ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NÔNG THỊ HOA
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI HOÀNG TINH TRẮNG (Disporopsis longifolia Craib)
LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM NGHIỆP
Chuyên ngành: Lâm học
Cao Bằng - 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NÔNG THỊ HOA
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI HOÀNG
TINH TRẮNG (Disporopsis longifolia Craib)
Chuyên ngành: Lâm học
Mã số: 60.62.02.01
LUẬN VĂN THẠC SĨ LÂM NGHIỆP
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Thị Thu Hà
Cao Bằng - 2020
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của bản thân tôi.
Các số liệu và kết quả nghiên là quá trình nghiên cứu hoàn toàn trung thực, chưa công
bố trên các tài liệu, nếu có gì sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Cao Bằng, ngày tháng năm
Người viết cam đoan
Nông Thị Hoa
ii
LỜI CẢM ƠN
Luận văn “Nghiên cứu nhân giống in vitro loài Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib)” được hoàn thành theo chương trình đào tạo cao học Lâm nghiệp, chuyên ngành Lâm học, khóa học K26 của Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên.
Trong quá trình học tập cũng như hoàn thành luận văn, tác giả đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học và các thầy, cô giáo Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên. Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Trong quá trình nghiên cứu, đề tài có kế thừa 1 phần kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh thái học, sinh học của loài Hoàng tinh trắng trong đề tài “Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) có giá trị kinh tế cao tại tỉnh Hà Giang” do Thạc sĩ Hoàng Thanh Phúc làm chủ nhiệm đề tài, thời gian (2018 – 2020) được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm Nghiệp và tỉnh Hà Giang. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Thị Thu Hà đại diện cơ quan chủ trì thực hiện đề tài và cũng là người hướng dân Tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, đã giúp cho tôi được tiếp cận và làm việc trong môi trường nghiên cứu với cơ sở vật chất khang trang, đầy đủ cùng với các đồng nghiệp, cộng sự dày dặn kinh nghiệm để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn chủ nhiệm đề tài Th.S Hoàng Thanh Phúc đã đồng ý và giúp tôi được tham gia nghiên cứu cùng nhóm nghiên cứu của đề tài.
Vì điều kiện thời gian nghiên cứu và trình độ chuyên môn của bản thân còn có những hạn chế nhất định, nên luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến góp ý quý báu của các nhà khoa học cũng như các bạn đồng nghiệp để bài luận văn này được hoàn chỉnh hơn.
Cuối cùng tác tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè và người thân trong gia đình đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Tác giả
Nông Thị Hoa
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................... vii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ .............................................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................................ i
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................... 2
3. Ý nghĩa của đề tài ........................................................................................................ 2
3.1. Ý nghĩa khoa học ...................................................................................................... 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...................................................................................................... 2
Chương 1 ......................................................................................................................... 3
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 3
1.1. Một số nghiên cứu về loài Hoàng tinh trắng trên thế giới ........................................ 3
1.2. Một số nghiên cứu về loài Hoàng tinh trắng ở Việt Nam ........................................ 3
1.3. Giới thiệu về cây Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) ......................... 4
1.3.1. Phân loại học ......................................................................................................... 4
1.3.2. Đặc điểm thực vật học ........................................................................................... 4
1.3.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố .............................................................................. 5
1.3.4. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý .............................................................. 5
1.3.5. Giá trị của cây Hoàng tinh trắng............................................................................ 5
1.4. Kế thừa kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh thái, sinh học của loài Hoàng
tinh trắng từ đề tài “Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen Hoàng tinh trắng
(Disporopsis longifolia Craib) có giá trị kinh tế cao tại tỉnh Hà Giang” .......................... 6
iv
1.5. Tổng quan về nhân giống in vitro............................................................................. 8
1.5.1. Khái quát nuôi cấy mô tế bào ................................................................................ 8
1.5.2. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào ............................................................... 9
1.5.3. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào ................................................................... 9
1.5.4. Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................................................... 10
1.5.5. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................................... 11
1.5.6. Các giai đoạn của nhân giống vô tính ................................................................. 13
Chương 2 ....................................................................................................................... 16
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 16
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................... 16
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .......................................................................... 16
2.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 16
2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 16
2.4.1. Phương pháp kế thừa tài liệu ............................................................................... 16
2.4.2. Hóa chất, thiết bị chuẩn bị cho nuôi cấy in vitro Hoàng tinh trắng .................... 17
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng bằng HgCl2 để tạo
vật liệu vô trùng phục vụ việc tái sinh in vitro ................................................................ 18
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh
chồi Hoàng tinh trắng ...................................................................................................... 19
2.4.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, BAP kết hợp với Kinetin đến khả
nhân nhanh chồi Hoàng tinh trắng ................................................................................... 19
2.4.6. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA, IBA đến khả năng ra rễ
Hoàng tinh trắng .............................................................................................................. 20
2.4.7. Điều kiện thí nghiệm ........................................................................................... 21
2.4.8. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu .............................................................. 21
Chương 3 ....................................................................................................................... 22
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 22
v
3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng bằng HgCl2 để tạo vật liệu
vô trùng phục vụ việc tái sinh in vitro ........................................................................... 22
3.2. Sự khác nhau của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi Hoàng tinh trắng ...... 24
3.3. Kết quả nghiên cứu sự khác nhau của nồng độ chất BAP, BAP kết hợp với Kinetin
đến khả năng nhân nhanh chồi Hoàng tinh trắng .......................................................... 27
3.3.1. Kết quả nghiên cứu sự khác nhau của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh
chồi chồi Hoàng tinh trắng .............................................................................................. 27
3.3.2. Sự khác nhau của nồng độ BAP kết hợp với Kinein đến khả năng nhân nhanh
chồi Hoàng tinh trắng ...................................................................................................... 29
3.4. Sự khác nhau của nồng độ IAA, NAA, IBA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng30
3.5. Đề xuất một số giải pháp bảo tồn, phát triển loài Hoàng tinh trắng từ kết quả
nghiên cứu ..................................................................................................................... 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 39
1. Kết luận ...................................................................................................................... 39
2. Kiến nghị ................................................................................................................... 39
PHỤ LỤC ...................................................................... Error! Bookmark not defined.
vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BAP : 6-Benzylaminopurine
cs : Cộng sự
: Gibberellic Acid GA3
IAA : Indole-3-acetic acid
IBA : Indole butyric acid
NAA : α-naphthaleneaceticd.
vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS ........................................................ 17
Bảng 2.2. Nghiên cứu Ảnh hưởng của IAA, NAA, IBA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh
trắng ............................................................................................................................... 20
Bảng 3.1. Sự khác nhau của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1 % đến khả năng tạo
vật liệu vô trùng ............................................................................................................. 22
Bảng 3.2. Sự khác nhau của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi Hoàng tinh trắng25
Bảng 3.3. Sự khác nhau của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Hoàng tinh
trắng ............................................................................................................................... 27
Bảng 3.5. Sự khác nhau của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng ......... 31
Bảng 3.6. Sự khác nhau của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng ........ 33
Bảng 3.7. Sự khác nhau của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng .......... 34
viii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Sự khác nhau giữa thời gian khử trùng đến khả năng tạo vật liệu ............ 23
vô trùng .......................................................................................................................... 23
Biểu đồ 3.2. Sự khác nhau của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi Hoàng tinh
trắng .............................................................................................................................. 26
Biểu đồ 3.3. Biểu đồ so sánh kết quả ra rễ giữa 3 chất điều hòa sinh trưởng IAA, NAA,
IBA ............................................................................................................................... 36
i
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình ảnh Lá, thân, hoa, quả cây Hoàng tinh trắng .......................................... 8
Hình 3.1. Hình ảnh mẫu Hoàng tinh trắng sống không bị nhiễm sau khi khử trùng bằng
HgCl2 0,1 % trong 5 phút .............................................................................................. 24
Hình 3.2. Hình ảnh tái sinh chồi của mẫu Hoàng tinh trắng khi môi trường có bổ sung
GA3 1,0 mg/l ................................................................................................................. 27
Hình 3.5. Mẫu Hoàng tinh trắng cấy trong môi trường có bổ sung IBA 1,0mg/l sau 30
ngày theo dõi ................................................................................................................. 35
Hình 3.6. Hình ảnh chồi Hoàng tinh trắng ra rễ khi bổ sung các chất kích thích ra rễ
khác nhau ....................................................................................................................... 36
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) là một loài dược liệu quý được
đưa vào Dược điển Việt Nam tập 2, 3: là vị thuốc được ghi đầu tiên trong “Danh y biệt
lục” với nhiều công năng và tác dụng chữa bệnh rất tốt và hữu ích. Hoàng tinh trắng có
tác dụng: bổ âm, bổ phế, bổ huyết, sinh tân dịch, bồi dưỡng cơ thể, đắp chữa sưng tấy,
đụng dập, trĩ và kết hợp với các vị thuốc để chữa nhiều bệnh khác (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Với nhiều công dụng tốt như vậy nên Hoàng tinh trắng ngoài tự nhiên bị khai thác ngày
càng cạn kiệt.
Hiện nay có rất ít các công trình nghiên cứu về bảo tồn và phát triển nguồn gen
các loài cây thuốc bản địa quý. Ở nước ta công tác bảo tồn các loài cây dược liệu nói
chung và cây Hoàng tinh trắng nói riêng chưa thực sự gắn liền với phát triển. Để phát
triển, công tác chọn tạo giống, công nghệ nhân và nuôi trồng giống tốt cung cấp
nguyên liệu chất lượng cần được quan tâm. Chính vì vậy, việc cải tiến áp dụng công
nghệ trong bảo tồn, nhân giống là một giải pháp hữu hiệu giải quyết vấn đề về phát
triển dược liệu hiện nay.
