ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜ NG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––
TRẦN THỊ BÍCH HẢO
PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƢỢNG CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƢỜNG TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
THÁI NGUYÊN - 2016
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜ NG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––
TRẦN THỊ BÍCH HẢO
PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƢỢNG CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƢỜNG TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG
CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
Chuyên ngành: Hoá Phân Tích Mã số: 60 44 0118
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHẠM THỊ THẮM
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
THÁI NGUYÊN - 2016
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tới
TS. Phạm Thị Thắm - nguyên giảng viên Trƣờng ĐH Khoa học - ĐH Thái
Nguyên nay là giảng viên Đại học Thủy Lợi đã tin tƣởng giao đề tài, định
hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi
hoàn thành luận văn thạc sỹ này.
Tôi xin gửi lời trân trọng cảm tới TS Dƣơng Nghĩa Bang, TS. Phạm Thế
Chính cùng các thầy cô khoa Hóa học, Trƣờng ĐH Khoa học- ĐH Thái
Nguyên đã ta ̣o điều kiê ̣n , giúp đỡ tôi trong quá trình tri ển khai nghiên cứu,
thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các thầy, cô, cán bộ, kĩ
thuật viên Phòng Hóa dƣợc, thuộc Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ dạy và hƣớng dẫn tôi trong quá trình học
tập, thực nghiệm và thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè lớp Cao
học khóa 2014- 2016 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập
và làm luận văn.
Tác giả luận văn
Trần Thị Bích Hảo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
a
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... a
MỤC LỤC ......................................................................................................... b
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ e
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. g
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 2
1.1. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc ..................................... 2
1.1.1. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR) .......................................................... 2
1.1.2. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ................................ 3
1.1.3. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng (MS) ........................................................ 5
1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng - sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........ 7
1.2.1. Khái niệm ................................................................................................ 7
1.2.2. Phân loại .................................................................................................. 8
1.2.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ................................................................. 8
1.2.4. Pha động trong sắc ký pha đảo ................................................................ 9
1.2.5. Detector dad .......................................................................................... 10
1.2.6. Detector ms ........................................................................................... 11
1.3. Khái quát về bệnh tiểu đƣờng .................................................................. 13
1.3.1. Phân loại bệnh tiểu đƣờng ..................................................................... 13
1.3.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đƣờng huyết ............................................ 14
1.3.3. Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đƣờng ............................. 15
1.3.4. Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng .......................................... 15
1.4. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng metformine hydrochloride ........................ 16
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .......................................................... 16
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc ........................................................ 17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Chƣơng 2: THỰC NGHIỆM ........................................................................ 20 b
2.1. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 20
2.1.1. Hóa chất và dung môi ........................................................................... 20
2.1.2. Thiết bị xác định và phân tích cấu trúc ................................................. 20
2.1.3. Phân tích xác định cấu trúc, định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh
khiết của các sản phẩm tổng hợp đƣợc ........................................................... 21
2.2. Tổng hợp và phân tích cấu trúc của metformine hydrochloride .............. 21
2.2.1. Quy trình tổng hợp metformin hydrochloride ....................................... 21
2.2.2. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ IR ............. 22
2.2.3. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ NMR ......... 22
2.2.4. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ MS ............ 22
2.3. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride ...................................... 23
2.3.1. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi Aceton .................. 23
2.3.2. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH .................. 23
2.3.3. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH .................... 23
2.4. Nghiên cứu hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp
(HPLC) ............................................................................................................ 24
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 26
3.1. Tổng hợp và phân tích cấu trúc metformine hydrochloride .................... 27
3.1.1. Tổng hợp metformin hydrochloride ...................................................... 27
3.1.2. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng pháp IR .... 27
3.1.3. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng
pháp NMR ...................................................................................................... 28
3.1.4. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng pháp MS . 30
3.2. Phân tích tìm kiếm các phƣơng pháp kết tinh metformine
hydrochloride để thu đƣợc độ sạch cao nhất ................................................... 31
3.3. Hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp hplc .............. 31
KẾT LUẬN .................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 35
PHỤ LỤC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
c
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
d
13C- NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear Magnetic
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Resonance)
1H- NMR
DMSO Dimethyl sulfoxide
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic Resonance)
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) IR
MS
Phổ khối lƣợng va chạm điện tử (Electron Impact-Mass Spectrometry)
Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon H, C
Phần triệu (parts per million) ppm
s singlet
dd Double doulet
Clorofrom CHCl3
EtOH Ethanol
MW Microwave
MeOH Methanol
OMe Methoxy
Sulfonylchlorua SOCl2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
e
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid. ............................................... 16
Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine. .......................................... 16
Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride ............................... 17
Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro .......... 18
Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi...... 18
Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin ........................................ 18
Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin .......................................... 18
Sơ đồ 3.1: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride ................................ 27
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
f
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của benzyl ancol ..................................................... 3
Hình 1.2: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của benzyl axetat ................................ 5
Hình 1.3: Phổ khối lƣợng của benzamit ............................................................ 7
Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS. ...................................................................... 9
Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang ........................................................ 10
Hình 1.6. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector ........................... 11
Hình 2.2: Biểu đồ đƣờng chuẩn. ..................................................................... 25
Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất metformin hydrochloride .............................. 27 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride ........................... 29 Hình 3.3: Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride .......................... 29
Hình 3.4: Phổ MS của metformin hydrochloride ............................................ 30
Hình 3.5: Biểu đồ đƣờng chuẩn định lƣợng .................................................... 32
Hình 3.6: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride .............................. 33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
g
MỞ ĐẦU
Metformin đƣợc mô tả năm 1957 nhƣ chất có hoạt tính hạ đƣờng
huyết và năm 1979 đƣợc đƣa ra thị trƣờng ở Pháp nhƣng đến tận 1994 mới
đƣợc FDA cho phép lƣu hành để chữa bệnh tiểu đƣờng Typ 2 ở Mỹ.
Metformin là một thuốc chống đái tháo đƣờng nhóm biguanid, có cơ chế tác
dụng khác với các thuốc chống đái tháo đƣờng nhóm sulfonylure.
Trƣớc đây, để xác định đƣợc cấu trúc phân tử một hợp chất hữu cơ đặc
biệt là cấu trúc và độ sạch của các hợp chất ứng dụng trong dƣợc phẩm không hề
đơn giản; có thể mất đến hàng năm hoặc vài năm. Để xây dựng đƣợc tiêu chuẩn
của hợp chất chính trong dƣợc phẩm là một công việc cực kì khó khăn và tốn
kém. Ngày nay, với các công cụ là các phƣơng pháp phân tích hóa lý hiện đại,
việc phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ đã trở thành đơn giản, có khi chỉ tốn
thời gian tính bằng giờ. Việc xác định hàm lƣợng và độ sạch của các loại thuốc
cũng nhanh hơn nhiều lần do có phƣơng pháp HPLC.
