ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
TRẦN THỊ HOÀNG QUYÊN
CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TỪ LOÀI DÓ ĐẤT (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen)
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
THÁI NGUYÊN - 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
TRẦN THỊ HOÀNG QUYÊN
CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TỪ LOÀI DÓ ĐẤT (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen)
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Bùi Hữu Tài
THÁI NGUYÊN - 2017
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.
Bùi Hữu Tài - Viện Hóa sinh Biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ
Việt Nam đã tin tưởng giao đề tài, định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn
và tạo những điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Em xin chân thành cảm ơn tới TS. Dương Nghĩa Bang, TS. Phạm Thế
Chính cùng các thầy cô khoa Hóa học, Trường Đại Học Khoa Học - Đại Học
Thái Nguyên đã tạo điều kiện , giúp đỡ em trong quá trình triển khai nghiên
cứu thực hiện đề tài.
Em xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các thầy, cô, cán bộ kĩ
thuật viên Viện Hóa sinh Biển - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt
Nam đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn em trong quá trình học tập, thực
nghiệm và thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè lớp
Cao học Khoá 2015 - 2017 đã giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn này.
Tác giả luận văn
a
Trần Thị Hoàng Quyên
LỜI CẢM ƠN .....................................................................................................a
MỤC LỤC .......................................................................................................... b
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... d
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... f
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... g
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 2
1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora và loài B. fungosa subsp indica ....... 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora ....................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật loài B. fungosa subsp indica ..................................... 3
1.2. Một số nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học chi Balanophora ......... 5
1.3. Phương pháp sắc ký trong phân tích, phân lập các hợp chất hữu cơ ....... 10
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng .................................................................................... 11
1.3.2. Sắc ký cột .............................................................................................. 12
1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................................................................... 13
1.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ .......... 15
1.4.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ......... 16
1.4.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều ........... 17
Chương 2. THỰC NGHIỆM ........................................................................... 19
2.1. Nguyên liệu, hóa chất ............................................................................... 19
2.2. Các phương pháp và thiết bị nghiên cứu ................................................. 19
2.2.1. Phương pháp và thiết bị nghiên cứu chiết xuất và phân lập các hợp chất ..... 19
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập .......... 20
2.2.3. Thiết bị phân tích hàm lượng của hợp chất trong mẫu dược liệu ......... 20
2.3. Thu thập và xử lý mẫu loài B. fungosa subsp. indica .............................. 21
2.4. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất lignan từ loài B. fungosa
b
subsp indica ............................................................................................. 21
2.6.1. Chuẩn bị mẫu .................................................................................................. 23
2.6.2. Khảo sát điều kiện phân tích ........................................................................... 23
2.6.3. Xây dựng đường chuẩn và định lượng hợp chất trong dịch chiết tổng ........... 23
2.6.4. Xử lý số liệu .................................................................................................... 24
2.6. Phân tích hàm lượng một số chất phân lập trong mẫu thực vật khô ........ 23
Chương 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................... 25
3.1. Mẫu thực vật ............................................................................................. 25
3.2. Thông số vật lí của một số hợp chất phân lập được từ loài B.
Fungosa subsp indica .............................................................................. 26
3.3. Biện giải cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ loài B.
fungosa subsp. indica .............................................................................. 27
3.4. Phân tích hàm lượng một số hợp chất lignan trong loài B. fungosa
subsp. indica ............................................................................................ 44
KẾT LUẬN ...................................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 52
PHỤ LỤC ............................................................................................................
c
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Balanophora ................................... 3
Hình 1.2. Một số hình ảnh về loài B. fungosa subsp. indica ............................ 4
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất BF1-BF4 từ loài B. fungosa
subsp. indica ............................................................................... 22
Hình 3.1. Một số hình ảnh mẫu thu thập về loài B. fungosa subsp. indica .... 25
Hình 3.2. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF1 .... 27
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF1 ..................................................... 29
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF1 .................................................... 29
Hình 3.5. Phổ DEPT-135 của hợp chất BF1 ................................................... 30
Hình 3.6. Phổ HSQC của hợp chất BF1 ......................................................... 30
Hình 3.7. Phổ HMBC của hợp chất BF1 ........................................................ 31
Hình 3.8. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF2 .... 31
Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF2 ...................................................... 33
Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF2 .................................................. 33
Hình 3.11. Phổ HMQC của hợp chất BF2 ...................................................... 34
Hình 3.12. Phổ HMBC của hợp chất BF2 ...................................................... 34
Hình 3.13. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF3 .... 35
Hình 3.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF3 ................................................... 38
Hình 3.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF3 .................................................. 38
Hình 3.16. Phổ HSQC của hợp chất BF3 ....................................................... 39
Hình 3.17. Phổ HMBC của hợp chất BF3 ...................................................... 39
Hình 3.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF4 .... 40
Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF4 ................................................... 42
Hình 3.20. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF4 .................................................. 42
d
Hình 3.21. Phổ HSQC của hợp chất BF4 ....................................................... 43
Hình 3.22. Phổ HMBC của hợp chất BF4 ...................................................... 43
Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất lignan (BF1-BF4) từ
loài B. fungosa subsp. indica ...................................................... 44
Hình 3.24. Phổ UV của các chất BF1 và BF3 ................................................ 45
Hình 3.25. Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết methanol loài B. fungosa
subsp. indica ở điều kiện lựa chọn phân tích. ............................. 45
Hình 3.26. Đường chuẩn định lượng của hợp chất BF1 ................................. 46
e
Hình 3.27. Đường chuẩn định lượng của hợp chất BF3 ................................. 49
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF1 và hợp chất tham khảo ......... 28
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF2 và hợp chất tham khảo BF1 ........ 32
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo ......... 37
Bảng 3.5. Phân tích HPLC của hợp chất BF1 ở các nồng độ khác nhau ....... 46
Bảng 3.6. Xác định giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định
lượng (LOQ) hợp chất BF1 .......................................................... 47
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của phép phân tích hợp chất BF1 ............ 47
Bảng 3.8. Hàm lượng hợp chất BF1 trong dịch chiết methanol mẫu B.
fungosa subsp. indica .................................................................... 48
Bảng 3.9. Phân tích HPLC của hợp chất BF3 ở các nồng độ khác nhau ....... 48
Bảng 3.10. Xác định giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định
lượng (LOQ) hợp chất BF3 .......................................................... 49
Bảng 3.11. Độ lặp lại và độ thu hồi của phép phân tích hợp chất BF3 .......... 49
Bảng 3.12. Hàm lượng hợp chất BF3 trong dịch chiết methanol mẫu B.
f
fungosa subsp. indica .................................................................... 50
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt
Viết đầy đủ (Tiếng Anh)
Viết đầy đủ (Tiếng Việt)
13C-NMR
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance
1H-NMR
Proton Nuclear Magnetic
Cô ̣ng hưở ng từ ha ̣t nhân cacbon 13 Cô ̣ng hưở ng từ ha ̣t nhân proton
Resonance
Column chromatography
Sắc kí cột
CC
Distortionless Enhancement
Distortionless Enhancement by
DEPT
by Polarisation Transfer Dimethyl sulfoxide
Polarisation Transfer Dimethyl sulfoxide
DMSO
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
DPPH
ESI-MS
Electrospray Ionization Mass
Spectrometry
Ethyl acetate
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Phổ khố i lượng ion hó a phun mù điê ̣n Etyl axetat
Heteronuclear mutiple Bond
Connectivity
HPLC
High-performance liquid
Tương tác di ̣ ha ̣t nhân qua nhiều liên kết Sắc ký lỏng hiệu năng cao
chromatography
HR-ESI-
High Resolution Electrospray
Ionization Mass Spectrometry
MS
Heteronuclear Single-
HSQC
Quantum Coherence
Limit of detection
Phổ khối lượng phân giải cao ion hó a phun mù điện Tương tác di ̣ ha ̣t nhân qua 1 liên kết Giới hạn phát hiện
LOD
Limit of quantitation Reserve phase C-18 Thin layer chromatography Tetramethylsilane
Giới hạn định lượng Chất hấp phụ pha đảo C-18 Sắc ký lớ p mỏ ng Tetramethylsilane
LOQ RP-18 TLC TMS
g
EtOAc HMBC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây thuốc và động vật làm thuốc đã và đang được nhiều dân tộc trên
thế giới sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh khác nhau. Theo thống kê sơ bộ,
ở một số nước châu Á và châu Phi, có tới 80 % dân số phụ thuộc vào y học cổ
truyền trong việc chăm sóc sức khỏe cơ bản. Ở nhiều nước phát triển, từ 70 %
đến 80 % dân số đã sử dụng các cây thuốc hoặc chế phẩm của nó. Các cây
thuốc sử dụng trong dân gian đã dần được chứng minh bởi các nghiên cứu
khoa học. Nó là một trong những cơ sở ban đầu của quá trình nghiên cứu phát
triển thuốc và đã tạo ra nhiều loại thuốc Tây. Trong vài thập kỉ qua, dựa trên
các bài thuốc dân gian, các dược liệu cổ truyền đóng vai trò là nguồn nguyên
liệu cung cấp cho thuốc Tây với hơn 40% tổng các loại thuốc. Hơn nữa việc
nghiên cứu hóa học của các loài cây thuốc có ý nghĩa vô cùng quan trọng
nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng nguồn tài nguyên một cách hiệu
quả nhất, lý giải công dụng ngăn ngừa bệnh đã được sử dụng trong các bài
thuốc dân tộc, và phát hiện các hợp chất thể hiện hoạt tính giúp định hướng
trong bào chế và phát hiện các thuốc mới. Bên cạnh đó, đánh giá hàm lượng
hoạt chất trong dược liệu cũng là một yêu cầu quan trọng nhằm nâng cao giá
trị sử dụng và hiệu quả kinh tế của dược liệu.
Các dược liệu thuộc chi Balanophora (Dó đất) thường được biết đến
với tên gọi ‘Tỏa dương’ hay ‘nấm ngọc cẩu’. Theo kinh nghiệm dân gian,
công dụng của các loài thuộc chi Balanophora chủ yế là bổ dương, kích thích
ăn ngon miệng, phục hồi sức khỏe nhanh …. Một số loài bị săn tìm ráo riết để
phục vụ cho những bài thuốc tăng cường sinh lực nên có thể dẫn đến nguy cơ
cạn kiệt, một số loài nằm trong sách đỏ của Việt Nam. Do đó, việc nghiên cứu
thành phần hóa học và đánh giá hàm lượng hoạt chất của các loài thuộc chi
Balanophora ở nước ta nói chung và loài B. fungosa subsp. indica nói riêng
mang nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn; vừa tạo cơ sở giải thích công dụng
1
dân gian của loài này vừa tạo cơ sở để đánh giá hiệu quả kinh tế của nó.
