i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-----------------------
VŨ KỲ LIÊN
XÁC ĐỊNH GENOTYPE HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS)
Ở MỘT SỐ PHỤ NỮ TỚI KHÁM TẠI KHOA SẢN CỦA
BỆNH VIỆN TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA THÁI
NGUYÊNNHIỄM VIRUS BẰNG KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ
REVERSE DOT BLOT
LLUUẬẬNN VVĂĂNN TTHHẠẠCC SSĨĨ CCÔÔNNGG NNGGHHỆỆ SSIINNHH HHỌỌCC
Thái Nguyên, 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
ii
MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. HPV – Human Papilloma Virus .................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm HPV........................................................................................ 3
1.1.2. Bộ gen HPV ........................................................................................... 4
1.1.3. Phân type HPV ....................................................................................... 9
1.1.4. Chu kỳ sống .......................................................................................... 10
1.2. Ung thƣ cổ tử cung do HPV ở ngƣời ........................................................... 13
1.2.1. Các bệnh do HPV ................................................................................. 13
1.2.2. Ung thƣ cổ tử cung ............................................................................... 14
1.2.3. Dịch tễ học HPV ................................................................................... 18
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện HPV ................................................................ 20
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 20
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .......................................................... 21
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 24
2.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 24
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................... 24
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ................................................................ 24
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................... 25
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 26
2.3.1. Phƣơng pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm ................................... 26
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
iii
2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA bằng phenol - chloroform ....................... 26
2.3.3. Phƣơng pháp Realtime-PCR phát hiện HPV-DNA ............................... 27
2.3.4. Phƣơng pháp lai Reverse Dot Blot (RDB) ............................................ 28
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 31
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phát hiện HPV-DNA ............................ 31
3.2. Kết quả xác định type (genotype) virus HPV............................................... 34
3.2.1. Kiểu type HPV đƣợc phát hiện ............................................................. 36
3.2.2. Sự phân bố của các types HPV đƣợc phát hiện ..................................... 37
3.2.3. Sự đồng nhiễm các type HPV ............................................................... 38
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ........................................................................ 41
KẾT LUẬN ....................................................................................................... 41
KHUYẾN NGHỊ ............................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 42
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt
ASCUS 1
Atypical Squamous cell of Undetermined Significance Thay đổi tế bào biểu mô gai không điển hình
CIN 2
Cervical Intraepithelial Neoplasia Tân sinh trong biểu mô cổ tử cung
EDTA 3
Ethylene diamine tetraacetic acid
EV 4
Epidermaldysplasia Vereuciform Rối loạn mụn cóc da biểu mô
HGSIL 5
High-grade Squamous Intraepithelial Lesion Tổn thƣơng biểu mô lát mức độ cao
IARC 6
International Agency for Resegrch on Cancer Tổ chức nghiên cứu ung thƣ quốc tế
kb Kilo base 7
kDa Kilodalton 8
LCR Long Control Region Vùng điều khiển dài 9
LSIL 10
Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion Tổn thƣơng biểu mô lát mức thấp
ORF Open reading frame Khung đọc mở 11
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp 12
RDB Reverse Dot Blot Lai phân tử 13
SIL Tổn thƣơng biểu mô vảy 14
Squamuos Intraepithelial Lesion
URR Upstream Regulatory Region 15
Vùng điều hòa thƣợng nguồn
VLPs Virus like particles Hạt virus giả 16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
v
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Sự hình thành capsid của genome HPV .................................................... 3
Hình 1.2. Hình dạng HPV........................................................................................ 4
Hình 1.3. Cấu trúc bộ gene HPV ............................................................................. 5
Hình 1.4. Bộ gene HPV dạng mạch thẳng ................................................................ 6
Hình 1.5. Cấu tạo hạt giả virus ................................................................................ 6
Hình 1.6. Hình ảnh HPV gây mụn cóc trên da và sùi mào gà miệng ...................... 14
Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt cơ chế gây ung thƣ của HPV ............................................ 15
Hình 1.8. Hình ảnh ung thƣ cổ tử cung .................................................................. 17
Hình 1.9. Hình ảnh tế bào biểu mô cổ tử cung bình thƣờng (trái) và tế bào ung thƣ
cổ tử cung (phải).................................................................................................... 18
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình xác định type HPV trên mẫu bệnh phẩm ........... 26
Hình 3.1. Kết quả phát hiện HPV (HPV-DNA dƣơng tính).................................... 32
bằng kỹ thuật Realtime-PCR. ................................................................................ 32
Hình 3.2. Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của chứng dƣơng. ........... 32
Hình 3.3. Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE ........................................ 33
của chứng âm. ....................................................................................................... 33
Hình 3.4. Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE ........................................ 33
của mẫu xét nghiệm ............................................................................................... 33
Hình 3.5. Sơ đồ vị trí gắn các mẫu dò probes đặc hiệu cho 24 types HPV trên màng
lai. ......................................................................................................................... 36
Hình 3.6. Biểu đồ phân bố các types HPV ............................................................. 37
Hình 3.7. Tỷ lệ đồng nhiễm các type HPV ............................................................. 39
Hình 3.8. Kết quả màng lai với nhóm HPV nguy cơ thấp (type 6, 11 và 81) .......... 40
Hình 3.9. Kết quả màng lai với nhóm HPV nguy cơ cao (type 16 và 18) ............... 40
Hình 3.10. Kết quả màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy cơ thấp-thấp ........... 40
Hình 3.11. Kết quả màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy cơ cao-thấp ............. 40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm ................................... 24
Bảng 2.2. Các thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ........................................... 25
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm các type HPV ..................................................................... 37
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm đơn thuần và đồng nhiễm các types HPV ........................... 38
Bảng 3.3. Tỷ lệ đồng nhiễm các types HPV ........................................................... 38
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Hiện nay ung thƣ cổ tử cung là loại ung thƣ xếp thứ hai trong các bệnh ung
thƣ phổ biến của phụ nữ trên thế giới nhƣng lại chiếm vị trí đầu trong các bệnh ung
thƣ của phụ nữ ở các nƣớc đang phát triển. HPV (Human Papilloma Vius) đã và
đang là mối nguy hiểm đe dọa sức khỏe của những ngƣời phụ nữ mắc ung thƣ cổ tử
cung hoặc những phụ nữ mang virus này. HPV đƣợc định type (genotype) dựa trên
sự khác biệt về trình tự DNA của virus. Đến nay các nhà khoa học đã xác định đƣợc
trên 100 type HPV khác nhau trong đó hơn 80 type đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ
gen và các type còn lại cũng đã đƣợc giải mã một phần. Dựa trên khả năng gây ra
các tổn thƣơng mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc
chia làm hai nhóm: nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các type HPV16,
18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70... trong đó HPV16, 18 chiếm tỷ lệ
cao nhất. Các type HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thƣơng
nghiêm trọng và phát triển thành ung thƣ cổ tử cung. Nhóm HPV nguy cơ thấp
(Low-risk HPV) gồm các type HPV1, 2, 6, 8, 9, 11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64... phổ
biến nhất là HPV6, 11. Các type nguy cơ thấp là tác nhân gây nên đa số các dạng
sùi mào gà sinh dục (HPV6, 11), mụn cóc ở chân (HPV1), mụn cơm ở tay (HPV2)
và các dạng viêm nhiễm khác.
Mối liên quan giữa nhiễm HPV và ung thƣ cổ tử cung đã đƣợc xác định từ
những năm 70 của thể kỷ trƣớc, theo đó HPV gây ra rối loạn sinh sản của tế bào
biểu mô cổ tử cung, với diễn tiến tự nhiên từ viêm nhiễm mạn tính, đến dị sản nhẹ,
dị sản vừa, dị sản nặng, rồi ung thƣ cổ tử cung. Tuy hầu hết (khoảng 98%) tình
trạng nhiễm HPV sẽ tự khỏi, nhƣng các types HPV thuộc nhóm nguy cơ cao có thể
làm tổn thƣơng cổ tử cung nặng hơn hoặc thành ung thƣ, thƣờng sau khoảng 10
năm. Khi đã bị nhiễm và có tổn thƣơng do HPV, không có thuốc điều trị đặc hiệu
cho HPV, để tránh nguy cơ tổn thƣơng diễn tiến nặng hơn, chỉ có một cách điều trị
là lấy đi tổn thƣơng này.
2
Hạn chế quan hệ tình dục sớm, không quan hệ tình dục với nhiều ngƣời và tình
dục an toàn là những cách có thể giúp giảm nguy cơ nhiễm HPV. Tuy nhiên, cách phòng
ngừa nhiễm HPV hiệu quả nhất là tiêm ngừa vacxin, hiện nay ở Việt Nam đang lƣu hành
3 loại vacxin phòng 4 types HPV phổ biến (type 6, 11, 16 và 18) đó là vacxin Vacxin
Gardasil (MERCK &CO., Inc.,) và vacxin Cervarix (GlaxoSmithKline). Với những tiến
bộ của y khoa hiện đại, ung thƣ cổ tử cung có thể đƣợc chữa khỏi nếu bệnh đƣợc phát
hiện sớm. Do đó bên cạnh việc tầm soát ung thƣ cổ tử cung bằng xét nghiệm tế bào học
cổ tử cung (xét nghiệm PAP) thì việc phát hiện tình trạng nhiễm HPV và định type virus
này cũng có vai trò rất quan trọng.
Trên cơ sở các kết quả thu đƣợc từ những đề tài nghiên cứu về HPV trƣớc đây,
chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số
phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm
virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
1. Phát hiện đƣợc HPV ở phụ nữ bằng kỹ thuật Realtime-PCR.
2. Xác định đƣợc genotype HPV bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu và phát hiện tình trạng nhiễm HPV ở nhóm phụ nữ đƣợc lựa
chọn bằng kỹ thuật Realtime-PCR.
- Xác định các genotype HPV ở những trƣờng hợp nhiễm virus này bằng kỹ
thuật lai phân tử Reverse Dot Blot.
3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. HPV – Human Papilloma Virus
1.1.1. Đặc điểm HPV
Human Papilloma Virus (HPV) là nhóm virus có kích thƣớc nhỏ, mang vật
liệu di truyền là DNA, gây bệnh ở ngƣời thuộc họ Papovaviridae. HPV có cấu trúc
capsid không vỏ và đối xứng xoắn ốc, đƣờng kính hạt virus khoảng 52- 55nm chứa
DNA dạng vòng, mạch đôi, liên kết với protein giống histone. Vỏ capsid đƣợc tạo
thành từ 72 đơn vị capsomere, mỗi đơn vị là một pentamer của protein cấu trúc L1
và một protein cấu trúc L2 (protein này là thành phần kháng nguyên đƣợc sử dụng
trong miễn dịch đặc hiệu). Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein
capsid chính (L1) chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus. Protein capsid phụ
(L2) chiếm khoảng 20%. Riboxom có hệ số lắng là 21S. Tiểu phần lớn có một vòng
xoắn cuộn có thể chuyển đổi thành tiểu phần nhỏ trong quá trình sao chép. Ngoài ra,
một tiểu phần thứ 3 có hệ số lắng là 14S sẽ xuất hiện chịu trách nhiệm sao chép lại
DNA tế bào chủ khi bao trong Virion. Khi đó, capsid chứa DNA tế bào chủ đƣợc
gọi là Virion giả hay Pseudovirion.
Hình 1.1. Sự hình thành capsid của genome HPV
4
Hình 1.2. Hình dạng HPV
HPV không phát triển trong điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, do
đó muốn thực hiện đề tài này chỉ có thể dựa trên nghiên cứu invivo trên ngƣời bị nhiễm và những mẫu bị nhiễm sẽ đƣợc lƣu giữ ở nhiệt độ -700C trong một thời gian
dài mà không làm ảnh hƣởng tới khả năng hoạt động của virus [22].
1.1.2. Bộ gen HPV
Genome của HPV là một phân tử ADN kép không hoàn chỉnh, siêu xoắn
vòng tức là capsome sắp xếp xung quanh theo chiều xoắn của acid nucleic (ở đây là
DNA) tạo thành ống giống nhƣ cầu thang xoắn, chiều dài của capsid phụ thuộc
chiều dài sợi acid nucleic, bộ gen virus chiếm 12% trọng lƣợng hạt virus, có kích
thƣớc nằm trong khoảng 7,2 kb đến 8,1 kb (trong đó các base Guanine và Cytosine
chiếm 42%), 10 khung đọc mở ORF. Khung đọc mở mã hoá cho toàn bộ protein
của HPV nằm trên một mạch của phân tử ADN kép, tức là sự sao chép, phiên mã
xảy ra trên một mạch và chỉ theo một chiều duy nhất [22].
