Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất, tinh chế các hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn thọ

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Lê Mỹ Kim Vương

CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Nha Trang - 2019

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Lê Mỹ Kim Vương

CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER

Chuyên ngành : Hoá phân tích

Mã số : 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Người hướng dẫn 1 Người hướng dẫn 2

TS. Hoàng Thị Huệ An TS. Trần Thị Phương Anh

Nha Trang - 2019

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Cải biến phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP – HPLC) xác định lutein, ứng dụng khảo sát

quá trình xà phòng hoá lutein ester” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi

và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới

thời điểm này.

Nha Trang, ngày 7 tháng 10 năm 2019

Tác giả luận văn

Lê Mỹ Kim Vương

Lời cảm ơn

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã

nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa

học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè trong lớp.

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Hoàng Thị Huệ An

và TS. Trần Thị Phương Anh đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi

hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công

nghệ, Khoa Hoá học và Phòng Đào tạo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ

tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.

Tôi chân thành cảm ơn các thầy cô ở Viện Nghiên cứu và Ứng dụng

Công nghệ Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa

học, đồng thời giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và các thầy cô tại Trung tâm

Thí nghiệm Thực hành Trường Đại học Nha Trang đã hỗ trợ trang thiết bị

thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn.

Đề tài này được thực hiện trong khuôn khổ dự án “Hoàn thiện quy trình

công nghệ chiết xuất, tinh chế các hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn

thọ”, mã số CNHD.DASXTN.026/17-18 thuộc Chương trình nghiên cứu

KHCN trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm

2020. Xin trân trọng cảm ơn Bộ Công Thương và Phòng Thí nghiệm trọng

điểm Công nghệ lọc, hóa dầu đã cấp kinh phí thực hiện dự án này.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân

và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học

tập và hoàn thành luận văn.

Trân trọng!

Nha Trang, ngày 7 tháng 10 năm 2019

Tác giả luận văn

Lê Mỹ Kim Vương

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

ANOVA analysis of variance Phân tích phương sai

AOAC Assosiation of Official Hiệp hội các nhà hóa

Analytical Chemists phân tích chính thức.

ASTM American Society for Testing Hiệp hội phép thử Mỹ.

of Materials

DAD Diod array detector Detector mảng diod.

DMF Dimethyle formamide

DNA Acid Deoxyribonucleic ADN

EU Europe Union Liên minh châu Âu

FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm

và dược phẩm

GC-MS Gas chromatography mass Sắc ký khí Khối phổ

spectrometry

HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng

cao. chromatography

ICH International Conference on Hội đồng hòa hợp quốc

tế. Harmonization

JECFA The Joint FAO/WHO Expert Hội đồng các chuyên gia

Committee on Food) FAO/WHO về phụ gia

thực phẩm

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện.

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng.

MTBE Methyle tert-butyle ether

Correlation coefficient Hệ số tương quan R2

Retention Time Thời gian lưu RT

Standard Deviation Độ lệch chuẩn SD

Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu. S/N

Tetrahydrofurane THF

UV – Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại khả kiến.

Volume/volume Thể tích/thể tích. v/v

Volume/weight Thể tích/khối lượng. v/w

Weight/weight Khối lượng/khối lượng. w/w

Wavelength of maximum Bước sóng hấp thụ cực lmax

absorption đại.

Danh mục các bảng

Bảng 1.1.Dữ kiện hấp thụ UV-Vis của lutein và zeaxanthin………………. 12

Bảng 2.1.Các thành phần pha động thử nghiệm ở chế độ rửa giải isocratic...52

Bảng 3.1.Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thừa số lưu giữ lutein và

lutein ester………………………………………………………………….. 62

Bảng 3.2.Giá trị k’ của lutein và lutein ester khi thử nghiệm rửa giải theo

chương trình gradient dung môi đề nghị…………………………………….66

Bảng 3.3.Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến độ rộng chân peak và số đĩa lý

thuyết của cột tách đối với các cấu tử phân tích……………………………..67

Bảng 3.4.Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến độ rộng chân peak, số đĩa lý

thuyết và chiều cao của đĩa đối với các cấu tử phân tích……………………70

Bảng 3.5.Kết quả xác định hàm lượng carotenoid tổng số và lutein có trong

lutein đối chứng……………………………………………………………...74

Bảng 3.6.Kết quả dựng đường chuẩn lutein (lặp lại 3 lần song song)……... 75

Bảng 3.7.Khảo sát độ lặp lại khi tiêm cùng mẫu chuẩn trong ngày………... 78

Bảng 3.8.Khảo sát độ thu hồi khi thêm mẫu chuẩn ở các nồng độ 12; 15;

18ppm………………………………………………………………………..81

Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oleoresin đến hiệu suất xà phòng

hoá…………………………………………………………………………...84

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa lutein

ester……………………………………………………………………. ……86

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa……...........88

Bảng 3.12.Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein

ester………………………………………………………………………….92

Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá trên mẫu lớn.…......96

Bảng 3.14.Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá mẫu thêm chuẩn

………………………………………………………………………...97

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) [15] ................. 10

Hình 1.2. Một số dạng đồng phân cis thường gặp của lutein [15] .................. 11

Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của Zeaxanthin (b, b’-carotene - 3,3’-diol) [15] .. 11

Hình 1.4. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B [16] ............. 17

Hình 1.5. Sơ đồ thiết bị HPLC [16] ................................................................ 18

Hình 1.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp 2 cấu tử A và B [16] .................................. 22

Hình 1.7. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách của hai chất .......... 23

Hình 3.1. Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và rửa giải của lutein và lutein ester ........................................................................................ 63

Hình 3.2. Sơ đồ sự thay đổi thành phần pha động trong quá trình rửa giải .... 65

Hình 3.3. Sắc ký đồ chế độ rửa giải gradient dung môi ................................. 65

Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến một số đại lượng sắc ký .............. 68

Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi tốc độ dòng từ 0,8 đến 1,2 ml/phút ......................................................................................... 69

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến quá trình sắc ký ................. 71

Hình 3.7. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi thể tích bơm mẫu ................................................................................................................. 72

Hình 3.8. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 40 ppm ................. 75

Hình 3.9. Kết quả HPLC của các mẫu trắng, mẫu chứng thực, mẫu thực và mẫu thêm ........................................................................................................ 76

Hình 3.10. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 30 ppm ............... 79

Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin không xà phòng hóa (lutein

ester) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml ...................................................... 82

Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin sau khi xà phòng hóa (lutein tự do) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml ..................................................... 82

Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu lutein đối chứng cho thấy trans-lutein có RT ~ 0,89

phút ................................................................................................................. 83

Hình 3.14. Phổ hấp thụ UV-Vis ứng với: a) peak trans-lutein (RT ~ 8,9 min); b) peak cis-lutein (RT ~ 10,3 min) .................................................................. 83

Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ oleoresin ...................................... 85

Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin

khi thay đổi nồng độ oleoresin từ 0,1 – 0,9 g/ml ............................................ 87

Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin khi cố định nồng độ oleoresin 0,3 g/ml .......................................................... 87

Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester 88

Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu oleoresin 0,3 g/ml sau khi xà phòng

hóa bằng KOH 5% w/v trong EtOH trong 1 h ở các nhiệt độ khác nhau ....... 91

Hình 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester 92

Hình 3.21. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu xà phòng hoá trong các khoảng thời gian khác nhau ................................................................................................ 95

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 6

1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................... 6

2. Mục đích của đề tài ..................................................................................... 8

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 8

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................. 9

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 10

1.1. TỔNG QUAN VỀ LUTEIN .................................................................... 10

1.1.1. Cấu trúc phân tử ................................................................................ 10

1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của lutein ............................................... 11

1.1.2.1. Tính chất vật lý ............................................................................ 11

1.1.2.2. Tính chất hóa học ........................................................................ 13

1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của lutein ........................................ 13

1.1.3.1. Hoạt tính sinh học của lutein ...................................................... 13

1.1.3.2. Ứng dụng của lutein .................................................................... 14

1.1.4. Các nguồn lutein quan trọng trong tự nhiên ...................................... 16

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC ........................................... 16

1.2.1. Khái niệm về phương pháp sắc ký .................................................... 16

1.2.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị HPLC .......................... 18

1.2.2.1. Bình đựng dung môi pha động .................................................... 18

1.2.2.2. Bộ phận khử khí ........................................................................... 19

1.2.2.3. Bơm cao áp .................................................................................. 19

1.2.2.4. Bộ phận tiêm mẫu ........................................................................ 19

1.2.2.5. Cột sắc ký .................................................................................... 19

1.2.2.6. Đầu dò ......................................................................................... 20

1.2.2.7. Bộ phận ghi tín hiệu .................................................................... 21

1.2.2.8. Thiết bị in dữ liệu ........................................................................ 21

1.2.3. Các đại lượng đặc trưng cơ bản trong HPLC .................................... 21

1.2.3.1. Thời gian lưu - Thời gian lưu thực .............................................. 21

1.2.3.2. Hệ số dung lượng ........................................................................ 22

1.2.3.3. Độ chọn lọc ................................................................................. 23

1.2.3.4. Số đĩa lý thuyết ............................................................................ 23

1.2.3.5. Độ phân giải ................................................................................ 24

1.2.4. Cách xây dựng một quy trình phân tích HPLC ................................. 25

1.2.4.1. Chọn kiểu sắc ký .......................................................................... 26

1.2.4.2. Chọn cột sắc ký ............................................................................ 26

1.2.4.3. Chọn pha động ............................................................................ 27

1.2.4.4. Chọn chế độ rửa giải ................................................................... 28

1.2.5. Cách thẩm định một quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC ..................................................................................................................... 28

1.2.5.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký ............................................. 29

1.2.5.2. Tính đặc hiệu (Specificity) ........................................................... 29

1.2.5.3. Độ đúng (Accuracy) .................................................................... 30

1.2.5.4. Độ chính xác (Precision) ............................................................. 30

1.2.5.5. Khoảng nồng độ tuyến tính (Range) ............................................ 31

1.2.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD: Detection Limit) ................................ 32

1.2.5.7. Độ thô (Robustness) .................................................................... 33

1.2.5.8. Khả năng áp dụng của phương pháp (Scope) ............................. 33

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CARATENOID .............................................................................................. 33

1.3.1. Định lượng carotenoid bằng phương pháp đo quang UV-Vis ........... 33

1.3.1.1. Định lượng sản phẩm carotenoid tinh chế .................................. 33

1.3.1.2. Định lượng carotenoid trong các mẫu sinh học .......................... 34

1.3.2. Định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC ............................. 34

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ..................... 38

1.4.1. Nghiên cứu quá trình xà phòng hóa lutein ester ................................ 38

1.4.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng lutein bằng phương pháp HPLC ........................................................................................................... 41

1.4.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................. 41

1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................ 45

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 48

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 48

2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 48

2.1.2. Hóa chất ............................................................................................. 48

2.2. DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ........................................................................... 49

2.2.1. Dụng cụ ............................................................................................. 49

2.2.2. Thiết bị ............................................................................................... 49

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 50

2.3.1. Cải biến phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp với lutein ester ................................................................................................... 50

2.3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch khảo sát điều kiện chạy HPLC ............. 50

2.3.1.2. Chọn thành phần pha động và chế độ rửa giải ........................... 51

2.3.1.3. Chọn tốc độ dòng ........................................................................ 53

2.3.1.4. Chọn thể tích bơm mẫu ................................................................ 53

2.3.1.5. Dựng đường chuẩn lutein ............................................................ 54

2.3.2. Thẩm định quy trình định lượng lutein .............................................. 56

2.3.2.1. Tính đặc hiệu ............................................................................... 56

2.3.2.2. Độ chụm (precision) .................................................................... 56

2.3.2.3. Độ tuyến tính của đường chuẩn – Khoảng nồng độ tuyến tính ... 57

2.3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [41] .. 57

2.3.2.5. Độ đúng. ...................................................................................... 57

2.3.3. Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định điều kiện thích hợp xà phòng hóa lutein ester .................................................................................. 58

2.3.3.1. Phương pháp tổng quát xà phòng hóa lutein ester ..................... 58

2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hiệu suất xà phòng hóa lutein ester ....... 58

2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa lutein ester đến đến hiệu suất xà phòng ............................................................................. 59

2.3.3.4. Thử nghiệm quy trình xà phòng hóa lutein ester ......................... 60

2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................. 61

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 62

3.1. CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN TRONG HỖN HỢP CHỨA LUTEIN ESTER ............................................................. 62

3.1.1. Chọn thành phần pha động ................................................................ 62

3.1.2. Chọn tốc độ dòng ............................................................................... 66

3.1.3. Chọn thể tích bơm mẫu ..................................................................... 70

3.1.4. Kết luận về điều kiện phân tích hỗn hợp lutein và lutein ester ......... 73

3.2. DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN .................. 74

3.2.1. Xác định độ tinh khiết của mẩu lutein đối chứng .............................. 74

3.2.2. Kết quả dựng đường chuẩn lutein ..................................................... 74

3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG ĐÃ XÂY DỰNG ............................................................................................................ 76

3.3.1. Tính đặc hiệu của phương pháp phân tích ......................................... 76

3.3.2. Độ lặp lại trong ngày (intra-day injection repeatability) ................... 78

3.3.3. Khoảng tuyến tính của đường chuẩn ................................................. 78

3.3.4. Xác định LOD và LOQ ..................................................................... 80

3.3.5. Xác định độ thu hồi ........................................................................... 80

3.3.6. Kết luận về việc thẩm định phương pháp HPLC đã xây dựng .......... 81

3.4. NHẬN BIẾT PEAK LUTEIN VÀ LUTEIN ESTER ............................. 82

3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐÃ THỬ NGHIỆM ĐỂ XÁC

ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ HOA CÚC VẠN THỌ ....................................... 84

3.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ oleoresin ..................................................... 84

3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa .............. 85

3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa .......... 88

3.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa ......... 92

3.5.5. Kết luận về khảo sát điều kiện xà phòng hoá .................................... 96

3.6. THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ .................................. 96

3.6.1. Thử nghiệm trên mẫu lớn .................................................................. 96

3.6.2. Thử nghiệm trên mẫu thêm chuẩn ..................................................... 97

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 98

4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................. 98

4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 100

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Lutein là một sắc tố carotenoid có màu vàng cam, là dẫn xuất 3,3’-diol

của b,e-caroten. Lutein có trong nhiều loài thực vật (cải bó xôi, bông cải xanh,

rau ngót, hoa, quả, rong, tảo…) và trong mô của một số loài động vật (lòng đỏ

trứng và da của gia cầm, da cá cảnh…) [1]. Lutein - cùng với đồng phân của

nó là zeaxanthin - là các sắc tố tập trung ở hoàng điểm của mắt người với hàm

lượng cao, có vai trò quan trọng trong việc xử lý hình ảnh, phát triển của thần

kinh thị giác và não bộ [2]. Nhiều nghiên cứu dịch tể học gần đây đã chứng

minh rằng lutein có khả năng bắt giữ oxy đơn và các gốc tự do, hấp thụ mạnh

tia tử ngoại. Nhờ đó, lutein có tác dụng bảo vệ cơ thể khỏi một số bệnh ung thư, bệnh tim mạch, ngăn ngừa triệu chứng lão hóa và các bệnh về mắt ở

người cao tuổi (bệnh đục thủy tinh thể, thoái hóa hoàng điểm) [3]. Do vậy,

lutein đang được quan tâm nghiên cứu khai thác từ các nguồn tự nhiên nhằm

ứng dụng trong trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm (làm

thuốc bổ mắt, vi chất dinh dưỡng, kem chống nắng, son dưỡng môi, chất màu

thực phẩm...) [4]

Hiện nay, nguồn nguyên liệu tự nhiên giàu lutein nhất là hoa cúc vạn

thọ châu Mỹ (Tagetes erecta L.). Lutein tồn tại trong hoa cúc vạn thọ dưới

dạng monoester hay diester của các acid béo (acid myristic, palmitic…). Hàm

lượng carotenoid tổng số trong cánh hoa chiếm khoảng 0,1 – 0,2% (tính theo

trọng lượng khô), trong đó lutein chiếm trên 80% [5]. Theo các quy trình

truyền thống, lutein ester từ hoa cúc vạn thọ thường được chiết bằng hexan;

dịch chiết được cô đặc dưới áp suất thấp để thu được một dạng dầu sệt (gọi là

oleoresin), sau đó được xà phòng hóa bằng KOH trong alcol để chuyển thành

dạng lutein tự do – là dạng cơ thể người có thể hấp thụ. Một số quy trình xà

phòng hóa lutein ester đã được đề nghị như các quy trình của Ausich (1997)

[6], Kumar (2004) [7], Swaminathan (2009) [8], Sankar (2012) [9] … Các

quy trình trên chưa có sự nhất quán về điều kiện phản ứng (nồng độ oleoresin,

nồng độ KOH, nhiệt độ, thời gian) cũng như chưa có đầy đủ thông tin về hiệu

suất xà phòng hóa. Hơn nữa, công đoạn xà phòng hóa thường được tiến hành

ở nhiệt độ cao (50 – 600C hoặc 70 – 800C) và trong thời gian khá dài (3 giờ – 10 giờ); điều này có thể gây ra sự phân hủy đáng kể lutein do lutein là một

hợp chất kém bền nhiệt. Nguyên nhân là do các tác giả trên đã sử dụng các

phương pháp khác nhau (sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao) để theo

dõi tiến trình phản ứng hoặc định lượng lutein trong hỗn hợp xà phòng hóa.

Thực tế này dẫn đến sự bối rối đối với người nghiên cứu trong việc chọn lựa

quy trình xà phòng hóa lutein ester ứng dụng cho các mục đích phân tích

lutein ở quy mô phòng thí nghiệm hoặc nhằm thu nhận lutein tự do từ cao

chiết lutein ester ở quy mô công nghiệp. Để làm sáng tỏ vấn đề trên, cần khảo

sát đầy đủ và hệ thống hơn về ảnh hưởng của các yếu tố phản ứng đến hiệu

suất chuyển hóa lutein ester thành lutein tự do, từ đó đưa ra quy trình thích

hợp cho phép xà phòng hóa lutein ester với hiệu suất cao và sản phẩm chất

lượng cao. Muốn vậy, cần sử dụng một phương pháp phân tích đáng tin cậy

cho phép định lượng lutein tự do trong hỗn hợp xà phòng hóa lutein ester

chiết tách từ hoa cúc vạn thọ.

Cho đến nay, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vẫn

được xem là một phương pháp hiệu quả để phân tích hỗn hợp carotenoid [10].

Nhiều quy trình phân tích sử dụng phương pháp HPLC đã được xây dựng để

phân tích hỗn hợp carotenoid trên các đối tượng khác nhau, trong đó có thể sử

dụng cột sắc ký pha thường (cột silica, cột cyanopropyl...) hay pha đảo (cột

C18, C30) với đầu dò tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), đầu dò dãy diode quang

(PDA), đầu dò khối phổ (MS), hoặc đầu dò cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

[10]. Trong số đó, phương pháp HPLC sử dụng cột silica là phương pháp đã

được JECFA sử dụng như là phương pháp tiêu chuẩn để định lượng lutein và

zeaxanthin trong các sản phẩm lutein tách chiết từ hoa cúc vạn thọ [11][12].

Tuy nhiên, ở Việt Nam với điều kiện khí hậu có độ ẩm cao, cột silica dễ hút

ẩm và do đó rất nhạy cảm với sự thay đổi thành phần nước trong pha động

chạy sắc ký, kết quả là thời gian lưu khó lặp lại [13]. Đối với các cột pha đảo,

cột C30 có ưu điểm là cho phép phân tách rất hiệu quả nhiều hỗn hợp

carotenoid phức tạp nhưng lại khá đắt tiền. Do đó, cột pha đảo C18 thường

được ưu tiên lựa chọn khi phân tích hỗn hợp carotenoid không quá phức tạp.

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu xây dựng phương pháp

HPLC định lượng lutein và hỗn hợp các carotenoid khác nhau sử dụng cột C18

[14] nhưng các phương pháp này không phù hợp với điều kiện sẵn có ở phòng

thí nghiệm của chúng tôi (hoặc về các thông số của cột sắc ký, hoặc về thành

phần pha động, …). Tại Việt Nam, rất ít nghiên cứu về định lượng carotenoid

bằng phương pháp HPLC. TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) đã sử dụng cột C18

(150 x 4,6 cm; 5 µm) với đầu dò PDA để xây dựng phương pháp RP-HPLC

khá hiệu quả và thuận tiện cho phép định lượng astaxanthin và hỗn hợp

carotenoid đi kèm (lutein, zeaxanthin, b-caroten, lycopen, astaxanthin ester)

trong đối tượng giáp xác thủy sản [13]. Trong nghiên cứu của Trương Ngọc

Bảo Hiếu và Ngô Văn Tứ đã xây dựng phương pháp phân tích b-carotene trong một số loại ngũ cốc có màu bằng cách sử dụng cột C18 (150 x 4,6 cm,

5µm). Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của chúng tôi hiện chỉ có cột pha đảo C18

(250 x 4,6 cm; 5 µm) và đối tượng nghiên cứu trong luận văn hướng tới

không phù hợp với các nghiên cứu trên. Do đó, việc cải biến phương pháp

HPLC định lượng carotenoid sẵn có sao cho phù hợp với điều kiện phòng thí

nghiệm và đối tượng phân tích cụ thể là vấn đề đặt ra đối với người làm công

tác phân tích. Vì vậy, trong đề tài này chúng tôi sẽ nghiên cứu cải biến

phương pháp HPLC nói trên để định lượng lutein và theo dõi quá trình xà

phòng hóa lutein ester.

2. Mục đích của đề tài

- Cải biến phương pháp RP-HPLC sử dụng cột C18 (250 x 4,6 cm;

5µm) phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, cho phép định lượng lutein

trong sự có mặt của hỗn hợp lutein ester.

- Xác định điều kiện thích hợp cho việc xà phòng hóa lutein ester

chiết tách từ hoa cúc vạn thọ dựa trên việc ứng dụng phương pháp HPLC đã

cải biến thông qua việc xác định hiệu suất xà phòng hoá và độ tinh khiết của

sản phẩm lutein tự do thu được.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Hoa cúc vạn thọ Mỹ Tagetes erecta L. được

trồng trong dự án đề tài cấp tỉnh của TS. Hoàng Thị Huệ An.

Phạm vi nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, chúng tôi kế thừa một số

kết quả nghiên cứu trước đây của TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) [13] và xây

dựng phương pháp HPLC phù hợp để định lượng lutein, từ đó ứng dụng kiểm

soát quá trình xà phòng hoá lutein ester.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Cung cấp dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của điều kiện sắc ký đến khả

năng định lượng lutein khi có mặt hỗn hợp lutein ester bằng phương pháp

HPLC sử dụng cột C18 (250 x 4,6 cm; 5 µm).

- Cung cấp dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa

(nồng độ tác chất, nhiệt độ, thời gian) đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Cho phép định lượng lutein trong các mẫu thực tế có chứa lutein và

lutein ester bằng phương pháp HPLC với cột pha đảo C18 (250 x 4,6 cm; 5

µm).

- Góp phần hoàn thiện quy trình xà phòng hóa lutein ester ở quy mô

phòng thí nghiệm và ở quy mô công nghiệp.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ LUTEIN

1.1.1. Cấu trúc phân tử

Lutein là một sắc tố xanthophyll (tức oxycarotenoid) có nhiều ứng

dụng trong công nghiệp chất màu thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm nhờ có

màu vàng cam rất đẹp và tác dụng chống oxy hóa khá mạnh.

