Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu biến tính bề mặt QDs CdTe ứng dụng cho chế tạo nanosensor

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------

TRẦN THỊ THANH HỢP

NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH BỀ MẶT QDs CdTe

ỨNG DỤNG CHO CHẾ TẠO NANOSENSOR

Chuyên ngành

: Hóa lý thuyết và hóa lý

Mã số

: 60440119

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. NGÔ TRỊNH TÙNG

HÀ NỘI, 2014

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất của mình

đến TS. Ngô Trịnh Tùng đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ dạy tận tình giúp em hoàn

thành luận văn thạc sĩ này.

Em xin gửi lời cảm ơn các thầy cô thuộc khoa Hóa học Trường đại học Khoa

học Tự Nhiên, ĐHQG Hà Nội đã giảng dạy tận tình và hướng dẫn em trong suốt

quá trình học tập và nghiên cứu.

Em xin chân thành cảm ơn các anh, chị thuộc tập thể vật liệu polymer chức

năng và hóa học nano, viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành nhiệm vụ của mình.

Em xin gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cung cấp chấm lượng tử CdTe để em có

thể tiến hành thực nghiệm phục vụ cho luận văn.

Em cũng xin cảm ơn PGS.TS Toshiaki Taniike, cùng các bạn trong Lab.

Taniike của Viện Khoa học công nghệ tiên tiến Nhật Bản (JAIST) đã tận tình hướng

dẫn, tạo điều kiện tốt nhất trong thời gian em tiến hành nghiên cứu tại Viện.

Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã

động viên, giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành bản luận văn này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Người viết

Trần Thị Thanh Hợp

LUẬN VĂN THẠC SĨ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. 1

MỤC LỤC ................................................................................................................... 1

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ ...................................................................... 3

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

Chương 1 - TỔNG QUAN .......................................................................................... 3

1.1 Hóa chất độc hại tồn dư trong thực phẩm ..................................................... 3

1.1.1 Clenbuterol .............................................................................................. 3

1.1.2 Rhodamine B .......................................................................................... 5

1.2 Vật liệu nano và chấm lượng tử .................................................................... 7

1.2.1 Tổng quan về chấm lượng tử ....................................................................... 7

1.2.2 Tổng hợp chấm lượng tử ........................................................................... 10

1.2.3 Tính chất của Qds phát huỳnh quang ........................................................ 16

1.2.4 Chức năng hóa và biến tính bề mặt các chấm lượng tử ............................ 18

1.3 Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) ................ 22

1.3.1 Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng ............................................. 22

1.3.2 Cơ sở lý thuyết của hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng .......... 23

1.4 Nanosensor .................................................................................................. 26

1.4.1 Nanosensor là gì? .................................................................................. 26

1.4.2 Một số loại cảm biến (nanosensor) sử dụng chấm lượng tử với hiệu ứng FRET……. ......................................................................................................... 28

Chương 2 - THỰC NGHIỆM ................................................................................... 34

2.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ............................................................. 34

2.2 Sensor để xác định Rhodamine B ................................................................ 34

2.3 Nanosensor để xác định Clenbuterol ........................................................... 35

2.3.1 Vấn đề cần nghiên cứu .............................................................................. 35

2.3.2 Nguyên lý hoạt động của biosensor dựa vào hiệu ứng FRET để xác định Clenbuterol ......................................................................................................... 38

TRẦN THỊ THANH HỢP

2.3.3 Nghiên cứu biến tính bề mặt chấm lượng tử CdTe ứng dụng trong nanosensor .......................................................................................................... 39

LUẬN VĂN THẠC SĨ

2.3.4 Phản ứng diazo Clenbuterol ...................................................................... 40

2.3.5 Phản ứng cộng hợp Clenbuterol với ligand ............................................... 40

2.4 Các phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 41

2.4.1 Đo phổ hấp thụ UV-Vis ........................................................................ 41

2.4.2 Đo phổ phát xạ huỳnh quang ................................................................ 42

2.4.3 Phương pháp đo phổ hồng ngoại .......................................................... 43

2.4.4 Phương pháp đo thời gian sống huỳnh quang ...................................... 44

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 45

3.1 Sensor xác định Rhodamine B .................................................................... 45

3.2 Nanosensor để xác định Clenbuterol ........................................................... 51

3.3 Diazo clenbuterol ......................................................................................... 55

3.4 Phản ứng cộng hợp của diazo clenbuterol với ligand.................................. 56

3.5 Mẫu thử sensor ............................................................................................ 59

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 61

TRẦN THỊ THANH HỢP

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 62

LUẬN VĂN THẠC SĨ

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1. 1: Các phương pháp tổng hợp QDs phổ biến nhất hiện nay ........................ 12 Bảng 1. 2: So sánh tính chất của các chất huỳnh quang hữu cơ/protein và quantum dots [13]..................................................................................................................... 16 Bảng 1. 3: Bảng phân loại ba hướng chế tạo nanosensor thông dụng ...................... 27 Bảng 2. 1: Nồng độ Rhodamine B của các mẫu ....................................................... 35

DANH MỤC HÌNH VẼ

TRẦN THỊ THANH HỢP

Hình 1. 1: Công thức cấu tạo của Clenbuterol ............................................................ 3 Hình 1. 2: Cấu trúc hóa học của một vài hợp chất nhóm β2- agonist ......................... 3 Hình 1. 3: Công thức cấu tạo của Rhodamine B ......................................................... 5 Hình 1. 4: Số lượng các bài báo được xuất bản liên quan đến QDs từ 1986 đến 2012 ..................................................................................................................................... 8 Hình 1. 5: Mô hình cacboxyl hóa chấm lượng tử CdTe ........................................... 19 Hình 1. 6: Liên kết hóa trị giữa Qds và các phân tử sinh học ................................... 20 Hình 1. 7: Tạo liên kết trực tiếp với Qds .................................................................. 20 Hình 1. 8: Tương tác tĩnh điện giữa Qds với phân tử sinh học ................................. 21 Hình 1. 9: Mô hình hiệu ứng FRET .......................................................................... 22 Hình 1. 10: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET.[22] ....................................... 23 Hình 1. 11: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất cho và nhận. Khu vực màu đỏ nâu là sự chồng chéo quang phổ giữa quang phổ huỳnh quang của các chất cho và phổ hấp thụ của chất nhận.[28] .............................................................. 24 Hình 1. 12: Quang phổ huỳnh quang của chất cho và chất nhận và dung dịch hỗn hợp của chất cho và chất nhận .................................................................................. 25 Hình 1. 13: Mô hình cơ chế hoạt động của Sensor hiệu ứng FRET dùng Qd của Mauro[32].................................................................................................................. 28 Hình 1. 14: Mô hình và cơ chế hoạt động của Biosensor DNA nano Qd (a,b) và thiết bị kiểm tra (c).[29] .................................................................................................... 30 Hình 1. 15: Sơ đồ cảm biến FRET cơ bản để phát hiện các protease hoạt động. (A) Quá trình FRET thông thường (B) FRET sử dụng QDs. D và A cho các nhà tài trợ năng lượng và chấp nhận năng lượng, tương ứng. .................................................... 31 Hình 1. 16: Minh họa sơ đồ của nanosensor QD-FRET để phân tích hoạt động của enzyme. ..................................................................................................................... 32 Hình 2. 1: Phổ hấp thụ của Clenbuterol và phổ phát xạ của Qds CdTe .................... 36 Hình 2. 2: Các hợp chất napthol, naphtyl có khả năng tạo hợp chất azo tiêu biểu .. 37 Hình 2. 3: Mô hình phản ứng của Naphtylethylene diamine với Qd và diazo clenbuterol ................................................................................................................. 38 Hình 2. 4: Mô hình nanosensor ................................................................................. 38

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TRẦN THỊ THANH HỢP

Hình 2. 5: Mô hình hoạt động của nanosensor khi có thêm chất cần nhận biết Clenbuterol ................................................................................................................ 39 Hình 2. 6: Tương tác tĩnh điện giữa Qd và Naphtylethylene diamine ...................... 39 Hình 2. 7: Phản ứng diazo clenbuterol ...................................................................... 40 Hình 2. 8: Phản ứng cộng hợp giữa Naphtylethylene diamin và diazo clenbuterol . 40 Hình 2. 9: Sơ đồ mô tả hệ đo quang phổ hấp thụ UV-Vis ....................................... 41 Hình 2. 10: Sơ đồ khối của phép đo quang huỳnh quang ......................................... 42 Hình 2. 11: Sơ đồ khối thiết bị đo thời gian sống huỳnh quang ............................... 44 Hình 3. 1: Ảnh TEM của chấm lượng tử CdTe trong dung dịch .............................. 45 Hình 3. 2: Phổ hấp thụ và phát xạ của chấm lượng tử CdTe được dùng trong luận văn này ...................................................................................................................... 45 Hình 3. 3: Phổ hấp thụ của chất màu rhodamine B ở các nồng độ khác nhau .......... 46 Hình 3. 4: Phổ huỳnh quang của Qds và hấp thụ của chất màu Rhodamine b ......... 47 Hình 3. 5: Mô tả tương tác tĩnh điện giữa QDs CdTe và Rhodamine B ................... 48 Hình 3. 6: Phổ huỳnh quang của cặp CdTe/Rhodamine B với nồng độ Rhodamine B ................................................................................................................................... 48 Hình 3. 7: Đường biểu diễn phân rã huỳnh quang của CdTe trong sự không có ..... 50 Hình 3. 8: Phổ hấp thụ của Naphtylethylene diamin và phổ phát xạ của Qd ........... 51 Hình 3. 9: Phổ phát xạ của Qd và hỗn hợp Qd- Naphtylethylene diamin ................ 52 Hình 3. 10: Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang của Qd- Naphtylethylene diamin vào pH ....................................................................................................................... 53 Hình 3. 11: Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang của Qd- Naphtylethylene diamin vào nhiệt độ ............................................................................................................... 54 Hình 3. 12: Phổ hấp thụ của hợp chất Diazo Clenbuterol ......................................... 55 Hình 3. 13: Phổ hấp thụ của hợp chất Clenbuterol- Naphtylethylene diamin .......... 56 Hình 3. 14: Phổ hấp thụ và phát xạ của chất cho (QD CdTe bước sóng phát xạ 530nm) và chất nhận (tổ hợp Clenbuterol- Naphtylethylene diamin) ...................... 57 Hình 3. 15: Phổ trùng chập của chất cho và chất nhận ............................................. 57 Hình 3. 16: Phổ hồng ngoại của muối diazo ............................................................. 58 Hình 3. 17: Sự thay đổi cường độ huỳnh quang theo nồng độ Clenbuterol ............. 59 Hình 3. 18: Tương quan giữa nồng độ Clenbuterol với cường độ phát xạ của nanosensor ................................................................................................................. 60

LUẬN VĂN THẠC SĨ

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Quantum dots QDs

Nano mét nm

Trioctylphosphine TOP

TOPO Trioctylphosphine oxide

Cadimium Cd

Tellurium Te

Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang FRET

Deoxyribonucleic acid DNA

Huỳnh quang HQ

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN

Sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ELISA

Axit 3-mercaptopropionic MPA

TRẦN THỊ THANH HỢP

Axit mercapto succinic MSA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

MỞ ĐẦU

Khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khoẻ của con người ngày càng

được chú trọng, trong đó vấn đề an toàn thực phẩm và vệ sinh môi trường được đặt

lên hàng đầu vì nó có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ của con người, hơn nữa đó

cũng là vấn đề đáng quan tâm của các khu chế biến, sản xuất và xuất nhập khẩu

thực phẩm. Sự tồn dư của các chất độc hại có trong thực phẩm đang là vấn đề đáng

lo ngại đối với người tiêu dùng. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ

thuật, nhiều kỹ thuật phân tích mới, hiện đại đã được áp dụng trong nhiều lĩnh vực

khác nhau đặc biệt trong đánh giá, kiểm định các chất gây độc trong thực phẩm.

Trong quá trình chế biến thực phẩm, để tạo cho thực phẩm màu sắc đẹp, bắt

mắt, người ta sử dụng phẩm màu công nghiệp. Phẩm màu công nghiệp nói chung,

Rhodamine B nói riêng đều độc hại, bị cấm sử dụng trong thực phẩm vì khó phân

huỷ. Tuỳ từng cơ thể mà ảnh hưởng đến gan, thận hoặc tồn dư lâu ngày gây độc hại

đến cơ thể con người, đặc biệt có thể gây ung thư.

Đặc biệt trong thời gian gần đây vấn đề thịt lợn siêu nạc được tạo nạc bằng chất

hóa học Clenbuterol rất nguy hiểm đối với sức khỏe con người. Nếu ăn phải có thể

gây ngộ độc cấp với các triệu chứng: run cơ, đau tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp,

choáng váng, thậm chí tử vong. Chất độc thường tập trung trong nội tạng của gia

súc như gan, cật, nước tiểu…và không bị phân hủy ở nhiệt độ cao khi đun nấu. Vì

vậy việc nghiên cứu xác định hàm lượng của Rhodamine B- một thành phần của

phẩm nhuộm trong thực phẩm và Clenbuterol trong thịt là vấn đề cần thiết đối với

sức khoẻ cộng đồng.

Hiện nay, một hướng nghiên cứu mới trên thế giới đang tập trung vào việc ứng

dụng khoa học và công nghệ nano mà ở đây là nanosensor nhằm phát hiện dư lượng

chất hóa học độc hại còn tồn dư trong thực phẩm. Để góp phần vào xu hướng phát

triển chung này tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu biến tính bề mặt QDs CdTe ứng dụng

cho chế tạo nanosensor”. Bằng sự thay đổi cường độ phát huỳnh quang của các

TRẦN THỊ THANH HỢP

1

chấm lượng tử CdTe trong hiệu ứng FRET theo nồng độ của Rhodamine B và

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Clenbuterol mà định lượng và định tính chúng. Nanosensor dựa vào hiệu ứng truyền

năng lượng cộng hưởng huỳnh quang với chất cho là QDs CdTe xác định dư lượng

chất hóa học với độ nhạy cao, phương pháp đơn giản chính xác. Kết quả thu được là

TRẦN THỊ THANH HỢP

2

triển vọng phát triển và hoàn thiện nanosensor ứng dụng trong thực tế.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chương 1- TỔNG QUAN

1.1 Hóa chất độc hại tồn dư trong thực phẩm

1.1.1 Clenbuterol

Hình 1. 1: Công thức cấu tạo của Clenbuterol

 Tên Hóa học: Clenbuterol

 Tên hóa học do tổ chức IUPAC:

1-(4-amino-3,5-dichlorophenyl)-2-(tertbutylamino)ethanol

 Cấu trúc phân tử: C12H18Cl2N2O

 Khối lượng phân tử: 277,19 g/mol

Clenbuterol là một chất trong những hợp chất thuộc họ β- agonist (hình 1.2) -

những hợp chất dùng trong chăn nuôi, đặc biệt là chăn nuôi heo để kích thích heo

tăng trưởng và cho thịt siêu nạc.

