Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu các đặc tính điện hóa của atorvastatin, fenofibrat và ứng dụng trong phân tích bằng phương pháp Von-ampe

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

ĐẶNG MINH HƢƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA ATORVASTATIN,

FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2016

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

ĐẶNG MINH HƢƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA ATORVASTATIN,

FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH

Chuyên ngành: Hóa môi trƣờng

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Giaoo viên hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Thị Kim Thƣờng

Hà Nội – Năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Thị Kim Thường đã giao đề tài và

tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô thuộc Bộ môn Hóa Phân tích - Khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG HN đã truyền đạt cho

tôi những kiến thức vô cùng quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại

khoa.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc với bố, mẹ, gia đình và các

bạn đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn đề tài QG 15.14 của Đại học Quốc gia Hà nội đã hỗ trợ kinh

phí cho chúng tôi thực hiện nghiên cứu này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Học viên

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU ATORVASTATIN ...................... 3

1.1.1. Cấu tạo của atorvastatin ................................................................................. 3

1.1.2. Dƣợc lực học và động học của Atorvastatin ................................................. 4

Dược lực học ............................................................................................................ 4

Dược động học ......................................................................................................... 4

1.2. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU FENOFIBRAT ............................. 4

1.2.1. Cấu tạo của fenofibrat .................................................................................... 4

1.2.2. Dƣợc lực học và động lực học của Fenofibrat .............................................. 5

Dược lực học ............................................................................................................ 5

Dược động học ......................................................................................................... 5

1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ATORVASTATIN, FENOFIBRAT.... 5

1.3.1. Các phƣơng pháp xác định atorvastin .......................................................... 6

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)..................................................... 6

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ................................................................ 6

Phương pháp von-ampe ........................................................................................... 6

1.3.2. Các phƣơng pháp xác định fenofibrat .......................................................... 7

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ................................................................ 7

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................................... 7 Phương pháp cực phổ và von-ampe hòa tan ............................................................ 8

1.4. GIỚI THIỆU PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN HẤP PHỤ .......... 9 1.4.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp von-ampe hoà tan hấp phụ (AdSV) ............ 9

1.4.2. Các kỹ thuật ghi đƣờng von-ampe hòa tan hấp phụ. ................................ 11

Kỹ thuật von-ampe xung vi phân (DP) .................................................................. 11

Kỹ thuật sóng vuông .............................................................................................. 12

CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 13 2.1. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 13

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .............................................................................. 13

2.2.1. Thiết bị ......................................................................................................... 13

2.2.2. Dụng cụ ........................................................................................................ 14

2.2.3. Hóa chất ....................................................................................................... 14 2.2.4. Chuẩn bị dung dịch ...................................................................................... 15

Pha dung dịch......................................................................................................... 15

Pha dung dịch gốc atorvastatin và fenofibrat ........................................................ 15

2.3. Xử lý mẫu .......................................................................................................... 15

2.3.1. Quy trình tiến hành phân tích mẫu thuốc atovastatin .................................. 15

2.3.2. Quy trình xử lý mẫu huyết tương xác định atorvastatin. ............................. 16

2.3.3. Quy trình tiến hành phân tích mẫu thuốc hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat.

............................................................................................................................... 16

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 18

3.1. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ATORVASTATIN TRONG

MẪU THUỐC BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE. ...................................... 18

3.1.1. Khảo sát các điều kiện cơ bản xác định atorvastatin ................................ 18

Nghiên cứu đặc tính điện hóa của atorvastatin ...................................................... 18

Khảo sát ảnh hưởng của pH ................................................................................... 19

Khảo sát ảnh hưởng thế hấp phụ ........................................................................... 20

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ............................................................ 22

Khảo sát thời gian cân bằng ................................................................................... 23 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế ................................................................ 25

3.1.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phƣơng pháp............................. 27

Khoảng tuyến tính. ................................................................................................. 27 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .................................... 28 Độ lặp lại ................................................................................................................ 28

3.1.3. Áp dụng thực tế phân tích hàm lƣợng atorvastatin trong các mẫu thuốc trên thị trƣờng. ........................................................................................................ 29

III

Phân tích mẫu thuốc Lipivastatin 20mg của công ty cổ phần hóa-dược phẩm

Mekopha ................................................................................................................ 29

Phân tích mẫu thuốc Avastor (10mg) của công ty cổ phần Dược phẩm Boston

Việt Nam. ............................................................................................................... 30

3.1.4. Nghiên cứu quy trình định lƣợng atorvastatin trong mẫu huyết tƣơng. . 32

Khảo sát thành phần hỗn hợp dung dịch rửa tạp. .................................................. 32

Khảo sát hành phần hỗn hợp dung dịch rửa giải. .................................................. 33

3.1.5. Xác định hiệu suất thu hồi của atorvastatin trong mẫu huyết tƣơng. ..... 34

3.2. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG HỖN HỢP ATORVASTATIN VÀ FENOFIBRAT BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE

HÒA TAN HẤP PHỤ ............................................................................................. 36

3.2.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp ................................................................. 36

Nghiên cứu đặc tính điện hóa của hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat .................. 36

Khảo sát ảnh hưởng của pH. .................................................................................. 39

Khảo sát ảnh hưởng thế hấp phụ ........................................................................... 41

Khảo sát ảnh hưởng thời gian hấp phụ .................................................................. 42

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế ................................................................ 44

3.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phƣơng pháp............................. 46

Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn ......................................... 46

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp........ 51

Đánh giá độ lặp lại của phép đo. ............................................................................ 51

3.2.3. Áp dụng thực tế phân tích một số hỗn hợp thuốc trên thị trƣờng ........... 52

Phân tích hàm lượng atorvastatin trong các mẫu thuốc ......................................... 52

Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng fenofibrat trong các mẫu thuốc ................ 54

Phân tích đồng thời hàm lượng atovastatin và fenofibrat trong mẫu thuốc. ......... 56

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 60

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Tiếng anh Tiếng việt Viết tắt

1 Anodic Stripping Voltammetry Von-ampe hòa tan a-nốt ASV

Asorptive Stripping Von-ampe hòa tan hấp phụ AdSV 2 Voltammetry

Ator Atorvastatin 3

Cathodic Stripping Von-ampe hòa tan ca-tốt CSV 4 Voltammetry

Cyclic Voltammetry Von-ampe vòng CV 5

Differential pulse stripping Von-ampe hòa tan xung vi phân DPV 6 Voltammetry

Feno Fenofibrat 7

Hanging Mercury Dropping Điện cực giọt thủy ngân treo HMDE 8 Electrode

High Perfomance Liquid Phương pháp sắc ký lỏng hiệu HPLC 9 Chromatography năng cao

GPPH Limit of Detection Giới hạn phát hiện 10 (LOD)

Limit of quantityication Giới hạn định lượng LOQ 11

Mercury Film Electrode Điện cực màng thủy ngân MFE 12

Square-Wave Stripping Von-ampe hòa tan sóng vuông SqW 13 Voltammetry

Static Mercury Dropping Điện cực giọt thủy ngân tĩnh SMDE 14 Electrode

Stripping Voltammetry Von-ampe hoà tan SV 15

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm-Autolab. ......................................... 14 Hình 3.1: Đường von-ampe vòng của atorvastatin 10-7mol.L-1 ............................... 18 Hình 3.2: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào pH .......................................... 20

Hình 3.3: Sự phụ thuộc cường độ dòng vào thế hấp phụ ......................................... 21

Hình 3.4: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thế hấp phụ .............................. 21 Hình 3.5: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại nồng độ

chất phân tích 5.10-7M ............................................................................................. 22

Hình 3.6: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại nồng độ

chất phân tích 10-8M ................................................................................................ 22 Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ ............................................................. 23

Hình 3.8: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào thời gian cân bằng. ............... 24

Hình 3.9: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian cân bằng. ................ 24

Hình 3.10: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào tốc độ quét thế. ..................... 26

Hình 3.11. Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét thế. ...................... 26

Hình 3.12: Đường von-ampe hòa tan của atorvastatin từ 10-8M đến 10-7M. ........ 27

Hình 3.13. Đường chuẩn của atorvastatin từ 10-8M đến 10-7M ............................. 28 Hình 3.14: Đường chuẩn của atorvastatin từ 10-7M đến 10-6 M .............................. 28 Hình 3.15: Đường von-ampe hòa tan mẫu thuốc mekopha ...................................... 29

Hình 3.16. Đường von-ampe hòa tan khi đo mẫu (10mg) của công ty dược phẩm

Boston bằng phương pháp thêm chuẩn ..................................................................... 31

Hình 3.17. Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thành phần dung dịch rửa tạp

................................................................................................................................... 32

Hình 3.18. Đường von-ampe phụ thuộc vào thành phần dung dịch rửa giải. .......... 34 Hình 3.19. Đường von–ampe hòa tan của atovastatin trong mẫu huyết tương........ 35

Hình 3.20: Đường CV của atorvastatin và fenofibrat. ............................................. 36

Hình 3.21: Đường von-ampe vòng của atorvastati và fenofibrat phụ thuộc vào tốc độ quét ....................................................................................................................... 38 Hình 3.22: Phản ứng điện hóa của atorvastatin ...................................................... 38 Hình 3.23: Phản ứng điện hóa của fenofibrat. ........................................................ 39 Hình 3.24: Sựphụ thuộc của cường độ dòng píc vào pH ......................................... 40 Hình 3.25: Đường von-ampe hòa tan khi thay đổi pH từ 5,0 đến 9,0. ..................... 40

Hình 3.26: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào thế hấp phụ. ................................. 41

Hình 3.27: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thế hấp phụ ............................ 42

Hình 3.28: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào thời gian hấp phụ tại nồng độ chất phân tích 5.10-7M. ............................................................................................. 43 Hình 3.29: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại nồng độ chất phân tích 5.10-7M. ............................................................................................. 44 Hình 3.30. Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét thế. ...................... 45

Hình 3.31: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp fenofibrat và atorvastatin ....... 47 ( fenofibrat : atorvastatin = 1: 3). ............................................................................. 47

Hình 3.32.Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của –log C fenofibrat vào cường độ

dòng I......................................................................................................................... 48

Hình 3.33. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của –log C atorvastatin vào cường độ dòng I.................................................................................................................... 48

Hình 3.34: Đường von-ampe hòa tan khi thay đổi nồng độ của hỗn hợp fenofibrat

và atorvastatin. .......................................................................................................... 49 Hình 3.35. Đường chuẩn của fenofibrat trong khoảng nồng độ từ 10-8M đến 107M. ................................................................................................................................... 49

Hình 3.36. Đường chuẩn của atorvastatin trong khoảng nồng độ từ 10-8M đến 10-

7M.............................................................................................................................. 50

Hình 3.37. Đường von-ampe hòa tan khi đo mẫu (10mg) của công ty dược phẩm

SHYT bằng phương pháp thêm chuẩn ...................................................................... 53

Hình 3.38. Đường von-ampe hòa tan của thuốc Lipistad 300mg ............................. 55

Hình 3.39: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp Atovastatin 10mg và Fenofibrat

300mg ........................................................................................................................ 57

VII

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng của píc ....................................... 19

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng píc ................................ 20

Bảng 3.3: Sự ảnh hưởng của tốc độ quét thế tới cường dộ dòng píc. ...................... 25

Bảng 3.4. Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc LIPIVASTIN bằng phương pháp

thêm chuẩn. .................................................................................................. 29

Bảng 3.5. Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc Avastor bằng phương pháp thêm chuẩn ............................................................................................................ 30

Bảng 3.6. Sự phụ thuộc của cường dộ dòng píc vào thành phần dung dịch rửa tạp. 32

Bảng 3.7. Sự phụ thuộc của cường dộ dòng píc vào thành phần dung dịch giải. ..... 33

Bảng 3.9. Cường độ dòng píc khi đo Atorvastatin trên nền mẫu huyết tương bằng

phương pháp thêm chuẩn. ............................................................................ 40

Bảng 3.10. Cường độ dòng píc khi thay đổi tốc độ quét từ 25mV/s đến 200mV/s. . 37

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng của píc ..................................... 39

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng píc .............................. 41

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ tới cường độ dòng píc tại nồng độ chất phân tích 5.10-7M. ........................................................................................ 43

Bảng 3.14. Sự ảnh hưởng của tốc độ quét thế tới cường dộ dòng píc. .................... 45

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ chất phân tích đến cường độ dòng píc ............ 47

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nồng độ chất phân tích đến cường độ dòng píc ............ 48

Bảng 3.18. Độ lặp lại của hỗn hợp Ato và Feno ....................................................... 52

Bảng 3.19. Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc Avastor bằng phương pháp thêm

chuẩn ............................................................................................................ 53

Bảng 3.20. Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc bằng phương pháp thêm chuẩn .. 55

Bảng 3.21. Cường độ dòng píc khi đo hỗn hợp mẫu thuốc Ato và Feno bằng phương pháp thêm chuẩn .......................................................................................... 56

VIII

MỞ ĐẦU

Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có hơn mười nghìn hợp chất hữu cơ có

hoạt tính sinh học dùng làm thuốc chữa bệnh cho con người. Theo sự phát triển của dịch vụ y tế, ngành Dược Việt Nam cũng đang trên đà lớn mạnh, tính đến tháng 9

năm 2015, cả nước có 171 doanh nghiệp sản xuất thuốc, trong đó có 93 doanh nghiệp sản xuất tân dược nhưng chỉ có 53 doanh nghiệp đạt chuẩn GMP – WHO

[1]. Theo WHO, thuốc giả chiếm tới 30% và thậm chí, có khi còn lên tới 50% lượng

dược phẩm lưu hành ở một số nước đang phát triển, còn tại Nigeria và Guinee, cứ

10 viên thuốc bán ra có tới 6 viên là thuốc giả[12]. Các mẫu thuốc giả chủ yếu là

những thuốc được sử dụng khá phổ biến, được bệnh nhân sử dụng thường xuyên

thuốc như thuốc điều chỉnh huyết áp, thuốc giảm đường huyết, giảm cholesterol,

thuốc kháng sinh, thuốc giảm đau…Điều khiến nhiều người quan tâm là tỉ lệ thuốc

giả ở Việt Nam ngày một diễn biến phức tạp, nên công tác kiểm tra ngày càng khó

khăn hơn.Theo TS. Trương Quốc Cường, Cục trưởng Cục Quản lý dược, Bộ Y tế,

tỷ lệ thuốc kém chất lượng ở Việt Nam hiện dao động khoảng 3% và thuốc giả dưới

0,02% [12]. Vì vậy, vấn đề kiểm định lại hàm lượng của thuốc theo đúng tiêu chuẩn

là một vấn đề rất quan trọng và thực sự cần thiết.