Lutein có công thức phân tử C40H56O2 (phân tử lượng 568,9), là dẫn

xuất 3,3’- diol của b,e-caroten và là một dạng tiền vitamin A [15]. Phân tử

lutein chứa bộ khung cấu trúc isoprenoid C40 điển hình của các carotenoid và

có 2 vòng 6 cạnh ở hai đầu mạch carbon. Chuỗi liên kết đôi liên hợp trong

lutein có thể tồn tại ở cấu hình cis hoặc trans, do đó tạo ra số lượng lớn đồng

phân mono-cis và poly-cis của lutein.

Trong tự nhiên lutein thường tồn tại ở dạng đồng phân hình học bền

nhất là dạng all-trans (hình 1.1) [15], [16].

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) [15]

Tuy nhiên, dưới tác dụng của bức xạ nhiệt hay ánh sáng, dạng all-trans

có thể bị chuyển hóa thành các dạng đồng phân cis, trong đó bền hơn cả là các

dạng 9-cis, 13-cis và 15-cis hay 9’-cis, 13’-cis, 15’-cis…(Hình 1.2.).

a) Đồng phân 9-cis- lutein b) Đồng phân 13-cis- lutein

c) Đồng phân 15-cis- lutein

Hình 1.2. Một số dạng đồng phân cis thường gặp của lutein [15]

Ngoài ra, trong tự nhiên cũng tồn tại một dạng đồng phân vị trí khác

của lutein là zeaxanthin (Hình 1.3).

Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của Zeaxanthin (b, b’-carotene - 3,3’-diol) [15]

1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của lutein

1.1.2.1. Tính chất vật lý

Lutein có thể tồn tại ở dạng bột chảy vô định hình hoặc kết tinh dạng

tinh thể hình kim, khối lăng trụ, đa diện hoặc dạng lá hình thoi [17]. Nhiệt độ nóng chảy 1900C.

Lutein là chất ít phân cực nên không tan trong nước, kém tan trong các dung môi hữu cơ phân cực (như methanol, ethanol…), nhưng tan tốt hơn

trong dung môi hữu cơ phân cực trung bình (acetone, ethyl acetate,

dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran...) [17][18].

Phân tử lutein có 10 nối đôi liên hợp nên hấp thụ mạnh tia tử ngoại và

ánh sáng xanh (400 - 490 nm), do đó lutein ở dạng bột có màu đỏ cam và ở

dạng dung dịch có màu vàng cam rất đẹp. So với zeaxanthin (có 11 nối đôi

liên hợp), các cực đại hấp thụ (λmax) của lutein thấp hơn khoảng 4 - 6 nm. Nhờ

đó, có thể phân biệt khá dễ dàng lutein và zeaxanthin dựa vào phổ hấp thụ

UV-Vis của chúng (Bảng 1.1).

Bảng 1.1. Dữ kiện hấp thụ UV-Vis của lutein và zeaxanthin

%1 1cmA

Hệ số hấp thụ Cực đại hấp thụ Carotenoid Dung môi ( ) (λmax, nm)

Chloroform 435 458 485 -

Ethanol 422 445 474 2550 Lutein Hexane 421 445 474 2480

Acetone 430 452 479 2340

462 493 Chloroform 433 -

Zeaxanthin 428 450 478 Ethanol 2480 (2540)

Hexane 424 449 476 2348

Nguồn: “Britton (1995) and Davies (1976)” [19]

Sự chuyển hóa lutein từ dạng trans thành dạng đồng phân mono-cis dẫn

đến sự giảm cường độ hấp thụ và giảm λmax khoảng 2 - 6 nm, đồng thời làm

xuất hiện đám hấp thụ cis (gọi tắt là peak cis) ở vùng UV gần 320 - 380 nm.

Cường độ hấp thụ của peak cis càng lớn khi liên kết đôi có cấu hình cis càng

gần tâm phân tử. Do vậy, cường độ hấp thụ của peak cis- ở đồng phân 15-cis

mạnh nhất. Nhờ đó, có thể nhận biết các đồng phân cis- bằng phương pháp

HPLC với đầu dò PDA [20][21].

1.1.2.2. Tính chất hóa học

Lutein thuộc họ carotenoid, trong phân tử có chuỗi polyen liên hợp nên

rất nhạy cảm đối với acid, các ion kim loại, chất oxy hoá, ánh sáng, nhiệt…

Nhóm hydroxyl ở hai đầu phân tử làm cho lutein dễ dàng tham gia vào các

phản ứng oxy hóa. Nhờ đó, nó có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn một số

carotenoid khác (như lycopen, b-caroten…). Vì vậy, lutein dễ bị oxi hóa bởi

oxy không khí, hấp thụ mạnh các gốc tự do hoặc bị đồng phân hóa bởi nhiệt

và ánh sáng, dẫn đến sự nhạt màu hay mất màu. Do đó, lutein cần được bảo

quản trong môi trường khí trơ hay chân không dưới nhiệt độ thấp, tránh ánh

sáng mặt trời.

Lutein khá bền trong môi trường kiềm [22]. Trong môi trường kiềm, lutein ester bị xà phòng hóa tạo thành lutein tự do. Để tránh sự oxy hóa lutein

bởi oxy không khí nên thực hiện phản ứng xà phòng hóa lutein ester dưới khí

trơ N2.

Trong các mô động - thực vật lutein có khả năng liên kết với các acid

béo, lipid, lipoprotein tạo thành các cấu trúc bền vững hơn so với dạng lutein

tự do [23].

1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của lutein

1.1.3.1. Hoạt tính sinh học của lutein

Phần lớn chức năng sinh học của chất màu lutein đều dựa trên khả năng

hấp thụ ánh sáng, khả năng dễ bị oxy hóa và khả năng bắt giữ các gốc tự do

của phân tử lutein.

Lutein có khả năng hấp thụ tia tử ngoại và ánh sáng xanh trong dải bức

xạ khả kiến, do đó có khả năng bảo vệ da, mắt khỏi tác hại của các bức xạ

này, ngăn ngừa ung thư da, thoái hóa điểm vàng [3], [24].

Người ta cho rằng các gốc tự do sinh ra trong tế bào và mô trong hoạt

động sống của con người có thể gây tác hại đến DNA, protein, carbohydrate

và lipid . Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng lutein có tác động loại trừ sự

xâm nhập của chất oxy hóa và gốc tự do qua màng tế bào, giúp ngăn chặn sự

oxy hóa lipid, hạn chế sự suy giảm khả năng miễn dịch đối với cơ thể, ngăn

ngừa những chứng bệnh hiểm nghèo như ung thư, tim mạch, một số bệnh về

mắt (thoái hóa võng mạc do tuổi già, đục thủy tinh thể viêm màng bồ đào…)

[19]. Tác dụng này của lutein nhờ vào khả năng bắt giữ các chất oxy hóa và

các gốc tự do sinh ra trong tế bào [26]. Khả năng chống oxy hóa của lutein có

thể được giải thích bởi cấu trúc hóa học đặc biệt của nó với chuỗi polyen rất

dễ bị oxy hóa. Ngoài ra, hai nhóm hydroxyl ở 2 vòng sáu đầu mạch trong

phân tử lutein làm cho hoạt tính chống oxy hóa của lutein trở nên mạnh hơn

so với các carotenoid khác (như lycopene, b-carotene, …) [27].

1.1.3.2. Ứng dụng của lutein Ø Trong công nghiệp thực phẩm

Nhờ có màu vàng rất đẹp lutein được phép sử dụng làm chất màu trong chế biến thực phẩm (mã số E161b). Lutein ở dạng chế phẩm hòa tan trong

nước được sử dụng để nhuộm vỏ ngoài cho giò chả, các bán thành phẩm từ

thịt gà, sữa chua, bánh nướng, kẹo, nước giải khát, nước ép trái cây, ngũ cốc

điểm tâm, các sản phẩm từ sữa, trứng, thực phẩm cho trẻ sơ sinh và trẻ mới

biết đi, chất béo, dầu, nước thịt, nước sốt và súp hỗn hợp [28].Theo quy định

của EU, Canada, Úc, New Zealand … lutein có thể được sử dụng với mức 0,5

- 2 mg/ngày [29].

Ø Trong công nghiệp dược phẩm

Ngoài khả năng tạo màu, lutein còn có tác dụng chống oxy hóa, hấp thụ

gốc tự do và tia tử ngoại, làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch, giúp duy trì

sức khỏe tim mạch, ngăn ngừa ung thư [24]. Lutein là carotenoid chủ yếu có

ở điểm vàng, giúp cải thiện khả năng truyền tin qua khe kết nối trong võng

mạc, rất cần thiết cho quá trình xử lý hình ảnh và sự phát triển của thần kinh

thị giác [31]. Đặc biệt, những nghiên cứu gần đây của tập đoàn dinh dưỡng

hàng đầu thế giới là DSM (Thụy Sĩ) đã phát hiện lutein chiếm đến 66 - 77%

lượng carotenoid hình thành não bộ của người, có chức năng quan trọng trong

việc phát triển và kích thích khả năng học hỏi, sự hình thành cảm xúc và ghi

nhớ của trẻ em, cải thiện tình trạng suy giảm chức năng nhận thức ở người

cao tuổi [32]. Do vậy, lutein cũng đã được đưa vào trong thành phần của một

số thuốc bổ (liều dùng 2 - 330 mg/kg), trong sữa cho bé, trong thuốc bổ cho

người cao tuổi.

- Lutein là chất ức chế khối u: Lutein cũng đã được cho là có tác dụng

làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch và ngăn ngừa một số dạng ung thư

(như ung thư vú, cổ tử cung) do khả năng chống oxy hoá khá tốt. Một nghiên

cứu của Đại học Tufts (Boston, Massachusetts) và các nhà điều tra Hàn Quốc

cho thấy, phụ nữ có nồng độ lutein trong máu ở mức cao nhất thì khả năng

ung thư vú giảm 88% [8].

– Lutein là chất ức chế sự tắc nghẽn mạch máu, viêm khớp, thậm chí

có thể giúp giảm đau viêm xương khớp và tàn tật ở 16 triệu người Mỹ. Các

nhà nghiên cứu tại Viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ gần đây đã phát hiện ra rằng

những người có nồng độ lutein cao trong máu (khoảng 70%) ít có khả năng bị

viêm khớp đầu gối và các mô liên kết khác [33].

– Lutein làm giảm các rối loạn mắt như thoái hóa điểm vàng, đục thủy

tinh thể. Ở người, lutein và zeaxanthin tập trung ở điểm vàng của mắt cũng

như ở da, vú và mô cổ tử cung. Lutein được coi là một vi chất dinh dưỡng cần

thiết cho thị lực bình thường [30][34]. Được sử dụng chủ yếu trong các sản

phẩm chăm sóc mắt để làm giảm mệt mỏi thị giác, giảm tỷ lệ mắc chứng thoái

hóa điểm vàng do tuổi già (AMD: Age-related macular degeneration), đục

thủy tinh thể, bệnh võng mạc…

Ø Trong công nghiệp mỹ phẩm

Lutein chủ yếu được sử dụng để chống nếp nhăn và bảo vệ da khỏi tác

hại của tia cực tím. Lutein và lutein ester có thể dễ dàng thâm nhập vào da và

cho hiệu quả chống nắng tốt [35]. Một số chế phẩm kem chống nắng công

thức thảo dược chứa lutein ester chiết suất từ Tagetes erecta L. đã được sản

xuất. [36].

Ø Trong chăn nuôi

Lutein được dùng để làm chất phụ gia trong chế biến thức ăn nuôi cá

cảnh, thức ăn cho gia súc và gia cầm để tạo màu vàng cho da gà và lòng đỏ trứng…

1.1.4. Các nguồn lutein quan trọng trong tự nhiên

Lutein là carotenoid rất phổ biến trong nhiều loài động – thực vật. Các

loại thực phẩm chứa nhiều lutein như cải spina, súp lơ xanh, cải xoăn, bắp,

trái kiwi, lòng đỏ trứng gà, trong một số loài rong, tảo... Đặc biệt, hoa cúc vạn

thọ Mỹ (Tagetes erecta L.) có khả năng tích lũy lutein với hàm lượng rất cao.

Nhiều nghiên cứu cho thấy cánh hoa cúc vạn thọ chứa khoảng 1,0 – 1,6%

carotenoid tổng số (tính theo trọng lượng khô), trong đó khoảng 90% lượng

carotenoid này là lutein ester (dưới dạng monoester và diester của các acid

béo C12 - C18 như acid lauric, myristic, oleic, linoleic, palmitic, stearic) và

chỉ có khoảng 5% là zeaxanthin ester (Kumar, 2004) [7]. Lutein dưới dạng

ester rất bền nhưng khi vào cơ thể con người chỉ bị thủy phân một phần thành

dạng tự do rồi mới được hấp thụ vào huyết thanh. Vì vậy, để tạo ra những chế

phẩm lutein bổ sung cho con người, lutein ester cần phải được thuỷ phân về

dạng lutein tự do [37].

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC

1.2.1. Khái niệm về phương pháp sắc ký

Sắc ký là kỹ thuật tách hỗn hợp phân tích thành các cấu tử riêng rẽ dựa

trên ái lực khác nhau của các cấu tử này giữa 2 pha không trộn lẫn, trong đó

một pha đứng yên (được gọi là pha tĩnh) và một pha còn lại là pha động.

Pha tĩnh có thể là các hạt rắn xốp, mịn hay cũng có thể là pha lỏng

được gắn kết trên bề mặt của các hạt giá thể rắn nào đó. Pha tĩnh có thể được

nhồi vào một cột bằng thủy tinh hay inox (sắc ký cột) hoặc tráng trên bản

mỏng (bằng nhựa hay nhôm). Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản

chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có

sắc ký hấp phụ, là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion, là chất lỏng ta

có sắc ký phân bố, là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử.

Để rửa giải chất phân tích ra khỏi pha tĩnh cần có một pha động. Pha

động ở trạng thái lỏng (gọi là sắc ký lỏng), trạng thái khí (sắc ký khí) hay

trạng thái siêu tới hạn (sắc ký siêu tới hạn).

Trong quá trình sắc ký, mẫu phân tích được nạp lên đầu cột pha tĩnh,

sau đó cho pha động dịch chuyển liên tục qua pha tĩnh. Trong quá trình này,

cấu tử nào có ái lực với pha tĩnh càng mạnh sẽ bị lưu giữ càng chặt trên pha

tĩnh, do đó tốc độ di chuyển càng chậm. Ngược lại, cấu tử có ái lực yếu với

pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn. Nếu chiều dài pha tĩnh đủ lớn thì sau một

thời gian các cấu tử phân tích sẽ được tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột. Quá

trình tách hỗn hợp phân tích được lưu giữ trên pha tĩnh bằng cách cho một

pha động di chuyển liên tục qua pha tĩnh như trên được gọi là sự rửa giải. Nếu

đầu ra của cột sắc ký được ghép nối với một detector có khả năng ghi nhận

một tín hiệu vật lý đặc trưng nào đó của các cấu tử phân tích (ví dụ: độ hấp

thụ ánh sáng, chiết suất, độ dẫn điện, cường độ phát huỳnh quang, ...) và biểu

diễn sự thay đổi của nồng độ chất phân tích (Cx) theo thời gian rửa giải (t), ta

sẽ thu một sắc ký đồ chứa các peak sắc ký (Hình 1.4).

Hình 1.4. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B [38]

Trong sắc ký cột cổ điển sử dụng pha động là pha lỏng (sắc ký lỏng),

kích thước các hạt pha tĩnh vào khoảng 50 – 230 µm. Thực tế cho thấy với

kích thước hạt pha tĩnh như vậy hiệu quả tách không cao, thường chỉ cho

phép tách những hỗn hợp chứa ít cấu tử và có ái lực với pha tĩnh khác nhau

khá nhiều. Để tách những hỗn hợp cấu tử phức tạp (chứa nhiều cấu tử hoặc ái

lực với pha tĩnh khác nhau không nhiều) cần tăng chiều dài đường đi của các cấu tử trên pha tĩnh bằng cách giảm kích thước các hạt pha tĩnh xuống khoảng

3 - 5 μm. Tuy nhiên, khi đó pha tĩnh được nén rất chặt nên phải hệ thống bơm

cao áp để đẩy pha động đi qua cột pha tĩnh. Kết quả là hình thành một kỹ

thuật sắc ký mới là sắc ký lỏng cao áp (High pressure liquid chromatography)

hay chính xác hơn là sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography), viết tắt là HPLC.

1.2.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị HPLC

Thiết bị HPLC gồm những bộ phận quan trọng sau (Hình 1.5):

Hình 1.5. Sơ đồ thiết bị HPLC [38]

1- Bình chứa dung môi pha động 2- Bộ phận khử khí 3- Bơm cao áp 4- Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler)

5- Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều

nhiệt

6- Đầu dò detector (nhận tín hiệu) 7- Hệ thống máy điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số

liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống

8- Thiết bị in dữ liệu

1.2.2.1. Bình đựng dung môi pha động

Thiết bị HPLC thường có 4 kênh dung môi đi vào đầu bơm cao áp, cho phép tạo ra các hệ pha động có thể chứa từ 1 – 4 dung môi để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn.

Tất cả dung môi, hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm phải là

hóa chất tinh khiết cho sắc ký lỏng (HPLC grade).

Mẫu trước khi bơm vào thiết bị phân tích phải được lọc qua màng lọc

0,2 – 0,45 µm nhằm tránh làm hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra

các peak tạp trong quá trình phân tích [39]

1.2.2.2. Bộ phận khử khí

Bộ phận khử khí nhằm loại trừ các bọt khí nhỏ còn sót lại trong dung

môi pha động. Nếu trong quá trình phân tích pha động còn bọt khí thì bơm sẽ

hút các dung môi trong pha động không đúng tỷ lệ, do đó sẽ làm thay đổi thời

gian lưu của các peak. Nếu bọt khí còn quá nhiều và bộ khử khí không thể

loại trừ hết được thì có thể bơm sẽ không hút được dung môi, áp suất sẽ

không lên và thiết bị sắc ký sẽ ngừng hoạt động [39].

1.2.2.3. Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình tách sắc ký. Tốc

độ bơm thường được cài đặt hằng định theo thông số đã lựa chọn. Bơm phải

tạo được áp suất cao khoảng 3000 – 6000 psi hoặc 250 – 500 atm và bơm

phải tạo dòng dung môi liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 – 9,999 ml/phút. Hiện

nay đã có nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar. Các máy sắc ký

lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar [39].

1.2.2.4. Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích với dung tích từ 5 – 100 µl. Có 2 cách

tiêm mẫu vào cột: tiêm bằng tay (dùng syringe) và tiêm tự động (dùng

autosampler).

1.2.2.5. Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu

năng cao. Cột pha tĩnh thường được làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột

khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong 1 – 10 mm, hạt chất nhồi cột cỡ 5 – 10

µm. Với chất nhồi cột cỡ 1,8 – 5 µm có thể dùng cột ngắn 3 – 10 cm và nhỏ

(đường kính trong 1 – 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao. Ngoài ra,

còn có một số cột dùng kích thước và kích cỡ hạt đặc biệt.

Chất nhồi cột tùy theo loại cột và kiểu sắc ký. Chất nhồi cột có thể là

silicagel (cột pha thường) hoặc silicagel đã được silan hóa hoặc được bao một

lớp mỏng hợp chất hữu cơ (cột pha đảo). Ngoài ra, người ta còn dùng các loại

pha tĩnh khác như nhôm oxid, polymer xốp, chất trao đổi ion [39].

1.2.2.6. Đầu dò

Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi

chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và

định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng

loại detector thích hợp và phải thỏa mãn điều kiện cường độ tín hiệu phụ

thuộc tuyến tính vào nồng độ trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân

tích.

A = k.C

trong đó:

A: là tín hiệu đo được;

C: nồng độ chất cần phân tích

k: hằng số thực nghiệm của detector đã chọn

Tín hiệu này có thể là độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ

điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất... Trên cơ sở đó, người ta đã chế

tạo ra detector tử ngoại - khả kiến UV-Vis (bước sóng từ 190 đến 900 nm)

hay detector dãy quang diod (DAD: Diod Array Detector), detector huỳnh

quang (FlD: Fluorescence Detector; để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh

quang tự nhiên hay dẫn chất có huỳnh quang), detector tán xạ ánh sáng bay

hơi (ELSD: Evaporative Light Scatterring detector), detector điện hóa (đo

dòng, độ dẫn, điện lượng...), detector chiết suất (RID: Refractive Index

Detector), detector điện hóa (đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt….). Hiện đại

hơn cả là detetor khối phổ (MSD: Mass Spectrometer), detector NMR.

1.2.2.7. Bộ phận ghi tín hiệu

Là bộ phận ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Trong các

máy HPLC thế hệ cũ thì sử dụng máy in đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời

gian lưu, diện tích peak, chiều cao peak... Các máy thế hệ mới đều dùng phần

mềm chạy trên máy tính, nó có thể lưu tất cả các thông số của mẫu, phổ đồ và

các thông số của peak (như tính đối xứng, hệ số phân giải...) trong quá trình

phân tích, đồng thời xử lý và tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử

dụng như nồng độ, % độ lệch chuẩn... [39]

1.2.2.8. Thiết bị in dữ liệu

Sau khi đã phân tích xong các mẫu, phần mềm sẽ tự động tính toán và

ta sẽ in kết quả ra giấy để hoàn thiện hồ sơ.

1.2.3. Các đại lượng đặc trưng cơ bản trong HPLC

1.2.3.1. Thời gian lưu - Thời gian lưu thực

Thời gian lưu của một chất (ký hiệu tr) là thời gian tính từ khi bơm mẫu

vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

Bản chất phân tử của chất tan.

- - Điều kiện chạy sắc ký: bản chất pha tĩnh; bản chất, thành phần,

pH và tốc độ của pha động; nhiệt độ cột.

Để đánh giá thời gian lưu thực của một cấu tử trong pha tĩnh cần phải

dùng thời gian lưu thực (ký hiệu: tr’):

tr’ = tr – t0

trong đó:

t0: là thời gian cần thiết để pha động (hay một cấu từ hoàn toàn không

bị lưu giữ) đi từ đầu cột đến detector

Trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn thì thời gian lưu thực của mỗi

chất là hằng định và các chất khác nhau sẽ có thời gian lưu khác nhau. Vì vậy,

dựa vào thời gian lưu để nhận biết sự có mặt của các chất.

Trong một phép phân tích nếu t’r nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu t’r

quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích

rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hóa chất,

độ chính xác của phép phân tích kém.

Hình 1.6 là sắc ký đồ khi rửa giải của 2 chất A và chất B. Chất A được

rửa giải ra trước với thời gian lưu trA ; chất B được rửa giải ra sau với thời

gian trB.

Hình 1.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp 2 cấu tử A và B [16]

Trong đó:

t0: thời gian lưu chết

trA: thời gian lưu chất A t’rA : thời gian lưu thực chất A

trB: thời gian lưu chất B t’rB: thời gian lưu thực chất B

1.2.3.2. Hệ số dung lượng

Hệ số dung lượng (ký hiệu: k’) của một chất cho biết khả năng phân bố

của chất đó giữa pha tĩnh và pha động và được tính bằng tỷ số giữa lượng chất

' r

- t

t t

tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.

Nếu k’ nhỏ thì tr cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu k’ lớn thì peak bị

doãng. Trong thực tế thì k’ = 1 – 5 là tối ưu.

1.2.3.3. Độ chọn lọc

Độ chọn lọc (ký hiệu: α) cho biết hiệu quả tách hai chất A và B bởi hệ

k k

' BR , ' AR ,

' B ' A

thống sắc ký.

α càng khác 1 thì khả năng tách càng tốt.

Hình 1.7 mô tả ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách của hai

chất A và B; với a = 1.02 các peak bị dính lại nên hiệu quả tách không cao,

với a = 1,2 thì các peak tách rời nhau cho thấy hiệu quả tách cao hơn.

