 0 0
0,56 Tổng cộng 886 12 5
31
Qua kết quả bảng 3.4 ta thấy:
Kết quả chọn lọc bằng basta (10mg/l) ở 12 cây chuyển gen T0 thu được 5
cây chuyển gen kháng sau khi phun (tỷ lệ 0,56%).
Kết quả này cho thấy cây chuyển gen T0 đã mang gen kháng basta và có
thể có gen chuyển CBF1 và cần kiểm tra bằng phương pháp PCR.
3.1.2. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm
Sau khi khử trùng hạt (Hình 4A), các lá mầm được tạo tổn thương.
Chuyển các mẫu cấy nửa hạt vào đĩa petri có chứa dịch huyền phù vi khuẩn
Agrobacterium đã chuẩn bị sẵn lây nhiễm trong 30 phút (Hình 4B- 4C). Có lắc
nhẹ nhàng (50 -70 vòng/phút).
Mỗi mẫu nửa lá mầm sau khi lây nhiễm mẫu cấy được chia đặt đều trên
giấy lọc vô trùng trên CCM rắn trong đĩa Petri (đường kính 90 mm x sâu 15
mm). Mẫu đồng nuôi cấy ở điều kiện 230C và thời gian chiếu sáng 18 / 6h (sáng
/tối) trong 5 ngày (Hình 7A).
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, các mẫu cấy có chuyển xanh (Hình 7B) được
đưa vào (nghiêng 45 độ) trong môi trường cảm ứng tạí sinh chồi SIM lần 1
trong 14 ngày có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và được duy trì ở điều kiện 230C
và thời gian chiếu sáng 18/6h sáng/tối (Hình 7C).
Hai tuần sau, các mẫu cấy được cắt bỏ phần lớn lá mầm, thu các cụm chồi
tạo thành chuyển sang môi trường tạo chồi lần thứ hai có bổ sung chất chọn lọc
và kháng sinh diệt khuẩn (Hình 7D). Duy trì 14 ngày ở chế độ 230C và thời gian
chiếu sáng 18/6h sáng/tối để chọn lọc chồi chuyển nạp gen. Các chồi chết là các
chồi không chứa gen biến nạp.
32
C
D
Hình 7. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào giống
đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Ghi chú:
(A) Mẫu đậu tương Cọc chùm đồng nuôi cấy trên môi trường CCM;
(B) Mẫu đậu tương Cọc chùm đồng nuôi cấy trên môi trường CCM sau
5 ngày;
(C) Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM lần 1;
(D) Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM lần 2;
33
Bần 2;n Error! Bookmark not defined. KSEQ bn gen trên môi trường SIM
lần 1;uẩn A. tumefaciens.sang môiu tương Cọ tương thông qua vi khu
môi tumefaciens
Số lượng mẫu Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi Lần thí Số mẫu nghiệm (%) CCM SIM1
Lần 1 100 90 61 67,78
Lần 2 100 81 62 76,54
Lần 3 100 92 59 64,13
Lần 4 100 88 69 78,41
Lần 5 100 85 64 75,29
Lần 6 100 89 58 65,17
Lần 7 100 72 49 68,06
Lần 8 100 91 63 69,23
Lần 9 100 68 54 79,41
Lần 10 100 75 52 69,33
71,12 Tổng cộng 1000 831 591
Qua kết quả bảng 3.5 ta thấy: sau 10 lần thí nghiệm chuyển gen tổng số
1000 mẫu đậu tương cọc chùm được lây nhiễm với vi khuẩn mang gen CBF1
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy thu được 831 mẫu sống sót. Với số mẫu tạo chồi là
591 sau 14 ngày tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen lần thứ nhất trên môi
trường SIM1 có chứa 10mg/l PPT. Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi ở đậu tương Cọc chùm
đạt 71,12%, cao hơn ở DT22 (68,05%) chứng tỏ bước đầu biến nạp đã thành
công.
