ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
TỐNG THỊ HOA
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI NGẢI CỨU
(ARTEMISIA VULGARIS L.) Ở THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
THÁI NGUYÊN - 2018
i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
TỐNG THỊ HOA
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI NGẢI CỨU
(ARTEMISIA VULGARIS L.) Ở THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN
Hóa hữu cơ
Mã số: 8 44 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
THÁI NGUYÊN - 2018
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài:“Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Ngải cứu
(Artemisia vulgaris L.) ở Thành phố Thái Nguyên” đây là công trình nghiên cứu của
riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công
bố trong bất kì công trình nào khác.
Học viên
Tống Thị Hoa
XÁC NHẬN CỦA NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN
ii
KHOA CHUYÊN MÔN HƯỚNG DẪN
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian qua, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của thầy cô, gia đình và
bạn bè. Những điều đó hết sức quý báu giúp em nỗ lực hoàn thành khóa luận này.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS.
Mai Thanh Nga, giảng viên bộ môn Hóa hữu cơ trường Đại học sư phạm – Đại học
Thái Nguyên, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình hoàn
thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn, các thầy cô kỹ
thuật viên tại bộ môn Hóa hữu cơ đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em thực
hiện khóa luận tại bộ môn.
Do bước đầu mới làm quen với nghiên cứu khoa học và do một số yếu tố khách
quan khác nên đề tài nghiên cứu khoa học của em không thể tránh khỏi những thiếu
sót. Em rất mong nhận được sự góp ý và chỉ bảo của các thầy giáo, cô giáo và các bạn
để đề tài được hoàn thiện hơn.
Và cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, người thành đã ở bên
động viên, giúp đỡ em thực hiện khóa luận.
Thái Nguyên, tháng 6 năm 2018
Học viên
iii
Tống Thị Hoa
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ............................................................................................. vii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................ 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................................ 1
2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ........................................................................ 2
5. Bố cục đề tài ................................................................................................................... 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 3
1.1. Giới thiệu về chi Artemisia .......................................................................................... 3
1.2. Tổng quan về cây ngải cứu ......................................................................................... 3
1.2.1. Tên khoa học ............................................................................................................. 3
1.2.2. Đặc điểm thực vật học .............................................................................................. 4
1.2.3. Nguồn gốc ................................................................................................................. 4
1.2.4. Công dụng của cây Ngải cứu ................................................................................... 5
1.2.5. Thành phần hóa học ................................................................................................. 6
1.2.6. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học ...................................................................... 7
1.3. Tổng quan về tinh dầu ................................................................................................. 9
1.3.1. Khái niệm .................................................................................................................. 9
1.3.2. Phân loại................................................................................................................... 9
1.3.3. Vai trò ....................................................................................................................... 9
1.3.4. Cách sử dụng .......................................................................................................... 12
1.3.5. Tính chất vật lý của tinh dầu .................................................................................. 13
1.3.6. Thành phần chủ yếu của tinh dầu........................................................................... 13
iv
1.3.7. Kiểm định và cách bảo quản tinh dầu .................................................................... 16
1.4. Tổng quan về flavonoid ............................................................................................. 16
1.4.1.Đại cương ................................................................................................................ 16
1.4.2. Vai trò của flavonoid trong cây .............................................................................. 17
1.4.3.Vai trò của flavonoid trong y học ............................................................................ 18
1.4.4. Phân loại ................................................................................................................. 19
CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM .................................................................................... 26
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................ 26
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu .................................................................. 26
2.2.1. Hóa chất .................................................................................................................. 26
2.2.2. Thiết bị .................................................................................................................... 26
2.3. Phương pháp định tính các chất trong dịch chiết ...................................................... 27
2.3.1. Định tính flavonoid ................................................................................................. 27
2.3.2. Định tính cumarine ................................................................................................. 28
2.3.3. Định tính saponine .................................................................................................. 28
2.3.4. Định tính alkaloid ................................................................................................... 29
2.3.5. Định tính tanine ...................................................................................................... 29
2.3.6. Định tính glycosid tim ............................................................................................. 30
2.3.7. Định tính đường khử ............................................................................................... 31
2.3.8. Định tính acid amin ................................................................................................ 31
2.3.9. Định tính polysaccharide ........................................................................................ 31
2.3.10. Định tính chất béo................................................................................................. 32
2.3.11. Định tính sterols.................................................................................................... 32
2.4. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước (tách tinh dầu) ....................................... 32
2.4.1. Xử lý nguyên liệu .................................................................................................... 32
2.4.2. Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến lượng tinh dầu ...................................................... 33
2.5. Phương pháp chiết tách và xác định cấu trúc hợp chất phân lập được ...................... 35
2.5.1. Xử lý mẫu thực vật .................................................................................................. 35
2.5.2. Chiết và phân lập hợp chất hữu cơ ......................................................................... 36
2.5.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc hóa học các chất .................................................. 38
Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................................... 39
3.1. Định tính các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong thân lá ngải cứu ......................... 39
3.2. Kết quả nghiên cứu chiết tách tinh dầu...................................................................... 40
3.2.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu .......................... 40
3.2.2. Kết quả nghiên cứu xác định thành phần và hàm lượng một số hợp chất trong tinh
dầu ngải cứu. .................................................................................................................... 42
3.3. Kết quả phân lập các hợp chất ................................................................................... 47
3.4. Xác định cấu trúc chất phân lập được ........................................................................ 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 52
1. KẾT LUẬN .................................................................................................................. 52
2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 53
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
EA Ethyl acetate
GC/MS Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ
H N-hexane
HMBC Phổ tương quan hai chiều H-C
HSQC Phổ tương quan một chiều H-C
Rf Hệ số lưu
13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân nguyên tử 13C
1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân nguyên tử 1H
iv
SKLM Sắc ký lớp mỏng
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Kết quả sắc ký cột silicagel của cao chiết ethyl acetate ................................... 37
Bảng 2.2: Kết quả sắc ký cột silicagel của phân đoạn ET3 .............................................. 38
Bảng 2.3. Kết quả sắc ký cột silicagel của phân đoạn ET 3.2 ........................................ 38
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong thân lá ngải cứu .................................. 39
Bảng 3.2. Khảo sát tỷ lệ nước ảnh hưởng đến tỉ lệ tinh dầu ............................................. 40
Bảng 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hàm lượng tinh dầu ................ 41
Bảng 3.4. Thời gian chưng cất tinh dầu thân, lá ngải cứu ................................................ 42
Bảng 3.5. Thành phần hóa học trong tinh dầu thân lá ngải cứu ....................................... 43
khi chiết với dung môi là nước ......................................................................................... 43
Bảng 3.6. Thành phần hóa học trong tinh dầu thân lá ngải cứu với dung môi chưng cất là
dung dịch muối ăn NaCl 10%. .......................................................................................... 45
Bảng 3.7. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của H 1 với số liệu phổ 1H-
v
NMR và 13C-NMR của 3,5,7,4’- tetrahydroxy flavone ................................................... 50
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Các bộ phận của cây ngải cứu ............................................................................ 4
Hình 1.2: Lá và hoa ngải cứu .............................................................................................. 4
Hình 1.3: Dược phẩm và sản phẩm dưỡng da .................................................................... 6
Hình 3.2: Phổ 13C-NRM của hợp chất H1 ....................................................................... 48
vi
Hình 3. 3: Khung flavone ................................................................................................. 49
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết tách tinh dầu cây Ngải cứu ........................................................... 33
vii
Sơ đồ 2.2. Quy trình chiết và phân lập hợp chất từ cây ngải cứu ..................................... 36
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay, cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học kĩ thuật, các sản phẩm
có tác dụng chữa bệnh đã được tổng hợp và sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, các sản phẩm
này cũng có những mặt hạn chế và gây ra các tác dụng phụ cho người sử dụng. Vì vậy,
việc nghiên cứu các hợp chất có tác dụng chữa bệnh từ cây cỏ trong thiên nhiên đang
ngày càng trở thành là một xu hướng được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nhằm tìm ra
những loại thuốc có hiệu quả cao, an toàn hơn đối với sức khoẻ con người, hầu như
không gây tác dụng phụ điều mà các dược phẩm tổng hợp không thể thay thế được. Cùng
với xu hướng chung đó, các nhà hóa học cũng đã tiến hành tách chiết, cô lập, bán tổng
hợp ngày càng nhiều những hợp chất có hoạt tính sinh học, tạo ra những sản phẩm hữu
ích từ cây cỏ thiên nhiên để nâng cao chất lượng cuộc sống, chăm sóc sức khoẻ con
người. Theo hướng nghiên cứu này, rất nhiều thực phẩm có nguồn gốc từ thảo dược đã
được ứng dụng như rutin được chiết xuất từ hoa hoè chữa một số bệnh tim mạch,
curcumin được chiết xuất từ củ nghệ vàng dùng để chữa một số bệnh viêm loét dạ dày và
đường tiêu hoá…[4].
Nước ta có khí hậu nhiệt đới ẩm nên thảm thực vật khá phong phú và đa dạng.
Theo các số liệu thống kê mới nhất thảm thực vật Việt Nam có trên 12000 loài, trong số
đó có trên 3850 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong y học dân gian. Đây là một
điều kiện hết sức thuận lợi giúp cho ngành hợp chất thiên nhiên ở nước ta đã và đang
phát triển mạnh mẽ.
Cây ngải cứu là vị thuốc được dân gian sử dụng khá phổ biến để chữa một số bệnh
như đau đầu, thuốc điều kinh, rong kinh, sảy thai, tăng cường sức khỏe…[6]. Tuy trên
thế giới đã có những công trình nghiên cứu về cây ngải cứu nhưng ở Việt Nam cho đến
nay có rất ít công trình nghiên cứu về loài cây này. Do đó chúng tôi đã lựa chọn đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) ở Thành phố
1
Thái Nguyên”. Kết quả của đề tài này sẽ đóng góp thêm những hiểu biết về tính chất,
thành phần hóa học của loài thực vật ngải cứu, làm phong phú thêm nguồn dược liệu cho
ngành y học.
2. Mục tiêu của đề tài
- Xác định thành phần hóa học trong tinh dầu cây ngải cứu.
- Phân lập và xác định cấu trúc một hợp chất trong cây ngải cứu.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tổng quan các nghiên cứu trong nước, trên thế giới về loài ngải cứu.
- Thu thập mẫu nghiên cứu, xác định tên khoa học.
- Chiết xuất và xác định thành phần hóa học trong tinh dầu loài ngải cứu.
- Phân lập và xác định cấu trúc 01 hợp chất từ loài ngải cứu.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học
+ Cung cấp những thông tin khoa học một số chỉ tiêu hóa lý, khảo sát quy trình
chiết, xác định thành phần hóa học trong tinh dầu cây ngải cứu.
+ Cung cấp những thông tin, tư liệu làm cơ sở cho việc nghiên cứu sau này.
- Ý nghĩa thực tiễn
+ Nhằm giúp cho việc định hướng ứng dụng ngải cứu có hiệu quả hơn.
+ Giải thích một cách khoa học số kinh nghiệm dân gian về ứng dụng của ngải cứu.
+ Tổng hợp kiến thức về hợp chất thiên nhiên phục vụ cho hoạt động giảng dạy ở
trường THPT.
+ Tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng nguồn gốc thực vật của Việt Nam một cách
có hiệu quả.
5. Bố cục đề tài
Nội dung của đề tài gồm làm 3 chương: Chương I – Tổng quan; Chương II – Thực
2
nghiệm; Chương III – Kết quả và thảo luận
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về chi Artemisia [6]
Chi Artemisia thuộc họ thực vật Compositae (Asteraceae) khoảng gồm 300 loài cây
cỏ, bụi, hằng niên, lưỡng niên hay lưu niên, mọc ở vùng khô của Bắc Bán Cầu, Nam Mỹ
chỉ có vài loài, còn ở Nam Phi chỉ có một loài duy nhất. Trung Quốc có hai tên gọi là
Quinnhao và Quinggao, trên thế giới có rất nhiều loài cây, gồm từ nhiều loài cây bụi đến
nhữn cây cao khoảng 4m. Thành phần hóa học của chi này rất đa dạng và phong phú. Ở
Việt Nam cso 15 loài thuộc chi Artemisia, trong đó có 4 loài rất giống nhau về ngoại
hình như:
Artemisia apiaceae
Artemisia campestrist (thanh cao biển)
Artemisia capillaris
Artemisia annua
1.2. Tổng quan về cây ngải cứu
1.2.1. Tên khoa học
- Tên khoa học: Artemisia vulgaris L.
- Tên thường gọi: Thuốc cứu, cây thuốc cao, ngải diệp, nhả ngải (tiếng Tày), quá sú
( H’mông), cỏ linh ti (Thái).
- Tên gọi khác: Mugwort (Anh), sagebrush, Wormwood, Absinth Armoise
3
commune (Pháp),….
1.2.2. Đặc điểm thực vật học
Ngải cứu là một loại cỏ sống lâu năm, cao 50–60 cm.Thân to có rãnh dọc. Lá mọc
so le, rộng, không có cuống (nhưng lá phía dưới thường có cuống), xẻ thùy lông chim,
màu lá ở hai mặt rất khác nhau, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới màu trắng tro do có
nhiều lông nhỏ. Hoa mọc thành chùy kép, gồm rất nhiều chùm hoa hình đầu [6]. Đây là
cây ưa ẩm, dễ trồng bằng cách giâm cành những đoạn gốc thân già.
Hình 1.1: Các bộ phận của cây ngải cứu
Hình 1.2: Lá và hoa ngải cứu
1.2.3. Nguồn gốc
Ngải cứu được biết đến từ thời cổ đại và đã từng được xem như một loại cỏ dại.
4
Đây là loại cây mọc tự nhiên ở nhiều vùng ôn đới ấm châu Âu hoặc châu Á.
Ngải cứu có nguồn gốc từ các vùng ôn đới ấm ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Châu Á; Vùng
nhiệt đới Bắc Phi và vùng hàn đới Alaska.
Ở nước ta, cây ngải cứu mọc hoang ở nhiều nơi như Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn,
Hòa Bình….
1.2.4. Công dụng của cây ngải cứu
- Trong y học dân gian, ngải cứu được biết đến không chỉ như một loại thực vật
dùng làm thực phẩm (hầu hết là gia vị) mà còn là nguồn dược liệu. Cây ngải cứu là một
vị thuốc chữa được rất nhiều bệnh như: điều kinh, giúp an thai, sơ cứu vết thương, trị
mụn, mẩn ngứa, đau thần kinh tọa, đau buốt xương khớp, đau đầu, hoa mắt, cảm cúm,
ho, đau họng …[6].
- Tăng cường sức khỏe, sát khuẩn, trị tiêu chảy, hạ sốt, điều hòa kinh nguyệt… bởi
trong thành phần chứa viamin B6 và vitamin C, glucose, absinthine, tannin, axit malic,
azulene và cadinene.
- Trên thế giới, một nghiên cứu đã phân lập được trong lá ngải cứu hơn hai mươi
flavonoid, nhiều nhất là Jaceosidine, Leuteolin, Quercetin và Eupafoline, Kaempferol.
Các chất này là những flavonoid có hoạt tính mạnh, có tác dụng chống viêm, làm giảm
sự tăng sinh các tế bào gây hại. Chúng có tác dụng điều trị ung thư tiazofurin trên các tế
bào ung thư biểu mô buồng trứng của người và trị ung thư carboxytriazol trên tế bào ung
thư biểu mô vú [20].
5
Một số chế phẩm được chiết xuất từ cây ngải cứu:
Hình 1.3: Dược phẩm và sản phẩm dưỡng da
1.2.5. Thành phần hóa học
- Thành phần hóa học trong lá ngải cứu chủ yếu là flavonoid (loại
trihydroxyflavone và tetra hydroxyflavone, dẫn xuất coumarine….) và tinh dầu với hàm
lượng từ 0,20 –0,34% (trong đó chiếm đến 90% là 1,8 – cineole, thujone và germacrene
D (41,46%), -caryophyllene (11,94%) là 2 chất này có thể đảm bảo mùi đặc trưng của
tinh dầu trong một thời gian dài hơn) [6],[15].
- Ngoài ra trong ngải cứu còn có hợp chất của indole, xeton, matricaria este
dehydro, tetradecatrilin, tricosanol, arachyl alcol, chất màu, vulgarin, profilin, các acid
6
amin như adenin, cholin,….
Cấu trúc phân tử hợp chất flavonoid
Hợp chất của cumarine
Một số hợp chất trong tinh dầu cây ngải cứu
1,8-cineole (-) - α-Thujone (+) -beta-Thujone
1.2.6. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học
- Năm 2011, Baixiao Zhao và cộng sự (Trung Quốc) đã thử nghiêm và thấy những
người tình nguyện khỏe mạnh tiếp xúc với khói ngải cứu đã giảm đáng kể về HR (sự
thay đổi nhịp tim của người), cũng có những thay đổi đáng kể trong các thông số HRV
(nhịp tim) từ đó đưa ra kết luận: Moxa khói có thể cải thiện hoạt động hệ thống thần kinh
tự trị [12].
- Năm 2013, Abdul Majeeth Kamarul Haniya và cộng sự nghiên cứu về khả năng
kháng oxi hoá của lá ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) [11].
- Cũng trong năm 2013, Shamilak and Padma P.R ở Viện Khoa học Gia đình và
7
Giáo dục Đại học cho Phụ nữ (Ấn Độ) đã nghiên cứu việc sử dụng chất chiết xuất lá để
điều trị ung thư biểu mô tế bào. Các kết quả của nghiên cứu này cho thấy việc sử dụng
chiết xuất lá ngải cứu như là nguồn tiềm năng của chất chống ung thư [21].
- Trong báo cáo của Gayan S. Bamunuarachchi và cộng sự được công bố vào năm
2013 cho thấy việc sử dụng một chiết xuất lá của ngải cứu dùng để uống, có hiệu quả
chống sốt rét, chống nấm, chống viêm da, hạ sốt, rất tốt, do đó có tiềm năng phát triển
thành một nguồn thuốc có nguồn gốc thực vật rẻ tiền trong tương lai [13].
- Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Gayan S. Bamunuarachchi và cộng sự đã chứng
minh rằng việc sử dụng một chiết xuất lá của ngải cứu dùng để uống, có tác dụng hạ
đường huyết, và giảm tiểu cầu, trong một mô hình sốt rét P. berghei [14].
- Vào năm 2014,nhóm nghiên cứu của Syed AA Rizvi và cộng sự (Saudi Arabia)
đã chỉ ra rằng các thành phần tự nhiên của tinh dầu ngải cứu (tinh dầu từ nụ hoa (AVO-
b) và lá (AVO-l)) hoạt động như là một tác nhân kích thích mạnh mẽ và có chọn lọc của
apoptosis trong các tế bào ung thư khác nhau với độ độc tế bào thấp hơn ở các tế bào
không biến đổi bình thường [22].
- Năm 2015, Nghiên cứu của K. Abedulla Khan trường Đại học Dược tại Ấn Độ về
dịch chiết từ rễ của Artemisia vulgaris có tác dụng làm giảm lipid máu, chống sơ vữa
động mạnh, thiếu máu não và các bệnh mạch ngoại biên được thử nghiệm trên chuột
bạch [16].
- Năm 2016, Ha Thi Thanh Nguyen và các cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh
cây ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) có hai tác động đối nghịch, co lại và thư giãn, trên
động mạch bị cô lập, giúp giải thích các chỉ dẫn mâu thuẫn nhau cho Ngải cứu trong liệu
pháp thảo dược truyền thống. 5-HT (thuốc đối kháng ketanserin ) là một yếu tố quan
trọng ảnh hưởng đến sự co động mạch khi có Ngải cứu [17].
- Năm 2017, nhóm tác giả Pandey PB, Thapa R, Upreti A. đã nghiên cứu thành
phần hóa học của Artemisia vulgaris L. trong dịch chiết methanol bằng phương pháp
phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho thấy có sự hiện diện của morin và
8
luteolin, Ngoài ra dịch chiết methanol còn thể hiện khả năng chống oxi hóa và kháng
khuẩn rất tốt. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy trong tinh dầu Artemisia vulgaris L. chủ
yếu là các hợp chất monoterpene và secquiterpene [18].
1.3. Tổng quan về tinh dầu
1.3.1. Khái niệm
Tinh dầu là những chất thơm hay chất mùi có trong một số bộ phận của cây cỏ (như
hạt, rễ, củ, vỏ cây, hoa, lá, quả, dầu,nhựa cây) hay động vật (túi tinh dầu). Tinh dầu được
ví như nhựa sống của cây, vì vậy nó mang sức sống, năng lượng và mạnh hơn 100 lần
các loại dược thảo sấy khô [9].
1.3.2. Phân loại
+ Tinh dầu nguyên chất: Hoàn toàn không có độc tố, không có chất bảo quản hóa
học nên rất an toàn cho người sử dụng và mang lại kết quả nhanh khi điều trị.
+ Tinh dầu không nguyên chất: Là tinh dầu được pha từ tinh dầu nguyên chất với
các chất hóa học khác mà vẫn giữ được hương của tinh dầu [9].
1.3.3. Vai trò
1.3.3.1. Dẫn dụ
Ở một số loài hoa, tinh dầu của nó có khả năng dẫn dụ côn trùng đến cho hoa thụ
phấn. Không chỉ có côn trùng bị dẫn dụ bởi tinh dầu của loài hoa mà đến động vật lớn
như mèo nhà cũng bị dẫn dụ bởi những terpen có trong tinh dầu bạc hà (catmint, nepeta,
cataria).
1.3.3.2. Bảo vệ
Người ta nhận thấy trong một số loài cây, tinh dầu của chúng góp phần bảo vệ cây
chống lại các loài ăn cỏ (loài vật và côn trùng) như juvabion trong tinh dầu của Ocimum
basilicum, có khả năng ngăn chặn chu kì sinh trưởng của một số côn trùng chuyên phá
9
hoại các loại cây xanh.
Ngoài ra, những loài côn trùng khi đến ăn lá hoặc hút nhựa của các loài cây có
chứa tinh dầu ở các lông tiết, chúng sẽ chạm vào các lông này và bị đẩy lùi bởi những
mono và secquiterpen có trong tinh dầu.