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora và loài B. fungosa subsp indica
1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora
Chi Balanophora ở nước ta còn được gọi là chi Dó đất. Theo khóa phân loại
thực vật, chi Balanophora có vị trí phân loại như sau :
+ Ngành: Mộc lan - Magnoliophyta
+ Lớp : Hai lá mầm - Magnoliopsida
+ Bộ : Đàn hương - Santalales
+ Họ : Dó đất, Dương đài - Balanophoraceae
+ Chi : Dó đất - Balanophora
Các loài thuộc chi Balanophora thuộc loại thực vật có hoa đặc biệt,
không có diệp lục-sống ký sinh. Các loài này thường sống ký sinh trên rễ của
nhiều loài cây gỗ lớn trong rừng ẩm. Chúng có thân thoái hóa thành một “củ”
nhỏ có kích thước và hình dạng khác nhau. Thân thường gồm nhiều thùy, sần
sùi, màu nâu sẫm, không có lá hay chỉ có lá vẩy, đến khi sinh sản thì cụm hoa
của nó mới lộ ra trên mặt đất. Cụm hoa là một bông nạc. Tùy từng loài, cây
Dó đất hoặc có hoa đơn tính cùng gốc, hoặc khác gốc. Cụm hoa đực thường
dài 10 - 15 cm, gốc trục cụm hoa có một ít lá vẩy. Bao hoa có 4 - 7 thùy, nhị
có bao phấn hình móng ngựa. Cụm hoa cái ngắn hơn, có hình thoi hay hình
trứng dài 5 - 7 cm, mang rất nhiều hoa cực nhỏ, không có bao hoa. Mùa hoa
thường vào tháng 10 đến tháng 2, thụ phấn nhờ côn trùng. Quả nhỏ, khô, dạng
bầu dục dài 0,2 - 0,5 mm.
Trên thế giới, chi Bananophora đã ghi nhận có khoảng 120 loài, phân
bố ở vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới châu Á và châu Úc [1]. Ở Việt Nam,
chi Bananophora có khoảng 7 loài, trong đó một số loài gặp phổ biến như B.
cucphuongensis, B. fungosa subsp indica, B. latisepala, B. laxiflora, và B.
polyandra. Chúng đều là những cây thuốc dân gian ở nước ta. Người dân tộc
2
miền núi thường dùng cụm hoa làm thuốc bổ, có tác dụng mạnh gân cốt, giúp
cơ thể cường tráng, chữa đau bụng, nhức mỏi chân tay. Người dân thương
dùng dưới dạng thuốc sắc nước hoặc ngâm rượu (thái mỏng, sao qua rồi ngâm
rượu) [2].
B. laxiflora B. cucphuongensis
B. fungosa subsp indica B. latisepala
Balanophora polyandra
Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Balanophora
1.1.2. Đặc điểm thực vật loài B. fungosa subsp indica
Loài B. fungosa subsp. indica ở nước ta có một số tên gọi như Dó đất,
3
Xà cô. Cây mọc trong các rừng thường xanh ở độ cao trải rộng từ 500-2.600
m. Loài này sống kí sinh trên rễ của nhiều loại cây thân gỗ, kể cả cả cây gỗ và
dây leo trong họ Nho hay nhiều cây họ Đậu. Mọc phổ biến ở các tỉnh vùng
tây nguyên nước ta. Loài này có thân thoái hóa thành một củ có nhiều dạng
khác nhau, thường gồm nhiều thùy. Củ thường có màu từ vàng cam tới nâu,
bề mặt hơi sần. Hoa thuộc loại đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực dài, trục hoa
ở gốc có một ít lá (dạng vẩy), bao hoa chứa 4-7 thùy, nhị hoa có 4-7 bao phấn.
Cụm hoa cái ngắn, hoa không có bao hoa mà chỉ là những khối hình trứng có
chân và kéo dài bằng một sợi mảnh [3].
4
Hình 1.2. Một số hình ảnh về loài B. fungosa subsp. indica
1.2. Một số nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học chi Balanophora
Các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành phần
hóa học chính của các loài thuộc chi Balanophora là các hợp chất dạng lignan
hay các hợp chất polyphenol có chứa các nhóm caffeoyl, coumaroyl, galloyl,
v/v. Có thể nói, nghiên cứu về thành phần hóa học chi Balanophora bắt đầu
vào giữa những năm 50 của thế kỉ 20, khởi đầu với công bố phân lập một số
hợp chất triterpen từ loài B. japonica [4].
Sau đó, cũng từ loài B. japonica, Mitsumasa và cộng sự đã thông báo phân
lập và xác định được một hợp chất neo-lignan, balanophonin (3), và 10 hợp
chất khác (4-13) thuộc lớp chất lignan và dẫn xuất phenolic acid [5].
Nghiên cứu khác về thành phần hóa học loài B. japonica, Jiang và cộng sự
người Nhật đã phân lập và xác định cấu trúc của 34 hợp chất phenolic (19-52)
có cấu trúc hóa học khá đặc biệt chỉ gồm một đơn vị đường liên kết qua cầu
ester với các phenolic acid khác nhau gồm caffeic acid, coumaroic acid,
5
galloic acid và hexahydroxydiphenoic acid [6].
Tuy chưa có các nghiên cứu về phân tích định lượng, các hợp chất 19-
52 đã sơ phân lập được với hiệu suất 0.0012- 0.7069% (các hợp chất 19, 20,
22, 24-27) so với khối lượng mẫu khô từ phần dưới mặt đất và hiệu suất
0.0014-0.2231% (các hợp chất 19-21, 23, 28-52) từ phần trên mặt đất loài B.
japonica [6].
Tiếp đó, Jiang và cộng sự tiếp tục công bố ba hợp chất,
balanophotannins A-C (53-55), các lignan glycoside (56-59);
balanophotannins D-G (60-63) từ loài B. japonica [7, 8]. Các kết quả đánh
giá hoạt tính gây độc tế bào đã phát hiện hợp chất balanophotannin E diệt tế
6
bào ung thư gan tốt nhất, với giá trị IC50 là 4.22 µM [8].
Trong thí nghiệm về sàng lọc hoạt tính chống oxi hóa (theo phương
pháp DPPH) của các dịch chiết từ các cây thuốc truyền thống, Wang và cộng
sự đã phát hiện dịch chiết 80% acetone từ loài B. polyandra thể hiện khả năng
thu dọn gốc tự do mạnh. Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài này đã
phân lập được 2 hợp chất, balapolyphorins A-B (64-65), cùng với 20 hợp chất
dạng lignan hoặc phenolic (9, 20, 35, 37, 41, 42, 50-52, 54, 57, 66-74). Các
hợp chất này cũng đã được đánh giá hoạt tính DPPH, hầu hết các hợp chất
đều thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do với giá trị thu dọn 50% số lượng gốc
7
tự do DPPH (SC50) từ 8.4-68.3 µM [9].
Từ hoa loài Balanophora laxiflora, Ho và cộng sự đã tiến hành nghiên
cứu các thành phần chống oxi hóa bằng hệ thống HPLC kết hợp DPPH. Trong
số các hợp chất phát hiện được, 5 hợp chất bao gồm: caffeic acid (6), 1-O-(E)-
caffeoyl-β-D-glucopyranose (20), 1-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranose
(19), 1-O-(E)-caffeoyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose
(46), và 1,3-di-O-galloyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose
(52) được xác định là thành phần chống oxi hóa chính của loài này [10]. Một
nghiên cứu khác của She cũng về tác dụng chống oxi hóa đã phân lập và xác
định cấu trúc của 2 hợp chất, balaxiflorins A- B (75, 76) cùng 17 hợp chất
phenolic khác (6, 20, 35, 37, 41, 48, 49, 52, 58, 68, 70, 71, 74, 77-80) [11].
Các hợp chất phenolic có chứa nhóm galloyl, cafeoyl, và (S)-
hexahydroxydiphenoyl (81-89) cũng được phát hiện thấy có trong thành phần
8
hóa học của loài B. tobiracola [12].
Từ loài B. harlandii, Wang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc
của hợp chất, 1-O-[(E)-p-coumaroyl]-3-O-galloyl-β-D-glucopyranose (90) và
18 hợp chất (7, 20, 30, 37, 42, 68, 71, 81-83, 86, 87, 91-96). Các hợp chất này
đã được đánh giá hoạt tính chống oxi hóa DPPH, kết quả cho thấy một số hợp
chất mang khung dihydrochalcone và tannin thể hiện hoạt tính tốt nhất với
giá trị SC50 trong khoảng 8.2-16.2 µM [13].
Từ loài B. involucrata, Luo và cộng sự phân lập được ba hợp chất
phenolic đã biết (11, 71, 72) [14]. Một nghiên cứu khác về thành phần hóa học
9
loài B. papuana của các nhà khoa học Nhật Bản, Hosoya và cộng sự đã phân lập
được 2 hợp chất khác có khung dihydrochalcone, papuabalanols A-B (97, 98).
Các hợp chất này đã được đánh giá hoạt tính hạ huyết áp và ức chế enzyme
tyrosinase [15]. Kết quả cho thấy, hợp chất 97 (100 µM) phát hiện có tác dụng
làm giãn mạch trong khi hợp chất 98 lại có tác dụng ức chế hoạt động của enzym
tyrosinase (33-79%) ở các nồng độ thử nghiệm 12.5, 25, và 50 µM.
Từ kết quả tổng quan các nghiên cứu trên, có thể nhận thấy các nghiên
cứu chủ yếu xuất phát từ các nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản và
Trung Quốc. Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Balanophora chủ yếu
là các hợp chất dạng ligan hoặc các phenolic có chứa các nhóm galloyl,
caffeoyl, và hexahydroxydiphenoyl. Tuy vậy, cho đến nay gần như chưa có
nghiên cứu về hóa học loài B. fungosa subsp. indica.
1.3. Phương pháp sắc ký trong phân tích, phân lập các hợp chất hữu cơ
Phương pháp sắc ký là một trong những phương pháp phổ biến và hữu
hiệu sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên
nhiên nói riêng. Cơ sở của phương pháp sắc ký dựa trên sự khác nhau về bản
chất hấp phụ và phân bố của các chất giữa hai pha: pha tĩnh và pha động. Tùy
theo bản chất của pha tĩnh hoặc pha động hay dựa trên cách thức triển khai
sắc ký mà người ta phân loại thành các phương pháp sắc ký khác nhau như
sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký điện di, sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc
ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký cột trọng lực, sắc ký cột trung áp,
10
sắc ký cột cao áp.... Tùy theo mục đích nghiên cứu và đối tượng cần phân lập
người ta lựa chọn những phương pháp sắc ký phù hợp. Thông thường để phân
lập một hợp chất cần có sự kết hợp của các phương pháp sắc ký khác nhau và
thường thấy là sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột trọng lực. Trong khi đó, để phân
tích định tính hay định lượng của một hợp chất trong thuốc, dược liệu thì cần
đến phương pháp sắc ký hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC),
HPLC gắn khối phổ.
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) hay còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu
vào hiện tượng hấp phụ của chất phân tích lên chất hấp phụ. SKLM thường
được sử dụng trong phân tích định tính hay sử dụng làm chỉ thị cho sắc ký
cột. Trong SKLM pha động sử dụng là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung
môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ (thường gặp
là: silica gel hay nhôm oxit). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều,
phủ lên nền phẳng như tấm kính hay tấm nhôm. Do chất hấp phụ được tráng
thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng và
tấm kính/nhôm tráng chất hấp phụ gọi là bản mỏng.
Chất phân tích được hòa tan trong dung môi dễ bay hơi và đưa lên bản
mỏng thành một điểm gọn nhờ một mao quản (capillary) và sấy đuổi dung
môi. Tùy theo mục đích nghiên cứu mà lượng chất phân tích đưa lên bản
mỏng là khác nhau.