5
Hình 1.3. Cấu trúc bộ gene HPV
Dựa theo chức năng, genome của HPV đƣợc chia thành ba vùng chính:
Vùng gene mã hoá cho protein muộn bao gồm các gene mã hoá cho các
protein cấu trúc L1 và L2 hình thành vỏ capsid của virus. Gene L1 và L2, vùng L1
mã hóa protein L1 là thành phần chủ yếu cấu tạo vỏ capsid của virus, đây là vùng
bảo tồn nhất của virus và cũng là vùng để phát hiện cũng nhƣ phân loại virus. L1 có
trọng lƣợng phân tử 56-60 kDa, đƣợc phosporyl hóa yếu và không gắn với DNA.
Vùng L2 mã hóa protein vỏ capsid phụ, có trọng lƣợng phân tử 49-60 kDa, lại đƣợc
phosphoryl hóa cao và có khả năng gắn DNA [22].
6
Hình 1.4. Bộ gene HPV dạng mạch thẳng
Khi chỉ gen L1 bộc lộ, có thể hình thành các hạt giả virus hoặc phân tử giống
virus (Virus like particles - VLPs), các thành phần này khó phân biệt với virus thực
sự và đóng vai trò quyết định trong sản xuất virus, sản xuất vaccine.
Hình 1.5. Cấu tạo hạt giả virus
Nếu L2 bộc lộ cùng với L1, nó cũng góp phần tạo ra VLPs, nhƣng L2 không
cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid. L1 và L2 bộc lộ đặc hiệu trong hầu hết lớp
ngoài cùng của tế bào sừng (nơi giải phóng các virus mới đƣợc hình thành). Mặc dù
L2 không đặc biệt cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid nhƣng có vai trò quan
trọng trong chu kỳ sống và trong quá trình xâm nhập của virus do L2 có khả năng
tạo sự gắn kết giữa receptor bề mặt tế bào với actin và với PML, cần thiết cho giai
đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm [22].
7
Vùng gene mã hoá cho các protein sớm gồm 6 gene: E1, E2, E4, E5, E6 và E7 và
khung đọc mở ORF. Các gene này mã hóa cho các protein có vai trò quan trọng trong
quá trình nhân lên của virus và sự tiến triển của ung thƣ cổ tử cung.
- Gene E1 là một trong 2 vùng bảo tồn nhất ở HPV (cùng với vùng L1).
Chức năng chính của E1 là mã hóa cho protein gắn đặc hiệu vào DNA, Gene E1
gắn vào vị trí khởi đầu của quá trình nhân lên (ori), thực hiện quá trình chia tách
DNA (helicase) và giúp các chuỗi gene của virus duỗi ra trong quá trình sao chép.
E1 có hoạt động tháo xoắn không phụ thuộc ATP, rất cần thiết cho sự sao chép của
virus [22].
- Gene E2, ngoài chức năng trong sao chép DNA của virus, E2 là gene mã
hóa chủ yếu cho các nhân tố phiên mã của tế bào, duy trì chuỗi gene virus ngoài
nhiếm sắc thể. Chức năng điều hòa giải mã của gene E2 đƣợc thực hiện do sự gắn
kết với E2BSs trong chuỗi gene của virus có ái lực với gene E2 và những vị trí liên
quan này xác định hiệu quả của gene E2 trong quá trình giải mã. Bên cạnh đó, E2
còn tƣơng tác với E1, giúp E1 dễ dàng gắn với điểm khởi đầu sao chép và có thể bắt
đầu sao chép tăng cƣờng hơn [22].
Gene E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá trình nhân lên
của virus. Gene E2 còn có khả năng gắn với chuỗi DNA đặc hiệu (vị trí gắn E2 -
E2BSs) và protein E1. Tuy nhiên, cả hai chức năng của E2 đều do gene E1 điều
chỉnh. Trong quá trình sao chép virus, có nhiều thành phần tế bào phụ thuộc gene
E1 nhƣ DNA polymerase, chaperone protein, histone H1 và yếu tố sao chép A vì
gene E1 có khả năng trực tiếp thúc đẩy các thành phần này [22].
- Gene E4 mã hóa cho protein E4, có vai trò trợ giúp trong sự trƣởng thành
và phóng thích HPV ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ.
- Gene E5 tổng hợp protein E5 một protein chuỗi đôi kỵ nƣớc, kích thƣớc
nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lƣới nguyên sinh chất của tế bào, giúp HPV xâm
nhập và tồn tại trong tế bào chủ. Protein E5 tác động ngay trong giai đoạn đầu của
sự xâm nhiễm, chúng tạo ra các phức hợp với các thụ thể của nhân tố tăng trƣởng và
biệt hóa, từ đó kích thích sự phát triển của tế bào và giúp virus lẩn trốn khả năng
8
miễn dịch của tế bào chủ. Protein E5 còn có vai trò trong việc ngăn chặn sự chết
theo chƣơng trình của tế bào khi có sự sai hỏng DNA do chính virus gây ra [22].
- Gene E6 mã hóa protein E6, cực kỳ quan trọng trong vai trò gây ung thƣ,
nhất là ở những types đƣợc xếp vào nhóm nguy cơ cao gây ung thƣ. Protein E6 gồm
151 amino acid hình thành 4 cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với kẽm điều hòa. Ba chức
năng chủ yếu của E6 cũng là những chức năng rất nguy hiểm đối với tế bào chủ: Thứ
nhất, liên kết hoặc không liên kết với protein E7 đều có khả năng kích thích tế bào
chủ phân bào mạnh mẽ và sự phân chia là mãi mãi gây bất tử hóa tế bào. Thứ hai, gắn
kết với protein p53 (một protein ức chế khối u của tế bào) và làm tăng sự phân giải
của protein p53 bởi hệ thống protein ubiquitin của tế bào và làm tăng khả năng ức chế
khối u của protein này, E6 còn có khả năng gắn kết với protein PDZ dẫn đến sự thoái
triển của protein PDZ, một protein đƣợc bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cần thiết
cho sự phát triển, kết dính, tăng sinh, biệt hóa và duy trì chu kỳ sống của tế bào. Thứ
ba, là liên kết với gene ras trong quá trình bất tử hóa tế bào, kích thích sự phát triển
của tế bào NIH 3T3, hoạt hóa promoter E2 của Adenovirus [22].
- Gene E7, tuy nhỏ hơn E6, protein E7 đƣợc mã hóa từ gene này chỉ gồm 98
amino acid và hình thành 2 cấu trúc gắn kẽm, nhƣng E7 cũng có vai trò không kém
phần quan trọng trong việc gây ung thƣ ở tế bào chủ. Trƣớc hết là sự tƣơng đồng ở
cấu trúc gắn kẽm với E6, đều là cấu trúc Cys-X-X-Cys, góp phần liên kết chặt chẽ
với E6 hơn, hỗ trợ nhau tác động lên sự bất tử hoá tế bào chủ. Nếu nhƣ E6 cản trở
quá trình tự sửa sai của tế bào chủ thông qua liên kết với p53 thì E7 thực hiện vai
trò này thông qua kiên kết với pRB, cũng là một gene ức chế khối u. Ái lực liên kết
này cao gấp 10 lần ở những types thuộc nhóm nguy cơ cao so với nhóm nguy cơ
thấp. Điều này làm giải phóng số lƣợng lớn nhân tố phiên mã E2F tự do, kích thích
quá trình phiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào [22].
Vùng điều hoà ngƣợc còn gọi là vùng điều khiển dài (LCR) không có chức
năng mã hoá (chứa DNA không mã hóa, có chức năng điều hòa quá trình sao chép
và quá trình phiên mã), vùng này có kích thƣớc 400-1000 bp. Vùng LCR mang các
trình tự điều khiển quá trình sao chép của HPV. Vùng điều hòa thƣợng nguồn URR
9
(Upstream Regulatory Region) hay cũng còn gọi là vùng điều hòa dài LCR (Long
Control Region): Chiếm 10% chiều dài bộ gene, chứa khoảng 800-1000 cặp base
tùy từng type. Đây cũng là vùng biến động nhất trong bộ gene HPV. Trình tự của
vùng bao gồm:
- Trình tự tăng cƣờng: Là nơi gắn của các nhân tố phiên mã (TEF1, TEF2,
YY1...).
- Promoter bao gồm cấu trúc TATA và vùng khởi đầu cho quá trình phiên
mã tổng hợp RNA (ở HPV 16 và HPV 18).
- Điểm khởi đầu sao chép ORI, các tiểu phần kích hoạt và một số chuỗi gene
câm (Silencing gene)...
1.1.3. Phân type HPV
HPV đƣợc định type dựa trên sự khác biệt về trình tự ADN. Đến nay các nhà
khoa học đã xác định đƣợc trên 100 types HPV khác nhau trong đó hơn 80 types đã
đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gen và các types còn lại cũng đã đƣợc giải mã một
phần. Có thể nói HPV là một trong số virus có nhiều types nhất. Việc định type
HPV không dựa vào huyết thanh nhƣ định type virus khác (virus gây viêm gan,
HIV…) mà đƣợc dựa trên sự tƣơng đồng DNA. Khi một type HPV có ít nhất 10%
gene vùng E6, E7, L1 khác với những types HPV đã biết trƣớc đó thì đƣợc xem là
một type HPV mới. Ngoài ra, ngƣời ta còn phân loại đến mức type phụ và những
dạng dễ thay đổi. Đƣợc xếp vào type phụ khi bộ gene của chúng khác nhau 2-10%
trong cùng 1 type đã biết. Nếu sự khác nhau chiếm 1-2% nằm trong vùng mã hóa,
hoặc 5% trong vùng không mã hóa thì đƣợc xem là dạng dễ thay đổi [32].
Dựa trên khả năng gây ra các tổn thƣơng mô học, đặc biệt là khả năng gây
ung thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc chia làm hai nhóm:
Nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các types HPV16, 18, 31,
45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70... Trong đó HPV16, 18 chiếm tỷ lệ cao
nhất. Các types HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thƣơng
nghiêm trọng và phát triển thành ung thƣ cổ tử cung.
10
Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các types HPV1, 2, 6, 8, 9,
11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64... phổ biến nhất là HPV6, 11. Các types nguy cơ thấp
là tác nhân gây nên đa số các dạng mụn cơm, mụn cóc sinh dục (HPV6, 11), sùi
mào gà ở chân (HPV1), sùi mào gà ở tay (HPV2) và các dạng viêm nhiễm khác.
Và có một nhóm chƣa xác định đƣợc nguy cơ (Unknown-risk type): Gồm đa
số các genotype HPV chƣa xác định đƣợc khả năng gây ung thƣ nhƣ: HPV 2a, 3, 7,
10, 13, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 74…
Điều dẫn đến sự khác nhau trong hoạt động của chúng là do vùng gene E6,
E7. Ở nhóm nguy cơ thấp, protein E6, E7 liên kết rất yếu với p53, pRb của ngƣời và
không có khả năng gắn xen vào DNA tế bào chủ [32].
1.1.4. Chu kỳ sống
Ung thƣ cổ tử cung là một hệ quả tất yếu có sự lan truyền lây lan qua đƣờng
tình dục. Thời gian từ lúc tiếp xúc với mầm bệnh cho tới khi xuất hiện mụn cóc là
khoảng 3 tháng, cũng có thể là vài tuần hoặc có thể là vài chục năm do tùy vào tình
trạng sức khỏe và đặc điểm sinh lý của mỗi ngƣời. Sự biểu hiện này có thể chỉ
thoáng qua và đƣợc xử lý bởi hệ miễn dịch của vật chủ. Sau đó, HPV sẽ vào giai
đoạn tiềm ẩn. Tuy nhiên, đối với những ngƣời có quan hệ tình dục bừa bãi, sự biểu
hiện có thể sẽ vƣợt khỏi sự kiểm soát của hệ miễn dịch và dẫn đến sự chuyển từ
dạng ôn hoà sang dạng ác tính, đó là bƣớc tiếp theo cho sự tấn công của virus [21].
HPV không giết chết tế bào chủ. Thay vào đó, nó điều khiển tế bào chủ thông
qua yếu tố gây mƣng mủ tế bào biểu mô tự nhiên. Sau đó, chúng sản xuất protein
capsule trên lớp biểu mô bề mặt để bảo vệ DNA của nó trong quá trình di truyền.