1.3.3.3. Hỗ trợ phát triển
Tại những vùng có hệ sinh thái bán khô cằn (semi-arid ecosystem) như vùng Viễn
Tây nước Mỹ, có những cây thuộc họ Lamiaceae và Asteraceae chứa rất nhiều tinh dầu.
Dứới điều kiện nóng khô, những tinh dầu này bay hơi, một số hơi tinh dầu bị đất hấp thụ
và giữ lại tạo thành một vùng ngăn chặn sự phát triển của các cây cùng loại (alleophathic
barrier). Một số monoterpencos khả năng đó như 1,8-xineol, campho....
1.3.3.4. Hoạt tính kháng sinh
Khi các động vật ăn cỏ hoặc một nguyên nhân cơ học nào đó làm tổn hại các cơ
quan của cây, tinh dầu từ các mô thoát ra bảo vệ vết thương không cho cây bị nhiễm
trùng thứ cấp. Người ta đã nhận thấy ở loài sim đầm lầy (Myrica gale), nồng độ tinh dầu
chứa trong các lông tiết trên lá tăng lên khoảng hai lần trên các cây bị loài ăn cỏ phá hoại
so với cây đối chứng.
1.3.3.5. Hoạt tính sinh học
Từ ngàn xưa người ta đã biết dùng tinh dầu để chữa bệnh cho người và gia
súc, hoặc ngăn chặn sự hư hỏng của thức ăn. Trong khảo cổ, người ta nhận thấy tinh dầu
được sử dụng trong việc bảo quản xác ướp [1].
1.3.3.6. Kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu trong điều kiện phòng thí nghiệm được
hiểu như là khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn (vi trùng) trong điều kiện invitro
thông qua việc đo đường kính vòng vô khuẩn (vô trùng). Rao (1989) nhận thấy tinh dầu
Limmophila gratissama có khả năng kháng khuẩn mạnh tương tự Streptomixin và
Cloramphenicol đối với những vi trùng gây bệnh cho người như Bacillus cereus,
10
Eschricha colo, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus.
Tinh dầu nhục đậu khuẩn (Elattaria cardimomum) có chứa limonen ức chế
rất hiệu quả vi khuẩn propionbacterium acne. Vi khuẩn này gây bệnh viêm cơ, các vết
phát ban màu xanh lợt đỏ thấy trên mặt da đầu, bàn tay dẫn đến sưng nặng thường kết
hợp với bệnh ung thư bên trong. Ngoài ra, trong một số báo cáo gần đây (2003), cho thấy
một số tinh dầu có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư, có hoạt tính kháng HIV.
1.3.3.7. Kháng oxi hóa
Sự oxi hóa thường xuất hiện trong thực phẩm để lâu ngày vì trong đó chứa
rất nhiều hợp chất bão hòa, và những hợp chất dễ bị oxi hóa bởi oxi không khí. Sự oxi
hóa này dễ đưa đến sự hư thối, mất phẩm chất của thực phẩm.
Những tinh dầu có chứa các dẫn xuất phenol như hương nhu, đinh hương, sage
(hoa xôn), savory (húng), thyme (cỏ xạ hương)... ngoài khả năng chống oxi hóa trong
thực phẩm còn có khả năng tiêu diệt vi trùng.
Ở Ấn Độ, đã có những nghiên cứu nhận thấy rằng tinh dầu tỏi ức chế sự
peroxy hóa lipit, tinh dầu này có chứa dẫn xuất phenol, có khả năng bắt lấy gốc tự do,
không cho phản ứng peroxy hóa xảy ra, bảo vệ các lipit [7].
1.3.3.8. Dược phẩm.
Tinh dầu là loại dược phẩm được sử dụng nhiều nhất trong y học cổ truyền.
Nhờ có chứa tinh dầu mà một số thảo dược có mùi thơm đặc trưng.
Một số loại tinh dầu như:
+ Tinh dầu bạc hà (Mentha sp.) chứa chủ yếu là hàm lượng mentol, có tác dụng
kích thích dây thần kinh gây cảm giác lạnh, giảm đau tại chỗ.
+ Tinh dầu hương nhu (Ocimum gratissimum) là nguồn cung cấp eugenol. Trong y
học, eugenol dùng làm thuốc sát trùng, thuốc giảm đau, chất dùng trong việc trám răng
tạm thời.
+ Tinh dầu thuộc họ hồ tiêu như tinh dầu hồ tiêu được dùng làm thuốc kích
11
thích giúp tiêu hóa tốt, tinh dầu lá lốt, lá ngải cứu dùng làm hương liệu cho các chế phẩm thuốc.
+ Tinh dầu hương diệp (Pelaeganium roseum) có thành phần chính là geraniol có
thể làm thuốc sát trùng, hạ huyết áp...[10].
1.3.4. Cách sử dụng
Liệu pháp tại chỗ (Bôi, mát xa):
Sử dụng tinh dầu để bôi: Chỉ có một số loại tinh dầu để bôi được trực tiếp lên da
như dầu tràm (Tràm trà: Tea Tree Oil; Tinh dầu tràm gió: Cajeput), tinh dầu oải hương là
có thể sử dụng được trực tiếp trên da.
Sử dụng tinh dầu để mát xa: Mát xa với tinh dầu là 1 liệu pháp hiệu quả để giảm trừ
căng thằng và chăm sóc da. Thường tinh dầu không mát xa trực tiếp được lên da mà phải
sử dụng kết hợp với dầu nền (dầu dừa, dầu jojoba, dầu hạnh nhân, dầu thầu dầu...) để
pha với nhau mới có thể mát xa trực tiếp được lên da.
Tỷ lệ pha trộn: Dầu nền 30 giọt pha với 1 giọt tinh dầu nguyên chất.
Liệu pháp hương thơm (hít, xông, khuếch tán, xịt)
- Các dùng để hít: Nhỏ 3 đến 5 giọt tinh dầu vào khăn có chất liệu vải cotton để ở
nơi mà bạn cần tạo mùi. Tinh dầu sẽ bay hương và lan tỏa những nơi gần đó.
- Cách dùng để xông: Vì tinh dầu chỉ bay hơi ở nhiệt độ cao nên phải dùng thêm
công cụ đó là đèn khuếch tán tinh dầu (Bằng điện hoặc bằng nến).
- Dùng để xịt: Do tinh dầu không tan trong nước chỉ tan trong cồn và dầu nền. Nên
muốn làm để xịt thì phải pha với cồn y tế 70 độ hoặc 90 độ.
Liệu pháp bên trong (ăn, uống, ngậm...)
Các loại tinh dầu chất lượng cao (Tinh dầu trị liệu) hầu hết dùng được bên trong
(theo hàm lượng nhất định) Thường tinh dầu nguyên chất không được chỉ định đường
uống do tinh dầu nguyên chất rất đậm đặc nên cần phải pha chế theo công thức, liệu
12
lượng chuẩn thì mới đảm bảo an toàn.
1.3.5. Tính chất vật lý của tinh dầu
Để xác định tính chất vật lý của tinh dầu, thông thường người ta tiến hành xác định
các chỉ số như tỷ trọng, chiết suất, tỷ lệ hòa tan trong cồn 90o ở 250oC, nhiệt độ sôi, năng
suất quay cực, màu sắc.
Hầu hết tỷ trọng của các loại tinh dầu thường nhỏ hơn 1, do vậy chúng thường nhẹ
hơn nước. Tuy nhiên, cũng có một vài tinh dầu có khối lượng riêng lớn hơn nước (như
tinh dầu quế, tinh dầu đinh hương…).
Tinh dầu không tan hoặc rất ít tan trong nước nhưng chúng hòa tan tốt trong đa số
các dung môi hữu cơ như eter, cồn... Chúng có nhiệt độ sôi khoảng 800o C đến 1500o C,
dễ bay hơi và có mùi thơm.
Về màu sắc, tinh dầu thường không màu hoặc có màu vàng nhạt. Một số ít tinh
dầu có màu (ví dụ: tinh dầu ngải cứu có màu xanh lơ, tinh dầu quế có màu nâu sẫm).
Còn mùi và vị của tinh dầu chủ yếu gây ra do các cấu tử bị oxy hóa [9].
1.3.6. Thành phần chủ yếu của tinh dầu
Tinh dầu ở thường ở thể lỏng được tinh chế (bằng cách chưng cất bằng hơi hoặc
nước) từ lá cây, thân cây, hoa, vỏ cây, rễ cây, hoặc những thành phần khác của thực vật.
Bất kỳ một loại tinh dầu nào cũng đều có những thành phần sau [3],[5]:
1.3.6.1. Monoterpenes
Tìm thấy trong hầu hết các loại tinh dầu, Monoterpenes có công thức phân tử là
C10 H16 mạch hở: Tiêu biểu như là miaxene, oximene, có trong tinh dầu hoa nguyệt quế.
13
Miaxene Oximene
Monoterpenes là chất khử trùng và thuốc bổ trong tự nhiên. Chúng lọc không khí
tốt. Monoterpenes có mặt trong hầu hết các loại tinh dầu.
1.3.6.2. Sesquiterpene
Mặc dù không phải là chất dễ bay hơi như Monoterpenes, các sesquiterpene mạch
thẳng và vòng tiêu biểu là farnesene, Zingiberene (tinh dầu gừng)
Farnesene
Sesquiterpene có khoảng 15 nguyên tử carbon trong đó. Và có tác dụng làm dịu,
chống viêm và chống nhiễm trùng.
1.3.6.3. Phenol
Một số chất phenol trích từ các loại tinh dầu như: Thymol, Estragol, Eugenol,…
Thymol Estragol Eugenol
Các chất khử trùng hầu hết có trong thực vật, kích thích cơ thể, phenol có tác dụng
khi sử dụng với liều lượng nhỏ. Tuy nhiên, liều lớn có thế là một chất độc cho hệ thần
kinh và có thể gây kích ứng da .
1.3.6.4. Ancol
Một số ancol quan trọng trích từ tinh dầu thường gặp như: menthol, α- terpineol, geraniol…
14
Menthol α- Terpineol Geraniol
Rất nhiều ancol cùng có mặt trong các loại tinh dầu. Làm chất sát trùng, kháng
khuẩn, chống nấm và thuốc kháng sinh, thuốc bổ rất tốt cho hệ thần kinh và kích thích
phản ứng miễn dịch trong cơ thể.
1.3.6.5.Este
Các este bốc hơi nhanh và tạo độ ngát cho hương. Một số este có trong tinh dầu:
etyl anthranilate, benzyl, acetat,…
Etyl anthranilate Benzyl acetat
Este có tính chất chống co thắt, kháng khuẩn và chống viêm, dùng este nhẹ nhàng
trên da sẽ giúp đỡ trong việc tái cân bằng của hệ thần kinh có hiệu quả.
1.3.6.6. Aldehyt
Trong tinh dầu có rất nhiều aldehyt, song hiện nay các aldehyt đều thu được qua
tổng hợp hóa học. Chỉ có aldehyt như aldehyt cuminic, citral và citronellal được ly trích
từ nguyên liệu tự nhiên.
Andehyt cuminic (Z)-Citral (neral)
15
(E)-Citral (geranial) Citronellal
Aldehyt chống viêm, có tính chất tương tự như ancol. Tuy nhiên, lượng aldehyt có
thể gây ra kích thích lớn cho da và các màng nhầy.