SKLM được triển khai trong một bình sắc ký bằng thủy tinh, hình dạng
đa dạng, có nắp đậy và bão hòa pha động. Pha động di chuyển chầm chậm
dọc theo bản mỏng, và lôi kéo mẫu chất phân tích đi theo nó. Tùy theo khả
năng hấp phụ-giải hấp phụ của mỗi chất mà chúng sẽ di chuyển với vận tốc
khác nhau và quãng đường khác nhau trên bản mỏng.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích trên bản
mỏng là hệ số di chuyển Rf. Hệ số này được tính bằng tỉ lệ giữa khoảng dịch
11
chuyển của chất phân tích và khoảng dịch chuyển của pha động trên bản
mỏng. Do vậy Rf sẽ có giá trị từ 0 đến 1 và mỗi hợp chất sẽ có một giá trị Rf
xác định đối với một hệ dung môi.
Dấu vết của các chất phân tích trên bản mỏng sau khi triển khai có thể
được quan sát bằng mắt thường (dựa trên màu sắc của chất phân tích) hay
hiện hình nhờ tia tử ngoại (thông thường sử dụng tia tử ngoại với bước sóng
254 và/hoặc 365 nm), hay bằng các phản ứng hóa học bằng cách phun các
dung dịch thuốc thử khác nhau tùy theo bản chất của chất phân tích. Chẳng
hạn ninhydrin phát hiện amino acid hay amin; 2,4-dinitrophenylhydrazin phát
hiện aldehyde hay ketone, Dragendorff phát hiện các hợp chất alkaloid… Với
các hợp chất hữu cơ thông thường có thể dùng dung dịch acid H2SO4 loãng
(khoảng 10%) và hơ nóng để phát hiện các vết chất trên bản mỏng.
SKLM có một số ưu điểm như chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân
tích, thực hiện dễ dàng cho kết quả nhanh với độ chính xác cao, có thể phân
tích đồng thời mẫu phân tích và chất chuẩn đối chứng. Tuy nhiên, SKLM chỉ
hiệu quả trong việc phân tích, định tính các hợp chất khó có tính khả thi trong
phân lập lượng lớn các hợp chất. Và do đó, người ta sử dụng SKLM chủ yếu
cho mục đích phân tích định tính hay sử dụng làm chỉ thị cho sắc ký cột để
phân lập các hợp chất hữu cơ.
1.3.2. Sắc ký cột
Sắc kí cột là phương pháp sắc ký phổ biến, đơn giản, và hay sử dụng
nhất trong phân lập các hợp chất hữu cơ từ nguồn tự nhiên. Trong sắc ký cột,
pha tĩnh được nạp trên các cột thủy tinh, pha động đi qua cột ở điều kiện áp
suất khí quyển nhờ lực hút của Trái đất do đó còn được gọi là sắc ký cột trọng
lực, sắc ký cột hở. Đồng thời pha tĩnh phải là các hạt có kích thước đủ lớn để
pha động có thể đi qua dễ dàng nhờ trọng lực. Thông thường kích thước hạt
trung bình từ 50-150 µM. Với chất hấp phụ silica gel, kích thước cỡ hạt trung
bình (40-63 µM) thường được sử dụng để phân lập các hợp chất tự nhiên. Pha
tĩnh được nạp lên cột sắc ký theo hai phương pháp khác nhau là nạp ướt và
12
nạp khô.
Trong phương pháp nạp khô, chất hấp phụ được đưa riêng lẻ, từ từ lên cột, gõ nhẹ cho chất hấp phụ phân bố đều lên cột và ổn định cột bằng pha động trước khi triển khai.
Ở phương pháp nạp ướt, chất hấp phụ được tẩm ướt hoàn toàn trong pha động. Hỗn dịch gồm pha động và pha tĩnh sau đó được đưa lên cột sắc ký và liên tục cho pha động chảy qua cột để ổn định cột sắc ký.
Hỗn hợp chất cần phân lập được đưa lên đầu cột, phía trên pha tĩnh. Thông thường, trước khi đưa hỗn hợp chất phân tích lên cột sắc ký, hỗn hợp này được trộn đều với chất hấp phụ theo phương pháp tẩm ướt (với chất hấp phụ là silica gel) hay đưa trực tiếp lên cột bằng cách hòa tan hoàn toàn trong thể tích tối thiểu pha động (với chất hấp phụ là pha đảo)
Hợp chất cần phân lập sau đó được rửa giải từ từ ra khỏi cột sắc ký bằng pha động. Quá trình các hợp chất rửa giải ra khỏi cột sắc ký được theo dõi bằng phân tích SKLM.
Quá trình sắc ký cột có thể được tiến hành lặp lại với các pha động khác nhau, hay kết hợp vơi các phương pháp khác đến khi thu được hợp chất có độ tinh khiết mong muốn.
1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography, HPLC) là một dạng của sắc ký cột trong đó các hợp chất cần phân tích được rửa giải trên cột sắc ký bằng pha động là dung môi/hệ dung môi được bơm ở áp suất cao. Pha tĩnh là các chất hấp phụ có cỡ hạt nhỏ khoảng 5-10 µm, thường gặp là chất hấp phụ pha đảo octadecylsilane (ODS). a) Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hình 1.3. Mô phỏng của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
13
Một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao thường gồm các phần chính sau: các bình cấp dung môi (pha động), các van và buồng trộn dung môi, bơm cao áp, hệ thống tiêm mẫu phân tích, cột sắc ký (pha tĩnh), bộ phận phát hiện (detector), máy tính (điều khiển, đọc, xuất tín hiệu dưới dạng các sắc ký đồ).
- Bình cấp dung môi: chứa các dung môi sử dụng làm pha động của
phép phân tích sắc ký.
- Các van chia và buồng trộn dung môi: chia dung môi từ các bình chứa
với tỉ lệ xác định và trộn đều thành một hệ dung môi pha động đồng nhất.
- Các bơm cao áp: bơm pha động qua cột sắc ký với tốc độ dòng nhất định. - Hệ thống tiêm mẫu phân tích: có thể là tiêm mẫu tự động hoặc tiêm
mẫu bằng tay, đưa các mẫu phân tích lên cột sắc ký.
- Cột sắc ký: phân tách các chất phân tích, thường là các cột sắc ký đã nhồi sẵn chất hấp phụ. Tùy theo mục đích phân tích mà sử dụng các loại cột có kích thước hoặc chất hấp phụ khác nhau.
- Bộ phận phát hiện (Detector): theo dõi quá trình phân tách của các chất phân tích trên cột sắc ký. Thường gặp là các detector UV, hoạt động dựa trên độ hấp thụ của các hợp chất phân tích ở các bước sóng UV xác định (200-400 nm) theo định luật hấp thụ Lambert-Beer. Detector có thể là loại phát hiện với một bước sóng xác định (fixed-wavelength detector) hay là phát hiện đồng thời ở nhiều bước sóng hoặc một dải sóng (multiple-wavelength detector) thường được biết đến với tên gọi Photodiode array detector (PDA) hay diode array detector (DAD).
- Hệ thống máy tính điều khiển: Điều khiển, đặt chương trình (hệ dung môi, tốc độ dòng pha động, thời gian phân tích, hoạt động của detector) cho quá trình phân tách, theo dõi quá trình sắc ký dưới dạng các sắc đồ.
14
b) Một số khái niệm quan trọng của sắc ký lỏng hiệu năng cao - Pha động: là dung môi dùng để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột sắc ký. Pha động có thể là một dung môi, một hỗn hợp dung môi trộn theo một tỉ lệ xác định theo thời gian (đẳng dòng-isocratic) hay tỉ lệ thay đổi theo thời gian (gradient). Với mỗi hỗn hợp chất phân tích sẽ có các hệ pha động riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất. Pha động là một trong những yếu tố quyết định đến hiệu suất tách của một hỗn hợp mẫu, ảnh hưởng đến
thời gian lưu, độ phân giải, độ rộng, và sự cân đối của pic sắc ký. Yêu cầu đối với một pha động là:
+ Phải trơ đỗi với pha tĩnh + Hòa tan được chất cần phân tích + Bền vững theo thời gian + Có độ tinh khiết cao + Nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký + Phù hợp với loại detertor dùng để phát hiện chất phân tích + Cho các pic sắc đồ có tính đối xứng cao. + Có tính kinh tế. - Thời gian lưu (tR): là thời gian cần thiết để một phân tử cần thiết rửa giải ra khỏi cột sắc kí. Nó có thể được tính bằng từ lúc tiêm mẫu vào cột tới khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại được phát hiện bởi detector. Tùy theo tích chất lý hóa của phân tử mà mỗi phân tử lại có một thời gian lưu khác nhau, và các giá trị này là hằng số trong cùng một điều kiện phân tích. Do đó, giá trị thời gian lưu chính là một đại lượng để định tính các hợp chất phân tích.
- Độ phân giải (RS): là đại lượng biểu thị mức độ phân tách của các chất ra khỏi nhau trong một điều kiện phân tích. Độ phân giải của 2 chất có thể được tính bằng tỉ lệ của hiệu số thời gian lưu với độ rộng trung bình đáy píc chất phân tích đo ở khoảng cách 1/20 chiều cao của pic chất.
- Hệ số đối xứng (T): là đại lượng biểu thị mực độ cân đối của pic chất phân tích trên sắc ký đồ. Nó được tính bằng một nửa của tỉ lệ giữa độ rộng của đáy pic và độ rộng nửa trước của đáy pic đo tại 1/20 chiều cao pic chất trên sắc ký đồ.
1.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ
15
Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ có thể được xác định nhờ vào các tính chất lý hóa đặc trưng của chúng. Cách xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ hiện nay phổ biến là phân tích kết hợp một hay nhiều phương pháp phổ như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng, nhiễu xạ tia X (X-Ray), …, hay tiến hành các chuyển hóa hóa học. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người
ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì càng yêu cầu phân tích kết hợp nhiều các phương pháp phân tích khác nhau. Với các hợp chất có hấp thụ UV, phân tích phổ UV cho phép dự đoán về sự xuất hiện của các nhóm mang màu, khung carbon của hợp chất phân tích. Trong khi đó phổ IR lại cho các tín hiệu dao động của các nhóm chức, từ đó cho phép xác định sự có mặt của các nhóm chức này trong cấu trúc hóa học của hợp chất phân tích. Với các hợp chất có cấu trúc hóa học mới hoặc khó xác định được công thức phân tử thì phổ khối lượng (đặc biệt là phổ khối lượng phân giải cao) và phương pháp phân tích nguyên tố là những phương pháp cần thiết ban đầu cho phép xác định chính xác công thức phân tử của hợp chất cần phân tích. Trong trường hợp các hợp chất có cấu trúc lập thể bất đối xứng thì nhiều trường hợp cần thiết phải phân tích phổ X-Ray hay phổ lưỡng sắc tròn (CD) để xác định chính xác cấu trúc tuyệt đối, phân bố trong không gian của các hợp chất này. Trong các phép phân tích phổ để xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất hữu cơ thì phổ NMR được sử dụng phổ biến và là một trong những phép phân tích đòi hỏi cho việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. Các kỹ thuật phân tích NMR được chia thành hai loại chính là phân tích NMR một chiều và hai chiều.
1.4.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều
Phân tích NMR một chiều hay gặp bao gồm phân tích cộng hưởng từ
hạt nhân proton (1H-NMR), cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR),
và các kỹ thuật phân tích DEPT như DEPT-45, DEPT-90, DEPT-135.