Với sự loại bỏ bề mặt nhuộm tự nhiên này, các tế bào chuyên chở HPV nhƣ là một
vector di truyền.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sau khi lây nhiễm vào cơ thể, các gene gây ung
thƣ (oncogen) của các virus này sẽ tƣơng tác với các yếu tố có mặt trong tế bào chủ
để thúc đẩy sự chuyển dạng tế bào. Sau khi tích hợp vào hệ gene vật chủ, cấu trúc
của gene E2 trong genome HPV bị phá vỡ và không còn khả năng kiểm soát hai
gene gây ung thƣ E6 và E7, do đó hai gene này đƣợc sao mã và tổng hợp các
11
protein tƣơng ứng. Hai protein E6 và E7 sẽ tƣơng tác với hai protein của tế bào là
protein RB (điều hoà chu trình tế bào) và protein p53 (điều hòa sinh trƣởng khối u).
Kết quả là tế bào bị nhiễm HPV sinh sản tự phát, không bị kiểm soát và phát triển
thành tế bào ung thƣ. HPV kìm chế hoạt động của hàng loạt các gene có vai trò
trong quá trình sinh trƣởng của tế bào và đáp ứng interferon chống virus, đồng thời
cũng làm tăng biểu hiện của hàng loạt các gene có vai trò trong hình thành các khối
u. Có thể chia chu kỳ sống của HPV thành 4 giai đoạn chính sau:
Giai đoạn xâm nhập: Chỗ xâm nhiễm đầu tiên của HPV là những tế bào
nằm ở những vị trí dễ bị thƣơng (tế bào lớp đáy), có thể chỉ là những vết thƣơng rất
nhỏ gây ra do quan hệ tình dục. Khả năng virus xâm nhập vào những tế bào cơ bản
này là rất cao. Sau đó, chính sự lành lặn lại ở chỗ vết trầy xƣớt này bằng việc kích
thích sự phân chia những tế bào cơ bản ban đầu đó sẽ dẫn đến làm tăng nhanh thêm
sự sao chép của HPV trong tế bào chủ vì đây là giai đoạn mà HPV chỉ sao chép khi
tế bào chủ sao chép. Chính vùng dễ bị tổn thƣơng nhất trong quan hệ tình dục trở
thành nơi phổ biến nhất cho virus phát triển [21].
Giai đoạn tiềm ẩn: DNA HPV có thể tồn tại rất lâu với số lƣợng ít và không
sao chép, không tạo các hạt virus. Các gene E1, E2 rất cần thiết cho sự nhân lên của
virus ở giai đoạn này. Đây là giai đoạn có sự xâm nhiễm của HPV nhƣng các kỹ
thuật xét nghiệm tế bào, hình thái, soi phóng đại đều cho kết quả bình thƣờng. Chỉ
những xét nghiệm sinh học phân tử có độ nhạy cao nhƣ PCR, lai phân tử mới có
khả năng phát hiện HPV. Thời kỳ này có thể kéo dài 1-8 tháng, tuỳ tình trạng sức
khoẻ mỗi ngƣời và ngƣời ta không xác định đƣợc là hệ miễn dịch có hoạt động hay
không. Cũng có ý kiến cho rằng lúc này hệ miễn dịch không hoạt động vì đòi hỏi sự
phát triển số lƣợng virus và những sản phẩm xâm nhiễm đến một giới hạn nào đó
mới kích thích đƣợc hệ miễn dịch hoạt động. Hầu hết những bệnh nhân đều chỉ có
những biểu hiện thoáng qua và không xác định đƣợc [21].
Giai đoạn nhân bản mạnh: Nếu nhƣ ở giai đoạn trên, HPV chỉ sao chép
cùng tế bào chủ thì bƣớc vào giai đoạn này, HPV sẽ là tác nhân kích thích tế bào
chủ phân chia mạnh. Từ sự hiện diện thấp lƣợng DNA virus ở những tế bào cơ bản,
12
sẽ có sự gia tăng mạnh số lƣợng DNA virus lẫn những sản phẩm xâm nhiễm ở
những tế bào biểu mô gần bề mặt nhất (sự tích lũy protein và những dạng virion của
chúng…). Sự xâm nhiễm có hiệu lực 3-8 tháng trƣớc khi hệ miễn dịch bắt đầu hoạt
động. Chúng phát triển mạnh các mạch máu bao quanh (nhất là ở những types 6, 11)
hình thành mụn nhỏ, dẹt, phẳng hoặc lồi, đến những biểu hiện ban đầu của bệnh
condyloma, acanthosis, koilocytosis, nuclear attypia….[21].
Giai đoạn có hoạt động của tế bào chủ: Đây là giai đoạn quan trọng quyết
định sự thành công hay thất bại của hệ miễn dịch khi đối phó với virus. Thời gian
này thƣờng từ 3-6 tháng, sau khi đã qua giai đoạn nhân bản mạnh của virus, có thể
nhanh hơn hoặc là không bao giờ. Nguyên nhân là vì HPV không xuyên xuống
màng nền biểu mô, chúng chỉ xâm nhập vào các tế bào biểu mô lớp trên, mà các tế
bào này lại rất kém trong hoạt động trình diện kháng nguyên. Nhờ đó, HPV có
nhiều thuận lợi không bị hệ miễn dịch của tế bào chủ nhận diện và tiêu diệt. Chúng
chỉ việc tồn tại an toàn trong những tế bào biểu mô nguyên vẹn. Chỉ khi có những
tổn thƣơng tế bào (do cọ xát hay hóa chất điều trị) làm lộ HPV cho hệ miễn dịch
nhận diện. Khi đó, hệ thống miễn dịch sẽ đƣợc hoạt hóa và tấn công các tế bào bị
nhiễm, khởi đầu là hoạt động của các bạch cầu đa nhân (macrophages), bạch cầu
đơn nhân (monocytes)… Chúng sẽ giải phóng các cytokine nhƣ interferon a, b, g,
interleukine… Interferon có tác dụng làm chậm sự phát triển của virus, làm giảm
những sản phẩm xâm nhiễm của chúng. Cytokine thì tấn công nhƣ là một tác nhân
hóa học bằng những phần tử dính kết lên tế bào cạnh mạch máu, kêu gọi bạch cầu
đến tiêu diệt vùng bị nhiễm. Kết quả của tất cả những hoạt động này là sự gia tăng
cytokine của những tế bào langerhan hay tế bào dendritic. Tế bào dendritic hoạt
động di chuyển qua kênh lymphatic đến vùng hạch lympho, nơi mà chúng thể hiện
kháng nguyên HPV lên bề mặt để lympho T nhận diện. Khi đó sẽ hình thành các
dòng lympho T đặc hiệu HPV, chúng di chuyển theo dòng máu đến vùng bị nhiễm.
Đầu tiên, chúng sẽ tiếp cận các tế bào endothelial trong những mạch máu bên dƣới
vùng rối loạn do HPV gây ra thông qua phân tử dính kết trên bề mặt kháng nguyên,
từ đó, theo grandient nồng độ cytokine qua thành mạch máu vào bên trong biểu mô
13
nhiễm HPV. Tế bào T đặc hiệu và tế bào giết tự nhiên (natural kill cell) sẽ vào bên
trong những mụn cóc, tiêu diệt tế bào bị nhiễm HPV. Bạch cầu đơn nhân và đa nhân
sẽ tiêu huỷ những mảnh vụn tế bào, bao gồm cả DNA của HPV. Sự liên kết những
yếu tố này giúp làm giảm kích thƣớc mụn cóc, làm sạch vùng bị nhiễm. Tế bào T
đặc hiệu sẽ trở thành tế bào nhớ ngăn chặn sự xâm nhiễm trở lại. Sau khoảng 9
tháng, bệnh nhân đƣợc chia thành 2 nhóm là hết bệnh hoặc bệnh vẫn tiếp diễn. Tuy
nhiên ở những bệnh nhân hết bệnh, khả năng hết hoàn toàn HPV và khả năng HPV
quay lại giai đoạn tiềm ẩn là không xác định đƣợc, nên vẫn phải tiếp tục theo dõi và
hạn chế lây nhiễm. Còn ở những bệnh nhân không thuyên giảm thì khả năng chuyển
sang ung thƣ ác tính là cực kỳ cao [21].
1.2. Ung thƣ cổ tử cung do HPV ở ngƣời
1.2.1. Các bệnh do HPV
Trên 99% ung thƣ cổ tử cung là liên quan đến HPV, điều đó cho thấy mức độ
tác động và tầm quan trọng của HPV đối với các tổn thƣơng ở vùng cơ quan sinh
dục. Bên cạnh đó, HPV còn gây các bệnh rối loạn khác. Trên da, chúng gây các
mụn cóc phẳng, dẹt, đôi khi nổi to thành những u sần, thậm chí dày đặc mà ngƣời ta
gọi là dạng hoa súp lơ. Khi có những tác động bất lợi nhƣ: Hệ miễn dịch của cơ thể
kém, vùng da chịu tác động nhiều, lâu ngày của tia UV, các hoá chất gây ung thƣ…
khả năng chuyển thành ung thƣ da là rất cao. Các types gây bệnh này chiếm tỷ lệ
khoảng 10%. Thƣờng gặp nhƣ types: 1, 3, 4, 60, 65, 49, 29. . . Một bệnh cũng khá
phổ biến do HPV gây ra là EV (Epidermaldysplasia Verruciform): Khoảng 20%
types HPV là nguyên nhân gây ra EV. Đây là một bệnh rối loạn mụn cóc dạng biểu
mô. 30% bệnh nhân EV chuyển sang ung thƣ da tế bào vảy. Phổ biến nhất là HPV
types 5 và 8. Các bệnh ung thƣ (ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ thanh quản…) phần
lớn là do các types HPV nhóm nguy cơ cao làm rối loạn quá trình tế bào của tế bào
chủ đẫn đến ung thƣ ở các vùng chúng xâm nhiễm đặc thù.
14
Hình 1.6. Hình ảnh HPV gây mụn cóc trên da và sùi mào gà miệng
Hiện nay virus HPV đang là nguyên nhân gây ra một số bệnh nhƣ ung thƣ hậu
môn, vòm họng còn nhanh và mạnh hơn uống rƣợu bia, ung thƣ dƣơng vật ở nam giới và
đặc biệt HPV đang đƣợc coi là “thủ phạm” của nhiều bệnh ung thƣ nguy hiểm nhƣ: Ung
thƣ cổ tử cung, ung thƣ âm hộ, ung thƣ âm đạo,....ở phụ nữ. Trong nhiều nghiên cứu cho
thấy virus HPV có trong 93% các ca ung thƣ cổ tử cung.
1.2.2. Ung thư cổ tử cung
Là loại ung thƣ mà tế bào đầu tiên chuyển thành tế bào ung thƣ là những tế
bào ở vùng cổ tử cung, chủ yếu là tế bào biểu mô vảy. Đó là những tế bào dẹt,
mỏng, hình chữ nhật, lót bên trong bề mặt cổ tử cung. Khả năng ung thƣ cổ tử cung
do virus HPV gây nên là rất cao. Tùy từng type HPV xâm nhiễm, đặc điểm sinh lý
và lối sống của mỗi ngƣời, vùng cổ tử cung bị nhiễm HPV có thể hình thành khối u
lành hay ác tính. Các khối u ác tính có thể di căn đi bất cứ vùng nào của cơ thể.
Nguy cơ cao nhất là mắc phải các types thuộc nhóm nguy cơ cao. Gene E6, E7 đóng
vai trò là các oncogen (gene gây ung thƣ). Vào giai đoạn cuối cùng của quá trình
xâm nhiễm, khi có sự mất kiểm soát của tế bào chủ và lƣợng HPV vẫn còn duy trì
15
đƣợc ở mức cao, đồng thời với những tác nhân hỗ trợ khác, bộ gene HPV có thể gắn
xen vào bộ gene ngƣời. Khi đó, bộ gene virus bị mất tại vùng gene E1, E2 làm mất
khả năng kiểm soát gene E6, E7. Gen E6, E7 tái biểu hiện, sản xuất nhiều protein
E6, E7. Protein E6 tạo thành phức hợp với protein p53 của ngƣời qua trung gian
E6-AP, còn E7 protein lại liên kết với pRB [23].
Tóm tắt cơ chế phát triển khối ung thƣ do HPV sát nhập bộ gene vào tế bào
chủ gồm 2 tác nhân E6 và E7 đƣợc mô tả nhƣ trong sơ đồ sau:
Bộ gene HPV
E2 E2
xxxx xxxx
Bộ gene ngƣời Bộ gene ngƣời
Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt cơ chế gây ung thư của HPV
Sự tiến triển của bệnh: Để phân chia các giai đoạn phát triển của bệnh từ
bình thƣờng đến ung thƣ, có 3 hệ thống. Tất cả các hệ thống này đều dựa trên cơ sở
sự thay đổi hình thái tế bào học quan sát đƣợc. Mức độ 1: Các tế bào đều bình
thƣờng khi quan sát bằng các phƣơng pháp tế bào học (pap’smear, soi phóng đại…).