1.3.6.7. Các hợp chất khác
Ngoài các hợp chất nói trên, trong các loại tinh dầu còn có các hợp chất thuộc
nhóm oxit như: (eucalyptus) và các aminoaxit (axit antranilic), các lacton (coumarin,
ambretolit), các hợp chất có lưu huỳnh như: (anlylisosulfocyannat), hợp chất có nitơ
(metyl antranilat).
1.3.7. Kiểm định và cách bảo quản tinh dầu
Kiểm định:
- Để kiểm tra tinh dầu có tự nhiên hay không, chúng ta hãy làm một thử nghiệm
nhỏ dưới đây. Nhỏ một giọt tinh dầu lên tờ giấy trắng và để khô. Nếu thấy sinh ra một
vòng dầu loang bao quanh thì đó không phải là tinh dầu nguyên chất.
- Tinh dầu có nguồn gốc đầy đủ tự nhiên nên mùi hương dễ chịu, không nồng, khi
ngửi thấy sảng khoái.
- Độ nhớt của tinh dầu hhi chúng ta nhỏ tinh dầu từ ống nhỏ giọt chuyên dụng mà
thấy tốc độ nhỏ giọt khá chậm thì đó là tinh dầu chất lượng tốt.
Cách bảo quản tinh dầu thiên nhiên: Tinh dầu nên được bảo quản trong lọ thủy
tinh kín và tối màu ở nhiệt độ mát mẻ, tránh anh sáng mặt trời trực tiếp. Hầu hết các loại
tinh dầu có thể được sử dụng một cách an toàn trong 1-2 năm trở lên sau khi mở nắp.
1.4. Tổng quan về flavonoid
1.4.1.Đại cương
Flavonoid là những chất màu thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa..
Phần lớn các flavonoid có màu vàng (do từ flavus : nghĩa là màu vàng), tuy vậy một số
16
sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu vì chúng có khung sườn căn bản, có cấu trúc cơ
bản kiểu C6-C3-C6, trong đó C6 là một vòng benzen gắn với C3 (I). Cấu trúc có thể là một
vòng kín hoặc mở.
Khung sườn của flavonoid
Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxy tự do đã thay thế một phần, vì
vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính acid.
Các polyphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxy để tạo thành các
phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như các oza
(dạng glycozid) hoặc protein.
Các flavonoid thường rễ kết tinh và thường có màu. Flavon có màu vàng nhạt
hoặc màu cam ; flavonol có màu vàng đến vàng nhạt ; chalcol có màu vàng đến cam đỏ.
Các isoflavon, flavanon, flavanonol, catechin kết tinh không màu. Autocyanidin thường
hiện diện ở dạng gucosid (pelargonidin, cyanidin…. ) màu xanh dương, đỏ, tím cho
những cánh hoa và trái.
1.4.2. Vai trò của flavonoid trong cây
1.4.2.1. Các nhóm phenol của flavonoid có vai trò trong sự hòa tan các chất và di
chuyển rễ dàng qua các màng sinh lí.
Một số flavonoid có tác dụng như những chất chống oxi hóa, bảo vệ acid ascocbic,
là thành phần quan trọng trong tế bào thực vật. Một số có tác dụng ức chế các enzym và
17
các chất độc của cây.
1.4.2.2. Vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng
Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng ức chế và kích thích sinh trưởng cây của
flavonoid. Nhóm chức -OH có vai trò quết định về tác dụng này. Ví dụ trong cây ổi, các
flavonoid có nhóm OH ở vị trí 4’ làm tăng cường hoạt tính của các enzym trong khi các
flavonoid có nhóm 3’ lại có tính ức chế. Flavonoid còn tham gia vào quá trình hô hấp,
quang hợp.
1.4.2.3. Vai trò tạo màu sắc
Flavonoid đóng vài trò tạo màu sắc hấp dẫn cho cây, góp phần thúc đẩy sự sinh tồn
của cây và phát triển hoa, quả.
Các flavon, flavonol, auron, chalcon cho màu vàng trong khi các autoxyannin cho
các màu hồng, đỏ, tím hoặc xanh thẫm.
1.4.2.3.Vai trò bảo vệ cây
Một số flavonoid không màu có trong lá đóng vai trò 1 chất bảo vệ cây, cản trở đối
với động vật ăn cỏ. Vị đắng và khó chịu của flavonoid làm cho động vật khi ăn phải có
cảm giác mất ngon và không thích ăn loại cây này.
Quecetin với nồng độ thấp đã có cảm giác mất ngon, nhưng với liều 0,2% sẽ ức chế
sự bài tiết của nước bọt.
1.4.3.Vai trò của flavonoid trong y học
Powera (1964) đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của 24 loại flavonoid trên 10
chủng vi khuẩn. Hầu hết các flavonoid đều ức chế hô hấp và sự tái sinh sản ở nồng độ 1-
2 micro mol trong môi trường có glucoza. Với 24 chất thử thì không có chất nào không
có tác dụng dưới 9 trong số 10 vi khuẩn thử.
Trong chương trình sàng lọc chất tác dụng với khối u đã phát hiện một số flavonoid
có tác dụng với một số dạng ung thư. Eupatin (II) và Eupatoretin (III) (Kupechan,
1969). Centaureidin (IV) (Kupelian và Bauerachmidt, 1971) đều có tác dụng đối với
18
carcinoma của ung thư vòm họng.
Tác dụng này có liên quan đến cấu trúc của flavonoid. Thực nghiệm cho thấy các
flavonoid có nhóm OH tự do ở vị trí 3’, 4’ có tác dụng tốt đối với sự nâng cao tính bền
vững của thành mạch. Rutin là chất tiêu biểu về tác dụng này.
(II) Eupatin: R=H (IV) Centaureidin
(III) Eupatoretin: R=Me
Hiện tượng xẩy thai của Cừu ở Úc là một vấn đề lớn đã được nghiên cứu ở nước
này. Nguyên nhân chủ yếu gây ra hiện tượng này là cừu ăn phải một loại cây (Trifolium
có một chất isoflavon là genistein (V) với hàm lượng 0,7% trong lá (Brabdury và White,
1951). Trên thực nghiệm chất này có tác dụng estrogen trên chuột nhắt.
(V) Genistein
1.4.4. Phân loại
Dựa trên khả năng oxi hóa vòng pyran trung tâm để phân loại flavonoid.
1.4.4.1. Flavone
Flavone có cấu trúc 2 vòng benzen A và B. Vòng B gắn vào vòng C (pyran) qua
19
dây nối ở C2 (VI)
Khung sườn của flavonoid
Flavone thường gặp nhất là Apigenin (VII) và Luteolin (VIII)
VII) Apigenin (VIII) Luteolin
Đã biết khoảng 130 hợp chất flavon ( Mabry,1975) ở dạng tự do cũng như
glycozid).
1.4.4.2. Flavanon
Khác với flavon là flavanon thiếu dây nối ở C2 và C3 (IX). Tất cả flavanon phát
hiện cho đến nay đều có nhóm OH ở vòng A hoặc B. Trong tự nhiên chúng thường có
bên cạch flavon tương ứng, có nhiều trong các họ Rosacoase, Rutaceac, Leguminoeac,
Asteraceac. Ba chất tiêu biểu là Naringin (X), prunin (XI), Heaperidin (XII).
20
(IX) Cấu trúc chung của flavanon (X) Naringin
(XI) Prunin (XII) Heaperidin
1.4.4.3. Flavonol
Khác với flavon là có thêm nhóm –OH ở vị trí C số 3 (XIII).
(XIII)
Flavonol rất phổ biến trong tự nhiên. Ba chất quan trọng nhất thường gặp là
Kaempferol (XIV) Quecxetin (XV) và Mirixetin (XVI). Đặc biệt có nhiều trong thực vật
hạt kín.
(XIV) (XV) (XVI)
Thống kê trên 1000 loài thuộc thực vật hạt kín thì có 48% loài có Kaempferol và
21
26% Quecxetin và 10% là Mirixetin trong tống số loài có flavonol.
1.4.4.4. Dihydroflavonol
Cấu trúc cơ bản giống flavonol nhưng không có nối đôi ở C2-C3 (XVII). Còn gọi là
3-hydroxyflavonol hoặc flavanonol.
Chất phổ biến và đơn giản nhất là - hydroxyflavonol (XVIII).
(XVII) (XVIII)
Thường gặp chúng ở các họ Leguminaceae, Rutaceae, Moraceae.
1.4.4.5. Chalcon
Là flavonoid vòng mở, 2 nhân thơm kết hợp nhau qua 1 dãy 3 cacbon , - không
bão hòa (XIX).
Trong tự nhiên, chalcon đều có nhóm -OH ở vòng A hoặc B là chất tạo ra màu
vàng tươi của nhiều loại hoa. Ngoài ra còn có ở trong gỗ 1 số loài như Acacta… Chất
chalcon phổ biến nhất là butein (XX).
22
(XIX) (XX)
1.4.4.6. Đihydrochalcon
Là chalcon mất nối đôi , . Loại này có ít trong tự nhiên. Thường gặp trong họ
rosaceae, fagaceae, saluceae. Chất tiêu biểu là phloridzin (trong quả táo) (XXI).
(XXI)
Về cấu trúc, nhóm này khác các flavonoid khác ở chỗ không có nhóm cacbonyl ở
C4 và luôn luôn có các nhóm oza gắn vào OH. Các oza phổ biến là glucoza, galactoza,
azabinoza, fructoza. Sau khi thủy phân chúng cho các antoxyanin tương ứng. Có 3 nhóm
antoxyanin là pelargonidin màu vàng cam hoặc hồng (XXII), xyanidin màu hồng xỉn
(XXIII) và deltinidin màu đỏ hoặc tím (XXIV).
(XXII) (XXIII) (XXIV)
1.4.4.8. Leucoantoxyanidin
Là 3,4-điol flavan (XXV) không màu. Nhưng gặp acid biến thành antoxyanin có
23
màu hồng hoặc đỏ rất phổ biến trong cây nhất là trong vỏ cây và gỗ.
(XXV)
1.4.4.9. Isoflavon
Là nhóm isoflavonoid phổ biến nhất và có nhiều giá trị về tác dụng chữa bệnh.
Ví dụ: Daidzein (XXVI) hoặc Formonometin (XXVII) có trong cam thảo
(glycyrrhiza glabra).
(XXVI) Daidzein: R1=R2=H (XXVII) Formonometin: R1=H; R2= Me
1.4.4.10. Rotenoit
Nhóm hợp chất này có cấu trúc cơ bản của hệ thống croman. Croman là dẫn xuất
của isoflavanon. Đã biết được khoảng 15 chất rotenoit. Trong đó quan trọng nhất là
Rotenon (XXVIII) (Mabry 1975). Tác dụng chủ yếu của hợp chất này là diệt sâu bọ.
24
(XXVIII)
1.4.4.11. Neoflavonoid
Thuật ngữ Neoflavonoid dùng để chỉ một nhóm hợp chất có khung cơ bản 4- aril
eroman (XXIX) chất đầu tiên phân lập được là calophyloit (XXX) chiết từ hạt cây Mù u
(calophyllum inophyllum và một số loài calophyllum khác, họ Guttiferne (Ormancey
Potier 1951).
