ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH
PROTEIN TÁI TỔ HỢP GLYCOPROTEIN (GP5)
CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ
HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV)
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Thái Nguyên, 2015
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự
hƣớng dẫn của PGS.TS. Lê Văn Sơn các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là
trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận văn
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hà Đăng Chiến
ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Văn Sơn đã tận
tình chỉ bảo và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và
hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy, Cô giáo – Các nhà
khoa học đã trực tiếp giảng dạy truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức
khoa học quý báu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè đã tận
tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi luôn
trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu thuộc Phòng Công
nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi
cũng xin cám ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen đã cung cấp
kinh phí, thiết bị cũng nhƣ cho phép tôi sử dụng các kết quả nghiên cứu
thuộc đề tài NV07-PTNTDD2015.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở đào tạo
thuộc Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ quá trình
thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tác giả luận văn
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hà Đăng Chiến
iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt
Base Pairs Cặp bazơ nitơ bp
Cộng sự CS
Deoxyribonucleic Acid DNA
Deoxynucleoside Triphosphate dNTP
Escherichia coli E.coli
Ethidium Bromide EtBr
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
Glycoprotein 5 GP5
Isopropylthio-β-Galactoside IPTG
Kilobase kb
Kilodalton kDa
LB Luria Bertani Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn
2-(N-morpholino)Etansulfonic acid MES
Optical Density Mật độ quang OD
Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR
PRRS Hội chứng rối loại hô hấp và sinh sản ở lợn Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
PRRSV Virus gây hội chứng rối loại hô hấp và sinh sản ở lợn Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus
RNA Ribonucleic Acid
RNase Ribonuclease
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
TAE Tris-Acetate-EDTA
TBS Tris-Buffered Saline
TTBS Tween Tris-Buffered Saline
v/p Vòng/ phút
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
X-gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Beta- D-Galacto-Pyranoside
iv
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vi
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu: ................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu: .................................................................................. 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3
1.1. Tổng quan về PRRS ................................................................................. 3
1.1.1. Khái niệm PRRS ................................................................................. 3
1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn ..................................... 3
1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) .............. 8
1.2. Protein tái tổ hợp .................................................................................... 11
1.2.1. Giới thiệu .......................................................................................... 11
1.2.2. Glycoprotein (GP5) .......................................................................... 12
1.2.3. Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 ...................................... 13
1.2.4. Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21 ................. 14
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 16
v
2.1. Vật liệu .................................................................................................... 16
2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 16
2.1.2. Hóa chất và môi trƣờng .................................................................... 18
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ......................................................... 19
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 19
2.2.1. Tạo dòng gen gp5 ............................................................................. 19
2.2.2. Tạo vector tái tổ hợp mang gen gp5 ................................................ 21
2.2.3. Phƣơng pháp biểu hiện và tinh sạch protein GP5 ........................... 25
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 29
3.1. Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5 .................................... 29
3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5 ...................... 32
3.3. Biểu hiện và tinh sạch protein GP5 trong E.coli .................................... 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 41
1. Kết luận ...................................................................................................... 41
2. Đề nghị ....................................................................................................... 41
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 42
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS ................................................... 10
Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pBT .......................................................... 16
Hình 2.2. Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+) ........................................... 17
Hình 3.1. Kết qủa điện di sản phẩm colony - PCR khuẩn lạc mang gen GP5 ...... 30
Hình 3.2. Kết quả cắt kiểm tra và tinh sạch pBT-GP5 .................................. 31
Hình 3.3. Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) bằng enzyme cắt giới hạn
SacI và HindIII .............................................................................................. 32
Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn
SacI và HindIII .............................................................................................. 34
Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE dịch nuôi vi khuẩn mang vector tái
tổ hợp ………. ........................................................................................ 35
Hình 3.6. Kết quả phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag (pha
loãng 1:1000 lần) ........................................................................................... 36
Hình 3.7. Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sạch sản phẩm ...................... 38
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.8. Kết quả điện di kiểm tra GP5 tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA ..... 39
vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tên thiết bị thí nghiệm .................................................................. 19
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ........................................................... 20
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ............................................... 20
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pBT mang gen GP5 ............................. 22
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt pET 32a(+) .......................................... 22
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ghép nối gen .............................................. 24
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Bảng 2.7. Thành phần gel điện di protein (SDS-PAGE)............................... 26
1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome), tại Việt Nam còn gọi là bệnh “lợn
tai xanh” (Blue Ear), đƣợc xem là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên
lợn từng đƣợc ghi nhận trên thế giới và đƣợc ghi nhận lần đầu tiên tại Bắc
Mỹ năm 1987, do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm
sau đó tím xanh. Đặc trƣng của bệnh, với lợn cái, PRRS gây hậu quả nghiêm
trọng nhƣ sảy thai, đẻ non, lợn con sinh ra yếu ớt, chết non, tình trạng bệnh
âm ỉ gây rối loạn sinh sản nhƣ động dục kéo dài, chậm động dục trở lại. Đối
với lợn đực giống, PRRS làm giảm số lƣợng tinh dịch, chất lƣợng tinh dịch
kém, ảnh hƣởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lƣợng đàn con [9]. “Lợn tai xanh”
là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, do virus PRRS (PRRSV), thuộc họ
Arteriviridae, bộ Nidovirales gây ra. Bệnh lây lan nhanh và làm chết nhiều
lợn nhiễm bệnh [1].
Hiện nay, PRRS đã và đang trở thành dịch ở nhiều nƣớc trên thế giới,
gây tổn thất nặng nề cho nền kinh tế. PRRS lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở
Hoa Kỳ vào năm 1987, châu Âu tại Đức năm 1990, tại Hà Lan năm 1991 và
tại châu Á vào đầu những năm 1990 [36]. Tại Việt Nam, PRRSV đƣợc phát
hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ năm 1997 bằng phản ứng huyết thanh học. Gần
đây, từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều
địa phƣơng trong cả nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn
nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm [7].
Virus PRRS có tính thích ứng rất cao đối với các đại thực bào ở phổi.
Hệ gen của PRRSV là phân tử RNA sợi đơn dƣơng, có cấu trúc tƣơng tự cấu
trúc của Coronavirus, gồm 7 khung đọc mở gối lên nhau mã hóa cho 7
protein của virus gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và N. Trong số đó,
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
protein GP5 (glycoprotein 5) đƣợc mã hoá bởi ORF5, là một protein đƣợc
2
glycosyl hoá, gắn với màng bọc ngoài của PRRSV, có tính kháng nguyên
mạnh và chịu trách nhiệm gây bệnh của virus.
Protein GP5 là đích chủ yếu của các kháng thể trung hoà, tham gia vào
cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV, do ngăn
cản hiện tƣợng trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tế
bào có thẩm quyền miễn dịch trong cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và qua
trung gian tế bào (CMI-cell mediated immunity). Ngoài ra, GP5 còn tham
gia hiện tƣợng “chết theo chƣơng trình” (apoptosis) của các tế bào trong cơ
thể bị nhiễm PRRSV. Sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân
làm gia tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnh
dịch PRRS ngày càng phức tạp, do làm giảm hiệu quả phòng bệnh của các
vaccine phòng bệnh đang lƣu hành.
Chính vì vậy, nghiên cứu protein tái tổ hợp GP5 của PRRSV là thực
sự cần thiết, giúp cho chẩn đoán xác định bệnh và sản xuất vaccine tái tổ hợp
thế hệ mới nhằm khống chế, giảm bớt thiệt hại do virus PRRSV gây ra.
Từ những cơ sở lý luận khoa học và những nghiên cứu của các nhà khoa
học trong và ngoài nƣớc chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của vius gây
hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế đƣợc vector biểu hiện protein tái tổ hợp GP5. Biểu hiện và
tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp GP5 của Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome virus.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo dòng vector mang gen gp5: Dựa trên thông tin về
trình tự nucleotide của gen gp5 đã công bố, thiết kế các cặp mồi phù hợp để
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
phân lập kiểm tra và nhân gen bằng PCR.
3
- Nghiên cƣ́ u thi ết kế vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa
cho protein GP5.
- Biểu hiện GP5 trong E. coli BL21 và tinh sạch protein tái tổ hợp (GP5 )
bằng sắc ký ái lực Ni-NTA.
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về PRRS
1.1.1. Khái niệm PRRS
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndome, PRRS), là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho lợn. Biểu
hiện đặc trƣng là các rối loạn sinh sản ở lợn cái nhƣ sảy thai, thai chết lƣu, lợn
sinh ra chết yểu, cũng nhƣ lợn con theo mẹ và lợn cái hậu bị còn thể hiện viêm
đƣờng hô hấp rất nặng nhƣ: sốt, ho, khó thở, chết với tỷ lệ cao [6], [20]…
Bệnh còn đƣợc gọi bằng một số tên khác nhƣ:
Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Disease Syndome). Hội chứng vô sinh và
hô hấp ở lợn, viết tắt là SIS (Swine Infertility and Respiratory Syndromde).
Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn, viết tắt là PEARS (Porcine Endemic and
Respiratory Syndrome). Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome). Bệnh lợn tai xanh (Blue-
ear Disease).
Năm 1992, Hội nghị quốc tế về bệnh này đƣợc tổ chức tại St. Paul,
Minnesota (Mỹ) đã nhất trí dùng tên hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở
lợn (PRRS) và đƣợc tổ chức Thú Y thế giới công nhận. Bệnh đƣợc gây ra
bởi virus PRRS, tồn tại dƣới dạng hạt virion gây nhiễm.
1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
* Cơ chế gây bệnh và các phƣơng pháp lan truyền
4
Virus gây PRRS có trong dịch mũi, nƣớc bọt, phân và nƣớc tiểu của
lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trƣờng; tinh dịch của lợn đực
giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn cái mang thai, virus có
thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh.
