Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu các hợp chất thành phần nhằm góp phần đánh giá tác dụng điều trị tiểu đường của cây Vối (Cleistocalyx Operculatus Roxb. Merr. et Perry)

MỞ ĐẦU

Hàng nghìn năm phát triển của loài người cho đến thời đại của Hóa học tổng

hợp với các sản phẩm thuốc và hương liệu nhân tạo con người vẫn phải dựa vào các

sản phẩm từ thiên nhiên, chủ yếu là từ thực vật. Ngày nay, Hóa học các hợp chất thiên

nhiên nhiên vẫn tìm được ứng dụng của mình trong các sản phẩm dược từ các loại

thực phẩm chức năng, các loại thuốc thay thế, bổ sung hoặc dự phòng, các chất màu và

hương liệu trong công nghiệp thực phẩm, và các chất thơm tinh tế cho các sản phẩm

nước hoa và hương liệu có giá trị cao. Dù cótính an toàn vì có nguồn gốc thiên nhiên,

khoa học vẫn cần giải quyết nhiều vấn đề phức tạp như cơ chế tác dụng thực sự của

các hợp chất thiên nhiên, cách thức chúng tương tác hiệp đồng với nhau khi tác dụng

lên các hệ sinh học, và con đường chuyển hóa chúng đi qua khi được đưa vào trong

các hệ sinh vật sống … cũng như bổ sung thêm cho các chất này nhiều tính chất phù

hợp cho các sản phẩm ứng dụng và tăng cường tác dụng sinh học.Các nghiên cứu này

chỉ có thể được thực hiện thành công trên cơ sở kiến thức khoa học toàn diện về thành

phần hóa học của các chất có trong các thực vật dùng làm thuốc, thực phẩm và hương

liệu.

Đái tháo đường là một bệnh mãn tính nội tiết do mức glucose cao trong

máu. Chất peptid hocmon insulin trong cơ thể chuyển hóa đường, tinh bột và các

thực phẩm khác thành năng lượng, nếu chất này không được tạo thành hoặc sử

dụng hợp lý dẫn đến bệnh đái tháo đường các dạng I và II.Ở dạng I cơ thể không

thể tạo thành insulin, còn dạng II kết quả từ sự kháng insulin. Điều trị các bệnh tiểu

đường dạng II thường sử dụng các thuốc như insulin, sulphonyl urea, biguanide,

metformin, acarbose, thiazolidinedion, ví dụ như acarbose là thuốc ức chế enzym

thủy phân cacbohydrat α-glucosidase, qua đó làm chậm và giảm sự hấp thu và tiêu

hóa cacbohydrat. Các tài liệu dược lý học dân tộc cho thấy thế giới có khoảng 800

cây thuốc được ghi nhận có tác dụng điều trị đái tháo đường dạng II,con số được

kiểm chứng qua các thử nghiệm sinh học không nhiều, mặc dù các hoạt chất thuộc

các nhóm flavonoid, terpenoid-steroid, alkaloid, cacbohydrat, amino acid được phát

hiện qua một số mô hình thử nghiệm in vitro và in vivo.Y học dân gian Việt Nam

cũng ghi nhận một vài cây thuốc có thể tác dụng lên bệnh đái tháo đường dạng II như

Mướp đắng (Momordica charantia L.) thuộc họ Cucurbitaceae, Ổi (Psidium

1

guajava L.), Chuối hột (Musra barjoo Sieb.) thuộc họ Musaceae, Dây thìa canh

(Gymnema sylvestre), Xoài (Mangifera indica L.) thuộc họ Anacardiaceae, Quế

(Cinnamomum cassia Bl.) thuộc họ Lauraceae, và Vối (Cleistocalyx operculatus

(Roxb.)Merr & Perry)thuộc họ Sim (Myrtaceae).Vối là một cây lớn mọc ở nhiều vùng

nông thôn miền Bắc, có nụ và lá được dùng để sắc nước uống. Một vài nghiên cứu

sàng lọc hoạt tính hạ đường huyết máu của các cao chiết từ lá và nụ Vối qua tác dụng

ức chế enzym -glucosidase được công bố trong những năm gần đây cho thấy cơ sở

khoa học của các ghi chép dân gian trên. Tuy nhiên cần có thêm các chứng cớ khoa

học liên kết được các tác dụng này với các chất thành phần có trong hỗn hợp phức tạp

của các cao chiết từ lá và nụ Vối. Nếu như có thể phát hiện được các hoạt chất ảnh

hưởng đến bệnh đái tháo đường sự sử dụng hợp lý cây thuốc này có thể được đưa ra,

dựa trên các phân tích cẩn thận về định tính và định lượng các hoạt chất và liều lượng

thuốc chứa lượng đủ hoạt chất được sử dụng. Các nghiên cứu hóa học trên cây Vối của

Việt Nam được thực hiện cho đến này còn thiếu hệ thống và chưa tương quan được

các thành phần hóa học với việc điều trị bệnh đái tháo đường, do đó, trong khuôn khổ

của một luận văn thạc sĩ nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu góp phần hệ

thống hóa các thành phần hóa học có trong lá cây Vối và liên hệ chúng với tác dụng

chữa bệnh đái tháo đường của lá cây Vối.

Các nội dung nghiên cứu chính của luận văn là:

1) Thực hiện các qui trình chiết etanol và etanol-nước để điều chế

các cao chiết có tác dụng ức chế enzym -glucosidase từ lá cây Vối.

2) Phân tách sắc ký phân tích và điều chế để phân lập các hợp chất

thành phần có trong các phần chiết etanol và etanol-nước từ lá cây Vối.

3) Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập bằng các phương

pháp phổ hiện đại như MS và NMR.

4) Liên hệ các hợp chất được phân lập với tác dụng lên bệnh đái tháo

đường của lá cây Vối.

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. KHÁI QUÁT VỀ HỌ SIM–MYRTACEAE [8]

Họ Sim-Myrtaceae phân bố ở các vùng rừng nhiệt đới và Á nhiệt đới, chủ yếu ở

châu Mỹ và châu Úc.Họ Sim là một họ lớn gồm 90 chi và 3000 loài, các cây thuộc họ

Sim có đặc điểm thực vật như sau:

Cây gỗ lớn, cây nhỡ hoặc cây bụi. Lá đơn, hoặc mép có khía răng, lá thường

mọc đối nhau và có tuyến mỡ. Hoa mọc thành cụm ở nách hay ở đầu cành, có hình

xim hoặc hình chùm. Hoa đều lưỡng tính. Đài hình ống dính hoàn toàn vào bầu hay

chỉ dính một ít. Lá đài gồm 4-5 cánh xếp lợp vào nhau, ít có ống dài nguyên.

Lá của chúng thuộc loại thường xanh, mọc so le hay mọc đối, lá đơn và thông

thường có mép lá nhẵn (không khía răng cưa). Hoa thường có 5 cánh hoa, mặc dù ở

một vài chi thì cánh hoa rất nhỏ hay không có. Nhị hoa thường rất dễ thấy, có màu

sáng và nhiều về lượng.Nhị xếp thành một hay nhiều dãy rời nhau hoàn toàn hoặc dính

ở gốc thành ống ngăn: bao phấn đính ở lưng hay gốc. Đĩa mật không có hay nếu có thì

hình vành khăn, che kín ở phía gốc vòi. Bầu hoàn toàn hạ hay hạ một phần, có 4-5 ô

hay nhiều hơn; vòi đơn kéo dài, đầu tròn, rất ít khi chia 3-4 thùy; trong bầu thì noãn

xếp thành hai hay nhiều dãy. Quả nang hoặc thịt, có sợi và thường được bọc kín bởi

ống đài.Trong quả thường có 1 hạt, hạt có nội nhũ, phôi thẳng hay cong, đôi khi nạc

với hai lá mầm không xa nhau.

Các cây thuộc họ Sim thường mọc xen lẫn với các cây gỗ khác thành đai rừng

nhiệt đới, ít khi mọc thuần loại.

1.1.1. ChiCleistocalyx [5, 11]

Chi Cleistocalyx là một chi tương đối lớn của họ Sim. Ngoài đặc điểm chung

của họ Sim: thường là cây gỗ hoặc cây nhỡ, lá mọc đối, có cuống; phiến lá có gân bên

xếp hình lông chim.Cụm hoa ở nách hoặc ở ngọn, dạng chùy. Hoa lưỡng tính, đài có

các lá đài dính nhau từ trong nụ và khi rơi toàn bộ thành một vòng trên phần còn lại

của đài và bầu, các loài cây thuộc chi Cleistocalyx còn có đặc điểm thực vật riêng: quả

nạc, khi chín không nở. Vòi không có lông, ô quả không có vách ngang chia thành ô

nhỏ, ống đài nguyên hay rách bất định, đài nguyên thành mũ, quả mập có một hạt.Cụm

hoa xim hay chuỳ.

Sau đây là một số cây đại diện thuộc chi Cleistocalyx thường thấy ở Việt Nam.

3

1.1.1.1. Cleistocalyx circumcissa (Trâm ô)

Đặc điểm thực vật: Cây đại mộc cao 15m, nhánh mảnh, lá có phiến xoan thon,

dài 4-7cm, chót có mũ, có đốm trong gân phụ, rất mảnh, nụ cao 13mm, rộng 3mm,

phần của đài và cánh hoa làm thành một lớp rụng sớm với nhị, noãn gồm 3 buồng, quả

mập.

Hình 1: Cleistocalyx circumcissa

Phân bố: rừng Biên Hoà.

1.1.1.2. Cleistocalyx nigrans (Trâm lá đen)

Đặc điểm thực vật: Cây đại mộc nhỏ, nhánh vàng đỏ. Lá có phiến bầu dục, màu

nâu đen trên mặt lúc khô, gân phụ cách nhau 2-3mm, cuống dài 1cm. Chùm tụ tán cao

6cm ở ngọn nhánh, hoa trắng, nụ dài 5mm, hoa 5 cánh rụng 1 lượt, tiểu nhị nhiều. Quả

mập tròn, lúc khô đen, to hơn 1cm, một hạt.

Hình 2: Cleistocalyx nigrans

4

Phân bố: rừng Bình Dương, Thủ Đức.

1.1.1.3. Cleistocalys nervosum(Trâm nắp vối)

Đặc điểm thực vật: Cây đại mộc trung, nhánh non dẹp, không lông. Lá có phiến

bầu dục thon, dài 12-13cm, có đốm nâu, gân phụ vào 10 cặp, gân cách bìa 3-5mm.

Phát hoa ở nách lá rụng, cao 5-8cm, đài hình đĩa hơi đứng, nắp cao; hoa có 4 cánh, cao

3mm, có nhiều tiểu nhụy. Phì quả tròn hay dài, to 7-14mm, đỏ hoặc đỏ đen chói, nạc

ngọt, một hạt.

Hình 3: Cleistocalys nervosum

Phân bố: rừng Bắc Trung Nam.

1.1.1.4. Cleistocalyx rehnervinus(Vối gân mạng)

Đặc điểm thực vật: Cây đại mộc nhỏ, nhánh tròn xám, to 2-3mm. Lá có

phiến bầu dục đến trái xoan, to 9-14x5,5-7cm chót lá rộng, đáy tròn gân phụ mịn,

cách nhau 4-8mm, gân cách bìa 2-3mm. Phát hoa ở lá và ngọn. Hoa như không

cọng, cao 7mm, đài rụng thành chóp, tiểu nhụy nhiều. Trái tròn, to 1,5mm, lùm bụi.

5

Hình 4: Cleistocalyx rehnervinus

Phân bố: các tỉnh Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam.

1.1.1.5. Cleistocalyx consperipuactatus (Vối nước)

Đặc điểm thực vật: Cây gỗ thường xanh, cao 20-25m. Vỏ dày 6-8mm, màu

xám trắng hay nâu đen nhạt. Cành non màu nâu xám, hình vuông, lúc già hình cột

tròn. Lá đơn, mọc đối, hình bầu dục dạng trứng ngược dài 6-12cm, rộng 2,5-5,5cm,

đầu tròn tù. Hoa mọc cụm, sinh ra đầu cành.Hoa lưỡng tính, đài đính thành 1 thể

dạng mũ, lúc nở hoa rụng dạng vòng.Nhiều nhị, rời nhau, lúc chồi hoa cong vào.

Quả mọng hình cầu hay hình trứng, lúc chín có màu nâu tím. Một năm có 2 mùa

hoa nở vào tháng 3 và giữa tháng 7.

Hình 5: Cleistocalyx consperipuactatus

Phân bố: Thanh Hoá, Nghệ Tĩnh, Bình Trị Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng,

GiaLai-KonTum.

6

1.1.2. Một số nghiên cứu dược lý về chi Cleistocalyx

Năm 2012, Charoensin S.và cộng sự đã đánh giá tác dụng chống đột biến dịch

chiết nước của Cleistocalyx nervosumvar. panialainvitrovà mô hình động vật thực

nghiệm [16]. Cleistocalyx nervosum var. paniala, được tìm thấy ở miền Bắc Thái Lan,

có quả ăn được chứa một lượng lớn các hợp chất phenolic có tác dụng chống oxi

hóa. Dịch chiết nước của trái cây chín được đánh giá an toàn và tác dụng gây độc gen

và độc tính. Dịch chiếtC. nervosum không gây đột biến ở vi khuẩn Salmonella

typhimurium chủng TA98 và TA100 khi có và không có sự kích hoạt trao đổi chất,có

tác dụng chống gây đột biến trung bìnhvới độc tố aflatoxin B1. Phân tích phổ ESI-MS

cho thấy dịch chiết có một lượng lớn anthocyanin, bao gồm cyanidin-3,5-

diglucosid,cyanidin-3-glucosid và cyanidin-5-glucosid. C. nervosum ở nồng độ 5.000

mg/kg thể trọng không gây ra độc tính cấp tính ở chuột. Một thử nghiệm được thực

hiện để phát hiệnảnh hưởng của cáccleistogenlàm đứt gãy nhiễm sắc thể. Các dịch

chiết ở liều 1.000 mg/kg không gây ra sự hình thành vi nhân trong gan của chuột. Các

nghiên cứu này cung cấp dữ liệu cho thấy sự an toàn và hiệu lực chống gây đột

biếncủa dịch chiết nước trái cây C. nervosum.

