ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN THU PHƯƠNG
ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN CỦA CÁC BỆNH NHÂN THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
THÁI NGUYÊN - 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN THU PHƯƠNG
ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN CỦA CÁC BỆNH NHÂN THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN
Chuyên ngành: Công nghệ sinh
Mã số: 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Người hướng dẫn khoa học: TS. BS. Bùi Thị Thu Hương
TS. Nguyễn Thị Kim Cúc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
THÁI NGUYÊN - 2019
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:
Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, các thầy cô giáo Khoa Công
nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi suốt
quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS
Bùi Thị Thu Hương và TS Nguyễn Thị Kim Cúc đã tận tình truyền đạt cho tôi
những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, trực tiếp hướng dẫn khoa học và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng chấm luận văn tốt
nghiệp đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Y
Dược Thái Nguyên, Khoa Miễn dịch - Di truyền phân tử Bệnh viện Trung ương
Thái Nguyên, đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình
học tập, nghiên cứu và thu thập số liệu cho luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp cùng gia đình đã luôn
động viên và là chỗ dựa vững chắc về mọi mặt cho tôi trong suốt quá trình học
tập nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019
Tác giả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Nguyễn Thu Phương
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA Deoxyribonucleic Acid
RNA Ribonucleic Acid
mRNA Messenger Ribonucleic Acid (RNA thông tin)
NST Nhiễm sắc thể
Cd Codon
Kb Kilo base
bp Base pair
dNTP deoxyribonucleoside triphosphate
ddNTP dideoxyribonucleoside triphosphate
PCR Polymerase Chain Reaction
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
Hb Hemoglobin
HC Hồng cầu
MCV Thể tích trung bình hồng cầu
MCH Huyết sắc tố trung bình hồng cầu
MCHC Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu
Nu Nucleotid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
WHO Tổ chức y tế thế giới
MỤC LỤC
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI .......................................................................................................................................... 1
2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI ................................................................................................................................................... 2
3. NỘI DUNG THỰC HIỆN ................................................................................................................................... 2
3.1. Sàng lọc, phát hiện, phân loại bệnh nhân, thu thập mẫu máu tách chiết DNA. 2
3.2. Ứng dụng quy trình phát hiện đột biến gen globin. .............................................................. 2
3.3. Phân tích đặc điểm đột biến gen gây bệnh Thalassemia tại Bệnh viện Trung
Ương Thái Nguyên ............................................................................................................................................................. 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................................................................ 3
1.1. Sơ lược về hemoglobin ....................................................................................................................................... 3
1.1.1. Chuỗi globin thường .................................................................................................................................... 3
1.1.2. Các loại hemoglobin sinh lý ................................................................................................................ 3
1.2. Khái niệm, phân loại bệnh thalassemia............................................................................................. 4
1.3. Sinh lý bệnh thalassemia .................................................................................................................................. 5
1.4. Cơ chế di truyền ......................................................................................................................................................... 7
1.5. Bệnh học phân tử bệnh β-thalassemia ................................................................................................ 7
1.5.1. Gen globin và các đột biến.................................................................................................................... 7
1.6. Một số kỹ thuật ứng dụng trong sinh học phân tử để phát hiện đột biến gen . 12
1.6.1. Phương pháp PCR cách đoạn (Gap-PCR) ........................................................................ 13
1.6.2. Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex
ligation dependent probe amplification – MLPA) .................................................................... 13
1.6.3. Kỹ thuật dùng enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease - RE) 14
1.6.4. Kỹ thuật khuếch đại alen đặc hiệu ARMS-PCR ....................................................... 14
1.6.5. Phương pháp lai ngược (Reverse Dot Blot) ................................................................... 15
1.6.6. Kỹ thuật lai phân tử (Reversehybridization - kit Strip Assay) ................... 15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
1.6.7. Kỹ thuật phân tích giải trình tự gen theo nguyên lý Sanger.......................... 16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 18
2.1. Đối tượng và bệnh phẩm nghiên cứu .............................................................................................. 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................................................................. 18
2.3. Địa điểm thời gian nghiên cứu ............................................................................................................... 18
2.4. Quy trình kỹ thuật nghiên cứu ................................................................................................................ 18
2.4.1. Thu mẫu ................................................................................................................................................................. 18
2.4.2. Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu và điện di huyết sắc tố ................. 19
2.4.3. Tách chiết DNA ............................................................................................................................................ 20
2.4.4. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của sản phẩm DNA ...................................... 20
2.4.5. Thiết kế mồi ...................................................................................................................................................... 21
2.4.6. Quy trình multiplex PCR xác định đột biến gen thalassemia...................... 23
2.5. Phân tích số liệu ..................................................................................................................................................... 24
2.6. Đạo đức trong nghiên cứu ........................................................................................................................... 24
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................ 25
3.1. Kết quả tách chiết DNA ................................................................................................................................. 25
3.2. Kết quả quy trình multiplex-PCR ....................................................................................................... 27
3.3. Đặc điểm đột biến gây bệnh Thalassemia tại Bệnh viện Trung Ương
Thái Nguyên ................................................................................................................................................ 31
KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ ................................................................................................................................. 39
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................................................. 41
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Phân bố kiểu gen đột biến trên các bệnh nhân - Thalassemia ........ 31
Bảng 3.2. Đặc điểm phân bố alen đột biến trên các bệnh nhân ...................................... 32
Bảng 3.3. Phân bố kiểu gen và giá trị trung bình các chỉ số huyết học .................. 34
Bảng 3.4. Đặc điểm đột biến gen alpha thalassemia .................................................................. 35
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Bảng 3.5. Phân bố kiểu gen và giá trị trung bình các chỉ số huyết học .................. 38
DANH MỤC HÌNH
Hình1.1. Sinh tổng hợp globin ở các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi
và thai ........................................................................................................................................................................ 4
Hình 1.2. Hậu quả sản xuất dư thừa chuỗi α-thalassemia ......................................................... 6
Hình 1.3. Cơ chế di truyền trên nhiễm sắc thể thường................................................................. 7
Hình 1.4. Cấu trúc gen β-globin ........................................................................................................................... 8
Hình 1.5. Cấu trúc gen α-globin ....................................................................................................................... 10
Hình 2.1. Sơ đồ sàng lọc, chẩn đoán đột biến gen thalassemia...................................... 19
Hình 2.2. Vị trí primer xác định đột biến trên alpha globin gen .................................... 23
Hình 3.1. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của một mẫu sản phẩm DNA....... 25
Hình 3.2. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ máu ngoại vi của các đối
tượng nghiên cứu ...................................................................................................................................... 26
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình beta 1) ................. 28
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình beta 2) ................. 28
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình alpha) ................... 29
1
MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Thalassemia là tên một loại bệnh thiếu máu do di truyền. Nguyên nhân do
các đột biến trên gen globin làm giảm hoặc mất khả năng tổng hợp chuỗi globin
trong phân tử hemoglobin. Tùy theo sự thiếu hụt khả năng tổng hợp chuỗi
globin mà bệnh thalassemia chia thành các loại khác nhau nhưng 2 loại phổ
biến nhất là α-thalassemia, β-thalassemia.
Hiện nay, có khoảng hơn 500 đột biến liên quan đến thalassemia đã được
báo cáo trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, theo nhiều nghiên cứu tần số alen
người Việt Nam cho thấy có 8 loại đột biến chính gây bệnh β-thalassemia là
Cd41/42(-TCTT), Cd71/72(+A), CD17, IVS1-1(G>T), IVS1-5(G>C), -28(A-
G), IVS2-654(C>T) và Cd26(GAG>AAG) [3]. Với alpha thalassemia con số
này là đột biến xoá đoạn lớn kiểu SEA, THAI; đột biến xoá đoạn nhỏ là alpha
3.7 và alpha 4.2;đột biến điểm là HbCS và HbQS.
Việc chẩn đoán thalassemia trước đây dựa chủ yếu vào triệu chứng lâm
sàng và các xét nghiệm sinh hoá huyết học. Tuy nhiên, các chẩn đoán này chỉ
giúp sàng lọc và xác định một số thể thalassemia nhất định. Với đối tượng người
lành mang gen hoặc thai nhi (trong chẩn đoán trước sinh) thì các phương pháp
này không thể xác định được thể bệnh. Ngày nay, với sự tiến bộ vượt bậc của
khoa học biệt là khoa học ứng dụng trong y học đã giúp các nhà nghiên cứu
chẩn đoán được bệnh thalassemia ở cấp độ phân tử, phát hiện chính xác sự có
mặt của các loại đột biến gây bệnh, mở ra sự hỗ trợ rất lớn cho công tác chẩn
đoán trước sinh và tư vấn di truyền phòng bệnh thalassemia. Ở nước ta các kỹ
thuật giúp cho sự chẩn đoán đột biến gen đang được nghiên cứu và đạt được
một số thành tựu nhất định. Tuy nhiên, phần lớn các dịch vụ chẩn đoán tập
trung ở các Viện, bệnh viện tuyến Trung ương trong khi bệnh nhân thalassemia
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
chủ yếu tập trung ở đồng bào dân tộc ít người khu vực vùng cao miền núi. Khả
2
năng tiếp cận của nhóm người này tới tuyến Trung ương là rất hạn chế. Mặt
khác thalassemia là bệnh rất đặc trưng cho vùng miền tương ứng với các nhóm
chủng tộc. Do đó khi triển khai dịch vụ chẩn đoán đột biến gen thalassemia,
người ta phải thực hiện các nghiên cứu cơ bản để xác định loại đột biến và tần
số allen nhằm thiết lập labo một cách chuẩn xác và tối ưu nhất.
Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên là bệnh viện tuyến Trung Ương duy
nhất của 6 tỉnh miền núi Đông Bắc, khu vực mà tập trung hầu hết nhóm dân tộc
ít người có dân số đông nhất cả nước. Tỷ lệ người mang gen thalassemia ở khu
vực này được báo cáo là rất cao 10-30%. Hàng năm, bệnh viện Trung Ương
Thái Nguyên cũng tiếp nhận 300-500 lượt bệnh nhân thalassemia thể nặng vào
truyền máu thải sắt. Nhu cầu dự phòng bệnh thalassemia cho khu vực là rất cấp
thiết. Để đáp ứng nhu cầu đó, bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên đã thành lập
khoa Miễn Dịch - Di truyền phân tử nhằm cung cấp các dịch vụ sang lọc và
chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia cũng như các bệnh di truyền khác. Để
đánh giá kết quả bước đầu áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong sàng lọc đột
biến gen gây bệnh thalasemia nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài nghiên cứu
“Đặc điểm đột biến gen globin của các bệnh nhân thalassemia tại bệnh viện
Trung Ương Thái Nguyên”.
2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Ứng dụng kỹ thuật Multiplex -PCR trong sàng lọc và xác định một số
đột biến phổ biến gây bệnh thalassemia.
3. NỘI DUNG THỰC HIỆN
3.1. Sàng lọc, phát hiện, phân loại bệnh nhân, thu thập mẫu máu tách chiết
DNA.
3.2. Ứng dụng quy trình phát hiện đột biến gen globin.
3.3. Phân tích đặc điểm đột biến gen gây bệnh Thalassemia tại Bệnh viện
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Trung Ương Thái Nguyên
3
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1. Sơ lược về hemoglobin
1.1.1. Chuỗi globin thường
Hemoglobin là một protein cấu trúc nằm trong hồng cầu có vai trò quan
trọng trong việc vận chuyển O2 đến các tổ chức và vận chuyển các sản phẩm
chuyển hóa H+ và CO2 đến thận và phổi để đào thải. Ngoài ra hemoglobin còn
có chức năng như một enzyme và hệ thống đệm.
Cấu trúc phân tử Hb gồm nhân hem và chuỗi globin trong đó:
Globin có cấu trúc là 2 cặp chuỗi polipeptid. Ở người trưởng thành
HbAchiếm 95% được cấu tạo từ 4 chuỗi globin: 2 chuỗi α và 2 chuỗiβ.
Chuỗi alpha tổng hợp từ đoạn gen nằm trên cánh ngắn NST 16 có kích
thước 141 acid amin.
Chuỗi beta tổng hợp từ đoạn gen nằm trên cánh ngắn NST 11 có kích
thước 146 acidamin.
Ngoài ra kích thước chuỗi delta, gama là 146 acid amin.
Nhân hem thuộc loại porphyrin là chất có khả năng kết hợp với các phân
tử kim loại. Hem ở người là loại porphyrin ІX kết hợp với FeІI+[7].
1.1.2. Các loại hemoglobin sinh lý
Ở người có sáu loại hemoglobin(Hb) biến đổi phát triển qua từng thời kỳ
phát triển. Ở thời kỳ phôi thai có Hb Gower, Hb Gower2 và Hb Porland.
Hemoglobin ở thời kỳ thai nhi tới trưởng thành là HbA1, HbA2 và HbF. Thành
phần các loại hemoglobin có một tỷ lệ giới hạn nhất định theo lứa tuổi, thay đổi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
tỷ lệ này là bệnh lý. [9]
4
Hình1.1 Sinh tổng hợp globin ở các giai đoạn phát triển khác nhau của
phôi và thai (Nguồn: thalassemia.vn)
Các chuỗi globin được chia làm 2 nhóm: chuỗi kép α gồm chuỗiζ và α; và
chuỗi kép không α (hay còn gọi chuỗi kép β) gồm các chuỗi ε,β và δ.
1.2. Khái niệm, phân loại bệnh thalassemia
Hội chứng Thalassemia chỉ bao gồm các bệnh có bất thường về số lượng
chuỗi globin, khác với nhóm bệnh huyết sắc tố khác có sự bất thường về chất
lượng chuỗi globin ví dụ như bệnh huyết sắc tố E, huyết sắc tố F… Trong một
số trường hợp có sự kết hợp giữa sự bất thường về chất lượng và bất thường về
số lượng chuỗi globin.
Tùy theo sự bất thường về số lượng chuỗi globin mà người ta chia
thalassemia thành hai thể lớn là α-thalassemia và β-thalassemia.
β-thalassemia chia làm các thể khác nhau là
β thalassemia thể nhẹ do đột biến gen HBB dạng dị hợp tử gây nên.
β thalassemia thể nặng (bệnh Cooley) do đột biến gen HBB dạng đồng
hợp tửgây nên.
Ngoài ra còn có các thể liên kết với các bệnh hemoglobin khác (β-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
thalassemia/ HbE, β-thalassemia/HbS, β-thalassemia/HbC và δβ-thalassemia).
5
Alpha thalassemia chia làm 4 thể khác nhau tuỳ thuốc số lượng đột biến
gen bị ảnh hưởng. Cụ thể:
Thể ẩn nếu 1 gen alpha globin bị đột biến, kiểu gen là -α/αα. Loại đột biết
thường gặp là -α3.7 và -α4.2.