Hình 1.7. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách của hai chất A và B [38]

1.2.3.4. Số đĩa lý thuyết

Số đĩa lý thuyết (ký hiệu: N) là đại lượng biểu thị hiệu năng tách của

cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Theo lý thuyết đĩa, cột sắc ký có thể

xem gồm nhiều đĩa lý thuyết có chiều cao là H, tại mỗi đĩa ứng một cân bằng

nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh

H =

L N

và pha động:

(L: chiều dài của pha tĩnh nhồi trong cột sắc ký)

Đối với peak có dạng phân bố chuẩn Gauss thì:

t W

2/1

æ çç 54,5 è

ö ÷÷ ø

trong đó: W1/2 là độ rộng tại ½ chiều cao của peak

)

(

2 C

d 2 l

2 f D

2 ddf P D

2 D g u

é ê ê ë

ù ú ú û

Theo Van Deemter:

trong đó:

dP: kích thước hạt pha tĩnh

df: độ dày lớp phủ lỏng trên pha tĩnh

dC: đường kính cột

λ: thông số phụ thuộc kích thước hạt và độ đồng nhất của pha tĩnh

g: thông số phụ thuộc khoảng cách giữa các hạt

k: hằng số đặc trưng cho quá trình chuyển khối

DM: hệ số khuếch tán trong pha động

DS: hệ số khuếch tán của cấu tử phân tích trong pha tĩnh

: tốc độ trung bình của pha động

Như vậy, H phụ thuộc vào đường kính và khả năng hấp phụ của hạt pha

tĩnh, tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động; hệ số khuếch tán của các

chất trong cột.

1.2.3.5. Độ phân giải

Độ phân giải (ký hiệu: R) là đại lượng biểu thị độ tách của các peak A,

t (2

)

Ar ,

1 4

' k

k +

a æ - ç a è

Br , WW + B

æ ö ç ÷ ç ø è

ö ÷ ÷ ø

B ra khỏi nhau trong một điều kiện sắc ký đã cho [39].

trong đó: là thừa số dung lượng trung bình của 2 cấu tử A và B cạnh

nhau cần phân tách.

Trong thực tế, nếu các peak đối xứng thì để định tính (hai peak tách

nhau) thì độ phân giải tối thiểu là R = 1,0; còn để định lượng R = 1,5 là phù

hợp.

Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak sẽ

không chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3 cách sau:

bằng cách giảm lực rửa giải của pha • Tăng thừa số dung lượng

động (giảm nhiệt độ cột, thay đổi thành phần pha động, thay đổi pha tĩnh sao

cho tăng khả năng lưu giữ chất)

• Tăng số đĩa lý thuyết N của cột bằng cách dùng cột dài hơn

• Giảm chiều cao đĩa lý thuyết H bằng cách điều chỉnh tốc độ pha động để H cực tiểu; dùng cột có kích thước hạt pha tĩnh nhỏ hơn hoặc cột có

đường kính nhỏ hơn

• Làm tăng độ chọn lọc α bằng cách dùng cột khác có pha tĩnh

tương tác chọn lọc hơn với các cấu tử cần tách.

Tuy nhiên, nếu R quá lớn thì thời gian phân tích sẽ dài, tốn nhiều pha

động, độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng

chương trình gradient dung môi. Tuy nhiên, nếu dùng gradient dung môi thì

trong quá trình chạy sắc ký sự thay đổi thành phần pha động sẽ kéo theo sự

thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích các

peak phân tích. Do vậy, nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung môi

[39].

1.2.4. Cách xây dựng một quy trình phân tích HPLC

Để xây dựng một quy trình phân tích HPLC cần xác lập các điều kiện

sắc ký sao cho tối ưu hóa độ phân giải đối với các chất cần phân tích trong

một thời gian ngắn nhất có thể được. Muốn vậy, cần thực hiện các bước khảo

sát sau:

1.2.4.1. Chọn kiểu sắc ký

Tùy thuộc vào loại và tính chất chất phân tích (độ tan, phân tử lượng),

nền mẫu và điều kiện phòng thí nghiệm (có sẵn loại cột sắc ký gì) mà chọn

kiểu sắc ký phù hợp.

- Chất phân tích có phân tử lượng <2000:

* Chất phân tích tan tốt trong nước: nếu là hợp chất ion thì dùng sắc ký

trao đổi ion hay sắc ký cặp ion; nếu là hợp chất phân cực và không điện ly thì

dùng sắc ký pha đảo.

* Chất phân tích tan tốt trong dung môi hữu cơ kém phân cực (như

hexan) thì dùng sắc ký pha thường; nếu tan trong dung môi hữu cơ phân cực

trung bình (như methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran…) thì dùng sắc ký pha

đảo.

- Chất phân tích có phân tử lượng >2000: nếu tan tốt trong nước thì

dùng sắc ký lọc gel theo cơ chế trao đổi ion; nếu tan tốt trong dung môi hữu

cơ thì dùng sắc ký thấm qua gel [40].

1.2.4.2. Chọn cột sắc ký

a) Chọn pha tĩnh: dựa vào thành phần và tính chất của các cấu tử có

trong mẫu phân tích để lựa chọn. Pha tĩnh cần có tương tác vừa phải và chọn

lọc hỗn hợp chất cần phân tích.

- Để tách các chất không phân cực hay ít phân cực: dùng cột pha

thường (NP: normal phase) tức cột có pha tĩnh phân cực (ví dụ: cột silica

trung tính có chứa các nhóm –OH phân cực trên bề mặt; cột silica được ghép

dây nhánh chứa nhóm chức phân cực như cyanopropyl, aminopropyl, diol...)

- Để tách các chất không phân cực, ít phân cực hay các chất phân cực

có thể tạo cặp ion: dùng cột pha đảo (RP: reversed phase) tức là cột kém phân

cực, trong đó pha tĩnh là silica được ghép dây nhánh Ankyl mạch hở (C3; C8;

C18; C30) hay alkyl chứa vòng thơm (cột phenyl). Trong số đó, cột C18 được

sử dụng nhiều nhất do nó có khả năng tách hiệu quả những nhóm hợp chất có

phân tử lượng nhỏ từ không phân cực, phân cực trung bình và cả những hợp

chất ion.

b) Chọn kích thước cột và cỡ hạt pha tĩnh:

Nếu muốn phân tích nhanh và hiệu quả tách tốt thì dùng cột ngắn và có

kích thước hạt nhỏ (<2 µm).

Nếu cần phân tích hỗn hợp phức tạp nhiều cấu tử thì dùng cột dài hơn.

1.2.4.3. Chọn pha động

Để luận chọn pha động phù hợp cần thỏa mãn các yêu cầu sau:

- Hòa tan được hỗn hợp chất phân tích để có thể rửa giải được chúng.

- Trơ với pha tĩnh, tức không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa

học.

- Bền theo thời gian, ít nhất trong suốt thời gian phân tích mẫu.

- Có độ tinh khiết cao (dung môi cho HPLC, hóa chất tinh khiết phân

tích)

- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.

- Phải không cho tín hiệu với loại detector sử dụng. Ví dụ: Dùng

detector UV/Vis thì dung môi không được hấp thụ trong vùng bước sóng

phân tích; dùng detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang...

- Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt.

Thông thường, pha động thường có độ phân cực ngược với pha tĩnh:

- Với hệ sắc ký pha đảo (RP – HPLC) pha động thường có là tổ hợp

một số dung môi phân cực (ví dụ: nước- methanol, nước- acetonitrile...).

Ngoài ra, có thể bổ sung một số dung môi phân cực trung bình

(tetrahydrofuran, dichloromethane, isopropanol...), hoặc thêm hỗn hợp đệm

để ổn định pH, thêm chất tạo phức, tạo cặp ion... để tạo ra sự rửa giải tốt nhất

- Với hệ sắc ký pha thường (NP-HPLC) thì dùng pha động kém phân

cực (ví dụ: hexan; hỗn hợp hexan – ethyl acetate...) [39].

1.2.4.4. Chọn chế độ rửa giải

Để chọn chế độ rửa giải phù hợp, cần thử nghiệm nhiều lần để chọn

thành phần pha động (chứa tổ hợp các dung môi nào), tốc độ dòng, nhiệt độ

cột... để đạt độ phân giải tốt và peak có độ nhạy cao.

Ngoài ra, cần chọn chế độ rửa giải sao cho hiệu quả tách tốt nhưng với

thời gian ngắn nhất.

- Nếu hỗn hợp phân tích gồm các cấu tử có độ phân cực không khác

nhau nhiều thì nên rửa giải isocratic.

- Nếu hỗn hợp phân tích chứa các cấu tử có độ phân cực khác nhau

nhiều (ví dụ: gồm hợp chất phân cực trung bình và kém phân cực) thì phải rửa

giải gradient.

Việc xây dựng quy trình phân tích HPLC là công việc hết sức cần thiết,

tuy nhiên, để có một quy trình phân tích tốt đòi hỏi mất nhiều thời gian khảo

sát [39]. Trong thực tế, chúng ta thường áp dụng một số quy trình phân tích

của một nhóm hợp chất nào đó đã được phát triển bởi các chuyên gia phân

tích. Thế nhưng, việc áp dụng những quy trình này có thể cho kết quả không

mong muốn. Do đó, để đỡ mất thời gian xây dựng một quy trình phân tích

mới, chúng ta có thể cải biến (modification) quy trình có sẵn sao cho đạt hiệu

quả mong muốn. Tuy vây, các quy trình này đều cần được thẩm định trước

khi áp dụng trên đối tượng phân tích.

1.2.5. Cách thẩm định một quy trình định lượng bằng phương

pháp HPLC

Việc thẩm định quy trình phân tích nhằm chứng minh quy trình đó có

phù hợp với mục đích ứng dụng không. Theo các hướng dẫn của ICH 1994 và

1996 [Q2A: Thẩm định phương pháp phân tích: Định nghĩa và thuật ngữ,

ngày 27 tháng 10 năm 1994”; “Q2B: Thẩm định quy trình phân tích: Phương

pháp luận, ngày 6 tháng 11 năm 1996”] để thẩm định một quy trình phân tích

định lượng bằng phương pháp HPLC cần tiến hành đánh giá những tiêu chí

tiêu sau:

1.2.5.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Đánh giá sự phù hợp của thiết bị đối với việc thực hiện phương pháp

HPLC đã cho để đạt độ đúng và độ tin cậy tối thiểu.

Cách khảo sát: Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, mẫu tự tạo hay

mẫu thử (ít nhất 6 lần tiêm).

Yêu cầu cần đạt: Độ phân giải giữa peak liền kề với peak của chất cần

phân tích phải ≥ 1,5. Số đĩa lý thuyết ≥ 2000. Giá trị RSD của thời gian lưu ≤

1,0% và của diện tích peak phải ≤ 2,0% (nếu RSD >2% phải có sự giải thích

phù hợp) [41].

1.2.5.2. Tính đặc hiệu (Specificity)

Là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các

thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Trong phân tích định lượng, tính

đặc hiệu đánh giá khả năng đưa ra kết quả chính xác về hàm lượng chất phân

tích trong mẫu thử.

- Cách khảo sát:

Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau: (1) mẫu trắng (dung môi pha

động/dung môi hòa tan mẫu); (2) mẫu nền (mẫu không có chất cần phân tích);

(3) mẫu chuẩn; (4) mẫu tự tạo (mẫu không có chất cần phân tích đã được cho

thêm chất chuẩn cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình) và (5) mẫu

thử chứa chất cần phân tích được chuẩn bị theo quy trình.

Yêu cầu cần đạt:

- Trên sắc ký đồ của mẫu thử/mẫu tự tạo cho peak của chất cần phân

tích phải tách hoàn toàn khỏi các peak khác (nếu có trong nền mẫu).

- Sắc ký đồ của mẫu trắng hay dung dịch nền mẫu không xuất hiện

peak ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.

Nếu có đáp ứng peak phải ≤ 1,0% so với đáp ứng peak của mẫu chuẩn.

- Peak của chất cần phân tích trong sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh

khiết, nghĩa là hệ số chồng phổ UV-Vis của peak hoạt chất cần phân tích thu

được trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử/mẫu tự tạo với peak tương ứng

trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn ≥ 0,99 [41].

1.2.5.3. Độ đúng (Accuracy)

Là biểu diễn sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực (hoặc giá

trị trung bình) với giá trị đúng (hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận).

Cách khảo sát:

- Cách 1 (tiến hành trên mẫu tự tạo): Chuẩn bị 03 mẫu tự tạo bằng cách

thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các nền mẫu

không có chất cần phân tích (Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn

thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ

phân tích). Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập. Tính kết

quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính.

- Cách 2 (thực hiện trên mẫu phân tích) : Chuẩn bị 06 mẫu thử độc lập

với lượng chất chuẩn thêm vào ứng với mức nồng độ 100% của chất cần phân

tích.

Tính độ thu hồi (% Recovery) theo công thức:

Độ thu hồi (%) = (Lượng chất phân tích tìm lại x 100)/Lượng chất

chuẩn thêm vào

Yêu cầu đối với phép thử định lượng: Độ thu hồi (%) = 98,0 - 102,0%

[40]

1.2.5.4. Độ chính xác (Precision)

Diễn tả sự trùng hợp (hay mức độ phân tán) của các kết quả đo được từ

nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô

tả.

Độ chính xác thường được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn (SD:

standard deviation) hoặc hệ số dao động (RSD: relative standard deviation)

của một loạt phép đo.

(

)

å

1 =

%100.

RSD =

trong đó:

Độ chính xác nên được thử trên một mẫu thử thực, đồng nhất (nếu

không có mẫu đồng nhất thì có thể dùng mẫu tự tạo hoặc một dung dịch mẫu

thử).

Độ chính xác có thể chia thành 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung

gian và độ tái lặp.

a) Độ lặp lại (Repeatability): diễn tả độ chính xác của một quy trình

phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn.

Cách khảo sát: Định lượng 06 mẫu thử độc lập trong cùng ngày.

b) Độ chính xác trung gian (Intermediate precision): diễn tả mức dao

động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày

khác nhau, bởi các kiểm nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau.

Cách khảo sát: Tiến hành như độ lặp lại nhưng khác ngày/khác kiểm

nghiệm viên/khác hệ thống HPLC.

Theo hướng dẫn của AOAC, giới hạn chấp nhận phù hợp cho mẫu phân

tích ở nồng độ nhỏ (<100 ppm) là giá trị RSD kết quả định lượng của mỗi

kiểm nghiệm viên/mỗi ngày (n = 6) ≤ 3,0% và của cả hai kiểm nghiệm

viên/khác ngày (n = 12) phải ≤ 5,0%.

c) Độ tái lặp (Reproducibility): diễn tả độ chính xác giữa các phòng thí

nghiệm phối hợp nhau để tiêu chuẩn hoá phương pháp [40].

1.2.5.5. Khoảng nồng độ tuyến tính (Range)

Là khoảng cách giữa nồng độ trên và dưới của chất phân tích trong mẫu thử trong đó quy trình phân tích đã được chứng minh đáp ứng độ chính xác, độ đúng và tính tuyến tính.

Cách khảo sát: Tiến hành sắc ký 5 - 8 dung dịch chuẩn. Xác định

phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn

có trong mẫu và đáp ứng peak thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp

bình phương tối thiểu.

Yêu cầu cần đạt: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995).

(Nếu r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp)

1.2.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD: Detection Limit)

Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà một quá trình phân tích có

thể phân biệt một cách đáng tin cậy với nhiễu nền.

LOD thường được xác định bằng nồng độ chất phân tích ứng với peak

có diện tích gấp 3 lần độ lệch chuẩn của nền khi phân tích mẫu trắng.

Giới hạn định lượng (LOQ: Quantitation Limit): là nồng độ nhỏ nhất

của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và

độ chính xác thích hợp. LOQ thường được tính bằng nồng độ chất phân tích

ứng với peak có diện tích gấp 10 lần độ lệch chuẩn của nền khi phân tích mẫu

trắng [41].

LOD và LOQ có thể xác định theo 1 trong 2 cách:

- Cách 1: Pha loãng dung dịch chuẩn đến lúc diện tích peak của

chất phân tích gấp 3 lần (nếu tính LOD) hay gấp 10 lần (đối với LOQ) độ lệch

chuẩn của nền khi phân tích mẫu trắng.

- Cách 2: Dựa vào đường chuẩn tuyến tính và độ lệch chuẩn của

đáp ứng.

LOD = (3,3 x s)/a; LOQ = 3,3 x LOD

trong đó:

s: độ lệch chuẩn của tín hiệu ứng với mẫu nền .

a: hệ góc của đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và đáp ứng

(thường là diện tích peak) của chất cần phân tích [40].

1.2.5.7. Độ thô (Robustness)

Đánh giá khả năng duy trì của quy trình phân tích không bị ảnh hưởng

bởi những biến đổi nhỏ nhưng có tính chủ định trong các thông số của

phương pháp và chỉ ra mức tin cậy của quy trình trong điều kiện sử dụng bình

thường.

1.2.5.8. Khả năng áp dụng của phương pháp (Scope)

Cho biết quy trình phân tích đã cho có thể áp dụng được trên các loại nền

mẫu nào.

Như vậy, việc xây dựng một quy trình HPLC đã khó khăn thì việc tiến

hành thẩm định quy trình càng phức tạp do rất tốn kém. Do vậy, trong thực tế

chỉ có thể đánh giá trên một số tiêu chí thực tiễn nào đó sao cho có sự cân đối

giữa yêu cầu về tính chính xác, tính khoa học của phương pháp với phí tổn,

thời gian và việc huấn luyện đội ngũ các nhà phân tích.

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

CARATENOID

Cũng như các carotenoid khác, dung dịch lutein hấp thụ mạnh trong

vùng khả kiến trong khoảng 400 – 500 nm. Sự hấp thụ này tuân theo định luật

Lambert-Beer trong một khoảng tương đối rộng (có thể dưới 1 ppm đến vài

chục ppm). Như vậy, về nguyên tắc, có thể định lượng các carotenoid bằng

phương pháp đo quang UV-Vis. Việc định lượng này đặc biệt nhạy nếu sử

dụng phương pháp HPLC với detector UV-Vis [42].

1.3.1. Định lượng carotenoid bằng phương pháp đo quang UV-Vis

1.3.1.1. Định lượng sản phẩm carotenoid tinh chế

Nguyên tắc:

Hoà tan lượng carotenoid với dung môi thích hợp. Đo độ hấp thụ của

dung dịch ở bước sóng ứng với cực đại hấp thụ của carotenoid trong dung

môi đã pha với cuvet 1cm.

Hàm lượng carotenoid tổng số trong mẫu (Y%) được tính theo công

thức:

(%)

. 10. DA %1 GA cm. 1

trong đó:

A: độ hấp thụ của dung dịch đo được; D: hệ số pha loãng.

%1 1cmA

: độ hấp thụ cực đại của dung dịch chứa 1% w/v carotenoid với

cuvette 1cm trong dung môi nghiên cứu.

G: số gam carotenoid đã cân (G lấy sao cho A đo được từ 0,3 – 0,7).

1.3.1.2. Định lượng carotenoid trong các mẫu sinh học

Các mẫu sinh học chứa lutein thường chứa hỗn hợp nhiều carotenoid

khác nhau, chúng có phổ hấp thụ khả kiến chồng lấn lên nhau, gây khó khăn

cho việc định lượng riêng rẽ một carotenoid nào đó. Bên cạnh đó, mẫu còn có

thể chứa một số hợp chất có màu không phải carotenoid nhưng cũng hấp thụ

bức xạ khả kiến do đó sẽ cản trở việc định lượng lutein bằng phương pháp

trắc quang - so màu. Khi đó, cần loại bỏ những hợp chất cản trở trước khi

định lượng carotenoid tổng số. Chẳng hạn, các mẫu dịch chiết thực vật (lá

cây, một số loài rong, tảo có màu lục) thường chứa chlorophyll. Ngoài khả

năng hấp thụ ở vùng 650 – 700 nm chlorophyll còn hấp thụ mạnh ở 430 nm

(chlorophyll a) và 450 – 460 nm (chlorophyll b). Do đó cần phải xà phòng

hoá mẫu carotenoid trước khi phân tích để loại bỏ các tạp chất béo khỏi dịch

chiết [43].

1.3.2. Định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC

So với phương pháp sắc ký cột cổ điển, phương pháp HPLC có những

ưu điểm sau: 1) Hiệu quả tách tốt nhờ sử dụng pha tĩnh có kích thước hạt nhỏ;

2) Giảm đáng kể nguy cơ phân hủy carotenoid do pha tĩnh được chứa trong

một cột kín bằng thép inox không tiếp xúc với ánh sáng và không khí; 3) Độ

lặp lại cao do cột sắc ký được nhồi sẵn, có thể dùng lại nhiều lần; 4) Phân tích

nhanh do hệ thống HPLC được điều khiển tự động; 5) Cho phép thu nhận các

thông tin về cấu trúc phân tử carotenoid nhờ sử dụng các detector PDA, MS

hay NMR. Vì vậy, phương pháp thông dụng nhất để định lượng carotenoid

hiện nay chính là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tuy nhiên, do sự

phức tạp về thành phần carotenoid trong mẫu sinh học cũng như sự đa dạng

của đối tượng phân tích nên cho tới nay không có quy trình tiêu chuẩn nào

cho phép định lượng carotenoid trong tất cả loại mẫu phân tích.

Đa số trường hợp định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC đều

dùng cột pha ngược trong đó phổ biến nhất là cột C18 do có ưu điểm là tương

thích với hầu hết dung môi hòa tan carotenoid và phù hợp với độ phân cực

của các carotenoid. Trong một số trường hợp cột pha thường với pha tĩnh là

silicagel được sử dụng để tách các xanthophyll (Ví dụ: dùng cột silica (250

mm x 4,6 mm; 3 µm) để định lượng lutein và zeaxanthin trong sản phẩm

lutein tinh chiết tách từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. theo quy trình của JECFA [11]; định lượng astaxanthin trong thức ăn nuôi cá bằng cột Lichrosorb Si60 (5 µm) được phủ một lớp acid phosphoric 1 (Sự acid hóa pha tĩnh bằng các acid yếu như trên có tác dụng ngăn ngừa sự lưu giữ quá mạnh

của các xanthophyll phân cực trên cột). Tuy nhiên, cột silica thường phân giải

kém đối với các carotene.

Nhiều hệ dung môi đã được đề nghị dùng làm pha động trong phân tích

carotenoid, trong đó thông dụng nhất là acetonitrile và methanol. Hầu hết các

hệ pha động đều dựa trên sự tổ hợp hai dung môi cơ bản trên nhưng có sự

thay đổi đôi chút về thành phần [44]. Acetonitrile được dùng rất phổ biến do

nó có độ nhớt thấp và độ chọn lọc tốt hơn khi tách các xanthophyll trên cột

C18 [45]. Trong khi đó pha động với thành phần cơ bản là methanol có ưu

điểm là cho độ thu hồi cao hơn, ngoài ra methanol rẻ và ít độc hơn acetonitrile

[46]. Trên cơ sở acetonitrile hay methanol, một vài dung môi khác

(dichloromethane, tetrahydrofuran, ethyl acetate, hexane, acetone, nước ...) có

thể được thêm vào pha động để đạt được sự lưu giữ mong muốn, cải thiện độ

phân giải và làm tăng độ tan của carotenoid. Ví dụ: thêm dịch loromethane

tăng tính chọn lọc của quá trình tách và tăng độ tan của carotenoid. Một số

1 bằng cách bơm dung dịch H3PO4 1% (1g dung dịch H3PO4 85% hòa tan trong 100 ml metanol) qua cột với tốc độ 1 ml/min trong 1 h

nhà phân tích có khuynh hướng sử dụng pha động chứa 3 - 4 dung môi

nhưng theo Craft (1992) [19], điều này có thể làm phức tạp hóa phương pháp

phân tích do tăng tính không trộn lẫn của chúng và tốc độ bay hơi khác nhau

của các dung môi sẽ làm thay đổi thành phần pha động trong quá trình phân

tích, do đó làm thay đổi thời gian lưu của carotenoid trong ngày. Neils và

Leenheer (1983) [47] cho rằng việc dùng pha động không chứa nước khi tách

hỗn hợp carotenoid phức tạp sẽ giúp làm tăng độ tan của carotenoid và giảm

khả năng kết tủa carotenoid trên cột. Tuy nhiên, một số nhà phân tích vẫn

thường thêm một lượng nước rất nhỏ vào pha động để hạn chế sự rửa giải quá

sớm của các xanthophyll tự do. Đôi khi acetat amoni (0,05 M trong methanol)

hay triethylamine (0,05 hay 0,1% v/v) có thể được thêm vào pha động để hạn

chế ảnh hưởng của tính acid gây ra bởi các nhóm silanol tự do trên pha tĩnh

silicagel, do vậy giảm hiện tượng kéo đuôi, cải thiện độ thu hồi các

carotenoid.