Mức độ 2: Có sự xuất hiện các tế bào vảy không điển hình, có sự nghi ngờ bƣớc
đầu, cần theo dõi và làm các xét nghiệm cụ thể hơn. Mức độ 3: Có sự thay đổi bƣớc
đầu về hình dạng, kích thƣớc, số lƣợng tế bào cổ tử cung. Mức độ 4: Xuất hiện một
số lƣợng lớn tế bào trên bề mặt cổ tử cung có những thay đổi bất thƣờng, nhƣng
chúng chỉ khu trú tại vùng này mà không lan rộng hay ăn sâu hay di căn vào những
vùng khác. Mức độ 5: Đây là giai đoạn ung thƣ đã tiến triển mạnh, các tế bào ung
thƣ lan nhanh, xâm lấn vào lớp sâu và các vùng khác của tử cung, cũng nhƣ khả
16
năng di căn là khó tránh. Nhìn chung, diễn tiến ung thƣ cổ tử cung có đặc trƣng là
khu trú tại vùng là rất lâu [23].
Mức độ phân loại Tên hệ thống
phân loại 1 2 3 4 5
Hệ thống CIN Bình Các tế CIN 1 CIN 2 CIN 3 Ung thƣ
(Cervical thƣờng bào xâm lấn
Intraepithelial không
Neoplasia) điển
hình
Phân chia theo Bình Tế bào Loạn Loạn Loạn sản Ung thƣ
mức độ loạn thƣờng vảy sản nhẹ sản vừa nặng xâm lấn
sản không
điển
hình
Hệ thống SIL Bình ASCUS LGSIL HGSIL Ung thƣ
xâm lấn (Squamous thƣờng
Intraepithelial
Lesion)
Bảng 1.1. Quá trình tiến triển của bệnh từ bình thƣờng đến ung thƣ [23].
Qua tiến triển của bệnh ngƣời ta phân chia ung thƣ cổ tử cung thành bốn giai
đoạn cụ thể sau:
Giai đoạn 1: Là bị nhiễm HPV. Khoảng 99,7% các trƣờng hợp ung thƣ cổ tử
cung là do nhiễm HPV nhƣng không phải bất cứ ai bị nhiễm HPV đều tiến triển
thành ung thƣ cổ tử cung. Sau khi bị nhiễm HPV, một trong hai khả năng sẽ xảy ra:
Hoặc virus tồn tại trong tế bào nhƣng không gây tác hại hoặc virus sẽ tiến triển và
gây nên tình trạng “tiền ung thƣ”.
Giai đoạn 2: Là tiền ung thƣ. Đây chính là giai đoạn mà y khoa muốn xác
định các triệu chứng của bệnh và ngăn ngừa bệnh trƣớc khi tế bào phát triển thành
17
ung thƣ. Thời gian từ khi bị nhiễm HPV đến tiền ung thƣ kéo dài từ 5 đến 10 năm.
Trung bình chỉ có khoảng 12% bệnh nhân ở giai đoạn này sẽ phát triển thành ung
thƣ chƣa di căn.
Giai đoạn 3: Là ung thƣ chƣa di căn (carcinoma in-situ). Ở giai đoạn này, tế
bào có dấu hiệu ung thƣ nhƣng khi điều trị kịp thời sẽ cho nhiều kết quả khả quan.
Giai đoạn 4: Là ung thƣ di căn. Chỉ khoảng 1% trƣờng hợp từ giai đoạn 2
phát triển thành loại ung thƣ nguy hiểm ở giai đoạn cuối này.
Quá trình hình thành và tốc độ biến chuyển của ung thƣ cổ tử cung còn tùy
thuộc vào hệ thống miễn dịch của ngƣời bị nhiễm mạnh hay yếu. Và đồng nhiễm
HPV với các tác nhân gây bệnh khác nhƣ Human Immunodeficiency Virus (HIV),
Herpes Simplex 2, Cytomegalovirus (CMV), Human Herpesvirus 6 (HHV6) hoặc là
Human Herpesvirus 7 (HHV7) sẽ làm tăng khả năng tiến triển ung thƣ cổ tử cung.
Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy đồng nhiễm nhiều types HPV với sự có mặt ít nhất
một type nguy cơ cao sẽ làm tăng khả năng tiến triển ung thƣ cổ tử cung. Tuy các
types nguy cơ thấp hầu nhƣ không gây ung thƣ khi lây nhiễm độc lập, nhƣng khi
đồng nhiễm cùng các types nguy cơ cao chúng sẽ làm tăng nhanh sự chuyển dạng tế
bào và rút ngắn thời gian tiến triển thành ung thƣ cổ tử cung [23].
Hình 1.8. Hình ảnh ung thư cổ tử cung
18
Hình 1.9. Hình ảnh tế bào biểu mô cổ tử cung bình thường (trái) và tế bào ung thư
cổ tử cung (phải).
1.2.3. Dịch tễ học HPV
* Trên thế giới:
Theo kết quả báo cáo của Tổ chức nghiên cứu ung thƣ quốc tế (IARC -
International Agency for Research on Cancer) [19], trên toàn thế giới có khoảng
6,6% phụ nữ độ tuổi từ 15 đến 74 bị nhiễm HPV và khoảng 80% phụ nữ nhiễm
HPV ít nhất một lần trong suốt đời sống tình dục của họ. Theo lứa tuổi, nhóm tuổi
dƣới 25, tỷ lệ nhiễm HPV ở châu Âu chiếm tỷ lệ cao nhất (50%), tiếp đó đến Trung
Á (38%), Châu Úc và Châu Á (21%). Ở nhóm tuổi từ 35 đến 50, tỷ lệ nhiễm HPV
có sự thay đổi ở các khu vực, đặc biệt ở khu vực châu Phi và châu Âu. Châu Âu có
tỷ lệ nhiễm HPV giảm rõ rệt theo độ tuổi tăng dần của phụ nữ (15%) nhƣng ngƣợc
lại, Châu Phi lại có tỷ lệ nhiễm HPV tăng cao hơn so với phụ nữ trẻ tuổi dƣới 25
(20%). Theo giới, nam giới đƣợc coi là nguồn mang HPV không triệu chứng và là
điều kiện làm lây lan HPV trong cộng đồng. Tỷ lệ nhiễm HPV chung ở nam trên
toàn thế giới trung bình khoảng 7,9%, dao động từ 3,5 - 45% tùy theo độ tuổi và ở
các quốc gia khác nhau, trong đó, tỷ lệ các types “nguy cơ cao” từ 2,3% đến 34,8%
và HPV 16 là type thƣờng gặp nhất. Tỷ lệ nhiễm types “nguy cơ thấp” từ 2,3% đến
23,9%. Tình trạng đa nhiễm các types HPV ở nam cũng chiếm tỷ lệ tƣơng đối cao
(3,4 - 22,6%). Nhƣ vậy, tỷ lệ nhiễm chung ở nam (7,9%) thấp hơn so với ở nữ
(17,9%). Tỷ lệ nhiễm HPV không chỉ thay đổi theo các lứa tuổi mà còn khác nhau
giữa các khu vực địa lý, đỉnh tuổi nhiễm HPV thay đổi tùy địa phƣơng, thí dụ: Nhƣ
19
ở Phần Lan, nhiễm HPV thƣờng xảy ra trong độ tuổi 20-29 tuổi. Nghiên cứu trên
10.758 phụ nữ tuổi từ 20-29 của Susanne K Kjaer ở Copenhagen tỷ lệ nhiễm HPV
là 14% cũng nhƣ một nghiên cứu khác của Anna R.Giuliano ở vùng biên giới Hoa
Kỳ - Mexico cho tỷ lệ nhiễm HPV là 14,4% trong nhóm 2319 phụ nữ từ 15-79 tuổi.
Khi điều chỉnh theo khu vực thì tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ trong cộng đồng trên
toàn cầu là 10,41% (95% CI: 10,2 - 10,7%) với khoảng giao động rộng từ 2 đến
44% và tỷ lệ nhiễm chung ở nam giới là 7,9% [31].
Hầu hết các trƣờng hợp nhiễm HPV không có triệu chứng. Đó là lý do tại sao
số trƣờng hợp mắc bệnh không đƣợc ghi nhận. Ngoài ra, những xét nghiệm tầm soát
HPV cũng mới đƣợc thực hiện nên những báo cáo về các trƣờng hợp bệnh mới mắc
thƣờng thấp hơn thực tế. Vì vậy, dự đoán về số ca mới hàng năm vào khoảng
9000.000 ngƣời. Theo thống kê có đƣợc thì có vào khoảng 269 triệu phụ nữ trên thế
giới nhiễm HPV. Tình trạng viêm nhiễm này dẫn đến 440.000 ngƣời bị ung thƣ cổ
tử cung hàng năm (Châu Âu có 23.000 - 35.000 ở Châu Mỹ Latin và 18.000 ngƣời
ở Bắc Mỹ). Số phụ nữ có nguy cơ nhiễm HPV khoảng 2 tỷ ngƣời. Có nghiên cứu
cho thấy nguy cơ nhiễm HPV là 79% Phụ nữ. Cách truyền bệnh chủ yếu qua quan
hệ tình dục [31].
* Ở Việt Nam:
Tại Việt Nam, ung thƣ cổ tử cung là căn bệnh gây tử vong hàng thứ 2 ở phụ
nữ, sau ung thƣ vú. Tỷ lệ mắc tuổi chuẩn là 17,3/100.000 so với ung thƣ vú là
17,4/100.000. Chi phí điều trị cao nhất là 53 tỷ đồng/năm. Số phụ nữ trong độ tuổi
tầm soát: 1,32 - 1,92 triệu ngƣời. Số phết cổ tử cung tầm soát định kỳ thực hiện vào
năm cao nhất: 0,85 - 1,05 triệu phết. Chi phí 1 ca tầm soát: 15.000 đồng. Chi phí
tầm soát định kỳ hằng năm cho tất cả phụ nữ năm cao nhất: 12,75 tỷ đồng. Một
điểm đặc thù mà do thói quen lối sống, điều kiện sinh hoạt mà miền Nam Việt Nam
có tỷ lệ ung thƣ cổ tử cung cao nhất nƣớc với tỷ lệ mắc tuổi chuẩn là 26,0. Ngƣợc
lại, ở miền Bắc ung thƣ cổ tử cung lại xếp hàng thứ 2 sau ung thƣ vú với tỷ lệ mắc
tuổi chuẩn là 6,8 (kém 4 lần so với miền Nam) [12].
20
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện HPV
Ở các phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng, kết quả xác định là dựa trên sự thay
đổi bất thƣờng của tế bào khi có virus nhiễm gây ra. Còn ở phƣơng pháp chẩn đoán
cận lâm sàng, kết quả xác định dựa trên sự có hay không có DNA của virus trong
mẫu bệnh phẩm, bất kỳ mẫu bệnh phẩm đó đang ở giai đoạn phát triển nào của bệnh.
Các phƣơng pháp chẩn đoán cận lâm sàng này đƣợc gọi chung là phƣơng pháp “xét
nghiệm HPV” (HPV testing) ra đời từ những năm đầu thập niên 1990 và không
ngừng phát triển. Sự ra đời của các phƣơng pháp chẩn đoán đều nhằm mục tiêu có
thể phát hiện sự nhiễm HPV ở giai đoạn sớm. Điều này giúp bệnh nhân có một
hƣớng điều trị kịp thời cũng nhƣ ngăn chặn sự lây nhiễm HPV.
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Một số kỹ thuật phân tử nhƣ PCR, lai tại chỗ (in situ hybridization) đƣợc
phát triển gần đây để phát hiện sự hiện diện của HPV-DNA trong tế bào cổ tử cung.