Virus gây PRRS có thể xâm nhập vào cơ thể lợn theo đƣờng hô hấp,
tiêu hóa và đƣờng âm đạo. Sau khi xâm nhập, đích tấn công chủ yếu của
virus là các đại thực bào ở phế nang. Đây là tế bào duy nhất có receptor phù
hợp với cấu trúc hạt của virus, vì thế chúng hấp thụ và thực hiện quá trình
nhân lên chỉ trong loại tế bào này và phá hủy nó. Ở lợn mắc bệnh, một tỷ lệ
lớn các tế bào đại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhập rất sớm và phá
hủy làm giảm khả năng phòng vệ của phổi. Lúc đầu, PRRSV có thể kính
thích sự tăng sinh của đại thực bào nhƣng sau 2-3 ngày, virus này sẽ giết chết
chúng, các virion đƣợc giải phòng ồ ạt xâm nhiễm sang các tế bào khác, tiếp
tục quá trình nhân lên và phá hủy đại thực bào. Trong cơ thể lợn ốm do mắc
PRRS có tới 40% tế bào đại thực bào bị virus giết chết [17]. Trong hệ thống
miễn dịch của cơ thể, đại thực bào đóng vai trò vô cùng quan trọng, cả trong
đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện
kháng nguyên thiết yếu. Khi đại thực bào bị phá hủy bởi PRRSV mở đầu cho
quá trình miễn dịch không xảy ra đƣợc, cơ thể lợn rơi vào trạng thái suy
giảm miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, điều này có thể
thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự
tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong
đƣờng hô hấp nhƣ Mycoplasma hyopneumoniae, P. multocida, S. suis, A.
pleuropneumoniae... Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] khi xác
định một số vi khuẩn kế phát gây chết lợn trong vùng dịch PRRS ở huyện
Văn Lâm, tỉnh Hƣng Yên năm 2010 đã cho thấy lợn mắc PRRS thƣờng kế
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
phát bệnh do các nhóm vi khuẩn đƣờng hô hấp và đƣờng ruột nhƣ A.
5
pleuropneumoniae, P. multocida, S.suis, Escherichia coli, Salmonella sp,
Clostridium perfringens. Kết quả phân lập đƣợc vi khuẩn A.
pleuropneumoniae với tỷ lệ cao nhất 63.33% và thấp nhất là P. multocida
10%[2]. Các tác giả nhận định các nhóm vi khuẩn kế phát trên đã làm cho
dịch PRRS trầm trọng và phức tạp hơn.
* Các biện pháp phòng bệnh
Hiện nay chƣa có thuốc điều trị đặc hiệu lợn mắc PRRS, do vậy việc
phòng bệnh bằng vaccine và vệ sinh phòng bệnh, tiêu độc khử trùng hiện
đang là hai biện pháp hữu hiệu ở nhiều cơ sở chăn nuôi lợn. Để chủ động
phòng chống dịch, cần thực hiện đồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng,
chống dịch nhƣ: Phát hiện sớm, bao vây xử lý kịp thời các ổ dịch; công tác
tuyên truyền thực hiện sâu rộng tới các ngành, các cấp và ngƣời dân tham gia
chăn nuôi; đặc biệt có sự chỉ đạo quyết liệt của chính quyền các cấp từ Trung
ƣơng tới các địa phƣơng. Trƣờng hợp có tỷ lệ lợn trong đàn kiểm tra huyết
thanh dƣơng tính cao thì tiêu hủy là phƣơng pháp hiệu quả. Tuy nhiên,
phƣơng pháp tiêu hủy rất tốn kém và có thể dẫn đến mất đi những giống
thuần. Điều này cho thấy trong chăn nuôi lợn việc chẩn đoán sớm những con
lợn mang trùng mà chƣa có dấu hiệu lâm sàng là rất cần thiết và cấp bách.
Các biện pháp quản lý không đƣợc kết hợp để cải thiện điều kiện chăn nuôi
thì nguy cơ dịch viêm phổi vẫn sẽ tồn tại [35].
* Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam
+ Trên thế giới
Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nƣớc và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các
châu lục trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới khẳng định phát
hiện có bệnh Tai xanh lƣu hành.
Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phƣơng ở nhiều nƣớc
trên thế giới, kể cả các nƣớc có ngành chăn nuôi lợn phát triển nhƣ Mỹ, Hà Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
6
Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức... và đã gây ra những tổn thất rất lớn về
kinh tế cho ngƣời chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [27]. Nhƣ hàng
năm Mỹ phải chịu tổn thất cho bệnh Tai xanh gây ra khoảng 560 triệu USD.
Các nƣớc trong khu vực có tỷ lệ bệnh Tai xanh lƣu hành rất cao. Ở Trung
Quốc là 80%. Đài Loan là 94,7% - 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là
97%, Malaysia là 94%, Hàn Quốc là 67,4% - 73,1%[5].
Tại Trung Quốc: Theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên
gia của Trung Quốc đã đƣợc phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006,
đàn lợn của Trung Quốc đã bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi "Hội chứng sốt
cao ở lợn" do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yểu là virus PRRS và các loại
mầm bệnh này đã làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy. Kết quả
nghiên cứu toàn diện của Trung Quốc đã khẳng định chủng virusPRRS gây
bệnh tại nƣớc này là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của virus
(thiếu hụt 30 acid amin trong gen). Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan,
Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hƣởng
nặng buộc Trung Quốc phải tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây
lan. Trƣớc diễn biến phức tạp của dịch Tai xanh, Bộ Nông Nghiệp Trung
Quốc đang thực hiện chƣơng trình phòng chống bệnh rất quy mô, riêng
chƣơng trình nghiên cứu, sản xuất vaccine đã đƣợc cam kết chi khoảng 280
triệu Nhân dân tệ tƣơng đƣơng với 36,5 triệu USD [25].
Tại Hồng Kông và Đài Loan đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và
Bắc Mỹ cùng lƣu hành, đặc biệt trong cùng một con lơn ở Hồng Kông đã
xác định nhiễm cả hai chủng nêu trên; dịch Tai xanh cũng đƣợc thông báo ở
Thái Lan từ các năm 2000 - 2007. Thông báo cho biết các virus gây bệnh
Tai xanh đƣợc phân lập từ nhiều địa phƣơng thuộc nƣớc này gồm cả chủng
dòng châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ. Trong đó, số virus thuộc chủng dòng
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
châu Âu chiếm 66,42%, còn các virus thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm
7
33,58%. Phần lớn ở những quốc gia này hiện còn đang lƣu hành virus gây
bệnh Tai xanh chủng châu Âu hoặc Bắc Mỹ, là những chủng virus cổ điển
độc lực thấp [13].
Tháng 9/2007, Nga là nƣớc thứ 3 đã báo cáo chính thức có dịch bệnh
Tai xanh do chủng virus PRRS thể độc lực cao gây [16].
+ Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn
lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh
dƣơng tính với PRRS và cả đàn đƣợc tiêu hủy ngay [6]. Tuy nhiên, theo điều
tra ở một số địa bàn thuộc thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho
thấy 25% mẫu huyết thanh lợn có kháng thể virut PRRS (596/2308 mẫu) và
5/15 trại (chiếm 33%) có lƣu hành huyết thanh bệnh lợn Tai xanh. Năm
2003, tỷ lệ huyết thanh dƣơng tính với bệnh tai xanh trên lợn nuôi tập trung
ở Cần Thơ là 66,86%. Nhƣ vậy, PRRS đã đƣợc phát hiện ở Việt Nam từ năm
1997, tuy nhiên, từ năm 1997 đến trƣớc tháng 3 năm 2007 chƣa phát hiện
các ổ dịch lâm sàng trên đàn lợn. Việc xảy ra các ổ dịch lần đầu ở các tỉnh
phía Bắc có liên quan đến tình hình dịch ở các nƣớc láng giềng. Theo thông
báo của các tổ chức quốc tế, trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở
một số nƣớc trong khu vực. Từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra
các đợt dịch bệnh ở nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm
tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn
nguồn virus lây nhiễm. Mặc dù chƣa có những nghiên cứu cụ thể về tốc độ
lây lan của virus, nhƣng quan sát dịch tễ học đợt dịch lần thứ nhất (tháng 3, 4
năm 2007) cho thấy chỉ một thời gian ngắn sau khi Hải Dƣơng có dịch thì
sáu tỉnh lân cận của vùng đồng bằng Bắc Bộ là Hƣng Yên, Quảng Ninh,
Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Phòng. Số lợn mắc bệnh 31.750 con,
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
số lợn chết và xử lý 7.296 con [15].
8
1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV)
Qua nghiên cứu giải mã gen của virus tại Mỹ và Trung Quốc cho thấy
các chủng PRRSV tại Việt Nam có mức tƣơng đồng về amino acid từ 99%
đến 99,7% so với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc và đều
bị mất 30 axít amin. Điều này cho thấy các chủng PRRSV ở nƣớc ta hiện nay
thuộc dòng Bắc Mỹ, có độc lực cao giống chủng ở Trung Quốc [16].
Nhiều nghiên cứu của các tác giả trong nƣớc từ năm 2009 đến nay đã
nhận định PRRSV tại Việt Nam hiện nay đƣợc xác định thuộc chủng Bắc
Mỹ dòng Trung Quốc [3], [8], [10], [14].