Nếu có thể, nên dùng chế độ rửa giải isocratic (thành phần pha động

không đổi) do nó có những ưu điểm sau: 1) đơn giản (chỉ cần dùng một bơm

cao áp); 2) nhanh; 3) cho đường nền ổn định; 4) thời gian lưu lặp lại tốt. Chế

độ rửa giải này nói chung có khả năng tách được các tiền vitamin A và

carotenoid chính trong các mẫu thực phẩm. Tuy nhiên, khi tách hỗn hợp gồm

nhiều carotenoid có độ phân cực rất khác nhau thì nên dùng chế độ rửa giải

gradient để cải thiện độ chọn lọc và tăng khả năng rửa giải các hợp chất lưu

giữ mạnh trên pha tĩnh.

Dung môi hòa tan mẫu phải tương thích với pha động HPLC. Nếu độ

tan của các carotenoid trong dung môi hòa tan mẫu tốt hơn nhiều so với trong

pha động và nhất là khi tiêm dung dịch mẫu gần như bão hòa vào cột thì sẽ

xảy ra hiện tượng kết tủa carotenoid trong buồng tiêm mẫu, dẫn đến hiện

tượng kéo đuôi, giãn peak, chẽ peak hay tạo thành các peak ma (ghost

peak)… Để tránh sự không tương thích này, nên dùng pha động làm dung môi

hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu bằng pha động trước khi tiêm vào cột sắc ký.

Theo Kimura et al. (1995) [47], acetone là dung môi hòa tan mẫu rất tốt khi

pha động chứa hỗn hợp acetonitrile – methanol – dichlorometane – hexane

do nó có độ phân cực và tính tan gần giống như pha động.

Khi phân tích carotenoid, nếu nồng độ carotenoid trong dung dịch khá

lớn sẽ dẫn đến hiện tượng biến dạng peak. Theo Khachik et al. (1988) [47], có

thể loại trừ hiện tượng này nếu thể tích tiêm mẫu giảm xuống còn 5 hay 10 µl.

Nhiệt độ cột cũng cần được ổn định để duy trì độ lặp lại về thời gian

lưu của các carotenoid cũng như độ chọn lọc và độ thu hồi của phương pháp phân tích. Chẳng hạn, ở 300C khi dùng cột C18 và pha động gồm acetonitrile- dichloromethane-methanol 70:20:10 thì không thể tách lutein với zeaxanthin, tách trans-β-carotene với đồng phân 9-cis nhưng ở 130C thì có thể tách tốt chúng (Sander và Craft, 1990) [47].

Như đã biết, các carotenoid hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại - khả kiến

nên để định lượng carotenoid thường dùng detector UV-Vis. Hơn nữa, loại

detector này khá rẻ tiền và dễ vận hành nhưng có độ nhạy cao, khoảng tuyến

tính khá rộng, ít chịu ảnh hưởng của sự thay đổi nhiệt độ. Nhược điểm của

chúng là không cho phép nhận biết được các carotenoid có thời gian lưu gần

giống nhau. Để khắc phục hạn chế này có thể dùng detector DAD: loại

detector đắt tiền hơn nhưng cho phép ghi phổ hấp thụ UV-Vis của các

carotenoid ứng với các peak tách ra trên sắc ký đồ, do đó cho phép khẳng

định phần nào cấu trúc của carotenoid, đồng thời kiểm tra độ tinh khiết của

peak. Tuy nhiên, các carotenoid chứa các đồng phân hình học hay đồng phân

quang học có phổ hấp thụ UV-Vis rất gần giống nhau. Trong trường hợp này,

không thể sử dụng detector DAD để nhận biết chúng mà phải dùng detector

MS hay NMR để khẳng định chính xác hơn cấu trúc phân tử carotenoid. Nói

chung, độ nhạy của detector MS cao hơn so với detector UV-Vis.

Để định lượng một carotenoid X nào đó bằng phương pháp HPLC

thường dùng phương pháp đường chuẩn. Lưu ý rằng các carotenoid đa số kém

bền nên hàm lượng carotenoid trong “mẫu chuẩn” thường bị suy giảm trong

quá trình bảo quản. Do vậy, cần kiểm tra lại hàm lượng carotenoid tổng số có

trong mẫu chuẩn bằng phương pháp đo quang UV-Vis (xem 1.3.1), sau đó

chạy HPLC để xác định % carotenoid X có trong tổng số carotenoid còn lại.

Hàm lượng carotenoid X trong mẫu chuẩn được tính theo công thức:

% CARX = % CAR TS* (SX/STS)*100%

trong đó:

%CARX: hàm lượng carotenoid X trong mẫu chuẩn.

%CARTS: hàm lượng carotenoid tổng số trong mẫu chuẩn xác định

bằng phương pháp đo quang UV-Vis.

SX: diện tích peak ứng với carotenoid X trên sắc ký đồ.

STS: tổng diện tích các peak xuất hiện trên sắc ký đồ.

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

1.4.1. Nghiên cứu quá trình xà phòng hóa lutein ester

Hiện nay, hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagetes erecta L.) được xem là nguồn

nguyên liệu tự nhiên tốt nhất dùng cho sản xuất lutein thương mại do nó có

khả năng tích lũy lutein với hàm lượng khá cao và gần như nguyên chất. Thật

vậy, kết quả phân tích cho thấy hàm lượng xanthophyll tổng số trong cánh

hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. vào khoảng 1,0 – 1,6% (tính theo trọng

lượng khô), trong đó khoảng 90% lượng carotenoid này là lutein ester (dưới

dạng monoester và diester của các acid béo C12 - C18 như acid lauric,

myristic, oleic, linoleic, palmitic, stearic) và chỉ có khoảng 5% là zeaxanthin

ester (Kumar, 2004). Lutein dưới dạng ester rất bền nhưng khi vào cơ thể con

người chỉ bị thủy phân một phần thành dạng tự do rồi mới được hấp thụ vào

huyết thanh. Vì vậy, để tạo ra những chế phẩm lutein bổ sung cho con người,

sau khi thu được oleoresin cần thủy phân lutein ester về dạng tự do [9].

Quá trình thủy phân lutein ester từ hoa cúc vạn thọ có thể thực hiện

bằng phương pháp hóa học hay sinh học. Phương pháp hóa học (còn gọi là

phương pháp xà phòng hóa) sử dụng tác nhân kiềm mạnh (thường là KOH)

trong alcohol hữu cơ (propylen glycol, ethanol) để cắt đứt liên kết ester giữa

các nhóm –OH trong phân tử lutein với các acid béo. Phương pháp xà phòng

hóa tuy ít tốn kém nhưng thường phải tiến hành ở nhiệt độ cao nên có thể gây

ra sự phân hủy lutein tự do. Do đó, một số tác giả khác nghiên cứu sử dụng

phương pháp sinh học trong đó sử dụng enzyme lipase để thủy phân lutein

ester ở nhiệt độ phòng nhằm hạn chế sự phân hủy hoạt chất. Tuy nhiên,

phương pháp này hiện nay ít được áp dụng rộng rãi do enzyme đắt tiền, hiệu

quả kinh tế không cao khi ứng dụng trong công nghiệp [48].

Trên thế giới đã có khá nhiều sáng chế về quá trình tách chiết và tinh

chế lutein từ hoa cúc vạn thọ, trong đó có đề cập đến phương pháp xà phòng

hóa lutein ester.

Sau đây là một số phương pháp xà phòng hóa lutein ester tiêu biểu:

Ausich và cs. (1997) [43] đã xà phòng hóa lutein ester bằng cách hòa tan oleoresin trong propylen glycol theo tỷ lệ 41:41 (w/w) rồi đun ở 50 - 600C cho tan ra, sau đó thêm từ từ 18 phần khối lượng dung dịch nước của KOH 45% w/w rồi đun nóng đến 65-800C (tốt nhất là ở 700C) trong 10 giờ. Như vậy, tỷ lệ oleoresin: propylen glycol: KOH: H2O trong hỗn hợp xà phòng hóa

ban đầu xấp xỉ 4:4:1:1 (w/w/w/w). Nhược điểm của quy trình này là oleoresin

khó tan trong propylen glycol (có độ nhớt cao) nên quá trình xà phòng hóa

cần tiến hành ở nhiệt độ khá cao trong thời gian dài, dẫn đến khả năng phân

hủy lutein, zeaxanthin thành các sản phẩm không mong muốn

Khachik, F. (2001) [49] đề nghị quá trình chiết lutein ester từ bột hoa

cúc vạn thọ khô (thu được bằng cách ủ xi-lô rồi sấy khô) bằng tetrahydrofuran

(THF) và đồng thời xà phòng hóa bằng cách phối trộn với dung dịch KOH

10% trong ethanol (EtOH) để đưa hỗn hợp về pH 12. Tỷ lệ các thành phần

trong hỗn hợp phản ứng như sau: 100 g bột hoa cúc: 1000 ml THF: 250 ml

KOH 10% w/v trong EtOH. Tiến hành chiết và xà phòng hóa lutein ester bằng

cách khuấy trộn hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng trong 2 h Tiến trình thủy phân

được giám sát bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC). Quy trình này mặc

dù cho hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm lutein cao nhưng có nhược

điềm là không có giai đoạn cô đặc lutein ester trước khi xà phòng hóa nên tiêu

tốn nhiều dung môi và KOH. Ngoài ra, THF dễ tạo thành các peroxid do đó

có thể phân hủy xanthophyll.

Madhavi (2002) [50] đưa ra quy trình xà phòng hóa oleoresin trong dung dịch isopropanol-nước như sau: Hòa tan 1 kg oleoresin trong 3 L

isopropanol rồi khuấy và đun nóng đến 600C đến khi chảy lỏng thành dung dịch. Sau đó, thêm 0,44 L dung dịch nước chứa 50% KOH (tức nồng độ

oleoresin và KOH trong hỗn hợp xà phòng hóa là 0,3 g/ml và nồng độ KOH là 6,4% w/v). Xà phòng hóa bằng cách khuấy và duy trì hỗn hợp ở 60-650C trong 90 phút. Sản phẩm thu được chứa 95% carotenoid tổng số (với 90% all-

trans lutein, 4% all-trans zeaxanthin, còn lại là các vết carotenoid khác).

Nhược điểm của quy trình này sinh ra nhiều nước thải do sử dụng lượng nước

lớn gấp 30 lần lượng oleoresin.

Kumar, S.T.K và cs. (2004) [7] đã xà phòng hóa lutein ester bằng cách

thêm dung dịch KOH 8 – 13% w/v trong isopropanol vào oleoresin sao cho

oleoresin với nồng độ oleoresin trong hỗn hợp là 0,33 g/ml. Hỗn hợp được đun nóng 65-800C trong 3 giờ. Tiến trình xà phòng hóa được giám sát bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nhược điểm của quy trình này phản ứng phải thực hiện ở nhiệt độ khá cao (70 - 800C) nên có khả năng dẫn đến sự chuyển hóa trans-lutein thành đồng phân cis- làm giảm hoạt tính

sinh học của sản phẩm.

Swaminathan (2009) [8] xà phòng hóa oleoresin bằng cách đun oleoresin đến dưới 450C, khuấy đều cho chảy lỏng ra, thêm 1,2 - 2,0 phần thể tích dung dịch KOH 13 - 15% trong EtOH tuyệt đối rồi đun ở 70 - 800C trong 40 phút. Hiệu suất xà phòng hóa thay đổi từ 55% - 80% tùy điều kiện phản

ứng cụ thể. Ưu điểm của quy trình này là ít sử dụng dung môi độc hại, rút

ngắn thời gian xà phòng hóa.

Gần đây, Joseph và cs. (2013) [51] đã cải tiến quy trình xà phòng hóa

lutein oleoresin bằng dung dịch KOH trong nước với sự có mặt của hỗn hợp

alcohol béo (lauryl alcohol) và acid béo (caprylic capric acid) để bảo vệ lutein

khỏi bị oxy hóa ở nhiệt độ cao như sau: 10 kg oleoresin được đun nóng và khuấy ở 450C trong 5-10 phút cho đồng nhất. Thêm từ từ 1,95 kg KOH 95% trong 3 kg nước rồi 0,86 kg caprylic capric acid và 4,3 kg of lauryl alcohol, khuấy đều và gia nhiệt ở 800C trong 3h (theo dõi quá trình xà phòng hóa bằng sắc ký bản mỏng). Hiệu suất phản ứng khoảng 80,15%. Phương pháp này tuy

không dùng dung môi EtOH và sản phẩm carotenoid thu được có độ tinh

khiết cao (khoảng 91,75% carotenoid tổng số) nhưng phải dùng hỗn hợp

caprylic capric acid-lauryl alcohol và lượng nước khá lớn khó có khả năng thu

hồi, yêu cầu thiết bị phức tạp (ly tâm tốc độ cao).

Từ việc tổng quan tài liệu có thể thấy rằng đa số phương pháp xà phòng

hóa đều sử dụng dung dịch KOH trong alcohol (methanol, ethanol,

isopropanol, propylen glycol…). Tuy nhiên, không có sự tương đồng về điều

kiện xà phòng hóa lutein ester. Nguyên nhân có lẽ là do các tác giả đã sử dụng

các dung môi khác nhau (hexane, ether dầu mỏ, ethyl acetate…) để chiết

lutein tự do từ hỗn hợp xà phòng hóa cũng như dùng các phương pháp và kỹ

thuật khác nhau (TLC, đo quang UV-Vis, HPLC) để đánh giá hiệu suất xà

phòng hóa. Thực tế trên dẫn đến sự băn khoăn trong việc lựa chọn phương

pháp xà phòng hóa để ứng dụng trong nghiên cứu và sản xuất.

Nhằm góp phần hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất, tinh chế các

hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn thọ, việc đánh giá lại ảnh hưởng

của điều kiện xà phòng hóa đến hiệu suất chuyển hóa lutein ester thành lutein

tự do, từ đó chọn lựa phương pháp thích hợp cho việc xà phòng hóa lutein

ester là vấn đề cần quan tâm.

1.4.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng lutein bằng

phương pháp HPLC

1.4.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Lutein là carotenoid có trong nhiều loài động - thực vật, có vai trò quan

trọng trong việc ngăn ngừa bệnh mù lòa ở người cao tuổi (thoái hóa hoàng

điểm, đục thủy tinh thể,...). Do đó, có nhiều công trình nghiên cứu định lượng

lutein và các carotenoid đi kèm trong các nguồn nguyên liệu tự nhiên, các

mẫu sinh học, thực phẩm, dược phẩm.

Một trong những công trình nghiên cứu lâu đời nhất định lượng

carotenoid trong thực vật bằng phương pháp HPLC sử dụng cột pha ngược

được thực hiện bởi Tee E. Siong và Lim Chin Lam (1992) [47]. Dịch chiết

carotenoid thu nhận từ 8 loài thực vật trước hết được tách sơ bộ bằng sắc ký

cột hở chứa hỗn hợp MgO2-diatomite (phương pháp AOAC, Deutsch, M.J,

1984 [28]), rửa giải bằng hỗn hợp acetone: hexane với tỷ lệ acetone tăng dần.

Các phân đoạn carotenoid tách ra được đo quang UV-Vis ở 450 nm để xác

định carotenoid tổng số, sau đó tiêm vào thiết bị HPLC sử dụng cột C18 (300 x

3,9 mm; 10 µm) với thể tích tiêm mẫu 50 - 100 µL; pha động là hỗn

acetonitrile-methanol-ethyl acetate, 88:10:2, v/v, tốc độ dòng 2,0 mL/min. Sử

dụng phương pháp này cho phép phân tách được a- và b- carotene, lutein,

lycopene trong một số rau quả, nhưng không phân giải được một số

carotenoid khác (lutein và zeaxanthin…). Kết quả cũng cho thấy việc xà

phòng hóa giúp loại bỏ chlorophyll, do đó cho phép định lượng carotenoid dễ

dàng hơn. Phương pháp này khá phức tạp, cần lượng mẫu nhiều, độ phân giải

không cao (do dùng pha tĩnh có kích thước hạt lớn), độ chính xác không cao,

mất nhiều thời gian nên hiện nay ít được sử dụng.

Sau đó, những tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực chế tạo thiết bị HPLC đã

cho phép các nhà phân tích sử dụng pha tĩnh C18 với kích thước hạt nhỏ hơn

và cột ngắn hơn, nhờ đó giảm lượng mẫu và thời gian phân tích nhưng hiệu

quả tách tốt hơn. Chẳng hạn, Maria V. Chandra-Hioe và cs. (2017) [47] đã

xây dựng quy trình định lượng lutein và β-carotene trong một số loài rau có lá

ở châu Á (rau muống, rau dền, su lơ trắng, su lơ xanh, mù tạc, rau mùi). Các

carotenoid được chiết từ các mẫu rau bằng acetone chứa 5% (w/v) CaCO3.

Dịch chiết được cô đặc ở 4°C, sau đó lọc và bơm vào thiết bị HPLC với cột

C18 (150 x 3,9 mm; 5 μm). Pha động gồm 2 hệ dung môi: A = acetonitrile:

methanol: đệm Tris 0,1 M pH 8 (84: 2:14) và B = methanol: ethyl acetate

(68:32). Rửa giải gradient trong 25 phút với tốc độ dòng 1,2 mL/phút (100%

A đến 100% B trong 12 phút, giữ trong 6 phút; về 100% A trong 1 phút và

cân bằng cột trong 6 phút). Ghi nhận tín hiệu bằng detector DAD ở 450 nm.

Các dung dịch chuẩn gốc β-carotene, lycopene and lutein được bảo quản ở - 800C dưới khí quyển N2 và pha loãng thành dung dịch chuẩn làm việc bằng pha động ngay trước khi dùng. Các đường chuẩn có R2 > 0,99. Phương pháp có độ thu hồi tốt đối với β-carotene và lutein (lần lượt là 132% và 100%); độ

chính xác khá cao (độ lặp lại trong ngày < 3,8%; độ lặp lại giữa các ngày < 11%).

Tuy vậy, đối với những hỗn hợp carotenoid phức tạp, cột C18 thường

không cho phép tách tốt, không thể định lượng chính xác. Vì vậy, những năm

gần đây các nhà sản xuất đã cho ra đời cột pha đảo C30. Kết quả nghiên cứu

trên nhiều đối tượng phân tích khác nhau cho thấy loại cột này có khả năng

phân giải rất tốt hỗn hợp carotenoid, đặc biệt cho phép tách rất hiệu quả các

đồng phân vị trí hay đồng phân quang học. Do đó, loại cột này hiện được sử

dụng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới để phân tích carotenoid.

Sau đây là một số ví dụ:

- Rebecca Yuhas và cs. (2011) [47] đã sử dụng cột C30 (250 x 4,6 mm;

5μm) để định lượng lutein trong sữa bột trẻ em: rửa giải gradient kiểu bậc

thang (85% A đến 70% A từ 0 – 18 phút; giảm xuống 10% A trong 1 phút và

giữ trong 4 phút; sau đó tăng lên đến 85% A trong 1 phút; cân bằng cột ở 85%

A trong 6 phút; trong đó A = MeOH; B = MTBE (Methyl – tert – butyl ether);

tốc độ dòng 1 mL/phút; ghi nhận tín hiệu bằng detector UV-Vis ở 445 nm. Đường chuẩn có độ tuyến tính tốt (R2 = 0,997). Phương pháp có độ lặp lại tốt (% RSD < 4%), độ chính xác trung gian cao (% RSD < 20% và < 12% khi

nồng độ lutein lần lượt dưới 25 µg/L và 200 µg/L). Độ thu hồi chung của toàn bộ quá trình từ 88% đến 106%.

- Domenico Montesano và cs. (2012) [47] đã nghiên cứu chiết và định

lượng lutein từ phế liệu cà chua (vỏ và hạt) bằng phương pháp HPLC-DAD.

Mẫu được đun sôi trong nước, lọc lấy bã đem chiết bằng acetone/ethanol 2:1

(v/v). Dịch chiết được cô quay rồi hòa tan trong hexane/ethyl acetate 96:4

(v/v) để làm sạch (loại các carotenoid kém phân cực như β-carotene,

lycopene) trên cột SPE Florisil. Dịch ra khỏi cột SPE được cô quay, rồi hòa

tan trong pha động sắc ký và bơm vào thiết bị HPLC trên cột C30 (250 × 4,6

mm; 5 µm), detector PDA ở bước sóng 450 nm, rửa giải isocratic bằng pha

động gồm MBTE:MeOH 30:70 v/v, tốc độ dòng 1,0 mL/phút. Đường chuẩn có độ tuyến tính và độ lặp lại tốt (R2 = 0,9999; %RSD = 1,7%), khoảng tuyến tính rộng (0,01 – 100 μg/mL), LOD và LOQ rất thấp (lần lượt là 0,02 và 0,07

μg/mL).

- Jing Tan và cs. (2017) [52] đã xây dựng và thẩm định phương pháp

định lượng all-trans lutein, zeaxanthin, b-cryptoxanthin, a-carotene, và b- carotene trong các mẫu sinh học như huyết thanh và sữa người sử dụng cột C30 (150 x 2,1 mm, 3 µm) ở 300C. Buồng tiêm mẫu được giữ ở 80C trong 48 giờ. Pha động gồm 2 hệ dung môi: A = MeOH : dung dịch ammonium acetate

1,5% (98:2, v/v) và B = MTBE : MeOH : dung dịch ammonium acetate 1,5%

(90:8:2, v/v/v). Rửa giải gradient như sau: 100% A giữ trong 1,5 phút; giảm

xuống 55% A ở 9,4 phút rồi xuống 5% A sau 2,0 phút và giữ trong 2,0 phút;

cuối cùng về 100% A sau 0,1 phút và giữ trong 3,0 phút. Tốc độ dòng cố định

0,5 mL/phút. Các carotenoid được phát hiện ở 445 nm, quét phổ UV-Vis 380

– 640 nm. Echinenone được sử dụng làm chất nội chuẩn. Các dung dịch

chuẩn gốc carotenoid được chuẩn hóa trước mỗi lần phân tích. Kết quả cho

thấy các peak lutein (ở 5,649 min) và peak của zeaxanthin (6,397 min) phân

giải rất tốt và quá trình sắc ký hoàn tất chỉ trong 18 phút, tức ngắn hơn 30 –

40 phút so với các phương pháp khác. Nguyên nhân là do sử dụng cột có kích

thước hạt và đường kính nhỏ. Độ tuyến tính tốt đạt được đối với các carotenoid (R2 > 0,9999). Giới hạn định lượng của phương pháp (MLOQ) đối với mẫu huyết thanh và sữa mẹ lần lượt là 10 ng/mL và 5 ng/mL. Kết quả

thẩm định cho thấy phương pháp có độ đúng tốt (độ thu hồi từ 85 –105%), độ

lặp lại khá cao (%RSD trên mẫu chuẩn lutein khoảng từ 3,3 – 4,2%; %RSD

đối với độ thu hồi lutein trên mẫu thực từ 2,2- 7,5%).