Các kỹ thuật phân tử này còn cho phép xác định đƣợc các types và phân biệt các
thƣơng tổn cổ tử cung không liên quan đến HPV. Đặc biệt kỹ thuật PCR, với độ
nhạy và độ đặc hiệu cao, đƣợc phát triển với hai hệ thống primer thông dụng là hệ
MY09 - MY11 (Bauer & cs, 1991) [13] và hệ GP5+-GP6+ (Snijders & cs, 1990)
[20]. Các hệ primer này đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gene L1, cho phép phát hiện
sự hiện diện của nhiều types HPV trong bệnh phẩm. Nhằm xác định chính xác các
types HPV hiện diện trong mẫu khảo sát, nhiều công trình sử dụng phối hợp các bộ
mồi consensus và mồi đặc hiệu type trong phản ứng nested PCR (Harwood & cs,
1999) [18] hoặc phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzyme cắt giới hạn (Nelson &
cs, 2000) [26]. Hybrid Capture Test (Digen Corporation), đã đƣợc thƣơng mại hóa ở
Hoa Kỳ, là thử nghiệm dựa trên kỹ thuật lai phân tử giữa mẫu dò (probe) với
HPV-DNA phát hiện bằng kháng thể với phản ứng hóa quang. Nhiều công trình
khác định type bằng cách sử dụng phối hợp PCR với lai phân tử, trong đó sản phẩm
PCR consensus đƣợc lai với các probe đặc hiệu cho type đƣợc cố định trên giá thể
rắn, kiểu lai có tên là reverse blotting (Ylitalo & cs, 1995 [35]; Gravitt & cs, (2000)
[16]). Những công trình sau đó so sánh hiệu quả phát hiện và định type của các
21
phƣơng pháp đã đƣợc công bố cho thấy sự kết hợp PCR với reverse blotting có
nhiều ƣu điểm nhất (Vernon & cs, 2000 [34]; Van Den Brule & cs, 2002 [33]). Gần
đây đã xuất hiện các công trình không những chỉ phát hiện và định type mà còn
định lƣợng virus có trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Real-time PCR (Hart & cs,
2001) [17]. Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng nhiều nhất với các bộ mồi đƣợc chọn vùng
gen bảo tồn cao giữa các types (E1 và L1) (Karlsen & cs, 1996 [24]; Gravitt & cs,
2000 [16]). Để xác định các types HPV, Harwood & cs, 1999 dùng phản ứng nested
PCR [18]; Nelson & cs 2000 phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzym giới hạn
[26]. Tháng 4/2002 Hiệp hội Soi cổ tử cung và Bệnh học cổ tử cung của Mỹ
(American Society for Colposcopy and Cervical Pathology) đã đƣa ra hƣớng dẫn
lâm sàng khuyến cáo thử HPV-DNA cho những phụ nữ có kết quả Pap test không
xác định. Các tác giả Hàn quốc (Lee và Seo 2002 [25]) tầm soát ung thƣ cổ tử cung
theo 3 giai đoạn: Tầm soát ban đầu, trong quản lý bệnh nhân có tế bào học bất
thƣờng ở mức độ thấp, và trong theo dõi sau điều trị những tổn thƣơng tiền ung thƣ
nêu ra thử nghiệm HPV-DNA có độ nhạy cao hơn tế bào học kinh điển bởi vì nó
đánh giá chính tình trạng nhiễm HPV.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Các tác giả Việt Nam nhƣ Trịnh Quang Diện & Nguyễn Vƣợng, Nguyễn Ngọc
Hiếu & Trần Ngọc Kính, Nguyễn Bá Đức & cs, Nguyễn thị Nhƣ Ngọc & cs… hầu
hết chỉ sử dụng phƣơng pháp tế bào học để phát hiện sớm ung thƣ cổ tử cung hay
chẩn đoán nhiễm HPV qua hình ảnh tế bào học [1], [3], [4], [5], [7], [8]. Bên cạnh
đó đã có thêm một số nghiên cứu với phƣơng pháp sinh học phân tử: “Nghiên cứu
ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán một số bệnh thƣờng gặp ở Việt
Nam” (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng & cs, 2004) [2], “Xây dựng quy trình phát hiện
HPV (Human papillomavirus) phục vụ nghiên cứu và chẩn đoán” (Thái Kế Quân &
cs, 2004) [11], “Human papillomavirus infection among women in South and North
Vietnam” (Pham Thi Hoang Anh & cs, 2003) [28]. Một nghiên cứu phối hợp của
Nguyễn Trọng Hiếu & Cs với WHO năm 2002 bằng test HPV-DNA [6], cho thấy tỉ
lệ nhiễm HPV ở một quận nội thành ở thành phố Hồ Chí Minh là 10,9% và 2% ở
22
Hà Nội. HPV đƣợc tìm thấy nhiều nhất ở phụ nữ dƣới 25 tuổi ở TP.Hồ Chí Minh
(22,3%). Nghiên cứu của Phạm Việt Thanh về tỷ lệ nhiễm HPV ở 408 trƣờng hợp
có tổn thƣơng tế bào HSIL và ung thƣ cổ tử cung là 93,14% trong đó nhiễm nhóm
nguy cơ cao là 95% và nhóm nguy cơ thấp là 5% [12]. Nghiên cứu của Vũ Thị
Nhung về tỷ lệ nhiễm HPV ở 50 trƣờng hợp có tổn thƣơng tế bào từ LSIL
(Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion là tổn thƣơng trong biểu mô lát mức
độ thấp) đến HSIL (High grade Squamous Intraepithelial Lesion là tổn thƣơng trong
biểu mô lát mức độ cao) và ung thƣ cổ tử cung là 76%. Tỷ lệ nhiễm HPV nhóm
nguy cơ cao có cao hơn nhóm nguy cơ thấp (52,64% / 47,36%) [9]. Nghiên cứu của
Nguyễn Thị Ngọc Dung (2004) cho kết luận khả năng HPV lây nhiễm từ mẹ sang
con trong bệnh u nhú thanh quản lúc sinh ngả âm đạo [1]. Một số bộ kit xây dựng
trong nƣớc cho phép phát hiện sự hiện diện của HPV trong mẫu bệnh phẩm của một
số công ty (Nam Khoa, Khoa Thƣơng - Tp.HCM) cũng đang đƣợc sử dụng tại các
cơ sở y tế tại Tp.HCM. Các bộ kit này chủ yếu dựa trên kỹ thuật PCR hoặc
PCR-ELISA với nhƣợc điểm là giá cả khá cao và số lƣợng type phát hiện có giới
hạn. Nhƣ vậy, một quy trình phát hiện và định type HPV tiện dụng và có giá rẻ hơn
so với những kit đang sử dụng sẽ có ý nghĩa cho công tác theo dõi và điều trị.
Nghiên cứu Vũ Thị Nhung xác định tỷ lệ nhiễm HPV phát hiện bằng phƣơng pháp
PCR là 12%, trong đó 77,78% nhiễm type HPV nguy cơ cao và 66,67% các tổn
thƣơng tiền ung thƣ dƣơng tính với HPV [10]. Trần Thị Lợi ghi nhận tỷ lệ nhiễm
HPV ở cộng đồng phụ nữ TPHCM là 10,84%. Tại Cần Thơ, tỷ lệ nhiễm HPV ở
quận Ninh Kiều là 9,5%. Theo nghiên cứu của Vũ Thị Nhung, Hồ Huỳnh Thùy
Dƣơng, Nguyễn Hoàng Chƣơng và Nguyễn Thị Vân Anh năm 2003 tại bệnh viện
Hùng Vƣơng, Thành phố Hồ Chí Minh có 38/50 bệnh nhân nhiễm HPV chiếm 76%
trong đó các types HPV phổ biến nhất là 11, 16. Năm 2004 Lê Thị Kiều Dung đã
nghiên cứu đƣợc tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ là 80%. Theo nghiên cứu của Vũ Thị
Nhung năm 2006 tại Thành phố Hồ Chí Minh thì tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng
là 11,86%, các types HPV phổ biến nhất là 18, 58, 16. Năm 2007 Phạm Hùng Vân
đã phát triển phƣơng pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu gene L1 để
23
nhờ đó xác định kiểu gene của HPV. Năm 2008 Nguyễn Thị Tuyết Ngân nghiên
cứu 472 phụ nữ trong độ tuổi sinh sản tại Huyện Cƣ Mgar, Tỉnh Đắk Lắk đƣa ra kết
quả tỷ lệ nhiễm HPV là 7,6%, các types HPV phát hiện là 16, 18, 58, 81, 45. Theo
nghiên cứu của Lan Vũ năm 2012 trên 4.500 phụ nữ đã lập gia đình ở Hà Nội,
Thành phố Hồ Chí Minh, Huế, Cần Thơ cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV ở các khu vực
lần lƣợt là: 6,13%, 8,27%, 9,2%, 8,6% và 10,2%.
24
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
* Phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ đến khám phụ khoa có biểu hiện viêm cổ tử cung.
- Tiêu chuẩn chọn đối tƣợng nghiên cứu:
+ Phụ nữ tuổi từ 18-60, đã có quan hệ tình dục.
+ Chƣa đƣợc tiêm vacxin phòng HPV.
+ Tại thời điểm khám phụ khoa không có thai, không trong thời kỳ hành kinh.
+ Không rửa sâu vào âm đạo trƣớc khi xét nghiệm.
+ Không điều trị bệnh phụ khoa ít nhất 7 ngày trƣớc khi đƣợc khám.
+ Có tổn thƣơng viêm cổ tử cung (mất biểu mô lát tầng nhẵn bóng, nốt sùi,
vết loét, viêm lộ tuyến).
- Mẫu bệnh phẩm là dịch phết cổ tử cung của phụ nữ đến khám phụ khoa có
đủ tiêu chuẩn lựa chọn cho nghiên cứu.
* Các type HPV
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm
STT Dung dịch Thành phần, nồng độ
242g Tris – Base
57,1 ml CH3COOH
100 ml 0,5 EDTA 1 Đệm TAE
H2O vừa đủ 1000 ml
pH = 8,5
2 Dung dịch nhuộm gel 0.1 µg/ml ethidium bromide
0,25 % bromophenol blue
3 Loading dye 40% sucrose
TAE 1X vừa đủ 100%
25
Bảng 2.2. Các thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
STT Thiết bị Hãng sản xuất ( nƣớc)
1 Tủ an toàn sinh học cấp II ESCO, Singapore
2 Cân điện tử Sartorious, Đức
3 Lò vi sóng Sharp – Malaysia
4 Nồi khử trùng ƣớt Tomy, Nhật Bản
5 Máy li tâm lạnh Eppendorf, Đức
6 Máy ủ nhiệt lắc rung Eppendorf, Đức
7 Máy Realtime-PCR
8 Hệ thống chụp ảnh điện di Eppendorf, Đức BioDoc-ItTM, Mỹ
9 Thiết bị điện di BIORAD, Mỹ
10 ESCO, Singapore
11 Buồng thao tác PCR Tủ lạnh -200C Frigor, Đan Mạch
Pipet, đầu côn các loại, ống 12 Trung Quốc, Đức, Việt Nam eppendorf các loại ….
- Hóa chất tách chiết DNA:
Dung dịch trizol pH 8: Trizol, phenol, guanidium thiocyanate, Natri citrate.
Dung dịch TE 1X: Tris-HCl, EDTA.
iVA
- Bộ kit Realtime-PCR định tính HPV (phát hiện HPV-DNA):
HPV rPCR Mix
iVA
- Bộ kit định kiểu gene Human Papilloma Virus (HPV):
HPV Genotype rPCR-RDB Mix
Nguồn cung cấp: Cty Cổ phần Cổ phần công nghệ Việt Á (Tiêu chuẩn ISO
9001:2008 và GMP-WHO).
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
* Thời gian: Từ tháng 3/2014 đến tháng 3/2015.
* Địa điểm nghiên cứu:
- Phòng khám Sản phụ khoa, Bệnh viện Đại học Y khoa Thái Nguyên.
26
- Phòng xét nghiệm Vi sinh-Sinh học phân tử, Trƣờng Đại học Y-Dƣợc, Đại
học Thái Nguyên.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Mẫu dịch phết CTC
Tách chiết DNA
HPV-DNA (-)
Thực hiện Realtime-PCR
HPV-DNA (+)
Lai Reverse Dot Blot
Xác định type HPV
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình xác định type HPV trên mẫu bệnh phẩm
2.3.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm
- Mẫu sử dụng là dịch phết cổ tử cung, đƣợc cung cấp từ Phòng khám Sản phụ
khoa, Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên. Tăm bông vô trùng sau khi
thu nhận mẫu đƣợc hòa trong dung dịch 0,5 ml dung dịch TE 1X trong ống
eppendorf 1,5ml, giữ lạnh, chuyển nhanh về Phòng xét nghiệm. Vortex để các virus
rời khỏi đầu tăm bông và hoà vào dung dịch.
- Bảo quản mẫu ở -200C đến khi tiến hành tách chiết DNA.
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA bằng phenol - chloroform
Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA bằng phƣơng pháp tủa (Chomczynski &
Sacchi, 1987). Nguyên tắc cơ bản của phƣơng pháp này là dùng các tác nhân biến
tính mạnh để phá vỡ màng tế bào và loại bỏ các thành phần không mong muốn
27
(protein, màng tế bào…). DNA sẽ đƣợc tủa bởi isopropanol ở điều kiện lạnh và thu lại qua các lần ly tâm. Cặn DNA đƣợc huyền phù trong TE 1X và bảo quản ở -200C.