- Phổ 1H-NMR: cho biết tín hiệu cộng hưởng của các proton có trong
phân tử hợp chất cần phân tích. Dựa vào bản chất liên kết giữa proton với
nguyên tử khác hay ảnh hưởng bởi các nguyên tử, nhóm nguyên tử gần cạnh
mà các proton cho các tín hiệu có độ chuyển dịch hóa học và sự phân tách
hình dạng tín hiệu khác nhau. Độ chuyển dịch hóa học của các proton được so
với hợp chất chuẩn nội TMS và thường nằm trong khoảng thang chia 0-14
ppm. Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu cộng hưởng của một proton được phân tách
16
theo quy tắc N+1 trong đó N là số lượng các proton tương đương về tính chất
từ ở gần cạnh nó. Mỗi dạng phân tách cho một tên gọi của tín hiệu khác nhau
như singlet (s, tín hiệu đơn), douplet (d, tín hiệu đôi, tỉ lệ chiều cao mỗi tín
hiệu phân tách 1:1), triplet (t, tín hiệu ba, tỉ lệ chiều cao mỗi tín hiệu phân
tách 1:2:1), quartet (q, tín hiệu bốn, tỉ lệ chiều cao mỗi tín hiệu phân tách
1:3:3:1), multiplet (m, tín hiệu đa). Trong khi đó, tỉ lệ diện tích các tín hiệu
cho biết tương quan về tỉ lệ số proton tương ứng với tín hiệu đó.
- Phổ 13C-NMR: cho biết số nguyên tử carbon trong phân tử của chất
phân tích. Tương tự như phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR nhận được các tín hiệu
cộng hưởng của carbon với các giá trị độ chuyển dịch hóa học khác nhau
nhưng với biên độ rộng hơn. Thông thường các tín hiệu của carbon xuất hiện
trong thang chia từ 0 tới 230 ppm. Số lượng tín hiệu nhận được trên phổ
carbon sẽ tương ứng với số lượng nguyên tử carbon không tương đương về
tính chất từ có trong phân tử chất phân tích.
- Phổ DEPT: cho phép phân loại các tín hiệu trên phổ carbon thành các
nhóm carbon khác nhau bao gồm: carbon không liên kết trực tiếp với hydro,
nhóm CH, nhóm CH2, và nhóm CH3. Để phân loại được các tín hiệu này cần
sử dụng kết hợp một số kỹ thuật phân tích DEPT khác nhau, tối thiểu là kết
hợp giữa DEPT-90 với DEPT-135 và 13C-NMR. Trên phổ DEPT135 sẽ vắng
mặt tín hiệu của carbon không liên kết trực tiếp với hydro, các tín hiệu của
CH2 có hướng về phía dưới và các tín hiệu của CH cùng với CH3 có hướng
lên trên. Trong khi đó phổ DEPT90 chỉ nhận được các tín hiệu của CH. Từ đó
cho phép phân loại được các dạng tín hiệu carbon khác nhau.
1.4.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Kỹ thuật phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều cho phép xác
định mối liên hệ giữa các proton với proton (phổ hai chiều tương tác đồng hạt
nhân), proton với carbon (phổ hai chiều tương tác dị hạt nhân) trong phân tử
hợp chất phân tích. Các kỹ thuật phân tích phổ hai chiều thường gặp là COSY
17
(tương tác đồng hạt nhân proton theo mạch liên kết), NOESY (tương tác đồng
hạt nhân theo phân bố trong không gian), HSQC (tương tác dị hạt nhân qua
một liên kết), HMBC (tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết).
- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): cho biết các tương tác trực tiếp H-C. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, trục còn lại là 13C-NMR. Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ nối giữa hai trục là tín hiệu 1H và 13C-NMR.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần cấu trúc của phân tử cũng như toàn phân tử được xây dựng và gép nối với nhau.
- Phổ 1H-1H COSY (1H-1H Corelation Spectroscopy): phổ này biểu diễn tương tác H-H theo mạch liên kết, chủ yếu là các proton đính trên cùng một nguyên tử carbon hoặc với nguyên tử cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các khung cơ sở/mảnh cấu trúc cơ sở của chất phân tích có thể được thiết lập.
18
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử. Ngoài ra, người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE một chiều để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Các proton có cùng phía cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiểu phổ với cường độ mạnh hơn bằng vệc đưa chúng vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định.
Chương 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên liệu, hóa chất
+ Mẫu dược liệu: cả cây loài B. fungosa subsp indica đã sấy khô,
nghiền nhỏ.
+ Dung môi hữu cơ thông thường: n-hexane, chloroform (có thể thay
thế bằng dichloromethane), EtOAc, methanol.
+ Dung môi sử dụng cho phân tích HPLC: acetonitrile, methanol, nước.
+ Dung môi đo NMR: CD3OD, CDCl3, DMSO-d6
+ Bản mỏng pha thường/pha đảo
+ Silica gel pha thường/pha đảo
+ Chất hấp phụ khác: sephadex LH-20, diaion HP-20
+ Các loại cột sắc ký: thủy tinh.
2.2. Các phương pháp và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp và thiết bị nghiên cứu chiết xuất và phân lập các hợp chất
+ Sử dụng phương pháp chiết: chiết siêu âm, chiết lỏng-lỏng để tạo
dịch chiết và các phân đoạn chiết.
+ Sắc ký lớp mỏng (SKLM): được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn
DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Các vệt chất được
phát hiện bằng soi dưới đèn UV (254, 365 nm), hiện màu với FeCl3 5%, hoặc
dung dịch H2SO4 10% và hơ nóng.
+ Sắc ký lớp mỏng điều chế: thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica
gel 60 F254 (Merck, ký hiệu 105875). Quan sát vùng chất di chuyển trên bản
bằng đèn UV (254 nm) và cắt dìa bản mỏng rồi hiện màu bằng dung dịch
H2SO4 10% và hơ nóng để xác định vùng bản mỏng chứa chất phân lập. Tách
19
phần silica gel chứa chất phân lập ra khỏi đế kính và giải hấp bằng methanol.
+ Sắc ký cột: tiến hành với chất hấp phụ là silica gel và pha đảo. Silica
gel có cỡ hạt là 40-63 µm (240-430 mesh). Pha đảo sử dụng loại silica gel C-
18 (RP-18) có cỡ hạt 75 - 150 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Sắc ký cột
được triển khai trên các cột sắc ký thủy tinh, ở áp suất khí quyển. Dung môi
rửa giải được hứng tự động trên máy hứng phân đoạn Eyela DC-1200
Fraction collector. Quá trình phân tách các hợp chất trên cột sắc ký được theo
dõi bằng SKLM
+ Dung môi được cất loại hoặc thu hồi trên hệ thông máy cấy quay
chân không.
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập
+ Độ quay cực đo trên máy Jasco P-2000 Polarimeter
1100 LC-MSD Trap.
+ Phổ khối lượng phân giải thấp ESI-MS được đo trên máy AGILENT
+ Phổ cộng hưởng từ nhân một chiều (1D) 1H-NMR, 13C-NMR,
DEPT, hai chiều (2D) HMQC, HMBC... được đo trên máy Varian 400 MHz
Spectrometer. Các hợp chất được pha trong dung môi đo NMR thích hợp (hòa
tan được chất phân tích, tương tự với tài liệu tham khảo, cho các pic phổ ít bị
chồng lấp...)
+ Phổ lưỡng sắc tròn (CD) được đo trên máy Chirascan.
2.2.3. Thiết bị phân tích hàm lượng của hợp chất trong mẫu dược liệu
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1290 Infinity bao gồm:
- Bơm mẫu cao áp 4 kênh dung môi
- Tiêm mẫu tự động
- Cột sắc ký Hydrosphere C18, kích thước cột 150×4.6 mm, kích thước
hạt 5 µm
- Detertor: phát hiện đa bước sóng DAD.
20
- Máy tính và phần mềm điều khiển Openlab.
2.3. Thu thập và xử lý mẫu loài B. fungosa subsp. indica
Mẫu nghiên cứu được thu thập và xử lý theo phương pháp thường quy
sử dụng trong phân lập các hợp chất tự nhiên từ nguồn dược liệu thực vật.
- Mẫu thực vật được thu thập và giám định tên khoa học và làm tiêu
bản bởi các nhà thực vật học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Mẫu thực vật sau khi thu thập được rửa sạch, cắt thành lát mỏng và sấy
khô ở 500C, nghiền nhỏ, và bảo quản trong phòng lưu mẫu đến khi nghiên cứu.
2.4. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất lignan từ loài B. fungosa
subsp indica
Mẫu nghiên cứu (3.5 kg) được chiết với 5L methanol ở 40°C trong bể
siêu âm (30 phút) rồi lọc lấy dịch methanol. Quá trình chiết được thực hiện
lặp lại 3 lần, các dịch methanol được gộp lại và cất thu hồi dung môi trên máy
cất quay chân không thu được cặn chiết methanol (300 g). Cặn chiết methanol
được tạo huyền phù với 2L nước cất sau đó chiết lỏng-lỏng lần lượt với các
dung môi dichloromethane và EtOAC. Cất thu hồi dung môi trên máy cất
quay chân không lần lượt thu được các cặn chiết tương ứng dichloromethane
(60 g), EtOAc (104 g), và lớp nước (136 g). Phân đoạn ethyl acetate được tẩm
đều với silica gel và tiến hành chạy sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ silica gel,
rửa giải với hệ dung môi dichloromethane-methanol tăng dần thể tích
methanol (0-100% methanol) thu được 8 phân đoạn, ký hiệu BF1A-BF1H.
Phân đoạn BF1B tiếp tục được tinh chế trên cột sắc ký sửa dụng chất hập phụ
silical gel, rửa giải với hệ dung môi dichloromethane/methanol/nước
(7/1/0,05, v/v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu BF2A-BF2C. Hợp
chất BF1 (250 mg) được phân lập từ phân đoạn BF2B sau khi tiến hành liên
tiếp sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ sephadex LH-20 rửa giải với hệ dung
môi methanol/nước (1/1, v/v) và chất hấp phụ pha đảo RP-18 rửa giải với hệ
21
dung môi methanol/nước (2/3, v/v). Phân đoạn BF1E được đưa lên cột sắc ký
với pha tĩnh là silica gel và pha động là hệ dung môi dichloromethane
/methanol/nước (6/1/0.1, v/v/v) thu được bốn phân đoạn ký hiệu BF3A-
BF3D. Tinh chế phân đoạn BF3B trên cột sắc ký pha đảo RP-18 và rửa giải
với hệ dung môi methanol/nước (2/3, v/v) thu được hợp chất BF3 (186 mg).
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất BF1-BF4 từ loài B. fungosa subsp. indica
Từ phân đoạn BF3C, tiến hành sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ pha đảo
RP-18 và rửa giải với hệ dung môi acetone/nước (1/2, v/v) thu được hợp chất
BF2 (14 mg). Tiếp đó, phân đoạn BF1F cũng được đưa lên cột sắc ký với chất
hấp phụ silica gel và rửa giải với hệ dung môi ethyl acetate/methanol/nước
(8/1/0.05, v/v/v) nhận được hai phân đoạn BF4A và BF4B. Phân đoạn BF4B
trước tiên được tinh chế trên cột sắc ký lọc gel sephadex LH-20 rửa giải với
hệ dung môi methanol/nước (1/1, v/v) sau đó tiếp tục tinh chế trên cột sắc ký
22
với chất hấp phụ pha đảo RP-18 và rửa giải với hệ dung môi methanol/nước
(1/2, v/v) để thu được hợp chất BF4 (109 mg). Các hợp chất BF1-BF4 sau khi
phân lập được tiến hành phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân để phân tích
cấu trúc hóa học của chúng.