Đặc tính sinh học của virus
Virus gây PRRS rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực
bào hoạt động ở vùng phổi. Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau
đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%). Đại thực bào bị giết chết nên
sức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng. Do vậy lợn mắc
PRRS thƣờng dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát. Virus không gây ngƣng kết với
các loại hồng cầu gà, dê, thỏ, chuột, hồng cầu type O của ngƣời. Virus phát
triển tốt trên môi trƣờng tế bào đại thực bào phế nang lợn, trên tế bào dòng
CL 2621, tế bào MA 140 với bệnh tích phá huỷ tế bào, sau 2- 6 ngày tế bào
co tròn, tập trung thành cụm dày lên, nhân co lại cuối cùng bong ra [17]. Tuy
có một số khác biệt về di truyền và kiểu hình nhƣng các chủng virus Bắc Mỹ
và các chủng virus Châu Âu lại cùng gây ra các triệu chứng lâm sàng về hô
hấp và sinh sản ở lợn rất giống nhau. Dựa vào những kết quả nghiên cứu tổn
thƣơng đại thể và vi thể của tổ chức phổi lợn mắc bệnh, ngƣời ta chia ra hai
nhóm virus là nhóm virus có độc lực cao và nhóm virus có độc lực thấp.
Nhóm virus có độc lực cao thƣờng gây ra các tổn thƣơng ở tổ chức phổi lợn
bệnh nặng hơn nhóm virus có độc lực thấp. Năm 2007, Kegong Tian và Yu
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
khi nghiên cứu về sự biến đổi về độc lực của PRRSV tại Trung Quốc cho
9
rằng virus đã có sự biến đổi về độc lực và hậu quả lợn nhiễm virus này có tỷ
lệ chết cao, trên 20% trong tổng số nhiễm bệnh [34].
Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của virus
+ Sức đề kháng của virus.
Virus gây PRRS có thể tồn tại một năm ở nhiệt độ lạnh từ -20 đến -70 oC; trong điều kiện 4oC virus có thể sống một tháng; nhiệt độ cao virus đề kháng kém ở 37oC chịu đƣợc 48 giờ, 56oC bị chết sau một giờ, virus thích
hợp ở pH 5 -7. Với các chất sát trùng thông thƣờng và môi trƣờng có pH
axit, virus dễ dàng bị tiêu diệt. Dƣới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia
tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng [10], [12].
+ Khả năng gây bệnh của virus
Ngƣời và các động vật khác không mắc PRRS, tuy nhiên trong các loài
thuỷ cầm chân màng có vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm. Virus có thể nhân
lên ở loài động vật này và chính đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng
nên rất khó khống chế [18]. Virus gây bệnh cho lợn ở tất cả các lứa tuổi, nhƣng
lợn con và lợn cái mang thai thƣờng mẫn cảm hơn cả. Lợn rừng là động vật
mang trùng và có thể coi là nguồn dịch thiên nhiên [12]. Về độc lực, các nghiên
cứu cho thấy virus gây PRRS tồn tại dƣới 2 dạng đó là dạng cổ điển và dạng
biến thể độc lực cao. Dạng cổ điển có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc
bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tổng đàn. Dạng biến thể độc lực
cao gây nhiễm bệnh cho lợn lây lan nhanh, trầm trọng và chết nhiều [34].
+ Cấu trúc và chức năng của virus
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Cấu trúc:
10
Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS
Dƣới kính hiển vi điện tử PRRSV là loại có vỏ bọc, hình cầu, có kích
thƣớc từ 45 - 80 nm, chứa nhân nucleocapsid có kích thƣớc từ 25 - 35 nm,
trên bề mặt có gai nhô ra rõ, có vỏ là lipid [17]. Virus gây PRRS là ARN
virus với bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dƣơng, có những đặc điểm
chung của nhóm Arterivirus. Sợi ARN này có kích thƣớc khoảng 15
kilobase, có chín ORF (open reading frame) mã hoá cho chín protein cấu
trúc. Tuy nhiên, có sáu phân tử protein chính có khả năng trung hoà kháng
thể bao gồm bốn phân tử glycoprotein, một phân tử protein xuyên màng (M)
và một protein nucleocapsid (N) [12]. Qua các nghiên cứu cho thấy sợi đơn
RNA của virus bao gồm một bộ gen có khoảng 15 kb, mã hóa 9 ORFs [7].
Bộ gen PRRSV bao gồm hai gen ORF1a và ORF1b là polymerase và bẩy
gen cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6 và 7. ORF1a và ORF1b cấu thành
khoảng 75% bộ gen của virus và đƣợc đặc trƣng bởi một quá trình khung
ribosome chuyển dịch thành một polyprotein lớn mà sự phân tách làm phát
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
sinh các protein không cấu trúc (NSP) bao gồm cả RNA phụ thuộc
11
Polymerase. Các khung đọc mở ORF2a, 3, 4 và 5 tất cả mã hóa cho các
protein glycosyl hóa là GP2a, GP3, GP4, GP5 tƣơng ứng. Các ORF2b mới
đƣợc định nghĩa mã hóa các protein nhỏ nhất của các hạt virus đƣợc chỉ định
GP2b. ORF7 mã hóa các protein nuclocapsid không glycosyl hóa (N) [24].
- Chức năng:
ORF1a và ORF1b nằm ở đầu 5’ của genome, chiếm hơn hai phần ba
bộ gen và mã hóa cho RNA Polymerase của virus đƣợc xem là protein chịu
trách nhiệm trong quá trình nhân lên của virus.
ORF2 đến ORF7 nằm ở phía sau của ORF1b, ở đầu 3’ của genome,
mã hóa cho các protein cấu trúc liên quan đến việc hình thành virion.
Sản phẩm của các ORF 5, 6, 7 bao gồm các protein chính của virus.
Cho đến nay ngƣời ta đã xác định đƣợc 3 protein cấu trúc chính của PRRS
đó là: Protein nhân (N-nucleocapsid) trọng lƣợng phân tử khoảng 15 kDa
định bởi ORF7, protein màng (M-membrane) trọng lƣợng khoảng 19 kDa
quy định bởi ORF6 và protein vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọng
lƣợng khoảng 24-25 kDa quy định bởi ORF5. Những nghiên cứu gần đây
cho thấy rằng ORF 2, 3 và 4 của Lelystad virus(LV), chủng Châu Âu của
PRRS virus có lẽ mã hóa cho 3 membrane-associated glycoprotein khác là:
29-30 kD GP2, 45-50 kD GP3, 31-35kD GP4 [22], [23], [33].
1.2. Protein tái tổ hợp
1.2.1. Giới thiệu
Hiện nay nhu cầu sử dụng kháng nguyên là protein trong chuẩn đoán
bệnh lý cũng nhƣ sản xuất vaccine là rất cao. Tuy nhiên, PRRSV thƣờng khó
nuôi trên môi trƣờng tế bào. Chúng chỉ phát triển tốt trên môi trƣờng đại thực
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
bào túi phổi heo (PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ Châu Phi. Hiện tại
12
ngƣời ta chƣa thành công trong việc tuyển lựa các dòng tế bào này trong nuôi
cấy nhân tạo. Các dòng tế bào thận khỉ thƣờng không nhạy cảm cho tất cả các
chủng virus PRRS. Chính vì thế phƣơng pháp sản xuất protein tái tổ hợp cho
PRRSV là hƣớng đi đúng và mang lại nhiều ƣu điểm, đặc biệt sản xuất protein
tái tổ hợp mã hóa bởi ORF5 mang tính ứng dụng cao trong các thử nghiệm
nhƣ dùng làm vật liệu trong các kit chẩn đoán, tạo vaccine tái tổ hợp thế hệ
mới… Sản xuất protein tái tổ hợp mở ra khả năng tạo số lƣợng lớn kháng
nguyên dùng làm vật liệu trong chẩn đoán nhất là khi dịch bệnh bùng phát.
Sản xuất protein tái tổ hợp cũng góp phần khắc phục đƣợc nhƣợc điểm hiện
tại là khó nuôi cấy PRRSV trên môi trƣờng tế bào nhƣ đã nêu ở trên.
1.2.2. Glycoprotein (GP5)
ORF5 của PRRSV mã hóa cho protein vỏ GP5 có kích thƣớc khoảng
25 kDa. GP5 nằm trên bề mặt màng virus chính là vị trí tiếp xúc của PRRSV
khi nó nhiễm vào vật chủ. GP5 là một trong những glycoprotein vỏ phong
phú và đa dạng nhất, là một tác nhân gây cảm ứng chính của kháng thể trung
hòa trong cơ thể. Nó bao gồm ba vị trí glycosylation đƣợc cho là N-linked
N34, N44, N51 nơi mà vị trí trung hòa virus đƣợc đặt tại đó [21]. Plagemann
và cs (2002) đã sử dụng bản đồ peptit để chỉ ra rằng các vị trí trung hòa virus
chính của PRRSV đƣợc đặt tại vị trí giữa của GP5 từ acid amin 36 đến 52.
GP5 đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại PRRSV. Vì vậy
GP5 rất đƣợc quan tâm nghiên cứu trong việc phân tích dịch tễ học và tiến
hóa phân tử cũng nhƣ biến đổi vật liệu di truyền của chủng virus này. Điển
hình là các peptide tín hiệu, vùng ngoại bào virus, vùng xuyên màng và vùng
nội bào virus, các điểm trung hòa virus và những đột biến quan trọng: 13 (R
Q), 151 (R G). Đây là những mô hình có vai trò quan trọng làm thay
đổi yếu tố ảnh hƣởng đến độc lực virus. Hai đột biến trên OFR5 đƣợc xem là
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
chỉ thị cho độc lực của chủng vaccine, đó là đột biến R13 thành Q13 và
13
R151 thành G151. Đột biến Q13 nằm trên trình tự peptide tín hiệu giả định là
trình tự sẽ bị loại bỏ sau dịch mã. Đột biến này có thể ảnh hƣởng đến sự vận
chuyển GP5 đến màng của mạng lƣới nội chất. Sự thay đổi G151 nằm trên
phần ƣa nƣớc của glycoprotein, đây là một trong những dấu hiệu đột biến
liên quan đến sự suy yếu của PRRSV.
Protein GP5 đóng vai trò quan trọng trong việc nhận biết, xâm lấn,
phản ứng miễn dịch của bệnh lợn tai xanh. Đây là một đối tƣợng đƣợc dùng
để nghiên cứu và đã đƣợc một số công trình phân lập, thiết kế biểu hiện
thành công trên E.coli [27], [32].