Mặt khác, ngoài việc định lượng và kiểm định chất lượng thuốc ở dạng bào

chế, thì cần phải có phương pháp phân tích một lượng thuốc nhỏ trong các mẫu sinh

học để có thể tìm hiểu khả năng tồn tại, cũng như khả năng hấp thu của thuốc trong

cơ thể. Ngày nay, có rất nhiều phương pháp được sử dụng để định lượng các hoạt

chất trong thuốc chủ yếu là nhóm các phương pháp sắc ký (HPLC, GC, GC- MS/MS, LC-MS/MS) và nhóm các phương pháp quang phổ (UV-VIS, IR…),

phương pháp cực phổ và phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ. Dược điển Việt

Nam sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp

thường quy để định lượng hoạt chất trong thuốc [1]. Phương pháp HPLC có ưu

điểm có độ nhạy, độ chọn lọc cao, khả năng tách tốt, nhưng khó áp dụng rộng rãi do thiết bị, hóa chất đắt tiền và không phân tích nhanh được. Phương pháp trắc quang tương đối phổ biến nhưng phải qua nhiều giai đoạn chiết tách mất thời gian, tốn hóa chất, hay mất chất phân tích và độ phân giải không cao. Vì vậy, việc nhiên cứu lựa chọn phương pháp phân tích đảm bảo độ đúng, độ chọn lọc, đơn giản, giá thành không cao, thời gian phân tích nhanh có thể kiểm tra song hành với các phương

pháp phân tích trong dược điển và đánh giá tương đương hoạt tính sinh học thuốc là

rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn. Vì vậy, chúng tôi đã chọn phương pháp Von-

ampe hòa tan hấp phụ để thực hiện đề tài luận văn của mình “Nghiên cứu các đặc

tính điện hóa của atorvastatin, fenofibrat và ứng dụng trong phân tích bằng phương pháp Von-ampe”. Atorvastatin và fenofibrat là hai thuốc được sử dụng khá phổ biến

hiện nay, có tác dụng làm giảm hàm lượng Cholesterol và triglicelid trong máu.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 . GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU ATORVASTATIN

1.1.1. Cấu tạo của atorvastatin

Atorvastatin có tên khoa học theo IUPAC: (3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)- axit

3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)-5-propan-2-ylpyrrol-1-yl]-3,5- dihydroxyheptanoic và được biết đến với tên thương mại là Lipitor hay Atorva [1].

Công thức cấu tạo của atorvastatin là

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Atorvastatin.

Công thức phân tử là C33H35FN2O5, khối lượng mol là 558,64 (g/mol)

Ngoài hoạt chất hay sử dụng trong các thuốc là atorvastatin còn có hoạt

chất atorvastatin canxi có công thức cấu tạo như hình 1.2.

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Atorvastatin canxi

Atorvastatin canxi có tên khoa học theo IUPAC là: (bR, dR)-2-(r- fluorophenyl)-b,ddihydroxy-5-isopropyl-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl) pyrrole-1- hepatanoicacid(1:2)trihydrate. Công thức phân tử là C18H68CaF2N4O10.3H2O hay (C33H34FN2O5)2Ca.3H2O[1].

Atrovastatin canxi có khối lượng mol là1155,34 g/mol[1]

Atorvastatin và dạng muối Atorvastatin canxi tồn tại ở dạng bột tinh thể rất

ít tan trong nước: 20,4 µg/mL (pH = 2,1); 1,23 mg/mL (pH = 6,0), tan ít trong etanol, tan tốt trong methanol [1].

1.1.2. Dƣợc lực học và động học của Atorvastatin Dược lực học

Atorvastatin là chất ức chế cạnh tranh và chọn lọc men khử 3-hydroxy-3-

methylglutaryl-coemzym A (HMG-CoA), ức chế quá trình chuyển hóa HMG-CoA

thành mevalonat, một tiền chất của sterol, bao gồm cholesterol. Do vậy atovasttin

có tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol và triglicelid trong máu.

Dược động học

Atorvastatin được hấp thu nhanh chóng sau khi uống, nồng độ thuốc trong

huyết tương tối đa đạt được trong vòng 1-2 giờ. Mức độ hấp thu và nồng độ atorvastatin tăng tỉ lệ với liều lượng atorvastatin. Atorvastatin dạng viên nén có độ

khả dụng sinh học 95-99% so với dạng dung dịch. Độ khả dụng sinh học tuyệt đối

của Atorvastatin là khoảng 14% và độ khả dụng toàn thân của hoạt động ức chế

men khử HMG-CoA là khoảng 30%. Khoảng 98 % atorvastatin gắn kết với các

protein trong huyết tương.Nồng độ thuốc trong huyết tương khi dùng thuốc buổi

chiều tối thấp hơn khi dùng buổi sáng, tuy nhiên nồng độ thuốc trong huyết tương

xấp xỉ 0,25 % cho thấy sự thấm thuốc vào tế bào hồng cầu thấp, nhưng hiệu quả

giảm LDL thì như nhau [2, 3]

Thời gian bán hủy atovastatin trong huyết tương của người 14 giờ. Dưới

2% lượng atorvastatin uống vào được tìm thấy trong nước tiểu [2, 3].

1.2. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU FENOFIBRAT

1.2.1. Cấu tạo của fenofibrat

Fenofibrat có tên khoa học theo IUPAC là propan-2-yl{2-4-[(4-clophenyl) cacbonyl] phenoxy}-2-methylpropanoat được biết với tên thương mại là tricor, là một dẫn xuất của axit fibric.

Công thức cấu tạo của fenofibrat:

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Fenofibrat

Công thức phân tử của fenofibrat: C20H21ClO4

Khối lượng mol (g/mol): 360,831

1.2.2. Dƣợc lực học và động lực học của Fenofibrat Dược lực học

Fenofibrat, dẫn chất của acid fibric, là thuốc hạ lipid máu. Thuốc ức chế

sinh tổng hợp cholesterol ở gan, làm giảm các thành phần gây xơ vữa động mạch và

còn làm giảm triglycerid máu. Do đó, cải thiện đáng kể sự phân bố cholesterol trong

huyết tương.

Dược động học

Fenofibrat được hấp thu tốt từ đường dạ dày ruột sau khi uống. Trong một

nghiên cứu ở người tình nguyện khoẻ mạnh, khoảng 80% liều duy nhất fenofibrat

đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ xuất hiện trong nước tiểu chủ yếu dưới dạng acid

fenofibric và các phức hợp glucuronide và 25% bài tiết trong phân. Nồng độ đỉnh

trong huyết tương của acid fenofibric xảy ra trong vòng 6 đến 8 giờ sau khi uống.

Không tìm thấy fenofibrat nguyên dạng trong huyết tương.

1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ATORVASTATIN,

FENOFIBRAT

Atovastatin, fenofibrat có thể xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau

như phương pháp quang học, phương pháp sắc ký, phương pháp von-ampe.

1.3.1. Các phƣơng pháp xác định atorvastin Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Atorvastatin trong các mẫu dược phẩm được xác định bằng phương pháp

sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột C18 [18,20,24], detector UV và

detector huỳnh quang. Các tác giả đã sử dụng một số pha động có thành phần khác

nhau như acetonnitril: nước cất (85:15) tại pH=4,5, khoảng tuyến tính của atorvastatin trong khoảng 2-12 mg/ml, hiệu suất thu hồi của atorvastatin được xác

định là đạt 99,03% [24]; acetonitril: photphat (C = 0,015 M, pH = 3, tỉ lệ thể tích

v/v = 45 : 55) [18] hay pha động là hỗn hợp acetonitril : nước = 48 : 52, = 2 được

điều chỉnh bằng axit orthophotphoric, khoảng tuyến tính của thuốc là 0,04 - 0,4 mg/mL, hệ số tương quan là R2 = 0,999 [20]. Thời gian lưu của atorvastatin phụ thuộc vào thành phần pha động, detector sử dụng.

Phương pháp HPLC có ưu điểm rất cao về độ nhạy, độ chính xác cao,

nhưng rất tốn kém do thiết bị đắt tiền và quy trình phân tích phức tạp. Phương pháp

HPLC rất phù hợp với những phòng thí nghiệm kiểm soát chất lượng tuyến trung ương.

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Baldha [19] và cộng sự đã sử dụng phương pháp quang phổ vùng tử ngoại

để xác định atorvastatin trong thuốc ở hai bước sóng hấp thụ λ = 227 nm và 246,5

nm, khoảng tuyến tính từ 5 - 30 mcg/ml. Tác giả Jadhav đã xác định atorvastatin bằng cách cho tạo phức màu xanh với FeCl30,3 % và K3[Fe(CN)6]0,02 %. Phức màu xanh được đo tại ước sóng hấp thụ cực đại 787 nm. Hiệu suất thu hồi

atorvastatin canxi đạt được trong khoảng từ 99,26 % đến 100,12 % [19].

Phương pháp von-ampe

Tác giả Ramadan [17] và cộng sự đã sử dụng phương pháp cực phổ xung vi

phân trên điện cực giọt thủy ngân tĩnh (SMDE) để xác định atorvastatin trong mẫu dược phẩm. Các điều kiện đo được tiến hành ở pH = 7,5, biên độ xung 100mV, khoảng quét thế - 0,9 V ÷ -1,5V, bước thế 8 mV, thời gian xung 40 ms, tốc độ quét thế 5,714 mV/s, giới hạn phát hiện (LOD)là 0,024μg.ml-1 và giới hạn định lượng (LOQ) là 0,071 μg.ml-1, hiệu suất thu hồi từ 97,0 đến 100,5 %.

Tác giả Wli Mohammadi [23] đã xác định đồng thời amlodipin và

atorvastatin canxi trên điện cực graphit được biến tính bề mặt bằng nano cacbon. So

với điện cực glassy cabon thì điện cực graphit có diện tích bề mặt và độ dẫn điện tốt

hơn nên có độ nhạy tốt hơn. Bằng phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ thì xác

định được khoảng tuyến tính là 2,5 đến 100 µg/ml với độ lệch chuẩn của amlodipin là 2,7 đến 7,1% và đối với atorvastatin canxi là 1,8 đến 8,3%, giới hạn phát hiện đối

với 2 chất là 1 µg/ml ở điều kiện pH=6.

Các điện cực glassy các bon và điện cực graphene oxit đã được sử dụng để

xác định atorvastatin trong môi trường pH từ 2,0 đến 4,5 bằng phương pháp von-

ampe hòa tan hấp phụ. Hơn nữa, điện cực rắn biến tính rất có triển vọng trong ứng

dụng phân tích dược và môi trường vì điện cực rắn có khoảng làm việc rộng, không

độc hại, thân thiện với môi trường, có thể tự chế tạo được.

1.3.2. Các phƣơng pháp xác định fenofibrat Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Tác giả [29] đã nghiên cứu xác định fenofibrat bằng phương pháp đo quang

trong mẫu dược phẩm sử dụng hai thuốc thử khác nhau. Với thuốc thử methylen

xanh (MTB) thì fenofibrat phản ứng với MTB trong dung môi cloroform và dùng dịch đệm axit phthalat pH = 2,4 tạo ra phức chất màu xanh, có cực đại hấp thụ là

630nm, khoảng tuyến tính tuân theo Định luật Beer là 5 đến 15 mg/ml với độ lệch

chuẩn của phương pháp là 0,86%. Ở phương pháp thứ hai, cũng tiến hành như

phương pháp đầu nhưng dựa trên phản ứng của fenofibrat với saffarin tạo thành

phức màu hồng và độ hấp thụ quang đo được ở 520nm, khoảng tuyến tính thu được:

10 – 30µg/ml và độ lệch chuẩn của phương pháp là 0,903%. Đo trên mẫu dược

phẩm 200mg thì đạt hiệu suất thu hồi ở 2 phương pháp lần lượt tương ứng là

99,16% và 99,35%.

Một nghiên cứu khác cũng đã fenofibrat xác định được trong mẫu dược

phẩm sử dụng thuốc thử MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone

hydrochloride). Dựa trên việc đo độ hấp thụ của fenofibrat trong hỗn hợp metanol (0,5% MBTH, 0,5% HCl, 1% FeCl3) thu được cực đại hấp thụ ở 596nm, khoảng tuyến tính là 2-5µg/ml, độ lệch chuẩn của phương pháp là 0,7719%, hiệu suất thu hồi 99,36 % [8].

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Tác giả N.Jain xây dựng quy trình xác định đồng thời atorvastatin canxi và feniobrat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo sử dụng cột tách C18

(250mmx46mm,5µm). Pha động gồm metanol/đệm acetate pH= 3,7 với tỉ lệ 82:18

(v/v) đã được lọc trước qua màng lọc 0,45µm. Tốc độ dòng chảy 1,5ml/min,

detector UV-VIS đo ở bước sóng 248nm, thời gian lưu của fenofibrat được xác định là 9,05 ± 0,2min. Khoảng tuyến tính là 16-80mg/ml với hệ số tương quan > 99,9%

và độ lệch chuẩn của phương pháp là 0,79%. Thực hiện xác định thuốc với mẫu dược phẩm 32µg/ml đạt hiệu suất thu hồi 100,6%, hệ số biến thiên 0,0038 [25].