Theo báo cáo của hầu hết các tỉnh vùng núi phía Bắc, việc bảo tồn và phát triển
các loài cây dược liệu tại các địa phương còn nhiều hạn chế từ giống cho đến trồng và
thu hoạch. Giống sử dụng không rõ nguồn gốc, giống tạp, chất lượng chưa cao, nhân
giống bằng phương pháp truyền thống nên giống không được đảm bảo cả số lượng và
chất lượng. Trên thế giới, ứng dụng nhân giống bằng công nghệ sinh học trong nhân
giống đảm bảo cây giống tạo ra chất lượng cao, sạch bệnh, đồng nhất thích hợp để sản
xuất đại trà, quy mô công nghiệp theo hướng sản xuất hàng hóa rất phát triển. Ở nước
ta, công nghệ sinh học cũng được ứng dụng để nhân giống thành công nhiều loài cây
dược liệu quý tại các cơ sở nghiên cứu viện, trường, trung tâm. Để bảo tồn và phát
triển được loài Hoàng tinh trắng thì việc điều tra, nghiên cứu các đặc điểm sinh thái
học, sinh học từ đó nghiên cứu các biện pháp nhân giống nhằm tạo ra nguồn giống tốt,
sạch bệnh chất lượng cao để cung cấp nguồn giống tốt trên quy mô công nghiệp là rất
cần thiết. Chính vì vậy chúng Tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống
invitro loài Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib)”.
2
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định được phương pháp khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng bằng
HgCl2 để tạo vật liệu vô trùng phục vụ việc tái sinh in vitro.
- Xác định được nồng độ GA3 thích hợp cho khả năng tái sinh chồi; nồng độ
BAP, BAP kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi; nồng độ IAA, NAA, IBA
thích hợp đến khả năng ra rễ của chồi.
- Đưa ra được một số đề xuất về bảo tồn và phát triển loài Hoàng tinh trắng
từ kết quả nghiên cứu.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là những tư liệu quý, tài liệu tham khảo có giá
trị và là cơ sở khoa học để đề xuất các biện pháp bảo tồn và phát triển loài cây Hoàng
tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) ở nước ta.
- Làm tài liệu cho công tác nghiên cứu khoa học, tài liệu tham khảo khác về loài
Hoàng tinh trắng.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Từ kết quả nghiên cứu của đề tài có thể áp dụng phương pháp nhân giống in
vitro loài Hoàng tinh trắng để sản xuất ra cây giống tốt, sạch bệnh, đồng đều với số
lượng lớn giúp cung cấp cây giống cho người dân có thể mở rộng các mô hình trồng
Hoàng tinh trắng trên quy mô công nghiệp, tạo công ăn việc làm, tăng thu nhập cho
người dân các vùng núi.
3
Chương 1
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. Một số nghiên cứu về loài Hoàng tinh trắng trên thế giới
Hoàng tinh trắng có tên khoa học là Disporopsis longifolia Craib, thuộc họ
Hoàng tinh (Convallariaceae) (Acharya et al., 2009). Cây phân bố rộng khắp các vùng
nhiệt đới từ Ấn Độ tới các dãy núi ở Đông Nam Á, Trung Quốc. Cây đặc biệt ưa ẩm,
ưa bóng và ưa vùng có khí hậu quanh năm ẩm mát. Chúng thường mọc thành khóm
trên đất ẩm nhiều mùn hay trên các hốc đá, dọc hành lang ven suối, dưới tán rừng ẩm ở
độ cao khoảng 400 - 1500 m (Thomas, 2016).
Hiện nay Hoàng tinh trắng được nhân giống vô tính chủ yếu bằng hom củ.
Trung Quốc là nước có lịch sử rất dài trong sử dụng các loài Hoàng tinh như một loại
thảo dược quý (Bulpitt, 2005). Trên thế giới, Hoàng tinh trắng ngoài tự nhiên đã bị thu
hái đến mức cạn kiệt. Giá bán trên thị trường thế giới khoảng 60.000 – 70.000 đồng/kg
củ tươi. Hoàng tinh trắng có tác dụng điều hòa huyết áp, lipit máu, tăng cường miễn
dịch, điều trị đái tháo đường.
Nghiên cứu hóa sinh hiện đại cho thấy dược liệu hoàng tinh chứa Glucose,
Mannose, Galacturonic acid, Fructose (Pengelly, 2004). Theo y học cổ truyền Đài
Loan, Hoàng tinh sau khi chế biến có tác dụng tăng cường chức năng miễn dịch, chống
xơ vữa động mạch, làm hạ đường huyết, tăng lưu lượng máu qua động mạch vành,
kháng viêm.
Hoàng tinh trắng đang được xếp vào Sách đỏ ở nhiều nước do môi trường sống
ngày càng thu hẹp (Winkel, 2006). Vì vậy, bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây
này đã được quan tâm ở nhiều nước. Nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng còn ít được
công bố.
1.2. Một số nghiên cứu về loài Hoàng tinh trắng ở Việt Nam
Hoàng tinh trắng được xếp vào dạng sẽ nguy cấp, sắp bị tuyệt chủng do số
lượng cá thể suy giảm nhanh, lại bị thu hái bằng cách đào thân rễ và môi trường sống
bị thu hẹp. Mức độ đe doạ: Bậc V. Hiện nay, loài cây này đang nằm trong sách Đỏ cần
ưu tiên bảo tồn và phát triển. Trong tự nhiên loài Hoàng tinh trắng phân bố chủ yếu
ngoài rừng tự nhiên nhưng do khai thác liên tục dẫn đến cạn kiệt và hiếm dần. Việc
4
nghiên cứu nhân giống để bảo tồn và phát triển loài dược liệu này đang là vấn đề cấp
bách. Cho đến nay có rất ít công trình nghiên cứu về bảo tồn và nhân giống Hoàng
tinh. Đặng Ngọc Hùng và Hoàng Thị Phong (2013) đã nhân giống cây Hoàng tinh
trắng (Disporopsis longifolia) bằng hom củ tại Cao Bằng. Trần Ngọc Hải đã tiến hành
đề tài cấp Bộ NN&PTNT: “Khai thác và phát triển nguồn gen hai loài cây thuốc
Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib.) và Củ dòm (Stephania dielsiana
Y.C.Wu.) ở một số tỉnh vùng miền núi Phía Bắc” giai đoạn 2012-2014. Nhìn chung
chưa có công bố nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô.
1.3. Giới thiệu về cây Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib)
1.3.1. Phân loại học
Ở Việt Nam Hoàng tinh trắng còn có tên gọi khác là: Hoàng tinh cách, Hoàng
tinh lá mọc cách, cây đót, co hán han (Thái), voòng chính, néng lài (Tày).
Hoàng tinh trắng có tên khoa học là Disporopsis longifolia Craib., thuộc họ
Hoàng tinh Convallariaceae, bộ Măng tây Asparagales (Sách đỏ Việt Nam, 2007).
Giới Thực vật (Plantae)
Phân giới Thực vật xanh (Viridaeplantae)
Ngành Hạt kín (Magnoliophyta)
Lớp Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida)
Bộ Cúc (Asterales)
Họ Hoa Chuông (Campanulaceae)
Chi Đẳng sâm (Codonopsis)
Loài C. Pilosula
1.3.2. Đặc điểm thực vật học
Hoàng tinh trắng là loại cây cỏ, sống nhiều năm. Thân rễ mập, thành chuỗi,
mọc ngang, gồm nhiều đốt, mặt trên có sẹo do vết thân tàn lụi để lại. Thân khí sinh cao
0,6 - 1 m, đứng, nhẵn, cao đến gần 1m. Lá không cuống, mọc so le, dài 10 - 20 (27)
cm, rộng 2,5 - 6 (10) cm phiến hình mác, đầu nhọn dài hình trứng hoặc trái xoan. Hoa
trắng, hình chuông, Cụm hoa mọc ở nách lá, có 5 - 7 hoa, rủ xuống, cuống hoa 1cm.
Hoa màu trắng, bao hoa hợp thành sống chia 6 thùy ở miệng. Nhị 6, đính ở miệng ống,
chỉ nhị, hình bản, có 2 tai ở đầu. Quả chín màu trắng xốp. Quả mọng, hình cầu, khi
5
chín màu tím đen. Mùa hoa tháng 3-5; Quả: Tháng 6-8. Tái sinh bằng thân rễ hoặc
bằng hạt. Cây sinh trưởng phát triển mạnh vào mùa xuân hè. Vào mùa thu đông chỉ
còn lại củ trong đất thời điểm này cần thu hoạch củ. Trồng và chăm sóc cây sau 3-4
năm sẽ cho thu hoạch củ (Đỗ Tất Lợi, 2004).
1.3.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố
Hoàng tinh trắng mọc ở nơi ẩm mát, ưa bóng, dưới tán rừng và ưa vùng có khí
hậu quanh năm ẩm mát trên các hốc mùn đá tại vùng núi cao ở ở các tỉnh miền núi
phía bắc như Hoà Bình, Hà Tây, Ninh Bình, Lai Châu, Điện Biên, Lào Cai, Sơn La,
Hà Giang, Yên Bái, Cao Bằng, Nghệ An. Cây mọc hoang thành khóm, trên đất ẩm
nhiều mùn hay trên các hốc đá, dọc hành lang ven suối, dưới tán rừng kín thường xanh
ẩm (nhất là loại hình rừng núi đá), ở độ cao 100 - 1200 m. Cho đến nay chủ yếu khai
thác từ nguồn gen mọc hoang, rất ít được trồng (Sách đỏ Việt Nam, 2007).
1.3.4. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý
Thành phần hoá học trong củ Hoàng tinh gồm chất nhầy, đường, tinh bột, acid
amin, alcaloid, flavonoid, sterol, chất béo, chất nhầy, iridoid glycozid, alcaloid, 17 acid
amin trong đó có nhiều acid amin cần thiết cho cơ thể (Nguyễn Thị Phương Dung,
2002).
Tác dụng: Hoàng tinh trắng được xem là một loài cây có giá trị cao trong y học.
Hoàng tinh có vị ngọt, tính bình; có tác dụng bổ trung ích khí, trừ phong thấp, nhuận
tâm phế, ích tỳ vị, trợ gân cốt, thêm tinh tuỷ, đen tóc sống lâu (Ngô Triệu Anh, 2011).
Ngày nay người ta đã biết Hoàng tinh trắng có tác dụng bổ, tăng lực, làm hạ đường
huyết, làm săn da và làm dịu viêm, chữa các chứng hư tổn, suy nhược, chứng mệt mỏi,
tăng huyết áp, chống lão suy, tăng cường chức năng miễn dịch, tăng lưu lượng máu
qua động mạch vành tim, chống xơ vữa mạch máu, hạ đường huyết, kháng viêm (Võ
Văn Chi, 1997).