1.2.3. Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5
Protein tái tổ hợp đƣợc sản xuất bằng cách chèn gen ORF5 mã hóa
cho protein GP5 vào sau promoter của pET 32a(+). Kết quả tạo ra plasmid
tái tổ hợp là pET 32a(+)/GP5, có thể biểu hiện đƣợc protein có kích thƣớc
25kDa trong tế bào E.coli chủng BL21. Protein này có kích thƣớc tƣơng tự
với kích thƣớc protein GP5 biểu hiện trong tế bào túi phổi heo và vẫn giữ
đƣợc cấu trúc kháng nguyên của Protein GP5 tự nhiên. Hiện nay ngƣời ta tập
trung hƣớng nghiên cứu ứng dụng protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 của virus
PRRS trong sản xuất vaccine vì protein GP5 đƣợc quy định bởi ORF này
có chứa những epitope trung hòa chính quan trọng của PRRSV [25].
Để tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên
của PRRSV, các vector tái tổ hợp biểu hiện các protein của virus đƣợc gắn
với các protein khác nhau hoặc cùng biểu hiện nhiều protein của virus
cùng lúc. Chuột tiêm GP5 và M biểu hiện từ vector replication-defective
adenovirus có hàm lƣợng kháng thể trung hòa cao hơn đáng kể so với chuột
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
chỉ tiệm vector biểu hiện GP5 hoặc M riêng rẽ [35].
14
1.2.4. Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21
- Vector biểu hiện pET 32a(+)
Hệ thống vector hiểu hiện pET cho phép dòng hóa và biểu hiện protein
tái tổ hợp ở dạng dung hợp với một homo oligohistidine (6xHis) trong tế bào
E. coli. Sự biểu hiện của gen mục tiêu đƣợc kiểm soát bởi promotor T7 và
nhờ hoạt tính của T7 RNA Polymerase của tế bào chủ đƣợc biến đổi bởi
phage T7. Vector biểu hiện này chứa đoạn DNA mã hóa oligohistidine gọi là
His-tag, đoạn này có thể chứa 6, 8 hoặc 10 acid amin. Vector biểu hiện pET
32a(+) có đầy đủ các yếu tố di truyền đảm bảo chức năng cơ bản của một
plasmid nhƣ: sao mã, phiên mã độc lập và ổn định qua các thế hệ tế bào.
Ngoài ra, hệ vector pET 32a(+) còn có nhiều đặc điểm quan trọng, vƣợt trội
hơn so với các hệ biểu hiện khác.
Gen ngoại lai đƣợc điều khiển bởi promoter T7 – đây là promoter
mạnh và có tính đặc hiệu cao, có khả năng biểu hiện protein ngoại lai lớn
chiếm 10 – 30 % tổng số protein tế bào, có độ nhạy cao với các chất cảm ứng
nên có thể điều khiển dễ dàng sự biểu hiện của gen ngoại lai. Không giống
nhƣ các promoter khác có nguồn gốc từ tế bào E. coli, T7 RNA Polymerase
là một enzyme hoạt động rất mạnh, có tốc độ kéo dài chuỗi nhanh gấp 5 lần
so với các RNA Polymerase có nguồn gốc từ E. coli.
Trên vector đã thiết kế một đoạn gen Trx mã hóa protein Thioredoxin.
Thioredoxin đƣợc phân lập đầu tiên từ E. coli và tìm thấy ở nấm, virus, vi
khuẩn, thực vật…Trong hệ biểu hiện E. coli, Thioredoxin chiếm khoảng
40% tổng protein của tế bào, là một protein oxi hóa khử có khối lƣợng phân
tử 19,5kDa, đƣợc biết đến trong tất cả các sinh vật, đóng vai trò quan trọng
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
trong nhiều quá trình sinh học bao gồm cả tín hiệu oxi hóa khử.
15
Thioredoxin góp phần làm tăng khả năng biểu hiện của gen ngoại lai
khi dung hợp. Ngoài ra vị trí cắt của enterokinase đƣợc thiết kế trƣớc vùng
đa điểm cắt tách protein tái tổ hợp ra khỏi Thioredoxin.
Tất cả các ƣu điểm trên cho thấy pET 32a(+) không chỉ thiết kế riêng
cho việc biểu hiện gen ngoại lai mà còn thuận lợi cho việc tinh sạch trong
quá trình thu nhận protein tái tổ hợp.
- Chủng biểu hiện E.coli BL21 [31]
Hệ gen của chủng E. coli BL21 đã đƣợc cải biến một số gen là opmT,
hsdS, gal, dcm, λ DE3:
Gen ompT: là một gen mã hóa cho protease nằm trên màng ngoài tế
bào, chủng khuyết gen ompT giúp tránh việc các protein tái tổ hợp bị phá
hủy ngay trong tế bào.
Gen hsdS: là một gen có chức năng phân giải plasmid ngoại lai xâm
nhập tế bào chủ, chủng BL21 khuyết hsdS để quá trình biến nạp vector tái tổ
hợp đƣợc hiệu quả hơn.
Gen gal: chủng BL21 (DE3) khuyết gen gal giúp tránh việc tế bào sử
dụng galactose làm nguồn cacbon cho sinh trƣởng.
Gen dcm: là gen methyl hóa trình tự (CCAGG và CCTGG), chủng
khuyết gen dcm tránh việc trình tự gen ngoại lai bị methyl hóa dẫn đến sai
khác trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp.
T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoter
lacUV dùng để điều khiển quá trình biểu hiện, đây là promoter đã đƣợc đột biến,
và đƣợc tạo ra từ phage λ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter của hệ biểu
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
hiện vi khuẩn tự nhiên nào.
16
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Gen mã hóa cho glycoprotein (GP5) của vius Porcine Reproductive
and Respiratory Syndrome (PRRSV) do Phòng Công nghệ tế bào thực vật –
Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện
Công nghệ sinh học cung cấp.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pBT
17
Vector biểu hiện pET 32a(+) do Phòng Công nghệ tế bào thực vật –
Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Hình 2.2. Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+)
Tế bào khả biến E.coli chủng DH5 (α) và chủng BL21 (DE3) do Viện
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
công nghệ sinh học cung cấp.
18
2.1.2. Hóa chất và môi trường
Hóa chất đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu sinh học phân tử của
Biolabs, Invitrogen, Sigma và Fremantas gồm:
Hóa chất phục vụ cho tách plasmid: Sol I (Tris-HCL 1M pH8, EDTA
0,5M ph8, Glucose, H2O khử ion), sol II (NaOH 3M, SDS 10%), sol III
ion), isopropanol, ethanol, (CH3COOK 3M, CH3COOH, H2O khử
chloroform, RNase…
Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: MgCl2, các loại đệm cho enzyme
khác nhau, Taq Polymerase, dNTP.
Hóa chất trong điện di DNA, protein: agarose 0,8%, polyacrylamid,
EtBr, nƣớc cất 1 lần…
LB lỏng (g/l): 5 g NaCl, 10 g Trypton, 5 g yeast extract.
LB đặc (g/l): 5 g NaCl, 10 g Trypton, 5 g yeast extract, 15 g agar.
Bộ kit thôi gel (binding buffer, washing buffer, elusion buffer) –
GenJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific.
Hóa chất dùng cho phản ứng ghép nối gen (buffer T4 ligase 10X, T4 ligase).
Vector tách dòng và biểu hiện: Vector pBT, pET 32a(+).
Kháng sinh Carbenicilin.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hóa chất dùng cho phản ứng lai Western blot…
19
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Bảng 2.1. Tên thiết bị thí nghiệm
Thiết bị STT Dụng cụ
Máy soi gel với tia UV (USA) 1 Bình đá
Bể ổn nhiệt (Jeio Tech – Hàn Quốc) 2 Bình tam giác các cỡ
Máy đo quang phổ (Thermo electron) 3 Cốc đong, ống đong
Bộ nguồn điện di, bể điện di ngang 4 Đầu côn các cỡ và bể điện di đứng.
Cân điện tử (Satorius – Đức) 5 Găng tay cao su, khẩu trang
6 Micropipet: 1 - 5 μl
Lò vi sóng (Sharp, Malaysia) Máy đo pH (Japan) 7 Micropipet: 0,5 - 10 μl
Máy PCR (Singapore) 8 Micropipet: 20 - 100 μl
Máy vortex 9 Ống Eppendorf các cỡ
10 Micropipet: 100 - 1000 μl
Nồi hấp khử trùng (Đài Loan) Tủ lạnh nhiệt độ 4oC, - 20oC (Italia) 11 Bình đựng nito lỏng
12 Giấy bạc, parafilm…
Máy ly tâm lạnh (Eppendorf – Đức) Tủ ổn nhiệt 37oC, 22oC 13
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tạo dòng gen gp5
Phƣơng pháp khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu
- Thiết kế mồi
Căn cứ thông tin về trình tự nucleotide của gen mã hóa protein
GP5 mang mã số HQ540655 trên Ngân hàng gen quốc tế [37], cặp mồi
GP5-F/GP5-R đã đƣợc thiết kế với các thuộc tính đã đƣợc mặc định của
chƣơng trình primer3.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
CGAGCTCATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCG GP5-F
20
GP5-R CCAAGCTTGAGACGACCCCATTGTTCCGCTGA
- Phương pháp PCR [11], [36]
Gen mã hóa cho protein GP5 đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với
cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế. Thành phần phản ứng PCR đƣợc trình bày ở
bảng 2.2.