Vì vậy, việc phân tích cấu trúc, hàm lƣợng của thuốc điều trị tiểu
đƣờng typ II metformin hydrochloride bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại
là công việc rất quan trọng, là cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn của sản phẩm và
là tiêu chí để đánh giá chất lƣợng giá thành của thuốc.
Do đó đề tài nghiên cứu phân tích cấu trúc, hàm lƣợng của thuốc điều
trị tiểu đƣờng typ II metformin hydrochloride bằng các phƣơng pháp hóa lý
hiện đại là có ý nghĩa khoa học và thực tiễn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1
Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc
1.1.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Trong số các phƣơng pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho
nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất.
Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bƣớc sóng khoảng 10-4 đến 10-6 m. Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến.
Phần của vùng hồng ngoại đƣợc sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm trong giữa 2,5x10-4 và 16x10-6 m. Đại lƣợng đƣợc sử dụng nhiều trong phổ hồng ngoại là số sóng (cm-1), ƣu điểm của việc dùng số sóng là là chúng tỷ lệ
thuận với năng lƣợng [3].
Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng
ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao
động cao hơn. Có 2 lại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị
và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết,
dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết.
Đƣờng cong biểu diễn cƣờng độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng
ngoại đƣợc gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với
những dao động đặc trƣng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định, (Hình 1.1).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2
Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của benzyl ancol
Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo đƣợc đối chiếu với các dao động đặc
trƣng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân
tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của
các phân tử khác nhau thì khác nhau, tƣơng tự nhƣ sự khác nhau của các vân
ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thƣờng đƣợc làm dẫn
chứng cho hai hợp chất giống nhau [3].
Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu đƣợc
chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trƣng. Các pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thƣờng đƣợc quan tâm đặc biệt, vì
vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, nhƣ OH, NH, C=O, C≡N… nên đƣợc gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức
tạp hơn và thƣờng đƣợc dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định
nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 đƣợc gọi là vùng vân ngón tay [3].
1.1.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (CHTHN) là phƣơng pháp vật lý hiện đại
nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phƣơng pháp phổ biến đƣợc sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có
momen từ. Nếu đặt proton trong từ trƣờng không đổi thì moment từ của nó có
thể định hƣớng cùng chiều hay ngƣợc chiều với từ trƣờng. Đó là spin hạt
nhân có tính chất lƣợng tử với các số lƣợng tử +1/2 và -1/2 [2].
Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hƣởng khác nhau. Đặc trƣng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3
Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hƣởng của chất chuẩn TMS và của
hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hƣởng của máy phổ.
Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học đƣợc định nghĩa
một các tổng quát nhƣ sau:
Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hƣởng của chất chuẩn và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hƣởng của máy phổ.
Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hƣởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C
trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến
chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học
của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hƣởng ở trƣờng yếu
hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [1].
Dựa vào độ chuyển dịch hóa học ta biết đƣợc loại proton nào có mặt
trong chất đƣợc khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên mà đƣợc tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4
Hình 1.2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat
Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân
không tƣơng đƣơng sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân
phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách
tín hiệu cộng hƣởng thành nhiều hợp phần là do tƣơng tác của các hạt nhân có
từ tính ở cạnh nhau. Tƣơng tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J
phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tƣơng tác, số liên kết và bản chất các liên
kết ngăn giữa các tƣơng tác [1].
Hằng số tƣơng tác spin-spin J đƣợc xác định bằng khoảng cách giữa các
hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tƣơng tác spin-spin J ta có thể rút ra
kết luận về vị trí trƣơng đối của các hạt nhân có tƣơng tác với nhau [2].
1.1.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS)
Nguyên tắc chung của phƣơng pháp phổ khối lƣợng là phá vỡ phân tử
trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dƣơng có số khối z = m/e. Sau
đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận đƣợc phổ khối lƣợng. Dựa
vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất
nghiên cứu [3,4].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
5
Để phá vỡ phân tử ngƣời ta có nhiều phƣơng pháp: bắn phá bằng dòng
electron (EI), phƣơng pháp ion hóa hóa học (CI), phƣơng pháp bắn phá
nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng eclectron có năng lƣợng cao để bắn
phá phân tử là phƣơng pháp hay đƣợc sử dụng nhất. Khi bắn phá các phân tử
hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dƣơng
hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:
Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là các
ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-). Năng lƣợng bắn phá các phân tử
thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhƣng với năng lƣợng cao thì ion phân tử
có thể phá vỡ thành các mảnh ion dƣơng (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc
phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên ngƣời ta thƣờng thực hiện bắn phá các phân
tử ở mức năng lƣợng 70 eV [3].
Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phƣơng pháp bắn phá và
năng lƣợng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa.
Các ion ion dƣơng hình thành đều có khối lƣợng m và mang điện tích e,
tỉ số m/e đƣợc gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác
nhau ra khỏi nhau và xác định đƣợc xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị
biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cƣờng độ I) và số khối z thì
đồ thị này đƣợc gọi là phổ khối lƣợng (Hình 1.3).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
6
Hình 1.3: Phổ khối lượng của benzamit (C6H5CONH2).
Nhƣ vậy, khi phân tích phổ khối lƣợng ngƣời ta thu đƣợc khối lƣợng
phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định
đƣợc cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những
thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần
nghiên cứu khi kết hợp nhiều phƣơng pháp phổ với nhau.
1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng - sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.2.1. Khái niệm
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968
trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là
một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa
trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất
lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến bằng liên
kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử
dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định
lƣợng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp HPLC rất rộng , nhƣ phân tích các
hợp chất thuốc trừ sâu , thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong
lĩnh vực thực phẩm, dƣợc phẩm, môi trƣờng…
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
7
1.2.2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngƣời
Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).
Sắc ký phân bố (partition chromatography).
Sắc ký ion (ion chromatography).
Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).
ta chia HPLC thành 4 loại:
Riêng SKPB đƣợc chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tƣơng đối giữa
pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thƣờng - SKPT (normal phase
chromatography) và sắc ký pha đảo - SKPĐ (reversed phase chromatography).
Trong đó, sắc ký pha đảo đƣợc sử dụng nhiều hơn cả.
1.2.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ
Pha tĩnh đƣợc giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý →
đƣợc gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded
sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).
phase chromatography).