* Tiến hành:
- Đánh dấu các tube vô trùng bằng ký hiệu mẫu.
- Cho 200l mẫu vào 1 tube vô trùng có sẵn 900l dung dịch trizol pH8,
vortex 30s, để yên 10 phút. Thêm vào 200l dung dịch chloroform, trộn đều. Ly
tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Thu 600l dịch nổi có chứa DNA (chú ý chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô
trùng có sẵn 600l dung dịch isopropanol. Trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13.000
vòng/phút trong 10 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (tránh loại bỏ phần cặn). Cho từ từ
900l dung dịch ethanol 70% vào. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ hết dịch nổi, thu cặn (tránh loại bỏ phần cặn màu xanh). Để khô ở
600C trong 3-5 phút. Hòa DNA với 50l dung dịch TE 1X.
- Bảo quản mẫu DNA đã tách chiết ở -200C tới khi thí nghiệm.
- Dùng 5l mẫu DNA đã tách chiết chạy phản ứng Realtime-PCR phát hiện
HPV-DNA.
Tất các các lƣợt tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm luôn có chứng âm và
chứng dƣơng đƣợc tách cùng.
2.3.3. Phương pháp Realtime-PCR phát hiện HPV-DNA
Nguyên tắc phản ứng PCR: Dựa vào hoạt động của enzyme Tag Polymerase,
enzyme này kéo dài mạch mới dựa trên trình tự khuôn với sự hiện diện của mồi và
các nucleotide tự do ở điều kiện và nhiệt độ phòng thích hợp
Thành phần phản ứng PCR: Một phản ứng Realtime-PCR thể tích 25µl
Mẫu xét nghiệm: 20µl HPV Realtime-PCR mix và 5µl DNA tách chiết.
Chứng dƣơng: 20µl HPV Realtime-PCR mix và 5µl chứng dƣơng.
Chứng âm: 20µl HPV Realtime-PCR mix và 5µl chứng âm. Chương trình Realtime-PCR: 1 chu kỳ: 950C/5 phút; 40 chu kỳ: 950C/15
giây, 550C/1 phút (chọn đọc kết quả tại bƣớc này), 720C/20 giây.
28
Phân tích kết quả:
Sau khi kết thúc quá trình Realtime PCR, chuyển sang chế độ “Analysis” để
phân tích kết quả. Phân tích đồ thị ở dạng “Linear” và dạng “Log”.
Phân tích chứng dƣơng và âm: Chỉ chọn giếng chứng dƣơng và âm, chọn màu
FAM rồi đến màu JOE. Thí nghiệm đạt yêu cầu và tiếp tục các bƣớc phân tích kết
quả nếu: Chứng dƣơng có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến
tính vƣợt quá tín hiệu nền (đƣờng biểu diễn dƣơng tính) và đƣờng biểu diễn tín hiệu
huỳnh quang màu JOE dƣơng tính hoặc thẳng và không vƣợt qua tín hiệu nền
(đƣờng biểu diễn âm tính), chứng âm có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu
FAM âm tính và đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dƣơng tính.
Phân tích mẫu: Chọn màu FAM. Chọn từng mẫu và phân tích đồ thị ở chế độ
dữ liệu chế độ thô. Mẫu có đƣờng biểu diễn dƣơng tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ
36 trở về trƣớc, kết luận “Mẫu dƣơng tính”. Mẫu có đƣờng biểu diễn dƣơng tính rõ
ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “Mẫu dƣơng tính dƣới ngƣỡng phát hiện”.
Mẫu có đƣờng biểu diễn dƣơng tính không rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận
“Mẫu nghi ngờ” và đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét
nghiệm sau 1-3 tháng. Mẫu có đƣờng biểu diễn âm tính, kết luận “Không tìm thấy virus
trong mẫu”. Những mẫu dƣơng tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tích, không cần
quan tâm đến chứng nội, chứng nội có thể dƣơng hoặc âm. Những mẫu âm tính, chứng
nội phải dƣơng tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.
In đồ thị kết quả: Chọn chứng âm, chứng nội và mẫu cần in đồ thị. Copy đồ
thị vào trang trả kết quả, chú thích các đƣờng biểu diễn diễn “Chứng âm”, “Chứng
nội” “Mẫu”.
Sản phẩm PCR dƣơng tính, kể cả dƣơng tính dƣới ngƣỡng đƣợc sử dụng trực
tiếp cho định kiểu gene với kit VA.A02-003J. Nếu chƣa sử dụng ngay đƣợc bảo quản ở -200C.
2.3.4. Phương pháp lai Reverse Dot Blot (RDB)
Nguyên tắc: Đây là kỹ thuật lai trên pha rắn, trong đó các mẫu dò đặc hiệu
cho các trình tự đích đƣợc cố định trên màng lai thành những điểm. Màng lai đƣợc
29
đem lai với sản phẩm PCR đánh dấu biotin đã đƣợc biến tính. Phản ứng lai xảy ra
khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt trong dung dịch lai ở nhiệt độ
thích hợp. Phân tử lai đƣợc phát hiện nhờ phản ứng hiện màu giữa
Streptavidin-Alkaline phosphatase với cơ chất NBT/BCIP.
Một số dung dịch dùng cho RDB:
Dung dịch DB1, DB2, DB3, DB4, DB5 và DB6 (bộ kít thƣơng mại)
Lai và phát hiện type HPV:
- Trộn đều các dung dịch trƣớc khi sử dụng. Đánh dấu các hộp chứa màng lai
bằng ký hiệu mẫu.
- Cho 50µl dung dịch DB1 vào tube 0,2ml chứa sẵn sản phẩm PCR, trộn đều
thật kỹ bằng pipette hoặc vortex, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Cho 100µl dung dịch DB6 vào tube 0,2ml chứa dung dịch DB4, trộn đều rồi
cho tất cả cùng với sản phẩm PCR trong dung dịch DB1 ở trên vào mỗi hộp nhỏ chứa màng lại đã cho sẵn 1,8ml dung dịch DB6, trộn đều, lắc ủ 3-4h ở 400C, lắc ở
tốc độ vừa phải để dung dịch không tràn ra ngoài.
- Loại hết dung dịch trong hộp bằng cách đổ bỏ, tránh để màng lai rơi ra ngoài.
Cho vào 5ml dung dịch DB6, lắc rửa 3 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 30 giây.
- Loại hết dung dịch trong hộp bằng cách đổ bỏ, tránh để màng lai rơi ra ngoài. Cho vào 1,5ml dung dịch DB5, ủ 15-45 phút ở 370C trong điều kiện tối, không đƣợc
lắc. Không để đầu tip dùng hút dung dịch DB5 chạm vào hộp hoặc màng lai, nếu lỡ
chạm phải, thay đầu tip mới ngay trƣớc khi tiếp tục hút DB5 cho các mẫu tiếp theo.
- Loại hết dung dịch trong hộp bằng cách đổ bỏ, lắc rửa màng lai trong 30 giây
với 5ml nƣớc cất.
- Loại bỏ hết nƣớc cất, đọc kết quả. Những tín hiệu dƣơng tính mạnh có thể
thấy rõ ràng trong hộp, những tín hiệu dƣơng tính yếu phải lấy màng lai ra khỏi hộp
và đƣa lên trƣớc bóng đèn huỳnh quang để thấy tín hiệu tốt nhất. Tín hiệu tròn, màu
xanh xuất hiện tại vị trí nào trên màng lai thì mẫu dƣơng tính tại vị trí đó.
30
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu nghiên cứu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel, phiên bản
2010.
2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
- Việc nghiên cứu chỉ đƣợc tiến hành khi đã có sự đồng ý của Ban lãnh đạo
bệnh viện, nơi tiến hành lấy mẫu nghiên cứu.
- Các thông tin thu đƣợc từ bệnh nhân chỉ nhằm phục vụ mục đích nghiên cứu.
- Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích dự phòng, chẩn đoán, điều trị bệnh và nâng
cao sức khỏe cộng đồng.
- Đối tƣợng tự nguyện tham gia nghiên cứu, mọi thông tin cá nhân của đối
tƣợng nghiên cứu đƣợc giữ bí mật.
- Trong quá trình nghiên cứu, đối tƣợng có quyền từ bỏ nếu không muốn tiếp
tục tham gia vào nghiên cứu.
31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phát hiện HPV-DNA
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một
lƣợng acid nucleic đủ lớn và đủ tinh sạch để sử dụng cho các thí nghiệm kết tiếp. Mối
quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết acid nucleic là thu nhận đƣợc các phân tử
này ở trạng thái nguyên vẹn, với lƣợng tối đa, không bị đứt gãy do các tác động cơ học
(phân tử bị đứt gãy do nghiền, lắc mạnh) hoặc bị phân hủy bởi các enzyme có trong tế
bào và từ môi trƣờng ngoài. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chất tảy rửa mạnh
SDS và proteinase K để tiến hành tách chiết DNA tổng số.
Với những phụ nữ có đầy đủ tiêu chuẩn lựa chọn cho nghiên cứu, khi đƣợc
khám lâm sàng phụ khoa nếu có hình ảnh tổn thƣơng cổ tử cung (mất biểu mô lát
tầng nhẵn bóng, nốt sùi, vết loét, viêm lộ tuyến) đƣợc chỉ định lấy dịch phết cổ tử
cung để xử lý, tách chiết DNA, sản phẩm DNA thu nhận sau quá trình tách chiết đã
đƣợc sử dụng để phát hiện DNA tổng số của virus HPV (HPV-DNA) bằng kỹ thuật
Realtime-PCR (kỹ thuật định tính).
Sản phẩm PCR thuộc vùng gene L1 của HPV đƣợc nhân bản trong phản ứng
Realtime-PCR bằng cặp mồi MY11/MY09, đây là một cặp mồi đã đƣợc công nhận và sử
dụng rất rộng rãi để phát hiện HPV. Để phát hiện HPV-DNA bằng kỹ thuật
Realtime-PCR, trong mỗi lƣợt phản ứng luôn có mẫu chứng dƣơng và chứng âm chạy
cùng với các mẫu xét nghiệm. Chứng dƣơng để đảm bảo sự khuếch đại trong phản ứng
là đủ nhạy (phản ứng khuếch đại không bị ức chế), chứng âm để đảm bảo quá trình thao
tác trong xét nghiệm không bị ngoại nhiễm (loại bỏ hiện tƣợng dƣơng tính giả của các
mẫu xét nghiệm). Trong chứng âm còn có chứng nội tại để chứng minh khâu tách chiết
DNA từ mẫu thử đạt độ nhạy và loại bỏ hiện tƣợng âm tính giả. Trong các mẫu xét
nghiệm đều có chứng nội tại để đảm bảo nếu mẫu âm tính thì là âm tính thực sự chứ
không phải là âm tính giả do phản ứng khuếch đại bị ức chế, mẫu xét nghiệm âm tính
thực sự khi xuất hiện kết quả dƣơng tính với chứng nội tại.
32
Hình 3.1. Kết quả phát hiện HPV (HPV-DNA dương tính)
bằng kỹ thuật Realtime-PCR.
Hình 3.1. cho thấy tín hiệu huỳnh quang màu FAM của mẫu xét nghiệm,
chứng dƣơng và chứng âm. Với chứng dƣơng và mẫu xét nghiệm cho thấy tín hiệu
huỳnh quang tuyến tính của màu FAM đều vƣợt qua đƣờng nền (base line), với
chứng âm tín hiệu huỳnh quang màu FAM nằm dƣới đƣờng nền. Khi kết hợp các
kết quả tín hiệu huỳnh quang này với tín hiệu huỳnh quanh của các chứng nội tại sẽ
cho thấy phản ứng đạt yêu cầu.
* Phân tích chứng dƣơng, chứng âm:
Hình 3.2. Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của chứng dương.
33
Hình 3.3. Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE
của chứng âm.
Hình 3.2. cho thấy chứng dƣơng có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu
FAM tuyến tính vƣợt quá tín hiệu nền (đƣờng biểu diễn dƣơng tính) và đƣờng biểu diễn
tín hiệu huỳnh quang màu JOE dƣơng tính và không vƣợt qua tín hiệu nền (đƣờng biểu
diễn âm tính). Chứng âm có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và
đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dƣơng tính (Hình 3.3.). Kết quả này cho
thấy phản ứng khuếch đại đạt yêu cầu.