TRẦN THỊ THANH HỢP

3

Hình 1. 2: Cấu trúc hóa học của một vài hợp chất nhóm β2- agonist

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Clenbuterol có tác dụng dãn phế quản, dãn cơ trơn ở cuống phổi, điều khiển các

chất dinh dưỡng hướng tới mô cơ. Clenbuterol kích thích tuyến thượng thận, điều

tiết sinh trưởng động vật, thúc đẩy quá trình phát triển cơ bắp, làm tăng

lượng thịt nạc và đẩy nhanh việc phân giải mỡ, giảm tối đa lượng mỡ hình thành

trong cơ thể, chỉ để lại một lớp rất mỏng. Từ những năm 1980, clenbuterol đã được

bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn, bò thịt, gà thịt... nhằm kích thích sinh trưởng,

tăng tỉ lệ thịt nạc, giảm chi phí thức ăn. Tuy nhiên, lượng clenbuterol tồn dư trong

thực phẩm làm rối loạn nhịp tim, run cơ, co thắt phế quản, phù nề, liệt cơ, tăng

huyết áp gây nguy hiểm đối với sức khoẻ con người. Clenbuterol trộn vào thức ăn

gia súc nhằm tạo ra vật nuôi siêu nạc, mau lớn. Clenbuterol có tác dụng đẩy nhanh

quá trình đốt cháy mỡ, tăng cường phát triển cơ bắp nhưng dùng quá liều sẽ khiến

cơ thể mang bệnh và có thể dẫn đến tử vong.

Việc ăn phải thịt lợn chứa chất Clenbuterol về lâu dài có thể gây biến chứng ung

thư, ngộ độc cấp, run cơ, đau tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, choáng váng…

Clenbuterol sẽ gây tổn hại cho hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, thậm chí gây chết người.

Đối với gia súc như lợn, con vật khi ăn phải chất này chỉ có thể tồn tại được quá nửa

tháng là phải giết mổ. Thời gian bán phân huỷ trong cơ thể lâu (khoảng 30 giờ), vì

vậy, đã bị cấm đưa vào thức ăn chăn nuôi ở Châu Âu từ năm 1996.Việt Nam cũng

đã cấm dùng chất này trong thức ăn chăn nuôi từ năm 2002. Tại Hồng Kông, người

sử dụng clenbuterol trong chăn nuôi bị phạt 50.000 đôla Hồng Kông và tù 6 tháng.

Các phương pháp được sử dụng cho việc xác định clenbuterol bao gồm HPLC,

GC/MS, mao dẫn điện và xét nghiệm miễn dịch (Horne et al. Năm 1998; Wasch et

al. Năm 1998; Johansson et al. 2004). Van Eenoo và Delbeke (2002) đã phát hiện

clenbuterol khi sử dụng GC/MS, với giới hạn là 0,1 ng ml-1 trong nước tiểu ngựa.

Niegocki et al. (2003) xử lý các mẫu bằng cách chiết pha-rắn, đạt được một giới hạn

phát hiện là 0,5 ng ml-1 trong nước tiểu. Để đơn giản hóa quá trình chiết clenbuterol

từ các mẫu thí nghiệm, một số phương pháp mới đã được thiết lập. Roda et al.

TRẦN THỊ THANH HỢP

4

(2000) đã báo cáo cách xác định clenbuterol với độ nhạy được cải thiện.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hiện nay phân tích hàm lượng chất siêu vết ở dạng ppb, ppt chỉ có thể áp dụng

sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) hoặc phương pháp ELISA. Những phương pháp

này thường yêu cầu sự chuẩn bị mẫu công phu và tốn nhiều thời gian, vì vậy gặp

nhiều trở ngại trong chăn nuôi gia súc và thủy sản, khó khăn trong quản lý thị

trường. Chính vì lẽ đó một số phòng thí nghiệm ở các nước phát triển như Mỹ,

Nhật, Châu Âu, Trung quốc đang nghiên cứu chế tạo Biosensor theo công nghệ

nano để mục đích phát hiện nhanh, độ nhạy cao dư lượng Clenbuterol.

1.1.2 Rhodamine B

Hình 1. 3: Công thức cấu tạo của Rhodamine B

 Tên Hóa học: Rhodamine B

 Tên hóa học do tổ chức IUPAC:

[9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]-diethylammonium chloride

 Cấu trúc phân tử: C28H31ClN2O3

 Khối lượng phân tử: 479,02g/mol

Rhodamine B là một thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt trong methanol,

ethanol, nước (khoảng 50 g/l). Độ hoà tan trong 100 gam dung môi: nước 0,78 gam

(260C), rượu etylic 1,74 gam. Dung dịch nước và rượu etylic có màu đỏ ánh xanh

nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ trong các dung dịch loãng.

Rhodamine B gây độc cấp và mãn tính. Qua tiếp xúc, nó gây dị ứng hoặc làm

TRẦN THỊ THANH HỢP

5

mẩn ngứa da, mắt,... Qua đường hô hấp, nó gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau ngực.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Qua đường tiêu hóa, nó gây nôn mửa, có hại cho gan và thận. Nếu tích tụ dần trong

cơ thể nó gây nhiều tác hại đối với gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh cũng như có

thể gây ung thư. Thực nghiệm trên chuột cho thấy Rhodamine B gây ung thư với

liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống hoặc tiêm vào tĩnh mạch, khi Rhodamine B

đi vào cơ thể có thể chuyển hóa thành amin thơm tương ứng có phần độc hại hơn

loại Rhodamine B thường, gây ung thư và phát triển khối u dạ dầy, tại đây

Rhodamine B và dẫn xuất của nó sẽ tác động mạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa

của tế bào gây ung thư gan, vì gan là cơ quan tạng đầu tiên lọc chất Rhodamine B.

Một số thực nghiệm khác cho thấy Rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc ADN và

nhiễm sắc thể khi đưa vào nuôi cấy tế bào.

Rhodamine B thường được sử dụng như một thuốc nhuộm tracer trong nước để

xác định tốc độ và hướng của dòng chảy vận chuyển. Được sử dụng rộng rãi trong

các ứng dụng công nghệ sinh học như kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng

chảy, quang phổ huỳnh quang. Rhodamine B đang được thử nghiệm để sử dụng như

một bio maker trong vacxin bệnh dại cho động vật hoang dã, như gấu trúc, để xác

định động vậthoang dã đã có thuốc phòng ngừa bằng cách cho Rhodamine B vào

râu và răng của động vật. Nó cũng được trộn vào thuốc diệt cỏ. Ngoài ra

Rhodamine B còn được sử dụng để tạo mầu và nhuộm mầu trong công nghiệp sợi,

nhuộm màu trong phòng thí nghiệm, để xét nghiệm tế bào do tính bền mầu.

Rhodamine B được sử dụng trong sinh học như là một thuốc nhuộm huỳnh quang.

Tận dụng đặc tính phát quang của Rhodamine B, người ta dùng chúng để giúp kiểm

soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây ớt, cây lấy dầu, Rhodamine B có thể

thấm vào ớt nếu dính dầu trong máy ép ớt, phơi ớt trên sàn được sơn cũng có thể

gây lây nhiễm chất nhuộm trên. Ủy ban Gia vị còn khuyến cáo không đựng các túi

cói nhuộm màu do nghi ngại chất nhuộm có thể thẩm lậu vào sản phẩm. Mặt khác

con đường thâm nhập hóa chất này vào các sản phẩm cây trồng hầu như không ai để

ý đến từ trước đến nay và nhất là chúng lại diễn ra ở nhiều nước đang phát triển.

TRẦN THỊ THANH HỢP

6

Ngoài ra, không chỉ với ớt bột hay các chất gia vị nói chung, chất tạo mầu

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Rhodamine B có nguy cơ xuất hiện trong hầu hết các sản phẩm lương thực, thực

phẩm đi từ cây trồng có dùng phân bón hóa học.

Hiện nay, Rhodamine B được xác định bằng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC), phương pháp UV-Vis, trong đó, phương pháp tối ưu nhất để xác

định Rhodamine B là sắc ký lỏng hiệu năng cao vì có độ chính xác, độ nhạy và độ

lặp lại cao. Rhodamine B trong mỹ phẩm được phân tích bởi L. Gagliardi, D. De

Orsi, G. Multari, D. Tonelli. Kết quả phân tích mẫu thực cho thấy dung dịch chứa

0.3µg/ml, pic xuất hiện ở 9.15 phút. Tác giả J.W.Hofstraat và cộng sự đã ứng dụng

kỹ thuật chiết pha rắn và sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang để xác

định Rhodamine B trong nước bề mặt. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10

pg/l. Tại Việt Nam, viện kiểm nghiệm thuốc trung ương đã tiến hành phân tích

Rhodamine B trên các mẫu dược liệu. Kết quả phân tích cho thấy trong dược liệu có

chứa Rhodamine B. Tháng 4 năm 2011, Việt Nam cũng đã đề xuất TCVN 8670-

2011 về việc xác định Rhodamine B bằng HPLC trên cơ sở của viện kiểm nghiệm

an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã xây dựng và thực nghiệm cho một số loại

thực phẩm có nhuộm màu.

1.2 Vật liệu nano và chấm lượng tử

1.2.1 Tổng quan về chấm lượng tử

Các nano tinh thể bán dẫn cũng được biết đến là các chấm luợng tử do kích

thước rất nhỏ bé của chúng từ 1–20 nano mét (nm), thể hiện các tính chất điện tử

và quang học thú vị. Ta có thể xếp tính chất của chúng giữa các vật liệu bán dẫn

khối và các phân tử hay các nguyên tử riêng biệt. Trong vòng 20 năm gần đây, các

nghiên cứu mạnh mẽ về chấm lượng tử đã được tiến hành và đạt được các tiến bộ to

lớn trong việc tổng hợp các chấm lượng tử, cũng như trong việc hiểu biết về các

TRẦN THỊ THANH HỢP

7

tính chất quang và điện của chúng (hình 1.4) [30].

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 1. 4: Số lượng các bài báo được xuất bản liên quan đến QDs từ 1986 đến 2012

Các nano tinh thể chấm lượng tử bán dẫn là các hạt phát sáng rất bé ở kích

thước nm. Các hạt này đã được nghiên cứu một cách mạnh mẽ và phát triển cho các

ứng dụng đa dạng, ví dụ như trong các linh kiện chuyển đổi năng lượng mặt trời,

các linh kiện quang điện tử, các detector siêu nhậy, trong các linh kiện phát sáng

QD-LED, trong các ứng dụng y-sinh như hiện ảnh phân tử và tế bào [14], [25],

[37], các cảm biến sinh học nano, nano-biosensor [26]. Có thể nói, hiện nay là thời

đại của chấm lượng tử vì có rất nhiều ứng dụng hứa hẹn và nổi bật của chấm lượng

tử trong các lĩnh vực kể trên. Đặc tính nổi trội của các chấm lượng tử là hiệu ứng

giam giữ lượng tử do kích thước giảm xuống còn cỡ nm. Hiệu ứng này dẫn đến việc

các hạt tải tích điện bị giam giữ về mặt không gian, ở bên trong thể tích rất bé của

nano tinh thể. Do hiệu ứng này, các nhà khoa học có thể sử dụng kích thước của các

chấm lượng tử này để thay đổi, trong một khoảng rộng và chính xác, năng lượng

của các trạng thái điện tử gián đoạn và các dịch chuyển quang học. Kết quả là các

nhà khoa học có thể thay đổi phát xạ ánh sáng từ các hạt chấm lượng tửnày, từ

TRẦN THỊ THANH HỢP

8

vùng phổ tử ngoại, nhìn thấy, hồng ngoại gần và tới vùng phổ hồng ngoại giữa. Các

LUẬN VĂN THẠC SĨ

hạt chấm lượng tử này cũng tạo ra nhiều tính chất quang mới như là sự nhân các hạt

tải carrier multiplication, đơn hạt nhấp nháy single - particle blinking và truyền tín

hiệu phổ. Như đã viết ở trên, nm là một phần tỷcủa mét (10-9m), là cột mốc đánh

dấu ranh giới giữa lý thuyết cổ điển của Newton và lý thuyết cơ lượng tử, và như

vậy, nhiều tính chất vật lý và hóa học duy nhất và khác biệt xuất hiện trong các hạt

nano mà không có ở các vật liệu khối [9].

Công nghệ nano tinh thể bán dẫn được phát triển đầu tiên vào những năm

đầu 1980 trong các phòng thí nghiệm của Louis Brus tại Bell Laboratories và của

Alexander Efros và Alexei I. Ekimov, ở Viện Công nghệ Vật lý A.F. Ioffe ở St.

Peterburg [9]. Thuật ngữ - chấm lượng tử đã được Mark A. Reed đưa ra đầu tiên

vào năm 1988 [24], trong đó bao hàm các nano tinh thể bán dẫn phát quang, mà các

exciton của chúng bị giam giữ trong cả ba chiều không gian - sự giam giữ lượng tử.