Bên cạnh đó, cũng có những phương pháp định lượng carotenoid sử

dụng cột pha thuận. Chẳng hạn:

- JECFA (2004) [12] đã phê chuẩn phương pháp kiểm tra chất lượng

sản phẩm lutein tinh chế thu nhận từ hoa cúc vạn thọ như sau: Mẫu lutein (cân

chính xác) được hòa tan trong EtOH tuyệt đối và độ hấp thụ ở 446 nm để xác

định hàm lượng carotenoid tổng số. Sau đó, xác định % lutein và %

zeaxanthin trong tổng số carotenoid bằng phương pháp HPLC sử dụng cột

silica (250 x 4,6 mm; 3 μm); rửa giải isocratic trong 40 phút (pha động là hỗn

hợp hexane/ethyl acetate 70:30 v/v; tốc độ 1,5 ml/phút); thể tích bơm mẫu 10 μl; detector UV-Vis ghi nhận tín hiệu ở 446 nm.

- Miroslav ŠIVEL và cs. (2014) [1] đã định lượng lutein trong các dịch

chiết cô đặc thu nhận từ hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagetes erecta L.) Mẫu được

hòa tan trong dung môi acetone-methanol (1:1 v/v) và bơm vào thiết bị HPLC-DAD ở 300C dùng cột pha thuận ZORBAX SB CN (75 mm × 4,6 mm; 3,5 μm), rửa giải gradient tuyến tính (0 phút 30% A; 10 phút 0% A và 15 phút

30% A; trong đó A = dung dịch nước chứa 3,153 g/L ammonium formate và

B = MeOH) với tốc độ dòng 0,7 mL/phút. Tín hiệu được ghi ở 446 nm.

Phương pháp có LOD = 0,22 μg/g; LOQ = 0,7 μg/g. Đường chuẩn tuyến tính tốt (R2 = 0,9982); độ lặp lại và độ thu hồi cao (đối với các dung dịch chuẩn RSD = 1,4% và độ thu hồi từ 99,0 – 101%).

Khó khăn lớn nhất trong việc định lượng các mẫu sinh học là việc xử lý

mẫu khá phức tạp, độ chính xác và độ lặp lại thường không cao do carotenoid

dễ phân hủy trong quá trình phân tích, độ phân giải của một số peak chưa tốt,

thời gian phân tích khá dài.

1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam với điều kiện khí hậu có độ ẩm cao, cột silica dễ hút ẩm và

do đó rất nhạy cảm với sự thay đổi thành phần nước trong pha động, kết quả

là thời gian lưu khó lặp lại. Đối với các cột pha đảo thì cột C30 tuy có ưu điểm

là cho phép phân tách rất hiệu quả nhiều hỗn hợp carotenoid khác nhau (đặc

biệt là hỗn hợp carotenoid ở các dạng đồng phân khác nhau) nhưng lại khá đắt

tiền. Do đó, cột pha đảo C18 thường được ưu tiên lựa chọn trong phân tích các

hỗn hợp carotenoid không quá phức tạp. Cho tới nay số công trình nghiên cứu

xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng các hợp chất nhóm

carotenoid rất ít.

Hoàng Thị Huệ An (2009) [13] đã xây dựng phương pháp HPLC định

lượng astaxanthin và các carotenoid đi kèm có trong một số loài giáp xác thủy

sản. Mẫu được xay nhỏ, trộn đều với Na2SO4 khan rồi đồng hóa trong dung

môi acetone. Dịch chiết acetone được chiết sang hỗn hợp ether ethylic - ether

tan

dầu mỏ (1:1, v/v), làm khan, cô quay, hòa trong methanol- dichloromethane (3:1, v/v) và xà phòng hóa ở 50C trong 18 giờ (phương pháp Yuan & Chen (2000) [47]). Hỗn hợp sau khi xà phòng hóa được chiết sang

ethyl axetat, cô quay. Hòa tan cặn thu được acetone, giữ qua đêm ở -200C để

kết tủa tạp chất lipid, rồi lọc dung dịch qua màng lọc PTFE 0,22 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC (Agilent 1100 Series, USA). Điều kiện sắc ký như sau: cột C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm); nhiệt độ cột 300C; thể tích bơm mẫu: 5 µl; tốc độ dòng: 1 ml/min; detector PDA ghi tín hiệu ở 480 nm và quét phổ từ 350 –

600 nm. Rửa giải gradient (100% A: 8 phút; 100% A đến 100% B: 5 phút;

100% B 15 phút; cân bằng cột: 15 phút; trong đó A = acetonitrile-methanol-

dichloromethane-H2O 85:5:5:5 v/v/v/v và B= acetonitrile-methanol-

dichloromethane-H2O 60:8:30:2 v/v/v/v). Phương pháp cho phép tách tốt hỗn

hợp astaxanthin, lutein/zeaxanthin, lycopene, b-carotene nhưng không phân tách được cặp đồng phân lutein/zeaxanthin. Kết quả cho thấy các đường chuẩn tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ carotenoid từ 1,5 - 10 µg/ml (R2 > 0,99); độ lặp lại cao (%RSD = 0,30 – 1,50% đối với mẫu chuẩn (n = 6) đo

trong ngày có n = 6 và từ 1,13 - 2,93% đối với mẫu chuẩn (n = 3) trong 2

tháng. Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi thấp (astaxanthin: 83%; lutein: 65,4%;

lycopene: 52,4%; b-carotene: 66,4%) do carotenoid bị mất mát trong quá

trình xà phòng hóa và kết tủa tạp chất lipid bằng acetone.

Trương Ngọc Bảo Hiếu và Ngô Văn Tứ (2017) [14] đã xây dựng

phương pháp phân tích β – carotene trong một số loại ngũ cốc có màu bằng

phương pháp HPLC với detector PDA sử dụng cột C18 (150 mm x 4,6 mm, 5

µm) ở nhiệt độ phòng. Pha động là MeOH:H2O 50:50 v/v, tốc độ dòng 1,0

mL/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μL. Kết quả nghiên cứu cho thấy : phương pháp

có độ nhạy cao, độ lặp lại tốt (RSD% < 3,5%, n = 6); LOD thấp (0,2 ppm); đường chuẩn β – carotene tuyến tính tốt trong khoảng 0,5 ÷ 10 ppm (R2 = 0,9999); độ đúng tốt (độ thu hồi trên mẫu thực tế từ 91 ÷ 101%).

Tuy đã có nhiều phương pháp định lượng lutein và hỗn hợp các

carotenoid khác nhau bằng phương pháp HPLC sử dụng cột C18 nhưng các

phương pháp này không phù hợp với điều kiện sẵn có ở phòng thí nghiệm của

chúng tôi (hoặc về các thông số của cột sắc ký, hoặc về thành phần pha động,

hoặc về phạm vi ứng dụng…). Do đó, việc cải biến phương pháp HPLC sẵn

có để phù hợp hơn với điều kiện phòng thí nghiệm và mục đích phân tích cụ

thể là điều cần thiết.

Trong đề tài này sẽ sử dụng thiết bị HPLC-DAD và cột C18 (250 x 4,6

mm; 5 μm) - là cột pha đảo C18 duy nhất có tại phòng thí nghiệm của chúng

tôi - để nghiên cứu định lượng lutein trong sự có mặt của một số carotenoid

khác (astaxanthin, zeaxanthin; b-caroten; các lutein ester) từ đó ứng dụng xác

định điều kiện thích hợp cho phản ứng xà phòng hóa lutein ester tách chiết từ

hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagteges erecta L.).

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguyên liệu

Hoa cúc vạn thọ Mỹ Tagetes erecta L. từ đề tài cấp tỉnh của TS. Hoàng

Thị Huệ An. Hoa sau khi thu hoạch được cắt lấy cánh, loại bỏ tạp chất, sấy ở 600C đến độ ẩm <10% rồi nghiền thành bột mịn, cân thành những lượng chính xác, đóng gói chân không, bảo quản ở -200C đến khi sử dụng.

2.1.2. Hóa chất

- Các hóa chất sử dụng trong quá trình chiết tách và xử lý mẫu (hexane,

ethanol, ethyl acetate, KOH, Na2SO4, NaCl) thuộc loại tinh khiết phân tích

của hãng Xilong (Trung Quốc).

- BHT (2,6-di-tert-butyl-4-metylphenol) thuộc loại tinh khiết phân tích

(Merck, Đức).

- Các carotenoid đối chứng gồm: lutein tinh thể (tinh khiết >90%) của

Công ty Biopurify (Trung Quốc); astaxanthin và b-carotene tinh thể (tinh

khiết > 95%) của Sigma-Aldrich (USA).

Các mẫu đối chứng được bảo quản trong lọ kín, ở -200C đến khi dùng.

- Nước cất 2 lần: thu nhận ngay trước khi dùng từ thiết bị cất nước siêu

sạch Milli Q Direct 8 (Millipore, USA).

- Dung môi hòa tan chuẩn bị mẫu phân tích và dung môi pha động chạy

sắc ký (acetone, methanol, dichloromethane, ethyl acetate) thuộc loại dùng

cho HPLC (Merck, Đức).

Các dung môi dùng làm pha động được lọc qua màng lọc 0,45µm và

siêu âm khử bọt khí trước khi cho vào bình đựng dung môi của thiết bị HPLC.

Tất cả dung môi hòa tan mẫu và sử dụng trong quá trình chiết tách,

chuẩn bị mẫu đều có thêm 0,1% BHT để chống oxy hóa.

2.2. DỤNG CỤ - THIẾT BỊ

2.2.1. Dụng cụ

- Micropipet các cỡ 100; 200; 1000; 5000 µL (Eppendorf, Đức).

- Bình định mức 5; 10; 25; 50; 100 mL (Schotte Duran, Đức).

- Bình lắng gạn 100; 250; 500 mL (Isolab, Đức).

- Bình cầu đáy bằng, đáy tròn các cỡ (Isolab, Đức).

- Phễu lọc thủy tinh.

- Bộ dụng cụ xà phòng hóa gồm: bình cầu đáy bằng (50; 500; 2000

mL), sinh hàn hồi lưu, nhiệt kế.

2.2.2. Thiết bị

- Cân kỹ thuật ± 10-3 g (OHAUS, Trung Quốc).

- Cân phân tích điện tử ± 10-4g (SATORIUS, Nhật).

- Máy đồng hóa Ultra Turax Basic T18 (IKA, Đức).

- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA, Đức).

- Máy lắc ổn nhiệt KS 4000 i Control (IKA, Đức).

- Quang phổ kế tử ngoại – khả kiến CARY 50 (Varian, Úc).

- Thiết bị cô chân không RV 10 Control V (IKA, Đức).

- Thiết bị chiết hồi lưu gia nhiệt có khuấy trộn (Công ty Pháp Việt

Food, Việt Nam).

- Tủ đông -200C (SANAKY, Việt Nam).

- Tủ sấy UNB 400 (Memmert, Đức).

- Máy sấy đối lưu dung tích 100 L (Công ty MACTECH, Việt Nam).

- Hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Chromaster của hãng HITACHI

(Nhật Bản) gồm có bơm cao áp 5110 với bộ trộn dung môi 4 kênh; bộ bơm

mẫu tự động (autosampler) 5210; cột phân tích C18 (250 x 4,6; 5 µm); lò điều

nhiệt cột 5310; đầu dò 5430 Diode Array (DAD), phần mềm xử lý Agilent

OpenLAB CDS version A.02.02.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Cải biến phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn

hợp với lutein ester

Trong nghiên cứu này, chúng tôi kế thừa một số kết quả nghiên cứu

trước đây của TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) [13], đó là:

- Chọn thành phần pha động để rửa giải hỗn hợp carotenoid là tổ hợp

của các dung môi methanol, acetonitrile, dichloromethane và nước.

- Dung môi hòa tan mẫu là acetone (thực nghiệm cho thấy dung môi

này có khả năng hòa tan tốt hầu hết carotenoid và tương thích tốt với hệ pha

động nói trên).

2.3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch khảo sát điều kiện chạy HPLC

a) Chuẩn bị dung dịch lutein đối chứng :

Cân khoảng 2 mg mẫu lutein đối chứng cho vào cốc 25 mL, thêm một

vài giọt dichloromethane cho tan rồi thêm tiếp acetone HPLC và chuyển vào

bình định mức 100 mL, định mức tới vạch bằng acetone, lắc đều. Bảo quản dung dịch trên trong tối ở -200C. Ngay trước khi dùng, đưa dung dịch về nhiệt

độ phòng, pha loãng 10 lần bằng acetone HPLC, lọc qua màng lọc 0,45 µm

rồi bơm vào thiết bị HPLC.

b) Chuẩn bị dung dịch lutein ester:

* Bước 1: Thu nhận lutein oleoresin từ bột hoa cúc vạn thọ khô:

Cân 1,0 kg bột hoa cúc vạn thọ khô cho vào nồi chiết của thiết bị chiết

hồi lưu gia nhiệt có cánh khuấy. Thêm vào đó 15 L hexane, khuấy trộn và đun

nóng ở trong 24 giờ để chiết carotenoid. Lọc lấy dịch chiết. Lặp lại quá trình

chiết nói trên với bã chiết. Gộp dịch chiết hexane lại, cô dưới áp suất thấp (<400C), thu được một dạng dầu sệt màu nâu đỏ (còn gọi là lutein oleoresin, chứa các carotenoid - chủ yếu dưới dạng lutein ester). Bảo quản lutein oleoresin ở -200C cho đến khi nghiên cứu.

* Bước 2: Chuẩn bị dung dịch lutein ester:

Cân khoảng 0,05 gam lutein oleoresin hòa tan và định mức thành 100 ml bằng acetone HPLC. Bảo quản dung dịch trên trong tối ở -200C (thời gian bảo quản không quá 1 tháng). Ngay trước khi dùng, đưa dung dịch về nhiệt độ

phòng, pha loãng 10 lần bằng acetone HPLC.

c) Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp lutein và lutein ester :

Ngay trước khi phân tích, hút 5mL dung dịch lutein đối chứng cho vào

bình định mức 10 ml chứa sẵn 5 mL dung dịch lutein ester. Đậy nắp, lắc đều.

Hút 1 ml dung dịch thu được, lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi bơm vào thiết bị

HPLC.

2.3.1.2. Chọn thành phần pha động và chế độ rửa giải

Thành phần pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải các chất mẫu

ra khỏi cột. Khi thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động

thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích, qua đó

làm thay đổi thừa số lưu giữ k’ của các cấu tử trong hỗn hợp phân tích. Vì

vậy, để có được thành phần pha động phù hợp cần tiến hành thử nghiệm sắc

ký với tỷ lệ dung môi khác nhau.

Trong quá trình nghiên cứu, các điều kiện sau đây được giữ cố định

trong suốt quá trình khảo sát (trường hợp có thay đổi sẽ được đề cập riêng):

- Cột phân tích TSKgel ODS-100V (250 mm x 4,6 mm; 5 μm);

- Nhiệt độ cột: 250C;

- Thể tích bơm mẫu: 20 µl;

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút;

- Detectơ PAD; bước sóng làm việc: 450 nm.

Các pha động được tổ hợp từ các dung môi acetonitrile (MeCN),

methanol (MeOH), dichloromethane (DCM) và nước (H2O).

Trước hết, khảo sát 6 chế độ rửa giải isocratic với thành phần pha động

thay đổi như sau (Bảng 2.1) :

Bảng 2.1. Các thành phần pha động thử nghiệm ở chế độ rửa giải

isocratic

Thành phần pha động (v/v/v/v) Ký hiệu MeCN MeOH DCM H2O

I1 70 15 10 5

I2 45 40 10 5

I3 70 9 20 1

I4 50 9 40 1

I5 45 12 42 1

I6 45 14 40 1

Dựa vào các kết quả thu được, để hiệu quả tách tốt cần lựa chọn thành

phần pha động và điều chỉnh chế độ rửa giải sao cho :

- Các cấu tử khảo sát có thừa số lưu giữ k’» 2 – 5 (nếu hỗn hợp phức

tạp thì k’ = 1 – 20).

- 2 peak kế cận nhau có độ chọn lọc a ³ 1.

- 2 peak kế cận nhau có độ phân giải Rs ³ 1,5.

trong đó:

- t

k k

' 2 ' 1

t (2 t ) - R 1 2 WW ( ) + 1

; ;

t0: thời gian chết, là giá trị trung bình cộng của thời gian xuất hiện peak

dung môi (thực nghiệm cho thấy hệ thống HPLC đang sử dụng có t0 » 3,1 phút).

tRi : thời gian lưu của cấu tử phân tích thứ i ;

1 và 2: hai cấu tử rửa giải kế cận nhau;

W1, W2: độ rộng chân peak của các cấu tử 1 và 2.

2.3.1.3. Chọn tốc độ dòng

Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó

ảnh hưởng tới quá trình thiết lập cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha

động. Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng dãn peak, thời gian rửa lâu

hơn. Tuy nhiên nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn

hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo

peak lên nhau. Vì vậy, cần phải khảo sát để tìm được tốc độ dòng phù hợp với

hệ thống sắc ký sử dụng.

Thử nghiệm bơm mẫu với các giá trị tốc độ dòng sau đây :

u1 = 0,8 ml/ phút; u2 = 1 ml/phút ; u3 = 1,2 ml/phút.

Dựa vào giá trị thời gian lưu (tR) và độ rộng peak (W) thu được trên sắc

ký đồ (phần mềm của thiết bị HPLC tính sẵn), tính được số đĩa lý thuyết (N)

của cột sắc ký đối với cấu tử phân tích ứng với tốc độ dòng khảo sát theo

- R W

æ ç 16 ç è

ö ÷ ÷ ø

công thức :

So sánh kết quả thu được, từ đó chọn tốc độ dòng phù hợp.

2.3.1.4. Chọn thể tích bơm mẫu

Thể tích bơm mẫu quá nhỏ thì lượng chất đưa vào cột sắc ký quá ít, do

đó khi rửa giải sẽ cho tín hiệu có cường độ thấp, chiều cao (hay diện tích

peak) quá nhỏ sẽ phát hiện hay định lượng không chính xác. Ngược lại, nếu

thể tích tiêm mẫu quá lớn thì lượng chất nạp vào cột quá nhiều, khi đó có thể

xảy ra hiện tượng cột bị quá tải, dẫn đến peak bị dãn rộng và độ phân giải

kém. Do vậy, cần khảo sát chọn thể tích bơm mẫu thích hợp.

Trong nghiên cứu này chúng tôi thay đổi thể tích bơm mẫu lần lượt là :

5; 10; 15 và 20 (µl).

Sau khi chạy HPLC, so sánh tính chất các peak (tính đối xứng, chiều

cao, độ rộng, tỷ lệ S/N), từ đó chọn thể tích bơm mẫu thích hợp nhất.

2.3.1.5. Dựng đường chuẩn lutein

a) Xác định độ tinh khiết của mẫu lutein đối chứng: lutein dễ phân hủy

trong quá trình bảo quản nên trước khi dựng đường chuẩn cần xác định lại

hàm lượng lutein trong mẫu đối chứng dựa vào phương pháp của JECFA

(2004) [12]. Cụ thể như sau:

Bước 1: Xác định hàm lượng carotenoid tổng số trong mẫu lutein đối

chứng:

Cân chính xác một lượng lutein đối chứng trên cân phân tích (khoảng

27 - 35 mg) cho vào bình định mức 100 ml. Thêm vào đó vài giọt

dichloromethane và đảo đều đến khi thấy tinh thể vừa tan, rồi pha loãng và

định mức đến vạch bằng ethanol tuyệt đối, lắc đều trong 10 phút.

Hút 1 mL dung dịch lutein thu được cho vào bình định mức 100 mL

thứ hai, pha loãng đến vạch bằng ethanol tuyệt đối, lắc đều trong 20 giây. Đo

độ hấp thụ của dung dịch vừa thu được ở 446 nm với cuvet 1cm (dùng

ethanol tuyệt đối làm dung dịch so sánh).

Hàm lượng carotenoid tổng số (% CARTS) trong mẫu lutein đối chứng

được tính theo công thức:

%

CAR

=

. DA 446 %1 GE . 1 cm

trong đó:

D = 100*100 = 104 là độ pha loãng dung dịch lutein trong ethanol

A446: độ hấp thụ của dung dịch lutein đo được

%1 1cmE

= 2550: độ hấp thụ của dung dịch lutein tinh khiết trong dung môi

ethanol ở 446 nm đo với cuvet 1 cm

G: lượng lutein đem phân tích (tính bằng g)

Bước 2: Xác định hàm lượng lutein có trong tổng carotenoid

Hút 1 mL dung dịch lutein trong ethanol thu được ở trên cho vào bình

định mức 50 ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng acetone HPLC, lắc

đều. Hút 1 ml dung dịch thu được lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi bơm vào thiết

bị HPLC đang sử dụng với cột phân tích C18 (250x 4,6; 5 µm), detector DAD

(ghi tín hiệu ở 446 nm), pha động là hỗn hợp MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O

45:40:10:5 (v/v/v/v), rửa giải isocratic trong 10 phút với tốc độ dòng 1

ml/phút.

Hàm lượng lutein trong tổng số carotenoid có trong mẫu lutein đối

chứng được tính theo công thức:

%

Lutein

%

CAR

.

=

S Lutein S

trong đó:

SLutein và STS lần lượt là diện tích peak lutein và tổng diện tích tất cả các

peak có trên sắc ký đồ

b) Dựng đường chuẩn lutein:

- Pha dung dịch chuẩn gốc lutein:

Cân 0,0276 gam lutein đối chứng (vừa xác định hàm lượng lutein như

trên) hòa tan và định mức đến 250 mL bằng acetone.

- Pha dãy chuẩn lutein chạy HPLC:

Từ dung dịch chuẩn gốc lutein vừa pha, hút lần lượt 1,25; 2,50; 5,00;

7,50 và 10,00 (mL) cho vào 5 bình định mức 25 mL (ký hiệu lần lượt là S1,

S2, S3, S4, S5), rồi pha loãng đến vạch mức bằng acetone HPLC (có chứa 0,1%

BHT). Lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC. Tiến hành phân

tích theo điều kiện HPLC thích hợp đã chọn ở phần 2.3.1.2. Dựng đồ thị biểu

diễn mối quan hệ giữa diện tích peak lutein (S) và nồng độ lutein (C) của dãy

chuẩn:

S = aC + b

trong đó:

a và b lần lượt là hệ số góc và tung độ gốc của đường chuẩn

Mỗi điểm chuẩn đo 3 lần để tính độ lệch chuẩn của a và b.

2.3.2. Thẩm định quy trình định lượng lutein

2.3.2.1. Tính đặc hiệu

Tiến hành chạy HPLC các loại mẫu sau:

Mẫu trắng: dùng dung môi acetone HPLC -

- Mẫu lutein đối chứng: chứa dung dịch lutein tan trong acetone

HPLC (chuẩn bị như mục 2.3.1.1.a)

- Mẫu thực: chứa lutein oleoresin chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ hòa

tan trong acetone HPLC (chuẩn bị như mục 2.3.1.1.b)

- Mẫu thêm: thêm dung dịch lutein đối chứng vào dung dịch lutein

ester (chuẩn bị theo mục 2.3.1.1.c)

Để khẳng định tính đặc hiệu của phương pháp, cần chứng minh peak

lutein không bị trùng với peak của các cấu tử khác có trong mẫu trắng và mẫu

thực:

- Mẫu trắng phải không cho peak ứng với thời gian lưu của lutein

- Cường độ peak của lutein của mẫu thêm chuẩn lớn hơn so với mẫu

thực.

Ngoài ra, kiểm tra giá trị độ tinh khiết của peak (% Peak purity) và so

sánh phổ UV-Vis của peak lutein với phổ UV-Vis của các dữ liệu phổ lutein.