* Phân tích mẫu xét nghiệm dƣơng tính:
Hình 3.4. Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE
của mẫu xét nghiệm
34
Hình 3.4 cho thấy mẫu xét nghiệm có đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu
FAM tuyến tính vƣợt quá tín hiệu nền (đƣờng biểu diễn dƣơng tính). Kết quả này cùng
với kết quả phân tích chứng dƣơng và chứng âm cho thấy mẫu xét nghiệm là dƣơng tính
thực sự (phát hiện đƣợc HPV-DNA trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân).
Với những mẫu xét nghiệm có chứng nội tại dƣơng tính thì đều đƣợc kết luận
mẫu âm tính thật sự (không phát hiện đƣợc HPV-DNA trong mẫu huyết thanh của
bệnh nhân).
* Kết quả phát hiện HPV-DNA và tỷ lệ nhiễm HPV:
Qua tiến hành phản ứng Realtime-PCR với mẫu phết bệnh phẩm cổ tử cung
của 166 phụ nữ có hình ảnh tổn thƣơng trên lâm sàng, kết quả cho thấy đã phát hiện
đƣợc 47 mẫu cho kết quả HPV-DNA dƣơng tính thực sự. Số mẫu bệnh phẩm còn
lại (119) là âm tính. Không có hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm tính giả trong các
lần thực hiện phản ứng, điều này cho thấy chất lƣợng các phản ứng khuếch đại
HPV-DNA đều đảm bảo yêu cầu. Nhƣ vậy tỷ lệ nhiễm HPV trong số phụ nữ khám
phụ khoa đƣợc lấy mẫu xét nghiệm phát hiện HPV là 28,31 %. Đã có sự khác biệt
về tỷ lệ nhiễm HPV giữa kết quả nghiên cứu của chúng tôi so với kết một nghiên
cứu trong nƣớc đã công bố [1], [3], [4], [5], [7], [8]. Sự khác biệt này có thể giải
thích do đối tƣợng của các nghiên cứu là không giống nhau nhƣ phụ nữ khám phụ
khóa, phụ nữ hành nghề mại dâm, …; có sự khác biệt về thời điểm nghiên cứu, khu
vực nghiên cứu và số lƣợng mẫu thu thập của mỗi nghiên cứu.
Tất các sản phẩm PCR dƣơng tính với HPV đều đƣợc sử dụng trực tiếp cho
định type HPV bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot.
3.2. Kết quả xác định type (genotype) virus HPV
Việc xác định type HPV không dựa vào sự khác biệt trong cấu trúc kháng
nguyên của virus (định type huyết thanh) nhƣ việc định type của nhiều virus khác
(virus gây viêm gan, HIV…) mà đƣợc dựa trên sự tƣơng đồng HPV-DNA. Đến nay
đã có trên 200 types HPV khác nhau đƣợc xác định, trong đó hơn 80 types đã đƣợc
giải trình tự toàn bộ hệ gene và các types còn lại cũng đã đƣợc giải mã một phần.
Nhƣ vậy có thể thấy HPV là một trong số virus có nhiều types nhất. Khi một type
35
HPV có ít nhất 10% gene vùng E6, E7, L1 khác với những types HPV đã đƣợc xác
định thì đƣợc xem là một type HPV mới.
Dựa trên khả năng gây ra các tổn thƣơng mô học, đặc biệt là khả năng gây ung
thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc chia làm hai nhóm:
Nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các types HPV16, 18, 31, 45,
33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70... Trong đó HPV16 và HPV18 chiếm tỷ lệ cao
nhất. Các types HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thƣơng
nghiêm trọng và phát triển thành ung thƣ cổ tử cung.
Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các types HPV1, 2, 6, 8, 9,
11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64... phổ biến nhất là HPV6 và HPV11. Các types nguy
cơ thấp là tác nhân gây nên đa số các dạng mụn cơm, mụn cóc trên da, sùi mào gà ở
vùng hậu môn, sinh dục và các dạng viêm nhiễm khác.
Đã có một số kỹ thuật đƣợc sử dụng để xác định type HPV nhƣ kỹ thuật
nested-PCR, phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzyme cắt giới hạn, kit Hybrid Capture
Test (là thử nghiệm dựa trên kỹ thuật lai phân tử giữa mẫu dò (probe) với HPV-DNA
phát hiện bằng kháng thể với phản ứng hóa quang) hoặc sử dụng phối hợp kỹ thuật PCR
với lai reverse blotting. Nhiều nghiên cứu xác định type HPV cho thấy sự kết hợp PCR
với reverse blotting có nhiều ƣu điểm nhất, chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi
đã sử dụng phƣơng pháp này trong việc định type HPV trong các mẫu bệnh phẩm lâm
sàng cho kết quả phát hiện định tính HPV dƣơng tính.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc xác định type HPV dựa trên kỹ thuật Reverse
Dot Blot với giá thể là màng lai Biodyn C (Pall coporation). Đây là kỹ thuật lai trên pha
rắn, trong đó các mẫu dò đặc hiệu cho các trình tự đích đƣợc cố định trên màng lai thành
những điểm. Sản phẩm PCR dƣơng tính đánh dấu biotin đƣợc đem lai với mẫu dò
(probes) gắn cố định trên màng lai. Các mẫu dò (probes) đƣợc gắn trên màng lai Biodyn
C có trong bộ kit đƣợc tham khảo từ bài báo của nhóm tác giả Van den Brule và cs
(2002), chúng nằm trong vùng nhân bản của cặp mồi MY11/MY09. Phản ứng lai xảy ra
khi các trình tự oligonucleotide đặc hiệu cho type HPV và mẫu dò gặp nhau do chuyển
động nhiệt trong dung dịch lai ở nhiệt độ thích hợp. Phân tử lai đƣợc phát hiện nhờ phản
ứng hiện màu giữa Streptavidine-Alkaline phosphatase với cơ chất NBT/BCIP. Bộ kit
36
reverse Dot Blot định kiểu gene Human Papilloma Virus (Tên: LightPower iVAHPV
Genotype RDB Kit, mã: VA.A02-003J, nguồn: Cty Cổ phần công nghệ Việt Á) cho
phép xác định 24 types HPV hiện diện trong mẫu bệnh phẩm, những types virus này bao
gồm 8 types virus nhóm nguy cơ thấp là 6, 11, 42, 43, 61, 70, 71, 81 và 16 type virus
thuộc nhóm nguy cơ cao là 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 82.
Để định type HPV bằng kỹ thuật lai phân tử, sản phẩm PCR dƣơng tính với
HPV từ các phản ứng Realtime-PCR đã đƣợc sử dụng trực tiếp trong các thử nghiệm
lai Reverse Dot Bot.
* Phân tích mẫu:
Với những mẫu có tín hiệu dƣơng tính mạnh có thể thấy rõ ràng trong hộp
chứa màng lai, những mẫu có tín hiệu dƣơng tính yếu thì màng lai đƣợc lấy ra khỏi
hộp và đƣa lên trƣớc bóng đèn huỳnh quang để thấy tín hiệu tốt nhất. Tín hiệu tròn
xanh xuất hiện tại vị trí tƣơng ứng với genotype nào thì kết luận mẫu nhiễm type
HPV đó, một mẫu có thể đồng nhiễm nhiều type virus (vừa có type nhóm nguy cơ
thấp vừa có type nhóm nguy cơ cao). Những mẫu âm tính với các types và dƣơng
tính tại vị trí chứng dƣơng đƣợc kết luận “Mẫu nhiễm HPV type khác ngoài 24
genotype của bộ kit”.
Hình 3.5. Sơ đồ vị trí gắn các mẫu dò probes đặc hiệu
cho 24 types HPV trên màng lai.
3.2.1. Kiểu type HPV được phát hiện
Với 47 mẫu xét nghiệm dƣơng tính với HPV-DNA, chúng tôi đã xác định
đƣợc 5 types HPV (gồm type 6, 11, 81, 16 và 18) trong số 24 types virus có thể xác
định bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot.
37
3.2.2. Sự phân bố của các types HPV được phát hiện
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm các type HPV
Nhóm type HPV Type HPV Số lƣợng Tỷ lệ %
12 25,53 6
Nguy cơ thấp 11 23,4 11
7 14,89 81
8 19,15 16 Nguy cơ cao 9 17,02 18
Tổng 47 100
Hình 3.6. Biểu đồ phân bố các types HPV
Kết quả bảng 3.1. và hình 3.6. cho thấy có tất cả 5 types HPV đã đƣợc xác định
trong số phụ nữ có kết quả xét nghiệm HPV-DNA dƣơng tính. Trong đó nhóm type
nguy cơ thấp chiếm đa số 30/47 mẫu (63,83%) gồm ba type 6, 11 và 81 lƣợt lƣợt chiếm
tỷ lệ là 25,53%, 23,4% và 14,89%. Nhóm type nguy cơ thấp có 17/47 mẫu (36,17%)
gồm hai types thƣờng gặp là type 16 và 18 với tỷ lệ tƣơng ứng là 19,15% và 17,02%.
Nghiên cứu của Võ Huỳnh Kha và Huỳnh Quyết Thắng (2011) trên đối
tƣợng là phụ nữ ung thƣ cổ tử cung tại Bệnh viện ung bƣớu Cần Thơ cho thấy tỷ lệ
nhiễm HPV là 92,9%, đã xác định đƣợc 9 types HPV thuộc nhóm nguy cơ cao ở các
38
đối tƣợng nghiên cứu, trong đó hay gặp nhất là các type 16, 18 và 58, không có type
virus nguy cơ thấp nào đƣợc phát hiện trong những đối tƣợng đƣợc nghiên cứu [13].
Trong nghiên cứu của chúng tôi mới chỉ phát hiện đƣợc 5 types HPV và tỷ lệ nhiễm
các type virus cũng có sự khác biệt. Điều này có thể đƣợc giải thích do nghiên cứu
của chúng tôi đƣợc tiến hành trong khoảng thời gian ngắn (khoảng 10 tháng) với số
lƣợng mẫu bệnh phẩm thu thập cho xét nghiệm còn ít nên số type HPV đƣợc phát
hiện cũng ít hơn. Do đối tƣợng đƣợc lấy mẫu xét nghiệm là phụ nữ đến khám sản
phụ khoa và khu vực nghiên cứu có sự khác nhau nên tỷ lệ nhiễm các types HPV ở
nhóm đối tƣợng nghiên cứu cũng có sự khác biệt.
3.2.3. Sự đồng nhiễm các type HPV
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm đơn thuần và đồng nhiễm các types HPV
Kiểu nhiễm HPV Số lƣợng Tỷ lệ %
36 Nhiễm 1 type 76,6
11 Nhiễm 2 type 23,4
0 Nhiễm ≥ 3 type 0,0
47 Tổng 100
Kết quả bảng 3.2. cho thấy đa số các trƣờng hợp là nhiễm HPV đơn thuần
một type (76,6%), chỉ có 23,4% là đồng nhiễm 2 types virus. Không có trƣờng hợp
nào đồng nhiễm từ 3 types HPV trở lên.
Bảng 3.3. Tỷ lệ đồng nhiễm các types HPV
Các type Tỷ lệ % đồng nhiễm Đồng nhiễm Số lƣợng Tỷ lệ % theo nhóm HPV
2 6-11 18,18
5 90,91 6-81 Nguy cơ thấp-thấp 45,45
3 11-81 27,7
1 9,09 16-6 Nguy cơ cao-thấp 9,09
0 0 Nguy cơ cao-cao 0,0
11 100 Tổng 100
39
Hình 3.7. Tỷ lệ đồng nhiễm các type HPV
Kết quả bảng 3.3 và hình 3.7. cho thấy có sự đồng nhiễm giữa 3 types HPV
nhóm nguy cơ thấp (6 và 11, 6 và 81 và 11 và 81) và các kiểu đồng nhiễm này
chiếm chủ yếu trong các kiểu đồng nhiễm giữa các types virus (90,91%). Chỉ có 1
trƣờng hợp có kiểu đồng nhiễm giữa nhóm quy thấp và nhóm nguy cơ cao (9,09%).
Trong bốn kiểu đồng nhiễm thì kiểu nhiễm phối hợp type 6-81 chiếm đa số
(45,45%). Không thấy xuất hiện kiểu nhiễm phối hợp từ 3 types HPV trở lên. Qua
kết quả nghiên cứu thu đƣợc cho thấy hiện tƣợng nhiễm HPV ở phụ nữ không chỉ là
nhiễm đơn thuần 1 type virus mà thực tế có thể nhiễm phối hợp 2 types virus, không
chỉ đồng nhiễm giữa các types HPV nhóm nguy cơ thấp mà còn có sự đồng nhiễm
các type virus giữ nhóm nguy cơ thấp và cao. Điều này cho thấy tầm quan trọng của
việc không chỉ cần xét nghiệm sàng lọc tình trạng nhiễm HPV mà còn phải xác định
đƣợc cả type HPV để có thể dự phòng, kiểm soát nhiễm virus và theo dõi sự tiến
triển của tổn thƣơng ác tính của tế bào biểu mô cổ tử cung trong tầm soát ung thƣ cổ
tử cung.