Sau 14 ngày chọn lọc trên môi trường SIM1, mẫu cấy tiếp tục được chọn
lọc trên môi trường SIM2 có chứa 5 mg/l PPT trong 14 ngày. Mẫu được cấy
chuyển sang môi trường cảm ứng kéo dài chồi SEM. Chồi tái sinh có kích
34
thước khoảng 4 cm (Hình 8A) được chuyển sang môi trường tạo rễ RM để
A
B
phát triển thành cây hoàn chỉnh (Hình 8B).
Hình 8. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi và ra rễ
Ghi chú: (A) Hình ảnh cây Cọc chùm chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM;
(B) Cây Chuyu Cyển ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường RM
Bảng 3. 2 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen
CBF1 vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Số lượng mẫu Tỷ lệ sống sau chọn lọc Lần thí nghiệm bằng kháng sinh (%) SIM SEM RM
Lần 1 61 13 2 21,31
Lần 2 62 6 1 9,68
Lần 3 59 9 0 15,25
Lần 4 69 3 1 4,35
Lần 5 64 8 3 12,50
Lần 6 58 8 2 13,79
Lần 7 49 2 1 4,08
Lần 8 62 3 3 4,83
Lần 9 54 9 0 16,67
35
Lần 10 52 6 0 11,54
Tổng cộng 590 67 13 11,35
Kết quả chọn lọc từ 590 mẫu trên môi trường SIM2 thu được tổng số 67
chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc SEM (tỷ lệ 11,35%), số chồi đủ tiêu
chuẩn chuyển sang môi trường tạo rễ là 13 chồi (Bảng 3.6, Hình 8).
Bcây đ Error! Bookmark not defined. KSEQ B trình chiếp tục được chọn
lọc bằng thuốc trừ cỏ basta và PCR. CBF1 vào cây đậu tươm thông qua
vig cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Lần thí nghiệm Chồi sống sót sau chọn lọc tạo rễ trên môi trường RM Số cây sống sót sau khi ra đất (cây)
2 1 Lần 1
1 Lần 2 0
0 Lần 3 0
1 Lần 4 1
3 Lần 5 2
2 Lần 6 1
1 Lần 7 1
3 Lần 8 3
0 Lần 9 0
0 0 Lần 10
13 9 Tổng cộng
Cây chuyển gen được chuyển ra chậu đất và trồng trong nhà lưới cho đến khi
trưởng thành (Hình 9A). Kết quả biến nạp của 10 thí nghiệm đã thu được 9 cây
36
đậu tương chuyển gen T0 sống sót sau khi chuyển ra trồng trong điều kiện nhà
lưới (Hình 9B). Cây chuyển T0 tiếp tục được chọn lọc bằng thuốc trừ cỏ basta và
B
A
PCR.
Hình 9. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp
gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens.
Ghi chú: (A): Cây chuyển gen được trồng ra bầu đất cảm ứng trong phòng;
(B): Cây chuyển gen được trồng trong điều kiện ngoài nhà lưới
B): Cây Error! Bookmark not defined. KSEQ By chuy By chuyển gen
được trồng trong điều k thông qua vi khuen A. tumefaciens
Lần thí nghiệm Số mẫu biến nạp (mẫu) Số cây sống sót sau khi ra đất (cây) Số cây sống sót sau khi phun kiểm tra basta (cây) Hiệu suất biến nạp (%)
Lần 1 90 1 1 1,1
Lần 2 81 0 0 0
Lần 3 92 0 0 0
Lần 4 88 1 1 1,13
Lần 5 85 2 1 1,17
Lần 6 89 1 0 0
Lần 7 72 1 0 0
Lần 8 91 3 1 1,1
37
0 0 Lần 9 68 0
0 0 Lần 10 75 0
4 0,48 Tổng cộng 831 9
Qua kết quả bảng 3.8 ta thấy:
Sau 10 lần thí nghiệm chuyển gen cấu trúc pER10-pUBQ14:CBF1 với 831
mẫu đậu tương cọc chùm được biến nạp, 9 cây chuyển gen T0 được sàng lọc
bằng basta thu được 4 cây sống sót. Hiệu suất chuyển gen đạt 0,48% thấp hơn
so với hiệu suất chuyển gen ở đậu tương DT22 (0,56%).