2.3.2.2. Độ chụm (precision)

Độ chụm được đánh giá qua các đại lượng sau:

a) Độ lặp lại của thiết bị HPLC (injection-repeatability): được đánh giá

qua giá trị %RSD khi đo tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn có nồng

%100.

RSD =

SD x

độ nằm trong khoảng giữa của đường chuẩn trong cùng một ngày.

(

)

trong đó:

å

1 =

b) Độ lặp lại của các kết quả phân tích song song (intra-assay

repeatability): xác định bằng cách phân tích lặp lại 3 lần mẫu lutein tinh thu

nhận từ hoa cúc vạn thọ.

2.3.2.3. Độ tuyến tính của đường chuẩn – Khoảng nồng độ tuyến tính

Đánh giá dựa vào giá trị R2 của đường chuẩn trong khoảng nồng độ

khảo sát

2.3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [41]

3,3

LOD

SD ´ b a

LOQ

LOD và LOQ được xác định theo các công thức sau:

SD ´ b a

và:

trong đó:

a: hệ số góc của đường chuẩn

SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu, được xác định bằng độ lệch chuẩn của

tung độ gốc (b) của đường chuẩn khi lặp lại phép dựng đường chuẩn 3 lần

2.3.2.5. Độ đúng:

Được xác định bằng cách thêm vào xác định qua giá trị độ thu thu hồi

(% R) khi phân tích các mẫu thêm chuẩn vào mẫu trắng (dung môi acetone

HPLC) ở 3 mức nồng độ thêm lần lượt là 12; 15 và 18 ppm (lặp lại 3 lần).

100

C tt C

Tính độ thu hồi (%R) theo công thức:

trong đó:

Ctt: nồng độ lutein tìm thấy sau khi phân tích

Cc: Nồng độ lutein đã thêm vào mẫu trắng

So sánh giá trị độ thu hồi tính trung bình tính được với độ thu hồi yêu

cầu cần đạt và kết luận.

2.3.3. Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định điều kiện thích

hợp xà phòng hóa lutein ester

2.3.3.1. Phương pháp tổng quát xà phòng hóa lutein ester

Cân chính xác G gam mẫu oleoresin (chứa hỗn hợp lutein ester thu

nhận từ hoa cúc vạn thọ) cho vào bình cầu cổ nhám 50 ml. Thêm vào mẫu oloeoresin V ml dung dịch KOH trong EtOH 960 (ký hiệu nồng độ KOH là CKOH, g/ml). Lắp sinh hàn hồi lưu, đun nóng và khuấy đều hỗn hợp ở 700C trong 1 h (trong điều kiện tránh ánh sáng).

Sau khi phản ứng kết thúc, thêm nước cất vào hỗn hợp đến thể tích gấp

đôi, lắc đều. Tiếp đó, chuyển hỗn hợp vào phễu chiết có chứa sẵn một thể tích

tương đương ethyl acetate, khuấy đều, để yên cho hỗn hợp phân lớp hoàn

toàn. Tách riêng pha nước bên dưới, đem chiết lặp lại như trên thêm 2 lần

nữa. Pha ethyl acetate bên trên trong các lần chiết (chứa lutein tự do) được

gộp lại, cho vào phễu chiết khác, rửa 3 lần bằng nước cất (thể tích tương

đương với thể tích ethyl acetate) để loại bỏ các tạp chất tan trong nước. Lọc

dịch chiết ethyl acetate qua một lớp Na2SO4 khan, cho vào bình định mức,

định mức đến vạch bằng acetate ethyl. Bảo quản dịch chiết dung dịch ở - 200C cho đến khi phân tích.

2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hiệu suất xà phòng hóa lutein ester

Dịch chiết lutein tự do trong ethyl acetate thu được sau quá trình xà

phòng hóa (xem mục 2.3.3.1) được pha loãng 100 lần bằng acetone HPLC rồi

bơm vào thiết bị HPLC Chromaster của hãng HITACHI (Nhật Bản) đang

nghiên cứu, trong đó điều kiện chạy HPLC dựa trên kết quả khảo sát “cải biến

phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp lutein ester” (xem mục

2.3.1)

Hiệu suất xà phòng hóa được tính theo công thức:

Hiệu suất xà phòng hóa (%) = SLutein*100/SLutein ester

Hiệu suất xà phòng hoá trans-lutein (%) = Strans-lutein*100/Slutein ester

Hiệu suất xà phòng hoá cis-lutein (%) = Scis-lutein*100/Slutein ester

với:

SLutein: là diện tích peak lutein tự do (dạng trans và dạng cis) trên sắc ký

đồ của mẫu sau khi xà phòng hóa (nhận biết peak lutein nhờ mẫu lutein đối

chứng; phân biệt các peak trans- và cis-lutein dựa vào sự khác biệt về phổ hấp

thụ UV-Vis của chúng trong ở vùng phổ 300 - 350 nm)

Strans-lutein: là diện tích peak của trans- lutein trên sắc ký đồ của mẫu sau

khi xà phòng hoá.

Scis-lutein: là diện tích peak của cis- lutein trên sắc ký đồ của mẫu sau khi

xà phòng hoá.

Slutein ester: là tổng diện tích tất cả các peak thu được trên sắc ký đồ khi

phân tích mẫu oleoresin (tức lutein ester) có cùng nồng độ không xà phòng

hóa nhưng cũng được chiết và phân tích trong điều kiện giống hệt mẫu đem

xà phòng hóa.

2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa lutein ester

đến đến hiệu suất xà phòng

a) Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oleoresin

Tiến hành xà phòng hóa oleoresin và chiết lutein tự do hình thành như

đã mô tả ở mục 2.3.3.1, trong đó cố định nồng độ KOH là CKOH = 0,15 g/ml

và thay đổi nồng độ oleoresin trong hỗn hợp phản ứng lần lượt là:

Coleoresin = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,8; 0,9 (g/ml).

Sau khi phản ứng hoàn tất, xác định hiệu suất xà phòng hóa của các

mẫu khảo sát. Từ đó, chọn nồng độ oleoresin thích hợp cho phản ứng.

b) Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ KOH

Tiến hành xà phòng hóa oleoresin và chiết lutein tự do hình thành như

đã mô tả ở mục 2.3.3.1, trong đó cố định nồng độ oleoresin là 0,3 g/ml và

thay đổi nồng độ KOH lần lượt là:

CKOH = 0,00; 0,025; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30 (g/ml).

Sau khi phản ứng hoàn tất, xác định hiệu suất xà phòng hóa của các

mẫu khảo sát. Từ đó, chọn tỷ lệ KOH/oleoresin thích hợp cho phản ứng.

c) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xà phòng hóa

Cân chính xác các lượng oleoresin (khoảng 3 gam) cho vào 5 bình cầu

cổ nhám 50 ml khác nhau. Thêm vào đó một thể tích chính xác của dung dịch KOH 5% w/v trong EtOH 960 (có 0,1% BHT) sao cho nồng độ oleoresin trong hỗn hợp là 0,3 g/ml. Tiến hành xà phòng hóa các mẫu (bằng cách đun

cách thủy và khuấy đều trong 1 giờ), trong đó nhiệt độ phản ứng ở các mẫu khảo sát thay đổi: 40; 50; 60; 70; 800C.

Sau khi phản ứng hoàn tất, xác định hiệu suất xà phòng hóa của các

mẫu khảo sát. Từ đó, chọn nhiệt độ xà phòng hóa thích hợp.

d) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xà phòng hóa

Tiến hành xà phòng hóa oleoresin và chiết lutein tự do hình thành như

đã mô tả ở mục 2.3.3.1, trong đó cố định nhiệt độ xà phòng hóa (bằng nhiệt

độ đã chọn từ kết quả thí nghiệm 2.3.3.1.c) nhưng thay đổi thời gian phản ứng

lần lượt là:

20; 40; 60; 80; 100; 120; 180 phút.

Sau khi phản ứng hoàn tất, xác định hiệu suất xà phòng hóa của các

mẫu khảo sát. Từ đó, chọn thời gian xà phòng hóa thích hợp.

2.3.3.4. Thử nghiệm quy trình xà phòng hóa lutein ester

a) Xà phòng hoá lutein ester lượng lớn

Cân 2 mẫu oleoresin (4 gam oleoresin/ mẫu) cho vào bình cầu 50ml. Thêm vào đó V ml dung dịch KOH trong EtOH 960C sao cho nồng độ

oleoresin và nồng độ KOH ứng với giá trị thích hợp được xác định từ các thí

nghiệm 2.3.3.3a và b. Lắp sinh hàn hồi lưu, khuấy đều, đun nóng hỗn hợp ở

nhiệt độ và thời gian được xác định từ kết quả các thí nghiệm 2.3.3.3 c và

2.3.3.3d. Hỗn hợp sau khi xà phòng hóa được chiết bằng ethyl acetate, rửa

bằng nước cất (3 lần), lọc qua Na2SO4 khan rồi định mức bằng acetone thành

100 ml. Hút dịch chiết ethyl acetate rồi pha loãng 100 lần bằng acetone

HPLC, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC.

b) Xà phòng hoá lutein ester thêm chuẩn

Tiến hành tương tự như mục 2.3.3.4a nhưng thêm vào đó 0,6g lutein

chuẩn.

Sau khi tiến hành xà phòng hoá và chạy HPLC, tính được hiệu suất thu

hồi lutein và độ thu hồi %R của quá trình xà phòng hoá theo công thức:

H% = C

%Rxà phòng hoá = (Lượng lutein trong mẫu thêm tìm thấy (mthêm tìm thấy) –

Lượng lutein trong mẫu không thêm (mkhông thêm))*100/ Lượng lutein đã thêm

(mthêm)

Từ đó tính được hiệu suất thu hồi lutein của toàn bộ quá trình phân tích

(bao gồm hiệu suất thu hồi của quá trình xà phòng hoá và hiệu suất thu hồi

được phân tích trên thiết bị HPLC)

%Rtoàn bộ = %Rxà phòng hoá * %Rphân tích

2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình.

Phân tích ANOVA với độ tin cậy P = 0,95 để đánh giá sự khác biệt có

ý nghĩa giữa các giá trị trung bình.

Dùng phần mềm EXCEL 2003 để vẽ đồ thị và xử lý số liệu.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN TRONG

HỖN HỢP CHỨA LUTEIN ESTER

3.1.1. Chọn thành phần pha động

Kết quả thử nghiệm 6 chế độ rửa giải isocratic được trình bày trong

bảng 3.1 và hình 3.1.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thừa số lưu giữ

lutein và lutein ester

Thành phần pha động Thời gian Thừa số Ký MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O Peak lưu lưu giữ hiệu (v/v/v/v) (tR) (k’)

9,293 1,966 Lu I1 70:15:10:5 KRG - LuE

8,873 1,862 Lu I2 45:40:10:5 KRG - LuE

5,493 0,772 Lu I3 70:9:20:1 KRG - LuE

- << 1 Lu I4 50:9:40:1 LuE 14,233 – 38,220 4,348 –11,329

- << 1 Lu I5 45:12:42:1 LuE 13,540 – 28,680 3,368 – 8,252

- << 1 Lu I6 45:14:40:1 LuE 12,039 – 24,433 2,591 – 5,757

Ghi chú : Lu: Lutein; LuE: Lutein ester; KRG: không rửa giải.

Hình 3.1. Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và rửa giải của lutein và lutein ester

Từ bảng 3.1. cho thấy:

Nhìn chung, khi thay đổi từ chế độ rửa giải isocratic từ I1 đến I6 (ứng

với tỷ lệ CH2Cl2 tăng dần từ 10% đến 40%) thì các carotenoid đều được rửa

giải nhanh hơn, tức thừa số lưu giữ của lutein tự do và lutein ester đều giảm

xuống. Nguyên nhân là do CH2Cl2 có khả năng hòa tan rất tốt các carotenoid,

do đó tỷ lệ CH2Cl2 càng lớn sẽ càng thuận lợi cho sự rửa giải lutein và lutein

ester ra khỏi pha tĩnh. Với tỷ lệ CH2Cl2 trong pha động là 10% thì thừa số lưu

giữ của lutein là k’lutein » 2 (từ 1,862 – 1,998), tức thỏa mãn yêu cầu trong sắc

ký (k’ = 2 – 5). Tuy nhiên, nếu tăng tỷ lệ CH2Cl2 trong pha động lên 20% thì

thừa số lưu giữ k’lutein = 0,772 <1. Ngược lại, khi tỷ lệ CH2Cl2 không quá 20%

thì lutein ester không rửa giải được (không thấy xuất hiện sau 120 phút). Khi tăng tỷ lệ CH2Cl2 lên 40% thì nhóm hợp chất này mới được rửa giải nhưng

khi đó lutein lại rửa giải quá sớm (k’lutein<<1). Nghịch lý trên cho thấy không

thể sử dụng chế độ rửa giải isocratic để phân tích hỗn hợp chứa đồng thời

lutein và lutein ester mà cần phải dùng chế độ rửa giải gradient.

Dựa vào việc phân tích các kết quả trên chúng tôi đề xuất sử dụng hệ 2

pha động:

A = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v)

B = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:14:40:1 (v/v/v/v)

với chế độ rửa giải như sau:

0 – 10 phút: 0% B

10 – 25 phút: 0% B đến 100% B (gradient tuyến tính)

25 – 60 phút: 100% B

60 – 70 phút: 100% B về 0% B

70 – 75 phút: 0% B (Cân bằng cột)

Tốc độ dòng: 1 ml/phút; Nhiệt độ cột: 250C

100

70 75

Hình 3.2. Sơ đồ sự thay đổi thành phần pha động trong quá trình rửa giải

Áp dụng chế độ rửa giải nói trên cho hỗn hợp lutein và lutein ester

chúng tôi ghi nhận được sắc ký đồ HPLC (Hình 3.3). Các thông số mô tả thời

gian lưu (tR) và thừa số lưu giữ (k’) của các cấu tử trong mẫu được cho trong

bảng 3.2.

Hình 3.3. Sắc ký đồ chế độ rửa giải gradient dung môi

Bảng 3.2. Giá trị k’ của lutein và lutein ester khi thử nghiệm rửa giải

theo chương trình gradient dung môi đề nghị.

Thời gian lưu Thừa số lưu giữ STT Cấu tử tR (phút) k’= (tR – t0)/t0

1 Dung môi (acetone) 3,100 0

2 Lutein tự do 8,847 1,854

3 Lutein ester-1 37,887 11,222

4 Lutein ester-2 40,433 12,043

5 Lutein ester-3 43,407 13,002

6 Lutein ester-4 46,940 14,142

7 Lutein ester-5 51,167 15,505

Với chương trình rửa giải gradient đã thử nghiệm thì các giá trị thừa số

lưu giữ của các cấu tử trong mẫu rơi vào khoảng 1,854 – 15,505. Với hỗn hợp

mẫu phức tạp gồm nhiều cấu tử có độ phân cực khác nhau nhiều (từ lutein tự

do khá phân cực đến lutein ester kém phân cực) thì có thể chọn chế độ rửa

giải sao cho k’ = 1 – 20. Do đó, chương trình rửa giải gradient nói trên được

chúng tôi áp dụng cho các khảo sát tiếp theo.

3.1.2. Chọn tốc độ dòng

Khi thay đổi tốc độ dòng lần lượt từ 0,8 đến 1,0 và 1,2 ml/phút thì các

sắc ký đồ thu được đều cho các peak rõ đẹp, tách nhau hoàn toàn. Để chọn tốc

độ dòng thích hợp, cần đánh giá ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thời gian lưu

(tR), thừa số lưu giữ (k’), độ rộng peak (W) và số đĩa lý thuyết (N) đối với các

cấu tử trong hỗn hợp lutein và các lutein ester (xem bảng 3.3 và các đồ thị

3.4.a, 3.4.b và 3.4.c).

Theo đó, khi tăng tốc độ dòng từ 0,8 lên 1,2 ml/phút thì:

- Thừa số lưu giữ (k’) của lutein gần như không đổi (» 1,85) nhưng của

các lutein ester tăng lên gần như tuyến tính. Nguyên nhân là do khi tốc độ pha

động tăng thì thời gian chết t0 giảm.

- Độ rộng chân peak (W) giảm đáng kể khi tốc độ dòng tăng từ 0,8-1,0

ml/phút nhưng sau đó giảm rất ít hay gần như không đổi (trên sắc ký đồ quan

sát thấy các peak trở nên thon, nhọn hơn)

- Số đĩa lý thuyết của các cấu tử (N) tăng khi tốc độ dòng tăng từ 0,8 - 1,0 ml/phút nhưng sau đó lại giảm hoặc gần như không đổi khi tốc độ dòng

tăng từ 1,0 đến 1,2 ml/phút.

Do vậy, để thu được sắc ký đồ với các peak thon gọn, hiệu quả tách của

cột tốt hơn, thời gian phân tích không dài, tốc độ dòng u = 1,0 ml/phút được

chọn để tiếp tục khảo sát.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến độ rộng chân peak và số đĩa lý

thuyết của cột tách đối với các cấu tử phân tích.

u Đại Cấu tử phân tích

(ml/ lượng sắc Dung Lu LuE- LuE- LuE- LuE- LuE-

phút) ký môi 1 2 3 4 5

tR (phút) 3,90 11,09 41,52 44,45 47,95 51,99 56,87

0,8 1,84 k’ 0 9,65 10,40 11,30 12,33 13,58

1,15 W (phút) 0,95 1,53 1,66 2,04 2,46

N (đĩa) 626 25091 11240 11268 8890 7419

tR (phút) 3,10 8,85 37,89 40,43 43,41 46,94 51,17

1,0 k’ 0 1,85 11,22 12,04 13,00 14,14 15,51

W (phút) 0,82 0,77 1,21 1,41 1,83 2,00

N (đĩa) 768 32657 15231 13075 9182 9242

tR (phút) 2,58 7,35 35,53 37,84 40,55 43,79 47,65

1,2 k’ 0 1,85 12,77 13,67 14,72 15,97 17,47

W (phút) 0,77 0,93 1,26 1,35 1,78 1,89

N (đĩa) 615 20081 12530 12655 8575 9100

' k

Lu LuE-1 Lu-2 LuE-3 LuE-4 LuE-5

0,6

0,8

1,2

1,4

u (mL/phút)

3,00

2,50

2,00

a) Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thừa số lưu giữ của lutein và lutein ester

i

) n m

1,50

(

Lu LuE-1 Lu-2 LuE-3 LuE-4 LuE-5

W

1,00

0,50

0,00

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

u (mL/phút)

b) Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến độ rộng chân peak của lutein và lutein

35000

30000

25000

20000

Lu LuE-1 LuE-2 LuE-3 LuE-4 LuE-5

ester

) a ĩ đ (

N

15000

10000

5000

0,6

0,8

1,2

1,4

u (mL/phút)

c) Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến số đĩa lý thuyết của lutein và lutein ester

Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến một số đại lượng sắc ký

Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi tốc độ dòng từ 0,8 đến 1,2 ml/phút

3.1.3. Chọn thể tích bơm mẫu

Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu (Vinj) đến đặc tính sắc ký của các cấu

tử được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.6

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến độ rộng chân peak, số

đĩa lý thuyết và chiều cao của đĩa đối với các cấu tử phân tích.

Cấu tử phân tích

Vinj

Đại lượng

sắc ký

(µl)

LuE-1

LuE-2

LuE-3

LuE-4

LuE-5

tR (phút)

8,84

38,00

40,30

43,50

47,07

51,41

k’

1,85

11,26

12,00

13,03

14,18

15,58

954584

610084

42156

795051

1005848

489592

0,70

0,87

1,39

1,29

1,62

1,66

N (đĩa)

1076

29253

13516

18591

14230

7072

H (mm/đĩa)

0,232

0,035

0,009

0,018

0,013

0,018

tR (phút)

8,88

37,94

40,49

43,51

47,07

51,37

k’

1,86

11,24

12,06

13,04

14,18

15,57

1245693 103020

434141

1181692

2775514

964367

0,9

0,64

0,95

1,27

1,72

1,66

N (đĩa)

660 47415

24789

16201

10455

13527

H (mm/đĩa)

0,379

0,005

0,010

0,015

0,024

0,018

tR (phút)

8,86

37,92

40,48

43,48

47,047

51,313

k’

1,85

11,23

12,06

13,03

14,178

15,55

2126024 197624

638967

1713045

4219258

1544386

0,95

1,35

1,97

1,79

N (đĩa)

588,19

14314,79

7962,44

11607,6

H (mm/đĩa)

0,425

0,830 28159,2 7 0,009

1,08 19166,8 6 0,013

0,017

0,031

0,022

tR (phút)

8,847

37,887

40,433

43,407

46,94

51,167

k’

1,85

11,22

12,04

13,01

14,14

15,50

3391830 345782

974498

2462189

5660473

2104321

1,02

0,77

1,21

1,41

1,83

N (đĩa)

507,93

32656,7 15231,2 13075,03

9182,46

9241,75

H (mm/đĩa)

0,49

0,01

0,012

0,02

0,027

6000000

5000000

LuE-1

4000000

3000000

LuE-2

2000000

LuE-3

1000000

LuE-4

LuE-5

v (µl)

a) Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến diện tích peak của lutein và

LuE-1

LuE-2

LuE-3

LuE-4

LuE-5

lutein ester

) a ĩ đ

,

N

( t ế y u h t ý

l

ĩ

50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

a đ ố S

15 V-inject (uL)

b) Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến số đĩa lý thuyết của lutein và

lutein ester

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến quá trình sắc ký

Qua khảo sát các thể tích bơm mẫu khác nhau từ 5µl; 10µl; 15µl; 20µl

thì hầu như các peak lutein và lutein ester đều rửa giải với thời gian lưu và hệ

số lưu giữ gần như là như nhau. Tuy nhiên, để lựa chọn thể tích bơm mẫu phù

hợp, chúng ta cần xét đến ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến diện tích peak

và số đĩa lý thuyết cũng như chiều cao đĩa, cụ thể như sau:

-Khi thể tích bơm mẫu tăng thì chiều cao và diện tích peak của các

lutein và lutein ester tăng đáng kể. Điều này cho thấy độ nhạy của phương

pháp tăng khi tăng thể tích bơm mẫu.

-Tuy nhiên, số đĩa lý thuyết của các cấu tử (N) lại giảm khi thể tích

bơm mẫu tăng. Điều này cho thấy, càng tăng thể tích bơm mẫu thì độ phân

giải của mẫu càng kém. Do đó, việc lựa chọn thể tích bơm mẫu vừa phải là

điều cần thiết.

Kết hợp với sắc ký đồ ở hình 3.7, khi thể tích bơm mẫu tăng từ 5µl -

20µl thì sắc ký đồ của lutein và lutein ester có peak sắc, nhọn và rõ nét hơn.

Do đó, thể tích bơm mẫu được chọn trong nghiên cứu này là 20µl.

Hình 3.7. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi thể tích bơm mẫu

3.1.4. Kết luận về điều kiện phân tích hỗn hợp lutein và lutein ester

Từ những kết quả khảo sát trên đây, có thể đi đến các kết luận sau:

Điều kiện thích hợp để tách hỗn hợp lutein và lutein ester bằng phương

pháp HPLC sử dụng cột phân tích TSKgel ODS-100V (250 mm x 4,6 mm; 5 μm) ở nhiệt độ 250C:

- Pha động: gồm 2 hệ dung môi sau:

A = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v)

B = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:14:40:1 (v/v/v/v)

Rửa giải gradient theo chương trình như sau:

0 - 10 phút: 0% B

10 – 25 phút: 0% B đến 100% B (gradient tuyến tính)

25 - 60 phút: 100% B

60 – 70 phút: 100% B về 0% B

70 – 75 phút: 0% B (Cân bằng cột)

Tốc độ dòng: 1 ml/phút

Thể tích bơm mẫu: 20 µl

(Detector DAD quét phổ từ 190-840 nm và ghi nhận tín hiệu ở 450 nm)

Ghi chú:

Trong trường hợp mẫu phân tích chỉ chứa lutein thì chỉ cần chạy chế độ

rửa giải isocratic trong 10 phút, trong đó pha động là hỗn hợp

MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v) (phần 3.1.1).