Thể nhẹ (người lành mang gen) khi đột biến xẩy ra trên 2 gen alpha globin,
loại này có kiểu gen là --/αα. Loại phổ biến ở Đông nam Á là --SEA, --THAI
Thể trung gian khi đột biến xẩy ra trên 3 alpha globin gen. Kiểu gen sẽ là
--/-α. Tiêu hiểu như HbH hoặc HbH-CS.
Thể nặng khi đột biến xẩy ra trên cả 4 gen alpha globin. Kiểu gen là --/--
(đồng hợp tử). Thể này biểu hiện rất nặng, thường gây phù thai, tử vong trong
những tháng cuối thai kỳ hoặc tử vong ngay sau khi sinh ra,
1.3. Sinh lý bệnh thalassemia
Ở người trưởng thành bình thường tỷ lệ HbA chiếm 95% có chức năng
chính vận chuyển oxy cho tế bào. HbA được cấu tạo bởi 2 chuỗi α và 2 chuỗi
β liên kết bằng lực hút tĩnh điện, liên kết ion, liên kết hydro.
Trong hội chứng thalassemia có hiện tượng là thiếu hụt một loại chuỗi
polypeptide thành phần cấu tạo của globin, dẫn đến sự dư thừa của chuỗi kia.
Nếu thiếu hụt chuỗi β thì gọi là bệnh β thalassemia, khi chuỗi β giảm thì chuỗi
α sẽ tăng. Nếu sự thiếu hụt xảy ra ở chuỗi alpha thì gọi là bệnh α thalassemia.
Bệnh nhân có biểu hiện khác nhau tùy thuộc vào từng thể bệnh và thường có
biểu hiện sau:
Giảm tổng hợp Hb.
Hồng cầu nhỏ và nhược sắc và tăng sinh hồng cầu non trong tủy.
Hồng cầu mất độ mềm dẻo.
Trong tủy hồng cầu non chết trước khi trưởng thành.
Việc thiếu hụt sản xuất chuỗi globin dẫn đến tình trạng mất cân bằng giữa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
các chuỗi alpha và beta. Các chuỗi dư thừa sẽ kết hợp với nhau tạo thành các
6
thể (hạt vùi) lắng xuống màng tế bào hồng cầu. Ở tủy xương, các hạt tủa gắn
lên nguyên sinh chất, màng hồng cầu non làm cho các hồng cầu non bị chết
trước khi trưởng thành. Điều này làm tăng sinh mạnh các hồng cầu non trong
tủy gây biến dạng xương, tăng hấp thu sắt gây nhiễm sắt cho cơ thể. Hiện tượng
sinh hồng cầu non nhưng không phát triển tới giai đoạn trưởng thành gọi là hiện
tượng sinh hồng cầu không hiệu quả. Hiện tượng này là cơ chế chủ yếu gây nên
các triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân thalassemia [10].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 1.2 Hậu quả sản xuất dư thừa chuỗi α-thalassemia[10].
7
1.4. Cơ chế di truyền
β-thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường do đột biến
gen β-globin nằm trên cánh ngắn NST 11 quy định (11p15.5) gây giảm hoặc
mất khả năng tổng hợp β-globin. β thalassemia có tần số và khả năng mắc bệnh
là giống nhau ở cả 2 giới nam và nữ.
Dưới đây là ví dụ minh họa cho cơ chế di truyền trên NST thường với cả
bố và mẹ mang gen dị hợp tử với một gen đột biến gây nên. Nguy cơ trong một
lần sinh như sau:
50% số con là người lành mang gen bệnh.
25% số con là hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh.
25% số con mắc bệnh β thalassemia thể nặng.
Hình 1.3. Cơ chế di truyền trên nhiễm sắc thể thường
(thefullwiki.org/Thalassemia).
1.5. Bệnh học phân tử bệnh β-thalassemia
1.5.1. Gen globin và các đột biến
Gen globin có kích thước nhỏ, gồm có 3 exon và 2 intron. Sự thay đổi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
biểu hiện gen globin được kiểm soát thông qua hoạt động của các vùng khởi
8
động (promoter), tăng cường (enhancer) và bất hoạt (silencer) trên mỗi gen
globin và ở các vùng trình tự điều khiển cụm gen [29], [30], [31], [32]. Giống
như các gen khác, gen globin sở hữu một loạt vị trí biểu hiện đặc hiệu như: vị
trí CAP - vị trí bắt đầu phiên mã, ATG - bộ ba (codon) mở đầu để bắt đầu phiên
mã mARN (Messenger Acid Ribonuleic); bộ ba xen giữa làm gián đoạn quá
trình phiên mã; tín hiệu bổ sung đuôi poly (A) vào mARN. Tầm quan trọng của
trật tự các nucleotit là yếu tố quyết định loại Hb, bất kỳ sự thay đổi nào như
mất, thêm, thay đổi nucleotit trên gen globin đều tạo ra bất thường mARN từ
đó gây nên các dạng bất thường của thalassemia ở mức độ sinh học phân tử
[29], [30], [31], [32].
1.5.1.1. Gen β-globin và đột biến gen β-globin
Hình 1.4. Cấu trúc gen β-globin
Họ gen β-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 11 (11p15.5) có độ dài
60 kilobases (kb) gồm có 5 gen chức năng, sắp xếp theo trật tự từ trái sang phải là
ε / γG / γA / δ / β (hình 1.2). Gen β-globin có 626 base pair (bp) tham gia mã hóa
nằm trên 3 exon là exon 1 (142 bp), exon 2 (223 bp) và exon 3 (261 bp). Độ dài
intron 1 là 130 bp và intron 2 là 850 bp. Gen β-globin có cơ chế điều hòa rất phức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
tạp, hoạt động ở mức độ đơn gen cũng như toàn bộ cụm gen [30].
9
Đột biến gen β-globin bao gồm:
β0 -thalassemia là các đột biến làm mất chức năng gen β-globin nên
không tổng hợp được chuỗi β-globin, ví dụ như: đột biến làm tạo thành bộ ba
kết thúc sớm như Cd17, Cd35, ...
β+ -thalassemia là các đột biến làm giảm chức năng gen β-globin nên
giảm tổng hợp chuỗi β-globin ở nhiều mức độ khác nhau, ví dụ như đột biến ở
vùng khởi động: -28, -88, ...
Các biến thể Hb là đột biến điểm làm thay đổi một acid amin, dẫn đến
tổng hợp nên các biến thể chuỗi β globin khác tạo Hb bất thường như HbE,
HbCs, HbS, ...
Hiện nay đã phát hiện trên 200 đột biến gen β-globin, chủ yếu là đột biến
không mất đoạn. Đột biến tại gen β-globin chiếm trên 75% các đột biến trong
cụm gen không α-globin. Các đột biến mang tính đặc trưng và phân bố khác
nhau ở các vùng miền, dân tộc [30], [31]
Cơ chế một số dạng đột biến thường gặp của gen β-globin:
- Đột biến điểm tại vùng khởi động (promoter): đột biến thay thế nucle-
otit tại vị trí TATA hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp chuỗi β-globin so với
bình thường, gây β+ -thalassemia, như đột biến: -90 (C > T), -88 (C >
T), -28 (A > G) [30], [33].
- Những đột biến vô nghĩa (nonsense mutations): sự thay thế một nucle-
otit trong exon có thể dẫn đến sự tạo thành một trong ba mã kết thúc (UAA,
UAG hoặc UGA) làm cho việc dịch mã kết thúc sớm hơn so với bình thường
và tạo sản phẩm β-globin không vững bền bị phá hủy ngay trong tế bào, gây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
bệnh β0-thalassemia như Cd17 (AAG > TAG), Cd35 (TAC > TAA)[31], [33].
10
- Đột biến tại những trình tự tín hiệu nối (splicing signals): Những đột
biến ở vị trí cho nối GT hoặc vị trí nhận nối AG của intron gây cản trở việc nối
exon, do đó không tạo được mARN β-globin nên gây β0 -thalassemia như IVS1-
1 (G > T) [30], [31], [33].
- Những đột biến tại vị trí 5, 6 của intron dẫn tới giảm khả năng nối ARN
chính xác nhưng còn tổng hợp được chuỗi β-globin gây bệnh β+ -thalassemia
như IVS1-5 (G > T), IVS1-6 ( T > C) [30], [31], [33].
- Đột biến ở trong các exon: các đột biến ở exon luôn tạo ra các bất
thường bản sao mARN nên gây ra β+-thalassemia như Cd26 (GAG >AAG) tạo
HbE [30], [31], [33].
- Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A: vị trí AATAAA tại vùng không dịch
mã là vị trí gắn poly Adenin cần thiết cho mARN di chuyển từ nhân ra tế bào
chất để tham gia vào quá trình dịch mã tạo sản phẩm protein. Các đột biến điểm
xảy ra tại vị trí (box) AATAAA sẽ gây β+-thalassemia, như: AATAAA →
AATGAA, AATAAA → CATAAA [30], [31], [33].
- Những đột biến khung đọc xảy ra ở các exon: đột biến thêm vào hoặc
mất đi một hoặc vài nucleotit, hoặc một đoạn có dẫn đến thay đổi khung đọc
mã di truyền làm thay đổi sản phẩm β-globin, như đột biến: Cd8/9 (+G),
Cd41/42 (–TTCT), Cd71/72 (+A) gây β0 -thalassemia [30], [31], [33].
1.5.1.2. Gen α-globin và đột biến gen α-globin
Hình 1.5. Cấu trúc gen α-globin
Họ gen α-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3) gồm 3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
gen chức năng là δ, α1, α2 và 4 gen giả là Ψδ1, Ψα1, Ψα2, θ (hình 1.3). Gen α1
11
có chiều dài 840 bp và gen α2 có chiều dài 830 bp. Số lượng chuỗi α- globin
được tổng hợp phụ thuộc vào số gen α-globin hoạt động [29]. Mức độ phiên
mã của gen α2 gấp 2 đến 3 lần so với gen α1 [31], [34], [35].
Khoảng 40 kb phía trước của cụm gen α globin là một khu vực được gọi
là HS-40. Khu vực này có nhiều vị trí nhạy cảm với ADNase và liên quan đến
các yếu tố phiên mã. Tính toàn vẹn của HS-40 là rất cần thiết cho sự hoạt động
của gen α-globin, nếu bị mất một đoạn trong phần đó có thể làm cả đoạn gen
α-globin sau đó không hoạt động được. Ngoài cấu trúc gen và trình tự của gen
α-globin, còn có một số yếu tố phiên mã gen cũng rất quan trọng. Các yếu tố
điều hòa hoạt động gen α-globin bằng cách gắn vào promoter gen α-globin
và/hoặc với vị trí tương tác protein gắn ADN tại vùng HS-40 hoặc cấu trúc
nhiễm sắc thể (ví dụ như gen ATRX trên nhiễm sắc thể 13) [29]. Vì thế, những
trường hợp mất đoạn vùng HS-40 cũng gây ra α-thalassemia, trong khi cả 2 gen
α-globin đều còn nguyên vẹn [29], [31].
Cơ chế một số dạng đột biến thường gặp của gen α-globin:
Đột biến gây bệnh α-thalassemia bao gồm đột biến mất đoạn và đột biến
điểm. Đột biến mất đoạn có 2 dạng là đột biến đoạn lớn làm mất cả 2 gen α và
đột biến đoạn nhỏ làm mất 1 gen α. Hiện nay đã phát hiện được trên 300 đột
biến, trong đó đột biến mất đoạn là chủ yếu (khoảng 90%) [29], [36].
Đột biến α+ -thalassemia: là đột biến làm mất 1 gen α-globin trên 1
nhiễm sắc thể (kiểu gen: -α). Có một số kiểu đột biến α+ -thalassemia, trong đó
phổ biến nhất là đột biến mất đoạn 3.7 kb (-α3.7) và 4.2 kb(-α4.2) [3], [4], [29].
Đột biến α0 -thalassemia: là đột biến mất cả 2 gen α trên 1 nhiễm sắc thể
(kiểu gen: --). Hiện nay đã xác định được khoảng 50 loại đột biến mất đoạn 2
gen globin gồm mất 1 phần gen trên cả 2 gen α, mất hoàn toàn cả 2 gen α hoặc
mất cả 2 gen α và gen δ làm mất hoàn toàn quá trình tổng hợp chuỗi α-globin
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
[29].Các đột biến α0 -thalassemia phổ biến ở khu vực Đông Nam Á bao gồm:
12
--SEA, --THAI, --FIL ởkhuvực Địa Trung Hải là -- MED. Đồng hợp tử các đột
biến α0-thalassemia gây Hb Bart’s, dị hợp tử α0 -thalassemia với α+thalassemia
gây ra HbH [29], [31].
Đột biến không mất đoạn: là các đột biến tại 1 hoặc vài nucleotit làm
tổng hợp ra các biến thể chuỗi α-globin (kiểu gen: αTα hoặc ααT). Các đột biến
điểm chủ yếu ở trong vùng HS-40 và trong gen α1, α2. Hiện nay người ta đã
xác định được 69 đột biến điểm liên quan đến biểu hiện của gen α globin [29].
Điển hình trong nhóm đột biến điểm là đột biến thay thế T thành C ở bộ 3 kết
thúc làm bộ 3 kết thúc dịch mã từ TAA chuyển thành CAA (mã hóa cho acid
amin glutamin) vì vậy ribosom tiếp tục dịch mã đến khi nó chạm vào mã kết
thúc tiếp theo trong khung đọc. Kết quả 1 chuỗi α-globin bị kéo dài thêm 31
acid amin so với phân tử 141 acid amin của chuỗi α-globin ban đầu tạo nên Hb
Constant Spring (HbCs), đây là đột biến điểm phổ biến nhất ở Đông Nam Á
(chiếm khoảng 4% các đột biến α-globin) [29], [31]. Ngoài ra, còn có các đột
biến khác làm tổng hợp các protein bất thường như đột biến α2 codon 125 (T >
C) tạo Hb Quong Sze (Qs), đột biến α2 codon 142 (A > T) tạo Hb Pakse cũng
gặp ở người Đông Nam Á [29], [31].
1.6. Một số kỹ thuật ứng dụng trong sinh học phân tử để phát hiện đột biến
gen
Hiện nay có nhiều phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR được sử dụng để
phát hiện đột biến gen globin. Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm khác nhau
trong phát hiện các loại đột biến, việc lựa chọn phương pháp nào là tùy thuộc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
vào các phòng xét nghiệm [25].
13
1.6.1. Phương pháp PCR cách đoạn (Gap-PCR)
Nguyên lý kỹ thuật: Kỹ thuật Gap-PCR sử dụng 1 mồi xuôi và 1 mồi
ngược gắn ở hai bên ranh giới của vùng ADN đứt gãy. Với alen bình thường,
khoảng cách giữa 2 mồi quá lớn nên không hình thành được sản phẩm ADN.Với
alen có đột biến, khoảng cách này đủ ngắn để 2 mồi tạo nên đoạn ADN sản phẩm.