(XXIX) (XXX)
1.4.4.12. Biflavonoid
Harbrne (1967) xem các Biflavonoid như các đime của Apigenin, có 6 nhóm
Biflavonoid, ví dụ nhóm Biflavon và Flavanonyl- flavon được gọi là nhóm Agathin
flavon (XXXI).
25
(XXXI)
CHƯƠNG II
THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tương nghiên cứu là thân lá cây ngải cứu non mẫu tươi và mẫu khô, thu hái vào
tháng 10 năm 2017 tại phường Tân Lập thành phố thái Nguyên.
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
- Ethanol, n-hexane, ethyl acetate, chloroform, H2SO4 đậm đặc, acid acetic, chì
acetate, FeCl3, chloroform, dung dịch NaOH,….đều là các hóa chất tinh khiết.
- Sắc ký bản được sử dụng bản mỏng từ silicagel 60 F254 tráng trên lá nhôm của
hãng Merck (Đức).
- Silicagel cỡ hạt 0,04-0,06 mm.
- Thuốc thử hiện vết trên bản mỏng: CeSO4 pha trong Mo(SO4)2.
2.2.2. Thiết bị
- Cân phân tích đọ chính xác 10-4, tủ sấy….
- Máy cất quay chân không Buchi, thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước.
-Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy theo phương pháp mao quản trên máy Spectrum two
Berlin Elmer tại Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NRM, HSQC và HMBC được đo trên
máy Bruker Avance – Đức 500MHz tại Viện hàn lâm Khoa học và công nghệ Quốc gia
26
Việt Nam.
2.3. Phương pháp định tính các chất trong dịch chiết [2]
2.3.1. Định tính flavonoid
Cân khoảng 10g thân lá ngải cứu cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90o. Đun
cách thủy khoảng 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
a. Phản ứng Cyanidin
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesium kim loại
(khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Để yên một vài phút, nhận thấy
dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu hồng là phản ứng dương tính [2].
b. Phản ứng với kiềm
Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi hơ
trên miệng lọ có chứa amoniac đậm đặc mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết
đối chứng thấy màu vàng của vết đậm lên rõ rệt là phản ứng dương tính.
Phản ứng với dung dịch NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài
giọt dung dịch NaOH 10%, thấy dịch chiết chuyển từ vàng sang vàng đậm, khi đun nóng
thấy xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính [2].
c. Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Phản
ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa xanh đen.
d. Phản ứng diazo hóa
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH, thêm vài
giọt dung dịch diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút thấy
xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính [2].
27
Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa flavonoid.
2.3.2. Định tính cumarine
Lấy khoảng 5g thân lá ngải cứu cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90o. Đun
cách thủy 5 phút, lọc nóng qua bông. Dịch lọc thu được làm các phản ứng sau:
a. Phản ứng mở vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết:
Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%.
Ống 2 để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm sôi. Để nguội rồi quan sát.
Ống 1: Có tủa đục
Ống 2: Trong suốt
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất, lắc đều, đều thấy:
Ống 1: Trong suốt
Ống 2: Có tủa đục
Acid hóa bằng cách cho thêm 1 giọt HCl đặc, ống 1 sẽ lại đục như ống 2
là phản ứng dương tính.
b. Phản ứng Diazo hóa
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách
thủy đến sôi, sau đó để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha. Thấy trong ống
nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch là phản ứng dương tính.
Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa cumarine.
2.3.3. Định tính saponine
a. Quan sát hiện tượng tạo bọt
Cho vào ống nghiệm 0,1g bột ngải cứu, thêm 5ml nước cất. Lắc mạnh trong 5 phút.
28
Để yên và quan sát thấy hiện tượng tạo bọt bền vững sau 15 phút.
b. Phản ứng phân biệt Saponin steroid và Saponin triterpenoid
Lấy 1g bột ngải cứu cho thêm 5ml cồn đun sôi cách thủy trong 15 phút. Lấy 2 ống
nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống nghiệm thứ nhất 5ml HCl 0,1N (pH=1) và ống thứ
hai 5ml NaOH 0,1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2 - 3 giọt dung dịch chiết cồn bịt
ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15s. Để yên thấy ống nghiệm cột acid có cột bọt
cao hơn ống còn lại là phản ứng âm tính.
Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu không chứa saponine.
2.3.4. Định tính alkaloid
Cho khoảng 1g bột thân lá ngải cứu vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15ml dung
dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi. Để nguội. Lọc dung dịch. Kiềm hóa dung dịch bằng
dung dịch NH3 ( đến pH=9 - 10). Chiết alcaloid base bằng chloroform (2 lần, mỗi lần
5ml). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng Na2SO4 khan, sau đó dùng để làm
phản ứng định tính.
Ống 1: Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer không thấy xuất hiện kết tủa trắng là phản
ứng âm tính.
Ống 2: Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất hiện kết tủa nâu là
phản ứng âm tính.
Ống 3: Nhỏ 2 - 3 thuốc thử Dragendorff, không thấy xuất hiện kêt tủa đỏ cam là
phản ứng âm tính.
Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu không chứa alkaloid.
2.3.5. Định tính tanine
Cho vào ống nghiệm 2g thân lá ngải cứu, thêm 10ml nước cất, đun sôi trong 5 phút.
Để nguội, lọc lấu dịch lọc. Dịch lọc để định tính.
a. Ống 1: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% thấy xuất hiện kết tủa
29
màu xanh nâu nhạt là phản ứng dương tính.
b. Ống 2: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch chì acetate 10% thấy xuất hiện
kết tủa bông là phản ứng dương tính.
Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa tanine.
2.3.6. Định tính glycosid tim
Lấy 3g thân lá ngải cứu, chiết soxhlet với n- hexane 1giờ. Bã sấy khô, cho vào bình
cầu đun hồi lưu với ethanol 40% trong 1 giờ. Gạn lấy dịch chiết, thêm 3ml dung dịch chì
acetate 30%, khuấy đều. Lọc loại tủa, thử đến khí dịch chiết không còn kết tủa với chì
acetate. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn lắc kỹ với hốn hợp chloroform: ethanol tỉ lệ
4:1(3 lần, mỗi lần 5ml), gạn lấy lớp chloroform. Chia dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ,
bốc hơi dung môi trên nồi cách thủy cho đến khô dung môi.
a. Phản ứng khung steroid
Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trê 1ml anhydrit acetic hòa tan cắn. Nghiêng ống
45o. Cho từ từ theo thành ống nghiệm 0,5ml H2SO4 đậm đặc, tránh xáo trộn chất lỏng
trong ống. Không nhận thấy mặt tiếp xúc giữa hai mặt chất lỏng có màu đỏ tím là phản
ứng âm tính.
b. Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh
- Phản ứng Baljet
Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn.
Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch
NaOH 10%) mới pha. Không thấy xuất hiện màu đỏ cam là phản ứng âm tính.
- Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn.
Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Phản ứng
30
thấy xuất hiện màu đỏ cam là phản ứng âm tính.
c. Phản ứng của phần đường 2,6 – desoxy: Phản ứng Keller – Kiliani
Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn.
Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 45o. Cho từ
từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp
xúc giữa hai lớp chất lỏng không có màu tím đỏ là phản ứng âm tính.
Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu không chứa glycosid tim.
2.3.7. Định tính đường khử
Lấy khoảng 2g thân lá ngải cứu, thêm 5ml cồn 90o, đun cách thủy 10 phút, lấy dịch
lọc. Cho1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc
thử Fehling B, đun sôi cách thủy. Thấy không có kết tủa đỏ gạch là phản ứng âm tính.
Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu không chứa đường khử.
2.3.8. Định tính acid amin
Cho 1g thân lá ngải cứu vào ống nghiệm, thêm 5ml nước cất. Đun sôi trực tiếp
trong 10 phút, lọc nóng. Lấy 2ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3 giọt Ninhydrin 3%
đun cách thủy sôi 10 phút thấy xuất hiện kết tủa tím đậm là phản ứng dương tính.
Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa acid amin.
2.3.9. Định tính polysaccharide
Chuẩn bị dịch chiết như acid amin. Chuẩn bị 3 ống nghiệm:
Ống 1: 4ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol
Ống 2: 4ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol
Ống 3: 4ml dịch chiết
Thấy ống 1 có màu đậm hơn ống 2 và ống 3 là phản ứng dương tính.
31
Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa polysaccharide.
2.3.10. Định tính chất béo
Lấy khoảng 5g thân lá ngải cứu cho vào bình nón 50ml. Đổ ngập ether dầu hỏa.
Đun cách thủy 15 phút, lọc lấy dịch để làm phản ứng. Nhỏ 1 giọt dịch lọc lên miếng giấy
lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi, không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc là phản
ứng âm tính.
Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu không chứa chất béo.
2.3.11. Định tính sterols
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi trên nồi cách thủy đến
cắn. Hòa tan cắn bằng 1ml anhydrit acetic, lắc cho tan cắn. Nghiêng ống nghiệm 45o cho
từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm. Thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp
trên có màu xanh lá là phản ứng dương tính.
Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa sterols.
2.4. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước (tách tinh dầu) [8]
2.4.1. Xử lý nguyên liệu
- Mẫu nghiên cứu là thân và lá ngải cứu non được thu hái tại cùng một địa điểm và
cùng khoảng thời gian, đem rửa sạch rồi để ráo nước, sau đó đem đi cân chính xác 500g/
mẫu rồi cho vào túi polyetylen buộc kín để hạn chế sự xâm nhập của không khí. Rồi bảo
32
quản nguyên liệu ở nhiệt độ 5-100C cho đến khi nghiên cứu.
Nguyên liệu
Xử lý
Nghiên cứu tỷ lệ nước/nguyên liệu (v/w)
Ngâm
Nghiên cứu nồng độ NaCl
Nghiên cứu thời gian chưng cất
Chưng cất lôi cuốn hơi nước
Ngưng tụ
Tinh dầu thô
Làm khan
Tinh dầu
Đo GC-MS
Xác định thành phần, hàm lượng các hợp chất trong tinh dầu
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết tách tinh dầu cây Ngải cứu
2.4.2. Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến lượng tinh dầu
2.4.2.1. Khảo sát tỷ lệ nước/ nguyên liệu
Mục đích: Nước có tác dụng thẩm thấu vào các mô nguyên liệu, sau đó sẽ hòa tan,
khuếch tán và lôi cuốn các hợp chất hữu cơ trong tinh dầu, có tác dụng phá vỡ hệ keo
xung quanh tinh dầu, tạo điều kiện cho tinh dầu thoát ra ngoài dễ dàng hơn. Nếu thể tích
dung môi quá ít sẽ làm chậm khả năng khuếch tán của tinh dầu vào trong dung dịch, dẫn
đến thời gian phân tích kéo dài và như vậy thời gian tiếp xúc nhiệt lâu dẫn đến chất
lượng tinh dầu giảm. Vì vậy tỉ lệ dung môi và nguyên liệu là yếu tố quan trọng ảnh
33
hưởng đến hiệu quả chưng cất tinh dầu.