3.1.3. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc
Sau khi khử trùng hạt (Hình 4A), các lá mầm được tạo tổn thương. Chuyển
các mẫu cấy nửa hạt vào đĩa petri có chứa dịch huyền phù vi khuẩn
Agrobacterium đã chuẩn bị sẵn lây nhiễm trong 30 phút (Hình 4B- 4C). Có lắc
nhẹ nhàng (50 -70 vòng/phút).
Mỗi mẫu nửa lá mầm sau khi lây nhiễm mẫu cấy được chia đặt đều trên
giấy lọc vô trùng trên CCM rắn trong đĩa Petri (đường kính 90 mm x sâu 15
mm) Mẫu đồng nuôi cấy ở điều kiện 230C và thời gian chiếu sáng 18 / 6h (sáng
/tối) trong 5 ngày (Hình 10A).
Sau thời gian đồng nuôi cấy CCM 5 ngày, các mẫu cấy có chuyển xanh
(Hình 10B) được đưa vào cấy (nghiêng 45 độ) trong môi trường cảm ứng tái sinh
chồi SIM lần 1 trong 14 ngày và được duy trì ở điều kiện 230C và thời gian chiếu
sáng 18/6h sáng/tối (Hình 10D).
Hai tuần sau, các mẫu cấy được cắt bỏ phần lớn lá mầm, thu các cụm chồi
tạo thành chuyển sang môi trường tạo chồi lần thứ hai có bổ sung chất chọn lọc
và kháng sinh diệt khuẩn (Hình 7D). Duy trì 14 ngày ở chế độ 230C và thời gian
chiếu sáng 18/6h sáng/tối để chọn lọc chồi chuyển nạp gen. Các chồi chết là các
chồi không chứa gen biến nạp.
38
Bác chồiError! Bookmark not defined. KSEQ Bồi chết là các chồi không
chứa gen biến nạp.CBF1 vào cây đlà các chCúc Hà B c thông qua vi khu
c A. tumefaciens
Số lượng mẫu Lần thí Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi Số mẫu nghiệm (%) CCM SIM1
Lần 1 100 88 72 81.82
Lần 2 100 91 75 82,41
Lần 3 100 93 62 66,67
Lần 4 100 87 66 75,86
Lần 5 100 92 71 77,17
Lần 6 100 78 59 75,64
Lần 7 100 84 62 73,80
Lần 8 100 92 57 61,96
Lần 9 100 68 55 80,89
Lần 10 100 77 43 55,84
81,20 Tổng cộng 1000 766 622
Qua kết quả bảng 3.9 ta thấy:
Sau 10 lần thí nghiệm chuyển gen tổng số 1000 mẫu đậu tương Cúc Hà
Bắc được lây nhiễm với vi khuẩn mang gen CBF1.Sau 5 ngày đồng nuôi cấy
thu được 766 mẫu sống sót.
Với số mẫu tạo chồi là 622 sau 14 ngày tái sinh và chọn lọc chồi chuyển
gen lần thứ nhất trên môi trường SIM1 có chứa 10mg/l PPT. Tỷ lệ mẫu tạo đa
chồi ở đậu tương Cúc Hà Bắc đạt 81,20% chứng tỏ bước đầu biến nạp đã thành
công.
39
Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi ở đậu tương Cúc Hà Bắc đạt 81,20% cao nhất so với
B
A
C
D
ở giống Cọc chùm (71,12%) và DT22 (68,05%).