Các sản phẩm PCR được điện di và so sánh kích thước với thang chuẩn ADN và
các băng của chứng dương để xác định đột biến của mẫu.
Ưu điểm: Kỹ thuật đơn giản, nhanh, chi phí thấp. Có thể sử dụng đồng thời
nhiều cặp mồi (Multiplex gap – PCR) để chẩn đoán đồng thời nhiều đột biến.
Nhược điểm: Chỉ phát hiện được những đột biến mất đoạn đã biết trước
trình tự vùng ADN đứt gãy.
Ứng dụng: để chẩn đoán các đột biến mất đoạn α-thalassemia như đột --
SEA, -- THAI, --MED, -- FIL, -α3.7 ,-α4.2 và một vài mất đoạn β
thalassemia nhưδβ-thalassemia, HPFH, ... [25].
1.6.2. Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex
ligation dependent probe amplification – MLPA)
Nguyên lý: Kỹ thuật này sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai
với phân tử ADN đích đặc hiệu. Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligonucleotide có
kích thước khác nhau (đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược). Các probe sẽ gắn đặc
hiệu vào phân tử ADN đích, sau đó enzyme ligase được thêm vào để nối hai
đoạn dò này lại với nhau tạo thành đoạn dò hoàn chỉnh và được khuếch đại
bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang. Đoạn
đệm được thiết kế dài ngắn khác nhau nên khi phản ứng PCR khuếch đại sẽ tạo
ra nhiều đoạn ADN có chiều dài khác nhau và được phân tách bằng điện di mao
quản. Nếu gen có đột biến mất đoạn thì không có hiện tượng lai probe và probe
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
đó sẽ không được khuếch đại. Nếu gen có đột biến lặp đoạn, kết quả trên hình
14
ảnh điện di mao quản cho thấy đỉnh tín hiệu của probe tương ứng với vùng bị
đột biến sẽ tăng cao so với bình thường.
Ưu điểm: xác định được tất cả các đột biến mất đoạn, lặp đoạn đã biết và
chưa biết trên cụm gen α-globin và β-globin.
Nhược điểm: Chi phí cao, kỹ thuật phức tạp.
Ứng dụng: Kỹ thuật MLPA được dùng để chẩn đoán các đột biến mất
đoạn, lặp đoạn trong α-thalassemia và β-thalassemia [26].
1.6.3. Kỹ thuật dùng enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease - RE)
Nguyên lý: Đoạn ADN muốn khảo sát sau khi được khuếch đại bằng
PCR sẽ được cắt tại các vị trí đặc hiệu bằng các enzyme cắt giới hạn. Các vị trí
cắt trên ADN có thể thay đổi tùy thuộc sự hiện diện của đột biến tạo các đoạn
ADN có kích thước khác nhau và được phát hiện bằng điện di.
Ưu điểm: Kỹ thuật đơn giản, nhanh chóng, có độ tin cậy cao.
Nhược điểm: Chỉ chẩn đoán được các đột biến điểm đã biết ...
Ứng dụng: Để chẩn đoán các đột biến điểm như đột biến HbCs,
HbS...[25].
1.6.4. Kỹ thuật khuếch đại alen đặc hiệu ARMS-PCR
Nguyên lý: Dựa trên đặc tính bổ sung nucleotit không tương hỗ ở đầu 3’
sẽ ngăn chặn sự kéo dài của mồi làm phản ứng PCR không thể xảy ra. Để xác
định một đột biến cụ thể, cần thiết kế 2 đoạn mồi đặc hiệu cho ADN bình
thường và 1 mồi đặc hiệu với ADN có đột biến. Mồi bình thường sẽ không gắn
vào đoạn ADN có đột biến và mồi đột biến sẽ không gắn vào đoạn ADN bình
thường. Các sản phẩm PCR được điện di và so sánh kích thước với thang chuẩn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ADN và các băng của chứng dương để xác định đột biến của mẫu.
15
Ưu điểm: phương pháp đơn giản, chi phí thấp. Có thể phát hiện được
nhiều đột biến cùng lúc.
Nhược điểm: Chỉ chẩn đoán được các đột biến điểm đã biết. Các đoạn
mồi suy biến có thể gắn vào các vị trí khác trong hệ gen và tạo ra những sản
phẩm không đặc hiệu [25].
Ứng dụng: Để chẩn đoán các đột biến điểm gây β-thalassemia [25].
1.6.5. Phương pháp lai ngược (Reverse Dot Blot)
Nguyên lý: Trong kỹ thuật lai ngược, các cặp đầu dò (probes) được gắn
cố định lên màng. Mỗi cặp đầu dò gồm một oligonucleotit bình thường và một
oligonucleotit đột biến. Với mỗi xét nghiệm, các sản phẩm ADN lai với các
đầu dò đặc hiệu đã cố định sẵn trên màng lai, cho phép phát hiện đồng thời
nhiều đột biến [25].
Ưu điểm: phương pháp đơn giản, chi phí thấp. Có thể phát hiện được
nhiều đột biến cùng lúc.
Nhược điểm: Cần có trình độ cao để tạo lập và đánh giá chất lượng của
bộ kit.
Ứng dụng: Phương pháp này thường được ứng dụng để phát hiện đột
biến điểm [25].
1.6.6. Kỹ thuật lai phân tử (Reversehybridization - kit Strip Assay)
Nguyên lý: Là phương pháp kết hợp của kỹ thuật Multiplex PCR và lai
ADN ngược (Reverse hybridization), sử dụng thanh test strip có đính nhiều đầu
dò để phát hiện đồng thời nhiều đột biến và xác định tính đồng hợp/ dị hợp tử
của đột biến. Các dầu dò đặc hiệu (Alen specific oligonucleotit –ASO probes)
cho alen bình thường và đầu dò cho alen đột biến được gắn cố định trên các dải
nitrocenlullose có màng nilon. Sản phẩm ADN được đánh dấu bằng biotin-16-
dUTP trong phản ứng khuếch đại (PCR). Các sản phẩm này được lai với các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
đầu dò đặc hiệu alen đột biến (mutant) và alen bình thường (wild type). Sau khi
16
rửa, sản phẩm lai đặc hiệu ở trên các băng vạch của thanh test trip có thể được
phát hiện bằng mắt thường.
Kit Strip Asay (ViennaLab, Áo) có bộ kít α-globin Strip Assay cho phép
sàng lọc được 21 đột biến α-thalassemia và bộ kít β-globin Strip Assay cho
phép sàng lọc được 22 đột biến β-thalasemia phổ biến trong khu vực Đông Nam
Á. Những bộ kít này đạt tiêu chuẩn chứng nhận IVD (In Vitro Diagnostics) cho
chẩn đoán bệnh được phép lưu hành tại Châu Âu và đã được sử dụng ở nhiều
nước trên thế giới như Malaysia, Iran, Iraq, Thổ Nhĩ Kỳ, Ai cập [27], [37], [38],
[39].
Ưu điểm: Dễ thực hiện, có thể cùng lúc phát hiện được nhiều đột biến
điểm, đột biến mất đoạn, xác định được các đột biến đồng hợp tử hay dị hợp tử.
Thời gian nhanh chóng (6 - 8 giờ). Lượng mẫu cần ít (10 – 50 ng ADN cho 1
phản ứng PCR duy nhất). Phương tiện máy móc đơn giản. Phân tích kết quả
đơn giản từ các băng vạch trên thanh phản ứng bằng mắt thường hoặc qua máy
đọc tự động. Độ chính xác cao [25], [26], [38].
Nhược điểm: chi phí cao. Chỉ xác định được những đột biến đã biết được
xây dựng trong bộ kit.
Ứng dụng: Để phát hiện các đột biến mất đoạn và đột biến điểm trong α
- thalassemia và β-thalassemia.
1.6.7. Kỹ thuật phân tích giải trình tự gen theo nguyên lý Sanger
Phương pháp giải trình tự gen Sanger có khả năng phân tích đoạn ADN
trên 1 kb, tất cả các đột biển điểm hay đa hình ADN đều có thể được xác định.
Do vậy, phương pháp này thường được áp dụng để xác định các đột biến hiếm
hoặc trường hợp nghi ngờ mà âm tính với các kỹ thuật khác.
Nguyên lý: Kỹ thuật này dựa trên phương pháp enzyme và trên nền tảng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
kỹ thuật PCR. Chuỗi ADN mới được kéo dài bởi ADN polymerase khi có mặt
17
của các dNTP và mồi. Phản ứng này được làm ngừng bằng cách bổ sung dNTP.
Tùy theo dNTP là gì mà phản ứng sẽ bị ngừng tại vị trí có dNTP đưa vào. Hỗn
hợp phản ứng thu được sẽ chứa tập hợp tất cả các đoạn ADN kích thước chênh
lệch nhau 1 nucleotit [25], [26].
Ưu điểm: Có thể xác định được tất cả các đột biến.
Nhược điểm: Chi phí cao.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Ứng dụng: Để chẩn đoán các đột biến hiếm gặp.
18
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và bệnh phẩm nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 58 bệnh nhân tại bệnh viện Đa khoa Trung Ương
Thái Nguyên đã được chẩn đoán bị bệnh β-thalassemia trên lâm sàng và đang
trong quá trình điều trị.
Bệnh phẩm là 3 ml máu tĩnh mạch của 58 bệnh nhân trên được chống đông
bằng EDTA. Bệnh phẩm được lấy trước khi truyền máu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp nghiên cứu cắt ngang để mô tả loại các loại gen đột
biến và tần số allen đột biến trong nhóm bệnh nhân thalassemia tới khám và
điều trị tại bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên.
2.3. Địa điểm thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu tại khoa Di Truyền - Miễn dịch Phân tử Bệnh viện
Trung Ương Thái Nguyên
Thời gian nghiên cứu từ tháng 1 năm 2017 tới tháng 1/2018
2.4. Quy trình kỹ thuật nghiên cứu
2.4.1. Thu mẫu
Với bệnh nhân thalassemia và bệnh nhân khác đều tiến hành lấy 3ml máu
tĩnh mạch chống đông bằng EDTA (1mg EDTA/1ml máu toàn phần). Mẫu máu
của đối tượng phải được lấy trước khi truyền máu.
Mẫu máu được bảo quản ở 4 ºC - 8 ºC trong tối đa 4h trước khi tách chiết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DNA. Nếu sau 4h, cần tách huyết thanh và bảo quản âm sâu trước khi tách DNA.
19
Hình 2.1. Sơ đồ sàng lọc, chẩn đoán đột biến gen thalassemia.
2.4.2. Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu và điện di huyết sắc tố
Các mẫu máu đều được thực hiện tổng phân tích tế bào máu để đánh giá
hình thái, tính chất hồng cầu và mức độ thiếu máu với từng kiểu gen tương ứng.
Với người đến khám sàng lọc bệnh, chỉ những mẫu máu nghi ngờ thalassemia
được lựa chọn. Việc sàng lọc dựa trên chỉ số MCV < 80 femtolit và/hoặc MCH<
27 picrogam. Mẫu máu âm tính với cả 2 chỉ số này bị loại ra khỏi nghiên cứu.
Tổng phân tích máu được thực hiện trên hệ thống máy phân tích tự động 18 chỉ
số (Celltac F, Japan).
Điện di huyết sắc tố được thực hiện cho toàn bộ bệnh nhân và người
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
dương tính với xét nghiệm sàng lọc nhằm xác định bất thường về tỷ lệ hoặc
20
thành phần HST. Ngoại trừ kiểu EA (HbE 25-30%) chỉ làm PCR cho β
thalassemia, tất cả các thể điện di khác đều phải làm chẩn đoán PCR cho α&β
thalassemia. Điện di huyết sắc tố thực hiện trên hệ thống máy minicap (Sebia,
France).
2.4.3. Tách chiết DNA
DNA được tách chiết từ máu ngoại vi theo phương pháp tách cột bằng
Kit thương mại (Qiagen; Hilden, Germany)theo quy trình hướng dẫn của hãng
sản xuất.
Về cơ bản quy trình tách DNA gồm các bước
Bước 1: Quá trình ly giải
Bước 2: Gắn ADN vào cột sắc ký
Bước 3: Rửa ADN
Bước 4: Loại ethanol bằng cách làm khô
Bước 5: Rửa giải ADN được gắn vào cột
Thiết bị, vật liệu, hoá chất và quy trình tách DNA cụ thể: (Xem chi tiết
ở phụ lục 1)
Sản phẩm DNA tách chiết được bảo quản ở 4°C trong thời gian ngắn
hoặc lưu giữ ở -20°C trong thời gian dài.
2.4.4. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của sản phẩm DNA
Nguyên tắc để xác định nồng độ acid nucleic (DNA) là dựa vào giá trị
mật độ quang OD như sau: dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước
sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước
sóng 260 nm (OD260 nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA
trong mẫu dựa vào tương quan sau: Một đơn vị OD260 nm tương ứng với một
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
nồng độ là:
21
50 μg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi.Hàm lượng DNA được xác
định bằng công thức: [DNA] = OD260 x 50 (μg)
Độ sạch của DNA được xác định bằng tỷ số OD260/ OD280. Nếu tỷ
số này 1,8 - 2,0 thì dung dịch DNA đem đo được coi là sạch.
2.4.5. Thiết kế mồi
Trong nghiên cứu này, mồi (primer) được thiết kế cho phương
pháp multiplex ARMS-PCR nhằm phát hiện một số đột biến thường gặp
tại Việt Nam.
Với beta thalassemia: mồi được thiết kế cho multiplex ARMS-PCR
phát hiện 9 đột biến thông thường được chia thành 3 quy trình nhỏ. Trong đó
quy trình beta 1 phát hiện các đột biến: CD95; CD41/42; IVS1-5; CD17. Quy
trình beta 2 phát hiện các đột biến:CD 26 (HbE); IVS I-1;. Quy trình beta 3
phát hiện các đột biến nt-28; CD71/72; IVSII-645. Trình tự mồi và kích thước
sản phẩm DNA được thể hiện ở các bảng dưới đây:
Quy trình beta 1:
Kích
Tên mồi
Trình tự mồi (5’ - 3’)
thước
IVS I-5
CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGTTAG
285
Cd 17
CTCACCACCAACTTCATCCACGTTCAGCTA
240
Cd 41/42
GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAACCT
443
Cd95
TCA GGA TCC ACG TGC AGC TTT
600
Quy trình beta 2:
Kích
Tên mồi
Trình tự mồi (5’ - 3’)
thước
Cd26
TAACCTTGATACCAACCTGCCCAGGGCGTT
502
IVS I-1
TTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACGAAA
281
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
22
Quy trình beta 3:
Tên mồi
Trình tự mồi (5’ - 3’)
Kích thước
Nt-28
AGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCTTAG
649
Cd 71/72
CATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAAG
238
IVS II-654
GAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAACGT
829
Với alpha thalassemia: trình tự mồi được thiết kế để phát hiện đồng
thời 5 đột biến xoá đoạn a3.7; a4.2; SEA, THAI, FIL trong 1 phản ứng.