Các điện tử và lỗ trống bị giam giữ một cách nghiêm ngặt khi bán kính

của hạt chấm lượng tử nhỏ hơn bán kính Bohr của exciton, kích thước điển hình cỡ

từ 2–20 nm. Thông thường, chúng là các hệ hai thành phần, bao gồm một lõi của

vật liệu bán dẫn rồi được bọc với một lớp vỏ của một chất bán dẫn khác. Huỳnh

quang (HQ) của chấm lượng tử được hình thành khi chấm lượng tử hấp thụ một

photon có năng lượng cao hơn năng lượng vùng cấm của vật liệu bán dẫn lõi, dẫn

đến việc một điện tử bị kích thích và được đưa lên vùng dẫn, để lại một lỗ trống ở

vùng hóa trị. Như vậy, một cặp điện tử - lỗ trống (exciton) được tạo ra. Thời gian

sống phát xạ của chấm lượng tử thì dài, cỡ từ 10-40 ns, do đó làm tăng xác suất hấp

thụ tại các bước sóng ngắn hơn và làm cho phổ hấp thụ mở rộng. Do năng lượng

vùng cấm quyết định bước sóng phát xạ photon, bởi vậy có thể kiểm soát bước sóng

phát xạ qua kích thước của hạt nano năng lượng vùng cấm tỉ lệ nghịch với bình

phương kích thước của chấm lượng tử). Các chấm lượng tửcó các tính chất vật lý

đơn nhất theo kích thước nm và thành phần tạo ra chúng. Chấm lượng tử được sử

dụng trực tiếp trong các ứng dụng liên quan đến các tính chất quang của chúng, do

sự hấp thụ mạnh, phát xạ HQ mạnh và hẹp, thay đổi theo kích thước, có độ bền

TRẦN THỊ THANH HỢP

9

quang cao so với các chất mầu hữu cơ, tốc độ bị bạc màu chậm. Phổ hấp thụ rộng

LUẬN VĂN THẠC SĨ

của các chấm lượng tử cho phép ta kích thích, tại cùng một bước sóng, kích thích

cùng một lúc các chấm lượng tử với kích thước khác nhau, trong vùng phổ rộng.

Các chấm lượng tử này có thể thay thế các chất màu hữu cơ như Rhodamine 640

trong các ứng dụng hiện ảnh sinh học, vì chúng phát quang mạnh và ít bị bạc màu

khi chiếu sáng so với chất mầu hữu cơ [33]. Không giống như các đơn phân tử

khác, các hạt chấm lượng tử chế tạo ra có thể được biến đổi bề mặt, để có các

tính chất hay chức năng cần thiết, cho các ứng dụng khác nhau.

1.2.2 Tổng hợp chấm lượng tử

Các công trình tiên phong từ những năm 1990 của P. Alivisatos ở Đại

học Berkley [6], [5], [20], của N.G. Bawendi ở Viện Công nghệ Massachusetts [3],

[2], [27] và của nhóm P. Guyot-Sionnest ở Đại học Chicago, đã dẫn đến phương

pháp mới chế tạo ra các chấm lượng tử bằng phép tổng hợp hoá học trong dung

dịch. Ta có thể chế tạo ra được hạt nano hình cầu kích thước vài nm, chứa cỡ vài

nghìn nguyên tử.

Họ chỉ ra rằng, Qd CdSe kết tinh cao, độ phân tán hẹp có thể được tổng hợp

ở nhiệt độ cao sử dụng một hỗn hợp của các tiền chất cơ kim và dung môi/ các

ligand trioctyl phosphine/trioctyl phosphine oxit (TOP/TOPO)[18]. Phản ứng tương

tự cũng được sử dụng để chế tạo lớp vỏ bọc tâm CdSe với một lớp bán dẫn có dải

vùng cấm rộng hơn như ZnS và CdS [7, 17]. Bề mặt thụ động lớp thứ hai này giữ và

làm tăng hiệu suất huỳnh quang [7, 8, 11]. Peng và các đồng nghiệp đã chế tạo ra

những sản phẩm chất lượng cao bằng cách sử dụng các tiền chất ít có khả năng tự

cháy như CdO và Cd axetate [23]. Đến nay, Qd lõi/vỏ CdSe/ZnS vẫn có giá trị nhất

cho tất cả các ứng dụng sinh học [15, 7, 21, 16]. Các Qd khác như ZnS, CdS, CdTe,

và PbSe với khoảng phát xạ từ vùng UV đến vùng IR cũng được tổng hợp, tuy

nhiên không được ứng dụng phổ biến trong các xét nghiệm sinh học [15, 16, 21].

Trong một báo cáo gần đây, Michalet đã đưa ra một miêu tả độc đáo về sự tương

quan giữa một vài vật liệu cấu tạo Qd, kích cỡ tâm của Qds và cực đại phát xạ của

TRẦN THỊ THANH HỢP

10

chúng [15]. Một vài loại Qds có thể phân tán tốt trong dung dịch nước và trong các

LUẬN VĂN THẠC SĨ

dung môi hữu cơ, hoặc có thể ở dạng bột hay phân tán trong màng mỏng chất

polymer đã được thương mại hóa từ Invitrogen Corporation (www.invitrogen.com)

hoặc Evident Technologies (www.Evidenttech.com), tuy nhiên giá thành của chúng

TRẦN THỊ THANH HỢP

11

khá đắt.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Bảng 1. 1: Các phương pháp tổng hợp QDs phổ biến nhất hiện nay

Các tiền chất Vỏ Tham khảo QDs (lõi/vỏ) Nhiệt độ (0C) Môi trường Loại tổng hợp

190-320 Ar - Murray et al.(1993) Hạt keo CdS, CdSe, CdTe

Cd(CH3)2 trong TOP Se, Te, (TMS)2S, (TMS)2Se hoặc (BDMS)2Te trong TOP

CdSe/ZnSe 23-260 Ar Danek et al. (1996)

CdSe/ZnS 300-350 Ar

Cd(CH3)2 trong TOP/TOPO Se trong TOP Cd(CH3)2 trong TOP/TOPO Se trong TOP Hines và Guyot - Sionnest (1996) Zn(C2H5)2, Se trong TOP Zn(CH3)2, (TMS)2S trong TOP

CdSe CdO, Se, HPA trong TBP/TOP 250 Ar - Peng và Peng (2001)

CdSe/ZnS Clapp et al (2007) Cd(acetylacetonate)2, Se, HAD, HDDO trong TOP/TOPO

CdSe/CdZnS 240 Ar Carion et al (2007) Cd(myristate)2, Se, oleic axit trong 1-octadecene 340-350 Ar/N2 Zn(ET)2, (TMS)2S trong TOP Zn(oleate)2, Cd(oleate)2 trong TOA

CdS 100 - N2 Nước Chen và Rosenzweig(2002)

TRẦN THỊ THANH HỢP

12

Cd(NO3)2, Na2S, Na(polyphosphate) Cd(NO3)2, Na2S, cysteine Cd(acetate)2, Na2S, cysteine Cd(acetate)2, Na2S, 1-thioglycerol

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CdS 100 - -

CdS - - - Vossmeyer et al (1994) Li et al (2006)

CdSe 90 - Liu et al (2009) Cd(ClO4)2, H2S, thiourea, 1-thioglycerol CdCl2, Na2S, poly (N-vinyl-2-pyrolidone) CdCl2, NaHSe, cysteine N2

ZnS 47 - Kho et al (2000) ZnSO4, Na2S, cysteine N2

CdTe 100 - Bao et el (2004) CdCl2, NaHTe, TGA N2

CdTe 100 - Chen et al (2010a) CdCl2, NaHTe, MPA N2

TRẦN THỊ THANH HỢP

13

100 - Wang C. Et. Al (2009) Mn-doped ZnSe Zn(NO3)2, NaHSe, MnCl2, MPA N2

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Trong đó: BDMS tert-butyldimethylsilyl; HDA hexadecylamine; HDDO 1,2-

hexadecanediol; HPA hexylphosphonic axit; MPA 3-mercaptopropionic axit; TBP

tributylphosphine; axit TGA thyoglycolic; TMS trimethylsilyl; TOA Trioctylamine;

TOP trictylphosphine; oxit TOPO trioctylphosphine.

Trong số các hợp chất bán dẫn nhóm II-VI, CdTe thu hút được nhiều sự quan

tâm chú ý bởi vì nó là một vật liệu có nãng lượng vùng cấm 1.52 eV phù hợp cho

phát xạ trong vùng phổ ánh sáng nhìn thấy bằng cách kiểm soát kích cỡ tương ứng

với sự giam hãm lượng tử của các hạt mang điện. Nó có thể phân biệt những loại

khác kháng nguyên khác nhau với các kích cỡ Qd khác nhau [34, 36]. Hơn nữa, so

sánh với CdSe, Qd CdTe dễ dàng tổng hợp hơn trong pha nước, do đó, CdTe cũng

dễ dàng sử dụng trong các ứng dụng gắn nhãn sinh học như gắn các tế bào ưng thư,

sensor vận chuyển thuốc và xác định cặn thuốc trừ sâu, cặn clenbuterol [35, 19, 31,

4, 12]. Qd CdSe được tổng hợp trong dung môi hữu cơ ở nhiệt độ sôi cao và phải

loại ligand khi ứng dụng cho biosensor. Do sự ký kết hợp tác giữa hai đơn vị Viện

Hóa học và Viện Khoa học Vật liệu, nên trong luận văn này QDs được sử dụng là

CdTe (bước sóng phát xạ 530 nm) do viện Khoa học vật liệu cung cấp. Tôi xin trình

bày quy trình chế tạo Qd CdTe nhận được. Các chấm lượng tử CdTe được tổng hợp

theo nguyên tắc là các tiền chất (ion Cd2+, Te2) phản ứng trong dung môi nước với

sự có mặt của các ligand (axit MPA 3-mercaptopropionic hoặc axit MSA mercapto

succinic) để tạo thành các hạt tinh thể, sau đó, những hạt tinh thể nhỏ bé này lớn

dần lên. MPA và MSA đóng vai trò quan trọng để chấm lượng tử có thể tồn tại ở

dạng keo. Cụ thể:

- Chuẩn bị dung dịch NaHTe (cho ion Te2-) bằng cách lấy 160 mg bột Te và

100 mg NaBH4 trong bình cầu 2 cổ, loại khí trong 30 phút và sau đó dẫn

bình cầu với khí N2 và cuối cùng thêm 2ml dung dịch nước cất. Để tăng tốc

độ phản ứng, sử dụng một máy phát siêu âm (40-50 kHz) trong 30 phút ở

nhiệt độ 50 -600C. Một dung dịch màu đỏ trong suốt của NaHTe được hình

TRẦN THỊ THANH HỢP

14

thành như phương trình phản ứng sau:

LUẬN VĂN THẠC SĨ

2NaBH4 + Te + 2H2O = NaHTe + NaBO2 + 11/2H2

- Chuẩn bị dung dịch CdBr2 (cho ion Cd2+): 12.5 mM dung dịch CdBr2 được

trộn lẫn với 18.75 mM dung dịch MPA với tỉ lệ Cd:MPA = 1:1.5 (mol/mol)

và pH của dung dịch này được điều chỉnh trong khoảng 7-12 bằng cách

thêm dung dịch NaOH 1.0M.

- Sau đó, dung dịch NaHTe 6.25 M được chuẩn bị (với tỉ lệ Cd:Te = 2:1)

được thêm nhanh vào bình cầu chứa Cd tại nhiệt độ phòng dưới điều kiện

khí N2. Hỗn hợp phản ứng ngay lập tức chuyển sang màu vàng chứng tỏ sự

hình thành các tinh thể CdTe.

Ngoài ra, Qd CdTe chất lượng cao cũng được điều chế theo cách khác từ TeO2

và CdBr2 với chất hoạt tính bề mặt MSA. Trong phương pháp tổng hợp này, TeO2

phản ứng với NaBH4 để hình thành NaHTe trong sự có mặt CdBr2, do đó các hạt

CdTe được hình thành cùng một lúc. Ưu điểm của phương pháp này là tránh tạo ra

sản phẩm trung gian NaHTe và không cần khí trơ để bảo vệ trong suốt quá trình

tổng hợp.

Kích cỡ của Qd được kiểm soát bằng thời gian từ vài phút đến vài giờ ở nhiệt độ

1200C. Mẫu Qd được giữ ở 40C trong bóng tối. Các Qds được tổng hợp trong dung

TRẦN THỊ THANH HỢP

15

dịch nước có thể sử dụng trực tiếp trong thí nghiệm gắn nhãn huỳnh quang.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

1.2.3 Tính chất của Qds phát huỳnh quang

Bảng 1.2 trình bày tổng quan tính chất của một số Qd khi so sánh với các

chất huỳnh quang dựa trên các chất hữu cơ và protein.

Bảng 1. 2: So sánh tính chất của các chất huỳnh quang hữu cơ/protein và quantum dots [13]

Tính chất Chất huỳnh quang Quantum dots

Tính quang lý

Phổ hấp thụ Thông thường có thể biến đổi/hẹp đối xứng với phổ phát xạ Phổ rộng, tăng đều đến vùng UV từ bờ hấp thụ đầu tiên

Hệ số dập tắt Molar Cao, gấp 10-100 lần chất huỳnh quang Biến đổi, thông thường < 200,000 M-1 cm-1

Phổ phát xạ Rộng, phát xạ đuôi đỏ bất đối xứng Bề rộng hẹp, khoảng 25-40 nm

Dịch chuyển Stokes < 100 nm > 200 nm

Thay đổi huỳnh quang Không Khoảng từ UV đến IR

Hiệu suất lượng tử Biến đổi tử thấp đến cao Cao, 0.2 đến 0.7 trong dung dịch đệm phụ thuộc lớp bọc bề mặt

Ngắn, < 5ns Thời gian sống huỳnh quang Dài, khoảng 10-20 ns hoặc lớn hơn

Khoảng phổ 40-60 nm UV-IR (phụ thuộc Qd là 2 nguyên tố hay 3 nguyên tố)

Độ bền quang Kém Tốt

Không bền Tốt Các khả năng đơn phân tử

Không bền, hầu hết dạng chất cho đơn – chất nhận đơn Khả năng truyền năng lượng huỳnh quang (FRET)

Là các chất cho phát huỳnh quang mạnh, phổ phát xạ phụ thuộc vào kích thước trùng chập với chất màu là chất nhận, có thể có dạng chất cho đơn, chất nhận đa.

Khả năng nhân bội Hiếm Tốt

TRẦN THỊ THANH HỢP

16

Tính gián đoạn Không đáng kể Có thể khó giải quyết trong

LUẬN VĂN THẠC SĨ

những trường hợp bị cô lập (phân tử đơn)

Tính hóa học

Độ bền hóa học Không bền Tốt

Khả năng phản ứng Có khả năng phản ứng Khả năng liên kết hóa học bị hạn chế

Liên kết đơn hóa trị Yếu Khó

Liên kết đa hóa trị Hiếm – hầu hết bis- functional Tốt, có thể liên kết một vài phân tử với Qd phụ thuộc kích cỡ

Các tính chất khác

Kích cỡ vật lý < 0.5 nm Đường kính 4-7 nm

Electrochromicity Hiếm Chưa nghiên cứu rộng

Rẻ, nhiều Đắt, hiếm

Chi phí

Vài tính chất quang lý của Qd thì rõ ràng vượt trội khi so sánh với các chất

huỳnh quang truyền thống. Đầu tiên là khả năng thay đổi huỳnh quang như là một

hàm của kích cỡ lõi và hệ số giam hãm lượng tử cho các liên kết nhị nguyên của vật

liệu bán dẫn. Những tính chất độc đáo này cho phép kiểm soát phổ phát xạ của Qd

bằng cách kiểm soát kích cỡ lõi. Tính chất thứ hai là phổ hấp thụ rộng bắt đầu từ

màu xanh của phát xạ của Qd và tăng đều về phía vùng UV. Thực tế, hệ số dập tắt

molar của Qd thì lớn hơn 10 đến 100 lần so với các chất màu truyền thống và có thể

đạt đến giá trị vài triệu.Rõ ràng rằng, Qd có thể được sử dụng để xác định đồng thời

hoặc phối hợp các tín hiệu huỳnh quang. Mà điều này khó có thể đạt được đối với

các chất huỳnh quang truyền thống do sự trùng chập phổ hấp thụ/phát xạ. Qd cũng

có hiệu suất lượng tử cao, khả năng chống chịu cao với cả dập tắt huỳnh quang và

sự phân hủy hóa học [13].