Cách tiến hành: Cân khoảng 500g nguyên liệu (thân và lá ngải cứu), giã nát, sau đó
thêm vào một lượng nước cất với tỉ lệ nước/ nguyên liệu thay đổi lần lượt là:1/1; 2/1;
3/1; 4/1; 5/1 (v/w) với nồng độ NaCl 5%. Ngâm nguyên liệu 60 phút nhằm tăng diện tích
tiếp xúc giữa nguyên liệu với môi trường nước, thúc đẩy quá trình khuếch tán của tinh
dầu. Sau đó chuyển toàn bộ nguyên liệu vào hệ thống chưng cất và tiến hành chưng cất
180 phút. Chiết lấy tinh dầu. So sánh thể tích tinh dầu thu được ở những lần thay đổi thể
tích dung môi khác nhau. Từ đó chọn tỷ lệ nước/ nguyên liệu cho thích hợp.
2.4.2.2. Khảo sát nồng độ muối ăn NaCl đến hàm lượng tinh dầu
Mục đích: Theo các tài liệu tham khảo, NaCl có tác dụng rất tốt trong quá trình
chưng cất tinh dầu vì NaCl có tác dụng làm tăng khả năng thẩm thấu của nước trong tế
bào, làm tăng độ phân cực của dung dịch, nhờ đó làm giảm lực tương tác giữa các các
cấu tử tinh dầu kém phân cực với nước. Do đó tinh dầu sẽ dễ dàng tách ra trong quá trình
chưng cất. Lượng tinh dầu thu được sẽ phụ thuộc vào nồng độ NaCl, nhưng đảm bảo
lượng cho vào là phù hợp đẻ thu được lượng tinh dầu là cao nhất.
Cách tiến hành: Cân khoảng 500 g nguyên liệu (thân và lá ngải cứu), giã nát, sau
đó thêm vào một lượng nước cất với tỉ lệ nước/ nguyên liệu là 4/1 (v/w). Thêm NaCl vào
ở các nồng độ 0%, 5%, 10%,15%, 20%. Sau đó ngâm nguyên liệu 60 phút. Tiếp tục
chuyển toàn bộ nguyên liệu đã ngâm vào hệ thống chưng cất hỗn hợp trong vòng 180
phút. Hỗn hợp sau khi gia nhiệt sẽ bay hơi và đi qua ống sinh hàn. Tại đây tinh dầu sẽ
ngưng tụ sau khi gặp lạnh, sau đó sẽ phân ly thành 2 lớp: Lớp trên là tinh dầu, phía dưới
là lớp nước. Chiết lấy tinh dầu phía trên.
2.4.2.3. Thực nghiệm xác định thời gian chưng cất
Mục đích: Thời gian chưng cất có vai trò quyết định lượng tinh dầu thu hồi. Nếu
thời gian quá ngắn thì lượng tinh dầu trích ly chưa hết do đó sẽ giảm thể tích tinh dầu thu
được. Ngược lại thời gian chưng cất lâu thì vừa tốn thời gian mà chất lượng tinh dầu
34
cũng giảm đi đáng kể.
Cách thực hiện: Cân khoảng 500 g nguyên liệu (thân và lá ngải cứu), giã nát, sau
đó thêm vào một lượng nước cất với tỉ lệ nước/ nguyên liệu là 4/1 (v/w), nồng độ NaCl
10%. Ngâm nguyên liệu trong thời gian 60 phút rồi mới tiến hành thực nghiệm chưng cất
nguyên liệu với các khoảng thời gian 60 phút, 90 phút, 120 phút, 180 phút, 240 phút.
Thời gian chưng cất bắt đầu tính khi có giọt tinh dầu đầu tiên rơi xuống bình chiết, chú ý
theo dõi và ghi lại thể tích tinh dầu ngưng tụ cho đến khi thấy thể tích tinh dầu thô không
tăng nữa. Lúc đó mới tiến hành ngừng quá trình chưng cất.
Tỉ lệ khối lượng tinh dầu thu hồi được tính theo công thức:
η =
Trong đó:
η : Tỷ lệ khối lượng thu hồi tinh dầu (%).
VTD: Thể tích tinh dầu thu được (ml).
dTD : Tỷ trọng của tinh dầu (g/ml).
mNL : Khối lượng nguyên liệu đem đi chưng cất (g).
2.5. Phương pháp chiết tách và xác định cấu trúc hợp chất phân lập được [8]
2.5.1. Xử lý mẫu thực vật
Thân lá cây ngải cứu non được thu hái tại cùng một địa điểm và cùng khoảng thời
gian, đem rửa sạch rồi để ráo nước, sau đó sấy khô ở 50oC, xay nhỏ và tiến hành ngâm
35
chiết trong dung môi thích hợp.
2.5.2. Chiết và phân lập hợp chất hữu cơ
Bột ngải cứu (2,5kg)
- Ngâm chiết bằng ethanol - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi Cao ethanol (150g)
- Ngâm chiết bằng n-hexane - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi
Cao chiết n-hexane (17g)
Dịch chiết nước
- Ngâm chiết bằng ethyl acetate - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi
Dịch chiết nước
Cao ethyl acetate (36g)
Săc ký cột
Hợp chất H1
Sơ đồ 2.2. Quy trình chiết và phân lập hợp chất từ cây ngải cứu
2.5.2.1. Chiết hợp chất hữu cơ
Cân 2,5kg bột ngải cứu ngâm chiết nhiều lần trong ethanol 90o (đến khi nào chất
trong bột ngải cứu được chiết ra hết hết). Quay cất thu hồi dung môi dưới áp suất thấp
thu được cặn chiết ethanol. Sau đó hòa tan cao chiết ethanol trong một lượng tối thiểu
ethanol, cho thêm 500 ml nước cất, tiếp tục chiết trong dung môi n-hexane nhiều lần để
loại các chất không phân cực (tan trong dung dịch n-hexane). Phần dung dịch còn lại
chiết bằng dung môi ethyl actate. Thu lấy phần dung dịch ethyl acetate, cô cạn dung môi
sẽ thu được cặn ethyl acetate.
2.5.2.2. Quá trình phân lập các chất từ cao ethyl acetate
36
Từ 36 gam cao ethyl acetate đem hòa tan trong một lượng tối thiểu dung môi ethyl
acetate, sau đó được hấp thụ silicagel (Merck cỡ hạt 40-63 μm). Khuấy đều cho đến khi
silicagel hấp thụ đều hết dung dịch mẫu, làm khô cho đến khi tạo thành hỗn hợp bột mịn.
Nhồi cột silicagel kích thước (đường kính: 4cm và chiều cao: 56cm) . Ổn định cột
bằng dung môi n-hexane. Hệ dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần từ n-hexane đến
ethanol, các phân đoạn có Rf giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gom vào cùng một
phân đoạn trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Kết quả sắc ký cột silicagel của cao chiết ethyl acetate
Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (g) Kết quả SKLM Ghi chú
H: 100 ET1
H:EA=95:5 4,5 Nhiều vết
H:EA=9:1
H:EA=4:2 ET2 8,3 Nhiều vết H:EA=1:1
Nhiều vết trong Khảo sát
ET3 6,2 đó có vết vàng EA: 100% đậm
ET4 EA:M=9:1 Nhiều vết 2,0
ET5 EA:M=7:3 Nhiều vết 1,8
EA:M=1:1
ET6 Nhiều vết 6,7 M:100%
Phân đoạn ET3 (6,2 g) tiến hành sắc ký trên cột silicagel với hệ dung môi giải ly H:
37
EA=8:2; 5:5; EA: 100%.
Bảng 2.2: Kết quả sắc ký cột silicagel của phân đoạn ET3
Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (g) Kết quả SKLM Ghi chú
ET 3.1 H:EA=8:2 Nhiều vết 1,500
ET 3.2 H:EA=5:5 2 vết vàng đậm Khảo sát 2,853
ET 3.3 H:EA=5:5 Nhiều vết 0,725
ET 3.4 EA 100% Nhiều vết 1,022
Phân đoạn ET 3.2 tiếp tục tiến hành sắc ký trên cột silicagel với hệ dung môi giải
ly CHCl3: EA=1:1 thu được 3 phân đoạn ET 3.2.1, ET 3.2.2, ET 3.2.3.
Bảng 2.3. Kết quả sắc ký cột silicagel của phân đoạn ET 3.2
Phân đoạn Kết quả SKLM Ghi chú
ET 3.2.1 Nhiều vết
ET 3.2.2 Vết rõ màu vàng Khảo sát, hợp chất H1
ET 3.2.3. Nhiều vết
Phân đoạn ET 3.2.2. sau khi cô kiệt dung môi thu được chất rắn màu vàng kí hiệu
là H1 (6,0 mg), nhiệt độ nóng chảy 276 - 278oC. Rf = 0,42 (CHCl3:EA=1:1).
2.5.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc hóa học các chất
Cấu trúc của các hợp chất tinh khiết được xác định bằng sự kết hợp các phương
pháp phổ hiện đại như cộng phổ hưởng từ hạt nhân proton (1H-NRM), carbon-13 (13C-
38
NRM), HSQC, HMBC và so sánh với tài liệu tham khảo.
Chương III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Định tính các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong thân lá ngải cứu
Chúng tôi tiến hành định tính sự có mặt của một số nhóm hợp chất hữu cơ trong
cây ngải cứu theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3. Kết quả thu được trình bày trong
bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong thân lá ngải cứu
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Sơ bộ kết luận
Phản ứng Cyanidin +++
Phản ứng với kiềm +++ 1 Flavonoid Có +++ Phản ứng với FeCl3
Phản ứng diazo hóa +++
Phản ứng mở vòng lacton +++ Cumarine 2 Có Phản ứng Diazo hóa ++
Quan sát hiện tượng tạo bọt +
Saponine 3 Không _ Phản ứng phân biệt Saponin steroid và Saponin triterpenoid
Thuốc thử Mayer _
4 _ Alkaloid Thuốc thử Bouchardat Không
Thuốc thử Dragendorff _
+ Dung dịch FeCl3 5% 5 Có Tanine Dung dịch chì acetat 10% ++
Phản ứng khung steroid _
Phản ứng Baljet _
6 Glycoside tim Phản ứng Legal _ Không
Phản ứng Keller – Kiliani _
39
+ Tinh thể Na2SO3
7 Đường khử _ Không Thuốc thử Fehling A và thuốc thử Fehling B
8 Acid amin Ninhydrin 3% + Có
9 Polysaccharide Thuốc thử Lugol + Có
10 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy _ Không
11 Sterols Phản ứng Liebeiiiiann + Có
Chú giải:
- : Phản ứng âm tính
+ : Phản ứng dương tính
++ :Phản ứng dương tính rõ
+++: Phản ứng dương tính rất rõ
Kết quả cho thấy, trong cây ngải cứu có chứa một số nhóm chất như flavonoid,
cumarine, tanine, acid amin…. Chúng tôi sử dụng kết quả định tính này làm định hướng
cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Kết quả nghiên cứu chiết tách tinh dầu
Tinh dầu thu được theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước từ cây ngải cứu
có màu vàng nhạt, mùi thơm hơi hắc, nhẹ hơn nước, không tan trong nước.