Thành phần phản ứng PCR:
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)
2.5 Buffer Pfu với MgSO4 (10X)
dNTPs (100mM) 2.5
Mồi xuôi (10µM) 1
Mồi ngƣợc (10µM) 1
DNA (50ng/ µl) 2
15,5 H2O
Taq Polymerase (5U) 0.5
Tổng thể tích 25
Chu trình nhiệt của phản ứng bao gồm:
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
3 Gắn mồi 58 30 giây 30
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
21
72 5 Hoàn tất chuỗi 10 phút 1
4 6 Kết thúc phản ứng ∞
Phƣơng pháp điện di và tinh sạch đoạn DNA từ gel agarose
- Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Mẫu DNA trƣớc khi tra vào các giếng cần bổ sung dung dịch đệm tra
mẫu 5X (Loading bufer- 0,1ml bromophenol blue 10%: 0,3ml glycerol 100%
dẫn nƣớc đến 1ml) tỷ lệ 1:5 chất này vừa có tác dụng tạo mầu để quan sát
vừa có tác dụng gắn mẫu DNA để cho DNA lắng xuống đáy giếng trƣớc khi
chạy điện di. Chạy điện di dƣới hiệu điện thế 100V, với thời gian 25-40 phút.
Gel agarose sau đó đƣợc nhuộm với EtBr (1µg/ ml) trong 10 phút quan sát
dƣới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA và chụp ảnh [11].
- Phương pháp tinh sạch DNA
Tinh sạch DNA từ gel agarose “GeneJET Gel extraction Kit” của hãng
“Thermo scientific” theo quy trình của nhà sản xuất.
2.2.2. Tạo vector tái tổ hợp mang gen gp5
Phƣơng pháp cắt DNA bằng enzym cắt giới hạn
Mục đích để kiểm tra xem DNA plasmid vừa tách chiết có mang đoạn
gen mã hóa GP5 hay không. Ngoài ra, còn đƣợc sử dụng để xử lý đoạn gen
mã hóa GP5 và vector biểu hiện tạo đầu dính, thuận lợi cho việc gắn gen vào
vector biểu hiện. Enzyme cắt là những endonuclease có khả năng thủy phân
DNA mạch kép ở các vị trí có trình tự xác định.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Ở đây sử dụng hai enzyme cắt đầu so le là SacI và HindIII (Fermantas).
22
Thành phần của phản ứng cắt pBT mang gen mã hóa GP5 của PRRSV
(tổng thể tích là 30 µl):
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pBT mang gen gp5
Thành Phần V (µl)
SacI (10 U/ µl) 2,5
HindIII (10 U/ µl) 2,5
pBT-gp5 (2.0 ng/µl) 15
BufferR (10X) 3
7 H2O
Thành phần của phản ứng cắt pET 32a(+)(tổng thể tích là 30 µl):
Thành phần thể tích (µl)
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt pET 32a(+)
Thành phần V (µl)
SacI (10 U/ µl) 2,5
HindIII (10 U/ µl) 2,5
pET 32 a (+) 15
BufferR (10X) 3
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
7 H2O
23
Thành phần phản ứng đƣợc trộn đều và tiến hành ủ ở 37oC trong 5 giờ.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel agarose 1%.
24
Phƣơng pháp ghép nối gen [11], [29]
Sau khi thu đƣợc sản phẩm tinh sạch của đoạn gen mã hóa GP5 tiến
hành gắn sản phẩm này vào vector biểu hiện pET-32a(+) với thành phần
phản ứng nhƣ sau:
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ghép nối gen
Thành Phần Thể tích (µl)
Buffer T4 (10X) 1
T4 ligase (1U) 1
DNA gp5 (1.8 ng/µl) 5
pET 32a(+) (2.0 ng/µl) 1
2 H2O
Tổng 10
Biến nạp plasmid vào E.coli BL21 (DE3) theo phƣơng pháp
Sambrook [29]
Tế bào khả biến đƣợc lấy ra từ tủ -84oC đƣợc làm tan trên đá trong 30 phút
sau đó bổ sung 10 µl vector đã gắn gen và ống đựng tế bào khả biến trộn nhẹ bỏ vào đá 10-15 phút. Hỗn hợp đƣợc bỏ vào bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42oC
trong 90 giây (1 phút 30 giây). Sau đó mẫu đƣợc lấy ra và bỏ vào đá lạnh
trong 10 phút và đƣợc bổ sung 500 µl môi trƣờng LB lỏng để nuôi phục hồi trong 1 giờ ở 37oC lắc 200 v/p.
Dùng que cấy trải 100-200 µl dịch khuẩn lên đĩa có chứa 15-20 ml môi
trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh Carbenicilin. Ủ đĩa ở 37oC qua đêm.
Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ E.coli
- Cách tiến hành.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Phá tế bào và loại trừ protein
25
Chuyển dịch nuôi cấy qua đêm sang ống Eppendorf 2 ml ly tâm 7000
v/p trong 5 phút. Hòa tan cặn tế bào vi khuẩn trong 100 µl dung dịch sol I
(để lạnh). Sau đó bổ sung 200 µl dung dịch Sol II (nhiệt độ phòng) lắc đảo
nhẹ tiếp tục bổ sung 150 µl dung dịch Sol III (để lạnh) lắc đảo nhẹ. Thêm
500 µl chloroform: isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1) lắc đảo nhẹ sau đó ly tâm
12000 v/p trong 15 phút mẫu sẽ tách thành 2 lớp.
Tủa DNA plasmid
Thu dịch nổi lớp trên cùng cho sang ống Eppendorf 1.5 ml. Bổ sung 450 µl dung dịch isopropanol đảo nhẹ ủ ở -4oC trong 30 phút. Ly tâm 12000
v/p trong 10 phút thu cặn.
Rửa DNA plasmid
Rửa cặn bằng 400 µl cồn 70% ly tâm 12000 v/p trong 5 phút. Lặp lại 2 lần
sau đó làm khô. Bổ sung 40-50 µl dH2O ử ở 37oC đến khi tan tủa giữ ở -20oC.
Nồng độ và độ tinh sạch của DNA đƣợc xác định bằng máy đo quang
phổ tử ngoại và điện di trên gel agarose 0,8 %.
2.2.3. Phương pháp biểu hiện và tinh sạch protein GP5
Cấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ của E.coli chủng BL21 (DE3) mang plasmid
tái tổ hợp vào 10ml môi trƣờng LB lỏng chứa carbenicillin (50 µg/ml). Nuôi lắc 37oC, 200 v/p qua đêm.
Hoạt hóa tế bào: Cấy chuyển 5ml dịch vi khuẩn đã nuôi qua đêm sang 50ml môi trƣờng LB lỏng chứa carbenicillin (50µg/ml), lắc ở 37oC, 200 v/p
trong khoảng 2 giờ cho tới khi OD600 đạt 0.6 thì cảm ứng biểu hiện với các
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
điều kiện đã đƣợc tối ƣu. Chúng tôi tiến hành biểu hiện protein tái tổ hợp GP5 ở nồng độ IPTG 0,1 mM, nhiệt độ 30oC thời gian cảm ứng là 5 giờ.
26
Bổ sung IPTG 0.1 mM vào dịch khuẩn thu đƣợc, nuôi lắc 200 v/p trong 5 giờ ở nhiệt độ 30oC. Sau 5 giờ thu mẫu ra ống falcon 50 mỗi ống
chứa 25 ml dịch nuôi cấy để chuẩn bị ly tâm. Tiếp tục ly tâm 4000 v/p trong
15 phút, loại bỏ dịch thu cặn. Bổ sung 3 ml NBB (Native Binding buffer)
vào cặn (tác dụng hồi sinh tế bào), đảo trộn bằng tay cho đều sau đó dồn vào
một ống falcon 50 ml, bỏ vào đá trong 10 phút chuẩn bị tiến hành siêu âm.
Tiến hành siêu âm trong đá để phá tế bào bằng máy siêu âm với chu kỳ 20
giây/lần, nghỉ 20 giây trong 30 phút. Hút dịch phá tế bào sau siêu âm ra các ống Eppendorf 1.5 để ly tâm 12000 v/p ở 4oC trong 10 phút. Thu dịch vào ống falcon 15 ml, cặn thu vào các ống Eppendorf. Bảo quản trong tủ -20oC
để điện di kiểm tra.
Kết quả đƣợc điện di trên gel polyacrylamid (SDS – PAGE) 12.5% để
tiến hành kiểm tra.
Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide
- Tiến hành:
Xử lý mẫu: Các protein trong tế bào sau khi thu lại bằng ly tâm đƣợc xử lý bằng đệm phá mẫu 6x và ủ 99oC trong 5 phút và đƣợc làm lạnh trên đá
trƣớc khi chạy điện di.
Đổ bản gel polyacrylamid 12,5 %
Bảng 2.7. Thành phần gel điện di protein (SDS-PAGE)
Thành Phần Gel tách (4,5 ml) Gel cô (1ml)
0,55ml 0,45ml
H2O Tris-HCL 1,5M (pH 8,8) 1,125 ml ---
Tris-HCL 0,5M (pH 6,8) --- 0,3 ml
Glycerol 50% 0,9ml ---
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Bis/acrylamide 30% 1,89ml 0,14ml
27
45µl 4 µl SDS 10%
30 µl 8 µl APS 10%
3 µl 1 µl TEMED 99%
- Chạy điện di:
Tra mẫu vào giếng và chạy với cƣờng độ dòng điện khoảng 20-22 mA
trong 1 giờ 30 phút tới 2 giờ (hoặc tới khi mẫu chạy hết bản điện di). Gỡ bản
gel và nhuộm với comassie brilliant blue.
Phƣơng pháp lai Western blot
- Phương pháp
Tiến hành gỡ bản gel chuyển sang bộ chuyển màng của hãng Bio-Rad
có chứa màng PVDF và dung dịch chạy Blotting 1X. Theo thứ tự sau: tấm
xốp + giấy thấm + gel + màng PVDF + giấy thấm + tấm xốp. Chạy Western blot với hiệu điện thế U = 25 V qua đêm ở nhiệt độ 4oC. Tiến hành lấy màng
PVDF ra và rửa bằng nƣớc khử ion và tráng qua bằng dung dịch đệm TBS
1X.