Tác giả Suresh Kumar đã xác định fenofibrat bằng phương pháp sắc kí lỏng

hiệu năng cao pha đảo sử dụng cột phân tích Inertsil ODS, 250x4,6mm, cột 5µ).

Pha động là hỗn hợp nước (điều chỉnh đến pH=2,5 với axit ortho phosphoric và

acetonitril với tỉ lệ 30:70(v/v), tốc độ dòng chảy 1,0 ml/min, detector UV-Vis đo ở

bước sóng 286 nm, thời gian lưu của fenofibrat là 20,5min, khoảng tuyến tính được

1000-3000µg/ml với hệ số tương quan >0,999. Giới hạn xác định và giới hạn phát

hiện lần lượt là 0,45µg/ml và 0,14µg/ml [26].

Một nghiên cứu khác sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định đồng thời ezeimibe, atorvastatin và fenofibrate. Sử dụng cột tách C18 (5µm, 280mm x 4,6mm) với thành phần pha động là hỗn hợp nước - acetonitril ở nhiệt độ

phòng, detector PDA, khoảng tuyến tính của fenofibrat là 32-160µg/ml với hệ số

tương quan là 0,994. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng là 1,9544µg/ml và

3,6225µg/ml tương ứng. Độ lệch chuẩn của phương pháp nhỏ hơn 2% [27].

Phương pháp cực phổ và von-ampe hòa tan

Tác giả Ceren Yardimci xác định fenofibrat trong mẫu thuốc bằng phương

pháp von-ampe hòa tan sóng vuông trên điện cực giọt thủy ngân treo (HDME) với các điều kiện: Dung dịch đệm borat pH = 9,0 có chứa tetrabutylammoni iodua ( C16H36IN) 0,01M và 12,5%(v/v) metanol, thời gian sục khí N2 để loại oxi là 10 phút, khoảng đo thế từ -0,6V đến -1,4V, tốc độ quét thế 250mV/s, tần số sóng

15Hz, biên độ xung 20mV, bước thế 4mV, thế đỉnh píc E=-1,2V, khoảng tuyến tính

là 0,146-4,96µg/ml, giới hạn phát hiện là 0,025µg/ml. Tác giả đã ứng dụng phương pháp để xác định mẫu thuốc có hàm lượng fenofibrat 250mg thu được hiệu suất thu hồi là 102,44% [28]. Hiện nay, phương pháp cực phổ sử dụng hệ xúc tác là một hướng quan trọng của ngành phân tích điện hóa. Đặc biệt là hệ xúc tác hydro áp dụng cả với chất hữu cơ làm tăng độ nhạy phân tích và giúp nghiên cứu quá trình điện cực và động học phản ứng hóa học.

Một nghiên cứu đã sử dụng phương pháp cực phổ dùng xúc tác hydro để

xác định fenofibrat. Fenofibrate và muối axit fenofibric dạng thủy phân của nó chứa nhóm cacbonyl, nhóm này nhường 2e/2H+ trong quá trình điện phân thành 2 pic tương ứng trong môi trường axit. Trong điều kiện thường, fenofibrat được thủy

phân hoàn toàn với muối axit fenofibric chỉ có 1 pic xuất hiện đã được xác định. Khi có mặt K2S2O8 cường độ dòng pic xúc tác, giới hạn phát hiện của phương pháp 4.10-5mg/ml .

Qua tổng quan tài liệu về các phương pháp xác định atorvastatin và

fenofibrat cho thấy, phương pháp von-ampe đã được nghiên cứu để xác định chúng

trong mẫu thuốc và mẫu sinh học, tuy nhiên các đặc tính điện hóa của chúng trên

điện cực giọt thủy ngân treo chưa được sáng tỏ, đặc biệt chưa thấy có công trình

nào nghiên cứu xác định đồng thời chúng trong mẫu thuốc. Chính vì vậy, chúng tôi

đã lựa chọn phương pháp von-ampe để nghiên cứu các đặc tính điện hóa của

atorvastatin, fenofibrat và ứng dụng trong phân tích.

1.4. GIỚI THIỆU PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN HẤP PHỤ

1.4.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp von-ampe hoà tan hấp phụ (AdSV)

ợc thực hiện qua ba Quy trình phân tích theo phương pháp AdSV cũng đư

giai đoạn: giai đoạn làm giàu động, giai đoạn dừng và giai đoạn hòa tan tĩnh

[14,15].

Phương pháp AdSV về cơ bản giống phương pháp von-ampe hoà tan, chỉ có

điểm khác cơ bản so với phương pháp von-ampe hoà tan là cơ chế của quá trình làm

giàu (hay quá trình tích luỹ chất trên bề mặt điện cực), làm giàu bằng cách hấp phụ

các chất hoặc các phức chất giữa kim loại với phối tử lên bề mặt điện cực làm việc

tiếp xúc dung dịch. Sau làm giàu vẫn phân cực hoà tan như phương pháp von-ampe

hoà tan.

Cơ chế tổng quát của giai đoạn làm giàu trong phương pháp AdSV như sau:

Trước hết phức của ion kim loại với phối tử hữu cơ được hình thành sau khi

thêm phối tử vào dung dịch phân tích, tiếp theo phức đó được tích luỹ bằng cách hấp

phụ (điện hóa, vật lý, hóa học) lên ranh giới tiếp xúc dung dịch -điện cực làm việc.

Trong thời gian làm giàu, thế trên điện cực làm việc được giữ không đổi, dung dịch

đo được khuấy. Thông thường AdSV có thể được thực hiện trên hầu hết các loại điện

cực dùng trong von-ampe, ví dụ như: HMDE, SMDE, Pt, than nhão (CPE), điện cực

graphit ngâm tẩm, các điện cực có biến tính hoá học. Tuy nhiên hầu hết các nghiên

cứu sử dụng kĩ thuật AdSV đều sử dụng điện cực HMDE do điện cực này có nhiều

ưu điểm: bề mặt được tự làm sạch và lặp lại, dễ tự động hoá.

Sau giai đoạn làm giàu là giai đoạn dừng để chất phân bố đều trên bề mặt điện

cực. Tiếp theo là giai đoạn hòa tan, ghi tín hiệu hòa tan bằng cách quét thế theo chiều

catot, tức là quét thế âm dần để khử chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc, có

thể là phức chất của ion kim loại với phối tử tạo phức hoặc chất phân tích (chất hữu

cơ) và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan bằng một kỹ thuật von-ampe nào đó, chẳng

hạn: von-ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), khi đó phương pháp được

gọi là von-ampe hòa tan catot hấp phụ xung vi phân (DP-AdSV) hoặc von-ampe

sóng vuông (Square Wave - SW) khi đó phương pháp được gọi là von-ampe hòa tan

hấp phụ sóng vuông (SW-AdSV). Ngược lại, ghi tín hiệu hòa tan bằng cách quét thế

theo chiều anot, tức là quét thế dương dần để oxi hóa chất hấp phụ trên bề mặt điện

cực làm việc và ghi tín hiệu hòa tan bằng các kỹ thuật von-ampe.

Đối với phương pháp AdSV, tín hiệu hòa tan thu được có dạng đỉnh. Thế

đỉnh hòa tan (Ep) và cường độ dòng đỉnh hòa tan (Ip) phụ thuộc vào các yếu tố như:

thành phần nền, phối tử ta ̣o phứ c , pH, thời gian tích lũy, thế tích lũy, bản chất củ a

điện cực làm việc, kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan. Trong những điều kiện

xác định, Ep đặc trưng cho bản chất điện hóa của chất phân tích và do đó dùng để

phân tích định tính. Ip tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích trong dung dịch, do vậy

Ip dùng để phân tích định lượng.

Phương pháp AdSV đặc biệt thích hợp để phân tích các ion kim loại không thể

xác định được bằng kĩ thuật cực phổ thông thường (hay quá trình xác định rất phức tạp)

như Al, Ca, Be, Pt, Ga, Nb hay các chất hữu cơ. Cũng như von-ampe hoà tan thông

thường phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ nhạy hơn so với các phương pháp đo

von-ampe điện hoá trực tiếp qua yếu tố làm giàu (tích luỹ). Ngoài những ưu điểm trên,

phương pháp AdSV còn có những ưu điểm riêng so với phương pháp SV như:

- Độ nhạy của AdSV thường lớn hơn nhiều so với ASV do kim loại không hoà

tan trong thuỷ ngân mà tạo thành các lớp phức đơn phân tử, ví dụ như điện cực màng

thuỷ ngân.

- Xác định được nhiều kim loại hơn và độ chọn lọc cao hơn so với phương

pháp ASV và CSV do có thể lựa chọn được nhiều thuốc thử tạo phức bền và chọn lọc

với kim loại cần phân tích.

- AdSV đặc biệt tỏ ra có ưu điểm trong phân tích các chất có hoạt tính sinh

học, dược phẩm, (có khả năng hấp phụ trên bề mặt điện cực giọt Hg), các chất không

có khả năng khử điện hoá trên điện cực giọt cũng có thể được xác định sau khi dẫn

xuất hoá bằng cách gắn với các nhóm dễ khử như nitroso, nitro… hoặc thủy phân tạo

thành chất mới có hoạt tính điện hóa.

- Một điểm đặc biệt của phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ là dựa vào

các đặc tính hấp phụ ta có thể giải quyết được bài toán liên quan đến các quá trình

điện cực, cơ chế phản ứng xảy ra trên điện cực như thế nào.

- Phương pháp AdSV có thể loại trừ được ảnh hưởng của các yếu tố cản trở

bằng cách chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp như: thành phần nền, pH, thế

điện phân làm giàu và thế hấp phu ̣ làm giàu.

1.4.2. Các kỹ thuật ghi đƣờng von-ampe hòa tan hấp phụ.

Trong phương pháp AdSV, các kỹ thuật sử dụng để ghi đường von-ampe

hòa tan là von-ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), von-ampe xung thường

(Normal Pulse - NP) và von-ampe sóng vuông (Square Wave - SW), khi đó tên của

phương pháp được gắn thêm tên của kỹ thuật đo, chẳng hạn như: Von-ampe hòa tan

hấp phụ xung vi phân DP-AdSV; Von-ampe hòa tan hấp phụ xung thường NP -

AdSV; Von-ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông SW-AdSV. Trong luận văn, chúng tôi

đã sử dụng kĩ thuật quét xung vi phân và kỹ thuật quét sóng vuông.

Kỹ thuật von-ampe xung vi phân (DP)

Trong kỹ thuật xung vi phân, điện cực được phân cực bằng một điện áp một

chiều biến thiên tuyến tính với một tốc độ chậm nhưng vào cuối mỗi chu kì xung trên

khung điện áp biến đổi một chiều người ta đặt thêm một xung vuông góc với biên độ

thay đổi từ 10-100mV và độ dài xung từ 40-100ms. Cường độ dòng được ghi hai lần,

lần 1 tại thời điểm i1, thường là 17ms trước khi nạp xung và lần hai là 17ms trước khi

cắt xung, lúc này ghi dòng cực phổ dưới tác dụng của xung. Hai giá trị này được gửi

vào bộ so sánh và kết quả ra bộ ghi là hiệu số của hai giá trị đó. Tín hiệu có dạng một

cực đại.

Kỹ thuật sóng vuông

Theo kỹ thuật này, điện cực được phân cực bằng điện áp một chiều biến

thiên đều, được đặt chồng lên điện áp xoay chiều dạng vuông góc có tần số từ 8 Hz

đến 2000 Hz, biên độ từ 1 đến 50mV. Trong mỗi chu kỳ xung, dòng được đo hai

lần: thời điểm 1 (dòng dương I1) và thời điểm 2 (dòng âm I2). Dòng thu được là hiệu

của hai giá trị dòng đó (Ip = I1 – I2) và Ip là hàm của thế áp vào điện cực làm việc.

Đối với các chất có tính thuận nghịch thì kỹ thuật hòa tan sóng vuông có độ nhạy

cao hơn kỹ thuật xung vi phân.

CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu

Trong luận văn này, mục đích nghiên cứu của đề tài là nghiên cứu các đặc

tính điện hóa và quy trình xác định atorvastatin và fenofibrat bằng phương pháp

Von-ampe hòa tan hấp phụ, sử dụng điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE). Từ đó,

ứng dụng quy trình để phân tích một số mẫu thuốc và mẫu huyết tương

Vì vậy nội dung nghiên cứu bao gồm:

1. Nghiên cứu đặc tính điện hóa của atorvastatin, hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat

bằng phương pháp von-ampe vòng (CV).

2. Tối ưu hóa các điều kiện xác định atorvastatin, hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat

trong mẫu thuốc và mẫu huyết tương.

- Khảo sát ảnh hưởngcủa môi trường pH

- Khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ

- Khảo sát ảnh hưởng thời gian hấp phụ.

- Khảo sát ảnh hưởng thời gian cân bằng.

- Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét.

3. Đánh giá phương pháp: Khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới

hạn phát hiện, giới hạn định lượng.

4. Áp dụng quy trình nghiên cứu được để phân tích atorvastatin, fenofibrat

trong một số mẫu thuốc trên thị trường và atorvastatin trong mẫu huyết tương.

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 2.2.1. Thiết bị

Máy đo pH meter TOA –Nhật Bản.

Cân phân tích Torius (độ chính xác 0,1 mg).

Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm-Autolab có ghép nối với máy tính và

phần mềm điều khiển.

Hình 2.1. Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm-Autolab.

Hệ điện cực:

+ Cực làm việc: điện cực giọt thủy ngân treo(HMDE).

+ Cực so sánh: Ag/AgCl/KCl.

+ Cực phụ trợ: thanh cacbon.

2.2.2. Dụng cụ

Pipet:0,50 ml; 1,00 ml; 2,00 ml; 5,00 ml; 10,00 ml.