Năm 2014, Taya S. và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của

Cleistocalyxnervosum (CE) trên diethylnitrosamine (DEN) và phenobarbital (PB)

gây stress oxy hóa trong giai đoạn đầu ung thư gan chuột. Chuột đực Wistar được

chia thành 4 nhóm, với nhóm 1 làđối chứng âm và nhóm 2 là nhóm tích cực được tiêm

DEN mỗi tuần một lần và PB trong nước uống trong 6 tuần. Hai tuần trước khi bắt đầu

điều trị DEN và PB, các nhóm 3 và 4 được cho ăn với liều 500 và 1000 mg/kg

CEStrong 8 tuần. Kết quả một số ổ GST-P, tổn thương tiền ung thư trong gan tăng

đáng kể trong chuột gây ung thư, nhưng giảm trong chuột được điều trị bằng 1000

mg/kg CE. CE gây giảm malondialdehyde trong huyết thanh và trong gan chuột được

điều trị với DEN và PB. Hơn nữa, CE tăng đáng kể peroxidase, hoạt tính của

glutathione và catalase trong gan chuột. Như vậy nghiên cứu đã chỉ ra rằng

Cleistocalyx nervosum (CE) điều chỉnh trạng thái chống oxy hóa và ngăn ngừa ung

thư[40].

Năm 2015, Manosroi J. vàcộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống lão hóa in

vitro của các chất chiết từ lá Cleistocalyxnervosum var. paniala[31].Lá cây được chiết

bằng nước, metanol, và chloroform bằng cách chiết siêu âm và chiết nóng.Các dịch

7

chiết được xác định tổng phenolic và flavonoid. Các dịch chiếtở 0,001-10 mg/mlđược

thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính ức chế tyrosinase sử dụng phương

pháp so màu. Khả năng gây độc của dịch chiết ở 0,0001-1 mg/ml được xác định với

các nguyên bào sợi da người. Ngoài ra, các dịch chiết ở 0,001, 0,01 và 0,1 mg/ml

không có độc tính.Dịch chiết lạnh metanol lá già cho tổng sốliều phenolic cao nhất

511,44±18,23 mg GAE/mg và hàm lượng flavonoid 262,96±2,98 mg QE/mg. Dịch

chiết này cũngquét gốc tự do, ức chế sự peroxid hóa lipid, và ức chế tyrosinase với các

giá trị SC50, IPC50 và IC50là 0,02±0,004, 0,23±0,13 và 0,02±0,006 mg/ml. Dịch chiết ở

0,1 mg/ml ức chế MMP-2 cao nhất 91,14±1,67%.Dịch chiết lạnh metanol từ lá già có

thể được tiếp tục phát triển thành tác nhân chống lão hóa.

Năm 2016, Poontawee W. và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ của

Cleistocalyx nervosum var. paniala. đối với cadmium. Cadmiumgây độc thận là một

vấn đề sức khỏe môi trường nghiêm trọng vì cuối cùng nó sẽ kết thúc với bệnh thận

giai đoạn cuối [36]. Cơ chế sinh hóa các kim loại nặng độc hại này có liên quan đến

stress oxi hóa. Nghiên cứu khảo sát xem liệu Cleistocalyx nervosum var.

paniala(CNFE) có thể bảo vệ chống lại sự hư hại oxi hóa thậngây bởi cadmium. Phân

tích ban đầu cho thấy khả năng chống oxy hóa caocủa dịch chiết và nồng độ

polyphenol, đặc biệt là catechin. Tác dụng với thận của dịch chiết đượcnghiên cứu ở

chuột đã được xử lývới tá dượcCNFE, cadmium (2 mg/kg), và cadmium cộng CNFE

(0,5, 1,2 g/kg) trong bốn tuần. Sự hư hại thận bởi oxi hóathận được phát triển sau tiếp

xúc với cadmium như sự lưu giữ nitơ urê máu và creatinin, sự giảm lọc cầu thận, sự

tổn thương cấu trúc thận, cùng với nitric oxide và malondialdehyde tăng, nhưng chất

chống oxi hóathiol, superoxide dismutase, catalase giảm trong các mô thận. Sự gây

độc thận bởi cadmium giảm đi trong chuột được bổ sung CNFE, đặc biệt là ở liều 1 và

2g/kg. Có thể kết luận rằng CNFE có thể bảo vệ chống lại sự gây độc thận cadmium,

chủ yếu qua tác dụng chống oxi hóa. Các kết quả cho thấy vai trò của chất chống oxi

hóa thiên nhiên này trong việc chống lại các bệnh khác gây bởi sự phá vỡ sự cân bằng

nội môi oxi hóa khử.

1.2. CÂY VỐI (CLEISTOCALYX OPERCULATUSROXB. MERR. ET PERRY)

1.2.1.Đặc điểm thực vật [7]

Cây Vối có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus Roxb. Merr. et Perry,

thuộc họ Sim (Myrtaceae), là loại cây thân mộc cỡ vừa, có thể cao tới 12-15 m. Vỏ 8

màu nâu đen, nứt dọc. Cành cây tròn hay đôi khi có hình 4 cạnh, nhẵn.Lá có cuống

dài 8-20 cm, hình trái xoan ngược hay bầu dục, hình trứng rộng 5-10 cm, giảm

nhọn ở gốc, có mũi nhọn ngắn, hai mặt cùng màu nhạt có đốm màu nâu, phiến dày,

dai, cứng, lá già có chấm đen ở mặt dưới. Hai mặt lá có những đốm màu nâu, cuống

lá ngắn tầm 1-1,5 cm. Hoa nhỏ gần như không có cuống, màu trắng lục, họp thành

cụm 3-5 hoa ở nách lá. Nụ hoa dài, 4 cánh, nhiều nhị. Cụm hoa hình tháp, trải ra ở

kẽ các lá đã rụng. Cây ra hoa tháng 5-7. Quả hình cầu hay hơi hình trứng, nhăn

nheo, đường kính 7-12 mm, nháp, có dịch, khi chín màu tím. Toàn lá, cành non và

nụ vối có mùi thơm đặc biệt dễ chịu của câyVối [1,8].

Hình 6:Lá cây Vối (Cleistocalyx operculatus Roxb. Merr. et Perry)

1.2.1.1. Phân bố

Cây Vối được trồng và mọc hoang ở khắp các tỉnh nước ta hoặc trồng ở

nhiều vùng quê miền Bắc, chủ yếu để lấy lá ủ nấu nước uống. Có 2 loại vối thường

gặp là vối nếp (lá nhỏ hơn bàn tay có màu vàng xanh) và vối tẻ (lá to hơn bàn tay,

hình thoi màu xanh thẫm). Vối còn thấy ở các nước nhiệt đới thuộc Châu Á như các

tỉnh Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam, Vân Nam Trung Quốc; Bangladesh, Ấn

Độ, Myanma, Campuchia, Lào, Thái Lan, Việt Nam, các đảo Java, Kalimantan,

Sumatra của Indonesia, Malaysia, Philippines và lãnh thổ Bắc Úc của Úc[4,8].

1.2.1.2.Công dụng dân gian[4]

Vối được trồng để lấy gỗ dùng trong xây dựng, làm công cụ, vỏ có chất dùng

để nhuộm đen. Quả vối ăn được.Lá vối tươi đem thái nhỏ, rửa sạch nhựa rồi cho

9

vào thùng ủ cho đến khi đen đều thì lấy ra rửa sạch, phơi khô dùng để nấu làm

nước uống rất thông dụng ở nông thôn Việt Nam.

Theo Viện nghiên cứu Đông y: lá vối tươi hay sắc khô nụ vối và lá vối có

tác dụng kháng sinh đối các nhiều loại vi khuẩn như Gram (+), Gram (-),

Streptococus (hemolytic và staman), vi trùng bạch hầu, Staphyllococcus,

Pneumcoccus, phế cầu, Salmonella, Bacillus subtilis, ... và không gây độc hại đối

với cơ thể. Chính vậy mà lá vối tươi hay khô sắc đặc được coi như một loại thuốc

sát khuẩn dùng trị liệu các bệnh ngoài da như ghẻ lở, mụn nhọt hoặc lấy lá vối tươi

nấu lấy nước đặc để gội đầu chữa chốc lở rất hiệu nghiệm.

Nụ vối, lá vối chữa một số bệnh đường ruột, viêm họng đạt kết quả tốt, có

thể dùng dưới dạng thuốc sắc, thuốc cao hay viên hoặc dạng muối natri.

Nụ vối có khả năng hạn chế tăng đường huyết sau ăn và hỗ trợ ổn định

đường huyết, hỗ trợ giảm lipid máu, phòng ngừa biến chứng của đái tháo đường khi

điều trị lâu dài mà được sử dụng nước nụ vối uống thường xuyên.

Nước vối còn là loại có công hiệu giải khát trong những ngày hè nóng nực,

làm mát và lợi tiểu nên còn có công năng đào thải các độc chất trong cơ thể qua

đường tiết niệu vì vậy lá và nụ vối được hãm lấy nước uống hàng ngày ở các làng

quê Việt Nam. Người ta uống nước sắc lá vối để chữa bệnh tiêu chảy và tắm nước

sắc lá vối. Nước sắc lá vối ủ có tác dụng lợi mật điều này giải thích được vì sao

nhân dân ta thường uống nước sắc lá vối để chữa bệnh đầy bụng, khó tiêu.

Một số bài thuốc chữa bệnh từ cây Vối:

- Trị đau bụng đi ngoài, phân sống: Lá vối 3 cái, vỏ ổi 8 g, núm quả chuối

tiêu 10g. Cùng thái nhỏ phơi khô sắc với 400 ml nước, còn 100 ml chia 2 lần uống

trong ngày, dùng liền 2-3 ngày.

- Chữa đầy bụng, không tiêu: Vỏ thân cây vối 6-12 g, sắc kỹ lấy nước đặc

uống 2 lần/ngày hoặc dùng nụ vối 10-15 g, sắc lấy nước đặc uống 3 lần trong ngày.

- Chữa lở ngứa, chốc đầu: Lá vối vừa đủ nấu kỹ lấy nước để tắm, rửa nơi lở

ngứa và gội đầu.

- Viêm gan, vàng da: Dùng rễ vối 200 g sắc uống mỗi ngày.

- Chữa viêm đại tràng mạn tính, đau bụng âm ỉ, thường xuyên đi phân sống:

200g lá vối tươi, vò nát, dùng 2 lít nước sôi, ngâm trong 1 giờ uống thay nước.

10

1.2.2. Thành phần hóa học

1.2.2.1. Tinh dầu

Năm 1994, Lê Thị Anh Đào và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học

của tinh dầu vối ở các địa phương khác nhau của tỉnh Nghệ An [3]. Hàm lượng tinh

dầu dao động trong khoảng 0,1-0,4% tập trung ở nụ hoa (0,48%), hoa đã nở lượng

tinh dầu giảm dần (0,28%) và ít nhất trong hoa già (0,18%). Các thành phần chính

của tinh dầu hoa vối, nụ vối và lá là β-myrcen (khoảng 24-38%) (1), (Z)-β-ocymen

(29-35%), (E)-β-ocymen (9-13%) (2).

2

1

1.2.2.2.Các phần chiết hữu cơ

Lá Cleistocalyx operculatus chứa tannin, flavonoid, alcaloid, tinh dầu, các

bộ phận khác chứa sterol, chất béo…

Năm 1990, ZhangF. X. và cộng sự (Trung Quốc) đã phân lập một số chất

trong hoa và nụ Cleistocalyx operculatus: axit cinnamic (3), axit gallic (4),

etylgalat (5), 7-hydroxy-5-metoxy-6,8-dimetylflavon (6), 2,4-dihydroxy-6-metoxy-

3,5-dimetylchacon (7), 5,7-dihydroxy-6,8-dimetylflavanon (8), axit oleanolic (9),

axit ursolic (10),β-sitosterol (11)[49].

4 3 5

11

6 7

8 9

11 10

Năm flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc từ nụ Cleistocalyx

operculatus là myricetin-3'-methyl ete 3-O-β-D-galactopyranosid(12), myricetin-

3',5'-dimethyl ete 3-O-β-D-galactopyranosid (13), quercetin (14), kaempferol (15)

và tamaricetin (16)[33].

12

12 13

14 15

16

Năm 2004, Ye C. L. và cộng sự đã phân lập được 2 flavonoid là 3'-formyl-

4',6'-dihydroxy-2'-methoxy-5'-methylchalcon(17)và (2S)-8-formyl-5-hydroxy-7-

methoxy-6-methylflavanon(18) cùng 5 flavonoid khác đã biết từ nụ Cleistocalyx

operculatus Trung Quốc[47].

13

18 17

Năm 2008, Min B. S. và cộng sự đã phân lập được 4 flavonoid mới 3'-

formyl-4',6',4-trihydroxy-2'-methoxy-5'-methylchalcon (19), 3'-formyl-6',4-

dihydro-2'-methoxy-5'-methylchalcon 4'-O-β-D-glucopyranosid(20), (2S)-8-formyl-

6-methylnaringenin(21) và (2S)-8-formyl-6-methylnaringenin 7-O-β-D-

glucoyranosid (22)từ dịch chiết hoaCleistocalyx operculatus[32].

19 20

21 22

Năm 2010, Min B. S. và cộng sự nghiên cứu các hợp chất flavonoid từ nụ

cây Cleistocalyx operculatus [34].Trong nghiên cứu này, một hợp chất flavonoid

D-galactopyranosid (23), gossypetin-8,3'-dimethyl ete-3---D-galactopyranosid

glucosid mới và 6 chất đã biết: 5,7,8,4'-tetrahydroxy-3',5'-dimethoxyflavon-3---

(24), myricetin-3'-methylether-3---D-galactopyranosid (25), myricetin-3'-methyl-

ete (26), quercetin (27), kaempferol (28) và tarmarixetin (29) đã được phân lập.

14

23 24

25 R = D-galactose 27 R1 = OH, R2 = OH

26 R = H 28 R1 = H, R2 = OH

29 R1 = OH, R2 = OCH3

Năm 2010, Dao T. T. và cộng sự đã phân lập được các hợp chất C-methyl

flavonoid30-43[19].

30 31

15

33 32

34 35

36

37

38 39

16

41 40

43 42

Năm 2014,Chen L. S. và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp định lượng vỏ

khô Cleistocalyx operculatus[17]. Nó là nguyên liệu thô của thuốc chống ngứa

Compound Hibiscuse. Tiêu chuẩn chất lượng của vỏ cây khô Cleistocalyx operculatus

"chuẩn theo thuốc cổ truyền Trung Quốc" của tỉnh Quảng Đông chỉ được nhận dạng

bằng TLC và không thể kiểm soát hiệu quả chất lượng Cleistocalyxoperculatus. Một

phương pháp HPLC pha đảo được sử dụng để xác định axit 3,3'-O-dimethylellagic

(44) từ vỏ cây Cleistocalyx operculatus và hàm lượng đã được tính toán bằng phương

pháp ngoại chuẩn. Theo các điều kiện sắc ký được lựa chọn, axit 3,3'-O-

dimethylellagic chuẩn ở nồng độ 1,00-25,0 mg/ml cho mối quan hệ tuyến tính

tốt. Đường chuẩn là Y = 77,33X + 7,904, r = 0,9995, thu hồi trung bình là 101%, RSD

là 1,3%[17].