Trong quá trình sử dụng, ngƣời ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có
o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động
nhiều ƣu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:
nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm
o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên ngƣời ta
đối với hợp chất phân tích.
không thể ứng dụng phƣơng pháp rửa giải gradient dung môi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
8
Vì vậy, ngƣời ta thƣờng chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên
kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu
trúc dạng này.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu nhƣ không phân
cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl mạch dài nhƣ C8 (n-octyl), C18 (n-
octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn
nhƣ C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân
cực cao hơn nhóm alkyl. Ngƣời ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả
tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại đƣợc sử dụng nhiều nhất.
Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS.
1.2.4. Pha động trong sắc ký pha đảo
Hòa tan mẫu phân tích.
Phù hợp với đầu dò.
Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.
Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.
Tinh khiết dùng cho sắc ký.
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:
Trong sắc ký pha đảo , dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhƣng kinh nghiệm thực
tế cho thấy nƣớc, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
9
Trong đó nƣớc là một dung môi đƣợc cho vào các dung môi hữu cơ để giảm
khả năng rửa giải.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tƣơng tác giữa hợp chất cần phân
tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lƣỡng cực, tính acid hoặc
tính base của dung môi. Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có
tác động lớn lên khả năng phân tách của sắc ký.
Thông thƣờng pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nƣớc
hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan
đƣợc trong nƣớc.
Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký
(chế độ isocratic) hoặc đƣợc thay đổi theo một chƣơng trình đã định sẵn
(chƣơng trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.
1.2.5. Detector dad
Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy
hiện nay có thể lắp 1024 diot) đƣợc sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên
tấm silicon tinh khiết, kích thƣớc 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là
0,0015 - 0,050 mm.
Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
10
Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot. Hệ
thống đƣợc điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện
đƣợc tích - 5V. Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện
phóng điện. Sự nạp điện lại đƣợc tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo. Kết quả là dòng
a) đường quang chữ Z, b) đường quang bong bóng, c) đường quang phản xạ nhiều lần.
điện tỷ lệ với lƣợng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ.
Hình 1.6. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector
(cải tiến flowcell)
1.2.6. Detector ms
Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phƣơng pháp
nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của
chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong
điện trƣờng hoặc từ trƣờng nhất định. Tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z)
có ảnh hƣởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết đƣợc điện
tích của ion thì ta dễ dàng xác định đƣợc khối lƣợng của ion đó.
Do quá trình phân tích vớ i đầu dò MS đòi hỏi mƣ́ c đô ̣ ch ân không cao,
nhiê ̣t đô ̣ cao , các chất khảo sát phải ở trạng thái khí , vâ ̣n tốc dòng chảy nhỏ ;
trong khi hê ̣ thống LC la ̣i hoa ̣t đô ̣ng ở áp suất cao vớ i mô ̣t lƣơ ̣ng dung môi
tƣơng đối lớ n , nhiê ̣t đô ̣ tƣơng đối thấp , các chất phân tí ch ở thể lỏng . Điều
này gây rất nhiều khó khăn trong viê ̣c tìm cách giải quyết đƣơ ̣c sƣ̣ tƣơng thích
giƣ̃a hê ̣ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
11
Để khắc phu ̣c nhƣ̃ng khó khăn trên, cần phải có mô ̣t kỹ thuâ ̣t trung gian
gọi là giao diện. Rất nhiều kỹ thuâ ̣t giao diê ̣n (interface technology) nhƣ chù m
(CF-FAB),… đã đƣơ ̣c tia ha ̣t (FB), bắn phá nguyên tƣ̉ nhanh dòng liên tu ̣c
nghiên cƣ́ u và ƣ́ ng du ̣ng , nhƣng mãi cho đến cuối thâ ̣p nhiên 80, mớ i có sƣ̣
(Atmospheric đô ̣t phá t hâ ̣t sƣ̣ vớ i kỹ thuâ ̣t ion hóa ta ̣i áp suất khí quyển
Pressure Ionization - API).
Ƣu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí
quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử
dụng trƣớc đó cho LC/MS nhƣ bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục
(continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay nhƣ tia nhiệt
(thermospray - TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự
ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân
tích nhờ đó thu đƣợc khối phổ của ion phân tử . Ngoài ra, với kỹ thuật này,
ngƣời ta có thể điều khiển đƣợc quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những
ion con tùy theo yêu cầu phân tích.
Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:
* Ion hóa tia điện (electrospray ionization - ESI).
* Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical
ionization - APCI).
* Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Photoionization - APPI).
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI , đă ̣c biê ̣t là ESI đƣợc sử dụng
nhiều hơn cả.
***Các loại đầu dò khố i phổ
Có các loại tổng quát sau:
* Sự uấn cong nhờ từ trƣờng (Magnetic field deflection).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
12
- Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trƣờng (a single focussing
magnetic sector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp.
- Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốn
cong nhờ từ trƣờng và điện trƣờng, máy có độ phân giải cao.
* Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer)
- Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass filter).
- Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap).
* Máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay (time of flight mass
spectrometry).
* Máy khối phổ cộng hƣởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourier
(Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS).
Trong đó , Máy khối phổ tứ cực; máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời
gian bay; máy khối phổ cộng hƣởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi
Fourierđƣợc sử dụng nhiều hơn cả.
1.3. Khái quát về bệnh tiểu đƣờng
1.3.1. Phân loại bệnh tiểu đường
Bệnh tiểu đƣờng đƣợc chia thành hai loại nhƣ sau:
Tiểu đƣờng tuýp 1: Tiểu đƣờng typ 1 là một bệnh tự miễn trong đó hệ
thống miễn dịch của cơ thể phản ứng lại và phá huỷ tế bào sản xuất insulin
của đảo tuỵ. Sự thiếu hụt insulin dẫn đến tăng glucose máu và thƣờng dẫn
đến các biến chứng mãn tính.
Tiểu đƣờng typ 2: Bệnh tiểu đƣờng typ 2 đƣợc đặc trƣng bởi kháng
insulin và giảm tiết chế insulin dẫn đến mất khả năng duy trì mức glucose
máu bình thƣờng.
Các typ tăng đƣờng huyết đặc hiệu khác:
- Đái tháo đƣờng thai kỳ.
- Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào .
- Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
13
- Bệnh tuyến tụy ngoại tiết ....
1.3.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết
Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tiểu đƣờng
đƣợc chia thành 3 nhóm chính nhƣ sau:
- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin.
- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
- Các thuốc chống tăng đƣờng huyết sau bữa ăn.
a) Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin:
+ Insulin:
Insulin là hormon do tế bào của tuyến tuỵ tiết xuất, đóng vai trò chủ
yếu trong cơ chế điều hoà đƣờng huyết của cơ thể. Insulin là một trong những
hormon quan trọng của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng
lƣợng và phát triển cơ thể, mà còn là chất cần thiết cho sự sống. Tác dụng của
insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà ảnh hƣởng cuối cùng là trên chuyển
hoá glucid, lipid và protid.