Bộ phận dùng: Thân rễ. Thu hái vào mùa thu. Rửa sạch, đồ chín, phơi khô, sau
đó chế thành "thục" bằng cách: ban đêm đun, ban ngày phơi, làm liên tục 9 lần.
1.3.5. Giá trị của cây Hoàng tinh trắng
Hiện nay ở nước ta, cây Hoàng tinh trắng được người dân thu hái và bán cho
thương lái giá trên 200 nghìn đồng/kg và chủ yếu bán cho thương lái Trung Quốc.
6
Việc bị săn lùng ráo riết để bán cho Đài Loan, Trung Quốc, đã dẫn tới cạn kiệt dược
thảo quý này ở nước ta.
Cây Hoàng tinh trắng thường xuyên bị khai thác trong vòng vài chục năm trở
lại đây; trữ lượng giảm mạnh; nhiều vùng chỉ còn cây nhỏ hoặc đã trở nên hiếm rõ rệt.
Hiện chỉ còn ở khu bảo tồn thiên nhiên Tát Kẻ - Bản Bung (Nà Hang - Tuyên Quang)
và Vườn Quốc gia Ba Bể thỉnh thoảng gặp cây lớn. Nạn phá rừng làm nương rẫy cũng
trực tiếp làm thu hẹp vùng phân bố (Văn Bàn và Mường Khương - Lào Cai; Tràng
Định - Lạng Sơn).
Loài Hoàng tinh trắng đang được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam với cấp đánh giá
“sẽ nguy cấp” (Bậc V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý
hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để
hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại. Bảo vệ các quần thể hiện có trong
các Vườn quốc gia (Ba Vì, Tam Đảo, Ba Bể, Cúc Phương). Chỉ nên khai thác những
cây lớn, có thân rễ (củ) khoảng 100 gam trở lên.
1.4. Kế thừa kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh thái, sinh học của loài
Hoàng tinh trắng từ đề tài “Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen Hoàng
tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) có giá trị kinh tế cao tại tỉnh Hà Giang”
* Đặc điểm sinh thái
Qua điều tra nghiên cứu loài Hoàng tinh trắng tại tỉnh Hà giang kết quả cho
thấy Hoàng tinh trắng là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng. Thường mọc thành khóm trên
đất ẩm nhiều mùn hay trên các hốc đá, dưới tán rừng. Khu vực phân bố Hoàng tinh
trắng có khí hậu ẩm mát quanh năm, nhiệt độ trung bình khoảng 23,40C, độ ẩm không
khí trung bình 84%, tổng lượng mưa trên năm khoảng 2.805 mm, tổng số giờ nắng trên
năm khoảng 1.210 giờ. Đất có màu từ xám nhạt đến xám đen, tầng đất mặt tơi xốp,
nhiều mùn, ẩm ướt, thành phần cơ giới đất từ thịt nhẹ, trung bình đến nặng, tỉ lệ lẫn đá
ít, khả năng thấm, thoát nước tốt. Hoàng tinh trắng phân bố hẹp thường mọc rải rác ở
ven rừng tự nhiên và dọc các khe suối có độ tàn che cao.
* Đặc điểm sinh học
7
- Lá Hoàng tinh trắng có màu xanh đậm khi trưởng thành và màu xanh nhạt lá mạ
khi còn non, lá có các vân dọc xong xong nhau. Lá không cuống, mọc so le, dài 10 -
20 cm, rộng 3 - 6 cm, phiến hình mác, đầu nhọn dài hình trứng hoặc trái xoan.
- Hoàng tinh trắng là cây thân thảo, đứng, sống nhiều năm, cao 0,6 - 1,2 m. Thân
nhẵn lúc non có đốm tím hồng, sau xanh trắng, đường kính 0,3 - 0,6 cm. Thân rễ mập,
mọc ngang chia thành những lóng tròn có sẹo to, lõm non như cái chén và nhiều ngấn
ngang. Thân lá lụi vào mùa đông, sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè, có khả
năng đẻ nhánh tạo thành khóm lớn với nhiều thân.
- Hoa Hoàng tinh trắng màu trắng, hình chuông. Cụm hoa mọc ở nách lá, có 5 - 7
hoa, rủ xuống, cuống hoa 1cm. Hoa màu trắng, bao hoa hợp thành sống chia 6 thùy ở
miệng. Nhị 6, đính ở miệng ống, chỉ nhị, hình bản, có 2 tai ở đầu. Mùa hoa tháng 3 - 6,
quả tháng 6 – 9.
- Quả Hoàng tinh trắng là dạng quả mọng, chín màu trắng xốp, hình cầu, khi
chín già màu tím đen. Mùa quả vào tháng 6-8, hạt nhỏ.
- Rễ Hoàng tinh trắng là dạng rễ chùm, Thân rễ mọc ngang có nhiều đốt, đường
kính to tới 3-4cm, lõi màu trắng, phía ngoài màu phớt hồng, mập mạp, có mùi thơm.
Cây con thường thấy xung quanh gốc cây mẹ. Phần thân mang lá lụi hàng năm vào
mùa đông, chồi mới mọc từ thân rễ vào đầu mùa xuân. Thân rễ bị gãy, phần còn lại
vẫn có thể tái sinh.
Lá cây Hoàng tinh trắng Thân cây Hoàng tinh trắng
8
Hoa cây Hoàng tinh trắng Quả cây Hoàng tinh trắng
Hình 1.1. Hình ảnh Lá, thân, hoa, quả cây Hoàng tinh trắng
* Đánh giá chung về tình hình tổng quan nghiên cứu
Nhìn chung các nghiên cứu về loài Hoàng tinh trắng ở Việt Nam và trên thế
giới đã nghiên cứu và mô tả được các đặc điểm sinh vật, đưa ra được đặc điểm sinh
thái phân bố của loài. Nghiên cứu được các thành phần hóa học trong củ Hoàng tinh
trắng và các tác dụng dược lý do Hoàng tinh trắng mang lại.
Các công trình nghiên cứu về bảo tồn và nhân giống loài Hoàng tinh trắng ở
Việt Nam và trên thế giới đã có nhưng rất ít và chủ yếu là nghiên cứu về giâm hom.
Nghiên cứu về nhân giống in vitro hầu như chưa có công bố nào chính thức. Một vấn
đề đặt ra hiện nay là muốn bảo tồn và phát triển loài Hoàng tinh trắng cần kết hợp giữa
các biện pháp bảo tồn với nghiên cứu nhân giống để tạo ra được các giống có nguồn
gen tốt đảm bảo chất lượng, cây giống tạo ra với số lượng lớn, độ đồng đều cao, giải
pháp tốt nhất hiện nay là nghiên cứu nhân giống in vitro loài Hoàng tinh trắng.
1.5. Tổng quan về nhân giống in vitro
1.5.1. Khái quát nuôi cấy mô tế bào
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng
nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên
nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ.
9
Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80
của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính in
vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản
nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo...Trịnh Đình Đạt (2007).
Trong những năm gần đây, nhiều quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nhân
giống vô tính nuôi cấy in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện
trên các đối tượng khác nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn
quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu… Nhằm góp phần vào cung cấp nguồn giống cây
rừng phục vụ cho công tác nâng cao và cải thiện giống cây rừng, đồng thời duy trì
bảo tồn và phát triển loài cây quý hiếm. Hàng loạt quy trình nhân giống in vitro các
loại cây rừng được nghiên cứu và hoàn thiện nhằm tạo ra lượng lớn cây giống, có
chất lượng tốt.
Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem giải pháp công nghệ
quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung. Trên môi trường nhân tạo, từ các
mô hoặc các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ
trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền
và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau.
1.5.2. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính
toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Haberlandt lần đầu tiên
đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng
tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học
hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang
toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện
thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính
toàn năng của tế bào (Nguyễn Quang Thạch, 2009).
1.5.3. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hoá
để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau.
10
Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để
thực hiện chức năng phân chia.
Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng.
1.5.4. Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật
Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Điều kiện vô trùng:
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo điều
kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm. Điều kiện
vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro (Đỗ Năng
Vịnh ,2005) Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất
hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
- Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH
+ Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các
yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời
gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu
sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 giờ/ngày (Đỗ Năng Vịnh, 2005)
Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy.
+ Nhiệt độ: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng
ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc vào
xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ
thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C (Hoàng Thị Sản,
2009).
+ pH: pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi
trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. pH của đa số môi trường được
điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng. pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển
sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng (Đỗ Năng Vịnh, 2002) (Vũ
Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2009).
11
1.5.5. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển hình
thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy.
Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế
bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các
chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các
khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm nguồn cacbon, các vitamin, các
chất điều hoà sinh trưởng. Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có
thành phần xác định (amino acid, EDTA,..) và một số chất có thành phần không xác
định như nước dừa, dịch trích nấm men…
+ Nước: Cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môi
trường dinh dưỡng. Hoàn toàn không nên sử dụng nước máy trong nuôi cấy mô.
Trong trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên sử dụng nước khử ion, mặc dù nước
này vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu cơ và các loài vi khuẩn (Nguyễn Quang
Thạch, 2009).
+ Dinh dưỡng vô cơ: Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: nguyên tố
dinh dưỡng đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng. Nguyên tố khoáng là nhu
cầu rất cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật. Giống như cây trồng ngoài tự nhiên
các mô và cơ thể thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm trên môi trường nhân tạo
chúng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển.
+ Đường: Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh
dưỡng nuôi cấy mô thực vật. Đường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực
vật là đường saccharose ở nồng độ 1-5%. Đường saccharose là dạng đường được
tổng hợp và vận chuyển tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mô nuôi cấy.
Cũng có thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô thực vật.
Nồng độ đường sử dụng phụ thuộc vào loại và tuổi mẫu cấy (Nguyễn Quang Thạch,
2009).
+ Vitamin: Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác
nhau. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin
(vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol. Vitamin có
12
tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó
có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy.
+ Agar: Agar là một loại polysacharit của tảo. Agar là chất keo đông thường
được sử dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ. Nồng độ của Agar
thạch dùng trong nuôi cấy rất dao động tùy theo độ tinh khiết của hóa chất và mục
tiêu nuôi cấy (thường 4-12 g/l, trung bình 6-12 g/l) nếu nồng độ quá cao môi trường
dinh dưỡng sẽ rất cứng chất dinh dưỡng khó khuếch tán để nuôi dưỡng mô cấy. Ở
800C thì ngậm nước chuyển sang trạng thái sol còn ở 40 0C thì trở về trạng thái gel.