2.6. Phân tích hàm lượng một số chất phân lập trong mẫu thực vật khô
2.6.1. Chuẩn bị mẫu
- Chuẩn bị mẫu dịch chiết:
Cân chính xác 20 g mẫu thực vật khô, chiết siêu âm với methanol ở
400C (chiết ba lần, mỗi lần 300 ml trong 2h). Lọc lấy dịch chiết, loại dung
môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết methanol. Cân chính xác lượng dịch
chiết thu được và hòa tan trong methanol đến nồng độ 5 mg/ml dung dịch
mẫu dịch chiết tổng. Dung dịch tổng tiếp tục được lọc qua màng lọc 0.45 µm
trước khi phân tích HPLC.
- Chuẩn bị mẫu chuẩn:
Cân lượng chính xác các mẫu chất chuẩn, và pha trong methanol đến
nồng độ 62.5, 125, 250, 500, và 1000 µg/mL. Các dung dịch mẫu chuẩn cũng
được lọc qua màng lọc 0.45 µm trước khi phân tích HPLC.
2.6.2. Khảo sát điều kiện phân tích
Mẫu chuẩn ở nồng độ 500 µg/mL, và mẫu dịch chiết tổng được tiến
hành phân tích HPLC ở các điều kiện pha động khác nhau. Điều kiện cho pic
sắc ký ứng với chất chuẩn có hiệu quả phân tách tốt trên sắc ký đồ được sử
dụng cho phân tích định lượng các hợp chất.
2.6.3. Xây dựng đường chuẩn và định lượng hợp chất trong dịch chiết tổng
- Tiến hành phân tích HPLC các dung dịch mẫu chuẩn ở điều kiện sắc
ký đã lựa chọn. Từ sắc ký đồ, lựa chọn các pic chất chuẩn, lấy diện tích píc và
dựng đồ thị phụ thuộc giữa diện tích pic chất với nồng độ của chất thu được
đường chuẩn sử dụng cho phân tích hàm lượng trong mẫu dịch tổng.
- Tiến hành phân tích HPLC các mẫu dịch chiết tổng ở điều kiện sắc ký
23
đã lựa chọn. Từ sắc ký đồ, lựa chọn pic sắc ký tương ứng với chất chuẩn, lấy
diện tích pic và sử dụng phương trình đường chuẩn tính toán nồng độ các chất
chuẩn có trong dung dịch tổng.
2.6.4. Xử lý số liệu
Các số liệu phân tích hàm lượng được tính toán tự động bằng phần
mềm phân tích Openlab của hệ thống sắc ký lỏng Agilent 1290 Infinity, và
24
Microsoft Excel 2016.
Chương 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1. Mẫu thực vật
Mẫu dược liệu được thu thập tại Đăk Lăk vào tháng 7 năm 2016. Tên
khoa học, Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen, được xác
định bởi TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản (ký hiệu NCCT-
P01) được lưu tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam. Loài này thường được người dân bản địa gọi với tên Dó đất.
25
Hình 3.1. Một số hình ảnh mẫu thu thập về loài B. fungosa subsp. indica
3.2. Thông số vật lí của một số hợp chất phân lập được từ loài B. Fungosa
subsp indica
3.2.1. Hợp chất BF1: Pinoresinol
Hình dạng : Chất bột vô định hình màu vàng nhạt.
Công thức phân tử : C20H22O6
Khối lượng phân tử : 358
Độ quay cực : + 62.7 (c=0.1, MeOH)
Phổ NMR : Xem biện giải cấu trúc mục 3.3.1.
3.2.2. Hợp chất BF2: Demethoxypinoresinol
Hình dạng : Chất bột vô định hình màu vàng nhạt.
Công thức phân tử : C19H20O5
Khối lượng phân tử : 328
Độ quay cực : + 68.1 (c=0.1, MeOH)
Phổ NMR : Xem biện giải cấu trúc mục 3.4.2.
3.2.3. Hợp chất BF3: Lariciresinol
Hình dạng : Chất bột vô định hình màu vàng nhạt.
Công thức phân tử : C20H24O6
Khối lượng phân tử : 360
Độ quay cực : + 33.4 (c=0.1, MeOH)
Phổ NMR : Xem biện giải cấu trúc mục 3.3.3.
3.2.4. Hợp chất BF4: Lariciresinol 4′-O-β-D-glucopyranoside
Hình dạng : Chất bột vô định hình màu vàng nhạt.
Công thức phân tử : C26H34O11.
Khối lượng phân tử : 522
26
Phổ NMR : Xem biện giải cấu trúc mục 3.3.4.
3.3. Biện giải cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ loài B.
fungosa subsp. indica
3.3.1. Hợp chất BF1: Pinoresinol
Hình 3.2. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF1
Hợp chất BF1 phân lập được dưới dạng chất rắn dạng bột vô định hình
màu vàng nhạt. Phổ 1H-NMR của BF1 nhận thấy tín hiệu của các proton với
các tỉ lệ tích phân 3 proton ở vùng proton thơm tại δH 6.96 (1H, s), 6.81 (2H);
tỉ lệ tích phân 1 proton ở δH 4.71 (1H, d, J = 4.0 Hz); tỉ lệ tích phân 1 proton
ở δH 4,23 (1H, dd, J = 6.8, 9.2 Hz), 3.65 (1H, dd, J = 3.2, 9.2 Hz) 3.13 (1H,
m); và tỉ lệ tích phân 3 proton ở δH 3.86 (3H, s). Mặt khác trên phổ 13C-NMR
nhận thấy xuất hiện 10 tín hiệu phổ trong đó có một tín hiệu đặc trưng cho
nhóm methoxy tại δC 56.4; sáu tín hiệu của carbon thơm trong vùng δC 110.9
~ 149.1; ba tín hiệu còn lại của các carbon lai hóa sp3 tại δC 87.4, 72.6, và
55.3. Sự xuất hiện các tín hiệu của một cấu trúc dạng C6-C3 như đề cập trên
cho thấy BF1 là một hợp chất dạng lignan có cấu trúc đối xứng. Hơn nữa, các
giá trị độ chuyển dịch hóa học của các carbon thuộc mảnh C3 (δC 87.4, 72.6,
và 55.3) được phân loại trên phổ DEPT lần lượt tương ứng với 1CH, 1CH2,
và 1CH đã cho thấy BF1 là một furanoid lignan có dạng 7,9′:9,7′-
diepoxylignan. Việc quy kết các số liệu phổ NMR và xác định cấu trúc hóa
học của BF1 được thực hiện bằng phân tích phổ hai chiều HSQC và HMBC.
Trên phổ HSQC cho biết các tương tác trực tiếp giữa carbon và hydro bao
27
gồm: tương tác C-2 (C-2′)/H-2 (H-2′) tại δC 110.9/ δH 6.96, tương tác C-5 (C-
5′)/H-5 (H-5′) tại δC 116.1/ δH 6.81, C-6 (C-6′)/H-6 (H-6′) tại δC 120.0/ δH
6.81, tương tác C-7 (C-7′)/H-7 (H-7′) tại δC 87.4/ δH 4.71, tương tác C-8 (C-
8′)/H-8 (H-8′) tại δC 55.3/ δH 3.13, C-9 (C-9′)/H-9 (H-9′) tại δC 72.6/ δH 4.23
và 3.56, tương tác của carbon methoxy và proton methoxy tại δC 56.4/ δH
3.86. Phổ hai chiều tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HMBC nhận thấy
tương tác giữa H-7 (δH 4.71) và các carbon C-1 (δC 133.8)/ C-2 (δC 110.9)/ C-
6 (δC 120.0)/ C-8 (δC 55.3) cho phép quy kết giá trị phổ tại các C-1, C-2, C-6,
C-7, C-8, C-9. Tương tác HMBC từ H-2 (δH 6.96), H-6 (δH 6.81) tới C-4 (δC
147.2) cho phép quy kết giá trị phổ tại C-4, đồng thời tương tác giữa H-5 (δH
2.81) và C-3 (δC 149.1) cho phép quy kết giá trị phổ tại C-3. Giá trị độ chuyển
dịch hóa học của C-3 (δC 149.1), C-4 (δC 147.2) và tương tác HMBC từ
proton methoxy (δH 3.86) tới C-3 (δC 149.1) cho phép xác định vị trí của
nhóm hydroxy và methoxy lần lượt tại C-4 và C-3. Như vậy, cấu trúc hóa học
của BF1 được xác định là pinoresinol. Các số liệu phổ 13C-NMR của BF1
cũng hoàn toàn phù hợp với các số liệu phổ của hợp chất pinoresinol đã được
công bố [16].
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF1 và hợp chất tham khảo
Pos. 1,1′ 2,2′ 3,3′ 4,4′ 5,5′ 6,6′ 7,7′ 8,8′ 9,9′
#δC 133.8 111.0 149.1 147.3 116.1 120.1 87.5 55.4 72.6
a,bδC 133.8 110.9 149.1 147.2 116.1 120.0 87.4 55.3 72.6
a,cδH (mult., J in Hz) - 6.96 (s) - - 6.81* 6.81* 4.71 (d, 4.0) 3.13 (m) 4.23 (dd, 6.8, 9.2) 3.65 (dd, 3.2, 9.2) 3.86 (s)
56.4 56.4
28
3,3′-OCH3 a)Đo trong CD3OD, b100 MHz, c400 MHz, #δC của hợp chất pinoresinol đo trong CD3OD [16]; mult: độ bội tín hiệu, *)Tín hiệu bị chồng lấp.
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF1
29
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF1
Hình 3.5. Phổ DEPT-135 của hợp chất BF1
30
Hình 3.6. Phổ HSQC của hợp chất BF1
Hình 3.7. Phổ HMBC của hợp chất BF1
3.3.2. Hợp chất BF2: Demethoxypinoresinol
Hình 3.8. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF2
Hợp chất BF2 phân lập được dưới dạng chất rắn dạng bột vô định hình
màu vàng nhạt. Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của BF2 nhận thấy xuất hiện tín
hiệu gần tương tự với BF1, chỉ có sự khác biệt ở các tín hiệu của vùng vòng
thơm. Đồng thời sự phân tách nhỏ các tín hiệu của hai mảnh cấu trúc C6-C3
nhận được trên phổ 13C-NMR của BF2 cho đấy cấu trúc của BF2 không còn
31
tính đối xứng như BF1.
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF2 và hợp chất tham khảo BF1 a,bδC 133.8 111.0 149.1 147.3 116.1 120.1 87.6 55.4 72.6
#δC 133.8 110.9 149.1 147.2 116.1 120.0 87.4 55.3 72.6
Pos. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
3-OCH3 1ʹ 2ʹ 3ʹ 4ʹ 5ʹ 6ʹ 7ʹ 8ʹ 9ʹ 56.4 133.8 110.9 149.1 147.2 116.1 120.0 87.4 55.3 72.6 56.4 133.0 128.7 116.2 158.2 116.2 128.7 87.4 55.2 72.5
a,cδH (mult., J in Hz) - 6.93 (s) - - 6.75 (d, 8.0) 6.79 (d, 8.0) 4.68 (br s) 3.11 (m) 4.20* 3.80* 3.83 (s) - 7.18 (d, 8.4) 6.74 (d, 8.4) - 6.74 (d, 8.4) 7.18 (d, 8.4) 4.68 (br s) 3.11 (m) 4.20* 3.80*
aĐo trong CD3OD, b100 MHz, c400MHz, #δC của BF1 đo trong CD3OD; mult: độ bội tín hiệu, *)Tín hiệu bị chồng lấp.