Hình 10. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào
giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Ghi chú:
(A) Mẫu đậu tương Cúc Hà Bắc đồng nuôi cấy trên môi trường CCM;
(B) Mẫu đậu tương Cúc Hà Bắc đồng nuôi cấy trên môi trường CCM sau
5 ngày;
(C) Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM lần 1;
(D) Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM lần 2.
40
Sau 14 ngày chọn lọc trên môi trường SIM1, mẫu cấy tiếp tục được chọn
lọc trên môi trường SIM2 có chứa 5 mg/l PPT trong 14 ngày. Mẫu được cấy
chuyển sang môi trường cảm ứng kéo dào chồi SEM. Chồi tái sinh có kích
thước khoảng 4 cm (Hình 11A) được chuyển sang môi trường tạo rễ RM để
A
B
phát triển thành cây hoàn chỉnh (Hình 11B).
Hình 11. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi và ra rễ
Ghi chú:
(A) Hình ảnh cây Cúc Hà Bắc chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM;
(B); Cây chuyển gen ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường RM;
Bảng 3. 3 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen
CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Số lượng mẫu Tỷ lệ sống sau chọn lọc Lần thí
bằng kháng sinh (%) nghiệm SIM2 SEM RM
Lần 1 69 11 2 15,94
Lần 2 71 9 1 12,67
Lần 3 62 4 0 6,45
Lần 4 66 7 1 10,60
Lần 5 71 7 2 9,86
Lần 6 52 5 2 9,61
Lần 7 62 3 3 4,84
41
3 Lần 8 56 2 3,57
1 Lần 9 53 6 11,32
0 Lần 10 43 4 9,30
59 15 9,75 Tổng cộng 605
Kết quả chọn lọc từ 605 mẫu trên môi trường SIM2 thu được tổng số 59
chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc SEM (tỷ lệ 9,75%), số chồi đủ tiêu chuẩn
chuyển sang môi trường tạo rễ là 15 chồi (Bảng 3.10, Hình 11).
Cây chuyển gen được chuyển ra chậu đất và trồng trong nhà lưới cho
đến khi trưởng thành .Kết quả biến nạp của 10 thí nghiệm đã thu được 11 cây
đậu tương chuyển gen T0 sống sót sau khi chuyển ra trồng trong điều kiện nhà
lưới (Hình 12). Cây chuyển T0 tiếp tục được chọn lọc bằng thuốc trừ cỏ basta
và PCR.
Bảng 3. 4 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các
thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua
vi khuẩn A. tumefaciens
Chồi sống sót sau chọn lọc tạo rễ Số cây sống sót Lần thí nghiệm trên môi trường RM sau khi ra đất
Lần 1 2 2
Lần 2 1 1
Lần 3 0 0
Lần 4 1 0
Lần 5 2 2
Lần 6 2 2
Lần 7 3 2
Lần 8 3 1
Lần 9 1 1
42
0 Lần 10 0
15 11 Tổng cộng
Hình 12. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp
gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens.
Bthông qError! Bookmark not defined. K2EQ B qchuy B qua vi khuẩn A.
tumefaciensCúc Hà Bua thông qua vi khuuẩn A. tumefacien
Số cây sống Số cây sống sót Hiệu suất Lần thí Số mẫu biến sót sau khi sau khi phun biến nạp nghiệm nạp (mẫu) ra đất kiểm tra basta (%)
Lần 1 72 2 1 1,38
Lần 2 75 1 1 1,33
Lần 3 62 0 0 0
Lần 4 66 0 0 0
Lần 5 71 2 0 0
Lần 6 59 2 1 1,69
43
Lần 7 62 2 0 0
Lần 8 57 1 1 1,75
Lần 9 55 1 1 1,82
Lần 10 43 0 0 0
Tổng cộng 622 11 5 0,8
Qua kết quả bảng 3.12 ta thấy: sau 10 lần thí nghiệm chuyển gen cấu trúc
pER10-pUBQ14:CBF1 với 622 mẫu đậu tương Cúc Hà Bắc được biến nạp thu
được 11 cây chuyển gen T0 sống sót.