17

44

1.2.3.Hoạt tính sinh học và dược lý của Cleistocalyx operculatus

Năm 1972, Nguyễn Đức Minh đã nghiên cứu tính chất kháng sinh của lá và

nụ cây vối đối với một số vi khuẩn Gram(+) và Gram (-)cho thấy lá và nụ vối đều

có tác dụng kháng sinh, cao nhất ở lá và hoàn toàn không độc đối với cơ thể [9].

Năm 2002, Woo A. Y. và các cộng sự đã xác định dịch chiết nước từ nụ Cleistocalyx operculatuscó hoạt tính ức chế Na+/K+-ATPase trong màng bao cơ tim chuột và ức chế Ca2+-ATPasase trong dịch mô đồng thể tim chuột với liều tương

tự. Hoạt tính ức chế enzym này đã góp phần giải thích cho hoạt động co cơ tích cực

và tiêu cực của tim chuộtđược truyền dịch [44].

Năm 2003, Đào Thị Thanh Hiền đã thử nghiệm một số tác dụng của cây

Vối[6]. Tính kháng khuẩn của lá vối, đặc biệt là lá vối ủ có tác dụng rất tốt trên vi

khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột, và hai vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) thường

gặp ở bệnh viêm da. Cho chuột nhắt trắng uống nước lá vối ủ thấy lá vối ủ có tác

dụng lợi mật rất mạnh, và khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư. Kết quả thử

tác dụng độc tế bào của lá vối cho thấy cả tinh dầu và cao thô đều có khả năng ức

chế sự phát triển tế bào ung thư (ung thư gan, ung thư màng tim, ung thư tử cung).

Năm 2003, Lu Y. H. và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ

của Cleistocalyx operculatus với sự peroxid hóa lipid gan chuột và sự tổn thương của

các tế bào PC12 gây bởi H2O2.Kết quả cho thấy Cleistocalyx operculatus có thể được

sử dụng như chất chống oxi hóa để ngăn ngừa hoặc trì hoãn sự sinh bệnh của các bệnh

tế bào thần kinh [27].

Năm 2004, YeC. L.và cộng sự đã phân lập được 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-

3',5'-dimethylchalcon (DMC)(7) từ nụ Cleistocalyx operculatus và điều tra tác dụng

18

của chúng lên 6 dòng ung thư người. Trong số các tế bàoSMMC-7721, 8898, HeLa,

SPC-A-1, 95-D, GBC-SD và SMMC-7721 thì SMMC-7721 là dòngnhạy cảm nhất

với IC50 bằng 32,3±1,13 M, EC50 bằng 9,00±0,36 M và chỉ số điều trị 3,59.

NhuộmHoechst 33,258 cho thấy sự phân mảnh và sự ngưng tụ của chất nhiễm sắc

thể trong tế bào được điều trị bằng 9 M DMC trong 48 h. Phân tích dòng

cytometric đã được thực hiện để xác định các tế bào hypodiploid. Các kết quả của

dòng cytometry cho thấy tỷ lệ phần trăm của các tế bào SMMC-7721 hypodiploid

là 49,44±1,06% sau khi điều trị 48 h với 18,0 M DMC. Điều trị dẫn đến sự xuất

hiện của một đỉnh hypodiploid (vùng A0), có thể là do sự hiện diện của các tế bào

tự chết hoặc các cơ quan tự hủy với lượngADN ít hơn 2nM[46]. Đến năm 2014,

nhóm nghiên cứu đãđịnh lượng phân mảnh DNA phát hiện ảnh hưởng của DMC ở

các nồng độ khác nhau trên tế bào SMMC-7721; phương pháp của Sellins và Cohen

cho thấy tỷ lệ phân mảnh DNA tăng phụ thuộc nồng độ, sau khi điều trị với DMC

trong 48h. So với nhóm chứng, tác dụng của telomerase bằng 66,2±2,1% sau khi

điều trị 48 h với 20 mmol/l DMC, các biểu hiện mRNA của c-myc và hTERT giảm

tương ứng 67,3±2,1% và 64,4±2,3%, và sự biểu hiện protein của c-myc và hTERT

giảm tương ứng 69,6±1,9% và 71,3±2,4%. Theo kết quả nghiên cứu, DMC có thể

gây ra sự tự chếttế bàoSMMC-7721 và cơ chế tự chết có thể liên quan đến các

mRNA và biểu hiện giảm protein của c-myc và hTERT [45].

Năm 2007, Trương Tuyết Mai và Nguyễn Văn Chuyên nghiên cứu hoạt tính

kháng sự tăng đường huyết máu của dịch chiết nước nụ hoa Cleistocalyx

operculatus[30].Dịch chiết có tác dụng ức chế enzym-glucosidase.Dịch chiết

nước có khả năng điều trị tiểu đường qua thử nghiệm in vitro và in vivo. Trong thử

nghiệm in vitro, dịch chiết có tác dụng ức chế maltose vàsucrose trong ruột chuột,

IC50 lần lượt là 0,70 và 0,47 mg/ml. Kiểm tra lượng glucose trong máu sau bữa ăn ở

chuột đối chứng và chuột được gây tiểu đường STZ bằng sự nạp maltose (2g/kg thể

trọng) cho thấy sự giảm lượng glucose máu (500 mg/kg thể trọng) ít hơn một chút

so với khi dùng acarbose (25 mg/kg thể trọng), nhưng tốt hơn so với dịch chiết lá ổi

(500 mg/kg thể trọng). Trong một thí nghiệm 8 tuần, mức glucose máu của chuột bị

tiểu đường STZ được điều trị với lượng dịch lá vối 500 mg/kg thể trọng/ngày giảm

đáng kể so với chuột bị tiểu đường không được điều trị.

19

Năm 2008,Nguyễn Thị Dung cùng các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính

kháng khuẩn và chống oxi hóa của tinh dầu và các phần chiết etanol nụCleistocalyx

operculatus. Tinh dầu nụvối được phân tích bằng GC và GC/MS. Tổng cộng có 55

hợp chất chiếm 93,71% hàm lượng tinh dầu đã được nhận dạng. Tinh dầu ức chế

mạch sự hư hỏng thực phẩm, các vi khuẩn gây bệnh da, Staphylococcus

aureuskháng methicillin (MRSA), Enterococci kháng vancomycin (VRE) và vi

khuẩn kháng đa kháng sinh (MARB). Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ

diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của tinh dầu với các vi sinh vật thử nghiệm ở trong

khoảng 1-20 g/ml. Trong khi đó, các phần chiết etanol có hoạt tính kháng

khuẩnvới các vi khuẩn Gram (+) và MBC trong khoảng 0,25-32 mg/ml. Tác dụng

chống oxi hóa và quét gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) của tinh

dầu và phần chiết ethanol cũng được nghiên cứu[21].

Năm 2009, Nguyễn Thị Dung và cộng sự nghiên cứu về tác dụng chống

viêm của tinh dầu nụ vối. Nhóm đã nghiên cứu các tác dụng in vitro và in vivo của

tinh dầu nụCleistocalyx operculatus. Trong các thử nghiệm,tinh dầu ức chế đáng kể

sự tiết các cytokine gây viêm, bao gồm cả yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-) và

interleukin-1 (IL-1), trong đại thực bào chuột RAW 264.7 được kích thích bởi

lipopolysaccharide (LPS). Sự biểu hiện mRNA của TNF- và IL-1 đã bị ức chế

bằng cách xử lý với tinh dầu trong tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi

LPS.Phân tích reporter gene cho thấy tinh dầu ức chếsự hoạt hóa phiên mã NF-B

gây bởi LPS trong tế bào RAW 264.7. Tinh dầu ức chế sự phù tai ở chuột BALB

gây bởi phorbol ester. Các kết quả này cho thấy tinh dầucó thểcho tác dụng chống

viêm bằng cách ức chế sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm qua ngăn chặn ít

nhất một phầnsự hoạt hóa NF-B[20].

Năm 2010, Trương Tuyết Mai và cộng sự đã nghiên cứu về tác dụng bảo vệ

và chống đục thủy tinh thể của chiết xuất dung dịch nước của nụ hoa vối (COB)

trên tế bào beta của chuột gây tiểu đường bằng streptozotocin. Sau 9 tuần bổ sung

COB (500 mg/kg thể trọng), nhóm COB có mức insulin ổn định hơn đáng kể so với

nhóm chuột đối chứng tiểu đường. Ngoài ra, COB trì hoãnmạnh sự đục thủy tinh

thểvà gây sự giảm đáng kể lượng glucose, sorbitol, fructose trong thủy tinh thể của

chuột bị tiểu đường[29].

20

Năm 2010, Min B. S. và cộng sự nghiên cứu các hợp chất flavonoid gây độc

tế bào từ nụ cây Cleistocalyx operculatus[34].Các hợp chất 23-25có gốc galactose đã

được đánh giá gây độc tế bào in vitro đối với các dòng tế bào ung thư Hela, HL-60,

A549 sử dụng phương pháp MTT.Các hợp chất 23-25có tác dụng gây độc tế bào yếu

đối vớidòng tế bào ung thư Hela với giá trị IC50 38,7 , 42,1 và 45,5 mM. Đối với HL-

60, tác dụng gây độc tế bào đạt giá trị IC5013,7-18,1 mM. Các chất ức chế yếucác dòng

tế bào A549 với giá trị IC50 hơn 100mM.

Năm 2010, Trong T. D. và cộng sự đã xác định hoạt tính ức chế mạnh virus

H1N1 và H9N2 của các flavonoid33, 36, 37 và 43[19]. Hợp chất 33 ức chế mạnh

nhất virus cúm H1N1 và ức chế biến thể H274 của H1N1 trên các tế bào 293T với

các giá trị IC50 lần lượt là 8,15±1,05 và 3,31±1,34 M. Các hợp chất33, 36, 37 và

43là các chấtức chế không cạnh tranh neuraminidase trong các nghiên cứu dược

động lực [19].

Năm 2010, Bajpai V. K. và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của

tinh dầu và các phần chiết từ nụCleistocalyx operculatusđối với các vi khuẩn gây bệnh

thực vậtXanthomonas spp.[14]. Đường kính kháng khuẩn của tinh dầu (1.000 mg/đĩa)

và các phần chiết (1.500 mg/đĩa) với các vi khuẩn thử nghiệm được tìm thấy trong

khoảng 7-23 mm. MIC và MBC của tinh dầu và các phần chiết vớiXanthomonas spp.

từ 31,25-125 với 62,5-250 µg/ml và 125-500 với 250-1,000 µg/ml. Nghiên cứu thể

hiện tác dụng ức chế của tinh dầu (1.000 mg/ml) và phần chiết hexan (250 mg/ml) với

Xanthomonas spp.. Ngoài ra tinh dầu có tác dụng kháng khuẩnin vivovới Xoo KX019

và XSP SK12 trên các cây dưa (Cucumis melo L. var. Makuwa) trồng nhà kính. Các

kết quả của nghiên cứu này cho thấy tinh dầu và các phần chiết Cleistocalyx

operculatus có thể được sử dụng như các chất diệt khuẩn tự nhiên trong các ngành

công nghiệp thực phẩm và nông nghiệp.

Năm 2012, Huang H. Y. và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng đảo ngược sự

kháng đa thuốc của chất 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon (DMC) có

nguồn gốc từ nụ của Cleistocalyx operculatus trong mô hình xenograft u tế bào gan

người[25].Một mô hình u xenograft u tế bào gan người đã được thiết lập với dòng tế bào BEL-7402/5-FU. Kết hợp điều trị 5-fluorouracil (5-FU) và DMC (40 mgkg-1) nâng

tỷ lệức chế khối u tới 72,2%. DMC cũng có thể làm tăng nồng độ 5-FU trong các mô

khối u và tăng cường hoạt tính caspase-3. Ngoài ra, liệu pháp điều trị kết hợp dẫn đến

21

tăng cường hoạt tính tự chết của khối u và giảm hoạt tính tăng sinh. Kiểm tra trọng

lượng cơ thể và các dấu hiệu độc tính không mong muốn của các nhóm điều trị khác

nhau không cho thấydấu hiệu của tác dụng phụ. Kháng đa thuốc (MDR) là một trở

ngại chính trong việc hóa trị liệu nhiều bệnh ung thư người. 2',4'-Dihydroxy-6'-

methoxy-3',5'-dimethylchalcon (DMC) được phân lập từ nụCleistocalyx operculatus

(Roxb.) Merr. et Perry (Myrtaceae), cho các hiệu ứng đảo ngược sự kháng đa thuốc 5-

FU của các tế bào ung thư.

Năm 2012, Luo Y. và Lu Y.đã nghiên cứu 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-

dimethylchalcon ức chế sự tự chết của tế bào MIN6 qua tăng cường chức năng của ty

lạp thể[28]. Rối loạn chức năng của ty lạp thể do sự stress oxi hóa và sự tự chếtđồng

thời của tế bào beta có thể đóng một vai trò quan trọng trong các bệnh tiểu đường loại

2. Ức chế sự tự chết của tế bào beta qua rối loạn chức năng của ty lạp thể do oxi hóa

với các chất thiên nhiên có tiềm năng phòng ngừa hoặc chữa bệnh. Tác dụng ức chếsự

tự chết tế bào của 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon (DMC) từ nụ

Cleistocalyx operculatus, trên tế bào MIN6 gây bởi H2O2 với nồng độ 250µM trong 3

h, sự sống của các tế bào MIN6 đã giảm đáng kể và sự tự chết tế bào gần như đã xảy

ra. Tiền xử lý với DMC ở nồng độ của 12,5-25µM trước khi cho H2O2, đã giảm sự

phân mảnh hạt nhân, giảm sự sản sinh các tiểu phần oxi hóa, và thế ty lạp thể tăng

cường (MMP), ức chế quá trình tự chết tế bào. Hơn nữa, đã quan sát được sự giảm

hoạt tính của caspase-3 và caspase-9. Các kết quả này cho thấy DMC bảo vệ tế bào

MIN6 chống lại sự tự chết tế bào do tác dụng bảo vệ ty lạp thể cao của nó, và do đó là

một thuốc tiềm năng cho việc chăm sóc bệnh tiểu đường.