Khả năng ngậm nước của Agar khá cao: 6-12 gam/lít nước. Agar ở dạng gel nhưng
vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dàng (Nguyễn Quang Thạch, 2009).
+ Chất điều hoà sinh trưởng: Là thành phần không thể thiếu trong môi
trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in
vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: nồng độ sử
dụng, hoạt tính vốn có của chúng và nguồn gốc mô cấy (Trịnh Đình Đạt, 2007).
Chất điều hoà sinh trưởng (phytohormon) được chia làm hai nhóm chất có
tác dụng đối kháng về sinh lý đó là: nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm chất
ức chế sinh trưởng. Đối với nhóm chất kích thích sinh trưởng gồm có 3 nhóm chính
đó là: auxin, gibberellin, và cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy. Còn
các chất thuộc nhóm ức chế sinh trưởng: ABA, etilen, các hợp chất phenol, các chất
ức chế tổng hợp như retardant, các chất diệt cỏ… Bên cạnh các chất điều hoà sinh
trưởng, người ta còn bổ sung thêm các dung dịch hữu cơ có thành phần phức tạp và
không xác định như: dịch chiết nấm men, nước ép khoai tây, chuối, nước dừa,
cazein thuỷ phân… nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy
(Nguyễn Quang Thạch, 2009).
+ Than hoạt tính: Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác
dụng khử độc. Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp
chất phenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu
nghiên cứu. Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở
nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ. Than
hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóa tốt. Nhìn chung nó có ảnh
13
hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường.
1.5.6. Các giai đoạn của nhân giống vô tính
Theo Trịnh Đình Đạt (2007) : Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giai đoạn sau:
Giai đoạn chuẩn bị:
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro.
Mục đích là phải tạo được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Có thể vô
trùng mẫu nuôi cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn như: CaOCl2, NaOCl,
HgCl2,….
Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo: Tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao;
tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu,
nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi
cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạn thân…
Sharma G.J. (2005) đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt thân rễ cây Địa
liền và cây Ngải máu. Sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2% trong 15 phút
để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu. Dương Tấn Nhựt và cs (2011) tiến hành khử
trùng lá cây Sâm Ngọc Linh bằng Cồn 70% trong 30 giây và HgCl 2 trong 5 phút
thu được tỷ lệ mẫu sạch cao.
Tái sinh mẫu nuôi cấy:
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm
bảo các yêu cầu như sau: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trưởng tốt.
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của
mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh
trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy.
Behera K.K. và cs (2010) sử dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để cảm ứng
chồi cây nghệ vàng. Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem
vào nuôi cấy. Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những
mô đã chuyển hoá.
14
Giai đoạn nhân nhanh chồi:
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lượng
thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Chính vì thế giai đoạn này được
coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy. Để tăng hệ số người ta thường đưa
vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin,…), các
chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm mem,…, kết hợp với các yếu tố
ánh sáng, nhiệt độ thích hợp. Chế độ nuôi cấy thường là 25-27ºC, có 16 giờ chiếu
sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy,
người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân
cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo
thành cây từ phôi vô tính. Jala A. và cs (2012) nghiên cứu trên cây Giảo cổ lam cho
thấy khi kết hợp BA 1 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8
chồi/mẫu sau 80 ngày nuôi cấy.
Tạo cây hoàn chỉnh:
Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường ra rễ.
Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở
giai đoạn này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng
thuộc nhóm auxin, là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô
nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-D được nghiên cứu và sử
dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi
Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên:
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng
dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Là giai đoạn
chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn. Do đó
phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao
trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất.
Sen A. và cs (2010) khi chuyển cây nghệ in vitro sang đất vườn và cát với tỷ lệ
1:1 cho kết quả 93% cây vi giống sinh trưởng và phát triển bình thường trong môi
trường tự nhiên.
15
Shahinozzaman M. (2013) chuyển cây con tái sinh in vitro sang chậu nhựa có
chứa hỗn hợp đất vườn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 và được làm thích nghi. Kết quả cho thấy
cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao.
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần
đảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,
số rễ, chiều cao cây).
+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.
+ Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng
như có chế độ dinh dưỡng phù hợp.
16
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu là loài Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib)
thu thập tại Hà Giang, đã được chọn lọc, đánh giá và trồng tại vườn giống gốc của
Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp – Trường đại học Nông Lâm Thái nguyên.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu các biện pháp khử trùng mẫu tạo vật liệu vô
trùng cho nuôi cấy in vitro, nghiên cứu nồng độ các chất GA3, BAP, BAP kết hợp với
kinetin, IAA, NAA, IBA đến khả năng tái sinh chồi, nhân nhanh và ra rễ chồi Hoàng
tinh trắng.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Nghiên cứu nhân giống in vitro loài Hoàng tinh trắng tại phòng
thí nghiệm của Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp – Trường đại học Nông
Lâm Thái nguyên
- Thời gian: 05/2019 đến tháng 09/2020.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng bằng HgCl2
để tạo vật liệu vô trùng phục vụ việc tái sinh in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi Hoàng
tinh trắng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, BAP kết hợp với Kinetin đến khả nhân
nhanh chồi Hoàng tinh trắng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA, NAA, IBA đến khả ra rễ Hoàng tinh
trắng.
- Đề xuất một số giải pháp về bảo tồn và phát triển loài Hoàng tinh trắng từ
kết quả nghiên cứu.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp kế thừa tài liệu
Kế thừa có chọn lọc các tài liệu, công trình nghiên cứu của các nhà khoa học
trong và ngoài nước đã nghiên cứu có liên quan đến loài Hoàng tinh trắng.
17
Kế thừa các kết quả nghiên cứu về các đặc điểm sinh thái học, sinh học và phân
tích lựa chọn các giống Hoàng tinh trắng có nguồn gen tốt được trồng và chăm sóc tại
vườn giống gốc của Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm Nghiệp – Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên trong đề tài “Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen Hoàng tinh
trắng (Disporopsis longifolia Craib) có giá trị kinh tế cao tại tỉnh Hà Giang” thời gian
thực hiện từ năm 2018 – 2020.
2.4.2. Hóa chất, thiết bị chuẩn bị cho nuôi cấy in vitro Hoàng tinh trắng
Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào (in vitro) được tiến hành trên nền môi
trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962).
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS
Thành phần Nồng độ (mg/l) Thành phần Nồng độ (mg/l)
440,000 0,025 CaCl2.H2O CuSO4.5H2O
170,000 0,250 KH2PO4 Na2MoO4.2H2O
1.900,000 27,800 KNO3 FeSO4.7H2O
370,000 37,300 MgSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O
1.650,000 Glicine 2,000 NH4NO3
6,200 Thiamin HCl 0,100 H3BO3
KI 0,830 Pyridoxin HCl 0,500
22,300 Axit nicotinic 0,500 MnSO4.4H2O
8,600 Myo-inositol 100,000 ZnSO4.7H2O
0,025 CoCl2.6H2O
Các thí nghiệm sử dụng các loại hoá chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc và Thuỵ Điển như các chất kích thích sinh trưởng BAP, Kinetin, α – NAA, IAA, IBA, đường saccharose, thạch agar, than hoạt tính, ethanol, NaOH, petroleum ether...
*Thiết bị
18
Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Bình tam giác 250ml, pipet, cốc thuỷ
tinh định mức, bông, giấy làm nút, giấy thấm. Bộ đồ cấy: dao cấy, pank cấy, đĩa cấy,
Box cấy vô trùng, nồi khử trùng, tủ sấy, máy đo pH, giàn nuôi cây...
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng bằng HgCl2 để
tạo vật liệu vô trùng phục vụ việc tái sinh in vitro
Vật liệu nghiên cứu là mẫu củ Hoàng tinh trắng thu thâp tại Hà Giang đã
được phân tích, lựa chọn và trồng tại vườn giống gốc của Viện Nghiên cứu và Phát
triển Lâm Ngiệp. Các củ được chọn là những củ bánh tẻ, có nhiều mắt ngủ và
không bị sâu bệnh. Hoàng tinh trắng ngoài tự nhiên sinh sản bằng củ nên tác giả
chọn củ Hoàng tinh trắng làm vật liệu vào mẫu để tăng khả năng nhân giống của
Hoàng tinh trắng.
Mẫu sau khi lấy làm sạch sơ bộ bằng cách: Rửa mẫu dưới vòi nước sạch.
Ngâm trong dung dịch chất tẩy nhẹ (xà phòng hoặc nước rửa chén) trong 5 phút.
Sau đó dùng chổi cọ nhẹ nhàng rửa sạch. Cuối cùng tráng lại nước cất vô trùng 3 -5
lần.
Khử trùng trong tủ cấy: Mẫu củ sau khi làm sạch sơ bộ, được đưa vào tủ cấy
vô trùng và khử trùng bề mặt bằng cồn 700 trong 60 giây, sau đó tráng sạch bằng
nước cất vô trùng (4-5 lần). Tiếp theo khử trùng bằng HgCl2 với nồng độ 0,1 % ở
các khoảng thời gian khác nhau : 0, 3, 5, 8, 10 phút. Thí nghiệm bố trí gồm 5 công
thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 15 mẫu. Mẫu được cấy vào môi
trường MS, sau 14 ngày theo dõi các chỉ tiêu:
- Tỉ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = (Tổng số mẫu sống không nhiễm / Tổng
số mẫu cấy) x 100%.
- Tỉ lệ mẫu sống bị nhiễm (%) = (Tổng số mẫu sống bị nhiễm/ Tổng số mẫu
cấy) x 100%.
- Tỉ lệ mẫu chết (%) = (Tổng số mẫu chết / Tổng số mẫu cấy) x 100%.
Các mẫu sống được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
19
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh
chồi Hoàng tinh trắng
Các mẫu sau khi khử trùng cấy vào môi trường MS sau 14 ngày không bị
nhiễm nấm và vi khuẩn sẽ được tiến hành cấy sang môi trường tái sinh.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 công thức, mỗi
công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 15 mẫu.