Phủ màng trong 2 giờ lắc ở 25oC bằng dung dịch sữa skin milk 5%
trong TBS 1X.
Rửa màng bằng TTBS 1X trong 5 phút, lặp lại 3 lần.
Rửa màng bằng TBS 1X trong 5 phút, lặp lại 3 lần.
Phủ kháng thể pha loãng 1/1000 lần trong skim milk 5% lắc ở nhiệt độ
phòng trong 1 giờ. Tiếp tục rửa màng bằng TTBS 1X trong 5 phút, lặp lại 3
lần và rửa màng bằng TBS 1X trong 5 phút, lặp lại 3 lần. Sau đó hiện màu
trong dung dịch alkaline. Ủ màng, lắc ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, quan
sát kết quả.
Phƣơng pháp tinh chế protein tái tổ hợp dƣới dạng liên kết.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
- Rửa cột và gắn ion kim loại lên cột (Re-charging)
28
Trƣớc hết cột đƣợc rửa bằng 50 ml H2O, sau đó đƣợc rửa tiếp với
dung dịch MES để đẩy toàn bộ các protein bám trên cột ra khỏi cột. Tiếp
theo cột đƣợc cho 50 ml H2O chạy qua để rửa hết dung dịch MES ra khỏi
cột, cho 50 ml dung dịch đẩy ion (50 mM EDTA) qua cột để loại hết các ion Ni2+ đang bám trên giá thể Sepharose ra khỏi cột. Rửa cột bằng 50 ml H2O để loại hết ion khỏi cột, gắn ion Ni2+ mới lên giá thể của cột bằng cách cho
12 ml dung dịch NiCl2 chạy vòng qua cột trong khoảng 30 phút. Để ổn định
cột cho 50 ml đệm bám cột chạy qua cột, sau đó giữ cột trong EtOH 20%.
- Tinh chế protein tái tổ hợp
Khi tiến hành tinh chế protein thì mẫu protein tổng số sẽ đƣợc lấy ra từ tủ - 80oC và đƣợc làm tan, sau đó mẫu đƣợc pha loãng 5 lần với đệm bám
cột (6 ml mẫu + 24 ml đệm bám cột), lọc dung dịch mẫu. Cột đƣợc ổn định
khi cho 25 ml đệm bám cột chạy qua. Tiến hành đƣa 30 ml mẫu protein tổng
số lên cột, điều chỉnh tốc độ dòng chảy trên cột đạt khoảng 2 ml/ phút.
Protein đƣợc rửa khỏi cột bằng đệm rửa mẫu. Protein tái tổ hợp đƣợc thu khi
cho đệm thu mẫu chạy qua. Cột đƣợc rửa bằng 50 ml H2O. Rửa lại cột bằng
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
dung dịch đệm rửa mẫu. Cột bảo quản trong EtOH 20%.
29
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5
Tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang gen gp5
Để gen hoạt động và biểu hiện ra sản phẩm protein, gen phải nằm
trong một cấu trúc hoàn chỉnh bao gồm đoạn khởi đầu ở phía trƣớc và đoạn
kết thúc ở phía sau gen, đoạn khởi đầu và kết thúc này sẽ điều khiển gen hoạt
động trong tế bào chủ thích hợp [19]. Bởi vậy, để GP5 biểu hiện đƣợc, trình
tự DNA mang mã di truyền của GP5 phải đƣợc lắp ghép đúng chiều vào giữa
đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của vector pET 32a(+).
Để thiết kế vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa protein
GP5 trƣớc hết trình tự của gen gp5 đƣợc ghép nối vào vector tách dòng pBT
đã mở vòng để nhân lên số lƣợng lớn, sau đó vector tái tổ hợp đƣợc cắt bằng
enzyme SacI và HindIII để thu lại đoạn gen mang trình tự gen gp5 làm
nguyên liệu lắp ghép vào vector pET 32a(+) (Hình 3.2 A, B).
Biến nạp pBT-gp5 vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.
Sau khi tiến hành ghép nối gp5 và vector tách dòng pBT. Vector tái tổ
hợp này đƣợc biến nạp vào chủng E.coli DH5α, đƣợc cấy chải trên môi
trƣờng LB đặc có chứa kháng sinh carbenicillin (100 mg/ml), IPTG (0.1 mM) và cơ chất X-gal (40 mg/ml), ủ ở nhiệt độ 37oC trong 16h. Kết quả thu
đƣợc có khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng. Chọn khuẩn lạc màu
trắng chuyển sang môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung kháng sinh Cacbenicilin
100 mg/ml) qua đêm. Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn đem kiểm tra sản phẩm
chọn dòng bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc, để xác định
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
khuẩn lạc mang gen mong muốn (Hình 3.1).
30
Sản phẩm colony – PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose
0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong Ethidium 1% và chụp ảnh dƣới
ánh sáng đèn cực tím (Hình 3.1).
M: thang chuẩn của hãng Thermo
Hình 3.1. Kết qủa điện di sản phẩm colony - PCR khuẩn lạc mang gen gp5
Từ kết quả colony-PCR (Hình 3.1) cho thấy cả hai khuẩn lạc trắng
đƣợc lựa chọn đều dƣơng tính với băng 650 bp điều đó chứng tỏ đã tiến hành
tạo dòng thành công vector tạo dòng pBT mang gen mã hóa cho GP5. Tiến
hành tách plasmid để thu plasmid tái tổ hợp pBT-gp5.
Trƣớc tiên, các tế bào trong dịch nuôi cấy đƣợc thu nhận bằng cách ly
tâm thu tủa. tiếp đó chúng đƣợc xử lý bằng dung dịch Sol I (có tác dụng rửa
sạch tế bào), sau đó màng tế bào đƣợc phá bằng dung dịch Sol II. Khi DNA
plasmid đã đƣợc giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn tiếp tục xử lý bằng dung
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
dịch Sol III thì pH môi trƣờng trở về khoảng acid yếu gắn với điểm đẳng
31
điện của DNA. Vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và đƣợc kiểm
tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.2 A giếng 1).
Cắt pBT-gp5 bằng enzyme cắt giới hạn thu DNA gp5 tinh sạch
Tiến hành phản ứng cắt pBT-gp5 với enzyme SacI và HindIII thành
phần hỗn hợp sau khi đƣợc trộn lẫn vào nhau đƣợc để trong tủ ổn nhiệt ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 5 giờ để phản ứng cắt xảy ra hoàn toàn. Hỗn
hợp sau đó đƣợc tiến hành điện di trên gel agrose 1% (Hình 3.2).
(A) (B)
M: Thang chuẩn của hãng Thermo
(A): Sản phẩm cắt vector pBT bằng enzyme giới hạn SacI và HindIII
(Giếng 1(A): Plasmid pBT-gp5 gốc. Giếng 2: Plasmid pBT-gp5 sau khi xử
lý bằng enzymme cắt giới hạn SacI và HindIII)
1(B): Điện di tinh sạch sản phẩm DNA gp5
Hình 3.2. Kết quả cắt kiểm tra và tinh sạch pBT-gp5
Qua hình 3.2 A cho thấy ở giếng số 1 có 2 băng đậm và sáng là chiều
dài của pBT-gp5. Có hai băng bởi vì plasmid tồn tại ở hai dạng xoắn và siêu
xoắn, siêu xoắn tốc độ di chuyển nhanh hơn. Ở giếng số 2 có thêm một băng
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
so với giếng 1, điều này là do sau khi chúng ta sử dụng enzyme cắt sẽ xuất
32
hiện đoạn gen này. Kích thƣớc của đoạn gen này khoảng 650bp, đây chính là
đoạn gen mã hóa gp5. Tuy nhiên, để thu đƣợc đoạn gen này cần tiến hành
tinh sạch từ gel agarose (Hình 3.2 B).
Trên hình 3.2 B là kết quả sau khi tiến hành tinh sạch gp5 từ gel
agarose bằng bộ kít của hãng “Thermo scientific’’. Kết quả trên cho thấy
băng 650 bp trùng khớp với kích thƣớc của gp5 và có độ tinh sạch cao, đảm
bảo cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5
Mở vòng vector pET 32a(+)
Vector biểu hiện pET 32a(+) cũng đƣợc xử lý bằng enzyme cắt giới
hạn SacI và HindIII tạo đầu dính bổ sung với gen gp5. Hỗn hợp đƣợc ủ trong 5 giờ ở 37oC sau đó tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả
trên hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) bằng enzyme cắt giới
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
hạn SacI và HindIII
33
Giếng 1, pET 32a(+) gốc, Giếng 2 pET 32a(+) sau khi được cắt bằng
enzyme giới hạn SacI và HindIII.
Ở hình 3.3 giếng 1 có hai băng sáng vì plasmid có cấu trúc dạng xoắn
và siêu xoắn, giếng thứ 2 chỉ có một băng vì sau khi xử lý bằng enzyme SacI
và HindIII plasmid chuyển thành dạng thẳng. Nhƣ vậy, việc cắt vector pET
32a(+) đã thành công. Tiến hành tinh sạch để loại bỏ các thành phần phụ trong
phản ứng cắt mở vòng pET 32a(+) để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Ghép nối plasmid pET 32a(+) với gen gp5 tạo vector tái tổ hợp
Để thu đƣợc vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa protein
GP5 tiến hành phản ứng nối vector pET 32a(+) đã mở vòng với DNA gp5.
Hỗn hợp của phản ứng nối đƣợc ủ trong tủ ổn nhiệt với nhiệt độ 22oC trong
thời gian 3 giờ. Sau đó biến nạp vào chủng biểu hiện E.coli BL21 để tạo
chủng biểu hiện mang vector tái tổ hợp.