Bình định mức: 25,0 ml; 50,0 ml; 100,0 ml.

Cốc: 100 ml; 250ml.

Cột chiết pha rắn: C18 có thể tích 3ml và bộ dụng cụ hút chân không.

2.2.3. Hóa chất

Chất chuẩn atorvastatin, fenofibrat dạng bột, độ tinh khiết 99 % được mua

tại Mĩ.

Các hóa chất khác như CH3COOH, H3PO4, H3BO3, NaOH, Na2B4O.10H2O,

metanol đều là hóa chất tính khiết phân tích của Merck, Sigma.

2.2.4. Chuẩn bị dung dịch

Pha dung dịch

- Dung dịch đệm BR có pH (4 ÷ 12) - Dung dịch A: Dung dịch hỗn hợp 3 axit H3PO4, H3BO3 và CH3CHOOH

cùng ở nồng độ 0,04 M

- Dung dịch B: Dung dịch NaOH 0,2 M - Pha dung dịch đệm Britton -Robinson bằng cách trộn hai dung dịch A và B

có tỉ lệ thích hợp [7]. Giá trị pH được điều chỉnh trên máy đo pH.

Pha dung dịch gốc atorvastatin và fenofibrat

- Cân 0,0288 g ± 0,0001g chất chuẩn atorvastatin canxi (M = 1155,34 g/mol),

thêm 15 ml methanol, rung siêu âm 10 phút và chuyển vào bình định 25ml và định mức tới vạch, được dung dịch có nồng độ 10-3M.

- Cân 0,0902± 0,0001g chất chuẩn fenofibrat (M = 360,83 g/mol) thêm trong

15 ml methanol, rung siêu âm 10 phút và chuyển vào bình định 25ml và định mức tới vạch, được dung dịch có nồng độ 10-2M.

- Dung dịch gốc được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C, các dung dich đo có

nồng độ thấp hơn được pha từ dung dịch gốc và dùng trong ngày.

2.3. Xử lý mẫu 2.3.1. Quy trình tiến hành phân tích mẫu thuốc atovastatin

Cân 10 viên thuốc trên cân phân tích để tính khối lượng trung bình (A g) của

một viên thuốc đó. Đem 10 viên thuốc đó đem nghiền mịn trên cối mã não, trộn đều

mẫu thuốc. Cân chính xác a g (khoảng 0,1g) mẫu thuốc bột mịn đó trên cân phân tích, cho vào cốc 100 ml, thêm 15 ml metanol, rung siêu âm 45 phút cho thuốc tan hết. Chuyển dung dịch vào bình định mức 25,0 ml, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, lọc dung dịch bằng giấy lọc băng xanh được dung dịch A có nồng độ C0(M). Lấy 1,0 ml dung dịch A định mức 100,0 ml được dung dịch B có nồng độ C1(M). Từ dung dịch B có nồng độ C1(M) lấy 1,00 ml dung dịch B và 10ml dung dịch đệm

BR pH=9,0 định mức trong bình 25ml được dung dịch C có nồng độ Cx(M). Nồng độ atorvastatin (Cx) trong viên thuốc được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.

Hàm lượng atorvastatin trong mẫu thuốc Ator (mg) được tính theo công thức:

2.3.2. Quy trình xử lý mẫu huyết tương xác định atorvastatin.

Huyết tương (plasma) là một trong hai thành phần chính của mô máu đó là tế bào ( hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) và huyết tương. Huyết tương chứa 90% nước về thể tích và 10% còn lại là các chất tan như: protein huyết tương (Albumin, globumin fibrinogen), các chất hữu cơ hữu cơ như axit amino, glucose, vitamin và loại peptide điều hòa, steroid hormone, lipide và muối vô cơ như một số Na, K, Ca v.v.

Mẫu huyết tương được đông lạnh ngay sau khi lấy mẫu và được bảo quản ở nhiệt độ -400C để hạn chế sự chuyển hóa của axit lactone. Trước khi phân tích, mẫu huyết tương được lấy ra, để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau khi mẫu rã đông về đến

nhiệt độ phòng, lấy 1,0 ml mẫu huyết tương trắng hoặc 1,0 ml huyết tương đã được

tiêm thêm chất chuẩn atorvastatin, cho vào ống nghiệm, thêm tiếp 1ml dung dịch

đệm Briston-Robitson (đệm BR, pH=9,0) vào ống nghiệm, đem lắc Vortex trong 5

phút và đem quay ly tâm ở tốc độ 1600 vòng trong 15 phút.

+ Quá trình hoạt hóa cột, cột C18 (thể tích 3ml) được lắp vào bộ dụng cụ

hút chân không. Trước tiên, cho đi qua cột 2ml nước cất 2 lần và 2 ml metanol. Sau

khi hoạt hóa cột xong, mẫu sẽ được đi qua cột với tốc độ 0,4 ml/ phút

+ Rửa tạp bằng 1ml H2O và 1 ml hỗn hợp metanol: H2O (5:95 v/v).

+ Rửa giải chất phân tích ra khỏi cột bằng 1ml hỗn hợp dung dịch metanol:

đệm (BR, pH = 9) theo tỉ lệ 95:5 (v/v).

2.3.3. Quy trình tiến hành phân tích mẫu thuốc hỗn hợp atorvastatin và

fenofibrat.

Cân 10 viên thuốc atorvastatin trên cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g để xác định khối lượng trung bình của từng viên, đem nghiền bằng cối mã não mỗi loại thuốc trên, trộn đều thuốc. Cân chính xác một lượng thuốc vừa nghiền mịn (khoảng

a = 0,0450 g ± 0,0001 g) cho vào cốc, sau đó thêm vào cốc 15ml metanol, rung siêu

âm 45 phút cho thuốc tan hết. Chuyển dung dịch vào bình định mức 25,0ml, định

mức tới vạch bằng nước cất 2 lần. Dung dịch được lọc qua giấy lọc băng xanh ta được dung dịch A.

Tương tự, cân 10 viên thuốc fenofibrat trên cân phân tích để xác định khối lượng trung bình của một viên thuốc, đem nghiền bằng cối mã não, trộn đều. Cân chính

xác một lượng thuốc vừa nghiền mịn (khoảng f = 0,0200 g ± 0,0001 g), thêm 15 ml

metanol vào cốc 50 ml, rung siêu âm 45 phút cho thuốc tan hết. Chuyển dung dịch

vào bình định mức 25,0 ml, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, ta được dung

dịch F.

Lấy 0,25 ml dung dich F và 2,5 ml dung dịch A chuyển vào bình định mức

25,0 ml, định mức bằng nước cất đến vạch ta được hỗn hợpdung dịch B, lấy 0,50 ml dung dịch B vào bình định mức 25,0 ml, thêm 10 ml dung dịch đệm BR tại

pH = 6,5 rồi định mức đến vạch bằng nước cất. Lắc kỹ rồi chuyển vào bình điện

hóa và tiến hành đo trong các điều kiện đã chọn. Hàm lượng atorvastatin và

fenofibrat được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.

Trong đó : Cx nồng độ chất phân tích trong dung dịch đo.

mf, ma là khối lượng trung bình của một viên thuốc fenofibrat và atorvastatin tương ứng.

f, a là lượng cân của thuốc fenofibrat và atorvastatin đem phân tích

5000 và 500 là hệ số pha loãng dung dịch của từng chất phân tích.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu quy trình định lƣợng atorvastatin trong mẫu thuốc bằng

phƣơng pháp von-ampe.

3.1.1. Khảo sát các điều kiện cơ bản xác định atorvastatin Nghiên cứu đặc tính điện hóa của atorvastatin

Để nghiên cứu đặc tính điện hóa của atorvastatin trên bề mặt điện cực giọt

thủy ngân treo (HMDE), chúng tôi đã tiến hành ghi đường von-ampe vòng trong

một khoảng thế rộng trong điều kiện không hấp phụ và có hấp phụ 60s. Kết quả thu được như sau:

Hình 3.1: Đường von-ampe vòng của atorvastatin 10-7mol.L-1, đường 1) mẫu trắng, đường 2) atorvastatin 10-7mol.L-1 không có thời gian hấp phụ, đường a) atorvastatin 10-7 mol.L-1 có thời gian hấp phụ 60s, các đường b,c) ghi liên tục sau

đường a), tốc độ quét 100 mV/s.

Qua kết quả khảo sát đường von-ampe vòng cho thấy, trên đường phân cực

catot có píc khử xuất hiện, trên đường phân cực anot không có píc oxi hóa, nên

atorvastatin là chất oxi hóa trên điện cực HMDE, píc khử là bất thuận nghịch.

So sánh đường von-ampe vòng ở đường 2) và đường a) thấy rằng, khi có

thời gian hấp phụ 60 s tại thế -0,9V thì cường độ dòng píc khử cao hơn so với đường von-ampe vòng không có giai đoạn hấp phụ. Đường b) đường c) là những

đường von-ampe vòng ghi liên tục sau đường a) trên cùng một giọt thì tín hiệu

cường độ dòng đường b) và và c) thấp hơn so với đường a) nhưng cao hơn đường

2). Điều này chứng tỏ atorvastatin có hấp phụ trên bề mặt điện cực HMDE tại thế -

0,9V, hiện tượng hấp phụ là đa lớp nên sau khi ghi đường hòa tan ở vòng 1 (đường

a)) thì chất hấp phụ chưa bị hòa tan hết nên tín hiệu ở vòng 2, 3 cao hơn tín hiệu ở

đường 2 khi không có hấp phụ.

Như vậy, qua kết quả khảo sát bằng phương pháp von- ampe vòng có thể

kết luận rằng, atorvastatin cho píc khử bất thuận nghịch và có hấp phụ trên điện cực

HMDE. Phương pháp lựa chọn để định lượng atovastatin là phương pháp von-ampe

hòa tan hấp phụ sóng vuông.

Khảo sát ảnh hưởng của pH

Thành phần dung dịch nền, pH quyết định độ dẫn điện của nền, dạng tồn tại

và khả năng hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt điện cực tức là ảnh hưởng đến

cường độ dòng, thế đỉnh píc và độ phân giải píc. Vì vậy việc tìm điều kiện pH tối

ưu là rất quan trọng. Do đó, tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng từ pH 7,0 đến 11,0, sử dụng đệm Britton-Robinson, nồng độ chất phân tích là 5.10- 7M tốc độ quét 150mV/s, kỹ thuật quét sóng vuông và kết quả được trình bày trong bảng như sau:

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng của píc

pH 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0

I(nA) 300 301 304 335 336 294 297 290 293

Hình 3.2: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào pH

Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH từ 7,0 đến 11,0 thấy rằng, trong khoảng pH từ 8,5 đến 9,0 thì cường độ dòng píc cao và ổn định. Vì vậy, tôi chọn pH

của dung dịch đệm là 9,0 cho các nghiên cứu sau.

Khảo sát ảnh hưởng thế hấp phụ

Để nghiên cứu đặc tính hấp phụ của một chất, chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng thế hấp phụ với các điều kiện đo: Nồng độ atovastatin là 5.10-7M, tốc độ quét 150 mV/s, thời gian hấp phụ 60s, thay đổi thế hấp phụ trong khoảng từ 0 V

đến -1,0 V. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2:

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng píc

Thế hấp 0 -0,1 -0,25 -0,5 -0,75 -0,9 -1,0

phụ U(V)

I(nA) 105 154 189 201 211 246 234

Hình 3.3: Sự phụ thuộc cường độ dòng vào thế hấp phụ

-0,9V

Hình 3.4: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thế hấp phụ

Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ từ 0V đến -1V thì cường độ dòng píc phụ thuộc nhiều vào giá trị thế hấp phụ được áp vào và đạt cao nhất tại thế hấp phụ là -0,9V. Do đó, tôi chọn thế hấp phụ của atorvastatin là -0,9V.

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ

Trong phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ, nồng độ chất phân tích phụ

thuộc vào thời gian hấp phụ, khi nồng độ chất phân tích nhỏ thì cần nhiều thời gian hấp phụ hơn so với nồng độ chất phân tích lớn. Cho nên việc chọn thời gian hấp

phụ phù hợp với nồng độ chất phân tích là yếu tố rất quan trọng. Chính vì vậy mà chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ ở hai mức nồng độ là 5.10-7M và 10-8M với các điều kiện đo dung dịch đệm BR pH=9, thế hấp phụ - 0,9V.Các đường von-ampe hòa tan được biểu diễn trên hình 3.5 và kết quả đo trên

hình 3.6.

Hình 3.6: Đường von-ampe hòa Hình 3.5: Đường von-ampe hòa

tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại

nồng độ chất phân tích 10-8M nồng độ chất phân tích 5.10-7M

8mol .L–1, Ehp = - 0,4 V, a=50 mV, f =50 Hz.

Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ (a): 5×10–7mol L–1và (b) 10–

Kết quả thu được từ hình 3.5 và hình 3.6 cho thấy, với nồng độ atorvastatin là 5.10-7 M, khi tăng thời gian hấp phụ từ 0 đến 90s thì cường độ dòng píc tăng dần, nếu tiếp tục tăng thời gian hấp phụ thì cường độ dòng píc giảm dần. Tại nồng độ atorvastatin là 10-8 M, khi tăng thời gian hấp phụ từ 20 đến 300s thì cường độ dòng píc tăng dần và khi tiếp tục tăng thời gian hấp phụ lên trên 300s thì cường độ dòng

píc giảm dần, điều đó cho thấy sự hấp phụ là đa lớp. Vì sau khi cường độ dòng píc đạt cực đại, nếu tiếp tục tăng thp thì cường độ dòng bị giảm do có thể chất đã hấp phụ thành nhiều lớp (đa lớp) nên khi hòa tan sẽ không được hoàn toàn.