3.2.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu
3.2.1.1. Khảo sát tỷ lệ nước/ nguyên liệu
Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nước/ nguyên liệu với thời gian
chưng cất 180 phút, nồng độ NaCl 5%. Kết quả thu được thể hiện trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khảo sát tỷ lệ nước ảnh hưởng đến tỉ lệ tinh dầu
Tỷ lệ (ml/g) 1/1 2/1 3/1 5/1 4/1
40
Vtinh dầu (ml) 0,5 1,3 1,5 1,6 1,6
Kết quả cho thấy tỷ lệ nước/ khối lượng là 4/1 hiệu quả tinh dầu thu được cao
nhất. Ở khoảng tỷ lệ này thì tinh dầu thu được trong suốt, ít tạo nhũ tương, mùi thơm tự
nhiên. Khi lượng nước càng cao thì khả năng tạo nhũ tương của tinh dầu với nước càng
cao. Chất lượng tinh dầu giảm.
3.2.1.2. Kết quả khảo sát nồng độ muối ăn NaCl đến hàm lượng tinh dầu
Chúng tôi tiến hành khảo sát 5 mẫu nghiên cứu với nồng độ NaCl thêm vào dung
dịch nước từ 0% đến 20%, thời gian chưng cất 180 phút, tỷ lệ nước/ khối lượng nguyên
liệu 4/1.
Bảng 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hàm lượng tinh dầu
Nồng độ NaCl (%) 0 5 10 15 20
1,0 1,6 1,9 1,9 1,8 Vtinh dầu (ml)
Số liệu bảng 3.3 cho thấy chiết tinh dầu bằng nước cất sẽ thu được hàm lượng
thấp hơn rất nhiều khi cho thêm NaCl. Nồng độ NaCl thêm vào có vai trò làm tăng khả
năng thẩm thấu của nước trong tế bào, đồng thời làm tăng tỉ trọng của nước phá vỡ hệ
nhũ tinh dầu- nước, làm cho tinh dầu dễ dàng tách lớp trong quá trình chưng cất.
Hàm lượng tinh dầu thu được cao nhất ở nồng độ muối 10%. Từ nồng độ muối ăn
20% trở lên lượng tinh dầu giảm dần do khi chưng cất, tinh dầu tạo với nước thành hệ
nhũ tương, việc cho thêm muối ăn sẽ tránh thất thoát tinh dầu dưới dạng nhũ, làm giảm
độ tan của một số thành phần không phân cực có trong tinh dầu và nước. Hơn nữa khi
nồng độ của NaCl cao sẽ làm cho các lớp biểu bì chứa tinh dầu co lại, ngăn cản sự thoát
tinh dầu ra ngoài.
3.2.1.3. Kết quả khảo sát thời gian chưng cất thích hợp
Chúng tôi tiến hành khảo sát với khoảng thời gian chưng cất từ 60 phút đến 240
phút. Với nồng độ muối ăn thích hợp là 10%, tỷ lệ nước/ nguyên liệu là 4/1 (v/w) thu
41
được kết quả sau:
Bảng 3.4. Thời gian chưng cất tinh dầu thân, lá ngải cứu
Thời gian (phút) 60 90 120 180 240
1,2 1,5 1,8 1,9 1,9 Vtinh dầu (ml)
Nhận xét: Theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, trong thời gian từ 60
phút giờ đến120 phút thể tích tinh dầu thu được tăng nhanh, từ 120 đến 180 phút thể tích
tinh dầu tăng không đáng kể, sau 180 phút thể tích không tăng thêm nữa. Do vậy, chúng
tôi chọn180 phút là thời gian chưng cất thích hợp nhất.
Kết luận: Qua quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã xây dựng được điều kiện thích
hợp để chưng cất tinh dầu ngải cứu bằng phương pháp chưng cất hơi nước là.
- Tỷ lệ nước/ nguyên liệu: 4/1
- Nồng dộ dung dịch NaCl: 10%
- Thời gian chưng cất: 180 phút.
- Tỷ lệ khối lượng tinh dầu ngải cứu là: 0,120% (w/w)
3.2.2. Kết quả nghiên cứu xác định thành phần và hàm lượng một số hợp chất trong tinh dầu ngải cứu.
Sau khi thu được tinh dầu, chúng tôi tiến hành gửi mẫu đi xác định thành phần
hóa học của tinh dầu ngải cứu bằng phương pháp sắc kí khí, ghép khối phổ GC/MS tại
Viện nghiên cứu và phát triển ứng dụng các hợp chất thiên nhiên- Đại học Bách Khoa
Hà Nội.
42
3.2.2.1. Thành phần hóa học trong tinh dầu thân lá ngải cứu khi chiết với dung môi là nước
Bảng 3.5. Thành phần hóa học trong tinh dầu thân lá ngải cứu
khi chiết với dung môi là nước
Hàm lượng (%) STT Thành phần
1. α-pinene 4,51
2. Camphene 3,30
3. β-pinene 3,18
4. Cymene 0,98
5. D-limonene 1,45
6. p-cineole 0,84
7. Camphor 1,11
8. Borneol 0,92
9. 2-isopropenyl -5-methyl-4-hexenyl acetate 1,17
10. Bornyl acetate 4.30
11. δ-elemene 0,57
12. isbornyl propionate 1,11
13. α-cubebene 0,68
14. (-)-β- elemene 5,73
15. Borneol butyrate 1,34
16. Cayophyllene 5,98
17. (Z)-β-farnesene 0,31
18. α-humulene 4,13
19. Eudesma-4(14),11-diene 3,83
43
20. Torreyol 0,68
21. Isbornyl-3-methylbutanoate 1,05
22. γ-cadinene 0,37
23. α-cedrol 1,66
24. (-)-caryophyllene oxide 17,38
25. Nerolidol 1,85
26. Spathulenol 6,32
trimethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl 3-methyl-2- 27. 1,12 1,7,7- butenoate
28. Bornyl angelate 1,11
29. Humulene oxide 6,20
30. α-cadinol 4,12
31. Juniper camphor 3,02
32. 1,15 6-isopropenyl-4,8a-dimethyl-1,2,3,5,6,7,8,8a- octahydro-naphthalene-2-ol
33. Elemene 1,02
34. Isobutyl phthalate 2,97
35. Phytol 1,91
Kết quả nghiên cứu cho thấy trong tinh dầu ngải cứu khi chiết bằng dung môi là
nước có tới 41 hợp chất trong đó 35 hợp chất đã được định danh với các thành phần hóa
học chủ yếu là các hợp chất (-)-caryophyllene oxide chiếm 17,38 %, spathulenol 6,32 %,
humulene epoxide II 6,20 %; trans-β-caryophyllene 5,98 %; (-)-β- elemene 5,73 % ; α-
pinene 4,51 %.
3.2.3.2. Thành phần hóa học trong tinh dầu thân lá ngải cứu với dung môi chưng cất là
44
dung dịch muối ăn NaCl 10%.
Phần thân lá ngải cứu được chưng cất với dung môi là dung dịch muối ăn NaCl
10% thu được tinh dầu có thành phần như sau:
Bảng 3.6. Thành phần hóa học trong tinh dầu thân lá ngải cứu với dung môi chưng
cất là dung dịch muối ăn NaCl 10%.
Hàm lượng (%) STT Thành phần
α-pinene 1. 3,49
β-phellandrene 2. 0,64
β-pinene 3. 0,88
4. Cymene 0,73
5. D-limonene 0,59
p-cineole 6. 1,08
Filifolone 7. 0,37
p-menta-E-2,8(9)-dien-1-ol 8. 0,24
9. 2-pinene-7-one 1,96
10. δ-elemene 0,22
11. α-copaene 0,80
12. (-)-β- elemene 4,25
13. Trans-β-caryophyllene 7,34
14. α-humulene 3,96
15. 0,79 2-isopropenyl-4a,8-dimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7- octahydronaphthalene
16. Valencene 0,46
17. β-selinene 2,22
45
18. Torreyol 0.79
19. γ-cadinene 0,28
20. Cubebol
21. Calamenene 0,20
22. 0,23 1H-Benzocyclohepten-7-ol,2,3,4,4a,5,6,7,8-octahydro- 1,1,4aα,7β-tetramethyl-cis
23. (-)-caryophyllene oxide 32,81
24. Palustrol 0,41
25. Spathulenol 8,32
26. Veridiflorol 1,77
27. Ledol 0,68
28. Humulene epoxide II 7,52
29. γ-eudesmol 1,25
30. Tetracyclo[6.3.2.0E1,8]tridecan-9-ol,4,4-dimethyl 0,29
31. α-cadinol 0,88
32. α-eudesmol 2,89
33. Juniper camphor 1,78
34. Trans-β-terpineol 0,38
35. Longiborneol 0,54
36. 1,07 6-isopropenyl-4,8a-dimethyl-1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro- naphthalene-2-ol
37. Cembrebe 1,79
38. 1-cyclohexanone,2-methyl-2-(3-methyl-2-oxobytyl) 0,69
39. Aromadendrenepoxxide-(I) 0,39
46
40 Trans-phytol 0,42
Kết quả nghiên cứu cho thấy trong tinh dầu ngải cứu khi chiết bằng dung môi là
NaCl 10% có tới 52 hợp chất trong đó có 40 hợp chất đã được định danh với các thành phần
chủ yếu là (-)-caryophyllene oxide chiếm 32,81%, spathulenol 8,32%, humulene epoxide II
7,52%; trans-β-caryophyllene 7,34%; (-)-β- elemene 4,25% ; α-humulene 3,96%.
Kết luận:
- Thành phần hóa học trong tinh dầu loài ngải cứu là rất đa dạng.
- Khi chiết bằng dung môi nước có mặt NaCl 10% sẽ thu được hàm lượng tinh
dầu lớn hơn, thành phần các hợp chất cũng nhiều hơn trong dung môi nước.
- Tách tinh dầu phương pháp chưng cất bằng hơi nước mang lại hiệu quả kinh tế
cao, dung môi rẻ tiền, thiết bị đơn giản.
3.3. Kết quả phân lập các hợp chất
Từ 2,5 kg bột ngải cứu ngâm chiết nhiều lần trong các dung môi: ethanol, n-
hexane, ethyl acetate.
Quá trình phân lập các chất từ cao ethyl acetate (36 g) được thực hiện bằng săc ký
cột silicagel với hệ thống dung môi thích hợp thu được 1 chất sạch ký hiệu H1.
3.4. Xác định cấu trúc chất phân lập được
Cấu trúc của H1 được xác định dựa vào dữ liệu phổ 1H-NRM, 13C-NRM, HSQC,
HMBC và so sánh tài liệu tham khảo.
Phổ 1H NMR có sáu proton vòng thơm, trong đó hai tín hiệu proton vòng thơm
xuất hiện với cường độ gấp đôi [δH 8,15 (2H, d) và 7.02 (2H, d)], có hằng số ghép J =
8,5 cho thấy đây là 2 cặp proton tương đương nằm ở vị trí ortho với nhau.
Tín hiệu δH 12,16 ppm trên phổ 1H NMR khẳng định nhóm –OH phải gắn vào C-
47
5 khung flavones (hình 3.1)
Hình 3.1: Phổ 1H-NRM của hợp chất H1
Hình 3.2: Phổ 13C-NRM của hợp chất H1
Phổ 13C-NMR của hợp chất H1 xuất hiện 13 tín hiệu, trong đó có 2 tín hiệu ở δC
48
130,465 ppm và δC 116.351 ppm có cường độ gấp đôi. Vậy trong công thức cấu tạo của
hợp chất H1 có tổng cộng 15 carbon, gồm12 carbon vòng thơm [δC 165.02 (C-4’);
162.34 (C-7); 160.5 (C-5); 157.82 (C-9); 130.46 (C-2’ và C-6’); 123.34 (C-1’); 116.35
(C-3’ và C-5’); 104.17 (C-10); 99.21(C-6) và 94.52 (C-8)], và 2 carbon olefin mang
oxygen [δC 147.06 (C-2) và 136.63 (C-3)], 1 carbon carbonyl [δC 176,61 (C- 4)] cho
phép dự đoán hợp chất H1 có khung flavone.