Môi trường tái sinh là môi trường MS có bổ sung GA3 với các nồng độ khác
nhau: 0 (mg/l), 0,3 (mg/l), 0,5 (mg/l), 1,0 (mg/l), 2,0 (mg/l).
Dùng pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp mẫu
đưa vào môi trường tái sinh đã chuẩn bị trước sau đó đưa vào phòng nuôi. Tiến
hành theo dõi sau 30 ngày cấy chuyển.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Thời gian bật chồi: Khoảng thời gian từ khi cấy chuyển đến lúc bật chồi.
- Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) = (Số mẫu tái sinh/Tổng số mẫu nuôi cấy) x 100%.
- Đánh giá chất lượng chồi:
Chồi tốt : Chồi mập, xanh đậm
Chồi trung bình : Chồi nhỏ, lá xanh.
Chồi kém : Chồi nhỏ, lá vàng nhạt.
2.4.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, BAP kết hợp với Kinetin đến
khả nhân nhanh chồi Hoàng tinh trắng
Các mẫu sống tái sinh không bị nhiễm khuẩn sau 30 ngày được cấy chuyển
sang môi trường nhân nhanh để tạo ra số lượng chồi lớn.
* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả nhân nhanh chồi
Hoàng tinh trắng
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 công thức,
mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 15 mẫu. Môi trường nhân nhanh
có bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau: 0 (mg/l), 0,5 (mg/l), 1,0 (mg/l), 2,0
(mg/l), 3,0 (mg/l). Theo dõi các mẫu sau 30 ngày nuôi cấy.
Các chỉ tiêu theo dõi:
20
- Số chồi được tạo thành (chồi),
- Chất lượng chồi.
- Hệ số nhân chồi (lần) = Số chồi tạo thành/ Số chồi đưa vào.
* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin đến khả
nhân nhanh chồi Hoàng tinh trắng
Các chồi tạo thành có chiều cao từ 1,5 - 2 cm sau 30 ngày nuôi cấy được cấy
chuyển sang môi trường nhân nhanh bao gồm: Nồng độ BAP tốt nhất ở thí nghiệm
trên kết hợp với các nồng độ Kinetin khác nhau: 0 (mg/l), 0,2 (mg/l), 0,5 (mg/l), 1,0
(mg/l), 1,5 (mg/l). Các thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức lặp
lại 3 lần, mỗi lần 15 mẫu và theo dõi sau 30 ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Số chồi được tạo thành (chồi)
- Chất lượng chồi.
- Hệ số nhân chồi (lần) = Số chồi tạo thành/Số chồi đưa vào.
2.4.6. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA, IBA đến khả năng ra rễ
Hoàng tinh trắng
Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh sạch khuẩn có từ 1-2 lá được cấy
chuyển sang môi trường tạo rễ bổ sung các chất kích thích sinh trưởng khác nhau:
IAA, NAA và IBA tương ứng với các nồng độ khác nhau.
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 công thức,
mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 15 mẫu. Tiến hành theo dõi và
đánh giá sau 30 ngày nuôi cấy.
Bảng 2.2. Nghiên cứu Ảnh hưởng của IAA, NAA, IBA đến khả năng ra rễ
Hoàng tinh trắng
IAA (mg/l) NAA (mg/l) IBA(mg/l)
Công thức (CT) CT1 (ĐC) 0 0 0
CT 2 0,3 0,3 0,3
CT 3 0,5 0,5 0,5
CT 4 CT 5 1 2 1 2 1 2
21
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tỉ lệ mẫu ra rễ (%) = (Tổng số mẫu ra rễ/Tổng số mẫu nuôi cấy) x 100%.
- Chiều dài rễ trung bình (cm) = (Tổng chiều dài rễ/Tổng số rễ)
- Số rễ trung bình (cái) = (Tổng số rễ/tổng số mẫu theo dõi)
- Chỉ số ra rễ = Số rễ trung bình x Chiều dài rễ trung bình.
- Thời gian ra rễ: Thời gian tính từ khi cấy mẫu sang môi trường ra rễ đến
khi mẫu ra rễ.
- Chất lượng rễ:
+ Rễ tốt: rễ trắng, mập.
+ Rễ trung bình: rễ trắng, nhỏ.
+ Rễ kém: rễ nhỏ màu vàng nâu.
2.4.7. Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các yếu tố vật
lí như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được duy trì ổn định.
- Nhiệt độ từ 25 - 270C
- Ánh sáng: Các mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn Neon với cường độ chiếu
sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 – 12 giờ/ngày.
- Môi trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng sinh trưởng (GA3, BAP,
kinetin, IAA, NAA, IBA); đường saccarose 30g/l; agar 6,0g/l; pH môi trường 5,6 -
5,8.
- Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút ở áp suất
1atm.
2.4.8. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Thu thập và xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học trên các phần
mềm IRRISTAT 5.0, Excel,…
22
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng bằng HgCl2 để tạo
vật liệu vô trùng phục vụ việc tái sinh in vitro
Giai đoạn khử trùng vật liệu nuôi cấy là giai đoạn đầu tiên trong quá trình nuôi cấy
in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được vật liệu vô trùng sạch bệnh.
Gốc Hg2+ có hoạt tính khử trùng mạnh. Hg2+ gây thoái hóa tổ chức, tạo thành các
hợp chất protein rất dễ tan làm tê liệt chức năng của các nhóm thiol (-SH), các hệ thống
men cơ bản và oxi hóa khử của tế bào; Hg2+ có thể liên kết với các protein của máu và
mô, làm tê liệt và phá hủy tế bào nấm, khuẩn nhanh chóng. Trong thí nghiệm này chúng
tôi tiến hành khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 với nồng độ 0,1 % ở các khoảng
thời gian khác nhau: 3 phút, 5 phút, 8 phút và 10 phút. Mẫu đối chứng khử trùng bằng
nước cất vô trùng. Kết quả khử trùng được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Sự khác nhau của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1 % đến
khả năng tạo vật liệu vô trùng
Thời gian Số mẫu Tỉ lệ Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu khử nuôi Công mẫu sống không sống bị trùng cấy thức chết nhiễm (%) nhiễm (%) (phút) (mẫu) (%)
CT1(ĐC) 45 0 0 0 100
CT2 45 3 8,89 6,67 84,44
CT3 45 5 88,89 2,22 8,89
CT4 45 8 37,78 24,44 37,78
CT5 45 10 17,78 6,67 75,55
4,58 LSD0,05
CV% 7,9
23
Nhìn vào kết quả bảng 3.1, với độ tin cậy 95 % sau 14 ngày theo dõi ta thấy ảnh
hưởng của thời gian khử trùng khác nhau của chất khử trùng lên mẫu Hoàng tinh trắng
là khác nhau. Ở Công thức đối chứng chỉ sử dụng nước cất vô trùng cho kết quả 100 %
mẫu bị nhiễm. Nguyên nhân do nước cất vô trùng không có khả năng diệt khuẩn để tạo
mẫu vô trùng. Khử trùng mẫu cấy Hoàng tinh trắng với HgCl2 0,1 % thời gian từ 3
phút đến 5 phút tỷ lệ mẫu sống không nhiễm tăng dần từ 8,89 % đến 88,89 %; tỷ lệ
mẫu sống bị nhiễm giảm từ 84,44 % xuống 8,89 %. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời
gian khử trùng lên 8 phút, 10 phút thì tỷ lệ mẫu sống không nhiễm không những không
tăng lên mà lại giảm xuống còn 37,78 % và 17,78 % và tỷ lệ mẫu bị chết tăng lên từ
37,78 % tới 75,55 %. Do đó, khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng với HgCl2 0,1 %
càng lâu (>5 phút) mẫu ngâm trong dung dịch khử trùng kéo dài hóa chất ngấm sâu
vào bên trong mẫu gây độc mô nuôi cấy, làm mất khả năng tái sinh chồi.
Biểu đồ 3.1. Sự khác nhau giữa thời gian khử trùng đến khả năng tạo vật liệu
vô trùng
Nhìn vào biểu đồ 3.1 ta thấy trong các chỉ tiêu theo dõi sự khác nhau giữa thời
gian khử trùng lên hiệu quả tạo mẫu vô trùng thì chỉ tiêu tỉ lệ mẫu sống không nhiễm
là quan trọng nhất vè là chỉ tiêu quyết định.
24
Như vậy, khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng với HgCl2 0,1 % trong thời gian 5
phút cho kết quả mẫu vô trùng tốt nhất với tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 88,89 %, tỉ
lệ mẫu sống bị nhiễm 8,89 % và tỷ lệ mẫu chết là 2,22 %.
Hình 3.1. Hình ảnh mẫu Hoàng tinh trắng sống không bị nhiễm sau khi khử
trùng bằng HgCl2 0,1 % trong 5 phút
3.2. Sự khác nhau của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi Hoàng tinh trắng
Trong nuôi cấy mô tế bào (in vitro) nhóm cytokinin là nhóm chất kích thích sự
phân chia tế bào mạnh mẽ, đặc biệt là sự phân hóa chồi, chúng có tác dụng phá ngủ
nghỉ của hạt, củ, chồi,... thuộc nhóm cytokinin này có 3 chất chính thường dùng trong
nuôi cấy mô tế bào thực vật là Kinetin, Zeatin và GA3. Trong đó GA3 là chất thường
được sử dụng và mang lại hiệu quả tái sinh cao do vậy chúng tôi đã chọn GA3 để
nghiên cứu khả năng tái sinh chồi in vitro mẫu Hoàng tinh trắng.
Các mẫu sống không bị nhiễm sau khử trùng 14 ngày sẽ được cấy chuyển sang
môi trường MS có bổ sung 30g/l saccarose, 6g/l Agar và GA3 ở các nồng độ khác
nhau. Theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy, kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.2.