+ Thuốc kích thích bài tiết insulin.
Các sulfonylurea.
Năm 1942, Janbon đã tình cờ phát hiện tác dụng hạ đƣờng huyết của dẫn
suất sulfonamid (1154RP) ở những bệnh nhân điều trị sốt thƣơng hàn. Từ
phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đƣờng huyết của các
sulfonylurea đã đƣợc tiến hành. Các nghiên cứu ngày càng làm sáng tỏ cơ chế
tác dụng của thuốc. Nhiều thuốc thuộc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao gồm
các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II
(Glyburide, Glypizide). Các thuốc này đang đƣợc sử dụng rộng rãi trên lâm
sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho ngƣời bệnh.
b) Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
Các biguanide:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
14
Năm 1926, Frank và cộng sự đã tổng hợp synthalin từ nhân guanidin.
Chính các synthalin là tiền thân của các biguanid sau này.
Công thức chung:
(4)
Các thuốc thuộc nhóm biguanide bao gồm: metformin, phenformin và
buformin. Hiện nay metformin là thuốc đang đƣợc sử dụng phổ biến nhất, vì
ít gây tăng axit lactic trong máu hơn. Các biguanide là thuốc chống tăng
đƣờng huyết, không gây hạ đƣờng huyết. Thuốc tác dụng chủ yếu ngoài tuỵ,
không có tác dụng kích thích tế bào tuyến tuỵ bài tiết insulin.
c) Thuốc chống tăng đƣờng huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym -
glucosidase).
Acarbose:
Acarbose là thuốc ức chế enzym glucosidase của tế bào niêm mạc ruột.
Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm quá trình hấp thụ
tinh bột, dextran và các disaccharide ở ruột non, tránh đƣợc tình trạng tăng
đƣờng huyết sau ăn. Thuốc có tác dụng tốt cho cả 2 typ bệnh.
1.3.3. Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường
Theo quan niệm của Đông y, bệnh thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba
triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều.
1.3.4. Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường
Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng chủ yếu là các thuốc có
nguồn gốc từ dƣợc liệu nhƣ sinh địa (Rehmania glutinosa Libosch,
Scrophulariaceae), cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, Asteraceae), mƣớp đắng
(Momordica charantia L.Cucurbitaceae), hoàng kỳ (Astragalus
membranaceus, Fabaceae), Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl,
Scrophulariaceae)...
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
15
1.4. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng metformine hydrochloride
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Cho đến nay, ở trong nƣớc có duy nhất một công trình nghiên cứu tổng
hợp metformin từ CaO, ure và dimethylamin. Quá trình tổng hợp đƣợc đƣợc
tiến hành qua 3 bƣớc [5]:
* Bƣớc 1: Tổng hợp calci cyanamide:
Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid.
Calci cyanamide đƣợc tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ
phản ứng. Theo tác giả Ngô Quốc Huy, quá trình phản ứng thực hiện theo
2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Nung CaO và ure ở nhiệt độ 180-300oC. - Giai đoạn 2: Tiếp tục nung hỗn hợp trên ở nhiệt độ 750oC.
*Bƣớc 2: Tổng hợp 1-cyanoguanidine:
Từ calci cyanamide đã đƣợc tổng hợp trong bƣớc 1, đem đun nóng trong
dung môi H2O nhận đƣợc 1-cyanoguanidin đƣợc mô tả trong sơ đồ sau:
1-cyanoguanidine.
Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine.
Điều kiện phản ứng thích hợp tổng hợp 1-cyanoguanidine là ở nhiệt độ 70 oC trong khoảng thời gian 30 phút. Phản ứng rất dễ bị polyme hóa nên khó
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
16
tinh chế, hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng. 1-
Cyanoguanidine đƣợc tổng hợp từ nguyên liệu rẻ nhƣ CaO và ure rất có ý
nghĩa, tuy nhiên quá trình phản ứng phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, đặc biệt cần phải thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 7500C nên khó kiểm soát và ít có ý
nghĩa thực tiễn.
* Bƣớc 3: Tổng hợp metformin hydrochloride:
1-Cyanoguanidine đƣợc phản ứng với dimethylamin hydrochloride ở
nhiệt độ cao nhận đƣợc metformin hydrochloride. Quá trình phản ứng đƣợc
mô tả trong sơ đồ sau:
metformin hydrochloride.
Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride
Mặc dù phƣơng pháp tổng hợp metformin từ những nguyên liệu rẻ tiền
nhƣ: CaO, ure và dimethylamin nhƣng do phản ứng cần tiến hành ở nhiệt độ
cao nên tạo ra sản phẩm polyme và khó tinh chế dẫn đến khó áp dụng ở quy
mô lớn để tổng hợp 1-cyanoguianidine (tên khác là dicyano diamide).
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Metformin đƣợc mô tả năm 1957 nhƣ chất có hoạt tính hạ đƣờng huyết
và năm 1979 đƣợc đƣa ra thị trƣờng ở Pháp nhƣng đến tận 1994 mới đƣợc
FDA cho phép lƣu hành để chữa bệnh tiểu đƣờng tuyp 2 ở Mỹ [19].
Metformin hydrochloride (N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide
hydrochloride) đƣợc tổng hợp bởi Shapiro và các cộng sự [31] bằng cách
cho dimethylamine hydrochloride phản ứng với dicyano diamide ở nhiệt độ 140oC (sơ đồ 1.4). Bằng con đƣờng này Shapiro và cộng sự đã tổng hợp đƣợc
hàng trăm dẫn chất biguanid. Các dẫn chất này đã đƣợc nghiên cứu hoạt tính
hạ đƣờng huyết.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
17
metformin hydrochloride.
Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro
Năm 2008, Anvar Shalmashi [32] đã đƣa ra phƣơng pháp mới để tổng
hợp metformin hydrochloride. Phản ứng điều chế metformin đƣợc thực hiện
trên bản mỏng điều chế và đƣợc đặt trong thiết bị microwave ở bƣớc sóng
540W trong 5 phút đạt hiệu suất 92%.
Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi
Gần đây đã có một số công trình nghiên cứu tạo các dẫn xuất của
metformin nhằm tăng hiệu quả sử dụng của nó trong điều trị bệnh tiểu đƣờng.
Kristiina và các cộng sự [22] đã tổng hợp đƣợc một số tiền chất của
metformin nhƣ mô tả trong sơ đồ 6 và sơ đồ 7. Các chất này có khả năng tan
tốt trong dầu và tăng khả năng hấp phụ trong ruột.
Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin
Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
18
Nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng của metformin, Rao và các cộng sự
đã nghiên cứu tổng hợp các phức chất của metformin với Cu và Ni. Các phức
này đã đƣợc nghiên cứu hoạt tính hạ đƣờng huyết. Kết quả nghiên cứu cho
thấy các chất này có hoạt tính cao hơn nhiều so với metformin [30].