Plasmid sau khi đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli đƣợc cấy trải trên
môi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh Carbecicilin (100 mg/ml) nuôi ở
37oC trong 16 giờ, lựa chọn khuẩn lạc đơn trên môi trƣờng LB đặc chuyển
sang nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh Carbecicilin (100
mg/ml) nuôi ở 37oC trong 16 giờ. Tiến hành tách plasmid tái tổ hợp và tiến
hành phản ứng cắt kiểm tra.
Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET 32a(+)-gp5 bằng enzyme cắt giới hạn.
Để kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) có mang gen gp5 hay
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
không. Chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) bằng
34
enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII kết quả đƣợc kiểm tra trên gel agarose
0.8% (Hình 3.4).
Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp
M: thang chuẩn 1kb của hãng Thermo
Giếng 1: pET 32a(+)-gp5 đƣợc xử lý bằng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII.
bằng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII
Từ Hình 3.4 (giếng 1) có thể thấy sau khi xử lý bằng enzyme cắt giới hạn
SacI và HindIII đã tạo đƣợc băng sáng kích thƣớc xấp xỉ 6kb chứng tỏ plasmid
pET 32a(+) đã đƣợc cắt bằng cắt giới hạn SacI và HindIII chuyển thành mạch
thẳng. Một băng có kích thƣớc xấp xỉ 0,65 kb đây chính là kích thƣớc của gp5
sau khi cắt bởi enzyme giới hạn SacI và HindIII. Nhƣ vậy, việc tạo vector tái tổ
hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa cho protein GP5 đã thành công. Chúng tôi
tiến hành biểu hiện protein GP5 trong tế bào E.coli chủng BL21.
3.3. Biểu hiện và tinh sạch protein GP5 trong E.coli
Biểu hiện protein GP5
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Quy trình nuôi cấy biểu hiện gen đƣợc tiến hành theo mô tả ở phần vật
35
liệu, phƣơng pháp. Theo lý thuyết GP5 đƣợc biểu hiện số lƣợng lớn dƣới
dạng protein dung hợp với Trx (gọi tắt là TrxGP5) và protein tạo thành có
khối lƣợng phân tử khoảng 43 kDa.
Dịch nuôi chứa E.coli BL21 mang vector pET 32a(+)/gp5 đƣợc nuôi trong 16 giờ sau đó tiếp tục nuôi biểu hiện trong môi trƣờng LB lỏng ở 30oC
trong 5 giờ có bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng độ 0,5 mM. Kết quả sau khi
điện di SDS-PAGE (Hình 3.5) cho thấy phân đoạn 43 kDa phân đoạn này
không xuất hiện ở mẫu đối chứng cảm ứng IPTG.
Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE dịch nuôi vi khuẩn
M: Thang chuẩn của hãng Thermo
Giếng 1: E.coli BL21mang plasmid tái tổ hợp pET32/Trxgp5
Giếng 2 DC: E.coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) (đối chứng)
mang vector tái tổ hợp
Tế bào E. coli BL21 mang vector pET 32a(+) không chứa gen ngoại
lai nên không có protein tái tổ hợp (đối chứng âm). Trên bản điện di (Hình
3.5) ở giếng 1 (E. coli BL21 mang pET32/Trxgp5) có một vạch protein khối
lƣợng khoảng 43 kDa rất đậm tƣơng ứng với kích thƣớc TrxGP5 mà ở
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
đƣờng chạy đối chứng không có. Trong khi đó tại giếng số 2 E.coli BL21
36
mang plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) không mang gen GP5 nên không thấy
xuất hiện vạch tại vị trí có kích thƣớc 43 kDa. Do đó, có thể khẳng định
protein tái tổ hợp TrxGP5 đã đƣợc tổng hợp trong tế bào E. coli và có kích
thƣớc đúng với kích thƣớc lý thuyết và có hàm lƣợng lớn.
Để tiến hành tinh chế protein cần phải phá vỡ lƣợng lớn tế bào nhằm
thu protein tổng số và loại bỏ những thành phần không cần thiết.
Kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp bằng Western blot
Để xác định protein, biểu hiện và tinh sạch đƣợc là GP5/His-tag, tiến
hành kỹ thuật lai Western blot sử dụng kháng thể kháng trình tự His-tag với
nồng độ pha loãng 1:1000 lần. Kết quả cho thấy trong dịch chiết tế bào đã
thu đƣợc băng protein có kích thƣớc 43kDa (Hình 3.6). Chứng tỏ GP5 đã
đƣợc biểu hiện thành công trong tế bào E.coli BL21. Kết quả này cũng chỉ ra
việc sử dụng cột sắc ký ái lực Ni-NTA đã cho phép tinh sạch đƣợc protein tái
tổ hợp GP5.
Hình 3.6. Kết quả phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag
M: thang chuẩn của hãng Thermo
1: phân đoạn thu mẫu
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
(pha loãng 1:1000 lần)
37
(-) đối chứng âm
Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh chế protein tái tổ hợp
Cột tinh chế protein đƣợc thiết kế có giá thể gắn với ion kim loại Ni2+
nhờ phức hợp càng cua, ion này có ái lực rất lớn với vòng Imidazol của
histidine. Khi cho các protein tổng số qua cột, protein nào có chứa amino acid histidine sẽ đƣợc giữ lại cột bởi tƣơng tác Imidazol - Ni2+, còn các
protein không chứa vòng Imidazol của histidine sẽ đi ra khỏi cột. Ái lực giữa
ion kim loại và protein mạnh hay yếu phụ thuộc vào protein đó có nhiều
Histidine không và các Histidine đó có nằm sát nhau hay không. Nếu protein
có nhiều Histidine và các Histidine đó nằm gần nhau thì liên kết giữa chúng
với ion kim loại càng mạnh.
Vector biểu hiện pET 32a(+) đƣợc thiết kế sao cho sau khi dịch mã ra
protein tái tổ hợp có mang 6 Histidine (Hexa histidine) nên chúng có ái lực rất cao với ion Ni2+. Khi cho mẫu chứa protein tổng số đi qua cột thì những
protein nào không có hoặc chứa ít Histidine sẽ đi ra khỏi cột, lúc này trên cột là những protein có histidine liên kết với ion Ni2+. Nhƣng mức độ liên kết
này lại khác nhau vì protein chứa nhiều amino acid Histidine sẽ liên kết với
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ion kim loại mạnh hơn và ngƣợc lại.
38
(+): đối chứng dƣơng.
M: thang chuẩn của hãng Thermo
Giếng 1: 20 mM Imidazol; giếng 2: 40 mM Imidazol; giếng 3: 60 mM
Imidazol; giếng 4: 80 mM Imidazol; giếng 5: 100 mM Imidazol.
Hình 3.7. Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sạch sản phẩm
Từ một số nghiên cứu thực nghiệm trên thế giới chúng tôi tiến hành
khảo sát nồng độ Imidazol ở mức 20 nM đến 100 mM. để đạt hiệu quả cao
nhất và chi phí thấp nhất
Khảo sát nồng độ Imidazol ở các mức 20 mM đến 100 mM. Có thể
thấy, nồng độ 100 mM Imidazol thu đƣợc băng sang đậm nhất. Chúng tôi lựa
chọn nồng độ 100 mM Imidazol vì có thể thu đƣợc lƣợng protein tái tổ hợp
lớn, ít tốn hóa chất và dễ dàng để loại muối bằng thẩm tách.
Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5
Do protein nằm trong pha dịch của tế bào nên sau khi siêu âm phá tế bào
tiến hành ly tâm loại bỏ phần xác tế bào lắng xuống, thu lấy phần dịch cho trực
tiếp qua cột sắc ký ái lực Ni-NTA. Do GP5 đƣợc biểu hiện bằng hệ thống
vector hiểu hiện pET 32a(+) nên protein đƣợc tạo ra sẽ đƣợc dung hợp với 1
trình tự gồm 6 amino acid histidine. Trình tự His-tag này sẽ giúp protein tái tổ
hợp kết bám vào cột sắc ký, trong khi các protein khác sẽ bị loại bỏ băng dung
dịch rửa chứa Imidazol 100 mM. Kết quả thu đƣợc trên bản điện di SDS-PAGE
cho thấy protein GP5 tái tổ hợp đƣợc thu lại dạng tinh sạch, có kích thƣớc 43
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
kDa tƣơng ứng với kích thƣớc tính toán lý thuyết (Hình 3.8).
39
M: Thang chuẩn của hãng Thermo Giếng 1: GP5 tinh sạch bằng Imidazol 100 mM
Giếng 2: đối chứng (+) Giếng 3: đối chứng (-)
Hình 3.8. Kết quả điện di kiểm tra GP5 tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA
Trên hình 3.8 cho thấy với nồng độ 100 mM Imidazol protein tái tổ
hợp thu đƣợc với lƣợng lớn và tinh sạch. Nhƣ vậy có thể thấy, để tinh chế
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
protein TrXGP5 có thể dùng Imidazol với nồng độ 100 mM. Nhƣ vậy việc
40
tinh chế protein tái tổ hợp đã thành công và đạt hiệu xuất cao, tinh sạch đảm
bảo cho các ứng dụng sau này của protein tái tổ hợp GP5 nhƣ việc tạo ra các
kit chuẩn đoán nhanh dịch bệnh hay tạo các sản phẩm có bản chất là vaccine
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
với chất lƣợng tƣơng đƣơng chất lƣợng quốc tế…
41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1) Đã đƣợc tách dòng thành công gen gp5vào vector pBT.
2) Gen mã hóa cho protein GP5 đã đƣợc thiết kế thành công vào vector
biểu hiện pET 32a(+).
3) Protein tái tổ hợp GP5 đã đƣợc biểu hiện và tinh sạch bằng cột sắc
ký ái lực Ni-NTA với kích thƣớc 43 kDa.