40
Hình 3.8. Kết quả màng lai với nhóm HPV nguy cơ thấp (type 6, 11 và 81)
Hình 3.9. Kết quả màng lai với nhóm HPV nguy cơ cao (type 16 và 18)
Hình 3.10. Kết quả màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy cơ thấp-thấp
Hình 3.11. Kết quả màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy cơ cao-thấp
41
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Phát hiện HPV ở phụ nữ bằng kỹ thuật Realtime-PCR
47/166 phụ nữ (chiếm 28,31%) nhiễm HPV (HPV-DNA dƣơng tính).
2. Xác định genotype HPV bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot
Trong tổng số 47 trƣờng hợp nhiễm HPV, kết quả xác định type virus cho thấy:
- Có 63,83% trƣờng hợp nhiễm HPV nhóm nguy cơ thấp và 36,17% trƣờng hợp
nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao.
- Ba types HPV nhóm nguy cơ thấp là type 6 (25,53%), type 11 (23,4%) và
type 81 (14,89%) và 2 types HPV nhóm nguy cơ cao là type 16 (19,15%) và type 18
(17,02%) đã đƣợc xác định.
- Tỷ lệ nhiễm HPV đơn thuần (nhiễm một type) là 76,6% và đồng nhiễm
(nhiễm 2 types) là 23,4%.
- Kiểu đồng nhiễm HPV nhóm nguy cơ thấp-thấp gồm: 6-11, 6-81 và 11-81.
- Kiểu đồng nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao-thấp là 16-6.
- Không phát hiện đƣợc sự đồng nhiễm giữa các type HPV nhóm nguy cơ cao.
- Không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào đồng nhiễm từ 3 types HPV trở lên.
KHUYẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu thêm sự phân bố của type HPV khác trong cộng đồng.
- Với những trƣờng hợp nhiễm các types HPV nhóm nguy cơ cao cần tiến
hành xét nghiệm PAP’smear xác định hình thái tế bào biểu mô cổ tử cung nhằm tầm
soát, phát hiện các trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung góp phần dự phòng và điều trị
bệnh sớm.
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Ngọc Dung (2004), “Khảo sát sự liên quan giữa mẹ nhiễm HPV
và con bệnh u nhú thanh quản”, Thời sự Y Dược học, Tháng 8/2004,
tr.199-201.
2. Nguyễn Hoàng Chƣơng, Nguyễn Chấn Hùng, Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng & cs
(2005), “Xây dựng quy trình PCR phát hiện Human Papillomavirus (HPV) trong
dịch phết tế bào âm đạo”, Tạp chí Y học Tp. HCM. Tập 9, số 1, tr. 49-53.
3. Trịnh Quang Diện & cs (1999), “Phát hiện sớm các tổn thƣơng biểu mô và
ung thƣ cổ tử cung bằng phƣơng pháp tế bào học”, Tạp chí Y học thực hành,
số 11, tr. 69-71.
4. Nguyễn Bá Đức & cs (1995), “Nghiên cứu các biện pháp cơ bản phòng ngừa
và phát hiện sớm ung thƣ cổ tử cung trong cộng đồng”, Thông tin Y Dược
học, Tháng 11/1995, tr.23-27.
5. Nguyễn Ngọc Hiếu & Trần Trọng Kính (1995), “Phát hiện sớm ung thƣ cổ tử
cung tại bệnh viện Phụ Sản Hà Nội”, Tạp chí Y học thực hành, số 11, tr. 74-75.
6. Nguyễn Trọng Hiếu (2004), “Tần suất nhiễm HPV ở phụ nữ TP HCM”, Thời
sự Y Dược học, Bộ IX số 4, Tháng 8/2004, tr.195-198.
7. Nguyễn Trọng Hiếu (2004), “Tần suất nhiễm HPV ở phụ nữ TP HCM và Hà
Nội”, Tạp Chí Phụ sản, Số 1-2, tập 4, Tháng 6/2004, tr.64-72.
8. Nguyễn Thị Nhƣ Ngọc & cs (2002), “Nhận định tình hình tỉ lệ nhiễm HPV
qua phết tế bào âm đạo tại bệnh viện Hùng Vƣơng”, Tạp chí Y Học TP.Hồ
Chí Minh, số 4, tr.382-386.
9. Vũ Thị Nhung (2004), “Nhận xét bƣớc đầu về liên quan giữa các type HPV
và các tổn thƣơng tiền ung thƣ, ung thƣ cổ tử cung tại Bệnh viện Hùng
Vƣơng”, Nội san Sản Phụ Khoa Số Đặc biệt Bình Dương 14-15/7/2004,
tr.170-175.
43
10. Vũ Thị Nhung & cs (2006), “Khảo sát tình hình nhiễm các types HPV
(Human papillomavirus) ở phụ nữ Thành Phố Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật
sinh học phân tử”. Đề tài Sở Khoa học và Công Nghệ Tp.HCM.
11. Thái Kế Quân & cs (2004), “Xây dựng quy trình phát hiện HPV (Human
papillomavirus) phục vụ nghiên cứu và chẩn đoán”, Chương trình vườn ươm
sang tạo Khoa học Kỹ thuật trẻ, Sở Khoa học và Công Nghệ Tp.HCM.
12. Phạm Việt Thanh (2006), “Chƣơng trình tầm soát Human Papilloma Virus
(HPV) trong ung thƣ cổ tử cung”, Tạp chí Y học thực hành, số 550, tr.13-24.
13. Võ Văn Kha, Huỳnh Quyết Thắng (2011), “Tỷ lệ nhiễm HPV trên bệnh nhân
ung thƣ cổ tử cung tại Bệnh viện ung bƣớu Cần Thơ”, Tạp chí Y học T.P. Hồ
Chí Minh, tập 15, số 2, tr.168-173.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
14. Baay, M.F.D., Quint, W.G.V., Koudstaal, J., Hollema, H., Duk, J.M., Burger,
M.P.M., Stolz, E., & Herbrink, P. (1996), “Comprehensive study of several
genral and type-specific primer pairs for detection of human papillomavirus
DNA by PCR in paraffin-embedded cervical carcinomas”. J. Clin. Microbiol.
34:745-747.
15. Bauer HM, Ting Y, Greer CE, Chambers JC, Tashiro CJ, Chimera J,
Reingold A, Manos MM. JAMA.(1991), “Genital human papillomavirus
infection in female university students as determined by a PCR-based
method”. Jan 23;265(4):472–477.
16. Gravitt, P.E., Peyton, C.L., Apple, R.J., & Wheeler, C.M. (1998),
“Genotyping of 27 human papillomavirus types by using L1 consensus PCR
products by a single-hybridization, reverse line blot detection method”. J.
Clin. Microbiol. 36:3020-3027.
17. Hart, K.W., Williams, O.M., Thelwell, N., Fiander, A.N., Brown, T.,
Borysiewicz, L.K., & Gelder, C.M. (2001), “Novel method for detection,
typing, and quantification of human papillomaviruses in clinical samples”. J.
Clin. Microbiol. 39:3204-3212.
44
18. Harwood CA, Spink PJ, Surentheran T, Leigh IM, de Villiers EM, McGregor
JM, Proby CM, Breuer J (1999), “Degenrate and nested PCR: a highly
sensitive and specific method for detection of human papillomavirus
infection in cutaneous warts”. J Clin Microbiol. 1999 Nov;37(11):3545-55.
19. IARC HPV prevalence Surveys, 1993-2004.
20. Jacobs, M.V., Snijders, P.J.F., Van den Brule, A.J.C., Helmerhorst, T.J.M.,
Meijer, C.J.L.M. & Walboomers, J.M.M. (1997), “A genral primer
GP5+/GP6+- mediated PCR-enzyme immunoassay method for rapid
detection of 14 high-risk and 6 low-risk human papillomavirus genotypes in
cervical scrapings”. J. Clin. Microbiol. 35:791-795.
21. John Doorbar (2005), “The papillomavirus life cycle”. Journal of Clinical
Virology 32S (2005) S7-S15.
22. Josko Zekan, Maja Sirotkovic-Skerlev and Mihael Skerlev. Oncogenic Aspects of
HPV Infections of the Female Genital Tract. In: Herve Seligmann, ed. (2011),
“DNA replication-current advances”. ISBN 978-953-307-593-8
23. Karl M, Amy B, Kirsten ME et al. Journal of Virology (2004), “Mechanism of
human papillomavirus-induced oncogensis”. 78(21):11451-11460.
24. Karlsen, F., Kalantari, M., Jenkins, A., Pettersen, E., Kristensen G., Holm, R.,
Johansson, B., & Hagmar, B. (1996), ”Use of multiple PCR primer sets for
optimal detection of Human Papillomavirus”. J. Clin. Microbiol. 34:2095-2100.
25. Lee HP, Seo SS (2002), “The application of human papillomavirus testing to
cervical cancer screening”. Yonsei Med I; 43(6): 763-768.
26. Nelson, J.H., Hawkins, G.A., Edlund, K., Evander, M., Kjellberg, L., Wadell,
G., Dillner, J., Gerasimova, T., Coker, A.L., Pirisi, L., Petereit, D., &
Lambert, P.F. (2000), “A novel and rapid PCR-based method for genotyping
human papillomaviruses in clinical samples”. J. Clin. Microbiol. 38:688-695.
27. Peitsaro, P., Johansson, B., & Syrjanen, S. (2002), “Integrated human
papillomavirus type 16 is frequently found in cervical cancer precursors as
45
demonstrated by a novel quantitative real-time PCR technique”. J. Clin.
Microbiol. 40:886-891.
28. Pham THA, Nguyen TH, Herrero R, Vaccarella S, Smith JS, Nguyen Thuy TT,
Nguyen HN, Nguyen BD, Ashley R, Snijders PJ, Meijer CJ, Munoz N, Parkin
DM, Franceschi S, (2003), “Human papillomavirus infection among women in
South and North Vietnam”. International Journal of Cancer. 104: 213-220.
29. Peyton, C.L., Schiffman, M., Lorincz, A.T., Hunt, W.C., Mielzynska, I.,
Bratti, C., Eaton, S., Hildesheim, A., Morera, L.A., Rodriguez, A.C., Herrero,
R., Sherman, M.E. & Wheeler, C.M. (1998), “Comparison of PCR-and
Hybrid capturebased human papillomavirus detection systems using multiple
cervical specimen collection strategies”. J. Clin. Microbiol. 36:3248-3254.
30. Qu, W., Jiang, G., Cruz, Y., Chang, C.J., Ho, G.Y.F., Klein, R.S., & Burk, R.D.
(1997), “PCR detection of Human Papillomavirus : Comparision between
MY09/MY11 and GP5+/GP6+ primer system”. J. Clin. Microbiol.
35:1304-1310.
31. S. de Sanjosé, M. Diaz, X. Castellsagué, G. Clifford, L. Bruni, N. Muñoz, and F.
X. Bosch. Jul. (2007), “Worldwide prevalence and genotype distribution of
cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology: a
meta-analysis”.The Lancet infectious diseases, vol. 7, no. 7, pp. 453- 459.
32. Silvia DS, Wim GVQ, Laia A et al. (2010), “Huaman papillomavirus
genotype attribution in invasive cervical cancer: a retrospective
cross-sectional worldwide study”. Lancet Oncol 2010; 11:1048-1056
33. Van den Brule, A.J.C., Pol, R., Fransen-Daalmeijer, N., Schouls, L.M.,
Meijer, C.J.L.M. & Snijders, P.J.F. (2002), “GP5+/6+ PCR followed by
reverse line blot analysis enables rapid and high-throughput identification of
human papillomavirus genotypes”. J. Clin. Microbiol. 40:779-787.
34. Vernon, S.D., Unger, E.R., & Williams, D. (2000), “Comparison of human
papillomaviruses detection and typing by cycle sequencing, line blotting, anf
hybrid capture”. J. Clin. Microbiol. 38:651-655.
46
35. Ylitalo, N., Bergstrom, T., & Gyllensten, U. (1995), “Detection of genital
human papillomavirus by single-tube nested PCR and type-specific
oligonucleotide hybridization”. J. Clin. Microbiol. 33:1822-1828.
36. Zur Hausen, H. (1996), “Papillomavirus infections – a major cause of human
cancers”. Biochimica et Biophysica acta 1228. F55-F78.