3.2. DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN

3.2.1. Xác định độ tinh khiết của mẩu lutein đối chứng

Tiến hành định lượng theo phương pháp JECFA (2004) đã xác định

được hàm lượng carotenoid tổng số (% CARTS) và hàm lượng lutein (% Lu)

trong mẫu lutein đối chứng như sau:

%CARTS = 94,10 ± 4,30

và: % Lu = 90,24 ± 2,76

Bảng 3.5. Kết quả xác định hàm lượng carotenoid tổng số và lutein có trong

lutein đối chứng

Khối

Độ

lượng

Lần

hấp thụ

%CARTS

SLutein

STS %SLu %Lu

lutein

đo

G (g)

0,0341

0,847

97,37

13740086 14441881 95,14 92,64

0,0336

0,820

95,69

21237152 22364853 94,96 90,87

0,0316

0,719

89,23

14302842 14631849 97,75 87,22

Trung

94,10

95,95 90,24

bình

4,30

1,56

2,76

3.2.2. Kết quả dựng đường chuẩn lutein

Từ kết quả định lượng lutein trong mẫu lutein đối chứng, tính được

24,90

Lutein

6,99

ppm

100

)

(

ppm

Lutein

6,27 x 25,0.100

( mg .100 V

pha

).% Lutein )( L Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha chế các dung dịch chuẩn làm việc có

nồng độ dung dịch chuẩn gốc lutein (xem mục 2.3.1.5.b) đã pha chế như sau:

nồng độ từ 5 – 40 ppm và chạy HPLC trên thiết bị đang khảo sát với điều kiện

rửa giải đã chọn ở phần 3.1.4.

Dữ liệu thu được khi dựng đường chuẩn lutein được trình bày trong

Bảng 3.6 và các Hình 3.8-1, 3.8-2; 3.8-3.

Bảng 3.6. Kết quả dựng đường chuẩn lutein (lặp lại 3 lần song song)

Dung

dịch Dung dịch Vđịnh chuẩn Vhút đo SLu SLu SLu SLu

mức

gốc (ml) CLutein Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB (ml)

Lutein

(ppm)

C0 (ppm)

0,5 10 5 385104 314880 301975 333986

1 10 10 653761 622050 542974 606262

100 2 10 20 1569806 1516295 1489448 1525183

3 10 30 2847378 2835697 2649827 2777634

4 10 40 4754935 4615401 4530198 4633511

Từ các dữ liệu trên, dựng được đường chuẩn mô tả mối quan hệ giữa

diện tích peak lutein (S) với nồng độ (C) của lutein trong dung dịch phân tích

(Hình 3.8) trong khoảng nồng độ 5 - 40 ppm.

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 2)

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 1)

5000000

4000000

S = 113248C - 331121 R2 = 0,9652

4000000

S = 123228C - 545601 R2 = 0,965

S

3000000

S

2000000

1000000

C-Lutein (ppm)

a) Đường chuẩn lutein (lần 1) b) Đường chuẩn lutein (lần 2)

Đường chuẩn HPLC trung bình của lutein (n = 3)

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 3)

5000000

S = 121339C - 572793 R2 = 0,9673

4000000

S = 110256C - 343742 R2 = 0,9585

3000000

S

3000000

S

2000000

1000000

C-Lutein (ppm)

d) Đường chuẩn lutein trung bình c) Đường chuẩn lutein (lần 3)

Hình 3.8. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 40 ppm

3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG ĐÃ XÂY

DỰNG

3.3.1. Tính đặc hiệu của phương pháp phân tích

Để đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp HPLC, kết quả thể hiện ở

a) Kết quả chạy HPLC mẫu trắng

b) Kết quả chạy HPC mẫu đối

hình 3.9.

c) Kết quả HPLC của mẫu thực (lutein ester)

d) Kết quả HPLC mẫu thêm

chứng

Hình 3.9. Kết quả HPLC của các mẫu trắng, mẫu chứng thực, mẫu thực và mẫu thêm

Qua đó ta có thể thấy được rằng:

- Ở mẫu trắng (chỉ dùng dung môi acetone HPLC) thì chỉ có 1 peak của

dung môi ở thời gian lưu 3 phút

- Đối với mẫu lutein đối chứng (chứa dung dịch lutein tan trong acetone

HPLC) xuất hiện peak ở thời gian lưu ~8,9 phút. Điều này cũng thể hiện rõ

trong nghiên cứu trước đây của TS. Hoàng Thị Huệ An (phụ lục.......)

- Mẫu thực chứa lutein ester gồm 5 peak với thời gian lưu tương ứng là

15,6; 18,0; 21,0; 24,5; 28,68 phút với hệ pha động là

MeCN/MeH/CH2Cl2/H2O là 45/14/40/1 v/v/v/v.

- Mẫu thêm chứa dung dịch lutein đối chứng (peak ở thời gian lưu 8.967

phút) và dung dịch asaxanthin (xuất hiện peak ở thời gian lưu 6.9 phút) đồng

thời 5 peak lutein ester ứng với thời gian lưu 34.4; 37.02; 40.098; 43.71;

48.12 phút. Ở đây hệ pha động được chạy như mục 3.1.4.

Từ kết quả trên cho thấy phương pháp HPLC đã chọn có tính chọn lọc

cao.

3.3.2. Độ lặp lại trong ngày (intra-day injection repeatability)

Kết quả chạy HPLC 6 mẫu chuẩn lutein (nồng độ 20 ppm) trong cùng

một ngày trên thiết bị và điều kiện phân tích như sau:

Bảng 3.7. Khảo sát độ lặp lại khi tiêm cùng mẫu chuẩn trong ngày.

Thời gian Diện tích Chiều cao Lần lưu peak peak chạy tR (phút) S H

1 9,100 2170432 120175

2 9,013 1930235 107780

3 9,000 1853365 105839

4 8,953 1793871 100445

5 8,940 1839218 106353

6 8,833 1958927 110278

Trung bình 8,973 1924341,33 108478,33

% RSD 0,991 7,01 6,09

% RSD yêu cầu 7,3 7,3 7,3 [41]

Từ kết quả bảng 3.7 cho thấy, với %RSD của diện tích peak là 7,01%

và của chiều cao là 6,09% gần như đạt yêu cầu. Điều này cho thấy độ lặp lại

là đáng tin cậy.

3.3.3. Khoảng tuyến tính của đường chuẩn

Kết quả dựng đường chuẩn lutein ở phần 3.2.2 cho thấy mối quan hệ

tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ lutein trong khoảng 5 – 40 ppm chưa cao (0,958 < R2 < 0,965) do có điểm chuẩn ở mức nồng độ 40 ppm lệch khá nhiều so với các đường hồi quy. Để đường chuẩn đạt mức độ tuyến tính tốt hơn, chúng tôi thu hẹp khoảng giá trị nồng độ định lượng từ 5 – 30 ppm

Khi đó, tính tuyến tính của đường chuẩn được cải thiện hơn trước (0,9814 < R2 < 0,986). Khi đó, đường chuẩn trung bình của lutein có dạng như sau:

S = 144861C – 148404 ; (R2 = 0,9791)

So với yêu cầu chung về giá trị R2 của các đường chuẩn theo quy định của ICH (R2 > 0,99) [41] thì giá trị R2 đối với đường chuẩn lutein xây dựng được chưa đạt yêu cầu. Nguyên nhân là do dung dịch lutein kém bền và dêx bị phân huỷ nên giá trị R2 thường không cao như đối với các hợp chất thông thường.

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 1)

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 2)

5000000

4000000

S = 99308C - 249741 R2 = 0,9814

4000000

S = 101008C - 319151 R2 = 0,9815

S

3000000

S

2000000

1000000

C-Lutein (ppm)

a) Đường chuẩn lutein (lần 1) b) Đường chuẩn lutein (lần 2)

Đường chuẩn HPLC trung bình của lutein (n = 3)

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 3)

3000000

5000000

2500000

S = 144861C - 148404 R2 = 0,9791

4000000

2000000

S = 95538C - 306441 R2 = 0,9855

S

3000000

S

1500000

2000000

1000000

500000

C-Lutein (ppm)

c) Đường chuẩn lutein (lần 3) d) Đường chuẩn lutein trung bình

Hình 3.10. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 30 ppm

3.3.4. Xác định LOD và LOQ

Dựa vào phương trình đường chuẩn đã được xây dựng ở mục 3.3.3. Ta

có thể tính được giới hạn định phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

như sau:

Lần Giá trị b

1 249741

2 319151

3 306441

Trung bình 148404

3,3

LOD

SD 36955

SD ´ b a

LOQ

= 0.84ppm

SD ´ b a

= 2.55ppm

Dựa vào kết quả tính toán LOD và LOQ ở trên, cho thấy giới hạn định

tính và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích đều thấp và đạt yêu

cầu.

3.3.5. Xác định độ thu hồi

Mẫu trắng thêm chuẩn

Dựa vào kết quả phân tích mẫu trắng (dung môi acetone) được bổ sung

với nồng độ 12; 15 và 18ppm được trình bày trong bảng 3.8. Cụ thể:

Bảng 3.8. Khảo sát độ thu hồi khi thêm mẫu chuẩn

ở các nồng độ 12; 15; 18ppm.

Lần đo thời gian S H Ctt %R

Nồng độ thêm Cthêm (ppm)

12ppm

8,9 8,9 8,88 8,9

15ppm

18ppm

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình %RSD Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình %RSD Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình %RSD 1532411 89662 11,60295 96,69 1335173 78759 10,24138 85,34 1241841 73715 9,597097 79,98 87,34 9,77 1631568 96680 12,28745 81,92 8.,887 1497958 88576 11,36512 75,77 73,51 8,887 1448906 86468 11,0265 77,06 5,65 8.,873 2034872 122750 15,07152 83,73 76,1 8,86 1836693 108442 13,70346 79,7 8,873 1929788 117403 14,34611 79,85 4,76

Nhận xét: Kết quả trong bảng 3.8, gía trị độ thu hồi %R ở mỗi nồng độ

đều đạt yêu cầu (từ 80 – 110%) [41]. Ở nồng độ thêm 12ppm, giá trị độ lệch

chuẩn %RSD đạt 9,77% cao hơn so với %RSD yêu cầu (7,3%) [41]. Do đó,

phương pháp HPLC đã xây dựng có độ thu hồi đạt yêu cầu.

3.3.6. Kết luận về việc thẩm định phương pháp HPLC đã xây dựng

Qua khảo sát về việc thẩm định phương pháp HPLC đã xây dựng, ta có

thể rút ra kết luận sau:

- Phương pháp có tính đặc hiệu cao, phân biệt được rõ các peak lutein

và lutein ester.

- Độ lặp lại của phương pháp tốt với %RSD là 7.01% đạt yêu cầu so

với %RSD yêu cầu (7,3%).

- Độ tuyến tính của đường chuẩn nằm trong khoảng nồng độ 5 – 30

ppm với độ lệch chuẩn R2 là 0,9791.

- Giới hạn phát hiện LOD = 0,84ppm và giới hạn định lượng LOQ =

2,55ppm.

- Độ thu hồi đạt yêu cầu với %R trung bình là 81,52% tương ứng với

các nồng độ 12ppm; 15ppm; 18ppm lần lượt là 87,34%; 77,36%; 79,85%

(%R yêu cầu trong khoảng 80 – 110%).

3.4. NHẬN BIẾT PEAK LUTEIN VÀ LUTEIN ESTER

Kết quả HPLC cho thấy oleoresin chiết từ mẫu hoa cúc vạn thọ nghiên

cứu là hỗn hợp chứa chủ yếu các dạng ester khác nhau của lutein, trong đó

hàm lượng lutein tự do trong mẫu oleorsin không phát hiện được (Hình 3.11). Sau quá trình xà phòng hóa ở điều kiện khảo sát (700C; 3 h), sắc ký đồ HPLC (Hình 3.12; Hình 3.13) và phổ hấp thụ UV-Vis của các peak trên sắc ký đồ

(Hình 3.44) cho thấy ngoài sự hình thành lutein tự do ở dạng trans có RT ~

8,9 phút luôn luôn tạo thành đồng phân cis-lutein (RT ~ 10,3 min).

Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin không xà phòng hóa (lutein ester) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml

Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin sau khi xà phòng hóa (lutein tự do) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml

Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu lutein đối chứng cho thấy trans-lutein có RT ~ 8,9 phút

b) cis-lutein: a) trans-lutein:

lmax = 328; 418; 442; 468 nm lmax = 424; 446; 474 (nm)

Hình 3.14. Phổ hấp thụ UV-Vis ứng với: a) peak trans-lutein (RT ~ 8,9 min); b) peak cis-lutein (RT ~ 10,3 min)

Các sắc ký đồ HPLC thu được (Hình 3.12) cho thấy với cột HPLC đang

sử dụng (cột C18 kích thước 250 mm x 4,6 mm; cỡ hạt 5µm) không phát hiện

được peak của zeaxanthin. Kết quả nghiên cứu của Hoàng Thị Huệ An (2009)

[13] cũng chứng tỏ cột C18 cỡ hạt 5 µm không có khả năng phân giải cặp đồng phân lutein/zeaxanthin. Để phân giải cặp đồng phân này cần dùng các cột C18

có cỡ hạt nhỏ hơn (cỡ 3 µm), hoặc dùng cột có pha tĩnh tương tác với lutein

và zeaxanthin chọn lọc hơn (như cột C30 hoặc cột silica). Do các cột HPLC

nói trên không được sử dụng phổ biến ở nước ta nên trong nghiên cứu này chỉ

đánh giá hàm lượng zeaxanthin qua hàm lượng lutein tổng cộng.

3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐÃ THỬ NGHIỆM ĐỂ XÁC

ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER

ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ HOA CÚC VẠN THỌ

Để khảo sát điều kiện thích hợp nhất khi tiến hành xà phòng hoá lutein

ester được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ, ta cần đi khảo sát các điều kiện về

ảnh hưởng của nồng độ lutein ester (oleoresin), nồng độ KOH, nhiệt độ và

thời gian đến hiệu suất xà phòng hoá.

3.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ oleoresin

Từ kết quả bảng 3.9 và hình 3.15, ta thấy rằng nồng độ oleoresin ảnh

hưởng không nhỏ đến hiệu suất xà phòng hoá lutein ester.

Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oleoresin đến

hiệu suất xà phòng hoá.

Coleoresin KOH/Oleoresin Hiệu suất thu Hiệu suất thu Hiệu suất xà

(g/ml) (w/w) nhận trans- nhận cis- phòng hóa

lutein (%) lutein (%) tổng cộng

(%)

0,1 1,50 2,98 18,08 15,10

0,2 0,75 4,75 21,53 16,78

0,3 0,50 4,97 22,38 17,41

0,4 0,38 6,14 21,96 15,82

0,5 0,30 5,54 25,64 20,10

0,6 0,25 12,40 63,08 50,68

0,8 0,19 15,49 92,81 77,32

0,9 0,17 9,60 41,75 32,15

Trans-Lutein

Cis-Lutein

Tổng lutein

100

)

%

(

a ó h g n ò h p à x t ấ u s u ệ i H

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

C-Oleoresin (g/ml)

Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ oleoresin

Nhận xét:

- Với nồng độ oleoresin thấp (với 0,1 – 0,5g/ml) tương ứng với tỷ lệ

KOH/oleoresin lớn (1,5 – 0,3 lần) ta nhận thấy rằng hiệu suất chuyển hoá của

lutein ester thành lutein tự do (dạng trans, cis – hay tổng số) đều rất thấp.

Điều này cho thấy lutein tự do bị phân huỷ khi có mặt của lượng kiềm dư khá

lớn.

- Khi nồng độ oleoresin tăng lên thì hiệu suất xà phòng hoá cũng tăng

lên đáng kể, ở nồng độ oleoresin 0,8g/ml (tương ứng với tỷ lệ KOH/oleoresin

là 0,19) thì đạt cực đại nhưng sau đó lại giảm mạnh ở nồng độ 0,9g/ml. Thực

nghiệm cho thấy rằng, khi tăng nồng độ oleoresin lên (>0,8g/ml) thì hỗn hợp rất đặc do đó việc khuấy trộn rất khó ngay cả khi nó được đun nóng đến 700C. Nguyên nhân của việc giảm hiệu suất xà phòng hoá khi tăng nồng độ

oleoresin là do sự giảm khả năng tiếp xúc các tác chất trong hỗn hợp phản

ứng. Vì vậy, để hiệu suất xà phòng hoá lutein ester cao nhất nên chọn nồng độ

oleoresin là 0,8g/ml.

3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa

Kết quả thực nghiệm từ bảng 3.10 cho thấy, nồng độ KOH ảnh hưởng

mạnh đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester. Khi cố định nồng độ oleoresin

là 0,3g/ml thì hiệu suất phản ứng tăng mạnh khi nồng độ KOH tăng từ 0,00 –

0,05g/ml và sau đó giảm dần khi tiếp tục tăng nồng độ KOH .

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa

lutein ester.

CKOH KOH/Oleoresin Hiệu suất thu Hiệu suất Hiệu suất xà

(g/ml) (w/w) nhận trans- thu nhận cis- phòng hóa

lutein (%) lutein (%) tổng cộng

(%)

0,000 0,00 0,00 0,00 0,00

0,025 0,08 18,95 5,21 24,15

0,050 0,17 56,88 9,22 66,10

0,100 0,33 53,35 5,21 58,56

0,150 0,50 16,74 4,53 21,27

0,200 0,67 11,20 2,52 13,72

0,250 0,83 8,90 2,74 11,63

0,300 1,00 4,12 1,34 5,45

Điều này được giải thích bởi sự phân huỷ lutein trong môi trường kiềm

dư. Chitta Ranjan Sarkar và cs. (2012) cũng đã đưa ra kết luận về sự suy giảm

hiệu suất xà phòng hoá lutein ester trong môi trường kiềm khi xà phòng hoá

lutein ester bằng KOH trong methanol.

Theo kết quả nghiên cứu trên (bảng 3.10), nhận thấy rằng để xà phòng

hoá lutein ester với nồng độ oleoresin được cố định là 0,3g/ml thì cần dùng

nồng độ KOH trong ethanol là 0,05g/ml (tức 5% w/v hay 0,89M) tương ứng

tỷ lệ giữa KOH/oleoresin là 0,17 w/w.

Trong khi đó, theo Swaminathan, điều kiện tối ưu để xà phòng hoá

lutein ester là nồng độ oleoresin 0,8g/ml với nồng độ KOH là 15% w/v (tức là

0,15g/ml hay 2,5M) ứng với tỷ lệ KOH/oleoresin là 0,1875 w/w) [8] . Mặc

dù, giá trị KOH tối ưu để xà phòng hoá khác nhau nhiều nhưng giá trị tỷ lệ

KOH/oleoresin tối ưu theo nghiên cứu của chúng tôi và Swaminathan lại khá

gần nhau. Một điều thú vị nữa là nếu chúng ta biểu diễn kết quả nghiên cứu ở bảng 3.9 và 3.10 qua các đồ thị hình 3.16 và 3.17 thì đều cho kết quả tỷ lệ

KOH/oleoresin tối ưu vào khoảng 0,17 – 0,19, điều này trùng hợp với kết quả

nghiên cứu của Swaminathan. Vì vậy, với tỷ lệ KOH/oleoresin tối ưu này thì

tùy theo nồng độ oleoresin trong hỗn hợp mà phải dùng nồng độ KOH khác

nhau. Điều đó giải thích tại sao nồng độ KOH tối ưu trong kết quả nghiên cứu

100

Trans-Lutein Cis-Lutein

0,19

Tổng lutein

của các tác giả khác nhau thường không giống nhau.

)

%

( a ó h

0,25

g n ò h p

0,17

à x t ấ u s

0,30

0,50

0,38

0,75

1,50

u ệ i H

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

KOH/Oleoresin (w/w)

100

Trans-Lutein Cis-Lutein

Tổng Lutein

Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin khi thay đổi nồng độ oleoresin từ 0,1 – 0,9 g/ml

)

%

0,17

0,33

0,08

0,50

( a ó h g n ò h p à x t ấ u s u ệ i H

0,67

0,83

1,00

0,00

0 0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

KOH/Oleoresin (w/w)

Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin khi cố định nồng độ oleoresin 0,3 g/ml

Như vậy, để hiệu suất xà phòng hóa lutein ester cao nhất nên tiến hành

phản ứng với tỷ lệ KOH/oleoresin khoảng 0,18 w/w. Khi đó, ứng với nồng độ

oleoresin tối ưu 0,8 g/ml thì nồng độ KOH cần dùng là: CKOH = 0,8 x 0,18 =

0,144 g/ml = 14,4% w/v = 2,58 M. Kết quả này khá tương đồng với điều kiện

xà phòng hóa đề nghị bởi Swaminathan (2010).

3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa

Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hoá

thể hiện qua bảng 3.11 và hình 3.18.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa.

Nhiệt độ Hiệu suất thu Hiệu suất thu Hiệu suất xà phòng

(0C) nhận trans-lutein nhận hóa

cis-lutein (%) tổng cộng (%) (%)

2,24 0,00 2,24 40

6,51 0,00 6,51 50

8,60 0,00 8,60 60

56,90 9,22 66,12 70

100

Trans-Lutein Cis-Lutein

Tổng Lutein

74,64

59,25 15,39 74,64 80

)

%

66,12

59,25

56,90

( a ó h g n ò h p à x t ấ u s u ệ i H

15,39

8,60

6,51

9,22

8,60

2,24

6,51

2,24 0,00

0,00

Nhiệt độ (độ C)

Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester

Từ kết quả trên cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất xà

phòng hóa lutein ester và chất lượng sản phẩm lutein tự do hình thành.

- Ở nhiệt độ 400C hiệu suất xà phòng hóa rất thấp (chỉ khoảng 2,24%) tại đó lượng lutein ester còn lại rất lớn trong khi đó lượng lutein tự do hình

thành không đáng kể. Điều đó thể hiện rõ ở sắc ký đồ hình 3.19.a). Thực nghiệm cho thấy ở 400C oleoresin chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ là một khối lỏng đặc sệt, rất khó khuấy trộn. Khi được gia nhiệt, oleoresin dần dần chảy

lỏng ra, dễ khuấy hơn.

- Khi tăng nhiệt độ từ 40 – 600C thì hiệu suất xà phòng hóa tăng lên nhưng chậm (từ 2,24% – 8,60%). Nếu tiếp tục tang nhiệt độ từ 60-700C thì hiệu suất phản ứng tăng rất mạnh (từ 8,6% – 66,12%) nhưng sau đó lại tăng

chậm dần. Như vậy, khi tăng nhiệt độ xà phòng hoá thì hiệu suất tăng có thể

được giải thích bởi sự gia tăng khả năng tiếp xúc các tác chất (oleoresin và

KOH) với nhau, nhờ đó tốc độ phản ứng tăng lên.

Các sắc ký đồ HPLC (Hình 3.19) cũng cho thấy ở nhiệt độ dưới 600C thì sản phẩm lutein tự do hình thành chỉ có đồng phân trans chứ không có đồng phân cis. Tuy nhiên, trên 600C thì đồng phân cis xuất hiện và tỷ lệ đồng phân cis/trans càng tăng khi nhiệt độ càng tăng. Do vậy, mặc dù hiệu suất xà phòng hóa ở 800C cao hơn ở 700C nhưng ở 800C tỷ lệ đồng phân cis trong hỗn hợp sản phẩm lutein tự do (khoảng 20%) cao hơn đáng kể so với tỷ lệ này ở 700C (khoảng 13,9%). Do vậy, để hiệu suất xà phòng hóa cao đồng thời bảo đảm hoạt tính sinh học của sản phẩm tương đối tốt, nên tiến hành xà phòng hóa ở 700C. Kết luận này cũng phù hợp với điều kiện về nhiệt độ xà phòng hóa lutein ester đã được đề nghị bởi Swaminathan (2009).

a) Ở 400C

b) Ở 500C

c) Ở 600C

d) Ở 700C

e) Ở 800C

Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu oleoresin 0,3 g/ml sau khi xà phòng hóa bằng KOH 5% w/v trong EtOH trong 1 h ở các nhiệt độ khác nhau.