Với kiểu hấp phụ đa lớp thì chúng ta nên chọn thời gian hấp phụ trong

khoảng tuyến tính thì tín hiệu đo cường độ dòng sẽ lặp lại và chọn lọc hơn. Với nồng độ của atorvastatin là 5.10-7M thì chúng tôi chọn thời gian hấp phụ 90s và tại nồng độ chất phân tích là 10-8 M thì chúng tôi chọn thời gian hấp phụ 300s.

Khảo sát thời gian cân bằng

Thời gian cân bằng là khoảng thời gian cần thiết để chất phân tích phân bố

đều trên bề mặt điện cực do đó nó cũng có ảnh hưởng đến cường độ dòng píc. Để chọn thời gian cân bằng phù hợp tôi tiến hành khảo sát ở các thời gian cân bằng khác nhau, điều kiện đo được tiến hành như sau: dung dịch đệm BR với pH=9, thế hấp phụ -0,9 V, thời gian hấp phụ 90s, nồng độ chất phân tích là 5.10-7M. Kết quả thu được biểu diễn trên hình 3.9.

10s

Hình 3.8: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào thời gian cân bằng.

Hình 3.9: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian cân bằng.

Kết quả thu được từ hình 3.10 cho thấy, khi thay đổi thời gian cân bằng từ 10s đến 30s thì cường độ dòng píc ổn định, nên tôi chọn thời gian cân bằng cho các nghiên cứu tiếp theo là ở 10s.

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế

Tốc độ quét thế ảnh hưởng đến giá trị cường độ píc. Trong phương pháp

cực phổ, khi tốc độ quét thế tăng thì cường độ dòng píc tăng, tuy nhiên nếu tốc độ quét quá cao thì quá trình ghi đường hòa tan chất hấp phụ trên bề mặt điện cực, chất

phân tích sẽ không được hòa tan hết nên cường độ dòng píc sẽ giảm. Vì vậy, tôi tiến hành khảo sát tốc độ quét, với các điều kiện đo như sau: dung dịch đệm là dung

dịch BR ở pH=9, thế hấp phụ -0,9 V, thời gian hấp phụ 90s, thời gian cân bằng 10s, nồng độ chất đo là 5.10-7M. Tốc độ quét được thay đổi từ 10mV/s đến 300mV/s. Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.3: Sự ảnh hưởng của tốc độ quét thế tới cường dộ dòng píc.

STT mV/s I(nA) STT mV/s I(nA)

1 10 28,9 7 200 222

2 20 68,5 8 250 239

3 40 110 9 300 255

4 60 136 10 350 269

5 100 153 11 400 295

6 120 183 12 450 286

7 150 193 - - -

40mV/s

250mv/s

300mv/s

350mV/s

450mV/s

400mV/s

Hình 3.10: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào tốc độ quét thế.

Hình 3.11. Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét thế.

Từ kết quả trên ta thấy tốc độ quét tăng thì cường độ dòng píc tăng nhưng tín hiệu píc dịch chuyển theo chiều âm hơn. Khi tốc độ quét là 300 mV/s thì tín hiệu píc đẹp và cân đối nhất, khi tốc độ quét thế lớn hơn 450 mV/s thì cường độ dòng píc

bắt đầu giảm. Vì vậy, tôi đã chọn tốc độ quét là 300 mV/s cho những nghiên cứu

tiếp theo.

Sau khi khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định atorvastatin bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông, chúng tôi đã lựa chọn được các điều

kiện như sau: Dung dịch đệm vạn năng với pH = 9,0, thế hấp phụ là -0,9V, thời gian hấp phụ là 90s với nồng độ 5.10-7 M và 300s với nồng độ 10-8M, thời gian cân bằng là 10s, tốc độ quét là 300 mV/s.

3.1.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phƣơng pháp Khoảng tuyến tính.

Để xây dựng đường chuẩn của chất phân tích, chúng tôi đã tiến hành đo nồng độ của atovastatin trong 2 khoảng nồng độ:10-8M đến 10-7M và 10-7M đến 10-6với các điều kiện thích hợp đã khảo sát phần trên. Kết quả được trình bày trên hình 3.12

10-8M

2.10-8M

4.10-8M

6.10-8M

8.10-8M

10.10-8 M

0-7M

Hình 3.12: Đường von-ampe hòa tan của atorvastatintừ 10-8M đến 10-7M.

Hình 3.13. Đường chuẩn của atorvastatin từ 10-8M đến 10-7M

(pH = 9,0;Ehp = -0,9;thp = 300s)

Hình 3.14: Đường chuẩn của atorvastatin từ 10-7M đến 10-6 M

(pH = 9,0;Ehp = -0,9;thp = 300s)

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp được tính toán dựa vào đường chuẩn k.S.Da/b [17, 19, 20] trong đó k = 3 cho giới hạn phát hiện và k = 10 cho giới hạn định lượng, S.Dalà độ lệch chuẩn và b là hệ số góc của đường chuẩn. Dựa vào kết quả tính toán được LOD là 9,6.10-10 mol.L-1và LOQ là 3.2.10-9 mol.L-1sau thời gian hấp phụ 300s. Độ lặp lại Độ lặp lại của phương pháp được đo lặp lại đối với dung dịch 5.10-7 mol.L-1, thời gian hấp phụ 30s, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) là 0,42%.

3.1.3. Áp dụng thực tế phân tích hàm lƣợng atorvastatin trong các mẫu thuốc trên thị trƣờng. Phân tích mẫu thuốc Lipivastatin 20mg của công ty cổ phần hóa-dược phẩm

Mekopha

Khối lượng trung bình của một viên thuốc là 0,3190 g ±0,0001g. Cân 0,1129 g

±0,0001g thuốc đã nghiền mịn, tiến hành xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu theo quy trình

2.3.1. Hàm lượng atorvastatin trong dung dịch đo được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, kết quả đo được trình bày trong bảng 3.4.

Bảng 3.4 : Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc Lipivastatin bằng phương pháp thêm chuẩn.

STT

1

2

3

4

5

6 CAtor trong mẫu Cx

Cx

0 0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

Vator5.10-6M thêm vào (ml)

CAtor(M)

Cx

Cx+5.10-8 Cx+1.10-7 Cx+1,5.10-7 Cx+2.10-7 Cx+2,5.10-7

I(nA)

106

129

165

182

208

237

Cx+5.10-8M Cx+5.10-8 Cx+1.10-7M

Cx+5.10-8

Cx+1,5.10-7M

Cx+2.10-7M

Cx+2,5.10-7

Hình 3.15: Đường von-ampe hòa tan mẫu thuốc mekopha

Bằng phương pháp thêm chuẩn, tính toán được nồng độ của atorvastin trong

dung dịch đo: Cx = (x ± t.SxE).10-7 (M) = (1,92583 ± 0,0530). 10-7(M)

Vậy ta có nồng độ atorvastatin trong dung dịch A ban đầu là:

C0 = 1,92583.10-7 .25.100 = 4,81457.10-4M

Hàm lượng Atorvastatin trong 1 viên thuốc có khối lượng 0,3190 g là:

So với hàm lượng atorvastatin ghi trên nhãn thuốc là 20 mg/viên thì

bằng phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ xác định được 19 mg/viên thấp hơn

1mg/viên.

Phân tích mẫu thuốc Avastor (10mg) của công ty cổ phần Dược phẩm Boston

Việt Nam.

Khối lượng trung bình của một viên thuốc là 0,1276 g, cân 0,1062 g ±

0,0001 g mẫu thuốc, tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình 2.3.1. Kết quả được

trình bày bằng bảng 3.5 như sau :

Bảng 3.5. Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc Avastor bằng phương pháp thêm chuẩn

STT 1 2 3 4 5 6

trong

CAtor mẫu thuốc

Cx

Vator 5.10-6M thêm vào(ml)

0 0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

Cx

CAtor(M)

Cx+5.10-8 Cx+1.10-7 Cx+1,5.10-7 Cx+2.10-7 Cx+2,5.10-7

I(nA)

113

140

171

200

228

257

Cx

Cx+5.10-8M Cx+5.10- 8

Cx+1.10-8M

Cx+5.10- Cx+1,5.10-7M 8

Cx+1,5.10-7M

Cx+2,5.10-7

Hình 3.16. Đường von-ampe hòa tan khi đo mẫu (10mg) của công ty dược

phẩm Boston bằng phương pháp thêm chuẩn

Bằng phương pháp thêm chuẩn, nồng độ chất phân tích trong mẫu là:

Cx = (x ± t.SxE).10-7 (M) = (1,93132 ± 0,0530). 10-7(M)

Vậy ta có nồng độ atorvastatin trong dung dịch A ban đầu là:

C0 = 1,93132.10-7. 100.25 = 4,8283.10-4M

Hàm lượng atorvastatin trong 1 viên thuốc có khối lượng 0,1276 g là:

So với hàm lượng atorvastatin (10 mg) ghi trên nhãn thuốc thì bằng phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ xác định được 8,102 mg/viên thấp hơn 1,898 mg/viên.

3.1.4. Nghiên cứu quy trình định lƣợng atorvastatin trong nền mẫu huyết tƣơng. Khảo sát thành phần hỗn hợp dung dịch rửa tạp. Mẫu huyết tương được bảo quản và chuẩn bị, xử lý theo quy trình phần

2.3.2. Sau khi cho chất đi qua cột, ta cần cho dung dịch rửa tạp đi qua cột để loại bỏ

các tạp chất mà có thể bị rửa giải ra khỏi cột làm ảnh hưởng đến chất phân tích. Vì

vậy, tôi đã khảo sát thành phần dung dịch rửa tạp với các điều kiện hoạt hóa và rửa giải như quy trình phần 2.3.1, thu được kết quả như sau:

Bảng 3.6: Sự phụ thuộc của cường dộ dòng píc vào thành phần dung dịch rửa tạp.

STT Điều kiện rửa tạp I(nA)

1 102 1ml H2O và 1ml metanol ( 5/95 v/v)

2 77,3 2ml H2O

3 66,9 2ml metanol/ H2O (5/95 v/v)

C

x + 5 . 1 0 -

Hình 3.17. Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thành phần dung dịch

C

x 1 + C 5 x . + 1 5 rửa tạp 8 0 . - 1 8 0 C -

x + 5 .

8 x +

Nếu rửa tạp chất chỉ bằng nước thì không loại bỏ hết được các chất ảnh

hưởng có hấp phụ trên cột. Nếu rửa bằng 2ml metanol : nước 5 : 95(v/v) thì có thể

chất phân tích bị rửa giải theo các tạp chất. Vì vậy, theo kết quả khảo sát bằng thực nghiệm, chọn thành phần dung dịch rửa tạp chất là metanol: nước 5 : 95 (v/v).

Khảo sát hành phần hỗn hợp dung dịch rửa giải.

Dung môi chiết (dung dịch rửa giải) phải có thành phần sao cho quá trình

rửa giải chất chất phân tích ra khỏi cột đạt hiệu quả tốt nhất mà không kéo theo

các tạp chất làm ảnh hưởng đến quá trình phân tích. Qua nghiên cứu tài liệu

methanol là dung môi hòa tan tốt atorvastatin nên chúng tôi chọn metanol cùng với đệm BR, pH = 9 để rửa giải atovastatin trên cột C18. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát thành phần hỗn hợp dung dịch rửa giải với các tỉ lệ metanol/đệm (BR,

pH=9,0 ) khác nhau (theo bảng 3.7) và tiến hành đo mẫu bằng phương pháp AdSV

với các điều kiện đã được khảo sát phần 3.2. Để chọn được thành phần metanol :

đệm thích hợp, các tỉ lệ dung môi : đệm khác nhau đã được khảo sát Kết được

trình bày trong bảng 3.7:

Bảng 3.7. Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào thành phần dung dịch giải.

STT Thành phân dung dịch rửa giải I(nA)

1 1ml methanol: đệm (BR, pH=9) (95:5 v/v) 92,5

2 1ml metannol: đệm (BR, pH=9) (90/10 v/v) 66,1

3 1ml methanol 58,6

4 1ml methanol: đệm (BR, pH=9) (80/20 v/v) 49,5

5 1ml metanol : đệm (BR, pH=9) (75/35 v/v) 42,2

Bình 1

Bình 2

Bình 3

Bình 4 33

Bình 5

Bình 2

Hình 3.18. Đường von-ampe phụ thuộc vào thành phần dung dịch rửa giải.

Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng thành phần dung dịch rửa giải nếu chỉ dùng

metanol để rửa giải thì tín hiệu cường độ dòng thấp hơn khi dùng dung dịch

metanol : đệm pH = 9. Điều này cho thấy ngoài metanol để rửa giải cần thêm một lượng dung dịch đệm pH thích hợp thì atovastatin mới tách ra khỏi cột C18.

Thay đổi tỷ lệ metanol : đệm từ 95 : 5 xuống 75 : 5 (giảm metanol ) thì tín

hiệu cường độ dòng đo được thấp. Do vậy chọn hành phần dung dịch rửa giải là

metanol : đệm = 95 : 5.

Thay đổi thể tích dung dịch rửa giải từ 0,5 ml metanol : đệm đến 1,5 ml

được kết quả 1ml methanol : đệm = 95 : 5 là thích hợp nhất để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột C18.

3.1.5. Xác định hiệu suất thu hồi của atorvastatin trong nền mẫu huyết tƣơng. Lấy 1ml mẫu huyết tương đã thêm atovastatin có chứa các nồng độ 1.10-7M; 5.10-7 M và 2,5.10-7 M. Thêm 1ml dung dịch đệm BR pH = 9,0 lắc dung dịch rồi cho đi qua cột C18. Rửa tạp bằng 1ml dung dịch metanol : H2O = 05 : 95 (v/v ), rửa giải chất phân tích bằng 1ml dung dịch metanol : đệm = 95 : 5 (v/v) chuyển dung dịch đó vào bình định mức 25ml, thêm 10 ml đệm BR pH = 9,0, định mức đến vạch. Các đường von-ampe hòa tan của atovastatin trong mẫu huyết tương được thể hiện trên hình 3.19.