Tên mồi
Trình tự (5’-3’)
Kích thước
SEA F
CTCTGTGTTCTCAGTATTGGAGGGAAGGAG
660
SEA R
ATATATGGGTCTGGAAGTGTATCCCTCCCA
AAGAGAATAAACCACCCAATTTTTAAATGGGCA
FIL F
550
GAGATAATAACCTTTATCTGCCACATGTAGCAA
FIL R
THAI F
CACGAGTAAAACATCAAGTACACTCCAGCC
411
THAIR
TGGATCTGCACCTCTGGGTAGGTTCTCTACC
CCCCTCGCCAAGTCCACCC
3.7 F
2020
AAAGCACTCTAGGGTCCAGCG
3.7R
CCCGTTGGATCTTCTCATTTCCC
4.2 R
1628
GGTTTACCCATGTGGTGCCTC
4.2 F
AGACCAGGAAGGGCCGGTG
α2 R
1800
CCCCTCGCCAAGTCCACCC
α2 F
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
23
Hình 2.2. Vị trí primer xác định đột biến trên alpha globin gen
2.4.6. Quy trình multiplex PCR xác định đột biến gen thalassemia
Với alpha thalassemia.
Bước 1: Chuẩn bị phản ứng PCR
STT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 pứ
1 H2O 5,5
2 2X GoTaq Green MM 12,5
3 DMSO 1,0
4 Hỗn hợp mồi 5,0
5 DNA 1,0
Tổng thể tích 25,0
Bước 2: Thực hiện cácchu kỳ nhiệt.
Bước 3: Điện di sản phẩm PCR trên agarose gel.
Bước 4: Đọc kết quả.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
(Quy trình chi tiết, máy xét nghiệm, vật liệu xem chi tiết tại phụ lục 3)
24
Với beta thalassemia: Các bước thao tác tương tự như alpha thalassemia nhưng
lần lượt theo thứ tự quy trình beta 1, 2, 3. Nếu phát hiện đột biến ở quy trình
trước thì không cần thực hiện quy trình sau. Quy trình chi tiết xin xem phụ lục
3.
2.5. Phân tích số liệu
Các số liệu được phân tích bằng phần mềm thống kê y học SPSS 20.
2.6. Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu được thông qua bởi hội đồng khoa học trường Đại học Khoa
Học - Đại học Thái Nguyên; Ban giám đốc bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên.
Đối tượng nghiên cứu được phổ biến quyền lợi và quyền quyết định tự
nguyện tham gia/không tham gia nghiên cứu.
Thông tin cá nhân đối tượng nghiên cứu được mã hoá và chỉ được sử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
dụng cho mục đích nghiên cứu phi lợi nhuận.
25
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết DNA
DNA của các bệnh nhân cùng DNA mẫuđối chứng được tách chiết
bằngQIAGEN Kit như mô tả ở phần phương pháp. Sau khi tách chiết, các mẫu
DNA được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch bằng phương pháp đo phổ hấp thụ tử
ngoại ở bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy Nano-Drop và điện di DNA tổng
số trên gel agarose 1%.
Hình 3.1. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của một mẫu sản phẩm DNA.
(Tỷ lệ OD 260/280 của mẫu này là 1,87 trong khoảng cho phép từ 1,8-2,0
nồng độ DNA là 545,1ng/ul.)
Nồng độ DNA tổng số tách được có giá trị trên 200ng/l và độ tinh sạch
của các mẫu đạt yêu cầu với tỷ lệ mật độ quang đo được ở bước sóng 260/280
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
nm luôn nằm trong khoảng 1,8-2,0.
26
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 3.2. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ máu ngoại vi
của các đối tượng nghiên cứu
Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân
thalassemia lên vạch rõ nét, không bị đứt gãy và có thể sử dụng để phân tích
đột biến.
Kỹ thuật sinh học phân tử đang ngày càng phát triển và có những đóng
góp rất lớn trong lĩnh vực khoa học nói chung và y học nói riêng. Đối với các
bệnh lý di truyền, chẩn đoán bệnh ở mức độ phân tử giúp chẩn đoán sớm và
chính xác bệnh. Đặc biệt với bệnh thalassemia, một bệnh di truyền trên nhiễm
sắc thể thường rất phổ biến ở người Việt Nam, đặc biệt là nhóm người dân tộc
thiểu số. Người bệnh có tình trạng thiếu máu, các bệnh lý về xương và ảnh
hưởng đến gan, lách, hạch bạch huyết, ngực và cột sống. Bệnh được chia làm
ba thể nặng, trung gian và nhẹ. Tuy nhiên thể nhẹ không có biểu hiện trên lâm
sàng, đồng thời các phương pháp chẩn đoán thông thường hiện nay như tổng
phân tích tế bào máu hay điện di huyết sắc tố chưa phát hiện được các trường
hợp người lành mang gen bệnh (như alpha thalassemia dị hợp tử). Việc phát
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
hiện người lành mang bệnh rất quan trọng và là hướng tiếp cận hiệu quả nhất
27
cho dự phòng thalassmia tại Việt Nam. Do đó ứng dụng các phương pháp sinh
học phân tử phát hiện đột biến gen thalassemia là rấtcần thiết cho chẩn đoán và
tư vấn các vấn đề di truyền trước khi sinh.
Khi tiến hành xác định đột biến gen, khâu tách chiết DNA được thực
hiện đầu tiên và là một bước khá quan trọng quyết định sự chính xác của xét
nghiệm. Chất lượng DNA có ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả của các kỹ thuật
sinh học phân tử. Yêu cầu của DNA tách chiết đạt tiêu chuẩn là: tinh khiết và
không đứt gãy; đảm bảo cho kết quả PCR và giải trình tự gen đạt độ chính xác
cao.Trong nghiên cứu này, DNA được tách chiết bằng Kit thương mại của hãng
QIAGEN, Đức theo quy trình tách cột. Kết quả tách chiết bằng phuong pháp này
tại bảng 3.1 cho thấy giá trị về hàm lượng và độ tinh sạch đều của các mẫu là rất
ổn định. Tỉ số A260/A280 nằm trong khoảng 1.8÷2.0 cho thấyDNA tách được
không bị tạp nhiễm. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (A260) của các
mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Hàm lượng DNA
thu được đều trên 200 ng/µl, đảm bảo đủ hàm lượng để tiến hành kỹ thuật
multiplex PCR.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
3.2. Kết quả quy trình multiplex-PCR
28
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình beta 1)
Trong đó:
Mẫu (1) (4) (6) (9) (10) DNA bệnh nhân dị hợp tử CD41/42 (ứng với kích
thước sản phẩm DNA là 443 bp)
Mẫu (2) (8) là mẫu DNA bệnh nhân đồng hợp tử CD41/42 và CD 17 (ứng
với kích thước sản phẩm DNA là 240 bp)
Mẫu (3) (7) là mẫu DNA bệnh nhân dị hợp tử CD17
Mẫu (5) là mẫu DNA chưa xác định đột biến ở quy trình beta 1
Các mẫu bệnh nhân đều lên tốt, kích thước phù hợp với các đột biến của
mồi tương ứng đã thiết kế.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình beta 2)
Trong đó
Mẫu(5) (7) (10) là dị hợp tử HbE ứng với kích thước 502 bp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Mẫu (6) (8) (9) âm tính với Cd26 và IVS1-1
29
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình alpha)
Trong đó:
Mẫu (1) là dị hợp tử -a3.7
Mẫu (2) (3) (5) (6) (8) âm tính với 5 đột biến thông thường
Mẫu (4) (7) (9) (10) (11) là dị hợp tử --SEA
Ngoại trừ mẫu 6, sản phẩm điện di DNA của các mẫu khác đều lên rõ,
kích thước phù hợp với kích thước mồi đã được thiết kế.
Kết quả điện di cho thấy chất lượng mồi lên tốt, các band sáng rõ và tương
ứng với kích thước dự kiến khi đối chiếu trên maker. Các trình tự mồi và thiết
kế được chuyển giao từ Viện Huyết học và Truyền máu. Đây cũng là các thiết
kế đã được chuẩn hoá và dùng thường quy trong xác định đột biến gen
Thhalassemia tại Viện Huyết học. Do vậy, dù chưa có điều kiện kiểm tra tính
đặc hiệu bằng phương pháp giải trình tự gen, đây là tiêu chuẩn vàng trong chẩn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
đoán bệnh nhân đột biến β-thalassemia, nhưng tất cả các trường hợp bệnh nhân
30
có chẩn đoán thalassemia chúng tôi đều phát hiện tối thiểu 1 đột biến bằng
panel sàng lọc này.
Về thiết kế mồi, trong nghiên cứu này, phương pháp multiplex ARMS -
PCR đã được áp dụng. Việc sử dụng các cặp mồi để sàng lọc được nhiều loại
đột biến đồng thời là rất thuận tiện, nó giúp giảm số lượt thực hiện xét nghiệm
do đó tiết kiệm được công sức cũng như tiết kiệm thời gian, vật liệu thực hiện
xét nghiệm. Thông thường quy trình xét nghiệm PCR thường kéo dài từ 4-6h
đồng hồ, thêm vào đó thalassemia có phân loại phức tạp và đa dạng cac loại đột
biến. Nếu thực hiện PCR thường sẽ mất rất nhiều lần sàng lọc cho đến khi tìm
được đột biến mới dừng lại.
Khi thực hiện phản ứng multiplex PCR với các bệnh nhân biết trước đột
biến thì sản phẩm điện di kết quả tìm được có kích thước phù hợp với kích
thước của đột biến từ đó cho thấy phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao hoàn
toàn có thể áp dụng thường quy tại labo.
Thêm vào đó việc chạy các cặp mồi cho wildtype cùng với các cặp mồi xác
định đột biến sẽ giúp multiplex ARMSPCR bớt đi một bước là kiểm tra tình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
trạng đồng hợp tử trên các bệnh nhân chỉ lên 1 band đột biến.
31
3.3. Đặc điểm đột biến gây bệnh Thalassemia tại Bệnh viện Trung Ương
Thái Nguyên
Bảng 3.1. Phân bố kiểu gen đột biến trên các bệnh nhân - Thalassemia
Kiểu hình
Kiểu gen
Số lượng
Tỷ lệ %
Đồng hợp/ dị hợp
3
7.0
0/0
Đồng hợp tử (n= 12)
8 1
18.6 2.3
0/0
5 1
11.6 2.3
2
4.7
8
18.6
Dị hợp tử kép (n= 27)
6
14.0
0/+
2
4.7
1
2.3
1 2
2.3 4.7
17/17 41/42/41/42 71/72/71/72 17/41/42 71/72/IVS1.1 41/42/IVS1.1 17/cd26 41/42/cd26 71/72/cd26 41/42/-90 -28/IVS2.654 41/42/
0/
1
2.3
71/72/
Dị hợp tử đơn
(n=5)
1
2.3
cd26/
+/
1
2.3
-28/
Tổng
43
100
Tống số 43 bệnh nhân beta thalassemia đều phát hiện thấy ít nhất một đột
biến gen bằng quy trình AMMS-PCR, trong đó 5 trường hợp mang kiểu gen dị
hợp tử đơn (11,6%), 12 trường hợp mang kiểu gen đồng hợp tử (27,9%) và 26
trường hợp có kiểu gen dị hợp tử kép (60,5%). Trong số dị hợp tử kép, 16 trường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
hợp có sự phối hợp một đột biến - thalassemia với HbE (37,2%).
32
Bảng 3.2. Đặc điểm phân bố alen đột biến trên các bệnh nhân
Kiểu hình
Alen đột biến
Số lượng
Tỷ lệ %
cd 41/42 (-TTCT)
32
37,1
cd17 (A T)
19
22,1
0- Thalassemia
cd 71/72 (+A)
6
7,0
3
3,5
IVS 1.1 (G T)
17
19,8
cd 26 (GA) HbE
2
2,3
-28 (A G)
+- Thalassemia
1
1,2
- 90 (C T)
1
1,2
IVS 2.654 (C T)
5
5,8
Không phát hiện đột biến đơn alen
86
100
Tổng
Trong 86 alen của 43 bệnh nhân β - thalassemia, có7 loại đột biến trong 8 loại
alen đột biến được phát hiện trên panel sàng lọc tại labo BV TƯTN.Bao gồm:
- 4 đột biến thuộc nhóm 0thalassemia (cd17, IVS 1.1, cd 41/42, cd71/72) và
3 đột biến thuộc nhóm + thalassemia (cd26 (HbE), nt-28, IVS 2.654.
- 1 đột biến cd -90 ngoài panel sàng lọc nhưng được gửi lên tuyến trên
kiểm tra loại đột biến.
Trong số các alen đột biến, alen gây biến đổi cấu trúc phân tử hemoglobin
cd 41/42 (-TTCT) chiếm tỷ lệ cao nhất (37,1%), kế tiếp là các alen cd17 (A
T) (22,1%) và HbE-cd26 (19,8%).
Bước đầu áp dụng kỹ thuật ARMS PCR cho 58 trường hợp bệnh nhân
điều trịthalassemia tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, chúng tôi phát hiện
được 43 trường hợp có đột biến beta thalassemia và 15 trường hợp đột biến
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
alpha thalassemia.
33
Với beta thalassemia, 15 kiểu tổ hợp gen biểuhiện ra ở 3 nhóm kiểu hình
trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất là dị hợp tử kép (60,5%) tiếp đến là nhóm đồng
hợp tử (27,9%) và dị hợp tử đơn chiếm (11,6%).Trong số các kiểu gen, kiểu
đồng hợp tử41/42/41/42 và dị hợp tử kép 17/cd26 hay - thalassemia-
HbE chiếm tỷ lệ cao nhất (18,6%). Điều này là phù hợp với tình trạng mang
gen trong khu vực. Theo nghiên cứu của Nguyễn Kiều Giang và cộng sự cho
thấy tần xuất đột biến của alen CD41/42, CD17 và CD26 đứng đầu trong nhóm
đột biến gây - thalassemia tại khu vực Thái Nguyên [28]. Nghiên cứu khác
trong nhóm quần thể tại Việt Nam cũng cho thấy tần xuất CD41/42 đứng đầu
với tỷ lệ 35%, tiếp đến là CD17 chiếm (25%) [40]. Nghiên cứu của chúng tôi
áp dụng kỹ thuật multiplex ARMS PCR cho 9 loại đột biến thông thường và
phát hiện được tối thiểu 1 đột biến gen trong tất cả các trường hợp. Tuy nhiên
có 1 trường hợp chúng tôi chỉ phát hiện được 1 kiểu đột biến đơn alen là cd41/42
nhưng kiểu hình trên lâm sàng, huyết đồ và điện di không tương xứng với tình
trạng dị hợp tử đơn. Trường hợp này được gửi đi làm giải trình tự gen với kết
quả xác định được 2 đột biến là CD-90 . Đây là đột biến hiếm gặp trong cộng đồng người Việt Nam và thuộc nhóm + thalassemia, tuy nhiên khi phối hợp với các đột biến 0, + hoặc E đều gây lên hội chứng thalassemia. Kết quả này
cho thấy sự hiện diện của các đột biến hiếm và gợi ý cho việc thiết lập thêm bộ
mồi cho các đột biến này để sẵn sàng chẩn đoán các trường hợp hiếm gặp bằng
kỹ thuật PCR khi chưa được trang bị thêm các phương tiện chẩn đoán khác.