Hình 3. 3: Khung flavone
Phổ DEPT NMR kết hợp với phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất H1 có 6 nhóm –
CH= và 9 nhóm C tứ cấp.
Phổ HSQC cho tín hệu proton tại δH 6,26 ppm gắn trực tiếp với C tại 99,21ppm;
H tại 6,52 gắn trực tiếp với C tại 94,52 ppm; H tại δH 7.02 ppm gắn trực tiếp với
carbon tại δC 116.35 ppm và tín hiệu proton tại δH 8,15 ppm gắn trực tiếp với C tại δC
130.46 ppm. .Điều này chứng tỏ bốn proton này cùng nằm trên vòng B có tính đối xứng.
Phổ HMBC (xét vòng A) proton của -OH nối tương quan với một carbon vòng
thơm mang oxygen [δC 162.3 ppm], một carbon vòng thơm tứ cấp [δC 104.1ppm] và một
carbon vòng thơm mang hydrogen [δC 99.2 ppm] khẳng định ba tín hiệu carbon này lần
lượt là C-5, C-10 và C-6. Proton H-6 [δH 6,26 ppm] ghép metha với proton δH 6,52 ppm,
nên proton này chỉ có thể là H-8. Mặt khác, hai proton H-6 và H-8 cùng tương quan với
carbon δC 162.3 ppm trên phổ HMBC, nên carbon này phải là C-7. Carbon δC 157.8 ppm
cũng cho tương quan với với proton H-8 trên phổ HMBC nên carbon này là carbon C-9.
Phổ HMBC (xét vòng B), tín hiệu proton δH 8,15 ppm cho tương quan với hai
49
carbon sp2 mang oxygen [δC 160.1 ppm và 147.0 ppm] và một carbon sp2 tứ cấp [δC
123.3 ppm]. Tín hiệu proton δH 7.02 ppm cũng cho tương quan với hai trong ba carbon
trên là δC 160.2 ppm và δC 123.3 ppm. Do đó có thể suy ra tín hiệu proton [δH 8,15 ppm]
ứng với H-2’ và H-6’, tín hiệu proton [δH 7.02 ppm] ứng với H-3’ và H-5’, ba carbon sp2
δC 130.4 ppm; δC 147.0 ppm và δC 123.3 ppm lần lượt là C-6’, C-2 và C-1’. Như vậy,
trong 13 tín hiệu carbon của khung flavone trên phổ 13C NMR chỉ còn tín hiệu carbon
sp2 [δC 136.6 ppm] nên carbon này phải là C-3.
Bảng 3.7. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của H 1 với số liệu phổ
1H-NMR và 13C-NMR của 3,5,7,4’- tetrahydroxy flavone [19]
H1 (Acetone-d6) 3,5,7,4’- tetrahydroxy flavone (Acetone-d6) [19] Vị trí
δC ppm 125 MHz δC ppm 125 MHz δH ppm (J, Hz) 500 MHz δH ppm (J, Hz) 500 MHz
2 147.0 147.9
3 136.6 137.0
4 176.6 177.2
5 160.2 160.4
6 6.26 (s) 99.2 6.28 (d) 99.2
7 162.3 162.4
8 6.52 (s) 94.5 6.54 (d) 94.4
9 157.8 158.1
10 104.1 104.5
1’ 123.3 123.7
2’ 8.15 (d, 8.5) 130.4 8.09 (d, 9.0) 130.6
3’ 7.02 (d, 9.0) 116.3 7.01 (d, 9.0) 116.2
4’ 165.0 165.4
5’ 7.02 (d, 9.0) 116.3 7.01 (d, 9.0) 116.2
50
6’ 8.15 (d, 8.5) 130.4 8.09 (d, 9.0) 130.6
Từ các dữ liệu phổ, kết hợp với kết quả của Rahaman M. et al. 2006, chúng tôi kết
luận hợp chất H1 là 3,5,7,4’- tetrahydroxy flavones (kaempferol).
Các kết quả nghiên cứu về hợp chất 3,5,7,4’- tetrahydroxy flavones cho thấy đây
là hợp chất có tác dụng tích cực trong việc chống ung thư và bệnh tim mạch, chống động
kinh, chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống co thắt, trị đái tháo đường, giảm
51
đau và làm giảm ho.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu về thành phần hóa học trong loài ngải cứu, chúng tôi thu
được một số kết quả chính như sau:
1.1. Định tính sự có mặt của một số nhóm hợp chất hữu cơ như flavonoid, cumarine,
tanin, acid amin…. trong cây ngải cứu.
1.2. Xây dựng được điều kiện tối ưu chiết xuất tinh dầu ngải cứu theo phương pháp
chưng cất lôi cuốn hơi nước.
- Tỷ lệ nước/ nguyên liệu: 4/1
- Nồng dộ dung dịch NaCl: 10%
- Thời gian chưng cất: 180 phút.
- Tỷ lệ khối lượng tinh dầu ngải cứu là: 0,120% (w/w)
1.3. Xác định thành phần và hàm lượng một số hợp chất trong tinh dầu loài ngải cứu:
- Chiết bằng dung môi nước: 35 hợp chất.
- Chiết bằng dung môi nước NaCl 10%: 40 hợp chất.
1.4. Phân lập được 01 hợp chất tinh khiết trong dịch chiết ethyl acetate và xác định
cấu trúc hợp chất H1 là 3,5,7,4’- tetrahydroxy flavones (hay còn gọi là kaempferol).
2. KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu theo hướng sâu hơn: chạy sắc ký cột để tách được các hợp
chất khác trong dịch chiết thân lá và hoa ngải cứu để so sánh. Làm giàu các cấu tử chính,
đánh giá hoạt tính sinh học như ức chế tế bào ung thư, bảo vệ tế bào… hoặc nghiên cứu
52
các phản ứng chuyển hóa của chúng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đái Duy Ban (2008), Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học phòng chống một
số bệnh cho người và vật nuôi, NXB Khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội.
2. Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên
cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản giáo dục.
3. Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia
TP. Hồ Chí Minh.
4. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây Cỏ Việt Nam, NXB Trẻ.
5. Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học tập II, NXB Y học ,Hà Nội.
6. Đỗ Tất Lợi (2003), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.
7. Phạm Quốc Long, Châu Văn Minh, Lipit và các axit béo hoạt tính sinh học có nguồn
gốc thiên nhiên, NXB khoa học và kỹ thuật, (2006).
8. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học
Quốc gia TP Hồ Chí Minh.
9. Lê Ngọc Thạch (2003). Tinh Dầu, NXB Đại học Quốc gia, Thành phố Hồ Chí Minh.
10. Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu tập 1, NXB Y học, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
11. Abdul Majeeth Kamarul Haniya and Palghat Raghunathan Padma (2013),
antioxidant effect of Artemisia vulgaris leaf extracts on oxda tively stressed
precision-cut liver slices, Vol 7,2, international research journal of pharmacy, ISSN
53
2230 – 8407, pp. 55-60.
12. Baixiao Zhao, Gerhard Litscher, Jun Li, Lu Wang, Yingxue Cui, Chaxi Huang, Ping
Liu (2011), Effects of Moxa (Artemisia vulgaris) Smoke Inhalation on Heart Rate
and Its Variability, Chinese Medicine, 2, pp. 53-57.
13. Gayan S. Bamunuarachchi, Wanigasekara D. Ratnasooriya, Sirimal Premakumara
&Preethi V. Udagama1 (2013), Antimalarial properties of Artemisia vulgaris L.
ethanolic leaf extract in a Plasmodium berghei murine malaria model, J Vector
Borne Dis 50, pp. 278–284.
14. Gayan S. Bamunuarachchi, Wanigasekara D. Ratnasooriya, Sirimal Premakumara &
Preethi V. Udagama1 (2014), Artemisia vulgaris L. ethanolic leaf extract reverses
thrombocytopenia/ thrombocytosis and averts end-stage disease of experimental
severe Plasmodium berghei murine malaria, J Vector Borne Dis 51, pp. 286–293.
15. I.Burzo, V.Ciocalan, Elena Delian, Aurelia Dobrescu, Liliana, Bawdulescu (2008),
researches regarding the essential oil composition of some Artemisia L. species,
University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine Bucharest, Romania,
Analele ştiinţifice ale Universităţii “Al. I. Cuza” Iaşi, Tomul LIV, fasc. 2, s.II a.
Biologie vegetală, pp.86-91.
16. K. Abedulla Khan (2015) “A preclinical antihyperlipidemic evaluation of Artemisia
vulgaris root in diet induced hyperlipidemic animal model” International Journal of
Pharmacological Research, ISSN: 2277-3312, Vol 5, Isue 4, p-110-114.
17. Nguyen HT, Nguyen HT, Islam MZ, Obi T, Pothinuch P, Zar PP, Hou de X, Van
Nguyen T, Nguyen TM, Van Dao C, Shiraishi M, Miyamoto A (2016),
Pharmacological characteristics of Artemisia vulgaris L. in isolated porcine basilar
artery, J Ethnopharmacol, Apr 22;182:16-26.
18. Pandey PB, Thapa R, Upreti A (2017) “Chemical composition, antioxidant and
antibacterial activities of essential oil and methanol extract of Artemisia vulgaris and
54
Gaultheria fragrantissima collected from Nepal” Asian Pac J Tropmed,p 952-959.
19. Rahaman M. S., AJM Moynul Hasan, M. Y. Ali and M. U. Ali (2006), “A Flavone
from the Leaves of Cassia Alata”, Bangladesh J. Sci. Ind. Res., 41(1-2), 93-96
20. Sang- Jun Lee, Ha- Yull Chung, In- Kyung Lee, Ick- Dong Yoo (1999), Isolation
and identification of flavonoids from ethanol extracts of Artemisia vulgaris and their
antioxidant activity, Korea J. Food Sci. Technolol. 31: 815-822.
21. Shamilak and Padma P.R (2013), Anticancer activity of Artemisia vulgaris on
hepatacellular carcinoma cells, International Journal of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences, ISSN-0975-1491 ,Vol 5, Suppl 3.
22. Syed AA Rizvi, Ayman M SalehEmail author, Ahmad Aljada, Amre Nasr, Ahmed S
Alaskar and Jack D Williams, In vitro cytotoxicity of Artemisia vulgaris L. essential
oil is mediated by a mitochondria-dependent apoptosis in HL-60 leukemic cell line,
BMC Complementary and Alternative Medicine, The official journal of the
International Society for Complementary Medicine Research (ISCMR), Published: 7
55
July 2014.
PHỤ LỤC
H ì n h S 1 :
P h ổ
1 3
-
C N M R c ủ a
H 1
H ì n h S 2 :
P h ổ H S Q C c ủ a c h ấ t
H 1
H ì n h S 3 :
P h ổ H M B C c ủ a c h a t
H 1