Kết quả nghiên cứu của Bentefrit và các cộng sự về tổng hợp phức chất
của metformin với platin cho thấy phức chất tetrachloro(metformin)platin
(IV) có hoạt tính kìm hãm sự tăng sinh của dòng tế bào ung thƣ P388 tƣơng
tự nhƣ Cis-platin [15].
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của metformin cho thấy, hợp chất
metformin không chỉ có tác dụng chữa bệnh tiểu đƣờng tuyp 2 rất hiệu quả
mà cũng có khả năng chống ung thƣ tuyến tụy, ung thƣ vú
[12,20,21,26,27,33,34].
Từ các tƣ liệu đã có có thể thấy rằng con đƣờng tổng hợp metformin từ
dicyano diamide là khả thi. Tổng hợp theo con đƣờng này chỉ có một bƣớc
phản ứng không cần những hóa chất đắt tiền nên rất khả thi và có thể thực
hiện đƣợc ở quy mô pilot.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
19
Chƣơng 2
THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất và dung môi
Các hoá chất dùng cho tổng hợp hữu cơ và dung môi đƣợc mua của hãng
Merck, hãng Sigma Aldrich và hãng Fluka và thuộc loại phân tích dùng cho
phân tích.
Bột silica gel cho sắc ký cột 100 - 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký
silica gel đế nhôm Art. 5554 DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck).
2.1.2. Thiết bị xác định và phân tích cấu trúc
Để xác định và phân tích cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp đƣợc, chúng
tôi tiến hành các phƣơng pháp sau:
- Xác định nhiệt độ nóng chảy.
Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp đƣợc đo trên máy đo trên máy
Gallenkeamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ - Viện hóa học
- Viện Hàn Lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam.
- Phổ hồng ngoại (IR).
Phổ IR của các chất nghiên cứu đƣợc ghi trên máy Impact 410 - Nicolet,
tại phòng thí nghiệm Phổ hồng ngoại Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa
học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn.
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR). Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên
cứu đƣợc đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500MHz với dung môi DMSO
và TMS là chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân - Viện Hóa học
- Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
- Phổ khối lƣợng (MS).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
20
Phổ khối của các chất nghiên cứu đƣợc ghi trên LC - MSD - Trap - SL
tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ
Việt Nam
2.1.3. Phân tích xác định cấu trúc, định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh
khiết của các sản phẩm tổng hợp được
Cấu trúc của các sản phẩm phản ứng đƣợc xác định nhờ các phƣơng pháp phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-
NMR,phổ hồng ngoại ( IR).
Các sản phẩm phản ứng đƣợc kiểm tra độ sạch bằng các phƣơng pháp
sắc kí lớp mỏng, sắc khí lỏng ghép nối khối phổ (LC/MS).
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) đƣợc sử dụng để định tính chất đầu và sản
phẩm. Thông thƣờng chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc
và sự phát quang khác nhau. Dùng sắc kí lớp mỏng để biết đƣợc phản ứng đã
xảy ra hay không xảy ra, phản ứng đã kết thúc hay chƣa kết thúc là dựa vào
các vết trên bản mỏng, cùng các giá trị Rf tƣơng ứng. Giá trị Rf của các chất
phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động. Dựa trên
tính chất đó, chúng ta có thể tìm đƣợc dung môi hay hỗn hợp dung môi để
tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm đƣợc hệ dung môi cần thiết
để tinh chế các chất.
2.2. Tổng hợp và phân tích cấu trúc của metformine hydrochloride
2.2.1. Quy trình tổng hợp metformin hydrochloride
(17)
Hỗn hợp của dimethylamine hydrochloride (50g; 0,61mol) và dicyano diamide (51,5g; 0,61mol) đƣợc đun trực tiếp ở nhiệt độ 140oC trong 6h nhận
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
21
đƣợc sản phẩm thô dạng đông đặc màu trắng.Hỗn hợp phản ứng đƣợc làm
lạnh bằng nƣớc đá đƣa về nhiệt độ phòng. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế trong
dung môi thích hợp thu đƣợc sản phẩm sạch metformin hydrochloride. Sản phẩm là tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 225-2260C.
2.2.2. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ IR
Cân 2 mg chất metformin và 100 mg KBr vào cối mã não, trộn đều và
đƣợc nghiền mịn thành hỗn hợp đồng nhất bằng chày của cối mã não. Hỗn
hợp này đƣợc đƣa vào thiết bị ép viên thủy lực 50 tấn của hãng HP, sau đó
mẫu đƣợc đo trên máy Impact 410 - Nicolet, tại phòng thí nghiệm Phổ hồng
ngoại Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đo ở
dạng ép viên với KBr rắn.
IR (KBr, cm-1): 3378; 3179; 2950; 1631; 1584; 1472; 1414.
2.2.3. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ NMR
25 mg chất metformin ở trên đƣợc cho vào trong ống NMR loại (tubes
NMR của Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml DMSO và lắc
đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất. Mẫu đƣợc đo trên
máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm
Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ
Việt Nam.
1H-NMR (500 MHz, DMSO- d6), δ (ppm): 2,91 (6H, s, 2x CH3). 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 160,0 (C-3); 158,3 (C-2);
37,4 (2CH3).
2.2.4. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ MS
1 mg chất metformin hydrochloride ở trên đƣợc pha trong 1 ml dung
dịch DMSO, lắc đều để tạo thể thống nhất. Sau đó mẫu đƣợc đƣa vào máy
trên LC - MSD - Trap - SL tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm
Khoa học & Công nghệ Việt Nam để ghi phổ MS.
EI-MS : m/z: [M-HCl]+ = 129.
CTPT: C4H11N5.HCl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
22
2.3. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride
2.3.1. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi Aceton
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong aceton (500ml),
hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu nhƣng khó tan. Dung dịch đƣợc lọc nóng để loại bỏ
các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ‚ (-20oC)
trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng
kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc, rửa 3 lần bằng aceton
lạnh, hút khô thu đƣợc sản phẩm metformin hydrochloride 12g. Dịch lọc
aceton tiếp tục đƣợc cô bớt dung môi và kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui
trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 3g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là
15g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 30%.
2.3.2. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong MeOH (500ml),
hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu đến tan, sản phẩm tan hoàn toàn trong dung môi
MeOH. Dung dịch đƣợc lọc nóng để lọai bỏ các tạp chất, dịch lọc đƣợc làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ‚ (-20oC)
trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng
kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc bằng phễu lọc thủy tinh,
rửa 3 lần bằng MeOH lạnh, hút khô sản phẩm thu đƣợc sản phẩm metformin
hydrochloride 33g. Dịch lọc MeOH đƣợc cô bớt dung môi tiếp tục đƣợc kết
tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 8g sản phẩm. Tổng
hai lần kết tinh thu đƣợc là 41g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 82%.