2. Đề nghị
Với những kết quả thu đƣợc nhƣ trên, chúng tôi đƣa ra một số định
hƣớng nghiên cứu tiếp theo nhƣ sau:
1) Tiếp tục thử nghiệm protein tái tổ hợp làm làm nguyên liệu để sản
xuất các hợp chất nhƣ vaccine thế hệ mới...
2) Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên GP5 để tạo kháng thể đặc hiệu
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
nhằm chuẩn đoán nhanh bệnh dịch PRRSV.
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1] Tiêu Quang An, Nguyễn Hữu Nam (2011), “ Xác định một số vi khuẩn kế
phát gây chết lợn trong vùng dịch lợn Tai xanh ở huyện Văn Lâm tỉnh
Hƣng Yên năm 2010”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(3), tr. 56 - 64.
[2] Bùi Quang Anh, Hoàng Văn Năm, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn
Long, Nguyễn Ngọc Tiến (2008), Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản
(Bệnh Tai xanh), Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 7 - 21.
[3] Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Tùng, Nguyễn Đăng Thọ, Tống Hữu Hiến
(2011), “Điều tra sự lƣu hành Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS)
trên đàn lợn một số tỉnh ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(1), tr.
21 - 30.
[4] Cục Thú y (2008), Báo cáo về chẩn đoán và nghiên cứu virus gây
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn Việt Nam từ tháng 3/2007
đến 5/2008, Hội thảo khoa học về phòng chống Hội chứng rối loạn hô
hấp và sinh sản ở lợn, ngày 21 tháng 5 năm 2008, Hà Nội.
[5] Nguyễn Tiến Dũng (2011), “Những vấn đề thời sự về Hội chứng rối loạn
hô hấp và sinh sản ở lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(1), tr. 5 - 11.
[6] Đậu Ngọc Hào, Văng Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Tiêu Quang Ân
(2008), “Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở
lợn từ cuối tháng 3 đến đầu tháng 7/2008 tại môt số tỉnh trong cả nƣớc”,
Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 15(5), tr. 14-20.
[7] Nguyễn Bá Hiên, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Hữu Nam (2013), “Ngiên
cứu chọn chủng virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS)
để sản xuất vaccine phòng bệnh tại Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
thuật thú y, 20(1), tr. 5 -15.
43
[8] Lê Thanh Hòa, Lê Thị Kim Xuyến, Đoàn Thị Thanh Hƣơng, Trần Quang
Vui, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Bá Hiên (2009), “ Phân tích gen M mã hóa
protein màng của vỉus gây PRRS tại Việt Nam và so sánh với các chủng của
Trung Quốc, thế giới”, Tạp chí Khoa học và phát triển, 7(3), tr. 282 - 290.
[9] Lê Văn Năm (2007), Kết quả khảo sát bước đầu tiên các biểu hiện lâm
sàng và bệnh tích đại thể bệnh PRRS tại một số địa phương thuộc Đồng
bằng Bắc bộ Việt Nam, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản
và bệnh do liên cầu gây ra ở lợn 10/2007, Trƣờng Đại học Nông nghiệp
Hà Nội, tr. 64 - 77.
[10] Phạm Ngọc Thạch (2007), Một số chỉ tiêu lâm sàng, chỉ tiêu máu ở lợn
mắc Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (bệnh Tai xanh) trên một số
đàn lợn tại tỉnh Hải Dương và Hưng Yên, Hội thảo khoa học về Hội
chứng rối loạn hô hấp và sinh sản và bệnh do liên cầu gây ra ở lợn
10/2007, Trƣờng Đại học Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 25 - 34.
[11] Khuất Hữu Thanh (2006), Kĩ thuật gen - nguyên lý và ứng dụng, NXB
KHKT, Hà Nội.
[12] Tô Long Thành (2007), “Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”,
Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 14 (3), tr. 81 - 88.
[13] Nguyễn Nhƣ Thanh (2007), Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản, Hội
thảo về PRRS và bệnh liên cầu khuẩn gây ra ở lợn tháng 10/2007,
Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
[14] Cao Văn Thật, Trần Thị Dân, Trần Thị Bích Liên, Thái Quốc Hiếu,
Nguyễn Văn Hân, Hồ Huỳnh Mai, Nguyễn Thị Mến (2012), “Mức độ
nhiễm virus PRRS và ảnh hƣởng của nhiễm ghép PRRSV-Leptospira lên
năng suất sinh sản heo nái tại tỉnh Tiền Giang”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật
thú y, 19(6), tr. 17 - 23.
[15] Nguyễn Ngọc Tiến (2011), “Tình hình dịch lợn Tai xanh (PRRS) ở Việt
Nam và công tác phòng chống dịch”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y,
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
18(1), tr. 12 - 20.
44
[16] Cục Thú y (2008), Báo cáo về chẩn đoán và nghiên cứu virus gây
hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn Việt Nam từ tháng 3/2007
đến 5/2008, Hội thảo khoa học về phòng chống hội chứng rối loạn hô
hấp và sinh sản ở lợn, ngày 21 tháng 5 năm 2008, Hà Nội.
[17] William T.Christianson, Han Soo Joo. (2001), “Hội chứng rối loạn sinh
sản và hô hấp ở lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 8 (2), tr. 74 - 87.
Tài liệu tiếng Anh
[18] Albina E., Madec F., Cariolet R., Torrison J. (1994), “Immune response
and persistence of the porcine reproductive and respiratory syndrome
virus in infected pigs and farm units”, Vet Rec 134, pp. 567 - 573.
[19] Alasdair D. I., Bruun R. T. (2000), Promoter, patent WO 0078975.
[20] Anonymous. (1992), “Porcine reproductive and respiratory syndrome
(PRRS or blue-eares pig disease)”, Vet Rec 130, pp. 87 - 89.
[21] Ansari I. H., Kwon B., Osorio F.A., Pattnaik A. K. (2006), “Influence
of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respirattory
syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to
induce neutralizing antibodies”, J. Virol 80, pp. 3994 - 4004.
[22] Cancel-Tirado S.M., Evans R.B. and Toom K.J. (2004), “Monoclonal
antibody analysis of porcine reproductive and respiratory sydrome virus
epitopes associated with antibody-dependent enhancement and
neutralization of virus infection”. Vet Immunol. Immunopathol 102, pp.
249 – 262.
[23] Carson S.D, Konigsberg W.H.
(1981), Phenyl-Sepharose chromatography of membrane proteins solubilized in Triton X-100. Anal Biochem 116, pp. 398-401.
[24] Collins J. E., Benfield D. A., Christianson W. T., Harris L., Hennings J.
C., Shaw D. P., Goyal S. M., McCullough S., Morrison R. B., Joo S. H.,
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Gorcyca D., Chladek D. (1992), “Isolation of swine infertility and
45
respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR- 2332) in North America
and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs”, J Vet
Diagn Invest 4, pp. 117 - 126.
[25] Zhang H., Yan Q., Song R., Feng T., Liu L., Zhou L., Lin T. (2013),
Construction and prokaryotic expression of the fusion gene PRRSV GP5
and Mycobacterium bovis Hsp70. Afri.J. Biotech. 12(30), pp: 475 – 4760.
[26] Jiang W., Jiang P., Wang X., Li Y., Tang J., Wang X., Ma S. (2006),
“Recombinant adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of
porcine reproductive and respiratory syndrome virus induce both
humoral and cell-mediated immune responses in mice”. Vet Immunol.
Immunopathol 113, pp. 169 - 180.
[27] Jiang W., Jiang P., Wang X., Li Y., Wang X., Du Y. (2007), “Influence
of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5
glycoprotein N-linked glycans on immune responses in mice”. Virus
Genes 35, pp. 663 - 671.
[28] Kegong Tian,. Yu X. (2007), Emergence of Fatal PRRSV Varants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark, PloS ONE 2(6): e526. doi:10. 1371/journal. pone. 0000526.
[29] Leman A. D. (1992), The decision to repopulate. In Proceedings. Am.
Assoc. Swine Pract. pp. 9 - 12.
[30] Lin P. K. T., Brown D.M. (1992), “Synthesis of oligodeoxyribonucleotides
containing degenrate bases and their use as primers in the Polymerase chain
reaction”, Nucleic Acids Res 19, pp. 5149 - 5152.
[31] Lim A., Dimalanta E.T., Potamousis K.D., Apodaca J., Ananthara-man T.S., and Witkin E.M, “Differences in sensitivity to radiation in Escherichia coli”. Proc Natl Acad Sci USA 32, pp. 59 – 68.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
[32] Liu C., Liu C.J., Yuan X.G., Zhang C. (2013), Purification and characterization of recombinant envelope protein GP5 of porcine
46
respiratorry syndrome virus from E.coili. J
reproductive and Chromatogr A 23, pp 1304: 133-7.
[33] Meulenberg J.J., Petersen den Besten A., de Kluyver E., van
Nieuwstandt A., Wensvoort G. and Moormann RJ. (2004), Molecular
characterization of Lelystand virus. Vet. Microbiol 55, pp. 197 – 202.
[34] Montpetit M. L., Cassol S., Salas T., and O'Shaughnessy M. V. (1992),
“OLIGOSCAN: A computer program to assist in the design of PCR
primers homologous to multiple DNA sequences”, J Virol Methods 36,
pp. 119 - 128.
[35] Sambrook J., Russell D. W. (2001), Molecular cloning a Laboratory
Manual, 3rd, ed. Cold spring harbor laboratory press, cold springhabor NY.
[36] Wensvoort G., Terpstra C., Pol J. M. A. (1991), “Mystery swine disease
in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus”, The Veterinary
Quarterly 13, pp. 121 - 130.
Internet
[37] Nguyen Van. D., Ken. I., Phan Xuan. T. (2010), Nucleotide Porcine
reproductive and respiratory syndrome virus, GeneBank databases Acc.
No. HQ540655, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/311909479, ngày
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
17/10/2010.