3.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng

hóa

Kết quả theo dõi ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hoá

khi cố định nồng độ oleoresin là 0,3g/ml; nồng độ KOH là 15% w/v; nhiệt độ 700C được thể hiện ở Bảng 3.12 và Hình 3.20.

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester.

Thờigian Hiệu suất thu nhận Hiệu suất thu nhận Hiệu suất xà phòng hóa

(min) trans-lutein (%) cis-lutein (%) tổng cộng (%)

0 0,00 0,00 0,00

20 54,98 11,10 66,07

40 57,70 10,55 68,25

60 61,54 13,20 74,74

80 67,65 14,30 81,95

100 57,93 14,08 72,01

120 55,12 15,56 70,68

100

Trans-Lutein Cis-Lutein

Tổng-Lutein

180 41,70 10,60 52,29

)

%

( n i e t u l n ậ h n u h t t ấ u s u ệ i H

100

120

140

160

180

200

Thời gian (phút)

Hình 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester

Từ kết quả khảo sát trên, cho thấy:

- Trong thời gian 20 phút đầu tiên hiệu suất chuyển hóa lutein ester

thành lutein tự do ở các dạng đồng phân trans, cis và tổng số đều tăng rất

mạnh (từ 0% lên đến 66,07%). Các sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin ban

đầu và sau khi xà phòng hóa (Hình 3.21a và Hình3.21b) cũng cho thấy chỉ sau

20 phút các peak lutein ester hầu như biến mất; ngược lại xuất hiện các peak

trans-lutein (RT ~ 9,3 phút) và cis-lutein (RT ~ 10,9 phút).

- Tiếp tục đun nóng từ 20 - 80 phút thì hiệu suất thu nhận lutein tự do

dạng trans và lutein tổng số tăng lên nhưng với tốc độ chậm hơn và sau đó lại

giảm đi nếu kéo dài thời gian phản ứng. Trong khi đó, hiệu suất hình thành

dạng cis-lutein hầu như không thay đổi khi thời gian phản ứng tăng từ 20 – 180 phút. Điều này chứng tỏ ở 700C đồng phân cis-lutein tương đối bền, còn đồng phân trans kém bền hơn. Nguyên nhân của việc giảm hiệu suất thu nhận

lutein dạng trans- nếu kéo dài thời gian xà phòng hoá (trên 80 phút) là do sự

chuyển hoá dạng đồng phân này sang dạng đồng phân cis- của lutein hoặc các

dạng sản phẩm phân huỷ khác.

Theo kết quả nghiên cứu trên cho thấy thời gian thích hợp nhất để xà phòng hóa lutein ester được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ ở 700C là 80 phút. Thời gian phản ứng này so với thời gian đề nghị bởi Swaminathan (2009) dài

hơn 50 phút. Nguyên nhân của sự khác biệt này là do trong quy trình của

Swaminathan phản ứng xà phòng hóa được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn (từ 70-800C). Như đã nhận xét ở phần 3.5.3, việc tăng nhiệt độ phản ứng từ 70- 800C tuy có tác dụng làm tăng hiệu suất xà phòng hóa (nhờ vậy rút ngắn thời gian phản ứng) nhưng sẽ làm tăng tỷ lệ đồng phân cis- trong sản phẩm phản

ứng, do đó làm giảm hoạt tính sinh học của sản phẩm lutein thu nhận được. Do vậy, chúng tôi vẫn chọn nhiệt độ xà phòng hóa là 700C, ứng với thời gian xà phòng hóa 80 phút.

a) Mẫu chưa xà phòng hóa

b) Mẫu xà phòng hóa 20 phút

c) Mẫu xà phòng hoá 40 phút

e) Mẫu xà phòng hoá 80 phút

f) Mẫu xà phòng hoá 100 phút

g) Mẫu xà phòng hoá 120 phút

h) Mẫu xà phòng hoá 180 phút

d) Mẫu xà phòng hoá 60 phút

Hình 3.21. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu xà phòng hoá trong các khoảng thời gian khác nhau.

3.5.5. Kết luận về khảo sát điều kiện xà phòng hoá

Qua kết quả khảo sát điều kiện xà phòng hoá trên để đạt để hiệu suất xà

phòng hoá cao, có thể rút ra một số kết luận sau:

- Nồng độ oleoresin là 0,8g/ml ứng với nồng độ KOH tối ưu là 14,4%

w/v tức tỷ lệ giữa KOH/oleoresin là 0,18 w/w.

- Nhiệt độ xà phòng hoá để đạt hiệu suất cao là 700C

- Thời gian xà phòng hoá là 80 phút

3.6. THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ

3.6.1. Thử nghiệm trên mẫu lớn

Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá cao chiết lutein ester trên

mẫu lớn được thể hiện ở bảng 3.13.

Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá trên mẫu lớn.

Mẫu đo Strans- Scis- Stổng mLutein (g) CLutein tìm thấy(ppm)

TB %RSD

CLutein tổng (ppm) 59,75 57,30 65,25 60,77 6,70 48,10 49,14 49,23 0,60 0,57 0,65 0,61 6,70 0,48 0,49 0,49

Mẫu 1 Lần 1 4695346 2202866 6898212 48,64 Lần 2 4604332 2005289 6609621 46,65 Lần 3 5351572 2196035 7547607 53,13 49,47 6,70 Mẫu 2 Lần 1 3915929 1608596 5524525 39,16 Lần 2 4131982 1515102 5647084 40,01 Lần 3 4387990 1269674 5657664 40,08 39,75 48,82 0,49

1,29

Trung bình %RSD 1,29 0,55

1,29 Trung bình %RSD 15,41

Từ kết quả trên cho thấy, %RSD của 2 mẫu lớn cao 15,41% vượt so với

yêu cầu là 7,3%. Từ đó cho thấy khả năng ứng dụng điều kiện xà phòng hoá

trong nghiên cứu này.

3.6.2. Thử nghiệm trên mẫu thêm chuẩn

Kết quả đo được thể hiện trong bảng 3.14.

Bảng 3.14. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá mẫu thêm chuẩn

CLutein tổng mLutein Mẫu Lần Strans- Scis- Stổng CLutein tìm thấy (ppm) (ppm (g)

1 9344453 3041293 12385746 2 7852670 2433703 10286373 3 8604178 3540186 12144364 TB %RSD

1 9153751 3257149 12410900 2 8230904 2869124 11100028 3 10981777 3783456 14765233 TB %RSD 86,53 72,03 84,86 81,14 9,77 86,70 77,65 102,95 89,10 14,39 TB(1+2) 106,27 88,47 104,23 99,66 9,77 106,49 95,37 126,45 109,43 14,39 TB(1+2) %RSD 1,06 0,88 1,04 1,00 9,77 1,06 0,95 1,26 1,09 14,39 1,05 6,61

Từ kết quả bảng 3.17 và 3.18, ta có thể tính được hiệu suất thu hồi của

quá trình xà phòng hoá như sau:

%Rxà phòng hoá = (mlutein (mẫu thêm chuẩn) – mlutein (mẫu lớn)) *100/mlutein

(đã thêm vào) = (1,05 – 0,55)*100/0,6 = 83,3%

Vậy hiệu suất thu hồi của quá trình xà phòng hoá trong nghiên cứu trên

là 83,3%. Kết quả này là đạt yêu cầu so với quy định (80% – 110%).

Từ kết quả tính hiệu suất thu hồi của quá trình xà phòng hoá, ta có thể

tính được hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình phân tích, bao gồm quá trình

xà phòng hoá và quá trình phân tích trên HPLC, cụ thể như sau:

%Rquá trình = (%Rxà phòng hoá * %RHPLC) * 100/1 = (81,52/100 *

83,3/100)*100/1 = 67,9%

Với kết quả hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình phân tích trên, ta

hoàn toàn có thể ứng dụng phương pháp nghiên cứu này vào việc phân tích

lutein hoặc các carotenoid khác.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Từ các kết quả thu được qua nghiên cứu trên có thể đi đến các kết luận

1. Đã xây dựng được phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn

hợp chứa lutein ester chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. sử dụng

cột pha ngược C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) như sau:

- Pha động: gồm hệ 2 dung môi

A = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v)

B = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:14:40:1 (v/v/v/v)

Rửa giải gradient theo chương trình như sau:

0 - 10 phút: 0% B (100% A)

10 – 25 phút: 0% B đến 100% B (100% A về 0% A) (gradient

tuyến tính)

25 - 60 phút: 100% B

60 – 70 phút: 100% B về 0% B

70 – 75 phút: 0% B (Cân bằng cột)

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Thể tích bơm mẫu: 20 µl

- Nhiệt độ cột 250C

- Detector DAD quét phổ từ 190-840 nm và ghi nhận tín hiệu ở 450 nm

2. Phương pháp HPLC đã xây dựng có

-Tính đặc hiệu cao, phân biệt được rõ các peak lutein và lutein ester.

- Độ lặp lại của phương pháp tốt với %RSD là 7.01%

- Độ tuyến tính của đường chuẩn nằm trong khoảng nồng độ 5 – 30

ppm với độ lệch chuẩn R2 là 0,9791.

- Giới hạn phát hiện LOD = 0,84ppm và giới hạn định lượng LOQ =

2,55ppm.

- Hiệu suất hồi đạt yêu cầu với %R trung bình 81,52%.

3. Dựa trên việc ứng dụng phương pháp HPLC nói trên, đã xác định

được điều kiện thích hợp để xà phòng hoá lutein ester từ hoa cúc vạn thọ như

- Nồng độ oleoresin là 0,8g/ml ứng với nồng độ KOH tối ưu là 14,4%

w/v tức tỷ lệ giữa KOH/oleoresin là 0,18 w/w.

- Nhiệt độ xà phòng hoá để đạt hiệu suất cao là 700C.

- Thời gian xà phòng hoá là 80 phút.

Với hiệu suất thu hồi lutein của quá trình xà phòng hoá 83,3% và hiệu

suất thu hồi của toàn bộ quá trình phân tích đạt 67,9%, ta hoàn toàn có thể

ứng dụng phương pháp trong nghiên cứu này vào các nghiên cứu tiếp theo về

lutein hoặc các carotenoid khác.

4.2. KIẾN NGHỊ

Để có những cơ sở chắc chắn hơn về phương pháp HPLC đã xây dựng,

cần có những nghiên cứu thêm về ứng dụng của phương pháp lên các mẫu

thực như hoa tươi, hoặc các sản phẩm về lutein được chiết xuất từ hoa cúc

vạn thọ.

100

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Miroslav ŠIVEL, Stanislav KRÁČMAR, Miroslav FIŠERA, Bořivoj

KLEJDUS, Vlastimil KUBÁŇ, 2014, Lutein Content in Marigold Flower

(Tagetes erecta L.) Concentrates used for Production of Food

Supplements, Czech J. Food Sci., 32(6): 521–525.

[2] Johnson, E. J. (2002). The role of carotenoids in human

health. Nutrition in clinical care, 5(2), 56-65.

[3]. Koushan, K., Rusovici, R., Li, W., Ferguson, L. R., & Chalam, K. V.

(2013). The role of lutein in eye-related disease. Nutrients, 5(5), 1823-

1839.

[4]. Bộ Y Tế, 2012, Thông tư Hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm,

Số: 27/2012/TT-BYT (20/11/2012).

[5]. Gregory, G. K., CHEN, T. S., & PHILIP, T., 1986, Quantitative

analysis of lutein esters in marigold flowers (Tagetes erecta) by high

performance liquid chromatography. Journal of Food Science, 51(4),

1093-1094.

[6]. Ausich, R.L., Sanders, D. J., 1997), Process for the formation,

isolation and purification of comestible xanthophyll crystals from plants,

US Patent: 5,648,564.

[7]. Kumar, S. T. K., Abdnlkadir; S. P., Sebastian, S., 2004, Process for

the preparation of xanthophyll crystals, US Patent, 6,743,953 B2.

[8]. Swaminathan, S., Madavalapil, K.P., 2009, Isolation and purification

of carotenoids from Marigold flowers, US. Patent, 7,622,599 B2.

101

[9]. Sarkar, C.R., Bhagawati, B., Das, L., Goswami, B.C., 2012, An

efficient condition of Saponification of Lutein ester from marigold flower,

J. Annals of Biological Research, 3 (3):1461-1466.

[10]. Aman, R., Biehl, J., Carle, R., Conrad, J., Beifuss, U., Schieber, A.,

2005, Application of HPLC coupled with DAD, APCI-MS and NMR to

the analysis of lutein and zeaxanthin stereoisomers in thermally processed

vegetables, J. Food Chem., 92: 753-763.

[11]. Cantrill, R., 2004, Lutein from Tagetes erecta: Chemical and

Technical Assessment, 63rd, JECFA.

[12]. JECFA 2004, Lutein from Tagetes erecta, Vol 4: 1–4.

[13]. Hoàng Thị Huệ An, 2009, Nghiên cứu định lượng astaxanthin và

carotenoid đi kèm trong đối tượng thủy sản bằng phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao (HPLC), Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Hóa Phân

tích, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

[14]. Trương Ngọc Bảo Hiếu, Ngô Văn Tứ, 2017, Phân tích hàm lượng b-

caroten trong một số loại ngũ cốc có màu ở Thừa Thiên Huế bằng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Hue University J. Science: Natural

Science, 126 (1D)

[15]. Ranjita Shegokar, Khalil Mitri, 2012, Carotenoid Lutein: A

Promising Candidate for Pharmaceutical and Nutraceutical Applications,

Journal of Dietary Supplements, 9(3):183–210.

[16]. Updike, A. A., & Schwartz, S. J., 2003, Thermal processing of

vegetables increases cis isomers of lutein and zeaxanthin. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 51(21), 6184-6190.

102

[17]. Philip, T., 1977, Purification of lutein-fatty acid esters from plant

materials, US. Patent, 4,048,203.

[18]. S. Madavalapil, K. P., 2009, Isolation and purification of carotenoids

from Marigold flowers, US. Patent, 7,622,599 B2.

[19]. Britton, G., 1995, Structure and properties of carotenoids in relation

to function, The FASEB Journal, 9, 1551-1558.

[20]. Craft, N. E., Soares, J. H., 1992, Relative Solubility, Stability, and

Absorptivity of Lutein and b-Carotene in Organic Solvents, J. Agric.

Food Chem., 40(431-434).

[21]. Aman, R., Biehl, J., Carle, R., Conrad, J., Beifuss, U., Schieber, A.,

2005, Application of HPLC coupled with DAD, APCI-MS and NMR to

the analysis of lutein and zeaxanthin stereoisomers in thermally processed

vegetables, J. Food Chem., 92, 753-763.

[22]. Karawya, M.S., Hammouda, F.M., S.I. Ismail, A.K. Zaki, N.M.

Nazif, 1996, HPLC and MS analyses of lutein – ester from Tagetes Patuia

L., Quatar Univ. Sci. J., 16(2), 251 – 255.

[23]. Khachik, F., 1995, Process for isolation, purification and

recrystallization of lutein from saponified marigold oleoresin and uses

thereof, US. Patent, 5,382,714

[24]. Ribaya, J. D., Jeffrey, B. B., 2004, Lutein and Zeaxanthin and Their

Potential Roles in Disease Prevention, J. Amer. College of Nutri., 23 (6),

567- 587.

[25]. Shao, A., 2001, The role of Lutein in Human Health, American

Nutraceutical Association (JANA), 4(2), 8-19.

[26]. Thorne Research, Inc., 2005, Lutein and Zeaxanthin, Alt. Med.

Review, 10(2), 128-135.

[27]. Wang, M., Tsao, R., Zhang, S., Dong, Z., Yang. R., Gong, J., Pei, Y., 2006, Antioxidant activity, mutagenicity/anti-mutagenicity, and

103

clastogenicity /anti-clastogenicity of lutein from marigold flowers, Food

& Chem. Toxic., 44: 1522–1529.

[28]. Deutsch, M.J., 1984, Vitamins and other nutrients. Williams, S.

(Ed.). Official methods of analysis of the AOAC, 14th ed. Virginia,

Association of Official Analytical Chemists, 1984, 834-835.

[29]. EFSA, 2010, Scientific Opinion on the re-evaluation of lutein (E

161b) as a food additive, EFSA Journal, 8(7):1678.

[30]. John, T.L., Richard, A.B., 2001, Lutein, Zeaxanthin, and the

Macular Pigment, Archives of Biochem. & Biophys., 385(1), 28 - 40.

[31]. Tso, M. O. M, Lam, T. T., Method of retarding and ameliorating

central nervous system and eye damage, US. Patent, 5527533.

[32]. http://vietnamnet.vn/vn/doi-song/suc-khoe/99497/phat-hien-moi-ve-

kha-nang-ho-tro-tri-nao-cua-lutein.html

[33]. Johnson, E.J., 2012, A possible role for lutein and zeaxanthin in

cognitive function in the elderly, Am. J. Clin. Nutr., doi:

10.3945/ajcn.112.034611, USA, 1S-5S.

[34]. WHO, 2006, Safety evaluation of certain food additives, WHO Food

Additives, Series: 54, WHO Press, Geneva.

[35]. Kale, S, Gaikwad, M, Bhandare, S., 2011, Determination and

comparison of in vitro SPF of topical formulation containing Lutein ester

from Tagetes erecta L. flowers, Moringa oleifera Lam seed oil containing

Lutein ester, International Journal of Research in Pharmaceutical and

Biomedical Sciences, Vol 2 (3):1220–1223.

[36]. Roberts, R. L., Green, J., & Lewis, B. (2009). Lutein and zeaxanthin

in eye and skin health. Clinics in Dermatology, 27(2), 195-201.

[37]. Sunita, T., D’mello, P.M., 2010, Enzyme assisted extraction of

lutein from marigold flowers and its evaluation by HPLC, Inter. J. Adv. in

Pharm. Sci., 2, 381-386.

104

[38]. Nguyễn Thành Lộc, 2013, Xác định đồng thời Paracetamol và

Ibuprofen trong các dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao – HPLC, Khoá luận tốt nghiệp Hoá học, Trường Đại học Sư phạm

thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh.

[39]. Dr. Phạm Luận, 1999, Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu

suất cao, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội,

Hà Nội.

[40]. Veronika R. Meyer, Practical High – Performance Liquid

Chromatography, New York, USA.

[41]. DS. Trần Cao Sơn, PGS.TS. Phạm Xuân Đà, TS. Lê Thị Hồng Hảo,

CN. Nguyễn Thành Trung, Thẩm định phương pháp trong phân tích hoá

học và vi sinh vật, Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh Thực phẩm quốc

gia.

[42]. Tee E. Siong, Lim Chin Lam, 1992, Analysis of Carotenoids in

Vegetables by HPLC, J. ASEAN Food, 7 (2).

[43]. Ausich, R. L., Sanders, D. J., 1997, Process for the formation,

isolation and purification of comestible xanthophyll crystals from plants,

US. Patent, 5,648,564.

[44]. Domenico Montesano & Oriella Gennari & Serenella Seccia &

Stefania Albrizio, 2012, A Simple and Selective Analytical Procedure for

the Extraction and Quantification of Lutein from Tomato By-Products by

HPLC–DAD, Food Anal. Methods, 5:710–715.

[45]. Prateek Gupta, Yellamaraju Sreelakshmi, Rameshwar Sharma, 2015

A rapid and sensitive method for determination of carotenoids in plant

tissues by high performance liquid chromatography, Plant Methods, 11:5

[46]. Md. Habib Ullah Bhuyian, A.F.M. Ariful Islam, Md. Isha Tareque,

2015, Development and validation of method for determination of lutein

by HPLC, World J. Pharm. Res., 4(04): 145-156.

105

[47]. Rodriguez-Amaya, D. B., 2001, A Guide to Carotenoid Analysis in

Foods, ILSI Press, USA.

[48]. Barzana, E., Rubio, D., Santamaria, R.I, Garcia-Correa, O., Garcia,

F., Ridaura Sanz, V.E, Loa pez-Munguiaa, A., 2002, Enzyme-mediated

solvent extraction of carotenoids from marigold flower (Tagetes erecta),

Agric.& Food Chem., 50, 4491–4495.

[49]. Khachik, F., 2001, Process for extraction and purification of lutein,

zeaxanthin and rare carotenoids from Marigold flowers and plants, US

Patent, 6,262,284 B1.

[50]. Madhavi, D. L., 2002, Process for isolation of mixed carotenoid

from plants, US Patent, 6380442 B1.

[51]. Joseph, S., Nadu, T., Anandane, A., Nagar, R. R., 2013, Process for

isolation and purification of carotenoids, US Patent 2013/00661.

[52]. Jing Tan, Jason Gek Leong Neo, Tania Setiawati, Chunyan Zhang,

2017, Determination of Carotenoids in Human Serum and Breast Milk

Using High Performance Liquid Chromatography Coupled with a Diode

Array, Separations, 4: 19.

Phụ lục

Phụ lục 1. Phương pháp định lượng carotenoit tổng số và % lutein,

% zeaxanthin trong sản phẩm lutein tinh chế

Cân chính xác khoảng 20 - 30 mg mẫu sản phẩm lutein cho vào bình

định mức 100 ml, thêm vài giọt diclorometan cho tan rồi pha loãng và định

mức đến vạch bằng etanol (có chứa 0,1% BHT), lắc trong 10 phút, thu được

dung dịch A.

a) Định lượng % catotenoid tổng số

Lấy 1 ml dung dịch A cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng

bằng etanol (chứa 0,1% BHT), đảo trộn trong 20 giây. Đo độ hấp thụ của

dung dịch này ở 446 nm, cuvet 1 cm (dùng etanol 0,1% BHT làm dung dịch

1000

Toal

carotenoid s

(%)

nền).

nm 446 xG

x 2550

Tính kết quả:

trong đó :

- 1000: hệ số pha loãng;

- 2550: độ hấp thụ của dung dịch carotenoit 1% đo trong etanol với

cuvet 1 cm.

b) Định lượng %lutein và %zeaxanthin

Hút 1 ml dung dịch A cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng

bằng hexan: axetat 70:30 v/v, đảo trộn trong 20 sec, lọc qua màng lọc PTFE

0,45 µum rồi bơm vào máy HPLC với detector PDA.

Điều kiện chạy HPLC:

- Cột bảo vệ: C18;

- Cột phân tích: C18 (3 µm, 4,6 mm x 250 mm)

- Nhiệt độ cột: 300C

- Pha động: hexan/axetat etyl 70:30 (v/v)

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 5 µl

- Bước sóng phát hiện: 445 nm

- Thời gian phân tích: 40 phút

Phát hiện các peak lutein và zeaxanthin dựa vào các phổ hấp thụ đặc

trưng của chúng cho bởi detector DAD.

% Lutein = % Carotenoit tổng số x %Diện tích peak lutein

% Zeaxanthin = % Carotenoit tổng số x %Diện tích peak

zeaxanthin

Hình PL2. Phổ hấp thụ UV-Vis của lutein tinh chế trong hexan

Phụ lục 2.Phổ UV-Vis của lutein tinh chế

Phụ lục 3. Một số hình ảnh thí nghiệm

Hình PL3.1 Xà phòng hoá lutein Hình PL3.2. Mẫu lutein ester sau khi

xà phòng hoá ester

Hình PL3.3. Chiết lutein tự do sau Hình PL 3.4. Mẫu lutein tự do trong

khi xà phòng hoá acetone (HPLC)