Trong 86 alen được khảo sát, alen đột biến CD41/42 chiếm tỷ lệ cao nhất
(37,1%) tiếp đến là CD17 (22,1%), các loại đột biến khác chiếm tỷ lệ ít hơn. Có
17 bệnh nhân (19,8 %) được phát hiện mang gen đột biến CD26 (HbE) và các trường hợp này kết hợp với gen β0 hoặc β+ tạo nên bệnh β thalassemia/HbE và các trường hợp β0/βE đều thể hiện tình trạng thiếu máu nặng trên huyết đồ. Kiểu alen
CD95 (+A) được phát hiện trong một số nghiên cứu trước đó được xem như là
loại đột biến của người Việt Nam. Bạch Quốc Khánh và cộng sự khi nghiên cứu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
trên 324 bệnh nhân beta thalassemia/HbE cho thấy tỷ lệ kết hợp CD95-CD26
34
(HbE) là 1,9% còn trong nghiên cứu của Nguyễn Thuỳ Trang là 0,7%[41], [42].
Tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi không phát hiện trường hợp nào mang
alen đột biến tại CD95. Có thể do sự phân bố dân tộc trong nhóm bệnh nhân
thalassemia tại đây hầu hết là người dân tộc thiểu số trong khi CD95 (+A) chủ
yếu được phát hiện trong nhóm người Kinh [40], [ 43]. Bảng 3.3. Phân bố kiểu gen và giá trị trung bình các chỉ số huyết học
Giá trị trung bình các chỉ số huyết học
Kiểu hình Kiểu gen
MCV
MCH
RDW
17/17
RBC (x1012/l 2,3 ± 0,7
Hb (mg/l) 55,5 ±16,8
79 ± 5,6
24,9 ± 2,45
19,2 ± 4,6
0/0
Max:3,2
Max: 91
Max:88,6
Max: 29
Max:27,6
41/42/41/42
(đồng hợp
Min:1,3
Min:32
Min: 68,2
Min: 22
Min: 4,6
tử)
71/72/71/72
17/41/42
2,8 ± 1,0
61,8 ± 18,7
76,5 ± 9,3
22,5 ± 2,7
23,3 ± 6,1
0/0
Max:4,3
Max: 97
Max:94,1
Max:26,9
Max:37,7
17/IVS1.1
(dị hợp tử
Min: 1,6
Min: 38
Min: 55
Min: 14,8
Min: 15,7
kép)
41/42/IVS1.1
17/cd26
3,2 ± 0,6
64,3 ± 15,4
69,2 ± 7,9
20,2 ± 3,1
25,5 ± 2,7
0/+
421/42/cd26
Max: 4,2
Max: 95
Max: 79,5
Max: 26
Max: 29,1
(dị hợp tử
71/72/cd26
Min: 2,3
Min: 44
Min: 56,5
Min: 15,5
Min: 19,7
kép)
-28/IVS2.654
17/
0/
3,6 ± 1,1
81,8 ± 13,5
74,9 ± 9,9
23,3 ± 3,4
17,6 ± 3,6
41/42/
+/
Max: 4,8
Max: 94
Max:86,7
Max: 26,6
Max: 23,0
(dị hợp tử
71/72/
Min: 2,5
Min: 66
Min: 63,9
Min: 19,2
Min: 15,4
đơn)
cd26/
Các chỉ số hồng cầu có sự thay đổi liên quan đến kiểu gen đột biến.Tình
trạng thiếu máu nặng được thể hiện ở các kiểu gen có sự góp mặt của các kiểu
đột biến gây tình trạng β0 như đồng hợp tử β0, dị hợp tử kép β0/β0, β0/β+,β0/βE.
Các chỉ số về huyết đồ trước khi truyền máu được xem xét trong mối
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
tương quan với kiểu gen đột biến bao gồm số lượng hồng cầu (Rbc), huyết sắc
35
tố (Hb), thể tích trung bình hồng cầu (MCV), huyết sắc tố trung bình hồng cầu
(MCH) và phân phối rộng của hồng cầu (RDW). Giá trị trung bình của các chỉ
số này được thể hiện ở Bảng 3.3. So với giá trị tham chiếu của WHO (2011)
dựa trên Hb thì các chỉ số về máu của bệnh nhân huyết tán cho thấy tình trạng
thiếu máu nặng với đặc điểm hồng cầu nhỏ nhược sắc. Hầu hết tình trạng thiếu
máu nặng được thể hiện ở các kiểu gen có sự góp mặt của các kiểu đột biến dẫn
tới không tổng hợp chuỗi beta như đồng hợp tử β0, dị hợp tử β0, dị hợp tử kết
hợp β0/β+ và dị hợp tử β0/βE. Nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự một số
tác giả tại Việt Nam, phần lớn bệnh nhân có các kiểu gen này biểu hiện tình
trạng thiêú máu từ nặng đến trung bình [42], [44].
Bảng 3.4. Đặc điểm đột biến gen alpha thalassemia
Kiểu Kiểu gen Kiểu Hb Số lượng % đột biến
αSEA/αα 10 66,6 A2A Dị hợp tử đơn αα/-α 3.7 HbH 1 6,7
Dị hợp tử kép αSEA/-α3.7 HbH 4 26,7
Tổng 15 100
Các đột biến thường gặp trên gen α globin ở nhóm nghiên cứu là đột biến
--SEA, α3.7. Trong số 15 trường hợp phát hiện được đột biến có 11 trường hợp dị
hợp tử đơn, trong đó có 10 trường hợp dị hợp tử SEA chiếm tỷ lệ 66,6%, 1 dị
hợp tử 3.7 (6,7%). 4 trường hợp dị hợp tử kép (HbH) phối hợp giữa đột biến
αSEA và -α3.7.
Kỹ thuật multiplex ARMS - PCR cũng đã được sử dụng để phát hiện
đồng thời 5 loại đột biến phổ biến gây bệnh α thalassemia. 15 trường hợp bệnh
nhân có đột biến alpha thalassemia đã được phát hiện. Các bệnh nhân này thực
hiện xét nghiệm gen khi dương tính với MCV/MCH, đông thời đều được làm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
điện di huyết sắc tốt để kiểm tra lại. 5 trong số 15 trường hợp có kết quả điện
36
di là bệnh HbH, kiểm tra đột biến gen trên nhóm bệnh nhân này, chúng tôi phát
hiện 4 trường hợp là dị hợp tử SEA kết hợp dị hợp tử 3.7. Đây là kiểu tổ hợp
rất phổ biến trong các chủng tộc người Đông Nam Á. Tuy nhiên có 1 trường
hợp chúng tôi chỉ phát hiện di hợp tử a3.7 , bệnh nhân này có tình trạng thiếu
máu trung gian và kết quả điện di HbH là phù hợp với tình trạng bệnh. Tuy
nhiên khi xác định đột biến gen chúng tôi chỉ xác định được 1 đột biến xoá đoạn
ngắn trên gen HBA1 là -a3.7. Theo chúng tôi điều này có thể do có một đột biến
xoá đoạn dài hoặc một đột biến điểm khác nằm ngoài panel sàng lọc mà chúng
tôi đang sử dụng. Hiện nay, người ta có thể dùng các phương pháp khác để
kiếm tra các đột biến xoá đoạn lớn như MLPA hoặc đột biến điểm như giải
trình tự gen để kiểm tra tiếp những trường hợp mà PCR thông thường chưa
sàng lọc được. Tuy nhiên các phương pháp này rất tốn kém và thường không
nằm trong danh mục bảo hiểm y tế nên chúng tôi chỉ tư vấn lại cho người bệnh
chứ chưa có khả năng thực hiện đến cùng.
Cũng trong bảng 3.4, có đến 10 trường hợp (66,6%) đối tượng được phát
hiện mang gen dị hợp tử SEA. Với kiểu điện di Hb là A2A, (nghĩa là không có
bất thường trên điện di), đây là những trường hợp người lành mang gen bệnh
alpha thalassemia điển hình. Các đối tượng này ngoài chỉ số hồng cầu nhỏ,
nhược sắc thì không hề có biểu hiện thiếu máu trên lâm sàng. Điều này cho
thấy tầm quan trong của việc tiếp tục phải sàng lọc alpha thalassemia ở những
người có tình trạng hồng cầu nhỏ nhược sắc nhưng không thấy bất thường về
thành phần tỷ lệ huyết sắc tố. Điều này là phù hợp với sinh lý bệnh thalassemia.
Alpha globin gen có 4 gen cùng tổng hợp chuỗi alpha globin, trường hợp chỉ
mất 1 đến 2 gen đột biến, các gen còn lại vẫn có thể sản xuất đủ số chuỗi alpha
để không gây lên tình trạng thiếu máu trên lâm sàng. Tuy nhiên, việc phát hiện
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
người mang gen SEA dị hợp tử là rất quan trọng cho tư vấn di truyền. Vì ở thể
37
đồng hợp tử với kiểu gen (--/--) sẽ gây tình trạng phù thai và làm thai nhi chết
lưu ở những tháng cuối hoặc chết ngay sau khi sinh ra.
So sánh với các nghiên cứu khác, kết quả này cũng tương động với
nghiên cứu của Lý Thị Thanh Hà và cộng sự khi tỷ lệ SEA cũng chiếm đến
58,8% tổng số các trường hợp mang gen. Tuy nhiên, kết quả này có sự khác
biệt với nghiên cứu ở Malaysia (0,5%) và ở Chines (1,36%). Điều này cho thấy
ở Việt Nam đột biến SEA chiếm chủ yếu trong nhóm đột biến gen alpha globin
[45], [46], [47].
Nghiên cứu này chưa tìm thấy đột biến THAI, FIL hay -α4.2 nào trong
các bệnh nhân nghiên cứu. Kết quả này tương đương với kết quả của Lý Thị
Thanh Hà. Điều này chứng tỏ đột biến Thai và đột biến FIL chưa phát hiện thấy
ở Việt Nam. Hai loại đột biến này thường có ở tộc người Thái Lan và Philipphin
[48], [49].Có thể do số mẫu còn chưa nhiều nên chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên
cứu để tìm thêm các loại đột biến khác.
Về tần số alen, kiểu --SEAđứng đầu với 14/30 alen nghiên cứu, tiếp theo
là kiểu α3.7với 5/30 alen khảo sát. Điều này là phù hợp với hầu hết các nghiên
cứu trong khu vực miền Bắc với tần số alen --SEA đứng đầu trong cac kiểu alen.
Tuy nhiên, với chỉ 2 đột biến với phát hiện được là chưa đủ để đưa ra các kết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
luận có tính đại diện.
38
Bảng 3.5.Phân bố kiểu gen và giá trị trung bình các chỉ số huyết học
Giá trị trung bình các chỉ số huyết học
Kiểu
Kiểu gen
RBC
Hb
hình
MCV
MCH
RDW
(x1012/l
(mg/l)
4,0 ± 0,5
10,8 ±6,7
80 ± 5,6
25,9 ± 2,45
17,1 ± 3,9
Max:4,8
Max: 12,1
Max:88,6
Max: 27
Max:23,9
αSEA/αα
Min:3,3
Min: 9,3
Min: 68,2
Min: 23
Min: 8,3
11,5
Dị hợp tử đơn
5,8 2,7 ± 0,7
63,2 75,4 ± 5,6
19,8 23,9 ± 2,45
23,3 19,9 ± 3,5
55,5 ±16,8
αα/-α 3.7
Max:3,1
Max: 87,6
Max:87,6
Max: 25
Max:26,6
Dị hợp
Min:2,3
Min: 38
Min: 66,2
Min: 21
Min: 4,6
αSEA/-α3.7 tửkép
Xem xét trong mối tương quan giữa các chỉ số về huyết đồ với kiểu gen
đột biến bao gồm số lượng hồng cầu (Rbc), huyết sắc tố (Hb), thể tích trung
bình hồng cầu (MCV), huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCH) và phân phối
rộng của hồng cầu (RDW). Giá trị trung bình của các chỉ số này được thể hiện
ở Bảng 3.5 so với giá trị tham chiếu của WHO (2011) dựa trên Hb thì các chỉ số
về máu của người mang gen alpha globin đột biến cho thấy tình trạng thiếu máu
chủ yếu mức độ nhẹ và trung bình, trừ những trường hợp HbH (mang 3 gen alpha
đột biến) có biểu hiện thiếu máu nặng như một bệnh nhân beta thalassemia và
cũng phải truyền máu khi nồng độ huyết sắc tố dưới 7g/l. Hầu hết tình trạng thiếu
máu nặng được thể hiện ở các kiểu gen có sự góp mặt của các kiểu đột biến dẫn
tới không tổng hợp chuỗi alpha. Nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự một số
tác giả tại Việt Nam, phần lớn bệnh nhân có các kiểu gen này biểu hiện tình trạng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
thiêú máu từ nhẹ đến trung bình hiếm gặp thể nặng.
39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1. Áp dụng kỹ thuật multiplex ARMS PCR đã xác định được chính xác
các đột biến phổ biến gây bệnh α và βthalassemia trong nhóm bệnh nhân tới
khám và điều trị tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên.
2. Bốn kiểu hình và 14 kiểu tổ hợp gen beta thalassemia đã được phát hiện.
Với alpha thalassemia là 2 kiểu hình và 3 kiểu tổ hợp gen. Alen CD41/42 chiếm
tần số cao nhất trong các đột biến trên gen HBB trong khi alen --SEA chiếm tỷ
lệ cao nhất trên gen HBA1 và HBA2.
3. Kiểu gen đột biến thalassemia có liên quan chặt chẽ tới mức độ và tính
chất thiếu máu trên lâm sàng. Các kiểu gen đồng hợp tử thể hiện mức độ thiếu
máu vừa đến nặng trong khi các trường hợp dị hợp tử hầu như không thiếu máu.
Hồng cầu của các trường hợp mang gen cả đồng hợp và dị hợp đều có hình thái
nhỏ và nhược sắc.
2.Kiến nghị
Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy tần số alen đột biến beta
thalassemi của khu vực Thái Nguyên và lân cận có sự khác biệt với các khu
vực khác. Do vậy, cần tiếp tục nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để có đủ số liệu
quần thể. Các số liệu sẽ gợi ý thiết lập panel sàng lọc phù hợp, có thể thay đổi
thêm hoặc bớt một số nhóm mồi đột biến hoặc thứ tự sàng lọc.