Các chấm lượng tử thì hầu hết có cường độ lớn hơn nhiều chất màu hữu cơ

truyền thống. Vật liệu tâm/ lõi CdSe-ZnS có đường kính từ 2 nm (bước sóng phát

xạ 480 nm) đến 8 nm (bước sóng phát xạ 660 nm) trong khi các tinh thể nano CdTe-

TRẦN THỊ THANH HỢP

17

CdSe phát xạ đỏ có khoảng đường kính từ 4nm (650nm) đến > 9nm (850nm). Tuy

LUẬN VĂN THẠC SĨ

nhiên, kích cỡ lõi không được coi như một yếu tố cho nhiều ứng dụng vốn có của

nó. Các protein, peptide hoặc các chất hóa học có thể tấn công lên bề mặt của QD.

Sau đó, tổng hợp được Qd-conjugate, có được những tính chất đặc trưng.

1.2.4 Chức năng hóa và biến tính bề mặt các chấm lượng tử

a. Chức năng hóa các chấm lượng tử

Bởi vì Qd thông thường được tổng hợp từ các tiền chất cơ kim và muối nên

chúng không có khả năng tan trong dung dịch nước, do đó, chức năng hóa bề mặt

Qd bằng các ligand hữu cơ không những làm Qd có khả năng hòa tan trong dung

dịch mà còn tăng khả năng liên kết sinh học. Việc gắn các nhóm chức khác nhau

trên bề mặt các chấm lượng tử và làm chúng phân tán trong môi trường nước là

quan trọng đối với các ứng dụng trong y - sinh. Các hạt nano đã chức năng hóa

này cần phải luôn ổn định trong dung dịch nước, phải tránh được sự kết tụ đám và

có thể gắn được các phân tử chức năng thích hợp lên bề mặt của hạt. Các kỹ thuật

được sử dụng cho việc biến đổi và chức năng hóa bề mặt các hạt chấm lượng tử

huyền phù là trao đổi ligand, biến đổi các ligand và sử dụng các lớp phủ bổ sung.

Các phân tử ligand liên kết với bề mặt các hạt chấm lượng tử giúp cho việc

khống chế kích thước hạt trong quá trình chế tạo và ngăn ngừa sự kết tụ các hạt

chấm lượng tử. Lực đẩy giữa các hạt chủ yếu là lực đẩy tĩnh điện. Tùy thuộc vào hệ

hạt và dung môi mà các hạt phân tán, việc lựa chọn ligand tốt có thể làm các hạt ổn

định lâu dài. Đầu tiên các phân tử ligand phải liên kết với bề mặt các hạt bằng lực

hút, như lực hút tĩnh điện hoặc tương tác kỵ nước, hầu hết bằng một nhóm của một

đầu phân tử ligand. Về tương tác của phân tử ligand với dung môi, các

phân tử ligand phân cực hay tích điện sẽ tan trong các dung môi phân cực hoặc

nước trong khi các hạt nano với các phân tử ligand không phân cực như các chuỗi

hydrocacbon chỉ tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực, ví dụ trong

hexane, toluene hay chloroform, các phân tử hữu cơ như TOPO, TOP hay HDA

thường được sử dụng trong chế tạo chấm lượng tử. Các phân tử ligand có hai đầu ưa

TRẦN THỊ THANH HỢP

18

nước và kỵ nước, như poly ethylene glycol, và các hạt nano kết hợp với chúng hay

LUẬN VĂN THẠC SĨ

các phân tử ligand khác có thể phân tán trong một số dung môi có độ phân cực

trung bình.

Ở trong các dung môi hữu cơ, bề mặt các chấm lượng tử được bao bọc bởi các

phân tử ligand kị nước để ngăn ngừa sự kết tụ các hạt. Các liên kết giữa bề mặt các

hạt nano vô cơ và một đầu của phân tử ligand cho điện tử, như là nhóm thiol (-SH),

amine hay phosphine làm cho các quá trình động học liên kết và không liên kết giữa

các chấm lượng tử và các chất này xảy ra. Điều này dẫn đến kết luận quan trọng là

các phân tử ligand có thể bị tách rời ra bằng cách rửa mạnh hay tác động mạnh bằng

các ligand khác, điều này có thể làm tổn hại sự ổn định của các hạt nano, dẫn đến

kết tụ và kết tủa.

Sự lựa chọn các phân tử ligand có thể phụ thuộc vào loại vật liệu của hạt nano

và dung môi. Nhìn chung, ngừời ta thấy rằng các phân tử liên kết mạnh tạo ra các

hạt ổn định tốt hơn các hạt liên kết yếu, đặc biệt trong các bước tiến hành và làm

sạch sau khi chế tạo hạt. Trong dung dịch nước, các phân tử ligand tích điện mạnh,

chứa các nhóm acid cacboxylic và sulfonic, sẽ ổn định các hạt trong thời gian dài.

Trong luận văn này, Qds CdTe sử dụng đã được cacboxyl hóa gắn các nhóm –

COOH lên bề mặt bằng cách chức năng hóa bề mặt Qds bằng hợp chất MPA (axit

3-mercaptopropionic) như hình 1.5:

TRẦN THỊ THANH HỢP

19

Hình 1. 5: Mô hình cacboxyl hóa chấm lượng tử CdTe

LUẬN VĂN THẠC SĨ

b. Liên kết sinh học của QDs

Có thể chia ra làm 3 loại chính cho các phương pháp để ghép nối các phân tử

sinh học lên.[13]

 Cách đầu tiên và phổ biến nhất là: Gắn phân tử sinh học với một nhóm chức

năng trên bề mặt của QD - ligand. Ví dụ cho nhóm này là: Amin, thiols hoặc

cacboxit.

Hình 1. 6: Liên kết hóa trị giữa Qds và các phân tử sinh học

 Cách thứ 2: Là liên kết sinh học dựa trên hướng tương tác của các phân tử

sinh học với các nguyên tử trên bề mặt của QDs.

TRẦN THỊ THANH HỢP

20

Hình 1. 7: Tạo liên kết trực tiếp với Qds

LUẬN VĂN THẠC SĨ

 Cách thứ 3: Là sử dụng tương tác tĩnh điện giữa bề mặt QDs và miền điện

tích trái dấu của protein hoặc các phân tử sinh học khác.

Hình 1. 8: Tương tác tĩnh điện giữa Qds với phân tử sinh học

Phương pháp đầu tiên và phổ biến nhất là tạo liên kết hóa trị giữa phân tử sinh

học với các nhóm hoạt tính trên bề mặt QDs (covalent modification). Ví dụ như các

nhóm amin, thiol và cacboxyl. Nhóm amin có thể được biến tính với este N-

hydroxysuccinimide (NHS) hoặc các phân tử hoạt hóa 1-Ethyl-3-(3-

dimethylaminopropyl) cacbodiimide (EDC). Các nhóm thiol cũng có thể hoạt động

như là những vị trí cho sự biến tính bởi meleimit hoặc trao đổi nhóm thiol. Ngoài ra,

các nhóm cacboxyl cũng có thể được hoạt động với EDC để cho gắn các phân tử có

nhóm amin hoạt động. (hình 1.6)

Phương pháp thứ hai là tạo liên kết trực tiếp giữa phân tử sinh học với nguyên

tử trên bề mặt Qd. Ví dụ như các phân tử lưu huỳnh hoặc kẽm của QDs. (hình 1.7)

Một ví dụ tiêu biểu của phương pháp thứ 3, protein (MBP) liên kết với maltozơ

tích điện dương có thể tương tác tĩnh điện với bề mặt tĩnh điện âm của Qds đã được

chức năng hóa bởi DHLA. Loại biến tính này, cũng cho phép gắn các kháng thể lên

Qd và làm sạch liên kết sinh sinh để ứng dụng cho các xét nghiệm sinh học sau.

TRẦN THỊ THANH HỢP

21

Công nghệ gen cũng được sử dụng để gắn leucine-zipper tích điện dượng lên

LUẬN VĂN THẠC SĨ

protein G, và sau đó sẽ được cố định lên Qds thông qua tương tác tĩnh điện, có thể

được sử dụng để liên kết Fe của các kháng thể.

1.3 Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET)

1.3.1 Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng

Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) là cơ chế mà

trong đó một điện tử có thể truyền năng lượng kích thích không bức xạ của nó cho

một điện tử độc lập khác ở một khoảng cách ngắn (khoảng cách nguyên tử).

Hình 1. 9: Mô hình hiệu ứng FRET

Một cặp hai nguyên tử tạo ra một điện trường qua sự tương tác lưỡng cực. Đầu

tiên sự hấp thụ ánh sáng xảy ra ở nguyên tử cho (donor molecule), bắt đầu bị kích

thích. Trước khi donor có thể phát huỳnh quang và quay trở về trạng thái ban đầu,

nó đang ở trạng thái kích thích nên truyền năng lượng cho nguyên tử nhận (aceptor

molecule) gần nhất có trạng thái năng lượng kích thích thấp nhất qua sự trao đổi của

một photon ảo. Nguyên tử cho (The donor) trở về trạng thái cơ bản còn nguyên tử

nhận trở lên trạng thái kích thích (hình 1.9).

Kết quả cuối cùng là phần tử nhận bắt đầu chuyển lên trạng thái kích thích nhờ

vào quá trình gián tiếp nhận photon ảo, mặt khác đây cũng là hiện tượng xảy ra rất

tự nhiên. FRET là một hiện tượng tự nhiên đầy lý thú bởi vì nó không phụ thuộc

TRẦN THỊ THANH HỢP

22

vào sự tiếp xúc vật lý cũng như truyền điện tử.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

1.3.2 Cơ sở lý thuyết của hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng

Tư tưởng chính của lý thuyết về FRET có thể tóm lược trong một vài ý chính

như sau:

Sự kích thích trên một ion có thể lan truyền sang một ion cùng loại khác ở trạng

thái cơ bản như là một kết quả của sự truyền năng lượng cộng hưởng (FRET) khi

chúng được định xứ gần nhau. Khoảng cách giữa các ion mà tại đó xác suất của quá

trình huỳnh quang và năng lượng trở nên cạnh tranh nhau là cỡ vài Angstrom. Sơ đồ

của quá trình truyền năng lượng cộng hưởng mô tả như hình dưới:

Hình 1. 10: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET.[22]

Trong quá trình phát huỳnh quang truyền năng lượng, một ion bị kích thích ban

đầu (donor D) sẽ truyền năng lượng kích thích của nó cho một ion (aceptor) khác

gần nhất theo sơ đồ sau: D* + A D + A*. (dấu ‘ * ‘ ký hiệu trạng thái kích

thích.)

Một số điều kiện cần phải được thỏa mãn để cho FRET xảy ra đó là:

(i) Phổ phát xạ huỳnh quang của các phân tử các chất cho phải chồng lên phổ

hấp thụ hoặc kích thích của chất màu nhận. Mức độ chồng chéo lên nhau được

gọi là quang phổ chồng lên nhau tích hợp (J).

TRẦN THỊ THANH HỢP

23

(ii) Chất cho (donor) phải có cường độ phát huỳnh quang mạnh

LUẬN VĂN THẠC SĨ

(iii) Hai chất này (các chất cho và chất nhận) phải ở khoảng cách gần nhau

(thường 1 đến 10 nanomet).

(iv) Các proentations chuyển tiếp lưỡng cực của các chất cho và chất nhận phải

gần như song song với nhau.

(v) Thời gian sống huỳnh quang của các phân tử các chất cho phải có khoảng

thời gian đủ để cho hiệu ứng FRET xảy ra.

Hình 1. 11: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất cho và nhận. Khu vực màu đỏ nâu là sự chồng chéo quang phổ giữa quang phổ huỳnh quang của các chất cho và phổ hấp thụ của chất nhận.[28]

Tóm lại, tỷ lệ FRET phụ thuộc vào mức độ chồng chéo quang phổ giữa các

cặp chất cho-chất nhận (hình 1.11), năng suất lượng tử của các chất cho, định hướng

tương đối của các chất cho-chất nhận những khoảng cách chuyển tiếp lưỡng cực và

khoảng cách từ các chất cho tới chất nhận. Bất kỳ sự kiện hoặc quá trình có ảnh

hưởng đến khoảng cách giữa các cặp chất cho/chất nhận sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất

của FRET.

Phát hiện hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET):

Việc phát hiện và định lượng hiệu ứng FRET có thể được thực hiện trong một

TRẦN THỊ THANH HỢP

24

số cách khác nhau. Đơn giản chỉ cần hiện tượng này có thể được quan sát bởi một

LUẬN VĂN THẠC SĨ

mẫu vật có chứa cả các chất cho và các phân tử chất nhận với ánh sáng phát ra ở các

bước sóng trung tâm gần với phát xạ. Bởi vì FRET có thể dẫn đến giảm phát huỳnh

quang của các phân tử các chất cho cũng như tăng huỳnh quang của chất nhận, nên

khi xác định tỷ lệ số liệu của hai tín hiệu có thể phát hiện được.

Ưu điểm của phương pháp này là một thước đo của sự tương tác có thể được

thực hiện là độc lập với nồng độ tuyệt đối của cảm biến. Bởi vì không phải tất cả

các gốc chất nhận đều phát huỳnh quang, nên chúng có thể được sử dụng như một

phương tiện để dập tắt huỳnh quang. Trong trường hợp này, những tương tác mà kết

quả trong một phân tử các chất huỳnh quang cho đến gần phân tử như vậy sẽ dẫn

đến một sự mất mát tín hiệu.