Hình 3.19. Đường von–ampe hòa tan của atovastatin trong mẫu huyết tương

Kết quả cho thấy, đường von-ampe hòa tan tăng tuyến tính với nồng độ

atorvastatin trong mẫu huyết tương. Sự phụ thuộc giữa cường độ dòng Ip và nồng độ chất atorvastatin tuân theo phương trình Ip = 29,88 . C.10-8 + 13,26 với hệ số tương quan R2 = 0,996.

Độ lặp lại của phương pháp khi xác định atorvastatin trong mẫu huyết

tương đã được kiểm tra với các mẫu khác nhau. Hiệu suất thu hồi của atovastatin

trong mẫu huyết tương được xác định theo quy trình như trong xây dựng đường

chuẩn là 94,7 ± 0,93%.

3.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lƣợng hỗn hợp atorvastatin và

fenofibrat bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ

3.2.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp Nghiên cứu đặc tính điện hóa của hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat

Để nghiên cứu đặc tính điện hóa của atorvastatin và fenofibrat trên điện cực

giọt thủy ngân treo (HMDE), chúng tôi tiến hành ghi đường von-ampe vòng của dung dịch hỗn hợp atorvastatin 5.10-6 M và fenofibrat 15.10-6 Mvới các điều kiện pH = 6,5, khoảng thế từ -0,25 V đến -1,5 V, tốc độ quét thế 100mV/s, kết quả thu

được như hình 3.20.

Hình 3.20: Đường CV của atorvastatin và fenofibrat. Đường a) mẫu trắng,

đường b) không có quá trình hấp phụ, đường c) có quá trình hấp phụ ở thế -0,25 V,

thời gian hấp phụ 30s)

Qua đường von-ampe vòng cho thấy, trên đường phân cực catot từ -0,25V đến -1,5V có hai píc xuất hiện ở thế -1,18V ứng với chất phân tích fenofibrat và - 1,32V ứng với atorvastatin.Trên đường phân cực anot không thấy xuất hiện píc nào,

điều đó cho thấy đặc tính điện hóa không thuận nghịch của fenofibrat và

atorvastatin. Từ kết quả đo được cho thấy, cường độ dòng píc khi có hấp phụ cao

hơn gấp 2 lần so với trường hợp không có hấp phụ. Như vậy, có thể khẳng định rằng atorvastatin và fenofibrat có hấp phụ trên điện cực giọt thủy ngân. Sự tách píc

của 2 chất rõ ràng nên có thể định lượng đồng thời hỗn hợp 2 chất bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ

Cường độ dòng píc của atorvastatin tăng không đáng kể khi tiến hành đo

dung dịch trong điều kiện có hấp phụ tại một thế xác định trong thời gian thích hợp,

nguyên nhân có thể do nồng độ của atorvastatin quá lớn nên bề mặt điện cực bị bão

hòa. Tuy nhiên, qua phần khảo sát đặc tính điện hóa của atovastatin thì atovastatin

có hấp phụ trên điện cực HMDE.

Để khẳng định phản ứng điện hóa xảy ra trên bề mặt điện cực, chúng tôi đã ghi đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét. Các điều kiện đó được tiến hành ở hỗn hợp dung dịch atorvastatin 15.10-7 M + fenofibrat 5.10-7M, thời gian hấp phụ là 60s tại thế hấp phụ là -0,25V, thay đổi tốc độ quét từ 25mV/s đến 200mV/s.

Bảng 3.8. Cường độ dòng píc khi thay đổi tốc độ quét từ 25mV/s đến 200mV/s.

Tốc độ quét mV/s Ifenofibrate(nA) Iatorvastatin(nA)

25 4,9 6,47

50 9,79 14,1

75 14,8 23,1

100 19,0 31,6

150 26,5 47,9

200 35,0 66,9

Hình 3.21: Đường von-ampe vòng của atorvastati và fenofibrat phụ thuộc

vào tốc độ quét

Khi tốc độ quét (γ) thế tăng thì cường độ dòng pic hòa tan tăng tuyến tính theo phương trình: logIp = 1,12 logγ – 0,75, R2 = 0,9995 đối với fenofibrat và log Ip = 0,94 logγ – 0,60R2 = 0,998 đối với atorvastatin. Hệ số góc của mối tương quan giữa log Ip và logγ là 1,12 với fenofibrat và 0,94 với atorvastatin. Kết quả nghiên

cứu này chứng tỏ atorvastatin và fenofibrat đều hấp phụ mạnh trên điện cực HMDE

[14,15].

Píc khử hòa tan của atorvastatin và fenofibrat trên điện cực giọt thủy ngân

treo xảy ra theo phương trình điện hóa:

Hình 3.22: Phản ứng điện hóa của atorvastatin

Hình 3.23: Phản ứng điện hóa của fenofibrat.

Khảo sát ảnh hưởng của pH.

pH ảnh hưởng đến đặc tính điện hóa của chất cũng như khả năng hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt điện cực HMDE. Vì vậy, việc chọn pH thích hợp là rất quan trọng. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng từ pH 5,0 đến 9,5 sử dụng đệm Britton-Robinson, nồng độ của fenofibrat là 5.10-7M và nồng độ atorvastatin là 15.10-7M, kết quả được trình bày trên bảng 3.9 và hình 3.24.

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng của píc

pH Ifenofibrate(nA) Iatorvastatin(nA)

6,0 11,50 6,04

6,5 13,00 6,58

7,0 17,03 8,05

7,5 6,55 13,43

8,0 3,60 13,30

8,5 4,99 11,87

9,0 1,89 13,20

pH=6,0

pH=6,5

pH=7,5

pH=8,5

pH=9,0

Hình 3.24: Sựphụ thuộc của cường độ dòng píc vào pH

Hình 3.25: Đường von-ampe hòa tan khi thay đổi pH từ 5,0 đến 9,0.

Qua kết quả thực nghiệm cho thấy tại pH = 5,0 đường von-ampe hòa tan

không có tín hiệu, khi tiến hành đo ở pH = 6,0 thì đường von-ampe hòa tan chỉ ghi

được píc khử của fenofbrat, không có píc khử của atorvastatin xuất hiện, điều này

chứng tỏ khi pH < 6,0 thì atorvastatin tồn tại dạng axit không có hoạt tính điện hóa. Khi pH = 6,5 thì píc khử của atorvastatin xuất hiện và tách riêng rẽ rất tốt với fenofibrat. Khi pH tiếp tục tăng lên thì cường độ dòng píc của atorvastatin tăng nhưng thế đỉnh pic dịch chuyển về phía dương hơn, trong khi đó thế đỉnh píc khử của fenofibrat dịch chuyển về phía âm. Do đó thế đỉnh píc khử của hai chất sát lại gần nhau. Vì vậy, bằng thực nghiệm chúng tôi chọn pH = 6,5, đây là môi trường thích hợp để phân tích đồng thời hai chất có mặt trong dung dịch đo.

Khảo sát ảnh hưởng thế hấp phụ

Để nghiên cứu đặc tính hấp phụ của chất, chúng tôi đã tiến hành khảo sát

ảnh hưởng của thế hấp phụ với các điều kiện đo: nồng độ dung dịch chất phân tích gồm atorvastatin có nồng độ15.10-7M và fenofibrat có nồng độ 5.10-7M, tốc độ quét 15mV/s, thời gian hấp phụ 60s, thay đổi thế hấp phụ trong khoảng từ -0,1V đến - 1,0V. Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng píc

Ehp (V) -0,1 -0,2 -0,4 -0,5 -0,6 -0,8 -0,9 -1,0 Ifenofibrate(nA) 26,30 29,80 29,70 28,10 25,80 19,60 22,60 17,50 Iatorvastatin(nA) 54,71 54,20 54,20 56,10 55,10 57,40 54,80 56,00

Hình 3.26: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào thế hấp phụ.

-0,4V

Hình 3.27: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thế hấp phụ

Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ thấy rằng, khi thay đổi thế

hấp phụ từ -0,1 V đến - 1,0 V chỉ có giá trị cường độ dòng của fenofibrat thay đổi,

còn atorvastatin không ảnh hưởng. Khi thế hấp phụ từ -0,3V đến -0,4 V thì cường

độ dòng píc của fenofibrat cao nhất và ổn định. Do vậy, chúng tôi chọn thế hấp phụ là -0,4V

Khảo sát ảnh hưởng thời gian hấp phụ

Trong phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ, thời gian hấp phụ hay thời

gian làm giàu chất phân tích lên bề mặt điện cực phụ thuộc vào nồng độ chất phân

tích, khi nồng độ chất phân tích nhỏ thì cần thời gian hấp phụ lâu hơn so với dung

dịch có nồng độ chất phân tích lớn. Cho nên việc chọn thời gian hấp phụ phù hợp

với nồng độ chất phân tích là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng đến giới hạn phát

hiện (LOD) cũng như độ chọn lọc của phương pháp. Chính vì vậy mà chúng tôi đã tiến hành khảo sát thời gian hấp phụ ở nồng độ là 5.10-7M và với các điều kiện đo dung dịch đệm BR pH=6,5, thế hấp phụ -0,4V. Kết quả đo được trình bày trên hình 3.28, hình 3.29 và bảng 3.11:

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ tới cường độ dòng píc tại nồng độ chất phân tích 5.10-7M.

I (nA) t(s) Feno Ato

0 17,1 10,2

10 29,0 30,1

20 38,1 45,4

30 39,7 43,1

60 46,0 65,4

90 50,8 88,4

120 50,4 92,3

150 53,2 100,5

Hình 3.28: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào thời gian hấp phụ tại

nồng độ chất phân tích 5.10-7M.

10s

Hình 3.29: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại

nồng độ chất phân tích 5.10-7M.

Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ thấy rằng, khi tăng

thời gian hấp phụ thì cường độ dòng píc tăng tương ứng. Tuy nhiên, khi tăng thời

gian hấp phụ, cường độ dòng píc của atorvastatin tăng nhưng tín hiệu píc nhọn và có dấu hiệu chẻ píc khi thời gian hấp phụ lớn hơn 20s. Do vậy, để có thể phân tích

được đồng thời được atorvastatin và fenofibrat chúng tôi chọn thời gian hấp phụ

10s.

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế

Trong phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ tốc độ quét thế ảnh hưởng

nhiều đến cường độ dòng hòa tan hấp phụ. Khi tốc độ quét thế tăng thì cường độ

dòng píc tăng, tuy nhiên khi tốc độ quét nhanh thì píc sẽ bị doãng ra, không cân đối

và đỉnh píc nhọn. Đặc biệt với kỹ thuật quét thế xung vi phân thì tốc độ quét chậm hơn rất nhiều so với kĩ thuật quét sóng vuông. Để chọn được tốc độ quét thế phù hợp cho việc phân tích đồng thời atorvastatin và fenofibrat trong mẫu dược phẩm, chúng tôi tiến hành khảo sát trong các điều kiện: nồng độ chất đo là 5.10-7M, pH = 6,5, thế hấp phụ -0,4 V, thời gian hấp phụ10s, thời gian cân bằng 5s, tốc độ quét được thay đổi từ 0mV/s đến 100mV/s. Kết quả biểu diễn trên bảng 3.12 và hình

3.30:

Bảng 3.12: Sự ảnh hưởng của tốc độ quét thế tới cường độ dòng píc.

I (nA) γ (mv/s) Feno Ator

10 21,4 37,3

15 30,6 40,9

20 37,2 44,0

25 45,4 47,6

50 - -

100 - -

Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế thấy rằng, khi tốc độ

quét thế tăng từ 10 mV/s đến 25 mV/s thì cường độ dòng píc của atorvastatin và fenofibrat tăng. Khi tốc độ quét thế lớn hơn 50 mV/s thì cường độ dòng píc cao hơn

nhưng píc bị biến dạng, sắc nhọn, không đo được cường độ dòng píc. Do vậy, chọn

15mv/s

tốc độ quét là 15 mV/s.

Hình 3.30. Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét thế.

Sau khi khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định hỗn hợp atorvastatin và

fenofibrat bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ, chúng tôi đã lựa chọn

được các điều kiện như sau:

Dung dịch đệm Britton - Robinson với pH = 6,5, thế hấp phụ là -0,4V, thời gian hấp phụ là 10s với hỗn hợp dung dịch fenofibrat nồng độ 5.10-7 M, atovastatin nồng độ 15.10-7, thời gian cân bằng là 5s, tốc độ quét là 15 mV/s.

3.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phƣơng pháp Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Sau khi nghiên cứu các điều kiện thích hợp xác định hỗn hợp atorvastatinvà

fenofibrat chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn định lượng hỗn hợp atorvastatinvà fenofibrat trong mẫu thuốc theo phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ đối với hỗn hợp fenofibrat (5.10-8M÷7,18.10-7 M) và atorvastatin (15.10-8M÷21,28.10-7M), nồng độ fenofibrat : atorvastatin = 1:3 thế hấp phụ - 0,4 V, thời gian hấp phụ 10s, tốc độ quét 15 mV/s. Cường độ dòng tăng khi

nồng độ chất phân tích tăng. Sự phụ thuộc giữa cường độ dòng Ip và –log C là tuyến tính theo phương trình Ip = 0,9012 log C – 5,12, R2 = 0,996 đối với fenofibrat và Ip = 4,92 log C – 24,92, R2 = 0,998 đối với atorvastatin.

Đối với trường hợp hỗn hợp dung dịch đo có nồng độ atorvastatin và

fenofibrat bằng nhau, tỉ lệ atorvastatin : fenofibrat = 1:1 thì sự phụ thuộc giữa Ip và C là tuyến tính theo phương trình Ip = 0,016C – 0,108, R2 = 0,996 đối với fenofibratvà Ip = 0,024 C – 0,061, R2 = 0,999 đối với atorvastatin

Hình 3.31: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp fenofibrat và atorvastatin

( fenofibrat : atorvastatin = 1: 3).