Kỹ thuật multiplex ARMS-PCR giúp tiết kiệm rất nhiều về thời gian và
nguyên liệu đồng thời cho độ chính xác cao. Labo cần tiếp tục nghiên cứu ứng
dụng và phát triển kỹ thuật này trong chẩn đoán trước sinh dự phòng bệnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
thalassemia.
40
Với tần suất cao và biểu hiện nặng nề của cácthể bệnh đồng hợp tử, bệnh
cần được phát hiện sớm và cần có biện pháp sàng lọc trước sinh nhằm nâng cao
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
chất lượng dân số, giảm bớt gánh nặng bệnh tật về xã hội và kinh tế.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1 Hà Thị Anh, Bùi Thị Mai An, Trần Văn Bình, Nguyễn Hà Thanh
(2009) “Huyết học – truyền máu” Nhà xuất bản Y học 2009
2 Trần Tuấn Anh;Vũ Thị Bích Hường và CS (2016) "Nghiên cứu tỷ lệ
đồng hợp tử và dị hợp tử của một số đột biến trong bệnh beta
thalassemia tại Viện Huyết học và Truyền máu TW" Tạp chí Y Học
Việt Nam. 448, tr. 21-27
3 Trịnh Văn Bảo (2011) Di Truyền y học. Nhà xuất bản giáo dục Việt
Nam, trang 99 - 104
4 Trịnh Văn Bảo và cộng sự, “Di truyền y học” Nhà xuất bản giáo dục
Việt Nam
5 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Kiều Giang (2016), "Thực trạng mang gen
bệnh tan máu bẩm sinh ở phụ nữ người dân tộc Tày tại huyện Định
Hóa, Tỉnh Thái Nguyên", Tạp chí Y Học Việt Nam. 448, tr. 13-20
6 Nguyễn Công Khanh 1993 Tần xuất bệnh hemoglobin ở việt nam. Y
học việt nam tập 174 số 8 11-16
7 Nguyễn Công Khanh(2008) “Bệnh hemoglobin” “Huyết học lâm sàng
y khoa”, nhà xuất bản y học: 127-146
8 Bạch Quốc Khánh (2015), "Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm
và đột biến gen ở bệnh nhân beta Thalassemia/HbE", Kỷ yếu hội nghị
khoa học Thalassemia toàn quốc lần thứ I, tr. 150-156.
9 Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai và cộng
sự (2010). Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán trước
và sau sinh bệnh alpha Thalassemia tại bệnh viên Nhi Trung ương. Tạp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
chí Nhi khoa, 3(3), 337 - 342.
10 Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Thị Thu Hà (2010) Cập nhật chuẩn đoán và
điều trị thalassemia. Nhà xuất bản y học:203-212
11 Nguyễn Thị Thùy Trang (2014), "Xác định tỷ lệ một số đột biến phổ
biến ở bệnh nhân Thalassemia khám và điều trị tại viện huyết học –
truyền máu TW", Tạp chí Y Học Việt Nam. 10, tr. 355-359.
12 Dương Bá Trực (1996). Đặc điểm lâm sàng và huyết học bệnh HbH ở
trẻ em Việt Nam, Bước đầu tìm hiểu tần suất alpha thalassemia ở Hà
Nội. Luận văn Tiến sỹ khoa học, Trường ñại học Y Hà Nội, 36 - 42.
13 Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh, Lê Minh Khôi,
Nguyễn Thị Băng Sương (2011), “Bệnh học phân tử”, Nhà xuất bản Y
học, tr. 67-80.
14 Tạ Thành Văn, (2010) “PCR và một số kỹ thuật Y sinh học phân tử”,
Nhà xuất bản Y học.
15 Bùi Văn Viên, Dương Bá Trực, Nguyễn Công Khanh 1999 Nhận xét
bước đầu cơ sở di truyền phân tử và mối quan hệ kiểu gen với mức độ
thiếu máu và thể tích hồng cầu trong bệnh HbE/β-thalassemia. Tạp chí
nhi khoa 8.
Tiếng anh
16 Anonymous. 1992 Diagnosis of Duchenne and Becker muscular
dystrophies by polymerase chain reaction. A multicenter study. JAMA
267:2609-2615
17 Borgna-Pignatti C, Cappellini MD, De Stefano P, Del Vecchio GC,
Forni GL, Gamberini MR, Ghilardi R, Origa R, Piga A, Romeo MA,
Triệu H, Cnaan A: Tỷ lệ sống và biến chứng trong bệnh thiếu máu. .
Ann NY Acad Khoa học năm 2005 1054: 40-47
18 Borgna-Pignatti C, Vergine G, Lombardo T, Cappellini MD, Cianciulli
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
P, Maggio A, Renda D, Lai ME, Mandas A, Forni G, Piga A, Bisconte
MG: Ung thư biểu mô tế bào gan trong các hội chứng bệnh thiếu máu.
Br J Haematol năm 2004 124:. 114-117
19 Caterina Borgna Pignatti, Renzo Galanello (2013) Thalassemias
andrelated Disorders: Quantitative Disorders of Hemoglobin
Synthesis. Wintrobe'sClinica Hematology 13th Edition Chapter 34, p.
1990- P2119.
20 Chamberlain, J.S., R.A. Gibbs, J.E. Ranier, P.N. Nguyen and C.T.
Caskey 1988 Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy
locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res. 16:11141-
11156.
21 Chui DH, Waye JS (1998) Hydrops fetalis caused by alpha-
thalassemia, an emerging health care problem. Blood, 91, 2213 - 2222
22 Crisan, D.1994 Molecular diagnostic testing for determination of
myeloid lineage in acute leukemias. Ann. Clin. Lab. Sci. 24:355-363.
23 Flatz G (1965) Hemoglobinophathiess in Thai Lhann. Br. J. Haematol,
11, 216 - 217.
24 Galanello R, Piras S, Barella S, Leoni GB, Cipollina MD, Perseu L,
Cao A: Sỏi mật và hội chứng Gilbert trong đồng hợp tử beta-
thalassemia.Br J Haematol năm 2001 115: 926-928
25 H.M. Aderson. H.M. Ranney (1990) Southeast Asian Iminmgarant: The
new thalassemia in American, Seminars in Hematol- ogy, 27, 239 - 246.
26 Henegariu, O., P. Hirschmann, K. Kilian, S. Kirsch, C. Lengauer, R.
Maiwald, K. Mielke and P. Vogt.1994 Rapid screening of the Y
chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF,
a genetic Y factor expressed during spermatogenesis. Andrologia
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
26:97-106.
27 Higgs D.R (2013) The molecular basis of α-thalassemia. Cold Spring
Harb Perspect Med, 3(1).
28 John Old, Cornelis L., Harteveld Joanne, et al. (2012) Prevention of
thalassemia and other haemoglobin disorders, Volume II (2012)
Thalassemia International Ferderation, 2nd edition
29 John S. W, David H.K. (2001) The α-globin gen cluster: genetics and
disorders. Clin. Invest. Med, 24(2) 103-109
30 Liebhaber SA, Cash FE, Ballas SK (1986) Human alpha-globin gene
expression. The dominant role of the alpha 2-locus in mRNA and
protein synthesis. J Biol Chem 261:15327-15333.
31 Mansfield, E.S., J.M. Robertson, R.V. Lebo, M.Y. Lucero, P.E.
Mayrand, E. Rappaport, T. Parrella, M. Sartore, S. Surrey and P.
Fortina. 1993 Duchenne/Becker muscular dystrophy carrier detection
using quantitative PCR and fluorescence-based strategies. Am. J. Med.
Genet 48:200-208.
32 Me onPK*,NimmakayaluM,BylappaSK (2015) Acomparisonofin
house Hemoglobin DNA mutation anaysis for β thalassemia by ARMS
PCR with a commercial Line Probe Assay. GMJ, ASM 2015;
4(S2):S77-82. NasrollahSaleh-Gohari,Arezo Khosrav Mashizi (2010)
Spectrumofα- globin gen mutations in the Kerman provine of Iran.
Hemoglobin, 34 (5): 451-460.
33 Molchanova TP, Pobedimskaya DD, Huisman TH (1994) The
differences in quantities of alpha 2 - and alpha 1-globin gene variants
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
in heterozygotes. Br J Haematol ;88:300-306.
34 Mr. Huisman phát THJ, Carver MFH, Baysal E: Một Đề cương của
đột biến Thalassemia. Các hồng cầu hình liềm Thiếu máu Foundation,
Augusta, GA 1997
35 Mutirangura, A., F. Greenberg, M.G. Butler, S. Malcolm, R.D.
Nicholls, A. Chakravarti and D.H. Ledbetter 1993 Multiplex PCR of
three dinucleotide repeats in the Prader-Willi/Angelman critical
region (15q11-q13): molecular diagnosis and mechanism of
uniparental disomy. Hum. Mol.Genet. 2:143-151.
36 O.Henegarui, N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance và P.H. Vogt
Tạp chí BioTechniques 23: 504-511 (tháng 9/1997)
37 Puehringer H, Najmabadi H, Law HY et al. Validation of a reverse-
hybridization StripAssay for the simultaneous analysis of common
alpha-thalassemia point mutations and deletions. Clin Chem Lab Med.
2007 45(5):605-610.
38 S. Cai và F. F. Chehab (1996) "New frameshift mutation, insertion of
A, at codon 95 of the beta-globin gene causes beta-thalassemia in two
Vietnamese families", Hum Mutat. 8(3) tr. 293-4
39 S. Svasti và các cộng sự. (2002) "Molecular analysis of beta-
thalassemia in South Vietnam", Am J Hematol. 71(2) tr. 85-8.
40 Shuber, A.P., J. Skoletsky, R. Stern and B.L. Handelin. 1993 Efficient
12-mutation testing in the CFTR gene: a general model for complex
mutation analysis. Hum. Mol. Genet. 2:153-158.
41 SteinbergM,ForgetB,HiggsD,WeatherallD,etal (2009) Disordersof
hemoglobin: genetics, pathophysiology and clinical management.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Cambridge University Press,323-356.
42 Svasti S. Hieu TM. Munkongdee T. Winichagoon P. Van be T. Van
Binh T. Fucharone S. Molecular analysis of beta thalassemia in South
Viet Nam 2002
43 Syahzuwan Hassan1, Rahimah aHmad1, Zubaidah Zakaria1(2012)
Detection of β-globin Gene MutationsAmong β-thalassaemia Carriers
and Patients in Malaysia: Application of MultiplexAmplification
Refractory Mutation System–Polymerase Chain Reaction. Malays J
Med Sci. Jan-Mar 2013; 20(1): 13-20.
44 Taher AT, Otrock ZK, Uthman tôi, Cappellini MD: Thalassemia và
tăng đông máu.Máu Rev 2008 22: 283-292.
45 Thalassemia International Federation:
[http://www.thalassemia.org.cy] webcite .Guidelines for the clinical
management of thalassemia . 2nd edition 2008
46 Thein S.L (2013) The Molecular Basis of -Thalassemia. Cold Spring
Harb Perspect Med, 3.
47 Vichinsky EP: Thay đổi mô hình của bệnh thiếu máu trên toàn thế giới.
Ann NY Acad Khoa học năm 2005 1054: 18-24
48 Viprakasit V(2013) Alpha thalassemia syndromes: from clinical and
molecular diagnosis to bedside managemnet. Hematology Education
programme: the education programme for annual congress of the
European Hematology Association ; 7: 11-19.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
PHỤC LỤC PHỤ LỤC 1: QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TỪ MÁU NGƯỜI
Nguyên lý
Nguyên lý tách chiết dựa trên nguyên lý sắc ký ái lực. Các đại phân tử trong mẫu sẽ bám vào chất hấp thụ trên cột. Chất hấp thụ này có thể là chất tích điện dương liên kết với các nhóm phosphate tích điện âm trên phân tử hoặc có thể là một trình tự oligo –dT liên kết với đuôi poly – A của các phân tử mRNA của sinh vật eukaryote. Các thành phần tạp nhiễm được loại bỏ bằng cách rửa qua cột. Sau khi rửa sạch, cột bị thay đổi điều kiện khiến cho chúng không còn ái lực với axit nucleic. Cuối cùng acid nucleic được đẩy ra khỏi cột trong một thể tích nhỏ nước tinh khiết hoặc dung dịch đệm
Thiết bị và vật liệu
Thiết bị
- Tủ an toàn sin hhọc cấp 2.