Năm 2014,Hu Y. C. và cộng sự đã nghiên cứu thấy 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-

3', 5'-dimethylchalcon bảo vệ sự tiết insulin suy giảm gây ra bởi độc tính glucose

trong các tế bào βtuyến tụy. 2',4'-Dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon (DMC),

được phân lập và tinh chế từ nụ hoa khô của Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et

Perry(Myrtaceae), đã được điều tra cho hoạt tính insulinotropicvới độc tính glucose

trong các phương pháp in vitro. Vớinồng độ glucose cao ở mức độ gây độc tế bào

trong 48 h, tế bào β RIN-5F chết đáng kể và suy giảm chức năng tiết insulin, trong khi

đồng xử lý với DMC có thể bảo vệ tế bào βchống lại sự giảm tiết insulin gây bởi độc

tính glucose trong một sự phụ thuộc liều lượng mà không ảnh hưởng đến sự tiết insulin

22

nền. DMC tăng sự tiết insulin chống lại độc tính glucose bằng cách mô phỏng tác dụng

của GLP-1 và tăng sự biểu hiện GLP-1R, nối tiếp bằng cách hoạt hóa đường truyền tín

hiệu của PDX-1, PRE-INS và GLUT2-GCK. Một cơ chế khác là DMC tránh các rối

loạn chức năng đảo tụy do tổn thương tế bào qua ức chế sự sản sinh oxit nitric (NO)

bởi iNOS, và biểu hiện MCP-1. Kết quả này cho thấy ứng dụng tiềm năng của DMC

trong việc can thiệp sự tăng đường huyết gây bởi độc tính glucose [24].

Năm 2015, Yu W. G. và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống viêm của

dimethyl cardamonin(DMC) qua đường tín hiệu PI3K-PDK1-PKCα[48]. Trà thảo

dược [nụ hoa Cleistocalyx operculatus (Roxb.)Merr. et Perry (Myrtaceae)] có tác dụng

chống lại nhiều bệnh tật như bệnh tiểu đường, hen suyễn và bệnh viêm ruột. HMGB1

được xem như yếu tố tiền viêm chìa khóa trong các bệnh trên. Dimethyl cardamonin

(2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon(DMC) là một thành phần chính của

nụ hoa C. operculatus. Trong nghiên cứu này, các tác dụng chống viêm của DMC và

tác dụng cơ chế phân tử đã được nghiên cứu trên đại thực bào được gây viêm

bởi lipopolysaccharide (LPS).DMC ức chế sự biểu hiện mRNA của TNF-α, IL-1β, IL-

6, và HMGB1, và giảm sự sản sinh chúng trong sự phụ thuộc vào liều lượng. DMC

giảm sự tiết HMGB1 gây bởi LPS. Hơn nữa, DMC ức chế sự hoạt hóa của

phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), kinase phosphoinositide 1 (PDK1), và protein

kinase C alpha (PKCα). Tất cả các dữ liệu chứng minh rằng DMC có tác dụng chống

viêm qua việc làm giảm TNF-α, IL-1β, IL-6 và HMGB1thông qua việc kết hợp với

PI3K-PDK1-PKCα.

Năm 2016, Choi J. W. và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng và cơ chế điều chỉnh

của 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon(DMC) được phân lập

từCleistocalyx operculatus trên các thông số chuyển hóa trong các bó cơ, tế bào mỡ và

mô hình chuột béo phì[18]. Kết quả cho thấy DMC làm tăng sự hấp thu glucose và sự

oxi hóa acid béo (FAO) trong các bó cơ. Ngoài ra, DMC ức chế sự phân chia tế bào

mỡvà mật trong các tế bào 3T3-L1. DMC kích thích phosphoryl hóa trên đơn vị alpha

(T172) protein kinase (AMPK) bằng cách liên kết trực tiếp vào AMPK.Hơn nữa,

DMC gắn vào AMPK với ái lực cao hơn AMP. Các kết quả này cho thấy tác động của

DMC chủ yếu qua trung gian bởi AMPK kích hoạt. Ngoài ra, chuột điều trị ăn nhiều

chất béo với DMC cải thiện dung nạp glucose và tăng đáng kể FAO của các cơ.

23

CHƯƠNG 2:THỰC NGHIỆM

24

2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1. Hóa chất

- Etanol thực phẩm 96o(Việt Nam).

-Dung môi n-hexan, diclometan, etylaxetat, axeton, metanol (Hàn Quốc)

dùng cho sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột.

- Axit sulfuric tinh khiết (Trung Quốc).

- Vanillin tinh khiết (Trung Quốc).

- Silica gel: các cỡ hạt 0,040-0,063 mm và 0,015-0,040 mm(Merck, CHLB

Đức) cho sắc ký cột.

- Bản mỏng silica gel tráng sẵn nền nhôm, DC-Alufolien 60 F254 (Merck,

CHLB Đức).

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị

- Máy cô quay chân không 1 lít hãng Büchi(Thụy Sĩ).

- Cân kỹ thuật, cân phân tích (Đức).

- Cột sắc ký các cỡ (CC, FC, Mini-C).

- Bơm nén cột (FC, Mini-C).

- Các thiết bị đo điểm nóng chảy Boetius (Đức) và Thermo Scientific Mel-

Temp 3.0 (Mỹ).

- Phổ khối lượng (ESI-MS) đo trên hệ thiết bị LC/MSD Trap Agilent Series

1100.

- Các phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR và DEPT (125 MHz) được ghi

trên thiết bị Bruker Avance 500 với TMS (tetrametylsilan) là chất chuẩn nội.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu và điều chế các phần chiết

Mẫu lá cây được phơi trong bóng râm đến gần khô sau đó sấy ở nhiệt độ 45 oC

đến khối lượng không đổi và xay thành bột nguyên liệu.

Bột nguyên liệu khô được ngâm chiết 3 lần với etanol 96% hoặc etanol/nước

60% ở nhiệt độ phòng. Các dịch chiết được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất

giảm thu được phần chiết etanol hoặc etanol-nước. Cao thô sau đó được hòa nước

25

và chiết chọn lọc theo độ phân cực của dung môi, n-hexan, diclometan và etyl

axetat để thu các phần chiết tương ứng.

2.2.2. Các phương pháp phân tích và phân lập các hợp chất

2.2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên lớp mỏng silica gel tráng sẵn, DC-

Alufolien 60 F254, với lớp silica gel dày 0,2 mm trên nền nhôm (Merck).

Phát hiện vệt chất trên lớp mỏng:

- Thuốc thử vanillin/axit sunfuric: Điều chế thuốc thử bằng cách hòa tan

1,0 g vanillin trong 100 ml axit sunfuric đặc. Thuốc thử vanillin/axit sunfuric khi

được phun lên lớp mỏng thường cho các vệt chất màu tím, tím hồng, tím đậm, đỏ,

hồng, vàng, xanh..., chỉ ra sự có mặt của các tecpenoit hoặc flavonoit.

- Thuốc thử ceri sunphat: Thuốc thử được điều chế bằng cách hoà tan 2,5 g

Ce(SO4)2.4H2O và 5 g axit phosphomolibdic trong 12 ml axit sunphuric đặc, sau đó

thêm nước cất đến 200 ml. Thuốc thử ceri sunphat cho các vệt chất màu xanh đen.

2.2.2.2. Sắc ký cột (CC, FC và Mini-C)

Chất hấp phụ dùng cho CC, FC và Mini-C là silica gel (Merck) với các cỡ

hạt khác nhau: cỡ hạt 0,040-0,063 mm và 0,015-0,040 mm.

Sắc ký cột CC được thực hiện dưới trọng lực của dung môi.

Sắc ký cột FC được sử dụng không khí nén với áp suất đẩy dung môi chạy

qua cột sắc ký.

Sắc ký cột Mini-C với kích thước cột nhỏ và độ nén silica gel (0,015-

0,040mm)cao dùng cho tinh chế lượng mẫu nhỏ.

2.2.2.3. Kết tinh lại

Chất cần kết tinh lại được hoà tan trong dung môi hoặc hỗn hợp dung môi,

lọc bỏ tạp chất không tan rồi để bay hơi bớt dung môi, làm lạnh hoặc thêm dung

môi ít hoà tan vào để tạo tinh thể.

2.2.3. Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Đã sử dụng kết hợp phương pháp phổ khối lượng ion hóa phun bụi điện tử

(ESI-MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1D NMR) và

26

phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (2D NMR) để xác định cấu trúc các hợp chất

được phân lập.

2.2.4. Nguyên liệu thực vật

Mẫu lá cây Vối (Cleistocalyx operculatus Roxb. Merr. et Perry) được thu hái

vào tháng 5 năm 2013 tại Như Quỳnh, Văn Lâm, Hưng Yên.

Mẫu lá cây được phơi trong bóng râm đến gần khô sau đó sấy ở nhiệt độ 45 oC

đến khối lượng không đổi và xay thành bột mịn.

2.2.5. Phương pháp điều chế các phần chiết

2.2.5.1. Điều chế phần chiết etanol từ lá vối

Ngâm 1 kg mẫu nguyên liệu bột lá vối khô trong etanol 96o thu được phần chiết

etanol thô. Phần chiết etanol thôđược hòa nước vàchiết lần lượt với dung môi n-hexan,

diclometan và etyl axetat để thu các phần chiết tương ứng là EH, ED và EE.

Quy trình điều chế các phần chiết để phân tách hợp chất từ lá vối được đưa ra

trong Sơ đồ 1.

27

Bột lá khô (1 kg)

Etanol 96 o

Dịch chiết

Lọc

Bã rắn

Dịch chiết etanol

Cô quay

Chiết hai lần

- Etanol 96o - Lọc

Bã thải

Cao etanol (127,5 g)

- Thêm nước - Chiết n-hexan

Dịch nước

Dịch chiết n-hexan

- Chiết diclometan - Chiết etyl axetat

Cô quay

Dịch nước

Dịch chiết diclometan

Dịch chiết etyl axetat

Cô quay

Cô quay

Cô quay

EH (26,6 g)

EN (29,3 g)

EE (5,8 g)

ED (48,7 g)

Sơ đồ 1: Quy trình điều chế các phần chiết từ lá vối

Khối lượng và hiệu suất thu nhận các phần chiết được ghi cụ thể trong

mục3.2., phần Kết quả và Thảo luận.

2.2.5.2. Điều chế phần chiết etanol-nước từ lá vối

Bột lá cây Vối khô (160 g) được ngâm chiết với hỗn hợp etanol/nước

60%.Dịch chiết EtOH/nước được cất loại dung môi dưới áp suất giảm, cặn chiết được 28

hòa với nước cất và chiết lần lượt với n-hexan, CH2Cl2 và EtOAc cho các phần chiết

tương ứng.

Quy trình điều chế và phân tách phần chiết etanol-nước được đưa ra trong Sơ

đồ2.

etanol/nước 60%

Cất loại dung môi

Bột lá vối khô (160g)

- Thêm nước - Chiết etyl axetat

Cô quay

Cao etanol-nước Dịch chiết etanol-nước

CC, Si gel, D/M 29:1, 19:1, 9:1, 4:1

Dịch chiết etyl axetat ENE(2,6 g)

ENE4 ENE5 ENE2 ENE1

ENE 3 - FC, Si gel, D/M 15:1, 9:1 - Kết tinh lại

FC, Si gel, D/M 15:1

ENE3.2

CO10 8 mg

Sơ đồ 2: Quy trình chiết và phân tách phần chiết etanol-nước

2.2.6. Phân tách phần chiết etanoltừ lá vối

2.2.6.1. Phân tách phần chiết n-hexan

25 g phần chiết n-hexan (EH) được hoà tan bằng một lượng diclometan vừa

đủ để tan hết, thêm 38 g silica gel (cỡ hạt 0,040-0,063 mm) vào, đảo đều đến khi

bay hơi hết dung môi, thu được hỗn hợp bột tơi mịn màu xanh đen.

Bột tẩm trên silica gel được phân tách bằng sắc ký cột FC trên chất hấp phụ

silica gel. Cột được nhồi ướt với 150 g silica gel (0,040-0,063 mm) trong dung môi 29

n-hexan và để ổn định qua đêm. Dung môi chạy cột là n-hexan và hệ dung môi

gradient n-hexan-etyl axetat 29:1, 19:1, 9:1, 4:1, 2:1, 1:1 (v/v). Thu được 80 phân

đoạn, mỗi phân đoạn 30 ml. Dựa trên kết quả khảo sát sắc ký lớp mỏng, các phân

đoạn này được gộp thành 9 nhóm phân đoạn từ EH1 đến EH9.

Nhóm phân đoạn EH3 (1,9 g) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột CC trên

silica gel (0,040-0,063 mm) với hệ dung môi n-hexan-etyl axetat 29:1, thu được 3

nhóm phân đoạn từ EH3.1 đến EH3.3. Nhóm phân đoạn EH3.1 được rửa bằng n-

hexan và axeton, sau đó kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi n-hexan-axeton thu

được 25 mg chất tinh khiết, dạng vô định hình, màu trắng, ký hiệu là CO1.

Nhóm phân đoạn EH5 (6,2 g) được phân tách bằng sắc ký cột FC trên silica

gel (0,040-0,063 mm) với hệ dung môi n-hexan-etyl axetat 29:1, 19:1 và 9:1 thu

được 60 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Các phân đoạn được gom thành 4 nhóm

phân đoạn từ EH5.1 đến EH5.4. Nhóm phân đoạn EH5.2 được rửa bằng dung môi

n-hexan sau đó kết tinh lại trong axeton thu được 407 mg chất kết tinh hình kim

màu da cam, ký hiệu là CO2. Nhóm phân đoạn EH5.3 (1,1 g) được phân tách tiếp

bằng sắc ký cột FC trên silica gel (0,015-0,040 mm) với hệ dung môi n-hexan-etyl

axetat 19:1 và 9:1 thu được 4 nhóm phân đoạn từ EH5.3.1 đến EH5.3.4. Nhóm

phân đoạn EH5.3.1 và EH5.3.2 được rửa bằng dung môi n-hexan và kết tinh lại

trong axeton thu được 214,5 mg CO2.Các nhóm phân đoạn EH5.3.3 và EH5.3.4

được phân tách tiếp bằng sắc ký cột FC trên silica gel (0,015-0,040 mm) với hệ

dung môi n-hexan-etyl axetat 29:1, 19:1 thu được chất kết tinh hình que màu trắng,

ký hiệu là CO3(40 mg). Nhóm phân đoạn EH5.4 (0,8 g) được rửa bằng metanol thu

được 30 mg chất kết tinh màu trắng CO3.

Nhóm phân đoạn EH7 (0,6 g) được phân tách bằng sắc ký cột FC trên silica

gel (0,040-0,063 mm) với hệ dung môi n-hexan-etyl axetat 9:1, rửa bằng axeton và

kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi diclometan-axeton thu được 20 mg chất vô

định hình màu trắng, ký hiệu là CO4.