Một phương pháp thay thế khác, ngày càng phổ biến nhanh chóng là để đo thời

gian sống huỳnh quang của các chất cho trong sự hiện diện và vắng mặt của nhóm

mang màu chất nhận. FRET sẽ gây ra sự giảm thời gian phát huỳnh quang của chất

cho.

Hình 1. 12: Quang phổ huỳnh quang của chất cho và chất nhận và dung dịch hỗn hợp của chất cho và chất nhận

Trong hình trên, huỳnh quang của chất nhận tăng gần sáu lần trong sự hiện diện

TRẦN THỊ THANH HỢP

25

của chất cho. Trong trường hợp như huỳnh quang các chất cho trở thành 1/3 huỳnh

LUẬN VĂN THẠC SĨ

quang các chất cho. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang là bằng chứng hình ảnh rõ

ràng của FRET. Các quang phổ huỳnh quang đã được ghi nhận là sự phát huỳnh

quang của chất cho và nhận. Đây là hiệu ứng FRET sử dụng các chất 3-octadecyl-

2[3-octadecyl-2(3H)-benzothizolidene) metyl] benzothiazolium perchlorate (chất

cho), Octadecyl rhodamine B (chất nhận).[28]

1.4 Nanosensor

1.4.1 Nanosensor là gì?

Nanosensor là một cảm biến được xây dựng ở cấp độ nano, với mục đích chủ

yếu là để thu thập số liệu về quy mô nguyên tử và chuyển nó thành dữ liệu có thể dễ

dàng phân tích. Các cảm biến này cũng có thể được định nghĩa là "Một cảm biến

hóa học, cảm biến vật lý, cảm biến sinh học sử dụng các thành phần có kích thước

nano, thông thường là từ kích thước micromet tới nanomet". Những cảm biến này

có độ nhạy cực kỳ cao và có thể phát hiện các hạt virus đơn lẻ hoặc thậm chí nồng

độ cực thấp dư lượng một chất nguy hiểm tiềm tàng còn sót lại. Vì hiện nay công

nghệ này đã và đang được nghiên cứu ở rất nhiều hướng khác nhau nên rất khó để

có thể cho một định nghĩa duy nhất về những gì chính xác là một nanosensor.

Một trong những ví dụ đầu tiên của một nanosensor tổng hợp nhận tạo được xây

dựng bởi các nhà nghiên cứu tại Viện Công nghệ Georgia vào năm 1999. Họ đã gắn

một hạt vào cuối của một ống nano carbon và đo tần số rung động của ống nano cả

hai trường hợp có và không có hạt đó. Sự khác nhau giữa hai tần số cho phép các

nhà nghiên cứu để đo khối lượng của hạt đính kèm.

Các ống nano carbon đã được sử dụng để phát hiện ion các phân tử khí, ví dụ

như ống nano được làm từ titan đã được sử dụng để phát hiện nồng độ khí quyển

của hydro ở mức độ phân tử. Nhiều hệ thống mà nanosensor được xây dựng chỉ để

phù hợp cho một loại phân tử. Đối với một loại phân tử cụ thể phù hợp với

nanosensor, và ánh sáng được chiếu vào nanosensor, nó sẽ phản ánh bước sóng

TRẦN THỊ THANH HỢP

26

khác nhau của ánh sáng do đó nó cho màu sắc khác nhau. Trong một nghiên cứu

LUẬN VĂN THẠC SĨ

tương tự, Flood và cộng sự đã chỉ ra rằng siêu phân tử hóa học chủ-khách có thể sử

dụng làm cảm biến định lượng sử dụng ánh sáng tán xạ Raman.

Nanosensor có thể được chế tạo bằng ba phương pháp phổ biến nhất là

lithography từ trên xuống, lắp ráp phân tử từ dưới lên và các phân tử tự lắp ráp. Các

nhà nghiên cứu cũng đã tìm ra cách chế tạo một nanosensor sử dụng dây nano bán

dẫn, mà được cho là một phương pháp “dễ làm” để chế tạo nanosensor. Ngoài ra

còn nhiều phương pháp khác tạo ra các nanosensor bao gồm việc sử dụng các ống

nano carbon.

Hiện nay có 3 hướng chế tạo sensor thông dụng như bảng 1.3: nanosensor vật

lý, nanosensor hóa học, nanosensor sinh học.

Bảng 1. 3: Bảng phân loại ba hướng chế tạo nanosensor thông dụng

Các loại nanosensor

Nanosnesor vật lý Nanosensor hóa học Nanosensor sinh học

Khối lượng Tương tác kháng nguyên/

kháng thể Áp suất Thành phần hóa học

Tương tác DNA Lực Nồng độ

Tương tác enzym Sự di chuyển

Với sự phát triển của khoa học công nghệ hiện nay, các loại cảm biến hiện đại

đã tích hợp các loại cảm biến riêng để tạo thành cảm biến hỗn hợp, và rất khó để có

thể phân loại được nữa. Rất nhiều dạng cảm biến mới được chế tạo như:

 Chemical nanosensors: là thiết bị nano có thành phần cảm biến bằng vật

liệu sinh học, mặt khác lại nhạy cảm với các chất hóa học.

 Biological nanobiosensors:làcác thiết bị nanocóphầncảm biếnlàm bằng

TRẦN THỊ THANH HỢP

27

vật liệusinh họcvànhạy cảm với cácvật liệu sinh học.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

 Physical nanobiosensors : là các thiết bị nanocóphầncảm biến bằng vật

liệusinh họcvànhạy cảm với cácđại lượng vật lý.

1.4.2 Một số loại cảm biến (nanosensor) sử dụng chấm lượng tử với hiệu ứng

FRET

Chấm lượng tử chất bán dẫn có cường độ phát quang rất mạnh so với các chất

huỳnh quang hữu cơ. Qd có hiệu suất lượng tử cao, độ hấp thụ quang mạnh, tính ổn

định quang lớn. Đồng thời ta có thể điều khiển bước sóng phát quang theo độ lớn

kích thước của hạt Qds. Với nhiều lợi điểm như vậy, nên chấm lượng tử được sử

dụng làm cảm biến sinh học để quan sát và chụp ảnh tế bào sinh học.

a. Nanosensor xác định hàm lượng Maltozơ

Mauro đã sử dụng Qd để chế tạo sensor theo hiệu ứng FRET bằng công nghệ tự

lắp ghép phân tử. Sơ đồ cơ chế hoạt động của sensor này như hình dưới. [32]

Hình 1. 13: Mô hình cơ chế hoạt động của Sensor hiệu ứng FRET dùng Qd của Mauro[32]

Như mô hình trên, trên bề mặt của Qd phủ một lớp chất Protein: Maitose-

Bindung Protein (MBP). Chất này có khả năng tạo chức năng hoạt hoá bề mặt Qd

trong dung dịch đường. Sau đó cho thêm chất B-Cyclo.dextrin-Qsy9 với vai trò là

chất dập tắt tín hiệu huỳnh quang (Quencher). Sensor này khi sử dụng để xác định

hàm lượng Maltose. Nếu trong môi tường có chất Maltol, tương tác giữa Maltol với

tác nhân Quencher, đẩy chất dập tắt quencher ra xa khỏi Qd. Kết quả theo hiệu ứng

FRET, cường độ phát quang của chấm lượng tử gia tăng. Lợi dụng kỹ thuật này,

bằng việc sử dụng chấm lượng tử, người ta có thể chế tạo sensor lai tạo (Hybrid

TRẦN THỊ THANH HỢP

28

sensor).

LUẬN VĂN THẠC SĨ

b. Nanosensor xác định DNA

Cũng từ nguyên lý của hiệu ứng FRET, các nhà khoa học đang trong giai đoạn

tạo ra loại Sensor DNA nano bằng việc sử dụng Qd để xác định các DNA. Trong kỹ

thuật này, các nhà phát minh đã sử dụng Qd là chất CdSe-ZnS được chế tạo bằng kỹ

thuật Core-Shell làm chất cho (Donor). Trên bề mặt của chấm lượng tử được biến

tính hoạt hoá bằng chất Streptavisin. Tiếp theo cho chất huỳnh quang Cy5.5 và

Biotin tác dụng với chất Oligonucleotit tạo thành hai tác nhân hoạt hoá với vai trò

khác nhau: tác nhân thông tin (Reporter probe) và tác nhân liên kết (Capture probe).

Hai nhóm phân tử chức năng này liên kết với phân tử DNA cần xác định (mục đích

DNA). Cụm phân tử hai chức năng thông tin và kết hợp có chứa DNA, liên kết với

Qd đã biến tính (Steptavidin Conjugated Qd), tạo thành biosensor DNA nano.

Biosenssor DNA nano này có nhóm biotin kết hợp với chất Steptavidin trên bề mặt

Qd. Nhờ vậy hiệu ứng FRET được phát huy. Bằng phương pháp này, ta có thể kiểm

chứng được DNA nhanh và độ chính xác cao. Hình 1.14 là mô hình cơ chế hoạt

TRẦN THỊ THANH HỢP

29

động của biosensor DNA nano.[24]

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 1. 14: Mô hình và cơ chế hoạt động của Biosensor DNA nano Qd (a,b) và

thiết bị kiểm tra (c).[29]

Nhìn chung, biosensor nano hiệu ứng FRET dùng chất phát huỳnh quang Qd có

nhiều ưu điểm so với huỳnh quang hữu cơ. Vì vậy nhiều loại biosensor để xác định

ảnh in vivo được nghiên cứu chế tạo.

c. Sử dụng nanosensor trong nghiên cứu Enzim

Giáo sư Gae Baik Kim và Young-Pil Kim cùng các cộng sự tại đại học Hanyang

Hàn quốc cũng nghiên cứu và phát triển phép phân tích Enzim Protease bằng

nanosensor sử dụng chấm lượng tử có hiệu ứng FRET.[10]

Nghiên cứu nàycho thấy việc phát hiện hoạt động của protease dựa trên sự

truyền năng lượng của các chấm lượng tử (QDs). Bằng cách kết hợp một số loại

protease vào thiết kế của dạng QDs cho cấu trúc truyền năng lượng cộng hưởng

huỳnh quang (FRET) và truyền năng lượng cộng hưởng phát quang sinh học (Bret),

hoạt động của protease dẫn đến những thay đổi trong hiệu suất truyền năng lượng.

Đặc biệt là do các đặc tính vượt trội của QDs, nó có thể được xem như một tác nhân

nhận biết protease với độ nhạy cao. Người ta dự đoán rằng QD dựa trên Fret/Bret

như một đầu dò sẽ có một tiềm năng lớn trong việc phân tích vai trò cơ bản của

protease và có khả năng chế tạo loại thuốc ức chế protease như thuốc điều trị sinh

học dạng nano medicine.

FRET là kỹ thuật phổ biến nhất được sử dụng trong các ứng dụng cảm biến

sinh-hóa hiện nay bởi độ nhạy cao, khả năng hồi phục trạng thái tốt, và khả năng

quan sát trong thời gian thực. Phương pháp thông thường để phát hiện hoạt động

protein được dựa trên phát huỳnh quang với các liên kết peptit hữu cơ. Ví dụ cho

hoạt động protease là đầu dò tự động, đầu dò mang màu kép, và đầu dò dựa trên các

photon hiệu ứngFRET, như mô tả trong hình1.15A.

Tuy nhiên, việc phát huỳnh quang hữu cơ thường gặp một vài vấn đề chẳng hạn

như hình ảnh bị tẩy trắng, độ nhạy ảnh hưởng bởi môi trường, khó khăn trong việc

TRẦN THỊ THANH HỢP

30

phân tích tổ hợp donor và acceptor. Như đã nói ở trên, những vấn đề này trong các

LUẬN VĂN THẠC SĨ

nghiên cứu về FRET có thể được khắc phục khi có phổ huỳnh quang thích hợp hoặc

dập tắt được sử dụng kết hợp với chấm lượng tử (QDs) (Hình 1.15B). Từ QDs có

dải hấp thụ rộng và phổ phát xạ hẹp cũng như sự ổn định quang cao, sẽ có thuận lợi

trong việc theo dõi lâu dài và cho phép phát hiện, QDs thường được sử dụng như

các donor trong khi các chất nhận năng lượng huỳnh quang (chất dập tắt) thường là

một peptit được biến tính thích hợp.

Hình 1. 15: Sơ đồcảm biếnFRETcơ bảnđể phát hiện cácprotease hoạt động. (A)

Quá trình FRET thông thường(B)FRET sử dụng QDs. D và A cho các nhà tài trợ

năng lượng và chấp nhận năng lượng, tương ứng.

d. Kiểm tra hoạt động của enzim

Nhóm nghiên cứu của Yizang tại đại học John Hopkins đã và đang nghiên cứu

nhằm chế tạo nanosensor sử dụng QD-FRET để theo dõicác hoạt động của các

enzime khác nhau phát triển từ các nghiên cứu trước đây của Medintz và cộng sự.

QDs có thể phục vụ như giàn đỡ nano để cố định enzim hoặc các chất nền của

TRẦN THỊ THANH HỢP

31

enzim trên bề mặt QD. Trong khi đó, QD cũng được dùng với chức năng như bộ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

chuyển đổi tín hiệu đem lại các thông tin về cấu trúc phân tử, cấu tạo, và tương tác

thông qua cơ chế QD-FRET.[32]

Hình 1. 16: Minh họa sơ đồ của nanosensor QD-FRET để phân tích hoạt động

của enzyme.

a)Nanosensor QD-FRETnhằm mục đích nghiên cứuprotezơ.

b) Nanosensor QD-FRETcho việc nghiên cứuprotein kinase.

c) Nanosensor QD-FRETcho việc nghiên cứuDNA polymerase.[32]

Protezơ là một trong những enzim đầu tiên được nghiên cứu bằng cảm biến

nano QD-FRET. Medintz và cộng sự đã dùng chất phát huỳnh quang hoặc chất khử

để đánh dấu peptit trên QDs thông qua polyhistidine để hình thành cảm biến nano

QD-peptit. Sự phát huỳnh quang của các nanosensor QD đã bị dập tắt bởi những

TRẦN THỊ THANH HỢP

32

chất nhận phù hợp thông qua mối liên kết peptit mà chuỗi này có thể được nhận biết

LUẬN VĂN THẠC SĨ

bởi caspase-1, collagenase, hoặc chymotrypsin. Khi có phản ứng nhận biết bởi các

enzim tương ứng, các peptit bề mặt sẽ tách ra để giải phóng huỳnh quang chất nhận

từ liên kết tự động giữa QD-peptit, dẫn đến sự phục hồi phát huỳnh quang của QD

như khi chưa có liên kết, được mô tả như hình 1.16a.