- Máy ly tâm 25000xg
- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml
- Máy ủ nhiệt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
- Máyvortex
- Tủ lạnh 20C - 80C
- Tủ âm sâu (- 200C hoặc - 700C) (nếucó)
- Micropipette
- Bộ lưu điện
Vật liệu
STT Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao Đơn vị Số lượng
Bông 1 kg 0,001
Cồn 2 ml 1,000
Bơm kim tiêm 3 Cái 1,000
Panh 4 Cái 0,0001
Khay đựng bệnh phẩm 5 Cái 0,0001
Hộp vận chuyển bệnh phẩm 6 Test 0,001
Tube đựng bệnh phẩm 7 Cái 2,000
Găng không có bột 8 Cái 0,500
9 Sinh phẩm chẩn đoán Test 1,000
10 Khấu hao sinh phẩm cho chứng và QC
kiểm tra chất lượng, standard các loại Test 1,350
0,02 11 Ngoại kiểm (nếucó)*
12 Kit tách chiết DNA- Qiagen Test 2,350
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
13 Ống Eppendorf 1,5 ml Tube 3,000
14 Ống Eppendorf 0,2 ml Tube 1,000
15 Đầu côn10µl có lọc Cái 1,000
16 Đầu côn 30µl Cái 1,200
17 Đầu côn 200µl có lọc Cái 2,200
18 Đầu côn 1ml có lọc Cái 3,200
19 Ethanol BDH ml 0,500
20 Water-DEPC Treated ml 2,000
21 Giấy thấm Cuộn 0,100
22 Giấy xét nghiệm Tờ 2,000
23 Sổ lưu kết quả xét nghiệm Tờ 0,001
24 Bút viết kính Cái 0,020
25 Bút bi Cái 0,010
26 Mũ Cái 0,020
27 Khẩu trang Cái 0,020
28 Găng tay Đôi 0,100
29 Găng tay xử lý dụng cụ Đôi 0,020
30 Quần áo bảo hộ Bộ 0,005
31 Dung dịch nước rửa tay ml 8,000
32 Cồn sát trùng tay nhanh ml 1,000
33 Dung dịch khử trùng ml 10,000
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
34 Khăn lau tay cái 0,010
Qui trình thực hiện
Thu mẫu và bảo quản mẫu
- 2-3ml máu toàn phần của đối tượng được thu trong ống có chất chống đông
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
máu EDTA.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Tách chiết DNA Bước 1: - Cho 20 μl Protease K vào ống eppendorf . Bổ sung 10μl IC (Note: lượng IC bằng 10% lượng Elution nhé, nếu elution 200μl thì bổ sung 10-20μl IC) - Cho 200μl bệnh phẩm. Cho 200 μl buffer AL vào các tubes (Chú ý: không cho trược tiếp buffer AL vào Protease K, vortex buffer AL trước khi sử dụng) Vortex kỹ trong 15s. - Ủ ở nhiệt độ 56oC trong 10 phút. Sau đó ly tâm nhẹ (spin down) để kéo dung dịch trên nắp ống xuống. Bước 2: - Cho 200μl ethanol (96-100%) vào dung dịch trên. Vortex trong 10 - 15 giây. Sau đó ly tâm nhẹ (spin down) để kéo dung dịch trên nắp ống xuống. - Chuyển toàn bộ hỗn hợp lên cột lọc có chứa ống hứng 2ml. Ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dung dịch trong ống hứng. Bước 3: - Cho 500μl buffer AW1. Ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ phần dung dịch trong ống hứng. - Cho 500μl buffer AW2. Ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 3 phút (hoặc tốc độ tối đa). Bỏ phần dung dịch trong ống hứng. - Ly tâm khô (không cho hóa chất) ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 1 phút (hoặc tốc độ tối đa). Loại bỏ ống hứng chứa dịch, đặt cột lọc vào ống eppendorf mới. Bước 4: - Cho 200μl buffer AVE (nên vortex nhẹ buffer AVE). (Chú ý nhỏ dung dịch thẳng giữa màng lọc nhưng không chạm đầu tip xuống màng lọc). - Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng trong 1 phút. Kiểm tra lại cột lọc xem còn dung dịch chưa xuống hết thì ly tâm lại. Bảo quản mẫu. - Nếu không tiến hành phản ứng PCR ngay trong ngày, bảo quản DNA tách chiết ở 2-8oC trong vòng 2-3 ngày, hoặc ở -20oC trong vòng 6 tháng
PHỤ LỤC 2: QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN GEN BỆNH
ALPHA THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP
1. Bệnh phẩm
2 ml máu toàn phần chống đông EDTA
2. Nguyên lý
Phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) là phản ứng cho phép nhân bản chính xác một
trình tự ADN quan tâm lên hàng triệu lần. Sử dụng phương pháp PCR thông
thường với một cặp mồi đặc trưng chỉ phát hiện được một đột biến. Để phát
hiện nhiều hơn một đột biến sẽ phải làm nhiều xét nghiệm PCR. Có rất nhiều
loại đột biến gây bệnh anpha Thalassemia. Trong trường hợp này sử dụng kỹ
thuật Multiplex PCR là giải pháp tối ưu. Đây là phương pháp sử dụng nhiều
cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR. Như vậy chỉ cần một phản ứng
Multiplex PCR chúng ta đã có thể phát hiện được nhiều đột biến cùng một lúc.
3. Trang thiết bị - hóa chất
Trang thiết bị
Máy PCR và hệ thống máy vi tính
Bộ lưu điện
Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;
Buồng vô trùng (biology cabinet);
Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
Máy vortex;
Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
Đầu côn có màng lọc;
Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -200C;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Găng tay.
Hóa chất
Kit tách ADN thương mại hoặc các hóa chất cần thiết cho tách chiết
thủ công ADN (proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt
đối).
Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi,
nước khử ion vô trùng.
Các mồi đặc hiệu gồm 12 mồi để xác định đồng thời 5 đột biếnmất
đoạn; đồng thời cho biết tính đồng hợp, dị hợp tử đột biến và 1 cặp mồi sử dụng
làm chứng nội kiểm (Internal control).
Mồi Trình tự ( 5’ - 3’)
SEA CF CTC TGT GTT CTC CAG TAT TGG AGG GAA GGA G
SEA NR TGA AGA GCC TGC AGG ACC AGG TCA GTG ACC G
SEA MR ATA TAT GGG TCT GGA AGT GTA TCC CTC CCA
FIL MF AAG AGA ATA AAC CAC CCA ATT TTT AAA TGG GCA
FIL MR GAG ATA ATA ACC TTT ATC TGC CAC ATG TAG CAA
THAI MF CAC GAG TAA AAC ATC AAG TAC ACT CCA GCC
THAI MR TGG ATC TGC ACC TCT TGG GTA GGT TCT CTA CC
α2/3.7 F CCC CTC GCC AAG TCC ACC C
3.7/20.5R AAA GCA CTC TGA GGG TCC AGC G
α2 R AGA CCA GGA AGG GCC GGT G
4.2 R CCC GTT GGA TCT TCT CAT TTC CC
4.2 F GGT TTA CCC ATG TGG TGC CTC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN.
4. Các bước thực hiện của quy trình
Tách chiết ADN
Tách chiết ADN từ máu ngoại vi
Chuẩn bị phản ứng PCR
STT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 pứ
5,5 1 H2O
2 2X GoTaq Green MM 12,5
3 DMSO 1,0
4 Hỗn hợp mồi 5,0
5 DNA 1,0
Tổng thể tích 25,0
Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn
Đặt vào máy PCR
Thực hiện 35 chu kỳ gồm các giai ñoạn duỗi xoắn ở 95oC
Bấm start để máy chạy
Điện di sản phẩm PCR
. Chuẩn bị gel agarose
Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt.
Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X...) vào bình, lắc đều.
Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn.
Để ấm đến 600 rồi đổ vào khay đã cắm lược.
Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.
. Điện di
Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu + 4 µl dH20
Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự
Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Đặt bản gel vào máy điện di
Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút
Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút
5. Nhận định kết quả
Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UVvà các sản phẩm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
điện di từ mẫu có kích thước tương đương với chứng dương.
PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN GEN BỆNH
BETA THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP
1. Nguyên lý
Phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) là phản ứng cho phép nhân bản chính xác một
trình tự ADN quan tâm lên hàng triệu lần. Sử dụng phương pháp PCR thông thường
với một cặp mồi đặc trưng chỉ phát hiện được một đột biến. Để phát hiện nhiều hơn
một đột biến sẽ phải làm nhiều xét nghiệm PCR. Có rất nhiều loại đột biến gây bệnh
Beta Thalassemia. Trong trường hợp này sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR là giải
pháp tối ưu. Đây là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng
PCR. Như vậy chỉ cần một phản ứng Multiplex PCR chúng ta đã có thể phát hiện
được nhiều đột biến cùng một lúc.
2. Phương tiện - hóa chất xét nghiệm
2.1. Phương tiện
Máy PCR và hệ thống máy vi tính
Bộ lưu điện
Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụpảnh;
Buồng vô trùng (biology cabinet);
Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
Máy vortex;
Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
Đầu côn có màng lọc;
Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -200C;
Găng tay.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2.2. Hóa chất
Kit tách ADN thương mại hoặc các hóa chất cần thiết cho tách chiết thủ công
ADN (proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối).
Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước
khử ion vô trùng.
Các mồi đặc hiệu gồm 12 mồi để xác định đồng thời đột biến điểm đồng thời
cho biết tính đồng hợp, dị hợp tử đột biến và 1 cặp mồi sử dụng làm chứng nội kiểm
(Internal control). Theo bảng sau:
Mồi
Trình Tự Mồi (5’- 3’)
5’ β-URR—109 ACCTCACCCTGTGGAGCCAC
3’ βoDEL
GAGTCAAGGCTGAGAGATGCAGGA
5’ βoDEL
CAATGTATCATGCCTCTTTGCACC
IVS I-5 M
CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGTTAG
Cd 17 M
CTCACCACCAACTTCATCCACGTTCAGCTA
Cd 41-42 M
GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAACCT
95M
TCA GGA TCC ACG TGC AGC TTT
Thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN.
Thuốc nhuộm redsafe.
3. Tiến hành quy trình kỹ thuật
3. 1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
3.2. Tiến hành kỹ thuật
Tách chiết ADN
- Xem quy trình “ Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Thực hiện phản ứng Multiplex PCR phát hiện đột biến bệnh beta thalassemia
STT
Sinh phẩm
Thành phần (µl)/1 pứ
1
1,9
H2O
2
2X GoTaq Green MM
7,5
3
Primer 3’ β DEL
1
4
5’ β DEL
1
5
5’ β URR-109
1,5
6
IVS1-5 M
0,5
7
CD95 M
0,3
8
CD17 M
0,2
9
CD41/42 M
0,2
10
DNA
1,0
Tổng thể tích
15 (ul)
+ Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn
+ Đặt vào máy PCR
+ Chọn chu trình nhiệt: 1 chu kỳ : 950C 3 phút
1 chu kỳ: 940C 20 giây
1 chu kỳ: 620C 20 giây
35 chu kỳ: 720C 35 giây
1 chu kỳ: 720C 1 phút
150C mãi mãi
+ Bấm start để máy chạy
Điện di sản phẩm PCR
. Chuẩn bị gel agarose
Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt.
Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X...) vào bình, lắc đều.
Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn.
Để ấm đến 600 rồi nhỏ thuốc nhuộm vào sau đó đổ vào khay đã cắm lược.
Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
. Điện di
. Lấy 6µl sản phẩm PCR nhỏ vào các giếng theo thứ tự
Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp
Đặt bản gel vào máy điện di
Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút
Nhận định kết quả
Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích
thước phù hợp theo lý thuyết.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN Ở BỆNH NHÂN BETA-THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN
Nguyễn Thu Phương1,Bùi Thị Thu Hương1, Nguyễn Thị Kim Cúc2 Mai Anh Tuấn1, Nguyễn Kiều Giang1, Mã Thị Ánh3, Nguyễn Quang Hảo3 Chịu trách nhiệm chính : Bùi Thị Thu Hương, Trường đại học Y Dược Thái Nguyên ĐT: 0912916863 Email: huongbuithithu@tnmc.edu.vn TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: Xác định kiểu đột biến gen gây bệnh - Thalassemia trong nhóm bệnh nhân điều trị thiếu máu tan máu tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 43 mẫu bệnh phẩm máu ngoại vi của các bệnh nhân - thalassemia được sàng lọc đột biến trên gen HBB bằng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR. Kết quả nghiên cứu:15 kiểu tổ hợp gen được phát hiện chia thành 3 nhóm gồm đồng hợp tử 0 thalchiếm 27,9% (gồm 17/17; 41/42/41/42; 71/72/71/72); Dị hợp tử kép 0/0 và0/+ chiếm 60,5% (gồm 17/41/42; 71/72/IVS1.1; 41/42/IVS1.1; 17/cd26; 41/42/cd26; 41/42/-90; 71/72/cd26; -28/IVS2.654);dị hợp tử đơn chiếm 11,6% (gồm 41/42/;71/72/;cd26/;-28/). Đột biến đơn alen CD41/42 chiếm tỷ lệ cao nhất 37,1%, kế tiếp là các alen CD17 22,1% và CD26 (HbE) 19,8%. Từ khoá: Beta -thalassemia, ARMS-PCR, đột biến gen. SUMARY
STUDY OF THE CHARACTERISTICS OF THE GLOBIN GENE MUTATION AMONG ΒETA-THALASSEMIA PATIENTS IN THAINGUYEN GENERAL HOSPITAL
heterozygous accounting single for
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Objectives: To determine the beta-globin genotypes among thalassemia patients in Thai Nguyen National Hospital. Subjects and Methods: 43 whole blood samples of thalassemia patients were screened for mutation by Multiplex ARMS-PCR. Results: 15 genotypes were divided into 3 groups: homozygous 0 thal accounting for 27.9% (include: 17/17;41/42/41/42; 71/72/71/72); Double heterozygous 0/0 và 0/+ accounting for 60.5% (gồm 17/41/42; 71/72/IVS1.1; 41/42/IVS1.1; 17/cd26; 41/42/cd26; 41/42/-90; 71/72/cd26; -28/IVS2.654); 11.6% (41/42/;71/72/;cd26/;-28/). The proportion of single-allels mutation CD 41/42 is the highest, standing at 37.1%, this was follow by the figure for alell CD17 (22,1%) and CD26 (HbE) (19,8%).
Key word: Beta -thalassemia, ARMS-PCR, gene mutation I. ĐẶT VẤN ĐỀ
-28 (AAG-TAG), CD41/42(-TCTT),
Thalassemia là một trong số các bệnh thiếu máu di truyền phổ biến nhất trên thế giới, bệnh liên quan chặt chẽ với nguồn gốc dân tộc, phân bố khắp toàn cầu song có tính địa dư rõ rệt. Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể (NST) thường do đột biến gen hemoglobin beta (HBB) quy định. Vùng gen gây đột biến beta thalassemia nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thế 11 (11p15.5), dài 1600bp, gồm 3 exon và 2 intron. Có khoảng hơn 200 đột biến trên HBB đã được tìm thấy phân thành 2 nhóm: nhóm gây mất hoàn toàn số lượng chuỗi β globin (β0 globin) và nhóm làm giảm số lượng chuỗi β globin (β+ globin)[6]. Các đột biến này phân bố với tỷ lệ khác nhau ở từng vùng địa lý và nhóm dân tộc khác nhau. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu tại miền Trung và miền Nam cho thấy có 8 đột biến gây ra 95% các trường hợp β tha- (A>G), lassemia gồm CD17 CD71/72(+A), IVS1-1(G>T), IVS1-5(G>C), IVS2-654(C>T) và CD26 (GAG>AAG) [9], [10], [8]. Tuy vậy, đặc điểm mang gen thalassemia tại khu vực Đông Bắc trong đó có tỉnh Thái Nguyên còn ít được nghiên cứu. Do tính đặc thù của bệnh thalassemia với yếu tố địa dư và dân tộc, việc nghiên cứu đặc điểm mang gen bệnh là rất cần thiết trong việc xây dựng chiến lược sàng lọc và dự phòng bệnh thalassemia. Trong nghiên cứu kiểu gen đột biến, các xét nghiệm di truyền phân tử cung cấp những thông tin rất quan trọng trong chẩn đoán sớm, điều trị, tiên lượng và dự phòng bệnh. Đặc biệt, xét nghiệm gen còn là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán trước sinh với bệnh beta thalassemia. Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên là bệnh viện tuyến Trung ương duy nhất của 6 tỉnh miền núi Đông Bắc. Hàng năm, bệnh viện đã tiếp nhận hàng trăm lượt bệnh nhân thalassemia vào điều trị truyền máu và thải sắt. Phần lớn các bệnh nhân này là người dân tộc thiểu số ở các tỉnh khu vực miền núi phía Đông Bắc. Từ năm 2017, bệnh viện đã trang bị labo sinh học phân tử, đủ năng lực thực hiện các xét nghiệm xác định đột biến gen trong nhóm bệnh nhân thalassemia. Do đó, chúng tôi đã lần đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử thực hiện đề tài này với mục tiêu: Xác định kiểu đột biến gen gây bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật mutiplex ARMS-PCR. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
43 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh -Thalassemia tại Khoa Huyết học lâm sàng và Khoa Nhi tổng hợp, Bệnh viện đa khoa Trung ương Thái Nguyên. Dựa vào triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình. Tiêu chuẩn lựa chọn: Xét nghiệm điện di huyết sắc tố với tỷ lệ HbA2>3,5%, HbF tăng >5% và/hoặc kèm theo HbE. Khám sàng có hội chứng thiếu máu tan máu mạn tính. 2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Từ tháng 6/2017 đến 4/2018 tại Khoa Miễn dịch – Di truyền
phân tử, Bệnh viện đa khoa Trung ương Thái Nguyên. 3. Phương pháp nghiên cứu 3.1. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang. 3.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu Kỹ thuật tách chiết DNA
+ 3ml máu tĩnh mạch cánh tay của bệnh nhân thalassemia được sử dụng để tách DNA. Kỹ thuật tách DNA dựa trên bộ kit thương mại QiaAmp DNA Mini Kit (Qiagen).
+ Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA được tách chiết bằng phương pháp đo quang trên máy NanoDrop: nồng độ DNA 300-380ng/ml, đánh giá độ tinh sạch bằng tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8. Kỹ thuật phát hiện đột biến gen gây bệnh beta thalassemia
Kỹ thuật mutiplex ARMS-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu alen (của hãng Sigma – Mỹ) được khuyến cáo trong tài liệu của Liên đoàn Thalassemia thế giới để ứng dụng trong nghiên cứu [7], phát hiện 8 dạng đột biến phổ biến trong quần thể người Việt Nam. Quy trình xét nghiệm bao gồm các quy trình đã được Viện Huyết học truyền máu Trung ương chuẩn hóa và chuyển giao kỹ thuật. Nhận định kết quả như sau:
I - Đặc điểm các băng sản phẩm PCR 1. Quy trình 1: Multiplex Control + cd95 + cd41/42 + IVS1-5 + cd17 Nhận xét Nội kiểm cho phản ứng PCR
Sản phẩm Control cd95 cd41/42 IVS1-5 cd17
Kích thước (bp) 861 600 443 285 240
2. Quy trình 2: Multiplex Control + IVS1-1 + cd26 + IVS2-654
Nhận xét Nội kiểm cho phản ứng PCR
Sản phẩm Control IVS2-654 IVS1-1 cd26
Kích thước (bp) 656 829 281 258 3. Quy trình 3: Đột biến -28 + cd71/72
Nhận xét Nội kiểm cho phản ứng PCR
Sản phẩm Control -28 cd71/72
Kích thước (bp) 861 649 238
II - Đọc kết quả beta thalassemia
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Các trường hợp
Nhận xét
+ Dương tính …... (tên đột biến) dị hợp tử
+ Dương tính …... (tên đột biến) đồng hợp tử
1. Dương tính một đột biến dị hợp tử - Có băng control, có 1 băng đột biến và có băng normal tương ứng 2. Dương tính một đột biến đồng hợp tử - Có băng control, có 1 băng đột biến và không có băng normal tương ứng 3. Dương tính nhiều đột biến - Có băng control và các băng đột biến trùng với kích thước tính toán
+ Dương tính …... (tên đột biến), …..(tên đột biến)
Các mẫu không phát hiện được đột biến phổ biến sẽ được gửi tới Viện Huyết học truyền máu Trung ương để thực hiện kỹ thuật giải trình tự gen (phương pháp Sanger) để phát hiện đột biến hiếm gặp. Trong nghiên cứu này 100% các mẫu đều phát hiện đột biến gen. 4. Phương pháp xử lý số liệu
Tần số và tỷ lệ phần trăm (%) được sử dụng cho thống kê mô tả với biến định lượng, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn được dùng cho thống kê mô tả với biến định tính. 5. Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu được Hội đồng xét duyệt đề cương nghiên cứu của Bênh viện thông qua. Đối tượng tham gia hoàn toàn tự nguyện. Thông tin cá nhân của đối tượng được mã hoá. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kiểu đột biến gen gây bệnh Beta - Thalassemia Bảng 1. Phân bố kiểu gen đột biến trên các bệnh nhân - Thalassemia Kiểu gen
Kiểu tổ hợp Kiểu hình
0/0
Đồng hợp tử (n= 12)
0/0
Dị hợp tử kép (n= 26)
0/+
0/
Dị hợp tử đơn (n=5)
Số lượng 3 8 1 5 1 2 8 6 2 1 1 2 1 1
Tỷ lệ % 7,0 18,6 2,3 11,6 2,3 4,7 18,6 14,0 4,7 2,3 2,3 4,7 2,3 2,3
+/
17/17 41/42/41/42 71/72/71/72 17/41/42 71/72/IVS1.1 41/42/IVS1.1 17/cd26 41/42/cd26 71/72/cd26 41/42/-90 -28/IVS2.654 41/42/ 71/72/ cd26/
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
-28/
1 43
2,3 100
Tổng
0 : đột biến trên gen HBB gây mất hoàn toàn chức năng tổng hợp chuỗi globin + : đột biến trên gen HBB gây giảm một phần chức năng tổng hợp chuỗi globin : kiểu gen bình thường
Nhận xét:
41/43 bệnh nhân tham gia nghiên cứu được phát hiện thấy ít nhất một đột biến gen bằng quy trình AMMS-PCR, 2/43 trường hợp phát hiện thêm đột biến hiếm trên alen bằng giải trình tự gen. Có 3 nhóm tổ hợp kiểu gen gồm 5 trường hợp mang kiểu gen dị hợp tử đơn (11,6%), 12 trường hợp mang kiểu gen đồng hợp tử (27,9%) và 26 trường hợp có kiểu gen dị hợp tử kép (60,5%). Trong số dị hợp tử kép, 16 trường hợp cớ sự phối hợp một đột biến - thalassemia với HbE (37,2%). Bảng 2. Đặc điểm phân bố alen đột biến trên các bệnh nhân Alen đột biến Kiểu hình Số lượng Tỷ lệ %
19 22,1 cd17 (A T)
cd 41/42 (-TTCT) 32 37,1 0- Thalassemia cd 71/72 (+A) 6 7,0
3 3,5 IVS 1.1 (G T)
17 19,8 cd 26 (GA) HbE
2 2,3 -28 (A G)
1 1,2 - 90 (C T) +- Thalassemia
1 1,2
5 5,8 IVS 2.654 (C T) Không phát hiện đột biến trên alen.
86 100 Tổng
Nhận xét:
Trong 86 alen của 43 bệnh nhân β - thalassemia, có 6 loại đột biến trong
8 loại alen đột biến trên panel sàng lọc, bao gồm:
- 4 đột biến thuộc nhóm 0 thalassemia (cd17, IVS 1.1, cd 41/42, cd71/72) và 3 đột biến thuộc nhóm + thalassemia (cd26-HbE), -28, IVS 2.654 (C T)). - 1 đột biến hiếm khác ngoài panel sàng lọc là cd -90 được phát hiện bằng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
phương pháp giải trình tự gen.
Trong số các alen đột biến, CD 41/42 (-TTCT) chiếm tỷ lệ cao nhất
(37,1%), kế tiếp là CD17 (A T) chiếm 22,1% và CD26(HbE) là 19,8%. IV. BÀN LUẬN
Bước đầu áp dụng kỹ thuật ARMS PCR cho 43 trường hợp bệnh nhân điều trị -thalassmia tại bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, chúng tôi phát hiện được 15 kiều tổ hợp gen biểu hiện ra ở 3 nhóm kiểu hình trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất là dị hợp tử kép (60,5%) tiếp đến là nhóm đồng hợp tử (27,9%) và dị hợp tử đơn chiếm (11,6%).Trong số các kiểu gen, kiểu đồng hợp tử 41/42/41/42 và dị hợp tử kép 17/cd26 hay - thalassemia - HbE chiếm tỷ lệ cao nhất (18,6%). Điều này là phù hợp với tình trạng mang gen trong khu vực. Theo nghiên cứu của Nguyễn Kiều Giang và cộng sự cho thấy tần xuất đột biến của alen CD41/42, CD17 và CD26 đứng đầu trong nhóm đột biến gây - thalassemia tại khu vực Thái Nguyên [1]. Nghiên cứu khác trong nhóm quần thể tại Việt Nam cũng cho thấy tần xuất CD41/42 đứng đầu với tỷ lệ 35%, tiếp đến là CD17 chiếm 25% [10]. Nghiên cứu của chúng tôi áp dụng kỹ thuật multiplex ARMS PCR cho 8 loại đột biến thông thường và phần lớn phát hiện được tối thiểu 1 đột biến gen trong tất cả các trường hợp. Tuy nhiên có 1 trường hợp chúng tôi chỉ phát hiện được đột biến đơn alen là CD41/42 nhưng kiểu hình trên lâm sàng không tương xứng với tình trạng mang gen. Trường hợp này được gửi đi làm giải trình tự gen với kết quả xác định được đột biến trên alen còn lại là CD-90. Đây là đột biến hiếm gặp trong cộng đồng người Việt Nam và thuộc nhóm + thalassemia, tuy nhiên khi phối hợp với các đột biến 0, + hoặc E đều gây lên hội chứng thalassemia. Kết quả này cho thấy sự hiện diện của các đột biến hiếm gặp và gợi ý cho việc thiết lập thêm bộ mồi cho các đột biến này để sẵn sàng chẩn đoán các trường hợp hiếm bằng kỹ thuật PCR khi chưa được trang bị thêm các phương tiện chẩn đoán khác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Trong 86 alen được khảo sát, alen đột biến CD41/42 chiếm tỷ lệ cao nhất (37,1%) tiếp đến là CD17 (22,1%), các loại đột biến khác chiếm tỷ lệ ít hơn. Có 17 bệnh nhân (19,8 %) được phát hiện mang gen đột biến CD26 (HbE) và các trường hợp này kết hợp với gen β0 hoặc β+ tạo nên bệnh β thalassemia/HbE và các trường hợp β0/βE đều thể hiện tình trạng thiếu máu nặng trên huyết đồ. Kiểu alen CD95 (+A) được phát hiện trong một số nghiên cứu trước đó được xem như là loại đột biến của người Việt Nam. Bạch Quốc Khánh và cộng sự khi nghiên cứu trên 324 bệnh nhân beta thalassemia/HbE cho thấy tỷ lệ kết hợp CD95-CD26 (HbE) là 1,9% còn trong nghiên cứu của Nguyễn Thuỳ Trang là 0,7% [3],[4]. Tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi không phát hiện trường hợp nào mang alen đột biến tại CD95. Có thể do sự phân bố dân tộc trong nhóm bệnh nhân thalassemia tại đây hầu hết là người dân tộc thiểu số trong khi CD95 (+A) chủ yếu được phát hiện trong nhóm người Kinh [5], [10].
Kỹ thuật multiplex PCR cho 8 loại đột biến phổ biến trên gen HBB tại Việt Nam đã chẩn đoán chính xác kiểu gen cho 41/43 trường hợp trẻ bệnh thalassemia điều trị tại Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng về kiểu gen đột biến trong nhóm quần thể nghiên cứu, điều này cho thấy sự cần thiết phải trong việc ứng dụng kỹ thuật kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán. Việc bước có ý nghĩa hỗ trợ thông tin rất cần thiết cho các bác sỹ lâm sàng trong chẩn đoán bệnh, tư vấn di truyền cũng như là bước đệm cho xây dựng quy trình chẩn đoán trước sinh – một quy trình rất quan trọng trong việc dự phòng các trường hợp mắc mới bệnh thalassemia trong quần thể.
V. KẾT LUẬN
- Bước đầu áp dụng thành công kỹ thuật ARMS PCR trong xác định đột biến gen gây bệnh thalassemia cho 43 bệnh nhân điều trị tại khoa Nhi bệnh viện Trung ương Thái Nguyên.
71/72/IVS1.1; 17/41/42; 60,5% chiếm (gồm
15 kiểu tổ hợp gen được phát hiện chia thành 3 nhóm gồm đồng hợp tử 0 thal chiếm 27,9% (gồm 17/17;41/42/41/42; 71/72/71/72); Dị hợp tử kép 0/0 và0/+ 41/42/IVS1.1; 17/cd26;41/42/cd26;41/42/-90;71/72/cd26; -28/IVS2.654); dị hợp tử đơn chiếm 11,6% (gồm 41/42/;71/72/;cd26/;-28/).
Đột biến đơn alen CD41/42 chiếm tỷ lệ cao nhất (37,1%), kế tiếp là các
alen CD17 (22,1%) và CD26 (HbE)(19,8%).
LỜI CẢM ƠN
Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc, Khoa Huyết học lâm sàng, Khoa Nhi,
Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên đã giúp chúng tôi hoàn thành nghiên cứu này.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Kiều Giang, "Thực trạng mang gen bệnh tan máu bẩm sinh ở phụ nữ người dân tộc Tày tại huyện Định Hóa, Tỉnh Thái Nguyên.", Tạp chí Y Học Việt Nam, 2016, 448, tr. 13-20. Vũ Thị Bích Hường, "Cơ sở phân tử của bệnh alpha thalaasemia một số điểm cần lưu ý trong chẩn đoán người mang gen ", Kỷ yếu hội nghị khoa học Thalassemia toàn quốc lần thứ I, 2015, tr. 10-18. Bạch Quốc Khánh, "Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm và đột biến gen ở bệnh nhân beta Thalassemia/HbE", Kỷ yếu hội nghị khoa học Thalassemia toàn quốc lần thứ I, 2015, tr. 150-156. Nguyễn Thị Thùy Trang, "Xác định tỷ lệ một số đột biến phổ biến ở bệnh nhân Thalassemia khám và điều trị tại viện huyết học – truyền máu TW", Tạp chí Y Học Việt Nam, 2014, 10, tr. 355-359. Cai S. và Chehab F. F., "New frameshift mutation, insertion of A, at codon 95 of the beta-globin gene causes beta-thalassemia in two Vietnamese families", Hum Mutat, 1996, 8(3), tr. 293-4. Galanello R. và Origa R., "Beta-thalassemia", Orphanet J Rare Dis, 2010, 5, tr. 5. H. V. Nguyen et al, "Thalassemia and hemoglobinopathies in Thua Thien Hue Province, Central Vietnam", Hemoglobin, 2013, 37(4), tr. 333-42. 8. John Old, Cornelis L., Harteveld Joanne, et al. (2012). Prevention of thalassemia and other haemoglobin disorders, Volume II (2012), Thalassemia International Ferderation, 2nd edition
9.
O'Riordan S. và các cộng sự, "Large scale screening for haemoglobin disorders in southern Vietnam: implications for avoidance and management", Br J Haematol, 2010, 150(3), tr. 359-64.
10. Svasti S. et al, "Molecular analysis of beta-thalassemia in South
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Vietnam", Am J Hematol. , 2002, 71(2), tr. 85-8.