Nhóm phân đoạn EH8 (4,0 g) được phân tách bằng sắc ký cột FC trên silica

gel (0,040-0,063 mm) với hệ dung môi n-hexan-etyl axetat 9:1 và 6:1 thu được 4

nhóm phân đoạn từ EH8.1 đến EH8.4. Nhóm phân đoạn EH8.1 được phân tách

tiếp bằng sắc ký cột và kết tinh lại thu được 15 mg CO4và 20 mg hỗn hợp 2 vô

30

định hình, màu trắng CO4 và CO5. Nhóm phân đoạn EH8.4 được phân tách tiếp

bằng sắc ký cột FC trên silica gel (0,015-0,040 mm) với hệ dung môi diclometan-

etyl axetat 29:1, kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi diclometan-axeton thu được

36 mg chất kết tinh hình que màu trắng, ký hiệu là CO6.

Nhóm phân đoạn EH9 (3,1 g) được rửa bằng axeton và kết tinh lại trong hỗn

hợp dung môi diclometan-axeton thu được 210 mg hỗn hợp của 3 chất CO4, CO5

và CO6.

Quá trình phân tách phần chiết n-hexan từ lá cây Vối được trình bày trên Sơ

đồ 3.

2.2.6.2. Phân tách phần chiết diclometan

48 g phần chiết diclometan (ED2) được hòa tan trong một lượng diclometan

vừa đủ. Thêm 50 g silica gel (0,040-0,063 mm) để tẩm mẫu trộn đều, nghiền trong

cốc thủy tinh cho đến khi bay hơi hết dung môi. Cột được nhồi ướt với 300 g silica

gel (0,040-0,063 mm) trong diclometan. Cột sắc ký (CC) được triển khai với hệ

dung môi diclometan-etyl axetat gradient 9:1, 6:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2 thu được 24

phân đoạn, mỗi phân đoạn 150 ml. Các phân đoạn này được gộp thành 7 nhóm

phân đoạn từ ED1 đến ED7.

Nhóm phân đoạn ED4 (4,4 g) được phân tách bằng sắc ký cột FC trên silica

gel (0,040-0,063 mm) với hệ dung môi diclometan-etyl axetat 9:1, 6:1, 4:1 thu được

55 phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Các phân đoạn được gom thành 5 nhóm phân

đoạn từ ED4.1 đến ED4.5. Nhóm phân đoạn ED4.1 (0,2 g) được phân tách bằng

mini cột FC trên silica gel (0,015-0,040 mm) với hệ dung môi diclometan-etyl

axetat 35:1 sau đó tinh chế thu được CO4(12 mg) và chất kết tinh hình que màu

trắng CO5 (19 mg). Nhóm phân đoạn ED4.4 (1,35 g) được phân tách bằng sắc ký

cột FC trên silica gel (0,015-0,040 mm) với hệ dung môi diclometan-etyl axetat

29:1, 19:1 và tinh chế bằng cách kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi diclometan-

axeton được 2 chất tinh khiết CO5 (150 mg) và CO6(70 mg).

Nhóm phân đoạn ED5 (5,8 g) được phân tách bằng sắc ký cột FC trên silica

gel (0,040-0,063 mm) với hệ dung môi diclometan-etyl axetat 9:1, 6:1, 4:1 thu được

2 nhóm phân đoạn là ED5.1 và ED5.2. Nhóm phân đoạn ED5.2 (1,9 g) được phân

tách tiếp bằng hệ dung môi diclometan-axeton 29:1, 19:1 và 9:1 thu được 4 nhóm

31

phân đoạn từ ED5.2.1 đến ED5.2.4. Nhóm phân đoạn ED5.2.4 được rửa bằng dung

môi axeton và kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi diclometan-axeton thu được 46,2

mg chất kết tinh hình que màu trắng, ký hiệu là CO7.

Quá trình phân tách phần chiết diclometan từ lá cây Vối được trình bày trên

Sơ đồ 4.

2.2.6.3. Phân tách phần chiết etyl axetat

5,5 g phần chiết etyl axetat (EE) được hòa tan trong một lượng axeton vừa

đủ. Tẩm mẫu với 8 g silica gel (0,040-0,63 mm), nghiền, trộn đều trong cốc thủy

tinh cho đến khi bay hết dung môi. Cột được nhồi ướt với 80 g silica gel (0,040-

0,063 mm) trong diclometan. Cột sắc ký (CC) được triển khai với hệ dung môi

diclometan-axeton 19:1, 9:1, 4:1 thu được 51 phân đoạn, mỗi phân đoạn 30 ml.

Các phân đoạn này được gộp thành 5 nhóm phân đoạn từ EE1 đến EE5.

Nhóm phân đoạn EE2 được phân tách tiếp bằng sắc ký cột FC trên silica gel

(0,015-0,040 mm), hệ dung môi diclometan-axeton 19:1 thu được 22,7 mg chất kết

tinh hình que màu vàng, ký hiệu là CO8.

Nhóm phân đoạn EE4 và EE5 được phân tách bằng sắc ký cột FC trên silica

gel (0,015-0,040 mm), hệ dung môi diclometan-metanol 29:1 thu được 25,7 mg

chất kết tinh hình que màu vàng, ký hiệu là CO9.

Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat từ lá cây Vối được trình bày trên

Sơ đồ 5.

2.2.7. Phân tách phần chiết etanol-nước từ lá vối

Phần chiết etylaxetat ENE (2,6 g) được phân tách bằng CC trên silica gel (cỡ

hạt 0,040-0,063 mm), rửa giải với hệ dung môi gradient diclometan/metanol29:1, 19:1,

9:1, 4:1 (v/v) thu được 5 nhóm phân đoạn từ ENE1 đến ENE5. Nhóm phân đoạn

ENE3 được phân tách bằng CC trên silica gel (0,040-0,063 mm), rửa giải với hệ dung

môi diclometan/metanol15:1, 9:1 (v/v)thu được 3 nhóm phân đoạn. Tinh chế tiếp bằng

Mini-CC trên silica gel (0,040-0,063 mm), rửa giải với hệ dung môi

diclometan/metanol15:1 thu được chất CO10 (8mg).

2.2.8. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất được phân lập

Chất CO1 (1-Tetratriacontanol)

32

Bột vô định hình màu trắng.

Rf= 0,3 (TLC, silica gel, n-hexan-etyl axetat 9:1, v/v).

1H-NMR (CDCl3): δ0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 34-CH3), 1,26 (62H, s br, 3-

ESI-MS: m/z 493 ([M - H]-) (C34H70O).

CH233-CH2), 1,57 (2H, m, 2-CH2), 3,61 (2H, t, J = 7,0 Hz, 1-CH2).

Chất CO2 (2',4'-Dihydroxy-6'-metoxy-3',5'-dimetylchalcon)

Tinh thể hình kim màu da cam, đ.n.c. 125-126 oC.

Rf= 0,4 (TLC, silica gel, n-hexan-etyl axetat 7:1, v/v).

ESI-MS: m/z 299 ([M + H]+), 297 ([M - H]-) (C18H18O4). 1H-NMR (CDCl3): δ 2,07 (3H, s, 3-CH3), 2,12 (3H, s, 5-CH3), 3,65 (3H, s, 6-

OCH3), 7,39 (3H, m, H-3, H-4, H-5), 7,63 (2H, dd, J = 8,0 Hz, 2,0 Hz, H-2, H-6),

7,83 (1H, d, J = 15,5 Hz, Hα), 7,97 (1H, d, J = 15,5 Hz, Hβ), 13,6 (1H, s, 2'-OH).

Chất CO3(β-Sitosterol)

Tinh thể hình que màu trắng, đ.n.c. 134-135 oC.

Rf= 0,34 (TLC, silica gel, n-hexan-etyl axetat 4:1, v/v).

Chất CO4(Betulin)

Bột vô định hình màu trắng.

Rf = 0,32 (TLC, silica gel, n-hexan-etyl axetat 4:1, v/v). ESI-MS: m/z 443 ([M + H]+) (C30H50O2). 1H-NMR (CDCl3): δ 0,76 (3H, s, 4-CH3), 0,83 (3H, s, 10-CH3), 0,97 (3H, s,

14-CH3), 0,98 (3H, s, 4-CH3), 1,02 (3H, s, 8-CH3), 1,68 (3H, s, 20-CH3), 2,38 (1H,

ddd, J = 11,0 Hz, 11,0 Hz, 6,0 Hz, H-19), 3,18 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 5,0 Hz, H-3),

3,33 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-28a), 3,79 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-28b), 4,58 (1H, d, J =

1,5 Hz, H-29a), 4,68 (1H, s br, H-29b).

Chất CO5(Axit betulinic)

Tinh thể hình que màu trắng, đ.n.c. 270-272 oC.

Rf = 0,43 (TLC, silica gel, diclometan-etyl axetat 15:1, v/v). ESI-MS: m/z 457 ([M + H]+), 455 ([M - H]-) (C30H48O3).

33

1H-NMR (CDCl3 + CD3OD):  0,75 (3H, s, 4-CH3), 0,83 (3H, s, 10-CH3),

0,95 (3H, s, 14-CH3), 0,96 (3H, s, 4-CH3), 0,98 (3H, s, 8-CH3), 1,71 (3H, s, 20-

CH3), 3,01 (1H, m, H-19), 3,16 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 7,5 Hz, H-3), 4,59 (1H, s, H-

29a), 4,72 (1H, s, H-29b).

Chất CO6(Axit oleanolic)

Tinh thể hình que màu trắng, đ.n.c. 264-265 oC.

Rf = 0,35 (TLC, silica gel, diclometan-etyl axetat 9:1, v/v). ESI-MS: m/z 457 ([M + H]+), 455 ([M - H]-) (C30H48O3). 1H-NMR (CDCl3):  0,77 (3H, s, 26-CH3), 0,78 (3H, s, 23-CH3), 0,90 (3H, s,

25-CH3), 0,91 (3H, s, 29-CH3), 0,93 (3H, s, 30-CH3), 0,98 (3H, s, 24-CH3), 1,14

(3H, s, 27-CH3), 2,83 (1H, dd, J = 13,5 Hz, 4,0 Hz, H-18), 3,20 (1H, dd, J = 10,0

13C-NMR/DEPT (CDCl3):  15,2 (q, C-24), 15,4 (q, C-25), 16,8 (q, C-26),

Hz, 6,0 Hz, H-3), 5,27 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12).

18,2 (t, C-6), 22,9 (t, C-11), 23,3 (t, C-16), 23,4 (q, C-30), 25,7 (q, C-27), 26,8 (t,

C-2), 27,6 (t, C-15), 27,9 (q, C-23), 30,6 (s, C-20), 32,4 (t, C-22), 32,6 (t, C-7),

32,9 (q, C-29), 33,8 (t, C-21), 36,9 (s, C-10), 38,4 (t, C-1), 38,6 (s, C-4), 39,2 (s, C-

8), 41,1 (d, C-18), 41,6 (s, C-14), 45,9 (t, C-19), 46,3 (s, C-17), 47,5 (d, C-9), 55,1

(d, C-5), 78,8 (d, C-3), 122,2 (d, C-12), 143,7 (s, C-13), 181,3 (s, C-28).

Chất CO7(Axit maslinic)

Tinh thể hình que màu trắng.

Rf = 0,48 (TLC, silica gel, diclometan-axeton 4:1, v/v).

1H-NMR (CDCl3):  0,79 (3H, s, 26-CH3), 0,81 (3H, s, 24-CH3), 0,91 (3H, s,

ESI-MS: m/z 473 ([M + H]+), 471 ([M - H]-) (C30H48O4).

29-CH3), 0,93 (3H, s, 30-CH3), 0,98 (3H, s, 25-CH3), 1,02 (3H, s, 23-CH3), 1,15

(3H, s, 27-CH3), 2,83 (1H, dd, J = 13,5 Hz, 4,0 Hz, H-18), 2,95 (1H, d, J = 10,5 Hz,

H-2), 3,65 (1H, ddd, J = 11,0 Hz, 10,0 Hz, 4,5 Hz, H-3), 5,28 (1H, s br, H-12).

Chất CO8(Kaempferol)

Tinh thể hình que màu vàng, đ.n.c. 276-278 oC.

Rf = 0,67 (TLC, silica gel, diclometan-axeton 4:1, v/v). ESI-MS: m/z 287 ([M + H]+), 285 ([M - H]-) (C15H10O6).

34

1H-NMR (CD3OD): δ 6,19 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-6), 6,41 (1H, s br, H-8),

13C-NMR/DEPT (CD3OD): δ94,5 (d, C-8), 99,3 (d, C-6), 104,6 (s, C-10),

6,92 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, H-6), 8,1 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, H-5).

116,3 (d, C-3, C-5), 123,7 (s, C-1), 130,7 (d, C-2, C-6), 137,1 (s, C-3), 148,1 (s,

C-2), 158,3 (s, C-9), 160,5 (s, C-4), 162,5 (s, C-5), 165,6 (s, C-7), 177,4 (s, C-4).

Chất CO9(Quercetin)

Tinh thể hình que màu vàng, đ.n.c. 295-297 oC.

Rf = 0,4 (TLC, silica gel, diclometan-axeton 4:1, v/v). ESI-MS: m/z 303 ([M + H]+), 301 ([M - H]-) (C15H10O7). 1H-NMR (CD3OD): δ 6,21 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,41 (1H, d, J = 2,0 Hz,

H-8), 6,9 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5), 7,65 (1H, dd, J = 9,0 Hz, 2,0 Hz, H-6), 7,75

(1H, d, J = 2,0 Hz, H-2).

Chất CO10 (Axit arjunolic)

Tinh thể hình que màu trắng.

Rf = 0,5 (TLC, silica gel, diclometan-metanol 9:1, v/v). 1H-NMR (CDCl3):  0,72 (3H, s, 26-CH3), 0,86 (3H, s, 24-CH3), 0,95 (3H, s,

29-CH3), 0,98 (3H, s, 30-CH3), 1,10 (3H, s, 25-CH3), 1,22 (3H, s, 27-CH3), 2,87 (1H,

dd, J = 12,0 Hz, 4,0 Hz, H-18), 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,37 (1H, d, J = 9,5

Hz, H-3), 3,54 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,71 (1H, ddd, J = 11,5 Hz, 9,5 Hz, 4,5

13C-NMR/DEPT (CDCl3):  13,9 (q, 24-CH3), 17,5 (q, 26-CH3), 17,8 (q, 25-

Hz, H-2), 5,28 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12).