25
Bảng 3.2. Sự khác nhau của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi
Hoàng tinh trắng
Tỷ lệ mẫu Số mẫu Thời gian Nồng độ GA3 tái sinh Công thức nuôi cấy bật chồi Chất lượng chồi (mg/l) (mẫu) (ngày) (%)
Chồi nhỏ, vàng CT 1 (ĐC) 0 45 42,22 28 nhạt
CT 2 0,3 45 55,55 Chồi nhỏ, xanh 25
CT 3 0,5 45 82,22 Chồi nhỏ, xanh 22
Chồi mập, xanh CT 4 1,0 45 95,55 20 đậm
CT 5 2,0 45 64,45 Chồi nhỏ, xanh 23
7,6 LSD0,05
CV% 5,9
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy nồng độ GA3 khác nhau sẽ cho tỷ lệ mẫu tái sinh
khác nhau với mức tin cậy là 95 %. Khi bổ sung GA3 đều cho kết quả về tỷ lệ mẫu tái
sinh cao hơn công thức đối chứng không bổ sung GA3. Tỷ lệ mẫu tái sinh tăng dần khi
tăng nồng độ GA3 từ 0,3 mg/l đến 1,0mg/l cho kết quả lần lượt là 55,55 %; 82,22 % và
95,55 % và thời gian bật chồi tương ứng là 25 ngày, 22 ngày và 20 ngày. Tuy nhiên
khi tăng nồng độ GA3 lên 2mg/l thì tỷ lệ tái sinh chồi lại bị giảm xuống còn 64,45 %.
Công thức đối chứng không bổ sung GA3 cho tỉ lệ mẫu tái sinh đạt 42,22 % và thời
gian bật chồi là 23 ngày. Kết quả này được giải thích như sau: GA3 có vai trò trong
việc hoạt hóa quá trình phân bào, nhờ có tác dụng tái sinh và phân hóa chồi cho cây.
Khi tăng dần nồng độ GA3 từ 0,3 đến 1,0mg/l trong môi trường nuôi cấy thì tỷ lệ mẫu
tái sinh tăng và cao nhất đạt 95,55 %. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nồng độ GA3 lên 2
26
mg/l không những không cho kết quả cao hơn mà lại giảm xuống vì hàm lượng GA3
quá cao sẽ gây độc cho mẫu, từ đó gây ức chế khả năng tái sinh chồi.
Nồng độ GA3 cũng ảnh hưởng đến chất lượng chồi. Công thức 4 khi bổ sung
GA3 nồng độ 1,0 (mg/l) cho chất lượng chồi tốt nhất: Chồi mập và xanh đậm. Các
công thức còn lại chồi nhỏ, xanh và công thức đối chứng chồi nhỏ, vàng nhạt.
Biểu đồ 3.2. Sự khác nhau của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi Hoàng tinh
trắng
Nhìn vào biểu đồ 3.2. ta thấy trong các yếu tố nghiên cứu về sự khác nhau giữa
nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi Hoàng tinh trắng thì chỉ tiêu theo dõi về tỉ lệ
mẫu tái sinh là quan trọng nhất và đóng vai trò quyết định về hiệu quả của nồng độ
GA3 đến tái sinh chồi Hoàng tinh trắng.
GA3 nồng độ 1,0 mg/l ở công thức 4 là nồng độ tốt nhất cho tái sinh chồi Hoàng
tinh trắng với tỉ lệ mẫu tái sinh là 95,55 %; thời gian bật chồi là 20 ngày, chồi mập lá
xanh.
27
Hình 3.2. Hình ảnh tái sinh chồi của mẫu Hoàng tinh trắng khi môi trường có bổ
sung GA3 1,0 mg/l
3.3. Kết quả nghiên cứu sự khác nhau của nồng độ chất BAP, BAP kết hợp với
Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hoàng tinh trắng
3.3.1. Kết quả nghiên cứu sự khác nhau của nồng độ BAP đến khả năng nhân
nhanh chồi chồi Hoàng tinh trắng
Sau giai đoạn tái sinh chồi mẫu được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh
chồi có bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Sự khác nhau của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Hoàng
tinh trắng
Chất lượng chồi Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Số mẫu nuôi cấy (mẫu) Hệ số nhân chồi (lần) Số chồi được tạo thành (chồi)
45 0 54 Chồi nhỏ, vàng nhạt 1,20
CT 1 (ĐC) CT 2 45 0,5 104 Chồi nhỏ, xanh 2,31
CT 3 45 1,0 132 Chồi mập, xanh đậm 2,93
CT 4 45 2,0 91 Chồi nhỏ, xanh 2,02
CT 5 45 3,0 63 Chồi nhỏ, vàng nhạt 1,40
0,17 LSD0,05
CV% 4,7
28
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy các công thức có bổ sung thêm BAP cho hệ số
nhân chồi cao hơn công thức đối chứng (CT1) không bổ sung BAP. Kết quả sau 30
ngày nuôi cấy cho thấy: Công thức đối chứng cho hệ số nhân chồi là 1,20 lần, chồi
nhỏ, lá màu vàng nhạt. Ở CT2 có bổ sung BAP 0,5 mg/l cho hệ số nhân chồi 2,31 lần,
chồi nhỏ, lá xanh. CT3 có bổ sung BAP 1,0 mg/l cho hệ số nhân chồi 2,93 lần, chồi
khỏe, mập, lá xanh. CT4 có bổ sung BAP 2,0 mg/l cho hệ số nhân chồi 2,02 lần, chồi
nhỏ, lá xanh. CT5 có bổ sung BAP 3,0 mg/l cho hệ số nhân chồi 1,4 lần, chồi nhỏ, lá
vàng nhạt.
Như vậy khi bổ sung thêm BAP có nồng độ từ 0,5 mg/l đến 1,0 mg/l vào môi
trường nuôi cấy cho hệ số nhân chồi tăng dần và đạt kết quả cao nhất ờ nồng độ 1,0
mg/l là 2,93 lần. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 2,0 mg/l đến 3,0 mg/l
thì hệ số nhân chồi không tăng lên mà giảm xuống còn 2,02 lần và 1,40 lần. Như vậy
khi bổ xung chất kích thích sinh trưởng BAP ở nồng độ thích hợp sẽ cho kết quả nhân
nhanh chồi tốt nhất, nồng độ quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi.
Nồng độ quá cao sẽ ức chế quá trình sinh trưởng của tế bào dẫn đến khả năng nhân
chồi kém.
Trong thí nghiệm này, nồng độ BAP tốt nhất cho khả năng nhân nhanh chồi
Hoàng tinh trắng là 1,0 mg/l với số chồi mới được tạo thành là 132 chồi và hệ số nhân
chồi là 2,93 lần, chồi mập và lá xanh đậm.
Hình 3.3. Mẫu Hoàng tinh trắng cấy trong môi trường nhân nhanh chồi có bổ sung
BAP 1,0mg/l
29
3.3.2. Sự khác nhau của nồng độ BAP kết hợp với Kinein đến khả năng nhân
nhanh chồi Hoàng tinh trắng
Từ kết quả ở thí nghiệm trên lựa chọn được nồng độ BAP 1,0 mg/l là thích hợp
nhất cho khả năng nhân nhanh chồi, kết hợp nồng độ BAP đó với các nồng độ Kinetin
khác nhau để nghiên cứu ảnh hướng của tổ hợp BAP và Kinetin đến khả năng nhân
nhanh chồi Hoàng tinh trắng, kết quả được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Sự khác nhau của tổ hợp nồng độ BAP và Kinetin đến khả năng nhân
nhanh chồi Hoàng tinh trắng
Số mẫu Số chồi Nồng độ Nồng độ Hệ số Công nuôi được tạo BAP Kinetin nhân chồi Chất lượng chồi thức cấy thành (mg/l) (mg/l) (lần) (mẫu) (chồi)
CT 1 Chồi nhỏ, vàng 0 45 132 2,93 (ĐC) nhạt
CT 2 0,2 45 177 3,93 Chồi nhỏ, xanh
Chồi mập, xanh CT 3 1,0 191 4,24 0,5 45 đậm
CT 4 1,0 45 164 3,64 Chồi nhỏ, xanh
Chồi nhỏ, xanh CT 5 1,5 45 153 3,40 nhạt
0,18 LSD0,05
CV% 2,7
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy các công thức có bổ sung thêm Kinetin cho hệ số
nhân chồi cao hơn công thức đối chứng (CT1) chỉ bổ sung BAP. Kết quả sau 30 ngày
nuôi cấy cho thấy: Công thức Đối chứng (BAP 1,0 mg/l) cho hệ số nhân chồi là 2,93
lần, chồi nhỏ, lá màu vàng nhạt. Ở CT2 (BAP 1,0 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l) cho hệ số
nhân chồi 3,93 lần, chồi nhỏ, lá xanh. CT3 (BAP 1,0 mg/l + Kinetin 0,5 mg/l) cho hệ
số nhân chồi 4,24 lần, chồi mập, lá xanh đậm. CT4 (BAP 1,0 mg/l + Kinetin 1,0 mg/l)
30
cho hệ số nhân chồi 3,64 lần, chồi nhỏ, lá xanh. CT5 (BAP 1,0 mg/l + Kinetin 1,5
mg/l) cho hệ số nhân chồi 3,40 lần, chồi nhỏ, lá xanh nhạt. Như vậy khi bổ sung thêm Kinetin có nồng độ từ 0,2 mg/l đến 0,5 mg/l cho hệ
số nhân chồi tăng dần và đạt kết quả cao nhất ờ nồng độ 0,5 mg/l là 4,24 lần. Khi tiếp
tục tăng nồng độ Kinetin lên 1,0 mg/l đến 1,5 mg/l thì hệ số nhân chồi không tăng mà
lại giảm xuống còn 3,64 lần và 3,40 lần.
Như vậy nồng độ Kinetin tốt nhất để kết hợp với BAP 1,0 mg/l cho nhân nhanh
in vitro Hoàng tinh trắng là 0,5 mg/l.
Hình 3.4. Mẫu Hoàng tinh trắng cấy trong môi trường nhân nhanh chồi có bổ sung
BAP 1,0 mg/l + Kinetin 0,5 mg/l
3.4. Sự khác nhau của nồng độ IAA, NAA, IBA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh
trắng
Các mẫu chồi sau khi nhân nhanh đạt tiêu chuẩn về chiều cao (5 – 7 cm) và số
lá (3 - 4 lá) sẽ được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ để tạo thành cây hoàn chỉnh.
Môi trường ra rễ là môi trường cơ bản MS có bổ sung 30g/l saccarose, 6 g/l Agar và
chất kích thích ra rễ (IAA, NAA, IBA) ở các nồng độ khác nhau và theo dõi sau 30
ngày nuôi cấy
31
.