Kết quả sàng lọc bằng thuốc trừ cỏ basta thu được 5 cây kháng thuốc. Hiệu
suất chuyển gen đạt 0,8% cao nhất trong ba giống đậu tương được sử dụng cho
chuyển gen (Cọc chùm 0,48% và DT22 0,56%).
Hình 13. Hình ảnh sàng lọc cây chuyển gen sau 3 ngày bằng Basta
Ghi chú:
(A) Lá cây không chuyển gen bị chết khi quét Basta (vạch kẻ màu vàng giữa
lá)
44
(B) lá cây chuyển gen CBF1 kháng lại Basta. Vạch kẻ ngang giữ lá chỉ vị
chí quét Basta để sàng lọc cây chuyển gen
(C) Cây chuyển gen được sàng lọc bằng phương pháp phun Basta. Mũi
tên chỉ cây không chuyển gen bị chết do không có khả năng kháng Basta.
3.2. Đánh giá đậu tương chuyển gen dương tính bằng sử dụng phương
pháp PCR.
Kết quả chọn lọc bằng thuốc trừ cỏ Basta thu được tổng số 14 cây chuyển gen
T0 ở cả 3 giống DT22, Cọc chùm và Cúc Hà Bắc. Để kiểm tra sự có mặt của gen
chuyển CBF và gen Bar các cây T0 được kiểm tra bằng PCR. DNA tổng số được
tách từ mẫu lá non của các dòng chuyển gen theo bộ kít DNeasy Plant Mini Kit của
hãng QIAGen (https://www.qiagen.com/). Mẫu được hòa loãng với 100l dung
dịch TE và kiểm tra nồng độ DNA bằng máy Nanodrop.
Kết quả kiểm tra cho thấy các mẫu cho kết quả A260/A280 ở mức cho phép
1.81-2.02 (Bảng 3.13). Nồng độ DNA dao động từ 192,3 đến 359,3 ng/l . Kết
quả này cho thấy các mẫu DNA hoàn toàn đảm bảo độ tinh sạch và nồng độ để
thực hiện các thí nghiệm phân tích PCR.
B Kết qu5 K3EQ Bảng_3. \* ARABIC A tổng số của các cây chuyển gen
Giống Cây số A260/A280 ng/l
DT22 1 1,89 310,8
2 1,92 303,8
3 1,95 198,5
4 1,91 195,8
5 1,89 287,5
6 Cọc chùm 1,92 305,8
7 2,00 205,5
8 1,98 192,3
9 2,02 192,5
10 1,94 213,6
45
Cúc Hà Bắc 1,99 314,4 11
1,81 159,2 12
1,90 302,2 13
1,94 359,3 14
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển CBF1 và bar trong cây chúng tôi
tiến hành kiểm tra bằng PCR với cặp mồi CBF1F/CBF1R và BarF/BarR. Kết
quả cho thấy tất cả các cây chuyển gen đều mang gen chuyển CBF1 với kích
thước tương ứng (Bảng 3.14 và hình 14).
Bảng 3. 6 Đánh giá biểu hiện gen ở cây chuyển gen T0 bằng PCR
Kết quả PCR
Cây số
Kháng Basta
CBF1F/CBF1R
BarF/BarR
x
+
+
1
x
+
+
2
x
+
+
2
x
+
+
3
x
+
+
4
x
+
+
5
x
+
+
6
x
+
+
7
x
+
+
8
x
+
+
9
x
+
+
10
x
+
+
11
x
+
+
12
x
+
+
13
46
14
x
+
+
Ghi chú: (x): kháng basta; (+): Dương tính
Hình 14. Kết quả phân tích PCR cây chuyển gen T0
Ghi chú:
(A) Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi gen CBF1F/CBF1R;
(B) Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi gen BarF/BarR.
M: DNA marker, từ 1-14: số thứ tự mẫu.
47
Chương 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận.