CH3), 19,1 (t, C-6), 23,9 (t, C-16), 24,0 (t, C-30), 24,6 (t, C-11), 26,5 (q, C-27), 28,8 (t,

C-15), 31,6 (s, C-20), 33,3 (t, C-22), 33,4 (s, C-29), 33,8 (t, C-7), 34,8 (t, C-21), 39,0

(s, C-8, C-10), 42,7 (d, C-18), 43,0 (s, C-14), 44,1 (s, C-4), 47,2 (t, C-19), 47,6 (s, C-

17), 47,8 (t, C-1), 48,1 (d, C-9), 48,9 (d, C-5), 66,2 (t, C-23), 69,9 (d, C-2), 78,1 (d, C-

3), 123,4 (d, C-12), 145,4 (s, C-13), 181,8 (s, C-28).

35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

Mẫu lá cây Vối (Cleistocalyx operculatus Roxb. Merr. et Perry) được thu hái

vào tháng 5 năm 2013 tại Như Quỳnh, Văn Lâm, Hưng Yên.

Quá trình xử lý mẫu nguyên liệu được nêu cụ thể trong mục 2.4., phần Thực

nghiệm.

3.2. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ LÁ VỐI

1 kg mẫu nguyên liệu lá vối khô được ngâm chiết trong etanol 96o thu được

phần chiết etanol (127,5 g; 12,75% so với lượng nguyên liệu khô)và các phần chiết

n-hexan (EH)(26,6 g; 2,66%), diclometan (ED) (48,7 g; 4,87%), etyl axetat (EE)

(5,8 g;0,58%)và nước (29,3 g; 2,93%) sau phân tách 2 pha lỏng.

160g bột lá vối khô được ngâm chiết với hỗn hợp etanol/nước 60%, thu được

các dịch chiết EtOH/nước và các phần chiếtn-hexan, CH2Cl2 và etyl axetat (ENE) (2,6

g; 1,62%)sau phân tách 2 pha lỏng.

Quy trình chiết cụ thể xem mục 2.5., phần Thực nghiệm.

3.3.PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT TỪ LÁ VỐI

3.3.1.Phân tách phần chiết n-hexan(EH)

25 g phần chiết n-hexan (EH) được phân tách bằng sắc ký cột FC trên chất

hấp phụ silica gel (0,040-0,063 mm) với hệ dung môi n-hexan-etyl axetat gradient

29:1, 19:1, 9:1, 4:1, 2:1, 1:1 (v/v) thu được 9 nhóm phân đoạn từ EH1 đến EH9.

Các nhóm phân đoạn EH3, EH5, EH7 và EH8 được phân tách tiếp nhiều lần bằng

sắc ký cột FC trên chất hấp phụ silica gel, rửa bằng các dung môi thích hợp để làm

sạch các chất kết tinh, sau đó kết tinh lại thu được 6 chất tinh khiết, ký hiệu là

CO1, CO2, CO3, CO4, CO5 và CO6.

Chi tiết quá trình phân tách được nêu ởmục 2.6.,phần Thực nghiệm và Sơ đồ

3.

36

EH(25 g)

CC, Si gel, H/E 29:1, 19:1, 9:1, 4:1, 2:1, 1:1

EH3 1,9 g

EH5 6,2 g

EH2 1,0 g

EH4 0,9 g

EH6 0,5 g

EH7 0,6 g

EH8 4,0 g

EH9 3,1 g

EH1 2,6g 0,41g

- CC, Si gel, H/E 29:1 - Kết tinh lại

- FC, Si gel, H/E 29:1, 19:1, 9:1

CC, Si gel, H/E 9:1, 6:1

- Rửa, - Kết tinh lại

- FC, Si gel, H/E 9:1 - Kết tinh lại

CO4+CO5+CO6 (210 mg) 8 mg

CO4 20 mg 40,5 mg

CO1 25 mg 40,5 mg

CO2 407mg

CO3 30 mg

EH5.3 (1,1g)

FC, Si gel, D/E 29:1 19:1

CO4+CO5 (20 mg)

CO6 36 mg

CO4 15 mg

FC, Si gel, H/E 29:1, 19:1

FC, Si gel, H/E 29:1, 19:1

CO3 40 mg

CO2 214,5 mg

Sơ đồ 3: Phân tách phần chiết n-hexan

3.3.2. Phân tách phần chiết diclometan(ED)

48 g phần chiết diclometan (ED) được phân tách bằng sắc ký cột FC trên

chất hấp phụ silica gel (0,040-0,063 mm) với hệ dung môi diclometan-etyl axetat

gradient 9:1, 6:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2 thu được 7 nhóm phân đoạn từ ED1 đến ED7.

Các nhóm phân đoạn ED4 và ED5 được phân tách tiếp nhiều lần bằng sắc ký cột

FC trên chất hấp phụ silica gel, rửa, kết tinh lại thu được 4 chất tinh khiết, ký hiệu

là CO4, CO5, CO6 và CO7.

Chi tiết quá trình phân tách được nêu ởmục 2.2.6.2.,phần Thực nghiệm và Sơ

đồ 4.

37

ED(48 g)

CC, Si gel, D/E 9:1, 6:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2 (v/v) H/E 7:1→1:1

ED2 0,3 g

ED5 5,8 g

ED6 3,7 g

ED7 0,5 g

ED3 10,4 g

ED4 4,4 g

ED1 0,1 g 0,41g

- FC, Si gel, D/E 9:1, 6:1, 4:1

- FC, Si gel, H/E 9:1 - Kết tinh lại

ED5.2 1,9 g

FC, Si gel, D/E 35:1

FC, Si gel, D/E 29:1, 19:1

CO7 46,2 mg

- FC, Si gel, D/A 19:1, 9:1 - Rửa, - Kết tinh lại

CO4 12 mg

CO5 19 mg

CO5 150 mg

CO6 70 mg

Sơ đồ 4: Phân tách phần chiết diclometan

3.3.3. Phân tách phần chiết etyl axetat(EE)

5,5 g phần chiết etyl axetat (EE) được phân tách bằng sắc ký cột FC trên

chất hấp phụ silica gel (0,040-0,063 mm) với hệ dung môi diclometan-axeton 19:1,

9:1, 4:1 thu được 5 nhóm phân đoạn từ EE1 đến EE5. Các nhóm phân đoạn EE2 và

EE4 được phân tách tiếp bằng sắc ký cột FC trên chất hấp phụ silica gel, rửa và kết

tinh lại thu được 2 chất tinh khiết là CO8 và CO9.

EE(5,5 g)

CC, Si gel, D/A 19:1, 9:1, 4:1

EE4

EE3

EE1

EE2

EE5

- FC, Si gel, D/A 19:1

- FC, Si gel, D/M 29:1, 19:1 - Kết tinh lại

- FC, Si gel, D/M 29:1 - Kết tinh lại

CO8 22,7 mg

CO9 5,7 mg

CO9 20 mg

Sơ đồ 5:Phân tách phần chiết etyl axetat

38

Chi tiết quá trình phân tách cụ thể được nêu ở mục 2.2.6.3. phần Thực

nghiệm và Sơ đồ 5.

3.3.4. Phân tách phần chiết etyl axetat (ENE)

2.6g phần chiết etyl axetat ENE được phân tách bằng CC trên silica gel (cỡ hạt

0,040-0,063 mm), với hệ dung môi gradient diclometan/metanol 29:1, 19:1, 9:1, 4:1

(v/v) thu được 5 nhóm phân đoạn từ ENE1 đến ENE5. Nhóm phân đoạn ENE3được

phân tách tiếp bằng sắc ký cột CC trên chất hấp phụ silica gel, rửa và kết tinh lại

thu được 1 chất tinh khiết là CO10.

Chi tiết quá trình phân tách cụ thể được nêu ở mục 2.2.7. phần Thực nghiệm

và Sơ đồ 2.

3.4. CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP

♦ ChấtCO1 (1-Tetratriacontanol)

Hợp chấtCO1 được phân lập từ phần chiết n-hexan của lá cây Vối dưới dạng

bột vô định hình màu trắng, Rf= 0,3 (TLC, silica gel, n-hexan-etyl axetat 9:1, v/v).

1-Tetratriacontanol – CO1

Phổ 1H-NMR của CO1 xác định các tín hiệu cộng hưởng từ proton của một nhóm ankyl mạch dài bao gồm 32 nhóm metylen sp3 ở δH 1,26 (62H, s br) và 1,56

(2H, m), một nhóm metyl cuối mạch ở δH 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz), và một nhóm

oxymetylen ở δH 3,61 (2H, t, J = 7,0 Hz).

Các dữ kiện phổ 1H-NMR đã xác định cấu trúc của CO1 là 1-

tetratriacontanol (C34H70O). Công thức phân tử này phù hợp với pic giả ion phân tử trên phổ ESI-MS ởm/z 493 ([M - H]-, C34H70O).

Chất này chưa được phân lập từ Cleistocalyx operculatus.

♦ ChấtCO2 (2',4'-Dihydroxy-6'-metoxy-3',5'-dimetylchalcon)

Hợp chấtCO2 được phân lập từ phần chiết n-hexan của lá cây Vối dưới dạng tinh thể hình kim màu da cam, đ.n.c. 125-126 oC, Rf= 0,4 (TLC, silica gel, n-hexan-

etyl axetat 7:1, v/v).

39

2',4'-Dihydroxy-6'-metoxy-3',5'-dimetylchalcon – CO2

Công thức phân tử C18H18O4 của CO2 được giả thiết từ phổ ESI-MS qua các

pic giả ion phân tử ởm/z 299 ([M + H]+) và 297 ([M - H]-).

Trên phổ 1H-NMR của CO2 thấy xuất hiện cụm các tín hiệu của hai nhóm

metyl liên kết với vòng thơm ở δH 2,07 (3H, s) và 2,12 (3H, s) và một nhóm metoxy

ở δH 3,65 (3H, s). Các nhóm này được liên kết vào một vòng benzen bị thế sáu lần

do không có một tín hiệu proton nào của vòng này được phát hiện. Một vòng

benzen thế một lần khác được nhận dạng qua cụm các tín hiệu đặc trưng ở δH 7,39

(3H, m), 7,63 (2H, dd, J = 8,0 Hz, 2,0 Hz). Hai vòng benzen này được liên kết với

nhau bằng một cầu etylen [δH 7,83 (1H, d, J = 15,5 Hz) và 7,97 (1H, d, J = 15,5

Hz)] có cấu hình trans được xác định bằng hằng số tương tác Hα-Hβ lớn (J = 15,0

Hz). Sự chuyển dịch độ chuyển dịch hóa học của các proton nối đôi về phía trường

thấp cho thấy nó phải được liên hợp với một nhóm cacbonyl, từ đó một cấu trúc

chalcon đã được giả thiết choCO2 [12].

Việc xác định vị trí các nhóm thế (2 nhóm metyl, một nhóm hydroxy và một

nhóm metoxy) trên vòng A của cấu trúc chalcon này được dựa trên sự tham khảo

tài liệu phổ của các chất tương tự. Tín hiệu của nhóm OH ở δH 13,6 (1H, s) cho

thấy có sự tạo cầu hydro của nhóm này với nhóm cacbonyl chalcon. Từ các phân tích phổ 1H-NMR trên, cấu trúc của CO2 đã được xác định là 2',4'-dihydroxy-6'-

metoxy-3',5'-dimetylchalcon [12].

Chất này đã được phân lập từ nụ và hoa cây Vối của Việt Nam.

Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của 2',4'-dihydroxy-6'-metoxy-3',5'-

dimetylchalcon đã được chứng minh với giá trị IC504,3±0,2 µg/ml [10].

♦ Chất CO3(β-Sitosterol)

40

Hợp chấtCO3 được phân lập từ phần chiết n-hexan của lá cây Vối dưới dạng tinh thể hình que màu trắng, đ.n.c. 134-135 oC, Rf= 0,34 (TLC, silica gel, n-hexan-

etyl axetat 4:1, v/v).

β-Sitosterol – CO3

Dựa vào nhiệt độ nóng chảy, kết quả phân tích TLC và co-TLC với chất

chuẩn có thể xác định CO3là β-sitosterol.Chất này là một sitosterol xuất hiện phổ

biến trong các thực vật và cũng có tác dụng giảm đường huyết trong máu với giá trị

IC50 283,67 µg/ml [37].

♦Chất CO4(Betulin)

Hợp chấtCO4 được phân lập từ phần chiết diclometan của lá cây Vối dưới

dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,32 (TLC, silica gel, n-hexan-etyl axetat

4:1, v/v).

Betulin – CO4

Công thức phân tửC30H50O2 của CO4 được giả thiết từ phổ ESI-MS qua sự

xuất hiện của pic giả ion phân tử ởm/z 443 ([M + H]+).

41

Trên phổ 1H-NMR của CO4 xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của một

nhóm oxymetin ở H 3,18 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 5,0 Hz), một nhóm hydroxymetyl ở

H 3,79 (1H, d, J = 11,0 Hz) và 3,33 (1H, d, J = 11,0 Hz), một nhóm isopropenyl ở

H 4,58 (1H, d, J = 1,5 Hz), 4,68 (1H, s br) và 1,68 (3H, s), và 5 nhóm metyl bậc ba

ở H 0,76 (3H, s), 0,83 (3H, s), 0,97 (3H, s), 0,98 (3H, s) và 1,02 (3H, s).

Trên cơ sở các dữ kiện phổ NMR, một cấu trúc khung lupan đã được giả

thiết cho CO4.Sự xuất hiện của một nhóm hydroxymetyl và một nhóm isopropenyl

cho thấy có sự biến đổi của một nhóm metyl (hydroxyl hóa thành hydroxymetyl) và

một nhóm isopropyl (thành nhóm isopropenyl) của khung lupan thành khung lup-

20(29)-en.Nhóm hydroxy được giả thiết là liên kết vào vị trí C-3 dựa trên sự phát

sinh sinh học của các triterpenoid dãy lupan[48]. Hóa lập thể của nhóm hydroxy ở

C-3 đã được xác định là 3 dựa trên hằng số tương tác Jax-ax = 11,0 Hz. Hằng số

này cho thấy H-3 phải có mối quan hệ trans-diaxial với một H-2, do đó, nhóm

hydroxy chiếm vị trí equatorial và nằm trên mặt phẳng vòng khung lupan.

Các dữ kiện phổ 1H-NMR của CO4hoàn toàn phù hợp với phổ của betulin

trong tài liệu tham khảo [42] và mẫu chuẩn của chúng tôi.

Betulin chứng minh có hoạt tính ức chế tốt enzym α-glucosidase với giá trị

IC50 10,02±1,24 µg/ml [41].Chất này chưa được công bố từ Cleistocalyx

operculatus.