2.3.3. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH
Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong EtOH (500ml),
hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu cho đến tan. Dung dịch đƣợc lọc nóng để lọai bỏ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ‚ (-20oC) 23
trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng
kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc, rửa 3 lần bằng EtOH
lạnh, hút khô thu đƣợc sản phẩm metformin hydrochloride 18g. Dịch lọc
EtOH tiếp tục đƣợc kết tinh lại sản phẩm lần thứ 2 lặp lại theo qui trình nhƣ
trên thu thêm đƣợc 6g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là 24g sản
phẩm với hiệu suất kết tinh là 48%.
Nhƣ vậy, dung môi MeOH phù hợp để kết tinh sản phẩm metformin
hydrocholoride. Sản phẩm metformin hydrochloride đƣợc kết tinh lại trong
MeOH 3 lần nhận đƣợc sản phẩm có độ sạch 99,7% ( đƣợc đánh giá bằng
phƣơng pháp HPLC).
2.4. Nghiên cứu hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp
(HPLC)
Xây dựng đƣờng chuẩn metformine hydrochloride: Cân 2mg
metformin hydrochloride chuẩn đƣợc pha loãng trong MeOH với các nồng độ
nhƣ sau: 2mg/ml, 0.4mg/ml, 0.2mg/ml, 0.1mg/ml.
Điều kiện và thiết bị phân tích: Sử dụng hệ thiết bị HPLC Agilent
1100, Detector DAD, bƣớc sóng 254nm. Pha động H2O:MeOH= 35:65. Hệ
Pha động đƣợc cài đặt nhƣ sau:
Time(min) %B (MeOH) Flow (ml/min)
0,00 0,01 65
4,00 0,01 65
5,00 0,3 65
30 0,3 65
Xây dựng đƣờng chuẩn: Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên phần
mềm excel.
Nồng Độ(mg/ml) Diện tích Pic
2 5393,66
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
24
0,4 1027,07
0,2 515,55
0,1 19,.97
Hình 2.2: Biểu đồ đường chuẩn.
Phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y= 2767,7x-129,11 với hệ số tƣơng quan R2 = 0,9985
Trong đó: x là Nồng độ metformin hydrochloride (mg/ml); y là diện tích
pic metformin hydrochloride .
Xác định nồng độ Metformine hydrochloride: Cân 0.8mg chất cần
phân tích, hòa tan trong 1ml MeOH. Kết quả đo diện tích pic (y)= 2078,7.
Thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta đƣợc Y= 0.79mg/ml.
Nhƣ vậy, mẫu phân tích chứa 99,7% metformine hydrochloride
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
25
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ là một trong số các nhiệm vụ
quan trọng của Hóa học vì chỉ khi biết chính xác cấu trúc, chúng ta mới có
câu trả lời chính xác cho việc định tính, định lƣợng và phân tích chúng trong
các mẫu nghiên cứu thực cũng nhƣ trong đời sống và công nghệ. Để phân
tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ có thể sử dụng các phƣơng pháp phổ
nhƣ phổ hồng ngoại, phổ tƣ̉ ngoa ̣i khả kiến, phổ cô ̣ng hƣở ng tƣ̀ ha ̣t nhân , phổ khối lƣơ ̣ng. Mỗi phƣơng pháp cho phép xác đi ̣nh mô ̣t số thông tin khác nhau của cấu trúc phân tử và h ỗ trợ lẫn nhau trong việc xác định cấu trúc các hợp
chất hữu cơ.
Metformin đƣợc mô tả năm 1957 nhƣ chất có hoạt tính hạ đƣờng huyết
và năm 1979 đƣợc đƣa ra thị trƣờng ở Pháp nhƣng đến tận 1994 mới đƣợc
FDA cho phép lƣu hành để chữa bệnh tiểu đƣờng Typ 2 ở Mỹ. Metformin là
một thuốc chống đái tháo đƣờng nhóm biguanid, có cơ chế tác dụng khác với
các thuốc chống đái tháo đƣờng nhóm sulfonylurê. Metformin không kích
thích giải phóng insulin từ các tế bào beta tuyến tụy. Thuốc không có tác dụng
hạ đƣờng huyết ở ngƣời không bị đái tháo đƣờng. Ngoài tác dụng chống đái
tháo đƣờng, metformin phần nào có ảnh hƣởng tốt trên chuyển hóa
lipoprotein, thƣờng bị rối loạn ở ngƣời bệnh đái tháo đƣờng không phụ thuộc
insulin. Trái với các sulfonylure, thể trọng của ngƣời đƣợc điều trị bằng
metformin có xu hƣớng ổn định hoặc có thể hơi giảm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
26
Vì thế việc nghiên cứu tổng hợp, phân tích hàm lƣợng và hàm lƣợng
của metformin hydrochloride rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Tổng hợp và phân tích cấu trúc metformine hydrochloride
3.1.1. Tổng hợp metformin hydrochloride
Tổng hợp metformine hydrochloride theo phƣơng pháp của Shapiro [3]
(sơ đồ 3.1) trong điều kiện không dung môi. Từ 1 mol dicyano diamide và 1
mol dimethyl amine hydrochloride trộn lẫn với nhau đƣợc đun ở nhiệt độ: 140oC trong 6h. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc kết tinh trong dung môi
metanol nhận đƣợc metformin hydrochloride với hiệu suất phản ứng là 82%.
Sơ đồ 3.1: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride
3.1.2. Phân tích cấ u trúc củ a metformin hydrochloride bằ ng
phư ơ ng pháp IR
Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất metformin hydrochloride
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
27
Phổ IR của hợp chất metformin hydrochlorid đƣợc đo trên Impact 410 -
Nicolet, tại phòng thí nghiệm Phổ hồng ngoại Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm
Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn.
Phổ IR của metformin thể hiện đầy đủ các tín hiệu hấp thụ của tất cả các
nhóm chức hóa học có mặt trong khung cấu trúc. Giá trị hấp thụ tại 3378 và
3179 cm-1 là tín hiệu đặc trƣng của dao động hóa trị nhóm NH2 và NH. Tín hiệu dao động hóa trị tại 2950 cm-1 là đặc trƣng của liên kết C-H bão hòa. Tín hiệu
hấp thụ tại 1631 cm -1 là dao động hóa trị của C=N, tín hiệu hấp thụ tại 1584 là
dao động biến dạng của liên kết C-N. Giá trị hấp thụ cƣờng độ trung bình tại
1472 và 1414 là đặc trƣng dao động biến dạng của liên kết C-H bão hòa.