* Kết quả nghiên cứu sự khác nhau của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ
Hoàng tinh trắng
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ của chồi Hoàng tinh
trắng được thể hiện trong bảng 3.5
Bảng 3.5. Sự khác nhau của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng
Chiều Nồng Số rễ Thời Số mẫu Tỷ lễ dài rễ Công độ trung gian ra Chỉ số Chất nuôi cấy mẫu ra trung thức IAA bình/mẫu rễ ra rễ lượng rễ (mẫu) rễ (%) bình (mg/l) (cái) (ngày) (cm)
Rễ nhỏ CT 1 27,00 5,30 0 45 31,11 2,55 2,08 màu vàng (ĐC) nâu
Rễ nhỏ, CT 2 26,00 9,74 0,3 45 42,22 4,20 2,32 trắng
Rễ mập, CT 3 24,00 13,25 0,5 45 75,55 5,00 2,65 trắng
Rễ nhỏ, CT 4 25,00 11,26 1,0 45 62,22 4,54 2,48 trắng
Rễ nhỏ, CT 5 26,00 8,10 2,0 45 51,11 3,70 2,19 trắng
7,94 0,3 0,1 LSD0,05
CV% 8,0 4,0 2,2
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy: Các nồng độ IAA khác nhau cho kết quả tạo rễ
khác nhau với độ tin cậy 95 %. Khi bổ sung IAA vào môi trường đều cho tỷ lệ ra rễ
của các chồi cao hơn công thức đối chứng không bổ sung IAA. Khi tăng nồng độ IAA
từ 0,3 mg/l đến 0,5 mg/l thì tỷ lệ chồi ra rễ tăng từ 42,22 % lên 75,55 %; Tương tự số
32
rễ trung bình/chồi cũng tăng lên từ 4,20 rễ lên 5,00 rễ và chiều dài trung bình của rễ
cũng tăng từ 2,32 cm lên 2,65 cm; Chỉ số ra rễ từ 9,74 lên 13,25. Nhưng khi tăng nồng
độ IAA từ 1,0 mg/l - 2,0 mg/l thì tỷ lệ ra rễ giảm xuống tương ứng là 62,22 % và
51,11 %; số rễ trung bình/chồi giảm xuống từ 4,54 rễ xuống 3,70 rễ và chiều dài rễ
trung bình từ 2,48 cm xuống 2,19 cm; chỉ số ra rễ 11,26 xuống 8,10. Công thức đối
chứng không bổ sung chất kích thích ra rễ IAA cho tỉ lệ mẫu ra rễ là 31,11 %; số rễ
trung bình/chồi 2,55 rễ và chiều dài rễ trung bình 2,08 cm; chỉ số ra 5,30, rễ nhỏ màu
vàng nâu. Công thức 3 cho chất lượng rễ tốt nhất: rễ mập và trắng, các công thức khác
cho chất lượng rễ kém hơn, rễ nhỏ, trắng.
Môi trường ra rễ cũng tương tự như môi trường nhân nhanh khi bổ sung các
chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ cao hay thấp đều ảnh hưởng đến quá trình ra rễ
của chồi, nồng độ quá cao cũng sẽ gây ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của tế
bào, hạn chế khả năng ra rễ của chồi. Ở công thức 3 thời gian ra rễ sớm nhất là 24,00
ngày, tiếp đến là công thức 4 với 25,00 ngày và ra rễ chậm nhất là công thức đối
chứng với 27,00 ngày.
Như vậy, công thức 3 với IAA nồng độ 0,5 mg/l cho kết quả tỉ lệ ra rễ của chồi
Hoàng tinh trắng tốt nhất với cho tỉ lệ mẫu ra rễ là 75,55 %; số rễ trung bình/chồi 5,00
rễ và chiều dài rễ trung bình 2,65 cm; chỉ số ra rễ 13,25, rễ nhỏ mập và trắng.
* Sự khác nhau của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Hoàng
tinh trắng được thể hiện trong bảng 3.6
33
Bảng 3.6. Sự khác nhau của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh
trắng
Công thức Chỉ số ra rễ Chất lượng rễ Nồng độ NAA (mg/l) Số mẫu nuôi cấy (mẫu) Tỷ lễ mẫu ra rễ (%) Số rễ trung bình/chồi (cái) Thời gian ra rễ (ngày) Chiều dài rễ trung bình (cm)
0 45 31,11 2,55 2,08 29,00 5,30 CT 1 (ĐC)
45 CT 2 0,3 88,89 5,03 2,83 25,00 14,23
45 CT 3 0,5 77,78 4,58 2,67 26,00 12,23
45 CT 4 1,0 55,55 3,69 2,55 28,00 9,41
45 CT 5 2,0 42,22 3,15 2,27 28,00 7,15
Rễ nhỏ màu vàng nâu Rễ mập, trắng Rễ nhỏ, trắng Rễ nhỏ, trắng Rễ nhỏ, trắng 6,87 0,4 0,11 LSD0,05
CV% 6,2 5,6 2,4
Kết quả xử lý số liệu với độ tin cậy 95 % ta thấy nồng độ NAA khác nhau cho
kết quả ra rễ của chồi Hoàng tinh trắng khác nhau.
Trong 5 công thức thí nghiệm thì công thức đối chứng không sử dụng chất điều
hòa sinh trưởng NAA là công thức cho kết quả ra rễ thấp nhất với tỉ lệ mẫu ra rễ 31,11
%; số rễ trung bình/chồi 2,55 rễ và chiều dài rễ trung bình 2,08 cm; chỉ số ra rễ 5,30;
rễ nhỏ màu vàng nâu.
Khi bổ sung NAA nồng độ từ 0,3 (mg/l) tăng dần đến 2,0 (mg/l) vào môi
trường ra rễ kết quả cho thấy công thức 2 khi bổ sung NAA với nồng độ 0,3 (mg/l)
cho hiệu quả ra rễ cao nhất với tỉ lệ mẫu ra rễ 88,89 %; số rễ trung bình/chồi 5,03 rễ
và chiều dài rễ trung bình 2,83 cm; chỉ số ra rễ 14,23; rễ mập và trắng.
Tăng nồng độ NAA từ 0,5 (mg/l) lên đến 2,0 (mg/l) thì hiệu quả ra rễ giảm
dần tương ứng với tỷ lễ mẫu ra rễ giảm từ 77,78 % xuống còn 42,22 %; Số rễ trung
bình/chồi từ 4,58 rễ xuống 3,15 rễ; Chiều dài rễ trung bình từ 2,67 xuống 2,27 cm
và chỉ số ra rễ 12,23 xuống 7,15; các rễ đều nhỏ và trắng.
34
Công thức 2 có thời gian ra rễ sớm nhất là 25,00 ngày, tiếp đến là công thức
3 với 26,00 ngày, công thức 4,5 với 28,00 ngày và lâu nhất là công thức đối chứng
với 29,00 ngày.
Như vậy, công thức 2 với nồng độ NAA 0,3 mg/l là công thức tốt nhất cho khả
năng ra rễ của chồi Hoàng tinh trắng in vitro.
* Kết quả nghiên cứu sự khác nhau của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ
Hoàng tinh trắng
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Hoàng tinh
trắng được thể hiện trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Sự khác nhau của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng
Chiều Thời Số mẫu Tỷ lễ Số rễ Nồng độ dài rễ gian ra Công nuôi mẫu trung Chỉ số Chất IBA trung rễ thức cấy ra rễ bình/chồi ra rễ lượng rễ (mg/l) (ngày) bình (mẫu) (%) (cái) (cm)
Rễ nhỏ CT 1 27,00 5,30 0 45 31,11 2,55 2,08 màu vàng (ĐC) nâu
Rễ nhỏ, CT 2 25,00 7,60 0,3 45 55,55 3,44 2,21 trắng
Rễ nhỏ, CT 3 25,00 13,05 0,5 45 84,45 4,47 2,92 trắng
Rễ mập, CT 4 24,00 15,77 1,0 45 97,78 5,09 3,10 trắng
Rễ nhỏ, CT 5 26,00 10,69 2,0 45 71,11 4,16 2,57 trắng
7,60 0,24 0,08 LSD0,05
CV% 5,9 3,2 1,7
35
Kết quả xử lý số liệu cho thấy khi bổ sung IBA vào môi trường ra rễ đều cho
kết quả ra rễ cao hơn công thức đối chứng không bổ sung IBA.
Khi bổ sung chất điều hòa sinh trưởng IBA với nồng độ tăng lên từ 0,3 mg/l
đến 1,0 mg/l thì tỷ lệ mẫu ra rễ tăng lên từ 55,55 % - 97,78 %; số rễ trung bình/chồi
cũng tăng lên từ 3,44 - 5,09 rễ và chiều dài rễ trung bình tăng lên từ 2,21 - 3,10 cm;
Chỉ số ra rễ từ 7,60 – 15,77 nhưng khi nồng độ IBA tiếp tục tăng lên đến 2,0 mg/l thì
tỷ lệ mẫu ra rễ giảm xuống còn 71,11%; Số rễ trung bình/chồi 4,16 rễ; và chiều dài rễ
trung bình giảm xuống còn 2,57cm.
Công thức 4 có thời gian ra rễ sơm nhất với 24,00 ngày, tiếp đến là công thức 3
và công thức 2 với 25,00 ngày và thấp nhất là công thức đối chứng với 17,00 ngày.
Như vậy, nồng độ IBA tốt nhất cho khả năng ra rễ in vitro Hoàng tinh trắng là
1,0 mg/l (công tức 4) với với tỉ lệ mẫu ra rễ 97,78 %; Số rễ trung bình/chồi 5,09 rễ và
chiều dài rễ trung bình 3,10 cm; chỉ số ra rễ 15,77; Rễ mập và trắng.