Protein kinase là một nhóm các enzim quy định chức năng tế bào quan trọng

thông qua quá trình phosphoryl hóa bằng cách kích hoạt hoặc khử hoạt một loạt các

enzim. Sử dụng một hệ thống cảm biến QD-FRET, Ghadiali và cộng sự nghiên cứu

hoạt động của các thụ thể tyrosine kinase Abl và Src. Peptit được cố định trên bề

mặt QD. Sau khi phosphoryl hóa, một Alexa647 gắn vào kháng thể đơn

phosphotyrosine cụ thể, đây là một nhóm phosphoryl với chất nhận FRET (hình

1.16b).

Mức độphosphoryl hóa được xác định bằng tỷ lệ của cường độ phát xạ

acceptor/donor. Các hệ thống tương tự cũng được sử dụng để định lượng enzim bị

ức chế thông qua chuẩn độ staurosporine để đánh giá độ nhạy của mộ thệ thống cảm

biến QD-FRET kinase như một nền tảng để xây dựng một hệ kiểm tra chất gây

nghiện.

Ngoài các enzim"tự lắp ghép", các loại khác của họ enzim liên quan đến phản

ứng thêm các nhóm chức năng hoặc monome các mẫu axit nucleic. Chúng rất quan

trọng đối với DNA trong việc nhân rộng, sửa chữa, sao chép hoặc truyền tín hiệu.

Các"phản ứng cộng" tạo điều kiện cho sự kết hợp của chất phát huỳnh quangvới các

phân tử mục tiêu, tạo điều kiện cho một loạt các chất phát huỳnh quang có thể được

TRẦN THỊ THANH HỢP

33

áp dụng.[32]

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chương 2 - THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

- Clenbuterol (C12H18Cl2N2O) khối lượng mol phân tử là 277.19 g/mol

- N-1-Naphtylethylene diamine Dyhydrocloride (C12H14N2.2HCl)

- Natri nitrite (NaNO2), axit clohidric (HCl), natri hidroxit (NaOH)

- Rohdamine B (C28H31ClN2O3) khối lượng mol phân tử là 478.5 g/mol

Tất cả các hóa chất được cấp bởi Merck ở mức độ phân tích, không phải tinh

chế trước khi sử dụng.

- Chấm lượng tử CdTe nồng độ 10-4M được bọc bởi axit 3-mercaptopropionic

(bước sóng 530 nm) do Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và

công nghệ Việt Nam cung cấp.

2.2 Sensor để xác định Rhodamine B

Trong khuôn khổ luận văn này mục đích của tôi là nghiên cứu chế tạo sensor

dựa vào hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) để xác định

Rhodamine B. Sensor để xác định Rhodamine B bao gồm có QDs CdTe đóng vai

trò là chất cho huỳnh quang, còn Rhodamine B đóng vai trò là chất nhận huỳnh

quang.

Chuẩn bị dung dịch chấm lượng tử CdTe: Pha dung dịch QDs CdTe 10-4M thành

100 ml dung dịch QDs CdTe 10-6M để dùng cho thí nghiệm. Mỗi mẫu sử dụng 1ml

CdTe này.

Chuẩn bị dung dịch chất màu:Lấy 0,01g Rhodamine B nguyên chất cho vào

bình định mức 100ml, thêm nước cất để tạo thành 100ml dung dịch Rhodamine B

nồng độ .

Chuẩn bị dung dịch đo:Với mỗi lần thí nghiệm sử dụng cố định 1ml CdTe, thêm

lượng Rhodamine B 10-4 g/ml và nước cất thích hợp để được 4ml dung dịch và

TRẦN THỊ THANH HỢP

34

nồng độ Rhodamine B tương ứng là 0.3.10-5; 0.5.10-5; 1.10-5; 5.10-5; 10.10-5 g/ml.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Bảng 2. 1: Nồng độ Rhodamine B của các mẫu

STT mẫu Nồng độ Rhodamine B

1 0.3. 10-5 g/ml

2 0.5.10 g/ml

3 1.10 g/ml

4 5.10 g/ml

5 10.10 g/ml

2.3 Nanosensor để xác định Clenbuterol

2.3.1 Vấn đề cần nghiên cứu

Clenbuterol là chất tăng trọng tạo nạc trong chăn nuôi gia súc đang bị nghiêm

cấm sử dụng. Mục tiêu thứ 2 của luận văn này là nghiên cứu chế tạo nanosensor dựa

vào hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng (FRET) để xác định clenbuterol.

Từ hình 2.1 cho thấy phổ UV-Vis của clenbuterol có đỉnh hấp thụ cực đại của

Clenbuterol là 294 nm và nằm hoàn toàn bên ngoài so với dải phát xạ của Qd (từ

460 đến 625 nm). Phổ hấp thụ của clenbuterol không trùng chập với phổ phát xạ

của Qd, điều này không thỏa mãn điều kiện của hiệu ứng FRET. Vấn đề ở đây là

nếu Qd với vai trò là chận cho, còn clenbuterol với vai trò là chất nhận thì hiệu ứng

FRET không xuất hiện với cặp chất này. Do đó, cần phải tìm một phân tử ligand,

vừa có khả năng liên kết với bề mặt Qd, vừa có khả năng tạo liên kết với

TRẦN THỊ THANH HỢP

35

clenbuterol.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 2. 1: Phổ hấp thụ của Clenbuterol và phổ phát xạ của Qds CdTe

Trong cấu trúc phân tử của Clenbuterol có chứa hai nhóm amine, một ở mạch

nhánh và một ở nhân benzen. Với nhóm amine ở nhân benzen ta có thể tiến hành

phản ứng diazo trong môi trường NaNO2/HCl. Trong cấu tạo của sản phẩm chăn

nuôi như thịt, nội tạng, nước tiểu… có hợp chất amin trong protein, urea. Tuy nhiên,

những hợp chất này không có khả năng tham gia phản ứng diazo. Do đó, nhóm

amine ở vòng thơm chính là nhóm chìa khóa để chế tạo sensor. Hơn nữa, hợp chất

clenbuterol sau khi đã được diazo hóa dễ dàng tham gia phản ứng coulping với các

hợp chất napthyl, napthol tạo muối azo, là những chất màu thường sử dụng trong

phẩm nhuộm. Muối azo có bước sóng hấp thụ tăng lên đáng kể so với bước sóng

hấp thụ của Clenbuterol do đó có thể giải quyết được vấn đề trùng chập phổ giữa

TRẦN THỊ THANH HỢP

36

chất cho và chất nhận.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Napthylamine

1- Napthol

2- Napthol

N-1-Naphtylethylenediamine

Dyhydrocloride

Hình 2. 2: Các hợp chất napthol, naphtyl có khả năng tạo hợp chất azo tiêu

biểu

Trong số các hợp chất napthol và naphtyl có khả năng tạo hợp chất màu azo

(hình 2.2) ở trên, hợp chất N-1-Naphtylethylene diamine Dyhydrocloride có công

thức phân tử là C12H14N2.2HCl được sử dụng là ligand - chất nhận biết Clenbuterol

trong nanosensor. Bởi vì hợp chất này có thể cộng hợp với diazo clenbuterol và

đồng thời có thể tạo liên kết với QDs do có tương tác tĩnh điện với bề mặt tĩnh điện

TRẦN THỊ THANH HỢP

37

âm của QDs (hình 2.3).

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 2. 3: Mô hình phản ứng của Naphtylethylene diamine với Qd và diazo clenbuterol

2.3.2 Nguyên lý hoạt động của biosensor dựa vào hiệu ứng FRET để xác định

Clenbuterol

TRẦN THỊ THANH HỢP

38

Hình 2. 4: Mô hình nanosensor

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 2. 5: Mô hình hoạt động của nanosensor khi có thêm chất cần nhận biết Clenbuterol Mẫu nanosensor ở dạng dung dịch được chế tạo để nhận biết dư lượng chất

Clenbuterol có mô hình cấu tạo và nguyên lý hoạt động như hình 2.5. Nanosensor là

QDs CdTe sau khi được biến tính bề mặt bởi ligand là N-1-Naphtylethylene

diamine Dyhydrocloride. Do không có sự trùng chập giữa phổ hấp thụ của ligand và

phổ phát xạ của Qd không thỏa mãn điều kiện của hiệu ứng FRET, do đó không xảy

ra hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng giữa QD và ligand. Nhưng khi nhỏ thêm

dung dịch diazo clenbuterol vào mẫu sensor, phản ứng hóa học giữa ligand và hợp

chất diazo clenbuterol hình thành nên hợp chất có bước sóng hấp thụ tăng so với

ligand và clenbuterol, và trùng chập với phổ phát xạ của Qd CdTe. Điều này thỏa

mãn điều kiện xảy ra hiệu ứng FRET. Do đó, sau khi thêm dung dịch diazo

Clenbuterol cường độ phát xạ của nanosensor sẽ bị dập tắt theo nồng độ của

Clenbuterol. Dựa vào sự thay đổi đó để nhận biết sự có mặt của clenbuterol.

2.3.3 Nghiên cứu biến tính bề mặt chấm lượng tử CdTe ứng dụng trong nanosensor

Qd CdTe (bước sóng phát xạ 530 nm) nhận được từ Viện Khoa học Vật liệu

được bao bọc bởi axit 3-Mercaptopropionic (C3H6O2S) nên bề mặt QDs tích điện

âm. Do đó, giữa Qd và ligand (N-1-Naphtylethylene diamine Dyhydrocloride) dễ

dàng xảy ra tương tác tĩnh điện (hình 2.6).

TRẦN THỊ THANH HỢP

39

Hình 2. 6: Tương tác tĩnh điện giữa Qd và Naphtylethylene diamine

LUẬN VĂN THẠC SĨ

2.3.4 Phản ứng diazo Clenbuterol

Hình 2. 7: Phản ứng diazo clenbuterol

Lấy 3mg Clenbuterol cho vào một cốc thủy tinh, dùng 1-2 ml nước để hòa tan

hết lượng clenbuterol này rồi thêm 3ml dung dịch HCl 0.01M. Đặt hỗn hợp trong

bát đá lạnh và khuấy trong 10 phút. Lấy một cốc khác thêm 2ml dung dịch NaNO2

0.01M đặt cốc này trong bát đá lạnh trong khoảng 10 phút. Sau đó, nhỏ từ từ cốc

thứ 2 vào cốc thứ nhất để từ 2-5 phút trong bóng tối.

2.3.5 Phản ứng cộng hợp Clenbuterol với ligand

Sau khi thực hiện phản ứng diazo, tiếp tục nhỏ từ từ 1,2 ml dung dịch N-1-

Naphtylethylene diamin Dyhydrocloride 0.01M vào hỗn hợp diazo clenbuterol.

Tiếp tục giữ hỗn hợp trong điều kiện lạnh, có khuấy, không có ánh sáng. Kết thúc

phản ứng thu được dung dịch có màu đỏ, giữ dung dịch ở 4oC trước khi sử dụng.

Hình 2. 8: Phản ứng cộng hợp giữa Naphtylethylene diamin và diazo

TRẦN THỊ THANH HỢP

40

clenbuterol

LUẬN VĂN THẠC SĨ

2.4 Các phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Đo phổ hấp thụ UV-Vis

Phổ UV – Vis là loại phổ electron, ứng với mỗi elctron chuyển mức năng lượng

ta thu được một vân phổ rộng. Phương pháp đo phổ UV – Vis (phương pháp trắc

quang) là một phương pháp định lượng xác định nồng độ của các chất thông qua độ

hấp thụ của dung dịch.

Máy quang phổ UV - Vis vận hành trên cơ sở đo độ hấp thụ ánh sáng đặc trưng

cũng như độ truyền quang ở các bước sóng khác nhau, nhờ đó kết quả thu được

nhanh và chính xác.

Để xác định phổ hấp thụ của mẫu (dung dịch, màng mỏng...) ta tiến hành theo

sơ đồ sau:

Hình 2. 9: Sơ đồ mô tả hệ đo quang phổ hấp thụ UV-Vis

Tia sáng từ nguồn sáng đơn sắc được tách làm hai tia 1 và 2 có cường độ IO như

nhau nhờ gương bán mạ L1, tia 1 truyền thẳng tới vật nền (trong trường hợp mẫu

dung dịch thì là lọ dùng để đựng dung dịch, với mẫu màng mỏng được phủ trên đế

thủy tinh thì là miếng thủy tinh dùng để phủ màng…), tia thứ 2 sau khi phản xạ trên

TRẦN THỊ THANH HỢP

41

gương L2 sẽ đưa tới mẫu cần xác định độ hấp thụ. Sau đó so sánh cường độ sáng

LUẬN VĂN THẠC SĨ

sau khi truyền qua mẫu IS và cường độ ánh sáng nền IG, ta sẽ xác định được độ hấp

thụ của mẫu. Cường độ sáng bị hấp thụ bởi mẫu được xác định:

IS = IO – IG

Để thu được phổ hấp thụ của mẫu, bước sóng ánh sáng tới sẽ được quét từ vùng

hồng ngoại gần tới vùng tử ngoại gần (UV-VIS-NIR). Bước sóng mà tại đó IS thu

được là lớn nhất chính là bước sóng hấp thụ của mẫu là cực đại, bước sóng này là

đặc trưng đối với từng mẫu. Các phổ có thể được vẽ dưới dạng phổ truyền qua

hoặc phổ hấp thụ . Các phép đo phổ hấp

thụ đựoc tiến hành trên hệ máy quang phổ UV-VIS-NIR, tại viện Khoa học Vật

liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với dải phổ làm việc từ

200nm - 800nm.

2.4.2 Đo phổ phát xạ huỳnh quang

Phổ quang huỳnh quang cho phép ta nghiên cứu cấu trúc điện tử và nhiều tính

chất quan trọng khác nhau của vật liệu. Sơ đồ nguyên lý của hệ đo huỳnh quang bao

gồm bốn phần chính:

1. Nguồn sáng để kích thích mẫu (thường dùng laser, diode hoặc đèn Xe).

2. Mẫu cần đo.

3. Bộ thu ánh sáng phát ra từ mẫu (có kèm theo kính lọc để loại bỏ ánh sáng

kích thích mẫu ) ánh sáng này sẽ được đưa vào máy phân tích phổ. Ở đây

ánh sáng được phân tích thành từng bước sóng phát xạ riêng biệt.