3.1.3. Phân tích cấ u trúc củ a metformin hydrochloride bằ ng
phư ơ ng pháp NMR
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) là một trong số các phƣơng pháp
phân tích hóa lý hiện đại dùng để phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ
và phức chất. Phổ NMR cho ta biết nhiều thông tin về cấu trúc nhƣ số lƣợng
proton, cacbon...tỷ lệ các nhóm chứa proton hoặc cacbon và các mối quan hệ
không gian của nhóm chức, nhóm nguyên tố chứa hydro và cacbon trong cấu
trúc phân tử của các hợp chất hữu cơ. Do đó luận văn này sử dụng phƣơng
pháp NMR để là phƣơng pháp chính để phân tích cấu trúc của metformin
hydrochloride.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
28
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất metformin hydrochloride
xuất hiện các tín hiệu đặc trƣng cho độ chuyển dịch hóa học của các proton có
mặt trong phân tử. Tín hiệu ở δH 2,91 ppm (6H, s,) đặc trƣng cho proton ở 2
nhóm CH3.
Hình 3.3: Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
29
Trên phổ 13C-NMR xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hƣởng của 4
nguyên tử cacbon bao gồm 2 nhóm metyl ( CH3) tại δC (ppm) 37,4 ( C-1 và
C-1’ ); 2 nhóm amin C-NH2 tại δC (ppm) 160,0 (C-3), và 158,3 (C-2).
3.1.4. Phân tích cấ u trúc củ a metformin hydrochloride bằ ng
phư ơ ng pháp MS
Hình 3.4: Phổ MS của metformin hydrochloride
Phổ khối EI-MS cho pic ion phân tử M+ = 129,3 phù hợp với công thức
phân tử [C4H11N5]. Do metformin hydrochloride tồn tại ở dạng muối
C4H11N5.HCl nên khi đo MS, xuất hiện mảnh ion phân tử M+ tƣơng ứng với
gốc metformin, mà không xuất hiện pic ion giả phân tử [M-H]+ hoặc ion phân
tử xuất hiện với metformin hydrochloride.
Nhƣ vậy, bằng các phƣơng pháp phân tích cấu trúc: phổ IR, phổ 1H-
NMR, 13C-NMR và phổ MS chúng tôi đã chứng minh đƣợc cấu trúc của
metformin hydrochloride.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
30
3.2. Phân tích tìm kiếm các phƣơng pháp kết tinh metformine
hydrochloride để thu đƣợc độ sạch cao nhất
Metformine hydrochloride đƣợc làm sạch bằng cách kết tinh trong các
dung môi khác nhau: aceton, metanol, etanol.
Sản phẩm thô metformine hydrochloride (50g) lần lƣợt đƣợc hoàn tan
trong các dung môi nóng aceton, MeOH và EtOH. Dung dịch đƣợc lọc nóng
để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc
đƣợc kết tinh trong tủ lạnh 24h, lọc bỏ dung môi, rửa tinh thể, hút khô nhận
đƣợc tinh thể metformine hydrochloride màu trắng với hiệu suất kết tinh trong
aceton là 30%, trong MeOH là 82% và trong EtOH là 48%. Nhƣ vậy,
metformine hydrochloride đƣợc kết tinh trong dung môi MeOH cho hiệu suất
kết tinh đạt 82% và độ tinh khiết 99,7 %.
3.3. Hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp hplc
Định lƣợng metformin hydrochloride bằng HPLC sử dụng hệ thiết bị
HPLC Agilent 1100, Detector DAD, bƣớc sóng 254nm. Pha động H2O:
MeOH= 35:65. Hệ Pha động đƣợc cài đặt nhƣ sau:
Time(min) %B (MeOH) Flow (ml/min)
0,00 0,01 65
4,00 0,01 65
5,00 0,3 65
30 0,3 65
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
31
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên phần mềm excel nhƣ chỉ ra ở
hình sau đây.
Hình 3.5: Biểu đồ đường chuẩn định lượng
Phƣơng trình đƣờng chuẩn:
Y= 2767,7x-129,11 với hệ số tƣơng quan R2 = 0,9985.
Trong đó: x là Nồng độ metformin hydrochloride (mg/ml); y là diện tích
pic metformin hydrochloride(mg/ml).
Hệ số tƣơng quan trong phƣơng trình đƣờng chuẩn là R2 = 0,9985 cho
thấy sự tuyến tỉnh ở trong khoảng nồng độ metformin hydrochloride khảo sát rất tốt (R2 >0,99). Nhƣ vậy, hoàn toàn có thể sử dụng phƣơng trình đƣờng
chuẩn này để xác định nồng độ của metformin hydrochloride trong khoảng từ
0,1 đến 2,0 mg/ml.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
32
Hình 3.6: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride
Xác định nồng độ Metformin: Cân 0,8mg chất cần phân tích, hòa tan
trong 1ml MeOH. Kết quả đo diện tích pic (X)= 2078,7(mg/ml).Thay vào
phƣơng trình đƣờng chuẩn ta đƣợc Y= 0,79mg/ml. Nhƣ vậy, mẫu phân tích
chứa 99,7 % metformin hydrochloride.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
33
KẾT LUẬN
1. Đã sử dụng các phƣơng pháp phân tích hóa lý hiện đại hỗ trợ phân
tích cấu trúc của metfomine hydrochloride tổng hợp đƣợc từ ngƣng tụ trực
tiếp dicyano diamide và dimetyl amine hydrochloride, kết quả cho thấy khi ngƣng tụ trực tiếp dicyano diamide và dimethyl amine ở nhiệt độ 1400C.
2. Đã phân tích tìm kiếm đƣợc điều kiện kết tinh metformine
hydrochloride trong các dung môi aceton, metanol, etanol. Kết quả cho thấy
kết tinh trong metanol cho hiệu suất cao nhất 82%, độ sạch đạt 99,7%.
3. Đã phân tích và định lƣợng đƣợc hàm lƣợng của metformine
hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC, kết quả cho thấy mẫu phân tích
chứa 99,7% metformin hydrochloride.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tiếng Việt:
1. Tạ Văn Bình, Hoàng Kim Ƣớc và cộng sự (2004), "Dịch tễ học bệnh đái
tháo đường, các yếu tố nguy cơ và các vấn đề liên quan đến quản lý bệnh
đái tháo đường tại khu vực nội thành 4 thành phố lớn năm 2001", Một số
công trình nghiên cứu khoa học tiêu biểu của các dự án quốc gia thực hiện
tại bệnh viện nội tiết 1969-2003, NXB Y Học,tr. 173-199.