56.4 3ʹ-OCH3
32
Mặt khác, sự thiếu vắng tín hiệu của một nhóm methoxy ở BF2 so với BF1, và sự xuất hiện các tín hiệu thuộc hệ tương tác spin AABB của một vòng benzen thế para tại δH 7.18 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.74 (2H, d, J = 8.4 Hz) cho phép xác định cấu trúc hóa học của BF2 chỉ khác với BF1 ở một nhóm methoxy. Do đó cấu trúc hóa học của BF2 là demethoxypinoresinol. Hợp chất này đã được công bố phân lập trước đây từ loài Mikania saltensis [17]
Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF2
33
Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF2
Hình 3.11. Phổ HMQC của hợp chất BF2
34
Hình 3.12. Phổ HMBC của hợp chất BF2
3.3.3. Hợp chất BF3: Lariciresinol
Hình 3.13. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF3
Hợp chất BF3 phân lập được dưới dạng chất rắn dạng bột vô định hình
màu vàng nhạt. Trên phổ 1H-NMR của BF3 nhận thấy các tín hiệu gồm: tín
hiệu của 6 proton thơm thuộc hai hệ tương tác spin-spin ABX tại δH 6.68 (1H,
s), 6.75 (1H, d, J =7.5 Hz), 6.75 (1H, d, J =7.5 Hz), 6.77 (1H, s), 6.69 (1H, d,
J = 8.0 Hz), 6.62 (1H, d, J = 8.0 Hz); tín hiệu proton của hai nhóm methoxy
tại δH 3.81 (6H, s). Phổ 13C-NMR của hợp chất BF3 cho thấy tín hiệu của 20
nguyên tử carbon. Trong đó, tín hiệu carbon tại δC 56.3 (×2C) được qui kết
cho hai nhóm methoxy. Tín hiệu của 18 nguyên tử carbon còn lại thuộc hai hệ
C6-C3 cho thấy hợp chất BF3 thuộc dạng lignan. Hơn nữa, các tín hiệu
carbon của mảnh cấu trúc C3 được phân loại thành ba tín hiệu carbon
methylen tại δC 33.6, 60.4, 73.5 và ba tín hiệu carbon methin tại δC 43.8,
54.0, 84.0 gợi ý cho thấy cấu trúc hóa học của BF3 là một furanoid lignan
dạng 7,9′-epoxylignan. Tín hiệu carbon methylene tại δC 60.4 gợi ý cho sự có
mặt của một nhóm hydroxymethylen. Việc quy kết các số liệu phổ và xác
định cấu trúc hóa học của BF3 cũng được thực hiện bởi các kỹ thuật phân tích
phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều. Giá trị độ chuyển dịch hóa học của tín
hiệu tại δC 84.0 và tương tác HSQC của tín hiệu carbon này với proton δH
4.72 được quy kết cho số liệu phổ của C-7 và H-7. Tiếp đó, tương tác HMBC
35
giữa proton H-7 (δH 4.72) tới các carbon C-1 (δC 135.7), C-2 (δC 110.6), C-6
(δC 119.8), C-8 (δC 54.0), C-9 (δC 60.4), C-8′ (δC 43.8), C-9′ (δC 73.5) lần lượt
cho phép quy kết các số liệu phổ tại C-1, C-2, C-6, C-8, C-9, C-8′, và C-9′.
Các tương tác HSQC lần lượt giữa C-2, C-6, C-8, C-9, C-8ʹ, C-9ʹ với H-2 (δH
6.88), H-6 (δH 6.75), H-8 (δH 2.35), H-9 (δH 3.80/3.61), H-8ʹ (δH 2.79), H-9ʹ
(δH 3.96/3.70) cho phép qui kết các tín hiệu phổ 1H-NMR này. Đồng thời
tương tác HMBC giữa H-7 (δH 4.72) với C-9ʹ (δC 73.5) và H-9ʹ (δH 3.80/3.61)
với C-7 (δC 84.0) cho phép khẳng định cấu trúc vòng epoxy giữa C-7 và C-9′.
Tương tác HMBC từ H-2 (δH 6.88), H-6 (δH 6.75) tới C-4 (δC 147.0) cho phép
quy kết số liệu phổ tại C-4 và tương tác HMBC từ H-5 (δH 6.75) tới C-3 (δC
149.0) cho phép quy kết số liệu phổ tại C-3. Tín hiệu ở trường thấp của C-3
(δC 149.0) và C-4 (δC 147.0) cùng với tương tác HMBC giữa proton methoxy
(δH 3.81) với C-3 cho phép xác định sự có mặt của một nhóm hydroxy tại C-4
và methoxy tại C-3. Tương tự như vậy số liệu phổ và cấu trúc hóa học của
mảnh C6 còn lại cũng được quy kết nhờ phân tích các tương tác trên phổ hai
chiều dị hạt nhân C-H. Tương tác HMBC giữa methylen proton H-7ʹ (δH
2.90/2.46) với C-1ʹ (δC 133.5), C-2ʹ (δC 113.4), C-6ʹ (δC 122.2) cho phép quy
kết số liệu phổ tại C-1ʹ, C-2ʹ, và C-6ʹ. Tương tác HMBC từ H-2ʹ (δH 6.77), H-
6ʹ (δH 6.62) tới C-4ʹ (δC 145.8) cho phép quy kết số liệu phổ tại C-4ʹ và tương
tác HMBC từ H-5ʹ (δH 6.69) tới C-3ʹ (δC 149.0) cho phép quy kết số liệu phổ
tại C-3ʹ. Tín hiệu ở trường thấp của C-3ʹ (δC 149.0) và C-4ʹ (δC 145.8) cùng
với tương tác HMBC giữa proton methoxy (δH 3.81) với C-3ʹ cho phép xác
định sự có mặt của một nhóm hydroxy tại C-4ʹ và methoxy tại C-3ʹ. Từ những
phân tích trên cho phép quy kết các giá trị phổ NMR và xác định cấu trúc hóa
học của hợp chất BF3 là lariciresinol. Các số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR
của BF3 được thống kê như bảng dưới. Các dữ liệu phổ này hoàn toàn trùng
khớp với số liệu phổ của hợp chất lariciresinol đã được công bố trước đây
36
[18].
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo
Pos.
a,cδH (mult., J in Hz)
#δC
a,bδC
1
135.8
135.7
-
2
110.7
110.6
6.88 (s)
3
149.0
149.0
-
4
147.1
147.0
-
5
116.0
116.0
6.75 (d, 7.5)
6
119.8
119.8
6.75 (d, 7.5)
7
84.1
84.0
4.72 (d, 6.8)
8
54.0
54.0
2.35 (m)
9
60.5
60.4
3.80*
3.61 (dd, 6.8, 10.8)
56.4
56.3
3.81 (s)
3-OCH3
1ʹ
133.6
133.5
-
2ʹ
113.5
113.4
6.77 (s)
3ʹ
149.0
149.0
-
4ʹ
145.8
145.8
-
5ʹ
116.2
116.2
6.69 (d, 8.0)
6ʹ
122.2
122.2
6.62 (d, 8.0)
7ʹ
33.7
33.6
2.90 (dd, 4.0, 13.6)
2.46 (dd, 12.0, 13.6)
8ʹ
43.9
43.8
2.79 (m)
9ʹ
73.5
73.5
3.96 (dd, 6.8, 8.0)
3.70 (dd, 6.0, 8.0)
56.4
56.3
3.81 (s)
3ʹ-OCH3
aĐo trong CD3OD, b100 MHz, c400 MHz, #δC của hợp chất Lariciresinol [18] đo
trong CD3OD; mult: độ bội tín hiệu, *)Tín hiệu bị chồng lấp.
37
Hình 3.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF3
38
Hình 3.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF3
Hình 3.16. Phổ HSQC của hợp chất BF3
39
Hình 3.17. Phổ HMBC của hợp chất BF3
3.3.4. Hợp chất BF4: Lariciresinol 4′-O-β-D-glucopyranoside
Hình 3.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF4
Hợp chất BF4 phân lập được dưới dạng chất rắn dạng bột vô định hình
màu vàng nhạt. Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của BF4 nhận thấy các tín
hiệu gần tương tự với hợp chất BF3 ngoại trừ sự xuất hiện thêm các tín hiệu
của một đơn vị đường. Trong đó, các tín hiệu carbon tại δC 102.6, 74.7, 77.8,
71.1, 77.5, 62.3 đặc trưng cho một đơn vị đường glucose. Việc quy kết các giá
trị phổ 1H-và 13C-NMR của BF4 cũng được tiến hành tương tự như với hợp
chất BF3. Vị trí liên kết của đơn vị đường glucose với phần aglycon cũng
được xác định chính xác nhờ phân tích phổ tương tác hai chiều HMBC. Cụ
thể như sau: các tương tác HMBC từ H-7ʹ (δH 2.90/2.47) tới C-2ʹ (δC 114.0) và
C-6ʹ (δC 122.1), và tương tác HSQC của H-2ʹ/C-2ʹ, H-6ʹ/C-6ʹ cho phép quy kết
giá trị phổ của H-2ʹ và H-6ʹ. Tiếp đó tương tác HMBC giữa H-2ʹ và H-6ʹ tới
C-4ʹ cho phép quy kết giá trị phổ NMR của C-4ʹ; cuối cùng tương tác HMBC
quan sát thấy giữa proton anomer với C-4ʹ cho phép kết luận vị trí của đơn vị
đường liên kết với phần aglycon tại C-4ʹ. Như vậy hợp chất BF4 được xác
40
định là lariciresinol 4′-O-β-D-glucopyranoside.
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF4, BF3 và hợp chất tham khảo
Pos. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
@δC 135.7 110.6 149.0 147.0 116.0 119.8 84.0 54.0 60.4
#δC 135.7 110.7 149.1 147.1 116.0 119.8 84.1 54.1 60.5
a,bδC 135.5 110.5 148.7 146.7 115.9 119.6 83.7 53.8 60.3
3-OCH3 1ʹ 2ʹ 3ʹ 4ʹ 5ʹ 6ʹ 7ʹ
56.3 133.5 113.4 149.0 145.8 116.2 122.2 33.6
56.8 137.2 114.4 150.9 146.4 118.3 122.3 33.7
56.3 136.9 114.0 150.4 146.0 117.8 122.1 33.5
8ʹ 9ʹ
43.8 73.5
43.8 73.5
43.5 73.2
3ʹ-OCH3 4ʹ -OGlc 1ʺ 2ʺ 3ʺ 4ʺ 5ʺ 6ʺ
56.3
56.4 103.0 75.0 78.2 71.4 77.9 62.6
56.6 102.6 74.7 77.8 71.1 77.5 62.3
a,cδH (mult., J in Hz) - 6.88 (s) - - 6.73* 6.73* 4.72 (d, 6.4) 2.35 (m) 3.81* 3.61* 3.80 (s) - 6.84 (s) - - 7.07 (d, 8.4) 6.71 (d, 8.4) 2.90 (br d, 12.0) 2.47 (dd, 12.0, 12.0) 2.70 (m) 3.94 (dd, 7.2, 7.2) 3.69* 3.80 (s) 4.86 (d, 6.5) 3.51* 3.41* 3.41* 3.51* 3.86 (br d, 11.6) 3.69*
aĐo trong CD3OD, b100MHz, c400MHz, #δC của BF3, #δC của lariciresinol-4ʹ-O-β-D-
glucopyranoside đo trong CD3OD [19]; mult: độ bội tín hiệu, *)Tín hiệu bị chồng lấp.