♦Chất CO5(Axit betulinic)

Hợp chấtCO5 được phân lập từ phần chiết diclometan của lá cây Vối dưới dạng tinh thể hình que màu trắng, đ.n.c. 270-272 oC, Rf = 0,43 (TLC, silica gel,

diclometan-etyl axetat 15:1, v/v).

42

Axit betulinic – CO5

Công thức phân tử C30H48O3 củaCO5được giả thiết từ phổ ESI-MS qua các

pic giả ion phân tử ởm/z 457 ([M + H]+) và 455 ([M - H]-).

Trên phổ 1H-NMR của CO5xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng từ đặc trưng

cho một nhóm oxymetin ở H 3,16 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 8,5 Hz), 5 nhóm metyl bậc

ba ở H 0,75 (3H, s), 0,83 (3H, s), 0,95 (3H, s), 0,96 (3H, s) và 0,98 (3H, s), và một nhóm isopropenyl ở H 4,59 (1H, s), 4,72 (1H, s) và 1,71 (3H, s). So với phổ 1H-

NMR của CO4có thể có sự thay thế nhóm hydroxymetyl ở C-28 bằng một nhóm

cacboxyl trong CO5.

Trên cơ sở các dữ kiện phổ NMR một cấu trúc khung lup-20(29)-en-3-ol đã

được giả thiết cho CO5. Nhóm hydroxy được giả thiết ở C-3 xuất phát từ sự sinh

tổng hợp các lupan triterpenoid từ squalen 2,3-epoxit. Cũng như ở betulin hóa lập

thể 3β-OH của nhóm này đã được xác định dựa trên các hằng số tương tác của H-3 (J = 11,0 Hz). Các dữ kiện phổ 1H-NMR của CO5đã được so sánh với tài liệu tham

khảo cho thấy các độ chuyển dịch hóa học của các nhóm methyl phù hợp với sự tồn tại của một nhóm cacboxyl ở C-28.Từ đó so sánh toàn phổ1H-NMR với phổ của

chất chuẩn axit betulinic trong cùng một điều kiện ghi đo cho thấy sự trùng lặp của

các dữ kiện phổ của các chất này.Do đó, cấu trúc của CO5đã được xác định là axit

betulinic [13].

Axit betulinic cũng đã được thử và khẳng định có hoạt tính ức chế enzym α-

glucosidase mạnh với giá trị IC50 là 3,6±0,5 µg/ml [10].

Axit betulinic đã được phân lập từ nụ cây Vối của Việt Nam.

43

♦ Chất CO6(Axit oleanolic)

Hợp chấtCO6 được phân lập từ phần chiết diclometan của lá cây Vối dưới dạng tinh thể hình que màu trắng, đ.n.c. 264-265 oC, Rf = 0,35 (TLC, silica gel,

diclometan-etyl axetat 9:1, v/v).

Axit oleanolic – CO6

Công thức phân tử C30H48O3 của CO6 được giả thiết từ phổ ESI-MS qua các

pic giả ion phân tử xuất hiện ở m/z 457 ([M + H]+) và 455 ([M - H]-).

Phổ 1H-NMR của CO6chỉ ra sự có mặt của 7 nhóm metyl bậc 3 ở dạng

singlet ở H 0,77 (3H), 0,78 (3H), 0,86 (3H), 0,90 (3H), 0,91 (3H), 0,93 (3H), 0,98

(3H) và 1,14 (3H), một nhóm oxymetin ở H 3,20 (1H, m) và một proton olefinic ở H 5,27 (1H, t, J = 3,5 Hz). Trên phổ 13C-NMR tín hiệu của nhóm cacboxyl ở C-28

xuất hiện ở C 181,3 (s). Các tín hiệu cacbon-13 khác bao gồm một nhóm oxymetin

ở C 78,8 (d) và một nối đôi thế ba lần ở ở C 122,2 (d) và 143,7 (s) phù hợp với tín

hiệu proton olefinic ở H 5,24, 7 nhóm metyl (7q), 10 nhóm metylen (10 t), 3 nhóm

metin (3d) và 6 cacbon (6s). Như vậy, các tín hiệu này phù hợp với một chất

oleanan trong đó một nhóm metyl đã được oxi hóa thành nhóm axit cacboxylic.Độ

chuyển dịch hóa học của các cacbon của nối đôi cho thấy vị trí C-12/C-13 của nối

đôi này.Nhóm hydroxy được giả thiết liên kết vào C-3 từ sự phát sinh sinh học của

các chất này từ squalen qua squalen oxit bằng một phản ứng đóng vòng. Trong

trường hợp này nhóm này được định hướng 3βdo hằng số tương tác J = 11,0 Hz của

hai proton chiếm các vị trí trans-diaxial.

44

So sánh phổ của CO6với các dữ kiện phổ của các chất oleanen-12-en trong

các tài liệu tham khảo đã xác định được cấu trúc của CO6là axit oleanolic [22].

Axit oleanolic đã được phân lập từ nụ cây Vối của Việt Nam.

Axit oleanolic đã được chứng minh có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase

với giá trị IC50 là 6,1±0,3 µg/ml [10].

♦ Chất CO7(Axit maslinic)

Hợp chấtCO7 được phân lập từ phần chiết diclometan của lá cây Vối dưới

dạng tinh thể hình que màu trắng, Rf = 0,48 (TLC, silica gel, diclometan-axeton

4:1, v/v).

Axit maslinic – CO7

Công thức phân tử C30H48O4 của CO7được giả thiết từ phổ ESI-MS với sự

xuất hiện của các pic giả ion phân tử ởm/z 473 ([M + H]+) và 471 ([M - H]-).

Phổ 1H-NMR của CO7chỉ ra sự có mặt của 7 nhóm metyl bậc 3 ở dạng

singlet ở H 0,79 (3H), 0,81 (3H), 0,91 (3H), 0,93 (3H), 0,98 (3H), 1,02 (3H) và

1,15 (3H), hai nhóm oxymetin ở H 2,95 (1H, d, J = 10,5 Hz) và 3,65 (1H, ddd, J =

11,0 Hz,10,5 Hz, 4,5 Hz và một proton olefinic ở H 5,28 (1H, s br). Độ chuyển

dịch hóa học proton của nối đôi cho thấy vị trí C-12/C-13 của nối đôi này. Do sự

không khác biệt nhiều của các tín hiệu proton của các vòng B, C, D và E của

CO7khiđược so với axit oleanolic (CO6) các nhóm hydroxy được giả thiết liên kết

vào các vị trí C-1, C-2 và C-3 của vòng A. Khi giữ nguyên một nhóm hydroxy ở C-

3 và phân tích các hằng số tương tác giữa các proton cacbinol quan sát thấy sự dịch

chuyển về phía trường thấp của H-3 từ H 3,20 về H 2,95; điều này cho giả thiết là

45

nhóm hydroxy còn lại được liên kết vào C-2. Trong trường hợp này các nhóm

hydroxy được định hướng 2α và 3βdo các hằng số tương tác J = 10,5 Hz giữa H-

3axial và H-2axial và 11,0 Hz giữa H-2axial và H-1axial và 10,5 Hz giữa H-2axial và H-

3axial.

So sánh phổ 1H-NMR của CO7với các dữ kiện phổ của các chất oleanen-12-

en trong các tài liệu tham khảo được đo trong cùng một dung môi đã xác định chính

xác được cấu trúc của CO7là axit maslinic [39].

Chất này đã được phân lập từ nụ cây Vối của Việt Nam.

Axit maslinic đã được chứng minh có hoạt tính ức chế tốt enzym α-

glucosidase với giá trị IC50 5,52±0,19 µg/ml [23].

♦ Chất CO8(Kaempferol)

Hợp chấtCO8 được phân lập từ phần chiết etyl axetat của lá cây Vối dưới dạng tinh thể hình que màu vàng, đ.n.c. 276-278 oC, Rf = 0,67 (TLC, silica gel,

diclometan-axeton 4:1, v/v).

Kaempferol – CO8

Công thức phân tử C15H10O6 của CO8được giả từ phổ ESI-MS với các pic

giả ion phân tử ở m/z 287 ([M + H]+) và 285 ([M - H]-).

Phổ 1H-NMR của CO8cho thấy sự có mặt của 4 nhóm tín hiệu cộng hưởng

từ proton ở δH 6,19 (1H, d, J = 1,0 Hz), 6,41 (1H, s br), 6,92 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 8,1 (2H, d, J = 8,5 Hz) của 6 proton vòng thơm. Các dữ kiện phổ 1H-NMR cho thấy

cấu trúc đặc trưng của một flavonol thế 5,7-dihydroxy ở vòng A và 4-hydroxy ở

vòng B.

46

Phổ 13C-NMR và DEPT của CO8 chỉ ra sự có mặt của một nhóm cacbonyl liên hợp α,β không no ở δC 177,4 (s); 8 cacbon sp2 trong đó có 4 cacbon liên kết với

oxy ở δC 165,6 (s), 162,5 (s), 160,5 (s), 158,3 (s), 148,1 (s), 137,1 (s), 123,7 (s) và

104,6 (s); và 6 nhóm methin của vòng thơm ở δC 130,7 (2d), 116,3 (2d), 99,3 (d) và

94,5 (d).

Các dữ kiện phổ NMR cho thấy cấu trúc của CO8là kaempferol phù hợp với

phổ của tài liệu tham khảo được đo trong cùng một dung môi [38].

Kaempferol đã được phân lập từ nụ cây Vối của Việt Nam.

Kaempferol đã được chứng minh có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase

với giá trị IC50 là 55±5 mM(8,41µg/ml) [10].

♦ Chất CO9(Quercetin)

Hợp chấtCO9 được phân lập từ phần chiết etyl axetat của lá cây Vối dưới dạng tinh thể hình que màu vàng, đ.n.c. 295-297 oC, Rf = 0,4 (TLC, silica gel,

diclometan-axeton 4:1, v/v).

Quercetin – CO9

Công thức phân tử C15H10O7 của CO9 được giả thiết từ phổ ESI-MS với sự

xuất hiện các pic giả ion phân tử ở m/z 303 ([M + H]+) và 301 ([M - H]-).

Phổ 1H-NMR (CD3OD) của CO9cho thấy sự có mặt của 5 nhóm tín

hiệu cộng hưởng từ proton ở δH 6,21 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,41 (1H, d, J = 2,0 Hz),

6,9 (1H, d, J = 9,0 Hz),7,65 (1H, dd, J = 9,0 Hz, 2,0 Hz) và 7,75 (1H, d, J = 2,0

Hz). Các tín hiệu này đặc trưng cho một cấu trúc khung flavonol với vòng A bị thế

5,7-dihydroxy và vòng B có phần cấu trúc catechol (3,4-dihydroxy).

47

Các dữ kiện phổ 1H-NMR cho thấy cấu trúc của CO9 là quercetin chồng khít

với phổ của tài liệu tham khảo được đo trong cùng một dung môi [35].

Quercetin đã được phân lập từ nụ cây Vối của Việt Nam.

Quercetin đã được chứng minh có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase khá

tốt với giá trị IC50 là 29,4 mM (8,88 µg/ml)[26].

♦ Chất CO10 (Axit arjunolic)

Hợp chất CO10 được phân lập từ phần chiết etanol-nước của lá cây Vối dưới dạng tinh thể hình que màu vàng, đ.n.c. 295-297 oC, Rf = 0,4 (TLC, silica gel,

diclometan-axeton 4:1, v/v).

Axit arjunolic – CO10

Phổ 1H-NMR của CO10chỉ ra sự có mặt của 6 nhóm metyl bậc 3 ở dạng singlet

ở H0,72 (3H, s), 0,86 (3H, s), 0,95 (3H, s), 0,98 (3H, s), 1,10 (3H, s), 1,22 (3H, s), hai

nhóm oxymetin ở H3,37 (1H, d, J = 9,5 Hz), 3,71 (1H, m) và một proton olefinic ở H

5,28 (1H, t, J = 3,5 Hz). Độ chuyển dịch hóa học proton của nối đôi cho thấy vị trí C-

12/C-13 của nối đôi này. Do không có sự khác biệt nhiều của các tín hiệu proton và

cacbon-13 ở các vòng B, C, D và E của CO10 khiđược so sánh với axit maslinic

(CO7), các nhóm hydroxy được giả thiết liên kết vào các vị trí C-2 và C-3 của vòng A.

Khi giữ nguyên một nhóm hydroxy ở C-3 và phân tích các hằng số tương tác giữa các

proton cacbinol quan sát thấy sự dịch chuyển về phía trường thấp của H-3 từ H 3,2 về

H 3,71; điều này cho giả thiết là nhóm hydroxy còn lại được liên kết vào C-2. Trong

48

trường hợp này các nhóm hydroxy được định hướng 2αvà3βdo các hằng số tương tác J

= 9,5 Hz giữa H-3axial và H-2axial và 11,5 Hz giữa H-2axial và H-1axial và 9,5 Hz giữa H-

2axial và H-3axial. Sự thiếu hụt một nhóm metyl được giải thích bằng các tín hiệu của

một hệ AB với hằng số tương tác J = 11,0 Hz của nhóm hydroxymetyl ở C-23. Một

cách tương ứng tín hiệu cộng hưởng cacbon-13 của C-24 được chuyển dịch về trường

cao từ C 17,6 của axit maslinic về C 13,9 của axit arjunolic. Các tín hiệu cacbon-13

còn lại cũng hoàn toàn phù hợp với phổ được công bố của chất này với 30 tín hiệu

cacbon-13 bao gồm 6 nhóm metyl CH3, 10 nhóm metylen CH2, 3 nhóm metin CH, 2

nhóm oxymetin ở C 69,9 (d) và 78,1 (d), một nhóm oxymetylen ở C 66,2 (t), một nối

đôi thế ba lần ở C 123,4 (t) và 145,4 (s) và một nhóm cacboxyl ở C 181,8 (s).

So sánh phổ 1H-NMR của CO10 với các dữ kiện phổ của các chất oleanen-12-

en trong các tài liệu tham khảo được đo trong cùng một dung môi đã xác định chính

xác được cấu trúc của CO10 là axit arjunolic [43].

Axit arjunolic ức chế enzymα-glucosidase với giá trị IC50 là 45,0±3,6µg/ml

[43].Chấtnày chưa được phân lập từCleistocalyx operculatus.