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ chất phân tích đến cường độ dòng píc

( fenofibrat : atorvastatin = 1: 3).

CM Ip(nA)

Feno 5. 10-8 7,16. 10-8 1. 10-7 1,96. 10-7 3,85. 10-7 7,16. 10-7 Ato 15.10-8 21,48.10-8 3.10-7 5,88.10-7 11,55.10-7 21,48.10-7 Feno 3,04 4,79 5,51 7,26 10,2 11,4 Ato 1,44 9.47 15,0 26,5 36,6 48,2

Hình 3.32.Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của –log C fenofibrat vào

cường độ dòng I

Hình 3.33. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của –log C atorvastatin vào

cường độ dòng I

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ chất phân tích đến cường độ dòng píc ( fenofibrat : atorvastatin = 1: 1).

độ I (nA)

Nồng (10-8M) Fenofibrat Atorvastatin

4 0,50 1,70

8 1,30 2,50

16 3,20 3,80

32 7,20 6,50

64 11,90 15,10

4.10-8M

8.10-8M 16.10-8M 32.10-8M

64.10-8M

Hình 3.34: Đường von-ampe hòa tan khi thay đổi nồng độ của hỗn hợp

fenofibrat và atorvastatin.

Hình 3.35. Đường chuẩn của fenofibrat trong khoảng nồng độ từ 10-8M đến

10-7 M.

Hình 3.36. Đường chuẩn của atorvastatin trong khoảng nồng độ từ 10-8M

đến 10-7M.

Sử dụng phần mềm Origin tính toán kết quả được:

Sử dụng chuẩn Student (t 2 phía) với mức độ tin cậy P=95%, số bậc tự do

f=n-2 nên tra bảng ta có t(0.95;3)= 3,182

Tính ∆a = t(0,95;3) . Sa =3,182.0,00345 = 0,0109

∆b = t(0,95;3) . Sb =3,182.0,00010 = 3,18.10-4

Ta có phương trình hồi quy đầy đủ như sau:

Y = (0,1087 ± 0,0109) + (0,0169 ± 3,18.10-4).X

Với Y là cường độ dòng píc (nA); X là nồng độ Fenofbrat .10-8M.

Tính ∆a = t(0,95;4) . Sa =3,182.0,00711 = 0,0226

∆b = t(0,95;4) . Sb = 3,182.0,00021 = 6,68.10-4

Ta có phương trình hồi quy đầy đủ như sau:

Y = (-0,0616 ± 0,0226) + (0,0245 ± 6,68.10-4).X

Với Y là cường độ dòng píc (nA); X là nồng độ Atovvastatin .10-8M

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp

LOD là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà phương pháp phân tích có

thể xác định được. Dựa vào phương trình hồi qui có thể tính được LOD:

LOQ được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân

tích định lượng được. LOQ được tính theo phương trình hồi quy như sau

Đối với Atovastatin: Từ đường chuẩn ta có: Sb = 6,68.10-4, b = 0,0245

Ta tính được: LOD = 8,2.10-10M, LOQ = 2,7. 10-9 M

Đối với Fenofbrat: Từ đường chuẩn ta có : Sb = 3,18.10-4, b = 0,016

Ta tính được: LOD = 5,9.10-10M, LOQ = 2.10-9M

Như vậy với các điều kiện đo như trên phương pháp có thể đạt giới hạn phát hiện của : Atovastatin là 8,2.10-10M, fenofibrat là 5,9.10-10M và giới hạn định lượng của là atorvastatin là 2,7.10-9M, fenofibrat là 2.10-9M.

Đánh giá độ lặp lại của phép đo.

Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp chúng tôi đã tiến hành đo một số dung dịch có nồng độ khác nhau (16.10-8M ;32.10-8M và 64.10-8M) trong cùng ngày và các ngày khác nhau, các điều kiện khác tương tự như trong phần xây dựng đường

chuẩn. Kết quả đo và tính toán được trình bày trong bảng 3.15.

Bảng 3.15: Độ lặp lại của hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat

Ngày I(nA) Nồng độ xác định (M) RSD (%) Nồng độ chuẩn Feno Ator Feno Ator Feno Ator

16,04.10-8 15,99.10-8 0,03 0,05 16.10-8 1/11 4,16 2,97

16.10-8 2/11 3,83 3,07 15,98.10-8 16,01.10-8

16.10-8 4/11 4,26 3,24 15,96.10-8 15,80.10-8

32.10-8 1/11 31,87.10-8 31,82.10-8 1,20 1,16 5,89 6,80

32.10-8 2/11 5,92 6,77 31,91.10-8 31,99.10-8

32.10-8 4/11 5,54 6,52 32,04.10-8 31,82.10-8

64.10-8 1/11 8,04 14,7 63,91.10-8 63,79.10-8 0,81 0,86

64.10-8 2/11 8,27 15,0 64,12.10-8 64,20.10-8

64.10-8 4/11 8,21 15,1 63,77.10-8 63,85.10-8

Kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp có độ chính xác cao, độ lệch

chuẩn tương đối đều nằm trong giới hạn cho phép (<2%). Vậy có thể áp dụng để phân tích định lượng hỗn hợp thuốc trong mẫu thuốc.

3.2.3. Áp dụng thực tế phân tích một số hỗn hợp thuốc trên thị trƣờng

Áp dụng qui trình phân tích đã xây dựng trong mục 2.3 chúng tôi tiến hành

định lượng atorvastatin, fenofibrat trong một số mẫu thuốc.

Phân tích hàm lượng atorvastatin trong các mẫu thuốc

Tiến hành định lượng atorvastatin trong thuốc Avastor 10mg viên nén sản

xuất tại trong công ty cổ phần dược phẩm Boston Việt Nam theo quy trình 3.3.3.

Cân 10 viên thuốc atorvastatin, xác định khối lượng trung bình của từng viên, đem nghiền bằng cối mã não, trộn đều. Cân chính xác một lượng mẫu thuốc, thêm 15ml metanol vào cốc 50ml, rung siêu âm 45 phút cho thuốc tan hết.Chuyển dung dịch vào bình định mức 25,0ml, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, ta được dung dịch A.

Lấy 2,5ml dung dịch A chuyển vào bình định mức 25,0ml, định mức bằng

nước cất đến vạch ta được dung dịch B, dung dịch này có nồng độ tương ứng khoảng 10-5M. Dùng pipet lấy 0,5ml vào bình định mức 25,0ml, thêm 10ml dung dịch đệm BR tại pH = 6,5 rồi định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ rồi chuyển

vào bình điện phân và tiến hành đo trong các điều kiện đã chọn. Hàm lượng atorvastatin được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.

Bảng 3.16. Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc Avastor bằng phương pháp thêm chuẩn

STT 1 2 3

Cx Cx Cx

0 0,5 0,5 Nồng độ Atorvastatin trong mẫu thuốc Thể tích dung dịch chuẩn hỗn hợp10-5M thêm vào (ml)

Nồng độ Atorvastatin trong bình(M) Cx Cx+2.10-7 Cx+4.10-7

Cường độ píc I(nA) 8,90 15,0 26,0

1

2

Hình 3.37. Đường von-ampe hòa tan khi đo mẫu (10mg) của công ty dược

phẩm SHYT bằng phương pháp thêm chuẩn

= 2,7.10-7(M).

Bằng phương pháp thêm chuẩn, tính toán được nồng độ của atorvastatin

trong dung dịch đo Cx

Áp dụng công thức trong mục 2.3.1.

Hàm lượng atorvastatin trong 1 viên thuốc có khối lượng 0,1574 g là:

So với hàm lượng Atorvastatin (10 mg) ghi trên nhãn thuốc thì bằng phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ xác định được 13,54 mg cao hơn 3,54 mg.

Bảng 3.17. Kết quả định lượng atovastatin trong viên nén (10mg) sản xuất

tại Công ty Cổ phần Dược phẩm SHYT.

Mẫu Iator(nA) Nồng độ Số liệu thống kê

M1 8,9 Hàm lượng ator (mg/viên) 13,54 Hàm lượng (%) 135

M2 8,62 11,84 118

M3 8,1 2,7.10-7 2,36. 10-7 1,9. 10-7 9,53 95 X=11,63, SD=2,15 RSD=0,18% m=11,63±0,05 (mức tin cậy 95%)

Hàm lượng atorvastatin trong viên thuốc xác định được là 11,63 mg

Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng fenofibrat trong các mẫu thuốc

Tiến hành định lượng fenofibrat trong thuốc Lipistad 300 mg viên nên sản

xuất tại trong công ty cổ phần Dược phẩm Stada Việt Nam.Tiến hành cân đo mẫu

theo quy trình phân tích đã xây dựng trong mục 2.3.1.

Tương tự, cân 10 viên thuốc fenofibrat, xác định khối lượng trung bình của

từng viên, đem nghiền bằng cối mã não, trộn đều. Cân chính xác mẫu thuốc đã

nghiền mịn, thêm 15ml metanol vào cốc 50ml, rung siêu âm 45 phút cho thuốc tan

hết.Chuyển dung dịch vào bình định mức 25,0ml, định mức tới vạch bằng nước cất

2 lần, ta được dung dịch F.

Lấy 0,25ml dung dich F chuyển vào bình định mức 25,0ml, định mức bằng

nước cất đến vạch ta được dung dịch hỗn hợp B, dung dịch này có nồng độ tương ứng khoảng 10-5M. Dùng pipet lấy 0,5ml vào bình định mức 25,0ml, thêm 10ml dung dịch đệm BR tại pH = 6,5 rồi định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo trong các điều kiện đã chọn. Hàm lượng atovastatin và fenofibrat được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.

Kết quả được trình bày bằng bảng 3.18 như sau :

Bảng 3.18. Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc bằng phương pháp thêm

chuẩn

STT 2 3 1

Nồng độ fenofibrat trong mẫu thuốc C Cx Cx

Thể tích dung dịch chuẩn hỗn hợp 1,0 1,0 0 10-5M thêm vào(ml)

Nồng độ hỗn hợp trong bình(M) Cx+4.10-7 Cx+8.10-7 Cx

Cường độ píc I(nA) 5,02 8,5 9,8

1

2

Hình 3.38. Đường von-ampe hòa tan của thuốc Lipistad 300mg

Bằng phương pháp thêm chuẩn, tính được nồng độ fenofibrat trong dung

dịch đo : Cx = 48,59. 10-8(M)

Áp dụng công thức trong mục 2.3.3.

Hàm lượng fenofibrat rong 1 viên thuốc có khối lượng 0,3969 g là :

So với hàm lượng fenofibrat (300 mg) ghi trên nhãn thuốc thì bằng phương

pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ xác định được 281 mg thấp hơn 19 mg.

Tương tự, tiến hành xác định hàm lượng fenofibrat trong các mẫu thuốc sau

Kết quả được trình bày trong bảng 3.19.

Bảng 3.19. Kết quả định lượng fenofibrat trong viên nang (300mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phấm Standa

Mẫu Ifeno(nA) Nồng độ Số liệu thống kê Hàm lượng feno (mg/viên)

M3 M1 M2 5,02 5,60 5,10 48,59. 10-8 281 55,07.10-8 319 34,50.10-8 215 Hàm lượng (%) 94 106 107

X=300 SD=38,0 RSD=0,12% m=300±0,05 (mức tin cậy 95%)

Phân tích đồng thời hàm lượng atovastatin và fenofibrat trong mẫu thuốc.

Tiến hành định lượng hỗn hợp thuốc atorvastatin 10 mg và fenofibrat

300mg. Tiến hành cân đo mẫu theo quy trình phân tích đã xây dựng trong mục

2.3.3. Kết quả đo được trình bày bằng bảng 3.20 như sau:

Bảng 3.20. Cường độ dòng píc khi đo hỗn hợp mẫu thuốc atorvastatin và

fenofibrat bằng phương pháp thêm chuẩn

STT 1 2

Cx Cx

0 0,50

Cx Cx+2.10-7

Nồng độ hỗn hợp ato và feno trong mẫu thuốc Thể tích dung dịch chuẩn10-5M thêm vào(ml) Nồng độ hỗn hợp ato và feno trong bình (M) Cường độ píc I(nA) Ato Feno Ato Feno

8,14 6,9 15,21 11,43

1

2

Hình 3.39: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp Atovastatin 10mg và

Fenofibrat 300mg (đường 1) mẫu; đường 2) thêm chuẩn)

Dựa vào kết quả đo cường độ dòng khi có thêm chuẩn hỗn hợp xác định

nồng độ fenofibrat trong mẫu là:3,4.10-7 M

Hàm lượng fenofibrat trong 1 viên thuốc có khối lượng 0,3969 g là

Nồng độ atovastatin trong mẫu là: 2,3.10-7

Hàm lượng Atovastatintrong 1 viên thuốc có khối lượng 0,1574 g là:

Tương tự, tiến hành xác định hàm atovastatin và fenofibrat trong các mẫu

thuốc sau. Kết quả thu được trong bảng.

Bảng 3.21. Kết quả định lượng fenofibrat 300 mg và atorvastatin 10 mg

Mẫu

I(nA)

Nồng độ feno

Nồng độ ato

Hàm lượng feno

Hàm lượng ato

Sự sai khác so với hàm lượng

feno

ator

(mg/viên)

ghi trên nhãn của fenofibrat

ghi trên nhãn của atovastatin

(%)

6,9

8,14

3,4.10-7

2,3.10-7

315

11,54

15,4

5,3

5,86

3,02.10-7

1,97.10-7

190

9,88

-5

-1,2

8,02

8,96

2,97.10-7

2,18.10-7

275

10,94

-8,3

9,4

5,9

8,9

2,14.10-7

2,3910-7

324

11,96

19,6

3.84

8,2

2,0.10-7

1,9.10-7

201

9,53

+0,5

-4,7

trong các mẫu thuốc.