2. Tạ Văn Bình, Hoàng Kim Ƣớc và cộng sự (2004), "Kết quả điều tra đái
tháo đường và rối loạn dung nạp đường huyết ở đối tượng có nguy cơ cao
tại Phú Thọ, Sơn La, Thanh Hoá và Nam Định năm 2003", Một số công
trình nghiên cứu khoa học tiêu biểu của các dự án quốc gia thực hiện tại
bệnh viện nội tiết 1969-2003, NXB Y Học,tr. 353-373.
3. Tạ Văn Bình, Stephen Colargiuri và cộng sự (2004), Phòng và quản lý
bệnh đái tháo đường tại Việt Nam - Phần 2, NXB Y Học, tr. 8-9, 12-13,17.
4. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, Nhà
xuất bản Y học, Hà Nội.
5. Trƣơng Phƣơng và Ngô Quốc Huy (2006), “Tạp chí Dƣợc học’’, tr. 264,
11-13.
6. Thái Hồng Quang (1997), “Bệnh đái tháo đường, Bệnh nội tiết’’, NXB Y
Học, Hà Nội, tr. 257-358.
7. Lê Đình Sáng (2010), Y học cổ truyên, NXB Y Học,Hà Nội.
8. Nguyễn Đình Triệu (2006), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa
học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
9. Mai Thế Trạch và cộng sự (1994), "Dịch tễ học và điều tra cơ bản về bệnh
tiểu đƣờng ở nội thành thành phố Hồ Chí Minh", Tạp chí Y Học, chuyên đề
nội tiết học, Trường Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, tr. 25-28.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
35
10. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng trong hoá
học, NXB Khoa học kỹ thuật,Hà Nội.
11. Nguyễn Minh Thảo (2001), Tổng hợp hữu cơ, NXB Đại học Quốc Gia Hà
Nội, Hà Nội.
II. Tiếng Anh
12. Alimova IN, Liu B, Fan Z, et al (2009), “Metformin inhibits breast cancer
cell growth, colony formation and induces cell cycle arrest in vitro’’, Cell
Cycle 26:8 .
13. Ashcroft SJH, Niki I, Kenna S, Weng L, Skeer L, Coles B, Ashcroft FM
(1993), “The -cell sulfonylurea receptor’’, Adv Exp Med Biol. ; 334: 47-61.
14. Barelli, Giulio; De, Regis Massimo (1997), “A glibenclamide-metformin
combination for the treatment of diabetes mellitus type II. PCT Int. Appl’’,
24 pp. CODEN: PIXXD2 WO 9717975 A1 19970522.
15. Bentefrit, F. và các cộng sự (1997), “J. Inorg. Biochem’’, 68, 53-59.
16. Dipalma J. R (1971), “Diabetes mellitus, Drill's pharmacology in
medicine’’, McGraw-Hill, 1492-1525.
17. Gaines KL, Hamilton S, Boyd AE III.(1988), ‘‘Characterization of the
sulfonylurea receptor on beta cell membranes’’, J Biol Chem; 263: 2589-92.
18. Hokfelt B, Jonsson A (1988), “Hypoglycemic activity in relation to
chemical structure of potential oral antidiabetic substances’’, I. 1-
Sulfonyl-3-alkylureas. J
19. http://www.fda.gov/bbs/topics/ANSWERS/ANS00627.html "FDA
Approves New Diabetes Drug "
20. Hadad SM, Appleyard V, Thompson AM (2009) “Therapeutic
metformin/AMPK activation promotes the angiogenic phenotype in the
ERalpha negative MDA-MB-435 breast cancer model’’, Breast Cancer
Res Treat 114:391.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
36
21. Hadad SM, Fleming S, Thompson AM ,Targeting AMPK (2008), “A new
therapeutic opportunity in breast cancer ’’, Crit Rev Oncol Hematol 67:1-7.
22. Kristiina, M. và các cộng sự (2009), “J. Med. Chem’’, 52, 4142-4118.
23. Lara Ochoa, Jose Manuel Francisco; De la Torre Garcia, Juan Antonio;
Franco Andrade, Fidencio ( publication date 25-01-2001), “Improved
process for the preparation of benzenesulfonylureas used as second-
generation oral hypoglycemic agents’’, PCT patent W 0015354 (A2).
24. Meyer M, Chudziak F, Schwanstecher C, Schwanstecher M, Panten U
(1999), ‘‘Structural requirements of sulphonylureas and analogues for in-
teraction with sulphonylurea receptor subtypes’’, Br J Pharmacol ;
128:27-34.
25. Niki I, Welsh M, Berggren PO, Hubbard P, Ashcroft SJ.(1991),
‘‘Characterization of the solubilized glibenclamide receptor in a hamster
pancreatic beta-cell line’’, HIT T15. Biochem J ;277:619-24.
26. Pamela, A. và các cộng sự (2009) , “Metformin in breast cancer: time of
action’’, J. Clin. Oncology, 27, 1-3.
27. Phoenix KN, Vumbaca F, Claffey KP (2009), “Therapeutic
metformin/AMPK activation promotes the angiogenic phenotype in the
ERalpha negative MDA-MB-435 breast cancer model ’’, Breast Cancer
Res Treat 113:101-111.
28. Proks P, Reimann F, Green N, Gribble F, Ashcroft F (2002), Sulfonylurea
stimulation of insulin secretion. Diabetes, ; 51(suppl 3):368-76.
29. Panten U, Schwanstecher M, Schwanstecher C (1992), “Pancreatic and
extrapancreatic sulfonylurea receptors’’, Horm Metab Res; 24:549- 54.
30. Rao, N. K. và các cộng sự (2007) , “JASA’’, 3, 43-45.
31. Shapiro, S. L.; Parrino, V. A.; Freedman (1959) , “L. J. Am. Chem. Soc’’,
81, 3728.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
37
32. Shalmashi A (2008), “New Route to Metformin Hydrochloride (N, N-
dimethylimidodicarbonimidic diamide hydrochloride) Synthesis’’,
Molbank , M564.
33. Stambolic V, Woodgett JR, Fantus IG, et al (2009) , “Utility of metformin
in breast cancer treatment, is neoangiogenesis a risk factor’’, Breast
Cancer Res Treat 114:387-389.
34. Zakikhani, M. và các cộng sự (2006), “Metformin is an AMP kinase-
dependent growth inhibitor of breast cancer cells’’, Cancer Res, 66,
10269-10273.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
38
PHỤ LỤC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1
1
Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của metformin hydrochloride
2
3
4
Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của metformin hydrochloride
5
6
Phụ lục 3: Phổ IR của metformin hydrochloride
7
Phụ lục 4: Phổ MS của metformin hydrochloride
8
Phụ lục 5: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride (mẫu phân tích)
9
Phụ lục 6: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride (đƣờng chuẩn)
10
11
12
13
14
15
16