3.5. TỔNG KẾT CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP

49

♦ Chất CO1 (1-Tetratriacontanol)

♦ Chất CO2 (2',4'-Dihydroxy-6'-metoxy-3',5'-dimetyl-chalcon)

♦ Chất CO3 (β-Sitosterol)

50

♦ Chất CO4 (Betulin)

♦ Chất CO5 (Axit betulinic)

♦ Chất CO6 (Axit oleanolic)

51

♦ Chất CO7 (Axit maslinic)

♦ Chất CO8 (Kaempferol)

♦ Chất CO9 (Quercetin)

52

♦ Chất CO10 (Axit arjunolic)

53

Bảng 1: Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase

của các hợp chất phân lập được từ lá cây Vối

Giá trị IC50 TT Tên chất Ghi chú (µg/ml)

Lần đầu tiên được 1 1-Tetratriacontanol(CO1) - phân lập

2',4'-Dihydroxy-6'-metoxy-3',5'- 2 4,3±0,2 [10] dimetylchalcon (CO2)

283,67 [37] 3 β-Sitosterol(CO3)

Lần đầu tiên được 10,02±1,24 [41] 4 Betulin(CO4) phân lập

3,6 ± 0,5 [10] 5 Axit betulinic(CO5)

6,1 ± 0,3 [10] 6 Axit oleanolic(CO6)

Lần đầu tiên được 5,52±0,19 [23] 7 Axit maslinic(CO7) phân lập

8,41 [10] 8 Kaempferol (CO8)

8,88 [26] 9 Quercetin(CO9)

Lần đầu tiên được 10 Axit arjunolic (CO10) 45,0±3,6 [43] phân lập

54

KẾT LUẬN

Luận văn “Nghiên cứu các hợp chất thành phần nhằm góp phần đánh giá tác

dụng điều trị tiểu đường của cây Vối (Cleistocalyx operculatus Roxb. Merr.et Perry)”

đã thực hiện đầy đủ các nhiệm vụ nghiên cứu đặt ra.Trong quá trình thực hiện đề

tài, chúng tôi đã thu được các kết quả nghiên cứu như sau:

1. Đã lựa chọn được quy trình chiết với etanol và etanol-nước để điều chế

được từ lá cây Vối các phần chiết có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase và phân

tách sắc ký để phân lập được 10 hợp chấtthành phần chính nhằm đánh giá ảnh

hưởng của chúng đến tác dụng điều trị tiểu đường của cây Vối.

2.Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, và

DEPT đã xác định được cấu trúc của các chất được phân lập là 1-

tetratriacontanol(CO1), 2',4'-dihydroxy-6'-metoxy-3',5'-dimetylchalcon (CO2), β-

sitosterol (CO3), betulin (CO4), axit betulinic (CO5), axit oleanolic (CO6), axit

maslinic (CO7), kaempferol (CO8), quercetin (CO9), axit arjunolic (CO10).Trong

số các chất được phân lập có3 flavonoid: CO2, CO8, CO9;5 triterpenoid: CO4,

CO5, CO6, CO7, CO10;1 ancol mạch dài: CO1 và1 steroid: CO3. Các chất 1-

tetratriacontanol (CO1), betulin (CO4), axit maslinic (CO7),axit arjunolic

(CO10)lần đầu tiên được phân lập từ Cleistocalyx operculatus.

3.Trong số các chất được phân lập 9/10 chất đã được chứng tỏ hoạt tính ức

chế tốt enzym α-glucosidase qua đó góp phần giải thích tác dụng ức chế enzym α-

glucosidase của các dịch chiết etanol và etanol-nước và tác dụng điều trị tiểu

đường của cây Vối trong Y học cổ truyền.

55

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Võ Văn Chi, Vũ Văn Chuyên, Lê Khả Kế (1971),Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam

(II), NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

2. Trương Thị Tố Chinh (2014), “ Nghiên cứu quy trình công nghệ chiết tách và tạo

chế phẩm từ cao chiết chứa hoạt chất có khả năng ức chế α-glucosidase từ cây Vối

(Cleistocalyx operculatus Roxb. Merr.Et Perry) sử dụng trong hỗ trợ điều trị tiểu

đường”, Đề tài nghiên cứu & phát triển, Bộ Công thương, Hà Nội.

3. Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Xuân Dũng, Hoàng Văn Lựu (1997),“Nghiên cứu

thành phần hoá học của cây vối Việt Nam”,Tạp chí Khoa học, 3, 47-51.

4.Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam,NXB Y học Hà Nội, 514-515.

5. Phạm Hoàng Hộ (1994),Cây cỏ Việt Nam (II),NXB Trẻ, Thành phố Hồ Chí

Minh.

6. Đào Thị Thanh Hiền, Phạm Thanh Kỳ(2003),“Nghiên cứu một số tác dụng sinh

học của lá cây Vối”, Tạp chí Dược học, 3,22-23.

7.https://vi.wikipedia.org/wiki/V%E1%BB%91i (truy cập tháng 12/2015).

8. Đỗ Tất Lợi (1999),Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà

Nội,423.

9. Nguyễn Đức Minh (1972),Tính kháng khuẩn của cây thuốc Việt Nam,NXB Y

học, Hà Nội.

10. Hà Thị Bích Ngọc (2011), “Điều tra nghiên cứu một số thực vật Việt Nam có

tác dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường trong máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái

tháo đường type 2”, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Hà nội.

11.Viện điều tra quy hoạch (1982), Cây gỗ rừng Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà

Nội.

TIẾNG ANH

12. Amor E. C., Villasenor I. M., Yasin A., Choudhary M. I. (2004), “Prolyl

endopeptidase inhibitors from Syzygium samarangense (Blume) Merr. & L. M.

Perry”, Z. Naturforsch., 59c, 86-92.

56

13. Ayatollahi A. M., Ghanadian M., Afsharypour S., Abdella O. M., Mirzai M.,

Askari G. (2011), “Pentacyclic triterpenes in Euphorbia microsciadia with their T-

cell proliferation activity”, Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 10, 287-

294.

14. Bajpai V. K., Dung N. T., Suh H. I., Kang S. C. (2010), “Antibacterial Activity

of Essential Oil and Extracts of Cleistocalyx operculatus Buds Against the

Bacteria of Xanthomonasspp.”, Journal of the American Oil Chemists' Society, 87

(11), 1341-1349.

15. Benalla W., Bellahcen S., Bnouham M. (2010), “Antidiabetic medicinal plants

as a source of alpha glucosidase inhibitors”, Current Diabetes Reviews, 6 (4), 247-

254.

16. CharoensinS., TayaS., WongpornchaiS., WongpoomchaiR. (2012), “Assessment

of genotoxicity and antigenotoxicity of an aqueous extract

of Cleistocalyx nervosum var. paniala in in vitro and in vivo models”, Interdiscip.

Toxicol.,5(4),201-206.

17. Chen L. S., OuJ. J., LiS. Y., LuS. G.(2014), “Study on quantitative methods of

Cleistocalycis operculatus cortex”,Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,39(16), 3128-3130.

18.Choi J. W., Kim M., Song H., Lee C. S., Oh W. K., Mook-Jung I., Chung S.

S., Park K. S. (2016), “DMC (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone)

improves glucose tolerance as a potent AMPK activator”,Metabolism, 65 (4), 533-542.

19. Dao T. T., Tung B. T., Nguyen P. H., Thuong P. T., Yoo S. S., Kim E. H.

(2010), “C-Methylated Flavonoids from Cleistocalyx operculatus and Their

Inhibitory Effects on Novel Influenza A (H1N1) Neuraminidase”, J. Nat. Prod. 73,

1636-1642.

20. Dung N. T., Bajpai V. K., Yoon J. I., Kang S. C. (2009), “Anti-inflammatory

effects of essential oil isolated from the buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.)

Merr. and Perry”,Food Chem. Toxicol.,47(2), 449-453.

21. Dung N. T., Kim J. M., Kang S. C.(2008), “Chemical composition,

antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and the ethanol extract

ofCleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. and Perry buds”,Food Chem. Toxicol.,

46(12), 3632-3639.

57

22. Guvenalp Z., Ozbe H. K., Kuruuzum-Uz A., Kazaz C., Demirezer L. O. (2009),

“Secondary metabolites from Nepeta heliotropifolia”, Turk. J. Chem., 33, 667-675.

23. Hou W., Li Y., Zhang Q., Wei X., Peng A., Chen L., Wei Y. (2009), Triterpene

acids isolated from Lagerstroemia speciosa leaves as α-glucosidase inhibitors,

Phytotherapy Research, 23 (5), 614–618.

24.Hu Y. C., Hao D. M., Zhou L. X., Zhang Z., Huang N., Hoptroff M., Lu Y. H.

(2014), “2',4'-Dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone protects the impaired

insulin secretion induced by glucotoxicity in pancreatic β-cells”,J. Agric. Food

Chem.,62(7),1602-1608.

25. Huang H. Y., Niu J. L., Lu Y. H. (2012), “Multidrug resistance reversal effect of

DMC derived from buds of Cleistocalyx operculatus in human hepatocellular tumor

xenograft model”,J. Sci. Food. Agric.,92(1), 135-140.

26. Kumar S., Narwal S., Kumar V., Prakash O. (2011), “α-Glucosidase inhibitor

from plants: A natural approach to treat diabetes”, Pharmacognosy Review, 5 (9),

19-29.

27.Lu Y. H., Du C. B., Wu Z. B., Ye C. L., Liu J. W., Wei D. Z. (2003), “Protective

effects of Cleistocalyx operculatus on lipid peroxidation and trauma of neuronal cells”

Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,28(10), 964-966.

28. Luo Y., Lu Y. (2012), “2',4'-Dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone inhibits

apoptosis of MIN6 cells via improving mitochondrial function”,Pharmazie, 67(9),

798-803.

29. Mai T. T., Yamaguchi K., Yamanaka M., Lam N. T., Otsuka Y., Chuyen N. V.

(2010), “Protective and anticataract effects of the aqueous extract of Cleistocalyx

operculatus flower buds on beta-cells of streptozotocin-diabetic rats”,J. Agric.

Food Chem., 58(7), 4162-4168.

30. Mai T. T., Chuyen N. V. (2007), “Anti-hyperglyceamic Activity of an Aqueous

Extract from Flower Buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.and Perry”,

Biosci. Biotechnol.Biochem., 71 (1), 69-76.

31. Manosroi J., Chankhampan C., Kumguan K., Manosroi W. (2015), ”In vitro anti-

aging activities of extracts from leaves of Ma Kiang (Cleistocalyx nervosum var.

paniala)”, Pharm. Biol.,53(6), 862-869.

58

32. MinB. S., ThuC. V., DatN. T., Dang N. H., Jang H. S., Hung T. M. (2008),

“Antioxidative Flavonoids from Cleistocalyx operculatus ((Roxb.) Merr. and

Perry”, Chem. Pharm. Bull., 56(12), 1725-1728.

33. MinB. S., Cuong T.D., Lee J. S., Shin B. S., Woo M. H., Hung T. M.(2010),

“Cholinestearase inhibitor from Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. and Perry

Bubs”, Arch. Pharm. Res., 33(10), 1665-1670.

34. Min B. S., Cuong T. D., Lee J. S., Won M. H., Hung T. M. (2010), “Flavonoids

FromCleistocalyx operculatus Buds and their Cytotoxic Activity”, Bull. Korean

Chem. Soc., 31(8), 2392-2394.

35. Naidu V. S., P. Kinthada M. M. S., Kalyani P., Muralidhar P. (2012),

“Characterization and biological activities of quercetin thiosemicarbazone

derivatives: potential anticancer drugs”, Int. J. Pharm. Biomed. Sci., 3, 24-27.

36. Poontawee W., Natakankitkul S., Wongmekiat O. (2016), “Protective Effect

of Cleistocalyx nervosum var. paniala Fruit Extract against Oxidative Renal Damage

Caused by Cadmium”,Molecules,21 (2), 133.

37. Sheng Z., Dai H. , Pan S., Wang H., Hu Y., Ma W. (2014), “Isolation and

characterization of an α-glucosidase inhibitor from Musa spp. (Baxijiao) Flowers”,

Molecules, 19, 10563-10573.

38. Soliman F. M., Shehata A. H., Khalael A. E., Ezzat S. M. (2002), “An acylated

kaempferol glycoside from flowers of Foeniculum vulgare and F.

dulce”, Molecules, 7, 245-251.

39. Tanaka J. C. A., Vidotti G. J., da Silva C. C. (2003), “A new tormentic acid

derivative from Luchea divaricata Mart. (Tuliaceae)”, J. Braz. Chem. Soc., 14,

475-478.

40. Taya S. , Punvittayagul C., Inboot W., Fukushima S., Wongpoomchai R. (2014),

“Cleistocalyx nervosum extract ameliorates chemical-induced oxidative stress in early

stages of rat hepatocarcinogenesis”,Asian Pac. J. Cancer Prev., 15 (6), 2825-2830.

41. Thiantogin P., Sotimuang C., Ovatlarnporn C. (2014), “α-Glucosidase and α-

amylase inhibitory activities of Thai folk antidiabetes formularies”. Proceedings of the

3rd CDD International Conference, Ao Nang, Thailand.

42. Tijjani A., Ndukwe I. G., Ayo R. G. (2012), “Isolation and characterization of

lup-20(29)-ene-3,28-diol (betulin) from the stem-bark of Adenium

59

obesum (Apocynaceae)”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 11, 159-

262.

43.Use of arjunolic acid in preparing glycosidase inhibitor (2009),Patent

CN101416970A.

44. Woo A. Y., Waye M. M., Kwan H. S., Chan M. C., Chau C. F., Cheng C. H.

(2002), “Inhibition of ATPases by Cleistocalyx operculatus. A possible mechanism

for the cardiotonic actions of the herb”,Vascul. Pharmacol., 38(3), 163-168.

45.Ye C. L., Lai Y. F., Liu X. G., Huang Q. (2014), “Study on mechanism of

inducing apoptosis in human hepatoma SMMC-7721 cells by DMC, a chalcone

from buds of Cleistocalyx operculatus”,Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 39(15), 2942-

2946.

46.Ye C. L., Liu J. W., Wei D. Z., Lu Y. H., Qian F. (2004), “In vitro anti-tumor

activity of 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone against six

established human cancer cell lines”, Pharmacol. Res., 50(5), 505-510.

47.Ye C. L., Lu Y. H., Wei D. Z.(2004), “Flavonoids from Cleistocalyx

operculatus”, Phytochemistry, 65(4),445-447.

48.Yu W. G., He H., Yao J. Y., Zhu Y. X., Lu Y. H. (2015), “Dimethyl Cardamonin

Exhibits Anti-inflammatory Effects via Interfering with the PI3K-PDK1-PKCα”,

Signaling Pathway, 23(6), 549-556.

49. Zhang F.-X., Liu M.-F., Lu R.-R. (1990), “Studies on the chemical constituents

from the bud of Cleistocalyx operculatus”,Acta Botanica Sinica, 32 (6), 469-472.

60

PHỤ LỤC

61