Kết quả chuyển gen CBF1 đã thu được số cây đậu tương sống sót sau
quá trình chọn lọc:
• DT22: 30 cây
• Cọc chùm: 13 cây
• Cúc Hà bắc: 15 cây
Số cây đậu tương chuyển gen CBF1 sống sót sau khi ra bầu đất:
• DT22: 12 cây
• Cọc chùm: 9 cây
• Cúc Hà bắc: 11 cây
Số cây đậu tương chuyển gen CBF1 sống sót sau khi sàng lọc bằng
phun Basta:
• DT22: 5 cây
• Cọc chùm: 4 cây
• Cúc Hà bắc: 5 cây
Hiệu quả biến nạp gen thông qua chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang
vector pER10-pUBQ14:CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc là cao nhất đạt
0,8%, sau đó đến giống đậu tương DT22 đạt 0,56% và thấp nhất ở giống đậu
tương Cọc chùm đạt 0,48%.
Kết quả sàng lọc cây chuyển gen bằng thuốc trừ cỏ basta và phân tích
PCR đã xác định được 14 cây đậu tương có phản ứng dương tính với gen đích
CBF1.
48
4.2. Đề nghị.
Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen vào một số giống đậu tương địa phương khác.
Tiến hành thí nghiệm khẳng định lại sự có mặt của gen đích cũng như ước
đoán số bản copy bằng phương pháp Southern blot của dòng chuyển gen thu
được.
Tiếp tục đánh giá và chọn lọc kiểm tra cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ
T1, T2 và T3 để kiểm tra đặc tính của cây chuyển gen qua các thế hệ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào
(1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp.
2. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Quyển I, Nhà xuất bản Trẻ.
3. Trần Văn Điền (2007), Cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội
4. Nguyễn Huy Hoàng (1992), Nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống
đậu tương nhập nội ở miền Bắc Việt Nam, Luận án phó tiễn sỹ, Hà nội
5. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh
Hương (2005), “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa và nhân gen
dehydrin của một số giống đậu tương địa phương vùng núi phía Bắc Việt
Nam”. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu cơ bản trong
khhoa học sự sống - Đại học Y Hà nội. NXB KHKT Hà nội, 2224 – 2227.
6. Trần Thị Phương Liên (1999), “Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học
phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt
Nam’’, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà nội.
7. Chu Hoàng Mậu (2001), “Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để
tạo các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt
Nam”, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà nội
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
8. Singh, Ram J.; Nelson, Randall L.; Chung, Gyuhwa (2006). Genetic
Resources, Chromosome Engineering, and Crop Improvement: Oilseed
Crops, Volume 4. London: Taylor & Francis. tr. 15.
9. Hymowitz, Theodore (1995). “Evaluation of Wild Perennial Glycine
Species and CrossesFor Resistance to Phakopsora”. Trong Sinclair, J.B.;
Hartman, G.L. Proceedings of the Soybean Rust Workshop. Urbana, IL:
National Soybean Research Laboratory. tr. 33–37.
10. Newell, C. A; Hymowitz, T. “Hybridization in the Genus Glycine
Subgenus Glycine Willd. (Leguminosae, Papilionoideae)”. American
Journal of Botany : 70 (3): 334–348
11. AF. Garay và Wallace Wilhelm (1983), “Root System Characteristics of
Two Soybean Isolines Undergoing Water Stress Condition”, Agronomy
Journal, Vol. 75.
12. Lakshmi P. Manavalan & Satish K. Guttikonda & Vinh T. Nguyen & J.
Grover Shannon & Henry T. Nguyen (2009), “Evaluation of diverse
soybean germplasm for root growth and architecture”, Plant Soil
13. Tetsuji Oya, Alexandre Lima Nepomuceno, Norman Neumaier, Jose
Renato Boucas Rarias, Satoshi Tobita và Osamu Ito (2004), “Drought
tolerance characteristics of Brazilian soybean cultivars evaluation and
characterization of drought tolerance of various Brazilian soybean cultivars
in field”, Plant Prod.Sci. 7 (2): 129-137.