41
Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF4
42
Hình 3.20. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF4
Hình 3.21. Phổ HSQC của hợp chất BF4
43
Hình 3.22. Phổ HMBC của hợp chất BF4
3.3.5. Tổng hợp cấu trúc hóa học của các hợp chất phenolic phân lập được
từ loài B. fungosa subsp. indica
Bằng các phương pháp chiết, sắc ký, bốn hợp chất lignan (BF1-BF4)
đã được phân lập từ loài B. fungosa subsp. indica. Cấu trúc hóa học của các
hợp chất được xác định dựa trên phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Các
hợp chất này được xác định lần lượt là pinoresinol, demethoxypinoresinol,
lariciresinol, và lariciresinol 4′-O-β-D-glucopyranoside. Các hợp chất này đều
được phân lập lần đầu tiên từ loài B. fungosa subsp. indica. Cấu trúc hóa học
của các hợp chất như được tổng hợp ở hình dưới.
Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất lignan (BF1-BF4) từ loài B.
fungosa subsp. indica
3.4. Phân tích hàm lượng một số hợp chất lignan trong loài B. fungosa
subsp. indica
Sơ bộ dựa trên khối lượng hợp chất phân lập, hai hợp chất BF1 và BF3
được sử dụng để tiến hành phân tích hàm lượng của chúng có trong mẫu dược
44
liệu khô. Các mẫu chuẩn và dịch chiết được phân tích sơ bộ trên hệ thống
HPLC Agilent 1290 để định vị các píc chất chuẩn trên sắc đồ của dịch chiết và
lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp. Kết quả cho thấy sử dụng điều kiện sắc
ký: pha động là dung môi đẳng dòng acetonitrile 20% trong nước, pha tĩnh là
cột YMC hydroxphere C18 (kích thước cột 150 × 4.6 mm, kích thước hạt
5µM), tốc độ dòng 0.5 mL/phút, thời gian 20 phút, có sử dụng để định lượng
đồng thời hai hợp chất này. Thể tích mẫu tiêm 5µL. Đồng thời, dựa trên quang
phổ UV thì bước sóng sử dụng để phát hiện lựa chọn phù hợp tại 230 nm
Hình 3.24. Phổ UV của các chất BF1 và BF3
Hình 3.25. Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết methanol loài B. fungosa subsp.
45
indica ở điều kiện lựa chọn phân tích.
3.4.1. Phân tích định lượng hợp chất BF1
+ Xây dựng đường chuẩn: Mẫu BF1 được pha với các nồng độ 62.5,
125, 250, 500, và 1000 µg/mL. Từ các sắc đồ HPLC tính được diện tích của
pic chất chuẩn, và từ sự phụ thuộc giữa diện tích píc chất phân tích với lượng
chất phân tích cho phép xây dựng đường chuẩn của chất phân tích. Kết quả
phân tích mẫu BF1 ở các nồng độ như sau.
Diện tích pic
Sai số
Lượng chất phân tích (ug)
Trung bình
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Nồng độ mẫu (µg/ml) 1000.0
Thể tích (µl) 5
5.00000 25111.0 25113.0 25109.0
25111.0 2.00000
500.0
5
2.50000 13000.0 13002.0 12997.0
12999.7 2.51661
250.0
5
1.25000
6745.0
6749.0
6743.0
6745.7 3.05505
125.0
5
0.62500
3452.0
3454.0
3450.0
3452.0 2.00000
62.5
5
0.31250
1907.0
1908.0
1903.0
1906.0 2.64575
Bảng 3.5. Phân tích HPLC của hợp chất BF1 ở các nồng độ khác nhau
Đường chuẩn xây dựng (ứng với giá trị trung bình cho 3 lần phân tích)
cho mẫu phân tích BF1 như sau:
46
Hình 3.26. Đường chuẩn định lượng của hợp chất BF1
Từ kết quả mỗi lần phân tích cho phép tính toán được các giá trị về độ
dốc của đường chuẩn và điểm ngoại suy (intercept) là điểm giao cắt giữa
đường chuẩn kéo dài và trục tung của đồ thị, và giá trị của hệ số tương quan
R2 như sau:
Bảng 3.6. Xác định giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Trung bình
Sai số
Độ dốc
4951.26882
4951.28602
4951.45376
4951.33620
0.10218
Điểm ngoại suy
449.91667
452.08333
446.95833
449.65278
2.57267
Hệ số R2
0.99977
0.99977
0.99977
0.99977
0.00000
LOD (µg)
0.00171
LOQ (µg)
0.00520
(LOQ) hợp chất BF1
Từ giá trị sai số của điểm ngoại suy với trung bình của độ dốc cho phép
tính toán được các giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng lần
lượt là 0.00171 và 0.00520 (µg)
Lượng
Tương
Lượng chất định lượng
Độ thu hồi
chất thêm
Trung bình
Sai số
quan sai số
(µg)
(%)
(µg)
(%)
Lần 1
Lần 2
Lần 3
2.5
2.53472
2.53512
2.53411
2.53465 0.00051
0.02005
101.4
1.25
1.27141
1.27222
1.27100
1.27154 0.00062
0.04853
101.7
0.625
0.60633
0.60673
0.60592
0.60633 0.00040
0.06662
97.0
0.3125
0.29428
0.29449
0.29348
0.29408 0.00053
0.18170
94.1
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của phép phân tích hợp chất BF1
Lần lượt thêm vào mẫu phân tích một lượng xác định chất phân tích và
tiến hành đánh giá hàm lượng chất thêm vào. Với bốn giá trị lượng mẫu thêm
vào khác nhau và ba lần phân tích cho mỗi mẫu. Kết quả cho thấy độ lặp lại
của phép phân tích với giá trị tương quan sai số từ 0.02 đến 0.18% và độ thu
47
hồi đạt 94.1-101.7%.
Tiếp đó đánh giá hàm lượng của hợp chất BF1 có trong mẫu B. fungosa
subsp. indica khô. Mẫu B. fungosa subsp. indica được chiết siêu âm với
methanol thu được dịch chiết, kết quả cho thấy từ 20 g mẫu dược liệu khô thu
được 2.66±0.11 g dịch chiết (chiếm 13.3% so với mẫu khô). Cặn chiết
methanol được hòa tan lại bằng methanol và tiến hành phân tích định lượng
hợp chất BF1. Sắc đồ phân tích HPLC như hình 3.25. Kết quả cho thấy hàm
lượng hợp chất BF1 có trong cặn chiết methanol là 0.25% tương ứng với
0.03325% so với mẫu dược liệu khô.
Bảng 3.8. Hàm lượng hợp chất BF1 trong dịch chiết methanol mẫu B.
Hàm
Tương
Lượng
Nồng độ
Thể tích
Lượng
Diện
Hàm lượng
lượng
quan
mẫu định
Sai số
mẫu (µg/ml)
tiêm (µl)
mẫu (µg)
tích píc
(%)
trung
sai số
lượng (µg)
bình
(%).
5
5
25.0
764.2
0.0635
0.2541
5
5
25.0
766.0
0.0639
0.2556
0.2535
0.0025 0.9814
5
5
25.0
760.0
0.0627
0.2507
fungosa subsp. indica
3.4.2. Phân tích định lượng hợp chất BF3
Tương tự như BF1, hợp chất BF3 cũng được tiến hành xây dựng đường
chuẩn, đánh giá độ lặp lại. Mẫu BF3 được phân tích ở các nồng độ 62.5, 125,
250, 500, và 1000 µg/ml. Từ các sắc ký đồ sẽ tính được diện tích pic chất.
Thể
Lượng
Diện tích pic
Nồng độ mẫu
tích
chất phân
Trung bình
Sai số
(µg/ml)
Lần 1
Lần 2
Lần 3
(µl)
tích (ug)
1000.0
5
5.00000
13781.0
13785.0
13790.0
13785.3 4.50925
500.0
5
2.50000
7268.0
7270.0
7280.0
7272.7 6.42910
250.0
5
1.25000
3741.0
3738.0
3730.0
3736.3 5.68624
125.0
5
0.62500
1938.0
1930.0
1924.0
1930.7 7.02377
62.5
5
0.31250
1018.0
1035.0
1030.0
1027.7 8.73689
Bảng 3.9. Phân tích HPLC của hợp chất BF3 ở các nồng độ khác nhau
Mối liên hệ giữa diện tíc pic và lượng chất phân tích cho phép xây
48
dựng đường chuẩn phân tích đối với hợp chất BF3.
Hình 3.27. Đường chuẩn định lượng của hợp chất BF3
Từ độ dốc của đường chuẩn và giá trị sai số của điểm ngoại suy cho
phép xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của hợp chất BF3
như sau:
Bảng 3.10. Xác định giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Trung bình
Sai số
Độ dốc
2719.84516
2719.72903
2722.64946
2720.74122
1.65361
279.50000
282.12500
275.66667
279.09722
3.24795
Điểm ngoại suy Hệ số R2
0.99956
0.99956
0.99956
0.99956
0.00000
LOD (µg)
0.00394
LOQ (µg)
0.01194
Tiếp đó, độ lặp lại và độ thu hồi của phép phân tích hợp chất BF3 được
(LOQ) hợp chất BF3
khảo sát và thu được kết quả như sau:
Lượng chất định lượng (µg)
Trung bình
Sai số Tương quan sai số (%) Độ thu hồi (%)
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Lượng chất thêm (µg) 2.5
2.56945
2.57018 2.57386
2.57116 0.00236
0.09193
102.8
1.25
1.27268
1.27158 1.26864
1.27097 0.00209
0.16449
101.7
0.625
0.60978
0.60684 0.60463
0.60708 0.00258
0.42538
97.1
0.3125
0.27152
0.27777 0.27593
0.27508 0.00321
1.16777
88.0
49
Bảng 3.11. Độ lặp lại và độ thu hồi của phép phân tích hợp chất BF3
Như vậy, đối với hợp chất BF3, độ lặp lại của phép phân tích với giá trị
tương quan sai số từ 0.09 tới 1.17% đồng thời độ thu hồi đạt từ 88.0-102.8%.
Tiến hành định lượng hợp chất BF3 có trong mẫu dịch chiết methanol
và mẫu khô loài B. fungosa subsp. indica (sắc đồ HPLC như hình 3.25) thu
được kết quả sau:
Bảng 3.12. Hàm lượng hợp chất BF3 trong dịch chiết methanol mẫu B.
Sai số
Thể tích tiêm (µl)
Hàm lượng trung bình (%)
Tương quan sai số (%).
Nồng độ mẫu (µg/ml) 5
5
Lượng mẫu (µg) 25.0
Diện tích píc 764.2
Lượng mẫu định lượng (µg) 0.1783
Hàm lượng (%) 0.7132
5
5
25.0
766.0
0.1790
0.7158
0.6358
fungosa subsp. indica
0.7120
0.0045
5
5
25.0
760.0
0.1768
0.7070
Hàm lượng hợp chất BF3 trong dịch chiết methanol là 0.71% tương
50
ứng với 0.0947% so với mẫu khô.