4. Bộ đầu thu để xử lý, biến đổi tín hiệu quang thành tín hiệu điện, tín hiệu

này được khuếch đại rồi được đưa vào máy tính với phần mềm thích hợp để

xử lý các tín hiệu điện thu được.

TRẦN THỊ THANH HỢP

42

Hình 2. 10: Sơ đồ khối của phép đo quang huỳnh quang

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ánh sáng từ nguồn kích thích đơn sắc, được chiếu tới mẫu là các chấm lượng tử

CdTe, CdSe/ZnS 10ML được phân tán trong dung môi. Khi đo, mẫu được chứa

trong cuvet bằng thạch anh. Phát xạ huỳnh quang phát ra từ mẫu được thu lấy và

được đưa vào khe của hệ máy đo, theo nguyên lý trình bày ở trên.

Các phép đo phổ huỳnh quang được tiến hành trên hệ máy quang phổ phổ

huỳnh quang tại phòng thí nghiệm quang phổ laser, trung tâm Điện tử học lượng tử,

Viện Vật Lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguồn kích thích

quang sử dụng trong nghiêm cứu là LED phát ra bước sóng 410 nm.

2.4.3 Phương pháp đo phổ hồng ngoại

Khi hấp thụ những bức xạ trong vùng hồng ngoại, năng lượng phân tử tăng lên

8-40 kJ/mol. Đây chính là khoảng năng lượng tương ứng với tần số của dao động

biến dạng và dao động quay của các liên kết trong hợp chất cộng hóa trị. Sự hấp thụ

xảy ra khi tần số bức xạ của tia tới bằng với tần số dao động riêng của một liên kết

nào đó trong phân tử. Tần số dao động riêng của các liên kết trong phân tử được

tính theo công thức:

Trong đó:

µ: khối lượng rút gọn

k: hằng số lực tương tác, phụ thuộc bản chất liên kết

c: tốc độ ánh sáng,

ν: tần số dao động riêng của liên kết

Như vậy mỗi một liên kết có một tần số dao động riêng xác định, phụ thuộc vào

bản chất các nguyên tố tham gia liên kết và môi trường mà liên kết đó tồn tại.

Phổ hồng ngoại của các chất được đo trên máy Nicolet – Impact 400FTR ở

TRẦN THỊ THANH HỢP

43

trong khoảng bước sóng 400 – 4000 cm-1, đo dưới dạng ép viên với KBr rắn, tại

LUẬN VĂN THẠC SĨ

phòng hồng ngoại – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

2.4.4 Phương pháp đo thời gian sống huỳnh quang

Để khảo sát thời gian phát huỳnh quang của tổ hợp chấm lượng tử CdTe -

rhodamine so sánh với thời gian phát huỳnh của riêng chấm lượng tử, tôi sử dụng

thiết bị đo thời gian phát huỳnh quang của các tổ hợp này.

Hình 2. 11: Sơ đồ khối thiết bị đo thời gian sống huỳnh quang

Các phép đo thời gian phát huỳnh quang được tiến hành trên hệ đo thời gian

sống tại phòng thí nghiệm quang phổ laser, trung tâm điện tử học lượng tử, Viện

Vật Lý, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Nguồn kích thích quang sử dụng trong thí nghiệm là laser bước sóng 405- nm.

Thiết bị đo thời gian sống phát quang trên cơ sở kỹ thuật đếm đơn photon tương

quan thời gian hoàn chỉnh bao gồm: nguồn sáng kích thích, khối đếm đơn photon

tương quan thời gian, phần mềm thu nhận và xử lý tín hiệu. Thiết bị cho phép đo

thời gian sống phát quang của vật liệu có tín hiệu huỳnh quang rất bé (đếm đơn

photon) và đo thời gian sống huỳnh quang độ phân giải rất cao (250 pico-giây)

Sử dụng thiết bị nghiên cứu quá trình trao đổi năng lượng của chất màu và hạt

nano, nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu xạ năng lượng cao lên tính chất

TRẦN THỊ THANH HỢP

44

quang học của chấm lượng tử CdTe.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Sensor xác định Rhodamine B

Phổ phát xạ huỳnh quang và hấp thụ của các chất

 Chấm lượng tử:

Hình 3. 1: Ảnh TEM của chấm lượng tử CdTe trong dung dịch

Hình 3. 2: Phổ hấp thụ và phát xạ của chấm lượng tử CdTe được dùng trong luận

văn này

TRẦN THỊ THANH HỢP

45

Nhận xét:

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chấm lượng tử sử dụng trong luận văn là CdTe, có cường độ phát xạ mạnh, có

tính tương thích cao với các chất màu hữu cơ và một đặc điểm được xem là quan

trọng nhất ở đây là chấm lượng tử CdTe với vỏ MPA (3-mercaptopropanoic acid)

phân tán rất tốt trong môi trường nước. Kết quả chụp ảnh TEM cho thấy kích thước

các hạt khá đồng đều cỡ từ 2.2 nm. Các chấm lượng tử CdTe đã được sử dụng ngay

trong các phép thí nghiệm này mà không cần trải qua bất cứ một khâu biến đổi bề

mặt nào cả.

 Chất màu hữu cơ:

Hình 3. 3: Phổ hấp thụ của chất màu rhodamine B ở các nồng độ khác nhau Trong đó: mẫu 1, 2, 3 là chất màu Rhodamine B với nồng độ tương ứng là 10-5,

10-6, 10-7 g/ml.

Nhận xét:

Nhìn vào phổ hấp thụ của các chất màu ta nhận thấy cường độ hấp thụ của các

chất màu thay đổi theo quy luật khi nồng độ chất màu thay đổi (cường độ hấp thụ

giảm dần khi nồng độ giảm dần), từ đó ta có thể xây dựng được mô hình FRET ứng

TRẦN THỊ THANH HỢP

46

dụng chế tạo nanosensor độ nhạy cao.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

 Sự chồng chập của phổ phát xạ huỳnh quang lên phổ hấp thụ:

Hình 3. 4: Phổ huỳnh quang của Qds và hấp thụ của chất màu Rhodamine b

Trong đó: mẫu 1, 2, 3, QD là chất màu Rhodamine B với nồng độ tương ứng là

10-5, 10-6, 10-7, 0 g/ml.

Nhận xét:

Hình cho thấy đỉnh hấp thụ của Rhodamine B ~560 nm, và có sự chồng chập

gần như hoàn toàn của phổ phát xạ của chấm lượng tử lên phổ hấp thụ của chất

màu. Điều này thỏa mãn điều kiện xảy ra hiệu ứng FRET hay là có sự truyền năng

TRẦN THỊ THANH HỢP

47

lượng không bức xạ từ CdTe sang Rhodamine B.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 3. 5: Mô tả tương tác tĩnh điện giữa QDs CdTe và Rhodamine B

Hơn nữa, từ hình cho thấy giữa QDs và rhodamine B tồn tại tương tác tĩnh điện,

do tương tác này mà các phân tử chất màu hữu cơ Rhodamine B có thể bao quanh

chấm lượng tử CdTe và thỏa mãn điều kiện về khoảng cách để xảy ra hiệu ứng

truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang từ CdTe sang Rhodamine B.

 Nghiên cứu phổ phát xạ của CdTe/Rhodamine B:

Hình 3. 6: Phổ huỳnh quang của cặp CdTe/Rhodamine B với nồng độ Rhodamine B

từ 0,3.10 - 10.10 .

Trong đó, các mẫu 1, 2, 3, 4, 5, QD tương ứng với nồng độ Rhodamine B là

0.3.10-5, 0.5.10-5, 1.10-5, 5.10-5, 10.10-5, 0 g/ml

Nhậnxét:

Từ hình 3.6, có thể thấy rằng hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng FRET

giữa cặp CdTe-Rhodamine B trong dung dịch thể hiện rõ qua sự thay đổi phổ huỳnh

TRẦN THỊ THANH HỢP

48

quang theo sự thay đổi nồng độ chất màu từ 0,3.10 g/ml tới 10.10 g/ml. Hình trên

LUẬN VĂN THẠC SĨ

thể hiện phổ phát xạ ở các nồng độ khác nhau của Rhodamine B: chỉ có một mình

QDs (màu hồng), sau đó bổ sung Rhodamine B: (màu đen), (màu

đỏ), (xanh lá cây), (xanh đậm), (xanh da trời).

Trong hình 3.6 ta nhận thấy có sự suy giảm cường độ huỳnh quang của chấm

lượng tử và tăng cường độ huỳnh quang của Rhodamine B theo nồng độ tăng dần

của Rhodamine B. Việc tăng dần nồng độ chất màu Rhodamine B đã dập tắt dần

huỳnh quang chất cho (chấm lượng tử CdTe) đồng thời với sự phát xạ của chất nhận

(Rhodamine B), điều này chỉ ra hình thức truyền năng lượng tới chất nhận. Từ hình

3.6có thể thấy rằng sự dập tắt huỳnh quang CdTe theo sự thay đổi nồng độ

Rhodamine B diễn ra mạnh mẽ. Sự dập tắt quá trình phát huỳnh quang của CdTe và

đồng thời nâng sự phát xạ Rhodamine B và đó là tín hiệu xác nhận việc truyền năng

lượng cộng hưởng không bức xạ từ CdTe đến Rhodamine B.

 Phép đo thời gian sống huỳnh quang

Phép đo thời gian phân rã huỳnh quang cung cấp thông tin quan trọng và chính

xác về sự tương tác phân tử hơn so với các phép đo trạng thái ổn định (như đó phổ

UV-Vis, phổ PL). Bằng cách theo dõi thời gian sống huỳnh quang của các chấm

lượng tử trong sự có mặt và không có chất màu, các thông số quan trọng có thể thu

được qua các tương tác phân tử. Hiệu quả của việc dập tắt huỳnh quang và đặc biệt

là quá trình FRET bây giờ được nghiên cứu rộng rãi trong các ứng dụng quang hóa

và quang sinh học, trong đó, phép đo phổ phát xạ huỳnh quang thường được sử

dụng để định lượng hiệu suất FRET, nhưng thời gian sống huỳnh quang lại là kỹ

thuật chính xác và mạnh mẽ hơn bởi vì nó không phụ thuộc vào nồng độ,và do đó

kết quả thu được là một thông số đáng tin cậy.Thời gian sống trong sự hiện diện và

sự vắng mặt của chất nhận (acceptor) có khả năng làm sáng tỏ hiệu suất FRET trong

TRẦN THỊ THANH HỢP

49

sự các lựa chọn cặp chất cho và chất nhận.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 3. 7: Đường biểu diễn phân rã huỳnh quang của CdTe trong sự không có

và có mặt chất màu Rhodamine B ở các nồng độ khác nhau.

Trong đó, các mẫu QD, 1, 2, …5 tương ứng với nồng độ Rhodamine B là 0,

0.3.10-5, 0.5.10-5, 1.10-5, 5.10-5, 10.10-5 g/ml.

Hình 3.7 cho thấy các đường cong phân rã huỳnh quang của QDs có và

không có Rhodamine B. Ở đây đã xảy ra hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng

huỳnh quang và thời gian phân rã suy giảm tuyến tính theo sự tăng dần nồng độ

rhodamine b đóng vai trò là chất dập tắt (nhận năng lượng từ chất cho là CdTe).

Qua hình 3.7 ta có thể thấy sự suy giảm thời gian sống khi nồng độ

Rhodamine B tăng dần tức là đường thời gian sống thời gian sống trung bình của

QDs sẽ giảm xuống một cách tuyến tính khi có sự hiện diện của chất dập tắt ở đây

TRẦN THỊ THANH HỢP

50

là chất màu theo nồng độ tăng dần.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

3.2 Nanosensor để xác định Clenbuterol

 Biến tính bề mặt chấm lượng tử

Hình 3. 8: Phổ hấp thụ của Naphtylethylene diamin và phổ phát xạ của Qd

Từ hình 3.8 nhận thấy rằng do không có sự trùng chập giữa phổ hấp thụ của

ligand và phổ phát xạ của Qd, không thỏa mãn điều kiện của hiệu ứng FRET, do đó

TRẦN THỊ THANH HỢP

51

không xảy ra hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng giữa QD và ligand.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 3. 9: Phổ phát xạ của Qd và hỗn hợp Qd-Naphtylethylene diamin

Hình 3.9 là phổ phát xạ của Qds và Qds sau khi được biến tính bởi

Naphtylethylene diamin. Qds ban đầu có bước sóng phát xạ là 530 nm, còn sau khi

biến tính, bước sóng phát xạ đã dịch chuyển 7nm về phía bước sóng dài, chứng tỏ

các phân tử Naphtylethylene diamin đã được gắn thành công trên bề mặt Qd là tăng

TRẦN THỊ THANH HỢP

52

kích thước hạt của chấm lượng tử do đó bước sóng phát xạ tăng.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 3. 10: Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang của Qd-Naphtylethylene diamin vào pH

Kết quả nghiên cứu cường độ huỳnh quang của tổ hợp Qd-Naphtylethylene

diaminphụ thuộc vào độ pH được trình bày trong hình 3.10. Từ hình nhận thấy rằng,

cường độ huỳnh quang tăng với sự tăng của độ pH, do trong môi trường axit QDs bị

mất huỳnh quang. Tuy nhiên, hợp chất diazo Clenbuterol không bền trong môi

trường bazo. Do đó, giá trị pH cho phản ứng tương tác của QDs và Naphtylethylene

TRẦN THỊ THANH HỢP

53

diamin nên được tiến hành ở pH trong khoảng 7.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 3. 11: Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang của Qd-Naphtylethylene diamin vào nhiệt độ

Hình 3.11 thể hiện sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang của QDs-

Naphtylethylene diamin vào nhiệt độ. Từ hình 3.11 cho thấy cường độ huỳnh quang

giảm dần khi nhiệt độ tăng từ 25– 50 oC. Nguyên nhân là do, ở nhiệt độ cao các hạt

chấm lượng tử dao động mạnh nên bị mất nhiều năng lượng làm giảm cường độ

huỳnh quang. Do đó, phản ứng của Qd-Naphtylethylene diamine có thể được tiến

TRẦN THỊ THANH HỢP

54

hành ở điều kiện nhiệt độ phòng.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

3.3 Diazo clenbuterol

Hình 3. 12: Phổ hấp thụ của hợp chất Diazo Clenbuterol

So sánh với phổ hấp thụ của Clenbuterol (hình 2.1), trong phổ hấp thụ của hợp

chất diazo clenbuterol (hình 3.12) cho thấy đỉnh hấp thụ cực đại của diazo

clenbuterol là 345.5 nm, tăng 54.5 nm so với đỉnh hấp thụ của Clenbuterol ban đầu,

điều này chứng tỏ sự hình thành của nhóm diazo –N=N- làm tăng bước sóng hấp

TRẦN THỊ THANH HỢP

55

thụ.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

3.4 Phản ứng cộng hợp của diazo clenbuterol với ligand

Hình 3. 13: Phổ hấp thụ của hợp chất Clenbuterol-Naphtylethylene diamin

Hình 3.13 là phổ hấp thụ của hợp chất Clenbuterol-Naphtylethylene diamin

được tổng hợp từ diazo Clenbuterol với N-1-Naphtylethylene diamin đihidroclorit .