14. Mary Dell Chilton, Randall K. Saiki, Narendra Yadavt, Milton P. Gordon
and Francis Quetieri (1980), “T-DNA from Agrobacterium Ti plasmid is in
the nuclear DNA fraction of crown gall tumor cells”, Proc. Nati. Acad. Sci.
USA, Vol. 77, No. 7, pp. 4060-4064.
15. Mutasim M. Khalafalla, Hany A. El-Shemy, Shaikh M. Rahman,
Masayoshi Teraishi, Hisakazu Hasegawa, Teruhiko Terakawa and Masao
Ishimoto, “Efficient production of transgenic soybean (Glycine max [L]
Merrill) plants mediated via whisker-supersonic (WSS) method”, African
Journal of Biotechnology Vol. 5 (18), pp. 1594-1599.
16. Tzvi Tzfira and Vitaly Citovsky (2006), “Agrobacterium-mediated genetic
transformation of plants: biology and biotechnology”, Current Opinion in
Biotechnology, 17:147-154.
17. Genlvin S.B. (2000), “Agrobacterium and plant genes involved in T- DNA
transfer and intergration”, Rev Plant Physiol Biology (51), pp. 223-256.
18. Hookaas P.J.J., and Beijersbergen, A.G.M (1994), “The virulence system
of Agrobacterium tumefaciens”. Ann.Rev. Phytopathol. 32: 157-179.
19. Lan-Ying Lee and Stanton B. Gelvin (2008), “T-DNA Binary Vectors and
Systems”, Plant Physiology, Vol. 146, pp. 325-332.
20. R. Walden, B. Reiss, C. Koncz, and J. Schell (1997), “The impact of Ti-
plasmid-derived gen vector on the study of the mechanism of action of
phytohormones”, Annu. Rev. Phytopathol. 35:45-66.
21. Tetsuya Yamada, Satoshi Watanabe, Maiko Arai, Kyuya Harada, Keisuke
Kitamura (2010),"Cotyledonary node pre-wounding with a micro-brush
increased frequency of Agrobacterium-mediated transformation in
soybean”, Plant Biotechnology, 27, 217-220.
22. Mutasim M. Khalafalla, Hany A. El-Shemy, Shaikh M. Rahman,
Masayoshi Teraishi, Hisakazu Hasegawa, Teruhiko Terakawa and Masao
Ishimoto, “Efficient production of transgenic soybean (Glycine max [L]
Merrill) plants mediated via whisker-supersonic (WSS) method”, African
Journal of Biotechnology Vol. 5 (18), pp. 1594-1599.
23. Gustavo A., Cabrera J., (1998), “The Agrobacterium tumefaciens: a natural
tool for plant transformation”, Plant Cell Report (26), pp. 1-11.
24. Hookaas P.J.J., and Beijersbergen, A.G.M (1994), “The virulence system
of Agrobacterium tumefaciens”. Ann.Rev. Phytopathol. 32: 157-179
25. Hooykass P.J.J., Schilperoort, R.A. (1992), “Agrobacterium and plant
genetic engineering”, Plant Molecular Biology (35), pp. 205-218
26. Hille J., Wullems G., Schiperoort R.A., (1983), “Non-oncogenic T- Region
mutants of Agrobacterium tumefaciens do transfer T-DNA into plant cells”,
Plant Molecular Biology (2), pp. 155-163.
27. Kirankumar S. Mysore, Burgund Bassuner, Xiao-bing Deng, Nune S.
Darbinian, Andrei Motchoulski, Walt Ream, and Stanton B. Gelvin (1998),
“Role of the Agrobacterium tumefaciens VirD2 Protein in T-DNA Transfer
and Integration”, MPMI, Vol. 11, No. 7, pp. 668-683.