Các kết quả phân tích đều có RSD nhỏ (<2%), đáp ứng yêu cầu của phương

pháp phân tích. Các kết quả phân tích cũng cho thấy hàm lượng atorvastatin trong

các viên thuốc từ 95,30 đến 119,60% so với ghi trên nhãn và hàm lượng fenofibrat

từ 91,66 đến 108,00% so với ghi trên nhãn, đối chiếu với tiêu chuẩn Dược điển

Việt Nam [1] thấy thuốc của các công ty trên đều đạt tiêu chuẩn 90 đến 110% so với

ghi trên nhãn và cũng cho thấy sự sai lệch giữa các kết quả phân tích trong giới hạn

cho phép sự sai khác chỉ là ngẫu nhiên.

Như vậy, với quy trình phân tích hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat nghiên

cứu được chúng ta có thể áp dụng để phân tích đồng thời hoặc riêng từng thuốc.

KẾT LUẬN

Qua thời gian nghiên cứu tính chất điện hóa của atorvastatin, fenofibrat và

ứng dụng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ để xác định chúng trong mẫu

thuốc và mẫu huyết tương chúng tôi đã rút ra được một số kết luận:

1. Đặc tính điện hóa của atorvastatin và hỗn hợp atorvastatin, fenofibrat trên

điện cực giọt thủy ngân treo là những chất oxi hóa, có hấp phụ trên điện cực, các píc

khử là bất thuận nghịch.

2. Đã khảo sát các điều kiện thích hợp để xác định atorvastatin bằng

phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ: pH = 9,0; thế hấp phụ -0,9V, thời gian hấp phụ 90s đối với nồng độ 5.10-7M; 300s đối với nồng độ chất phân tích là 10-8 M, khoảng tuyến tính trong khoảng nồng độ 10-8 M đến 10-7M, giới hạn phát hiện LOD = 9,6.10-8M, giới hạn định lượng LOQ = 3,2.10-8M . Đã ứng dụng quy trình khảo

sát phân tích một số mẫu thuốc trên thị trường và mẫu huyết tương.

3. Đã nghiên cứu quy trình xác định đồng thời atorvastatin và fenofibrat

trong mẫu thuốc bằng phương pháp von-ampe hòa tan với các điều kiện đo: pH = 6,5, thế hấp phụ -0,4V, thời gian hấp phụ 10s, khoảng tuyến tính 5.10-8M đến 10-6M đối với atorvastatin và 1,5.10-7M đến 2,1.10-6M đối với fenofibrat, giới hạn phát hiện LOD là 8,20.10-10 mol.L-1; LOQ là 2,70. 10-9 mol.L-1 đối với atorvastatin và 1,5.10-7mol.L-1 đến 2,1.10-6mol.L-1 LOD là 5,9.10-10mol.L-1; LOQ là 2,0.10-9mol.L-1

đối với fenofibrat. Áp dụng quy trình phân tích đồng thời atorvastatin và fenofibrat

trong mẫu thuốc.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Dược điển Việt Nam (2009), tái xuất lần thứ 4, Nhà xuất bản Y dược.

2. Dược lý học lâm sàng (2009), Trường đại học Y Hà Nội, Nhà xuất bản Y học.

3. Dược thư quốc gia Việt Nam (2011), Bộ Y tế, Nhà xuất bản Y học.

4. Lê Quốc Hùng, Vũ Thị Thu Hà (2006), “Sự phát triển xu thế và khả năng sử

dụng điện cực màng thủy ngân trong phân tích điện hóa”, Tạp chí hóa học,

Viện hóa học, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam.

5. Nguyễn Văn Ri (2012), “Các phương pháp phân tích công cụ”, Đại Học Khoa

Học Tự Nhiên–Đại Học Quốc Gia Hà Nội.

6. Phạm Luận (1998),Giáo trình về những vấn đề cơ sở của kỹ thuật xử lý mẫu phân

tích, Khoa hóa học, Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

7. Phạm Luận (1989), Sổ tay pha chế dung dịch, Bộ môn hóa phân tích, Khoa hóa

học, Đại học Tổng hợp Hà Nội

8. Tạ Thị Thảo (2006), Chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, Đại Học Quốc Gia

Hà Nội.

9. Từ Vọng Nghi ( 1969) , Phương pháp phân tích cực phổ - Các bài tập bộ môn

phân tích – Khoa hóa học – Đại học Tổng hợp.

10. Từ Vọng Nghi, Trần Chương Huyến, Phạm Luận (1990), Một số phương pháp

phân tích điện hóa hiện đại, Đại học tổng hợp Hà Nội.

11. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2006),

“Hóa học phân tích”, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên–Đại Học Quốc Gia Hà

Nội.

12. Trương Xuân Hà (2014), Thuốc giả ngành công nghiệp tội lỗi, Sức khẻo & đời

sống, Cơ quan ngôn luận của bộ Y tế, Hà Nội.

Trung kiên (2015), Sóng ngầm thuốc giả, An ninh thủ đô, Cơ quan công an của

thành phố Hà Nội, Hà nội.

13. Trần Chương Huyến, Nguyễn Thị Kim Thường (2010), Xác định cephalexin

bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân, Tạp chí Phân

tích Hóa, Lý và sinh học, T.15(3), tr 166-172.

14. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007),

Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất

bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

15. Từ Vọng Nghi (2011), Các phương pháp phân tích điện hóa hiện đại, (Chuyên

đề cho học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành hóa phân tích, Đại

học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN).

16. Lê Đức Ngọc (1999), Xử lí số liệu và kế hoạch hóa thực nghiệm, Đại học Quốc

gia Hà Nội.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

17. ABDul Aziz Ramadan, Hasna Maldil and Bahaa Hafez (2013), “Differential

pulse polarography of ator vastatin in pure and pharmaceutical dosage forms

using static mercury drop electrode”, Academic Sciences, Vol.5, Issue 1, PP

434-440.

18. BaHiA. Moussa, Asmaa A, El-Zaler, Marianne A. Mahrouse and Maha S.

Ahmed (2013), “Simultaneous Determination of Amlodipine Besylater and

Atorvastatin Calcium in Binary Mixture by Spectrofluorimetry and HPLC

Coupled with Fluorescence Detection”.

19. Baldha R.G, Patel Vandana. B and Mayank Bapna (2009), “Simultaneous

Spectrophotometric determination of Atorvastatin Calcium and Ezetimibe in

tablet dosage form”, CODEN (USA), Vol.1, No.2, PP 233-236.

20. Beata Stanisz and Lukasz Kania (2006), “Validation of HPLC method for

determination of atorvastatin in tablets and for monitoring stability in solid

phase”, Acta Poloniae Pharmaceutica- Drug Research, Vol 63 No.6, PP

471-476.

21. Kishore Kumar Hotha, Narasimha Reddy Yarramu, Thriveni Kandibedala

Vijaya Bharathi Dasari, Venkateswarlu Vobalaboina (2012), “Simutaneous

determination of Atorvastatin and Glimepiride by LC-MS/MS in Human

plasma and Its application to a pharmacokinetic study”, American Jourak of

Analutical Chemistry, PP 559-569.

22. Swapnil D. Jadhav, Manish S. Bhatia, Shivaji L. Thamake (2010),

“Spectrophotometric methods for Estimation of Atorvastatin Calcium form

tablet dosage forms”, CODEN (USA), Vol.2, No.3, PP 19478-1953.

23. Wli Mohammadi (2013), “Electro- oxidation and simultaneous determination of

amlodipine and atorvastatin in commercial tablets using nanotube modified

electrode”, Micro & Nano Letters, Volume 8, Issue 8, p. 413-417.

24. Jaiprakash N. Sangshetti (2012), “Development and validation of RP-HPLC

method for determination of Atorvastatin calcium and Nicotinic acid in

combined tablet dosage form”, Journal of Saudi Chemical Society, Available

online 20 December 2012.

25. N. Jain, R. Raghuwanshi, and Deepti Jain(2008)Development and validation of

RP-HPLC method for simultaneous estimation of atorvastatin calcium and

fenofibrate in tablet dosage forms”,Indian J Pharm Sci, 2008, 70 (2): 263-

265.

26. Suresh Kumar and Rajendraprasad (2010),“Development and Validation of

Reversed-Phase HPLC Method for Simultaneous Estimation of Rosuvastatin

and Fenofibrate in Tablet Dosage Form”,International Journal of

PharmTech Research CODEN (USA), Vol.2, No.3, pp 2016-2021.

27. Sahu, Murthy, Srinivas and Swain (2016), “Simultaneous RP-HPLC Method

Development and Validation of Atorvastatin, Ezetimibe and

Fenofibrate”,Sahu et al., Pharmaceut Reg Affairs, 2016, 5:2.

28. Ceren Yardımcı, Nuran Özaltın (2004), “Electrochemical studies and square-

wave voltammetric determination of fenofibrate in pharmaceutical

formulations”,Analytical and Bioanalytical Chemistry, Volume378,Issue

2, pp 495–498.

29. Korany MA, Ismail HI; , Karim Abdel-Hay M, “Determination of etofibrate,

fenofibrate, and atorvastatin in pharmaceutical preparations and plasma using

differential pulse polarographic and square wave voltammetric techniques”,

Journal of AOAC International, 2008;91(5):1051-1058.

30. Suma BV, Kannan K, Madhavan V, Chandini R Nayar, “Simultaneous

estimation and validation of atorvastatin calcium and nicotinic acid in

combined tablet dosage form by RP HPLC method”. Int J Pharmacy and

Pharm Sci, 2012; 4, (1): 369-372.

31. Shah Y, Iqbal Z, Ahmad L, Khan A, Khan MI, Nazir S, Nasir F, “Simultaneous

determination of rosuvastatin and atorvastatin in human serum using RP-

HPLC/UV detection: Method development, validation and optimization of

various experimental parameters”. J Chromatogr B, 2011; 879(9–10): 557-

563.

32. Dogan-TopalBurcu, UsluBengi, OzkanSibel A,”Investigation of electrochemical

behavior of lipid lowering agent atorvastatin calcium in aqueous media and

its determination from pharmaceutical dosage forms and biological fluids

using borondoped diamond and glassy carbon electrodes”. Combinatorial

Chemistry & High Throughput Screening,2007; 10(7): 571-582.

33. Erk N, “Development of electrochemical methods for determination of

atorvastatin and analytical application to pharmaceutical products and spiked

human plasma”. Crit Rev Anal Chem, 2004; 34 :1–6.

34. A.A. Kadav, D.N. Vora, “Stability indicating UPLC method for simultaneous

determination of atorvastatin, fenofibrate and their degradation products in

Issue 1, 10 September 2008, Pages 120–126.

tablets”. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 48,

35. NV Nakarani et al,” Estimation of Atorvastatin Calcium and Fenofibrate in

Tablets by Derivative Spectrophotometry and Liquid Chromatography”, J

AOAC Int 90 (3), 700-705. May-Jun 2007.

36. Nagaraj, Simultaneous Quantitative Resolution of Atorvastatin Calcium and

Fenofibrate in Pharmaceutical Preparation by Using Derivative Ratio

Analytical Sciences 23(4):445-51 · May 2007.

Spectrophotometry and Chemometric Calibrations.

37. Mohamed A Korany, Ismail I Hewala, Karim M Abdel-Hay. Determination of

etofibrate, fenofibrate, and atorvastatin in pharmaceutical preparations and

plasma using differential pulse polarographic and square wave voltammetric

techniques. J AOAC Int 2008; 91:1051-8.

38. Rupali H, Ravindra B, Manish K. RP-HPLC method for simultaneous

estimation of atorvastatin calcium and fenofibrate in tablet dosage forms. J

Pharm Res 2010;3:2400-1.

39. Choudhari VP, Nikalje AP. Simultaneous estimation of atorvastatin, ezetimibe

and fenofibrate in pharmaceutical formulation by RP-LC-PDA. Pharm Anal

Acta 2010;1:111-5.

40. Dhabale PN, Gharge DS. Simultaneous spectrophotometric estimation of

atorvastatin and fenofibrate in bulk drug and dosage form by using

simultaneous equation method. Int J ChemTech Res 2010;2:325-8.

41. R. Sahu, and Patel V.B., Simultaneous spectrophotometric determination of

amlodipine besylate and atorvastatin calcium from their binary mixture by

dual wavelength and zero absorbance measurement, Indian Drugs, 2006,

43(2), 160-161.

42. Dhaneshwar S. S., Dhaneshwar S. R., Deshpande P. and Patil M., Development

and validation of a method for simultaneous densitometric estimation of

atorvastatin calcium and ezetimibe as the bulk drug and in tablet dosage

forms, ACTA Chromatographica, 2007, 19, 141-148.

PHỤ LỤC

Phụ lục: Các đƣờng von-ampe hòa tan của atovastatin và fenofibrat

trong các mẫu thuốc

Hình P1: Đường von-ampe hòa tan của atovastatin 10mg

Hình P2: Đường von-ampe hòa tan của mẫu M2: Atovastatin 10mg

Hình P3. Đường von-ampe hòa tan của M3 Lipistad 300mg

Hình P4. Đường von-ampe hòa tan của M2 Lipistad 300mg

Hình P5: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp mẫu M2: Atovastatin 10mg

và Fenofibrat 300mg( đường a) mẫu; đường b) thêm chuẩn)

Hình P6: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp mẫu M2: Atovastatin 10mg và Fenofibrat 300mg( đường a) mẫu; đường b) thêm chuẩn.

Hình P7: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp mẫu M1: Atovastatin 10mg và Fenofibrat 300mg( đường a) mẫu; đường b) thêm chuẩn)

Hình P8: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp mẫu M4: Atovastatin 10mg và Fenofibrat 300mg( đường a) mẫu; đường b) thêm chuẩn)

Hình P9: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp mẫu M5: Atovastatin 10mg và Fenofibrat 300mg( đường a) mẫu; đường b) thêm chuẩn)