Nhận thấy rằng, đỉnh hấp thụ cực đại của hợp chất này là 464 nm và dịch chuyển về

phía bước sóng dài so với clenbuterol và diazo clenbuterol. Kết quả này chứng minh

sự gắn thành công phân tử diazo clenbuterol lên hợp chất ligand làm tăng số liên kết

TRẦN THỊ THANH HỢP

56

pi liên hợp do đó làm tăng đỉnh hấp thụ.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 3. 14: Phổ hấp thụ và phát xạ của chất cho (QD CdTe bước sóng phát xạ 530nm) và chất nhận (tổ hợp Clenbuterol-Naphtylethylene diamin)

TRẦN THỊ THANH HỢP

57

Hình 3. 15: Phổ trùng chập của chất cho và chất nhận

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Sau quá trình diazo clenbuterol và coulping diazo clenbuterol với ligand, ta thu

được hợp chất mới có đỉnh hấp thụ 464 nm. Từ hình 3.14 và 3.15, có thể thấy phổ

hấp thụ của hợp chất mới này trùng chập với phổ phát xạ của QDs (vùng trùng

chập) và thỏa mãn điều kiện xảy ra hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh

quang (FRET). Hợp chất này có phổ phát xạ nằm hoàn toàn trong vùng phổ phát xạ

của Qds (hình 3.14) nên có thể dự đoán trong trường hợp này phổ huỳnh quang của

cặp chất cho – chất nhận thu được chỉ xuất hiện 1 đỉnh.

Muối diazo của ligand với diazo clenbuterol thu được đem đo phổ hồng ngoại

để nghiên cứu cấu trúc.

Hình 3. 16: Phổ hồng ngoại của muối diazo

Trên phổ hồng ngoại (hình 3.16) thấy xuất hiện pic nhọn chân rộng hấp thụ mạnh

trong vùng 3332.82 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của amin và nhóm OH; pic ở

2976 cm-1 là dao động hóa trị của liên kết C-H, pic ở 1615 cm-1 tương ứng với dao

động biến dạng N-H, còn pic hấp thụ ở 1576 cm-1 là đối với nhóm azo, chứng tỏ phản

ứng coulping thành công. Ngoài ra, trên phổ còn có pic 1330 cm-1 ứng với dao động

TRẦN THỊ THANH HỢP

58

hóa trị C-N của amin thơm.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

3.5 Mẫu thử sensor

Hình 3. 17: Sự thay đổi cường độ huỳnh quang theo nồng độ Clenbuterol

Trong đó, các mẫu QD, 1, 2, 3….10 tương ứng với nồng độ của Clenbuterol là

0, 10-13, 10-12, 10-11, 10-10, ….10-4 (g/ml).

Sự thay đổi cường độ huỳnh quang của nanosensor tương ứng với nồng độ của

Clenbuterol được thể hiện trong hình 3.17. Nhận thấy rằng, phổ phát quang của

nanosensor rất rõ nét, và kết quả thu được chỉ có 1 đỉnh phát xạ, điều này chứng tỏ

đã xuất hiện hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang từ chất cho QDs

sang tổ hợp chất nhận. Cường độ huỳnh quang của nanosensor giảm dần tương ứng

với sự tăng dần của nồng độ Clenbuterol. Ở nồng độ của Clenbuterol là 10-13 g/ml,

thì không có sự thay đổi đáng kể so với QDs ban đầu. và cường độ bị dập tắt hoàn

TRẦN THỊ THANH HỢP

59

toàn ở nồng độ 10-4 g/ml.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 3. 18: Tương quan giữa nồng độ Clenbuterol với cường độ phát xạ của nanosensor

Cường độ phát quang của nanosensor phụ thuộc rõ vào nồng độ của

Clenbuterol. Nồng độ Clenbuterol so với Qd càng cao cường độ phát huỳnh quang

càng nhỏ. Ngược lại, nồng độ Clenbuterol càng thấp cường độ huỳnh quang càng

mạnh. Quan hệ này gần như tuyến tính trong khoảng nồng độ Clenbuterol từ 10-7

đến 10-12 g/ml (hình 3.18).

So với các phương pháp được sử dụng để xác định nồng độ Clenbuterol hiện

nay (GC/MS, ELISA), nanosensor sử dụng Qd và hiệu ứng truyền năng lượng cộng

hưởng huỳnh quang đã xác định được nồng độ Clenbuterol ở hàm lượng thấp hơn

10-12 g/ml trong khi giới hạn xác định của GC/MS và ELISA là 0.1 ppb, hơn nữa,

TRẦN THỊ THANH HỢP

60

phương pháp tiến hành đơn giản cho kết quả nhanh và chính xác.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KẾT LUẬN

Luận văn đã thu được một số những kết quả và thành công như sau:

- Đã chế tạo được nanosensors sử dụng Qds và hiệu ứng truyền năng lượng

cộng hưởng huỳnh quang (FRET) để xác định lượng dư chất hóa học trong thực

phẩm là Rhodamine B và Clenbuterol. Dựa trên sự thay đổi cường độ phát xạ huỳnh

quang của nanosensor để định lượng và định tính sự tồn tại của dư lượng

Rhodamine B, Clenbuterol.

- Nanosensor loại này có độ nhạy cao, có khả năng xác định dư lượng nhỏ đến

10‾¹² g/ml chất Clenbuterol trong sản phẩm chăn nuôi, thấp hơn so với hai phương

pháp phổ biến hiện nay GC/MS và ELISA. Phương pháp này có thời gian xác định

ngắn, các bước tiến hành đơn giản. Kết quả bước đầu này mở ra triển vọng chế tạo

hoàn thiện và ứng dụng trong thực tế Nanobiosensor xác định vi lượng Clenbuterol

TRẦN THỊ THANH HỢP

61

trong vật nuôi và sản phẩm chăn nuôi.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Nguyễn Đức Nghĩa, Polyme chức năng và vật liệu lai cấu trúc nano, Nhà xuất bản Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ, 2009, tr. 393-409

Tài liệu tiếng Anh

2. Bawendi M. G., Wilson W. L., Rothberg L., Carroll P. J., Jedju T. M., Steigerwald M. L., Brus L. E. (1990), Electronic structure and photoexcitedcarrier dynamics in nanometer-size CdSe clusters, Physical Review Letters 65(13), 1623-1626.

3. Bawendi M. G., Carroll P. J., Wilson W. L., Brus L. E. (1992), "Luminescence properties of CdSe quantum crystallites: Resonance between interior and surface localized states", The Journal of Chemical Physics 96, pp. 946-954.

4. Chi T T K, Chinh V D, Thuy U T D, Yen N H, Hai N N, Cao D T, Nga P T and Liem N Q 2012 Adv. Nat. Sci.: Nanosci. Nanotechnol. 3 035008

5. Colvin V.L., Alivisatos A.P. (1992), CdSe Nanocrystals with a DipoleMoment in the 1st Excited-State, Journal of Chemical Physics 97(1), 730-733.

6. Colvin V.L., Alivisatos A.P., Tobin J.G. (1991), Valence-Band Photoemission from a Quantum-Dot System, Physical Review Letters 66(21), 2786-2789.

7. Dabbousi, B.O.; Rodriguez-Viejo, J.; Mikulec, F.V.; Heine, J.R.; Mattoussi, H.; Ober, R.; Jensen, K.F.; Bawendi, M.G. (CdSe)ZnS Core- Shell Quantum Dots: Synthesis and Optical and Structural Characterization of a Size Series of Highly Luminescent Materials. J. Phys. Chem. B. 1997, 101, 9463-9475.

8. Derfus, A.M.; Chan, W.C.W.; Bhatia, S.N. Probing the Cytotoxicity of Semiconductor Quantum Dots. NanoLett. 2004, 4, 11-18.

9. Drummen G.P.C. (2010), Quantum Dots—From Synthesis to Applications in Biomedicine and Life Sciences, International Journal of Molecular Sciences 11, 154-163.

TRẦN THỊ THANH HỢP

62

10. Gae Baik Kim and Young-Pil Kim (2012), Analysis of Protease Activity Using Quantum Dots and Resonance Energy Transfer, Theranostics 2012,

LUẬN VĂN THẠC SĨ

2(2). 127-138

11. Hines, M.A.; Guyot-Sionnest, P. Synthesis and Characterization of Strongly Luminescing ZnSCapped CdSe Nanocrystals. J. Phys. Chem. 1996, 100, 468-471.

12. Hoa N T, Thuy U T D, Hien V T, Chi T T K, Quyen D V, Khang D D and Liem N Q 2012 Adv. Nat. Sci.: Nanosci. Nanotechnol. 3 035014

13. Kim E.Sapsford, Thomas Pons, Igor L. Medintz, Hedi Mattoussi, Bionsensing with Luminescent Semiconductor Quantum Dots, Sensor 2006, 6, 925-953.

14. Mahto S. K., Park C., Yoon T. H., Rhee S. W. (2010), Assessment of cytocompatibility of surface-modified CdSe/ZnSe quantum dots for BALB/3T3 fibroblast cells, Toxicology in Vitro 24, 1070-1077

15. Michalet, X.; Pinaud, F.F.; Bentolila, L.A.; Tsay, J.M.; Doose, S.; Li, J.J.; Sundaresan, G.; Wu, A.M.; Gambhir, S.S.; Weiss, S. Quantum Dots for Live Cells, In Vivo Imaging, and diagnostics. Science 2005, 307, 538-544. 16. Murphy, C.J. Optical Sensing with quangtum dots. Anal. Chem 2002, 74, 520A-526A

17. Murray, C.B.; Kagan, C.R.; Bawendi, M.G. Synthesis and Characterization of Monodisperse Nanocrystals and Close-Packed Nanocrystal Assemblies. Ann. Rev. Mater. Sci. 2000, 30, 545-610.

18. Murray, C.B.; Norris, D.J.; Bawendi, M.G. Synthesis and Characterization of Nearly Monodisperse CdE (E = Sulfur, Selenium, Tellurium) Semiconductor Nanocrystallites. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 8706-8715.

19. Nghia N D, Tung N T, Ha H M and Liem N Q 2012 Adv. Nat. Sci: Nanosci. Nanotechnol. 3 035014

20. Olshavsky M.A., Goldstein A.N., Alivisatos A.P. (1990), "Organometallic Synthesis of Gaas Crystallites Exhibiting Quantum Confinement", Journal of the American Chemical Society 112(25), pp. 9438-9439.

21. Ozkan, M. Quantum Dots and Other Nanoparticles: What Can They Offer

to Drug Discovery? Drug Discovery Today 2004, 9, 1065-1071.

TRẦN THỊ THANH HỢP

63

22. Peng, X.; Schlamp, M.C.; Kadavanich, A.V.; Alivisatos, A.P. Epitaxial Growth of Highly Luminescent CdSe/CdS Core/ShellNanocrystals with Photostability and Electronic Accessibility. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7019-7029.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

23. Peng, Z.A.; Peng, X. Formation of High-Quality CdTe, CdSe, and CdS Nanocrystals Using CdO as Precursor. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 183- 184.

24. Reed M.A., Randall J. N., Aggarwal R. J., Matyi R. J., Moore T. M., Wetsel A. E. (1988), Observation of discrete electronic states in a zero-dimensional semiconductor nanostructure, Phys Rev Lett 60 (6), 535- 537.

25. Smith A.M., Mohs A.M., Nie S. (2009), Tuning the optical and electronic properties of colloidal nanocrystals by lattice strain, Nature Nanotechnology 4, 56-63.

26. Smith A.M., Nie S. (2009), Semiconductor Nanocrystals: Structure, Properties, and Band Gap Engineering, Accounts of Chemical Research 43, 190-200.

27. Sungjee K., Fisher B., Eisler H. J., Bawendi M. (2003), Type-II Quantum CdSe/ZnTe(Core/Shell) and Dots: CdTe/CdSe(Core/Shell) Heterostructures, J. am. chem. soc. 125, 11466-11467.

28. Syed Arshad Hussain (2010), An Introduction to Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET).

29. Timothy Jamieson, Raheleh Bakhshi, Daniela Petrova (2007), Review Biological applications of quantum dots, Biomaterials volume 28 (2007), 4717–4732.

30. Tomczak N., Jánczewski D., Han M., Vancso G. J. (2009), Designer polymer–quantum dot architectures, Progress in Polymer Science 34, 393- 430.

31. Wang X, Lou X, Wang Y, Gou Q, Fang Z, Zhong X, Mao H, Jin Q, Wu L, Zhao H and Zhao J 2010 Biosens. Bioelectron. 25 1934

32. Yi Zhang and Tza-Huei Wang (2012), Quantum Dot Enabled Molecular Sensing and Diagnostics, Theranostics 2012, 2(7), 631-654, 2012.

33. Yu W.W., Chang E., Drezek R., Colvin V.L., (2006), Water-soluble quantum dots for biomedical applications, Biochemical and Biophysical Research Communications 348, 781-786.

TRẦN THỊ THANH HỢP

64

34. Yu T, Shen J S, Bai H H, Guo L, Tang J J, Jiang Y B and Xie J W 2009 Analyst 134 2153.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

35. Yun Z, Zhengtao D, Jiachang Y, Fangqiong T and Qun W 2007 Anal. Biochem. 364 122.

36. Zeng R, Zhang T, Liu J, Hu S, Wan Q, Liu X, Peng Z and Zou B 2009 Nanotechnology 20 095102.

TRẦN THỊ THANH HỢP

65

37. Zhou C., Shen H., Guo Y., Xu L., Niu J., Zhang Z., Du Z., Chen J., Li L. S.(2010), A versatile method for the preparation of water-soluble amphiphilic oligomer-coated semiconductor quantum dots with high fluorescence and stability, Journal of Colloid and Interface Science 344, 279-285.