28. Michal Sharabi- Schwager, Amnon Lers, Alon Samach, Charles L. Guy and
Ron Porat (2009), “Overexpression of the CBF2 transcriptional activator in
Arabidopsis delays leaf senescence and extends plant longevity’’, Journal
of Experimental Botany, Vol. 61, No. 1, pp. 261–273
29. http://soybeanbreederstoolbox.org/
30. El Kayal W, NavarroM, Marque G, Keller G, Marque C, Teulieres C (2006)
Ex pression profile of CBF- like transcriptional factor genes from Eucalyptus
in response to cold. J Exp Bot.57: 2455- 2469.
31. Kasuga M, Miura S, Shinozaki K, Yamaguchi- Shinozaki K. (2004). A
combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress- induciblerd 29
Apromoter impeoved drought and low- temperature stress tolerance in
tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol. 45: 346- 350.
32. Tổng cục thống kê (2010), Niên giám thống kê 2009, NXB Thống kê, Hà
Nội.
33. Jorgensen, R.A., Cluster, P.D., English, J., Que, Q., and Napoli, C.A.
(1996), “Chalcone synthase cosuppression phenotype in petunia flowers:
comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-
DNA sequences”. Plant Mol.Biol. 31: 957-973.
34. http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC
35. https://www.gso.gov.vn
36. Yoshida, T., Fujita Y., et al. (2010), AREB1, AREB2, and ABF3 are master
transcription factors that cooteratively reglate ABRE dependent ABA
signation, The Plant Journal, 61(4). pp. 672- 685.
37. Jian Lia, Yaqing Wâng, BoYua, Qiping Songa, Yang Liua Tony, H. H.
Chenb Gang Lia Xinghong Yanga. “Ectopic expression of StCBF1 have
difirent functions in response to freezing and drought stresses in
Arabidopsis”. Plant science. Pp 221- 233.
38. Singh S, Rathore M, Goyary D, Singh RK, Anandhan S, Sharma DK,
Ahmed Z. “carrot antifreeze protein enhances chilling tolerance in
transgenic tomato”, Haldwani 263.
39. Paz MM, Martinez JC, Kalvig AB, Fonger TM, Wang K. “Improved
cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature
seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”. Plant
Cell Rep. 2006 Mar; 25(3):206-13.
PHỤ LỤC 1
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
CCM
SIM
SEM
RM
(Co-
GM
(Shoot
(Shoot
(Rootting
Compounds
(Germination
cultivation
induction
elongation
elongation
medium)
medium)
medium)
medium)
medium)
Full-strenght MS
X
X
x
x
x
B5 Vitamins
1x
1x
1x
1x
1x
MES
3,9 mg/l
0,59 mg/l 0,59 mg/l 0,59 mg/l
Sucrose
30 g/l
30 g/l
30 g/l
30 g/l
30 g/l
pH
5,6 - 5,8
5,6 - 5,8
5,6 - 5,8
5,6 - 5,8
5,6 - 5,8
Agar
7,5 g/l
7,5 g/l
7,5 g/l
7,5 g/l
Acetosyringone
0 - 0,4
(AS)
mM
-
-
-
-
L – cysteine*
400 mg/l
-
-
-
-
L – asparagine*
-
-
50 mg/l
-
-
L - izoglutamic
acid*
-
-
100 mg/l
-
-
BAP
-
-
1 mg/l
1,67 mg/l 1,67 mg/l
IAA
-
-
0,1 mg/l
-
-
IBA
-
-
-
0,8 mg/l
-
Ticarcillin
-
250 mg/l
250 mg/l
250 mg/l
-
Cefotaxime
-
200 mg/l
200 mg/l
200 mg/l
-
Ghi chú: (*) – Lọc qua màng lọc và bổ sung sau khi khử trùng môi trường
PHỤ LỤC 2
MÔI TRƯỜNG LB
STT Thành phần Khối lượng
1 Trytone 10 g/L
2 Yeast Extract 5 g/L
3 Nacl 10 g/L