Hình 3.5. Mẫu Hoàng tinh trắng cấy trong môi trường có bổ sung IBA 1,0mg/l sau
30 ngày theo dõi
* So sánh giữa 3 chất điều hòa sinh trưởng IAA, NAA, IBA đến khả năng ra
rễ Hoàng tinh trắng
Kết quả so sánh giữa 3 chất điều hòa sinh trưởng IAA, NAA, IBA đến khả năng
ra rễ Hoàng tinh trắng được thể hiện qua biểu đồ 3.3
36
Biểu đồ 3.3. Biểu đồ so sánh kết quả ra rễ giữa 3 chất điều hòa sinh
trưởng IAA, NAA, IBA
Dựa vào kết quả ở bảng 3.5, 3.6 và 3.7 và biểu đồ 3.3 cho thấy khi bổ sung chất
điều hòa sinh trưởng IBA với nồng độ 1,0 mg/l vào môi trường cho kết quả ra rễ chồi
Hoàng tinh trắng tốt nhất so với chất điều hòa sinh trưởng IAA (0,5 mg/l) , NAA (0,3
mg/l) với tỷ lệ mẫu ra rễ đạt 97,78 %; số rễ trung bình/chồi là 5,09 rễ và chiều dài rễ
trung bình là 3,10 cm, chỉ số ra rễ 15,77, thời gian ra rễ 24,00 ngày, các rễ mập và
trắng.
Hình 3.6. Hình ảnh chồi Hoàng tinh trắng ra rễ khi bổ sung các chất kích thích
ra rễ khác nhau
37
3.5. Đề xuất một số giải pháp bảo tồn, phát triển loài Hoàng tinh trắng từ kết quả
nghiên cứu
Hoàng tinh trắng là một loài dược liệu quý cần được bảo tồn và phát triển. Đặc
điểm sinh thái của loài Hoàng tinh trắng thường mọc rải rác ở vùng núi, ven rừng tự
nhiên và dọc các khe suối do vậy nên người dân thường thu hái và khai thác một cách
bừa bãi và triệt để (nhổ cả cụm củ) nên muốn bảo tồn loài Hoàng tinh trắng các cơ
quan chức năng cần kết hợp với người dân địa phương xây dựng bản đồ phân bố loài
Hoàng tinh trắng và có các chính sách khai thác hợp lý.
Cần kết hợp song song giữa việc bảo tồn và phát triển loài Hoàng tinh trắng
bằng cách mở rộng nghiên cứu các đặc điểm sinh thái, đặc điểm phân bố, đặc điểm
sinh học trên cơ sở đó lựa chọn những nguồn gen tốt để xây dựng các vườn giống gốc
cung cấp nguồn nghuyên liệu phục vu cho công tác nghiên cứu chọn lọc giống.
Phương pháp nhân giống hiện đại tạo ra cây giống với số lượng lớn, nguồn gen
đảm bảo, độ đồng đều cao và sạch bệnh hiện nay chính là áp dụng phương pháp nhân
giống nuôi cấy mô tế bào (in vitro).
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở khoa học và áp dụng vào thực tiễn
công tác nhân giống in vitro loài Hoàng tinh trắng để tạo ra số lượng cây giống lớn,
chất lượng cây giống tốt cung cấp cho người dân các địa phương mở rộng sản xuất và
tăng thu nhập, nâng cao đời sống của người dân.
Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng chỉ ra rằng nhân giống in vitro cây Hoàng
tinh trắng nói riêng và các loài cây dược liệu nói chung hiện nay là một trong những
định hướng tiên tiến hiện đại hiện nay nên áp dụng trong công tác bảo tồn và phát triển
các loài cây dược liệu.
Hiện nay chi phí để tạo ra một cây giống từ phương pháp nuôi cấy mô tế bào (in
vitro) vẫn còn khá cao, với đề tài nghiên cứu này tác giả mong muốn sẽ có nhiều nhà
khoa học khác nghiên cứu về các biện pháp nhân giống nuôi cấy mô tế bào hơn nữa để
áp dụng vào thực tế sản xuất giảm được chi phí sản xuất cây giống đảm bảo mọi người
dân vùng núi hay đồng bằng đều có thể mua và trồng được các nguồn giống cây tốt
đem lại hiệu quả cao. Qua đây tác giả cũng mong muốn nhà nước, các cơ quan, tổ
chức đoàn thể có nhiều chương trình, dự án, chính sách hỗ trợ người dân về giống để
38
người dân được tiếp cận với khoa học kỹ thuật, được sử dụng nguồn giống tốt đảm bảo
chất lượng đưa vào trồng trọt để thu được hiệu quả kinh tế cao, nâng cao đời sống vật
chất và tinh thần.
39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
- Phương pháp khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng với HgCl2 0,1 % trong thời
gian 5 phút cho kết quả mẫu vô trùng tốt nhất với tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt
88,89 %, tỉ lệ mẫu sống bị nhiễm 8,89 % và tỷ lệ mẫu chết là 2,22 %.
- Sử dụng GA3 nồng độ 1,0 mg/l là nồng độ tốt nhất cho tái sinh chồi Hoàng tinh
trắng với tỉ lệ mẫu tái sinh là 95,55 %; thời gian bật chồi là 20 ngày, chồi mập lá xanh.
- Môi trường thích hợp nhất cho sự nhân nhanh chồi Hoàng tinh trắng là: MS cơ
bản + đường sucrose 30g/l + agar 6,0g/l + BAP 1,0 mg/l + kinetin 0,5 mg/l cho kết quả
với hệ số nhân chồi đạt 4,24 lần, chồi mập và lá xanh đậm.
- Môi trường thích hợp nhất cho sự ra rễ của chồi Hoàng tinh trắng là: MS cơ
bản + đường sucrose 30g/l + agar 6,0g/l + IBA 1,0 mg/l cho kết quả với với tỉ lệ mẫu
ra rễ đạt 97,78 %; số rễ trung bình/chồi là 5,09 rễ và chiều dài rễ trung bình là 3,10
cm, chỉ số ra rễ 15,77, thời gian ra rễ 24,00 ngày, các rễ mập và trắng.
- Một số giải pháp về bảo tồn và phát triển loài Hoàng tinh trắng từ kết quả
nghiên cứu: Kết hợp giữa các cơ quan chức năng và người dân xây dựng bản đồ
phân bố loài Hoàng tinh trắng và có chính sách khai thác hợp lý. Kết hợp song song
giữa bảo tồn và phát triển loài Hoàng tinh trắng. Áp dụng biện pháp nhân giống in
vitro trong việc sản xuất giống chất lượng cao.
2. Kiến nghị
Cần nghiên cứu thêm các biện pháp nhân giống in vitro, các loại chất kích thích
sinh trưởng khác với các nồng độ khác nhau để đem lại hiệu quả nhân giống in vitro
cao hơn nữa. Nghiên cứu thêm các giai đoạn ra ngôi và chăm sóc ngoài vườn ươm sau
in vitro để quy trình nhân giống tạo ra cây con Hoàng tinh trắng được hoàn thiện hơn.
40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Ngô Triệu Anh (2011). Y Dược học Trung Hoa, NXB Y học
2. Bộ Khoa Học và Công Nghệ (2007). Sách đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa
học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội.
3. Võ Văn Chi (1997). Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 937 - 938.
4. Nguyễn Thị Phương Dung (2002), “Góp phần nghiên cứu chế biến vị thuốc
Hoàng tinh”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội.
5. Trịnh Đình Đạt (2007), Công nghệ Sinh học - T4, Nxb Giáo dục
6. Trần Ngọc Hải (2014), Khai thác và phát triển nguồn gen hai loài cây thuốc
Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib. 1912) và Củ dòm (Stephania
dielsiana Y.C.Wu.1940) ở một số tỉnh vùng miền núi phía bắc, Báo cáo dự án cấp
Quốc gia, Trường ĐH Lâm nghiệp.
7. Đặng Ngọc Hùng, Hoàng Thị Phong (2013). Nghiên cứu nhân giống cây Hoàng
tinh trắng (Disporopsis longifolia) bằng hom củ tại huyện Bảo Lâm, tỉnh Cao
Bằng.
8. Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB y học.
9. Hoàng Thị Sản (2009), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục.
10. Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở Công nghệ sinh học-tập 3, Nxb Giáo dục.
11. Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nxb Nông nghiệp Hà
Nội.
12. Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
13. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009), Công nghệ Sinh học -
T2, Nxb Giáo dục.
Tiếng Anh
14. Acharya K.P. and M.B. Rokaya (2009). Ethnobotanical survey of medicinal
plants traded in the streets of Kathmandu valley. Sci. World 3: 44-48.
15. Behera K. K., Pani D. and Shahoo S. (2010), “Effect of plant growth regulator on
in vitro multiplucation of turmeric (Curcumar longa L.cv.Ranga)”, International
Journal of Biological Technology, 1(1): 16 - 23.
41
16. Bulpitt, C.J. (2005). The uses and misuses of orchids in medicine. QJM: An
Intern”, J. Medicine, 98, pp. 625-631
17. Duong Tan Nhut, Nguyen Phuc Huy, Vu Quoc Luan, Nguyen Van Binh, Nguyen
Ba Nam, Le Nu Minh Thuy, Dang Thi Ngoc Ha, Hoang Xuan Chien, Trinh
Thi Huong, Hoang Van Cuong, Le Kim Cuong and Vu Thi Hien (2011),
“Shoot regeneration and micropropagation of Panax vietnamensis Ha et Grushv.
from ex vitro leaf-derived callus”, African Journal of Biotechnology, 10(84):19499
- 19504.
18. Jala A. and Patchpoonporn W. (2012), “Effect of BA, NAA and 2,4-D on
micropropagation of Jiaogulan (Gynostemma pentaphyllum makino)”,
International Transaction Journal of Enginneering, Management, Applied Sciences
& Technologies, 3(4): 363 - 370.
19. Sen A., Goyal A.K., Ganguly K. and Mishra T. (2010), “In vitro multiplication of
Curcuma Longa Linn.- an important medicinal zingiber”, Journal of Plant Science,
4: 21 - 24.
20. Shahinozzaman M., Faruq M. O., Azad M. A. K. and Amin M. N. (2013),
“Studies on in vitro propagation of an important medicinal plant - Curcuma
zedoaria Roscoe using rhizome explants”, Persian Gulf Crop Protection Available
online, 2( 4): 1- 6.
21. Sharma G.J., Sinha S.K. and Chirangini P. (2005), “In vitro propagation and
microrhizome induction in Kaempferia galanga Linn. and Kaempferia rotunda
Linn.”, Indian Journal of Biotechnology, 4: 404 - 408
22. Pengenlly Andrew (2004), The Constituents of Medicinal Plants, Medical
Herbalist .
23. Thomas S.C.Li (2006). Taiwanese Native Medicinal Plants, Taylor & Francis
24. Winkel, G.V(2006), Finding plant Nepal, The plant Rev.11:188-191.