KẾT LUẬN
1. Đã thu thập và xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu: loài B. fungosa
subsp. indica, tên phổ thông Dó đất.
2. Đã tiến hành chiết, phân đoạn, và phân lập được 04 hợp chất từ loài B.
fungosa subsp. indica.
3. Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định dựa trên phân tích phổ
cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, hai chiều, và so sánh với các số liệu
phổ đã được công bố trên tài liệu tham khảo. Bốn hợp chất phân lập được
đều thuộc dạng hợp chất lignan và được xác định là: pinoresinol (BF1),
demthoxypinoresinol (BF2), lariciresinol (BF3), và lariciresinol 4′-O-β-
D-glucopyranoside (BF4). Đây là công bố đầu tiên về phân lập các hợp
chất này từ loài B. fungosa subsp. indica.
4. Các hợp chất BF1 và BL3 được phân tích hàm lượng có trong dịch chiết
methanol và trong mẫu khô bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao,
kết quả cho thấy hàm lượng của hai hợp chất này trong dịch chiết
methanol là 0.25% và 0.71%, tương ứng với mẫu khô là 0.03325% và
51
0.0947%.
[1] Wang, X., Liu, Z., Qiao, W., Cheng, R., Liu, B., She, G. "Phytochemicals and
biological studies of plants from the genus Balanophora", Chemistry Central
journal, 2012, 6, 79(71)-79(79).
[2] Khánh, T.C. "Cây Dó đất", Tạp chí Thuốc & Sức khỏe, 2012, 420-421, 33.
[3] Chi, V.V., Dó đất, NXB Y học, Hà Nội, 2012.
[4] Yagishita, K. "Isolation and identification of taraxasterol and β-amyrin from the
bird-lime of Balanophora japonica Makino", Bulletin of the Agricultural
Chemical Society of Japan, 1956, 20, 206-210.
[5] Haruna, M., Koube, T., Ito, K., Murata, H. "Balanophonin, A new neo-lignan
from Balanophora japonica Makino", Chemical & Pharmaceutical Bulletin,
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1982, 30, 1525-1527.
[6] Jiang, Z.H., Hirose, Y., Iwata, H., Sakamoto, S., Tanaka, T., Kouno, I. "Caffeoyl,
coumaroyl, galloyl, and hexahydroxydiphenoyl glucoses from Balanophora
japonica", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2001, 49, 887-892.
[7] Jiang, Z.H., Tanaka, T., Iwata, H., Sakamoto, S., Hirose, Y., Kouno, I.
"Ellagitannins
and
lignan
glycosides
from Balanophora
japonica
(Balanophoraceae)", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2005, 53, 339-341.
[8] Jiang, Z.H., Wen, X.Y., Tanaka, T., Wu, S.Y., Liu, Z., Iwata, H., Hirose, Y.,
Wu, S., Kouno, I. "Cytotoxic hydrolyzable tannins from Balanophora
japonica", Journal of Natural Products, 2008, 71, 719-723.
[9] Wang, K.J., Zhang, Y.J., Yang, C.R. "New phenolic constituents from
Balanophora polyandra with radical-scavenging activity", Chemistry &
Biodiversity, 2006, 3, 1317-1324.
[10] Ho, S.T., Tung, Y.T., Cheng, K.C., Wu, J.H. "Screening, determination and
quantification of major antioxidants from Balanophora laxiflora flowers",
Food Chemistry, 2010, 122, 584-588.
[11] She, G.M., Zhang, Y.J., Yang, C.R. "Phenolic constituents from Balanophora
laxiflora with DPPH radical-scavenging activity", Chemistry & Biodiversity,
2009, 6, 875-880.
52
[12] Tanaka, T., Uehara, R., Nishida, K., Kouno, I. "Galloyl, caffeoyl and
hexahydroxydiphenoyl
esters of dihydrochalcone glucosides
from
Balanophora tobiracola", Phytochemistry, 2005, 66, 675-681.
[13] Wang, W., Zeng, S.F., Yang, C.R., Zhang, Y.J. "A new hydrolyzable tannin
from Balanophora harlandii with radical-scavenging activity", Helvetica
Chimica Acta, 2009, 92, 1817-1822.
[14] Luo, B., Zou, K., Guo, Z., Dan, F., Wang, J., Wang, H. "Balanoinvolin, a new
steroid derivative from Balanophora involucrate", Chem Nat Compd, 2009,
45, 371-373.
[15] Hosoya, T., Nakata, A., Zaima, K., Latip, J., Din, L.B., Muslim, N., Morita, H.
"Papuabalanols A and B, new tannins from Balanophora papuana",
Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2010, 58, 738-741.
[16] Xie, L.-H., Akao, T., Hamasaki, K., Deyama, T., Hattori, M.
"Biotransformation of pinoresinol diglucoside to mammalian lignans by
human intestinal microflora, and isolation of Enterococcus faecalis strain
PDG-1 responsible for the transformation of (+)-pinoresinol to (+)-
lariciresinol", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2003, 51, 508-515.
[17] Cuenca, M.D.R., Catalan, C.A.N., Díaz, J.G., Herz, W. "Monoterpenes and
lignans from Mikania saltensis", Journal of Natural Products, 1991, 54,
1162-1164.
[18] Xie, L.H., Akao, T., Hamasaki, K., Deyama, T., Hattori, M.
"Biotransformation of Pinoresinol Diglucoside to Mammalian Lignans by
Human Intestinal Microflora, and Isolation of Enterococcus faecalis Strain
PDG-1 Responsible for the Transformation of (+)-Pinoresinol to (+)-
Lariciresinol", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2003, 51, 508-515.
[19] Sugiyama, M., Kikuchi, M. "Characterization of lariciresinol glucosides from
Osmanthus asiaticus", Heterocycles, 1993, 36, 117-121.
53
PHỤ LỤC
1
Phụ lục 1. Biên bản giám định mẫu B. fungosa subsp. indica .......................... 3 Phụ lục 2. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF1 ...................................................... 4 Phụ lục 3. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF1 .............................................. 4 Phụ lục 4. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF1 ..................................................... 5 Phụ lục 5. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF1 ............................................. 5 Phụ lục 6. Phổ DEPT-135 của hợp chất BF1 ................................................... 6 Phụ lục 7. Phổ HSQC của hợp chất BF1 .......................................................... 6 Phụ lục 8. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF1 .................................................. 7 Phụ lục 9. Phổ HMBC của hợp chất BF1 ......................................................... 7 Phụ lục 10. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF1 ............................................... 8 Phụ lục 11. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF1 ............................................... 8 Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF2 .................................................... 9 Phụ lục 13. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF2 ............................................ 9 Phụ lục 14. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF2 ................................................. 10 Phụ lục 15. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF2 ......................................... 10 Phụ lục 16. Phổ HSQC của hợp chất BF2 ...................................................... 11 Phụ lục 17. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF2 .............................................. 11 Phụ lục 18. Phổ HMBC của hợp chất BF2 ..................................................... 12 Phụ lục 19. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF2 ............................................. 12 Phụ lục 20. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF2 ............................................. 13 Phụ lục 21. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF3 .................................................. 13 Phụ lục 22. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF3 .......................................... 14 Phụ lục 23. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF3 .......................................... 14 Phụ lục 24. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF3 ................................................. 15 Phụ lục 25. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF3 ......................................... 15 Phụ lục 26. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF3 ......................................... 16 Phụ lục 27. Phổ HSQC của hợp chất BF3 ...................................................... 16 Phụ lục 28. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF3 .............................................. 17 Phụ lục 29. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF3 .............................................. 17 Phụ lục 30. Phổ HMBC của hợp chất BF3 ..................................................... 18 Phụ lục 31. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF3 ............................................. 18
Phụ lục 32. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF3 ............................................. 19 Phụ lục 33. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF4 .................................................. 19 Phụ lục 34. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF4 .......................................... 20 Phụ lục 35. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF4 .......................................... 20 Phụ lục 36. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF4 ................................................. 21 Phụ lục 37. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF4 ......................................... 21 Phụ lục 38. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF4 ......................................... 22 Phụ lục 39. Phổ HSQC của hợp chất BF4 ...................................................... 22 Phụ lục 40. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF4 .............................................. 23 Phụ lục 41. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF4 .............................................. 23 Phụ lục 42. Phổ HMBC của hợp chất BF4 ..................................................... 24 Phụ lục 43. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF4 ............................................. 24 Phụ lục 44. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF4 ............................................. 25 Phụ lục 45. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF4 ............................................. 25 Phụ lục 46. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF4 ............................................. 26 Phụ lục 47. Sắc ký đồ của BF1 ở các nồng độ lần lượt 62.5, 125, 250,
500, và 1000 µg/mL .................................................................... 27
Phụ lục 48. Sắc ký đồ của BF3 ở các nồng độ lần lượt 62.5, 125, 250,
500, và 1000 µg/mL .................................................................... 28
Phụ lục 49. Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết methanol loài B. fungosa
2
subsp. indica ở điều kiện lựa chọn phân tích. ............................. 29
3
Phụ lục 1. Biên bản giám định mẫu B. fungosa subsp. indica
Phụ lục 2. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF1
4
Phụ lục 3. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF1
Phụ lục 4. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF1
5
Phụ lục 5. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF1
Phụ lục 6. Phổ DEPT-135 của hợp chất BF1
6
Phụ lục 7. Phổ HSQC của hợp chất BF1
Phụ lục 8. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF1
7
Phụ lục 9. Phổ HMBC của hợp chất BF1
Phụ lục 10. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF1
8
Phụ lục 11. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF1
Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF2
9
Phụ lục 13. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF2
Phụ lục 14. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF2
10
Phụ lục 15. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF2
Phụ lục 16. Phổ HSQC của hợp chất BF2
11
Phụ lục 17. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF2
Phụ lục 18. Phổ HMBC của hợp chất BF2
12
Phụ lục 19. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF2
Phụ lục 20. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF2
13
Phụ lục 21. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF3
Phụ lục 22. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF3
14
Phụ lục 23. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF3
Phụ lục 24. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF3
15
Phụ lục 25. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF3
Phụ lục 26. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF3
16
Phụ lục 27. Phổ HSQC của hợp chất BF3
Phụ lục 28. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF3
17
Phụ lục 29. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF3
Phụ lục 30. Phổ HMBC của hợp chất BF3
18
Phụ lục 31. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF3
Phụ lục 32. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF3
19
Phụ lục 33. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF4
Phụ lục 34. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF4
20
Phụ lục 35. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất BF4
Phụ lục 36. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF4
21
Phụ lục 37. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF4
Phụ lục 38. Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất BF4
22
Phụ lục 39. Phổ HSQC của hợp chất BF4
Phụ lục 40. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF4
23
Phụ lục 41. Phổ HSQC giãn của hợp chất BF4
Phụ lục 42. Phổ HMBC của hợp chất BF4
24
Phụ lục 43. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF4
Phụ lục 44. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF4
25
Phụ lục 45. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF4
26
Phụ lục 46. Phổ HMBC giãn của hợp chất BF4
Phụ lục 47. Sắc ký đồ của BF1 ở các nồng độ lần lượt 62.5, 125, 250, 500, và
27
1000 µg/mL
Phụ lục 48. Sắc ký đồ của BF3 ở các nồng độ lần lượt 62.5, 125, 250, 500, và
28
1000 µg/mL
Phụ lục 49. Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết methanol loài B. fungosa subsp.
29
indica ở điều kiện lựa chọn phân tích.
